Brevet FR2173632A1 — publié le 19731012

La présente invention concerne les procédés de récupération et de purification des antibiotiques, et de façon plus précise elle vise un procédé de récupération et de purification chimique de l'amphotéricine B qui se classe parmi les aiti- biotiques macrolidiques heptaéniques. L'amphotéricine B trouve des applications dans la pratique médicale pour le traitement des formes graves de mycoses et d'autres affections dues aux champignons. On connait déjà des procédés de récupération et de purz- fication chimique de l'amphotéricine B, notamment un procédé qui consiste à précipiter, au moyen d'eau, l'antibiotique brut dissous dans le dimétnylformamide à séparer ensuite le préci- pité par filtration, à le laver avec de l'acétone puis à le sécher sous vide. Dans un autre procédé on dissout l'antibiotique brut dans une solution aqueuse d'alcool isopropylique à pHcompris entre 2 et 3, on sépare par filtration le sédiment non dissous, on neutralise la solution jusqu'à un pH de 5 à 7, on sépare par filtration le précipité d'antibiotique qui en résulte, on lave ce dernier avec de l'acétone, puis on sèche sous vide. On connaît également un procédé dans lequel l'antibiotique brut subit une reprécipitation au moyen d'eau au sein d'une solution de chlorure de calcium dans le méthanol, suivie du lavage et séchage de l'antibiotique. L'activité du produit final obtenu selon les procédés indiqués se chiffre par 750 /mg. L'inconvénient desdits procédés réside dans le fait qu'aucun d'entre eux ne prévoit une purification de l'amphotéricine. B pour en éliminer ltheptaène inactif qui l'accompagne. Cet heptaene se forme, parallèlement à l'accumulation de l'antibiotique, au cours de la fermentation de-la culture productrice "Actinomyces nodosus". La présence de ce produit déprécie la qualité du produit fini. La présente invention se propose de supprimer l'inconvénient précité. Conformément à cet objectif, l'invention vise à améliorer la qualité du produit final par le choix d'une nouvelle composition organique aqueuse et par la mise- en oeuvre d'un moyen de fabrication approprie. Le problème ainsi posé a été résolu en ce que dans le procédé, conforme à l'invention, de récupération et de purification chimique de l'amphotéricine B par précipitation de cetui-ci au moyen d'eau au sein d'une solution d'antibiotique brut dans le diméthylformamide, suivie d'un lavage par un solvant organique, on ajoute à la solution d'antibiotique brut dans le diméthylformamide 0,5 volume d'eau distillée par rapport au volume de diméthylformamide, on acidule le mélange ainsi obtenu jusqu'à un pH de 2 à 7,6 on sépare par filtration les impuretés précipitées, on ajoute au filtrat un volume d'eau égal au volume initial du solvant, on porte ensuite le mélange à un pH compris entre 6,5 et 7,0 et on isole le produit visé que l'on lave avec une solution aqueuse de n-propanol puis avec de l'acétone et on sèche. Il est avantageux de préparer la solution d'antibiotique brut dans le diméthylformamide en mélangeant 1 partie en masse d'antibiotique brut avec 10 à 20 volumes de diméthylformamide et en acidulant ensuite le mélange obtenu jusqu a un pH de 7 à 7,5 au moyen d'acide chlorhydrique. L'acidulation du mélange jusqu'à un pH de 2 à 3,6 est de préférence effectuée par une solution aqueuse à 10 % d'acide chlorhydrique. I1 est avantageux d'effectuer l'alcalinisation du mélange jusqu'à un pH de 6,5 à 7,0 par une solution aqueuse à 10 %0 d'hydroxyde de sodium. Il y a intéret à utiliser pour-le lavage du produit final une solution aqueuse à 50 % de n-propanol. Be procédé faisant l'objet de l'invention est réalisé de la manière suivante. On met en suspension l'amphotéric-ine B brute de départ dans le diméthylformamide. A cette fin, on mélange 1 partie en masse d'amphotéricine B brute avec 10 à 20 volumes de diméthylformamide. Ensuite tout en agitant le mélange, on l'acidule au moyen d'acide chlorhydrique concentré jusqu'.à un pH de 7 à 7,5. On continue de malaxer le mélange pendant 1,5 à 2 heures jusqu'à la dissolution complète des heptaènes. Cela fait, on ajoute lentement tout en agitant de l'eau distil lée à raison de 0,5 volume par rapport au volume de diméthTlfor- mamiae engagé On ajuste le pH du mélange à 2-3,6 au moyen d'une solution à 'O d'acide chlorhydrique. Le précipité ou en résulte, constitué essentiellement pas de ltheptaène inactif, est séparé par filtration ou centrifugeage et rejeté. A la solution limpide on ajoute, tout en agitant, de l'eau distillée à raison de 1 volume par volume de diméthylformamide. On porte le mélange à un pH de 6,5 à 7,0 au mcyen d'une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde de sodium, et on filtre ou centrifuge la suspension d'antibiotique formée.La pate obtenue est lavée par une solution aqueuse à po d'alcool propylique normal, puis par de l'acétone, après quoi elle est séchée sous vide. On obtient finalement l'amphotéricine B résentant une activité spécifique supérieure à 750""'/mg, la teneur en cendres étant inférieure à 0,54. Be procédé conforme à l'invention permet d'obtenir l'amphotéricine B d'une haute pureté, destinée à la préparation de solutés injectables. L'invention est illustrée dans ce qui suit par des exemples de mise en oeuvre du procédé de préparation de l'amphotéricine B conformément à l'invention. Exemple 1. On mélange 25 g d'amphotéricine B brute présentant une activité biologique spécifique de 500#/mg, une extinction # ##### = 1100 et contenant moins de 5% d'aiaphotéri- cine A, avec 500 ml de diméthylformamide, en opérant à la température de 200C. On ajuste le pH du mélange, tout en agitant à 7,2 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. On malaxe le mélange pendant 1,5 heure. A la solution obtenue on ajoute lentement, durant 1 heure et tout en agitant, 250 ml d'eau distillée. On ajuste le pH du mélange à 3,2 au moyen d'une solution à 10% d'acide chlorhydrique. Le précipité qui en résulte est séparé par filtration sous tride- et rejeté. A la solution transparente on ajoute tout en agitant, 500 ml d'eau distillée. On porte le pH du mélange à 6,5 par addition d'une solution aqueuse à 10 d'hydroxyde de sodium et on soumet au centrifugeage la suspension formée. Tout en agitant, on lave la pate d'antibiotique obtenue avec 500 ml d'une solution aqueuse à 50% d'alcool n propylique, en opérant pendant 2 heures à la température ambiante. Après lavage on sépare la pâte par centrifugeage, on lave avec de l'acétone, on filtre et on sèche sous vide, sous une pression résiduelle de 10 mm de Hg et à une teterat-ure de 20 C.Le poids du produit finalement obtenu est de 8,0 g, l'activité biologique spécifique de la poudre est de 800 #/mg, et l'extinction # ####### est égale à 1500. Le rendement en amphotéricine B, rapporté à l'activité manifestée par l'antibiotique brut, est égal à 51 Exemple 2. On charge dans un réacteur émaillé muni d'un agitateur 100 g d'amphotéricine B brute présentant une activité biologique spécifique de 500 Y/mg, une extinction 1% 1150 et contenant moins de 5% d'amphotéricine A, on y ajoute 1 litre de diméthylformamide et, tout en agitant on porte le pH du mélange à 7,0 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. On continue de malaxer le mélange pendant encore 2 heures. wla solution ainsi obtenue on ajoute lentement, durant 1,5 heures et tout en agitant, 0,5 litre d'eau distillée. On ajuste le pH du mélange à 2,8 au moyen d'acide chlorhydrique con-entré.Le préci- pité qui en résulte est séparé par centrifugeage et rejeté. A a solution transparente placée dans un réacteur émaillé on ajoute, tout en agitant, 1 litre d'eau distillée. On porte le mélange à un p11 de 6,8 par addition d'une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde de sodium et on sépare le précipité d'antibiotique qui en résulte par centrifugeage. La pâte obtenue est lavée, dans un récipient émaillé, avec 2 litres d'une solution aqueuse à 50% de n-propanol, en opérant pendant 3 heures à la température ambiante.A l'issue du lavage, on sépare la pâte par centrifugeage, on lave avec de l'acétone, on filtre et on sèche sous vide, sous une pression résiduelle de 10 mm de Hg et à une température de 2O0C. Le poids du produit fini est de 20 g, l'activité biologique spécifique de la poudre est de 900 Y/mg et l'extinction 1% est égale à 1500. Be rendement en amphotéricine B, rapporté å activité manifestée par l'antibiotique brut, est égal à 76. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Un procédé de récupération et de purification chimique de l'amphotéricine B, utilisée notamment en tant qu'antibiotique pour le traitement des mycoses et autres affections des aux champignons, procédé du type dans lequel on procède à une précipitation de l'amphotéricine B au moyen d'eau au sein d'une solution d'antibioti que brut dans le diméthylformamide suivie cie lavages par au moins un solvant organique constitué par une solution aqueuse d'un alcool, ledit procédé étant caractérisé sn ce qu'à la solution d'antibiotique brut dans le diméthylformamide, on ajoute 0,5 volume d'eau distillée par rapport à celui de diméthylformamide, on acidule le mélange obtenu jusqu'à un pH de 2 à 3,6, on sépare par filtration les impuretés précipitées, on ajoute au filtrat un volume d'eau égal au volume initial du solvant, on porte ensuite le pH du mélange à 6,5 à 7,0 et on isole le produit visé par lavage du précipité avec une solution aqueuse de n-propanol puis avec de l'acétone, et sédhage. 2.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution d'antibiotique brut dans le diméthylformamide est préparée en mélangeant 1 partie, en masse, d'antibiotique brut avec 10 à 20 volumes de diméthylformamide et on acidule ensuite le mélange obtenu jusqu'à un pH de 7 à 7,5 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. 3.- Un procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'acidulation du mélange jusqu'à un pH de 2 à 3,6 est effectuée par une solution aqueuse à 10 % d'acide chlorhydrique. 4.- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'alcalinisation jusqu'à un pH de 6,5 à 7,0 est effectuée par une solution aqueuse à 10 % d'hydroxyde de sodium. 5.- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le lavage du produit visé est effectué par une solution aqueuse à 50 % de n-propanol. 6.- L'amphotéricine 3, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé suivant l'une des revendications 1 à 5.