Brevet FR2172882A1 — publié le 19731005

Cette invention concerne un procédé de transformation enzymatique en fructose d'une partie - da glucose contenu dans une solution. L'utilisation principale du glucose et des sirops de mais qui contiennent du glucose, se trouve dans la production de denrées alimentaires, par exemple dans les industries de la boulangerie, des boissons, des conserves alimentaires et de la confiserie, pour donner un doit sucré, du corps ou pour régula- riser la croissance d'un cristal. Toutefois, son emploi est quelque peu limité parce que le glucose n'a de lui-mEme un gott sucré qu't un faible degré et a une saveur relativement fade. On surmonte cette difficulté, jusqu'a un certain point, en mélangeant au glucose ou aux sirops de mars du saccharose ou des sirops inversés pour améliorer le doit sucré total. Toutefois ceci n'a pas donné entière satisfaction en raison des prix et des autres facteurs impliqués. On a trouvé que si on peut transformer en fructose,pendant la production de sirops de mais et d'autres sirops contenant du glucose,une proportion importante du glucose, on obtient dans sirops qui sont suffisamment sucrés pour remplir les buts de leur addition. On sait depuis longtemps dans la technique que l'on peut transformer le glucose en fructose en chauffant une liqueur contenant du glucose, comme un sirop de mais, en présence d'un catalyseur basique. En raison de la non-sélectivité des catalyseurs basiques, on produit divers sous-produits indésirables, comme de grandes quantités de corps colorés et de substances acides.Raffiner la liqueur alcaline isomérisée pour en enlever les sous-produits indésirables demande des modes opératoires de raffinage plutôt compliqués et motteux. En conséquence, on n'a pas pratiqué d l'échelle industrielle l'isomérisation alcaline, pour autant que les inventeurs le sachent, en raison sans doute des prix entrains par le raffinage d'une telle liqueur isomérisée et la qualité relativement faille du produit résultant. Divers micro-organismes produisent des enzymes qui isomérisent en fructose le glucose contenu dans des sirops. Par exemple, les brevets japonais 7428/66 et 7430/66 de Takasaki et al., décrivent un certain nombre de micro-organismes appartenant au genre Streptomyces comme élaborant l'isomérase du glucose. D'autres micro-organismes qui élaborent l'isomérase du glucose sont décrits, par exemple, dans les brevets japonais 11897/65, 20230/65, 7431/66 et 17640/66. Bien que les enzymes isomérisant le glucose sont plus sélectives dans la transformation du glucose en fructose que ne 11 est un catalyseur basique, un certain nombre de problèmes sont toutefois associés à leur utilisation industrielle. Le principal problème est que le rendement ou la quantité d'isomérase du glucose produite par les micro-organismes est généralement relativement faible. Aussi, comme l'isomérase du glucose est produite principalement dans les cellules des microorganismes et que c'est une pratique courante d'utiliser les cellules entières pour les réactionsdtisomérisation, il faut utiliser de grandes quantités du matériau cellulaire.Ces grandes quantités de matériau cellulaire entrainent des manipulations et des systèmes de transport trop importants, activent des réactions secondaires indésirables pendant la réaction d' isomérisation et prennent de la place dans le réacteur dans lequel on effectue l'isomérisation, place que l'on pourrait utiliser pour la solution de glucose. On a besoin d un procédé de transformation enzymatique du glucose en fructose dans lequel on utilise comme source d'enzymesdes cellules microbiennes contenant une grande quantité d'isomérase du glucose. Selon la: présente invention, il est fourni un procédé de transformation enzymatique en fructose d'une partie du glucose contenu dans une solution, lequel procédé consiste à traiter des micro-organismes viables qui contiennent de l'isomérase du glucose dans leurs cellules, par une quantité d'un agent toxique qui détruit au moins 95 pour cent des micro-organismes viables, à cultiver les micro-organismes encore viables après ledit traitement dans des conditions qui favorisent leur croissance, d incorporer l'isomérase du glucose ainsi produite à une solution contenant du glucose, et à maintenir l'isomérase du glucose dans la solution dans des conditions dans lesquelles une certaine quantité du glucose est transformée en fructose, les micro-organismes viables traités étant caractérisés par le fait qu'ils produisent au moins environ 30 pour cent de plus d'isomérase du glucose que les micro-organismes non traités, quand on les cultive dans les mêmes conditions. Le terme "micro-organisme" employé ici comprend les spores et les cellules végétatives. On peut utiliser dans le présent procédé un certain nombre d'agents toxiques. Comme exemple tels agents, citons la chlorethazine, la p-propionolactone, le carbamate d'éthyle, l'éthylènenimine, le peroxyde d'hydrogène, la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine, le chlorhydrate d'acriflavine, la 8-éthoxycaféine, la nitrosométhylurée et le rayonnement d'isotopes radioactifs et la lumière ultraviolette. On doit utiliser de préférence ces agents toxiques dans des quantités et dans des conditions telles que l'on détruit au moins 95 pour cent des micro-organismes viables.Les micro-organismes qui n' ont pas été détruits par un tel traitement, produisent généralement au moins 30 pour cent et de préférence au moins 50 pour cent de plus d'isomérase du glucose que les micro-organismes que l'on n'a pas ainsi traités. Dans les procédés industriels de culture des micro-organismes, il est nécessaire de procéder par étapes. Ces étapes peuvent être peu nombreuses ou nombreuses, selon la nature du procédé et les caractéristiques des micro-organismes. Généralement, on démarre la culture en ensemençant des spores provenant dune culture sur tube incliné dans un milieu nutritif pré-stérilisé contenu généralement dans un flacon à agitation. Dans le flacon, on encourage la croissance des micro-organismes par divers moyens, par exemple agiter pour aérer et maintenir une température appropriée. On peut répéter ce stade ou étape une ou plusieurs fois dans des flacons ou des récipients contenant des volumes identiques ou plus grands dq milieu nutritif. Pour raison de commodité, on peut appeler ces étapes des étapes de développement de la culture. On introduit ou on ensemence dans un grand fermenteur les micro-organismes accompagnés ou non du milieu de culture, pour produire des quantités industrielles des microorganismes ou de leurs sous-produits. Dans le procédé de la présente invention,on préfère traiter les micro-organismes par l'agent toxique dans la première étape du développement de la culture, par exemple, dans un flacon à agitation contenant un milieu nutritif approprié. Après traitement, on peut placer les cellules des micro-organismes dans des boutes de Pétri cuslçena-=-, par exemple, un milieu d'agar et on laisse les cellules sporuler. Puis on enlève les spores et on les cultive Eour produire des micro-organismes contenant de grandes quantités d'isomérase du glucose. On peut utiliser d'autres procédés de traitement, par exemple on peut traiter les spores avec un agent toxique, enlever l'agent toxique par centrifugation, filtration ou autre, laver les spores et les repiquer dans un milieu approprié ou l'on favorise la germination. Après avoir cultivé les micro-organismes, on les sépare du milieu nutritif par filtration, centrifugation ou autre. On utilise généralement une petite quantité d'adjuvant de filtration pour faciliter la séparation. Traiter les microorganismes par un agent toxique selon le présent procédé, donne des micro-organismes que l'on sépare relativement facilement du milieu nutritif. Sans un tel traitement, la séparation est difficile, la filtration est prolongée et on a besoin de grandes quantités d'adjuvant de filtration. Puis oglpeut incorporer directement le matériau séparé à une solution contenant du glucose, en maintenant les conditions d'isomérisation du glucose. Quand la quantité voulue de fructose est formée, on sépare la substance cellulaire de la solution par filtration, centrifugation, etc., et on fait subir à RF solution isomérisée un raffinage qui enlève la coloration indésirable et les substances odorantes. Dans le procédé de la présente invention on préfère utiliser des micro-organismes du genre Streptomycos,les plus préférés étant Streptomyces ATCC 21175 ou 21176. Les conditions dans lesquelles on effectue la réaction d'isomé- citation peuvent varier largement. Par exemple, on peut effectuer la réaction d'isomérisation à une température comprise entre 500 et 75pu, mais l'isstervalle préféré de température va de 600 à 700C. Le pH type du mélange réactionnel est compris entre 6 et 7,5 et de préférence entre 6,5 et 7. On peut maintenir ces valeurs du pH pendant l'isomérisation en ajoutant une substance basique appropriée comme NaOH ou Mg(OEI)2. Pour décrire plus clairement la nature de la présente invention, on décrit par la suite des exemples spécifiques. Toutefois, il est évident que ceci est fait uniquement pour exemple et ne doit pas étre compris comme limitant le champ d'application de 1' invention ni l'ambition des revendications ci-jointes. Dans les exemples et dans la description, les pourcentages sont des pourcentages pondéraux, à moins d'une autre indication. On effectue la détermination de l'activité en isomérase du glucose de la préparation enzymatique par le procédé modifié au réactif cystéine-carbazole de Dische et Borenfreundw qui est paru dans le Journal of Biological Chemistry, Vol. 192, p.583 (1951). On met en oeuvre ce procédé comme suit On fait incuber à un pH de 7,5 et à une température de 700C, une partie du bouillon de fermentation contenant l'isomérase du glucose et pratiquement pas de matériau cellulaire, dans un milieu aqueux contenant O,lM de glucose 0,05M de NaH2PO4 0,005M de MgSO4.7H20 Au bout d'une heure, on abaisse le pH du mélange réactionnel à 3 par addition d'une solution dans l'eau de 5 pour cent, en poids, d'acide perchlorique, pour inactiver l'isomérase du glucose.On place dans un tube à essai I ml du mélange réactionnel, 0,2 ml d'une solution à 0,2 pour cent de chlorhydrate de cystéine, 5 ml d'une solution à 75 pour cent, en vplume, de H2S04 et 0,15 ml de 0,12 pour cent de carbazole dans de l'méthanol à 95 pour cent, on les mélange, et on place le tube à essai dans un bain-marie maintenu à 600C. Au bout de 10 minutes, on enlève du bain le tube à essai et on le refroidit rapidement à la température de la pièce. On mesure l'absorption de la lumière de la solution à 560 u et on détermine la teneur en fructose de l'échantillon. L'unité internationale d'isomérase du glucose (IGIU) est la quantité d'isomérase du glucose qui forme 7,87 mg de fructose dans les conditions ci-dessits. On fait des essais à blanc appropriés pour compenser les cétoses présente au départ dans la préparaticn enzymatique et ceux formés par l'isomérisation alcaline. EXEMPLE I Cet exemple illustre l'utilisation de l'éthylènimine comme agent toxique pour produire un micro-organisme qui forme de grandes quantités de l'isomérase du glucose. On fait sporuler une culture de Streptomyces ATCC 21175 sur un milieu stérile d'agar contenant 0,4 pour cent de xylose, 0,4 pour cent d'extrait de levure, 1,0 pour cent d'extrait de malt et 2 pour cent d'agar. Le pH du milieu est 7,3. On ensemence des spores provenant de cette culture sur tube incliné dans un flacon à agitation contenant 100 ml d'un milieu stérile composé de 1 pour cent de peptone, 1 pour cent d'extrait de levure, 0,1 pour cent de MgS04.7H20, 0,2 pour cent d'agar et 1 pour cent de xylose. Le pH du milieu est 7,0. On maintient le flacon à 300C et on l'agite à 200 tpm pendant 16 heures. Puis on ajoute au milieu 3,5 ml d'une solution aqueuse à 0,5 pour cent d'éthylènimine, et on agite le flacon pendant 30 minutes. On enlève les cellules du milieu par centrifugation et on place les cellules dans des bottes de Pétri contenant le milieu stérile d'agar décrit ci-dessus. On laisse les cellules crotte et sporuler. On repique ces spores à l'anse dans un flacon d'Erlenmeyer de 300 ml contenant 100 ml de milieu stérile, de pH 7, composé de 1 pour cent de peptone, 1 pour cent d'extrait de levure, 1 pour cent de xylose, 0,1 pour cent de MgSo4.7H20, 0,3 pour cent de K2zPo4 et 0,2 pour cent d'agar. On fait incuber le flacon ensemencé pendant 48 heures à-300C sur un agitateur rotatif à 200 tpm. On prélève du flacon 30 ml du bouillon fermenté et on le repique dans un flacon d'Erlenmeyer à déflecteur de 2 litres conteant 800 ml du milieu décrit immédiatement au-dessus On repique 20 ml de bouillon fermenté contenant Streptomyces ATCC 21175 que l'on a pré-traité à leéthylènimine dans un autre flacon d'Erlenmeyer à déflecteur de 2 litres contenant 800 ml du meme milieu.On agite ces flacons, à une température de 300C, pendant 48 heures à 180 tpm et on ensemence séparément le contenu total de chaque flacon dans deux fermenteurs de 40 litres contenant 25 litres d'un milieu stérilisé, de pH 7, composé de 1000 g de liqueur de macération de mais (290 Baumé), 6 g de CoC12.6H20, 250 g de sorbitol, 190 g de glucose, 1344 ml d'hydrolysat de graines de coton, 25 ml d'un agent antimoussant (Pluronic L-61 fabriqué par Wyandotte Chemical Co.), le complément étant de l'eau.On prépare l'hydrolysat de graines de coton en traitant une sus pension Contenant 16 pour cent, en poids, d'enveloppes de graines de coton et 2,5 pour cent, en poids, de H2S04, pendant 10 minutes à 300 c. On refroidit l'hydrolysat à 120-1400C , on le neutralise un un pH d'environ 4, on le filtre et on le concentre à 300 Baumé. On maintient la température des fermenteurs à 300 C, on les agite à 200 tpm et on les aère avec 1 volume d'air par minute par volume de milieu Après 65 h 1/2, on enlève le matériau cellulaire par filtration. On observe que le matériau cellulaire contenant le micro-organisme traité à l'éthylènimine filtre plus rapidement que ne le fait le matériau cellulaire contenant le micro-organisme que lton n'a pas traité à l'éthylènimine. On détermine l'activité en isomérase du glucose du gateau de filtration, et les résultats sont indiqués dans le Tableau. On ajoute à 800 ml de sirop de mats contenant 528 g de dextrose, O,OOlM de CoC12, 0,005M de MgS04, à un pH de 6,5, une quantité suffisante de matériau cellulaire du micro-organisme traité à l'éthylènimine pour obtenir un niveau de 560 IGlU. On maintient le mélange à 700C et à un pH de 6,5. Au bout de 59 heures, le sirop de mats contient 44,13 pour cent de fructose par rapport d la substance sèche. TABLEAU Activité en isomérase du glucose Micro-organisme (IGIU/g de substance sèche) 6treptomvces ATCC 21175 318 Stre tom ces ATCC 21175 518 traité par ltéthylènimine Le Tableau ci-dessus montre que, lorsqu'on traite un micro-organisme produisant l'isomérase du glucose par un agent toxique, on augmente grandement le rendement en isomérase du glucose obtenu ainsi. EXEMPLE Il Cet exemple illustre l'utilisation d'une combinaison d'agents toxiques pour produire un micro-organisme qui forme de grandes quantités de l'isomérase du glucose. On repique des spores de StreptomycesATcc 21175 dans une solution à 0,3 pour cent de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. On agite la solution pendant 30 minutes. On enlève les spores par centrifugation et on les met en suspension dans une solution saline stérile. On repique les spores de la solution saline dans une botte de Pétri contenant un milieu d'agar tel que celui décrit dans l'Exemple I. On laisse les spores germer et sporuler de nouveau. On met en suspension les spores d'une seule colonie dans une solution saline stérile contenue dans une botte de Pétri. On irradie la suspension pendant 90 minutes en utilisant une lumière ultraviolette (Sylvania-Black-Light-Blue), placée à 30 cm au-dessus de la botte de Pétri. On enlève les spores de la solution saline et on les étale dans des bottes de Pétri contenant le milieu stérile décrit dans l'Exemple I. On manipule les spores, on cultive le micro-organisme et on détermine l'activite en isomérase du glucose de la manière décrite dans l'Exemple I. L'activité en isomérase du glucose des micro-organismes traités est de 459 IGIU par gramme de substance sèche dans le bouillon du fermenteur. EXEMPLE III Cet exemple illustre l'utilisation de lumière ultraviolette pour produire un micro-organisme qui forme de grandes quantités de l'isomérase du glucose. On repique des spores de Streptomyces ATCC 21175 dans une solution saline stérile contenue dans une botte de pétri, et on les irradie pendant 2 heures en utilisant une lumière ultraviolette (Sylvania-Black-Light-Blue) placée à 23 cm au-dessus de la botte de Pétri. Pendant que l'on irradie les spores, on agite la solution saline. On manipule les spores, on cultive le micro-organisme, et on détermine l'activité de l'isomérase du glucose de la manière décrite dans l'Exemple Il. L'acitivité en isomérase du glucose du micro-organisme traité est de 412 IGIU par gramme de substance sèche dans le bouillon du fermenteur. REVENDLCATIONS 1. Procédé de transformation enzymatique en fructose d'une partie du glucose contenu dans une solution, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter des micro-organismes viables qui contiennent de l'isomérase du glucose dans leurs cellules, par une quantité d'un agent toxique qui détruit au moins 95 pour cent des microorganismes viables, à cultiver les micro-organismes encore viables après ledit traitement dans des conditions qui favo- risent leur croissance, à incorporer l'isomérase du glucose ainsi produite à une solution contenant du glucose, et à maintenir l'isomérase du glucose dans la solution dans des conditions dans lesquelles une certaine quantité du glucose est transformée en fructose, les micro-organimes viables traités étant caractérisés par le fait qu'ils produisent au moins environ 30 pour cent de plus d'isomérase du glucose que les micro-organismes non traités, quand on les cultive dans les mimes conditions. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit les micro-organismes dans le genre Streptomyces. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est Streptomyces ATCC 21175 ou ATCC 21176. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce qu'on choirait l'agent toxique dans le groupe formé de l'éthylènimine, la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine et la lumière ultraviolette. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 4, caractérisé en ce que l'on maintient la solution du glucose contenant les micro-organismes à une température de 50 à 750C et à un pH de 6 à 7,5. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la température est de 60 à 700C et le pH de 6,5 à 7,0. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'isomérase du glucose incorporée à la solution contenant du glucose se trouve dans les cellules des micrc-organismes cultivés.