Brevet FR2168179A1 — publié le 19730831

L'invention concerne un système et des milieux d'essai permettant d'identifier sélectivement des espèces particulières de bacilles entériques. Il existe de nombreuses variétés de bactéries qui habitent les voies intestinales et urinaires de 11 homme. Cependant, de nombreux membres du groupe entérique que l'on trouve fréquemment dans les voies intestinales ne causent aucun désordre pathologique tandis que d'autres, comme la Salmonella et la Shigella, lorsqu'on les trouve dans l'intestin, causent toujours une maladie. Ils sont capables de causer de la dysenterie, des nausées, des vomissements, une élévation de température, une hémorragie intestinale, une invasion du courant sanguin, etc0 Quand un médecin croit qu'un patient est malade par suite d'une infection bactérienne, il ordonne un test microbiologique.Si l'on n'arrive pas à isoler et à identifier ces organismes au laboratoire microbiologique, il peut en résulter un sérieux dommage pour le patient. Dans le cas où un traitement non approprié est administré à ces patients, les organismes peuvent envahir des organes internes, causant un dommage permanent, des complications internes et, parfois, la mort. 9i les patients survivent, il est possible qu'ils deviennent porteurs et transmettent l'infection à d'autres, causant parfois une épidémie. Les laboratoires hospitaliers aussi bien que les laboratoires privés se trouvent souvent devant deux problèmes importants dans ce domaine de la microbiologie diagnostique ou bien ils ont des microbiologistes inexpérimentés, ou bien ils ne disposent pas de la place ni des installations permettant un travail convenable. Par suite, la majorité des laboratoires prennent de 72 heures à une semaine, parfois plus, pour signaler la présence d'une Salmonella ou d'une Shigella.Pendant ce temps, les patients sont traités à l'aveuglette, le médecin attendant les résultats, parfois en vaine La famille des entérobactériacées comprend de nombreux genres apparentés qui sont tous impossibles à distinguer au microscope, ce sont des bâtonnets de 3 à 5 * sur 0,5 *, relativement rectilignes, à extrémités arrondies, de Gram négatif, de motilité diverse, certains d'entre eux étant capsulés, mais aucun d'eux ne possédant de spores. Tous les membres de la famille font fermenter le glucose avec ou sans formation de gaz.Les nombreuses caractéristiques communes rendent difficile l'identification d'une espèce particulière, meme pour un bactériologiste compétent On présente ci-après un nouveau système et un nouveau milieu de culture, conçus pour différencier les membres du groupe entérique de bactéries. Ce milieu a l'avantage de permettre la différenciation entre tous les groupes principaux de bactéries entériques après une nuit d'incubation à 3700 de colonies obtenues à partir de spécimens appliqués en stries sur une boute de culture et qu'on a fait incuber environ 24 heures. Traditionnellement, pour effectuer l'isolement et l'identification de ces microorganismes, on place le spécimen sur des milieux de culture sélectifs et différentiels, on place alors cette culture dans un incubateur à 970C et après une nuit d'incubation, on examine les milieux de culture pour déterminer la croissance caractéristique de colonies bactériennes du groupe entérique. On place alors les colonies dans des milieux diffé- rentiels de culture comme l'agar-agar au fer et aux trois sucres ou l'agar-agar au fer de Xligler et on les fait à nouveau incuber à 370C. Les réactions dans ces milieux différentiels sont basées sur l'aptitude de l'organisme à faire fermenter divers hydrates de carbone et à former de l'hydrogène sulfuré.Les résultats obtenus dans ces milieux ne permettent pas encore de conclusions, mais le tableau de réactions biochimiques obtenu donne au microbiologiste des indications sur la façon de poursuivre ses investigations. Il se peut que l'identification finale de l'organisme nécessite des milieux de culture supplémen- taires pour de nouveaux essais biochimiques. Aussi, il peut s'écouler plus de 72 heures entre la réception du spécimen et l'identification finale des organismes.Il est extrêmement important pour le médecin d'identifier les organismes pathogènes aussi rapidement que possible de manière à pouvoir commencer rapidement un traitement efficace du patient. Préquemment, les autorités sanitaires doivent utiliser des tests de ce genre pour déterminer la source d'infections bactériennes. La nécessité d'une identification rapide permettant d'empêcher la diffusion de la maladie est évidente. Le milieu différentiel pour bacilles entériques de l'invention réunit en un seul test tous les essais biochimiques importants. Outre la fermentation différentielle des hydrates d carbone, l permet aussi de dtermirssr la mvt lité, la décarboxylation de la lysine, la formation d'hydrogène sulfuré et la désamination de la phénylalanine. De cette manière, on peut différencier la Salmonella, le Citrobacter, la Shigella, l'Escherichia coli et l'Arizona. Ce milieu différencie aussi les groupes Proteus et Providence tout en permettant le groupement des espèces Proteus.Quarante-huit heures après la réception du spécimen au laboratoire, l'identification de l'organis- me est réalisée. ainsi, on économiqe au minimum 24 heures sur le procédé antérieur. Le médecin peut donc commencer plus tbt le traitement efficace du patient0 Ce milieu, outre qu'il permet plus rapidement des diagnoctics bactériologiques concluants, économise aussi le temps du microbiologiste, assurant ainsi une efficacité accrue. Il existe un besoin d'un système de différenciation des bactéries entériques qui permette une différenciation et une identification exactes et rapides meme lorsqu'il est pratiqué par des techniciens inexpérimentés. L'invention a pour objet de fournir un système et des milieux d'essai convenant à cet effet. L'invention concerne un système de différenciation de bacilles entériques qui contient au moins deux milieux séparés et qui est caractérisé par un premier récipient tranaparent contenant un premier milieu et un deuxième milieu dont la surface est complètement couverte par le premier milieu, le premier milieu comprenant un gel non toxique pour les bacilles dans lequel sont dispersées suffisamment de substances nutritives pour entretenir la croissance des bacilles à différencier, suffisamment d'aminoacide et une source suffisante de fer disponible pour assurer une indication de la désamination de 1' aminoacide par des bacilles choisis, suffisamment d'hydrates de carbone pour donner une indication de la fermentation et jouer le rôle de catalyseur de décarboxylation, suffisamment d'électrolyte pour permettre l'écoulement d'ions à travers le gel, une source de soufre servant à accroStre la formation de H2S en présence de bacilles choisis et un indicateur de pH, tandis que le deuxième milieu comprend un gel contenant de la lysine et comprenant des moyens de détection de la décarboxylation de la lysine en présence de bacilles provoquant la décarboxylation de la lysine. La figure 1 est une représentation schématique du procédé de différenciation de la technique antérieure, accom pagnée d'une échelle de temps. La figure 2 est une représentation schématique du procédé de l'invention, accompagnée d'une échelle de temps. La figure 3 est un diagramme montrant les réactions causées par diverses bactéries entériques lorsqu'on les inocule dans les milieux aux trois sucres et au fer T S I de la technique antérieure et dans les milieux de l'invention, et La figure 4 est une vue en perspective d'une chambre d'essai tubulaire préférée. Le procédé de la technique antérieure est illustré par la figure 1 sous la forme d 'une succession de stades ou d'étapes sur une échelle de temps et on le décrira d'abord pour comparaison avec l'invention. - Etape 1 - Temps : O heure Le spécimen 10 de selles ou d'urine arrive au laboratoire microbiologique dans une forme quelconque de récipient stérile. - Etape 2 On applique au tampon un échantillon des selles ou de l'urine sur des boites d'agar-agar 12 et on le place aussi dans des bouillons d'enrichissement. Les boîtes communément utilisées comprennent de l'agar-agar MacConkey, de l'E.M.B., du X.L.D., du S.S., etc. Les bouillons communément utilisés comprennent du G.N. sélénite et du tétrathionate. On fait des stries sur les bottes en partant de la zone tamponnée pour arriver dans les portions non inoculées de la botte, avec une configuration qui crée une dilution de l'échantillon et favorise le développement de minuscules colonies isolées de bactéries etc. - Etape 3 On fait alors incuber à 970C pendant 24 heures les bottes et bouillons inoculés. - Etape 4 - Temps : 24 heures Vingt-quatre heures plus tard, on recueille au moyen d'un fil métallique rectiligne quelques-unes des colonies qui apparatssent sur les bottes et on les inocule dans un tube à essais 14 contenant de l'agar-agar T.S.I. (trois sucres et fer) ou de l'agar-agar au fer de Eligler. - Etape 5 On fait alors incuber le tube 24 heures de plus. - Etape 6 - Temps : 48 heures On interprète les résultats. - Etape 7 On soumet chaque tube T.S0I. ou bigler à une série de tests biochimiques, on utilise un échantillon tiré du tube T.S.I., 14, pour des essais portant sur les différentes réac tions biochimiques, dans les tubes 16a à 16f, et pour le test de motilité 18. - Etape 8 On fait incuber pendant 24 heures les tubes de l'étape 7. Des tableaux biochimiques différents identifient la famille à laquelle appartient la colonie. Les tests biochi miques le plus couramment pratiqués sont ceux de l'indole, du citrate, de l'urée, de la phénylalanine, de la lysine-décarboxy lase, de l'ornUthine-décarboxylase, etc. Des réactions obtenues avec le T.S.I. ou le Figer sont la formation de gaz, des modes de fermentation de sucres et la formation d'hydrogène sulfuré. Certains tests biochimiques nécessitent une nouvelle incubation de 24 heures. Il faut examiner indépendamment chaque colonie et on les traite toutes indépendamment dans leurs futurs tests, par exemple 10 colonies nécessitent 10 tests T.S.I. plus 6 à 9 tests pour chaque test T.S,I. À ce stade, il peut arriver que le technicien manipule 60 à 100 tubes à essais pour étudier les 10 colonies. - Etape 9 du minimum 72 heures plus tard, le bactériologiste peut effectuer la lecture et l'interprétation de la réaction biochimique établie à l'étape 2. - Etapes 10 à 12 L'introduction des nombreux systèmes biochimiques à l'étape 7 crée une source possible de contamination entrainant des réactions erronées, ce qui cause une confusion et le cher cheur ne peut pas arriver à une conclusion au bout de 72 heures (étape 9). Ainsi, il est forcé de revenir au tube T.S.I. et de tenter à nouveau d'identifier l'organisme0 Le temps varie donc de 72 heures à une semaine pour le procédé de la technique anté rieure. Le procédé de l'invention est représenté par la figure 2. - Etapes 1 et 2 - Temps : O heure Ces étapes sont les mêmes que dans la technique antérieure. A titre d'exemple, les milieux utilisés peuvent être de l'agar-agar MacConkey, du X.L.I)0 ou du bouillon G.N. On applique le bouillon en boite comme à l'étape 1. - Etape 3 - Incubation - Etapes 4 et 5 Àu bout de 18 et 24 heures d'incubation, on recueille au moyen d'un fil métallique rectiligne quelques-unes des colonies qui apparaissent sur les boites 12 et on les inocule dans les milieux de l'invention. Il faut étudier indépendamment chaque colonie. - Etape 6 On fait alors incuber les milieux inoculés pendant 24 heures de plus. - Etape 7 - Temps : 48 heures Quarante heures plus tard, d'après l'apparence des milieux, l'interprétation de réactions biochimiques importantes et significatives permet l'identification immédiate. Le système appliqué aux milieux utilisés dans les étapes 4 et 5 donne maintenant le résultat de ces tests biochimiques, au lieu du commencement, ce qui économise 24 heures. La simplicité du processus utilisant l'invention permet l'étude d'un plus grand nombre de colonies, car 10 colonies essayées dans le milieu de l'invention donnent 10 réponses, alors que 10 essais T.S.I. ou Kligler obligeraient à lire et à interpréter le lendemain le déroulement d'environ 100 réactions biochimiques. La figure 3 montre, dans le coin inférieur droit, deux tubes I et II et le tube T.S.I. de la ichnique antérieure avant l'inoculation. Les autres tubes montrent l'effet de l'inoculation par divers bacilles. L'une des caractéristiques de l'invention est que l'on utilise un milieu double, autrement dit, il y a deux milieux À et 3, À étant celui de la partie supérieure et 3 celui de la partie inférieure, comme le montrent les hachures différentes pour la même couleur sur la figure 3 Pour le remplissage, on coule une solution liquide dans la partie inférieure puis on la laisse se solidifier. On coule alors la partie supérieure et on la laisse se solidifier, le tube étant maintenu incliné de manière à obtenir une zone inclinée. Il est important d'avoir au moins deux zones en butée. On peut utiliser un tube mesurant par exemple 15C mm de profondeur sur 16 mm de diamètre. On ccule à chaud environ 4 ml de solution B. On stérilise alors à l'autoclave le tube et Bon contenu. Après refroidissement, on ajoute 6 ml de solution À et on laisse solidifier, le tube étant maintenu incliné. Solution À (partie supérieure) À - Substance nutritive peptone 15,0 g extrait de levure 3,0 g B - Aminoacide L-phénylalanine 3,0 g L-tryptophnne 2,0 g C - Agent de fermentat on dextrose 1,0 g lactose 10,0 g D - Electrolyte chlorure de sodium 5,0 g E - Indicateur de H2S citrate ferrique d'ammonium 0,5 g thiosulfate de sodium 0,5 g F- Agent de solidification agar-agar 15,0 g G - Indicateur pourpre de bromocrésol 0,02 g H - Solvant eau distillée H20 1000 ml Solution B (partie inférieure) À - Substance nutritive peptone 5,0 g extrait de levure 3,0 g B - Lysine lysine 10,0 g C - Agent de fermentation dextrose 1,0 g D - Agent de solidification agar-agar 6,0 g E - Indicateur pourpre de bromocrésol 0,02 g F - Solvant eau distillée, H20 1000 ml La formule ci-dessus est donnée à titre d'exemple et on peut y apporter certaines modifications; par exemple, on peut faire varier dans une large gamme les proportions relatives de phénylalanine et de tryptophane. Pour que la décarboxylation de l'aminoacide se produise, il faut que le milieu soit acide. Etant donné que la fermentation du dextrose par certaines bactéries forme de l'acide, le pH s'abaisse ce qui permet la décarboxylation. Le pH initial du milieu doit autre en relation avec le point de virage de l'indicateur utilisé. Si l'on utilise comme indicateur du pourpre de bromocrésol, il faut utiliser un pH de 6,0 à 7,0 et, de préférence, d'environ 6,5. Si on le remplace par un autre indicateur, il faut utiliser un pH convenant à l'indicateur. Dans la solution 3, on utilise 3 à 8 g d'agPr- agar pour former un gel semi-solide qui permet de détecter le degré de motilité des bactéries dans le même milieu que le test de décarboxylation de la lysine. Pour assurer une différenciation sûre, on prévoit un deuxième tube. On sait depuis de nombreuses années que certains organismes bactériens ont la propriété de former de l'indole par dégradation du tryptophane. On en tire parti comme instrument de taxonomie. Beaucoup des organismes dont il est question ont la propriété de décarboxyler les aminoacides comme l'ornithine et on en tire aussi parti en taxonomie. Habituellement, il faut effectuer un test séparé pour démontrer la formation d'indole et la dUcarboxylation de l'ornithine. Antérieurement, le problème était de surmonter la "réaction de mise en réserve" des hydrates de carbone0 L'indole ne se forme pas en présence d'hydrates de carbone et les hydrates de carbone sont nécessaires pour démontrer la décarboxylation de l'ornithine. On a surmonté cela par la composition suivante Formule a À - Substance nutritive peptone 20,0 g extrait de levure 3,0 g B - Aminoacides L-ornithine 5,0 g L-tryptophane 5,0 g C - Agent de fermentation dextrose 1,0 g D - Agent de solidification agar-agar 15,0 g E - Indicateur pourpre de bromocrésol 0,02 g complément en eau pour faire 1000 ml. On dissout 49,02 g de la composition ci-dessus dans 1000 ml de H20 distillé et on fait bouillir une minute. On distribue alors cette solution en quantités de 4 ml dans des tubes à essais de 13 x 100 mm que l'on ferme avec un bouchon et on les passe à l'autoclave pendant 15 minutes à 12100 et sous une pression de 1,05 kg/cm2. On laisse le milieu se solidifier en tenant le tube en position inclinée de manière à obtenir une portion en butée profonde et une portion inclinée courte Le milieu de l'invention est donc contenu dans un tube sous la forme d'une portion en butée et d'une portion inclinée. On inocule le milieu au moyen d'un fil métallique d'environ 76 mm de longueur. Après avoir prélevé la colonie désirée, on enfonce le fil dans la portion en butée inférieure, puis on retire le fil en striant la portion inclinée en même temps. On répète l'opération dans le tube Il. On fait alors incuber les tubes à 370C pendant 24 heures0 Après incubation, on peut lire la réaction de décarboxylation de l'ornithine d'après le virage de la portion en butée. La réaction positive donne une couleur pourpre, la réaction négative une couleur jaune. Pour déterminer la formation d'indole, on retire une portion de la culture de la portion inclinée du tube et on la frotte sur une bande de papier IV (papier filtre) que l'on a saturée d'une solution de para-diméthylbenzaldéhyde à 5 /o dans de l'acide chlorhydrique aqueux à 10 *. S'il s'est formé de l'indole, le papier devient rouge. S'il reste inchangé ou prend une couleur autre que le rouge, le test est négatif. On peut aussi formuler le milieu autrement en utilisant 5 g de peptone au lieu de 20. On pourrait aussi pré parer un milieu par double coulée comme le premier, le milieu d'ornithine-décarboxylase se trouvant en-dessous et le milieu de détection d'indole au-dessus; autrement dit, la composition de la formule C moins ltornithine se trouverait en haut et la formule C moins le tryptophane en bas. La figure 3 montre un diagramme représenté par des tubes à essais contenant les milieux d'essais de l'invention. Le tube I contient les milieux À et 3 et le tube II contient le milieu C. Sous la forme non inoculée, les tubes ont une couleur pourpre. Àvec le tube de l'invention, on a représenté le tube T.S.I. classique. Àu bout de 24 heures d'incubation après l'inoculation avec la colonie de bactéries choisie, il se produit diverses réactions indiquées par le diagramme. On notera que le T.S.I. de la technique antérieure peut réagir d'au moins quatre façons différentes dont aucune n'indique spécifiquement~ les bactéries présentes et qui, en fait, peuvent indiquer sim- plement la présence de n'importe laquelle de deux à sept espèces de bactéries.D'autre part, on voit qu'avec les milieux de l'invention, on obtient une différenciation claire de la plupart des bactéries, les seules similitudes se produisant dans le cas de l'E. Coli, de la aerratia, de la Hafnia et de l'Àero- bacter. Un simple test de tachea sur papier différencie immé diatement 1'E. Coli. Il se produit une autre réaction commune entre les espèces P. Rettgeri et Providence mais elle ne pose aucun problème car on peut effectuer une identification sure par le test normal de l'urée. Par contre, il existe un groupe de sept espèces de bactéries y compris l'espèce pathogène Shigella qui donnent des réactions identiques sur le T.S.I. Les organismes du genre Salmonella isolés de cette manière donnent une portion inclinée nettement pourpre, une portion en butée supérieure à bande noire et une portion en butée inférieure pourpre. Les organismes du genre Shigella isolés de cette manière donnent une portion inclinée nettement pourpre, une portion en butée supérieure jaune et une portion en butée inférieure jaune, il ne se forme pas de gaz. Les organismes du genre Citrobacter, qui causaient antérieurement des difficultés de différenciation et étaient une source de confusion avec les espèces Salmonella, se distinguent maintenant nettement par une portion inclinée pourpre, une bande noire dans i portion an butée supérieure jaune et une portion en butée inférieure jaune (pas d'exceptions)0 Le Proteus vulgaris et le Proteus mirabilis isolés de cette manière donnellt une portion inclinée brun-rouge distincte, une bande noire dans la portion en butée supérieure jaune et une portion en butée inférieure jaune. Le Proteus morganii, le Proteus rettgeri et le groupe Providence donnent une portion inclinée brun-rouge distincte, une portion en butée supérieure jaune et une portion en butée inférieure jaune. L'E. Coli et l'Àerobacter donnent diverses formes de portion inclinée jaune et de portion en butée jaune avec une formation de gaz qui cause une séparation. Toutes les combinaisons de couleurs sont typiques des réactions biochimiques et de fermentation pour lesquelles ces organismes ont été précédemment groupés et identifiés; en raison des combinaisons utilisées, il n'y a pas de fausses réactions positives et les réactions colorées sont spécifiques des groupes qutelles représentent. Dans le tube I, la bande noire et/ou la portion en butée supérieure noire résultent de la formation de X2SO On peut 1ire la réaction de décarboxylation de la lysine d'après le changement de couleur de la portion en butée0 Une réaction positive est indiquée par la couleur pourpre, une réaction négative par la couleur jaune. On peut déterminer la motilité par le degré de diffusion de l'organisme à travers le milieu. La désamination de la phénylalanine se traduit par une modification de l'indicateur dans la portion inclinée du milieu supérieur avec formation d'une couleur brun-rouge distinctive. Au lieu de deux tubes séparés I et II, il est préférable d'avoir un récipient double comme celui que montre la figure 4. Le récipient est sous la forme d'un flacon transparent 50 en verre ou en matière plastique stérilisable, muni d'un couvercle vissable 52. Une barrière 51 sépare l'intérieur en deux compartiments dont l'un contient les milieux À et B et l'autre le milieu C. L'avantage de ce récipient est que le microbiologiste peut dévisser le couvercle en le maintenant entre les phalanges du petit doigt ou entre l'index et le médius et en faisant tourner le flacon, puis, en maintenant le fil entre le pouce et l'index, il peut introduire le spécimen à travers une zone commune aux deux chambres. Les couvercles vissables sont les plus commodes et assurent une bonne fermeture pour un bas prix. REVEIXDICAgIONS 1. Système servant à différencier les bacilles entériques, contenant au moins deux milieux séparés, caractérisé en ce qutil comprend un premier récipient transparent qui contient un premier milieu et un deuxième milieu dont la surface est complètement recouverte par le premier milieu, le premier milieu comprenant un gel non toxique pour les bacilles dans lequel sont dispersés (a) suffisamment de substance nutritive pour entretenir la croissance de bacilles à différencier, (b) suffisamment d's;;noacide et une source suffisante de fer disponible pour donner une indication de la désamination de 1 ami- noacide par des bacilles, (c) suffisamment d'hydrates de carbone pour donner une indication de la fermentation et jouer le rôle de catalyseur de décarboxylation, (d) suffisamment d'électrolyte pour permettre l'écoulement d'ions à travers le gel, (e) une source de soufre servant à accroître la formation de H2S en présence de bacilles donnés et (9) un indicateur de pH, et le deuxième milieu comprenant un gel contenant de la lysine et comprenant des moyens de détection de la décarboxylation de la lysine en présence de bacilles provoquant la décarboxylation de la lysine. 2. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte un deuxième récipient transparent qui contient un troisième milieu comprenant des moyens de détection de l'indole formé par des bacilles donnés. 3. Système selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la surface du premier milieu est inclinée. 4. Système selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les premier et deuxième récipients sont dans une enveloppe commune. 5. Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'enveloppe commune destinée au premier et au deuxième récipients présente une cloison intérieure définissant deux compartiments, le premier et le deuxième milieux se trouvant dans l'un de ces compartiments. 6. Système selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est allongé suivant un axe principal, le premier milieu étant un solide et présentant une surface inclinée dans un plan faisant un angle aigu avec l'ase principal. 7. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'indicateur est du pourpre de bromocrésol. 8. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le deuxième milieu est un gel semi-solide. 9. Milieu d'essai destiné à titre utilisé avec un système selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, qui est normalement basique et sous forme de gel et présente une portion superficielle inclinée, caractérisé en ce qu'il contient une substance nutritive pour bacilles entériques, suffisamment d'agent gélifiant pour solidifier le milieu, du pourpre de bromocrésol, des aminoacides capables de donner un changement net de couleur dans la portion inclinée du milieu en présence des groupes Proteus ou Providence par suite de la désamination des aminoacides, des réactifs servant à indiquer la présence de bacilles entériques producteurs de H2S, une matière capable de fermenter et de donner un acide en présence de bactéries entdri- ques, et suffisamment d'électrolyte pour permettre 11 écoulement d'ions à travers le gel. 10. Système selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que le premier milieu comprend peptone 15,0 parties t 1,0 % extrait de levure 3,0 " + 2,0 % phénylalanine 3,0 " + 0,5 % tryptophane 2,0 " + 0,5 ! dextrose 1,0 " + 0,5 % lactose 10,0 " + 1,0 ,0 chlorure de sodium 5,0 " + 1,0 % citrate ferrique d'ammonium 0,5 " + 0,5 % thiosulfate de sodium 0,5 " + 0,5 % agar-agar 15,Q " + 1,0 % pourpre de bromocrésol 0,2 " + 0,001 de eau 1000 " # 0 % Le deuxième milieu-comprend : peptone 5,0 parties # 1,0 ?/a extrait de levure 3,0 " # 2,0 % lysine 10,0 " # 0,8 % dextrose 1,0 " # 0,5 % agar-agar 6,0 " + 0,3 % pourpre de bromocrésol 0,2 parties # 0,C01 % eau 1000 n et le troisième milieu comprend peptone 20,0 parties + 1,0 ew extrait de levure 3,0 " + 2,0 % L-ornithine 5,0 " + 1,C % tryptophane 5,0 'I ± 1,0 c dextrose 1,0 " + 0,5 o agar-agar 15.0 " + 0,5 % pourpre de bromocrésol 0,02 " + 0,001 % eau 1000 " # 0