Brevet FR2182154A1 — publié le 19731207

La présente invention concerne de façon générale la détection de cellules malignes et plus particulièrement un "procédé et un appareil de détection de cellules malignes exfoliées, par absorption de gallium in-vitro, 5 puis détection de la probabilité de malignité par mesure de la teneur en gallium des cellules en utilisant un procédé, soit par fluorescence, soit par radioactivitéo L'invention est notamment destinée à être appliquée dans l'analyse de taches de Papani-10 colau (PAP) pour éliminer de façon sûre les taches normales en évitant tout examen poussé par des cytotechniciens ou des cytopathologistes spécialisés, de façon que l'examen détaillé se limite à celui des taches présentant une grande probabilité de contenir des cellules malignes» L'examen cellule par cellule 15 que l'on fait ultérieurement facilite un diagnostic beaucoup plus précis avec moins de frais pour les essais. Un essai PAP concerne le grattage de cellules vivantes, et leur dépôt sur une plaquetteo On teint cette plaquette avec deux ou trois colorants, puis le 20 cytotechnicien observe la plaquette à l'aide d'un microscope pour trouver les cellules présentant les critères de malignitéo En général, il s'agit des cellules suivantes : 1) Le rapport entre le nucleus et le cytoplasme est modifiée 25 2) Lorsque la ehromatine du nucleus n'est pas condensée, elle présente une surface tachetée avec souvent des surfaces éclaircies régulièrement° 3) Il y a une modification de la dimension du nucleus (anisonucleosis) et une coloration 30 intense par la ehromatine (anisochromie) des cellules anomaleso 1+) La membrane du nucleus est irrégulière et présente des variations brutales d'épaisseur» 5) La ehromatine du nucleus présente des pointes et des angleso 35 6) Les nuclei présentent plus de nucleoli anormaux que le nombre normal ou dont les dimensions sont anormales0 Si la plaquette est suspecte, l'examinateur a recours à un cytopatbiologiste., 40 L'examen particulier d'une 73 15202 2182154 plaquette nécessite pour un technicien environ 15 minutes dans le cas d'un spécimen négatif. Or, de façon caractéristique, on trouve seulement 55 spécimens positifs sur lOoOOO échantillons,, Les opérations manuelles relatives aux essais 5 demandent actuellement beaucoup de temps pour les techniciens spécialiséso On a déjà-tenté d'automatiser l'analyse de taches PAP notamment dans Summary of State-of-the-Art Workshop on Papanicolau Smear Analysis édité par Ramsey-Klee 10 en Avril 1970, et disponible à Clearinghouse for Fédéral Scientic and Technical Information in Springfield, Virginia. On a suggéré l'utilisation de détecteurs fluorescents et la littérature indique que l'on peut utiliser le gallium 67 pour localiser les tumeurs in-vivoQ On n'a aucune information 15 antérieure sûre concernant l'utilisation du gallium 67 pour distinguer in-vitro les cellules malignes des cellules normales ou des cellules caractéristiques, mais non maligneso Le gallium 67 est un isotope radio-actif ayant une demi-durée de vie de seulement 78 heures. 20 Ainsi les essais faits même in-vitro, utilisant du gallium 67 pour les essais de masse, nécessitent l'utilisation d'un laboratoire d'essais central. Pour la détection de masse du gallium 67, le produit doit être transmis rapidement au 25 laboratoire d'essais et être utilisé absolument dans un délai de six jours après sa création (2 demi-durées de vie) pour éviter des pertes de radio-activité. La présente invention a pour but de créer un procédé et un moyen de détection de cellules 30 malignes permettant l'envoi d'échantillons sous forme de taches à des laboratoires centraux pour l'analyse au gallium, et évitant l'utilisation de gallium radio-actif dans les cliniques ou les cabinets de médecins, où l'on prélève les échantillons de taches sur les patients» 35 L'invention a également pour but de créer des techniques de détection de cellules malignes utilisables dans des installations d'examens automatiques de taches PAP, supprimant l'examen manuel des échantillons négatifs tout en détectant le petit nombre de cellules qui 40 peuvent être ou qui sont positives» 73 15202 3 2182154 L'invention se propose également de créer un procédé et un moyen permettant d'être utilisés par un personnel relativement peu qualifié, pour effectuer des essais plus précis de la malignité des cellules, et plus 5 rapides avec des dépenses moindres. A cet effet, l'invention concerne un procédé selon lequel on mélange un échantillon susceptible de contenir des cellules normales et malignes, exfoliées, que l'on mélange à une solution d'un composé de 10 gallium tel que du nitrate de gallium ou tout autre sel de gallium pour faire absorber le gallium par les cellules maligneso De préférence, le mélange se fait pendant un temps suffisamment long pour que l'absorption 15 de gallium soit pratiquement complète,, A cet effet, on choisit une durée caractéristique comprise entre 20 minutes et 24 heureso On ajuste préalablement l'acidité (pH) de la solution et la présence de sels neutres pour favoriser la fixation sélective caractéristique du gallium sur les cellules 20 malignes, en état préliminaire de malignité ou les cellules enflammées. Dans ces conditions, le niveau de gallium de x-échantillon est déterminé en premier lieu par la fixation de gaxiium pour seulement une faible fraction de l'échantillon total (environ 25 %) et on mesure l'état de santé de l'échan-25 tillono Le niveau de gallium de l'échantillon peut alors se détecter par des procédés de détection par fluorescence ou radio-activité o Suivant une caractéristique de l'invention, on utilise comme source de gallium .le gallium 67 30 radio-actifo La suspension de cellules qui a absorbé le gallium 67 est manipulée de façon â donner un échantillon de tache. La masse totale ou le nombre de cellules de l'échantillon de tache est déterminé par pesée ou par tout autre procédé adéquat et on détermine la radio-activité totale de la 35 tache par comptage radio-actif= Suivant une autre caractéristique de l'invention, la suspension de cellules, qui a absorbé le gallium, subit un examen de la teneur en gallium cellule par cellule, dans un appareil continu, à écoulement capillaire 40 utilisant la détection de la radio-activité0 73 15202 2182154 Suivant une autre caractéristique de l'invention, on effectue une détection par points dans la solution à l'aide d'un réactif d'essai par points^ piégé dans 3 S le produit chimique radio-actif, tel que le soufre S>y pour 5 donner du gallium piégé'par ce produit chimique radîj-actif, destiné à être exposé au détecteur à comptage et donner un comptage qui représente la malignité» De préférence, on prépare une tache et on la mesure pour déterminer le nombre total de cellules par pesée ou par d'autres techniques adéquates 10 avant de la présenter à un détecteur de radio-activité. Suivant une autre caractéristique de l'invention, on soumet les cellules traitées à un traitement secondaire avec un matériau tel que l'oxyquinoléine qui peut contenir un produit colorant, puis on les examine une à une 15 au point de vue de la teneur en gallium dans un appareil en continu, à tube capillaire, en utilisant un procédé de détection par fluorescence» La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des dessins annexés, dans 20 lesquels : - La figure 1 est un schéma-bloc montrant un diagramme logique selon l'invention; - La figure 2 est un autre diagramme logique de l'invention; 25 - La figure 3 est un tableau des résultats obtenus par le comptage des grains d'argent après photographie» Selon les dessins et plus particulièrement selon la figure 1, on a représenté un diagramme 30 logique illustrant le procédé de l'invention» On traite un échantillon 11 pour donner une indication à l'aide d'un compteur de radio-activité 12 et déterminer s'il y a une grande probabilité de cellules malignes dans l'échantillon 11» Au cours de la phase 1, on 35 prend des frottis ou des lavages contenant des cellules épi-théliales provenant de la partie cervicale de l'utérus ou de la cavité orale qui peuvent être des cellules fraîches ou qui peuvent avoir été préalablement fixées par immersion dans une solution d'alcool contenant entre 70 % et 100 % en volume . 40 d'alcool méthylique ou d'alcool éthylique» Au cours de la 73 15202 2182154 phase 2, ces frottis sont mis dans une solution 13 de gallium contenant du citrate de gallium ou un autre sel de galliumo Si la solution est une solution aqueuse isotonique ayant un pH approximativement égal à 7,0, on utilise du citrate de gallium 5 ou un composé de gallium analogue, pour éviter la précipitation du gallium à ce pH3 Si la solution est de l'alcool éthylique ou de l'alcool méthylique à 70 $>-95 ak en volume dans de l'eau, le sel de gallium utilisé est de préférence le trichlorure» Lorsqu'on utilise des solutions 10 alcooliques, la fixation préférentielle du gallium par les cellules malignes, à l'état préliminaire de malignité ou enflammées, peut être augmentée par rapport à la fixation par des cellules normales en utilisant une solution dont l'acidité correspond à un pH 3*5-4,5 et un sel neutre pour abaisser les 15 coefficients d'activité ionique moyens» De tels sels doivent contenir des cations dont les rayons ioniques sont supérieurs d'au moins 5 % à celui du rayon ionique de l'ion gallium trivalent, déterminé par des mesures cristallo-graphiqueso La concentration de ces sels neutres est choisie de préférence 20 entre 0,05 à 0,15 mole/litre. La concentration des sels de gallium est déterminée par le procédé de détection que l'on utiliseo Dans le cas du gallium non radio-actif, on fixe les —3 concentrations des solutions entre 10 ^ et 1,0 microgrammes 25 de gallium par centimètre cube dans un volume total de solution 3 se situant entre 3 et 10 cm o Si l'on utilise du gallium radio-actif, on fixe la concentration des solutions à un niveau d'activité donné égal à 0,1 jtc/ml - 10 >ic/ml du volume total • de la solution qui est égal à 3 - 10 crr?, Il est préférable 30 de placer suffisamment de cellules grattées dans la solution 13, de façon que l'échantillon contienne entre 1000 et 10o000 cellules ou pluso Les prélèvements grattés ont généralement un poids compris entre 1 et 50 milligrammes et contiennent également des agglomérats de cellules composées de 50o000 à 35 plus de Io000o000 de cellules. Après une période de mise en équilibre qui est de façon caractéristique de l'ordre de 24 minutes à 24 heures, on sépare les cellules de la masse de solution 13, par centrifugation à une vitesse de 200 tours 40 par minute pendant 10 minutes et on évacue la charge qui surnage 73 15202 2182154 par rapport au liquide en laissant les cellules en suspension dans approximativement 0S2 ml en volume « On peut également filtrer la masse de solution en utilisant un filtre à pores microscopiques qui laisse passer les cellules et des résidus 5 ayant un diamètre au plus égal à 5 microns. Lorsqu'on utilise un tel micro-filtre, il est classique d'augmenter le volume des 3 à 10 millilitres de solution en diluant pour obtenir 100 à 150 millilitres, de façon à combiner un lavage initial à la première séparation de la masse de la solution radio-active. 10 On effectue le filtrage jusqu'à ce que le volume de la solution soit réduit à 6-15 mlo Puis on lave les celluleso Si l'on utilise la centrifugation pour séparer les cellules, le lavage consiste à ajouter au résidu de cellules qui est 15 approximativement égal à 0,2 ml, une solution qui ne contient pas de gallium et qui fait passer le volume total de la solution de 0j,2 ml à 6-10 mlo La solution servant au lavage peut être une sçlution isotonique telle que le sel de Hanks tamponné, en solution^ ou une solution aqueuse d'alcool méthylique ou 20 d'alcool éthylique à 70-95 % d'alcool en^volumeo La solution ainsi diluée est agitée vigoureusement pendant quelques minutes pour mettre la matière cellulaire complètement en contact avec la solution de lavage° Puis on centrifuge à 2o000 tours/minute pendant 10 minutes. A l'aide de ce procédé, on constate que 25 la matière cellulaire se rassemble sous forme de suspension -compacte dans un volume de 0,2 millilitre, que l'on* peut séparer de la masse de la solution de lavage. Si l'on utilise un filtrage à l'aide d'un filtre à pores microscopiques pour séparer les 30 cellules, le lavage consiste à ajouter suffisamment de solution sans radio-activité au premier résidu du filtrage sur ce filtre à pores microscopiques pour arriver à un volume de solution compris entre 100 et 150 ml. Cette solution diluée est agitée vigoureusement pendant quelques minutes, puis filtrée à-l'aide 35 d'un filtre à pores microscopiques qui laisse passer les produits ayant un diamètre au plus supérieur à 5 microns^ jusqu'à ce que le volume de la solution soit réduit à six à quinze cm^. Gomme pour la centrifugationj le liquide de lavage est par exemple une solution isotonique telle qu'une solution 40 tamponnée de sel de Hanks ou une solution-aqueuse d'alcool 73 15202 2182154 contenant entre 70 et 95 % d'alcool méthylique ou d'alcool éthylique» Le lavage se poursuit jusqu'à ce que le comptage radio-actif du liquide de lavage filtre 5 corresponde à un comptage de baseo Cela demande en général trois ou quatre lavages par centrifugation et deux ou trois lavages par le procédé de filtrage au filtre à pores microscopiques o Le lavage enlève le gallium qui n'est pas absorbé par les celluleso 10 Après le lavage des' cellules, celles-ci sont remises en suspension dans une solution alcoolique contenant 70-95 % d'alcool par volumec Pour les cellules lavées par centrifugation, on peut prendre approximativement 0S2 ml de suspension de cellules après la dernière centrifu-15 gation et on dilue cette quantité dans un volume d'alcool à 95-100 % jusqu'à ce que la concentration finale en alcool soit comprise entre 70 et 95 Pour des cellules lavées par le procédé de filtrage sur filtre microscopique, les cellules sont dans une suspension d'alcool si l'on a utilisé une solu-20 tion alcoolique pour le lavage, Si l'on utilise, pour le lavage, des solutions aqueuses isotoniques, on augmente le volume réduit après le dernier filtrage, par addition de 95-100 % de volume d'alcool jusqu'à une concentration finale en alcool 25 de 70-95 % en volumeo Le volume de la solution est réduit à une valeur convenable (6 à 10 ml) par filtrage sur un filtre à pores microscopiques qui laisse passer les produits ayant un diamètre au plus égal à 5 micronso Après lavage et mise en suspen-30 sion dans de l'alcool, on mesure une quantité aliquote de solution contenant entre loOOO et 10o000 cellules^ Le procédé d'obtention d'une telle quantité aliquote, très connu, consiste à déterminer la concentration de cellules dans un échantillon de suspension en utilisant soit un compteur de numération 35 globulaire, soit une technique de comptage microscopiqueo On peut faire un étalement de cette dose de la suspension de cellules finale, lavéeo Cette préparation microscopique se prépare généralement à partir d'une suspension de cellules dans l'alcool en étalant la suspension sur la plaquette avec 40 un pinceau.fin» Toutefois, le procédé d'étalement n'est pas 73 15202 8 2182154 déterminant pour le résultat général du procédé» D?autres procédés de dépôt de cellules sur des plaquettes peuvent consister à utiliser entre cinq et quinze gouttes de suspension alcooliques de cellules, à les placer sur une plaquette de verre 5 et à laisser évaporer 1'alcoolo On peut également utiliser un tampon que l'on plonge dans la suspension alcoolique de cellules pour laisser une traînée sur la plaquette de verre» La plaquette recouverte, ainsi préparée, sèche; puis on la lave suivant les procédés cyto-10 logiques.classiques» Une succession adéquate de lavages consiste en : toute trace de sel résiduel et de poussière qui a pu se préci-25 piter sur la plaquette au cours de sa préparation Si l'on a utilisé le gallium radio-actif comme agent galliquê, la plaquette est prête pour le comptage après le séchage du xylène» Si l'on a utilisé du gallium non radio-actif, il est nécessaire de procéder à un autre traitement de la plaquette0 30 Une plaquette préparée à partir de cellules traitées par du gallium non radio-actif à des niveaux de concentration indiqués ci-dessus peut s'examiner en utilisant un réactif par points pour détecter le gallium.» Un tel réactif par point peut être de l'acide oxyquinoléine 3 5 35 sulfonique, "contenant comme traceur S * Il se forme un complexe insoluble avec le gallium dans des conditions adéquates de pHo De façon caractéristique pour les concentrations de gallium intéressantes, on utilise une plage de pH comprise entre 5 et 80 Un tel agent traceur peut donner jusqu'à 40 8 x 10 désintégrations par seconde pour chaque cellule malade» 15 20 a) 95 % d'alcool éthylique, 1-1,5 minute b) 70 % d'alcool éthylique, 1-1,5 minute c) 50 % d'alcool éthylique, 1-1,5 minute d) Eau distillée 1-1,5 minute e) Eau distillée 1-1,5 minute f) -50 % d'alcool éthylique, 5 secondes g) 75 % d'alcool éthylique, 5 secondes h) 100 % d'alcool éthylique, 5 secondes i) Xylène, 5 secondes j) Xylène, 5 secondes k) Xylène, 1 minute Ce procédé permet d'enlever 73 15202 2182154 Le réactif par points est alors enlevé de la plaquette par un second lavage, si bien qu'il y reste le complexe de gallium qui a été absorbé par les cellules malignes, comme éléments d'une composition contenant le gallium et un traceur radio-5 actifo •-* Suivant une variante, une plaquette préparée à partir de cellules traitées par du gallium non radio-actif peut s'examiner en utilisant les techniques de fluorescence» Dans ce cas, la plaquette qui a été traitée 10 par le procédé de lavage décrit ci-dessus est suspendue dans une chambre fermée analogue à une chambre de séchage, et qui contient suffisamment d'oxyquinoléine pour saturer l'atmosphère de la chambre en vapeur, ainsi que quelques gouttes d'eau. Le récipient est alors placé dans une étuve à 60°C pendant 15 10 à 15 minutes. Les plaquettes sont enlevées et on protège leurs surfaces par des couvercles coulissants, Puis on expose les plaquettes à une lumière ultra-violette de longueur d'onde de 3&50 Â ou 4358 Â, si bien que l'on obtient une fluorescence intense à l'endroit où se trouve le gallium, 20 Les plaquettes peuvent également être exposées à l'oxyquinoléine par une phase supplémentaire au cours du lavage, après la phase c (50 % d'alcool éthylique, 1-1,5 minutes). Cette phase de traitement consiste à immerger les plaquettes dans une solution aqueuse d'oxyquinoléine à pH-7» 25 Lorsqu'on utilise du gallium non radio-actif, une variante préférentielle du procédé pour piéger le gallium avec le réactif ponctuel, l'acide oxyquinoléine 35 sulfonique contenant S ou l'oxyquinoléine seule, consiste à faire réagir ces réactifs avec le gallium dans les cellules 30 avant de préparer les plaquettes. On peut faire cela immédiatement après le lavage, lorsque la solution ne contient plus de gallium excédentaire. L'incorporation se fait en utilisant une solution isotonique telle que de sel de Hanks tamponné en solution à pH 7 pour dissoudre le réactif traceur, si pour le 35 lavage on a utilisé comme solution de lavage du réactif la solution de sel de Hanks tamponné; on utilise une solution aqueuse à pH 7 pour dissoudre les traceurs, si, pour le lavage, on a utilisé des solutions alcooliques. Si l'on a utilisé des solutions alcooliques pour le lavage, les cellules sont 40 soumises à des lavages successifs de solutions alcooliques 73 15202 2182154 à 70 et 50 °jo avant que les plaquettes ne soient immergées dans la solution du traceur» Que l'on utilise une solution de sel de Hanks tamponnée ou une solution aqueuse d'un agent traceur, le temps d'exposition des cellules à l'agent traceur 5 pour le gallium est de l'ordre de 3 minutes à 15 minuteso Cette opération est suivie par au moins trois lavages à l'aide d'une solution ne contenant pas d'agent-traceur» Après les lavages, les cellules sont mises en suspension dans .de l'alcool d'après le procédé suivi quand on utilise le gallium radio-10 actif» Au cours de la phase 6, on peut placer la plaquette 14 dans un compteur de cellules 16 qui peut être une balance comme indiqué pour indiquer le nombre de cellules regroupées sur la plaquette» 15 Puis au cours de la phase 7, la plaquette 14 éclaire un détecteur de radio-activité 17 pour le comptage qui est assuré par un compteur de radioactivité 12» De cette façon, le degré de radio-activité indique le degré de la malignité des cellules» Suivant une 20 variante, on pourrait utiliser les techniques par fluorescence pour détecter les cellules de la façon décrite ci-après» Après détection de la teneur en gallium, on peut colorer la plaquette avec les colorants cytologiques classiques pour permettre l'examen de cette 25 plaquette par un analyste» On utilise avantageusement la coloration à l'hématoxyline et au Papanicolau ou la coloration à l'hématoxyline et à l9éosine» Exemple caractéristique : On étale le résultat du grattage 30 d'une patiente ayant un carcinome récurrent de la partie cervicale de l'utérus dans 6 ml d'alcool à 95 % où on le maintient pendant quinze jours» On utilise, en même temps, le produit d'un raclage cellulaire d'une femme sans aucun signe de carcinome (Classe II - Papanicolau) et on le met dans 6 ml 35 d'alcool à 95 °/° pendant dix-sept jours» A la fin de cette période, on traite simultanément les deux échantillons» Les suspensions ont d'abord été tamisées à travers un tamis à pores de 53 microns et on a utilisé pour l'analyse 3 ml de suspension» On a ajouté un demi-millilitre de solution saline 40 aqueuse contenant 52,2 grammes de NaCl par litre que l'on a 73 15202 2182154 ajouté à la suspension alcoolique des cellules ainsi que 0ffl ml d'acide chlorhydrique à 0,0604 N, Le volume de la suspension de cellules a été amené à 6 ml par addition d'alcool éthylique à 95 7° en volume A chacune des suspensions, on a ajouté 0,1 ml d'une solution de trichlorure de gallium contenant 60 uC/ml de Ga^, de sorte que l'échantillon a reçu 6,0 de 10 Ga ' pour donner une concentration de solution de 1 jxG/ml de Ga^. Les échantillons ont été exposés à une solution radioactive pendant une heure» Les solutions ont ensuite été diluées à 120 ml par addition d'alcool éthylique à 95 % en volume» Les solutions diluées ont été agitées vigoureusement 15 pendant quelques minutes, puis filtrées à travers un filtre à pores microscopiques de 5 microns, jusqu'à l'obtention de volumes de solution approximativement égaux à 10 mlo Ces solutions ont de nouveau été diluées à l'aide de 110 ml d'alcool éthylique à 95 puis ajoutées et filtrées de nouveau 20 à travers un filtre microporeux pour obtenir des volumes de 10 millilitres.. Cette opération a été répétée» Les volumes définitifs étaient de 8 ml pour l'échantillon malin et de 5 ml pour l'échantillon normalo Les volumes définitifs des 25 suspensions alcooliques de cellules ont été étalés sur quatre plaquettes en utilisant un pinceau fin. Après lavage et séchage, on a procédé à la numération des plaquettes dans un compteur donnant par minute après correction du fond les résultats suivants : 30 9550 9544 7613 Echantillons malins 9203 35910 total 35 5809 4952 4751 Echantillons normaux 4636 40 20148 total 73 15202 2182154 La plaquette de l'échantillon normal donnant 4952 G/min a été examinée au microscope pour déterminer le nombre total probable de cellules» Le nombre total de cellules a été évalué à 628» La plaquette de l'échan- 5 tillon malin a donné 9544 C/min» Cette plaquette a été examinée comme la plaquette ci-dessus et on a évalué le nombre total de cellules sur la plaquette à 1556» , Les deux plaquettes ont alors été traitées par radiographie automatique en utilisant une 10 émulsion Kodak NTB 2 et un temps d'exposition de deux heures» Après exposition et développement de l'émulsions on a coloré les plaquettes en utilisant les moyens classiques» Puis on a compté les grains d'argent représentant les cellules» Des échantillons de 300 cellules statistiquement aléatoires 15 ont été choisis pour examen sur chaque plaquette. Les résultats obtenus sont résumés dans la figure 3 ci-jointe» On a mesuré par observation microscopique la fixation de gallium-67 sur les cellules 20 individuelles et on a compté les grains de Ag développés^ à une distance déterminée par rapport au centre de la cellule choisie» On a utilisé un oculaire de Whipple pour mesurer la distance à partir du centre de la cellule. La mesure a été faite à une distance de 36 microns par rapport au centre 25 suivant quatre carrés de Whipple, diagonalement symétriques -4 9 ayant une surface de 2,9 x 10 mm" chacun» Ces mesures combinées ont été consignées dans le tableau 1» Ces mesures donnent la fréquence relative de la présence de chaque fixation de cellules par le gallium-67 pour un sujet normal et pour un 30 sujet sur lequel on a diagnostiqué un carcinome de la partie cervicale de l'utérus» La fixation a été mesurée par les grains de Ag développés dans les quatre carrés de Whipple» Diverses conclusions ressortent clairement de ces données. La fixation moyenne de Ga^? dans 35 une cellule unique d'un sujet normal est de 1499 + 0,4 grain 2 ■" pour 4 carrés de Whipple = 12»850 grains/mm » Toutes les erreurs sont données par rapport à une différence normalisée. La fixation correspondante sur un sujet atteint est de 32,9 + 0S4 grain pour 4 carrés de Whipples c'est-à-dire 40 28»420 grains/mm 0 Ces fixations ont été corrigées par la 73 15202 2182154 mesure du "fond" des plaquettes respectiveso Ainsi, la moyenne A n de fixation de Ga par cellule dans une population de cellules normales est environ la moitié de la fixation moyenne dans une population de cellules d'une patiente atteinte d'un cancer 5 de la partie cervicale de l'utérus Pour corriger la radiation émise par des sources non cellulaires, on a fait le comptage des grains de Ag du "fond" de la plaquette, en utilisant deux plaquettes; de plus, on a utilisé une plaquette-témoin qui A n 10 n'a subi aucun des traitements par Ga . La plaquette-témoin a présenté un fond de 8690 + 190 grains/mm , la plaquette des "* cellules cancéreuses 9800 + 164 grains/mm , et la plaquette p des cellules normales 14300 + 216 grains/mm o Le fond des grains provenant de l'activité de Ga^ s'obtient par sous-15 traction des grains comptés sur la plaquette-témoins ce qui donne 5610 + 288 grains/mm pour la plaquette normale et 1110 + 251 grains/mm sur la plaquette cancéreuseo Ainsi, le fond de Ga^ sur la plaquette normale était environ cinq fois supérieur à celui de la plaquette cancéreuseo On attribue A *7 20 cette augmentation du fond de Ga à une quantité plus grande de débris cellulaires sur la plaquette normale. Le taux de comptage des cellules a été mesuré par un compteur à scintillation rattaché à un comptage de grains de Ag par voie optique, suivant l'équation 25 suivante : Tc =£ j_Na*? + An Dans cette formule : C = le taux de comptage du compteur à scintillation (chiffre/minute) 30 = temps d'exposition de l'émulsion photographique à l'activité de Ga^? avant la fixation de Ag (minutes) = 120 minutes = rendement du compteur à scintillation = 0,0764 comptage/ désintégration de Ga^? 35 N = nombre de cellules sur la plaquette a = densité moyenne d'un grain de Ag par cellule, mesurée à une distance déterminée (36 jj.) par rapport au centre de la cellule (grains/mm^) A = 1400 mm^ 40 n = densité de fond en grains provenant du Ga^? (grains/mm^) >] 73 15202 2182154 Les paramètres de l'émulsion sont les suivants : M = conversion d'un grain compté par cellule par rapport aux désintégrations de Ga^7 dans la cellule (désintégrations/ 5 grain/mm2 de cellule)» (l = conversion des grains du fond due au Ga6? par rapport au "fond" des désintégrations de Ga^7 (désintégrations/ grain)» Les équations ci-dessus peuvent 10 être exprimées respectivement pour la plaquette "normale" et pour la plaquette "cancéreuse" par les relations suivantes : (120) 4952 = 0,0764 if(628) (12„850)/fy+ (1400) (56lO)/3j (120) 9544 = 0,0764 f (1556) (2&o420)^+ (1400) (1110) fcj En résolvant ces équations en 15 etyS , on obtient : /^= 0jJl6 désintégrations/grain/cellule mm 0,666 désintégrations/graino Les deux paramètres des émulsions se trouvent dans les limites de l'ordre de grandeur des valeurs 20 espérées lorsqu'on tient compte du rayonnement Beta et de l'émission d'électrons Auger du Ga^, ainsi que la géométrie des mesures et de l'émulsion» Avec de tels paramètres, le nombre de désintégrations de Ga^7 par minute dans une cellule moyenne de l'histogramme normal était (12850)(0,316)* 120 = 25 33,84 désintégrations/minute, ce qui correspond à une fixation de 15,2 j/yy curies» On a obtenu une moyenne de cellule dans l'histogramme cancéreux avec 74,84 désintégrations/ minute ou une fixation de 33,7 jx y. curies» La fixation d'une 30 seule cellule moyenne d'un produit cliniquement néoplasique se mesure ainsi facilement à l'aide d'un compteur à scintillation» En plus des cellules qui constituent la base des histogrammes du tableau 1, on estime 35 qu'on trouve un petit nombre d'objets qui sont d'autres cellules isolées ou au plus un agglomérat d'un petit nombre de cellulesj, dans la population de cellules prises sur des patientes sur lesquelles on a détecté un carcinome» Ces produits ont présenté une fixation beaucoup plus élevée en 40 Ga^ que la moyenne des cellules des histogrammes» Aucune 73 15202 w 2182154 de ces cellules n'a été trouvée sur 60 patientes saines» On fi 7 a évalué une limite inférieure pour la fixation de Ga , pour l'une de ces cellules en supposant une fonction inverse du carré pour les grains comptés à distance. Cette limite infé-5 rieure était de 3680 désintégrations/minute ou de 1658 p. p. curies. L'examinâtion de toutes les données a montré que le procédé selon l'invention distingue clairement entre les échantillons normaux et les échantillons 10 malades du cancer de la partie cervicale de l'utérus. Dans l'échantillon malin, le nombre de cellules à fixation faible de gallium^ radio-actif est tombé de 248 pour les échantillons normaux (82,7 % du total des cellules) à 179 pour l'échantillon malin (59 % du total des cellules). Le faible comptage des 15 cellules dans l'échantillon normal est remplacé par un nombre plus élevé de cellules dans l'échantillon malin, pratiquement le double du nombre de cellules avec une fixation plus grande de gallium^. Les estimations reposent sur 20 une concentration en gallium de 55 microgrammes par gramme de tissu humide o Les estimations pour Set C^ supposent que les composés qui réagissent avec le gallium sont piégés par seulement un atome de soufre ou de carbone par molécule et que l'on a seulement une molécule de composé qui réagit 25 avec le galliumo En utilisant un dérivé d'oxyquinoléine, ce nombre est multiplié par trois, car trois molécules réagissent avec un atome de galliumo Si Ga67 constitue lui-même l'élément-traceur, le nombre probable de désintégrations peut 30 atteindre jusqu'à ... 2,2 x 10^ par cellule par seconde pour permettre l'examen des cellules séparées, à un taux de six mille par minute avec une seule installation de comptage de cellules, décrite plus en détail ci-aprèso Les quantités totales de radio-35 activité par échantillon peuvent être également importantes pour les deux techniques soit en continu, soit par étalement er utilisant soit Ga^7 ou comme éléments traceurso Ces quantités sont plus faibles lorsqu'on utilise C^ comme traceur» 40 On peut estimer la radio- 73 15202 16 2182154 activité de" fond probable lorsqu'on utilise comme agent oc n J tracteur S ou C , pour identifier le gallium par précipitation car un composé d'oxyquinoléineo Si le pH n'était pas déterminé et si l'estimation des quantités d'ions de Al, Ga, 5 Cu et autres éléments représentés dans le tableau III précipitaient complètement sous forme d'oxyquinoléates, le niveau de radiation de "fond" pour une seule cellule avec une concentration de gallium de 55 ppm serait de 58 % du niveau total de radiation et celui du chélate du gallium de la cellule 10 serait de 42 % du niveau de radiation total» Si le pH était choisi pour éviter uniquement la précipitation des oxyquino-léates de calcium et de magnésium, le niveau de radiation de fond serait de 8S5 % du niveau total des radiations pour une seule cellule et le niveau pour le gallium à une concentration 15 de 55 ppm serait de 91,5 % du niveau total de radiation» A côté du calcium et du magnésium le fer est important pour les radiations de "fond"; ces radiations de fond peuvent être réduites en provoquant une précipitation à l'aide d'un réactif tel que le Cup fer, avant la 20 réaction avec l'oxyquinoléine, pour précipiter le fer et augmenter ainsi la fraction du comptage total provenant du gallium des cellules malades» Une autre source importante de radiations de fond lorsqu'on utilise des chélates comme 25 traceurs, pour identifier le gallium, est provoquée par les globules rouges» Alors que la concentration en fer est élevée, la quantité totale de fer est faible comparée au gallium qui peut être présent dans les cellules épithéliales vaginales principales. Cette différence provient de la grande différence 30 des dimensions des cellules» Si tout le fer et le magnésium d'un globule rouge caractéristique sont précipités par des oxyquinoléates contenant soit ou C"^ comme atomes-traceurs, l'activité de fond d'un globule rouge représente jusqu'à environ 8 % de l'activité d'un oxyquinoléate-traceur, précipité 35 avec le gallium dans une cellule épithéliale» Lorsqu'on fait la détection par intégration des radiations de chélates traceurs, l'opération initiale consistant à enlever le fer comme décrit ci-dessus permet de supprimer le risque de voir le fer de globules rouges réagir avec les chélates et produire un 40 niveau de fond élevé» Suivant une variante, les échantillons 73 15202 2182154 peuvent passer dans un tube capillaire, au niveau d'un détecteur de radio-activité et, dans ce cas, on examine les cellules une à une. A la figure 2, on a représenté 5 de façon schématique une variante du procédé de détection de cellules malades selon l'inventiono Les phases 1, 2 et 3 sont les mêmes que celles décrites en relation avec la figure 10 La phase 4 consiste en un traitement auxiliaire de- l'échantillon dans la solution 21„ Lorsqu'on utilise cette variante de 10 procédé pour détecter les cellules malignes selon l'invention, on met de préférence ces cellules en suspension dans une solution isotonique telle qu'une solution de sel de Hanks tamponnée, toutefois on pourrait également utiliser une solution organique telle que de l'alcool, du xylène ou du naphtalène» 15 Si le procédé de détection de gallium dans la technique d'analyse par écoulement repose sur l'utilisation du gallium 67, on met les cellules grattées en suspension soit dans une solution de sel de Hanks tamponnée ou dans de l'alcool avant de les traiter au galliumo On mesure 20 une quantité de solution contenant entre lo000 et lOoOOO cellules» Cette quantité est traitée dans une solution de gallium contenant entre 1 et 2 pC/1000 cellules» Les conditions de traitement sont les mêmes que celles décrites dans le procédé par étalement (procédé I)0 Un tel traitement au gallium 67 donne 25 un taux de comptage d'environ 3 comptages/seconde pour des cellules normales et 10 comptages/seconde-30 comptages/seconde ou plus pour des cellules malignes en supposant que le rendement du comptage soit de 10 Après traitement au gallium 67, 30 on lave les cellules par centrifugation ou par filtrage sur un filtre à pores microscopiques et on laisse s'écouler la suspension de cellules, lentement à travers un appareil de comptage de la radio-activitéo Si le procédé de comptage de la radio-activité repose sur la technique de scintillation 35 de liquide, il fauts après le lavage des cellules, les mettre en suspension dans un liquide compatible avec la scintillation chimique» La présence de cellules isolées dans la plage du compteur est déterminée automatiquement par l'observation des scintillations lumineuses provoquées par chaque cellule à son 40 passage dans le faisceau lumineux microscopique, avant son 73 15202 218215.4 entrée dans le compteur» Le compteur est commandé par des impulsions de lumière, dispersées de façon que le comptage soit seulement accepté si la cellule est dans le champ du compteur» Des moyens tels que les montages à porte sont bien connus en 5 comptage nucléaire» Dans les conditions décrites, on détecte les cellules normales par un taux de comptage de 0 à 4 + 2 comptages/seconde et les cellules malignes par des comptages de 12 + 4 à 30 + 5 et plus par seconde» Les comptages 10 des diverses cellules sont contrôlés et l'appareil de détection donne les résultats sous la forme d'un tableau de nombres de cellules par rapport au taux de comptage» Les échantillons malins se distinguent des échantillons normaux du fait qu'ils ont essentiellement 1 % ou plus de la population de cellules 15 avec des taux de comptage de 10 comptages/seconde ou plus» Si le procédé de détection de gallium dans l'analyse en continu repose sur l'utilisation de gallium non radio-actif, il n'est pas important de déterminer la concentration des cellules par unité de volume avant l'expo-20 sition de la solution contenant du gallium» Des cellules grattées, caractéristiques contenant 25 mg de matière, correspondent à environ 1»000»000 de cellules» Pour arriver à un niveau décelable de gallium dans un tel échantillon,, il est nécessaire de l'exposer à un total de 1,5 microgrammes de 25 gallium» On l'obtient en mettant les cellules grattées en suspension dans une solution de 10 ml de solution isotonique telle qu'une solution de sel de Hanks tamponnée contenant 0S15 microgrammes de gallium par millilitre, sous forme de trichlorure de gallium» Le pH de cette solution devant être 30 de 7, il faut ajouter suffisamment de citrate dé sodium pour éviter la précipitation du gallium (environ 0^1 à 1 milligramme de citrate de sodium/ml}» Suivant une variante préférentielle de procédé^ on utilise une solution d'alcool contenant la quantité correcte de sel neutre et ayant un pH d'environ 3S0» 35 Pour une telle acidité, on peut maintenir le gallium en solution sans utiliser de complexe de citrate. Après les avoir exposées à la solution de gallium, on lave les cellules par centrifugation ou par filtrage sur un filtre à pores microscopiques et on 40 soumet la suspension de cellules à un traitement auxiliaire» 73 15202 2182154 Ce traitement auxiliaire consiste à exposer les cellules à de 3 5 l'acide oxyquinoléine sulfonique piégé par £r- ou encore de l'oxyquinoléine seule. L'incorporation de ces agents traceurs dans les cellules' pour l'identification du gallium se fait 5 par dissolution des réactifs dans des solutions de sel isotoniques dont les pH sont compris entre 6,0 et 7S5 en mettant le résidu de cellules en suspension après centrifugation ou filtration, dans la solution de traçage, pendant trois à trente minutes. Après exposition à la solution de traçage, 10 on lave les cellules avec une solution de sel isotonique en utilisant la centrifugation ou le filtrage pour enlever les liquides de lavage. Lorsqu'on utilise de l'acide oxyquinoléine sulfonique, piégé par il est conseillé 15 d'exposer à l'agent-traceur seulement la quantité mesurée de suspension de cellules préalablement traitée par le galliumo Cette quantité doit contenir entre lo000 et 10o000 cellules. On limite cette exposition à l'agent de traçage pour réduire la quantité de S^5 radio-actif qu'il faut par échantillon. 20 Les cellules piégées et lavées • sont alors examinées dans un appareil d'analyse en continu. Si l'agent-traceur utilisé est de l'acide oxyquinoléine sulfonique piégé par S^-*, la radio-activité de S^5 est considérée comme une mesure du gallium présent. De plus, les cellules 25 peuvent être irradiées par une lumière ultra-violette et la fluorescence du complexe gallium-acide oxyquinoléine sulfonique est déterminée pour chaque cellule. Les mesures de fluorescence et de radio-activité sont mises en coïncidence de façon logique pour être sûr que le comptage de la radio-activité correspond 30 directement à chaque cellule. Si l'agent-traceur est l'oxyquinoléine seule, la détection du gallium se fait par fluorescence à partir de chaque cellule lorsqu'elle est exposée à la lumière ultra-violette. 35 La phase 5 consiste à détecter la fluorescence des cellules pour obtenir une indication de la malignité potentielle des cellules. Plus particulièrement, l'échantillon passe dans un tube capillaire 22 pour permettre un examen cellule par cellule de la fluorescence lorsque la 40 source lumineuse 23 éclaire la cellule que l'on observe au 73 15202 2182154 point 24 à travers un filtre 25 et un photodéteeteur 26 0 Si la radio-activité représente le degré de malignité, un détecteur de radio-activité peut s'utiliser pour détecter la radio= activité au point 24o 5 L'observation de la fluorescence du composé formé par le gallium et l'oxyquinoléine est un procédé pratique pour détecter les concentrations de gallium dans les cellules malignesc Ce composé précipite dans des solutions aqueuses avec un pH supérieur à 2,8, selon la 10 réaction : 0" 15 + Ga+3: 3 Les oxyquinoléates de quelques autres métaux présentent également de la fluorescence dans les mêmes conditions que le galliumo Les oxyquinoléates les plus fréquents sont ceux de l'aluminium et du zinc» Cependant, les 20 concentrations cellulaires de ces ions sont beaucoup plus faibles que celles du gallium., Quoique le cuivre et le fer constituent des oxyquinoléates colorés, ces composés ne sont pas fluorescentso On peut également s'attendre à une certaine fluorescence de "fond" provenant des constituants organiques 25 de la cellule» On ne considère pas qu'elle puisse être^ comparable à la fluorescence du composé d'oxyquinoléate de gallium pour les zones de longueurs d'ondes appropriéeso De façon pratique, les concentrations de gallium se déterminent par extraction des hydroxy-30 quinoléates de gallium dans line solution de chloroformée Cette solution est irradiée par de la lumière ayant une longueur d'onde de 30650 Â ou 4°358 & et on mesure l'intensité de la fluorescence à l'aide d'un photomultiplicateur. Les chélates d'oxyquinoléine sont considérés comme fluorescents en solution 35 aqueuse, si bien que les solvants organiques ne sont pas essentiels pour observer cet effet» Cependant, la plupart des chélates d'oxyquinoléine sont insolubles à des pH supérieurs à 3,0 et la dissolution des précipités dans le chloroforme constitue un moyen efficace pour obtenir une activation prati-40 quement uniforme et pour permettre l'extraction des chélates des 73 15202 2182154 ions étrangers qui peuvent exister dans les solutions aqueuses. La précipitation d'oxyquinoléate de gallium dans le liquide cytoplasmique se fait à un pH qui évite la précipitation de tous les autres ions à l'exception 5 d'un petit nombre„ On suppose que ces ions étrangers forment une masse totale faible par rapport à celle correspondant au gallium» Les conditions d'éclairage nécessaires à l'observation de la fluorescence d'oxyquinoléate 10 de gallium précipité dans le liquide cytoplasmique peut s'évaluer de façon suivante : L'équation de base de cette évaluation est : F = HqKEcIA, 15 formule dans laquelle : F est la puissance du rayonnement fluorescent (watts) pour l'échantillon dans tous les angles solides, Hq est le rayonnement de l'échantillon (watts/cm ), K est la fluorescence fournie par la substance, 20 E est le coefficient d'extinction de molaire du complexe, c est la concentration du complexe en moles/litre, 1 est la longueur du chemin dans le milieu absorbant, A est la surface de la coupe transversale de la solution contenant le complexe» 25 Pour une lumière à 4358 &, la valeur de E pour le complexe de gallium d'oxyquinoléine est d'environ 6400 cm"^ mole "^"/litre» La concentration molaire de 1'oxyquinoléate de gallium dans le liquide cytoplasmique correspondant à une concentration de 55 ppm dans le tissu " 30 humide est de l'ordre 0,79 x 10"^ mole/litre. La longueur moyenne du chemin dans une cellule sphérique est environ 0,85 du diamètre de la cellule, c'est-à-dire 28,2 x 10"^ cm» Le rendement fluorescent K du complexe d'oxyquinoléate de gallium dans le liquide cytoplasmique est de l'ordre de 0S01» 35 En mettant ces valeurs dans l'équation, on obtient : F = 1,47 x 10~4 HqA. La lumière diffusée par la cellule peut être évaluée à partir de la théorie de dispersion pour des gouttelettes de grande dimension» En supposant que 40 l'indice de réfraction de la paroi de la cellule soit de 1,53 73 15202 22 2182154 et que celui de la solution soit de 1,33» la lumière de longueur d'onde 43 5 8& diffractée à 90° par rapport au faisceau incident est la suivante : Idiff = 0,793 x 10^ H0A watts/cm^ stéradian, 5 et celle transmise par réflexion à 90° par rapport au faisceau i • incident est : Ire£> = 8^2 x 10 HqA watts/cm stéradian» Les unités de lumière incidente Hq sont les mêmes dans l'équation exprimant la dispersion et la fluorescence» Les unités de l'intensité dispersée sont exprimées en watts/cm^ 10 par unité d'angle solide» La lumière dispersée a la même amplitude que la lumière fluorescente» La lumière dispersée peut être supprimée en utilisant un filtre passe-haut 25 (filtre laissant passer les grandes longueurs d'onde) selon la figure 15 2» Quoique l'excitation à une lumière de 3650 donne une fluorescence de grande intensité, i-1 peut être plus avantageux O d'utiliser la longueur d'onde 4358 A pour réduire une éventuelle fluorescence provenant de constituants organiques de la cellule» On peut utiliser un filtre à bande large pour éviter l'exci-20 tation dispersée de la lumière pour le détecteur 26 sans réduire l'intensité de la fluorescence, notamment parce que la bande de fluorescence pour une lumière de 4358 Â est assez faible si l'on n'utilise pas de longueur d'onde supérieure à 4500 X» Les filtres à bande large laissant passer 60 % de 25 l'énergie fluorescente et arrêtant plus de 99»9 % de l'énergie d'excitation permettent de réduire l'intensité dispersée jusqu'à environ 1 % de l'intensité fluorescente du gallium dans la cellule» Dans le procédé continu, 30 préféré, les cellules mises dans une suspension aqueuse peuvent 4 5 s'examiner avec un débit de 10-10 cellules par minute a l'aide de techniques telles celles décrites par VanDilla et autres dans 163 Science 1213-1214 (1969)» Dans un tel procédé, on éclaire une surface ayant un diamètre d'environ 100 microns 35 au point 24, et les cellules franchissent le détecteur qui est placé à angle droit par rapport à l'éclairage» Les cellules passent à raison d'une cellule toutes les quinze à vingt microsecondes» La puissance d'éclairage pour 40 un tel procédé en continu ayant un moyen de détection reposant 73 15202 « 2182154 sur la fluorescence du gallium peut être faibleo Les divers éléments sont : Facteur de perte Rendement.fluorescent K cl 1,47 x 10"^ 5 Surface d'utilisation du , 0 faisceau incident v2 0,11 ïïfF Fraction de l'angle solide total examinée par le 10 détecteur 0S15 Filtre 0^,50 Rendement du détecteur 0,10 Pertes de transmission 0,01 Coefficient de pertes 15 totales évalué 1,2. x 10*"^ Pour le photo-multiplicateur moyen, le nombre total d'impulsions de bruit par unité seconde est de l'ordre de 5 x 10^, ce qui correspond à un intervalle moyen entre les impulsions de bruit de 20 microsecondeso 20 Si l'on veut un comptage de 100 photons par cellule contenant 55 ppm de gallium en 20 microsecondes, il est nécessaire d'avoir pour l'installation d'éclairage 10^/(1,2 x 10~^ x 2,0 x 10"^), soit 0,415 x 10"^ photons/secondeo Des énergies rayonnantes de l'ordre de 25 4,2 à 76 watts correspondent à des lampes à mercure classiques émettant dans les longueurs d'onde de 4300 Â à 4400 JL Quoique de telles valeurs doivent être diminuées par des facteurs de l'ordre de 100 pour permettre des pertes dans la concentration de la lumière de la lampe et sa focalisation dans l'instal-30 lation d'éclairage, la puissance de la lampe ne constitue aucune limite. Les lasers donnant 100 milliviatts d'une lumière à 3638 X que l'on peut facilement focaliser sur la surface d'illumination voulue peuvent aussi être utiliséso Un aspect important de l'in-35 vention est la découverte que des cellules malignes exfoliées du liquide vaginal peuvent absorber sélectivement le gallium avec une concentration absolue en gallium de l'ordre de lQ-20g Ga/cellule et jusqu'à 10"^g Ga/celluleo Plus, les concentrations sont élevées et plus on facilite l'identifi-40 cation directe des diverses cellules maligneso Ainsi 73 15202 2182154 l'invention fournit non seulement une possibilité de réduire le temps nécessaire à la détermination de la malignité potentielle, mais se caractérise également par la possibilité de détecter la malignité dès son début, avec une précision 5 plus grande qu'à l'aide des techniques, manuelles classiques» Un nombre important de découvertes a été fait en relation avec l'invention» On a trouvé que l'on pouvait ajouter des quantités plus importantes de gallium au liquide de traitement et que la fixation de gallium 10 par cellule augmente plus ou moins de façon proportionnelle» Cette propriété non évidente facilite la mesure de la fixation par les diverses cellules au moyen d'un compteur de radioactivité si le gallium est radio-actif» L'augmentation de la-concentration de gallium dans la solution de traitement se 15 traduit par une plus grande fixation de gallium sur les cellules, ce qui augmente la différence entre la radio-activité de cellules normales et de cellules malignes» On a trouvé que des cellules d'un patient cancéreux, de l'ordre de 5«000 cellules, présentent 20 une fixation extraordinairement élevée en Ga^ de 100 comptages/ seconde, lorsqu'on compare ces cellules à un comptage de fond correspondant à un comptage/minute» Ces cellules ont une fixation extraordinairement élevée voire- énorme» On n'a constaté aucune fixation énorme dans les cellules normales, sur 25 60 patients» Pour des concentrations moyennes de gallium, le taux de comptage moyen est de façon caractéristique de quatre comptages/minute pour une seule cellule normale et de huit comptages par minute pour une seule cellule 30 maligne. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à l'exemple de réalisation ci-dessus décrit et représenté, à partir duquel on pourra prévoir d'autres formes et d'autres modes de réalisations, sans pour cela sortir du 35 cadre de l'invention» 73 15202 2182154 REVENDICATIONS 1°) Procédé de détection de cellules malignes, procédé caractérisé en ce qu'on prend un échantillon de cellules exfoliées, susceptible de contenir 5 des cellules malignes, introduit ces cellules dans une solution contenant un composé de gallium et fait absorber le gallium de la solution par les cellules puis on lave le gallium de la solution à l'exception du gallium absorbé par les cellules et on détecte le gallium dans les cellules de la 10 solution.. 2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on déplace les cellules et les moyens de détection l'un par rapport à l'autre pour fournir une indication du gallium absorbé par chaque celluleo 15 3°) Procédé selon la revendi cation 1, caractérisé en ce qu'on fait précipiter un composé de gallium par réaction avec les cellules et on détecte l'énergie rayonnante associée à cette précipitation dont l'intensité correspond à la quantité de gallium ainsi pré-20 cipité. 4°) Procédé selon la revendication 3» caractérisé en ce que l'énergie rayonnante est fournie par au moins une source lumineuse ou par une substance radio-active telle que le gallium 67o 25 5°) Procédé selon la revendi cation 4, caractérisé en ce qu'on piège le composé de gallium par un élément radio-actif tel que S^5 et C^» 6°) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le précipité est soumis à 30 l'action de l'acide oxyquinoléine sulfonique piégé par S-^o 7°) Procédé selon la revendication 3» caractérisé en ce que le précipité est soumis à l'action d'un produit choisi dans le groupe formé par. l'oxyquinoléine et l'acide oxyquinoléine sulfonique piégés 3 5 par S^ ^. 8°) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on fait passer les cellules dans un tube capillaire et on détecte la radiation émise par chaque cellule lorsque celle-ci passe au point où se 40 fait 1'exameno 73 15202 2182154 9°) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la phase de détection de radiation consiste à compter la radio-activité de chaque cellule lorsqu'elle passe au point d'examen» 5 10°) Procédé selon la revendi cation 9, caractérisé en ce qu'on observe la lumière dispersée par chaque cellule lorsqu'elle passe dans un faisceau lumineux large du point de vue microscopique, juste avant qu'elle atteigne le point d'examen, pour donner une impulsion de 10 lumière dispersée et on synchronise par porte un compteur de radio-activité avec cette impulsion de lumière dispersée, pour accepter le comptage uniquement lorsqu'une cellule se trouve au point d'examen0 11°) Procédé selon la revendi-15 cation 4, caractérisé en ce qu'on détecte sélectivement la radiation dans le groupe des 'raies spectrales de 3650 & et 4358 iL 12°) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on atténue l'énergie de la 20 lumière dispersée pour les longueurs d'onde autres que les-longueurs d'ondes choisies pour la détection» 13°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on laisse les cellules dans la solution pendant une période d'équilibre comprise entre 25 une demi-heure et 24 heures de façon que la fixation de gallium sur les cellules malignes soit pratiquement complète et en plus on prépare un étalement ou une tache de cellules après le lavage, puis on mesure cette tache pour avoir une indication du nombre de cellules qu'elle contient et enfin on rriesure 30 l'énergie rayonnée par cette tache» 14°) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on fait suivre le lavage par la coloration des cellules à l'aide d'un colorant ayant une importante fluorescence caractéristique en combinaison avec 35 le gallium, on illumine la tache avec une lumière ultraviolette et on mesure la fluorescence de la tache en réponse à l'illumination par l'énergie ultra-violette» 15°) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le colorant contient de 40 l'oxyquinoléine» 73 15202 2? 2182154 16°) Procédé selùn la revendication 1, caractérisé en ce que le composé colorant est un sel de gallium, ce sel étant notamment choisi dans le groupe composé par le citrate de gallium et le chlorure de galliumo 5 17°) Appareil pour la détection de cellules malignes, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, appareil caractérisé en ce qu'il contient une solution contenant un composé de gallium, un moyen pour combiner un échantillon de cellules 10 exfoliées susceptibles de contenir des cellules malignes, - avec cette solution pour faire passer le gallium de la solution dans les cellules, pour que le gallium soit absorbé par celles-ci, des moyens de lavage des cellules pour enlever tout le gallium excédentaire, à l'exception de celui qui a été 15 absorbé par les cellules, et des moyens pour détecter le rayonnement émis par les cellules et donner une indication concernant la quantité de gallium absorbée» 18°) Appareil selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour 20 fournir du produit radio-actif aux cellules en combinaison avec la quantité de gallium absorbée les moyens de détection comprenant des moyens de comptage de la radioactivité des cellules» 19°) Appareil selon la revendi-25 cation 17» caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour teinter les cellules lavées à l'aide d'un colorant ayant une fluorescence caractéristique élevée en combinaison avec le gallium et des moyens pour éclairer les cellules colorées au moyen d'un rayonnement ultra-violet qui donne une fluorescence 30 d'intensité correspondant à la quantité de gallium absorbée, les moyens de détection comprenant des moyens de mesure de cette intensité» 20°) Appareil selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour 35 faire passer les cellules lavées une à une en un point d'examen et des moyens de détection placés au voisinage du point d'examen pour détecter la radiation de chaque cellule à „ son passage en ce point. 21°) Procédé selon la revendi-40 cation 1, caractérisé en ce qu'on fixe les cellules exfoliées 73 15202 28 2182154 sur un agent fixateur, peu de temps après les avoir prises sur le corps humain, de façon à pouvoir les traiter au cours des autres phases, pour détecter la maladie„ 22°) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'agent fixateur contient de l'alcool»