Brevet FR2150559A1 — publié le 19730413

La présente invention a pour objet un proc.uG le concentra tion et de purification de l'antigène Australie, ainsi que les suspensions d'antigène Australie obtenues par e procédé. On sait que l'antigène Australie, qui t été découvert par ALLISON et BLUMBERG, s'est révélé être étroitement ssocié à certaines maladies de l'homme ou des primates telles que hépatites, polyartérites, leucémies, syndrome de DOWN. La présente invention se propose de fournir un procédé de concentration et de purification permettant d'obtenir industriellement et de façon économique des suspensions purifiées d'antigène Australie. La présente invention a pour objet un procédé de concentration et de purification de l'antigène Australie, caractérisé par le fait qu'après avoir introduit dans un rotor zonal, par exemple du type B XIV, B XV ou B XXIX, une quantité d'overlay de 50 d 700 ml, on introduit, le rotor tournant entre 2500 et 5000 tours/minute, 100 à 500 ml d'échantillon à purifier, éventuellement préalablement concentre par ultrafiltration, puis une première solution de saccharose et/ou tartrate dont le volume est compris entre 300 et 700 ml, puis une seconde solution de saccharose et/ou tartrate dipotassique de 50 à 200 mi, la densité de la première solution étant inférieure à la densité des particules virales, et la densité de la seconde solution étant supérieure à la densité desdites particules virales, que l'on effectue ensuite une centrifugation b au moins 20000 tours/minute pendant une durée au moins égale d 8 heures, que l'on ramène ensuite la vitesse du rotor entre 2500 et 5000 toursSminute pour décharger le rotor en poussant par une solution de saccharose et/ou tartrate introduite par la périphérie, que lton recueille les fractions contenant de l'Antigène Australie sortant par le centre, que l'on effectue une concentration par ultrafiltration desdites fractions, puis, qu'après avoir introduit dans le rotor un volume d'Overlay compris entre 50 et 700 ml, on introduit, par la périphérie, le rotor tournant entre 2500 et 5000 tours/minute, lesdites fractions concentrées qui forment un volume compris entre 50 et 200 ml, à la suite de quoi l'on introduit successivement au moins deux solutions de saccharose et/ou tartrate, de volumes respectivement compris entre 300 ml et 700 ml, et entre 50 ml et 200 ml, et de concentration croissante, la densité de la première solution au moins étant inférieure à ia densite des particules d'antigène, et la uenit ue la dernière solution au moins étant supérieure aux densités des particules d'antigène, que l'on effectue une seconde centrifugation à au moins 20000 tours/minute pendant une durée au moins égale à 8 heures puis, qu'après avoir ramené la vitesse de rotation du rotor entre 2500 et 5000 tours/minute, on décharge le rotor en introduisant, par la périphérie, une solution de saccharose et/ou tartrate de densité suffisante, que l'on renouvelle entuellement cette seconde centrifugation, et que l'on recueille les fractions contenant l'antigène Australie. Les rotors zonaux utilisés sont de préférence des rotors B XIV, B XV et B XXIX, commercialisés notamment par les firmes "Measuring Scientific Equipment" de Londres et "Beclanan" de Californie. Dans une forme de réalisation préférée, on utilise un sérum. contenant l'antigène Australie, que l'on clarifie préalablement par centrifugation, par exemple à 2000 g pendant 30 minutes. Cette étape permet d'éliminer les bactéries qui ont pu contaminer le sérum, et d'éliminer les précipités ayant pu apparai- tre au cours de la conservation ou de la décongélation éventuelle. Toutefois, on peut aussi utiliser comme source d'antigène brut un plasma, un liquide d'ascite, ou tout liquide biologique contenant l'antigène. Dans cette forme de réalisation préférée, on utilise un rotor B XV dans lequel on introduit d'abord 1'overlay, par exemple un tampon SOERENSEN de pH 7, puis, par la périphérie, l'échantillon à purifier, ajusté si nécessaire par addition de saccharose à une densité de 1,02 à 1,03, puis deux coussins de solution de saccharose, le premier à 15X, et le second à 45%. Lors de son introduction, chacune de ces solutions repousse la précédente vers le centre, et, dans ces conditions, aucun remélange des diverses solutions, ni aucune fuite au niveau des joints stationnaires et tournants, n'ont lieu. Toujours dans cette forme de réalisation préférée, l'ultracentrifugation se poursuit pendant 18 heures à 25000 tcurs/ minute, à une température ae l'ordre de + 50C. Après cette centrIfugation, lors de ia décharge du rotor le liquide repoussé est analysé par spectrophotométrie en continu. On recueille le liquide repoussé en plusieurs fractions séparées, l'antigène étant contenu dans les fractions de densité allant de 1,10 à 1,20. Ces fractions sont ensuite ultrafiltrées pour concentrer l'antigène Australie surRune membrane convenable, et le concentré brut ajusté à une densité de l'ordre de 1,03 est alors amené pérlphériquement dans le rotor contenant l'overlay, à la suite de quoi le rotor tournant reçoit successivement au moins deux coussins de saccharose à 15 % et 45 %. Après la mise en place de la dernière solution à 45 %, l'ultracentrifugation est effectuée à 25000 tours/minute à + 50C, pendant une durée d'environ 18 heures. Cette forme de mise en oeuvre préférée de l'invention permet avantageusement, non seulement de séparer les antigènes Australie des protéines du liquide biologique initial, mais encore de séparer entre elles les deux formes sphérique et tubulaire de l'antigène Australie. Par "forme tubulaire" on entend la forme présentant des particules tubulaires de longueurs variables, qui restent toujours mélangées à des particules sphériques apparemmXent différentes des précédentes. On constate que la forme sphérique d'environ 20 nm de diamètre se trouve dans un premier pic dont le sommet correspond à environ 30% de saccharose, c'est-à-dire une densité de 1,13 g/ cm3. La forme allongée, cylindrique, de. diamètre voisin de 20 nm et de longueur variable, se trouve dans le second pic dont le sommet correspond à environ 35 % de saccharose (d = 1,16 g/cm3). Si l'on poursuivait la centrifugation, on retrouverait finalement ces deux formes dans des pics correspondant respectivement à 35 % et 41 % de sacc-harose. Chacun de ces deux pics est débarrassé des protéines et des hétéroprotéines, comme l'indique l'immunoélectrophorèse révélée par un sérum anti-protéines humaines et en témoigne la spectrophotométrie en continu des fractions sortant du rotor lors du déchargement. Des techniques de vérification plus sensibles pourraient éventuellement montrer la présence de protéines qui pourraient alors être éliminées par un renouvellement de cette seconde ultracentrifugation. L'invention a également pour objet les suspensions d'anti gène Australie obtenues par le procédé précité. Dans une première forme de réalisation préférée, l'invention a pour objet deux suspensions d'antigène Australie, respectivement caractérisées par le fait qu'elles comprennent, respectivement, les formes sphérique et tubulaire de l'antigène Australie à un état pratiquement pur. Toutefois, l'invention a également pour objet les suspensions d'antigène comprenant, dans une proportion quelconque, les deux formes sphérique et tubulaire. Ces suspensions d'antigène Australie peuvent avantageusement subir ensuite une dialyse ou une dilution dans le tampon PBS pH 7,2, pour ramener la concentration en saccharose à un taux physiologique voisin de 8 %. On peut effectuer ensuite une ultrafiltration, par exemple sur membrane XM 300 AMICON, pour concentrer le volume selon le facteur désiré. On peut ensuite, si on le désire, effectuer une filtration stérilisante sur membrane MILLIPORE 0,22/u, pour éliminer toute trace de contaminant bactérien ou fungique. Les deux types d'antigène Australie purifié peuvent être marqués par des substances ou couplés à des particules pour permettre la détection d'anticorps spécifiques antigène Australie dans des milieux biologiques. Dans une variante, les suspensions d'antigène Australie sont utilisées pour immuniser des animaux et permettent de recueillir un sérum ou un plasma contenant des anticorps spécifiques de l'antigène Australie avec lesquels ils donnent des réactions sérologiques spécifiques qui servent à l'identifier dans les milieux biologiques. Les suspensions d'antigène Australie ainsi purifiées facilitent la fabrication industrielle d'un antisérum servant de réactif standardisé pour la détection de l'antigène Australie dans les milieux biologiques humains ou animaux. Enfin, en réalisant de cette façon des quantités industrielles de sérum hyperimmun d'origine animale ou même humaine, il est possible d'extraire les immunoglobulines qui peuvent être utilisées en diagnostic, combinées par exemple à un marqueur radioactif, fluorescent, enzymatique ou autre, permettant d'identifier l'antigène Australie dans les organes et milieux biologiques susceptibles de le contenir et, donc, de diagnostiquer toute maladie due ou associée i l'antigène Australie. La description qui v suivre, à ti9r d'exemple l!on limit tif, a trait à un mode de mise en oeuvre partiuclier illustrant le procédé selon l'invention. Partant d'un sérum contenant l'antigène Attstraiie, on effectue une centrifugation de 2000 g pendant 30 minutes, de ce sérum. Ceci permet d'éliminer les bactéries qui ont pu contaminer le sérum, ainsi que les précipités qui ont pu apparaStre. On introduit ensuite, par la périphérie d'un rotor zonal B XV tournant à 3000 tours/minute, 500 ml de tampon SOERENSEN pH 7, réalisé lui-même par 39 volumes d'une solution à M de 15 KH2P04 et 61 volumes d'une solution à M de Na2HP04, 2H20. On introduit ensuite 500 ml d'échantillon à purifier, ajusté si nécessaire par addition de saccharose à une densité de 1,02 à 1,03. On introduit ensuite un premier coussin constitué d'une solution de saccharose à 15 S ayant une densité de 1,06, la quantité introduite étant de 550 ml. Le deuxième coussin qui est ensuite introduit est une solution de saccharose à 45 % ayant une densité de 1,20, la quantité introduite étant de 120 ml. Ces solutions de saccharose doivent être préparées avec un saccharose très pur, de façon que la propre densité optique de ces solutions en U.V. soit négligeable. Par exemple, on peut utiliser le saccharose pour usages scientifiques, commercia lisé par la firme "PROLABO". Le saccharose en quint tés conve- nables est dissous dans le tampon phosphate de SORRENSEN de pH 7, puis chacune des solutions est filtrée sur membrane MILLIPORE 0,22 /u et conservée à + 50C. Le premier coussin de saccharose diffuse très rapidement vers l'échantillon, de même que le second coussin vers le premier, si bien qu'il s'établit presque instantanément un gradient de densité. Le premier coussin, devenu première partie du gradient, favorise la séparation des constituants de l'chantillon, l'antigène Australie étant le plus rapide. Le second coussin arrête l'antigène d'une densité Inférieure dans sa zone d'isodensité. Une fois ces deux coussins de solution de saccharose introduits, on effectue une ultracentrifugation à 25000 tours/minute pendant 18 heures, à température de + 5 C environ. Après cette ultracentrifugation, on ramène la vitesse du rotor à 3000 tours/minute, et l'on décharge le rotor en effectuant l'analyse spectrophotométrique en continu des fractions qui sortent du rotor sous la poussée dtune solution de sacch- 3 introduite périphériquement. On constate que plus de 90 9 des protéines et hétéroprotéines initiales ont été séparées de l'antigène. Le volume total de toutes les fractions contenant de l'antigène Australie (dont les densités sont comprises entre tW,iO t 1,20) est voisin de 375 mi. L'ensemble de ces fractions est alors immédiatement concentré à environ 40 ml par ultrafiltration sur une membrane retenant l'antigène Australie dans une cellule du type AMICON par exemple. Les protéines restantes et l'antigène Australie sont "li concentrées d'environ dix fois, sans précipitation, la sri de saccharose à cet instant favorisant une bonne solubilité de ce concentré.Le produit concentré brut est alors prélevez c1.e la cellule ultrafiltration qui est rincée avec deux fois 50 mi de tampon SOERENSEN pH 7, et l'ensemble est alors mélangé et ajusté à 150 ml et à environ 9 % de saccharose en poids, puis remis dans le rotor qui a reçu primitivement 650 ml de tampon SOERENSEN pour former l'overlay. Le chargement du rotor s'effectue comme précédemment à 3000 tours/minute, et on introduit successivement les 150 ml du concentré brut ayant une densité d'environ 1,03 puis un premier coussin de 700 ml de saccharose à 15 %, et enfin le second coussin composé d'une solution de 170 ml de saccharcre à 45 %. On effectue ensuite une ultracentrifugation de 18 heures à 25000 tours/minute, à + 50C. Après cette ultracentrifugation, l'antigène Australie est concentré au voisinage de sa zone d'isodensité formant un volume d'environ 250 ml, et l'on peut en séparer les deux formes sphérique et tubulaire, la forme sphérique se trouvant dans un premier pic dont le sommet correspond à environ 30 % de saccharose, alors que la forme allongée cylindrique se trouve dans un second pic dont le sommet correspond à 35 S de saccharose. Dans chacun de ces deux pics, l'antigène est pratiquement débarrassé des protéines sériques. Sinon, on peut ajouter sans inconvénient un nouveau cycle de centrifugation. L'antigène Australie ainsi concentré et purifié peut être alors soumis aux différentes operations qui ont été décrites précédemment. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de mise en oeuvre particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter différentes modifications sans, pour cela, s'éloigner ni de son cadre, ni de son esprit. En particulier, en utilisant un rotor B XIV, les volumes indiqués sont avantageusement divisés par un facteur de 2,5. Les centrifugations s'effectueront, de préférence, a 47000 tours/minute. pendant une durée d'environ 10 heures. Dans ce cas, les volumes utilisés peuvent avantageusement être les suivants Première ultracentrifugation - 50 ml d'overlay - 150 ml d'échantillon - 350 ml de saccharose à 15 % - 100 ml de saccharose à 45 % Deuxième ultracentrifugation - 50 ml d'overlay - 50 ml de fractions concentrées d'antigène - 450 ml de saccharose à 15 % - 100 ml de saccharose à 45 %. REVENDICATIONS 1. Procédé de concentration et de purification de l'antigène Australie, caractérisé par le fait qu'après avoir introduit dans un rotor zonal du type B XIV, B XV ou B XXIX, une quantité d'overlay comprise entre 50 et 700 ml, on introduit d'abord, le rotor tournant à une vitesse comprise entre 2500 et 5000 tours/minute, 100 à 500 ml d'échantillon à purifier, puis une première solution de saccharose et/ou tartrate, dont le volume est compris entre 300 et 700 ml, puis une seconde solution de saccharose et/ou tartrate dipotassique, dont le volume est compris entre 50 et 200 ml, la densité de la première solution étant inférieure à celle des particules virales, et la densité de la seconde solution étant supérieure à celle desdites particules virales, que lton effectue ensuite une centrifugation à au moins 20000 tours/minutes pendant une durée au moins égale à 8 heures, qu'après avoir ramené la vitesse du rotor entre 2500 et 5000 tours/minute, on décharge le rotor en poussant par une solution de saccharose et/ou tartrate introduite par sa périphérie, que l'on recueille les fractions contenant de l'antigène Australie sortant par le centre, que l'on effectue une concentration par ultrafiltration desdites fractions, puis, qu'après avoir introduit dans le rotor un volume d'overlay compris entre 50 et 700 mi, on introduit par la périphérie, le rotor tournant entre 2500 et 5000 tours/minute, lesdites fractions concentrées qui forment un volume compris entre 50 et 200 mi, à la suite de quoi l'on introduit successivement au moins deux solutions de saccharose et/ou tartrate, de volumes respectivement compris entre 300 ml et 700 ml et entre 50 et 200 ml, et de concentration croissant-e, la densité de la première solution au moins étant inférieure à la densité des particules d'antigène, et la densité de la deuxième solution au moins étant supérieure à celle desdites particules d'antigène, que l'on effectue une centrifugation à au moins 20000 tours/minute pendant une durée au moins égale à 8 heures puis, qu'après avoir ramené la vitesse de rotation du rotor entre 2500 et 5000 tours/ minute > on décharge le rotor en introduisant, par la périphérie, une solution de saccharose et/ou tartrate, de densité suffisante, que l'on renouvelle éventuellement cette seconde ultracentrifugation, et que l'on recueille les fractions contenant Zl'antlgène Australie. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on recueille successivement et séparément les formes sphérique et tubulaire de l'antigène Australie. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel on utilise un rotor du type B XV, caractérisé par le fait que l'on introduit environ 500 ml de tampon, puis environ 500 ml d'échantillon, ajusté à une densité de 1,02 à 1,03, puis, successivement, environ 550 ml d'une solution de saccharose à 15 %, et environ 120 ml d'une solution de saccharose à 45 %, que l'on effectue ensuite une ultracentrifugation à 25000 tours/minute pendant 18 heures à une température de +50C puis, qu'ayant ramené la vitesse du rotor à 5000 tours, on décharge le rotor et l'on recueille la fraction contenant l'an tigène Australie, que l'on concentre ensuite ladite fraction par ultrafiltration jusqu'à environ 40 ml, et que l'on rajuste à 150 ml environ et à 9 % de saccharose en poids environ la partie concentrée, qu'après avoir mis en place environ 650 ml d'overlay on charge le rotor à environ 3000 tours/minute avec lesdits 150 ml de concentré, puis avec environ 700 ml de saccharose à 15 % et 170 ml environ de solution de saccharose à 45%, que l'on effectue ensuite une ultracentrifugation à 25000 tours/ minute pendant environ 18 heures à + 50C, et qu'après cette ultracentrifugation on recueille le pic correspondant à une densité de 1,13 g/cm3, et le pic correspondant à une densité de 1,16 g/cm3. 4. Suspension d'antigène Australie obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Suspension selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle comporte, à l'état pratiquement pur de toute protéine, uniquement la forme sphérique de l'antigène Australie. 6. Suspension selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle contient, à l'état pratiquement pur de toute protéine, uniquement la forme tubulaire de l'antigène Australie. 7. Suspension selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée par le fait qu'elle a subi une dialyse ou dilution ramenant la concentration en saccharose à un taux voisin de 8 %. 8. Suspension selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée par le fait qu'elle a été concentrée par ultrafiltration.