Brevet FR2201877A1 — publié le 19740503

La présente invention est relative à des vaccins contenant un virus vivant de la varicelle et un procédé de préparation de tels vaccins. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé nouveau et avantageux pour préparer un vaccin contenant un virus vivant de la varicelle grâce à l'utilisation de cellules primaires d'un tissu de lapin comme milieu de culture. La varicelle est l'une des maladies les plus courantes et les plus faciles à communiquer qui se produit , principalement, chez les enfants. Une éruption est généralement observée sur le corps entier en même temps qu'une poussée de fièvre qui se produit après une période d'incubation comprise généralement entre 14 et 17 jours. La maladie elle-même détermine l'apparition de macules qui peuvent dans certains cas former des pustules et, dans des cas extrêmes laisser des cicatrices. D'autres problèmes et complications peuvent surgir, par exemple dans le cas d'un nourrisson sous-alimonté, qui peut alors présenter un ulcère dermique de type nécrotique. D'autres complications telles que des troubles du système nerveux central, une myélite et une névrite ont déjà été constatées àla suite d'une varicelle. Bien qu'on ait tenté de trouver un moyen prophylactique pour la varicelle et bien qu'on ait essayé d'obtenir un vaccin contenant un virus vivant contre la varicelle, les tentatives antérieures n'ont pas donné de résultats satisfaisants. Par exemple, on a tenté d'obtenir le vaccin en utilisant des cellules diplordes humaines ou bien des cellules de testicules de singes comme milieu de culture pour le virus. Ces méthodes de production d'un vaccin pour les êtres humains ont présenté plusieurs inconvénients, tels que la quantité de matières de départ nécessaires pour la production du vaccin et la difficulté d'obtenir une culture sur un milieu sain dans le cas des singes.Dans le cas des cellules diplotdes humaines, des procédés compliqués sont requis, en particulier en ce qui concerne le caryotype et également en ce qui concerne la nature biochimique et l'aptitude à produire des tumeurs des cellules qui sont utilisées. Confornément à l'invention, il a été découvert qu'un vaccin contenant un virus vivant de la varicelle, particulièrement produit à partir de la souche Oka du virus de la varicelle,peut être produit d'une manière facile et sûre grâce à l'utilisation d'un rein de la pin comme milieu de culture. Le vaccin contenant un virus vivant de la varicelle conforme à l'invention est produit par un procédé nouveau qui consiste à utiliser une culture de cellules primaires d'un tissu de rein de lapin comme milieu de culture (qu'on désignera par la suite par l'abréviation "RK"). Il a été constaté que RK convient extrêmement bien pour la culture d'un virus destiné à la production d'un vaccin de la varicelle, en particulier en ce qui concerne une caractéristique d'adaptation excellente du virus de la varicelle au milieu RK, ce-qui assure une croissance rapide du virus, croissance rapide qui est nécessaire pour produire le vaccin.Un autre avantage de- la que présente invention réside dans le fait la différence des singes qui peuvent être contaminés par le virus simien, il est relativement facile d'obtenir des échantillons du milieu XK sains en nourrissant des lapins dans des conditions telles qu'ils ne puissent pas devenir malades. On a constaté qu'il est particulièrement approprié d'utiliser des lapins albinos en bonne santé ayant un poids vif moyen d'environ 1 kg. Les lapins sont nourris dans des conditions strictement saines, à l'état isolé, afin que les animaux soient dépourvus de maladies et d'autres contaminations.On prélève le rein des lapins et on fait digérer les cellules avec de la trypsine, de préférence en une concentration de 0, 25fi. Après digestion, on centrifuge la suspension contenant les cellules et on met les cellules résultantes en suspension dans une solution d'harle contenant 0,5% d'un hydrolysat de lactalbumine et 10 de sérum de veau, ce qui fournit 200 000 à 400 000 cellules par ml de solution. On verse des portions de 50 à 60 ml de la suspens ion dans des fioles de Roux stériles et on exécute une culture fixe à 36 k 37oC pendans environ 7 jours. Après la formation d'une monocouche de cellules, on jette le milieu de culture et on inocule des portions de 5 ml d'une suspension du virus de la varicelle.Le procédé de l'invention est applicable d'une façon générale au virus de la varicelle, bien que, sauf mention contraire, une référence spécifique au virus de la varicelle s'applique à la souche Oka (résumé d'un compte rendu présenté à la Conférence annuelle de Japanese Society for Virology, page 2046) (dans le cas présent : virus de la varicelle, souche Oka). Le virus frais de la varicelle, appelé à titre illustratif le virus de varicelle de souche Oka, est isolé des vésicules d'un malade de 3 ans chez lequel un diagnostic clinique a reconnu la varicelle. Ce virus a été appelé souche Oka (cette souche est l'une des souches générales du virus frais ou tué de la varicelle). Il a été isolé dans les cellules embryonnaires du poumon humain (cellules BEL) a été identifié comme un virus de la varicelle et d'après son caractère cytopathogène dans des cellules HEL, avec absence de libération du virus hors des cellules, et par un essai de fixation de l'alexine par comparaison avec du sérum d'un malade atteint de la maladie à l'état aigu et d'un sérum d'un malade convalescent. Le milieu de culture ainsi inoculé du virus de la varicelle de souche Oka est laissé au repos 8 32 - 379C environ 90 minutes, de manière que l'adsorption du virus par les cellules puisse avoir lieu. Ensuite, on y verse une solution d'Earle franche contenant 0,5,' d'un hydrolysat de lactalbumine et 5% de sérum de veau et on poursuit la culture à 32 - 37QC pendant 5 C 10 jours, au cours desquels on change le milieu ci-dessus tous les trois jours. L'examen au microscope de la culture montre la déformation des cellules de RK qui deviennent arrondies et aciculaires; il a été confirmé que cette déformation est provoquée par le virus de la varicelle au moyen de la coloration des anticorps rendus fluorescents. Exemple 1 Sur le milieu RK préparé dans des flacons de 56 cm3 environ, de la manière décrite ci-dessus, on inocule des portions de 1 ml de virus de 18 varicelle, souche Oka. On cultive le virus en succession en effectuant 7 passages dans RK et on examinela prolifération du virus. Les résultats sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 DEVELOPPEXENT DU VIRUS DE LA VARICELLE (SOUCHE Oka) DANS DES CELLULES PRIMAIRES DE kEIN DE LAPIN 2 h 24 h 48 h 72 h 96 h Phase fluide to2s0* 1O2,5 104,0 105,0 105,0 Cellules * 103,0 103,0 104,5 105,5 105,5 associées (TCID50/ml dans des cellules embryonnaires de poumon humain) * On recueille les cellules, on les met en suspension dans le volume initial de milieu talles et on soumet la suspension à un traitement par les ultrasons pendant 30 secondes. Après centrifugation pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, on détermine l'infectiosité de la couche surnageante. Il est visible que le virus de la varicelle se multiplie parfaitement dans des cellules RK et qu'une grande quantité de virus dépourvu de cellules est spontanément libérée dans le liquide de culture, ce qui montre l'avantage important de la présente invention dans la production d'un vaccin. Exemple 2 On cultive le virus de la varicelle, souche Oka qu'on a isolé des vésicules d'un malade atteint de varicelle, en utilisant des cellules embryonnaires de poumon humain, en opérant une culture en succession avec 14 passages. On identifie le virus propagé comme le virus de la varicelle avec du sérum d'un malade atteint de varicelle dans la phase aiguë et de malade atteint de/varicelle convalescent , par l'essai de fixation du complément et la méthode de coloration des anticorps rendus fluorescents. Le virus ainsi identifié est cultivé en succession, en 7 passages, dans le milieu RK, de la même manière que décrit ci-dessus, ce qui donne un virus atténué de la varicelle appartenant à la souche Oka. On inocule ensuite le virus sur le milieu HK de la manière décrite ci-dessus et on conduit la culture selon les résultats de l'Exemple 1. Quand on observe un effet cytopathique de 50%, on lave RK à deux reprises avec une solution de Hank et on change ensuite le milieu de culture en utilisant un "milieu 199". On poursuit la culture jusqu'à observation d'un effet cytopathique de 70%. A ce moment? on recueille le milieu de culture et on le centrifuge à 3000 tours/minutes pendant 10 minutes pour éliminer les débris éventuels de cellules.Ensuite, on ajoute un agent de stabilisation tel que le sorbitol en une concentration finale de 5,0 - 7,5%. A l'aide d'une pipette, on retire également les cellules se trouvant sur le verre dans des fioles de Boux et on les met en suspens ion dans la solution de culture susmentionnée. Ensuite, on traite la suspension de cellules résultante par désintégration aux ultrasons (20h\, 30 secondes) et on centrifuge pendant 10 minutes à 3000 tours/minute pour recueillir la couche surnageante. On ajoute ensuite un agent stabilisant à une concentration finale de 5,0 - 7,5fui. On titre la suspens ion de virus de la varicelle ainsi préparée en opérant divers essais selon les normes concernant les préparations biologiques établies par le Ministère de la Santé du Japon en 1972 et les normes officielles des Etats-Unis d'Amérique (voir The Federal Begister, Vol. 34, No. 109, 1969) et on l'utilise ensuite comme un vaccin contenant un virus vivant dont les propriétéset la sécurité ont été contrôlées. Le vaccin de la présente invention est toujours conservé au froid, à -80QC. Pour confirmer le caractère non pathogène et le caractère immunogène du vaccin contenant un virus vivant préparé selon la présente invention, on inocule une portion de 2,0 ml du vaccin (in510 TCID50/ml) à chacun de 5 lapins isolés et nourris dans un isolateur en matière vinylique, après quoi on observe les annimaux pendant 30 jours. Les résultats sont portés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Lapin Poids vif du lapin (kg) Teneur en anticorps dans le sang(*) Devant 30 jours Avant 30 jours ino- après ino- ino- après ino culation culation culation culation I 1,5 1,7 (8 16 2 1,8 2,1 (8 8 3 1,8 2,0 48 8 4 2,0 2,2 16 5 1,6 1,8 C8 8 (*) Valeur mesurée lors de la réaction de fixation du complément. Exemple 3 A des enfants dépourvus d'anticorps de la varicelle, on inocule respectivement par voie sous-cutanée 0,5 ml du vaccin contenant un virus vivant de la varicelle (souche Oka) préparé par culture successive dans un milieu Kh au 9ème passage, de la meme manière que dans l'Exemple 2. Le vaccin vivant dérivé du fluide récolté est de préférence utilisé pour l'inoculation. Les résultats sont donnés dans le Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Teneur Teneur eq anticorps dans Manifestation Age Sexe clinique le sang clinique Avant 30 jours après inoculation inoculation 30 N non observée 1:8 3 M '' 41:4 1:16 6 F " 1:32 4 M " 1:16 5 P 41:4 1::8 * Le virus Oka cultivé en succession dans des cellules embrynnnaires de poumon humain est utilisé comme antigene en vue de la mesure aans l'essai de fixation du complément. Dans d'autres essais, 270 enfants au total reçoivent ce vaccin en des doses variables comprises entre 5 x 104,5 et 103' TCID par personne. On n'observe pas de réaction clinique et le taux de séroconversion est supérieur à 90A0 pour chaque dose du virus. Comme il ressort des résultats ci-dessus, le-vaccin contenant un virus vivant préparé selon le procédé de la présente invention montre une sûreté et une efficacité élevées quant à ses synjtomes cliniques et un effet d'immunisation et il a donc été démontré explicitement que K convient extremement bien comme milieu de culture d'un virus de varicelle pour la production d'un vaccin satisfaisant. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture sur tissu de rein de lapin caractérisé par le fait qu'il comprend du rein de lapin constitué en milieu de culture qu'on inocule avec le virus de la varicelle. 2. Vaccin vivant convenant pour protéger des entres humains contre la varicelle, caractérisé par le fait qu'il comprend un virus vivant de la varicelle obtenu à partir du milieu de culture selon la revendication 1. 3. Procédé de préparation d'un vaccin vivant comprenant un virus de la varicelle, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre à des passages un virus de la varicelle dans une culture de cellules primaires de tissu de lapin jusqu'8 ce que le virus de la varicelle soit suffisamment atténué pour pouvoir etre utilisé comme vaccin vivant. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la souche du virus de la varicelle soumise auxpassages est la souche Oka. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le tissu de lapin est constitué par des cellules de rein.