Brevet FR2176958A1 — publié le 19731102

i 2176958 La présente invention concerne un procédé de fermentation pour la production de micro-organismes dans lequel un microorganisme est cultivé en continu dans un appareil de fermentation où un milieu aqueux stérilisé est ajouté et une qualité commer-5 eiale d'aeide phosphorique est utilisée comme source de phosphore. Les procédés de fermentation ont été mentionnés pour la production de micro-organismes comme par exemple de levures • alimentaires où on utilise un milieu nutritif aqueux stérilisé contenant un acide phosphorique de qualité commerciale comme 10 source de phosphore. L'acide phosphorique de qualité commerciale est un mélange comprenant de l'acide phosphorique pur, de l'eau et des impuretés telles que de petites quantités d'ions métalliques. L'acide phosphorique de qualité commerciale est produit, soit par le procédé thermique, soit par le procédé par voie humi-15 de. L'acide phosphorique produit par le procédé thermique est habituellement appelé acide phosphorique qualité thermique et l'acide phosphorique produit par le procédé par voie humide est habituellement appelé acide phosphorique qualité humide. Ces qualités commerciales d'acide phosphorique sont vendues selon 20 diverses forces. La force de l'acide phosphorique de qualité commerciale peut être définie soit (a) en fonction du pourcentage en poids d'acide phosphorique pur par rapport au poids total du mélange, soit (b) en fonction du pourcentage en poids de pentoxyde de 25 phosphore (PgO^) par rapport au poids total du mélange ou (c) en fonction de la densité. Un acide phosphorique de qualité commerciale moyenne a une force de 67 en poids par rapport à l'acide phosphorique pur, de 49 1" en poids par rapport au pentoxyde de phosphore (P5) et une densité de 1,5. Bans l'invention, 30 la force de l'acide phosphorique de qualité commerciale est exprimée en fonction du pourcentage en poids de l'acide phosphorique pur par rapport au poids total du mélange. Jusqu'à présent, lors de la mise en oeuvre de procédés de fermentation du type précité, il a été courant dans la pratique, de stériliser l'acide phospho-35 rique soit séparément, soit avec le milieu aqueux avant de l'amener dans l'appareil de fermentation. La stérilisation est habituellement mise en oeuvre en chauffant l'acide ou un milieu nutritif aqueux contenant l'acide pendant une période de temps suffisante et à une température telle pour tuer ou rendre inactifs 73 09969 2 2176958 les micro-organismes présents dans l'acide ou dans le milieu contenant l'acide. D'autres techniques de stérilisation comme la filtration ou l'irradiation, par exemple par âe la lumière ultraviolette ou des rayons X, peuvent être utilisées mais ces techni-5 ques sont plus coûteuses et moins sûres que la Stérilisation à la chaleur. On a trouvé que lorsque la chaleur est utilisée pour stériliser séparément l'acide phosphorique, des problèmes apparaissent en raison de la nature corrosive de l'acide phosphori-10 que chaud. D'un autre côté, quand l'acide est stérilisé à la chaleur avec le milieu, il existe une tendance que les échangeurs de chaleur et systèmes de conduits associés avec les échangeurs de chaleur, soient obturés par la formation d'un dépôt de matières insolubles comme, par exemple, des phosphates de fer et, de 15 plus, il existe de sévères problèmes de corrosion, lors d'une opération continue soutenue, la corrosion et le dépôt de matières insolubles peuvent devenir si sévères qu'ils sont capables de rendre l'échangeur de chaleur inutilisable. l'encrassement provoqué par la présence d'acide phosphorique 20 est extrêmement fort et très difficile à retirer sans altérer l'équipement, l'encrassement ne peut pas être retiré par des techniques de nettoyage chimiques comme le traitement avec des acides forts ou des alcalis forts. Le nettoyage manuel est seulement partiellement fructueux. Le décapage au sable retire l'en-25 crassement, mais altère les surfaces de l'échangeur de ehi.eur. On a maintenant trouvé que certaines forces d'acides phosphoriques de qualité commerciale, sont auto-stérilisantes lorsque l'acide phosphorique est maintenu à la température ambiante en dehors du contact avec la contamination microbienne 30 externe pendant une période de temps qui est suffisante pour rendre inactifs ou tuer les micro-organismes déjà présents dans l'acide. La période de temps varie avec la foree de l'acide. L'invention crée un procédé de production de micro-organismes qui consiste à cultiver en continu dans un appareil de 35 fermentation, un micro-organisme en présence d'un milieu nutritif aqueux stérilisé et d'un acide phosphorique de qualité commerciale ayant une force d'au moins 55 comme défini plus haut, qui a été stérilisé sans l'application d'une technique de stérilisation à la chaleur en maintenant l'acide en dehors du contact de 73 09969 3 2176958 la contamination microbienne externe pendant une période de temps qui est suffisante pour rendre inactifs ou tuer les micro-organismes déjà présents dans l'acide. On préfère stériliser l'acide phosphorique à la température 5 ambiante, cependant, si on le désire, on peut appliquer une certaine chaleur externe. On préfère l'acide phosphorique qualité thermique, toutefois, l'acide phosphorique qualité humide est approprié. L'acide phosphorique de qualité commerciale doit avoir une force d'au moins 10 55 fa. Les acides phosphoriques de qualité commerciale ont habituellement des forces comprises dans la gamme de 55 à 88 $ en poids. La période âe temps au cours âe laquelle l'acide doit être maintenu en dehors du contact avec la contamination microbienne 15 externe, varie avec la force âe l'acide. Le tableau ci-après constitue un guide de la relation entre la durée à la température ambiante, c'est-à-dire environ 20°C et la force de l'acide. 20 force de l'acide phosphorique de qualité commerciale période de temps minimale pour tuer complètement les microorganismes, heures. 55 * 24 25 60 Io 6 65 i 4 70 ^ 4 79 ^ 1 30 Les acides de qualité commerciale ayant une force comprise dans la gamme de 55 à 79 i, nécessitent une durée de stérilisation de 1 à 24 heures. Il est approprié de maintenir l'acide dans un récipient fermé à la température ambiante pendant la durée nécessaire pour 35 rendre inactifs ou tuer les micro-organismes déjà présents dans l'acide. L'acide stérilisé peut être mélangé avec le milieu aqueux stérilisé avant l'addition à l'appareil de fermentation ou il peut être ajouté séparément à l'appareil de fermentation. Quand l'acide est ajouté séparément à l'appareil de fermentation, 73 09969 4 2176958 par exemple, par l'intermédiaire d'un système de conduits, il est possible de prévoir la longueur des conduits, l'alésage et le débit d'écoulement de l'acide pour avoir une durée de sé;'our de l'acide dans le système qui est suffisante pour rendre inaetifs 5 ou tuer les micro-organismes déjà présents dans l'acide. Le milieu nutritif aqueux peut être choisi à partir de n'importe quels milieux qui sont connus comme étant appropriés pour la croissance du micro-organisme que l'on désire cultiver. Les conditions sous lesquelles le micro-organisme est cultivé, peu-10 vent être celles normalement utilisées. Le milieu nutritif aqueux peut être stérilisé en employant n'importe quelle technique de stérilisation connue, de préférence, la stérilisation à la chaleur. On préfère, notamment, stériliser le milieu nutritif aqueux par passage à travers un échangeur de chaleur. Tout échangeur de 15 chaleur qui est normalement utilisé dans les procédés de fermentation pour la stérilisation de milieux, peut être employé dans le procédé de l'invention. Le procédé est d'une valeur particulière dans les fermentations dans lesquelles des œla de fer, par exemple des sels 20 contenant des cations de fer et notamment des sulfates de fer sont désirés par le micro-organisme. Quand ces sels contenant du fer sont stérilisés à la chaleur avec le milieu nutritif aqueux, ils forment des oxydes de fer qui s'établissent sur les surfaces internes de l'échangeur de chaleur et qui interfèrent sérieuse-25 ment le transfert de chaleur. Ce problème peut être remédié en utilisant les propriétés d'auto-stérilisation de l'acide phosphorique pour stériliser séparément les sels de fer. A titre d'exemple, les sels de fer peuvent être dissous dans l'acide phosphorique et la solution maintenue hors de contact de la contamination 30 microbienne externe pendant une période de temps qui est suffisante pour rendre inactifs ou tuer les micro-organismes déjà présents. Le procédé est particulièrement approprié pour la production de levures, notammant de levures utilisant un hydrocarbure comme 35 substrat de carbone. Toutefois, il peut être employé dans la culture de n'importe quel micro-organisme qui nécessite du phosphore comme agent nutritif essentiel. Lorsqu'un hydrocarbure est utilisé comme source de carbone, des exemples de matières premières appropriées comprennent le 73 09969 5 2176958 kérosène, les n-alcanes ayant de 10 à 30 atomes de carbone, les gas-oil et les huiles lubrifiantes. le micro-organisme peut être une levure utilisant un hydrocarbure comme par exemple une souche du genre Candida, Torulopsis, 5 Hansenula ou Ueurospora. Des exemples d'espèces appropriées du genre Candida sont représentés par lipolytica, pulcherrima, utilis, utilis variati major et tropicalis. L'invention est représentée par les exemples non limitatifs suivants. 10 Exemple 1 On cultive sous des conditions aseptiques dans tin appareil de fermentation d'une capacité de 2 000 litres, ayant un volume de travail de 1 800 litres, la souche candida lipolytica CBS n° 6331 . On stérilise en continu par passage à travers un échan-15 geur de chaleur du type à plaques, un milieu nutritif aqueux ayant la composition suivante : (^2 S04 2,0 g KC1 1,15g 2Q Mg S04, 7H20 0,65g MnS04, 4H20 0,045g PeSO^, 7H20 0,068g ZnSO^, H20 0,17g extrait de levure 10,000g 25 CuS04, 5H20 0,008g eau de ville qsp 1 litre le milieu a un temps de séjour dans l'échangeur de chaleur de une minute à une température de 140°C. le milieu stérilisé est alimenté ensuite en continu à l'appareil de fermentation. 30 la source de carbone est un mélange stérilisé séparément d'alca-nes normaux de la gamme du kérosène ayant de 10 à 14 atomes de carbone qui est obtenu en soumettant une matière première à base de pétrole à un traitement au tamis moléculaire. Un acide phosphorique qualité thermique ayant une force de 35 70 % en poids, comme défini ci-dessus, est amené séparément à l'appareil de fermentation, l'acide est emmagasiné dans un réservoir et est amené à l'appareil de fermentation par l'intermédiaire d'un système de conduits, le réservoir et le système de conduits sont à la température ambiante, c'est-à-dire de l'ordre 73 09969 6 2176958 de 20°G. La longueur et l'alésage du système de conduits sont d'une dimension telle que la durée de séjour minimale de l'acide, c'est-à-dire la période de temps au cours de laquelle l'acide est hors de contact du milieu externe, est au moins de 4 heures 5 quand l'acide est amené à l'appareil de fermentation selon une quantité et un débit qui sont suffisants pour satisfaire aux besoins en phosphore de la fermentation. Dans cet exemple, le besoin en phosphore est de 1g d'acide de qualité commerciale par litre de bouillon de l'appareil de fermentation. 10 L'appareil de fermentation est mis en fonctionnement en continu de cette façon pendant un total de 2817 heures sans blocage ou défaut dans l'échangeur de chaleur et sans contamination. A titre de comparaison, une fermentation est mise en oeuvre 15 en continu sous les mêmes conditions et en employant la même technique que celle décrite précédemment pour l'exemple 1 à l'exception que l'acide phosphorique est ajouté au milieu nutritif aqueux avant le passage du mélange du milieu et d'acide à l'échangeur de chaleur pour la stérilisation. Une opération continue est 20 satisfaisante pour 1820 heures mais est accompagnée par une chute graduelle dans le coefficient de transfert de chaleur de 1'échangeur de chaleur. Après 1820 heures de fonctionnement continu, la chute de pression au niveau de l'échangeur de chaleur commence à augmenter d'une manière significative jusqu'à 1970 heures où il 25 y a une opération sérieusement affectée à faible coefficient de transfert de chaleur et grande chute de pression. Après 2087 heures de fonctionnement continu, les joints de l'échangeur de chaleur se percent avec une défaillance totale conséquente de 1.* échangeur. Les plaques sont sérieusement encrassées et ne peu-30 vent pas être nettoyées par l'utilisation soit d'acide soit d'alcali caustique. Le nettoyage manuel est seulement partiellement fructueux. Finalement, le nettoyage est terminé en utilisant une technique de décapage au sable qui altère les plaques. Exemple 2 35 On cultive sous des conditions aseptiques en continu dans un appareil de fermentation d'une capacité de 2000 litres ayant un volume de travail de 1800 litres, la souche Oandida Lipolytica CBS n° 6 331. Le milieu nutritif aqueux ayant la composition suivante est stérilisé en continu par passage à travers un 73 09969 7 2176958 échangeur de chaleur du type à plaques (*h4)2 so4 2,0 g 1,15g 0,65g 0,045g 0,17g 10,000g 0,0008g 1 litre KC1 MgS04, 7H20 5 MnS04, 4H20 ZnS04, HgO extrait de levure 0uS04, 5H20 eau de ville qsp 10 le milieu a un temps de séjour dans l'échangeur de chaleur de une minute à une température de 140°C. le milieu stérilisé est amené ensuite en continu à l'appareil de fermentation, la source de carbone est un mélange stérilisé séparément de n-alcanea dans la gamme du kérosène ayant de 10 à 14 atomes de 15 carbone qui est obtenu en soumettant une matière première à base de pétrole à un traitement au tamis moléculaire. le l'acide phosphorique qualité thermique ayant une force de 70 comme défini plus haut, est amené séparément à l'appareil de fermentation, l'acide est mélangé avec du sulfate 20 ferreux (PeS04, 7H20) pour avoir une solution ayant une concentration en sulfate ferreux de 2,7 fi en poids, la solution est emmagasinée dans un réservoir et est amenée à l'appareil de fermentation par l'intermédiaire d'un système de conduits. Le réservoir et le système de conduits sont à la température ambiante, c'est-25 à-dire environ 20°C. la longueur et l'alésage du système de conduits sont de dimensions telles que la durée de séjour minimum de la solution dans le système est d'au moins 4 heures, la solution est amenée à l'appareil de fermentation à un débit qui donne approximativement lg d'aciâe phosphorique par litre du bouillon 30 de l'appareil de fermentation. l'appareil de fermentation est utilisé en continu pendant une durée totale âe 4270 heures de cette façon, sans obturation ou défaillance de l'échangeur de chaleur et sans contamination. continu dans un appareil de fermentation ayant une capacité de travail de 20 litres. Un milieu nutritif aqueux ayant la composition suivante, est stérilisé en continu par passage à travers un échangeur de chaleur du- type à plaques. 35 Exemple 5 On cultive une souche Candida lipolytica CBS n.° 6331 en 73 09969 8 2176958 '""4'2 4 2,0g KC1 1,15g KgS04, 7H20 0,65g KnS04, 4H20 0,045g 5 FeS04, 7H20 0,068g ZnS04, H20 0,17 g extrait de levure 10,000g CuS04, 5H20 0,0008g eau de ville qsp 1 litre 10 Le milieu a un temps de séjour dans l'échangeur de chaleur de une minute à une température de 140°0. Un acide phosphorique qualité thermique ayant une force de 55 comme défini plus haut, est emmagasinée dans un résefvoir fermé à la température ambiante (environ 20°C) et hors de contact avec la contamination 15 microbienne externe pendant 24 heures. L'acide est ensuite mélangé avec le milieu nutritif aqueux stérilisé pour donner une teneur en acide phosphorique d'ig par litre. Le mélange est ensuite amené en continu dans l'appareil de fermentation. La source de carbone est un mélange stérilisé séparément de n-alcanes dans 20 la gamme du gas-oil ayant de 14 à 17 atomes de carbone qui est obtenu en soumettant une matière première à base de pétrole à un traitement au tamis moléculaire. L'appareil de fermentation est mis en fonctionnement en continu pendant un total de 300 heures de cette façon sans bloca-25 ge ni défaillance de l'échangeur de chaleur et contamination. 73 09969 9 2176958 REVENDICATIONS 1 - Procédé de production de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en continu dans un appareil de fermentation, un micro-organisme en présence d'un milieu nutritif 5 aqueux stérilisé et d'un acide phosphorique de qualité commerciale ayant une force d'au moins 55 $ qui a été stérilisé sans l'application d'une technique de stérilisation à la chaleur en maintenant l'acide en âehors du contact avec la contamination microbienne externe pendant une période de temps qui est suffisante 10 pour rendre inactifs ou tuer lés micro-organismes déjà présents dans l'acide. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'un des milieux nutritifs est un sel de fer qui est stérilisé en dissolvant le sel dans l'acide phosphorique de qualité commer- 15 ciale et en maintenant la solution en dehors du contact avec la contamination microbienne externe pendant une période de temps qui est suffisante pour rendre inactifs ou tuer les micro-organismes déjà présents dans la solution. 3 - Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, 20 caractérisé en ce que l'acide phosphorique de qualité commerciale est ajouté séparément à l'appareil de fermentation par l'intermédiaire d'un système de conduits et en ce que le temps de séjour de l'acide dans le système est suffisant pour rendre inactifs ou tuer les micro-organismes déjà présents dans l'acide. 25 4 - Précédé suivant l'une des revendications 1 à 3» caracté risé en ce que l'acide est maintenu à la température ambiante. 5 - Micro-organisme produit par le procédé suivant l'une des revendications 1 à 4.