Brevet FR2187320A1 — publié le 19740118

La présente invention a pour objet un procédé pour lg préparation de nouveaux composés à action cytolytique. Parmi les divers travaux biochimiques consacrés à la famille des Bétulacées, nous citerons dans le domaine flavonique les recherches de Horhammer dt coll. (Botanisches Institut der Technischen Hochschule, Darmstatt(1953-57) portant sur 60 espèces environ, soit la moitié des constituants du groupe. Les feuilles de ces arbres se caractérisent par la présence de glycosides de quer cétine (genre Alnus, quelques espèces de genre Carpinus et Betula, dont Betula ermanii, une espèce des genres Corylus et Ostrya) ou de myricétine (genre Corylus, quelques espèces du genre Betula, et Carpinus betulus).De faibles quantités d'un éther diméthylique de l'apigénine ont été signalées en outre dans les bourgeons d'un Bouleau par Bauer et Dietrich (Service de Phytochimie, Université Lyon I, 43, boulevard du 11 Novembre, F-69 Villeurbanne La Doua (1933)). Une étude étendue de la titulaire sur des espèces d'Aulnes et de Bouleaux a révélé la très grande richesse flavonique de plusieurs Bouleaux, son attention ayant été plus particulièrement portée sur la plante Betula ermanii chez qui pas moins de vingttrois composés ont pu être mis en évidence. Sur ces vingt-trois substances, douze ont d'ores et déjà été homologuées à des flavonoides connus, mais deux désignées comme B6 et B11, se sont révélées constituer de nouveaux flavonoides naturels, dont les structures, étroitement apparentées d'ailleurs sont : trihydroxy-3, 5, 7, diméthoxy-4', 6 (B11) et dihydroxy5, 7-triméthoxy-3, 4', 6-flavones (B6), soit un flavonol et son éther méthylique en position 3. Blt et B6 constituent à la connaissance de la titulaire de nouveaux composés naturels, pour lesquels ils proposent le nom de Bètuletol, le second flavonoide étant alors nommé Méthyl-3betuletol. Ces composés ont la formule suivante La titulaire a trouvé un procédé pour préparer ces deux composés à partir du matériel végétal, essentiellement de bourgeons de Betula ermanii. Le matériel végétal (par exemple : bourgeons) est soumis à deux macérations acétoniques, à froid, de 24 heures chacune. Les macérations se font sous agitation mécanique, à raison de 500 ml d'acétone pour 100 g de matériel végétal. ce traitement a pour résultat de rompre les liaisons chimiques hydrogene qui assurent la cohésion des complexes naturels des Bétulétols dans les cellules végétales. Un ordre rigoureux dans la succession des solvants, comme il est indiqué dans la présente description permet ensuite de les séparer. Après évaporation du solvant, l'extrait est repris par quelques cc de benzène et versé sur une colonne de polyamide, ltélution étant conduite par du benzène progressivement enrichi en méthyl-éthyl-cétone à 3 %, 5 % et 10 , puis par du méthanol à 5 % et 10 %. L'élution est terminée par du méthyl-éthyl-cétone et du méthanol à parties égales. Après différents essais de purification (tel que, par exemple l'essai à l'acétate de Pb) il a été trouvé que la formation des dérivés acétylés permettait d'obtenir le meilleur résultat on fait alors réagir les substances brutes obtenues avec l'anhydride acétique en milieu pyridine. On fait cristalliser les acétates dans l'éthanol. On procede ensuite à une désacétylation par HCl deux fois normal dans l'alcool à ébullition. Les produits purs ainsi obtenus sont alors cristallisés dans de l'éthanol. Ils se présentent alors sous forme de poudres cristalli nes jaune-citron. B6 a un point de fusion de 159 -161 B11 a un point de fusion de 223 -225 . Ces deux nouveaux composés ont une action nettement cytolytique telle qu'elle ressort des études suivantes Conditions expérimentales Se présentant comme une poudre cristalline jaune, les quantités pondérales fournies sont pour le B6 et le Bli respectivement de l'ordre de 2 et 5 mg. Elles sont séparément reprises dans du liquide de Hanks à la concentration de 2 mg par ml. On note leur très faible solubilité. Elles sont ensuite ajoutées à des concentrations variables à des tubes de KB en culture, dans les conditions suivantes : on prépare trois séries de deux flacons de culture T, B6, B11. Dans chacun de ces flacons on répartit 5 ml de milieu au caséinate (Institut Pasteur) enrichi de sérum de veau à 10 % et on y dispose une petite lamelle de verre 1 x 2 cm. Le milieu est ensemencé de 400.000 cellules KB carcinomateuses fournies par l'institut Pasteur. Les cultures sont suivies par observation microscopique et dès quelles manifestent un certain pouvoir prolifératif, soit entre 24 et 48 heures après l'ensemencement, on répartit dans chacun des flacons B6 et B11 des quantités variables de substance, ctest-à-dire :: B6 B11 Placions 1 2 3 4 0,10 ml 0,50 mi 0,10 ml 0,50 mi (2oo) (1 mg) (200 #) (1 mg) Les flacons sont reportés à l'étuve à 380 pendant 48 H à 72 H. Au bout de ce temps on procède à une nouvelle observation microscopique puis on retire les lamelles des flacons. Elles sont fixées à l'alcool éther, colorées à l'hématéine éosine et montées au baume sur lame. On peut renouveler l'examen microscopique et apprécier les lésions cellulaires. Ces essais ont été renouvelés trois fois. Résultats L'action cytolytique des composés B6 et B11 a été étudiée par rapport à des tubes témoins en envisageant 1) La densité de la culture. 2) Les lésions oDervées au niveau du noyau et au niveau du cytoplasme. Ils peuvent être ainsi schématisés T B6 B11 1 2 3 4 200# 1mg 200# 1mg densité +++ +++ +++ + + lésions cytoplasmiques 0 + + ++ lésions nucléaires 0 + + + + Au point de vue qualitatif 1) Les cellules de culture B6 subissent une différenciation d'aspect fibroplastique, elles deviennent allongées et leurs contours sont nettement dessinés. Il y a quelques lésions de vacuolisation cytoplasmique. 2) Les cellules des cultures B11 présentent des lésions cytoplasmiques accusées avec imprécision des limites cellulaires pour 200tlésions encore plus accentuées avec 1 mg : formation de plasmodes géants parsemés de masses nucléaires de taille irrégulière. Revendications I. Procédé pour la préparation de nouveaux composés à action cytolytique répondant à la formule R = H, B11 (Bétulétol) R = CH3, B6 (Méthyl-3-bétulétol) caractérisé en ce qu'on traite le matériel végétal de bouleau avec de l'acétone pendant 24 heures sous agitation pour rompre les liaisons chimiques des complexes des flavones et pour libérer les composés actifs, en ce qu'on les sépare ensuite par chromatographie et en ce qu'on les purifie en les transformant en leurs dérivés acétylés que l'on desacétyle ensuite. II. Composés à action cytolitique obtenus selon le procédé de la revendication I.