Brevet FR2183837A1 — publié le 19731221

ta présente invention concerne la souche Nocardia asiatica sp. nov. 2739 productrice de la rifamycine B. ta rifamycine B est un produit de départ pour lteotention, par transformations chimiques, de deux remèdes : du sel sodique de la rifamycine SV et de la rifampicine. te sel sodique de la rifamycine EV est actif dans les affections provoquées par des micro-organismes gram positif. la rifampicine possède un large spectre d'action antibactérien, inhibe le développement de micro-organismes gram positifs, gram négatifs et acidorésistants. tes deux produits inhibent le développement de microorganismes résistants à l'action d'autres antibiotiques connus. il est connu que les rifamycines sont formées par l'espèce Streptomyces mediterranei Margalith et al, 1960 (Emmend Thiemann et al., 1969) souche type A.T.C.C. (American Type Culture Collection) 13685 (brevet de Grande-Bretagne n0877732 du 20.09 1961). L'invention a pour but l'obtention d'une nouvelle espèce productrice de la rifamycine B. 'la souche 2739 qui a été isolée par les auteurs de l'invention à partir du sol et qui est productrice de la rifamycine B diffère de toutes les espèces connues et se rapporte à une espèce nouvelle: Nocardia asiatica sp. nov. Cette souche est déposée au Musée des Cultures de 1'Institut pour la Recherche des Antibiotiques nouveaux de l'Académie des sciences m édicales de l'U.R.S.S. sous l'indice 9 NA 2739. La souche se distingue par les particularités suivantes de croissance sur des milieux de diagnose différents à 280C pendant 7 à 21 jours. Milieu minéral n01 de Gauzé. (composition : amidon 20 g, EC2HP04 0,4 g, MgS04 0,5 g, 03 I g, NaCL 0,5 g, FeS04 10 mg, gélose 30 g, eau de-robinet f litre). te mycélium aérien est blanc et fin. Le mycélium végétatif est incolore, dans le cas de croissance à la lumière sa coloration varie de l'orangé au rouge-cerise. Il ne colore pas le milieu. Croissance discrète. Morphologie. 'les hyphes du. mycélium aérien se désintègrent sur toute leur longueur en spores allongées à surface lisse. Milieu organique n02 de Gauzé (composition : bouillon de Hottinger (700 mg d'azote des amines) 30 cm3, peptone 5 g, NaCL 5 g, glucose 10 g, gélose 30 g, eau de robinet 1 litre) Le mycélium aérien fait défaut, le mycélium végétatif est de coloration orangé brillant. Le milieu n'est pas coloré. Croissance active. Gélose de Czapek (composition-: saccharose 30 g, NaNo3 2 g, K2HP04 I g, MgSO40 7H20 0,5 g, KCL 0,5 g, FeSO4 0,01 g, gélose 30 g, eau distillée 1 litre). le mycélium aérien de coloration blanche à rosâtre, est bien développé. Be mycélium végétatif est de coloration rouge cerise. La coloration du mycélium végétatif est due à la formation d'un pigment rouge qui peut etre extrait à partir du mycélium à l'acétone. te milieu n'est pas coloré. Croissance proliférante. Gélose SR-I de Krassilnikov (composition: glucose 20 g, K2XP04 0,5 g, 03 I g, NaCl; 0,2 g, MgCO3 0,3 g, CaCO3 0,5 g, FeS04 0,01 g, gélose 30 g, eau de robinet 1 litre) et milieu gélosé au glucose et à l'asparagine (composition : glucose 10 g, asparagine 0,5 g, EC2HP04 0,5 g, gélose 30 g, eau distillée 1 litre). Mycélium aérien d'une coloration évoluant du blanc au rosepâle. Mycélium végétatif d'une coloration évoluant de l'orangé au rouge vif. le milieu n'est pas coloré. Croissance abondante. Milieu gélosé de Lindenbein (composition: glycérine 30 mg; NaNO3 2 g, W2HP04 I g, MgS04 0,5 g, FeS04 10 mg, gélose 30 g, eau distillée 1 litre). Mycélium aérien de coloration rose-crème. le mycélium végé- tatif est d'une coloration rouge-cerise vif. te milieu n'est pas coloré. Croissance abondante. Milieu gélosé à l'avoine (com position : avoine broyée 65 g, gélose 30 g, eau distillée 1 litre). Mycélium aérien blanc, mycélium végétatif rouge-orangé. Le milieu n'est pas coloré. Croissance modérée. Milieu gélosé de Tresner-Koreniako (composition : KN03 I g, ItP04 0,5 g, MgS04 0,5 g, NaCl 0,5 g, citrate de fer 0,5 g, CaC03 I g, glucose 20 g, gélose 30 g, eau distillée I litre). Mycélium aérien blanc, discret; mycélium végétatif rouge cerise fonce. Le milieu n'est pas coloré. Croissance abondante. Milieu gélosé de Tresner (composition : peptone 10 g, citrate de fer 0,5 g, gélose 30 g, eau distillée I 1). Ne forme pas de pigments mélanoides. Utilisation de sources de carbone d'après Pridham et Gottlieb (T.G.Tridham, D.Gottlieb. Assimilation of carbon compounds in syntretic medium. J. Bacteriol., 56, 107 - 114, 1948). Assimile bien le fructose, le glucose, le galactose, la glycérine, le raffinose, le xylose, l'arabinose, l'inositol, le rhamnose, le mannitol. N'assimile pas la cellulose. tes hydrolysats de cellules entières obtenus et étudiés d'après un procédé connu (-B.Becker, M.POLechevalier, R.E.Gordon and E.A.Lechevalier. Appel. Microbiol., 12 421 - 423, 1964; M.P. techevalier. J. tabor. and Clinical Medicine, 71, n06, 934 - 944, 1968) contiennent l'acide mésodiaminopimélique, l'arabinose et le galactose. Par ses caractéristiques morphologiques et culturales ainsi que par la teneur en acide diaminopimélique, en arabinose et galactose des hydrolysats de cellules entières, la souche 2739 peut être classée avec l'espèce Nocardia. Par fermentation sur milieu nutritif liquide, à l'état immergé la souche 2739 synthétise 320 à 450 microgrammes par litre de rifamycine B. ta souche 2739 isolée pour la première fois du sol par les auteurs de l'invention a été comparée avec la souche productrice connue de rifamycine Str. mediterranei ATCC 13685 'les résultats de la comparaison sont résumés dans le tableau qui suit Comparaison de la nouvelle souche productrice de rifamycine B (souche 2739) avec la souche productrice connue Str.mediterranei ATCC 13685 Milieu Culture nouvellement isolée Culture déjà connue Str de souche productrice mediterranei ATCC 13685 (souche 2739) CARACTERI S TIQUES Czapek M.a. blanc au rostre blanc discret M.V. rouge vif au incolore à jaunâtre rouge-cerise r. néant néant Krassilni M.a. blanc au rosâtre-påle blanc, discret kov et M.V. orangé au rouge-vif incolore à jaunâtre Glucose- P.s. néant néant asparagine Lindenbein M.a. crème-rose blanc, discret M.V. rouge-cerise vif incolore à jaune néant néant A l'avoine M.a. blanc blanc, discret M.V. rouge-orangé orangé-rosâtre Pots. néant néant Tresner- M.a blanc néant Koreniako MoV rouge-cerise foncé incolore P.s. néant néant Milieu miné- M.a. blanc, pauvre blanc, discret ral n01 de M.V. incolore incolore Gauzé P.s. néant néant Chaînettes de spores droites droites Spores lisses lisses Milieu orga- M.a. néant néant nique n02 M.V. orangé vif orangé de Gauzé P.s. néant néant Assimilations des sources de carbone sur milieu de Pridham-Gottlieb Raffinose Rhamnose ++ ++ Xylose ++ Arabinose Glucose ++ +++ Fructose +++ + Galactose +4+ +4+ Mannitol ++ e+ Saccharose -WF Inositol ++ +++ Cellulose Explications relatives au tableau M.a. : mycélium aérien; M.V. : mycélium végétatif; P.s. : pigment soluble. +4+ : croissance abondante ++ : croissance modérée; + : croissance mauvaise - : pas de croissance. Comme l'indiquent les résultats résumés dans le tableau, la souche isolée du sol par les auteurs de l'invention diffère sensiblement de la souche Str mediterranei ATCC 13685 C'est ainsi que sur le milieu gélosé de Czapek, la nouvelle souche 2739 forme un mycélium végétatif de coloration rouge-vif à rouge-cerise, alors que la culture 13685 donne un mycélium immergé incolore à jaunâtre. Sur le milieu gélosé de KDrassilnikov SR-I et sur le milieu gélosé au glucose et à l'asparagine le mycélium végétatif de la souche 2739 est de coloration orangé à rouge-vif, alors que celui de la culture 13685 est incolore à jaunâtre. Sur le milieu gélosé de Lindenbein la souche 2739 donne un mycélium rouge cerise vif -alors que le mycélium de milieu de culture 13685 est incolore à jaunâtre. ta souche nouvelle 2739, à l'encontre de la souche 13685, assimile le raffinose. En tenant compte de ces résultats, la souche 2739 isolée pour la première fois par les auteurs de l'invention peut etre classée comme une espèce nouvelle qu'ils ont proposé de dénommer "Nocardia asiatica spOnov." La culture de cette souche se conserve pendant 6 mois sur le milieu organique gélosé n02 de Gauzé et sur le milieu gélosé de Czapek à +20 C et à +50C. Pour obtenir l'antibiotique rifamycine B à partir d'une liqueur de culture on fait croître la souche 2739 à l'état immergé ou secoué sur un milieu de composition suivante (% en masse): farine de soja 1,5, glycérine 3,0, chlorure de sodium 0,2, carbonate de calcium 0,5, barbitel (de sodium) 0,1, graisse de cachalot 0,1, eau de robinet q.s.p. 100,0. On fait croître le mycélium de semence pendant 24 heures sur un milieu nutritif de composition suivante (% en masse) bouillon de Hottinger (700 à 800 mg d'azote des amines) 3,0, glucose 1,0, peptone 0,5, chlorure de sodium 0,5, carbonate de calcium 0,3, eau de robinet q.s.p. 100,0. On procède à l'extraction de la rifamycine B à partir de la liqueur de culture et on effectue sa purification chimique suivant un procédé connu. Ci-après est décrit un exemple non limitatif de culture de la souche 2739 à l'état immergé en vue de l'obtention d'une liqueur de culture contenant la rifamycine B. Exemple. Pour obtenir des spores on fait croître la souche pendant 10 jours à une température de 280C dans des eprouvettes contenant un milieu nutritif gélosé incliné de composition massique suivante (%) farine de pois 1,0 glucose 1 ,0 chlorure de sodium 0,5 gélose 3,0 eau q.s.p. 100,0 pH du milieu après stérilisation 7,0. On stérilise le milieu avant l'inoculation à la vapeur d'eau à une température de 12100 pendant 30 minutes. Pour obtenir du mycélium de semence on inocule les spores de culture obtenues sur le milieu gélosé précité dans des fioles d'Erlenmeyer d'une capacité de 750 cm3 contenant 150 cm3 de milieu nutritif de composition massique suivante (ss): farine de soja 0,5 glycérine 2,0 sulfate d'ammonium 0,2 chlorure de sodium 0,3 carbonate de calcium 0,7 eau de robinet q.s.p. 100,0 pH du milieu après stérilisation 7,0. Avant l'inoculation oi stérilise le milieu à la vapeur d'eau sous pression, à 1210C pendant 30 minutes. On procède à l'incubation des fioles sur des secoueuses fonctionnant à 200 tr/mm pendant 72 heures à 280C. On introduit l'inoculum à partir de ces fioles à raison de 5% en volume dansles fioles suivantes contenant 200 cm3 de milieu nutritif de composition massique suivante (46) : bouillon de Hottinger (700 à 800 mg d'azote) 3,0 des amines) glucose 1,0 peptone 0,5 chlorure de sodium 0,5 carbonate de calcium 0,3 eau de robinet qOs.p. 100,0 On introduit le mycélium recueilli après croissance dans les fioles dans des fermenteurs à raison de 6 litres de semence pour 300 litres de milieu (2% en volume de semence). Les fermenteurs de 700 1 de capacité contiennent 300 1 de milieu nutritif de composition massique suivante (%): farine de soja t,5 glycérine 7,0 chlorure de sodium 0,2 carbonate de calcium 0,5 barbital (de sodium) 0,1 graisse de cachalot 0,1 eau de robinet q.s,p, 100,0 On stérilise le milieu avant l'inoculation à la vapeur d'eau pendant 50 minutes à une température de 121 C. On procède à la fermentation à une température de 280 à 300 C, sous une pression de 0,) à 0,5 atmosphèré effective, en présence d'aération (à raison de 1 litre.d'air pour I litre de milieu par minute), l'agitateur étant en marche et fonctionnant à 240 tr/mm. ta fermentation se poursuit pendant 120 à 140 heures. 'l'accumulation maximale de l'antibiotique dans la liqueur de culture est observée après 120 à 140 haures de croissance; elle atteint 350 à 420 microgrammes de rifamycine B par centimètre cube. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. BEVENDICATIONS 1. Nouvelle souche microbienne dénommée Nocardia sp. nov. 2739, productrice de rifamycine B, caractérisée par les propriétés suivantes en cas de culture sur milieux félosés sur le milieu minéral n01 de Gauzé elle forme un mycélium aérien blanc discret et un mycélium végétatif incolore, elle ne colore pas le milieu; les hyphes du mycélium aérien se désintègrent sur toute leur longueur en spores allongées à surface lisse; sur le milieu organique no2 de Gauzé elle ne forme pas de mycélium aérien, le mycélium végétatif est orangévif, elle ne colore pas le milieu; sur le milieu gélosé de Czapek elle forme un mycélium aérien bien développé dont la colaration va du blanc au rosâtre, le mycélium végétatif est d'une coloration allant du rouge-vif au rouge cerise, la coloration du mycélium végétatif est conditionnée par la formation d'un pigment rouge qui peut être extrait du mycélium par l'acétone, le pigment ne pénètre pas dans le milieu;sursmilieu gélosé au glucose et à l'asparagine elle forme un mycélium aérien de coloration s'échelonnant du blanc au rosâtre pâle et un mycélium végétatif d'une coloration s'échelonnant de l'orangé au rouge vif, elle ne colore pas le milieu; sur le milieu gélosé de Lindenbein elle forme un mycélium aérien de coloration crème-rose et un mycélium végétatif de coloration rouge cerise vif, elle ne colore pas le milieu; sur un milieu gélosé à l'avoine elle forme un mycélium aérien blanc et un mycélium végétatif rouge-orangé, elle ne colore pas le milieu; sur le milieu gélosé de Tresner-Koreniako de composition suivante : KN03 1 g, K2HP04 0,5 g, NaCI 0,5 g, Mus04 0,5 g, citrate de fer 0,5 g, CaC03 1 g, glucose 20 g, gélose 70 g, eau distillée t litre, elle forme un mycélium aérien blanc discret et un mycélium végétatif rouge-cerise foncé, elle ne colore pas le milieu; elle ne forme pas de pigments mélansïaes sur le milieu de Tresner; parmi les sources de carbone (sur le milieu de Pridham-Gottlieb) elle assimile le fructose, le glucose, le galactose, la glycérine, le saccharose, le raffinose, le xylose, l'inositol, l'arabinose, le rhamnose, le mannitol et n'assimile pas la cellulose; les hydrolysats des cellules entières contiennent de l'acide mésodiaminopimélique, de l'arabinose et du galactose; au cours d'une fermentation au sein d'un milieu nutritif liquide (imrnersion ou secouage) elle synthétise de 320 à 450 microgrammes par centimètre cube de rifamycine B. 2. Procédé d'obtention de la rifamycine B et de ses dérivés, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus par un processus comprenant la culture de la souche précitéesur un milieu de culture approprié. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par l'utilisation de deux milieux de culture successifs, dont l'un a la composition suivante (% en masse) : bouillon de Hottinger (700 à 800 mg d'arote des amines) 3,0, glucose 1,0, peptone 0,5, chlorure de sodium 0,5, carbonate de calcium 0,3, eau de robinet q.s.p. 100,0, et l'autre la composition suivante (% en masse) farine de soja 1,5, glycérine 3,0, chlorure de sodium 0,2, carbonate de calcium 0,5, barbital (de sodium) 0,1, graisse de cachalot O,t, eau de robinet q.s.p. 100,0.