Brevet FR2146909A1 — publié le 19730309

J)anL le certlfiaat d'Addition français n 305 CAM on a décrit une composition pour le traitement d'affections gastriques relevant de troubles de sécrétion de mucus et d'acide chlorhydrique par la muqueuse de l'estomac (hyperacidités et ulcères) contenant comme principe actif des protéines d'Hélix et un sel minéral du type chlorure de sodium et un composé organique du genre sorbitol, acide tartrique ou acide citrique ou les sels alcalins ou alcalino-terreux de ces acides. Le procédé décrit consiste à faire sécréter des gasteropodes appartenant aux espèces Hélix (Hélix pomatia, Hélix aspersa ou Hélix nemoralis) à l'aide d'un agent d'excitation comprenant un sel minéral non toxique du genre du chlorure de sodium et un composé organique du genre du sorbitol, de l'acide tartrique, de l'acide citrique ou les sels alcalins ou alcalino-terreux de ces acides, à enlever ensuite l'excès de sel minéral et à procéder à une évaporation à température relative basse Jusqu'à siccité de manière à obtenir une poudre blanche contenant des protéines. Ces protéines présentent l'avantage d'une activité à très faible dose puisque 15 à 20 mg. protègent le rat contre l'ulcère expérimental. Une donnée importante est l'opération de dessalage destinte à éliminer les sels minéraux du genre du chlorure de sodium dont l'excès rendrait le produit impropre à un usage anti-ulcère. Dans le Certificat d'AddItònrÇcette élimination se fait à l'aide d'une résine échangeuse en général disposée dans une co lonne de filtration. Des études plus complètes ont montré que les protéines actives ont des poids moléculaires supérieurs à 20.000. L,actir vité décrit fortement dans les fractions de poids moléculaires inférieurs et devient nulle dans la fraction contenant les acides aminés. Suivant l'invention également, la préparation de la fraction est améliorée considérablement par la réunion en une seule opération des trois opérations - concentration des solutions de départ (élimination de l'eau > ; - dessalage de ces solutions (élimination des substances dtaccom- pagnement du moins la plus grande partie car la filtration ne permet pas d'aller Jusqutà une substance sèche) ; - séparation de la fraction la plus active (sélection des protéines). Cette opération unique consiste à filtrer la solution salée sur une membrane à porosité moléculaire (membranes d'ultrafiltration ou membranes de séparation moléculaire). En filtrant les solutions diluées contenant les sels minéraux ou organiques, le sorbitol et les protéines sur une membrane d'ultrafiltration appropriée on peut retenir les protéines actives puisque celles-ci présentent des poids moléculaires considérablement plus élevés que les substances d'accompagnement. Ces substances et liteau se trouvent ainsi aisément éliminées tandis que la fraction n'ayant pas franchi la membrane est une solution fortement enrichie en protéines. l'obligation de concentrer plus de 100 litres de solution pour obtenir un peu plus de 700 gr de poudre a conduit à modifier la méthode d'obtention, cette modification consiste à remplacer le dessalage sur résine par une filtration sur membrane0 Les membranes d'ultrafiltration qui ont été utilisées sont celles connues par les spécialistes du domaine sous la dénomination DIAFLO et produites par la Société AMICON (Pays-Bas). De telles membranes créées depuis quelques années sont utilisées pour la séparation et la purification de colloïdes et macromolécules. En pratique le type employé dans le procédé objet de l'invention est 1'UM 20. Comme il existe des membranes d'ultrafiltration cali brées il a été possible de séparer non seulement les protéines des substances d'accompagnement mais aussi les protéines entre elles. Disposant dans le filtre une membrane d'ultrafiltra- tion calibrée pour les poids moléculaires égaux ou supérieurs à 5.000, une solution de protéines d'Hélix est filtrée de telle sorte qu'on ne conserve dans l'appareil que le dixième du volume total, éliminant ainsi 90 dó de la solution.Le résultat ob tenfl se concrétise dans les formules analytiques suivantes : Solution brute de protéines Chlorure de sodium 270 mg Citrate de magnésie 214 mg Sorbitol 254 mg Protéines 155 mg Eau 1.000 ml Après filtration, on obtient : Solution filtrée Solution retenue sur le filtre Chlorure de sodium 243 mg 27 mg Citrate de magnésie 192 mg 21,4 mg Sorbitol 229,6 mg 25,4 mg Protéines 25 mg 130 mg Eau 900 mi 100 ml On aboutit donc à l'élimination des substances d'accompagnement des protéines dans la mesure où lton élimine l'eau puisque ces substances ont des poids moléculaires inférieurs à 5.090. Quant aux protéines, elles subissent une perte centésimale du fait qutelles renferment des molécules d'acides aminés libres et de petits peptides de poids moléculaires filtrants. Si la solution retenue par la membrane, donc la solution enrichie en protéines, est passée sur une membrane d'ultrafiltration calibrée pour les poids moléculaires égaux ou supérieurs à î0.0oe, on va à nouveau la déconcentrer en substances d'accompagnement et la fraction protéinique perdra les peptides de poids moléculaires inférieurs à 10.000. On est arrivé de la sorte, par fractionnements, ê créer trois fractions protéiniques : protéines de P.M. 5000 à 10.000 - protéines de P;M. 10.000 à 20.000 - protéines de PJM. 20.000 et au-dessus. Cette dernière fraction s'est révélée la plus active contre l'ulcère gastrique expérimental du rat. L'exemple ci-après décrit une petite fabrication de poudre destinée à l'expérimentation. 4 kgs d'escargots Hélix pomatia, récoltés en fin avril, sont lavés à l'eau pour les débarrasser d'exeréments et de ma- tières étrangères. Ils sont alors disposés sur un tamis et aspergés d'eau jusqu'à ce qu'ils sortent tous de leur coquille. Ils sont ensuite arrosés avec une solution tiédie à 260-280C, de composition suivante Citrate de magnésium 25 g Sorbitol 25 g Eau 5 litres. Les animaux se mettent à secréter un mucus salivaire et gastrique visqueux et rentrent lentement dans leur coquille tout en continuant à secréter. Après environ 1 heure, on les lave avec une solution de chlorure de sodium à 20 g par litre. On recueille au total 19,5 litres de solution jaune clair, que l'on filtre sur toile et outil est avantageux de centrifuger de façon à l'obtenir tout à fait limpide. La conservation de cette solution se fait en glacière à + 40C. Le dessalage, la concentration et la sélection des protéines s'effectua7tsur membrane d'ultrafiltration pour poids molé culaires égaux ou supérieur s à 20,000, L'appareil de filtration n'est pas spécial au procédé ; seule la membrane est importante. L'appareil utilisé dans lecas décrit présentement est constitué par un récipient cylindrique en matière plastique alimenté en solution à sa partie supérieure et portant fixée sur le fond la membrane de séparation moléculaire. La solution qui a franchi la membrane est évacuée grace à une plaque poreuse qui soutient la membrane et qui permet l'écoulement par un orifice ménagé dans le fondue l'appareil. La membrane est protégée du colmatage par un petit agitateur qui tourne à quelques millimètres de distance et évite une concentration locale trop forte. L'appareil est alimenté en solution à filtrer par un réservoir que lton peut mettre sous pression d'azote, la filtration s'effectuant sous une pression de 1 à 2 kgs. Avec une membrane d'un diamètre de 100 mm, la filtration des 19,5 litres de solution brute de protéines dure 38 heures et exige deux renouvellements de membrane. On obtient en fin d'opération 1,9 litre de solution concentrée et dessalée, répondant à la composition suivante : Chlorure de sodium 2,6 g Citrate de magnésium 2,2 g Sorbitol 2,3 g Protéine Pi 20.000 17 g Eau la890 ml Cette solution est évaporée sous vide à basse température et fournit une poudre brun clair très hygroscopique que l'on conserve en glacière. La poudre obtenue se révèle, chez le rat, au moins 4 fois plus active que la poudre totale obtenue par dessalage sur résine. Les résultats obtenus dans la prévention de l'ulcere de contrainte du rat se résument ainsi Rats témoins non traités 44 ulcères Rats traités par produit de référence (Urogastrone) 19 ulcères Rats traités par protéines totales (15 mg par animal) 4 ulcères Rats traités par protéines PM 20.000 (7,5 mg par animal) 0 à 2 ulcères La modification du procédé conduit donc à un produit nettement plus actif. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par 1Chonime de l'art au procédé et à la composition qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENPICPTI0NS 1 - Composition pour le traitement des affections gastriques relevant de troubles de sécrétion de mucus et d'acide chlorhydrique par la muqueuse de l'estomac (hyperacidité et ulcères) contenant comme principe actif un produit protéinique obtenu en faisant sécréter des gastéropodes à l'aide d'un agent d'excitation comprenant des protéines d'Hélix, un sel minéral tel que du chlorure de sodium et un composé organique choisi parmi le sorbitol,l'acide tartrique, l'acide citrique et leurs sels,caractérisé en ce que les protéines actives contenues dans la composition ont des poids moléculaires supérieurs à 20.000. 2 - Procédé de préparation d'une composition suivant la revendication 1, consistant à faire sécréter des gastéropodes appartenant aux espèces Hélix (Hélix pomatia, Hélix aspersa ou Hélix nemoralis) à l'aide d'un agent d'excitation comprenant un sel minéral non toxique du genre du chlorure de sodium et un composé organique du genre du sorbitol, de l'acide tartrique, de l'acide citrique ou les sels alcalins ou alcalino-terreux de ces acides et à enlever ensuite l'excès de sel minéral, caractérisé en ce que les trois opérations suivantes concentration des solutions de départ (élimination de l'eau); dessalage de ces solutions (élimination de la plus grande partie des substances d'accompagnement); sélection des protéines; ont lieu par une filtration sur une membrane à porosité moléculaire (membrane d'ultra-filtration ou membrane de séparation moléculaire) de manière à réunir ces trois opérations en une opération unique. 3 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que les membranes d'ultrafiltration utilisées sont celles connues sous la dénomination DIAFLO et produites par la Société AMICON (Pays-Bas). 4 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'action de la membrane d'ultrafiltration permet de séparer non seulement les protéines des substances d'accompagnement, mais aussi les protéines entre elles. 5 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2, 3 et 4, caractérisé en ce que la membrane d'ultrafiltration est calibrée pour les poids moléculaires égaux ou supérieurs à 5.000, de telle sorte que lors de la filtration de la solution de protéines d'Hélix, il n'est conservé dans l'appareil que le dixième du volume total, en éliminant ainsi 90 45 de la solution. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la solution retenue par la membrane selon cette revendication 5 est passée ensuite sur une membrane d'ultrafiltration calibrée pour les poids moléculaires égaux ou supérieurs à 10.000 la fraction protidique perd les peptides de poids moléculaires inférieurs à 10.000. 7. Procédé suivant ltune quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que par fractionnements successifs on crée trois fractions protéiniques de Pli 5.000 à 10.000, protéines de P}i 10.000 à 20.000 et protéines de BM 20.000 et au-dessus cette fraction étant la plus active contre l'ulcère gastrique (expérimental du rat > . 8. Composition obtenue par le procddd.suivant la revendication 2, après concentration et dessalage, cette composition répondant à la teneur ci-après NaCl 2,6 gr. Citrate de magnésium 2,2 gr. Sorbitol 2,3 gr. Protéine PM > 20.000 17 gr. Eau t.890 milO