Brevet FR2144648A1 — publié le 19730216

Dans les procédés classiques de fabrication du fromage, le lait est caillé ou copulé et ln caillebotte ainsi formée ensuite est découpée en morceaux qui sont/ci.ls. Le petit lait est séparé de la caillebotte qui est ensuite décoW > ée en blocs,pressée et mûrie pendant plusieurs mois pour obtenir le fromage voulu. La présure de veau est généralement utilisée pour coaguler ou cailler le lait en caillebotte. La présure de veau est une substance secrétée par l'endothéllium de la caillette des veaux de lait. I1 est évident que la qualité et la quantité de présure disponible pour la fabrication des fromages dépendent directement du nombre et de la race des veaux abattus pour l'alimentation. On a donc été incité, dans la technique antérieure, à rechercher un substitut convenable à la présure de veau. Différentes présures microbiennes sont maintenant disponibles. Elles sont synthétisées,par exemple, par les soucies de Mucor miehei et de Mucor pusillu9'. Une présure microbienne particulièrement utile est synthétisée par la souche Mucor miehei NRRL 5420 ou ses mutants. Bien que ces présures microbiennes aient un pouvoir élevé et souhaitable de coagulation du lait, elles contiennent fréquemment des impuretés de lipase responsables de la rancidité des fromages. La présente invention concerne donc un procédé destiné à éliminer ces impuretés de la présure microbienne et qui comprend les étapes suivantes : ajustement du plus de la présure à une valeur comprise entre environ 4 et environ 6 afin que le précipité formé contienne une lipase active, puis séparation de la solution de présure microbienne ainsi purifiée, du précipité. La présure microbienne constituant la matière prenière utilisable dans le procédé de l'invention peut être obtenue par des méthodes connues. Une présure microbienne particulièrement utile peut etre préparée par culture aérobie de mucor michei, et plus particulièrement de la souche NRRL 3420 ou de ses mutants, dans un milieu contenant des éléments nutritifs convenables, puis récupération de l'enzyme formée. Le procédé de l'invention peut être appliqué à la purification des présures microbiennes sous leurs diverses for!res, par exemple des cultures aqueuses totales ou des liquides de fermentation connus des spécialistes. Elles peuvent également se présenter sous forme de matière sèche, alors dissoute dans un milieu aqueux avant son utilisation. la concentration en présure microbienne de la solution aqueuse utilisée n'est pas déterminante. I1 est connu qu'il faut traiter de grandes quantités de liquide, lorsque les solutions sont diluées, polir purifier une quantité donnée de présure microbienne. Des solutions concentrées permettent de purifier une quantité donnée de présure microbienne facilement et rapidement. le procédé de l'invention peut hêtre mis en oeuvre par addition d'une quantité suffisante d'acide, par exemple d'acide sulfurique, à une solution aqueuse de présure microbienne, afin d'en ajuster le pH à une valeur comprise entre environ 4 et environ 6. La floculation consécutive à l'action de la lipase se produit presque immédiatement. Le précipité résultant peut être séparé de la présure microbienne ainsi purifiée, par filtration ou par centrifugation et décantation. Si le pH est inférieur à environ 4, l'activité de la présure microbienne tend à s'altérer. Si le pH est supérieur à environ 6, l'élimination de la lipase est insuffisante. le pH doit etre de préférence compris entre environ 4,5 et environ 4,7 pour que l'élimination de la lipase soit maximale et que l'altération de l'activité -de la présure soit minimale. Pour éliminer les dernières traces de lipase active, il est, de plus, souhaitable de concentrer la présure microbienne liquide par des techniques connues après qu'elle a été ajustée au pH cité ci-dessus et filtrez, puis de soumettre la solution concentrée ainsi obtenue à une filtration de finition. les conditions expérimentales de mise en oeuvre de l'invention ne sont pas très limitées. Les températures peuvent varier d'environ 0 C à environ 350C, -les solutions enzymatiques tendant à geler en-dessouide OOC et la présure microbienne étant inactive au-dessus de 350C, De préférence, la température doit etre comprise entre environ 4 C et environ 250C. L'invention concerne l'élimination de la lipase de pré sure microbienne afin obtenir un produit dont le rapport des unités de pouvoir de coaulatior-l aux unités d'activité lipase est élevé et sohaitable. Les procédés suivants sont utilisés pour mesurer le pouvoir de coag::]ation et l'activité li pesse des matières brutes et purifiées POUVOIR DE COAGULATION Une solution aqueue a 10 % (poids/volume) est préparée par dissollttion d'une quntité appropriée dc lait sec écrémé dans l'eau. On ajoute ensuite, à cette sobtion, du CaCl2.2H2O afin que la concentration en calcium soit de 0,01 M. 5 ml de la solution de lait ainsi préparée sont placés dans un tube à essai et chauffés à 37,50C.0,5 ml d'une solution aqueuse diluée d'enzyme , à 37,50C, est ensuite ajouté à la solution de lait contenue dans le tube à essai.Le mélange est ensuite agité et on mesure le temps nécessaire à la formation du premier caillot. La concentration en enzyme est choisie de façon que le temps de coaç1lation soit d'environ 4 mn. Le pouvoir de coagulation du lait de l'enzyme est calculé comme suit Unités Soxhlet = M (ml)/ E (mg) x (2400 (s)/ T (s) x 1000 dans cette formule, M représente le volume de lait, E le poids d'enzyme et T le temps nécessaire à la formation du premier caillot. L'activité de l'enzyme est ensuite exprimée en unités Soxhlet (U.S.) par gramme. lorsqu'on utilise l'enzyme sous forme liquide au lieu de dissoudre une enzyme en poudre dans de l'eau, E représente le volume convenable d'enzyme, exprimé en microlitres dans la formule ci-dessus, et l'activité enzymatique est exprimée en unités Soxhlet par millilitre. Une unité Soxhlet représente l'activité d'une enzyme pouvant coaguler un ml de la solution de lait décrite ci-dessus en 40 mn. ACTIVITE LIPASE On prépare un mélange réactionnel en émulsifiant 15 ml de tributyrine dans 135 ml d'une solution aqueuse à 10 % (poids/ volume) de gomme arabique. L'émulsion de tributyrine ainsi obtenue est ensuite mélangée avec 60 ml d'une solution aqueu se 0,001 M d'un tampon de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane-HCl à pH 8,0, 60 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 3,0 M et 180 ml d'eau distillée. On place 5 ml du mélange dé crit ci-dessus, ajusté à pH 8,0, dans le récipient réactionnel d'un appareil pouvant ajouter des quantités suffisantes d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,02 N pour maintenir le pH du mélange réactionnel à 8,0. Si -l'enzyme est en poudre, elle est dissoute dans une solution aqueuse tampon de tris (hydroxyméthyl)aminométhane-HCl 0,001 M à pli 8,0. Si elle est liquides son pII est ajusté à 8,0. Un ml d'échantillon d'enzyme liquide est ajouté aux 5 ml du mélange réactionnel décrit ci-dessus, et l'ensemble mélange réactionneSenzJTme est Llaintenu à 35 C pendant 5 à 4 mn. Pendant ce temps, le pli de l'ensemble est maintenu à 8,0 par addition de la solution d'hydroxyde de sodium décrite ci-dessus. On mesure le temps total écoulé (en secondes) et la quantité totale de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,02 N ajoutée po-ur maintenir le pH à 8,0. l'activité lipase est ensuite calculée comme suit Unités lipase V x 1200 T dans cette formule, V est le volume d'hydroxyde de sodium en ml, et T est le temps en secondes. L'activité enzymatique est ensuite exprimée en unités lipase (UL) par ml. Une unité lipase correspond à la quantité d'enzyme nécessaire pour produire une micromole d'acide gras par minute dans les conditions données. La solution d'hydroxyde de sodium ajoutée pour maintenir le pH neutralise l'acide gras produit et permet d'en mesurer la quantité formée. La présente invention sera décrite plus en détail dans les exemples illustratifs suivants. EXEI(PLE 1 Une présure microbienne est préparée par culture classique de la souche Mucor miehei MRRL 3420 dans un milieu stérilisé contenant de l'amidon de mais, du mais broyé, de la farine de soja, du carbonate de calcium et de l'eau. Le milieu fermenté résultant est ensuite filtré et isolé du mycélium. Des petites quantités de filtrat contenant chacune 6,7 unités lipase par ml sont mélangées à la température ambiante avec de l'acide sulfurique afin d'ajuster le pH à 5,5, 5,0, et 4,5 respectivement. les précipités formés dans chaque échantillon sont isolés par filtration. Les filtrats obtenus contiennent respectivement 3,7, 2,6, et 1,8 unités lipase par ml correspondant respectivement à une élimination de 44,8 %; 61,2 % et 73,1 % de la lipase.cecij:net clairement en évidence le rôle de l'ajustement du pH à une valeur comprise entre environ 4 et environ 6 dans ltélimination de la lipase. EXEMPLE 2 Plusieurs éctillons de 25 ml d'un milieu fermenté filtré analogue a celui décrit dans l'exemple 1 et contenant chacun 11,1 UL nl sont traités individuellement par l'acide sulfurique Dour obtenir diverses valeurs de plI. Les precipi- tés obtenus sont séparés par centrifugation et les liquides surnageants sont décantés. Les précipités sont ensuite suspendus individuellement dans 5 ml d'une solution aqueuse de tampon mi phosphate 0,01 N à pH 6,1.On mesure ensuite l'activité lipase des précipités mis en suspension et on obtient les résultats représentés dans le tableau ci-dessous TABLEAU I pH UL/ml Précipité mis en suspension 4,7 55,3 4,6 54,9 4,5 51 ,3 4,4 50,5 4,3 49,7 Ces résultats montrent que l'ajustement du pH à une valeur comprise entre environ 4,5 et environ 4,7 permet l'éli- mination de la majeure partie de l'activité lipase, puisque les précipités formés dans cette gamme de pH contiennent les plus grandes quantités de lipase. EXEMPTE 3 On prépare un milieu fermenté contenant une présure microbienne comme décrit dans l'exemple 1 avec la souche Mucor miehei NRRl 3420, puis on-le filtre pour en éliminer le myc- lium. Ce premier filtrat contient 73 UL/ml, sur la base d'une solution type ayant un pouvoir de coagulation de 54 000 US/ml. On ajoute de l'acide sulfurique pour ajuster le pH à 4,6. le précipité obtenu est éliminé par filtration sur de la terre de diatomées ; le filtrat résultant contient 9,4 Ul/nl, sur la base d'une solution-type ayant un pouvoir de coagulation de 54 000 US/ml. Ce filtrat est ensuite concentré par évaporation sous vide jusqu'à ce qu'il ait un pouvoir de coagula tion type de 54 000 US/ml, puis il est filtré sur la terre de diatomées . Le produit final obtenu contient 2,4 U1/ml et a un rapport pouvoir de coagulation/activité lipase de 22 590, valeur élevée souhaitable. 96,8 % de la lipase contenue dans la matière prerr.ière sont ainsi éliminés. EXEMPLE 4 On répète le mode opératoire de l'exemple 3 en utilisant le premier filtrat contenant 34 UL/ml sur la base d'unc solution ayant un pouvoir de coagulation type. Le filtrat, après ajustement du pif et filtration, contient 2,02 Ul/ml sur la base d'un pouvoir de coagulation type. le produit obtenu après concentration et filtration de finition ne contient pas de lipase en quantité mesurable. EXEMPLE 5 Du lait complet pasteurisé est traité classiquement par une culture de ferments lactiques et une présure microbienne traitée selon l'un des procédés des exemples 1 à 4 afin dten éliminer l'activité lipase0 le lait coagulé et une caillebotte satisfaisante sont ainsi préparés. Cette caillebotte permet de préparer ensuite un fromage normal et satisfaisant après une mise en réserve convenable0 Les fromages fabriqués avec la présure microbienne non traitée, comme décrit précédemmentfpour en éliminer la lipase, présentent une certaine rancidité après une mise en réserve analogue. EXEMPLE 6 On prépare 4 échantillons d'un milieu à base de grain comprenant chacun un mélange de 0,5 g de peptone mycologique "Oxoid", 1,0 g de dextrose, 420 mg de phosphate monosodique, 213 mg de phosphate disodique et 50 ml d'eau distillée. Chaque échantillon est ensuite mis dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml et stérilisé. les quatre fioles sont ensuite inoculées séparément avec des échantillons de cultures inclinées des sou-ches Mucor pusillus NRRS 2543, Mucor miehei A7772, Mucor miehei ATCC 16457, et Mucor meihei NREL ça3042 et mises à incuber à 370C pendant 24 h sur une secoueuse rotative ayant unie course de 25,4mm à 250 tours/minute. Un milieu de culture est préparé et divisé en quatre échantillons contenant chacun un mélange de 3,2 g de dextrose, 2,3 g de peptone M"Cudahy"193 mg de phosphate monosodique, 483 mg de phosphate disodique, 5,0 g de mals complet broyé, 40 mg d'amylase alpha bactérienne et 100 ml d'eau du robinet. Chaque échantillon est ensuite placé dans une fiole d'Erlenmeyer d'un litre et stérilisé. Les quatre fioles sont ensuite inocules séparélnent avec 2 ml de culture sur grain décrite précéderlaent etincubées à 370C pendant 6 jours sur une secouveuse alternative ayant une course de 50,8 mm à 232 cour sesAnn. Les mycélium sont ensuite éliminés par filtration et l-'activité lipase des filtrats obtenus est mesurée. Des échantillons de 10 ml de chaque filtrat sont ajustés à pH 4,5 avec de l'acide sulfurique dilué puis centrifugé. Le liquide surnageant est décanté. Les précipités obtenus sont remis en suspension dans 3 ml d'eau distillée, puis on mesure l'activité lipase de ces échantillons. Les résultats obtenus sont représentés ci-dessous. TABLEAU II Unités lipase Unités lipase pré- ffi de lipase filtrats ori- cipité remis en éliminé ginaux suspension C*alture 10 ml 3 ml ~ 2543 10,8 4,8 44,4 A7772 55,8 12,0 2.1,5 16457 10,6 3,6 34,0 A13042 63,5 17,7 27,9 la présente invention permet d'éliminer la lipase de la présure microbienne produite de diverses façons. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé décrit sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICV?IONS 1.- Procédé d'élimlnation des impuretés de lipase d'une présure microbienne,c.ar'ctérisé en ce qu'il comprend l'ajustement du pli de la présure microbienne à une valeur comprise entre environ 4 et environ 6 afin d'obtenir un précipité contenant l'activité lipase puis la séparation de la présure microbienne, ainsi purifiée, du précipité. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH est ajusté à une valeur comprise entre environ 4,5 et environ 4,7. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la présure microbienne est synthétisée par Mucor miehei. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la présure microbienne est synthétisée par la souche Mucor meihei NRRS 3420 ou l'un de ses mutants. 5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la présure microbienne ainsi purifiée est concentrée et soumise à une filtration de finition.