Brevet FR2193026A1 — publié le 19740215

La présente invention a trait a un nouveau procédé de séparation de macromolécules biologiques telles que des protéines permettant soit la séparation totale, soit la purification soit encore la concentration de telles macromolécules. On connait dja de nombreux procédés de séparation utilisant des particules adsorbantes sur lesquelles on fixe, soit par adsorption reversible, soit à l'aide de liaisons non réversibles, des groupements ou des molécules, permettant d'obtenir des particules susceptibles d'assurer une séparation sdlec- tive à l'aide de procédés tels que la chromatographie. Parmi les procédés les plus intéressants se trouvent ceux qui utilisent, comme support, des particules solides telles que des billes de verre, de silice ou d'alumine. En effet les particules ainsi obtenues se pretent plus facilement à l'exploitation industrielle en raison de leur tenue aux efforts mécani- ques et de leurs possibilités supérieures de régénération en colonne. C'est ainsi que l'on a déJA prevu de fixer sur des particules de silice colloïdale des protéines telles que des enzymes, par adsorption préalable suivie d'une reticulation des protéines adsorbées a l'aide d'un agent réticulant tel que le glutaraldéhyde. I1 est ainsi possible d'utiliser secondairement les fonctions enzymatiques de tels supports. Afin de permettre la fixation de telles protéines sur des billes de silice poreuse on a déjà prévu d'utiliser des groupements silanes, en particulier des amino-alkylsilanes, qui activés par le glutaraldéhyde sont capables de fixer des pro théines. On a également déjà proposé de réaliser sur la surface de particules adsorbantes, telles que, du charbon de bois, un revetement formant une sorte de tamis moléculaire ne permettant qu'une adsorption sélective grâce à la barrière réalisée par ce revetement moléculaire. Ce procédé présente cependant également de nombreux inconvénients, et notamment il se prête mal d une exploitation industrielle car le tamisage ainsi obtenu n'est pas parfait et est de plus extremement difficile à réaliser. Toutes ces particules complexes obtenues étaient principalement utilisées comme réactifs et ne -présentent pas de possibilités générales de séparation de macromolécules biologiques. La présente invention se propose de remédier à ces différents inconvénients et de- fournir un procédé de séparation de macromolécules biologiques et généralement de protéines permettant de réaliser, de façon industrielle, des séparations, concentrations, purifications et chromatographies dans des conditions de séparation extrêmement générales. La présente invention a pour objet un procédé de séparation des macromolécules biologiques, caractérisé par le fait que l'on utilise, pour la séparation desdites macromolécules d'avec le restant-d'un mélange, des supports poreux sous forme particulaire tels que de la silice ou de l'alumine dont la surface présente des propriétés d'affinité et notamment-d'adsorption réversible et/ou d'échange d'ions pour retenir soit les macromolécules a séparer, les autres constituants du mélange ne présentant pas de propriétés d'affinité avec lesdites particules, soit les autres composants du mélange, les macromolécules à séparer ne présentant pas d'affinité avec lesdites particules. Les propriétés d'affinité des particules de silice ou d'alumine peuvent être obtenues notamment par adsorption ou fixation d'une population de molécules permettant de favoriser une affinité par échange d t ions ou par adsorption réversible. De façon avantageuse on choisit la porosité des particules support de façon à favoriser au maximum la séparation des macromolécules d'avec le mélange initial. Selon un premier mode de réalisation l'invention a pour objet un procédé de séparation des macromolécules biologiques utilisant des supports poreux tels que de la silice ou de l'alumine pour la séparation partielle ou totale des macromolécules a partir d'un mélange, caractérisé par le fait que l'on utilise des particules dont la surface présente des propriétés d'affinité et notamment d'adsorption réversibles et/ou d'échange d'ions, la porosité desdites particules étant choisie de manière d assurer un tamisage moléculaire desdites macromolécules, complétant l'action de ladite affinité. Par macromolécules biologiques on entend notamment les protéines et les hétéroprotéines, les acides nucléiques. Dans un premier mode de réalisation préféré la valeur de la porosité est déterminée de façon à permettre uniquement l'introduction dans les pores de molécules de taille inférieure d la macromolécule a séparer, la surface de la particule étant traitée de façon d empêcher la fixation ou l'adsorption de la macromolécule à séparer et simultanément de façon d contribuer d la rétention des autres constituants du mélange. Dans un tel mode de mise en oeuvre, particulièrement adapté pour séparer une population donnée de macromolécules d'avec un milieu protéique particulièrement complexe, la particule peut avantageusement être revetue d'une couche de molécules permettant la production de phénomène d'échange d'ions auxquels la population de macromolécules a séparer reste insensible. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre, la porosité des particules peut être choisie de façon à inclure les macromolécules à séparer et la surface de la particule est alors traitée de façon d présenter des propriétés électriques empêchant l'adsorption et les phénomènes d'échange d'ions avec le reste de la population du mélange traité. La modification des propriétés d'adsorption ou d'échange d'ions peut avantageusement être obtenue par choix convenable du pH du milieu. La fixation, sur la particule, de molécules destinées à conférer S la particule des propriétés d'affinité particulière s'effectue de préférence, lorsque l'on utilise des particules en silice, d l'aide de groupements silanes. Ainsi on peut utiliser un groupement silane présentant une fonction ammonium quaternaire, ou encore présentant une fonction lipophile, ou encore des groupements présentant une fonction échangeuse de cations. Dans le cas où l'on utilise, pour traiter la surface du support poreux, des molécules de taille importante, et notamment des protéines, la fixation desdites protéines peut avantageusement s'effectuer avec des groupements silanes permettant l'adsorption totale de la population macromoléculaire sur la surface de la particule poreuse. Cette population peut ensuite être fixée par un agent réticulant. Des agents réticulants particulièrement indiqués sont des di-aldéhydes tels que le glutaraldéhyde. De préférence les supports poreux sont constitués de particules poreuses de silice telles que celles vendues sous les marques "SPHEROSIL" ou "PORASIL" et provenant de la société française RHONE-PROGIL. L'invention a également pour objet les préparations de macromolécules séparées, purifiées ou concentrées grâce au procédé selon l'invention. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront S la lecture de la description suivante faite S titre d'exemple non limitatif. 1 ) Purification industrielle des gamma-globulines humaines ou animales à partir d'un plasma défibriné. On utilise des p-articules de silice poreuse telles que celles commercialisées sous la marque "SPHEROSIL" ou "PORASIL" par la Société RHONE PROGIL. Les particules de silice sont préparées par un procédé en soi connu pour obtenir un diamètre moyen des pores compris o o entre 200 et 500 A et de préférence égal à 300 A. Les particules de silice sont ensuite revêtues de fonctions ammonium quaternaire ayant la formule générale Ce revêtement peut s'effectuer par simple adsorption ou par polymérisation mais dans un mode de mise en oeuvre préféré on effectue le revêtement par greffage covalent de silanes permettant d'obtenir cette fonction et dans ce cas R1 est choisi de préférence identique à dans lequel A, A', A" identiques ou différents sont soit des atomes d'halogènes soit des fonctions éthoxy CH3 - CH2 - O R' et R" sont ehoisis de préférence identiques à CH2 - CH3 ou - CH2 - CH2 - OH, tandis que R" est choisi de pré férence égal à - H ou - CH2 - CH2 - OH ou CF CH3 D'une façon plus générale cependant on peut utiliser des dérivés avec ou sans atomes de carbone donnant lieu à la formation d'changeurs anioniques du type en solution aqueuse. La surface de la silice poreuse est de 100 m2/g et correspond å un diamètre moyen des pores égal à 300 A. A titre d'exemple on fixe, par greffage covalent sur ces particules, le silane ou le silane On effectue le greffage en mélangeant en présence d'eau la silice SPHEROSIL avec le silane précité sous agitation. La granulométrie du support obtenu est homogène et est comprise entre 20 et 400 'L et permet de fabriquer des colonnes de taille et de volume quelconques par voie sèche ou humide. La colonne réalisée est, lavée à température ambiante par une solution normale d'acide chlorhydrique pour faire ap paraître éventuellement la fonction chlorhydrate, puis est lavée à l'eau déminéralisée jusqu'au retour du pz aux environs de 4. La colonne préparée est ensuite équilibrée avec untampon de chromatographie avec un pH compris entre 5 et 7,5 de préférence voisin de 6. A titre d'exemple on peut utiliser un tampon Tris 0,05 N + HCl ou encore un tampon Phosphate 0,02 M. L'échantillon protéique, en l'occurrence un plasma défibriné est ensuite passé sur la colonne en étant préalablement débarrassé de la majorité des lipoprotéines grâce à un prétraitement en bain par une silice colloïdale ou à un prétraitement à l'éthanol. Cette solution est ajustée si nécessaire à une concentration protéique comprise entre 30 et 60 g/l par dilution dans le tampon de chromatographie, l'ensemble étant ajusté à un pH compris entre 5 et 7,5, de préférence égal à 6. On peut avantageusement additionner l'échantillon de chlorure de sodium jusqu'à 0,2 M. Le débit peut etre avantageusement égal à 30 ml/cm2/h, et le volume de l'échantillon peut avantageusement être calculé en tenant compte du fait qu'un gramme de silice ainsi traité permet de recevoir par cycle environ 30 mg de protéines. Derrière l'échantillon la colonne est immédiatement lavée par le tampon de chromatographie, avec un débit identique, L'analyse continue de ltéluat par spectrophotométrie U.V. permet d'enregistrer la sortie d'un pic presque complètement symétrique dont l'analyse permet de vérifier la présence de gammaglobulines de type IgG, sensiblement à l'exclusion de toute autre protéine sérique, le rendement pouvant atteindre 80 %. On obtient ainsi une préparation de gamma-globulines extrêmement purifiée susceptible d'être utilisée pour des traitements immunologiques. A la fin de la chromatographie on effectue la régénération de la colonne par élution des protéines fixées à l'aide d'un tampon citrate Mac Ilvaine à pH 4, puis par passage d'une solution normaled'acide chlorhydrique à la suite de quoi la colonne est rééquilibrée avec le tampon de chromatographie. L'expérience a permis de montrer que de nombreux cycles successifs peuvent etre réalisés sans altération des performances de la colonne. I1 a été vérifié qu'à toute condition égale, l'utilisation d'un support plus poreux, par exemple de diamètre moyen poreux égal à 600 arrête toutes les protéines y compris les gamma globulines tandis qu'un support moins poreux de diamètre égal à o 150 A n'arrête pas efficacement les protéines sériques du type albumines 1- > a2-sB1-' ss - globulines. De même si l'on supprime la phase stationnaire greffée contenant les fonctions ammonium quaternaire les propriétés spécifiques d'adsorption des protéines sont inversées et l'albumine ne d'adsorbe plus, alors que la gamma-globuline est fortement retenue. D'autres sources de y-globulines telles que des sangs hemolysés ou des extraits placentaires peuvent être utilisées. Dans ce cas certaines protéines, telles que l'hémoglobine peuvent être présentes à la fin de la séparation. Ces protéines peuvent être éliminées par d'autres voies connues. 20) Délipidation d'un milieu tel qu'un sérum contenant des lipoprotéines lipophiles. On utilise des particules de silice "SPHEROSIL" du type XOB 030 ou XOC ayant un diamètre poreux moyen supérieur ou égal à 600 . On fixe sur le support constitué par ces particules une phase stationnaire ayant des propriétés partiellement lipophiles ; ladite phase étant composée d'une chaîne carbonée d'acide gras, En variante il est également possible d'utiliser des déridés halogénés. La fixation de la phase stationnaire s'effectue de préférence en utilisant un silane contenant une chaîne carbone d'acide gras. Le pH pendant la chromatographie est fixé à 8 de sorte que toutes les protéines sériques sont chargées négativement et n'ont pas tendance à s'accrocher sur les fonctions carboxyles ionisées négativement.Par contre, les liaisons hydrophobes entre les chaînes carbonées et les lipoprotéines entrent en jeu et permettent d'arrêter sélectivement ces dernières. Ce procédé permet de délipider facilement un sérum pour des études sérologiques et aussi d'éliminer l'Antigène Australie éventuellement présent dans un dérivé sanguin. 30) Séparation de l'albumine et de l'hémoglobine. On se propose de séparer l'albumine de l'hémoglobine dans une préparation d'extrait placentaire. Les particules utilisées sont des particules de silice t'SPHEROSIL" de type XOB 075, de diamètre poreux moyen égal à o 300 A. Ces particules sont enrobées à l'aide d'une phase stationnaire hydrophyle contenant des charges électriques négatives, à savoir 50311 ou COO , en utilisant des groupements de forme générale R-SO,H, ow R COO , R étant un radical présentant une 3 fonction silane. Le passage de l'extrait sur la colonne s'effectue à un pH égal à 5. L'hémoglobine chargée positivement à ce pH est retenue alors que l'albumine non chargée n'est pas adsorbée. 40) Concentration de solutions diluées de protéines. On utilise une silice poreuse "SPHEROSIL" ayant un diamètre o poreux moyen égal à 600 A, enrobé d'une phase stationnaire contenant des fonctions ammonium quaternaire telles que décrit dans l'exemple 1. Le passage s'effectue sur la colonne contenant ces particules de silice enrobées, à un pH de l'ordre de 6 de sorte que la quasi totalité des protéines du sérum se trouve retenue. On effectue ensuite l'éluvion des protéines fixées sur le support en modifiant le pH et on obtient ainsi une solution concentrée de protéines. 5Q) Purification de virus dispersés au sein d'une solu tion protéique. A titre d'exemple on choisit un "SPHEROSIL" de diamètre poreux moyen compris entre 200 et 600 excluant la fixation d'un virus non adsorbé. Le ' SPHEROSIL" est revêtu d'une phase stationnaire possédant des fonctions ammonium quaternaire comme dans 11 exemple 1. On effectue un passage d'une préparation de virus GRIPPE contamindepar les protéines d'oeuf du liquide allantoîque ayant servi à la culture du virus. Le passage se fait à un pH sensiblement égal à 6 selon les modalités de l'exemple 1. Les protéines contaminantes, de taille bien inférieure aux particules virales sont adsorbées et généralement incluses tandis que les particules virales sont entraînées et purifiées. Dans les exemples précités les particules de silice présentent une surface pourvue de fonctions chimxtues simples telles que des groupements échangeurs d'ions ou lipophiles. I1 est cependant également possible, selon l'invention d'utiliser des particules, telles que les particules de silice, ayant de préférence une grande porosité, et revêtues d'une couche stable de protéines ou de molécules protéiques. Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux, on fixe sur de la silice poreuse, "SPHEROSIL" ou o "PORASIL", ayant une porosité supérieure ou égale à 600 A, une première couche de dérivés de silane contenant des fonctions ammonium quaternaire telles que décrites dans l'exemple I. Dans les conditions de chromatographie décrites dans cet exemple 1, on fait adsorber à ce support des protéines d'activité immunologique ou enzymatique désirée et en particulier des protéines sériques, y compris les gamma-globulines. D'une façon générale il est ainsi possible d'immobiliser de manière réversible 10 à 100 mg de protéines quelconques par g de support. Dans un deuxième stade ou assure alors la fixation irréversible de la couche protéique par réticulation. La polymérisation ou réticulation des molécules sur le noyau solide, qui s'effectue après l'adsorption peut avantageusement être effectuée après que l'on ait déterminé le nombre de molécules à réticuler, ceci en déterminant par exemple le nombre de molécules qui restent à 11 état non adsorbé. Dans le cas notamment de macromolécules, le rapport molécules d'agents réticulants/molécules à réticuler, est de préférence compris entre 10 et 1000 et le plus souvent voisin de 100. Le pH optimum, lors de la réticulation, peut s'accorder avec le point iso-électrique de la molécule et être compris entre 4 et 8. Toutefois, dans la majorité des cas, un pH neutre est suffisant. La température de réticulation est choisie suffisamment basse pour ne pas provoquer de dénaturation des molécules à polymériser sur les particules de substrat. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, on réticule autour d'un noyau, de préférence sous forme de particules, des molécules et macro-molécules bio-chimiques, notamment des molécules protidiques telles que les aminoacides, les peptides, protéines, lipoprotéines, glyco-protéines, métalloprotéines, ou hétéroprotéines. Parmi les substances protidiques, on peut citer notamment les protéines sériques de toutes espèces animales et notamment les albumines, les a1, a2, ss-, y - globulines, englobulines et pseudoglobulines, des molécules protidiques à activité biochimique ou immuno-chimique, tels que des antigènes, anticorps, complexes antigène-anticorps, agglutinogènes, agglutinines, enzymes, inhibiteurs, substrats d'enzymes, récepteurs, médiateurs, hormones, transporteurs ou cofacteurs. Le procédé selon l'invention s'applique également de façon avantageuse aux lipides et glucides, notamment ceux possédant des groupements -NH2 naturels ou artificiels ainsi qu'aux acides nucléiques et aux nucléotides, de même encore qu'aux substances ou particules d'origine virale, bactérienne ou cellulaire et aux organismes ccrrespondants. Dans le mode de mise en oeuvre préféré, l'agent pontant ou réticulant est de préférence un dialdéhyde et notamment le glu taraldéhyde, cet agent permettant non seulement d'assurer des liaisons entre les molécules de la population adsorbée, mais encore d'assurer des liaisons directement avec le noyau notamment lorsque les particules de substrat sont en silice et possèdent des fonctions .NH2, ces dernières pouvant être éventuellement greffées chimiquement en même temps que le groupement ammonium quaternaire sur le support de silice poreuse avant l'étape d'adsorption des protéines. En variante, il est cependant possible d'utiliser d'autres agents réticulants, et notamment des molécules bis-diazotées telles que par exemple la benzine bis-diazotée, qui peuvent coupler entre elles des molécules possédant des fcn-ciiS phénols, et en particulier des protéines contentant, de la tyrosine, qui peuvent ainsi être réticulées entre elles avec une silice ou tous polymères ou granulés contenant naturellement ou artificiellement des fonctions phénols. Comme autre agent de réticulation, il est également pos sible d'utiliser des molécules dihalogénées pour coupler entre elles des fonctions NH2 > -NH-, -OH, -COOH, comme par exemple le difluorodinitrobenzène ou le chlorure cyanurique ; des molécules à double fonction isocyanate ou isothiocyanate, pour coupler des fonctions -NH2 - pH 9 ; des carbodiimides pour coupler une fonction - COOH à une fonction -NPi en solution aqueuse et à température ambiante. Dans certains cas, il est possible d'effectuer la réticulation sans agent réticulant par simple copolymérisation des molécules devant réaliser le polymère réticulé. C'est notamment le cas de nombreux amino-acides et en particulier de la lysine, en effectuant l'adsorption d'un mélange de l'acide aminé et de l'anhydride carbamique correspondant. En variante, cette copolymérisation peut également être effectuée par addition de carbodiimide soluble dans 11 eau à la solution d'acide aminé. Dans tous les cas l'on conserve intact le maximum de groupements -NH2, -OH, -SH, -COOH, situé sur la chaîne latérale des acides aminés, permettant d'obtenir des produits hautement actifs. Dans le mode de mise en oeuvre préféré, la réticulation des molécules entre elles, et éventuellement avec la silice, s'effectue de préférence à une température comprise entre + 4 et + 370C. En utilisant le glutaraldéhyde comme agent réticulant, la réticulation des molécules, notamment des molécules protidiques entre elles et avec la silice,s'effectue en général en moins d'une heure à une température de préférence de l'ordre de 250C et à pH neutre. Les particules ainsi revêtues sont ensuite lavées par lavage intensif à l'aide d'un tampon Mac Ilvaine pH 4, l'excès d'agent réticulant est éliminé et la colonne est équilibrée par un tampon Tris 0,05 M de pH compris entre 7 et 8. L'utilisation de ce tampon possédant des fonctions amines permet de neutraliser le cas échéant toute trace de glutaraldéhyde qui n'aurait pas complètement réagi ou qui n'aurait pas été éliminée lors du lavage. Le biopolymère hautement poreux, ainsi formé est insoluble même dans des milieux contenant des détergents ou de molarité très élevée, ou de pH extrêmes à la température ambiante. Les biopolymères ainsi préparés peuvent provenir des molécules suivantes : Les molécules ou complexes qui ont été ainsi réticulés sur la surface intérieure des grains sont : la lysine, des histones extraits de thymus de mammifères et notamment de singes, de l'albumine humaine, de l'albumine bovine, des a-globulines humaines du commerce, des a-globulines animales, des mélanges de protéines provenant de sérum de sang humain, de sang de cheval, de sang de lapin, de sang de cobaye, la glucose oxydase, l'uréase, la trypsine, l'insuline, la gonado trophine chorionique humaine,l'Antigène Australie, le virus de la rage, le virus grippal, le virus de la poliomyélite, des membranes de cellules en provenance d'hématies, de leucocytes, de lymphocytes, de cellules fibroblastiques, lesdites membranes ayant été éclatées par choc osmotique ou action de détergent et ayant}técoltées par centrifigation. L'ensemble de ces biopolymères montre bien la généralité du procédé de la préparation de particules pour la mise en oeuvre de l'invention. L'invention a également pour objet les procédés de séparation de purification ou de chromatographie en colonne ou en bain effectués à l'aide des produits selon l'invention, gracie aux propriétés d'affinité chimique, bio-himique ou immuno-chimique des molécules qui sont très peu dénaturées lors de la polymérisation ou réticulation et qui,de plus, présentent une stabilité accrue de la fonction de la molécule par rapport au milieu de l'environnement extérieur. Le tableau ci-après résume les différents procédés qu'il est possible de mettre en oeuvre avec ces particules. : Nature des molécules : Nature des molécules qu'il est réticulées alors possible de concentrer et purifier ou d'éliminer Enzyme Substrat correspondant ou inhibi teur correspondant : Substrat d'enzyme : Enzyme correspondante : Inhibiteur d'enzyme : Enzyme correspondante + : : MacromOlécule chargée"in vivo" du : Métabolite ou médiateur : transporttou de la réception de ce : : médiateur ou métabolite Antigène . Anticorps correspondant limphocyte sensible à cet antigène Agglutinogène ; Agglutinine correspondante : Anticorps : Antigène correspondant Agglutinine : Agglutinogène correspondant Ainsi pour éliminer une substance par exemple un anticorps, à partir d'un milieu extrêmement complexe, il suffit d'incuber dans le milieu les particules contenant sous forme polymérisée ou réticulée, l'antigène correspondant à cet anticorps. I1 s'effectue alors une liaison antigène-anticorps qui relie les anticorps aux antigènes, et par là > aux particules de substrat. I1 suffit alors d'effectuer une simple centrifugation ou filtration pour recueillir le milieu débarrassé de la substance considérée. Cette substance peut être récupérée de façon pratiquement totalement pure, en effectuant ensuite un lavage avec un tampon approprié, qui provoque la rupture de la liaison, par exemple la liaison antigène-anticorps, et permet de récupérer la seule substance qui s'était fixée sur les particules. Les particules libérées des anticorps peuvent ensuite être réutilisées pour une nouvelle purification ou séparation. En général pour des procédés de chromatographie en colonne il suffit que les particules selon l'invention comportent de 0,01 à 0,1 g de biopolymère par gramme de noyau pour permettre un débit très élevé. REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation de macromolécules, telles que notamment les protéines, les hétéro-protéines et les acides nucléiques, à partir d'un milieu contenant lesdites macromolécules, caractérisé par le fait que l'on fait passer ledit milieu sur des supports particulaires poreux de silice ou d'alumine dont la surface présente des propriétés d'affinité avec lesdites macromolécules, les autres constituants du milieu étant pratiquement indifférents auxdites propriétés d'affinité. 2. Procédé de séparation de macromolécules, telles que notamment les protéines, les hétéro-protéines et les acides nucléiques à partir d'un milieu contenant lesdites macromolécules, caractérisé par le fait que l'on fait passer ledit milieu sur des supports particulaires poreux de silice Qu d'alumine dont la surface présente des propriétés d'affinité avec les constituants dudit milieu, à l'exception des macromolécules à séparer. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on utilise des supports poreux ayant une porosité permettant le tamisage moléculaire de la protéine à séparer, ledit tamisage complétant l'effet desdites propriétés d'affinité. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'affinité est une affinité d'adsorption, d'échange ionique, une affinité enzymatique ou une affinité immunologique. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on utilise une valeur de porosité telle que la macromolécule sépare est empêchée d'entrer dans les pores du support. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on utilise une valeur de porosité telle que la macromolécule à séparer pénètre dans les pores du support. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on fixe sur le support des groupements présentant une ou plusieurs fonctions pour l'échange ions. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'on fixe lesdits groupements sur des supports de silice par l'intermédiaire de fonctions silanes. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on fixe sur le support un groupement contenant une fonction ammonium quaternaire, 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que R' et R" sont identiques à CH2-CH3 ou CH2-CH2-OH et que R"' est identique à -H ou -CH2- CH2 -OH ou -CH2-CH3 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8, 9 et 10, caractérisé par le fait que pour la fixation sur support de silice le radical R, est un radical dans lequel A, A', A" identiques ou différents sont soit des atomes d'halogène soit des fonctions éthoxy CH3 -CH2 -O- 12.Procédé selon l'ensemble des revendications 1, 6 et 8, caractérisé par le fait que l'on fixe sur le support un groupement lipophile composé d'une chalne carbonée d'acide gras ou d'un dérivé halogéné. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4 à 8, caractérisé par le fait que l'on fixe sur le support poreux un groupement possédant une propriété d'échange cationique et notamment un groupement SO 3H ou COO-. 14. Application du procédé selon la revendication 5 en combinaison avec l'une quelconque des revendications 8,9,10 et 11 pour la séparation, concentration, ou purification de gammaglobulines, caractérisée par le fait que llon fait passer le milieu contenant les gamma-globulines sur le support présentant o une porosité comprise entre 200 et 600 A dans un tampon présentant un pH compris entre 5 et 7,5 t de préférence égal à 6. 15. Application selon la revendication 14, caractérisée par le fait que lton régénère le support par passage d'un tampon de pH 4 puis par passage d'une solution normale d'acide chlorhydrique. 16. Application du procédé selon la revendication 12, à la séparation de lipoprotéines lipophiles, caractérisée par le fait que l'on fait passer le milieu contenant les protéines lipophiles sur le support à pH sensiblement égal à 8. 17. Application selon la revendication 16, pou la séparation de l'Antigène Australe, caractérisée par le fait que l'on utilise des supports poreux présentant une porosité o moyenne supérieure cu égale à GO A. 18. Application du procédé selon la revendication 13, à la séparation de 11 albumine et de l'hémoglobine, caractérisée par le fait que l'on utilise des supports poreux de porosité mo o yenne égale à 300 A et que l'on fait passer le milieu sur les supports à pH sensiblement égal à 5. 19. Application du procédé selon la revendication 5 en combinaison avec l'une quelconque des revendications 8, 9, 10, 11 à la concentration des protéines à partir dune solution de protéines diluée, caractérisée pr le fait que l'on utilise un support poreux présentant fin porosité moyenne égale ou supérieure à 600 et que l'on fait passer le milieu à un pH compris entre 5 et 7,5 et de préférence voisin de 6, à la suite de quoi on effectue une élution avec un pH modifié. 20. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 à la puriiication de virus dispersés au sein d'une solution protéique caractérisée par le fait que l'on utilise des supports présentant une porosité excluant la fiction des particules virales. 21. Application selon la revendication 20 pour la séparation du virus GRIPPE d'avec les protéines du liquide allantornque de l'oeuf, caractérisée par le fait que l'on utilise un support présentant une porosité comprise entre 200 et 600 , enrobé de fonctions ammonium quaternaire. 22. Procédé ou application selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé par le fait que l'on utilise comme support particulaire, des particules de silice telles que celles vendues sous la marque "SPHEROSIL" ou "PORASIL". 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le :?a5.-.t que l'on adsorbe sur des particules poreuses, une population de protéines ayant une activité immunologique ou enzymatique et que l'on assure ensuite une réticulation desdites molécules entre elles ou sur le support particultire, à la suite de quoi on met en contact les particules ainsi revêtues avec le milieu contenant les macromolécules à séparer. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que lton utilise un groupement silane pour la fixation desdites protéines sur le support. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 et 24, caractérisé par le fait que l'on utilise comme agent réticulant un dialdéhyde, notamment le glutaradéhyde. 26. Préparation de macromolécules telles que des pro téines obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25.