Brevet FR2168353A1 — publié le 19730831

La présente invention concerne un nouveau procédé pour la N-acylation des acides 7-aminocéphème-4-carboxyliques substitués en position 3 ,les produits obtenus étant des agents antibactériens intéressants. Ce procédé présente l'avantage d'être particulièrement judicieux en ce qui concerne sa mise en oeuvre dans la pratique et des produits de pureté satisfaisante sont obtenus directement L'invention concerne en conséquence un procédé pour la N-acylation des acides 7-aminocéphème-4-carboxyliques substitués en position 3 ,ce procédé consistant à mettre en contact une solution contenant un acide 7-aminocéphème-4-carboxylique substitué en position 3 avec un polymère d'acylation solide sensiblement insoluble dans cette solution et présentant des unités récurrentes -RCOB- , dans lesquelles RCO est un radical acyle organique et B est un radical activé dans le polymère puis à récupérer le produit d'acylation à partir de la solution résultante L'expression acides 7-aminocéphème-4-carboxyliques substitués en position 3 , utilisée ici , désigne un composé de formule dans laquelle le substituant en position 3 est CH2A et A est un atome d'hydrogène ,un groupe alcanoyloxy inférieur ,benzoyloxy, azido , pyridinium ou un groupe dérivé d'un nucléophile puissant (en particulier d'un thiol ou d'un xanthate ),ou lorsqu'il est pris en combinaison avec M, une liaison carbone-oxygne monovalente ;M est un atome d'hydrogène ,un cation pharmaceutiquement acceptable non toxique ,une charge anionique lorsque A est du pyridinium,ou lorsqu'il est pris en conbinaison avec A, une liaison carbone-oxygène monovalente,ou des dérivés fonctionnels de ceux-ci . Le cycle peut également contenir d'autres substituants , et on comprendra qu'il peut s'agir d'une liaison #ȃu lieu de la liaison # . Ces composés sont bien connus dans cette technique et peuvent litre préparés d'une manière également connue Des polymères d'acylation solides convenables sont décrits dans le brevet français n0 69-08017 et certains autres polymères d'acylation sont décrits dans les exemples suivants. D'une façon caractéristique , ils ont pour formule : dans laquelle RCO et B ont la même signification que ci-dessus et A est une partie récurrente du squelette d'un polymère synthétique ou d'un polymère naturel , et n est un nombre entier. Le polymère d'acylation peut être obtenu en traitant un polymère non acylé correspondant avec un agent d'acylation de fa çon à introduire le groupe RCO . Après la N-acylation,la céphalosporine résultante peut être aisément récupérée sous une forme pure en la séparant du polymère insoluble ,puis en soumettant la solution à une évaporation,extraction ou lyophilisation , ou à tout autre processus convenable . Ce procédé convient à une mise en oeuvre par charges successives ou continue , et dans ce dernier cas la séparation de la solution contenant la céphalosporine se produit rapidement si le polymère d'acylation est utilisé sous la forme d'une colonne .Pour la réaction de N-acylation,on peut utiliser à la fois systèmes solvants aqueux et non aqueux Les exemples suivants,donnés à titre non limitatif permettront de mieux comprendre l'invention EXEMPLE 1 4-Hydroxybenzyl-Polystyrène On chauffe au reflux 100 g de chlorométhyl-polystyrène réticulé avec 2% de divinyl-benzène (tamis N 200-400 ,mailles de 0,076 à 0,037 mm ) sous forme de perles présentant une teneur en chlore de 10,9 % , dans 1 litre d'une solution à 50ch de phénol dans le 1,2-dichloréthane.Après avoir atteint la température de reflux ,on ajoute 0,25 g de chlorure de zinc anhydre le mélange réactionnel vire au brun-rouge , avec gaiement d'acide chlorhydrique gazeux .On poursuit le chauffage au reflux jusqu'à ce que le dégagement d'acide chlorhydrique cesse (24 36 heures ) ,puis on sépare le polymère par filtration ,on lave avec 3 litres d'HCl 1N dans du dioxanne aqueux ,avec 3 litres de dioxanne et 1 litre de méthanol . Après avoir séché sous vide à lOOe C , on obtient 124,3 g du produit désiré EXEMPLE 2 4-Hyd roxy- 3-nitrobenzyl-Polystyrène On met en suspension 50 g du polymère obtenu dans l'exemple 1 dans 500 ml d'acide nitrique à 64% , à la température ambiante, et on maintient à cette température pendant 5 heures.On sépare par filtration le polymère rouge-brun,on le lave avec de l'eau ,puis avec des solvants organiques,jusqu'à ce qu'aucune particule colorée n'apparaisse dans les produits de lavage , et finalement on lave le polymère avec du méthanol, puis on sèche comme dans l'exemple 1 . On obtient ainsi 58 g du produit désiré ; teneur en azote : 2,16% EXEMPLE 3 Bêta-/ 4-Hydroxy-3-nitrophényl 7-éthylaminométhyl-Polystyrène On met en suspension 5 g de chlorométhyl-polystyrène dans 50 ml d'une solution de diméthylformamide contenant 5 g (27 m.mole ) de 4-hydroxy-3-nitrophényléthylamine et 2,1 ml (30 m.mole ) de triéthylamine , et on maintient à 100" C pendant 24 heures On sépare le polymère par filtration,puis on le lave successivement avec 500 ml d'HCl 1N dans une solution aqueuse de dioxanne à 10% et avec NaOH 1N dans du dioxanne aqueux à 10%. On le lave ensuite avec des solvants organiques et du méthanol, et on sèche comme dans l'exemple 1 . On obtient 7,1 g du produit désiré. Les teneurs en azote et en chlore indiquent qu'une substitution sensiblement quantitative du chlore du polymère a eu lieu On provoque l'acylation du polymre ainsi obtenu en le mettant en suspension dans de l'anhydride acétique contenant une faible quantité de pyridine. On lave soigneusement le polymère ,puis on le sèche ; son analyse donne la teneur attendue en groupes N-acétyle et O-acétyle EXEMPLE 4 4-Hydroxy-3-nitrobenzyl-Polystyrène. On met en suspension 20 g de polystyrène réticulé avec 2% de divinyl-benzène (tamis NO 200-400 ),dans 100 ml de chlorobenzène contenant 10 g ( 52 m.mole) de 4-chlorométhyl-2nitrophénol à 70" C ,puis on ajoute 5 g (30 m.mole )d'AlCl3 anhydre. Le mélange réactionnel vire au rouge-orange et il se produit un dégagement d'acide chlorhydrique gazeux. Après. 24 heures, on sépare le polymère par filtration ,on le lave avec 1 litre de chloroforme-, 2 litres d'HCl 1N dans du dioxanne aqueux à 20% , et avec NaOH 1N dans du dioxanne aqueux, jusqu'à ce qutaucune couleur du nitrophénolate ne soit décelée dans les lavages.On lave le polymère avec de l'acide chlorhydrique 1N dans du dioxanne aqueux et la couleur vire de nouveau au jaune. Après avoir lavé avec du méthanoi,puis séché,on obtient alors 25,6 g du produit désiré .11 contient 1296% d'azote EXEMPLE 5 4-Mercaptobenzyl-Polystyrène On chauffe au reflux 5 g de chlorométhyl-polystyrène dans 50 ml de 1,2-dichloréthane contenant 10 g de bisulfure de diphényle . Lorsque la température de reflux est atteinte,on ajoute 1 g de chlorure de zinc ; le mélange réactionnel vire au rouge-brun et il se produit un dégagement d'acide chlorhydrique gazeux .On poursuit le chauffage au reflux jusqu'à ce que le dégagement d'acide chlorhydrique cesse,on filtre le polymère,on le lave ,puis on le sèche , ce qui donne 5,8 g du produit désiré; la teneur en soufre est de 5,8%. On met en suspension îg du polymère ainsi obtenu dans 10 ml de tétrahydrofuranne et on ajoute 0,36 g de NaBH4 . On laisse le mélange réactionnel sous agitation pendant toute la nuit à la température ambiante,on sépare le polymère par filtration ,on le lave avec un acide minéral dans du dioxanne aqueux, puis avec des solvants organiques , jusqu'à ce qu'aucune odeur de thiophénol ne soit détectée dans le polymère . On constate que la teneur en groupes SH libres sur la résine est de 0,8 m. mole par gramme , teneur qui est déterminée en ajoutant un excès connu d'iode et en titrant le reste d'iode par du thiosulfate EXEMPLE 6 Préparation du polymère de la N-hydroxy-succinimide Stade A : Préparation du 1,11,2-tri-carbéthoxyéthane-polysty rène. On agite 25 g de sodium pur en morceaux dans 2,5 1 de tétrahydrofuranne anhydre contenant 5 ml d'éthanol absolument anhydre . On ajoute lentement 270 ml de 1,1',2-tricarbétho- xy-éthane . On maintient le mélange réactionnel à l'état anhydre au moyen de tubes de chlorure de calcium. Après dissolution du sodium,on ajoute 250 g de chlorométhyl-polystyrène ayant une teneur en chlore de 10,93% ,puis on chauffe le mélange réactionnel au reflux pendant 48 heures .On sépare le polymère par filtration ,on le lave avec 10 litres d'HCl 1N dans du dioxanne, 10 litres d'un mélange dioxanne-eau 1 : 1 , puis avec 5 litres de dioxanne .On lave un échantillon de 1 g avec de l'éthanol et de l'éther ,puis on sèche sous vide à 1000C . Le produit présente une teneur en chlore de 0,6% et une teneur en groupes éthoxy de 20,8% Stade B : Préparation du polymère d'acide succinique On saponifie le polymère obtenu au cours du stade précédent par chauffage au reflux pendant une semaine dans 4 litres de KOH lON dans du dioxanne aqueux . On sépare le polymère résultant par filtration ,on le lave avec de l'eau,puis on chauffe au reflux pendant toute la nuit dans 4 litres d'acide chlorhydrique concentré,on filtre , et on lave avec de l'eau, du dioxanne et du méthanol. Après avoir séché sous vide à îOO0C, on obtient un polymère ayant une teneur en groupes éthoxy de 1,7% Stade C : Préparation du polymère de N-hydroxy-succinimide. On chauffe au reflux 50 g du polymère obtenu au stade précédent pendant une nuit dans 250 ml d'anhydride acetique.On lave le produit avec 21 de dioxanne anhydre,puis avec I 1 d'éther , et on sèche sous vide à 100 C. On laisse gonfler le polymère dans 200 ml de tétrahydrofuranne puis on ajoute une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine neutre dans de l'eau (3m. mole par gramme de polymère ).On effectue la neutralisation en dissolvant le chlorhydrate dthyuroxyl=mine dans une quantité minimum d'eau froide et en ajoutant la quantité équivalente d'une solution de soude concentrée. Après avoir agité le mélange réactionnel pendant 48 heures à la température ambiante lave le produit avec du HCl 1N dans du dioxanne,avec du dioxanne : méthanol (3 : 1 ) et avec de l'éther,pais on sèche sous vide toute la nuit à 100 C.On obtient une teneur en azote de 2,11% EXEMPLE 7 Préparation du Bêta-/ 4-hydroxy-3-nitrophényl 7-éthyl-polyacry- lamide On fait réagir 2 g d'azoture de polyacrylamide avec du 4-amino-éthyl-2-nitrophénol dans les mêmes conditions que celles décrites pour l'aminoéthyl-nitrophénol . La charge du polymère est presque quantitative , ce qui est déterminé par hydrolyse acide totale de l'échantillon séché et par détermination spectroscopique de l'aminoéthyl-nitrophénol . Les dérivés du polystyrène décrits ci-dessus conservent leur forme de perles et présentent de bonnes propriétés de gonflement dans un grand nombre de solvantstels que le diméthylformamide, le tétrahydrofuranne , le chloroforme ,etc.. Le gonflement des dérivés de polyacrylamide dans l'eau est un peu plus faible que celui du polyacrylamide; leur gonflement dans les solvants organiques est meilleur EXEMPLE 8 Fixation des groupes acyle sur les polymères Stade A : Polymère de nitrobenzoyl-nitrophénol On met en suspension 2 g du polymère obtenu dans l'e- xemple 2 dans 15 ml de chloroforme contenant 0,92 g de chlorure de p-nitro-benzoyle et 1 ml de pyridine , et on laisse reposer pendant 18 heures . On sépare le polymère par filtration,puis on le lave avec 50 ml de chloroforme et 200 ml de dioxanne aqueux . Après avoir lavé avec du méthanol et de l'éther ,on le sèche sous vide à 1000 C , ce qui donne 2,45 g du produit dési ré. On chauffe au reflux un échantillon de quelques mg du polymère pendant une nuit dans du chloroforme contenant un excès de benzylamine . On titre la benzylamine non-acylee avec HC104 dans du dioxanne . Le polymère contient 1,15 m.mole/g. de groupes p-nitrobenzoyle. Stade B : Polymère de thiénylacétyl-nitrophénol On met en suspension 5 g du polymère obtenu dans l'exemple 4 dans 30 ml de diméthylformamide avec 1,42 g ( 10 m. mole )d'acide 2-thiénylacétique . On refroidit le mélange réactionnel à 0 C , puis on ajoute 2 g ( 10 m.mole ) de dicyclohexylcarbodiimide dans 15 ml de diméthylformamide . On agite le mélange réactionnel pendant 1 heure à 0 C , puis à la température ambiante pendant encore 4 heures. On sépare le polymère par filtration ,on le lave avec 3 portions de 50 ml chacune de diméthylformamide , puis avec 6 portions de 60 ml chacune d'un mélange 1 : 1 ( v/v) de chloroforme et de méthanol , et finalement avec 100 ml d'éther anhydre,puis on fait sécher sous vide à 60C C La couleur jaune due au groupe nitrophényle disparait .On obtient une récolte de 5,8 g,contenant 4,05% de soufre Stade C : Fixation de la benzyloxycarbonyl-phénylalanine sur le polymère de l'exemple 6 On met en suspension 5 g du polymère obtenu dans l'exemple 6 dans 40 ml de chlorure de méthylène contenant 3 g (10 m. mole ) de benzyloxy-carbonyl-phénylalanine On refroidit le mélange réactionnel à OOC ,puis on ajoute 2 g ( 10 m.mole ) de dicyclohexylcarbodiimide dans lo ml de chlorure de méthylène . On agite le mélange réactionnel à 0 C pendant 1 heure ,puis à la température ambiante pendant encore 3 heures . On sépare le polymère par filtration,puis on le lave avec 3 portions de 150 ml chacune de chlorure de méthylène , avec 6 portions de 50 ml chacune de chloroforme/Méthanol (1 : 1 , v/v ) , avec 150 ml d'éther anhydre,puis on sèche sous vide à 60 C . On obtient une récolte de 6,6 g contenant 0,95 m. mole de benzyloxycarbonyl-phénylalanine par gramme de produit On hydrolyse un échantillon de quelques mg de l'aster actif polymère par traitement avec de l'acide chlorhydrique 6N dans de l'acide acétique glacial,pendant 24 heures à 11C" Cq On détermine la teneur en phénylalanine par analyse des aminoacides ;le produit contient 1,05 m.mole/g. Stade D : Fixation de la 2,4-dinitrophénylalanine sur le polymère de l'exemple 6 On met en suspension 10 g du polymère obtenu dans l'exemple 6 dans 40 nil de diméthylformamide contenant 5,1 g (20 m.mole) de 2,4-dinitrophénylalanine . On refroidit le mélange réactionnel à O" C, puis on ajoute 4g de dicyclohexylcarbodiimide dans 10 ml de diméthylformamide . On agite le mélange réactionnel à 0 C pendant 2 heures . On détermine spectroscopiquement dans des parties aliquotes la disparition de la 2,4-dinitrophénylalanine . Après 45 minutes,la réaction est complète et tous les groupes fonctionnels sont chargés.On sépare le polymère par filtration ,on le lave ,puis on le sèche comme dans l'exemple précédent .- On obtient une récolte de 12,5 g Stade E : Fixation de la 2,4-dinitrophénylalanine sur le polymère de l'exemple 7 On laisse gonfler 2 g du polymère obtenu dans l'exem ple 7 dans 50 ml de formamide et on ajoute 2-g de dicyclohexylcarbodiimide et do 2,4-dinitrophénylalanine comme décrit dans l'exemple précédent . On agite le mélange réactionnel pendant une nuit ,on sépare le polymère par filtration,on le lave avec 300 ml de formamide par petites fractions,et avec 300 ml de chloroforme-méthanol (1 : 1 ) ,puis on sèche sous vide .On détermine spectroscopiquement la quantité de groupes acyle (dinitrophényl-alanine) après hydrolyse alcaline totale ; on constate que cette quantité représente 95% du produit attendu On répète l'expérience ci-dessus avec différents polymères , en utilisant la méthode àu dicyclohexylcarbodiimide, la méthode à l'halogenure d'acyle ou la méthode à l'anhydride mixte . il n'existe aucune dépendance relativement aux solvants aussi longtemps que les polymères gonflent dans le solvant Les résultats sont indiqués dans le tableau I (Voir tableau I page suivante EXEMPLE 9 Préparation de la céphalothine On met en suspension 4 g du polymère préparé suivant l'exemple 8 , stade B,chargé avec 1 m. mole/g d'acide thiényl TABLEAU I Polymère utilisé Groupe acyle Solvant Degré de suivant l'expé- charge rience n 2 CH3CO Anhydride acéti- 2,2 que 2 Z-gly DMF 0,7 2 Z Phe CH3CN 0,6 4,6 Z Phe THF-DMF-CH2C12 quantitatif 4,6 Acide thiényl acétique THF-DMF-CH2Cl2 I - 1,2 4 Acide phényl acétique DMF quantitatif 4 phenoxy DMF quantitatif 4,6 Acide Dce- DMF-CHCl aminophényl- THF-CH2Cl2 Cl acétique 2 2 quantitatif 4,6 Acide BOC D THF-CH2Cl2 quantitatif OC -amino phénylacéti que 4 BOC L Ala CHCl3 quantitatif 4 Di Z Lys. CHCl3 0,5- - 0,8 6 Z gly3OH DMF 0,95 6 Z Ala3OH DMF 0,66 acétique ,pendant quelques heures dans 20 ml d'une solution de chlorure de méthylène anhydre contenant 2 m.mole de sel de triéthylammonium du 7-ACA (acide 7-amino-céphalosporanique ) , que l'on prépare à partir de 544 mg de 7-ACA ( 2m.mole ) et de 0,56 ml de triéthylamine ( 4 m. mole )à la température ambiante. Lorsque seules quelques traces de 7-ACA restent en solution (indiqué par CCM sur de la cellulose dans une solution dans le propanol aqueux à 70% ) ,on sépare alors le polymère par filtration et on le lave avec 3 portions de 50 ml chacune de chlorure de i.tAthylène , On fait évaporer les filtrats combinés et on dissout le résidu dans 20 ml d'eau distillée On acidifie la solution à pH 2 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 0,2 N , puis on extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle . On sèche la solution sur du sulfate de sodium,puis on fait évaporer à la température ambiante .On fait sécher le solide restant pendant une nuit sur de l'anhydride phosphorique sous vide .On obtient 720 mg d'un produit (rendement de 87% ) dont on constate qu'il donne une tache lors d'une CCM (cellulose, propanol aqueux à 70% ) et dont on constate chromatographiquement , spectroscopiquement et biologiquement qu'il est identique à un produit obtenu par des méthodes classiques Analyse Calculé N = 6,9% S = 15,7% Trouvé :N = 6,7% -S = 15,7%- Dans le tableau II ci-après ,on a résumé la préparation des céphalosporines et des pénicillines par la méthode cidessus TABLEAU II Acylation de 1'acide 7-amino-céphalosporanique (7-ACA) et de l'acide 6-aminopénicillanique (6-APA)à l-laide de réactifs polvm"-res e Polymère utilisé Groupe acyle Amine Rendement suivant l'expé- en rience N produit 4 Acide Thiénylacétique 7-ACA 87% 6 Acide Thiénylacétique 7-ACA 6 Acide D-oc-amino- phényl-acétique 6-APA 4 Acide D phényl-acétique 6-APA 65% 4 Acide De-aminophé- nylacétique 7-ACA 50% 4 Acide Phénylacétique 7-ACA 84% 4 Acide Phénoxyacétique 7-ACA 75% 4 Acide Phényl-acétique 6-APA 99X EXEMPLE 10 On charge le polymère décrit dans l'exemple 4 avec de l'acide thiénylacétique comme décrit dans l'exemple 8, Stade B, et on l'utilise pour acyler divers acides 7-aminocé-3-ème-4- carboxyliques substitués en position 3 de la façon suivante : : Substituant en position 3 Rendement en dérivé 14-acyle CH3 77 CH2C H 61 CH2N3 79 CH2SMe 71 CH20Me 58 CH2S 4 | e 63 On isole les produits d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 9 Des modifications peuvent etre apportées aux modes de mise en oeuvre décrits , dans le domaine des équivalences techniques , sans s'écarter de l'invention REVENDICATIONS 1.- Procédé pour la N-acylation des acides 7-aminocéphème-4-carboxyliques substitués en position 3, caractérisé en ce qu'on met en contact une solution contenant un acide 7 aminocéphème-4-carboxylique substitué en position 3 avec un polymère d'acylation solide sensiblement insoluble dans cette solution et ayant des unités récurrentes -RCOB- , dans lesquelles RCO est un radical acyle organique et B est un radical activé dans le polymère ,puis on récupère le produit d'acylation à partir de la solution résultante 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide 7-aminocéphème-4-carboxylique substitué en position 3 préparé est la céphalothine .