Brevet FR2172041A1 — publié le 19730928

L'invention est relative à un procédé destiné à apprécier la présence de microorganismes vivants dans un liquide alimentaire. Xe procédé s'applique plus particulièrement, mais non exclusivement, au contrôle de la stérilité des bières et à la détection des levures sauvages. On sait que les exigences de ce type de contrôle sont ioe très haute sensibilité, l'idéal étant de détecter toute cellule vivante présente, et une grande rapidité, le temps alloué n'excédant pas une dizaine d'heures ; or, ces deux exigences sont difficiles à concilier. La méthode qui les concilie le mieux est actuellement celle de Richards qui consiste en une recherche microscopique des cellules recueillies sur une membrane après coloration des cellules et transparisation de la membrane : selon l'auteur la détection n'est possible que si la membrane porte au moins cinq cents cellules vivantes et si la bière a été préincubée cinq heures pour permettre le bourgeonnement des cellules. Cette méthode présente donc plusieurs inconvénients : elle est peu sensible, elle nécessite une incubation assez longue et surtout la détection consiste en une recherche microscopique longue et fastidieuse le procédé selon l'invention vise à améliorer ces performances et à remédier à ces inconvénients. Ce procédé est caractérisé par le fait qu'il consiste à filtrer le liquide alimentaire sur une membrane, à recueillir les microorganismes sur ladite membrane, à placer les microorganismes au contact d'un milieu nutritif radioisotopique, à séparer les microorganismes du liquide nutritif et à me sur rer la radioactivité absorbée par les microorganismes après une incubation déterminée. Dans un premier stade du procédé, une quantité déterminée de liquide aliz mentaire est filtrée afin d'en isoler les microorganismes. De nombreux dispos sitifs de filtration peuvent convenir à cet effet. Lors de l'application du procédé dé à la bière, il s'est avéré préférable d'utiliser un système de filtration classique sous aspiration avec une membrane de porosité assez élevée de l'ordre de 0,45 ou 0, 8 microns. Ces membranes seront préférentiellement choisies à bord hydrophobe de quelques millimètres pour faciliter leur pré hension et leur mise en place lors de la suite des opérations ;les membranes t'Milliporet' à bord hydrophobe conviennent bien. On pourrait également, en appliquant le procédé à d'autres liquides aliment tares que la bière , utiliser une boSe filtre nécessitant moins de manipulations lors de l'incubation et du rinçage ultérieurs de la membrane. Mais on a observé qu'il était difficile d'utiliser cette bofte avec un liquide alimentaire contenant des acides aminés en quantité importante ou présentant un phénomè- ne de dégazage. Quel que soit le dispositif de filtration utilisé, il est primordial, comme on le verra par la suite, de minimiser l'importance de la radioactivité retenue sur la membrane en l'absence de cellules afin d'améliorer le seuil de détection du procédé. Naturellement, la radioactivité retenue par le filtre seul devra être constante dans des conditions opératoires déterminées. L'échantillon est filtré aseptiquement dans un dispositif de filtration stérai~ le. Pour plus de précaution, on insèrera un tampon absorbant sous la membrane filtrante pour éviter de la déchirer pendant le serrage de l'appareil. le filtre chargé de microorganismes est ensuite incubé sur un tampon placé dans une boite de préférence étanche. Les conditions d'incubation sont variables suivant les cellules recherchées. Une optimisation réalisée sur différentes saccharomyces conduit à préconiser des températures comprises entre 25 et 350 Celcius pendant une durée de plusieurs heures. Pour également améliorer le seuil de détection du procédé, on a cherché, lors du choix du produit marqué et de la mise au point du milieu de culture, à optimiser l'entrée de ce produit dans chaque cellule. le milieu de culture, connu sous le nom de YCB (Yeast Carbon Base Difco) a donné satisfaction, après les quelques modifications indiquées ci-dessous. GI pourrait naturellement utiliser d'autres milieux de culture à la disposition de l'Homme de l'Art actuellement. Plusieurs types de produits radioactifs marqués sont utilisables et incorpore rables au milieu nutritif. Parmi eux, on a expérimenté avec satisfaction les produits marqués au tritium tels que le 3H Glucose ou le 3H Lysine à condition d'utiliser la solution immédiatement après livraison. Les acides aminés, marqués au 14C ont donné de-meilleurs résultats car leurs solutions se conservent mieux lorsqu'on lesmaintient à basse tempéra; ture. Parmi les acides aminés testés, on peut citer la L-14C Lysine, la L-14C Arginine, l'acide L14C glutamique, la L-14C Méthionine, l'hydrolysat de protéines de chlorelles. L'un ou l'autre de ces produits peut être utilisé sui- vant la nature du microorganisme recherché. Le produit choisi doit engendrer un rapport radioactivité des cellules le plus élevé possible radioactivité du filtre seul La lysine donne les résultats les plus favorables lorsque l'on applique le procédé à la bière qui contient des levures en fin de garde. Les modifications suivantes du milieu Y. C. B. se sont avérées favorables à la détection - le tamponnement à pH 6 au lieu de pH 4,5 - l'addition aux acides aminés radioactifs d'acides aminés entraineurs à concentration faible, de façon à réaliser une activité spécifique bien déterminée - l'addition de sulfate d'ammonium à concentration faible Le taux de glucose du milieu, quant à lui, est sans effet sur la radioactivité retenue. Le mileu nutritif radioactif est stérilisé 1h à 100 degrés Celcius ou par filtration, puis congelé; il est décongelé juste avant l'emploi pour être disposé sur tout support approprié. On peut utiliser à titre exemple un tampon disposé au fond d'une enceinte type boite de Pétri par exemple : ce tampon est imbibé de façon aseptique avec le milieu jusqu a ce que sa surface transpire, puis la membrane est retirée aseptiquement du dispositif de filtration pour être appliquée à la surface du tampon absorbant contenant le liquide radioactif. Les dimensions du tampon peuvent être inférieures à celles de la membrane à bord hydrophobe et dans ce cas le fait que ces derniers débordent du tampon facilitera la manoeuvre. La membrane saisie par un bord au moyen de pinces sera déposée par son autre bord sur une partie de la périphérie du tampon. Elle sera ensuite lâchée délicatement en évitant que le tampon touche les pinces. Les enceintes ou les boites seront ensuite incubées en atmosphère saturée après avoir été fermées hermétiquement ou placées dans un dessicateur. L'incubation pour de la bière a été réalisée pendant neuf heures à 28 degrés Celcius, mais ce temps d'incubation ne représente pas une limite. Après incubation, il est nécessaire de séparer les microorganismes du liquide nutritif radioactif. A partir de cette phase du procédé, les manipulations n'ont plus à être menées aseptiquement. Cette séparation est réalisée par un ou plusieurs rinçages de la membrane séparée de son milieu nutritif et replacée sur un dispositif de filtration. La solution de rinçage est constituée essentiellement d'un détergent com mercial (D.D.N. 150 par exemple) qui favorise la décontamination du filtre tant par son caractère basique que par son pouvoir d'abaisser la tension su. perficielle, et d'un substrat entraineur à faible concentration. Ce substrat permet d'améliorer et de rendre plus reproductible la décontamination de la membrane et ne diminue pas la radioactivité retenue par les microorganis mes tant que sa concentration reste faible. n permet au contraire d'amélio- rer la reproductibilité des résultats. Le volume de rinçage au-delà d'un cerw tain seuil, qui permet de ramener la radioactivité à un taux convenable, n'a pas d'effet nuisible puisqu'il n'a aucune action d'extraction sensible sur les acides aminés marqués absorbés par les cellules. Après le rinçage, la membrane est sortie du dispositif de filtration pour autre placée dans un flacon de mesure de scintillation. La membrane est ensui te séchée parfaitement dans le flacon, par exemple à l'étuve à 100 Celcius pendant quinze minutes. Un liquide scintillant est ensuite introduit dans le flacon avant d'effectuer le comptage au scintillateur. On donnera après à titre d'exemple une illustration chiffrée du procédé selon l'invention: Afin de contrôler la pasteurisation d'une bière, on prélève un échantillon de 250 ml qui est filtré aseptiquement dans un système de filtration stérile. Le milieu nutritif radioisotopique a été préparé de la façon suivante pour une dose de 50 mi - dissoudre 1,18 g de Y.C.B. dans quelques millilitres d'eau distillée - ajouter 0, 5 ml d'une solution de sulfate d'ammonium à 132 mg/l - ajouter 1 ml de solution de chlorhydrate de L-l4C lysine à 10 microcurie/mL d'activité spécifique 146 microcuries/micromole, et compléter le volume à 50 ml. Le milieu a alors le pH 4, 5. Le milieu est stérilisé une heure à 100" Celcius puis refroidi et conservé au congélateur à s250 Celcius. Après décongélation, juste avant emploi, on imbibe un tampon de façon aseptique avec 1 à 2 ml du milieu. L'incubation est réalisée pendant 9 heures à 28 Celcius, les membranes étant tournées vers le bas. La solution de rinçage comprenait par litre 200 mg de D.L. lysine et 20 ml de D. D. N. 150. Le liquide scintillant était constitué d'une solution dans le toluène, qualité scintillation de préférence, par litre de P.P.O. 5g P.O.P.O.P. : 0,lg Le comptage au scintillateur permet de vérifier que la pasteurisation a été effective. Pour celà, on a déterminé au préalable la radioactivité de la membrane seule et son écartztype qui détermine le seuil de détection du procédé. Dans les conditions décrites ci-dessus la valeur moyenne de la radioactivité retenue par le filtre seul au cours d'un grand nombre d'essais effectués sur un type de bière est de 1 260 i.p.m., l'écartZtype de la mesure étant de 180 i.p.m.. Pour ne pas retenir à tort plus d'un échantillon sur cent, on ne considère comme porteurs de cellules que les filtres dont la radioactivité excède la moyenne 1260 i.p.m. de 3 V, c'estàdire 540 i.p.m., ce qui porte à 1 800 i.p.m. le niveau de radioactivité au delà duquel l'échantillon est consiZ déré comme contaminé. Le seuil de détection exprimé en nombre de cellules représente le rapport de 3 à la radioactivité retenue par une cellule : une cellule de Saccharomyces carlsbergensis (souche Kronenbourg) absorbant 3,6 i. p. m. en neuf heures et 55,2 i.p.m. en vingt quatre heures, le seuil de détection est dans nos con. ditions de travail de cent cinquante cellules par membrane, soit six cents cellules par litre en heuf heures et de dix cellules par membrane soit quarante cellules par litre en vingt quatre heures ; dans le cas de levures sauvages dont la présence dans la bière est particulièrement redoutée, Saccharomyces diastaticus et Saccharomyces pastorianus, le seuil de détection est environ dix fois plus faible ; erfin les bactéries de la bière absorbent également de façon appréciable la 14 C lysine. Cette expérience a été réalisée à pH 4, 5 mais il a été constaté ensuite que le tamponnement à pH 6 apporte une amélioration. La méthode fournit également une indication quantitative : l'importance de la différence entre la radioactivité totale et la radioactivité moyenne des fil. tres renseigne sur la gravité de la contamination. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'un exemple particulier, il s'applique également à d'autres produits alimentaires et couvre également l'utilisation de produits équivalents à ceux qui ont été décrits. Revendications I) Procédé destiné à apprécier rapidement et quantitativement la présence de microorganismes vivants dans un liquide alimentaire, notamment la bière, caractérisé par le fait qu'il consiste à filtrer le liquide alimentaire sur une membrane, à recueillir les microorganismes sur ladite membrane, à placer les microorganismes au contact d'un milieu nutritif radioisotopique, à sépa- rer-les microorganismes du liquide nutritif et à mesurer la radioactivité absorbée par les microorganismes après une incubation déterminée. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le constituant radioactif du milieu est choisi parmi les acides aminés marqués au 14C ou parmi des mélanges de tels acides aminés. 3) Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les acides aminés utilisés de préférence mais non exclusivement sont la L-14C lysine, la L-l4C arginine, l'acide L-14C glutamique, la L-14C méthionine, le mélange constipe tué par l'hydrolysat de protéines de chlorelles. 4) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la membrane à bord hydrophobe sur laquelle a été filtré le liquide alimentaire est placée sur un tampon absorbant imbibé de liquide nutritif radioactif et incubée la face libre orientée vers le bas. 5) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séparation des cellules du liquide nutritif s'effectue par filtration au travers de la membrane ne chargée de cellules d'une solution contenant un détergent et un acide aminé entraîneur de la même espèce que l'acide aminé marqué du milieu nutritif. 6) Procédé selon la revendication 3 directement appliqué à la bière caraco térisé en ce que le milieu qui sert de base est additionné de chlorhydrate de L14C lysine, de sulfate d'ammonium et tamponné à pH 6 et que l'incubation a lieu entre 250 et 35 Celcius pendant une période de neuf heures.