Brevet FR2166060A1 — publié le 19730810

La présente invention est relative à une nouvelle substance, l'itabashilline, à son procédé de préparation et à ses applications notamment thérapeutiques. L'itabashilline est faiblement toxique et est utile à titre d'agent antifongique, en particulier contre Trichophytic pompholyciformis provoqué par Trichophyton. En outre, elle inhibe la croissance de certains microorganismes pathogènes, par exemple Bacillus subtilis et est donc utile pour soigner les infections des yeux. Il est bien connu que Penicillium oxalicun produit de l'assymétrine. Celle-ci contient de l'azote, tandis que l'itabashilline suivant l'invention n'en contient pas, de sorte que l'on peut les distinguer l'une de l'autre [cf Ronsuke Sumiki : "Antibiotics, Supplement I", page 258 (1970) publié par Publication Society of the Tokyo University]. I - Propriétés physico-chimiques de l'itabashilline Cristaux en forme d'aiguilles Jaunes. Point de fusion : 264,5 à 266ç5 C. Contient du carbone, de l'hydrogène et de ltoxygène, mais pas d'azote. Analyse élémentaire : C 60,45', H 4,796, 0 34,95'. Poids moléculaire : 638 Formule moléculaire : C32HS0014 Spectre de nasse (figure 1. Vide : 10-7 torr Courant d'ionisation : 250 pA Energie d'ionisation : 79 eA Tension d'accélération : 8,0 KV Sensibilité du multiplicateur d'électron : 1,5 KV Pouvoir rotatoire : (C est la concentration en grammes par 16,5 100 cm3) (&alpha;)D16,5 = + 100,4 (C = 1 dans le dioxane) (d)D = + 950 (C = 0,5 dans le dioxane) (&alpha;;)D20 = + 76 (C = 0,5 dans le chloroforme) td)D = + 194 (C = 0,5 dans la pyridine) Spectre d'absorption ultraviolette (figure 2) Les maximums d'absorption se trouvent à 238 mp, 265 m , 336 m dans l'éthanol acide (C2H5OH à 50% de HCl 0,1 N) (ligne pleine) et à 245 m et 357 m dans méthanol alcalin (C2H5OH à 50% de NaOH 0,1 N) (ligne tiretée). L'itabashilline est stable dans le solvant acide précité mais instable dans le solvant alcalin et le maximum d'absorption varie en fonction du temps (voir figure 3 dans laquelle la ligne tiretée montre la courbe d'absorption au temps zéro et la ligne en traits et en points montre la courbe d'absorption au bout de 20 heures).Ainsi, au bout de 20 heures, non seulement le maximum d'absorption se déplace de 245 mp à 265 mp, mais également l'absorption de l'itabashilline augmente et le maximum d'absorption à 357 m1 se déplace à 367 mu et l'absorption de l'itabashilline décroit. A la figure 4, la ligne en trait plein représente la variation de l'absorption à 336 mp dans l'éthanol acide en fonction du temps, tandis que la ligne tiretée représente la variation de l'absorption à 357 mp dans méthanol alcalin en fonction du temps, la densité optique initiale étant de 1,0 dans les deux-cas. Spectre d'absorption infra-rouge (figure 5) Bandes d'absorptions principales: 3560, 3500, 2970, 2880, 1740, 1727, 1610, 1590, 1560, 1430, 1328, 1230, 1055 et 817 cl 1. Spectre de résonance magnétique nucléaire protonique à 100 Mégahertz dans l'hexadeutéro diméthyl surf oxyde (DMS0 5) (figure 6) Absorptions principales : # = 1,06 (doublet), # = 2~3 (multiplet), # = 3,64 (singulet), # = 3,86 (doublet), d7= 6,68 (doublet), g = 7,52 (doublet), # = 11,64 (singulet) et # = 13,65 (singulet large). Le rapport d'intensité de ces absorptions est 3:3:3:1:1:1:1:1. L'absorption # = 2 ~ 3 n'est pas précise puisque l'ab- sorption du solvant y a été partiellement incluse. Solubilité dans divers solvants Facilement soluble dans le dioxane. Légèrement soluble dans l'acétone, l'éther, le chlo roforme et le n-butanol. Faiblement soluble dans le méthanol et dans l'étha- nol. Insoluble dans l'eau. Soluble dans les acides forts et les alcalis forts tels que l'acide sulfurique concentré et l'hydroxyde de sodium concentré en devenant légèrement brun. Stabilité Ne présente aucune diminution de l'activité anti microbienne à température ambiante dans des solvants acides et neutres et peut résister à un chauffage à 1200C pendant 1 heure en particulier dans un solvant neutre. Présente une réduction marquée de l'activité anti microbienne dans un solvant alcalin et cette perte d'activité antimicrobienne n'est pas restaurée même quand on ramène le pH du cbté acide. Ceci correspond à la diminution d'absorption à 357 mp représentée à la figure 4. Réaction colorée Réaction de décoloration du permanganate : positive. Réaction de Fehling : positive. Réaction de coloration au nitroprussiate : obscure. Réaction au chlorure ferrique en solution aqueuse: négative. Réaction au chlorure ferrique en solvant organi que : positive. Réaction de détection d'une amine primaire aromati que : négative. Réaction de coloration à la ninhydrine : négative. Réaction de Molish : négative. Réaction au sulfate de tryptophane : négative. Activité Soigne les infections fongiques, en particulier Trichophytic pompholyciformis provoqué par Tricho phyton. Arrête la formation et/ou la germination de spores et la croissance des hyphae des fongus ci dessus. Inhibe la croissance de Bacillus subtilis qui est impliqué dans l'infection de l'oeil, à la concentration de par exemple I pg/ml. On a mesuré l'activité antimicrobienne de l'itaba shilline par la méthode de dilution à la plaque de gélose, tandis que son activité est rapportée dans le tableau ci-dessous en termes de concentration minimale pour inhiber la croissance. (Lorsque la croissance n'a pas pu autre inhibée complètement mais seulement retardée, l'activité est donnée en termes de concentration donnant la vitesse de croissance minimale et signalée par un astérisque). Spectre antimicrobien de l'itabashilline Concentration minimale d'i nhibition de la croissance Microorganisme essayé ((/mû) Staphylococcus aureus, 209P 100 Bacillus subtilis, PCI 219 1 Escherichia coil, K-12 > 100 Erwinia carotovora, IFO 3057 > 100 Xanthomonas oryzae, IAM 1657 > 100 Vibrio metschnikovii, IAM 1039 > 100 Mycobacterium 607 > 100 Pseudomonas aeruginosa > 100 Pseudomonas solanacearm > 100(1*) Aspergillus oryzae L > 100 Aspergillus niger, ATCC 6275 > 100 Phizopus nigricans, EHRENBERG SN 32 > 100 Penicillium citrinum, ATCC 9849 > 100 Trichophyton mentagrophytes, IAM 5064 1 Glomerella lagenarium, IAM 8051 > 100 Alternaria kikuchiana, TANAKA, IAM 5005 > 100(1*) Fusarium oxysporum > 100(1*) Botrytis cinerea PERSOON, IAM 5130 > 100 Candida albicans, IFO 0583 > 100 Saccharomyces cerevisiae > 100 IFO : Institute for Fermentation, Osaka, Japon. IAM : Institute of Applied Microbiology, Université de Tokyo. Au vu des propriétés physiologiques et physicochimiques précitées, l'itabashilline obtenue suivant l'invention est un composé nouveau. L'itabashilline peut être utilisée sous la forme de sels ou d'esters pharmaceutiquement acceptables tels que les sels de sodium ou de métaux alcalins semblables notamment de chlorhydrates, de sulfates ou de sels d'ammonium quaternaire. II - Procédé de préparation On obtient l'itabashilline en cultivant dans un milieu Penicillium oxalicum var. itabashikum (déposé sous le N FERM-P 1282, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon ; NRRL 5672, Etats Unis) qui est isolé du sol de Itabashi, Tokyo. Comportement de l'itabashilline sur les milieux Gélose de Czapek Des fines colonies cotonneuses se forment au bout de 2 Jours de culture à 300C, elles deviennent vert sombre à mesure que le temps s'écoule. Veloutées en surface, planes et sans sillon ; virent au vert JaunStre ou au vert jaxlnOtre sombre, deviennent brun rougeatre avec le temps. Pas de produit de lixiviation, pas d'odeur. Marge de la colonie blanche et ayant de 1 à 2 a de large, devenant gris sombre en raison de la formation de conidia. Par de formation de sclerotia, pas de sécrétion de pigment dans le milieu. Les hyphae sont incolores et à paroi. Les penicilli sont le plus souvent biverticillés et asymétriques, parfois monoverticillés. Les conidia sont ovales et ont une dimension de 2 r x 3 p ; la dimension de la channe conidiale va de 150 à 230 P ; les sterigmata ont une dimension de 2 p x 10 P ; les metulae de 3 x 14 p ; petites branches de 4 x 22 p. La souche croit à un pH allant de 1 à Il et à une température allant de 10 à 400C. Les conditions de croissance optimale sont un pH de 7 et une température de 30 C. Les vitesses de croissance des colonies sur un milieu de gélose de Czapek à un pH de 7 sont de 20 mm le 5ème Jour et de 68 a le 10ème Jour à 250C ; de 36 mm le Sème Jour et de 72 a le 10ème Jour à 30 C ; de 25 mm le 5ème jour et de 56 a le 10ème Jour à 370C. Gélose de Czapek additionnée de liqueur de macération du mais Les colonies deviennent rapidement vert sombre ; les conidia sont plus abondantes que dans le cas du milieu de gélose de Czapek. Gélose au Jus de malt Les colonies croissent aussi rapidement que dans le milieu de gélose de Czapek mais le degré de croissance est quelque peu plus lent et-le ton de coloration des colonies devient quelque peu vert sombre grisâtre. Les autres comportements sont les mêmes que dans le milieu de gélose de Czapek. Gélose au nitrite Croissance extrêmement bonne. Lorsqu'on la classe suivant Raper et Thom : "Manual of the Penicillia", 1949, publié par Williams & Wilkins, la souche précitée est considérée comme une variante appartenant à Penicillium oxalicum Currie et Thom. La souche a été dénommée Penicillium oxalicum var. itabashikum, suivant le nom du district d'Itabashi-ku, du sol duquel la souche a été isolée et suivant le nom de la substance itabashilline qui est produite par la souche. Aux fins de l'invention, on peut utiliser un mutant spontané ou artificiel de la souche précitée, pourvu qu'il ait l'aptitude à fournir de l'itabashilline. Milieu A titre de milieu on peut utiliser tout liquide ou solide contenant des quantités convenables d'une source de carbone assimilable, et d'une source d'azote et de sels minéraux. Des exemples de la source de carbone sont les saccharides tels que le lactose, le glucose, le saccharose, l'amidon et la gly cérine. Des exemples de la source d'azote sont des constituants d'animaux et de végétaux, tels que la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, une liqueur de macération du maIs, de la farine de soJa dégraissée et leurs extraits par lixiviation, des sels d'ammonium d'acides organiques, tels que le succinate d'ammonium et le malonate d'ammonium, des sels d'ammonium d'acides minéraux, tels que le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium et le chlorure d'ammonium, et l'urée et les composés azotés organiques et minéraux semblables. Parmi les sels minéraux figurent des phosphates et des sels de magnésium, potassium, sodium, fer et métaux semblables.Il va sans dire qu'un milieu contenant d'autres constituants que ceux indiqués ci-dessus peut également être utilisé suivant l'invention, dans la mesure où ces constituants ne nuisent pas à la production et à l'accumulation de la substance désirée par croissance de la souche de culture. Culture Si lton utilise un milieu liquide, on effectue avantageusement la culture suivant le processus de culture par secouage ou par agitation sous aération. Les conditions de la culture telles que le pH du milieu, la température et la durée, peuvent outre choisies ou réglées correctement de sorte que les conditions conviennent pour la croissance de la souche et que le rendement de la substance désirée devienne le plus grand. Lorsqu'on effectue la culture suivant le processus par secouage ou par agitation sous aération, il est bon d'adopter un pH de 4 à 7, une température de 20 à 3O0C et une durée de 3 à 6 Jours. Séparation (récuPération) Lorsqu'on a effectué la culture dans un milieu liquide, l'itabashilline est contenue tant dans la portion de liqueur que dans la souche cultivée, mais surtout dans cette dernière. L'itabashilline ainsi produite est recueillie gracie à l'un ou plusieurs des processus suivants : l'un utilise la différence de solubilité, d'affinité d'absorption ou de résistance de liaison ionique entre l'itabashilline et les impuretés, un autre procède par précipitation de l'itabashilline dans une solution par relargage, un troisième utilise ltélectrophorèse ou la dialyse. Pratiquement, il est avantageux d'adopter un processus tel que la liqueur de culture soit filtrée pour obtenir des cellules et que la substance efficace précitée soit recueillie des cellules puis purifiée. On peut par exemple pratiquer comme suit : on extrait les cellules par un solvant organique tel que l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther, le chloroforme ou le butanol. On concentre l'extrait sous pression réduite pour enlever le solvant organique. On purifie le résidu des impuretés en lavant au méthanol froid, à ltéther de pétrole ou à lthexane ou par chromatographie de colonne en utilisant un gel de silice ou une matière Sephadex LH-20. Ensuite, on recueille l'itabashilline désirée sous forme de cristaux dans le dioxane, méthanol, le butanol, le chloroforme ou l'acétone aqueux. Les exemples suivants, dans lesquels les pourcentages sont en poids/volume, illustrent l'invention. Exemple 1 On inocule 500 ml d'une suspension de graines de Penicillium oxalicum var. itabashikumNRRL 5672 dans 10 litres d'un milieu (pH 5,0) comprenant 3% de lactose, 1% de glucose, 0,35' de liqueur de macération du maIs, 0,25' de sulfate d'ammonium, 0,1% de phosphate primaire de potassium, 0,055' de chlorure de sodium, 0,055' de sulfate de magnésium, 0,0196 de sulfate ferreux et 0,55' de carbonate de calcium.On met le milieu dans un fermenteur qui est un récipient de 20 litres et on cultive la souche pendant 120 heures à une température de 280 +14C, à une vitesse d'agitation de 450 tours par minute et sous une pression interne de 0,2 à 0,3 kg/cm2, l'introduction de l'air étant de 10 litres par minute et le pH ne changeant pas en raison de la présence de carbonate de calcium. On filtre la liqueur de culture pour obtenir 1 kg de cellules qu'on lave ensuite trois fois par 1 litre d'une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,8%. On extrait trois fois par l'acétone les cellules lavées en ajoutant 2 litres d'acétone aux cellules, en laissant reposer à température ambiante pendant 5 heures le mélange obtenu et en en enlevant les cellules. On concentre l'extrait obtenu sous pression réduite pour enlever I'acétone. On extrait le résidu trois fois par 2 litres de n-butanol et on lave extrait trois fois par 1 litre d'eau. Après le lavage, on concentre l'extrait sous pression réduite pour enlever le n-butanol et on centrifuge le résidu pour obtenir un précipité qu'on recueille. On le lave par 20 ml de méthanol refroidi à -100C puis on centrifuge pour enlever le méthanol. On répète le lavage au méthanol trois fois pour obtenir 2 g d'une poudre brune. On ajoute à cette poudre 20 ml de dioxane et on chauffe le mélange obtenu pour dissoudre la poudre autant que possible. On filtre la solution pour enlever les matières insolubles puis on lui aJoute 20 ml d'eau, ce qui entratne la formation d'un précipité mais on redissout le précipité en chauffant. On laisse refroidir la solution à température ambiante pour cristalliser l'itabashilline sous forme de cristaux Jaunes en aiguilles. On recueille les cristaux par filtration, on les lave par un peu de méthanol. On obtient ainsi 1,1 g d'itabashilline cristalline. Exemple 2 On arrache les poils du dos de dix souris et on attaque leur peau avec du papier émeri. On inocule une suspension de spores de Trichophyton mentagrophytes IAN 5064. Au bout de trois Jours, on applique sur la partie affectée l'onguent à l'itabashilline suivant à raison d'une fois par jour pendant dix jours Itabashilline 0,1% en poids Excipient à base de polyéthylène glycol (carbovax) 99,946 en poids On tue les souris le Jour suivant et on traite les parties affectées par une solution d'un sublimat corrosif (x 1000). On cultive des morceaux de peau (de 2 mm de diamètre) obtenus par asepsie sur un milieu de culture gélosé nutritif et on effectue des essais au bout de cinq Jours pour déterminer s'il y a des fongus. Le taux de guérissement, c'est-à-dire le nombre de pièces guéries rapporté au nombre de pièces essayées est de 8/10 c'est-à-dire de 80%. Exemple 3 On reprend l'exemple 2 si ce n'est qu'on utilise la solution suivante d'itabashilline au lieu de l'onguent Itabashilline 0,15' poids/volume Diméthylsulfoxide 1% n Ethanol 98,946 w Le rapport de guérison est de 9/10 c'est-à-dire de 909s. Exemple 4 20 malades Trichophytic pompholyciformis (10 hommes et 10 femmes) dont les plantes des pieds étaient infectées par Trichophyton microsprum epiderumophyton, sont divisés en deux groupes, de 5 hommes et 5 femmes chacun, et on applique deux fois par Jour respectivement l'onguent dtitabashilline et la solution d'itabashilline précités pendant deux semaines. Onguent Solution Pratiquement guéris un malade un malade Le prurit disparate et les ampoules diminuent quatre trois Le prurit diminue trois cinq Sans changement deux un REVENDICATIONS 1. Une substance de formule C32H30014 dont le point de fusion est compris entre 264,5 et 266,50C et qui est sous la forme de cristaux jaunes en aiguilles, cette substance présentant des courbes d'absorption ultraviolette comme représenté à la figure 3, une courbe d'absorption infra-rouge comme représenté à la figure 5, les maximums d'absorption étant à 3560, 3500, 2970, 2880, 1740, 1727, 1610, 1590, 1560, 1430, 1328, 1230, 1005 et 817 cm et un spectre de résonance magnétique nucléaire protonique dans l'hexadeutéro diméthyl sulfoxyde (100 MHz) comme représenté à la figure 6. 2. Un procédé de préparation de l'itabashilline, caractérisé en ce quton cultive aérobiquement une souche productrice d'itabashilline appartenant au genre Penicillium dans un milieu contenant une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux pour produire et accumuler l'itabashilline dans le milieu, et on recueille l'itabashilline de la culture. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la souche productrice d'itabashilline est Penicillium oxalicum var. itabashikum NRRL 5672. 4. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce quton effectue la culture entre 10 et 4O0C et à un pH compris entre 1 et 11. 5. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on cultive la souche productrice d'itabashilline entre 20 et 300C pendant trois à six Jours dans un milieu liquide ayant un-pH compris entre 4 et 7. 6. Un médicament inhibant notamment la croissance de certains microorganismes pathogènes et antifongique, actif en particulier contre Trichophytic pompholyciformis, caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de principe actif, la substance définie à la revendication 1 ou 8. 7. Médicament suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le principe actif en présente environ 0,196 en poids. 8. Les sels ou esters, notamment de sodium ou de métal alcalin tels que les chlorhydrates, sulfates ou sels d'ammonium quaternaire de la substance définie à la revendication 1.