Brevet FR2143588A1 — publié le 19730209

La présente invention concerne un vaccin contre la maladie dite hépatite des oies, destiné à réaliser une immunisation des oiseaux aquatiques, et en particulier des oies, contre cette maladie. L'hépatite des oies est une maladie virale qui peut causer de grands dommages dans les élevages d'oiseaux du genre aquatique. Des recherches exécutées jusqu'à présent se sont occupées d'une manière prédominante d'une description clinique de différentes familles de virus. Ces recherches ont montré qu'aucun des virus isolés n'était en mesure de reproduire le développement de la maladie observée sur place, de sorte que les agents d'excitation isolés n'ont pas pu être considérés comme étant les véritables virus causant la maladie. On n'a pas reconnu, en effet, que la maladie se manifestât d'une manière prédominante par une inflammation du foie des animaux tombés malades. Or, des recherches précises ont indiqué que la maladie se manifeste d'une manière prédominante dans une inflammation du foie des animaux malades (hépatite) et dans une inflammation du pancréas (pancréatite). Du fait que l'aspect de la maladie se présente sous différentes formes de phénomènes suivant la susceptibilité des oisons, qui dépend à son tour de la teneur en anticorps dans le sang maternel, il faut admettre que la maladie se présente sous des aspects cliniques variables. Après une infection expérimentale avec le virus isolé, on a observé trois formes différentes de maladies. 1 - Si l'on infecte des oisons âgés de 1 à 8 jours, il se produit une maladie grave survenant très rapidement, à laquelle tous les oisons succombent s'ils ne possèdent pas de protection par anticorps maternels. Les premiers symptômes de la maladie s'observent habituellement le 3ème jour après l'infection. Ainsi donc le 3ème jour, mais quelquefois aussi seulement le 4ème ou le 6ème jour, les animaux infectés refusent la nourriture, ont des hochements fréquents de tête, présentent une certaine conjonctivite et restent la plupart du temps blottis, serrés les uns contre les autres. Ils ont un besoin accru de chaleur. A ce moment, les oisons sont encore assez vigoureux, étant donné que, rus qu'au moment où ils refusent la nourriture, ils se développent aussi bien que des animaux non infectés.Mais 1 à 2 jours après, ils refusent aussi l'eau qu'on leur donne, leur visage se creuse et leurs yeux se collent. Dans l'intervalle, ils se sont affaiblis d'une manière telle qu'ils ne peuvent se soulever qu'avec beaucoup de peine et qu'ils ne peuvent faire que quelques pas. En ce faisant, ils appuient leur tête sur le sol et ils succombent dans ce stade, la plupart du temps en quelques heures. Une dissection montre nettement un foie gonflé, une vésicule biliaire remplie, une augmentation de liquide dans la cavité abdominale et un contenu de l'estomac mucilagineux et ayant une coloration gris-verdâtre, qui sort fréquemment par le bec après que la mort est survenue. 2- Les animaux âgés de 12 à 14 jours présentent, après qu'ils ont été infectés, deux aspects de maladie différents a) 5 à 6 jours après l'infection, tous les oisons infectés tombent visiblement malades. Une partie d'entre eux refuse la nourriture et pour les autres la consommation de nourriture est seulement réduite. La fiente devient blanchatre et très fluide, et plus tard blanche et mucilagineuse. Une partie de ces animaux devient d'une manière frappante fatiguée et affaiblie ; ces animaux succombent 4 à 10 jours après l'apparition des premiers symptômes de la maladie. La plupart de ces oies ont des ouvertures nasales collées, les yeux collés,ainsi que des dépôts fibrineux membraneux sur la langue et sur le palais. Les animaux survivants ont un développement nettement retardé, la cage thoracique se ré- trécit,et quelquefois ces animaux ont un ventre gonflé et ils perdent leurs plumes, en particulier celles du dos, des ailes et du cou. Quelques animaux paraissent d'une manière générale déplumés, avec une peau fortement rougie et avec un croupion fortement enflé. Des troupeaux présentant cet aspect doivent être considérés comme étant infectés déjà d'une manière importante. La plus grande partie de ces oies est faible, elle se différencie du restant du troupeau et elle succombe au cours de la huitième ou de la dixième semaine. 3 - Des oies de trois semaines ne sont tombées malades cliniquement que pour une partie seulement d'entre elles. L'aspect de la maladie qui se produit est bi-en retardé quelque peu, mais il ressemble essentiellement à celui qui a été décrit sous 2 b). Toutefois, on a observé dans ce groupe une augmentation des déperditions de force. Les oies boitaient,la plupart du temps, d'une patte, quelquefois aussi des deux, et elles ne pouvaient se soulever du sol que difficilement. Une partie de ces animaux a succombé, l'autre partie a survécu, mais avec une croissance nettement retardée. 30 % environ de tous les animaux survivants ont présenté une conjonctivite très prononcée dans la période de a 10ème à la 12ème semaine.En raison d'une infection qui a suivi, et qui a été produite par des bactéries appartenant au groupe "pasteurella", beaucoup de ces animaux sont devenus aveugles. 4 - De jeunes oies de quatre semaines s'infectent sans présenter de symptômes visibles de maladie. Toutefois, elles ne sont pas résistantes à 100 %, étant donné, qu'après injection intraveineuse, elles présentent un aspect de maladie identique à celui qui a été décrit sous 2). Ces formes d'atteintes par la maladie ont été constatées aussi dans des observations faites à la ferme. La durée d'incubation est par conséquent de 3 jours au moins, mais elle peut s'étendre jusqu'a 18 jours après l'infection. Ainsi qu'on peut s'en rendre compte d'après les descriptions faites sous i et 2., le pronostic est mauvais. Les modifications de tissus des animaux tombés malades apparaissent en particulier dans le foie qui, la plupart du temps est fortement augmenté et, par conséquent, enflé. En outre, il se produit des modifications de tissus du pancréas, des membranes séreuses du ventre, des modifications des muscles du coeur et des modifications d'autres organes. Des recherches spéciales, concernant les propriétés biologiques et physicochimiques du virus de l'hépatite des oies, ont montré que le microbe pathogène possède des propriétés qui diffèrent de celles de tous les virus connus jusqu'à présent parmi les volatiles. On a pu déterminer pour ce virus les propriétés suivantes 1.On a pu exclure une parenté sérologique avec les virus suivants des volatiles: Bronchite infectieuse des poules Peste atypique des volatiles (Newcastle discase) Variole des volatiles Influenza A des volatiles Encephalomyélite des oiseaux (AE) Adénovirus des oiseaux (CELO) Réovirus des oiseaux (souche 2313) Laryngotrachéite infectieuse (ILT) Réovirùs des oies (isolat Krall:s) Réovirus des oies (isolat Csontos, Derzsy) Hépatite infectieuse des canards (souche classique) Peste des canards (entérite infectieuse des canards) Inflammation infectieuse du foie et de la rate des chouettes. Inflammation infectieuse de la "bursa" des poules (Gumboro Disease) 2. Le virus de l'hépatite des oies se multiplie dans la culture des tissus (fibroblastes des oies) avec des modifications, concernant les cellules infectées, non connues jusqu'à présent pour les virus des volatiles. On a observé, dans les noyaux des cellules et dans le plasma des. cellules,des inclusions de corpuscules. Les propriétés physiques sont résumées ci-après : 1 - Le virus n'a pas d'enveloppe. Par suite, il résiste à l'éther et au chloroforme. 2 - Le virus présente une résistance élevée aux moyens d'inactivation (la sensibilité ou la résistance constituent des critères pour la classification des virus) a) inactivation thermique b) influence des ferments (0,25 % de trypsine) c) 1 MgCl molaire à 560C d) faible pH (3,0) e) carbures d'hydrogène fluorés à faible teneur en fluor (fréon 113) f) dodécylsulfate de sodium (0,1 /) SDS g) formaline 1 : 1000 h) phénol 0,5 % i) désoxycholate de sodium (0,25 %) Doc k) traitement à l'éther et au chloroforme. 3 Des essais de filtration ont montré que la grosseur moyenne des.particules de l'excitant est inférieure à 50 nm. 4 - L'effet zytopathique dans des cultures d'embryofibroplastes d'oie a pu être complètement empêché par l'addition d'inhibiteurs au DNA (5-iode-2-désoxyuri dine). Cela signifie que GHV contient comme acide nucléique de l'acide désoxyribonucléique (DNA). Ci-après sont résumées une fois encore les différentes propriétés en comparaison avec celles d'autres virus de volatiles. 1. Dimensions inférieures à 50 nm ) inconnus pour les autres 2. Type de l'acide nucléique DNA ) virus de volatiles 3. Le CPE typique dans la culture de tissu est différent de tous les virus de volatiles connus jusqu'a présent. 4. Résistance extrême vis-à-vis des moyens d'inactivation. 5. Pas de parenté sérologique avec d'autres virus connus de volatiles. Toutes ces propriétés servent de caractéristiques des virus englobés dans le groupe des parvoviruss dont quelques représentants n'ont pu étre isolés jusqu'a présent qu'au cours de recherches exécutées sur l'homme et sur des mammifères. Etant donné que GHV est le premier isolat de ce groupe, on a demandé son insertion dans la"American Type Culture Collection Les isolats suivants de ce groupe doivent être désignés scientifiquement comme virus de l'hépatite des oies,dans le cas où ils présenteraient sérologiquement une parenté avec ce virus. L'invention qui va suivre doit être valable dans la même mesure pour tous les isolats présentant une parenté avec cet exci ant. Les pertes économiques sont produites, d'une part, par les cas de mort directs, et d'autre part, par le manque d'augmentation du poids des jeunes oies, qui ont été atteintes par la maladie, mais qui ont pu être guéries. Il n'existe pas jusqu'a présent de description précise de cette maladie, a laquelle doit être appliquée la désignation d'whépatite des oies", conformément aux indications qui précèdent. Il existe cependant déjà, concernant des aspects de maladie analogues chez les oies, une littérature peu étendue, qui se base sur des observations faites à la ferme. Comme mesure préventive, on a recommandé l'inoculation de prélèvements de sérum provenant de troupeaux qui subissaient des pertesrmais on n'a pas pu obtenir de résultat en pourcentage, étant donné que, jusqu'a présent, on n'a pu vérifier, ni la teneur en anticorps, ni la spécificité de ces sérums. En outre, des essais ont montré que des oisons, ainsi immunisés, souffraient d'hépatite après une infection expérimentale avec du virus de l'hépatite des oies. En outre, il n'y avait jusqu'à présent aucun procédé qui permit de fabriquer un sérum spécial, conférant une superimmunisatlon contre la maladie. Il n'y avait jusqu'à présent aucun procédé permettant d'immuniser les oies d'élevage, afin que les descendants naissent avec une protection d'anticorps et soient protégés complètement par des anticorps maternels pendant la période de réceptivité, qui s'etend largement pendant les trois premières semaines. En outre' il n'y avait aucun procédé qui permit de fabriquer un sérum de superimmunisation contre la maladie, protégeant les oisons ou les embryons d'oie couvés, à partir de la vaccination, contre l'apparition de l'hépatite des oies. L'invention a pour but de créer un vaccin pour une immunisation active des oiseaux aquatiques contre l'hépatite des oies, vaccin caractérisé en ce qu'il contient des virus virulents de l'hépatite des oies, qui provoquent chez les jeunes oies les symptômes de maladie décrits sous les points 1 à 4. Le virus virulent de ce vaccin se présente de préférence sous la forme d'une suspension de cellules dans du liquide I'oeuf et un tissu de cellules d'embryon (de préférence broyées et homogénéisées),ou sous la forme d'une suspension de cellules d'un virus,cultivé en tant que culture de tissu dans un milieu nourrissant. Les cultures d'oeuf ou de tissu à employer proviennent de préférence d'oiseaux aquatiques et en particulier d'oies. L'invention s'étend à un procédé pour la fabrication du vaccin précédent, caractérisé en ce que l'on multiplie des virus virulents d'hépatite des oies, par l'intermédiaire de culture d'oeufs ou de culture de tissus de volatiles aquatiques, et de préférence sous une forme convenant pour l'administration parentérale. La multiplication du virus est exécutée de préférence dans un milieu de culture pharmacologiquement admissible. L'invention concerne également un procédé pour l'immunisation active des oiseaux aquatiques, procédé caractérisé en ce qu'on administre à des animaux d'élevage relativement âgés,et de préférence à des oies âgées de plus de 4 semaines, un vaccin conforme au précédent, de préférence sous la forme d'une suspension liquide qui peut être avantageusement parentérale. De préférence, le vaccin est administré à plusieurs reprises et la seconde administration est exécutée avantageusement 3 à 6 semaines après la première. Suivant le procédé de fabrication du vaccin atténué de l'invention, on atténue des virus virulents d'hépatite des oies par traitement avec des produits chimiques, jusqu'à ce que soit supprimée la pathogénité et obtenue l'antigénicité. On procède à cet effet avantageusement en séparant le virus atténué de la matière cellulaire qui l'accompagne, et en le concentrant par voie chimique ou physique. L'atténuation du virus est exécutée avantageusement avec du g -propiolactone. On procède avantageusement en administrant le vaccin parentéralement avec addition d'un adjuvant. L'invention concerne un sérum dthyper- immunisation, pour l'immunisation passive d'oiseaux aquatiques ou de leurs embryons contre l'hépatite des oies, sérum caractérisé en ce qu'il c > ntient des anticorps produits par la présence de virus virulent de l'hépatite des oies. Le sérum d'hyperimmunisation peut être complété par du sérum de l'espèce d'animaux à immuniser. L'invention concerne un procédé pour la fabrication du sérum d'hyperimmunisation précédent, procédé caractérisé en ce qu'on inocule à plusieurs reprises du virus virulent de l'hépatite des oies à des animaux d'élevage. Le virus peut être inoculé à des mammifères ou à des oiseaux aquatiques, de préférence à des oies, par voie parentérale. Pour l'inoculation des animaux d'élevage d'autres genres, on utilise une suspension de virus épurée, l'épuration étant obtenue avantageusement par traitement avec un hydrocarbure fluoré à faible teneur en fluor (par exemple frigène 113). Il convient d'employer des virus provenant de cultures de cellules d'oiseaux aquatiques, en particulier d'oies,et de compléter le milieu de culture avec du sérum de l'espèce d'animaux à immuniser. Le sérum d'hyperimmunisation ainsi fabriqué contient des anticorps tout prêts, de nature apparentée ou de nature étrangère contre les virus de l'hé- patite des oies, et il ne contient pas de virus vivant. Le sérum d'hyperimmunisation précédent est utilisé pour l'immunisation passive des oiseaux aquatiques (en particulier des oies) ou de leurs embryons. Dans le premier cas, le sérum d1hyperimmunisation est inoculé par voie parentérale à des oisons âgés de 1 à 2 jours ; dans le second cas, le sérum est inoculé à des oeufs d'oie fécondés, de préférence le 8ème jour de la couvaison. L'inoculation peut être exécutée, sans addition d'antiseptiques, de préférence dans le jaune d'oeuf. De cette manière, l'embryon qui se développe se trouve déjà protégé dans oeuf, étant donné ques dans la plupart des cas, les oeufs couvés sont déjà infec tés. La description ci-après expose, d'une manière détaillée, les différents objets de l'invention. Préparation du virus virulent de l'hépatite des oies. Le virus peut être obtenu par dissection d'une petite oie atteinte dthépatite.au moyen de l'ablation d'organes tels que le pancréas et le foie. Le diagnostic peut être porté sur la ba.'e de l'histoire du troupeau, de la forme des phénomènes pathologico-anatomiques, des modifications histologiques, ainsi que de la preuve de l'existence du virus fournipar une iumunofluorescence. En outre, on réussit avantageusement à isoler le virus par l'intermédiaire de cultures d'oeufs d'oie. A cet effet, on mélange des prélèvements de foie, de rate et de pancréas avec une solution tampon stérile, pour en faire un délayage homogène auquel on ajoute des antibiotiques (80 mg de streptomycine, 10.000 unités de pénicilline/ml).Après avoir laissé reposer pendant 30 minutes le mélange homogène à la température ambiante, on le sépare par une centrifugation à 3000 g et l'on inocule 1 cm3sdu liquide qui surnagersur la membrane choriallantoine d'embryons d'oie couvés pendant 15 jours. On lette les oeufs qui s'atrophient au bout de 24 à 48 heures, étant donné qu'ils sont la plupart du temps contaminés par des bactéries. On doit s'attendre à une mort spécifique de l'embryon du 5ème au 15ème jour de couvaison après l'inoculation. On recueille comme porte-virus le liquide allantoique de l'amnios ainsi que le CAM et l'embryon. Dans le cas d'embryons qui meurent dans un stade de développement en progrès, il est recommandé de procéder à un nouveau passage sur des embryons d'oie.Une souche de virus ainsi isolée est déposée auprès de l"'American Type Culture Collection", Maryland, Etats-Unis d'Amerique, et à l'Etablissement d'Etat de Recherches Bactériologiques, Munich,,auquel elle peut être demandée. La détermination d'isolats de ferme peut être assurée par des réactions sérologiques exécutées au moyen de sérums de référence. Fabrication du vaccin avec du GHV virulent (virus d'hépatite des oies) La souche GHV, précédemment définie et mentionnée sous la désignation GHV - SHM 319.est multipliée par inoculation de 0,2 ml sur la membrane chorioallantolne (CAM) d'oeufs d'oie couvés pendant 15 jours. Les cultures d'oeuf ainsi infectées dépérissent dans un délai de 4 à 8 jours en raison de la multiplication du virus. Sur les embryons qui ont dépéri, on recueille, d'une manière stérile, les liquides de l'oeuf (liquide allantolque de l'amnios),ainsi que les membranes de l'oeuf (CAM) et les embryons, on broie la matière au moyen d'un homogénéisateur,dans des conditions stériles, et on la congèle à la température de - 200 C. La congélation a pour but de rompre les cellules encore intactes et d'assurer ainsi un rendement maximal en virus.On arrive au même résultat par un traitement de la suspension de cellules aux ultra-sons ou par un traitement de cette suspension avec une solution de désoxycholate de sodium (solution à 0,25 % , traitement de 4 heures à 70 C). Après le dégel ou après l'autre traitement indiqué, on produit la sédimentation de la matière grossière des cellules par une centrifugation (1000 T.p.m) de 20 minutes, et l'on utilise le liquide qui surnage comme virus de vaccination. Avant de transvaser ce liquide en petites portions, il est nécessaire de procéder à un contrôle de sa stérilité .pour l'élimination des bactéries d'accompagnement. Les préparations de virus contaminées doivent être jetées. La teneur en virus de cette solution,reconnue comme étant exempte de bactéries est déterminée par un titrage dans des cultures de tissu ou dans des cultures d'oeuf. Elle s'élève habituellement à 105 à 106 de doses léthales embryon (ELD50) par ml. Ce virus peut être utilisé ensuite après addition d'antibiotiques, comme virus de vaccination. Jusqu'à son utilisation, le virus est déposé à l'état de rigidité obtenue par le froid (congélation à une température de - 20 à - 70 OC ou bien déssèché et congelé) et,12 heures avant d'être employé, il est mélangé intimement avec une addition de dépôt (hydroxyde d'aluminium préparé conformément aux dispositions légales concernant les produits pharmaceutiques), dans un rapport de 1 : 10, c'està-dire 1 partie de suspension de virus pour 9 parties de solution d'hydroxyde d'aluminium et,après une adsorption d'une durée de 12 heures, il est utilisé à une température de 40C. Ce vaccin convient non seulement pour une application parentérale, mais aussi pour une application orale, étant donné qu'il s'agit ici d'un virus vivant qui, appliqué dans un sujet homologue, peut inciter ce dernier à une multiplication particulière du virus et l'engager, par ce processus de l'infection, à la formation d'anticorps. Comme autre procédé pour la fabrication de virus de vaccination, on peut utiliser la culture de tissus. A cet effet, on infecte des cultures de fibroblantes d'oiseaux aquatiques,qui se sont déeloppées dans des milieux nourrissants techniques, du commerce, tels que, par exemple le milieu 199, avec des additions de protéine (bouillon tryptose - phosphate), avec du GVH adapté à la culture de tissus, et on les ré- colte après une autre incubation de 4 à 6 jours. Le virus produit,en raison de sa multiplication,une destruction des enveloppes ou cellules. Lors de la récolte du virus, on enlève non seulement le liquide surnageant,mais aussi les enveloppes de cellules, on désagrège de la manière précédemment décrite, par voie physique ou chimique, le mélange de cellules et de liquide, on sépare par centrifugation la matière des cellules, et l'on poursuit le traitement comme dans le cas du virus sur culture d'oeuf. Immunisatior active avec vaccin virulent GHV. On administre par voie sous cutanée 3 cm3 du vaccin décrit, par deux fois, a an intervalle de 3 à 6 semaines (parentéralement). La dernière inoculation doit être exécutée au moins 6 semaines avant le commencement de la ponte. Etant donné que des recherches ont montré que les oies possèdent,seulement à partir de l'âge de 6 semaines, une résistance suffisamment marquée, il ne faut immuniser des oies qu'à partir de cet âge, et l'on choisira de préférence des oies ayant plus de 8 semaines. Pour prévenir des insuccès, il convient d'immuniser tout 3e troupeau, oies et jars, en un seul jour. Trois semaines avant le commencement de la ponte, il conviendrait de vérifier l'état en anticorps du troupeau, par prise de prélèvement de sérum, afin que, si le titre en anticorps était insuffisant, on puisse procéder une fois encore à l'immunisation de tout le troupeau. L'immunisation peut aussi être exécutée avec du virus de culture seulement, c'est-à-dire sans addition d'une matière de dépôt. Un avantage particulier de l'invention réside en ce que les animaux d'élevage ainsi immunisés transmettent leur immunité de parents à leur progéniture, de sorte qu'une immunité maternelle des oisons est assurée pendant la période de susceptibilité maximale, c'est-à-dire pendant les trois premières semaines de leur vie. Fabrication d'un vaccin avec un GHV atténué. Des recherches ont montré que, même des animaux des troupeaux hétérologues, c'est-à-dire des animaux dans lesquels le R rus ne se présente pas d'une manière naturelle, sont capables de former des anticorps contre le virus. Etant donné que des recherches de laboratoire ont montré que le virus ne se multiplie pas dans des cellules isolées et cultivées de ces sujets, il faut admettre qu'ici, le virus, en tant que protéine, incite le corps à la formation d'anticorps. Il est bien évident que.pour ce processus, il faut employer une concentration de virus qui soit convenablement plus élevée. Dans ce procédé, on cultive du GHV de la manière précédemment décrite. Cela peut être exécuté non seulement dans des cultures d'oeuf, mais aussi dans des cultures de tissu. Après la centrifugation de clarification, le virus est précipité au moyen d'une ultracentrifugation (100 000 g, 60 min) ou par addition de Na2 C03 (concentration finale 50 mM) et de AlCl (concentration finale 25 mM). En outre, 3 on peut appliquer d'autres procédés de concentration physiques et chimiques qui sont connus d'après la littérature spécialisée. La concentration décuple obtenue ici des particules de virus est rendue inactive par une addition de / -proprolactone (Belaprone, Fellow's Testagar Co, Detroit, Michigan, ou Schuchard - Feinchemik- alien, Munich). On prépare en même temps, immédiatement avant d'avoir à l'employer, une solution à 5,0 % de A - proprolactone (BPL) dans de l'eau distillée. Puis on ajoute une partie du BPL dilué à neuf parties de concentré de virus. Les dilutions de BPL sont préparées à une température de O à 40C. Aprèslladdition du BPL à la suspension de virus concentrée, on secoue le mélange dans des récipients fermés,à une température de 40C pendant 10 minutes,et on l'abandonne ensuite pendant 4 heures dans un bain d'eau à une température de 370C, en le remuant au moyen d'agitateurs magnétiques.On conserve la préparation pendant la nuit à la température de 40C, le BPL se trouvant ainsi complètement hydrolisé. On éprouve, au point de vue du pouvoir d'infection restant, la suspension de virus ainsi traitée, par l'introduction de 0,1 ml d'une suspension non diluée et de 0,1 ml d'une dilution 1 : 100 sur la membrane chorioallantoique d'oeufs d'oie avec embryons de 14 jours. On administre,par voie sous cutanée ou intramuscu 3 laire, 5 cm3 au moins du virus ainsi rendu inactif trois fois à des intervalles de trois semaines. Les épreuves d'anticorps doivent être exécutées après la seconde immunisation et après chaque immunisation suivante. Fabrication de sérum d'hyperimmunisation a) Sujets homologues (oies) A cet effet, on immunise des oies, qui ont été mises en étable en vue de la préparation du sérum d'hyperimmunisation, trois fois à des intervalles de trois semaines, par voie intramuscu laire,-avec 5 ml du virus vivant atténué préparé la manière décrite ci-dessus. Après l'épreuve des anticorps par réactions sérologiques, on saigne les animaux 20 jours après la dernière inoculation,en les abattant ou bien en procédant à une ponction veineuse (I1 convient de faire cette ponction dans la veine de l'aile ou de la patte). Dans le dernier cas, les animaux demeurent en vie et ils peuvent être saignés de nouveau après le renouvellement physiologique du sang perdu.La quantité de sang maximale tolérable pouvant être prélevée sur une oie adulte est de 100 à 150 ml (suivant le poids du corps de l'animal). Après chaque prélèvement de sang, il faut procéder à une nouvelle infection avec du virus vivant. Le sang ayant été rendu non coagulable par une addition de 3 % de citrate de sodium (1 ml de citrate de sodium a 3 % pour 12 ml de sang), on peut obtenir le plasma du sang prélevé au moyen d'une séparation par centrifugation des corpuscules du sang. Sans moyens empêchant la coagulation du sang, on en arrive à une solidification du sang,et le sérum se sépare du gateau solide. Ce processus physiologique peut être accéléré par la centrifugation du sang solidifié (à 3000 tpm, 45 min.). Le sérum séparé par centrifugation, jaune ambré ou coloré légèrement en rouge, est recueilli, reçoit des substances antiseptiques, et il est ensuite filtré de manière stérile (antiseptique 0,5 % de phénol ou merthiolate 1 : 10000). Le sérum ainsi préparé est conservé jusqu'a son utilisation à l'état congelé à une température de - 20 C. Au sérum sans antiseptique, on peut ajouter des antibiotiques (10 000 unites de pénicilline et 40 mg de streptomycine par ml). b) Sujets hétérologues 1. Autres oiseaux aquatiques et mammifères La réaction des sujets hétérologues après une infection par du GVH ntest pas basée sur une formation d'anticorps en raison de la multiplication du virus dans le sujet correspondant, mis sur une réaction de rejet du sujet vis-à-vis de protides de nature étrangère. Les particules de virus réagiss mt donc en tant que protéines de nature étrangère, et par contre le sujet à immuniser forme des anticorps. Les anticorps ainsi produits conviennent pour neutraliser le virus GHV dans un système restant,et ils sont en outre capables,s'ils sont administrés par voie parentérale dans des oies prédisposées, de protéger ces dernières contre l'apparition de la maladie. Les anticorps sont, comme les anticorps des sujets homologues, dirigés directement contre le virus spécifique. Ils ne produisent pas d'immunité permanente mais ils sont éliminés hors du courant sanguin par le processus de dégradation physiologique, dans un délai de 3 à 4 semaines. Pour la fabrication de ces sérums, on cultive et on récolte, de la manière précédemment décrite, du vi rus frais de culture (culture d'oeufs ou culture de tissus). Après la congélation, on mélange intimement le liquide ayant subi la centrifugation de clarification avec du frigène 113 (fréon 113 = hydrocarbure fluoré à faible teneur en fluor) dans un rapport 1 : 1,au moyen d'un homogénéisateur rapide, et après une interruption de 30 à 40 minutes, on le centrifuge dans une centrifugeuse de refroidissement tournant à 3000 tpm, à une température de 40C (durée de la centrifugation 20 min.). Dans ce processus, le mélange frigène-protéine forme un gel, et il est projeté sur le fond du verre de la centrifugeuse, tandis que les particules de virus demeurent dans la phase aqueuse qui surnage. Le virus est précipité de nouveau de ce liquide au moyen de 50 mM de Na2 C03 et de 25 m M de 3 Al Cl . Les sujets à employer sont immunisés au moins trois fois, intervalles de trois semaines,au moyen de ce virus concentré. La quantité du virus concentré utilisée dépend de la taille du sujet employé (2 ml pour les volatiles, 20 ml pour un grand animal adUlte). Avant chaque renouvellement d'inoculation, on détermine le titre en anticorps par des procédés sérologiques de laboratoire et,lorsque des valeurs suffisamment élevées de titre ont été atteintes, on saigne les animaux. Si les animaux ainsi immunisés doivent rester en vie, la quantité de sang à prélever dépend de la perte maximale de sang pouvant être tolérée- par l'animal. Il est recommandé de procéder, après chaque prélèvement de sang, à une réimmunisation. Le sérum du sang ou le plasma du sang sont recueillis et préparés suivant les procédés qui ont été décrits pour les sujets homologues. On détermine le titre en anticorps de chaque pool de sérum recueilli et l'on en prend note. En outre, on caractérise au moyen de numéros chaque pool de sérum et l'on retient de manière précise la date et la nature de la préparation. Si le législateur le demande, on peut éprouver des échantillons prélevés au hasard à l'institut Paul-Ehrlich, Francfort sur le Main. Le processus étendu d'épuration peut être inutile si l'on utilise, pour l'immunisation,un virus de culture de tissus qui s'est développé dans le sérum de l'espèce d'animaux à immuniser. Dans ce cas, on n'en arrive pas, dans le cas d'une application parentérale du virus de culture dans le sujet à immuniser, à des réactions de choc dangereuses. En outre, on évite par ce procédé une perte de virus qui se produit à chaque processus d'épuration. Toutefois, on peut exécuter aussi, avec ce virus de culture, un processus de concentration, de la manière décrite plus haut. 2. Chevaux On immunise, de la manière décrite ci-dessus des chevaux pesant de 800 à i 000 Kgs. Après achèvement de l'opération d'immunisation, on saigne les animaux. Le sang est rendu incoagulable au moyen d'anticoagulants (citrate de sodium à 2,8 S4). Sur un cheval pesant 900 Kgs, on prélève 8 litres de sang, par ponction de la veine jugulaire, et on les laisse reposer pendant la nuit à la température de 40C. Le matin suivant, on sépare le plasma sanguin qui stest déposé du dépôt des corpuscules sanguins rouges et blancs et, après resuspension des corpuscules sanguins dans une solution physiologique de chlorure de sodium à 370 C, on réintroduit ces corpuscules dans le sujet donneur à travers des filtres en gaze stérile. De cette manière, on peut prélever chaque semaine 8 litresde sang, la quantité maximale de plasma étant de 4 litres. On peut employer des procédés analogues dans le cas des chèvres ou des moutons. Dans la plupart des cas, il est inu tile de procéder à une séparation spéciale de la globuline gamma d'immunisation par une précipitation chimique. Toutefois, cette précipitation peut être exécutée, si on le désire, d'une manière connue en soi. (Précipitation avec du sulfate d'ammonium présentant une facturation de 40 à 50 %, suivie d'une dialyse vis-à-vis de solutions tampon appropriées). On peut exécuter un complément du sérum d'immunisation avec des vitamines et des concentrations spéciales d'antibiotiques, calculé sur la base d'un > ison par ml. en tant que dose thérapeutique. Application du sérum d'immunisation dans le cas des oisons On peut employer de la même manière du sérum homologue et du sérum hétérologue. Il faudrait employer en général 1 ml de sérum d'hyperimmunisation par oison. On a constaté qu'une immunisation aussi précoce que possible des oisons est indiquée,étant donné qu'une infection peut avoir lieu déjà dans l'oeuf ou bien pendant l'opération d'éclosion. On vaccine par conséquent avantageusement les oisons.lors du prélèvement hors de la couveuse, avec 1 cm3 de sérum.par piqure sous-cutanée sur la face dorsale, à la transition du cou au thorax. Il existe à cet endroit suffisamment de tissu lâche de liaison sous la peau, dans lequel on peut 3 déposer dans de bonnes conditions 1 cm3 de sérum. Lors d'une vaccination dans la musculature de la cuisse, il peut arriver facilement que soient produites des blessures de tendons et d'articulations, ce qui peut être la cause de paralysies. Application du sérum d'immunisation aux embryons d'oie Etant donné qu'il peut se produire assez facilement une infection de embryon dans l'oeuf, on a étudié un procédé qui permette de protéger l'embryon en cours de développement. Dans ce but, les oeufs d'oie couvés sont examinés au moyen de rayons lumineux le 8ème jour après le début de la couvaison, et l'on enlève les oeufs non fécondés ainsi que les embryons morts. On place les oeufs verticalement sur leur pointe et sous contrôle de la lumière, on perce un petit trou dans la chambre à air.au-dessus du liquide de l'oeuf. L'ouverture doit être disposée autant que possible du côté éloigné de l'embryon.Après avoir désinfecté le point d'inoculation ainsi marqué, à l'aide d'une solution de teinture d'iode, on inocule dans l'intérieur de l'oeuf avec une canule de diamètre aussi petit que possible (nO 18 ou 14), 1 cm3 de sérum, profondément dans l'intérieur de oeuf. Lors des premiers essais, on peut vérifier au moyen d'une lègère aspiration de la seringue,le siège exact dans le sac du jaune. On ferme ensuite l'ouverture pratiquée dans la coquille au moyen de cire pour bougie et l'on remet les oeufs en place pour qu'ils continuent à être couves. L'immunité ainsi produite des oisons s'est avérée comme étant extrêmement efficace contre l'appari- tion de l'hépatite des oies. Le sérum d'immunisation utilisé dans ce but ne devrait pas contenir, indépendamment des antibiotiques, des antiseptiques. Les oisons éclos dans ce cas n'ont pas besoin d'être immunisés une fois encore. Les résultats de recherches indiqués ci-après servent à poursuivre 11 explication de l'invention. 1 - 130 oisons d'une couvée commune ont été maintenus dans un parc d'isolement spécial, et ils ont été infectés aux époques qui sont indiquées dans le tableau suivant (soude GHV SHM 319 5. Passage à l'oeuf d'oie,titre 5,5 x 105'5 ELD50). 15 oies ont été infectées par injection intramusculaire de l ml de virus, tandis que 6 oies ont été ajoutées comme controles de contact. Les animaux non infectés sont demeurés dans un strict isolement. Age des oisons Nombre des animaux Nombre à l'époque manifestement tombés des cas de mort de l'infection malades au point de vue clinique (jours) animaux controles Animaux contrôles infectés de contact infectés de contact 2 15 6 15 6 8. 15 6 15 6 15 15 6 10 4 22 10 2 5 1 29 3 0 2 0 35 0 0 0 0 Observation. Les cas de mort se rapportent à la durée totale de l'essai (3 mois). Sur tous les animaux ayant succom bé, on a pu s'assurer de l'exactitude du diagnostic hépatite des oies. 2 - A 15 oies de six semaines, on a inoculé directement dans la voie sanguine (piqûre intraveineuse) 3 cm3 du même virus. Sur tous les animaux,sont apparus nettement des phénomènes cliniques de l'hépatite des oies, tels qu'ils ont été décrits dans l'introduction, sous les points 2 et 3. Trois de ces animaux ont succombé avec des signes typiques (transformations) de l'appendice des oies,tandis que les autres animaux tombés malades ont souffert d'une dépression de croissant et se sont ensuite rétablis. 3 - Essais dtimmunisation. A 5 oies, dont 2 vielles oies pondeuses et 3 jars (de 8 semaines), on a inoculé par piqûre intramusculaire 4 ml de virus. L'inoculation a été renouvelée le 12ème jour et le 21ème jour. On a recueilli le sérum des animaux le 28ème jour après la première infection. Le sérum de 2 jars a été conjugué avec de l'isothiocyanate de fluoresceine et utilisé dans un essai d'immunofluorescence. Le sérum a pré- senté une fluorescence spécifique en présence de virus de l'héè patite des oies. Les oeufs des oies ont été en outre recueillis et couvés. Les oisons éclos ont été infectés par le nez à leur deuxième jour. Jusqu'à une durée d'observation de 3 semaines, on nta pu observer aucun symptôme de maladie. Etant donné que les premiers oeufs de ces oies (avant l'immunisation) ont été utilisés pour des cultures de virus et que quatre oisons de ces vieilles oies étaient réceptifs lors d'une inoculation antérieure, la résistance des oisons ultérieurs doit être attribuée à une immunité maternelle qui a été transmise à l'oeuf. Cette étude a été confirmée par des observations faites à la ferme. 4 - Du sérum d'hyperimmunisation des jars décrits ci-dessus a été filtré d'une manière stérile.et on lui a ajouté,pour une inoculation dans l'oeuf d'oie muni d'un embryon,5 000 unités de pénicilline et 40 mg de streptq glycine par cm3. A cinq oeufs d'oie couvés munis d'un embryon (8 jours après l'introduction dans la couveuse),on a inoculé dans le sac à jaune de l'embryon 0,5 ml de sérum,et à cinq autres oeufs, on a inoculé 1 ml de sérum. 5 oeufs n'ont pas été infectés et i-ls sont demeurés comme contrôle. Les oisons sont éclos dans de boîtes séparées et ils ont été aussitôt marqués,puis maintenus jusqu'à leur 18ème jour dans un strict isolement.Ensuite, tous les animaux ont été infectés le 18ème jour par inoculation dans la voie sanguine de 4 cm3 de GHV (piqure intraveineuse)dose de virus 7.5 2,0 x 10 ELD50). Il s'agit ici d'une très forte dose et par suite d'un essai de charge maximale. 8 jours après l'infection, 3 des animaux de contrôle n'ayant pas subi d'inoculation (oeufs non inoculés) étaient déjà morts, en présentant des signes caractéristiques de l'hépatite des oies. Les deux autres animaux de contrôle présentaient des symptômes nets de la maladie. Les animaux auxquels avait été faite une inoculation de 0,5 cm3 présentaient, pour une partie, des phénomènes cliniques analogues à ceux qui sont décrits dans l'introduction sous les points 2 et 3.Il n'y eut qu'un animal de ce groupe qui succomba tandis que les autres jeunes oies. auxquelles avait été faite, dans J 'oeuf, une inoculation de 1 cm3 de sérum d'hyperimmunisation,continuèrent à se développer suivant une croissance absolument normale, sans présenter de symptômes de maladie. L'essai a montré qu'avec ce genre d'immunisation de l'embryon qui se développe, il existe vrai semblablement, outre une immunité humorale,une immunité cellulaire,étant donné que normalement une grande partie des anticorps maternels devrait être, à ce moment, éliminée du sang. 5 - 3 pigeons de quatre semaines (pas de sujets naturels du virus) ont été immunisés quatre fois à intervalles de 7 jours7avec du virus de culture d'oeuf, épuré avec du frigène 113. Le sérum a été éprouvé ensuite dans la réaction de liaison de complément, vis-à-vis de virus de l'hépatite des oies,et il s'est avéré comme étant positif (titre 1 : 64). L'essai montre que,même des animaux de nature étrangère,peuvent former des anticorps contre le virus. 6 - 10 pigeons ont subi une infection par voie sous cutanée et intramusculaire,au moyen d'un virus rendu inactif (suivant le procédé précédemment indiqué) par du ss - propiolactone. L'inoculation a été renouvelée trois fois. 5 semaines après la première immunisation, ces sérums présentaient en moyenne un titre de 1 : 40 (liaison de complément). Cet essai fournit la preuve que des sujets de nature étrangère peuvent, eux aussi, former des anticorps contre du virus rendu inactif. Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux exemples ci-dessus decrits à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation,sans qu'on s'écarte pour cela du champ de l'invention. REVENDICATIONS 10) Vaccin pour l'immunisation active d'oiseaux aquatiques contre la maladie dite "hépatite des oies", vaccin caractérisé en ce qu'il contient des virus virulents de l'hépatite des oies de la souche déposée auprès de la "American Type Culture Collection" Maryland, Etats-Unis d'Amérique et à l'Etablissetient d'Etat de Recherches Bactériologiques, Munich, qui provoquent chez de jeunes oies les symptomes de maladie caractéristiques de cette maladie. 20) Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus se présente sous la forme d'une suspension de cellules dans un liquide d'oeuf et de tissus de cellules d'embryons de cultures d'oeufs d'oiseaux infectées. 30) Vaccin suivant l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le virus se présente sous la forme d'une suspension de cellul-es d'un virus cultivé dans un milieu nourrissant. 40) Vaccin suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le virus représente un virus multiplié par l'intermédiaire de cultures d'oeufs ou de tissus d'oiseaux aquatiques. 50) Procédé pour la fabrication du vaccin suivant l'une des revendications 1 à 4, procédé caractérisé en ce qu'on multiplie des virus virulents de l'hépatite des oies par l'intermédiaire de cultures d'oeufs ou de cultures de tissus d'oiseaux aquatiques, et en ce qu'on les amène de préférence dans une forme convenant pour 1' adrninistration ,parentérale. 60) Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'on exécute la multiplication dans un milieu de culture admissible au point de vue pharmacologique. 70) Procédé pour l'immunisation active d'oiseaux aquatiques contre l'hépatite des oies, caractérisé en ce qu'on administre, à des animaux d'élevage relativement âgés, en particulier à des-oies ayant plus de quatre semaines, le vaccin suivant les revendications 1 à 4. 80) Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce quton administre, d'une manière parentérale, le vaccin se présentant sous la forme d'une suspension liquide. 90) Procédé suivant l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'on exécute à plusieurs reprises l'administration du vaccin. 100) Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce quton exécute la seconde application 3 à 6 semaines après la première application. 11 ) Vaccin pour l'immunisation active d'oiseaux aquatiques contre l'hépatite des oies, caractérisé en ce qu'il contient des virus atténués contre l'hépatite des oies,suivant l'une des revendications 1 à 4. 120) Procédé pour la fabrication d'un vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce qu'on atténue des virus virulents de l'hépatite des oies, suivant l'une des revendications 1 à 4, par un traitement avec des produits chimiques.jusqutà suppression de la pathogénité avec obtention de l'antigénicité. 130) Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on sépare le virus atténué de la matière de cellules qui l'accompagnes et en cè qu'on le concentre par voie physique ou chimique. 140) Procédé suivant l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce quton exécute l'atténuation du virus avec du Js -propiolactone. 150) Procédé pour l'immunisation active d'oiseaux aquatiques contre l'hépatite des oies, caractérisé en ce qu'on admini > tre,à des animaux d'élevage ou à des poussins, le vaccin suivant la revendication 11. 160) Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce qu'on administre le vaccinsavec addition d'un adjuvant. par voie parentérale. 170) Sérum d'hyperimmunisation pour l'immunisation passive d'oiseaux aquatiques ou de leurs embryons contre l'hépatite des oies, caractérisé en ce qu'il contient. en raison de passages dans des animaux,des anticorps produits par du virus de l'hépatite des oies, suivant l'une des revendications 1 à 4 et 19 à 23. 180) Sérum d'hyperimmunisation suivant la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est complété par du sérum de l'espece d'animaux à immuniser. 190) Procédé pour la fabrication d'un sérum d'hyperimuunisation, suivant l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'on inocule à plusieurs reprises à des animaux d'élevage du sérum virulent de l'hépatite des oies, suivant l'une des revendications 1 à 4. 200) Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on inocule le virus à des mammifères ou à des oiseaux aquatiques, de préférence à des oies. 210) Procédé suivant l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce qu'on inocule le virus aux animaux d'élevage par voie parentérale. 220) Procédé suivant l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que.pour l'inoculation dans des animaux d'élevage, de genre différent, on emploie une suspension de virus épurée par traitement avec un hydrocarbure fluoré à faible teneur en fluor (frigène 113). 230) Procédé suivant l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce qu'on emploie du sérum provenant de cultures de cellules d'oiseaux aquatiques, d'oies de préférence, et on complète le milieu de culture avec du sérum de l'espèce des animaux à immuniser. 240) Procédé d'utilisation du sérum d'hyperimmunisation suivant la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce quton l'inocule pour l'immunisation passive d'oiseaux aquatiques ou de leurs embryons. 250) Procédé d'utilisation suivant la revendication 24, cara. térisé en ce qu'on inocule.par voie parentérale. 1 cm3 environ du sérum d'hyperimmunisation à des oisons âgés de 1 à 2 jours. 260) Procédé d'utilisation suivant la revendication 20, caractérisé en ce qu'on inocule du sérum d'hyperimmunisation à des oeufs d'oie fécondés, de préférence le 8ème jour de la couvaison. 270) Procédé d'utilisation suivant la revendication 26, caractérisé en ce qu'on inocule le sérum d'hyperimmunisation dans le sac du jaune de l'oeuf.