Brevet FR2168312A1 — publié le 19730831

La présente invention se rapporte à la préparation de produits doués d'activité enzymatique et elle concerne plus particulièrement la production par biosynthèse de produits provoquant la coagulation du lait, susceptibles de remplacer la présure. La présure, produit d'origine naturelle, exerçant une action coagulante sur la caséine du lait, est un extrait obtenu à partir de certaines muqueuses gastriques du veau de lait. Cette action coagulante est due à la présence dans cet extrait d'un enzyme, à savoir la rennine, possédant une activité protéolytique spécifique vis-à-vis de la kappa caséine. Compte tenu de la nature de sa source, la présure ne peut être obtenue que de façon assez irrégulière, notamment en fonction des saisons, et en quantités limitées. Ce produit étant utilisé en quantités importantes, en particulier dans l'industrie fromagbre, on s'est efforcé de trouver des produits susceptibles de le remplacer. De nombreuses investigations, effectuées notamment dans le domaine de la biosynthèse d'enzymes protéolytiques caillant le lait, ont permis de préparer de tels enzymes, appelés fréquemment "présures microbiennes". Cependant ces présures microbiennes, qui présentent fréquemment des activités protéolytiques notablement différentes de celles de la présure naturelle, ne permettent généralement pas d'obtenir des caillés de qualité satisfaisante, en particulier pour la fabrication des fromages. La présente invention se rapporte essentiellement à la préparation d'un enzyme présentant une activité protéolytique semblable à celle de la rennine, en particulier vis-à-vis de la kappa caséine et permettant d'obtenir par coagulation du lait un caillé de bonne qualité. Elle a trait notamment à un procédé de production par biosynthèse d'un enzyme caillant le lait, caractérisé par le fait que l'on cultive un microorganisme de l'espèce Physarum polycéphalum product.eur de cet enzyme, en conditions aérobies, en présence d'un milieu nutritif aqueux jusqu'à l'accumulation d'une quantité substantielle de cet enzyme, puis que l'on sépare ledit enzyme du microorganisme. L'invention a également pour objet l'enzyme obtenu par le procédé tel qu'il vient d'être défini, ainsi que l'utilisation de cet enzyme pour le caillage du lait. Le Physarum polycéphalum est un microorganisme connu-, appartenant à l'ordre des Physarales, de la classe des Myxomycètes. Une souche de ce microorganisme, déposée auprès du Centraalbureau vor Schimmelcultures, Baarn, sous le numéro 491.61, est accessible au public. Ce microorganisme se présente, au cours d'une phase de son cycle de vie, à savoir la phase de croissance, sous une forme caractéristique des Myxomycètes appelée plasmodium. Ce plasmodium est une masse irrégulière de protoplasme contenant de nombreux noyaux, non subdivisée en cellules, présentant une coloration jaune, et susceptible de couvrir plusieurs centimètres carrés. Si le milieu dans lequel est placé le plasmodium est favorable à la vie du microorganisme, le plasmodium se développe sur place, mais si ce milieu devient défavorable, ou s'il s'appauvrit en substances nutritives, le plasmodium émigre.Si cette migration du plasmodium n'apporte aucune amélioration des conditions de vie du Physarum polycépbalum,le microorganisme prend une nouvelle forme appelée sclérotium, sous laquelle il peut résister au froid et à la dessiccation et peut survivre pendant une année ou plus. La croissance du plasmodium de Physarum polycephalum peut être conduite en conditions aérobies, à une température comprise entre 200 et 25OC, en présence d'un milieu nutritif aqueux dont le pH est ajusté de préférence entre 4.5 et 4.6. L'expression "milieu nutritif aqueux" désigne un milieu de culture aqueux contenant les substances nécessaires à la vie du microorganisme et assimilables par celui-ci. Parmi ces substances on peut citer notamment les sources de carbone et d'azote ainsi que les sels minéraux. Cependant ce milieu nutritif peut également contenir d'autres substances telles que des vitamines, des facteurs de croissance et des oligo éléments. Ainsi le milieu nutritif aqueux peut contenir des hydrates de carbone tels que le glucose, des hydrolysats de protéines, des extraits de levure, des extraits d'embryon de poulet, des sels minéraux. Les hydrolysats de protéine, les extraits de levure et les extraits d'embryon de poulet peuvent être remplacés respectivement par un mélange d'acides aminés, par de la biotine et par del'hématine. La croissance du Physarum polycéphalum peut être conduite aussi bien en culture de surface sur un support solide qu'en culture submergée, par exemple dans des flacons à secousses ou dans un fermenteur. C'est ainsi, par exemple, que si l'on effectue la culture en surface du plasmodium de Physarum polvcephalum, on prépare un milieu de culture approprié en ajoutant de l'agar à un milieu nutritif aqueux préalablement stérilisé contenant du glucose, de l'extrait de levure, un hydrolysat de protéine, des sels minéraux et de l'hématine, ce dernier constituant étant ajouté aprs stérilisation du milieu aqueux. Le mélange est versé dans des boites de Pétri, inoculé avec un plasmodium de Phosarum polvcéphalum et maintenu à cette température d'incubation, par exemple à 25 C. La culture se développe rapidement, couvre la surface de la boîte de Pétri en quelques jours et reste sous forme de plasmodium pendant encore une semaine avant apparition du sclérotium. La culture de surface peut également être effectuée sur du papier filtre alimenté en milieu nutritif liquide par capillarité. Lorsque la croissance du microorganisme est conduite en culture submergée, par exemple dans des flacons à secousses ou dans un fermenteur, le Physarum polycéphalum se présente sous forme d'un plasmodium divisé en particules trbs fines, appelées microplasmodia, qui sont en suspension dans le milieu nutritif liquide. Si la culture submergée est effectuée en flacons, on introduit le milieu nutritif, préalablement stérilisé, dans des flacons, et l'on inocule ce milieu à l'aide de plasmodium issu d'une culture en surface ou d'une culture submergée. On poursuit la culture à une température adéquate, par exemple 250C, en agitant les flacons par secousses afin d'assurer une oxygénation correcte du microorganisme. Après une phase de latence.qui peut durer de 12 heures, si l'inoculum provient d'une culture sbmer- gée, à 2 ou 3 jours si l'inoculum provient d'une culture de surface sur agar, la croissance atteint son taux maximum en 3 jours. Si la culture en conditions submergées est exécutée dans un fermenteur, on introduit dans le fermenteur le milieu nutritif liquide et on le stérilise. De préférence les sources de carbone et d'azote assimilables sont constituées par du glucose, de l'extrait de levure et un hydrolysat de protéine, et le glucose n'est introduit dans le milieu nutritif qu'après stérilisation des autres constituants dans le fermenteur, selon une technique connue. L'i noculum, provenant de préférence d'une culture submergée, est introduit dans le fermenteur, celui-ci étant maintenu à une température de croissance du microorganisme, par exemple 250C. La culture est conduite sous agitation à l'aide d'un agitateur rotatif tournant à une vitesse suffisante pour assurer une oxygénation correcte du milieu de culture. L'examen du milieu de culture a montré que, quel que soit le mode de culture utilisé, le Physarum polvcéphalum produit, par voie extracellulaire, un enzyme protéplytique caillant le lait. Cet enzyme, qui peut être ensuite recueilli en solution aqueuse, peut être utilisé avantageusement à titre de substitut de la présure pour provoquer la coagulation du lait. Si la croissance de l'enzyme a été conduite en culture de surface, l'enzyme peut ête récupéré par lavage du microorganisme à l'aide d'une solution saline, par exemple une solution aqueuse de chlorure de sodium contenant 9.0 g de NaCl par litre d'eau, et recueil de la solution de lavage contenant l'enzyme en solution. Si la culture du Physarum polvcéphalum a été exécutée en conditions submergées, en flacons ou dans un fermenteur, on sépare les microplasmodia du milieu nutritif liquide, par exemple par décantation, filtration ou centrifugation, et l'on recueille le liquide aqueux résiduél contenant l'enzyme en solution. La solution aqueuse recueillie selon l'une ou l'autre méthode montre une activité protéolytique aisément mesurable. D'autre part l'effet coagulant de cette solution aqueuse vis à-vis du lait a été mise en évidence sur des laits écrémés présentant différentes concentrations en matières solides, en particulier 12 % et 24 %. Selon un mode d'exécution du procédé suivant l'invention par ticuliérement avantageux, on prépare une solution concentrée de l'enzyme par cryoconcentration de la solution aqueuse recueillie selon l'une ou l'autre des méthodes décrites précédemment. A cet effet on soumet la solution aqueuse à une congélation lente, on sépare la phase congelée de la phase liquide et l'on recueille la phase liquide résiduelle qui est plus riche en protéines que la phase congelée. De préférence on recueille cette phase liquide par mélange avec une solution tampon dont le pH est favorable à l'activité de l'enzyme protéolytique. On peut également, si l'on désire préparer un produit pur, séparer l'enzyme protéolytique des autres substances présentes dans la solution enzymatique concentrée. A cet effet, on peut séparer les protéines de la solution concentrée, par exemple par précipitation, préparer une nouvelle solution aqueuse de ces protéines et fractionner cette solution par une méthode chromatographique. On isole ensuite les fractions éluées présentant la densité optique et l'activité protéolytique désirées, pour obtenir un produit pratiquement pur. L'étude de l'enzyme ainsi purifié a montré que celui-ci coupe spécifiquement la liaison phénylalanine-méthionine de la chaine peptidique de la kappa caséine, c'est-à-dire qu'il exerce sur le lait une action coagulante qui peut être considérée comme identique d celle de la rennine. Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celle-ci n'étant cependant pas limitée aux conditions qui y sont décrites. Exemple I On effectue la culture en conditions sSmergées d'une souche de Physarum polycéphalum , obtenue autres de l'institut Suisse de Recherches sur le Cancer (Lausanne, Suisse), dans un fermenteur de 15 litres contenant un milieu nutritif aqueux dont la-composition, exprimée en pourcentages pondéraux, est la suivante o/o Glucose 1 Extrait de levure 0,15 Hydrolysat de caséine (tryptone) 1 Caca21 2 0,06 2 KH2P04 0,2 MgS04, 7H20 0,06 Fe C12, 4HO 0,006 Mn C12, 4H20 0,0085 Zn S04, 7H20 0,0035 Acide citrique 0,35 Hématine 0,0005 Eau du robinet balance à 100 %. A cet effet on introduit dans le fermenteur 8 litres d'une solution aqueuse contenant ces constituants sauf le glucose et l'hématine et l'on stérilise la solution par chauffage à 1210C sous pression pendant 15 minutes. Le glucose est dissout dans de l'eau, à raison de 50- g par litre et sérilisé séparément. On refroidit ensuite la solution contenue dans le fermenteur à 250C et l'on introduit la solution aqueuse stérile de glucose dans le fermenteur. On ajuste le pH du mélange à 4,5 à l'aide d'une solution aqueuse stérile d'hydroxyde de sodium puis on ajoute l'hé o matine préalablement stérilisée à 121 C pendant 15 minutes en so- lution aqueuse alcaline. On introduit ensuite dans ce milieu nutritif 2 litres d'un inoculum obtenu par culture simergée en flacons de microplasmodia de Physarum polvcephalum pendant deux jours. Le milieu nutritif est brassé à l'aide d'un agitateur rotatif tournant à 150 tours/min. afin d'assurer une oxygénation suffisante du milieu, et maintenu à 250C. On poursuit ainsi la culture du microorganisme pendant 20 heures et l'on obtient un bouillon de culture contenant 1 %, en poids de matibre souche, de matiare cellulaire. On sépare ensuite le microplasmodia de Physarum polvcephalum du milieu nutritif aqueux par centrifugation et l'on recueille le surnageant. On mesure ensuite l'activité protéolytique de ce surnageant par la méthode dite "Azocoll". Cette méthode consiste à faire agir la solution dont on désire mesurer l'activité protéolytique sur un substrat appelé "Azocoll" constitué par une poudre insoluble de cuir de vache contenant un colorant rouge vif. Cette substance contient les innombrables liaisons peptidiques usuelles, caractéristiques des protéines. Lorsqu'un enzyme protéolytique exerce son action sur cette substance, le colorant rouge est libéré dans le milieu et la coloration de ce milieu permet de mesurer l'activité protéolytique de l'enzyme essayé. Le substrat "Azocoll" est mis en suspension dans un tampon acétate 0,05 M, à pH 4,5, à raison de 25 mg d'Azocoll pour 5 ml de tampon. Le surnageant est ajouté à une quantité donnée de cette suspension, le mélange est maintenu à 370C pendant 15 minutes, puis le substrat est éliminé par filtration. On mesure ensuite la densité optique de la solution obtenue, à une longueur d'onde de 510 nm. Une unité d'activité mesurée selon cette méthode est définie comme la quantité de produit enzymatique, c'est-à-dire de surnageant, provoquant un accroissement de la densité optique d'une unité. L'activité protéolytique du surnageant, ainsi mesurée, est de 0,7 unités par ml. Le produit doué d'activité enzymatique obtenu présente les caractéristiques suivantes - Influence du pH sur l'activité protéolytique L'étude de l'activité protéolytique effectuée dans une gamme de pH s'étendant de 3,0 à 7,0, a montré que cette activité est maximum entre pH 4,0 et pH 5,0 et décroît à moins de 15 % du maximum à pH 7,0. - Influence de la température sur l'activité L'activité protéolytique est constante de O à 300C puis décroît au-dessus de 300C pour devenir pratiquement nulle au-dessus de 600C. - Influence coagulante sur le lait Le mélange à 370C, à volumes égaux, du surnageant et d'un lait écrémé contenant 12 % de matibres solides provo que le caillage de celui-ci en 10 minutes. Un mélange effectué dans des conditions identiques avec un lait écrémé contenant 24 % de matiares solides provoque la coagulation de ce dernier en 4 minutes. Exemple 2 Le surnageant obtenu à l'exemple 1 est concentré par cryoconcentration; A cet effet on le refroidit afin de provoquer un début de solidification. La fraction non congelée, dont la concentration en matibres protéiques s'est accrue aux dépends de celle de la phase solidifiée, est recueillie et mélangée avec une solution tampon acétate 0,05 M, à pH 4,5. On obtient ainsi 1,5 1 d'une solution concentrée dont l'activité protéolytique, mesurée par la méthode "Azocoll" comme décrit dans l'exemple 1, est de 3,5 unités par ml. On précipite ensuite les protéines contenues dans la solution concentrée à l'aide de sulfate d'ammonium et l'on recueille par centrifugation le précipité formé. On dissout ensuite ce précipité dans une solution tampon acétate 0,05 M à pH 4,5 et l'on dialyse cette solution pendant 24 heures contre la même solution tampon. La solution obtenue est ensuite fractionnée par chromatographie par passage à travers une colonne de diéthylamino-éthyl-cellulose équilibrée à l'aide d'une solution tampon acétate 0,05 M contenant du chlorure de sodium à une concentration décinormale. L'élution est exécutée avec cette solution tampon, sous un débit de 50 ml/h. Chaque fraction éluée fait l'objet d'une mesure de densité optique à une longueur d'onde de 260 nm, ainsi que d'une détermination de l'activité protéolytique. L'élution.de l'enzyme protéolytique se traduit par 3 pics d'activité protéolytique trés prononcés, et l'on recueille les fractions correspondant à ces 3 pics d'élution. On étudie ensuite comparativement les modes d'action de la rennine et de chacune des fractions d'élution obtenues sur la kappa caséine. On sait que la rennine coupe spécifiquement la liaison phénylalanine-méthionine de la chaine peptidique de la kappa caséine. Si l'on fait agir la rennine sur la kappa caséine et si l'on ajoute de la carboxypeptidase A, la phénylalanine est libérée et peut être dosée. I1 convient d'ajouter que l'addition seule de carboxypeptidase ne provoque aucune libération de phénylalanine. Or l'action des fractions d'élution correspondant aux 3 pics d'activité protéolytique sur la kappa caséine, à raison d'une partie en poids de produit enzymatique pour 100 parties pondérales de substrat, suivie de l'action de la carboxypeptidase A, se traduit par la libération de phénylalanine. Ceci met en évidence la similarité des modes d'action de la rennine et du produit enzymatique obtenu vis-à-vis de la kappa caséine. Revendications 1. Procédé de production par biosynthbse d'un enzyme caillant le lait, caractérisé par le fait que l'on cultive un microorganisme de l'espace Physarum Polvcéphalum producteur de cet enzyme en conditions aérobies en présence d'un milieu nutritif aqueux jusqu'à l'accumulation d'une quantité substantielle de cet enzyme, puis que l'on sépare ledit enzyme du microorganisme. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on cultive ledit microorganisme en culture de surface et que l'on sépare l'enzyme du microorganisme par lavage. 3. Procédé'selon les revendications 1 et 2, caractérisé par le fait. que l'on sépare l'enzyme du microorganisme par lavage à l'aide d'une solution saline. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on cultive ledit microorganisme en conditions submergées, dans un milieu nutritif liquide et que l'on sépare le microorganisme du milieu nutritif liquide. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on recueille l'enzyme sous forme d'une solution aqueuse et que l'on concentre cette solution par cryoconcentration. 6. Enzyme obtenu par le procédé selon la revendication 1. 7. Utilisation de l'enzyme selon la revendication 6 pour le caillage du lait.