Brevet FR2187909A1 — publié le 19740118

La présente invention a trait à un procédé pour la préparation d'antigènes destinés à des réactions d'hémagglutination passive ainsi qu'aulx antigènes obtenus par ce procédé. I1 est connu depuis longtemps de fixer des antigènes sur des globules rouges, par exemple des globules rouges de mouton, afin d'effectuer des hémagglutinations passives dans des buts de tests, de contrôles ou de mesures. Ainsi, on a par exemple déjà préparé des antigènes de la fièvre aphteuse en les fixant sur des globules rouges de mouton après les avoir préalablement inactivés au formol. I1 n'a cependant pas été possible d'obtenir de bons résultats. En particulier, il n'a pas été possible de réaliser jusqu'S présent des antigènes pour l'hémagglutination qui conservent leur valeur antigénique pendant un temps suffisant, et de façon suffisamment constante pour permettre d'en faire des réactifs standardisés, utilisables sans précaution particulière et de façon massive par des opérateurs non spécialisés. La présente invention se propose de fournir un procédé de préparation d'antigènes pour I'hémagglutination-passive qui remédie à ces inconvénients et permette d'obtenir des antigènes possédant des qualités antigéniques constantes, sures, et ceci pendant des durées très longues. De plus, les antigènes préparés selon l'invention permettent de réaliser facilement des essais dthémagglutination dans des conditions n'exigeant pas de l'opérateur une rigueur opératoire excessive, ni des contrôles constants facilitant ainsi les opérations de contrôle et de diagnostic. L'invention a pour objet un procédé de préparation d'antigènes pour lthémagglutination passive, caractérisé par le fait que l'on inactive une préparation d'antigènes d'un type déterminé, qu'on effectue le pontage de ces antigènes sur des globules rouges et que l'on procède enfin à la lyophilisation des antigènes pontés. Alors qu'en général la lyophilisation des antigènes conduit à des résultats décevants, il s'est avéré de façon surprenante, que la lyophilisation des antigènes pontés procure une stabilité antigénique remarquable, probablement due à l'association de l'antigène avec le globule rouge de mouton dans le lyophilisat. Les globules rouges proviennent de préférence de mammifères notamment d'ovins, de bovins, et d'équins. Cependant, ils peuvent aussi, dans certains cas, provenir d'oiseaux tels que des gallinacés ou des anatidés. Selon une forme de réalisation particulièrement intéressante, on effectue la lyophilisation avec un substrat réalisé- par le mélange de deux solutions, la première étant une solution aqueuse contenant une partie en poids de peptone et cinq parties en poids de lactose, la seconde étant constituée par un tampon phosphate additionné d'un antiseptique convenable. Pour la lyopholisation, on utilise environ deux parties d'antigènes pontés sur globules rouges de mouton, pour une partie de substrat. Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement intéressant de l'invention, destiné à la préparation d'antigènes viraux, on effectue le pontage des antigènes sur des globules rouges de moutons en utilisant des dialdéhydes, notamment la glutaraldéhyde. Ce pontage peut s'effectuer directement pour les virus non enveloppés, tels que par exemple la fièvre aphteuse, les picorna-virus, le corysa du chat, la poliomiélyte, les adénovirus, l'hépatite contagieuse du chien. On lave alors de préférence les antigènes pontés à l'aide d'un tampon phosphate avant de procéder à la lyophilisation, éliminant ainsi les résidus de fonction alcool ou aldéhyde qui peuvent subsister, notamment en raison des moyens utilisés pour le pontage. Le pontage s'effectue après enlèvement de l'enveloppe pour les virus enveloppés tels que la rougeole, la grippe, la maladie de Carré, la rubéole, la maladie de Newcastle, la peste porcine, l'herpès, les pox virus et la rage. L'inactivation des virus s'effectue de préference à la 13-propiolactone. Le tween éther peut également être utilisé, notamment pour les virus enveloppés. Pour la préparation d'antigènes bactériens on utilise de préférence des extraits bactériens, notamment des parois que l'on ponte sur des globules rouges, notamment à l'aide d'un dialdéhyde tel que la glutaraldéhyde. Ce mode de mise en oeuvre est particulièrement intéressant pour la brucellose, la salmonellose et les colibacilles, le charbon, les staphylocoques, les streptocoques, les leptospires, les spirochètes, la diphtérie, la coqueluche et les rickettsies. L'invention est également applicable à la préparation d'antigènes de toxines telles que par exemple les toxines tétanique, diphtérique et botulinique. L'invention a également pour objet les antigènes pontés sur globules rouges et lyophilisés selon le procédé précité. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description non limitative suivante: I. Préparation d'antigènes aphteux. On prépare, par un procédé de culture quelconque, par exemple du type Frenkel, des antigènes aphteux de la souche C.Vosges 60. Ces antigènes sont concentrés puis purifiés par ultracentrifugation en gradient de saccharose. L'inactivation à la ss -propiolactone est effectuée avant la concentration. On prépare d'autre part une préparation de globules rouges de mouton et l'on effectue le pontage chimique de l'antigène purifié sur les hématies en solution de glutaraldéhyde à la température du laboratoire pendant une durée de l'ordre d'une heure. La concentration en glutaraldéhyde est de l'ordre de 0,2% à 1%. On effectue ensuite une centrifugation et le culot est lavé deux fois en tampon phosphate à pH 7,6 puis remis en suspension dans du tampon. On procède alors à la lyophilisation en présence d'un substrat formé par le mélange des solutions A et B suivantes: A- Lactose .............. 200 B- tampon phosphate Peptone .............. 40 un antiseptique Eau ................ QS pour 1 litre. On utilise une partie de substrat pour deux parties de couple virus-hématies. Les antigènes ainsi préparés et lyophilisés se conservent très longtemps et après une durée de 6 mois, on a obtenu, après remise en suspension dans de l'eau distillée, le même titre antigénique que celui obtenu avant lyophilisation. Ceci est un progrès considérable par rapport aux antigènes aphteux de référence classiques dont la stabilité n'excédait pas 1 à 2 semaines. Les antigènes lyophilisés ainsi préparés ont servi à t-st- des sérums de différentes espèces tels que les sérums de bovins, porcins, ovins, caprins, cobayes, rats et souris. Avant d'effectuer le test proprement dit le sérum est inactivé par chauffage à 560. Il est également traité prélablement par les hématies pour éliminer les agglutinines naturelles anti-mouton. On dispose ensuite dans un certain nombre de cupules contenant initialement toutes le même volume de tampon, des volumes identiques de dilution de sérum, les concentrations en sérum des dilutions étant variables d'une cupule à l'autre. De façon avantageuse, on prépare également un jeu de cupules témoins dont le contenu est chaque fois rigoureusement identique au contenu des cupules d'expérience. On dépose ensuite la même quantité d'antigènes anti-aphteux fixés sur un globule rouge, dans chaclme des cupules de la réaction. Dans les cupules témoins on dépose une quantité équivalente de globules rouges sans antigène. Après agitation on laisse les cupules à la température du laboratoire pendant environ 1 heure. La lecture se fait également à la température du laboratoire. Dans le cas d'une réaction très positive, on constate dans la cupule la formation d'une pastille dont les bords sont repliés en feston. Pour des réactions positives, on obtient des agglutinats macroscopiques plus larges ou pour le moins un film d'hématies assez homogène. Par contre, dans le cas d'une réaction négative, les globules rouges sont ramassés au centre du fond de la cupule en un petit anneau régulier. Des résultats similaires ont été obtenus pour des antigèn s aphteux selon l'invention préparés comme ci-dessus à partir des souches A Allier 60 et O Lausanne 65. II. Préparation d'antigènes adénovirus III bovins. On effectue d'une façon en soi connue, une culture d'adénovirus III bovins sur cellules de rein de veau Après récolte, on obtient une solution titrant entre 90 et 110 pg/ml de virus que lton inactive par adjonction de ss -propiolactone. On effectue ensuite le pontage sur globules rouges de mouton par adjonction de glutaraldéhyde la concentration finale en poids en glutaral déhyde étant de 07%. Après lavage au tampon phosphate on procède à la lyophilisation. Les antigènes obtenus sont remarquablement stables. III. Préparation d'antigènes de la maladie de Newcastle. On cultive le virus sur liquide allantoldien d'oeuf, d'une façon en soi connue et l'on récolte le virus. On sépare ensuite l'enveloppe du virus par adjonction de tween éther à 40C p-J'' une nuit. Le tween éther inactive simultanément les particules virales. On centrifuge pour éliminer le surnageant qui contient les enveloppes. Le culot contenant les virions est lavé. Le titre en virus est alors ê 80 vg/ml. Le pontage sur globules rouges de mouton s'effectue par adjonction de glutaraldéhyde avec une concentration finale de 0,5X. Après lavage au tampon phosphate on effectue la lyophilisation qui permet d'obtenir des antigènes très stables. IV. Préparation d'antigènes de la rage. On effectue une culture, en soi connue, de virus de la rage sur cellules NIL et on récolte le virus. On sépare ensuite les enveloppes par adjonction de tween éther et centrifugation comme dans III, ce qui permet également d'inactiver le virus. Dans une solution virale ainsi obtenue, titrant 150 ug/ml on effectue le pontage sur globules rouges dc mouton, la concentration finale en glutaraldéhyde étant de 0,8%. Après lavage du tampon phosphate on procède à la lyohilisation, obtenant ainsi des antigènes pontés très stables. V. Préparation d'antigènes Herpès virus bovin. On effectue, d'une façon en soi connue, une culture du virus sur cellules de rein de veau et on récolte le virus. Après action du tween éther, centrifugation et lavage comme dans III, on effectue le pontage sur globules rouges de mouton de la solution virale titrant 120 vg/ml par adjonction de glutaraldéhyde avec une concentration finale de 0,8%. Après lavage en tampon phosphate et lyophilisation, on obtient des antigènes pontés extrêmement stables. R E V E t; D I C A T I O N S 1. Procédé de préparation d'^ntigènes pour I 'hénagglutina- tin passive, caractérisé par le fait que l'cn inactive une préparation d'antigènes d'un type déterminé, qu'on effectue le pontage de ces antigènes sur des globules rouges et que l'on procède enfin à la lyophilisation des antigènes pontés. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les globules rouges proviennent de mammifères, de gallinacés ou d'anatidc-s. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que les globules rouges proviennent de moutons. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on effectue la lyophilisation avec un substrat réalisé par le mélange de deux solutions, la première étant une solution aqueuse contenant environ une partie en poids de peptone et environ cinq parties en poids de lactose 5 la seconde étant constituée par un tampon phosphate additionné d'un antiseptique, la lyophilisation s'effectuant avec environ deux parties d'un antigène ponté pour une partie de substrat. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que pour la préparation d'antigènes viraux on effectue le pontage sur les globules rouges en utilisant un di aldéhyde. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'on utilise le glutaraldéhyde pour effectuer le pontage. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5 caractérisé par le fait que pour préparer des antigènes de virus non enveloppe, on effectue le pontage directement sur les particules virales inactivées. 8. Preedé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que pour la préparation d'antigènes de virus enveloppé, l'on enlève l'enveloppe duvirus avant le pontage. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on effectue la séparation de l'enveloppe par action du tween éther. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que l'on utilise comme antigène un virus de la fièvre aphteuse. 11.Procéd selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que l'on utilise les antigènes choisis dans le groupe formé par les picorna-virus et les adénovirus. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé par le fait que lton utilise un antigène choisi dans le groupe formé par la rougeole, la grippe, la maladie de Carré, la rubéole, la maladie de Newcastle, la peste porcine, l'herpès les pox-virus et la rage. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, caractérisé par le fait que lton inactive le virus à la ss -propiolactone ou au tween éther. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que pour réaliser des antigènes bactériens, on utilise des extraits de bactériens, notamment des parois. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on utilise des extraits d'antigènes choisis dans le groupe formé par la brucellose, la salmonellose, les colibacilles, le charbon, les staphylocoques, les streptocoques, les leptospires, les spirochètes, la diphtérie, la coqueluche et les rickettsies. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on utilise comme antigène une toxine choisie dans le groupe formé par les toxines tétanique, diphterique et botulinique. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé par le fait que l'on inactive les antigènes à la 8-propiolactone. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé par le fait que l'on effectue le pontage à l'aide d'un dialdéhyde, notamment le glutaraldéhyde. 19. Antigènes pontés sur globules rouges et lyophilisés obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 18.