Brevet FR2150472A1 — publié le 19730406

La présente invention concerne un procédé de fermentation pour convertir le méthane en substances du type protéique . En particulier , l'invention concerne un procédé continu pour la production de micro-organismes utilisant le méthane comme substrat carboné On a décrit des procédés pour la produc tion de micro-organismes dans lesquels on cultive un micro-or ganisme utilisant le méthane dans un bouillon aqueux contenant des sels nutritifs , en présence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène libre .Dans lesdits procédés, on a utilisé comme substrat azoté des nitrates , des sels d'ammonium , par exemple le chlorure ou le sulfate d'ammonium , ou encore l'ammoniac ou lthydroxyde d'ammonium Dans le cadre de l'invention, la demande resse a maintenant trouvé que, dans des procédés continus l'utilisation des ions ammonium comme substrat azoté a pour conséquence une diminution de la vitesse de croissance des micro-organismes utilisant le méthane qui aboutit finalement à un épuisement du micro-organisme à moins de prendre les mesures particulières trouvées selon l'invention et décrites en détail comme suit. Selon l'invention, on propose par suite un procédé continu pour convertir le méthane en substances du type protéique qui consiste à Ül-iver un micro-organisme utilisant le méthane en continu dans des conditions stationnaires à une vitesse de production d'au moins 0,81 g ( poids sec ) de micro-organisme par litre et par heure dans un bouillon aqueux contenant des sels nutritifs et des ions ammonium , en présence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène libre , le pH du bouillon étant maintenu dans l'intervalle de 4,5 à 8,0 et la concentration en ion ammonium étant maintenue dans l'intervalle de 2 à 100 mg/l Le procédé de l'invention est fondé sur la découverte effectuée par le demanderesse que , dans une culture continue aux vitesses de production élevées, par exemple dans l'intervalle de 0,81 à 5,0 g ( poids sec ) de micro-organismes par litre et par heure, la concentration maximale en ion ammo nium que les micro-organismes utilisant le méthane puissent tolérer dans le bouillon est d'environ 100 mg/l. La demanderesse a trouvé que , dans les procédés pour la culture continue d'un micr-organisme utilisant le méthane à des taux de dilution donnés, la présence dans le bouillon de concentrations en ion ammonium au-dessus de certains niveaux critiques a pour effet d'abaisser suffisamment la vitesse de croissance spécifique pour entratner 1' "épuisement" de la culture De préférence, la quantité d'ions ammonium ne doit pas être supérieure à 80 mg/l et on doit la maintenir dans l'intervalle de 2 à 50 mg/l .En dessous d'une valeur de 2 mg/l pour ladite quantité d'ions ammonium, on considère que la croissance doit être limitée par manque d'azote ammoniacal , mais ladite valeur n'a pas été difinie avec précision et elle n'indique que la limite de détection par les méthodes utilisées pour l'évaluation des ions ammonium . Dans la mise en oeuvre du procédé , la plus grande partie des ions ammonium ajoutés au bouillon aqueux , de préférence sous forme d'ammoniac ou d'hydroxyde d'ammonium, sont utilisés immédiatement par les micro-organismes . On règle ensuite la quantité des ions ammonium restants dans l'intervalle requis .En pratique, on met couramment en oeuvre le procédé à une eoncentration en ion ammonium d'environ 10 à 30 mg/ 1 On peut évaluer la concentration en ion ammonium dans le bouillon en effectuant un prélèvement sur le bouillon à divers intervalles , suivi d'une détermination chimique quantitative des ions ammonium . Par exemple , des méthodes colorimétriques convenables à cet effet , fondées sur la Nesslérisation sont décrites par Paul J. (1958) dans the Analyst, vol. 83, p. )7-42 et par Meynell, G.G. et Meynell, E. (1965) Theory and Practice in Experimental Bacteriology, Cambridge University Press. D'une manière différente , on peut utiliser une sonde , de préférence une "sonde ammoniacale" en combinaison avec un pH-mètre pour déterminer en continu ou d'une manière discontinue le concentration en ion ammonium dans le bouillon . Ladite sonde et ledit appareil de mesure sont mis le commerce par la firme anglaise Electronic Instruments Ltd. De préférence , on fournit les ions ammonium en ajoutant au bouillon de l'ammoniac ou de l'hydroxyde d'ammonium D'une manière convenable , on peut mettre en oeuvre le procédé en utilisant l'une ou l'autre des techniques suivantes (a) en restreignant le pH du milieu nutritif aqueux ajouté au bouillon et eri réglant le pH du bouillon par addition d'ions ammonium en réponse aux variations de pH du bouillon . Le pH du milieu aqueux ajouté au bouillon est tel que la concentration résultante en ion hydrogène dans le bouillon n'exige pas la présence de plus de 100 mg/l d'ions ammonium pour le réglage du pH ou (b) en maintenant une concentration en ion ammonium dans le bouillon dans l'intervalle de 2 à 100 mg/l en réponse aux données de détermination de la concentration dans le bouillon .On règle le pH du bouillon par addition d'un alcali différent de l'ammoniac ou de l'hydroxyde d'ammonium ou par addition d'un acide Lorsqu'on utilise de l'ammoniac ou de l'hydroxyde d'ammonium à la fois comme substrat azoté et comme seul agent de réglage du pH du bouillon , selon la technique (a) définie ci-dessus , le milieu nutritif aqueux ajouté au bouillon doit avoir un pH inférieur à 7,5 et doit avoir une valeur suffisamment inférieure à celle du pH du bouillon de sorte que la concentration en ions hydrogène résultante dans le bouillon soittelle que la quantité d'ions ammonium requise à tout instant donné pour le réglage du pH du bouillon ne soit pas supérieure à 100 mg/l. Le pH du milieu aqueux est en général compris dans l'intervalle de 1,0 à 7,5 et , dans les cas les plus pratiques , il est compris dans l'intervalle de 2,0 à 3,5 On peut choisir le milieu aqueux parmi ou d'après tous les milieux connus utilisés dans les fermenta tions du méthane à partir desquels tout ou partie de la source d'azote a été omise. On doit régler la quantité de chacun des ingrédients nutritifs de manière à assurer au milieu la possibi lité de supporter une croissance sans restriction du micro organisme à la vitesse désirée. Le pH naturel du milieu dépend de la composition des sels nutritifs et il peut litre trop élevé ou trop faible pour le but de l'invention , d'où en conséquence un acide ou un alcali peut hêtre nécessaire pour amener ledit milieu à son pH désiré . Le pH d'un milieu contenant des sels formés par le phosphate de sodium ou le phosphate de potassium comme source de phosphate peut être trop élevé et il est alors nécessaire d'ajouter un acide , par exemple de l'acide sulfurique ou de l'acide phosphorique. Par ailleurs, le pH d'un milieu contenant de l'acide phosphorique comme source de phosphate peut litre trop faible et il peut être nécessaire dans ce cas d'ajouter un alcali, par exemple de l'hydroxyde de sodium. La valeur du pH du milieu qui est nécessaire dépend de la densité de cellules et du pH auquel on désire mette en oeuvre la fermentation . La densité de cellules peut dépendre , par exemple , de la vitesse de transfert de l'oxygène lorsque l'oxygène est l'agent nutritif limite à un taux de dilution donné ou de la vitesse de transfert du méthane lorsque le méthane est l'agent nutritif limite .On peut déterminer le pH précis nécessaire d'une manière empirique par des expériences simples pour chaque série particulière des conditions de fermentation D'une manière convenable, on peut ajouter l'ammoniac ou l'hydroxyde d'ammonium au bouillon en réponse à un appareil de titrage automatique qui comprend une électrode de mesure des variations de pH du bouillon et des dispositifs pour l'addition de l'ammoniac oude l'hydroxyde d'ammonium au bouillon en réponse auxdites variations de manière à maintenir un pH de fermentation désiré La quantité d 'ammoniac ou d'hydroxyde d'ammonium ajoutée de la manière précitée est égale à la somme de la quantité d'ions ammonium requise pour une croissance non restreinte du micro-organisme et la quantité requise pour le réglage du pH du bouillon par neutralisation des ions hydrogène en excès provenant du milieu aqueux ajouté au bouillon en vue de la nutrition Lorsqu'on désire utiliser un milieu nutritif aqueux sans la restriction de pH précité , on peut utiliser la technique (b) décrite ci-dessus . Ladite technique comprend le maintien du pH du bouillon dans l'intervalle de 4,5 à 8,0 par addition d'un acide ou d'un alcali différent de l'ammoniac ou de l'hydroxyde d'ammonium et le maintien de la concentration en ion ammonium du bouillon dans l'intervalle de 2 à 100 mg/l, de préférence , par addition d'ammoniac ou d'hydroxyde d'ammonium, en réponse aux données de la détermination de la concentration des ions ammonium dans le bouillon On peut déterminer la concentration en ion ammonium du bouillon selon les méthodes décrites ci-dessus. On peut ajouter l'hydroxyde d'ammonium au milieu ou au bouillon , de préférence par une pompe, telle que par exemple une pompe dose use courante , le débit de la pompe étant réglé soit par voie manuelle soit par voie automatique en réponse à la concentration en ion ammonium évaluée dans le bouillon . On peut alimenter le milieu ou le bouillon d'une manière dosée en ammoniac liquide ou gazeux au moyen d'un débit-mètre courant L'alcali différent de l'ammoniac ou de l'hydroxyde d'ammonium que l'on peut utiliser pour régler le pH du bouillon peut être un hydroxyde d'un métal alcalin , par exemple,l'hydroxyde de sodium.Des acides convenables sont, par exemple , l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique La technique précitée facilite l'utilisation d'un milieu ayant un pH quelconque, toutefois on préfère un milieu ayant un pH inférieur à 4,0 de manière à maintenir les sels minéraux en solution De la manière la plus convenable lorsqu'on met en euvre le procédé selon l'une ou l'autre des techniques précitées, la limite supérieure du pH du bouillon est de 7,5 et, de préférence , elle est située dans l'intervalle de 5,0 à 7,0 La température opératoire peut être comprise dans l'intervalle de 30 à 480c . Lorsqu'on utilise Methylococcus capsulatus, on préfère opérer à un pH dans l'intervalle de 6,0 à 7,0 et à une température dans l'intervalle d'environ 42 à environ 48"G. On met normalement en oeuvre le procédé sous pression atmosphérique mais on peut toutefois utiliser des pressions s'élevant jusqu a environ 3,51 kg/cm2 manométriques. Normalement, la proportion des constituants gazeux utilisant des mélanges d'air-méthane doit avoir une teneur en oxygène d'environ 10 à 19% et , de préférence d'environ 16 à 18% en volume , avec une teneur en méthane d'environ 10 à 50% et, de préférence, de 15 à 25% en volume . Le méthane peut litre présent dans les gaz contenant du méthane , par exemple , en tant que gaz naturel . On peut utiliser des gaz enrichis d'oxygène tels que de l'air enrichi d'oxygène Les conditions dans lesquelles on peut mettre en oeuvre le procédé de l'invention sont sélectives pour les micro-organismes utilisant le méthane. I1 n'est pas nécessaire d'utiliser des techniques de fermentations aseptiques et, principalement pour des raisons économiques, on préfère recourir à ureopération non aseptique. On peut séparer les micro-organismes à partir du bouillon de culture par des techniques connues telles que la centrifugation et/ou la filtration que l'on peut combiner avec un stade de floculation. On peut obtenir les micro-organismes utilisant le méthane en utilisant l'une quelconque des techniques d'isolement connues pour ce type de micro-organismes . Des techniques convenables à cet effet sont décrites par Sheehan et Johnson dans Applied Microbiology" Vol. 21, No. 3, 1971 p. 511-515 ou par Whittenbury dans the Journal of General Microbiology, 1970, Vol. 60 p. 205-208. Methylcoccus capsulatus est la bactérie préférée. Les techniques d'enrichissement constituent une voie particulièrement convenable pour l'obtention de population microbiennes contenant des micro-organismes utilisant le méthane en vue de leur utilisation dans le procédé de l'invention. L'invention est illustrée ci-après avec plus de détails par des exemples nullement destinés à la limiter dans son cadre et son esprit, dans lesquels les taux de dilution s'entendent par heure. EXEMPLE 1 Stade A: Méthode pour obtenir une culture de hactéries utilisant le méthane en vue de leur utilisation dans le procédé de l'invention On ajoute des suspensions de 530 ml de boue contenant du méthane provenant de bassins stagnants , à intervalles quotidiens pendant 5 jours, à un fermenteur agité, aéré, qui a un volume opératoire de 3,0 litres et qui contient 3,0 litres d'un milieu aqueux ayant la composition suivante:: KH2P04 P04 1600 mg/l Na2HP04.12H20 2928,0 mg/l NaNO3 1180,0 mg/l MgS04-7 H20 80,0 mg/1 FeSO4.4 H20 14,0 mg/l Ca(NO)2.4 H20 25,0 mg/l CuS04.5 H20 4,0 mg/l ZnS04.7 H20 0,34 mg/l MnS04.H20 0,30 mg/l NaMo0.2 H20 0,24 mg/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 6,2 On maintient le fermenteur à une température de 450C , un taux de dilution de 0,084 par heure et une vitesse d'agitateur de 1000 tours par minute On maintient le pH à 6,7 par l'addition d'hydroxyde de sodium o,5 N sel.tn les besoins .On envoie un mélange gazeux , constitué de 33 en volume de méthane, 64% en volume d'air et 30 en volume d'anydride carbonique , par l'orifice d'admission du fermenteur au débit de 20 volumes/volume. heure On laisse se développer naturellement une po.pulation bactérienne utilisant le méthane dans lesdites conditions sélectives Après une opération pendant 7 jours utilisant ledit milieu dans les conditions précitées, la population bactérienne atteint une densité de cellules de XOg (poids sec) et elle a la composition suivante . Seule une souche de bactérie utilisant le méthane peut être isolée à partir de ladite population . Les autres types de bactéries ne sont pas susceptibles d'utiliser le méthane . La proportion de bactéries utilisant le méthane par rapport aux autres types de bactéries est d'environ 90 à 95 en nombre . La bactérie utilisant le méthane est un coccus ayant un diamètre d'environ 1,1 à 1,4 .Ladite bactérie forme une capsule et elle est capable d'utiliser aussi bien le méthane que le méthanol mais non pas le glucose . Sur milieu solide , préparé par addition de 1,0% en poids/volume de gélose au milieu de fermentation décrit unitialement, après incubation pendant 3-4 jours à 45 C sous une atmosphère de méthane-air (50-50 en volume ) , les colonies ont la morphologie suivante . Le diamètre est d'environ 1-2 mm et l'aspect est blanc, lisse et arrondi . Lesdites caractéristiques sont conformes à tous égards -à celles d'une souche de Methylococcus capsulatus décrite par J.W. Foster et R.H. Davis (1966) Journal of Bacteriology, Vol. 91, p. 1924 et par R. Wittenbury, K.C. Phillips et J.F. Wilkinson ( 1970 ) , Journal of General Microbiology, Vol. 61, p. 205. Stade B: Stade intermédiaire pour accrottre la densité oellu- laire en vue d'une opération stationnaire On utilise 3,0 1 du bouillon de culture contenant la population bactérienne utilisant le méthane, obtenu selon le stade A , pour déclencher le fonctionnement d'un fermenteur agité , mis en oeuvre en continu , ayant un volume opératoire de 3,0 1 .On alimente le fermenteur en continu avec un milieu aqueux ayant la composition suivante NH2P04 355,0 mg/l Na2HPO4.12H20 277,5 mg/l NaNO3 1193,8 mg/l MgS04.7H20 160,0 mg/l Ca(N03)2.4H0 90,0 mg/l CuS04.5H20 4,6 mg/l FeS04.7H20 14,5 mg/l ZnS04.7H0 0,6 mg/l MnSO4.H2O 0,8 mg/l CoC12.6H20 0,03 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,3 mg/l H2S04 (36 N ) 0,34 ml/l HNO3 (13,6 N ) 3,1 ml/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 1,3 On maintient le fermenteur à une tempéra ture de 450C, au taux de dilution de 0,18 et à une vitesse d'a gitateur de 1500 tr/mn .On applique au fermenteur un débit gazeux de 30 volumes/volume . heure . Ledit gaz comprend 20 en volume de méthane et 80 en volume d'air . Après une période initiale de quelques minutes au cours de laquelle on règle le pH avec NaOH 1,0 N , on règle ensuite le pH à 6,0 par l'addition de H2S04 1,0 N ou NaOH 1,0 N selon les besoins à partir d'un appareil de titrage automatique . On met en oeuvre la fermentation jusqu'à ce que la densité cellulaire soit d'environ 7,0 g ( poids sec) par litre .On change ensuite le milieu pour le remplacer par le milieu de composition suivante H3P04 722,5 mg/l MgSO4.7H0 375,0 mg/l KC1 250,0 mg/l FeS04.7H20 37,5 mg/l CaCl2 75,0 mg/l CuS04.5H20 15,0 mg/l znSO4.7H20 2,25 mg/l MnS04.H20 0,75 mg/l Na2MoO4.2O 1,0 mg/l CoCl2.6H20 0,35 mg/l NaOH 250,0 mg/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 3,0 Stade C: Opération stationnaire utilisant de l'hydroxyde d'ammonium comme source d'azote et en même temps pour régler le pH du bouillon On règle le pH à 6,0 par l'addition d'hydroxyde d'ammonium 1,1 N à partir d'un appareil de titrage automatique en réponse aux variations de pH dans le bouillon. On met en oeuvre la fermentation dans les conditions stationnaires pendant une durée minimale de 7 jours . La densité cellulaire se stabilise dans ces conditions à environ 5,0 g par litre en donnant un taux de production de cellules d'environ 0,9 g ( poids sec ) par litre et par heure . Le facteur de rendement sur le méthane , c'est-à-dire le poids des cellules produites ( poids sec ) par poids unitaire de méthane consommé dans la fermentation est de 0,66. Le facteur de rendement sur l'oxygène est de 0,21. Les résultats suivants sont typiques de ceux que l'on obtient pendant ladite expérience Alimentation Densité Concentçation de NH en excès Durée en milieu cellulaire dans lé bouillon (heures) (ml/heure) (g/l) (mg/litre) 0 510 4,9 16,2 12 " 5,1 7,5 24 " 4,9 12,3 36 " 5,0 10,9 48 " 5,2 9,2 60 " 5,1 20,3 4,9 31,7 Concentration de NH4+ en excès Alimentation Densité Durée en milieu cellulaire dans le bouillon (heures) (ml/heure) (g/l) (mg/litre) 84 " 5,0 25,5 96 " 5,0 18,4 On détermine la concentration d'ion ammonium en excès dans des échantillons de 10 ml de billon en utilisant une technique colorimétrique Les résultats précités démontrent le fait qu'en utilisant un milieu ayant une valeur de pH précise conçue d'une manière spécifique pour une fermentation dans des conditions stationnaires précises , l'acidité en excès dans le bouillon de fermentation est limitée à un niveau qui n'exige seulement qu'une neutralisation très limitée par l'hydroxyde d 'ammonium . Ladite quantité d'hydroxyde d'ammonium entrasse la formation d'une concentration d'ions ammonium en excès dans le bouillon qui est normalement comprise entre 7,5 et 31,7 mg/l. Le totalité d'hydroxyde d'ammonium ajoutée à la fermentation est immédiatement utilisée comme source d'azote pour le croissance de culture bactérienne utilisant le méthane EXEMPLE 2 On utilise 3,0 1 du billon dé culture contenant la population bactérienne utilisant le méthane obtenu suivant les stades A et B d'isolement et d'accroissement de la densité cellulaire de l'exemple 1 , pour'déclencher le ronctionnement d'un fermenteur de production mis en oeuvre en continu , ayant un volume opératoire de 3,0 1.On alimente en continu le fermenteur au moyen d'un milieu aqueux ayant la composition suivante KH2P04 355,0 mg/l Na2HP04-12H20 277,5 mg/l MgS04.7H20 200,0 mg/l CaC12 50,0 mg/l NaSO4 (anhydre ) 500,0 mg/l ZnSO4.7IO 5,0 mg/l CuSO4.5H2O 2,0 mg/l MnSO4.H2O 0,2 mg/l NaMoO4-2H20 3,0 mg/l CoC12.6H20 0,01 mg/l FeS04.7H20 5,0 mg/l H2S04 2,3 milliéquiva lents /1 Eau déminéralisée qsp 1 litre pH 3,1 Stade C:Opération stationnaire utilisant l'hydroxyde d'ammo nium comme source d'azote et , en meme temps , pour régler le pH du bouillon On maintient le fermenteur à une température de 4500 , avec un taux de dilution de 0,18 et une vitesse d'agitateur de 1500tr/mn . On applique au fermenteur un débit gazeux de 30 volumes/volume . heure . Le gaz comprend 20 en volume de méthane et 80,; en volume d'air On règle le pH à 6 par l'addition d'hydroxyde d'ammonium 1,1 N , selon les besoins . On met en oeuvre la fermentation dans des conditions stationnaires pendant 7 jours . La densité cellulaire dans ces conditions est de 4,5 g/l avec un taux de production de cellules bactdriennes de 0,81 g ( poids sec ) par litre et par heure .Le facteur de rendement par rapport au méthane , c'est-à-dire le poids des cellules produites ( poids sec ) par unité de poids de méthane d'alimentation dans le fermenteur est de 0,66 Le facteur de rendement par rapport à l'oxygène est de 0,21 En ajoutant au bouillon un milieu nutritif aqueux ayant un pH de 3,1 et contenant 2,3 milliéquivalents par litre d'acide sulfurique à un taux de dilution de 0,18 par heure , la concentration en ion hydrogène résultante dans la phase aqueuse est telle que la quantité d'ions ammonium requise dans la phase aqueuse à tout moment donné pour régler le pH à la valeur de 6 dans une opération continue stationnaire, varie dans l'intervalle de 5,0 à 50 mg/l . L'hydroxyde d'ammo nium est utilisé en même temps comme source d'azote et comme agent de réglage du pH du bouillon. EXEMPLE 3 Stade B: Stade intermédiaire pour accroStre la densité cellulaire en vue d'une opération stationnaire On utilise 5,0 1 de bouillon de culture contenant la polulation bactérienne utilisant le méthane obtenue selon le stade A de l'exemple 1, pour déclencher le fonctionnement d'un fermenteur agité opérant en continu, ayant un volume opératoire de 5,0 litres .On alimente en continu le fermenteur avec un milieu ayant la composition suivante KH2 P04 782,0 mg/l Na2HPO4.l2O 647,5 mggl NaNO3 2785,5 mg/l MgS04.7H20 373,0 mg/l Ca(N03)2.4H20 210,0 mg/l CuSO,SH20 10,6 mg/l FeS04.7H20 33,8 mg/l ZnSO4.7H2O 1,3 mg/l MnSO4 .H20 1,8 mg/l CoC12.6H20 0,06 mg/l Na2MoO4.2O 0,75 mg/l H2S04 (36 N ) 0,8 ml/l HN03 (13,6 N ) 7,3 ml/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 1,3 On fait fonctionner le fermenteur à une température de 45 C , un taux de dilution de 0,18 h-1 et une vitesse d'agitateur de 3000 tr/mn .On applique à l'orifice d'entrée du fermenteur un débit gazeux de 66 volumes/volume heure . Le gaz comprend 18,2% en volume de méthane et 81,8 % en volume d'air . On règle le pH à 6,1 et ensuite , on poursuit son réglage à ladite valeur de 6,1 par l'addition d'une solution de H2S04 1,0 N ou de NaOH 1,0 N , selon les besoins , à partir d'un appareil de titrage automatique Dans lesdites conditions , la densité cellulaire augmente graduellement jusqu a environ 14 g ( poids sec) par litre .A ce moment, on remplace le milieu précité par le milieu suivant KH2P 4 937,5 mg/l Na2HPO4.12H2O 787,5 mg/l MgSO4.7H20 562,5 mg/l FeSO4.7H2O 50,6 mg/l CaCl2 112,5 mg/l CuS04.5H20 20,5 mg/l ZnSO4.7H2O 2,5 mg/l MflSO4 H20 1,7 mg/l Na2MoO4.2H2O 1,5 mg/l CoC12.6H20 0,5 mg/l Na2S 4 225,0 mg/l H2S04 (36 N ) 0,2 ml/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 2,6 Stade C:Opération stationnaire utilisant de l'hydroxyde d'ammonium en meame temps comme source d'azote et pour le réglage du pH du bouillon On règle le pH du bouillon de fermentation à 6,1 par l'addition d'une solution de HH4OH 1,1 N à partir d'un appareil de titrage automatique en réponse aux variations de pH du bouillon . L'hydroxyde d'ammonium sert en même temps de source d'azote pour la croissance et d'agent de neutralisation. Dans ces conditions, la densité cellulaire se stabilise à environ 14 g , en poids , par litre . On met en oeuvre la fermentation dans des conditions stationnaires pendant une durée minimale de 7 jours . Le taux de production bactérienne est d'environ 2,5 g, en poids sec, de cellules produites par litre et par heure . On détermine la concentration d'ion ammonium en excès dans le bouillon selon la technique décrite à l'exemple 2. Les résultats suivants sont typiques de ceux que l'on obtient pendant ladite expérience Concentration de Alimentation Densité NH4+ en excès Durée en milieu cellulaire dans le bouillon (heures) (ml/heure) (g/l) (mg/litre ) 0 820 14,1 14,4 12 " 14,0 11,5 24 n 14,1 9,2 36 " 14,0 10,4 48 " 14,0 18,3 60 " 14,1 17,6 72 " 14,2 20,4 84 " 14,1 21,2 96 " 14,0 18,5 EXEMPLE 4 Stade B : Stade intermédiaire pour accroStre la densité cellulaire én vue d'une opération stationnaire On utilise 5,0 1 d'un bouillon de culture contenant la population bactérienne assimilant le méthane obtenue suivant le stade A de l'exemple 1, pour déclencher le fonctionnement d'un fermenteur agité opérant en continu , ayant un volume opératoire de 5,0 1.On alimente en continu le fermenteur au moyen d'un milieu aqueux ayant la composition suivante KH2P04 782,0 mg/l Na2HP04-12H2 647,5 mg/l NaNO3 2785,5 mg/l MgSO4.7H2O 373,0 mg/l Ca(N03)2.4H20 210,0 mg/l CuS04.5H20 10,6 mg/l FeSO4.7H2O 33,8 mg/l ZnSO4 .7O 1,3 mg/l MnSO4.H2O 1,8 mg/l CoC12.6H20 o,o6 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,75 mg/l H2S04 (36 N ) 0,8 ml/l HN03 (13,6 N ) 7,3 ml/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 1,3 On fait fonctionner le fermenteur à une température de 4500 , un taux de dilution de 0,10 h-1 et une vitesse d'agitateur de 3000 tr/mn .On applique à l'orifice du fermenteur un débit gazeux de 66 volumes/volume . heure Le gaz comprend 18,2% en volume de méthane et 81,8% en volume d'air . On règle le pH à 6,1 et on poursuit ensuite son réglage à ladite valeur de 6,1 par l'addition d'une solution de H2S04 1,0 N ou d' NaOH 1,0 N ( selon les besoins ) à partir d'un appareil de tritrage automatique. Dans lesdites conditions , la densité cellulaire croît graduellement jusqu'à environ 25 g ( poids sec ) par litre . A ce moment, on remplace le milieu précité par le milieu de composition suivante KH2PO4 1875,0 mg/l Na2HPO4.12H2O 1575,0 mg/l MgSO4.710 1125,0 mg/lp FeSO4.7H2O 101,4 mg/l C8CS2 225,0 mg/l CuSO4.5H2O 41,0 mg/l ZnSO4 .7H20 5,0 mg/l MnS04 .H2O 3,4 mg/l Na2MoO4 .2H20 2,9 mg/l CoC12.6h20 1,0 mg/l Na2S 4 450,0 mg/l H2S04 (36 N ) 0,4 ml/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 2,3 Stade C:Opération stationnaire utilisant de l'hydroxyde d'ammonium en même temps comme source d'azote et pour régler le pH du bouillon On règle le pH du bouillon de ferment a tion à 6,1 par l'addition d'une solution de NH4OH 1,1 N à partir d'un appareil de titrage automatique en réponse aux variations de pH dans le bouillon . L'hydroxyde d'ammonium sert en même temps de source d'azote pour la croissance d'agent de neutralisation La densité cellulaire dans lesdites conditions se stabilisant à environ de 25,0 g (poids sec ) par litre . On met en oeuvre la fermentation dans des conditions stationnaires pendant une durée minimale de 7 jours . Le taux de production bactérienne est d'environ 2,5 g ( poids sec ) de cellules produites par litre et par heure .On détermine la concentration d'ion ammonium en excès dans le bouillon par une technique colorimétrique Les résultats suivants sont typiques de ceux que l'on obtient pendant ladite expérience Concentration de NH4+ en excès Alimentation Densité dans le bouillon Durée en milieu cellulaire (heures) (ml/heure) (g/l) (mg/litre ) 0 415 25,0 21,6 12 " 25,0 22,0 24 " 24,5 18,0 36 ,. 25,0 19,5 48 " 25,5 17,2 60 " 25,0 22,0 72 " 24,5 25,0 84 TT 25,0 30,0 EXEMPLE 5 Stade A:Méthode pour obtenir une culture de bactéries utilisant le méthane , en vue de son application dans le procédé de l'invention On ajoute des suspensions de 500 ml d'une boue contenant du méthane provenant de bassins stagnants , à in tervalles journaliers pendant 5 jours à un fermenteur agité aéré .Ledit fermenteur a un volume opératoire de 5,0 1 et contient 5,0 1 d'un milieu auqueux ayant la composition suivante: KH2P04 1600,0 mg/l NaHPO4.12H2O 2928,0 mg/l NaNO3 1180,0 mg/l MgS04 .710 80,0 mg/l FeSO4.7H2O 14,0 mg/l Ca (NO3 )2.4H20 25,0 mg/l CuS04.5H20 4,0 mg/l ZnS047H20 0,34 mg/l Mins04 H20 0,30 mg/l Na2Mo04.2H20 0,24 mB/1 Eau déminéralisée qsp 1 litre pH 6,25 On maintient le fermenteur à une température de 450C , au taux de dilution de 0,084 par heure et une vitesse d'agitateur de 1000 tr/mn On maintient le pH à 6,75 par l'addition dthydro- xyde de sodium 0,5 N selon les besoins .On applique à 11 orifice du fermenteur un mélange gazeux comprenant 33% en volume de méthane , 64% en volume d'air et 3% en volume d'anhydride carbonique , au débit de 20 volumes/volume . heure On laisse se développer naturellement une popula tion bactérienne utilisant du méthane dans lesdites conditions sélectives .Après une opération pendant 7 jours en utilisant ledit milieu dans les conditions précitées > la population bactérienne atteint une densité cellulaire de 1,10 g ( poids sec) par litre et elle a la composition suivante . On ne peut isoler qu'une seule souche de bactérie utilisant du méthane à partir de ladite population . Les autres types de bactéries ne sont pas susceptibles d'utiliser le méthane .La proportion de bactéries utilisant le méthane par rapport aux autres types de bactéries est d'environ 90 à 95% en nombre . La bactérie utiliaant le méthane est un coccus ayant un diamètre d'environ 1,1 à 1,4 p. Elle forme une capsule et est capable d'utiliser à la fois le méthane et le méthanol mais non pas le glucose . Sur un milieu solide , préparé en ajoutant 1,0% en poids/volume de gélose au milieu de fermentation décrit initialement , après une incu bation pendant 3-4 jours à 45"C sous une atmosphère de méthane-air ( 50-50 en volume ) , les colonies ont la morphologie suivante Le diamètre dst d'environ 1-2 mm et l'aspect est blanc, lisse et arrondi . Lesdites caractéristiques concordent à tous égards avec celles d'une souche de Methylococcus capsulatus décrite par J.W. Foster et R.H. Davis (1955) J. Bact. Vol. 91, 1924 et R. Whittenbury , K.C. Phillips et J.F. Wilkinson (1970) J. Gen. Microbiology , Vol. 61, 205. Stade B: Stade intermédiaire pour accrottre la densité cellulaire en vue d'une opération stationnaire On utilise les 5,0 1 du bouillon de culture contenant la population bactérienne utilisant le méthane obtens de manière précitée, pour déclencher le fonctionnement d'un fermenteur de production opérant en continu , ayant un volume opératoire de 5,0 1.On alimente en continu le fermen teur au moyen d'un milieu aqueux ayant le composition suivante KH2PO4 937,5 mg/l Na2HPO4.12H2O 787,5 mg/l MgSO4.7H2O 562,5 mg/l H2S04 706,0 mg/l CaC12 (anhydre ) 112,5 mg/l FeSO4.7H2O 42,7 mg/l Na2SO4 (anhydre) 225,0 mg/l CuSO4.5H2O 20,5 mg/l ZnSO4.7H2O 2,5 mg/l Na2MoO4.2H2O 1,5 mg/l MnSO4 .H20 1,7 mg/l CoC12.6H20 0,5 mg/l Eau qsp 1 litre pH environ 2,6 On fait fonctionner le fermenteur à une tempé- rature de 4500 > un taux de dilution de 0,18 et une vitesse dagitateur de 3000 tr/mn .On applique à l'orifice d'entrée du ft3rmenteur un débit gazeux de 66 volumes/volume . heure . Le gaz comprend 18,0 en volume de méthane et 81,8% en volume d'air On règle le pH à 6,5 en utilisant NaOH et , ensuite , on poursuit le réglage à 6,5 par l'addition de NaOH 1,0 N selon les besoins, en réponse à un appareil de titrage automatique-. On alimente l'azote sous forme d'hydroxyde d'ammonium (1,1 N ) que l'on introduit par pompage dans le fermenteur à une vitesse croissant graduellement pour ramener la densité cellulaire à la valeur d'environ 14 g en poids sec . On détermine la concentration d'ion ammonium en exeès dans le bouillon de culture par des prélèvements de 10 ml de bouillon toutes les 10 minutes et en déterminant ensuite la concentration d'ion ammonium en utilisant la technique colorimétrique décrite par Paul J. dans Analyst, 1958, Vol. 83, p. 37-42 ( ou Maynell, GG et Maynell, E. ( 1965) Theory ans Pratice of Experimental Bacteriology, Cambridge University Press) .D'une manière différente, on peut determiner la concentration en ion ammonium par une "sonde ammoniacale" en combinaison avec un pH-mètre tel que la sonde mise dans le commerce par le firme Electronic Instruments Ltd. (EIL) , Grande-Bretagne , comme modèle de Laboratoire n de Code 8002-2 , en combinaison avec un pH-mètre mis dans le commerce par la firme EIL sous le nom de modèle 7030.On maintient l"'excès" TT T d'ions ammonium dans le bouillon à une concentration de 5 à 10 g par litre en réglant par voie manuelle la vitesse à laquelle on introduit l'hydroxyde d'ammonium par pompage dans le fermenteur Stade C: Opération stationnaire utilisant lrhydroxyde d'ammonium comme source d'azote avec un réglage indépendant de pH utilisant de lthydroxyde de sodium Lorsque la densité cellulaire dans le fermenteur au stade B a atteint la valeur de 13,5 g/l on débute l'opération stationnaire en utilisant les mimes conditions de fermentation que celles qui sont décrites pour le stade B . On maintient 1' excès d'ion ammonium à une concentration comprise entre environ 5 et 10 mg 1 en utilisant l'une des techniques décrites ci-dessus.A ce moment, la vitesse à laquelle on introduit par pompage l'hydroxyde d'ammonium dans le fermenteur est pratiquement constante à l'exception de faibles réglages. On met en oeuvre la fermentation dans des conditions stationnaires pendant 17 jours . La densité cellulaire dans les conditions précitées est de 13,5 g/l avec un taux de production de cellules bactériennes de 13,5 x 0,18 g ( poids sec) par litre . heure. Le facteur de rendement par rapport au méthane, c'est-à-dire le poids de cellules produites ( poids sec) par unité de poids de méthane d'alimentation dans le fermenteur est de 0,63. Le facteur de rendement en rapport à- l'oxygène est de 0,23. EXEMPLE 6 Stade B: Stade intermédiaire pour accroître la densité cellu laire en vue d'une opération stationnaire On utilise 3,0 litres d'un bouillon de culture contenant la population bactérienne utilisant le méthane obtenue selon le stade A de l'exemple 1, pour déclencher le fonctionnement d'un fermenteur agité , opérant en continu , ayant in volume opératoire de 3,0 litres .On alimente en continu le fermenteur avec un milieu aqueux ayant la composition suivante; KH2P 4 335,0 mg/l Na2HPO4.12H2O 277,5 mg/l MgS04-7H20 160,0 mg/l PeS04.7H20 1X,5 mg/l CaCl2 40,0 mg/l CuS04-5H20 4,55 mg/l ZnSO4.7H2O 0,55 mg/l MnS 4 .H2O 0,75 mg/l Na2MoO4.2H20 0,32 mg/l CoC12.6H20 0,23 mg/l H2S04 (36 N) 0,125 ml /1 Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 2,6 On maintient le fermenteur à une température de 450C , un taux de dilution de 0,18 et une vitesse de d'agitateur de 1500 tr/mn .On applique au fermenteur un débti gazeux de 30 volumes/volume . heure . Le gaz comprend 20% en volume de méthane et 80% en volume d'air Stade C: Opération stationnaire utilisant l'hydroxyde d'ammonium comme source d'azote avec un réglage de pH indépendant utilisant de l'hydroxyde de sodium On règle le pH à 6,6 par l'additinn d'hydroxyde de sodium 1,0 N à partir d'un appareil de tritrage automatique en réponse aux variations du pH dans le bouillon. On ajoute une solution d'hydroxyde d'ammonium 1,1 N par une pompe , la vitesse d'admission étant réglée selon la concentration d'ion ammonium déterminée dans le bouillon . On détermine la concentration d'lon ammonium par une méthode colorimétrique indiquée au stade B de l'exemple 5. On met en oeuvre la fermentation pendant une durée minimale de 7 jours .La densité cellulaire dans lesdites conditions est d'environ 5,0 g/l , fournissant un taux de production de cellules bactériennes d'environ 0,9 g ( poids sec ) par litre et par heure Les résulats suivants sont typiques de ceux que l'on obtient pendant ladite expérience Concentration de Absorption de NH4+ en excès Alimentation NaOH 1,0 N Densité Durée en milieu par titrage cellulaire dans le bouillon (heures) (ml/heure) (ml/h) (g/i) (mg/litre ) O 500 3,0 4,9 15,0 12 1 3,C 5,0 8,0 24 " 2,9 5,0 7,5 36 " 3,0 4,9 10,0 48 " 3,1 4,9 12,5 60 " 2,9 5,0 15,0 72 TT 3,0 5, 17,5 84 " 3,0 4,8 16,C 96 " 2,9 5,0 15,0 Les résultats précités démontrent rue par alimentation d'hydroxyde d'ammonium au moyen d'une pompe en réponse à la concentration d'ion NH4 en excès dans le bouillon, on peut réaliser une mise en oeuvre stationnaire de la fermenta tion . par neutralisation au moyen d'hydroxyde de sodium, on maintient un pH constant dans le bouillon de fermentation EXEMPTE 7 Stade B: Stade intermédiaire pour accroître la densité cellulaire On utilise 5,0 1 d'un bouillon de culture contenant la population bactérienne utilisant le méthane obtenue suivant le stade A de l'exemple 1, pour déclencher un fermenteur agité opérant en continu , ayant un volume opératoire de 5,0 1 .On alimente en continu le fermenteur avec un milieu aqueux ayant la composition suivante H3P04 1098,0 mg/l MgS04.7H20 825,0 mg/l KC1 275,0 mg/l Na2SO4 210,0 mg/l FeSOll.7H20 54,4 mg/l CaC12 75,0 mg/l CuS04.5H20 20,6 mg/l ZnSO4 7H20 2,9 mg/l MnS04 .H20 0,8 mg/l Na2MoO4.2H2O 1,5 mg/l CoCl2. 6H20 0,5 mg/l Eau déminéralisée qsp 1000 ml pH 2,25 On fait fonctionner le fermenteur à une température de 45CC, au taux de dilution de 0,18 -1 et une vitesse d'agitateur de 3000 tr/mn .On applique à l'orifice d'entrée du fermenteur un débit gazeux de 66 volumes/volume . heure. Le gaz comprend 18,2% en volume de méthane et 81,8$ en volume d'air. On ajoute une solution 1,1 N d'hydro xyde d'ammonium au bouillon du fermenteur au moyen d'une pompe, en réglant la vitesse d'admission selon la concentration d'ion ammonium dans le bouillon en utilisant la technique de détermination indiquée à l'exemple 5. On règle le pH à 6,2 par l'addi tion d'une solution de NaOH 1,0 N à partir d'un appareil de titrage automatique en réponse aux variations de pH dans le bouillon Stade C: Opération stationnaire utilisant l'hydroxvde d'ammo nium comme source d'azote avec un réglage de pH indépendant utilisant l'hydroxyde de sodium La densité cellulaire dans lesdites conditions se stabilise à environ 14 g ( poids sec) par litre On met en oeuvre la fermentation dans des conditions stationnai res pendant une durée minimale de 7 jours . Le taux de production bactérienne est d'environ 2,5 g (poids sec) par litre et par heure Les résultats suivants sont typiques de ceux que l'on obtient pendant ladite expérience. Concentration de Absorption de NH4+ en excès Alimentation NaOH 1,0 N Densité Durée en milieu par titrage cellulaire dans le bouillon (heures) (ml/heure) (ml/h) (g,/l) (mg/litre) 0 815 5,3 1),9 15,0 12 " 5,5 14,0 12,5 24 " 5,7 14,3 10,0 36 TT 5,8 14,4 9,5 48 TT 5,5 14,0 10,0 60 " 5,7 14,1 8,0 72 " 5,1 14,3 7,5 84 " 5,6 14,0 7, 96 " 5,7 14,0 9,5 REVENDICATIONS 1. Procédé continu pour convertir le méthane en substances du type protéique, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'on cultive un micro-organisme uti lisant le méthane, en continu dans des conditions stationnaires à une vitesse de production d'au moins 0,81 g ( poids sec ) de micro-organisme par litre et par heure dans un bouillon aqueux contenant des sels nutritifs et des ions ammonium , en présence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène libre le pH du bouillon étant maintenu dans l'intervalle de 4,5 à 8,0 et la concentration en ion ammonium étant maintenue dans l'in tervalle de 2 à 100 mg/l 2.Procédé selon la revendication i, caractérisé par le fait que le pH du milieu nutritif aqueux ajouté au bouillon est inférieur à 7,5 et qu'il a une valeur suffisamment inférieure à celle du pH du bouillon pour que la concentration en ion hydrpgène résultante dans ledit bouillon soit telle que la quantité d'ions amm-onium requise à tout moment donné pour régler le pH du bouillon soit comprise dans l'intervalle de 2 à 100 mg/l 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le pH du milieu aqueux est compris dans l'intervalle de 2,0 à 3,5. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le pH du bouillon est maintenu dans l'intervalle de 4,5 à 8,0 par l'addition d'un acide ou d'un alcalin différent de l'ammoniac ou de l'hydroxyde d'ammonium et que la concentration en ion ammonium est maintenue dans l'inter valle de 2 à 100 mg/l en réponse aux moyens de détermination de la concentration en ion ammonium dans le bouillon. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'alcali différent de l'ammoniac est tri hydroxyde d'un métal alcalin , notamment l'hydroxyde de sodium 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par le fait que le moyen pour déterminer la concen tration en ions ammonium dans le bouillon est une sonde en combinaison avec un pH-mètre. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé par le fait que les ions ammonium sont fournis par une addition d'un composé choisi parmi l'ammoniac et l'hydroxyde d'ammonium au bouillon. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé par le fait que la concentration en ion ammonium dans le bouillon est maintenue dans l'intervalle de 2 à 50 mg,/l 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la concentration en ion ammonium dans le bouillon est maintenue dans l'intervalle de 10 à 30 mg/l 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé par le fait que le mLcro-organisme utilisant du méthane fait partie d'une population microbienne ontenue par une technique d'enrichissement 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé par le fait que le micro-organisme utilisant du méthane est le Methylococcus capsulatus. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que la température de mise en oeuvre est comprise dans l'intervalle d'environ 42 à environ 480C.