Brevet FR2167910A1 — publié le 19730824

La présente invention est relative à des antibiotiques de la série de la mégalomycine et à la production d'antibio- tiques de cette série par culture d'un microorganisme appartenant à une nouvelle espèce du genre Micromonospora. II est décrit dans se brevet américain n 3.632.750 que la mégalomycine est un antibiotique complexe qui est produit par Micromonospora megalonicea var. megalomicea NRRL 3274 et Micromonospora megalomicea var. nigra NRRL 3275. L'antibiotique complexe est composé de quatre constituants principaux.Ces quatre constituants principaux sont appelés mégalomycine As B, C1 et C2 et sont caractérisés par la formule chimique suivante R1 R2 mégalomycine A hydrogène hydrogène " B hydrogène acétyle n C1 acétyle acétyle " C2 acétiyle propionyle Il est bien connu que les antiobiotiques de la série de la mégalomycine possedent une gamme étendue d'activités anti microbiennes vis-à-vis de microorganismes Gram-positifs du genre Streptococcus, Staphylococcus, Diplococcus, etc..., ainsi que visà-vis de microorganismes Gram-négatifs, du genre Escherichia, Solmonella, Proteus, Psoudomonas, etc... Un procédé avantageux et économique permettant la pro duction d'antibiotiques de la surie de la mégalomycine est donc fortement recherché. Selon la présente invention, on utilise une nouvelle espèce de omoncsora pour produire des antibiotiques de la série de la mégalomycine. La nouvelle espèce appelée MK-41 a été isolée du sol de forêts prélevé à Hokkaido, Jingu Shrine, Sapporo City, Hokkaido (Japon). Après culture dans un milieu approprié, la liqueur de culture résultante montre une forte activité antibiotique. Le principe actif de la liqueur de culture est purifié par extraction au moyen de solvants organiques, etc..., et est récupéré sous forme d'une poudre. Les poudres ainsi obtenues sont soumises à une chromatographie sur une colonne d'alumine. On obtient trois fractions possédant chacune une activité antibiotique et qui sont appelées respectivement XK-41-A, XK-41-B et XK-41-C. Par distribution à contre-courant, on sépare XK-41-A en deux constituants, X-41-A1 et XK-4l-A2 et on sépare également XK-41-B en deux constituants, XK-41-B1 et XK-41-B2. On obtient ainsi cinq constituants ayant une activité antibiotique. On a comparé les propriétés chimiques de ces constituants avec celles d'antibiotiques connus et on a constaté que ces constituants étaient des antibiotiques de la série de la mégalomycine. Plus particulièrement, la demanderesse a donné aux fractions XK-41-Alg xK-4l-A2, XK-41-B1 et XK-41-C les noms de mégalomycine C2, mégalomycine Cl > mégalomycine B et mégalomycine A, respectivement. En outre, il a été constanté que XK-41-B2 est un nouvel antibiotique de la série de la mégalomycine possédant une structure chimique générale dans laquelle R1 est un atome d'hydrogène et R2 est un groupe propionyle. En conséquence, on a appelé ce nouvel antibiotique 4 '-propionyl mégalomycine A. La souche susmentionnée est caractérisée par les propriétés suivantes I. Morphologie I1 se forme un substrat de mycélia non cloisonnés, parfaitement développéss ramifiés d'un diamètre de 0s5 à 0,8 micron, mais pas de mycélium aérien. Généralement, il se forme un très petit nombre de spores sur divers milieux. Certains spores sont formés à l'extrémité de chaque mycélium sporogène (2 à 3 microns de longueur) produit par ramification du substrat de mycelia. Les spores ont un diamètre de 0,8 à 1,0 micron et ont une forme ovale ou ronde avec une surface lisse. II. Caractéristiques de culture sur divers milieux La présente souche est lete à se développer par comparaison avec les souches ordinaires du genre Streptomyces Généralement, la croissance est orange sur des milieux à croissance abaondante et incolore ou jaune sur des milieux à croissance pauvre. Le tableau 1 montre les caractéristiques de culture de la présente souche sur des milieux nutritifs couramment utilisés. Ces observations sont basées sur une culture sur chacun des milieux à 27 C pendant deux semaines. Milieu Croissance Couleur Pigments solubles Gélose de Czapek Pauvre Incolore Néant Gélose glucosée asparaginée Pauvre Incolore Néant Gélose glycérinée au malate de calcium Pauvre Incolore Néant Gélose seule Pauvre Incolore Néant Gélose nutritive Bonne, repliée Orange Néant (4 la) Sérum de Loeffler Modéré, plate Orange Neant (4 la) Pomme de terre Modéré, repliée Abricot Néant t4 ga) Gélose à l'albu- Pauvre ou modérée Rose pale Néant mine d'oeuf (5 ca) Gélose à l'amidon Pauvres plate Incolore Néant Gélose à l'extrait Modérée, plate et Orange Néant de malt et extrait humide (4 la) de levure Gélose à la farine Pauvre ou modérées Jaune melon Néant d'avoine plate clair (3 ea) Gélose de Bennett Bonnes repliée Orange bril- Néant lant (4 na) Gélose d'Emerson Modérées plissée Jaune melon Néant brillant (3 ia) Gélose glucosée à Bonnes repliée Orange bril- Néant l'extrait de le- lant (4 na) vure Gélose peptonée au Modérée, plate Jaune bril- Néant fer lant (3 na) Gélose à la tyro- Bonne, plissée Orange (4 la) Néant sine (cristaux de ty rosine disparus) Les indications de couleurs sont conformes aux classifications données dans Color Harmony Manual (Container Corporation of America). Le milieu à la tyrosine utilisé est décrit dans Gordon & Smith, J. Bact. 69 147 (1955). III. Utilisation des sources de carbone L'utilisation des sources de carbone par la présente souche est donnée dans le tableau 2 suivant TABlEAU 2 Utilisation des sources de carbone Source de carbone Utilisation Source de carbone Utilisation D-arabinose - Mannose ++ D-galactose ++ D-raffinose ++ Glycérol - L-rhamnose D-glucose ++ Salicine D-lactose + D-sorbitol D-fructose + Amidon ++ L-inositol + Saccharose + D-mannitosl D-Yylose ++ IV. Propriétés physiologiques 1. Conditions de croissance : la croissance est bonne dans des conditions aérobies. La tempéra ture de croissance est comprise entre 25 et 400C, la température optimale étant comprise entre 30 et 350C.La présente souche est capable de se développer à un pH compris entre 5,5 et 8v52 le pH optimal étant voisin de 793. 2. Liquéfaction de la gélatine : on observe une li quéfaction sur un milieu à la gélatine dans une culture en profondeur (à 270C pendant 2 semaines). 3. Action sur le lait : la croissance du mycélium est très médiocre après culture pendant 3 semai nes à 270C, mais on observe une faible coagula tion au cours de la troisième semaine. On n'ob serve pas de conversion en cétone. 4. Décomposition de la cellulose : légère décomposi tion. 5. Hydrolyse de l'amidon : positive. 6. Réduction des nitrates : négative. 7. Formation de tyrosinase : négative. 8. Action chromogène : négative. Eu égard aux propriétés décrites ci-dessus, on considère que la souche MK-41 est un microorganisme du genre Micromonospora. Comme on la noté ci-dessus, dans le brevet américain n 3.632.750S il est mentionné que les;antibiotiques de la série de la mégalowycine sont produits par des microorganismes du genre Micromonospora megalomicea. On compare les propriétés de la présente souche avec celles de Micromonospora megalomicea var. megalomicea var. megalomicea NRRL 3274. Les résultats sont donnés dans le tableau 3 ci-après. TABLEAU 3 Micromonospora megalomicea var. megalomicea NRRL 3274 MK-41 Gélose de Czapeck Croissance ç bonne, re- Croissance ; médiocre pliée. Couleur : orange clair Gélose nutri- Croissance : modérée, Croissance : bonnes retive plate. Couleur jaune pliée. Couleur : orange melon Gélose de Ben- Croissance : modérée, Croissance : bonnes renett plate. Couleur jaune pliée. Couleur : orange melon brillant Gélose à la Croissance : modérée, plate Croissance bonnet plistyrosine Couleur jaune melon pig- sée.Couleur : orange, ments solubles bruns pas de pigments solubles Utilisation des Galactose, inositol et Galactoses inositol et sources 1e car- raffinose non utilisés; raffinose utilisés e bone D-arabincse utilisé D-arabinese non utilisé Comme il ressort de ce tableau ces deux souches sont différentes en ce qui concerne la croissance et la production de couleur sur les quatre milieux, en ce qui concerne le pigment brun soluble sur un milieu gélosé à la tyrosine et en ce qui concerne l'utilisation de quatre types de sources de carbone. En conséquence, on suppose que la souche MK-41 est distincte du microorganisme de Micromonospora megalomicea. On compare en outre les propriétés de la présente souche avec celles d'autres espèces du genre Micromonospora. Les microorganismes du genre Micromonospora, qui ont déjà été mentionnés, peuvent être répartis en trois groupes sur la base de la couleur du mycélium, à savoir un groupe orange, un groupe pourpre et un groupe bleu-vert. La souche MK-41 appartient au groupe orange. D'autres souches classées dans le groupe orange comprennent, par exemple, Micromonospora fusca, Micromonospora chalceag Micromonospora parva, Micromonospora melanosporea, Micromonospora carbonaceae, Micromonospora halophytica, Micromonospora aurantiacas Micromonospora s osa, Micromonospora inyoensis, etc.La souche MK-41 est très similaire à Micromonospora chalcea si lton consi de les propriétés microbiologiques suivantes que possède la souche MK-41 : le mycélium sporogène est relativement long et avec des ramifications peu abondantes; les spores ne sont pas nombreux et sont formés isolément, sont sans symétrie par rapport au mycélium et ne sont pas formés directement sur le mycélium long; les spores ont une surface lisse; les pigments solubles bruns ne sont pas produits sur un milieu contenant des substances natureiles; enfin, le D-rhamnose n'est pas utilisé et le D-raffinose est parfaitement utilisé. Le microorganisme Micromonospora chalcea et ses variétés mentionnées montrent une croissance moyenne sur un milieu gélosé à base de glucose-asparagine; il forme une couche de spores de couleur vert foncé à brun foncé sur un milieu gélosé à croissance abondante; il donne des pigments bruns sur le milieu gélosé a la tyrosine susmentionée, et il coagule le lait en formant des peptones. Par ailleurs9 la souche MK-41 pousse de façon médiocre sur un milieu gélosé à base de glucose-asparagine > ne forme pas de couche de spores sur un milieu gélosé à croissance abondante ou à croissance médiocre montre toujours une couleur orange pâle du mycélium, ne produit pas de pigment soluble sur un milieu gélosé à la tyrosine et montre une croissance médiocre sur du lait accompagnée d'une faible coagulation du lait.En outre, aucune des souches des microorganismes connus du genre Micromono spora n'utilise le L-inositol. A cet égard, la souche MK-41 utilise des quantités considérables de L-inositol. Compte tenu de cette ca ractéristique, la présente souche a été considérée comme apparte- nant à une nouvelle espèce et cette nouvelle espèce a été nommée Micromonospora inositola. La souche MK-41/ a été déposée à l'organisme American Type Culture Collections à Rockville, Maryland, (E.U.A.) et a reçu le n 21773. Selon la présente invention, les antibiotiques de la série de la mégalomycine sont produits par culture d'une souchede Micromonospora inositola, qui est par exemple Micromonospora inositola MK-41. Comme dans le cas d'autres souches d'actinomycètes, cette souche peut subir une mutation à l'aide de moyens artificiels tels qu'une irradiation par les rayons ultraviolets; une irradiation par du cobalt 60, une irradiation par les rayons X et divers produits chimiques inducteurs de mutation. En conséquence, n'importe quelle souche de Micromonospora inositola, même si elle a subi une telle mutation, peut convenir dans la présente invention à condition qu'elle soit capable de produire des antibiotiques de la série de la mégalomycine. En général, les méthodes courantes de culture de microorganismes du type des actinomycètes peuvent être appliquées dans le procédé de la présente invention. On peut utiliser diverses sources nutritives pour la culture. La source de carbone peut être des mélasses, du glucose, de ltamidon, du mannose, du fructosse, de l'inositols du saccharose, etc..., qu'on peut utiliser seuls ou en combinaison. En outre, on peut incorporer des compo sés hydrocarbonéss des alcools, des acides organiques, etc..., selon l'aptitude d'assimilation du microorganisme.Des sources d'azote minérales et organiques telles que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammoniums le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'urée, etc..., et des sources d'azote naturelles comme la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la levure sèche, la liqueur de macération du mais, la poudre de soja, l'acide casaminé, etc..., peuvent être utilisées seules ou en combinaison. En outre, si nécessaireS on peut ajouter au milieu des sels minéraux tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le carbonate et le phosphate de calcium.De plusn des substances minérales ou organiques capables de favoriser la croissance du présent microorganisme et la production d'antibiotiques de la série de la mégalomycine peuvent être ajoutées de façon appropriée au milieu de culture. Une méthode de culture en milieu liquide > spécial ment une culture submergée avec agitation9 convient parfaitement dans le procédé de la présente invention. La température de culture est comprise entre 25 et 40"C et mieux encore entre 30 et 350C. il est préférable d'exécuter la culture à un pH sensiblement neutre, I1 se forme ainsi des antibiotiques de la série de la mégalomycine qui s'accumulent dans la liqueur de culture habituellement après environ 2 à 12 jours. Quand le rendement en antibiotiques de la série de la mégalomycine dans la liqueur de culture atteint une valeur maximale, on interrompt la culture, on sépare les produits désirés de la liqueur de culture et on les purifie après avoir éliminé les cellules microbiennes, par exemple par fill tration. On exécute l'isolement et la purification des antibiotiques de la série de la mégalomycine en appliquant des procédés usuels dans l'isolement et la purification de produits de métabolisme microbien contenus dans des liqueurs de culture. Etant donné que les antibiotiques de la série de la mégalomycine sont médiocrement solubles dans l'eau mais solubles dans des solvants organiques ordinaires, et qu'ils sont ba siques, on peut récupérer les produits désirés en faisant appel à une combinaison appropriée de ces propriétés.Plus spécifiquementi les antibiotiques de la série de la mégalomycine peuvent être purifiés par une combinaison appropriée d'opérations telles qu'une extraction par un solvant organique insoluble dans l'eau tel que le chloroforme, le benzène, le butyl acétate, l'éthyl acétate, le butanol, le chlorure de méthylène, la méthyl isobutyl cétone, etc...; une adsorption et une désorption utilisant du charbon actif et des résines comme les résines Amberlite (Rohm & Haas Co-.) XAD, Amberlite IRC 50, etc-..., une -chromato- graphie sur une colonne du gel de silice Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals Inc.) LH-20;; etc..., une distribution à contrecourant utilisant des solvants appropriéS, et des méthodes ana loges. Par exemples on isole tout d'abord les antibiotiques de la série de la mégalomycine du filtrat de culture par extraction à l'aide d'un solvant organique. Etant donné que les antibiotiques de la série de la mégalomycine sont basiques, on exécute l'extraction en utilisant un solvant tel que le chloroforme, après avoir ajusté le pH de la liqueur de culture à 9,5. Ensuite, on concentre l'extrait chloroformique et on extrait le concentré avec de l'eau à pH 4. On ajuste de nouveau la solution aqueuse résultante à pH 9,5 et on l'extrait par le chloro- forme. On concentre l'extrait chloroformique jusqu'-à siccité, ce qui donne une poudre. On dissout les poudres ainsi obtenues dans une petite quantité d'acétate d'éthyle et on soumet la solution résultante à une chromatographie sur une colonne d'alumine. On élue tout d'abord avec de l'acétate d'éthyle et ensuite avec un solvant mixte comprenant du méthanol et de l'acétate d'éthyles par la méthode d'élution par gradient de pouvoir éluant dans laquelle le rapport du méthanol à l'acétate d'éthyle est graduellement augmenté jusqu'à 1:9, en volume. De cette manière, on peut séparer au moins 3 fractions distinctes par élution. En d'autres termes, la fraction A est éluée en premier, la fraction B (contenant une petite quantité de fraction A) et la fraction C sont respectivement dissoutes dans l'acétate d'éthyle.Les solutions ainsi obtenues sont respectivement dissoutes dans l'acétate d'éthyle et sont ensuite soumises respectivement b une distribution à contre-courant entre une solution tampon à l'acide phosphorique M/15 (phase stationnaire ou couche inférieure) et l'acétate d'éthyle (phase mobile ou couche supérieure) en 350 à 500 transferts, et la fraction qest séparée en deux fractions, à savoir XK-41-A1 et XK-41-A2 tandis que la fraction B est également séparée en deux fractions, à savoir XK-41-B1 et XK-41-B2. On recueille séparément chacune des fractions isolées XK-41-A1, XK-41-A2, XK-41-B1, XK-41 B2 et XK-41-C, on les ajuste à pH 10 avec NaOH et on les extrait par l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.On concentre chacun des extraits sous pression réduite et on dissout ensuite le concentré dans une petite quantité d'éther. Après avoir-conservé la solution dans une pièce froides on peut facilement obtenir chaque constituant sous forme cristalline. Les constituants obtenus lors de ia chromatographie sur une colonne d'alumine et de l'extraction par distribution à contrecourant sont vérifiés par chromatographie en couche mince en utilisant une feuille d'alumine (type E, fabriquée par Merck & Co.) activée à 1200C pendant 2 heures. On exécute le développement à température ambiante pendant 3 heures, à l'aide d'un solvant mixte comprenant 9 parties en volume d'acétate d'éthyle et 1 partie en volume de méthanol à titre de révélateur. Les valeurs de Rf approximatives des composants sont les suivants XK-41-A1 0,85 XK-41-A2 0,80 XK-41-B1 0,45 XK-41-B2 0,55 XK-41-C 0,20 Les propriétés physicochimiques de ces constituants sont décrites ci-dessous. 1, XK-41-A1 Cristaux amorphes blancs. Basiques Analyse élémentaire : C = 59,93%, H = 8,86% et N = 2,20%. P.f 147,50 - 149 C. Le spectre d'absorption ultraviolet de cette substance, illustré sur la fig. 1 montre, un maximum d'absorption à 279m dans le méthanol, E1 1cm étant alors de 0,52. Rotation spécifique j( & D20 =-101,9, (C=1 dans l'ethanol). Le spectre d'absorption infrarouge de cette substance est illustré sur la fig. 2. Comme on le voit sur cette dernière figure, XK-41-A1 montre des pics aux longueurs d'onde suivantes exprimées en an-1. 700, 810, 840, 870, 900, 910, 960, 1000, 1016, 1030, 1075, 1085, 1120, 1170, 1275, 1320, 1350, 1380, 1465, 1430, 1690, 1740, 2800, 2830, 2838, 8900, 3000, 3480, D'après ces résultats ainsi que d'autres, on a identifié la fraction XK-41-A1 comme étant la mégalomycine C2. 2. XK-41-A2 Cristaux amorphes blancs Basiques. Analyse-élémentaire C = 60,37, H = 8,43% et N = 2,34%, P.f. ç 239 - 2410C. Le spectre d'absorption ultraviolet de cette substance tel qu'illustré sur la fig. 3 montre un maximum d'absorption à 278 M , E11% om étant alors de 0,96. Rotation spécifique ( & D20 = -107,8 (C=1, dans lVéthanol). Le spectre d'absorption infrarouge de cette subs- tance est représenté sur la fig. 4.Comme on le voit sur la fig. 43 XK-41-A2 montre des pics aux longueurs d'ondes suivantes, expri- mées en cm-1, 700, 840, 865, 900, 910, 960, 990, 1000, 1040, 1050, 1075, 1085g 1110, 1120, 1165, 1230, 1245 > 1325, 1350, 1380,1400, 1460, 1630, 1695, 1740, 2800, 2810, 2819, 2830, 2835, 3500. Un spectre de masse à haute résolution de XK-41-A2 sous forme de base litre montre que cette substance a un poids moléculaire de 960 et-répond à la formule moléculaire C48H84N2O17. En outre, d'après les caractéristiques du spectre de résonance magnétique nucléaire et les caractéristiques du spectre de masse autres que les caractéristiques données ci-des sus > cette substance est identifiée comme étant la mégalomycine C1. 3. XK-41-B1 Cristaux aciculaires blancs. Basiques. Analyse élémentaire : C = 58,91%, H = 8,93% et N = 2,65%. Ces cristaux fondent à 1410C en produisant de la mousse et fon- dent complètement à 150 C. Le spectre d'absorption ultraviolet de cette substance, tel qu'illustré sur la fig. 5, montre un maximum d'absorption à 261-265 m dans le méthanol, E1 1%cm étant alors de 1,0. Rotation spécifique : ( & D20 = -89,5 (C = 1 dans ltéthanol). Le spectre d'absorption infrarouge de XK-41-B1 est illustré sur la fig. 6. Comme on le voit sur cette figure, XK-41-B1 montre des pics aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en cm-1: 700, 780, 840, 865, 900, 920, 930, 970, 995, 1005, 1040, 1075, 1118, 1140, 1165, 1245, 1270, 1345, 1380, 1395, 1465, 1635, 1715, 1740, 2800, 2810, 2819, 2830, 28359 35D0. Un spectre de masse à haute résolution de XK-41-B1 sous forme de base libre montre que cette substance a un poids moléculaire de 918 et répond à la formule moléculaire C46H82N2O16. En outre, d'après le spectre de résonance magnétique nucléaire et le spectre de masse, en plus des diverses caractéristiques susmentionnées, cettes substance identifiée comme étant la mégalomycine B. 4. XK-41-C On identifie cette substance comme étant la mégalomyci- ne A à partir de diverses caractéristiques comprenant le spectre de résonance magnétique nucléaire, le spectre de masse, le spectre infrarouge, etc... En outre, cette substance montre une valeur Rf identique à celle de la mégalomycine A comme décrit dans le brevet américain n 3.632.750, d'après une chromatographie en couche mince utilisant le même système de solvants. 5. XK-41-B2 Aiguilles blanches. Basique. Analyse élémentaire : C = 58,97%, H = 10953% et N = 2,98%. P.f. 212 - 212,5 C. Le spectre d'absorption ultraviolet de cette substance, apparaissant sur la fig. 7, montre un maximum d'absorption à 286 m dans le méthanol, E1 1% étant alors de 0s62. Rotation spécifique: (&alpha;)D20 = -92,3 (C = 1, dans l'éthanol). Le spectre d'absorption infrarougé de XK-41-B2 est illustré sur la fig. 8. Comme il ressort de la fig. 8, XK-41-B2 montre des pics aux longueurs d'onde suivantes exprimées en #1 700, 750, 780, 840, 860, 910, 935, 955, 980, 1000, 1030, 1070, 1115, 1140, 1170, 1270, 1345, 1380, 1460, 1690, 1740, 2800, 2880, 2980, 3500. Un spectre de masse à haute résolution de XK-41-B2 sous forme de base libre montre que cette substance a un poids moléculaire de .932 et répond à la formule moléculaire C47H84N2016. La proportion en poids de chacun des éléments calculée d'après la formule moléculaire est la suivante C = 60,52%, H = 9,01%, N = 3,00%. En outre, d'après les caractéristiques du spectre de résonance magnétique nucléaire (fig. 9) et du spectre de masse, etc..., on détermine que la formule chimique générale de cette substance est celle de la mégalomycine, mais R1 étant un atome d'hydrogène et R2 un groupe propionyle. On identifie donc XK-41-B2 comme étant un nouvel antibiotique de la série de la mégalomycine et on l'appelle 4'-propionyl mégalomycine A, XK-41-B2 est soluble dans des solvants organiques tels que le chloroforme, le benzène, l'acétate d'éthyle, le diméthylformamide, l1éther, l'éthanol, le méthanol, le butanol, etc..., et est insoluble dans l'eau, l'éther de pétrole, le nhexane, etc... Les valeurs de Rf de XK-41-B2 obtenues après chromate graphie sur papier à l'aide de divers révélateurs sont données dans le tableau .4. TABLEAU 4 Chromatographie ascendante sur papier de XK-41-B2 Révélateur Valeur de Rf Temps de déve loppement (heures) Chlorure d'ammonium à 20% (poids/ 0,60 3 volume) n-butanol saturé d'eau 0,85 15 n-butanol-acide acétique : eau (mélange 3:1:1) 0,73 15 Acétate d'éthyle saturé d'eau 0,00 n-butanol saturé d'eau contenant 2% (poids/vol.) d'acide p-toluène sul- 0,87 15 fonique et 2% tpoids/volume de pipéridine Chlorure d'ammonium à 5% tpoids/volume) 0,70 3 Méthyl isobutyl cétone saturée d'eau 0,75 3 Méthyl isobutyl cétone saturée d'eau contenant 1% d'acide p-toluène sulfonique tpoids/volume) o,87 3 Acétone ç eau (1:1) 0,80 - 0,90 3 Méthanol-n-butanol-eau (1:4::2) contenant 21% d'orange méthyle (poids/volume) 0,89 15 Le tableau 5 montre le spectre antimicrobien des mégalomycines B, C1 et C2 et XK-41-B2 t4'-propionyl mégalomycine A) préparées selon le procédé de la présente invention. On utilise la mégalomycine A du brevet américain nO 3.632.750 comme témoin dans la détermination de l'activité antimicrobienne. TABLEAU 5 Concentration inhibritrice minimale déterminée par la méthode de dilution de la gélaose Microorganismes d'essai XK-41-A1 XK-41-A2 XK-41-B1 XK-41-2 mégalomycine A (mégalo- mégalo- (mégalo- (4'-propio- brevet E.U.A. mycine C2 mycine C2 mycine nyl mégalo- n 3.632.750) mycine A Streptococcus faecalis ATCC 10541 0,13 0,13 1,0 0,83 0,13 Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0,13 0,13 2,0 0,83 0,26 Staphylococcus aureus 209P 0,13 0,26 2,0 1,65 0,52 Staphylococcus aureus 45 0,13 0,26 4,2 3,25 1,0 Staphylococcus aureus KY 8946 (résistant aux antibiotiques macrolides > 8,3 > 8,3 > 16,6 > 41,7 > 8,3 Staphylococcus aureus KY8949 (résistant aux antibiotiues macrolides) > 8,3 > 8,3 > 16,6 > 41,7 > 8,3 Staphylococcus aureus KY8947 (résistant aux antibiotiues macrolides) > 8,3 > 8,3 > 16,6 105 > 8,3 Staphylococcus aureus KY8945 (résistant aux antibiotiues macrolides) 8,3 8,3 > 16,6 50 > 8,3 Bacillus subtillis n 10707 0,016 0,065 0,52 0,65 0,13 Sarcina lutea ATCC 9341 > 0,0041 > 0,0041 0,32 - Mycrobacterium avium F (Shiga University KB 44) 0,033 0,033 0,52 5,0 0,13 Mycobacterium phlei IFO 3158 (mégalo- mégalo- (mégalo- (4'-propio- brevet E.U.A. mycine C2) mycine C2) mycine nyl mégalo- n 3.632.750) mycine A Mycrobacterium koda KB 47 0,065 0,13 0,52 0,33 0,13 Mycrobacterium smegmatis ATCC 10143 0,033 0,065 0,52 1,3 0,033 Mycobacterium smegmatis (réistant à la streptomycine et à la kanamycine) 0,082 0,0041 0,26 - 0,0082 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 > 8,3 > 8,3 > 16,6 26,0 > 8,3 Serratia marcescens ATCC 4003 > 8,3 > 8,3 > 16,6 > 417 > 8,3 Neisseria catarrhalis 0,26 0,26 0,52 Aerobacter aerogenes ATCC 13048 > 8,3 > 8,3 > 16,6 417 > 8,3 Escherichia coli ATCC 26 8,3(4,2 > 8,3 16,6 50,0 > 8,3 Escherichia coli ATCC 4352 > 8,3 > 8,3 > 16,6 210 > 8,3 Escherichia coli Juhl KY +286 > 8,3 > 8,3 > 16,6 50,0 > 8,3 Escherichia coli ATCC > 8,3 > 8,3 > 16,6 50,0 > 8,3 1175 Escherichia coli (résistant à la streptomycine, la kanamycine, néomycine, la paromomycine, la tétracycline et au chloramphénicol 1,0 2,1 4,2 41,7 > 8,3 Paracolon sp. Abbott P-1 > 8,3 > 8,3 > 16,6 > 41,7 > 8,3 Pseudomonas aeruginosa > 8,3 > 8,3 > 16,6 - > 8,3 BMH n 1 Microorganismes d'essai XK-41-A1 XK-41-A2 XK-41-B1 XK-41-2 mégalomycine A (mégalo- mégalo- (mégalo- (4'-propio- brevet E.U.A. mycine C2) mycine C2) mycine nyl mégalo- n 3.632.750) mycine A Proteus vulgaris ATCC > 8,3 > 8,3 > 16,6 - > 8,3 6897 Shigella sonnei ATTC 9290 2,1 2,1 4,2 26,0 4,2 Salmonella typhosa ATCC 9992 8,3 8,3 8,3 105 > 8,3 Candida albicants ATCC 1023 > 8,3 > 8,3 > 16,6 > 417 8,3 Aspergillus niger > 8,3 > 8,3 > 16,6 > 417 > 8,3 (messure exécutée à pH 8,0) Ainsi qu'il ressort de ce qui précède, les mégalomycines B, C1 et C2 et la 4'-propionyl mégalomycine A sont efficaces vis-d- vis des bactéries Gram-positives telles que Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Sarcina lutea, etc..., les bactéries résistant aux acides comme Mycobacterium avium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, etc..., et, en outre, les bactéries Gram-négatives telles Neisseria catarrhalis, Escherichia coli (qui résistent à divers antibiotiques connus) Shigella sonnei, Salmonella typhosa, etc... On donne ci-après des exemples à titre-indicatif et non limitatif de la portée de l'invention-. EXEMPLE 1 On inocule initialement une boucle de Micromonospora inositola NK-41 ATCC 21773 dans 30 ml d'un premier milieu d'en semencement contenant 1% de dextrine, 1% de glucoses 0,5 de peptone, 05% d'extrait de levure et 0,1% de carbonate de calcium (pH 7,2 avant stérilisation) dans un Erlenmeyer de 250 ml, On exécute la culture en secouant à 30 C pendant 5 tours-. On inocule 30 ml de la liqueur de culture d'ensemencement résultante dans 300 ml d'un second milieu d'ensemencement, dans un Erlenmeyer de 2 litres, comportant des chicanes.La composition du second milieu d'ensemencement est identique à celle du premier milieu. On cultive le second milieu d'ensemencement avec secousses à 300C, pendant 2 jours. On inocule ensuite 900 ml de la seconde liqueur de culture d'ensemencement (correspondant au contenu de 3 fioles) dans 15 litres d'un milieu de fermentation principal dans un fermenteur en verre de 30 litres.Le milieu de fermentation principal comprend Saccharose 2% Extrait de levure 0,5% Liqueur de fermentation du maIs 0s5% K2HPO4 0,05% MgSO4,7H2O 0,05% KC1 OS03% Carbonate de calcium (pH 7,2 avant stérilisation) La culture dans le fermenteur est exécutée à 300C pendant 5 jours par une méthode avec aération et agitation (vitesse de ro talion de 350 t/mn), aération de 15 l/mn). Lorsque la culture est achevée, on centrifuge la liqueur de culture résultante pour séparer les cellules microbiennes et on ajuste le filtrt à pH 9,5 avec de la soude caustique 2N. En y ajoutant 7,5 litres de chloroforme et en agitant le mélange résultant, le principe actif est extrait et passe dans la couche chloroformique. On opère deux fois cette extraction. On obtient ainsi une solution de principe actif dans 15 litres de chloroforme. On concentre la solution chloroformique résultante sous pression réduite jusku'à un volume de 5 1. En ajoutant 5 litres d'eau distillée, ajustée à pH 4,0 avec de l'acide chlorhydrique 2N, et en agitant, le principe actif est extrait et passe dans la couche aqueuse. On sépare la couche aqueuse, on l'ajuste à pH 9,5 avec de la soude caustique 2N et on la soumet de nouveau à une extraction en utilisant 5 litres de chloroforme. Après concentration de la couche chloroformique sous pression réduite, on obtient 500 mg de poudre brute. On dissout la poudre brute dans 15 ml d'acétate d'éthyle. On fait passer la solution à travers un tube en verre de l5 mm x 68 mm garni d'alumine. On élue tout d'abord avec 500 ml d'acétate d'éthyle et ensuite avec des portions de 500 ml d'un mélange comprenant de l'acétate d'éthyle et du méthanol dans des rapports respectifs de 90:2 > 90:4, 90:6, 90:8 et 90:10, en volume. Ensuite, on élue la fraction XK-41-A qui est suivie par fraction XK-41-B/et ensuite par la fraction XK-4l-C. On concentre chacune des fractions actives sous pression réduite et on les cristallise dans l'é ther. On obtient ainsi 230 mg de XK-41-A. 150 mg de XK-41-B et 50 mg de XK-4l-C. EXEMP-LE 2 On obtient 40 g de poudre brute d'antibiotiques de la série de la mégalomycine (contenant XK-4l-A, XK-41-B et XK-41-C) par un procédé similaire à celui qui se décrit dans l'exemple 1, mais exécuté à plus grande échelle. On dissout la poudre brute ainsi obtenue dans 100 ml d'acétate d'éthyle saturé d'une solution tampon de phosphate 1/15M ajustée à. pH 6,0. On verse des portions de 10 ml de la solution résultante dans 12 tubes d'un distributeur à contre-courant. La distribution à contre-courant est exécutée entre une solution tampon de phosphate 1/15M (phase stationnaire ou couche inférieure) et l'acétate d'éthyle (phase mobile ou couche supérieure) en 500 transferts.Les résultats sont les suivants Tubes d'essai Fraction n 1-39 mélange de XK-41-C et XK-41-B (mélange de mégalomycines A et B) Tubes d'essai Fraction n 40 - 118 : XK-41-B1 (mégalomycine B) n 119 - 142 : XK-41-B2 (4'-propionyl mégalo mycine n 143 - 249 : XK-41-A2 (mégalomycine C1) n 250 - 420 : XK-41-A1 Çmégalomycine C2) On ajuste chacune-des fractions à pH 9,5 avec de la soude caustique 2N. Après extraction par le chloroforme, on concentre la couche chloroformique. On obtient ainsi 1 g de XK-41-C (mégalomycine A), 12 > 9 g de XK-41-B1 Çmégalomycine B), 2,9 g de XK-41-B2 (4'-propionyl mégalomycine A), -8,29 g de XK-41-A2 (méga- lomycine C1) et 10,3 g de XK-41-A1 (mégalomycine C2). EXEMPLE 3 On répète le procédé décrit dans l'exemple i à cette exception qu'on utilise un milieu de fermentation ayant la composition suivante Amidon soluble 3% Glucose 1% Tourteau de soja 2% Peptone 1% Extrait de levure 0,2% MgSO4,7H2O 0,05% KCl 0,03% Carbonate de calcium 091% (pH 7,2 avant stérilisation) Après 5 jours de fermentation, 45, mg/ml de XH-41-A1, 1,6 mg/ml de XK-41-A2, il s'est accumulé 0,9 mg/ml de XK-41-B1, 0,5 mg/ml de XK-41-B2 et 0,43 mg/ml de XK-41-C dans la liqueur de culture. On exécute la purification et la séparation comme décrit dans les exemples 1 et 2. On obtient ainsi 15,8 g de XK-41-A1, 17,0 g de XK-41-A2, 9,5 g de XK-41-B1, 4,9 g de XK-41-B2 et 4,7 g de XK-41-C. Sur le dessin annexé, les fig. 1, 3, 5 et 7 représentent les spectres d'absorption dans l'ultraviolet de XK-41-A1, XK-41-A2. XK-41-B1 et respectivement, l'absroption étant portée en ordonnées, en % et la longueur d'onde en abscisses en microns; les fig. 2, 4, 6 et 8 représentent les spectres d'absorption dans l'infrarouge de XK-41-A1, XK-41-A2, XK-41-B1 et XK-B2, respecti ment, l'absorption étant portée en ordonnées et les longueurs d'ondes en abscisses, en cm-1 et les fig. 9a et 9b de la fig. 9 montrent le spectre de résonance magnétique nucléaire de XK-41-B2. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de mégalomycine, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver une souche productrice de mégalomycine de Micromonospora inositola ATCC 21773 dans un milieu nutritif, d laisser la mégalomycine staccumuler dans le milieu nutritif précité et à récupérer ladite mégalomycine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on exécute la culture précitée à une température de 30 à 350C et à pH sensiblement neutre. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qui consiste en outre à isoler la mégalomycine A, la mégalomycine B, la mégalomycine C1, la mégalomycine C2 et la 4'-propionyl mégalomycine A. 4. 4'-propionyl mégalomycine-A, obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Composition identifiée comme étant la 4'-propionyl mégalomycine-A douée de propriétés antibiotiques et caractérisée par le fait qu'elle présente les propriétés suivantes de formule globale : C47H84N2016 ; poids moléculaire de 932; point de fusion de 212-212,5 C spectre d'absorption ultraviolet : comme représenté fig. 7; spectre d'absorption infrarouge : comme représenté fig. 8, rotation spécifique : |X)D20 de -92,3 CC = 1, dans l'éthanol); valeur de Rf : comme dans le tableau 4; spectre de résonance magnétique nucléaire : comme illustré fig. 9.