Brevet FR2154522A1 — publié le 19730511

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'insuline et de pancréatine dans lequel une pancréatine contenant de l'insuline sert de matière première, à partir de laquelle, selon un procédé approprié, on extrait l'insuline et le résidu de pancréatine se présente avec les activités enzymatiques spécifiques complètement retenues (lipase, amylase, trypsine, chymotrypsine). Conformément aux procédés connus jusqu'à présent on ne pouvait obtenir à partir du pancréas que ltinsuline ou la pancréatine. Grâce au procédé de la présente invention, il est possible pour la premiere fois d'obtenir l'insuline pure et conjointement une pancréatine fortement active, de sorte que la glande pancréatique est doublement utilisée. L'augmentation constante du nombre de diabétiques et le fait que, jusqu'à présent il n'existe encore pas de succédané satisfaisant de l'insuline augmentent constamment les besoins en insuline. Comme les maladies de la digestion aussi augmentent actuellement, les besoins en pancréatine s'accroissent encore pour une thérapie de substitution. I1 en résulte déjà une pénurie de glandes pancréatiques. Le procédé selon la présente invention re tiédie à cet inconvénient par la double utilisation des glandes et il est donc d'une importance particulière. Les procédés actuels pour la fabrication de l'insuline utilisent généralement de l'éthanol en solution acide pour l'ex- traction de l'insuline de la glande pancréatique. Cependant, les enzymes de la glande pancréatique se trouvent de la sorte irré versiblement inactivés. En particulier pour la lipase, on ne peut déceler que des traces d'activité dans le résidu d'extraction. les expériences ne manquent pas en vue d'isoler les activités ensyeatiques subsistantes dans le résidu d'extraction, pour dtau- tres applications. Ce résidu n'est nullement approprié à la récupération de la pancréatine (voir par exemple K. JÂNH0IE & P. HOIM Novo Therapeutisk Lab. Brevet danois no 102.821; S. EOEK, N.V. Philips' Gloeilampenfabrieken, brevet néerlandais n 112.875; R. EOJEE, Earchoninskie Zaklady Far2aceutyczne "Polfa" Brevet polonais n 50.085; Wellcome Foundation Ltd, Brevet néerlandais n 66.02 259 déposé le 23 aoflt 1966). Grade à la présente invention, il est désormais possible d'obtenir l'insuline à partir de pancréatine et, pour une perte en pancréatine de 10 % environ, de conserver pratiquement les activités enzymatiques spécifiques à leur pleine valeur.On obtient la pancréatine à partir du pancréas par lyophilisation et ensuite par un dégraissage à l'aide d'un solvant des graisses, ce qui permet d'obtenir l'insuline totale. Le procédé de préparation de l'insuline et la pancréatine selon la présente invention se caractérise en ce qu'on effectue l'extraction de pancréatine contenant de l'insuline avec un mélange d'eau et de solvant organique miscible à l'eau, de sorte que le mélange contienne un sel monovalent en concentration de 1 à 5 %, que l'on récupère du résidu d'extraction la pancréatine libérée de l'insuline par séchage sous vide, et qu'on précipite l'insuline à partir de l'extrait par élimination du solvant organique et qu'on la purifie de façon en elle-meme connue. Le procédé selon la présente invention fonctionne sans addition d'acide uniquement avec des solvants organiques aqueux, avantageusement avec de l'éthanol aqueux. On utilise le puissant effet de salification par des sels monovalents de sorte que, de préférence, on utilise le chlorure de sodium comme sel minéral. Le pH de la solution d'extraction doit s'accorder à la stabilité optimale des enzymes, soit environ pH 6. On peut utiliser à la place de l'éthanol préféré, d'autres solvants organiques (par exemple l'acétone, le méthanol). Avec l'éthanol toutefois, on obtient les meilleurs résultats. Avantageusement le mélange d'extraction contient le solvant organique en concentration d'environ 60 à 80 %. La séparation du solvant organique peut se faire par exemple par distillation. il subsiste alors un résidu aqueux dans lequel le sel monovalent est si fortement concentré que l'insuli- ne se salifie, donc devient insoluble et précipite. Les exemples suivants expliquent en plus amples détails le procédé selon la présente invention EXEMPIS 1 On agite pendant 30 minutes à OOC, 10 kg de pancréatine avec 150 litres d'une solution aqueuse d'éthanol à 70 % qui contient 3,5 kg de chlorure de sodium et on filtre par aspiration sur filtre de Büchner. La pancréatine extraite est séchée sous vide. On chasse par distillation l'alcool sous vide du filtrat et on récupère l'insuline salifiée par centrifugation. Pour éliminer les constituants graisseux on effectue l'extraction avec environ 10 litres d'alcool et on salifie à nouveau l'insuline qui subsiste dans le résidu après dissolution dans l'eau à pH 2,5, par addition de 12 % de chlorure de sodium.Pour la purification ultérieure, on agite le précipité avec une solution de chlorure de sodium à 4,5 % par addition de 5 g d'acide éthylène-diamine tétracétique, à pH 6,6, de sorte que l'insuline passe en solution. Elle précipite de cette solution par addition d'acétate de zinc, on dissout le précipité d'insuline zincique dans un peu d'acide chlorhydrique à pH 2,5 et on effectue la chromatographie sur tamis moléculaire de degré de réticulation approprié (Eluant Acide acétique 1 M, NaCl 1 %). On précipite l'insuline à partir des fractions recueillies par addition de chlorure de sodium et enfin on cristallise. Le rendement en insuline cristalline est de 3 g avec une activité biologique de 28 Unités internationales par milligramme (selon DAB 7/DDR). On obtient la qualité de la-pancréatine recueillie par comparaison des activités enzymatiques avant et après extraction d'insuline. Enzyme Avant extraction Après extraction Lipase 44.500 43.000 Amylase 45.000 41.100 Chymotrypsine 11.680 9.750 Trypsine 2.980 2.980 Les unités pour les enzymes sont déterminées selon des procédés normalisés et sont données en Unités internationales par gramme de pancréatine. EXEMPLE 2 On effectue comme indiqué à l'exemple 1 l'extraction et la reprise de 100 g de pancréatine avec 1500 ml d'acétone aqueuse à 70 % qui contient 50 g de chlorure de sodium. Le rendement en insuline correspond à celui de l'exemple 1. On trouve après extraction les activités enzymatiques spécifiques suivantes: Lipase 30.700 Amylase 30.200 Chymotrypsine 6.050 Trypsine 3.450 - REVENDICA2IONS - 1 - Procédé de préparation d'insuline et de pancréatine dont les activités enzymatiques sont totalement conservées (lipase, amylase, trypsine, chymotrypsine), caractérisé en ce qu'on effectue ltextraction de pancréatine contenant de l'insuline avec un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau, de sorte que le mélange contienne un sel monovalent en concentration de 1 à 5 c%, qu'on récupère par séchage sous vide la pancréatine libérée de l'insuline dans le résidu d'extraction et qu'on précipite l'insuline à partir de l'extrait par élimination du solvant organique et qu'on purifie de façon en elle-même connue. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange contient le solvant organique en concentration d'environ 60 à 80 C 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le solvant organique miscible à l'eau est l'éthanolO 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel monovalent utilisé est le chlorure de sodium.