Brevet FR2153193A1 — publié le 19730504

L'invention concerne le domaine de l'immunologie et a plus particulièrement pour objet un sérum antilymphocytaire utilisable en médecine humaine. L'invention concerne l'obtention d'immunoglobulines antilymphocytaires humaines et leurs applications pour le traitement de certains malades, en particulier par immu nothérapie D'une marnière générale, on utilise, pour préparer un tel sérum, des cellules lymphocytaires d'origine humaine, que l'on purifie et que l'on prépare ensuite pour l'immunisation d'un animal, tel que par exemple le cheval. On recueille ensuite le sérum, que l'on purifie en vue de son utilisation en médecine humaine. La présente invention met à profit la possibilité d'établir des souches permanentes de culture de lymphocytes humains pro venant de tissus hématopoiétiques, du sang péripherique ou de la lymphe. En effet, les lymphocytes d'origine humaine destinés à l'établissement de souches permanentes de culture de lymphocytes sont, par exemple, obtenus à partir de sang humain, de lymphe humaine, d'organes riches en lymphocytes, tels que le thymus, la rate, les ganglions et autres organes, qui peuvent être prélevés sur des cadavres ou sur des sujets venant de subir une intervention chilurgicale, ayant pour effet l'ablation dudit organe Ce rho'ytes humains air.sirecueillis sont maintenant, comme il est colir1u, utilisés pour constituer des souches permanentes de cultures. Selon l'inmntion, on peut établir de nombreuses cultures permanentes de l-Jmphocytes humains. L'invention a pour objet général le mélange de différentes souches de lymphocytes humains de cultures permanentes, après la sélection desdites souches selon certains critères biologiques, et l'utilisation subséquente appropriée dudit mélange de souches pour l'obtention d'un sérum antilymphocytaire polyvalent, à activité antilymphocytaire constante et de tolérance parfaite. On a en effet découvert que cette sélection selon un certain nombre de critères biologiques, que l'on verra en détail plus loin, de souches de lymphocytes d'origine humaine et un mélange convepabla desdites souches sélectionnées, permettent d'améliorer considérablement la qualité antigénique des préparations lymphoctîres destinées à l'immunisation de l'animal producteur de sérum. On a découvert que ce procédé selon l'invention permet de supprimer de façon constante dans le temps l'activité érythroagglutinante des sérums antilymphocytaires. On sait que l'immunisation d'un animal par des lymphocytes frais, mëme purifiés, provoque la formation d'anticorps dirigés non seulement contre les lymphocytes mais aussi contre les érythrocytes, les cellules conjonctives et les plaquettes, anticorps que les purifications même les plus poussées n'arrivent pas a éliminer. On sait aussi que l'immunisation d'un animal par les lymphocytes des souches permanentes précédemment indiquées provoque la formation d'anticorps dirigés non seulement contre les antigènes portés par les lymphocytes seuls, mais également contre les antigènes communs aux lymphocytes et ayx érythrocytes. On sait par ailleurs que les anticorps antiêry- thvocyves sont dangereux et peuvent provoquer une hémolyse lorsqu'ils sont infectés aux sujets. Il est de fait connu que l'activité érythroaggluni@ante des sérums antilymphocytaires actuels représente un inconvénient majeur, car elle est responsable, chez le sujet traité, d'intolérance locale et générale importante, de choc et d'anémie hémolytique. Dans ces conditions, on en était réduit à absorber les immunoglobulines antilymphocytaires sur un "pool" de globules rouges humains, afin d'éliminer la majorité des anticorps antiérythrocytaires. Or cetto absorption présente de nombreux inconvénients. En effet, il est Uusqutà maintenant impossible, par les procédés de l'art antérieur, d'éliminer la totalité des anticorps antiérythrocytaires; d'autre part cette absorption entraîne une perte importante d'immunoglobulines antilymphocytaires, ce qui provoque par conséquent une chute de l'activité antilymphocytaire et inunodépressive du sérum antilymphocytaire, voir D. Allan et coll, Clin. exp. Immunol (171) 8, 101-105. Il G en outre été montré récemment que, même si le pouvoir érythroggrutinant des immunoglobulines antilymphocytaires, après absorption sur des globules rouges, est très faible voire nul, cette absorption n'empêche pas la formation, in vivo chez le malade traité par un tel sérum antilymphocytaire, d'anticorps anti-lobules rouges; il a en effet été démontré expérimentalement qu'après absorption sur des globules rouges, les préparations d'immunoglobulines contiennent de nombreux antigènes érythrocytaires, libérés au moment de cette absorption, et c'est ce qui explique que les préparations d'immunoglobulines antilymphocytaires, même absorbées, soient encore capables de provoquer par elles-mêmes la formation d'anticorps anti-érythrocytaireschez l'animal (voir article de D.Allan et coll, supra); La préparation de sérum antilymphocytaire à partir de souches lymphoblastoides permanentes n'éliminait pas constamment l'activité anti-érythrocytaire des sérums, ni donc l'inconvénient que représente l'absorption. On a alors eu l'idée, qui est à la base de la présente invention, de réaliser des préparations lymphocytaires par mélange d'un nombre supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de différentes souches de culture permanente préalablement sélectionnées, n1 étant utilisées pour la préparation du sérum antilymphocytaire que les souches dont le sérum correspondant présente une activité érythroagglutinante la plus faible possible, chiffrée à une dilution inférieure ou au plus égale à 1/8. A partir des préparations antigéniques ainsi utilisées, on obtient le sérum antilymphocytaire humain par immunisation du cheval; on peut cependant, comme il est connu, procéder à l'immunisation d'autres animaux, tels que le lapin, la chèvre, ou l'âne. On avait jusqu'à maintenant préconisé d'effectuir les injections de préparation lymphocytaire au cheval, par voie intradermique ou sous-cutanée, en des temps espacés de 10 jours, à des doses de I à 5.îo cellules lymphoblastoides par ineec- tion, et de saigner le cheval 7 à 10 jours dès après la trdisiè- me injection et après chaque injection de rappel, selon les enseignements, par exemple, de Najarian (a-.s.) et col., dans Ann. Surg. 1969, 770 (4), pp.617-632. Or, on a maintenant découvert de façon inattendue que c'est à partir de la sixième des injections pratiquement, et en tous cas entre la sixième et la huitième des injections, espacées de 1 semaine et telles que la dose totale de cellules lymphoplastoides des préparations lymphocytaires selon l'invention injectées soit de 100 à 200 .109, que l'activité cytotoxique du sérum antilymphocytaire est maximale, tandis que son activité antiérythrocytaire est, elle, fortement abaissée. Un autre objet de la présente invention est donc l'application des préparations lymphocytaires seloh l'invention à l'obtention d'un sérum antilymphocytaire actif et de tolérance parfaite constante, caractérisée en ca que l'on immunise le cheval, par injection d'une dose totale de cellules lymphoblastoides de 100 à 200.109, répartie en 6 à 8 injections à doses croissantes, espacées de 1 semaine environ, et qu'on recueille le sérum brut produit par saignée entre environ le dixième et le vingtième jour après la dernière injection. Lesdites injections peuvent etre effectuées par voie souscutanée ou intra-dermique, ou encore par la voie intra-veineuse, cette dernière procurant généralement une meilleure immunisation, mais nécessitant des soins techniques particuliers, en raison du risque de choc encouru par l'animal. Les avantages du procédé selon l'invention apparaissent plus clairement si l'on se réfère aux figures en annexe. La figure 1 représente l'évolution de l'activité antiérythrocytaire (anticorps antiérythrocytaires en 1) et antithrombocytaire (anticorps antithrombocytaires en 2) au cours de l'immunisation du cheval, selon l'invention. En abscisse sont portés les jours, dans l'échelle supérieure, et les injections pratiquées (1ère à 6ème), dans l'échelle inférieure. Le petit carré se trouvant sous la droite (2) et le petit triangle sur l'axe des abscisses figurent les globulines antilymphocytaires (GAL) purifiées à partir du sérum brut obtenu, dans l'exemple, 14 jours après la 6ème injection. En ordonnée sont portées pour la courbe (1) les dilutions maximales du sérum de cheval provoquant encore une étythroagglutination, et pour la courbe (2), la dilution maximale du sérum du cheval provogBant encore une thromboagglutination.Dans l'exemple considéré, l'érythroagglutination du sérum est maximale au 21è jour, alors qu'elle est beaucoup plus faible, chiffrée à une dilution inférieure au 1/4, au 56e jour. Quant à la thromboaglutination, elle est constamment nulle, même lorsqu'elle est testée sur le sérum de cheval non dilué. La figure 2 représente l'évolution de l'activité cytotoxi que du sérum antilymphocytaire obtenu en fonction du temps auquel on le prélève sur le cheval immunisé à l'aide des préparations lymphocytaires selon l'invention. L'abscisse est identique à celle de la figure 1. L'ordonnée indique la cytotoxicité en (%) de cellules non viables au bleu Drypan, par rapport au nombre total de cellules. Les différentes courbes correspondent chacune à la dilutio indiquée en regard. La figure 3 montre l'inhibition de la formation spontanée des rosettes par les immunoglobulines purifiées du sérum antilymphocytaire selon l'invention. Le témoin est figuré par le petit triangle sur l'axe des ordonnées. En ordonnées est porté le nombre de rosettes formées pour 1000 cellules. En abscisse sont portées les valeurs de l'inverse de la dilution en globulines antilymphocytaires (G.h.X.) x 10 3. Ce test est actuellement reconnu comme étant l'un des meilleurs pour déterminer in vitro l'activité immunosupprasiva d'un sérum antilymphocytaire (voir en particulier Bach, Nature Vol.217, 17 Février 1968, pp. 658-559). Le sérum obtenu par le procédé d'immunisation selon l'invention est donc particulièrement actif (voir figures 2 et 3) et ne présente aucune activité antithrombocytaire et antiérythrocytaire, comme le montre la figure 1. Quand on a saigné le cheval comme indiqué, c'est-à-dire en tre environ le dixième et le vingtième Jour suivant la 6ème à la huitième injection telles que définies, on a recueilli un sérum particulièrement actif, dont on a extrait et purifié les immunoglobulines de façon connue en soi, sans qu'il fut besoin d'effectuer une quelconque absorption sur globules rouges. La perte d'activité antilymphocytaire au cours de cette purification est des plus réduites. Une variante particulièrement avantageuse de ladite application selon l'invention consiste en la lyophilisation des préparations lymphocytaires obtenues selon l'invention et en leur mise sous forme de pastilles par exemple, qui sont simplement implantées sous la peau de l'animal. Les souches permanentes utilisées résultent de cultures en milieu artificiel semi-synthétique, après établissement en lignée continue. Depuis quelques années maintenant, un nombre important de lignées permanentes a été obtenu par différentes équipas de chercheurs, par exemple à partir de sang de sujets présumés normaux (voir à ce sujet: GEi?BZ'R(P.) et f.iONROE (J/H.) Studies on Leucocytes growing in continuous culture derived from normal human donors, J. nat. Cancer Inst., 1968, 40, 855; MOORE (G.E.), GER1ER (R.E.), KITAMURA (H), MINOWADA (J.) et FJELDE (A), Lymphocyte cell lines derived from normal individuals Proc. 3rd annual leukocyte culture conf. éditenr William 0. Rieke, 1969, 16 178, RSlOORE (G.E.) GERNER (R.E.) et FRANKLIN (H. A.), Culture of normal human leucocytes, J. Amer. ed. Ass., 1967, 199, 87); des lignées ont également été obtenues à partir de ganglions et de rates humains (voir par exemple : JENSEN (E.M.) KOROL (w.) DITTMAR (S.L.) et MEDREK (g.T.), Virus containing lymphocyte culture from cancer patients, J. Nat. Cancer Inst. 1967, 39, 745 (LEVY (J.A.), VIROLAINEN (.) et DEFENDI (V), Human lymphoblastoid line from nod and spleen, Cancer, 1968, 22, 517). Des lignées permanentes ont également été obtenues à partir de matériel leucémique humain, tel que le sang, voir par exemple Moire (G.E.), Grace (J.I.) Citron (P.), Gerner (R.E.) et Burns A. "Leukocyte cultures of patients with leukeia . and lymphomas" NY J. Med. 66 2757 (1966), et Moore (G.E.) et Minowada J. "Human hematopoietic cell lines : a progress report. Hennic celle in vitro, étid. 4 100 (1969) ainsi que Belpomme D. et autres "Aspects morphologiques de plusieurs lignées permanentes (I.C.I.) établies à partir de sang leucémique humain: étude ultrastructurale et chromosomique des cellules avant et après passage en lignée continue,' dans la Revue Française d'Etudes cliniques et Biologiques, volume XIV pages 848-860 (1969). On peut ainsi obtenir des souches permanentes de culture de lymphocytes humains selon une fréquence variable. Les cellules de ces souches présentent un aspect lympho blastoide, ont une durée de vie illimitée et poussent en suspension dans un milieu semi-synthétique ordinairement constitué pour une part du produit vendu sous la dénomination commerciale R P M I 1640 par Grant Island Biological Co, New York 14072, Oakland, Californie 94 604, et pour une autre part de sérum embryonnaire de veau. Cette technique de culture en suspension stationnaire a été décrite en détail par exemple par BELPO.22 (D.) et col. dans Europ. J. Cancer, 1969, 5, 55 et par LE BORGNE de KAOUEL (Ch.), BELPOMME (D) et col. dans la Revue Française et clin. biol. 1969, 14, 53C. Le procédé de culture utilisé permet ici, selon l'invention, l'obtention de telles souches avec un rendement élevé. Il consiste à ensemencer, dans des flacons Falcon contenant du milieu RPiZ 1640 additionné de 20 ,0 de sérum embryonnaire de veau et d'antibiotiques, un grand nombre de leucocytes humains. Il peut s'agir de leucocytes provenant de sang, de moelle, de ganglions, de la rate, du thymus ou de lymphe prélevée au canal thoracique, etc. Lorsque l'échantillon mis en culture est solide, les éléments cellulaires sont au préalable dissociés par un moyen mécanique non traumatisant et la suspension est centrifugée, afin de procurer les leucocytes, constitués en majorité par des lymphocytes (ou thymocytes). Lorsque l'échantillon mis en culture est liquide, comme c'est le cas lorsqu'il s1 agit de sang ou de moelle, on ensemence directement les leucocytes qui sont obtenus après sédimentation à 370C de l'échantilon pendant de 30 à 90 minutes. Selon un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, et ce afin d'obtenir un très grand nombre de lymphocytes humains pour l'ensemencement des cultures, on peut prélever directement ces cellules chez le donneur, par centrifugation différentielle en se servant d'une machine trieuse spéciale, par exemple celle mise sur le marché à cet effet par la Société IBEi. Les cellules ensemencées sont cultivées en suspension stationnaire et nourries par renouvellement au demi avec du milieu neuf, et cela une à deux fois par semaine selon le pH de la culture. Après de 5 à 30 jours de culture, ou parfois plus si nécessaire, de grandes cellules monocytoïdes se déposent en monocouche au fond des flacons et adhèrent à la matière plastique de ces derniers. Selon l'invention, on trie les différents flacons et on ne conserve que ceux présentant une couche monocellulaire importante. On a an effet observé que seules les cultures ainsi retenues, évoluent alors régulièrement et de manière spontanée vers l'établissement en lignée permanente. Il est à noter que l'adjonction de certains facteurs au milieu de culture permet d'augmenter la fréquence des établissements en lignée permanente.En particulier or peut citer, comme exemples de tels facteurs le P.H.A., le B.C.G. ajouté de façon répétitive et à dose convenable, enfin certains suroageants et extraits acellulaires provenant de cultures de souches humaines variées. L'établissement en lignée permanente se manifeste par la décroissance du pH de la culture et par l'apparition d'agrégats de cellules lymphoblastoidas dans le surnageant de la culture. Lorsque la soucheermanente est définitivement établie, c'est-à-dire une fois que les cultures ont traversé une phase critique de croissance qui nécessite des soins techniques répétés, les cultures sont alors entretenues par dédoublement 2 fois par semaine. Selon l'invention, il est alors possible de disposer d'un nombre élevé de souches. On peut opérer parmi elles la sélection diorite selon l'invention, en utilisant comme critérium l'activité érythroagglutinante des sérums antilymphocytaîres obtenus chez l'animal. Grâce au procédé de culture précédemment décrit,il-est possible d'isoler plusieurs dizaines de lignées cellulaires permanentes de type lymphoblastoide, à partir de lymphocytes humains; les lignées envisagées à titre d'exemples dans la suite sont dénommées SER 001 à SER 028. On a caractérisé ultrastructuralement, chromosomiquement et immunologiquement chacune de ces lignes permanentes. Parmi les caractéristiques identifiables et retenues, certaines sont communes à toutes les lignées, quelle que soit leur origine, d'autres permettent de les individualiser, telles par exemple les caractéristiques immunologiques. De façon générale, chaque lignée cellulaire permanente est constituée par une population cellulaire homogène comprenant pour la plus grande partie des cellules lymphoblastoidas, quelles que soient l'origine et la nature de l'échantillon de départ mis en culture. Ce$ cellules ont toujours la même structure indifférenciée. Elles n'adhèrent à aucun supports elles sont disposées en agrégats macroscopiques et poussent en suspension dans le surnageant de la culture. Ces cellules présentent l'ultrastructura suivante: leur noyau arrondi ou polylobé présente une chromatine diffuse, un peu plus condensée sur le pourtour interne de la membrane nucléaire, ainsi que un à plusieurs nucléoles de struc ture granulaira. Dans le cytoplasme, les ribosomes sont le plus souvent libres. Le réticulum endoplasmique, qui est le plus souvent réduit, est très développé pour certaines cellules, mais cela ne saurait constituer en soi une caractéristique suffisamment distinctive. Les nitochondries sont de tailla moyenne et généralement nombreuses; quelques cellules présentent une activité macrophagique, mais là encore cela ne saurait permettre de les individualiser. On peut dans certains cas mettre en évidence dans un petit nombre de cellules la présence de quelques particules virales de type herpès, dont la structure est analogue à celle de l'herpès simplex. En définitive, aucune différence ultrastructurale déterminante ne peut entre mise en évidence au sein de ces lignées de lymphocytes humains. Par ailleurs, les études chromosomiques de ces memes souches ont montré que, pour la plupart d'entre elles, même après plusieurs moin de culture, le caryotype est diploïde (2n chromosomes), pour la majorité des mitoses, qu il possède les mêmos chromosomes sexuels que ceux des leucocytes du donneur de cellules et, qu'il ne présente pas d'anomalies structurales. Ces différentes souches peuvent toutefois être distinguées de façon certaine les unes des autres par leurs caractéristiques immunologicues. En particulier, les antigènes membranaires de type IELA (antigènes d'histocompatibilité) sont retrouvés intacts, en quantité et en qualité, sur les cellules lymphoblastoides de culture. Pour la déternination de ces antigènes d'histocompatibili té HLu. chez lthomme, on peut se référer à la publication de Terasaki et col intitulée "Sarotyping for Eomotransplantation. X:Survival of 196 Grafted Kidneys Subsequent of Typing" dans Transplantation, 5: 1057,1967. Autrement dit, il existe pour chaque souche ou lignée un spectre déterminé en antigènes HLk différents les uns des autres, ce spectre étant semblable à celui du sujet dont les cellules ont été mises en culture. Selon l'invention, on réalise la préparation cellulaire utilisée pour l'immunisation de l'animal par mélange d'au moins 5, et de préférence d'au moins 10 lignées, chaque lignée -et donc chaque spectre en HLA- étant avantageusement représentée à l'intérieur de ce "pool" de lignées à dose cellulaire sensiblement égale, n'étant d'autre part utilisées pour ce mélange que les souches ou lignées dont le sérum correspondant présente une activité érythroagglutinante faible, chiffrée à une dilution inférieure ou au plus égale à 1/8. On a en effet déterminé expérimentalement que les sérums obtenus après immunisation de l'animal, par exemple le cheval, par des cellules provenant d'une seule lignée ont une activité antilymphocytaire très variable; leur cytotoxicité varie de 1/1024 a 1/8 192 et l'inhibition des rosettes est en outre également variable. A l'inverse et dans les mêmes conditions expérimentales, lorsqu immunise l'animai, par exemple le cheval, à l'aide de cellules provenant d'un "ppol" de plusieurs souches réalisé selon l'invention, le sérum convenablement recueilli présente constamment une forte activité antilymphocytaire (cytotoxicité et inhibition des rosettes), ce qui n'est pas le cas des sérums obtenus lorsqu'on injecte à l'animal une quantité égale de cellules lymphoblastoides provenant d'une seule souche de tissus hématopoiétiques ou sanguins. De plus, cette mise en oeuvre selon l'invention d'une préparation lymphocytaire constituée par un mélange de plusieurs lignées tel que définizpermet d'obtenir un sérum présentant une plus grande polyvalence. C'est ainsi que, par exemple, les sérums convenablement obtenus à l'aide de ladite préparation lymphocytaire sont efficaces in vitro sur un plus grand nombre d'échantillons lymphocytaires testés, en ce qui concerne la cytotoxicité et l'ihibition de la formation spontanée des rosettes. En pratique, on réalise des cultures en grande quantité des différentes souches lymphoblastoides retenues comme donnant un sérum présentant une activité érythroagglutinante inférieure ou au plus égale à 1/8, en utilisant des procédés de culture industriels connus. Lorsque le nombre désiré de cellules est atteint, on sépare ces dernières du surnageant de culture, par exemple par sédimentation, puis par centrifugation. On lave ensuite les cellules deux PDis avec du sérum physiologique, on les numère au bleu de Trypan, et on les mélange ensuite à des doses convenables, de préférence à des doses égales, avec les cellules d'autres lignées, pour constituer un "ppolss' lymphocytaire selon l'invention. A titre d'exemples, on donne dans le tableau I ci-après les titres en érythroagglutinines pour différentes souches lymphocytaires injectées à un cheval, à savoir les titres en érythroagglutinines pour les lignées appelées SER 001 à SER 009, choisies parmi les lignées SER 001 à SER 028 mentionnées plus haut. TABLEAU I SER GM SER002 SER003 SER004 SER oe4 SR 006 SER007 SER 008 SER 009 1/8 1/8 1/16 1/4 1/64 1/32 1/16 1/32 1/128 Selon une forme de mise en oeuvre particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, on soumet les préparations lymphocytaires obtenues après ledit mélange à une lyophilisation Cependant, il est évident que l'on peut également les utiliser directement à 11 état frais, ou après les avoir conservées à environ -700C. Comme il apparaîtra clairement aux hommes de l'art, les avantages du sérum selon l'invention sont nombreux. Les lymphocytes humains cultivés en lignée permanente utilisés selon l'invention constituent une substance homogène et pure ne comportant ni plaquettes, ni érythrocytes, ni cellules d'un autre tissus Le procédé selon l'invention permet de rendre constante et exceptionnellement bonne la qualité des sérums antilymphocytaires, en particulier en ce qui concerne la reproductibilité de leur action biologique efficace (cytotoxicité antilymphocytaire et activité immunosuppressive) et la reproductibilité de leur parfaite tolérance clinique (absence totale d'activité antithrombocytaire et antiérythrocytaire).Or on sait qu'une telle reproductibilité était actuellement impossible à obtenir avec les sérums préparés aussi bien à partir de tissus frais qu'à partir de cellules de culture, la qualité de ces sérums de l'art antérieur étant variable d'un échantillon à l'autre ou d'une souche cellulaire à l'autre. L'invention permet donc en définitive une standardisation parfaite desdits sérums. De plus, les sérums obtenus selon l'invention sont très polyvalents, c'est-àdîre efficaces cliniquement sur un plus grand nombre de malades. Chez le singe, ledit sérum est bien toléré, tant sur le plan général que local même lorsqu'il est injecté à forte dose, à savoir, par exemple 1,5 mu/24 heures et par kg. Son efficacité immunosuppressive est démontrée par la très longue survie des allogreffes, qui est égale ou même plus souvent supérieure à 3 semaines, par rapport aux témoins. Chez l'homme, le sérum selon l'invention possède aussi une tolérance parfaite, même lorsqu'il est injecté à de très fortes doses jamais encore utilisées avec les autres sérums antilymphocytaires connus. Les doses utilisées en clinique humaine peuvent aller, pour un adulte, jusqu'à 120 ml par jour ou davantage, d'une suspension de gammaglobulines antilymphocytaires à 4 %. Après injection du sérum antilymphocytaire obtenu selon l'invention, on note - l'absence totale de thrombopénie, - l'absence complète d'anémie, - l'absence de fièvre après l'injection, - l'absence de choc, - l'absence de syndrome rénal, avec en particulier parfaite conservation de la diurèse, - l'absence de douleur et de complications locales au point d'injection. Ce sérum antilymphocytaire possède donc de nombreuses applications cliniques, parmi lesquelles on peut citer à titre d'exemples non limitatifs - le conditionnement des receveurs et des donneurs dans les greffes de moelle osseuse, - le conditionnement des receveurs pour toutes les transplantations d'organes (rein, coeur, foie, etc..), -le traitement des maladies auto-immunes, - le traitement de certaines affections neurologiques, telles que la sclérose en plaque, - le traitement des poussées inflammatoires évolutives de certaines affections telles que l'hépatite cirrhogène évolutive, la rectocolite hémorragique, etc. - le traitement des connectivités. L'invention est décrite plus en détail par les exemples ciaprès, qui n'en constituent aucunement une limitation. EXIPLE 1 On a prélevé un grand nombre de leucocytes humains sur un sujet normal. On a ensuite procédé à une culture en suspension stationnaire, en vue d'obtenir les lignées désirées. Pour chaque mise en culture, on a prélevé asptiquement, à l'aide d'une seringue héparinée, 50 ml de sang périphérique. Après sédimentation des hématies à 370C pendant de 30 à 60 minutes, on a recueilli le plasma surnageant et on a lavé les cellules deux fois dans de 20 à 30 ml de milieu RPAE 1640.On a mis le dernier culot cellulaire en suspension dans 5 mi de milieu et on a numéré les cellules tablas au bleu de Trypan. On a ensemencé les cellules à une concentration initiale de 2,5 à 5 x 106 cellules/ml, dans 40 ml de milieu RPi\!I 1640, enrichi de 20 % de sérum embryonnaire de veau, préalablement décomplementé et additionné d'antibiotiques (Pénicilline : 100 U/ml; sulfate de streptomycine ou kanamycine: 50 tg/ml). On a réalisé les cultures dans des flacons cylindriques en verre neutre, d'une contenance de 250 ml, à goulot étroit, col vissable et bouchon en bakélite ou dans des flacons "Balcon" sans "feeder layer" et en atmosphère ordinaire à 37 C. Deux fois par semaine, on a enlevé la moitié du surnageant de la culture et on a,àohaque fois, ajouté un volume de milieu frais tel que la concentration cellulaire dans la culture demeurât supérieure ou au moins égale à 500.106. cellules/ml. Lorsque le nombre total de cellules par flacon est devenu inférieur à 5.106 cellules, on a réuni le contenu de plusieurs flacons dans le flacon où la couche de cellules mono cytofdes était la plus importante. Après l'établissement en lignée permanente, on a entretenu les cultures par dédoublement deux fois par semaine. Lorsque le nombre désiré de cellales a été atteint, on a séparé les cellules du surnageant de culture, par sédimentation puis par centrifugation. On a ensuite lavé les cellules deux fois avec du sérum physiologique et on les a numérées au bleu de trypan. Pour chaque souche, il existait un spectre en antigènes RTA déterminé, semblable à celui du sujet dont les cellules avaient été mises en culture. E3z2DPLE 2 On a mélangé des cellules obtenues selon l'exemple 1 avec une dose pratiquement identique de cellules de chacune de 9 autres lignées établies selon le mode opératoire indiqué dans l'exemple 1, pour constituer les "pools't ou préparations lympho cytaires, que l'on a conservées àr700C environ. On a ensuite utilisé la préparation lymphocytaire ainsi préparée pour l'immunisation d'un cheval auquel on a injecté par voie sous-cutanée, 105.105 de ces cellules lymphoblastoides, sous la forme de 6 injections espacées de 1 semaine chacune et comportant les doses croissantes respectives suivantes : 5.109; 10.109, 15.109, 20.109; 25.109; 30.109 cellules. On a recueilli le sérum brut 10 jours après la dernière injection. Le sérum ainsi obtenu était particulièrement actif, il possédait une cytotoxicité de 15 % au 1/4096 ème et une inhibition de la formation spontanée des rosettes encore au 1/256ème . Il ne présentait en outre aucune activité thrombocytaire, ni aucune activité antiérythrocytaire. On a ensuite extrait les immunoglobulines de ce sérum et on les a purifiées, sans absorption sur globules rouges. La perte d'activité antilymphocytaire au cours de cette purification était des plus réduites. EXEMPLE 3 On a procédé comme dans I'exemple 2, à cette différence près que l'on a réalisé 8 injections, les 2 injections supplémentaires ainsi effectuées comportant respectivement des doses de 35 x 109 et 40 x 109 cellules lymphoblastoides d'une pré+a-' ration lymphocytaire selon l'invention. On a recueilli le sérum brut 20 jours après la huitième injection. Le sérum ainsi obtenu était également actif, possédant une cytotoxicité -de 15 0% à la dilution de 1/8192 et une inhibition de la formation spontanée des rosettes encore à la dilution de 1/256. Il ne présentait également ni activité thrombocytaire, ni activité antiérythrocytaire. On a extrait et purifié les immunoglobulines de ce sérum comme indiqué dans l'exemple 2. EvrIITLE 4 On a procédé comme indiqué dans l'exemple 2, à cette différence près que l'on a administré les préparations lymphocy tares au cheval sous la forme de pastilles de préparation lymphocytaire selon l'exemple 1, préalablement lyophilisée et comprimée, implantées sous la peau de l'animal aux doses et à la fréquence indiquées. Le sérum prélevé après l'implantation de plusieurs pastilles s'est révélé avoir des caractéristiques identiques à celles du sérum obtenu selon l'exemple 2. R'1E 5 On a procédé à l'immunisation du cheval comme indiqué à l'exemple 2, mais avec des cellules provenant d'une seule lignée préparée selon l'exemple 1. On a répété ce mode opératoire sur plusieurs chevaux et avec chaque fois une lignée unique différente. Dans tous les cas, on a obtenu après saignée des animaux un sérum ayant une activité antilymphocytaire comprise entre 1/1024 et 1/8192. Cette activité était en outre très variable d'un sérum à l'autre. L'inhibition de la formation spontanée de rosettes était également très variable. Ces essais comparatifs ont fait ressortir les résultats exceptionnels du procédé selon l'invention et la qualité particulière à tous points de vue du sérum antilymphocytaire ainsi obtenu. REVEi1) ICAT IONS 1. Préparations lymphocytaires, caractérisées en ce qu'on les obtient par mélange d'un nombre supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de différentes souches de cultures permanentes préalablement sélectionnées de type lymphoblastoide, provenant de sujets humainsZn'étant utilisées pour ledit mélange en vue de la préparation de sérum antilymphocytaire que les souches dont le sérum correspondant présente une activité érythroagglutinante la plus faible possible, chiffrée à une dilution inférieure ou au plus égale à 1/8 environ. 2. Préparations lymphocytaires selon la revendication 1, caractérisées en ce que les différentes souches de culture permanente figurent dans ledit mélange à des doses cellulaires sensiblement égales. 3. Procédé pour l'obtention de préparations lymphocytaires selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mélange un nombre supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de différentes souches de culture permanente préalablement sélectionnées de type lymphoblastoide, provenant de sujets humains,,, n' étant utilisées pour ledit mélange en vue de la préparation de sérum antilymphocytaire que les souches dont le sérum correspondant présente une activité érythroagglutinante inférieure ou au plus égale à 1/8 environ. 4. Application des préparations lymphocytaires selon l'une des revendications 1 ou 2 à l'obtention d'un sérum antilymphocytaire pratiquement polyvalent et à activité antilymphocytaire constante, caractérisée en ce que l'on immunise un animal receveur, tel que le cheval par une dose totale de celIules lympho blastoides desdites préparations lymphocytaires de 100 à 200.109 répartie en 6 à 8 injections à doses croissantes, espacées de 1 semaine environ, et qu'on recueille le sérum brut, produit, par saignée entre environ le dixième et le vingtième jour suivant la dernière injection. 5. Application selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on administre lesdites préparations lymphocytaires à 11 animal par voie sous-cutanée, par voie intra-dermique ou par voie -intra-veineuse. 6. Application selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'on lyophilise lesdites préparations lymphocytaires et on les met sous forme de pastilles qu'on implante sous la peau de l'animal. 7. Procédé pour l'obtention de sérum antilymphocytaire caractérisé en ce qu'on utilise des préparations lymphocytai- res obtenues par mélange d'un nombre supérieur à 5, de préf é- rence supérieur à 10, de différentes souches de cultures permanentes préalablement sélectionnées de type lymphoblastoide, provenant de sujets humains, n'étant utilisées pour ledit mélange en vue de la préparation de sérum antilymphocytaire que les souches dont le sérum correspondant présente une activité érythroagrlutinante la plus faible Possible, chiffrée à une dilution inférieure ou au plus égale à 1/8 environ, qu'on immunise un animal receveur, tel que le cheval, par une dose totale de cellules lymphoblastoides desdites préparations lymphocytaires de 100 à 200.109, répartie en 6 à 8 injections à doses croissantes, espacées de 1 semaine environ, et qu'on recueille le sérum brut produit, par saignée entre environ le dixième et le vingtième jour suivant la dernière injection. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on administre lesdites préparations lymphocytaires à l'animal par voie sous-cutanée, par voie intra-dermique ou par voie intraveineuse. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que l'on lyophilise lesdites préparations lymphocy- taires et on les met sous forme de pastilles qu'on implante sous la peau de l'animal. 10. Sérum antilymphocytaire obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9.