Brevet FR2181507A1 — publié le 19731207

La présente invention a trait à un procédé d'obtention de protéolysat de substances naturelles d'origine animale ou végétale. Elle a trait également aux protéolysats obtenus selon ledit procédé et à leur application en thérapeutique, notamment pour le traitement de la dénutrition. On sait que l'on a préparé des protéolysats de substances naturelles, notamment en soumettant lesdites substances à l'action d1u > eenzyme protéolytique. Les procédés préconisés sont difficilement reproductibles en ce sens qu'ils ne précisent pas l'instant auquel il convient de stopper la digestion enzymatique. Selon la durée de la protéolyse, on obtient un mélange en proportion variable de polypeptides et d'acides aminés, le mélange ainsi obtenu étant destiné, soit au traitement de l'hypertension, soit au traitement de la dénutrition, soit au traitement des déficiences hépatiques, cardiaques ou pancréatiques. Selon l'invention, on propose un procédé de préparation permettant d'obtenir de façon reproductible, quelle que soit la substance naturelle de départ, des protéolysats ayant un rapport azote aminé/azote total constamment compris entre 60 et 80% et contenant essentiellement des acides aminés optiquement actifs. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet une substance naturelle animale ou végétale, finement broyée, à l'action en milieu aqueux d'au moins uneenzyme protéolytique ou complexe enzymatique protéolytique, élimine les graisses par décantation à basse température, filtre le milieu réactionnel après dégraissage, fait passer le filtrat sur une résine échangeuse d'ions, et concentre les principes actifs de l'éluat selon une méthode connue en soi. Parmi les substances animales et végétales qui conviennent, on peut notamment citer, d'une part, les organes d'animaux : coeur, foie, rein, muscle, et, d'autre part, les substances végétales protéiniques telles que la protéine du soja. Par enzyme et complexe enzymatique protéolytiques, on entend ici les protéases et les mélanges enzymatiques qui ont une activité protéolytique. Les produits enzymatiques qui conviennent sont notamment des protéases obtenues par extraction de substances animales, végétales ou par fermentation bactérienne ou fongiques, telles que, par exemple, la pancréatine, la trypsine, la chyme trypsine parmi les enzymes d'origine animale, la ficine, la broméline, la papatne parmi les enzymes d'origine végétale, et, les protéases du Bacillus subtilis, du Streptomyces fradiae et du Streptomyces griseus parmi les enzymes préparées par fermentation. Sans sortir du cadre de l'invention, on peut notamment effectuer la digestion protéolytique au moyen d'un mélange de deux ou plusieurs enzymes citées ci-dessus. La quantité d'enzyme et de complexe enzymatique dépend naturellement de l'activité protéolytique de l'agent protéolysant. D'une manière générale, la quantité pondérale d'enzyme sera comprise entre 0,2 et 2 % par rapport au poids de matière protéique mis en oeuvre, exprimé en extrait sec. Bien entendu, on peut remplacer les enzymes d'origines animales ou végétales par les quantités biologiquement équivalentes d'organe et de substance végétale . Par exemple on pourra remplacer la pancréatine de porc ou de boeuf par une quantité équivalente du point de vue biologique de pancréas de porc et de boeuf. Les conditions de la protéolyse, à savoir le pH, les proportions respectives d'enzyme et de substrat, la température et la durée de protéoXyse, sont fonction de la nature de l'enzyme utilisée. D'une manière générale, si l'on fait appel à une protéase agissant en milieu acide, on procédera au voisinage de son pH optimal, et si l'on fait appel à une protéase agissant en milieu alcalin, on se placera de même en milieu alcalin au voisinage de son pH optimal. Bien entendu, le milieu de protéolyse peut renfermer les coenzymes nécessairesaux actions des enzymes sur les protéines. Parmi les coenzymes qui conviennent on pourra notamment utiliser les oligoéléments. La protéolyse étant terminée, le milieu réactionnel est ramené à une température comprise entre 0 et 40C pour permettre aux graisses de se figer en surface. On soutire le liquide sous-jacent qui est filtré jusqu'à solution limpide, cette solution est ensuite passée sur colonne de résine échangeuse d'ions, acide ou alcaline, avec élution ultérieure, soit avec une solution aqueuse d'ammoniac (de 20 à 30 g/l), si on a utilisé une résine acide ou élution à l'acide chlorhydrique (concentration 20 à 30 g/l en acide HC1 concentré de densité 1,19) si on a utilisé une résine alcaline. L'élut est ensuite évaporé sous pression réduite jusqu'à obtention d'un concentré à 30% d'extrait sec, le concentré étant lui-même desséché en poudre, soit par atomisation, soit par lyophilisation. Les produits obtenus contiennent la quasi-totalité de l'azote protéique de la matière première de départ sous forme d'acides aminés et de polypeptides de faible poids moléculaire qui peuvent être utilisés avec les meilleurs résultats dans tous les cas de dénutrition, soit per os, soit par voie injectable. L'intérêt du procédé réside dans la transformation de la quasi-totalité de l'azote protéique contenu dans la substance d'origine en un extrait concentré d'acides aminés naturels, soluble, immédiatement assimilable et permettant la suralimentation de tous les malades en état de dénutritison, notamment par injection, perfusion ou sonde. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples depréparation nullement limitatifs donnés à titre d'illustration. EXEMPLE l Protéolyrnt de foie On soumet 100 g de foie de veau frais broyés à une digestion enzymatique sous agitation lente avec 2 g de pancréatine de porc répondant aux spécifications du Codex français, dans 400 ml d'eau distillée, pendant 8 heures, à pH 8 et à une température de 450C. La température est ensuite abaissée entre O et + 40C pour permettre, au bout d'une heure, le figeage des graisses contenues dans ltémulsion. Après soutirage du liquide sous-jacent, on filtre, on écarte le résidu et on fait passer le filtrat sur une résine échangeuse de cations / Amberlite IRC-50 commercialisée par Rohm & Haas - cf. Merck Index 7ème édition (1960), page 1583 /. On élue avec une solution aqueuse d'ammoniac à 30 g/l (3 fois avec à chaque fois 200 ml de solution). Les éluats sont rassemblés, concentrés sous pression réduite et desséchés en poudre, par atomisation, Le rendement obtenu est de 8 g d'une poudre à 6 % d'humidité en poids. Lorsque l'on lyophilise au lieu d'atomiser, on peut obtenir par filtration stérilisante préalable, une poudre ayant les mêmes caractéristiques que celle obtenue par atomisation et parfaitement stérile. En opérant comme indiqué ci-dessus en remplaçant la pancréatine par 10 g de pancréas de porc finement broyé on obtient une poudre équivalente. EXEMPLE 2 Protéolysat de coeur On soumet 100 g de pulpe de coeur finement broyés à une digestion enzymatique sous agitation lente avec 1 g de papatne, de titre 600 selon le Codex français, dans 400 ml d'eau distillée à 600C pendant 6 heures à pH 5,5. Après dégraissage et filtration comme dans l'exemple 1, on passe le filtrat sur une résine échangeuse d'anions /Amberlite IR-45 de Rohm & Haas I puis on élue avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (20 g d'acide concentré de densité 1,I9 par litre dreai, On élue au total à trois reprises avec chaque fois 200 ml de solution d'acide chlorhydrique. On obtient par lyophilisation 7 g de poudre. EXEMPLE 3 Protéolysat de soja On soumet 100 g de poudre de soja déshuilé à l'action de 0,20 g de Pronase AF (enzyme protéolytique fabriqué par KAKEN CHEMICAL CO. ttd à partir du Sreptomyces griseus et titrant 15000 unités P.U.K. par gramme) dans 300 ml d'eau distillée à 50"C pendant 4 heures à pH 8. Après dégraissage et filtration comme dans les exemples ci-dessus, on élue à 3 reprises sur Amberlite IRC-50 avec une solution aqueuse d'ammoniac à 30 g par litre. On obtient après traitement comme ci-dessus 12 g de poudre sèche. EXEMPLE 4 Protéolysat de muscle de boeuf On soumet 100 g de pulpe de muscle de boeuf à l'action de 0,20 g de Pronase AF(titrant 15000 unités P.U.K./g) dans 400 mî d'eau distillée à 500C pendant 4 heures à pH 8. Après séparation des graisses par refroidissement et filtration comme indiqué à l'exemple 1, on fait passer le filtrat sur une colonne échangeuse de cations/ Amberlite I.R.C. 50 7 puis on élue 3 fois avec 200 ml à chaque fois d'une solution aqueuse d'ammoniac à 30 g/l. Après atomisation, on obtient 8 g d'une poudre à 6 X dthumidité. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un protéolysat de substance naturelle au moyen d'une digestion enzymatique, caractérisé en ce que l'on soumet une substance animale ou végétale finement broyée, à l'action d'au moins une enzyme protéolytique ou complexe enzymatique protéolytique, élimine les graisses par décantation à basse température, filtre le milieu réactionnel, fait passer le filtrat sur une résine échangeuse d'ions, puis, après une ou plusieurs élutions, concentre les principes actifs contenus dans l'éluat, la quantité d'enzyme protéolytique utilisée pour la digestion protéolytique étant comprise entre 0,2 et 2% en poids par rapport au poids de matière protéique exprimé en extrait sec. 2. Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique est une enzyme d'origine bactérienne, fongique, végétale et animale ou une quantité biologiquement équivalente de substance végétale ou d'organe. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique utiliséeest la protéase du Bacillus subtilis, la protéase du Streptomyces fradiae, la protéase du Streptomyces qriseus, la ficine, la broméline, la papaïne, la trypsine, la cbymotrypsine, la pancréatine ou le pancréas lui-meme. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce que la matière protéique soumise à une digestion enzymatique est choisie notamment parmi le foie,le coeur, le muscle, le rein et le soja. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élution de la résine échangeuse d'ions est effectuée au moyen d'une solution aqueuse d'ammoniac à 30 g/l quand il s'agit d'une résine échangeuse de cations et au moyen d'une solution d'acide chlorhydrique de 20 à 30 g/l d'HCl de densité 1,19 quand il s'agit d'une résine échangeuse d'anions. 6. Protéolysats obtenus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et utilisables notamment par voie orale ou injectable.