Brevet FR2197979A1 — publié le 19740329

La présente invention a pour objet un procédé amélioré de production d'acide aspartique par bio-conversion d'acide fumarique. De nombreuses méthodes de préparation ou d'isolement d'acide aspartique à partir de produits naturels ont été décrites. Parmi celles-ci, la plupart font appel soit à des matières premières aléatoires, soit à des procédés compliqués. Seules les méthodes utilisant la bio-conversion sont les plus aptes à recevoir des applications industrielles. Toutefois, tous les procédés décrits jusqu'ici font apparaitre des vitesses de réaction faibles et leur mise en oeuvre conduit à un cotit élevé du produit final, ce qui en limite les applications aux usages pharmaceutiques. Les nouvelles utilisations de l'acide aspartique comme matière première pour la synthèse de peptides divers offrent des débouchés très intéressanS à cet amino-acide. Mais encore faut-il pour cela obtenir économiquement l'acide aspartique avec une pureté convenable. On note que généralement les micro-organismes considérés comme les plus aptes à produire l'amino-transférase nécessitent pour leur croissance un milieu de culture complexe contenant outre une source de carbone assimilable, des sources d'azotes organiques telles que les hy-a.rolysats protéiques qui sont des matières premières peu constantes en composition et relativement onéreuses. De ce fait, les méthodes utilisant de tels micro-organismes peuvent etre considérées comme complexes et peu adaptées à une production industrielle. Or, la demanderesse a découvert un nouveau micro-organisme capable de réaliser, par la mise en oeuvre de moyens simples, la bio-conversion d'acides organiques non saturés tels que fumarique en acide L aspartique avec des vitesses considérablement plus élevées que celles correspondant aux procédés décrits jusqu'ici. En outre, le micro-organisme revendiqué se développe au contraire dans un milieu simple puisqu'il se compose essentiellement de résidus de l'extraction du sucre, c'est-à-dire les mélasses de betterave ou de canne supplémentées par un apport de phosphore minéral sous forme de phosphate et d'azote sous forme d'urée ou d'ammoniac ainsi que quelques oligo-éléments. De plus, la demanderesse a pu faire la preuve que le milieu à base de mélasses constituait un substrat qui, pour des raisons qui n'ont pas été élucidées, favorisait la formation par le micro-organisme d'aminotransférase. Ainsi, les exemples donnés plus loin montrent la spécificité de la souche pour un tel milieu. La mesure en est effectuée d'une part, par le dosage de l'enzyme spécifique dans le milieu, et d'autre part, par la mesure de la vitesse de transformation - Acide fumarique > Acide aspartique. Ces mesures montrent que le me me micro-organisme cultivé sur un milieu artificiel à base de glucose et d'azote protéique ne permet que des vitesses de transformation de 30 à 50 % inférieures à celles obtenues lorsque le micro-organisme est développé sur un milieu mélassé. L'objet de l'invention est réalisé par incubation en aérobiose de la souche PO 7111 dans un milieu de culture contenant de la mélasse de betterave ou de canne comme seule source de carbone et une quantité limitée d'acide fumarique comme agent potentiateur de l'accumulation d'aminotransférase par ce micro-organisme. Cette première phase est contrôlée en mesurant l'activité enz-7matique correspondante selon la méthode décrite dans "Méthods in enzymology" Volume 13. Lorsque la teneur optimum est atteinte, la culture est stoppée puis mise en présence du substrat en vue de sa transformation en acide aspartique. Cette phase de bio-conversion est effectuée sans aération afin d'éviter la formation de produits secondaires indésirables, en particulier de produits d'oxydation de l'acide éthylénique. La substance attaquée est le fumarate diammonique. La réaction est effectuée sous couverture d'un gaz neutre tel que l'azote. Durant la transformation, la température est maintenue entre 30 et 400C, de préférence entre 35 et 370C. Au fur et à mesure de la bio-conversion, le pH du milieu a tendance à se modifier. Afin de favoriser la vitesse de transformation, ce facteur est maintenu constant par addition de quantités mesurées d'ammoniac gazeux. La valeur pH est maintenue à 8 tout au long de l'opération. Le substrat à transformer peut etre mis en présence de la culture, soit en une seule fois au début de la seconde phase, soit en plusieurs fois ou en alimentant le mélange avec une solution de fumarate au fur et à mesure de sa transformation. En fin de réaction, c'est-à-dire lorsque le taux d'acide fumarique résiduel est descendu à des valeurs telles que le rendement soit optimum, la masse est soumise à une séparation effectuée par les moyens habituels et connus en soi, tels que centrifugation, filtration, etc..., ceci afin d'en éliminer les micro-organismes et tout autre composé insoluble. On obtient ainsi une solution concentrée d'acide aspartique de laquelle l'aminoacide est extrait par des moyens classiques tels que insolubilisation par amenéedu pH au point iso-électrique. Suivant les conditions de l'invention, le produit cristallisé ainsi obtenu est d'une pureté suffisante pour des usages industriels mais peut être purifié jusqu'à l'obtention d'un produit conforme aux normes pharmaceutiques par un simple traitement de recristallisation après décoloration. Le micro-organisme a été isolé à NESLE dans la Somme (80) à partir d'effluents liquides. I1 appartient au genre PSEUDOMONA6mais doit Btre considéré comme original puisqu'il diffère par un ou plusieurs caractères fiables et stables des bactéries de ce type selon les critères définis dans le "BERGEY'S MANUEL" édition 1957. DESCRIPTION DE LA SOUCHE PO 7111 - bâtonnets : courts, isolés ou par paires, peu ou pas mobiles. - coloration de gram : négative - colonies sur gélose : rondes, blanch tre à chamois clair, brillantes, convexes à bords translucides, diamètre 3mm après quatre jours d'incubation à 3O0C. sur gélatine : rondes, blanch tre à jaune, brillantes, bombées lisses. - piqûres sur culot de gélatine : pas de liquéfaction - milieu B de KING : production de pigment vert fluorescent, non diffusibles après 24 heures d'incubation à 300C. - lait : non alcalinisé - nitrate : non réduit en nitrite - croissance sur glucose, lactose, saccharose, levulose, mannitol, glycérol, sans acidification - milieu tyrosine : pas de développement - phénol non attaqué - pas de production d'indole d'hydrogène sulfuré ou de gaz - pas de lysine décarboxylase - aérobie : bonne croissance entre 30 et 370C. Les exemples suivants sans être limitatifs vont montrer tout l'intérêt de la découverte revendiquée EXEMPLE 1 On prépare parallèlement deux milieux de culture ayant les caractéristiques suivantes I - MILIEU ARTIFICIEL - glucose ... 60 g/l - liqueur de macération de mais 40 g/l - sulfate de magnésium 7 H2O 0,5 g/l - phosphate mono-potassique 5 g/l - acide fumarique 1 g/l II - MILIEU MELASSE - mélasse 60 g/l, exprimé en sucres totaux - phosphate mono-potassique 5 g/l - sulfate de magnésium 7 H20 : 0,5 g/l - urée 8 g/l. Après stérilisation 20 mn à 1210C, le pH est ajusté de 7 à 7,2 stérilement avec l'ammoniac gazeux. On inocule alors chaque milieu avec une suspension saline de la souche. La culture est réalisée sur agitateur rotatif dans des fioles de 6 1 contenant 1 litre de milieu. On suit le développement bactérien par mesure de la densité optique après dilution au 20è et celle de l'activité aminotransférase par la méthode décrite dans "Méthods in enzymology". DUREE MILIEU 1 : GLUCOSE MILIEU 2 : MELASSE DE Activité exprimée Activité exprimée FERMEN- Population en unité amino- Population en unité amino TATION en bact/ml transférase inter- en bact/ml transférase inter EN h. nationale/l/h. nationale/l/h. O 1 x 108 - 1 x 108 10 0,8 x 109 18,8 0,9 x 109 26 15 1 x 1010 18 0,9 x 1010 34 20 1,1 x 1010 19 1,1 x 101 32,6 24 1,1 x 101O 18,8 1,0 x 1010 31,2 On constate que si le développement bactérien est à peu près identique dans les deux milieux, les activités aminotransférase sont plus élevées de 50 à 60 % lorsque le micro-organisme est cultivé dans le milieu 2. EXEMPLE 2 On prépare un milieu composé de - mélasse de betterave 40 g/l exprimés en sucres to - phosphate mono-potassique....... 5 g/l taux - urée............................ 8 g/l - sulfate de magnésium 7 H2O...... 0,5 g/l - acide fumarique 1 g/l 1,5 litre de ce milieu est placé dans un erlenmeyer de 6 litres muni de bafles contre-agitatrices et stérilisé à l'autoclave 20 mn à 1210C. Après refroidissement à 300C, le pH est ajusté stérilement à 7 avec de l'ammoniac. On inocule alors avec 20 cm3 d'une solution saline provenant d'une culture surgélose de la souche PO 7111. La culture est effectuée en milieu stérile à 300C en aérobiose. Pour ce faire, la fiole est placée sur un shaker rotatif tournant à 180 tours/mn avec une excentricité de 5 cm. Après 10 heures, le pH est de 7,65 et la population bactérienne de 1010 bactéries/ml. Un litre de ce milieu sert à inoculer un fermenteurpilote de 20 1 de volume utile dans lequel on a stérilisé un milieu contenant - mélasse 800 g exprimés en sucres totaux - acide fumarique : 46 g - sulfate de magnésium 7 H20 : lo g - acide fumarique 20 g - eau pour compléter à 20 1 - ammoniac : quantité nécessaire pour amener le pH à 8 après stérilisation. La fermentation est effectuée sous agitation avec un taux d'aération de 0,3 1 d'air stérile/mn/l de milieu, soit un débit de 360 1/heurte. Le fermenteur est maintenu sous couverture d'air stérile à une pression de 300 g/cm2. Après 16 heures, le pH est compris entre 8,8 et 9 et la population bactérienne atteint 1010 bactéries/ml. L'activité aminotransférase du moût est alors de 30 unités enzymatiques internationales. On rappelle qu'une unité internationale correspond dans les conditions opératoires à la conversion d'une micromole d'acide fumarique par minute. L'aération et l'agitation sont alors stoppées et la température est progressivement élevée jusqu'à 370C. On transfère alors le moût fermenté dans un récipient clos de 50 1 utiles contenant une solution de fumarate d'ammonium à 200 g/l exprimés en acide fumarique. La température de cette solution a été préalablement portée à 370C et le pH ajusté à 8 avec de l'ammoniac. Après transfert, on agite lentement durant quelques minutes pour homogénéiser puis on chasse l'air restant par un balayage d'azote. L'opération se déroule alors sans agitation et sous une pression de couverture de gaz inerte de 100 g/cm2. On suit l'évolution de la réaction par dosage de 1' aci- de L aspartique formé et de l'acide fumarique résiduel. Après douze heures, la concentration en acide L aspartique atteint 112 g/l dans le milieu, soit un taux de conversion de 97,8 % et une vitesse de transformation voisine de 17 g d'acide fumarique/l/h ramenée au moût actif. EXEMPLE 3 Vingt litres d'un moût obtenu dans les memes conditions que l'exemple 2 sont transférés dans une cuve close, munie d'un agitateur et d'une arrivée d'ammoniac gazeux, contenant 10 1 d'une suspension de fumarate diammonique à 400 g/l exprimés en acide fumarique. Comme précédemment, on agite pour homogénéiser et établit une légère surpression d'azote. On effectue alors la bio-conversion en maintenant le pH à 8 par addition d'ammoniac gazeux. Après 10 heures de fonctionnement, la concentration en acide fumarique est tombée à 10 g/l. On ajoute alors progressivement des fractions d'une suspension à 400 g/l d'acide fumarique en maintenant le pH à 8 et la teneur en acide fumarique du milieu entre 10 et 20 g/l. On poursuit ainsi durant trente heures. La concentration en acide aspartique dans le milieu atteint alors 195 g/l. On arr8te l'addition de suspension d'acide fumarique et on laisse la réaction se poursuivre durant deux heures. Le taux d'acide fumarique non transformé est, à ce moment, de 2 g/l et on a effectué la bio-conversion de 8 kg d'acide fumarique. Le rendement molaire de la réaction est de l'ordre de 98 % et la vitesse moyenne de transformation de 13g d'acide fumarique parrh/l de moût actif. EXEMPLE 4 10 m3 d'une solution résultant de la bio-conversion d'acide fumarique en acide L aspartique et obtenus par l'application industrielle du procédé tel que décrit dans l'exemple 3, sont traités en vue de l'extraction de l'amino-acide. Dans ce but, le pH est ajusté à 5,8 par addition d'un acide minéral concentré tel que, par exemple, de l'acide sulfurique à 60 % en poids. Dans le meme temps, la température est portée vers 550C. On ajoute alors un agent de floculation du type polystyrène sulfoné sous forme d'une solution aqueuse à 10 g/l. L'agent floculant utilisé pour cet exemple est connu sous la dénomination commerciale de PURIFLOC A-21. On en utilise 0,5 g/l de solution à traiter. Après 15 mn de contact, on sépare les micro-organismes, débris cellulaires, colloldes floculés et autres impuretés insolubles par centrifugation en utilisant un séparateur à assiettes du type "écrémeuse". La séparation est excellente puisque la turbidité de la phase claire est de 250 Kaolin contre plus de 50000 Kaolin avant traitement. On rappelle que 10 Kaolin et la turbidité correspondent à la suspension de 1 mg de Kaolin dans un litre d'eau. On sépare ainsi environ 0,5% en poids de boues ne contenant qu'une très faible partie d'acide aspartique. La solution claire est alors soumise à un traitement de purification par addition de charbon actif et d'un adjuvant de filtration. Les 10 m3 de solution à 300 g/l d'acide aspartique sont ainsi additionnés des 30 kg de charbon actif "SA 1635" et des 50kg d'une perlite-expansée comme la "DICALITE". Après 30 mn de contact sous agitation douce et en maintenant la température, la suspension est filtrée sur filtre-presse ou filtre à tambour sous vide. La filtration est très rapide. Le débit moyen étant de 1 m3/m2/heure. La solution obtenue est parfaitement limpide et d'une coloration jaune pâle peu prononcée. On cristallise alors l'acide L aspartique par addition d'acide sulfurique concentré à 60 %. Cette opération est réalisée en continu dans un ensemble de cuves agitées, placées en séries, dans lesquelles la bouillie de cristaux circule par débordement de l'une à l'autre et où l'on ajoute en continu à chacune d'elles des quantités d'acide telles qu'il se produit un gradient linéaire de pH jusqu'à la dernière cuve. Dans celle-ci le pH est ajusté à 2,8 - 3. Durant la cristallisation, les cuves sont refroidies de façon à maintenir la température vers 42 - 450C. L'épuisement de la solution mère est réalisé en discontinu par malaxage à 20 C durant huit heures dans une cuve spéciale munie d'une agitation adaptée et d'un système de refroidissement. La masse finale ainsi obtenue est soumise à une séparation liquide-solide par essorage avec une centrifugeuse à panier. Les cristaux sont lavés à l'eau adoucie avant séchage. On obtient 2700 kg de cristaux d'acide L aspartique d'une pureté de 97,5 à 98 %. Le produit ne contient pas d'acide fumarique et seulement quelques sels minéraux en particulier du sulfate d'ammoniac. Ce dernier est très facile à éliminer par une simple remise en suspension dans de l'eau acidulée et séparation de 1' amino-acide cristallisé. Le produit tel qu'il est obtenu, sans lavage ultérieur, est d'une pureté suffisante pour hêtre employé pour la synthèse des peptides en général et des peptides édulcorants en particulier. REVENDICATIONS 1. Procédé de production industrielle d'acide L aspartique, qui est la forme naturelle, à partir d'un acide éthylénique tel que acide fumarique et d'ammoniac grâce à une aminotransférase excrétée par un microorganisme de la famille des PSEUDOMONACEES ainsi qu'un procédé d'isolement dudit aminoacide du milieu obte nu. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le microorganisme est original et capable d'accumuler dans un mi lieu spécifique des quantités importantes telles que 30 unités internationales/ml d'aminotransférase. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé par le fait que le milieu spécifique est constitué de mélasse comme source de carbone et d'urée ou d'ammoniac comme source d'azote. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3 prises dans leur ensem ble caractérisé par le fait que le microorganisme est dévelop pé par culture aérobie sous agitation et pression d'air stérile. 5. Procédé selon les revendications 1 à 4 prises dans leur ensem ble caractérisé par le fait que l'optimum de production d'ami notransférase est obtenu entre la 12ème et la 16ème heure de culture. 6. Procédé selon les revendications 1 à 5 prises dans leur ensem ble caractérisé par le fait que la culture obtenue par applica tion de ces moyens est capable de transformer une suspension de fumarate d'ammonium en aspartate en milieu alcalin. 7. Procédé selon les revendications 1 à 6 prises dans leur ensem ble caractérisé par le fait que le substrat organique à trans