Brevet FR2157982A1 — publié le 19730608

La présente invention se rapporte à une préparation insoluble d'enzyme. Plus particulièrement, elle se rapporte à une préparation stable, insoluble dans liteau, d'une enzyme choisie parmi l'uréase, l'uricase, l'asparaginase et l'aspartase. L'uréase est distribuée dans des bactéries, des moisissures, dans une plante du genre des légumineuses, dans des tissus des mammifères (par exemple dans les globules rouges du sang ou dans la membrane muqueuse de l'estomac) et a été très utilisée pour la détermination d'urée dans le sang. L'uricase est distribuée dans des microorganismes, des tissus de plantes et d'animaux et elle catalyse la décomposition de l'acide urique en allantoIne. L'asparaginase est distribuée dans des tissus des plantes et des animaux et catalyse l'hydrolyse de l'asparagine en acide aspartique et en ammoniac. L'aspartase est distribuée dans des microorganismes, des tissus des plantes et des animaux et elle catalyse la synthèse d'acide aspartique à partir d'acide fumarique et d'ammoniac. Ainsi, ces enzymes sont utiles dans le domaine médical. Cependant, lorsque ces enzymes sont utilisées telles qu'elles sont pour une réaction enzymatique sous la forme d'une solution aqueuse, il est difficile de les récupérer après la réaction et, en conséquence, elles doivent être évacuées après avoir été utilisées une seule fois. En outre, elles sont généralement instables sous la forme de solution.De ce point de vue, on a essayé d'insolubiliser l'enzyme par liaison covalente de l'enzyme à un composé de diazonium d'un copolymère p-aminophénylalanine-aminoacide ou à un composé de diazonium d'un verre d'-(p-aminobenzoylamido)alkylsilane dans le cas de l'uréase, ou par liaison ionique ou de covalence de l'enzyme avec la diéthylaminoéthylcellulose ou l'azothydrure de carboxyméthyldextrane ou par réticulation de l'enzyme avec le glutaraldéhyde dans le cas de l'asparaginase, ou par liaison ionique de l'enzyme avec un dérivé de polysaccharide échangeur d'ions, insoluble dans l'eau, dans le cas de l'aspartase, ou de micro-encapsuler l'enzyme avec un film semi-perméable de produit dit nylon (Journal of Biological Chemistry, Vol. 239, No. 5, pages 1.521 1.524, 1964 ; brevet américain nO 3.519.538 ;Science, Vol. 146, pages 524 - 525, 1964 ; Biochemistry (USSR), Vol. 27, page 713, 1962 ; Cancer Research, Vol. 30, page 2.736, 1970, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 47, page 66, 1972 ; et Nature, Vol. 229, page 117, 1971). Cependant, ces enzymes insolubilisées décrites ci-dessus ont un inconvénient tel qu'elles sontdécanpowoespar des protéases (par exemple la trypsine ou la chymotrypsine) ou par des microorganismes (par exemple des moisissures ou des bactéries) puisque la protéine de l'enzyme entre en contact directement avec l'environ nement extérieur et, en outre, le procédé de microencapsulation a un inconvénient tel que l'enzyme est désactivée dans ltétape de microencapsulation ; en conséquence, on ne peut pas obtenir de préparation d'enzyme ayant une activité enzymatique élevée puisque l'enzyme est extrêmement sensible aux conditions(par exemple, la température, la pression, la force ionique, le pH et le solvant organique). Dans ces circonstances, la demanderesse a fait des études pour résuudre ces inconvénients et elle a alors trouvé maintenant qu'en immobilisant l'enzyme dans un réseau de gel de polyacrylamide ou en microencapsulant l'enzyme avec des films de polymères semi-perméable on peut obtenir une préparation stable d'enzyme, insoluble dans l'eau, ayant une activité enzymatique supérieure par comparaison avec une préparation microencapsulée utilisant une enzyme soluble dans l'eau, telle qu'elle est, et, en outre, que la préparation d'enzyme, insoluble dans l'eau, peut être mise en réserve pendant une longue période de temps sans aucun abaissement de 1 'activité enzymatique. Un objet de la présente invention est de prévoir une préparation d'enzyme insoluble dans l'eau, choisie parmi l'uréase, l'uricase, l'asparaginase et l'aspartase (ci-après, le terme "enzyme" signifie l'uréase, l'uricase, l'asparaginase ou l'aspartase). Un autre objet de la présente invention est de prévoir une préparation d'enzyme insoluble dans l'eau qui a une activité enzymatique supérieure et conserve l'activité enzymatique pendant une longue période de temps. Un autre objet de la présente invention est de prévoir une préparation d'enzyme insoluble dans l'eau qui peut être utilisée à maintes reprises. Ces objets et d'autres objets de la présente invention apparaîtront d'après la description suivante. Selon la présente invention, la préparation d'enzyme insoluble dans l'eau peut être préparée par des procédés classiques par exemple (1) en adsorbant physiquement une enzyme soluble dans l'eau sur un support insoluble dans l'eau (par exemple du charbon actif, de la kaolinite, de l'hydroxyîapatite ou du stéarate de baryum-silicate dethorium) (Journal of the American Chemical Society, Vol. 60, page 1.351, 1938), (2) par liaison ionique d'une enzyme soluble dans l'eau à un dérivé de polysaccharide échangeur d'ions, insoluble dans l'eau (par exemple la diéthylaminoéthylcellulose, le produit dit diéthylaminoéthyl Sephadex ou la triéthylaminoéthylcellulose) (Biochemistry (USSR), Vol. 27, page 713, 1962), ()) par liaison covalente d'une enzyme soluble dans l'eau à un dérivé de polysaccharide réactif échangeur d'ions (par exemple l'azothydrure de p-aminobenzylcellulose ou la bromoacétylcellulose) ou une matière réactive à poids moléculaire élevé (par exemple un composé de diazonium de verre de ss-(p-aminobenzoylamido)- éthylsilane, un composé de diazonium de verre de t-(p-aminobenzoyl- amido)propylsilane ou un composé de diazonium de copolymère p-aminophénylalanine-aminoacide formé de glycine, de leucine ou d'alanine) (Cancer Research, Vol. 30, page 2.736, 1970 ;Journal of Biological Chemistry, Vol. 239, N" 5, pages 1.521 - 1.524, 1964 ; brevet américain nO 3.519.538), (4) par réticulation d'une enzyme soluble dans l'eau avec un produit réagissant ayant deux (ou davantage) groupes fonctionnels (par exemple le glutaraldéhyde ou le diisocyanate d'hexaméthylène) (FEBS Lettes, Vol. 10, page 325 ; Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 47, page 66, 1972) ou (5) en traitant une solution aqueuse d'une enzyme native avec un solvant organique (par exemple l'éthanol ou l'acétone). L'enzyme native soluble dans l'eau, utilisée pour l'insolubilisation, peut être un extrait brut ou un produit partiellement ou complètement purifié. En outre, pour le mode opératoire d'immobilisation ou de microencapsulation, l'enzyme insolubilisée dans 1' eau peut être traitée à l'état d'une seule enzyme ou d'un mélange de deux (ou davantage) enzymes. Dans le procédé de la présente invention, la réaction de polymérisation du monomère d'acrylamide dans une suspension aqueuse d'enzyme insolubilisée dans l'eau peut être réalisée en ajoutant un monomèred'acrylamide, un initiateur de polymérisation et un accélérateur de polymérisation à une suspension aqueuse d'une enzyme insolubilisée dans l'eau, et puis en laissant reposer la suspension résultante. Des exemples convenables du monomère d'acrylamide peuvent être l'acrylamide, la N,N'-méthylènebisacrylamide et la N,N'-propylènebisacrylamide. Comme initiateur de polymérisation, on peut citer le persulfate de potassium, le persulfate d'ammonium et analo gues, et, comme accélérateur de polymérisation, on peut employer le B-diméthylaminopropionitrile, la N,N,N' > N' tétraméthylet2W%oedan ne et analogues. La réaction de polymérisation peut être, de préférence, réalisée à une température aux alentours de 20 à 300C et la valeur de pH du mélange réactionnel peut, de préférence, être d'environ 7 à 8. Selon la présente réaction de polymérisation, l'enzyme in solubilisée dans l'eau est immobilisée dans le réseau d'un gel de polyacrylamide et ainsi on peut obtenir la préparation d'enzyme désirée, stable, insoluble dans l'eau. La microencapsulation d'une enzyme insolubilisée dans 1' eau selon la présente invention peut être réalisée par émulsionnement d'un solvant aqueux, contenant une enzyme insolubilisée dans l'eau, et d'un composé polyaminé dans un solvant hydrophobe, et puis en ajoutant à l'émulsion, avec agitation, un solvant hydrophobe contenant un halogénure de polyacide ou un composé de polyisocyanate. Par le mode opératoire réactionnel, le composé polyaminé réagit avec le composé de polyisocyanate ou l'halogénure de polyacide à l'interface du solvant aqueux et du solvant hydrophobe et puis l'enzyme insolubilisée dans l'eau est microencapsulée par le film de polymère semiperméable produit. La réaction peut de préférence être réalisée avec refroidissement, en particulier à une température d'environ 0 à 40C. Le composé polyaminé utilisé dans la réaction indiquée ci-dessus peut être, par exemple, l'hexaméthylènediamine, l'éthy- lènediamine et la triéthylènediamine ; l'halogénure de polyacide peut être, par exemple, un halogénure de sébacoyle, un halogénure de téréphtaloyle et un halogénure d'adipoyle, et le composé de polyisocyanate peut être, par exemple, le diisocyanate de toluène et le diisocyanate d'hexaméthylène. Comme solvant hydrophobe, on peut utiliser n'importe quel solvant non miscible avec l'eau, par exemple, le chloroforme, le cyclohexane, le benzène, le tétrachlorure de carbone ou leurs mélanges. La dimension de particules de la microcapsule produite est due à la dimension de l'enzyme utilisée, insolubilisée dans l'eau, mais généralement il est préférable de contrôler les conditions réactionnelles (par exemple, le degré d'émulsion du solvellt aqueux-solvant hydrophobe et la vitesse d'agitation dans la rée^- tion de polymérisation) afin que la dimension de particules de microcapsule roit dans une gamme de plusieurs dizaines à plusiei'nr. centaines de microns, de préférence 100 à 500 . Par exemple, quand la concentration d'émulsionnant est 0,≈ffi (en volume/volume) et que la vitesse d'agitation est 500 tours par minute, on peut obtenir une microcapsule ayant une dimension de particules de 100 à 3009 . Pour donner la semiperméabilité au film de la microcapsule produite, les quantités des produits réagissants sont contrôlées pour que les quantités de composé polyaminé, d'halogénure de polyacide et de polyisocyanate soient respectivement 0,06 à 1,0 % Xn poids/volume), de 0,06 à 2,0 ss (en poids/volume) et 0,1 à 2,0 ffi (en poids/volume) dans le mélange réactionnel final. Dans le cas de la microencapsulation indiquée ci-dessus, le solvant aqueux contenant l'enzyme insolubilisée dans l'eau peut aussi renfermer, de manière facultative, certaines autres matières, telles que de l'albumine, de l'hémoglobine, de la caséine, de la gélatine, du sérum ou une faible quantité de substancesprotectricespour l'enzyme. En outre, le solvant aqueux peut contenir, de manière facultative, un agent tensio-actif non ionique, tel que le produit dit Span 85 et l'éther de nonyle et de phényle, dans le but d'émulsionner facilement le solvant aqueux et le solvant hydrophobe. Selon le présent procédé, enzyme insolubilisée dans l'eau peut être immobilisée de manière stable ou microencapsulée pour donner la préparation d'enzyme souhaitée, insoluble dans l'eau, ayant une activité enzymatique supérieure à celle obtenue par microencapsulation d'une enzyme native soluble dans l'eau, telle qu' elle est. La présente préparation d'enzyme insoluble dans l'eau a un autre avantage du fait qu'elle est extrêmement stable et qu'elle conserve une activité enzymatique élevée pendant une longue période de temps, puisqu'elle n'est pas décomposée par un microorganisme ou une protéase qui existe dans l'environnement extérieur. L'activité de l'enzyme est mesurée comme suit Dans le cas de 1'uréase, la réaction enzymatique est réalisée à un pH de 7,0 et à 370C en utilisant de l'urée comme substrat et puis l'ammoniac produit est mesuré par colorimétrie de Nessler. Lorsqu'une? mole d'ammoniac est produite dans une heure, l'activité enzymatique est définie comme étant une unité. Dans le cas de 1'uricase, la réaction enzymatique est réalisée à un pH de 8,5 et à 370C en utilisant de l'acide urique comme substrat et puis la décomposition de l'acide urique est mesurée par absorption dans l'ultraviolet a 290 my . Lorsqu'une mo- le d'acide urique est décomposée en une heure, l'activité enzymatique est définie comme étant une unité. Dans le cas de l'asparaginase, la réaction enzymatique est réalisée à un pH de 8,0 et à 37 C en utilisant la L-asparagine comme substrat et puis l'ammoniac produit est mesuré par colorimétrie de Nessler. Lorsqu'unermole d'ammoniac est produite en une minute, l'activité enzymatique est définie comme étant une unité. Dans le cas de l'aspartase, la réaction enzymatique est réalisée à un pH de 8,5 et à 370C en utilisant du fumarate d'ammonium comme substrat et puis l'acide L-aspartique produit est mesuré par colorimétrie de Folin. 'sorsqu'une)Imole d'acide L-aspartique est produite en une heure, l'activité enzymatique est définie comme étant une unité. Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 De l'uréase partiellement purifiée, extraite de Canavalia ensiformis (800.000 unités/g ; 1 g) a été dissoute dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,7 ; 100 ml) et on y a ajouté une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (5 ml) et de l'éthanol (67 ml). On a laissé reposer le mélange à 37"C pendant 60 minutes. Les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation et lavés à l'eau et avec un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0) pour donner de l'ure'ase insolubilisée dans l'eau (1.600.000 unités/ g ; 0,5 g).L'uréase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 40 ml) contenant de l'acrylamide (7,5 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,4 g), et on y a ajouté en outre du diméthylaminspropio- nitrile à 5 ss (5 ml) et du persulfate de potassium à 1 % (5 ml). Le mélange a été soumis à une réaction de polymérisation en le laissant reposer à 230C pendant 30 minutes pour donner une préparation d'uréase insoluble dans l'eau (3.430 unités/g ; 70 g à l'état humide). EXEMPLE 2 De l'uréase partiellement purifiée, extraite de Canavalia ensiformis (800.000 unités/g ; 0,1 g) a été dissoute dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 10 ml) et on y a ajouté une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (0,5 ml) et de l'acétone (6,7 ml). On a laissé reposer le mélange à 37"C pendant 30 minutes et puis on l'a traité de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1 pour donner de l'uréase insolubilisée dans l'eau (1.600.000 unités/g ; 0,05 g). L'uréase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon de borate 0,2 M (pH 8,5 ; 15 ml) contenant de la caséine (0,05 g) et de la 1,6-hexaméthylènediamine (4 mmoles). La suspension a été émulsionnée dans un mélange de cyclohexane-chloroforme (5 : 1 ; 100 ml) contenant le produit dit Span 85 (0,5 ffi en volume/volume).Dans l'émulsion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques que celui mentionné ci-dessus (75 ml) contenant du 2,4diisocyanate de toluène (7 mmoles) à 40C en agitant. Le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes pour former un film de polyurée semiperméable dans lequel 1 'uréase insolubilisée dans l'eau a été microencapsulée. La microcapsule produite a été séparée par filtration et lavée à l'méthanol et à l'eau pour donner une préparation d'uréase insoluble dans l'eau ayant une dimension de particules de 100 à )007 (960 unités/g ; 25 g à l'état humide). EXEMPLE 3 Un copolymère p-amino-DL-phénylalanine-L-leucine (rapport de polymérisation : 1 : 25 ; 1 g) a été mis en suspension dans du nitrite de sodium 0,5 M (6 ml). La suspension a été agitée à 40C pendant 90 minutes pour donner un composé de diazonium de ce copolymère. Le composé de diazonium ainsi obtenu a été lavé plusieurs fois avec un tampon tris-acide sulfurique 0,1 M (pH 7,5) et puis mis en suspension dans le même tampon que celui mentionné ci-dessus (40 ml). Dans la suspension, on a ajouté de l'uréase cristalline, extraite de Canavalia ensiformis (8.000.000 d'unités/g ; 0,15 g) et le mélange a été agité à 40C pendant 20 heures.Les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation et bien lavés avec un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0) pour donner de l'u- réase insolubilisée dans l'eau (300.000 unités/g ; 2 g). L'uréase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 8 ml) contenant de l'acrylamide (1,5g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,08 g), puis on y a ajouté du ss-diméthylaminopropionitrile à 5 % (1 ml) et du persulfate de potassium à 1 % (1 ml). Le mélange a été traité de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1 pour donner une préparation d'uréase insoluble dans l'eau (34.000 unités/g ; 14 g à l'état humide). EXEMPLE 4 Du verre de silice poreux (passant au tamis dont l'ouver- ture de maille est comprise entre 0,420 mm et 0,177 mm, soit 40 à 80 mesh ; 2 g) a été mis en suspension dans du toluène (100 ml) contenant du \/ -aminopropyltriéthoxysilane (10 % en poids) et le mé- lange a été chauffé au reflux toute la nuit. Dans du méthanol absolu (20 ml) contenant le verre de g-aminopropylsilane résultant (2 g), on a ajouté de l'acide p-nitrobenzoSque (1 g) et de la N,N'dicyclohexylcarbodiimide (2 g), et le mélange a été agité à 23 C pendant 2 jours.Le verre de g-(p-nitrobenzoylamido)propylsilane produit (3 g) a été mis en suspension dans l'eau (500 ml), on y a ajouté du dithionite de sodium (5 g) et puis le mélange a été chauffé pendant 30 minutes. Le verre de -(p-aminobenzoylamido)propyl- silane produit (3 g) a été mis en suspension dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N (100 ml), puis on y a ajouté du nitrite de sodium (500 mg) et le mélange a été agité à OOC pendant 20 minutes.Le composé de diazonium du verre de }-(benzoylamido)propylsilane ainsi produit (1 g) a été mis en suspension dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,5 ; 50 ml), puis on y a ajouté de l'uréase cristalline extraite de Canavalia ensiformis (8.ooo.ooo d'unités/g ; 0,02 g) et le mélange a été agité à 4 C pendant 20 heures. Les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation et bien lavés avec le même tampon que celui mentionné ci-dessus pour donner de l'uréase insolubilisée dans l'eau (16.000 unités/g ; 1 g). L'uréase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 15 ml) contenant de la l,6-hexaméthylènediamine (4 mmoles). La suspension a été dispersée dans un mélange de cyclohexane et de chloroforme (5 : 1 100 ml).Dans la dispersion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques mentionné ci-dessus (75 m1) contenant du chlorure de sébacoyle (4 mmoles) à 4 C en agitant. Le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes pour former un film de nylon semiperméable dans lequel l'uréase insolubilisée dans l'eau a été microencapsulée.La microcapsule produite a été séparée par filtration et lavée à l'éthanol et à l'eau pour donner une préparation d'uréase insoluble dans l'eau, ayant une dimensi de particules de 200 à 500/ (450 unités/g ; 25 g à l'état hum~9es EXEMPLE 5 De l'asparaginase partiellement purifiée, préparée à par tir de Proteus vulgaris (70.000 unités/g ; 0,01 g) a été dissoute dans l'eau (95 ml) et on y a ajouté de la diéthylaminoéthy1ce1': lose (0,5 g), puis le mélange a été agité à 4 C pendant 40 minutes. Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation et bien lavés à l'eau pour donner de l'aspara- ginase insolubilisée dans l'eau (116 unités/g ; 3 g). L'asparaginase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,0 ; 8 ml) contenant de l'acrylamide (1,5 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,08 g), puis on y a ajouté du ss-diméthylaminopropionitrile à 5 ffi ( 1 ml) et du persulfate de potassium à 1 % (1 ml). On a laissé reposer le mélange à 230C pendant 30 minutes pour donner une préparation d'asparaginase insoluble dans l'eau (20 unités/g ; 14 g). EXEMPLE 6 Du carboxyméthyldextrane (10 g) a été dissous dans du méthanol absolu (500 ml) et on a réalisé une estérification par le groupe méthyle par passage à travers de l'acide chlorhydrique gazeux. De l'hydrate d'hydrazine (50 g) a été en outre ajouté pour donner l'hydrazide de carboxyméthyldextrane, puis on y a ajouté de l'acide chlorhydrique à 2 ffi (500 ml) et du nitrite de sodium à 3 % (60 ml). L'azothydrure de carboxyméthyldextrane ainsi produit (0,4 g) a été mis en suspension dans l'eau (20 ml) et on y a ajouté de l'asparaginase cristalline produite à partir d'Escherichia coli (200.000 unités/g ; 0,002 g). Le mélange a été agité à 4"C pendant 16 heures.Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation et bien lavés à l'eau pour donner de 1'asparaginase insolubilisée dans l'eau (80 unités/g 1 g). L'asparaginase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 15 ml) contenant de la 1,6-hexaméthylènediamine (4 mmoles) et la suspension a été dispersée dans un mélange de cyclohexane-chloroforme (5 : 1 ; 100 ml). Dans la dispersion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques que celui mentionné ci-dessus (75 ml) contenant du 2,4-diisocyanate de toluène (7 mmoles) à 4"C en agitant. Le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes pour former un film de polyurée semiperméable dans lequel 1 'asparaginase insolubilisée dans l'eau a été microencapsulée. La microcapsule produite a été séparée par filtration et lavée à l'eau pour donner une préparation d'asparaginase insoluble dans l'eau, ayant une dimension de particules de 100 à 5009 (2,5 unités/g 25 g). EXEMPLE 7 De la cellulose cristalline fine (2 g) a été mise en sus pension dans une solution aqueuse de bromure de cyanogène (25 mg/ ml ; 80 ml). En maintenant la valeur de pH à 11 par addition d'une solution aqueuse de soude 5N, le mélange a été agité à 250C pendant 8 minutes. Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par filtration et lavés à l'eau et avec une solution a qeuse de bicarbonate de sodium 0,1 M pour donner de la cellulose activée (2 g). Le produit ainsi obtenu (0,4 g) a été mis en suspension dans un tampon au borate 0,1 M (pH 8,5 ; 12 ml), on y a ajouté de l'asparaginase cristalline préparée à partir d'Escherichia coli (200.000 unités/g ; 0,002 g) et le mélange a été agité à 40C pendant 16 heures.Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation pour donner de l'aspa- raginase insolubilisée dans l'eau (16 unités/g ; 5 g). L'asparaginase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 8 ml) contenant de l'acrylamide (1,5 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,08 gj. Le mélange a été traité de la même manière que celle décrite dans l'exemple 5 pour donner une préparation d'asparaginase insoluble dans l'eau (4 unités/g ; 14 g). EXEMPLE 8 De l'aspartase brute préparée à partir d'Escherichia coli (60.000 unités/g ; 0,1 g) a été dissoute dans l'eau (20 ml) et on y a ajouté de la triéthylamineéthylcellulose (type OH ; 6 ml), puis le mélange a été agité à 23"C pendant une heure. Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par filtration et bien lavés à l'eau pour donner de l'aspartase insolubilisée dans l'eau (400 unités/g ; 3 g).L'aspartase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,0 ; 8 ml) contenant de l'acrylamide (1,5 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (o,o8 g), puis on y a ajouté du ss-diméthylaminopropionitrile à 5 ffi (1 ml) et du persulfate de potassium à 1 ffi (1 ml). On a laissé reposer le mélange à 230C pendant 30 minutes pour donner une préparation d'aspartase insoluble dans l'eau (77 unités/g ; 14 g). EXEMPLE 9 De l'aspartase partiellement purifiée, préparée à partir d'Escherichia coli (600.000 unités/g ; 0,02 g) a été dissoute dans l'eau (10 ml), on y a ajouté le produit dit diéthylaminoétr.yl Sephadex (type C1 ; 6 ml) et le mélange a été agité à 23 C pendant une heure. Les précipités résultants ont été rassemblés par fil tration et bien lavés à l'eau pour donner de l'aspartase insolubilisée dans l'eau (800 unités ; 3 g). L'aspartase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,05 M (pH 8,5 ; 15 ml) contenant de la 1,6-hexaméthylènediamine (4 mmoles), et la suspension a été dispersée dans un mélange de cyclohexane-chloroforme (5 : 1 ; 100 ml).Dans la dispersion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques que celui mentionné ci-dessus (75 ml) contenant du 2,4diisocyanate de toluène (7 mmoles), à 40C en agitant. Le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes pour former un film de polyurée, dans lequel l'aspartase insolubilisée dans l'eau a été microencapsulée. La microcapsule produite a été séparée par filtration et lavée à 1'méthanol et à l'eau pour donner une préparation d'aspartase insoluble dans l'eau, ayant une dimension de particules de 200 à 250r (67 unités/g ; 25 g). EXEMPLE 10 De l'aspartase brute préparée à partir d'Escherichia coli (60.000 unités/g ; 0,1 g) a été dissoute dans l'eau (20 ml), on y a ajouté du gel de phosphate de calcium (6 ml) et le mélange a été agité à 230C pendant une heure. Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation et bien lavés avec de l'eau pour donner de l'aspartase insolubilisée dans l'eau (150 unités/g ; 4 g). Le produit ainsi obtenu a été traité de la même manière que celle décrite dans l'exemple 8 pour donner une préparation d'aspartase insoluble dans l'eau (21 unités/g ; 14,3 g). EXEMPLE 11 Le produit dit Sepharose 6ss (7 g) a été mis en suspension dans une solution aqueuse de bromure de cyanogène (25 mg/ml 280 ml). En maintenant la valeur de pH à 11 par addition d'une solution aqueuse de soude 5 N, le mélange a été agité à 250C pendant 8 minutes. Après la réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par filtration, lavés à l'eau et avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1 M pour donner le produit dit Sepharose 6Q activé (6,5 g). Le produit ainsi obtenu (0,3 g) a été mis en suspension dans un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 5 ml), on y a ajouté de l'uricase préparée à partir de foie de porc (215 unités/mg ; 0,4 mg) et le mélange a été agité à 40C pendant 20 heures.Après réaction, les précipités résultants ont été rassemblés par centrifugation pour donner de l'uricase insolubilisée dans l'eau (34,4 unités/g ; 0,5 g). L'uricase insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 8 ml) contenant de 1'acrylamide (1,5 g) et de La N,N'-méthylènebisacrylamide (0,08 g), et puis on y a ajouté du diméthylaminopropionitrile à 5 ss (1 ml) et du persulfate de potassium à 1 % (1 ml). On a laissé reposer le mélange à 23"C pendant 30 minutes pour donner une préparation d'uricase insoluble dans l'eau (1,1 unité/g ; 10 g). EXEMPLE 12 Le produit dit Sephadex G-200 a été activé avec du bromure de cyanogène en utilisant le même procédé que celui décri dans l'exemple 11. Le produit dit Sephadex G-200 activé ainsi obtenu (0,3 g) a été mis en suspension dans un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 5 ml) et on y a ajouté de l'uricase préparée à partir de foie de porc (215 unités/g ; 0,4 mg). Le mélange a été traité de la même manière que celle décrite dans l'exemple 11 pour donner de l'uricase insolubilisée dans l'eau (31 unités/g ; 0,5 g). L'un- case insolubilisée dans l'eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 15 ml) contenant de la l,6-hexaméthylènediamine (4 mmoles), et la suspension a été dispersée dans un mélange de cyclohexane-chloroforme (5 : 1 ; 100 ml). Dans la dispersion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques que celui mentionné ci-dessus (75 ml) contenant du 2,4-diisocyanate de toluène (7 mmoles) à 40C en agitant. Le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes pour former un film de polyurée dans lequel l'uricase insolubilisée dans liteau a été microencapsulée. La microcapsule produite a été séparée par filtration et lavée avec de l'éthane et de l'eau pour donner une préparation d'uricase insoluble dans l'eau, ayant une dimension de particules de 100 à 300 P (0,0774 unité/g ; 20 g). EXEMPLE 13 Le produit dit Enzacryle AA (1 g) a été mis en suspension dans de l'acide chlorhydrique 2 N (50 ml), on y a ajouté du nitrite de sodium (2 ss ; 40 ml) et le mélange a été agité à 40 pendant 15 minutes pour donner un composé de diazonium de ce poT y- mère.Le composé de diazonium ainsi obtenu (0,6 g) a été mis en suspension dans un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 5 ml), on y a ajouté de 1'uricase préparée à partir de foie de porc (215 unités/mg ; 0,4 mg) et le mélange a été agité à 40C pendant 20 e- res.-Après réaction, les précipités résultants ont été rassemb éc par entrifugation pour donner de l'uricase insolubilisée dans l'eau (10,)2 unités/ g ; l g). L'uricase insolubilisée dans 1 1eau ainsi obtenue a été mise en suspension dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 8 ml) contenant de l'acrylamide !i,5 gl et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,08 g). Le mélange a té traité de la même manière que celle décrite dans exemple 11 peur donner une préparation d'uricase insoluble dans l'eau (0,66 unité/g ; 10 g). Test 1 Les préparations d'uréase insolubles dans l'eau, obtenues dans les exemples 1, 3 et 4 ont été utilisées comme substances expérimentales , B et C, respectivement. Les préparations d' asparaginase insolubles dans l'eau dans les exemples 5, 6 et 7 ont été utilisées respectivement comme substances expérimentales D, E et F. Les préparations d'aspartase insolubles dans l'eau, obtenues dans les exemples 8, 9 et 10, ont été utilisées comme substances expérimentales G, H et I, respectivement, et les préparations d'uri- case insolubles dans l'eau obtenues dans les exemples 11, 12 et 13 ont été utilisées respectivement comme substances expérimentales J, K et L.En outre, un gel d'acrylamide contenant de 1'uréase, une asparaginase microencapsulée, un gel d'acrylamide contenant de 1' aspartase, une aspartase microencapsulée et un gel d'acrylamide contenant de 1'uricase, qui ont été préparés à la manière décrite ci-dessous, ont été utilisés respectivement comme contrôles M, N, O, P et Q. L'activité enzymatique de ces substances expérimentales et de contrôle a été mesurée et on a calculé le rendement d'activité enzymatique. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Le contrôle M a été préparé comme suit Dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 40 ml), on a dissous de l'uréase (800.000 unités/g ; 1 g), de l'acrylamide (7,5 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,4 g), on y a aJouté du 2-diméthylaminopropionitrile à 5 A (5 ml) et du persulfate de potassium à 1 X (5 ml),et le mélange a été polymérisé en le laissant reposer à 230C pendant 30 minutes pour donner un gel d'acrylamide contenant de l'uréase (1.830 unités/g ; 70 g à l'état humide). Le contrôle N a été préparé comme suit Dans un mélange de cyclohexane-chloroforme (5 : 1 ; 100 ml), on a dispersé un tampon au borate 0,2 M (pH 8,5 ; 15 ml) contenant de l'asparaginase partiellement purifiée (70.000 unités/g ; 0,01 g) et de la 1,6-hexaméthylènediamine (4 mmoles). Dans la dispersion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques que celui mentionné ci-dessus (75 ml) contenant du 2,4diisocyanate de toluène (7 mmoles) à 4"C en agitant et le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes. Le contrôle O a été préparé comme suit Dans un tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,0 ; 8 ml), on a dissous de l'aspartase (60.000 unités/g ; 0,1 g), de l'acryîamide (1,5 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,08 g), puis on y a ajouté du ss-diméthylaminopropionitrile à 5 ss (1 ml) et du persulfate de potassium à 1 % (1 ml), et puis le mélange a été polymérisé en le laissant reposer à 23"C pendant 30 minutes.. Le contrôle P a été préparé comme suit Dans un mélange de cyclohexane-ehloroforme (5 : 1 ; 100 ml), on a dispersé un tampon phosphaté 0,05 M (pH 8, 5 ; 15 ml) non- tenant de l'aspartase (60.000 unités/g ; 0,1 g) et de la 1,6-hexa- méthylènediamine (4 mmoles). Dans la dispersion, on a ajouté goutte à goutte le même mélange de solvants organiques que celui mentionné ci-dessus contenant du 2,4-diisocyanate de toluène (7 mmoles) à 40C en agitant et le mélange a été continuellement agité pendant 3 minutes. Le contrôle Q a été préparé comme suit Dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0 ; 4 ml), on a dissous de l'uricase (215 unités/mg ; 0,2 mg), de l'acrylamide (0,75 g) et de la N,N'-méthylènebisacrylamide (0,04 g), et on y a ajouté du ss-diméthylaminopropionitrile à 5 % (0,5 ml) et du persulfate de potassium à 1 ss (0,5 ml). Le mélange a été polymérisé en le laissant reposer à 23 C pendant 30 minutes. TABLEAU 1 Activité Rendement en enzymatique activité (unité) enzymatique Substance expérimentale A 240.100 30 B 476.000 80 C 11.250 70 Contrôle M 128.100 16 Substance expérimentale D 280 80 E 62,5 78,1 F 56 70 Contrôle N O 0 Substance expérimentale G 1.078 90 H 1.675 70 I 300 50 Contrôle 0 O 0 P O O Substance expérimentale J 11,0 54 K 1,55 10 L 6,6 64 Contrôle Q 0 O Remarque :tLe rendement est présenté par l'activité enzymatique relative par rapport à l'activité (égale à 10C) de 1' enzyme correspondante insolubilisée dans lteau qui a été utilisée pour la préparation d'enzyme insoluble dans 1 1eau. Comme cela apparait clairement d'après les résultats présentés dans le tableau 1, les présentes préparations d'enzyme insolubles dans l'eau A, B, C, D, E, F, , H, I, J, K et L présentaient une activité enzymatique supérieure par comparaison avec celles des contrôles M, N, O, P et Q dans lesquels une enzyme soluble dans l'eau a été immobilisée ou microencapsulée. Spécialement dans le cas de l'asparaginase, de 1'aspartase et de l'urica- se, la présente préparation insoluble dans l'eau conservait une activité enzymatique élevée égale à 50-90 , mais, au contraire, dans les contrôles, l'enzyme était presque désactivée au cours de la préparation. Test 2 La même préparation d'uréase A ou de contrôle M que dans le test 1 (0,8 g) a été mise en suspension dans une solition aqueuse d'urée 0,1 M (pH 7 ; 30 ml) et le mélange a été soumis à une réaction enzymatique à 3700 pendant 10 minutes. Après la réaction, la préparation d'uréase a été récupérée par filtration et de nouveau soumise à une réaction enzymatique dans les mêmes conditions que ci-dessus. Le mode opératoire de réaction enzymatique a été répété plusieurs fois et ainsi la stab;lité de la préparation d' u- réase A et du contrôle M, quand on les a utilisés à maintes reprises, a été mesurée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Nombre Préparation d'uréase A Contrôle M d uti- Activité Taux d'activité Activité Taux d'acti lisa- enzymatique restante* enzymatique vité restan- tiens tions (unité) (%) (unité) te* (, (unité) (%) (unité) te* (%) 1 2.750 100 1.530 100 2 2.170 79 700 46 3 1.950 71 470 31 Remarque : *Le taux est présenté par l'activité enzymatique rela tive par rapport à l'activité (100) de la préparation d'uréase A ou du contrôle Mavant l'utilisation pour le test. Selon les résultats, il apparaît clairement que la présente préparation d'uréase insoluble dans l'eau montre une stabilité supérieure lorsqu'on l'utilise à maintes reprises, par compa- raison avec celle du contrôle M dans lequel une uréase soluble dans l'eau a été immobilisée. Test 3 La même préparation d'asparaginase D que dans le test 1 (14 g) a été ajoutée à une solution aqueuse d'asparagine 0,1 14 (pH 8,0 ; 30 ml) et le mélange a été agité à 370C pendant 10 minutes. Après la réaction, la préparation d'asparaginase a été récu pérée par filtration e à nouveau soumise à une réaction enzymati- que dans les mêmes conditions que ci-dessus. Le mode opératoire de réaction enzymatique a été répété plusieurs fois et ainsi on a mesuré la stabilité de la préparation d'asparaginase D quand on l'utilise à maintes reprises. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Nombre Activité enzymatique de Taux d'activité restante préparation d'asparagi utilisations nase D (unité) (%)* 1 80 100 2 80 100 3 80 100 Remarque : t e taux est présenté par l'activité enzymatique rela- tive par rapport à l'activité(100) de la préparation I asparaginase D avant l'utilisation pour le test. Selon les résultats, il apparaît clairement que la présente préparation d'asparaginase insoluble dans l'eau ne montre pas d'abaissement d'activité enzymatique et est extremement stable, même lorsqu'on l'utilise à maintes reprises. Test 4 La même préparation d'enzyme A (0,7 g!, C (7 g), E (5 g), G (1,4 g), H (2,4 g), J (5 g) ou K (10 g) a été ajoutée à une solution aqueuse (pH 7,0) de chymotrypsine, de trypsine ou de pronase P, et le mélange a été soumis à une réaction à 370C pendant 10 minutes. Séparément, en tant que contrôles, de l'uréase (800 unités/mg ; 10 mg), de l'asparaginase (200 unités/mg ; 1 mg), de l'aspartase (60.000 unités/g ; 0,001 g) ou de l'uricase (215 unités/ mg ; 0,2 mg) a été ajoutée à la même solution de protéase et soumise à la réaction dans les mêmes conditions que ci-dessus. Après la réaction, l'activité enzymatique restante dans chaque cas a été mesurée. Les résultats sont présentés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Substance Activité enzymatique restante (%) expérimentale expérimentale l Chymotrypsine Trypsine Pronase P A 100 100 100 C 100 100 100 Uréase 5 37 30 1 t E 100 100 100 Asparaginase 4 28 12 G 100 100 i H 100 j 100 Aspartase O - 5 J 100 - 100 K 100 -~ 100 Uricase 5 - 10 Selon les résultats, il est clair que les présentes préparations d'enzyme insolubles dans l'eau A, C, , G, X, J et K ne sont pas décomposées par des protéases. Test 5 La même préparation d'enzyme J (5 g) ou K (10 g) a été mise en suspension dans un tampon au borate 0,1 M (pH 8,5) et la suspension a été chauffée à 600C pendant 10 minutes. Comme contrôle, de l'uricase (215 unités/mg ; 0,2 mg) a été dissoute dans le même tampon et traitée dans les memes conditions que ci-dessus. Après le traitement, le mélange a été immédiatement refroidi et l'activité enzymatique restante a été mesurée. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. TABLEAU 5 Substance expérimentale Activité enzymatique restante (X) J 100 K 100 Uricase 9 Selon les résultats obtenus, il est clair que la stabilité à la chaleur était fortement renforcée par l'immobilisation. La présente invention n?est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau, caractérisée en ce qu'elle comprend une enzyme -insolubilisée dans l'eau, choisie parmi l'uréase, l'uricase, l'asparaginase et 1 'aspartase, cette enzyme insolubilisée dans l'eau étant immobilisée dans un réseau de liaison de polyacrylamide au moyen de la polymérisation d'un monomère d'acrylamide dans une suspension aqueuse de l'enzy- me, ou étant microencapsulée a7ec un film de polymère semiperméable au moyen d'un émulsionnement d'un solvant aqueux contenant cette enzyme et d'un composé polyaminé dans un solvant hydrophobe, et puis addition à l'émulsion, avec agitation, d'un solvant hydrophobe contenant un halogénure de polyacide ou un composé de polyisocyanate. 2 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau selon la revendication 1, caractérisée en ce que la polymérisation d'un monomère d'acrylamide dans une suspension aqueuse d'une enzyme insolubilisée dans l'eau est réalisée à une température environ égale à 20-300C et b un pH d'environ 7 à 8. 3 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau selon la revendication 2, caractérisée en ce que le monomère d'acrylamide est un membre choisi dans le groupe se composant d'acrylamide, de N,N'-méthylènebisacrylamide et de N,N'-propylènebisacrylamide. 4 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau selon la revendication 1, caractérisée en ce que la microencapsulation est réalisée à une température d'environ O à 4 C. 5 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé polyaminé utilisé dans la microencapsulation est un membre choisi dans le groupe se composant d'hexaméthylènediamine, d'éthylènediamine et de tri éthylènediamine ; l'halogénure de polyacide est un membre choisi dans le groupe se composant d'halogénure de sébacoyle, d'nalogénure de téréphtaloyle et d'halogénure d'adipoyle, et le composé de polyisocyanate est un membre choisi dans le groupe se composant de diisocyanate de toluène et de diisocyanate d'nexaméthylène. 6 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau selon la revendication 1, caractérisée en ce que le solvant hydrophobe est le chloroforme, le cyclohexane, le benzène, le tétrachlorure de carbone ou leurs mélanes. 7 - Préparation d'enzyme insoluble dans l'eau selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé polyaminé, ltha- logénure de polyacide et le polyisocyanate utilisés dans la microencapsulation sont employés respectivement en quantité de 0,05 à 1,0 ffi (en poids/volume), de 0,06 à 2,0 ffi (en poids/volume) et de 0,1 à 2,0 % (en poids/volume) dans le mélange réactionnel final. 8 - Microcapsule d'une enzyme insolubilisée dans l'eau choisie parmi 1 'uréase, 1 'asparaginase et 1' aspartase, caractérisée en ce qu'elle a une dimension de particules de plusieurs dizaines à plusieurs centaines de microns, l'enzyme est microencapsulée avec un film de polymère semiperméable au moyen d'un émulsionnement d'un solvant aqueux contenant cette enzyme et d'un composé polyaminé dans un solvant hydrophobe, et puis par addition, avec agitation, d'un solvant hydrophobe contenant un halogénure de polyacide ou un composé de polyisocyanate à l'émulsion. 9 - Microcapsule selon la revendication 8, caractérisée en ce que la microencapsulation est réalisée dans des conditions telles que la concentration d'émulsionnant est 0,5 % (en volume/ volume) et la vitesse d'agitation est de 500 tours par minute, pour donner une microcapsule ayant une dimension de particules de 100 à 300 .