Brevet FR2186235A1 — publié le 19740111

La présente invention a trait à un nouveau médicament pour la protection contre les infections virales et la stimulation des défenses non spécifiques de l'organisme, notamment de l'organisme humain, ainsi qu'à un procede de fabrication de ce médicament. Le médicament selon l'invention permet la protection contre les infections virales et la stimulation des défenses non spécifiques de l'organisme et est inducteur d'interférons. Le medicament est actif notamment mais non exclusivement, contre la maladie de Newcastle, la fièvre aphteuse et la grippe humaine. Le médicament selon l'invention est caractérisé par le fait qu'il contient une fraction isolée à partir de bactéries lysées du genre Brucella, possédant un poids moléculaire compris entre 2000 et 35000. Le médicament ne contient donc pas de corps bactériens ou de fragments de corps bactériens visibles en microscopie optique ou électronique. De préférence, le médicament ne comporte pas non plus d'acides nucléiques. Dans une première forme de réalisation, le médicament selon l'invention peut comprendre sensiblement toutes les molécules ayant un poids moléculaire compris entre 2000 et 35000 et isolées à partir de bactéries lysées du genre Brucella. Dans une autre forme de réalisation, le médicament peut ne comprendre que des éléments ayant un poids moléculaire compris dans une ou plusieurs plages plus réduites, toutes situées entre 2000 et 35000. Ainsi, dans une forme de réalisation particulièrement avantageuse, le médicament selon l'invention peut principalement comprendre des éléments ayant un poids moléculaire compris entre 25000 et 35000. Dans une autre forme de réalisation également très avantageuse, le médicament peut comporter principalement des éléments ayant un poids moléculaire compris entre 7000 et 11000. De façon avantageuse, le médicament peut comporter un antiseptique tel que par exemple le mercurothiolate sodique. Dans une forme de réalisation préférée, le médicament contient des extraits de bactéries Brucella abo-tu ',- nais d'autres Brucella peuvent également être utilisées. Le médicament selon l'invention peut avantageusement se présenter sous forme de solution. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ce medicament caractérisé par le fait que l'on lave, inactive et lyse une souche de Brucella, que l'on élimine de préférence les acides nucléiques et que l'on sépare la fraction de poids moléculaire compris entre 2000 et 35000 d'avec les autres fractions. Dans un mode de mise en oeuvre particulier de ce procédé, on peut séparer la fraction de poids moléculaire comprise entre 25000 et 35000 d'avec les autres fractions. Dans un autre mode de mise en oeuvre, on peut séparer la fraction de poids moléculaire compris entre 7000 et 11000. La séparation de la fraction peut être effectuée par exemple à l'aide d'une ultra-filtration par l'utilisation d'ultra-filtres retenant les substances d'con poids moléculaire supérieur à 35000. Cette ultra-filtration peut être suivie d'une nouvelle ultra-filtration retenant les éléments de poids moléculaire supérieur à 2000. Dans un autre mode de réalisation, cette séparation peut être effectuée par précipitation à froid à l'aide d'une concentration de sulfate d ' ammonium variant de 20 à 40% de la saturation de sel. La lyse desBrucella, qui peuvent obtenues à partir d'une culture de Brucella en phase S ou bien en phase R, peut s'effectuer soit de façon mecanique, par exemple à l'aide de billes de verre, soit de façon physique, par exemple à l'aide d'ultra-sons, soit de façon chimique à l'aide d'enzymes de base ou d'acides soit encore de façon biologique, par exemple à l'aide de bactériophages. De façon avantageuse, la suspension bactérienne initiale destinée à être lysée peut contenir de 5 à 10 milligrammes par millilitres de bactéries en poids sec. L'élimination des acides nucléiques peut être effectuée de façon avantageuse par précipitation par le sulfate de streptomycine. En variante elle peut également etre effectuée par action de la désoxyribonucléase et de la ribonucléase, suivie d'une dialyse à travers une membrane convenable permettant l'élimination des nucléotides. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparàitront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Premier exemple de préparation On cultive une souche de Brucella abortus en phase S, en milieu liquide en fermenteur aéré, pendant une durée de 72 heures à la température de 37 0C. Les bactéries sont recueillies par centrifugation, lavées trois fois en eau physiologique et remises en suspension en tampon phosphate à raison de 10 milligrammes par millilitres de poids sec bactérien. La suspension ainsi obtenue est soumise à l'action du lysosyme en solution aqueuse à 10 microgrammes/ml pendant 15 minutes à 37 0C. Le lysat obtenu est dilué au demi, puis centrifugé et le surnageant est filtré sur un filtre permettant d'éliminer les corps bactériens encore intacts ainsi que les débris cellulaires. On effectue ensuite un contrôle au microscope optique pour vérifier que la solution est débarrassée de ses éléments visibles. La solution est ensuite soumise à l'action du sulfate de streptomycine à 15% pour éliminer les acides nucléiques. Le précipité est éliminé par centrifugation et le surnageant récupéré. Le surnageant est alors passé sur ultra-filtre retenant les substances d'un poids moléculaire supérieur à 30000. Le filtrat obtenu constitue le médicament. Le médicament peut ensuite être concentré par ultra-filtration sur ultra-filtre retenant les substances d'un poids moléculaire supérieur à 2000. La fraction retenue constitue le médicament concentré. Deuxième exemple de préparation On cultive une souche de Brucella abortus en phase S sur milieu gélosé à la pomme de terre. Les cellules bactériennes sont récoltées après 72 heures à 370C. La suspension bactérienne est lavée trois fois en eau physiologique, puis centrifugée de nouveau et le culot bactérien obtenu est remis en suspension en tampon phosphate, la concentration bactérienne étant alors de l'ordre de 10 milligrammes/ml en poids sec. On effectue un broyage mécanique aux billes de verre. La suspension obtenue est diluée au demi et le surnageant filtré pour éliminer les corps bactériens encore intacts et les débris cellulaires. Le contrôle est effectué au microscope pour vérifier que ces éléments sont éliminés. La solution est ensuite soumise à l'action de la désoxyribonucléase à raison de 2 microgrammes/ml pendant une heure à 370C et de la ribonucléase à raison de 5 microgrammes/ml pendant une heure à 370C. Les nucléotides résultant de la dégradation des acides nucléiques sont éliminés par filtration à travers un ultrafiltre retenant les substances d'un poids moléculaire supérieur à 2000. La préparation ainsi débarassée des acides nucléiques est soumise à la précipitation à froid par le sulfate d'ammonium à l'aide d'une concentration de sel variant de 20% à 40%. Le précipité récupéré et-remis en solution constitue le médicament. Activités et propriétés du médicament : Le médicament obtenu par le procédé selon l'invention-est dénué de toxicité pour l'oeuf embryonné, la souris et le souriceau nouveau né. L'activité du médicament a été mise en évidence vis à vis de trois-virus : 10) Virus de la maladie de Newcastle : la multiplication virale a été appréciée sur l'oeuf embryonné à l'aide de l'épreuve de l'hémagglutination virale. La multiplication du virus dans l'embryon passe de l'indice 100 pour les lots non traités à un indice compris entre 1 et 10 pour les lots traités. 20) Virus de la fièvre aphteuse : l'animal d'expérience choisi a été le souriceau nouveau né avec un virus de type C, adapté au souriceau. La mortalité a été appréciée chez les animaux traités et chez les animaux non traités par le médicament. Cette mortalité passe de 90% à 100% dans les lots non traités à 0% à 30% dans les lots traités. 30) Virus de la grippe humaine : L'animal d'expérience choisi a été la souris adulte et la mortalité a été appréciée chez les animaux traités ou non traités par le médicament. La mortalité passe de 80% à 100% dans les lots non traités à 0% à 30% dans les lots traités. On a d'autre part constaté que le produit injecté à la souris détermine un titre d'interférons élevé. La dose active chez l'homme est de préférence comprise entre 100 et 500 microgrammes ramenés au poids sec de bactéries. La dose peut être administrée soit par voie nasale, soit par injection souscutanée. REVENDICATIONS 1- Médicament pour la protection contre les infections virales et la stimulation des défenses non spécifiques de l'organisme, caractérisé par le fait qu'il contient une fraction isolée à partir de bactéries lysées du genre Brucella, possédant un poids moléculaire compris entre 2000 et 35000. 2- Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est dépourvu d'acides nucléiques. 3- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il contient une fraction possédant un poids moléculaire compris entre 7000 et 11000. 4- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il contient une fraction possédant un poids moléculaire compris entre 25000 et 35000. 5- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il contient un antiseptique. 6- Médicament selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il contient du mercurothiolate sodique. 7- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la fraction est obtenue à partir de bactéries Brucella abortus. 8- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la dose active contient entre 100 et 500 microgrammes de fraction ramenée au poids sec de bactéries. 9- Procédé de préparation du médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que l'on lave, inactive et lyse une souche de Brucella, et que l'on sépare la fraction de poids moléculaire compris entre 2000 et 35000 d'avec les autres fractions. 10- Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on élimine les acides nucléiques. 11- Procédé selon I'.une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé par le fait que l'on sépare la fraction de poids moléculaire compris entre 7000 et 11000. 12- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé par le fait que l'on effectue la séparation de la fraction de poids moléculaire compris entre 25000 et 35000. 13- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé par le fait que l'on effectue la séparation de la fraction à l'aide d'une ultra-filtration par un ultrafiltre retenant les substances d'un poids moléculaire supérieur au poids moléculaire maximum désiré. 14- Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que l'on effectue en outre une ultra-filtration à l'aide d'un ultra-filtre retenant les éléments dont le poids moléculaire est inférieur à la limite inférieure désirée. 15- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé par le fait que l'on effectue la séparation par précipitation à froid à l'aide d'une concentration de sulfate d'ammonium comprise entre 20 et 40% de la saturation du sel. 16- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé par le fait que la suspension bactérienne initiale destinée à être lysée contient de 5 à 10 milligrammes de bactéries en poids sec par millilitres. 17- Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 16, caractérisé par le fait que l'on élimine les acides nucléiques par précipitation par le sulfate de streptomycine. 18- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé par le fait que l'on élimine les acides nucléiques par action de la désoxyribonucléase et de la ribonucléase.