Brevet FR2195425A1 — publié le 19740308

La présente invention concerne un procédé pour la producton de préparations liquides à partir d'organes animaux, ainsi que les produits obtenus par ledit procédé. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé pour l'obtention, à partir d'organes animaux comme le foie, le placenta, les reins, d'une préparation liquide à usage thérapeutique, formée uniquement d'éléments en provenance de l'organe animal traité. Ainsi qu'il est connu d'après la technique antérieure, de nombreuses préparations pharmacologiques, essentiellement constituées d'éléments à activité thérapeutique extraits d'organes animaux comme le foie, le placenta, la rate, etc, sont actuellement produits et utilisés en grandes quantités entre autres pour le traitement des affections les plus diverses, pour l'accroissement des défenses de l'organisme et pour des actions hémopoiétiques et eutrophiques. Les techniques opératoires utilisées jusqu'à présent pour la préparation de ces extraits comportent, dans une première phase, le traitement de l'organe animal par des solvants et des solutions des types les plus divers, et ensuite diverses opérations de dilution et de concentration, et diverses manipulations devant être considérées comme non dépourvues d'un certain effet réducteur sur 1'efficacité des principes actifs contenus dans les extraits, et par suite sur le pouvoir thérapeutique initialement présent. Suivant les techniques actuellement en usage, l'administration de ce type d'extraits s'effectue au moyen de préparations dans lesquelles le liquide solvant est l'eau distillée ou un autre milieu convenable. Le problème que vise à résoudre la présente invention est la simplification des techniques opératoires ci-dessus, en diminuant le nombre des opérations, et par suite les risques d'altérations du pouvoir thérapeutique initial des éléments obtenus, essentiellement par remplacement de l'eau distillée généralement utilisée comme il a été dit pour l'obtention de préparations cliniques, par un liquide plus approprié pour participer aux phénomènes phy biologiques se déroulant à l'intérieur de l'organisme humain. La présente invention tire son origine de la constatation que les organes à traiter pour l'obtention d'extraits pratiquement purs de n'importe quel organe animal contiennent un pourcentage élevé d'eau, soit libre, soit fixée, qui présente dans les organismes vivants des caractères spéciaux, par lesquels elle intervient comme élément de base, indispensable dans tous les phénomènes physiologiques essentiels. On voit donc l'avantage que présenterait, pour des buts thérapeutiques, un procédé conforme au procédé selon l'invention, pour l'obtention directe des principes actifs d'un organe donné, en solution dans leur propre liquide biologique, dans lequel n'entrerait aucun élément étranger ou rapporté, même pas l'eau distil lée. Un autre avantage incontestable du procédé selon l'invention réside dans le rendement amélioré de l'opération de production, en ce sens que, pour un égal poids de départ de l'organe frais, on obtient dans un même volume de produit une concentration supérieure en éléments thérapeutiquement actifs. outil suffise à ce suet de rappeler que les préparations à base d'organes animaux doivent, pour être efficaces aux doses prescrites, posséder une concentration en éléments actifs comprise dans des intervalles bien dérinis.Cette concentration est présente dans les préparations obtenues par le procédé de l'invention, pour lesquelles aucun autre traitement ultérieur de concentration n'est donc normalement nécessaire, contrairement aux extraits traditionnels, cela a pour conséquence que les quantités nécessaires sont moins élevées qu'avec les extraits traditionnels, comme sont également moins élevées les dépenses pour l'obtention de la dite concentration. Les solutions opératoires proposées par l'invention, en dehors de cet important avantage sur le plan qualitatif comme sur le plan quantitatif, permettent en outre, par la suppression de l'utilisation de solvants ou de liquides en général, d'obtenir une nouvelle réduction des coûts de production. On a trouvé que, de façon surprenante, si l'on effectue la dégradation des protéines et des éléments biologiques d'un produits homogénéisé venant de l'organe animal à traiter, au moyen d'enzymes protéolytiques en poudre, et de préférence d'enzymes pancréatiques, en effectuant le traitement à la température et au pH convenant à l'enzyme choisie, on peut obtenir une préparation ayant les caractères indiqués, c'est-à-dire constituée uniquement d'éléments en provenance de organe, en solution dans l'eau libre qu'ils contenaient. L'objet essentiel de la présente invention est par suite un procédé pour la production de préparation liquides à partir d'organes animaux, avec une concentration en éléments actifs très voi sine de la concentration initiale dans l'organe traité, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la succession des phases suivantes a) homogénéisation, sans addition de liquides ou d'autres agents de traitement, de l'organe animal, à une température inférieure à la température de dégradation des éléments actifs qu'il contient ; b) mélange du produit homogénéisé avec des enzymes protéolytiques en poudre, avec agitation continue, à la température et au pH convenant à l'enzyme introduite; c) filtration de la masse semi-liquide obtenue; d) purification du filtrat liquide par traitement à chaud à pH acide. e) décantation du liquide, sans aide ei:térieure, pendant 24 heures à basse température, filtration et ajustage du pH à la valeur voulue pour une administration parentérale, et ensuite repos du liquide pendant encore 24 heures à basse température; f) ultrafiltration du liquide. Des conditions préférées, mais non limitatives, sont les suivantes a) la température d'homogénéisation est de préférence de 400C; b) ies enzymes préférées sont les enzymes pancréatiques, mises en oeuvre à une température de 37 à 38"C à un pH voisin de 7,5. On peut également préciser que les protéines et les composés biologiques, après leur dégradation, ont libéré les éléments qui les composent et l'eau qui leur est liée, avec formation d'une masse semi-liquide qui est filtrée sur papier ou carton filtrant, ou centrifugée, en faisant toutefois remarquer que a) ce traitement de purification à chaud et à pH acide, est de préférence effectué à 600C pendant deux heures; b) la première opération de décantation et l'opération finale sont de préférence réalisées à + 50C; c) le pH du produit final est amené à la valeur de 5,5; et d) l'ultrafiltration est effectuée sur membrane ou sur bougies filtrantes. On obtient ainsi un produit formé par a) une partie liquide comprenant l'eau libre contenue dans l'organe et l'eau déjà liée aux protéines et aux autres complexes biologiques, libérée par leur dégradation enzymatique; et b) des éléments hydrosolubles, ou qui le sont devenus par suite de la dégradation des protéines, en solution dans la partie liquide a). Ledit produit correspond quasi strictement, quoique parfois non intégralement à l'individualité biologique de l'organe traité. On donne ci-après quelques indications sur les résultats expérimentaux obtenus par administration d'une préparation suivant l'invention, à des animaux de laboratoire. Le produit choisi est un extrait placentaire, qui sera désigné dans ce qui suit par l'appellation PLA, et sur lequel on a erfectué des essais pour vérifier, soit son innocuité, sa tolérance, ses effets secondaires, etc.... soit ses effets thérapeutiques. Dans la suite de la description l'abréviation "Dtd" signifie "dose thérapeutique". Il a été ainsi constaté que le PLA, administré aux animaux habituels de laboratoire (rat, Mus musculus), ne présente pas de toxicité, aiguë ou chronique, aux doses prévues pour l'utilisation clinique, et est bien toléré en administration parentérale, même à doses plus élevées. Des traitements poursuivis pendant 180 jours sur le rat avec le PLA, mme à des doses supérieures aux doses prévues (2 ml par kg et par jour) n'amenèrent aucune modification significative de l'évolution du poids, de la fonction urino poiétique, de l'azotémie, de la glycémie, de la structure histologique interne des principaux organes, de la crase hématique périphérique et de la moelle hémopoiétique. QuelquesFxpériences sur des lapins ont montré une tolérance satisfaisante de la part du tissu musculaire. On a étudié de m"eme le syndrome anaphylactique, l'activité tératogène et la toxicité embryo-foetale. Il n'apparatt pas non plus de modifications de la pression artérielle ou de I'élec- tro-cardiogramme chez lécha ou le chien, ni d'altération de la motilité des muscles lisses. Enfin, on n'a pas remarqué d'effets progestatifs ou oestrogènes. Parmi les effets clinico-pharmacologiques, on a en particulier mis en évidence les suivants a) effets significatifs sur la régénération des fibres nerveuses, obtenus au cours d'expériences sur des lapins par la technique du test cornéen de JENT, modifié suivant MARTINI et al, par comparaison entre des lapins traités par le PLA et par des extraits placentaires classiques; et plus précisément sur des animaux opérés de la cornée avec résection des fibres nerveuses allant de la périphérie au centre de la cornée, et traités par le PLA (de 6 à 30 Dtd par kg et par jour). On a relevé en fonction des doses mises en oeuvre, les temps nécessaires au retour de la sensibilité cornéenne, ces temps sont rapportés dans le tableau I ci-après, comparés à des temps témoins. TABLEAU I Effets du PLA, du placenta A et du placenta B sur la régénéra tion des fibres nerveuses cornéennes du lapin Nombre d'a- Traitement par voie intramuscu- Valeurs moyennes nimaux laire sur les animaux opérés en jours, + er reurs expérimenta les, du temps de retour de la sen sibilité cornéenne 5 témoins 17,2 + 0,7 5 PLA (6 Dtd/kg/jour;0,4 13,8 + 0,2 @ ml/kg/jour) 5 PLA (30 Dtd/kg/jour;; 2 ml/kg/jour) 10,4 + 0,4 * 5 A (0,4 ml/kg/jour) 15,1 + 0,5 * 5 A( 2 ml/kg/jour) 13,2 - 0,4 é 5 B (0,4 ml/kg/jour) 14,6 @ 0,) * 5 B (2 ml/kg/jour) 12,2 + 0,2 * * Valeurs statistiquement significatives (P rapport aux témoins. b) action élective sur la régénération des cellules hépatiques après hépatectomie partielle. Les expériences ont été effectuées sur des rats blancs mâles de 170 à 180g. Ces rats ont été opérés comme suit : sous anesthésie à l'éther, le lobe médian et le lobe gauche du foie (soit 60 à 65% du total de l'organe) ont été amputés. Les animaux ainsi opérés ont été divisés en 4 groupes de chacun 10 sujets, qui ont été traités selon le schéma suivant Groupe I témoins. Groupe II animaux traités par voie intramusculaire par le PLA (,0 Dtd/kg/jour pendant 3 jours consécutifs, soit 2 ml/ kg/jour de produit). Groupes III et IV Animaux traités respectivement avec les Placentas A e 5 (2 ml/kg/jour, pendant 3 jours consécutifs). Douze heures après le dernier traitement, les animaux ont été sacrifiés par saignée. Le foie a été prélevé et pesé sur une balance de Mettler On en a mesuré le contenu en ATP (méthode d'Adam). Comme on peut le voirisur le tableau II ci-après, le PLA stimule la régénération hépatique en augmentant la quantité d'ATP dans le foie régénéré, beaucoup plus que les témoins. c) action cicatrisante, mise en évidence par des essais sur des cobayes adultes (400 à 500g), sur lesquels on a pratiqué des blessures de 100 mm2 de surface sur la région fronto-pariétale, avec étude de la blessure 2 heures après l'opération et ensuite tous les trois jours jusqu'à la fin de l'expérience. Sur les animaux traités au PLA, on a constaté entre le 9ème et le 15ème jour après l'opération des temps de cicatrisation très inférieurs à ceux des témoins. d) effet sur la "respiration" des levures. On a étudié dans ce but les effets"in vitro" du PLA et des Placentas et B. Dans des tubes de Einhorn, on a introduit successivement : 2 ml de solution de NaCl à 20%, 2 ml d'une solution de glucose à 4%, 4 ml d'une suspension obtenue par homogénéisation de lOg de levure dans une solution de NaCl à 4%, et 2 ml d'eau distillée stérile. On n'a rien ajouté d'autre dans les tubes témoins. Dans les autres, on a ajouté du PLA, du Placenta A ou B en quantités différentes, de façon à obtenir des concentrations finales de 4.10 4 et 4.10 ml par ml. Les tubes ont été mis, sitôt préparés, dans un thermostat à 57 C, et maintenus dans ces conditions pendant toute la durée de l'essai. On peut voir d'après les résultats (Tableau III) que le PLA stimule la "respiration" des levures plus que ne le font les PlacentasA et B. TABLEAU II Régénération hépatique après hépatectomie partielle sur des rats traités par voie intramusculaire par le PLA, le placenta A ou le placenta B reste du Nombre Traitement poids frais du tis- Poids frais du/ % de variation de d'ani- su hépatique ampu- foie au moment l'ATP du foie régémaux té de l'autopsie néré (écart moyen) par rapport à celui de la partie amputée 10 Témoins 4,62 # 0,08 2,57 # 0,10 - 42 # 2 10 PLA (30 Dtd/kg/jour; 4,59 # 0,03 3,44 # 0,11 (*) - 23 # 2 (*) 2 ml/kg/jour 10 PLACENTA A (2 ml/kg/jour) 4,64 # 0,07 3,01 # 0,06 (*) - 31 # 5 (*) 10 PLACENTA B (2ml/kg/ jour) 4,65 # 0,11 3,15 # 0,09 (*) - 28 # 3 (*) (*) Valeurs statistiquement significatives par rapport aux témoins. TABLEAU III EFFETS DU PLA, DU PLACENTA A ET DU PLACENTA B SUR LA RESPIRATION DES LEVURES Extrais placentaires et leurs Dégagement de CO2 en ml après diverses durées concentrations finales de séjour dans le thermostat 30' 60' 90' Témoins 0,45 # 0,02 1,63 # 0,11 3,78 # 0,26 Placenta A 4 x 10-4 ml/ml 0,51 # 0,08 2,10 # 0,18 4,18 # 0,25 Placenta A 4 x 10-3 ml/ml 0,66 # 0,09 2,86 # 0,30 5,06 # 0,36 Placenta B 4 x 10-4 ml/ml 0,53 # 0,03 2,21 # 0,11 4,29 # 0,21 Placenta B 4 x 10-3 ml/ml 0,72 # 0,05 2,95 # 0,13 5,21 # 0,31 PLA 4 x 10-4 ml/ml 0.61 # 0,08 2,45 # 0,15 4,45 # 0,18 PLA 4 x 10-3 ml/ml 0,81 # 0.07 3,16 # 0,22 5,53 # 0,25 RIENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention de préparations liquides à partir d'organes animaux, avec une concentration en éléments actifs très voisine de la concentration initiale dans l'organe traité, caractérisé par la succession des phases suivantes a) homogénéisation, sans addition de liquides ou d'autres agents de traitement, de l'organe animal, à une température inférieure à la température de dégradation des éléments actifs qu'il contient ; b) mélange du produit homogénéisé avec des enzymes protéolytiques en poudre, avec agitation continue, à la température et au pH convenant à l'enzyme introduite ; c) filtration de la masse semi-liquide obtenue ; d) purification du filtrat liquide par traitement à chaud à pH acide ;; e) décantation du liquide sans aide extérieure, pendant 24 heures à basse température, filtration et ajustage du pH à la valeur voulue pour une administration parentérale, et ensuite repos du liquide pendant encore 24 heures à basse température ; f) ultrafiltration du liquide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites enzymes protéolytiques en poudre sont des enzymes d'origine pancréatique. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'homogénéisation est effectuée à une témpérature d'environ 400C. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le produit résultant de l'homogénéisation est mélangé à l'en- zyme pancréatique à une température de 37 à 38"C, à un pH voisin de 7,5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'opération de purification est effectuée à une température d'environ 600C. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les opérations de décantation du liquide sont effectuées à une température d'environ 5 C, avec un pH final de 5,5, l'ultrafiltration étant réalisée sur membrane ou sur bougies filtrantes. 7. Préparations liquides obtenues à partir d'organes animaux suivant le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont formées par a) une partie liquide comprenant l'eau libre contenue dans l'organe et l'eau déjà liée au protéines et au autres com- plexes biologiques, libérée par leur dégradation enzymatique; et b) des éléments hydrosolubles, ou qui le sont devenus par suite de la dégradation des protéines, en solution dans la partie liquide a). 8. Préparations liquides selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues à partir de foie, de placenta, de reins ou de la rate.