Brevet FR2197653A1 — publié le 19740329

la présente invention concerne l'utilisation d'un mélange d'acides aminosulfoniques polyprotiques comme ampholytes véhicules au cours d!une focalisation isoélectrique. e procédé d'utilisation dtacides aminocarboxyliques comme atniolytes véhicules au cours de la focalisation iso- électrique est décrit par Vesterberg, 0., et Svensson, H. (Scta Chem. Scand. 20, 820, (1966)). Une condition de l'u- tilisation de la focalisation isoélectrique pour l'analyse sélective et le fractionnement des protéines par exemple est que le système d'ampholytes véhicules utilisé donne un gradient de pH stable au cours du temps. (Svensson, H., Acta Chem. Scand 15, 325, 1961). Ces substances doivent avoir un faible poids moléculaire et une capacité suffisante comme matière tampon (Svensson, H., Acta Chem. cand. 16,456,1962). De plus, le système doit comprendre des substances dont les points isoelectriques sont répartis sensiblement uniformément dans la plage de pH allant de 2 à 11, car la plupart des protéines ont leurs points isoélectriques dans cet intervalle de pH. es points isoélectriques des substances doivent être séparés par d'étroits intervalles de pH, cette caractéristique étant évidente à partir des calculs théoriques qui montrent que cent substances environ sont nécessaires dans l'intervalle de pH allant de 3 à 10 (Almgren, M., Chemica Scripta 1, 69, 1971). Il est de plus souhaitable que les substances aient les propriétés suivantes 1. Une borgne solubilité dans lteau pour un pH proche du point isoélectrique (pI). 2. Une faible absorption lumineuse dans une solution aqueuse à 1 9 à des longueurs d'ondes supérieures à 25C nm. 3. Une interférence nulle ou insignifiante avec les réactions chimiques courantes pour la détection des protéines, par exemple pour la méthode au bluret ou la méthode décrite par Lewry et collaborateurs, O.H., et collaborateurs, J. Biol. Chem., 193, 265, 1951). Il est tout à fait souhaitable que les substances satisfassent aux critères 2/et 3 car elles peuvent perturber l'analyse dez protéines après fractionnement dans le cas con traire. Loris d'un essaI de réalisation d'un système de produits chimiques séparés disponibles dans le commerce, le système qui peut être obtenu est très incomplet car il ne satisfait pas aux propriétés citées 1 à 3. La préparation par synthèse organique d'ampholytes véhicules séparés réalisés sur mesure est une tâche très délicate même pour un chimiste très versé dans les synthèses. Cependant, l'obtention d'un système d'ampholytes vé- hicules à partir de polyamines-aliphatiques auxquelles sont ajoutés un ou plusieurs groupes contenant chacun au moins un groupe carboxyle libre est possible. Les amines doivent avoir des constantes de dissociation p5 séparées par de faibles intervalles de pH et réparties au moins dans l'intervalle de pH allant de 3 à 10 (Vesterberg, O., Acta Chem. Scand. 2v, 2653, 1969). Ces ampholytes cependant ne satisfont pas à tous les critères 1 à 3 cités. Ils interfèrent avec les méthodes d'analyses des protéines du critère 7 . De plus, la réalisation d'un système est délicate à partir de telles matières, dans l'intervalle de pH recouvrant aussi l'intervalle 2 à 3,5. La présente invention permet la satisfaction de tous les critères précités de qualité et recouvre aussi l'intervalle de pH 2-3,5. De plus, les ampholytes véhicules de l'in Invention ont en général une tendance réduite à la complexation des métaux, en comparaison des ampholytes véhicules du type acide aminocarboxylique. En conséquence, les risques de perturbation lors de l'utilisation des ampholytes véhicules de 1'invention avec des protéines contenant des métaux sont réduits. te système d'ampholytes véhicules de l'invention satisSait à tous les critères raisonnables d'un bon système d'ampholytes véhicules.Le système de 11 invention est obtenu à partir de polyamines aliphatiques dont les PEs sont répartis dans l'intervalle de pH 2,5-11,5, et auxquels sont ajouté un ou plusieurs groupes comprenant chacun au moins un groupe acide sulfonique libre, de manière que des acides aminosul foniques se forment. Un tel système n1a pas encore été décrit. On n'a pas encore décrit dans la technique antérieure la constitution des polyamines, par exemple les pK5 que doivent avoir les amines pour que les acides aminosulfoniques convenant aux systèmes d'ampholytes véhicules, puissent 8tre obtenus.On n'a pas non plus décrit comme avantage la synthèse d'ampholytes véhicules par réaction d'addition de polyamines aliphatiques avec des sultones (esters internes d'acides hydroxysulfoniques) ou avec des acides vinylsulfoniques. Si au contraire, on essaie d'autres réactions de couplage, on rencontre souvent un problème important car des ions mi néraux tels que sodium et chlorure sont présents et doivent entre retirés avant l'utilisation des ampholytes. Il est connu que les acides aminosulfoniques peuvent entre obtenus lorsqutune sultone réagit avec une amine (Helberger, J.H. et collaborateurs, Justus Liebigs Annalen der Chemie 565S 22, 1949, et brevets de la République Fédérale d'A11emagne n t 200 318 et n 1 211 156). Des acides aminosulfoniques simples ont été obtenus par réaction d'acide vinylsulfonique avec des amines (Danusso, F. et collaborateurs Chem. Ind.0Milan/ 50, 71, 1968). Un fait commun à ces descriptions est que les réactions concernent le plus souvent l'utilisation des amines contenant un ou au maximum deux groupes amine. En général, un seul acide aminosulfonique particulier est voulu pour chaque réaction, et non pas des mélanges de plusieurs acides aminosulfoniques. De plus, les produits en question sont en général bien délimités à certains domaines, totalement différents de la focalisation iso- électrique, par exemple dans les utilisations comme agents antistatiques pour vêtements. tes substances selon l'invention peuvent aussi être utilisées comme matières d'espacement en électrophorère et en isotachophorèse. Ce comportement est dû au fait que le systhème comprend un spectre de substances ayant divers pI et di verses mobilités d'électrophorèse. En ce qui concerne la méthode isotachophorétique et l'utilisation des acides aminocarboxyliques comme matières dtespacement, on peut consulter l'article de (Rvendsen, P.J., Science Tools 17, 13, 1970 les substances de l'invention conviennent aussi comme substances acides perturbant d'autres molécules, par exemple des protéines, des acides nucléiques et des nucléotides, en chromatographie par déplacement, sur des matières d'échange d'ions, au cours d'analyses ou de préparations. les substances de l'invention conviennent aussi comme mélanges dans lesquels les points isoélectriques sont répartis dans des intervalles de pu plus étroits que l'intervalle cité de 2 à 11. De telles préparations qui recouvrent avantageusement les pH de 1 à 2, conviennent très bien pour les séparations ultra fines à l'aide des procédés précités. Ces préparations peuvent être obtenues par séparation par groupes des mélanges de synthèse par focalisation isoélectrique dans l'appareil d'électrolyse du type décrit par exemple par Vesterberg, O. (Acta Chem. Scand. 23, 2655, 1969). Comme aucun des ampholytes véhicules séparés du système décrit n'est disponible dans le commerce, le procédé de synthèse utilisé pour la préparation du mélange d'acides aminosulfoniques polyprotiques est décrit dans la suite. Un tel procédé a l'avantage de donner directement le système complet d'ampholytes. Ainsi, la synthèse ne comprend pas la séparation d'espèces chimiques puis leur mélange . De tels mélanges seraient excessivement coûteux car ils doivent comprendre environ une centaine de substances ayant divers pI. le mélange de l'invention est avantageusement préparé par réaction d'une ou de préférence plusieurs substances organiques de faible poids moléculaire ayant chacune au moins deux atomes d'azote primaires et/ou secondaires avec une sultone de manière qutun ou de préférence plusieurs groupes contenant des acides sulfoniques soient fixés aux amines. La base azotée organique de faible poids moléculaire a avantageusement un poids moléculaire qui ne dépasse pas 600. Un ou plusieurs atomes d'azote peuvent être substitués par exemple des groupes méthyle, éthyle, éthanolamino et hydroxyle. L'amine pout être représenté c schématiquement par la formule suivante ou un groupe alkvle du type méthyle, éthyle, propyle ou hy droxyméthyle, hydroxyéthyle, et R' est un groupe polyméthylène ayant avantageusement au maximum six groupes méthylène. Un ou plusieurs des groupes méthylène peut être substitué par des groupes R du type cité. La distance entre la distance PXs analogue ne doit pas dépasser 3,5 unités de pH. L'amine utilisée est de préférence aliphatique. Des amines qui conviennent sont par exemple la diéthylènetriamine, la triéthylènetétramine, la tétraéthylènepentamine,la pentaéthylènehexami ne et aussi les propyléneamines correspondantes.Cependant,l'amine peut aussi être alicyclique ou hétérocyclique ou elle peut contenir des groupes aromatiques et dans ce dernier cas cependant, le mélange ampholyte présente une légère absorption entre 250 et 285 nm. tes amines peuvent aussi être avantageusemen+ utilisées sous forme de mélange, le mélange pouvant alors aussi contenir une ou plusieurs monoamines. La sultone qui doit avoir un faible poids moléculaire peut etre schématiquement représentée par la formule dans laquelle X est un groupe polyméthylène ou des dérivés dc tels groupes substitués par des groupes méthyle, éthyle, propyle sur un ou plusieurs atomes de carbone. ta sultone utilisée est de préférence du type propanesultone-1,3-(1 propanesulforique acide 3-hydroxysultone) ou du type butanesultone-1,4-(1-butanesulfonique acide 4-hydroxysultone; Ce pendant, d'autres sultones, par exemple l'éthanesultone-1,2 conviennent.On peut utiliser simultanément plusieurs s3- tones. L réaction entre l'amine et la sultone peut Qre représentée dans im cas particulier par la formule suivante dans laquelle R, R' et X ont la signification correspondant aux formules 1 et 2 citées. tes réactions citées a) et b) peuvent avoir lieu simultanément et le nombre d'ampholytes différents qui est obtenu augmente notablement avec le nombre d'atomes d'azote et le nombre de groupes acides sulfonlques ajouté. le choix approprié des rapports molaires de l'amine et de la- sultone permet l'obtention d'une répartition statistique de produits, formant une série homologue ayant des nombres différents de groupes acides sulfoniques et des pI différents en conséquence.Pour chaque nombre déterminé de groupes acides et basiques, il apparatt spontanément plusieurs isomères si bien que l'addition peut être réalisée sur des atomes d'azote situés à divers emplacements dans la molécule. On obtient divers pK5 en diverses positions si bien que les différents isomères ont des pI quelque peu différents. ta réaction est mise en oeuvre avec une quantité de sultones inférieure à la quantité nécessaire à la saturation de tous les atomes d'azote primaire et secondaire. De cette manière, on obtient un mélange de plusieurs isomères et homologues ayant des pI différents. De manière analogue, on peut ajouter des acides vinylsulfoniques aux amines du type cité de manière que les ampho- lytes véhicules du type acide aminosulfonique se forment. L'acide vinylsulfonique peut être représenté schématiquement par la formule dans laquelle R est un groupe méthyle, propyle, éthyle ou un atome d'hydrogène. La réaction avec l'amine peut entre représenté par la réaction 7 si l'acide vinylsulfonique remplace la sultone et si le groupe remplace X dans les produits. les considérations relatives aux réactions et aux produits d'addition avec une sultone restent valables pour l'addition des acides vinylsulfoniques. La température de la réaction est habituellement maintenue entre -10 et 11000, de préférence entre -10 et -5 C lors de l'utilisation d'une sultone et entre 60 et 1100C lors de l'utilisation d'un acide vinylsulfonique. Un solvant n'lest pas nécessaire, mais-lteau ainsi que les solvants organiques polaires tels que les alcools et les hydrocarbures chlorés, conviennent. Lors de la mise en oeuvre du procédé, il se forme habituellement des ampholytes qui sont des homologues et des isomères ayant un spectre de pI compris entre le pH 2 et 11. Pour la majorité des ampholytes, on montre que les valeurs pKS du groupe amino déterminent le pI. les valeurs pEs des groupes amino sont seulement très peu modifiées par addition du groupe acide sulfonique et en conséquence on peut avoir une bonne idée sur les valeurs de pKs et pI de l'ampholyte en considérant les pES des amines de départ, qui peuvent être déterminées par titrage. les pES et la capacité comme matière tampon des ampholytes obtenus peuvent être déterminés par ti traite. Le cas échéant, une séparation par groupes de pI peut être réalisée par focalisation isoélectrique de manière que le pI du mélange obtenu recouvre 1 à 2 unités de pH. Cette séparation convient aussi pour la détermination du rendement dans un certain intervalle de pH. La modification du rapport molaire des amines à la sultone ou à l'acide vinylsulfonique permet l'obtention d'une partie accrue du rendement total dans une certaine plage de pH. le mélange décrit d'acide aminosulfonique convient avantageusement comme matière d'espacement car il comprend un spectre de matière ayant des mobilités différentes par électrophorèse. L'avantage des diverses préparations à cet effet est contrôlé par des expériences pratiques qui concernent par exemple les protéines et on cherche en général à obtenir une séparation optimale. On va maintenant décrire un exemple particulier de mise en oeuvre de l'invention. On ajoute goutte à goutte en agitant 450 parties molaires de propanesultone à 100 parties molaires de triéthy lènetétramine et 100 parties molaires de pentaéthylènehexamine dans un ballon maintenu à O C (bain de glace). Après 2 heures, on chauffe le mélange à 400C et on le laisse à cette température pendant 24 heures sans agiter. On dissout alors le mélange dans 11 eau de manière qu'il forme une solution à 5 %. On soumet cette solution à une focalisation isoélectrique pendant 24 heures à 700 volts dans un appareil et suivant le procédé de fractionnement essentiellement décrit par Vesterberg, O., (Acta Chem. Scand. 2D, 2653, 1969).Ce procédé convient aussi pour le retrait par éleetrolyse d'acide alkylsulfonique (qui peut Qtre formé lors de la synthèse dans le cas de la présence d'eau) et d'amines qui n1 ont pas réagi en formant des ampholytes lors de la synthèse. lors de ltélectrolyse, les acides aikylsulfoniques migrent vers l'anode et les amines vers la cathode et sont donc ainsi sé- parés des ampholytes. La mesure du pH dans les fractions après focalisa tion isoélectrique donne uvale idée de l'avantage du mélange comme ampholytes véhicules, et entre autre chose, l'inter- valle de pH donné par les ampholytes et l'aspect du gradient de pH peuvont être déterminés. La capacité comme matière tampon et La. ounductivité des fraction sont mesurées et calculées et rapportées à la quantité de substances sèches exprimées en milligrammes. lies rendements dans différents intervalles de pH sont déterminés par pesée.Ces expériences montrent que 90 d10 du rendement total des ampholytes ont un pI compris entre 2 et 10,5. le.rendement dans une certaine plage de pI peut être modifié par sélection d'autres amines et d'autres rapports molaires d'amines à la sultone Une augmentation de 3a quantité de sultones accroît le nombre d'ampholytes acides. La légère absorption des ampholytes de ltexem ple aux longueurs d'ondes supérieures à 250 nm peut être négligée en comparaison des absorptions lumineuses des protéines. On peut remplacer la tétraéthylèrepentamine et la pentaéthylènehexamine par la triaéthylènetétramine et la tripropylèetétramine. La sultone peut aussi être remplacée par la butanesultone-1,4 ou ltéthanesultone-1,2 ou l'acide vinylsulfonique, avec des résultats analogues. les ampholytes obtenus ont un spectre de mobilité qui convient aux matières d'espacement et les pi des substances ont un spectre qui recouvre le champ d'application de la focalisation isoélectri- que. Il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et représentée qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra apporter tcute équivalence technique dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir du cadre de l'invention, qui est défini dans les revendications annexées. REVENDICATIONS 1. Procédé de focalisation isoélectrique à laide d'ampholytes véhicules formés d'un mélange d'acides aminosulfongiques polyprotiques, caractérisé en ce que le mélange préparé par synthèse par addition contient au moins trois acides aminosulfoniques polyprotiques ayant au moins quatre groupes protolytes comprenant au moins un groupe acide sulfonique et au moins un atome basique d'azote. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé on ce que les points isoélectriques des ampholytes cités sont compris dans un intervalle étroit de pH. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le mélange est préparé par réaction dtaddition entre un composé organique ayant au moins deux groupes amino imino ou amino et imino, et une sultone de faible poids moléculaire. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le mélange est préparé par réaction d'addition entre un composé organique ayant au moins deux groupes amino, imino ou amino et imino, et un acide vinylsulfonique de faible poids moléculaire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ampholytes cités ne sont pas aromatiques. 6. Mélange d'ampholytes, caractérisé en ce qutil est obtenu par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, et en ce que l'ensemble du mélange ou des parties de celui-ci sont utilisés comme matière d'espacement en isotachophorèse. 7. Mélange ampholyte, caractérisé en ce qu'il est préparé par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et en ce que ltensemble du mélange ou des parties de celui-ci constitue des substances actives en chromatographie par déplacement.