Brevet FR2190412A1 — publié le 19740201

L'invention est relative à un procédé de purification, notamment de dépyrogénation, de substances biologiquement actives, et elle concerne plus particulièrement, parce que ctest dans ce cas que son application semble présenter le plus d'intérêt, mais non exclusivement, un procédé de dépyrogénation de l'urokinase, notamment extraite d'urines humaines. On sait que l'urokinase est une enzyme présente dans l'urine et qui catalyse la transformation du plasminogène en plasmine, peptidase dont le rôle physiologique est de dissoudre les forma- tions fibrineuses intravasculaires. Un défaut dans les mécanis- mes d'activation du plasminogène en cas de cinétique accéléré du systme de coagulation ou d'altération des parois vasculaires, conduit au maintien de fibrine intravasculaire qui en définitive diterine les divers syndromes thrombo-emboliques (thromboses, embolies, coagulation intra-vasculaire disséminée, etc.).L'ad iinistration d'urokinase dans ces cas pathologiques provoque une accélération de la formation de plasmine notamment au niveau des formations fibrineuses comme l'indique la littérature. L'urokinase constitue donc le traitement de choix des syndromes throbo-emboliques et son origine humaine écarte les dangers de chocs anaphylactiques. L'utilisation des urokinases purifiées obtenues jusqu ce jour reste cependant délicate, en raison de leurs teneurs encore trop importantes en substances pyrogènes, que les procédés de purification connus n'ont pas réussi à éliminer, au moins à un degré suffisant. I1 est certes possible de parvenir à un fort enricissement de l'urokinase par rapport à la teneur en protéines qui l'accompagnent dans les urines humaines, notamment en ayant recours au procédé perfectionné décrit dans la demande de brevet n 71 34435 déposée le 14 septembre 1971 par la demande resse et dans la demande de premier certificat d'addition à ce brevet, pour des wperfectionnements aux procédés de préparation de l'urokinase", déposée le 30juin 1972, ce procédé permettant l'obtention d'exclusions et d'adsorptions différentielles de l'urokinase dans des conditions déterminées. On observe cependant que ces conditions prédéterminées, et encore moins celles qui caractérisent les autres procédés de purification connus i ce jour (passages sur amiante, adsorption sur alcalino-terreux, etc.) ne permettent pas la différentiation des comportements physico-chimiques de l'urokinase et d'une partie au moins des substances pyrogènes, donc finalement leur séparation.C'est ainsi que l'on observe que l'urokinase purifiée, obtenue par le procédé perfectionné susmentionné, produit encore une certaine hyperthermie chez le lapin lorsque les doses administrées dépassent un seuil modérément élevé. Injectée i des lapins dans les conditions conformes aux méthodes générales d'analyses de la Pharmacopée Française, 8ème édition, page 1615, à raison de 3000 unités CTA/kg, l'urokinase purifiée susdite produit une élévation de température qui varie de 0,5 à 0,9 C d'un lapin à l'autre. La pyrogénicité des urokinases purifiées représente donc un inconvénient qui peut devenir majeur si l'on tient compte de l'extrême sensibilité qui s'observe souvent chez les malades qui rel & ent d'un traitement i basê d'uro3cinase, traitement qui implique l'administration par voie intraveineuse de doses d'urokinase qui peuvent autre élevées, pouvant, par exemple, atteindre 150 000 unités cTA ou davantage en une seule injection.Le but de l'invention est donc de remédier à des inconvEnients de ce type, notamment de fournir un procédé qui permette la séparation de ces substances pyrogènes, au moins à un degré suffisant pour permettre l'obtention d'une urokinase pratiquement apyrogène à des doses élevées. Le procédé de purification selon l'invention, appliqué à une solution aqueuse d'une substance protéique à activité biologique, notamment d'urokinase, qui a de préference subi une purification préalable, est caractérisé en ce que l'on produit une saturation partielle de cette solution avec un agent de précipi- tation des protéines jusqu un degré, fonction de la concentra- tion initiale de la solution en protéines, tel que cette saturation partielle n'induise la précipitation que d'une partie des protéines contenues dans la solution initiale, cette partie étant suffisamment réduite pour que sa teneur en la substance protéique à activité biologique soit maintenue dans des proportions faibles prédéterminées, sinon pratiquement négligeables, et que l'on recueillie le surnageant. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, appliqué à l'urokinase, l'agent de précipitation est constitué par du sulfate d'ammonium, la précipitation partielle susdite étant opérée sur une solution d'urokinase contenant de 1,5 à 3 mg de protéines par ml, à pH compris entre 3 et 4,5, de préférence de l'ordre de 3,8, la conductivité de cette solution ayant été réglée au préalable à une valeur comprise entre 15.000 et 25.0C0 micromhos, le degré de saturation de la solution en sulfate d'ammonium, compris entre 0,25 k 0,35, étant pas poussé au delà de celui qui produit une précipitation de protéines entraînant plus de 5% de l'activité en urokinase contenue dans la solution initiale (étant entendu que le degré de saturation de la solution est égal à 1, lorsqu la solution est saturée complètement : c'est-à-dire par dissolution de 700 g de sulfate d'ammonium dans 1000 ml d'eau distillée à +4 C). L'urokina pratiquement exempte de substances pyrogènes contenue dans le surnageant peut alors autre isolée, notamment par salage de la solution avec du sulfate d'ammonium cristallisé. On appréciera que, compte tenu des fourchettes de concen- trations en protéines préférées indiquées ci-dessus, l'on aura intérbt à procéder à une purification préalable aussi poussés que possible des urokinases à traiter, pour éliminer le maximum possible de protéines, pour qu'il ne soit pas nécessaire d'opérer sur des volumes trep importants de solution.En d'autres termes, le procédé selon l'invention constitue, dans l'une de ses appli cations préférées, us étape de purification finale destinée à parachever les effets d'un procédé de purification préalable, conformément à 1 lue des techniques antérieurement connues. Vit procédé de purification préalable préféré est celui qui est décrit dans les demandes de brevet et de premier certificat d'addition précitées, procédé qui permet l'élimination jusqu'à 80-90% des protéines qui accompagnaient l'urokinase contenue dans les urines humaines dont elle est extraite. L'urokinase soumise à l'étape de purification finale dans les conditions préconisées par l'invention est denc avantageuse- ment constituée par celle obtenue à partir d'une urine humaine obtenue à partir d'un procédé qui comporte des opérations a) de traitement de l'urine humaine avec un adjuvant de filtration, tel que celui commercialisé sous la marque "Hyflosupercel" ; b) de réextraction de l'urokinase et des protéines adsorbées de l'ad- juvant de filtration; c) de relargage de l'urokinase contenue dans la solution d'extraction au moyen de sulfate d'ammonium d) de dissolution du précipité obtenu dans une solution glucosée et de dialyses de celle-ci, jusqu'à obtenir une solution concentrée en urokinase brute dont la conductivité est comprise entre 15000 et 25000 micromhos, de préférence égale à environ 22000 micromohs ; e) une première chromatographie d'exclusion effectuée sur cette solution à un pH compris entre 4 et 6 au contact d'une résine DEAE cellulose, prise de préférence en un poids compris entre 15 et 40 g par 10 millions d'unités CTA en urokinase; f) une seconde chromatographie d'exclusion effectuée sur la solution résultant de la réunion de l'effluent et des lavages de la résine de la première chromatographie d'exclusion après réglage si besoin du pH à une valeur comprise entre 6 et 7, de la conductivité de la solution à une valeur au moins égale à 15000 micromhos, de préférence comprise entre 15000 et 18000 micromhos, à nouveau sur résine DEAE cellulose, celle-ci étant prise en un poids de 30 à 60 g,de préférence 40 à 53 g, par 14 millions d'unités CTA d'ac activité urokinase, la conductivité du milieu étant progressivement amenée jusqu'à une valeur de 9000 micromhos enfin, soit g 1) une chromatographie d'adsorption sur carboxyméthylcellulose de l'urokinase contenue dans la solution résultant de la réunion de l'effluent et de lavages de la résine de la seconde chromato- graphie d'exclusion, à pli de l'ordre de 5, et élution de l'urokinase adsorbée sur la carboxyméthylcellulose avec un tampon phosphate à pH 6,8 - 6,9, soit g 2) a adsorption de la solution résultant de la réunion de l'effluent et des lavages de la seconde chromatographie d'exclusion sur kaolin à pH 6,2, évolution de l'urokinase retenue sur le kaolin par une solution de chlorure d'ammonium dans de l'ammoniaque à 4X, précipitation au sulfate d'ammonium et dialyse contre une solution de phosphate 0,05 M tamponnée à pH 6,2. On a constaté, comme déjà indiqué ci-dessus, que le degré de saturation de la solution en sulfate d'ammonium qui produit la formation d'un précipité de protéines (parmi lesquelles les substances pyrogènes) retenant un pourcentage donné minimum d'urokinase varie en fonction, notamment inverse, de la teneur initiale en protéines de la solution traitée. Les valeurs, qui ont été déterminées expérimentalement, qu'il convient de donner à ce degré de saturation, compte-tenu de la teneur initiale de la solution en protéines, découlent notamment du graphique de la figure unique du dessin ci-annexé, dont l'axe A est gradué en concentrations de protéines (en mg/ ml) des solutions à traiter, l'axe C en degrés de saturation (S) de la solution en sulfate d'ammonium et l'axe B en X d'urokinase entraînée dans le précipité de protéines formé dans les conditions de l'invention.Les dispositions relatives de ces axes et les échelles de leurs graduations ont été choisies de telle façon que le pourcentage d'urokinase entraînée est, dans chaque cas, donné par le joint d'intersection avec l'axe B d'une droita passant par les joints représentatifs de la concentration en protéines, sur l'axe A, et du degré de saturation en sulfate d'ammo- nium sur l'axe C respectivement.Ainsi obtient-on, par exemple, un précipité de protéines retenant 5% de 1 'activité en urokinase de la solution initiale en amenant à 0,30 le degré de saturation en sulfate d'ammonium de la solution lorsque la teneur initiale en protéines de celle-ci est de 2 mg/ml (droite a en traits interrompus), ou en 1 l'amenant à 0,25 lorsque cette teneur ini- tiale est de 3 mg/il (droite b en traits mixtes). Considérant de façon plus précise, par exemple, le cas d'une solution initiale d'urokinase contenant 2 mg/ml de pro tétines, on peut faire les observations suivantes. Jusqu'i une valeur du degré de saturation égale à 0,20, il n'y a pas formation de précipité. La solution obtenue conser ve donc ses substances pyrogènes. A la maie concentration en protéines et avec un degré de saturation égal à 0,25, un luger précipité prend naissance, ce précipité retenant environ 2,5X de l'urokinase contenue dans le milieu. Cette saturation n'est pas suffisante pour retenir la totalité des substances pyrogènes. Par contre, avec un degré de saturation de 0,30, le précipité formé qui contient environ 5% de l'urokinase, retient également la plus grande partie des substances pyrogènes. Le surnageant, qui contient encore 95% de l'activité urokinase totale contenue dans la solution initiale, est exempt de substances pyrogènes selon les normes fixées par la Pharmacopée Française déjà men- tionnées à des doses aussi élevées que 15000 unités CTA/kg.A une saturation supérieure à 0,30 le surnageant sera également apyrogène aux maies doses mais la quantité d'urokinase retenue sur le précipité sera plus importante, comme le montre le graphique. Des caractéristiques supplémentaires du procédé selon l'invention apparaîtront encore au cours de la description complète d'exemples de mise en oeuvre du procédé. Il est entendu que dans ce qui suit, toutes les opérations sont effectuées à une température de l'ordre de 4-C, sauf dans les cas où l'on stipulera expressément une valeur de température différente. Exemple I 1) - Collecte d'urine 1000 litres d'urine sont recueillis sur phénol. La quants té de phénol mise en oeuvre à cet effet est telle qu'à la fin de la collecte, la concentration en phénol soit au minimum de 0,5X. Par addition d'acide acétique, le pH de l'urine ainsi collectée est ajusté à 5,8. 2 - Adsorption de i 'urokinase contenue dans l'urine sur l'hyflo- supercel On ajoute au mélange S kg d'hyflosupercel et, dans une cuve de Grignard à double enveloppe refroidie à 4-C, on le soumet à une agitation pendant 3 heures. La poudre d'hyflosupercel est recueillie par filtration sur filtre presse et on obtient 17 kg d'une p & e contenant 12 kg d'eau. 3 - Extraction de l'urokinase adsorbe sur l'hyflosupercel La p & e obtenue est additionnée de 960 g de chlorure de sodium cristallisé et de 17 litres d'une solution tamponnée à pH 7,2 obtenue en ajoutant dans 10o0 il d'eau déminéralisée, 10,8 g de phosphate disodique et 80 g de Macs. La résistivité de la solution tampon est de 84000 microhms à 15 C. Après 30 minutes d'agitation, la poudre d'hyflosupercel est séparée du mélange par filtration sur un entonnoir du type Buchner de 200 mm de diamètre, garni d'une toile par exemple en fibres synthétiques, comme celles commercialisées sous la marque Tergal. On laisse déposer la poudre et on termine la filtration en opérant sous une dépression de 500 mm de mercure. Avant que la poudre ne soit complètement sèche, on la lave avec 10 litres de lavage, on obtient un volume de 30 litres. L'activité en urokinase de la solution ainsi obtenue est de 4millions d'uni- tés CTA. 4 - Précipitation de l'urokinase contenue dans la solution tampon Le pH de la solution est ajusté à 4,2 par addition d'acide chlorhydrique 5 X. On ajoute 13,5 kg de sulfate d'ammonium (450 g par litre de solution) et on agite jusqu'à dissolution complète du sel. Le mélange est laissé au repos pendant 12 heures. Le précipité qui s'est formé est recueilli par centrifugation. On utilise à cet effet une centrifugeuse commercialisée sous la marque Alfa Laval du type B 1424 F. On obtient 60 g de précipité humide, on ajoute au précipité 60 il d'une solution aqueuse renfermant 18 g de glucose par litre d'eau. Le mélange est alors dialysé jusqu'à ce que la conducti vité finale de la solution renfermant l'urokînase soit de 22.000 micromhos. On active la dialyse par agitation. La solution dialysée est clarifiée par centrifugation. L'activité de la solution obtenue est de 4.000.000 unités CTA d'urokinase. 5. Exclusion de lturokinase sur DEAE cellulose. a) On ajoute 7,lg de DEAE cellulose à la solution clarifiée précédente et on amène le pH à 4,5. Après 30 minutes d'agitation, on sépare la DEAE cellulose par filtration sur un entonnoir Buchner de 150 mm de diamètre, en opérant sous un vide modéré pour empOcher la formation de mousse. La DEAE cellulose est lavée à deux reprises avec une solution de sulfate d'ammonium à conductivité de 15.000 micromhos,à pH 4,5. Le volume utilisé pour chaque lavage est égal à celui de la DEAE cellulose et représente environ 250 ml. Pendant la filtration de la solution de lavage on maintient la fiole à vide dans un bain de glace. L'activité du filtrat est de 4.000.000 unités CTA. b)Le filtrat obtenu, de pH 4,5, est additionné de 17,2 g de DEAE cellulose et amené à pH 6,7. La conductivité est abaissée par dilution avec de l'eau jusqu'à 9.000 micromhos. Après 30 minutes d'agitation, on sépare la DEAE cellulose par filtration sur un entonnoir Buchner de porcelaine, de 150 mm de diamètre. Au fur et à mesure de la filtration, on amène le pH des filtrats ou effluents recueillis à 5 par addition d'acide sulfurique 5 N. On lave la DEAE cellulose avec une solution de sulfate d'ammonium, de conductivité 9.000 micromhos, à pH 7, jusqu'à l'obtention d'un filtrat incolore. Les filtrats et solutions de lavage sont réunis et ajustés à pH 5. L'activité en urokinase de la solution obtenue est de 4.400.000 unités CTA. 6. Adsorption de l'urokinase sur kaolin et séparation par élution. On prépare du kaolin comme suit: 1 kg de kaolin est lavé et mis en suspension dans 3 litres d'veau distillée. On laisse le mélange pendant 90 minutes à 120C dans l'autoclave. Après avoir laissé déposer les matières en suspension, on sépare le kaolin puis on le met à sécher au four à 2000C. La solution obtenue au cours de la dernière étape titrant 4.400.000 d'unités CTA est amenée à un pH de 6,8, puis après addition de 65 g de kaolin préparé de la manière sus-indiquée, à un pH de 6,2. Le mélange est soumis à l'agitation durant une heure. Le kaolin est ensuite séparé par centrifugation à froid et mis en suspension dans un litte d'une solution de phosphate 0,05M tamponnée à pH 6,2. Après 30 minutes d'agitation, on sépare le kaolin par centrifugation. Les 65 g de kaolin sont mis en suspension dans 500 ml d'une solution contenant 75 g de chlorure d'ammonium par litre d'ammoniaque à 4 p.100, et agités pendant 30 minutes. Le kaolin,séparé du surnageant par centrifugation, est soumis à la même opération d'évolution deux autres fois. Les surnegeants obtenus lors des centrifugations sont réunis et additionnés d'acide sulfurique 0,1 N pour obtenir un pH de 3,5. En réunissant les surnageants obtenus lors des centrifugations, on obtient 1.400 ml d'éluat. Le pH de l'éluat est amené à 3,5 par addition d'acide sulfurique 0,1 N. On ajoute alors 490 g de sulfate d'ammonium (350 g par litre d'éluat). On recueille le précipité formé par centrifugation à froid et on le met en suspension dans l'eau. On effectue alors pendant 18 heures une dialyse contre une solution de phosphate 0,05 M tamponnée à pH 6,2. L'activité en urokinase de la solution obtenue est de 2.800.000 unités CTA. 7. Filtration du dialysat sur une colonne de résine. La solution dialysée est filtrée sur une colonne de résine du type Amberlite IRC 50, de 4 cm de diamètre et de 60 cm de haut, équilibrée préalablement avec la solution de phosphate 0,05 M tamponnée à pH 6,2. Lorsque léluat s'est écoulé de la colonne, on lave la résine avec la solution tampon jusqu'à ce que l'addition d'acide trichloracétique à 5% ne provoque plus la formation de précipité dans les fractions recueillies. Pour éluer l'urokinase, on utilise une solution tampon de phosphate 0,2 M, de pH 8,2, renfermant 75 g de chlorure d'ammonium par litre de solution. L'éluat est recueilli dans un collecteur de fractions. Les tubes contenant l'activité sont précipités par le sulfate d'ammonium à pH 3,5 pour précipiter l'urokinase présente, à raison de 350 g de sulfate d'ammonium par litre d'éluat, soit 158 g pour les 450 ml d'éluat obtenus. 8.- Dépyrogénation Le précipité est recueilli par centrifugation, puis dissous dans de l'eau distillée apyrogène et stérile, de façon à obtenir une conductivité comprise entre 15.000 et 25.000 micromhos. La concentration de cette solution en protéines est de l'ordre de 2 mg/ml. Le pH étant réglé à la valeur de 3,8 et la température comprise entre O et 4"C, on ajoute à ce milieu une solution saturée de sulfate d'ammonium jusqu'à obtenir une saturation de 0,3 (soit une solution 1,22 M en sulfate d'ammonium). On agite le milieu pendant 15 minutes, puis on laisse au repos, également pendant 15 minutes. On recueille le précipité par centrifugation à 10.000 g (fraction A). Le surnageant est additionné de sulfate ammonium pur, à raison de 250 g/l, à pH 3-3,5, puis agité pendant 30 minutes. Le précipité contenant l'urokinase est recueilli par centrifugation à 10.000 g (fraction B). 9.- Résultats Chacun de ces précipités (fractions A et B) est remis en suspension dans de l'eau distillée, apyrogène et stérile, le pH de la suspension est amené à 7, la suspension étant finalement filtrée sur membrane 0,22,u en milieu stérile. Le filtrat provenant de la fraction A contient environ 5% de l'activité urokinase. Le filtrat provenant de la fraction B contient environ 95% de l'activité urokinase de la solution initiale. La fraction A se révèle pratiquement retenir la totalité des substances pyrogènes initialement contenues dans la solution initiale obtenue par dissolution du précipité au sulfate d'ammonium avant le fractionnement. La fraction B est au contraire exemptes de substances pyrogènes selon les normes de la pharmacopée française, loc.cit.Ces résultats découlent du tableau I ci-dessous dans lequel on a reporté les élévations de tempéra- ture observées respectivement dans des séries distinctes de 3 lapins pour chacune des fractions testées, et dans une série supplémentaire de 8 lapins pour la fraction B, tous ces lapins ayant reçu les doses indiquées dans la partie gauche-du tableau, dans les conditions prévues par la Pharmacopée Française" -TABLEAU I- Solutions de Elévations de température en C valeur moyenne valeur moyenne fractions testées séries de 3 lapins série de 8 lapins (3 lapins) (8 lapins) solution initiale:: 3.000 uCTA/kg 0 5 0 8 0 9 0 7 fraction A 3.000 uCTA/kg 0 9 0 9 1 0 9 fraction B 15.000 uCTA/kg 0 1 0 2 0 0 , 0 , 0 , 0 , 0 1, 0 3, 0 4, 0 1 0 1 0 1 EXEMPLE II A) Obtention d'une urokinase brute concentrée On part de 22.000 litres d'urine humaine et l'on procède à une extraction de lurokinase brute dans des conditions identiques à celles décrites dans les paragraphes 1 à 4) de l'exemple I. B) Conditions de première exclusion: Le précipité au sulfate d'ammonium est solubilisé dans une à deux parties d'eau glucosée, à raison de 18 grammes de glucose par litre et le pH est réglé à une valeur comprise entre 4 et 6 et de préférence égal à 4,5. La solution obtenue est dialysée contre de l'eau distillée jusqutàlbbtention d'une conductivité comprise entre 30.000 micromhos et 50.000 micromhos, de préférence égale à 40.000 micromhos. On centrifuge la solution obtenue à 3.000 g pour éliminer l'insoluble formé constitué par des impuretés non protéiques. On réalise une nouvelle dialyse du surnageant jusqu'à obtention d'un dialysat dont la conductivité est comprise entre 15.000 et 25.000 micromhos, de préférence égale à 22.000 micromhos. On ajoute de la DEAE cellulose à la solution obtenue à raison de 25 g de résine sèche ou de 100 g de résine essorée, préalablement équilibrée avec une solution de sulfate d'ammonium 0,11 M à pH 4,5 (conductivité de 15.000 micromhos à 4"C), par 14 millions d'unités CTA d'urokinase. On agite le milieu pendant une durée de 20 à 40 minutes, de préférence de 30 minutes. On essore la résine, notamment sur Buchner sous dépression légère et on la lave avec une solution de sulfate d'ammonium 0,11 M à pH 4,5 jusqu obtention d'un filtrat incolore. On réunit le filtrat et les lavages. L'activité totale urokinase de la solution obtenue est sensiblement égale à celle qui a été engagée au départ. C) Conditions de seconde exclusion: La solution ci-dessus est amenée à un pH compris entre 6 et 7, de préférence de l'ordre de 6,6. On ajoute à cette solution 60g de DEAE cellulose poudre ou 250 g de DEAE cellulose essorée, préalablement équilibrée avec une solution de sulfate d'ammonium 0,068 M à pH 7 (conductivité 9.000 micromhos à 4"C), par 14 millions d'unités CTA d'urokinase. La conductivité du milieu est alors de 15.000 à 18.000 micromhos. La conductivité du milieu est alors amenée à 9.000 micromhos par des additions successives d'eau distillée apyrogène, de façon telle que chaque addition produise une baisse de conductivité du milieu de 1.000 micromhos, chaque addition étant séparée par une agitation pendant une durée de 5 à 15 minutes, de préférance égale à 10 minutes. Le pH du milieu est alors ajusté à 7 par addition de soude 2 M. Après agitation pendant une durée de 30 minutes, on filtre, notamment sur Buchner inox sous dépression légère, le récipient récepteur étant maintenu dans un bain de glace fondante, on lave la résine avec une solution de sulfate d'ammonium de conductivité 9.000 microphos, 0,068M et de pH 7 jusqu'à obtention d'un filtrat incolore. La solution obtenue par réunion du filtrat et des lavages peut alors subir des traitements de purification supplémentaires, notamment par les traitements d'adsorption sur kaolin et de chromatographie d'adsorption sur résine du type Amberlite dans les conditions décrites dans la demande de brevet principal ou encore par chromatographie d'adsorption sur carboxyméthylcellulose dans les conditions suivantes: D) Chromatographie d'adsorption sur carboxyméthylcellulose. La solution susdite, ramenée à pH 5, est additionnée de carboxyméthylcellulose à raison de 80 g de résine sèche par 14.000.000 unités CTA d'urokinase, la carboxyméthylcellulose ayant au préalable été équilibrée avec une solution de sulfate d'ammonium 9.000yuMhos, pH5, = 0,068 M. La suspension est maintenue en agitation modérée pendant une durée de 12 à 14 heures à une température comprise entre 2 et 4"C, son pH étant maintenu à 5 + La suspension est ensuite filtrée sur papier crêpé par l'intermédiaire d'un Buchner en porcelaine sous dépression légère. Les effluents conservent la coloration initiale. La carboxyméthylcellulose est alors lavée par une solution de sulfate d'ammonium de 9.000 micromhos à pH 5, puis par un tampon phosphate 0,05 M à pH 6,5, dans le but de déplacer des sulfates, jusqu'à obtention d'une solution incolore. La carboxyméthylcellulose est ensuite essorée. On ajoute ensuite à celle-ci un volume de tampon phosphate 0,5M égal au poids de tampon 0,05 M retenu dans la carboxyméthylcellulose essorée, à une température de 15-200C sous agitation. On ajoute ensuite un volume égal d'un tampon phosphate de sodium 0,29 M, puis d'un tampon phosphate 0,5 M, pour obtenir une molarité finale de 0,29M et un pH de l'ordre de 6,8 à 6,9. La température est alors ramenée à 6"C, la suspension est agitée pendant 30 minutes, la carboxyméthylcellulose étant ensuite essorée sur papier crêpé (sur Büchner) et lavée avec un tampon phosphate 0,29 M jusqu'à obtention d'une solution claire qui ne précipite pas au tanin. L'éluat et les lavages sont réunis pour former une solution purifiée d'urokinase contenant 80 à 90% de l'activité d'urokinase de la solution résultant de la réunion de l'effluent et des solutions de lavage obtenues au terme de la seconde chromatographie d'exclusion susdite. E) Dépyrogénation La solution purifiée obtenue, qui contient 65.000.000 u. CTA d'urokinase, est amenée à pH 3,5 et lurokinase est précipitée par du sulfate d'ammonium, à raison de 350 g de sulfate d'ammonium par litre d'éluat. On obtient 35g d'un précipité titrant au total 65 millions d'unités CTA en urokinase. Ce précipité est dissous dans 600 ml d'eau distillée stérile apyrogène, la solution obtenue présentant, à pH 3,8, une conductivité de 15.000 micromhos et une teneur en protéines de 2 mg/ml. Cette solution provoque dans le test pyrogène sur le lapin une hyperthermie de 0,9"C à la dose de 3.000 unités CTA/kg. On ajoute lentement sous agitation 258 ml de solution saturée de sulfate d'ammonium préalablement amenée à pH 4 et à 4"C. Le pH du milieu est amené à pH 3,8, agité pendant 15 minutes, puis laissé au repos pendant 15 minutes. Le léger précipité formé est recueilli par centrifugation à 10.000 g: on isole 5 g de précipité (fraction C). Le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pur cristallisé, à raison de 250 g/litre, agité pendant 30 minutes. Le pH du milieu est ensuite amené à 3 par addition de quelques gouttes d'acide sulfurique 2N. Le précipité formé est recueilli par centrifugation à 10.00C g et le surnageant est écarté: on obtient 25 g de précipité (fraction D). F) Résultats Le précipité de la fraction C est dissous dans 25 ml d'eau distillée stérile, apyrogène, et le pH est amené à 7 par de la soude O,lN. La solution obtenue est filtrée stérilement: son titre en urokinase est égal à 100.000 unités CTA/ml; Le précipité de la fraction D est dissous dans 150 ml d'eau distillée stérile, apyrogène. Le pH est amené à 7 par de la soude O,IN et la solution obtenue est filtrée stérilement. Son titre en urokinase est égal à 300.000 unités CTA/ml. Son activité spécifique sur protéine est de 43.000 unités CTA par mg de protéines. On est là encore amené à faire les mêmes observations que dans le cas précédent. On constate que la majeure partie des substances pyrogènes a été retenue dans la fraction C, tandis que la fraction D est exempte de substances pyrogènes selon les normes de la Pharmacopée Française, comme il ressort du tableau II ci-après établi dans des conditions semblables à celles relatées en rapport avec le tableau I. TABLEAU II Solutions ou Elévations de température dans chacun des lapins testés Fractions Série de Série de Valeur moyenne Valeur moyenne testées 3 lapins 8 lapins (3 lapins) (8 lapins) Solution initiale 1 1, 0 9, 0 8 0 9 3000 uCTA/kg Fraction C 0 9, 0 8, 0 8 0 8 3000 uCTA/kg Fraction D 0 1 0 , 0 1 0 , 0 , 0 , 0 3, 0 1, 0 1, 0 3, 0 0 07 0 1 15000 uCTA/kg Fraction D 0 , 0 , 0 , 0 , 0 1, 0 1, 0 3, 0 3 0 1 20000 uCTA/kg En suite de quoi on obtient un procédé de dépyrogénation, et également de concentration relative de l'urokinase vis-à-vis de sa teneur en protéinesi simple et particulièrement efficace, avec un rendement d'au moins 95% en activité urokinase, l'urokinase obtenue, apyrogène à des doses élevées, pouvant alors être administrée à des patients sans aucun effet secondaire à des doses de 150000 uCTA ou davantage en une seule injection par voie intraveineuse pour le traitement des affections susmentionnées, soit telle quelle, soit sous une autre forme, par exemple après transformation en héparinate dturokinase dans les conditions décrites dans la demande de brevet n" 71 34435 déjà citée. L'administration d'héparinate dcurokinase exempt de substances pyrogènes à 10 malades présentant des syndromes d'infarctus du myocarde plus ou moins avancés, à des doses répétées de 75.000 à 150.000 unités CTA a résulté dans tous les cas en une évolution rapide et favorable des syndromes observés dès les premiers jours du traitement. On donne ci-après les lignes principales de l'une de ces dix observations cliniques particulièrement typique relativement à l'action de l'héparinate d'urokinase exempte de substances pyrogènes. B.... Jean Louis, 44 ans, éducateur enfance inadaptée, est hospitalisé pour un syndrome prémonitoire d'infarctus du myocarde. I1 souffre depuis une semaine d'un mal angineux accompagné d'une hyperthermie. L'électrocardiogramme révèle une ischémie sous-épicardique étendue. Il reçoit par perfusion un traitement à base d'héparinate d'urokinase à raison de 75.000 unités CTA par heure pendant 24 heures, soit au total 1.850.000 unités CTA, d'héparine (30 mg toutes les deux heures) et du corticostérolde commercialisé sous la marque SOLUDECADRON. On observe sur le plan clinique une régression de l'hyperthermie et une disparition du syndrome angineux dès la 4ème heure du traitement. L'électrocardiographie révèle une évolution favorable rapide au cours des 24 heures du traitement. Au bout de 8 jours l'électrocardiogramme est de nouveau pratiquement normal. Sur le plan biologique on observe parallèlement une diminution rapide du taux de plasminogène, ce qui traduit une transformation rapide de celui-ci en plasmine, et une augmentation rapide des produits de dégradation de la fibrine, qui objective la lyse de la fibrine du caillot pathologique. Les séquelles qui subsistent chez le patient après sa convalescence sont à ce point réduites qu'il peut reprendre son travail. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes: on relèvera en particulier qu'à la place du sulfate d'ammonium on peut utiliser tout autre sel connu pour son aptitude à précipiter des protéines, tels que. par exemple, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, etc., étant entendu qu'il est nécessaire dans chaque cas, de déterminer au préalable le degré de saturation de la solution initiale en le sel considéré qui conduira à une précipitation de protéines dans les conditions susindiquées. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification d'une substance protéique à activité biologique, telle que l'urokinase, mélangée à des protéines étrangères, notamment pyrogènes, caractérisé en ce que l'on produit une saturation partielle d'une solution aqueuse de cette substance protéique avec un agent de précipitation de protéines jusqu'à un degré, fonction de la concentration initiale de la solution en protéines, tel que cette saturation partielle n'induise la précipitation que d'une partie des protéines contenues dans la solution initiale, cette partie étant suffisamment réduite pour que sa teneur en la substance protéique à activité biologique soit maintenue dans des proportions faibles prédéterminées, sinon pratiquement négligeables, et que l'on recueille le surnageant. 2. Procédé de purification d'une solution d'urokinase mélangée à des protéines étrangères et à des substances pyrogènes, caractérisé en ce que.l'on produit une saturation partielle de la solution aqueuse d ' u r o k i n a s e a v e c un agent de précipitation de protéines, jusqu'à un degré, fonction de la concentration initiale de l & solution en protéines, tel que cette saturation partielle n'induise la précipitation que d'une partie des protéines contenues dans la solution initiale, cette partie étant suffisamment réduite pour que sa teneur en urokinase soit maintenue dans des proportions faibles prédéterminées, sinon pratiquement négligeables, et que l'on recueille le surnageant qui contient l'urokinase. 3. Procédé de purification d'urokinase selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel l'agent de précipitation est constitué par du sulfate d'ammonium, caractérisé en ce que la saturation de la solution contenant l'urokinase à purifier ne dépasse pas une valeur pour laquelle le précipité formé entrarne- rait plus de 5% de l'activité totale en urokinase de la solution initiale. 4. Procédé de purification selon la revendication 3 dans lequel la concentration en protéines de la solution contenant l'urokinase à purifier est comprise entre 1,5 et 3 mg par ml, caractérisé en ce que l'on règle le pH de la solution à une valeur comprise entre 3 et 4,5 et la conductivité de cette solution à une valeur comprise entre 15.000 et 25.000 micromhos, que l'on détermine la valeur de la concentration en sulfate d'ammonium néces saire, compte tenu de la concentration initiale de la solution en protéines, à la formation dans cette solution d'un précipité contenant de 2 à S; de l'activité urokinase, que l'on ajoute à cette solution la quantité de sulfate d'ammonium nécessaire à l'obtention de la concentration ainsi déterminée et que l'on recueille le surnageant. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on ajuste la concentration de la solution en sulfate d'ammonium à la valeur correspondant à un degré de saturation de la solution égal à 0,3. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 5, caractérisé en ce que l'urokinase initiale a été obtenue à partir d'une urine humaine par l'intermédiaire d'un procédé qui comporte des opérations a) de traitement de l'urine humaine avec un adjuvant de filtration, tel que celui commercialisé sous la marque "Hyflosupercel"; b) de réextraction de l'urokinase et des protéines adsorbées de l'adjuvant de filtration; c) de relargage de l'urokinase contenue dans la solution d'extraction au moyen de sulfate d'ammonium; d) de dissolution du précipité obtenu dans une solution glucosée et dialyses de celle-ci jusqu'à obtenir une solution concentrée en urokinase brute dont la conductivité est comprise entre 15.00Q et 25.000 micromhos, de préférence égale à environ 22.000 micromhos; e) une première chromatographie d'exclusion effectuée sur cette solution à un pH compris entre 4 et 6 au contact d'une résine DEAE cellulose, prise de préférence en un poids compris entre 15 et 40 g par 10 millions d'unités CTA en urokinase; f) une seconde chromatographie d'exclusion effectuée sur la solution résultant de la réunion de l'effluent et des lavages de la résine de la première chromatographie d'exclusion après réglage si besoin du pH à une valeur comprise entre 6 et 7 de la conductivité de la solution à une valeur au moins égale à 15.000 micromhos, de préférence comprise entre 15.000 et 18.000 micromhos, à nouveau sur résine DEAE cellulose, celle-ci étant prise en un poids de 30 à 60 g, de préférence 40 à 53 g, par 14 millions d'unités CTA d'activité urokinase, la conductivité du milieu étant progressivement amenée jusqu une valeur de 9.000 micromhos; enfin soit g 1) une chromatographie d'adsorption sur carboxyméthylcellulose de l'urokinase contenue dans la solution résultant de la réunion de l'effluent et de lavages de la résine de la seconde chromatographie d'exclusion, à pH de l'ordre de 5, et élution de l'urokinase adsorbée sur la carboxyméthylcellulose avec un tampon phosphate à pH 6,8-6,9, scit g 2) une adsorption de la solution résultant de la réunion de I'effluent et de lavages de la seconde chromatographie d'exclusion sur kaolin à pH 6,2, élution de l'urokinase retenue sur le kaolin par une solution de chlorure d'ammonium dans de l'ammoniaque à 4, précipitation au sulfate d'ammonium et dialyse contre une solution de phosphate 0,05 M tamponnée à pH 6,2. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le surnageant est précipité avec un excès de l'agent de précipitation et le précipité est séparé par centrifugation. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le précipité est repris à pH 7 dans de l'eau distillée stérile et apyrogène.