Brevet FR2189021A1 — publié le 19740125

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Monsieur Pierre JOLLES et Madame Daniele MIGLIORE-SAMOUR, concerne un extrait hydrosoluble de mycobactéries, sa préparation et son emploi comme adjuvant immunologique. Certaines préparations mycobactériennes possèdent la propriété de simuler la formation des anticorps (J. Freund, Adv, Tuberc. Res., 7, 130 (1956)) mais présentent certains inconvénients comme l'induction de l'arthrite expérimentale chez le rat (B.H. Waksmann et coll., J. Immunol., 85, 4 003 (1960)). Parmi ces préparations peuvent être citées la "cire D" et les parois (R.G. White et Coll., fmmunology, 1, 54 (1958) ; R.G. White et coll., Immunology, 7, 158 (1964)). Dans ces différentes substances actives un polysaccharide (Poly) est lié à un peptidoglycane (PA). Plus particulièrement, une'bire D" de Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, est constituée d'une partie lipidique reliée par des liaisons esters à la partie -hydrosoluble Poly-PA. I1 est possible d'obtenir la partie hydrosoluble (Poly-PA) par des méthodes chimiques telles que la saponification (J. Asselineau, C.R. Acad. Sci., 2 229; 791 (1969)) ou l'acétylation (P.Jollès et coll., Immunology, 14, 159 (1968)). Toutefois ces parties hydrosolubles obtenues par des méthodes chimiques ne se montrente pas actives de façon régulière comme adjuvant immunologique. Ce comportement irrégulier est dû notamment aux modifications plus ou moins importantes occasionnées aux sucres. I1 a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que l'on peut obtenir, à partir de mycobactéries délipidées, par un traitement qui ne modifie pas les sucres, une partie hydrosoluble qui est douée d'une activité adjuvante et non arthrogène. La partie hydrosoluble (Poly-PA) selon l'invention possède les caractéristiques suivantes - aspect : poudre blanche pulvérulente (après lyophilisation) - composition a) en acides aminés (rapport moléculaire) : alanine (3), acide glutamique (2), acide , '-diaminopimélique (2) b) en sucres aminés ( rapport moléculaire) : N-acétylglucosamine (2), acide N-glycolylmuramique (2) ; présence de N-acétylgalactosamine c) en sucres réducteurs non aminés : arabinose, galactose présence de mannose d) en lipides : inférieure à 0,5 % -poids moléculaire (calculé sur la base de trois résidus alanine par molécule) : 14 000 t 2 000 - constante de sédimentation S20 (déterminée avec un appareil Beckman) : 2. Selon la présente invention, la partie hydrosoluble (Poly-PA) est obtenue par extraction douce (homogénéisation en milieu aqueux) des résidus bactériens délipidés de mycobactéries préparés selon la méthode de 1. Aebi et coll., Bull. Soc. Chim. Biol., 35, 661 (1953) suivie de relargages au moyen d'un sel tel que le sulfate d'ammonium, de centrifugations, de dialyses et de chromatographies successives. Ce procédé présente le double avantage, d'une part, d'utiliser des produits facilement accessibles (cellules délipidées) et, d'autre part, de ne pas nécessiter d'adjonction d'enzymes pour réaliser la lyse des cellules. Les mycobactéries qui peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont celles d'origine humaine ou non-humaine, virulentes ou non-virulentes chez lesquelles l'existence d'une "cire D" a pu être mise en évidence. Parmi les mycobactéries qui peuvent être employées peuvent être citées : Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis, var.bovis, souches LA et BB, etc. Le pouvoir adjuvant est déterminé chez le cobaye, souche Hattley, selon le principe de la méthode deR.G. White et coll., Immunology, 7, 158 (1964) et les pouvoirs arthrogène et protecteur selon les méthodes décrites par F. Bonhomme, C.R. Acad. Sci., série D, 263, 1 422 (1966) et C.R. Acad. Sci., série D, 265, 2 115 (1967). Les essais comparatifs entre la Poly-PA selon l'invention et les cires D" saponifiées ou acétylées montrent que : - la partie hydrosoluble (Poly-PA) selon l'invention possède le pouvoir adjuvant mais n'est pas arthrogène ni protectrice vis-àtvis d'une 'cire Dn arthrogène, - la partie hydrosoluble obtenue par saponification ne possède pas le façon régulière le pouvoir adjuvant ; les sucres étant plus ou moins modifiés ou détruits, - l'acétylation d'une cire D" d'origine humaine la prive de-son pouvoir arthrogène en lui conservant, atténué, son pouvoir adjuvant elle la rend "protectrice" vis-à-vis d'une "cire D" arthrogène administrée ultérieurement. Chez le cobaye, la Poly-PA selon l'invention provoque une augmentation du taux d'anticorps à des doses supérieures ou égales à 0,1 mg par voie intradermique. Le nouveau produit selon l'invention est utilisable en thérapeutique humaine ou vétérinaire pour favoriser la résistance aux infections d'origine virale ou bactérienne. I1 provoque une augmentation de la formation d'anticorps utiles contre les organismes pathogènes et il peut être adjoint à l'administration de vaccins pour assurer le maximum de réaction d'anticorps. La présente invention concerne également les compositions pkarmaceutiques qui contiennent la Poly-PA selon l'invention en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et éventuellement avec d'autres médicaments tels que des antibiotiques, des décongestifs et des vaccins. Dans ces compositions, la teneur en Poly-PA est généralement supérieure à 0,1 %. Ces compositions peuvent être utilisées par voie orale, rectale, parentérale ou en aérosols. En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché. Elles-peuvent être comprises entre 10 et 50 mg par jour pour un adulte. L'exemple suivant, donné à titre non Imitatif, illustre la présente invention. Exemple 100 g de résidus bactériens obtenus à partir de Mycobacterium tuberculosis var.hominis, souche Peurois, selon la méthode de A. Aebi et coll. sont broyés et homogénéisés dans 500 cm3 d'eau au moyen d'un broyeur (Ultra-Turrax). Après avoir agité pendant 5 heures à 200C et centrifugé pendant 30 minutes à 40C (4 000 tours/mn), la couche surnageante est chauffée à 800C. On ajoute alors du sulfate d'ammonium de façon à obtenir une solution à 40 % de la saturation. Après 12 heures à 40C et centrifugation pendant 30 minutes, on obtient un précipité (P40). A la couche surnageante on ajoute du sulfate d'ammonium de façon à obtenir une solution à 70 % de la saturation. Après 12 heures à 4"C et centrifugation pendant 30 minutes dans les mêmes conditions on obtient un précipité (P70). Les précipités P40, P70 et la dernière couche surnageante obtenue (S70) sont ensuite dialysés séparément contre de l'eau distillée. Les diverses solutions qui ne dialysent pas sont lyophilisées. On obtient ainsi 1,2 g de fraction P40, 1,4 g de fraction P70 et 0,9 g de fraction S70 qui contient la majeure partie de la substance biologiquement active. Cette dernière fraction est purifiée par chromatographie sur DEAE-cellulose équilibrée avec un tamponEhosphate 0,05 M à pH 7 en éluant avec un tampon au citrate de sodium 0,05 M à pH 3. On obtient ainsi 400 mg de Poly-PA purifiée. Après filtration sur Biogel P1O, en éluant avec de l'eau, on obtient 150 mg de Poly-PA hautement purifiée. La composition de la Poly-PA obtenue est determinée de la manière suivante - la composition en aminoacides et en aminosucres est déterminée au moyen d'un autoanalyseur (Type Technicon) après hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6 N à 1100C respectivement pendant 18 heures et 6 heures, - la composition en sucres neutres non aminés est déterminée, après hydrolyse par l'acide chlorhydrique 2 N pendant 2 heures à 11O0C, qualitativement par chromatographie sur papier (Whatman nO 1 solvant : butanol-pyridine-eau (6-4-3 en volumes)) et quantitativement sur un autoanalyseur-sucres (type Technicon), - la recherche des lipides est effectuée par chromatographie sur couche mince de gel de silice après hydrolyse totale et extraction à l'éther. La Poly-PA purifiée obtenue précédemment possède les caractéristiques suivantes - aspect : poudre blanche pulvérulente - composition : a) en acides aminés (rapport moléculaire) : alanine (3), acide glutamique (2), acideocrff '-diaminopimélique (2), en en sucres aminés (rapport moléculaire) : N-acétylglucosamine (2), acide N-glycolylmuramique (2) ; présence de N-acétylgalactosamine, c) en sucres réducteurs non aminés : arabinose, galactose ; présence de mannose, d) en lipides : inférieure à 0,5 % - la teneur en aminoacides est de 6,2 %, en aminosucres de 7-8 % et le reste est constitué par des sucres réducteurs non aminés. - poids moléculaire (calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule) : 14 000 + 2 000 - constante de sédimentation : 2 - spectre infrarouge, représenté en figure 1 -REVENDICATIONS1- Extrait hydrosoluble dé mycobactéries d'origine humaine ou non hymaine, virulentes ou non-virulentes chez lesquelles l'existence d'une cidre D" peut être mise en évidence, caractérisé en ce que - il contient de l'alanine, de l'acide glutamique et de l'acide Ce ,ct'-diamino-pimélique dans le rapport moléculaire 3-2-2, de la N-acétylglucosamine et dé l'acide N-glycolymuramique dans le rapport moléculaire 2-2, de la N-acétyl-galactosamine, du galactose, de l'arabinose et du mannose, - son poids moléculaire (calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule) est 14 000 + 2 000, - sa constante de sédimentation S20 est 2 - il est doué d'une activité adjuvante immunologique et n'est pas arthrogène. 2- Extrait hydrosoluble selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient 5 à 8 % d'amino acides 6 à 9 % d'amino sucres 83 à 88% de sucres réducteurs non aminés moins de 0,5 % de lipide. l'une queconque des l'une queconque des 3- Procédé de préparation de l'extrait selon revendicationsl & 2 caractérisé en ce que l'on extrait par homogénéisation en milieu aqueux des résidus bactériens délipidés de mycobactéries et isole le produit obtenu par relargages, centrifugations, dialyses et éventuellement chromatographies successives. 4- Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la mycobactérie utilisée est Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, souche Peurois. 5- Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'on effectue, après homogénéisation en milieu aqueux et centrifugation, deux relargages au moyen de sulfate d'ammonium suivis chacun d'une centrifugation, puis dialyse contre de l'eau distillée le surnageant obtenu, chromatographie sur colonne et isole l'extrait hydrosoluble actif. 6- Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient l'extrait selon i'une quelconque des revendications 1 et 2 en présence de tout fluant ou adjuvant compatible.