Brevet FR2183710A1 — publié le 19731221

La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de la daunomvcine et se rapporte en particulier a la synthèse chimique de cet antibiotique par réaction entre le daunomycinone et la daunosamine. La daunomycine et son chlorhydrate ont eté décrits et revendiqués dans le brevet britannique nO 1 003 383 de la demanderesse. La daunomycine répond a la formule suivante et elle possède une activité antileucémique et antitumorale notable. Selon la méthode décrite dans le brevet ci-dessus, la daunomycine est produite par fermentation, en presence du microorganisme S. peucetius. Dans le bouillon de fermentation, il se forme, à côté de la daunomycine, une quantité notable de daunomycinone qui, n'etant pas actif , reste inutilisée. On a récemment découvert un procéde de préparation d'un tel composé par voie synthétique (Wong et al., Canad. Chem. 49, 2712, 1971). La daunosamine a été synthétisée, sous sa forme racémique, (brevet japonais n" 18962/66 et sous les deux formes L-daunosamine (Marsh et al., Chem. Comm., 973, 1967) et D-daunosamine (Richardson Chem. Comm., 627, 1965). La demanderesse a établi qu'en faisant réagir la daunosamine et le daunomvcinone, on obtient la daunomycine a l'état très pur avec un bon rendement. Le daunomycinone qui a pour formule est dissoute dans un solvant anhydre, par exemple le dioxanne, et est ensuite ajoutee a un dérivé de la daunosamine de formule dans laquelle R est un radical trifluoroacetyle, trichloroacétyle, tribromo 1 acétyle, dichloroacétyle ou dibromoacétyle et R2 est un atome d'hydrogène ou un groupement acyle comportant de 1 à 4 atomes de carbone; on additionne au mélange obtenu du chlorure de méthylène acidifié par un hydracide halogéné 0,3N, l'acide chlorhydrique par exemple, et enfin agite le tout, à l'abri de la lumière et de l'humidité. On suit le cours de la reaction en prélevant toutes les 24 heures un échantillon du mélange et en l'analysant par chromatographie sur couche mince (CCM) sur gel de silice avec pour éluant le mélange chloroforme/acetone (4:1). Le daunomycinone et le produit qui se forme au cours de la réaction ont un Rf respectif de 0,60 et 0,35 dont'l'observation est relativement facile. Après 286 heures, la concentration de ce produit est de 50%; on filtre alors le mélange et dissous le résidu dans le chloroforme; la solution obtenue est purifiée sur colonne de chromatographie.Le produit obtenu est recristallisé dans le tétrahydrofuranne et on obtient un produit cristallisé rouge dont le Pf est de 169-170"C et dont l'identification peut être faite par spectrophoto métrie IR, UV, visible et RMN; on peut attribuer à ce produit la formule suivante Le produit ainsi obtenu peut être ensuite dissous dans de la soude diluée; on maintient cette solution durant une heure a température ambiante puis on lui fait subir une extraction à l'aide de CHCl3 à pH 8,5-; l'extrait est concentré puis on l'additionne d'une solution de méthanol chlorhydrique. On obtient le chlorhydrate de daunomycine qu'on compare à un échantillon témoin de l'antibiotique. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de l'exemple non limitatif suivant. EXEMPLE 400mg de daunomycinone (I) sont dissous dans 35mQ de dioxanne anhydre; on ajoute 69 d'agent déshydratant (exemple : tamis moléculaire type 4A de Merck), 490mg de di[N-trifluoroacétyl-a daunosaminei (II) dont la température de fusion 23 Pf est de 149-15Q0et dont EaJ D = -138" (c 0,4 dioxanne) et enfin 1 mt d'acide chlorhydrique 0,3N dans le chlorure de méthylène. On agite à l'abri de la lumière et de l'humidité pendant 24 heures a temperature ambiante. On ajoute toutes les 24 heures, l mz d'acide chlorhydrique 0,3N dans le chlorure de méthymène, en continuant l'agitation dans les conditions décrites.On suit le cours de la réaction en prélevant des échantillons toutes les 24 heures et en'les analysant par chromatographie sur couche mince et gel de silice, en utilisant comme gluant le mélange chloroforme-acetone (4:1). Ce solvant (I) et le produit (III) qui se forme ont respectivement un Rf de 0,60 et 0,35. Les deux bandes sont eluées avec de l'acétone et les solutions sont évaporées sous vide. On reprend le résidu avec de l'alcool méthylique puis on détermine par spectrophotométrie le contenu de la solution en (I) et (III). Le cours de la réaction peut se résumer de la manière suivante (I) (III) 48 heures 97,5% 2,5% 72 " 95 X 5 % 96 " 90 % 10 % 138 " 75 % 25 % 186 " 60 % 40 % 260 " 52 % 48 % 286 " 50 % 50 % A ce stade, le melange réactionnel est filtré; on lave le désséchant à l'aide de chloroforme et réunit le filtrat et les solutions de lavage puis effectue une concentration sous vide. Le résidu est dissous dans le chloroforme et purifié sur colonne de gel de silice en suspension dans le chloroforme. Par élution avec de l'acétate d'éthyle contenant 5% de chloroforme, on obtient 200mg de I (50%) alors qu'avec l'acétate d'éthyle, contenant 15% de chloroforme, on obtient 200mg de III (32%). Ce dernier, recristallisé dans un mélange de tétrahydrofuranne-hexane donne des cristaux aciculaires rouges, dont la tempé rature de fusion Pf est de 169-1700C et dont |a| ai 2030 est de +230 (c 0,09 CHCl3) La comparaison des spectres UV et visible, IR (dans le KBr) et RMN (dans CDCl3) et le point de fusion du mélange de III avec la N-trifluoroacetyl daunomycine naturelle (obtenue par N-trifluoroacétylation du glucoside naturel) ont permis d'attribuer a III la structure indiquee.Enfin, à partir d'une solution de 100mg de III dans 200ma de soude 0,1N, que l'on maintient durant une heure à temperature ambiante et porte a pH 8,5 par addition d'acide chlorhydrique 0,5N puis après concentration de l'extrait et addition de la quantité stoechiométrique d'acide chlorhydrique 1N dans le méthanol, on obtient 70mg de daunomycine sous forme de chlorhydrate cristallisé (IV) dont Pf = 188-1890C et lal 23 +2400 (c 0,01 méthanol). Ce dernier a été identifié par ses caracteristiques physico-chimiques (point de fusion en mélange, comportement chromatographique, spectres UV, vis., IR et RMN) et son activité biologique, par comparaison avec un echantillon témoin de l'antibiotique daunomysine sous la forme de son chlorhydrate. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à l'exemple donné ci-dessus, elle est susceptible de nombreuses autres variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagêes et sans s'ecarter pour cela de l'esprit de l'invention. REVENDICATION Procédé de préparation de la daunomycine et de son chlorhydrate, caractérisé en ce que le daunomycinone de formule (I) dissout dans un solvant approprié anhydre, par exemple le dioxanne, est addi tionné a un dérive de la daunosamine de formule (II) en ce que le mélange est acidifie et maintenu, à température ambiante sous agitation, à l'abri de la lumière et de l'humidité, en ce que le produit de formule (III) qui se forme est ensuite filtré, purifié et recristallisé, et en ce que le produit obtenu est ensuite traité par de la soude aqueuse diluée, à température ambiante, porte à un pH de 8,5, puis subit une extraction à l'aide de chloroforme et une concentration qui conduisent a la daunomycine obtenue sous forme de base libre qui peut être isolée telle quelle ou transformée en son chlorhydrate par traitement avec un équivalent d'acide chlorhydrique dans le méthanol.