Brevet FR2193652A1 — publié le 19740222

L'invention concerne un dispositif et un procédé de mise en oeuvre de réactifs biologiques, tels que les enzymes et les hormones, dans l'industrie et au laboratoire , et plus précisément un dispositif de traitement de diverses solutions de substrat par un réactif biologique fixé, par mise en oeuvre de turbulence locale dans la solution et à proximité du réactif de manière que le contact mutuel soit maximal. L'utilisation de la catalyse enzymatique, au laboratoire et dans l'industries est limitée par le prix élevé de la purification des enzymes et par les problèmes d'élimination de l'enzyme du produit final. L'élimination de l'enzyme et des agents de contaminatin associés, lors de l'utilisation de préparations brutes, d'un système réactionnel homogène (enzyme et substrat solubles) nécessite habisuellement une précipitation par chauffage, une acidification ou une addition d'un solvant organique puis, une centrifugation ou une filtration. La récupération de l'enzyme pour une utilisation ultérieure est impossible en raison de 11 instabilité de la molécule enzymatique. Le procédé de l'invention évite ces inconvénients, par fixation des molécules d'enzymes sur un support insoluble qui permet l'isolement facile de enzyme du produit final et sa réutilisation. Ls enzymes, à l'état naturel et bien organisé de métabolites fonctionnels inclus dans les structuras cellulaires, sont fixées de la même façon. Cette hypothèse est suggérée par exemple par les travaux de E.S. Kempner et J.H.Miller décrits dans "Experimental Cell Researcbtt Vol. 51, page 150 (1968), qui mettent en évidence que les enzymes intra-cellulaires des algues sont associées aux organites celft-laires L'article de A.Bar-Eli et E. Kalchalski publié dans "Nature" Vol. 158, page 856 (1960) sur i'insolubilisation de la trypsine a accru l'intérêt porté à ce problème. G.Eay dans "Process Biochemistry", volume 3 (8), page 36 (1968j et I.H Silman et E.Kalchalski dans "Annual Review cf Biochemistry", Volume 35, page C5 , pulsé par "Annual Review Incorporated't, Palo Alto, Califcpia 1966), récapitule les premiers travaux et problèmes à e sujet. Les enzymes sont des protéines dont la structure particulière est caractéristique, qui ont une activité catalytigue, c'est-à-dire qui provoquent la variation de la structure chimoque d'une molécule de substrat sans que leurs molécules elles-mEmes soient modifiées définitivement. Les protéines com prennent au moins une channe d'acides aminés, c' est-à-dire une chaîne polypeptidique. Le nombre et la séquehce des acides aminés (environ 20 acides aminés différents) déterminent la structure et les caractéristiques fonctionnelles de la molécule de protéine. La configuration de la molécule enzymatique active dépend d'interactions non-covalentes,c'est-à-dire de liaisons hydrogène entre les chaînes d'acides aminés et entre ces chat- nes et le solvant.Le pH , la concentration en ions, la composition du solvant, la température et les autres solutés jouent également un roule dans cette structure. La structure de enzyme active comporte au moins un site actif dont la configuration spatiale est exactement complémentaire de celle de la molécule de substrat. Cette correspondance,analogue à celle d'une clef et de sa serrure, explique la plage très limitée des substrats sur lesquels une enzyme donnée agit. Le degré de spécificité varie avec les différentes enzymes; dans de nombreux cas, une enzyme n'agit que sur un seul substrat; dans d'autre cas, elle peut agir sur un certain nombre de matières étroitement apparentées. Cette spécificité et une activité élevée, c' est-à-dire la capacité d'une molécule d'enzyme à agir sur une très grande quantité de molécules de substrat, très rapidement, confèrent aux enzymes une importance potentielle dans le traitement chimique. Au cours des douze dernières années, on a mis en évidence la possibilité de stabilisation de nombreuses enzymes et de leur fixation sur un support insoluble, sans blocage du centre actif; Les principaux procédés de fixation sont 1) L'adsorption - Ce procédé ntest pas très satisfaisant en raison de tendances à la désorption 2) L'inclusion - La molécule d'enzyme est enfermée ou emprisonnée dans un réseau de gel dont les pores sont trop petits pour laisser sortir l'ensyme, mais suffisamment grands pour laisser entrer les molécules de substrat et laisser sortir le produit final. 3) La formation de liaisons covalentes - Dans ce cas, il se forme une liaison chimique entre la molécule d'enzyme et la molécule de support, mais cette liaison ne concerne pas le site actif. Ce procédé est actuellement le plus utilisé 4) La réticulation - Les molécules d'enzymes sont liées les unes aux autres par des liaisons covalentes et forment un réseau au sein de polymères insolubles avantageux et autour de ceux-ci. L'efficacité des enzymes fixées dépendant du nombre de sites actifs accessibles au substrat, le véhicule qui supporte l'enzyme doit avoir une surface spécifique maximale. Les enzymes fixées sont donc généralement utilisées sous forme par ticulaire Les particules peuventttre utilisées sous forme de lit fixe que la solution de substrat traverse, par exemple dans une colonne continue ou sur un filtre-entonnoir. Ces particules peuvent également titre dispersées, par agitation, dans la solution de substrat, puis récupérées par centrifugation, filtration ou décantation.S.P. 0'Neil,P. Dunnill et M.D. Lilly dans 1,Biotechnology and Bioengineering", vol. 13, page 337 (1971),comparent l'efficacité d'un réacteur à lit garni et d'un réacteur sous agitation continue, dans le cas d'une amyloglucosidase fixée par liaison covalente à de la cellulose DEAE. K.L. Smiley, dans "Biotechnology and Bioengineering",vol 15, page 309 (1971) décrit la transformation continue d'amidon en glucose sous l'action d'une glucoamylase fixée et dans un réacteur sous agitation et montre que les colonnes ne sont pas satisfaisantes, car le temps de séjour nécessaire à la transformation souhaitée du substrat est trop long et le complexe de cellulose et d'enzyme se tasse très fortement et s'oppose à l'écoulement. M.J.Grove, G.W. Strandberg et K.L. Smiley, dans "Biotechnology and Bioengineering", vol. 13, page 7C9 (1971) décrivent une fixation satisfaisante, par liaison covalente, entre une enzyme modificatrice des stéroïdes et des billes de verre, ce procédé permettant un meilleur débit que les autres. L'activité, c'est-à-dire le nombre de moles de substrat transformées par mole d'enzyme et par minute, exprime la vites se de la catalyse enzymatique. La constante de Michaelis indi que l'effet de la concentration du substrat sur la vitesse de la réaction; c'est une constante cinétique dont dépend la vi tesse de forntioIi et de disparition du complexe intermédiaire enzyme-subtrat, dans les conditions optimales. Ces facteurs sont caractéristiques de l'enzyme et dépendent des conditions d'étude. Dans le cas d'enzymes fixées, le passage dc la molécule de substrat au niveau du site actif est un autre facteur très important limitant la vitesse de la réaction. G. Kay dans "Process Biochemistry", vol. 3, " 8, page 36, (1968), donne deux facteurs limitant la diffusion: l'un d' eux concerne la présence d'une pellicule liquide autour des particules dispersées au sein de ce liquide et l'autre concerne la dimension des pores, le debit étant proportionnel à la puissance 4 du rayon du pore. L'invention concerne un procédé qui favorise le passage du substrat au niveau du site actif de l'enzyme. Le dispositif et le procédé de l'invention présentent trois avantages importants dans lsapplicati*Qn pratique des réactions biologiques, comme les catalyses enzymatiques: 1) Le réactif biologique, par exemple une enzyme, est fixé sur une pellicule déposée sur un support par l'un des procédés connu , l'enzyme ou le système enzymatique étant ainsi facile à isoler du produit final. 2) Le dispositifs convient à une production continue ou non. 3) La matière qui porte l'enzyme active est fixée à des déflecteurs qui créent des turbulences favorisant le contact entre le substrat et l'enzyme. Le dispositif de l'invention comprend un récipient allongé qui a un orifice d'entrée et un orifice de sortie. Au centre de ce récipient, se trouve un axe entraîné par un moteur et au- quel sont fixés des disques réactifs. Le diamètre de ces disques est un peu plus petit que le diamètre intérieur du récipient. Des chicanes fixes, minces et solides, sont fixées sur la paroi intérieure du récipient. Ces chicanes sont percées en leur centre d'un orifice de diamètre légèrement supérieur à celui de l'axe. Lorsque la solution de substrat pénètre dans le réacteur par l'orifice d'entrée, elle s'écoule contact intime avec le disque réactif rotatif, à la périphérie des disques et vers le centre, cor ltlmposent les chicanes, mais toujours en contact intime avec le disque réactif rotatif.. Au niveau de l'axe, la solution de substrat passe dans l'orifice ménagé entre la chicane et l'axe et s'écoule de nouveau le long du disque réactif suivant. La répétition de ce cycle, lorsque la solution s'écoule dans le dispositif, dure jusqu'à ce que la solution de substrat transformé quitte ce dispositif par l'orifice de sortie. Les disques réactifs comportent un support poreux auquel est fixée une enzyme ou un système enzymatique fixe accessible, ou dans lequel est inclus cette enzyme ou ce système enzymatique. Le disque plat de support du catalyseur. porte sur ses deux faces, auxquelles elles sQnt étroitement associées, des déflecteurs poreux dont l'épaisseur est teile que la paroi verticale des pores forme un déflecteur qui perturbe l'écoulement laminaire de la solution de substrat. La turbulence locale ainsi créée à la surface du disque de support favorise notablement la réactinn biologique. Les parois déflectrices qui durcissent et maintiennent à plat le support de l'enzyme peuvent titre en toile de métal ou de fibres de verre rigides, de "Nylon" ou mame de matière plastique. La vitesse à laquelle la solution de substrat est pompée dans le réacteur règle le taux de conversion. Les réactifs biologiques fixés utilisés dans le procédé de l'invention sont des enzymes ou des hormones qui jouent un- rible dans une réaction biologique, mais qui ne sont pas incorporées au produit de cette réaction. L'invention convient particulièrement aux enzymes fixées, mais elle n'est pas limitée à celles-ci ni mtme aux enzymes. La forme particulière du réactif biologique fixé n'est pas déterminante. L'invention sera décrite plus en détail en regard du dessin annexé à titre d'exemple nullement limitatif, et sur lequel la figure 1 est une coupe longitudinale d'un mode de realisatio avantageux du dispositif de l'invention; la figure 2 est une coupe transversale selon la ligne 2-2 de la figure 1, au niveau d'un disque réactif; et la figure 5 est une perspc'.ctiv éclatée du disque de 'a figure 2. la figure i représente un mode de réalisation préféré du dispositif destiné a la production de turbulences locales et à l'amélioration du contact entre un réactif biologique fixé et une solution de substrat. Le dispositif 1 comprend un récipient 3 allongé qui comporte un orifice 5 d'entrée à se partie inférieure et un orifice 7 de sortie à s partie supérieure. La solution de substrat pénètre par orifice 5, s'écoule dans le récipient 3 et quitte celui-ci par l'orifice 7. Au centre du récipient 3 se trouve un axe longitudinal 9 qui tourne. Líaxe 9 porte plusieurs disques il réactifs, espacés les uns des autres. Les disques i tournent avec l'axe 9 dans le récipient. Les disques 11 sont les supports du réactif biologique fixé. Plusieurs chicanes 13 fixes sont solidaires de la paroi intérieure du récipient 3. Ces chicanes 13 sont percées en leur centre et laissent passer l'axe 9. Le diamètre du trou central des chicanes 13 est suffisamment grand pour que l'axe 9 tourne librement. Les chicanes 13 et les disques il sont alternés régulièrement le long de l'axe. Un moteur 14 entraîne l'axe 9. Selon ce mode de réalisation, le récipient 3 est un cylindre dont l'axe longitudinal est vertical. Nais, selon d'autres modes de réalisation, le récipient peut avoir toutes les configurations possibles de révolution. Les disques 11 et les chicanes 13 sont dans un plan perpendiculaire à l'axe longi- tudinal au récipient 5. L'orifice central des chicanes 13 est suffisamment grand pourvue la solution de substrat puisse sté- couler entre l'axe 9 et la limite des chicanes 13. D'autres modes de réalisation de l'invention peuvent être tels outils permettent l'utilisation dans une position autre que la position verticale, par exemple dans la position horizontale. La silure 2 montre que tous les disques 11 tournent autour de l'axe 9 dans le récipient 3. Le contour extérieur du disque ji correspond au contour intérieur du récipient 3, en coupe , et l'espace entre le disque il et la paroi intérieure du récipient 3 laisse le passage à la solution de substrat. La figure 2 rie montre pas la chicane 15. Sur la figure 3, chaque disque il comprend un disque 15 poreux de support du réactif biologique fixé, par exemple d'une enzyme fixée, et deux déflecteurs 17 poreux Un des déflecteurs 17 est placé d'un cOté du disque 15 et l'autre, de l'autre coté, et l'ensemble est fixé sur l'axe 9. Les disques 15 peuvent être en toile de matière plastique. Les déflecteurs 17 poreux peuvent titre en toile métallique. Le réacteur biologique fixé peut entre une enzyme, par exemple une lactase, et la solution de substrat peut être le lait ou un produit dérivé du lait La glucoamylase qui hydrolyse l'amidon convient également bien. Une hélice propulsive (non représentée) peut également titre fixée à l'axe. 9 pour l'amélioration de 11 écoulement de la solution de substrat dans le récipient 5. On utilise le dispositif représenté sur le dessin comme décrit ci-après : plusieurs disques 15 poreux portent un réactif biologique fixé, par exemple une enzyme. Chacun des disques 15 qui porte le réactif biologique fié, est compris entre deux déflecteurs 17 poreux. Une solution de substrat s'écoule le long des ensembles constitués par les déflecteurs et les disques poreux. Lorsque la solution de substrat s'écoule le long de ces dispositifs, l'écoulement laminaire de la solution est perturbé par les déflecteurs 17 poreux qui provoquent la formation de turbulence locale àla surface de chacun des disques 15, et rendent ainsi maximal le contact entre le réactif biologique fixé et la solution de substrat.La rotation des dispositifs constitués par les déflecteurs 17 et les disques 15, tandis que la solution de substrat s'écoule le long de ces dispositifs, augmente encore la formation locale de turbulence . L'écoulement de la solution de substrat est provoqué par pompage de cette solution dans le récipient 3 par orifice 5. La vitesse de 11 écoulement de la solution de substrat le long des déflecteurs 17 et des disques 15 est réglée par la vitesse de pompage de cette solution, au niveau de l'orifice 5. La solution de substrat est pompée par 1'- orifice 5 dans le récipient 3. Elle s'écoule le long de la face inférieure du premier disque 11,puis, elle le traverse et passe entre la partie extérieure de celui-el et la paroi intérieure du ré copient. Ensuite, la solution s'écoule Je long de la face horizontale supérieure de ce premier disque 11, entre celui-ci et la première chicane 13, la solution s'écoulant alors vers l'axe 9.Elle passe ensuite par Itorifice central de la pre mère chicane 15, autour de l'axe 9 et atteint la face infé- rieure du deuxième disque il Elle s'écoule le long de la face inférieure de ce deuxième disque, vers sa périphérie et le processus se répète jusqu'à ce qu'elle atteigne la partie supérieure du récipient 3 d'où elle sort par l'orifice 7. Le réactif, par exemple une enzyme, peut être fixé à l'intérieur ou à la surface d'un support qui est insolllble dans le substrat à traiter. Le support peut être une membrane semi-perméable et le réactif est alors inclus dans la membrane semi-perméable par un procédé convenable. Le brevet allemand N" 1 227 855 décrit, par exemple, des procédés de ce type. Une membrane semi-perméable est une pellicule ou une membrane de polymère linéaire, c'est-à-dire non réticulé, qui est perméable à des composés de poids moléculaire faible mais imperméable à des composés macro-moléculaires comme les protéines. En général, ces pellicules ou membranes ont des pores dont le diamètre moyen a une dimension comprise entre celle des particules de bas poids mcléculaire et celle des composés macro-molécula-ires. La taille réelle des pores n'est pas déterminante. En fait, le rapport de la dimension des pores de la membrane à celle des molécules de réactif est le facteur important. La dimensinn des pores doit être inférieure à celle des molécules de réactif, pour que celui-ci soit retenu dans la membrane.Par ailleurs, la dimension des pores doit être suffisante pour laisser passer le substrat sur lequel le réactif agit. En général, les membranes dont les pores ont des diamètres compris entre 20 et 60 Angströms environ conviennent. Le polymère de la membrane doit être soluble dans des solvants relativement volatils, dans des conditions dans lesquelles le réactif est stable, mais insoluble dans le substrat à traiter. En outre, le polymère doit être inerte, c'est-à-dire qu il ne doit réagir ni avec le réactif, ni avec le substrat. Les pclyr.-Jeres qui conviennit sont connus et sont utilisés pour la fabrication de merlbranes de dialyse Ces polymères sont, par exemple, des dérivés de cellulose tels que la cellophane, la cellulose régénérée et des esters tels que l'acétate de cellulose et le coton partiellement nitré ou pyroxylune, le cellulose et les colloion, des protéines comme le collagène, des polymères vinyliques,en particulier les esters vinyliques comme le polyméthacrylate de méthyle et analogues. Le collodion est avantageux. Le réactif est introduIt dans la membrane semi-permea- ble par dispersion et dissolution dans une solution de polymère filmogène. Le solvant du polymère n1 est pas déterminant, pourvu qu'il soit inerte, c'est-à-dire qu'il ne réagisse pas avec le polymère ou avec le réactif enzymatique, et qu'il soit relativement volatil, c'est-à-dire qu'il puisse'8tre évaporé dans les conditions dans lesquelles le réactif est stable, de préférence à la température ambiante.Le solvant particulier choisi dépend, évidemment, du polymère, mais les éthers volatils, par exemple l'éther diéthylique, les cétones, par exemple l'acétone, les hydrocarbures chlorés, par exemple le 1,2-di- chloro éthane et analogues et leurs mélanges conviennent généralement. Le solvant peut également être un solvant du réactif, mais ce n'est pas indispensable. La concentration du polymère dans la solution n'est pas déterminante, pourvu que celle-ci ntait pas une viscosité suffisante pour empêcher la répartition uniforme du réactif dans le polymère, ou s'opposer au mode particulier d'application et, pourvu en outre, que la quantité de solvant soit suffisante pour la dissolution éventuelle du réactif. Cependant,il est avantageux de ne pas utiliser plus de solvant qu'il n'est nécessaire pour que le temps de séchage soit minimal. En général, les solutions qui contiennent 10 à 50% en poids de polymère conviennent. De même, le rapport du réactif au polymère n'est pas très déterminant pourvu que la quantité de réactif soit suffisante polaque la membrane ou la pellicule obtenue ait l'activité nécessaire et que la quantité de polymère suffise à la formation d'une matière de support autour du réactif. En général, il est avantageux que la membrane contienne au moins 0,3 à 1 million d'un tés de réactif par gramme de polymère qui forme la membrane. On applique la suspension ou la solution de réactif, de polymère et de solvant sur une surface convenable sur laquelle il se forme une pellicule d'épaisseur voulue, normalement de l'ordre de 10 microns à i mm et on évapore le solvant. Si on doit utiliser le film tel quel, on le coule sur un support non-ahésif, par exemple de verre, et on le détache d support lorsqutil est sec. Selon une variante, on peut extruder la solution de polymère qui contient le réactif dans un bain de coagulation, selon des procédés connus. La pellicule est avantageusement utilisée sur un support et la solution qui contient le réactif peut être aéposée directement sur celui-ci. Par exemple, la solution peut être appliquée sur une toile de matière inerte, par exemple de '!Nylon" puis séchée. Les spécialistes connaissent bien toutes les formes possibles de support. Cependant, les supports les plus avantageux sont ceux comme les toiles, qui rendent maximale la surface spécifique de la membrane. Le produit fini comprend une membrane dans la- quelle la toile est incluse. Il va de soi que la présente invention a été décrite ci-dessus à titre purement indicatif, mais nullement limitatif, et que l'on pourra lui apporter toutes modifications de détail conformes à son esprit sans sortir de son cadre. RER7i;'5lDICATfO' S i - Dispositif destiné à la production de turbulences locales et à l'amélioration du contact entre un réactif biologique fixé et une solution de substrat, du type qui comprend un récipient allongé ayant un orifice d'entrée et un orifice de sortie par lesquels la solution de substrat sté- coule, un axe central longitudinal et un dispositif d'entrai- nement de cet axe dans le récipient, dispositif caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, plusieurs disques de support des réSotifs biologiques fixés, portés par l'axe à une certaine distance les uns des autres et tournant avec celuici, et plusieurs chicanes fixes, disposées dans le récipient et fixées à ses parois intérieures, chacune de ces chicanes d'écoulement étant percée en son centre dlun trou suffisamment large pour le passage de l'axe et sa rotation libre, les chicanes d'ccoulement et les disques réactifs étant alternés régulièrement les uns par rapport aux autres. 2 - Dispositif selon la revendication i, caractérisé en ce que le disque réactif comprend un disque de support poreux, un réactif biologique fixé sur ce support et deux déflecteurs poreux placés de part et d'autre du disque de support e 3 - Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le support poreux est une toile de matière plastique. 4 - Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les déflecteurs poreux sont des toiles métalliques. 5 - Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le réactif biologique fixé est une enzyme, par exemple la lactase ou la glucoamylase. 6 - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce quel'orIfice central des chicanes d'écoulement est suffisamment large pour que la solution de substrat s'écoule entre l'axe et la limite intérieure des chicanes. 7 - Dispositif selon la revendication i, caractérisé en ce que le récipient allongé est cylindrique et en ce que son axe longitudinal est vertical, orifice d'entrée étant disposé à sa partie inférieure et ltorifice de sortie a' sa partie supérieure. 8 - Dispositif selon la revendication 1, csractérisé en cc que les dictes réactifs et les chicanes d'écoulement sont dans un plan perpendiculaire à l'axe longitudinal du réci- pient et en ce que le contour extérieur des disques réactifs correspond au contour intérieur du récipient ailongé , en coupe I'espace entre le disque réactif et la paroi intérieure du ré cipient allongé étant te' que la solution de substrat peut s'y écouler. 9 - Dispositif selon la revendication i, caractérisé en ce qu il comprend en outre une hélice fixée sur l'axe et qui amliore l'écoulement de la solution de substrat dans le récipient. 10 - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l?axe est entraîné par LUI moteur. il - Procédé de production de turbulences locales et d'augmentation du contact entre un réactif biologique fixé et une solution de substrat dans un dispositif qui comprend un récipient allongé ayant un orifice d'entrée et un orifice de sortie, un axe, plusieurs disques réactifs fixés sur cet axe et plusieurs chicanes fixes dtécoulement, procédé caractérisé en ce qu'il comprend la fixation du réactif biologique sur plusieurs disques poreux qui contiennent chacun le réactif biologique fixé entre deux déflecteurs poreux , 11 écoulement d'une solution de substrat à la surface de 1? ensemble constitué par les déflecteurs et les disques poreux, et la pertur- bation de 11 écoulement laminaire de la solution de substrat par les déflecteurs poreux qui provoquent la formation locale de turbulence à la surface des disques de support. 12- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en outre par la rotation de ltensemble formé par les déflecteurs et les disques pendant l'écoulement de la solution de substrat, augmentant la formation locale de turbulences. 15 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en outre par le réglage,par une pompe, dc la vitesse à laquelle la solution de substrat s'écoule le long des déflecteurs poreux et des disques. 14 - Procédé de production locale de turbulences et d'a.néitoration du contact entre un réactif biologique fixé et une solution de substrat dans un dispositif qui comprend un récipient allongé ayant un orifice d'entrée et un orifice de sortie, un axe, plusieurs disques réactifs fixés sur cet axe et plusieurs chicanes fixes d'écoulement, procédé caractérisé en ce qu'il comprend le pompage de la solution de substrat par l'orifice d'entrée, dans le récipient d'un dispositif destiné à la production des turbulences locales, l'écoulement de la solution de substrat le long de la face inférieure du premier disque réactif, vers la périphérie de ce disque à travers le disque et entre son contour extérieur et la paroi intérieure du récipient, le long de la face supérieure du premier disque réactif, entre celui-ci et la première chicane fixe d'écoulement, en direction de 1 axe, par l'orifice central de la première chicane d'écoulement entre celle-ci et l'axe, et le long de la face inférieure du deuxième disque réactif, vers la périphérie de ce disque, et la répétition de l'écoulement décrit jusqu'à ce que la solution de substrat atteigne la partie supérieure du récipient et en sorte par l'orifice.