Brevet FR2193029A1 — publié le 19740215

La présente invention concerne un procédé pour précipiter des solutions concentrées de protéase dans lequel, pour éviter des pertes d'activité, on stabilise la protéase par addition de lactaîbumine et/ou de poudre de lait écrémé. Parmi les nombreux procédés connus pour purifier les protéases, le procédé par passage sur échangeur d'ions a donné les meilleurs résultats. A cet effet, après addition de produits auxiliaires usuels, on filtre la solution souillée-par des colorants et d'autres impuretés, par exemple un bouillon de fermentation contenant de la protéase, on dilue le filtrat et on adsorbe sur un échangeur d'ions. Après lavage de l'échangeur et élution de la protéase à l'aide d'une solution saline ou d'une solutinn tampon, on obtient une solution concentrée d'enzyme, très pure. Mais cette solution concentrée de protéase est instable ; à la conservation, mais surtout lors de la précipitation industrielle habituelle à l'aide de sulfate de sodium, elle subit une désactivation importante.On a donc cherché à éliminer ou à limiter dans la plus grande mesure possible cette désactivation qui se produit au cours des traitements. On a déjà décrit des procédés pour stabiliser des protéases en solution aqueuse à faible teneur en enzyme. Ainsi, selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3 296 094, on utilise pour stabiliser des solutions aqueuses d'enzymes protéolytiques un collagène hydrolysé et solubilisé et de la glycérine. Cependant, ce procédé exige des quantités de glycérine tellement fortes que, pour cette seule raison, il ne peut être utilisé pour stabiliser des solutions de protéases à précipiter. La même observation s'applique au procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3 095 358 et selon lequel la stabilisation est effectuée à l'aide de sorbitol.D'autre part, on a déjà proposé pour stabiliser des solutions diluées d'enzymes protéolytiques des adjonctions de propylène glycol, de diéthylène glycol, de polyéthylène glycol, d'alcools inférieurs, d'éthers-alcools inférieurs, de dialkylformamides, de tétrahydrofuranne, de dioxanne et d'acétone. Des essais effectués avec les agents stabilisants -décrits antérieurement pour les solutions diluées d'enzymes protéolytiques ont montré que ces agents ne convenaient pas pour la stabilisation d'une solution concentrée de protéase obtenue par purification sur échangeur d'ions et qui, à la suite de la purification, doit être précipitée. Parmi les agents stabilisants connus, le diéthylène glycol seul a manifesté un effet stabilisant exploitable, mais,lorsqu'on l'utilise aux proportions suffisantes pour provoquer la stabilisation, il suscite des difficultés à la précipitation de l'enzyme. Lorsqu'on précipite de la manière habituelle la protéase par le sulfate de sodium à partir de l'éluat concentré, on obtint en présence de diéthylène glycol des précipités gélatineux et que, pratiquement, on ne peut plus filtrer.De sorte que, finalement, les procédés connus pour stabiliser les solutions diluées d'enzymes protéolytiques ne peuvent pas être exploités pour résoudre le présent problème, à savoir stabiliser les solutions concentrées de protéases au cours de leurs transformations industrielles. La demanderesse a maintenant trouvé quuon pouvait stabiliser et précipiter des solutions aqueuses concentrées de protéase d'une manière très satisfaisante lorsqu'on ajoutait aux solutions, en tant qu'agents stabilisants, de la lactalbumine et/ou de la poudre de lait écrémé et qu'on précipitait l'enzyme à chaud par addition d'un sel, en particulier par addition de sulfate de sodium. Les protéasesauxquelles on peut appliquer le procédé selon l'invention, sont obtenues en général à partir de mycètes et de bactéries. En principe, on peut également appliquer le procédé à d'autres enzymes protéolytiques provenant d'origines végétales et animales, mais en raison des propriétés différentes et du comportement particulier de ces produits, il exige des modifications spéciales. Les enzymes protéolytiques à activité relativement forte auxquelles on peut appliquer le procédé selon l'invention sont obtenues par culture de micro-organismes d'espèces variées, par exemple des souches des espèces Fusarium, Giberella, Streptomyces, Aspergillus, Penicillium, Cytophage, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas et Bacillus. Le procédé présente un intérêt particulier dans la stabilisation et la précipitation de protéases alcalines telles que les aminopeptidases, les carboxypeptidases, les kératinases, les élastases, les aspergillopeptidases, les subtilisines et les enzymes analogues. Le domaine d'application préféré du procédé selon l'invention consiste cependant en la stabilisation et la précipitation de solutions alcalines de protéases obtenues à partir de solutions de fermentation de cultures des espèces Bac il lus subtilis et Bacillus licheniformis et qu'on a purifiées et concentrées sur échangeurs d'ions. Au cours du traitement de ces solutions de fermentation provenant de cultures de Bacillus subtilis ou de Bacillus licheniformis, la protéase contenue dans la solution filtrée ou centrifugée, laquelle est encore souillée de colorants et d'autres impuretés, est adsorbée sur des échangeurs d'ions. On peut utiliser à cet effet des échangeurs de cations de types variés, par exemple à base de résines acryliques, de résines méthacryliques, de polymères modifiés par des groupes acide sulfonique, par exemple de polystyrène modifié par des groupes acide sulfonique, de carboxyméthylcelluloses traitées spécialement, etc.La solution concentrée de protéase obtenue, après lavage de l'échangeur, par élution à lrtide d'une solution de sel ou d'une solution tampon, est additionnée de lactalbumine ethos de poudre de lait écrémé. La quantité d'agent stabilisant à utiliser se situe dans les limites de 2 à 20 %, de préférence de 5 à 15 % du poids de la solution concentrée de protéase à stabiliser.La précipitation de la protéase à partir de ces solutions stabilisées est réalisée en pratique par relargage à l'aide par exemple de chlorure de sodium, de sulfate d'ammonium, de chlorure de calcium et plus particulièrement à l'aide de sulfate de sodium, à tiède, aux environs de 35 à 40"C. Dans ce type de précipitation, il subsiste en règle générale dans les liqueurs mères moins de 0,5 % de l'activité ; de sorte que la forte diminution d'activité qu'on observe lors de la précipitation de solutions de protéases non stabilisées doit être attribuee à la désactivation de l'enzyme au cours de la conservation en solution concentrée et au cours de l'opération de précipitation. Alors que dans les solutions de protéases non stabilisées ou additionnées des agents stabilisants de la technique antérieure, on observait un recul d'activité dans la solution et une diminution de la quantité d'enzyme active précipitée représentant du 1/3 à la moitié environ de l'activité initiale, l'adjonction des agents stabilisants selon l'invention permet de conserver l'activité presque en totalité ; même dans les conditions les plus défavorables, le recul d'activité est inférieur à 10 %. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter ; dans ces exemples, les indications de parties et de % s'entendent en poids sauf mention contraire. EXEMPLES. On part d'une solution de culture de protéase obtenue par culture d'une espèce Bacillus subtilis, filtrée et diluée ; on l'adsorbe sur un échangeur de carboxyméthylcellulose réticulée à pH 6,0 (tampon phosphate) et on élue à l'aide d'un tampon de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,0. La solution concentrée de protéase obtenue, qui présente une activité de 33,5 millions d'unités de protéase par litre est conservée pendant 20 heures à une température de 37"C en plusieurs échantillons sans agent stabilisant et avec des agents stabilisants variés. A l'expiration de cette période, on mesure l'activité résiduelle dans chaque échantillon et on l'exprime en % de l'activité initiale. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après.Les proportions ajoutées des divers agents stabilisants sont rapportées en Z du poids de la solution concentrée de protéase. TABLEAU I Activité résiduelle, 7 de l'acti Agent stabilisant ajouté vité initiale, au bout de 20 h de conservation à 37:C Essai témoin sans stabilisant 54 0,2 % de caséine Hammersten 50 1 % de gélatine alba 52 10 % d'acétate de sodium 58 10 % de diéthylène glycol 66 20 Z de diéthylène glycol 90 10 % de D-glucose 56 5 7 de lactalbumine 92 10 % de poudre de lait écrémé 100 Les résultats rapportés dans le tableau I montrent clairement l'excellent effet stabilisant de la poudre de lait écrémé et de la lactalbumine ; cet effet ne peut être approché que par le diéthylène glycol en fortes proportions. Cependant, l'utilité d'un stabilisant ne peut pas être jugéeuniquement par l'efficacité dans la solution ; il existe d'autres facteurs importants : les effets sur la précipitation de l'enzyme, aussi bien relativement à la perte d'activité que relativement à la perfection dela précipitation et à la filtrabilité du précipité.Pour étudier le comportement des divers agents stabilisants dans les conditions de la précipitation, on a ajouté à des échantillons des solutions concentrées de protéase ci-dessus, présentant une activité initiale de 33,5 millions d'unités de protéase par litre, sans agent stabilisant et avec adjonction de stabilisants variés, 25 % de sulfate de sodium anhydre par rapport à la solution concentrée de protéase, sous agitation et à une tem.perature d'environ 37-400C ; au bout de 20 à 30 mn, on a filtré le précipite La protéase solide a été déshydratée par lyophilisation. Pour controler 15 perfection de la précipitation, on a mesuré l'activité résiduelle dans les liqueurs mères. Pour apprécier les pertes d'activité à la précipitation, on a déterminé les quantités et les activités des produits solides obtenus et cn les a rapportées en 7 à l'activité initiale dela solution précipitée. On a obtenu les résultats rapportés dans le tableau II ci-après. Ici encore, les proportions ajoutées des divers stabilisants sont rapportées en % du poids de la solution concentrée de protéase. L'activité trouvée dans les liqueurs mères qui constitue une mesure de la perfection de la précipitation, est donnée en 7 de l'activité initiale. T A B L E A U II Agent stabilisant Activité des liqueurs Rendement en enzyme mères, té mère, 7 de l'acti- sèche précipitée, ajouté vité de l'éluat % de la quantité d'acti vité dans l'éluat coacéntré Essai témoin sans additif 0,5 -~ 65 10 7 de diéthylène glycol 10 - ~ 68 -mauvaise filtration 20 % de diéthylène glycol précipité gélatineux infiltrable 10 % de D-glucose 0,8 62 5 % de lactalbumine 0,3 93 10 % de poudre de lait écrémé 0,4 98 Les résultats rapportés dans le tableau II montrent que, lors de l'opération de précipitation, l'effet stabilisant de la lactalbumine et de la poudre de lait écrémé est supérieur à celui du diéthylène glycol, qui est d'ailleurs exclu en raison des mauvais résultats observés à la précipitation. On a procédé à des essais analogues à ceux décrits ci-dessus sur une solution de culture de protéase obtenue par culture d'une variété de Bac il lus licheniformis, souche P 300 (demande de brevet allemand n P 20 63 988.7 de la demandresse) et qu'on a traitée comme décrit ci-dessus. La solution concentrée de protéase présente une activité initiale de 36 millions d'unités de protéase par litre. Les résultats obtenus dans ces essais sont rapportés dans le tableau III ci-après, avec les memes règles que pour le tableau I. T A B L E A U III Agent stabilisant ajouté Activité résiduelle, 7 de l'activité initiale, au initiale, au bout de 20 h de repos à 370C Essai témoin sans stabilisant 60 10 % de diéthylène glycol 65 20 % de diéthylène glycol 87 10 % de D-glucose 62 5 % de lactalbumine 97 10 % de poudre de lait écrémé 100 Les essais de précipitation effectués sur la solution de protéase dérivant de Bac il lus licheniformis, souche P 300, donnent les résultats rapportés dans le tableau IV ci-après. T A B L E A U IV Rendement en enzyme sèche Agent stabilisant Activité des liqueurs Rendement en enzyme sèche mères, % de l'acti- précipitée, % de la quantité ajouté mères, 7 d'activité dans l'éluat vité de 1'éluat concentré Essai témoin sans 0,6 62 stabilisant 0,6 62 10 % de diéthylène glycol 7 74 20 % de diéthylène glycol - précipité gélatineux non filtrable 10 7 de D-glucose 1,5 65 5 7 de lactalbumine 0,5 94 10 7 de poudre de lait 0,4 écrémé 96 Ces résultats confirment l'activité supérieure de la lactalbumine et de la poudre de lait écrémé dans la stabilisation de solutions alcalines de protéases au cours de la conservation et de la précipitation de l'enzyme. La détermination de l'activité protéolytique des protéases dans la solution concentrée, dans la matière sèche précipitée, et la mesure des activités résiduelles ont été effectuées selon un procédé mis au point par les laboratoires de la firme Henkel et Cie GmbH, DUsseldorf, et décrit en détail dans la revue "Tenside", 7ème année, nO 3 (1970) pages 125-132. Le principe de cette méthode est décrit brièvement ci-après On fait agir l'enzyme ou le produit enzymatique dans une eau de 26,80 français de dureté et en présence de tripolyphosphate de sodium, dans des conditions déterminées, sur de la caséine étalon. On interrompt la réaction par addition d'acide trichloracétique et on précipite la caséine non dégradée. Après filtration, on mesure l'extinction du filtrat comparativement à un échantillon à blanc dans lequel la dégradation enzymatique a été inhibée par addition préalable d'une quantité suffisante d'acide trichloracétique. L'extinction mesurée, provoquée par les fractions aromatiques (en particulier la tyrosine) des produits de dégradation solubles dans l'acide trichloracétique dilué, sert de mesure de l'activité enzymatique. Pratiquement, on mesure l'extinction du filtrat de l'échantillon au maximum à 275 microns comparativement à l'échantillon à blanc sous une épaisseur de couche de 1 cm. De l'extinction trouvée, on déduit la valeur mesurée à 300 microns. La différence AE sert dans la formule à calculer l'activité en unités de protéase (UP) par gramme de la préparation enzymatique. Cette soustraction de fond sert à éliminer au mieux possible l'influence éventuelle de troubles différents dans l'échantillon et dans l'échantillon à blanc. L'activité en unités de protéase par gramme de la préparation enzymatique est calculée par l'équation suivante : UP/g = ÂE x facteur de dilution/épaisseur de couche (cm) x 20 ; le facteur de dilution est le quotient du volume de la solution d'enzyme préparée, en ml, par le poids de ltéchantillon en g. L'unité d'activité enzymatique est définie par la règle suivante : une préparation enzymatique possède une activité de protéase de 1 000 unités lorsqu'une solution de 1 g de la préparation d'enzyme dans 100 ml provoque une différence d'extinction de 0,500. L'avantage du procédé selon l'invention réside principalement en ce qu'il permet de préparer avec de très bons rendements une protéase bien purifiée et à haute activité par précipitation des éluats concentrés d'échangeurs d'ions. REVENDICATIONS 1. Procédé pour stabiliser et précipiter des solutions aqueuses concentrées de protéases, le procédé se caractérisant en ce que lton ajoute aux solutions, en tant qu'agents stabilisants, de la lactalbumine et/ou de la poudre de lait écrémé et en ce que l'on précipite l'enzyme à chaud par addition d'un sel, en particulier de sulfate de sodium. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise l'agent stabilisant en proportions de 2 à 20, plus spécialement de 5 à 15 7 du poids de la solution concentrée de protéase à stabiliser. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on stabilise et précipite des solutions de protéasesalcalines. 4. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les solutions de protéases traitées snnt des solutions de fermentation de Bacillus subtilis purifiées et concentrées sur échangeur d'ions. 5. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les solutions de protéases traitées sont des solutions de fermentation de Bacillus licheniformis purifiées et concentrées sur échangeur d'ions.