Brevet FR2177628A1 — publié le 19731109

L'invention, qui est due aux travaux de Monsieur Henri POURRAT et à laquelle a participé Madame Frençoise REGERAT, a pour objet un peptide thérapeutiquement actif. Elle vise également un procédé de préparation de ce peptide par extraction à partir d'échinops spinosus, composée connue sous le nom de Teskra qui est répandue au sud du pourtour méditerranéen. Le peptide conforme à l'invention est un composé qui se présente sous la forme de cristaux blancs fondant à environ 230 C et répondant à la formule brute (C4H7O4N)n, dans laquelle n est supérieur à 5 Le procédé de préparation conforme à l'invention du susdit peptide est caractérisé par le fait que l'on soumet une masse végétale broyée de Teskra, de préférence constituée par les sommités florales, à un ensemble de traitements comprenant successivement, - une extraction à chaud à l'aide d'un solvant non polaire, notamment l'éther de pétrole, le chloroforme, le chlorure de méthylène, le benzène, - une extraction à chaud à l'aide d'un solvant alcoolique, notamment méthanol et le méthanol - la distillation du solvant alcoolique et la reprise de l'extrait alcoolique avec de l'eau désionisée à chaud - la séparation des pigments fannEues,zdwmsent pr acidificationJ --pH amené vers 3 à 3,5-- de ltextrait aqueux qui est maintenu à une température légèrement supérieure à 00C pendant une durée suffisante pour provoquer la précipitation desdits pigments flavoniques qui sont alors séparés, - la neutralisation du filtrat puis - ou bien un passage sur une colonne de résine échangeuse de cations, le principe actif se retrouvant dans l'élut de cette dernière, - ou bien une évaporation, une lyophilisation cu une nébulisation du filtrat et une extraction du principe actif à l'aide d'un solvant organique, notamment le méthanol et l'éthanol. On a trouvé que le peptide conforme à l'invention, obtenu notamment par mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, présente d'intéressantes propriétés thérapeutiques, en particulier hypotensives, vasoconstrictrices, spasmolytiques et muscu lotropes. L'invention a donc également pour objet des médicaments, notamment des médicaments hypotenseurs, vasoconstricteurs, spasmolytiques et musculotropes, caractérisés par le fait que dans leur substance active ils contiennent une quantité efficace du peptide conforme à l'invention. Elle vise, mises à part les susdites dispositions, encore d'autres dispositions qui s'utilisent de préférence en même temps et dont il sera plus explicitement question ci-après. Et elle pourra, de toute façon, être bien comprise à l'aide du complément de description qui suit et qui est relatif à des modes de réalisation avantageux de l'invention. Selon l'invention- et, plus spécialement, selon ceux de ses modes d'application, ainsi que selon deux des modes de réalisation de ses diverses parties, auxquels il semble qu'il y ait lieu d'accorder la préférence, se proposant d'établir des médicaments du genre en question, on s'y prend comme suit ou de fa çon analogue. On utilise en tant que composé thérapeutiquement actif un peptide qui se présente sous la forme de crista- blancs fondant à environ 230"C et répondant à la formule bru' sC404H74 . On sait que n > 5 , mais on on ne peut dons une valeur plus précise étant donné que les peptides même cristallisés sont fréquemment constitués d'un mélange de plusieurs polymères différents. Le susdit peptide est extrait d'une composée, l'échinops spinosus, souvent désignée par le nom vulgaire de Teskra qui le contient puncipalement dans les sommités florales. Ce sont ces sommités florales que, de préférence, on hache et broie, par exemple à l'aide d'un broyeur à couteaux (les sommités possédant une partie externe élastique, ce qui nécessite un hachage et un broyage), de façon à obtenir des fragments de taille suffisamment petite pour l'extraction à laquelle la masse végétale broyée est ensuite soumise, cette extraction comprenant un certain nombre d'étapes opératoires dont il va être question. Tout d'abord, on procède à une extraction de la masse végétale broyée en ayant recours à un solvant non polaire. Ce solvant est choisi, de préférence, dans le groupe comprenant les éthers de pétrole, le chloroforme et le chlorure de mé thylène. Cette extraction est pratiquée à chaud, de préférence à une température voisine de la température d'ébullition du solvant choisi, donc de l'ordre de 40 à 650C, pendant une durée suffisante pour extraire les stérols, les esters de stérols et certains pigments. La fin de cette extraction est mise en évidence en procédant périodiquement à la pesée du résidu d'évaporation de prises de 20 ml du milieu. Lorsque le poids du résidu est inférieur à quelques milligrammes (limite variable suivant le degré d'extraction retenu qui doit être compatible avec une exploitation industrielle), on arrête l'extraction. Dans la pratique, la durée est de l'ordre de 2C heures, les quantités de solvant utilisé par kg de matière végétale broyée étant souvent de 11 ordre de 12 litres, cette quantité pouvant varier suivant les caractéristiques de l'extracteur utilisé. A l'issue de cette première extraction, le solvant est chassé par distillation à la pression ordinaire et la masse végétale ainsi traitée est soumise à une seconde extraction, également à chaud, cette fois-ci à l'aide d'un solvant alcoolique, propre à retirer de la masse broyée notamment le peptide recherché. Le solvant préféré est l'éthanol aqueux, mais on peut également utiliser d'autres solvants, par exemple le méthanol. La température de mise en oeuvre de ce solvant est de préférence voisine de sa température d'ébullition et le titre du solvant est choisi à la fois assez élevé pour ne pas extraire une trop grande quantité de constituants hydrosolubles inactifs et gênants, et assez faible pour permettre la dissolution de la totalité du peptide recherché. Dans le cas de l'éthanol, on utilisera de préférence un titre d'environ 85 à 90O Le moment où la totalité du peptide a été extraite est repéré, par exemple, par l'essai consistant à faire réagir le résidu d'évaporation de quelques millilitres de solvant avec une solution de ninhydrine . L'absence de coloration violette indique la fin de la réaction. En général, la durée de l'extraction, variable avec le dispositif d'extraction et le solvant choisis, est de l'ordre de 20 à 30 heures. A titre de variante, il est aussi possible de traiter la masse végétale broyée tout d'abord par un solvant alcoolique et de traiter ensuite l'extrait alcoolique --après avoir chasse le solvant alcoolique-- à l'aide du susdit solvant non polaire. Cette variante donne toutefois de moins bons résultats, elle est plus longue que l'autre et les composés à éliminer forment fréquemment des complexes. Ceci étant, l'extrait alcoolique obtenu à l'issue de la deuxième extraction de la susdite première variante est concentré par distillation du solvant alcoolique et le résidu -- en général de l'ordre de 80 g pour une quantité de 1 kg de masse végétale broyée-- est traitée par de l'eau désionisée à chaud. De préférence, la température de l'eau désionisée est de l'ordre de 90 à 1000C. La quantité d'eau mise en oeuvre est proportionnelle à la quantité de résidu et, par voie de conséquence, à la quantité de masse végétale broyée. En général, il y a lieu d'avoir recours à environ 1 litre d'eau désionisée pour environ 80 g de résidu, la mise en contact de l'eau désionisée et du résidu étant poursuivie pendant suffisamment longtemps pour que la totalité du peptide recherché présent dans le résidu soit dissoute. Dans la pratique, il suffit de maintenir le contact pendant environ une heure. La solution aqueuse obtenue contient, outre le peptide recherché, des impuretés constituées, d'une part par des pigments de type flavonique, et d'autre part par des sels minéraux. On élimine tout d'abord les pigments flavoniques. Pour ce faire, on acidifie la solution aqueuse et on abaisse sa température à une valeur légèrement supérieure à 00C pendant une durée suffisante pour provoquer la précipitation desdits pigments. De préférence, l'acidité à laquelle on amène la solution correspond à un pH de 3 à 3,5 et la température à laquelle elle est amenée est de l'ordre de 4 à 60C. Elle est maintenue à cette température généralement pendant 24 à 48 heures. Pour déterminer le moment où cette purification est terminée, on peut procéder à un contrôle basé sur la diminution d'intensité de la réaction de Wilson au réactif citroborique avec dosage au spectrophotomètre à 410 nm. Ainsi, on considère que la purification est terminée lorsqu'une quantité d'environ 40 mg de résidu d'évaporation de la solution aqueuse donne, après la réaction de Wilson, une densité optique D.o. Le précipité de pigments est ensuite éliminé par filtration et le filtrat est traité en vue de la récupération du peptide recherché. Deux possibilités s'offrent pour cette récupération qui consiste en fait à éliminer les sels minéraux inactifs et gê- nants, notamment du chlorure de potassium, qui sont passés en solution aqueuse en même temps que ledit peptide Suivant une première possibilité, on fait passer la susdite solution aqueuse sur une colonne échangeuse de cations. Le peptide recherché, qui est adsorbé sur la résine cationique, peut être élué à l'aide d'eau distillée désionisée de pH 7. L'éluat est ensuite évaporé et le résidu, qui est constitué par le susdit peptide, est recristallisé dans l'méthanol Pour fixer les idées, on signale que de bons résultats ont été obtenus en utilisant comme résine cationique celle qui est connue sous la marque AMBERLITE IR 120. Suivant une deuxième possibilité, la solution aqueuse acide débarrassée des pigments flavoniques est évaporée, lyophilisée ou nébulisée, le résidu ainsi obtenu (il est en général de l'ordre de 4,8 g pour 100 ml de solution) étant repris par du méthanol bouillant qui dissout la totalité du peptide recherché et le minimum d'impuretés. Le méthanol utilisé est du méthanol pur titrant 99 . Il est possible de remplacer le méthanol par de méthanol. Dans la pratique, on a recours à plusieurs extractions méthanoliques successives, la quantité totale de méthanol mise en oeuvre correspondant à vingt à trente fois le poids de résidu à traiter. Par exemple, on peut procéder à deux extractions successives, la première étant effectuée avec une quantité de méthanol correspondant à quinze fois le poids de résidu, et la seconde avec une quantité de méthanol correspondant à dix fois le poids de résidu Les solutions méthanoliques sont ensuite réunies et évapo rées, ce qui fournit le peptide recherché. L'expérience montre que le procédé selon l'invention permet de récupérer la plupart du temps au moins environ 600mg de peptide par kg de masse végétale broyée. Pour illustrer le susdit procédé, on donne ci-après un exemple numérique de mise en oeuvre. Exemple Une quantité de 5 kg de sommités florales de Teskra est hachée et broyée de manière à obtenir une poudre grossière. Celle-ci est extraite à l'ébuliition,pendant 20 heures environ, par 60 litres de chloroforme dans un extracteur en continu. Après élimination du solvant, la poudre est extraite à l'ébullition, pendant 30 heures environ, dans le même extracteur par un volume identique d'méthanol à 85 La distillation de la solution éthanolique laisse un résidu de 400 g, soit 80 g par kilo de matière végétale mise en jeu. Ce résidu est repris,par 5 litres d'eau désionisée amenée à pH 7, pendant une heure à une température voisine de l'ébullition. Pendant cette opération, on agite le liquide par intermittence pour faciliter la dissolution. Après refroidissement à la température du laboratoire, on décante le liquide surnageant et le liquide décanté est ensuite filtré. La solution aqueuse liquide est amenée,par de l'acide chlorhydrique pur, à un pH compris entre 3 et 3,5. Pendant l'addition d'acide chlorhydrique,on maintient une agitation au sein de la solution. On abandonne ensuite cette solution pendant 48 heures environ au réfrigérateur. Le précipité formé est éliminé par filtration et le pH est amené au voisinage de 7 en utilisant d'abord la lessive de soude,et pour terminer une solution de soude à 10 %. On fait passer cette solution sur une colonne de résine échangeuse de cations (Amberlite I.R. 120). On utilise un volume de 200 ml de résine par litre de solution. La colonne est ensuite éluée par l'eau distillée de pH 7. L'éluat, évaporé sous vide, laisse un résidu à partir duquel, après dissolution dans de méthanol à 960 à l'ébullition, on fat cristalliser le peptide recherché. On amorce la cristallisation par addition -d'un peu d'eau à la solution alcoolique. On obtient 3 g environ de peptide. Ceci étant, on rappelle qu'il a été possible de trouver que le peptide conforme à l'invention, notamment obtenu à l'aide du susdit procédé, présente des propriétés thérapeutiques intéressantes. Ces propriétés, à savoir les activités hypotensive , vasoconstrictrice, spasmolytique et musculotrope, ont été mises en évidence à l'aide des expérinces pharmacologiques qui vont être décrites. En ce qui concerne tout d'abord l'action hypotensive artérielle, elle a été étudiée sur le lapin selon la technique de J. GAUTRELET. La préparation, administrée par voie veineuse, entraîne une hypotension objectivée proportionnelle à la dose administrée. Cette action est voisine de celle développée par l'acétylcholine ; elle est environ deux à trois fois moins intense. Cette action ne s'accompagne d'aucune modification respiratoire. Les résultats d'essais effectués sur des groupes de cinq lapins fauve de BourQogne, d'un poids compris entre 2,8 et 3,1 kg sont réunis dans le Tableau I. TABLEAU I Produit essayé Peptide Acétylcholine selon l'invention Dose par voie i.v. 0,6 mg 1 mcg par kg Hypotension 4,5 5,0 4,0 4,6 (lue sur le tracé, 4,4 5,0 exprimée en cm) 4,5 5,0 4,5 4,9 L'étude des effets vasoconstricteurs a été faite par perfusion des vaisseaux de l'oreille du lapin selon la technique de SAVINI E.C. La préparation présente un effet vasoconstricteur très net à des doses comprises entre 7,5 mg et 15 mg par kilo. Le tracé obtenu est comparable à celui que l'on obtient après injection de noradrénaline. L'action du produit parait plus durable que celle de la noradrénaline. Les effets spasmolytique et musculotrope ont été mis en évidence sur le duodénum isolé de rat selon les techniques de MAGNUS et de COHEN. A des doses variables mais relativement faibles, la préparation possède un effet contracturant sur le duodenum isolé de rat. L'étude de la toxicité du peptide selon l'invention a été faite par voie orale et par voie intrapéritonéale chez la souris. Par voie orale, des doses de 2,50 g par kg d'animal n'ont entrainé aucune mort. Par voie intra-péritonéale, ces mêmes doses n'ont provoqué aucune mortalité. On peut donc conclure l'absence totale de toxicité à des doses bien supérieures aux doses thérapeutiques. Compte tenu de ce qui précède, le peptide conforme à l'invention peut être utilisé en tant que substance active de formes pharmaceutiques. L'action hypotensive artérielle est particulièrement intéressante, car elle est obtenue à des doses très éloignées des doses qui pourraient être toxiques. D'autre part, comme cette action n'est accompagnée d'aucune modification respiratoire, on peut envisager l'application de ce peptide au traitement de nombreux types d'hypertension. Il est particulièrement intéressant de souligner que cette action hypotensive n'est pas due à une vasodilatation puisqu'elle est accompagnée d'un effet vasoconstricteur très net du type noradrénaline. Il peut donc s'agir d'un hypotenseur d'origine centrale et ces types d'hypotenseurs sont particulièrement recherchés. Etant donné l'effet hypotenseur associé à l'effet vasoconstricteur veineux, on pourra utiliser le susdit peptide dans le traitement des troubles veineux, notamment dans le traitement des varices et, également, dans celui des hémorroïdes, puisqu'on a, à la fois, une action vasoconstrictrice sur les vaisseaux et une diminution de la tension. L'activité spasmolytique musculotrope peut être mise à profit dans les cas où un effet contracturant du duodénum est recherché pour le traitement de certaines hypertensions. Etant donné l'absence pratique de toxicité du peptide selon l'invention, il peut être utilisé comme hypotenseur pour des traitements de longue durée, associé éventuellement à- des hypotenseurs à action rapide, mais dont la toxicité et les effets secondaires limitent l'emploi dans le temps. Pour le traitement des différents troubles veineux, en particulier varices et hémorroides, l'administration du peptide devant être continuée pendant un temps variable mais de l'ordre de quelques semaines, on aura surtout recours à une forme d1adminis- tration par voie orale. Une forme injectable est également prévue Pour l'utilisation per os, le peptide conforme à l'invention sera administré par exemple sous forme de gouttes, comprimés, gélules et ampoules buvables. L'administration du produit à travers la peau est également prévue, des formes pharmaceutiques correspondantes étant des pommades, gels et solutions. Ep ce qui concerne les doses posologiques unitaires et quotidiennes en substance active, elles pourront être respectivement choisies de l'ordre de 10 mg en ce qui concerne la dose unitaire en administration par voie orale et de l'ordre de quelques dizaines de milligrammes en ce qui concerne la dose quotidienne. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement indiqués ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Peptide thérapeutiquement actif, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme de cristaux blancs fondant à environ 2300C et répondant à la formule brute (C4H7CaN)n, dans laquelle n est supérieur à 5. 2 Procédé de préparation d'un peptide thérapeutiquement actif, caractérisé par le fait que l'on soumet une masse végétale broyée de Teskra, de préférence constituée par les sommités florales, à un ensemble de traitements comprenant - une extraction à chaud à l'aide d'un solvant non polaire - une extraction à chaud à l'aide d'un solvant alcoolique, - la distillation du solvant alcoolique et la reprise del'extrait alcoolique dans de l'eau désionisée à chaud, - l'élimination des pigments flavoniques - la neutralisation du filtrat, puis un passage sur une colonne de résine échangeuse de cations, le principe actif se retrouvant dans l'éluat de cette dernière. 3. Procédé de préparation d'un peptide thérapeutiquement actif, caractérisé par le fait que l'on soumet une masse végétale broyée de Teskra, de préférence constituée par les sommités florales, à un ensemble de traitementscomprenant : - une extraction à chaud à l'aide d'un solvant non polaire, - une extraction à chaud à l'aide d'un solvant alcoolique, - la distillation du solvant alcoolique et la reprise de l'extrait alcoolique dans de l'eau désionisée à chaud, - l'élimination des pigments flavoniques, - la neutralisation du filtrat, puis une évaporation, une lyophilisation ou une nébulisation du filtrat-et une extraction du principe actif à l'aide d'un solvant organique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait - que l'extraction à chaud à l'aide d'un solvant non polaire est effectuée avec l'un des solvants du groupe comprenant l'éther de pétrole, le chloroforme, le chlorure de méthylène et lebenzène, - que l'extraction à chaud à l'aide d'un solvant alcoolique est réalisée avec de méthanol ou du méthanol - que l'élimination de pigments flavoniques est réalisée par acidification de l'extrait aqueux obtenu à l'issue de l'étape précédente, l'extrait acidifié étant maintenu à une température légèrement supérieure à 00C pendant une durée suffisante pour provoquer la précipitation desdits pigments. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que lors de l'acidification subséquente, le pH est amené vers 3-3,5 et que l'extrait aqueux acidifié est maintenu à une température de 4 à 6"C pendant 24 à 48 heures. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait que l'ordre des extractions par solvant non polaire et par solvant alcoolique est inversé. 7. Peptide thérapeutiquement actif, caractérisé par le fait qu'il présente les propriétés de celui obtenu à l'aide du procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 60 8. Médicament, caractérisé par le fait qu'il comprend dans sa substance active une quantité efficace d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 7. 9. Médicament hypotenseur, vasoconstricteur, spasmolytique et musculotrope, caractérisé par le fait qu'il comprend dans sa substance active une quantité efficace d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 7. 10. Médicament selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il se présente sous une forme pharmaceutique administrable par voie orale, la dose posologique unitaire en substance active étant de l'ordre de 10 mg.