Brevet FR2201074A1 — publié le 19740426

l'invention concerne un procédé pour l'obtention d'un antibiotique a pigent inconnu jusqu'à maintenant doue de Dropr-e- ts cancérostatieues, virostatiques et ayant notamment des effets nouveaux et surprenants contre les différents avents pathogènes des infections mycoplasmiques qui est désigné sous le nom de violamycine. Contre les tumeurs et les maladies provoouées par des virus chez l'homme et chez les animaux domestiques, il n'existe que peu de moyens ou des moyens insuffisants. Un inconvénient reconnu est le fait que les traitements utilises en chimiotherapie contre les affections mycoplasmiques n'ont pas n'effet bactéricide sur les agents pathogènes. Le but de l'invention est de créer un médicament contre les tumeurs, affections virales et affections coplasmiques. L'invention devra donc indiquer pour ce médicament un procédé de fabrication approprié. On a constaté que, dans les solutions de fermeneation de la souche IMET JA 6844, il se forme avec un rendement important un nouvel antibiotique donnant de bons résultats dans le traitement des affections néoplastiques, virales et en particulier dans les affections provoquées par des mycoplasmes, aui est designs sous le nom de violamycine et qui neut être isolé en procédant dans les conditions décrites ci-après. Le micro-ormanisme pour l'obtention de la violamycine est consigné dans la collection de souches de l'institut central pour la microbiologie et la thérapeutiaue expérimentale à Iéna dépendant de l'Académie allemande des Sciences de Berlin sous le numéro de collection de souches IMET JA 6844.Le type à l'état sauvage du producteur a éte isolé en 1958 à partir d'un échantillon de terre Drovenant de Schwellenburg, près d'Elxleben (rfurt). La souche frit partie du genre "streptomyces" et corresnond au diagnoctic du "streptomyces violaceus" (Rossi-Doris 1891, Kraszilnikov 1941, Waksman 1953), ainsi qu'il est indiaué d'après l'étude de la néo-souche type ISP 5082 (= INMI - I, RIA 656, ATCC 15888) dans le "International Streptomyces Project" de shiriling et Gottlieb (Int. J. syst. Bact. 19:497 (1969).La souche présente les caractéristiques suivantes : le substrat mycélien est coloré en rouge, violet ou bleu sur différents milieux et à des époques différentes. Le pigment qui peut diffuser également dans les milieux à base d'agar-agar présente des propriétés d'indicateur : virage en rouge sous action acide, au bleu sous action alcaline. Le mycélium aérien est color en rose pâle, rose ou gris rosé. Les chaînes de anoures sont disposées en spirales plus ou moins régulières, la plupart du temps ouvertes sur des thyphes principaux en partie longs. La surface des spores est hérissée de piounats. Sur des bilieux contenant de la neptone ou de la tyrosine un pigment allant du brun au bleu-noim use dans l'agar-agar.La souche se déveloope sur un milieu basique avec addition de d-glucose, l-arabinose, d-xylose, m-isonitol, d-mannitol, d-fructose, rhamnose, saccharose et raffinose. Le procédé selon l'invention consiste à cultiver la souche strepomyces violnceus IMET JA 6844 ou bien ses mutants et variantes, dans des conditions de culture aérobies dans un milieu nutritif liauide comportant des sources appropriées de carbone et d'azote ainsi que des sels minéraux. 1a culture s'effectue dans les milieux nutritifs appropriés à une température de 25 à 37 C pendant P à 6 ajours avec aération et agitation. Après séparation du mycélium de la solution nutritive l'antibiotique violamycine est extrait avec des solvants organiques du filtrat de culture et du mycélium.Les extraits sont concentrés jusqu'à la phase aqueuse et à partir des concentrés bruts, l'antibiotioue est à nouveau réduit à la phase organique puis est obtenu à partir des concentrés d'extrait par précipitation PU moyen d'une fraction d'hydrocarbures à bas point d'bullition et est enfin purifié par des procédés chromatographiques connus. La culture de la souche IMET JA 6844 ainsi que de ses mutants et de ses variantes s'effectue dans des conditions aérobiques. Les spores de la souche séchées par lyophilisation sur de la terre sont ensemencées dans des bouillons de culture à base d'agar-agar appropriés puis dans des milieus de culture nutritifs liauides préalablement stérilisés, et le mycélium obtenu est cultivé de facon connue en soi à une température comprise entre 25 et 370C, (de préférence à 280C), pendant une durée de 2 à 6 jours (de préférence 4 jours), sous une acidité dont le pH est compris entre 6,2 et r?,O au début du processus de fermentation et entre 7,5 et 8,3 à la fin de cette fermentation. Le bouillon de culture est constitué par des sources de carbone et d'azote ainsi que par des sels non organiques.Comme sources rie carbone on peut utiliser l'amidon, le glucose, la glycérine, le mannitol, la dextrine, la saccharose, l'huile de soja et la farine de soja. Comme sources d'azote on peut utiliser, outre les substrats contenant de l'azote mentionnés cidessus la levure sèche, la pentone de viande et la caséine. Cn neut obtenir rie bons résultats de fermentation en ajoutant des sels minéraux. Ces derniers favorisent le developpe- ment de la fermentation suivant le genre de bouillon de culture utilisé. Dans les milieux complexes qui contiennent différentes farines on a eu des résultats particulièrement avantageux en ajoutant du carbonate de calcium, du phosphate de sodium ou du phosphate rie notassium. La fermentation du producteur peut s'effectuer dars ries bouteilles d'incubation et dans des ballons à fond rond de capacité variée, dans des récipients de fermentation en verre ainsi que dans des réservoirs du type V2A. tour isoler l'antibiotique à à pigment violamycine on procède de la façon suivente. l'antibiotique est extrait du filtrat de culture avec des solvants organiques non miscibles ou peu miscibles à l'eau et il est extrait du mycélium au moyen de solvants organiques miscibles à l'eau ; ensuite, après concentration des extraits, il est converti à la phase aqueuse puis, au moyen de solvants organiques, non miscibles à l'eau, il est extrait une nouvelle fois de la phase aqueuse avec un pH compris entre 3,0 et ,0 (de préfrence à 8,2) ; ensuite, à partir des concentrés d'extrait, il est Précipité sous agitation par mélange avec de l'éther de pétrole ou de l'essence ; il est ensuite débarrass de son solvant nar filtrage, dissous dans le chloroforne, séparé nPr filtrage des résidus insolubles ; la solution est lavée à l'eau, concentrée une nouvelle fois, et, par mélange avec de l'éther de pétrole, la fraction A précipite; enfin cette fraction h pst dissoute dans des alcools inférieure, épurée dans une colonne chromatographique, et séparée en deux parties; le chromonhore violamycinone A biologiquement inactif et le complexe antibiotique violamycine A biologiquement actif. La fraction B est réextraite de l'eau de lavaFe de l'extrait rie chlorofor-e par extraction sous un pH compris entre 6 et 9 au moyen rie butanol, le produit de la réextraction est concentré et le mélange est pre-cipité avec de l'éther rie pétrole ; la fraction B est dissoute dans des alcools inférieurs et est séparée par chromatographie en deux parties : l'antibiotique violamycine B et le complexe chromophore violarycinone B, biologiquemement inactif. les violamycines A et B se distinguent l'une de l'autre par leur teneur en combinaisons à base de sucre et elles peuvent. être séparées par chromatographie sur napier, en six éléments constitutifs différents. Les hydrolisats de la violamycine A et de la violamycine B donnent le même mélange de chromophores mais avec des différences auantitatives entre les différents éléments constitutifs. Les complexes chromophoriques des violamycinones A et B se distinguent également dans la qualité des constituants chromophoriques. Les mélanges de chromophores obtenus à partir des hydrolisats sont séparés dans une colonne chromatographique ; les chromophores violamycinones A1 à A6 sont comparés aux chromophores B1 à B6 et leur appartenance à la classe de structure chimique des anthracyclinones est déterminée. L'antibiotique violamycine A est un complexe de substances amorphes de couleur brun-rouge qui se dissout bien dans le chloroforme, l'acétone et les alcools, moins bien dans le benzol et est insoluble dans l'éther et dans l'eau. L'antibiotique violamycine A possède les propriétés d'un indicateur : il vire au rouge dans les solutions acides et au bleu dans les solutions alcalines. Les violamycinones A1 (B1) et A2 (B2) ont de même que le rhodomycinone et l'isorhodomycinone connus un groupe OH en position C10 et correspondent donc au type du ss-rhodomycinone et du p-isorhodomycinone. Les violamycinones A3 (B3), A4 (B4), A5 (R5) et A6 (B6) ont en position C10 un groupe carbomethoxy et correspondent au type du #-rhodomycinone et du #-isorhodomycinone qui jusqu'-à maintenant ne sont pas connus comme éléments constitutifs d'un antibiotioue. A3 (B3) et A5 ( B5 ) constituent après leur absorntion W les combinaisons isorhodomycinones et A4 (B4) et A6 (B6) sont les combinaisons rhodomycinones. les violamycinones montrent les maxima d'absorption ci- après dans la zone visible du spectre électromagnétique A1 (B1) absorption pour = 564 ; 5',1 ; 524; 495 eau A3 (B3) n "= = 564 ; 551 ; 524; 495 nu A5 (B5) n "= 564 ; 951 ; 524; 495 nu A2 (B2) n n t 529 ; 516 ; 495; qu A4 (B4) absorption pour = 529; 516; 495; m A6 (B6) " " = 529; 516; 495; m aussi bien les billons de fermentation frais du producteur de violamycine que l'antibiotique isolé à partir de ces bouillons jouent un rôle d'inhibiteur empêchant la croissance des bactéries et mycobactéries gram-positives et dans une plus faible mesure celle des représentants des bactéries gram-négatives; par contre les levures et les champignons ne subissent pas d'influence antibiotiaue. Contre les cellules nourricières cultivées in vitro et contre les tumeurs animales expérinentales la violamycine monstre une cytostatique et cancérostatique. Ftude le l'action cancérostatique de l'antibiotique violamycine Au premier stade du test cancérostatique (domaine thérapeutique expèrimental de ZIMET, Iéna), le produit brut de la violamycine expérimenté sur des souris auxquelles ont été transmises les leucémies expérimentales L 1210 et LAJI ainsi que le sarcome 18C manifesta son efficacité contre le sarcome 180. Avec une application i.p. uninue de 5 mcg et de C-,5 mcm de produit brut de violamycine par 20 grammes de souris la croissance de la tumeur solide est diminuée respectivement de 48,0 % et de 53,6 % par rapport aux sujets de contrôle non traités. La multiplication intracellulaire des virus bactériens ainsi nue -elle des représentants des virus animaux est freinée Dar l'antibiotique sans qu'il y ait en même temps blocage du métabolisme rie la cellule-hôte. La violamycine exerce un effet particulièrement fort sur la division cellulaire et sur le métabolisme de repos des catégories de mycoplasmes. Etude de l'action bactériostatique et bactéricide de ''antibiotique violamycine sur les mycoplasmes L'action de l'antibiotique à été expérimentée sur deux agents pathogènes d'épizootie importants dans l'élevage du bé tail et l'entretien des animaux domestiques.Les violamycines A et B se caractérisent par une activité bactériostatique et en même tenus bactéricide étonnament puissante contre le mycoplasma gallisepticum souche S 6) et contre le mycoplsme hyorhinis. l'étude comparative de l'activité biologique des comnlexes antibiotiques violamycines A et B donne le spectre d'activité ci-après, après exploitation du test de dilution sur bouillon de culture TABLEAU I Organisme test Concentrstlon inhibitrice minimale bactériostatique bactéricide (mcg/ml) (mcg/ml) violamycine : violamycine : A : B : A : B : mycoplasma gallisepticum 0,03 0,15 0,76 0,76 douche S6 mycoplasma hyorhinis 0,15 0,15 19,0 0,76 Les résultats présentés dans ce tableau 1 montrent que la violamycine A est nlus efficace au point de vue bactériostatiaue contre le mycoplasma gallisepticum (souche 9 6) que la violamycine e mais que par contre la violamycine B exerce contre le mycoplasma hyorhinis une action bactéricide plus intense que la violamycine A. Les deux violamycines en question se distin- tuent des Droduits naturels connus jusqu'à maintenant et qui agissent contre les mycoplasmes, par leur action bactéricide qui est plusieurs centaines de fois supérieure. Une telle activité biologique contre les représentants des mycoplasmes qui peuvent provoquer des symptômes de maladie chez les animaux domestiques n'a jamais été décrite jusqu'à présent pour les antibiotiques anthracycline et est surprenante. Le nouvel antibiotique violamycine et ses dérivés peuvent être utilisés comme agents chimiothérapeuticues potentiels contre les affections mycoplasmiques de l'homme et des animaux domestiques, contre les tumeurs et contre les affections virales. Les caractémistiques et avantages de la présente invention ressortiront d'ailleurs des exemple de réalisation ci-après. EXEMPLE 1 Deux bouteilles à incubation de 500 ml contiennent chacune 80 ml du milieu de culture suivant Glucose 1,5% Farine de soja 4,5 % Chlonlre de Na 0,5 % Carbonate de Ca 0,1% Phosphate de K primaire 0,03 % dans de l'eau de robinet. Stérilisation: 35 minutés à 110 C. Après stérilisation l'acidité a un pH rie 6,3. Chaque bouteille est encemencée avec une suanension de snores et de mycélium oui est obtenue avec une solution de chlorure de sodium stérile et isotonique t partir d'une culture de pro- ducteur de violamycine, vieille de 10 à 15 jours, cultivée en éprouvette sur un bouillon de culture ayant la con position suivante Farine d'avnine 1 % Flocons d'avoine moulus 1% Agar-agar 2% dans rie l'eau de robinet. Stérilisation : 35 minutes h 1200C ; acidité naturelle. Les cultures encemencée sont mises sous incubation pendant 48 heures à 28 C sur un agitateur tournant à 180 tours/minute. 8 ml d'une culture ainsi traitée servent à ensemencer des bouteilles à fermenter de 500 ml qui contiement chaucune 80 ml du milieu de production suivant Glucose 2,0 % Farine de soja 2,0 % Chlorure de sodium 0,5 % Carbonate de calcium 0,3 % dans de l'eau de robinet. Stérilisation : 35 minutes à 115 C. L'acidité après stérilisation présente un pH rie 6,3. La température pendant la fermentation est de 28 C et la vitesse de l'agitateur est de 180 tours/ minute. Après ?? heures rie fermentation on obtient la teneur maximale en violamycine, soit 125 mcg/ml. La détermination d'activité s'effectue à l'aide d'une série de procédé connus et nouveaux de tests microbiologiques de diffusion sur agar-agar. Dans ces procédés l'action de ralentissement de la violamycine sur la multiplication des virus bactériens dans leurs cellules-hôtes sert d'échelle de mesure pour l'activité de l'antibiotique. (voir Fleck W, 1968, Allg. Mikrobiol. 8 (2), 139). EXEMPLE 2 On procède comme pour l'exemple 1 mais avec la différence que le n.. milieu de production présente la composition suivante Glucose 1,0 % Amidon 1,0 % Farine de soja 0,5 % Levure de boulan ger 0,5 % Chlorure de sodium 0,5 % carbonate de cal cium 0,3 % dans de l'eau de robinet. Stérilisation : 40 minutes à 116 C. Après stérilisation l'acidi té présente un pR de 6,2, La teneur maximale en violamycine est obtenue au bout de 90 heures ; elle est de 100 mcg/ml. EXEMPLE 3 Au moyen d d'une culture du Producteur de violamycine provenant d'un milieu de culture solide tel qu'il est décrit à l'exemple 1 on ensemence 80 ml du milieu de culture liquide indiqué à l'exemple 1 qui est contenu dans une bouteille à incuhation de 500 ml. On fait incuber pendant 24 heures à 280C sur un appa- reil à vibrations tournant à 180 tours/minute. 12 ml du bouillon de culture ainsi obtenu servent à ensemencer 400 ml du même mi lieu qui est contenu dans un ballon en verre de 2 litres.On laisse incuber encore tendant 24 heures à 280C et sous une vi bration produite par lui agitateur tournant à 180 tours/minute, avant d'utiliser les 400 ml de bouillon de culture ainsi obtenus pour ensemencer 20 litres du milieu de production décrit à l'exemple 1. Ce dernier est contenu dans un récipient à fermentation en verre de 32 litres Pendant la fermentation qui est effec tuée sous une vitesse d'agitation de 400 tours/minute et avec une arrivée d'air de 15 litres/minute, la formation de mousse est contrôlée en ajoutant de petites quantités d'huile de tournesol ou d'autres agents anti-moussants contenant du silicone. 20 litres de solution de culture sont amenés à un pH de 5,0 à l'aide d'acide chlorhydriaue et, après séparation du mycélium, on obtient 18 litres du filtrat de culture. L'extrait au butanol du filtrat de culture est ramené sous vide à 1:10 du volume initial et est ajouté au réextrait de butanol du concentré d'extrait de mycélium. Auparavant le mycélium est intimement mélangé deux fois par brassage avec du méthanol dans la proportion de 1 pour 6. Les extraits réunis sont rameners sous pression réduite à 1/20 du volume de néthanol et la solution aqueuse ainsi obtenue est extraite à épuisement total avec du butanol. Les extraits au butanol réunis sont comprimés avec l'extrait au butanol du filtrat de culture à 1/25 du volume de la solution de culture.Du concentré final on tire an ajoutant 3 fois son volume d'éther de pétrole 5C0 g de produit brut biologiquement actif (A 6844) par in de solution de culture. EXEMPLE 4 Ce procd se distingue de celui de l'exemple 3 en ce qu'après culture Préalable dans un ballon de 2 litres le producteur de violamycine est ensemencé dans un réservoir V2A de 400 litres au lieu de litre dans un récipient de fermentation de 32 litres, ce réservoir contenant le milieu de production décrit à l'exem nle 1. La vitesse de l'agitatrice est de 280 tours/minute et l'arrivée d'air est de 40C litres/minute. D'après le procédé décrit à l'exemple 3 on tire de 300 litres de solution de culture 300 grammes de produit brut A 6844 par m3. Le produit brut A 6844 est utilisé nour préparer les complexes biologinues actifs violamycine A et B. EXEMPLE 5 20C grammes de produit brut A 6844 sont mis en suspension dans 5 litres de chloroforme et, après une heure d'agitation, la solution est séparée du résidu insoluble. La solution dans le chloroforme est lavée 5 ou 6 fois avec la moitié de son volume d'eau et est ainsi entièrement débarrasse de pigments solubles dans l'eau. Après séchage la solution dans le chloroforme est concentrée sous pression réduite jusqu'à 1/50 du volume initial et est brassée avec dix fois sa quantité d'éther de pétrole. La fraction A de violamycine biologiquenent active précipite. Cette fraction A est séparée par filtrage, lavée à l'éther de pétrole pur et, sous pression réduite, est séchée sur acide sulfurique concentre dans l'exsiccateur. On obtient ainsi 16 grammes de fraction A. La fraction A de violamycine est séparée sur une colonne chromatographique en deux parties : l'antibiotique violamycine A et le complexe chromophorique violamycinone A biologiquement inactif. 10 grammes de fraction A de violamycine donnent 5 gram- mes de violamycine A. La fraction B de violamycine est tirée nar extraction avec le butanol de l'eau de lavage de l'extrait de chloroforme après que l'acidité a été portée au pH 8,5. Après concentration de l'extrait au butanol et brassage avec de l'éther de pétrole le précipit qui se forme est séparé par filtrage et séché. te renderent en fraction B de violamycine est de 25 grammes pour 2CC grammes de produit brut 6844. D'une façon analogue à la fraction A, la fraction B peut être séparée en deux éléments : l'antibiotique violamycine B et le complexe chromophorique biologiquement inactif violamycinone B.10 grammes de fraction B donnent a,S grammes de l'antibiotique violamycine B. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé pour l'obtention d'un nouvel antibiotique violamycine ainsi aue de son aglycone par culture comnortant des sources de carbone et d'azote appropriées et des sels minéraux, caractérisé en ce qu'on utilise comme producteur le streptomyces violaceus (IMET JA 6844) ou ses mutants et variantes, et en cR que la culture est effectuée sous aération et avec agitation dans des milieux de culture aprxopriés, à des températures de 25 à 37 C pendant 2 à 6 jours, et en ce que l'an tibiotique ainsi formé est tiré par extraction du filtrat de culture et du mycélium, puis est purifié et séparé en ses éléments condtitutifs. 2 - Antibiotique violamycine et son aglycone, obtenus suivant le procédé de la revendication 1, caractérisé en ce que le streptomyces violaceus ItET JA 6844 est cultivé dans un milieu de culture liauide comportant des sources de carbone et d'azote appropriées ainsi que des sels minéraux à des températures de 25 à 370C, pendant 2 n 6 jours, sous aération et avec agitation, et en ce que l'antibiotique ainsi formé est tiré par extraction d'après des methodes connues en soi du filtrat de culture et du mycélium, puis est purifié et séparé en ses éléments constitutifs.