Brevet FR2162139A1 — publié le 19730713

La présente invention a pour objet un procédé de concentration et de purification de virus et plus particulièrement de myxo-virus. Les méthodes de purification et de concentration de virus employées jusqu'ici présentent de grands inconvénients lors de leur exécution. C'est ainsi qu'il est le plus souvent nécessaire de prépurifier la solution ou la suspension contenant le virus, par exemple par centrifugation à faible vitesse, par filtration sur laine de verre, sur gaze ou autres, par filtration fractionnée sur membranes poreuses de différentes dimensions de pores ou par adsorption sélective. A cette opération succède ensuite la véritable concentration et purification, telle que centrifugation différentielle, adsorption sélective sur gel de phosphate d'aluminium, sulfate de baryum ou sur un adsorbant minéral analogue, ou sur des érythrocytes, précipitation avec le sulfate d'ammonium ou ur. alun, ou centrifugation zonale.En général, ces procédés fournissent des virus ayant une pureté à peu près satisfaisante, mais avec de mauvais rendements qui, de plus, ne sont souvent pas reproductibles, ou alors permettent d'atteindre de bons rendements en virus mais dans ce cas la pureté des virus obtenus n'est pas satisfaisante. En outre, surtout en ce qui concerne la filtration sur membrane poreuse et les méthodes de centrifugation, les procédés mis en jeu nécessitent une dépense très élevée en appareillage. La demanderesse a trouvé maintenant un procédé qui permet de préparer1 avec de bons rendements, des virus ayant une pureté satisfaisante, tout en utilisant un appareillage peu couteux. Le procédé de l'invention est caractérisé par le fait qu'on prépurifie la solution ou la suspension virale à purifier, par exemple le liquide allantoMdien ou une culture de tissu, par traitement avec du tétrachlorure de carbone, et qu'on ajoute une solution de polyéthylèneglycol au liquide viral prépurifié. Selon un autre mode d'exécution du procéda de l'invention, on ajoute sans prepurification une solution de polyéthyleneglycol a la solution ou suspension virale à purifier, par exemple au liquide allantoldien ou une culture de tissu. Le traitement au tétrachlorure de carbone est avantageusement effectué pendant un temps court et une seule fuis. Une grande partie des lipides et des impuretés de l'albumine de l'hotte est ainsi éliminée sans perte de virus. On exécute par exemple le procédé de l'invention en homogénéisant sous refroidissement à une température comprise de préférence entre Omet 100, un liquide allantordien infecté et du tétrachlorure de carbone, par exemple dans un mixer. On utilise le tétrachlorure de carbone en une quantité représentant de préférence 1/20eme à1 fois, plus particulibrement 1/10sème a 1/4, le volume de liquide alantordien à purifier.On achève le traitement de l'émulsion laiteuse résultante par exemple par centrifugation a froid puis essorage ou décantation du liquide limpide supérieur.En procédant de cette manier, on obtient au moins 90% de la quantité de virus initiale, d'après la mesure du titre d'hémagglutination.Aù liquide purifié ainsi obtenu, on ajoute du polyéthylèneglycol en une quantité telle que la concentration finale de polyéthylène-glycol dans la solution a purifier soit de préférence supérieure à 2% et plus particulièrement supérieure a 4%. A cet effet, on utilisera par exemple du polyéthylène-glycol 6000. Contrairement aux méthodes connues, on peut achever le traitement du précipité ainsi obtenu, par simple centrifugation a basse vitesse.On peut par exemple le séparer par centrifugation a 3000 tours par minute après lavoir laissé reposer longuement, par exemple pendant une durée de une a 20 heures a 40. Le sédiment obtenu peut être mis en suspension par exemple dans une solution physiologique de phosphate, le volume de cette solution de phosphate étant compris entre environ 1/100 et 1/20 du volume existant avant la séparation du précipité. On ne peut pas donner une limite supérieure fixe pour la concentration finale de polyéthylène-glycol a employer. La valeur supérieure est variable et est en général limitée par le fait qu'à une concentration en polyéthylène-glycol déterminée, les protéines se trouvant dans la solution à purifier précipitent. Cette limite supérieure de la concentration en poly éthylène-glycol est d'environ 8% lorsqu'on utilise le liquide allantotdflen. Le procédé de l'invention est approprié pour la purification des virus, en particulier des myxo-virus et est avantageusement utilisé pour la préparation des vaccins contre la grippe. I1 se signale par son action très ménagée; de plus, il ne nécessite qu'un appareillage réduit et son exécution est rapide. La pureté du produit obtenu est substantiellement meilleure que celle qu'on peut atteindre avec la plupart des procédés connus et le caractère ménagé du procédé est prouvé par le fait que la virulence du matériau ne diminue pas de façon notable et par l'invariabilité du comportement de sédimentation au gradient de densité (centrifugation de sédimentation et centrifugation d'équilibre).Le concentré final contient au moins 90% de la quantité initiale de virus (mesurée par le titre d'hémagglutination). La solution ou suspension virale introduite pour la purification peut être soumise, avant le traitement de l'invention, à une prépurification grossière. Cette prépurification élimine les impuretés grossières du milieu; elle peut consister par exemple en une centrifugation à basse vitesse ou en une filtration sur laine de verre, gaze ou autres. Une telle prépurification est avantageuse mais n'est pas nécessaire pour le procédé de l'invention. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont toutes indiquées en degrés centigrades. Les concentrations indiquées en % se rapportent à des poids (g) par volume (litre). Exemple 1 On inocule 1500 oeufs de poule fécondés et incubés pendant 11 jours avec la souche de virus influenza A2X-31 et on les maintient pendant 40 à 48 heures à 380. On prélève par aspiration le liquide allantofdien qui contient le virus et on élimine les grosses particules par centrifugation pendant 15 minutes à 2500 tours/minute dans une centrifugeuse Christ IV KS. Tout en refroidissant, on homogénéise trois parties de ce liquide allantoidìen contenant le virus avec une partie de tétrachlorure de carbone. On effectue cette homogénéisation dans un Star-Mixer, Ultra-Turrax ou dans un appareil analogue. Au bout de 20 secondes à une minute de ce traitement, on obtient une émulsion laiteuse qu'on sépare par centrifugation à 3000 tours/minute pendant 10 minutes dans une centrifugeuse froide. On décante ou bien on préleve par aspiration le liquide supérieur et on jette le résidu contenant les lipides. Tout en agitant, on traite le liquide clarifié par centrifugation, par 1/5e de son volume d'une solution de polyéthylène-glycol a 60% de polyéthylène-glycol 6000 dans du chlorure de sodium 0,3 M ou dans de l'eau.On conserve le mélange à +40 et, après avoir laissé reposer pendant 2 heures le précipité obtenu, on le sépare par centrifugation à basse vitesse. On met le précipité en suspension dans 1/100 du volume de départ d'une solution physiologique de phosphate; il contient plus de 90% de la quantité de virus initiale, déterminée par le test normal d'hémagglutination. Exemple 2 On inocule 1000 oeufs de poule fécondés et incubés pendant 12 jours avec la souche de virus influenza B-Lee et on les incube pendant 46 heures à 38 . On conserve les oeufs d 40 pendant la nuit et on décante le liquide allan- toldien. On élimine les grosses particules par filtration du liquide allantofdien sur laine de verre ou sur gaze. Tout en refroidissant, on homogénéise trois parties de ce liquide allantordien contenant le virus avec une partie de tétrachlorure de carbone. On effectue cette homogénéisation dans un Star-Mixer, Ultra-Turrax ou dans un appareil analogue. Au bout de 20 secondes à une minute de ce traitement, on obtient une émulsion laiteuse qu'on sépare par centrifugation à 3000 tours/minute pendant 10 minutes dans une centrifugeuse froide. On décante ou on prélève par aspiration le liquide superieur et on jette le résidu contenant les lipides. Tout en refroidissant et en agitant, on traite le liquide obtenu par l/2Se de son volume d'une solution de polyéthylène-glycol a 60% de polyéthylène-glycol 6000 dans du chlorure de sodium 0,5M ou dans de l'eau. On laisse reposer le mélange à 4 pendant une heure et on sépare par centrifugation le précipité obtenu, par exemple pendant 20 minutes à 3000 tours/minute dans une centrifugeuse Christ IV XS. Après avoir séparé la couche supérieure par décantation, on met le précipité en suspension dans 1/50 du volume de départ d'une solution physiologique de phosphate. Exemple 3 On procède comme décrit à l'exemple 2, mais on utilise la souche de virus influenza A2/58 à la place de la souche de virus influenza B-Lee. Exemple 4 On procède comme décrit à l'exemple 2, mais on utilise la souche de virus influenza A2-X-31 à la place de la souche de virus influenza B-Lee Exemple 5 Trois jours après l'ensemencement, on inocule des cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de poulet avec le virus influenza A2-x-3I. A des flacons en rotation contenant chacun 1,3x108 cellules, on ajoute par flacon 109'4 particules virales (unités formatrices de plaques) dans 10 ml de milieu MEM (Eagle), puis, après une durée d'adsorption de 30 minutes,on on dilue avec 190 ml de ce milieu contenant 1% de pénicilline -streptomycine et un peu de NaHC03.Après 20 heures d'incubation à 370, on verse le con- tenu du flacon dans un bol de centrifugeuse et on sépare le milieu et les cellules par centrifugation. Tout en refroidissant, on homogénéise trois parties du milieu contenant le virus avec une partie de tétrachlorure de carbone.On effectue cette homogénéisation dans un Star-Mixer, Ultra-Turrax ou dans un appareil analogue. Au bout de 20 secondes à une minute de ce traitement, on obtient une émulsion laiteuse qu'on sépare par centrifugation à 3000 tours/minute pendant 10 minutes, dans une centrifugeuse froide. On décante ou on prélève par aspiration le liquide limpide supérieur et on jette le résidu contenant les lipides.A partir du liquide obtenu, on concentre le virus par précipitation avec une solution de polyéthylène-glycol, en ajoutant sous agitation 7 ml a d'une solution de polyethylène-glycol à 60% de poly- éthylène-glycol 6000 dans du chlorure de sodium 0,3 M ou dans de l'eau, a 200 ml du milieu contenant le virus et refroidi à +40. Après avoir laissé reposer 3 heures å +40, on centrifuge le précipité pendant 20 minutes a 2500 tours/ minute et on le met en suspension dans l/SOe du volume de départ de tampon physiologique au phosphate. Exemple 6 On procède comme décrit à l'exemple 5, mais on utilise la souche de virus influenza B-Lee à la place ae la souche de virus influenza A2-X-31. Exemple 7 On procède comme décrit à l'exemple 5, mais on utilise la souche de virus influenza A2/58 a la place de la souche de virus influenza A2-X-31. Exemple 8 On procède comme décrit à l'exemple 5, mais on utilise la souche de virus influenza Ao-PR8 a la place de la souche de virus influenza A2-X-31. Exemple 9 Quatre jours après l'ensemencement, on inocule des cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de poulet avec le virus Sindbis. A des flacons en rotation contenant chacun lxl08 cellules, on ajoute par flacon l,6xl09 particules virales (unités formatrices de plaques)dans 10 ml de milieu MEM (Eagle), puis, après une durée d'adsorption de 30 minutes, on dilue avec 190 ml de ce milieu contenant 1% de pénicilline-streptomycine et un peu de NaHC03. Apres 48 heures d'incubation à 370, on verse le contenu du flacon dans un bol de centrifugeuse et on sépare le milieu et les cellules par centrifugation. A partir du liquide obtenu, on concentre le virus par précipitation avec une solution de polyéthylène-glycol, en ajoutant à un litre du milieu provenant de 5 flacons, 50 ml d'une solution de polyéthylène-glycol a 60% de polyéthylène-glycol 6000 dans du chlorure de sodium 0,3 M ou dans de l'eau. Après avoir laissé reposer pendant 4 heures a 40, on centrifuge le précipité pendant 20 minutes à 2500 tours/minute et on le met en suspension dans l/50e du volume de départ de taxon physiologique au phosphate. Le rendement en virus, déterminé avant et après la précipita- tion par la teneur en unités formatrices de plaques, est voisin de 100%. REVENDICATIONS 1.- Procédé de concentration et de purification de virus, caractérisé en ce qu'on traite une solution ou une suspension contenant le virus par du tétrachlorure de carbone et on ajoute une solution de polyéthylène-glycol au liquide obtenu. 2.- Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce qu'on homogénéise la solution ou la suspension contenant le virus avec l/20e à 1 fois son volume de tétrachlorure de carbone. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le traitement de la solution ou de la suspension contenant le virus est effectué pendant un temps court et une seule fois. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution ou la suspensi9-- contenant le virus est soumise, avant le traitement par le tétrachlorure de carbone1 à une prépurification grossière. 5.- Procédé de concentration et de purification de myxo-virus, caractérisé en ce qu'on traite la solution ou la suspension contenant le myxo-virus par une solution de polyéthylêne-glycol. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 5, caractérisé en ce qu'on ajoute une quantité de polyéthylène-glycol telle que la concentration finale de polyéthylène-glycol dans la solution à purifier soit supérieure à 2e. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 5, caractérisé en ce qu'on utilise du polyéthylèneglycol 6000.