Brevet FR2189020A1 — publié le 19740125

L'invention est relative à un agent hydrosoluble, à activité immunostimulante et antitumorale. Plus particulièrement, elle est relative à un agent hydrosoluble apte à renforcer, de façon non spécifique, les réponses immunitaires de l'homme et des animaux à l'égard d'antisènes à caractère pathogène, notamment de ceux qui sont de nature à induire la formation de tumeurs. I1 est connu que certaines mycobactéries, notamment celles connues sous la dénomination "bacilles de Calmette et Guérin" ou BCG, sont aptes à influencer favorablement les réponses immunitaires non spécifiques de l'hôte à qui elles sont administrées. Les effets secondaires qui accompagnent cette action et l'insolubilité des mycobactéries, limitent cependant, pratiquement de façon considérable, les possibilités de leur utilisation en thérapeutique. L'invention a donc pour but de fournir un agent parfaitement soluble qui, tout en bénéficiant des propriétés bénéfiques du BCGI soit également dépourvu des effets secondaires nuisibles qui caractérisent celui-ci. Elle a également pour but de fournir un procédé d'obtention d'un tel agent hydrosoluble. L'agent soluble selon l'invention, ci-après appelé MAAF, est caractérisé par le fait qu'il est constitué en majeure partie par des sucres neutres, dont les constituants principaux sont l'arabinose et le galactose, le restant étant principalement constitué par des amino-acides, notamment de l'alanine, de l'acide glutamique, de l'acide méso-a-a'-diaminopimélique et de la galactosamine, et par le fait qu'il est totalement dépourvu de lipides. Le procédé d'obtention de l'agent selon l'invention est caractérisé en ce que l'on cultive une souche de mycobactéries ou de micro-organismes apparentés à celles-ci, en ce que l'on recueille les micro-organismes de la souche cultivée, en ce que l'on traite ces micro-organismes avec un ou plusieurs des solvants de délipidation jusqu'à obtenir une délipidation aussi complète que possible, en ce que l'on soumet les micro-organisms délipidés obtenus à une hydrogénation catalytique, notamment en présence de palladium, en ce que l'on sépare le surnageant, lave la fraction solide avec un liquide de rinçage non solubilisant du MAAF, tel que l'méthanol ou l'acétone, en ce que l'on soumet ensuite le résidu solide à une opération d'extraction avec un solvant du MAAF, notamment de l'eau distillée, en ce que l'on filtre le milieu et recueille le filtrat contenant le MAAF. Le MAAF peut être obtenu à l'état solide par précipitation hors du filtrat, de préférence préalablement concentré sous vide, à l'aide d'un solvant, tel que l'acétone ou l'éthanol, dans lequel le MAAF est insoluble. Agent hydrosoluble selon l'invention se caractérise par des propriétés immunostimulantes et antitumorales, lesquelles ont été mises en évidence, notamment par les tests pharmacologiques qui seront décrits plus loin. D'autres particularités de l'invention apparattront de toute façon encore au cours de la description qui suit de certains de ses modes de mise en oeuvre préférés. Se proposant notamment de fabriquer un agent parfaitement hydrosoluble, à activité immunostimulante et antitumorale, à partir du BCG, souche Pasteur, on sty prend comme suit ou de façon analogue. Le BCG, cultivé dans le milieu de Sauton pendant dix-sept jours à 370C, est récolté par filtration et lavé à l'eau distillée, puis laissé immergé dans le mélange éther-éthanol (à volume égal) à +4"C. Au bout de trois semaines, on filtre puis on lave la masse de BCG retenue sur le filtre successivement avec le même mélange éther-éthanol (à volume égal), puis avec le chloroforme jusqu'à élimination complète des substances lipidiques. 10 g du BCG délipidé ainsi obtenu sont introduits dans un récipient contenant 200 ml d'une solution d'éthanol à 20 X d'acide acétique. On ajoute dans le mélange 15 mg de catalyseur (Palladium sur charbon actif à 5 % de palladium) puis on relie le récipient à une source d'hydrogène et on remplit l'appareil d'hydrogène gazeux après avoir chassé le volume d'air. Le tout est maintenu à la température ambiante sous agitation continue. Lorsque l'absorption de l'hydrogène a cessé (après huit heures). On filtre et la masse retenue sur le filtre est ensuite soumise a: - des rinçages à méthanol, notamment pour éliminer les traces d'acide acétique retenues dans le produit solide - une extraction sous agitation continue à la température ambiante pendant 3 heures, dans 100 ml d'eau distillée, cette opération étant répétée au moins trois fois - une filtration. Les eaux d'extraction (filtrats) réunies sont ensuite concentrées sous vide à 320C jusqu'à un volume final de 50 ml. On ajoute ensuite de l'acétone à la solution concentrée contenant l'extrait puis on laisse reposer pendant quatre heures à la température ambiante. Le précipité formé (MAAF) est recueilli par filtration et lavé avec de l'éthanol puis séché sous vide à la température ambiante. On obtient ainsi 1 g de MAAF, ce qui représente un rendement de 10 X. Il présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes Il est constitué principalement par des sucres neutres (92 à 96 pour cent d'Arabinose et de Galactose dans un rapport molaire approximatif de 1:2). Il présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes 20 20 + 67e ; c - 0,2 dans l'eau ; - solubilité : 9,6 g/100 ml H20 à 200C - poids moléculaire approximatif : 32.000 (par ultracentrifugation analytique). Les analyses par chromatographie sur papier révèlent la présence de l'Alanine, de l'acide glutamique. de l'acide méso ~a-diaminopimélique et de la galactosamine. Le MAAF ne contient pas de lipide. Le MAAF forme une poudre très stable à la température ambiante. Il est enfin caractérisé par le spectre d'absorption infrarouge dont la partie essentielle est reproduite dans la figure 1 des dessins ci-annexes. On observera que l'on a isolé dans les mêmes conditions que ci-dessus un MAAF à partir d'une souche humaine virulente de mycobactéries (souche Canetti). La fraction soluble obtenue contient les trois acides aminés caractéristiques identifiés plus haut. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DU MAAF Le MAAF s'est révélé présenter des propriétés pharmacologiques de valeur, tout en étant dépourvu de toxicité. I1 présente à la fois des propriétés adjuvantes des réactions immunitaires chez l'homme et 11 animal et des propriétés antitumorales qui le rendent d'un intérêt particulier pour la formation de médicaments dans lequel il est associé avec des vaccins de médicaments contenant le MAAF seul et permettant la stimulation non spécifique des défenses immunitaires de l'organisme i et de médicaments à action antitumorale. Il constitue également un produit parfaitement défini qui peut remplacer avantageusement l'adjuvant de Freund en immunologie expérimentale. Les tests pharmacologiques dont la description suit ont été réalisés avec le MAAF extrait du BCG, sauf dans les cas où l'on stipulera expressément le contraire. 1. Mise en évidence de l'activité adjuvante du MAAF dans la production d'anticorps à l'égard des globules rouges de moutons. Le MAAF accrott les réponses immunitaires à des antigènes particulaires, tels que les globules rouges de moutons. comme le montre le test suivant. On administre par injection, par voie intrapéritonéale, des globules rouges de moutons (GRM) à des souris de la race FI (DBA/2 x C57Bl/6) pesant environ 20 g, à raison de 9 GRM par animal ; 15 minutes après chaque animal reçoit, par la même voie, 0,25 mg de MAAF en solution dans 0,1 ml de solution saline. Un groupe de souris témoins reçoit 0,1 ml de solution saline exempte de MAAF. Les animaux sont sacrifiés quatre jours plus tard. On détermine le nombre de cellules qui dans la rate ont formé des anticorps selon la technique de Jerne, N.X. et Nordin, A.A., Science, 140, 405 (1963). Le tableau I ci-dessous montre que le MAAF a induit chez les animaux traités un accroissement très important du nombre d'anticorps formés. Chaque groupe (animaux traités et témoins) comprenait six souris. TABLEAU I Adjuvant Nombre de GRM Nombre moyen de cellules formant ~~~~~~~~~~~~~~ formant des plaques témoins 109 26 000 MAAF 109 243 000 2. Mise en évidence des propriétés à la fois antitumorales et adjuvantes de l'activité antitumorale de vaccins à base de cellules leucémiques L 1210 tuées par irradiation sous 15 000 rads (CL I). 100 souris de la race FI (DBA/2 x C57Bl/6) reçoivent par injection sous-cutanée 104 cellules de tumeurs leucémiques L1210. Les souris sont divisées au hasard en cinq groupes de vingt animaux. Le premier groupe sert de témoin. Le deuxième groupe reçoit cinq injections par voie intrapéritonéale, chaque fois de 0,25 mg de MAAF en solution dans 0,1 ml de solution saline, à des intervalles de trois jours, la première injection étant faite une heure après l'administration de cellules tumorales. Le troisième groupe reçoit, une heure après l'administration des cellules tumorales, une injection unique par voie intravei 7 neuse, de 10 CLI. Le quatrième groupe reçoit au total la même dose de CLI, cependant en cinq injections, à des intervalles de trois jours, la première injection étant faite une heure après l'administration des cellules tumorales. 7 Le cinquième groupe reçoit une injection unique de 10 CLI, une heure après l'administration des cellules tumorales, et cinq injections successives de 0,25 mg de MAAF à-des intervalles de trois jours, la première étant faite quinze minutes après l'administration des cellules tumorales. Les courbes (1) à (5) de la figure 2 des dessins ci-annexés sont représentatives des résultats des cinq groupes susdits respectivement. Ces courbes indiquent la variation des pourcentages (axe des ordonnées) des animaux décédés dans chaque groupe, en fonction du temps, exprimé en jours sur l'axe des abscisses. Le tableau met en évidence le fait que le MAAF pris seul a une activité antitumorale du même ordre de grandeur que les CLI (comme il résulte de la comparaison des courbes (2), (3) et (4). Le MAAF protège environ 50 % des souris inoculées avec les cellules tumorales, alors que la totalité des témoins sont décédés au bout d'une trentaire de jours (courbe (1)). Des résultats particulièrement remarquables sont obtenus chez les souris qui ont été traitées à la fois avec le MAAF et les CLI (courbe (5)), puisque 90 % des souris du groupe correspondant survivent à l'inoculation initiale des cellules tumorales. 3. Mise en évidence de l'action du MAAF dans l'apparition des défenses immunitaires de l'organisme à 11 égard d'antigènes faiblement inducteurs d'anticorps. Des cobayes femelles albinos de 400-500 g sont sensibilisés par injection dans les coussinets plantaires des pattes antérieu res de chacun d'eux, d'une solution de 0,1 mg de MAAF dans 0,1 ml de solution saline, contenant également 0,25 mg d'albumine cristalline de blanc d'oeuf (ACBO). Vingt-et-un jours plus tard les animaux font l'objet d'un test de peau, par injection intradermique, dans leurs flancs préalablement tondus, de différentes doses d'ACBO en solution dans 0,1 ml de solution saline. On relève, 48 heures plus tard, les diamètres des taches rouges, lorsqu'elles se sont formées, aux niveaux des sites d'injection de 1'ACBO, ces taches rouges témoignant d'une hypersensibilité retardée des cobayes à l'antigène considéré. Ces diamètres, ainsi que les doses d'antigènes qui ont produit ces taches figurent dans le tableau II ci-dessous. Dans certains cas on observe une nécrose au centre de la tache, ce qui est signalé dans le tableau par la lettre N à côté des indications correspondantes relatives aux diamètres. TABLEAU II Sensibilisation Hypersensibilité 6 animaux dans Antigène Adjuvant retardée chaque groupe sensibi- utilisé o,l mg 3 ug 0,2,ug nOS des cobayes lisant 1 18(N) 12 3 2 16 (N) 8 2 3 MAAF 20(N) 10 5 4 20(N) 14 4 5 20(N) 12 7 6 20(N) 1 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 3 O O O 4 Témoins O 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 Les hypersensibilités retardées au niveau de la peau que l'on observe chez ceux des animaux qui ont été traités par le MAAF traduit l'apparition chez ceux-ci de réponses immunitaires à médiation cellulaire lesquelles sont inexistantes chez les témoins. Des tests semblables, réalisés avec le I4AAF extrait de la souche Canetti, conduisent au même résultat, à savoir que ce MAAF est doué d'une activité adjuvante semblable à celle du MAAF extrait de BCG. 4. Mise en évidence de l'inocuité du MAAF. On sait que 1injection intrapéritonéale de BCG entrasse chs la souris une hypertrophie de la rate, mesurable par l'accroisse- ment de poids de ces organes trois à quatorze jours après l'injection. L'injection intrapéritonéale du MAAF n'entrain pas de façon significative une telle hypertrophie, comme le montre le test suivant. Un groupe de cinq souris Fl(DBA2/C57B16) reçoit quatre injections intrapéritonéales, chaque fois d'une dose de 1 mg de MAAF, à des intervalles de trois jours. Les animaux (ainsi que des témoins n'ayant pas reçu le MAAF) sont sacrifiés vingt cinq jours plus tard et leurs corps et leurs rates respectivement pesés. Les résultats figurent dans le tableau III ci-dessous. TABLEAU III Nombre Dose in- Nombre Nombre de survi- Poids Poids de jectée d'in- vants 25 jours du de la jours tous les jections plus tard corps rate trois (en g) (en g) ours 35,1 0,096 33,0 0,093 5 1 mg 4 5 33,7 0,097 31,4 0,095 34,1 0,091 34,2 0,088 36,5 0,081 5 O mg O 5 33,4 0,093 36,1 0,092 35,2 0,083 On obtient donc ainsi un principe actif de médicament de grande valeur possédant des propriétés à la fois adjuvantes et antitumorales remarquables, dont la solubilité totale permet la préparation de solutés injectables parfaitement clairs et limpides. Les agents thérapeutiques peuvent donc être utilisés, soit comme agents antitumoraux, soit, de préférence, en association avec des antigènes de force atténuée pour favoriser l'immunisation préventive ou la protection de l'homme ou de l'animal à l'égard des mêmes antigènes à l'état virulent. Ils sont indiqués en particulier pour le traitement préventif ou curatif des arthrites, des leucémies et cancers, et.dlune façon générale, des affections que l'agent connu sous le nom d' "adjuvant de Freund" aurait permis de combattre s'il n'était pas si toxique. Les agents selon l'invention peuvent donc entrer dans des compositions de vaccins propres à être administrés par injection intramusculaire, intradermique ou sous-cutanée. ou par scarification. Ils peuvent de même titre utilisés pour la fabrication de sérums. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux des modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un agent hydrosoluble à activite immunostimulante et antitumorale, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de mycobactéries ou de micro-organismes apparentés à celles-ci, en ce que l'on recueille les micro-organismes de la souche cultivée, en ce que l'on traite ces micro-crgGnismes usqu'à obtenir une'délipidation aussi complète cue possible, en ce que l'on soumet les micro-organismes délipidés obtenus à une hydrogénation catalytique, en ce que l'on sépare le surnageant, lave la fraction solide avec un premier sclvant, tel que l'méthanol ou l'acétone, dans lequel l'agent hydrosoluble à extraire n'est pas soluble, en ce que l'on soumet le résidu solide à une opération d'extraction avec de l'eau distillée, en ce que l'on filtre la suspension et recueille le filtrat contenant l'agent hydrosoluble susdit. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de mycobactéries qui est cultivée est constituée par du BCG, souche Pasteur. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de mycobactéries qui est cultivée est la souche humaine virulente dite souche Canetti. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'hydrogénation catalytique des micro-organismes délipidés est réalisée en présence de palladium. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on recueille l'agent hydrosoluble susdit à partir du susdit filtrat, par précipitation à l'aide d'un solvant, tel que l'acétone ou l'éthanol, dans lequel l'agent hydrosoluble est insoluble. 6. Agent hydrosoluble caractérisé en ce qu'il est identique ou semblable, dans ses propriétés physico-chimiques et pharmacologiques, à celui qui est obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Agent hydrosoluble d'origine mycobactérienne constitué en majeure partie par des sucres neutres, dont les constituants principaux sont l'arabinose et le galactose, la partie restante étant principalement constituée par des aminoacides, parmi lesquels alanine, l'acide glutamique, l'acide méso- -A'-diamino-pimélique et la galactosamine, cet agent hydrosoluble étant en outre totalement dépourvu de lipide. 8. Agent hydrosoluble selon la revendication 6, caractérisé - en ce qu'il contient 92 à 96 % d'arabinose et de galactose dans un rapport molaire approximatif de 1:2, - en ce qu'il présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes /-/2C = + 670 ; c = 0,2 dans l'eau solubilité dans l'eau : 9,6 g/100 ml à 20 C poids moléculaire approximatif : 32.C00 (par ultracentrifugation analytique), et - en ce qu'il présente un spectre d'adsorption comportant une partie telle que représentée dans la figure 1. 9. Application de l'agent hydrosoluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou de l'agent hydrosoluble selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 en tant que médicament, mettant notamment à profit ses propriétés immuno-stimulantes ou antitumorales. 10. Application de l'agent hydrosoluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou de l'agent hydrosoluble selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 en tant qu'adjuvant pour sérums. 11. Composition pharmaceutique, administrable par voie parentérale ou par scarification, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif l'agent hydrosoluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou l'agent hydrosoluble selon les revendications 6 à 8, en association avec un véhicule pharmaceutique physiologiquement acceptable. 12. Composition de vaccin administrable par voie parentérale ou par scarification, caractérisée en ce qu'elle contient l'agent hydrosoluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou de l'agent hydrosoluble selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, en association avec un antigène de force atténuée et avec un véhicule liquide physiologiquement acceptable. 13. Composition de vaccin selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'antigène de force atténuée est constitué par des cellules leucémiques tuées.