Brevet FR2181819A1 — publié le 19731207

La présente invention concerne un nouvel antibiotique et ses dérivés remarquables pour leur activité élevée vis-a-vis des microorganismes des types levure et moisissure. Cette invention concerne aussi la fabrication de tels antibiotiques par un procédé de fermentation ainsi qu'une méthode de concentration de purification et d'isolement de l'antibiotique des autres produits de la fermentation. L'antibiotique selon l'invention, dénomme cl-après "thermozymocidine", est l'acide amino-2 hydroxyméthyl-2 dihydroxy-3,4 oxo-14 trans-eicosene-6 otique de formule : Selon l'invention, la thermozymocidine est produite par culture dans des conditions contrôlées d'un micro-organisme appartenant au groupe eumyces thermophile, genre Myriococcum, espèce Albomyces. Cette souche a été isolée à partir d'un échantillon de sol cultivé en maîs pris dans la province de Milan, Italie. La souche est déposée à la collection de l'institut de Pathologie Végétale de l'Université de Milan sous le n I.P.V. F-433 et à l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le n 20.349. Pour isoler les souches d'eumyces thermophîle nécessaires pour les buts de l'invention, on fait incuber à une température de 45 à 500C une suspension de l'échantillon de sol avant son incorporation à ut milieu de gélose-pomme de terre-glucose-extrait de levure, comprenant 20 g de gélose, 20 g de glucose, 2 g d'extrait de levure par litre de l'infusion de pomme de terre utilisée; l'infusion de pomme de terre est préparée à partir de 200 g de pulpe de pomme de terre dans de l'eau distillée. Le milieu de culture a un pH ajusté à 6,8 et,ensuite, on le stérilise à une température de 121 C pendant 20 mn. Après 2 à 4 jours d'incubation à une température de 45 à 500C, les colonies d'eumyces thermophie I.P.V. F-433 (ATCC n 20349) sont isolées et transplantées dans un milieu de gélose-pomme de terre-glucose- extrait de levure. Dans ce milieu, après 4 à 6 jours, la température de développement minimale des micro-organismes est de 260C tandis qi.c Ia température de développement maximale est de 50 à 55 C, la températur. optimale étant voisine de 43 C. La souche d'eumyces thermophile I.P.V. F-433 (ATCC n" 20349) produit normalement, dans les milieux de culture solides utilisés (voir tableau I), des colonies ayant une apparence veloutée légèrement cotonneuse, consistant en un mycélium ayant un substrat initialement translucide, qui acquiert une couleur jaune crème et un mycélium aérien blan chatre. I1 peut y avoir un pigment d'une couleur légèrement jaune qui n' est pas facilement diffusable dans le milieu. TABLEAU I Croissance des micro-organismes dans divers milieux à base de gelose après 6 jours d'incubation à 430C avec la souche I.P.V. F-4i-3 (ATCC nc 20e349). Milieu Croissance Malt Bonne Lait Assez bonne Pomme de terre-glucose-extrait de levure Bonne Glucose-extrait de levure Assez bonne Amidon-extrait de levure Bonne Classique Médiocre Classique-extrait de levure Médiocre Classique, avec glucose Assez bonne Soja Assez bonne Avoine Médiocre Infusion de riz Bonne Infusion d'engrais stable Assez bonne Asparagine-glycérol Assez bonne Milieu de Czapek Très mauvaise Le mycélium de la souche d'eumyces thermophile I.P.V. F-433 (ATCC ne 20349) est constitué d'hyphes ramifiées cloisonnées ayant des diamètres compris entre 2 et 12 microns, leur disposition peut donner naissance à des formations dactylotdes, à des enroulements et à des agrégats d'hypes ayant une tendance particulière à se scléroser. Des phases particulièrement conidiales ou sexuées n'ont pas été encore observées et la reproduction se produit seulement par des tragments ou conglomérats d'hyphes. La souche produisant la thermozymocidine a aussi les propriétés physiologiques suivantes Besoin en oxygène : aérobie. pH nécessaire : bonne croissance pour un pH compris entre 5,5 et 8. Activité protéolytique : positive. Activité de Rennet : positive. Activité amylolytique : positive. Activité lypolytique : positive. Activité cellulosolytique : faiblement positive. Activité de ribonucléase positive. Sources de carbone utilisables : glucose, fructose, galactose, xylose, maltose, lactose, saccharose, dextrine, amidon, inuline, glycérine et mannitol. Sourcesd'azote utilisables : peptones, asparagine, urée et nitrate de potas sium. Le sulfate d'ammonium n'est guère utilisable. En tant qu'antibiotique, la thermozymocidine a un spectre d'activité particulièrement antifongique. A des concentrations de 0,1 à 10 ylml (méthode de dilutions successives dans un mélange gélose-malt à 28 C), les espèces suivantes de levure sont inhibées Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces, Endomycopsis, Schizosacchwces, Kloeckera, Thodotorula, Torulopsis, Candida, Trichosporon et Cryptococcus. On a remarqué une activité inhibitrice particulière de la thermozymocidine vis-à-vis du Cryptococcus neoformans, agent pathogène de certaines formes de mycose, Ce micro-organisme est sensible à des concentrations de 0,05 à 0,1 y/ml. De plus, à des concentrations de 5 à 50 y/ml, différentes espèces d'eumyces filamenteux des types suivants : Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Botrytis, Cercospora, Helminthosporium, - Oidium, Mucor, Neurospora, Trichophyton et Microsporum sont également inhibées. A la concentration de 50 ylml, la thermozymocidine n'inhibe pas les bactéries Gram positives suivantes Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus Anthracis, Micrococcus flavus, Micrococcus lysodeikticus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Sarcina lutea, Diplococcus pneumoniae, Lactobacilluscasei, Corynebacterium agui et Corynebacterium diphteriae. Parallèlement à la concentration de 50 &gamma;/ml, thermozymocidine n'inhibe pas les bactéries Gram négatives suivantes Salmonella typhi murium, Salmonella paratyphi, Serratia Marcescens, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Alcaligenes faecalis, Shigella dysenterîae et Brucella abortus, ni les bactéries, résistantes aux acides, suivantes Mvcobacterium butvricum, Mycobacterium smeematis, Mvcobacterium tuberculosis et Mscobacterium phlei, ni les actinomyces suivants Nocardia blackwellii, Nocardia opaca, Streptomyces grises, Streptosporangium album et Welksmania rosea. Selon le procédé de l'invention, la souche produisant la thermozymocidine est produite en culture submergée dans un milieu nutritif aqueux à une température voisine de 40"C et à un pH compris entre 6,5 et 7,5, ceci dans des conditions aérobies et sous agitation. Le milieu de culture normal contient une source de carbone telle qu'amidon, dextrine, maltose, glucose, lactose et glycérol, et une source convenable d'azote organique, ou telle que les protéines ou leurs lysats d'azote inorganique. On peut également ajouter des sels inorganiques, tels que le phosphate de potassium et le sulfate de magnésium, ainsi que des silicones ou d'autres agents antimousse. Lorsque le développement nécessaire pour assurer les propriétés antibiotiques au milieu est atteint (normalement en trois jours), la thermozymocidine est isolée du bouillon de fermentation. Dans ce but, le bouillon de culture est soumis à un traitement par centrifugation ou filtration et le mycélium est extrait par le méthanol ou l'acétone pendant que la phase liquide est traitée par une résine échangeuse dotions à caractère faiblement acide ou basique. Cette phase liquide peut encore être extraite par un mélange de solvants. Les fractions actives brutes sont purifiées par chromatographie sur gel de silice, ensuite la cristallisation à partir de solvants organiques purs ou mélangéseut intervenir. La thermozymocidine se présente sous la forme d'une poudre blanche ayant les propriétés suivantes F. 168 à 1700C (décomposition). Pouvoir rotatoire :/ a I = + 40 + 8 (c = 0,12 dans la pyridine). -D Spectre d'absorption ultraviolet : 206 mu (méthanol). -l Spectre d'absorption infrarouge: 3375, 3180, 1710, 1665, 1605 et 1570 cm (Nujol). Analyse élémentaire : C H N Calculé pour C21H39N06 62,81 9,79 3,39 Trouvé 62,64 10,38 3,48 Réactions positives Réactions négatives : foline, biuret, sakaguchi, anthrone, naphtorésorcinol, triphényltétrazole et nitrate d'argent. Spectre de résonance magnétique nucléaire (CDCl3) d'un polyacétate obtenu avec de l'anhydride acétique dans la pyridine: : 2,02 (S,3); 2,05 (S,3); 2,1 (S,3); 4,;3 (S,2); 4,75 (m,l); 505 (m,3); 5,8 (d,2); 6,12 (m,l) ppm en outre des signaux complexes correspondant à 24 protons et se situant entre 0,8 et 2,6 ppm ont été enregistrés. Degré de solubilité : La thermozymocidine est insoluble dans l'éther de pétrole, ltéthyléther et le benzène; il est substantiellement insoluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isoamyle, l'acétone et l'eau; pas difficilement soluble (0,05 à 0,2%) dans le diméthylformamide, le chloroforme, la pyridine, le méthanol, méthanol et le n-butanol; soluble dans le diméthylsulfoxyde (approximativement 0,4%), dans une solution de soude 0,1 N (approximativement 1%), dans l'acide acétique et soluble à chaud dans l'acide chlorhydrique 2N. La figure ci-jointe représente le spectre infrarouge. La thermozymocidine a une stabilité remarquable. Son titre en antibiotique reste constant après 2 jours dans des solutions alcooliques ayant des pH compris entre 2 et 10 à 50qu. Les solutions alcooliques se révèlent stables après 1 mois à 40C. L'antibiotique n'est pas rendu inactif par le sérum bovin. La toxicité de préparations aqueuses de thermozymocidine a été déterminée sur des souris albinos par des injections suivant la méthode intrapéritonéale; on a constaté que la DLo est de 5 mg/kg et que la dose létale 50 est approximativement de 8 mg/kg. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On prépare une suspension de la souche productrice à partir de deux cultures inclinées de 2 à 3 jours sur un milieu pomme de terre-gélose-extrait de levure, lavées avec 5 à 10 ml de sérum physiologique; on inocule la suspension dans une fiole d'Erlenmeyer de 750 ml contenant 100 ml dtun milieu de culture de composition suivante Farine de mats 30 g K2HP04 3g MgSO4,7H2O 0,5 g Eau de source q.s.p. 1 000 ml On ajuste le milieu à pH 7 et on le stérilise à 121"C pendant 30 mn; après refroidissement-à 40 C et inoculation, on le place pendant 36 à 48 h dans une secoueuse linéaire à 120 cycles/mn (course 8 cm), en ajustant la température au moyen d'un thermostat à 40-430C. On utilise le bouillon de culture obtenu à partir de 3 à 5 de ces échantillons pour inoculer une cuve de fermentation de 10 1 contenant 5 1 du milieu décrit ci-dessus. Après culture pendant 48 h à 4O0C avec agitation à 400 tr/mn et aération à un débit de 0,5 1/1/mon, on utilise le bouillon de culture de cette cuve de fermentation pour inoculer au taux de 5% des cuves de fermentation de 20 1 contenant 12 litres du milieu décrit ci-dessus. Les conditions de fermentation pour la production de la thermozymocidine sont les suivantes : température 400C, agitation 500 tr/mn, aération 0,6-0,8 1/1/mon. On utilise également comme agent antimousse une émulsion de silicone vendue sous le nom de Antifoam FG-10 par la Société Dow Corning. Après fermentation pendant environ 80 h, on arrete la fermentation lorsque l'on a atteint la concentration la plus élevée en antibiotique (égale à environ 80 mg/l de bouillon de culture). Au cours de la fermentation, le pH ne présente pas de variations notables et sa valeur finale est de 6,8 à 7,2. EXEMPLE 2 On soumet à un traitement de centrifugation, 50 1 de bouillon de culture obtenu à l'exemple 1. On extrait deux fois le mycélium avec 2 1 d'acétone, en agitant pendant 4 h à la température ambiante. On verse les extrais acétoniques dans la couche surnageante provenant du traitement de centrifugation du bouillon de culture. I1 se forme un léger précipité que l'on sépare par filtration sur Cellite et on fait passer le filtrat sur une colonne contenant 3 kg d'une résine faiblement acide vendue sous le nom d'Amberlite IRC-50, sous forme acide, au débit de 4 l/h. De cette manière, l'adsorption de l'antibiotique s'effectue avec des rendements supérieurs à 907.. On lave ensuite la colonne avec 6 1 d'eau distillée puis on commence à éluer, d'abord avec 10 1 d'ammoniaque 1 N, permettant de séparer. les 5 à 6 premiers litres, et ensuite avec 5 1 d'un mélange ammoniaque 1 Nméthanol 1:1 en volume. On concentre les fractions actives combinées par évaporation sous pression réduite à une température d'environ 800C pour réduire le volume à 3 1. On extrait ensuite la fraction concentrée deux fois avec 1 litre de n-butanol, On évapore à siccité les extraits butanoliques combinés par évaporation sous pression réduite à environ 80"C. De cette manière, on obtient 15 à 16 g d'antibiotique pur que lton traite ensuite trois fois avec 150 ml d'acétate d'éthyle. On sépare la fraction inactive. On obtient environ 2,2 g du produit actif blanc jaunâtre que l'on chromatographie sur gel de silice, enéluant avec un mélange acétate d'isoamyîe méthanol-acide formique-eau 65:25:5:5 en volume. On obtient 1,5 g d'antibiotique de pureté analytique par recristallisation dans un mélange chloroforme-éthanol, I1 est enténdu que les modes de réalisation décrits ci-dessus ne sont pas limitatif s et que l'homme de l'art pourra y apporter diverses modifications sans toutefois s'écarter du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication d'un antibiotique dénommé 'thermo- zymocidine", caractérisé en ce que l'on cultive un micro-organisme appartenant au groupe des eumyces thermophiles et portant la référence ATCC nO 20349, dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone organique et une source d'azote organique ou inorganique, à une température d'environ 40"C à pH 6,5-7,5 et en culture submergée et en conditions aérobies, en agitant jusqu'à ce que le milieu ait acquis une activite antibiotique notable et on isole ladite thermozymocidine du bouillon de fermentation. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu t on utilise comme source d'azote orgariique une substance choisie parmi les protéines ou leurs peptones solubles. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme source de carbone une substance choisie parmi l'amidon, la dextrine, le maltose, le glucose, le lactose et le glycérol. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet le bouillon de fermentation à un traitement de centrifugation ou de filtration et on soumet le mycélium à l'extraction par solvant, en traitant l'extrait par une résine échangeuse d'ions faiblement acide ou basique et on purifie les fractions actives brutes par chromatographie sur gel de silice et recristallisation dans un solvant organique pur ou un mélange solvant. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit solvant est choisi parmi l'acétone et le méthanol. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit solvant est un mélange de solvants. 7 - Nouveau médicament dénommé thermozymocidine, utile comme antibiotique, en particulier contre les levures et les moisissures,caraco- risé ence qu'il répond à la formule suivante