Brevet FR2159246A1 — publié le 19730622

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique, appelé "G-418", ainsi que sa préparation par culture de deux espèces microbiologiques inconnues jusqu'à présent, du genre MicromonosPora, à savoir Micromonospora rhodorangea et Micro monospora prise. L'invention concerne en outre un autre nouvel antibiotique appelé "verdamicine I", qui est produit en même temps que l'antibiotique G-418 par culture de Micromonospora grisez. De plus, l'invention concerne de nouveaux procédés pour la peépara- tion des antibiotiques connus que sont la "sisomicine" et la "gentamicine A" qui sont aussi produits, en même temps que les nouveaux antibiotiques précités, par culture de Micromonospora grisea. L'invention s'étend également aux dérivés pharmaceutique. ment acceptables des nouveaux antibiotiques que sont la verdamicine I et G-418, tels que les sels d'addition d'acide et les dérivés type oxazolidine-base de Schiff, qui sont aussi des antibiotiques de valeur. L'invention concerne en outre les compositions pharmaceutiques contenant l'un au moins des nouveaux antibiotiques G-418 et verdamicine I, ainsi que leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables. 'les microorganismes A. Micromonospora rhodorangea (parfois désigné dans le présent texte par M. rhodorangea) a été classé comme étant une nouvelle espèce de Micromonos@ra d'après ses propriétés taxonomiques et ses propriétés de croissance, sur de nombreux milieux nutritifs classiques à base d'agar. Zur de tels milieux, les colonies ont un aspect rouge orangé et@par conséquent le microorganisme a été appelé Micromonospora rLdoranea. La production de l'antibiotique G-418 est une caractérb+ique de cette espèce. Micromonospora rhodorangea a fait l'objet d un dépôt à la "Northern Utilization Research and Developmen- Division", Departement américain de l'agriculture, Peoria, Illinois, et a été ajouté à la collection de microorganismes de et Institut sous la référence "NRRL 5326". Ce microorganisme possède les propriétés microscopiques macroscopiques et biochimiques suivantes Taxonomie (a) L'observation macroscopique d'une culture agée de 30 jours, incubée à 240-260C, sur un milieu à 3% du produit aminé connu sous la dénomination commerciale "NZ Amine Type A", 1% de dextrose et 1,5% d'agar, montre une faible croissance avec une absence de caractéristiques distinctives visibles. (b) 'l'observation microscopique de la même culture montre que le mycélium d'environ 0,4-0,8 micron de diamètre est faiblement ramifié. On observe à l'occasion des chlamydospores; cependant on n'observe pas de véritables spores. Ainsi, l'espèce apparaît être une espèce non-sporulée. (c) Des observations effectuées sur l'agar d'Emerson, l'agar de Bennett, le mélange extrait de levure-dextrose-agar et le melange amidon-agar donnent substantiellement les mêmes résultats que ceux indiqués dans le paragraphe (b) ci-dessus. Ce microorganisme est aérobie et il peut être cultivé, d'une manière appropriée à des températures allant de 200 à 400C et à un pH de 6,5 à 8,5. L'intervalle préféré de températures est de 28 à 350C et l'intervalle préféré de pH va de 7,2 à 8,3. I1 ne se produit pas de croissance à 450C ou au-dessus de cette température. Micromonos-pora rhodorangea réduit les nitrates. Dans les descriptions des microorganismes M.rhodorangea et M. prise dans la présente description, on utilise deux systèmes de désignation des couleurs. Be premier système de désignation des couleurs est celui de "Color Harmony Manual", 4ème édition, 1958, édité par Container Corporation of America (Etats-Unis d'Amérique) et la description correspondante peut en être prise dans "Descriptive Color Name Dictionary" par Taylor, Knoche et Granville, également édité par Container Corporation of America (1950). Le second système de désignation des couleurs est équivalent ou presque équivalent au premier et se trouve dans "National Bureau of Standards Circular NO 553" (1955) (Etats-Unis d'Amérique). Les tableaux I, II et III montrent une caractérisation complémentaire de M. rhodorangea TABLEAU I OBSERVATIONS DES COLONIES DE MICROMONOSPORA RHODORANGEA SUR DIVERS MI'lIEUX Milieu Observation Glucose Asparagine pas de croissance Agar Gélatine faible liquéfaction Irait bonne croissance, hydrolyse complète, plissement de la colonie, rouge coeur brillant g6pa, orangé rougeâtre vif 34 Saccharose utilisation Amidon bonne croissance, hydrolyse complète Cellulose décomposition Saccharose-agar de faible croissance, plane, couleur Czapek connu sous Bourgogne g7pl, grisâtre sombre, brun dénomination commer- rougeâtre 47 ciale "Difoo" Agar de Bennett bonne croissance, plissement, membra neuse, pas de mycélium aérien, pas de pigment diffusable, couleur : rouge de Chine g6pg, orangé rougeâtre intense 36 Purée de tomate faible croissance, non enregistrable Farine d'avoine, Agar Glucose croissance modérée, colonie membraneuse, Extrait de levure pas de mycélium aérien, pas de pigment Agar diffusable, couleur : rouge étable "g6pg barn red" type brun rougeâtre 43 Tranche de pomme de terre pas de croissance Saccharose faible croissance, plane, couleur : vin Agar nitraté sombre g 7 + pi,brun rougeâtre sombre 44 (Agar de Czapek) TABLEAU I (suite) Milieu Observation Tyrosine faible croissance, plissement, cristaux Agar (levure de tyrosine) dissous, pigment diffusable ambre sombre. Viande de boeuf à la faible croissance, plane, cristaux non tyrosine dissous, pigment diffusable ambre faible. Observations 2,7 et 14 jours (d'après Gordon Smith, J.Bact. 69:147 Peptone pas de croissance Agar avec fer Observations à 2,7 et 14 jours Solution de glucose-Czapek faible croissance à 3 et 10 jours, texture : un précipité très fin et floconneux, une couleur terne jaune orangé présente dans le bouillon après 10 jours d'incubation. Lait pourpre au bromocrésol complètement peptonisée, marron sombre TABLEAU II UTILISATION DES HYDRATES DE CARBONE Hydrate de carbone Observation L (+) Arabinose croissance modérée D (-) Arabinose Cellulose " assez bonne D (+) Glucose " bonne D (-) Galactose " assez bonne /3 Lactose D (-) Lévulose (Fructose) " faible D (+) Mannose " bonne D (+) Raffinose " faible L (+) Rhamnose Amidon " bonne TABLEAU II (suite) Hydrate de carbone Observation Saccharose croissance bonne D (+) Xylose " I' i - Inositol " faible D (+) Mannitol " " Sorbitol Témoin 0,5% d'extrait de levure " TABLEAU III UTILISATION DE SOURCES D'AZOTE Sources d'azote Observation + 1 ffi de glucose 0,5% d'extrait de levure croissance modérée, membraneuse, "Difco" pas de mycélium aérien, pas de pigment diffusable, couleur : rouge étable g 6 pg ("g 6 pg barn red"), brun rougeâtre intense 41 1 ,o% de "NZ Amine croissance assez bonne, plane, Type A" présence de sillons, pas de mycé lium aérien, pas de pigment diffu sable, rouge de Chine g6pc, orange rougeâtre intense 36 1% d'asparagine croissance faible, plane, pas de mycélium aérien, pas de pigment diffusable, brun aeajou g6pi, brun rougeâtre intense 41 1% d'acide glutamique croissance faible, plane, pas de mycélium aérien, pas de pigment diffusable, couleur vin sombre g7pi, brun rougeâtre sombre 44 1% de nitrate de sodium pas de croissance 1% de nitrate d 'ammonium pas de croissance B.Micromonospora Grisea Le microorganisme Micromonospora grisea (parfois appelé ici M. prise) a été obtenu à partir d'échantillons de sol dans le voisinage de Topeka, Pansas. Ce microorganisme a été déposé au Département de l'Agriculture des Etats-Unis, "Northern Utilization Research and Development Division", Peoria, Illinois, organisme autres duquel des cultures sont disponibles, ce microorganisme ayant reçu la désignation numérique officielle "NRRL 3800". Micromonospora prise a été classé comme une nouvelle espèce de Micromonospora d'après ses caractéristiques taxonomiques et de croissance sur de nombreux milieux classiques. Micromonospora prise donne un pigment gris-vert lorsqu'il est cultivé sur divers milieux, tels que le milieu de caractérisation donné ci-dessous. Tes caractéristiques les plus distinctives de Micromonospora grisea consistent en son aptitude, sous des conditions controlées, à élaborer un produit actif comme antibiotique, qui est constitué de quatre constituants essentiels, qui seront définis ci-après, en même temps que de quantités mineures d'autres substances, non encore identifiées. Milieu de caractérisation 'levure connue sous la dénomination 0,5 % commerciale "Difoo" Saccharose 3,0 % Carbonate de calcium 0,1 % Agar "Difco" 1,5 %0 Eau distillée 1,0 'lorsqu'on inocule le milieu stérilisé au moyen de Micromonospora prise et que l'on effectue l'incubation à 260-280C pendant 24 jours, on observe l'évolution suivante de couleur Aire de sporulation : vert ardoise g231i, vert grisâtre 150; par incubation prolongée, l'aire de sporulation peut devenir noire. Aire végétative : tan clair g3gc, brun jaunâtre clair 76. Micromonospora grisez peut être en outre caractérisé par les données taxonomiques ci-après Milieu : 3% de produit aminé connu sous la dénomination commerciale "NZ Amine Iype A", 1% de dextrose, 1,5% d'agar Observations (21 jours après inoculation) Observation macroscoPique Observation microscopique Croissance assez bonne Mycélium long, faiblement plissement ; périphérie: ramifié, 0,5-0,8 micron de tan clair g3gc, brun diamètre. Spores relativement jaunâtre clair. Centre: abondantes, produites isolécouleur castor g31i, brun ment, apparaissant colorées jaunâtre - grisâtre sombre en brun par transmission de 81 lumière, 1,0-1,5 micron de diamètre, apparaissant à parois rugueuses ou d'aspect grossier. Micromonospora grises ne réduit pas les nitrates, croit bien sur la gélatine, en provoquant l'hydrolyse et croît dans les milieux contenant 1 ,5% de chlorure de sodium, mais ne croît pas dans les milieux similaires contenant 3% de chlorure de sodium. Micromonospora grisea nécessite des sources assimilables de carbone et d'azote pour une bonne croissance et la production de substances antibiotiques. On peut utiliser une grande variété de telles sources. Ce microorganisme est aérobie et croît à des températures allant de 20 à 400C, de préférence de 28 à 350C, et à des pH allant de 6,5 à 8,5, de préférence de 7,2 à 8,3. En plus des données taxonomiques précitées, les tableaux IV, V et VI caractérisent encore M. grisez TABLEAU IV OBSERVATIONS DES COLONIES DE MICROMONOSPORA GRISEA SUR DIVERS MILIEUX Milieu Observation Milieu de Czapek croissance : faible, ne se prête pas (glucose) à une description Milieu asparagine- croissance : assez bonne à faible, glucose granulaire, brun clair g31g, brun jaunâtre modéré 77 Calcium croissance : faible, ne se prête pas Malate à la description Agar Agar ordinaire croissance : faible, ne se prête pas (Agar aqueux) à la description Agar nutritif croissance : faible, ne se prête pas à la description Milieu de sérum de croissance : faible, pas de réaction Toeffler ("Difco") Morceau de pomme de te croissance : bonne, plissement, couleur : tan clair g3gc, brun jaunâtre clair 76 Peptone et glucose croissance : faible, ne se prête pas Agar à une description Oeufs et agar milieu croissance : faible, pas de réaction d'oeufs du Dorset (Difco) Amidon croissance : bonne, plissement avec Agar sillons, pas de mycélium aérien couleur : brun moutarde g2NI, olive modéré 107 hydrolyse : positive Tournesol Peptonisation partielle avec réaction Lait (Difco) acide Milieu de cellulose Décomposition très lente, exigeant 3 à 6 mois ou plus Agar de Bennett croissance : bonne, plissement, lierre g24ml, vert grisâtre sombre 151 TABLEAU IV (suite) Milieu Observation Agar d'Emerson croissance : assez bonne, culture plane, tan clair g3gc, brun jaunâtre clair 76 Purée de tomate croissance : assez bonne, saillies Farine d'avoine, agar et sillons, abricot g4ga, orange clair 52 Glucose, extrait de croissance : bonne, culture plissée, levure agar couleur chameau g31 E, brun jau nâtre modéré 77 Tranche de pomme de terre croissance : bonne, plissement, tan clair g3gc, brun jaunâtre clair 76 Saccharose croissance : assez bonne, plane, Nitrate-agar beige clair g3ec, brun grisâtre (agar de Czapek) jaunâtre clair 79 Tyrosine-agar croissance : faible, pas de réaction de couleur Observations à 2, 7 et 14 jours (d'après Gordon et Smith, J.Bact. 69:147) Peptone croissance : assez bonne, pas de Fer Agar réaction de couleur Observations à 2, 7 et 14 jours Glucose-asparagine croissance : assez bonne à faible, Agar granulaire, brun clair g3 1 g, brun jaunâtre modéré 77 Lait Hydrolyse : positive croissance : faible Solution de glucose- croissance à 3 et 10 jours : faible, Czapek texture non observable, couleur jaune paille pâle présente dans le bouillon après 10 jours d'incu bation. TABLEAU V UTILISATION DES HYDRATES DE CARBONE Hydrate de carbone Croissance L (+) Arabinose bonne D (-) Arabinose D (+) Glucose D (-) Lévulose D (+) Mannose Saccharose D (+) Xylose Amidon Dulcitol faible D (+) Galactose Glycérol i-Inositol Lactose D (+) Mannitol -D ( + )Mélibiose D (+) Mélézitose D (+) Raffinose L (+) Rhamnose Salicine Témoin : 0,5% d'extrait de levure TABLEAU VI UTILISATION DE SOURCES D'AZOTE Source d'azote : Observation de la croissance (+ 1% de glucose) 0,5% d'extrait de levure : bonne "Difco" 1,0% de "NZ Amine : bonne Type A" 1% d'asparagine : faible 1% d'acide glutamique : faible 1% de nitrate de sodium : faible 1% de nitrate d'ammonium : faible Le tableau VII compare M. prise et M. rhodorangea avec d'autres Nicromonospora qui produisent des antibiotiques. TABLEAU VII - COMPARAISON DE MICROMONOSPORA GRISEA ET M. RHODORANGEA AVEC D'AUTRES MICROMONOSPORA M. purpurea M. echinospora M. carbonacea M. carbonacea M. megalomicea M. grisea M. rhodoranges (NRRL 2953) (NRRL 2985) Variété carbo- Variété auran- (NRRL 3274 et (NRRL 3800) (NRRL 5326) nacea (NRRL 2972) tiaca (NRRL 2997) 3275 Sporophores longs Oui* Oui Oui Oui Oui Oui Non Sporophores ramifiés Oui* Oui Oui Oui Oui Oui Non Sporophores courts Oui* Oui Oui Oui Oui Oui Non Croissance sur assez bonne assez bonne assez bonne assez bonne faible faible faible milieu nutritif à faible à faible à faible à faible d'agar Croissance sur la pomme de faible faible assez boone assez bonne non bonne faible terre Liquéfaction de faible faible Oui Oui Non Oui Oui la gélatine Hydrolyse de Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui l'amidon Inversion du Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui saccharcse Décomposition attaquée à attquée à un attaquée à un attaquée à un Non Lente Oui de la un faible faible degré faible degréc faible degréc cellulose degré Antagonisme Gentamieines Gentamicines Everninomicines Everninomicines Mégalomicines Antibiotique Antibiotique G-418 G-418 VerdamicineI Sisomicine Gentamicine A * Sporulation faible ou abortive Fermentation de Micromonospora rhodorangea et de Micromonospora prise La fermentation est effectuée en utilisant des méthodes classiques pour la préparation des antibiotiques par culture de microorganismes. Des quantités substantielles d'antibiotiques sont produites lorsque les microorganismes respectifs sont cultivés dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies, de préférence en aérobie submergée. Comme exemple de sources de carbone assimilables, on peut citer les hydrates de carbone, tels que ceux donnés dans les tableaux II et V, spécialement le glucose, le xylose et le mannose. Comme exemple de sources assimilables d'azote, on peut citer les protéines et les amino-acides, et les substances contenant ceux-ci, tel que l'extrait de viande de boeuf, l'extrait de levure et la farine de soja. Une bonne croissance et une bonne production des antibiotiques peuvent être obtenues en utilisant le processus de fermentation donné ici dans les exemples 1 et 5 à 7. Les milieux peuvent être additionnés de traces de sels inorganiques, tels que le sulfate de magnésium, le sulfate ferreux, et spécialement le chlorure de cobalt, pour favoriser la production des antibiotiques. La fermentation est habituellement effectuée en deux ou trois étapes, la première étape ou les deux premières étapes étant réservées à la germination du microorganisme, pour produire un inoculum approprié. En règle générale, des fermentations intéressant des gros volumes (réservoir) exigent deux étapes de germination tandis que des fermentations en flacon, ballon ou récipient agité nécessitent seulement une étape de germination. Les étapes de germination sont effectuées dans des conditions aérobies sous agitation, de préférence par agitation rotatoire à par exemple environ 250 à 400 tours par minute, habituellement à une température de l'ordre d'environ 250 à environ 350C, pendant un à quatre jours. La dernière étape de fermentation (étape de production) commenee par l'inoculation, dans des conditions stériles, d'un milieu approprié avec l'inoculum préalablement préparé. L'étape de production du processus de fermentation est habituellement effectuée dans le même intervalle de température que l'étape de germination. De plus, elle exige habituellement environ 4 à environ 7 jours pour atteindre l'activité de pic (activité maximale). A l'inverse du stade de germination, où le pH reste habituellement stable, l'étape de production nécessite une régulation du pH dans un intervalle allant d'environ 7,2 à environ 8,3, spécialement lorsqu'on utilise M. prise. Au cours de la fermentation, particulièrement après les 24 premières heures, la fermentation est soumise à des essais, à des intervalles appropriés (par exemple tous les 6 à 8 heures), pour déterminer le moment où le pic d'activité antibiotique est atteint. Llessai est de préférence un essai avec une plaque normalisée, en forme de disque, en utilisant un milieu normalisé et l'organisme à essayer. Des détails des essais préférés sont donnés dans une autre partie de la présente description. Isolement des antibiotiques Lorsque l'activité antibiotique de pic est atteinte, le produit est récolté, généralement par une combinaison d'étapes telle que l'acidification, la filtration, l'adsorption, l'élution et l'évaporation, par exemple sous lyophilisation. Dans un processus d'isolement préféré, les ions calcium présents sont précipités sous forme de sel insoluble, l'ensemble du bouillon étant acidifié, de préférence au moyen d'un acide minéral, et le mélange de fermentation est clarifié par filtration ou centrifugation. Après neutralisation, l'antibiotique est adsorbé sur une résine échangeuse de cations appropriée, par exemple une résine échangeuse d'ions faiblement acide sous forme ammonium, puis élué avec un alcali dilué, de préférence de l'hydroxyde d'ammonium, et enfin isolé par évaporation, par exemple par lyophilisation. Selon un processus que l'on préfère tout particulièrement, on ajoute à l'ensemble du bouillon de l'acide oxalique, approximativement 5 à 8 grammes/litre de fermentation, pour précipiter le calcium sous forme d'oxalate insoluble, et l'on ajuste le pH du milieu de fermentation à 2,0 avec un acide minéral fort, par exemple l'acide sulfurique 6N. pour libérer l'antibiotique du mycélium. Après filtration, le bouillon clarifié est neutralisé avec de l'hydroxyde d'ammonium, les antibiotiques sont adsorbés sur la résine échangeuse d'ions connus sous la dénomination commerciale "Amberlite IRC-50" (forme NH+4) dont les particules correspondent à des ouvertures de tamis de 20 à 50 mailles/2,4 cm (fabriquée par Rohm and Haas, Philadelphie, Pennsylvanie) et le bouillon épuisé (c'est-à-dire extrait) est jeté.La composition antibiotique est éluée de la résine avec une base, de préférence l'hydroxyde d'ammonium 2N, à la suite de quoi l'éluat est concentré jusqu'à un petit volume sous vide et évaporé jusqu'à siccité, par exemple par lyophilisation. 'les antibiotiques A. Antibiotiques produits par culture de Micromonospora rhodorangea En soumettant le produit brut obtenu dans l'étape d'isolement à la chromatographie et à la bioautographie, on observe une pluralité de zones d'inhibition. Par exemple, en utilisant un système chromatographique constitué de 2-butanone/butanol tertiaire/ méthanol/ammoniac concentré, dans les proportions respectives de 16:3:1:6 (en volume), sur du papier Whatman NO 4, en descendant pendant toute une nuit (16 heures), on détecte, par bioautographie vis-à-vis de Staphylococcus aureus ATCC6538P, un produit majeur ou principal et environ cinq produits mineurs. te produit majeur, qui est l'antibiotique dénommé G-418, comme indiqué plus haut, est le moins polaire du groupe.D'après les résultats numériques physico-chimiques suivants et d'après la dégradation chimique, on croit que l'antibiotique G-418 possède la structure montrée par la formule I ci-après. Cependant, il n'y a pas lieu de tirer de cette formule structurale des conclusions d'ordre stéréochimique. Lorsqu'il est soumis à des processus chromatographiques normalisés, l'antibiotique G-418 substantiellement pur présente le schéma suivant R f Rt (16 h.) I. Chloroforme-méthanol-ammoniac concentré sur le produit connu sous la dénomina tion commerciale "Chromar 500" (montée) 0,40 II. 2-butanone-butanol tertiaire-méthanol ammoniac concentré (descente) 0,24 III. Phénol aqueux à 80% (montée) 0,32 IV. Méthanol-eau + 3% NaCl (descente) 0,64 V.Propanol-pyridine-acide acétique eau (descente) 0,51 distance de la zone depuis l'origine Rt a à l'instant t distance de l'origine jusqu a la fin du papier L'antibiotique G-418 est un aminoglucoside et par conséquent il appartient à la classe qui comprend la gentamicine, la néomycine, la paromomycine, la sisomicine et la kanamycine. Il est habituellement isolé sous la forme d'un solide blanc amorphe ayant les constantes physiques suivantes : point de fusion 1381440C; pouvoir rotatoire : + 1400+ 90 (dans l'eau; concentration égale à 0,3); poids moléculaire (par spectométrie de masse) : 497; formule brute : C20H40010N4 (base); C20H40010N4. 2H2804 (sulfate). Le spectre de résonance magnétique nucléaire est substantiellement tel que représenté sur la figure 4 des dessins ci-joints, qui a été obtenue à partir d'une solution contenant 15% d'antibiotique G-418 dans le deutério-mdthanol avec 3% de tétraméthylsilane ajouté comme référence interne. Spectre infrarouge : dans une huile minérale, ce spectre étant représenté sur la figure 3 des dessins ci-joints et présentant les bandes caractéristiques d'absorption ci-après 3,02 (S) 9,07 (S) 11,86 (W) 6,32 (M) 9,49 a (S) 13,05 )} (W) 7,76 (W) 9,77 (S) 13,87 (W) 8,70 r(M) 10,42 (M) (S) = Forte (M) = Moyenne (W) = Faible. B. Antibiotiques produits par culture de Micromonospora grisea. La détection des antibiotiques et la détermination de l'homogénéité des fractions est effectuée par chromatographie sur papier et est réalisée par deux méthodes : 1) par l'utilisa tion de réactifs, et 2) par un processus microbien. La première méthode est effectuée en pulvérisant sur les chromatogrammes sur papier de la ninhydrine à 0,25% dans le mélange pyridine-acétone et en chauffant ensuite à 1050C, pendant plusieurs minutes. Les zones apparaissent comme des taches colorées sur un fond blanc La détection microbienne des zones antibiotiques est effectuée en étendant le papier sur une plaque d'agar ensemencée avec Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Au bout de dix minutes, le papier est retiré et après une période d'incubation appropriée (habituellement 16 à 18 heures), les zones d'inhibition représentant les antibiotiques Dnt observées. Ce; essais et des essais similaires montrent que le produit antibiotique obtenu par le procédé de fermentation décrit ci-dessus comprend une pluralité de constituants. Quatre de ces constituants apparaissent comme constituant la majeure partie du produit; ils sont désignés par l'expression "les quatre constituants principaux" da@s la suite de la présente description. La séparation est obtenue par une quelconque des nom reuses techniques bien connues de l'art antérieur, telle que l'ext@action à contre-courant ou la chromatographie sur résines échangeuses d'ions ou sur d'autres adsorbants solides tels que le gel de silice, le produit connu sous la dénomination commerciale "chromosorb" et la cellulose. On préfère la chromatographie sur gel de silice. Les deux premiers des quatre constituants principaux sont élués avec la phase inférieure d'un mélange de solvants constitué de chloroforme, d'isopropanol et d'hydroxyde d'ammonium concentré (proportions volumiques respectives 2:1:1); l'élution est continuée avec la phase inférieure d'un mélange 1:1:1 des mêmes solvants jusqu'à ce que la désorption des antibiotiques restants soit complète. D'après diverses données numériques d'ordre physique, chimique et biologique, on peut montrer que ces quatre constituants principaux sont 1. La verdamicine I, qui constitue un antibiotique inconnu jusqu'à présent. 2. La sisomicine; les propriétés biologiques de la sisomicine sont décrites dans "Journal of Antibiotics" Vol. XXIII NO 11, pages 551-565. La préparation et les propriétés de l'antibiotique sont décrits dans le brevet belge NO 735,145. 3. L'antibiotique G-418; celui-ci est aussi produit par culture de Micromonospora rhodoran,wea décrit plus haut. 4. La gentamicine A; les propriétés antibactériennes de la gentamicine A ont été données par Weinstein et al dans "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", 1965, pages 816 820, et sa structure a été publiée par Maehr et Schaffner dans "Journal of the American Chemical Society", 89:25, December 6, 1967. Be comportement de ces quatre constituants principaux lors de la chromatographie sur papier est donné dans le tableau VIII. En plus de ces quatre constituants principaux, il est quelquefois possible de détecter la présence d'autres substances antibactériennes. Cependant, ces substances sont produites en quantités tellement petites que leur isolement, purification et caractérisation ne se sont pas effectués avec succès. Par exemple, un extrait brut contenant substantiellement tous les antibiotiques produits par fermentation a été réduit de volume de façon à former un concentré sipureux. Ce concentré a été ensuite soumis à une chromatographie ascendante sur le produit connu sous la dénomination commerciale "Chromar 500", pendant environ une heure, en utilisant un système constitué par du chloroforme, du méthanol et de l'hydroxyde d'ammonium concentré (proportions volumiques respectives 1:1:1).Le chromatogramme obtenu a été ensuite bioautographié en utilisant Staphylococcus aureus ATCC 6538P, ce qui a à peine permis de détecter de petites quantités de trois produits de fermentation additionnels. Ces produits présentaient les valeurs suivantes de Rf (pas plus précises que ne le permettait leur détermination) : 0,41 ; 0,30 et 0,12. TABLEAU VIII VALEURS COMPAREES DE R f ET DE R t Rf des antibiotiques Systèmes de chroma-: Verda- :Sisomicine:Antibio :Gentamicine tographie sur : micine : : tique : A papier . I . : G-418 Chloroforme: 0,65 0,58 0,41 0,18 mé thanol hydroxyde d'ammo nium concentré (1:1:1) sur feuille de "Chromar 500" en montée Rt des antibiotiques t = 6 heures Chloroforme : 0,40 0,21 0,05 méthanol: hydroxyde d'ammonium à 17 % (2:1:1) sur papier Whatman N 1, en descente Rt des antibiotiques t = 16 heures 2-butanone tertiobutanol : 0,44 0,36 0,27 méthanol : hydroxyde d'ammonium concentré (16:3:1:6) sur papier Whatman N 1, en descente distance de la zone à partir de l'origine Rt = distance depuis l'origine usqu' à la fin à l'instant t distance depuis @ origine jusqu a la @@n du papier Commé mentionné plus haut, l'analyse physico-chimique de la verdamicine I indique qu'il s'agit d'une substance nouvelle cependant, sa structure présente une relation avec celle de la gentamicine C2.L'hydrolyse de ces deux antibiotiques au moyen d'acide chlorhydrique 6N à 1000C et pendant deux heures, suivie d'une chromatographie sur papier dans un système de solvants constitué soit (1) de n-butanol, de pyridine, d'eau et d'acide acétique dans les proportions respectives volumiques de 6:4:3:1, soit (2) de propanol, de pyridine, d'eau, et d'acide acétique dans les proportions respectives volumiques de 6:4:3:1, avec pulvérisation subséquente de ninhydrine sur les chromatogrammes, révèle clairement que la gentamicine C2 et la verdamicine I donnent des produits d'hydrolyse qui sont différents. Dans les deux systèmes, les chromatogrammes indiquent la présence de deux produits communs dont l'un est la 2-désoxystreptamine. Be produit résiduel d'hydrolyse de la verdamicine I est cependant non semblable au produit correspondant de la gentamicine C2. Sur la base des résultats numériques d'ordre physique et chimique donnés plus loin et d'après l'analyse de ses produits d'hydrolyse, on croit que la verdamicine I possède la formule structurale suivante sans que l'on puisse lui assigner une configuration stéréochimique. Les propriétés chimiques et physiques de la verdamicine I sont données dans le tableau IX ci-après TABLEAU IX Propriétés physiques et chimiques de la verdamicine I (1) Base Sulfate Analyse Moyenne Moyenne Moyenne Moyenne élémentaire de 2 de 2 de 2 de 2 C 47,98 48,04 31,10 30,95 H 8,13 8,22 6,61 6,60 N 13,43 13,28 8,99 8,69 O(par différence) 30,45 30,47 504 - 29,30 Pouvoir rota- + 155,70 + 167,10 + 96,50 + 99,40 toire dans l'eau c = 0,3 c = 0,3 c = 0,3 c = 0,3 Equivalent en poids 108,5 104,9 pKa 8,1 8,1 Formule brute C20H39 7N5 ( )L'analyse est en accord avec la formule C20H3907N5*3H20 c désigne la concentration. La verdamicine I forme facilement des produits de solvatation et des hydrates à partir desquels il est difficile d'obtenir l'antibiotique non solvaté ou anhydre. En conséquenceR l'analyse élémentaire donnée dans le tableau IX est en excellent accord avec celle correspondant au trihydrate de l'antibiotique (c'est-à-dire C20H3907H5.3H2O). La verdamicine I ne présente pas d'absorption dans l'intervalle d'ultraviolet allant de 220 à 400 millimicrons. De plus, cet antibiotique est stable à l'ébullition pendant au moins trente minutes dans des tampons 0,1 molaires dans l'intervalle de pH 2-10. La verdamicine I(base libre) possède un spectre de résonance magnétique nucléaire caractéristique qui est représenté sur la figure 2 des dessins ci-joints. Ce spectre de résonance magnétique nucléaire (spectre RMN) est obtenu en utilisant un spectromètre du type connu sous la dénomination "Varian A-60-A" (Varian Associates, 611 Hansen Way, Palo Alto, Californie) et en opérant sur une solution d'environ ,31 ml contenant environ 22 mg d'antibiotique dans un mélange oxyde de deutérium (D20) diméthylsulfoxyde (DMSO). Le spectre est enregistré en parties par million (PPM) à partir du sel de sodium de l'acide 3-(triméthylsilyl)-propanesulfonique, référence interne. Le sulfate de verdamicine I possède un spectre d'absorption infrarouge caractéristique dans l'huile minérale (Nujol) comme représenté sur la figure 1 des dessins ci-joints. Les bandes d'absorption les plus caractéristiques sont données dans le tableau X ci-après. TABLEAU X Bandes d'absorption infrarouge caractéristiques Sulfate de verdamicine I 2,9 - 3,8 (VS, VB) 7,25 (huile minérale) 3,38- 3,52 (huile minérale) 7,75 (W-M) 4,25 (P) 8,6 - 9,6 y (VS, VB) 4,80 (W,B) 10,30 (W-M) 5,93 (P) 10,92 (P) 6,16 , > (MS) 11,42 (W) 6,50 y (MS) 12,10 (Vw, B) 6,83 (huile minérale)12,75 (Vw, B) Notations : B = Barge M = Moyenne P = Palier ou S = Forte V = Très W = faible épaulement D'autres propriétés chimiques et physiques des antibiotiques verdamicine I et G-418 sont données dans les tableaux XI et XII ci-après TABLEAU XI Essais de classification de l'antibiotique Pulvérisa- : Réactif :Hypochlorite: Essai d'Elson : tion de : de Amidon KI :Morgan ninhydrine : Sakaguchi: Verdamicine I (Sulfate) . Positif : Négatif : Positif : Négatif ANtibiotique G-418 : Positif : Négatif : Positif : Négatif (sulfate) TABLEAU XII Solubilité tTerminologie correspondant à celle définie à la page 8, chapitre XVIII de "Pharmacopeia (Etats-Unis)] Solvant : Verdamicine I : Verdamicine I : Antibiotique:Antibiotique (Sulfate) : W418 : G-418 (Sulfate)' Méthanol: faiblement : insoluble : faiblement : insoluble soluble : : soluble Chloro- :faiblement :très légèrement:très légère- très légère forme soluble soluble ment soluble :ment soluble Benzène très légèrement: insoluble : insoluble : insoluble soluble Essai microbiolo,gique de l'antibiotique G-418 Cet essai utilise un disque normalisé et le milieu antibiotique N 5 (Difco), avec Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme d'essai. Les conditions physiques de l'essai sont substantiellement celles décrites, par Grove et Randall pour la néomycine dans "Assay Methods of Antibiotics", édité par Medical Encyclopedia Incorporated (1955). Llessai est effectué par rapport à une préparation de référence de l'antibiotique G-418 ayant une puissance de 1000 g/mg. Un microgramme de cette préparation de référence donne une zone d'inhibition de 16,5 # 1,5 mm, dans cet essai.L'antibiotique sulfate de référence titre environ 7502tg/mg par rapport à l'antibiotique base de référence. Essai microbiolo,gique de la verdamicine I et d'autres antibiotiques produits par M. prise L'essai microbiologique des substances antibiotiques est un essai avec un- disque plat, en utilisant Staphylococcus aureus ATCC 6538P comme organisme d'essai. 'les conditions physiques de l'essai sont similaires à celles décrites pour la gentamicine (Oden et al., "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", 1963, American Society for Microbiology). La verdamicine I base, de référence, possède une puissance définie de 1000 g/mg. Un de de la référence, dans les conditions de cet essai, donne une zone d'inhibition de 17,0 + 1,3 mm. La verdamicine I base titre 1000 g/mg dans l'essai de gentamicine et la courbe de réponse à la dose de verdamicine est parallèle à celle de la gentamicine.La verdamicine I sulfate titre 674 g/mg dans l'essai de gentamicine et 695g/mg par référence à la base correspondante, prise comme reférence de comparaison. Sels 'les nouveaux antibiotiques de la présente invention, à savoir la verdamicine I et l'antibiotique G-418, sont de nature basique et forment des sels d'addition d'acide avec les acides organiques et inorganiques. Comme exemples de tels acides, on peut citer les acides sulfurique, chlorhydrique, phosphorique toluène-p-sulfonique, succinique, maléfique, acétique, propionique, cyclo-propane carboxylique, adamantane carboxylique, furoîque, benzoique et phénylacétique; les sels comprennent aussi les dérivés alcalins des sels antibiotiques de diacides ou de triacides. En général, les sels sont solubles dans l'eau et ils peuvent être formés en traitant une solution aqueuse de l'antibiotique par une quantité stoechiométrique d'acide et en lyophilisant la solution résultante. Les sels peuvent aussi être précipités à partir d'une solution aqueuse par addition de solvants organiques miscibles dans l'eau, tels que les cétones d'alcoyle inférieur (par exemple l'acétone), les alcools inférieurs (par exemple le méthanol), les éthers cycliques (par exemple le tétrahydrofurane), ou les amides tertiaires inférieurs tels que le diméthylformamide et le diéthylacétamide. Dérivés type oxazolidine - base de Schiff L'antibiotique O418 et laverdamicine I forment aussi des dérivés du type oxazolidine-base de Schiff, avec les aldéhydes, par des processus qui sont connus dans l'art antérieur. 'les dérivés de ce type que l'on préfère particulièrement sont ceux formés par condensation de l'antibiotique avec des aldéhydes aliphatiques, alicycliques, aromatiques ou hétérocycliques ayant jusqu'à Environ 12 atomes de carbone, par exemple l'acétaldéhyde, le propionaldéhyde, le furfural, le cyclopentylacétaldéhyde, la vanilline, le pyridoxal, le vératraldéhyde, le butyraldéhyde, I'acroléine, le salicylaldéhyde, le succinodialdéhyde, le crotonaldéhyde, le benzaldéhyde et le p-nitrobenzaldéhyde. Les dérivés du type oxazolidine-base de Schiff qui sont pharmaceutiquement acceptables sont généralement préparés en traitant une solution alcoolique de l'antibiotique base exempt d'azote par un excès d'aldéhyde ou de dérivés réactif de celui-ci, par exemple un acétal, particulièrement le diéthylacétal, au-dessus de la température ambiante, pendant environ une heure et en refroidissant brusquement la solution pour obtenir le produit désiré, habituellement sous la forme d'un solide cristallin. Comme on peut le voir d'après la formule I, l'antibiotique O418 possède trois groupes amino primaires, dont chacun peut former une base de Schiff. De plus, l'antibiotique possède un groupe amino secondaire et un groupe hydroxy tertiaire voisin de ce dernier groupe amino, lesquels groupes, par réaction avec un aldéhyde, donnent naissance à un noyau oxazolidine. Ainsi, lorsque l'antibiotique est mis à réagir avec un excès d'aldéhyde R1CHO, ou d'un dérivé réactif de cet aldéhyde, quatre moles de l'aldéhyde réagissent avec chaque mole d'antibiotique pour donner le dérivé de type oxazolidine-base de Schiff répondant à la formule III ci-après Dans cette formule, R1 est de préférence un radical alcoyle contenant 1 à 11 atanes de carbone, un radical cycloalcoyle contenant 3 à 11 atomes de carbone, un radical cyclo-alcoylalcoyle contenant 4 à 11 atomes de carbone, ou un radical aromatique-hétérocyclique ou bien aromatique-hétérocyclique-alcoylique contenant 5 à 11 atomes de carbone. Comme on peut le voir d'après la formule II, la verdamicine I possède quatre groupes amino primaires qui forment une base de Schiff et aussi un groupe amino secondaire et un groupe hydroxy tertiaire voisin de ce dernier groupe amino, ces deux derniers groupes donnant naissance à un noyau oxazolidine par réaction avec un aldéhyde. Ainsi, la verdamicine Ij par réaction avec un excès d'aldéhyde R1CHO ou d'un dérivé réactif de cet aldéhyde, donne un dérivé du type oxazolidine-base de Schiff. Les dérivés type oxazolidine-base de Schiff ne sont pas solubles, d'une manière appréciable, dans l'eau, mais ils sont solubles dans les solvants organiques usuels tels que le chloroforme, le méthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, et analogues. De plus, ces dérivés sont instables dans les solvants organiques contenant des traces d'eau et ils redonnent l'antibiotique à l'état libre. 'la présence d'une trace d'acide facilite la régénération de l'antibiotique. Propriétés biologiques des antibiotiques A. : Antibiotique G-418 Dans les tableaux XIII et XIV on donne les activités antibactériennes in vitro de l'antibiotique G-418, de diverses bactéries à Gram positif et à Gram négatif, telles qu'elles sont obtenues en utilisant des méthodes normalisées dans la technique considérée TABLEAU XIII Activité antibactérienne in vitro Milieu : Tryptose Bouillon de phosphate pH 7,2 - 7,5 Organisme MIC* ( g/ml) Staphylococcus aureus 209P 0,8 Gray 7,5 Wood 0,8 Ziegler 0,8 Streptococcus sp. C > 25 C203 17,5 Escherichia coli Sc 3,0 894 7,5 Kiebsiella pneumoniae DA20 3,0 Pseudomonas aeruginosa VA6 3,0 37 17,5 MIC* signifie "concentration minimale pour inhibition". TABLEAU XIV Activité antibactérienne in vitro (Bouillon de Meuller-Hinton pH 7,2 - 7,5) Organisme MIC ( g/ml) Bacillus subtilis 6633 3,0 Staphylococcus aureus 12 3,0 1257 0,3 Sm 1 0,3 6 0,3 23 0,3 26 3,0 32 7,5 Streptococcus sp. 30 7,5 27 7,5 16245 7,5 6589 7,5 3045 7,5 Escherichia coli 777 3,0 887 3,0 Pseudomonas aeruginosa 1262 17,5 1236 17,5 20 3,0 83 7,5 Proteus mirabilis 12453 7,5 morganii 8019 0,8 rettgeri 9250 0,3 Dans le tableau XV, on donne les résultats numériques de l'activité antibactérienne in vivo , obtenus avec l'antibiotique G-418. 'les animaux hôtes utilisés pour obtenir ces résultats étaient des souris type CF-1 fournis par Carworth Parmes et pesant environ 18-20 g, réparties en groupes de 7. La protection in vivo (PD50) est déterminée en injectant intrapéritonalement dans les souris une dose léthale de bactéries pathogènes. Un groupe de souris sert de témoins; les autres groupes reçoivent diverses doses simples d'antibiotique G-418 une heure plus tard. Les témoins non protégés meurent en 18-24 heures. L'essai se termine 48 heures après l'infection et l'on compte alors le nombre de souris encore vivantes dans chaque groupe ayant reçu l'antibiotique G-418. Les résultats sont analysés par des méthodes statistiques normalisées pour déterminer les valeurs de PD50 avec des limites de fiabilité ou reproductibilité de 95%. TABLEAU XV Activité antibactérienne in vivo A. Activité de protection Organisme Voie PD50 (mg/kg) Staphylococcue aureus Gray S.C. 2,5 Orale 40 Escherichia coli Sc. S.C. 1,5 Staphylococcus aureus St. M N 1 S.C. 3,0 Pseudomonas aeruginosa N 1 S.C. 5,0 B. Toxicité aiguë Voie XD50 (m,/k,) I.V. 140 Note : S.C. = voie sous-cutanée I.V. = intraveineuse Le tableau XVI donne les résultats d'essai in vivo qui illustrent l'activité anti-protozoaire de l'antibiotique G-418. 'les hôtes pour les essais étaient des rats mâles de race Royal Hart, récemment sévrés (agés de 3 à 4 semaines) et pesant environ 50-70 g. Le processus d'essai est une modification de celui décrit par R.J. Schnitzer, pages 355-443 dans "Experimental Chemotherapy", Volume 1, Academic Press, New York (1963). TABLEAU XVI Activité orale de l'antibiotique G-418 et de substances de référence vis-à-vis des infections expérimentales pascales dues à E. Histolytica chez les rats. Nombre de Guérisons para Dose orale jours d'ad- sitologiques/ Préparation mg/kg/jour ministration total D.M.I.* Antibiotique 25 6 19/19 o G-418 12,5 6 24/24 0 10 3 7/7 0 10 1 4/7 0,7 6,5 6 4/4 0 6,5 3 4/5 0,4 6,5 1 2/5 1,0 3,5 6 5/6 0,2 3,5 3 0/7 1,7 Paromomycine 25 6 6/7 O 12 6 4/8 0,8 10 3 2/6 1,0 10 1 0/7 2,1 6,5 6 2/4 1,3 6,5 3 1/5 1,0 6,5 1 0/4 1,0 3,5 6 1/6 1,5 3,5 3 1/7 1,9 Métronidazole 25 6 1/5 0,8 13 6 2/6 0,8 6,5 6 1/4 0,8 6,5 3 0/3 1,7 6,5 1 0/4 1,5 Témoins (doses 6 4/45 2,2 administrées eau) *D.M.I. représente le degré moyen d'infection, basé sur l'obser- vation macroscopique de changements pathologiques dans le caecum et les observations microscopiques du nombre d'amibes trouvé.Ces observations sont enregistrées sur une échelle allant de O à 4, O représentant un caecum substantiellement normal. 'les témoins non traités mais infectés correspondent à des valeurs allant de deux à quatre. Dans les résultats numériques donnés ci-dessus, la moyenne des témoins est de 2,2. B: Verdamicine I In vitro La verdamicine I présente un spectre large d'activité antibactérienne lorsqu'elle est soumise à des essais in vitro sur des bactéries représentatives à Gram positif et à Gram négatif. Elle est active vis-à-vis des bactéries résistant à la kanamycine, mais elle apparaît avoir une résistance croisée avec la gentamicine. L'antibiotique ne présente aucune activité sensible in vitro contre la levure. Dans le tableau XVII, on donne les concentrations minimales pour inhibition, du sulfate de verdamicine I contre des espèces représentatives de bactéries et de levure. 'les essais sont effectués dans un bouillon de viande de boeuf avec levure (pH 7,4), l'inhibition étant déterminée après 24 heures et à nouveau après 48 heures. 'les résultats obtenus avec le sulfate de gentamicine sont donnés dans un but de comparaison. TABLEAU XVII Concentration minimale pour inhibition - CMI ÇP/m1) Verdamicine I (Sulfate) Gentamicine (Sulfate) Organisme 24 heures 48 heures 24 heures Staphylococcus 0,3 0,75 0,1 aureus 209P Streptococcus 0,75 3,0 3,0 pyogenes-C Streptococcus 0,3 0,75 1,0 pyogenes 6 Aerobacter aero- 0,3 0,3 0,6 genes 3 Aerobacter aero- 0,3 0,3 0,3 genes 4 Escherichia 0,3 0,75 0,75 coli Sc TABLEAU XVII (suite) Verdamicine I (Sulfate) Gentamicine (Sulfate) Organisme 24 heures 48 heures 24 heures Escherichia 0,3 0,75 0,3 coli 5 Escherichia 0,3 0,3 0,3 coli 19 Klebsiella 0,3 0,3 0,3 pneumoniae Ad KR* Klebsiella 0,3 0,3 0,3 pneumoniae 17 KR Proteus 0,3 0,3 0,3 mirabilis MeF Proteus 0,3 0,3 0,3 vulgaris 2 Pseudomonas 0,075 0,3 0,3 aeruginosa 8689 Pseudomonas 0,75 0,75 0,5 aeruginosa Miller Salmonella 0,3 0,75 1,0 paratyphi Bl Salmonella 0,3 0,3 0,5 paratyphi B2 Candida > 10 > 10 > 50 albicans 406 Candida > 10 > 10 > 50 albicans 401 Candida > 10 > 10 > 50 albicans 411 Saccharomyces > 10 > 10 > 50 cerevisiae *KR = résistant à la kanamycine In vivo La verdamicine I a été essayée à nouveau contre quatre espèces de bactéries infectieuses chez les souris et elle a été administrée sous la forme d'une dose sous-cutanée simple, une heure après infection par injection intrapéritonéale d'une quantité léthale du pathogène. Un groupe de souris sert de témoins ; les autres groupes reçoivent des doses diverses de verdamicine I. 'les témoins non protégés meurent en 18-24 heures.L'essai se termine 48 heures après infection, et l'on compte alors le nombre de souris encore vivantes dans chaque groupe ayant reçu la verdamicine I. 'les résultats sont analysés par des méthodes statistiques normalisées pour déterminer les valeurs de PD50 avec des limites de fiabilité de 95%. Dans le tableau XVIII, on donne les résultats de ces essais in vivo qui montrent que la verdamicine I est un agent antibactérien vis-à-vis des organismes à Gram positif et à Gram négatif 'les résultats obtenus avec la gentamicine sont donnés dans un but de comparaison. Be tableau XVIII donne aussi la toxicité aiguë de laerdamicine I par administration intra-veineuse. TABLEAU XVIII Activité de protection chez les souris PD50 (mR/kR) Organisme voie Verdamicine I Gentamicine Staphylococcus aureus Gray S.C. 2,5 2,4 Streptococcus pyogenes C S.C. 1,0 5,0 Escherichia coli 10536 S.C. 1,5 1,7 Pseudomonas aeruginosa 8689 S.C. 2,0 1,7 Note : S.C. = sous-cutanée Toxicité ai,zuë chez les souris Voie LD50 (mg/kg) I.V. 75 Note : I.V. = intra-veineuse C :Activité biologique du mélanRe d'antibiotiques obtenu par culture de Micromonospora prise La composition antibiotique, qui comprend principalement la verdamicine I, la sisomicine, l'antibiotique G-418 et la gentamicine A présente un spectre étendu d'activité anti-bactérienne lorsqu'elle est soumise à des essais in iritro sur des bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Be tableau XIX ciaprès donne les concentrations minimales du mélange antibiotique pour l'inhibition d'espèces représentatives de bactéries et de levure. 'les essais sont effectués dans un bouillon de viande de boeuf à la levure (pH 7,4). TABLEAU XIX Organisme CMI 2g/ml) Bacillus subtilis 6633 0,03 Staphylococcus aureus 209P 0,8 Staphylococcus aureus G 0,3 Streptococcus pyogenes C 3,0 Escherichia coli 10536 0,8 Escherichia coli 3 0,8 Klebsiella sp. 803 0,8 Proteus sp 126 0,8 Proteus sp. McFadden 0ç3 Pseudomonas aeruginosa Sc 0,3 Pseudomonas aeruginosa 13 0,3 Salmonella sp. Sb. 3,0 Note : CMI = concentration minimale pour inhibition Utilisation des antibiotiques Comme indiqué plus haut, l'antibiotique G-418 et la verdamicine I, ainsi que les dérivés pharmaceutiquement acceptables de ces produites, sont des antibiotiques doués d'une activité élevée, qui inhibent ou affectent la croissance des microorganismes à Gram positif et à Gram négatif. Par exemple, ils sont actifs contre Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus et Pseudomonas. De plus, l'antibiotique G-418 inhibe ou affecte la croissance des helminthes tels que Syphacia obvelata et Hymenolepsis nana, et des protozoaires, en particulier les proto zoaires parasites comme Trichomonas @ inalis et Entamoeba histo- lytica. Cependant, ces deux antibiotiques sont inactifs contre les levures et les champignons filamenteux tels que Saccharomyces, Candida, Aspergillus et Trichophyton. 'les antibiotiques et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés in vivo ou in vitro. Ils peuvent être utilisés pour inhiber ou détruire les espèces des organismes précités qui sont sensibles à leur action ; ils peuvent être utilisés, en association avec des savons et des détergents, pour éliminer de tels organismes des surfaces de l'appareillage de laboratoire, des instruments chirurgicaux, du matériel en verre des laboratoires et analogues. En raison de bir action in vivo, ces antibiotiques et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés pour détruire ou inhiber les organismes sensibles à leur action qui se trouvent chez des hôtes constituant des mammifères, tels que par exemple la souris, le rat, le chat, le chien et le bétail en général. Ces antibiotiques et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables peuvent aussi être utilisés pour le traitement de maux ou maladies dus aux organismes sensibles à leur action et existant chez les hôtes humains. En vue de leur utilisation in vivo, un antibiotique choisi parmi l'antibiotique G-418, l'antibiotique verdamicine I et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, est amené sous une forme appropriée pour l'administration thérapeutique, par exemple par mélange avec un véhicule ou excipient pharmaceutique. L'invention a par conséquent pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant comme constituant actif au moins un composé choisi parmi l'antibiotique G-418 et la verdamicine I, ainsi que leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutique. Ces compositions peuvent être sous la forme d'une dose unitaire, par exemple un article se présentant sous une forme déterminée.Cependant ces compositions sont de préférence sous la forme de préparations injectables contenues dans des ampoules ou sous la forme de pommades, crèmes, ou lotions. 'les dérivés du type oxazolidine-base de Schiff de la verdamici- ne I et de l'antibiotique G-418 peuvent être employés, si on le dési- re, sous la forme d'une solution dans un solvant organique (par exemple sous la forme d'une teinture). Ils peuvent être aussi employés dans des crèmes et pommades topiques, là où se produit une compatibilité bénéfique avec les substances lipidiques. EXEMPLE I Fermentation de Micromonospora rhodoran,eea dans un récipient. A. Première étape de germination : à 1000 ml d'eau on ajoute ingrédients suivants : extrait de viande de boeuf 3g, tryptose 5 g, extrait de levure 5 g, dextrose 1 g, amidon 24 g, carbonate de calcium 2 g. On chauffe le mélange sous agitation jusqu'à ce que les substances solides soient uniformément réparties et/ou substantiellement dissoutes. On divise le mélange en dix parties égales (en volume) et on transfère celles-ci dans des ballons d'agitation, de 300 ml chacun. On stérilise le milieu à 1210C, sous une pression de 1,05 kg/cm2 pendant vingt minutes, puis on refroidit le milieu jusqu a la température ambiante. Dans des conditions stériles, on inocule dans chaque flacon 5 ml d'une préparation de bouillon entier préalablement préparée.On incube le contenu des flacons à environ 350C, sous agitation rotatoire (300 tours par minute) pendant 3 jours. B. Seconde étape de germination : dans 500 ml de milieu stérile, préparé comme décrit ci-dessus, on introduit d'une manière aseptique, 25 ml du milieu provenant de la première étape de germination et on incube l'ensemble à 280C, pendant 3 jours, sous agitation rotatoire (300 tours par minute). C. Fermentation : Dans un fermenteur de 14 litres, on prépare 10 litres de milieu de fermentation ayant la composition suivante farine de soja 350 g, dextrine 500 g, dextrose 50 g, carbonate de calcium 70 g, chlorure de cobalt 130 g, et eau 10 litres. On stérilise le fermenteur et le milieu qu'il contient, à 121 C, sous 1,05 kg/cm2, pendant 30 minutes, et on refroidit ensuite l'ensemble à peu près jusqu a la température ambiante. On réalise l'incubation du milieu de fermentation par addition dans des conditions aseptiques, de 500 ml d'inoculum provenant de la seconde étape de germination. On conduit la fermentation à une température d'environ 350C, avec introduction d'air à raison d'environ 2,5 à 5,0 litres par minute. On agite le milieu à raison d'environ 250 à 500 tours par minute. On continue la fermentation jusqu'à ce que l'on atteigne le maximum ou pic d'activité, ainsi qu'il est déterminé par la technique d'essai précédemment décrite et mise en oeuvre comme indiqué dans l'exemple 2. EXEMPlE 2 Isolement de l'antibiotique G-41 8 A 20 litres de bouillon de fermentation, on ajoute environ 130 g d'acide oxalique sous agitation vigoureuse. On ajuste le pH du bouillon à 2,0 avec de l'acide sulfurique 6N. On agite le mélange pendant environ 30 minutes et lton filtre. On lave le précipité avec de 1 'eau du robinet jusqu'à ce que les eaux de lavage soient substantiellement non colorées. On réunit le filtrat et les eaux de lavage et on ajuste le pH à 7 avec de l'hydroxyde d'ammonium 6N. On fait passer le filtrat et les eaux de lavage réunis à travers une colonne de résine échangeuse d'ions contenant environ 250 g de la résine connus sous la dénomination commerciale "IRC-50" sous forme ammonium, à un débit d'environ 50 à 75 ml/minute.On lave le lit de résine jusqu'à ce que les eaux de lavage ne soient plus colorées et l'on élue l'antibiotique avec de l'hydroxyde d'ammonium 2N. L'élut est concentré sous vide et lyophilisé, ce qui donne environ 5 g d'antibiotique brut titrant environ 105tg/mg. La chromatographie sur papier de cet antibiotique brut, dans un système descendant constitué de 2-butanone, de tertiobutanol, de méthanol, d'hydroxyde d'ammonium concentré (proportions relatives 16:3:1:6), suivie d'une bioautographie avec Staphylococcus aureus ATCC 6538P donne un bioautogramme qui est substantiellement constitué d'une tache avec plusieurs petites taches à peine visibles ; ainsi, l'antibiotique est presque constitué par un seul composé. EXEMPlE3 Purification partielle de l'antibiotique G-41 8 On dissout 4 g d'antibiotique G-418, tel qu'il est obtenu dans l'exemple 2, dans 100 ml d'eau. On ajuste le pH à 4,2 avec de l'acide sulfurique 2N et on ajoute 250 mg de charbon activé (connu sous la dénomination commerciale "Darco G-60", Atlas Powder Co., Wilmington, Delaware). On agite le suspension pendant environ une heure et l'on filtre. On concentre le filtrat jusqu'à environ 50 ml, à la suite de quoi on provoque sa précipitation par son addition dans 500 ml de méthanol. On sépare le précipité résultant, par filtration, on le lave avec du méthanol et on le dissout dans environ 20 ml d'eau.On prépare une colonne de la résine échangeuse d'anions connus sous la dénomination commerciale "Amberlite IRA-401S" disponible auprès de Rohm and Haas, Philadelphie, Pennsylvanie), cette colonne ayant substantiellement les dimensions suivantes : hauteur 65 cm ; diamètre intérieur 25 cm ; poids de résine 200 g. On place la solution antibiotique au sommet de la colonne de résine et on lave la solution à travers la colonne avec de l'eau désionisée. On concentre l'éluat de la colonne jusqu'à environ 20 mi sous vide et on lyophilise le produit pour obtenir d'environ 800 mg à environ 1,2 g d'antibiotique G-418 titrant environ 480Jt g/mg. EXE1!IPLE 4 Purification complémentaire de l'antibiotique Préparation du sulfate de l'antibiotique G-418 On dissout 2,6 g d'antibiotique G-418, préparé comme dans l'exemple 7, dans 250 ml d'eau et l'on ajuste le pH de la solution à 4,2 avec de l'acide sulfurique dilué (1 à 6N). On ajoute environ 5 g du produit connu sous la dénomination commerciale "Darco G-60" à la solution et l'on agite pendant environ une heure à la température ambiante. On filtre la suspension et l'on concentre le filtrat jusqu a siccité sous vide. On dissout le résidu dans 20 ml d'eau et l'on ajoute goutte à goutte la solution à 500 ml de méthanol sous agitation vigoureuse.On filtre la suspension résultante, on lave le produit solide avec du méthanol et on le sèche à environ 400C sous vide, ce qui donne 3,36 g d'antibiotique G-418 sulfate titrant environ 700pg/mg. D'une manière similaire, en remplaçant l'acide sulfurique par une quantité équivalente d'autres acides inorganiques ou organiques et en utilisant l'acétone comme solvant de précipitation, on peut préparer d'autres sels d'addition d'acide. EXEMPLE 5 1. Production d'antibiotiques dans un récipient soumis à agitation, au moyen de M. grisea a. Préparation de l'inoculum : on inocule M. prise en ruban, prélevé sur un milieu nutritif à base d'agar, dans un récipient (ballon) contenant 100 ml du milieu stérile suivant (milieu A) Milieu A. Extrait de boeuf 7 g Tryptose 5 g Extrait de levure 5 g Dextrose 5 g Amidon 24 g Carbonate de calcium 2 g Eau du robinet 1000 ml On réalise l'incubation sous agitation continue du récipient au moyen d'un agitateur rotatif tournant à 250-300 tours par minute, à 25-350C, jusqu a ce qu'on atteigne une croissance substantielle. Ceci demande habituellement 1 à environ 4 jours. b. Fermentation : on inocule un inoculum à 5% préparé dans l'étape a, dans un récipient de 2,0 litres contenant 500 ml du milieu ci-après Milieu B. Farine de soja 30 g Dextrine 50 g Dextrose 5 g Carbonate de calcium 7 g Eau du robinet 1000 ml On fermente le milieu inoculé à une température comprise entre environ 260C et environ 350C, pendant environ 4 à environ 7 jours, sous agitation continue,sur un agitateur rotatif tournant à 200-300 tours par minute. On soumet le milieu fermenté à des essais périodiques après les premières 48 heures pour déterminer le -moment où l'activité maximale (pic d'activité) est atteinte, et, à ce moment, on effectue la fermentation par le processus de l'exemple 8. EXEMPlE 6 Fermentation par X. grisea dans un récipient de 14 litres a. Etape de germination : on transfère une portion de 25 ml d'inoculum, préparée comme décrit dans l'exemple 5, dans un Erlenmeyer de deux litres contenant 500 ml de milieu d'inoculum stérile. On incube 1' inoculum pendant environ 2 à environ 4 jours, sous agitation continue, à raison d'environ 280 tours par minute, à environ 280C. b. Fermentation : on transfère la totalité du contenu du récipient de germination dans un fermenteur de 14 litres contenant 10 litres du milieu stérile B. On incube le mélange de fermentshan à environ 350C sous agitation continue, à raison d'environ 250 500 tours par minute, pendant environ 90 heures. On maintient le pH entre 7,2 et 8,3 pendant toute la fermentation tout en aérant le milieu de culture au moyen d'environ 3 à environ 5 litres d'air par minute. On soumet périodiquement le mélange de fermentation à des essais, après les premières 48 heures, pour déterminer le moment où le pic d'activité antibiotique est atteint, et, à ce moment,on effectue la fermentation par le processus de l'exemple 8. EXEMPIE 7 Fermentation par M. grisea dans un récipient de 95 litres Etape inoculum Milieu C Extrait de levure 5,0 g Extrait de boeuf 3,0 g Trypt one 5,0 g Amidon de pomme de terre 24,0 g Cérélose (glucose) 1,0 g Carbonate de calcium 1,0 g Eau 1,0 litre On prépare 1,0 litre du milieu C dans les proportions données ci-dessus. On ajuste le pH à 7,3 et l'on introduit des parties aliquotes de 0,5 litre de ce milieu dans des flacons d'Erlenmeyer de 2 litres. On stérilise le milieu pendant 45 minutes à 1210C. On refroidit à la température ambiante et l'on inocule 5 ml d'une culture de M. grisea dans chaque Erlenmeyer. On incube chacun d'eux pendant 72 heures sur un agitateur rotatif (200 tours par minute) à 300C. On transfère l'inoculum (25 ml par flacon) -dans 0,5 litre de milieu stérile C et l'on incube chaque flacon pendant 48 heures sur un agitateur rotatif à 300C. On combine 5,0 litres de cet inoculum et on ajoute à 90 litres de milieu stérile C, à la suite de quoi on règle la température à 300 C, le pH à environ 7,3-7,7, l'aération à environ 28-56 litres par minute et la vitesse d'agitation à environ 200-400 tours par minute. On poursuit la fermentation pendant une durée allant d'environ 100 à environ 130 heures jusqu a ce que l'zon atteigne un pic d'activité antibiotique, à la suite de quoi on effectue la fermentation par le processus de l'exemple 8. EXEMPLE 8 Isolement du complexe antibiotique A 60 litres du bouillon de fermentation obtenu par un procédé comme décrit dans les exemples 5 à 7, on ajoute environ 400 g d'acide oxalique, sous agitation vigoureuse. On ajuste le pH du mélange de fermentation à 2,0 avec de l'acide sulfurique 6N et l'on agite pendant environ 20 minutes. On filtre le mélange de fermentation acidifié et on retient le filtrat. On lave le gateau de mycélium avec de l'eau du robinet et on réunit les eaux de lavage au bouillon filtré. A ce moment, il est avantageux de réunir les filtrats et les eaux de lavage provenant d'environ trois fermentations de 60 litres (c'est-à-dire environ 180 litres3. On neutralise les filtrats et eaux de lavage réunis avec de l'hydroxyde d'ammonium 6N (ce qui exige environ 500 à 900 ml de ce réactif). On adsorbe le complexe antibiotique sur la résine connue sous la dénomination commerciale "IRC-50" sous forme ammonium, en faisant passer le bouillon neutre à travers une colonne de cette résine, laquelle colonne possède un diamètre de 5,1 cm et une hauteur de 65,6 cm. On règle le débit d'écoulement à environ 175200 ml/ minute jusqu'à ce que tout le bouillon soit traité. On lave la colonne exempte de coloration avec de liteau désionisée (environ 20 litres). On désorbe le complexe antibiotique avec de l'hydroxyde d'ammonium 2N amené à un débit de 80 ml/minute, à la suite de quoi on fait passer de l'eau désionisée lorsque le pH de l'éluat atteint 10.On concentre l'éluat sous vide jusqu'à environ 1 litre et on le lyophilise pour obtenir le complexe antibiotique. Selon une variante, lorsque l'éluat est fortement coloré, on peut effectuer le traitement avec la résine "Amberlite IRA-401S". Ce traitement est habituellement effectué en faisant passer l'éluat de la colonne précédente à travers une colonne de résine "Amberlite IRA-401S", d'un diamètre de 2,54 cm et d'une hauteur de 50,8 cm, à raison d'environ 120 ml/minute. On lave la colonne de résine exempte d'antibiotique et l'on concentre l'éluat et le liquide de lavage comme décrit plus haut. MEMPI;E 9 A. Préparation du sulfate du complexe antibiotique On dissout 37 g du complexe brut, à l'état de base, obtenu selon l'exemple 8, dans 1000 ml d'eau et l'on règle le pH à 4,5 avec de l'acide sulfurique. On agite la solution avec le produit connu sous la dénomination commerciale "Darco G60" pendant environ 0,5 h et l'on filtre. On concentre le filtrat à environ 100 ml et l'on ajoute un excès de méthanol. Be précipité résultant est séparé par filtration, des sulfates mélangés et séché sous vide. B Transformation du sulfate du complexe antibiotique en la base correspondante On met les sulfates, obtenus selon r étape A, en suspension dans 1000 ml de chloroforme et l'on fait passer bulle à bulle, à travers la suspension, pendant environ 0,5 h, de l'ammoniac. On filtre le mélange et l'on évapore le filtrat jusqu'à siccité pour obtenir le complexe antibiotique à l'état de base. EXEMPIE 10 Isolement de la verdamicine I, de la sisomicine, de l'anti biotique G 418 et de la ,gentamieine A On met en suspension 5245 kg de gel de silice dans la phase inférieure d'un mélange de solvants constitué d'isopropanol, de chloroforme, d'hydroxyde d'ammonium concentré (proportions respectives en volume 1:2:1). On transfère la suspension dans une colonne chromatographique ayant un diamètre interne d'environ 10,2 cm. On met en suspension 100 g du complexe antibiotique, tel qu'il est obtenu dans l'exemple 8 dans environ 1,0 litre de la phase inférieure du système de solvants utilisé pour préparer la colonne chromatographique. On filtre la suspension ainsi obtenue et l'on retient les insolubles pour traitement ultérieur. On concentre le filtrat jusqu'à approximativement 1,0 litre avant de le placer au sommet de la colonne. Sous chauffage et agitation, on dissout dans le méthanol la substance insoluble précédemment obtenue (environ 66 g) et l'on filtre pour éliminer la substance inorganique présente (environ 6 g). On refroidit la solution méthanolique avec exposition à l'air et l'on filtre à nouveau pour retirer la plus grande partie du carbonate de gentamicine A faiblement soluble. On adsorbe le complexe antibiotique, duquel la plus grande partie de la gentamicine A a été enlevée, sur la colonne de gel de silice préparée comme indiqué plus haut eut l'on développe le chromatogramme avec le mélange de solvants, en prenant des fractions de 2,0 litres et en faisant travailler la colonne à plein débit. Lorsque la sisomicine est désorbée (ce qui demande normalement environ 90 à environ 100 fractions), les proportions relatives des solvants sont modifiées et amenées à 1:1:1 et l'on poursuit l'élution jusqu'à ce que la substance résiduelle soit désorbée. Généralement, lorsqu'on effectue la séparation du complexe antibiotique sur une colonne de cette dimension, le nombre de fractions recueillies est d'environ 150 à environ 350. On met une goutte de chaque fraction sur du papier filtre et l'on fait un essai avec la ninhydrine pour déterminer la présence ou l'absence d'antibiotique, c'est-à-dire de substance réagissant positivement à la ninhydrine. On soumet celles des fractions contenant des substances antibiotiques à une chromatographie sur papier dans un système constitué de chloroforme, de méthanol, et d'hydroxyde d'ammonium à 1 7% (proportions respectives volumiques :(2: 1 (2:1:1), à la suite de quoi on fait une bioautographie au moyen de Staphylococcus aureus ATCC 6538P, pour déterminer quelles sont les fractions qui contiennent le même antibiotique.On réunit les fractions en fonction des résultats de la chromatographie et. de la bioautographie, on concentre sous vide jusqu a environ 100 ml les fractions réunies et on effectue une lyophilisation. La répartition des antibiotiques à l'aide de la colonne est substantiellement la suivante Fractions Antibiotiques 1- 65 Substances organiques ioss 66- 87 Verdamicine I 88- 91 Sisomicine 119-259 Antibiotique G-41 8 259-dernière fraction Gentamicine A résiduelle EXEMPLE 1 1 Préparation du sulfate de verdamicine I On dissout 500 mg de verdamicine I préparée selon le processus de l'exemple 10 dans 90 ml d'eau et l'on ajuste le pH de la solution à 4,5 avec de l'acide sulfurique dilué. On agite la solution après y avoir ajouté 1 à 2 g d'un charbon décolorant (dénomination commerciale "Darco G-60") pendant environ 30 minutes et l'on filtre.On concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 10 ml et on le verse dans environ 100 ml de méthanol sous agitation. On filtre la suspension résultante, on lave le produit solide avec du méthanol frais et on le sèche, ce qui donne environ 450 mg de sulfate de verdamicine I. EXEMPlE 12 Préparation du chlorhydrate de verdamicine I On dissout 400 mg de verdamicine I telle que préparée dans l'exemple 10 dans environ 75 ml d'eau et l'on ajuste le pH de la solution à 4,5 avec de l'acte chlorhydrique dilué. On agite la solution avec 1 à 2 g de charbon décolorant ("Darco G -60") pendant environ 30 minutes et l'on filtre. On concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 75 ml et on le verse dans 150 ml de mélange méthanol : acétone (rapport volumique 1:2) sous agitation. On filtre la suspension résultante, on lave le produit solide avec de l'acétone frais et on le sèche, ce qui donne environ 300 mg de chlorhydrate de verdamicine I. Le procédé précédemment décrit peut être appliqué d'une manière très générale et il peut être utilisé avec une quantité équivalente des acides précédemment mentionnés pour former des sels d'addition d'acide non toxiques qui sont les équivalents fonctionnels du chlorhydrate de verdamicine I et du sulfate de verdamicine I. EXEMPtE 13 Préparation de la verdamicine I base On dissout 39C mg de sulfate de verdamicine I, tel que préparé dans l'exemple 11 dans 10 ml d'eau. On prépare une colonne de résine "Amberlite IRA-401S" ayant une hauteur de 25 cm et un diamètre externe de 2 cm. On charge la solution antibiotique dans la colonne de résine et l'on élue avec de l'eau désionisée jusqu'à ce que l'éluat présente une réaction négative avec la ninhydrine. On concentre l'éluat jusqu'à environ 25 ml et l'on effectue une lyophilisation, ce qui donne environ 230 mg de verdamicine I. Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux modes d'exécution décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. -REVENDICATIONS - 1.- Procédé de préparation d'une substance douée d'activité antibiotique contenant un nouvel antibiotique dénommé "Antibiotique G-418", et des dérivés correspondants, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme de l'espèce Micromonospora rhororan,gea ou de l'espèce Micromonospora prise dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies, jusqu'a ce qu' une activité antibiotique substantielle soit conférée audit milieu. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est cultivé dans un milieu nutritif, dans des conditions d'aérobie submergée. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou'2, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température comprise entre 20 et 400C, de préférence entre 28 et 350C. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de préférence entre 7,2 et 8,3. 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le microorganisme de 1? espèce Micromonospora prise appartient à la souche référencée NRRI 3800. 6.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le microorganisme de l'espèce Micromonospora rhodoranRea appartient à la souche référencée NRRL 5326. 7.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on récupère une substance douée d'activité antibiotique et contenant le nouvel antibiotique G-418, à- partir du milieu de fermentation ou à partir du mycélium, de préférence en acidifiant le milieu de fermentation, en séparant le mycélium de celui-ci, en neutralisant le milieu de fermentation, et en extrayant de celui-ci une substance douée d'activité antibiotique, contenant le nouvel antibiotique G-418. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'antibiotique G-418 lui-même, ayant la formule est isolé sous sa forme libre ou sous la forme d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable, en particulier un sel d'addition d'acide, de préférence le sulfate, ou un dérivé du type oxazolidine-base de Schiff, de préférence de formule dans laquelle R1 est un radical alcoyle contenant 1 à Il atomes de carbone, un radical cycloalcoyle contenant 3 à 11 atomes de carbone, un radical cycloalcoylalcoyle contenant 4 à 11 atomes de carbone, un radical aryle ou aralcoyle contenant 6 à 11 atomes de carbone, ou un radical aromatique-hétérocyclique ou aromatiquehétérocyclique-alcoylique contenant 5 à Il atomes de carbone. 9.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'une substance douée d'activité antibiotique et contenant non seulement le nouvel antibiotique G-418, mais aussi au moins un antibiotique choisi parmi la gentamicine A, la sisomicine, et le nouvel antibiotique verdamicine I, est produite par culture de Micromonospora ,prise, et récupérée du milieu de fermentation ou du mycélium, de préférence en acidifiant le milieu de fermentation, en séparant le mycélium de celui-ci, en neutralisant le milieu de fermentation et en extrayant de celui-ci la substance douée d 'activité antibiotique. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le nouvel antibiotique appelé "Verdamicine I", ayant la formule est isolé sous sa fane libre ou sous la forme d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable, spcialement un sel d'addition d'acide, de préférence le sulfate, ou un dérivé du type oxazolidine-base de Schiff, à partir de la substance douée d'activité antibiotique. 11.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on isole de la substance douée d'activité antibiotique, sous la forme libre ou sous la forme d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable, en particulier un sel d'addition d'acide, de préférence le sulfate, un mélange de deux ou de plus de deux des antibiotiques suivants : sisomicine, verdamicine I, gentamicine A et antibiotique G-41 8. 12.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on isole la gentamicine A et/ou la sisomicine, sous la forme libre ou sous la forme d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable, en particulier un sel d'addition d'acide, de la substance douée d'activité antibiotique contenant le nouvel antibiotique G-418. 13.- Substances douées d'activité antibiotique, caractérisées en ce qu'elles sont préparées par le procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 14.- Antibiotique S418 et dérivés pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, en particulier ses sels d'addition d'acide et ses dérivés du type oxazolidine-base de Schiff. 15.- Nouvel antibiotique, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'antibiotique dénommé "antibiotique (1-418" de formule et ayant un spectre infrarouge dans l'huile minérale et un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le deutériométhanol, substantiellement comme montré, respectivement dans les figures 3 et 4 des dessins ci-joints; et son sulfate. 16.- Verdamicine I et ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, en particulier ses sels d'addition d'acide et ses dérivés du type oxazolidine-base de Schiff. 17.- Nouvel antibiotique, caractérisé en ee qu'il est choisi parmi l'antibiotique appelé "verdamicine I", de formule et ayant un spectre infrarouge dans l'huile minérale et un spectre de résonance magnétique nucléaire dans un mélange d'oxyde de deutérium et de diméthylsulfoxyde, substantiellement comme montré, respectivement dans les figures 1 et 2 des dessins ci-joints; son sulfate, et son chlorhydrate. 18.- Composition douée d'activité antibiotique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'antibiotique G-418 défini par la revendication 15, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, en association avec au moins un antibiotique choisi parmi la verdamicine I définie par la revendication 17, la sisomicine, la gentamicine A et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables; ou en ce qu'elle est constituée par la verdamicine I, ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec au moins un antibiotique choisi parmi la sisomicine, la gentamicine A, et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables. 19.- Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent, comme ingrédient actif, au moins un composé choisi parmi l'antibiotique G-418 défini par la revendication 15, la verdamicine I définie par la revendication 17, et leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.