Brevet FR2182211A1 — publié le 19731207

La présente invention concerne la production de L~lysine et plus particulièrement un procédé de production de L-lysine par fermentation. L'invention a pour objet de produire la L-lysine avec un 5 faible prix de revient à partir de produits de départ facilement disponibles. On sait que la L-lysine est indispensable pour la nutrition humaine et animale et on peut s'attendre à son utilisation étendue pour l'enrichissement des aliments. Il est connu de produire la L-lysine à partir d'hydrates de 10 carbone fermentescible au moyen de micro-organismes. Parmi les microorganismes producteurs de L-lysine, on connaît trois types caractéristiques de bactéries : le premier type est un mutant ayant: besoin pour sa croissance d'aminoacides apparentés à la biosynthèse de la L-lysine , tel que le mutant de Micrococcus glutamicus ayant besoin d'homosérine décrit dans le brevet 15 des Etats-Unis d'Amérique n° 2.979,439. Le second type est représenté par les mutants sensibles à la thréonine ou à la méthionine et les mutants sensibles à la thréonine et ayant besoin de thréonine dont la croissance est inhibée par une faible concentration de thréonine ou de méthionine, mais ces derniers ont besoin de thréonine pour leur croissance et ces mutants sont décrits dans le brevet français n° 1.533.688. Le troisième type est un mutant résistant à la S-(j3-aminoéthyl)-L-cystéine, ci-après dénommé AEC, qui est un homologue soufré de la L-lysine et ces mutants sont décrits dans le Brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.707.441. La demanderesse a découvert selon l'invention que lorsque l'on cultive dans un milieu approprié contenant des sources de carbone assimilable, des sources d'azote assimilable et des substances inorganiques, un mutant résistant à l'inhibition par rétroaction par la lysine et les analogues de la lysine et ayant besoin comme substance nutritive d'au moins un composé choisi parmi la sérine, la proline, l'alanine, le nicotinamide, l'acide pantothénique, la thiamine, le guanide, l'hypo-xanthine et la vitamine B^j produit la L-lysine qui s'accumule en grande quantité dans ledit milieu et la L-lysine ainsi produite est facilement récupérée du milieu. Le micro-organisme utilisé dans le procédé de l'invention est 5 une souche capable de produire la L-lysine choisie parmi les mutants résistant à la lysine et à ses homologues et présentant un ou plusieurs des besoins nutritionnels mentionnés ci-dessus, et on l'obtient facilement 73 15472 2 2182211 par des procédés d'induction de mutations bien connus dans la technique à partir des souches mères choisies parmi les micro-organismes appartenant aux genres Brevibacterium et Corynebacterium. Bien que la production de L-lysine par fermentation en 5 mettant à profit certains besoins nutritionnels soit connue, les besoins nutritionnels des mutants utilisés selon l'invention sont tout à fait nouveaux et l'on ne connaissait pas leur effet spécifique sur la production de L-lysine. . Dans la présente description, on entend par besoin 'hutri-10 tionnel" utilisé dans le procédé de l'invention, outre la définition normale du besoin nutritionnel, les souches incomplètes ou déficientes dont la croissance est accélérée par les substances nutritives considérées. Les micro-organismes utilisés dans le procédé de l'invention peuvent également être des mutants ayant d'autres propriétés biolo-15 giques, telles que d'autres besoins nutritionnels et/ou la résistance à d'autres réactifs, conjointement avec les besoins et la résistance ci-dessus mentionnés aux analogues de la lysine tels que l'AEC. On peut obtenir les souches pour le procédé de l'invention par sélection ou par un procédé classique pour l'induction d'un mutant 20 artificiel et les procédés utilisés à cet effet sont expliqués en détail ci-après sous la mention "expérience". A titre de mutants caractéristiques utiles pour le procédé de l'invention, on peut citer les suivants : Brevibacterium lactofermentum Y-108 (ATGG 21798), souche 25 ayant besoin de sérine et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum AC-73 (ATCC 21799), souche ayant besoin d'acide pantothénique et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum AD-5 (ATCC 21800), souche ayant besoin de thiamine et AEC-résistance; Brevibacterium lactofermentum AD-162 (ATCC 21801), souche ayant besoin d'adénine ou de guanine et AEC-résistance; Brevicacterium 30 lactofermentum AJ-3424 (FERM P-1711), souche ayant besoin d'alanine et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum AJ-3425 (FERM P-1712), souche ayant besoin d'alanine ou de valine et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum Aj-3429 (FERM-P-1857),souche ayant besoin d'alanine + leucine et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum Aj-3391 (FERM P-1570), 35 souche ayant besoin de proline et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum AJ-3394 (FERM P-1573), souche ayant besoin de vitamine B^ et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum Aj-3395 (FERM P-1574), souche ayant besoin 73 15472 3 2182211 de nicotinamide et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum AJ-3396 (FERM P-1575), souche ayant besoin d'hypoxanthine et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum Aj-3392 (FERM P-1571), souche ayant besoin de nicotinamide + leucine et AEC-résistante; Brevibacterium lactofermentum 5 AJ-3393 (FERM P-1572), souche ayant besoin de sérine + leucine et AEC-résistante; Corynebacterium glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613), souche ayant de besoin de sérine et AEC-résistante; Corynebacterium glutamicum AJ-3458 (FERM P-1982), souche ayant besoin de proline et AEC-résistante; Corynebacterium glutamicum AJ-3460 (FERM P-1984), souche ayant besoin de 10 guanine et AEC-résistante; Corynebacterium glutamicum AJ-3461 (FERM P-1985), souche ayant besoin de vitamine Bj^ + leucine et AEC-résistante; Corynebacterium lilium Aj-3464 (FERM P-2026), souche ayant besoin d'alanine et AEC-résistante; et Corynebacterium acétoacidophilum AJ-3465 (FERM P-2027), souche ayant besoin d'alanine et AEC-résistante. 15 Les numéros de référence "FERM P" sont les numéros sous lesquels les souches ont été déposées au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of Technology, au Ministère de l'Industrie et du Commerce au Japon et où l'on peut obtenir ces souches. Expérience 1 20 On isole des souches de mutants ayant certains besoins nutri tionnels par la méthode de reproduction ou à partir de colonies apparaissant dans une plaque de gélose complète dans lesquelles on a cultivé à 31°C pendant 4 à 10 jours des cellules microbiennes obtenues par irradiation aux rayons X de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. 25 Le besoin nutritionnel des mutants isolés comme mentionné ci-dessus est déterminé par un procédé connu. On a donc obtenu ainsi notamment quatre souches, à savoir les mutants ayant besoin de sérine, ayant besoin d'acide pentothénique, ayant besoin de thiamine et ayant besoin de guanine (ou d'adénine). 30 On traite ces quatres souches avec 200 y/ml de nitroso- guanidine à 30°C pendant 30 mn respectivement et ensuite on les inocule sur des plaques de gélose contenant 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'urée, la substance correspondant au besoin de la souche (30 mg/dl de sérine, 10 mg/1 de pantothénate de calcium ou 100 mg/1 d'adénine), 0,5 g/dl de 35 thréonine, 0,1 g/dl de KH„P0,, 0,04 g/dl de MgSO, ,7 H „ 0 , 2+ 2+ 2 ppm de Fe ,2 ppm de Mn ,50 y/1 de biotine, 100 y/1 de thiamine, 5CC y/xl d'AEC 2t 2 g/dl de gélose, à pH 7,0 et on cultive à 31°C pendant 4 à 10 jours. 73 15472 4 2182211 On obtient les quatre souches mutantes suivantes capables de produire de grandes quantités de L-lysine en examinant l'aptitude a j-roci::ie la L— lysine de chaque souche isolée de colonies apparaissant sur les plaques des cultures ci-dessus mentionnées: R — 5 - Brevibacterium lactofermentum Y-108 (AEC + sér ) R — - Brevibacterium lactofermentun AC-73 (AEC + Acide pantothénique ) R — - Brevibacterium lactofermentum AD-5 (AEC + thiamine ) R — — - Brevibacterium lactofermentum AD-162 (AEC + adénine ou guanine ) R R Le symbole dans l'expression AEC signifie que la souche est résistante 10 à l'AEC et le signe ' signifie que la souche a besoin de la substance nutritive citée. On étudie la croissance desdites quatre souches mutantes dans un milieu minimal et dans un milieu minimal additionné d'une substance dont la souche a besoin, de la manière suivante : 15 On prépare un milieu minimal contenant 2 g/dl de glucose, 1 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,3 g/dl d'urée, 0,1 g/dl de KH„P0,, 0,04 g/dl 2+ 2+ de MgSO^^I^O, 2 ppm de chacun des ions Fe ' et Mn ,50 y/1 de biotine et 200 y/1 d.e chlorhydrate de thiamine, ajusté à pH 7,2, on ajoute chaque fois 30 mg/dl de l'aminoacide comme indiqué dans le tableau I ci-après, 20 10 mg/1 de pantothénate de calcium ou 100 mg/1 d'adénine et on cultive chaque ffluche mutante à 31°C pendant 24 h en culture agitée. On dilue le bouillon de culture à 26 fois son volume initial et on détermine la densité optique spécifique en mesurant l'absorption de la lumière à 562 aji . Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I ci»après. 25 Expérience 2 On traite Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 avec 250 y/ml de nitrosoguanidine à 30°C pendant 30 mn et on l'inocule sur une plaque de gélose contenant 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'urée, 1 g/dl de (NH^^SO^, 0,5 g/dl de thréonine, 0,1 g/dl de KI^PO^, 0,04 g/dl de MgSO^^I^O, 30 2 ppm de chacun des ions Fe^+ et Mn^+, 50 y/1 de biotine, 200 y/1 de chaque chlorhydrate de thiamine, 5 mg/ml d'AEC et 2 g/dl de gélose à pH 7,0 et on cultive à 31°C pendant 4 à 10 jours. On isole les souches de chaque colonie apparaissant sur la plaque de gélose cultivée comme souche AEC-résistante, et parmi lesquelles on isole les mutants capables de produire la 35 L-lysine en examinant l'aptitude de chaque souche à produire la L-lysine. On traite la souche mutante (souche AEC-résistante mais n'ayant pas de besoin nutritionnel) à nouveau par 250 y/ml de nitrosoguanidine à 30°C pendant 30 mn, et, après ce traitement, on isole les mutants capables 73 15472 5 2182211 de produire de grandes quantités de L-lysine comme mutants AEC-résistants et présentant certains besoins nutritionnels. Les besoins nutritionnels des mutants isolés par le procédé ci-dessus mentionné sont déterminés par un procédé connu. 5 On obtient, par le procédé ci-dessus mentionné, les six souches suivantes : R — - Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 (AEC + pro ) R — — - Brevibacterium lactofermentum Aj-3392 (AEC + nicotinamide ~ + leu ) R — — - Brevibacterium lactofermentum AJ-3393 (AEC + sér 4- leu ) R — 10 - Brevibacterium lactofermentum Aj-3394 (AEC + vitamine B ~) R — - Brevibacterium lactofermentum AJ-3395 (AEC 4 nicotinamide ) R •- - Brevibacterium lactofermentum Aj-3396 (AEC -1- hypoxanthine ). On confirme le besoin nutritionnel desdites six souches en examinant leur croissance comme mentionné ci-dessous. 15 On prépare un milieu minimal contenant 2% de glucose, 0,3% d'urée, 1% de (NH^SO^ 0,11 de KH2P04, 0,04% MgSO^i^O, 2 ppm de fe2+, 2 ppm de Mn^+, 50 y/1 de biotine et 200 y/1 de chlorhydrate de thiamine à pH 7,2. On ajoute à chacun des échantillons de 3 ml dudit milieu 20 minimal une substance nutritive nécessaire aux souches mutantes, comme indiqué dans le tableau II ci-après et on l'inocule avec la souche mutante correspondante préalablement cultivée sur gélose inclinée au bouillon, et on cultive à 31°C pendant 24 h avec aération et agitation. On dilue le bouillon de cultuve à 26 fois son volume initial et on détermine la densité 25 optique spécifique en mesurant l'absorption de la lumière à 562 mp . Les / résultats obtenus sont indiqués dans le tableau II. Expérience 3 On traite Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 par 250 y/1 de nitrosoguanidine à 30°C pendant 30 mn et on inocule sur une plaque 30 de gélose contenant 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'urée, 1 g/dl de (NH^^SO^, 0,4 g/dl de thréonine, 0,1 g/dl de KH_P0,, 0,04 g/dl de MgS0,,7H 0, 2 ppm 2+2+ de chacun des ions Fe et Mn , 50 y/1 de biotine, 100 y/1 de chlorhydrate de thiamine, 4 mg/ml d'AEC et 2 g/dl de gélose à pH 7,0 et on cultive à 31°C pendant 4 à 10 jours. On isole les souches de chaque colonie apparaissant 35 sur la plaque comme souche AEC-résistante et on en sépare les mutants capables de produire la L-lysine en examinant l'aptitude de chaque souche à produire la L-lysine. On obtient la souche mutante n° 872 comme mentionné ci-dessus. 73 15472 6 2182211 On traite à nouveau la souche mutante n° 872 (souche AEC-résistante mais sans besoin nutritionnel) avec 250 y/ml de nitrosoguanidine à 30°C pendant 30 mn et ensuite on isole lesdits mutants ainsi traités capables de produire de grandes quantités de L-lysine comme mutants 5 AEC-résistants présentant également certains besoins nutritionnels. Les besoins nutritionnels des mutants isolés par le procédé mentionné ci-dessus sont déterminés par un procédé connu. On obtient ainsi les deux souches mutantes suivantes AEC-résistantes et ayant en outre besoin d'alanine et d'alanine ou de valine 10 respectivement, qui sont de bons producteurs de L-lysine : R — - Brevibacterium lactofermentum AJ-3424 (AEC + ala ) R _ - Brevibacterium lactofermentum AJ--S425 (AEC 4- ala ou val ). On traite encore la souche mutante AJ-3424 par la nitrosoguanidine, de la même manière que mentionné ci -dessus, et l'on obtient 15 également la souche AJ-3429 AEC-résistante et ayant besoin d'alanine et de leucine, comme bons conducteurs de L-lysine. On confirme le besoin nutritionnel desdites trois souches en étudiant leur croissance comme mentionné ci-dessous : On prépare un milieu minimal contenant 2% de glucose, 20 0,3% d'urée, 1% de (NH^SO^ 0,1% de KH2P04, 0,04% de MgS04,7H20, 0,05% de NaCl, 2 ppm de Fe^+, 2 ppm de Mn^+, 50 y/1 de biotine et 200 y/1 de chlorhydrate de thiamine,à pH 7,0. On prépare respectivement des suspensions de cellules desdides trois souches en ajoutant respectivement des cellules microbiennes 25 de chaque souche préalablement cultivées sur gélose inclinée au bouillon à 31°C pendant 24 h à 6 ml dudit milieu minimal. Les concentrations en cellules microbiennes,exprimées par la densité optique D dans chaque suspension, sont de 0,250 pour la souche AJ-3424 et 0,295 pour la souche AJ-3425 respectivement. 30 On inocule des échantillons de 3 ml dudit milieu minimal additionnés des substances nutritives indiquées dans les tableaux III et IV ci-après, avec 0,1 ml de chacune desdites suspensions de cellule respectivement, et on cultive à 31°C pendant 24 h avec aération et agitation. On dilue le bouillon de culture à.26 fois son volume initial et on détermine 35 la densité optique en mesurant l'absorption de la lumière à 262 m^i . Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux III et IV. 73 15472 7 2182211 Expérience 4 On obtient Corynebacterium glutamicum 2J-3463 (FERM P-1987), souche AEC-résistante, mais sans besoin nutritionnel, de la même manière que mentionné à l'expérience 3 en utilisant Micrococcus glutamicus ATCC 13032 5 (la dénomination taxonomique de cette souche a été remplacée par Corynebacterium glutamicum) comme souche mère. On obtient les trois souches mutantes suivantes douées de résistance à l'AEC avec certains besoins nutritionnels par le même procédé que mentionné à l'expérience 3 à partir de ladite souche AJ-3463 : R — 10 - Corynebacterium glutamicum AJ-3458 (AEC + pro ) R — - Corynebacterium glutamicum AJ-3460 (AEC + guanine ) R -* — - Corynebacterium glutamicum AJ-3461 (AEC + vitamine B^" + leu )• Les besoins nutritionnels desdites trois souches sont confirmées par l'examen de leur croissance de la même manière que mentionné 15 à l'expérience 3 en utilisant le milieu de composition suivant : Glucose 2 % (NH4)2S°4 1 % KH2P04 0,1 % MgS04,7H20 0,04 7o NaCl 0,05 % Biotine 50 y/1 Thiamine,HC1 200 y/1 ^ 2+ Fe 2 ppm 2+ Mn 2 ppm CaCO^ 2 % ajusté à pH 7,0 Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau V ci-après. Expérience 5 On obtient également des souches mutantes Corynebacterium 30 glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613) et Corynebacterium lilium Aj-3464 (FERM P-2026) comme décrit à l'expérience 3. La souche mère de la souche mutante AJ-3397 est Micrococcus glutamicus ATCC 13032 et celle de la souche mutante AJ-3464 est Corynebacterium lilium NRRL B-2243 (ATCC 15990), dont les caractéristiques taxonomiques ont été décrites dans le brevet des Etats-Unis 35 d'Amérique nJ 3.087.863. Un avantage du procédé de l'invention sur les procédés clat>bï.qut:b utilisés dans la technique réside dans de nouvelles souches mutantes qui peuvent produire une quantité remarquable de L-lysine et un autre avantage est que la productivité en L-lysine n'est pas tant influencé 73 15472 8 2182211 par les fluctuations de la quantité de thréonine et autres agents nutritifs incorporés dans le milieu en raison de leur résistance aux analogues de la lysine. En ce qui concerne la composition du milieu de fermentation 5 et la méthode de culture, on peut utiliser les procédés classiques utilisés pour la production d'aminoacides par fermentation et les milieux habituellement utilisés dans les procédés classiques de production d'aminoacides par fermentation ainsi que les milieux bien connus pour la production de lysine par fermentation qui sont tout à fait appropriés. Donc,un milieu de 10 culture synthétique ou naturel est approprié pour cultiver les souches utilisées dans le procédé de l'invention, pour autant qu'il contienne les agents nutritifs essentiels pour la croissance de la souche utilisée. Ces agents nutritifs sont bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote et des compo-15 sés inorganiques qui sont utilisés par le micro-organisme utilisé, en quantités appropriées. On peut mentionner comme sources de carbone, par exemple les hydrates de carbone tels que glucose, fructose, maltose, saccharose, amidon, hydrolysat d'amidon, mélasse, etc. ou toute autre source de carbone 20 telle que des acides organiques, par exemple acide acétique, propionique, fumarique, etc., des composés chimiques organiques, par exemple acide benzoîqu ou des alcools, par exemple méthanol et éthanol. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en mélange de deux ou plusieurs d'entre elles. Selon l'assimilation par le micro-organisme employé, il 25 est possible d'utiliser des hydrocarbures en quantités plus ou moins grandes dans le milieu de fermentation comme source de carbone. Comme source d'azote, on peut utiliser divers types de sels inorganiques ou organiques ou de composés tels que l'urée ou les sels d'ammonium, tels que chlorure d'ammonium, sulfate d'ammonium, nitrate 30 d'ammonium, phosphate d'ammonium, etc. ou un ou plusieurs aminoacides ou des substances naturelles azotées, telles que liqueur de trempage de mats, extrait de levure, extrait de viande, farine de poisson, peptone, bouillon, hydrolysats de caséine, substances solubles extraites du poisson, extrait de son de riz, etc. Ces substances peuvent également être utilisées seules 35 ou en mélange de deux ou plusieurs d'entre elles. Les composés inorganiques que l'on peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le 73 15472 9 2182211 dihydrogénophosphate de potassium, le monohydrogénophosphate de potassium, le sulfate de fer ou d'autres sels de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodium etc. Les agents nutritifs et autres substances qui sont néces-5 saires pour la croissance de la souche mutante doivent être présents dans le milieu de culture. Des agents promoteurs de croissance et des agents nutritifs mineurs qui améliorent le rendement et la vitesse de production de la L-lysine comprennent des aminoacides tels que sérine, proline, alanine, leucine, etc., diverses vitamines, telles que vitamine 10 thiamine, acide pantothénique, nicotinamide (ou acide nicotinique) etc., des bases puriques, telles que guanine, adénine et hypoxanthine, l'hydrolysat de protéine du soja, l'extrait de levure, la liqueur de trempage de maïs, la peptone, l'hydrolysat de caséine et ainsi de suite. Un facteur important est la limitation de la quantité 15 d'aminoacide et d'autres agents nutritifs nécessaires à moins de la concentration optimale pour la croissance de la souche de micro-organisme, technique tout à fait générale dans la production d'amino-acides par fermentation. On effectue la fermentation à une température de 24 à 37°C pendant environ 24 à 96 h en conditions aérobies, en culture agitée ou 20 avec aération et agitation, le pH du milieu étant régulé entre 5 et 9. Lorsque lé pH du milieu tend à tomber au-dessous de 5,0, on ajuste, au moyen d'agents de neutralisation, tels que carbonate de calcium et ammoniaque aqueuse. Lorsqu'on utilise des acides organiques comme sources de carbone, le pH du milieu tend à s'élever et on le ramène dans la gamme ci-dessus au moyen 25 d'acides tels que l'acide organique utilisé comme source de carbone, le chlorure d'hydrogène ou l'acide sulfurique. La récupération de la L-lysine du bouillon de culture peut s'effectuer selon des procédés connus. On peut séparer les celles bactériennes par filtration ou centrifugation et recuillir la L-lysine en utilisant 30 une résine échangeuse de cation. On identifie la L-lysine produite selon l'invention par les résultats obtenus dans des essais tels que valeur du Rf dans le chroma-togramme sur papier, électrophorèse, réponse à l'essai microbiologique et réponse à la lysinedécarboxylase,ainsi que les résultats obtenus en utilisant 35 un échantillon authentique. La quantité de lysine produite dans le bouillon de culture est en utilisant la 1/si.ie Jécarbcxj l£ fe. 73 15472 10 2182211 Les exemples suivants illustrent l'invention sans . toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On prépare un milieu de culture contenant 10 g/dl de 5 glucose, 5 g/dl de (NH^SO^, 0,1 g/dl de KH^O^, 0,04 g/dl de MgS04,7H20, 2 ppm d'ions Fe et Mn , 50 y/1 de chlorhydrate de thiamine, 50 y/1 de biotine, 1,5 ml/dl d'hydrolysat de protéines de soja (contenant un total de 7% d'azote) et 5 g/dl de carbonate de potassium, ajusté à pH 7,2. On place des échantillons de 20 ml du milieu dans des flacons de 500 ml pour culture 0 agitée et on les stérilise. On inocule le milieu avec les aminoacides, comme indiqué dans le tableau VI ci-après et on cultive à 31°C pendant 72 h en culture agitée. Les quantités de L-lysine (sous forme de chlorhydrate) produite sont énumarées dans le tableau VI. Les milieux de culture utilisés pour les souches AC-73 5 et AD-162 contiennent 5 mg/ml de pantothénate de calcium et 100 mg/1 d'adénine et de guanine respectivement. On sépare les cellules bactériennes et les sels de calcium solides du bouillon de culture de la souche Y-108 par centrifugation, on introduit 1 litre de la liqueur surnageante sur une colonne garnie d'une 0 résine échangeuse de cations forte, telle que celle vendue sous le nom de marque d'Amberlite IR-120, sous la forme H, on élue la L-lysine adsorbée sur la résine par l'ammoniaque aqueuse à 3% et on concentre l'éluat sous pression réduite. On ajoute de l'acide chlorhydrique à la solution concentrée, on refroidit dans la glace pour précipiter la L—lysine et on obtient 30,2 g 5 de chlorhydrate de L-lysine dihydraté brut. EXEMPLE 2 On inocule avec Brevibacterium lactofermantum Y-108 (ATCC 21798), AC-73 (ATCC 21799), AD-5 (ATCC 21800) et AD-162 (ATCC 21801), respectivement^un milieu de culture d'ensemencement contenant 1,5 g/dl de 0 glucose, 0,3 g/dl d'acétate d'ammonium, 0,1 g/dl de K^PO^, 0,04 g/dl de MgS04,7H20, 2 ppm d'ions Fe2+ et Mn^+, 50 y/1 de biotine, 200 y/1 de chlorhydrate de thimaine, 1,5 ml/dl d'hydrolysat de protéine de sojat (teneur totale en azote 7%) et 0,5 g/dl d'extrait de levure, ajusté à pH 8,0, et on cultive à 31°C pendant 16 h avec agitation et aération. 5 On inocule avec 15 ml de chaque culture d'ensemencement 300 ml d'un milieu de culture principal contenant 3 g/dl de glucose, 0,5 g/dl 6'acétate d'ammonium, 0,2 g/dl d'urée, 0,1 g/dl deK^PO^, 0,04 g/dl de 73 15472 ii 2182211 MgSO^,711^0, 2 ppm d'ions Fe2+ et Mn2+, 50 y/1 de biotine, 50 y/1 de chlorhydrate de thiamine, 3 ml/dl d'hydrolysat de protéine de soja et les agents nutritifs indiqués dans le tableau VII, ajusté à pH 7,5 et on cultive à 31,5°C en agitant à 1500 tr/mn en introduisant par minute 5 un égal volume d'air. On maintient, pendant la culture, le pH entre 7,2 et 8,0 par addition automatique d'une solution d'acide acétique et d'acétate d'ammonium contenant 0,25 mole d'acétate d'ammonium par mole d'acide acétique et dont la concentration en acide acétique est de 60%. Après culture pendant 48 h, on trouve, dans le bouillon 10 de culture pour chaque souche,4,8 à 6,4 g/dl de chlorhydrate de L-lysine, comme indiqué dans le tableau VII ci-après. EXEMPLE 3 On cultive Brevibacterium lactofermentum Y-108 (ATCC 21798), AC-73 (ATCC 21799), AD-5 (ATCC 21800) et AD-162 (ATCC 21801) respectivement, 15 à 31,5°C pendant 16 h en culture agitée sur un milieu de culture d'ensemencement contenant 1,5 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'urée, 0,1 g/dl de KH9P0,, O i Oj. ^ ** 0,04 g/dl de MgSO^^I^Q, 2 ppm d'ions Fe et Mn , 50 y/1 de biotine, 200 y/1 de chlorhydrate de thiamine, 1,5 ml/dl d'hydrolysat de protéine de soja et 0,5 g/dl d'extrait de levure, ajusté à pH 8,0. 20 On ajoute 15 ml de chacune des cultures d'ensemencement pour inoculer un milieu de culture principal de 300 ml de composition suivante Glucose Ethanol (NH4)2S°4 25 Urée KH2P°4 • MgSO,,7H 0 Fe2 Mn2+ 30 Biotine Vitamine B^ ,HCl Hydrolysat de protéine de soja (azote total : 77») Agents nutritifs comme indiqué 35 dans le tableau VIII ajusté à pH 7,5 et on cultive à 31,5°C en agitant à 1500 tr/mn en faisant passer un égal volume d'air par minute dans le milieu. 1 g/dl 1,5 g/dl 0,5 g/dl 0,2 g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 2 ppm 2 ppm 50 y/1 50 y/1 3 ml/dl 73 15472 12 2182211 Pendant la fermentation, on maintient le pH du milieu entre 7,0 et 7,5 en introduisant dans le milieu de l'ammoniac gazeux. La quantité d'éthanol résiduel est déterminée par chroraato-graphie en phase gazeuse et on introduit de 1'éthanol dans le milieu lorsque 5 la teneur résiduelle a diminué à environ 0,3 g/dl. Après 48 h, on trouve que le bouillon de culture de chaque souche contient le chlorhydrate de L-lysine dans la quantité indiquée au tableau VIII. EXEMPLE 4 10 On utilise comme souches d'ensemencement Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 (FERM P-1570), AJ-3392 (FERM P-1571), AJ-3393 (FERM P-1572), AJ-3394 (FERM P-1573), AJ-3395 (FERM P-1574) et AJ-3396 (FERM P-1575) respectivement,et on les cultive de la même manière que décrit à l'exemple 1, sauf qu'on ajoute la quantité d'hydrolysat de protéine de soja indiquée 15 dans le tableau IX et 5 mg/ml d'hypoxanthine au milieu pour la souche AJ-3396. Après incubation pendant 72 h, on trouve, da;ns le bouillon résultant pour chaque souche la quantité de L-lysine (sous forme de chlorhydrate indiquée dans le tableau IX ci-après. 20 EXEMPLE 5 On utilise comme souche d'ensemencement Brevibacterium lactofermentum AJ-SS91 (FERM P-1570), AJ-3392 (FERM P-1571), Aj-3393 (FERM P-1572), AJ-3394 (FERM P-1573), AJ-3395 (FERM P-1574).et AJ-3396 (FERM P-1575), respectivement, et on les cultive en utilisant l'acide acé-25 tique comme principale source de carbone, de la même manière que décrit à l'exemple 2, sauf qu'on ajoute au milieu 5 mg/ml d'hypoxanthine pour la souche AJ-3396. Après 48 h d'incubation, on trouve dans le bouillon résultant, pour chaque souche,la quantité de L-lysine sous forme de chlorhydrate 30 indiquée dans le tableau X ci-après. Après culture pendant 48 h de la souche AJ-3392, la consommation en acide acétique est de 30% en volume par rapport au volume du milieu initial et on trouve que le bouillon de culture contient 7,1 g/dl de chlorhydrate de L-lysine, En traitant 1 litre de bouillon de culture comme 35 décrit dans l'exemple 1, on obtient 56,3 g de chlorhydrate de L-lysine dihydraté. EXEMPLE 6 On utilise comme souches d'ensemencement Brevibacterium 73 15472 13 2182211 lactofermentum AJ-3391, AJ-3392, AJ-3393, AJ-3394, AJ-3395 et AJ-3396, respectivement, et on les cultive en utilisant 1'éthanol comme principale source de carbone, de la même manière que décrit à l'exemple 3, sauf qu'on ajoute 5 mg/ml d'hypoxanthine comme agent nutritif au milieu pour 5 la souche AJ-3396. formées dans le bouillon résultant pour chaque souche, après 48 h d'incubation, sont indiquées dans le tableau XI, ci-après. 10 culture, 6,3 g (rendement 27,7% par rapport à 1'éthanol utilisé) de chlorhydrate de L-lysine dans le bouillon de culture et on obtient 50,4 g de chlorhydrate de L-lysine dihydraté à partir de 1 litre de bouillon de culture, par le même procédé que décrit à l'exemple 1. EXEMPLE 7 15 On utilise comme souche d'ensemencement Brevibacterium lactofermentum AJ-3424 (FERM P-1711), AJ-3425 (FERM P-1712) et n° 872 (témoin) respectivement, et on les cultive de la même manière que décrit à l'exemple, sauf qu'on ajoute 200 y/1 de chlorhydrate de thiamine et 3% d'hydrolysat de protéine de soja au milieu pour la souche AJ-3425. 20 Les quantités de L-lysine (sous forme de chlorhydrate) formées dans le bouillon résultant pour chaque souche après 72 h d'incubation, sont indiquées dans le tableau XII ci-après. EXEMPLE 8 25 AJ-3425 et n° 872 (témoin)Respectivement, un milieu de culture d'ensemencement de composition suivante et on cultive à 31°C pendant 18 h avec agitation et aération : Les quantités de L-lysine (sous forme de chlorhydrate) Comme le montre le tableau XI, on trouve, après 48 h de On inocule avec Brevibacterium lactofermentum AJ-3424, 30 35 Glucose Acétate d'ammonium Urée MgS04,7H20 Biotine Chlorhydrate de thiamine Hydrolysat de protéine de soja (azote total 7%) 1,5 % 0,3 % 0,1 % 0,1 % 0,04 % 2 ppm 2 ppm 50 y/1 200 y/1 2 % PH 7,5 73 15472 14 2182211 On place des échantillons de 300 ml du milieu de culture principal de composition ci-dessous dans des cuves à fermentation en verre de 1 litre. Glucose 2 % Acétate d'ammonium 0,5 % Urée 0,2 % kh2po4 0,1 % MgSO,,7H 0 Fe2 Mn2+ 0,04 % 2 2 ppm ppm Biotine 50 y/1 Chlorhydrate de thiamine 50 y/1 Hydrolysat de protéine de soja (azote total 7%) 2,5 % pH 7,5 Après stérilisation, on inocule chaque milieu avec 15 ml du bouillon de culture d'ensemencement de chaque souche préparé ci-dessus et on cultive à 31-33°C en agitant à 1500 tr/mn et en faisant passer dans le milieu un égal volume d'air par minute. Pendant la culture, on maintient le pH du milieu entre 7,2 et 8,0 par addition automatique d'une solution 20 d'acide acétique et d'acétate d'ammonium dont la concentration en acide acétique est de 60% et contenant. 0,25 mole d'acétate d'ammonium par mole d'acide acétique. Après culture pendant 55 h, on trouve, dans les bouillons de culture, les quantités de chlorhydrate de L-lysine indiquées dans le 25 tableau XIII ci-après. EXEMPLE 9 On inocule avec Brevibacterium lactofermentum AJ-3424, AJ-3425 et n° 872 (témoin), respectivement, sur un milieu de culture d'ensemencement de même composition qu'à l'exemple 8, sauf qu'on ajoute 0,5% 30 d'éthanol au lieu de l'acétate d'ammonium et 0,3% d'urée au milieu de culture et on cultive à 31°G pendant 18 h avec agitation et aération. On effectue la fermentation de la même manière en utilisant le bouillon de culture d'ensemencement ci-dessus mentionné, comme décrit à l'exemple 8, sauf qu'on ajoute au milieu de culture principal 1% de 35 glucose, 1% d'éthanol et 0,5% de sulfate d'ammonium au lieu d'acétate d'ammonium. Pendant la fermentation, on maintien le pH du milieu entre 7,2 et 8,2 en introduisant de l'ammoniac gazeux. 73 15472 15 2182211 On détermine la quantité d'éthanol résiduel par chromato-graphie en phase gazeuse et on introduit de 1'éthanol dans le milieu lorsque sa teneur résiduelle diminue à environ 0,3%. Après 48 h, on trouve dans le bouillon de culture, pour chaque 5 souche, les quantités de chlorhydrate de L-lysine indiquées dans le tableau XIV ci-après. EXEMPLE 10 On prépare un milieu de culture de composition suivante : Glucose 10 % 0 (NH4>2S04 4>5 % kh2po4 0,1 % MgSO,,7H_0 0,04 % 2+ Fe 2 ppm _ 2+ Mn 2 ppm 5 Biotine 50 y/1 Chlorhydrate de thiamine 200 y/1 Hydrolysat de protéine de soja (azote total 7%) 1 % CaC03 5 % 3 pH 7,0 ' On place des échantillons de 20 ml du milieu dans des flacons «fe 500 ml pour culture agitée et on stérilise à 110°C pendant 5 mn. On inocule le milieu de culture ci-dessus mentionné avec Brevibacterium lactofermentum AJ-3429 (FERM P-1857) préalablement . cultivé sur gélose inclinée au bouillon et on cultive à 31°C pendant 72 h en culture agitée-. Il s'accumule dans le bouillon de culture 5,1 g/dl de L-lysine sous forme de chlorhydrate (rendement 51% par rapport au glucose utilisé). EXEMPLE 11 On utilise comme souche d'ensemencement Corynebacterium ) 5 glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613), AJ-3458 (FERM P-1982), AJ-3460 (FERM P-1984), AJ-3461 (FERM P-1985), Corynebacterium lilium AJ-3464 (FERM P-2026) et Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3465 (FERM P-2027), respectivement, et on les cultive de la même manière que décrit à l'exemple 10, sauf qu'on ajoute en outre 0,5 % d'extrait de levure au milieu pour, la souche AJ-3460. On obtient la souche AJ-3465 AEC résistante et ayant besoin d'clcr.ine par un procédé semblable à celui décrit précédemment dans l'expérience 3 en utilisant comme souche mère Corynebacterium acetoacidophilum 73 15472 16 2182211 410 ATCC 13870. On prépare également Corynebacterium glutamicum AJ-3463 (FERM P-1987), AEC-résistant et sans besoin nutritionnel, par un procédé semblable à celui décrit à l'expérience 3, à partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 comme souche mère et on utilise cette souche comme 5 témoin dans le présent exemple. formée après 72 h de culture dans le bouillon résiduel pour chaque souche sont indiquées dans le tableau XV. EXEMPLE 12 glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613), AJ-3458 (FERM P-1982), AJ-3460 (FERM P-1984), AJ-3461 (FERM P-1985), Corynebacterium lilium AJ-3464 (FERM P-2026) etCorynebacterium acetoacidophilum AJ-3465 (FERM P-2027) respectivement, et on les cultive de là même manière en utilisant l'acide acétique 15 comme principale source de carbone comme décrit à l'exemple 2, sauf qu'on ajoute en outre 0,5% d'extrait de levure au milieu d'ensemencement et on ajuste son pH à 7,0 et on ajoute 2,5% d'hydrolysat de protéine de soja au milieu de culture principal. 20 dans le bouillon résultant de chaque souche après 55 h de culture sont indiquées dans le tableau XVI ci-après. EXEMPLE 13 Corynebacterium lilium Aj-3464 ' (FERM P-2026) et Corynebacterium aceto-25 acidophilum AJ-3465 (FERM P-2027) respectivement, sur un milieu de culture d'ensemencement de composition suivante : Les quantités de L-lysine (sous forme de chlorhydrate) 10 On utilise comme souches d'ensemencement Corynebacterium Les quantités de L-lysine (sous forme de chlorhydrate formée On inocule Corynebacterium glutamicum AJ-3397. (FERM P-1613), 30 35 Biotine Chlorhydrate de thiamine Hydrolysat de protéine de soja (azote total 7%) KH2P°4 MgS04,7H20 Glucose Urée 1,5 % 0,3 % 0,1 % 0,04 % 2 ppm 2 ppm 50 -y/1 200 y/1 1,5 % pH 7,5 I 73 15472 17 2182211 et on cultive à 31°C pendant 18 h avec agitation et aération. On place des échantillons de 300 ml d'un milieu de culture principal de composition suivante dans des cuves à fermentation en verre de 1 litre. 5 Glucose 1 % Ethanol 1 % (NH.) S0. 0,5 % 4 2 4 Urée 0,2 % kh2po4 0,1 % 10 MgSO,,7H.0 0,04 % 2+ Fe 2 ppm „ 2+ Mn 2 ppm Biotine 50 y/1 Chlorhydrate de thiamine 50 y/1 15 Hydrolysat de protéine de soja (azote total 7%) 2,5 % Après stérilisation, on inocule chaque milieu avec 15 ml dudit bouillon de culture ensemencé avec chaque souche et on cultive à 31-33aC en agitant et en faisant passer un égal volume d'air par minute. Pendant 2Q la culture, on maintient le pH du milieu entre 7,2 et 7,8 par introduction de gaz d'ammoniac dans le milieu. On détermine par chromatographie en phase gazeuse la quantité d'éthanol résiduel dans le milieu et on introduit de 1"éthanol au milieu lorsque la concentration résiduelle s'est abaissée à environ 0,3%. 25 Les quantités de L-lysine (sous forme de chlorhydrate),formée dans le bouillon résultant pour chaque souche après 48 h de culture, sont indiquées dans le tableau XVII. 73 15472 18 2182211 TABLEAU I Souche Densité optique (D) après culture sur milieu minimal Sans Avec Brevibacterium ATCC 13869 lactofermentum 0,400 Brevibacterium ATCC 21798 lactofermentum 0,065 (sérine) 0,410 Brevibacterium ATCC 21799 lactofermentum 0,059 (pantothénate de Ca) 0,405 Brevibacterium ATCC 21800 lactofermentum 0,380 0,075* Brevibacterium ATCC 21801 lactofermentum 0,052 (adénine) 0,375 * Pas de thiamine dans le milieu minimal. TABLEAU II Croissance (D) Souche Milieu minimal Milieu minimal + agent nutritif ATCC 13869 0,400 AJ-3391 0,058 0,440 (40 mg/dl de proline) AJ-3392 0,057 0,420 (0,5 mg/dl de nicotinamide + 40 mg/dl de leucine) AJ-3393 0,052 0,460 (50 mg/dl de sérine + 40 mg/dl de leucine) AJ-3394 0,058 0,390 (10 y/dl de vitamine AJ-3395 0,055 0,430 (1 mg/dl de nicotinamide) AJ-3396 0,059 0,420 (5 mg/dl d'hypoxanthine) 73 15472 19 2182211 TABLEAU III Agent nutri Concentra Croissance (D) tif ajouté tion (mg/dl) AJ-3424 AJ -3425 non - 0,027 0,025 0,068 0,070 L-ala 50 0,185 0,152 0,170 0,176 D-ala 50 0,155 0,162 0,236 0,250 val. 50 • 0,058 0,080 0,160 0,210 nie. 0,5 0,045 0,037 0,066 0,071 thr. + 50 met. 50 0,022 0,020 0,072 0,076 L-ala.+ 50 0,425 0,460 0,238 0,251 nie. 0,5 D-ala. + 50 0,510 0,480 0,348 0,341 nie. 0,5 val. + 50 nie. 0,5 — 0,312 0,323 nie = nicotinamide ou acide nicotinique. TABLEAU IV Souche Aj-3429 Agents nutritifs ajoutés Croissance (D) néant 0,030 0,035 ala. 0,031 0,033 leu. 0,032 0,033 ala. + leu. 0,180 0,176 ala. + leu. + nie. 0,460 0,480 ala. + leu. + nie. + thr. + met. 0,435 0,445 Les concentrations sont de 50 mg/dl pour chaque aminoacide et 5 mg/1 pour le nicotinamide. 73 15472 20 TABLEAU V 2182211 Souche Besoin nutritionnel Concentration (D) suspension de cellules Agent nutritif Quantité (mg/dl) Croissance (D) AJ-3458 0,455 L-proline O o 0,475 0,030 AJ-3460 0,430 guanine 5 0 0,320 0,090 AJ-3461 0,400 vitamine B-_ j L-leucine 0,01 + 50 0+0 0,300 0,075 AJ-3463 0,451 - - 0,512 TABLEAU VI Souche Quantité de lysine produite (g/dl) Brevibacterium lactofermentum Y-108 (FERM P-1443) ATCC 21798 4,1 Brevibacterium lactofermentum AC-73 (FERM P-1444) ATCC 21799 2,5 Brevibacterium lactofermentum AD-5 (FERM P-1445) ATCC 21800 3,0 Brevibacterium lactofeimentum AD-162 (FERM P-1446) ATCC 21801 . 2,8 5472 21 2182211 TABLEAU VII Souche Agent nutritif ajouté (mg/1) Quantité de lysine produite (*/dl) Y-108 (ATCC 21798) - 6,4 AC-73 (ATCC 21799) pantothénate de Ca : 5 4,8 AD-5 (ATCC 21800) - 5,7 AD-162 (ATCC 21801) adénine : 100 + guanine : 100 6,0 TABLEAU VIII Souche Agent nutritif ajouté (mg/1) Quantité de lysine produite (g/dl) Y-108 (ATCC 21798) - 5,5 AC-73 (ATCC 21799) pantothénate de Ca : 5 4,4 AD-5 (ATCC 21800) - 5,5 AD-162 (ATCC 21801 adénine : 100 + guanine : 100 5,7 TABLEAU IX Souche Quantité d'hydrolysat de protéines de soja (%) Quantité de L-lysine produite (g/dl) AJ-3391 3 2,9 AJ-3392 1,5 5,0 AJ-3393 1,5 4,6 AJ-3394 3 3,5 AJ-3395 2 3,1 AJ-3396 3 3,0 15472 22 TABLEAU X 2182211 Souche Addition d'hypoxanthine (mg/dl) •Quantité de L-lysine produite (g/dl) AJ-3391 - 5,4 AJ-3392 - 7,1 AJ-3393 - 7,0 AJ-3394 - 6,5 AJ-3395 - 5,8 AJ-3396 5 6,1 TABLEAU XI Souche Addition d'hypoxanthine (mg/dl) Quantité de L-lysine produite (g/dl) AJ-3391 - 5,2 AJ-3392 - 6,3 AJ-3393 - 6,5 AJ-3394 - 6,1 AJ-3395 - 5,0 AJ-3396 5 5,5 TABLEAU XII Souche Quantité de L-lysine produite (g/dl) Rendement, par rapport au glucose utilisé (%) AJ-3424 4,4 44 AJ-3425 3,2 32 n° 872 1,8 18 73 15472 23 2182211 TABLEAU XIII Souche Quantité de L-lysine produite (g/dl) Acide acétique consommé (%) AJ-3424 7,2 22 AJ-3425 6,1 24 n° 872 4,0 32 TABLEAU XIV Souche Quantité de L-lysine produite (g/dl) Rendement par rapport à l'éthanol utilisé (%) AJ-3424 6,6 26 AJ-3425 5,6 20 n° 872 3,6 17 TABLEAU XV Souche Quantité de L-lysine produite (g/dl) Rendement par rapport au glucose utilisé (%) AJ-3397 3,0 30 AJ-3458 3,0 30 AJ-3461 4,1 41 AJ-3460 3,1 31 AJ-3464 2,9 29 AJ-3465 3,2 32 AJ-3463 2,0 20 73 15472 24 2182211 TABLEAU XVI Souche Quantité de L-lysine produite(g/dl) Acide acétique consommé (%) AJ-3397 5,0 22 AJ-3458 5,2 23,5 AJ-3460 4,7 25 AJ-3461 6,4 23 AJ-3464 5,5 24 AJ-3465 5,8 22 TABLEAU XVII Souche Quantité de L-lysine produite (g/dl) Rendement par rapport à 1'éthanol utilisé (%) AJ-3397 4,8 23 AJ-3464 4,1 20,5 AJ-3465 4,6 24 73 15472 2182211 25 REVENDICATIONS 1 - Procédé microbiologique pour l'obtention de L-lysine, caractérisé en ce que l'on cultive une souche productrice de lysine appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium en conditions aérobies dans 5 un milieu contenant des sources assimilables de carbone et d'azote des sels inorganiques des substances nécessaires à la croissance et des substances organiques facilitant la croissance à pH 5-9, jusqu'à ce que la L-lysine soit produite dans ledit milieu, ladite souche présentant une résistance à l'inhibition par rétroaction de la lysine et ses analogues et un 10 besoin nutritionnel en au moins un composé choisi parmi la sérine, la proline, l'alanine, le nicotinamide, l'acide pantothénique, la thiamine, la guanine, 1'hypoxanthine et la vitamine B^s et accumulant la L-lysine dans le bouillon de culture résultant. 2 - Procédé selon la revendication 1, caraetérisé en ce que 15 ladite source assimilable de carbone est un hydrate de carbone. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite source assimilable de carbone est l'acide acétique. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite source assimilable de carbone est 1'éthanol. 20 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit analogue de lysine est la S-(p-aminoéthyl)-L-cystéine. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les substances nécessaires à la croissance sont présentes dans ledit milieu sous forme d'un composé d'une substance naturelle. 25 7 - Procédé.selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite source productrice de lysine est choisie parmi Brevibacterium lactofermentum Y-108 ATCC 21798, Brevibacterium lactofermentum AC-73 ATCC 21799, Brevibacterium lactofermentum AD-5 ATCC 21800, Brevibacterium lactofermentum AD-162 ATCC 21801, Brevibacterium lactofermentum AJ-3424 FERM P-1711, 30 Brevibacterium lactofermentum AJ-3425 FERM P-1712, Brevibacterium lactofermentum AJ-3429 FERM P-1857,.Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 FERM P-1570, Brevibacterium lactofermentum AJ-3394 FERM P-1573, Brevibacterium lactofermentum AJ-3395 FERM P-1574, Brevibacterium lactofermentum AJ-3396 FERM P-1575, Brevibacterium lactofermentum AJ-3392 FERM P-1571, Brevibacterium lactofermentum 35 AJ-3393 FERM P—1572, Corynebacterium glutamicum AJ-3397 FERM P-1613, Corynebacterium lilium AJ-3464 FERM P-2026, Corynebacterium acétoacidophilum AJ-3465 FERM P-2027, Corynebacterium glutamicum AJ-3458 FERM P-1982, Corynebacterium glutamicum AJ-3460 FERM P-1984 et Corynebacterium glutamicum AJ-3461 FERM P-1985.