Brevet FR2183192A1 — publié le 19731214

la présente invention concerne le domaine des antibiotiques et elle a trait en particulier à la modification d'anti- biotiques par leur fixation à des matrices solides insolubles dans 11 eau, à savoir la cellulose ou un dérivé cellulosique. L'invention concerne plus particulièrement des procédés d'insolubilisation dans l'eau d'antibiotiques doués d'activité antibactérienne, par fixation à certains dérivés de cellulose de manière que les antibiotiques insolubilisés conservent une partie du spectre d'activité biologique qu'ils déploient normalement en solution. Ils protègent ainsi ces dérivés cellulosiques d'une attaque par des micro-organismes particuliers.Ces antibiotiques insolubilisés ont des applications dans la protection sélective contre l'attaque microbienne du papier et de documents officiels, de la toile, de garnitures de colonnes chromatographiques lorsque ces garnitures sont à bass de dérivés cellulosiques, de réactifs enzymatiques insolubilisés basés sur la fixation de l'enzyme à des dérivés cellulosiques, la protection de certaines garnitures å base de cellulose pour tours de refroidissement et de papiers muraux à base de cellulose.Ils offrent également une nouvelle forme de stérilité pour des feuilles et d'autres tissus et gazes à base de coton et ils peuvent etre intéressants à utiliser comme pansements pour blessures, notamment pour des brûlures ayant tendance à être infectées par Pseudomonas aeruginosa, ou pour le traitement de canaux infectés de racines dentaires avant l'obturation. I1 est bien connu que les antibiotiques déploient leur activité antimicrobienne en solution même à de faibles concentrations. Bien qu'il soit difficile de faire des prévisions avant leur préparation et leur expérimentation, il a été établi également qutun nombre limité de dérivés d'antibiotiques déploient également une activité biologique en solution. Un fait inattendu est que certaines préparations d t antibiotiques insolubilisés par fixation à de la cellulose, déploient encore en partie, mais généralement non en totalité, l'activité antimicro- bienne normale de leur forme initiale soluble i,l3me lorsque lesdites préparations ont été correctement lavées avec de l'eau et des solutions concentrées de sels.On a obtenu un nombre limité de préparations antibiotiques insolubles qui inhibent la croissance de quatre organismes soumis aux essais, à savoir Streptococcus faecalis, Staphylococcus pyogenes, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. On a décrit un procédé d'insolubilisation des antibiotiques basé sur une technique dans laquelle un dérivé cellulosique de titane, étain, zirconium, fer ou vanadium est combiné chimiquement avec un antibiotique. L'invention concerne des alltlbiotioues fixés à des matrices solides insolubles dans l'eau Elle concerne en particulier des préparations actives insolubles dans l'eau d'antibiotiques doués d'activité antibactérienne, qui sont combinés chimiquement avec des dérivés organo-métalliques de cellulose ou d'un dérivé cellulosique. Elle a trait à des dérivés insolubles de streptomycine, paromomycine, gentamycine, kanamycine, néomycine, polymyxine, ampicilline et natamycine, en combinaison chimique avec des dérivés de titane, étain, zirconium, fer ou vanadium de la cellulose ou d'un dérivé cellulosique. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un antibiotique insoluble dans l'eau, procédé qui consiste à faire réagir à un pH égal à 3-7 un antibiotique doué d'activité antibactérienne avec un dérivé de titane, étain, zirconium, fer ou vanadium cellulose ou d'un dérivé cellulosique. Le dérivé organo-métallique de cellulose ou d'un composé cellulosique peut être obtenu par réaction de la cellulose ou d'un composé cellulosique avec un sel ou un autre dérivé de titane, tain, zirconium, fer ou vanadium qui forme un dérivé organo-métallique convenable. La réaction peut être conduite à un pH de 4,5. pendant une heure à 4 C. L'antibiotique doué d'activité antimicroblenne contient de prélérence au moins un groupe amino ; normalement7 un ou plusieurs groupes aminc primaires sont présents. On utilise des titrages biologiques antibactériens pour estimer l'efficacité des préparations. Attendu que les échantillons des antibiotiques fixés à la cellulose sont insolubles dans l'eau, on adopte une modification de la méthode usuelle de dilution par degrés. En outre, on expérimente à chaque fois un poids constant (15 mg) de l'échantillon pour obtenir des résultats comparables. Chaque antibiotique est combiné dans les conditions optimales par l'intermédiaire d'un dérivé métallique particulier de cellulose pour obtenir l'activité antimicrobienne maximale. Ainsi, d'après les résultats indiqués sur les tableaux 1 à 5, on constate que les antibiotiques suivants déploient une activité antibactérienne qui va en croissant depuis le premier sel métallique mentionné utilisé pour la combinaison avec la cellulose jusqu'au dernier de chaque série. Streptomycine : SnCl4 > ZrCL4 > TiCl3 > VCl3 > FeCl3 Paramomycine : SnCl4 > FeCl3 > ZeCl4 > TiCl3 > VCl3 Gentamycine : SnCl4 # ZrCl4 # TiCl4 # FeCl3 # VCl3 Kanamycine : SnCl4 # ZrCL4 # FeCl3 # TiCl3 # VCl3 Néomycine : ZrCl4 > SnCl4 > FeCl3 # VCl3 > TiCl3 Polymyxine : FeCl3 # VCl3 > SNCl4 = ZrCl4 = TiCl3 Ampicilline : SnCl4 > FeCl3 > VCl3 > TiCl3 > ZrCl4 Natamycine : SnCl$ > VCl3 > FeCl3 > ZrCl4 ou TiCl3 Ces ordres d'activité antibactérienne ont été déterminés d'après l'action exercée contre deux bactéries Gram-positives et deux bactéries Gram-négatives. Les ordres d'activité indiqués ci-dessus dictent par conséquent les procédés préférés de combinaison de l'antibiotique avec la cellulose. Lorsque deux procédés de combinaison sont en apparence également efficaces, on choisit de préférence le métal le moins toxique et le meilleur marché. Pour des applications particulières, d'autres facteurs tels que l'aptitude à inhiber la croissance de Pseudomonas aeruginosa dans un pansement pour brûlures est déterminante. En particulier, les combinaisons suivantes ont été efficaces contre les quatre organismes testés Streptomycine - dérivé d'étain de la cellulose Streptomycine - dérivé de zirconium de la cellulose Paromomycine - dérivé d'étain de la cellulose Gentamycine - dérivé d'étain de la cellulose Gentamycine - dérivé de titane de la cellulose Gentamycine - dérivé de zirconium de la cellulose IRanamycine - dérivé d'étain de la cellulose Kanamycine - dérivé de zirconium de la cellulose Néomycine - dérivé de zirconium de la cellulose Néomycine - dérivé d'étain de la cellulose Natamycine - dérivé d'étain de la cellulose. On donne ci-après, à titre d'exemple, une description de procédés de mise en oeuvre de l'invention. Généralités et méthodes d'essai Sources d'antibiotiques : sulfate de streptomycine (Glaxo Laboratories Ltd.), sulfate de néomycine (Boots Pur Drug Co. Ltd.), sulfate de kanamycine (Bayer), sulfate de paromomycine (Parke-Davis Ltd.), sulfate de gentamycine (Aspro-Nicholas Ltd.), ampicilline (Beecham Research Lab.), sulfate de polymyxine B (Burrough Wellcome and Co.) et natamycine (Arthur H. Cox and Co. Ltd.). Méthodes de titrage biologique (a) titrage antibactérien On effectue le titrage biologique antibactérien en u lisant deu- bactéries Gram-positives (Streptococ faecilis et Staphylococcus pyogenes) et deux bactéries Gram-négatives (Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa) comme organismes représentatifs. On prépare au moment de l'essai une plaque circulaire de gélose nutritive (8,7 cm de diamètre) à partir de gélose nutritive stérile, fondue et refroidie, et on creuse un sillon diamétral (1,2 cm). On verse dans le sillon une suspension de la matière d'essai (15 mg) dans la même gélose, et on inocule en stries, en travers du sillon, des cultures pures des quatre organismes. On fait ensuite incuber la plaque à 370C pendant 24 heures..On mesure à partir du bord du sillon l'extension de l'inhibition de croissance de chaque organisme. On prépare en même temps des plaques témoins ne renfermant pas les échantillons pour controler la croissance des organismes. On expérimente de la même façon des étalons des antibiotiques purs. Exemple 1 On agite mécaniquement de la cellulose microcristalline ("Sigmacell", type 38 ; Sigma Chemical Company) (20 g) avec du chlorure de titane filtré (British Drug Houses Ltd.). concentration 12,5 % poids/volume, 200 ml). On sépare la matière solide par filtration et on la maintient pendant 24 heures dans une étuve à 450C, on la broie en une poudre et on conserve cette poudre à la température ambiante dans un dessicateur sur du pentoxyde de phosphore. On lave des échantillons du dérivé de titane de cellulose ainsi obtenu (1500 mg) deux fois avec un tampon au phosphate 0,02 M (pH 5,1). Les échantillons sont ensuite agités au moyen d'un agitateur magnétique avec une solution d'antibiotique (100 mg) dans 30 ml de tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 4,5) pendant 1 heure à 40C. On lave cinq fois la matière insoluble avec à chaque fois 30 ml de tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 5,1) puis avec du chlorure de sodium 0,5 M dans 30 ml de tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 5,1). les échantillons sont ensuite mis en suspension dans 30 ml de tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 5,1) et dialysés vis-à-vis d'eau courante pendant environ 16 heures.On ajuste le volume final de chaque suspension à 30 ml avant l'essai. Les résultats obtenus sont indiqués sur les tableaux I et Ilo TABLEAU I Combinaison d'un dérivé de titane de la cellulose avec des antibiotiques Produit de Inhibition vis-à-vis de: titane-cellulose et de: Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Sulfate de 7 mm - 5 mm 4 mm streptomycine du sillon du sillon du sillon Sulfate de 5mm - 5 mm paromomycine du sillon du sillon Sulfate de 5 mm travers du 5 mm travers du gentamycine du sillon sillon du sillon sillon Sulfate de 5 mm travers du 5 mm kanamycine du sillon sillon du sillon TABLEAU II Combinaison d'un dérivé de titane de la cellulose avec des antibiotiques Produit de Inhibition vis-à-vis de: titane-cellulose et de:Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Sulfate de - travers du travers du néomycine sillon sillon Sulfate de 2 mm - - travers du polymyxine du sillon sillon Ampicilline - - développement réduit au travers du sillon Exemple 2 On répète les modes opératoires décrits dans l'exemple 1 en utilisant d'autres solutions de sels métalliques à la place du chlorure de titane.On prépare ainsi des dérivés de fer, étain, zirconium et vanadium de la cellulose en utilisant respectivement le chlorure ferrique (de pureté "réactif", Hopkin and Williams Ltd., concentration 12,5 % en poids/volume), le chlorure stannique (Hopkin and Williams Ltd., 12,5 % en poids/volume), le tétrachlorure de zirconium (British Drug Houses Ltd., concentration 12,5 % en poids/volume) et le trichlorure de vanadium (British Drug Houses Ltd., concentration 12,5 % en poids/volume). On place des échantillons de chacun des dérivés de cellulose mentionnés ci-dessus en contact avec des solutions de l'antibiotique indiqué dans l'exemple 1 et on les soumet à la même opération de lavage avant les tests biologiques. Les résultats obtenus sont indiqués sur les tableaux III, IV et V. TABLEAU III Combinaison d'un dérivé de titane de la cellulose avec des antibiotiques avec des dérivés de fer, étain, et vanadium de la cellulose Antibiotique Inhibition vis-à-vis de: combiné avec Methode la cellulose utilisée Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Sulfate de FeCl3 - travers du 5 mm du sillon streptomycine sillon SnCl4 15 mm du 3 mm du 15 mm du 6 m du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 12 mm du travers du 12 mm du travers du sillon sillon sillon sillon VCl3 7 mm du - 8 mm du sillon sillon Paromomycine FeCl3 5 mm du réduction au 7 mm du travers du sillon travers du sillon sillon sillon SnCl4 10 mm du travers du 10 mm du travers du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 9 mm du travers du 10 mm du sillon sillon sillon VCl3 4 mm du - 5 mm du sillon sillon TABLEAU III Combinaison d'un dérivé de titane de la cellulose avec des antibiotiques avec des dérivés de fer, étain, zirconium et vanadium de la cellulose Antibiotique Inhibition vis-à-vis de: combiné avec Methode la cellulose utilisée Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Gentamycine FeCl3 7 mm du - 10 mm du sillon sillon SnCl4 11 mm du 4 mm du 12 mm du 3 mm du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 10 mm du 4 mm du 14 mm du 3 mm du sillon silon sillon sillon VCl3 3 mm du réduction au 6 mm du travers du sillon sillon TABLEAU IV Combinaison d'un dérivé de titane de la cellulose avec des antibiotiques avec des dérivés de fer, étain,zirconium et vanadium de la cellulose Antibiotique Inhibition vis-à-vis de: combiné avec Methode la cellulose utilisée Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Kanamycine FeCl3 5 mm du travers du 6 mm du sillon sillon sillon SnCl4 12 mm du 2 mm du 14 mm du travers du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 12 mm du travers du 12 mm du travers du sillon sillon sillon sillon VCl3 travers du - 4 mm du sillon sillon Néomycine FeCl3 3 mm du réduction du 3 mm du réduction au sillon travers du sillon travers du sillon sillon SnCl4 3 mm du travers du 4 mm du travers du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 5 mm du travers du 4 mm du travers du sillon sillon sillon sillon VCl3 3 mm du réduction au 3 mm du réduction au sillon travers du sillon travers du sillon sillon TABLEAU V Combinaison d'un dérivé de titane de la cellulose avec des antibiotiques avec des dérivés de fer, étain, zirconium et vanadium de la cellulose Antibiotique Inhibition vis-à-vis de: combiné avec Methode la cellulose utilisée Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Polymyxine FeCl3 travers du - travers du travers du sillon sillon sillon SnCl4 3 mm du - - travers du sillon sillon ZrCl4 2 mm du - - travers du sillon sillon VCl3 1 mm du travers du - travers du sillon sillon sillon Natamycine FeCl3 travers du réduction au - sillon travers du sillon SnCl4 travers du travers du travers du travers du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 - - - VCl3 réduction au réduction au réduction au travers du travers du travers du sillon sillon sillon TABLEAU V (suite) Antibiotique Inhibition vis-à-vis de: combiné avec Methode la cellulose utilisée Escherichia Streptococcus Staphylococcus Pseudomonas coli faecalis pyogenes aeruginosa Ampicilline FeCl3 travers du réduction au - sillon travers du sillon SnCl4 réduction au réduction au réduction au réduction au travers du travers du travers du travers du sillon sillon sillon sillon ZrCl4 - - - VCl3 réduction au réduction au - travers du travers du sillon sillon REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un antibiotique insoluble dans l'eau, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir à un pH égal à 3-7 un antibiotique doué d'activité antibactérienne avec un dérivé de titane, étain , zirconium, fer ou vanadium de cellulose ou d'un dérivé cellulosique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on obtient un dérivé organo-métallique de cellulose ou d'un dérivé cellulosique par réaction de la cellulose ou de son dérivé avec un sel ou un autre dérivé de titane, étain, zirconium, fer ou vanadium. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la réaction est conduite à un pH de 4,5 pendant 1 heure à 40C. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'antibiotique doué d'activité antibactérienne contient au moins un groupe amino. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que l'antibiotique doué d'activité antibactérienne contient un ou plusieurs groupes amino primaires. 6. Procédé suivant la revendication 1 caractérisé par le fait que l'antibiotique est la streptomycine, la paromomycine, la gentamyfine, la kanamycine, la néomycine, la polymyxine, l'ampicilline ou la natamycine.