Brevet FR2180594A1 — publié le 19731130

La présente invention concerne de nouvelles compositions pharmaceutiques permettant de minimiser les effets toxiques de l'infection due à des bactéries produisant une élastase. les bactéries produisant une élastase ont acquis au cours des années une importance considérable en tant qu'agents pathogènes, dans diverses infections. Il importe particulièrement de noter l'incidence croissante de 12 infection due à des organismes du genre Pseudomonas chez les leucémiques, ou après des blessures ou des brûlures graves, c'est-à-dire des cas dans lesquels la réaction naturelle de défense contre l'infection bactérienne est altérée. L'infection par des organismes du genre Pseudomonas constitue un facteur sévère de complications dans ces cas, à cause de l'effet nécrotique, dA à ltelastase, qu'elle exerce sur le tissu vasculaire et le tissu conjonctif. En général, les antibiotiques sont dépourvus d'efficacité contre une infection à Pseudomonas déjà établie. On a. préparé des vaccins, mais du fait qu'ils dérivent d'antigènes somatiques, ils ont peu de valeur contre d'autres souches du même organisme. En outre, ces vaccins contiennent une matière cellulaire étrangère, qui peut provoquer des réactions d'allergie, et les protéases qui proviennent de l'organisme peuvent annihiler les mécanismes de défense de l'h8te, si elles ne sont pas neutralisées. On vient de découvrir que les effets toxiques de l'infection par des bactéries-produisant une élastase, telles que Pseudomonas, peuvent entre minimisés par l'immunisation d'animaux réceptifs contre ltélastase bactérienne, en utilisant cette élastase comme antigène. Du point de vue de l'immunité active, la composition de l'invention permet de minimiser les effets toxiques de lXinfection due à des bactéries élaborant une élastase, lorsqu'elle est administrée par voie parentérale à un animal ré ceptif, sous la forme d'élastase bactérienne purifiée en quantité suffisante pour provoquer chez l'animal la formation d'anticorps. Du point de vue de l'immunité passive, la composition de l'invention permet de minimiser les effets toxiques de l'infection due à des bactéries élaborant une élastase, lorsqu'elle est administrée par voie parentérale à des animaux réceptifs sous la forme d'un sérum immunisant contenant des anticorps contre ltélastase bactérienne. La présente invention est illustrée par son rapport particulier avec des organismes du genre Pseudomonas. Toutefois, elle s'applique également à l'immunisation d'animaux réceptifs contre les effets toxiques d'infections dues à d'autres organismes élaborant une élastase. La majeure partie, sinon la totalité des souches virulentes de Pseudomonas aeruginosa élaborent une protéase douée d'acti- vité élastolytique. L'enzyme, appelé élastase, est spécifique et varie très peu dtune souche à une autre. Bien que de légères différences spécifiques apparaissent dans l'élastase, un caractère commun d'antigénicité croisée domine le genre. La plupart des vaccins bactériens, y compris les vaccins polyvalents, dériveni2antigènes somatiques et présentent peu d'intérêt contre des souches de l'organisme qui n'est pas inclus dans leur préparation. Contrairément aux vaccins classiques antérieurs, l'antigène utilisé conformément à la présente invention est excempt et indépendant des antigènes somatiques particuliers à la souche et à ltespèce. Ainsi, les compositions de l'invention immunisent non seulement des-animaux réceptifs contre des bactéries particulières élaborant une élastase, mais aussi contre les effets toxiques de l'élastase proprement dite. L'élastase de Pseudomonas aeruginosa peut entre préparée et purifiée au moyen du procédé décrit par Morihara et Collaborateurs, dans "Journal of EiologicalChemistry'1, 240, 3295 (1965)-. Comme indiqué par Johnson et collaborateurs dans "Canadian Journal of Microbiology", 13, 711 (1967), on obtient une amélioration des rendements en élastase lorsqu'on cultive ltorga- nisme sur un milieu gélosé et que l'on extrait ltélastase de la gélose. On insiste particulièrement sur le fait que l'élas- tase utilisée conformément à l'invention doit être soigneusement purifide. Après avoir essayé de nombreuses variantes, on a adopté le meilleur procédé d'isolement et de purification de l'élastase, que lton décrit ci-après On cultive des souches de Pseudomonas élaborant une élastase, pendant environ 16 heures dans du bouillon de boeuf ou dans un autre milieu nutritif liquide et on utilise ces cultures pour inoculer une trypticase solide. Après 18 à 24 heures d'incubation à 300C, on récolte les cellules qui se sont multipliées en surface, on les met en suspension dans une solution de chlorure de potassium 0,15M, on agite la suspension par secousses avec des perles de verre et on élimine les débris cellulaires par centrifugation. On précipite l'élastase brute par l'addition de quatre volumes d'éthanol froid.Après réfrigération à 50C pendant environ 16 heures, on recueille la matière précipité par centrifugation à grande vitesse et on la dissout dans un volume d'eau égal au dixième du volume initial de l'extrait cellulaire. On dialyse la matière soluble par échange avec un tampon au phosphate 0,002M à un pH égal à 7,5, puis on l'applique à des colonnes de diéthylaminoéthylcellulose préalablement équilibrées avec le meme tampon.On développe les colonnes à 50C avec des gradients linéaires de sels préparés à partir du tampon d'équilibrage indiqué ci-dessus, et d'un volume égal de tampon au phosphate 0,03M, également à un pH de 7,5r . Btélastase obtenue en utilisant ce processus chromatographique d'échange ionique satisfait habituellement aux critères immunochimiques et physicochimiques de pureté ; l'opé- ration peut être répétée le cas échéant. L'élastase purifiée est mise en suspension dans une solution physiologique ou une solution tamponnée de sel à une concentration d'environ 1 mg d'élastase par ml de solution de sel (lisuspension a une densité optique spectrophotométrique de 2,8 à 420 mp ta suspension-mère est ensuite diluée en série aux concentrations d'essai désirées. On administre par voie intrapéritonéale en une seule -dose ou en doses répétées un millilitre de la suspension diluée contenant l'adjuvant complet de Freund, à des souris de laboratoire pesant environ 13-15 g. Onze ou douze jours plus tard, les souris, qui pèsent alors environ 22-25 g, sont sou mises à un test par administration intrapéritonéale d'une suspension contenant une souche virulente de Psedomonas aeruginosa préparée par culture de 1 organisme dans un bouillon nutritif de boeuf pendant environ 4-5 heures puis dilution en série avec de la mucine gastrique à 4 %0. tes cas mortels surviennent habituellement 48 heures après le test et on attribue la mort à l'infection par l'organisme utilisé dans le test. Comme on doit s'y attendre, l'immunité est renforoée par l'administration de doses répétées de la suspension contenant ltantigène. les résultats obtenus dans les essais de protection des souris par immunité active, par exemple, le quatrième jour après le test, sont récapitulés ci-après. Jour d'immu- Jour du Dilution de Taux de survie dans le test Taux de survie des témoins nisation test l'immunogène effectué auvec des dilutions non immunisés recevant la de la culture de: culture du test à des dilu 10-5 10-6 10-7 tions de: 10-6 10-7 10-8 10-9 1 11 12- 6/10 8/10 7/10 0/10 5/10 3/10 7/10 10-4 5/10 7/10 9/10 10-6 6/10 7/10 10/10 17-8 9/10 10/10 10/10 1 & 8 18 10- 10/10 10/10 10/10 1/10 3/10 3/10 1/10 10-4 8/10 9/10 8/9 10-6 7/10 10/10 9/10 10-8 9/10 10/10 10/10 1 & 8 29 10- 8/9 6/10 9/10 0/10 0/10 0/10 0/10 10-6 4/10 8/10 8/10 10-9 7/10 6/10 7/10 10-12 2/10 6/10 6/10 Jour d'immu- Jour du Dilution de Taux de survie dans le test Taux de survie des témoins nisation test l'immunogène effectué auvec des dilutions non immunisés recevant la de la culture de: culture du test à des dilu 10-5 10-6 10-7 tions de: 10-6 10-7 10-8 10-9 1 11 12- 6/9 9/10 8/10 2/10 2/10 7/10 7/10 10- 2/10 6/10 4/10 10-5 6/10 9/10 7/10 1 & 8 12 10-6 9/10 9/10 10/10 1/10 3/10 0/10 6/10 10-8 8/9 8/10 9/10 10-10 6/10 8/10 10/10 10-12 7/10 10/10 10/10 1 & 8 10 10- 6/9 5/10 7/10 0/9 0/9 0/10 3/10 10-6 5/9 8/10 7/10 10-9 2/9 2/10 8/10 10-12 2/10 5/9 6/10 1 & 7 11 10- 7/10 6/10 10/10 0/10 5/10 0/10 4/10 10-6 6/10 10/10 9/10 10-9 7/10 10/10 10/10 10-12 8/10 9/9 10/10 Dans toutes les séries, sauf la dernière, l'élastase est élaborée par Pseudomonas aeruginosa, forme typique de Habs 0:6 - souche 332-1369. Dans la dernière série, l'élastase est élaborée par la forme typique de Habs 0:10 - souche B 319. L'organisme utilisé dans les première, deuxième, troisième et dernière séries du test est la souche homologue 332. Dans les quatrième et cinquième séries, l'organisme du test est la forme typique de Habs 0:10 - souche 319 ; dans les séries suivantes, et jusqutà la dernière, l'organisme du test est la forme typique de Habs 0:2 - souche 112. les deux dernières souches sont des souches particulièrement virulentes récemment isolées de patients gravement atteints. le sérum immunisant est préparé par injection intramusculaire à des lapins, d'un millilitre d'un adjuvant contenant une dilution à 1/1280 d'élastase élaborée par P. aeruginosa, forme typique de Habs 0:6 - souche 332 - 1369. Cette administration est répétée trois semaines après la première inoculation et des injections de rappel sont effectuées à une dilution de 1/2560 chaque semaine suivante. On prélève des échantillons de sang, on prépare le sérum et on l'utilise pour conférer l'immunité passive à des souris, que l'on contrôle par le test décrit ci-dessus. Dans un test de 18 heures effectué avec la souche homologue, un volume de 0,5 ml du sérum de lapin, à une dilution de 1/320 protège les souris soumises au test, contre une dose représentant 100 fois la dose léthale minimale. La méme quantité de sérum à une dilution de 1/80 protège les souris soumises au test contre une dose correspondant à 1000 fois la dose léthale minimale. Dans un test effectué avec une souche appartenant à un sérum hétérologue, un volume de 0,5 ml du sérum de lapin, à une dilution de 1/20 protège les souris soumises au test contre une dose égale à 100 fois la dose léthale minimale. La même quantité de sérum diluée à 1/40 offre une protection contre 10 fois la dose léthale minimale de l'organisme utilisé dans le test. La suspension contenant l'immunogène doit être administrée par voie parentérale à l'animal à protéger ou à la source de sérum immunisant. La suspension contient habituellement un adjuvant classique tel que l'adjuvant complet de Freund, qui favorise la production d'anticorps. L'administration, dans le domaine pratique, devrait très probablement être effectuée par injection sous-cutanée ou intramusculaire. il va de soi que l'invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y autre apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Vaccin destiné à l'administration parentérale à un animal réceptif, pour minimiser les effets toxiques de l'infection due à des bactéries élaborant une élastase, caractérisé par le fait qu'il contient une élastase bactérienne purifiée en suspension dans un véhicule liquide acceptable du point de vue pharmaceutique. 2. Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le véhicule liquide est une solution physiologique de sel. 3. Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le véhicule liquide est une solution tamponnée de sel. 4. Vaccin suivant la revendicationh, caractérisé par le fait qu'il contient en outre unádjuvant. 5. Sérum immunisant propre à conférer l'immunité passive à des animaux contre les effets toxiques de l'infection par des bactéries élaborant une élastase, caractérisé par le fait qutil contient des anticorps contre l'élastase bactérienne. 6. Sérum immunisant suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il contient en outre un adjuvant. 7. Procédé de préparation d'un sérum immunisant propre à conférer l'immunité passive à des animaux contre les effets toxiques de l'infection due à des bactéries élaborant une élastace, caractérisé par le fait qutil consiste à administrer par voie parentérale à un animal donneur, une élastase bactérienne purifiée, et à prélever le sérum immunisant dudit animal. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le fait que l'élastase bactérienne est tirée d'un organisme du genre Pseudomonas.