Brevet FR2143572A1 — publié le 19730209

La présente invention est relative à un vaccin vivant fortement atténué de la rubéole, vaccin qui est non seulement nouveau et efficace, mais en outre plus atténué, c'est-à-dire beaucoup plue dépourvu d'effets secondaires, que ceux qu'on connaissait jusqu'ici. La rubéole est une maladie infectieuse analogue à la rougeole, causée par le virus de la rubéole, c'est-à-dire qu'elle est caractérisée par une légère fièvre éruptive accompagnée de lympho dinomatose qui se manifeste après une période d'incubation de quel ques semaines.Tout en ne présentant pas de symptomes sérieux dans le Ca. des enfants et des bébés, la maladie tend à être plus sévère chez les adultes où elle est accompagnée d'arthrite, d'arthralgie ou de manifestations analogues. En particulier quand les femmes enceintes souffrent de cette maladie à un stade précooe de leur grossesse, l'infection s'tend du placenta au foetus, ce qui fait que le bébé présente les syndromes congénitaux de la rubéole, comme par exemple la cataracte, des malformations cardiaques congénitales et des difficultés d'audition óngénitales, à un taux élevé. De plae, on a observé une tendance périodique à des épidémies importantes de rubéole.Par conséquent, la mise au point d'un mode de lutte efficace oontre la rubéole s'impose aux médecins. Il va sans dire que la rubéole doit être combattue de façon désirable de n'importe quelle façon et une possibilité de vaccination de la rubéole a fait l'objet de recherches intensives après la découverte du virus de la rubéole par Weller et al. et par Parkeman et al, en 1962. À la suite de ces recherches, on a réuni à multiplier le virus de la rubéole dans une culture sur des tissus embrionnaires de mammSières ou de volailles, et on a en outre constaté que ce virus peut être atténué gr0é à des passages en série dans ladite culture jusqu'à un stade de virulence qui permet l'inoculation aux outre humains sous forme d'un vaccin vivant atténué et qui confère l'immunité aux personnes vaccinées sans effets secondaires importants. Des essais cliniques ont démontré que, lorsqu'un vaccin vivant atténué de la rubéole est inoculé à des bébés et à des enfants, la formation correspondante d'anticorps peut outre obtenue sans donner lieu à des réactions cliniques indésirables et il a 'salement été constaté que oeux qui ont aoquis les anticorps peuvent outre protégés de l'attaque de la rubéole.Le virus de la rubéole est parfois récupéré, au laboratoire, dans les sécrétions pharyngées des vaccinés, mais on sait que l'infection par contact n'a jamais été constatée chez des enfants et des adultes réceptifs vivant côte à côte, car les contacts n'ont jamais fait apparaître une attaque clinique de la rubéole et la mise en évidence sérologique d'une infection par le virus de la rubéole. Toutefois, par contre, quand les vaccins déjà connus du virus vivant atténué de la rubéole sont inoculés aux adultes g en particulier aux femmes en âge d'avoir des enfants, les réactions sont différentes de celles dee enfants et des bébés, et on observe fréquemment ce qu'on pourrait appeler des symptômes analogues à ceux de la rubéole g comme la fièvre, les malaises, une éruption épidermique, de l'arthrite, de I'artralgie, etc. Par conséquent, il se pose encore un problème difficile à résoudre en ce qui concerne l'inoculation des vaccins du virus vivant atténué de la rubéole aux adultes réceptifs. En outre, on ne sait pas si le vaccin connu est complbte- ment dépourvu de caractère tératogène ou de toxicité foetale pour les enfants des femmes enceintes quand il est inoculé à ces dernières. Pendant les recherches exécutées par la demanderesse à titre de comparaison en ce qui concerne le comportement biologique de nombreuses souches du virus de la rubéole ayant subi des passages encombres divers, quelques-unes ayant été isolées par la demanderesse et d'autres ayant été isolées par d'autres chercheurs dans le monde entier, la demanderesse a constaté que certaines malformations ou anomalies congénitales similaires au syndrome congénital de la rubéole congénitale observé chez les outre humains se manifeste chez la progéniture d'une lapine quand on inocule à celle-cl le virus de la rubéole au début de sa grossesse. La demanderesse a encore constaté que parmi les virus de la rubéole soumis aux essais, la souche To-336, du virus de la rubéole, qui est l'une des souches isolées par la demanderesse, ne présente sensiblement pas de toxicité foetale non seulement chez les lapins, mais aussi chez les souris et les rats (voir les essais 1 et 2 décrits en détail par la suite). L'atténuation de cette souche a finalement permis de roduire un vaccin obtenu à partir du virus fortement atténué de la rubéole, qui ne fait pas apparaitre, chez les entres humains adultes, les effets secondaires indésirables mentionnés plus haut. La présente invention a pour objet - l'obtention d'un vaccin du virus vivant fortement atténué de la rubéolsyvaccin qui est nouveau et efficace, mais qui ne détermine pas l'apparition, après la vaccination, de symptômes ana loges à la rubéole et qui n'a pas de caractère tératogène ou de toxicité foetale, ces effets secondaires ayant tous deux été difficilement supprimés avec les vaccins connus jusqu'ici du virus de la rubéole, - un procédé de production de ce vaccin nouveau et efficace obtenu à partir du virus vivant fortement atténué de la rubéole, cette production étant aisée et économiquement réalisable, - la mise au point d'une mesure immunologique efficace et plus sare pour protéger les adultes humains, en particulier les femmes en 4e d'avoir des enfants, d'une infection par le virus de la rubéole, sans manifestation de caractère tératogène ou de toxicité foetale et sans réaction fâcheuse, On atteint ces buts en soumettant la souche "To-336" du virus de la rubéole, ayant subi au moins 10 passages d'une façon connue, à d'autres passages de culture dans une culture sur tissu, préparée à partir d'un animal à sang chaud, à une température d'environ 28 à 36 , jusqu'd obtention d'une atténuation suffisante. La souche "To-336" du virus de la rubéole a été isolée au Japon par la demanderesse, à partir d'un prélèvement laryngé ef fectué chez un enfant souffrant de la rubéole, et sa culture secondaire a été déposée à l'organismes "American Type Culture Collection", à Maryland, E.U.A. sous le NO "ÀTCO-VR-553". Par exemple, la souche "To-336" est inoculée dans une culture sur tissu contenant des cellules primaires appropriées d'un animai à sang chaud et elle est incubée dans un incubateur fixe ou rotatif, à une température comprise entre 28 et 360C (habituellement entre 29 et 320C), pendant environ 5 à 10 jours (habituellement pendant environ une semaine), après quoi le virus multiplié est transféré dans une culture franche sur tissu, contenant des cellules primaires du genre qu'on vient de mentionner, en vue du passage de culture suivant. A mesure que ces passages sont répétés en succession, l'atténuation progresse rapidement. Les cellules utilisées pour la culture sur tissu sont choisies de façon appropriée parmi les tissus ou les cellules d'animaux à sang chaud, c'est-à-dire de mammifères et de volailles, comme par exemple les cellules primaires du rein de divers animaux (comme les singes, les bovidés, les porcs, les lapins et les chiens), les cellules embryonnaires de divers oiseaux de basse-cour (comme les poules ou les canards), etc... En outre, pour exécuter les passages de culture en série, on peut faire appel à des cultures sur des cellules diploïdes du foetus humain. Dans une variante, la souche "To-336" est inoculée dans la cavité amniotique d'un oeuf embryonné (par exemple d'un oeuf de poule ou de canard au 7ème ou 8ème jour), et est incubée à une température d'environ 30 à 360C pendant environ 7 à 10 jours. L'amnios inoculé est ensuite prélevé dans des conditions aseptiques et est trituré dans un milieu approprié comme une eau physiologique équilibrée de Hanks (qu'on décrira en détail ci-dessous) ou dans un milieu analogue, pour préparer une suspension à environ 10 ffi qu'on centrifuge ensuite pour séparer le fluide surnageant. Le fluide surnageanycontient le virus multiplié et peut être soumis au passage de culture ultérieur de la m8me manière que décrit cidessus, ce qui fait que l'atténuation progresse rapidement. En ce qui concerne le nouveau passage de culture sur tissu ou sur un oeuf embryonné, le fluide de culture du passage précédent est habituellement dilué à environ 10 fois son volume et le fluide dilué est utilisé comme virus d'ensemencement à inoculer. Toutefois, si on le désire, on peut utiliser un fluide de culture non dilué, ou bien on peut occasionnellement appliquer ce qu'on appelle la méthode de dilution limitée. Le passage ou les passages dans la cavité amniotique peuvent étre ultérieurement suivis d'un ou plusieurs passages pour lesquels on utilise un tissu de culture contenant les cellules primaires d'un animal à sang chaud ou des cellules diploïdes d'origine humaine, et vice-versa. Dans le milieu de culture, utilisé pour exécuter un passage de culture, on peut ajouter un ou plusieurs antibiotiques comme la streptomycine, la dihydrostreptomycine, la néomycine ou les pénicillines, de manière que des microorganismes adventices ne puissent pas se propager dans la culture par suite d'une contamination accidentelle. De la même manière, le virus de la rubéole souche To-336 est soumis à de nombreux. passages de culture repétés jusqu'à ce qu'un essai d'inoculation dans un corps humain dont la séroréaction est négative et qui est sensible au virus de la rubéole, confirme que le virus a été suffisamment atténué. Cette souche "To-336" ainsi atténuée est utilisée comme virus d'ensemencement dans la production d'un vaccin obtenu à partir du virus fortement atténué de la rubéole, selon la présente invention. On inocule le virus d'ensemencement dans un milieu de culture tel que ceux qu'on a décrits ci-dessus en vue de l'exécu- tion des passages d'atténuation. Le milieu choisi peut être identique au milieu utilisé pour l'atténuation du virus d'ensemencement ou en outre différent. Dans le cas oU l'on choisit une culture sur tissu pour la production du vaccin, il est recommandé de laisser le virus se multiplier dans un milieu de culture ne contenant auoune substance capable d'agir comme un antigène quand le vaccin résultant est inoculé dans le corps d'un être humain. On élimine les matières solides, telles que les cellules, les fragments de cellules, etc, du liquide résultant de la culture, par exemple par filtration ou par centrifugation, et le filtrat' ou le fluide surnageant peuvent être utilisés à titre de produit de la présente invention, après avoir été facultativement dilués aveo un diluant approprié, tel qu'une solution saline physiologique ou do l'eau distillée, selon son titre en virus. Bien que le vaccin obtenu de cette manière à partir du virus fortement atténué de la rubéole puisse être utilisé tel quel, on peut le conserver sous une forme congelée après y avoir facultativement ajouté un ou plusieurs agents stabilisants tels que le saccharose, le lactose, des glutamates, des phosphates, etc... Dans une variante, on peut le lyophiliser après avoir facultative- ment ajouté un ou plusieurs agents stabilisants tels que de l'albumine du sérum humain, la gélatine, et des produits analogues as suant ea conservation, et, lorsqu'on veut utiliser le produit lyo philisé, on le dissout avec un diluant approprié tel qu'une eau physiologique ou de l'eau distillée stérile. Pour une vaccination satisfaisante, il faut inoculer le virus avec un titre d'au moins 102,0 Dingo (dose à 50 % d'inter- iérence), par personne, de préférence par voie sous-cutanée et en une seule fois. Une dose DIn , particulièrement préférable est comprise entre environ 102,5 et51003,5. Une dose plus élevée ne risque pas de causer des effets secondaires indésirables en raison de la grande sécurité du vaccin selon la présente invention, mais il est inutile d'utiliser une dose aussi dlevée car on ne peut pas en attendre une augmentation particulière de 11 effet recherché de la vaccination. Pour une inoculation sous-cutanée, une dose ayant le titre nécessaire en virus doit être contenue dans une composition aqueuse d'un volume d'environ 0,1 à 10 ml, de façon désirable 0,25 à 0,5 ml. Ainsi, le vaccin de la présente invention doit être ajusté, au moment de l'utilisation, de manière qu'il comprenne la souche "To-336" du virus de la rubéole fortement atténué avec un titre correspondant à une dose d'interférence (D1N50) d'au moins 102,0/mol, de préférence d'environ 102,5 à 104'5/ml, ainsi qu'un adjuvant convenant physiologiquement. Quand le vaccin ainsi obtenu à partir du virus fortement atténué de la rubéole est inoculé aux enfants et aux bébés, on observe ultérieurement un accroissement notable du taux d'anticorps dans le sérum, ce qui fait qu'ils ne peuvent pas être infectés par le virus de la rubéole. Quand le vaccin est administré à des adultes, y compris les femmes en age d'avoir des enfants, on constate également une augmentation des anticorps du sérum dans le sang mais, ce qui est remarquable, on n' observe aucun des symptômes de la rubéole qui sont considérés comme is effets sec on daires indésirables se produisant souvent après la vaocination' par les vaccins obtenus jusqu'à ce jour à partir du virus de la rubéole.Ainsi, le nouveau vaccin obtenu à partir du virus de la rubéole fortement atténué, d'une manière conforme à la présente invention, peut être utilisé en toute sécurité même chez des adultes pour les immuniser efficacement contre une infection par le virus de la rubéole. La sécurité du vaccin obtenu conformément à la présente invention à partir du virus fortement atténué de la rubéole sera démontrée à l'aide des essais qu'on va décrire et qui seront suivis d'exemples de mise en oeuvre de la présente invention. Essai 1 (Toxicitd foetale chez le laPin) On accouple des lapines japonaises blanches en bonne santé, ågées de 8 mois, et huitjours après la conception, on inocule 1,0 ml d'un échantillon d'essai dans la veine de ltoreille des lapines pleines.Les échantillons d'essai utilisés sont les suivants a) Liquide de culture sur tissu infecté du virus non atténué de la rubéole (souche "o-336") cultivé pendant 3 passages dans les cellules d'un rein de singe callitriche d'Afrique (cellules qu'on désignera ci-après par l'abréviation "AGME ) b) Vaccin obtenu à partir du virus fortement atténué de la rubéole comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessous c) Liquide infecté obtenu par culture sur tissu d'un virus non atténué de la rubéole (Brown Strain) soumis à 5 passages avec des cellules ÂGNK (témoin positif) d) Liquide non infecté obtenu par culture sur tissu de cellules AGMK (témoin négatif). Les lapereaux mis au monde par les mères lapines infectées sont observés pendant 30 jours après leur naissance et on sacrifice ensuite les lapereaux survivants en vue de leur autopsie par des observations microscopiques ou histopathologiques. Les résultats des observations sont donnés dans le tableau 1. Dans le cas du groupe (c) où les lapines ont été infectées aveo la souche Brown, 7 lapereaux seulement survivent parmi les 58 mis au monde et, chez 4 lapereaux parmi ces 7 survivants, on observe dee malformations typiques telles que la cataracte, une défectuosité de l'iris, une opacité cornéenne, une invasion capillaire dans la cornée, un staphylome et de la microphtalmie, bilatérale ou unilatérale. Dans les autres groupes (a), (b) et (d), 58 lapereaux, 56 lapereaux et 61 lapereaux survivent, sans malformation notable quelconque. Dans le cas du groupe (c) où les mères ont été infectées aveo la souche Brown, on observe plus de 51 décès pendant les 3 jours suivant la naissance et le taux de mortalité parmi les lapereaux qui ont survécu pendant 7 jours après la naissance atteint le même degré que pour les autres groupes. TABLEAU 1 Groupe : (a) : (b) : (c) : (d) Souche To-336 To-336 Brown (1) Néant Passages (2) AGME-3 AGMK-25 AGMK-5 - Dose administrée (3) : 4,2 4,3 4,3 3,5 O o Nombre de lapines grosses :10 : 8 : 8 :10 Nombre de lapereaux (N) 78 :66 58 :74 -rs- de lapereaux qui : : : meurent après la naissance (D):20 :10 : 51 :13 Taux de décès (D/N) (%) 25,6 i15,2 87,9 17,6 Taux de malformations chez : : : les survivants :0/58 :0/56 : 4/7 :0/61 Nota (1) La souche Brown est l'une des souches non cultivées de la rubéole qui sont les plus répandues et les plus typiques aux E.U.A. (2) AGME signifie que les passages ont été effectués avec des cellules de rein de singe callitriche d'Afrique et le chiffre correspond au nombre des passages. (3) La dose est exprimée en logarithme ordinaire de la dose d'interférence à 50 % (logarithme10 Du50) Essai 2 (Essai de toxicité foetale chez la souris et le rat) On accouple des souris femelles (CF-1) ainsi que des rats (Sprague Dawley), en bonne santé et âges de 10 à 12 semaines et, 5 semaines après la conception, on inocule une dose Dix50 104,8/0,2 ml d'un fluide de culture sur tissu du virus de la rubéole souche "To-336", qu'on a soumis à trois passages avec des cellules AGIE. La veille du jour supposé de la délivrance, c'est-à-dire le 19ème jour de la grossesse pour les souris et le 21sème jour pour les rats , on soumet les animaux à une césarienne pour prélever les foetus qu'on soumet à des observations macroscopiques, y compris la structure cartilagineuse colorée par la méthode de Dowsons avoir Dowsons, A.B. "Stain Technology" 1, 123 à 124 (1926)j ainsi qutà une recherche histopathologique des yeux et du système auditif. À titre de témoin négatif, on administre le liquide de culture sur tissu non infecté.Les résultats des observations faites lors d'une comparaison avec le témoin négatif sont donnés dans le tableau 2 où l'on peut voir que, lorsque les mères sont infectées avec la souche "To-336", les foetus ne présentent pas d' anomalies. TABLEAU 2 Espèce de : Souris Rat l'animal groupe Témoin : To-336 : Témoin: To-336 Nombre de femelles 7 9 12 12 Mortalité foetale (%) 35,0 :34,1 : 9,0 : 6,2 (foetus morts/nombre total : : : d'implants) : : : : Nombre de foetus vivants .56 60 .152 :151 poids de chaque foetus (g) : 1.03 : 1.10 : 3.17 : 3.22 (poide moyen + erreur normaliée) +0.031 +0.063 : +0.063: +0.097 Nombre de foetus présentant O 0 . C c des anomalies du squelette . q Nombre de foetus présentant : 0 : O : O : O des malformations viscérales : : : : r étude histopathologique des résultat résultat résultat résultat yeux et du système auditif normal normal normal normal Essai 3 vessai d'inoculation chez les singes) Les singes de trois groupes comprenant chacun 5 singes callitriches d'Afrique en bonne santé sont respectivement inoculés avec un vaccin qu'on a obtenu à partir du virus fortement atténué de-la rubéole de la manière décrite dans l'exemple 1 ci-dessous et dont le titre en virus est d'au moins 104' DIn50/ml : (a) par voie intrathalamique (1,0 ml et 0,5 ml dans cha cune des deux hémisphères) (b) par voie intrarachidienne (0,2 ml), et (c) par voie intramusculaire (1,0 ml). On observe les singes pendant 28 jours après l'inoculation et on effectue des recherches histopathologiques qui ne permettent de déceler aucune anomalie. Essai 4 (Essai de sécurité) Le vaccin obtenu à partir du virus fortement atténué de la rubéole comme décrit dans l'exemple 1 ci-après est soumis à des essais de la manière décrite dans le chapitre 73.114 des lois de "Public Health Service Regulations", Titre 42, Partie 73, E.U.A, en ce qui concerne les essais de sécurité du "vaccin vivant de la poliomyélite, administré par voie orale" et de la manière décrite dans le paragraphe 73.73 des mêmes lois concernant les essais de stérilité. À la suite d'essais d'inoculation dans divers animaux (c'est-à-dire des lapins, des souris adultes, des souriceaux té- tant leur mère et des cobayes), des essais de culture sur tissu avec diverses cellules primaires (c'est-à-dire avec des reins de singe, de l'amnios humain, des reins humains et des reins de lapin), et d'essais négatifs d'agents accessoires, il a été confirmé que le vaccin soumis aux essais remplit toutes les conditions requises par les lois susmentionnées. EXEMPLE 1 On prélève les reins de singes callitriches d'Afrique en bonne santé, dans des conditions aseptiques. On lave les reins (AGME) avec une eau physiologique équilibrée de Hanks et on les émince. On met en suspension le tissu émincé dans environ 50 fois son volume d'une solution de Hanks contenant en supplément 0,25 ffi de trypsine et on fait digérer tout en agitant la solution0 On recueille les cellules libres résultantes par centrifugation à une vitesse de 1000 tours/minute pendant 5 minutes et on les dilue avec une solution de lactalbumine de Hanks, à laquelle on a ajouté 5 % de sérum de veau inactivé, jusqu'à ce que la suspension résultante contienne environ 5 x 105 cellules/ml.On fait incuber la suspension dans des bouteilles de Roux à 360C, dans des conditions fixes. Après 7 jours, quand les cellules se sont abondamment multipliées sur la paroi interne des bouteilles, on lave les cellules à trois reprises, avec le milieu TO 199 pour préparer un milieu de culture contenant des cellules AGIE. On inocule dans les cellules un virus d'ensemencement de la rubéole, souche "To-336", et il est absorbé dans les cellules à 370C pendant 90 minutes. Ensuite, on jette les liquides et on lave'les cellules à trois reprises avec le milieu TO 199. Finalement, on introduit dans la bouteille 40 ml de milieu TO 199 auquel on a ajouté 2 % de sérum de veau inactivé. On exécute l'incubation à 320C pendant 7 jours. On centrifuge le liquide de culture à 3000 tours/minute pendant 5 minutes et il se sépare une couche surnageante qu'on utilise comme virus d'ensemencement lors du passage suivant, après dilution avec 10 fois son volume de milieu TC-199. On effectue plusieurs passages avec la culture sur'tissu BGMg, à savoir 24 passages depuis le début de l'isolement de la souche brute To-336, ce qui donne un virus d'ensemencement pour la production dtun vaccin à partir du virus de la rubéole. On inocule le virus d'ensemencement dans les cellules et on fait incuber dans 40 ml de milieu TC-199 exempt de sérum, à 320C pendant 7 jours0 On eecueille les fluides de culture et on les fait immédiatement congeler en vue d'un stockage à -700C. On ajoute une autre portion de 40 ml de milieu TC-199 frais, exempt de sérum, aux cellules de culture restantes et on poursuit l'incubation à 320C pendant 24 heures. On recueille de nouveau les fluides de culture et on les congèle. On répète le procédé jusqu'au poème jour de l'incubation. On dégèle rapidement tous les fluides de culture congelés, on les rassemble et on les centrifuge à 3000 tours/minute pendant 5 minutes, ce qui permet de séparer une couche surnageante qui est le vaccin du virus fortement atténué de la rubéole. La couche surnageante contient le virus de la rubéole à raison de 104'2 DIn50/ml quand on fait la détermination avec un système comprenant le produit ECH0-ll et AGIR. On congèle le produit à -70 C en vue de son stockage. Après 100 jours de stockage, on le dégèle et on le dilue à 3 fois son volume avec une solution physiologique. On inocule le vaccin dilué, par voie sous-cutanée, dans le bras d'êtres humains adultes, aussi bien que d'enfants et de bébés, pour démontrer l'effet désirable d'immunisation. Bota : 1 - Eau physiologique équilibrée de Tanks NaCl 8,0 g KCl 0,4 g CaC12 0,2 g NgS04,7R0 0,2 g Ra2HP04,2E20 0,06 g KH2PO4 0,06 g NaHCO3 0,25 g d-glucose 1,0 g Rouge phénol 0,02 g. Eau distillée (à trois reprises), en quantité pour obtenir 1 litre au total. 2 - On prépare une solution à la lactalbumine de Tanks en dissolvant 5 g d'un hydrolysat de lactalbumine dans l'eau physiologique équilibrée de Hanks pour porter le total à 1.000 ml. 3 - Le milieu "TC 199" est une solution aqueuse stérile au pli 7,2, contenant des aminoacides, des purine bases, des pyrimidine bases, des vitamines, des sucres, des nucléotides, des sels minéraux, etc... La composition détaillée est donnée par exemple par Morgan, J.F. et al. dans "Proc. Soc. Exp. Biol. Med." 22, pp. 1 à 8 (1950). ECHO 4 - ECHO-ll signifie le virus/Eype 11 (souche (Gregory), la souche étant souvent utilisée pour les essais d'infection du virus de la rubéole. EXEMPLE 2 On prélève aseptiquement des embryons (désignés par la suite par l'abréviation "DE") d'oeufs de canard parvenus au 13ème jour de l'incubation et, après avoir coupé la tête, on les traite de la même manière que dans l'exemple 1, pour préparer un milieu de culture sur cellules DE dans des bouteilles de Roux. On inocule dans le milieu de culture un virus d'ensemencement de la rubéole, souche "To-336", ayant subi 20 passages avec des cellules AGIE, comme décrit dans l'exemple 1. On fait incuber l'inoculum dans les conditions mentionnées dans l'exemple 1. On répète à 4 reprises le passage sur culture de cellules DE et on centrifuge le liquide de culture recueilli à la quatrième culture, ce qui donne un virus d'ensemencement pour la production d'un vaccin de la rubéole. On inocule le virus d'ensemencement à des cellules DE placées dans des bouteilles de Roux et on traite de la même manière que dans l'exemple 1 en utilisant un milieu TC-199 exempt de sérum, pour produire un vaccin à partir du virus fortement atténué de la rubéole. Le vaccin résultant de la centrifugation finale contient 104,0 DIn50/ml quand on détermine ce titre de la manière décrite dans ltesemple 1. De la même manière que dans 1' exemple 1, on congèle le produit en vue du stockage, puis on le dégèle ultérieurement et on l'utilise pour la vaccination, et on obtient une immunisation satisfaisante chez les êtres humains adultes, ainsi que chez leurs enfants et leurs béhés. Les cellules DE utilisées pour les passages de culture sur tissu et la production du vaccin doivent donner un résultat négatif dans l'essai COFAL avoir à ce sujet par exemple Sarma, P.S. et al, dans "Virology" 23, 313 et suivantes (1964)j. EXEMPLE 3 Des reins prélevés aseptiquement chez des lapins en bonne santé (désignés par l'abréviation "RE" par la suite) sont traités de la même manière que dans 1' exemple 1 pour préparer un milieu de culture de cellules EX dans des bouteilles de Roux. On inocule dans le milieu de culture un virus d'ensemencement de la rubéole, "To-336", ayant subi 5 passages avec des cellules AGMK, comme décrit dans l'exemple 1. On fait incuber l'inoculum dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. On effectue 54 passages avec la culture de cellules RK, puis on centrifuge le fluide de culture obtenu au 54ème passage pour obtenir un virus d'ensemencement des tiné à la production d'un vaccin du virus de la rubéole. On inocule le virus d'ensemencement dans les cellules EX placées dans des fioles de Rous et on traite de la même manière que dans 1' exemple 1 en utilisant un milieu TO-199 ne contenant pas de sérum, ce qui donne le vaccin du virus fortement atténué de la rubéole. Le vaccin obtenu lors de la centrifugation finale montre un titre en virus de la rubéole de 104,2 DIn5g /Ml quand on effectue la détermination de la même manière que dans l'exemple 1. De la même manière que dans r exemple 1, on congèle le pro- duit en vue du stockage et on le dégèle ultérieurement avant de l'utiliser pour la vaccination, ce qui permet d'immuniser de façon satisfaisante des êtres humains adultes ainsi que des enfants et des bébés. REVENDI CATI ONS 1 - Procédé de production d'un vaccin à partir du virus fortement atténué de la rubéole, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre la souche "To-336" du virus de la rubéole, qui a été soumise à au moins 10 passages, à d'autres passages sur une culture de tissu contenant des cellules vivantes d'un animal à sang chaud capables de supporter ledit virus, à une température de 28 à 360C, jusqu'à obtention d'une atténuation suffisante. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules vivantes sont des cellules du singe callitriche d'Afrique. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules vivantes sont des cellules embryonnaires de canard. 4 - Procédé selon la revendication 1, oaractérisé par le fait que les cellules vivantes sont celles du lapin. 5 - Procédé de production d'un vaccin à partir du virus fortement atténué de la rubéole, caractérisé par le fait qutil consiste à soumettre le virus de la rubéole à des passages sur culture de tissu contenant des cellules vivantes d'un animal à sang chaud capables de supporter ce virus, à une température de 28 à 36 OC, et à faire cesser les passages précités lorsqu'une atténuation suffisante est obtenue, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on utilise le virus de la rubéole souche "To-336" et qu'on soumet cette souche à plus de 10 passages de culture. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que les cellules vivantes sont celles du singe callitriche dtAfrique. 7 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que les cellules vivantes sont celles de 11 embryon de canard. 8 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que les cellules vivantes sont celles du lapin. 9 - Vaccin obtenu à partir du virus fortement atténué de la rubéole, ce vaccin comprenant (a) un virus vivant de la rubéole souche "To-336", qui a été soumis à plus de 10 passages de culture et (b) un adjuvant physiologiquement acceptable, le titre en virus de la rubéole de ce vaccin étant d'au moins lu270 DIn5Jme ltre après dilution sous une forme inoculable (dom50 = dose drinter- férence). 10 - Vaccin selon la revendication 9, caractérisé par le fait que le titre du virus de la rubéole est compris entre 102,5 et 104'5 DIn50/millilitre.