Brevet FR2203620A1 — publié le 19740517

La présente invention se rapporte à une nouvelle substance antibiotique ainsi qu'à un procédé de préparation de cette substance. Plus précisément, l'invention a trait à une nouvelle substance antibiotique appelée "gatavaline" et à des moyens pour la préparer. On sait que le bouillon de culture obtenu par la fermentation de Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA contient une colistine qui représente une excellente action antibiotique contre les bactéries à Gram négatif. La Demanderesse a découvert que la fermentation de Bacillus polymyxa sousespèce colistinus KOYAMA produit un nouvel antibiotique qui a un spectre antimicrobien différent de celui de la colistine ci-dessus, et elle a donné à ce nouvel antibiotique le nom de gatravaline. En conséquence, l'un des buts de la présente invention est de fournir une nouvelle substance antibiotiqué. Un autre but de l'invention est de faire connaître un procédé pour isoler et recueillir la gatavaline. Les buts de l'invention, ainsi que d'autres, peuvent être atteints en faisant fermenter le Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYANA, ATTC NO 21830 et en recueillant la gatavaline. Le Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA utilisé dans la présente invention, a les propriétés suivantes Bâtonnets : 0,9 --1,1 x 4,5--4,69 , Gram positif mobiles, Spores 1,0--1,2 x 1,2--1,5 , ellipsotdes, centraux. Ensemencement sur gélatine : Liquéfaction Culture en tube incliné sur glucose-agar : Bonne croissance, culture élevée, scintillante, collante avec production de gaz, translucide, bordure lobée. Culture sur glucose-nitrate-agar : bonne croissance, collante Bouillon ; uniforment trouble, sédiment collant. Bouillon Na Cl : aucune croissance dans une solution de NaCl à 5%. Lait : Coagulé avec production de gaz,caséine hydrolysée. Pomme de terre : croissance abondante, visqueuse, brun jaunâtre, pomme de terre décomposée avec production de gaz. Indole : pas produit Sources de carbone utilisées Arabinose + Celobiose + Fructose + Galactose + Inuline - Lactose + Maltose + Mannose + Rhamnose - Sorbose - Sucrose + Salicine - Xylose + Adonitol - Dulcitol - Erythritol Inocitol - Mannitol + Sorbitol - Citrate Acétate - Succinate - Tartrate Amidon : hydrolysé De l'acétylméthylcarbinol est produit. Des nitrites sont produits à partir de nitrates. La biotine est nécessaire à la croissance. Antibiotiques produits Colistine, gatavaline, jolipeptine. Le bouillon de culture utilisé dans la présente invention est préparé selon les méthodes habituelles utilisées pour produire la colistine. Diverses substances peuvent être utilisées dans le milieu de culture comme source nutritive, bien que les substances préférées soient celles contenant une source d'azote comme la peptone, le son et la farine de blé, la décoction de mats, le jus de viande, les hydrolates de protéines, un nitrate inorganique les sels d'ammonium, etc. Une source de carbone doit aussi être présente, par exemple, sous la forme de dextrose, lactose, maltose amidon, glycérine, de molasses etc., et doit être utilisée en assez grandes quantités. Divers sels inorganiques, auxiliaires et autres peuvent aussi être utilisés, le cas échéant.Pour obtenir un milieu de culture comportant sur une grande échelle les substances nutritives indiquées cidessus, il est avantageux d'opérer en culture immergée. La température de culture doit être d'environ 28 à 35"C. Le pH initial du milieu de culture doit se situer autour de pH 7. Etant donné que la gatavaline est principalement produite en cellules, seules les cellules peuvent être séparées du bouillon de culture et utilisées. Dans la mise en pratique de l'invention, on acidifie le bouillon de culture ci-dessus ou une suspension aqueuse de cellules, de préférence, à un pH de 2 à 5, par addition d'un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, etc., puis, au besoin, on le chauffe. Ce traitement libère la gatavaline contenue dans les cellules. Bien que le gatavaline-ne soit libérée par acidification et agita tion de la suspension de cellules ou du bouillon de culture cette libération peut être accélérée par un chauffage, par exemple, à une température de 50 à 80 g BEnaant: 5 à 30 minutes. * Ensuite, la solution ainsi obtenue, qui contient la gatavaline, est soumise à une extraction au moyen d'un solvant organique qui n'est pas miscible à l'eau et qui peut dissoudre la gatavaline,-tel que l'alcool butylique, l'alcool isoamylique, le chloroforme,-etc. On utilise le solvant organique de préférence dans la proportion d'un tiers du volume du liquide mère. Par ce traitement, toute la gatavaline est transférée au solvant organique mentionné, tandis que la colistine reste dans le liquide mère. Ainsi, la gatavaline peut être isolée. Pour recueillir la gatavaline de l'extrait ci-dessus, on concentre celuici sous une pression réduite de façon à réduire approximativement son volume de moitié, puis on précipite la gatavaline par addition d'un solvant insoluble dans la gatavaline, tel que-I'esther, l'acétate d'ethyle, l'acétate de butyle ou l'acé tone. Bien que la quantité de ce solvant à ajouter dépende de la concentration de la gatavaline dans l'extrait et du solvant utilisé, celle-ci se situe, habituellement, entre 1 et 3 fois l'extrait. La gatavaline brute ainsi obtenue contient encore certaines impuretés, mais elle peut être putifiée, par exemple, en la dissolvant dans un mélange d'alcool butylique, d'alcool méthylique et d'eau (1/211), en la traitant avec de l'alumine activée et en concentrant la solution, puis en ajoutant au résidu le solvant insoluble dans la gatavaline, de façon à précipiter la gatavaline pure. Propriétés de la gatavaline 1. Substance neutre 2. Poids moléculaire : environ 2000 3. Stabilité : Stable en milieu acide et instable en milieu alcalin Stable chauffée -à 100"C pendant 30 minutes à pH 3. Stable pendant plus d'une semine dans une solution aqueuse froide. 4. Absorption des rayons ultra-violets : absorption finale. 5. Solubilité : Soluble dans le diméthyl sulfoxyde, l'acide acétique, l'éthylène- glycol, le méthanol et l'éthanol ; légèrement soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther éthylique, l'acétate de butyle, le ben zène et l'acétone. 6. Réactions de coloration : Réaction à la ninhydrine (-) Réaction à la nynhydrine (après hydrolyse avec un acide) (+) ; réaction au biuret (+), à l'hypochlo- rite de tert. butyle (+'. à la liqueur de Fehling (-), réaction de Molisch (-). 7. Bioautographie sur plaque d'agar ensemencée avec des staphylocoques dorés n-butanol : acide acétique : eau 3/1/I Rf = 0,9h0,95 8. Composition en acides aminés Acide glutamique mole) Acide aspartique 1 Alanine 2 Thréonine 3 Valine 3 9. Point de fusion 245'L2480C 1C. Analyse élémentaire C 51,19% H 8,19%, N 14,16% 11. Spectre d'absorption en infra-rouge -l 3300, 2900, 1740, 1620, 1520, 1220, 1150, cm (Fig. 1) 12. Rotation spécifique (&alpha;)23 D + 22,4 (C : 6,5% dans le méthanol à 50%). Spectre antimicrobien Concentration minimale Organisme d'hinibition (mcgfml) Bacillus subtilis 1,25 Bacillus cereus 2,5 Staphylococcus aureus 0,625 Staphylococcus aureus (Mac-R*) 0,625 Sarcina lutea 0,625 Brevibacterium ammoniagenes 1,25 Micrococcus lysodeikticus 0,312 Mycobacterium 607 0,625 Escherichia coli 100 Pseudomonas aeruginosa 100 Proteus mirabilis 100 Proteus rettgeri 100 Aerobacter aerogenes 100 Achromobacter liquidum 100 Flavobacterium sulfureum 100 Serratia marcescens 100 Xanthomonas oryzae 100 Candida krusei 10 Candida pseudotropicalis 0,625 Saccharomyces cerevisiae 5 Aspergillus oryzae 5 Aspergillus niger 1,25 Penicillium expansum 1,25 Absidia butteri 2,5 Fusarium sp. 1,25 '(Mac-R) : Résistant aux antibiotiques macrolides. Toxicité (administration par voie intraper tondale) Souris : LD50 : 22,5 mg/kg Rat : LD50: > 50 mg/kg Des exemples réels de production et de purification de la gatavaline sont décrits ci-dessous : Production de gatavaline Exemple 1 On ut lise deux litres d?une culture de 24 heures de Bacillus polymyxa sous-espèce colsstinus KOYAMA, qu on a fait croître à 300C dans un récipient à mouvement alternatif pour inoculer un fermentateur, tel que 500 litres contiennent 200 litres de milieu et on poursuit l'incubation à 30 C pendant 24 heures avec une aération convenable.Le milieu utilisé contient 10 g d'amidon, 5 g de (NH4)2SO4, 0,5 g de MgS04 . 7H2O, 0,5g de KH2P04, 3 g de CaCO3, 0,5 g de NaCl, 150 mcg de MnSO4 et 10mcg de biotine par litre : PH = 7 Séparation de la gatavaline Exemple 2 200 litres du bouillon de culture ainsi obtenu sont soumis à une centrifugation pour séparer les cellules et le liquide surnageant, et seules les cellules sont récupérées. On met ces cellules en suspension dans 20 litres d'eau, et on règle le pH de la suspension à 3, avec de l'acide chlorhydrique. On chauffe la suspension à 70 C pendant 10 à 15 minutes, puis on sépare par centrifugation les cellules et le liquide surnageant contenant la gatavaline. A ce liquide surnageant, on ajoute 10 litres de n-butanol en remuant pour extraire la gatavaline. On concentre la couche de n-butanol à 5 litres sous une pression réduite, puis on ajoute 10 litres d'éther au résidu afin d'obtenir un précipité. On recueille ce précipité, par filtration et on le sèche pour obtenir de la gatavaline brute (rendement : 80 g). On dissout 20 g de cette gatavaline brute dans un litre d'un mélange de butanol, de méthane et d'eau (1/2/1) et on élimine les matières insolubles. On fait passer le filtrat à travers une colonne d'alumine garnie avec 40 g d'alumine active On concentre lteffluent à 100 ml sous une pression réduite entre 50 et 6O0C et on ajoute 300 ml d'éther au résidu, puis on recueille la poudre blanche précipitée et on obtient ainsi 3 g de gatavaline pure. Exemple 3 On acidifie 300 1 de bouillon de culture à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique 4N, et on chauffe à 800C pendant 10 minutes avant de filtrer. Après refroidissement à 200C, on acidifie à nouveau le filtrat à pH I avec de l'acide chlorhydrique 4N, puis on ajoute sous agitation et pendant une heure, 100 1 de n-butanol pour extraire la gatavaline. On concentre la couche de butanol à 10 litres sous pression réduite, puis on précipite la gatavaline avec 3 volumes d'éther éthylique. On dissout 100 g de poudre précipitée et séchée (gatavaline brute), dans 5 litres de mathanol à 50 %, on règle le pH à 4 avec de l'acide chlorhydrique IN, puis on fait passer la solution à travers une colonne d'alumine (30 K 500 mm) garnie avec 200 g d'alumine activée. On concentre l'effluent sous pression réduite, en l'amenant à 3 litres, et on extrait la gatavaline au moyen de 3 litres de n-butanol. On concentre sous pression réduite la couche de butanol contenant la gatavaline, en amenant ladite couche à la moitié de son volume, puis on précipite la gatavaline par addition d'éther éthylique et on obtient ainsi 20 g d'une poudre blanche de gatavaline. Pour la purifier davantage, on dissout la poudre blanche ci-dessus dans du méthanol à 50 %, et la fait passer à travers une colonne Sephadex LH 20. On concentre scis pression réduite la solution ainsi traitée, puis on la précipite au moyen d'éther éthylique pour obtenir 15,5 g de gatavaline pure. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une substance antibiotique dénommée "gatavaline", qui consiste à cultiver une souche de Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAlA, ATTC NO 21830, puis à isoler et à recueillir la gatavaline du bouillon de culture, caractérisé en ce que pour isoler et recueillir la gatavaline du bouillon de culture, on acidifie celui-ci entre pH 2 et 5, le chauffe puis extrait la gatavaline au moyen d'un solvant organique non miscible à l'eau mais pouvant dissoudre la gatavaline et précipite alors cette der nière par addition d'un solvant insoluble dans la gatavaline. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on isole et récupère la gatavaline du bouillon de culture en séparant les cellules, en mettant ces cellules en suspension dans l'eau, en acidifiant la solution entre pH 2 et 5, puis en chauffant et en extrayant la gatavaline au moyen d'un solvant organique qui n'est pas miscible à l'eau, mais peut dissoudre la gatavaline, puis en précipitant cette dernier par addition d'un solvant insoluble dans la gatavaline. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le solvant organique est une substance telle que l'alcool butylique, l'alcool isoamylique, et le chloroforme. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le solvant insoluble dans la gatavaline est une substance telle que l'éther, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et l'acétone. 5. Gatavaline ayant les propriétés caractéristiques suivantes Poids moléculaire : environ 2000 Point de fusion : 2459248"C Analyse élémentaire : C 51,19 %, H 8,19 %, N 14,16 Z Composition en acides aminés : acide glutamique (1 mole) acide aspartique (1 mole) alanine (2 moles), valine (3 moles) thréonine (3 moles) Spectre d'absorption en infra-rouge : 3300, 2900, 1740, 1620, 1520, 1220, 1150 cm 1 Rotation spécifique : (49)D + 22,4 (C : 6,5 % dans du méthanol à 50 %) Biautographie : Rf = 0,9~O,95 (n-butanol : acide acétique : eau = 3/1/1). Ultraviolet : absorption terminale Réactions de coloration : positive au biuret et à l'hypochlorite de tertbutyle, négative à la ninhydrine, à la liqueur de Fehling et à la réaction de Molish. 6. A titre de nouvel antibiotique, la gatavaline selon la revendication 5.