Brevet FR2163363A1 — publié le 19730727

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé M.M. PENSASSE Lucien, BARTHELEMY Pierre et Madame HÂSBISS Denise, a pour objet un procédé de purification d'enzymea L'invention a plus précisément pour objet un procédé de purification d'enzymes du type asparaginase et, en particulier, de la L-asparaginase possédant une activité antitumorale. On sait que la L-asparaginase possède une forte activité antinéoplasique,et que pour effectuer un traitement efficace des tumeurs, tout en évitant les effets secondaires, il est nécessaire que le produit soit d'une grande pureté. La L-asparaginase peut être préparée par culture d'Escherichia Coli ou de Serratia marcescens, suivie d'une lyse des cellules bactériennes, d'une concentration de l'enzyme ainsi obtenu et d'une extraction. La L-asparaginase obtenue à partir de cet extrait a alors besoin d'être purifiée. Il est connu d'effectuer une telle purification par chromatographie sur colonne ou par précipitation fractionnée avec un sel minéral tel que le sulfate d'ammonium ; mais ces procédés ne présentent pas un grand intérêt sur le plan industriel. De plus, si l'on emploie un sel minéral, on se heurte au problème de l'élimination des traces minérales dans le produit purifié, ce qui nécessite une opération supplémentaire de dialyse. Il a été également préconisé d'effectuer la purification de la L-asparaginase par chauffage, à une température de 5500 pendant dix minutes, d'une solution enzymatique ; cette méthode décrite dans le brevet français nO 1.585.246 permet la dénaturation d'une grande partie des protéines présentes initialement. Ces protéines dénaturées précipitent et on peut ainsi facilement les éliminer. Cette méthode est intéressante en raison de sa simplicitd technique, mais ne permet pas l'obtention d'une L-asparaginase suffisamment pure ; de plus, il est difficile d'avoir une température homogène du milieu. Il existe par ailleurs des procédés qui utilisent soit des alcools primaires, soit des polyols comme agents de précipitation. Le brevet français déposé par la demanderesse à l'Institut National de la Propriété Industrielle le 23 Mars 1970, sous le nO 70.10333 pour "Procédé de purification d'enzymes4 peut ainsi être donné à titre d'exemple. La demanderesse a trouvé,depuis lors, un nouveau procédé de purification de la L-asparaginase qui présente des avantages par rapport aux procédés antérieurs, notamment par sa simplicité de mise en oeuvre et/ou par la pureté du produit qu'il permet d'obtenr. Ce procédé de purification d'enzymes, qui fait appel à un alcool tertiaire, est caractérisé en ce que l'on traite une solution aqueuse impure renfermant de la L-asparaginase par du butanol tertiaire, sais agitation, et que l'on recueille le précipité de L-asparaginase purifiée ainsi obtenu. bans une mise en oeuvre préférencielle du procédé, on effectue l'addition de butanol tertiaire à une température comprise entre OOC et 250C, de préférence entre 200C et 250C. Un tel procédé permet une précipitation lente et progressive favorisant notamment la purification de l'enzyme et la formation de cristaux. C'est ainsi qu'il est particulièrement avantageux d'opérer de la façon suivante La L-asparaginase en solution aqueuse est précipitée à 210Ca 10C par addition de 0,3 à 0,6 volume de butanol tertiaire par volume de solution traitée, ladite solution renfermant de 5 à 30mg de protéines par ml. Le précipité obtenu est recueilli par filtration,puis lavé par un mélange butanol tertiaire-solution aqueuse EDTA 10 3M à pH5,5. Le précipité est alors séché par lyophilisation ou par tout autre procédé.La solution aqueuse de Lasparaginase de départ peut être préparée par toutes les méthodes connues, La purification, selon le procédé objet de l'invention, peut être effectuée aussi bien sur des solutions de t-asparaginase de haute activité enzymatique que sur des solutions de très basse activité ; dans le cas de l'emploi d'une solution peu riche en enzyme,il est possible d'appliquer plusieurs fois le procédé de l'invention. il va être donné maintenant, titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1 A 5ml d'une solution aqueuse de L-asparaginase brute de pi5,5 renfermant 3750 U.I./ml de L-asparaginase et 15 mg de protéines prml (soit une activité spécifique de 250 U.I./mg), on ajoute goutte à goutte, sous agitation à + 5"C, 2ml de butanol tertiaire. On maintient l'agitation pendant 1 heure à + 50C, puis on isole par centrifugation le précipité formé. L'analyse du précipité est effectuée après redissolution de ce dernier dans une solution aqueuse d'E.D.T.A. 10-3M de pH5,5. On obtient ainsi une solution contenant 3120 U.I./ml de L-asparaginaseet 11,60 mg de protéines par ml (soit une activité spécifique de 269 U.I./mg). Le rendement est de 83,2 % en activité et de 77,4 % en protéines. EXEMPLE 2 A 10 ml d'une solution aqueuse de L-asparaginase brute de pH 5,5 renfermant 6250 U.I./ml de L-asparaginase et 25 mg de protéines par ml (soit une activité spécifique de 250 U.I./mg), on ajoute, sous agitation à+50C, 4 ml de butanol tertiaire. On maintient l'agitation pendant 1 heure à + 50C, puis on isole le précipité formé par centrifugation. L'analyse du précipité est effectuée après redissolution de ce dernier dans une solution aqueuse d'E.D.T.A. 10 3M de pH5,5. On obtient ainsi une solution contenant 5940 U.I./ml de L-asparaginase et 21,15 mg de protéines par ml (soit une activité spécifique de 281 U.I./mg). Le rendement est de 95 % en activité et de 84,5 % en protéines. EXEMPLE 3 On ajoute goutte à goutte, à température ambiante (210Ct10C) sous agitation,- 2 ml de butanol tertiaire à 5 ml d'une solution aqueuse de L-asparaginase brute de pH 5,5 renfermant 6250 U.I./ml de L-asparaginase et 25 mg de protéines par ml (soit une activité spécifique de 250 U. I./mg). On maintient l'agitation de la solution pendant 1 heure à la même température, puis on isole le précipité formé par centrifugation. L'analyse du précipité obtenu est effectuée après redissolution de ce dernier dans une solution aqueuse d'ED.TA.10-5I de pH 5,5. On obtient ainsi une solution contenant 5750 U.i./ml de L-asparaginase et 15,6 mg de protéines par ml (soit une activité spécifique de 368 U.I./mg). Le rendement est de 92 Vo en activité et de 62,5 % en protéines. EXEMPLE 4 En opérant comme indiqué à l'exemple 3, mais en ajoutant 2 ml de butanol tertiaire à 5 ml d'une solution aqueuse de L-asparaginase brute renfermant 3750 U.I./ml de L-asparaginase et 15 mg de pratéines par ml(soit une activité spécifique de 250 U.I./mg on obtient une solution contenant 3100 U.I./ml de L-asparaginase et 8,85 mg/ml de protéine (soit une activité spécifique de 350 U.I./mg). Le rendement est de 82,5 % en activité et de 59 5 en protéines. REVENDICATIONS 1) Procédé de purification d'enzymes du type asparaginase, et en particulier de la L-asparaginase poasédant une activité anti tumorale, caractérisé en ce que l'on traite une solution aqueuse impure renfermant de la L-asparaginase par du buta nol tertiaire, sous agitation, et que l'on recueille le préci pité de L-asparaginase purifiée ainsi obtenu. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'addition de butanol tertiaire à une température comprise entre OOC et 250C et de préférence entre 200C et 25 C. 3) Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la L-asparaginase est précipitée à 21 Cz1 C par addition de 0,3 à 0,6 volume de butanol tertiaire par volume de solu tion traitée, ladite solution renfermant de 5 à 30mg de pro téines par ml.