Brevet FR2147150A1 — publié le 19730309

La présente invention concerne un procédé de pré- paration de leucoagglutinine pure à partir d'extraits de Phaseolus vulgaris, l'extrait étant purifié par précipitation, dialyse, adsorption, solution et reprécipitation de la matière protéinique. Il est connu que les graines de la fève Phaseolus vulgaris contiennent des substances appelées phytohémagglutinines (PIPA) possédant une activité mitogdnique, c'est-à-dire une capacité de stimuler la croissance et la division des lymphocytes dans une culture de tissu. La phytohémagglutinine contient plusieurs composants ayant une activité mitogénique variable. L'un de ces composants est la leucoagglutinine qui est fortement mitogénique. La leucoagglutinine agglutine les globules blancs (leucocytes) mais elle n'agglutine pas les globules rouges (érythrocytes). L'érythroagglutinine est un autre composant de la phytohémagglutinine. En outre, il peut y avoir dee leucoérythro-agglutinines combinées qui agglutinent à la fois les leucocytes et les érythrocytes et stimulent aussi la division des lymphocytes, mais probablement pas aussi fortement que la leucoagglutinine. La leucoagglutinine a été auparavant isolée à l'état pur mais seulement en petites quantités et au moyen de procédés ne convenant pas à la production à l'échelle industrielle. (T. Weber (1969) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 111 ; L.W. Allen et colt, (1969) Proc. Nat.Acad. Sci. 63, 334). Cependant, la leucoagglutinine pure sous forme cristalline n'a pas encore été isolée. Les préparations de phytohémagglutinine disponibles dans le commerce, par exemple la "Bacto-Phytohémagglutini- ne M et la Bactcphytohémagglutinine P" vendues par les Laboratoires Difco aux USA et les préparations vendues sous le nom de Phytohémagglutinine par Wellcome Reagents LTD en Grande Bretagne sont des mélanges assez impurs qui contiennent de toute évidence plusieurs composants stimulant la croissance des lymphocytes, parmi lesquels la leucoagglutinine et 1'érythroagglutinine. La leucoagglutinine pure a les caractéristiques suivantes Dans l'électrophorèse par disques à pH 4,5, elle se déplace sous la forme d'une zone unique ayant une mobilité cathodique. Elle agglutine les leucocytes humains à des concentrations aussi basses que 2 à 3 t,g/ml (déterminées suivant la méthode de Killman revue par Weber et Coll. S.A. Kilîman (1960) Agglutinines des leucocytes. Publications scientifiques Blackwell, Oxford ; Weber et coll. (1967) Scand. J. Hematol. 4, 77). Il n'a pas été trouvé que l'activité d'agglutination des érythrocytes soit la propriété de la leucoagglutinine cristalline à des concentrations allant jusqu'à 3 mg/ml, en utilisant la méthode de Salk (J.E. Salk (1944) J. Immunol. 49, 87). La leucoagglutinine cause une incorporation maximum de 125 I-uridine par les lymphocytes à une concentration de 2,8 Mg/ml. La stimulation commence à une concentration de 0,087 eg/ml et se termine à une concentration de 180 Mg/ml. Le but de la présente invention est d'indiquer un procédé de préparation de la leucoagglutinine pure sous une forme cristalline. A cet effet, l'invention concerne un procédé de préparation de leucoagglutinine pure à partir d'extraits de Phaseolus vulgaris, l'extrait étant purifié par précipitation, dialyse, adsorption, élution et reprécipitation de la matière protéinique, procédé caractérisé en ce que, une solution de la matière protéinique purifiée est mélangée sous agitation à pH faiblement acide à une matière chromatographique pour séparer la leucoagglutinine des autres substances, la matière chromatographique est séparée de la solution et lavée si nécessaire, la leucoagglutinine est éluée de la matière chromatographique en utilisant une solution tampon ayant un pH faiblement acide, le pic de protéine éluée est isolé et la leucoagglutinine est précipitée, ce après quoi l'on réduit la concentration en sel du précipité jusqu'à ce que la leucoagglutinine cristallise et on recueille ensuite les cristaux de leucoagglutinine. La quantité convenable de matière chromatographique est approximativement de 1 g par gramme de protéine. Une matière chromatographique pouvant convenir à la mise en oeuvre du procédé de la présente invention est vendue par Pharmacia AB, Suède, sous la marque "SP-Sephadex C 50". On utilise de préférence de l'eau distillée pour la dialyse du précipité de leucoagglutinine. Avant l'additon de la matière chromatographique, la solution de protéine est de préférence dialysée, jusqu'à obtention de l'équilibre, en présence d'une solution tampon ayant un pH d'approximativement 5, par exemple une solution tampon 1/15 molaire de phosphate de sodium à pH 4,9. Ltélution de la leucoagglutinine à partir de la matière chromatographique peut se faire en utilisant une solu tion tampon 1/15 molaire de phosphate de sodium à un pH de 5,6 à 6,0 L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'e- xemple non limitatif ci-après: Exemple 10 Extraction On extrait 1 kg de fèves Phaseolus vulgaris fine ment broyées pendant une nuit à 40C en utilisant 4 litres d'une solution de HCl 0,1 N contenant 0,9% de Nazi. La bouillie est filtrée sur gaze. On répète l'extraction en utilisant 1,5 litre de la même solution, ce après quoi l'on rassemble les extraits et on centrifuge pendant 10 minutes à 7.000 x g. 20 Précipitation Au liquide surnageant, on ajoute la moitié de son volume d'méthanol à 94 pour cent en poids et la température est maintenue entre -5 C et +5 C. Le précipité est rassemblé par centrifugation à 7.000 x g à froid pendant 10 minutes et il est ensuite dialysé à l'eau du robinet pendant trois jours. 30 Adsorption sur diéthylaminoéthyle-(DEAE)-cellulose et élut ion On ajuste le volume du précipité dialysé à appro ximativement 1 litre par addition de tris(hydroxyméthyl)amino- méthane-HCl 0,05 molaire en solution tampon à pH 8,0 et l'on ajuste ensuite le pH à 8,0 par utilisation du mme composé en solution 2 molaire. La DEAE-cellulose humide (DE-52, Whatman), de laquelle la majeure partie de la solution tampon a été enlevée par filtration sur Bnchner est ajoutée en quantité de 10 g/1 g do matière protéinique. Avant utilisation, la DEAE cellulose est équilibrée par une solution tampon de tris(hy droxyéthyl)amino-méthane-HCl 0,05 molaire à pH 8,0. Le mélange est agité pendant au moins une heure, il est centrifugé et la cellulose est lavée trois fois en utilisant le même volume de la solution tampon OS05 molaire ci-dessus à pH 8,0. La cel lulose lavée est mise en suspension dans la même solution tampon. Cettte même solution, mais NaCl 1 molaire, est ajoutée à 1 t suspension en quantité telle que sa concentration en NaCl soi; de 70 mM. La suspension est agitée pendant au moins une hev:e, la cellulose est séparée par centrifugation et lavée deui fois en utilisant la solution ci-dessus 70 mM NaCl/0,05 M à P 8,0. Tous les éluats sont réunis et on leur ajoute une quantité de sulfate d'ammonium de 65 g/100 ml.Après une attente d'au moins une heure on rassemble le précipité par centrifugation à 7.000 x g pendant 20 minutes. Le précipité est dissous dans une ablution tamponnée de NaCl (0,9% de NaCl dans une solution tampon 10 mM de phosphate de sodium à pH 7,4). 40 Adsorption sur Sephadex et élution Le précipité dissous additionné de sulfate d'ammonium est dialysé en présence d'une solution tampon 1/15 molaire de phosphate de sodium à pH 4,9 jusqu'à ce que l'équilibre ionique doit atteint et il est ensuite centrifugé. Au liquide surnaguant, on ajoute du sulfopropyl-nSephadex" (SP-Sephadex C 50, Pharmav.a AB) équilibré par la même solution tampon, en quantité de g/g de protéine. Le mélange est agité pendant au moins une heur, filtré sur Bffchner et le Sephadex humide est lavé deux fois wec une solution tampon 1/15 molaire de phosphate de sodium à pH 4,9 . Le Sephadex est mis sous la forme d'une colonne ayant un diamètre de 25 mm.Si nécessaire, on le lave avec la mdme solution tampon jusqu'à ce que ltabsorption de la lumière à 280 *m de l'éluat soit inférieure à 0,C5. La leucoagglutinine es éluée ae la colonne en utilisant une solution tampon 1/15 mol. re de phosphate de sodium ayant un pH de 5,6 à 6,0. Le pic de protéine est isolé et l'on ajoute 65 g/100 ml de sulfate dwammo.8-um pour précipiter la protéine. 50 Cristallisation Le précipité obtenu au sulfate d'ammonium est dialysé à l'eau dist?ilée; au début, le précipité se dissout. Lorsque la concentrat:rn en sel a été suffisamment réduite, la cristallisation se produit. Le rendement en leucoagglutinine cristalline pure varie 3ltre 100 mg et 300 mg. Bien entendi, invention n'est pas limitée à leexemple de réalisation s dessus décrit, à partir duquel on pourra prévoir d'autres modes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. REVENDICBTIONS 1.- Procédé de préparation de leucoagglutinine pure à partir d'extraits de Phaseolus vulgaris, l'extrait étant purifié par précipitation, dialyse,adsorption, élution et reprécipitation de la matière protéinique, procédé caractérisé en ce que, une solution de la matière protéinique purifiée est mélangée sous agitation à pH faiblement acide à une matière chromatographique pour séparer la leucoagglutinine des autres substances, la matière chromatographique est séparée de la solution et lavée si nécessaire, la leucoagglutinine est diluée de la matière chromatographique en utilisant une solution tampon ayant un pu faiblement acide, le pic de protéine éluée est isolé et la leucoagglutinine est précipitée, ce après quoi l'on réduit la concentration en sel du précipité jusqu'à ce que la leucoagglutinine cristallise et on recueille ensuite les cristaux de leucoagglutinine. 2.- Procédé suivant la revendication l, caractérisé en ce que l'on réduit la concentration en sel du précipité de leucoagglutinine par dialyse à l'eau distillée. 3.~ Procédé suivant lune quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajoute de la matière chromatographique par quantités d'approximativement 1 g/g de matière protéinique. 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on dialyse la solution de la matière protéinique purifiée en présence d'une solution tampon se trouvant approximativement à pH 5, jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint, avant son traitement par la matière chromatographique. 5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lon élue la leucoagglutinine de la matière chromatographique en utilisant une solution tampon de phosphate de pH 5,6 à 6,0.