Brevet FR2172767A1 — publié le 19731005

Cette invention concerne un procédé amélioré de production de l'isomérase du glucose. L'isomérase du glucose est une enzyme qui a la propriété d'isomériser le glucose en fructose. On sait dans la technique que l'on peut transformer le glucose en fructose en chauffant une liqueur contenant du glucose, c'est-à-dire du sirop de malus, en présence d'un catalyseur basique. En raison de la non-sélectivité du catalyseur basique, on produit divers sous-produits indésirables, comme de grandes quantités de corps colorés et de substances acides. Raffiner une liqueur isomérisée d l'aide d'une base pour enlever ces sous-produits indésirables nécessite des modes opératoires de raffinage plutôt compliqués et coûteux. En conséquence, pour autant qu'on le seche, on n'a pas pratiqué industriellement 1' isomérisation alcaline. Divers mxaxworganismes produisent l'isomérase du glucose. Par exemple, dans un article paru dans Science, Vol. 125, pp. 648-9 (1957), on décrit qu'une enzyme dérivée de Pseudomonas hvdrophila isomérise le glucose en fructose. Le brevet britannique NO 1.103.394 et le brevet japonais 17.640 (1966 > décrivent également que les mBox-organismes classés comme appartenant au genre Streptotrrvces, comme Strelrtomyces flavorirens, Streptomvces achromoqenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus et Strepto- mvces phaeochromovenes, produisent l'isomérase du glucose. Dans la production industrielle d'enzymes microbiennes, il est généralement nécessaire de procéder par étapes. Ces étapes peuvent être peu nombreuses ou nombreuses, selon la nature du procédé et les caractéristiques des micro-organismes. Généralement, on démarre la propagation en ensemençant des spores provenant d'une culture en tube incliné dans un milieu nutritif préstérilisé, contenu généralement dans un flacon à agitation. Dans le flacon, on encourage la croissance des mtcro-organismes par de nombreux moyens, par exemple agiter pour aérer et maintenir une température appropriée. On répète cette étape une ou plusieurs fois dans des flacons ou des récipients contenant des volumes identiques ou plus grandsdemilieu nutritif.Pour des raisons de commodité on peut désigner ces étapes comme des étapes du développement de la culture et la dernière étape comme l'étape de la culture d'ensemencement. On introduit ou on ensemence les nicro-organismes provenant de l'étape de la culture d'ensemencement, accompagnés ou non de milieu de culture, dans un grand fermenteur où l'on effectue la fermentation pour produire des quantités industrielles d'enzymes. Les raisons de cultiver les micro-organismes par étapes sont nombreuses, mais on le fait principalement en raison des conditions nécessaires å la culture des micro-organismes et/ou à la production d'enzymes. Ces conditions comprennent la stabilité des micro-organismes, les milieux nutritifs appropriés, le pH, les relations osmotiques, le degré d'aération, la température et le maintien des conditions d'une culture pure pendant la fermentation. Par exemple, por obtenir des rendements maximaux en enzymes,il faut changer quelque peu les conditions de fermentation dans l'étape finale par rapport à celles utilisées pour obtenir une croissance optimale des micro-organismes dans les étapes de développement de culture.Maintenir la pureté du milieu est également d'une très grande importance, particulièrement quand on effectue la fermentation dans des conditions d'aérobiose. Si l'on démarre initialement la fermentation dans un grand fermenteur avec de petites quantités d'inoculum, il faut un temps relativement long pour obtenir un rendement appréciable en enzyme. Ceci augmente évidemment la possibilité de contamination du milieu nutritif et de mutation du microorganisme. On a besoin d'un procédé de production de l'isomérase du glucose dans lequel on obtienne des rendements améliorés en isomérase du glucose. Selon la présente invention, il est fourni un procédé de production de l'isomérase du glucose, lequel procédé consiste å cultiver par étapes un micro-organisme qui produit l'iso- mérase du glucose, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions de fermentation er aérobiose et en immersion, en présence, au moins dans l'étape finale de culture, d'un sel d'ammonium qui permet la production de l'isomérase du glucose, et de liqueur de macération de mais. On a utilisé dans le passé les sels d'ammonium et la liqueur de macération de mais comme sourcesd'azote pour la production d'enzymes.Mais les inventeurs ne sont pas au courant que l'on ait utilisé un sel d'ammonium et la liqueur de macération de mas en combinaison pour produire l'isomérase du glucose. L'utiLisation de cette combinaison de sourcesdtazote fournit un certain nombre d'améliorations importantes dans la production de 1 'isomérase du glucose. L'amélioration la plus importante est que, dans la plupart des cas, on obtient des rendements supérieurs en isomérase du glucose.D'autres avantages apparaissent dans la description suivante et peuvent comprendre un temps de fermentation plus court pour obtenir des rendements appréciables en isomérase du glucose et le fait que l'on a besoin d'une quantité inférieure de liqueur de macération de mais dans les milieux de fermentation. Le sel d'ammonium utilisé dans le présent procédé peut etre l'un de ceux qui, lorsqu'il est utilisé comme seule source d'azote, permet la production de l'isomérase du glucose. On peut déterminer si on peut utiliser un sel d'ammonium particulier dans le présent procédé, simplement en cultivant le micro-organisme en présence du sel d'ammonium qui est la seule source d'azote, et en déterminant l'activité en isomérase du glucose du milieu de fermentation. Comme il est évident pour llhomme de l'art, d'autres substances nutritives, par exemple le xylose, le xylane, etc., et des sources de facteurs de croissance et de minéraux comme l'extrait de levure, l'extrait de malt, etc., doivent bien sûr etre présentes pendant la fermentation pour produire des conditions de culture appropriées, Comme exemplesdes sels d'ammonium que l'on peut utiliser dans le présent procédé, citons les phosphates, les carbonates, les sulfates, les tartrates. le chlorure, le nitrate, etc. On préfère les sels d'ammonium minéraux et celui que l'on préfère le plus est le phosphate d'ammonium. Certains sels d'ammonium organiques comme l'acétate et le stéarate ne permettent pas, quand on les utilise comme seule source d'azote, la production de l'isomérase du glucose à un degré suffisamment important, et donc il n'est pas recommandé d'utiliser ces sels dans le présent procédé. Les quantités de liqueur de ma cérat ion du mais et de sels d'ammonium utilisées dans le présent procédé peuvent varier largement, mais, d'une façon type, la liqueur de macération de mais représente de 0,25 pour cent à 5 pour cent. de préférence de 2 à 3 pour cent et mieux encore 2,6 pour cent. La quantité type de sel d'ammonium présente est de 0,25 à 3 pour cent, de préférence de 0,5 à 1 pour cent, et mieux encore 0,5 pour cent. La "liqueur de macération de mais" est un produit bien connu dans la technique et on l'obtient à partir de la liqueur dans laquelle on fait macérer le mais en vue de le ramollir pour un procédé de mouture du maïs par voie humide. On concentre généralement par évaporation la liqueur de macération de mais. Comme la teneur en solides de la liqueur de macération de mais peut varier selon le fournisseur, chaque fois que l'on se réfère à une liqueur de macération de mais dans la description suivante et dans les revendications ci-jointes, il s'agit d'une liqueur de macération de mais ayant une teneur en solides de 50 pour cent. Toutefois il est évident que la description d'une liqueur de macération de mais avec cette teneur particulière en solides ne limite pas le présent procédé à l'utilisation de cette seule liqueur particulière de liqueur de mais, car on peut utiliser des liqueurs de macération de mais ayant diverses teneurs en solides si les quantités utilisées de ces liqueurs sont proportionnelles à la quantité de liqueur de macération de mais indiquée ci-dessus, par rapport aux solides. On préfère utiliser dans le présent procédé les microorganismes classés comme appartenant au genre strePtomsces. Les micro-organismes de ce genre que l'on préfère le plus sont ceux qui sont caractérisés comme ayant la propriéte d'assimiler le xylane pour produire l'isomérase du glucose. Des exemples de ces micro-organismes préférés sont identifiés comme Strepto myces sp. ATCC 21175 et Streptomyces sp. ATCC 21176. On peut obtenir des cultures de ces rlicro-organismes, de la collection permanente de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn, Rockville, Maryland, 20852,U.S.A. Comme on le sait bien dans la technique, une source de glucides est généralement nécessaire pour la production des microorganismes. Dans le présent procédé, bien que l'on puisse utiliser diverses sources de glucides, on préfère que la source de glucides fournie dans l'étape finale de culture soit un hydrolysat d'une substance contenant du xylane. Pour les besoins de cette invention, le terme "hydrolysat" signifie une substance contenant du xylane complètement ou partiellement hydrolysé. Quand le xylane est complètement hydrolysé, le principal glucide présent est le D-xylose. Dans le cas o; le xylane est seulement partiellement hydrolysé, des oligosaccharides et des polysaccharides sont également présents en plus du D-xylose. On peut produire les hydrolysats par des moyens bien connus dans la technique. Par exemple, on peut faire une suspension dans l'eau d'enveloppes de graines de coton, et leur ajouter des quantités suffisantes d'acide sulfurique ou chlorhydrique pour effectuer l'hydrolyse acide d'une partie importante du xylane dans un temps raisonnable. Le temps nécessaire pour hydrolyser le xylane dépend évidemment des températures, des pressions et de la quantité d'acide utilisées. Par exemple, pour une concentration en acide sulfurique de 0,1 à 0,5 M et à des températures et des pressions relativement élevées, le temps peut etre aussi faible que 5 minutes, alors qu'à la pression atmpsphèrique il est nécessaire que le temps soit aussi long que 6 heures.On peut également utiliser la xylanase, une enzyme qui peut former le D-xylose à partir du xylane, dans des conditions appropriées d'hydrolyse, pour former un hydrolysat approprié. Comme exemples de substances contenant du xylane hydrolysé que l'on peut utiliser. dans le présent procédé, citons les hydrolysats acides de rafles de mais, de son de blé, d'enveloppes de graines de coton, de paille, de ribres de bois, et de la fibre grossière d'un procédé de mouture de mais par voie humide. Les hydrolysats préparés en traitant la pulpe de bois à des températures et des pressions élevées sont également appropriés. La présence d'hydrolysats de substances contenant du xylane, de liqueur de macération de mais, et de sels dtammonium dans le milieu nutritif pour la culture des micro-organismes du genre Streptomyces stimule la production de l'isomérase du glucose. On n'a pas besoin de soumettre les hydrolysats d'une substance contenant du xylane utilisés dans le milieu nutritif, à des procédés importants de raffinage nécessaires pour-enlever divers produits de réaction, comme le furfural, l'hydroxyméthylfurfural et l'acide lévulinique, qui sont normalement toxiques vis-à-vis de certains micro-organismes bacté-enS ou retardent la formation de l'isomérase du glucose. Dans les conditions préférées du présent procédé, il est seulement nécessaire de filtrer les hydrolysats pour enlever certaines substances insolubles avant de les incorporer dans le milieu nutritif pour micro-organismes du genre Streptomyces.Cette découverte fournit l'avantage que l'on n'a pas besoin de faire subir aux hydrolysats de substances contenant du xylane des procédés coflteux et longs de raffinage avant de les utiliser dans un milieu nutritif. Pendant la fermentation, on a observé que le bouillon a tendance à devenir plus acide. Bien que le développement de l'acidité ne soit pas sensiblement gênant pendant les premières étapes de culture, parce qutil ne gene pas sensiblement la croissance des micro-organismes, il altère la production de l'isomérase de glucose. Donc, on doit éviter ce développement de l'acidité dans une étape industrielle ou finale de la fermentation.On a trouvé que, lorsqu'unie quantité d'hydrolysat équivalente à 0,25 - 5,0 pour cent de xylose, mais de préférence 1,0 pour cent de xylose, à 0,4 - 1,0 pour cent de glucose, mais de préférence 0,75 pour cent de glucose, à 0,5 - 2,5 pour cent de sorbitol, mais de préférence 1 pour cent de sorbitol, est présentedans le milieu de fermentation et qu'on y ajoute la combinaison appropriée de liqueur de macération de mais et de sels d'ammonium, comme le phosphate de diammonium, on maintient le pH du milieu dans un domaine où l'on obtient des rendements maximaux dans l'isomérase du glucose. Ce domaine de pH varie de 6,2 à 6,7. Pour décrire plus clairement ia nature de la présente invention, on décrit cidessous des exemples spécifiques. Toutefois il est évident que ceci est fait seulement pour exemple et qu'il ne faut pasle comprendre comme limitant le champ d'application de l'invention ni l'ambition des revendications ci-jointes. Dans les exemples et dans cette description, les pourcentages utilisés sont des pourcentages pondéraux et sont exprimés par rapport au poids du milieu nutritif, ou du bouillon, sauf indication contraire. On détermine la teneur en xylose des hydrolysats par le procédé modifé de Lane-Eynon tel qu'il est décrit dans la méthode E-26 de la Corn Industries Research Foundation dans Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Industries Research Foundation, en multipliant la valeur réduite calculée en dextrose par 0,85. On effectue comme suit la détermination de l'activité en isomérase du glucose de la préparation enzymatique On fait subir à une portion du bouillon de fermentation con tenant l'isomérase du glucose un traitement par ultrasons pour briser les cellules et libérer l'enzyme. Puis on centri fuge le bouillon pour enlever les débris et les substances cellulaires. Puis on fait incuber la solution enymatique à un pH de 7,5 et à une température de 700C dans un milieu aqueux contenant O,lM de glucose 0,05 M de NaH2P04 0,005 M MgS04-7H20 Après une heure, on abaisse le pH du mélange réactionnel à 3 avec une solution à 5 pour cent, en poids, d'acide perchlorique pour inactiver l'isomérase du glucose.On place dans un tube à essai 1 ml du mélange réactionnel, 0:2 ml d'une solution à 0,2 pour cent de chlorhydrate de cystéine, 5 ml d'une solution à 75 pour cent, en volume, de H2S04 et 0,15 ml de carbazole à 0,12 pour cent dans une solution alcoolique, on les mélange et on place le tube à essai dans un bain-marie maintenu à 60 C. Après 10 minutes, on enlève du ban le tube à esSai et on le refroidit rapidement à la température de la pièce.On détermine la quantité de fructose selon la procédé de Dische et Borenfreund (Journal of Bioloqical ChemistrY, Vol.192, p. 583, 15=1). Une unite d'activité de l'isomérase est la quantité d'enzyme qui produit 7,87 mg de fructose par heure. On effectue des essais appropriés à blanc pour compenser les cétoses présents dans la préparation enzymatique et ceux formés lors d l'isomérisation alcaline. EXEMPLE I Cet exemple illustre l'effet de la présence de divers sels d'ammonium dans un milieu de culture sur la production de l'isomérase du glucose par le micro-organisme Streptomyces sp. ATCC 21175. On prépare un milieu composé de 0,4 pour cent de xylose purifié, 0,4 pour cent d'extrait de levure, 1 pour cent d'extrait de malt, 2 pour cent d'agar, le reste étant de l'eau désionisée. On ajuste le pH à 7,3 avec NaOH. On stérilise le milieu à l'autoclave pendant 20 minutes à 1210C et on le répartit en tubes inclinés. On ensemence ces tubes inclinés avec Streptomyces sp. ATCC 21175 et on laisse incuber pendant 5 jours à 3O0C. I1 se produit une sporulation uniforme des micro-organismes. On prépare un milieu de culture aqueux ayant un pH de 7 et se composant de 1 pour cent de xylose purifié, 1 pour cent de peptone, 1 pour cent d'extrait de levure, 0,1 pour cent MgS04.7H20, 0,3 pour cent de K2HP04, 0,1 pour cent d'agar, le reste étant de l'eau. On stérise le milieu, sauf le xylose1 à l'autoclave pendant 30 minutes à 1210C. On stérilise le xylose à l'autoclave pendant 15 minutes à 1210C avant de l'incorporer dans le milieu. On ensemence un flacon contenant 150 ml de milieu avec des spores provenant de la culture sur tube incliné indiqués ci-dessus, on maintient le flacon à 3O0C et on agite pendant 48 hures à 180 t.p.m., pour avoir des conditions de culture en aérobiose. Les myceliums obtenus sont filamenteux. On place dans une série de flacons d'Erlenmeyer de 300 ml, 100 ml de milieu aqueux contenant 1 pour cent de sorbitol, 0,5 pour cent de dextrose, suffisamment d'enveloppes de graines de coton ayant subi une hydrolyse acide pour obtenir une concentration en xylose de 1 pour cent, de 0,024 pour cent de CoC12.6H20. On ajoute au milieu les sels d'ammonium ou la liqueur de macération de maïs indiqués dans le Tableau I ci-dessous. On n'ajoute aucun supplément d'azote à l'un des flacons qui sert de témoin. On ajuste le pfl des milieux à 7, puis on bouche les flacons avec un tampon de coton et on les passe à l'autoclave pendant 30 minutes à 1210C. Après refroidissement, on ajoute à chacun des flacons A rpl du bouillon fermenté de l'étape précedente, et on maintient les flacons à 300C en les agitant pendant 88 heures à 200 t.p.m. pour avoir des conditions de culture en aérobiose. Après cette période, ogn détermine l'activité en isomérase du glucose du milieu. Les résultats de cette détermination sont indiqués ci-dessous dans le Tableau I. TABLEAU I Source d'azote % ajoutés Activité en ajoutée au au isomérase du Echantillon milieu milieu glucose NO ~~~~~~~~~~~~~~~ ~~ ~ ~ ~ ~ (unités/ml) 1 Pas d'addition 3,7 2 Liqueur de macé- 2,0 6,7 ration de mais 3 Phosphate de 0,5 6,4 diammonium 4 Acetate 1,7 0,5 d'ammonium 5 Bicarbonate 2,o 5,5 d' ammonium 6 Chlorure 0,8 6,5 d' ammonium 7 Nitrate 1,2 5,5 d'ammonium 8 Sulfate d'ammonium 1,0 6,6 9 Tartrate d'ammonium 1,4 7,6 10 Stéarate d'ammonium 3,1 0,4 ll Urée 1,0 2,8 12 Phosphate de 0,5 chaque 5,2 diamnonium et urée On voit d'après le tableau ci-dessus que le milieu sans apport supplémentaire d'azote fournit des niveaux plus faibles d'activité en isomérase du glucose que lorsque l'on ajoute au milieu certaines sources supplémentaires d'azote.D'autres sources d'azote, notamment 11 acétate d'ammonium, l'urée et le stéarate d'ammonium ne permettent pas d'une façon sensible la production de l'isomérase du glucose. MEMPL;E Il Cet exemple illustre l'effet de la présence d'une combinaison de liqueur de macération de mais et d'un sel d'ammonium dans le milieu de culture pour la production de l'isomérase du glucose par le micro-organisme Streptomyces sp. ATCC 21175. On effectue une série de fermentations selon le mode opératoire décrit dans 1'Exemple 1, sauf lorsqu'une indication contraire est indiquée dans le Tableau II ci-dessous. TABLEAU II Pourcentage de liqueur de ma- Pourcentage de Activité en isomé cération de mats (RH )2HPO rase du glucose Echantillon ajoutée au ajoute 4au (unités/ml) après milieu milieu un temps de fermentation ~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~ tation de 79 heures 1 4 néant 5,45 2 3 n 4,95 3 2 n 4,25 4 1 n 2,05 5 2 0,25 5,94 6 1 n 4,95 7 0 n 1,56 8 2 0,5 5,73 9 1 4,17 10 0 n 3,33 11 2 1,0 5,66 12 1 " 4,81 13 0 n 2,55 On voit d'après le tableau ci-dessus que la combinaison de la liqueur de macération de mais et d'un sel d'ammonium a un effet stimulant sur la production de 1'isomérase du glucose. On voit également que l'on peut réduire sensiblement la quantité de liqueur de macération de mais ajoutée au milieu et que l'on obtient de bons rendements çn isomérase du glucose quand un sel d'ammonium est également présent dans le milieu. EXEMPLE III Cet exemple illustre la production de 1 'isomérase du glucose à une échelle commerciale. On effectue une série de fermentations comme suit On prépare 190 litres d'un milieu contenant 4 pour cent de liqueur de macération de mais, 1 pcur cent de sorbitol, 0,7 pour cent de glucose, 0,024 pour cent de CoC12.6H20, 0,013 pour cent d'un agent antimoussant (Pluronic L-61 fabriqué par la wyandotte Chemical Company), et suffisamment d'enveloppes de graines de coton ayant subi une hydrolyse acide pour obtenir 1 pour cent de xylose, et on en ajuste le pH à 2,4-4,5. On stérilise le milieu, on le refroidit à la température ambiante et on ajuste son pH à 6,9-7,1 d'une façon aseptique. On ensemence le milieu avec Streptomvces ep. ATCC 21175.On maintient ensuite ce milieu pendant 48 heures dans des conditions d'aérobiose à une température de 300C, un débit d'aération de 113 1/mon (avec une contre-pression de 0,68 atm. effective) et on l'agite à la vitesse de 180 t.p.m. On effectue une série de fermentations de la manière indiquée ci-dessus pour fournir de l'inoculum pour les fermentations suivantes à l'échelle industrielle. On prépare un milieu nutritif tel qu'il est décrit ci-dessus, sauf que l'on réduit la quantité de liqueur de macération de mais à 2,6 pour cent, et on incorpore dans le milieu 0,5 pour cent de phosphate de diammonium avant d'en ajuster le pH à 6,9-7,1. On ajoute à ce milieu du bouillon fermenté provenant des fermenteurs de 190 litres, et on maintient le mOlange dans des conditions d'aérobiose à une température de 300C, un df c d'narration de 22,6 m3/mn (0,34 atm. effective de contl--pression) et une vitesse d'agitation de 100 t.p.m. On effectue de cette manière une série de 12 fermentations, 6 d'entre elles contenant 22.800 litres de milieu et 6 d'entre elles contenant 3.800 litres de milieu. Après un temps de fermentation moyen de 29,7 heures, l'activité moyenne en isomérase du glucose du milieu est de 4,31 unités/ml. On effectue une autre série de fermentations exactement de la manière décrite ci-dessus sauf que l'on n'y met pas de phosphate de diammonium. Cette série consiste en une fermentation contenant 22.800 litres de milieu et 14 fermentations contenant 3.800 litres de milieu. Après un temps moyen de fermentation de 44,3 heures, les séries de fermentations qui ne contiennent pas de phosphate de diammonium ont une activité moyenne en isomérase du glucose de 3,0 unités/ml. Ceci démontre clairement que dans la production industrielle de lrisomérase du glucose on peut obtenir des rendements plus élevés, en des périodes plus courtes quand est présente dans le milieu une combinaison de liqueur de macération de mais et d1un sel d'ammonium. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de l'isomérase du glucose, caractérisé en ce que l'on cultive par étapesun micro-organisme qui produit l'isomérase du glucose, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions de fermentation en aérobiose et en immersion, avec la présence, au moins dans l'étape finale de culture, d'un sel d'ammonium qui permet la production de l'isomérase du glucose, et de liqueur de macération de maïs. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est un micro-organisme du genre Streptomvces qui est caractérisé comme ayant la propriété d'assimiler le sylane pour produire l'isomérase du glucose. 3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la quantité de liqueur de macération de mais présente est d'environ 0,25 à environ 5 pour cent et que la quantité de sel d'ammonium est d'environ 0,25 à environ 3 pour cent, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids du milieu nutritif aqueux. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la quantité de liqueur de macération de mais présente est d'environ 2 à environ 3 pour cent et la quantité de sel d'ammonium est d'environ 0,5 à environ 1 pour cent. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 4, caractérisé en ce que le sel A' ammonium est le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le tartrate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, ou des mélanges de ces sels. 6. Procédé selon 11 une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'est présent dans le milieu nutritif un hydrolysat d'une substance contenant du xylane 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'est présente une quantite suffisante de l'hydrjlysat pour fournir d'environ 0,25 à environ 5 pour cent de xylose dans le milieu nutritif. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractériaé en ce que sont présents d'environ 0,4 à environ 0,75 pour cent de glucose et d'environ 0,5 à environ 2,5 pour cent de sorbitol. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on maintient le pH du milieu nutritif entre environ 6,2 et environ 6,8 pendant la production de l'isomérase du glucose. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9., caractérisé en ce que le micro-organisme est le Streptomyces sp, ATCC 21175 ou le Streptomyces sp. ATCC 21175 et le sel d'ammonium est le phosphate d'ammonium.