Brevet FR2185680A1 — publié le 19740104

La présente invention concerne un procédé de préparation de la vitamine E qui est utilisée en médecine, dans les industries alimentaires, en agriculture et dans d'autres domaines d'activité. On connaît déjà un procédé de préparation de la vitamine E à partir de semences, de graines et de germes de végétaux, notamment de froment, de soja, et de cotonnier. Ce procédé consiste essentiellement à extraire la vitamine E à partir des huiles végétales des semences, des graines et des germes de végétaux par des procédés de distillation moléculaire et d'extraction (cf. à ce propos l'ouvrage de I.E. Gekker, M.S. Shipalov, "Obtention de concentrés de vitamines A et E par des procédés de distillation moléculaire", recueil "Vitamines", nO 11, pp. 5 à 13, Editions de l'Académie des Sciences de l'Ukraine, Kiev, 1956). Le rendement en vitamine par ce procédé est fonction de la teneur en vitamine de la matière première. La teneur en vitamine E de la matière première la plus riche que constituent les grains de froment se chiffre par 0,009 milligramme par gramme de grain sec. Les inconvénients du procédé connu tiennent à la mise en oeuvre de matières premieres onéreuses (huiles végétales de semences, de grains et de germes de plantes) ainsi qu'à-l'obtention de la vitamine E avec un rendement insuffisant. La présente im-ention a pour but de supprimer les inconvénients précités. Elle se propose de fournir un procédé de préparation de la vitamine E qui permette de mettre en oeuvre des matières premières moins onéreuses et d'augmenter le rendement en produit final. Selon l'invention la solution consiste à faire croître des bactéries phototrophes du genre Ectothiorhodospira sur un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone, d'azote, de soufre et de phosphore et des oligoéléments, à l'abri de l'air à une température de 200 à 400C, en éclairant continuellement les bactéries en cours de croissance par une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 650 à 1 000 nm avec une intensité ne depas- sant pas 105 erg/cm.s et en les soumettant à un éclairage complémentaire au cours de la phase logarithmique de croissance et/ou de la phase du maximum stationnaire par une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 270 à 650 nm avec une intensité ne dépassant pas 1016 erg/cm2 s pendant un laps de temps de 10 9 seconde à 48 heures. A l'expiration de ce laps de temps on arrête l'eclai- rage complémentaire et 48 heures au plus après la cessation de cet éclairage complémentaire, on sépare les bactéries de la liqueur de culture, on extrait les lipides, notamment la vitamine E, à partir des bactéries susdites par des agents d'extraction et on isole la vitamine E à partir de l'extrait ainsi obtenu par chromatographie ou par distillation moléculaire. I1 est particulièrement avantageux de faire croître les bactéries à une température de 300C. I1 est recommandé de faire croître les bactéries sous un éclairage continu, l'intensité de la lumière étant de 103 à 1Q erg/cm2. s. I1 est recommandé en outre de faire croître les bactéries phototrophes sous un éclairage complémentaire avec une lumière d'une intensité ne dépassant pas 107 erg/cm.s pendant un laps de temps de 102 seconde jusqu'à 48 heures, ou d'une intensité supérieure à 107 et ne dépassant pas 1016 erg/cm2.s pendant un laps de temps de 10 9 à 102 seconde. I1 est recommandé d'utiliser en tant que solvants or ganiques pour l'extraction des lipides à partir des bactéries séparées de la liqueur de culture un mélange chloroforme-méthanol, le rapport en volume des constituants du mélange étant égal à 2 : 1 respectivement, ou bien du benzène. Dans le procédé de l'invention, on utilise une matière première moins onéreuse que sont les bactéries phototrophes du genre Ectothiorhodospira. Le rendement en produit final atteint alors 1 milligramme par gramme de poids sec des bactéries. On met en oeuvre le procédé de préraration de la vitamine E suivant l'invention de la façon suivante. On ensemence par une culture de bactéries phototrophes du genr tetothiorhodo5pirFtn milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone, d'azote, de soufre et de phosphore et des oligoéléments. On fait croître ces bactéries à l'abri de l'air à une température de 200 à 400C et sous un éclairage continu (de ces bactéries en cours de croissance) par une lumière dans la gamme des longueurs d'onde de 650 à 1 000 nm d'une intensité ne dépas S 2 sant pas 10 erg/cm s. Cette dernière mesure (illumination conti- nue par une lumière ayant les caractéristiques indiquées) permet de réaliser la croissance phototrophe de la culture de bactéries. Au cours de la phase logarithmique et au cours de la phase du maximum stationnaire on soumet la culture des bactéries à une irradiation complsmentaire par une lumière dans la gamme de longueurs d'ondes de 270 à 650 nm d'une intensité ne dépassant pas 1016 erg/ 2 -9 cm pendant-un laps de temps de 10 9 seconde à 48 heures. A l'expiration de ce laps de temps on cesse l'irradiation complé mentaire, on -sépare les bactéries de la liqueur de culture, par exemple dans une centrifugeuse, 48 heures au maximum après la ces sation de l'irradiation et on isole la vitamine E à partir de ces bactéries. A cet effet on traite lesdites bactéries par des solvants organiques pour en extraire les lipides et notamment la vitamine E.A titre d'agents d'extraction on-peut utiliser un grand choix de solvants organiques et de leurs mélanges, notamment un mélange chloroforme-méthanol, le benzène, l'iso-octane et l'etha- nol. On isole la vitamine E à partir de l'extrait obtenu par chromatographie ou par distillation moléculaire. Pour l'obtention pratique de la vitamine E selon le procédé de l'invention, il est essentiel de choisir convenablement les régimes optimaux de l'irradiation continue qui assure la croissance phototrophe des bactéries, ainsi que de l'irradiation complémentaire. C'est ainsi qu'il est avantageux d'effectuer, comme on l'a déjà indiqué, l'irradiation continue des bactéries phototrophes par une lumière d'une intensité de 10 à 104 erg/cm.s. Dans le cas de l'irradiation complémentaire par une 2 lumière d'une intensité ne dépassant pas 107 erg/cm2.s la duree -de l'irradiation recommandée se chiffre par 10 seconde à 48 heu res. C'est ainsi que, dans le cas d'une irradiation complémentaire par une lumière d'une intensité de 10 erg/cm.s la durée préfé- rable d'irradiation est de 12 heures, tandis que dans le cas où l'irradiation complémentaire se fait par une lumière d'une inten sité de 105 erg/cm2.s la durée d'irradiation peut être réduite jusqu'à 45 minutes. Lorsque l'irradiation complémentaire se fait par une lumière plus intense (intensité supérieure à 1Q7 et ne dépassant pas 1016 erg/cm2 s) la durée d'irradiation recommandée se chiffre par 10 9 à 102 seconde. C'est ainsi que dans le cas d'une irradia tion complémentaire par une lumière d'une intensité de 1010 erg/ 2 -4 cm la durée d'irradiation préférée est de 10 seconde, tandis que dans le cas d'une irradiation complémentaire par une lumière d'une intensité de 1014 erg/cm.s elle est égale à 10-8 seconde. Un régime correctement choisi d'irradiation continue et d'irradiation complémentaire des bactéries phototrophes permet d'obtenir la vitamine E avec le rendement maximal. Le rendement quantitatifSen vitamine E dépend de même fortement de l'intervalle de temps écoulé entre l'arret de l'irradiation complémentaire et le début de la séparation des bactéries de la liqueur de culture ainsi que de l'isolement à partir de ces bactÉries de la vitamine E. Comme on l'a indiqué, la séparation des bactéries de la liqueur de culture et l'isolement subséquent de la vitamine E à partir de ces bactéries doit se faire 48 heures au plus tard après 1 'arrêt de l'irradiation complémentaire. I1 est essentiel d'ailleurs de déterminer correctement pour chaque régime concret d'irradiation complémentaire l'époque optimale de séparation des bactéries de la liqueur de culture et de l'isolement subséquent de la vitamine E à partir de ces bactéries.C'est ainsi que dans le cas d'une irradiation complémentaire par une lumière d'une intensité de 103 erg/cm2.s pendant 12 heures on obtient le rendement maximal en vitamine E si on sépare les bactéries de la liqueur de culture et si on en isole le produit final 3 heures après l'arrêt de l'irradiation complémentaire. Un écart par rapport au régime optimal entraîne une baisse du rendement en vitamine E. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples non limitatifs de préparation de la vitamine E. EXEMPLE 1 On cultive dans des récipients en quartz hermétiquement clos de 0,6 litre de capacité, sur un milieu nutritif aqueux, des bactéries phototrophes, notamment des bactéries sulfureuses pourpres Ectothiorhodospira shaposhnicovii. La composition du milieu nutritif aqueux (en pour cent en poids) est la suivante NH4Cl Na2S,9H2O 0,1 ; NaHCO3 0,4 ; FeC13 > 6H2O 0,003 ; CH3COONa 0,2 oligoéléments 0,01.10-2 ; H2O q.s.p. 100 ; pH du milieu 8,0 à 8,2. On fait croître les bactéries à l'abri de l'air à une température de 300C et sous une irradiation continue par une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 650 à 1 000 nm et d'une intensité de 2.104 erg/cm2.s (en tant que source due rayonnement on utilise une lripeà incandescence). A la fin de la phase logarithmique et au début de la phase du maximum stationnaire de la croissance on soumet les bactéries aux effets d'une irradiation complémentaire par une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 270 à 650 6.102 2 nm d'une intensité de 6.102 erg/crn s pendant 24 heures.A l'ex- piration de cette période on arrête l'irradiation complémentaire, on continue à faire croître les bactéries sous un éclairage continu pendant encore 30 minutes, après quoi on les sépare de la li queur de culture sous la forme d'un dépôt dans une centrifugeuse (40 000 g, pendant 40 minutes). On transfère les bactéries séparées de la liqueur de culture dans un ballon placé sur une machine à secouer et on en extrait les lipides, notamment la vitamine E par un mélange chloroforme-méthanol (rapport en volume-chloroforme : méthanol 2 : I) à une température de 0 à 50C pendant 20 minutes. On sépare l'extrait obtenu en fractions par centrifugation (4 000 g, 20 minutes. On prélève la fraction cherchée (dans le chloroforme) contenant les lipides, y compris la vitamine E, et on l'évapore partiellement sous vide à une température de 300C. On ajoute à la solution de lipides dans le chloroforme réduite par évaporation du pyrogallol et du KOH et on fait bouillir la solution pendant 3 minutes. Au cours de cette opération une partie des lipides est saponifiée. On prélève dans une ampoule à décanter la fraction des lipides non saponifiables, y compris la vitamine E, et on dissout ces lipides dans l'iso-octane. Ensuite on sépare les lipides non saponifiables du solvant en évaporant ce dernier sous vide, on pèse le résidu sec et on le dissout dans 3 le chloroforme.On 'place une prise de 0,1 cm de cette solution dans une colonne chromatographique garnie d'un agent d'adsorption, le Sephadex LH-20 (de la firme suédoise "Farmacia"). Dans la colonne le mélange de non-saponifiables se sépare en constituants isolés. On prélève sur la colonne la fraction utile contenant la vitamine E et on procède à l'évaluation quantitative du rendement en produit. Dans les conditions spécifiées de croissance des bactéries et d'extraction des lipides à partir de ces bactéries le rendement en vitamine E se chiffre par 1,2 mg/g du poids sec des bactéries. EXEMPLE 2 On cultive des bactéries Ectothiorhodospira shaposhnicovii sur le même milieu nutritif, à la même température et sous le même éclairage que dans l'exemple 1. Au cours de la phase du maximum stationnaire de croissance on soumet les bactéries à un éclairage complémentaire par une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 270 à 650 nom et d'une intensité de 104 erg/cm. s pendant 4 heures. A l'expiration de cette période on cesse l'irradiation complémentaire et les bactéries continuent à croître sous un éclairage continu pendant 8 heures encore. Ensuite on sépare les bactéries de la liqueur de culture, on en extrait les lipides, notamment la vitamine E, et on isole de l'extrait le produit final d'une façon analogue à ce qui a été décrit dans l'exemple 1. Dans les conditions spécifiées le rendement en yita- mine E est de 0,9 mg/g du poids sec des bactéries. EXEMPLE 3 On cultive des bactéries Ectothiorhodospira shaposhnicovii sur le même milieu nutritif, à la même température et en présence d'un éclairage du même genre que dans l'exemple 1. Au cours de la phase du maximum stationnaire de la croissance on soumet les bactéries à un éclairage complémentaire d'une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 270 à 550 nm d'une intensité de 2.10 erg/cm.s pendant 5 heures. A l'expiration du temps indiqué on arrête l'éclairage complémentaire et on continue à faire croître les bactéries sous un éclairage continu pendant 3 heures encore. On sépare ensuite les bactéries de la liqueur de culture, on en extrait les lipides, notamment la vitamine E, avec du benzène et on isole de l'extrait le produit final comme décrit dans l'exemple 1. Dans les conditions indiquées ci-dessus de croissance des bacteries et d'extraction de lipides à partir de ces bac téries le rendement en vitamine E est de 1,0 mg par gramme du poids sec des bactéries. EXEMPLE 4 On cultive des bactéries Ectothiorhodospira shaposhnicovii sur le même milieu, à la même température et sous un éclairage du même genre que dans l'exemple 1. Au cours de la phase logarithmique de la croissance on soumet les bactéries à un éclairage ge additionnel par des éclairs dans la gamme des longueurs d'ondes de-270 à 650 nm d'une intensité de 1015 erg/cm2 s pendant seconde. En tant que source de rayonnement on utilise une lampe flash droite de 5 000 joules. Après l'éclairage complémentaire on poursuit la croissance des bactéries sous un éclairage continu pendant 10 minutes encore. Ensuite on sépare les bactÉries de la liqueur de culture, on en extrait les lipides, notamment la vitamine E, et on isole de l'extrait le produit final d'une manière analogue à celle qui a été décrite dans l'exemple 1.Dans les conditions décrites le rendement en vitamine E est de 0,01 mg par gramme du poids sec des bacteries. EXEMPLE 5 On cultive des bactéries Ectothiorhodospira shaposhni nvli dans des conditions analogues à celles qui ont été décrites dans l'exemple 4. La différence tient en ce que, après la cessation de l'éclairage complémentaire, on continue à faire croître les bactéries sous un éclairage continu pendant 24 heures encore. Ensuite on sépare les bactéries de la liqueur de culture, on en extrait les lipides, notamment la vitamine E, et on isole de l'extrait le produit final comme décrit dans l'exemple 1. Dans les conditions indiquées le rendement en vitamine E est de 0,001 mg par gramme du poids sec des bactéries. EXEMPLE 6 On fait croître des bactéries Ectothiorhodospira sha poshnicovii sur le même milieu nutritif, à la même température et en présence d'un éclairage du même type que dans l'exemple 1. Au cours de la phase logarithmique de la croissance des bactéries on les soumet à un éclairage additionnel par des flashes (éclairs) d'une lumière de 337 nm de longueur d'onde et d'une intensité de 12 ergs/cm2 s pendant 10 minutes (la durée d'un éclair étant de 5.10 9 seconde, la fréquence de succession des éclairs de 100 hz > . Après la cessation de l'éclairage complémentaire on continue à faire croître les bactéries sous un éclairage continu pendant 2 heures encore. Ensuite on sépare les bactéries de la liqueur de culture, on en extrait les lipides, notamment la vitamine E, et on isole de l'extrait le produit final d'une manière analogue à celle qui a été décrite dans l'exemple 1. Dans les conditions indiquées le rendement en vitamine E est de 0,07 mg/g du poids sec des bac téries. L'identification de la vitamine E obtenue dans les exemples de 1 à 6 a été effectuée sur la base des résultats ob tenus par chromatographie sur couches minces, chromatogrpahie sur colonne et spectres d'absorption ultraviolets. La chromatographie sur couches minces a été réalisée dans le chloroforme sur des plaques Silufol (Tchécoslovaquie), tandis que la chromatographie sur colonne a été réalisée avec une colonne d'un diamètre de 1,0 cm et d'une hauteur de 60 cm garnie d'un agent d'adsorption tel que le Sephadex LH-20 et avec une phase mobile telle que le chloroforme. C'est ainsi que dans le cas de l'identification de 1' &alpha; -tocopherolsa mobilité d'après les résultats de la chromato- graphie sur couches minces a été caractérisée par une valeur de Rf = 0,6 ; la valeur du volume d'effluent de 1' -tocophérol d'après les résultats de la chromatographie sur colonne était de 30,5 à 31,0 cm3. Le spectre d'absorption ultraviolet de l'-toco- phérol a été caractérisé par un maximum net à 295 nm. Dans toutes les méthodes d'identification de l'o(-tocophérol on a utilisé, en tant que témoin, de l'c(-tocophérol synthétique (produit de la société "Serva", République Fédérale d'Allemagne). Ce produit a les mêmes R f et volume d'effluent et une forme analogue de spectre d'absorption ultra-violet avec un maximum à X= 295 nm que le produit à identifier. REVENDICATIONS 1. procédé de préparation de vitamine E caractérisé en ce qu'on cultive des bactéries phototrophes du genre Ectothiorhodospira sur un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone, d'azote, de soufre et de phosphore et des oligoéléments à l'abri de l'air, à une température de 200 à 400C, en éclairant continuellement les bactéries en cours de croissance par une lumière dans la gamme des longueurs d'onde de 650 à 1 000 nm d'une 5 2 intensité ne dépassant pas 10 erg/cm s et en les soumettant à un éclairage complémentaire dans la phase de croissance logarithmique et/ou dans la phase du maximum stationnaire de la croissance par une lumière dans la gamme des longueurs d'ondes de 270 à 650 nm d'une intensité ne dépassant pas 1016 erg/cm.s pendant un laps de temps de 10 seconde à 48 heures, on arrête ensuite l'éclairage complémentaire, on sépare à un moment ne dépassant pas 48 heures après la cessation de l'éclairage complémentaire, les bactéries de la liqueur de culture, on extrait desdites bactéries les lipides, y compris la vitamine E, au moyen de solvants organiques et on isole à partir de l'extrait obtenu la vitamine E par chromatographie ou par distillation moléculaire. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive les bactéries phototrophes à une température de 300C. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on cultive les bactéries phototrophes sous un éclairage continu par une lumière d'une intensité de 103 à 104 ergs/ cm2. s. 4 Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on cultive les bactéries phototrophes sous un éclairage complémentaire par une lumière d'une intensité ne dépassant pas 107 erq/cm.s pendant un laps de temps de 102 seconde à 48 heures, ou d'une intensité supérieure à 107 erg/cm.s et ne dépassant pas 1016 erg/cm.s pendant un laps de temps de 10 9 à 102s. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise, en tant que solvant organique pour l'extraction des lipides, un mélange chloroforme-méthanol, le rapport en volume des constituants de ce mélange étant de 2 : 1 respectivement. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendica Fions 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise le benzène en tant que solvant organique pour l'extraction des lipides.