Brevet FR2176591A1 — publié le 19731102

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Madame Nicole LANGLOIS et Messieurs Pierre POTIER et Philippe kASOANAIVO, concerne un nouvel alcaloïde appelé "calongine", s préparation par extraction des parties aériennes d'une pervenche de Madagascar (Catharanthus longifolius Pich.) et les compositions qui le contiennent. Les parties aériennes de Catharanthus longifolius Pich. extraites et fractionnées selon la méthode de GeHo Svoboda et colle, JO Amer, Phare Ass., Sci. Ed., 48 , 659 (1959), fournissent un certain nombre d'alcalotdes monoindoliques qui représentent les principaux types connus de squelettes d'alcaloïdes indoliques et des alcalotdes bis-indoliques connus tels que la leurosine, ia vincaleucoblastine, la vindolicine, la catharine et la catharicineO I1 a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que lton peut isoler un nouvel alcalose bis-indolique, qui 2 été appelé "calongine", par traitement approprié des extraits des parties aériennes de Catharanthus longifolius Pich.. La "calongine" selon l'invention présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes - poids moléculaire = 776 - formule brute (déterminée par spectrographie de masse à haute résolution) = C45 52 8 4 - spectre ultra-violet (éthanol) = Xmax. = 259 nm = 11 000 Xmax. = 292 nm g = 6 500 - les fragmentations observées en spectrographie de masse montrent que la calongine est constituée d'une molécule de vindoline et d'une molécule de nature indolique dont la formule brute est C20H2202N2 - le spectre de résonance magnétique nucléaire montre que la vindoline est liée à la partie indolique par le carbone en position 10 - la calongine donne une coloration violette caractéristique avec le réactif cérique EN.R. Farnsworth et collez Lloydia, 27-, 302 (1964) Selon l'invention, la calongine est obtenue en utilisant une méthode analogue à celle de Svoboda et coll. basée sur la différence de solubilité des tartrates des différents alcaloïdes dans les solvants organiques et sur la différence de comportement des alcaloses en chromatographie de partage. Le principe de ltextraction est le suivant Les parties aériennes de la plante, débarrassées de leurs constituants solubles dans l'éther de pétrole, sont traitées par une solution aqueuse d'acide tartrique (20 g/l) puis la suspension obtenue est extraite a benzène. Les extraits organiques, après concentration sous pression réduite à un volume égal au dixième environ de leur volume initial, sont traités par un volume à peu près égal d'une solution aqueuse d7acide tartrique (20 gll) puis le benzène est éliminé totalement par distillation sous pression réduite, La solution aqueuse tartrique est ensuite alcalinisée au moyen d'une solution aqueuse d'ammoniaque puis les alcaloïdes totaux sont extraits par du benzène. Les alcaloYdes totaux ainsi obtenus sont chromatographiés sur un gel de Sephadex pour séparer les alcaloses bis-indoliques des alcaloïdes monoindoliques. Les alcalordes bis-indoliques sont séparés selon une technique d'extraction par gradient de pH voisine de celle de GeHo Svoboda, Lloydia, 27, 299 (1964). Les alcaloïdes extraits à pH 4,5 sont chromatographiés sur alumine désactivée. La calongine est éluée par du chloroforme et est purifiée par chromatographie sur couches épaisses de gel de silice0 La calongine présente un intérêt tout particulier par suite de son activité aùtitumorala prononcée qui a été démontrée au laboratoire sur les tumeurs greffables de la souris telles que la forme solide du sarcome 180, la tumeur ascitique d'Ehrlich, la leucémie L 1 210, la leucémie A.K.R., le réticulosarcome, la leucosarcomatose et les carcinomes mammaires, utérins ou pulmonaires à des doses comprises entre 5 et 25 mg/kg par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée. La présente invention comprend également les compositions médicinales contenant la calongine en association avec tout autre produit compatible, qutil soit inerte ou lui-même physiologiquement actif Ces compositions peuvent être présentées sous toute forme pharmaceutique appropriée à la voie d'administration prévue0 La proportion de produit actif dans ces compositions peut varier selon lteffet thérapeutique recherché. En thérapeutique humaine, la calongine est active en particulier sur les leucémies aigus lymphoblastiques ou myéloblastiques, par voie intraveineuse, à des doses journalières comprises entre 0,5 et 1 mg/kg pour un adulte : une composition pour injection consiste par exemple en une solution à 0,1 mg/cm3 de calongine dans du sérum physiologique0 L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, montre comment l'invention peut être mise en pratiquez Exemple 35 kg de parties aériennes de Catharanthus longifolius sont séchées et broyées puis traitées, dans un turbo-extracteur, par 155 litres puis 140 litres d'éther de pétrole. Après essorage et séchage, la poudre végétale est additionnée de 22,7 litres d'une solution aqueuse d'acide tartrique à 2 % puis la suspension obtenue est agitée pendant 1/2 heure. La suspension est extraite par 245 litres puis 4 fois 140 litres de benzène en agitant pendant 1 heure pendant chaque extraction. Les extraits organiques sont filtrés sur laine de verre puis le benzène est évaporé sous pression réduite à une température inférieure à 500 C jusqu'à l'obtention d'un volume de 87 litres0 On ajoute alors 87 litres dlune solution aqueuse d'acide tartrique à 2 % puis élimine le benzène par distillation sous pression réduite.La solution aqueuse dont le pH est voisin de 2,3 est filtrée sur Célite puis alcalinisée à pH 9 par addition d'une solution aqueuse d'ammoniaque à 30 % et enfin extraite,jusqu là réaction de Mayer négative, par 4 fois 15 litres de benzène0 Après séchage des couches organiques sur sulfate de sodium, on obtient 57 g d'alcaloYdes totaux, Les alcaloïdes totaux sont chromatographiés sur une colonne de Sephadex LH 20 ( 1 800 g) en éluant avec un mélange chloroforme-méthanol (3-7 en volumes), en faisant des fractions de 80 cm3 et en étudiant le comportement de chaque fraction en chromatographie sur couche mince de silice neutre et en éluant avec un mélange chloroforme-méthanol (5-95 en volumes)0 Les alcaloïdes bis-indoliques sont élués d'abord et peuvent être facilement séparés des alcaloïdes mono-indoliques en repérant sur la plaque la vindoline qui donne une tache rouge facilement reconnaissable en présence de réactif sérique; Les fractions contenant les alcalotdes bis-indoliques sont réunies puis concentrées à sec à une température inférieure à 500 C. On obtient ainsi 12,5 g d'alcalotdes bis-indoliques qui sont dissous dans 600 cm3 de benzène. A la solution obtenue on ajoute 600 cm3 d'une solution aqueuse d'acide citrique 0,1 M (19,2 gil) puis le benzène est totalement éliminé par distillation sous pression réduite, Le précipité est filtré puis lavé 2 fois avec environ 75 cm3 de solution aqueuse d'acide tartrique. La solution obtenue dont le pH est égal à 2,9X3 est extraite par trois fois 500 cm3 de benzène0 La solution aqueuse est amenée à pH 4,5 par addition d'une solution aqueuse d'ammoniaque à 30 % puis est extraite trois fois par 500 cm3 de benzène Les extraits benzéniques sont séchés sur sulfate de sodium anhydre puis concentrés à sec. On obtient ainsi 3,38 g d'une fraction contenant la calonginew Cette fraction est chromatographiée sur 40 fois son poids d'alumine désactivée par 10 % d'acide acétique. Ltélutioll au chloroforme fournit une fraction très enrichie en calongine Par chromatographie sur couche épaisse de gel de silice en éluant par un mélange acétate dtéthyle-éthanol absolu (3-2 en volumes), on obtient 120 mg de calongine pure. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Nouvel alcaloïde extrait de Catharanthus longifollus Pich., appelé calongine, caractérisé en ce que son poids moléculaire est 776, sa formule brute est Ca5H5208N4, son spectre ultra-violet présente des maximums d'absorption à 259 nm et 292 nm et qutil est constitué d'une molécule de vindoline attachée par sa position 10 à une molécule de nature indolique dont la formule brute est C20iI2202N2. 2 - Procédé de préparation de la calongine selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on extrait cet alcaloïde par traitement approprié des parties aériennes de Catharanthus longifolius Pich.. 3 - Composition médicinale caractérisée en ce qu'elle contient comme principe actif l'alcaloïde selon la revendication 1 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables.