Brevet FR2174745A1 — publié le 19731019

La présente invention a pour objet, à titre de nouveau produit et de médicament, un vaccin mixte contre le charbon symptomatique et le charbon bactéridien. Les maladies provoquées par les virus du charbon symptôma- tique et du charbon bactéridien affectent le bétail, spécialement dans les pays tropicaux. I1 stagit d'infections telluriques enzootiques qui font peser une menace permanente sur le bétail et rendent donc obligatoire la vaccination annuelle; celle-ci est le seul moyen de protection contre de telles infections puisque la possibilité de 11stérilisation " du milieu est exclue. Le charbon symptômatique peut sévir sous forme épizootique grave. On a compté par exemple, 15.000 cas mortels au Cameroun en 1942, et récemment 200.000 cas mortels à Madagascar en 19691970. I1 est connu de vacciner les animaux contre chacune des maladies. Cependant, les vaccinations séparées sont beaucoup plus difficiles à réaliser sur le terrain et les campagnes de vaccination sont coûteuses I1 est donc de plus en plus désirable de mettre au point des vaccins mixtes pour immuniser simultanément les animaux contre un certain nombre de maladies, et, dans le cas présent, contre le charbon symptômatique et le charbon bactéridien. Les problèmes rencontrés lors de la préparation des vaccins mixtes sont nombreux et ont été déjà rapportés par de nombreux auteurs. Sur ce sujet, on peut par exemple citer les références bibliographiques suivantes BURDOV (AN.) - Simultaneous immunization of farm animals against anaerobic and aerobic infections . combined vaccine against anthrax malignant oedema and blackleg. 1962, Trudy vsesoyuz. Inst. eksp. Vet, 26, : 139 - 144. - KAGAN (F.I.) NIKIFOROVA (N.M.) & KOLESOVA (A.I.) - Combined vaccine against blackleg, n alignant oedema and pasteurellosis. Veterinariva, Moscow NO ., 1961, 21-22 - MACADAM (I.) - The response cf zebu cattle to tissue culture rinderpest vaccine mixted in (I) blackquarter vaccine and (2) anthrax spore vaccine - Bull. epizoot. Dis. Afr. 1964, 2 : 401-405. - SIMPSON (R.M.) - A study of the immunity produced in cattle by simultaneous inoculation with a number of vaccines. Bulb. epizoot. Dis. Afr. 1964, 12 (4) : 405-28. STERNE fM.) BATTY (L.) THOMSON (a) ROBERTSON (.J.M.)- Immunization of sheep with multicomponent clostridial vaccines. Vet. Rec.,1962 > 74, 909-913. A la connaissance du Demandeur, il n'a pas encore été proposé de vaccin mixte efficace contre le charbon symptômatique et le charbon bactéridien, probablement en raison du fait qu'on ne peut mélanger à un vaccin vivant un vaccin tué contenant un antiseptique, ce dernier supprimant l'efficacité du premier. La présente invention a pour objet un vaccin mixte, à l'aide duquel il devient possible de vacciner efficacement des animaux, tels que les bovins et les ovins, contre le charbon sympt8- matique et le charbon bactéridien en une seule injection. Le nouveau produit selon 1 'invention consiste en un vaccin mixte contre le charbon symptomatique et le charbon bactéridien caractérisé en ce qu'il contient simultanément des spores vivantes de "Bacillus anthracis"et une culture de "Clostridium chauvei" inactivée par de la bétapropiolactone. L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention d'un tel vaccin mixte, ledit procédé étant caractérisé en ce que a)on cultive une souche vaccinale de "Bacillus anthracis"ron recueille les spores et on ajuste la dilution en vue de la dose vaccinale requise pour les animaux à vacciner, b) on cultive une souche virulente de "Clostridium chauvei" que l'on inactive ensuite par addition due A - propiolactone, ce qui conduit à une culture neutralisée, à pH acide, à laquelle on ajoute de la glycérine et de l'alun de potassium et c) on mélange intimement les spores de Bacillus anthracis" obtenues à l'étape (a) et le vaccin anti-Clostridium chauvei obtenu à l'étape (b) dans les proportions relatives correspondant au titre désiré de chaque vaccin. I1 est préféré d'utiliser une souche vaccinale capsulée de"Bacillus anthracis'l,mais ce choixn 'a aucune interférence sur le procédé en lui-même. Dans la pratique, les spores provenant de la culture de t'Bacillus anthracis" sont récoltées dans un mélange de glycérine et d'eau physiologique,la dilution allant de 1/120 à 1/160, ce qui correspond notamment à un titre de lû OLOO spores par ml. Au cours de l'étape (b) la souche virulente d "Clostridium chauvei"est cultivée dans les milieux connus. Lorsque la culture est achevée,on lui ajoute au moins 0,25 partie en volume de bétépropiolactone pour 100 volumes de la culture dans le milieu considéré. Dans la pratique, une quantité de bétapropiolactone de 0,5 p. 100 en volume convient. La bétapropiolactone inactive totalement la culture de "Clostridium chauvei" à des dilutions supérieures à 0,25 p.100.Après inactivation, la culture est additionnée de glycérine et d'alum de potassium, à titre d'agent de stabilisation et d'adjuvant de l'immunité dans des proportions relatives dont un exemple est donné ci-après Culture inactivée de "Clostridium chauvei" .... 9.000 ml Glycérine 300 ml Alun de potassium en solution à 10,?o 900 ml Dans l'étape (c), les spores de Bacillus anthracis sont ajoutées au vaccin anti-Clostridium chauvei de façon qu'elles y soient diluées dans les proportions indiquées par le titrage (1/120 à 1/160 en général). Le vaccin mixte ainsi obtenu a été expérimenté sur des moutons et sur des bovins. Tant en ce qui concerne son innocuité que son efficacité, le nouveau vaccin s'est avéré entièrement satisfaisant. La culture de "Clostridium chauvei", après hydrolyse spontanée de la bétapropiolactone, permet donc la survie des spores d'une souche vaccinale de Bacilles anthracis" tout en évitant les contaminations du vaccin grâce à son acidité naturelle. On notera que le vaccin selon l'invention peut être identifié sur le plan biologique, par isolement et caractérisation de la souche vaccinale de Bacillus anthracis, d'une part, et recherche sérologique des antigènes de Clostridium chauvei", d'autre part. Par des moyens biochimiques, il est également possible de caractériser le nouveau vaccin mixte, du fait de la présence des produits d'hydrolyse de la bétapropiolactone. L'hydrolyse de cette dernière, qui doit être considérée comme totale, prend place en milieu aqueux en donnant naissance à de l'acide propionique et à de l'acide hydracrylique qui sont décelables dans le vaccin final. On illustrera ci-après plus en détail la fabrication du vaccin à l'aide d'exemples de mise en oeuvre particuliers. Etape (a) - Culture de Bacillus anthracis Cette culture est réalisée sur gélose Martin, en botte de Roux, à partir d'une souche capsulée atténuée (souche A 43 de virulence égale à celle du premier vaccin Pasteur). Après 8 jours à 57 C, puis 8 jours à température ambiante (180C à 280C), les spores de chaque boîte sont récoltées dans un mélange de E5lycé- rine (25 ml) et d'eau physiologique (25ml) puis gardées un mois à température ambiante afin de détruire les formes mycéliennes subsistantes.Le vaccin est alors titré sur souris ou cobaye de façon à déterminer la dilution à effectuer pour qu'une dose vaccinale bovin (2 ml) tue, en moyenne, la souris de 20 grammes en 45 heures (#/10 et le cobaye de 350 grammes en 72 heures (+ 10). En pratique > cette dilution est de 1/120 à 1/160, ce qui correspond à un titre de 100.000 spores par ml. Etape (b) -Culture inactivée de "Clostridium chauvei" Une souche virulente de "Clostridium chauvei" (souche 735 dont 0,1 ml tue un cobaye de 350 grammes en 12 à 18 heures) est cultivée en flacon de dix litres sur un milieu V.F. u un milieu type "Thioglycollate Fluid Sodium DIFCO".Le milieu V.F. est le milieu classique préparé, par digestion pepsique de viande et de foie de boeuf, pour la culture des germes anaérobies et le milieu "DIFCO" au thioglycollate de sodium possède la composition suivante (citée par le fabricant), par litre Bacto-Yeast Extract ...................... 5 g Bacto-Casitone ........................... 15 g Chlorure de sodium ....................... 2,5 g l-Cystine DiSco . 0,25 g Acide thioglycollique O, i 0 > 3 ml Bacto-Agar ............................... 0,75 g Bacto-Methylene Blue ..................... 0,002 g. Lorsque la culture est achevée (arrêt de dégagement de gaz et dépôt des corps microbiens), il lui est ajouté 0,5 de bétapro piolactone et le mélange est agité toutes les 15 minutes durant une heure. Cette culture, dont le pH est alors de 4 à 4,5 n'est pas neutralisée. Elle contient en moyenne 5 millions de bactéries tuées par ml. Elle est additionnée, 24 heures plus tard, de glycérine et d'alun de potassium selon les proportions suivantes Culture inactivée de "Clostridium chauvei" .... 9.000 ml Glycérine e*es 300 ml Alun de potassium en solution à 10?,o 900 mi I1 se produit un abondant précipité.Le vaccin est prêt à être mélangé à la culture dd "Bacillus anthracis" dès la 24ème heure suivant l'addition de l'alun de potassium. Retape (c) - Mélange de deux vaccins. Les spores de "Bacillus anthracis" sont ajoutées au vaccin anti-Clostridium chauvei de façon qu'elles y soient diluées dans les proportions indiquées par le titrage (1/120 à 1/160 .en général). Le vaccin mixte est agité durant deux heures (sur agitateur magnétique) puis réparti sous agitation continue en flacon de 125 ml à bouchon perforable. Des essais d'innocuité et d'efficacité ont été effectués sur des moutons et sur des bovins. Par les essais d'innocuité, on a constaté que les bovins et les ovins résistent à une dose quadruple de la dose vaccinale normale (soit respectivement 8 ml et 2 ml) injectée par voie sous-cutanée. Par les essais d'efficacité, on a trouvé en outre que, après l'injection de deux doses vaccinales à 12 jours d'intervalle, les ovins et les bovins résistent tous à une inoculation d'épreuve de 20 à 40 doses sûrement mortelles pour les animaux témoins (praticable entre le 30ème et le 120ème jours après le rappel), Les essais en cause sont brièvement résumés ci-après 1 - Contrôle de l'innocuité. Cinquante cobayes ont reçu, par voie intra-musculaire, une dose vaccinale bovine (2 ml) du vaccin charbon symptomatique avant adjonction de la souche de charbon bactéridien (mortelle pour le cobaye) : aucun trouble dans les 30 jours suivants n'a été constaté Cinquante moutons ont reçu, par voie sous-cutanée, une dose double de la dose vaccinale bovine (2 ml) : aucun trouble dans les six mois suivants'a été enregistré. Dix bovins ont reçu, par voie sous-cutanée, une dose double de la dose vaccinale bovine (4 ml) : aucun trouble dans les neuf mois suivants n a été noté. Sept cents bovins ont reçu une dose vaccinale par voie sous-cutanée cu niveau de l'encolure et sept cents autres par voie sous-cutanée à la base de la queue . aucun trouble dans les 30 jours nla été constaté. En outre, par contrôle 'ssk.våtro", on trouve qu'aucun "Clostridiiun chauvei" n' est revivifiable en bouillon V.F. ou milieu au thioglycollate (tel que défini précédemment). 2 - Contrôle de l'efficacité du vaccin 45 jours après vaccination Contrôle sur cobayes Ces animaux, etant tués par la souche vaccinale de "Bacillus anthracis" ne peuvent servir de contrôle que pour la composante "Clostridium chauvei" du raccin mixte Cinquante cobayes de 250 à 400 grammes ayant reçu une dose vaccinale bovine par voie sous-cutanée, suivie 15 jours plus tard par un rappel avec la mAeme dose, ont été éprouvés 45 jours après le rappel par une dose de culture mortelle pour 25 cobayes témoins. Aucun des cobayes vaccinés n'est mort. Contr8le sur moutons Douze moutons ont reçu, par voie sous-cutanée, une dose vaccinale "mouton". Ils ont été éprouvés 45 jours après le rappel, ainsi que 6 témoins, par une dose de "Clostridium chauvei" sûrement mortelle pour les moutons 10 animaux vaccinés ont résisté, les six témoins sont morts. Les dix moutons survivants ont été éprouvés, 10 jours après l'expérience précédente, par une dose de "Bacillus anthracis" sûrement mortelle pour le mouton ainsi que 5 témoins : tous les témoins sont morts, 9 animaux vaccinés ont résisté. Contrôle sur bovins Dix bovins ont reçu, par voie sous-cutanée, une dose vaccinale "bovin". Ils ont été éprouvés 45 jours plus tard, par une dose de "Clostridium chauvei" mortelle pour 5 témoins. Tous les animaux vaccinés ont résisté, mais l'un a présenté une lymphangite grave. Les mêmes animaux ont été éprouvés 10 jours plus tard par une dose de "Bacillus anthracis" mortelle pour 5 témoins . tous les animaux ont résisté. En conclusion, on constate que le vaccin satisfait aux normes d'innocuité et d'efficacité, en particulier colles qui ont été décrites par Ruth M. Simpson dans l'article de la revue Bull. epiz. Dis. Afr. 1964, 12, p. 405-428 ou danS la pharmacopée vétérinaire britannique "British Veterinary REVENDICATIONS 1. Vaccin mixte contre le charbon symptmatique et le chu > - bon bactéridien caractérisé en ce qu'il contient simultanément des spores de "Bacillus anthracis" et une culture de "Clostridium chauvei" inactivée par de la bétapropiolactone. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion des spores de "Bacillus anthracis" dans le vaccin anti4;hlostridium chauvei est celle définie par le titrage préalable et est comprise, notamment, entre 1/120 et 1/160 en volume. 3. Procédé pour l'obtention de vaccin mixte selon l'une des revendications 1 ou 2, ledit procédé étant caractérisé en ce que a) on cultive une souche vaccinale de Bacillus anthracis" on recueille les spores et on ajuste la dilution en vue de la dose vaccinale requise pour les animaux à vacciner, b) on cultive une souche virulente de "Clostridium chauvei" que l'on inactive ensuite par addition de lF - propiolactone, ce qui conduit à une culture neutralisée, à pH acide, à laquelle on ajoute de la glycérine et de l'alun de potassium. c) on mélange intimement les spores de "Bacillus anthracis" obtenues à l'étape (a) et le vaccin anti-Clostridium chauvei obtenu à l'étape (b) dans les proportions relatives correspondant au titre désiré de chaque vaccin. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les spores provenant de la culture de "Bacillus anthracis1, sont récoltées dans un mélange de glycérine et d'eau physiologique, la dilution allant de 1/120 à 1/160, ce qui correspond notamment à un titre de 100.000 spores par ml. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, dans l'étape (b) on ajoute au moins 0,25 partie en volume de bétapropiolactone, pour 100 volumes de la culture, dans le milieu considéré. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la proportion de bétapropiolactone est de 0,5 en volume environ par rapport au milieu de culture. 7. Vaccin mixte selon l'une des revendications 1 ou 2, ou obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, ledit vaccin étant conditionné en flacons contenant un certain nombre de doses vaccinales, notamment en flacons de 125 ml contenant au moins 60 doses vaccinales par flacon.