Brevet FR2201869A1 — publié le 19740503

La présente invention concerne de nouveaux antibiotiques respectivement appelés composés DOA, DOP, EOA et EOP, ainsi qu'un procédé permettant de les obtenir. L'invention a trait, en outre, à la production par fermentation, la concentration et l'isolement de ces antibiotiques. Elle concerne, de plus, les antibiotiques sous la forme diluée, la forme de concentrés bruts et la forme pure. On vient de découvrir qu'un antibiotique du type nmacroliden appelé YL 704 est produit par culture de Streptomyces platensis var. sp. NRRL 3761 dans un milieu nutritif classique (voir brevet japonais N 28836/1971). Cet antibiotique 'tmacrolide" comprend au moins deux groupes de substances antibiotiques dont l'un est appelé YL 704A, cette matière se subdivisant en deux composants YL 704A1 et YL 7044. L'autre groupe est appelé YL 704B et peut être subdivisé en deux composants Yt 704B1 et YL 704B2. En outre, chacun de ces quatre composants de ltantibiotique nmacrolide" n 704 est une lactone à seize charnons attachée à un mycarosyl-mycaminose portant un groupe O-isovaléryle ou propionyle en position 4 du radical mycarose. Divers travaux de recherche ont permis de,dLécouvrir qu'une souche de Streptomyces platensis, telle que la souche de Streptomyces Sp. SRRI 3761, cultivée en présence de zinc métallique ou d'un sel de zinc dans un milieu nutritif, peut produire de nouveaux antibiotiques, à savoir les composés DOA, DOP, EOA et EOP.La structure chimique de ces composés est représentée par la formule suivante Composé DOA : R = acétyle, X = -CH=CH Composé DO? : R = propionyle, X = -CH=CH Composé EOA : R = acétyle, X = Composé EOP : R = propionyle, X = 'les antibiotiques(I) exercent un puissant effet inhibiteur sur la croissance de divers micro-organismes, notamment de bactéries Gram-positives. En outre, les antibiotiques (I) peuvent entre utilisés comme composés intermédiaires pour la synthèse d'antibiotiques du type "macrolide" dont certains au moins sont connus pour leurs propriétés thérapeutiques intéressantes.Certains des antibiotiques (I) peuvent aussi etre utilisés comme précurseurs dans la production par fermentation d'antibiotiques du type "macrolide". Conformément à la présente invention, les antibiotiques (I) peuvent être préparés par fermentation d'une souche de Streptomyces platensis telle que Streptomyces Sp. ERRAI 3761 en présence de zinc métallique ou d2un sel de zinc dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies, puis isolement des antibiotiques (I) du bouillon de fermentation. 'les caractéristiques de morphologie et de culture de Streptomyces platensis var. sp. ERRI 3761 sont données dans le brevet japonais NO 28 836/1971. Toutefois, sous ce rapport, il y a lieu de remarquer que la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation de Streptomyces sp. NRRI 3761 pour la production des antibiotiques (I). L'invention couvre également l'utilisation de mutants ou variants naturels ou artificiels produits à partir de ce micro-organisme. La production artificielle de mutants ou de variants peut être effectuée par une opération classique, par exemple par l'emploi de rayons X, de rayons ultraviolets ét de mutagènes chimiques tels que la moutarde à l'azote. La- fermentation, selon la présente invention, peut être conduite par culture avec agitation par secousses ou fermentation en immersion dans des conditions aérobies. On peut utiliser pour la fermentation les sources classiques qui ont été utilisées pour la culture d'un actinomycète. Par exemple, l'amidon, le glucose, la glycérine et la dextrine constituent une source convenable de carbone. Des exemples de sources convenables d'azote comprennent un extrait de viande, la peptone, un extrait de levure, la farine de soja et la farine de graineshe cotonnier. Be chlorure de sodium, le carbonate de calcium, etc., constituent des sources convenables d'éléments minéraux. On préfère ajouter au milieu une quantité de zinc métallique ou d'un sel de zinc drenviron 0,005 à 0,40 % en poids/volume, notamment 0,01 à 0,25 % en poids/volume. Be sel de zinc que l'on peut utiliser à cette fin est le sulfate ou le chlorure de zinc. Dans la conduite de la fermentation en immersion, on peut encore ajouter au milieu fermentescible un agent antimousse tel qurune huile siliconée, une huile végétale ou un agent tensio-actif. Il est préférable de conduire la fermentation à un pH à peu près neutre et entre 25 et 350C, notamment à environ 270C. La quantité d'antibiotique (I) qui s'accumule dans le milieu de fermentation peut etre aisément contr8lée,iendant la fermentation. Par exemple, une petite quantité du bouillon de fermentation est filtrée et le pH du filtrat est ajusté à 8,0. Le filtrat est extrait à l'acétate méthylique. La phase d'extraction à acétate éthylique est concentrée à sec. Ensuite, le résidu ainsi obtenu est développé sur une couche mince d'oxyde dtalumine, en utilisant comme solvant un mélange en proportions égales de benzène et d'acétone. On estime la concentration de 11 antibiotique (I) dans le bouillon de fermentation d'après le spectre d'absorption ultraviolette (longueur d'onde 232 mll, 280 mll) des taches décelées dans la chromatographie en couche mince. Be rendement maximal en antibiotique (I) peut entre obtenu au bout de 34 à 80 heures de férmentation. Tes antibiotiques (I) s'accumulent principalement dans la partie liquide du bouillon de fermentation. Par conséquent, après le développement des micro-organismes, on sépare les mycéliums et les autres composants solides du bouillon de fermentation par filtration et/ou par centrifugation, le cas échéant- en utilisant de la terre de diatomées comme auxiliaire de filtration. L'extraction et l'isolement des antibiotiques (I) du filtrat ou de la solution surnageante peuvent être effectués aisément. Par exemple, le pH du filtrat ou de la solution surnageante est ajusté à 7 ou à une valeur supérieure à 7,0, puis le filtrat ou la solution est extrait avec un solvant organique choisi par exemple entre des hydrocarbures halogénés (tels que chloroforme, chlorure de méthylène), des esters d'acides gras (par exemple acétate méthylique, acétate éthylique, acétate butylique), des cétones (par exemple acétone, méthylisobutylcétone) ou des alcanols (par exemple butanol, alcool amylique). L'extrait est réextrait avec de l'eau acidifiée (pH 5,0). Après avoir ajusté son pH à 8,0, on extrait encore la solution aqueuse acide avec le meme solvant organique que celui qui a été mentionné ci-dessus.Par évaporation de ltextrait,on obtient les antibiotiques(I)sounLa forme d'une poudre brute de nature légèrement basique. A titre de variante, les antibiotiques (I) peuvent être isolés par contact du filtrat ou de la solution surnageante du bouillon de fermentation avec une matière adsorbante telle que le carbone activé, la bentonite, ltoxyde d'aluminium ou le gel de silice, en extrayant la matière adsorbante avec une solution aqueuse acide de méthanol ou d'acétone puis en évaporant ltex- trait pour chasser le solvant. On peut effectuer la purification des antibiotiques bruts (I) ou leur séparation en leurs composants par chromatographie sur colonne ou par distribution à contre-courant. Dans la mise en oeuvre de la chromatographie sur colonne, il convient d'utiliser une matière adsorbante telle que le gel de silice, l'oxyde d'aluminium, l'acide silicique ourle silicate d'aluminium. Il est avantageux d'utiliser comme solvant pour le développement, des hydrocarbures halogénés (par exemple le chloroforme), des esters d'acides gras (par exemple l'acétate méthylique, l'acétate éthylique), des cétones (par exemple l'acétone, la méthyléthylcétone), des alcanols (par exemple le méthanol, ltéthano , un mélange de ces solvants ou un mélange de l'un de ces solvants et d'un solvant non polaire (par exemple le benzène).D'autre part, lorsqu'on effectue une distribution à contre-courant, il est avantageux d'utiliser deux solvants non miscibles tels qu'un solvant organique (par exemple benzène, acétate éthylique) et une solution aqueuse de pH égal à 6,0. les propriétés physico-chimiques et antimicrobiennes des antibiotiques (I) ainsi obtenus sont indiquées ci-après (1) Aspect 'les composés DOA, DOP, EOA et EOP se présentent tous sous la forme d'une poudre blanche. (2) Point de fusion : Composé DOA : 83-860C Composé DOP : 92-940C Composé EOA : 133-1360C Composé EOP : 135-138 C (3) Analyse élémentaire Composé DOA : C % H % N % Calculé pour C37H59N014 : 59,92 7,96 1,89 Trouvé : 59,80 7,79 1,93 Composé DOP : C % H % N % Calculé pour C38H61N014 : 60,40 8,08 1,85 Trouvé : 60,63 8,06 1,93 Composé EOA C % H % N % Calculé pour C37H59NO15 : 58,63 7,79 1,85 Trouvé : 58,39 7,81 1,78 Composé EOP : C % H % N % Calculé pour C38H61N 15 : 59,14 7,91 1,82 Trouvé : 59,21 7,97 1,79 (4) Poids moléculaire : Composé DOA : 741 Composé DOP : 755 Composé EOA : 757 Composé EOP : 771 (5) Spectre d'absorption infrarouge [# KBr , cm-1] : max. Composé DOA : 3455, 2920, 2720, 1734, 1672, 1626, 1595, 1450, 1370, 1290, 1217, 1154, 1112, 1072, 1043, 1008, 990, 895. Composé DOP 3440, 2810, 2720, 1728, 1670, 1626, 1595, 1450, 1380, 1287, 1235, 1154, 1113, 1073, 1043, 1007, 990, 895. Composé EOA : 3460, 2910, 2720, 1730, 1684, 1620, 1447, 1370, 1287, 1218, 1152, 1114, 1070, 1040, 1007, 900. Composé EOP : 3460, 2920, 2720, 1730, 1690, 1620, 1450, 1383, 1287, 1226, 1155, 1118, 1074, 1043, 1008, 900. (6) Spectre d'absorption ultraviolette Composé DOA # EtOH 281,5 m (log # = 4,18) max. Composé DOP # EtOH 282 m (log # = 4,27) max. Composé EOA : X EtOH 241 m (loge = 4,07) max. Composé EOP : # EtOH 238 m (log E = 4,02) max. (7) Solubilité Tous les composés DOA, DOP, EOA et EOP sont solubles dans le méthanol, méthanol, le butanol, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate, de butyle, le chloroforme, l'acétone, l'éther éthylique et le benzène, légèrement solubles dans l'eau et insolubles dans le cyclohexane, le n-hexane et l'éther de pétrole. (8) Réaction colorée Tous les composés DOA, DOP, EOA et EOP se révèlent négatifs dans les réactions à la ninhydrine et au chlorure ferrique. Ils sont décolorés par une solution de brome ou de permanganate de potassium. Il prennent une teinte violet rougeStre en présence d'acide sulfurique concentré et une couleur pourpre en présence d'acide chlorhydrique concentré. (9) Valeur de Rf dans la chromatographie en couche mince : 'les valeurs de Rf des composés DOA, DOP, EOA et EOP, par développement sur une couche mince dioxyde d'aluminium [solvant : benzène-acétone (1:1)] ou de gel de silice tsolvant:acétate éthylique-méthanol (19:153 sont indiquées sur le tableau I. TA: EAU I Couche mince Substance oxyde d2alu- Gel de minium silice Composé DOA 0,47 0,56 Composé DOP 1 0,64 0,60 Composé EOA 0,35 0,48 Composé EOP 0,38 0,51 (10) spectre antimicrobien L'activité in vitro des composés DOA, DOP, EOA et EOP déterminée par la méthode de dilution à la gélose est indiquée sur le tableau II. 'les résultats sont basés sur l'activité après incubation à 370C pendant 48 heures. On utilise dans les essais un milieu gélosé à l'infusion de coeur. TABLEAU II Organismes Concentration inhibitrice minimale ( g/ml) Composé Composé Composé Composé DOA DOP EOA EOP Staphylococcus aureus EDA 209P 1,56 3,13 3,13 1,56 Staphylococcus aureus Terashima 0,78 1,56 3,13 3,13 Staphylococcus aureus Smith 3,15 6,25 6,25 6,25 Staphylococcus epider midis 10131 3,13 6,25 6,25 3,13 Streptococcus faecalis 25 12,5 12,5 25 Bacillus subtilis PCI 219 3,13 3,13 3,13 3,13 Escherichia coli NIHJ > 100 > 100 > 100 > 100 Elebsiella pneumoniae 50 100 50 1 oe Pseudomonas aeruginosa A3 > 100 > 100 > 100 > 100 Proteus vulgaris 100 100 100 100 Comme l'indique le tableau II, les antibiotiques (I) de la présente invention exercent de puissants effets inhibiteurs sur la croissance de micro-organismes, notamment sur la croissance de bactéries Gram-positives, et ils sont intéressants à utiliser comme désinfectants ou comme agents chimiothérapeutiques. En outre, les antibiotiques (I) de la présente invention peuvent etre utilisés comme composés intermédiaires,dans la synthèse d'antibiotiques intéressants du type "macrolide". Trois groupes hydroxy en positions 2', 3't et 4" de chacun des antibiotiques (I) montrent une réactivité ou un comportement différent. En dtautres termes, le groupe hydroxy en position 2' (ctest-à-dire la position 2 du radical mycaminose) a une plus grande réactivité vis-àvis d'un agent acylant que le groupe hydroxy en position 4" (c'est-à-dire la position 4 du radical mycarose), tandis que le groupe hydroxy en position 3" (c'est-à-dire la posi tion 3 du radical mycarose)est peu sensible à un agent acylant. Pour cette raison, la carbomycine A (brevets des Etats-Unis d'Amérique N 2 771 392 et N 2 960 438) peut être préparée par acétylation du composé EOA avec une quantité équimolaire de chlorure d'acétyle ou d!anhydride acétique dans un solvant anhydre, estérification du 2'-acétyl-EOA résultant avec le chlorure d'isovaléryle ou l'anhydride d'acide isovalérique dans un solvant anhydre contenant un agent alcalin, puis hydrolyse du 2'-acétyl-4"-isovaléryl-EOA résultant avec une solution aqueuse d'acétone pour en éliminer le groupe 2 acétyle. la carbomycine B peut aussi être préparée par utilisation du composé DOA à la place du composé EOA dans les réactions indiquées ci-dessus. En outre, les composés DOP et EOP peuvent aussi être utilisés pour la conduite d'autres travaux de recherche, en vue d'obtenir de nouveaux antibiotiques semi-synthétiques du type nmacrolide", par utilisation de ces composés dans les réactions mentionnées ci-dessus, en remplaçant, éventuellement, le chlorure d'isovaléryle ou l'anhydride d'acide isovalérique par un autre agent acylant.De plus, les composés EOA, EOP et DOA de ltinvention peuvent être utilisés comme précurseurs dans la production par fermentation d'antibiotiques du type nmacrolide". Par exemple, la carbomycine A (ou carbomycine B) peut entre accumulée dans un bouillon de fermentation à une forte concentration lorsqutune souche de Streptomyces var. sp. NRRL 5633 est fermentée en présence du composé EOA (ou DOA) dans des conditions aérobies. A titre de variante, la maridomycine I, III et V (ou maridomycine II, IV et VI) décrite dans "Experimentia" 28, 501 (1972) peut entre préparée par fermentation de Streptomyces var. sp. NRRL 3761 en présence de composé EOP (ou EOA).La quantité de composé EOA, EOP ou DOA que l'on doit ajouter au milieu, est approximativement de 0,2 à 0,6 % en poids/volume. La fermentation peut être conduite de la même manière que dans le brevet japonais N 28 836/1971 précité. 'l'invention est illustrée par ltexemple suivant, donné à titre non limitatif. Exemple (Culture) On charge dans un appareil de fermentation de 30 litres, 15 litres dlun milieu nutritif aqueux contenant 1,5 46 en poids/volume d'amidon, 1,0 % en poids/volume de glucose, 0,8 % en poids/volume de farine de soja, 0,1 ffi en poids/volume de gluten, 0,5 % en poids/volume de chlorure de sodium, 0,2 % en poids/volume de carbonate de calcium, 0,05 % en poids/volume de phosphate de potassium secondaire et 0,06 % en poids/volume de sulfate de zinc heptahydraté. On ajuste le pH du milieu à 7,0 et on stérilise le milieu à 1200C pendant 20 mn, par autoclavage.On prépare une culture d'ensemencement en cultivant Streptomyces platensis var. sp. NRRL 3761 pendant 48 heures dans un milieu nutritif ayant la composition mentionnée ci-dessus, à la différence qutil ne renferme pas de sulfate de zinc heptahydraté. On inocule au milieu, dans des conditions aseptiques, 150 ml de la culture d'ensemencement. lDnsuite, on cultive le milieu à 270C dans des conditions d'aération et d'agitation. 'le pH du milieu augmente progressivement et atteint 7,6 au bout d'environ 120 heures de culture. Les antibiotiques (I) commencent/ s t accumuler après 24-48 heures de culture et leur rendement maximal peut Qtre obtenu au bout d'environ 72 heures. (Extraction et concentration) On filtre 100 litres du bouillon de fermentation ainsi obtenu en utilisant comme auxiliaire 2 % en poids/ volume de terre de diatomées. On obtient 98 litres de filtrat. On ajuste le pH du filtrat à 8,0 avec une solution aqueuse d'ammoniac. Ensuite, on extrait le filtrat deux fois avec 30 litres acétate éthylique. On concentre ltextrait à 5 litres sous pression réduite. On ajuste le pH de l'extrait concentré à 5,0 avec de l'acide chlorhydrique et on procède à une double extraction avec 2,0 litres dreau acidifiée. Après avoir ajusté le pH à 8,0, on procède de nouveau à une double extraction d'une solution acide aqueuse avec 2,0 litres de benzène. On concentre extrait benzénique à 100 ml, sous pression réduite. On ajoute 100 ml de n-hexane à l'extrait concentré. On recueille par filtration les précipités résultants puis on les sèche sous vide. On obtient 2,0 g d'une poudre blanche contenant les antibiotiques (I). (Séparation des antibiotiques DOA, DOP, EOA et EOP) On soumet 2,0 g de la poudre blanche ainsi obtenue à une chromatographie sur colonne, en utilisant une colonne de 100 g de gel de silice (fabriqué par la firme Nerck & Co. et vendu sous le nom de "Silica Gel H"), chargé dans un tube de 3 cm de diamètre et 40 cm de hauteur, en choisissant comme solvant un mélange de benzène et d'acétone (teneur en acétone de 30 à 70 % en volume/volume) et on recueille chaque fraction de 20 ml. On ajuste la teneur en acétone du solvant à 30 % dans les fractions N0 1-30,à 40 % dans les fractions NO 31-60, à 50 % dans les raclions NO 61-90, à 60 % dans les fractions NO 91-120 et à 70 0 dans les fractions NO 121-150. Par cette opération, le composé DOP est élué principalement dans les fractions NO 30-45, le composé DOP est élué principalement dans les fractions NO 45-60, le composé EOP est élué principalement dans les fractions NO 60-67 et le composé EOA est élué principalement dans les fractions NO 66-75. 'les éluats des fractions NO 35-42 sont rassemblés et évaporés pour chasser le solvant, en sorte quton obtient sous la forme d'uneioudre 160 mg du composé DOP. 80 mg de composé DOA, 20 mg de composé EOP et 10 mg de composé EOA sont aussi isolés respectivement de l'éluat des fractions N0 50-56, des fractions N 63-65 et des fractions N 6S70, de la même manière que ci-dessus. 'les composés DO?, DOA , EOP et EOA ainsi obtenus sont respectivement recristallisés dans un mélange de benzène et de n-hexane et donnent une poudre blanche. Beurs propriétés physico-chimiques ont été indiquées ci-dessus. REVENDICATIONS 1. Nouvel antibiotique, caractérisé par le fait qutil répond à la formule : dans laquelle R est un groupe acétyle ou propionyle et X est un groupe de formule -CH=CH- ou 2. Procédé de production drun antibiotique de formule: (dans laquelle R est un groupe acétyle ou propionyle et X est un groupe de formule -CH=CH- ou procédé caractérisé par le fait qutil consiste à cultiver une souche de Streptomyces platensis en présence de zinc métallique ou dtun sel de zinc dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies pour produire un bouillon de fermentation, et à isoler les antibiotiques du bouillon. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la culture est conduite en présence de 0,01 à 0,25 ffi en poids/volume de zinc métallique ou d'un sel de zinc tel que le sulfate ou le chlorure de zinc. 4. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la culture est conduite à un pH pratiquement neutre. 5. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la culture est conduite entre 25 et 350C. 6. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la culture est conduite dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone assimilable, d'azote assimilable et de sels minéraux. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé par le fait que la souche est Streptomyces platensis sp. SRRI 3761 ou un mutant ou un variant de cette souche. 8. Procédé suivant l'une des revendications 2 et 7, caractérisé par le fait que pour isoler l'antibiotique du bouillon de fermentation, on filtre ou on centrifuge ce bouillon, on ajuste le pH du filtrat ou de la solution surnageante à un pH égal ou supérieur à 7,0, on extrait le filtrat ou la solution surnageante avec un solvant choisi entre des hydrocarbures halogénés, des esters d'acides gras, des cétones et des alcanols, on réextrait Extrait avec de l'eau acidifiée, on ajuste le pH de 11 extrait aqueux à 8,0, on extrait encore l'extrait aqueux avec un solvant organique choisi entre des hydrocarbures halogénés, des esters d'acides gras, des cétones et des alcanols et on évapore l'extrait pour chasser le solvant organique. 9. Procédé suivant l'une des revendications 2 et 7, caractérisé par le fait qu'on isole l'antibiotique du bouillon de fermentation par filtration ou centrifugation de ce bouillon, on fait passer le filtrat ou la solution surnageante au contact d'une matière adsorbante choisie entre le carbone activé, la bentonite, 11 oxyde d'aluminium et le gel de silice, on extrait la matière adsorbante avec une solution aqueuse acide de méthanol ou d'acétone et on évapore extrait pour chasser le solvant. 10. Procédé suivant l'une des revendications 8 et 9, caractérisé par le fait qu'on soumet ensuite l'antibiotique à une chromatographie sur colonne de gel de silice, d'oxyde d'aluminium, d'acide silicique ou de carbone activé, et on isole l'antibiotique de la colonne sous la forme pure. 11. Procédé suivant l'une des revendications 8 et 9, caractérisé par le fait qu'on soumet ensuite l'antibiotique à une distribution à contre-courant en utilisant un solvant organique et une solution aqueuse (pH 6,0) comme solvants non miscibles, et on isole l'antibiotique sous la forme pure. 12. Médicament, applicable notamment comme antibiotique, caractérisé par le fait qu'il est constitué par ou qu'il contient un composé de formule indiquée dans la revendication 1.