Brevet FR2189011A1 — publié le 19740125

La présente invention concerne un nouvel antibiotique appelé XK-62-2 et son procédé de préparation. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé selon lequel on cultive un micro-organisme produisant l'antibiotique XK-62-2 appartenant au genre Micromonospora dans 5 un milieu approprié pour former le nouvel antibiotique XK-62-2, et on récupère l'antibiotique à partir de la liqueur de culture. Ce nouvel antibiotique XK-62-2 est un antibiotique basique soluble dans l'eau qui a une activité antibactérienne très prononcée contre diverses bactéries gram-positives et gram-négatives. Il possède 10 également une forte activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus et Escherichia coli, ces bactéries résistant à divers antibiotiques connus. En outre, l'antibiotique selon l'invention est très efficace contre les micro-organismes du genre Proteus et Pseudomonas contre lesquels on ne connaît que très peu d'antibiotiques efficaces; et, parmi les micro-organismes du 15 genre Pseudomonas, l'antibiotique selon l'invention est particulièrement efficace contre les souches résistant à l'antibiotique gentamicine C^a (Cooper et col. Journal of Chemical Society 1971, p. 3126-3129). La demanderesse a découvert selon l'invention que l'antibiotique XK-62-2 présente des effets thérapeutiques excellents pour 20 diverses infections (quelles soient humaines ou animales) provoquées par les bactéries phlogogènes décrites ci-dessus. Grâce à son excellente activité antibactérienne, le XK-62-2 peut être utilisé comme antibiotique en médecine. On peut également l'utiliser comme additif dans les aliments pour animaux comme produit favorisant leur croissance. 25 En raison de sa nature, que l'on décrira plus précisément ci-après, on pense que ce nouvel antibiotique appartient au type complexe de gentamicine. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.091.572 décrit la production d'un antibiotique basique, la gentamicine. Ainsi, on sait que 30 l'on peut produire à l'aide de micro-organismes appartenant aux espèces Micromonospora echinospora et Micromonospora.purpurea la gentamicine ainsi que deux fractions supplémentaires appelées fraction A et fraction B. D'autres recherches ont déterminé que le complexe de gentamicine contient encore six constituants. Voir à ce sujet "Séparation, Structural and Physical Studies 35 on the Gentamicin C Complex", Kershner, Rutgers, State University of New Jersey, 1971. Ces six constituants sont désignés comme suit : C^, C2-I, C2-1I, C2-III et C . 2 2189011 L'antibiotique selon l'invention se rapproche le plus de la fraction mais> raison de différences importantes dans le spectre de résonance magnétique nucléaire, comme on le décrira également plus précisément ci-après, l'antibiotique selon l'invention doit être 5 considéré comme différent de la fraction Cconnue dans la technique antérieure. Selon l'invention, on obtient l'antibiotique XK-62-2 par fermentation de micro-organismes appartenant au genre Micromonospora dans un milieu nutritif approprié et isolement ultérieur de l'antibiotique 10 spécifique. Pour cela, la demanderesse a isolé une nouvelle espèce du genre Micromonospora qui produit facilement l'antibiotique. La culture type a été appelée Micromonospora sagamiensis MK-65 et les deux variétés que l'on a également identifiées ont été appelées Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK-62 et Micromonospora sagamiensis var. flava Mm-628. Ces 15 trois souches ont été déposées à 1'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland et ont reçu les numéros 21826, 21S03 et 21827, respectivement. Ces souches ont les caractéristiques suivantes : I - Morphologie : Un mycélium de substrat non cloisonné, ramifié et bien développé, ayant un diamètre de 0,5^u environ, est formé mais il n'y a pas vraiment de mycélium aérien formé. Les spores sont bien formés et des spores uniques sont placés aux extrémités de sporophores simples (de longueur 1,0-2,0/u) ramifiés à partir du mycélium de substrat. De nombreux spores sont formés autour des extrémités du mycélium de substrat. Les spores à maturité ont un diamètre de l,0yU environ et ont une forme ovale ou sphérique avec une surface rugueuse. II - Caractéristiques de culture sur divers milieux : Souche MK-65 : La croissance est brune sur un milieu de gélose pour forte croissance avec formation de nombreux spores, mais est orange sur un milieu pour faible croissance avec formation assez médiocre des spores . Parfois, la nuance de couleur varie en fonction du milieu. Souche Mm 628 : La croissance est très médiocre sur les milieux synthétiques ordinaires et cette croissance n'est bonne que sur des milieux naturels formant une couche de spores. La couleur est nettement différente de celle de la souche MK-65 sur tous les milieux, cette couleur 20 25 30 35 3 2189011 et à la couleur du blé clair variant du brun moutarde au brun chocolat/. A maturité, la croissance est brunâtre à noirâtre en raison de la couleur des spores et parfois grisâtre. Souche MK-62 : En général, il se forme de nombreux spores sur les milieux de gélose pour forte croissance, sur lesquels la 5 croissance est la plupart du temps brun foncé. Cependant, la croissance est orange sur les milieux pour faible croissance et les spores ne se forment pas facilement. En outre, il se forme des spores noirs sur les milieux de gélose sur lesquels la croissance du mycélium de substrat est médiocre mais les spores se forment facilement. En milieu liquide, la 10 croissance est orange en raison de la couleur du milieu de substrat. On donne dans le tableau I ci-après les caractéristiques de culture sur divers milieux après culture à 27°C pendant deux semaines. Les indications de couleurs sont données selon les classifications du Color Harmony Manual tContainer Corporation of America). 15 III - Propriétés physiologiques : On donne dans le tableau II ci-après les propriétés physiologiques des souches MK-62, MK-65 et Mm 628. La température optimale est déterminée au bout de 5 jours de culture et l'action sur le lait et la 20 décomposition de la cellulose sont observées au bout d'un mois de culture. Les autres observatiçns sont faites sur la base d'une culture à 27°C pendant deux semaines. Comme les souches MK-62, MK-65 et Mm 628 ne forment pas vraiment un mycélium aérien et forment un spore unique sur le mycélium de 25 substrat, ces souches peuvent être considérées comme appartenant au genre Micromonospora. Les micro-organismes connus du genre Micromonospora peuvent être classés en quatre groupes d'après la couleur du mycélium, c'est-à-dire les groupes orange, rouge-violet, vert-bleu et brun. En raison des différences de couleurs et d'autres différences indiquées dans les tableaux I 30 et II ci-après, les souches MK-62, MK-65 et Mm 628 appartiennent à de nouvelles espèces du genre Micromonospora. La souche MK-65 est choisie comme culture type et appelée Micromonospora sagamiensis car elle a été isolée à partir du sol de la forêt des environs de Sagamihara-shi, Kanagawa-ken, Japon. La souche 35 MK-62 a des propriétés très semblables à celles de la souche MK-65 sauf en ce qui concerne la réduction de l'acide nitrique, l'utilisation du D-arabinose pour la. liquéfaction et la coagulation du lait et la couleur du mycélium sur divers Bilieux . Par suite, la souche 4 2189011 MK-62 est considérée comme une variante de la culture type et appelée Micromonospora sagamiensis var. nonreducans car elle ne réduit pas l'acide nitrique. La souche Mm 628 d'autre part diffère des deux premières car la croissance est généralement plus médiocre et a une couleur brun moutarde à 5 brun chocolat et à blé clair sur un milieu de gélose et elle utilise le D-arabinose mais non le lévulose. Par conséquent, cette souche est également considérée comme une variante de la culture type et appelée Micromonospora sagamiensis var. flava en raison de sa couleur jaune. Outre la production de l'antibiotique XK-62-2, les nouvelles espèces 10 décrites ci-dessus produisent d'autres antibiotiques, tels que ceux appartenant au type complexe C de gentamicine. L'invention concerne donc également un nouveau procédé de préparation de ces antibiotiques. La demanderesse a également découvert que certaines autres souches appartenant au type Micromono spora produisent l'antibiotique XK-62-2, c'est-à-15 dire Micromonospora echinospora ATCC 15837, Micromono spora echinospora var. ferruginea NRRL 2995, Micromono spora echinospora var. pallida NRRL 2996, ATCC 15836, ATCC 15838 et Micromonospora purpurea NRRL 2953, ATCC 15835. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.091.572 (demande de brevet japonais publiée n° 21394/69) décrit ces souches qui sont connues pour produire la 20 gentamicine. Cependant, on n'a pas jusqu'à présent remarqué que ces souches permettaient de préparer l'antibiotique selon l'invention. Les souches ci-dessus sont déposées à 1'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Comme dans le cas d'autres souches d'actinomycetes, les micro-organismes utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention peuvent subir une 25 mutation par un procédé artificiel par exemple par irradiation par un rayonnement ultraviolet, irradiation au Co^, irradiation aux rayons X et action de diverses substances chimiques produisant des mutations. Par conséquent, on peut utiliser toute souche, même si elle a ainsi subi une mutation, selon l'invention dans la mesure où elle est capable de produire l'antibiotique XK-62-2. 30 En effet, un mutant MK-62-NG-164 (ATCC 21949) a été obtenu à partir du MK-62 et ce mutant produit de façon caractéristique le XK-62-2. En général, on peut utiliser dans le procédé selon l'invention les méthodes usuelles de culture des micro-organismes du type actinomycetes. On peut utiliser dans le milieu de culture diverses sources 35 nutritives. Comme sources de carbone, on peut utiliser, seuls ou en combinaison, le glucose, l'amidon, le glycérol, l'inositol et le mannitol, le saccharose, la dextrine, les mélasses, etc. 5 2189011 On peut en outre utiliser des hydrocarbures, alcools, acides organiques, etc. en fonction des caractéristiques d'utilisation que possède le microorganisme. On peut utiliser, seules ou en combinaison, des sources inorganiques et organiques d'azote, telles que chlorure d'ammonium, sulfate 5 d'ammonium, urée, nitrate d'ammonium, nitrate de sodium, etc. et des sources d'azote naturelles, telles que peptone, extrait de viande, extrait de levure, extrait sec, liqueur de macération de maïs, poudre de soja, acide casamino, protéines végétales solubles, etc. En outre, on peut ajouter au milieu, si nécessaire,des sels inorganiques tels que chlorure 10 de sodium, chlorure de potassium, carbonate de calcium et phosphate de calcium. On peut également ajouter avantageusement au milieu de culture des substances organiques ou inorganiques susceptibles de favoriser la croissance du micro-organisme. Il est préférable d'utiliser pour le procédé selon 15 l'invention une méthode de culture en milieu liquide, en particulier une méthode de culture submergée avec agitation. La température de culture est comprise entre 25 et 55°C et il est souhaitable que cette culture soit réalisée à un pH à peu près neutre. L'antibiotique selon l'invention se forme et s'accumule 20 dans la liqueur de culture habituellement au bout de 1 à 12 jours de culture. Lorsque le rendement en XK-62-2 dans la liqueur de culture atteint un maximum, on arrête la culture et on isole le produit désiré que l'on purifie à partir de cette liqueur de culture après avoir éliminé les cellules microbiennes, par .exemple par filtration. 25 L'isolement et la purification de l'antibiotique à partir du filtrat se font selon les méthodes usuelles utilisées pour les produits métaboliques microbiens provenant d'une liqueur de culture. Comme le XK-62-2 est basique et très soluble dans l'eau mais faiblement soluble dans les solvants organiques ordinaires 30 on peut purifier ce produit par les méthodes utilisées habituellement pour la purification de ce qu'on appelle les antibiotiques basiques solubles dans l'eau. Plus particulièrement, on peut purifier le XK-62-2 par une combinaison appropriée des techniques suivantes : adsorption et désorption sur une résine échangeuse de cations et sur du charbon actif, 35 chromatographie sur colonne à l'aide de cellulose du type Sephadex LH-20 et gel de silice,et analogues. Comme la base libre est soluble dans l'acétone et le sulfate faiblement soluble dans le méthanol, on peut dissoudre le produit désiré et le précipiter en combinant ces propriétés. 6 2189011 Par exemple, on ajuste d'abord le filtrat de culture « à un pH de 7,5 et on le soumet à une adsorpcion sur une résine échangeuse de cations du type IRC-50 (forme NH^+). Après lavage à l'eau, on élue avec de l'ammoniaque IN. On concentre la fraction active sous pression réduite. On traite alors le concentré avec une résine échangeuse d'anions du type Dowex 1x2 (forme OH ) et on concentre encore sous pression réduite. On ajuste le pH du concentré à 10,5 environ et on ajoute cinq volumes d'acétone. On enlève par filtration le précipité résultant et on concentre le filtrat, puis on ajuste le pH à 4,5 à l'aide d'acide sulfurique. On ajoute alors 5 à 10 volumes de méthanol. On récupère le précipité par filtration et on le sèche sous vide. On obtient des poudres brutes blanches. On dissout ces poudres brutes ainsi obtenues dans la couche inférieure d'un mélange solvant de chloroforme, isopropanol et ammoniaque (2:1:1) et on soumet la solution résultante à une chromatographie sur colonne de gel de silice. On élue avec le même solvant à un débit de 30 ml par heure environ. On recueille les fractions de XK-62-2 et on les concentre sous pression réduite. Après lyophilisation du concentré, on obtient la base libre blanche. Ou encore, on ajuste le concentré de la 4.5 à fraction active à un pH ae/5,5 à l'aide d'acide sulfurique puis on filtre. Après lyophilisation du filtrat, on obtient le sulfate blanc de XK-62-2. La base libre de l'antibiotique XK-62-2 est une poudre blanche. L'analyse élémentaire donne les résultats suivants : C = 51,90%, H = 8,81%, N = 15,18% et 0 = 24,11%. Le point de fusion du sulfate est 260°C (décomposition). Le pouvoir rotatoire de la base libre est — —?n / = +116° (ci' h20)- La figure 1 annexée donne le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse de XK-62-2. Ce spectre ne présente pas de maxima d'absorption caractéristiques entre 220 et 360 m^u, mais seulement deux absorptions terminales. La figure 2 annexée donne le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'antibiotique (tablette de KBr). Comme le montre ce spectre, le XK-62-2 présente les pics suivants (longueurs d'onde en cm ^) : 610, 1040, 1110, 1285, 1340, 1390, 1460, 1510, 1620, 2050, 2920, 3030, 3350. La figure 3 annexée représente enfin le spectre de résonance magnétique nucléaire du sulfate de XK-62-2. Le spectre de RMN est mesuré sur un appareil Varian Associates HA-100 après que les atomes d'hydrogène du XK-62-2 aient été remplacés par des atomes de deutérium à 7 2189011 l'aide d'une lyophilisation répétée dans de l'eau lourde. Les absorptions à 5,60 ppm et 6,32 ppm sont dues au proton anomère du composant sucre. Les absorptions des groupes N-méthyle et C tertiaire-méthyle sont respectivement à 3,38 et 1,80 ppm. De façon caractéristique, on observe une autre 5 absorption du groupe N-méthyle à 3,21 ppm avec une différence de 0,17 ppm par rapport à 3,38 ppm. Comme le montrent les mesures effectuées à l'aide d'un appareil de spectrographie de masse possédant un pouvoir de résolution élevé, le XK-62-2 a un ion moléculaire (M+l)+ de 464, ce qui correspond donc à un 10 poids moléculaire de 463 et à une formule brute de C-JH.-N.-O-,. Par consé- 20 41 5 7 quent, les données d'analyse élémentaire calculées sont les suivantes : C = 51,847., H = 8,86%, N = 15,12% et 0 = 24,19%. Sur la base des données çi-dessus, on pense que l'antibiotique XK-62-2 a la formule structurale suivante : 20 25 0H, CH. A 2 H \ cil / C-H nhch3 0H NHCH. H-^-H VH v 30 H NH„ La base libre de XK-62-2 est très soluble dans l'eau, soluble dans le méthano]. légèrement soluble dans l'éthanol ou l'acétone, mais insoluble dans des solvants organiques, tels que chloroforme, benzène, 35 acétate d'éthyle, acétate de butyle, éther, butanol, éther de pétrole, n-hexane, etc. Le sulfate de XK-62-2 est très soluble dans l'eau, mais insoluble dans des solvants organiques, tels que méthanol, acétone, etc. 2189011 On donne dans le tableau III ci-après les valeurs de Rf du XK-62-2 obtenues par chromatographie sur papier et ehromatographie sur couche mince en utilisant divers développateurs. On donne dans le tableau IV ci-après les valeurs de Rf du XK-62-2 5 en comparaison avec celles d'antibiotiques connus obtenues par chromatographie sur papier en utilisant comme développateur la couche inférieure d'un mélange de chloroforme, méthanol et ammoniaque à 17% (2:1:1). Sur la base des études mentionnées ci-dessus, on considère que l'antibiotique selon l'invention est du type complexe de gentamicine. Comme 10 on l'a mentionné plus haut, la production de la gentamicine est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.091.572. Dans ce brevet, on décrit les propriétés et la structure de la gentamicine ainsi que celles de deux fractions associées appelées fraction A et fraction B. On a isolé ultérieurement d'autres fractions. Par exemple, on mentionne dans la thèse de Allan S. 15 Kershner, "Séparation, Structural and Physical Studies on The Gentamicin C Complexe", Rutgers University, The State University of New JerBey, 1971, une série d'antibiotiques du type gentamicine appelés C^, C^a5 ^2~^' ^2"*'''"' C.-III et C.. . 2 la Bien que l'antibiotique selon l'invention se rapproche beaucoup, des 20 antibiotiques connus faisant partie des complexes de la gentamicine, il s'agit cependant d'un antibiotique inconnu jusqu'à présent conane le montrent les caractéristiques données plus haut, en particulier le spectre d'absorption dans l'ultraviolet, le spectre d'absorption dans l'infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire. Plus particulièrement, comme on l'a men-25 tionné plus haut, l'antibiotique selon l'invention ressemble spécialement à la fraction C2a de gentamicine mais, cette fraction ne présente pas le même spectre de résonance magnétique nucléaire que l'antibiotique selon l1invention. Ainsi, on peut considérer que le XK-62-2 est une substance nouvelle possédant d'excellentes propriétés antibiotiques comme on le montre dans les tableaux 30 ci-après. On donne dans le. tableau V ci-après le spectre antibactérien du XK-62-2 contre divers micro-organismes. L'activité in vitro du XK-62-2 contre diverses bactéries gram-posi-tives et gram-négatives est largement supérieure à celle de la streptomycine 35 et de la kanamycine et cette activité est comparable a. celle de la gentamicine. On donne dans le tableau VI ci-après les activités comparatives in vitro de ces antibiotiques contre divers micro-organismes du genre Proteus. L'activité antibactérienne du XK-62-2 contre diverses souches de Pseudomonas aeruginosa isolées cliniquement et également comparée à celle de la 40 streptomycine, de la kanamycine, du complexe de gentamicine et de la gentamicine C]_a comme on le montre dans le tableau VII ci-après. 2189011 En outre, on a également déterminé l'activité in vivo du XK-62-2 contre des infections bactériennes pathogènes chez des souris. On infecte la souris avec un inoculum de Pseudomonas aeruginosa BMH n° 1 ou de Pseudomonas aeruginosa KY 8510 par injection intrapéritonéale. On 5 traite alors avec diverses doses de l'antibiotique d'essai par injection sous-cutanée. On donne dans le tableau VIII ci-après l'effet du XK-62-2 pour la protection contre les infections bactériennes, 10 souris étant utilisées pour chaque essai. Comme le montre ce qui précède, le XK-62-2 a une 10 activité antibactérienne très forte contre un grand nombre de bactéries gram-positives et gram-négatives. Le XK-62-2 a également une forte activité antibactérienne contre Staphylocoecus aureus et Escherichia coli qui résistent à divers antibiotiques connus et est particulièrement efficace contre les micro-organismes du genre Proteus et Pseudomonas contre lesquels on ne 15 connaît que peu d'antibiotiques efficaces. Les tableaux ci-après permettent de constater que le XK-62-2 a une excellente activité antibactérienne et un effet thérapeutique remarquable contre certaines souches (isolées cliniquement) de Pseudomonas aeruginosa en comparaison avec le complexe de gentamicine ou la gentamicine 20 C^a qui est un des constituants du complexe de gentamicine. Plus particulièrement, le XK-62-2 a une activité antibactérienne contre Pseudomonas aeruginosa KY 8510 et KY 8516 beaucoup plus élevée que le complexe de gentamicine ou la gentamicine C^a> La demanderesse a constaté, après des études enzymologiques, que les souches KY 8510 et KY 8516 ont un système 25 enzymatique spécifique qui inactive la gentamicine C^a ou la kanamycine par acétylation du groupe Nï^ en position 6' de la fraction purpurosamine de la gentamicine C^a ou du groupe Nf^ en position 6' de la kanamycine. C'est la raison essentielle pour laquelle les souches KY 8510 et KY 8516 résistent particulièrement à la gentamicine C, . Cependant, ces deux souches X â. 30 sont sensibles au XK-62-2. On pense que cela est dû au fait que le XK-62-2 ne subit pas d'acétylation par cette enzyme inactivante car le groupe en position 6' du XK-62-2 est méthylé. Ainsi, en comparaison avec la gentamicine C^a ou le complexe de gentamicine contenant la gentamicine , le XK-62-2 est particulièrement efficace par son activité antibactérienne 35 contre Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae, quipossèdent ce mécanisae de résistance par acétylation. 10 2189011 D'autres antibiotiques, c'est-à-dire le complexe de gentamicine /M.J. Weinstein et col. : Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1963) I et D.J. Cooper et col. : J. Infect. Dis. 119, 342 (1969)_/, l'antibiotique n° 460 (demande de brevet japonais publiée n° 16153/71) 5 et la sisomicine /^M.J. Weinstein et col. : J. Antibiotics 23, 551, 555, 559 (19700/ sont des antibiotiques solubles dans l'eau et basiques possédant un large spectre antimicrobien et peuvent être obtenus à l'aide de microorganismes du genre Micromonospora.Cependant, comme le montre évidemment ce qui précède, le XK-62-2 se distingue nettement de chacun des antibio-10 tiques gentamicine A, C^a' C^ et C^, ces antibiotiques faisant partie du complexe de gentamicine, de l'antibiotique n° 460 et de la sisomicine par les valeurs de Rf obtenues par chromatographie sur papier. Les antibiotiques d'aminoglucosides basiques et solubles dans l'eau tels que, par exemple, la néomycine A, la néomycine B, la kanamycine A, la kanamycine B, la paro-15 momycine, le complexe de nébramycine et la tobramycine sont considérés comme ayant des propriétés analogues à celles du XK-62-2. Cependant, il est également évident que le XK-62-2 diffère totalement de ces antibiotiques par ses valeurs de Rf. Les exemples suivants illutrent l'invention sans 20 toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 A. Culture du MK-65 : Dans cet exemple, on utilise comme souche d'inoculation 25 Mi c romono spora sagamiensis MK-65 ATCC 21826 (FERM-P n° 1530). On inocule une anse de cette souche dans 30 ml d'un premier milieu d'ensemencement contenu dans un Erlenmeyer de 250 ml. Ce premier milieu d'ensemencement possède la composition suivante : 30 Dextrine 1% Glucose 1% Peptone 0,5% Extrait de levure 0,5% Carbonate de calcium 0,1% 35 (pH =7,2 avant stérilisation) 11 2189011 On réalise la culture avec agitation à 30°C pendant 5 jours. On inocule alors 30 ml de cette culture d'ensemencement dans 300 ml d'un second milieu d'ensemencement de la même composition que le premier milieu, dans un Erlenmeyer de 2 1 muni de chicanes. La seconde culture 5 d'ensemencement est réalisée avec agitation à 30°C pendant 2 jours. Puis on inocule 1,5 1 de la seconde culture d'ensemencement (correspondant au contenu de 5 Erlenmeyers) dans 15 1 d'un troisième milieu d'ensemencement de la même composition que les premiers placé dans un récipient de fermentation en verre de 30 1. On réalise la culture dans ce récipient de fermen-10 tation avec aération (15 1/mn) et agitation (350 tr/mn) à 30°C pendant 2 jours. Puis on inocule 15 1 de la troisième culture d'ensemencement dans 60 1 d'un quatrième milieu d'ensemencement de la même composition que les précédents dans un récipient de fermentation de 300 1. On réalise la culture dans ce récipient avec aération (60 1/mn) et agitation (150 tr/mn) à 30°C 15 pendant 2 jours. Enfin, on inocule 60 1 de la quatrième culture d'ensemencement dans. 600 1 d'un milieu de fermentation placé dans un récipient de 1000 1 et ayant la composition suivante : Dextrine 5% 20 Farine de soja 4% CaC03 0,77. (pH =7,2 avant stérilisation) On réalise la culture dans le récipient de fermentation 25 avec aération (600 1/mn) et agitation (150 tr/mn) à 35°C pendant 5 jours. B. Isolement de l'antibiotique brut : Après avoir achevé la fermentation, on ajuste la liqueur de culture à un pH de 2,0 à l'aide d'acide sulfurique 12N et on 30 agite pendant 30 mn. Puis on ajoute environ 10 kg d'un adjuvant de filtration, la Radiolite n° 600 (produit de la Société Showa Kagaku Kogyo Co., Ltd.> Japon) et on élimine les cellules microbiennes par filtration. On ajuste le filtrat à un pH de 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium 6N et on le fait passer à travers une colonne remplie de 50 1 environ d'une résine échangeuse 35 de cations du type Amberlite IRC-50 (forme ammoniac). La substance active est.adsorbée sur la résine et l'éluat est rejeté.' Après lavage de la résine à l'eau, on élue la substance active avec de l'ammoniaque IN. On détermine t 12 2189011 l'activité de l'éluat ainsi obtenu contre Bacillus subtilis n° 10707 par la méthode au disque de papier à l'aide d'une plaque de gélose. On réunit les fractions actives et on les concentre sous vide jusqu'à 5 1 environ. On ajuste alors le pH du concentré à 8,0 à 5 l'aide d'acide sulfurique 6N et on fait passer ce concentré à travers une colonne remplie de 1 litre d'une résine échangeuse d'anions du type Dowex 1x2 (forme OH ). On lave la colonne avec 5 1 environ d'eau et on concentre la substance active au 1/15 en volume. On ajuste le pH du concentré à 10,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium 6N et on ajoute 5 volumes d'acétone. On 10 sépare par filtration le précipité résultant et on concentre le filtrat à 500 ml. On ajuste le concentré à un pH de 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 6N et on ajoute 2,5 1 de méthanol. Après refroidissement, on obtient un précipité blanc. On sépare le précipité par filtration et on le lave au méthanol. Après séchage sous vide, on obtient environ 300 g d'une poudre 15 blanche. Cette poudre blanche est un mélange du sulfate de gentamicine C^a et du sulfate de XK-62-2 et présente une activité de 620 unités/mg (l'activité de 1 mg du produit pur correspond à 1000 unités). C. Isolement et purification du XK-62-2 : 20 On dispose 100 g de la poudre blanche obtenue dans l'étape B ci-dessus pour former une couche mince uniforme à la partie supérieure d'une colonne de 5 cm de diamètre et de 150 cm de longueur remplie avec environ 3 kg de gel de silice mis auparavant en suspension dans un solvant de chloroforme, isopropanol et ammoniaque (2:1:1 en volume). 25 Puis on élue avec le môme solvant à un débit de 250 ml/h environ. On sépare l'éluat en fractions de 100 ml. On soumet la fraction active à une chromatographie sur papier pour examiner les composants élués. Le XK-62-2 est élué dans les fractions n° 53-75 et la gentamicine C^& est éluée dans les fractions n° 85-120. On réunit les fractions 53-75 et on les concentre 30 sous pression réduite pour suffisamment éliminer le solvant. On dissout alors le concentré dans une petite quantité d'eau. Après lyophilisation de la solution, on obtient environ 38 g de XK-62-2 purifié (base libre). Ce produit a une activité de 950 unités/mg. De même, on réunit les fractions n° 85-120 et on les concentre sous pression réduite pour suffisamment 35 éliminer le solvant. On dissout alors le concentré dans une petite quantité d'eau. Après lyophilisation de la solution, on obtient environ 50 g de gentamicine C^a purifiée (base libre). L'activité de ce produit est de 980 unités/mg environ. 13 2189011 EXEMPLE 2 Dans cet exemple, on utilise comme souche d'ensemencement Micromonospora sagamiensis var. flava Mm 628 ATCC 21827 (FERM-P n° 1531). On réalise la culture d'ensemencement de la même façon que dans l'exemple 1 5 en utilisant le même milieu. On inocule 60 1 de la quatrième culture d'ensemencement dans 600 1 d'un milieu de fermentation placé dans un récipient de 1000 1. La composition du milieu de fermentation est comme suit : 10 Amidon soluble 4% Liqueur de macération de maïs 1% Farine de soja 2% K„HP0. 0,05% 2 4 MgS04,7H20 0,05% 15 KC1 0,03% CoCl2, 2H^0 0^005/3 CaC03 0,1% On réalise la fermentation avec aération de 600 1/mn 20 et agitation à 150 tr/mn à 30°C pendant 96 h. Après achèvement de la fermentation, on sépare le produit brut de la liqueur de culture comme il est décrit dans l'exemple 1 pour obtenir 400 g d'une poudre blanche. Comme le montre la chromatographie sur papier, la poudre contient de la gentamicine C^, C2 et C^a en plus du XK-62-2. 25 On place alors les 400 g de poudre blanche à la partie supérieure d'une colonne de verre cylindrique remplie de façon uniforme avec environ 8 kg de gel de silice que l'on a mis au préalable en suspension dans un solvant de chloroforme, isopropanol et ammoniaque à 17% (2:1:1 en volume). Après avoir placé la poudre à la partie supérieure 30 de la colonne, on élue avec le même solvant à une vitesse de 500 ml/h environ. On sépare l'éluat en fractions de 500 ml. On soumet chacune de ces fractions à une chromatographie sur papier. On constate que les composants sont élués dans l'ordre suivant : gentamicine C^, XK-62-2, gentamicine C_ et-gentamicine C, . Les fractions contenant le même composant z. la 35 sont réunies et concentrées. On dissout le concentré dans l'eau et on le lyophilise,et on isole sous forme de bases libres les composants suivants : 14 2189011 Composant Activité Rendement (g) (unité/mg) Gentamicine C^ 880 150 XK-62-2 932 60 5 Gentamicine C^ 925 113 Gentamicine Cn 940 52 la EXEMPLE 3 Dans cet exemple, on utilise comme souche d'ensemen-10 cernent Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK-62, ATCC 21803 (FERM-P n° 1477). On inocule le contenu d'une anse de la souche d'ensemencement dans 30 ml d'un premier milieu d'ensemencement placé dans un Erlenmeyer de 250 ml. Ce milieu d'ensemencement contient : 15 Dextrine 1% Glucose 1% Peptone 0,5% Extrait de levure 0,5% Carbonate de calcium 0,1% 20 (pH =7,2 avant stérilisation) On cultive avec agitation à 30°C pendant 5 jours. Puis on inocule 30 ml de la culture d'ensemencement dans 300 ml d'un second milieu d'ensemencement ayant la même composition que le premier et placé 25 dans un Erlenmeyer de 2 1 muni de chicanes. La seconde culture est réalisée avec agitation à 30°C pendant 2 jours. Puis on inocule 1,5 1 de la seconde culture (correspondant au contenu de 5 Erlenmeyers) dans 15 1 d'un troisième milieu d'ensemencement, de la même composition que les deux premiers, placé dans un récipient de fermentation en verre de 30 1. 30 On réalise la culture d'ensemencement dans ce récipient avec aération (15 1/inn) et agitation (350 tr/mn) à 30°C pendant 2 jours. Puis on inocule 15 1 de la troisième culture d'ensemencement dans 60 1 d'un quatrième milieu d'ensemencement de même composition que les premiers, placé dans un récipient de fermentation de 300 1. On réalise la culture 'SI- dans ce récipient avec aération (60 1/mn) et agitation (150 tr/mn) à 30°C pendant 2 jours. Enfin, on inocule 60 1 de la quatrième culture d'ensemencement dans 600 1 d'un milieu de fermentation placé dans un récipient de 1000 1 et ayant la composition suivante : 15 2189011 Dextrine 5% Farine de soja 3,5% CaC03 0,7% (pH =7,2 avant stérilisation) 5 On réalise la culture dans le récipient de fermentation avec aération (500 1/mn) et agitation (150 tr/mn) à 30°C pendant 5 jours. Après avoir achevé la fermentation, on ajuste la liqueur de culture à un pH de 2,0 à l'aide d'acide sulfurique 12N et on 10 agite pendant 30 mn. Puis on ajoute environ 10 kg de Radiolite n° 600 et on élimine les cellules microbiennes par filtration. On ajuste le filtrat à un pH de 8,0 à l!aide d'hydroxyde de sodium 6N et on le fait passer à travers une colonne remplie d'environ 50 1 d'une résine échangeuse de cations du type Amberlite IRC-50 (forme ammoniac). On rejette l'éluat. 15 Après lavage de la résine à l'eau, on élue la substance active à l'aide d'ammoniaque IN. On détermine l'activité de l'éluat ainsi obtenu contre Bacillus subtilis n° 10707 par la méthode au disque de papier à l'aide d'une plaque de gélose. On réunit les fractions actives et on les concentre 20 sous vide à environ 5 1. On ajuste le concentré à un pH de 8,0 à l'aide d'acide sulfurique 6N et on le fait passer à travers une colonne remplie de 1 litre d'une résine échangeuse d'anions du type Dowex 1x2 (forme OH ), puis on lave ensuite avec environ 5 1 d'eau pour éliminer les impuretés. On concentre la fraction active jusqu'au 1/15 en volume. On ajuste alors 25 le concentré à un pH de 10,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium 6N et on . ajoute 5 volumes d'acétone. On sépare par filtration le précipité résultant et on concentre la couche d'acétone à 500 ml. On ajuste le concentré à un pH de 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 6N et on ajoute 2,5 1 de méthanol. Après refroidissement, on obtient un précipité blanc. On sépare le prëci-30 pité par filtration et on le lave au méthanol. Après séchage sous vide, on obtient 16-20 g d'une poudre blanche. Cette poudre blanche est un mélange du sulfate de gentamicine C^a et du sulfate de XK-62-2 et présente une activité de 550 unités/mg (l'activité de 1 mg d'un produit pur correspond à 1000 unités). 35 On dispose 5 g de la poudre blanche pour former une couche mince uniforme à la partie supérieure d'une colonne de diamètre 25 mm et de longueur 50 cm remplie d'environ 300 ml de gel de silice que 16 2189011 l'on a mis auparavant en suspension dans ua solvant de chloroforme, isopropanol et ammoniaque (2:1:1 en volume). On élue alors avec le même solvant à un débit de 30 ml/h environ. On sépare l'éluat en fractions de 10 ml. On soumet la fraction active à une chromatographie sur papier pour 5 examiner les composants élués. Le XK-62-2 est élué dans les fractions n° 53-75 et la gentamicine est éluée dans les fractions n° 85-120. On réunit les fractions n° 53-75 et on les concentre sous pression réduite pour suffisamment éliminer le solvant. On dissout le concentré dans une petite quantité d'eau. Après lyophilisation de la solution, on obtient 10 environ 900 mg de XK-62-2 purifié (base libre). Ce produit a une activité de 950 unités/mg environ. De même, on réunit les fractions n° 85-120 et on les concentre sous pression réduite pour suffisamment éliminer le solvant. On dissout le concentré dans une petite quantité d'eau. Après lyophilisation de la solution, on obtient environ 1,8 g de gentamicine C^& purifiée (base 15 libre). L'activité de ce produit est de 980 unités/mg environ. EXEMPLE 4 Dans cet exemple, on utilise à nouveau Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK-62 (ATCC 21803) comme souche d'ensemencement. 20 La composition du milieu d'ensemencement est comme suit : Amidon soluble 2% NZ-amine de type A 0,5% Extrait de levure 0,5% 25 Carbonate de calcium 0,1% On inocule une anse de la culture d'ensemencement dans 300 ml du milieu d'ensemencement placé dans un Erlenmeyer de 2 1. On réalise la première culture avec agitation à 30°C pendant 4 jours. Puis on inocule 30 le contenu de 3 Erlenmeyers de la première culture dans 15 1 d'un milieu d'ensemencement frais contenu dans un récipient de fermentation de 30 1. On réalise la seconde culture avec aération et agitation à 30°C pendant 2 jours. Puis on transfère 150 1 de la troisième culture d'ensemencement dans un récipient de 3000 1 contenant 150 1 d'un milieu de fermentation de composi-35 tion suivante : 17 2189011 Amidon soluble 4% Liqueur de macération de maïs 17» Farine de soja 2% K.HPO. 0,05% 2 4 5 MgS04,7H20 0,05% KC1 0,03% CoCl^j 21^0 0,0057. CaC03 0,1% 10 On réalise la fermentation avec aération et agitation à 30°C pendant 4 jours. La production de la substance active atteint un maximum au bout de 4 jours de fermentation et l'activité de la substance n'est pas réduite pendant un certain temps. Après achèvement de la fermentation, on ajuste la 15 liqueur de culture à un pH de 2,0 à l'aide d'acide oxalique et on agite pendant 1 h. De cette façon, la majeure partie de la substance active contenue dans les cellules microbiennes est extraite dans le liquide. Puis on ajoute 20 kg de Celite 545 comme adjuvant de filtration et on élimine par filtration les cellules microbiennes et l'oxalate de calcium. On ajuste 20 le filtrat à un pH de 6,8 à l'aide d'hydroxyde de sodium 6N et on le fait passer à travers une colonne remplie d'environ 100 1 d'une résine échangeuse de cations du type Amberlite IRC-50 (forme sodium). On lave la colonne à l'eau. L'effluent et les produits de lavage contiennent des impuretés et des substances qui ne sont pas absorbées sur la résine et qui ne sont actifs 25 que contre des micro-organismes gram-positifs. On réalise l'élu'tion avec environ 300 1 d'acide sulfurique 2N et on récupère les composants actifs dans l'éluat par fractions On réunit ces fractions et "on ajuste le pH à 7,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium 2N. On concentre la solution résultante sous pression réduite 30 jusqu'à 20 1 et on ajuste le concentré à un pH de 10,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium 2N. On ajoute 5 volumes d'acétone en agitant, ce qui provoque la formation d'un précipité que l'on sépare ensuite par filtration et que l'on lave à l'acétone. On réunit le filtrat et les produits de lavage et on concentre sous pression réduite jusqu'à volume de 1 litre. On ajuste le 35 concentré à un pH de 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 6N. Puis on ajoute 5 1 de méthanol, en agitant, et on laisse le mélange résultant reposer dans une chambre froide. Il se forme ainsi un précipité blanc que l'on sépare par 18 2189011 filtration et que l'on lave avec du méthanol. Après séchage du précipité sous vide, on obtient environ 65 g d'antibiotique brut. La poudre brute est un mélange du sulfate de gentamicine Cn et du sulfate de XK-62-2 et X â a une activité de 450 unités/mg. 5 Puis on dissout 60 g de la poudre brute ainsi obtenue dans 10 1 d'eau. On ajuste la solution à un pH de 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium 2N et on la fait passer à travers une colonne remplie de 3 1 d'une résine échangeuse d'anions du type Amberlite IRA-400 (forme 0H ). On lave la colonne avec 10 1 d'eau et on réunit l'éluat et les produits 10 de lavage que l'on concentre à 1 litre. On ajuste le concentré à un pH de 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 6N et on ajoute 10 1 de méthanol. On obtient ainsi environ 50 g du sulfate purifié d'un antibiotique. On place environ 50 g de l'antibiotique purifié à la partie supérieure d'une colonne de diamètre 4 cm et de longueur 100 cm 15 remplie d'environ 2,8 1 de poudres de cellulose. On élue progressivement avec la couche inférieure d'un solvant mixte de chloroforme, méthanol et ammoniaque à 17% (2:1:1). La vitesse d'élution est contrôlée de façon à ce qu'on ne dépasse pas des portions de 100 ml. On sépare l'éluat en portions de 20 ml et on élue séparément le XK-62-2 et la gentamicine C^a dans les 20 fractions n° 62-86 et dans les fractions n° 95-130, respectivement. On réunit les fractions contenant chacun des composants et on les concentre sous pression réduite pour éliminer le solvant, puis on dissout le concentré dans une petite quantité d'eau. On ajuste la solution résultante à un pH de 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 2N. Après lyophilisation, on obtient 8,7 g 25 du sulfate de XK-62-2 (792 unités/mg) et 1,8 g du sulfate de gentamicine C JLâ (787 unités/mg), chacun de ces produits étant sous forme d'une poudre blanche. Pour préparer la base libre, on dissout 5 g du sulfate d'eau et on fait passer à travers une colonne remplie de 70 ml de XK-62-2 dans 500 ml/d'une résine échangeuse d'anions du type Dowex 1x2 (forme OH ). Après lavage de la colonne avec 500 ml d'eau, on concentre 30 sous pression réduite l'éluat présentant une activité jusqu'à 100 ml. Après lyophilisation, on obtient comme produit de concentration 3,3 g de la base libre de XK-62-2 (990 unités/mg). EXEMPLE 5 35 Dans cet exemple, on utilise comme souche d'ensemence ment Micromonospora purpurea NRRL 2953. On réalise la culture comme il est décrit dans l'exemple 2. On obtient ainsi 60 g d'une poudre blanche comme 19 2189011 il est indiqué dans l'étape B de l'exemple 1. D'après chromatographie sur papier, cette poudre contient les composants suivants : XK-62-2, gentamicine C^, gentamicine C2 et gentamicine C1&. On isole chacun de ces composants sous forme de base libre à partir de la poudre comme il est décrit dans l'exemple 2. 5 Les résultats obtenus sont les suivants : Composant Activité (unité/mg) Rendement (g) Gentamicine C^ 821 21 XK-62-2 925 2 Gentamicine C2 880 15 10 Gentamicine C^a 850 7 EXEMPLE 6 Dans cet exemple, on utilise comme souches d'ensemencement Micromonospora echinospora ATCC 15837, Micromono spora echinospora var. ferruginea ATCC 15836, NRRL 2995 et Micromonospora echinospora var. pallida ATCC 15838, 15 NRRL 2996. On réalise la culture de la même façon que dans l'exemple 2 et on obtient une poudre blanche comprenant un mélange des composants provenant de chacune des liqueurs de culture comme il est décrit dans l'étape B de 1'exemple 1. On isole alors chacun des composants sous forme de la base libre de la même façon que dans 1'exemple 2. 20 L'activité et le rendement pour chacune des fractions ainsi isolées sont comme suit : Micromonospora Micromonospora Micromonospora echinospora echinospora var. echinospora var. ATCC 15837 ferruginea NRRL 2995 pallida NRRL 2996 25 Activité Rendement Activité Rendement Activité Rendement (unité/mg) (g) (unité/mg) (g) (unité/mg) Gentamicine C1 906 15 830 13 940 18 XK-62-2 898 3 912 1,5 925 2,5 Gentamicine C2 845 12 853 8 859 7,5 30 Gentamicine Cj_ 880 9 920 5,8 890 11 EXEMPLE 7 On cultive le MK-62-NG-164 de l'exemple 5 comme il est indiqué dans 1 'exemple 3 pour obtenir 95 g (75 unités/mg) d'un mélange de C^a et de XK-62-2. 35 On traite ce mélange comme indiqué dans l'étape C de 1'exemple 1 pour obtenir 49 g de XK-62-2 (975 unités/mg) et 0,95 g de C^a (980 unités/mg). TABLEAU I Souches Milieu Gélose de Czapek Gélose d'asparagine-glucose Gélose nutritive Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62 C : modérée, plane S : jaune melon brillant (3 ia) à brun foncé (3 pn) SP : néant C : modérée, plane S : rouge brique-henné (5 ng) SP : néant C : médiocre à modérée, plane S : orange (4 la) SP : néant Micromonospora sagamiensis MK-65 C : modérée, plane S : abricot (4 ga) à brun foncé (4 ni) néant SP C S SP C S SP : néant médiocre à modérée, plane rouge brique (5 ne) néant médiocre à modérée, plane or clair (2ic) C S SP Mi cromono-spora sagamiensis var, fiava Min 628 médiocre médiocre médiocre à modérée, plane couleur de blé clair (2 ea ) néant Gélose d'albumine d'oeuf médiocre, couche plane de spores noirs C : médiocre à modérée, plane S : brun-chocolat (5 1g) SP : néant médiocre TABLEAU I (suite 1) Souches Milieu * Micromonospora sagamiensis nonreducans MK 62 Micromonospora sagamiensis MK-65 Gélose à l'amidon C : modérée, granulaire C : granulaire, modérée C s : brun cuivre clair S : brun intense (5 pg) (4 pl) SP : néant SP : néant Gélose à l'extrait de C : modérée, érigée C : modérée, granulaire C levure-extrait de malt S : brun intense S : brun-noisette S (5 pl) (4 ni) SP : néant SP Gélose à la farine C : médiocre, plane C : médiocre, plane C d'avoine S : orange (4 la) S : orange (4 la) S SP : néant SP : néant SP Gélose (1/3) à 1'aminé C : modérée, érigée C : modérée, plane C NZ-Dextrose S : jaune-brun rappelant S : jaune brillant S le cuir (4 ne) (3 la) SP : néant SP : néant SP Micromonospora sagamiensis var. fiava Mm 628 médiocre bonne, érigée,striée brun-moutarde (2 pl) à noir néant médiocre brun moutarde (2 pl) à noir néant médiocre, granulaire couleur de blé clair (2ea) néant T A B L EAU I (suite 2) Souches Milieu Gélose de Bennett Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62 G : modérée, érigée, striée S : orange poudreux (4 le) SP : néant C S Micromonospora sagamiensis MK-65 modérée, granulaire brun-chêne (4 pi) SP : néant Micromonospora sagamiensis var. flava Mm 628 C : modérée, plane S : brun-moutarde (2 pi) SP j néant Gélose d'Emerson C : médiocre, formant des plis S : orange brillant (4 na) SP : néant C : médiocre à modérée, granulaire S : orange (4 la) SP : néant C : modétée, granulaire SP jaune melon brillant (3 ia) néant to IO Gélose à l'extrait de levure-glucose C : modérée, érigée S : orange brillant (4 na) SP : néant C : modérée, granulaire C : modérée, granulaire SP orange-roussâ tre (4 ne) néant SP brun-moutarde (2 pi) néant C : croissance ; S : couleur du mycélium de substrat ; SP : pigment,soluble. K> —» 00 O Propriétés physiologiques Liquéfaction de la gélatine Liquéfaction du lait Coagulation du lait Décomposition de la cellulose Hydrolyse de l'amidon Utilisation de sources de carbone D-arabinose D-galactose D-glucose Glycérol D-lactose Lévulose L-inositol D-mannitol D-raffinose L-rhamnose D-xylose Saccharose Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62 + + ++ pH de croissance optima le 7,0 - 8,0 TABLEAU II Micromonospora sagamiensis MK-65 + + (lente) + + Micromonospora sagamiensis var. flava Mm 628 + + (lente) + + + ++ + + M U> K) OO •vO o 7,0 - 8,0 7,0 - 8,5 Propriétés physiologiques Micromono- Température de croissance optimale Réduction des nitrates Formation de tyrosinase Formation de mélanol'de spora sagamiensis var. nonreducans MK 62 35°C - 40°C TABLEAD II (suite) Micromonospora sagamiensis MK-65 30°C - 40°C + Micromonospora sagamiensis var. fiava Mm 628 30°C - 40°C fo 4> ro co -o o TABLEAU III 1) Valeursde Rf de XK-62-2 par chromatographie sur papier ascendante (à 28°C) Développateur Valeur de Rf Temps de développement (h) Chlorure d'ammonium à 20 % 0,98 3 (poids/volume) n-butanol saturé en eau 0,00 15 mélange (3:1:1) n-hutanol- acide acétique-eau 0,06 15 Acétate d'éthyle saturé en eau 0,00 4 n-butanol saturé en eau contenant 2% (poids/volume) d'acide p-toluène-sulfonique et 2% (poids/volume) de pipéridine 0,03 15 2) Valeurs de Rf de XK-62-2 par chromatographie sur couche mince de gel de silice (à température ambiante) Développateur Valeur de Rf Temps de développement (h) Couche supérieure d'un mélange de chloroforme, méthanol et ammoniaque à 17% à 2:1:1 en volume 0,86 3 Mélange 1:1 en volume d'acétate d'ammonium à 10% et de méthanol 0,21 3 TABLEAU IV Chromatographie sur papier ascendante (à température ambiante) temps de développement : 12 heures. Antibiotiques Gentamicine A Gentamicine C, la Gentamicine C^ Gentamicine C^ Antibiotique n° 460 Sisomicine Néomycine A Néomycine B Kanamycine A Kanamycine B Paromomycine Complexe de nébramycine Tobramycine XK-62-2 Valeur de Rf 0,00 0,18 0,38 0,59 0,01 0,18 0,00 0,02 0,01 0,00 0,02 0,02 0,00 0,49 27 2189011 TABLEAU_V Spectre antibactérien de XK-62-2 par la méthode de dilution sur gélose Micro-organisme d'essai Streptococcus faecalis ATCC 10541 Staphvlococcus aureus ATCC 6538 P Staphylococcu8 aureus KY 8942 (résistant à la kanamycine, paromomycine et streptomycine) Staphvlococcus aureus KY 8950 (résistant à la streptmocyne, tétracycline, pénicilline et aux sulfonamides) Staphvlococcus aureus KY 8953 (résistance à la streptomycine, kanamycine, paromomycine, tétracycline, néomycine, kanendomycine et erythromycine) Staphylococcus aureus KY 8956 (Résistant à la streptomycine, paramomycine tétracycline, érythromycine et oléandomycine) Staphylococcus aureus KY 8957 (résistant au chloramphénicol et à la streptomycine, kanendomycine, tétracycline et paromomycine) Bacillus subtilis n° 10707 Bacillu8 cereus ATCC 9634 Bacillus cereus var. mycoides ATCC 9463 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Escherichia coli ATCC 26 Escherichia coli KY 8302 (résistant au chloramphénicol et à la streptomycine,kanamycine, paromomycine, tétracycline et spectinomycine) Escherichia coli KY 8310 (résistant au chloramphénicol et à la streptomycine, kanamycine, gentamicine, kanendomycine, paromomycine, tétracycline et spectinomycine) Escherichia coli KY 83là (résistant à la streptomycine) Escherichia coli KY 8315 (résistant à la streptomycines kanamycine, paromomycine et méomycine) Pseudomonas aeruginosa BMH n° 1 Proteus vulgaris ATCC 6897 Shigella sonnei ATCC 9290 Salmonella typhQSfl ATCC 9992 Concentration inhibi-trice minimale (y/ml) 1,05 eC 0,0041 0,065 0,0082 0,0041 0,0021 1,05 0,0082 0,016 0,53 0,03 0,07 0,018 TABLEAU VI Concentration lnhlbitri.ee minimale (y/ml) déterminée par la méthode de dilution sur gélose Micro-o rganisme XK-62-2 Complexe de gentamicine Streptomycine Kanamycine Proteus vulgaris KY 4296 0,021 0,021 - - Proteus vulgaris KY 4297 0,021 0,021 - - Proteus vulgaris ATCC 6897 0,04 0,04 >40 0,34 Proteus vulgaris (Abbott JJ) 0,021 0,021 >40 0,16 Proteus mirabilis (Finland 9) 0,04 0,04 J>40 0,04 Proteus mirabilis n° 825 0,021 0,021 >40 0,04 Proteus mirabilis n° 39 0,021 0,04 ^>40 0,33 Proteus morganii (Jenkins) 0,04 0,04 ^>40 0,16 Proteus rettgeri (Booth) 0,021 0,021 >40 0,08 Proteus rettgeri faambrook) 0,021 ^>40 0,08 TABLEAUVII Concentration Inhibitrice minimale (y/ml) déterminée par la méthode de dilution sur gélose Souches de Psudomonas aeruginosa XK-62-2 Complexe de Gentamicine C^ Spectomycine Kanamy- gentamicine cine KY 4276 0,33 0,33 0,33 2,6 1,63 KY 8510 0,33 1,3 2,6 0,65 13 KY 8511 ^42 4 2 42 ">2500 13 KY 8512 0,33 0,65 0,33 42 3,3 KY 8514 0,55 1,3 0,33 156 208 KY 8 515 ^>42 62 ^>-42 624 416 KY 8516 0,33 1,3 5,2 0,65 26 KY 8520 0,33 0,65 0,33 5,2 104 KY 8562 ^>" 42 62 42 156 167 TABLEAU VIII Dose (mg/souris) Pourcentage de survivance des souris Pseudomonas aeruginosa BMH n° 1 XK-62-2 Complexe de gentamicinfe Pseudomonas aeruginosa KY 8510 XK-62-2 Complexe de Gentamicine C^ gentamicine 2 1 0,5 0,25 0,125 100 90 50 10 0 100 100 70 20 0 100 80 50 30 0 90 40 30 10 O 20 10 0 0 0 LO O K> OO vO o \ 31 218901 1 REVENDICATIONS 1. Nouvel antibiotique appelé XK-62-2 ayant un poids moléculaire de 463 et répondant à la formule brute C2qH4^N^0^, caractérisé en ce que : a) son spectre d'absorption dans l'ultraviolet en solution aqueuse ne présente pas de maxima d'absorption caractéristiques entre 220 et 5 360 m^u, mais seulement deux absorptions terminales, b) son spectre d'absorption dans l'infrarouge (pastille de KBr) présente les pics suivants (longueurs d'onde en cm"1) : 610, 1040, 1110, 1285, 1340, 1390, 1460, 1510, 1620, 2050, 2920, 3030 et 3350, c) le spectre de BMN de son sulfate obtenu sur 10 un appareil du type "Varian Associates HA-100" présente des absorptions à 5,60 ppm et 6,32 ppm (proton anomère de la fraction sucre), 3,38 et 1,80 ppm (groupes N-méthyle et C-tertiaire-méthyle) et 3,21 ppm (également groupe N-méthyle). 2. Nouvel antibiotique, caractérisé en ce qu'il consiste en le 15 sulfate de l'antibiotique selon la revendication 1. 3. Procédé de préparation de l'antibiotique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive un micro-organisme du genre Micromonospora sagamiensis capable de produire le XK-62-2 dans un milieu nutritif, on laisse le XK-62-2 s'accumuler dans la liqueur de culture et on 20 l'isole ensuite à partir de celle-ci. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le micro-organisme est Micromonospora sagamiensis ATCC 21826. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le micro-organisme est Micromonospora sagamiensis var. flava ATCC 21827. 25 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le micro-organisme est Micromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21803. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape supplémentaire d'extraction de l'antibiotique à partir des cellules microbiennes avant l'étape d'isolement. 30 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la culture est réalisée à une température de 25 à 55°C et à un pH approximativement neutre. 9. Procédé de préparation de l'antibiotique XK-62-2 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif 35 un micro-organisme produisant le XK-62-2 choisi parmi Micromonospora 32 2189011 sagamiensis ATCC 21826, Micromono spora sagamiensis var. flava ATCC 21827 et Micromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21803, Micromonospora echinospora ATCC 15837, Micromono spora echinospora var. ferruginea ATCC 15836, Micromonospora echinospora var. pallida ATCC 15838, Micromonospora 5 purpurea ATCC 15835 et Micromono spora nonreducans ATCC 21949, on laisse le XK-62-2 s'accumuler dans ce milieu puis on l'isole à partir de ce milieu. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on réalise la culture à une température de 25 à 55°C et à un pH approximativement neutre. 10 11. Procédé de préparation d'un antibiotique appartenant au complexe de gentamicine C, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif un micro-organisme du genre Micromonospora sagamiensis, on laisse l'antibiotique s'accumuler dans le milieu puis on isole le complexe de gentamicine C à partir de ce milieu. 15 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi parmi Micromonospora sagamiensis ATCC 21826, Micromonospora sagamiensis var. flava ATCC 21827, Micromono spora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21803 et Micromonospora nonreducans ATCC 21949. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que 20 l'étape d'isolement comprend l'isolement à partir de la liqueur de culture d'au moins un des antibiotiques du groupe constitué par la gentamicine Cp la gentamicine C2 et la gentamicine C^. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on réalise la culture à une température de 25 à 55°C et à un pH approximativement 25 neutre. 15. Nouveau médicament, caractérisé en ce qu'il consiste en un antibiotique selon la revendication 1 ou 2. 16. Compositions thérapeutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédient actif un médicament selon la revendication 15. 30 17. Formes pharmaceutiques appropriées à l'administration des compositions selon la revendication 16. 18. Additif alimentaire pour animaux, caractérisé en ce qu'il consiste en un antibiotique selon la revendication 1 ou 2.