Brevet FR2184432A1 — publié le 19731228

L'inventlon est relative ve à de nouvelles &alpha;-glucane-hydrolases et à un procédé de préparation de ces -glucane-hydrolases. Elle a pour but de fournir des tAglucane-hydrolases à haute activité, qui soient utilisables de façon avantageuse dans le cadre des applications classiques deso I1 a été établi que la plaque dentaire résulte de l'adsorption d'abord d'éléments salivaires, de protéines salivaires et de glucoprotéines sur l'émail des dents pour former une pellicule que colonisent rapidement, surtout en l'absence d'une hygiène dentaire suffisante, des micro-organismes qui, utilisant les apports alimentaires, élaborent des dépôts visqueux constituant la plaque dentaire proprement dite, laquelle résulte de la métabolisation par ces micro-organismes des -apports salivaires et alimentaires.Cette plaque permet alors la rétention au contact de 1'é- mail des dents, avec les inconvénients que l'on sait, de la flore cariogène qui autrement ne pourrait pas se fixer sur l'émail du fait de l'affrontement des dents, de la mastication d'aliments durs, de l'insalivation abondante qui lave sans cesse les surfaces dentaires, des mouvements de la langue, etc... I1 a été établi que ce sont des lignées de streptocoques qui sont parmi les souches qui colonisent en premier la plaque en formation, ces streptocoques (notamment Streptococcus sanquis, S. salivarius et S. mitis et, surtout, Streptococcus mutans) ayant la propriété caractéristique de synthétiser, à partir du saccharose, des polysaccharides intra et extracellulaires essentiellement constitués d' -glucanes et d' &alpha;-fructanes, les &alpha;-glucanes étant toutefois largement dominants par rapport auxoC-fructanes. La destruction de la plaque dentaire, notamment par l'hydrolyse des &alpha;-glucanes qu'elle contient, pourrait résulter en une protection efficace contre la carie. Des essais ont déjà été réalisés dans ce sens, en ayant recours à des dextranases produites par des souches connues pour leur aptitude à cet effet, notamment des souches Penicillium funiculosum ou Penicillium lilacinum. En particulier R.J. Fitzgerald, D.M. Spinell et T.H Stoudt (Arch. Oral Biol., Vol. 13, pp. 125-126, 1968, Pergamon Press) ont testé l'action de préparations de dextranases produites par Penicillium funiculosum, en présence de dextranes inducteurs du commerce, sur des "dextranes' produits paï différentes iignées de streptococci connus pour leur action cariogène chez le rat. Les dextranases testées se sont révélées présenter une activité notable à l'égard de "dextranes" produits par des micro-organismes présents dans le milieu buccal d'animaux, notamment du rat.Cependant, comme les auteurs eux-mêmes l'ont indiqué dans leur article, ces mêmes dextranases ne furent que faiblement actives ou même simplement inactives à l'égard de ceux des "dextranes" testés qui avaient été produits dans un système de plaque dentaire artificielle par des micro-organismes présents dans le milieu buccal humain. La faible activité ou l'absence d'activité des dextranases de Fitzgerald, Spinell et Stoudt sur les dextranes testés pour- rait s'expliquer par le fait que les "dextranes" de la plaque den taire du rat sont différents de ceux de la plaque dentaire humain ne. Ces derniers comprennent (surtout ceux produits par Strepto- coccus mutans) une forte proportion de liaisons &alpha;(1-3). On sàit par ailleurs que les dextranases produites par les souches usuelles, notamment Penicillium funiculosum, sont capables d'hydrolyser des dextranes (w(1-6) glucanes) contenant des liaisons &alpha; (1-6), propriété qui, on le rappelle, est spécifique aux &alpha;-glucane-hydrolases appelées "dextranases" selon la définition qui en est donnée dans le système de classification établi par la Commission Internationale des Enzymes.Il ne serait alors pas surprenant que de telles "dextranases" se soient révélées peu actives, voire inactives à l'éganddes &alpha;-glucanes produits par les micro-organismes, présents dans le milieu buccal humain, des auteurs précités, surtout s'il devait être établi que les dextranases produites par Penicillium funiculosum en présence de dextranes inducteurs du commerce n'agissent que peu ou même pas du tout sur des liaisons autres que (1-6). Quoi qu'il en soit, on observe qu'aucune des a-glueane-hy- drolases testées jusqu'à ce jour ne présente une activité et une rapidité d'action suffisantes pour une application satisfaisante au traitement de la plaque dentaire chez l'homme. L'exposé que précède rend donc compte de l'importance des buts poursuivis par l'invention, lesquels, on le rappels, visent à l'obtention d'&alpha;-glucane-hydrolases très actives, non seulement en tant que telles, mais également actives et d'action très rapide à l'égard de la plaque dentaire humaine. Les &alpha;-glucane-hydrolases selon l'invention sont obtenues par un procédé dans lequel on effectue une biosynthèse en ayant recours à une souche de micro-organismes productrice d'-glucane- hydrolases au sein d'un bouillon de culture en présence d'un d- glucane inducteur, notamment un M-glucane produit par une souche telle que celles présentes dans le milieu buccal humain, ce procé- dé étant plus particulièrement caractérisé en ce que la souche utilisée appartient à l'espèce Penicillium purpuroqenum var. rubri-sclerotium Thom. Les caractéristiques taxonomiques de cette souche sont les suivantes - biverticillé symétrique - colonies présentant un aspect velouté ou laineux - conidiophores se développant directement à partir du milieu - coloration rouge sombre très accentuée du re vers des colonies avec diffusion du pigment dans la gélose - surfaces très sporulées avec zonesconidiennes vertes - présence d'une zone limitée, mais évidente, de mycélium aérien stérile et jaune - conidies elliptiques à subglobuleuses ; - formation de sclérotes. Des &alpha;-glucane-hydrolases particulièrement actives sont obtenues en ayant recours à la souche Penicillium purpuroqenum var rubri-sclerotium Thom. qui a été déposée à l'American Type Culture Collection sous le nO ATCC 22.964. Les Ot t-glucane-hydrolases produites, notamment par la souche préférée identifiée ci-dessus, se caractérisent par un pouvoir hydrolysant extrêmement élevé. L'expérience a en outre montré que les &alpha;-glucane-hydrolases produites étaient actives à l'égard des dextranes d-glucanes du type de ceux que l'on trouve dans la plaque dentaire humaine. Ces &alpha;-glucane-hydrolases sont donc applicables au traitement de la plaque dentaire humaine, cette application se présentant dans des conditions d'autant plus favorables que L'activité enzy matique obtenue rat très rapide, condition qui est importante si l'on tiert compte d? ce que les modes d'application envisagés (par l'intermédiaire de dentifrice ou par rinçage de la bouche' impliquent un temps de contact, qui, nécessairement, est assez court. Dans un mode de réalisation préfére du procédé selon l'invention, la biosynthèse des &alpha;-glucane-hyrdrolases est réalisée e présence d'O(-glucane inducteurs analogues ou identiques à ceux auxquels on se propose d'appliquer les &alpha;-glucane-hydrolases pr- duites. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description de modes de mise en oeuvre particuliers du procédé selon linvention, donnée ci-après et en rapport avec le dessin dans lequel - la figure 1 montre des courbes de variations de pH et de activité enzymatique d'un filtrat de culture de Penicillium @@@@@ roqenum var. rubri-sclerotium Thom., en fonction du temps - la figure 2 montre une courbe de cinétique enzymatique de 1 une des préparations obtenues par le procédé conforme à l'invention. Exemple 1 : Production d'-qlucane-hydrolases en fiole avec indu- tion par un dextrane du commerce (PM 5-40 millions La souche utilisée pour la production d'&alpha;-glucane-hydrolases est la souche Penicillium purpurogenum var. rubri-sclerotium @@@ n ATTC 22.964 sur le tube gélosé. On réalise d'abord une préculture en fiole e" présence d'un dextrane inducteur présentant un poids moléculaire sPM) de 60.000 à 90.000, puis une culture en utilisa@ le même milieu mais en présence d'un dextrane inducteur de poids moléculaire de 5 à 40 millions.Ces opérations sont réalisée dam les conditions suivantes a) Pré-culture On introduit 900 ml du milieu de culture suivant dans une fiole conique d'Erlenmeyer de six litres. MILIEU D CULTURE - Dextre (PM 60.000 à 90.000) 2X - Extrait de levure Difco Réf. 012.701 (Catalogue Difco) 0,5% - NH4N03 0,5% - MgS04,7 H20 0,05% K2 H P04 0,05% - K H2P04 0,05% On ensemence le milieu à partir du tube gélosé. On place les fioles sur un agitateur rotatif tournant à 20v tours/mn, et on les y maintient à 28 C pendant 5 à 6 jours pour former la préculture. b) Culture On utilise le même milieu de culture mais en remplaçant le dextrane inducteur de la pré-culture par un dextrane de PM 5 à 40 millions commercialisé par Kock-Light Laboratories LTD, référence 1527 d, Batch 49.613. On opère dans des fioles de 6.000 ml contenant chacune 2.400 ml de milieu de culture. On ensemence le milieu de chacune des fioles avec 300 ml de la pré-culture susdite. Les cultures sont placées sur une table d'agitation, animée d'une vitesse de rotation de 300 tours/mn, à la température de 300C. Les cultures sont terminées cinq jours plus tard. c) Préparation complémentaire On élimine le mycélium par filtration. On précipite au sulfate d'ammonium à raison de 70 g pour 100 ml du milieu. On récupère le précipité, on le redissout dans une solution de tampon acétate 0,1 M, on le dialyse pour éliminer les sels d'ammonium et on lyophilise le dialysat. On obtient 6 g d'une préparation concentrée enC(-glucane- hydrolases. Elle est dosée selon la méthode de dosage des sucres réducteurs de Tsuchiya et coll., 1952, Journal of Bacteriology, 64, p. 513-519. La préparation obtenue présente une activité de 195 uAE/mg. On rappelle que cette unité est définie comme la quantité d'enzyme qui libère une millimole de glucose ou d'isomaltose en une heure à 400C dans les conditions qui ont été décrites par Tsuchiya. Exemple 2 : Production d' -glucane-hydroiases en fermenteur avec induction par un dextrane du commerce (PM 5-40 mil lions) On réalise une pré-culture dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, sur 1.500 ml du même milieu de culture dans une fiole de six litres. La pré-culture obtenue est ensuitetutilisée pour ensemencer quinze litres du même milieu de culture dans un fermenteur de quinze litres. Le milieu est maintenu sous agitation (400 à 700 tours/mn) à une température de 30 C L'incubation est maintenue pendant 48 heures. Le pH est enregistré en continu perdant toute la durée de l'opération. On fait également périodiquement des prélevements du milieu pour déterminer l'activité enzymatique produite, notamment par la méthode de dosage dite "méthode au bleu dextraneh telle que décrite par Koh et Khouw, Canadian Journal of Biochemistry, Vol. 48, n 1, 1970 p. 225-227). Les courbes de la figure 1 sont représentatives de la variation du pH du milieu (courbe a) et de son activité enzymatique (courbe b) en fonction du temps. Sur l'axe des ordonnées figurent d'une part les pH, d'autre part les activités enzymatiques en ui/ml, étant entendu que l'unité dans la méthode au bleu dextrane est définie comme la quantité d'enzyme qui libère un milligramme du complexe coloré décrit dans la publication précitée en cinq minutes. Le temps est indiqué en heures sur l'axe des abcisses. La courbe b de la figure 1 met en évidence que l'on obtenu une activité enzymatique maximum 32 à 34 heures après le début de l'incubation. Cette activité tend à décroître pour remonter à une valeur proche du maximum atteint antérieurement vers la quarante neuvième heure. La préparation d'os-glucane-hydrolases obtenue peut être complétée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. On obtient finalement 350 ml d'une préparation titrant 25 ui/ml selon la méthode au bleu dextrane. Les solutions du produit obtenu sont stables. Exemple 3: Production d'o(-glucane-hydrolases en fermenteur avec induction Par un dextrane du commerce de haut poids moléculaire (30-40 millions) La pré-culture est réalisée dans les conditions décrites à l'exemple 2, en utilisant la même souche, sur 500 ml du meme milieu de culture dans une fiole de six litres. La culture est de même réalisée comme dans l'exemple 2, par ensemencement en fermenteur de cinq litres du milieu susdit avec les 500 millilitres de pré-culture obtenus, la culture étant interrompue après trente-trois heures d'incubation. Après préparation complémentaire dans les conditions de l'exemple 2, on obtient 200 millilitres d'une préparatiJr itrant 50 ui/ml selon la méthode au bleu trane. Exemple 4: production d'&alpha;-glucane-hyrolases en fiole avec in C or un un &alpha;-glucane aré à partir d'ure souche présente da;s le milieu buccal humain La technique utilisée est celle de la pré-culture des exemples précédents. L'sglucane inducteur utilisé a ëté produit par Streptococcus mutans OMZ. 176 (selon le numéro d'inscription de la souche sur le catalogue de l'Institut Odontologico-Médical de Zurich). La pré-culture a eté réalisée en trois jours dans une fiole sur 50 ml du milieu susdit. On ensemence ensuite 250 ml de milieu avec 25 ml de cette pré-culture et l'on poursuit la culture pendant cinq jours. On recueille le filtrat de culture dont l'activité a été étudiée dans les conditions indiquées plus loin. L'o(-glucane inducteur utilisé a été obtenu par culture de la souche de S.mutans sur 250 ml d'un milieu contenant les produits suivants -"Brain-heart infusion" 3,7% - Glucose 1% - Carbonate de calcium 1 trace pendant douze heures à 370C. La pré-culture obtenue sert à ensemencer 500 ml du milieu de culture décrit par Niven et coll, (J. Bact., 51, 711-716). Après douze heures d'incubation à 37 C, le milieu est transféré dans un fermenteur contenant quinze litres du même milieu. L'incubation est réalisée à 37 C, à un pH réglé de façon constante à 6,5 par addition de soude 4 N. Après incubation, le milieu est centrifugé et les produits solides (cellules + polysaccharides) sont recueillis. Après lavage à l'eau distillée, cette fraction solide est émulsifiée par de la potasse N et soumise à agitation, l'émulsion étant ensuite centrifugée pour éliminer les cellules. La solution potassique de polysaccharides obtenue est soumise à une précipitation alcoolique, le précipité est repris par de la potasse N, l'opération de précipitation alcoolique et de redissolution dans la potasse N étant ensuite répétée. La solution potassique de polysaccharides finalement obtenue est dialysée contre de l'eau distillée jusqu'à élimination totale de la potasse, le dialysat étant ensuite lyophilisé. Le produit lyophilisé contient 1 ;glucane qui a été utilisé comme inducteur dans ce qui précède. Exemple 5 : Production d' -qlucane-hvdroiases par une autre sou che Peniciilium purpuroqenum var. rubri-scierotium Une autre souche de la variété susdite, à savoir celle qui a été déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro 10.064, est également productrice de o(-giucane-hydrolase. Cette souche a été ensemencée sur ie milieu contenant du bleu dextrare .000 selon la technique décrite par Mencier (Ann. Inst. Pasteur 972, 122, 156-157). Les micro-organismes se sont développés sur ce milieu et ont produit une hydrolyse de la molecule de bleu deux trane avec libération du complexe coloré.La zone éclaircie, pro duite dans le milieu au contact de la colonie et entourée d'une auréole bleu foncé due à l'accumulation du colorant libéré, pre sente, après incubation à la température de 370C pendant 48 @@@- res un diamètre de 2 cm. PROPRIETE DES GLUCANE-HYDROLASES OBTENUES Les enzymes selon l'invention présentent une activité remar- quable qui se manifeste rapidement. L'étude de la cinétique enzymatique des &alpha;-glucane-hyrolase selon l'invention, notamment dans les conditions indiquées 1;ar T.Y. Koh et B.T. Khouw, Loc. Cit. montre que l'action des enzyme sur unoç-glucane à hydrolyser est très rapide, notamment comme le montre la courbe de la figure 2 représentative de la variation d la densité optique D (portée sur l'axe des ordonnées), observée lors de l'hydrolyse d'une préparation de dextrane bleu 2.000 ou- mis à l'action de la préparation enzymatique de l'exemple 2, en fonction du temps, exprimé en minutes sur l'axe des abcisses.La courbe de la figure 2 témoigne de l'apparition quasi immédiat d'une activité enzymatique pour atteindre un premier palier des la deuxième minute pendant un temps relativement bref, l'activité enzymatique continuant à croitre rapidement jusqu'à épuisemen du substrat. Les essais d'activité témoignent d'une activité très impor- tante des enzymes selon l'invention. Cette activité très élevée @ notamment été mise en évidence par l'étude de l'action des &alpha;-glu- cane-hydrolases de l'exemple 3 sur un dextrane de haut poids mo- léculaire semblable à celui choisi pour l'induction et dont la composition est décrite par Jeanes et coll., J. Amer. Chem. -Soc. 75, 5911, 1953. Cette haute activité a notamment été mise en évidence par les essais suivants a) Essais viscosimétriques On a ajouté à une solution, tamponnée à pH4 de 12,5 mi du susdit dextrane, 0,6 ui d'&alpha;-glucane-hydrolases. On a laisse incu- ber ensuite la solution pendant quinze minute d 404C. On a de mê- me fait incuber la même solution de dextrane dans les mêmes condi tions, mais en l'absence d'enzyme. La viscosité des deux solutions après incubation est déterminée au viscosimètre d'Oswald selon la technique décrite dans la notice n E1576 PROBALO, 12, rue Pelée, Paris XIè, ce viscosimètre (appareil PROLABO n 4080) se caractérisent par une constante viscosimétrique de K = 0,002763. La descente du ménisque de la préparation entre les deux traits repères de la tubulure de l'appareil s'effectue en 720 secondes pour la préparation témoin et en 30 secondes pour la préparation contenant l'enzyme. Ces deux temps témoignent donc d'une baisse considérable de la viscosité de la solution initiale, viscosité qui est de 1,77 centistokes pour la préparation témoin et de 0,074 centistokes pour la préparation contenant l'enzyme, d'où une hydrolyse importante du dextrane initialement contenu dans la préparation. b) Détermination de la constante de Michaelis des enzymes selon l'invention La méthode utilisée pour déterminer la constante de Michaelis des enzymes obtenus par la mise en oeuvre de l'exemple 3 sur un dextrane analogue à celui qui a servi à l'induction de la production de ces enzymes est celle préconisée par Lineveawer et Burke selon Barman (Enzyme Handbook 1969, Vol. 1, Springerverlag p. 6 à 8; La valeur trouvée est de Km = 0,035 x 10-6 M Cette valeur de la constante de Michaelis est très inférieure à celle indiquée par Koh et Khouw pour une dextranase du commerce (Km = 2,5 x 1 -6 M) de sorte que l'on peut dire que les &alpha; ;-glucane hydrolases de Penicillium Purpurosenum var. rubrisclerotium ont une cinétique d'action environ 70 foix plus rapide que la dextranase du commerce en question. Les enzymes selon l'invention sont en outre actives à 1'é- gard d'une grande variété d'Sglucanes. Ainsi observe-t-on que la préparation enzymatique de l'exemple 2, qui a une activité de 92,4 uAE/ml (après quinze minutes de contact) sur le dextrane du commerce ayant servi à l'induction de sa production, présente une activité importante à l'égard d'&alpha;-glucanes tout a' fait différents, par exemple de 52,6 uAE/ml sur l'O(-glucane insoluble produit par Streptococcus sanquis dans les conditions qui ont été décrites plus haut pour la production d'&alpha;-glucane par Streptococcus mutans. De même on a observé que les préparations enzymatiques selon l'invention, même celles préparées en utilisant comme inducteur un dextrane du commerce de haut poids moléculaire, étaient de na ture à réaliser l'hydrolyse rapide des t-glucanes produits par des micro-organismes tels que ceux présents dans le milieu buccal humain, notamment Streptococcus mitis 5.625 et Streptococcus sali varius S6 de la collection de l'institut Odontologico-Médical de Zurich. Ces résultats qui seront explicités plus en détail dans ce qui suit, ainsi que ceux obtenus avec la préparation d'O(-glucane- hydrolases de l'exemple 4 obtenues en présence d'&alpha;-glucanes induc teurs préparés à partir d'une souche présente dans le milieu buc cal humain, sont particulièrement intéressants en ce qu'ils té moignent de l'appropriation des enzymes selon l'invention au trai- tement des plaques dentaires humaines. c) Essais d'activité des &alpha;-glucane-hydrolases selon l'invention sur des plaques dentaires artificielles Les plaques dentaires artificielles utilisées dans les expé riences dont la description suit, ont été réalisées en ayant re cours à la technique décrite par R.M. McCabe, P.H. Keyes et A. Howell, Jr. (Archs Oral Biol. Vol. 12, pp. 1653/1656, 1967, Per gamon Press Ltd.), cependant légèrement modifiées en ce qui con cerne le milieu de culture utilisé. Ce milieu de culture conte nait Bactotryptone Difco (Réf. 012302) 1X Extrait de levure Difco (Réf. 012701) 0,5% Phosphate bipotassique 0,5% Saccharose 5% Les plaques dentaires artificielles sont formées sur une plaque de nickel-chrome. Ces plaques, supportant les plaques dentaires artificielles formées, sont plongées dans une solution tampon de pH4 contenant 1 ui/ml d'&alpha;-glucane-hydrolase (titrée par la méthode au bleu dex trane). L'ensemble est maintenu à 37 C. Au bout d'une heure, l'action est visible et au bout e deux heures la plaque s'est décrochée. On observe enfin une lyso com plate, avec passage en solution de la totalité des &alpha;-glucanes. Cet essai démontr. donc la grande activité de @'enzyme pro- duite à l'égard d'oWglul anes du type de ceux tue l'on rencontre dans la plaque dentaire humaine. d) Action de l'&alpha;-glucane-hydrolase produite avec induction par un &alpha;-glucane préparé à partir d'une souche présente dans le milieu buccal humain La préparation enzymatique soumise à l'expérience est le filtrat de culture de l'exemple 4 ci-dessus. Son action a été étu diée directement sur l'kglucane inducteur, produit par Streptococcus mutans OMZ 176. L'activité du filtrat de culture a été étudiée par l'effet qu'il induit sur la viscosité d'une solution d l'&alpha;-glucane susdit à 20X, après un temps d'action de quinze minutes. On a ajouté, dans cette expérience, 0,2 ml du filtrat de culture à 10 ml de la solution de l'o(-glucane. Le même dosage est effectué sur une solution témoin de cet &alpha;-glucane qui n'a pas été mis au contact de l'enzyme. Dans le tableau ci-après figurent les temps d'écoulement des préparations testées entre les repères de la tubulure de l'appareil des différentes préparations testées ainsi que les valeurs correspondantes de leur viscosité. On constate que la préparation enzymatique cause une baisse de viscosité significative de la solution de l'&alpha;-glucane. TABLEAU TEMOIN &alpha;-glucane seul + eau &alpha;-glucane + distillée &alpha;-glucane-hydrolase Temps Moyenne Temps Moyenne écoule- Centi- + inter- écoule- Centi- + inter ment en stokes valle de ment en stokes valle de secondes confiance secondes confiance 680 " 1,87 495 " 1,36 -glucane 678 " 1,87 500 " 1,38 de OMZ 176 670 " 1,85 1,88 # 512 " 1,41 1,40 # 0,054 0,061 (&alpha;=0,01) (&alpha;=0,01) 696 " 1,92 513 " 1,41 687 " 1,89 523 " 1,44 L'importance et la rapidité de l'action enzymatique des &alpha;-glucane-hydrolases selon l'invention ainsi que leur possibilité d'agir sur de nombreux owglucanes, les rendent particulièrement intéressantes. Une @@@ @@@ particulièrement avantageuses @ cerne l'hygiène dentaire. Les &alpha;-glucane-hydrolases selon l'inver tion pourront être incorporées à des solutions de rinçage ou à des dentifrices soit au moment de l'élaboration de ceux ci, @@ extemporanément. Ces &alpha;-glucane-hyrolases sont naturellement applicables @ autres domaines dans lesquels l'utilisation d'&alpha;-glucane-hydrola- ses ou de dextranases est courante, notamment dans la fabrication de dextranes de bas poids moléculaires utilisés comme du plasma sanquin à partir de dextranes natifs d hauts po dL mo léculaires. La rapidité et l'importance de leur actio les rend également propres à d'autres usages industriels, notarsmcrt x dans lesquels se pose le problème de la destruction d'accumula- tionsd'o(-glucanes. Par exemple ils pourront trouver ure applies tion dans l'industrie sucrière qui connaît souvent des problènqes de tuyauteries obstruées par des dépôts de glucanes. On pourra alors avoir recours à des solutions contenant des &alpha;-glucane-hydr lases du genre de celles de l'invention dans ces tuyauteries afin de dissoudre ces dépôts parasites. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spéciale- ment envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les varlan- tes. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'&alpha;-glucane-hydrolases par une souche de micro-organismes en présence d 'un &alpha;-glucane inducteur au sein d'un bouillon de culture, caractérisé en ce le la souche uti- lisée appartient à l'espèce Penicillium purpurogenum var. rubrisclerotium Thom. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche susdite a été déposée à l'American Type Culture Collection sous le n ATCC 22.964. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'&alpha;-gluc- inducteur utilisé est identique ou analogue à celui auquel on se propose d'appliquer les &alpha;-glucane- hydrolases produites. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'oc-glucane inducteur est constitué par un dextrane ou of-glucane à haut poids moléculaire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'&alpha;-glucane inducteur utilisé présente un poids moléculaire compris entre environ 5 et 40 millions. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que 1'-glucane inducteur utilisé présente un poids moléculaire compris entre environ 30 et 40 millions. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l't-glucane inducteur utilisé a été produit par un micro-organisme tel que ceux qui produisent de l'Ô(-glucane dans le milieu buccal humain. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le susdit micro-organisme est constitué par Streptococcus mutans. 9. O(-glucane-hydrolases obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou présentant les caractéristiques physico-chimiques et biologiques de celles obtenues par la mise en oeuvre de l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Application des &alpha;-glucane-hydrolases obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications I à 8 ou encore du produit selon la revendication 9 au traitement des plaques dentaires, notamment chez l'homme.