Brevet FR2201078A1 — publié le 19740426

La présente invention a trait à un médicament biologique dépresseur de l'immunité et à son procédé de préparationo Le médicament selon l'invention permet d'obtenir une dépression efficace du système immunologique, notamment en inhibant les agents de l'immunité tissulaire. Le médicament selon l'invention est donc particulièrement indiqué pour le traitement su rejet des greffes ainsi que pour le traitement des maladies immunitaires à support cellulaire. L'invention a pour objet un médicament dépresseur de l'immunité, caractérisé par le fait qu'il comporte des globulines et notamment des gamma-globulines immuno-dépressives extraites du tissu placentaire, notamment du tissu placentaire humain. Les gamma-globulines extraites selon l'invention du tissu placentaire, sont différentes des gamma-globulines habituelles que l'on obtient à partir du sang ou du sérum placentaire, que l'on dénomme généralement "gamma-globulines placentaires", et qui ne possèdent sensiblement pas d'effet immuno-dépresseur. Au contraire, les gamma-globulines du médicament selon l'inven- tion sont fixées directement sur le tissu placentaire et n'en sont pas séparées par les techniques usuelles d'obtention des "gamma-globulines placentaires". Le terme "extraction" dans la présente invention veut donc dire rupture d'une liaison directe entre la globuline et le tissu. Les gamma-globulines du médicament selon l'invention sont de préférence extraites du tissu placentaire, convenablement lavé ; elles sont obtenues par traitement du tissu à l'aide d t un tampon à pH acide. Les gamma-globulines du médicament selon l'invention sont de préférence présentées comme un sérum thérapeutique à usage humain. Ces gamma-globulines présentent én outre les caractéristiques suivantes Elles réagissent et précipitent avec un sérum de lapin ou de mouton anti-gamma-globulines humaines. Elles présentent une cytotoxicité nulle ou très faible pour les lymphocytes humains en présence de complément. D'autre part, elles ont des propriétés inhibitrices de l'immuno-cyto-adhérence, ce qui peut être v rifié par le test des rosettes, qui consiste à observer la formation des rosettes, c'est-à-dire l'agglutination de globules rouges de mouton autour de lymphocytes humains en présence de complément de cobaye. L'invention a également pour objet un procédé de préparation du médicament, caractérisé par le fait que l'on lave du tissu placentaire divisé ou broyé, que l'on extrait ensuite les gamma-globulines fixées sur le tissu, que l'on sépare les gamma-globulines extraites d'avec les éléments tissulaires, à la suite de quoi on peut conditionner les gamma-globulines en doses médicinales. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, on effectue avant l'extraction plusieurs lavages successifs du tissu placentaire broyé provenant d'un mélange de placentas en nombre suffisant pour présenter l'ensemble des spécificités tissulaires souhaitées. Le liquide du dernier lavage effectué ne contient sensiblement plus de protéines. On effectue ensuite une élution, à pH acide, des anticorps de transplantation fixés sur le tissu placentaire lavé. L'extraction des gamma-globulines est réalisée en traitant le tissu par du tampon glycine-HCI, de préférence à un pH compris entre 2 et 3. Le traitement qui dure environ pendant 30 mn, steffec- tue à une température comprise de préférence entre 10 et 380C et par exemple à 370cl L'extraction d'immuno-globulines par élution peut être renouvelée plusieurs fois de suite sur le tissu placentaire. Après élution, on procède rapidement à la séparation des gamma-globulines contenues dans l'élut acide, par les procédés physico-chimiques usuels (précipitation à 'méthanol ou à l'acide polyphosphorique par exemple). On ramène ensuite le pH du milieu contenant les immuno-globulines à une valeur sensiblement neutre et on procède à une ou plusieurs dialyses. L'éventuel précipité résiduel est éliminé par centrifugation. De façon avantageuse, on peut ensuite reconcentrer la préparation d'immuno-globulines en ajoutant de l'éthanol, puis effectuer une ou plusieurs dialyses successives permettant de purifier les gamma-globulines. Les préparations, provenant des différentes extrac ions, peuvent, soit être rassemblées pour être incorporées dans un même médicament, soit être utilisées distinctement pour réaliser des médicaments séparés. On va maintenant décrire de façon détaillée, à titre d'exemple non limitatif, un mode de mise en oeuvre 2O1 l'invention ainsi q les propriétés du médicament obtenu. La matière de départ est constituée par un mélange de 30 placentas frais, non congelés, conservés à +40C dans du tampon PBS (NaCI : 8gr - KCI : 0,2 g - Na2HPO4 [2H2O]: 1,44gr KH2P04 : 0,2 gr - eau distillée q.s.p. 1 Litre). Cette matière est broyée, ce qui permet de déparer 8,8 kilos de matière tissulaire et 6 litres de sang placentaire. On effectue ensuite un lavage en tampon PBS, à raison de quatre litres de tampon par kilogramme de tissu placentaire, de sorte que le poids de la matière tissulaire se trouve ramené à 7,8 kilogrammes après lavage. On effectue ainsi cinq lavages consécutifs; Au dernier lavage, le liquide de lavage ne contient pratiquement plus de prctéines. Après le dernier lavage, le poids de matière tissulaire se trouve réduit à 5 kilogrammes. On effectue alors une première extraction à pH 2,2 par mélange de 5 kilogrammes de tissu lavé avec 20 litres de tampon glycine-HCI et agitation modérée pendant 30 mn à 370C. Le tampon glycine-HCI utilisé se compose, pour 1 litre, d'un mélange de deux solutions dans les proportions suivantes 420 ml d'une solution de HCI (0,1 M) dilué au 1.120 et 580 ml d'une solution salée (Glycocolle : 4,3 gr - NaCI: 3,39 gr Eau distillée q.s.p. 580 ml). On effectue ensuite une centrifugation permettant de séparer 20 litres de premier surnageant et 4,8 kilos de matière tissulaire. Le pH du premier surnageant est remonté par du tampon Tris HCI, pH 10, comprenant pour 1 litre de solution : Tris hydroxyméthylaminotéthane 0,1 M (12,1 g) ; eau distillée q.s.p. 1 litre ; HCI q.s.p. pH 10. On élimine le précipité qui se forme et l'on obtient une solution de 29 litres environ, à laquelle on ajoute de l'méthanol jusqu'à une concentration de 40%. On obtient ainsi 210 grammes de précipité que l'on recueille et que l'on dialyse tout d'abord contre de liteau, puis contre du tampon PBS. On effectue ensuite à nouveau une dialyse contre de l'eau et l'on obtient finalement 0,200 1 à 7,32 grammes de gammaglobulines par litre. Les 4,8 kilos de matière tissulaire précipitée subissent une seconde extraction à pH 2,2 dans du tampon glycine-HCI pendant 30 mn à 370C, selon le même processus que ci-dessus. Le second surnageant, d'un volume de 20 litres est recueilli par centrifugation et le pH est remonté à la valeur 7 par adjonction de tampon Tris HCI. On ajoute de l'éthanol jusqu'à 40 % et on effectue sur le précipité obtenu deux dialyses successives, 17une contre de l'eau, une seconde contre du tampon PBS. On obtient ainsi 20 millilitres contenant 5585 grammes de agan a-gloDulines par litre. Les gamma-globulines contenues dans cette solution sont séparées par précipitation et conditionnees dans du sérum thérapeutique usuel. Une analyse immunoélectrophorétique des gamma-globulines provenant de l'extraction révèle principalelnent la présence de gamma-globulines de type G, ainsi que celle de gamma-globulines de types A et M. On vérifie que les gamma-globulines ainsi obtenues n'ont pas d'effet lymphocytotoxique en présence d'un excès de complément de lapin. Si une activité cytotoxique est décelée, le produit peut éventuellement être soumis à une dégradation enzymatique par la pepsine ou la papaine en vue d'obtenir des fragments d'immunoglobulines Fab2 et Far2, non cytotoxiques et immunodépresseurs. Les gamma-globulines du médicament selon l'invention inhibent la réaction lymphocytaire mixte, c'est-à-dire la transformation en culture des lymphocytes humains provenant de deux organismes histo-incompatibles. La réaction lymphocytaire mixte est considérée comme l'équivalent in vitro de la réaction cellulaire induite par l'introduction d'une greffe incompatible dans un organisme. On mesure le titre inhibiteur de la préparation de gamma-globulines sur la transformation lymphoblastique en culture mixte d'un mélange de lymphocytes provenant de deux organismes donneurs différents. La mesure s'effectue par comptage en scintillation liquide de la radio-activité incorporée par les noyaux des cellules en culture'après exposition de 16 heures en présence de I uc de 3 H méthyl thymidine (activité spécifique de 100 pc/mM). Le titre inhibiteur 50 % est de 1/100 pour la préparation citée en exemple (soit 0,05 mg/ml). Les gamma-globulines selon l'invention inhibent également la transformation et la prolifération de lymphocytes humains cultivés en présence d'un antigène tel que par exemple la tuberculine ou différents autres antigènes. Les gamnia-globulines selon l'invention inhibent également à cncentrations plus élevées que dans les tests précédents la transformation et la proliferation de lymphocytes humains induits par des mitogènes tels que par exemple la phytohémagglutînine. Le médicament selon l'invention est particulièrement adapté aux traitements préventifs des rejets de greffes chez I'homme, ainsi qu'aux traitements des maladies auto-immunes. Dans une variante avantageuse de l'invention, le médicament peut en outre être associé à dlautres agents izmuno- dépresseurs tells que le sérum antilymphocytaire préparé par immunisation de l'animal à l'aide de lymhocytes d'origine humaine ou simienne ou tels que les agents chimiques immuno dépresseurs. La dose de gamma-globulines placentaires immunodépressives, selon linvention, administrable à un homme adulte peut être, à titre de simple exemple, de l'ordre de 500 mg par jour, pendant plusieurs jours. Dans la pratique, cette dose dépend des affections traitées, ainsi que de l'utilisation thérapeutique concomitante de drogues immunodépressives telles que le sérum antilymphocytaire ou les immunodépresseurs chimiques. Le produit peut être utilisé pour la perfusion intraartérielle des organismes transplantés au moment de la greffe et dans lus suites opératoires, puis il peut être administré par voie parentérale. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée, et qu'on peut lui apporter différentes modifications de forme ou de matériaux sans pour cela s'éloigner ni de son cadre ni de son esprit. REVENDICATIONS 1. Médicament dépresseur de l'immunité, caractérisé par le fait qu'il eomporte des gamma-globulines humaines immunodépressives extraites du tissu placentaire. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les gamma-globulines sont extraites par élut ion du tissu placentaire humain. 3. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les gamma-globulines réagissent avec un sérum animal anti-gamma-globulines humaines présentent une lymphocytotoxicité pratiquement nulle, inhibent la transformation lymphoblastique des lymphocytes humains stimulés par la phytohémagglutinine et par divers antigènes, et inhibent la transformation lymphoblastique des lymphocytes humains histo-incompatibles en culture mixte. 14. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que les gamma globulines sont extraites par élution à partir d'un mélange de placentas humains divisés et traités à l'aide d'un tampon glycine-HCI. 5. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que les gamma-globulines sont contenues dans un sérum thérapeutique utilisable chez l'homme. 6. Médicament selon l'une quelconque des revendication 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il se présente sous forme de dose humaine contenant environ 500 mg de protéines. 7. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comprend également au moins un autre agent immunodépresseur. 8. Médicament selon la revendication 7, caractérisé par le fait qu'il contient un sérum antilymphocytes humains. 9. Procédé de préparation du médicament selon lune quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que l'on lave des tissus placentaires divisés ou broyés, que l'on extrait ensuite les gamma-globulines fixées sur le tissu et que l'on sépare les gamma-globulines extraites d'avec les éléments tissulaires. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on effectue l'extraction à l'aide d'un tampon pH acide (2 à 3,5). 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'extraction dure environ trente minutes. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait que l'extraction s'effectue à une température de l'ordre de 370C. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé par le fait qu'après l'extraction on sépare les gamma-globulines d'avec les éléments tissulaires par centrifugation. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que l'on remonte ensuite le pH du surnageant à une valeur sensiblement neutre, que l'on ajoute de l'éthanol et que l'on effectue au moins une dialyse pour concentrer les gamma-globulinoe. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, caractérisé par le fait que le lavage du tissu placentaire s'effectue à l'aide d'un tampon PBS. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé par le fait que l'on effectue plusieurs lavages successifs.