Brevet FR2183679A1 — publié le 19731221

La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant une nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée, injectable par voie intraveineuse et un procédé de sa préparation, cette immuno-sérum-globuline pouvant être administrée par voie intraveineuse dans un but thérapeutique chez l'homme. On ne peut administrer les préparations ordinaires de y-globulines par voie intraveineuse, car cette administration provoque des réactions assez fréquentes, en particulier chez les sujets présentant une agammaglobulinémie. On a associé ces réactions à la baisse de la teneur en complément du sérum, qui est apparemment due à la fixation du complément par la y-globuline administrée, voir S. Barandum et Coll. Vox Sang. 7, 157-174 (1962). L'aptitude des y-globulines à fixer le complément, c'est-à-dire leur pouvoir anticomplémentaire, augmente considérablement du fait de la dénaturation provoquée par le fractionnement, en particulier par l'agglomération en variétés de poids moléculaire élevé. Le mécanisme de fixation du complément de ces agglomérats semble entre identique à celui des complexes antigèneanticorps, voir D.M. Marcus, J.Immunol. 84, 273-284 (1960). Lorsqu'on sépare les agglomérats par ultracentrifugation à 100 000 x g, on obtient un produit à faible activité anticomplémentaire dont l'injection intraveineuse est bien tolérée, voir Barandum et Coll. supra. On a réalisé diverses tentatives pour rendre sans danger l'administration intraveineuse des y-globulines. Toutes ces tentatives reposent sur l'élimination de l'activité anticomplémentaire. L'ultracentrifugation (précédemment citée) est impossible du point de vue technique et on peut s'attendre à ce que le produit ainsi obtenu reprenne son activité anticomplémentaire pendant le stockage. Le traitement enzymatique d'une y-globuline par la pepsine à pH 4 provoque un clivage protéolytique de la molécule en donnant un fragment ayant un poids moléculaire d'environ 100 000 qui a un coefficient de sédimentation lors de l'ultracentrifugation d'environ 5S, voir A. Nisonoff et Coll. Science; 132, 1770-1771 (1960).Bien que ce fragment survivant conserve une activité bivalente d'anticorps et ne présente pas d'activité anticomplémentaire et soit bien toléré et efficace par administration par voie intraveineuse, voir W. Baumgarten, Vox Sang. 13, 84 (1967), lteffet thérapeutique obtenu a une durée trop brève pour convenir car il est excrété rapidement, sa demi-vie de circulation n'étant que de 18 heures, peut-être un peu plus longue chez les sujets atteints d'agammaglobulinémie, tandis que la y-globuline non modifiée a une demi-vie dans la circulation de 19,8 jours5 voir E. Merler et Coll. Vox Sang. 13, 102 (1967); B. Jager, Arch. Intern. Med. 119, 60 (1967). Bien que cette demi-vie considérablement réduite de la 7-globuline traitée par la pepsine soit probablement due en partie à la diminution considérable de la taille de la molécule, des indices permettent de penser que la vitesse de catabolisme de la r globuline est liée à des propriétés spécifiques de la portion de la molécule digérée par la pepsine, J.L. Fahey et Coll. J. Exper. Med., 118, 845-868 (1963). Cette portion de la molécule demeure intacte dans l'invention. Un autre inconvénient du traitement par la pepsine est que la pepsine qui demeure présente est d'origine animale et peut stimuler la production d'anticorps, en particulier par administration répétée : C. Blatrix et Col. Presse Med. 77, 635-637 (1969).L'utilisation de plasmine d'origine humaine supprime cette difficulté et constitue le fondement d'un autre procédé de préparation d'une y-globuline injectable par voie intraveineuse. Le traitement de la 7-globuline par la plasmine humaine provoque un clivage en trois composants ayant un poids moléculaire d'environ 50 000 : J.T. Sgouris, Vox Sang. 13, 71 (1967). Lorsqu'on utilise des teneurs suffisamment faibles en plasmine, 15% seulement environ des molécules sont clivés et 85% de la 7-globuline demeurent intacts : Sgouris supra. La Y- globuline intacte demeurant non digérée présente une faible activité anticomplémentaire et on l'a administrée par voie intraveineuse sans réaction défavorable : J Hinman et Coll. Vox Sang. 13, 85 (1967). Le produit ainsi préparé semble conserver in vitro et in vivo son activité protectråce : F.K. Fitzpatrick, Vox Sang, 13, 85 (1967). Un des inconvénients de ce procédé est qu'on ne peut éliminer complètement la plasmine, si bien que la dégradation se poursuit même lorsqu'on conserve le produit à 40C. f f On a constaté que l'incubation de r-globuline à pH 4,0 à 370C pendant des durées diverses abaisse l'activité anticomplémentaire à de faibles valeurs. On a suggéré que ceci était dû à la présence de petites quantités d'enzyme sérique constituant une impureté de la y-globuline : Blatrix et Coll. supra. Comme dans le cas d'une y-globuline traitée par la plasmine, cette y-globuline traitée à pH 4,0 s'est révélée reprendre son activité anticomplémentaire lors du stockage à une vitesse qu'il est impossible de prévoir, si bien qu'il est nécessaire d'évaluer l'activité anticomplémen taire avant l'administration à un malade : J. Malgras et Coll.,Rev. Franc. Trans., 13, 73 (1970). La Y globuline traitée à la plasmine, Hinman et Coll. supra et la y-globuline incubée à pH 4,05 H. Koblet et Coll., Vox Sang. 13, 93 (1967); J.V. Wells et Coll. Austr. Ann. Med. 18, 271 (1969) présentent in vivo des demi-vies plus faibles que la Y globuline non modifiée. Par exemple, la demi-vie chez le sujet normal de la y-globuline incubée à pH 4,0 est d'environ 14 jours, Koblet et Coll. supra5 tandis que le produit traité par la plasmine a une demi-vie de 16 jours, Merler et Coll. supra. Le Centre National de Transfusion Sanguine (C.N.T.S.) de Paris, par fractionnement rigoureux et filtration de 7-globuline d'un plasma frais choisi, a produit une y-globuline injectable par voie intraveineuse ayant une faible activité anticomplémentaire : Blatrix et Coll., supra; ibid., Presse Med. 77, 159-161 (1969); M. Steinbuch et CoL1., Vox Sang. 13, 103 (1967). Ce produit ne semble pas totalement dépourvu d'activité anticomplémentaire et on doit l'administrer avec précautions et certains malades présentent des réactions. On peut administrer de la cortisone avant l'injection pour supprimer ces réactions, mais l'élimination apparemment incomplète de l'activité anticomplémentaire semble gener la généralisation de l'emploi de ce produit. Les effets sur l'activité anticomplémentaire de la réduction des liaisons disulfures de la y-globuline suivie d'une réaction avec l'iodoacétamide ont été étudiés dans l'art antérieur. S. Barandum et Coll., supra indiquent qu'en traitant une solution à 7% de 7-globuline avec de la cystéamine 0,2M puis de l'iodoacétamide 0,2M, on obtient une perte presque complete de l'activité anticomplémentaire, tandis que le traitement avec la cystéamine ou l'iodoacétamide seul ne diminue pas de façon significative l'activité anticomplémentaire. Par suite de la toxicité de l'iodoacétamide, ces chercheurs n'ont pas poursuivi leur tentative d'obtention d'une 7-globuline injectable par voie intraveineuse. De façon semblable, Wiederman et Coll., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 609-613 (1963) ont montré qu'en traitant une y-globuline avec du mercaptoéthanol 0,lM puis dialyse prolongée contre de l'iodoacétamide 0,02M, on obtient une solution qui, lorsqu'on la mélange avec un antigène, ne fixe pas le complément. L'activité anticomplémentaire des y-globulines traitées et non traitées était absente lorsqu'on les testait selon leur technique d'essai insensible. Ces chercheurs également n'indiquent pas qu'ils aient tenté d'obtenir, selon cette technique, une 7- globuline injectable par voie intraveineuse. Dans l'art antérieur, on a abondamment démontré que le mercaptoéthanol, J.B. Fleischman et Coll. Arch. Biochem. et Biophys. Supp. 1, 174 180 (1952) et la mercaptoéthylamine, G.M. Edelman, J. Am. Chem. Soc. 81, 3155 (1959)3 à des-concentrations molaires élevées sont capables de réduire les liaisons disulfures réunissant les chaînes de la 7- globuline. Les liaisons disulfures,qui sont les plus labiles par réduction avec un thiol, semblent être associées à la fixation du complément, tandis que les liaisons disulfures,qui sont les plus résistantes à la réduction par un thiol r sembleat être liées à l'interaction avec un antigène P.H. Schur et Coll. J. Exp. Med., 120, 531 (1964).Les inconvénients inhérents à l'utilisation de concentrations élevées (0,1 - 0,5M) de thiols pour réduire les liaisons disulfures réunissant les chaînes d'une 7 globuline disparaissent lorsqu'on utilise comme agent réducteur du dithiothréitol (DTT) à des concen trations limitées : W.W. Cleland, Biochem. 3, 480 (1964). Comme le DDT est oxydé de façon irréversible en formant un cycle hexagonal stable, on peut utiliser des quantités pratiquement stoechiométriques de cet agent réducteur, ce qui évite l'utilisation d'un grand excès de thiol. On obtient une réduction pratiquement complète des liaisons disulfures réunissant les chaines d'une y-globuline humaine par action d'une solution 0,0125M de DTT sur une solution de Sy-globuline à 2%; P. Gunewardena et Coll. Biochem. Journ. 99, 8 (1966). Cependant, on n'a pas signalé la conséquence de cette réduction et de l'aîkylation ultérieure par l'iodoacétamide sur la teneur en anticorps. Malgré ces recherches poussées tendant à modifier une immuno-sérum-globuline de façon à éliminer complètement son activité anticomplémentaire, il ne semble pas qugil existe d'immuno-sérum-globuline modifiée commercialisable qui : (a) soit entièrement dépourvue d'activité anticomplémentaire présente et latente, (b) présente pratiquement la demi-vie biologique et l'activité d'anticorps de 1'immuno-sérum-globuline non modifiée et (c) soit dépourvue de produits réactionnels non protéiques et soit sous une forme pratiquement pure convenant à l'injection intraveineuse. L'invention concerne des compositions pharmaceutiques convenant à l'administration intraveineuse renfermant une nouvelle immunosérum-globuline modifiée pratiquement pure injectable par voie intraveineuse qui est pratiquement dépourvue d'activité anticomplémentaire présente et latente et qui a pratiquement la demi-vie biologique et l'activité d'anticorps de l'immuno-sérum-globuline non modifiée. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont constituées, dans un support aqueux convenant en pharmacie adapté à l'administration intraveineuse, d'une nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée prati quement pure, injectable par voie intraveineuse dont pratiquement toutes les liaisons disulfures,réunissant les chaînes lourdes et légères et jusqu'à 4 liaisons disulfures au total, sont remplacées par des paires de radicaux -S-CH2CONH2, les chaînes légères demeurant unies aux chaînes lourdes par une association non covalente, si bien que le poids moléculaire apparent dans les solvants non dissociants est pratiquement le même que celui de l'immunosérum-globuline non modifiée.Cette sérum-globuline est pratiquement dépourvue d'activité anticomplémentaire présente et latente et a pratiquement la demi-vie biologique et l'activité d'anticorps de l'immuno-sérum-globuline non modifiée, comme le montrent les essais sérologiques,et on l'obtient par réduction sélective de pratiquement la totalité des liaisons disulfures réunissant les chaînes et de jusqu'à 4 liaisons disulfures au total avec du dithiothréitol dilué; en alkylant avec de l'iodoacétamide les radicaux mercapto ainsi obtenus de l'immuno-sérum-globuline réduite;et en séparant l'immuno-sérum-globuline alkylée des produits réactionnels non protéiques. On administre la sérum-globuline ainsi modifiée et purifiée par voie intraveineuse dans un support convenant en pharmacie adapté à l'administration intraveineuse. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation et en se référant aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 représente un graphique montrant le rapport entre le nombre des groupes -SH bloqués et le titre anticomplémentaire obtenu de la nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée, lorsqu'on conduit la réaction de modification à diverses concentrations de dithiothréitol et diverses durées réactionnelles; et - la figure 2 représente un graphique comparant la distribution de la taille moléculaire déterminée par chromatographie par perméation de gel de l'immuno-sérum-globuline de départ utilisée dans l'exemple l(b) avec celle de la nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée (voir tableau page 24 ). La nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée injectable de l'invention est caractérisée en ce qu'elle présente des caractéristiques physiques et des fonctions biologiques pratiquement inchangées, si ce n'est l'activité anticomplémentaire, mais qu'elle se distingue du point de vue chimique par le remplacement de pratiquement la totalité des liaisons disulfures réunissant les chaînes et de jusqu'à 4 liaisons disulfures environ au total avec un nombre identique de paires de groupes -S-CH2CONH2, la molécule d' immuno-sérum-globuline étant, sinon, pratiquement inchangée. La réduction de ces liaisons disulfures spécifiques et l'alkylation ultérieure des radicaux mercapto ainsi obtenus éliminent pratiquement l'activité anticomplémentaire.La réduction des radicaux disulfures est nécessaire à l'élimination de l'activité de fixation du complément et l'alkylation des radicaux mercapto ainsi obtenus empêche la réapparition de l'activité anticomplémentaire. Comme les réactions de réduction sélective et d'alkylation de l'invention affectent les liaisons disulfures réunissant les chaînes et laissent les liaisons disulfures à l'intérieur des chaînes pratiquement inaltérées, la molécule de protéine n'est pas fragmentée et l'activité d'anticorps de l'immunosérum-globuline demeure pratiquement intacte. Le fait que le reste de la molécule soit pratiquement inchangé conserve également la demi-vie biologique de l'immuno-sérumSglobuline modifiée après injection chez l'homme. Produit de départ. Le produit de départ dans le procédé de l'invention est une immuno-sérum-globuline humaine non modifiée. On entend ici par immuno-sérum-globuline une substance qu'on appelle également, de façons diverses dans la littérature,gamma-globuline, y-globuline, IgG et immuno-globuline G. Elle est constituée essentiellement et, de préférence, d'au moins environ 85% de la variété 7S de y-globuline qui a un poids moléculaire d'environ 160 000. Le reste éventuel est constitué, de préférence, de la variété 9S qui a un poids moléculaire d'environ 300 000. On peut utiliser des immuno- et hyper-immuno-sérum-globuîines telles que des immuno-sérum-globulines antitétaniques et antirabiques, le produit modifié étant respectivement constitué d'immuno- et dthyper-immuno-sérum-globuline. Ainsi, un produit de départ approprié au procédé de l'invention est constitué par la fraction II de Cohn (figures 5 et 6) (voir Cohn E.J. et Coll. J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946); ibid. 71, 541 (1949)). La fraction II, comme le montre l'ultracentrifugation, est essentiellement constituée (environ 85%) de la variété 7S (ayant une constante-de sédimentation de 7), c'est-à-dire d'une y-globuline ayant un poids moléculaire moyen de 160 000. La fraction restante est essentiellement constituée de la variété 9S ayant un poids moléculaire d'environ 30Q 000. On lyophilise couramment une pâte humide de la fraction II (ayant une teneur en solides d'environ 30%) en obtenant une poudre dtimmuno sérum-globuline sèche qu'on dissout et qu'on prépare pour l'injection intramusculaire sous forme d'une solution stérile à 16,5%.La pâte humide de la fraction II ou la poudre sèche d'immuno-sérum-globuline (avant ou après dissolution dans un véhicule aqueux approprié) constitue un produit de départ approprié au procédé de l'invention. On peut utiliser,comme produit de départ dans le procédé de modification chimique de l'invention, une y-globuline obtenue selon un procédé quelconque présentant pratiquement la même composition en constituants protéiques que la fraction II de Cohn. Selon le procédé de modification chimique de l'invention, on peut éliminer pratiquement totalement l'activité anticomplémentaire du plasma sanguin ou du sérum total. On peut utiliser, comme matière de départ, une immunoou une hyper-immuno-sérum-globuline classiques. Comme on le sait, on obtient une hyper-immuno-sérum-globuline à partir du plasma ou du sérum de donneurs choisis dont le titre en un anticorps spécifique est bien supérieur à celui de la moyenne de la population. Ces donneurs, soit ont été récemment immunisés avec un vaccin particulier, soit viennent de guérir d'une infection ou d'une maladie. On regroupe ces sérums ou plasmas à titre élevé et on les soumet à un fractionnement classique selon la méthode de Cohn pour isoler la fraction 11. Les standards biologiques concernant les anticorps pour les hyper-immunosérum-globulines correspondent actuellement à des produits administrés par voie intramusculaire.Ces standards reposent sur l'administration d'une dose intramusculaire standard (1 à 10 ml) de globuline reconstituée. Comme la quantité d'anticorps nécessaire pour obtenir une réponse immunologique donnée est nettement inférieure lors d'une administration intraveineuse, il est évident que la dose intraveineuse est nettement inférieure à la dose intramusculaire apportant le même titre sérique en anticorps. Donc, la dose d'administration intramusculaire d'immuno- et d'hyper-immuno-sérum-globulines doit être supérieure à celle utilisée pour obtenir le même titre sérique en anticorps lorsqu'on utilise une globuline présentant la même activité d'anticorps par voie intraveineuse. On dissout la pâte humide ou la poudre lyophilisée de départ dans un volume d'eau, de préférence dans une solution aqueuse .de glycine et de chlorure de sodium, en obtenant une solution protéique à la concentration désirée, généralement de 1 à 20%, par exemple de 3, 5, 10 et 16,5%, de préférence d'environ 5%. De façon surprenante, tandis que les solutions d'immuno-sérum-gîobulines non modifiées sont particulièrement stables à des concentrations élevées, par exemple de 16 à 18%, les solutions des nouvelles immuno-sérum-globulines modifiées de l'invention sont stables à des concentrations nettement inférieures5 par exemple de 10%. La glycine et le chlorure de sodium ne sont pas indispensables mais on les incorpore de préférence pour favoriser la stabilisation de la solution protéique.La glycine peut être à une concentration quelconque pouvant atteindre environ 1,OM. La solution de chlorure de sodium est de préférence à une concentration d'environ 0,075M. Après dissolution de la protéine, on ajuste la solution au pH modérément alcalin désiré, par exemple d'environ 7,2 à 9, de préférence d'environ 8,0 à 8,6 et, mieux, d'environ 8,0 à 8,2, en ajoutant de l'hydroxyde de sodium ou une autre base. Si, dans ce stade, la solution n'est pas limpide, on la clarifie de préférence avant le stade de réduction. Stade de réduction. Dans le premier stade du procédé de l'invention, on réduit, par du dithiothréitol, les liaisons disulfures réunissant les chaînes de l'immuno-sérum-globuline de départ. On réalise ceci de façon pratique en réduisant au total environ 2,5 à environ 4, de préférence 2,5 à 4 et, mieux, environ 2,8 à 3,8 liaisons disulfures avec au moins environ 2,5, par exemple 2,5 à 50 et, de préférence, environ 4 à 6 et tout particulièrement environ 5 à 6 équivalents molaires de l'agent réducteur. Sur la figure 1, le nombre des groupes mercapto est représenté en ordonnées et la concentration en dithiothréitol est représentée en abscisses. Les courbes correspondent à une réduction de llimmuno-sérum- globuline en solution à 5% par le dithiothréitol. La courbe (#) correspond à un traitement par l'iodoacétamide de 10 mn et la courbe (tel) à 60 mn. La courbe (O ) correspond à un traitement par le 14C-iodoacétamide pour une durée de réduction de 10 mn et la courbe (o ) pour 60 mn. La courbe (---) correspond au titre 1 anticomplémentaire. Comme le montre la figure 1, on peut éliminer l'activité anticomplémentaire présente et latente par réduction sélective suivie d'une alkylation d'environ 3 des liaisons disulfures réunissant les chaînes par molécule d'immuno-sérum-globuline. La réduction et l'alkylation d'environ une liaison disulfure nta pas d'effet apparent sur l'activité de fixation du complément de 1' l'immuno-sérum-globuline. La réduction d'en moyenne 2,5 radicaux disulfures diminue considérablement l'activité anticomplémentaire. Cependant, pour éliminer pratiquement totalement l'activité anticomplémentaire, il est généralement nécessaire de réduire d'environ 2,8 radicaux disulfures ou plus. La réduction de 3 à 4 liaisons disulfures n'a pas d'effet nuisible et un tel taux de réduction et d'alkylation permet d'obtenir avec certitude l'élimination complète désirée de l'activité anticomplémentaire présente et latente sans provoquer de réduction des liaisons disulfures moins réactives à l'intérieur des channes qui sont indispensables à l'activité biologique. La réduction et l'alkylation de plus de 4 liaisons disulfures n'apportent pas d'amélioration de la 7-globuline pour administration intraveineuse et, en pratique, entrai- nent une suppression partielle ou complète de activité biologique. On obtient la réduction sélective désirée de pratiquement la totalité des liaisons disulfures réunissant les chaînes en combinant la concentration du dithiothréitol dans le mélange réactionnel, la proportion molaire du dithiothréitol par rapport à la protéine de départ et la durée, la température et le pH de la réaction. On conduit le stade de réduction à la température ordinaire ou en chauffant ou refroidissant modérément, par exemple entre environ O et 40 C, de préférence entre 20 et 350C et, mieux, en opérant à la température ordinaire. Aux températures inférieures à la température ordinaire, il est nécessaire d'utiliser des concentrations plus importantes de dithiothréitol pour obtenir le meme degré de réduction. Des analyses indirectes montrent qu'à la température ordinaire, à pH 8,2 et pour une concentration en protéines de 5%, environ 60% du DTT (pour une concentration de 0,0015M) ont réagi en 10 mn et 65% en 60 mn. Ces valeurs indiquent que l'importance de la réaction dans des conditions données de pH-et de concentration en protéines et en DTT dépend essentiellement de la durée réactionnelle.On peut donc conduire la réaction pendant une durée appropriée quelconque, par exemple d'environ 2 mn à 2 h ou plus. A des températures supérieures à la température ordinaire, on peut utiliser la quantité théorique nécessaire de dithiothréitol pour obtenir le degré de réduction désiré ou, si on utilise un excès, on peut suivre la réaction et l'arrêter en détruisant excès d'agent réducteur, lorsque l'on a atteint le nombre de radicaux mercapto désirés. On conduit de préférence la réduction à un pH modérément alcalin, par exemple d'environ 7,2 à 9, de préférence d'environ 8 à 8,6. Pour un pH plus bas, la vitesse réactionnelle des agents de réduction et d'alkyla- tion diminue considérablement. A un pH inférieur à 8, des températures quelque peu tÇJies > des durées réactionnelles plus longues et/ou des concentrations plus importantes en dithiothréitol sont nécessaires. Un pH nettement plus élevé tend à dénaturer l'immuno-sérum-globuline. On préfère utiliser un tampon convenant en physiologie pour maintenir le pH désiré car 11 élimination complète ultérieure a moins d'importance. On peut ajouter le dithiothréitol sous forme d'une solution à la solution protéique ou opérer dans le sens inverse ou sous forme d'un solide mouton ajoute à la solution protéique. Sinon, ce qui est moins souhaitable, on peut dissoudre la protéine dans la solution de dithiothréitol ou mélanger à sec la protéine et le dithiothréitol, puis les dissoudre simul tanément dans le solvant réactionnel aqueux en réalisant la concentration protéique désirée, par exemple d'au moins environ 1% et de préférence d'environ 5 à 18%. On peut suivre l'avancement de la réaction, si on le désire, en déterminant le dithiothréitol résiduel dans le mélange réactionnel. Lorsqu'il n'y a plus de consommation d'agent réducteur, la réaction est achevée. On peut commodément conduire la réaction dans l'air. Ceci provoque lauto-oxydation d'une petite proportion de dithiothréitol qu'on compense en utilisant une quantité un peu supérieure au rapport molaire théorique. Si on le désire, on peut également conduire la réaction dans une atmosphère inerte, par exemple d'azote. La proportion molaire du dithiothréitol à la protéine utilisée dépend en partie de la concentration en protéines du mélange réactionnel, du pH, de la durée réactionnelle, de la température réactionnelle et de l'atmosphère réactionnelle. Théoriquement, au moins un équivalent molaire de DTT est nécessaire pour réduire une liaison disulfure par mole de protéine et produire deux groupes mercapto. Donc, la quantité minimale théorique de dithiothréitol nécessaire pour réduire chaque liaison disulfure correspond au moins à un équivalent molaire.Puisque, comme précédemment indiqué (voir également la figure 1), la réduction d'environ 3 liaisons disulfures et l'alkylation ultérieure des radicaux mercapto sont nécessaires à l'élimination de l'activité anticomplémentaire, au moins 3 équivalents molaires de DTT sont nécessaires pour éliminer pratiquement l'activité anticomplémentaire, même dans les conditions optimales. Dans le procédé de l'invention, on utilise environ 2,5 à 50 équivalents molaires, de préférence au moins environ 3 et généralement moins de 10, par exemple de 4 à 6 et tout particulièrement environ 5 équivalents molaires de dithiothréitol pour obtenir la réduction désirée dans une durée raisonnable dans les conditions préférées de concentra tion protéique, de pH et de température réactionnelle. Pour un poids moléculaire moyen de 160 000, la molarité de la solution protéique de départ à 5% est d'environ 3 x 10 M. Donc, pour obtenir le degré désiré de la réduction des groupes disulfures, on doit ajouter suffisamment de dithiothréitol à la solution protéique à 5% pour obtenir une concentration d'environ 5 x lO M à 25 x 104M et, de préférence, voisine de 15 x 10 M. On conduit commodément la réaction de réduction dans l'air, ce qui est le cas des exemples décrits ci-après. Comme une partie du dithiothréitol est oxydée par l'air, on peut utiliser des quantités de dithiothréitol plus voisines de la quantité théorique si on conduit la réaction sous azote ou sous une autre atmosphère inerte. Comme on peut achever le stade de réduction à un moment quelconque en détruisant le dithiothréitol demeurant dans le mélange réactionnel, dans la plupart des conditions réactionnelles, on peut utiliser une concentration en dithiothréitol nettement supérieure à la quantité théorique nécessaire pour obtenir le degré désiré de réduction, par exemple un excès de 5 à 1200% et de préférence de 10 à 100%, en arrêtant la réaction lorsqu'on a atteint le degré désiré de réduction. Lorsqu'on utilise des excès molaires très importants de dithiothréitol, on préfère une température réactionnelle plus faible, par exemple de O à 5"C et/ou un pH plus faible, par exemple de 7,2 à 7,8 pour maintenir la sélectivité réactionnelle.Lorsque la molarité du dithiothréitol est inférieure à 1,6 x 10 M environ, on peut généralement conduire la réduction de la solution protéique à 5% pendant environ 1 h avant qu'il se produise une réduction de plus de 3 radicaux disulfures par molécule. Pour une concentration d'environ 1,6 à 1,8 x 103M, on doit généralement arrêter la réaction dans les 30 mn environ. Pour des concentrations plus élevées en dithiothréitol, par exemple de 2,0 à 2,5 x 10 M, on doit arrêter la réaction dans les 5 à 15 mn. Ces durées réactionnelles sont réduites lorsqu'on opère à des températures supérieures à la température ordinaire et, inversement, augmentent à des températures inférieures à la température ordinaire. Egalement, pour des concentrations protéiques autres que 5% et des pH autres que 8,0 à 8,6 environ, on doit ajuster la durée réactionnelle lorsqu'on utilise un excès de dithiothréitol. On admet ci-après que la molarité de la solution protéique est telle que la quantité de dithiothréitol présente dans le mélange réactionnel soit en excès par rapport à celle nécessaire pour réduire en moyenne 4 radicaux di sulfures par molécule, ce qui correspond à la réduction maximale dans le procédé de l'invention. Si on le désire, on peut déterminer,avec une portion de l'immuno-sérum-globuline de départ, la quantité exacte de DTT nécessaire pour réduire le nombre préféré de liaisons disulfures qui est voisin de 3, correspondant par exemple à 2,8 à 3,8 et obtenir ainsi en moyenne de 5,6 à 7,6 radicaux mercapto par molécule dans les conditions réactionnelles choisies. Dans ce cas, l'importance de la formation des radicaux mercapto est essentiellement indépendante de la durée réactionnelle. Généralement, le dithiothréitol sera présent dans le mélange réactionnel à une concentration d'au moins 5,0 x 10 M et généralement inférieure à 1 x 1OYM, par exemple environ 1 2 x 10 3 et, de préférence, -3 1,2 à 1,8 x 10 M, lorsqu'on réduit une solution protéique à environ 5% pendant une durée brève au voisinage de la température ordinaire. La quantité de dithiothréitol nécessaire pour obtenir cette molarité initiale peut être introduite en une seule fois ou en continu ou par portions pendant la réaction. Le rapport entre la concentration en DTT et la durée réactionnelle est illustré par la figure 1 qui montre le résultat de la réduction d'une solution à 5% dtimmuno-sérum-globuline avec du DTT à des concentrations diverses dans le mélange réactionnel. Comme le montre la figure, avec une concentration de 5% en immuno-sérum-globuline, on ne peut obtenir la réduction minimale de 2,5 liaisons disulfures en 5 radicaux mercapto par molécule pour une molarité en DTT inférieure à environ 1,0 x 10 3M, ce qui correspond à 1,3 fois la quantité théorique nécessaire, quelle que soit la durée réactionnelle. Pour obtenir 6 groupes mercapto en 1 heure, on doit utiliser une molarité d'au moins environ 1,6 x 10 M, ce qui correspond à environ 1,67 fois la quantité théorique.Sur la courbe supérieure de la figure, le nombre de radicaux mercapto formés pendant la réduction est déterminé à partir de la teneur en carboxyméthylcystéine d'un hydrolysat acide de l'immuno-sérum-globuline modifiée chimiquement. Pendant l'hydrolyse acide, les restes de cystéine alkylés par l'iodoacétamide sont transformés en carboxyméthylcystéine, si bien que le dosage de ces restes indique le nombre des radicaux mercapto alkylés. Dans la courbe inférieure, on utilise du C-iodoacétamide pour bloquer les radicaux mercapto, ce qui permet d'obtenir,par mesure de la radioactivité, le nombre de groupes alkylés. Les valeurs de la carboxyméthylcystéine sont quelque peu supérieures et on pense que ceci tient à une meilleure précision due à la nature des expériences. Un équivalent chimique évident du dithiothréitol utilisé dans l'invention est le dithioelWuitol qui est son diastéréoisomàre et, dans chacun des exemples ci-apres, on peut utiliser ces composés l'un à la place de l'autre. On transforme ensuite le produit du stade de réduction, c'est-à-dire l'immuno-sérum-globuline réduite mais ne présentant pratiquement pas d'autres modifications dont pratiquement toutes les liaisons disulfures réunissant les channes et jusqu'à 4 liaisons disulfures environ au total sont réduites en paires de radicaux mercapto, généralement sans purification ni isolement intermédiaire, en un produit final stable dans le stade d'alkylation. Stade d'alkylation Dans le stade d'alkylation, on alkyle le produit du stade de réduction avec de l'iodoacétamide pour former la nouvelle immuno-sérum-globu- line modifiée de l'invention. Dans ce stade, on utilise suffisamment d'iodoacétamide pour qu'il réagisse avec tout le dithiothréitol inutilisé et alkyle la totalité des groupes mercapto présents dans le produit réduit. On conduit généralement ce stade dans le mélange réactionnel du stade de réduction. Cependant, si on le désire, on peut isoler la protéine réduite, par exemple par précipitation et utiliser m naNeaus6LtErtaqv Pour alkyler entièrement le produit du stade de réduction, il est généralement nécessaire d'utiliser au moins deux équivalents molaires d'iodoacétamide par rapport au dithiothréitol utilisé dans le stade de réduction. De préférence, on utilise un excès molaire de 10% ou plus pour assurer une alkylation complète de la totalité du DTT résiduel et la conversion de tous les radicaux mercapto de la protéine en radicaux -S-CH2CONH2.Par exemple, si on utilise le dithiothréitol à une concentration initiale de 15 x 10 4M dans le mélange réactionnel, la molarité initiale préférée de l'iodoacétamide dans le mélange réactionnel est d'environ 33 x 10 M. On peut utiliser des excès molaires plus importants, par exemple atteignant 20 équivalents molaires, sans effets nuisibles, car on sépare l'excès d'iodoacétamide du produit alkylé après le stade d'alkylation, par exemple par précipitation de la protéine ou par dialyse. Les conditions réactionnelles sont pratiquement les mêmes que celles utilisées dans le stade de réduction, si ce n'est mouton utilise généralement des durées réactionnelles quelque peu plus longues,par exemple de 1 à 2 heures. On peut ajouter l'iodoacétamide sous forme solide ou sous forme d'une solution. Comme dans le stade de réduction, on peut suivre l'avancement de la réaction en déterminant les radicaux mercapto libres. Comme la présence de radicaux mercapto libres dans la molécule de protéine peut permettre la réapparition d'une activité anticomplémentaire, on doit débarrasser autant que possible le produit réactionnel des radicaux mercapto de façon qu'ils soient plus qu'à l'état de trace.Cette alkylation complète des radicaux mercapto empoche également l'agglomération ultérieure des molécules de y-globuline. Bien qu'on réalise dans le procédé de l'invention l'alkylation du radical mercapto produit par réduction des liaisons disulfures réunissant les chaines avec de l'iodoacétamide pour obtenir des paires de radicaux -SCH2CONH2, on peut également bloquer les radicaux mercapto par alkylation de l'immuno-sérum-globuline réduite avec d'autres agents d'alkylation pour obtenir une immuno-sérum-globuline modifiée ayant pratiquement les memes propriétés physiques et biologiques que celles dans laquelle les liaisons disulfures réunissant les chaînes clivées sont remplacées par des paires de radicaux -SCH2CONl12. On obtient une immuno-sérum-globuline modifiée dont pratiquement toutes les liaisons disulfures réunissant les chaînes sont remplacées par des paires d'autres groupes -SR et qui présente un poids moléculaire apparent essentiellement identique à celui de la sérum-globuline non modifiée, qui ne présente pratiquement pas d'activité anticomplémentaire et dont les radicaux -SR sont chimiquement stables et incapables de permettre la reformation de liaisons disulfures et dont la demi-vie biologique et l'activité d'anticorps sont pratiquement identiques à celles de l'immuno-sérum-globuîine non modifiée. Le symbole R dans le radical thioéther peut représenter un radical alkyle inférieur, par exemple méthyle, éthyle et propyle ; N,N-dialkyl inférieur carbamidoalkyle inférieur, par exemple N,N-diéthylcarbamidométhyle(-CH2CONEt2) alcoxy inférieur carbonylalkyle inférieur, par exemple éthoxycarbonylméthyle (-CH2C02C2H5), éthoxycarbonyléthyle carboxyalkyle inférieur, par exemple carboxyméthyl(-CH2C02H), carboxyéthyle cyanoalkyle inférieur, par exemple -CH2CN ; ,8-aminoalkyle inférieur, par exemple -CH2CH2NH2 et benzoylalkyle inférieur, par exemple -CH2COC6H5.On peut alkyler les radicaux mercapto en obtenant des radicaux -SR où R représente un radical alkyle inférieur, en traitant l'immuno-sérum-globuline réduite, par exemple avec de l'O-méthylisourée dans des conditions modérément alcalines, auquel cas il se forme des radicaux -SCH3. On entend ici par alkyle inférieur et alcoxy inférieur, des radicaux comportant de 1 à 4 atomes de carbone.On peut former d'autres alkylthioéthers substitués en utilisant un N,N-dialkyl-x-haloacétamide approprié, tel que C1CH2CON(C2H5)2 ; un ester haloacétique, un ester oc-halopropionique, tel que ICH2C02C2H5, ; un acide haloacétique, un acide oc-halopropionique tel que ICH2C02H, imine telle haloacétonitrile tel que ICH2CN, une alkylène un halogénure de phénacyle tel que le chlorure de phénacyle. On conduit les réactions d'alkylation dans des conditions modérément alcalines. Isolement de l'immuno-sérum-globuline modifiée. Pour obtenir un produit modifié convenant en pharmacie adapté à l'administration intraveineuse, il est nécessaire de séparer la nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée des produits réactionnels et composés réagissarjts non protéiques. Ceci peut être réalisé de diverses façons, par exemple par chromatographie d'échange d'ions, chromatographie de perméation sur gel, ultracentrifugation et de préférence par dialyse ou par précipitation de l'imminosérum-globuline, par exemple avec un solvant organique miscible à l'eau tel que le méthanol, l'éthanol, etc. Lorsqu'on obtient une solution d'immuno-sérumglobuline plus diluée qu'on ne le désire, on peut également utiliser de façon efficace l'ultrafiltration pour concentrer la solution à la concentration protéique désirée. Dans un mode opératoire préféré, de préférence apres dilution de la solution protéique avec de l'eau à une concentration en protéines d'environ 1,5%, on précipite l'immuno-sérum-globuline modifiée avec de l'éthanol, approximativement dans les mêmes conditions que dans le procédé bien connu de Cohn, pour obtenir le précipité II à partir du surnageant III. On recueille ce précipité et on le lave, de préférence au moins deux fois avec une solution tampon éthanolique dans des conditions de pH, de température et de concentration en éthanol telles que la protéine ne se redissolve pas mais qui élimine les quantités mesurables des composés réagissants résiduels et des produits non protéiques. On sèche alors le produit de façon classique, par exemple selon le procédé utilisé pour sécher la fraction II de Cohn et il est alors prêt à etre conditionné de façon stérile pour l'utilisation intraveineuse après reconstitution à la concentration protéique désirée dans un support convenant en pharmacie approprié à l'administration intraveineuse. Dans un autre mode opératoire préféré, on utilise comme produit de départ, une solution concentrée dtimmuno-sérum-globuline, par exemple à 15-18% et on dialyse le produit du stade d'alkylation jusqu'à ce qu'il soit débarrassé des composants non protéiques du produit réactionnel. On peut soumettre l'immuno-sérum-globuîine modifiée obtenue à une filtration stérile et la conditionner stérilement dans des récipients, par exemple des flacons de lOml, pour l'utiliser telle quelle ou la lyophiliser. Sinon ou pour éliminer complètement les composés réagissants, on peut de plus traiter la solution dialysée comme précédemment décrit, c'est-à-dire par précipitation de 1'immunosérum-globuline modifiée lavage du précipité et reconstitution à la concentration protéique désirée dans un support convenant en pharmacie.Lorsqu'on obtient une solution d'immuno-sérum-globuline plus diluée mouton ne le désire, on peut également utiliser de façon efficace l'ultrafiltration pour concentrer la solution à la concentration protéique désirée. Nouvelle immuno-sérum-globuline La nouvelle y-globuline de l'invention est pratiquement dépourvue d'activité anticomplémentaire présente et latente. Son poids moléculaire est pratiquement non modifié. Elle sédimente essentiellement en 7S par ultracentrifugation avec environ 10 à 15% du composant 9S qui est également présent dans une 7-globuline non modifiée produite par la méthode de fractionnement de Cohn. Son diagramme de chromatographie par filtration sur gel sur des perles de polyacrylamide. (Bio-Gel p-3OO) dans du tampon Tris à pH 8,0, présente un pic principal correspondant à 80-90% de la totalité de la protéine pour un poids moléculaire de 160 000 avec peu ou pas de fragments de taille inférieure.Cependant, la chromatographie sur gel dans des conditions dissociantes, par exemple dans de l'acide acétique 1 M, met en évidence une quantité importante de chatnes légères (ou de channes dimérisées légères), ce qui indique que les liaisons disulfures unissant les channes légères aux chaînes lourdes dimérisées sont clivées selon le procédé de l'invention. Comme ces liaisons di sulfures rejoignent la chaîne lourde au voisinage de la région qu'on estime comporter le site de fixation du complément, (charnière), on pense que le changement de conformation provoqué par la réduction et l'aîkylation est responsable de la perte de l'activité anticomplémentaire présente et latente.Le titre d'anticorps ne diffère pas de façon significative de celui de la y-globuline non modifiée de départ, c'est-à-dire qu'il correspond à une immunoou hyper-immuno-sérum-globuline, par exemple une hyper-immuno-globuline antitétanique ou antirabique selon le titre de l'anticorps de la globuline non modifiée de départ. Les molécules d'anticorps sont bivalentes, comme l'indique leur aptitude à précipiter avec l'antigène. La précipitation quantitative avec l'anatoxine tétanique indique que 65 à 80% des anticorps antitétaniques précipitants sont conservés après modification chimique de l'immuno-globuline tétanique. La nouvelle immuno-sérum-globuline apporte une protection passive contre la toxine tétanique comme le confirment les-études sur les animaux de laboratoires.La demi-vie des nouvelles y-globulines modifiées chimiquement chez l'homme et les animaux de laboratoires ne diffère pratiquement pas de celle de la 7-globuline non modifiée. Contrairement aux y-globulines injectables par voie intraveineuse préparées par traitement à chaud à pH 4,0 ou par traitement limité par la plasmine, la nouvelle immuno-sérum-globuline ne fixe pas de façon appréciable le complément, meme losqu'on l'a volontairement agglomérée par traitement à chaud ou par un acide, puis neutralisée. Elle ne reprend pas d'activité anticomplémentaire significative lorsqu'on la conserve pendant 2 ans à 50C dans une solution stérile convenant à l'administration intraveineuse. Bien que les liaisons disulfures réunissant les chaînes entre les chaînes lourdes et légères soient clivées dans le procédé de l'invention, les chaînes légères demeurent unies aux chaines lourdes par association non covalente, si bien que le poids moléculaire apparent du produit réduit et alkylé demeure pratiquement inchangé, comme le montrent la filtration sur gel et l'ultracentrigation dans des solvants non dissociants. Cependant, le clivage de ces liaisons disulfures réunissant les chaînes est mis en évidence par dissolution du nouveau produit dans de l'acide acétique 1 M où les chaînes légères sont dissociées du reste de la molécule. En chromatrographiant la solution obtenue et en analysant séparément l'absorption ultraviolette de la portion de l'éîuat contenant les chaînes lourdes et légères, on constate que la fraction légère constitue la quantité théorique (environ 20%) de l'absorption ultraviolette totale du nouveau produit, ce qui prouve qu'il ne reste pratiquement pas de liaisons disulfures entre les chaînes dans la nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée chimiquement. La nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée de l'invention a les memes titres en anticorps que l'immuno-sérum-globuline de départ ou des titres légèrement inférieurs. Une nouvelle caractéristique de I'immuno l'immuno-sérum-globuline modifiée de l'invention est son absence d'activité protéolytique. On sait que certains échantillons dtimmuno-sérum-globuline se fragmentent lorsqu'on les stocke. Cette fragmentation est due à une digestion protéolytique par une enzyme contaminante qu'on estime souvent être la plasmine. Cette fragmentation est indésirable car elle diminue la quantité d'anticorps actifs en solution. Le procédé de l'invention diminue considérablement l'activité protéolytique dans l'immuno-sérum-globuline en la réduisant à des valeurs indécalables ou au plus à des traces.D'autres expériences ont montré que la y-globuline modifiée chimiquement présente une activité protéolytique non spécifique de 0,004 unité caséine/ml, alors que le produit de départ renferme 0,03 unité caséine/ml. Donc, le nouveau procédé de l'invention supprime l'activité protéolytique dans la y-globuline, ce qui augmente la stabilité du produit. On sait également qu'en chauffant une immuno-sérumglobuline, on provoque l'agglomération des molécules sous forme de protéines de poids moléculaire plus élevé et on augmente considérablement le titre anticomplémentaire, par exemple de 16 à plus de 500. Le procédé de l'invention supprime cette augmentation de l'activité anticomplémentaire et ramène l'activité anticomplémentaire à une valeur pratiquement nulle. Administration intraveineuse. L'immuno-sérum-globuline modifiée de l'invention est essentiellement destinée à l'administration intraveineuse. Donc, des modes préférés de réalisation de l'invention concernent des compositions pharmaceutiques constituées d'une solution injectable par voie intraveineuse de l'immuno-sérum-glubuline modifiée de l'invention dans un support convenant en pharmacie adapté à l'administration intraveineuse. L'immuno-sérum-globuline modifiée est présente dans ces solutions à une concentration quelconque convenant à l'administration intraveineuse, soit immédiate, soit après dilution à des concentrations convenables, par exemple avec une solution saline isotonique, par exemple une solution protéique à 1-18%, de préférence d'environ 1 à 15% et mieux d'environ 10% pour l'administration immédiate et d'environ 16% dans le cas d'une administration après dilution préalable. Ces solutions sont stériles et ne contiennent pas de particules. On peut utiliser divers solvants aqueux de la protéine tels que l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline à 0,4%, de la glycine 0,3 M, etc. On peut utiliser les véhicules aqueux utilisés classiquement pour les immuno-sérum-globulines ou les hyper-immuno-sérum-globulines non modifiées, à l'exception des constituants produisant une réaction malencontreuse par administration intraveineuse. On peut administrer 1'immuno-sérum-globuline modifiée par voie intraveineuse seule ou en association avec d'autres produits d'origine sanguine tels que du sang total, du plasma, du fibrinogène, des facteurs de coagulation et de l'albumine. On peut administrer par voie intraveineuse, généralement à l'homme, une composition pharmaceutique comme précédemment définie, contenant la nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée de l'invention. On administre la composition de façon classique, c'est-à-dire en une quantité apportant des quantités thérapeutiques appropriées d'anticorps. Pour une solution protéique à 16,5%, la dose unitaire habituelle est d'environ 1 à 25ml. On administre généralement les doses suivantes entre 24 et 72 heures, selon la gravité de la maladie et le temps d'exposition. On prépare comme indiqué ci-dessous, les matières de départ des exemples suivants du procédé de modification chimique. Procédé -1) On met en suspension à -50C une pate de fraction II de Cohn contenant environ 30% de y-globuline dans un tampon glycine-chlorure de sodium pour obtenir une solution contenant environ 5% de y-globuline, 2,25% de glycine et 0,45% de chlorure de sodium avec un pH d'environ 6,5. -2) On dissout à 25"C une pâte lyophilisée de fraction II, dont la teneur en protéines est d'environ 100% en y-globuline dans un tampon à 2,25% de glycine et 0,45% de chlorure de sodium, à pH 6,8, en obtenant une solution finale contenant environ 5% de protéines. -3) On dilue avec une quantité additionnelle de tampon, une solution du commerce à 16,5% d'immuno-sérum-globuline dans un tampon glycine-chlorure de sodium, en obtenant une solution finale contenant environ 5% de protéines. La fraction II de la pate, de la poudre ou de la solution est obtenue par fractionnement selon la méthode de Cohn d'un ensemble de plasmas de donneurs humains normaux ou d'un ensemble de plasmas de donneurs choisis présentant des titres élevés en un anticorps particulier, par exemple des anticorps antitétaniques antirabiques ou antihépatite. On détermine par spectrométrie la concentration en protéines, en utilisant un coefficient d'extinction spécifique 1% E = 13,8 à 280 m u 1cm I EXEMPLE 1 On chauffe à 22"C, une solution contenant 750g d'immunoglobuline antitétanique préparée selon (1) dans 15 litres de tampon glycinechlorure de sodium et on ajuste le pH à 8,2 en ajoutant 130 ml de NaOH 1 N. On ajoute une solution contenant 3,47 g (0,0225 mole) de dithiothréitol (DTT) dans 23 ml de tampon glycine-chlorure de sodium pour obtenir une concentration en dithiothréitol de 0,0015 M dans le mélange réactionnel. On agite la solution pendant 15 mn, puis on ajoute une solution contenant 9,15g (0,0494 mole) d'l:uacétamide dans 229 ml de tampon glycine-chlorure de sodium,en obtenant une concentration en iodoacétamide de 0,0033 M dans le mélange rdactlonnel, On maintient le pH de la solution entre 8,1 et 8,2 pendant les deux heures qui suivent en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 1 N à la demande.On ajuste alors le mélange réactionnel à pH fi,80 en ajoutant 245 ml d'acide chlorhydrique 1 N et on refroidit à 5oC, On traite la solution des deux façons suivantes: -a) On dialyse une portion de 50 ml du mélange réactionnel contre du tampon à 2,25 % de glycine et 0,45 % de chlorure de sodium à pH 6,8 qu'on change plusieurs fois. On concentre le dialysat par ultrafiltration à un volume d'environ 25 ml et on le soumet à une filtration stérile à travers une membrane ayant des pores de 0,22 micron. La solution stérile constitue un produit convenant à l'injection intraveineuse chez l'homme et contient 8,6% de protéines déterminées par spectrophométrie. -b) On dilue le reste du mélange réactionnel (15 litres) avec 19,2 litres d'eau froide. On récupère la 7-globuline modifiée chimiquement dans cette solution par précipitation à OCC avec de l'éthanol -froid dans les conditions de la méthode 9 de Cohn et on recueille la patte de 7-globuline par centrifugation. On lave alors la pate humide avec deux portions- de 10 litres de tampon glycine-chlorure de sodium contenant suffisamment d'éthanol pour empêcher la dissolution de la y-globuline. Ces lavages éliminent les composés réagissants résiduels retenus dans la 7-globuline précipitée. On lyophilise alors la patte humide en obtenant 560 g de y-globuline sèche modifiée chimiquement. On prépare alors une solution contenant environ 10% de protéine en dissolvant 529 g de poudre dans 4,5 litres de tampon à 2,25 % de glycine et 0,45 % de chlorure de sodium à pH 6,8. On soumet alors cette solution à une filtration,8térile pour obtenir un produit convenant à l'administration intraveineuse chez l'homme. On peut conditionner stérilement cette solution de la nouvelle immuno-sérumglobuline modifiée dans des flacons pour dose unitaire de- 10 ml qu'on ferme de façon classique avec un bouchon caoutchouté. On détermine l'activité anticomplémentaire selon une technique de dilution standard. De façon typique, on incube pendant 2 h à 370C, 0,2 ml d'une dilution en série au demi de la substance étudiée avec deux unités entières de complément de cobaye dans 0,4 ml de sérum physiologique. (Une unité entière de complément est celle qui provoque lthémolyse complète de 0,4 ml d'une suspension à 1% d'érythrocytes de mouton sensibilisés). On détermine alors le complément résiduel en ajoutant 0,4 ml d'une suspension à 1% d'érythrocytes de mouton sensibilisés en incubant pendant encore 30 mn à 350C. On estime à l'oeil nu le degré d'hémolyse et on choisit, comme titre anticomplémentaire, la dilution la plus importante de la substance étudiée provoquant une hémolyse d'au moins 50%. Le produit de départ de l'exemple 1 a un titre anticomplémentaire de 1,512 lorsqu'on le détermine dans une solution à 10% de protéines selon cette méthode. Le produit modifié chimiquement isolé par le procédé a) ou le procédé b) a un titre anticomplémentaire inférieur à 1/1, c'est-à-dire qu'on n'observe pas d'hémolyse dans l'échantillon non dilué. Le produit modifié chimiquement selon l'invention ne fixe donc pratiquement pas de complément et est donc pratiquement dépourvu d'activité anticomplémentaire. L'analyse des amino-acides du produit de l'exemple 1 b) montre qutil contient 7,7 radicaux -S-CH2CONHZ par molécule de y-globuline modifiée. On détermine ce résultat à partir d'un hydrolysat acide du produit en utilisant un poids moléculaire de 160 000 pour la y-globuline et en déterminant le nombre de restes carboxyméthylcystéine par molécule de y-globuline. On détermine les anticorps antitétaniques du produit de l'exemple 1 b) selon une technique de précipitation quantitative. Unml d'une solution à 10% du produit précipite 163 unités Lf d'anatoxine tétanique, tandis qu'un ml d'une solution à 10% de la y-globuline non modifiée précipite 198 unités Lf. I1 y a donc une conservation à 82% des anticorps précipitants antitétaniques après modification chimique. La diffusion sur gel avec l'anatoxine tétanique et un antigène de Streptococcus du groupe A, montre pratiquement la meme teneur en anticorps pour le produit modifié chimiquement et le produit de départ non modifié. Le poids moléculaire du constituant principal de l'immunosérum-globuline est inaltéré par le traitement de modification chimique. La figure 2 représente un diagramme de chromatographie par perméation de gel où l'absorbance à 280 nm est représentée en ordonnées et la taille moléculaire en abscisses. La courbe en trait discontinu correspond à l'immuno-sérum-globuline et la courbe en trait continu correspond à la nouvelle immuno-sérum-globuline modifiée. Cette figure permet de comparer le diagramme de filtration sur gel sur Bio-Gel A-0,5m du produit de l'exemple 1 b) (-) à celui du produit de départ non modifié (---). On conduit cette filtration sur gel dans un tampon Tris à pH 8,0. Lorsqu'on conduit la filtration sur gel dans de l'acide acétique 1 M, le produit de l'exemple 1 b) présente un pic contenant environ 17% de la totalité des protéines dont le poids moléculaire correspond aux chaînes légères libres. Dans une solution aqueuse à pH 7, le produit de l'exemple 1 est constitué de 83,7% de la variété 6,685, de 14,5% de la variété 9,735 et de 1,7% de la variété 12,1S selon l'analyse par ultracentrifugation. On ne met pas en évidence de fragments sédimentant en dessous de 6S. EXEMPLE 2 On prépare selon le procédé 2), une solution contenant 190 g d'immuno-globuline antitétanique dans 3,54 1 de tampon glycine-chlorure de sodium. On chauffe la solution à 220C et on ajuste le pH à 8,35 en ajoutant 45 ml d'hydroxyde de sodium 1 N. On traite cette solution avec 1,38 g (0,0090 mole) de dithiothréitol dans 9 ml de tampon glycine-chlorure de sodium et on laisse la réduction se produire pendant 10 mn. On alkyle alors ce mélange en ajoutant 1,82 g (0,010 mole) d'iodoacétamide dans 45 ml de tampon glycine-chlorure de sodium. Après deux heures, on abaisse le pH du mélange réactionnel à 6,75 en ajoutant 50 ml d'acide chlorhydrique 1 N. On traite la solution de y-globuline réduite et alkylée comme décrit dans le procédé b) de exemple 1.On obtient ainsi 156 g de poudre lyophilisée qu'on peut dissoudre dans du tampon glycine-chlorure de sodium et soumettre à une filtration stérile en obtenant une solution à 10% de protéines convenant à l'injection intraveineuse. Le produit a un titre anticomplémentaire de 1/1, tandis que celui du produit de départ non modifié est de 1/512, les deux déterminations étant réalisées avec des solutions protéiques à 10%. Après 18 mois de stockage à 5"C, le produit modifié chimiquement a un titre anticomplémentaire de 1/2. Lorsqu'on le détermine à nouveau après 19 mois, le titre est de 1/1 La détermination des amino-acides de 1'immuno-sérumglobuline modifiée indique la présence de 6,7 restes -SCH2CONH2 pour un poids moléculaire de 160 000. Les diagrammes de filtration sur gel sont pratiquement les mêmes que ceux du produit de l'exemple 1. Le produit modifié chimiquement est constitué de 80% de la variété 6,84S, 17% de la variété 9,865 et 3% de la variété 10-llS par ultracentrifugation. On compare 1'immuno-sérum-globuline modifiée et le produit de départ non modifié en ce qui concerne leur aptitude à conférer une protection passive aux cobayes auxquels on administre ensuite une dose de toxines tétaniques de 100 DL50. On observe un point d'aboutissement de protection passive à 50% de 7,75 jours pour le produit de départ non modifié et de 8,5 jours pour le produit modifié chimiquement. Les résultats concordent avec le point d'aboutissement immunologique admis de 9 jours pour une t-globuline humaine chez les cobayes. La demi-vie in vivo de l'immuno-sérum-globuline modifiée Pst de 2,3 jours chez le cobaye et de 2,5 jours pour le produit de départ non modifié. Chez des sujets présentant une agammaglobulinémie, la demi-vie moyenne plasmatique de l'immuno-sérum-globuline modifiée est de 22,4 jours. Une injection intraveineuse massive est sans danger et bien tolérée. EXEMPLE 3 A 6ml d'une solution à 17,3% d'immuno-globuline antira bique dans du tampon glycine-chlorure de sodium, on ajoute 15 ml de tampon glycine-chlorure de sodium additionnels pour obtenir une solution contenant 5,04% de protéines. On chauffe 15 ml de cette solution à la température ordinai re et on ajuste à pH 8,2 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N. On agite la solu tion et on la traite avec 0,10 ml d'une solution 0,225 M de dithiothréitol préparée dans du tampon glycine-chlorure de sodium. Après 10 mn, on ajoute 0,20 ml dtiodoacétamide 0,25 M dans du tampon glycine-chlorure de sodium. On élève à 8,25, par addition d'hydroxyde de sodium 0,1 N, le pH qui s'est abaissé à 8,10.Après 2 heures, on dialyse le mélange réactionnel contre du tampon glycine-chlorure de sodium à pH 6,85 et on soumet à une filtration stérile à travers un filtre ayant des pores de 0,22 micron. La solution stérile obtenue d'immuno-globuline antirabique modifiée chimiquement a une teneur en protéines de 3,3% par détermination spectrophotométrique. On soumet ce produit à un test in vivo de protection de la souris qui indique un titre quelque peu inférieur d'anticorps protec teurs vis-à-vis du virus rabique (1/1100) par rapport à l'immuno-globuline antirabique non modifiée (1/2000). Par suite des variations inhérentes aux techniques d'essai biologique, on considère que cette différence n'est pas significative. L'activité anticomplémentaire (solution à 5%) de 1'immuno sérum-globuline modifiée est négative par rapport à un titre de 1,32 pour l'immuno-sérum-globuline de départ. EXEMPLES 4 à 7 On dissout 60 g de pate de fraction II dans du tampon glycine-chlorure de sodium selon le procédé 1), en obtenant 422 ml de solution contenant 4,86 % de protéines. On ajuste cette solution à pH 8,2 et on la divise en portionsde 40 ml. On réduit chaque échantillon avec du dithiothréitol (DTT)et on alkyle avec de 1'iodoacétamide(IAM) comme indiqué dans le tableau. Après alkylation pendant la durée indiquée, on dialyse chaque échantillon contre du tampon glycine-chlorure de sodium jusqu'à ce qu'il soit débarrassé des composés réagissants et des produits réactionnels non protéiques. On concentre les échan tillons en une teneur en protéines d'environ 10% par ultrafiltration. Par fil tration stérile sur un filtre stérile ayant des pores de 0,22 micron, on obtient une solution stérile convenant à l'administration intraveineuse (échantillons 4 à 7) On détermine les anticorps de chacun de ces 9 échantillons correspondant à l'antigèneduistreptococcus du groupe A. Les échantillons 2 à 8 contiennent environ la même quantité d'anticorps que l'échantillon nO 1 non traité, tandis que la teneur en anticorps de l'échantillon 9 est considérablement réduite et devient indéterminable.On hydrolyse les échantillons ci-dessus avec de l'acide et on soumet les hydrolysats à une analyse des aminoacides pour déterminer le nombre de groupes -S-CH2CONH2 par molécule de y-globuline. On détermine l'activité anticomplémentaire selon le procédé décrit dans l'exemple 1. Les résultats de la détermination du titre anticomplémentaire, de la teneur en anticorps et de l'analyse des amino-acides figurent dans le tableau suivant. I s" fl rld u - ~~ G; h JJ o s: a é -s 'n' s: -s s: -s -soe s: -s'Jo 8 ry C n H 8 8 h ri s o 9 9 EB J: s: s: -s a 's zou G; 'a -s 'e -s o o x - 's JJ -s -s G; X W m 4 = X Cs: G; O 's bo o s: p, 9, G; G; G; G; G; o C > 'e C > G; 's oo -sG; z 8 c h i CIL 4JG; o o -s 'n o s:- a /U U il E ic14 A l - - - - 1,128 0 + B 2 0,5 10 1,1 120 1,128 3,00 + C 3 1,0 10 2,2 120 1,8 1 5,78 + 4 4 1,5 5 3,3 120 1,2 7,50 + 5 5 1,5 10 3,3 120 1,1 7,40 + 6 6 1,5 60 3,3 120 7,27 + 7 7 1,5 10 3,3 30 8,13 + D 8 1,5 10 -- - 1,128 O + E 9 5,0 60 11,0 120 8,13 indéterminable Ces résultats montrent que par réduction avec du dithio thréitol 0,0015M pendant 10 mn, suivie d'une.alkylation de 2 heures avec de l'iodoacétamide 0,0033M (échantillon 5), on obtient un produit pratiquement dépourvu d'activité anticomplémentaire et contenant 7,4 radicaux -SCH2CONH2 par molécule de y-globuline, sans diminution apparente de la teneur en anticorps. Des réductions de 60 mn (échantillon 6) ou de 5 mn (échantillon 4) ou une alky lation de 30 mn au lieu de 120 mn (échantillon 7) donnent des produits pratique ment identiques à l'échantillon 5. Cependant, la perte de l'activité anticomplé mentaire est incomplète lorsqu'on utilise des concentrations inférieures de dithiothréitol (échantillons 2 et 3). Bien que l'activité anticomplémentaire soit fiable dans l'échantillon 9 (réduit avec une teneur élevée en DTT pendant 60 mn), les propriétés d'anticorps ont disparu. EXEMPLE 8 On réduit à la température ordinaire, une solution du commerce de y-globuline constituée de 16,5% d'immunoglobuline antitétanique avec du dithiothréitol (0,0075M) pendant une heure et on alkyle avec de l'iodo- acétamide (0,00825M) pendant deux heures, comme décrit dans l'exemple 1. On dialyse le produit obtenu contre un diluant à la glycine, jusqu'à ce qu'il ne contienne plus la portion non protéique du produit réactionnel, on soumet à une filtration stérile et on conditionne stérilement dans des flacons de 10 ml convenant à l'administration à l'homme. On observe respectivement pour le témoin et les échantillons modifiés chimiquement, des teneurs d'anticorps antitéta niques de 127 unités Lf et de 110 unités Lf et un titre anticomplémentaire de 1/256 et de 1/4.Ce mode opératoire présente l'avantage de fournir la globuline modifiée à la concentration finale désirée de 16,5% et de ne pas nécessiter de concentration pour le conditionnement final. EXEMPLE 9 On élève la teneur sérique en 7-globuline de malades présentant une agammaglobulinémie à des taux au moins égaux à ceux obtenus par l'administration intramusculaire de 10 ml d'une solution de 16,5% d'immuno sérum-globuline non modifiée par administration intraveineuse de 16,5 ml d'une solution à 10% de 1'immuno-sérum-globuline modifiée de l'exemple 5 ou 6 dans un support stérile constitué de glycine 0,3 M et de chlorure de sodium à 0,45%. Les demi-vies sont pratiquement les mêmes. EXEMPLE 10 L'administration intraveineuse de 1 ml d'une solution à 16,5% d'hyper-immuno-sérum-globuline (solution à 16,5% contenant 250 unités d'anticorps antitétaniques par ml) modifiée selon l'exemple 6, dans de la glycine 0,3M et du chlorure de sodium à 0,45 %, donne le même effet immunologique que l'administration intramusculaire d'une dose semblable de l'hyperimmuno-sérum-globuline de départ (hyper-TetR, Cutter Laboratories Inc., Berkeley, Californie). On peutrépéter les exemples précédents avec le même succès en remplaçant les composés réagissants et/ou les conditions opératoires de ces exemples par ceux de l'invention décrits de façon générale ou particulière. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs, sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Immuno-sérum-globuline modifiée, pratiquement pure, injectable par voie intraveineuse, caractérisée en ce que pratiquement toutes les liaisons disulfures réunissant les chaînes lourdes et les chaînes légères et jusqu'à quatre liaisons disulfures environ au total, sont remplacées par des paires de radicaux -S-R dans lesquels R représente un groupe alkyle inférieur, par exemple méthyle, éthyle ou propyle, -CH2CONH2, N,N-dialkyl inférieur-carba mido alkyle inférieur, par exemple -CH2CONET2, alcoxy inférieur - carbonylalkyle inférieur, par exemple -CH2C02C2H5 ou carboxyalkyle inférieur, par exemple -CH2C02H ou cyanoalkyle inférieur, par exemple -CH2CN, p-aminalkyle indriur, par exemple -CH2CH2NH2, ou benzoylalkyle, inférieur, par ex emple -CHC 6H5, les chss légères demeurant unies aux ciaines lourdes a:sociat ini lente de telle sorte que le poids moléculaire apparent dans les solvants non dissociants soit pratiquement le meme que celui de l'immuno-sérum-globuline non modifiée, cette immuno-sérum-globuline modifiée étant pratiquement dépourvu vue d'activité anticomplémentaire présente et latente et présentant pratiquement la demi-vie biologique et l'activité d'anticorps de l'immuno-sérumglobuline non modifiée. 2. Nouveaux médicaments utiles notamment pour conférer une immmnité passive, caractérisés en ce qu'ils consistent en une immuno-sérum-globuline modifiée selon la revendication 1. 3. Compositions thérapeutiques pour l'administration intraveineuse, caractérisées en ce qu'elles contiennent dans un support aqueux convenant en pharmacie et à l'administration intraveineuse, une immuno-sérum-globuline modifiée selon la revendication 1. 4. Formes pharmaceutiques d'administration des compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce que la concentration en immuno-sérumglobuline modifiée est comprise entre environ 1 et 18% et est de préférence voisine de 16,5%. 5. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que 1'immuno-sérum-globuline modifiée comporte en moyenne de 5,5 à 8,2 radicaux -S-CH2CONH2 par molécule. 6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que la sérum-globuline modifiée est une hyper-immuno-sérum-globuîine modifiée. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'hyper-immuno-sérum-globuline modifiée est une immuno-globuline antitétanique. 8. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que I'hyper- immuno-globuline modifiée est une immuno-globuline antirabique. 9. Procédé de préparation d'une immuno-sérum-globuline modifiée selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à -a) réduire à un pH modérément alcalin de 2 à environ 4 les liaisons disulfures d'une solution aqueuse d'immuno-sérum-globuline non modifiée avec du dithiotréitol ou du dithioerythritol à une concentration dans le mélange réactionnel inférieure à environ 0,01 M et dans une proportion molaire par rapport à la protéine d"environ 2,5 à 50;; -b) alkyler à un pH modérément alcalin une solution aqueuse de l'immuno-sérum globuline ainsi réduite avec au moins un équivalent molaire, calculé à partir de l'agent réducteur d'un composé choisi parmi l'iodoacétamide, les N,N -dialkyl- a-halogénoacétamides, les esters halogénsacétiques, les esters halogénopropioniques, les acides halogénoacétiques, les acides a-halogéno- propioniques, les halogénoacétonitriles, les alkylèneimines et les halogénures de phénacyle et, -c) séparer 1'immuno-sérum-globuline modifiée obtenue des produits réactionnels et composés réagissants non protéiques. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on conduit le stade de réduction à une concentration en protéines d'au moins 1% environ. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on conduit le stade de réduction avec un rapport molaire du dithiothréitol aux protéines d'environ 4/6. 12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on obtient dans le stade de réduction entre 4 et 8 radicaux mercapto par molécule. 13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on conduit le stade de réduction à'un pH d'environ 8,0 à 8,6. 14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on conduit le stade de réduction avec un rapport molaire du dithiothréitol aux protéines d'environ 5 à un pH d'environ 8,0 à 8,6 et en ce qu'on obtient en moyenne environ 5,5 à 8,2 radicaux mercapto par molécule. 15. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on conduit le stade d'alkylation avec un excès molaire d'au moins 10% environ d'iodoacétamide, calculé par rapport au dithiothréitol. 16. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on conduit le stade d'alkylation à un pH d'environ 7,2 à 9,0. 17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on conduit le stade dBalkylation avec un excès molaire de 10% au moins environ d'iodoacétamide calculé par rapport au dithiothréitol, et à un pH d'environ 8,0 à 8,6. 18. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que, dans le stade de séparation, on précipite l'immunosérum-globu1ine modifiée par un solvant. 19. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que, dans le stade de séparation, on élimine par dialyse les produits réactionnels et les composés réagissants non protéiques. 20. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on sépare l'immuno-sérum-globuline modifiée sous forme d'une solution qu'on concentre ensuite. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'on concentre par ultrafiltration l'immuno-sérum-globuline modifiée séparée.