Brevet FR2148264A1 — publié le 19730311

La présente invention est relative à la fabrication d'enzy Jles. On sait produire des enzymes en stimulant la croissance, dans un milieu de culture artificiel, de certains micro-organismes capables de produire l'enzyme en question en quantités industrielles. De manière typique, on laisse fermenter le bouillon de culture dans des cuves puis on le filtre pour séparer la matière vivante en suspension et on le concentre par évaporation pour obtenir un concentrat à partir duquel on peut précipiter un produit séché ayant une activité enzymatique élevée. Un exemple d'une telle opération est la production de protéases destinées aux détergents à partir de certaines souches de Bacillus Bubtilis. Les problèmes importants que posent ces opérations de fermen- tation sont de choisir des souches convenables de micro-organisnB de stimuler la croissance de la souche choisie, de favoriser une transformation efficace des matières nutritives en enzymes par 1' organisme choisi et d'éviter la contamination du bouillon par des organismes qui s'y trouvent en compétition avec les ensyme* La croissance de la souche choisie peut Titre favorisée par un choix convenable de la température et de 1' acidité et en maintenant un équilibre convenable des matières nutritives dans le bouillon.L'enzyme peut parfois Entre produite plus efficacement si l'organisme est placé sous certaines contraintes chimiques ou physiques qui stimulent cette production. La contanination du bouillon est un facteur important car elle diminue la quantité de matière nutritive disponible pour l'organisme choisi et elle peut aussi produire des métabolites indésirables qui contaiinent le produit final. En outre, la conta mination a tendance à augmenter au cours de la fermentation et peut nécessiter l'arr%t prématuré du procédé, empêchant donc une opération continue. La contamination peut en général être maintenue dans des limites raisonnables, soit en mettant en oeuvre le procédé en discontinu avec des opérations de faible durée, soit en opérant dans des conditions stridsment aseptiques.Bien que la dernière méthode permette un fonctionnement continu, elle est dif- facile et conteuse à réaliser à l'échelle industrielle et contribue du façon importante au cotit de fabrication des enzymes. L'invention a pour objet un procédé amélioré de production d'enzymes, en particulier des protéases de moisissures, plus efficace et avec risques réduits de contamination. Dans sa forme préférée, l'invention permet d'obtenir des protéases de façon efficace au cours d'opérations de relativement longue durée sans avoir recours à des conditions strictement aseptiques.Il a été constaté que les organismes producteurs d'enzymes, comme par exemple les souches productrices de protéases de la moisssure Cephalo- sworium corda, peuvent etre stimulés pour produire des enzymes plus efficacement, par la présence de concentration élevées (c'est i-dire de tordre de 1 partie pour mille) de certains ions métalliques polyvalents,, spécialement le zinc et le cuivre. L'invention a donc pour objet un procédé de production d'en cymes qui consiste à former une culture d'un micro-organisme producteur d'enzyme dans un milieu nutritif aqueux, à maintenir un ion métallique polyvalent ayant un numéro atomique de 26 à 30, as le milieu nutritif à une concentration d'au moins 0,2 g/l, à a- ser le milieu nutritif fermenter, à séparer les solides en suspension du milieu nutritif fermenté et à récupérer le liquide résiduel riche, en enzymes0 Le temna "producteur d'enzyme", tel qu'il est utilisé ici qualifie un micro-organisme assurant une production suffisante d'enzyme pour en permettre la récupération industrielle à partir du milieu nutritif fermenté.L'organisme peut autre une bactérie, un protozoaire ou une algue mais c'est de préférence une moisissure. On préfère en particulier les souches productrices d'enzymes d'Acremonium, de Cephalosnorium et d'lieurismium, par exemple Âcremonium Kiliense ou CePhalosDorium corda. La composition du milieu nutritif dépend de l'organisme particulier. Un bouillon typique consiste en une suspension aqueuse de soJa et d'amidon avec des sels nutritifs. L'ion métallique polyvalent peut être l'un de ceux qui ont un numéro atomique compris entre 26 et 30, par exemple le fer, le cobalt, le nickel, le cuivre ou le zinc. Parmi ceux-ci le cuivre et le zinc donnent l'augmentation la plus satisfaisante de production d'enzyme et le métal préféré est le zinc. La présence de traces (par exemple 1 ou 2 p.p.m.) de divers ions métalliques est nécessaire pour assurer la nutrition mais on a précédemment fndiqué que l'augmentation de la concentration des ions métalliques a tendance à inhiber la production d'enzymes. il est donc surprenant que les concentrations du métal d'une élévation sans précédent, utilisées selon la présente invention stimulent la production d'enzyme. On peut utiliser de 0,2 à 5 g/l, de métal, de préférence de 1 à 2 g/l. Un avantage de la présence d'ions métalliques à des concentrations élevées est qu'elle a tendance à inhiber la contamination. En particulier, on a constaté qu'en utilisant des moisissures comme Acremonium, CePhalosPhorium et Aleurismium, on peut opérer dans des conditions plus acides quten l'absence d'ions métalliques. La combinaison des conditions acides et les concentrations élevées en ions métalliques diminue suffisamment la contamination pour que la production d'enzymes soit possible en continu, pendant des périodes relativement longues, sans avoir recours à des conditions aseptiques strictes. Le pH des cultures de moisissures mises en oeuvre selon l'invention peut donc aller d'aussi bas que 4,8, Jusqu'à la valeur plus courante de 7, le pH préféré étant compris entre 5 et 5,5 par exemple 5,2. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de production d'enzymes conforme à l'invention consiste donc à maintenir de façon continue une culture en fermentation d'une moisissure productrice dEnzymesX telle qu'Acremonium, CePhalosporium ou lieurismium, dans un milieu nutritif aqueux à un pH compris entre 4,8 et 7 et de préférence entre 5 et 5,5, en maintenant des ions cuivre ou zinc dans le milieu à une concentration de 0,2 à 5 g/l, i soutirer de façon continue une partie du milieu de fermentation i séparer les solides en suspension de la partie ainsi soutirée et à récupérer du liquide un produit riche en enzyme. Le pH du milieu nutritif peut en général être plus acide que le pH optimum du bouillon de fermentation, qui a tendance à aug ienter avec la croissance du mycélium. En conséquence, le milieu nutritif introduit peut être à un pH de 4 à 4,5 qui est suffisant pour inhiber la contamination bactérienne et, en même temps, permet au pH de la cuve de fermentation de élever à une valeur optimale supérieure pour la production d'enzymes lorsque le mycélium est complètement établi. La température du milieu est de préférence maintenue entre 20 et 300C, par exemple 230 O. Les solides en suspension peuvent être séparés du bouillon par filtration ou centrifugation. La présente invention a également pour objet des compositiom enzymatiques et en particulier de nouvelles enzymes utilisables dans des produits détergents qui peuvent être préparées selon les méthodes ci-dessus décrites. On sait que l'on peut utiliser certaines enzymes protéolytiques tomme constituants des poudres de lavage pour décomposer les taches protéiniques sur les tissus. L'utilisation des enzymes pour la lessive est connue depuis plus de cinquante ans, mais la formulation de poudres détergentes contenant aes enzymes est relativement récente. Un problème majeur que pose la préparation de telles poudres est de trouver une enzyme qui soit active dans les conditions d'alcalinité élevée qui sont courantes dans les produits détergents, mais stable en présence des constituants les plus agressifs du détergent, comme le perborate de sodium. Il a été constaté que les enzymes bactériennes produites par les souches de Bacillus Subtilis étaient suffisamment stables pour permettre la formulation de produits de lavage enzymatiques commercialement acceptables. Néanmoins, les enzymes de lavage connues ont toutes tendance à perdre leur activité par exposition prolongée aux constituants normaux des poudres de lavage. Il a maintenant été découvert que certaines souches apparentées de moisissures produisent des enzymes protéoliques qui sont; actives à un pH inhabituellement élevé et qui conservent leur activité en présence des constituants du détergent à un degré plus grand que les enzymes de lavage connues. L'identification taxonomique de ces souches productrices d'enzymes n'est pas certains, mais elles sont apparemment étroitement apparentées au genre CePhalosporium. Les souches sont définies par deux cultures, qu'on pense titre Âcremonium kiliense; parfois appelée CePhalosDorium acremonium, qui ont été déposées, respectivement sous les Nos 20 337 et 20 338 dans la collection ras semblée aux Etats Unis sous la dénomination "Âmerican Type Culture Collection" (L'PCC). Les moisissures en question sont des organismes aérobies actifs à un pH compris entre 3 et 9 et capables de se développer dans un milieu contenant des sucres, de lla- midon cuit, des acides gras, des glycérides, de l'acide citrique ou acétique, des protéines, de l'azote ammoniacal ou nitrique ou de l'urée. Les moisissures sont de préférence cultivées sur agar malté ou agar lacté, ou avec agitation continue dans une solution de soja ou d'amidon cuit à 20-25 C. Les nouvelles protéases produites par les souches en question semblent entre étroitement apparentées et se caractérisent par une activité protéolytique aux fortes alcalinités. Dans un but de commodité, toutes les enzymes produites par CePhalosPoria ou par les moisissures apparentées, sont désignés ci-après par l'expression "protéase céphalosporale"0 L'invention a donc également pour objet une protéase céphalosporale ayant une activité protéolytique entre un pH minimum de 5 au moins (et de préférence 6) et un maximum de i1 à 13 (par exemple 12). L'activité optimale se situe de préférence à un pH compris entre 10 et 11. Les protéases sont décrites et définies ci-après avec réSé- rence particulière au produit de la souche ÂTCC n 20 337. I1 faut remarquer ici que d'autres nouvelles-enzymes confor mes à l'invention, bien qu'étroitement apparentées à cet exemple, peuvent en différer dans une certaine mesure en ce qui touche l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes. Linsyme présente les caractéristiques générales suivantes: (a) c'est une endoprotéase; (b) elle est active à un pH de 6 & 12, avec une activité optimale à pH 10,5; (c) elle manifeste une activité exoprotéolytique négligeable; (d) c'est une protéine à chaine unique; (e) elle ne possède pas de groupes sulfydyles libres; (f) l'enzyme est stable et active dans l'urée 8 molaire. L'enzyme en question a en outre les caractéristiques particulières suivantes s Elle est inhibée par l'hypochlorite de sodium, le fluorure de phénylméthylsulfonyle, le phosphofluoridate de di-isopropyle, le chlorure de diphénylcarbamoyle et le chlorhydrate de guinidine ( & la concentration 6 M). Elle n'est pas notablement inhibée par l'urée, la tosylamide- 2-phOnyl éthyl-chlorométhyl cétone, l'acide iodoacétique, l'acide éthylènediaminetétraacétique ou 1 'o-phénanthroline Elle agit sur l'ester éthylique de l'acétyltyrosine pour donner de l'éthanol. Elle n'agit pas sur l'ester éthylique de la benzoyl arginin4 le paranitroanilide de la glutaryl phénylalanine, la carbobenzoxy- arginylglycine, la leucylglycine, la carbobenzoxyleucyl ph6nyl- alanine, la carbobenzoxyaspartyl glycine, la phénylalenyl glycine, la carbobenzoxytryptophényl glycine, ou la carbobenzoxyglycyphé- nylelanine. Elle a un poids moléculaire de 28000 environ et la composition approximative suivante en acides aminés Acide Nbre de résidus p. mole Lys 5 Ris 4 Arg 10 Asp 28 Thr 23 Glu 10 Pro 14 Gly 40 Aie 34 Val 14 Met 2 Isoles 16 Leu 17 tyr 10 Phe ers 4 CySSCy 2 ou 3 L'invention a également pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé de production d'enzymes selon l'invention, qui consiste à maintenir une culture d'une moisissure productrice de protéase céphalosporale dans un milieu nutritif aqueux, à séparer le solide en suspension dudit milieu et à récupérer le liquide résiduel riche en enzyme. Les enzymes sont de préférence préparées par le procédé décrit ci-dessus. Les enzymes peuvent être récupérées à l'état pur par centrifugation du milieu aqueux pour éliminer la matière en suspension, concentration du liquide et séparation de sa teneur organique par dialyse et chromatographie par échange d'ions. On préfère néanmoins, pour les applications de lavage, utiliser l'enzyme sous forme impure, par exemple en évaporant à sec la solution filtrée ou centrifugée pour obtenir un produit sec ayant une activité protéolytique élevée. On préfère en particulier utiliser l'enzyme en association avec un diluant. Le produit séché peut être mélangé à un diluant solide tel que le sulfate de sodium, ou de préférence, on peut pulvériser une solution concen trée sur la surface d'un diluant hydratable granulaire comme le tripolyphosphate de sodium, pour former un revêtement d'enzyme, sur les granules secs de tripolyphosphate hydraté ou partiellement hydraté. La composition enzymatique peut être utilisée pour la formulation de détergents. L'invention a donc encore pour objet une composition détergente comprenant un agent tensioactif anionique et une protéase céphalosporale stable vis à vis des bases. L'enzyme peut être incorporée dans le détergent par 141ne des techniques qui ont été décrites, par exemple, dans les brevets anglais 1 156 238, 1 156 237, 1 151 748 ou dans nos demandes de brevets français 69-40 237 et 70-28 786. Les compositions détergentes peuvent contenir tous les agents tensio-actifs, liants, agents de blanchiment ou autres constituants décrits dans les brevets et demandes de brevets précités. L'enzyme caractérisée ci-dessus à titre d'exemple a été préparée par le procédé suivant, qui est donné comme exemple de réalisation du procédé selon l'invention. EXEMPLE On a maintenu dans une cuve, à une température de 230cl avec agitation et aération, une solution nutritive ayant un pue de 4 et contenant 40 g/l aussi bien de soja que d'amidon, des sels nutritifs en 1 g/l. de zinc sous forme de sulfate. On a introduit dans la cuve une souche choisie productrice d'enzyme d'une moisissure identifie de façon provisoire comme étant Âcremonium kiliense et enregistrée dans la collection ÂTCC sous le nO 20 337. Au bout do deux jours, le pH était monté à 5 et après 60 heures, on a commencé la production d'enzymes en soutirant le bouillon de la cuve à travers un filtre apte à retenir le mycélium dans la cuve. Le volume du liquide en fermentation a été maintenu constant en introduisant en continu de la solution nutritive frat- che à raison de 70 * du volume de la cuve par jour. La solution nutritive franche avait la même concentration en zinc que la solution initiale, mais contenait des quantités moindres de soja et d'amidon. Le filtrat avait une activité de 4500 uD/ml. On a pu le sécher pour donner 9 g/l d'enzyme en poudre ayant une activité de 500.000 uD/g. Cette valeur doit Entre comparée à l'activité de 300.000 uD/g obtenue en l'absence de sels de zinc. L'enzyme pure a pu strie isolée par dialyse et chromatographie sur cellulose. L'enzyme avait les caractéristiques indiquées ci-dessus. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'enzyme consistant à former une culture d'un micro-organisme producteur d'enzyme dans un milieu nutritif aqueux, à laisser le milieu nutritif fermenter, à séparer les solides en suspension du milieu nutritif fermenté et à récupérer le liquide résiduel riche en enzyme, caractérisé en ce qu'on maintient un ion métallique polyvalent ayant un numéro atomique compris entre 26 et 30 dans le milieu nutritif, à une coincez tration d'au moins 0,2 g/l. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ions métalliques sont le zinc ou le cuivre. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le micro-organisme producteur d'enzyme est une moisissure, de préférence appartenant à l'un des genres Cénhalossorium" Aleurismium ou Acremonium, et plus particuliérement à l'espèce Acremonium kiliense. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la moisissure est sensiblement de la même souche que les cultures déposées dans la collection "Americae Type Culture Collection" sous les numéros d'enregistrement 20 337 et 20 338. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ion métallique polyvalent est présent à une concentration de 0,2 à 5 g/l et de préférence de 1 à 2 g/l. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH du milieu de fermentation est maintenu à une valeur comprise entre 4 8 et 7, de préférence entre 5 et 5s5 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fermentation est mise en oeuvre en continu ou semi-continu, des portions du bouillon de fermentation étant filtrées et soutirées en continu ou par intermittence et remplacées par une solution fratche ayant un pH de 4 à 4,5. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précé dents, caractérisé en ce que la température du milieu est maintenue entre 20 et 300C. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu nutritif est une solution de soja et d'amidon cuit. 10. Les enzymes préparées par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 11. Protéase céphalosporale ayant une activité protéolytique à un pH compris entre un minimum d'au moins 5 et un maximum de Il à 13,, de préférence entre un minimum de 6 et un maximum de 7, et une activité optimale à un pH compris entre 10 et 11 de préféren- ce à pH 10,5. 12. Enzyme protéolytique selon la revendication 11, caractérisée par le fait que c'est une endoprotéase présentant une activité exoprotéolytique négligeable, contenant une channe protéinique unique sans groupes sulfydryles libres et qui est stable et active dans l'urée 8 fois molaire. 13. Enzyme selon la revendication 12 caractérisée en outre par le fait qu'elle est inhibée par l'hypochlorite de sodium, le fluorure de phénylméthylsulfonyle, le phosphofluoridate de diisopropyle, le chlorure de diphénylcarbamoyle ou le chlorhydrate de guanidine à une concentration 6 fois molaire, mais n'est pas notablement inhibée par l'urée, la tosylamide-2-phényl éthyl chlo rométhyl cétone, l'acide iodoacétique, l'acide éthylène-dismine- tétraacétique ou la o-phénanthroline. 14. Enzyme selon la revendication 13 caractérisée en outre par son action sur l'ester éthylique de l'acétyltyrosine pour donner de l'éthanol mais son absence d'action sur lester éthylique de la benzoylarginine, le p-nitroanilide de la glutaryl phénylalanine, la carbobenzoxyarginyl glycine, la leucylglycine, la carbobenzoxyleucyl phénylalanine, la carbobenzoxyaspartyl glycine, la phénylalanylglycine, la carbobenzoxytriptophenylglycine ou la carbobenzoxyglycylphénylalanine. . 15. Enzyme conforme à la revendication 16 ayant un poids moléculaire approximatif de 28 000 et la composition suivante en aminoacides : Acide nbre de résidus p.mole Lys 5 Ris 4 Arg 10 Asp 28 Thr 23 Glu 10 Pro 14 Gly 40 Ala 34 Val 14 Met 2 Isoleu 16 Leu 17 flyr 10 Phe 7 Try 4 CysSCy 2 ou 3 16. Composition endoprotéolytique séparée & partir d'un ferment d'Acremonium kiliense, en particulier de l'une des cultures déposées dans la Collection American Type Culture Collection sous les numéros d'enregistrement 20 337 et 20 338. 17. Produit de lavage comprenant une composition détergente et une enzyme selon l'une quelconque des revendications 10 à 16.