Brevet FR2180555A1 — publié le 19731130

La présente invention a pour objet la synthese biochimique d'un aminoacide, la L-lysine, à partir de bactéries gram-négatives en sélectionnant des mutants de types particuliers et nlus spécialement des mutants doubles. Parmi les bactéries gram-négatives, on retiendra de préférence celles du genre Pseudomonas et plus spécialement du groupe Pseudomonas acidovorans comprenant les espèces Pseudomonas acidovorans et Pseudomonas testosteroni, tel que défini par Stanier, Palleroni et Doudoroff, J. Gen.Microbiol (1966) 43, 159. De nombreux brevets ont été déposés concernant la production de Lysine par fermentation. La plupart de ces procédés mettent en oeuvre des bactéries gram-positives telles que Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium qui ont besoin pour leur croissance de thréonine ou de méthionine et de thréonine et utilisent comme substrats les hydrates de carbone et notamment les mélasses. La présente invention a pour but - de fournir un procédé de production sélective de L-lysine, - d'utiliser à cet effet un substrat d'origine non agricole peu coûteux,l'acide acétique présentant l'avantage de stabilité en ce qui concerne la qualité, le prix et les quantités disponibles par rapport aux substrats d'origine agricole ainsi que les autres acides gras, notamment les acides gras inférieurs, tels que les acides propionique, butyrique et valérique, - d'effectuer cette synthèse avec un microorganisme présentant des exigences nutritionnelles minimales. A cet effet, des organismes ont été sélectionnés pour leur aptitude à utiliser le.s substrats désirés et pour leur incapacité à dégrader la lysine, les travaux des auteurs ayant montré l'importance de ce facteur pour l'obtention de bons rendements en lysine. Par exemple Pseudomonas acidovorans ne produit pas naturellement de lysine, mais on a obtenu des mutants de cette souche qui en produisent. Une caractéristique essentielle de la présente invention réside dans la nature des mutants utilisés. L'inconvénient des mutants habituellement utilisés dans la production de lysine est leur besoin en divers aminoacides, généralement méthionine ou thréonine, ou méthionine et thréonine (ou homosérine qui remplace simultanément méthionine et thréonine), car certains des aminoacides nécessaires, notamment la thréonine et l'homosérine sont motteux. L'un des demandeurs avait, dans des travaux précédents, mis au point une méthode d'obtention de mutants d'un type nouveau n'ayant pas de besoins nutritionnels.Ainsi par l'utilisation d'analogues de la lysine, tels que la S-(p-aminoéthyl) cystéine, des mutants excréteurs de lysine avaient été obtenus chez Pseudomonas aeruginosa (Brevet français 2.04I.658 du 16/5/1969). On peut tenter d'expliquer l'action de la S-( -aminoéthyl) cystéine de la manière suivante ce composé permettrait de sélectionner les mutants libérés de l'inhition de la biosynthèse de la lysine exercée par la lysine (rétroinhibition)sur les enzymes qui interviennent dans la biosynthèse de la lysine notamment l'aspartokinase, la première enzyme de cette biosynthèse. On a également utilisé des analogues de la lysine dont la liste est donnée ci-dessous a/ la S-(ss-aminoéthyl) - cystéine 2HN (CH2-S - CH2 - CHNH2 - COOH b/ la 4 - oxalysine 2HN 2 CH2 - 0 - CH2 - CHNH2 - C00H c/ la trans - 4 - dehydrolysine 2HN - CH =CH-CH2-CHNH2-COOH d/1'#-méthyllysine CH3 - CHNH2 - CH2 - CH2- CH2 - CHNH2 COOH e/ la 3 - mminocvelohexvlalanine f/ la 3 aminométhylcyclohexyl glycine g/ la 8-hydroxylysine 2HN-CH2-CHOH-CH2-CH2-CHNH2-COOH pour tenter d'obtenir des mutants excréteurs de lysine avec Pseudomonas acidovorans.Cependant, en essayant d'appliquer la technique de simple mutation du brevet français ci-dessus, on s'est aperçu que les mutants obtenus ne produisaient que de faibles quantités de lysine. La présente invention est basée sur la découverte d'un nouveau procédé de mutation applicable aux bactéries gram-négatives et par exemple à Pseudomonas acidovorans les rendant aptes à excréter de la lysine en quantité importante. Afin d'obtenir une libération complète de la biosynthèse de la lysine et donc une production accrue de lysine il a été découvert qu'il était nécessaire d'obtenir des doubles mutants Pour tenter d'expliquer le phénomène observé, on peut supposer que l'inhibit ion de la synthèse de la lysine concerne deux enzymes.Dans les exemples considérés ces enzymes ont pu être caractérisées comme étant l'aspartokinaseetla dihydrodipicolinate synthétase. Toutefois d'autres systèmes enzymatiques, tels que des perméases peuvent être impliqués dans les mutations effectuées. de Le procédé1 mutation de l'invention consiste dans une première étape à cultiver la souche de bactérie-gram-négative sur un milieu de culture solide contenant un analogue de la lysine, à recueillir les bactéries qui se sont développées et dans une deuxième étape, à cultiver les bactéries ainsi recueillies sur un milieu de culture solide contenant à la fois de la thréonine ou l'un de ses analogues tel que la p -hydroxynorvaline de structure CH3 - CH2 - CHOH - CHNH2 - COOH et un analogue de la lysine tel que l'un de ceux décrits ci-dessus. DESCRIPTION DE LA SOUCHE PSEUDOMONAS ACIDOVORANS L 6 A titre d'exemple, on peut utiliser le souche Pseudomonas acidovorans L6. Cette souche isolée au laboratoire a été identifiée selon les méthodes décrites par Stanier, Palleroni et Doudoroff, J. Gent Microbiol. (1966) 43 159. Elle présente les caractères suivants 1/ Morphologie : bâtonnets unicellulaires 2/ Mobiles au moyen de flagelles 3/ Coloration gram-négative 4/ Ne forme pas de spores, 5/ Métabolisme aérobie 6/ Dénitrification : néant 7/ Production du pigment : néant 81 Croissance à 40 néant à 410 néant 9/ Réaction oxydase positive 10/ Croissance sur les substrats suivants - Acides gras : acétique, propionique, butyrique, valérique, isovalérique, - Acides dicarboxyliques : malonique, succinique, fumarique, adipique - Produits organiques divers : éthanol, D-fructose,D et L Tryptophane, acide S -aminovalérique, acétamide, DL- norleucine. 11/ Absence de croissance avec les substrats suivants : D-glucose, L-lysine, testostérone, hexadécane, arginine, bétaine, 12/ La température optimale de croissance est .300 à un pH voisin de la neutralité. OBTENTION DE MUTANTS EXCRETEURS DE LYSINE a) Obtention de mutants s imlesrésistants à l'aminoéthlcystéine~ L'aminoéthylcystéine inhibe la croissance de la souche L6. En étalant quelques gouttes d'une culture de la souche L6 sur des boites- de Pétri contenant le milieu de croissance (milieu minéral de exemple 1 ci-après et le succinate de sodium 0,05 M comme substrat dans 2 % d'agar) additionné d'aminoéthylcystéine à une concentration pouvant varier entre 0,05 M et 0,1 M, puis en incubant ces boites à 30 pendant 3 jours, on voit apparaître à la surface un certain nombre de colonies isolées qui sont des mutants résistants à l'aminoéthylcystéine. Ces mutants sont repris et purifiés. On détermine chez chacun d'eux, la production extracellulaire de lysine par croissance en milieu liquide à 300 en fioles agitées avec le succinate de sodium comme substrat. On prépare aussi à partir des cultures de ces mutants des extraits enzymatiques et on détermine la sensi bilité des enzymes aspartokinase et dihydrodipicolinate synthétase à l'inhibition par la lysine. On a sélectionné de cette façon le mutant L6A45 dont les caractéristiques biochimiques qui le distinguent de la souche sauvage L6 sont données dans le tableau 1. On voit dans ce tableau que chez ce mutant la dihydrodipicolinate synthétase ntest pas inhibée par la lysine, à la différence de la souche sauvage. Par contre, l'aspartokinase est, comme chez la souche sauvage, inhibée par le mélange de lysine et de thréonine. b/ Obtention de mutants doubles résistants à l'aminoéthcstéine et et à la thréonine On est reparti du mutant simple L6A45 pour obtenir ces doubles mutants. On a constaté que si l'aminoéthylcystéine n'était pas inhibiteur de sa croissance, par contre, l'addition simultanée d'aminoéthylcystéine et de thréonine en inhibait la croissance. En effectuant des étalements du mutant L6A45 sur boites de Pétri contenant le même milieu de croissance que selon (a) ci-dessus (même milieu minéral, même teneur en succinate de sodium) mais contenant cette fois de l'aminoéthylcystéine te,05 M) et de la thréonine (0,05 à 0,1 M) au lieu d'aminoéthylcystéine seule, on a pu obtenir à nouveau des colonies isolées que l'on a à nouveau purifiées. Chez les mutants stables obtenus, on a testé la production de lysine et les caractères biochimiques qui établissent la nature des mutations provoquées.On a ainsi sélectionné le mutant L6A45AT10 dont les caractéristiques sont données dans le tableaul. On constate que cette fois les deux enzymes aspartokinase et dihydrodipicolinate synthétase sont devenus insensibles à la rétroinhibition. Ce mutant double produit plus de lysine que le mutant simple dont il est dérivé. TABLEAU I Caractères biochimiques des mutants excréteurs de lysine Aspartokinase Dihydrodipicolinate Inhibition de la croissance -c Inhibition par le synthétase mélange lysine+ Inhibition par la par amino- par amoniéthyl thréonine (%) lysine (%) éthylcystéine cystéine 0,05 M a b 0,05 M + thréonine 0,05 M L6 67 47 + + (souche sauvage L6A45 70 8 0 + L6A45AT10 4 0 0 0 a - mesure effectuée en présence de 10-2 M thréonine + 10-4 M lysine b - mesure effectuée en présence de 10-4 M lysine c - le signe + indique l'absence de croissance visible après 48 h. sur le PRODUCTION DE LYSINE PAR LES MUTANTS OBTENUS Exemple 1 : On a utilisé un milieu minéral dont la composition est la suivante NH4C1 3 g Na2HPO4, l2H20 6 g H2KP04 4 g MgSO4 0,2 g FeSO4. 7H20 1 mg. Zn 504. 7H20 0,1 mg. 4 5H2O 0,1 mg 3 40 g Mn SO4, H2O 40 g MoO3. H20 20 g Ces sels sont dissous dans l'eau et le pH est ajusté à 7,0 avec KOH normale Le volume est complété à 1 litre. Le substrat utilisé était le succinate de sodium 0,1 M. On a effectué la culture en fioles agitées (70 oscillations/mn) maintenues à 300. Le dosage de la lysine était effectué par une méthode colorimétrique, par une méthode bactériologique (spécifique de la L-lysine) -et au moyen d'un analyseur d'aminoacides, au cours de la culture sur le milieu débarrassé de cellules par centrifugation. Le pH était maintenu à 7,0 par addition de HC1 N deux fois par jour. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 TABLEAU 2 Chlorhydrate de Rendement par Souche lysine produit rapport à l'acide après 4 jours de succinique % culture g/l L6 0,00 L6A45 0,70 5,9 L6A45T10 1,85 15,7 Exemple 2 : On a recommencé les essais dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1 mais en remplaçant le succinate de sodium par l'acétate de sodium 0,1 M. Dans cet essai, on utilisait l'acide acétique M au lieu de l'acide chlorhydrique pour la neutralisation du milieu au cours de la culture. Les résultats sont donnés dans le tableau 3. TABLEAU a Chlorhydrate de lysine Souche produit après 4 jours de culture (g/l) L6 0,00 L6A45AT10 1,20 Le rendement par rapport à l'acide acétique mis en oeuvre est ici de 10,5% pour le mutant L6A45AT10. Ces résultats sont donnés à titre d'exemple. De nombreux autres substrats et notamment les autres acides gras inférieurs, propionique, butyrique, valérique et isovalérique, purs ou en mélange sont utilisables pour la production de lysine avec ces mutants. On peut notamment utiliser un mélange d'acides provenant de l'oxydation de coupes pétrolières légères, naphtas par exemple. Les autres diacides du cycle citrique tels que les acides fumarique,l-malique et citrique et d'autres diacides comme l'acide adipique sont aussi utilisables. I1 est bien entendu que dans les cultures effectuées à pH voisin de la neutralité, les acides utilisés sont sous forme de leurs sels de métaux usuels, tels que sodium, potassium, ammonium et que ces sels peuvent être utilisés aussi bien que les acides correspondants à la préparation des milieux de culture. Parmi les alcools, l'méthanol et le glycérol le sont aussi. En ce qui concerne la source d'azote, d'autres sels d'ammonium tels que les phosphates, nitrate, chlorure et carbonate sont utilisables. I1 peut être avantageux d'utiliser le ou les sels d'ammonium du ou des acides utilisés pour la croissance, par exemple l'acétate d'ammonium, ou d'utiliser l'acide acétique et le neutraliser par l'ammoniaque. La zone de pH favorable à la production de lysine se situe entre 5 et 9 et les meilleurs résultats ont été observés aux environs de la neutralité. En ce qui concerne la température, une gamme allant de 15 à 370 environ, est utilisable avec une préférence aux environs de 300. En ce qui concerne la récupération de la lysine du milieu de culture des méthodes connues de séparation sont utilisables. On peut notamment éliminer les cellules par centrifugation ou filtration et extraire la lysine de la solution en utilisant des résines échangeuses d'ions sous forme acide.On élue ensuite les cations organiques (essentiellement la lysine) par une solution ammoniacale laquelle est ensuite concentrée par exemple sous pression réduite, l'excès d'ammoniac étant ainsi éliminé. Le chlorhydrate de lysine est ensuite précipité en amenant, à l'aide d'acide chlorhydrique, la solution concentrée à un pH compris entre 5 et 6. REVENDIATI ONS 1/ Procédé de production de lysine par culture d'un microorganisme, caractérisé en ce que l'on cultive, dans un milieu nutritifXun mutant de bactérie gram-négative obtenu en cultivant, dans une première étape, une souche de bactérie gram-négative sur un milieu de culture solide contenant un analogue de la lysine, en recueillant les bactéries qui se sont développées et, dans une seconde étape, en cultivant les bactéries ainsi recueillies sur un milieu de culture solide contenant, à la fois, de la thréonine ou l'un de ses analogues et un analogue de la lysine. 2/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la bactérie gram-négative est du genre Pseudomonas. 3/ Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que la bactérie gram-négative est du groupe Pseudomonas acidovorans. 4/ Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que la bactérie gram-négative est de l'espèce Pseudomonas acidovorans L6. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'analogue de la lysine est la S (p ~aminoéthyl) cystéine. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'analogue de la lysine est la 4-oxalysine, la trans-4- dehydrolysine, - k - méthyllysine, la 3-amino cyclohexyl alanine, la 3"aminométhyl cyclohexyl glycine ou la #-hydroxylysine. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient des sels minéraux et au moins un acide gras. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'acide gras est l'acide acétique ou un mélange d'acides provenant de l'oxydation de coupes pétrolières légères.