Brevet FR2122472A1 — publié le 19720901

i 2122472 La présente invention concerne l'amélioration de procédés en vue de, ou bien ayant trait à, la culture de levures capables de croître sur hydrocarbures. Un certain nombre de procédés en vue de la cul-5 ture de levures sur des substrats composés d'hydrocarbures assimilables sont déjà connus. Le plus souvent, suivant de tels procédés, on cultive une levure capable de croître sur hydrocarbures à chaîne linéaire sur un substrat composé d'un hydrocarbure à chaîne linéaire, ou du moins comportant un tel hydrocarbure, en présence 10 d'un milieu nutritif aqueux et d'un gaz contenant de l'oxygène libre. Au cours du déroulement du procédé de culture, il y a formation d'acides monocarboxyliques aliphatiques par suite de l'oxydation des hydrocarbures présents dans le bouillon. On a également constaté que la présence de certains de ces acides est susceptible 15 de réduire la vitesse de croissance de la levure. Nous venons de découvrir que la présence dans le bouillon de culture de certains acides monocarboxyliques aliphatiques ajoutés a pour effet de stimuler la croissance de la levure lors de la phase de croissance exponentielle. 20 Le procédé de culture d'une levure capable de croître sur hydrocarbures selon la présente invention consiste à cultiver une levure croissant sur hydrocarbures à chaîne linéaire sur une charge d'hydrocarbures comportant au moins une certaine quantité d'hydrocarbures à chaîne linéaire, un milieu nutritif 25 aqueux, un gaz contenant de l'oxygène libre, et, lors de la phase de croissance exponentielle, en présence d'un acide monocarboxyli-que aliphatique ajouté à plus de 12 atomes de carbone par molécule. Les acides monocarboxyliques aliphatiques compren-30 nent les acides saturés et non saturés, à chaîne linéaire ou ramifiée. Les acides ayant de 14 à l8 atomes de carbone dans la chaîne linéaire comportant la fonction carboxyle se sont avérés particulièrement efficaces. Il est particulièrement souhaitable que le nombre d'atomes de carbone dans la chaîne linéaire comportant la 35 fonction carboxyle soit compris entre 13 et 24. Pour des raisons de disponibilité, de prix et d'efficacité, il est recommandé d'utiliser des acides à chaîne linéaire. De même, il est souhaitable d'utiliser une concentration d'acide comprise entre 0,1 et 10 millimoles par litre de 40 bouillon. Cette fourchette de concentration s'avère particulièrement 72 01466 2 2122472 efficace si l'on maintient le pH du bouillon de culture à une valeur de 4,0 environ. La concentration du substrat influera sur ce seuil de 0,1 millimole par litre de bouillon. Il est recommandé de dissoudre l'acife dans la 5 charge d'hydrocarbures et d'ajouter cette solution au milieu nutritif aqueux en vue de former le bouillon de culture. On peut ajouter l'acide au bouillon soit avant, soit au cours de la fermentation. Parmi les charges d'hydrocarbures pouvant être 10 mises en oeuvre, on peut citer par exemple des gas-oils qui peu-'vent avoir, ou non, subi un traitement de raffinage mais qui, en tout état de cause, doivent comporter une certaine quantité d'hydrocarbures à chaîne linéaire et à 10 atomes au moins de carbone par molécule. Un gas-oil comportant de 3 à 45# en poids de tels 15 hydrocarbures à chaîne linéaire est particulièrement désigné. Le procédé peut se dérouler suivant l'une quelconque des techniques de culture déjà connues. On utilise~norma-lement une température comprise entre 25 et 35°C. Si on utilise la levure préférée, à savoir Candida tropicalis, il est recomman-20 dé de maintenir la température à une valeur comprise entre 28 et 32°C. Normalement, on maintient le pH du milieu nutritif à une valeur comprise entre 3 et 6 et de préférence entre 4 et 5- Parmi les levures utilisables, on recommande plus particulièrement une souche du genre Candida capable de croître sur hydrocarbures. 25 L'invention permet de diminuer le temps de dé marrage des procédés de fermentation en continu, correspondant à l'ensemencement, ce qui permet de mettre le fermenteur en service plus rapidement après chaque ensemencement. On peut citer l'exemple suivant de mise en oeu-30 vre de l'invention : Exemple On a étudié l'influence des acides tétradéca-noïque, hexadécanoîquë, octadécanoîque et 2-méthyl hexadécanol-que sur la vitesse de croissance d'une souche de Candida tropi-35 calis capable de croître sur hydrocarbures dans les conditions de culture discontinue et en utilisant du gas-oil en tant que substrat carboné. On procède à une fermentation témoin discontinue dans les mêmes conditions, sans ajouter d'acides. On en compare les résultats à ceux obtenus par fermentation discontinue 40 dans les mêmes conditions mais en ajoutant les acides undécanol- 72 01466 3 2122472 que et dodécanoîque. Le mode opératoire est le suivant : Inoculum On fait croître une souche de Candida tropicalis 5 croissant sur hydrocarbures dans un bouillon de culture comportant du gas-oil en tant que substrat carboné ainsi qu'un milieu aqueux contenant des sels nutritifs. La culture se déroule en continu et en milieu aérobie» On maintient le pH du milieu à une valeur de 4,0 environ. Ensuite, on sépare la levure cultivée du bouillon 10 sous forme d'une crème ou pâte et on la lave en vue d'éliminer toute trace de gas-oil résiduel» Matériel On effectue la fermentation dans des récipients ayant un volume utile de 1 litre. Chaque récipient est muni d'un 15 dispositif d'agitation à 6 palettes en acier inoxydable. Le milieu est aéré au moyen d'un courant d'air comprimé et filtré, à raison de 50 1/h par récipient. On prévoit également un moyen d'alimentation en ammoniac sous forme d'hydroxyde d'ammonium, en vue de fournir une 20 source d'azote et de permettre de régler le pH en fonction des besoins. Le dispositif utilisé est un pH mètre/titreur du type "Radiometer TTT1". Bouillon de culture La composition de la phase aqueuse est la suivan- 25 te : 30 35 (nh4)2 . hpo4 . 2,0 KC1 1,0 MgS04 . 7Ho0 CL 0,5 MnS04 - H2O 0,5 FeSO^ . 7H20 0,1 ZnSO^ & H-jO 0,3 Eau d'appoint 1 litre On règle le pH de la phase aqueuse à une valeur de 4,0 + 0,05 en ajoutant une solution normale d'acide sulfurique. Source de carbone lourd. On utilise un gas-oil/à raison de 62,5 g par litre de la phase aqueuse. Le gas-oil contient 14,7$ en poids de paraffines à ohaîne linéaire à nombre d'atomes de carbone compris entre 16 et 26 par molécule. 72 01466 4 2122472 Acides monocarboxyliques aliphatiques ajoutés On répartit le gas-oil en plusieurs lots. Ensuite, ai ajoute à chaque lot l'un des acides étudiés, en quantité suffisante pour assurer une concentration initiale de 6,70 mil-5 limoles par litre de bouillon de culture. Mode de fermentation On utilise une fermentation discontinue et on effectue cette fermentation séparément pour chacun des acides étudiés Les conditions opératoires sont les mêmes pour chaque 10 fermentation. On ajoute 1 g (poids sec) de l'inoculum de levure pour chaque litre de bouillon de culture. On maintient une température de 30°C + 0,5 pendant toute la durée de la fermentation et on utilise une vitesse 15 d'agitation de 1000 t/mn. On aère à raison de 50 volumes d'air par volume unitaire du milieu et par heure. On maintient le pH à une valeur de 4,0 + 0,05 en ajoutant une solution d'hydroxyde d'ammonium en fonction des besoins, la quantité d'hydroxyde d'ammonium utilisée étant mesurée au moyen d'une burette. 20 On évalue le taux de croissance de la levure en quantité d'hydroxyde d'ammonium mise en oeuvre pour maintenir le pH de fermentation à la valeur de 4,0 + 0,05 (il existe une excellente corrélation entre le poids sec de cellulles de levure produites et la quantité d'hydroxyde d'ammonium utilisée). Ensuite 25 on calcule la densité cellulaire de la levure obtenue d'après la relation : X = 0,155 Y X représente la quantité en grammes de levure obtenue 6t Y le volume en millilitres de solution normale d'hydroxyde d'ammonium ajoutée. Ensuite, on établit une courbe de croissance pour chaque fermentation en portant sur un graphique les valeurs du log^Q de la densité cellulaire en fonction du temps. Le taux de croissance spécifique pour chacun des 35 acides étudiés ainsi que pour la fermentation témoin en l'absence d'acide est ensuite calculé d'après la relation : Taux de croissance spécifique (^u) = loSe2 40 Temps moyen de génération pendant la phase de croissance expgjteji- 72 01466 5 2122472 Le temps de génération moyen est le temps nécessaire pour atteindre une densité cellulaire deux fois plus grande d'après les courbes de croissance. Le tableau ci-après présente les taux de crois-5 sance spécifiques (^u) obtenus pour chacun des fermenteurs. Ces résultats montrent que la présence lors de la phase de croissance exponentielle des acides tétradécanoïque, hexadécnoîque, octa-décanoîque et 2-méthylhexadécanoïque assure une augmentation du taux de croissance spécifique de la Candida tropicalis d'au moins 10 20$. Il s'ensuit que, lors des fermentations discontinues, 1'addition cfe ces acides est susceptible de conduire à une réduction du temps de fermentation de l'ordre de 20$. La présence desdits acides lors des phases d'ensemencement des fermentations en continu sur substrats d'hydrocarbures assure un taux de croissance 15 supérieur, ce qui réduit le temps de démarrage. Ces acides se caractérisent par le fait qu'ils prolongent la durée de la phase de croissance exponentielle, et ce de manière sensible» En outre, ils réduisent la tendance à l'inhibition de la vitesse de croissance liée à la présence 20 dans le bouillon de culture d'acides à chaîne courte et notamment d'acides carboxyliques à chaîne courte ramifiée susceptibles d'être formés par suite de la co-oxydation des paraffines à chaîne ramifiée présentes dans les substrats d'hydrocarbures mixtes. Citons par exemple l'acide n-octadécanoïque dont la pré-25 sence réduit l'effet toxique de l'acide 2-méthyl hexanoïque présent dans le bouillon de culturec TABLEAU 30 35 Acide à chaîne longue Fermentation Taux de croissance spécifique (^u) Néant Témoin 0,32 Undécanoîque Dodécanoïque Fermentations comparatives 0,2? 0,32 Tétradécanoïque Hexadéeanoïque Octadécanoïque 2-méthylhexadécanoïque Fermentations expérimentales 0,385 0,385 0,385 0,385 72 01466 6 2122472 REVENDICATIONS 1. Procédé de culture d'une levure capable de croître sur hydrocarbures, caractérisé par le fait que l'on cultive une levure capable de croître sur hydrocarbures à chaîne 5 linéaire sur une charge d'hydrocarbures comportant une certaine quantité au moins d'hydrocarbures à chaîne linéaire, un milieu nutritif aqueux, un gaz contenant de l'oxygène libre ; et, qu'au moment où se trouve atteinte la phase de croissance exponentielle, on incorpore dans ladite charge un acide monocarboxylique alipha-10 tique comportant plus de 12 atomes de carbone par molécule, 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en outre par le fait qu'on utilise un acide monocarboxylique aliphatique de concentration comprise entre 0,1 et 10 millimoles par litre de bouillon de culture. 15 3. Procédé suivant l'une quelconque des revendica tions 1 et 2, caractérisé en outre par le fait qu'on utilise comme charge d'hydrocarbures du gas-oil. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en outre par le fait qu'au lieu d'incor- 20 porer ledit milieu nutritif aqueux dans ladite charge d'hydrocarbures, on dissout d'abord ledit acide monocarboxylique aliphatique dans cette charge ; et que l'on ajoute ensuite ledit milieu nutritif aqueux à la solution ainsi obtenue. 5. Levure croissant sur hydrocarbures résultant 25 de la mise en oeuvre du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4.