Brevet FR2111909A1 — publié le 19720609

B8646 1 2111909 La présente invention a pour objet de nouveaux polypep-tides répondant à la formule générale I H-Cys-Ser-Asn-Leu-3er-Thr-Cys~Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-5 Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-NHg ^ dans laquelle soit X représente un reste valyle et Y signifie un reste alanyle, soit X représente un reste alanyle et Y signifie un reste valyle, ainsi que leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes métalliques. 10 L'invention concerne également les procédés permettant de préparer ces composés, ainsi que leurs sels et leurs complexes métalliques, et l'application en thérapeutique des nouveaux polypeptides, de leurs sels et de leurs complexes métalliques, à titre de principes actifs de médicaments. 15 Les nouveaux polypeptides de formule I peuvent être pré parés selon les méthodes généralement connues pour la synthèse de composés de ce type.Les acides sont alors associés dans l'ordre où ils figurent dans la formule représentée ci-dessus, soit isolément, soit par petites séquences peptidiques préalablement formées, la 20 formation du pont disulfure étant réalisée à un stade approprié de la synthèse. Le couplage des acides aminés et/ou des unités peptidiques est effectué par exemple en faisant réagir un acide aminé ou un peptide dont le groupe a-amino est protégé et le groupe carboxyli-25 que terminal activé, avec un acide aminé ou un peptide ayant le groupe a-amino libre et le groupe carboxylique terminal libre ou protégé. On peut également faire réagir un acide aminé ou un peptide dont le groupe a-amino est activé et le groupe carboxylique terminal protégé, avec un acide aminé ou un peptide ayant le 30 groupe carboxylique terminal libre et le groupe a-amino protégé. Le groupe carboxylique peut être activé par exemple par transformation en azide, en anhydride d'acide, en imidazolide, en isoxazolide ou en ester activé, ou par réaction au moyen du car- bodiimide ou du N,N'-carbonyl-diimidazole. 25 Comme méthode de condensation, on utilise de préférence la méthode de couplage au carbodiimide, à 1'azide, à l'ester activé, à l'anhydride d'acide et la méthode de Merrifield. Cependant, au dernier stade de la condensation il est conseillé d'uti 71 38646 2111909 liser des méthodes qui ne provoquent pas de racérnisation ou qui ne provoquent qu'une racérnisation peu importante, de préférence la méthode de couplage à 1'azide ou à l'ester activé, en employant, pour 1'activation, de préférence le N-hydroxy-succinimide. 5 Les groupes fonctionnels libres qui ne participent pas à la réaction peuvent, au cours de la synthèse des nouveaux polypeptides, être protégés par les groupes protecteurs habituellement utilisés dans la synthèse des polypeptides. C'est ainsi que pour bloquer le groupe guanidino de 10 l'arginine dans les séquences partielles C^ et Cg décrites ci-après, on utilise par exemple le groupe benzyloxy-carbonyle; cependant, on peut employer d'autres groupes protecteurs approprjés tels que le groupe nitro, tosyle, p-nitrobenz.yloxycarbonyle ou 2-(isopropyloxycarbonyl,5> 6-tétrachlorobenzoyle. Dans la 15 synthèse, il est également possible d'avoir recours à l'effet protecteur de la protonisation du groupe guanidino. Pour bloquer le groupe w-amino de la lysine, par exemple dans les séquences partielles et décrites ci-après, on peut utiliser un groupe tert.-alcoxycarbonyle, de préférence le 20 groupe tert.-butoxycarbonyle. Le groupe tert.-butoxy s'est montré approprié pour bloquer le groupe /3-carboxylique, par exemple dans la séquence partielle décrite ci-après; on peut cependant utiliser, dans le même but, d'autres groupes protecteurs, tels que le groupe 25 raéthoxy, éthoxy, tert.-amyloxy, amide ou benzyloxy. Au cours du procédé de préparation des nouveaux polypeptides, la transformation d'un groupe amino protégé en groupe amino libre,ainsi que .la transformation d'un groupe carboxylique modifié en groupe carboxylique libre, peut être effectuée selon J>0 des méthodes connues par traitement avec des agents hydrolysants ou réducteurs. Selon un procédé préféré de l'invention, on fait réagir taie séquence peptidique contenant le groupe H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-35 sous forme protégée. C'est ainsi par exemple qu'on condense le nonapeptide de formule II 71 38646 2111909 i 1 BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH (II) après activation préalable, avec le tricosapeptide de formule III H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-His-5 Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- (III) Gly-X-Gly-Y-Pro-NHg dans laquelle X et Y ont les significations déjà données, à partir du dotriacontapeptide ainsi obtenu qui répond à la formule IV BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-10 Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-HIs-Lys(BOC)- Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg~Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-NH2 on élimine les groupes protecteurs tert.-butyloxycarbonyle et tert.-butyloxy et, le cas échéant, on transforma les polypeptides 15 de formule I ainsi obtenus en leurs sels d'addition d'acides ou en leurs complexes métalliques. Les produits de départ utilisés dans la préparation des nouveaux polypeptides sont connus ou peuvent être préparés selon des méthodes connues appliquées dans la chimie des peptides, 20 les acides aminés étant associés les uns aux autres, soit un par un, coit par petites séquences peptidiques préalablement formées. Les nouveaux polypeptides peuvent être obtenus ou utilisés soit tels quels, soit sous forme de leurs sels ou de leurs complexes métalliques. Comme sels, on peut citer ceux qui 25 dérivent d'acides organiques, comme l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide succinique, l'acide benzoïque, l'acide salicy-lique, l'acide méthane-sulfonique, l'acide toluène-sulfonique ou des acides polymères, comme l'acide tannique et la carboxyméthyl-eellulose, et ceux qui dérivent d'acides minéraux, comme l'acide 50 sulfurique, l'acide phosphorique ou les acides halohydriques, par exemple l'acide chlorhydrique. Comme complexes métalliques, on peut citer les complexes formés avec des métaux tels que le calcium, le magnésium, l'aluminium, le cobalt et surtout le zinc. Les nouveaux polypeptides de l'invention se signalent 35 par d'intéressantes propriétés pharmacodynamiques. C'est ainsi qu'ils abaissent le taux du calcium sanguin et, en tant qu'anta 71 38646 4 2111909 gonistes de la parathormone, empêchent le catab'.ll^c. -oUvva. L'activité biologique des polypeptides de formule I peut être mise en évidence par l'hypocalcémie qu'ils provoquent chez le rat. 5 On utilise des rats mâles pesant entre 100 et 130 g maintenus au jeûne pendant 16 heures et hydratés avec une solution physiologique de chlorure de sodium. On prélève chez l'animal environ 1 ml de sang à partir du plexus véneux rétroorbitaire. On injecte ensuite dans la queue, par voie intraveineuse, 1 ml/» 2: 10 d'une solution du composé à essayer dans de l'acide acétique 0,2N et une heure plus tard on prélève à nouveau du sang. Après coagulation on centrifuge les échantillons de sang, on sépare le sérum surnageant, on le dilue avec une solution à 0,25$ d'acide éthylènediamine-tétra-aeétique et on détermine le taux de calcium 15 au moyen d'un spectrophotomètre d'absorption. La différence entre les valeurs trouvées avant et après administration de la substance donne la mesure de l'hypocalcémie. Les activités sont calculées selon la méthode décrite par M.A. Kumar et coll. dans J.Endocrin. 33» 469 (1965). Les résultats obtenus sont comparés 20 à ceux obtenus avec un échantillon étalon de thyrocalcitonine provenant du "Médical Research Council" (MRC); l'activité est exprimée en unité MRC par mg de peptide (10 milli-unités provoquent chez le rat une baisse de 10$, soit 1 mg/100 ml, du taux de calcium dans le sérum). Dans cet essai, les nouveaux polypep-25 tides de l'invention possèdent une activité de 3000 à 6000 unités MRC/mg de peptide. La dose à administrer dépend de l'action désirée ainsi que du mode d'application. En général, on obtient des résultats satisfaisants en administrant des doses quotidiennes comprises 30 entre environ 70 et 700 unités, soit en une seule fois, soit en plusieurs fractions. Pour l'application intramusculaire, les formes d'administration appropriées contiennent environ de J0 à 700 unités de substance active, en mélange avec un support liquide. 35 Les composés de formule I peuvent être utilisés en thérapeutique pour le traitement de tous les états dans 71 38646 2111909 on désire obtenir line baisse de la calcémie ou agir sur le métabolisme osseux, comme par exemple les hyperealcémies dues à l'insuffisance de thyrocalcitonine endogène résultant d'une inactivité du tissu thyroïdien ou à 1'hyper-para-thyroïdie. Les cora-5 posés de formule I sont également indiqués pour le traitement de toutes les ostéopathies provoquées par un catabolisme osseux trop élevé ou des ostéopathies dans lesquelles on désire provoquer une fixation de calcium dans l'os, comme par exemple les ostéoporoses, les fractures, les ostéomalacies, le rachitisme et 10 les ostéites déformantes hypertrophiques d'origine rénale. On pourra également utiliser les composés de l'invention en combinaison avec du calcium ou des phosphates. Les nouveaux composés ainsi que leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes métalliques peuvent être utilisés 15 comme médicaments sous forme de compositions pharmaceutiques. Celles-ci renferment la substance active, en mélange avec un excipient minéral ou organique, approprié pour l'administration par la voie orale ou parentérale. Comme excipients, on utilisera des produits qui ne réagissent pas avec les nouveaux composés, comme 20 par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, ls stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, l'alcool hen^ylique, la gomme arabique, les poly-alkylène-glycols, le cholestérol ou d'autres excipients pharmaceutiques connus». Les préparations pharmaceutiques liquides peuvent être 25 par exemple des solutions, des suspensions ou des émulsions. Gn peut les stériliser et/ou leur ajouter des adjuvants, tels que des agents de conservation, des stabilisants, des mouillants ou des émulsionnants. Elles peuvent également contenir d'autres substances actives. Les composés de formule I peuvent également 30 être administrés sous forme de préparations à effet retardé. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont toutes exprimées en degrés centigrades. Les pouvoirs rotatoires ont été déterminés avec c = 1. Par ailleurs, on fait usage dans la 35 présente description des abréviations suivantes: 71 38646 6 2111909 Z = benzyloxycarbonyl Bzl = benzyl BOC = tert.-butyloxycarbcnyl Trt = trityl = triphénylméthyl 5 OTB = tert.-butyloxy ONP = ester p-nitrophénylique OCP = 2,4,5-trichlorophénoxy OSu = N-oxy-succinimide OMe = méthoxy 10 OEt = éthoxy Ser = L-séryl Asn = L-asparaginyl Asp = L-aspartyl Leu = L-leucyl 15 Lys = L-lysyl Thr = L-thréonyl Val = L-valyl Gin = L-glutaminyl Ala = L-alanyl 20 Arg = L-arginyl Phe = L-phénylalanyl His = L-histidyl Pro = L-prolyl Gly = glycyl 25 Cys = L-cystéinyl t.-But = tert.-butyl 1. Préparation des produits de départ Séquence partielle_A1£ H-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ On met en suspension 27,5 g de Z-Val-Gly-Ala-Pro-NE2 30 dans 550 ml de méthanol, on ajoute 3 ml d'acide sulfurique à 96$ et on hydrogène en présence de 4,1 ml d'acide acétique glacial et de 3,1 S de palladium à 10$ sur charbon. On filtre la solution et on l'évaporé, ce aui donne le sulfate de H-Val-Glv-AIa-Pro-NH2; Rfj- = 0,2, chromatographie en couche mince sur gel de silice. 35 Séguence_partielle_A2j_ H-Ala-Gly-Val-Pro-NH^ a) Z-Val-Pro-NEU 71 38646 7 2111909 On dissout 75 g de H-Pro-NH^ dans 850 ml de diméthylformamide, on ajoute 312 g de Z-Val-OCP et on laisse reposer la solution pendant 16 heures à la température ambiante. On évapore sous pression réduite et on recristallise le résidu d'évaporation 5 dans l'acétate d'éthyie, ce qui donne le Z-Val-Pro-NH0 qui fond PO à I3O-I3I0; [a]j} = -41° dans le diméthylfo^mamide. b) Z-Gly-Val-Pro-NHc On dissout 190 g de Z-Val-Pro-NH^ dans 2200 ml de méthanol, on ajoute 85 ml d'acide chlorhydrique méthanolique 6n, on 10 hydrogène en présence de palladium sur charbon,à 20° et sous pression normale, et on sépare le catalyseur par filtration. On fait précipiter le produit avec de l'éther, on le lave et on le sèche. On met en suspension 120 g du H-¥al-Fro-NHp*KCl ainsi PO obtenu (F = 217-218° avec décomposition; [et3^ = -57° dans le 15 méthanol) dans 1800 ml de diméthylformamide, on ajoute d'abord 196 g de Z-Gly-OCP, puis 67 ml de triéthylamine et on agite pendant 17 heures à 20°. On élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité, on évapore le filtrat sous pression réduite et on dissout le résidu d'évaporation dans un 20 mélange d'acétate d'éthyie et d'eau. Après séchage sur sulfate de sodium et évaporation, on obtient le Z-Gly-Val-Pro-NHp fon- 20 dant à 82° (avec décomposition); = -76° dans le méthanol. c) Z--Ala-Gly-Val-Pro-NEU On dissout 92 g de Z-Gly-Val-Pro-NH2 dans 2000 ml de 25 méthanol, on ajoute 27 ml d'acide acétique et on hydrogène à 20° sous pression normale, en présence de palladium bur charbon. On filtre, on évapore à siccité sous pression réduite et on dissout le résidu ainsi obtenu dans 1000 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite 100 g de Z-Ala-OCP, on agite et on laisse reposer 30 la solution pendant 17 heures à 20°. On évapore à siccité sous pression réduite et on fait cristalliser le résidu d'évaporation dans un mélange d'acétate d'éthyie et d'éther. On obtient ainsi le Z-Ala-Gly-Val-Pro-NHp fondant à 80° (avec décomposition); on [a]^ = -31° dans le diméthylformamide. 35 d) H-Ala-Gly-Val-Pro-NH^ On met en suspension 27,5 g de Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH^ 71 38646 8 2111909 dans 550 ml de méthanol, on ajoute 3 ml d'acide yulfuiiq^w a 9S/o et on hydrogène en présence de 4,1 ml d'acide acétique glacial et de 3,1 g de palladium à 10$ sur charbon. On filtre la solution et on l'évaporé, ce qui donne le sulfate de H-Ala-Gly-Val-5 Pro-NH2; chromatographie en couche mince sur gel de silice: Rf^ = 0,4. (Système; mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 7:3 + 0,5$ d'eau.). Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH^ On dissout 98 g de Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt dans 1000 ml 10 de diméthylformamide et on ajoute 100 ml d'hydrate d'hydrazine. On laisse reposer pendant 16 heures à la température ambiante, on filtre et on lave à l'eau et à l'éther, ce qui donne le com- PO posé indiqué dans le titre fondant à 221°j [r*]p = ~9° dans le diméthylformamide. 15 Séquence partielle C^: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ On dissout 13,5 g de BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHg danc 270 ml d'ion mélange de diméthylformamide et d'eau dans le rapport 8:2, on refroidit à -15° et on ajoute 40 ml d'une solution 4N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 2,5 ml de nitrite 20 de tert.-butyle. On agite à -15° pendant 10 minutes, on ajoute 28 ml de triéthylamine, on filtre, on ajoute 10,5 S d H-Yal-Gly-Ala-Pro-NHg (séquence partielle A^) et on agite pendant 16 heures à 0°. On évapore à siccité, on lave le résidu d'évaporation à l'éther et on le sèche. On dissout le résidu dans le méthanol, 25 on ajoute un dixième de volume d'eau et sept fois la quantité de chloroforme et on chromatographie la solution ainsi obtenue sur 500 g de gel de silice en éluant avec une quantité croissante de méthanol. Après évaporation, on obtient le BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ que l'on met en suspension 30 dans 200 ml d'une solution 4iï d'acide chlorhydrique dans du dioxanne. On agite pendant 2 heures à 25°, on évapore à siccité et on dissout le résidu d'évaporation dans de l'acide acétique 0,2N. On traite la solution ainsi obtenue par de l'Amberlite-IRA-410 (forme acétate) et on lyophilise la solution aqueuse. On 35 lave ensuite le résidu à l'éther, à l'acétate d'éthyie et de nouveau à l'éther et on sèche sur copeaux d'hydrox^ue ac ouuxuïh. 71 38646 2111909 On obtient alors le diacétate du composé du titre fondant à 195° 20 (avec décomposition); [a]^ = -64° dans un mélange à parts égales de diméthylformamide et d'acide chlorhydrique IN. §équence_partielle 0^' H-A rg-Thr-A sn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH^ 5 En procédant comme décrit pour la séquence on obtient, à partir de BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHg et de H-Ala-Gly-Val- Pro-NHp (séquence partielle Ap), le diacétatp du composé du titre 20 fondant à 155° (avec décomposition); [a]p = -J>8° dans le diméthylformamide. 10 Séquence _partielle_C^j_ Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-AIa-Pro-NH,-, A une solution refroidie à -15° de 11 g de Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHg (séquence partielle B.^ dans 350 ml de diméthylformamide, on ajoute 47 ml d'une solution 1,&5N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 2,2 ml de nitrite de tert.-butyie. 15 On agite pendant 10 minutes à -15°, 011 refroidit à -30°, on ajoute 12 ml de triéthylamine et on filtre sur une solution froide de H-Val-Gly-Ala-Pro-KH2 (séquence partielle A^) dans du diméthylformamide. On agite pendant 90 minutes à 0°, on concentre sous pression réduite, on ajoute du chloroforme, puis on filtre et on 20 sèche le produit qui a précipité. On filtre sur Dowex 50 une solution de ce produit brut dans un mélange d'eau et de méthanol, on la neutralise avec de l'Amberlite IRA 410 et on évapore sous pression réduite. On triture le résidu d'évaporation avec de 1'acétonitrile, on le chauffe, on le filtre et on le sèche. On 25 obtient ainsi le composé du titre fondant à 220° (avec déeompo-20 sition); [cc]^ - -28° dans le diméthylformamide. Séquence partielle C^: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Yal-Pro-NEU En opérant comme décrit pour la séquence on obtient, à partir de Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHKHg (séquence partielle B^) et 30 de H-Ala-Gly-Val-Pro-NHp (séquence partielle A_), le composé du • -20 titre fondant à 206° (avec décomposition); [aj^ = -25° dans le diméthylformamide. Séquence partielle C,_: Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHU On dissout 10 g de Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-35 NH2 (séquence partielle C^) dans 800 ml d'un mélange de méthanol et d'eau, on ajoute 0,5 g de palladium sur charbon et on hydro 71 38646 10 2111909 gène sous pression normale. On élimine le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat sous pression réduite. On obtient ainsi le H-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro~NH2 sous forme d'une huile qu'on dissout dans 100 ml de diméthylformamide. On ajoute 5 10 g de Z^-Arg-OSu et on laisse reposer pendant 16 heures à 20°. On concentre ensuite la solution sous pression réduite, on fait précipiter le produit avec de l'acétone et on filtre. On met le résidu en fine suspension dans l'acétone, on fait bouillir, on filtre et on sèche, ce qui donne le composé du titre fondant à 20 10 201° (avec décomposition); [a}^ = -15° dans le diméthylformamide. Séquence partielle_Cg: Z^-Arg-Thr-Asn-'Thr-Gly-Ala-GIy-Val-Pro-NH^ En opérant comme décrit pour la séquence on obtient, à partir de Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH0 (séquence partielle Cj.) et de Z-z-Arg-OSu, le composé du titre fondant à 185° * 20 15 (avec décomposition); [a]^ = -14° dans le diméthylformamide. Séquence_partielle_D1£ Z-His-Ly?(BOC)-Lau-Gln-Thr-Phe-Pro-OK a) H-Thr-Phe-Pro-OH On dissout 176 g de Z-Phe-Pro-OMe dans un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique IN, on hydrogène la solution 20 en présence de palladium sur charbon,à 20° et sous une atmosphère, on l'évaporé et on dissout le résidu d'évaporation dans 400 mi de diméthylformamide. On ajoute, à 0°, 100 ml de triéthylamine, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a cristallisé et on ajoute au filtrat du Z-Thr-N^, préparé par 25 dissolution de 87 g de Z-Thr-NHNHg dans 100 ml d'acide chlorhydrique IN et addition de 35 ml de nitrite de sodium IN. On laisse ensuite reposer le mélange réactionnel pendant 16 heures à 0°, on l'évaporé à siccité, on dissout le résidu ainsi obtenu dans l'acétate d'éthyie, on lave successivement la solution avec de 30 l'acide chlorhydrique dilué et de l'ammoniaque, on sèche et on évapore. On pulvérise le résidu d'évaporation dans l'heptane, on lave à l'éther de pétrole et on sèche. On obtient ainsi le Z-Thr- PO Phe-Pro-OMe fondant à 92° (avec décomposition); [a]D = -16° dans le diméthylformamide. 35 On dissout 53 S de Z-Thr-Phe-Pro-OMe dans 530 ml de méthanol, on ajoute 100 ml d'une solution 2N d'hydroxyde de 71 38646 11 2111909 sodium et on laisse reposer à 25° pendant une heure. On ajoute 50 ml d'acide chlorhydrique 2N, on concentre à environ 200 ml, on ajoute encore 100 ml d'eau et on ajuste le pH à 10. On lave ensuite la solution aqueuse à deux reprises avec de l'acétate 5 d'éthyie, on ajuste le pH à 1 au moyen d'acide chlorhydrique 4N, on extrait le tripeptide Z-Thr-Phe-Pro-OH ainsi formé à l'acétate d'éthyie, on sèche et on évapore} le produit fond on à 105°, = -28° dans le diméthylformamide. On le dissout dans un mélange de 500 ml de dioxanne et de 100 ml d'eau et on 10 hydrogène à 20° et sous pression normale, en présence d'un catalyseur au palladium. On filtre, on évapore à siccité, on lave le résidu à l'éther et on le sèche, ce qui donne le H-T'nr-Phe- PO Pro-OH fondant à 192° (avec décomposition); = -^1° dans l'acide acétique à 95$« 15 b) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH On dissout 40 g de Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NHg dans 400 ml de diméthylformamide, on refroidit la solution à -20°, on ajoute 75 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique 2N, puis 6 ml de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant 10 20 minutes à -20°, on ajoute 30 ml de triéthylamine et 20 g de H-Thr-Phe-Pro-OH et on laisse réagir le mélange pendant 16 heures à 25°. On l'évaporé ensuite à siccité, on lave le résidu successivement à l'éther, à l'acide acétique dilué, à l'éther et à l'acétate d'éthyie chaud. On sèche ensuite sous vide poussé, ce 25 qui donne le Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH fondant à 20 200° (avec décomposition); = -47° dans le diméthylformamide. Séquence partielle_D2j_ Z-His-Lys (BOC ) -Leu-C-ln-Thr-Phe-Pro-NHNH^ a) Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe On dissout 84,8 g de Z-Thr(t.-But.)-0Me dans 1500 ml 30 de méthanol et on ajoute 125 ml d'acide chlorhydrique 2N et 10 g de palladium à 10$ sur charbon. Après avoir hydrogéné pendant 4 heures, on élimine le catalyseur par filtration et on évapore complètement le filtrat. On dissout 6l,2 g de Z-Gln-OH et 25,6 g de N-hydroxy-35 succinimide dans 1000 ml d'un mélange d'acétonitrile et de dirné-thylformamide et on refroidit la solution à -15°• On y verse 71 38646 12 2111909 ensuite une solution de 45,7 g de dicyclohexyl-carbodiiri." ' rlan* 200 ml d'acétonitriie, puis le chlorhydrate de H-Thr-(t.-But.)-OMe obtenu auparavant, dissout dans du dimélhylformarnide, en présence de 30,4 ml de triéthylamine. On abandonne le mélange 5 réactionnel pendant 16 heures à la température ambiante, tout en agitant de tençs en temps, puis on sépare par filtration le-chlorhydrate de triéthylamine qui a cristallisé ou la dicyclohexylurée et on évapore le filtrat jusqu'à épuisement total. On reprend le résidu par de l'acétate d'éthyie et on lave à l'acide chlorhydri-10 que IN et au bicarbonate de soude à 5$. On sèche sur sulfate de sodium, on concentre la phase organique à un volume d'environ 200 ml et on y ajoute de l'éther de pétrole. On transforme l'huile qui a précipité en une poudre qu'on filtre. On obtient ainsi le pn Z-Gln-Thr(t.-But.)-0Me fondant à 106°; [aj^ = +11° dans le di-15 méthylformamide. On dissout j8 g de Z-Gln-Thr(t.-But)~0Me dans 800 ml de méthanol et on ajoute à la solution ainsi obtenue f>5 ml d'hydrate d'hydrazine. On abandonne ensuite le mélange réactionnel pendant 48 heures à la température ambiante, puis on l'évaporé 20 totalement. On traite le résidu d'évaporation par de l'eau et on le recristallise dans un mélange de méthanol et d'eau, ce qui donne le Z-Gln-Thr(t.-But.)-NHNHg fondant à 202°j [a]^° = -13° dans le méthanol. On dissout 45.3 g de Z-Phe-Pro-OMe dans 750 ml de métha-25 nol et on y ajoute 55 ml d'acide chlorhydrique 2N et 12 g d'un catalyseur à 10$ de palladium. On hydrogène la solution pendant 2 heures; la quantité calculée d'hydrogène est alors presque totalement absorbée. On élimine le catalyseur par filtration et on évapore entièrement le filtrat, ce qui donne le HCl*H-Phe-Pro-30 OMe. On dissout 49,5 g de Z-Gln-Thr(t.-But.)-NHNH2 dans 500 ml de diméthylformaide et on refroidit la solution à -20°. On ajoute 77 ml d'acide chlorhydrique 5N dans de l'éther et 13,4 ml de nitrite de tert.-butyle, on agite encore pendant 10 minutes 35 et on neutralise au moyen de 54 ml de triéthylamine. On dissout le HCl*H-Phe-Pro-OMe obtenu plus haut dans 150 ml il.v1 71 38646 13 2111909 formamide, on ajoute 15.4 ml de triéthylamine et.on verse cette solution à la solution du dipeptide-azide préparée ci-dessus. On agite pendant 4 heures à la température ambiante, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité 5 et on évapore le filtrat. On filtre le résidu d'évaporation sur gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme et de méthanol. Après cristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyie et d'éther de pétrole, on obtient le Z-Gln-Thr(t.-But.)- PO Phe-Pro-OMe fondant à 110°j = -41° dans le méthanol. 10 On dissout le tétrapèptide ainsi obtenu dans 250 ml d'acide trifluoroacétique. On abandonne la solution pendant 20 minutes à la température ambiante, on la concentre à la moitié de son volume, puis on fait précipiter le produit avec de l'éther. On filtre le précipité, on le lave à plusieurs reprises à l'éther 15 et on le sèche. On obtient ainsi le Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe fon- PO dant à 154° j [et]^ = -59° dans le méthanol. b) Z-His-Lys(BOC)-Leu-KHNH^ On dissout 114 g de Z-Lys(B0C)-0H, 48 g de H-Leu-OMe et 69 g de N-hydroxysuccinimide dans 600 ml d'acétate d'éthyie 20 et on refroidit à -20°. Dans la solution ainsi obtenue, on verse une solution de 65 g de dicyclohexylcarbodiimide dans 300 ml d'acétate d'éthyie. On abandonne le mélange réactionnel pendant 16 heures à la température ambiante, tout en agitant de temps en temps. On élimine ensuite par filtration la dicyclohexylurée qui 25 a cristallisé, on évapore le filtrat à siccité et on traite le résidu d'évaporation solide par de l'eau. Après cristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyie et d'éther de pétrole, on obtient le Z-Lys(BOC)-Leu-OMe fondant à 113°; -18° dans le méthanol. 30 On dissout 101,5 g de Z-Lys(BOC)-Leu-OMe dans 1000 ml d'acétate d'éthyie et on ajoute une solution préalablement refroidie de 40 ml d'acide chlorhydrique 5N dans de l'éther, dans 300 ml d'acétate d'éthyie. On âjoute 5 S d'un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon, en suspension dans 50 ml de diméthyl-35 formamide, et on hydrogène pendant 3 heures et demie. La quantité calculée d'hydrogène est presque entièrement absorbée. On sépare 71 38646 14 2111909 ensuite le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat, ce qui donne le HC1*H-Lys(BOC)-Leu-OMe. On dissout 78,7 g de Z-His-NHNH^ dans 400 ml de diméthylformamide, on ajoute 182 ml d'acide chlorhydrique 5N dans de 5 l'éther et on refroidit à -10°. On ajoute 32,5 ml de nitrite de tert.-butyle, on continue d'agiter pendant 10 minutes et on neutralise au moyen de 140 ml de triéthylamine. A la solution d'azide ainsi obtenue, on ajoute une solution contenant le HCl'H-Lys(BOC)-Leu-OMe obtenu plus haut dans 300 ml de diméthylformami-10 de et 36,4 ml de triéthylamine. On agite pendant 4 heures à la température ambiante, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité et on évapore complètement le filtrat, ce qui donne une huile qu'on dissout dans l'acétate d'éthyie. On lave la phase organique à l'eau, on la sèche sur 15 sulfate de sodium, on la filtre et on la concentre. On fait ensuite précipiter le produit avec de l'éther de pétrole et on le recueille par filtration. On le purifie par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme et de méthanol. On obtient ainsi le Z-His-Lys(BOC)-Leu-OMe fondant à 20 146° après cristallisation dans un mélange d'éther et d'éther de 20 pétrole; = -28° dans le méthanol. On dissout 64,5 g de Z-His-Lys(BOC)-Leu-OMe dans 300 ml de méthanol et on ajoute 15 ml d'hydrate d'hydrazine. On laisse reposer la solution pendant 3 jours à la température ambiante, 25 puis on l'évaporé complètement. On traite le résidu d'évaporation par un mélange d'acétate d'éthyie et de n-butanol, on lave la phase organique à plusieurs reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, on l'évaporé à siccité et on filtre le résidu sur gel de silice en éluant avec tin mélange de chloroforme 30 et de méthanol. On obtient ainsi le Z-His-Lys(BOC)-Leu-NHNHp PO fondant à l8l°; [a]^ = -26° dans le méthanol. c) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH^ On dissout 3^,4 g de Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe dans 1500 ml d'un mélange de méthanol et de diméthylformamide, on verse dans 35 la solution ainsi obtenue une suspension de 10 g d'un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon dans 50 ml d'eau et on hydrogène. 71 38646 15 2111909 f Au bout d'environ une demi-heure, la quantité calculée d'hydrogène est pratiquement absorbée. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat, ce qui donne le H-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe. 5 On dissout 38,6 g de Z-His-Lys(BOC)-Leu-NHNH2 dans 250 ml de diméthylformamide. Après refroidissement à -15°, on ajoute 42 ml d'acide chlorhydrique 5N dans dp l'éther et 7,3 ml de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant 10 minutes et on neutralise le mélange réactionnel au moyen de 29,5 ml de triéthyl-10 aminé. A la solution du peptide-azide ainsi obtenue, on verse une solution de H-Gln-Tlir-Phe-Pro-OMe obtenu plus haut dans 250 ml de diméthylformamide. On agite pendant 4 heures à la température ambiante, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité et on évapore le filtrat à siccité. 15 On reprend le résidu d'évaporation dans un mélange d'acétate d'éthyie et de n-butanol, on lave successivement à l'ammoniaque IN, à l'acide sulfurique IN et plusieurs fois à l'eau. On évapore complètement la phase organique et on purifie le résidu sur gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme, de méthanol 20 et d'eau. On obtient ainsi le Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro- PO OMe fondant à 171°; = -54° dans le méthanol. On dissout 43,6 g de Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe dans 1000 ml d'un mélange de méthanol et de diméthylformamide et on ajoute 44 ml d'hydrate d'hydrazine. On laisse reposer la 25 solution pendant 4 jours à la température ambiante, on l'évaporé complètement et on fait bouillir le résidu d'évapora.tion dans 1'acétonitrile. On refroidit à environ 20° et on filtre, ce qui donne le Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNHp fondant à 175°i or\ ^ [alD = -58° dans le méthanol. 30 Séquence partielle E^: H-Hls-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg- Thr-A sn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ Méthode A On dissout 10 g de Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH (séquence partielle dans 100 ml de diméthylformamide, on 35 évapore la solution, on dissout le résidu dans 100 ml de diméthylformamide et on ajoute 15 g de N-hydroxysuccinimide. On refroidit 71 38646 16 2111909 ensuite à 0°, on ajoute 5 g de dicyclohexyl-carbodiimide et on laisse réagir le mélange réactionnel pendant 3 heures. On élimine par filtration la dicyclohexylurée qui a précipité, on concentre à un volume de 30 ml et on fait précipiter le Z-His-Lys(BOC)-Leu-5 Gln-Thr-Phe-Pro-OSu formé, par addition d'éther. On épuise le précipité à l'éther, on dissout.le résidu dans 100 ml de diméthylformamide, on' ajoute 10 g de H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (séquence partielle C^) et on laisse réagir pendant 16 heures. On ajoute ensuite 500 ml d'acétate d'éthyie, on 10 filtre et on dissout le résidu dans le diméthylformamide. On ajoute 10 ml d'acide acétique à la solution ainsi obtenue et on fait précipiter le produit par addition d'acétate d'éthyie. On filtre, on lave le résidu à l'acétate d'éthyie, puis à l'éther et on sèche. On obtient ainsi le Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe- PO 15 Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2.2CH^C00H ([a]D = -24° dans le diméthylformamide), qu'on dissout directement dans de l'acide acétique à 80$. On ajoute ensuite 5 g de palladium sur charbon et on hydrogène à pression normale et température ambiante. On filtre, on évapore à siccité sous vide poussé à 20°, on 20 lave le résidu à l'éther-et on le sèche sur copeaux d'hydr-oxyde de potassium. On obtient ainsi le triacétate du composé du titre 20 fondant à 185° (avec décomposition); [a]^ = -42° dans l'acide acétique IN. Méthode B 25 On dissout 12 g de Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala- 3 Pro-NH2 (séquence partielle C^) dans 1000 ml d'un mélange de diméthylformamide et d'eau, on ajoute 1,8 g de palladium sur charbon et on hydrogène sous pression normale. On sépare le catalyseur par filtration et on concentre le filtrat sous pres-30 sion réduite à un volume de 60 ml. On conserve cette solution de H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 à -20°. A une solution préalablement refroidie à -15° de 10 g de Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 (séquence partielle D2) dans 100 ml de diméthylformamide, on ajoute 21 ml d'une so-35 lution 1,85N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 1,1 ml de nitrite de tert,-butyle. On agite pendant 10 minutes à -15°, 71 38646 17 2111909 on refroidit à -30°, on ajoute 6 ml de triéthylamine et on filtre sur une solution froide de H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^, obtenue précédemment, dans du diméthylformamide. On agite la solution pendant 90 minutes à 0°, on la concentre sous pres-5 sion réduite, on y ajoute du chloroforme, on filtre le précipité, on le lave au chloroforme puis à l'acétate d'éthyie et on le sèche. On dissout le produit brut ainsi obtenu dans un mélange de méthanol, de chloroforme et d'eau et on chromatographie sur une colonne de gel de silice. On élue, on réunit les fractions 10 pures et on évapore à siccité sous pression réduite. On dissout le résidu dans le méthanol, on fait précipiter le produit avec de l'acétate d'éthyie, on le filtre et on le sèche, ce qui donne le Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg~Thr-Asn-Thr-Gly-Val- PO Gly-Ala-Pro-NH^ fondant à 185° (avec décomposition); = -29° 15 dans le diméthylformamide. On dissout 3*68 g du produit ainsi obtenu dans 120 ml d'un mélange de diméthylforffiaaide et d'eau, on ajoute 3 g d'un catalyseur à 10% de palladium en suspension dans 10 ml d'eau et on hydrogène. Au bout de 2 heures environ, la quantité calculée 20 d'hydrogène est pratiquement absorbée. On sépare alors le catalyseur par filtration et on évapore complètement le filtrat. On obtient ainsi le produit du titre. Séquence partielle E^: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH^ 25 Méthode A En procédant comme décrit pour la séquence partielle E^ (méthode A), on obtient, à partir du Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH (séquence D^) et du H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val- Pro-NH9 (séquence partielle Cp), 1s triacétate du composé du ' 20 30 titre fondant à 164° (avec décomposition); [aj^ = -19° dans le diméthylformamide. Méthode B On dissout 30 g de Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-C-ly-Val-Pro-NHg (séquence partielle C^) dans 450 ml d'un mélange de di-35 méthylformamide et d'eau, on ajoute 3 S d'un catalyseur au palladium sur charbon et on hydrogène sous pression normale. On élimi 71 38646 18 2111909 ne le catalyseur par filtration et on concentre le filtrat sous pression réduite à un volume de 250 ml. On conserve la solution de H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHg ainsi obtenue à -20°. A une solution préalablement refroidie à -15° de 24 g 5 de Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 (séquence partielle D2) dans 200 ml de diméthylformamide, on ajoute 52 ml d'une solution 1,85N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 2,6 ml de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant 10 minutes à -15°, on refroidit à -30°, on ajoute 14 ml de triéthylamine et on filtre 10 sur la solution froide de H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 dans du diméthylformamide, obtenue précédemment. On agite la solution pendant 90 minutes à 0°, on la concentre sous pression • réduite, on y ajoute du chloroforme, on filtre le précipité, on le lave au chloroforme puis à l'acétate d'éthyie et on le sèche. 15 On dissout le produit brut ainsi obtenu dans un mélange de méthanol, de chloroforme et d'eau et on chromatographie sur une colonne de gel de silice. On élue,- on réunit les fractions pures et on les évapore à siccité sous pression réduite. On dissout le résidu dans du méthanol, on fait précipiter le produit avec de 20 l'acétate d'éthyie, on le filtre et on le sèche, ce qui donne le Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- PO Val-Pro-NHg fondant à l80° (avec décomposition); = -j50° dans le diméthylformamide. On dissout 6,75 g du produit ainsi obtenu dans 220 ml 25 d'un mélange de méthanol et d'eau, on ajoute 6 g d'un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon en suspension dans 20 ml d'eau et on hydrogène. Au bout de 2 heures environ, la quantité calculée d'hydrogène est pratiquement absorbée. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat à siccité. On obtient 30 ainsi le composé du titre. Séquence_partielle_F1_: Trt-Gly-Lys (BOC ) -Leu-Ser-Gln-Asp (0TB) - Leu-NHNH^ a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe On dissout 151 g de Z-Asp(0TB)-0H et 54 g de N-hydroxy-35 succinimide dans 700 ml d'acétonitrile et on refroidit la solution à -20°. On ajoute ensuite une solution de 96,5 g de dicyclo- copy 71 38646 19 2111909 hexyl-carbodiimide dans 350 ml d'acétonitrile, on laisse reposer pendant environ 30 minutes, puis on élimine par filtration la dicyclohexylurée formée. On ajoute 71,2 g d^ H-Leu-OMe au filtrat, on laisse reposer pendant 4 heures, on évapore sous pression ré-5 duite et on traite le résidu solide ainsi obtenu par un mélange d'acétate d'éthyie et d'eau. On lave ensuite la phase organique avec successivement une solution de bicarbonate de sodium à 5$, de l'eau et de l'acide sulfurique dilué (pH3j, on la neutralise, on la sèche sur sulfate de sodium et on l'évaporé. On dissout 10 le résidu d'évaporation dans du chloroforme contenant 1$ de méthanol et on filtre sur 10 fois la quantité de gel de silice. On obtient ainsi le Z-Asp(0TB)-Leu-OMe fondant à 58°; ta^°= -16° dans le diméthylformamide. b) Z-Gln-Asp(0TB)-Leu-OMe 15 On dissout 118 g de Z-Asp(0tb)-Leu-OMe dans 2000 ml de méthanol. On prépare alors un mélange de 15 g d1un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon dans 63 ml d'acide chlorhydrique 4n et on l'ajoute à la solution. On hydrogène le tout pendant 2 heures à la température ambiante et sous pression normale; envi-20 ron 85$ de la quantité théorique d'hydrogène sont alors absorbés. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat à siccité, ce qui donne le H-Asp(0tb)-Leu-OMe.HCl sous forme d'une mousse amorphe. On dissout 91,7 g de Z-Gln-ONP et 93*8 g de H-Asp(0TB)- 25 Leu-OMe-HCl dans 500 ml de diméthylformamide et on ajoute 51 ml de N-méthylmorpholine. On abandonne la solution pendant 15 heures à la température ambiante, puis on l'évaporé complètement sous pression réduite. On traite soigneusement à l'eau le résidu ainsi obtenu et on le recueille par filtration. Après re- 30 cristallisation dans le méthanol, on obtient le Z-Gln-Âsp(OTB)- 20 Leu-OMe fondant à 189° (avec décomposition); [a]^ = -30° dans le diméthylformamide. c) Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Le'q-OMe On dissout 44,4 g de Z-Gln-Asp(0TB)-Leu-OMe dans 1200 35 ml d'un mélange de méthanol et de diméthylformamide et on ajoute à la solution 15 g d'un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon OOPY 71 38646 20 2111909 dans 50 ml d'eau. On hydrogène ensuite pendant environ 2 heures; la quantité calculée d'hydrogène est alors presque entièrement absorbée. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat sous pression réduite,ce qui donne le H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe. . 5 On dissout 21,4 g de Z-Ser-NHNHg dans 100 ml de dimé thylformamide et on refroidit la solution à -20°. On ajoute 50,6 ml d'acide cnlorhydrique 5N dans de l'éther et 10,3 ml de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant 10 minutes, puis on ajuste le pH à 7*5 au moyen de 35,6 ml de triéthylamine. On 10 ajoute ensuite 34,2 g de H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe dans 100 ml de diméthylformamide. On agite pendant 4 heures à 20°, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité et on évapore le filtrat à siccité. On traite le résidu d'évaporation à l'eau et on le fait cristalliser dans un mélange d'eau 15 et de méthanol, ce qui donne le produit à l'état brut qu'on purifie par filtration sur colonne de gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme et de méthanol. On obtient ainsi le Z-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-OMe fondant à 172°; Ca]^°= -24° dans le diméthylformamide. 20 d) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-NHNH^ On dissout 50,8 g de Z-Lys(BOC)-Leu-OMe dans 600 ml d'acétate d'éthyie, on ajoute 25 ml d'acide chlorhydrique 4n dans de l'éther et 3 g d'un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon et on hydrogène pendant environ 4 heures; la quantité 25 d'hydrogène calculée est alors presque totalement absorbée. On sépare le catalyseur par filtration et on concentre le filtrat à la moitié de son volume. On dissout 33 S de Trt-Gly-OH et 12 g de N-hydroxy-succinimide dans 150 ml de diméthylformamide et on refroidit à 30 -15°. Dans la solution ainsi obtenue, on verse une solution de 21,6 g de dicyclohexyl-carbodiimide dans 100 ml d'acétonitrile et on abandonne le mélange ainsi obtenu pendant 3 heures à la température ambiante, tout en agitant de temps en temps. On sépare par filtration la dicyclohexylurée qui a cristallisé et on 35 ajoute au filtrat 25 ml de N-méthylmorpholine et la solution du dipeptide obtenu au cours de l'hydrogénation déc^tf* ni . 71 38646 21 21-11909 On abandonne la solution pendant 16 heures, on évapore à siccité, on reprend le résidu par de l'acétate d'éthyie et on le traite à 0° avec de l'acide sulfurique IN et une solution de bicarbonate de sodium à 5$» On sèche la phase organique sur sulfate de sodium 5 et on l'évaporé à siccité. On obtient ainsi une mousse qu'on filtre sur gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme et de méthanol, ce qui donne le Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-OMe sous 20 forme d'une mousse amorphe; [a]^ = -10° dans le méthanol. On dissout le résidu ainsi obtenu dans 300 ml de métha-10 nol, on ajoute 17 rnl d'hydrate d'hydrazine et on laisse reposer la solution pendant 16 heures à la température ambiante. On l'évaporé ensuite complètement, on sèche le résidu sous vide poussé et on le filtre sur gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme et de méthanol. Après cristallisation dans un mélan- 15 ge de chloroforme et d'éther de pétrole,on obtient le Trt-Gly- PO Lys (BOC ) -Leu-NHNHg fondant à 175°; = -12° dans le méthanol. e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-NHNHC On dissout 26,6 g de Z-Ser-Gln-Àsp(OTB)-Leu-OMe dans un litre d'un mélange de méthanol et de diméthylformamide, on 20 ajoute 5 g d'un catalyseur à 10$ de palladium sur charbon en suspension dans 100 ml d'eau et on hydrogène. Après une heure, la quantité calculée d'hydrogène est absorbée. On sépare le cataly-sur par filtration et on concentre le filtrat par évaporation. On dissout 29,6 g de Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-NHNHg dans 25 150 ml de diméthylformamide. On refroidit la solution à -20° et on ajoute 26,2 ml d'acide chlorhydrique 5N dans Je l'éther et 5,3 ml de nitrite de tert-.-butyle. On agite pendant 10 minutes, puis on ajoute 18,5 nil de triéthylamine et la solution concentrée de H-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe obtenue ci-dessus. On agite pendant 30 4 heures à la température ambiante, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine formé et on évapore le filtrat à siccité. On reprend le résidu d'évaporation par de l'éther, on pulvérise et on filtre à la trompe. On chromatographie le produit brut ainsi obtenu sur gel de silice en éluant avec un mélan- 35 ge de chloroforme et de méthanol, ce qui donne le Trt-Gly-Lys PO (BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-OMe fondant à 217°; Cet= -30° 71 38646 22 2111909 dans le méthanol. On dissout ce produit dans 400 ml de méthanol, on ajoute 1,4 ml d'hydrate d'hydrazine et on agite pendant. 48 heures à la température ambiante. On filtre 1'hydrazide qui a précipité, 5 on le lave à l'éther et on le sèche jusqu'à poids constant- Le on produit du titre ainsi obtenu fond è 218°; [a]p = -16° dans le diméthylformamide. Trt-Gly-Lys (BOC ) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-10 Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ On dissout g de Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp- (0TB)-Leu-NHNH2 (séquence partielle F^) dans 30 ml de diméthylformamide. On refroidit la solution à -20° et on ajoute 1,45 ml d'acide chlorhydrique 5N dans de l'éther et 0,252 ml de nitrite 15 de tert.-butyle. On agite encore pendant 10 minutes, puis on neutralise au moyen de 1,01 ml de triéthylamine. On dissout 1'hexadécapeptide dans 50 ml de diméthylformamide et on le verse dans la solution d'heptapeptide-azide préparée ci-dessus. On agite pendant 4 heures à la température 20 ambiante, on élimine par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité et on évapore le filtrat à saccité. On dissout le résidu dans un peu de méthanol chaud et on fait précipiter par addition d'éther. On chromatographie le produit ainsi obtenu sur colonne de gel de silice en éluant avec un mé- 25 lange de chloroforme, de méthanol et d'eau. On obtient ainsi le po diacétate trihydraté du composé du titre fondant à 225°j = -18° dans le diméthylformamide. Séquence partielle G2: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)- Leu-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-30 Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHg En opérant comme décrit pour la séquence partielle G^ on obtient, à partir de 1'heptapeptide de la séquence partielle F^ et de 1'hexadécapeptide de la séquence partielle Eg, le diacétate trihydraté du composé indiqué dans le titre fondant à 35 216°; [a]^°= -19° dans le diméthylformamide. 71 38646 2111909 2. Préparation des composés de formule I Exemple 1 r 1 H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-i..eu-Ser-Gln-Asp- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-5 Pro-NHU On dissout 650 mg de tricosapeptide (séquence partielle G^) dans 30 ml d'acide acétique à 60% et on laisse reposer la solution pendant 16 heures à la température ambiante. On ajoute ensuite de l'eau et on lave à plusieurs reprises à l'éther. On 10 fait passer la phase aqueuse à travers une colonne d'Amberlite-IRA 410 sous sa forme acétate et on évapore la solution à siccité. f 1 On dissout 295 mg de BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH dans 10 ml d'un mélange de diméthylsuifoxyde et de diméthylformamide, on ajoute 131 mg de N-hydioxysuccinimide et 15 59 mg de dicyclohexyl-carbodiimide. On laisse reposer le mélange réactionnel pendant 6 heures, puis on sépare par filtration la dicyclohexylurée formée. On dissout dans 10 ml de diméthylformamide le tricosapeptide obtenu ci-dessus par élimination du groupe trityle, et on verse la solution dans le filtrat contenant le 20 noiiapeptide. On abandonne pendant 48 heures à la température ambiante, puis on fait précipiter le produit par addition d'éther et on décante la solution surnageante. On dissout le précipité dans un peu de méthanol et on le transforme en poudre par une nouvelle addition d'éther. On essore cette poudre, on la sèche 25 et on dissout 220 mg du dotriacontapeptide protégé ainsi obtenu à l'état brut dans 4 ml d'un mélange de chlorure de méthylène, d'acide trifluoroacétique et d'eau. On abandonne la solution pendant 1 heure à la température ambiante, puis on l'évaporé à siccité. On reprend le résidu par de l'acide acétique 0,2N et on 30 chromatographie sur colonne de Biogel-Pg (lx^OOcm), en éluant avec de l'acide acétique 0,2N. On réunit les fractions pures, on les évapore et on les lyophilise. On obtient ainsi le composé du titre fondant à 215° (avec décomposition); [a]p = -75° dans l'acide acétique IN. 35 Composition en acides aminés déterminée par hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6N,pendant 16 heures): Asp 3»1» 71 38646 24 2111909 Thr 3,7; Ser 2,8; Gin 1,9; Pro 2,0; Gly 2,9; Ala 1,0; Cys 1,6; Val 2,0; Leu 5,2; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 0,9» Exemple 2 H-C'ys-Ser-Asn-Leu-Ser~Thr-C,Vs-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-5 Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHc On dissout 300 mg de tricosapeptide (séquence partielle Gg) dans 15 ml d'acide acétique à 60$ et on laisse reposer la solution pendant 16 heures à la température ambiante. On ajoute 10 ensuite de l'eau et on lave à plusieurs reprises à l'éther. On fait passer la phase aqueuse à travers une colonne d'Amberlite-IRA 410 sous sa forme acétate et on évapore ensuite la solution à siccité. \ 1 On dissout 170 mg de BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-15 Val-Leu-OH dans 5 ml d'un mélange de diméthylsulfoxyde et de diméthylformamide, on ajoute 56 mg de N-hydroxysuccinimide et 26 mg de dicyclohexyl-carbodiimide, on abandonne le mélange réactionnel pendant 6 heures, puis on sépare par filtration la dicyclohexylurée formée. On dissout dans 10 ml de diméthylformamide 20 le tricosapeptide obtenu ci-dessus par élimination du groupe trityle, et on verse la solution dans le filtrat contenant le nonapeptide. On abandonne pendant 48 heures à la température ambiante, puis on fait précipiter le produit par addition d'éther et on décante la solution surnageante. On dissout le précipité 25 dans un peu de méthanol et on le transforme en poudre par une nouvelle addition d'éther. On essore cette poudre, on la sèche et on dissout 180 mg du dotriacontapeptide protégé ainsi obtenu à l'état brut dans 4 ml d'un mélange de chlorure de méthylène, d'acide trifluoroacétique et d'eau. On abandonne la solution pen-30 dant une heure à la température ambiante, puis on l'évaporé à siccité. On reprend le résidu par de l'acide acétique 0,2N et on chromatographie sur colonne de Biogel-Pg (1x300cm), en éluant avec de l'acide acétique 0,2N. On évapore les fractions pures réunies et on les lyophilise. On obtient ainsi le composé du 20 35 titre fondant à 210° (avec décomposition); [alD = -18° dans 71 38646 25 2111909 l'acide acétique à 50$. Composition en acides aminés déterminée par hydroly totale (acide chlorhydrique 6N, pendant 16 heures): Asp 3,2; Thr 3,9; Ser 2,7; Gin 2,0; Pro 2,0; Gly 3,0; Ala 1,0; Cys 1,6 Val 2,0; Leu 5,0; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 1,0. 71 38646 26 2111909 REVENDICATIONS 1.- Nouveaux polypeptides caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule I 5 H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Gly-Lys-Leu-Ser-Cln-Asp-Leu-His-Lys- (I) Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-X-Gly-Y-Pro-NHg 10 dans laquelle soit X représente un reste valyle et Y signifie un reste alanyle, soit X représente un reste alanyle et Y signifie un reste valyle, ainsi que leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes métalliques. 2.- Le H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys- 15 Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn~T.hr- ' Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2, ses sels d'addition d'acides et ses complexes métalliques. 3.- Le H-Cy's-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn- 20 Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHg, ses sels d'addition d'acides et ses complexes métalliques. 4.- Un procédé de préparation des nouveaux polypeptides de formule I 25 H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu- Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X- Gly-Y-Pro-NH0 (D 30 dans laquelle soit X représente un reste valyle et Y signifie un reste alanyle, soit X représente un reste alanyle et Y signifie /métalliques»/ un reste valyle, de leurs sels et de leurs complexes / caractérisé en ce qu'on fait réagir les acides aminés dans l'ordre oîi ils figurent dans la formule I, soit isolément, soit par 35 petites séquences peptidiques préalablement formées, et, le cas échéant, on transforme les polypeptides ainsi obtenus en 71 38646 27 2111909 leurs sels d'addition d'acides ou-en leurs complexes métalliques. 5.- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, après avoir protégé dans chaque polypeptide les groupes amino et carboxyliques ne devant pas participer à la réaction, on condense le nonapeptide de formule H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH 10 avec le tricosapeptide de formule H-Glv-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-NH2 dans laquelle X et Y ont les significations déjà données, puis 15 on libère les groupes amino et carboxyliques qui avaient été protégés et, le cas échéant, on transforme les polypeptides ainsi obtenus en leurs sels d'addition d'acides ou eiï .leurs complexes métalliques. 6.- Un procédé selon la revendication 5, caractérisé 20 en ce qu'on condense le nonapeptide après activation du groupe carboxylique terminal. 7.- Un procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on active le nonapeptide par transformation en ester activé et on condense en présence de dicyclonexylcarbodiimide. 25 8.- Un procédé selon l'une quelconque des revendica tions 5 à 7j caractérisé en ce qu'on condense le nonapeptide protégé de formule II BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH ( H ) 30 après activation préalable, avec le tricosapeptide de formule III H-Gly-Lys ( BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-His-Lys (m) (BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X- 35 Gly-Y-Pro-NHg dans laquelle X et Y ont les significations déjà données, on 71 38646 28 2111909 élimine les groupes protecteurs des doti-iacontapeptides a^asi obtenus et, le cas échéant,on transforme les polypeptides de formule I ainsi obtenus en leurs sels d'addition d'acides ou en leurs complexes métalliques. 9.- Un procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on élimine les groupes protecteurs tert.-butyloxycarbo-nyle et tert.-butyloxy à partir du dotriacontapeptide de formule IV BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly- Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB )-Leu-His-Lys(BOC)- (IV) Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Tfrr-Oly-X-Gly- Y-Pro-NHg dans laquelle X et Y ont les significations déjà données, et, le cas échéant, on transforme les polypeptides de formule I ainsi obtenus en leurs sels d'addition d'acides ou en leurs complexes métalliques. 10.- L'application en thérapeutique des nouveaux polypeptides spécifiés à l'une quelconque des revendications 1 à 3* à titre de principes actifs de médicaments. 11.- Un médicament; exerçant notamment une action hypocalcémiante et caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, le H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg, à l'état de bat>e libre ou sous forme d'un sel d'addition d'acides ou de complexe métallique acceptables du point de vue pharmaceutique. 12.- Un médicament exerçant notamment une action hypocalcémiante et caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, le H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys~Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHg, à l'état de base libre ou sous forme d'un sel d'addition d'acides ou de complexe métallique acceptables du point de vue pharmaceutique. 71 38646 29 2111909 13 •- Une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient le principe actif spécifié à la revendication 11 ou 12, en association avec des excipients et véhicules acceptables du point de vue pharmaceutique.