Brevet FR2133923A1 — publié le 19721201

La présente invention a pour objet un procédé de fabrication enzymati-que de L-tryptophane. On sait que cet amino-acide est très important dans l'industrie de l'alimentation diététique, comme additif au fourrage des animaux et pour la 5 réalisation de nourriture à faible teneur en protéine (farine de pommes de terre et en général les composés hydrocarbonés). On sait qu'il existe également des méthodes chimiques et de fermentation pour leur.production. Cependant les premières ont peu d'importance du point de vue industriel du fait des faibles rendements, du coût élevé des mat. ières premières et de la 10 formation de racème, et les dernières ne sont pas sans présenter des inconvénients notables bien qu'elles soient largement utilisées de manière intensive. Le choix d'un microorganisme pour produire convenablement 1'amino-acide est très difficile et demande beaucoup de temps du fait des incertitudes que tout choix présente toujours. 15 . Les microorganismes doivent croître convenablement en présence de concentrations élevées en composés initiateurs tels que l'acide anthranilique ou l'indole et leur croissance ne doit pas être empêchée par le tryptophane qui s'accumule. " On a" maintenant découvert un "procédé de fabrication de L-tryptophane 20 qui élimine les-inconvénients de la fermentation. Le procédé selon la présente invention consiste à mettre en contact l'indole et la serine avec des structures filamenteuses qui enrobent des complexes enzymatiques capables de synthétiser le tryptophane. Le procédé selon l'invention peut également être employé pour accroî-25 tre la teneur en tryptophane de composés protéiniques hydrolysés qui n'en possèdent pas ; il suffit de rectifier le pH pour l'amener à la valeur la plus convenable, d'ajouter ces composés avec la quantité désirée d'indole et de les mettre en contact avec la fibre enzymatique. Une partie de la sérine présente est alors transformée en tryptophane. 30 De cette manière l'enzyme enrobée peut être facilement récupérée à la fin de la réaction et être à nouveau employée â plusieurs reprises. Les structures filamenteuses utilisables et la méthode pour enrober l'enzyme sont celles décrites dans le brevet italien n° 836.162, selon lequel les fibres enrobant l'enzyme peuvent être obtenues à partir de solutions de 72 13902 2 2133923 polymères capables de donner des fibres, dans lesquelles les composés enzymatiques sont dispersés sous la forme de très petites gouttelettes de la dimension de l'ordre de celles des émulsions. L'émulsion ainsi obtenue peut être filée à l'état humide ou sec pour 5 donner une fibre qui,à 11 intérieur^présente de très petits trous dans lesquels se disposent les enzymes qui sont séparés de l'espace réactionnel par une très fine membrane, empêchant que l'enzyme soit libéré et se disperse dans la masse réactionnelle, mais permettant néanmoins à l'enzyme de conserver toute son - activité. 10 Parmi les polymères enrobant l'enzyme on mentionnera les polymères estérifiés de cellulose, les nitrates, les polyoléfines, les polymères et copo-lymères obtenus à partir d'acrylonitrile, d'acrylate, de méthacrylate, d'esters de vinyle, de chlorure de vinyle, de chlorure de vinylidène, de styrène, de polyamides, de butyral de polyvinyle, etc ... 15 L'enzyme approprié pour le couplage de la serine et de l'indole peut être préparée à partir de diverses sources microbiennes : E.Coli, Claviceps, Neurospora, B. Subtilis, Saccaromyces, etc ... Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant lé triacétate de cellulose et l'enzyme de E. Coli. 20 L'enzyme enrobé a une durée de vie remarquable : son activité a été testée dans différentes conditions de travail pendant six mois sans qu'on observe aucune diminution d'activité. Ceci réduit considérablement ou rend sans importance le coût de la préparation catalytique dans l'économie totale du procédé. Il permet l'emploi 25 de composés d'enzyme très purs qui sont de plus très actifs. Les enzymes enrobés ne diffusent pas dans le milieu réactionnel : par suite il n'y a pas de problème de séparation et la solution finale de tryptophane ne contient pas drimpuretés rendant difficile l'extraction comme dans le cas de la fermentation ; en effet, cette dernière produit comparativement de 30 grandes quantités d'autres amino-acides, notamment l'analine et la valine, sans compter les impuretés du milieu. L'enzyme utilise seulement la forme L de sérine, par suite on peut utiliser la DL sérine dans le mélange réactionnel. La D~sérine non utilisée peut être récupérée avec de bons rendements, 35 racémisée par une méthode chimique et ensuite recyclée. 72 13902 3 2133923 Le procédé de 1'invention ne nécessite aucun travail de choix et de conservation du microorganisme nécessaire à la production microbiologique du L-tryptophane pas plus que l'emploi d'éléments nourrissants constituant le milieu. Un autre grand avantage du procédé de l'invention réside dans la 5 possibilité de travailler en continu, ce qui simplifie considérablement l'installation et diminue les coûts opératoires. La fermentation nécessaire exige un appareil compliqué qui réalise l'agitation, l'aération, la stérilisation de la masse et divers contrôles de quantités physiques variables du procédé lui-même. En travaillant selon le 10 procédé de l'invention, il suffit d'utiliser une ou plusieurs colonnes d'acier ou de matière plastique ainsi qu'une pompe. On peut également travailler en discontinu en mettant en contact le substrat et l'enzyme pendant le temps nécessaire,, en enlevant le produit et en alimentant à nouveau en substrat la même fibre enzymatique qui peut être ainsi 15 utilisée pour un nombre illimité de cycles. Quand on travaille en continu, il est possible d'une part d'effectuer la réaction catalysée par la fibre enzymatique et d'autre part d'extraire la L-tryptophane produite par des méthodes connues, par exemple par absorption au moyen de charbon actif, ou par résines échangeuscs d'ions ou par simple cristallisation quand les conditions de satu-20 ration sont atteintes. Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la "" limiter. EXEMPLE 1 On utilise 70 g de cellules de E. Coli, que l'on a fait croître dans 25 un milieu minimal de Davis. On y ajoute de faibles quantités d'indole dans -2 -4 140 ml d'un tampon de phosphate (10 M EDTA, 10 M de phosphate pyridoxal, pH = 7,8). On soumet la suspension à un traitement aux yltra-sons et ensuite à une centrifugation. 30 Le récipient est chauffé à 53°C pendant 3' et à nouveau on centri fuge . Les protéines précipitées à 0°C dans du sulfate d'ammonium à un degré de saturation compris entre 0,30 et 0,50, sont dissoutes dans le tampon de -2 -2 -4 phosphate (10 M EDTA, 2 x 10 M de DL sérine, 4 x 10 M de phosphate pyri- 35 doxal, 30 % en volume par volume de glycérol) . 72 13902 4 2133923 La solution obtenue contient 32 r.g de protéines par ml et 110 unités capables de synthétiser le tryptophane par ml de protéine (par unité on entend la quantité d'enzyine qui, à 25°C et en 30', catalyse la formation de 0,Immole de L-tryptophane ). 5 On dissout séparément sous agitation 20 g de triacétate de cellulose (Fluka A.G., Chemische Fabrik CH-9470 Buchs Schweiz) dans 265 g de chlorure de méthylène (Carlo Erba S.p.A., via Imbonati 24, Milano). On ajoute à la solution polyméricue ci-dessus, 30 ml de la solution enzymatique. 10 L'émulsion des deux phases s'effectue par fôrte agitation à 0°C pendant 30'. On verse l'émulsion dans un petit creuset maintenu à 0°C, et on la file sous pression d'azote, on la coagule ensuite dans le toluène à la température ambiante. Le filament est séché sous vide pour éliminer le toluène. 15 On le met dans un réacteur cylindrique de 2 litres, plongé dans l'eau à 25°C et maintenu en rotation autour de son propre axe. On introduit 10 g de fibre enzymatique et 1 litre de mélange réactionnel dans ledit réacteur, le mélange réactionnel étant constitué par 20 mg/ml de DL-sérine et 2 mg/ml de phosphate pyridoxal dans un tampon phosphate à 0,01 M au pH = 7,8. 20 Du fait de sa faible solubilité, l'indole est fractionné et ajouté sous forme de solide. La.fibre enzymatique est mise en contact avec le milieu réactionnel pendant huit heures ; ensuite on enlève le liquide et on le remplace par un mélange réactionnel frais ; on effectue plusieurs cycles de travail en utili- 25 sant la même fibre. La quantité de L-tryptophane dans le mélange réactionnel à la fin d'un cycle s'élève à 7,9 g. Après 150 cycles, la quantité de L-tryptophane produite par cycle reste pratiquement constante et égale à 7,7 g. 30 EXEMPLE 2 Selon la méthode de l'exemple 1, on prépare une fibre en utilisant 20 g de triacétate de cellulose et 40 ml de mélange glycérol-eau contenant 90 mg/ml de protéines ayant une activité spécifique de 110 unités par mg. 72 13902 5 2133923 On obtient une fibre contenant 180 mg de protéines à 19.800 unités par gramme de triacétate de cellulose. En utilisant le même réacteur qu'à l'exemple 1, on maintient 10 g de la fibre ci-dessus à 25°C et, sous agitation, on la contacte avec 1 litre 5 de mélange réactionnel ayant une composition analogue à celle de l'exemple 1. Au bout de 8 heures, le L-tryptophane dans la solution représentait 15 g. Le tryptophane produit et la sérine inchangée ont été absorbés sur une résine échangeuse d'ions et séparément élués par changement du pH. 10 De cette manière on a pu récupérer 98 % du L-tryptophane et 90 % de la sérine résiduelle. La sérine récupérée a été racémisée par des méthodes chimiques et à nouveau utilisée pour la synthèse du L-tryptophane selon le procédé décrit. EXEMPLE '3 15 On utilise un appareil constitué par une colonne de verre d'un dia mètre intérieur de 4 cm et d'une longueur de 50 cm, muni d'un thermostat. Des orifices d'entrée et de sortie sont réunis à un réacteur muni d'un agitateur. Une pompe péristaltique est placée à l'entrée et assure un débit compris entre 0 et 1000 ml/min. 20 On introduit 10 g de la même fibre que celle utilisée à l'exemple 2 dans la colonne ; ensuite on y fait passer à un débit de 600 ml/min, 2 litres de mélange réactionnel ayant une composition identique à celle des exemples 1 et 2. On ajoute de l'indole, fraction par fraction, dans le réacteur mainte-25 nu sous agitation. Après huit heures d'agitation, la concentration en tryptophane du mélange réactionnel s'établissait à 8 mg/ml. On retire 1 litre de ce mélange et on le remplace par 1 litre de mélange réactionnel frais. La fraction soutirée est alors soumise à une concentration sous vide de manière à précipiter une fraction du tryptophane présent. 30 La solution, débarrassée d'une partie du tryptophane, est recyclée de manière à obtenir graduellement la transformation complète de la L-sérine. La solution de D-sérine résiduelle est récupérée et est soumise à un traitement chimique de manière à la racémiser et à l'utiliser à nouveau. 72 13902 2133923 De cette manière on a pu convertir jusqu'à environ 80 % de sérine racémique en L-tryptophane. EXEMPLE 4 : obtenu On a utilisé un composé protéinique hydrolyse/ à partir de caséine et 5 de sang (50 : 50 en poids) et contenant 5,4- parties en poids de L-sérine. On dissout 100 g de ce composé hydrolyse dans 500 ml d'un tampon de phosphate à 0,1 M et on ajuste le pH à 7,8. La solution, après addition de 2 mg de phosphate pyridoxal, est passée dans la même colonne qu'à l'exemple 3 thermostatisée à 25°C jusqu'à ce que l'on 10 atteigne une conversion de 20 % de L-sérine en L-tryptophane. Enfin la solution a été analysée par un analyseur automatique d'amino-acides et la quantité de L-tryptophane mesurée était de 1 mg/ml. EXEMPLE 5 : Le dessin annexé représente un schéma simplifié du procédé continu 15 de synthèse enzymatique de L-tryptophane à partir d'indole et de DL-sérine. Le mélange réactionnel est préparé de manière discontinue dans le récipient 5, ce mélange étant constitué de DL-sérine, indole, phosphate pyridoxal et eau tamponnée par 0,1 M de phosphate de potassium à un pH de 7,8, qui sont introduits en 5 par les canalisations 1, 2, 3 et M- respectivement. 20 Le récipient 5 est agité fortement de -manière à faciliter la dissolu tion des réactifs et est muni d'un ehemisage. Au moyen de la pompe 6, on transfère le mélange obtenu, par la canalisation 7, au récipient 8, qui alimente en continu le réacteur 12 contenant les fibres enrobant l'enzyme. 25 La fibre ne doit pas être très tassée de manière à permettre à l'en zyme d'avoir une bonne activité catalytique : en pratique il est approprié d'utiliser de 10 à 100 kg de fibres par m3 de volume du réacteur. Le taux d'utilisation de L-sérine diminue à mesure que la réaction se développe. Par suite il convient de travailler à une conversion de 60 à 70 % 30 de manière à éviter un taux de réaction faible et d'effectuer le recyclage de la DL-sérine n'ayant pas réagi. On indique ci-apr.ès un exemple réel de bilan matière par rapport à 1 kg de fibre. Far la pompe 9 on introduit : - 72 13902 7 2133923 120 g/h de DL-sérine 50,8 g/h d'indole 6 mg/h de phosphate pyridoxal 30 kg/h d'eau 5 0,3 mole/h de phosphate de potassium Du réacteur, il sort : 60 g/h de D-sérine 20 g/h de L-sérine 78 g/h de L-tryptophane 10 6 g/h d'indole 30 kg/h d'eau 6 mg/h de phosphate pyridoxal 0,3 mole/h de phosphate de potassium Par la pompe 10, le mélange réactionnel circule rapidement en 12 afin 15 de rendre homogène le système et l'on maintient une faible concentration en indole dans tout le réacteur. 3 Le débit de la pompe 10 est d'environ 1 m /h par kg de fibre. On ne réalise pas de régulation du pH puisque le pH ne change pas sensiblement au cours de la réaction. 20 On élimine l'indole de la solution aqueuse provenant de 12 par extrac tion liquide-liquide : le toluène pourrait être-utilisé comme solvant. L'opération s'effectue au moyen d'un système mélangeur-décanteur à un ou plusieurs étages. Selon le schéma représenté, on extrait l'indole en 13 par le toluène 25 venu par la ligne 30, et la séparation des deux phases liquides s'effectue dans le séparateur 14-. On récupère le solvant par la ligne 31 et on l'envoie à la purification. La pompe 15 permet d'envoyer la phase aqueuse contenant la sérine et le tryptophane dans le séparateur 16 afin d'en récupérer le tryptophane. 30 La séparation tryptophane-sérine peut s'effectuer par une opération d'échange d'ions ou par une adsorption au charbon actif. Dans le premier cas, par exemple, la solution aqueuse de tryptophane et sérine peut être envoyée dans une colonne remplie d'amberlite IR 118 (forme H+) (Rohm and Haas Co. U.S.A.) 72 13902 8 2133923 La résine retient les deux composés : ensuite elle est éluée dans un premier temps par une solution aqueuse à 0,2 M de NH^Cl pour récupérer' la sérine, et dans un second temps par une solution à 0,2 M d'ammoniaque pour récupérer le tryptophane. 5 Au contraire, dans le schéma de la figure 1, on sépare le tryptophane de la sérine en envoyant la solution aqueuse provenant.de 14 à une colonne remplie de charbon actif (16). Le tryptophane est adsorbé, tandis que la solution contenant toute la D-sérinè de départ et la L-sérine non utilisée-est envoyée au réacteur 18 10 par la ligne 17. On a utilisé plusieurs colonnes en parallèle, afin de rendre continu le procédé d'adsorption ; l'adsorption du tryptophane s'effectuant dans une colonne, les autres restent disponibles pour éluer le tryptophane et pour le laver à l'eau déminéralisée introduite par la ligne 20 et éliminée par la 15 ligne 32. L'élution du tryptophane s'effectue par une solution eau-alcool (50 % en poids à un pH de 8) introduite par la ligne 19. ■ Par la ligne 21, on récupère la solution de tryptophane et on l'homogénéise dans le récipient 22, la solution contenant également des traces de 20 phosphate pyridoxal. Par la pompe 23, on envoie la solution à 1'evaporateur 24, où elle est concentrée sous vide à 40°C et, par 25, on l'envoie à un cris-talliseur 27, après l'avoir fait passer dans l'échangeur 26. En 27 le tryptophane est précipité par ajustement du pH à 5,9. On centrifuge alors la suspension : une partie de l'eau est recyclée en 22 par 25 la ligne 28, on élimine aussi une partie de l'eau pour éviter l'accumulation d'impuretés. Les cristaux mouillés sont soumis au séchage sous vide. La solution de D,L-sérine,provenant de la colonne 16, est racémisée dans le réacteur 18 par chauffage sous pression à 8éo°C. 30 La solution de D,L-sérine, refroidie dans l'échangeur 29, est envoyée au réservoir 33, où elle est disponible pour la préparation du milieu réactionnel, qui s'effectue en 5. En 29 une sortie est prévue pour éviter l'accumulation d'impuretés. 72 13902 9 2133923 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation enzymatique de L-tryptophane, caractérisé en ce que l'on met en contact l'indole et la sérine avec une structure filamenteuse dans laquelle est enrobé un complexe enzymatique capable de synthétiser le tryptophane. 2. Procodé de préparation enzymatique de L-tryptophane selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme peut être obtenue à partir de diverses sources microbiennes telles que E. Coli, Claviceps, Neurospora, B. Subtilis et Saccaromyces. 3. Procédé de production enzymatique de L-tryptophane selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'-on utilise de préférence comme enzyme celle obtenue à partir de E. Coli. 4. Procédé de fabrication enzymatique de L-tryptophane selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fibres dans lesquelles est enrobé le complexe enzymatique sont obtenues à partir de polymères capables de donner des fibres et choisis parmi les polymères estérifiés, de nitrate,de cellulose, les polyoléfines, les polymères et copalymères d'acrylo-nitrile, acrylates, méthacrylates, esters de vinyle, chlorure de vinyle, chlorure de vinylidène, styrène et les polyamides. 5. Procédé de fabrication enzymatique de L-tryptophane selon la revendication M-, caractérisé en ce que la fibre dans laquelle est enrobé le complexe enzymatique est de triacétate de cellulose.