Brevet FR2128587A1 — publié le 19721020

La présente invention concerne un procédé pour la préparation de L-hydroxy-5 tryptophane (désigné ci-après en abrégé par "L-5HTP") à partir d'hydroxy-5 indole par emploi d'un microorganisme. Plus précisément, l'invention concerne un procédé pour la préparation de L-5HTP à partir d'hydroxy-5 indole avec ou sans sérine, où l'on utilise un microorganisme qui est capable de former du L-tryptophane à partir d'indole et de sérine. Le L-5HTP est un produit intermédiaire du métabolisme extrêmement important, utilisé dans le système métabolique à l'intérieur du corps vivant qui réalise la synthèse d'hormone intracérébrale du type amine, telle que la L-hydroxy-5 tryptamine (sérotonine) ou la L-méthoxy-5 tryptamine, à partir du L-tryptophane. Récemment, le L-5HTP a été considéré avec un grand intérêt en tant qu'agent antidépressif et en tant que composé capable de manifester différents effets hormonaux et l'on a ressenti la nécessité de mettre au point un procédé permettant une préparation industrielle et économique de ce composé. Parmi les procédés mycologiques pour la préparation de L-5HTP, on a décrit un procédé dans lequel le tryptophane est soumis à une oxyhydrogénation au moyen d'une enzyme telle que la tryptophane-5 hydroxylase du Chromobacterium violaceum (C. Mitoma et al. : Arch. Biochem. Biophys., 63 122 -1C56-) et un procédé dans lequel lthydroxy-5 indole est traité par une enzyme telle que la tryptophane synthétase de Claviceps purpurea, Cordyceps militaris ou Aspergillus oryzae (. Mutscher et al. Arch. Pharm., 22 291 -1g68-). Ces procédés, toutefois, n'ont pas donné satisfaction par leurs rendements et par d'autres inconvénients. Les procédés de synthèse chimique ne sont pas économiques non plus. En conséquence, le produit est nécessairement coûteux. Il est également bien connu que l'enzyme tryptophane synth(tase qui favorise la formation du L-tryptophane ) tartir de l'indole (les enzymes qui favorisent cette réaction sont génériquement appelées tryptophanes synthétases) est largement pre- sente dans bien des microorganismes tels que les bactéries, les levures, les actinomycètes et les moisissures. in portant attention au fait que l'on peut s'attendre à obtenir du L-5HTP à partir d'hydroxy-5 indole lors de l'emploi des microorganismes ci-dessus mentionnés, les inventeurs de la présente demande ont trouvé certains microorganismes déterminés qui sont susceptibles de former du L-5HTP à partir d'hydroxy-5 indole avec un rendement élevé et ils sont ainsi parvenus 2 la conception du nouveau procédé selon l'invention permettant d'obtenir des rendements élevés de L-5HTP à partir d'hydroxy-5 indole. Un but de la présente invention est de fournir un nouveau procédé pour obtenir du L-5HTP à partir d'hydroxy-5 indole avec ou sans sérine. Un autre but de l'invention est de fournir un nouveau procédé pour obtenir du L-5HTP à l'échelle industrielle et à faible prix de revient. D'autres objectifs et d'autres avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit. Conformément N la présente invention, un microorganisme oui est capable de produire du tryptophane à partir d'indole et de sérine, est cultivé dans un milieu contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux et des aliments organiques en présence ou en l'absence d'hydroxy-5 indole avec ou sans sérine. Dans le premier cas, du L-5HTP est produit dans le milieu. Dans le second cas, le microorganisme développé est isolé et mis en suspension dans une solution aqueuse contenant un phosphate N laquelle on ajoute de l'hydroxy- 5 indole avec ou sans sérine. Les microorganismes utilisables selon la présente invention sont ceux qui, lorsqu'ils sont soumis à la méthode de détermination mentionnée ci-après, peuvent conduire à au moins 0,2 mg/ml de L-tryptophane. Le procédé de détermination (essai sur la force de l'activité enzymatique du tryptophane synthétase) est le suivant Une préparation liquide contenant 2 mg/ml d'indole, 2 mg/ml de L-sérine, 100 m de phosphate tampon à pH 8,0 et 40 mg/ml de cellule d'essai congelée, est laissée à réagir pendant un laps de temps défini. Puis une quantité définie du liquide réactionnel est développée par chromatographie sur papier et la fraction tryptophane est extraite à l'eau. Ensuite, l'extrait est soumis à une détermination colorimétrique selon le procédé au xanthydrol (S. R.Dickman et al. : J. . C., 220 957 -1956-) et la concentration en L-tryptophane est déterminée sur une courbe normalisée. De nombreux microorganismes satisfont à l'essai d'activité enzymatique ci-dessus. De tels microorganismes sont largement répandus dans les bactéries, les levures, les actinomycètes et les moisissures. Parmi ces microorganismes, les bactéries sont celles qui appartiennent aux espèces Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Micrococcus, acillu, Flavobacterium, Agrobacterium, Aerobacter, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Protaminobacter, Enqinia, Arthrobacter, Serratia, Stapnylococcus, Sarcina, Xanthomonas et Achromobacter. Des exemples de telles bactéries sont en aparticulier Corynebacterium sp. No. 14001 (FERM-P No. 1048) ; Corynebacterium melassecola ATCC 17965 ; Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 ; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 ; Micrococcus luteus ATCC 21102 ; Bacillus subtilis ATCC 14593 ; Flavobacterium arborescens ATCC 4358 : Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 ; Aerobacter aerogenes IFO 3317 ; Escherichia coli ATCC 9637 ; Proteus mirabilis IFO 3849 ; Pseudomonas fragi IFO 3458 ; Protaminobacter alboflavus IFO 3707 ; Erwinia carotovora IFO 3057 ; Athrobacter globiformis ATCC 8010 ; Serratia marcescens IFO 3046 ; Staphylococcus citreus ATCC 4012 ; Sarcina lutea ATCC 15176 ; Xanthomonas pruni IFO 3511 et Achromobacter petrophilum FARM-P 239. Parmi celles-ci, Corynebacterium sp.No. 14001 (FERM-P No. 1048) et Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 sont les plus avantageuses. Des exemples de levures comprennent Hansenula anomala IFC 0113 ; Candida petrophilum ATCC 20226 ; Brettanomyces petrophilum ATCC 20224 ; Torulopsis petrophilum ATCC 20225 et Saccheromyces cerevisiae ATCC 7754. Des exemples d'actinomyctes comprennent iTocardia asteroides IFO 3384 et Streptomyces aureus ATCC 330?. Comme exemples de moisissures on peut citer Penicillium chrysogenum ATCC 15241 et Aspergillus oryzae IFO 4075. Les souches Corynebacterium sp. No. 14001 et Agrobacterium tumefaciens, à titre d'exemple, peuvent produire du L-tryptophane en quantité de 3,80 mg/ml et 3, 75 mg, ml, respec- tivement, conformément à la méthode de détermination. Les microorganismes utilisables dans la présente invention ne sont pas limités exclusivement a ceux qui sont mentionnés ci-dessus, mais ils comportent également tous microorganismes appartenant - l'espèce desdites souches et capables de produire du L-tryptophane -'N partir d'indole et de sérine. Leurs variants et mutants sont également utilisables dans la présente invention. Parmi les microorganismes utilisés selon la présente invention, Corynebacterium sp. No. 14001 (FERM-P No. 1048) constitue une nouvelle souche, de sorte que les propriétés mycologiques de cette souche sont indiquées ci-aprs. Í) Caractéristiques morphologiques Baguettes fines, 0,5 à 1,0 par 3,0 microns. Très diverses dans leurs formes ; baguette droite, ramifiée, etc, non en mouvement. Gramme positif. 2) Etat de croissance a) Bouillon de culture sur gélose en culot : croissance ondulée et surélevée ; circonférence ondulée et vermillon pâle. b) Bouillon de culture sur gélose inclinée : croissance granuleuse et degré moyen. Aucun changement n'est observé dans le milieu ; vermillon pile. c) ouillon de culture liquide : croissance moyenne avec légère turbidité. Un précipité se forme. d) Culture en milieu de gélatine : pas de liquéfaction. e ? Lait de tournesol : inchangé. 3) Propriétés physiologiques : a) Réduction des nitrates : observée. b) Formation d'indole : aucune. c) Formation d'hydrogène sulfuré : légère. d) Formation d'ammoniac : observée. e) vessai VP : négatif. f) Essai i' : négatif. g) Hydrolyse de l'amidon : positive. h) Catalase : positive. i) Décomposition des saccharides : acides formés a partir du glucose, du fructose, du mannose et du glycérol. Pas de production de gaz. j) Domaine de croissance : pH 4,0 à 9,0, 20 à 400C. En fonction de ce qui précède, on considère, conformément au "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 7th ed.", que cette souche est l'une des souches qui appartiennent à l'espèce Corynebacterium. Toutefois, la présente souche diffère de Corynebacterium pseudotuberculosis dans son comportement à la réduction par les nitrates et à d'autres réactions, bien qu'elle lui soit similaire par l'état de croissance. De plus, la présente souche ne coincide pas avec Corynebacterium murisepticum du fait qu'elle ne se développé pas en longs filaments. Ainsi, Corynebacterium sp. No. 14001 (FERM-P No. 1048) est une nouvelle souche. Cette souche est déposée au "Fermentatlon Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba City, Japon" sous la référence FESN1-P o. 1048. Cette souche est également déposée au Département de l'Agriculture des Etats Unis au "tsorthen Regional Research Laboratory" à Peoria, Illinois, Etats-Unis d'mérique, où elle a reçu la référence NRRL B-5395. Le milieu utilisé selon la présente invention est constitué de sources de carbone, de sources d'azote, de sels minéraux, de matières nutritives organiques naturelles, etc, qui sont préférées en vue d'une croissance favorable du microorganisme utilisé et d'une production régulière de L-5H?P. Des exemples de sources de carbone sont le glucose, le fructose, le sucrose, le mannose, l'amidon, le sorbitol, le glycérol, les alcools, l'acide acétique et l'acide citrique. Ces sources de carbone peuvent être utilisées soit seules soit par combinaison de deux d'entre elles ou plus. La quantité des sources de carbone n'est pas essentielle mais elle est de préférence comprise entre environ 1 et 10 (poids'volume). Les sources d'azote sont par exemple l'ammoniac, l'urée, le sulfate d'ammonium, l'acétate dtammonium, le nitrate d'ammonium et le nitrate de sodium.Ces sources d'azote peuvent également être utilisées soit seules soit par combinaison de deu ou plus. Les sels minéraux sont par exemple les sels de sodium, de potassium, de magnésium, de manganèse, de fer ou de calcium, de l'acide phosphorique ou de l'acide chlorhydrique. Des exemples de matières nutritives organique s qui favorisent le développement de la souche utilisée comprennent la peptone, les extraits de viande, une liqueur ae macération de blé (corn steep liquor), des acides casamino, des extraits de levure et de la farine de soja. En outre, une faible quantité de vitamines ou d'acides nucléiques peut être incorporée dans le milieu de culture. Pour la réaction de formation du L-5HTP, on ajoute le produit de départ, c'est-à-dire l'hydroxy-5 indole seul ou avec de la sérine. La sérine peut être soit sous forme L soit sous forme DL. L'addition est effectuée de la manière suivante. Un premier mode consiste ' ajouter le produit de départ directement dans le milieu pendant que la culture est effectuée. La formation de L-5EITP est réalisée simultanément avec la croissance du microorganisme. Le second mode consiste N mettre en suspension dans une solution aqueuse de phosphate des cellules dé j" développées qui ont été obtenues par culture du microorganisme dans le milieu ci-dessus mentionné et isolation, puis y ajouter le produit de départ. Dans ce second mode on peut remplacer les cellules vivantes par des cellules sèches soumises un traitement de cryodessication, des cellules broyées, des cellules traitées par les ultrasons ou des cellules traitées par un solvant tel que l'acétone,l'éthanol, le toluène, etc.Les quantités d'hydroxy-5 indole et de sérine à incorporer ne sont pas essentielles, mais elles sont de préférence de l'ordre de C,02 à 2,0 g/dl chacune. Elles peuvent être incor poux es soit en une seule fois soit par additions successives. La culture peut être effectuée, selon le microorganisme utilisé, par une culture avec agitation ou avec introduction d'air dans des conditions aérobies, ou par une culture au repos. Le pH pendant la culture avant l'addition d'hydroxy-5 indole est de préférence compris entre 4 et 9. La température de culture est comprise entre 200C et 400C et de préférence entre 250C et 35 C. Après l'addition d'hydroxy-5 indole, le pH est de pré férence compris entre 7 et 10 et la température entre 250C et 4000. Quel que soit le mode d'incorporation choisi, on peut utiliser n'importe quel agent de neutralisation connu, tel que l'ammoniac, la soude, la chaux, le carbonate de calcium et l'acide chlorhydrique comme agent de neutralisation pour le réglage du pH. Le temps de culture ou le temps de réaction varie en fonction du mode d'addition du produit de départ, de la concentration du produit de départ ajouté et du type de souche utilisé. Toutefois, d'une manière générale, le L-5HTP se forme en un temps de 1 à 5 jours. Selon l'invention, 0,03 à 1,0 g/dl de L-5HTP peut être accumulé dans la liqueur de culture (ou dans le liquide de réaction). Le L-5HTP ainsi accumulé peut être isolé conformément à un procédé connu en soi. Ainsi, le L-5HTP est absorbé sur du charbon actif ou sur une résine échangeuse d'ions telle que la résine Dowex-1 (CH3C00), élué par un solvant organique tel que l'éthanol chaud ou par une solution aqueuse d'acide acétique, concentré puis récupéré par addition d'un alcool inférieur tel que par exemple l'éthanol. Selon l'invention, l'IdentifIcation du L-5HTP est effectuée en identifiant le L-tryptophane selon le procédé au Xanthydrol déjà mentionné. L'invention est illustrée en détail ci-après dans des exemples de mise en oeuvre particuliers. Sauf indication contraire, tous les pourcentages sont exprimés en poids par unité de volume. Exemple 1 Le microorganisme Corynebacterium sp. No. 14001 (FERM-P No. 1048 : NRRL B-5305) est injecté dans un flacon à agitation contenant 50 ml d'un milieu aqueux (pH 7,0) constitué de 1,0 I; de peptone, 1,0 . d'extrait de viande, 0,4 . de chlo rure de sodium et , d'extrait de levure, Où il est cultivé avec agitation 30 C pendant 24 heures. Les cellules obtenues sont ensuite recueillies et mises en suspension dans 60 mM d'une solution tampon de phosphate (pH 8,5). A la suspension ainsi obtenue on ajoute 40 mg d'hydroxy-5 indole, LO mg de L-sérine et 120 mg de glucose.Après avoir complété le volume total de la suspension à 20 ml par addition d'eau, la suspension est laissée sous agitation fi OOC pendant 16 heures. La quantité de L-5HTP finalement a. cumulée dans le liquide de réaction est de 2,94 mg/ml. Le liquide de réaction est chauffé et les cellules en sont éliminées. Le liquide surnageant est traité dans une colonne à charbon actif jusqu' absorption du L-5HTP. On ajoute alors une solution aqueuse d'éthanol chaude pour éluer le L-5HTP. La solution est condensée sous pression réduite pour isoler le L-5HTP. Rendement : 55 mg. Par ailleurs, on effectue la même réaction aue cidessus pendant 32 heures, mais en effectuant trois additions de 20 mg d'hydroxy-5 indole et de 20 mg de L-sérine respective ment N la Sème heure, à la 16ème heure et à la la 24ème heure après le début de la réaction. Dans ce cas la quantité de L-5HTP accumulée est de 7,01 mg/ml. Exemple 2 Chacun des microorganismes indiqués dans le tableau 1 est injecté dans un flacon a agitation contenant 50 ml d'un milieu aqueux (pH 7,0) présentant la composition suivante 3 % de glucose, 0,6 d'urée, 0,3 ', de peptone, 0,3 , d'extrait de levure, 0.1 % KH2PO4, 0.1 % K2HPO4, 0.05 % MgSO4.7H2O et 0,001 % MnSO4.4H2O. La culture est effectuée avec agitation à 300C. A la 32ème heure après le début de la mise en culture, on ajoute au milieu 1,0 mg/ml d'hydroxy-5 indole et 2,0 mg/ml de DL-sérine et la culture est poursuivie pendant encore 24 heures. On obtient les quantités de L-5HTP formées dans ce milieu qui sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.La séparation est effectuée comme indiqué dans l'exemple 1. Tableau 1 L-5HTP Microorganisme (mg/ml) Corynebacterium melassecola ATCC 17965 0,39 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 0,25 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 0,37 Hicrococcus luteus ATCC 21102 0,32 Bacillus subtilis ATCC 14593 0,33 Plavobacterium arborescens ATCC 4358 0,60 Aerobacter aerogenes IFO 3317 0,64 Escherichin coli ATCC 9637 0,61 Proteus mirabilis IFO 364 0,46 Pseudomonas fragi IFO 3458 0,50 Protaminobacter alboflavus IFO 3707 0,51 Erwinia carotovora IFO 3057 0,61 Arthrobacter globiformis A1CC 8010 0,26 Serratia marcescens IFO 3046 0,52 Staphylococcus citreus ATCC 4012 0,27 Sarcina lutea ATCC 15176 0,42 Achromobacter petrophilum FARM-P 239 0,50 Xanthomonas pruni IFO 3511 0,52 Nocardia asteroides IFO 3384 0,56 Streptomyces aureus ATCC 3309 0,29 Penicillium chrysogenum ATCC 15241 0,27 Aspergillus oryzae IFO 4075 0,30 Exemple 3 Chacun des microorganismes indiqués sur le tableau 2 est injecté dans un flacon , agitation contenant 50 ml d'un milieu aqueux (pH 6,5) présentant la composition suivante 5,0 % de glycérol, 0,2 % NH4NO3, 0,2 , d'urée, C,1 ;; d'extrait de levure, 0.1 % KH2PO4, 0.1 % K2HPO4, 0.05 % MgSO4.7H2O, 0.01 % NaCl, 0,001 J FeSO4.7H2O et 1,0 % CaCO3. La cùlture est effectuée avec agitation à 300C. A la 24ème heure après le début de la mise en culture, on ajoute 1,5 mg/ml d'hydroxy-5 indole et la culture est poursuivie pendant encore 24 heures pour accumuler de L-5HTP dans la liqueur de culture.La quantité de L-5HTP accumulé est celle indiquée dans le tableau 2. La solution est traitée comme dans l'exemple 1. Tableau 2 Microorganisme L-5HTP (mg/ml) Hansenula anomala IFO 011S 0,59 Candida petrophilum ATCC 2022G 0,38 Brettanomyces petrophilum ATCC 20224 0,37 Torulopsis petrophilum ATCC 20225 0,26 Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 0,28 Exemple 4 On répète la procédure de l'exemple 1, si ce n'est que le surnageant d'un liquide de cellules soumises à un traitement par les ultrasons (1C KC, 10 min.) est utilisé comme source d'enzymes pour obtenir 0,39 mg/ml de L-5HTP. Exemple 5 e microorganisme Agrobaterium tumefaciens IFO 3058 est soumis à la même culture que clans l'exemple 2. Au moment de la 32ème et de la 48ème heure après le début de la mise en culture, on ajoute 1,0 mg/ml d'hydroxy-5 indole et 2,C mgsml de DL-sr';rine et la culture est poursuivie pendant encore 12 heures pour obtenir 2,48 mgXml de L-5HTP. La séparation est effec- tuée conformément à l'exemple 1. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation de L-hydroxy-5 tryptophane, caracterisé en ce qu'il comporte la culture d'un microorganisme capable de produire du L-tryptophane à partir d'indole et de sérine dans un milieu de culture contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux et des matières organiques nutritives et la mise en contact des cellules avec de lthydroxy-5 indole éventuellement en mélange avec de la serine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme produit au moins 0,2 mg/ml de L-tryptophane selon l'essai d'activité enzymatique de tryptophane synthétase. 3. Procédé selon la revendication ? ou 2, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi a) les bactéries appartenant aux espèces Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Agrobacterium, Aerobacter, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Protaminobacter, Erwinia, Arthrobacter, Serratia, StaphylococcLs, Sarcina, Xanthomonas et Achromobacter b) les levures appartenant aux espèces Hansenula, Candida, Brettanomyces, Torulopsis et Saccharomyces c) les actinomycètes appartenant aux espèces ocardia et Streptomyces d) les moisissures appartenant aux espèces Penicillium et Aspergillus. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi Corynebacterium sp. No. 14001 (FERM-P No. 1C48) ; Corynebacterium melassecola ATCC 17 965 ; Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 ; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 ; Micrococcus luteus ATCC 211G2 :Bacillus subtilis ATCC 14593 ; Flavobacterium arborescens ATCC 435 ; Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 ; Aerobacter aerogenes IFO 3317 ; Escherichia coli ATCC 9637 ; Proteus mirabilis IFO 3849 ; Pseudomonas fragi IFO 3458 ; Protaminobacter alboflavus IFO 3707 ; Erwinia carotovora IFO 3057 ; Arthrobacter globiformis ATCC 8010 ; Serratia Marcescents IFO 3046 ; Staphylococcus citreus ATCC 4012 ; Sarcina lutea ATCC 15176 ; Xanthomonas pruni IFO 3511 ; Achromobacter petrophilum FARM-P 239 Hansenula anomala IFO 0118 ; Candida petrophilum ATCC 20226 Brettanomyces petrophilum ATCC 20224 ; Torulopsis petrophilum ATCC 20225 ; Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 ; Nocardia asteroides IFO 3384 ;Streptomyces aureus ATCC 3309 ; Penicil- lium chrysogenum ATCC 15241 et Aspergillus oryzae IFO 4075. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que lton ajoute N un milieu de culture lthydroxy-5 indole éventuellement en mélange avec de la sérine et en ce que l'on poursuit la culture. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on interrompt la culture pour isoler les cellules et en ce que les cellules sont mises en suspension dans une solution aqueuse contenant de l'acide phosphorique à laquelle l'on ajoute l'hydroxy-5 indole ou son mélange avec de la sérine. Procédé selon la revendication 5 ou ó, caractérisé en ce que lthyaroxy-5 indole ou son mélange avec de la sérine est incorporé en une seule fois ou par additions successives. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la culture est effectuée après addition d'hydroxy-5 indole à un pH de 7 à 10 et à une température de 250C à 400C. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 i 8, caractérisé en ce que l'hdroxy-5 indole et éventuellement la sérine sont ajoutés chacun en quantité comprise entre 0,02 et 2,C g/dl.