Brevet FR2126414A1 — publié le 19721006

i 2126414 Cette invention concerne un composé qui est caractérisé par une activité antirachitique et par son aptitude à entraîner rapidement l'absorption intestinale du calcium. Plus précisément, cette invention concerne un dérivé de la 5 vitamine . Le caractère et l'activité des vitamines D (vitamines et D2) sont bien connus. Plus récemment, on a trouvé que certains dérivés des vitamines D avaient même une activité supérieure à celle des vitamines D elles-mêmes. (Voir demandes de Brevets E.U.A. 10 N° 741.239,déposée le 1er Juillet 1968 et 009.541 déposé le 24 Mars 1969). On pense maintenant que d'autres dérivés des vitamines D, et plus précisément de la vitamine , sont spécifiquement actifs en certains points de l'organisme normal pour induire et favoriser certaines fonctions spécifiques. 15 On a maintenant trouvé un dérivé de la vitamine qui présente des propriétés antirachitiques et qui agit beaucoup plus rapidement que la vitamine ou le 2 5-hydroxycholécalciférol (25-HCC) pour ce qui est d'induire l'absorption intestinale du calcium. Ce dérivé étant identifié comme étant le 1,2 5-dihydroxycholécalciférol. 20 Dans les dessins : La Figure 1 est le profil'radioactif Se l'extrait lipidique intestinal effectué sur des poulets ayant reçu une dose de 3 vitamine marquée par H dans le cas où l'extrait a été dissous dans 65 % de CHClg dans du Skellysolve B et placé sur une 25 colonne de 3 x 70 cm garnie de 110 g de Sephadex LH-20 dans 65 % de CHClg dans le Skellysolve B. La Figure 2 représente la courbe de réponse aux doses pour le 2 5-HCC et l'absorption du calcium chez les poulets. Chaque point représente 6 poulets et les traits verticaux représentent l'écart 30 type. La Figure 3 représente la réponse de l'absorption intestinale du calcium chez les poulets au 25-HCC, à la vitamine et au produit correspondant au pic V. La Figure 4 représente la réponse au 25-HCC et au produit 35 correspondant au pic V du calcium du plasma chez des rats carencés en vitamine D soumis à un régime contenant peu de calcium, chaque point représentant 4 à 6 animaux. On a mis 1450 poulets dans des cages à 38°C, on les a protégés de la lumière ultraviolette et on les a soumis pendant 40 quatre semaines à un régime carencé en vitamine D de composition 72 06457 2 2126414 suivante, toutes les valeurs données étant exprimées en pourcentages pondéraux : protéine de soja 25,6 saccharose 56,0 Dl-méthionine 0,6 glycine 0,4 cellulose 3,0 huile de graines de coton 4,0 CaHP04 0,52 K Hj P04 1,55 CaC03 co CM CM NaCl 0,8 On a également ajouté au régime des traces d'autres sels et vitamines comme il est indiqué par Imrie et al dafis Arch. Biochem. 15 Biophys., 12Q, pi- 525, (1967) . On a ensuite administré par voie orale à chaque poussin une 3 3 dose de 2,5 //q de vitamine marquée par H (1,2- H) (Radioactivité spécifique de 8000 dpnv'0,025//g) dans 0,2 ml d'huile de Wesson (mélange d'huile de graines de coton et d'huile de soja). 20 Vingt-quatre heures plus tard on a sacrifié les poulets et on en a extirpé tout l'intestin grêle. On a rincé l'intestin extirpé avec de l'eau distillée glacée et on l'a rapidement congelé sur CX>2 solide. On a homogénéisé les intestins congelés (12,5 kg) dans de l'alcool méthylique (2 parties de mêthanol pour 1 partie d'intestin 25 v/pds). On a ajouté une partie en volume de chloroforme et on a ensuite conservé la masse homogénéisée pendant 48 heures sous atmosphère d'azote à 3°C. On a alors filtré la masse homogénéisée et on a extrait de nouveau le précipité protéinique avec une solution de méthanol et 30 de chloroforme (2:1) pendant vingt-quatre heures. On a réuni les filtrats provenant de la première extraction et de la nouvelle extraction et on a ajouté une partie de chloroforme, une partie d'eau distillée et 0,05 partie de solution de WaCl saturée (en volume) pour faire une séparation en phases. On a séparé 35 la coupe phase chloroformique en retirant la couche inférieure et on l'a lavée à l'eau distillée pendant deux jours de la manière décrite par Suda et al, Biochemistry, 9^ 2917 (1970). On a concentré la phase chloroformique lavée jusqu'à environ 500 ml à l'aide d'un évaporateur éclair rotatif et on a fait un 40 partage de l'huile jaune résultante entre le Skellysolve B et 72 06457 3 2126414 une solution de 90 % de méthanol dans l'eau de la manière.décrite par Suda et al dans la publication précédente. (Le Skellysolve B est constitué essentiellement d'hexane normal provenant d'huile de pétrole et commercialisé par Skelly Oil Company, et a un point 5 d'ébullition de 67-69°C). On a séparé la phase aqueuse et on l'a extraite deux fois par le chloroforme. On a réuni les phases chloroformiques provenant de chaque extraction et on a concentré par évaporation éclair pour obtenir approximativement 30 ml d'huile jaune. 10 On a trouvé antérieurement que la chromatographie sur colonne a l'aide d'une colonne de Sephadex LH-20 (le Sephadex LH-20 est un dérivé d'éther d'hydroxypropyle avec un polydextrane, commercialisé par Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, N.J.) constituait une excellente technique de séparation pour isoler divers mêtabolites de la vitamine D^. Par conséquent, on a chromatographié l'huile jaune obtenue comme il est indiqué précédemment en faisant trois opérations séparées sur une colonne de Sephadex comme il est décrit ci-après. On a dissoua 10 ml de l'huile jaune dans 20 ml de 65 % de 20 chloroforme dans le Skellysolve B et on les a fait passer sur une colonne de verre de 3 x 70 cm garnie de llo g de Sephadex LH-20 dans 65 % de CHCLj dans le Skellysolve B. On a recueilli 100 fractions de 10 ml et on a fait un comptage radioactif sur 100 yUX de chaque fraction pour déterminer le profil radioactif de l'extrait qui est 2 5 représenté par la Figure 1. (Toutes les mesures de radioactivité ont été effectuées à l'aide d'un compteur à scintillation de liquide Packard Tri-Carb Modèle 3375 muni d'un système de titrage externe automatique). Les échantillons à soumettre au comptage ont été évaporés à sec à l'aide d'un courant d'air, ils ont été 30 dissous dans une solution de comptage de toluène (2 g de 2,5- diphényloxazole et 100 mg de l,4-bis/2-(4—méthyl-5-phényloxyazolyl)-benzène7 par litre de toluène) et soumis au comptage. Pour les besoins de cette invention la substance éluôsf identifiée par le pic V de la Figure 1, est la substance désirés 35 étant donné que son activité, comme il est montré ci-après, indique qu'elle contient le dérivé spécifique (métabolite) de la vitamine de cette invention. Les autres pics du profil de radioactivité sur la Figure 1 sont identifiés de la manière suivante : 72 06457 4 2126414 Pic I esters de vitamine D avec des acides gras à longue chaîne Pic III vitamine Pic IV 2 5-HCC 5 Pic Va 21,2 5-dihydroxycholécalciférol. Sur la base de l'activité spécifique du métabolite, il a été récupéré 11 JUq de substance du pic V dans environ 320 mg d'huile jaune, cette substance a été chromatographiée sur une colonne de 1 x 150 cm garnie de Sephadex LH-20 dans l'alcool 10 méthylique comme il est décrit par Suda et al (référence ci-dassus) On a recueilli 80 fractions de 2,5 ml et on a soumis 5 ^ul de chaque fraction au comptage pour déterminer la position de la substance du pic V à l'élution. On a réuni les fractions du pic V et on a fait une évaporation sur évaporateur éclair, et on a 15 récupéré pratiquement 100 % des lly^g dans 31 mg d'huile. On a dissous le résidu huileux dans O,15 ml de 65 % de CHCl3 dans du Skellysolve B et on l'a chromatographié sur une colonne de 1 x 150 cm garnie de perles Bio Beads SX-C (polymère de polystyrène réticulé poreux commercialisé par Bio Rad Laboratories, 20 Richmond, Californie) dans 65 % de CHCl^ dans le Skellysolve B. On a recueilli 50 fractions de 2,5 ml et on a fait un comptage sur 5 de chaque fraction pour déterminer la position de la substance du pic V à l'élution. On a de nouveau réuni le contenu des tubes collecteurs qui contenaient 8yt Skellysolve B. On a fait passer la substance résultante sur une colonne de 1 x 100 cm garnie de Sephadex LH-20 dans 65 % de CHCl^ dans le Skellysolve B et on a récupéré la substance du pic V. On a ensuite fait réagir les C^wg de substance isolée du 30 pic V avec lOyU.1 de TBT (mélange spécial de TMS-Imidazole, Bis-TMS-Acétamide et Triméthylchlorosilane commercialisé par Pierce Chemical Co., Rockford, 111.) dans 10 yuX de pyridine pendant 10 minutes. On a chromatographié le dérivé éther tri-triméthyl sylylique résultant sur une colonne de 1 x 60 cm 35 garnie de 1C g de Sephadex LH-20 dans 50 % de CHCl^ dans le Skellysolve B. On a désilylé le dérivé éther tri-triméthyl siiylique dans 100yijl. de 0,00036 % de HCl dans MeOH + 50yu 1 de pyridine à 60°C pendant 4 heures. On a séparé 1'éther disilylique. 1'éther monosilylique et lês produits non silylés dans £0 % de CKCl 72 06457 5 2126414 dans le Skellysolve B sur une colonne de 1 x 60 cm garnie de Sephadex LH-20 dans 50 % de CHClg dans le Skellysolve B. On a chromatographié séparément le produit du pic V non silylê et le dérivé éther mono-triméthylsilylique du produit isolé, du pic V sur 5 une colonne de 1 x 60 cm, garnie de Sephadex LH-20 dans MeOH et on a préparé les dérivés et le produit isolé du pic V désilylé pour les soumettre à la spectrométrie de masse. On a déterminé la,structure de la substance du pic V récupérée en utilisant le spectre de masse obtenue à l'aide d'un spectromètre 10 de Associated Electric Industries mocÈXeMS-9 et on l'a fait reposer sur les indications suivantes : le spectre de masse de la substance présentait un ion moléculaire à ir/e 416, nécessitant 1'incorporation de deux atomes d'hydrogène supplémentaires dans le squelette carboné de la vitamine de base (cholécalciférol). 15 La présence de trois fonctions hydroxyle dans la substance isolée a été démontrée par la formation d'un dérivé éther tri-triméthyl-silylique de PM=632. Le spectre de masse des deux dérivés, éther tri-triméthyl-silylique et éther mono-triméthylsilylique (PM=488 ; obtenu à 20 partir du composé tri-triméthylsilylé par désilylation partielle) et la substance éther triméthylsilylique-diacétate présentait un pic intense à m/e 131, qui démontrait la présence d'une fonction hydroxyle sur le C-2 5. En outre, le spectre de masse du composé éther mono-triméthylsilylique présentait des pics à m/e 152 et 134 25 (152 - 18) qui correspondent aux ions caractéristiques à m/e 136 et 118 dans les spectres du cholécalciférol, du 25-hydroxycholécal-ciférol et des autres métabolites du cholécalciférol. Etant donné que les ions à m/e 136 et 118 (136-18) sont connus comme provenant du cycle A du squelette de la vitamine D de 30 base, le déplacement de ces ions de 16 u.m. (c'est-à-dire 136 + 16 = 152 ; 118 + 16 = 234) dans le spectre de masse des dérivés étheis mono-triméthylsilylique du produit isolé du pic V, démontrait la présence d'une fonction hydroxyle supplémentaire dans le cycle A. On observe également les mêmes pics (152, 134) 35 dans le spectre de masse du produit isolé du pic V, tandis que dans le spectre de masse du dérivé éther tri-triméthylsilylique ces pics sont déplacés en m/e 296 (152 + 2 groupements silyle) et 206 (296-HOSi(Qî3)^). Outre le fait de fournir une preuve concluante de la présence de deux fonctions hydroxyle dans le 40 cycle A, les pics à m/e 152 et 134 (et 296 et 206 dans le cas 72 06457 6 2126414 du dérive éther tri-triméthylsilylique) établissent également l'existence du système de double liaison d'un triène dans le produit isolé du pic V étant donné que ces pics de spectre de masse sont très caractéristiques de la structure de triène de type 5 vitamine D. L'absorption ultraviolette à 265 nm fournit une autre preuvemarquée de la présence d'un système cis-triène. Les atomes de carbone 1, 2 ou 4 sont donc les seules possibilités pour la position de la fonction hydroxyle supplémentaire dans le cycle A. La présence d'un groupement hydroxyle en C-l a été déterminée 10 par les expériences suivantes î la réduction catalytique (Pt02/H2) du produit isolé du pic V a donné un produit que l'on a montré être identique (par co-chromatographie) au 25-hydroxyhexahydro-cholécalciférol. Etant donné que la formation de 25-hydroxyhexa-hydrocholécalciférol à partir du produit isolé nécessite l'hydro-15 génolyse d'un groupement hydroxyle, la fonction hydroxyle perdue dans cette méthode devait être localisée soit sur le C~1 soit sur le C-4 (c'est-à-dire allylique vis-à-vis du système de double liaison). Le fait que le produit isolé ne réagisse paa avec le periodate élimine la possibilité pour le groupement hydroxyle d'être 20 sur le carbone 4 et nécessite alors que le groupement hydroxyle supplémentaire soit placé sur le carbone 1. Le fait que l'on ait remarqué que la biosynthèse de ce produit isolé faite à partir du 1,2-ditritiocholécalciférol a pour résultat la perte d'un atome de tritium fournit une preuve confirmant l'existence d'un composé 2 5 hydroxylé sur le carbone 1. Les indications précédentes permettent donc d'établir que la structure du produit isolé est celle du 1,2 5-dihydroxycholécalciférol. Les observations et déductions reposent en partie sur les travaux antérieurs de Suda et al, Biochemistry ]3, 3513 (1969) , 30 Biochemistry 9, 2917 (1970) et Biochemistry 9, 4776 (1970) et Blunt et al, Biochemistry ]_, 3317 (1968) . Essai du "Test de la ligne" On a mis de tout jeunes rats au régime rachitigène de Steeribock and Black, J. Biol. Chem. 64, 263 (192 5) pendant 21 jours 35 et à volonté. On a modifié le régime en ajoutant des vitamines hydrosolubles cristallines comme il est décrit par Suda et al., J. Nutr. 100, 1049 ( 1970). Après la période d'épuisement de 21 jours on a administré par voie intrajugulaire une seule dose de 4 UI (260 p moles) de vitamine classique ou de 2 5-hydroxycholécal-40 ciférol (25-HCC) ou de substance isolée du pic V dans 0,02 ml 72 06457 7 2126414 d'éthanol à 95 %. Les témoins n'ont reçu que 0,02 ml d'éthanol à 95 %. Sept jours plus tard on a sacrifié les rats et on a effectué le test de la ligne sur les radius et les cubitus sectionnés de chacun des rats. On a déterminé l'activité biologique 5 comme il est décrit dans U.S. Pharmacopeia, 14th revision (Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1955) et on a obtenu les résultats suivants qui représentent les valeurs moyennes obtenues avec sept animaux dans chaque cas : •U Composé Activité en Ul/nm 10 Vitamine D3 15,4 t o,la 2 5-hcc 21,5 i 0,1 Produit du pic V (1,25- 8,1 - 0,2 dihydroxycholécalciféro1) Témoin O 15 a = écart-type *Ul/nm = Unité internationale d'activité antirachitique par nanomole de composé Il est évident d'après ce qui précède que le produit isolé correspondant au pic. V a une activité antirachitique bien qu'il 20 soit également évident que dans les situations normales le 2 5-HCC serait le composé évidemment choisi pour être administré en raison de sa plus grande activité comme le montre le test de la ligne précédent. Toutefois, la valeur du test de la ligne est basée sur l'effet total de la substance administrée et mesure 25 ainsi l'activité totale de la vitamine ou du produit isolé pour ce qui est d'induire la calcification. Comme on le verra ci-après, le produit isolé correspondant au pic V agit beaucoup plus rapidement que le 2 5-HCC ou la vitamine pour ce qui est de stimuler le transport du calcium intestinal. Toutefois, son effet 30 est de plus courte durée alors que celui de la vitamine et celui du 25-HCC sont "3e plus longue durée ce qui est évident dans les résultats du test de la ligne. En raison de l'action rapide du produit isolé correspondant au pic V pour ce qui est d'induire l'absorption du calcium dans les intestins, ce peut être 3 5 la substance de choix à administrer dans les cas où cette réponse rapide paraît importante dans le traitement du rachitisme ou des autres maladies qui sont du ressort d'une thérapie vitaminique, ainsi une maladie rénale chronique, le rachitisme familial par résistance à la vitamine D par hypophosphatémie,et les maladies 40 par carence en pseudo-vitamine D. 72 06457 8 2126414 Absorption intestinale du calcium L'accroissement de l'absorption intestinale du calcium chez les poussins ayant reçu beaucoup de vitamine D était la base du bio-essai. On a estimé l'absorption du calcium (c'est-à-dire de 45 5 Ca) en utilisant une méthode avec anse duodénale in situ. On a administré à des très jeunes poulets carencés en vitamine D pesant entre 170 et 190 g des doses (orales ou intraveineuses) de 25-HCC, de vitamine ou de métabolite du pic V à divers intervalles de temps avant l'expérimentation. On a fait jeûner 10 les poulets 15 heures avant l'expérimentation et ensuite on les a anesthésiés à l'hydrate de chloral (35 mg/100 g de poids corporel, voie intramusculaire). On a ligaturé un tronçon de 10 cm de l'anse duodénale et on en a rincé la lumière avec 5 ml d'une solution de bicarbonate exempte de phosphate (120 mM de NaCl, 15 4,9 mM de KCl, et 9,2 mM de NaHCO^ • pH ajusté à 7 par COg) et ensuite on a obturé en serrant la ligature la plus proche. On a serré la ligature la plus éloignée autour d'une aiguille émoussée de 1,3 mm par laquelle on a injecté 0,2 ml de solution de bicar- 45 45 bonate exempte de phosphate de Ca (0,5^/JCi de Ca/ml ; 20 lo mM de CaC^) dans la lumière de l'anse duodénale. Après avoir retiré l'aiguille on s'est assuré de la solidité de la ligature et l'on a remis l'anse dans la cavité péritonéale pendant 30 minutes puis on a sacrifié l'animal. On a extirpé rapidement l'anse et on l'a ensuite réduite en cendres dans des creusets de porcelaine 25 à 600° pendant 48 heures. Cn a dissous le produit réduit en cendres dans HCl 2 N, on l'a neutralisé avec le réactif Tris 2 N et on a réparti en gouttes des aliquotes de 0,05 ml sur des disques de papier filtre (diamètre de 2,3 cm). On a déterminé la radioactivité en mettant le disque de papier dans une fiole 30 de comptage à scintillation de 20 ml, en ajoutant 10 ml de solution de toluène pour comptage (Neville et al, Biochemistry J5, 2201, 1966) et en faisant le comptage dans un spectromètre à scintillation liquide Tri-Carb (modèle 3375). On a exprimé les résultats en pourcentage d'absorption de ^ca (% ^Ca) et on 35 a fait les calculs en utilisant la formule suivante : (100) 45 ' °/ 45Ca /o Abs i 45_ 1 ~ R CaA 72 06457 9 2126414 45 45 dans laquelle Ca_ est la quantité de ca restant dans l'anse R 45 . , duodénale après l'incubation in situ et Ca est la quantité M J- de Ca ajoutée initialement à la préparation de l'anse. La méthode in situ pour déceler les changements dans 5 l'absorption du calcium s'est révélée être très sensible comme le montre nettement la Figure 3. Une quantité de 2 5-HCC aussi faible que 188 p moles a donné une augmentation importante de l'absorption du calcium. Le déplacement du calcium dans une seule direction (c'est-à-dire du sang vers l'intestin) était compris entre 0,7 et 1,4 % du calcium mis dans l'intestin, ce facteur ajoutant donc uri'3 erreur négligeable aux calculs. On a obtenu un profil de l'absorption du calcium en fonction du temps pour la vitamine D^, le 25-HCC et le produit isolé correspondant au pic V. Ce profil est représenté par la Figure 3. On a noté que l'effet du 25-HCC 15 précédait celui de la vitamine d'approximativement 5 heures, les deux composés présentant des profils d'absorption du calcium similaires. Toutefois, le produit isolé correspondant au pic V présentait des caractéristiques remarquablement nouvelles du fait qu'il surpassait le 25-HCC par la brièveté de la phase de latence 20 et l'importance de la réponse de l'absorption du calcium. Le produit isolé correspondant au pic V a donné une réponse maximale pour environ 10 heures, qui était égale au double de la réponse maximale du 25-HCC telle qu'elle a été déterminée au bout de 24 heures et ensuite elle a diminué jusqu'à ce qu'elle atteigne 25 une activité égale à celle du 2 5-HCC au bout de 24 heures. Mobilisation des minéraux par l'os On a soumis de tout jeunes rats mâles,logés séparément dans des cages de grillage suspendues,au régime (à volonté) de faible teneur en calcium et carence en vitamine D tel qu'il 30 est décrit par Suda et al, J. Nutr. 100, 1049 (1970) pendant 3-4 semaines si ce n'est que l'on a éliminé le calcium du régime. On a fait aux rats soumis au régime de faible teneur en calcium et carences en vitamine D une injection intraveineuse de 0,02 ml d'éthanol contenant 65 p moles de 25-HCC ou de produit 35 isolé du pic V. Les témoins ont reçu 0,02 ml du porteur soit l'éthanol. On a prélevé des échantillons de sang au bout de 6, 24, 48, 72 et 96 heures pour déterminer la teneur en calcium. On a déterminé le calcium par spectrophotométrie d'absorption atomique (Perkin-Elmer, Modèle N° 214). On a dissous les 72 06457 10 2126414 échantillons de sérum (0,05 ml) dans 2 ml de LaCl^ à 0,1 % et on a titré le calcium directement. On a fait des solutions à blanc et étalon pour qu'elles soient voisines du sérum dilué en ajoutant NaCl (3,42 mM) et KC1 (0,19 mM) . 5 La série d'échantillons sanguins présentait une augmentation importante de la teneur en calcium du sérum au bout de 24 heures et de 72 heures à la fois pour le 25-HCC et pour le produit isolé du pic V comme le montre la Figure 4. La teneur en calcium du sérum présentait un accroissement maximal approximativement de 10 3 mg/100 ml de sérum à la fois pour le 25-HCC et pour le produit isolé du pic V lorsqu'on lâ mesurait à 48 heures tandis que à 96 heures dans les deux cas elle était revenue au niveau du témoin. Il est donc évident que le produit isolé correspondant au pic V possède une activité de mobilisation du calcium par l'os. 15 Cette activité suggère l'application du produit isolé du pic V, le 1,2 5-dihydroxycholécalciférol, dans les cas d'hypopara-thyroïdisme. 72 06457 11 2126414 revendications 1. Le 1,25-dihydroxycholécalciférol. 2. Composition antirachitique contenant du 1,25-dihydroxycholécalciférol et un porteur acceptable.