Brevet FR2132201A1 — publié le 19721117

La présente invention a pour objet un procédé de culture de microorganismes et trouve des applications dans l'industrie des produits médicaux, l'industrie microbiologique, l'industrie alimentaire, l'agriculture et d'autres domaines. 5 L'invention concerne les méthodes physiques d'intensification de l'activité vitale et de la biosynthèse chez les microorganismes, notamment les germes se classant parmi les genres Gandida, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Bacillus, Bacterium, Pseudomonas, Olostridium, Lactobacterium, 10 Propionibacterium, Aspergillus, Pénicillium, Mucor, Bhizopus, Streptococcus, Aerobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Ourrulia, Digimella, Acetobacter, Gremothecium, Actinomyces, Alternaria, Arthorabacter, Azotobacter, Csehirichia, Fusarium, Methano- bacterium, Neurospora, îlitrobacter, Uocarida, Ruminococcus, Serratia, Streptomyces. 15 On connaît déjà un procédé de culture de microorganismes, lequel consiste à ensemencer dans un milieu nutritif contenu dans des flacons les conidies sèches du champignon Aspergillus niger et à faire incuber la culture pendant 48 à 60 heures sous un éclairage unilatéral par la lumière émisepar des lampes 2 a 2 20 luminescentes et ayant une intensité de 60 W/m (6,10 erg/cm .s), sans agitation, à une température de 30 à 32°0. Après l'achèvement du stade de croissance, on élimine le milieu nutritif et on introduit sous la pellicule constituée par les champignons 30 ml d'une solution à 20fa de sucre et 0,19$ 25 de chlorure d'ammonium. On maintient les champignons pendant 96 à 120 heures en contact avec la liqueur de fermentation. On en détermine l'acidité par titrage au moyen de ÎTaOH décinormal. Il ressort des résultats de ce procédé que l'éclairage de la culture du champignon pendant toute la période 30 de croissance (48 à 60 heures) provoque une augmentation" de 30 à 70% de la sécrétion d'acides par la culture, à condition que le stade de fermentation définitif se déroule à l'abri de la lumière. L'allumage de la lumière à ce stade réduit de 30fo la formation d'acides. 3^ Un inconvénient du procédé en question réside dans la 5 nécessité d'un éclairage prolongé (à savoir pendant 48 à 60 72 11101 2 2132201 heures) de la culture de microorganismes. En outre, la réalisation de l'éclairage au stade de fermentation fait apparaître des difficultés considérables en ce qui concerne l'appareillage mis en jeu. 5 La présente invention se propose de supprimer les inconvénients précités. Conformément à cet objectif, l'invention vise, en modifiant les opérations technologiques., "à simplifier le procédé et l'appareillage mis en oeuvre pour sa réalisation. 10 Oe problème est résolu du fait que dans un procédé de culture de microorganismes, consistant à préparer une semence, à l'ensemencer sur un milieu nutritif, et à faire ensuite incuber la culture sous éclairage, selon l'invention, la semence de microorganismes est soumise avant son ensemencement sur le 15 milieu nutritif, à l'éclairage par une lumière de longueur d'onde comprise entre 300 et 750 nia. Il est préférable de réaliser l'éclairage par une 3 2 lumière d'intensité nogfeupérieure à 5>10 erg/cm .s pendant 1 à 30 mn, et par une lumière d'intensité non supérieure à 20 10^ erg/cm^.s pendant 1,10" ^ à 10^ s. Afin d'augmenter la sensibilité des cellules microbiennes, l'éclairage de la semence est réalisé en présence d'un pigment-sensibilisateur vital, absorbant la lumière dans le _7 domaine spectral indiqué,, et engagé en concentrations de 10 25 à 10~3 mole. En tant que pigment-sensibilisateur il est préférable d'utiliser le bleu de méthylène. le procédé faisant l'objet de 1'invention est mis en oeuvre de la maiiière suivante. - 30 La semence de microorganismes, immédiatement avant son ensemencement dans un milieu nutritif contenu dans une enceinte destinée à la culture, est soumise à tin éclairage par une lumière de composition spectrale,. d'intensité et 4e durées déterminées. ; - , - 35 Les cellules microbiennes à éclairer sont diluées jusqu'à ' la densité requise, égale ou inférieure à 0,6 unité de densité optique r dans la liqueur de culture, dans l'eau, dans une eau 4 72 11101 3 2T32201 physiologique, ou encore dans une solution de pigment-sensibilisateur vital. Pour chaque Éicroorganisme concret il est nécessaire de choisir un régime individuel d'éclairage de l'inoculât. 5 la longueur d'onde de la lumière mise en oeuvre est choisie dans les limites de 300 à 750 nm. l'utilisation d'une lumière de longueur d'onde inférieure à 300 nm exclut l'effet mutagène des rayons ultra-violets. Une lumière de longueur d'onde supérieure à 750 nm 10 n'exerce pas d'action spécifique sur l'activité vitale des microorganismes. le choix d'une intensité lumineuse et d'une durée d'éclairage optimales revêt une grande importance. Une dé^dation insignifiante par rapport au régime choisi est susceptible de diminuer 15 l'effet recherché . les régimes suivants sont particulièrement indiqués. lorsqu'on utilise des intensités lumineuses peu ? 2 f éLevées, c'est-à-dire ne dépassant pas 5.10 erg/cm , s, la durée d'éclairage.doit être comprise entre 1 et 30 mn. Par 20 exemple, avec une longueur d'onde égale à 440 nm et une 2 r intensité lumineuse de 100 erg/cm .s, la durée d'éclairage optimale est de 5 mn. Si l'on recourt à des intensités lumineuses plus élevées, la durée d'éclairage deJa semence est réduite. 16 Dans ce cas, si l'intensité lumineuse ne dépasse pas 10 2 —9 £5 erg/cm .s, la durée d'éclairage devra être de.1.10 . à p 10 s. Par exemple, en éclairant l'inoculât pendant 10 s avec une lumière dont la longueur d'onde est de 350 nm, et l'intensité de 10 erg/cm .s, on observe par la suite une intensification considérable de l'activité vitale, l'augmentation de la durée 30 d'éclairage jusqu'à 3 mn a pour effet une inhibition de l'activité vitale. la lumière de longueur d'onde 695 nm et d'intensité 1C 2 v lumineuse 10 erg/cm .s stimule les phénomènes de biosynthèse, si — 8- la durée d'éclairage est de 10 s. En vue d'augmenter la sensibilité des cellules microbiennes 35 à la lumière, il est avantageux d'utiliser des pigments-sensibilisateurs vitaux absorbant la lumière du domaine spectral indiqué. 72 11101 4 2132201 En tant que pigments-sensibilisateurs vitaux, on utilise, entre autres, le "bleu de méthylène, le janus vert. _7 On les utilise de préférence en concentrations de 10 à 10 mole. Après l'éclairage de la semnce, on l'introduit 5 dans un fermenteur et on procède à la culture. L'éclairage de l'inoculât avant l'ensemencement a pour conséquence un accroissement considérable du rendement en produits protidiques, ferments, antibiotiques, hiberrilines, toxines, corps gras, vitamines, éthers et esters, acides organiques et 10 alcools, acides aminés et autres composés biologiquement actifs; d'autre part, on observe une accélération considérable-de la vitesse de division cellulaire, une réduction de la durée de la lag-phase, des phases exponentielle et logarithmique, ainsi qu'un accroissement du rendement eh masse microbienne 1 5 sèche. L'invention permet de simplifier la"technologie du procédé, en ne soumettant à l'éclairage que la semence. Ledit procédé peut être appliqué avec la même efficacité à une gamme étendue de microrganismes producteurs de divers composés biologiquement actifs. Le procédé proposé permet 20 d'augmenter le rendement en produits biologiquement actifs et de réduire notablement la durée de culture des microorganismes grâce à la réalisation plus rapide des différents stades du cycle de développement de ceux-ci. Le procédé faisant l'objet de l'invention peut être mis en oeuvre en régimesde production 25* aussi bien discontinus que continus. La présente invention sera mieux comprise à lg&ecture des exemples non limitatifs suivants de mise en oeuvre du procédé. proposé de culture de microorganismes. Exemple 1.- Une culture de Pseudomonas fluorescens . 30 subit deux passages sur un bouillon de viande et de peptone avec addition de 0,1$ de salpêtre. Un troisième passage est effectué à un moment choisi de façon que vers le commencement de l'expérience là semence soit âgée de 18 heures. La semence ainsi obtenue est distribuée dans des tubes à essai en quartz et 35 soumise à uh éclairage pendant 5 minutes par une lumière monochromatique d'une longueur d'onde de 340 nm et d'une intensité de 700 72 11101 5 2132201 erg/cm^.s, émise par une lampe .aPw -1000 (lampe à arc au èercure sphérique, 1000 W). Cela fait, on procède à l'ensemencement des échantillons éclairés et non éclairés (témoins) sur un milieu nutritif constitué ~ 5 par du bouillon de viande et de peptone avec addition de 0,1$ de salpêtre, que l'on distribue dans des tubes à essai. Sur la surface du milieu on dépose une couche de paraffine, afin de créer des conditions d'anaérobie absolue. Après l'inoculation, tous les échantillons sont placés dans 10 ufte étuve réglée à 30°C. Au moment où la culture de Pseudomonas fluorescens atteint la phase stationnaire de développement, on détermine dans la culture la teneur totale en protéines d'après Lawry et la quantité dé vitamines sur un 15 fluoromètre. Pour le^fconditions d'éclairage décrites on constate un accroissement de 60$ (en masse) du rendement en produits protidiques et une augmentation de 130$ (en masse) du rendement en vitamines B^. Exemple 2.- La préparation de la semence de Pseudomonas 20 fluorescens est effectuée comme dans l'exemple 1. l'inoculât est éclairé pendant 10 mn par une lumière de longueur d'onde 2 390 nm et d'intensité lumineuse 700 erg/cm .s, émise par une lampe APui- 1000 définie ci-dessus ; La culture subséquente et la détermination de la quantité totale de protéines 25 et de vitamines B^ sont réalisées comme décrit dans l'exemplel. Dans ces conditions on observe un accroissement de 75$ (eu masse) du rendement eijferoduits protidiques et une augmentation de 85$ (en masse) du rendement en vitamine B^. Exemple 3.- Pour la culture de Clostridium butiricum on 50 utilise une végétation de spores obtenue de la manière suivante : un milieu à 25$ de pommes de terre avec addition de craie est distribué dans des tubes à essai de façon àyformer des colonnes assez hautes.Avant l'inoculation on chauffe le milieu pendant 40 à 60 mn sur un bain d'eau en ébullition. Après refroidissement 55 des tubes d'essai jusqu'à une température de 30 à 40°C, on dépose sur le fond de chacun d'eux. 0,2 ml de spores. La fermentation dure 7 à 10 jours à la température de 37°C. A l'issue de la À 72 11101 6 2132201 fermentation on scelle les tubes d'essai et on les conserve à l'abri de la lumière à la température de 20°G. Avant de procéder à l'expérience, on fait germer les spores sur un milieu à base de glucose et de peptone: 2$ en masse de 5 glucose, 1 $ en masse de peptone, 0,1$ en masse de KH^PO^, craie au fond des tubes à essai, le reste étant de l'eau. Avant l'ensemencement, on chauffe le milieu pendant 40 à 60 mn sur un bain d'eau en ébullâtâon. On dépose la végétation de spores, à raison de 1$ du volume du milieu, 10 sur le fond des tubes d'essai, et on fait incuber la culture pendant 24 heures à la température de 37°C. La culture ainsi obtenue est utilisée comme inoculât"' pour Idéalisation des. expériences. Dans les expériences les bactéries sont cultivées 15 sur un milieu synthétique: 1$ en masse de glucose, 0,1$ en masse d'acide fumarique, 0,3$ en masse de (NH^^HPO^, 140 mg/l de EDH, 0,001 mg/l de biotine, le reste étant de l'eau. Le pH du milieu est de 6,7 à 6,8. Avant l'ensemencement de l'inoculât sur ce. milieu, on 20 éclaire l'inoculât pendant 5 mn par une lumière monochromatique 2 de longueur d'onde 440 nm et d'intensité lumineuse 200 erg/cm .s, émise par une lampe m- 1000 précitée. Après éclairage, on introduit la semence dans le milieu nutritif et on conduit la culture à la.température de 37°C jusqu'à ce qu'elle 25 atteigne la phase stationnaire de croissance. A ce moment, on détermine la teneur totale en protéines d'après Lawry et le nombre de cellules dans la culture de Clostridium butiricum d'après Vinogradsky. Pour le régime d'éclairage indiqué on . constate un accroissement de 30$ (en masse) du. rendement en 30 produits protidiques et une accélération de 75$ de la vitesse de division cellulaire. Exemple 4.- La préparation de la semence de Clostridium butiricum est effectuée comme dans l'exemple 3. La semence est éclairée par la lumière d'une lampe£"i/B-30 (lampe ultraviolette 35 germicide, 30 W) en association avec un photofiltre transmettant les longueurs d'onde supérieure à 310 nm, ce qui exclut l'action létale des rayons ultraviolets à courtes longueurs d'onde. 72 11101 7 2132201 2 L'intensité lumineuse est de 200 erg/cm; .s , la durée d'éclairage de 20 mn. Dans ces conditions on observe une accélération de 170$ de la division cellulaire, une augmentation de 35$ (en mass^ du rendement en produits' protéiniques. En outre, un tel régime d'éclairage assure une réduction sensible de la lag-phase, qui est de 6 heures dans l'expérience témoin et de 3,5 heures seulement dans 1'expérience principale. Exemple 5.- Une semence de Aspergillus oryzae est préparée suivant la technique suivante. D'une surface de gélose inclinée on enlève une culture de Aspergillus oryzae avec 10 ml d'eau stérile. On introduit 1 ml de la suspension ainsi obtenue dans des flacons contenant du son stérile, à 50$ d'humidité, et on place ces flacons dans un étuve réglée à 30°C, pendant 72 heures. On submerge la culture propagée dans 100 ml d'eau stérile, on mélange et laisse reposer. Le liquide qui surnage est utilisé comme semence. La semence est exposée pendant 15 mn à la lumière d'une lampe£VB-30, . avec une intensité lumineuse 3 2 de 2,10 erg/cm .s. La végétation irradiée est distribuée à raison de 4 ml dans des flacons de "verre coniques de 250 ml, contenant chacun 10 g de son stérile à 65$ d'humidité. Dans l'expérience témoin, on ensemence un inoculât non éclairé. Après l'ensemencement on place les flacons pendant 36 heures» dans une étuve réglée à 3O°0. Lorsque la propagation de la culture du champignon Aspergillus oryzae s'achève, on en détermine l'activité protéolytique. 4^ette fin, on place 5 g de son, avec les champignons qui ont poussé sur lui, dans 45 ml d'eau distillée et 5 ml de phosphate tamponné, pH= 7,2. On maintient la suspension dans 1'étuve pendant 1 heure à la température de 30°C. Ensuite, on filtre la suspension pour utiliser le filtrat comme solution de travail (ferment). A la température de 30°C on mélange 0,5 ml de solution de ferment et 2,5 ml d'une solution à 2$ d'hémoglobine, pH=7,2, et on maintient pendant 60 mn à la température de 30°C. La réaction de protéolyse de l'hémoglobine est interrompue par addition de 5 ml d'une solution 0,3 M d'acide trichloracétique; le précipité 72 11101 8 2132201 qui en résulte est éliminé au bout de 15 mn. l'activité de la protéinase est proportionnelle à la concentration de la tyrosine, acide aminé libre prenant naissance lors de la décomposition enzymatique de l'hémoglobine. On 5 détermine la concentration de tyrosine sur un spectrophotometre, arec calcul ultérieur d'après une courbe d'étalonnage. Dans ces conditions d'éclairage de l'inoculât avant l'ensemencement on observe une augmentation de 200$ de l'activité protéolytique dans l'expérience d'essai en comparaison 10 de l'expérience témoin. Exemple 6.- On effectue une culture de Candida guilïïermondii - sur la gélose inclinée pendant 24 heures à la température de 30°C. On enlève la culture dans chaque tube d'essai avec 5 ml de H^O. la suspension de cellules, de 1 ,5 ml de volume, 15 est placée dans des tubes d'essai coniques de 15 mm de diamètre. la semence ainsi préparée est exposée avant l'ensemencement aux éclairs d'une lumière de longueur —S d'onde 694*3 nm, d'une durée de 2,10 s et d'une intensité 15 2 lumineuse de 10 erg/cm .s. Après irradiation, on ensemence 20 l'inoculât dans des flacons à secouer, la végétation non irradiée, ensemencée elle aussi dans des flacons à secouer, fait office de témoin. On cultive les levures dans un milieu liquide de composition suivante :2 g de HH^H^PO^; 2 g de (ÏÏH^)2HP0^; 2 g de K^SO^; 2 g de MgSO^; 20 ml d'autolysat; 1 litre 25 d'eau;, après l'ensemencement on introduit dans les flaeons de la paraffine à raison de 1 ml pour 100 ml de milieu. Dans chaque flacon on introduit î ml de suspension de cellules, la densité initiale est de 0,07 à 0,1 unité de densité optique. Après l'ensemencement on place les flacons sur une secoueuse et 30 on effectue la culture pendant 24 heures à la température de 30°0. Au cours de l'expérience on détermine la vitesse de propagation de la culture d'après l'accroissement du nombre de cellules et d'après l'allure des variations du pH du milieu. En outre, on détermine la masse de la végétation. 35 On a établi que l'éclairage préalable de l'inoculât accélère de 2 fois le développement de Oandida guilliermondii et augmente de 100$ lginasse de végétation. 72 11101 9 2132201 Exemple 7.- la préparation de la semence de Candida guilliermondii est effectuée comme dans l'exemple 6. la semence est exposée aux éclairs d'une lumière de longueur —3 d'onde 694,3 oui-, d'une durée de 3.10 s et d' intensité 5 lumineuse 10^ erg/cm^.s. Après irradiation, on ensemence l'inoculât dans des flacons à secouer et on procède à la culture comme décrit dans l'exemple 6. On a établi que l'éclairage préalable de la semence accélère de 1,5 fois le développement de Qandida guilliermondii 10 et augmente de 50$ (en masse) la production de végétation. Exemple 8.- On fait incuber une culture de Candida guilliermondii sur la gélose inclinée pendant 24 heures à la température de 30°G. On enlève la culture de chaque gélose inclinée avec 5 ml d'une solution aqueuse d'un pigment-sensibilisateur vital constitué 15 par le bleu de méthylène en concentration de 10- ^ M. les opérations ultérieures sont effectuées suivant la technique décrite dans l'exemple 7. On a établi que dans ces conditions, le développement des microorganismes est accéléré de 2 fois et que la masse 20 de végétation augmente de 100$. Exemple 9.- la préparation de la semence de Gandida guilliermondii est effectuée suivant la technique de l'exemple 6. la semence est éclairée par une lumière d'intensité lumineuse ET Q 10 erg/cm .s pendant 60 s. Après irradiation, l'inoculât 25 est ensemencé dans des flacons placée sur une secoueuse, et la culture est réalisée cornue dans l'exemple 6. On a établi que dans ces conditions il y a une augmentation de 80$ de la masse de végétation. Exemple 10.- la semence de Bacillus brevis var 0-B est 3 0 cultivée en boîtes de Pétri sur un milieu de composition suivante (milieu I): 1 litre d'eau, 10 g d'azote de groupes aminés; 10 g de peptonë; 5 g de FaCl; 35 g de gélose. Ilensemencement est opéré à la maille métallique à partir d'une colonie unitaire, uniformément sur toute la boîte. La culture est effectuée pendant 35 48 heures à la température de 37°G. On enlève à la maille 5 à 6 colonies nouvellement formées et on les transfère dans un flacon adapté à la secoueuse, contenant un milieu liquide de 72 11101 10 2132201 composition suivante (milieu II) : 1 litre d'eau, 5 g de NaOl, 0,2 g de MgSO^, 20 g de glycérine, 8,12 g d'oxalate d1 ammonium,"9,9 g de K^HPO^, 8 ml d'acide lactique par litre. On effectue la culture pendant 17 heures à la température de 40°C. 5 l'inoculât ainsi obtenu, d'un volume de 15 ml, est éclairé pendant 30 s par une lumière de longueur/i 'onde 440 nm et 4-2 d'intensité lumineuse 4,10 erg/cm .s, puis il est placé dans des flacons à secouer contenant le milieu II. Dans les flacons témoins on introduit l'inoculât non 10 éclairé. On réalise la culture sur une secoueuse pendant 48 heures à la température de 40°0. lorsque la propagation de la culture s'achève, on prélève de chaque'flacon 1 ml de suspension, on ajoute 3 ml d'alcool à 96° et on maintient pendant 24 heures à la température de 37°0. 15 la détermination de l'activité antibiotique est réalisée par la méthode de diffusion dans la gélose. En tant que microorganisme de test on utilise Bacillus subtilis que l'on ensemence sur un milieu solide III de composition suivante : 1 litre de bouillon de Hottinger; 3 litres d'eau 20 distillée, 2$ en masse de gélose, 2$ en masse de K01, pH= 7,2. Dans le milieu solide on pratique des puits de 4 mm de diamètre, dans lesquels ory(rerse des volumes identiques de la solution à essayer et d'.une solution de gramicidine faisant 25 office de témoin. Cela fait, on place le milieu de culture pendant 24 heures dans une étuve réglée à 37°C. le diamètre,de la zone stérile autour du puits est proportionnel à l'activité antibiotique. On a établi que l'exposition préalable de l'inoculât à la 30 lumière provoque une augmentation de 150 à 200$ de l'activité antibiotique dans l'expérience de l'essai en comparaison de l'expérience témoin. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnéi^u'à 35 titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. 72 11101 n 2132201 REVENDICATIONS 1Un procédé de culture de microorganismes, du type consistant à préparer une semence, à l'ensemencer dans un milieu nutritif et à la faire ensuite incuber sous éclairage, ledit procédé étant caractérisé en ce que la semence est 5 soumise, avant son ensemencement dans le milieu nutritif, à un éclairage par une lumière dont le domaine spectral est de 300 à 750 nm. 2.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'éclairage est effectué par une lumière 3 2 10 d'intensité non supérieure à 5,10 erg/cm .s pendant 1 à 30 mn. 3-- Un procédé selon la revendication 1t caractérisé en ce que l'éclairage est effectué par une lumière 16 2 _q ^ d'intensité non supérieure à 10 erg/cm .s. pendant 1,10 à 10 s. 4.- Un procédé selon la revendication 3, caractérisé 15 en ce que l'éclairage de la semence est effectué en présence d'un pigment-sensibilisateur vital absorbant la lumière dans ledit domaine spectral et introduit en concentrations allant de 10-^ à 10~~3 mole. 5.- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en 20 ce qu'en tant que pigment-sensibilisateur on utilise le bleu de méthylène. 6.- les microorganismes, doués notamment de propriétés médicales et microbiologiques, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé suivant l'une des revendications 25 1 à 5.