Brevet FR2132453A1 — publié le 19721117

i 2132453 Cette invention se rapporte à un procédé pour prolonger l'activité biologique du glucagon. Grâce à la méthode de cette invention, on prolonge l'activité biologique du glucagon en iodant le glucagon pour obtenir un 5 glucagon chimiquement modifié contenant en moyenne jusqu'à environ 5 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon. Cette invention enseigne un procédé permettant de prolonger l'activité biologique du glucagon, procédé qui consiste à ioder le glucagon avec une quantité suffisante d'agent iodant 10 pour obtenir un glucagon chimiquement modifié contenant en moyenne jusqu'à environ 5 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon. Dans un mode de réalisation plus spécifique, la présente invention fournit un procédé permettant de prolonger l'activité 15 biologique du glucagon en iodant le glucagon à concurrence d'environ 2 à environ 4 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon. La molécule de glucagon contient deux restes de tyrosine dans son enchaînement d'aminoacides. on pense que ces restes 20 sont les sites principaux où a lieu l'iodation. La tyrosine est elle-même connue pour réagir rapidement avec les agents iodants classiques, en donnant tout d'abord la 3-iodotyrosine, puis la 3,5-diiodotyrosine. on pense qu'il se produit une réaction analogue pour le glucagon, l'iodation modifiant les 25 restes de tyrosine qui y sont présents. Il faut cependant noter qu'il n1est pas prévu de limiter la présente invention à une quelconque théorie particulière de réaction localisée, de mécanisme de réaction ou de structure de produit eh ce qui concerne la modification du glucagon. 30 La méthode de réalisation de l'iodation de glucagon n'est pas cruciale pour l'exposé de la présente invention. Tout réactif convenable efficace pour accomplir l'addition d'iode est satisfaisant. Parmi les agents iodants convenables,on trouve le monochlorure d'iode, le triiodure de potassium, l'association 35 d'un sel qui est un iodure et de chioramine T, etc. Un réactif iodant préféré est le monochlorure d'iode. Dans les conditions de réaction choisies, l'iodation est normalement stoechiométrique. C'est pourquoi on utilise en général seulement la quantité de réactif iodant suffisante nécessaire pour effectuer l'iodation 40 du glucagon au degré voulu. 72 11931 2 2132453 La température et la pression auxquelles est effectuée la réaction d'iodation ne sont pas cruciales si ce n'est que la température doit être assez élevée pour provoquer la décomposition du glucagon. Généralement,on utilise la température 5 ambiante ou une température inférieure, une température de -10°C à +10°C étant particulièrement préférée. L'iodation est habituellement effectuée à la pression atmosphérique, bien que des pressions supérieures à la pression atmosphérique soient également satisfaisantes. 10 De même, un solvant n'est pas un point essentiel de la réaction d'iodation. On peut utiliser tout milieu de réaction qui est inerte vis-à-vis des réactifs, et en outre on peut effectuer l'iodation, le glucagon relativement insoluble étant présent dans le milieu sous la forme d'une suspension. 15 Le pH du milieu de réaction n'est également pas essentiel. L'iodation peut être effectuée en milieu acide, neutre ou alcalin ; cependant, il est préférable d"ioder le glucagon dans des conditions qui sont légèrement alcalines, généralement à un pH d'environ 7,5-9,0. 20 La durée de réaction est celle qui est assez longue pour assurer l'obtention du degré d'iodation voulu. La durée de réaction varie naturellement beaucoup avec les autres conditions de réaction choisies. Etant donné que la présente invention est orientée vers la 25 prolongation de l'activité biologique du glucagon par une modification chimique, la dose de glucagon iodé est mesurée d'après la dose usuelle de glucagon naturel. La dose de glucagon iodé est donc généralement comprise dans la gamme d'environ 0,1 à environ 100 jug par kg. 30 En outre, la dose peut être simple ou cumulative. Par cumulative, on entend une dose mesurée d'après plusieurs doses séparées, chaque dose séparée étant administrée avant que le sujet ait fini de répondre à la dose précédente. On administre le glucagon iodé en utilisant les mêmes 35 méthodes que celles dont on dispose pour administrer le glucagon. Parmi celles-ci, on trouve toutes les voies parentérales usuelles, par exemple les voies intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée et intramusculaire. Lorsqu'on compare l'activité biologique du glucagon à celle du glucagon iodé, il faut 40 administrer l'un et l'autre produits par la même méthode 72 11931 3 2132453 puisque, généralement, l'administration intraveineuse entraîne un démarrage plus rapide avec une durée plus courte ; l'administration intrapéritonéale est intermédiaire ; et l'injection sous-cutanée ou intramusculaire entraîne un démarrage relati-5 vement plus lent avec vzic durée plus longue. Les exemples suivants illustrent la modification du glucagon destinée à produire le glucagon iodé et démontrent que l'activité biologique du glucagon iodé est prolongée par rapport à celle du glucagon. 10 EXEMPLE I On a dissout 350 mg de glucagon cristallin (100 micromoles) à 0°C et à une concentration de 5 mg par ml dans une solution-tampon de HCl-glycine 0,2 M à un pH de 3,0. On a ajouté goutte à goutte et en agitant sur une période d'environ 5 minutes une 15 solution 0,2 M de 0,8 millimoles de monochlorure d'iode (ICI) à la solution de glucagon. Après 3 autres minutes, on a détruit l'excès de I^ en ajoutant 50 )il de mercaptoéthanol. On a fait passer immédiatement la solution sur une colonne (5 x 60 cm) de Sephadex G 10 dans l'acide acétique 1 M. On a lyophilisé la 20 fraction initiale absorbant l'UV provenant de l'effluent, exempte d'électrolytes, en obtenant 280 ml (rendement de 80%) de glucagon iodé blanc contenant 3,S6 atomes-grammes d'iode par mole. EXEMPLE II 25 On a mis du glucagon (20 p. moles) en suspension dans 4 ml de tampon de phosphate-citrate 0,05 H à 0°C et un pH de 6,0. On a ajouté à la suspension sous agitation 80 p. moles de ICI. On a alors agité la suspension à 4°C jusqu'à disparition de la couleur jaune pâle de IOn a dialysé le mélange de réaction 30 pendant 24 heures par rapport à deux fois 1.000 volumes d'acétate d'ammonium 0,01 M à pH 5,0. On a recueilli le précipité blanc résultant à l'intérieur du sac de dialyse par centri-fugation, on l'a dissout dans de l'acide acétique 1M et on l'a fait passer sur une colonne de Sephadex G-10 de 2,5 x 60 cm. 35 On a lyophilisé la fraction protéinique, en obtenant ainsi un rendement de 90% de glucagon iodé contenant 3,5 atomes-grammes d'iode par mole. EXEMPLE III On a dissout du glucagon cristallin (5 millimoles) dans 40 lin mélange HCl-guanidine 5 M à 0°C. On a ajusté le pH de la 72 11931 4 2132453 solution à S,5 en ajoutant un tampon de glycine 0,2 M. On a ajouté à la solution de glucagon une solution de 20 millimoles de ICI par petites quantités provenant d'une microburette sur une durée correspondant à un équivalent d'iode pour 5 5 minutes. Aucun excès d'iode n'a été observé par l'essai à l'amidon. Pendant la réaction, on a maintenu le pH de la solution à 8,8-8,5 en ajoutant du tampon. On a ensuite dyalisé immédiatement le mélange de réaction pendant 16 heures à 4°C par rapport à l.OOO volumes de tampon acétique 0,1 M à pH 5,0. Dans les 10 30 minutes, il est apparu un précipité blanc lourd à l'intérieur de la membrane Visking. on a lyophilisé le contenu du sac de dyalise et on a dissout la poudre sèche dans de l'acide acétique lMet on l'a fait passer sur une colonne de Sephadex G-10 de de 2,5 x 60 cm. On a lyophilisé la fraction protéinique, 15 et on a obtenu du glucagon iodé contenant approximativement 4 atomes-grammes d'iode par mole. Activité biologique comparative de l'iodocrlucacron et du glucagon naturel A. Force de contraction cardiaque et rythme cardiaque. 20 On a comparé 1!activité biologique de 11iodoglucagon avec celle du glucagon naturel en ce qui concerne la force de contraction cardiaque et le rythme cardiaque. Comme sujets, on a utilisé quatre chiens. On a anesthésié les chiens avec du phénobarbital, on leur a fait une vagotomie, 25 et on les a préparés pour étudier le rythme cardiaque et la force de contraction cardiaque. On a obtenu les réponses aux doses cumulatives, et on a mesuré les paramètres à différents intervalles pendant trois heures après l'administration de la dernière dose de chaque préparation de glucagon. Dans le cas de 30 dose cumulative, on n'utilise pas de délai consistant à attendre la fin de la réponse à la dose précédente. Au contraire, dès que la réponse à la dose immédiatement précédente a atteint un plateau, on a administré une autre dose, et on a continué ainsi jusqu'à ce que le sujet ait reçu la quantité cumulative. On a 35 effectué l'essai en deux parties. Dans la première partie, deux des chiens ont reçu le glucagon naturel tandis que les deux autres ont reçu 1'iodoglucagon. Dans la seconde partie, on a utilisé le même mode opératoire,si ce n'est que les deux chiens qui avaient reçu le glucagon naturel dans la première 40 partie ont alors reçu 1'iodoglucagon, et vice versa. 72 11931 5 2132453 L'iodoglucagon utilisé dans cette démonstration d'activité biologique comparative contenait environ 4 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon. Les Tableaux I et II donnent les résultats qui ont été obtenus. Le Tableau I démontre l'efficacité 5 biologique du glucagon modifié parïiode comparativement au glucagon naturel. Le Tableau II démontre la prolongation importante de 1'activité biologique du glucagon lorsque ce dernier a été modifié par l'iode. 10 TABLEAU I EFFICACITE RELATIVE DU GLUCAGON NATUREL ET DE L ' IODOGLUCAGON Dose /ug/kg Rythme cardiaque (A) Force de contraction cumulative h attement s /mn (A), mm 15 Ga IGb G IG 0,5 + 2 + 2 o,o 0,0 1 + 5 + 5 +0,2 0,0 2 +10 + 10 +0,5 +0,4 4 +30 + 32 +2,0 +2,0 20 8 +55 + 60 +3,3 +4,3 16 +70 + 85 +4,1 +5,7 32 +82 +100 +4,6 +6,3 a - glucagon naturel b - iodoglucagon 72 11931 6 2132453 TABLEAU II PROLONGATION DE L'EFFET DE L'IODOGLUCAGON PAR RAPPORT AU GLUCAGON NATUREL A UNE DOSE CUMULATIVE DE 32 jucf/kq Temps (mn) Rythme cardiaque, % de Force de contraction, max. (a) % de max. (a) b _ c G IG G IG 5 95 98 85 98 10 91 100 43 92 20 72 97 -8 68 30 45 90 -13 50 40 25 85 -17 38 50 10 80 -13 28 60 3 73 -15 23 90 2 62 -22 ÎO 120 4 60 -20 7 180 3 52 -12 0 a - Réponse maximale dans le Tableau I 2q b - Glucagon naturel c - Iodoglucagon B. Hyperglycémie Le Tableau III donne l'effet du glucagon naturel et des 25 I-, I2~s I3~' I^~ et 1^- glucagons sur la quantité de glucose présente dans le sang de lapins à des temps variables allant jusqu'à 4 heures après l'injection de l'échantillon de glucagon ou de glucagon modifié par l'iode, on a traité au préalable chacun des lapins avec de la cortisone et ensuite on leur a 30 fait une injection sous-cutanée de glucagon ou de glucagon modifié à raison de 8 jag par kg. Les résultats fournissent une démonstration nette de la prolongation de l'effet hyperglycê-mique du glucagon modifié par l'iode comparativement au glucagon naturel. Les données du Tableau II montrent également que la 35 prolongation de l'effet hyperglycémique est directement proportionnel au degré d'iodation. 72 11931 2132453 TABLEAU III EFFET HYPERGLYCEMIQUE Nombre d'heures après 1'injection Augmentation moyenne du glucose du sang * (mg par 100ml G IG I2G I3G I4G I_G D 0,5 1 2 4 124(104) 147 55 -10 129(16) 185 114 6 143(32) 212 190 23 137(48) 220 248 60 146(80) 220 255 94 136(64) 224 264 159 Dans le tableau précédent, G désigne le glucagon, IG le monoiodoglucagon, I^G le diiodoglucagon, I^G le triiodoglucagon, 15 I^G le tétraiodoglucagon, et I^G le pentaiodoglucagon. * Le nombre indiqué entre parenthèses désigne le nombre de lapins de l'essai. C. Diminution des aminoacides du sang Une autre méthode de comparaison de la durée d'action de 20 diverses préparations de glucagon met en oeuvre leur effet d'abaissement des aminoacides du sang, Bromer and Chance, Diabetes 18, 748 (1969). Les effets du glucagon et du tétraiodo-glucagon ont été comparés sur des lapins ayant reçu des doses sous-cutanées de 50 pg par kg, et les résultats sont donnés 25 dans le Tableau IV. L'effet de l'iodation du glucagon sur la prolongation de l'action biologique est de nouveau évident. TABLEAU IV DIMINUTION DES AMINOACIDES DU SANG Nombre d'heures après 1'iniection Rminoacides du sang, % de la concentration initiale* Solution (16) saline Glucagon (lo) I4~glucagon (10) 0 100 lOO 100 1 93 57 47 3 90 68 41 5 85 87 47 * Le nombre indiqué entre parenthèses désigne le nombre de lapins de l'essai. On voit donc d'après ce qui précède qu'on réalise une 40amélioration importante de l'activité biologique du glucagon en 2132453 faisant une modification chimique ds sa structure consistant à y incorporer jusqu'à environ 5 atomes-grammes d'iode. 72 11931 72 11931 9 2132453 REVENDICATIONS 1. Procédé pour prolonger l'activité biologique du glucagon, qui consiste à ioder le glucagon avec une quantité d'agent iodant suffisante pour produire un glucagon chimiquement 5 modifié ayant en moyenne jusqu'à environ 5 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon. 2. Procédé selon la revendication 1, qui consiste à produire un glucagon contenant d'environ 2 à environ 4 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon. 10 3. Procédé selon la revendication 2, qui consiste à ioder le glucagon par réaction avec une quantité de monochlorure d'iode appropriée. 4. Procédé selon la revendication 3, qui consiste à ioder le glucagon par réaction dans un milieu alcalin. 15 5. Procédé selon la revendication 4, qui consiste à ioder le glucagon par réaction à un pH d'environ 7,5 à environ 9,0. 6. Glucagon chimiquement modifié à activité biologique prolongée, caractérisé en ce qu'il comporte en moyenne jusqu'à environ 5 atomes-grammes d'iode par mole de glucagon.