Brevet FR2134433A1 — publié le 19721208

la présente invention concerne tui procédé de purification et de concentration de 11 inhibiteur de kallikréine et de trypsine en solutions impures. On connaît toute une série de procédés permettant .5 d ' extraire un inhibiteur de kallikréine et de trypsine d1 organes de "boeuf, par exemple les glandes parotides ou les poumons. l'attaque des organes .peut,par exemple,être effectuée avec des acides ou des solvants organiques miscibles à l'eau, de préférence avec le méthanol, avec addition de divers sels 10 de métaux alcalins ou alcalino-terreux (voir brevet français n° 1 290 131 et son premier certifical d'addition ïï° 80.105 ou les brevets belges N° 589 123 et N° 605 027. Pour parfaire la purification, on procède par précipitation de la substance active, par exemple à l'acétone [voir 15 brevet français n° 1 290 131 ou brevet belge n° 589 123 précités], au sulfate d'ammonium (NH^)gSO^ [("Biochem. J." 54. 257 (1953)]ou avec d'autres sels. On a fait connaître récemment quelques procédés.qui permettent de parfaire la purification de l'inhibiteur de kalli-20 kréine et de trypsine par chromâtographie sur colonne, les procédés que l'on utilise à cette fin sont la chromatographie sur DEAE-cellulose et la chromatographie sur CM-cellulose ["Collection Szech. Chem. Commun." 30, 1705 (1965) 5 "C.R. Acad. Se. Paris", 260, 3491 (1965)]. 25 l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine est fixé par les échangeurs ioniques acides en tant que polypeptide fortement basique. la Demanderesse vient de découvrir que la liaison de l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine à des échangeurs 30 ioniques amphotères à base de polystyrène est très solide et,en outre,très sélective . Ceci concerne en particulier les échangeurs ioniques amphotères à base de polystyrène, qui portent des groupes acide aminoacétique et/ou des groupes acide imino-diacétique. Cette fixation par adsorption sélective n'a pas 35 lieu dans le cas des impuretés renfermées par des solutions d'inhibiteurs de kallikréine et trypsine. le procédé conforme à l'invention convient donc pour purifier et concentrer l'inhi 72 14415 2 2134433 biteur de kallikréine et de trypsine dans ses solutions impures. Les solutions aqueuses de l'inhibiteur "brut sont chargées sur une colonne qui a été garnie d'échangeur ionique amphotère et équilibrée avec un tampon au phosphate. La matière 5 nonadsorbée est éliminée par lavage avec le tampon au phosphate ou une solution de sel. Ensuite, on effectue l'élution de la substance active avec un gradient de sel. Les fractions actives sont rassemblées et relarguées au moyen des procédés classiques, Les impuretés fortementjcolorées de même que la majeure par-10 tie des antigènes étrangers sont alors éliminées d'une façon simple. L'élution de l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine est effectuée à une concentration de chlorure de sodium de 0,25 M à des pH de 6,2 à 8,0, c'est-à-dire dans des conditions douces 15 qui ménagent l'inhibiteur. La coexistence de groupes basiques et acides dans l'échangeur ionique amphotère exerce donc une le influence favorable sur /processus d'elution de l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine. Il est surprenant de constater la grande capacité de l'échangeur ionique pour la liaison de la 20 substance active. Ce fait doit être attribué à la structure en partie macro-poreuse de l'échangeur ionique. Le procédé conforme à l'invention permet de préparer l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine, dont l'importance en tant que produit pharmaceutique est connue, avec une pureté particulière. 25 Exemple 1 La résine d'échange ionique amphotère est lavée avec de l'hydroxyde de sodium 1ÎT, de l'eau distillée, de l'acide chlorhydrique 0,5N et de l'eau distillée, puis chargée. Ensuite, on procède à l'équilibrage à un pH égal à 8,0 avec un tampon de 30 phosphates|de sodium et de potassium 0,01 M. On introduit^ dans une colonne (2,5 x 20 cm) 100 ml de l'échangeur ainsi préalablement traité. L'inhibiteur de kallikréine et de trypsine ad-sorbé sur du kieselguhr est extrait à l'eau, avec un degré de pureté d'environ 2000 unités d'inhibiteur de kallikréine 35 par mg. Cette solution est ajustée par addition alternée d'é- changeurs ioniques (forme H+ et forme 0H~) à une conductivité spé- _•] cifique de 0,12 mSxcm . On fait passer 670 ml de cette solution 72 14415 3 2134433 titrant 5100 imités d'inhibiteur de kallikréine/ml (activité totale : 3,4 x 10® unités d'inhibiteur de kallikréine) à une 2 vitesse de 1,15 ml/mn/cm sur la colonne. On lave cette dernière avec un tampon au phosphate 0,01 M et on l'élue avec un 5 gradient linéaire de 2 1 de tampon au phosphate 0,01 M (pH 8,0 et de 2 1 de tampon au phosphate 0,01 M (pH 8,0 + 1,0 M de 2 NaCl, à une vitesse de 0,35 ml/mn/cm . On rassemble les fractions actives, on les relargue avec des échangeurs ioniques et on lyophilise la solution. Le rendement atteint 87 i°, et 10 l'activité spécifique est de 6 030 unités d'inhibiteur de kallikréine/mg. Exemple 2 L'échangeur ionique amphotère est chargé comme décrit dans l'exemple 1 et équilibré avec im tampon au phosphate de 15 Na/K 0,01 M (pH 6,2 + de l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) 0,001 M. On charge 100 ml d'échangeur dans une colonne (2,5 x 20 cm). On fait passer sur la colonne 20 ml d'une solution d'inhibiteur préalablement purifiée,d'activité égale à 110 000 unités d'inhibiteur de kallikréine (UIK)/ml (activité r 20 totale 2,2 x 10 UIK) et de pureté égale à 4000 TJŒK/mg, à une vitesse de 0,35 ml/mn/cm . On lave la colonne avec un tampon au phosphate 0,01 M et on élue ensuite la substance active avec un gradient linéaire de 2 1 de tampon au phosphate 0,01 M (pH 6,2 + de l'acide éthylènediaminetétracétique 0,001 M et 25 2 1 de tampon au phosphate 0,01 M (pH 6,2 + 0,001 M d'acide éthylènediaminetétracétique f 1,0 M de chlorure de sodium. On rassemble les fractions actives, on les relargue avec des échangeurs ioniques et on lyophilise la solution. Le rendement s'élève à 86 $ et l'activité spécifique est de 5 000 TJIE/mg. 30 L'immuno-électrophoi-égramme présente une seule bande, à côté d'un antigène secondaire, tandis que la matière première présente une multitude de bandes. Exemple 3 La résine d'échange ionique amphotère est chargée comme 35 décrit dans l'exemple 1 et équilibrée avec un tampon au phosphate de Na/K 0,01 M (pH 8,0). On fait passer 1300 ml d'une solution brute d'inhibiteur , encore fortement colorée, titrant 72 14415 4 2134433 7 800 UlZ/ml activité totale : 10,1 x 10 ^ UIK) et dont le degré de pureté est égal à 2 400 UIK/nig, à -une vitesse de 0,35 ml/mn/cm , sur une colonne (2,5 x 20 cm) chargée de 100 ml d'échangeur ionique. Après le lavage avec un tampon au phos-5 phate 0,01 M, on procède à l'élution avec un gradient linéaire de ÏTaCl dans le tampon au phosphate. Les fractions actives sont rassemblées, relarguées avec des échangeurs ioniques, et la solution est lyophilisée. On obtient 1,58 g de substance solide ayant une activité spécifique de 5 500 UIK/mg (activité g 10 totale : 8,68 x 10 UIK), ce qui correspond à un rendement de 86 fo. Le produit obtenu est incolore et totalement débarrassé des antigènes étrangers. 72 14415 5 2134433 KBVEBDICATIOffS 1. Procédé de purification et de concentration de l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine à partir de ses solutions impures, caractérisé par le fait qu'on adsorbe des 5 solutions brutes de l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine sur une résine d'échange ionique amphotère à base de polystyrène, on élimine les substances non adsorbées par lavage avec des solutions tampons ou des solutions de sels, puis on élue l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine avec 10 un gradient de sels, on relargue les fractions actives rassemblées au moyen de procédés connus, et on lyophilise la solution. 2. Procédé suivant la revendication 1 , caractérisé par le fait qu'on effectue l'élution avec le gradient de sels 15 à des valeurs de pH de 6,0 à 10,0, de préférence de 6,2 à 8,0. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise des résines d'échange ionique amphotères à base de polystyrène, qui portent des restes acide 20 aminoacétique et/ou des restes acide iminodiacétique.