Brevet FR2132316A1 — publié le 19721117

' 2132316 L'inhibiteur de kallikréine et trypsine extrait d'organes de boeuf ( "Trasylol", marque déposée) est un polypeptide basique de poids moléculaire égal à 6500, dont la structure chimique a été établie. [F.A. Anderer et S. HSrnle, "Z. Ifaturforsch'.', par-» 5 tie b, 20 457 (1965) ; F.A. Anderer, "Z. Naturforsch", partie b, 20, 462 (1965) ; F.A. Anderer et S. Hornle, "J. Biolog. Chem." 241 1568 (1965)]. Il inhibe diverses protéases dont les plus importantes sont la kallikréine, la trypsine, la chymotrypsine et la plasmine. L'inhibiteur a trouvé de nombreuses applications 10 thérapeutiques, notamment sous la forme d'une préparation injectable [R. Gross et G. Kroneberg, "N'eue Aspekte der Trasylol-Therapie", F. K. Schattauer Verl.»;, Stuttgart 1965]. naturellement, à cette fin, sa pureté doit obéir à des conditions très strictes. Pour respecter ces conditions, on a 15 dû jusqu'à présent effectuer la purification de l'extrait brut en plusieurs étapes au moyen de réactifs spécifiques de précipitation tels que l'acide sulfosalicylique., l'acide métaphospho-rique, l'acide trichloracétique, en terminant par une cristallisation [brevet de la République Fédérale d'Allemagne 1° 954 284, 20 brevet français N° 1 290 131 ou brevet belge N° 589 123, brevet de la République Fédérale d'Allemagne F0 1 155 563, brevet français F0 1 395 949 ou brevet belge ,¥° 646 313j brevet français 11° 1 395 948 ou brevet belge ET0 64S 342- ^ F. Schultz, "Natuxwiss" 54;. 338 (1967)]» Entre ces opérations, plusieurs étapes de re-25 largage sont nécessaires et impliquent l'utilisation d'échangeurs ioniques. Pour simplifier ce relargage et "pour obtenir en même temps une concentration des extraits, on a expérimenté le procédé de G-ustafson ["R.L. Gustafson" (Rohm and Haas Company, Philadelphie), brevet français 1T° 1 463 729 ou brevet belge 30 F0 674 884] et le procédé de H.W. Blessing et P. LaRoche de Benneville (Rohm and Haas Company£ Philadelphie),(demande de brevet/ République Fédérale d'Allemagne misera l'inspection publique sous le N° 2 040 107), procédés qui décrivent la séparation de substances organiques dans des gammes hydrophobes, par exemple des 35 agents mouillants, des acides biliaires, la trypsine, des poly-peptides, etc, en solution aqueuse, sur des résines polystyrène poreuses. } 72 11457 2 2132316 ' On a constaté le fait surprenant qu'on peut non seulement absorber l'inhibiteur de kallikréine et trypsine sur des résines polystyrène poreuses particulières à grande surface interne à partir d'extraits bruts d'organes de boeuf, par exemple de poumon, 5 qui renferment de nombreux polypeptides et d'autres substances cellulaires, mais aussi qu'on peut ensuite les éluer sélectivement, à un haut degré. On peut ainsi obtenir en une seule étape non seulement une séparation et une concentration du polypeptide à partir d'une solution aqueuse diluée et une élimination de sels, 10 mais aussi une purification poussée et l'élimination des impuretés qui l'accompagnent./1,procédé peut être mis en oeuvre aussi bien sur des colonnes chromatographiques que par portions, dans des chaudières. Même en ce qui concerne le procédé du brevet français G C X *tï 6 S 15 F0 1 463 729 ou brevet belge ET0 674 884/et celui de la demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne mise à l'inspection publique sous le ET0 2 040 107» il est inattendu et très surprenant de constater qu'on parvient, au moyen du procédé conforme à l'invention, à concentrer sélectivement et séparer l'in-20 hibiteur de kallikréine et trypsine d'une solution qui contient de nombreux polypeptides différents. Des résines adsorbantes convenables comprennent des produits poreux de copolymérisation de styrène et de divinylbenzène du type décrit dans la demande de brevet de la République Fédé-25 raie d'Allemagne mise à l'inspection publique sous le F0 1 745 717. le paramètre de solubilité ô des matières "inertes utilisées pour produire la porosité se situe dans les limites indiquées dans le brevet français F0 1 463 729 précité, les données concernant les pores des résines conformes à l'invention ne se distinguent par 30 conséquent pas de celles des résines du brevet français F0 1 463 729 précité. le paramètre de solubilité ô est défini par la racine carrée du quotient de l'énergie de vaporisation ÀE par le volume molaire V du liquide correspondant j 35 à = (AE/V)1/2 le volume molaire V est défini de la façon suivante ; 72 11457 3 2132316 Y - moléculaire Densité 1*énergie de vaporisation AE peut être calculée à partir de la chaleur de vaporisation AH (enthalpie de vaporisation), qui 5 diffère de AE du travail R. T. nécessaire pour la variation de volume, c'est-à-dire AE = AH - RT (R = constante des gaz T = Température absolue en °K) 10 Les valeurs indiquées dans la littérature pour AH sont données pour une température déterminée de travail. Etant donné que la densité est également nécessaire pour le calcul de 6 , on doit utiliser la valeur de densité qui correspond à la température de travail définie ci-dessus. 15 Pour la mise en oeuvre du procédé, la nature de l'extrait brut est importante. Si l'organe, par exemple le poumon ou la glande parotide, est traité au moyen du procédé d'extraction au méthanol décrit dans le brevet français 1T0 1 290 131 précité, le méthanol étant ensuite totalement chassé de 1'extrait, ce 20 dernier peut être utilisé directement pour le procédé, après clarification. L'activité spécifique est de 70 à 90 unités d'inhibiteur de kallikréine par mg de poids sec-» Toutefois, si l'attaque est effectuée avec addition d'un acide carboxylique ou d'un acide minéral, l'adsorption de l'in-25 hibiteur sur la résine après la clarification est incomplète. Cependant, elle peut être améliorée par un traitement préalable approprié de l'extrait brut, par exemple par addition de sels tels que le sulfate d'ammonium, ou bien on effectue l'attaque directement en présence de sulfate d'ammonium. L'adsorption est 30 améliorée par une concentration croissante du sel, et on ne doit pas dépasser la limite supérieure correspondant à la concentration de précipitation commençante de l'inhibiteur. Pour le sulfate d'ammonium, la gamme la plus favorable est une saturation de 0,2-0,5 pour une valeur de pH de 1,0-2,5. 35 La nature de la résine a également son importance. On uti lise des produits poreux de polymérisation de styrène et de di-vinylbenzène qui sont vendus dans le commerce sous le nom de 72 11457 4 2132316 "Lewapol" (marque déposée de la firme Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen). Il convient,en particulier, d'utiliser des résines à grande surface interne pour le procédé (voir tableau). 5 TABLEAU Adsorption de l'inhibiteur de kallikréine et trypsine dans des solutions brutes de résines poreuses de polystyrène Type de Surface, Quantité adsorbée d8inhibiteur, 10 resine m2/g Unités d'inhibi- mg de subs- teur de kalli- tance pure kréine/ml de par ml de résine résine Ca 9221 330 30300 4,3 15 Ca 9255 150 21000 3,0 Do 18/65 115 23000 3,3 Do 8/60 70 3800 0,54 L8adsorption de 1'inhibiteur sur la résine a été effectuée avantageusement à partir de solutions acides à des pH égaux à 20 1-3. Dans la gamme neutre, l'adsorption est moins complète, et en milieu alcalin, bien que 18adsorption soit convenable, llélution réserve des difficultés. Lorsque l'adsorption de l'inhibiteur a été effectuée, la résine est lavée avec des solutions aqueuses. En plus de l'eau 25 pure, on utilise aussi, avantageusement, de l'acide chlorhydrique 0,01 M puis une solution 0,02 M du sel de sodium de l'acide éthylènediaminetétracétique. Ceci permet d'éliminer les impuretés. Pour séparer l'inhibiteur de la résine par élution, on uti-30 lise des solvants organiques qui sont miscibles à l'eau, par exemple le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone, etc. Si le procédé est mis en oeuvre sur une colonne, on peut obtenir par élution l'inhibiteur particulièrement pur, en faisant croître lentement la concentration du solvant organique et en recueillant 35 l'éluat par fractions. Naturellement, comme dans le procédé discontinu, une élution avec élévation progressive de la concentration du solvant organique est possible. 72 11457 5 2132316 la concentration à laquelle l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine est élué dépend de la nature du solvant. Si l'on utilise le méthanol, l'inhibiteur est élué entre 40 et 60 et dans le cas de l'isopropanol, la majeure partie est déjà éluée pour 5 une proportion de 20 fo. Des additions de solvant peuvent également modifier le comportement à la désorption. Ainsi, une addition d'ammoniac accélère l'élution, mais des constituants colorés sont entraînés en même temps. Une élution sans solvant organique par déplacement avec une autre substance, par exemple la tri-10 éthylamine, est également possible. L'inhibiteur de kallikréine et trypsine obtenu de cette façon est débarrassé dans une large mesure des autres polypeptides qui l'accompagnent et débarrassé des sels, comme on peut s1 en assurer par électrophorèse dans le polyacrylamide ou sur 15 des bandes d'acétylcellulose. L'activité spécifique est de 3000-4000 unités d'inhibiteur de kallikréine par mg de poids sec. Le rendement atteint 60-80 fo de la capacité inhibitrice de l'extrait brut pour une concentration d'un facteur 30-40. Exemple 1 20 On attaque 700 g de poumon de boeuf, débarrassé du tissu conjonctif et finement broyé, avec du méthanol en présence de chlorure de calcium, au moyen du procédé décrit dans le brevet français ET0 1 290 131 précité.On centrifuge la suspension .et on la concentre à 275 ml, sous vide?dans un évaporateur rotatif. 25 On doit éliminer totalement le méthanol. Le pH de là solution est ajusté à 1,5 par addition d'acide chlorhydrique 2ÎF ; ensuite, on centrifuge encore une fois. La liqueur surnageante contient 880 000 unités d'inhibiteur de kallikréine. Cette solution est chargée sur la colonne définie ci-après : B. 30 On introduit 50 g de résine polyester poreuse "Lewapol " 2 r Ca 9221) de surface spécifique égale à 330 m /g, dans du méthanol et on la lave jusqu'à ce que le méthanol soit pratiquement exempt de substances adsorbant la lumière ultraviolette (280 nm). On verse ensuite le méthanol par décantation et on le remplace 35 par de l'eau distillée bouillie. La suspension aqueuse de résine (environ 100 ml) est chargée dans une colonne de verre de 3 cm de diamètre et 30 cm de hauteur, jsans formation de bulles d'air, 72 11457 2132316 ' et lavée avec 200 ml d'eau. L'extrait brut contenant l'inhibiteur est chargé" sur la colonne à un débit de 100 ml/h. Ensuite, on lave la colonne avec 200 ml d'acide chlorhydrique 0,01 M puis avec 200 ml de sel de 5 sodium d'acide éthylènediaminetétracétique 0,02 M et 100 ml d'eau. On élue ensuite l'inhibiteur avec un gradient linéaire d'un litre d'eau pour un litre de méthanol à 80 $ et on recueille des fractions. On rassemble les fractions contenant l'inhibiteur, on chasse le méthanol par évaporation sous vide et on déshydrate 10 la solution aqueuse par congélation. On obtient 180 ml d'inhibiteur titrant 71-4 000 unités d'inhibiteur de kallikréine, c'est-à-dire 81 % de la capacité d'inhibition utilisée, inactivité spécifique est de 3960 unités d'inhibiteur de kallikréine par mg. 15 Exemple 2 On charge sous agitation 4 kg de poumon de boeuf broyé dans 7,2 litres d'eau distillée. Après agitation pendant 10 minutes, on ajoute 350 ml d'acide sulfurique à 10 $ (volume/volume), jusqu'à ce que le pH soit égal à 1,9. On complète à 12,0 litres, 20 on ajoute 200 ml de toluène et on agite à la température ambiante pendant environ 16 heures. On centrifuge la suspension pendant 10 minutes à 4800 tr/mn. L'activité totale dans la liqueur sur- g nageante est de 8,15 x 10 unités d'inhibiteur de kallikréine. Tout en agitant, on ajoute en 30 minutes du sulfate d'ammonium 25 jusqu'à un taux de saturation de 0,45. On ajuste le pH à 1,5 avec de l'acide sulfurique concentré, on ajoute 320 g de kieselguhr comme auxiliaire de filtration et on filtre immédiatement. On charge 7,0 litres de cette solution (activité totale de 4,38 x 10^ unités d'inhibiteur de kallikréine) sur une colon-30 ne contenant environ 2 litres de résine poreuse de polystyrène de surface spécifique égale à 150 m2/g ("Lewapol" ^ Ca 9255). On lave tout d'abord la colonne avec de l'acide chlorhydrique en solution méthanolique 1F, du méthanol et de l'eau. Après avoir chargé l'extrait, on lave la colonne avec 4 litres d'aci-35 de chlorhydrique 0,01 F, 4 litres de sel de sodium d'acide éthylènediaminetétracétique 0,02 M et' 2 litres d'eau distillée, puis on élue avec un gradient linéaire de 5 litres d'eau distillée et 72 11457 7 2132316 5 litres de méthanol à 80 fo. On rassemble les fractions actives, on chasse le méthanol par distillation sous vide et on lyophilise la solution. On obtient 1,3 g de substance ayant une activité spécifique de 2500 unités d'inhibiteur de kallikréine 5 par mg (activité totale de 3,22 z 10^ unités d'inhibiteur d.e kallikréine), ce qui correspond à un rendement de 73,5 Exemple 3 On attaque 120 kg de poumon de boeuf avec un mélange de méthanol/CaCl2,comme indiqué dans l'exemple 1. On chasse-le mé-10 thanol avec précaution des 400 litres de filtrat clair obtenu . La solution aqueuse contenant l'inhibiteur de kallikréine et trypsine sous la forme brute, est acidifiée avec de l'acide chlorhydrique à un pH de 1,5. et chargée sur une colonne de 8 litres de résine polystyrène poreuse de surface spécifique égale à 15 150 m2/g ("Lewapol " Ca 9255). L'activité totale est de g 152 x 10 unités d'inhibiteur de kallikréine. On lave la colonne avec 16 litres d'acide chlorhydrique 0,01 H, 16 litres d'acide éthylènediaminetétracétique 0,02 M et 10 litres d'eau distillée. Ensuite, on élue la substance active avec un gradient 20 linéaire de 20 litres d'eau distillée et 20 litres de méthanol à 80 fo. On rassemble les fractions qui contiennent la substance active, on chasse le méthanol par distillation et on lyophilise la solution. On obtient 25,7 g de substance .solide d'activité spécifique égale à 4200 unités d'inhibiteur de kallikréine par C 25 mg (activité totale de 108 x 10 unités d'inhibiteur de kallikréine), ce qui correspond à un rendement de 71 f°* ■ Exemple 4 On attaque 120 g de poumon de boeuf, comme indiqué dans l'exemple 1,avec un mélange de méthanol/chlorure de calcium, 30 et on obtient, après élimination du méthanol, réglage du pH à 1,5 et centrifugation, 67 ml de liqueur surnageante contenant 150 000 unités d'inhibiteur de kallikréine. On introduit dans cette solution brute de l'inhibiteur, ït sous agitation, 10 ml de résine polystyrène poreuse ("Lewapol " 2 35 Ca 9255 de surface spécifique égale à 150 m /g). Au bout de 30 minutes, on essore la résine au filtre-presse et on la lave avec 100 ml d'eau. Ensuite, on met la résine en suspension dans v 72 11457 2132316 ' une solution de 20 ml d'isopropanol, étendue à 100 ml avec de l'eau, et on agite pendant 30 minutes. On sépare la résine par filtration à la trompe et on détermine la quantité d'inhibiteur dans le filtrat après avoir chassé l'isopropanol par distillation sous vide. On obtient 123 000 unités d'inhibiteur de kallikréine, c'est-à-dire 82 $ de la capacité inhibitrice utilisée. 72 11457 9 2132316 JRB'VffNDICATIOIT Procédé pour concentrer et séparer l'inhibiteur de kallikréine et trypsine de solutions aqueuses qui contiennent cet inhibiteur, à llaide de substances adsorbantes et en effectuant ensuite une désorption, procédé caractérisé par le fait qu'on utilise comme adsorbant des particules de produits de polymérisation non ionogènes, réticulés, insolubles dans lleau, à structure poreuse, à base de styrène et de divinylbenzène, ayant une O surface active de 10 à 1000 m /g.