Brevet FR2130412A1 — publié le 19721103

L'invention concerne la prévention des caries dentaires et des compositions utilisables dans ce but. Elle concerne plus particulièrement la fourniture d'un vaccin utilisable pour immuniser contre la carie dentaire, des procédés de préparation 5 du vaccin et des méthodes d'immunisation. Elle concerne plus précisément la formation d'un vaccin à partir du microorganisme cariogène Streptococcus SS2, et son utilisation pour l'immunisation contre les caries. Il a été indiqué, au cours de la dernière décade, que 10 la formation dans les dents de caries résulte d'une inter-réac-tion entre les hydrates de carbone, notamment le saccharose, et des bactéries spécifiques à la surface de la dent. On a découvert que divers organismes spécifiques étaient des agents étio-logiques de cette maladie infectieuse, parmi lesquels en parti-15 culier les Streptococci. On a isolé divers Streptococci de la cavité buccale, et on a trouvé que ceux-ci provoquaient des caries dentaires chez des animaux d'expériences. Au cours de l'expérimentation dans ce domaine, plusieurs tentatives ont été faites pour fournir une technique immunolo-20 gique contre la formation de caries dentaires, mais on n'a pas encore trouvé de méthode appropriée. Par exemple, M. Wagner a signalé dans sa thèse de Philosophiae Doctor, en 1966, à l'université de Purdue, l'immunisation de rats exempts de germes contre la carie dentaire en utilisant un vaccin préparé à partir 25 d'une souche de Streptococcus faecalis. En 1960, W.H. Bowen a indiqué (J. Br. Dent. Res., vol. 126, p. 159-160), que l'utilisation d'un organisme cariogène produisant du dextrane sous la forme de cellules viables entières immunisait des singes contre les caries dentaires. L'organisme utilisé était une souche de 30 Streptococcus mutans, une des deux bactéries généralement considérées comme étant les agents responsables de la formation de caries dentaires. L'autre organisme est une souche de Streptococcus caractérisée en général comme étant Streptococcus souche SS2, isolé par Gibbons et Banghart et qui a fait l'objet d'un 35 exposé dans Archives of Oral Biology, 1367, volume 12, pages 11 à 24. Cet organisme est fourni par de nombreux laboratoires dans tous les Etats-Unis d'Amérique, en particulier par le Forsyth Dental Center, à Boston (Massachusetts) et il est facile de l'isoler de la cavité buccale, en particulier des caries dentaires, 40 en utilisant des techniques classiques. 72 09476 t- • 2130412 Streptococcus mutans et Streptococcus souche SS2 sont des organismes qui sont nettement différents l'un de l'autre. Une de leurs différences réside dans le comportement physiologique de l'organisme en présence de saccharose. Streptococcus 5 mutans et Streptococcus souche SS2 produisent tous deux un poly-saccharide extra cellulaire collant analogue à une gomme lorsqu'on les cultive en présence de saccharose. Cependant, les polysaccharides produits ne sont pas les mêmes pour chacun des deux organismes, en dépit du fait que l'on pense en général 10 qu'ils sont réellement impliqués dans la formation de la plaque qui donne le départ aux caries. Streptococcus mutans élabore principalement un polysaccharide de type dextrane, tandis que Streptococcus souche SS2 élabore principalement un polysaccharide de type levâne. 15 La présente invention est basée sur la découverte que le polysaccharide du type levane produit par Streptococcus souche SS2 possède de puissantes propriétés d'immunisation contre la formation des caries dentaires. Elle concerne donc l'utilisation d'un microorganisme producteur de levane pour la pré-20 paration d'un vaccin et dans des procédures d'immunisation. On pense que l'introduction du produit à base de levane dans l'hôte provoque la formation d'anticorps contre l'organisme étiologique Streptococcus et conduit à une diminution de l'incidence des caries par rapport à celles produites lorsqu'on n'utilise pas 25 la procédure d'immunisation. Le mécanisme exact par lequel les anticorps inactivent l'organisme n'est pas complètement compris. On note cependant une amélioration importante de l'action sur la cariogénèse lorsqu'on se conforme au concept de l'invention, quelque soit le mécanisme particulier que l'on estime intervenir. 30 Conformément à l'invention, on cultive une souche de Streptococcus productrice de levane, de préférence Streptococcus souche SS2 pour permettre la formation de polysaccharide levane extracellulaire. Ceci est obtenu en cultivant l'organisme en anaérobie dans un milieu nutritif contenant du saccharose pendant 35 un temps suffisant pour permettre une accumulation extracellulaire du polysaccharide levane comme il est décrit ci-dessous. Comme milieu de culture du microorganisme, on utilise un milieu contenant du saccharose comme source de carbone. Les autres sources de carbone sont de préférence réduites au mini-40 mum. La quantité de saccharose présente va avantageusement de 2 72 09476 2 130412 à 16, et de préférence de 5 à Qfa en poids par rapport au milieu entier. Le milieu contient en outre une source appropriée d'azote. Par exemple, il peut contenir une source d'azote naturelle comme la peptone, un extrait de viande, un extrait de levure, un bouil-5 Ion de soja, etc.. On jjeut aussi utiliser des sources d'azote minéral comme le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium etc... De plus, des sels minéraux comme des phosphates, des sels de magnésium comme du sulfate de magnésium, des ions métalliques comme le fer, le sodium, le potassium, le 10 manganèse, le zinc, le calcium, etc.., et des anions comme des chlorures et des nitrates peuvent être présents en quantités appropriées. Si nécessaire, on utilise toute autre substance nutritive exigée pour la croissance des Streptococci. La culture s'effectue dans des conditions anaérobies 15 en utilisant des procédés classiques. La température de culture est de 35 à 38°G, de préférence 37°C, et le pH de culture est de 6,8 à 7,4, de préférence 7,0 à 7,2. Le temps de culture est habituellement de 12 à 72 heures, et de préférence de 24 à 48 heures, temps au cours duquel il se forme une quantité suffisante 20 de polysaccharide levane extracellulaire dans le milieu de culture . Pour la préparation du vaccin de l'invention, le po iy-saccharide levane peut être fourni sous la forme de la liqueur de culture elle-même, de préférence après élimination des cellu-25 les, mais on peut utiliser les cellules tuées elles-même. On préfère cependant isoler et récupérer le produit à base de levane sous une forme relativement pure pour l'utilisation comme principe actif dans le vaccin. Par exemple, on peut récupérer le polysaccharide levane du milieu de culture de n'importe quelle 30 manière comme dans la technique. Un procédé particulièrement approprié consiste à précipiter le levane des liqueurs-mères exemptes de cellules du milieu de culture en leur ajoutant un alcanol comme l'éthanol. D'ordinaire, il convient d'utiliser 1,5 à 2 volumes d'éthanol. A ce moment, il est souhaitable, quoique non 35 nécessaire, d'éliminer la fraction de faible masse moléculaire du polysaccharide. Ceci peut être réalisé par dialyse ou par tout autre nrocén.é approprié. De ce point de vue, 1>: levane a normalement une p;amme de masses moléculaires allant ie 16 à 2 3 millions, dont environ 0,25:,« à 0,5'^ da/.s la ^amme des masses molé-40 culaires les plus basses, de 2000 à 500C. C'est cette fraction 7 2 0 V 4/o 2130412 qu'il est souhaitable d'éliminer par dialyse. Puis on traite de préférence le polysaccharide pour en éliminer toute protéine résiduelle. Ceci peut aussi s'effectuer par n'importe quel procédé approprié connu dans la technique, 5 mais on a trouvé particulièrement avantageux d'utiliser la méthode de Sevag et al. Journal of Biological Chemistry, vol. 124, p. 425 - 435, 1938. Ce procédé consiste à utiliser du chloroforme et du butanol ou un alcanol comme 1'isopropanol, l'hexanol etc.. pour 10 dissoudre la protéine. On peut ensuite reprécipiter le levane ainsi purifié avec, par exemple, un supplément d'éthanol, le laver et le sécher. Il est alors prêt pour la préparation du vaccin de l'invention. le levane préparé conformément au mode de réalisation 15 préféré de l'invention, c'est-à-dire dont le produit de masse moléculaire inférieur est séparé du produit de masse moléculaire supérieur, et dont le produit ayant la masse moléculaire la plus élevée est déprotéinisé, est éminemment utilisable comme produit de vaccination. Bien que ce produit n'ait pas été caractérisé du 20 point de vue de la formule structurale, il a été caractérisé du point de vue de son pouvoir d'absorption des infra-rouges, et de sa composition chimique globale. Il possède des pics caractéristiques à 920 cm"'', 875 cm"'' et 805 cm~^ . Lorsque le levane est hydrolysé par un acide, l'hydro-25 lysat présente -seulement le fructose comme monomère à l'analyse chromatographique. En outre, le levane de l'invention possède les caractéristiques suivantes : viscosité intrinsèque à 25°C 0,15 à 0,16 pouvoir rotatoire ZX7d° 450 à 540 30 hexose total 98,4 "fa azote protéinique moins de 0,5$ Les vaccins de la présente invention sont liquides, ce sont de préférence des solutions ou des émulsions aqueuses contenant de 0,1 à 1, et de préférence de 0,4 à 0,6 gramme de levane 35 par litre de liquide, les quantités de levane étant relatives à la forme purifiée. Le véhicule liquide est de préférence du sérum physiologique stérile, et mieux encore modifié par des adjuvants tels que l'adjuvant de Preund ou un adjuvant analogue, auquel cas on obtient des émulsions. Si on utilise l'adjuvant de Preund, 40 celui-ci est avantageusement dans le rapport de un sur un. Comme 72 09476 5. 2130412 10 15 20 25 30 35 sels isotoniques, on peut utiliser les sels normaux servant à préparer des solutions salines, comme les chlorures de sodium ou de potassium. Comme il a été indiqué ci-dessus, au lieu du levane purifié ou non purifié, on peut utiliser des cellules tuées du Streptococcus souche 3S2. Les cellules tuées au formol, c'est-à- dire les cellules formolées, conviennent particulièrement. Il est également commode d'utiliser l'adjuvant de Preund quelle que soit la source particulière de levane. Lorsqu'on utilise des cellules tuées, il faut utiliser suffisamment de cellules pour avoir une quantité de levane dans les gammes indiquées ci-dessus. En géné- 7 7 ral, ceci correspondra à 0,5.10 - 4.10, et de préférence à 7 7 1.10 - 2.10 cellules par millilitre de solution. On peut en utiliser des quantités plus faibles lors de l'administration de doses de rappel après la première inoculation. De même si on utilise du levane non purifié, la quantité de celui-ci qui est utilisé doit être suffisante pour fournir une quantité efficace du produit sur la base de la quantité de produit pur telle qu'indiquée par les gammes ci-dessus. On peut administrer les vaccins de l'invention par n'importe quelle technique normalement utilisée, par exemple par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, etc.. Il convient d'utiliser des doses de 1 à 20 microgrammes, et de préférence de 5 à 10 microgrammes de levane par kilogramme de poids corporel. On peut administrer des doses de rappel de temps à autre si nécessaire. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE 1 Nombre inoculation de Streptococcus 40 régime réduction cario- de la flo-gène re par an- tibiotiques Groupe I 10 Mitchell non non Groupe II 10 Mitchell oui oui Groupe III 10 Mitchell oui oui On répartit en trois groupes équilibrés trente hamsters dorés nouvellement sevrés et de la même portée, provenant de la colonie du National Institute of Health. Dans tous les cas, les animaux reçoivent le régime cariogène de Mitchell et de l'eau immunisation par cellules de Strep. formolées non non oui 72 09476 6. 2130412 désionisée. Le Groupe I, groupe témoin, reçoit seulement le régime de Mitchell. Au sevrage, on réduit la flore normale gram-positive des hamsters des groupes II et III en incorporant 100 unités de 5 pénicilline par gramme de régime de Mitchell, pendant une période de quatre jours consécutifs. Au cinquième jour, on arrête l'administration de l'antibiotique et on inocule les animaux des groupes II et III, dans la région de la poche juguale avec 0,1 millilitre d'une culture de 18 heures d'un mutant résistant à la 10 streptomycine de Streptococcus souche SS2 formateur de levane. C'est uniquement pour des raisons expérimentales que l'on utilise une souche résistant à la streptomycine, c'est-à-dire pour permettre une vérification ultérieure de la procédure d'inoculation en recueillant les organismes sur Mitus Salivarius streptomycine 15 agar. Le Streptococcus souche SS2 utilisé ici a été fourni par le Dr. R.J. Gibbons du Forsyth Dental Center, à Boston, Massachussets. Il est déposé à 1'American type Culture Collection Rockville, Maryland, et porte le numéro d'entrée à l'ATCC 27006. 20 On maintient l'organisme sur un bouillon de soja à la trypticase sans dextrose des Baltimore Biological Laboratories (BBL) additionné de 0,5% de saccharose à 37°C à un pH de 7,2. On autoclave le saccharose séparément et l'ajoute aseptiquement au milieu. On fait croître l'organisme en anaérobie dans un bocal 25 anaérobie BBL, dans une atmosphère de 90% d'hydrogène et 10% de gaz carbonique à 37°C. Le jour même de l'inoculation, on immunise les animaux du Groupe III par une injection intrapéritonéale de 0,5 millilitres d'un vaccin constitué de cellules tuées au formol dans 30 l'adjuvant de Freund complet, dans un rapport de un sur un. Cette n injection équivaut à l'administration de 1x10 organismes. Le vaccin pour l'immunisation est préparé comme suit : on laisse les organismes croître en anaérobie pendant 18 heures sur un milieu de bouillon de soja à la trypticase contenant 0,5 pour cent de 35 saccharose et 100 ^ug par millilitre de streptomycine. On soumet la suspension de cellules lavée par du sérum physiologique à un traitement sonique pour rompre les chaines. Cette désintégration effectuée avant de tuer les cellules, est réalisée au moyen d'un appareil sonique Raythéon à 0,65 amp. pendant 5 minutes. On aiup-40 te la suspension avec du sérum physiologique pour avoir une den 72 09476 7. 2130412 sité optique de 0,22 à 610 millimicrons avec un colorimstre Bausch et Lomb. On met ensuite en suspension les cellules dans du formol à 0,6% pendant une nuit de façon à les tuer efficacement . 5 On effectue quatre injections supplémentaires à des in tervalles d'environ deux semaines, avec des concentrations décroissantes en organismes forriolés (de 1.10^ à 2.104) dans les adjuvants. Au bout d'une période de 12 semaines, on sacrifie les animaux et on recueille des échantillons de salive et de sérum 10 de chaque groupe pour le titrage des anticorps. On compare l'anticorps pour le sérum et la salive à un extrait dans le sérum physiologique de Streptococcus souche SS2 et de levane obtenu à partir de celui-ci, et ceci montre qu'on obtient une réponse adéquate à l'anticorps dans le sérum et la salive dans le groupe 15 d'animaux immunisé. On enlève ensuite la chair des têtes des animaux par la méthode bien connue de Russel, et on les note du point de vue des caries dentaires par une méthode de Keyes modifiée. On utilise les seconde et troisième molaires maxillaires dans la pro-20 cédure de notation des caries. Un animal du Groupe I, le groupe témoin, et deux animaux du Groupe II sont morts au cours de l'étude pour des raisons sans rapports avec les procédures expérimentales. Les numérations des caries dentaires sont données ci-dessous. 25 Notation moyenne des caries Groupe I 26,89 Groupe II 37,66 Groupe III 12,18 30 On peut voir d'après les résultats ci-dessus que le procédé de l'invention est éminemment efficace pour réduire l'incidence des caries dentaires. Les animaux du Groupe II, inoculés avec le microorganisne cariogène, présentent une augmentation de "olus de 40 % de l'incidence des caries par rapport 35 au groupe témoin (Groupe I) n'ayant pas reçu de r.icroorganisme cariogène. Les deux groupes, ainsi que le groupe III, étaient à des régimes cariogènes. Le groupe traité, immunisé (Groupe III) présente par contre une réduction de plus de 67'^ de l'incidence des caries 40 dentaires par rapport au Groupe II, démontrant ainsi que la pro- Yariation + 40,05 % - 67,66 % 72 0 v 4 /1> 2130412 cédure d'immunisation est extrêmement efficace. Du point, de vue statistique, les résultats ci-dessus sont significatifs au niveau de confiance de 99 f°. EXEMPLE 2 5 Préparation de levane On cultive en anaérobie Streptococcus souche SS2 dans un bouillon de soja à la trypticase sans dextrose (Baltimore Biological Laboratories - BBL) additionnée de 8 % de saccharose, pendant 48 heures, dans une atmosphère de 90 % d'hydrogène et 10 de 10 % de gaz carbonique à une température de 37°C et à un pH de 7,2. On centrifuge ensuite les organismes à 10.000 tours/ minute dans une centrifugeuse réfrigérée Sorvall pendant 10 minutes avec une tête SS-34. On précipite le polysaccharide levane du liquide surnageant par 2,5 volumes d'éthanol à 95 %. On re-15 dissout dans de l'eau la gomme précipitée, puis on la déprotéi-nise plusieurs fois par addition de 0,25 volume de chloroforme et 0,1 volume d'alcool amylique à la solution de polysaccharide. On agite le mélange pendant 15 minutes. On dialyse la couche aqueuse contenant le polysaccharide levane contre de l'eau dis-20 tillée pendant 24 heures pour éliminer les fractions de faible masse moléculaire. On reprécipite le polysaccharide levane de la couche aqueuse par addition d'éthanol et le transforme en une suspension de fine poudre. On recueille le levane maintenant purifié sur un 25 entonnoir de Buchner, sur un papier filtre lavé à l'acide (Whatman 52), on le lave à l'éthanol absolu, à l'acétone et à l'éther de pétrole, et le transfère immédiatement dans un dessi-cateur. EXEMPLE 3 30 On suit le mode opératoire de l'exemple 1, excepté que les animaux du groupe III, au lieu d'être vaccinés avec le Streptococcus souche SS2 formolé, sont immunisés par 0,5 millilitre d'une solution contenant 500 microgrammes de levane par millilitre de solution saline dans l'adjuvant de Preund dans un 35 rapport un sur un. Le levane utilisé est préparé conformément au mode opératoire décrit dans l'exemple 2 ci-dessus. Après la première inoculation du vaccin au levane, on effectue quatre injections supplémentaires à des intervalles de deux semaines à partir de la première injection en utilisant 0,5 millilitre de 40 la solution de levane utilisée pour la première inoculation. % 72 09476 9. 2130412 On note ensuite l'étendue des caries dentaires produites dans ce groupe par rapport à celle des deux groupes de l'exemple 1, et la compare en suivant le mode opératoire indiqué dans l'exemple 1. Du fait de l'immunisation, la notation des caries den-5 taires pour le Groupe III est la suivante : Notation moyenne des caries Variation $ Groupe III 11,2 - 70% On voit par ce qui précède que les animaux du Groupe III immunisés par du levane pur présentent une diminution de 70 % 10 de l'incidence des caries par rapport aux animaux du Groupe II dont il a été question dans l'exemple 1. Ceci démontre que l'immunisation a bien été très efficace. Les résultats ci-dessus sont significatifs du point de vue statistique au niveau de confiance de 99 15 72 0947b 2130412 REVENDICATIONS 1.- Vaccin pour l'immunisation contre les caries dentaires, caractérisé en ce qu'il contient, dans un véhicule liquide, 5 un polysaccharide levane provenant de la culture anaérobie d'une souche productrice de levane du genre Streptococcus. 2.- Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ce véhicule est un véhicule salin aqueux. 3.- Vaccin suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé 10 en ce que la souche de Streptococcus est le Streptococcus souche SS2. 4.- Vaccin suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le levane est fourni sous la forme de cellules de Streptococcus souche S52 tuées. 15 5.- Vaccin suivant la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le levane a une gamme de masse moléculaire allant de 16 à 23 millions. 6.- Vaccin suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le levane est présent en solution à la concentration de 0,1 20 à 1 gramme par litre de solution. 7.- Vaccin suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le levane est présent en solution à la dose de 0,4 à 0,6 gramme par litre de solution. 8.- Vaccin suivant l'une quelconque des revendications 3 25 à 7, caractérisé en ce que le levane présente des pics caracté- —1 —1 ristiques d'absorption des infra-rouges à 920 cm , 875 cm et — 1 805 cm , une viscosité intrinsèque à 25°C de 0,15 à 0,16, et un pouvoir rotatoire de 43° à 54° 9.- Vaccin suivant l'une quelconque des revendications 30 3 à 8, caractérisé en ce que le levane est préparé en cultivant Streptococcus souche SS2 en anaérobie en présence de saccharose à une température de 35 à 38°C et à un pH de 6,8 à 7,4. 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