Brevet FR2122560A1 — publié le 19720901

i 2122560 La présente invention concerne un vaccin pour l'immunisation des équidés contre la gourme et un procédé de sa préparation et de son utilisation. La gourme est une maladie très contagieuse des chevaux 5 provoquée par Streptococcus equi. Bien que le taux de mortalité soit faible, de l'ordre de 2 $>, cette maladie est gênante et débilitante et atteint des groupes importants de chevaux lors- . qu'ils sont réunis sur les pistes de course, dans les concours hippiques, les ventes, et similaires. Les signes cliniques de 10 la maladie sont une élévation de la température à 40-4l°C, une augmentation du rythme respiratoire, de la dépression, de l'anorexie, une inflammation de la muqueuse nasale, un catarrhe nasal, un gonflement des ganglions lymphatiques, la formation d'abcès et autres symptômes. L'organisme causal S.equi est très résis-15 tant et peut survivre de nombreux mois dans les écuries et les autres locaux où séjournent les chevaux. Les jeunes chevaux sont plus sensibles à l'infection, sans doute car les animaux plus âgés ont été au contact de la maladie et ont développé une immunité qui est prolongée et très efficace. 20 Lorsqu'une souche virulente de S.equi apparaît dans un groupe de chevaux non immunisés, il est très difficile d'empêcher sa propagation. On dispose de vaccins efficaces contre S.equi possédant des propriétés immunisantes satisfaisantes. Cependant, les vaccins du commerce sont des suspensions de 25 S.equi qui contiennent des protéines étrangères et des fractions hydrocarbonées d'origine cellulaire et extracellulaire qui provoquent de nombreuses réactions secondaires telles qu'un purpura, un oedème au point d'injection, une raideur articulaire, un gonflement ganglionnaire passager avec jetage, et des réactions j50 qui se traduisent souvent par une perte de l'appétit, une faiblesse, une mauvaise condition physique et des symptômes atténués de la maladie. S.equi fait partie des streptocoques du groupe C, qui est constitué de souches possédant en commun un polysaccharide 35 antigénique spécifique du groupe. Les souches de S.equi ne fermentent pas le lactose, le sorbitol ni le tréhalose. Les colonies sont généralement mucoîdes et lisses et n'ont pas l'aspect mat des autres streptocoques qui produisent un antigène protéique M. 72 01934 2 2122560 La présente invention repose sur la découverte d'un antigène très efficace provoquant, lorsqu'on l'injecte au cheval, la formation d'anticorps contre S.equi très efficaces qu'on peut extraire de cultures de S,equi. L'antigène sur lequel repose i 5 le nouveau vaccin de l'invention se trouve à la surface cellulaire des bactéries et il n'est présent avfec le polysaccharide antigénique spécifique du groupe que par coïncidence» Sa nature est protéique, et il est détruit par les protéases qui se développent également dans la culture de S.equi, et par conséquent, lors 10 de la culture de S.equi et lors de l'extraction, on utilise des techniques diminuant la destruction de l'antigène protéique par ôes protéases. La production de protéases par les streptocoques est favorisée par des conditions réductrices dans le milieu de cul-15 ture, et par conséquent, on doit cultiver S.equi en conditions aérobies. On peut utiliser des flacons agités pour la production de petites quantités, mais pour préparer des quantités importantes de culture, par'exemple, dans des cuves, on doit aérer le milieu. La nature de la peptone dans le milieu a un effet sur la pro-20 duction de protéases. Par exemple, la peptone Pfanstiehl et les protéose-pepto^es favorisent la production de protéases et doivent dont êtî*e évitées. La néopeptone ne provoque qu'une concentration minimale de protéases. L'extrait de levure favorise la croissance de S.equi, sans augmenter la production de protéases. 25 En réglant la température et' la concentration en hydrogène du milieu, on peut également inhiber la formation de protéases. Certains agents chimiques tels que le formaldéhyde, l'acide iodoacétique et la P-propiolactone détruisent les protéases et tuent les cultures, et on peut donc les utiliser pour j50 arrêter le développement des protéases qui, sinon, détruiraient l'antigène à leur contact. Le chauffage du milieu de culture pendant quelques minutes détruit également les bactéries et la protéase sans endommager l'antigène. Comme la protéase se trouve dans la totalité du milieu de culture^ il est souhaitable de 35 séparer ce liquide des cellules bactériennes,dès que l'obtention optimale de l'antigène a été obtenue dans les cellules. Ceci peut être réalisé par centrifugation,. Si 6n réalise l'extraction acide de l'antigène de cellules de S.equi fraîchement cultivées, 72 01934 3 2122560 immédiatement après que la culture a atteint son pouvoir antigé-nique maximum, il est inutile de tuer les cellules et de détruire lesi protéases ou leurs précurseurs dans le milieu, avant de procéder à l'extraction. 5 On peut extraire l'antigène de la matière cellulaire selon diverses techniques, mais on préfère l'extraire en chauffant à pH 2,0 avec de l'acide chlorhydrique pendant 10 minutes, comme dans l'exemple ci-après. On peut bien entendu utiliser d'autres acides ne dénaturant pas les antigènes protéiques. La concentra-10 tion en ions hydrogène peut être comprise entre environ 1,5 et 6,0 ; aux pH élevés, la durée d'extraction est plus longue. Il est également.possible d'extraire l'antigène d'autres façons. Par exemple, on peut broyer les cellules bactériennes dans un broyeur à billes et les extraire par des solutions tamponnées 15 à pH 6-11, à 3T°C. Des vibrations ultrasonores facilitent la libération de l'antigène à la surface cellulaire des bactéries correspondantes. On peut utiliser l'action enzymatique d'une lysine apportée par des bactériophages pour obtenir des préparations d'antigène avec un rendement satisfaisant. 20 Bien qu'on puisse utiliser l'antigène comme vaccin, tel qu'il a été obtenu par extraction acide et neutralisation, après centrifugatlon pour éliminer les particules en suspension, on peut le purifier encore si on le désire, par adsorption chro- • matographique sur colonne, précipitation au sulfate d'ammonium, 25 électrolyse de zone et autres techniques connues. On préfère en pratique, utiliser le vaccin associé à du gel d'hydroxyde d'aluminium comme décrit ci-après. On peut utiliser d'autres additifs tels que le phosphate d'aluminium avec l'antigène pour réaliser des préparations de vaccin convenant à l'emploi. 30 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'un exemple de réalisation. Exemple On prépare un bouillon de Todd-Hewitt contenant les 35 ingrédients suivants par litre d'eau distillée. Infusion de coeur de boeuf correspondant à 500 g. Néopeptone 20 g. Glucose 10g. 72 01934 2122560 Chlorure de sodium 2 g. Phosphate disodique 0,4 g. Carbonate de sodium 2,5 g. Extrait de levure (déshydraté) 30 g. 5 On ensemence le milieu avec une culture de S.equi obtenue à partir d'un abcès de l'encolure d'un cheval présentant des symptômes caractéristiques de la gourme et qu'on identifie comme étant S.equi, On cultive pendant 4 à 20 heures à 37°C à un pH compris entre 7,8 et 6,3 dans des flacons agités, bouchés 10 au coton pour permettre l'aération. Lorsqu'on recueille les cultures, on vérifie la présence de grandes capsules entourant les cellules de S.equi ainsi que la pureté. Il n'est pas cependant nécessaire que les bactéries' aient des capsule^ car l'antigène n'est pas dans la capsule. On peut détruire la capsule ou l'éli-15 miner avant l'extraction de l'antigène. Le développement approprié de la culture peut être mis en évidence à l'oeil nu par un technicien expérimenté. On obtient régulièrement de bonnes cultures en 6 heures à 37°C. en utilisant 5 à 10 % d'inoculum. Une telle culture fournit 2,5 g de cellules humides par litre. 20 Immédiatement après les avoir recueillies, on tue les cultures en ajoutant de la P-propiolactone qui abaisse le pH à 4,5. On centrifuge alors les cellules dans le milieu de culture et on les congèle. On remet la pâte de culture ainsi obtenue en suspension dans une solution saline à raison de 5 g de pâte 25 humide pour 50 ml de solution saline. On ajuste le pH de la suspension à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 1 N et on chauffe à 90-95°C au bain-marie bouillant pendant 10 minutes en agitant. Une seconde extraction avec moitié moins de solution saline fournit une quantité additionnelle d'antigène. On refroidit 30 la solution et on ajuste le pH à 7,4 + 0,1 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N et on centrifuge. On rejette le sédiment. On ajuste la concentration en ions nydrogène du liquide surnageant contenant l'antigène à pH 6 avec de l'acide chlorhydrique 1 N et on porte le volume à 100 ml avec de la solution saline. On 35 ajoute du gel d'hydroxyde d'aluminium pour obtenir une concentration de 20 % et du merthiolate comme conservateur à la concentration de 1/10 000. Ce produit constitue la vaccin de 1'invention. 72 01934 2122560 Pour prouver l'efficacité du vaccin préparé comme il vient d'être décrit, on divise 20 chevaux en bonne santé, susceptibles d'être infectés par le S.equi virulent,en.quatre groupes de cinq. Les chevaux d'un de ces-groupes servent de 5 témoins. On prélève le sang de tous les chevaux avant la première inoculation pour mettre en évidence l'absence d'anticorps anti S.equi. On inocule par voie intramusculaire chacun des chevaux d'un groupe de 5^avec 2 ml d'une suspension cellulaire totale 10 de S.equi préparée comme suit : On prépare une suspension cellulaire de Siequi virulent en cultivant en aérobiose la bactérie dans le bouillon de Todd-Hewitt modifié précédemment indiqué. On traite la suspension cellulaire par de la 3-propiolactone pour obtenir un-pH d'environ 15 4,5 et on ajoute 1/10 000 de merthiolate, on centrifuge et on réalise une pâte de streptocoques comme dans la préparation du vaccin de 1'invention, mais sans réaliser l'extraction acide à chaud, en obtenant une concentration finale de 50 mg par dose de 2 ml. On inocule par voie intramusculaire cinq chevaux, cha-20 cun avec ^ ml de cette suspension cellulaire totale*trois fois à sept jours d'intervalle. On inocule par voie intramusculaire un second groupe de cinq chevaux, avec 10 ml d'un vaccin anti S.equi du commerce à 7 jours d'intervalle. 25 On inocule au troisième groupe de chevaux, par voie intramusculaire, 2 ml d'antigène obtenu par extraction acide et adsorbé sur hydroxyde d'aluminium précédemment décrit, à 7 jours d'intervalle. On maintient les 20 chevaux des quatre groupes dans 30 une installation de ferme isolée-, à l'abri de l'infection par S.equi. On les infecte par voie nasale avec une cul'tUre de 12 heures d'une combinaison de deux souches de S.equi virulent. Après cette infection, on constate que quatre des cinq sujets du groupe témoin présentent, à des degrés divers, 35 une élévation de température, un gonflement latéral ou bilatéral des ganglions lymphatiques, et .un jetage muco-purulent bilatéral. Ce groupe présente les symptômes et les lésions caractéristiques de l'infection par Streptococcus equi. 72 01934 tl , 2122560 Quatre des cinq, sujets du groupe auquel on a administré la suspension cellulaire totale présentent une température élevée un jetage muco-purulent et un gonflement ganglionnaire. La protection de ce groupe vis-à-vis du produit pathogène administré 5 est donc insuffisante. • Quatre sur cinq des sujets du groupe inoculé par un vaccin du commerce présentent des symptômes caractéristiques de la gourme après infection. On observe dans ce groupe un jetage mueo-purulent, une perte de l'appétit, et une élévation nette 10 de la température. Un seul des sujets de ce groupe de cinq reste normal après infection. Il n'existe pas d'explication de la mau-, vaise efficacité de ce vaccin du commerce. Enfin, le groupe auquel on a administré l'antigène selon l'invention reste pratiquement en bonne santé-pendant 15 l'expérience. Un sujet présente un jetage passager. Après la première inoculation, on observe un certain gonflement- musculaire. Cependant, un autre lot de vaccin de l'invention utilisé dans une inoculation ultérieure ne provoque pas de gonflement. Bien que dans les vaccinations qui viennent d'être dé-20 crites, on ait inoculé les chevaux à trois occasions différentes avec 2 ml de l'antigène obtenu par extraction acide et adsorbé sur hydroxyde d'aluminium, il est évident à l'homme de l'art qu'on peut modifier quelque peu les protocoles de vaccination. Par exemple, on peut vacciner les chevaux avec 2 ml d'un vaccin con-25 tenant l'antigène extrait de 5 g de cellules de S.équi centrifugées pour 120 ml de vaccin, et répéter cette vaccination, trois fois au total, à une semaine, d'intervalle. Avec,une production plus efficace d'antigène pendant la culture, une suppression plus efficace de la destruction de l'antigène par les protéases 30 et une récupération -plus efficace de l'antigène des cellules totales, et de meilleurs additifs, les doses immunisantes de vaccin correspondraient à une dose d'antigène par inoculation provenant de moins de cellules. La bonne protection contre l'infection assez grave décrite montre également que de faibles quan-35 tités d'antigène apportent une protection efficace. On peut donc penser qu'un nombre moindre d'inoculations dé l'antigène extrait d'environ 0,08 g d'une culture fraîche de cellules de S.equi encapsulées peut suffire pour provoquer une formation efficace 72 01934 7 2122560 d'anticorps après inoculation intramusculaire chez le cheval. Des inoculations répétées à des intervalles appropriés établissent une immunité plus prolongée, comme il est connu de l'homme de l'art. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif, sans sortir du cadre de l'invention. 72 01934 8 2122560 R _E _V_E_N_D_I_Ç _A_T _I_0_N_S 1. Procédé de préparation d'un vaccin actif contre lès souches virulentes de Streptococcus equi, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver du Streptococcus equi virulent en aérobiose, à séparer les cellules bactériennes du milieu de culture, à extrai-5 re un antigène protéique efficace contre Streptococcus equi en chauffant les cellules bactériennes dans une solution acide chaude à pH 1,5 à 6,0 à ajuster le pH de la solution au-dessus de.7,0 à éliminer les matières insolubles et à ajuster le pH en dessous de 7,0. 10 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on extrait l'antigène des cellules bactériennes isolées par chauffage entre 90 et 95°C,à un pH de 2,0 pendant environ 10 minutes, en agitant. 3'.' Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 15 qu'on tue Streptococcus equi immédiatement après que la culture a atteint le développement désiré, en détruisant'les protéases et en arrêtant leur formation ultérieure. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on Abaisse en dessous de 7,0 le pH de la solution dont on 20 a éliminé les matières insolubles à un pH supérieur à 7,0, en ce qu'on ajoute du gel d'hydroxyde d'aluminium pour adsorber l'antigène et comme adjuvant du vaccin. 5. Vaccin utile pour protéger les équidés contre l'infection par les souches virulentes de Streptococcus equi, carac- 25 térisé en ce qu'il est constitué d'un antigène protéique extrait des cellules de Streptococcus equi, préparé selon la revendication 1. 6. Vaccin utile pour protéger les équidés contre l'infection par les souches virulentes de-Streptococcus equi, caracté- 30 risé en ce qu'il est constitué d'un antigène protéique extrait des cellules de Streptococcus equi, préparé selon la revendication 4. 7. Vaccin utile pour protéger les équidés contre l'infection par les souches virulentes de Streptococcus equi, caracté- 35 risé en ce qu'il est constitué d'un antigène protéique extrait par l'acide de cellules de Streptococcus equi, adsorbé sur hydroxyde d'aluminium en suspension dans un véhicule injectable, ce vaccin ne contenant pas "de débris cellulaires ni d'autres 72 01934 2122560 9 tissus insolubles dans l'eau. 8. Vaccin selon la revendication J, caractérisé en ce qu'il contient de 10 à 50 mg d'antigène protéique de cellules de Streptococcus equi par ml.