Brevet FR2128467A1 — publié le 19721020

La présente invention a pour objet des agents induisant une immunité précoce, de longue durée et élevée. Elle concerne également un procédé d'induction de la forma- tion d'anticorps grâce à l'utilisation de ces agents. Il est déjà bien connu que des oligo et polynucléotides, naturels ou synthétiques, stimulent la réponse immunitaire (Braun et coîl., dans Nucleic Acids Immunology, O.J. Plescia et W. Braun, Springer Verlag New York, page 347 (1968)). On sait également que les polyanions carboxy liques, comme l'acide polyacryligue, augmentent, en présence d'antigènes, le nombre des cellules spléniques productrices d'anticorps, ainsi que le taux sérique d1anticorps (T. Diamantstein et coll, Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. 8, page 632 (1970)). Néanmoins, la réponse immunitaire marquée provoquée par ces substances n'est nue de courte durée, et elle se limite dans la plupart des cas à la réponse primaire, c'esrt-à-dire à une réponse immunitaie qui se manifeste après la première et unique administration d'antigène. Bn outre l'élévation, aussi bien de la réponse immunitaire primaire que de la réponse immunitaire secondaire, se limite aux anticorps de la classe 195 (constante de sédimentation). Or, la Demanderesse a trouvé que l'administration de polyanions sulfatés (esters sulfuriques de polymères) a pour résultat une élévation précoce du taux des anticorps circulants et une élévation du titre d'anticorps persistant pendant plusieurs semaines. Contrairement à ce qui se passe avec les polyanions carboxylés et phosphatés, l'administration de polyanions sulfatés ne provoque pas seulement une élévation du titre des inticorps appartenant à la classe 19S, mais aussi une éléxr-4ion du titre de ceux appartenant à la classe 7 S .De pl.ts la formation des anticorps, qu'ils soient de la classe 195 ou de la classe ?s , se produit dans un délai plus court que chez les témoins. Contrairement aux polynucléotides, les polyanions sulfatés élèvent également la réponse secondaire à un multiple de la valeur qu'elle aurait sans leur addition. On obtient cet effet de déclenchement de la réponse secondaire aussi bien avec une faible dose d'antigène qu'avec une dose optimale de celui-ci. La formation d1anticorps (immunisation) grâce aux polyanions sulfatés est la plus marquée lorsqu'on administre des antigènes en faible quantité, comme injection primaire ou secondaire. Dans un domaine de dosages où les antigènes seuls ne déclenchent, ni une réponse primaire typique, ni une réponse secondaire typique, on arrive, grâce à l'admi- nistration simultanée de polyanions sulfatés, à une réaction primaire ou secondaire typique, que l'on n'obtiendrait autrement qu'avec des doses optimales d'antigènes. Par administration de polyanions sulfates, avec ou sans antigène, on obtient, par ailleurs, une élévation au triple de la fraction -globulines dans le sérum. La présente invention a donc pour objet des agents conférant une immunité précoce, durable et élevée, constitués de doses sous-optimales d'antigène et d'esters sulfuriques de polymères, ainsi que des agents permettant une protection spécifique ou aspécifique, contre les infections bactériennes et virales, à base d'esters sulfuriques de po lymères. L'invention concerne également un procédé d'induction de la formation d'anticorps chez un hôte ou dans une culture de tissus, procédé caractérisé en ce que l'on applique un agent constitué de doses d'antigène inférieures aux doses optimales et d'esters sulfuriques de polymères, ainsi qu'un procédé permettant de renforcer les défenses, spécifiques ou non, contre les infections bactériennes et virales, caractérisé en ce que l'on applique un agent à base d'esters sulfuriques de polymères. Par le terme d'antigènes, il faut entendre toutes les substances capables d'induire chez un hôte la formation d'anticorps. Comme esters sulfuriques de polymères on peut envisager par exemple les composés suivants - le sulfate de dextrane [C6H803 (OSO3Na)1 - 23n ayant un poids moléculaire moyen de 500 000 (DS500), - le sulfate de dextrane [C6R803(0S03Na) 1 - 23D ayant un poids moléculaire moyen de 50 000 (DS50) - le sulfate de polyvinyle [C2H3(OSO3Na)]n (Serva, Heidelberg), - le sulfate de pentosane, ayant un poids moléculaire de 2 000 (SP54), et aussi le sulfate de l'vane, l'héparine, l'acide chondroi tine-sulfurique, l'acide hyaluronique, etc. La dose efficace de sulfate varie d'une substance à l'autre. D'une manière @énérale, des doses de 0,05 à 200 mg/kg de poids corporel sont nécessaires. Les antigènes et les esters sulfuriques de poly mères peuvent être administrés simultanément ou non. C'est ainsi que l'on observe encore des effets acoréciables lorsque l'ester sulfurique est applique dans un intervalle de temps allant jusqu'à 24 heures avant ou après l'apport d'antigène. Néanmoins, on obtient les meilleurs résultats lorsque l'on applique l'antigène et l'ester sulfurique simultanément ou peu de temps l'un après l'autre. Lorsque l'on utilise des érythrocytes de moutons comme antigènes, il est recommandé d'appliquer les esters sulfuriques environ 10 minutes avant ou après l'administration d'antigène. L'application, quand l'hôte est un homéotherme, peut s'effectuer, par exemple, par voie sous-cutanée, par voie intra-péritonéalo, par voie intraveineuse ou par voie orale. Les substances sont généralement administrées dans une solution physiologique de chlorure de sodium tamponne. Les agents confortes à l'invention conviennent remarouablement bien comme vacoins conférant une immunité précoce, durable et élevée. Ces vasQins présentant l'avantage que la dose d'antigène est abaisse par rapport à celle des vaccins connus comparables.- On peut ainsi éviter les effets secondaires résultant de doses élevées d'antigène. Fn outre, les défenses, spécifiques ou non écifiques, contre les infoctions bactériennes ou virales sont considérablement renforces. Les esters sulfuriques peuvent être @d@inistrés aussi bien dins un but prophylactique, lorsnu'il existe un grand risque d'infection, nue dans le cas d'une infection déjà établie, en vue de faire évoluer dans un sens favorable le cours de la maladie. L'addition d'antigène n'est plus alors nécessaire. L outre, les polyanions sulfatés possèdent une activité antitumorale. A partir du sang d'animaux qui ont été traités p?r l'agent conforme à l'invention, on peut obtenir des antisérums. Ces antiséruas sont nrcessaires pour la deternina- tion immunologique, par exemple, des hormones. L'invention concerne donc aussi un procédé d'obtention d'antisérums ayant un titre élevé, caractérisé en ce que lton applique l'agent conforme à l'invention, on prélève du sang ru bout d'un délai de 5 à 120 jours, puis on prépare le sérum de la manière habituelle. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer la présente invention. Sauf indication contraire expresse, les parties et pourcentages sont donnes en poids. Les. tempé- ratures sont indiquées en degrés Celsius. EXEMPLE 1 : Sclutions pour l'annlication par voie intrapéritonéale ou ou intraveineuse. a) On dissout 100 mg de sulfate de dextrane DS500 (Serva, Heidelberg) dans 50 ml d'une solution physiologique de chlorure de sodium stérile, 0,15 molaire tamponnée au phosphate à pH = 7,2 (PBS), et on introduit le tout dans des ampoules par portions de 0,5 ml. b) On lave avec PBS, à trois reprises, 2.106 hématies de mouton (Behringwerke, Marburg), puis on les met en suspension dans 0,5 ml de PBS. EXEMPLE 2 Solutions pour application par voie sous-cutanée. a) On dissout 100 mg de sulfate de dextrane DS50 (Serva, Heidelberg) dans 50 ml d'une solution physiologique de chlorure de so dium stérile, 0,15 molaire, tamponnée au phosphate à pH = 7,2 (PBS), puis on introduit la solution obtenue dans des an poules par portions de 0,5 ml. b) On lave à trois reprises 2.106 érythrocytes de mouton (Behringwerke, !Iarburg) avec PBS, nuis on les met en susponsion dans 0,5 ml de PBS. EXEMPLE 3 : Vingt souris blanches de la souche X;RI reçoi- vent, par voie intrapéritonéale, 1 mg de sulfate de dextrane DS500 (Serva, Hendelberg) dans 0,5 ml d'une solution physiologique 0,15 molaire de chlorure de sodium, stérile et tam- ponnée au phosphate à pH = 7,2 (PBS). Au bout de 10 minutes, on immunise les animaux, par voie itra-péritonéale, au moyen de 2, 106 érythrocytes de mouton (Behringwerke, Marburg). Les érythrocytes de mouton ont été au préalable lavés à trois reprises avec PBS, puis mis en suspension dans 0,5 ml de PBS. Vingt souris supplémentaires sont immunisées, par voie intra-peritonéale, uniquement au moyen de 2. 106 érythrocytes de mouton en suspension dans 0,5 ml de PBS. Au bout de 96 heures après le début de l'essai, on prélève des sérums par ponction intracardiaque. On sacrifie ensuite les animaux par décapitation et on prépare de la manière habituelle, avec réfrigération, des suspensions de cellules spléniques. Dans le sérum : on détermine le titre d'hém- lysine anti-érythrocytes de mouton selon la méthode de Sabet et coll. (Immunology, 1969, 16 : 433). On considère comme titre la dilution la plus élevée de sérum qui provoque une hémolyse totale des érythrocytes de mouton. Dans le cas des animaux traités avec des érythrocytes de mouton et avec DS500, on trouve un titre d'anticorps égal à 256, tandis que chez les témoins qui ont reçu seulement des érythrocytes de mouton, ce titre est inférieur à 8. Dans la rate le nombre des cellules splénioues génératrices d'anticorps 19S et 7 S diriges contre les érythrocytes de mouton a été déterminé selon la méthode de Jerne et coll. (Conference on Cell-Bound Antibodies. Rédacteurs : B. Amos et H. Koprowski, page 109, instar Institute Press, Philadelphia (1963)). Dans le cas des animaux traités avec des érythrocytes de mouton et DS500, on trouve 65 000 + 10 000 cellules généra trices d'anticorps par rate, tandis que, chez les témoins ayant seulement reçu des érythrocytes de mouton, on ne trouve, pour chaque rate, que 41 cellules génératrices d'anticorps. De manière analogue, on immunise des souris avec des érythrocytes de mouton et 1 mg de DS50, de sulfate de polyvinyle (PVS) ou de sulfate de pentosane (SP54). Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-dessous (l'abré- viation "PFC" veut dire : cellules productrices d'anticorps). TABLEAU I Stimulation de la formation d'anticorps par les polyanions sulfatés (esters sulfuriques de polymères). Polyanions Groupes S04 Nombre des Nombre des Titre sulfatés PFC pour 106 PFC par rate d'anticorps* atomes atomes de cellules carbone spléniques DS500 1/3 244t50 65 000 + 10 000 256 DS50 1/3 210t60 58 000 t 8 600 128 1/2 1/2 25,0t6 6 500 t 1 000 32 SP54 1/3 71#12 15 000 t 3 000 64 Témoins - 0,4 41 * Titre d'anticorps = titre d'anticorps hémolysant les érythrocytes de mouton. EXEMPLE 4 : Dans un essai analogue à celui de l'exemple 3, on étudie 11 influence de la dose de SP54. On effectue l'immunisation avec 2. 106 érythrocytes de mouton après administration de différentes doses de SP54. Les résultats sont roprésentés sur la figure 1 du dessin annexé. On constate que c'est avec 4 mg de SP54 que l'on obtient les titres optimaux et les valeurs optimales de PPC (cellules productrices d'anticorps = plaque forming cells). Pour l'expérience, on immunise 20 souris (témoins) par voie intra-péritonéale avec 2. 106 érythrocytes de moutons (EM). Des groupes composés de chacun 20 souris reçoivent 10 minutes avant l'inmunisation par 2. 106 EM diverses doses de SP54 par voie intrapéritonéale. Sur la figure : 0 = témoins = animaux traités par SP54 Tite d'anticoros (inverse) :,= ténoins ; #: animaux traités par SP54. EXEMPLE 5 Dans un essai analogue à celui de l'exemple 3, on étudie l'influence de la dose de DS500 (immunisation avec 2,106 érythrocytes de mouton après administration de diffrentes doses de DSsoo). Les résultats sont représentés dans la figure 2 du dessin annexé. Dans cette expérience, 20 souris sont immunisées avec 2.106 érythrocytes de mouton par voie intrapéritonéale (témonis). Des groupes composés de chacun 20 souris reçoivent, 10 minutes rès immunisation avec 2.106 EE, différentes doses de DS500 par voie intrapéritonale. Sue la figure, PFC = cellules produisant des anticorps ; 0 = témoins ; @ = animaux traités par DS500. EXEMPLE 6 Dans un essai analogue à celui de l'exemple 3, on étudie la réponse primaire après immunisation à l'aide de 1 mg de DS500 et e différente doses d'antigène(2,106.2.107 et 2.108 EM). Les résultats sont indiqués sur les figures 3 du dessin annexé. Sur la figure 3a, la dose d'antigène est de 2.106 EM, sur la figure 3b elle est de 2,107, et, sur la figure 3c, de 2.108. 0 indique l'immunisation et @ l'immunisation et le traitement par 1 mg de DS500. Les lignes continues indi cuent les cellules produisant l'anticorps 19 S, et les lignes discontinues, les cellules produisant les enticorps 19 S et 7 S. P7C = cellules produisant des anticorps. On voit que 11 effet le plus marqué a lieu avec des doses de 2.106 à 2.107 érythrocytes. EXEMPLE 7 Dans un essai analogue à celui de l'exemple 3, on étudie la réponse secondaire (2ème immunisation effectuée 30 jours après la première) après administration de 1 mg de DS500 et de différentes doses d'antigène. Les résultats sont rapportés sur les figures 4 à 6 du destin annexé. -ur la figure 4 est indiqué le titre des anticorps hémolysant les érythrocytes de mouton dans le sérum des animaux d'épreuve (après traitement par des érythrocytes ;e mouton, plus DS500) et celui des témoins (après traitement par des érythrocytes de mouton). Les témoins reçoivent d'abord 2,106 érythrocytes de mouton, par voie intra-péritonéale, et, 30 jours plus tard, la meme dose par la meme voie Les souris d'un autre groupe immunisées de la même manière, reçoivent, 15 rinutes @près la première et la deuxième immunisation, 1 mg de DS500 par voie intrapéritonéale .Sur la figure 0 -- témoins ; = nimaux ayant reçu Ds500 ; lignes continues titre d'anticorps 19 - et 7 S ; lignes discontinues = titre d'anticorps 7 . La figure 5 montre la réponse secondaire de souris traites àr DS500, ayant reçu lors de la première et de la deuxième injection 2.106 érythrocytes de mouton. On a porté, en ordonne, le nombre de cellules produisant des anticorps (PFC) dans chaque rate et, en abscisse, le nombre de jours après la deuxième injection d'antigène. Les souris témoins reçoivent les injections d'érythrocytes à 30 jours d'intervalle, par voie intrapéritonéale ; les animaux d'épreuve reçoivent, 15 minutes après la première et la deuxième immunisations, 1 mg de DS500, par voie intrapéritonéale. Les lignes continues indiquent les cellules produisant les anticorps 7 S et 19 S ; les lignes interrompues indiquent les cellules produisant l'anticorps 7 S. La figure 5 montre la réponse secondaire chez des souris, traitées par DS500, ayant reçu, comme première injection une dose sous-optimale d'antigène (2.106 érythrocytes le mouton) et, comme deuxiène injection, une dose d'antigène optimale (2.108 érythrocytes de mouton). Sur la figure sont ports, en ordonnée, le nombre de cellules produisant des anticorps (PFC) dans chaque rate et, en abscisse, le nombre de jours après la deuxième injection d'antigène. Les souris sont d';bord immunises à l'aide de 2.106 érythrocy- tes c?e mouton, puis , 30 jours plus tard, avec 2.108 érythrocytes, lans les deux cas par voie intrapéritonéale. Un autre groupe de souris, immunisé de la meme manière, reçoit, 15 minutes après la première et la deuxième immunisations, 1 mg de DS500, par voie intrapéritonéale. Dans la figure, 0 = témoins ; s = animaux traités par DS500 i les lignes continues représentent les PFC produisant 19 S et 7 S ; les lignes discontinues représentent les PFC produisant 7 S. EXEMPLE 8 : On effectue la séparation, par électrophorèse sur des bandes d'acétate de cellulose selon la méthode de Kohn (Shandon Instrument Applications : Zur Technik der Zelluloseacetat-Elektrophorese, 1965, N Il (G)),de sérums de souris non-immunisées, et de souris également non-immunisées mais traitées par 1 mg de DS500 par voie intrapéritonéale, et on effectue une évaluation quantitatrice. Des figures 7a et 7b (dans 7a, le spectre est pris avant le traitement par DS500 et dans 7b, 4 jours après le traitement par 1 mg de DS500), il ressort que le traitement par DS 500 double le taux de la fraction de &gamma;-globulines. EXEMPLE 9 : A titre d'exemple, pour étudier l'action d'un ester sulfurique de polymère sur la formation d'anticorps dans le cas d'un autre antigène, en l'espèce l'albumine sérique de bovidés (RSA) et par application par voie sous-cutanée, on compare l'action de DS500 à celle de l'adjuvant de Freund complet (SCA). On injecte à des lapins, d'un poids de 2 à 2,5 kg, 10 mg/kg de RSA ( Behringwerke, Marburg) par voie souscutanée, dans la région de la nuque. De la même manière, on injecte à un autre groupe de lapins un mélange constitué de 10 mg/kg de RSA et de 1 ml de FCÀ / kg. Un troisième groupe de lapins reçoit 10 mg/kg de RSA en mélange avec 33 mg/kg de DS500, de la manière décrite plus haut. L'albumine sérique de bovidés et DS500 sont l'un et l'autre en solution dans 1 ml d'un soluté physiologique de chlorure de sodium tamponné au phosphate à pH = 7,2 (PBS). Comme témoins supplémentaires on utilise des animaux qui ont reçu 2 ml de PBS.Le titre sérique d'anticorps des animaux est déterminé au bout de différents laps de temps par la méthode radio-immutolo- gique, suivant les directives de CATT, de la manière suivante on adsorbe sur de petits tubes de polystyrène du sérum dilué à I : 1000 avec un tampon au bicarbonate (pH = 9,6 ; 0,05 molaire) et l'on mesure la fixation spécifique de RSA marquée par 131 I sur les tubes de polystyrène revêtus d1anti sérum. La radioactivité fixée est mesuré au moyen d'un compteurs (Packard) et est désignée dans ce qui suit comme titre d'anticorps. Le tableau II montre les résultats d'un tel essai.Tandis que les sérums des animaux auxquels on a injecté seulement de la RSA ne présentent aucune élévation mesurable du titre d'anticorps par rapport aux animaux non-immunisés, les animaux auxquels on a injecté un mélange de RSA et de FCA présentent, au 15ème jour après l'immunisation, un titre de 200 et au 30ème jour, un titre de 370. Les animaux traités par un mélange de RSA et de DS500 présentent,au bout de 15 jours,un titre de 380 et, au trentième jour, un titre de 430. TABLEAU II Jours écoulés Titre 10 mg de 10 mg de RSA/kg 10 mg de entre le trai- d'anticorps RSA/kg dans dans 1 ml de RSA/kg + tement et la 2 ml de PBS +1 ml de 33 mg/kg de détermination traitement PBS FCA/kg DS500 dans du titre par PBS 2 ml de PBS (2 ml) 15 0 0 200 380 30 0 0 370 430 R E V E N D I C A T I O N S I.- agents permettant d'induire une immunité durable et @levée, constitués de doses sous-optimales d'@ntigènes et d'esters sulfuriques de polymères. 2.- Agents selon la revendication 1, constitués de doses sous-optimales d'antigènes ainsi que de sulfate de dextrane, de sulfate de polyvinyle, de sulfate de nentosane, de sulfate de lévane, d'héoarine, d'acide chondroitinesulfurique ou d'acide hyaluronique, à titre d'esters sulfuriques de poly@ères. 7.- Agents selon les revendications 1 et 2, caractérisés par une teneur correspondant à un dosage de 0,05 à 200 mg/kg de poids corporel en esters sulfurioues de polymères. 4.- Agents permettant d'augmenter la résistance, spécifique ou non, contre les infections bactériennes et virales, à base d'esters sulfuriques de polymères. 5.- Agents selon la revendication 4, caractérisés par une teneur correspondant à un dose de 0,5 à 200 mg/kg de poids corporel an esters sulfuriques de polymères. 6.- Procédé d'induction de la formation d'anti- corps chez un hôte ou dans une culture de tissus, caractérisé en ce que l'on applique un agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 7.- Procédé d'augmentation de la résistance, spécifique ou non, contre les infections bactériennes et virales, caractérisé en ce nue l'on utilise un agent selon l'une des revendications 4 et 5. 8.- Procédé d'obtention d'antisérums à titre élevé, caractérisé an ce que l'on applique un agent selon la revendication 1, on effcctue le prélèvement de sang après un délai e 5 à 120 jours, puis on prépare le sérum de la manière habituelle. 9.- Procédé de préparation d'un agent permettant d'induire une inmunité précoce, durable et élevée, caractérisé en ce nue l'on dissout , dans un soluté physiologique tamponné, et on met en ampoules, séparément, kes esters sulfuriques de polymères et les antigènes. 10.- Procédé de préparation d'un agent permettant d'augmenter la résistance, spécifique ou non, contre les infections bactériennes et virales, caractérisé en ce que l'on dissout des esters sulfuriques de polymères dans une solution physiologique de chlorure de sodium tamponnée et que l'on et le tout en ampoules.