Brevet FR2133607A1 — publié le 19721201

La présente invention concerne un nouveau mode de fixation de substances azotées naturelles ou synthétiques sur un support insoluble. Ce support peut se présenter sous forme granulaire ou sous forme de perles parfaitement sphériques, pouvant prendre 5 des tailles variables. A cet effet, tous les polymères, naturels ou synthétiques, susceptibles de donner des gels en milieux aqueux, sont susceptibles d'être utilisés comme supports dans ce procédé. Les plus couramment employés sont les gels de polysaccha-rides (par exemple l'agar-agar ou l'agarose), ou d'acrylamide. 10 ces gels peuvent être utilisés soit seuls, soit en association (par exemple une association d'agarose avec 1'acrylamide) à des concentrations variables. Les substances qui peuvent être fixées selGn l'invention sur le support insoluble sont soit des composés naturels, tels 15 que des acides aminés, des polypeptides, des protéines ou tous autres composés biochimiques possédant dans leur molécule une partie protéique ou plus simplement une fonction aminé ou asd.de„ Parmi les produits naturels, on peut citer les enzymes, les inhibiteurs d'enzymes, les anti corps,les anti gênes, les hormones 20 polypeptiques ou protéiques, ainsi que certaines protéinesf telles que les con canavalines. Parmi les produits de synthèse, les inhibiteurs d'enzymes apparaissent également présenter un grand intérêt dans le procédé salon l'invention. Selon l'invention, les substances azotées sont fixées sur le support 25 insoluble par le moyen d'un composé organique bifonctionnel? formant un pont entre la substance à fixer et le support. Ces composés sont de nature dialdéhydique, les fonctions aldéhyde étant situées aux extrémités d'une chaîne alipkatique ou aromatique. Ces composes répondent, à la formule générale 30 0HC-(R)-CH0 dans laquelle R représente une chaîne aliphatique 72 12029 2 2133607 ou aromatique de composition et de longueur variables. Dans le cas le plus courant (R) = (CH2^n' — ®tant compris entre 0 et 6 En effet, dans la pratique, les dialdéhydes qui sont le plus communément utilisés sont la glutaraldéhyde (pentane-dial) 5 et le glyoxal (éthane-dial). Le composé dialdéhydique réagit d'une part avec les groupements hydrophile du gel support, par exemple les groupements hydroxyle de l'agarose ou les groupements amide de 1'acrylamide, et d'autre part avec les fonctions aminé des protéines ou des autres substances azotées 10 que l'on désire fixer sur ce support. La fixation ou le couplage s'effectue selon l'invention en deux temps : - dans, un premier stade, une quantité connue de gel à' l'état soit hydraté,soit sec (gel lyophilisé re-hydratable) est mise en 15 contact avec un excès de glutaraldéhyde en solution aqueuse du tampon ou dans un tampon approprié, à 1'exception/tris(hydroxyméthyl) amino-méthane qui réagirait avec le dialdéhyde. Le gel ainsi activé est lavé pour en éliminer l'aldéhyde non combiné. - dans un deuxième stade, la substance azotée est combinée aux 20 groupements aldéhydes libres. La combinaison substance azotée- support est lavée pour en éliminer l'excès de substances non fixées. Un intérêt de cette combinaison est que le gel peut être lyophilisé et conservé à sec sous forme rehydratable. Le procédé de fixation selon l'invention est particulièrement 25 adapté au cas des enzymes. En effet l'un des problèmes majeurs lors de la préparation des enzymes insolubles, est leur perte d'activité au cours des réactions chimiques utilisées pour leur fixation, l'activité de l'enzyme fixé étant en général très inférieure à celle de l'enzyme soluble. Or, la déposante a constaté 30 que, grâce à ce procédé, non seulement toute l'activité de l'enzy 72 12029 3 2133607 me est conservée, mais que dans la plupart des cas, l'activité est augmentée , en particulier lorsque les enzymes sont fixées sur des gels d'acrylamide-agarose commeil apparait au Tableau I ci-aprës. Dans le cas de l'amylase, par exemple l'activité trouvée, bien 5 qu'inférieure à 100%, est remarquable, car le substrat (amidon soluble) ayant un poids moléculaire élevé, le contact avec les molécules d'enzyme fixées à l'intérieur des perles est considérablement réduit. La déposante a constaté également que les enzymes insolubles 10 résultant de la mise en oeuvre de ce procédé, sont plus stables que les enzymes solubles correspondantes. Leur stabilité dans le temps et leur résistance à la dinaturation thermique sont meilleures que celles des enzymes solubles. En outre, le fait de fixer les enzymes sur des perles par-15 faitement calibrées permet de confectionner des colonnes à écoulement régulier, de telle sorte que la réaction enzymatique peut être effectuée par passage du substrat à travers la colonne de gel. En dehors de l'intérêt des enzymes fixées sur gel en 20 ce qui concerne les réactions enzymatiques qui leur sont propres, il existe d'autres possibilités liées à l'affinité sélective des enzymes pour certaines substances naturelles et plus particulièrement pour leurs inhibiteurs. Ainsi les enzymes protéolytiques insolubles se combinent dans certaines conditions 25 de pH à leurs inhibiteurs, que l'on peut ensuite éluer par une solution tampon de pH différents. Inversement, l'utilisation d'inhibiteurs naturels ou synthétiques fixés sur gel permet la séparation sélective des enzymes correspondantes. De même, la fixation de certains substrats sélectifs sur gel peut être 30 utilisée pour l'absorption sélective des enzymes agissant sur ces 72 12029 4 2133607 TABLEAU I Enzyme Composition du gel % acryla- % aga-mide rose % enzyme fixée sur gel déshydraté % activité de 11 enzyme fixée par rapport à l'enzyme solu-ble Trypsine 4 2 4,6 116 4 3 5,0 114 6 4 6,5 156 Chymotrypsine 4 2 4,6 110 4 4 6,5 140 6 2 6,8 lOO Protéases / pancréatiques 4 4 3,0 120 Protéases du suc de papayer 4 2 3,2 120 4 4 3,5 130 Alpha- amylase 3 4 2,5 80 Urease 3 2 4,2 100 Arginase 4 2 4,1 100 Lysozyme 5 1 2,5 Cytochrome 4 4 6,0 25 Note : Pour les protéases la mesure ci-dessus a été faite sur substrat hemoglobine ~ Sur substrat synthétique ont été observésdes résultats souvent meilleurs 72 12029 5 2133607 substrats. Cette séparation sélective d'enzymes sur gel insoluble d'inhibiteur ou de substrat est effectuée de préférence par passage de la solution extractive contenant 1'enzyme sur la colonne de gel, ce dernier étant constitué par des perles soigneusement 5 calibrées, permettant un écoulement régulier et suffisamment rapide des solutions à travers la colonne. L'enzyme étant fixée, la colonne est lavée, puis l'enzyme est entraînée par une solution tampon de pH donné . Il est également possible d'absorber l'enzyme par dispersion des perles dans le liquide d'extraction 10 contenant l'enzyme, puis de recueillir les perles par centri-fugation, de les laver et d'éluer l'enzyme. Cette technique est également valable dans le cas de la fixation d'anti-corps ou d'anti-gênes sur le gel. Les anti-gënes insolubles permettent d'isoler sélectivement les anti-corps 15 correspondants, par exemple les anti-corps sériques, et inversement les anti-gênes insolubles absorbent sélectivement les anti-corps correspondants, par exemple l'insuline. One autre application de l'invention est l'utilisation de protéines insolubles possédant une affinité pour certains 20 constituants biologiques données. Par exemple, les concanavalines qui sont des protéines végétales, possèdent une affinité particulière pour les polysaccharides et les gluccprotéines„ Suivant la concanavaline fixée sur le gel, il est possible de séparer un polysaccharide ou une gluco-protëine donnée. Cette technique 25 permet d'isoler non seulement sélectivement les polysaccharides qui entrent dans la constitution des parois cellulaires, mais également de séparer les cellules dont les parois contiennent ces polysaccharides ou des gluco-protëines. Les possibilités d'utilisation des gels d'acrylamide, 30 d'agarose, d'acrylamide-agarose et analogues sur lesquels on peut 72 12029 6 2133607 fixer des substances azotées, naturelles ou synthétiques, conformément à l'invention, sont tellement vastes que la présente description ne peut en donner qu'un aperçu très limité. On donne cependant à titre d'exemple^un certain nombre de techniques qui 5 ont été utilisées pour l'application pratique de l'invention, étant bien entendu que ces exemples n'ont aucun caractère limitatif. EXEMPLE I Fixation d'acides aminés sur des perles d'acrylamide-agarose 10 à l'aide de glutaraldéhyde On met en suspension 100g de gel lyophilisé dans 2,5 litres d'une solution aqueuse à 10% de glutaraldéhyde, et on laisse sous agitation pendant 4 à 5 heures à une température' comprise entre 10 et 25°C. 15 Le gel ainsi activé est lavé par remise en suspension dans de l'eau déminéralisée, puis filtration ou centrifugation jusqu'à élimination complète de la glutaraldéhyde non combinée (contrôle spectro-photométrique à 280 nm. Par ailleurs, on dissout 15 grammes de l'acide aminé choisi 20 dans 1 litre d'une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M à pH 7,5 et on met en suspension dans cette solution le gel activé essoré ou centrifugé. On agite mécaniquement pendant environ 60 minutes pour permettre la fixation de l'acide aminé sur le support puis on recueille le gel par filtration sous vide, on 25 le lave à plusieurs reprises avec un tampon bicarbonaté puis avec de l'eau déminéralisée pour éliminer la fraction d'acide aminé non fixée. On essore une dernière fois le gel, que l'on pourra conserver, soit à l'état hydraté à température ambiante en présence d'un bactériostatique (azoture de sodium à 0,02 %) 30 ou à 4°C, soit à l'état lyophilisé à la température ambiante. 72 12029 7 2133607 On a ainsi effectue un certain nombre de préparations, à partir d'acides aminés neutres (1- et d- tryptophane), acides (acide d,1-aspartique), basiques(1-argine etl-lysine)et soufré (1-cystéine). On a réuni dans le tableau II ci-après les résultats obtenus. TABLEAU II V] ro ro o ro \o Acide aminé Composition du gel % acrylamide % agarose % acide aminé fixé sur gel déshydraté 1-tryptophane d-tryptophane 1-tryptophane 1-cystéine 1-arginine d,1-aspartique (acide) 1-lysine 8 8 : 6 4 8 6 3 2 4 3 2 2 2 11,9 12,3 4,5 6,5 3,2 8,0 11,6 ro OJ LM ON O VI 72 12029 9 2133607 On remarquera que dans le cas de la cystéine, la quantité de groupements-SH libres dans la cystéine fixée est déterminée selon la technique au 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoïque acide) décrite par ELLMAN dans Archiv. biochem. J32, 70 (1959); cette 5 quantité est de 55%; EXEMPLE 2 Fixation des protéines sériques à l'aide de glutaraldéhyde On met en suspension 10g de gel déshydraté dans 250 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde i 10% à température lO ambiante,et on agite pendant 5 heures. On lave ensuite plusieurs fois les perles avec de lleau déminéralisée pour éliminer l'excès de glutaraldéhyde non combiné. Par ailleurs, on prépare une solution de la protéine sëri-que à fixer dans du chlorure de sodium à 0,15 M, soit 1 gramme 15 de protéine dans 100 ml de solution chlorurée. On introduit le gel essoré dans cette solution, et on agite mécaniquement pendant environ une heure. La protéine étant fixée, on lave le gel à plusieurs reprises avec la solution chlorurée pour .éliminer l'excès de protéine puis on l'essore. La combinaison 20 insoluble, après un dernier lavage a lEeau pour éliminer le chlorure, est essorée puis conservée à l'état déshydraté après lyophilisation. On a mis en oeuvre cette technique dans deux cas distincts, à savoir dans un premier cas avec des gamma glubulines sur du 25 gel acrylamide-agarose (4%-3%)f et dans un second cas avec de le sérum-albumine sur gel acrylsaiids-agarose (4%--2&J . Dans le premier, cas, la quantité de protéine fixée est de 3f8% et dans le second cas, elle est de 3,3%. Un troisième essai de fixation, à savoir d'albumine sur un çel &orylamir.a-agarose 30 (6%-4%) a conduit à un produit contenant 8% de protéine fixée,. 72 12029 2133607 EXEMPLE 3 Fixation d'une protéine végétale à l'aide du glutaraldéhyde. On donnera à titre d'illustration de cette technique le mode de fixation de la Concanavaline A sur gel d'acrylamide-agarose 5 (4%-2%) On met en suspension 1g de gel lyophilisé dans 20 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 10% et on agite à température ambiante pendant trois heures. Après lavage à l'eau déminéralisée pour éliminer l'excès de lO glutaraldéhyde et essorage, on introduit le gel dans une solution de concanavaline, préparée par dissolution de 50 mg de protéine dans 4 ml de chlorure de sodium M dilué avec 6 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,07 M. / Après agitation à 4°C pendant deux heures, on essore le gel 15 puis on le lave à plusieurs reprises jusqu'à élimination de la concanavaline non fixée (vérification par spectrophotométrie à 280 nm). Après un dernier essorage, la combinaison gel-concana-valine est recueillie et conservée soit en suspension dans 80 ml de chlorure de sodium M à 4°C soit après lyophilisation à tempé-20 rature ordinaire. La quantité de concanavaline fixée sur le gel déshydraté est de 3,5%. EXEMPLE 4 Fixation d'une protéine à activité hormonale à l'aide de glutaraldéhyde 25 On prend comme exemple de cette technique la fixation d'une hormone protéique, à savoir l'insuline, sur des perles d'acry-lamide-agarcse (4%-3%). On active un gramme de sel conformément à la technique indiquée S 1'EXEMPLE 3 ci-dessus, puis on dissout 80 mg d'insuline dans 30 10 ml de solution de chlorure de sodium 0,15 M et on introduit 72 12029 ii 2133607 dans la solution d'insuline le gel activé et essoré et on agite pendant 3 heures à 5°C. La combinaison gel-insuline est essorée, lavée plusieurs fois avec la solution chlorurée jusqu'à élimination de l'insuline en excès( puis après un dernier essorage 5 recueillie et conservée à 4°C. La quantité d'insuline fixée sur les perles déhydratées est de 2,2%. - EXEMPLE 5" Fixation de protéines à activité enzymatique à l'aide de glyoxal 10 On met en suspension 10g de gel d'acrylamide-agarose (4%-2%) lyophilisé dans 350 ml d'une solution à 40% de glyoxal et on agite mécaniquement pendant 5 à 6 heures S la température ambiante Le gel se réhydrate lentement en même temps qu'il réagit avec le glyoxal. A la fin de l'opération la suspension est essorée 15 puis lavée jusqu'à élimination totale de l'excès de glyoxal (vérification par spectrophotométrie à 260 nm). Le gel lavé et essoré est mis en suspension dans 170 ml d'une solution à 1% de l'enzyme à fixer dans du chlorure de calcium 0,02 M à pH 7,8 et agité mécaniquement pendant deux heures à 4°C. Le 20 complexe insoluble est essoré, lavé à l'eau jusqu'à élimination de l'excès d'enzyme et conservé après un dernier essorage à l'état hydraté à 4°C ou lyophilisé. On a mis en oeuvre cette technique, dans un premier cas avec de la trypsine, et dans un second cas avec de la chymotryp-25 sine : dans le premier cas la quantité d'enzyme fixée a été de 5,5 pour cent et dans le second cas de 5,8 pour cent. EXEMPLE 6 Fixation d'une protéine à activité enzymatique sur gel d'acrylamide à 1'aide de glutaraldéhyde 30 On met en suspension 4g de gel d'acrylamide à 12 pour cent 72 12029 2133607 déshydraté dans 100 ml d'une solution à 10% de glutaraldéhyde et de chlorure de sodium 0,02 M à pH 7,5 en agitant. On poursuit l'agitation pendant deux heures à 50°C. Le gel est ensuite centrifugé, lavé plusieurs fois avec une solution de chlorure 5 de calcium 0,02 M jusqu'à élimination de la glutaraldéhyde non combinée (réaction négative du filtrat avec la fuchsine ou mesure de la densité optique à 280 nm). Par ailleurs, on dissout 1,20 g de l'enzyme à fixer dans 100ml d'une solution de chlorure de calcium 0,02 M à pH 7,8. On verse 10 le gel activé centrifugé dans la solution d'enzymes et on agite à 4°C pendant 60 à 90 minutes. On centrifuge le gel, on le lave avec la solution de chlorure de calcium 0,2 M pour éliminer l'enzyme non fixée puis on le recueille par centrifuga-tion et on le lyophilise. Un essai de fabrication effectué avec 15 la trypsine selon cette technique a donné un produit déshydraté renfermant 0,260 g d'enzymes par gramme de gel. EXEMPLE 7 Fixation d'ungferotéine à activité enzymatique sur un gel hydraté à l'aide de glutaraldéhyde. 20 A 20 ml de gel hydraté, mesuré dans une éprouvette graduée après sédimentation, on ajoute 10 ml d' une solution de glutaraldéhyde à 25% dans Iteau. On agite le mélange à froid pendant 5 heures puis on essore le gel activé et on le lave à plusieurs reprises à l'eau déminéralisée pour éliminer l'excès de glutaraldéhyde. 25 On prépare par ailleurs une solution de trypsine à 1% dans du chlorure de calcium 0,02 M à pH 7,8 et on mélange 10 ml de cette solution à 4°C au gel lavé et essoré précédent. On agite la suspension pendant 60 minutes à 4°C puis on essore la combinaison par essorage ou centrifugation. Après plusieurs lavages avec 30 chaque fois 30 ml de chlorure de calcium 0,02 M, le gel est à 72 12029 2133607 nouveau essoré puis conservé à l'état soit hydraté soit lyophilisé. En suivant cette technique on a effectué deux essais avec la trypsine, en prenant dans un cas comme support des perles d'agaro-se à 4% et dans l'autre cas un gel acrylamide agarose (4%-2%). Les 5 quantités d'enzymes fixées ont été respectivement de 7% dans le premier cas et de 4,9% dans le second cas, en calculant en produit déshydraté. EXEMPLE 8 Fixation de diverses enzymes ou co-enzymes sur gel acrylamide-ÎO agarose à l'aide de glutaraldéhyde. Dans cet exemple est décrite la méthode générale utilisée pour l'étude de la fixation d'enzymes, d'extraits enzymatiques ou de co-enzymes sur des perles acrylamide-agarose de composition variable. Selon cette méthode, on prélève 1g de gël -lyophilisé 15 et on le met en suspension dans 25 ml d'une solution de chlorure de calcium 0,02 M à pH 7-8 contenant lO% de glutaraldéhyde. On agite le mélange pendant 4-5 heures à une température de 1Q-25°C* Après essorage, le gel est lavé avec Ta solution de chlorure de calcium jusqu'à élimination complète de la glutaraldéhyde librec 20 Par ailleurs, on dissout 100-125 mg d'un enzyme à fixer dans lu ial de la solution de chlorure de calcium 0,02 M à PH 7-8 refroidi à 4°C. On verse le gel essoré dans la solution snzvnta-feique et on agite le mélange pendant 60-90 minutes en maintenant la température à 4°C. La fixation de l'enzyme sur le gel étant achevée, on 25 recueille ce dernier par essorage, on le lave avec la solution de chlorure de calcium pour éliminer l'enzyme sa excès, puis, après un dernier essorage, on recueille le gel et le lyophilise. On a réuni au tableau I précédent les résultats obtenus au cours d'un certain nombre d'essais pratiqués sur toute une série d'snzy-30 mes et de ço-enzymes. 72 12029 » 2133607 EXEMPLE 9 Fixation d'un substrat synthétique sur gel acrylamlde-agarose Comme exemple de cette technique particulière de la fixation d'une substance azotée synthétique, on donnera la technique 5 utilisée pour lier chimiquement l'ester éthylique de la benzoyl-arginine sur du gel acrylamide-agarose à 4-3%. On met en suspension 10g de gel déshydraté dans 25 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 10% et on agite pendant 4 heures à température ambiante. 10 Par ailleurs, on dissout 1,5g du substrat dans 100 ml d'eau déminéralisée. On mélange à la solution le gel activé, lavé et essoré puis on agite à 5°C pendant 60 minutes. La combinaison est ensuite essorée, lavée à plusieurs reprisés puis lyophilisée après un dernier essorage. 15 La quantité de substrat fixée est de 1,2%. 72 12029 2133607 REVENDICATIONS 1 - Procédé pour fixer une substance azotée sur un support insoluble, caractérisé en ce que l'on forme entre ledit support et ladite substance un pont au moyen d'un composé organique bifonctionnel. 2 - Procédé selon 1, caractérisé en ce que le support insoluble est sous forme de perles sphériques. 3 - Procédé selon 1 et 2, caractérisé en ce que le support insoluble est constitué par un gel de polysaccharide, tel que l'agar ou 1'agarose, 1'acrylamide, ou à une association des deux à concentration variable. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance azotée fixée est un compsoé naturel, tel qu'un acide aminé, un polypeptide ou tout composé comportant dans sa molécule une portion protéique ou une fonction aminé ou amide tel que les enzymes, les inhibiteurs d'enzymes, les anti corps, les anti gênes, les hormones polypeptidiques ou protéiques, ou une protéine telle que les concanavalines. 5 - Procédé selon une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé organique bifonctionnel donnant naissance à un pont entre le support et la substance azotée est un composé dialdéhydique de forme générale OHC-(R}-CHO dans laquelle (R) représente une chaîne aliphatique ou aromatique . 6 - Procédé selon 5, caractérisé en ce que (R) représente une chaîne de forme (CH^)n dans laquelle n est compris entre O et 6 7 - Procédé selon 6, caractérisé en ce que le composé dialdéhydique est la glutaraldéhyde ou le glyoxal. 72 12029 2133607 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que, dans une première étape, on met en contact les perles de gel avec un excès du composé dialdéhydique en solution aqueuse, et dans une seconde étape, on combine la 5 subtance azotée aux groupements aldéhydiques demeurant libres. 9 - Procédé pour provoquer un accroissement de l'activité et de la stabilité des enzymes, caractérisé en ce que l'on fixe lesdites enzymes sur un gel d'agarose-acrylamide conformément aux Revendications 1 à 8. 10 10 - Procédé selon 9, caractérisé en ce que l'enzyme es choisie entre la trypsine, la chymotrypsine, les protéases pancréatiques, les protéases du sec de papayer, 1'alpha-amylase, 1' uréase, l'arginase , le lysozyme et le cytochrome. / 11 - Nouvelles combinaisons insolubles résultant de la 15 . fixation des substances'azotées par des ponts dialdéhydiques sur des perles de gels insolubles, résultant de la mise en oeuvre des caractéristiques des revendications 1 à 10.