Brevet FR2130731A1 — publié le 19721103

i 2.1307 31 La présente invention concerne une nouvelle substance hypotensive nommée dopastine. Elle concerne en outre l'isolation et la production de la dopastine. De nombreuses tentatives ont été faites en vue de trouver 5 de nouvelles substances utilisables comme médicaments. Parmi les médicaments, les agents hypotensifs, Jouent un rôle très important car beaucoup de personnes souffrent d'hypertension. L'invention a donc comme objet principal de fournir un nouvel agent hypotensif. Elle a encore pour objet de fournir un procédé 10 de production par fermentation de ce nouvel agent hypotensif. D'autres objets de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit. Les inventeurs ont effectué des recherches poussées et systématiques sur de nombreux produits métaboliques de micro-15 organismes dans le but d'y trouver une substance physiologiquement active, capable d'inhiber l'action de la tyrosine hydroxylase et celle de la dopamine j3 -hydroxylase. Or ils ont constaté qu'une substance capable d'inhiber l'action de ces enzymes est présente dans le bouillon de culture d'une souche de bacté-2) ries Gram négatives qui se présentent sous la forme de bâtonnets, souche qui a été appelée 1° BAC-125. Ils ont réussi à isoler cette substance inhibitrice de l'action des dits enzymes à l'état pur et ont testé les activités physiologiques de cette substance. Ils ont découvert que cette substance est efficace pour diminuer 25 la tension artérielle de rats hypertendus et qu'elle est utilisable comme agent hypotensif pour l'homme et les animaux» Ils ont aussi examiné les propriétés physiques et chimiques de cette substance et ont trouvé qu'il s'agissait d*un composé nouveau auquel ils ont donné le nom de dopastine. 30 Selon Tin des aspects de la présente invention, celle-ci fournit donc une nouvelle substance hypotensive appelée dopastine, qui donne des cristaux incolores de forme aciculaire fondant à une température comprise entre 116 et 119°C, lorsqu'elle est cristallisée par évaporation de sa solution dans un mélange d'-35 acétone et d'hexane ou de benzène et d'hexane, qui est soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, 1' acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le chloroforme et le benzène, mais qui est insoluble dans l'hexane et l'éther de pétrole, dont l'analyse élémentaire donne : C = 49,96 %, H = 40 8,13 % , N = 19,33 % et 0 = 22,67 %, qui est optiquement active 72 111"5 2 2130731 et a une rotation optique ^ = -250°, dans une solution d'é-thanol à 0,5 %, qui est négative à la réaction au chlorure ferrique, à la réaction aux énols, à la réaction au nitroprus-siate, à la réaction de Ehrlich, à la réaction à la ninhydrine 5 et à la réaction de Tollens, mais qui est positive à la réaction de Rydon-Smith, qui inhibe fortement l'action de la tyrosine hydroxylase et de la dopaminé J3 -hydroxylase, qui présente deux absorptions maximales à 213 m p et à 245 m p dans une solution tamponnée au phosphate (pH = 7,0), deux absorptions maximales 10 à 213 mp et 246 mjj lorsqu'elle est dissoute dans une solution aqueuse de soude à 0,01 normal et dans l'eau neutre, et une absorption maximale à 215 m jJ , lorsqu'elle est dissoute dans de l'acide chlorhydrique à 0,01 normal, qui présente des bandes d'absorption dans la zone infrarouge du spectre lorsqu'elle est 15 "pastillée" dans du bromure de potassium, aux nombres d'ondes suivants : en cm-1! 3340, 3050, 2970, 1675, 1635, 1535, 1450, 1425, 1345, 1250, 1225, 1150, 1060, 1045, 1005, 965, 930, 830, 720, et 690, et qui présente une acidité de pKa = 5,2 lorsque sa solution dans de l'acide chlorhydrique à 0,1 noriial est titrée 20 avec une solution aqueuse normale de soude. Dans le dessin annexé : Figure 1 montre trois courbes A-, B et C du spectre d' absorption dans 1'ultra-violet de la dopastine, respectivement en solution tamponnée au phosphate (à un pH de 7,0}, dans une 25 solution aqueuse à 0,01 normal de HC1 et dans une solution aqueuse à 0,01 normal de NaOH ; Figure 2 montre une courbe du spectre d'absorption dans 1'infra-rouge de la dopastine, "pastillée" dans du bromure de potassium. 30 D'autres propriétés physiques et chimiques de la dopas tine sont décrites ci-après. D'après les résultats de l'analyse élémentaire, de l'équivalence de titrage et du spectre de résonance magnétique nucléaire, on peut considérer que la dopastine a pour formule empirique : C^H^N^Oj (calculés pour : 35 C = 50,22 %, H = 7,96 %, F - 19,32 % et 0 = 22,30 %). Comme on peut la voir à la figure 1, la dopastine présente deux absorptions maximales à 213 mjj ^icia = ^40) ^ 245 m jj = 490) dans une solution de 10 g/ml de dopastine, tamponnée au phosphate (pH = 7,0), une absorption maximale à 215 m/ ^ ÎL = 970) dans i 0121 40 une solution de 10 g/ml de dopastine dans HC1 à 0,01 normal et 72 1U4-1 3 2130731 i % deux absorptions maximales à 213 = 830) et 246 m jj y\ C cm. ^1cm = ^00) dans une solution de 10 g/ml de dopastine dans NaOH à 0,01 normal. La dopastine a une nature acide et peut former un sel avec 5 une base minérale ou organique. La dopastine peut être extraite dans l'acétate de butyle à un pH de 2,0, d'où elle peut être transférée dans l'eau à un pH de 8,0. Elle peut être adsorbée par une résine échangeuse d'anions et peut en être extraite au moyen d'une solution aqueuse de HC1 à 0,1 normal. Elle peut être 1 0 adsorbée par le charbon actif et en être extraite au moyen d'une solution aqueuse de HC1 à 0,1 normal ou de MH^OH à 0,1 normal dans ûn méthanol à 50 %. A la chromatographie en couche mince sur gel de silice, la dopastine donne un spot à une valeur Ef de 0,40 lorsqu'elle est développée dans un système solvant 15 constitué par un mélange de chloroforme et de méthanol dans une proportion de 5/1» La dopastine a une nature stable, de sorte que son pouvoir inhibiteur ne diminue pas même lorsqu'une solution aqueuse de dopastine est chauffée à 60°C pendant 39fainutes, à des pH de 2,0, 20 7,0, et 9,0. Parmi les produits du métabolisme des bactéries et autres micro-organismes, on n'a pu trouver, ni une substance ayant pour formule empirique CgH^N^O^ et formant des cristaux qui ont un point de fusion compris entre 116 et 119°C, ni une substance présentant les propriétés chimiques et physiques préci-25 iées. C'est pourquoi il est confirmé que la dopastine est une substance nouvelle qui n'a jamais été connue. Les propriétés pharmacologiques de la dopastine sont les suivantes : La dopastine a une faible toxicité et sa EL^q es^ supérieure 30 à 250 mg/kg lorsqu'elle est administrée à une souris par injection intrapéritonéale. La dopastine a comme activité biologiques celles d'inhiber les actions respectives de la tyrosine hydroxylase et de la dopamine r> -hydroxylase et d'inhiber fortement la biosynthèse de la norépinéphrine, ce qui indique qu'elle est 35 me substance utilisable dans le traitement thérapeutique de 1' hypertension chez l'homme. Les détails des procédés employés pour tester l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'action de la tyrosine hydroxylase et l'étroite relation entre les activités biologiques 40 in vivo et in vitro sont bien décrits dans certaines publications, 72 Î1144 4 2130731 par exemple, "Journal of Antibiotics", 23, 514 (1970) et "J. Am. Chem. Soc'.' 93, 1285 (1971)* L'hydroxylation de la tyrosine constitue la phase limitant le taux dans la biosynthëse de la norépinéphrine. C'est pourquoi l'inhibition de l'action de la 5 tyrosine hydroxylase se traduit par une inhibition de la synthèse de la norépinéphrine in vivo, laquelle amène, à son tour, une diminution de la pression artérielle. En outre, la dopamine-J3 -hydroxylase joue aussi un rôle dans la biosynthèse de la norépinéphrine. En conséquence, lors-que les actions respectives 10 de ces deux enzymes, notamment la tyrosine hydroxylase et la dopanine j^-hydroxylase, sont inhibées, la synthèse in vivo de la norépinéphrine peut être fortement inhibée, ce qui se traduit par une diminution notable de la pression artérielle. L'action de la dopamine J3 -hydroxylase peut être inhibée 15 à 50 % en faisant réagir cet enzyme avec la dopastine à une —6 concentration de 4,7 x 10 moles. L'activité de la tyrosine hydroxylase en présence de la dopastine est mesurée par la méthode décrite dans le "Journal of Antibiotics", 21, 350 à 352 (1968) afin d'évaler ■ l'effet inhibiteur de la dopastine, et on a 20 observé que l'activité de la tyrosine hydroxylase est inhibée à 50 % par une réaction avec 2,5 x 10~^~ moles de dopastine. L' effet hypotensif de la dopastine a été mis en évidence par son administration à des rats génétiquement hypertendus élevés par le prof. Okamoto, à la Faculté de Médecine^ l'Université 25 de Kyoto, Japon. Lorsqu'on fait me injection intrapéritonéale de 10 mg/kg de dopastine à des rats hypertendus ayant une tension artérielle de 170 mm, cette tension, est abaissée à 137-158 mm pendant 3 à 24 heures après l'injection. De même, lorsqu'on fait une injection intrapéritonéale de 40 mg/kg de dopastine 30 à des rats hypertendus dont la tension est de 180 mm, cette tension est abaissée à 137-158 mm pendant 3 à 24 heures après l'injection. Sous un autre de ses aspects, l'invention fournit donc un agent hypotensif nouveau, constitué par la dopastine telle qu' 35 elle a été définie ci-dessus, ou par un sel pharmaceutiquement acceptable de la dopastine, comme ingrédient actif. La nouvelle substance selon l'invention peut être administrée de diverses façons, par exemple, par voie orale, par voie intravaineuse ou par voie rectale. Elle peut donc être présentée sous diverses 40 formes : poudre, comprimés, pilules, cachets, pastilles, solution 72 1114 4 5 2130731 injectable, en suspension, en suppositoires et sous forme de poudre stérile à faire dissoudre dans de l'eau stérile pour donner une solution injectable immédiatement avant usage. Dans les fçrmes solides, on peut mélanger avec la substance active 5 selon l'invention n'importe quel support ou véhiculeur connu pharmaceutiquement acceptable, comme la lactose, l'amidon, on un agent lubrifiant connu, comme le stéarate de magnésium, dans la mesure où il y a compatibilité. La dopastine est la nouvelle substance qui, comme l'ont 110 découvert les inventeurs, existe dans la culture de la souche bactérienne, N°.BAC-125« On a découvert en septembre 1969 que la souche N°.BAC-125 existe dans le coprs du fruit d'un champignon xioamé Crepidotus mollis (Fr.) Kumm.). Cette souche a été isolée du'corps du fruit du champignon, cultivée et appelée 15 souche H°.BAC*125. Une culture de cette souche a été déposée sous le N0 FERM-P 858 à l'Institut de Recherches sur les Fermentations, Agence pour la Science et la Technologie Industrielles, Inage, Chiba city, Japon, en mars 1971* Une autre culture de la souche ïï°.BAC-125 a été déposée sous le U° ATCC. 20 21774 à 1 "'American Type Culture Collection", Washington, D.O., U.S.A. Les propriétés microbiologiques de la souche EF°.BAC-125 sont décrites ci-dessous. Lersqu'on ensemence un bouillon de culture gélosé avec cet-25 te souche, les cellules se présentent sous une-forme ovale, ou sous la forme de bâtonnets, ou, occasionnellement, sous la forme de sphères, et sont séparéôs l'une de l'autre ou groupées comme chez les microcoques. Après une longue période de culture, il se forme une matière visqueuse analogue à de la gélatine. La 30 grandeur de ces cellules est de 0,5 à 0,76 m jj par 0,8 à 1,6 mj! . On observe des granules colorables, mais pas de formation de spores. L'observation au microscope électronique révèle parfois la présence de flagelles et que, dans ce cas, il y a des flagelles polaires. Les cellules bactériennes sont Gram-négatives et réa-55 gissent négativement à la coloration Ziehl-Neelson. Sur une plaque de bouillon de culture gélosé, la colonie a une forme ponctuelle de moins de 1 mm de diamètre, et la croissance est cir-ctilaire, par la tête et les bords ; son aspect est humide, lisse, chatoyant et pratiquement incolore ou translucide, La colonie 40 immergée a aussi une forme ponctuelle. 72 1114 4 e 2130731 Dans une culture gélosée inclinée, la colonie est filiforme, pratiquement incolore, opaque, relevée, humide et chatoyan-te. L0rsque la culture est ancienne, la masse bactérienne est visqueuse. Dans une culture en milieu liquide statique, le milieu 5 devient trouble et il se produit un sédiment visqueux Dans ce milieu de culture liquide statique, il peut se former ocaa-sionnellement une pellicule avec le temps. Dans une culture sur barres de gélatine, le développement est médiocre à la surface du milieu de culture*. mais on n'observe pas de liquéfaction 10 de la gélatine. Dans le lait de tournesol, la colonie se développe sous la forme d'un anneau crémeux et produit des précipités blancs, avec coagulation, mais sans liquéfaction; Onn' observe ensuite pratiquement aucun changement dans la réaction. La souche 1°. BAC-125 produit des nitrites à partir des ri.trates 15 et de l'ammoniaque à partir des peptones. La souche 11° BAC-125 est négative à l'essai au rouge de méthyle, mais décolore ensuite le colorant. Elle ne produit ni acétylméthylcarbinol, ni indol, ni hydrogène sulfuré. En outre, la souche N°. BAC-125 ne produit, ni l'hydrolyse de l'amidon, 20 ni la décarboxylation de la lysine, mais elle utilise l'acide citrique dans le milieu de culture Simmons et Christensen ; La souche N° BAC-125 se développe mal dans un milieu de culture incliné comprenant 1 % de maltose, 0,02 % de chlorure de potassium, 0,1 % de phosphate d'ammonium dihydrogéné, 0,02 % de sulfa-25 te de magnésium et 1,5 % de gélose, et elle fait virer au jaune la couleur du BCP (Pourpe de Bromocrésol). Dans un milieu de culture incliné comprenant 1 % de maltose, 0,02 % de nitrate de potassium, 0,02 % de chlorure de potassium, 0,02 % de sulfate de magnésium et 1,5 % de gélose, la souche N° BAC-125 fait virer 30 au violet la couleur du BCP. Dans les bouillons de culture faits de gélose, la souche ne produit pas de pigments. La souche N°. BAC-125 n'a pas de réaction avec l'uréase, ni avec la cyto-chrome oxydase, mais elle réagit négativement ou positivement avec la catalase. Dans un bouillon de culture liquide statique, 35 la gamme de pH pour permettre la croissance est comprise entre P,0 et 8,0 et celle pour -une croissance optimale est comprise entre 6,0 et 7,0. Dans un milieu de culture comprenant de l'extrait de levure, du phosphate et du glucose, cette souche peut se développer même lorsque le pH est égal à 4,0. Dans un milieu 40 de culture liquide statique, la gamme des températures permettant 72 11144 7 2130731 la croissance est comprise entre 10 et 30°C, mais on n'observe aucune croissance à 37°C. Dans un milieu de culture gélosé incliné, on observe une croissance à 37°C et la gamme de température optimale est comprise entre 25°C et 30°C. On tue la souche 5 si on chauffe à 50°C pendant 10 minutes. Les bactéries de la souche ï.ro. BAC-125 sont du type aérobique et la souche décompose le glucose en acide dans des conditions aérobiques, lorsqu'elle est soumise au test de ferrenbation avec oxydation suivant la méthode de Hugh Leifson. Lorsqu'on ensemence avec la souche H°. 10 BAC-125 une solution aqueuse de peptones contenant du L-arabinose du D-xylose, du D-glucose, du D-mannose, du D-fructose, du D-galactose, du maltose, du saccharose, du lactose, du trehalose, du D-sorbitol, du D-mannitol, de l'inositol, de la gjycérine, de la dextrine ou de l'amidon, le milieu de culture devient 15 faiblement alcalin pendant la culture du micro-organisme sans changer la couleur du tournesol (bleu) et sans dégagement da gaz. On a constaté que la souche N° BAC-125 n'est pas pathogène pour les souris. Etant donné ce qui a été publié dans le "Manual of Deter-20 minative Bacteriology" de Bergey, 7ème édition (1957)» on comparera la souche N°. BAC-125 à des espèces de bactéries connues, qui sont Gram-négatives, se présentent sous forme de bâtonnets et ont des flagelles polaires, mais sans production de spores. Il ressort de cette comparaison que la souche ïï"°. BAC-25 "125 ressemble aux bactéries du genre Pseudomonas et du genre Xanthomonas. Toutefois, la souche ÎT°. BAC-125 diffère des bactéries du genre Xanthomonas en ce qu'elle ne produit ni pigment, jaune, ni hydrogène sulfuré, alors que les bactéries du genre Xanthomonas produisent les deux. C'est pourquoi on croit que la 30 souche N°.BAC-125 serait une espèce très proche du genre Pseudomonas. Comme les bactéries sont susceptibles de subir une mutation artificielle ou naturelle, la souche ÎT* .BAC-125 selon l'invention englobe tous les mutants et toutes leurs variantes, productifs de la dopastine. 35 Dans un autre encore de ses aspects, l'invention fournit un procédé de préparation de la dopastine, qui consiste à cultiver la souche ïf° BAC-125, ou un mutant ou une variante de cette souche capable de produire de la dopastine, dans un milieu de culture contenant -une source de carbone et une source d'azote 40 dans des conditions aérobiques pour produire et accumuler de la 72 11144 8 2130731 dopastine dans le bouillon de culture, puis à récupérer la dopastine contenue dans le bouillon de culture. Dans le procédé selon l'invention, la dopastine peut généralement être obtenue en cultivant la souche productrice 5 de dopastine dans un milieu de culture connu, dans des conditions aérobiques, suivant n'importe quel procédé connu de culture des micro-organismes, de façon que la dopastine soit produite et accumulée dans le milieu de culture. La culture par transferts successifs de la couche productrice de dopastina peut être 10 effectuée dans un milieu de culture comprenant 2,0 % de glucose, 0,3 % d'extrait de levure, 0,5 % de peptone et 1,5% de gélose, et ayant un pH de 5,4. Le milieu de culture de production peut être ensemencé directement avec une culture faite dans ce milieu gélosé, dans le but de produire de la dopastine, bien qu'il 15 soit préférable, d'effectuer une culture préparatoire pour obtenir une "semence" qui sera placée ultérieurement dans le milieu de culture de production. La souche N°. BAC-125 qui produit la dopastine peut se développer à une température aomprise entre 10 et 30°C, mais il est habituellement préférable que la 20 culture ait lieu à une température comprise entre 27°C et 30°C pour la production de la dopastine. Pour cultiver la souche productrice de dopastine, on peut utiliser toutes les sources nutritives connues déjà utilisées pour 3a culture des bactéries et autres micro-organismes. Par exemple, on peut utiliser comme 25 source de carbone : du glucose, du maltose, de la dextrine, de l'amidon, du saccharose, de la glycérine, du galactose et autres produits similaires. On a testé la culture de la souche N°. BAC-125 en utilisant divers hydrates de carbone comme sources de carbone. C'est ainsi qu'on a préparé divers milieux de culture 30 en ajoutant 1,0 % de glucose, de maltose, de dextrine, d'amidon, de lactose, de saccharose, de glycérine, de galactose d'arabinose ou de xylose comme source de carbone à un milieu de base contenant 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % de KH^PO^, 0,1 % de MgSO^^H^O (pH = 6,5), en plaçant 125 cm3 du 35 mélange qui en résulte dans un flacon secoué de 500 cm3 et en stérilisant à 120°C pendant 20 minutes. Après refroidissement, on ajoute à chaque milieu de culture 2,0 % de glucose, puis on ensemence avec la valeur d'une boucle de fil de platine de souche productrice de dopastine. La culture est poursuivie pendant 40 40 heures à une température comprise entre 27 et 30°C, afin d'obtenir 72 11144 9 2130731 une semence. Après avoir inoculé 2 cm3 de cette semence à un milieu de culture de production, la culture est poursuivie pendant 48 heures à 30°C en secouant. Pour déterminer la production et le rendement de dopastine dans le milieu de culture, 5 on dilue le bouillon de culture résultant avec de l'eau de façon à obtenir cinq fois le volume du bouillon, puis on détermine le pourcentage d'inhibition de la dopamine -hydroxylase par ce bouillon dilué en suivant la méthode décrite dans le "Chemical and Pharmaceutical Bulletin", Vol. 17, pages 2377 à 10 2380 (1969). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 1 ci-après. TABLEAU 1 Source de carbone % d'inhibition aucune addition 56,2 15 glucose 70,7 maltose 63,5 destrine 65,6 amidon 60,2 lactose 53,5 20 saccharose 57,0 glycérine 76,2 galactose 69,1 arabinose 49,2 xylose 48,4 25 Comme le montrent les résultats ci-dessus, n'importe la quelle des sources connues de carbone qui sont habituellement disponibles pour la culture des bactéries et autres micro-organismes peuvent être utilisées pour la culture de la souche H°. BAC-125 en vue de la production de dopastine par fermentation. 30 Parmi les sources connues de carbone, le glucose et la glycérine sont celles qui semblent les mieux appropiiées à la production de la dopastine. En outre, on comprendra que des huiles végétales telles que l'huile de soja et.des huiles animales, comme le saindoux peuvent être utilisées, non seulement comme agent antimousse 35 pour un milieu de cul tiare liquide, mais aussi comme parties de la source de carbone pour la souche K°. BAC-125 dans la production de la dopastine. Comme on peut le déduire du fait que la dopastine a pour formule empirique C^H^N^O^, la souche N°. BAC-125 a besoin es-4 0 sentiellement d'une source d'azote pour produire la dopastine. 72 11144 10 2130731 La culture de la souche N°.BAC-125 a fait l'objet d'essais au cours desquels on a utilisé diverses matières aeotées comme source dbzote. C'est ainsi que divers milieux de culture ont été préparés en ajoutant 1,0 % d'extrait de levure, d'extrait de viande, 5 d'extrait de malt, de peptones, d'aminé N-Z, de casamino acide et d'infusion de grains comme source d'azote à un milieu de base contenant, 1,0 % de glucose, 0,2 % de KH^PO^, 0,2 % de K^HPO^, et 0,1 % de MgSO^.711^0, puis en réglant le pH du milieu à 6,5» La stérilisation des milieux de culture ainsi prépa-10 rés, l'ensemencement avec une culture de la souche N°. BAC-125, l'incubation des milieux ensemencés, la détermination de la production de la dopastine et du pourcentage d'inhibition de la dopamine Ji -hydroxylase ont été effectués de la même manière que lors des essais précités relatifs à l'étude des effets 15 des sources de carbone. Les résultats obtenus sont indiqués sommairement dans le tableau 2 ci-aprèso TABLEAU 2 Source d'azote % d'inhibition pas d'addition 0 20 extrait de levure 55,2 extrait de viande 53,3 extrait de malt 23,0 peptones 55,5 aminé N-Z 62,1 25 casamino acide 10,9 infusion de grains 54-,7 A l'examen des résultats ci-dessus, on voit clairement qu'un milieu de culture contenant du glucose comme source de carbone et, comme source d'azote, un ou plusieurs de produits 30 tels qu'extrait de levure, extrait de viande, peptones, aminé N-g et infusion de grains, est préférable pour la culture de la souche N°. BAC-125 en vue de produire la dopastine de la présente invention. Pareillement aux matières azotées précitées, on peut aussi utiliser la farine d'arachides, la farine de graines de coton, 35 la caséine, 1'hydrolysate de caséine et autres similaires comme source d'azote pour la production par fermentation de la dopastine selon l'invention» La souche N° BAC-125 isolée du champignon par les inventeurs peut se développer à une température comprise entre 10 et 40 30°C en culture liquide statique avec un bouillon, et elle peut 72 11144 n 2130731 se développer à une température qui peut atteindre 37°C en culture inclinée sur "bouillon-gélose, ainsi qu'il a été dit plus haut. En vue de&éterminer la température appropriée pour la culture de la souche N°.BAC-125 en vue de la production de do-5 pastine, les essais ci-après ont été effectués. La couche N°.BAC 125 a été cultivée dans un milieu secoué pendant 48 heures à différentes températures indiquées au tableau 5» en utilisant un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % de peptones, 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % de KE^PO^ et 0,1 % 10 de MgSO^^HgO. On a ensuite déterminé de la manière déjà décrite le pourcentage d'inhibition de la dopamine -hydroxylase par le bouillon de culture résultant. Les résultats des essais sont indiqués dans le tableau 3« TABLEAU 3 15 Température (en °C) % d'inhibition 25 4-4,9 27 à 28 50,8 30 58,6 37 10,5 20 A la lecture de ces résultats, on peut voir que la tempé rature qui convient à la production de la dopastine par culture (en milieu secoué) de la souche H"° BAC-125 est comprise entre 27 et 30°Cc Cette souche K"°. BAC-125 peut se développer dans un milieu 25 de culture liquide statique ayant une valeur de pH comprise entre 4,0 et 8,0, si le milieu contient 2,0 % de glucose, 0,5 % de peptones, 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % de KH^PO^ et 0,1 % de MgSO^.THgO. La détermination du pourcentage d'inhibition de la dopamine J® -hydroxylase a été faite de la manière déjà décrite 30 sur des bouillons de culture obtenus par culture statique liquide à des valeurs de pH différentes. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. IL ressort de l'examen de ces résultats que la culture en liquide statique de la souche Hp.BAo-125 peut être effectuée avantageusement à des valeurs de pH comprises entre 5?0 35 et 7,0 en vue de la production par fermentation de la dopastine selon la présente invention. TABLEAU 4 pH % d'inhibition 3 pas de développement 40 4 66,4 72 1 1 144 12 2130731 5 70,5 6 73,0 7 71,3 8 45,5 5 Lorsque la souche productrice de dopastine est cultivée dans des milieux de culture synthétiques, tels que le milieu d'Uschinsky, le milieu de Frahkel, le milieu de Maasen et le milieu de Henneberg, les bouillons de culture qui en résultent présentent une faible activité et inhibent l'action de la dopanti-10 ne j.] -hydroxylase. On peut continuer la culture de la souche productrice de dopastine jusqu'à ce qu'une quantité importante de dopastine ait été produite et se soit accumulée dans le bouillon de culture La dopastine peut ensuite être récupérée ou séparée du bouillon 15 de culture qui la contient par extraction à l'aide d'un solvant organique non miscible avec l'eau dans des conditions acides ou en traitant le bouillon fermenté avec une résine basique échangeuse d'ions pour adsorber la dopastine. La dopastine est, ainsi qu'il a été dit plus haut, facilement soluble dans des 20 solvants organiques comme le butanol, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et le chloroforme, et elle peut être extraite du bouillon fermenté, dans des conditions acides, à l'aide dè l'un ou l'autre de ces solvants. Les coefficients de partage de la dopastine pure entre l'eau et un solvant organique choisi parmi 25 le butanol, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et le chloroforme ont été mesurés en déterminant le pourcentage d'inhibition de la dopamine fa -hydroxylase par chacune de ces phases liqiides<> Les résultats obtenus sont approximativement les suivants : le coefficient de partage est de 27,0 entre le butanol et l'eau, 30 pH 2,0, supérieur à 10,0 entre l'acétate d'éthyle et l'eau, pH 2,0, 9,4 entre l'acétate de butyle at l'eau, pH 2,0, inférieur à 1,0 entre l'acétate de butyle et l'eau lorsque le pH est 8,0 et supérieur à 10,0 entre le chloroforme et l'eau pour un pH de 2,0. 35 Les coefficients de partage ci-dessus montrant que la dopastine a une nature acide. En utilisant cette propriété de la dopastine, on peut la transférer de l'eau dans un solvant organique non miscible avec l'eau mais dans lequel elle est facilement soluble, dans des conditions acides. La solution de dopastine 40 dans le solvant organique peut ensuite être concentrée par dis- 72 11144 13- 2130731 tillation du solvant, étant donné que la dopastine est thermique-ment stable, ainsi qu'il a été dit plus haut. On peut aussi obtenir une solution aqueuse plus concentrée de dopastine en transférant la dopastine du solvant organique dans 1'eau à un 5 pH alcalin, de préférence faiblement alcalin, ou à un pH neutre. On peut concentrer une solution de dopastine jusqu'à l'obtention d'un produit sec en éliminant le solvant par évaporation, de préférence sous une pression, réduite, le résidu obtenu pouvant être ensuite extrait à l'aide d'un solvant organique dans lequel 10 la dopastine est très soluble, comme le méthanol, l'éthanol, 1' acétone et autres solvants similaires. A la solution de dopastine ainsi obtenue, on peut ajouter un diluant ou un solvant organique dans lequel la dopastine est médiocrement soluble, oomme l'éther de pétrole et l'hexane, après quoi on laisse reposer le mélange 15 pour précipiter la dopastine sous forme de cristaux, la dopastine se cristallise difficilement à partir de sa solution brute lorsque celle-ci contient de grandes quantités de contaminants Bans ce cas, toutefois, une solution brute de dopastine dans un solvant organique non miscible avec l'eau, par exemple, l'acétate 20 d'éthyle, l'acétate de butyle ou le chloroforme, peut être purifiée par extraction au moyen d'une solution aqueuse de carbonate de soude ou d'eau avec un pH alcalin, pour transférer la substance active dans la phase eau. La solution aqueuse de dopastine ainsi obtenue peut ensuite être concentrée par distil-25 lation du solvant sous vide, ou ëLle peut être extraite de nouveau avec un solvant organique non miscible avec l'eau à un pH acide pour transférer la substance active dans le solvant organique, opération suivie par la concentration de la solution organique. De cette façon, la dopastine peut se déposer sous la forme 30 d'un produit cristallisé pur. Lorsqu'une solution brute de dopastine contient trop d'impuretés pour permettre la cristallisation de la dopastine, on peut la traiter par chromâtographie. Par exemple, en effectuant la chromatographie sur gel de silice et en effectuant l'élution avec du chloroforme, on peut récupérer effi-35 cacement la dopastine sous une forme extrêmement pure. Etant donné que la dopastine a une nature acide, elle peut être adsorbée par une résine échangeuse d'ions contenant des groupements basiques comme groupements fonctionnels, puis extraite de cette résine par élution. On peut utiliser efficacement une 40 résine échangeuse d'ions basique pour l'isolation et la purifi- 72 1114 4 14 2130731 cation de la dopastine. Par exemple, une résine échangeuse d1 anions fortement "basique, comme celle connue sous le nom commercial de "Dcwex 1 x 2" et produite par la société Dow Chemical Co., U.SoA. (constituée principalement de copolymères du styrène 5 et du divinylbenzène contenant des groupements ammonium quaternaires, comme groupements fonctionnels, cycle OH), peut être utilisée à cet effet. La résine "JJowex 1 x 2" qui a adsorbé la dopastine peut être lavée à l'eau, puis traitée par élution avec de l'acide chlorhydrique à 0,1 normal pour récupérer une 10 très forte proportion de la dopastine adsorbée. En outre, la dopastine peut aussi être adsorbée efficacement par le charbon actif dans des conditions faiblement acides ou faiblement alcalines, puis être extraite par élution dans des conditions acides, par exemple, en utilisant un mélange d'HCl à 0,1 normal 15 et dévolution aqueuse de méthanol à 50 %, ou dans des conditions, basiques en utilisant un mélange de ÏÏH^OH à 0,1 normal et de solution aqueuse de méthanol à 50 %. La dopastine dissoute dans un solvant organique peut être concentrée en éliminant le solvant par distillation sous pression réduite ou par tout autre moyen 20 convenable, mais elle peut être précipitée en diluant la solution au moyen d'un liquide organique dans lequel la dopastine n'est pas soluble ou ne l'est que très faiblement. Etant donné que la dopastine est acide par nature, elle peut être précipitée à partir de sa solution par addition de cations métalliques, tels que 25 Cu+^ et Ca+^ pour former un sel de dopastine qui est moins soluble dans le solvant. Par exemple, lorsqu'on ajoute à une solution de dopastine dans le méthanol une certaine quantité de chaux hydratée dans de l'eau, on obtient un précipité d'un sel de calcium de la dopastine. Le sel précipité peut être extrait au 30 moyen d'un solvant organique dans des conditions acides pour obtenir une forme acide libre purifiée de la dopastine. En général, on peut faire réagir la forme libre ou le sel d'ammonium de la dopastine avec un sel de cuivre tel que CuC^, un hydrate de métal alcalin, comme l'hydrate de sodium et l'hydrate de po-35 tassium, ou un hydrate de métal alcalino-terreux, comme l'hydrate de calcium et celui de magnésium en solution dans l'eau ou dans l'éthanol pour former le sel métallique correspondant de la dopastine. Comme il a été décrit plus haut, la dopastine peut, dans 40 le procédé, selon l'invention, être extraite du bouillon de cul 72 11144 15 2130731 ture de la souche N°.BAC-125 par n'importe quelle méthode connue, par exemple, par extraction à l'aide d'un solvant, par précipitation, par adsorption suivie d1élution et/ou par chromatographie et la dopastine brute peut être purifiée d'une manière connue et 5 cristallisée, si on le&ésire. La dopastine selon l'invention peut être séparée, soit sous forme brute, soit sous forme pure en solution, à l'état solide, brute ou pure, ou à l'état cristallisé pur. En outre, elle peut être obtenue sous la forme d'acide libre ou sous la forme d'un sel d'un métal, en particulier d'un 10 métal alcalin, pharmaceutiquement acceptable. La présente invention est illustrée à l'aide d'exemples qui ne limitent en rien sa portée. Exemple 1 Dans un flacon secoueur d'une contenance de 500 cm3, on 15 introduit 125 cm3 d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % de peptones, 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % de KH^PO^, et 0,1 % de MgSO^^H^O à un pi de 6,0. La stérilisation est effectuée à une température de 120°C et dure 20 minutes. Après avoir refroidi le milieu de culture stérilisé, on l'ensemence 20 avec la valeur d'une boucle de fil de platine d'une culture inclinée sur gélose de la souche N°. BAC-135 productrice de la dopastine (ATCC.21774) et on poursuit la culture avec agitation à une température de 30°C pendant 24 heures pour obtenir une semence utilisée pour la production par fermentation de la dopastine. Dans 25 57 flacons secoueurs d'une contenance de 500 cm3, on introduit une quantité d'un milieu de culture stérile ayant la même composition que celle indiquée plus haut, puis on ensemence chaque flacon avec 20 cm3 de la semence obtenue. La culture est poursuivie à 30°C pendant-48 heures et on obtient au total 6,9 litres d'un 30 bouillon de culture contenant 130 mg/litre dedopastine et dont les .cellules bactériennes n'ont pas été séparées par filtration. On règle le pH du bouillon de culture à 2,0 en ajoutant de l'acide chlorhydrique à 2,0 normal, puis on extrait par deux fois avec 3,5 litres d'acétate de butyle. On mélange les produits des deux 35 extractions et on procède à une nouvelle, extraction avec 3,5 litres d'une solution aqueuse de carbonate de soude à 0,5 % de façon à transférer la dopastine, ou substance active, dans la solution de carbonate. On règle à 2,0 le pH de la solution dans laquelle la dopastine a été transférée en ajoutant de l'acide ehlorhydri-40 que à 2,0 normal, puis on extrait par deux fois avec 1,7 litre 72 1114-1 16 2130731 d'acétate de butyle. On mélange les produits de cex deux extractions, puis on concentre ce mélange jusqu'à l'obtention d'un produit sec, par distillation sous vide ; on obtient 1,9 g d'une masse sirupeuse, visqueuse, de couleur brune, qui contient 5 de la dopastine. Cette matière est ensuite traitée par chromatographie en colonne sur gel de silice, puis extraite par élution au moyen d'un mélange liquide de 100 parties de benzène pour 15 parties de méthanol. Les fractions actives (dans chacune desquelles la présence de dopastine est confirmée par la chromatographie 10 en couche mince, sur gel de silice, suivie d'une coloration et d'une détection d'un spot correspondant à celui de la dopastine) sont mélangées et concentrées jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation sous pression réduite ; on obtient 998 mg d'une matière visqueuse, sirupeuse, de couleur brune. On traite 15 de nouveau cette matière par chromatographie dans une colonne de gel de silice d'un volume de 50 cm3 et on extrait par élution snrec du chloroforme. Les fractions actives de l'éluat dans lesquelles la présence de dopastine a pu être confirmée sont mélangées et le mélange est concentré jusqu'à l'obtention d'un 20 produit sec par évaporation du solvant sous une pression réduite, on obtient ainsi mg d'une substance cristallisée, légèrement colorée en jaune. On fait dissoudre cette substance dans un petit volume d'acétone et, à la solution qui en résulte, on ajoute goutte à goutte du n-hexane jusqu'à ce qu'il se produise un léger 25 trouble. On refroidit le mélange, puis on le laisse reposer, et on obtient ainsi 260 mg de dopastine sous la forme d'aiguilles incolores dont le point de fusion est compris entre 116 et 119°C. Exemple 2 La culture de la semence de la souche N° . BAC-125 (ATCC. 30 21779) s'effectue de la même manière qu'à l'exemple 1, en vue de la production de dopastine par fermentation. On obtient 9,2 litres de bouillon de culture dont on règle le pH à 2,0 par addition d'acide chlorhydrique à 2,0 normal, puis on procède à 1' extraction avec 9,2 litres de butanol. 0& concentre l'extrait 35 jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation du solvant sous une pression réduite et le résidu obtenu est placé dans 30 cm3 de méthanol. La matière insoluble est séparée par filtration et le filtrat est concentré jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation sous pression réduite. On obtient 13,8 g d'une 40matière de couleur frEune. Cette matière est placée dans 10 cm3 72 11144 17 2130731 de méthanol, puis on ajoute 100 cm3 d'eau» On fait passer cette solution à travers une colonne de 300 cm3 chargée de résine échangeuse d'anions "Dowex 1 x 2" (cycle OH) pour procéder à sa chromatographie. On lave ensuite la colonne avec 300 cm3 d' 5 eau, puis on lait passer 400 cm3 d'HCl à 0,1 normal pour extraire la dopastine» le pH de l'éluat est réglé à 2,0 par addition d'acide chlorhydrique à 2,0 normal, puis on extrait avec 400 cm3 de butanol. On concentre l'extrait jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation sous pression réduite, ce qui laisse 10 3,0 g d'une matière de couleur brune. Cette matière est traitée par chromatographie sur gel de silice dans une colonne d'un volume de 100 cm3, puis on extrait par élution avec un solvant constitué par 50 parties de benzène pour 1 partie de méthanol» La présence de dopastine dans chaque fraction de l'éluat .est 15 confirmée par chromatographie en couche mince sur gel de silice et les fractions actives qui contiennent le moins d'impuretés sont mélangées ; on concentre ce mélange jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation du solvant sous une pression réduite. Le résidu obtenu est ensuite cristallisé par évaporation 20 de sa solution dans un mélange d'acétone et de n-hexane de la méfie manière qu'à l'exemple 1 et on obtient 71,1 mg de dopastine sous la forme d'aiguilles incolores dont le point de fusion est compris entre 116 et 119°C, Les fractions actives dans lesquelles des quantités plus importantes d'impuretés ont été ob- 29 servées sont mélangées et le mélange est concentré jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation du solvant sous une pression réduite. On mélange le résidu obtenu avec la liqueur mère à partir de laquelle on a cristallisé la première récolte de dopastine* Ce mélange est traité par chromatiographie en colon- 30 ne sur gel de silice de la même manière qu'à l'exemple 1» On obtient 90 mg de dopastine cristallisée sous la forme d'aiguilles incolores, comme seconde récolte. Exemple 3 Dans un fermentoir d'une contenance de 30 litres équipé 35d'un agitateur, on verse 16 litres d'un milieu de culture ayant la même composition que celui utilisé à l'Exemple 1 et 10 ml d'un agent antimoussant du type silicones. On stérilise à 120°C pendant 20 minutes. Après refroidissement, on ensemence le milieu stérile avec 500 cm3 de la semence utilisée à l'exemple^. L'incubation 40 a lieu à une température de 30°C, l'agitateur tournant à une 72 11144 18 2130731 vitesse de 250 t/m et on. ventile à raison de 16 litres/minute. À mesure que la fermentation avance, la teneur de sucres (mesurée par le procédé Anthrone) diminue dans le milieu de culture, le volume des cellules (mesuré par l'adsorption à 660 m/) augmente, 5 la quantité de dopastine produite (mesurée par le pourcentage d'inhibition de la dopaminej3-hydroxylase par des liqueurs préparées en diluant des échantillons prélevés dans le bouillon de culture avec de l'eau de façon à quintupler leur volume) augmente aussi et le pH du bouillon de culture change. Les résultats 10 sont consignés dans le tableau 5» TABLEAU 5 Teups de culture (heures) Teneur totale des sucres restants (%) O.D» (à 660 m^) % d'inhibition de la dopamine P-hydroxylase pH 16 2,20 0,245 5,2 5,4 24 2,10 0,712 8,3 5,5 40 1,60 5,73 50,9 4,6 48 0,60 8,34 59,0 3,4 64 0,06 9,71 72,6 5,4 Après 64- heures de culture on ajoute au bouillon de 20 culture obtenu (qui contient 155 mg/î- de dopastine) 160 g de charbon actif et on agite pendant 30 minutes environ. On élimine ensuite le charbon actif par filtration, on lave avec 10,0 litres d'eau puis oijéxtrait par élution avec 4,0 litres d'une solution aqueuse à 0,2 normal de NH^OH (contenant 50 % méthanol), puis 25 on recommence par daux fois avec une solution aqueuse à 0,1 normal de BH^OH (contenant 50 % de méthanol). On obtient au total 11,5 litres d'éluat. On règle le pH de l'éluat à 2,0 par addition d'acide chlorhydrique à 2,0 normal et on extrait par deux fois avec 5,0 litres d'acétate de butyle, on extrait de nouveau la 30 phase acétate de butyle avec 2,0 litres d'eau à un pH de 8,0 pour transférer la dopastine dans la phase eau. La solution aqueuse est amenée à un pH de 2,0 par addition d'acide chlorhydrique à 2,0 normal et on extrait par deux fois avec 1,0 litre d'acétate de butyle. On concentre la phase acétate de butyle 35 jusqu'à l'obtention d'un produit sec par évaporation du solvant sous pression réduite et on obtient alors 4,8 g d'une matière de couleur brune. On traite cette matière brune par chromatographie en colonne sur gel de silice (volume de la colonne 300 cm3) le gel étant imprégné de benzène. On fait passer tout d'abord 40 800 cm3 de benzène à travers la colonne, puis on fait passer un 72 11144 19 2130731 mélange de 100 parties de benzène pour 15 parties de méthanol pour en extraire la dopastine. Au cours de cette élution, on retient les fractions obtenues entre le moment où 2,0 litres d'éluat se sont écoulés hors de la colonne et celui où 2,3 5 d'éluat se sont écoulés. On mélange entre elles les fractions d'éluat contenant de la dopastine et on concentre jusqu'à l'obtention d'un produit sec, par évaporation sous pression réduite. On obtient ainsi 2, 4 g d'une matière solorée. On traite cette matière par chromatographie en colonne (100 cm3) 10 sur gel de silice et on extrait avec du chloroforme. Pendant 1'élution, on conserve les fractions obtenues entre le moment où 400 cm3 d'éluat se sont écoulés hors de la colonne et celui ou 500 cm3 d'éluat se sont écoulés. On mélange entre elles les fractions actives et on concentre le mélange jusqu'à l'ob-15 tention d'un produit sec par évaporation sous pression réduite. On obtient ainsi 1,1 g d'une substance légèrement colorée en jaune. On verse cette substance dans un faible volume d'acétone et on ajoute goutte à goutte à la solution ainsi obtenue une certaine quantité de n-hexane, puis on laisse refroidir. On laisse 20 reposer la solution refroidie et on cristallise la dopastine par évaporation,, On obtient 485 mg de dopastine sous forme d' aiguilles incolores dont le point de fusion est compris entre 116 et119°0. 72 11144 20 2130731 REVENDICATIONS 1. - Substance hypotensive appelée dopastine, caractérisée en ce qu'elle est cristallisable sous forme d'aiguilles incolores dont le point de fusion est compris entre 116 et 119°C 5 par évaporation de sa solution dans un mélange d'acétone et d' hexane ou de benzène et d'hexane, en ce qu'elle est soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, 1' acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le chloroforme, et le benzène, mais insoluble dans 1'hexane et l'éther de pétrole, 10 en ce que son analyse élémentaire donne C - 49,96 %, H = 8,13 % N = 19,33 %, 6 = 22,67 %, en ce qu'elle est optiquement active, avec une rotation active = -250° en solution dans de l'éthanol, à 0,5 %, en ce qu'elle se comporte négativement dans la réaction avec le chlorure ferrique, dans la réac-15 tion avec les énols, dans la réaction avec le nitroprussiate, dans la réaction d'Ehrlich, dans la réaction avec la ninhydrine et dans la réaction de Tollens, mais positivement dans la réaction de Rydon-Smith, en ce qu'elle inhibe fortement les actions respectives de la tyrosine hydroxylase et de la dopamine 20 J^-hydroxylase, en ce qu'elle présente deux absorptions maximales à 213 m/J et 246 mp dans sa solution dans l'hydrate de sodium aqueux à 0,01 normal et dans l'eau neutre et me Absorption maximale à 215 mjl en solution dans l'acide chlorhydrique à 0,01 normal, en ce qu'elle présente des bandes d'absorption 25 caractéristiques dans 1'infra-rouge du spectre lorsqu'elle est pastillée dans du bromure de potassium, aux nombres d'onde ci-après, en cm-1 : 3340, 3050, 2970, 1675, 1635, 1535, 1450, 1425, 1345, 1250, 1225, 1150, 1060, 1045, 1005, 965, 930,8^0, 720, et 690, et en ce qu'elle présente une acidité de pKà )= 5,2 30 lorsque sa solution dans de l'acide chlorhydrique à 0,1 normal est titrée avec une solution aqueuse normale d'hydrate de sodium. 2o - Substance hypotensive selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'aiguilles 35 incolores dont le point de fusion est compris entre 116 etH9°C» 3. - Substance hypotei±sive selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme de son sel avec un métal pharmaceutiquement acceptable. 4o - Procédé pour la préparation d'une substance hypotensive 40 appelée dopastine selon la revendication 1, caractérisée en ce 72 11144 21 2130731 qu'il consiste à cultiver la souche N°.BAC-125, identifiée sous le F° ATCC.21774 ou un mutant ou une variante de cette souche, producteurs de dopastine, dans un milieu de culture contenant une source de carbone et une source d'azote, dans des conditions 5 aérobiques, pour produire et accumuler la dopastine dans le bouillon de culture, puis à récupérer la dopastine contenue dans ledit bouillon. p. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce quçda culture de la souche H° BAC-125 est effectuée à line tempé-10 rature comprise entre 27 et 50oCo b. - Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que la culture de la souche N°.BAC-125 est effectuée à un pH compris entre 5,0 et 7,0. 7. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce 15 que le bouillon de culture contenant la dopastine est traité par extraction avec un solvant organique non miscible avec l'eau dans des conditions acides pour récupérer la dopastine. 8o - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le bouillon de culture contenant la dopastine est traité par 20 extraction avec un solvant organique non miscible avec l'eau, dans des conditions acides, et en ce que l'extrait organique obtenu est traité de nouveau par extraction avec de l'eau, dans des conditions neutres ou f^aiiement alcalines pour transférer la dopastine de la phase organique dans la phase aqueuse. 25 9- - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le bouillon de culture contenant la dopastine est traité avec une résine basique échangeuse, d'anions pour adsorber et séparer la dopastine du bouillon de culture, en vue de récupérer la dopastine. 50 10. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le bouilloncfe culture contenant la dopastine est traité avec du charbon actif pour adsorber et séparer la dopastine du dit bouillon de culture en vue de récupérer la dopastine. 11 « - Jtgent hypotensif contenant de la dopastine selon la 35 revendication 1 ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci comme ingrédient actif.