Brevet FR2133504A1 — publié le 19721201

La présente invention concerne la possibilité d'utiliser la lignée cellulaire dite IB-RS-2 pour la production de virus destinés à la préparation de vaccins. La cellule IB-RS-2 a été isolée à l'institut de Biologie de Sao Paulo et presentée par Mme Maria PEREIRA de CASTRO au 14e Congrès annuel de la "Tissue Culture Association"à Boston les 28, 29 et 30 mai 1963. Elle a été décrite par l'auteur dans - la revue ARQ. INST. BIOL. SAO PAULO (37 (2), 103-127, 1970; 34, 223-241, 1967; 285-294, -; 295-299, -; 31 (3), 63-78, 1964; 31 (4) 155-166, 1964). Cette lignée cellulaire est issue d'une culture primaire présentant un karyotype normal de femelle (karyotype O) constitué de 38 chromosomes groupés comme suit : Z G-I, 2 G II, 2 G III-1, 2 G 111-2, 14 G IV (chromosome de sexe inclus) 4 C V, 2 G VI, 4 G VII, 2 G VIII-l, 4 G VIII-2. L'auteur a décrit dans le détail (ARQ. INST. BIOL. SAO PAULO 37 (2) 1O3-127, 1970)- les diverses possibilités de réarrangements chromosomiques qui ont pu se produire au cours de l'évolution de la lignée cellulaire IB-RS-2. Il est à noter que tous les clones cellulaires étudiés et décrits jusqu'à maintenant par l'auteur se caractérisent par le respect des ss oupes 2 G I, 2 G II, 4 G V, 4 G VII, 4 G VIII-2 alors que tous présentent une modification dans le groupe 2 G 2 qui devient 1 G III-2. Par divers réarrangements le nombre total de chromosomes peut varier, suivant les clones cellulaires étudiés, entre 37 et 38 chromosomes. Ces caractéristiques chromosomiques correspondent aux clones déjà décrits et actuellement utilisés, mais n'est pas exclue pour autant la possibilité d'utiliser d'autres clones issus de la lignée IB-RS-2 et comportant des réarrangements chromosomiques différents. Cette lignée cellulaire dite IB-RS-2 peut être multipliée dans les divers milieux utilisés pour la culture cellulaire : milieu synthétiqUe type 199 ou milieux à base d'extraits de levure et hydrolysats de caséine ou de lactalbumine. Son taux de multiplication est élevé et peut atteindre un facteur de 10 entre chaque subculture en monocouche. La demanderesse a trouvé que la cellule IB-RS-2 peut être cultivée en suspension.Cette culture peut être réalisée dans tout fermenteur utilisé pour la culture cellulaire-t équipé de systèmes d'agitation et d'aération. Divers milieux peuvent être utilisés, qui sont à base d'acides aminés et de vitamines, à base d'hydrolysats de protéines et d'extraits de levure. Dans les deux cas > on ajoute un sucre et un milieu physiologique tamponné. Pour les cultures en monocouches ou en suspension, on ajoute aux milieux de culture classiques 5 à 10 % de sérum de veau ou de porc. La demanderesse a de plus montré que la cellule IB-RS-2 multipliée en monocouche ou adaptée à la culture en sus pension est démunie de pouvoir tumorigène pour le hamster Des hamsters ont été inoculés dans la poche jugale avec respectivement 10 x 106y 2 x 106 > 1 x 106 et 1 x 105 cellules vivantes. Un petit nodule se développe dès le Sème jour après inoculation de 10 x 10 cellules et disparaît progressivement à partir du poème jour. Ce nodule est imperceptible après 1 mois et a disparu complètement après 2 mois. Avec les concentrations inférieures:2 x 106 et en dessous, il n'y a aucun nodule meme à 5 jours. D'autre part, on a rapporté (S.S. Breese-; Archiv. fur die Gesamte Virusforschung 30, 401-404, 1970) que la cellule IB:RS-2, de même que la lignée cellulaire porcine PK 15,contiennent- des particules ressemblant à des virus, ayant un diamètre moyen extérieur de 90 m,p et un noyau central de 60 m/u. Ces particules ressemblent à celles décrites pour la lignée cellulaire BHK 21. L'invention a principalement pour objet l'emploi de la cellule IB-RS-2 pour la multiplication de divers virus et la préparation de suspensions virales utilisées soit à des fins de diagnostic, soit pour la-prépara- tion de vaccins. Les chercheurs de 1'Institut de Biologie de Sao Paulo qui ont isolé la lignée cellulaire IB-RS-2 ont déjà décrit la sensibilité des divers clones de cette lignée cellulaire au virus aphteux : (ARQ. INST. BIOL. SAO PAULO, 31 (3), 63-78, 1964; 31 (4) 155-166, I964; 37 (2) 103-127 > (1970). La demanderesse a trouvé que la cellule pouvait être utilisée pour la multiplication du virus aphteux, et la préparation de suspensions virales qui, après inactivation, constituent un vaccin antiaphteux conférant une très bonne immunité à l'espèce porcine (demande de brevet 70-17 053 du 11 mai 1970). On a maintenant trouvé que ce vaccin confère aussi une bonne immunité à l'espèce bovine. On a également trouvé que la cellule IB-RS-2 peut être utilisée pour la multiplication de divers virus tels que le virus de la maladie de Newcastle, le virus de la peste porcine. Cette lignée cellulaire est également sensible au virus para-influenza, Ia présence du virus étant décelée par hémadsorption. En outre, et au même titre que d'autres lignées cellulaires ou cultures primaires de reins de porc, la lignée IB-RS-2 peut servir' due substrat pour la multiplication du virus de la gastro-entérite infectieuse. Cette liste de virus, susceptible de se multiplier sur les cellules de la lignés IB-RS-2 > n'est pas limitative. L'origine porcine de la cellule IB-RS-2 fait qu'elle convient particulièrement bien à la multiplication de tous les virus provoquant des maladies chez cette espèce animale; les suspensions Virales obtenues permettent la préparation de vaccins ne présentant pour l'espèce porcine. aucun des dangers de sensibilisation consécutifs à l'emploi de cellules hétérologues. La demanderesse a maintenant trouvé que la cellule IB-RS-2 est porteuse à l'état permanent d'un virus atténué de la peste porcine, que ce virus est exempt de tout pouvoir pathogène pour le porc mais peut lui conférer une immunité spécifique élevée, le protégeant complètement contre une épreuve virulente de la peste porcine. Ce virus atténué existe dans les cellules intactes (virus intra-cellulaire) et peut être récupéré par lyse cellulaire obtenue par les moyens physico-chimiques connus. Le virus existe également dans le liquide de culture de la cellule IB-RS-2. L'invention a donc également pour objet l'emploi de ce virus comme souche vaccinale (vaccin vivant atténué). Les exemples 1 et 2 suivants illustrent la préparation de vaccins inactivés de la fièvre aphteuse et de la maladie de Newcastle. Les exemples 3, 4 et 5 illustrent l'emploi du virus atténué se trouvant dans les:cellules IB-RS-2, comme souche vaccinale contre la peste porcine. EXEMPLE 1 Préparation d'un vaccin antiaphteux conférant une bonne immunité à l'espèce bovine. La cellule IB-RS-2 est multipliée en monocouche sur flacons roulants de 1 litre. L'inoculum cellulaire peut être de 100 à 300 mille cellules par ml. Le milieu de culture utilisés raison de 100à 200 ml pour un flacon de 1 litre, est composé d'une base saline de Hanks additionnée de 2,5 % d'hydrolysat de lactalbumine, de 0,5 % d'extrait de le ure et de 5% de sérum de veau. La culture cellulaire se développe pendant 4 à 5 jours. On élimine le liquide de culture et le remplace par 50 ml de liquide de culture de même formule contenant le virus inoculum. Le, virus inoculum est préparé à partir de virus aphteux provenant de bovins, multiplié par plusieurs subcultures sur la cellule IB-RS-2. Le nombre de subcultures virales peut être de 2 à 20. Après 16 à 24 h de culture virale le tapis cellulaire est totalement détruit; on récolte le virus, le stérilise bactériologiquement par filtration ou moyens chimiques, l'inactive par un agent d'inactivation reconnu valable pour le virus aphteux par la demanderesse (Durand M.; Bull. Off. Int. Epiz. 69 (3-4) 429-465, 1968). Dans l'exemple cité on a inactivé le virus aphteux par le glycidaldéhyde à 0,05 /00 agissant à la température de 25"C pendant 16 h. Le virus ainsi inactivé a été mélangé à des adjuvants d'immunité qui étaient de l'hydroxyde d'alumine à 2%(exprimé en A1203),à raisonde 25% volume/volume et de la saponine (0,06 % poids/volume). Le vaccin,formulé sous un volume de 5 ml par dose trivalente, a été inoculé à 15 bovins sous un volume de 1,25 ml, correspondant à 1/4 de la dose bovine, préconisée par la demanderesse. Plus de 50% des bovins ont été protégés contre la généralisation provoquée par l'épreuve virulente à l'aide de 10.000 doses infectieuses 50% de chacun des trois types de virus aphteux européens 0, A et C Type O : 3 animaux protégés sur 5; Type A : 5 animaux protégés sur 5; Type C : 5 animaux protégés sur 5. EXEMPLE 2 Préparation d'un vaccin contre la maladie de Newcastle. La demanderesse a démontré que la cellule IB-RS-2 est particulièrement sensible au virus de la maladie de Newcastle Un stock virus provenant de liquide allantorque d'oeuf embryonné a été titré sur oeuf embryonné, sur cellule IB-RS-2 et sur cellule BHK-21. Pour chaque dilution, la présence du virus a été déterminée par la recherche de lteffet cytopathogène pour les cellules, et par le pouvoir hémagglutinant des liquides de culture cellulaire et du liquide allantoique. Le titre infectieux a été calculé par la méthode des totaux cumulés, d'après REED et MUNCH. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant Titre déterminé par: Effet cytopathogène Pouvoir hémagglutinant BHK 107,83 îo 107 > 83 IB-RS-2 108,5 1o8,5 Oeuf embryons - 108,6 Un virus virulent, sous forme de liquide aîlantoique d'oeuf embryonné infecté} a été multiplié sur des monocouches de cellules IB-RS-2, en vue de l'obtention d'antigène destiné à la préparation de vaccin inactivé. La demanderesse a d'abord trouvé que le virus inoculum (liquide allantoique infectieux) devait être dilué à un taux convenable pour éviter les phénomènes d'auto-interférence et obtenir un taux optimal de multiplication virale. Le tableau ci-dessous montre que la dilution de 10-4 est très favorable à l'obtention d'un taux élevé de multiplication virale. Dilution du Inoculum conservé 48 h Liquide virulent IB-RS-2 virus dans à 37 C récolté après 48 h. l'inoculum Effet létal Effet cyto- Pouvoir Effet létal Effet cyto- Pouvoir 50% pour pathogène hémagglu- 50%pour l'oeuf pathogène aggluti l'oeuf 50% pour la tinant embryonné 502 pour nant embryonné cellule cellule BHK 21 BHK 21 10-I 107,5 105'5 1/256 107,1 105,1 1/256 10-2 105,8 104,2 1/128 75 lo6 1/128 10-3 n.d. 103 1/4 n.d n.d 1/128 10-4 103 101,8 107,9 106,5 1/128 n.d = non déterminé. Des flacons roulants portant une monocouche de cellules IB-RS-2 ont été ensemencés avec 50 ml de milieu de culture contenant comme virus inoculum un liquide allantoîque virulent dilué à 10-4, et dont le titre infectieux était de 104,5 pour l'oeuf embryonné. Le même virus dilué à 10-4 dans un liquide de culture a été d'autre part inoculé à une série d'oeufs embryonnés de 13 jours, par la voie allahtotque. On a récolté, après 48 h les deux liquides virulents et on les a comparés d'après les tests décrits précédemment. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant, Liquide allantoîque Liquide de culture IB-RS-2 Pouvoir hémagglutinant l/8000 1/500 Effet cytopathogène 50% pour les cellules IB-RS-2 107,5 107,5 Effet létal 50% pour l'oeuf embryonné 108,5 108,6 Ces résultats montrent que la cellule IB-RS-2 constitue un excellent substrat pour la multiplication du virus de la maladie de Newcastle et que, sans adaptation préalable, lors de la première culture sur cette lignée, on peut obtenir un liquide virulent possédant le, même pouvoir infectieux qu'un liquide allantoSque. Les deux préparations virales ainsi obtenues ont été inactivées par la P-propiolactone, puis additionnées d'hydroxyde d'alumine à 2% (exprimé en AI 203) à raison de 50% en volume sur volume. On obtenait deux vaccins qui furent inoculés respectivement à des lots de poulets à raison de I ml par poulet par voie sous-cutanée. Trois semaines plus tard, les animaux furent éprouvés par lots de 10 avec diverses dilutions de virus de Newcastle (de 10 La lO ). Dans les deux cas, correspondant respectivement à chacun des vaccins, la totalité des animaux ont été protégés alors que les témoins succombaient à la maladie provoquée. On a également montré qu'il est possible d'utiliser la cellule IB-RS-2 pour la multiplication des virus atténués de la maladie S ewcasFle tels que le virus Hitchner B1. Dans ce cas l'effet cytopathogène est modéré mais le titre calculé par la recherche du pouvoir hémagglutinant est appréciable sur cellule IB-RS-2 = titre infectieux 10 4 > 83 sur cellule BHK-21 = titre infectieux 10 EXEMPLE 3 Utilisation du liquide de culture de la cellule IB-RS-2 comme vaccin vivant contre la peste porcine. Un lot de 10 porcs reçoit 5 ml de liquide de culture décrit dans l'exemple 1 et ayant servi à la multiplication de la cellule IB-RS-2 en monocouche. Pendant une durée d'observation de 25 jours, aucun animal ne présente d'élévation thermique. A la fin de cette période les porcs sont éprouvés avec 1 ml de sang virulent de porc prélevé lors de la virémie, et dilué à 1/10e. Après épreuve les animaux sont conservés en observation durant 15 jours. Aucun de ces animaux nta présente d'élévation thermique significative, ni aucun signe de la maladie peste porcine. EXEMPLE 4 Utilisation des cellules IB-RS-2 vivantes comme vaccin vivant contre la peste porcine. 10 animaux sont vaccinés dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4 avec 10.106 cellules IB-RS-2 vivantes par animal. La tolérance a.-été parfaite, aucune élévation thermique significative durant les 24 jours d'immunisation. La protection-contre l'épreuve virulente exécutée comme à l'exemple 4.-a été totale. EXEMPLE 5 Utilisation des cellules IB-RS-2 lysées comme vaccin vivant copte la peste porcine. Un lysat obtenu-par congélation et décongélation de cellules IB-RS-2, mélangé avec du liquide de culture été soumis à la lyophilisation. Le .produit obtenu constitue un vaccin vivant contre la peste porcine. Afin de déterminer son titre protecteur et sa tolérance, ce vaccin a été inoculé, aux dilutions de 10-1 à 10-5, à des lots de 5 porcs. Pendant la durée d'immunisation, aucun ?nimaln'a présenté d'élévation thermique significative. Par la suite, les animaux ont été éprouvés par 1 ml de sang virulent. On a ainsi calculé-le pouvoir protecteur qui a été trouvé égal à 10 4. Le vaccin contient-donc 104 particules immunisantes. REVENDICATIONS 1 - Procédé de culture de virus, caractérisé par le fait qu'on utilise comme cellules-hotes, une lignée de cellules de reins de porcs isolée et conservée à l'Institut de Biologie de Sao Paulo, et désignée sous le nom de cellule IB-RS-2, multipliée en monocouches ou adaptée à la culture en suspension. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le virus cultivé est le virus de la peste porcine pré-existant dans la cellule IB-RS-2. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le virus cultivé est le virus de la maladie de Newcastle. 4 - Procédé de préparation d'un vaccin inactivé de la fièvre aphteuse destiné à l'espèce bovine, caractérisé par le fait qu'on cultive le virus sur cellule IB-RS-2 selon la revendication 1, qu' on inactive la suspension virale obtenue par un procédé connu en soi et qu'on y ajoute des adjuvants d'immunité connus en eux-mêmes. 5 - Procédé de préparation d'un vaccin inactivé de la maladie de Newcastle, caractérisé par le fait qu'on cultivessur sur cellule IB-RS-2 selon la revendication 1, un virus virulent de la maladie de Newcastle, qu'on inactive la suspension virale obtenue par un procédé connu en soi, et qu'on y ajoute des adjuvants connus en eux-mêmes. 6 - Procédé de préparation d'un vaccin vivant de la maladie de Newcastle, caractérisé par le fait qu'on cultive,sur cellule lB-RS-2 selon la revendication 1, un virus atténué de la maladie de Newcastle. 7 - Procédé de préparation d'un vaccin contre la peste porcine du type vaccin vivant atténué, caractérisé par le fait qu'on cultive, en monocouche ou en suspension, la cellule IB-RS-2 et qu on recueille1 éventuel- lementr après lyse des cellules, le liquide de culture qui contient un virus atténué de la peste porcine. 8 - Vaccins préparés selon l'une des revendications 4 à 7.