Brevet FR2132080A1 — publié le 19721117

La présente invention se rapporte à la fabrication de produits présentant une activité enzymatique et elle concerne plus particulièrement la fabrication de tels produits insolubles en milieu aqueux. 5 Les réactions enzymatique s, notaiôraant les hydrolyses p-.r voie enzymatique, sont généralement conduites à l'aide d'un ou plusieurs enzymes en solution dans le railisu co^tena^t la substrat. Par le terme "substrat" on entend désigner, dans 1''exposé qui suit, la substance que l'on désire soumettre à l'action de l'enzyme. lO Lorsque l'enzyme est en solution dans le milieu réactionnei, il ne peut être que très difficilement isolé du substrat et il est généralement nécessaire, lorsqu'on désire arrêter la réaction, d*inactiver l'enzyme, par exemple par chauffage, et par conséquent l'enzyme ne peut être récupéré. 15 Afin de remédier à ces inconvénients, on a proposé un cer tain nombre de procédés de préparation de produits insolubles dans l'eau et présentant une activité enzymatique. Les réactions enzy-matiques effectuées à l'aide de ces produits peuvent être conduites soit par percolation du substrat au travers d'une colonne gar-20 nie de produit insoluble, soit par dispersion du produit dans la solution contenant le substrat et séparation mécanique du produit insoluble, par exemple par filtratiç>n ou centrifugation. Parmi les procédés de préparation d'enzymes insolubilisés connus, on peut citer 1'adsorption de 1'enzyme sur un support in-25 soluble, son encapsulation dans un réseau de polymère, sa réticu-lation à l'aide de substances bi-fonctionnelles, et sa fixation par liaison covalente sur un support insoluble. Les produits obtenus par adsorption de l'enzyme sur un support insoluble présentent l'inconvénient d'être peu stables. Les 30 enzymes encapsulés dans un réseau de polymère possèdent une bonne stabilité mais ne présentent qu'une activité limitée vis-à-vis des substrats dont les molécules ont des dimensions comparables à celles des mailles du réseau. Enfin, les méthodes d'insolubili-sation par réticulation mettent en jeu un nombre plus élevé de 35 liaisons et nécessitent fréquemment la protection préalable des groupes actifs de l'enzyme. De plus, les procédés d'insolubilisa-tion par réticulation ne permettent pas d'obtenir de façon simple 72 10644 2 2132080 des produits sous forme de billes ou de granules dont les dimensions sont adaptées à des modes de séparation mécanique définis. Les méthodes consistant à fixer un enzyme sur un support insoluble par liaison covalente, notamment sur un polymère insolu-5 ble dans l'eau, nécessitent généralement de coûteux traitements préliminaires des supports tels que la mise en place de groupes réactifs intermédiaires, par exemple par diazotation, ou la mise en oeuvre de copolymères.De plus, la nature des liaisons entre le support et l'enzyme porte fréquemment atteinte à l'intégrité des 10 groupes actifs de l'enzyme et il s'avère nécessaire de protéger ces derniers par un traitement préalable de l'enzyme. La présente invention se rapporte essentiellement à un produit insoluble possédant une activité enzymatique, obtenu par fixation d'un enzyme sur un polymère insoluble dans l'eau selon un 15 processus particulièrement simple. Elle a trait notamment à un produit doué d'activité enzymatique et insoluble en milieu aqueux, lequel est caractérisé par le fait qu'il comprend un enzyme lié par covalence à des groupements aldéhyde libres portés par un po-lysaccharide insoluble oxydé. 20 L'invention a également pour objet un procédé de préparation du produit qui vient d'être défini. Ce produit peut être utilisé dans les réactions enzymatiques à la place de l'enzyme correspondant sous forme soluble, et peut être récupéré en fin de réaction par séparation mécanique. 25 Par groupements aldéhyde libres on entend désigner, dans l'ex posé qui suit, des groupements aldéhyde portés par le polysaccha-ride oxydé qui sont disponibles pour participer à des liaisons chimiques avec d'autres substances. Il est connu que l'oxydation d'un polysaccharide tel que la 30 cellulose provoque la formation de groupements aldéhyde libres par oxydation des fonctions alcool portées par la chaîne du polymère. C'est ainsi que l'oxydation d'un polysaccharide insoluble tel que la cellulose par un périodate tel que par exemple le pé-riodate de sodium peut donner un polymère insoluble comportant 10 35 à 12 % de groupes, réducteurs, c'est-à-dire un nombre de groupes aldéhyde libres égal à 10 - 12 % du nombre de molécules de glucose du polymère. 72 10644 3 2132080 La détermination expérimentale de la présence de ces groupements aldéhyde ainsi que leur dosage peuvent être avantageusement exécutés par la méthode de Park et Johnson (dosage des sucres réducteurs) adaptée aux matériaux insolubles, telle qu'elle est 5 décrite par J.S. Thompson et G.D. Schockman dans Analytical Bio-chemistry, 22, 260-268 (1968). Le procédé selon l'invention est applicable aux enzymes qui contiennent des groupes fonctionnels capables de réagir par cova-lence avec les groupes aldéhyde libres du polysaccharide. Parmi 10 de tels groupes fonctionnels on peut citer par exemple les groupes amino libres portés par certains acides aminés tels que la lysine, en particulier le groupe amino situé en € de la lysine. La fixation de l'enzyme sur le polysaccharide insoluble oxydé est effectuée par mélange sous agitation de l'enzyme et du po-15 lymère dans une solution tampon pendant quelques heures à une tem pérature inférieure à la température d'inactivation de l'enzyme. Le complexe insoluble, isolé par centrifugation et lavé avec une solution tampon, peut ensuite être lyophilisé. Les résultats obtenus au cours de la mise en oeuvre du pro-20 cédé selon l'invention ont mis en évidence le fait que les paramètres énumérés ci-après n'ont pas de caractère critique vis-à-vis de la réaction de fixation de l'enzyme sur le polymère. C'est ainsi que la nature âu-mi-lieu réactionnel, dans la mesure où elle est compatible avec l'intégrité de l'enzyme et du po 25 lymère, n'exerce pas d'influence notable sur la réaction. Bien que cela ne soit pas indispensable, il est préférable de mélanger le polymère et l'enzyme dans une solution tampon afin de maintenir les conditions optimales de pH citées plus loin. D'autre part les quantités d'enzyme et de polysaccharide 30 oxydé mises en présence, ainsi que leurs concentrations, ne présentent pas de limites critiques. Ces quantités et concentrations peuvent être choisies en fonction de la nature des réactifs de fa çon à obtenir un rendement de fixation optimum. De même, les paramètres réactionnels tels que le pH et la 35 température peuvent être choisis dans des gammes très larges dans la mesure où ils'ne portent pas atteinte à l'intégrité de l'enzyme. En effet, bien que les meilleurs résultats soient obtenus pour un pH compris entre 7 et 8, la fixation de l'enzyme sur le 72 10644 4 2132080 polysaccharide oxydé peut être effectuée dans une gamme de pH qui peut s'étendre de 1 à 11. De même, bien que la réaction soit conduite de préférence àine température comprise entre 0°C et la température ambiante, celle-ci peut être menée à bien à une tempéra-5 ture plus élevée, mais bien entendu inférieure à la température d'inactivation de l'enzyme considéré. Enfin les durées de réaction peuvent être choisies entre quelques minutes et plusieurs heures. La récupération du complexe insoluble polysaccharide-enzyme 10 après la réaction de fixation peut être exécutée par tout procédé mécanique approprié tel que centrifugation, filtration ou décantation. Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé de préparation du produit selon l'invention, sans que celle-ci 15 soit limitée aux conditions qui y sont décrites. Dans ces exemples les activités des produits insolubles sont exprimées en pourcentages par rapport à l'activité d'une quantité d'enzyme soluble égale à la quantité d'enzyme insolubilisé recueillie. Si le surnageant obtenu après centrifugation ne présen-20 te aucune activité enzymatique, cette, quantité d'enzyme insolubilisé recueillie peut être calculée en considérant que les rapports quantité d'enzyme insolubilisé recueillie / quantité initiale d'en zyme, et : poids de produit insoluble recueilli / poids total de polysaccharide et d'enzyme mis en jeu, sont égaux. Si le surna-25 géant présente une activité enzymatique, c'est-à-dire si l'enzyme introduit dans le milieu réactionnel n'a pas été fixé en totalité, ce mode de calcul ne se justifie plus et il est nécessaire de déterminer expérimentalement la quantité d'enzyme insolubilisé recueillie, par exemple par un dosage de l'azote total effec-30 tué sur une quantité déterminée du produit insoluble préparé. Exemple 1 On effectue l'oxydation de 10 g de cellulose à 4°C dans 2 litres d'une solution aqueuse de périodate de sodium 0,05 M. La réaction d'oxydation est suivie par titration du périodate. 35 Après 125 heures de réaction, le périodate est consommé à raison de 0,5 mole de périodate par unité glucose du polysaccharide, et l'on arrête l'oxydation par addition d'éthylène-glycol. 72 10644 5 2132080 Le polysaccharide insoluble oxydé est lavé 2 fois à l'eau distillée puis séché. Il contient 10 à 12 % de groupes réducteurs. On prépare une solution tampon de chlorhydrate da barbital sodique 0,2 M dont on ajuste le pH à 8,0. On mélange- dans cette 5 solution tampon 100 mg de la cellulose oxydée qui vient -d'être préparée avec 80 mg de papaîne cristallisés. L'ensemble est maintenu sous agitation pendant 3 heures à température ambiante puis le produit insoluble est sépara par centrifugation. Le surnageant obtenu ne présente aucune activité enzymatique. La produit -inso-10 lubie est lavé 3 fois à l'aide dsune solution tampon contenant, par litre de solution, 1,210 g de chlorhydrate de cystéine, 13,5 g de phosphate de potassium et 20 ml d'une solution décinormale d'éthylène-diaminetétracétate disodique et dont le pH a été ajusté à 7,2, et enfin lavé 2 fois à l'eau distillée. 15 L'activité de ce produit est mesurée vis-à-vis d'un substrat _3 constitué par une solution contenant 2.10 Mole de°C, N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide par litre de la solution tampon de lavage à pH 7,2, ainsi que 5 % en poids de diméthyl-sulfoxyde. L'activité enzymatique est déterminée par dosage de la p-nitro-20 aniline libérée (spectre d'absorption dans l'ultra-violet pour une longueur d'onde de 405 nm). L'activité du produit insoluble ainsi mesurée est de 85 %. Exemple 2 On prépare une solution aqueuse 0,2 M de trihydroxyméthyle-25 amino-méthane dont on ajuste le pH à 8,0 à l'aide d'acide chlo-rhydrique. On ajoute ensuite 0,08 Mole de chlorure de calcium par litre de solution et l'on dilue cette solution tampon afin d'obtenir des concentrations respectives en trihydroxyméthyle-amino-méthane et en chlorure de calcium de 0,05 et de 0,02 Mole par li-30 tre. On mélange ensuite, dans 50 ml de cette solution tampon, 200 mg de trypsine cristallisée et 250 mg de cellulose oxydée préparée comme décrit dans l'exemple 1, sous agitation à 4°C pendant 20 heures. Le produit insoluble est ensuite séparé par cen-35 trifugation, lavé 3 fois à l'aide de la solution tampon puis 2 fois à l'eau distillée, et enfin lyophilisé. On obtient ainsi 190 mg de produit insoluble contenant 30 mg de trypsine, cette 72 10644 6 2132080 quantité de trypsine étant déterminée par dosage de l'azote total. Il convient de noter que, dans cet exemple, le surnageant obtenu par centrifugation au cours de la séparation du produit insoluble, présente une activité enzymatique. L'activité enzymatique du produit insoluble recueilli, mesurée vis-à-vis du même substrat que celui décrit dans l'exemple 1, est de 33 %. 72 10644 7 2132080 Revendications 1. Produit doué d'activité enzymatique et insoluble en milieu aqueux, caractérisé par le fait qu'il comprend un enzyme lié par covalence à des groupements aldéhyde libres portés par un 5 polysaccharide insoluble oxydé. 2. Produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme est la papaïne. 3. Produit selon la revendication 1, caractérisé par le, fait que l'enzyme est la trypsine. 10 4. Produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polysaccharide est la cellulose. 5. Procédé de préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on fait réagir l'enzyme avec le polysaccharide insoluble oxydé en mélangeant ces 2 substances dans 15 une solution tampon puis que l'on sépare le produit insoluble du milieu réactionnel. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le pH de la solution tampon est compris entre 7 et 8. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait 20 que l'on lyophilise le produit insoluble.