Brevet FR2121772A1 — publié le 19720825

Cette invention concerne une nouvelle forme d'acide ribonucléique à double chaîne ayant une activité antivirale et un procédé pour la préparation de cette nouvelle forme. On sait que les acides ribonucléiques à double chaîne et 5 leurs sels (désignés ci-après conjointement par l'abréviation ARN d0c.) sont des générateurs ou producteurs d'interférons puissants et sont ainsi intéressants dans la prophylaxie à large spectre des infections virales et, à un.moindre degré, dans le traitement de ces infections. L'ARN d.c. à la fois d'origine 10 naturelle et synthétique possède, comme cela a été démontré, une activité génératrice d'interférons. Parmi les sources spécifiques d'ARN d.c. naturel générateur d'interférons qui ont été cités dans la littérature, on peut mentionner les particules virales trouvées dans certaines souches de Pénicillium 15 chrysogenum, P. funiculosum et P. stoloniferum; le virus de polyédrose cytoplasmique, le virion du réovirus 3 et la forme constituant la réplique du coliphage MS2 ainsi que du coliphage de mutation MU9. Toutefois, certaines constatations suggèrent que l'ARN d.c. 20 d'origine naturelle peut être excessivement toxique.chez l'homme et les animaux et qu'ainsi son utilité médicale et vétérinaire peut être limitée. On cherche donc à créer un procédé capable de réduire la toxicité de l'ARN d.c. naturel, tout en conservant son activité génératrice d'interférons (et-par suite son activi-25 té antivirale). L'invention est matérialisée dans une nouvelle forme d'acide ribonucléique à double chaîne dérivé d'une source naturelle et dans les sels de cet acide, cette nouvelle forme étant caractérisée en ce que : -30 (a) Elle présente une hyperchromicité en pourcentage réduite relativement à la forme "normale" (telle que définie ci-après) de l'ARN d.c. provenant de la même source. (b) Elle présente la même composition de base fixée que la forme "normale" de l'ARN d.c. provenant de la même source» 35 (c) Les molécules de la nouvellte forme présentent un degré "d'agrégation" (tel que défini ci-après) plus élevé que les molécules de la forme "normale" de l'ARN d.c. provenant de la même source. (d) Elle présente sensiblement les mêmes caractéristiques de 40 sédimentation sur un support à gradient de saccharose que la 72 00692 2 2121772 forme "normale" de l'ARN d.c. provenant de la même source. (e) Une solution de la nouvelle forme a une viscosité plus faible qu'une solution de la forme "normale" de l'ARN d.c. provenant de la même source à la même concentration. 5 (f) Quand les chaînes de polynucléotides de la nouvelle forme de l'ARN d.c. sont séparées de façon irréversible dans des conditions qui, par elles-mêmes, ne provoquent pas l'hydrolyse des liaisons diesters phosphates, les polynucléotides à une seule chaîne résultants ont des poids moléculaires plus faibles que 10 les polynucléotides à une seule chaîne obtenus à partir de la forme "normale" de l'ARN d.c. provenant de la même source quand on la traite de la même manière. (g) Lors d'une administration par voie intrapéritoriéale à des souris de la souche CD1, la nouvelle forme présente un 15 plus élevé relativement à la forme "normale" de l'ARN d.c. provenant de la même source, administrée de la même manière selon les mêmes doses. (h) La nouvelle forme présente une activité antivirale contre le virus de 1*encéphalomyocardite in vivo chez les souris, sou- 20 che CD1, infectées par le virus 24 heures après l'administration de la dose. Les sels de la nouvelle forme de l'ARN d.c. comprennent les sels d'ammonium, d'aminés et de métaux. Afin de pouvoir comprendre la définition de la nouvelle forme de l'ARN d.c. correspon-25 dant à l'invention, il est nécessaire tout d'abord de comprendre les caractéristiques de la forme "normale" de l'ARN d.c. . On entend par forme "normale" de l'ARN d.c. la forme selon laquelle l'ARN d.c. est obtenu à partir de sa source naturelle par des processus d'extraction éliminant sensiblement la totalité de 30 la substance qui n'est pas constituée par l'acide ribonucléique à partir de cette source, mais pendant lesquels le pH du milieu de travail ne dépasse pas 10 ou ne tombe pas au-dessous de 2 environ, et pendant lesquels en outre les conditions opératoires ne provoquent pas la fragmentation des molécules à double chaîne 35 de l'ARN d.c. en fragments de nucléotides ou polynucléotides plus courts contenant moins de 25 unités nucléotides ou ne provoquent pas de modification quelconque dans la composition de base fixée de l'acide ribonucléique. Ces conditions peuvent paraître très sévères, mais en fait tous les processus d'extraction mentionnés 40 pour l'ARN d.c. connus de la Demanderesse remplissent ces condi— 72 00892 3 2121772 tions et fournissent la forme "normale" de l'ARN d.c. A titre d'exemples de méthodes applicables pour l'extraction de l'ARN d.c. à partir de sources naturelles, on se reportera aux brevets britanniques n° 1<>170.929 et 10211.142 et aux brevets belges 5 n° 739.424 et 739.425o Bien que la preuve doive nécessairement être indirecte, il semble habituellement que l'ARN d.c. "normal" soit formé de molécules à double chaîne hautement ordonnées, avec, une liaison hydrogène intense entre les bases opposées. Les deux chaînes 10 formant chaque molécule d'ARN d.c. "normal" sont des chaînes de polynucléotides simples non brisées et, quand on les examine au microscope électronique, les molécules d'ARN dcc. "normal" sont formées, comme on le voit, de longs filaments qui ne sont que doucement incurvés. 15 Une des caractéristiques de la nouvelle forme d'ARN d.c. suivant l'invention réside dans le fait que les molécules présentent un degré "d'agrégation" plus élevé que les■molécules de la forme "normale". En ce qui concerne la présente description, on notera que les molécules d'ARN d.c. sont considérées 20 comme "agrégées" quand, en principe, la totalité de l'ARN d.c. subit une élution dans le volume de vides d'une colonne contenant un gel d'agarose (polysaccharide linéaire formé d'unités D-galactose et 3,6-anhydro-L-galactose en alternance) ayant subi un gonflement par l'eau, ce gel ayant une limite d'exclusion 25 exprimée en poids moléculaire pour les protéines égale à 6 ' * ' 20-30 x 10 . (Ce gel peut être préparé à partir de l'agarose vendu sous la dénomination "Sépharose 2B"). Une autre indication confirmant que 1'"agrégation" s'est produite peut résulter du comportement de l'ARN d.cD lors d'une 30 électrophorèse sur gel en utilisant des gels de polyacrylamide. On constate que la nouvelle forme "agrégée" d'ARN d.c. a une mobilité plus faible lors d'une électrophorèse sur gel de ce genre que la forme normale. La preuve qualitative de 1'"agrégation" ou de l'"agglomé-35 ration" peut être obtenue au microscope électronique (une étude particulière est faite ci-après), car les filaments moléculaires non ramifiés régulièrement ou faiblement incurvés de la forme normale d'ARN d.c. peuvent être nettement distingués des molécules plus courtes de contour angulaire plus heurté de la 40 nouvelle forme "agrégée". 72 00892 4 2121772 L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une nouvelle forme d'ARN d.c. telle que définie ci-avant ce procédé consistant (a) à traiter la forme "normale" d'un ARN d.c. naturel (tel que défini ici) avec un hydroxyde de métal 5 alcalin à un pH compris entre 11,0 environ et 12,5 environ dans une solution aqueuse d'électrolyte, dans des conditions de température, de temps, de concentration de 1'électrolyte et de pH telles qu'une séparation partielle des chaînes de polynucléotides de chaque molécule d'ARN d»c. commence immédiatement et que 10 pas plus de 25 liaisons di-esters phosphates par chaîne soient hydrolysées pendant la durée de la réaction, puis (b) à neutraliser la solution résultante. Si désiré, la nouvelle forme d'ARN d.c. peut être récupérée à l'état solide par précipitation dans l'éthanol ou par 15 lyophilisation. Il est évident qu'il serait possible de faire varier les paramètres réactionnels (température, temps, concentration de 1'électrolyte et pH) d'une façon presque continue. Toutefois, on doit éviter des conditions brutales (c'est-à-dire des pH élevés, des températures élevées, de longs temps de réac 20 tion et des concentrations élevées d'électrolyte), étant donné que dans ces conditions il va se produire une dégradation de l'ARN d.c. Bien qu'il ne soit pas possible de définir un jeu particulier de conditions réactionnelles nécessaires pour la préparation de la nouvelle forme, certaines indications généra-25 les peuvent être donnéeso D'une façon générale, il va être judicieux d'effectuer la réaction à la température ambiante (20— 25° C.) et une solution d'électrolyte comprise entre 0,lMet 0,8 M va habituellement convenir. La température et les concentrations en électrolyte étant fixées à ces valeurs, un pH compris 30 entre 11,0 et 11,8 environ, pendant une période de 5 à 30 minutes environ, va généralement produire la "nouvelle" forme d'ARN d.c. Toutefois, étant donné qu'il est extrêmement difficile de définir le procédé faisant l'objet de cette invention en termes génériques, d'autres détails relatifs à la manière dont les pa-35 ramètres réactionnels peuvent être modifiés seront donnés ci-après dans des exemples spécifiques. On remarquera que le procédé suivant l'invention peut, si désiré, être incorporé à titre de stade opératoire séparé à un processus d'extraction d'ARN d.c. à partir d'une source naturel 40 le, de telle sorte que la "nouvelle" forme soit obtenue direc- 72 00842 5 2121772 temento L'invention concerne encore une composition pharmaceutique renfermant une nouvelle forme d'ARN d.c. telle que caractérisée ici, conjointement à un ou plusieurs véhicules acceptables sur 5 le plan pharmaceutique. La composition peut être formulée en vue d'une administration orale, parentérale ou d'une application locale, mais une composition préférée se présente sous la forme de pulvérisations intranasales, en particulier sous forme de pulvérisations en 10 aérosolso Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif permettront de mieux comprendre comment l'invention peut être mise en oeuvre. Exemple 1 15 On fait dissoudre de l'ARN d.c. (400 mg) obtenu a partir des particules virales trouvées dans P. chrysogenum.ATCC 10.002 dans du NaCl 0,15M (80 ml). On prélève trois fractions de 26 ml de cette solution. Fraction 1 : Diluée à 130 ml avec NaCl 0,15M (INT 218) 20 Fraction 2 : Traitée avec 6,5 ml de NaOH 0,lN. Le pH de la solution est ensuite égal à 11,8. On laisse la solution reposer à 20° C. pendant 10 minutes, on neutralise avec 32,5 ml d'HCl 0,02N et on dilue à 130 ml par l'addition de 65 ml de NaCl 0,23M. La 25 solution finale est alors égale à lmg/ml d'ARN d0c. dans NaCl 0,15M, pH 7 (INT 219). Fraction 3 : Traitée de la même manière que la fraction 2, mais en prolongeant le traitement par l'alcali à 20 minutes (INT 220). 30 Caractéristiques Physico-Chimiques 1. Tm et hyperchromicité. On mesure la Tm et 1'hyperchromicité sur des solutions dans NaCl 0,15M. On effectue les mesures dans des cellules de 1 cm en utilisant un spectromètre Unicam SP 800B. Les températures des solutions ont été élevées de 0,5° par 35 minute. Hyperchromicité % Tm" (258 nm) INT 218 38,2 92 INT 219 30,0 90 40 INT 220 29,4 89 72 00692 6 2121772 2. Electrophorèse. On effectue 1'électrophorèse en employant des gels d'acrylamide à 4% et un tampon contenant du tris, 0,04M; de l'acétate de sodium 0,02M; de l'EDTA de sodium, 2 mM; et de l'acide acétique pour amener le pH à 7,8. On a effectué les ex-5 périences dans des tubes ayant un diamètre intérieur de 6,3 mm et une longueur de 100 mm à 20° C, en appliquant le courant jusqu'à lO v/cm à 5 MA/gel pendant 1 à 3 heures. On a ensuite prélevé les gels et on les a colorés avec une solution de bleu de méthylène, puis on a observé les bandes. 10 Le constituant de INT 219 et INT 220 formé par l'acide nu cléique était visible sous forme d'une seule bande concentrée juste sur le gel. L'ARN d.c, non modifié (INT 218) a une mobilité plus grande et se sépare en trois bandes. 3. Chromatoqraphie sur Sepharose 2B. On a effectué la chromato-15 graphie en utilisant une colonne de 90 cm de longueur, de 2,5 cm de diamètre intérieur et d'un volume d'environ 500 ml. On a effectué l'élution de la colonne en direction du haut avec une solution contenant du chlorure de sodium (0,15M), un tampon au tris (0,05M) et du chlorure de magnésium (0,005M), à un pH de 20 7,5, avec un débit d'écoulement de 0,4 ml par minute. On a recueilli des fractions de chacune 7,2 ml. On a contrôlé la teneur des fractions en acide nucléique par mesure de l'absorption des ultraviolets à 260 nm. La trace d'élution pour l'ARN d.c. (INT 218) indique que 25 l'acide nucléique de poids moléculaire le plus élevé a subi l'élution dans les fractions 16-21 (Maximum dans la fraction 18, Kav = 0,05). Dans le cas de INT 219 et 220, le constituant principal a subi l'élution dans chaque cas dans les fractions 16-19 (maximum 30 dans la fraction 17, Kav = 0). 4. Analyse par sédimentation. On a formé une couche d'une solution d'ARN contenant environ 100 microgrammes d'ARN sur la partie supérieure d'un support à gradient de saccharose à 5-25% préformé dans tris-HCl 10 mM et NaCl 150 mM, à un pH de 7,0 et 35 on a soumis à une centrifugation à 100.000 g dans un rotor Beckmann Spinco SW50 pendant 5 heures à 20°. La distribution des matières subissant une absorption à 254 r.m a été analysée en employant un appareil d'analyse aux ultraviolets Isco Modèle 2220 40 Dans ces conditions, la vitesse de sédimentation de INT 219 72 00842 7 2121772 et INT 220 ne diffère pas de façon notable de celle de l'ARN d.c. non modifié (INT 218). Toxicité aiguë et activité de INT 218, INT 219 et INT 220 contre le virus de 1'encéphalomyocardite 5 (EMC) Méthode Toxicité : On a injecté par voie intrapéritonéale à des groupes comprenant chacun 8 animaux (souris, souche CD1, poids 18-22 g) 5, 10, 20, 40, 60, 80, 110, 125 ou 150 mg/kg de INT 218, 10 INT 219 ou INT 220 respectivement. On a observé les animaux pendant 8 jours et on a enregistré la mortalité (Fig. 2, nombre d'animaux morts en ordonnées). La dose de chaque composé constituant la dose létale pour 50% des souris a été calculée selon la méthode de Reed et Muench (réf. Reed, L.J. et Muench,' H. 1938, 15 American Journal et Hygiène, Vol 27, p. 493). Protection contre EMC. On a injecté par voie intrapéritonéale, à des groupes comprenant chacun 10 souris, INT 218, INT 219 et INT 220, 24' heures avant l'infection avec 160 ou 16 LD^0 de virus de 1•encéphalomyocardite. Les doses de INT 218 INT 219 20 et INT 220 employées étaient les suivantes : 0,5, 5, 50, 250 yug/kg; 0,5, 2,5, 5, 10 mg/kg. On a enregistré les mortalités quotidiennement pendant 12 jours; la mortalité totale est indiquée sur la fig. 1 (nombre d'animaux morts en ordonnées). Résultats 25 La toxicité aiguë (LD^q) par voie intrapéritonéale est la suivante : INT 218 40 mg/kg INT 219 140 mg/kg INT 220 150 mg/kg 30 La fig. 1 montre que le degré de protection antivirale conféré par les trois substances d'essai pour la dose de virus plus élevée suit l'ordre INT 218, INT 219 et INT 220. Pour la dose de virus plus faible, les trois substances confèrent approximativement le même degré de protection antivirale. 35 Lors de l'interprétation de ces résultats, on doit se rap peler que, du fait de l'utilisation de groupes de 10 souris, la méthode d'essai employée pour tester l'activité antivirale n'est pas une méthode reproductible. Par exemple, pour les deux doses de virus, les résultats utilisant INT 218 et INT 219 sont 40 compris dans la gamme de variation à laquelle on peut s'atten 72 00892 8 2121772 dre sur la base de l'expérience existante si l'on effectue deux essais identiques le même jour en utilisant simplement INT 218. Examen au microscope électronique. On prépare de l'ARN à double chaîne à partir de PD 5 chrysogenum et ses modifications INT 219 et INT 220 en vue d'un examen au microscope électronique par la technique de microdiffusion de Mayer et Jordan (1968). On prélève les solutions de base d'ARN dQc. et des dérivés à 1 microgramme/ml dans l'acétate d'ammonium 0,2M par microdiffusion sur une monocouche dénaturée 10 de Cytochrome C (concentration de départ 10 mg/ml). On projette optiquement avec rotation un alliage platine-palladium (80:20) sur les préparations montées à 8° ; on examine les échantillons au microscope électronique Phillips EM 300 à 40 kV. H.T. et avec un grossissement sur l'écran de 11.000. On effectue en-15 suite des agrandissements photographiques pour obtenir un grossissement final de 30o600 diamètres sur le tirage. A une concentration de 1 microgramme/ml, l'ARN d.c» non traité apparaît sous forme d'une masse de filaments non ramifiés ayant diverses longueurs, présentant simplement des courbes dou-20 ces ou régulières sur leur longueur (Fig. 3)o INT 219 et INT 220 présentent simplement des molécules plus courtes de contour plus heurté (Fig. 4 et 5). Les longueurs semblent diminuer quand la série et l'angularité des molécules augmentent. On n'observe pas de variation de la largeur» 25 Exemple 2 Modifications structurelles se produisant dans ARN d.c. aux pH alcalins. Afin de mieux comprendre les conditions nécessaires à la formation des modifications "agrégées" de l'ARN d.c. préparées 30 dans l'exemple 1 (INT 219 et INT 220) et la nature physico- chimique de la modification, des expériences ont été effectuées pour mesurer 1'hyperchromicité développée immédiatement, puis après plusieurs jours dans NaCl 0,15M, pour une gamme de pH alcalins. 35 Conditions expérimentales. On a ajouté, à des parties aliquotes de 4 ml de solutions de soude allant de 0,001N à 0,1N, 1 ml d'une solution de 250 microgrammes/ml d'ARN d.c. dans du chlorure de sodium 0,75Mo Immédiatement après l'addition, on a mélangé intimement la solu-40 tion et on a déterminé le spectre ultraviolet. On a ensuite 72 00692 9 2121772 mesuré le pH de la solution. Après 4 jours à 20°, les spectres ultraviolets et les pH des solutions ont été de nouveau déterminés. Sur la fig. 6, on a représenté 1'hyperchromicité immédiate et finale (mesurée à 258 nm) en fonction du pH. La courbe A cor-5 respond à la mesure immédiate et la courbe B à la mesure après 4 jours.. Résultats et étude. Plusieurs points intéressants apparaissent lors de cette étude. Tout d'abord, on constate que ARN d.c. est complètement 10 stable dans NaCl 0,15M à 20° jusqu'à des pH de 11,0o A un pH de 11,4, une hyperchromicité immédiate commence à se développer et elle croît rapidement jusqu'à ce qu'elle soit complète pour un pH de 12,1. De nouvelles augmentations du pH n'ont aucun effet sur 1'hyperchromicité immédiate qui, lorsqu'elle est complète, 15 est égale à 29%. Cette hyperchromicité immédiate est due à l'élimination de protons par l'ion hydroxyle à partir des liaisons hydrogène entre des bases complémentaires dans les deux chaînes. Ceci a pour conséquence une séparation des chaînes de la double hélice et,à un pH de 12,5 ou au-dessus, l'acide nucléique existe 20 sous forme de chaînes simples. Lors d'une exposition prolongée à des pH alcalins au-dessus de 11,0, l'hydrolyse des liaisons esters phosphates internucléotides a pour conséquence le développement d'une nouvelle hyperchromicité. L'hydrolyse est complète (hyperchromicité 53%) après 4 jours à 20° à des pH supérieurs à 25 12,3o Au pH de 11,8, conditions dans lesquelles la formation des modifications agrégées (INT 219 et INT 220) a été observée, l'ARN d.c. subit une séparation immédiate des chaînes à environ 50%, et une certaine hydrolyse se produit également. Il est pos-30 sible que les parties à une seule chaîne puissent ensuite former des liaisons hydrogène avec des parties complémentaires semblables, autres que celles auxquelles elles étaient associées dans l'ARN d.c» initial. Il en résulterait une modification profonde de conformation et ceci pourrait être l'explication des 35 propriétés physico-chimiques observées. Exemple 3 Effet de la concentration du chlorure de sodium. L'effet de la concentration du chlorure de sodium sur le développement immédiat de 1'hyperchromicité par ARN d.c. aux 40 pH alcalins a été étudiée 72 00892 10 2121772 Conditions expérimentales. On a ajouté, à des parties aliquotes de 4 ml de solutions de soude allant de 0,001N à 0,1N, 1 ml d'une solution de 250 microgrammes/ml d'ARN d.c. qui a subi une dialyse avec une solu-5 tion contenant 5 fois la concentration finale requise de chlorure de sodium. Immédiatement après l'addition, la solution a été mélangée intimement et on a déterminé le spectre ultraviolet. On a ensuite mesuré le pH de la solution. Les résultats obtenus dans l'eau (courbe C>, dans NaCl 0,15M (courbe D) et dans NaCl 10 0,75M (courbe E) sont indiqués sur la fig. 7, qui montre l'effet de la concentration de NaCl sur 1'hyperchromicité immédiate. Résultats et étude. Si la concentration en sel diminue, des pH plus élevés sont nécessaires pour dénaturer l'ARN d0c. Seules de petites différen-15 ces ont été observées entre NaCl 0,15M et 0,75M, mais dans l'eau un pH beaucoup plus élevé est nécessaire pour la séparation des chaînes. En outre, la séparation se produit ensuite sur une gamme de pH plus étroite. Des résultats similaires ont été observés avec ADN (F.W. Studier, J. Molo Biol., 1965, 11, 373) et ils 20 ont été attribués au fait qu'en l'absence d'ions antagonistes chargés positivement, l'approche des ions hydroxyle est gênée ou inhibée par la charge négative présente sur l'acide nucléique. Exemple 4 Hyperchromicité résiduelle. 25 On a déterminé 1'hyperchromicité résiduelle irréversible après neutralisation des solutions d'ARN d.c. dans le chlorure de sodium 0,15M et dans l'eau, après exposition à des pH alcalins. Conditions expérimentales. 30 On a ajouté, à des parties aliquotes de 4 ml de solutions de soude allant de 0,001N à 0,1N, 1 ml d'une solution de 250 microgrammes/ml d'ARN d.c. dans NaCl 0,75M ou dans l'eau. On a mélangé intimement la solution, on l'a laissé reposer à 20° pendant lO minutes, puis on a neutralisé avec 1 ml d'une solution 35 d'acide chlorhydrique ayant 4 fois la normalité de la solution de soude utilisée. On a ensuite déterminé les spectres ultraviolets des solutions. Dans le cas des solutions obtenues à partir de solutions d'ARN d.c0 dans l'eau, on a ajouté un même volume de chlorure de sodium 0,3M et on a déterminé à nouveau les 40 spectres ultraviolets. Sur la Fig0 8, on a représenté l'hyper- 72 00892 11 2121772 chromicité résiduelle ou irréversible (corrigée pour tenir compte des facteurs de dilution) en fonction des pH. La courbe F correspond à NaCl 0,15K, la courbe G à l'eau et la ccurbe H à l'eau puis après neutralisation NaCl, concentration ajustée à 0,15M. 5 Résultats et étude. Dans le chlorure de sodium 0,15M, 1'hyperchromicité est complètement réversible après exposition à des pH inférieurs à 11,7 pendant 10 minutes à 20°. Ce pH provoque une séparation des chaînes d'environ 50%, comme cela a été démontré par la 10 courbe d'hyperchromicité immédiate en fonction du pH (Fig. 6). Une augmentation rapide de 1'hyperchromicité irréversible se produit ensuite jusqu'à un pH de 12, suivie d'un accroissement à une vitesse plus lente. La partie abrupte de la courbe réfléchit probablement le facteur d'entropie de plus en plus 15 grand qui intervient lors d'un réalignement parfait des deux chaînes lorsque la séparation initiale est presque complète. Toutefois, même après exposition à un pH de 2, il semble que lors de la neutralisation une réunion à 50% se produise de nouveau. Comme cela a été mis en évidence (Fig. 6), une hydrolyse 20 se produit également à ces pH élevés, et non seulement elle est à l'origine du nouveau développement de 1'hyperchromicité irréversible à des pH supérieurs à 12, mais elle en constitue probablement également un facteur dans la gamme des pH de 11,7 à 12. 25 Dans l'eau, l'accroissement le plus rapide de 1'hyperchro micité irréversible se produit également dans la gamme des pH requise pour la séparation des chaînes (Fig. 7). Une nouvelle réunion des acides nucléiques à double chaîne ne se produit pas d'une façon aussi efficace à une faible concentration ionique, 30 et ceci apparaît dans 1 'hyperchromicité résiduelle pliis élevée après exposition à des pH supérieurs à ceux requis pour la séparation des chaînes. Quand la concentration ionique de la solution neutralisée est réglée à 0,15M dans le chlorure de sodium, une nouvelle réunion ou re-combinaison se produit» 35 Dans les conditions utilisées pour la préparation d'INT 219 (pH 11,8), le développement de 1'hyperchromicité irréversible ne fait que commencer. Ceci est en concordance avec l'observation selon laquelle INT 219 a une hyperchromicité réduite lors d'une dénaturation thermique par comparaison avec celle obtenue 40 pour ARN d.c.. BAD ORIGINAL 72 00892 12 2121772 Exemple 5 Vitesses d'hydrolyse. L'observation selon laquelle un pH plus élevé est nécessaire pour la séparation des chaînes d'ARN d.c. dans l'eau par 5 rapport au chlorure de sodium 0,15M suggère qu'il serait possible d'hydrolyser les liaisons phosphates inter-nucléotides d'ARN d.c. dans l'eau à des pH inférieurs à ceux requis pour la séparation des chaînes. Une étude des vitesses d'hydrolyse relatives à un pH de 11,8 dans les deux solvants a par conséquent été effectuée. 10 Conditions expérimentales. Cn ajoute, à des parties aliquotes de 4 ml. d'une solution de soude C,C5N, 1 ml. d'une solution de 2 35 microgrammes/ml. d'ARN d.c. dans le chlorure de sodium 0,75M ou dans l'eau. Dans chaque cas, le pH de la solution est égal à 11,8. L'absorption 15 des ultraviolets à 258 nm pour les deux solutions est déterminée heure par heure pendant 16 heures. Sur la Fig. 9, on a représenté la densité optique en ordonnées en fontion du temps (en abscisses). Résultats et étude. 20 Dans le chlorure de sodium 0,15M, après 1'hyperchromicité due a la séparation initiale des chaînes, la vitesse d'augmentation de la densité optique diminue et devient linéaire par rapport au temps. L'augmentation de 1'hyperchromicité dans la partie linéaire est attribuée à l'hydrolyse des liaisons phos-25 phates internucléotides. Dans l'eau, aucune séparation immédiate des chaînes ne se produit et une hyperchromicité ultérieure se développe à une vitesse beaucoup plus lente. Etant donné que 1'hyperchromicité totale est faible (6% après 16 heures), il n'est pas possible de 30 déterminer si ceci résulte de la séparation des chaînes ou de l'hydrolyse, mais on constate à partir de ces expériences que le pH requis pour chaque processus est plus élevé à une faible concentration ionique0 A partir de ces études de vitesse, il est également possible 35 d'effectuer un calcul approximatif du nombre de ruptures de chaînes qui se produisent pendant la formation de INT 219 à partir d'ARN d.c. L'hyperchromicité développée par suite de la séparation totale des chaînes est, comme on l'a démontré, de 29%, et celle 40 due à la séparation totale et à l'hydrolyse est de 53%. Ainsi, 72 00692 13 2121772 1'hyperchromicité qui résulte de l'hydrolyse totale est de 24%. A partir de la Fig. 9, qui montre les vitesses d'hydrolyse de ARN d.c. dans l'eau (courbe J) et dans NaCl 0,15M (courbe K) en fonction du temps (en abscisses) à un pH de 11,8, on voit que la 5 vitesse de développement de 1'hyperchromicité dans le chlorure de sodium 0,15M, à un pH de 11,8, après la séparation initiale des chaînes est = 0,05 unité de densité optique en 10 heures. = 0,05 x 100 = Hyperchromicité de 5,3% en 10 heures. 10 0,94 = 5,3 = Hyperchromicité de 0,0883% en 10 minutes. 60 Par suite, si l'on suppose un poids moléculaire de ARN d.c. = 2 x 10 et si le poids moléculaire moyen d'un nucléotide est égal à 340, le nombre des ruptures de chaîne par molécule de 15 ARN d.c. est égal à 0,0883 x 2 x 10ù = 22, 24 340 c'est-à-dire 11 ruptures par chaîne. Les mêmes calculs indiquent que, dans INT 220, il se produit 22 ruptures par chaîne. 20 Exemple 6 Effet du cation. La dénaturation de l'ARN d.c. par l'hydroxyde de césium dans le chlorure de césium 0,15M a été comparée avec la dénaturation par la soude dans le chlorure de sodium 0,15M. 25 Conditions expérimentales. On a ajouté, à des parties aliquotes de 4 ml. de solutions d'hydroxyde de césium allant de 0,001N à 0,1N, 1 ml. d'une solution à 2 50 microgrammes/ml. d'ARN d.c. dans le chlorure de césium 0,75N. Immédiatement après l'addition, on a mélangé intime-30 ment la solution et on a déterminé le spectre ultraviolet. Le pH de la solution a ensuite été mesuré. Sur la Fig. 10, on a représenté 1'hyperchromicité (mesurée à 258 nm) en fonction du pH et on a comparé avec les données obtenues avec la soude dans le chlorure de sodium 0,15M. La 35 courbe L se rapporte au chlorure de césium et la courbe M au chlorure de sodium.. Résultats et étude. En présence d'ions césium, une séparation des chaînes se produit à un pH plus faible que cela n'est le cas en présence 72 00892 14 2121772 d'ions sodium,, Il a été de même indiqué (M. Ageno, E. Don et C. Frontali, Biophys. JP, 1969, £, 1281.) que la séparation des chaînes de l'ADN se produit à des pH plus faibles lorsque le rayon ionique de l'ion antagoniste est augmenté. 5 Exemple 7 Dénaturation par le carbonate de sodium. On a étudié la vitesse de développement de 1'hyperchromicité avec l'ARN d.c. dans des solutions de carbonate de sodium. Conditions expérimentales. 10 On a effectué la lyophilisation de solutions d'ARN d.c. (162 Jjg) dans l'eau (1,5 ml.) et on a ajouté aux solides 3 ml. de carbonate de sodium N, de carbonate de sodium 0,1N ou d'eau0 Les spectres ultraviolets des solutions ont été déterminés immédiatement et on a mesuré l'absorption à 258 nm à des interval-15 les de 30 minutes pendant 18 heures. Sur la Fig. 11, on a représenté la densité optique (en ordonnées) en fonction du temps (en heures, en abscisses). La courbe N correspond au Na2C0^5N et la courbe 0 au Na^CO^, 0,1N. Les pH étaient de 11,6 et 11,3 respectivement. 20 Résultats et étude. Dans le carbonate de sodium 0,1N (pH 11,3) il ne se produit ni séparation des chaînes ni hydrolyse. Dans le carbonate de sodium N (pH 11,6), bien que 1'hyperchromicité immédiate soit faible (9,2%), une séparation des chaînes se produit d'une façon 25 relativement rapide et elle est complète après deux -heures environ. Le développement d'une nouvelle hyperchromicité, attribué à l'hydrolyse, s'effectue à une vitesse légèrement plus rapide (6,0% en 10 heures) qu'à un pH de 11,8 dans le chlorure de sodium 0,15M. Ceci peut être une conséquence du fait de la con— 30 centration beaucoup plus élevée en ions sodium présents. La différence de vitesses relatives de la séparation des chaînes, et d'hydrolyses dans le carbonate de sodium N, pH 11,6 et dans le chlorure de sodium 0,15K/soude 0,02N, à un pH 11,8 indique que des produits identiques à INT 219 et INT 220 ne sont 5 pas obtenus lors de l'exposition d'ARN d.c. à l'action de carbonate de sodium N. Ceci a été confirmé par le traitement d'ARN d=c. avec du carbonate de sodium N pendant 10 minutes et 20 minutes à 20°. Les caractéristiques de dénaturation thermique des produits, mesurées dans le chlorure de sodium 0,15m, sont iden-40 tiques à celles de l'ARN d.c. d'origine. Bien qu'une bonne 72 00892 15 2121772 protection antivirale soit mise en évidence pour ces produits, le PD(-0 a augmenté avec la durée de l'exposition à l'effet du carbonate de sodium et on considère en conséquence que le carbonate de sodium est un réactif qui ne convient pas pour 3a prépa— 5 ration de la "nouvelle" forme de l'ARN d.c. telle que définie ici. Propriétés physico-chimiques de INT 219 et INT 220. En plus des propriétés physiques de INT 219 et INT 220 in-10 diquées dans l'Exemple 1, d'autres propriétés ont également été étudiées. 1. Une comparaison de la dénaturation thermique de INT 21 y et, IMT 219 dans une solution saline tamponnée au citrate a également été effectuée (Fig. 12). 15 Dans un solvant S.S.C„ (chlorure de sodium 0,15M/citrate trisodique 0,015M, pH 7) les courbes de fusion sont similaires dans l'ensemble, comme dans le chlorure de sodium 0,15M non tamponné, 1'hyperchromicité totale obtenue avec INT 219 est plus faible et la Tm est réduite de 2°. Toutefois, dans un solvant 20 S.S.C. 0,1 (chlorure de sodium 0,015M/citrate trisodique 0,0015M, pH 7) de grandes différences sont observées» Avec INT 219, la dénaturation commence à des températures très basses et la courbe de fusion semble être à 3 phases. L'hyperchromicité totale observée pour INT 219 est ici encore nettement plus faible que 25 pour INT 218 et la Tm est réduite de 6,5°. 2. Chromatographie par pénétration sur gel On effectue la chromatographie en utilisant une colonne de 26 cm de longueur, de 2,5 cm de diamètre intérieur et de 130 ml 30 de volume environ. On soumet la colonne à une élution vers le haut avec une solution contenant du chlorure de sodium (0,15M), l'agent tampon tris (0,05M) et du chlorure de magnésium (0,005M), à un pH 7,5, selon un débit de 0,08 ml par minute. On recueille des fractions représentant 3,3 ml chacune. On contrôle la te-35 neur en acide nucléique des fractions par mesure de l'absorption des ultraviolets à 260 nm. La trace d'élution pour ARN d.c. (INT 218) indique que l'acide nucléique de poids moléculaire le plus élevé a subi une élution dans les fractions 16-17 (maximum dans la fraction 21, 40 Kav =0,2). Exemple 8 3io—Gel 150M 72 00892 16 2121772 Avec INT 219, le constituant principal subit une élution dans les fractions 13-18 (maximum dans la fraction 15, Kav =0). 3. Viscosité. Pour les mesures de viscosité, on a utilisé un viscosimètre 5 miniature, à niveau suspendu, équipé d'un dispositif formant minuterie photo-électrique» Une expérimentation préliminaire a établi que 'T sp/c dépend à peine du taux de cisaillement quand /, T_/ ^10 dl/g. Les déterminations ont été effectuées dans du chlorure de sodium 0,15M à 25°. Les résultats obtenus 10 sont résumés dans la Fig. 13, qui établit une comparaison entre les viscosités de solutions de INT 218 et INT 219. 4. Stabilité. On a examiné la stabilité de l'INT 219 a la précipitation dans l'éthanol et à la lyophilisation, qui sont des processus 15 utilisés de façon courante dans l'isolement des acides nucléi-queSo Une récupération quantitative de l'INT 219 a été obtenue après précipitation à partir d'une solution à 1 mg/ml. dans le chlorure de sodium 0,15M avec 2 volumes d'éthanol. Le produit obtenu par ce processus et le produit obtenu par lyophilisation 20 d'une solution à 1 mg/ml„ dans le chlorure de sodium 0,15M, reconstitué à 1 mg/ml. dans le chlorure de sodium 0,15M, ont tous deux des propriétés physico-chimiques identiques (Hc, Tm., électrophorèse sur gel, Sepharose 2B) à celles de l'INT 219 d* origine. 25 5. Dénaturation par le formaldéhydeo Des conditions expérimentales pour examiner la séparation irréversible des deux chaînes d'ARN d.c. et du produit modifié par un alcali INT 219 ont été étudiées et mises au point. Le processus comprend le traitement d'une solution de l'acide 30 nucléique (4 mg) dans le chlorure de sodium 0,15M (4 ml) avec une solution aqueuse à 40% de formaldéhyde (1 ml.) et du diméthylsulfoxyde (15 ml.) à 50° pendant 30 minutes. Une expérimentation préalable a établi que ARN d.c. est dénaturé dans le diméthylsulfoxyde à 75% à 50° et la température de réaction 3 5 relativement basse a été utilisée afin d'éviter des réactions de réticulation avec le formaldéhyde. Les solutions ont été refroidies, soumises à une dialyse avec du formaldéhyde à 0,5%, pH 7,5 (2 litres) et à une analyse par chromatographie sur du Sepharose 2B. On a utilisé une colonne de 35 cm de longueur, de 1,5 cm 40 de diamètre intérieur et d'un volume de 60 ml. environ,, On a BAD ORIQINAt] 72 00892 17 2121772 soumis la colonne à une élution vers le haut avec une solution contenant du formaldéhyde à 0,5% et du chlorure de sodium 0,15M, pH 7,5, avec tin débit de 0,08 ml. par minute. On a recueilli des fractions représentant 3,3 ml. chacune» On a contrôlé la 5 teneur en acide nucléique des fractions par mesure de l'absorption des ultraviolets à 260 nm. Les résultats obtenus sont résumés sur la Fig. 14. Bien que dans ces conditions INT 219 subisse une élution une fraction avant ARN d.c. (INT 218), en accord avec les obser-10 vations précédentes concernant sa nature agrégée, INT 219 dénaturé par le formaidéhyde-diméthylsuifoxyde subit une élution 2 fractions plus tard que INT 218 dénaturé de façon similaire» Ces résultats concordent avec la conclusion atteinte à partir des études d'hyperchromicité selon laquelle, lors de la prépa-15 ration de INT 219 à partir d'ARN d.c., il se produit environ 11 ruptures de chaîne par chaîne» Sur la Fig. 14, la courbe P correspond à INT 219, la courbe Q à ARN d.c., la courbe R à INT 219 dénaturé, et la courbe S à ARN d.c. dénaturé. 20 Exemple 9 Résultats biologiques. A. Protection contre le virus EMC. Les résultats d'autres comparaisons de la protection antivirale fournie par INT 218 et INT 219 sont résumés dans le 25 tableau I ci-après et dans les Fig» 15 et 16» Comme décrit dans l'Exemple 1, on administre les composés 24 heures avant le test au virus. Sur les Fig. 15 et 16, on a porté les doses en mg/kg en abscisses et les mortalités en % en ordonnées» La variation journalière importante dans les résultats est 30 évidente et en conséquence la protection fournie par INT 218 et INT 219 ne semble pas différer de façon notable. (VOIR TABLEAU I PAGE SUIVANTE) 3. Toxicité intrapéritonéale. D'autres évaluations des toxicités relatives de INT 218 et 35 INT 219 administrés par voie intrapéritonéale ont également été effectuées» Le processus utilisé était le même que celui décrit dans l'Exemple 1. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau II ci-après et sur la Fig. 17, sur laquelle on a porté les doses en mg/kg en abscisses et les mortalités en % en or-40 données» BAD ORIGINE INT 218 et INT 219. TABLEAU I Protection contre EMC chez la souris CD1, >4 N> Virus (EMC) Dose de composé INT 218 mortalité Dose ip (mg/kg) 13/10/70 2/11/70 28/1/71 9/2/71 7/6/71 TOTAL % 0,0005 9/10 30/30 9/10 48/50 96 0,005 9/10 29/30 8/10 46/50 92 io"4 0,05 5/10 ; 9/10 14/20 70 (160 LD5Q) 0,25 6/10 5/10 16/30 2 7/50 54 0, 5 2,5 5/10 7/10 0/10 2/10 13/30 5/10 32/70 0/10 46 0 5 0/10 2/10 3/30 5/10 10/60 17 10 1/10 2/10 6/30 9/50 18 0,005 7/10 17/30 24/40 60 0,005 4/10 14/29 18/39 46 0,05 2/10 2/30 4/40 10 10*5 0,25 1/10 0/10 1/20 5 (16 LD50) 0, 5 4/10 0/10 3/30 0/10 7/60 12 2,5 1/10 1/10 10 5 0/10 0/10 3/30 3/50 6 10 0/10 0/10 0/20 0 -v] •^1 NJ TABLEAU I (Suite) INT 218 et INT 219» Protection contre EMC chez la souris CD1. Virus (EMC) Dose ip Dose de composé (mg/kg) INT 219, Mortalité : 13/10/70 2/11/70 28/1/71 9/2/71 7/6/71 TOTAL % j 0,0005 9/10 28/30 8/10 45/50 90 : 0,005 8/10 28/30 6/10 42/50 84 : îo""4 0,05 8/10 9/10 17/20 85 : (160 LD5q) 0,25 7/10 8/10 24/30 39/50 78 : 0,5 2,5 8/10 3/10 3/10 6/10 25/30 6/10 48/70 3/10 69 j 30 : 5 3/10 0/10 10/30 5/10 18/60 30 : 10 3/10 2/10 8/30 13/50 26 : 0,005 4/10 17/30 21/40 53 : 0,005 2/10 9/30 11/40 28 : 0,05 4/10 8/30 12/40 30 ' ! 10-5 0,25 2/10 3/10 5/20 25 : (16 LD5q) 0,5 1/10 0/10 5/30 1/10 7/60 12 : 2,5 1/10 1/10 10 : 5 1/10 0/10 4/30 5/50 10 : 10 1/10 0/10 1/20 5 : K> O O CD «O to WD K) IO IO TABLEAU II Toxicité intrapéritonéale chez la souris pour INT 218 et INT 219 ^4 M Dose de composé INT 218, Mortalité (mg/kg) 14/10/70 2/11/70 20/1/71 15/2/71 TOTAL % 5 0/8 0/8 * 0/16 0 10 0/8 0/8 0/20 0/20 0/56 0 20 5/8 0/8 6/20 7/20 18/56 32 30 6/8 9/20 15/28 54 40 4/4 6/8 9/20 12/20 31/52 60 50 4/4 4/4 ÎOO 60 5/8 20/20 12/20 37/48 77 80 8/8 20/20 15/20 43/48 89 100 110 8/8 8/8 100 120 125 8/8 8/8 100 140 150 7/8 7/8 88 160 200 •^4 KJ TABLEAU II (SUITE) Toxicité Intrapéritonéale chez la souris pour INT 218 et INT 219 M : Dose de : composé INT 219, Mortalité " :(mg/kg) 14/10/70 2/11/70 20/1/71 15/2/71 TOTAL % î : 5 0/8 0/8 0/16 0 : ; io 0/8 0/8 0/16 o ; : 20 0/8 0/8 0/20 0/36 0 : ; 30 0/8 0/8 o ; : 40 0/4 0/8 2/20 2/32 6 : ! 50 1/4 1/4 25 ; : 60 1/8 3/10 4/20 8/38 21 : j 80 0/8 6/10 8/20 14/38 37' ; ; 100 10/ÎO 20/20 30/30 100 : ; no 0/8 0/8 0 ! : 120 10/10 17./20 27/30 90 ; ; 125 1/8 1/8 13 ; : 140 10/10 9/20 19/30 63 : ; 150 8/8 10/10 18/18 100 ; : 160 20/20 , 20/20 100 : ; 200 10/10 10/10 100 ; •Nj KJ 72 00892 22 2121772 Ici encore, on note une variation quotidienne considérable des résultats, mais la toxicité de INT 219 est nettement inférieure à celle de INT 218 (LDg^= 31 mg/kg pour INT 218 et 87 mg/kg pour INT 219). 5 C. Toxicité intraveineuse On a déterminé également la toxicité intraveineuse de INT 218, INT 219 et INT 220 chez la souris CDl pesant 18-22g. On a observé les animaux pendant 10 jours et on a enregistré les mortalités (Tableau III ci-après). La toxicité intraveineuse 10 de INT 219 et INT 220 est réduite par rapport à celle de INT 218 mais les différences ne sont pas aussi importantes que pour la toxicité intrapéritonéale. TABLEAU III Figure 15 - Toxicité intraveineuse de INT 218, INT 219 et INT 220 15 Composé Dose Mortalité LD50 (mg/kg) (mg/kg) INT 218 10 0/20 20 INT 218 20 8/20 21 40 20/20 10 0/20 INT 219 20 5/20 32 25 40 12/20 80 10/10 10 0/20 INT 220 20 3/20 46 30 40 8/20 80 7/10 D. Protection intranasale contre la grippe chez la souris On a assuré 1»infection par le virus avec la souche PR8 35 administrée par aérosol durant 1 heure, en utilisant une grosseur de particules de 8 microns environ. On a administré aux souris INT 218 ou INT 219 30 heures et 6 heures avant l'infection et 18 heures après celle-ci, en utilisant un aérosol produit par nébulisation d'une solution à 1 mg/ml dans le chlorure 40 de sodium 0,15M, pendant une durée de 30 minutes» 72 00892 23 2121772 On a estimé que chaque souris reçoit environ 1,2 Jig de substance en 30 minutes. 10 jours après l'infection, on a classé les souris selon une détermination macroscopique du degré d'hépatisation du poumon, en utilisant l'échelle suivante : 5 O Pas de lésions 1 0-15% 2 15-37% 3 37-62% 4 62-85% 10 5 85-100% On a additionné les résultats concernant les poumons pour les souris de chaque groupe de 20 animaux et on a obtenu une valeur moyenne. Le nombre de souris ayant des lésions dans chaque groupe a été calculé sous forme de pourcentage de la taille 15 du groupe, et le résultat a été exprimé sous forme d'incidence de lésions pulmonaires. Les résultats obtenus sont résumés ci-après : Nombre moyen de Incidence de lésions des pou- lésions % 20 mons. Témoin négatif 2,0 85 INT 218 0,4 20 INT 219 0,5 30 Les activités de INT 218 et INT 219. ne sont pas considérées 25 comme s'écartant nettement l'une de l'autre. E. Activité antitumorale dans le système de tumeur L5178Y. On s'est servi de souris DBA 2/J, ayant au moins 8 semaines et la tumeur a été amenée chaque semaine à une forme ascitique, 10^ cellules étant injectées dans la cavité intrapéritonéale. 30 A des fins expérimentales, la tumeur est administrée par voie intradermique sur le flan rasé, à raison d'environ 10^ cellules dans 0,1 ml. de milieu 199. On commence l'administration des doses après une semaine et on administre 3 doses. Les valeurs enregistrées sont le nombre de régressions observées par nombre 35 d'animaux dans un groupe. Expérience 1. On essaie INT 218, INT 219 et INT 220 à raison de 100 pg par dose, les doses étant administrées aux jours 7,10 et 12. Résultats. 40 (voir tableau page suivante) 72 00892 24 2121772 TABLEAU IV Jours après 1'infection INT 218 INT 219 INT 220 Témoin 7 0/5 0/6 0/6 0/10 10 5/5 6/6 1/6 0/10 12 5/5 6/6 2/6 0/10 14 5/5 6/6 3/6 0/10 Conclusions. INT 219 est aussi actif que INT 218 et fournit une régression de la tumeur chez tous les animaux pour ce taux d'administration, mais INT 220 est moins actifo 15 Expérience 2. On a comparé l'activité de différentes doses d'INT 218 et d'INT 219. Les doses ont ici encore été administrées aux jours 7, 10 et 12. Résultats. 20 TABLEAU V Jours après l'infection INT 218 Dose ( fig) INT 219 Dose ( }ig) Témoin 50 15 5 50 15 5 7 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/8 10 5/5 0/5 0/5 5/5 0/5 0/5 0/8 12 5/5 0/5 0/5 5/5 0/5 0/5 0/8 14 5/5 3/5 0/5 5/5 2/5 0/5 0/8 Conclusions. INT 218 et INT 219 présentent ici encore une activité similaire, tous deux étant légèrement actifs après 3 doses de 15 jug/souris et fournissant une régression complète pour une 35 dose de 50 pg/souris. F. Taux d'interférons dans le sérum. On a administré par voie intrapéritonéale à des souris (groupe de 6 animaux) ÎO jag de composé. On a recueilli le sang par ponction cardiaque et on a réuni les prélèvements. On 40 a titré les taux d'interférons par mesure de la réduction du 72 00892 25 2121772 nombre de plaques virales (virus EMC) observées dans une feuille ou nappe de cellules L-929 (fibroblaste de la souris), dues au pré-traitement des cellules avec une dilution de sérumo Le PDD(-0 est l'inverse de la dilution du sérum qui réduit le nora-5 bre des plaques à 50% du nombre chez les animaux témoinso PDD^q aux temps indiqués après l'injection du composé Composé 2 heures 4 heures 24 heures 10 INT 218 385 >1000 165 INT 219 >1000 500 INT 219 fournit un taux d'interférons de pointe plus tôt que INT 2180 Dans l'ensemble de la description, les termes "hyperchromi-15 cité" et "Tm" se rapportent à des paramètres relatifs au degré d'oxydation des substances, obtenus en enregistrant l'absorption des ultraviolets par la substance à une fréquence particulière, tout en augmentant graduellement la température de cette substance. La différence entre les deux extrêmes d'absorption (substan-20 ce à deux chaînes et substance à une seule chaîne), exprimée en pourcentage de l'absorption de la substance à double chaîne, est dénommée "hyperchromicité", et la valeur "Tm" désigne la température pour laquelle l'absorption est équidistante des valeurs d'absorption de la substance à double chaîne et de la subs-25 tance à une seule chaîne. Par ailleurs, l'expression "agent tampon tris" correspond à l'agent tampon formé par le 2-amino-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diolo Des modifications peuvent être apportées aux modes de mise 30 en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de l'invention0 72 00892 26 2121772 REVENDICATIONS 1.- Procédé pour la préparation d'une nouvelle forme d'ARN d.c» naturel ayant une activité antivirale et présentant une toxicité aiguë réduite relativement à la forme normale 5 d'ARN d.c. provenant de la même source naturelle, caractérisé en ce que (a) on traite la forme normale d'un ARN d.c. naturel avec un hydroxyde de métal alcalin à un pH compris entre 11,0 environ et 12,5 environ dans une solution aqueuse d'électrolyte, dans des conditions de température, de temps, de concentration 10 d*électrolyte et de pH telles qu'une séparation partielle des chaînes de polynucléotides de chaque molécule d'ARN d.c» commence immédiatement et que pas plus de 25 liaisons di-esters phosphates par chaîne soient hydrolysées pendant la durée de la réaction, puis (b) on neutralise la solution résultante» 15 2»- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la forme normale de l'ARN d.c. naturel est traitée avec de la soude à un pH de 11,8 environ dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15M à environ 20° C, pendant un laps de temps d'environ 10 minutes, puis la solution résultante est neu-20 tralisée» 3.- Nouvelle forme d'ARN d.c» naturel, ayant une activité antivirale et présentant une toxicité aiguë réduite relativement à la forme normale d'ARN d.c. provenant de la même source naturelle, et sels de cette nouvelle forme d'ARN d.c», celle-ci 25 étant caractérisée en ce que :- a) Elle présente une hyperchromicité en pourcentage réduite relativement à la forme normale d'ARN d.c0 provenant de la même source; b) Elle a la même composition de base fixée que la forme normale 30 d'ARN d.c. provenant de la même source; c) Les molécules de cette nouvelle forme sont "agrégées" (comme défini précédemment); d) Elle a sensiblement les mêmes caractéristiques de sédimentation sur un support à gradient de saccharose que la forme nor- 35 maie d'ARN d.c0 provenant de la même source; e) Une solution de cette nouvelle forme a une viscosité plus faible qu'une solution de la forme normale d'ARN d.c. provenant de la même source à la même concentration; f) Quand les chaînes de polynucléotides de la nouvelle forme 40 d'ARN d.c. sont séparées de façon irréversible dans des condi 72 00892 27 2121772 tions qui, par elles-mêmes, ne provoquent pas l'hydrolyse des liaisons di-esters phosphates, les polynucléotides à une seule chaîne résultants ont des poids moléculaires plus faibles que les polynucléotides à une seule chaîne obtenus à partir de la forme 5 normale d'ARN d.c, provenant de la même source quand on la traite de la même manière; g) Lors d'une administration par voie intrapéritonéale à des souris, la nouvelle forme présente un LDç-q plus élevé que la forme normale d'ARN d.c. provenant de la même source, adminis^ 10 trée de la même manière selon les mêmes doses; h) La nouvelle forme présente une activité antivirale contre le virus de 1'encéphalomyocardite in vivo chez les souris infectées par le virus 24 heures après l'administration. 4.— Nouvelle forme d'ARN d0c, suivant la revendication 3, 15 caractérisée en ce qu'elle présente un pourcentage d'hyperchromicité allant de 29% à 35%, mesuré dans une solution de chlorure de sodium 0,15M à un pH de 7,0 et à une longueur d'onde de 258 nm. 5.- Nouvelle forme d'ARN d,c0 suivant la revendication 3 20 ou 4, caractérisée en ce que 5 à 20 liaisons di—esters phosphates par chaîne sont hydrolysées, 6.- Nouvelle forme d'ARN d.c. suivant l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle a un pourcentage d'hyperchromicité de 30,0% mesuré dans une solution de 25 chlorure de sodium 0,15M à un pH de 7,0 et à une longueur d'onde de 258 nm.