Brevet FR2135658A1 — publié le 19721222

y. Il est bien connu que la thyroxine (T-4) e t .-la tri-iodo-thyronine (T-3) du plasma, sont fixées par des liaisons faibles sur des protéines spécifiques du sérum généralement nommées "protéines de liaison des hormones thyroïdiennes". Le degré de 5 saturation des protéines du sérum par les hormones thyroïdiennes dépend des différents états de la f.onction thyroïdienne. Dans le cas par exemple,_ d'hyperthyroïdisme, les protéirtes du sérum sont saturées par les hormones thyroïdiennes dans une proportion relativement importante -et, de., ce fait, le. nombre de sites accepteurs ■j O libres des protéines du sérum (représentant la capacité de liaison avec les hormones thyroïdiennes, par insaturation) est relativement-faible. Le . contraire est vrai dans le cas,, d'hypothyroïdisme. Les liaisons entre la thyroxine et les protéines du sérum étant plus fortes que celles existant entre la tri-iodothyronine et 15 ' ces mêmes protéines, le nombre de sites accepteurs libres de celles-ci dépend principalement de la concentration en thyroxine du plasrfia. Hamolski et collaborateurs dans J. Clin. Endocr. 17>33 (1957) décrivent l'absorption de la tri-iodothyï'ohine. marquée 20 à l'iode 131, par les globules rouges du sang total, comme une méthode d'estimation de la saturation des protéines de liaison des hormones thyroïdiennes. Ils remarquent que le taux d'absorption de radio-activité des érythrocytes, après incubation de tri-iodothyronine marquée à l'.iode 131 avec du plasma d'un patient 25 hyperthyroïdien,est inférieur à celui observé après incubation 'avec du plasma de patients ayant un fonctionnement thyroïdien normal. Cette méthode s'est révélée valable pour l'établissement d'un diagnostic des troubles thyroïdiens et des anomalies de transport de la thyroxine par les protéines et pour le dosage 30 de la thérapeutique thyroïdienne. Les mesures faites -concernant une hormone marquée par un élément radio-actif, les erreurs introduites par les. composants iodés organiques contaminants du sérum sont minimales. En général, ces essais d'absorption de la tri-iodothyronl-35 ne T-3 sont effectués par mise en équilibre de quantités infimes de T-3 marquée par un élément radio-actif avec un échantillon du sérum du malade. L'ensemble est ensuite mis en équilibre avec une matière acceptrice secondaire telle que les globules rouges sanguins. Cette matière présente une certaine affinité pour T-3 72 16152 2 2135658 de sorte qu'elle, en absorbe une partie. Si cette matière absorbante a une affinité constante pour T-3, la répartition de T-3 radioactive entre elle et les protéines du sérum dépend du nombre de sites accepteurs libres de ces protéines. 5 En raison des diverses difficultés inhérentes à l'utili sation des globules rouges sanguins, diverses autres matières absorbantes ont été utilisées, telles que, par exemple, une substance échangeuse d '.anions, fortement basique, utilisée sous la forme de perles de résine à l'état libre de résine imbibée dans une épon-10 g^d'une membrane. L'hémoglobine absorbée sur du charbon est également utilisée. Ces matières peuvent capter T-3 fixée sur des protéines. Dans tous les procédés de l'art antérieur par absorptions compétitives, la matière absorbante et l'échantillon de sérum 15 sont mis en contact par lots contrairement à ce qui se passe dans la- technique sur colonne de l'invention. Dans ces procédés, des conditions d'équilibre ou voisines de l'équilibre sont recherchées car, il semble que des résultats cliniques reproductibles ne peuvent être obtenus que de cette façon. Dans ce but, l'échantillon de •20 sérum et la matière absorbante sont mélangés constamment et agités par secouage ou rotation pendant un temps relativement long, compris entre environ.30 mn et environ 1h30. A l'issue de cette opération, il faut séparer la matière absorbante de la phase liquide pour définir le pourcentage de fixation de T-3 par ïa matière ab-25 sorbante. II.faut que le temps de mélange.des échantillons à essayer soit relativement constant et que les dispositifs de contrôle Utilisés soient relativement uniformes pour que les valeurs obtenues soient connues et utiles pour le procédé d'essai. Le présent procédé élimine ces étapes fastidieuses et ces 30 longues périodes de temps perdu. En général le nouveau procédé sur -colonne .ne demande .qu'environ 10 mn de contact entre l'échantillon et la matière absorbante et, plus souvent, 5 mn seulement environ. Dans le mode.de réalisation préféré décrit ci-après, le temps de contact est inférieur à environ 3,mn. Après ce temps de contact, 35 la-phase liquide est prélevée directement.de l'efflueht de la co-- ,vJonne séparé de la phase solide correspondant à la matière ab-■ ; sorbante,. de sorte qu'aucune étape de séparation supplémentaire . ^n,'est. nécessaire comme dans la technique par lots. En dépit du : fait que le temps de. contact est très bref, cette technique donne 72 16152 3 2135658 des résultats comparables ou même meilleurs que ceux obtenus avec les techniques de l'art antérieur. Ceci est très surprenant étant donné les efforts faits jusqu'à présent pour mélanger les composants de façon continue et pendant des périodes de temps relative-5 ment longues pour établir ou avoisiner des conditions d'équilibre du lot. " Dans la technique sur colonne, aucunë condition d'équilibre entre la matière absorbante et la solution n'existe. Au contraire, la relation existant entre la matière absorbante et la so-•jO lut ion varie iconstamment puisque la solution migre dans la matière absorbante de la colonne. En un sens, dans cette technique, les parties successives de la matière absorbante fixent instantanément l'hormone thyroïdienne alors que la solution se déplace dans la colonne. Chaque fixation instantanée correspond à une variation 15 si brusque de la pente d'une courbe de fixation qu'un degré acceptable de reproductibllité des résultats ne peut être espéré. Néanmoins, la technique sur colonne, de l'invention donne des résultats, aussi valables, sinon meilleurs, que ceux de la technique par lots. Par exemple, 1J parties du même échantillon de sérum sont traitées 20 dans une colonne, selon le procédé de l'invention; le pourcentage d'erreur est de 2,5$. Ce pourcentage d'erreur, inférieur à ceux correspondant aux techniques de lrart antérieur, est très acceptable pour un diagnostic clinique. En outre, après comparaison de la technique de l'invention avec celle de l'art antérieur, basée sur 25 un procédé par équilibre des lots, on constante l'existence d'une corrélation linéaire entre les résultats obtenus dans les deux cas. Seuls 2% des résultats obtenus par la technique de l'invention diffèrent de ceux obtenus par la technique de lfart antérieur. En dehors de sa simplicité et de l'économie de temps 30 qu'elle permet, la technique de l'invention présente une autre caractéristique importante: elle permet de mesurer le taux de dissociation de T-3 et des sites accepteurs.de la protéine. Dans la sont technique antérieure, les conditions/à l'équilibre ou voisines de l'équilibre. Les résultats ne donnent qu'une mesure dé la capacité 35 de liaison, à l'équilibre, des sites accepteurs. Dans la technique de l'invention appliquée à T-3, il semble que les résultats concernent le taux de T-3 fixée par la matière absorbante, la capacité de liaison des protéines avec T-3 et le taux de dissociation de ces protéines et de T-3. Le taux.de dissociation de T-3 et des protéines 72 16152 4 2135658 étant déterminant, ce taux est l'un des premiers mesuré par la présente technique. N'importe quelle matière absorbante convenable peut être utilisée dans le procédé de l'invention à condition qu'elle absorbe environ '10 à 9~Q# du poids de l'hormone thyroïdienne de l'échantillon. De préférence, la matière absorbante et les conditions expérimentales sont choisies pour que 40 à 60% en poids de l'hormone thyroïdienne d'un échantillon de sérum d'un patient ayant un fonctionnement thyroïdien normal, soient absorbés. Les matières absorbantes préférées mises en oeuvre dans le procédé de l'invention sont, par exemple, des résines échangeuses d'ions. Les résines échangeuses d'anïons sont. plus- particulièrement souhaitables lors" de l'utilisation d'hormone thyroïdienne marquée par un composé radio-actif pour déterminer le pourcentage de fixation par la matière absorbante. La résine échangeuse d'anions permet d'éliminer tout autre déchet radio-actif dont la présence peut fausser les résultats de l'essai.. Comme on le verra dans les exemples décrits ci-après, une résine échangeuse d'anions?fortement basique donne des résultats particulièrement souhaitables. Toute technique de mesure analytique du pourcentage de fixation de l'hormone-par la matière absorbante est envisagée. Un procédé préféré consiste à incorporer une quantité choisie de T-3 ou de T-4 marquée par un élément radio-actif dans l'échantillon de sérum. Lorsque l'équilibre est atteint, l'échantillon passe sur la colonne et la quantité de T-3 ou de T-4 marquée, par l'élé- ,ex , , ment radio-actif/contenue dans 1 effluent est mesuree par des techniques classiques. Comme-il est bien connu, les taux de fixation de l'hormone marquée par un,élément radio-actif,ainsi obtenus permettent .d'évaluer le fonctionnement de la thyroïde par comparaison avec des valeurs connues concernant des sérums traités dans des conditions comparables, L'information voulue peut être obtenue par mesure de la quantité de radio-activité de la matière absorbante ou de l'effluent de la colonne. De' préférence, les mesures sont faites sur l'effluent. La rétention par la matière absorbante de 10 à QQ% du poids de l'hormone de l'échantillon implique un certain nombre de variables. L'absorbant, son type (c'est-à-dire s'il est ou non une résine échangeuse d'ions et son degré de réticulation si c'est-une résine) , le volume utilisé et la dimension des mailles 72 16152 5 2135658 influent sur le pourcentage de rétention. En outre, les dimensions de la colonne, en particulier son diamètre, influent également sur les résultats. En général, les conditions sont choisies dë façon que,pour un volume d'échantillon donné, la valeur de rétention vcv>~ 5 lue sait atteinte en un temps bref noté. Comme on le verra dans l'exemple décrit ultérieurement, la rétention désirée de l'hormone thyroïdienne au cours d'un bref temps de contact peut être obtenue en utilisant 1,2 ml (volume particulaire) d'une résine échangeuse d'anions fortement basique ayant un pourcentage de réticulation en •{G poids de 8# une ouverture de maille de 0,074 mm à G>149 et dans une colonne dont le diamètre est environ 0,75 cm. Le temps de contact nécessaire avec une telle colonne ne dépasse pas environ 3 ran. De préférence, l'échantillon liquidçéssayé contient 3us-15 qu'à environ 1 ml de sérum sanguin et de préférence environ 0,5- ml. Comme dans la technique antérieure, l'échantillon est convenablement dilué avec une solution tampon ayant de préférence un pH .d'environ 5• L'invention est illustrée par le procédé suivant qui don-20 he d'excellents résultats. EXEMPLE 0,5 ml de sérum d'un malade est mélangé avec 2,5ml d'un tampon à l'acétate de sodium 0,4 N à pH 5 et contenant des quantités infimes de tri-iodothyronine marquée par un élément radio-actif. 25 Ce mélange reste au repos pendant 20 ma afin d'assurer la distribution statistique de T-3 radio-actif entre le sérum et la solution. Il passe ensuite sur une résine échangeuse d'anions, fortement basique, dans une colonne. La colonne contient 1 ,2. ml d'une résine échangeuse d'allions, fortement basique sous 30 sa forme chlorure, ayant un pourcentage de réticulation de 8$ et dont les mailles ont des dimensions comprises entre 0,074 et 0,149 mm. Le diamètre intérieur de la colonne mesure environ 0,75 cm. L1effluent de la colonne est recueilli dans un tube gradué.. La radio-activité du contenu du tube est ensuite me-35 surée. Le degré d'insaturation des sites accepteurs des protéines du sérum est déterminé par comparaison avec un étalon tel que du sérum étalon disponible dans le commerce et ayant une-valeur connue. 72 16152 6 2135658 La première ligne du tableau ci-dessous indique les résultats obtenue avee les matières décrites dans le précédent paragrsjtte.. £es données représentées sur les lignes 2 à 5 clu tableau sont obtenues en utilisant le même procédé mais des résines échangeuses d'ions et des volumes, différents comme indiqué. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées.au procédé décrit sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU Relation entre les types de résine utilisés et les résultats obtenus FO Résine Volume de Débit Sérum normal Sérum anormal ILT* ON résine ^'d'élutlon % d'élution ^ ui AG1 X8, 0,074-0,149 mm 1,2 ml 1,0 ml/nm 43,4 30,0 0,69 1x3 AG-1 X4, 0,074-0,149 mm 1,2 ml 1,0 ml/mn 34,5 23,5 0,68 AG1.X2, 0,074-0,149 mm 1,2 ml 1,0 ml/mn 36,0 24,4 0,68 AG50WX8, 0,074-0,149 mm 2,0 ml — 40,0 23,4 0,59 AG40WX2, 0,074-0,149 mm 2,0 ml -- 36,7 24,4 0,67 ■H* ' ILT - Indice de Liaison Thyroïdienne ' ; La valeur de ILT d'un sérum anormal est calculée pour être de 0,68 d'après,les résultats obtenus en utilisant les techniques de l'art antérieur. , .. Les résines AG sont des résines échangeuses d'ions disponibles dans le commerce et fabriquées par Bio-Rad Laboratories, Richmond, Oalifornia, Les résines AG1 sont des résines échangeuses d'anions fortement basiques. Les résines AG50W sont des résines échangeuses de cations fortement acides. Le nombre suivant le "X" indique le pourcentage»en poids, de réticulation de la résine. l—^ LM ' U1 ON OO 72 16152 8 2135658 REVENDICATIONS 1 - Procédé de détermination du taux de fixation de l'hormone thyroïdienne par une matière absorbante acceptrice et compétitive, l'hormone thyroïdienne de l'échantillon liquide étant liée à des 5 protéines acceptrices, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: mise en place de la matière absorbante dans une colonne, passage de l'échantillon liquide sur cette colonne, les dimensions de la colonne et la matière absorbante étant choisies pour que la dernière fixe compétitivement 10 à 90% en poids de l'hormone de 10 l'échantillon au cours d'un seul passage sur la colonne, et mesure du taux de rétention de l'hormone thyroïdienne dans la colonne par rapport à la quantité d'hormone présente dans 1'effluent de cette colonne. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 15 les dimensions de la colonne, le type, le volume et la dimension des mailles de la matière absorbante, et le volume de l'échantillon liquide sont choisis pour quefLe temps de contact de l'échantillon ne soit pas supérieur à environ 10 minutes. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 20 la matière absorbante est une résine échangeuse d'ions,par exemple une résine réticulée échangeuse d'anions. 4 - Application du procédé selon la revendication 1 à l'évaluation de la fonction thyroïdienne par mise en contact du sérum sanguin avec une substance absorbante,par liaison compétitive, 25 de l'hormone thyroïdienne,au sein d'un mélange constamment agité du sérum et de la matière absorbante dans une solution tamponnée et pendant un temps assez long, procédé dans lequel l'analyse de l'absorption compétitive de l'hormone thyroïdienne par les protéines acceptrices du sérum et la matière absorbante donne une 30 informatisai de l'approximation de la concentration en sites accepteurs libres du sérum sanguin, procédé caractérisé en ce que la mise en contact a lieu lors d'un passage rapide du sérum sanguin et de la solution tamponnée sur une colonne stationnaire de la matière absorbante compétitive. 35 5 - Application du procédé selon la revendication 1 à l'éva luation de l'état du fonctionnement thyroïdien, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : mise en équilibre d'un échantillon contenant du sérum sanguin avec une quantité donnée d'hormone thyroïdienne marquée par un élément radio-actif, mise 72 16152 9 2135658 en place d'une colonne de résine échangeuse d'ions destinée à absorber environ 10 à 90% en poids de l'hormone thyroïdienne liée au sérum de l'échantillon, passage de l'échantillon sur la colonne en moins d'environ 5 minutes, masure de la radioactivité de la matière absorbante de la colonne et éventuellement de l1effluent de la colonne et détermination du pourcentage de-l'hormone thyroïdienne absorbée par la colonne et'éventuellement 11 effluent, par mesure de la radio-activité. 6 - -Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'hormone thyroïdienne marquée par un élément radio-actif est de la tri-iodothyronine ou de la thyroxine. 7 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce. que l'échantillon contient une solution tamponnée diluante. 8 - Procédé selon la revendication 5* caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions est une résine échangeuse d'anions» fortement basique . 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions a un taux de réticulation d'environ 8%. 10 - Procédé selon la revendication 5? caractérisé en ce que la colonne de résine échangeuse d;ions permet dAbsorber environ 40 à 60% du poids de l'hormone thyroïdienne d'un échantillon de sérum d'un patient ayant un fonctionnement thyroïdien normal. 11 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions en particules ayant des dimensions correspondant à une ouverture de maille comprise entre 0,074 et 0,149 rara* représente un volume d'environ 1,2 ml et en ce qUè le diamètre de la colonne mesure environ 0,75 cm, le temps de séjour de l'échantillon dans la colonne étant inférieur à environ j5 minutes. . 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'échantillon contient environ 1 ml au maximum de sérum sanguin, et de préférence environ 0,5 ml;