Brevet FR2110410A1 — publié le 19720602

La présente invention concerne un procédé de préparation de glyco-lipides contenant du rhamnose par fermentation et en particulier la préparation de nouveaux glycolipides contenant une unité de L-rhamnose à partir d'une culture de bactéries productrice de glyco-lipides contenant du rhamnose appartenant au genre Pseudomonas et la présente invention concerne ces nouveaux lipides. Jusqu'ici, on savait que les glyco-lipides contenant du rhamnose étaient produits intracellulairement à l'état de traces par certains microorganismes, tels que les bactéries appartenant au genre Pseudomonas, etc, mais il a été difficile de produire des glyco-lipides contenant du rhamnose extracellulairement en quantité relativement grande.De plus, on a obtenu, à partir de telles bactéries, un glyco-lipide contenant deux unités de L-rhamnose, sans obtenir de glyco-lipide ayant une seule unité de L-rhsmnoseO La demanderesse, à la suite d'études répétées, a trouvé qu'un microorganisme capable d'assimiler des hydrocarbures, en particulier des paraffines normales, à titre de source de carbone, peut produire des glyco-lipides contenant du rhamnose extracellulairement, avec des rendements élevés, à partir de paraffines normales ou d'une source de carbone pouvant autre assimilée par le microorganisme, et elle a ainsi réalisé la présente invention. Ainsi, la présente invention propose un procédé de préparation de nouveaux glyco-lipides contenant du T- rhamnose par cultures aérobie d'une bactérie productrice de glyco-lipides contenant du rhamnose appartenant au genre Pseudomonas dans un milieu contenant une source de carbone, qui peut entre assimilée par ladite bactérie (de préférence une paraffine normale), par formation et accumulation des glyco-lipides contenant le rhamnose dans le milieu, et par récupération de ces glyco-lipides à partir de celui-ci.Avantageusement, le procédé de la présente invention produit des glyco-lipides contenant du rhamnose, qui sont utiles comme agents émulsifiants ou comme médicaments, d'une façon industrielle et économique, par culture d'un microorganisme, en utilisant comme matières premières des hydrocarbures ou des hydrates de carbone bon marché. Conformément à la présente invention, les glyco-lipides contenant du rhamnose obtenus peuvent autre récupérés à partir de la liqueur de fermentation de façon beaucoup plus efficace que dans le procédé pratiqué jusqu'ici,dans lequel les glyco-lipides contenant du rhamnose étaient récupérés à l'état- de traces à partir des cellules microbiennes par une technique d'extraction. De plus, conformément au procédé de la présente invention, bien que les alcools, le sorbitol, le glycérol, etc., puissent être utilisés comme source de carbone, on a trouvé que les n-paraffines constituent une source de carbone particulièrement appropriée à la préparation de glyco-lipides contenant une unité de L-rhamnose. Les glyco-lipides contenant du rhamnose obtenus et récupérés dans le procédé de la présente invention présentent une activité antimycoplasmique et un certain type d'activité antivirale, à côté d'une propriété d'agent dispersif. De plus, il est possible de récupérer facilement, respectivement, le rhamnose et les acides gras hydroxylés, par traitement des glyco-lipides contenant le rhamnose avec un alcali ou un acide. Comme microorganismes employés dans le procédé de la présente invention, on peut citer Pseudomonas aeruginosa sgac 15246 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Pseudomonas fluorescens AUCC 15453 Pseudomonas butina ÂTCC 4359 Pseudomonas cruciviae ÂTCC 21283 Pseudomonas boreopolis ATCC 15452 Pseudomonas oleovorans ÂTCC 8062 En d'autres termes, les microorganismes utilisés dans la présente invention comprennent toutes les souches productrices de glyco-lipides contenant du rhamnose appartenant au genre Pseudomonas, aussi bien que leurs mutants naturels ou artificiels. Les glyco-lipides contenant du rhamnose sont produits par culture d'un microorganisme dans des conditions appropriées. Les composés peuvent être produits soit intracellulairement soit extracellulairement par culture dans un milieu liquide ; cependant, pour obtenir une grande quantité dr glyco-lipides contenant du rhamnose, on préfère récupérer ceux qui sont produits extraceilulairement par culture dans un milieu liquide. On peut éffectuer la culture à la température de croissance des souches productrices de glyco-lipides contenant du rhamnose et habituellement, à une température comprise entre 250C et 370C, Comme source de carbone, on préfère employer dans la présente invention, des n-paraffines et diverses fractions d'hydrocarbures contenant des n-paraffines. Les n-paraffines appropriées contiennent de 1Q à 20 atomes de carbone par molécule. On utilise habituellement des mélanges de telles paraffines. On peut utiliser d'autres sources de carbone assimilables telles que les monoalcools ou les polyalcools, comme le glycérol, le sorbitol, l'éthanol, etc., des acides organiques, d'autres hydrates de carbone, etc. Comme source d'azote, on peut utiliser des sources d'azote minérales ou différents types de sources d'azote organiques.On peut utiliser, par exemple , l'urée, l'ammoniaque ou des sels d'ammonium tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium,le carbonate d'ammonium, etc., ou des substances naturelles contenant de l'azote, telles que la liqueur de trempage de mais, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, le bouillon, les hydrolysats de caséine, l'acide aminé de caséine, les extraits solubles de poisson, l'extrait de son de ric, la "NZ-mine" (une série dlhydrolysats de caséine), le tourteau de soja dégraissé, des produits digérés tels que la farine de poisson digérée ou le tourteau de soja dégraissé digéré, l'hydrolysat de fève, etc. On peut utiliser une seule de ces substances ou une combinaison de deux ou plusieurs de ces substances. Pour effectuer la culture, on prépare un milieu à partir d'une seule ou d'un mélange des sources de carbone précitées, des sources d'azote précitées, de phosphate, de sulfate, de chlorhydrate, de sels d'acide organique, de sels de métaux lourds, comme le cuivre, le fer, le nickel, le coblat, le manganèse, etc., et d'autres facteurs de croissance exigés et on stérilise le mélange. On inocule un microorganisme producteur de glyco-lipides contenant du rhamnose de la présente invention dans le milieu de culture ainsi préparé et on effectue la culture en aérobie. Pendant la culture, on ajuste le pH du milieu à 4 à 10 (de préférence 6 à 8) , par addition d'une solution d'urée , d'une solution aqueuse d'ammoniac ou d'une solution de carbonate d'ammonium. La fermentation est effectuée en 1 à 6 jours mais se termine lorsque la quantité de glyco-lipides contenant du rhamnose produits atteint le maximum. Pour isoler le glyco-lipide contenant du rhamnose de la liqueur de culture, on acidifie cette dernière et on en élimine les cellules microbiennes et les substances à haut poids moléculaire, telles que les protéines, par centrifugation. Puis, on peut extraire les glyco-lipides contenant du rhamnose à partir de la liqueur de culture faiblement acide avec des solvants tels que le butanol, l'acétate d'éthyle,etc. La liqueur d'extraction par solvant, dans de nombreux cas, contient différents glyco-lipides contenant du rhamnose, qui peuvent être isolés par chromatographie sur gel de silice.On peut séparer les glyco-lipides isolés contenant du rhamnose par dissolution de ces glyco-lipides dans l'eau neutre et par ajustement du pH de la solution obtenue à 3 à 4 avec de l'acide chlorhydrique ou d'une autre façon, par dissolution dé ces glyco-lipides dans l'éthanol et ensuite par refroidissement de la solution obtenue. Ainsi, selon le produit obtenu, on isole une masse de couleur blanche et/ou des cristaux sous forme d'écailles de couleur blanche. Le composé de la présente invention (lipide b) a la formule suivante et est appelé a-L-rhamnopyrannosyl-.-hydroxydécanoyl--hydro- xydécanoate. On a également isolé un autre glyco-lipide (lipide B) de formule et on l'a appelé 2-O-&alpha;-L-rhamnopyrannosyl-&alpha;-L-rhamnopyrannosyl- ss-hydroxydécanoyl-ss-hydroxydécanoate. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants, qui sont donnés simplement dans un but d'illustration mais ne sont pas limitatifs de la portée de la présente invention. Exemple 1 On cultive Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 pendant 24 heures, tout en agitant, dans un milieu comprenant 2,0 % de sorbitol, 1,0 * d'extrait de viande, 1,0 % de polypeptone et 0,3 * de sel de cuisine et ayant un pH de 7,3 (avant stérilisation).On inocule la culture ensemencée ainsi préparée dans un fermenteur à secousses de 30 litres contenant 15 litres d'un milieu de culture ayant la composition suivante à une concentration de 5 % en volume : (NH4)2SO4 0,5 % KH2PO4 0,2 % Na2HPO4 0,2 % K2S04 0,1 * NgS04 . 7H20 0,1 % FeSO4 . 7H20 0,1 * MnSO4 . 4H2O 0,005 % ZnS04 . 7H20 0,001 * Biotine 100 Fg/l Liqueur de trempage de maTs 0,3 Extrait de levure 0,2 % n-paraffine 10% (volume/volume) (mélange en C12-Cl5) pH 6,5 (avant stérilisation) On effectue la culture à 300C pendant 72 heures, avec une agitation de 400 tours par minute et une aération de 1 litre/l par minute d'air stérilisé. Pendant la culture, on ajuste le pH du milieu à 6,0 à 7,5 avec une solution aqueuse d'ammoniac Lorsque la culture est terminée, le substrat de n-paraffine est presque entièrement consommé. On ajuste la liqueur de fermentation séparée des cellules microbiennes à pH 3 pour coaguler les substances à haut poids moléculaire, telles que les protéines, etc., et on centrifuge, ce qui entraîne la formation d'un liquide surnageant. On soumet le liquide surnageant à une extraction en utilisant un volume égal d'acétate d'éthyle. On concentre la liqueur d'extraction et on fait passer le concentré à travers une colonne de gel de silice. On effectue une chromatographie en utilisant du chloroforme comme éluant. Les paraffines normales sont d'abord entrarnées , puis on élue le glyco-lipide À contenant du rhamnose en faisant passer un excès de chloroforme. Ensuite, on élue le glyco-lipide B contenant du rhamnose avec une solution mixte chloroforme-méthanol (90 : 10). On concentre séparément les fractions À et B et on soumet ensuite chaque concentré à une chromatographie. Après purification séparée des lipides À et B, on dissout chaque concentré dans l'éthanol-chaud et on le laisse reposer, (le lipide B étant cristallisé) dans une chambre froide Après dissolution dans l'eau, on peut reprécipiter ou recristalliser chacun des lipides par ajustement du pH de la solution à 3,0 à 3,5. On récupère 3 g de lipide A sous forme d'un précipité de couleur blanche et 8 g de lipide B sous forme de cristaux à partir de 5 litres d liquéur de culture. L'analyse élémentaire, e spectre d'absorption infra-rouge et d'autres données physico-chimiques montrent que les -lipides A et-B ont les structures représentées par les formules I et II respectivement. On hydrolyse les deux lipides avec H2SO4 1 N pendant 2 heures pour isoler une substance ayant un pouvoir réducteur. Le spectre d'absorption infrarouge, l'analyse élémentaire et la chromatographie sur papier de la substance montre tutelle est identique au rhamnose (6-déhydrooygmannose). Les teneurs en rhamnose des lipides isolés À et B sont respectivement 42 % en poids et 57 * en poids. On soumet ces glyco-lipides contenant du rhamnose à une chromatographie sur couche mince de gel de silice et on développe avec un système chloroforme-méthanol-acide acétique (85:10:5). A la suite d'une pulvérisation de réactif anthrone suivi d'un chauffage à 1000C, on détecte le lipide À à Rf 0,75 et le lipide B à Rf 0,45. ExemPle 2 On cultive Pseudomonas fluorescens ATCC 15453 de la mtme manière que dans l'exemple 1. A la suite de la détermination des glyco-lipides contenant du rhamnose formés dans le milieu de culture, en soumettant la liqueur de fermentation à une extraction suffisante avec de l'acétate d'éthyle, on constate la formation de 1,8 g/l de lipide A et de 3,2 g/l de lipide B de l'exemple le Exemple 3 On cultive Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 de la mtme manière que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise comme source de carbone le glycérol, Après 82 heures de culture, on soumet la liqueur de fermentation à une centrifugation ; on obtient alors un liquide surnageant. On soumet le liquide surnageant ainsi obtenu à une extraction suffisante avec du butanol et on élimine le solvant par distillation. On laisse reposer encore toute la nuit puis on recueille le précipité par centrifugation0 On dissout le précipité ainsi obtenu dans l'éthanol et on le refroidit pour le faire cristalliser. On fait recristalliser dans l'eau les cristaux obtenus et on obtient 2,6 g de lipide B à partir de 3 litres de liqueur de culture. Exemple 4 On cultive Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 de la mtme manière que dans l'exemple 1, sauf qu'après 10 heures de culture, on ajoute au milieu 500 Ilg par millilitre de FeS047H20 et 50 pgXml de CoS0407E20. Au bout de 48 heures, la culture est terminée. A la suite de la détermination des glycolipides contenant du rhamnose formés dans le milieu de culture, en soumettant la liqueur de fermentation à une extraction suffisante avec de l'acétate d'éthyle, on constate la formation de 4,5 g/l de lipide A et 5,2 g/l de lipide B. Exemple 5 On cultive Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 de la méme manière que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise comme source de carbone 5 % de glucose. Après 24 heures de culture, on ajoute au milieu 5 * de glucose et la culture est terminée au bout de 55 heures. A la suite de la détermination des glyco-lipides contenant du rhamnose formés dans le milieu de culture, en soumettant la liqueur de fermentation à une extraction suffisante avec de l'acétate d'éthyle, on constate la formation de 2,1 g/l de lipide À et de 3,5 g/l de lipide B. ExemPle 6 On inocule Pseudomonas fluorescens ÂTCC 15453 dans un fermenteur à secousses de 5 litres contenant 3 litres d'un milieu ayant la même composition que dans l'exem- ple 1, sauf qu'on utilise du glycérol à la place de la n-paraffine et on effectue la culture à 300C pendant 72 heures avec une agitation de 600 tours par minute et une aération de 1 1/1 par minute d'air. Par suite, 3,0 g/l de lipide A et 7,0 g/l de lipide B se sont formés dans le milieu. Exemple 7 L'examen du lipide A, c'est-à-aire de l -rhamnopyrannosyl-ss-hydroxydécanoyl"ss-hydroxydécanoate montre que ce composé a les propriétés suivantes 10 Solubilité Soluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétone, le méthanol, l'éthanol, l'éther, l'eau (alcaline) et le n-butanol. Insoluble dans l'eau acidifiée. 20 Réaction avec les colorants. Réaction à l'anthrone : positive Réaction à l'acide phénolsulfonique : positive Réaction au nitrate d'argent ammoniacal : négative Réaction à la ninhydrine : négative 30 Valeur de Rf du chromatogramme sur couchemince de gel de silice Solvant Vaieur de Rf Chloroforme :néthanol:acide acétique 80 : 15 : 5 0,73 - 0,85 90 : 5 : 5 0,50 40 Point de fusion pas encore déterminé 50 activité antibiotique la concentration minimale dtinhibition contre le Bacillus subtilis est de 10-20 AgZml Cette activité est 10 a' 20 fois plus élevée que celle du lipide B. 60 Toxicité aiguë. environ 200 mg/kg (injection intraveineuse sur une souris). 70 Activité antimycoplasmique 2,04 cm (10 mg/ml de solution aqueuse) selon la méthode du disque. 80 Spectre infrarouge indiqué sur la figure unique du dessin annexé, REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de glyco-li- pides contenant du rhamnose, caractérisé par le fait qu'il comprend la culture d'une bactérie productrice de glycolipides contenant du rhamnose appartenant au genre Pseudomonas, dans un milieu nutritif contenant une source de carbone qui peut être assimilée par ladite bactérie, la formation et l'accumulation des glyco-lipides contenant du rhamnose dans ledit milieu, et la récupération des glyco-lipides à partir du milieu, ces lipides comprenant un lipide contenant une seule unité de Erhamnose par molécule. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les lipides précités comprennent aussi un lipide contenant deux unités de L-rhamnose par molécule. 3. Procédé selon la revendication lt Ca- ractérisé par le fait que la culture de ladite bactérie est effectuée dans un milieu liquide à une température comprise entre 25 et 370C. 4. Procédé selon la revendication-3,caractérisé par le fait que, pendant la culture, le pH du milieu est ajusté à 4 à 10 par addition d'une solution d'urée, d'une solution aqueuse d'ammoniac ou d'une solution de carbonate d' ammonium. 5. Procédé selon la revendication l,ca- ractérisé par le fait que ladite bactérie est choisie dans le groupe comprenant Psedomonas aeruginosa ATCC 15246, Pseudooo- nas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas fluorescens ATCC 15453, Pseudomonas putida ATCC 4359, Pseudomonas cruciviae ATCC 21283, Pseudomonas boreoolis ATCC 15452, et Pseudomonas oleovorans ATCC 8062. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le lipide contenant une seule unité de L-rhamnose est l'&alpha;-L-rharmnopyrannol-ss-hydroxydécanoyl-ss- hydroxydécanoate. 7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le lipide contenant deux unités de L- rhasnose est le 2-0-a-L-rhamnopyrannonyl-&alpha;-L-rhamnopyranLossyl-ss- hydroxy-décanoyl-ss-hydroxydécanoate. 8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'on récupère lesdits glyco-lipides en acidifiant la liqueur de culture, en éliminant les substances à haut poids moléculaire et les cellules microbiennes par centrifugation, en extrayant les glyco-lipides avec des solvants à partir de la liqueur de culture faiblement acide obtenue et en isolant les glyco-lipides par chromatographie en phase liquide. 9. Nouveau glyco-lipide caractérisé par le fait qu'il est l1a-L-rhamnopyrannosyl--hydroxydécanoyl-P- hydroxydécanoate.