Brevet FR2116501A1 — publié le 19720713

La présente ' nver. t " t-i: sr: a un vacsi.-î p«ju? | ' Ibsquû! saticr. du bétail contre la rhinotrachéi te hov J-ne infectieuse provoquant la fors-afcion d'interférun dans les sécrétions tiâsâles et ie sérum, ttn procédé de préparation du vaccin et un procédé permettant d!itm:nise? le béïaiî evec ceiui-ciu 5 La thiriotrdchéite bovine infectieuse (IBR) est u&& maladie virale très contagieuse du bétail caractérisée par une inflammation sévère des voies respiratoires supérieures et de la tiachée. Elle est prevoquée par un viras qui se transmet facilement dans de îiuee gouttelettes en suspension dans l'airù auxvoies respiratoires des animaux» Le bétail Infecté peut avoir une température 10 comprise entre 40,0 et 41,7**C, présente ur. écoulement nasal muqueux importants un état dépressif, une perte d'appétitj -jt, rythme respiratoire accru, une respiration pénible et de la toux. Une brom tu;-pneumonie secondaire peut éventuellement compliquer la situation. Une autre séquelle importante de 1: infecticr- »st l'avortement des animaux infectés pendant leur gestation » Le virus ll-f; prouG-eue 15 également une maladie connue sous le nom de viirc-vagir;i.te pustulairs isfesïisuse. Bien que la mortalité soit faible, rarement supérieure à 5 %-la morbidité est assez élevée et, en raison de la nature fortement infectieuse du virus IBR, un troupeau entier de bétail prédisposé à cette maladie peut être infecté. Un aspect important de la maladie est la perte de poids et la 20 dégradation de l'état des bestiaux engraissés en raison de leur état dépressif et de leur perte d'appétit, et il devient nécessaire d'alimenter ces animaux pendant plus longtemps avant de pouvoir les vendre. La baisse de la production laitière dans un troupeau laitier est également une conséquence importante de la maladie. 25 Plusieurs vaccins efficaces pour l'immunisation des bestiaux contre l'IBR sont disponibles et un certain nombre de brevets ont été déposés pour des procédés de préparation de ces vaccins. Par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2 934 473 décrit un procédé de modification du virus IBR par passage en série rapide du virus dans des cultures de tissus bovins 30 jusqu'à ce que, d'après ce brevet, le virus soit modifié de façon qu'il ne provoque plus la maladie lorsqu'on l'injecte à des bovins normaux, Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2941 925 décrit un procédé de modification d'un virus de rhinotrachéite bovine infectieuse par propagation de ce virus dans des cultures de tissus rénaux de porcs, ce qui donne un vaccin 35 qui protège les veaux prédisposés à la maladie contre cette maladie, après inoculation parentérale. 71 43322 2 2116501 Le brevet des Etats-Unis d'Amétique n° 3 048 524 décrit uri procédé d'atténuation du virus IBR par passage en série du virus à travers des cultures de tissus canins a raison de 10 passages au moins. Le vaccin préparé à partir de ce virus atténué semble stimuler une formation d'anticorps 5 lorsqu'on l'injecte à des bovins. Bien que les souches atténuées précitées de virus IBR stimulent le développement d'anticorps protecteurs chez les bestiaux, après injection intramusculaire, et sont des vaccins efficaces pour éviter la déclaration de la maladie chez des bestiaux exposés à des souches naturelles de virus de 10 rhinotrachéite bovi.ne infectieuse, les vaccins préparés à partir de ces souches ne sont pas dépourvus d'inconvénients. Par exemple3 on a trouvé que le virus du vaccin pouvait ne pas être suffisamment atténué pour être totalement sûr lorsqu'on l'inj-ecte par voie intramusculaire à des bestiaux et que son utilisation par voie intranasale était contre-indiquée en raison de son potentiel 15 pathogène. Après administration intramusculaire, le virus du vaccin peut apparaître dans les sécrétions de l'appareil respiratoire des animaux vaccinés et ce virus peut être transmis à l'appareil respiratoire de bestiaux non immuns , ce qui peut alors provoquer une infection avec les symptômes cliniques connus de la maladie. On compte sur la protection contre l'infection par l'IBR 10 à 14 jours 20 après l'administration intramusculaire du vaccin, cette protection étant réalisée par le développement d'anticorps circulants spécifiques. Le risque d'avortement des vaches gravides est si important que les étiquettes placées sur les vaccins disponibles dans le commerce avertissent le vétérinaire de ne pas inoculer ce vaccin à des animaux gravides. C'est pourquoi il est évident qu'il faut 25 disposer d'un vaccin IBR plus fortement atténué mais sûr et efficace. L'invention réalise ce but. En bref, le vaccin selon l'invention comprend un virus IBR vivant que l'on a modifié, ou atténué, par passage en série dans des cultures sur tissus rénaux de lapins à un degré tel que le bétail puisse être immuniser contre 30 l'infection par l'IBR par vaccination intranasale à l'aide du virus. La voie intranasale est la voie habituelle par laquelle le bétail est infecté par le virus IBR mais, comme on l'a indiqué ci-dessus, les vaccins disponibles habi-r tuellement ne peuvent être utilisés ainsi car ils conservent encore un certain pouvoir pathogène. Le bétail ainsi vacciné est tout à fait susceptible de 35 présenter les symptômes cliniques de la maladie avec toutes ses conséquences importantes, comprenant l'infection d'animaux non immuns avec lesquels ils sont en contact. Le vaccin atténué selon l'invention ne provoque pas les symptômes cliniques de la maladie mais néanmoins provoque la formation d'un titre en 71 43322 3 2116501 anticorps IBR aussi élevé, ou habituellement plus élevé, que' celui obtenu lorsqu'on vaccine par voie intramusculaire les animaux à l'aide des vaccins de virus IBR couramment disponibles. Le vaccin selon l'invention présente également un certain 5 nombre d'autres avantages importants. Par exemple, le risque d'avortement des vaches gravides par l'utilisation du vaccin atténué selon l'invention est éliminé ou nettement réduit. Le vaccin selon l'invention provoque chez les bestiaux vaccinés par voie intranasale l'excrétion de virus dans leurs sécrétions nasales pendant 10 une période moyenne de 11 jours environ, ces sécrétions immunisant les bestiaux non-immuns avec lesquels les animaux vaccinés sont en contact. Les bestiaux qui ont été ainsi infectés développent des immun-anticorps et résistent à l'infection par des souches naturelles de virus IBR pathogène mais ne présentent pas les symptômes cliniques de la maladie après leur contact avec des bestiaux 15 vaccinés par voie intranasale. Les veaux peuvent rester avec leur mère récemment vaccinée ou avec d'autres animaux vaccinés et peuvent acquérir une immunité à la suite de ce contact. Ceci ne serat pas possible si les animaux étaient vaccinés par voie intramusculaire avec l'un des vaccins IBR moins fortement atténués couramment disponibles. 20 Le virus IBR atténué sur tissus rénaux de lapins des vaccins selon l'invention n'est pas pathogène et ne donne pas la maladie aux animaux après 5 passages en série au moins chez les bestiaux. Cependant, le vaccin conserve sa faculté d'immunisation et des veaux que l'on a vacciné par voie intranasale avec le virus après 5 passages en série chez des bestiaux sont 25 infectés, sans présenter les symptômes cliniques de la maladie et leurs sécrétions nasales ont des titres élevés en virus. Les veaux ainsi vaccinés présentent des titres élevés en anticorps circulants, 10 à 14 jours après leur vaccination. La demanderesse a constaté selon l'invention que la réaction de protection vis-à-vis de l'infection virale n'est pas limitée à la production 30 d'anticorps car ceux-ci ne sont décelables qu'assez tard dans le déroulement de la maladie. La demanderesse a découvert selon l'invention qu'il existe des mécanismes de défense aupplémentairesopérant sur les sites primaires d'infection, qui, dans le cas d;infection par IBR.sont les muqueuses des voies nasales, qui fournissent une protection plus rapide et plus directe que celle 35 apportée par les anticorps développés quelques jours après l'infection. Deux mécanismes fonctionnent sur J.es sites de l'infection et ce sont le système d'anticorps local et le mécanisme d'interféron . Les anticorps sécréteurs comprennent la classe IgA de 1'immunoglobine et ces anticorps sont synthétisés 71 43322 4 2116501 localement dans l'appareil respiratoire. La production de ces anticorps sécréteurs n'est pas facilement activée par injection parentérale d'un antigène mais peut être facilement provoquée par administration locale du virus IBR. Par conséquent, le mécanisme immum sécréteur des bovins répond 5 plus activement à une stimulation locale d'un antigène qu'à une injection de l'antigène en un site éloigné. La libération d'interféron est l'une des réactions biologiques à l'infection virale que l'on peut mettre en évidence le plus facilement. L'interféron supprime la réplication virale. Un développement précoce d'inter-10 féron sur le site de l'infection est par conséquent important au cours de la période précédant le développement d'une concentration adéquate en anticorps protecteurs dans l'organisme de l'animal. La demanderesse a découvert que la vaccination intranasale des bestiaux à l'aide d'un vaccin de virus atténué par culture sur tissus de lapins selon l'invention provoque le dévelop-15 pement précoce d'interféron dans les tissus de l'appareil respiratoire de l'animal et fournit ainsi une protection préliminaire contre l'infection. Ceci a été démontré par l'apparition de titres élevés en interféron dans les sécrétions nasales des animaux, 40 à 72 h après la vaccination. Des titres inférieurs en interféron apparaissent dans le sérum. L'interféron est présent 20 dans les fluides de l'appareil respiratoire jusqu'à environ 8 jours après la vaccination. La vaccination intranasale des bovins provoque la formation d'anticorps neutralisant l'IBR dans leur sérum, en quantité décelable le lOème jour et en quantité élevée le 14ème jour. On trouve, le 14ème jour, des anticorps neutralisants dans les sécrétions nasales. 25 Le développement d'interféron après infection de l'appareil nasal des bovins par le virus IBR est un avantage important du vaccin selon l'invention. D'autre part, des veaux ayant subi une vaccination intramusculaire à l'aide d'un vaccin de virus IBR atténué sur tissus rénaux bovins ne présentent pas des quantités décelables d'interféron dans leurs sécrétions nasales et peu 30 ou pas d'interféron dans leur sérum. Le développement précoce de l'interféron, tel qu'il se produit lorsqu'on utilise le vaccin selon l'invention, est particulièrement avantageux pour la protection de veaux qui sont mélangés avec un grand nombre de veaux dans des terrains de pâture de différentes origines. Non seulement les veaux 35 vaccinés sont protégés contre l'infection par des souches virulentes de virus IBR pouvant être présentes dans les veaux non vaccinés avec lesquels ils sont en contact, mais ils sont également protégés contre d'autres infections virales dans la mesure où l'interféron protège contre les virus d'autres maladies Ainsi, 71 43322 5 2116501 tout en étant activement immunisés contre l'IBR, les veaux vaccinés à l'aide du vaccin selon l'invention sont protégés de l'infection par des souches naturelles d'IBR et sont également protégés dans une certaine mesure contre d'autres virus. Les veaux que l'on a vaccinés par voie intramusculaire ne sont 5 pas ainsi protégés. Naturellement, comme on l'a mentionné plus haut, il est en outre avantageux que les veaux non vaccinés présents soient immunisés par le virus IBR non pathogène sécrété avec l'écoulement nasal des veaux vaccinés. On donne maintenant des détails particuliers de la préparation du vaccin selon l'invention. Comm il est évident pour l'homme de l'art, les 10 modes opératoires utilisés sont des techniques de culture sur tissus usuelles et on peut faire des changements en ce qui concerne la composition des milieux de culture, les méthodes de culture et analogues, sans que cela nuise à la nouveauté de l'invention. Par exemple, on utilise des tissus rénaux comme étant les cellules préférées sur lesquelles le virus IBR est cultivé et atténué mais 15 on peut utiliser des cellules provenant d'autres organes de ces animaux. Les cellules rénales sont cependant celles qui cçnviennent le mieux pour les procédés sur tissus car elles semblent avoir une meilleure croissance que la plupart des autres cellules in vitro. Le virus IBR que l'on utilise dans le mode opératoire suivant 20 a été fourni par le Docteur Charles York, Veterinary Research Laboratory, Agricultural Experiment Station, Montana State College, Bozeman, Montana et a subi 41 passages en série sur des cultures de cellules rénales bovines. Lorsque l'on applique ce virus dans les voies nasales des veaux, ces veaux présentent des symptômes cliniques de rhinotrachéite bovine infectieuse et il 25 n'est donc pas souhaitable d'utiliser le virus comme vaccin intranasal sans modification ultérieure selon les caractéristiques de 1'invention. Comme il est connu de l'homme de l'art, de nombreuses souches de virus IBR pathogène croissant dans des cultures sur tissus bovins sont facilement disponibles et ces diverses souches peuvent être utilisées pour mettre 30 en pratique le procédé selon l'invention. Propagation du virus IBR dans les cellules bovines. On prépare par des techniques usuelles des cultures de cellules de tissus rénaux embryonnaires bovins comme suit : on se procure des embryons 35 de 3 à 6 mois provenant de vaches saines, on prélève les reins de façon aseptique et on coupe la substance corticale et médullaire en petits morceaux. On expose ces morceaux à une solution de 0,25 °L de trypsine dans une solution de sel basique de Earle à une température de 37°C, en agitant constamment jusqu'à ce que les cellules soient dispersées. On centrifuga cette suspension à 4°C pendant 71 43322 6 2116501 10 îirn à. raison de 1000 tours/ma et on élimine la coîiche surnageante. On met à nouveau en suspension les cellules déposées, à raison d'une concentration finale en volume de 1:200, dans un milieu de croissance contenant les ingrédients suivants : 5 solution saline tamponnée de Earle 80 % hydrolysat de lactalbumine, solution aqueuse à 5 /° m 7 (poids/volurne) sérum bovin filtré 10 °L polymyxine B 100 unités/ml sulfate de néomycine 100 yjg/ml amphotéricine B 1 ^ig/ml. On place 500 ml de cette suspension dans des bouteilles pour culture sur tissus de Povitsky. On laisse incuber ces bouteilles à 37°C jusqu'à ce que les monocouches confluantes des cellules couvrent la surface du fond 15 (4 à 6 jours). On enlève le milieu de croissance et on le remplace par un milieu d'entretien de composition suivante : solution saline tamponnée de Earle 88 % hydrolysat de lactalbumine, solution aqueuse à 5 % in 7 (poids/volume) 20 sérum bovin filtré 2 % polymyxine B 100 unités/ml sulfate de néomycine 100 yig/ml amphotéricine B 1 yug/ml On inocule alors chacune de ces bouteilles avec une dilution 25 à 1:80-1:500 de virus IBR d'York propagé par culture sur tissus rénaux bovins (brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2 934 473) et on laisse incuber jusqu'à ce que 95 à 100 % des cellules présentent des modifications caractéristiques de l'infection (3 à 5 jours). On recueille alors les fluides, ce qui achève le passage. On répète ce mode opératoire 13 fois. 30 Préparation des cellules rénales de lapin. On prélève de façon aseptique des reins chez des lapins de souche "New Zealand White" âgés de 4 à 6 semaines. On coupe de façon aseptique la substance corticale et médullaire en petits morceaux que l'on place dans 35 une solution contenant 0,25 % de trypsine dans une solution saline tamponnée de Earle. On laisse incuber ce mélange en agitant constamment à 37°C jusqu'à ce que les cellules soient dispersées. On centrifuge alors la suspension de cellules à 4°C pendant 10 mn à raison de 1000 tours/mn et on élimine la couche 71 43322 7 2116501 surnageante. On remet en suspension les cellules déposées à raison d'une concentration en volume de 1:200 dans un milieu de croissance sur tissus rénaux de lapin (RK) constitué par les ingrédients suivants : Milieu Essentiel Minimal de Eagle * 80 % 5 hydrolysat de lactalbumine, solution aqueuse à 5 % in 7 (potds/volume) sérum bovin foetal 10 %, pénicilline 100 unités/ml sulfate de streptomycine 100 ^ig/ml 10 Amphotéricine B 1 ^tg/ml * référence bibliographique : Eagle, H.: Science 130:432, 1959 ** sérum bovin foetal que l'on a inactivé à la chaleur à 56°C pendant 1 h puis stérilisé par filtration à travers un filtre à membrane de 220 milli-microns. 15 On ajoute 300 ml de la suspension de cellules à des bouteilles de culture sur tissus de Povltsky que l'on laisse alors incuber à 37°C jusqu'à ce qu'il se forme dans le fond des bouteilles des monocouches confluantes de cellules (5 à 6 jours). A ce moment, on enlève le milieu de croissance et on le remplace par 50 ml d'une solution constituée comme suit : 20 Composant mg/1 NaCl 8000,0 KC1 400^0 Dextrose 1000,0 NaHCÛ3 580,0 25 Trypsine (1:250) 500,0 EDTA (acide éthylènediamino-tétracétique) 200,0 On laisse incuber les bouteilles pendant 30 mn à 37°C, ce qui réalise la séparation des cellules de la surface de verre et de la dispersion 30 des cellules. On centrifuge la suspension de cellules à 4°C pendant 10 ton à raison de 1000 tours/ran et on élimine la couche surnageante. On remet en suspension les cellules déposées dans un milieu de croissance RK (dont la composition a été donnée ci-dessus) à une concentration en volume de 1:400. On place 150 ml de cette suspension dans des bouteilles cylindriques pour 35 culture sur tissus, de contenance 1 litre que l'on laisse incuber à 37°C sur un agitateur rotatif à cylindres à raison d'une révolution toutes les 20 nm. On continue l'incubation jusqu'à ce qu'il se forme des monocouches confluantes de cellules (2 à 3 jours). A ce moment, on enlève le milieu de croissance et k 71 43322 8 2116501 on le remplace par un milieu d'entretien consistant en une solution saline tamponnée de Earle avec 0,5 % d'hydrolysat de lactalbumine et 2 % de sérum bovin foetal, à laquelle on a ajouté 100 unités de pénicilline, 100 ^ig de sulfate de streptomycine et 1 yag d'anphotéricine B par ml. On ajoute alors 5 1' inoculum viral à une dilution de 1:100 au milieu d'entretien dans les bouteilles cylindriques pour infecter les cellules. Inoculation de cellules rénales de lapin par le virus IBR. On inocule la première bouteille cylindrique de cellules RK à 10 l'aide de virus IBR ayant subi 54 passages sur des cultures de cellules rénales bovines. L1 inoculum a un volume de 1,0 ml et contient environ 10^'^ particules infectantes de culture sur tissus en moyenne par ml. Le virus obtenu à partir de cet inoculum est recueilli 2 jours plus tard. On détermine le moment où on doit recueillir le virus, pour ce passage et pour tous les passages ultérieurs, 15 en observant la quantité d'effet cytopathique (CPE) dans les cellules de la monocouche RK. On recueille le virus lorsque 95 à 100 % des cellules se sont détachées de la surface du verre et/ou lorsqu'elles présentent des modifications morphologiques caractéristiques d'une infection avancée par le virus IBR. Ces conditions sont habituellement réalisées 48 à 72 h après l'inoculation 20 de virus dans les bouteilles cylindriques ; par conséquent, on recueille le virus 48 à 72 h après l'inoculation pour tous les passages successifs, excepté pour les passages 19 et 20. On recueille ces passages environ 30 h après inoculation. Il n'y a pas de différence importante entre les virus obtenus 30, 48ou 72h après l'inoculation dans là mesure où on a pu observer les critères donnés 25 ci-dessus pour l'évaluation du CPE. Les passages 1 à 4 (RK-1 à RK-4) sont réalisés en série, le matériau recueilli dans le passage précédent étant inoculé directement dans une bouteille cylindrique de cellules RK pour le passage ultérieur. Le volume de l'inoculum est constant pour chaque passage et de 5,0 ml. 30 La substance virale recueillie au moment du passage RK-4 est congelée à -65°C après avoir été répartie , p a r volume de 4,0 ml,dans des flacons de verre soigneusement bouchés. On maintient cette substance à l'état de congélation pendant 60 jours après quoi on la dégèle et on l'utilise comme innoculûm pour le RK-5. On complète les passages en jsérie de RK-5 à RK-17 35 comme il est décrit ci-dessus pour les passages de RK-1 à RK-4. Le virus du passage RK-17 est congelé comme il est indiqué ci-dessus et maintenu pendant 7 semaines puis dégélé et inoculé dans une bouteille cylindrique contenant 71 43322 9 2116501 une culture de cellules RK pour la production du passage RK-18. On recueille le passage RK-18 et on le congèle comme il est décrit ci-dessus. Formation du clone de dilution finale. 5 On prépare une série de dilutions allant de 10 en 10 entre 10 ^ -8 et 10 à partir de la suspension de virus du passage RK-18. On inocule un -4 -8 lOème de ml de chaque dilution de 10 à 10 dans 10 tubes de verre pour culture sur tissus de 16 x 150 ml contenant des monocouches de cellules RK préparés comme il est décrit pour la culture de cellules dans des bouteilles cylindriques, 10 sauf que l'on laisse incuber les tubes sur des supports fixes placés à un angle de 5° par rapport à l'horizontal. On laisse incuber les tubes inoculés à 37°C pendant 6 jours. Au bout de ce temps, on recueille le tube n° 1 qui présente les modifications cytopathiques caractéristiques des cellules pour la dilution la plus élevée (10 "*) parmi les tubes présentant une réaction, positive, et on 15 dilue le fluide recueilli en une série de dilutions de facteur 10 comme il -4 -8 est décrit ci-dessus, chaque dilution entre 10 et 10 étant inoculée par volumes de 1/10 ème de ml dans chacun desdits tubes de 16 x 150 ml contenant les monocouches de cellules RK. La 1ère récolte de virus du tube 1 (à 10 "*) donne le clone de dilution finale n° 1. On désigne ce virus comme le virus de 20 passage RK-19. On réalise la formation de clones de dilution finale par des séries de 3 fois. On recueille le virus du clone de dilution finale n° 2 après 5 jours d'incubation suivant l'inoculation et on le désigne comme étant le virus IBR de passage RK-20. On répète le mode opératoire, ce qui donne le virus du clone de dilution finale n° 3 représentant le virus de passage RK-21. 25 Préparation du vaccin. On inocule le virus de passage RK-21 (clone de dilution finale na 3) en un volume de 1,0 ml, dans un flacon pour culture sur tissus dé polystyrène contenant une monocouche de cellules RK préparé comme il est décrit 2 30 ci-dessus. La surface du fond du flacon mesure 75 cm et le volume du milieu d'entretien de la culture sur tissus est de 30 ml. On recueille le virus obtenu par cette inoculation au bout de 48 h d'incubation à 37°C ; ce virus représente le virus IBR de passage RK-22. On inocule 10 ml du virus IBR de passage RK-22 dans une bouteille 35 cylindrique de 10 1 contenant une monocouche de cellules RK préparée comme il est décrit ci-dessus pour les bouteilles cylindriques de 1 litre sauf que l'on ajoute 1000 ml d'une suspension de cellules RK pour la croissance des cellules à la place des 150 ml utilisés dans les bouteilles de 1 litre. Le virus obtenu 71 43322 10 2116501 par cette inoculation est recueilli au bout de 30 h d'incubation sur l'agitateur rotatif à cylindres, à 37°C. Ce virus représente le virus IBR ayant subi 54 passages dans des cultures de cellules rénales bovines et 23 passages dans des cultures de cellules rénales de lapins. Le produit ci-dessus 5 contenant le virus atténué constitue le vaccin selon l'invention. Stabilisation du virus. Le virus obtenu comme il est décrit ci-dessus peut être conservé en diverses quantités lorsque'il est maintenu dans des récipients de verre ou 10 de polypropylène fermés à une température inférieur à -40°C ou lorsqu'on le conserve par lyophilisation suivie d'une addition d'un mélange stabilisant. Les composants stabilisants et les détails de la lyophilisation sont indiqués ci-après. 15 Préparation stabilisante. Composant g/1 N-Z aminé AS 100,0 Lactose 100,0 Dextrane 40,0 20 L-glutamate monopotassique (monohydrate) 1,0 Albumine V bovine 10,0 Glutathione 0,4 Eau distillée complément à 1 litre 25 On mélange 1 partie du stabilisant avec 3 parties de la suspension de virus. La suspension de virus stabilisée est alors répartie de façon aseptique à l'aide d'un équipement automatique dans des flacons tubulaires de taille appropriée ( par exemple des flacons tubulaires n° 103-contenance 2 ml, 30 d° 111 - contenance 4 ml ou n° 118 - contenance 8 ml). On place sur chaque flacon des dispositifs de fermeture pour lyophilisation et on place les supports des flacons dans la chambre de lyophilisation pour les congeler à -40°C. Lorsque le produit et la chambre sont à une température inférieure à -40°C, on ouvre la conduite à vide placée entre le condenseur à -55°C et la chambre, 35 ce qui provoque la lyophilisation. Après établissement d'un équilibre et lorsque la pression de vapeur dans la chambre est inférieure à 100 jx, on augmente progressivement la température de la chambre, par étape, en ne laissant pas la pression, de vapeur dépasser 100 p.. Le cycle complet est achevé lorsque la 71 43322 11 2116501 température du produit est restée à 25°C pendant 1 h. Le cycle complet dure environ 24 h. On ferme alors les dispositifs de fermeture de flacons, on supprime le vide et on enlève le produit lyophilisé. Les flacons sont alors automatiquement capsulés et stockés. 5 Procédé de vaccination. On administre ce vaccin par instillation directe dans les narines des bovins de 0,5 à 2,0 ml, environ, d'une suspension de virus contenant en 4 moyenne au moins 10 particules infectantes de culture sur tissus.'Des concen- 10 trations inférieures du virus atténué se sont relévées capables de réaliser l'immunisation lorsqu'on les applique dans les voies nasales de veaux, mais tous les veaux ainsi vaccinés, par exemple avec des concentrations de virus ■ 3 2 de 10 ' TCID^q ne forment pas une quantité suffisante d'anticorps protecteurs pour résister à l'infection par des souches libres virulentes de virus IBR. 15 L'instillation intranasale peut être réalisée à l'aide d'une seringue hypodermique médicale usuelle à laquelle est reliée une canule de matière plastique de 50 mm de long comportant 3 petits trous à son extrémité. Les autres méthodes d'inoculation comprennent une pulvérisation d'aérosol dirigée dans'fes narines ou l'exposition des animaux à une pulvérisation d'aérosol dans une chambre dans 20 laquelle les animaux sont maintenus pendant un temps nécessaire pour permettre l'inhalation de quantités suffisantes de virus dans les voies nasales. Le traitement avec ce vaccin peut, conme conséquence de la production d'interféron prouvée qui donne lieu à des quantités élevées d'interféron dans les sécrétions nasales et à des quantités modérées dans le sérum, protéger avec 25 une efficacité variable contre des virus appartenant à tous les groupes de virus principaux. Les virus du groupe arbovirus et mixovirus sont en général les plus sensibles aux effets de l'interféron. Les virus bovins qui pénètrent par l'appareil respiratoire doivent être ceux qui sont inhibés le plus efficacement en raison des quantités élevées d'interféron présentes dans les 30 séc'rétions de l'appareil respiratoire. Ces virus comprennent, en plus du virus IBR, les virus de parainfluenza, les rhinovirus, les réovirus. le virus de la diarrhée virale bovine, les adénovirus bovins et éventuellement les virus des affections des pieds et de la bouche. Cette protection doit persister aussi longtemps que ces teneurs en interféron sont maintenues dans les sécrétions 35 et dans le sérum, ce qui représente environ 6 à 8 jours. Le virus IBR atténué par passage en série dans des cultures de cellules rénales de lapin comme il est décrit ci-dessus peut être mélangé avec d'autres agents viraux atténués de façon appropriée qui ne présentent pas de 71 43322 12 2116501 danger et sonc efficaces pour la vaccination des bovins par voie intranasale tels que, par exemple, le virus de parainfluenza 3, les adénovirus bovins, les réovirus et autres agents viraux infectants, ce qui permet de réaliser un vaccin multivalent qui, lorsqu'il est appliqué par voie intranasale sur les 5 muqueuses des voies nasales des bovins, provoque le développement d'anticorps protecteurs contre les agents viraux infectants que l'on a incorporés dans le vaccin multivalent. Le passage en série de virus IBR virulent dans des cultures de tissus bovins ne représente pas une caractéristique critique de l'invention et il n'y 10 a pas de raison de faire passer le virus par 50 passages en série ou plus. Le passage en série du virus dans des cultures de tissus bovins permet au virus virulent de résister plus facilement à la culture ultérieure sur tissus de lapin. Ainsi, une partie de la virulence du virus disparaît au cours de la culture sur tissus bovins et il est probable qu'un plus petit nombre de passages 15 en série sur les tissus de lapin est ensuite nécessaire. La demanderesse a découvert selon l'invention que le passage en série du virus IBR de tissus bovins dans 18 cultures sur tissus rénaux de lapin suffit à atténuer le virus de façon qu'on puisse l'instiller avec sécurité dans l'appareil nasal des veaux sans provoquer l'apparition des symptômes cliniques les plus 20 sérieux de la maladie. Il est possible qu'un nombre inférieur de passages du virus, par exemple 15 passages en série, soient suffisants. D'autre part, un nombre supérieur de passages dans les tissus rénaux de lapin peut provoquer un affaiblissement des propriétés antigéniques du virus de sorte que celui-ci n'est plus adapté à l'utilisation dans la préparation d'un vaccin. Le nombre ZZ maximal de passages en série n'a cependant pd^, été déterrsiné actuellement avec précision. copy 71 43322 13 2116501 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un vaccin efficace pour la protection des bovins contre les souches pathogènes de virus IBR lorsque les animaux sont vaccinés par voie intranasale, caractérisé en ce qu'il comprend la propagation des souches pathogènes de virus IBR dans des cultures sur tissus de lapin pendant au moins 15 passages en série, ce qui réduit le caractère pathogène du virus IBR tout en laissant au virus sa faculté de provoquer le développement d'anticorps protecteurs. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on a cultivé le virus IBR pathogène en série dans des cultures sur tissus bovins avant sa propagation dans des tissus de lapin. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le virus IBR pathogène est modifié par au moins 18 passages en série dans des tissus rénaux de lapin. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le virus atténué sur tissus de lapin est soumis à un procédé de formation de clnne selon lequel on choisit les entités virales les mieux adaptées à la propagation dans des cultures sur tissus de lapin pour une propagation ultérieure, dans des cultures sur tissus de lapin et pour la préparation de vaccin. 5. Nouveau vaccin, caractérisé en ce qu'il contient un virus IBR vivant que l'on a atténué par passage dans des cultures sur tissus non bovins jusqu'à ce que ce virus soit modifié de façon qu'il ne provoque plus l'apparition des symptômes cliniques usuels d'une infection IBR active chez des bovins non-±mmuTts lorsqu 'on l'applique sur leurs tissus nasaux et soit efficace pour provoquer le développement précoce de teneurs élevées en interféron dans les sécrétions nasales des bovins, le développement précoce d'anticorps spécifiques locaux contre le virus IBR dans les tissus de l'appareil respiratoire, le développement précoce de virus IBR non pathogène dans les sécrétions nasales et le développement chez les bovins d'anticorps circulants efficaces contre le virus IBR pathogène. 6. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on a choisi le virus atténué par un procédé de formation de clone pour éliminer les particules de virus IBR pathogène et obtenir à partir de la culture sur tissus non bovins une souche de virus.la mieux adaptée à la croissance dans des cultures sur tissus animaux non bovins. 71 43322 14 2116501 7. Nouveau vaccin efficace pour provoquer le développement d'anticorps agissant contre les souches pathogènes de virus IBR, caractérisé en ce qu'il comprend un virus IBR vivant que l'on a atténué par passages en série dans des cultures sur tissus de lapin jusqu'à ce que ce virus ait été modifié de façon qu'il ne provoque plus l'apparition des symptômes cliniques usuels de l'infection IBR active chez des bovins non-inanunslorsque les particules virales sont appliquées sur la muqueuse nasale, 8. Vaccin selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on a fait passer le virus par au moins 18 cultures sur tissus rénaux de lapin. 9. Composition d'immunisation des bovins contre l'infection par des souches pathogènes de virus IBR appliquée sur les muqueuses des voies 4 0 nasales des bovins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 10 ' particules infectantes de culture sur tissus d'un virus IBR vivant que l'on a modifié par passage en série dans des cultures sur tissus de lapin jusqu'à ce que le virus ne provoque plus l'apparition des symptômes cliniques de l'infection IBR mais provoque cependant le développement d'immun-anticorps d'IBR et d'interféron. 10. Forme pharmaceutique appropriée à l'administration de la conço-sition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle consiste notanœent en une suspension aqueuse que l'on administre aux bovins dans chaque narine.