Brevet FR2137869A1 — publié le 19721229

Il est connu qu'un enzyme appelé isoiîirase de glucose peut êtr^tatilisé pour catalyser la transformation de glucose (dextrose) en fructose (lévulose) de plus grand pouvoir sucrant que la matière première. Il est également connu que l'isomérase 5 de glucose est produite par fermentation d'organismes tels que Pseudomonas hydrophila, Streptomyces flavovireus, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus, etc., dans des milieux nutritifs appropriés» L'isomérase de glucose est formée au sein des cellules 10 bactériennes qui se développent pendant sa production, les cellules peuvent être séparées par filtration du bouillon de fermentation et utilisées directement comme source d'isomérase de glucose. A titre de variante, les cellules peuvent être séparées par filtration puis rompues par des moyens bien connus, les cellules 15 rompues obtenues et leur contenu libéré peuvent être utilisés comme source d'isomérase de glucose. En outre, les cellules peu-. vent être rompues et les débris peuvent être séparés par centri-fugation. lia liqueur surnageante peut être utilisée directement comme source d'isomérase de glucose, ou bien l'enzyme peut être i orme 20 récupéré de ce liquide sous/de poudre par des techniques bien connues. L'isomérase de glucose produite par toutes ces techniques antérieures nra pas été utilisée à l'échelle industrielle, à cause du coût élevé de son utilisation. Les frais de production de l'enzyme scmt élevés à cause des milieux nutritifs coûteux 25 nécessaireset cEes rendements relativement faibles en enzyme, comparativement a»x techniques de production d'autres enzymes. Il est donc nécessaire que l'isomérase de glucose puisse être récupéré# après sont utilisation puis réutilisée pour d'autres transformations de glaicose en fructose. 50 L'isomérase de glucose est très pratique à. récupérer et à réutiliser ei elle est encore contenue dans les cellules bactériennes d'origine» Les cellules bactériennes peuvent être faci-lement séparées du milieu réactiormel àe transformation contenant le sucre. Toutefois, les techniques antérieures ont encore empêché 55 une réutilisation importante des cellules bactériennes, parce que les cellules ont perdu environ 50 fo de leur activité d'isomérase de glucose pendant chaque utilisation. L'irrrentian concerne un procédé de stabilisation d'iso— méras-e de glucose dans des cellules bactériennes, procédé qui 72 17129 2137869 consiste à traiter ax-, glutaraldéhyde des cellules "bactériennes ayant une activité d'isomérase de glucoseo les cellules bactériennes ayant une activité d'isomérase de glucose et auxquelles on peut appliquer le procédé de l'inven-5 tion peuvent être produites par des procédés bien connus. Les cellules préférées contenant un enzyme sont obtenues par culture, dans des conditions aérobies, en immersion, d'une souche de Streptomyces olivaceus NRE1 3583 ou de ses formes mutantes, dans un milieu contenant des substances nutritives appropriées» 10 les cellules bactériennes résultantes sont séparées du bouillon de fermentation par filtration ou c ent r ifugat i on « Les cellules bactériennes récupérées sont ensuite mises en suspension dans un. milieu, aqueux et mélangées avec du glutaral-déhyde. On utilise ce dernier en une quantité d'environ 0,1 à 15 environ 50 fo en poids sur la base du poids sec des cellules» De préférence, le glutaraldéhyde est utilisé en une quantité d'environ 10 à environ 50 % en poids sur la base du poids sec des cellules. Les cellules bactériennes ont initialement un pH de 8,5 environ. A. mesure que les cellules bactériennes sont 20, traitées avec le glutaraldéhyde, le pH s'abaisse finalement à environ 6,5» Si le pÏÏ initial est supérieur à environ 8,5, ou si le pH pendant le traitement tombe au-dessous d ' enviroi)€, 5, on doit ajouter des tampons convenables pour maintenir le pH des cellules bactériennes dans la gamme d'environ 6,5 à environ 8,5. 25 Les cellules bactériennes doivent être traitées avec le glutaraldéhyde pendant environ. 0,5 à. environ 2 heures. La durée préférée de traitement va d'environ 1 à environ 1,5 heure. 5t& température du traitement n'est pas très déterminante et peut avantageusement être eonprise entre environ 15 et environ 30 60°C» L'activité d'isomérase de glucose des cellules bactériennes utilisées comme matière première et de la matière traitée au gltïtaraldéhyde a été titrée au moyen de la méthode suivante. On prépare une solution aqueuse à 62,5 7° (sur une baze 35 poids/volume) de glucose en ajoutant lentement, sous agitation, 625 g de glucose anhydre à 500 ml d*eau distillée chaude» On ■ refroidit la solution à la température ambiante et on ajoute 125 ml de solution aqueuse TM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane à un pH égal à 8,5, Î25 ml de solution aqueuse de sulfate de 72 17129 3 2137869 magnésium 1M et 50 ml de solution aqueuse de chlorure cobalteux 0,025 M. le mélange résultant est ensuite dilué à 1 litre avec de l'eau distillée. On introduit une portion de 10 ml de la solution de glucose indiquée ci-dessus dans une fiole jaugée de 5 25 ml. On ajoute une quantité suffisante de l'enzyme à titrer pour produire une réduction de la rotation spécifique, comme défini ci-après, d'environ 2,9 à environ 7,5°. le contenu de la fiole est ensuite dilué à 25 ml avec de l'eau distillée, et on fait incuber le mélange résultant à 60°C pendant deux heures. 10 On arrête ensuite la réaction en ajoutant 1 ml de solution aqueuse 0,5 M d'acide perchlorique» On centrifuge ensuite le mélange à 15 000 tr/mn pendant 20 minutes, et on mesure la rotation optique (en degrés) de la liqueur surnageante par des techniques bien connues. On effectue un blanc en suivant le même mode 15 opératoire, mais en l'absence de l'enzyme. On mesure également /— —25 la rotation optique du blanc. La rotation spécifique J_ alpha/^ de l'échantillon ou du blanc est égale à 2alpha, soit deux fois la rotation optique observée. Le pourcentage de transformation du glucose en fructose est calculé d'après la formtile suivante ï 20 Transformation du = Z aJ-Pka!^blanc L alpha/échantillon x -mo glucose, * Z"alPb§7M„„ + 92 L'activité enzymatique exprimée en unités d'isomérase de glucose (HIGr) de l'échantillon d'enzyme que l'on titre, se calcule d'après la formule suivante : ^ UlOr/gramme ou Microgrammes de fructose formé- x 0,0463 UIG/litre mg ou ml d'enzyme utilisé dans laquelle les microgrammes de fructose formé sont calculés en multipliant le taux de transformation de glucose ($) indiqué ci-dessus par 6,25 x 10^. Une unité d'isomérase de glucose est 30 la quantité d'enzyme capable de transformer une micromole de glucose en fructose par minute dans les conditions de l'essai. D'autres détails de l'invention sont donnés dans les exemples suivants ï 72 17129 2137869 Exemple 1 On transfère une culture de Streptomyces olivaceus NRR1 3583 dans un appareil de fermentation équipé d'un agitateur et d'un dispositif d'injection d'air, contenant 10 litres . 5 d'un mélange aqueux renfermant 0,7 7° de xylose , 0,3 7° d'amidon de maïs raffiné, 1,0 7° de peptone, 0,50 7° d'extrait de viande, 0,25 d'extrait de levure, 0,50 7e de chlorure de sodium et 0,05 7° de sulfate de magnésium et ayant un pH de 7,0» Tous les pourcentages indiqués ci-dessus sont exprimés sur une base poids/volume. 10 On fait tourner l'agitateur à 400 tr/mn et on fait passer de l'air dans le milieu à un débit de.3 volumes d'air par volume de milieu par minute» On poursuit la fermentation pendant 24 heures à 32°C» On centrifuge ensuite le bouillon de fermentation à 40 000 tr/mn pour séparer les cellules bactériennes» On con-15 gèle ensuite une portion des cellules bactériennes et on les lyophilise» On met en suspension 3 grammes des cellules entières lyophilisées dans 50 ml de solution aqueuse de tris-(hydroxymé— thyl)aminométhane à un pH de 8,5, et on traite la suspension sous 20 agitation avec 0,1 g d'une solution aqueuse à 25 $ en poids de glutaraldéhyde (0,83 7° en poids de glutaraldéhyde sur la base du poids sec) en agitant à la température ambiante (environ 20°C) pendant 1,5 heure. . les cellules traitées ayant une activité de 145 UIG/g sont recueillies par filtration et ajoutées 25 à une solution aqueuse à 62,5 7° en poids de glucose contenant 0,001 $sn poids de chlorure de cobalt et 0,01 7° en poids de chlorure de magnésium. On fait réagir le mélange résultant à 70°C pendant deux heures pour transformer environ 4,5 7° du glucose en fructose. On sépare les cellules du milieu réaction-30 nel par centrifugation et on verse le mélange fructose-dextrose par décantation, le titrage des cellules montre qu'elles ont la même activité d'isomérase de glucose qu'avant leur utilisation. Ensuite, on utilise de nouveau les cellule Êjfcour traiter une solution de glucose fraîchement préparée, dans les conditions in-35 diquées ci-dessus, puis on les sépare et on les titre, les cellules sont utilisées au total 12 fois, en suivant ce même mode opératoire. Elles contiennent encore 56 7° de l'activité initiale d'isomérase de glucose, les cellules qui n'ont pas été traitées 72 17129 3157869 au glutaraldéhyde ont perdu pratiquement la totalité de leur activité d'isomérase de glucose après avoir été utilisées deux fois. Exemple 2 On prépare un bouillon de fermentation contenant des cel-5 Iules bactériennes de Streptomyces olivaceus KRRIi 3583, comme indiqué dans l'exemple 1. On centriguge une portion de ce bouillon et on isole une portion de 3 g de cellules bactériennes entières humides. On met ensuite ces cellules en suspension dans 50 ml d'eau et on traite la suspension avec 0,1 g d'une solution aqueuse 10 à 25 $ en poids de glutaraldéhyde dans la gamme de pH de 6,5 à 8,5 à la température ambiante pendant une heure. Les cellules traitées ayant une activité de 265 UIG/g sont recueillies par filtration et utilisées pour transformer du glucose en fructose de la manière décrite dans l'exemple t. On récupère les cellules Î5 et on les réutilise avec du glucose fraîchement préparé, 12 fois au total. Les cellules ont encore 60,T # de 1'activité initiale d'isomérase de glucose. Exemple 3 On prépare un bouillon de fermentation contenant des cel— 20 Iules bactériennes de Streptomyces olivaceus ERBL 3583 de la manière décrite dans l'exemple 1. On mélange une portion aliquote du bouillon entier contenant 3 g de cellules entières avec 0,2g d'une solution aqueuse à 25 en poids de glutaraldéhyde (1,67 f° en poids de glutaraldéhyde sur la base du poids sec des eellules) sous 25 agitation à la température ambiante et dans la gamme de pH de 6,5 à 8,5,. pendant raie heure. Les cellules traitées ayant une activité de 271 UTCr/g sont recueillies par filtration et utilisées pour transformer- du glucose en fructose, de la manière décrite dans l'exemple 1. On récupère les cellules et an les réutilise 30 avec du glocose fraîchement préparé, au total 12 fois. Les cellules ont encore 61,6 i» de l'activité initiale d'isomérase de glucose. Exemple 4 On prépare un bottillon de fermentation contenant des cellules bactériennes de Streptomyces olivaceus 1EEL 3585 de -55 la manière décrite dans 1"exemple 1. On mélange une portion aliquote du bouillon entier contenant 4 g de cellules entières avec 0,4 g d'une solution aqueuse à. 25 en poids de glutaraldéhyde (2,5 7° en poids de glutaraldéhyde sur la base du poids sec des 72 17129 2137869 cellules) sous agitation h la température ambiante pendant une heure. On n'effectue pas de réglage du pH. Au début de la réaction, le mélange de cellules a un pH de 8,4. A la fin de la période de réaction, le pH est égal à 6,8. les cellules traitées ayant une 5 activité de 387 UIG-/g sont recueillies par filtration et utilisées pour transformer du glucose en fructose de la manière décrite dans l'exemple 1. On récupère les cellules et on les réutilise avec du glucose fraîchement préparé, cinq fois au total, les cellules ont encore 100 fi> de l'activité initiale d'isomérase de glucose. 10 Exemple 5 On prépare un bouillon de fermentation contenant de§6el-lules bactériennes de Streptomyces olivaceus HEE1 3583 de la manière décrite dans l'exemple 1 en utilisant un appareil de fermentation de 380 litres environ. Ce bouillon a une activité totale de t5 T 350 000 m G- ei^ontient 3,1 5 'kg de cellules bactériennes sur base sèche (425 UX(r/g). On ajuste le pH du bouillon à 8,2 par addition d'hydroxyde de sodium. On ajoute au bouillon sous agitation, en. 30—40 minutes, une portion de 3,15 3sg de solution aqueuse à 50 fi en poids de glutaraldéhyde diluéefà une concentration de 0,5-0,6 fi 20 (base poids/volume) (50 filde glutaraldéhyde sur la base du poids sec des cellules). On fait réagir le mélange résultant à la température ambiante pendant t,5 heure sous- agitation modérée. On ajoute ensuite tme portion, de 0,5 fi (sur la base poids/volume) de terre de diatomées comme auxiliaire de filtration, et on filtre le bouil-25 Ion sur un filtre rotatif à vide» On . lave le résidu de filtration avec de. l'eau pour éliminer les réslcfus du bouillon, usé» les cellules bactériennes recueillies ont une activité totale de T 2Î5 000 UIG-, soit 90 fi de l'activité initiale. 30 On prépare une solution de glucose en mélangeant 101,25 kg de glucose avec environ 210 litres d'eau (49,2 fi de glucose sur une base poids/volume), On ajoute à cette solution du chlorure de cobalt en quantité de 0f001 ?£(sur une base poids/volume) et du chlorure àe magnésium en une quantité de 0,01 fi (sur la même 35 base). On ajoute également à la solution de glucose une portion des cellules bactériennes traitées au glutaraldéhyde et préparées comme indiqué ci-dessus, ayant une activité totale de 407 2 50 ÏÏIG. On agite le mélange résultant à 60°C pendant 24 heures, période pendant laquelle on main.tien.tvls pH à 7,7-7,9 par addition 72 17129 2137869 d'hydroxyde de sodium. On sépare les cellules bactériennes par filtration du mélange réactionnel, dont le titrage indique ensuite qu'il contient 40,2 de fructose. Les cellules bactériennes recueillies comme indiqué ci-5 dessus sont ensuite réutilisées dans une solution de gLucose fraîchement préparée, de la manière décrite ci-dessus. On répète ensuite ce mode opératoire jusqu'à ce que les cellules bactériennes aient été utilisées neuf fois au total. Dans le neuvième essai, l'activité d'isomérase de glucose dans les cellules bactériennes 10 donne 38,8 % de fructose, ce qui représente encore 96,5 i° du résultat obtenu initialement. 72 17129 2137869 eeve;tdicatio?is 1. Procédé de stabilisation d'isomérase de glucose contenue dans des cellules bactériennes, caractérisé par le fait qu'il consiste à traiter au glutaraldéhyde des cellules bacté-5 riennes renfermant une activité d'isomérase de glucose. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le glutaraldéhyde est utilisé en une quantité d'environ 0,1 à environ 50 i<> en poids sur la base du poids sec des cellules. 3. Procédé.suivant la revendication 1, caractérisé par le 10 fait que le glutaraldéhyde est utilisé en une quantité d'environ 10 à environ 50 fo en poids sur la base du poids sec des cellules. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules bactériennes sont maintenues à un pH d'environ 6,5 à environ 8,5 pendant leur traitement au glutaraldéhyde. 15 5« Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules bactériennes proviennent de Streptomyces olivaceus. 6. Des cellules bactériennes contenant une activité d'isomérase de glucose, qui ont été stabilisées, notamment,au moyen 20 d'un procédé conforme à la revendication 1. S I