Brevet FR2112084A1 — publié le 19720616

Dans la demande de brevet N 69 34747 du 10 octobre 1969 déposée par la Demanderesse ont été décrits entre autres, des compposés nouveaux, qui sont des dérivés alcoyles en N6 de l'acide adénosine-3',5'-phosphorique cyclique (AMP cyclique) ainsi que leur préparation et leurs propriétés. La présente invention a pour but, en premier lieu, de procurer des composés nouveaux qui sont eux aussi des dérivés de 1'AMP cyclique mais des dérivés de substitution en d'autres positions. Elle a en outre pour but de fournir un procédé de préparation de l'acide adénosine-3',5'-monophosphorique cyclique ou AMP cyclique ainsi que de dérivés de celui-ci, procédé qui offre l'5ntérAt de permettre, d'une façon plus générale, de fabriquer des nucléotides cycliques à partir de 5'-nucléotides. Les nouveaux dérivés de L'VAMP cyclique sont ceux qui répondent à la formule dans laquelle R1 désigne un atome dfhYdrogène ou de brome ou un groupe suShydryles hydroxyle, méthylthio ou amino et R2 un atome d'hydrogène ou un groupe amino la signification R1 = R2 = H étant exclue, ainsi que les sels résultant de la salification de l'hydroxyle lié au phsophore. Il s'agit plus spécialement de ceux pour lesquels R2 = H et R1 = Br, SH, S-CH3, OH ou NH2 et celui pour lequel =NH2 et R1=H. Quant au nouveau procédé de préparation de nucléotides cycliques à partir de 5'-nucléotides, il s'apparente G celui de Smith, Drummond et Khorana, J. Amer. Chem. Soc. 83, 698 (161), qui consiste à chauffer à l'ébullition, à reflux, un sel d'en 5'-nucléotide avec de la dicyclohexyl-carbodi-imide (DCHC) ou di-(cyclohexylimino) méthane, en présence de pyridine anhydre La caractéristique de l'invention consiste er ce qu'on ajoute de la diméthyl formamide ce qui a un double effet d'une part, les 5'-nucléotides se dissolvent plus facilement dans le mélange, d'autre part la diméthyl formamide semble favoriser la réaction.On ajoute la diméthyl formamide en quantité suffisante pour que le 5'-nucléotide soit dissous complètement. On peut utiliser, par exemple, un mélange de pyridine et de diméthyl formamide à volumes égaux. Le procédé est plus simple que le mode de cyclisation des esters p-nitro phénoliques indiqués dans le brevet principal. Il donne des rendements moins élevés dans le cas de dérivés de l'AMP portant en 2 un groupe amino, en raison de la formation d'un produit accessoire, labile en milieu acide ou en milieu alcalin et qui semble représenter un acide adénosine-N2,5'-phosphorique contenant une liaison phosphami dtque qui explique sa labilité. Après traitement au moyen de soude caustique, ce composé régénère le nucléotide de départ qu'on peut isoler et soumettre à la même suite d'opérations, ce qui augmente le rendement global. On peut ainsi, à partir de l'acide guanosine-5'phosphorique (GMP) préparer directement du GhS cyclique dont des découvertes récentes ont montré la présence dans la nature et l'action biologique, qualitativement analogue à celle de l'M- cyclique ; dans certaines épreuves biologiques, ce GMP cyclique a même une action quantitative supérieure à celle de l'AMP cyclique. lies exemples suivants, non limitatifs, illustrent la présente invention. lies exemples 1 et 2 relatifs à la préparation de produits connus montrent nomment mettre en oeuvre le nouveau procédé. EXEMPLE 1: Acide N6-n-butyl-adénosine-3',5'-phosphorique cyclique (N6-n-butyl-AMP cyclique) 175 mg d'acide N6-n-butyl-adénosine-5'-phosphorique (N6-n-butyl-AMP), préparé selon l'exemple 3 du brevet principal sont transformés en sel de triéthyl ammonium qu'on sèche soigneusement. On dissout dans 10 ml de diméthyl formamide anhydre La solution est introduite goutte à goutte, en l'espace de 2 heures, dans 10 ml d'un mélange, porté à l'ébullitIon, de diméthyl formamide et de pyridine anhydre à volumes égaux, le mélange étant additionné de 180 mg de DCHC. On chauffe encore 1 heure à l'ébullition à reflux. On agite continuellement durant toute l'opération. près évaporation à siccité sous vide, on reprend par 50 ml d'eau. On filtre pour enlever la dicyclohexylurée qui a précipité et on soumet la solution à une extraction par deux fois, au moyen de 20 ml d'éther pour éliminer la DCHC. La solution aqueuse est ensuite versée sur une colonne (40 cm de hauteur et 2,8 cm de diamètre) de DEAE-cellulose sous sa forme bicarbonatée. Après lavage de la colonne par 500 ml d'eau bidistillée, on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M ; on emploie au total 2 litres du mélange. On recueille des fractions de 20 ml. lie nucléotide cyclique est contenu dans les tubes N 60 à 81. Leur contenu est évaporé à siccité sous vide le résidu est additionné à deux reprises de méthanol anhydre qu'on casse par évaporation sous vide. On reprend ensuite par 1,5 m; ce méthanol absolu. Le sel de sodium du nucléotide cyclique est précipité par addition de 20 ml d'une solution C,125 m de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre. lie solide (100 mg) eQt recueilli par centrifugation et lavé plusieurs fois à l'acétone anhydre. Le sel répond à la formule brute C14H19N506P Na et l'acide correspondant (préparé comme il sera décrit plus loin) possède tous les caractères indiqués dans le brevet principal, pour le N6-n-butyl-AMP cyclique. EXEMPLE 2: Acide quanosine-3',5'-phosphorique (GMP cyclique). 150 mg de GMP sous forme d'acide libre sont dissous dans 25 ml de diméthyl formamide. En l'espace de 2 heures on introduit la solution goutte à goutte dans un mélange bouillant de 50 ml de pyridine, 50 mi de diméthyl formamide anhydre et 170 mg de DCHC. On chauffe encore 2 heures à l'ébullition à reflux. On agite continuellement Après évaporation à siccité sous vide, on reprend par 25 ml d'eau, on filtre et on extrait 3 fois au moyen de 15 ml d'éther. La solution aqueuse est évaporée à siccité sous vide A côté de GIS cyclique, le résidu contient une substance qui est vraisemblablement de l'acide guanosine-N2-, 5'-phosphorique. Pour hydrolyser la liaison phosphamidique, on reprend par 10 ml de soude caustique 0,2 N et on chauffe 45 minutes à 600. Après neutralisation à l'acide acétique, on verse sur une colonne (40 cm de hauteur et 2,8 cm de diamètre) de DEAL-cellulose ; on lave la colonne avec 300 ml d'eau et on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M ; on emploie au total 3 litres de mélange. On recueille des fractions de 20 ml. Les fractions N 40 à 64 qui contiennent le GES cyclique sont évaporées à siccité sous vide. On ajoute à trois reprises du méthanol anhydre et on évapore à siccité. On reprend ensuite par 1 ml de méthanol anhydre et on précipite le GMP cyclique sous forme de sel de sodium (38 mg) par addition de 12,5 ml d'une solution 0,1 M de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre. lie produit est recueilli par centrifugation et lavé à l'acétone anhydre. Il répond à la formule brute C10H11N507P Na, H20 ; par ses divers caractères (spectres W, IR et Rf dans divers dissoivants), il se montre identique à du GMP cyclique authentique. lie GMP inaltéré ou régénéré est récupéré par lavage de la colonne au moyen de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,15 Me Son sel de triéthyl ammonium peut ensuite être soumis à la suite d'opérations indiquées pour sa transformation en GMP cyclique, ce qui permet d'augmenter le rendement global. lies exemples qui suivent concernent la préparation des nouveaux dérivés de l'AMP cyclique. Pour ceux qui portent un substituant en 8 la synthèse peut se faire soit à partir de l'AMP non cyclique soit à partir de l'AMP cyclique. lie produit intermédiaire est, dans les deux cas, le dérivé bromé en 8. L'halogène de ce dérivé est assez mobile, si on le traite par des substituants nucléophilesr On peut ainsi le remplacer par un groupe amino, sulfhydryle, méthylthio ou hydroxyle. Les principes de synthèses indiqués ci-dessus sont illustrés par les exemples suivants. EXEMPLE 3: Acide 8-bromo-adénosine-3', 5'-phosphorique (8-bromo-AMP cyclique) a) à partir de l'AMP cyclique, 500 mg d'AMP cyclique sont dissous dans 0,75 ml de soude caustique 1 N. Après addition de 15 ml d'eau de brome saturée, on laisse 6 heures à la température ordinaire. On agite ensuite avec 10 g de charbon actif, en l'espèce de la norite lavée d'abord avec un mélange ammoniaque : éthanol : eau (15:60 : 25 en volume) puis à l'acide chlorhydrique et à 11 eau : on filtre et on lave le charbon à l'eau jusqu'à disparition conplète des ions Br-. On élue ensuite par agitation avec le mélange d'ammoniaque d'éthanol et d'eau (15:60:25).La solution est évaporée à siccité sous vide et le résidu est repris par de l'eau. Cette solution est versée sur une colonne (40 cm de hauteur et 2,8 cm de diamètre) de DEAE-cellulose sous sa forme bicarbonatée. La colonne est lavée d'abord avec 500 ml d'eau. On élue ensuite par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M. On emploie au total 3 litres de mélange. On recueille des fractions de 20 ml. Les fractions N 35 à 60 sont combinées et évaporées à siccité sous vide. Le résine est repris à trois reprises par du méthanol puis on evapore sous vide. Pour finir on reprend par 5 ml d'eau et VU acidifie à pli 2,5 ce qui provoque la cristallisation du produit. On agoute encore 2 volumes d'alcool et on abandonne à 0 pendant 24 heures. Le solide est ensuite recueilli par centrifugation et lavé deux fois avec 5 ml d'alcool absolu, et enfin séché. On en obtient 410 mg (rendement 67 %). lie sel de sodium répond a la formule brute C10H10N5O6PBrNa. b) à partir du 8-bromo-AMP. Le 8-bromo-AMP a été préparé d'après la methode de Ikehare, Uesugi et Kaneko, Chem. Commun. 1,17 (1967). 1 cyclisation a été effectuée d'après la méthode de Smith, Drummond et Khorana, J. Amer. Chez. Soc. 83, 698 (1967). 170,4 mg de 8-bromo-AMP (0,4 mmole) sont disse dans 10 ml de pyridine additionnée de 2 ml d'eau. Or ajoute 117,6 mg de 4-morpholine-N,N'-dicyclohexylcarboxamidine (0,8 mmole). La solution est évaporée à siccité sous vide reprend le résidu par 20 ml de pyridine anhydre et on de nouveau à siccité. Cette opération est répétée deux fois pour chasser complètement liteau. On dissout finalement, dans 20 ml de pyridine anhydre et on introduit goutte à goutte en l'espace d'une heure et demie dans une solution de 16: mg de dicyclohexylcarbodiimide dans 40 ml de pyridine anhydre cha à l'ébullition. On maintient pendant 2 heures encore ti l'ébullition à reflux. La solution est ensuite évapore à sous vide.On reprend le résidu par 20 ml d'eau ; après f t; tration, on extrait trois fois au moyen de 20 ml d'éther. On opère le fractionnement comme indiqué dans l'exemple précédert après avoir versé la solution sur une colonne (20 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre) de DEAE-cellulose. lie 8-bromo-AMP cyclique obtenu (121 mg) possède les mêmes propriétés que le produit préparé selon a. lie rendement est susceptible d'amélioration si la cyclisation est effectuée en présence de diméthyl formamide (cf. exemple 1). EXEMPLE 4: Acides 8-thio-adénosine-5'-phosphorique (8-thio et 8-thio-adénsine-3',5'-phosphorique (8-thio AMP cyclique). Dans cet exemple, comme dans les trois suivants le 8-bromo-AMP et le 8-bromo-AMP cyclique sont traitée pa- réactifs nucléophiles avec départ de l'halogène et substituts par d'autres groupes. a) 8-thio-AMP. 500 mg de 8-bromo-AMP bien pulvérisés sont mis en suspension dans 50 ml d'alcool éthylique à 90 % ; on introduit 200 mg de thio-urée et on chauffe 6 heures à l'ébullition à reflux, en agitant contituellement. lie produit de départ a alors complètement disparu. On neutralise à la triéthylamine et on fractionne sur une colonne de 1)EAE-cellulose dans les conditions décrites plus haut. lie 8-thio-AMP n'est élué que si l'on élève la concentration du bicarbonate de triéthyl ammonium de 0,1 M à 0,2 M. lies tubes N 120 à 150 contiennent le produit attendu.On opère ensuite comme décrit plus haut. lie produit est recristallisé par dissolution dans 1 ml d'eau. On ajuste le pH à 2,5 et on ajoute 2 ml d'alcool éthylique absolu. On en obtient 250 mg (rendement 52 %). il répond à la formule brute C10H14N5O7PS. b) 8-thio-ASS cyclique. La méthode de substitutuon employée dans le cas du 8-bromo-AMP s'est montrée inapplicable au 8-bromo-AMP cyclique On a employé finalement la méthode utilisée dans d'autres cas par Holme et Robins (J Amer. Chem. Soc. 86, 1243 (1964)). On fait barboter à basse température de l'hydrogène sulfuré dans 20 ml d'une solution alcoolique I M d'éthylate de sodium afin d'obtenir du sulfhydrate de sodium. L'excès d'hydrogène sulfuré est ensuite chassé par chauffage à l'ébullition. On introduit alors 100 mg de 8-bromo-AMP cyclique et on chauffe 5 heures à l'ébullition à reflux.Après neutralisation à l'acide acétique, on évapore à siccité sous vide, on reprend par 10 ml d'eau et on fractionne dans les conditions habituelles sur une colonne (30 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre) de DEAE-cellulose. lie produit n'est élué que par du bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M ; il se trouve dans les fractions N 80 à 110, Après le traitement habituel, on obtient le produit à l'état cristallisé en abaissant le pH à 2,5 ; on recristallise dans l'alcool éthylique. On obtient 52 mg (rendement 58 %). lia substance répond à la formule brute C10H12N5O6PS. EXEMPLE 5 Acide 8-méthylthio-adénosine 3',5'-phosphorique (8-méthylthio-AMP cyclique). On met 100 mg de 8-bromo-AMP cyclique en suspension dans une solution de 1 M de méthyl-mercaptate de sodium dans l'alcool absolu et on chauffe 6 heures à l'ébullition à reflux. On neutralise ensuite par de l'acide acétique et cn évapore à siccité dans le vide. lie résidu est repris par 50 ml d'eau ; on ajuste à pH 3 et on absorbe le nucléotide par agitation avec 3 g de charbon actif. On lave à l'eau et on élue par traitement avec un mélange d'éthanol, d'ammoniaque concentrée et d'eau (60 : 15 : 25 en volume). La solution est évaporée à siccité sous vide et le résidu est repris par 10 ml d'eau.On fractionne ensuite dans les conditions habituelles sur une colonne (50 cm de hauteur et 1,2 dm de diamètre) de DEAEcellulose. lie produit attendu se trouve dans les fractions PTO 45 à 60 (il est nécessaire d'observer le spectre W tube par tube pour effectuer une séparation d'avec deux autres produits non identifiés) Le sel de triéthylamine contenu dans ces fractions est transformé en sel de sodium de la manière décrite précédemment. On en obtient 36 mg (rendement 40 %). La substance répond à la formule brute C11H12N506P S Na. EXEMPLE 6: Acide 8-hydroxy-adénosine-3',5'-phosphorique (8-hydroxy-AMP cyclique). 225 mg d'acétate de sodium anhydre fraichement fondu sont dissous dans 7,5 mi d'acide acétique glacial ; on ajoute 150 mg de 8-bromo-AiMP cyclique sous forme d'acide libre anhydre. On plonge dans un bain chauffé à 1350 et on chauffe 2 heures à l'-ébullition à reflux (au bout de 15 minutes le nucléotide est complètement dissous). La solution est ensuite évaporée à siccité et le résidu est repris par 10 ml d'eau. lie fractionnement sur une colonne de DEAE-cellulose est effectué dans les conditions habituelles. lie produit attendu se trouve dans les fractions N 50 à 70 ; on les réunit et on évapore à siccité sous vide. Le sel de triéthyl ammonium présent est transformé en sel de sodium dans les conditions déjà décrites.On en obtient 85 mg (rendement 66 %). lie produit répond à la formule brute C10N10N5O7P Na. EXEMPLE 7 : Acides 8-amino-adénosine-5'-phosphorique (8-amino-AMP) et 8-amino-adénosine-3',5' phosphorique (8-amino-AMP cyclique). 426 mg de 8-bromo-AMP sont dissous dans 2,5 ml de formamide ; on ajoute 10 ml de méthanol saturé d'ammoniac. On chauffe en tube scellé à 87-92 durant 48 heures. On évapore le méthanol, on ajoute 10 ml d'eau et on fractionne dans les conditions habituelles sur une colonne de DEAE-cellulose L produit attendu est contenu dans les fractions Nd 50 à 70 on les réunit et on évapore à siccité sous vide. Le 8-amino-AMP est accompagné dans le mélange brut de deux composés donnant des pics mineurs et dont l'un est difficile à séparer du produit principal. Ce dernier est néanmoins utilisable pour la suite, bien qu'il n'ait pas donné des chiffres correct à l'analyse. Le rendement obtenu est de 70 , d'après la quantité de phosphore récupérée. 176 mg de sel de triéthyl ammonium, bien sèche du 8-amino-ELP sont dissous dans un mélange de 25 ml de pyridine de de 5 ml d'eau. On ajoute 146 mg de 4-morpholine-N,N'- dicyclohexylcarboxamidinium dans le but de transformer le nucléotide en un sel soluble. On évapore à siccité sous vide on reprend par 25 ml de pyridine et on évapore de nouveau à siccité ; cette opération est répétée deux fois. Finalement le résidu est dissous dans 50 ml de pyridine.La cyclisatioll en présence de 202 mg de dicyclohexyl-carbodiimide dissous dans 50 ml de pyridine est effectuée comme il est décrit dans l'exemple 3 b. lie produit de réaction est fractionné sur une colonne de DEAR-cellulose dans les conditions habituelles. lie produit attendu se trouve dans les fractions N 50 à 65 que l'on réunit et évapore à siccité sous vide. On transforme ensuite en oci de sodium dans les conditions déjà décrites. On en obtient 56 mg (rendement 32 %). Ce rendement peut être amélioré par emploi de diméthyl formamide lors de la cyclisation (exemple 1). Le produit répond à la formule brute C10H12N606P Nac EXEMPLE 8: Acide 2-amino-adénosine-3',5'-phosphorique (2-amino-AMP cyclique) Le principe de sa synthèse est le suivant On part de la 2-amino-6-chloro-9 (2',3',5'triacétyl-ss-D-ribofuranosyl)-purine qui se prépare à partir de la guanosine. Les groupe acétyles sont enlevés par ammonolyse. La 2-amino-6-chloro-9(ss-D-ribofuranosyl)-purine est traitée dans des conditions plus Énergiques par de l'ammoniaque ce qui fournit de la 2-amino-adénosine.Le produit est transformé en dérivé 2',3'-isopropylidénique qui par phosphorylation aU moyen d'oxychlorure de phosphore en présence de pyridine et d'acide formique(cf. Asahi Chemical Industry Co, Ltd, brevet français N 1 531 156) donne du 2-amino-AMP. Ce dernier, par cyclisation en présence de DCHC et de diméthyl formamide (cf. exemple 2) fournit finalement le 2-amino-AMP cyclique Les trois derniers produits sont nouveaux et font partie de l'invention. La 2-amino-6-chloro-9 (2',3',5'-triacétyl-ss-D- ribofuranosyl)-purine est préparée, à partir de la guanosine, d'après les indications de Gerster, Lewis et Robbins, jletbods in Nucleic Acids Chemistry 1, 242. On traite le produit durant 14 heures, à la température ordinaire par une solution saturée d'ammoniac dans du méthanol pour le désacétylerO On évapore sous vide et on recristallise dans le méthanol. La substitution du chlore par un groupe amino exige des conditions assez énergiques. 200 mg du produit précédent sont chauffés 48 heures à l'autoclave à 1200 avec 50 ml d'ammoniaque concentrée. Les cristaux du 2,6-diamino-nucléoside déposés après refroidissement (rendement 55 à 65 %) sont recueillis, lavés à l'alcool et à l'eau et séchés. Le produit avait déjà été préparé par une méthode différente mais le procédé objet de l'invention est plus pratique. 173 g du composé précédent sont mis en suspension dans 220 ml d'acétone ; on ajoute 52 ml de diméthoxy propane et 9,2 g d'acide p-toluène-sulfonique monohydraté ; on agite à la température ordinaire. Après dissolution du nucléoside, le p-toluène-sulfonate du dérivé isopropylidénique précipite. Au bout d'une heure, le sel est recueilli par centrifugation et lavé à l'acétone ; on le décompose en le traitant par 40 ml de bicarbonate de sodium à 10 %. Après dissolution complète suivie de l'évaporation à siccité sous vide, le résidu est séché par addition à trois reprises de 50 ml de benzène puis évaporation. On extrait par 150 ml, au total, de chloroforme et on évapore à siccité. On sèche de nouveau par introduction, à deux reprises, de 50 ml de benzène suivie d'évaporetion e Le résidu est dissous dans la quantité minimum de chloroforme on précipite par addition de benzène en excès. On obtient 1,2 g de produit amorphe, homogène à la chromatographle. Pour la phosphorylation la substance précédente (1,1 gE est introduite dans un mélange de 3,5 ml d'acétonltrile, 1,74 r] d'oxychlorure de phosphore, 0,46 ml d'acide formique anhydre ex 1,5 ml de pyridine anhydre. On agite jusqu'à dissolution, à la chambre froide, et o: abandonne à une température de 3 à 40 durant 2 heures. On introduit alors lentement, à 0 , 35ml d'eau on agite 2 heures à 0 et ajuste le pH à 1,5 au moyen d'hydroxyde de sodium. On chauffe à 70 pendant 1 heure pour enlever les groupes isopropylidènes et on agite ensuite avec 16 g de charbon actif.Ce dernier est lavé à l'eau. On élue le nucléotide absorbé au moyen d'un mélange d'éthanol, d'ammoniaque concentrée et d'eau (60 : 15 : 25 en vol.). On fractionne ensuite sur une colonne de DE.tE-cellulose par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate d'ammonium 0,35 M. Le 2-amino-ASIP est contenu dans les fractions N 100 à 140. Son sel de triéthyl ammonium isolé dans les conditions habituelles est utilisé directement pour la suite (la quantité de phosphore présente correspond à 640 mg de sel). La cyclisation a été effectuée C partir de 400 mg de sel de triéthyl ammonium de 2-amino-A > IP dissous dans 5 ml d'eau. Après addition de 360 mg de 4-morpholine-N,N'-dicyclohexyl-carboxa- midine, on procède comme décrit dans les exemples I et 2 en utilisant 510 mg de DCHC et 50 ml de diméthyl formamide. Par chrometographie sur papier, on décèle à coté du produit attendu, un autre composé migrant plus rapidement, qui peut être (voir exemple 2) de 1 acide 2-amino-adénosine-N2, 5'-phosphorique. Après évaporation à siccité sous vide, on traite le mélange brut pendant 1 heure à 600 par 50 parties d'hydroxyde de sodium 0,1 N. On neutralise à placide acétique et fractionne dans les conditions habituelles sur une colonne de DEAE-cellulose. Le produit est transformé finalement en sel de sodium, de la manière indiquée. On en obtient 106 mg. Le produit répond à la formule brute C10H12N606P Na. Comme il est indiqué dans la demande de brevet français N 69 34747 du 10 octobre 1969 au nom de la Demanderesse, on peut précipiter les sels d'argent à partir de solutions aqueuses concentrées des sels de sodium des dérivés de nucléotides auxquels a trait l'invention, p déc-mposition des sels d'argent au moyen dthydrogène sulfuré, oe obtient les acides libres et ensuite, par neutralisation, au moyen de bases minérales et organiques, les sels correspondants. D'autre part, tous ces composés sont susceptibles d'acylation en N6 ou 2'-0 et éventuellement en N8, 8-0,8-S et N2. Si, en particulier, on traite au moyen d'-anhydride butyrique en présence de pyridine (brevet principal) on obtient les dérivés butyrylés en N6 et 2'-0 et, éventuellement, en 8-0, 8-S, N8 et N. Ces composés présentent de l'intérêt car le dibutyryl N6,2'-0-hMP cyclique manifeste dans beaucoup d'épreuves in vivo une action supérieure à celle du nucléotide de base. EXEMPLE 9: N6,2'-O-dibutyryl-8-thio-AMP cyclique On met en suspension 75 mg de 8-thio-AMP cyclique dans un mélange de 2,5 ml de pyridine anhydre et de 1,25 mi d'anhydride butyrique. On agite durant 3 heures jusqu'à dissolution complète et on abandonne 20 heures à la tempe-ra- ture ambiante. On refroidit alors la solution à -10 et on ajoute avec précaution 1,5 ml d'eau glacée. Après 3 heures de repos à la température ambiante, on évapore à siccité sous vide poussé et on maintient sous ce vide pendant 24 heures. On reprend par 5 ml d'eau et on fractionne sur une colonne de DEAE-cellulose dans les conditions indiquées plus haut. La fraction contenant le dérivé butyrylé est évaporée à siccité ; on coévapore plusieurs fois avec du méthanol anhydre et on reprend par 2 ml d'éthanol.On ajoute la quantité théorique d'iodure de baryum dans 1 ml d'alcool (on se base sur la tendeur en phosphore en solution : pour 1 atome P il faut 1/2 mole de BaI2). lie sel de baryum précipite au bout d'un certain temps et il est recueilli par centrifugation et lavé avec un peu d'alcool. On obtient 29 mg de produit ; une quantité considérable de produit resté dans les eaux mères peut astre récupérée sous forme moins pure par addition de 2 à 3 volumes d'éther anhydre. lie produit répcnd à la formule brute C18H23N5O8PS.Ba/2. D'après sa composition et son spectre IR le produit ne contient que 2 groupes butyryles qui sont sans doute fixés en N6 et 2'-0. lie groupe sulfhydryle en C-8 n'a pas réagi ce qui s'explique par le fait qu'il est complètement sous sa forme tautomère de thio-cétonee Quelques caractères des déridés de l'AMP cyclique faisant partie de l'intention sont indiqués dans le tableau I suivant T A B L E A U I #max.** Rf dans 2 systèmes Substances (m ) #max.** de dissolvants* A 3 8-bromo-AMP c*** 266 15.200 0,43 0,63 8-thio-AMP c 297**** 24.000**** 0,25 0,40 8-méthylthio-AMP c 280 18.400 0,48 0,66 8-hydroxy-AMP c 270 11.500 0,38 0,48 8-amino-AMP c 273 16.000 0,23 0,32 2-amino-AMP c 258 10.200 282 10.200 0,20 0,25 8-amino-AMP 274 16.100 0,05 0,23 8-thio-AMP 236*** 25.200 0,06 0,25 24.100 dibutyryl-8-thio- 246 19.800 0,85 0,82 AMP c 326 25.500 *) systèmes de dissolvants : A = éthanol-acétate d'ammonium 0,5 M (5:2 en vol.) : B = isopropanol-sulfate d'ammonium à 1 % (2:1 en vol.) **) mesures effectuées dans l'eau, sauf indication contraire à pH 7. ***) c = cyclique ****) mesures effectuées à pH 11,0. Les dérivés de l'acide adénosine-3',5'-monophospho- rique cyclique ont été étudiés en ce qui concerne la libération in vitro de l'hormone de croissance hypophysaire chez le rat. Le dosage de l'hormone de croissance hypophysaire (GH) et de la prolactine (PR) a été effectué par électrophorèse sur gel. Le tableau suivant Il indique les résultats obtenus. lies concentrations de nucléotides sont exprimées en mG et les quantités d'hormone de croissance hypophysaire libérées dans les milieux d'incubation sont exprimées en g/mg d'hypophyse et en pourcentage par rapport aux témoins. T A B L E A U II GH Expérience Dose g GH % (mM) (2 ml) g/mg hyp. par rt au témoin A Témoin ~ 32 1,07 8-amino-AMP c 2 74 2,72 254 8-bromo-AMP c 2 156 4,88 456 B Témoin ~ 16 0,75 AMP c 5 32 1,40 186 S-thio-AMP c 2 92 4,53 604 8-hydroxy-AMP c 2 56 2,68 357 8-amino-AMP c 2 32 1,55 206 C Témoin - 36 1,29 AMP c 4 66 2,65 205 8-thiométhyl- 2 84 3,31 256 AMP c 8-thio-AMP c 2 82 3,37 261 8-amino-AMP c 2 54 2,21 171 8-bromo-AMP c 2 188 5,68 440 8-hydroxy-AMP c 2 72 2,98 231 D Témoin - 23 0,81 AMP c 9 52 1,90 235 AMP c 3 30 ,99 122 2-amino-AMP c 2 41 1,47 181 8-thio-AMP c 2 97 3,56 439 8-bromo-AMP c I 53 1,75 216 E Témoin - 21 0,69 8-thio-AMP c 1,5 62 2,19 .317 8-hydroxy-AMP c 4 66 2,34 339 T A B L E A U II (suite et fin) Dose GH Gi' Expérience (mM) g g/mg hyp. par rt au témoin (2 ml) F Témoin - 20 9,82 8-amino-AMP c 4 44 2,01 245 8-hydroxy-AMP c 4 60 2,34 285 2-amino-AMP c 4 37 1,58 193 DBC* 2 75 3,06 373 DBC* 1,5 55 2,53 309 * DBC = N6,2'-dibutyryl-AMP cyclique. Les nouveaux dérivés de l'AMP cyclique peuvent astre utilisés dans l'industrie aux mêmes fins que l'AMP cyclique, notamment pour les recherches biochimiques, biologiques et pharmaceutiques. Les nouveaux dérivés sont utilisables en recherche pour l'étude du mécanisme de l'action hormonale. Etant donné qu'ils jouent le rôle de second messager de l'action hormonale, ils pourraient remplacer l'action des hormones elles-memes dans l'organisme. REVENDICATIONS 1.- Dérivé d'acide adénosine-5'-monophosphorique qui répond à la formule dans laquelle R1 représente Br, SH, SCH3, OH ou NH2 et R2 représente H ou R1 représente H et R2 représente NH2 X désigne OH et Y désigne H ou X et Y ensemble representant une liaison directe entre P et O ainsi que les sels résultant de la salification de l'hydroxyle lié au phosphore quand X et Y représentent la liaison directe. 2.- Procédé pour obtenir un des dérivés d'acide adénosine-3',5'-monophosphorique de la revendication 1, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on soumet le dérivé correspondant d'acide adénosine-5'-monophosphorique à une cyclisation en présence de dicyclohexyl-carbodi-imide, de pyridine et de diméthyl formamide. 3.- Procédé de préparation d'un dérivé d'acide adénosine-3',5'-monophosphorique tel que le définit la revendication 1, ce procédé étant caractérisé par le stade selon lequel on fait réagir de l'acide adénosine-3',5'-monophosphorique avec du brome en solution aqueuse, pour obtenir l'acide 8-bromo-adénosine-3',5' -monophosphorique e 4.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on part d'acide 8-bromo-adénosine-5'-monophosphorique. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on fait ensuite réagir l'acide 8-bromo-adénosine-3',5'monophosphorique ainsi obtenu avec un composé du groupe constitué par l'acétate de sodium, le sulfhydrate de sodium et le méthyl mercaptate de sodium. 6.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on part d'acide 8-amino-adénosine-3',5'-monophosphorique. 7.- Dérivé butyrylé d'un des acides adénosine-3',5'monophosphoriques définis dans la revendication 1, ce dérivé étant caractérisé en ce qu'il est butyrylé en N6 et/ou 2'0 et/ou en N8 et/ou en N et/ou en 8-O et/ou en 8-S 8.- Dérivé N6,2'-O-dibutyrylé de l'acide 8-thio adénosine-3',51-monophosphorique de la revendication 7 et son sel de baryum. 9.- Procédé de préparation d'un dérivé butyrylé selon la revendication 8, procédé caractérisé en ce qu'on traite un acide adénosine-3',5'-monophosphorique tel que défini dans la revendication 1 par de l'anhydride butyrique en présence de pyridine anhydre. de cyclisation défini dans la revendication 4 du brevet principal. 9.- Un procédé de préparation d'acide 8-amino adénosine-3',5'-monophosphorique, caractérisé en ce qu'on fait réagir de l'acide 8-amino-adénosine-5'-monophosphorique avec de la dicyclohexyl-carbodiimide dans de la pyridine en présence de diméthyl formamide. 10.- Un dérivé d'acide adénosine-5-monophosphorique qui répond à la formule dans laquelle R1 représente Br, NH2, OH, SH ou CH3 et R2 désigne H ou encore R1 représente H et R2 représente RH2. 11.- es dérivés butyrylés des acides adénosine-3',5'- phosphoriques spécifiés dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dérivés dans lesquels les groupes butyryles sont fixés en N6 et (ou) en 2t-0 et (ou) en N8 et (ou) en N2 et (ou) en 8-0 et (ou) en 8-S. 12.-L'acide N6,2'-O-dibutyryl-8-thio-adénosine-3',5'monophosphorique cyclique et son sel de baryum. 13.- Un procédé de préparation des dérivés butyrylés indiqués en 11, procédé caractérisé en ce qu'on traite les acides adénosine-3',5'-phosphoriques spécifiés dans l'une quelconque des revendications 1 à 3 par de l'anhydride butyrique en présence de pyridine anhydre.