Brevet FR2126415A1 — publié le 19721006

i 2126415 La présente invention fournit un nouvel antibiotique A-46S6 et ses sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables. La détérioration des dents et les maladies de.s gencives sont 5 parmi les importants problèmes de santé avec lesquels l'homme se débat continuellement. Il existe des preuves convaincantes que les plaques dentobactériennes contribuent à la formation de caries des dents, ou de lésions du periodonte, ou bien à l'un et l'autre. Il existe un besoin de programmes prophylactiques 10 qui permettent de lutter contre la formation de plaques dentobactériennes ou de maintenir ces dépôts au-dessous du niveau au ;uel des réactions toxiques ont lieu. On a élaboré des antibiotiques qui inhibent la croissance des microorganismes formateurs de plaques, mais le besoin d'agents plus actifs 15 utiles pour prévenir et traiter la détérioration des dents et les maladies des gencives demeure. La production efficace de protéines animales destinées à la consommation de l'homme est un problème continuel de l'agriculture. On a trouvé de nombreux agents, et parmi eux 20 de nombreux antibiotiques, qui sont efficaces comme additifs alimentaires en produisant un gain de poids supplémentaire chez les porcs et les poulets en développement. On a sans cesse besoin de substances améliorées gui soient sûres et économiques et que l'on puisse ajouter à la nourriture des animaux pour en 25 augmenter le gain de poids et améliorer le rendement alimentaire. La découverte d'agents qui répondent à ces besoins représente un progrès réel dans la technique. On produit l'antibiotique de cette invention en cultivant l'organisme Actinoplanes sp., souche ATCC 23342, dans un milieu 30 nutritif aqueux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion. On sépare l'antibiotique du bouillon de fermentation filtré en faisant une adsorption sur un adsorbant activé et on en fait l'élution à l'aide d'un solvant acide. On purifie l'antibiotique A -4696 sous forme de composé cristallin en faisant une 35 adsorption sur un adsorbant chromatographique acidifié et on en' fait l'élution à l'aide d'un solvant acide. De préférence, on transforme l'antibiotique en chlorhydrate ou en sulfate dans une solution aqueuse de méthanol et on l'obtient sous forme d'un sel cristallin pur en y ajoutant de l'acétone et en séparant par 40 filtration le précipité qui se forme. L'antibiotique A-4696 possède C0PY 72 06458 2 2126415 une activité antibactêrienne et une activité favorisant la croissance. Le nouvel antibiotique de cette invention est un composé basique capable de former des sels avec les acides appropriés. 5 Les données de caractérisation présentées ci-après sont relatives à l'antibiotique A-4696 sous forme de chlorhydrate. Il est commode d'isoler et de caractériser l'antibiotique sous forme du chlorhydrate, bien qu'il soit possible de préparer d'autres sels pharmaceutiquement acceptables à l'aide de méthodes bien 10 connues dans la technique. L'antibiotique A-4696, sous forme de chlorhydrate, est un composé cristallin blanc ayant un point de fusion supérieur à 220°C. Il est soluble dans l'eau, et insoluble dans les solvants tels que méthanol, acétone, éther, chloroforme, pyridine, benzène, 15 hydrocarbures aliphatiques, etc... Il est très stable en solution dans une gamme de pH allant d'environ 1,0 à environ 10,0, à des températures allant jusqu'à environ 27°C. Le titrage électométrique du chlorhydrate de A-4696 dans l'eau ou dans un mélange diméthylformamide : eau (2 ; 1) donne 20 une courbe voisine d'une ligne droite ayant une pente d'environ 0,14 de pH 6,0 à 13,0. Une moyenne de plusieurs microanalyses a montré que le chlorhydrate de A-4696 avait approximativement la composition élémentaire suivante : C, 51,33 ; H, 5,79 ; N, 5,46 ; 0, 30,96 ; 25 Cl, 6,72 pour cent. Le poids moléculaire apparent, déterminé par la méthode osmotique de la pression de vapeur, est égale à 1153. Le pouvoir rotatoire spécifique,/"7D chlorhydrate de A-4696 à 25°C est égal à -42,3° (C=l, H20). Le spectre d'absorption ultraviolet du chlorhydrate de 30 A-4696 dans des solutions acides et neutres présente un unique maximum d'absorption à 276 mu , avec un coefficient d'extinction 1% ' Elcm de 45* En solut^on basique le chlorhydrate de A-4696 présente un unique maximum d'absorption de 300 , avec un coefficient d'extinction de 65. 35 Le spectre d'absorption infrarouge du chlorhydrate de A-4696 dans une pâte d'huile minérale est représenté par la Figure 1 du dessin annexé. Les maxima d'absorption discernables observés dans la gamme de 2,0 à 15,0yU sont les suivants : 3,0, 5,8, 5,9,6,03, 6,15 , 6,28 , 6,63 , 6,85 , 7,27 , 7,75 , 8,1 , 8,25 , 8,9 , 9,4 , 40 9,9 , 10,1 microns. 72 06458 3 2126415 L'allure de la chromatographie sur papier du chlorhydrate de A-4696 est représentée par les valeurs du dans le Tableau I ci-après. Les valeurs ont été obtenues dans chaque cas avec du papier Whatman N°1 et le système solvant indiqué. On à déterminé 5 la position de l'antibiotique sur le chromatogramme en faisant un bioautographe à l'aide de Bacillus subtilis comme organisme. TABLEAU I Chromatographie sur papier du chlorhydrate de A-4696 10 Système solvant Valeurs du 1 0,88 2 0,72 3 0,80 4 0,59 15 5 0,35 6 0,77 7 0,80 8 0,74 9 0,87 20 10 0,59 11 0,77 X La valeur du R^ est définie comme le rapport de la distance parcourue par l'antibiotique depuis l'origine à la distance parcourue par le front du solvant depuis l'origine. 25 Systèmes solvants ; 1. Eau saturée de butanol plus 1% d'acide p-toluènesulfonique. 2. Eau saturée de méthylisobutyl cétone plus 1% d'acide p-toluènesulfonique. 3. Eau saturée de méthylisobutyl cétone plus 1% d'acide p-toluène-30 sulfonique et 1% de pipéridine. 4. Eau -, méthanol i acétone (12-; 3:1). La solution est ajustée à pH 10,5 avec NH^OH puis le pH est ramené à 7,5 avec H^PO^. 5. Méthanol . HCl 0,111 (3 .1). 6. Un pour cent de méthylisobutyl cétone plus 0,5% de NH^OH dans 35 l'eau. 7. Sept pour cent de chlorure de sodium plus 2,5% de méthylisobu-tylcétone dans l'eau. 8. Dix pour cent de propanol dans l'eau. 9. Eutanol:éthanol:eau (150:15-13,5). 40 10. Propanol : pyridine :: acide acétique : eau (15:10~ 3:12) . 72 06458 4 2126415 11. Eau r éthanol : acide acétique (70 24 :6) . On peut préparer les sels pharmaceutiquement acceptables de l'antibiotique A-4696 avec des acides minéraux tels que les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphorique, etc..., 5 et également avec des acides organiques tels que les acides citrique. , tartrique, maléique, p-toluènesulfonique, salicylique, fumarique, acétique, propionique, etc... On peut préparer les sels de l'antibiotique avec ces acides, par exemple en acidifiant une solution de la base libre de l'antibiotique avec l'acide 10 désiré et en précipitant le sel ainsi formé en ajoutant dix volumes d'acétone à la solution contenant le sel de A-4696 avec l'acide. On peut préparer les sels de la même manière dans certains cas par échange d ' ions sur une colonne échangeuse d ' ions,- . On peut également utiliser d'autres méthodes couramment utilisées pour 15 préparer les sels d'antibiotiques. Le nouvel antibiotique de cette invention a une action inhibitrice sur la croissance de nombreux organismes microbiens gui sont pathogènes pour l'homme, les animaux et les végétaux, et c'est pourquoi il est utilisable pour supprimer le développement 20 de ces organismes. Les taux auxquels le chlorhydrate de A-4696 provoque l'inhibition de la croissance des organismes illustratifs sont représentés par les chiffres donnés dans le Tableau H ci-après. Les valeurs inhibitrices ont été déterminées soit par le test de dilution sur agar soit par le test de dilution sur bouillon, 25 et elles sont exprimées par la concentration inhibitrice minimale (CIM), en microgramme(s) par millilitre (^ug/ml). (ces tests sont désignés dans le Tableau II par les lettres "ad" et "bd", respectivement). Dans le test de dilution en agar on étale l'organisme test 30 en stries ou bien on ensemence sur des plaques d'agar dont l'agar contient diverses concentrations de chlorhydrate de A-4696. On met les plaques du test à l'incubation à 37°C pendant 48 heures, et on détermine la CIM comme étant la plaque à la concentration la plus faible en antibiotique où la croissance de l'organisme 35 test est inhibée. Dans le test de dilution en bouillon on ensemence l'organisme test dans une série de tubes contenant le bouillon nutritif et diverses concentrations de chlorhydrate de A-4696 et on met incuber à 37°C pendant 24 heures. On détermine la CIM comme étant la 40 concentration antibiotique la plus faible à laquelle aucune 72 06458 5 2126415 croissance ne se fait dans le tube. TABLEAU II 5 Organisme test Staphylococcus aureus 3055 Concentration inhibitrice minimale (yug/ml) 12,5 ad 6,25bd Bacillus subtilis 0,78ad Mycobacterium avium 0,4 ad 10 Streptococcus faecalis ^ 3,12ad Trichophyton mentagrophytes 0,2 ad Vibrio coli 12,5 bd Mycoplasma gallisepticum 50,0 bd Staphylococcus aureus (résistant à la 15 (pénicilline) 10,0 bd Staphylococcus aureus (résistant à la (méthicilline) 5,0 bd Diplococcus pneumoniae 3,12bd Clostridium perfringens 1,25bd 20 Clostridium tetani 2,5 bd Corynebacterium gravis 1,25bd Lactobacillus casei >100 ad Leuconostoc citrovorum >100 ad Escherichia coli >100 ad 25 Proteus sp. >100 ad Pseudomonas sp. >100 ad Salmonella sp. >■100 ad Vibrio metschnikovii JivlOO ad Saccharomyces pastorianus >100 ad 30 Candida albicans ^100 ad Donnâ on injection ^ouB -arrûanée à des oouriB 1s chlorhydrate de l.1 antibiotique A-4696 a une activité antimicrobienne in vivo contre les organismes infectieux ; par exemple les valeurs de la DE50 {dose efficace pour protéger 50% des animaux test)pour les 35 infections données à titre illustratif sont les suivantes lorsqu'on utilise deux doses : Staphylococcus aureus,9,2 mg/kg ; Streptococcus pyoqenes,0,68 mg/kg ; et Diplococcus pneumoniae, 0,76 mg/kg. Le nouvel antibiotique de cette invention est également actif 4C en ce qu'il inhibe la croissance des microorganismes qui contribuent 72 Ô6458 6 2126415 au développement des maladies du periodonte et à la détérioration des dents. Par exemple, une solution de chlorhydrate de A-4696 présente une activité antimicrobienne contre les organismes formateurs de plaques comme il est illustré par le système test 5 suivant ; on ensemence des tubes de bouillon nutritif contenant 5% de saccharose avec un microorganisme cariogène.' On immerge des baguettes de verre dans le milieu et on met les tubes à l'incubation à 37°C pendant une nuit après laquelle la couche constituant la plaque (essentiellement des cellules et du doxtrane) 10 se forme à là surface des baguettes. On transporte ensuite les baguettes dans des solutions contenant diverses concentrations de chlorhydrate de A-4696 et on les laisse au contact de l'antibiotique pendant 5, 10 et 15 minutes. Après écoulement du temps approprié, on rince les baguettes avec de l'eau 15 désionisée, stérile, et on les immerge dans un milieu non ensemencé contenant du saccharose. Après incubation pendant une nuit à 37°C on ajoute du bleu de bromothymol dans chaque milieu. On décèle un développement en notant le changement de couleur qui passe du bleu au jaune en raison de la production d'acide par les 20 organismes lorsqu'ils se développent dans un milieu contenant du saccharose. Une solution de chlorhydrate de A-4696 à une concentration de 0,01% était active contre un Streptococcus sp. cariogène non idaitifié lorsqu'elle était en contact avec les baguettes 25incrustrées de plaques pendant dix minutes. La croissance de cet organisme était inhibée par le chlorhydrate de A-4696 à une concentration de 0,1% lorsque la solution était en contact de la baguette test pendant 5 minutes. En outre, le chlorhydrate de A-4696 inhibe la croissance 30 de l'organisme formateur de plaques Odontomyces viscosus à une concentration de 6,25 ^/ug/ml dans un test de dilution en bouillon. L'incorporation de A-4696 ou de l'un de 3es sels d'addition d'acide a une pâte, un gel, une poudre, etc...,dentifrices appropriés, ou à un liquide pour bain de bouche approprié, 35 ou à une autre préparation pour hygiène de la bouche, peut constituer une méthode efficace pour inhiber le développement des caries dentaires et des maladies du periodonte. Sinon, on peut appliquer une solution de A-4696, ou d'un de ses sels d'addition d'acide à une concentration appropriée, à la surface des 40 gencives et des dents avec un tampon approprié. 72 06458 7 2126415 On a trouvé également gue l'antibiotique A-4696 était actif en ce qu'il favorisait la croissance des animaux. Lorsqu'on ajoute du chlorhydrate de A-4696 à la ration de base de poulets en cours de croissance à raison de 50 g/tonne, on remarque 5 que les gains de poids et les rendements alimentaires sont améliorés par rapport à ceux des poulets ne recevant pas d'antibiotique . Le Tableau III ci-après donne les indications fournies par quatre expériences séparées effectuées pour déterminer l'efficacité du chlorhydrate de A-4696 dans les tests de poids 10 des poulets. On a effectué.tous les essais sur des groupes de poulets placés en des locaux maintenus à environ 25°C. Les volatiles utilisés dans les divers essais étaient âgés de 1 à 5 jours au début de l'expérience. On a fait varier les périodes d'essai de lo à 17 jours. Pendant toute l'expérience on a utilisé 15 continuellement de la lumière et on a donné de la nourriture à volonté. Ration alimentaire Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A-4696 Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A-4696 Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A-4696 TABLEAU III Gains de poids et rendement alimentaire ches des jeunes poulets dont la ration alimentaire contient du chlorhydrate de A-4696 Nombre de volatiles en traitement Chlorhydrate de A-4696 g/t d'aliment Nombre de jours de traitement 0 50 0 50 0 50 10 10 10 10 17 17 40 40 20 20 80 80 Gain Rendement pondéral de cioyen transformation des al îmenËi/ gain 147 1,53 146 1,47 146 1,50 153 1,45 295 1,56 320 1,46 K> O O en cx> CD Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A—4696 Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A—4696 0 50 50 17 17 17 17 80 80 80 80 300 318 287 307 1,51 1,43 1,58 1,47 K> K3 O tn 72 06458 9 2126415 On a testé l'effet obtenu en ajoutant du chlorhydrate de A-4696 à la nourriture de jeunes porcelets ainsi que son influence sur le gain de poids quotidien moyen et sur le rendement alimentaire. On a maintenu des porcelets âgés de 5 4 à 5 semaines à un régime qui ne contenait pas d'antibiotiques pendant environ une semaine avant de commencer l'expérience. Ensuite on a pesé les porcs et on les a mis dans des groupes expérimentaux sur la base du poids et de la portée. On a mis les porcs dans des locaux fermés avec chauffage et ventilation 10 convenables et on a mis de.la nourriture et de l'eau à leur disposition et à volonté à tous moments. Dans chaque expérience les porcs étaient divisés en deux groupes, l'un des groupes recevait la ration de base ne comportant pas d'antibiotique , et l'autre groupe recevait la même ration de base plus du 15 chlorhydrate de l'antibiotique A-4696. Le Tableau IV représenté ci-après donne l'augmentation de gain quotidien moyen et de rendement alimentaire chez les porcs qui ont reçu le chlorhydrate de A-4696 comparativement à ceux qui n'ont reçu que la ration de base. TABLEAU IV Gain de poids quotidien moyen et rendement alimentaire chez des porcelets dont une partie du régime quotidien est constituée de chlorhydrate d'antibiotique A-4696 Ration alimentaire Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A-4696 Ration de base Ration de base + chlorhydrate de A-4696 Chlorhydrate de A—4696 2/È 0 0 50 Nombre de porcs dans 1'essai 11 11 11 11 Nombre de jours d'essai 28 28 34 34 Gain de poids quotidien moyen (fo?) 0,30 0,43 0,50 0,55 Rendement pondéral de transformation des aliments aliments/gain 1,91 1,77 2,41 2,17 -J1 K> O O Ut 00 N> —* K_> O -t* en 72 06458 ii 2126415 La toxicité aiguë du chlorhydrate de A-46S6, déterminée chez la souris et exprimée par la DL^q est de 2400 mg/kg lorsque le produit est administré par voie intrapéritonéalle. On produit le nouvel antibiotique de cette invention en 5 cultivant une souche d'Actinoplanes découverte récemment, dans des conditions aérobies dans un milieu de culture approprié jusqu'à ce que le milieu de culture contienne une activité antibiotique importante. On peut récupérer l'antibiotique en utilisant divers procédés d'isolement et de purification 10 couramment utilisés et compris dans la technique;. Lorsquè l'antibiotique est destiné à être incorporé à la nourriture des animaux, on a besoin d'un degré de purification moins élevé que celui qui est nécessaire si l'antibiotique est destiné à être utilisé dans un but médical. 15 On a identifié le microorganisme utilisé selon cette invention pour produire l'antibiotique A-4696 comme étant la souche d'une espèce d'Actinoplanes de la famille des Actinopla-naceae. Les Actinoplanaceae sont une nouvelle famille de microorganismes de l'ordre des Actinomycétales, ayant été tout 20 d'abord décrits par Dr. John H. Couch, Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 65, 315-318 (1949) ; et 66, 87-92 (1950) r Trans. New York Acad. Sci., 16, 315-313 (1954) ; Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148-155 et 269 (1955) ; Bergey's Manual of Determinative Bacte-riology, 7th Edition, 825-29 (1957) ; et Jour. Elisha Mitchell 25 Sci. Soc., 79., 53-70 (1963). La souche Actinoplanes sp. utilisée dans la production de l'antibiotique A--4696 a été remise à la collection de cultures de réserve de 1'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, dont elle constitue un élément et elle est disponible 30 pour le public sans limitation sous le n° ATCC 23342. La souche Actinoplanes sp. utilisée dans la production de A-4696 a été isolée d'un échantillon de terre provenant de la région montagneuse de Cascade dans l'état de Washington. Cet organisme a été désigné par le N° 581 dans la collection 35 du Dr.John N. Couch de l'Université de Caroline du Nord. Actinoplanes sp., souche ATCC 23342, est caractérisée par les propriétés physiques et par les propriétés de culture exposées dans les paragraphes suivants. Pour nommer les couleurs on emploie le système de Ridgeway, Color Standards and Nomenclature, 40 (1912). 72 06458 12 2126415 Morphologie microscopique et caractéristiques générales de culture de Actinoplanes sp. ATCC 23342 Morphologie microscopique - Le mycélium est plutôt épars sur pollen de Liquidambar (arbre à ambre liquide) dans l'eau. Les 5 hyphes sont ramifiées, cloisonnées, et ont 0,2-l,5yu de diamètre. Les hyphes remplissent le grain de pollen, s'allongeant dans l'eau jusqu'à une distance environ égale au diamètre du grain. Les Sporangiophores sont projetés au-dessus de la surface de l'eau ;pédoncules des sporanges habituellement uniques, parfois 10 ramifiés pour porter deux, ou rarement plus, sporanges sur le même sporangiophore ; pédoncules de 1,0-1,5ya., épais, cloisonnés Les sporanges sont plutôt petits, 4-llyu de diamètre, subglobuleux, rarement globuleux, habituellement avec une paroi irrégulière. Les spores muras sont disposées en un ou plusieurs enroulements 15 non distincts dans le sporange. La déhiscence du sporange se fait par gonflement d'une substance se trouvant entre les spores et qui fait grossir le sporange et lui fait presque prendre une forme sphérique lisse. Les spores sont mobiles, ont 1,0-1,5 de diamètre et sont globuleuses à subglobuleuses. 20 Caractéristiques de culture sur : Czapek gélosé (S. A. Waksman, The Actinomycetes, 1950). Le développement est bon ; le point d1inoculation atteint environ 2 cm de diamètre après huit semaines. La partie centrale est bombée ? le frottis est aplati et finement bosselé. La couleur 25 du mycélium est zinc orangé brillant ; la gélose est d'une couleur chamois pâle à nettement jaunâtre. Les sporanges sont rares. Czapek peptoné gélosé (5 g de peptone au lieu de 2 g de uitrite de sodium) . Le développement est analogue à celui observé sur 30 Czapek gélosé, mais les sillons, les rides et les inégalités sont plus nettes que sur Czapek gélosé. Il n'y a pas formation de sporange. Comme il a été indiqué antérieurement, on peut cultiver Actinoplanes sp., souche ATCC 23342, dans un milieu de culture 35 pour obtenir l'antibiotique A-4696. Le milieu de culture peut être l'un quelconque de milieux différents. Cependant, pour des raisons d'économie de production, de rendement maximal, et de facilité d'isolement de l'antibiotique, certains milieux de culture ont la préférence. Ainsi, par exemple l'amidon est l'une 40 des sources de glucides préférées, et la farine de soja est l'une 72 06458 13 2126415 des sources d'azote préférées. Les autres sources de glucides qui peuvent être utilisés comprennent les mélasses, le glucoose, la dextrine, le glycércJ, etc. ..Les sources d'azote comprennent également les mélanges d'acides aminés,les peptones, etc... 5 Les sels minéraux nutritifs à incorporer dans lsmilieux de culture peuvent comprendre les sels habituels capables de fournir les ions sodium,potassium, ammonium, calcium, phosphate, chlorure, sulfate, acétate, glucide, et ions analogues. En outre, des sources de facteurs de croissance, tels que solubles de 10 distillerie et extraits de levure, peuvent être "incorporées en donnant un effet bénéfique sur la production de 1'antibiotique A-4696. Comme il est nécessaire à la croissance et au développement des autres microorganismes, des oligc -éléments essentiels peuvent également être incorporés au milieu de culture destiné 15 à la culture de 1 'Actinoplanes sp. utilisé dans cette invention.Ces oligo -éléments sont couramment portés sous forme d'impuretés provenant de l'addition des autres constituants du milieu. L'organisme utilisé pour produire A-4696 peut être cultivé 20 dans une gamme de jjH relativement large. Cependant, il est souhaitable d'ajuster le pH du milieu da culture à une valeur comprise entre environ 6,5 et 7,2 avant d'ensemencer l'organisme. Comme avec les autres Actinomycètes, le pH du milieu de culture change progressivement pendant la durée de la culture ; à la fin 25 de la période de fermentation le pH va généralement d'environ 7,0 à 7,8. Pour la production de A-4696 il est préférable d'utiliser des conditions de culture en aérobiose et immersion. On peut obtenir des quantités d'antibiotigue relativement faibles en 30 faisant une culture en flacon agité ; cependant,pour préparer de grandes quantités, on préfrre faire une culture en aérobiose et immersion dans des réservoirs stériles. Le milieu de culture contenu dans le réservoir stérile peut être ensemencé avec une suspension de spores ou de fragments inycêliens; mais en raison 35 de la phase de latence qui intervient lorsqu'on utilise une suspension sporulée, on préfère utiliser comme inoculum la forme végétative de la culture. On utilise l'équipement de fermentation de manière plus efficace en évitant la phase de latence dans le cycle de développement. 40 Par conséquent, il est souhaitable de produire un inoculum 72 06458 14 2126415 végétatif de l'organisme en ensemençant une quantité relativement faible de milieu de culture avec les spores ou les fragments mycéliens de l'organisme, et lorsqu'on a obtenu un inoculum végétatif actif jeune de le transporter aaeptiquement dans 5 le grand réservoir. Le milieu dans lequel on cultive 1'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour la fermentation de A-4696 à grande échelle, bien que l'on puisse utiliser d'autres milieux. L'Actinoplanes sp., producteur de A-4696, souche ATCC 23342, 10 se développe à des températures comprises entre environ 20° et 40°C. Il semble que les quantités de A-4696 les plus grandes se produisent à une température d'environ 30°C. On fait passer de l'air stérile dans le milieu de culture dans le procédé de culture en aérobiose et immersion. Le volume 15 d'air dispersé dans le milieu de culture varie d'environ 0,1 à environ 1,0 volume d'air par minute par volume de milieu de culture. Le développement et la production d'antibiotique les plus importants sont obtenus lorsque, le volume d'air est au moins égal à un demi volume d'air par minute par volume de milieu de 20 culture. On peut suivre la vitesse de production de A-4696 et la concentration de 1'activité-antibiotique dans le milieu de culture pendant la période de développement en recherchant l'activité antibiotique d'échantillons du bouillon de fermentation 25vis-à-vis d'organismes connus pour être sensibles à l'antibiotique. L'un de ces organismes d'essai utile dans la présente invention est Bacillus subtilis. On peut effectuer le biotitrage par les méthodes classiques de turbidimétrie ou des cylindres, ou par le titrage avec disques de papier sur boîtes d'agar. 30 Généralement la production maximale de l'antibiotique a lieu au bout d'environ 4 à 6 jours dans des flacons agités ou dans la fermentation des cultures en aérobiose ou immersion. On peut récupérer l'antibiotique A-4696 du milieu de culture et le séparer des autres substances qui peuvent être présentes 35 par des techniques d'adsorption et d'extract, on. On préfère les techniques d'adsorption car ces méthodes évitent l'emploi des grands volumes de solvants nécessaires dans les procédés d'extraction. Après la fermentation, 1'activité antibiotique se trouve à la fois dans le bouillon et le mycélium. On filtre le milieu 40 de culture pour séparer le bouillon de fermentation du mycélium 72 06458 15 2126415 solide. On lave le gâteau mycélien avec de l'eau et ensuite on en fait une suspension dans l'eau ajustée à un pH de 10,5 par NaOH 5,011, on agite vigoureusement pendant 30 minutes et on filtre. On rassemble les deux filtrats et l'eau de lavage et 5 on absorbe l'activité antibiotique sur un agent d'adsorption approprié tel que charbon activé, alumine acide activée, résine polyamide, cellulose, gel de silice, etc On peut effectuer 1'adsorption en faisant passer la solution contenant l'activité antibiotique sur un lit d'adsorbant, ou en ajoutant 1'adsorbant 10 à la solution, en mélangeant intimement pendant 20 à 30 minutes et en séparant le solvant par filtration. On peut récupérer l'antibiotique adhérant à 1'adsorbant sous forme de A-4696 par les procédés d'élution habituels. On peut purifier l'antibiotique A-4696 brut en en préparant 15 le picrate et en transformant celui-ci en chlorhydrate, ou bien en utilisant des procédés d'adsorption et dilution avec un adsorbant approprié ou une résine échangeuse d'ions. Les adsorbants qui conviennent comprennent la Bolyamide rusin (II. woelm., Eschwege, RFA), l'alumine acide, l'alumine neutre, l'alumine basique, 20 le gel de silice, l'Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas, Philadelphie), JL. l'Amberlite XAD-4 (Rohm and Haas, Philadelphie), et la Dowex 50(H ) (Dow Chemical, Midland, Michigan). Cette invention est illustrée plus en détails par les exemples suivants s 25 EXEMPLES 1 A. Fermentation de l'antibiotique A-4696 en flacon agité. On a ensemencé des fragments de mycélium d1Actinoplanes sp., souche ATCC 23342, sur une gélose nutritive inclinée ayant la composition suivante ; 30 Ingrédient Quantité Farine d'avoine précuite 60 g Levure 2,5 g K2HP04 1,0 g Solubles de distillerie séchés 5,0 g 35 Solution minérale de réserve de Czapelc 5,0 ml Gélose 25 g Eau, désionisée 1 litre La solution minérale de réserve de Czapek a la composition suivante : 72 06458 16 2126415 KCl 100 g MgSOA .7H20 100 g PeS04.7H20 2 g (Dissous dans 2 ml de HC1 concentré) 5 Eau, désionisée 1 litre On a ensemencé le milieu incliné avec la souche ATCC 23342 et on l'a mis à l'incubation pendant 6 jours à 30°C. La culture ne sporule pas normalement sur ce milieu et il est nécessaire de faire macérer le feutrage mycélien en utilisant une aiguille 10 à ensemencement aplatie, aiguisée, de manière à augmenter le nombre de centres d'où pourrait se faire la croissance. On a recouvert la cultursmûre macérée avec de l'eau distillée stérile et on l'a grattée soigneusement avec une baguette stérile pour obtenir une suspension mycélienne. 15 On a utilisé la suspension ainsi obtenue pour ensemencer 100 ml de milieu végétatif stérile ayant la composition suivante : Ingrédient Quantité Glucose 5,0 g Dextrine 20,0 g 20 Farine de soja 15,0 g Extrait de levure 2,5 g Carbonate de calcium 1,0 g Eau du robinet 1 litre On a laissé le mycélium végétatif ensemencé se développer 25 pendant 48 heures à 30°C sur une secouause rotative fonctionnant à 250 tpm. On a ensemencé 10 ml du milieu végétatif"incubé dans 100 ml d'un milieu "végétatif*stérile de même composition que celle donnée immédiatement ci-dessus. On a mis le milieu "végétatif" 30 ainsi inoculé à l'incubation pendant 24 heures à 30°C en le soumettant à une agitation constante sur une secoueuse rotative fonctionnant à 250 tpm. On a ensemencé 0,4 ml de milieu "végétatif" incubé dans des portions de 100 ml d'un milieu de production ayant la composition 35 donnée ci-après et contenues dans des flacons d'Erlenmeyer de 500 ml, et stérilisées à 120°C pendant 30 minutes : 72 06458 2126415 Inqrédient Pour cent Dextrose 1,0 Dextrine 3,0 Peptone 1,5 Farine de soja 0,5 MgS04.7H20 0,2 Mélasses, sucre de betterave 1,5 Liqueur de macération de maïs 0,5 Bétaine 0,1 K2HP04 0,05 Eau désionisée, q.s.p. 25 ml a ajusté le pH du milieu à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 5N avant stérilisation. Après la stérilisation le pH était approximativement de 6,9. 15 On a secoué le milieu de fermentation pour la production pendant environ 96 heures à une température de 30°C sur une secoueuse rotative fonctionnant à 250 ppm. A la fin du cycle de fermentation le pH était de 7,2 environ. B. Fermentation de l'antibiotique A-4696 en réservoir de 40 litres. 20 Pour la préparation de 1'inoculum on a procédé par l'incubation du milieu "végétatif" dont le détail est donné dans la partie A précédente. On a stérilisé 25 milieu de production tel que celui décrit précédemment, additionné de 0,02% d1 antimoussant de Dow Corning, en 1'autoclavant à 120°C pendant 30 minutes 25 et en le mettant dans un réservoir de fermentation de 40 litres. On a inoculé 100 ml de milieu "végétatif" incubé dans le milieu de production stérile. On a laissé le milieu de production ensemencé placé dans le réservoir de 40 1 fermenter pendant 4 jours à 30°C. On a aéré le milieu de fermentation avec de l'air stérile 30 à raison d'environ un demi volume d'air par volume de milieu de culture par minute. On a ajité le milieu de production en cours de fermentation à l'aide d'un agitateur à hélice de taille appropriée et tournant à une vitesse appropriée pour assurer un mélangeage convenable de l'air avec le milieu. Le pH du milieu 35 de culture s'est accru progressivement d'une valeur initiale d'environ 6,9 à la valeur d'environ 7,2 au fur et à mesure que se faisait la fermentation. C. Isolement de l'antibiotique A-4696 On a filtré le bouillon total obtenu dans une fermentation 40 de A-4696, telle que décrite précédemment, en s'aidant d'un 72 06458 18 2126415 adjuvant de filtration du commerce. On a mis le filtrat de côté. On a lavé le gâteau mycélien avec 32 1 d'eau et on a mis l'eau de lavage de côté. Ensuite on a mis le gâteau mycélien en suspension dans 32 1 d'eau supplémentaires et on a ajusté le pH 5 du mélange à 10,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 5N . On a agité la suspension de gâteau mycélien dans l'eau pendant 45 minutes et on a filtré le mélange. On a rassemblé ce filtrat et l'eau de lavage avec le filtrat d'origine provenant du bouillon de fermentation et on a ajusté le pH des filtrats réunis à une 10 valeur de 4,0 avec ^SO^. On a fait passer les filtrats réunis acidifiés sur une colonne de charbon en utilisant un kilo de charbon activé, (Pittsburgh, 12 x 40). On a lavé la colonne de charbon activé, jusqu'à ce que l'effluent soit incolore. L'activité de A-4696 était absorbée sur la colonne de charbon. On a élué 15 l'activité de A-4696 de la colonne de charbon en utilisant une solution de H2S04 à 1% dans un mélange acétone : h20 (1 : 1). Deux litres de la solution acétone-eau acidifiée étaient suffisants pour éluer l'activité de A-4696 de la colonne de charbon. On a traité l'éluat contenant l'activité de A-4696 par une 20 solution d'hydroxyde de baryum saturée,' de manière à former un précipité de sulfate de baryum, en éliminant ainsi les ions sulfate de la solution. On a filtré le mélange et on a rejeté le précipité de sulfate de baryum. On a concentré le filtrat contenant l'activité 25 de A-4696 sous vide jusqu'à siccité. La quantité de résidu résultant comportant l'activité de A-4696 atteignait approximativement 80 g. D. Transformation de l'activité de A-4696 en chlorhydrate de A-4696 brut 30 On a repris les 80 g approximatifs d'activité de A--4696 par un volume de 5 1 d'eau, et ensuite on les a traités par 500 g de charbon activé (Darco G-60, Atlas Chemical, wilmington, Del.). On a agité ce mélange pendant une heure et ensuite on l'a filtré. On a rejeté le filtrat. On a lavé le gâteau de filtration de 35 charbon contenant l'activité de A-4696 avec un litre d'eau et on a rejeté le liquide de lavage aqueux. On a encore lavé le gâteau de filtration de charbon avec un litre de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,05N. On a rejeté le liquide de lavage acide. On a dilué le gâteau de charbon lavé en agitant 30 minutes avec 40 500 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique et d'acétone 72 06458 19 2126415 ( HCl 0,05N : acétone /7 : 37- On a filtré le mélange et on a mis le filtrat de côté. On a répété l'élution du charbon activé 4 fois de la même manière, en mettant chaque fois le filtrat de côté. On a réuni les cinq éluats contenant l'activité de 5 A-4696. On a ensuite concentré sous vide les éluats réunis jusqu'à un volume d'approximativement 100 ml. On a ajouté 200 ml de méthanol au concentré aqueux contenant l'activité de A-4696. On a ajouté deux litres d'acétone à cette solution aqueuse méthanolique. il s'est formé un précipité, constitué 10 de chlorhydrate de A-4696-brut, dans la solution d'acétone et de méthanol aqueux. Après filtration et séchage du précipité on a récupéré 60,9 g de chlorhydrate de A-4696 brut. E. Préparation du chlorhydrate de A-4696 cristallin. On a dissous 25 g de chlorhydrate de A-4696 préparé selon le 15 mode opératoire exposé dans la partie D de cet exemple dans 20 ml d'eau. On a fait passer la solution de chlorhydrate de A-4696 sur un lit de résine Polyamide (m. woelm, Eschwege, RFA), lavée à l'eau, contenue dans une colonne de verre d'approximativement 7 x 60 cm. On a mis l'effluent de côté. On a lavé la colonne 20 de résine Polyam:'Jg avec de l'eau à un débit d ' approximativement 8-10 ml par minute. On a mesuré l'activité antimicrobienne de l'effluent de la colonne par des méthodes classiques. On a réuni les effluents contenant l'activité antimicrobienne et on a concentré sous vide jusqu'à siccité. On a dissous le résidu dans 25 un mélange de 25 ml d'eau et de 50 ml de méthanol. On a acidifié cette solution méthanolique aqueuse de chlorhydrate de A-4696 jusqu'à un pH de 2,0 avec HCl 5N. On a ajouté approximativement 1,5 1 d'acétone à la solution aqueuse méthanolique pour précipiter le chlorhydrate de A-4696. On a filtré le mélange et on a 30 récupéré le précipité de chlorhydrate de A-4696. On a dissous le gâteau de filtration contenant le chlorhydrate de A-4696 dans une quantité minimale d'eau. On a alors ajouté une quantité d'éthanol égale à deux fois le volume d'eau et on a chauffé le mélange jusqu'à approximativement 60°C. On a alors 35 refroidi le mélange et le chlorhydrate de A-4696 a cristallisé . On a filtré les cristaux et on les a séchés. On a recueilli approximativement S g de chlorhydrate de A-4696 cristallin. EXEMPLE 2 Purification de A-4696 sur alumine lavée à l'acide. 40 On a dissous 2,3 g de A-4696 brut, obtenu comme il est décrit 72 06458 20 2126415 dans l'Exemple 1 tout au long de la partie D précédente, dans 20 ml de méthanol aqueux à 50 pour cent et on a fait passer Hur une colonned'alumine lavée à l'acide (Alcoa) de 2 x 4 cm. On a lavé immédiatement la colonne avec du méthanol. On a éiié 5 l'activité de l'alumine acide avec du méthanol aqueux à 50 pour cent. On a recueilli des parties aliquotes de l'éluat et on a déterminé l'activité antimicrobienne de chaque fraction. On a réuni les fractions qui présentaient une activité antimicrobienne, on les a concentrées à approximativement 100 ml et on y a 10 ajouté de l'acétone pour précipiter l'antibiotique A-4696. On a filtré le précipité et on l'a séché sous vide, et on a obtenu approximativement 930 mg de A-4696 cristallin pur. On a préparé 1'alumine lavée à l'acide utilisée dans la purification décrite précédemment de la manière suivante : 15 on a lavé de l'alumine F-20 activée Alcoa avec de l'eau ajustée à pli 3 avec H2S0A en agitant pendant 6 heures et en maintenant le pH à 3,0. On a séparé l'alumine par filtration, on l'a lavée avec du méthanol aqueux à 50%, et on l'a séchée dans un four à 100°C. 20 EXEMPLE 3 Purification de A-4696 par préparation du picrate et transformation de celui-ci en chlorhydrate On a dissous 500 mg de A-4696 brut , obtenu comme il est décrit dans l'Exemple 1 tout au long de la partie D précédente, 25 dans 25 ml d'eau et on a ajouté 25 ml d'une solution aqueuse d'acide picrique saturée, en agitant. On a laissé reposer le mélange pendant une nuit à 5°C et il s'est formé un précipité. On a séparé le précipité par centrifugation et on l'a séché. On a dissous le précipité ainsi obtenu dans 25 ml de méthanol, on a 30 ajusté le pH à 1,5 avec HCl, et on a ajouté ceci à 500 ml de diéthyl éther pour précipiter le chlorhydrate de A-4696. On a séparé le chlorhydrate par centrifugation, on l'a lavé au diéthyl éther et on l'a séché sous vide pour obtenir approximativement 305 mg de chlorhydrate de A-4696 sous forme d'un sel 35cristallin blanc. EXEMPLE 4 Préparation du sulfate de A-4696 On a dissous deux grammes de chlorhydrate de A-4696, obtenus comme il est décrit dans l'Exemple 1 tout au long de la partie E 40 précédente, dans 300 ml d'eau, on a ajusté le pH à 7,5 72 06458 21 2126415 avec de 11hydroxyde de sodium 5N, et on ajouté 30 g de charbon Darco G-60. On a agité le mélange pendant 30 minutes ; on l'a filtré à l'aide d'un adjuvant da filtration du commerce, et on a lavé le gâteau de filtration successivement avec 300 ml d'eau 5 et 300 ml de H2S04 0,05îT. On a élué l'activité du gâteau de filtration en ajoutant le gâteau de filtration à 500 ml d'un mélange constitué de 70% de î^SO^ 0,05N et de 30% d'acétone, en agitant pendant 30 minutes et en filtrant pour éliminer le charbon. On a concentré -10 le filtrat à approximativement 10 ml. On a ajouté environ 20 ml d'éthanol au concentré et on a ajouté la solution ainsi obtenue à 600 ml d'acétone pour précipiter le sulfate de A-4696. On a séparé le précipité par filtration ; on l'a lavé à l'acétone et séché sous vide, pour obtenir 862 mg de sulfate de A-4696 sous 15 forme d'un sel cristallin blanc. 72 06458 22 2126415 REVENDICATIONS 1. La substance antibiotique A-4696, ou un de ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables. 2. L'antibiotique de la revendication 1 qui sous la forme 5 de son chlorhydrate est une substance cristalline, blanche, solubie dans l'eau et insoluble dans les solvants organiques courants ; a un point de fusion supérieur à 220°C ; a une courbe de titrage électrométrique dans le diméthylformamide aqueux à 66 pour cent voisine d'une ligne droite ayant une pente d'environ 0,14 de 10 pH 6,0 à pH 13,0 ; à la composition approximative de 51,33 pour cent de carbone, 5,79 pour cent d'hydrogène, 5,46 pour cent d'azote, 30,96 pour cent d'oxygène, et 6,72 pour cent de chlore ; a un poids moléculaire apparent de 1158, tel que déterminé par la méthode osmotique de la pression de vapeur ; a un pouvoir ■— 25 15 rotatoire spécifique /§7D de -42,3° (c=l, HgO) ; a dans son spectre d'absorption ultraviolette en solution acide et en solution neutre un seul maximum d'absorption à 276 mAi , avec un 1 °/ coefficient d'extinction E, /0 de 45, et en solution basique un 1 cm ^ seul maximum d'absorption de 300 mié , avec un coefficient n a ' 20 d'extinction E /0 de 65 ; et a les bandes discernables suivantes 1 cm dans son spectre d'absorption infrarouge lorsque la détermination est faite dans une pâte avec une huile minérale : 3,0, 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, 6,28, 6,63, 6,S5, 7,27, 7,75, 8,1, 8,25, 8,9, 9,4, 9,9 et 10,1 microns. 25 3. Le chlorhydrate de l'antibiotique A-4696 tel qu'il est défini dans la revendication 1. 4. Le sulfate de l'antibiotique A-4696 tel qu'il est défini dans la revendication 1. 5. Procédé de production de l'antibiotique de la revendi-cation 1, caractéris' en ce qu'il consiste à cultiver l'organisme Actinoplanes sp., souche ATCC 23342, dans un milieu de culture liquide contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et des sels minéraux dans des conditions d'aérobiose et d'immersion jusqu'à ce que ledit organisme ait communiqué une activité 35 antibiotique importante audit milieu de culture. 6. La méthode de la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle consiste à adsorber l'activité antibiotique produite sur un adsorbant ; à éluer ladite activité antibiotique dudit adsorbant par un solvant acide ; à adsorber ladite activité antibiotique 40 Sur un adsorbant chromatographique acidifié y et à éluer ledit 72 06458 23 2126415 antibiotique dudit adsorbant chromatographique. 7. Composition d'inhibition de la croissance des microorganismes qui contribuent au développement des maladies du périodonte et des caries dentaires, caractérisée en ce qu'elle 5 comporte l'antibiotique de l'une des revendications 1 à 4 et un porteur convenable. S. Composition alimentaire pour animaux, caractérisée en ce qu'elle comporte l'antibiotique de l'une des revendications 1 à 4 et un porteur convenable. 10 9. Composition alimentaire pour volaille, caractérisée en ce qu'elle comporte l'antibiotique de l'une des revendications 1 à 4 et un porteur convenable.