Brevet FR2125248A1 — publié le 19720929

L'invention concerne des polypeptides et en particulier des hepta- et octapeptides de formule OH dans laquelle R est un atome d'hydrogène, un groupe succinyle, L-aspartyle, sarcosyle, L-séryle, succinamyle, L-propyle, glycyle ou D- ou L-asparaginyle, R^ est un reste de L-alanine, Ir ou D-leucine, glycine, L-isoleucine ou p-alanine; et R2 est un groupe L-valyle, L-isoleucyle, ou L-alanyle. 15 Les peptides selon l'invention possèdent une activité pharma- cologique. Ils sont capables d'inhiber l'effet presseur de l'amide angio-tensine sur la pression sanguine. Ainsi, lorsqu'ils sont- administrés par perfusion intraveineuse à des rats en très petites quantités de 20 mcg par kg et par mn, l'effet presseur de l'amide angiotensine administré 20 de façon analogue est inhibibé. En vertu de cette propriété inhibitrice sur l'élévation de la pression sanguine provoquée par l'amide angiotensine, les peptides selon l'invention sont des agents de valeur pour combattre l'hypertension due à l'amide angiotensive. Ils peuvent également inhiber l'hypertension chez des rats à hypertension rénale unilatérale 25 aiguS, par perfusion intraveineuse. Les hepta- et octapeptides selon l'invention peuvent être facilement préparés selon les méthodes connues de préparation des peptides. De telles méthodes comportent la formation d'une chaîne linéaire d'amino-acides par l'intermédiaire de liaison amide répétitive en employant pour 30 réaliser de tels alignements séquentiels, les groupes protecteurs nécessaires susceptibles de s'éliminer facilement par les méthodes habituelles. L'adaptation de telles méthodes aux peptides selon l'invention est décrite ci-après dans l'exemple suivant: 35 L-asparaginyl-L-arginvl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-propyl-L-alanine A) BOC-Asn-Arg(NO^)-Val-Tyr(O-Bzl)-Val-His(N^"m-Bzl)-Pro-Ala-polymère On place dans un récipient réactionnel de Merrifield de 200 ml, du type à bascule, 5 g (soit 0,5 millimole/g) de l'ester résinique de BOC-Alanine. On gonfle la résine dans le chloroforme (qualité analytique) 71 20247 2125248 2 en la faisant basculer pendant 20 minutes puis en la lavant avec trois portions de 50 ml d'acide acétique glacial. La durée d'une telle opération de lavage est de 3 à 5 minutes. Le groupe protecteur t-butoxycarbonyle(BOC) est éliminé par de l'acide chlorhydrique 1 N dans l'acide acétique 5 anhydre,dans l'appareil à bascule pendant 40 minutes. La résine est lavée successivement trois fois avec chacun des produits suivants : acide acétique, éthanol absolu, N,N-diméthylformamide. Le chlorhydrate résultant de l'ester résinique de l'alanine est neutralisé avec une solution à 10% de triéthylamine dans le diméthylformamide dans l'appareil à bascule 10 pendant 10 minutes. Ensuite, on lave la résine avec trois portions de diméthylformamide, d1éthanol absolu, de chloroforme et de chlorure de méthylène, et on ajoute la solution de 8,5 mmoles (trois fois en excès) de BOC-proline dans 40 ml de chlorure de méthylène. On laisse l'appareil à bascule fonctionner pendant 20 minutes pour donner le temps au dérivé 15 d'aminoacide de pénétrer la résine. Puis on ajoute 8,5 mmoles de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DDC) dans 10 ml de chlorure de méthylène et on laisse la copulation s'effectuer pendant 12 heures dans l'appareil à bascule. Ensuite, on lave la résine avec trois portions de chacun des produits suivants : chlorure de méthylène, éthanol absolu, et acide acé-20 tique et on la prépare pour la prochaine étape d'élimination des groupes protecteurs conme décrit ci-dessus avec l'acide chlorhydrique dans l'acide acétique. Les étapes de lavage, de neutralisation et de copulation ont été effectuées par la méthode décrite en utilisant : B0G-His(N^m-Bzl)-0H, BOC-Val-OH, B0C-Tyr(0-Bzl)-0H et B0C-Arg(N02)-0H. 25 Une modification a été faite dans l'étape de copulation de B0C-His(N m-Bzl)-0H et de BOC-ArgOiO^-OH i étapes dans lesquelles on a utilisé comme solvant un mélange de 2:1 de diméthylformamide et de chlorure de méthylène. Le couplage de l'asparagine à l'heptapeptide résinique débarrassé; du groupe protecteur a été effectué en utilisant le BOC-asparagine-30 p-nitrophénylester (BOC-Asn-ONP) dans le diméthylformamide en mettant le mélange pendant 72 heures dans l'appareil à bascule. Après la dernière étape de copulation, on lave le peptide résinique avec le diméthylformamide, 1'éthanol, l'acide acétique et 1'éthanol puis on le sèche sous vide sur anhydride phosphorique. Le poids 35 de peptide résinique obtenu est de 7,3 g. 71 20247 2125248 3 B) H-Asn-Arg(NO„)-Val-Tyr(O-Bzl)-Val-His(Nlm-Bzl)-Pro-Ala-OH.2HBr 7,3 g du peptide résinique I préparé ci-dessus ont été mis en suspension dans 25 ml d'acide trifluoracétique anhydre, et on faisait passer au travers cette suspension à vitesse lente un courant d'acide bromhydrique anhydre. Après 20 minutes, on séparait la résine par filtration et la traitait une fois de plus par un mélange acide bromhydri-que-acide trifluoracétique pendant 40 minutes. On évaporait les filtrats à sec sous vide à 20°, précipitait les résidus huileux par l'éther absolu, et séchait le produit dans un dessiccateur sur potasse. Le rendement total obtenu était de 1980 mg (59,8%) du dibromhydrate d'oc-tapeptide protégé. C) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH L'octapeptide protégé (B) (1,0 g) fut dissous dans 20 ml d'un mélange 4:4:1 en volume d'acide acétique, de dioxanne, et d'eau et soumis à l'hydrogénolyse sur palladium/sulfate de baryum (catalyseur à 10% 0,5 g) pendant 48 h à la pression atmosphérique. Après ce temps, on ajoute une nouvelle portion (0,2 g) de catalyseur et on continue l'hydrogénation pendant 24 heures. La solution filtrée est diluée et lyophilisée. Le rendement est de 750 mg (point de fusion 150 à 165°C) (calculé pour le dibromhydrate : 15,32%, Br; trouvé 13,36% Br). On purifie le produit brut par chromatographie sur gel Sephadex G-25 dans l'acide acétique 0,2N. Les fractions contenant le peptide pur ont été réunies et lyophilisées. Le composé purifié ne contient que des traces d'halogène, CCM* : plaques de cellulose F de Merck; système solvant : n-butanol- acide acétique-eau (6:2:3 v/v), Rf 0,35; plaque de gel de silice F 254 de Merck avec le même système solvant: Rf 0,13 — —20 — —?n L «_/D = -59,4 (c= 0,2, AcOH IN) / a-'y]% ~61'1 (c = °'2 Âc0H 1N) Analyse des Amino-acides : Ala : 1,00 Arg 1,00 Asn 1,00 His 0,90 Pro 1,04 Tyr 0,75 Val 1,94 £ CCM = chromatographie en couches minces De façon analogue d'autres peptides selon l'invention ont été préparés en introduisant l'unité voulue au stade approprié. Les peptides ainsi préparés sont énumérés dans les tableaux ci-après. Dans les tableaux ci-après, selon la nomenclature IUPAC pour distinguer les formes L- et D- des amino-acides dans les polypeptides, les aminoacides L- ont été désignés par une première lettre capitale tandis que les amino-acides D- ont été désignés par une première lettre minuscule. Tableaul "-«4 Peptide Formule - poids moléculaire Pouvoir rota-toire spécifique (concentration et solvant) CCM sur plaques de gel de silice F-254 de Merck CCM sur plaques de cellulose F-254 de Merck Butanol-acide acétique-eau (6:2:3 v/v) détection à la ninhydrine H-asn-Arg-tyal-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH k L ^43^66^14^11'' p"'m' / H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Leu-OH 597'2-7 H-asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-leu-OH •^•^46^72^14^11' P*m* 997,2_/ Succinyl-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH L C43H64N12°125 p,m" 941'-^ H-Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH - C43H65N13°12' p,m* 956,l~ H-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH i-"C39H60N12°9' P-m- 841'°-7 l «_/"=-81,33 (c = 0,22, AcOH 1 N) — — L «_/ p -70,55 (c = 1, AcOH IN) = "87,32 (c = 0,2 AcOH, 1 N) L aJl3= "64>90 (c = 1, AcOH IN) Z~a_7p3= -101,62 (c = 0,3 AcOH IN) f*J^m -68,31 (c = 0,24 AcOH IN) 0,20 0,15 0,10 0,40 réactif de Pauly 0,03 0,02 0,50 0,65 0,60 0,70 réactif de Pauly 0,45 0,20 NO O K3 ■-4 4^ NJ K) en K) -Cs» 00 TABLEAU_II peptide (formule, poids moléculaire) Pouvoir rotatoire spécifique CCM sur plaques de gel .te silice F 254 de Merck , détection à la ninhydrine (Concentration, solvant) Butanol-acide acétique-eau (6:2:3 v/v) butanol-acide acé-tique-pyridine-eau (9:2:7:6 v/v) H-Sar-Arg-Val-Tyr -Val-His-Pro-Ala-OH ^C42H65N13°105 P'm' 912»11^ />_723 = -84,41 (c = 0,24, AcOH IN) 0,05 0,30 H-Ser-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH (C42H65N13Ou, p.m. 928,11) laJ\h = 69j00 (c = 0,2, AcOH IN) 0,02 4 38 H-Asn-Aïg-Val-Tyr-Val-His-Pro-leu-OH L«_/J9= 54,40 0,15 0,50 ^C46H72N14°11' p'm' 997>22^ (c = 0,25, AcOH IN) Succinamyl-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH (C43H65N13°U' P-m' 94°'12) ZV721 - 83,14 (c - 0,25, AcOH IN) o o 0,20 H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH (C42H64N14°U' P*m- 941'U) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ile-OH ^C46H72N14°11' P*m' 997,22^ r«_723= -54,90 (c = 1,0 AcOH IN) Ca_7p7 =-5 5,33 (c =0,3 AcOH IN) 0,10 0,09 0,25 0,40 TABLEAU_III Peptide (Formule, poids moléculaire) Pouvoir rotatoire spécifique (concentration, solvant) CCM sur gel de silice F-254 de Merck (Détection du réactif de Pauly) Butanol-acide acéti-que-eau , (6:2:3 v/v) Butanol-acide acéti-que-pyridine-eau (9:2:7:6 v/v) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH (C41H63N13°105 898>10) H-Pro-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Gly-OH R-Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-P-Ala-OH (C42H65B13°10' 912'10) H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-fi-Ala-OH (C43H66S14°ll- 955'10) ï-Gly-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH L -74,6 (c = 0,57 , AcOH IN) fcj?- "81,0 (c = 0,53; AcOH IN) £olJ11 = -67,0 (c » 0,51, AcOH 1 N) 2~c£_722= -59,0 (c = 0,52, AcOH IN) /~a_722= -53,7 (c=0,53, AcOH IN) LaJ^=, -80'3 (c=0,56, AcOH IN) 0,15 0,10 0,15 0,05 0,15 0,25 0,25 0,35 0,32 0,25 0,45 0,32 TABLEAU_III (suite) Peptide (Formule, poids moléculaire) Pouvoir rotatoire spécifique (concentration, solvant) CCM sur gel de silice F-254 de Merck (détection au réacti f de Pauly) Butanol-acide acé-tique-eau (6:2:3 v/v) Butanol-acide acé-tique-pyridine-eau (9:2:7:6 v/v) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH H-Asn-Arg-Val-Tyr.-Ile-His-Pro-Leu-OH ^47^74^14^11' 1°11,25) H-Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ala-OH ^C43H67N13°10' 926'14^ H-Asn-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ala-OH ^C44H68N14°11' 969'17^ H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala-OH H-Asn-Arg-Val-Tyr-Ala-His-Pro-Ala-OH / ot__/p7= -56,7 (c = 0,30, AcOH IN) L «_/21= "77,5 (c= 0,54, AcOH IN) La_7p1= -80,5 (c = 0,54; AcOH IN) / (c = 0,52; AcOH IN) / 48,4 (c = 0,25, AcOH IN) L aJl2:= "68>2 (c = 0,50, AcOH IN) 0,15 0,25 0,28 0,10 0,05 0,10 0,45 0,35 0,35 0,38 0,30 0,35 71 20247 2125248 8 REVENDICATIONS 10 1. Peptides de formule h2n-c=nh NH (ch2>3 R - NH - H,C CH 3 \ / 3 çw SH - CONH - CH -CONH - CH - CO - R2~ NH - CH - CON- !H - CO - R, dans laquelle R est un atome d'hydrogène, un groupe succinyle, L-aspartyle, sarcosyle, L-séryle, succinamyle, L-prolyle, glycyle, ou D- ou L-aspara-ginyle; R^ est un reste L-alanine, L- ou D-leucine, glycine, L-isoleucine 15 ou p-alanine, et R2 est un groupe L-valyle, L-isoleucyle ou L-alanyle. 2. Composé selon la revendication 1 dans lequel R est un atome d'hydrogène, R^ un reste L-alanine et R^ un groupe L-valyle. 3. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe L-asparaginyle, R^ est un reste L-alanine et R2 est un groupe 20 L-valyle. 4. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe D-asparaginyle, R^ est un reste L-alanine, et R2 est un groupe L-valyle. 5. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un 25 groupe L-asparaginyle, R^ est un reste L-leucine et R2 est un groupe L-valyle. 6. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe D-asparaginyle, est un reste L-leucine et R2 est un groupe L-valyle. 30 7. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe L-aspartyle, R^ un reste L-alanine; et R2 un groupe L-valyle. 8. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe succinyle, R^ un reste L-alanine, et R2 un groupe L-valyle. 9. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un 35 groupe sarcosyle, R^ un groupe L-alanine, et R£ un groupe L-valyle. 10. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe L-séryle, R^ un reste L-alanine et R2 un groupe L-valyle. 71 20247 2125248 9 11.Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe L-asparaginyle, R^ un reste D-leucine et R£ un groupe L-valyle. 12. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe succinamyle, R^ un reste L-alanine et R£ un groupe L-valyle. 5 13. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe L-asparaginyle, R^ est un reste glycine, et R^ un groupe L-valyle. 14. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe L-asparaginyle, R^ un reste L-isoleucine et R£ un groupe L-valyle. 15. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un 10 groupe L-prolyle, R^ un reste glycine et R^ un groupe L-valyle. 16. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe sarcosyle, R^ un reste p-alanine et R£ un groupe L-valyle. 17. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe glycyle, R^ un reste L-alanine et R^ un groupe L-valyle. 15 18. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un groupe sarcosyle, R^ un reste L-leucine et R^ un groupe L-isoleucyle. 19. Composé selon la revendication 1, dans lfequel R.est un groupe L-asparaginyle, R^ un reste L-leiïcine et R£ un groupe L-isoleucyle. 20. Composé selon la revendication 1, dans lequel R est un 20 groupe L-asparaginyle, R^ un reste L-alanine et R^ un groupe L-alanyle.