Brevet FR2125563A1 — publié le 19720929

3ja présente invention concerne un procédé pour la production de micro-organismes et les produits qui peuvent être ainsi obtenus. Les procédés classiques de fermentation sont mis en 5 oeuvre d'une manière discontinue ou continue. Dans le premier cas, on inocule les micro-organismes à un milieu de culture habituellement liquide dans un récipient à fermentation et on les laisse ensuite se développer. Quand le développement est complet, (c'est-à-dire quand un état stationnaire est atteint), 10 le milieu est enlevé du récipient et on extrait le produit. On répète ensuite le processus avec une quantité fraîche de milieu. Dans un fermentation continue, le milieu contenant le micro-organisme cultivé est évacué continuellement du récipient tandis qu'en même temps du milieu frais est ajouté dans le 15 récipient. Pour qu'on obtienne une fermentation aseptique satisfaisante, il est essentiel que le milieu de culture soit complètement exempt d'autres micro-organismes viables qui se multiplieraient aussi dans les conditions de la fermentation. 20 Jusqu'à présent, le procédé préféré de stérilisation du milieu a consisté à utiliser la chaleur, par exemple à utiliser de la vapeur d'eau surchauffée, pour la fermentation continue en particulier, qui exige de grandes quantités de milieu, l'utilisation de la stérilisation par la chaleur contribue notablement 25 aux dépenses d'installation et aux frais de mise en oeuvre du procédé. De plus, une fois le milieu stérilisé, des précautions spéciales doivent être prises pour éviter une contamination avant sont introduction dans le récipient à fermentation. Ce problème se pose spécialement dans les procédés continus et 30 semi-continus qui exigent l'entretien de grandes quantités de milieu stérile. En conséquence, la présente invention a pour but de fournir un procédé pour la production de micro-organismes dans lequel on utilise un autre procédé de stérilisation du milieu» 35 Dans le procédé de production de micro-organismes selon l'invention, on inocule une culture des micro-organismes dans un milieu de culture liquide stérile contenant des sources 72 05376 2 2125563 assimilables d'azote et de sels minéraux essentiels, on laisse se développer le microorganisme en présence d'une source de carbone assimilable et, si nécessaire, d'une source d'oxygène gazeux et on ajoute du milieu de culture stérile frais au mi-5 lieu inoculé durant le développement du micro-organisme, le milieu de culture frais contenant une concentration stérilisante d'un microbiocide qui, aux concentrations plus basses produites par le mélange du milieu frais avec le milieu inoculé, est métabolisable par le micro-organisme en cours de 10 développement. On connaît de nombreux micro-organismes qui peuvent utiliser un composé organique contenant un seul atome de carbone dans sa molécule comme seule source de carbone assimilable. La biomasse riche en protéines pouvant être obtenue par 15 la culture de ces micro-organismes a été considérée comme une matière alimentaire possible ou un supplément à la nourriture pour l'homme et les animaux. Des exemples de tels micro-organismes sont des micro-organismes consommant du méthane comme ceux de l'espèce Methyloccus et ceux de l'espèce Methanomonas 20 et des micro-organismes consommant du méthanol comme Pseudomo-nas extorquans NCIB N° 9399» Protaminobacter ruber NGIB lî° 2879 et ceux de l'espèce Hyphomicrobium. le procédé de la présente invention est particulièrement utilisable pour la culture de ces types de micro-orga-25 nismes, car on a trouvé qu'ils sont capables d'assimiler de basses concentrations du composé fortement bactéricide qu'est le formaldéhyde en présence des supports plus usuels méthane ou méthanol. Ainsi, le milieu frais qui doit être introduit pour une fermentation continue ou semi-continue peut contenir 30 une concentration de formaldéhyde, commodément de 0,01 à 10 % en poids/volume, qui est toxique pour les micro-organismes. De cette manière, le milieu est maintenu dans un état stérile jusqu'au moment même où il est ajouté au milieu contenant le micro-organisme se développant activement. Quand le milieu 35 contenant le formaldéhyde est introduit, la concentration du formaldéhyde est réduite par dilution à une concentration non toxique et comme à une telle concentration le formaldéhyde est 72 05376 3 2125563 rapidement métabolisé par le micro-organisme, un accroissement de la concentration du formaldéhyde durant l'addition continue est empêché. On a trouvé que le micro-organisme Ps. extorquans HCIB Iï° 9399 peut se développer en présence de jusqu'à environ 5 0,5 m de formaldéhyde M/1 dans le milieu de culture. Dans la pratique, on doit prendre les précautions suivantes pour éviter la présence de concentrations toxiques de formaldéhyde dans le milieu inoculé : (a) au début de la fermetation, la stérilisation du 10 volume initial de milieu doit de préférence ne pas être effee- tuéepar utilisation de formaldéhyde, parce que ceci exigerait une concentration du produit chimique qui serait toxique aussi pour le micro-organisme à cultiver ; (b) l'addition du milieu contenant le formaldéhyde 15 doit être suffisamment lente pour éviter l'accumulation dans la culture ; (c) l'alimentation en oxygène ne doit pas devenir un facteur limitatif pour le développement, car s'il en était ainsi le micro-organisme pourrait ne pas être capable d'effec- 20 tuer une utilisation maximale du formaldéhyde, qui alors s'accumulerait finalement à des concentrations toxiques. Quand on observe les précautions ci-dessus, on peut effectuer des fermentations successives en présence de formaldéhyde avec les avantages suivants : 25 (a) la stérilisation à la vapeur d'eau du milieu est évitée dans une large mesure, sauf pour le volume relativement petit de milieu au démarrage ; (b) un "développement vers l'arrière" du micro-organisme le long de la canalisation d'alimentation en milieu est 30 empêché ; (c) la contamination du réservoir à milieu et des canalisations d'alimentation est empêchée ; (.d) on peut effectuer des additions au milieu sans utiliser des techniques stériles de transfert. 35 Bien que l'invention ait été décrite principalement par référence à l'utilisation de formaldéhyde dans la production de micro-organismes utilisant , il sera évident pour 72 05376 4 2125563 l'homme de l'art que le procédé de l'invention est applicable aussi à la production de micro-organismes capables d'assimiler d'autres types de composés bactéricides, par exemple des phénols, des alcools, d'autres aldéhydes, des acides carboxyliques 5 et des antibiotiques» l'invention est encore illustrée par les exemples suivants, dans lesquels le milieu aqueux de culture utilisé est désigné par et a la composition suivante : Na2HP0412H20, 3,0 g/l ; KH2PC>4, 3,0 g/1 ; (NH4)2S04, 3,0 g/1 ; 10 MgS04.7H20, 0,1 g/l ; en même temps que 2 cm^/1 d'une solution concentrée normale contenant des oligo-éléments. •prsrRMT>Ti"R 1 - Propriétés bactéricides du formaldéhyde les propriétés bactéricides du formaldéhyde sur des bactéries utilisant le méthanol sont étudiées comme suit : •X 15 Dans 22 ballons à secousses de 500 cm , on introduit des portions de 50 cm de milieu D2 et on ajoute les quantités de méthanol, de formaldéhyde et/ou de glucose indiquées dans le tableau I. On prépare un inoculum riche en organismes utilisant le méthanol en prenant 10 g. de terre provenant d'une 20 parcelle qui a été préalablement traitée d'une manière régulière avec du méthanol pendant une période de 3 mois et 10 g de terre provenant d'une parcelle non traitée et en mettant en •z suspension les échantillons dans 50 cm d'une culture de Pseu-domonas extorquans NCIB 9399 effectuée avec du méthanol et 25 ayant une concentration en poids à sec de cellules de 3 g/lo 3 On utilise 0,1 cm de cette suspension pour inoculer chaque ballon à secousses. Gomme témoin, un ballon contenant 1,0 ^ de méthanol et pas du tout de formaldéhyde est chauffé dans un autoclave p 30 avec de la vapeur d'eau sous 1,05 kg/cm pendant 15 minutes. Tous les ballons sont ensuite mis en incubation à 30°C dans un appareil à secousses, les ballons sont examinés en ce qui concerne le développement des micro-organismes après 3 à 5 jours et les résultats sont présentés dans le tableau I 72 05376 5 2125563 Pour vérifier que l'action du formaldéhyde est vraiment bactéricide et non pas bactériostatique, une quantité 3 de 0,1 cm de la culture dans chaque ballon ne présentant pas de développement après une incubation de 4 jours est transfé-5 rée dans 50 cm de milieu D9, contenant 1 56 de méthanol dans des ballons à secousses de 500 cm que l'on met en incubation pendant encore 5 jours. Aucun développement ne se produit, sauf dans le cas de 1*échantillon provenant du ballon 22 qui ne contenait pas de glucose, de méthanol ni de formaldéhyde. Ces 10 ballons sont ensuite inoculés avec une culture de Ps. extor-quans ITCIB H° 9399 et mis en incubation. Dans chaque cas, un développement se produit, ce qui montre que la teneur résiduelle en formaldéhyde est insuffisante pour empêcher le développement. 15 (Voir tableau I page 8)„ EXEMPLE II Effet du formaldéhyde sur une culture continue de Ps Extorquans Dans un récipient à fermentation d'une capacité de 7 20 litres équipé d'un agitateur, d'un dispositif de barbotage et de dispositifs de réglage de la température et du pH, on introduit 4 litres de milieu D2 contenant 0,58 l (en poids/volume) de méthanol. On inocule ce milieu avec une culture de 4S heures en ballon à secousses de Ps. extorquans ÎTCIB ïï° 9399 qu'on 25 laisse ensuite se développer. la température dans le récipient est maintenue à 30°C et le pH à 6,4 et la culture est énergi-quement agitée et aérée. On suit le cours de la fermentation par analyse régulière d'échantillons de la culture pour déterminer en concentration en poids à sec de cellules dans le mi-30 lieu, les résultats sont reportés sur la figure 1. Quand la culture atteint l'état stationnaire (c'est-à-dire quand sa densité optique est inchangée pendant une période de 4 heures), on commence une culture continue en introduisant du milieu D0 contenant C,58 $ de méthanol à raison ~Z 35 de 25C cm /min dans le récipient (point A). Le volume total de milieu «dans le récipient est maintenu constant à 4 litres par refoulement du milieu par une sortie à une hauteur déterminée au-dessus du fond du récipient. 72 05376 6 2125563 Après 4 jours de fermentation continue, on remplace le milieu par du D2 contenant 0,58 $> en poids/volume de méthanol et 0,25 $ en poids/volume de formaldéhyde (point B). On continue la fermentation pendant encore 4 jours, après quoi on 5 remplace le milieu par du D2 contenant 0,75 $> de formaldéhyde et pas de méthanol (point C). On voit clairement d'après la figure 1 que quand 0,25 i° en poids/volume de formaldéhyde est inclus dans le milieu, la concentration en poids à sec de cellules monte de 10 1,6 à 2,16 g/l, ce qui montre que non seulement la culture subsiste en présence d'une faible concentration de formaldéhyde, mais en fait elle est capable d'utiliser le formaldéhyde comme support, maintenant ainsi la concentration du formaldéhyde dans le récipient à un niveau non toxique. Toutefois, quand il n'y a 15 pas de méthanol présent dans le milieu, il se produit un épuisement par lavage de la culture, ce qui montre que les micro-organismes ne peuvent pas se développer sur le formaldéhyde seulement. EXEMPLE III 20 Culture continue typique de Ps. extorquans en utilisant une stérilisation au formaldéhyde 4 litres de milieu D2 dans un récipient à fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple précédent sont stérilisés à 120°C pendant 20 minutes. Après refroidissement 25 du milieu, on ajoute du méthanol stérile de manière à obtenir une concentration de 1,0 $ (en poids/volume). On inocule au ■3 milieu 20 cnr d'une culture de 48 heures de Ps.extorquans ïfCIB ÏT° 9399 et on le met en incubation jusqu'à ce qu'un état sta-tionnaire soit atteint (32 heures). le récipient est ensuite rz 30 alimenté continuellement à raison de 50 cnr/h en milieu D2 contenant 1,0 $ en poids/volume de méthanol et 0,25 $ en poids/ volume de formaldéhyde. Durant toute la fermentation, le volume de la culture est maintenu à 4 litres, la température à 30°C et le pH à 6,4 35 par addition d'une solution 1 M d'hydroxyde de sodium, le milieu est agité à 1 300 tours par minute et on introduit de l'air à raison de 395 litres par minute. 72 05376 7 2125563 Un régime permanent correspondant à une concentration en poids à sec de cellules de 2,4 g/l est atteint et maintenu pendant plus de 1 000 heures. Pendant ce temps, aucune contamination de la culture ne se produit, ce qui montre que le 5 formaldéhyde peut être utilisé pour maintenir le milieu dans un état stérile pendant des périodes importantes. EXEMPLE IV Culture continue de micro-organismes utilisant le méthane en utilisant une stérilisation au formal-10 déhyde Une culture continue d'un micro-organisme utilisant le méthane (Methanomonas sp. ) est établie dans un récipient à fermentation de 2 litres contenant du milieu D2 dans les conditions suivantes : 15 température 34°C vitesse d'agitation 1200 tours par minute pH 6,7 alimentation en gaz : 2 1/min de mélange 1:1 méthane/ air -x 20 alimentation en milieu D2 : 30 cm /h. On suit le cours de la culture par des mesures régulières de la densité optique et ces résultats sont reportés sur la figure 2. Après 4 jours de culture continue, on remplace le 25 milieu par du I>2 contenant 0,1 $ en poids/volume de formaldéhyde (point D) et après encore 2 jours 1/2, le débit d'introduction du milieu est porté à 46 cm^/h (point l). Il est évident d'après la figure 2 que l'addition de formaldéhyde au milieu introduit dans une.culture- continue de 30 micro-organismes consommant du méthane n'a pas d'influence défavorable sur la culture et que ceci représente un procédé commode de stérilisation du milieu dans de telles cultures. 72 05376 8 2125563 TABLEAU I Ballon Contenu du ballon, 50 cm^ de I>2 + Développement des organismes micro- n° méthanol formaldéhyde f> glucose JOURS i> •$> 3 4 5 1 0,5 mm _ ++ +++ +++ 2 1 ,0 — - +++ ++++ ++++ 3 2,5 - - + ++ +++ 4 5,0 - - — — 5 0,5 0,1 - — — — 6 0,5 0,5 - — — — 7 0,5 1,0 - - — — 8 0,5 2,5 - — — — 9 0,5 5,0 - — — — 10 1,0 0,1 - - ■ — — 11 1,0 0,5 - - — — 12 1,0 1,0 - - - — 13 1,0 2,5 - - - — 14 1,0 5,0 - - ■ - — 15 - - 1,0 +++ ++++ ++++■+ 16 - 0,1 1,0 - - - 17 - 0,5 1,0 - - — 18 - 1,0 1,0 - - - 19 - 2,5 1,0 - - - 20 - 5,0 1,0 • - — 21 (témoin) 1,0 (stérilisé par la chaleur) — - - 22 (témoin) - - - - - 72 05376 9 2125563 5 10 15 2. 3. 20 4. 25 5. 6. 30 7. 8. 35 9. REVENDICATIONS Un procédé pour la production de micro-organismes, selon lequel on inocule une culture des micro-organismes à un milieu de culture liquide stérile contenant des sources assimilables d'azote et de sels minéraux essentiels, on laisse se développer 2e micro-organisme en présence d'une source de carbone assimilable et, si nécessaire, d'une source droxygène gazeux et on ajoute du milieu de culture stérile frais au milieu inoculé durant le développement du micro-organisme, le milieu de culture frais contenant une concentration stérilisante d'un microbiocide qui» aux concentrations plus basses produites par le mélange du milieu frais avec le milieu inoculé, est matabolisable par le micro-organisme en cours de développement. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est un micro-organisme qui peut utiliser un composé organique contenant un seul atome de carbone dans sa molécule comme seule source de carbone. Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est un micro-organisme consommant du méthane ou du méthanol. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le micro-organisme est Methanomonas st>. ou Pseudomonas extorquans ETCIB N° 9399. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4» caractérisé en ce que le microbiocide est du formaldéhyde. Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration du formaldéhyde dans le milieu de culture frais est comprise entre 0,01 et 10 ^ en poids/volume. Un procédé selon la revendication caractérisé en ce que la concentration du formaldéhyde dans le milieu de culture frais est comprise entre 0,1 et 0,25 fa en poids/volume. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est conforme à l'un des exemples II à IV. Les micro-organismes produits par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8.