Brevet FR2128121A1 — publié le 19721020

La présente invention concerne un procédé de fermentation d'un antibiotique fongicide de la série polyénique, dit "lévorine", ce procédé faisant partie du cycle de préparation dudit antibiotique. La lévorine se classe parmi les antibiotique macrolides heptaénique et trouve des applications dans la pratique médicale pour le traitement des candidoses du tube digestif, de la on ose des viscères, et localement pour le traitement des candidoses de la peau, des muqueuses buccales et des organes genitaux. On tonnait déjà des procédé de fermentation de la lévorine, qui consistent à faire incuber une monoculture de l'actinomycète "Actinomyces levoris" synthétisant la lévorine sur des milieux nutritifs variés contenant, sous forme d'une solution ou suspension aqueuse, différents produits minéraux et organiques indispensables à la propagation de la culture productrice et à la synthèse de l'antibiotique, tels que le glucose, la farine de mais, le chlorure de sodium et le carbonate de calcium. Le milieu nutritif est soumis a la stérilisation, après quoi on l'ensemence par une suspension de la culture productrice de l'antibiotique, et on conduit la fermentation jusqu'à ce que la concentration d'antibiotique atteigne son maximum. L'activité de la liqueur de culture obtenue est comprise entre 15.000 et 20.000 unités par ml. L'inconvénient des procédés connus réside dans la faible activité de ia liqueur de culture obtenue. La présente invention se propose de supprimer cet inconvénient. Conformément a cet objectif, l'invention vise, en enrichissant le milieu nutritif au cours de la fermentation de l'actinomycète, à augumenter l'activité de la liqueur de culture obtenue. Le problème ainsi se est résolu en ce que dans le procédé de fermentation de l'antibiotique fongicide de la série polyénique, dit "lévorine", par culture de l'"Actinomyces lévoris" sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'ayote et des sels minéraux jusqu'à l'obtention d'une liqueur de culture à concentration d'antibiotique maximale, on fait incuber, conformément à l'invention, une culture d'"Acticomyces lévoris" sur un milieu nutritif, en association avec les levures ou les champignons blasto- porés apparentés du genre "Candida", "Saccharomyces", Monilia. Pour accroître l'activité de la liqueur de culture obtenue, il est avantageux d1effectuer la culture sur un milieu nutritif de la composition suivante (% en masse) : farine de mals - 2, farine de soja, hydrol (en calculant en substances réductrices) - 1, chlorure de sodium 0,5, carbonate de calcium - 0,1, le reste étant de l'eau. On inocule la culture des levures ou des champignons apparentés dans le milieu nutritif à raison de 1 à 4% en volume. Le processus de fermentation peut être réalisé par culture des levures ou des champignons apparentés sur le milieu nutritif pendant 24 à 48 heures, en inoculant ultérieurement une culture d'Actino- myces levoris" ou par culture simultanée sur le milieu nutritif d'une culture de levure ou de champignons apparentés et d ' une culture d'"Actinomyces levoris". Le procédé objet de l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante. Afin de préparer la semence, on fait incuber une culture d'"Actynomyces levoris" sur un milieu gélosé de la composition suivante : phosphate dipotossique - ig, nitrate de sodium - 7 g, chlorure de potassium - 0,5 g, sulfate de magnésium - 0,5 g, sulfate de fer - 0,015 g, glucose - 20 g, gélose - 25 g, pour 1 litre d'eau, le pli étant compris entre 7,0 et 7,2. On conduit 1a culture pendant 10 jours à une température de 27 à 2800. Ensuite, la semence destinée à la préparation de l'inoculum est introduite dans des flacons de 750 ni de capacité placés sur une secoueuse animée d'une rotation à une vitesse de 220 tr/mn, lesdits flacons contenant un milieu nutritif de la composition suivante farine de soja - 10 g, glucose - 10 g, chlorure de sodium - 5 g, carbonate de calcium - 1 g, pour 1 litre d'eau. La culture dans les flacons s'effectue pendant 48 heures à une température de 27 a 28 C. Pour la culture de l'actinomycète conjointement avec les levures ou les champignons apparentés, cn utIlise un milieu nutritif contenant des sources d'azote et de carbone et des sels minéraux. Il est avantageux d'utiliser un milieu nutritif de la composition suivante : farine de mais - 20 g, farine de soja - 10 g, hydrol - 1C g, chlorure de sodium - 5 g, carbonate de calcium - 5 g, pour 1 litre d'eau. On place le milieu dans les flacons de 750 ml placés sur la secoueuse rotative, à raison de 50 ml dans chaque flacon, et on stérilise pendant 30 mn à la température de 1200C. Pour la culture combinée on utilise, entre autres, les espèces suivantes de levure et de champignons apparentés : "Candida albicans", "Candida Krusei", Candida tropicalis", "Candida pseudotropicalis", Saccharomyces cerevisiae", "Monilia nivea", "Candida parapsilasis', etc... Les levures et les champignons apparentés sont préalablement cultivés sur un moût gélosé pendant 24 heures à la température de 370 C. En cas de culture combinée, on introduit dans les flacons contenant le milieu nutritif une suspension de levures à raison de 1 à 4% en volume. On place les flacons sur la secoueuse et on fait incuber la culture pendant 24 à 48 heures à une température de 27 à 280C. On introduit ensuite dans les flacons, à raison de 10% en volume, la semence d'actinomycète obtenue, ainsi qu'il a été décrit plus haut. On conduit la fermentation pendant 72 à 120 heures à une température de 270 à 2800. Activité de la liqueur de culture obtenue atteint 65.000 unités par ml. La culture combinée des levures et des champignons apparentés avec l'actinomycète peut etre également effectuée en inoculant simultanément dans le milieu nutritif la culture de levures et celle de l'"Actinomyces levoris". A cette fin, dans des flacons contenant un milieu à base de farine de soja, de farine de maïs et d'hydrol, de la composition susmentionnée, on inocule une suspension de levures à raison de 2 à 4% en volume. On place les flacons sur une secoueuse et on fait incuber les levures pendant 24 à 48 heures. On prépare parallelement un inoculum d'"Actinomyces levoris" âgé de 48 heures. Ensuite, on introduit simultanément dans le milieu nutritif l'ino- culum de levures et celui de l'actinomycète et on conduit la fermentation pendant 72 à 120 heures à une température de 27 à 280C. L'activité de la liqueur de culture obtenue atteint 55.000 unités par ml. Le procédé objet de l'invention permet d'enrichir le milieu nutritif en protéines, hydrates de carbone, vitamines et autres facteurs de croissance, par incorporation au milieu des levures et des champignons apparentés, et, de ce fait, d'élever le niveau de concentration des substances antibiotiques, laquelle augmente de 50% comparativement aux procédés connus. La mise en oeuvre d'un milieu nutritif de composition perfectionnée dans laquelle entrent la farine de soja et l'hydrol, permet d'augmenter la teneur de la liqueur de culture en lévorine de 2,8 fois en comparaison des résultats obtenus avec les milieux nutritifs connus. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs suivants de mise en oeuvre du procédé de fermentation de l'antibiotique fongicide de la série polyénique, dit lévorine. Exemple 1. Dans des flacons de 750 ml de capacité, placés sur une secoueuse animée d'une rotation à une vitesse de 220 tr/mn, lesdits flacons contenant chacun 50 ml d'un milieu ayant la composition suivante ; farine de maïs - 20 g, farine de soja - 10 g, hydrol 10 g, chlorure de sodium - 5 g, carbonate de calcium - 1 g, pour 1 litre d'eau, on introduit 2 ml d'une suspension de culture de "Saccharomyces cerevisiae" titrant 1 milliard de cellules par ml. Pour préparer la suspens ion avec une telle dilution de la culture indiquée, on fait incuber cette dernière sur un moût gélosé pendant 24 heures à la température de 370C, puis on l'enlève au moyen d'eau physiologique. Après l'introduction de ladite suspension, on conduit la culture pendant 24 heures à la température de 270 C. Dans les flacons contenant la végétation de levures ainsi obtenue on inocule stérilement 5 ml d'une semence âgée de deux jours d"'Actinomyces levoris" N028, préparée par culture pendant 48 heures à une température de 27 à 280G sur un milieu nutritif de la composition suivante : farine de soja - 10 g, glucose - 10 g, chlorure de sodium - 5 g, carbonate de calcium - 1 g, pour 1 litre d'eau. Cela fait, on conduit la fermentation pendant 6 heures à la température de 2700. activité de la liqueur de culture, résultant de la culture combinée des levures t'Saccharomyces cerevisiae" et de l'actinomycète, est égale à 62.300 unités/ml. Exemple 2. Dans des flacons de 750 ml de capacité placés sur une secoueuse animée d'une rotation à une vitesse de 200 tr/mn, lesdits flacons contenant chacun 50 ml d'un milieu nutritif de la composition suivante ; farine de mais - 20 g, farine de soja - 10 g, hydrol - 10 g, chlorure de sodium - 5 g, carbonate de calcium - 1 g, pour 1 litre d'eau, on introduit 1 ml d'une suspension de culture de "Candida tropicalis" titrant 1 milliard de cellules microbiennes par ml. Pour préparer la suspension av.ec une telle dilution de la culture indiquée, on fait incuber cette dernière sur un moût gélosé pendant 24 heures à la température de 37 C, puis on I'enlève au moyen d'eau physiologique. Après l'introduction de ladite suspension, on conduit la culture pendant 48 heures à la température de 270C. Dans les flacons contenant la végétation de levures ainsi obtenue, on inocule stérilement 5 ml d'une semence, âgée de deux jours, d"tActinomyces levoris" N028, préparée comme dans l'exemple 1. Cela fait, on conduit la fermentation pendant 120 heures à une température de 27 B280C. La liqueur de culture résultant de la culture combinée des levures "Candida tropicalis" et de l'actinomycète présente une activité de 64.100 unités/ml. Exemple 3. Dans des flacons de 750 ml de capacité placés sur une secoueuse animée d'une rotation à une vitesse de 220 tr/mn, lesdits flacons contenant chacun 50 ml d'un milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, on introduit 2 ml d'une suspension de la culture "Monilia nivea" titrant 1 milliard de cellules microbiennes par ml. Pour préparer la suspension avec une telle dilution de la culture indiquée, on fait incuber cette dernière sur un moût gélosé pendant 24 heures à la température de 37 C, puis on l'enlève au moyen d'eau physizlogique, Après l'introduction de ladite suspension, on conduit la culture pendant 24 heures à la température de 270C. Ensuite, on inocule dans les flacons contenant la végétation de levures ainsi obtenue 5 ml d'une semence, âgée de deux jours, d"'Actinomyces levoris" N028, préparée comme dans l'exemple 1. On conduit la fermentation pendant 72 heures à une température de 27 à 280C. L'activité de la liqueur de culture résultant de la culture combinée de "Monilia nivea" et de l'actinomycète est égale à 61.800 unités/ml. Exemple 4. Dans des flacons de 750 ml de capacité placés sur une secoueuse animée d'une rotation à une vitesse de 220 tr/mn, lesdits flacons contenant chacun 50 ml d'un milieu nutritif de la composition suivante : glucose - 20 g, farine de soja - 20 g, carbonate de calcium - 1 g, pour 1 litre d'eau, le pH étant compris entre 6,8 et 7,2, on introduit 4 ml d'une suspension de culture de "Candida tropicalis" titrant 1 milliard de cellules microbiennes par ml. Pour préparer la suspension avec une telle dilution de la culture indiquée, on fait incuber cette dernière sur un moût gélosé pendant 24 heures à la température de 370G, puis on l'enlève au moyen d'eau physiologique. Après l'introduction de ladite suspension, on conduit la culture pendant 48 heures à la température de 270C.Dans les flacons contenant la végétation de levures ainsi obtenue on inocule stérilement 5 ml d'une semence, âgée de deux jours, d"'Actinomye.es levoris" N028, préparée comme dans l'exemple 1. Cela fait, on conduit la fermentation pendant 120 heures à une température de 27 à 280C. La liqueur de culture finalement obtenue présente une activité de 31.700 unités/ml. Exemple 5. Dans des flacons de 750 ml de capacité placés sur une secoueuse animée d'une rotation une vitesse de 220 tr/mn, lesdits flacons contenant chacun 50 ml d'un milieu nutritif de la composition suivante ; farine de malus - 20 g, farine de soja - 10 g, hydrol - 10 g, chlorure de sodium - 5 g, carbonate de calcium - 1 g, pour 1 litre d'eau, on introduit 2 ml d'une suspension de culture de "Candida tropicalis"titrant 1 milliard de cellules microbiennes par ml. La suspension avec une telle dilution de la culture indiquée est obtenue en faisant incuber cette dernière sur un moût gélosé pendant 24 heures à la température de 370G et en l'enlevant ultérieurement au moyen d'eau physiologique. La culture introduite dans les flacons est conduite pendant 48 heures à la température de 270C. On inocule ensuite 5 ml de la culture de levures "Candida tropicalis" et 5 ml d'une semence d'"Actinomyces levoris" N 28 préparée comme dans l'exemple 1; dans des flacons de 750 ml de capacité placés sur une secoueuse et contenant chacun 50 ml du milieu nutritif susmentionné à base de farine de soja, de farine de maïs et d'hydrol, et on conduit la fermentation pendant 120 heures à la température de 270C. L'activité de la liqueur de culture résultant de la culture combinée des levures "Candida tropicalis" et de l'actinomycète est égale à 53.700 unités/ml. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. - R E V E N D I C A T I O N S 1.-Procédé de fermentation d'un antibiotique fongicide de la série polyénique, dit "lévorine", par culture de l'"Actinomyces levoris" sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux jusqu'à l'obtention d'une liqueur de culture à concentration maximale d'antibiotique, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on fait incuber la culture de "Actinomyces levoris" sur le milieu nutritif indiqué conjointement avec des levures ou des champignons apparentés du-genre "Candida", "Saccharomyces", "Monilia" 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est effectuée sur un milieu nutritif de la composition suivante (% en masse) : farine de maïs - 2, farine de soja - 1, hydrol (en calculant en substances réductrices) - 1, chlorure de sodium - 0,5, carbonate de calcium -- 0,1, le reste étant de l'eau. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que- ladite culture de levures ou de champignons apparentés est introduite dans le milieu nutritif à raison de 1 à 4% en volume. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites levures ou lesdits champignons apparentés sont cultivés pendant 24 à 48 heures sur ledit milieu nutritif qui est ensuite ensemencé additionnellement par une culture de "Actinomyces levons 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la culture de "Actinomyces levoris" et celle des levures ou des champignons apparentés sont conduites simultanément. 6. - Les antibiotiques fongicides utiles notamment pour le traitement des candidoses, caractérisés en ce qu'il sont obtenus par un procédé suivant l'une des revendications 1 à 5.