Brevet FR2135301A1 — publié le 19721215

L'invention, due à HOLZ Gunter, GRAMSALL Johanna, NELBOECK-HOCHSTETTER Michael, BERGMEYER Hans Ulrich..., a pour objet un procédé de préparation de l'enzyme créatinine-amidohydrolase et, le cas échéant, de l'enzyme créâtine-amidinohydrolase à partir de micro-organismes. Au laboratoire d'analyses médicales, en particulier pour l'examen du fonctionnement du rein, le dosage des produits intermédiaires et finals du métabolisme protidique joue un rôle important. La créâtinine et la créatine se trouvent, entre autres, parmi les produits concernés. On a déjà décrit à plusieurs reprises le dosage de la créatinine. La plupart des méthodes connues sont basées sur la réaction non-enzymatique de Jaffé qui présente toutefois l'inconvénient d'être non-spécifique. En outre, on a déjà décrit une méthode de dosage microbiologique spécifique à l'aide de bactéries isolées dans laquelle on utilise pour le dosage de la créatinine une suspension de cellules lavées, l'effet enzymatique étant déterminé en fonction de la formation d'urée et d'ammoniaque. Il n'a toutefois pas été possible d'obtenir en ce faisant des extraits d'enzymes solubles, capables d'assurer la dégradation de la créatinine. Or, la condition préalable à la mise au point d'une méthode de dosage spécifique de la créatinine à l'aide d'enzymes était de trouver des enzymes solubles, capables de catalyser de façon spécifique et mesurable des réactions de la créatinine. Roche, Lacombe et Girard (BBA j5 , 210, 1950) ont caractérisé dans deux espèces de Pseudomonas, en tant qu'enzymes spécifiques, une créatinase, une créâtininase et une glucocyaminase qui libèrent de l'urée à partir de leurs substrats du groupe des guanidines. Par ailleurs, Akamatsu et ses collaborateurs ont isolé (Enzymologia, lji, pages 122, 158 et 173 ; 1951) dans des bactéries du sol une enzyme nommée créatine-mutase qui aurait pour effet d'agir sur l'établissement de l'équilibre entre la créatinine et la créatine. La dégradation de la créatinine s'effectuerait alors de la façon suivante : créatinine créatine * urée et sarcosine—^ glycine—♦NH3. Dans la demande déposée ce jour au nom de la demanderesse sous le titre "Procédé de préparation et de purification de créatinine- amidohydrolase", on décrit un procédé de séparation et de préparation de deux enzymes, découvertes et isolées pour la première fois et qui participent à ce mécanisme de dégradation d'une -Jp " 72 15956 2 2135301 10 15 20 25 30 35 40 façon décisive. On isole ces enzymes à partir de micro-organismes. La demanderesse s'est proposée de trouver des microorganismes particulièrement appropriés à servir de matière première pour la préparation de nouvelles enzymes créatinine-amidohydrolase et créatine-amidinohydrolase décrites dans la demande de brevet identifiée ci-dessus. Il a déjà été essayé â plusieurs reprises de dégrader la créatinine par voie enzymatique à l'aide de micro-organismes. Il n'a toutefois pas été possible de préparer des extraits enzymati-ques hydrosolubles capables de dégrader la créatinine dans une mesure suffisante. De tels essais ont été effectués par exemple avec Corynebacterium, avec Pseudomonas aeruginosa, avec Pseudomo-nas ovalis, avec Pseudomonas eisenbergii et avec les différents types de Clostridium. Le but de 1'invention est donc de trouver et de cultiver des micro-organismes dont le milieu de désagrégation comporte une fraction hydrosoluble appropriée à la préparation des deux enzymes nouvelles susindiquées. Or, la demanderesse a trouvé qu'il était possible de préparer de la créatinine-amidohydrolase et de la créatine-amydino-hydrolase en utilisant en tant que micro-organismes, ceux connus sous les appellations Alcaligenes spec. WS 51400 et Pénicillium WS 90001. En ce qui concerne tout d'abord Alcaligenes spec. WS 51400, il se présente sous la forme de bâtonnets courts gram-négatifs strictement oxydatifs et flagellés à la façon des péritriches. Les germes sont faiblement oxydase-positifs, ils alcalinisent le lait de tournesol et sont capables de dénitrifier . Ce micro-organisme présente en outre les caractéristiques suivantes : croissance à 4#C - m-Inosite croissance à 41*C - Glycolates liquéfaction de gélatine - Pélargonates hydrolyse de Tributyrine - Adipates réaction avec le jaune d'oeuf- p-Hydroxybenzoates + pigmentation - acétate de phényle pouvoir de faire fermenter Valine Arabinose + Arginine (+) Glucose + S-Aminovalérates Maltose (+) Tryptophane Cellobiose (+) Bétaïne + i 72 15956 3 2135301 Tréhalose + Hippurates - 2-cëtogluconate + Acëtamide - Mannite (+) Benzylamine Selon l'état actuel des connaissances, ces germes appar-5 tiennent à la famille des achromobactériaceae et, très probablement, à l'espèce Alcaligenes. Pour ce qui est maintenant du WS 90001, il s'agit d'un champignon du genre Pénicillium. Pour enrichir les micro-organismes mis en oeuvre conformé-10 ment à l'invention d'une façon adaptative en les enzymes désirées, on les cultive, de préférence, en ajoutant de la créatinine au milieu de culture. On cultive les deux micro-organismes avantageusement dans un milieu de culture contenant du glucose ou de la glycérine comme source de carbone, de la créatinine ainsi que des 15 sels et des vitamines, les quantités et la composition étant celles connues en microbiologie. Un bouillon de culture particulièrement approprié présente la composition suivante : - Glucose ou glycérine 0,5% en poids - Créatinine 0,5% en poids 20 ~ Sulfate d'ammonium 0,08% en poids - Sulfathydrate de magnésium 0,02% en poids - Traces de sulfate de fer, chlorure de calcium et sulfate de manganèse 25 - Extrait de levure 0,05% en poids - Acide nicotinique - p-aminobenzoate de thiamine - Vitamine Bg par mg - Biotine 0,1 mg 30 Ce milieu est dissous dans un tampon de phosphate de potas sium 0,1 molaire de pH 6 (pour le champignon) ou de pH 7 (pour 1'alcaligenes). On conserve la souche des micro-organismes selon l'invention d'une manière connue dans des tubes inclinés à agar sur un 35 bouillon de culture approprié, de préférence un bouillon de la composition susindiquée, additionné de 2% d'agar et, en plus, de 5 ml/litre d'une solution de bleu de bromothimol à 0,05%. Sous les conditions de croissance préférées, cet indicateur vire, en raison de la dégradation créatinine-créatine, après 4-6 jours, dans le 40 cas du champignon ou après 2-3 jours dans le cas de la bactérie, y*; 72 15956 4 2135301 à la coloration correspondant au domaine alcalin. Des microorganismes consommant de la créatinine qui n'effectuent pas la dégradation suivant le mécanisme métabolique susindiqué avec les enzymes susindiquées ne présentent pas cette alcalinisation. 5 Les micro-organismes utilisés conformément à l'invention permettent la préparation économique des enzymes créatinine-amidohydrolase et créatine-amidinohydrolase à partir de la fraction protéique hydrosoluble obtenue par la désagrégation des micro-organismes selon le procédé décrit plus en détail dans la 2Q demande de brevet susindiquée déposée le même jour. Les exemples non limitatifs suivants décrivent l'invention d'une façon plus détaillée. Exemple 1. Enrichissement de mycélium de champignon actif en culture 15 submergée en secoueuse. On ensemence dans un ballon approprié monté dans une secoueuse 2 litres d'un bouillon de culture, contenant 1% en poids de glucose, 0,5% en poids de créatinine, 0,08% en poids de sulfate d'ammonium, 0,02% en poids de sulfate de magnésium heptahydraté 2o 0,05% en poids de levure, 1 mg d'acide nicotinique, 1 mg de p- aminobenzoâte de thiamine, 1 mg de vitamine Bg, 0,1 mg de biotine et des traces de sulfate de fer, de chlorure de calcium et de sulfate de manganèse dans un tampon de phosphate de potassium 0,1 molaire de pH 6, avec 200 ml d'une culture préalable de Penicil-25 lium WS 90001 âgée de 48 heures et on agite le ballon dans la secoueuse durant 4 jours. Pendant ce temps, la teneur en créatinine décroît en passant de 0,5% jusqu'à peine 0,1% et le glucose est, après ce délai, presque entièrement consommé. Le pH croît pendant ce temps jusqu'à une valeur de 7,5 à 8,0. On obtient ainsi, par 30 litre de bouillon de culture, 3 à 4 g (matière sèche) de WS 90001 contenant 45 à 60 UI de créatinine-amidohydrolase par gramme de matière sèche. Exemple 2. Dans un récipient de culture approprié, on introduit 15 35 litres du milieu décrit dans l'exemple 1, on ensemence avec 1,5 litres d'une culture préalable, bien développée, d'Alcaligenes spec. WS 51400 et on cultive sous aération énergique. On maintient pendant toute la durée de la culture le pH constant à la valeur de 7,0 et on contrôle constamment la teneur en créatinine et en 40 glucose. La consommation de la créatinine s'effectue principale 1 72 15956 s 2135301 ment durant le deuxième tiers de la phase logarithmique de développement, tandis que le glucose se dégrade le premier. On maintient la culture à la température de 30°C. Au bout de 35 heures, on peut récolter par litre de bouillon de culture une quantité de 5 1,5 g de masse bactérienne (masse sèche) présentant par gramme de matière sèche une activité spécifique de 1600 UI de créatinine-amidohydrolase . Exemple 3. On cultive de la façon décrite dans l'exemple 2 de l'Alcali-!0 genes spec. WS 51400 dans 60 litres de volume de travail. Aussitôt que l'état de croissance désiré est atteint, on commence à ajouter dans le récipient de culture du bouillon de culture frais et à en retirer dans la même mesure la solution à culture développée en maintenant un taux de dilution (vitesse d'écoulement/volu-me de travail) de 0,13 à 0,18, de préférence de 0,16. On fait traverser le bouillon par de l'air à raison de 500 litres/heure. On obtient ainsi, par culture en continu, un rendement par litre de culture de 3 à 5 g de masse bactérienne sèche dont l'activité spécifique est égale à celle du produit obtenu suivant le procé-20 dé discontinu décrit dans l'exemple 2. Alcaligenes spec. WS 51400 se prête parfaitement S la culture en continu telle qu'elle est décrite dans cet exemple. Les deux micro-organismes sont déposés dans la collection de l'Institut Bactériologique de l'Université Technique de Munich 25 à Weihenstephan. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les 30 variantes. 72 15956 6 2135301 REVENDICATIONS 1 - Application d'Alcaligenes spec. WS 51400 ou de Pénicillium WS 90001 à la préparation de créatinine-amidohydrolase et/ou de créatine-amidinohydrolase solubles. 5 2 - Application à la préparation de créatinine-amidohydrola se et/ou de créatine-amidinohydrolase solubles cultivés dans un milieu de culture contenant de la créatinine. 3 - Application à la préparation de crëatinine-amidohydro-lase et/ou de créatine-amidinohydrolase solubles des micro-10 organismes définis dans la revendication 1, cultivés dans un milieu de culture contenant de la créatinine, du glucose ou de la glycérine ainsi que des sels et des vitamines.