Brevet FR2130253A1 — publié le 19721103

Des essais d* échantillons 'iqoS.&és, destinés à déterminer1 la présence de micro-organismes, sont fréquemment requis en médecine, dans l'industrie et par les Offices Gouvernementaux, pour déterminer leur degré de contamination microbiologique. Dans de 5 nombreux essais de ce type, la présence des micro-organismes a souvent une importance secondaire et la concentration des microorganismes dans l'échantillon est le facteur principal à déterminer. Par exemple, la diagnose de la bactériurie est déterminée par la concentration des micro-organismes présents dans un échantillon 10 d'urine et non par leur simple présence. De même, on considère que des échantillons de lait et d'eau sont "contaminés" uniquement lorsque la concentration en micro-organismes présents dans ces échantillons dépasse une valeur maximale type, définie. Evidemment, lorsque la concentration en micro-organismes dépasse cette valeur,. 15 il est utile, et souvent nécessaire, d'identifier le micro-organisme en question afin d'appliquer le traitement approprié à l'infection ou de déterminer et de minimiser la cause de la contamination. Un procédé de dosage de micro-organismes, nécessite la pré-20 paration de dilutions en série d'une quantité mesurée de l'échantillon, l'inoculation d'un milieu nutritif gélose par une quantité mesurée d'une dilution et l'incubation du milieu inoculé pendant environ 24 h. Si l'échantillon est contaminé, des colonies individuelles du micro-organisme incriminé peuvent être observées à 25 l'oeil nu et comptées. La concentrsftiôrr~en-mero-organismes par ml d'échantillon est ensuite calculée en multipliant le nombre de colonies de micro-organismes par la dilution de l'échantillon. Les colonies discrètes ainsi développées constituent une source brute de micro-organismes utilisable pour leur culture sur des milieux 30 différentiels ou sélectifs permettant de les identifier. Ces cultures nécessitent souvent une incubation supplémentaire de 24 h. La méthode décrite ci-dessus nécessite la préparation de dilutions en série de l'échantillon, la préparation d'un milieu gélosé, une période de temps suffisante pour effectuer à la fois 55 un dosage quantitatif et un essai différentiel et un équipement important de laboratoire,propre et stérilisé; ces exigences représentent les inconvénients inhérents à ce procédé. Un second procédé a été imaginé, selon lequel des volumes mesurés d'un échantillon sont filtrés sur une membrane semi-perméable. Le principe de 72 08974 2 2130253 ce procédé consiste à choisir une membrane, dont la porosité est telle que les micro-organismes ne peuvent la traverser. Après filtration, la membrane est détachée du filtre et posée au contact d'un milieu nutritif gélose afin que les éléments nutritifs conte-5 nus dans celui-ci puissent diffuser dans la membrane. Après incubation, les micro-organismes se développent sur la membrane et on peut alors les observer et les compter comme dans le procédé décrit ci-dessus. Bien que ce dernier procédé représente une amélioration 10 ce certains aspects du procédé original, il nécessite un équipement de filtration qu'il faut, en outre, nettoyer et restériliser. Il faut également mesurer l'échantillon avant de le filtrer, ce qui demande du temps et un équipement supplémentaires. 15 Le dispositif d'essai selon l'invention comprend une ma trice absorbante imprégnée d'un milieu nutritif contenant des réactifs d'essai et un agent de suspension. En pratique, la matrice imprégnée est plongée momentanément dans le liquide destiné à l'inoculer, ou saturée de celui-ci par n'importe quelle autre mé-20 thode et elle absorbe un volume connu de l'échantillon. Selon le milieu nutritif et les réactifs utilisés, un essai semi-quantitatif ou différentiel peut être effectué. De même, un certain nombre Un dispositif d'essai utilisable suivant un procédé consistant à inoculer une matrice imprégnée d'un milieu nutritif, par 30 immersion directe dans un échantillon à analyser, est actuellement connu. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2 904 474 décrit ce dispositif qui comporte, en général, une bande de papier imprégnée d'un milieu nutritif contenant la substance à essayer, la bande comportant une poignée amovible et une gaine enfermant la bande 35 lors de l1 incubation. L'absence d'un agent de suspension .dans le dispositif décrit ci-dessus entraîne les inconvénients suivants : (1) élution des agents nutritifs solubles et des substances d'essai dans le 72 08974 3 2130253 Ai eu, aï; ;**s . 6; l'iuîrarsion àu dispositif dans 1'échantillonj (2) tendance à la diffusion par gravité,vers la partie inférieure de la bande, des substances solubles restant dans celle-ci après immersion *,(3) localisation défectueuse, et donc formation défec-5 tueuse, de colonies discrètes, celles-ci étant nécessaires pour l'essai semi-quantitatif, des micro-organismes mobiles. L'adjonction d'un agent de suspension au dispositif d'essai de l'invention permet de remédier à tous les inconvénients décrits ci-dessus et concernant les techniques de l'art antérieur. 10 Le dispositif d'essai de l'invention permet donc l'inoculation directe d'un échantillon et évite la mesure et/ou la dilution préalables de l'échantillon. Une inoculation directe et sans dilution met le milieu de culture dans des conditions d'environnement pratiquement semblables à celles de l'échantillon, réduit le 15 temps d'adaptation normal des micro-organismes à de nouvelles conditions d'environnement cependant convenables et accélère donc leur développement. Ce dispositif d'essai destiné à une étude différentielle et permettant d'inoculer directement les échantillons,permet d'effectuer simultanément des essais semi-quantitatifs 20 et différentiels. L'invention concerne donc un dispositif destiné à l'analyse des micro-organismes d'un échantillon, pouvant être inoculé par immersion dans un échantillon liquide, incubé dans un récipient obturable et comprenant une matrice constituée 25 d'une matière absorbante, de préférence'du-papier-filtre, imprégnée d'un milieu nutritif classique comprenant des réactifs convenables et un agent de suspension, ce dernier évitant l'élution au cours de l'immersion des matières d'imprégnation, et permettant la répartition régulière des colonies formées sur la matrice. Ce 30 dispositif peut comporter une poignée et un récipient qui le complètent. Le dispositif de l'invention permet de détecter la présence de micro-organismes par culture après son immersion dans un échantillon liquide. Ce dispositif est simple et sûr, il permet 35 de déterminer la concentration en micro-organismes d'un échantillon liquide sans mesurer ou diluer celui-ci et de faire l'analyse différentielle des micro-organismes, il peut être inoculé directement par l'échantillon,et son utilisation ne nécessite pas 72 08974 t 2130253 en oeuvre f équipement superflu qu'il faut nettoyer et stériliser et sa mise/ demande peu de temps. Le dispositif de l'invention est simple, éeo-romique, sacrifiable et sûr. L'invention sera décrite plus en détail en regard du 5 dessin annexé à titre d'exemple nullement limitatif. Sur ce dessin : la figure 1 est une élévation du dispositif d'essai selon 1'invention,enfermé dans un récipient; la figure 2 est une coupe partielle, à échelle agrandie, 10 selon la ligne 2-2 de la figure 1, du dispositif retiré du récipient; et les figures 3, 4, 5 et 6 sont des vues en plan des matrices du dispositif représentant les colonies disposées à leur surface. 15 Sur ce dessin , et plus particulièrement sur la figure 1 , le dispositif d'essai de l'invention porte la référence 10. Le dispositif 10 comporte généralement une matrice 11 absorbante, fixée à une poignée 12 et logée dans un récipient 13, obtu-rable. 20 La matrice 11 est en matière absorbante plane,du papier- filtre par exemple, ou analogue, imprégnée d'un milieu nutritif convenable comprenant un réactif et un agent de suspension. Elle peut être inoculée par immersion dans l'échantillon à essayer, cela évite donc de mesurer et/ou diluer l'échantillon comme décrit ci-25 dessus. En conséquence, il faut que la matrice 11 ait une capacité d'absorption constante connue pour pouvoir être utilisée pour des déterminations.semi-quantitatives. Ainsi, si la matrice absorbe un volume connu de l'échantillon,c'est-à-dire 0,2 ml, la concentration en micro-organismes de l'échantillon peut être facilement dé-30 terminée comme décrit ci-dessus. Il est évident que la réhydratation de la matrice absorbante dans un échantillon liquide, conduit à l'absorption par la matrice d'un volume spécifique de l'échantillon et de n'importe quels micro-organismes. • Celle -ci est ainsi inoculée. 35 Lorsque la matrice inoculée et imprégnée d'un milieu nutritif convenable est mise à incuber, les micro-organismes se développent et forment des colonies. Au cours de cette description, l'expression "micro-organisme" désigne en général la classe des micro-organismes y compris 72 08974 5 2130253 les levures, champignons ou oac.tér'ieo présents dans l'échantillon à analyser. L'expression "colonies" désigne les uJ.cro-organisées obtenus après culture. L'expression "emplacement de la colonie" désigne l'emplacement d'une colonie tel qu'observé sur la ms--5 trice 11 et est donc synonyme, dans le cas de cette description, de l'expression "colonie". Le milieu nutritif peut être n'importe quel milieu classique ou modifié constituant un environnement convenable pour l'essai choisi. Dans le cas d'un essai semi-quantitatif, un milieu ■\ o nutritif tel que "Bacto Brain Heart Infusion" commercialisé par Difco Laboratories, Détroit, Michigan,peut être utilisé. On considère que ce type de milieu est général et qu'il permet de cultiver la plupart des micro-organismes. Dans le cas d'un essai différentiel, on peut choisir un milieu nutritif donnant une ré-15 ponse positive en présence de certains micro-organismes,et négative en présence d'autres. Des exemples de milieux convenables utiles sont : la formulât!on de Christensen décrite dans le Journal of Bacteriology, 42 : 461 qui donne une réaction positive en présence de l'espèce Prôteus, mais une réaction négative en 20 présence d'autres micro-organismes Gram négatif, et le Citrate de Simmons, bien connu pour permettre la croissance des organismes utilisant le eitrate, tels que Klebsiella et Enterobacter, mais pas de ceux ne pouvant pas utiliser le citrate, tel que Escherl-chia coli. 25 Le réactif comporte, de préférence, un indicateur chan geant de couleur sur la matrice 11, en réponse à une croissance positive de micro-organismes. Le réactif peut être incorporé au milieu nutritif et peut comprendre un indicateur simple de pH,tel que le rouge de phénol habituellement utilisé dans la formulation 30 de Christensen. Cet indicateur passe de l'orangé -jaune au rose vif en présence d'un micro-organisme, par exemple l'espèce Proteus,capable de décomposer l'urée de la formulation. De même, le réactif peut comprendre un indicateur du type oxydo-réducteur tel que l'un des dérivés du tétrazoli'um, soit le chlorure de 2,3,5-35 triphényltétrazolium (incolore) , qui est réduit en un formazan, soit le triphénylformazan (rouge intense), par la plupart des micro-organismes, au cours de leur croissance. Lors de la préparation de la matrice pour un essai semi-quantitatif,on préfère 72 08974 6 2130253 ' utiliser le triphényltétrazolium comme indicateur,car le produit réduit ou triphényltétraformazan, donne non seulement une couleur vive visible, mais est de plus insoluble. Cette dernière propriété, associée à celles des agents de suspension décrits ci-dessous, 5 l'acilite la formation de colonies discrètes et distinctes. Il est nécessaire d'ajouter un agent de suspension à la formulation d'imprégnation afin d'éviter l'élution du milieu soluble et du réactif de la matrice 11, au cours de son immersion dans l'échantillon liquide et afin de'localiser les micro-orga-10 nismes sur la matrice après inoculation.L'aptitude de l'agent de suspension à localiser les micro-organismes et à entraîner la formation de colonies séparées et distinctes dans et sur l'a matrice 11, est particulièrement importante dans le cas des essais semi-quantitatifs. L'agent de suspension est utilisé dans la for-15 mulation,à des concentrations comprises ëntre environ 0,1# et 5,0^ en poids et de préférence entre environ 0,5$ et 3>°$ en poids. L'agent de suspension est caractérisé par sa solubilité dans une solution aqueuse avec laquelle il forme une suspension colloïdale visqueuse. Des agents de suspension qui conviennent, 20 seuls ou en combinaisons, sont les colloïdes, les gommes inertes, les carraghénines, les alginates et divers polysaccharides et po-lypeptides. Après imprégnation de la matrice, celle-ci est séchée. Etant donné qu'une température élevée peut affecter certains 25 des agents nutritifs et des matières d'essais imprégnant la matrice, il est préférable de la sécher dans rune étuve sous vide ou à . , , ^ „ / pendant 1 a 3h air puise, a environ 40~60°C/.Afin de compléter le dispositif d'essai 10, la matricè 11 imprégnée et séchée, est fixée à une poignée ou manche 12, ce"manche 12étant,de préférence, un élément 30 allongé en matière'insoluble et rigide telle que, par exemple, une bande de téréphtalate de polyéthylène ou analogue. La matrice 11 étant destinée à une utilisation en microbiologie, plutôt qu'en chimie, il est nécessaire de prendre des précautions particulières pour fixer cette matrice 11 à la poignée 12 au moyen d'un adhésif 35 inerte du point de vue microbiologique. Certaines bandes à double face telles que les n° 415 et 419 commercialisés par 3 M Company, Minneapolis Minnesota, conviennent très bien dans ce cas. la matrice 11 peut être également facilement fixée à.la poignée 12 par une COPY /2 oay/t v ZIôuzïi liaison a'ef:ai mûries ni le milieu ou le réactif qui l'imprègne. Pour plus de facilité, une mince feuille 14, de poly- ' éthylène (figure 2) est placée entre la poignée 12 et la matrice 11 et une quantité suffisante de chaleur est appliquée à la face 5 16 de la poignée 12 (la plus éloignée de la matrice 11) afin de provoquer la fusion de la bande et la liaison de la matrice 11 et de la poignée 12. la matrice 11 (figure 1) et la poignée 12 qui en est solidaire, sont ensuite disposées dans le récipient 13, et celui-ci 10 est fermé après stérilisation. En général, n'importe quel récipient classique pouvant être refermé convient. Une enveloppe de polyéthylène, ou analogue, dont les côtés 17 et 18 et le fond 19 sont fermés,peut être utilisée. La partie supérieure 21 du récipient 13 °u de l'enveloppe comporte de préférence une lèvre 22 15 de verrouillage étanche fermant à friction le récipient 13 sur lequel on exerce une pression et évitant l'utilisation d'instruments de fermeture particuliers. Le récipient 13 est, de préférence, en matière transparente permettant à L'opérateur de voir et d'étudier la matrice 11 contenue dans le récipient,sans risque 20 de contamination de l'opérateur ou du laboratoire par les microorganismes. En pratique, le récipient 13 n'est pas fermé et on en retire la poignée 12 et la matrice 11 stériles. On plonge la matrice dans l'échantillon liquide à essayer, par exemple de l'urine, du lait, 25 de l'eau ou analogue, pour la réhydrater—e.t 1_'inoculer. La matrice inoculée et sa poignée sont remises dans le récipient dans des .et conditions d asepsiq/ le récipient est refermé et mis à incuber à la température optimale dépendant du micro-organisme présumé, pendant au moins 4 heures. La plupart des micro-organismes sont 30 incubés dans des conditions optimales entre 4 et 40°C, de préférence entre 35 et 39°C. Après incubation, la matrice est. observée à l'oeil nu et les résultats de l'essai particulier sont lus.Dans le cas d'un essai semi-quantitatif, on observe l'aspect des taches colorées indiquant la présence de colonies et leur densité, comme 35 décrit ci-dessous. Dans le cas d'un essai différentiel, on observe la couleur de la matrice indiquant si la croissance est positive ou non. Lorsque les résultats de l'essai sont connus,on peut stériliser, puis jeter le dispositif 10. Cependant, la stérilisation COPY 72 08974 8 2130253 ne provoqua?;'., pad de variations importantes de la coloration de la matrice résultant de la croissance des micro-organismes, le dispositif 1G ou simplement la matrice peuvent être conservés comme enregistrement permanent. :> Les résultats expérimentaux concernant les concentrations sont exprimés en puissance de 10 et indiquent la concentration relative en micro-organismes d'un millilitre d'échantillon. Les figures 3 et 6 représentant les colonies telles qu'elles apparaissent sur la matrice à diverses concentrations, permettent de 10 comprendre ceci facilement. Les colonies représentées en 23a et 23b sur les figures 3 et 4 respectivement, peuvent être dénombrées aisément,alors que les colonies multiples représentées en 23c et 23d sur les figures 5 et 6 sont si nombreuses qu'il est très difficile de les compter précisément. Cependant, étant donné 15 que le nombre de colonies n'est que relatif, la concentration en micro-organismes par millilitre peut facilement être déterminée à l'oeil nu par comparaison de la densité des colonies présentes sur la matrice avec une courbe d'étalonnage ou un témoin. A titre d'exemple, les matrices 11a_ et 1ld représentées 20 sur les figures 3 et 6 absorbent 0,2 ml d'échantillon aqueux. Le nombre et la densité des colonies 23a de la figure 3 indiquent la présence de 4 colonies 23a dans 0,2 millilitre de l'échantillon,soit 20 micro-organismes par 1,0 millilitre d'échantillon essayé. 25 Cependant, étant donné que les concentrations exprimées ne sont que relatives, une telle concentration est généralement -] désignée par 10 micro-organismes par millilitre. La concentration correspondant aux résultats représentés sur la figure 4 O s'exprime par 10 , soit environ 100 micro-organismes par milli-30 litre. Les colonies 23c et 23d des figures 5 et 6 sont très nombreuses et dans ce cas, la densité des colonies définit la concentration des micro-organismes dans l'échantillon. La figure 5 correspond à 10^,soit environ 1 000 micro-organismes par milli- v 4 litre et la figure 6 a 10 micro-organismes par millilitre. Des 35 concentrations supérieures à 10^ micro-organismes par millilitre correspondent à une coloration totale de la matrice. Les exemples suivants illustrent le dispositif d'essai de l'invention. 72 08974 3 2130253 EXEMPLE 1 - Dispositif d'essai. On ajoute 20,0 grammes d'alginate de sodium à 1 litre d'eau distillée et on agite jusqu'à dissolution. On ajoute à 5 cette solution la formulation suivante : Infusion de cervelle de veau 220 g- Infusion de coeur de boeuf 275 g Peptone-protéase 11 g Dextrose 2,2 g 10 Chlorure de sodium 5,5 g Phosphate disodique 2,75 g Chlorure de triphényltétrazolium 0,165 g "Polysorbate 80" 0,1 ml (0,01^) Les ingrédients sont mélangés intimement jusqu'à disse 15 lution dans la solution d'alginate, le pH final atteignant 7,4. Des feuilles de papier filtre n° #70 de Schleider et Schuell sont plongées dans la solution préparée ci-dessus jusqu'à ce qu'elles soient entièrement saturées; elles sont ensuite retirées entre 2 tiges de verre serrées afin d'éliminer l'excès 20 de solution et d'assurer une imprégnation uniforme. Les feuilles sont ensuite séchées dans une étuve à air puisé à 55°C, pendant 2 h. Les feuilles déshydratées sont alors découpées en tampons de 1 x 2 cm, absorbant 0,2 ml d'échantillon liquide. On peut préparer des poignées pour ces tampons en décou-25 pant des feuilles de téréphtalate"ffs -polyéthylène en bandes de 1 x 6 cm . Afin de fixer les tampons aux poignées, on place ceux-ci sur une table rembourrée et on les recouvre chacun d'une mince feuille de polyéthylène. On place ensuite les bandes sur les feuilles de polyéthylène de façon que chaque tampon soit adjacent J>0 à une des extrémités d'une bande. On place sur les bandes, pendant environ 5 s,raie plaque chauffée à 13>8°C environ, afin de faire fondre les feuilles de polyéthylène et de'souder les tampons aux bandes. Les poignées et les tampons qui en sont solidaires sont ensuite disposés dans des récipients transparents que l'on peut 35 fermer et stérilisés à l'oxyde d'éthylène. EXEMPLE 2 - Essai semi-quantitatif. a Préparation des échantillons d'essai On prépare des échantillons d'essai en cultivant des 72 08974 io 2130253 cellules d'Esonerichia coli, Proteus mirabilis, Eiiterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococous aureus et Streptococcus faecalis dans des bouillons de culture tels qu'une infusion de coeur- et de cervelle, jusqu'à obtention d'un trouble 5 maximal (1 à 5 x tO" cellules par millilitre). On prépare des dilutions en série au i/"10 pour chaque culture en utilisant une solution saline comme diluant; on obtient ainsi des suspensions de bactéries de chaque culture dont la concentration théorique 1 7 • .ou comprise entre 10 et 10* cellules par millilitre. 10 h Essai des échantillons On utilise un dispositif tel que décrit dans l'exemple 1 pour essayer chacune des dilutions des échantillons décrits ci-dessus. Le récipient n'est pas fermé et la poignée et son tampon en sont sortis. La matrice stérile et déshydratée est plongée dans I5 l'un des échantillons dilués afin d'être inoculée et réhydratée. Le tampon inoculé et sa poignée sont replacés dane$.e récipient. Le récipient est ensuite fermé afin d'éviter la déshydratation du tampon, puis placé dans une chambre d'incubation à 37°C pendant environ 12 heures. On prépare une boîte de comptage classique 20 pour chaque dilution de l'échantillon afin de vérifier sa concentration en cellules et on l'utilisé comme témoin à comparer aux résultats observés sur le dispositif de l'invention. .Après incubation, les dispositifs sont retirés de l'incubateur et on observe les matrices à travers les récipients trans 25 parents. La réduction du triphényltétrazolium incolore en triphé-nylformazan coloré en magenta par les micro-organismes est observable sur tous les tampons incubés. Les tampons inoculés avec des échantillons dont la concentration en cellules est inférieure à 10^ par millilitre présentent des taches colorées en magenta dis-30 crêtes et délimitées,.correspondant chacune à une colonie, le nombre de ces taches augmentant proportionnellement à la concentration connue des échantillons d'essai. Tous les tampons inoculés avec un échantillon de concentration égale ou supérieure à 10^ cellules par millilitre, présentent une coloration magenta totale. 35 II existe une relation définie et discrète entre le nom bre de taches observées sur les tampons et les concentrations en cellules des échantillons. La densité ou le nombre de colonies aug mente avec la concentration des micro-organismes dans les échantillons d'essai. 72 08974 " 21JU253 ~ t.vc- ici ^Uniques i Uï*'ine, des échantillons de lait fraîchement pasteurisé de qualv efc un échantillon de lait pollué, et on obtient essentiellement les mêmes résultats. Le nombre de colonies'observées sur les tam» 5 pons correspond aux résultats observés sur le témoin en boîte de comptage remplie de gélose. On obtient essentiellement les mêmes résultats en ce qui concerne le développement des colonies en remplaçant l'alginate de sodium par d'autres agents classiques de suspension tels que 10 divers alginates, des gommes de polysaccharides non réactifs, des polysaccharides linéaires, des carraghénines et de la gélose à 0 faibles concentrations/ on obtient ainsi une détermination semi-cuantitative. Lorsqu'on répète les expériences en utilisant un dispositif 15 préparé comme décrit dans l'exemple 1, sans agent de suspension, les tampons présentent, après incubation, une coloration rose ou :.:agenta totale à toutes les concentrations. Il est donc impossibl d'effectuer une détermination semi-quantitative des dilutions de 1'échantillon en l'absence de l'agent de suspension , car les mi-20 ero-organismes ne sont pas localisés. EXEMPLE 3 -Essai différentiel On ajoute 20,0 gd'alginate de sodium à un litre d'eau distillée pour préparer une solution selon le procédé de l'exemple 1 25 On ajoute ensuite à cette solution-milieu de Christensen comprenant les composés suivants : Peptone 1,00 g Glucose 1,00 g NaCl 5,00 g 30 kh2po4 2'00 S Urée ■ 20,00 g Rouge de phénol 0,12 g "Polysorbate 80" 0,1 ml La formulation est intimement mélangée à la solution d'algi-35 nate de sodium jusqu'à dissolution et la solution résultante est-utilisée pour imprégner du papier filtre n° 470 S & S selon le procédé de l'exemple 1. Les feuilles de papier imprégnées sont séchées dans une étuvè à vide, à 40°C pendant 2 heures. Les feuil les déshydratées et imprégnées sont découpées en tampons qui sont 72 08974 12 2130253 fixés à des poigr-ees, disposés dans des récipients et stérilisés, comme décrit dans l'exemple 1, Les poignées et tampons sont ensuite retirés des récipients et inoculés avec toutes les dilutions d'échantillons décrites dans 5 l'exemple 2a et contenant des Proteus mirabilis, Enterobaoter aerogenes et Esoherichia coli, puis mis à incuber 12 heures à 36°C, On observe une coloration rose totale de tous les tampons inoculés avec des dilutions des échantillons contenant des Proteus mirabilis et pour toutes les concentrations* On n'observe aucun 10 changement sur les tampons inoculés avec les échantillons d'essai contenant Enterobaoter aerogenes et Es'^erlohia coli, exemple 4 -Essai différentiel On ajoute 20,0 g d'alginate de sodium à un litre d^eau dis-15 tillée pour préparer une solution telle que décrite dans l'exemple 1 . On ajoute à cette solution un milieu modifié, au citrate de Simmons,comportant les composés suivants ; NH^PO^ 1,00 g NaCl. 5,00 g 20 MgSO^ 0,20 g k2hpo4 1,00 g citrate de sodium 2,00 g bleu de bromo- thymol 0,80 g 25 "Polysorbate 80" 0,1 g La composition ci-dessus est mélangée intimement à la solution et dissoute dans celle-ci; on l'utilise ensuite pour imprégner des feuilles de papier filtre N° 470 S & S et on répète le procédé de préparation du dispositif'd'essai décrit dans l'exemple 30 1. Les tampons ainsi préparés sont inoculés et réhydratés avec trois échantillons de l'exemple 3, à toutes les concentrations, puis mis à incuber 12 heures à 37°0. Les tampons inoculés avec toutes les concentrations des 35 échantillons d'essai contenant Enterobaoter aerogenes passent d'une coloration vert pâle totale à une coloration bleu vif totale caractéristique de la présence de l'espèce Enterobaoter. Les tampons inoculés avec les échantillons d'essai contenant Proteus miratoLlis 72 08974 13 2150255 et Escherlchia coli conservent leur coloration vert, pâle. EXEMPLE 5 - Essai différentiel On ajoute 20 g de "Kelsan", polysaccharide linéaire eoiîBïier— 5 cialisé par Kelcô Laboratories de San Diego, Californie, à un litre d'eau distillée pour en préparer une solution. On ajoute à cette solution, un milieu modifié EMB de Levine, comprenant les composes suivants : Peptone 10,0 g 10 Lactose 10,0 g Phospnate dipo-tassique 2,00 g Eosine Y • 4,00 g Bleu de méthylène 0,650 g 15 "Polysorbate 80" 0,1 ml puis on agite jusqu'à mélange intime et dissolution. On prépare c'es tampons en imprégnant des feuilles de papier filtre n° 470 S & S de la solution obtenue et des dispositifs d'essai selon 1'exemple 1. 20 Les tampons sont plongés dans toutes les concentrations des échantillons d'essai décrits dans l'exemple 3- Les tampons inoculés avec les échantillons contenant Escherlchia coli présentent une coloration vert métallique nacré caractéristique. Les dispositifs inoculés avec .les échantillons contenant 25 Enterobaoter aerogenes et Proteus mirabilis conservent leur coloration violet sombre sans la moindre trace de coloration nacrée» Bien que la description qui précède, ainsi que les exemples, concernent primitivement un dispositif d'essai comportant une matrice reliée à une poignée et contenue dans un récipient, il est 30 évident que l'invention concerne également la production de la matrice imprégnée seule. On peut, par exemple, utiliser du matériel classique de laboratoire, tel que des pinces et des boîtes à lames à la place de la poignée 12 et du récipient 13, respectivement. On peut saisir la matrice"stérile déshydratée à l'aide des pinces 35 et la plonger dangies échantillons à analyser, puis la placer dans une boîte à lames et la mettre à incuber. La matrice 11 imprégnée peut également être réhydratée et inoculée par addition directe d'un volume mesure de l'échantillon à la matrice 11 au lieu d'être immergée comme dans le procédé décrit ci-dessus. 72 08974 1" 2130253 Il est, de plus,évident à l'homme de l'art que le dispositif peut être adapté à la détection de micro-organismes dans des échantillons :-jOn liquides. Dans ce cas, il faut réhydrater la matrice avec de l'eau 5 stérile, ou « wlogue, et inoculer par contact avec l'échantillon solide à analyser. Il est 3gç.l»?.»ent bien entendu que la présente invention n'est pas limite aux matières absorbantes spécifiques, aux mi-7.ieux nutritifs, aux réactifs et aux agents de suspension décrits ".0 --'^ns les ci-dessus et que l'on peut employer une grande variété de combinaisons de matières absorbantes, milieux nutritifs, réactifs ^t agents de suspension pour élaborer le dispositif de l'invention. En résumé, la présente invention concerne un dispositif 15 expérimental destiné à essayer un échantillon pour en analyser les micro-organismes, ce dispositif comportant une matrice absorbante imprégnée d'un mi lieu nutritif comprenant un réactif et un agent de suspension. Ce dispositif peut être inoculé par immersion dans un échantillon à essayer et les micro-organismes 20 contenus dans cet échantillon sont cultivés par incubation. Ce dispositif permet d'effectuer une analyse micro-biologique différentielle ou serai quantitative rapide d'un échantillon,grâce à un procédé simple et économique. 72 08974 2130253 HE VlMDICÂÏ'l QHS 1 - Dispositif a essai pour l'analyse des micro-organismes a un échantillon, ce dispositif étant destiné à être inoculé pay un échantillon et à être mis à incuber dans un récipient obtura- 5 ble, et étant caractérisé en ce qu'il comporte une matrice imDrç-gnee d'un milieu nutritif qui comprend un réactif et un agent de suspension. 2 - Dispositif d'essai selon la revendication 1, caractérisé on ce que la matrice est en matière absorbante et plate. 10 3 - Dispositif d'essai selon la revendication 2, caracté risa en ce que la matière absorbante a une capacité d'absorption constante et connue. 4 - Dispositif d'essai selon la revendication 2, caractérisé en ce que le réactif comprend un indicateur coloré. 15 5 - Dispositif d'essai selon la revendication 4-, caractéri sé en ce que l'indicateur est le chlorure de triphényltétrazolium. 6 - Dispositif d'essai selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de suspension comprend une substance soluble formant une suspension colloïdale visqueuse dans une solution 20 aqueuse. .. . 7 - Dispositif d'essai selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de suspension est choisi parmi les colloïdes, les carraghénines,les gommes inertes, les polysaccharides et les alginates. 25 8 - Dispositif d'essai selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent de suspension est de l'alginate de sodium.. 9 - Dispositif d'essai selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agence suspension est un polysaccharide linéaire. 10 - Dispositif d'essai destiné à l'analyse des micro-or- 30 ganismes d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une matrice absorbante imprégnée d'un milieu nutritif comportant un réactif et un agent de suspension, une poignée étant fixée à la matière qui est logée,avec cette poignée,dans un récipient obtu-rable. 35 11 - Dispositif d'essai selon la revendication 10, caracté risé en'ce que la poignée comprend un élément allongé et rigide. 12 - Dispositif d'essai-selon la revendication 11, caractérisé en ce que le récipient est transparent. /i uo^/4 !° Z15U2D5 îp - "pcoitif d:eùSôi Gelon la r evenaicatior 11, caractérisé en ce que le récipient comprend uiie lèvre de fermeture.