Brevet FR2118178A1 — publié le 19720728

-- 1 2118178 .71 «538.7 la présente invention concerne une nouvelle composition pharmaceutique destinée à l'évaluation de la sécrétion biliaire chez des animaux. lia digestion des aliments a- lieu principalement dans les 5 régions supérieures de 1*intestin grêle où le suc pancréatique et la bile se mélangent avec le chyme sortant de l'estomac. Dans ce processus de digestion, le suc pancréatique fournit les enzymes digestifs qui sont responsables de la dégradation des protéines, des glucides et des lipides, tandis que la bile fournit les sels - 10 biliaires qui coopèrent avec la lipase pancréatique dans la décomposition des triglycérides. Ainsi, 1*absence du suc pancréatique ou de la bile entraîne la présence d'une concentration anormale de graisse non décomposée dans les matières fécales. la bile est sécrétée par le foie et s'accumule dans la 15 vésicule biliaire. En. pénétrant dans la partie supérieure de l*intestin grêle, le chyme stimule l'écoulement de la bile vers 1*intestin. Normalement, les sels biliaires sont réabsorbés dans l,iléum et ramenés au foie, en sorte que les sels biliaires ne passent qu'en très faible quantité à l'extérieur de l'organisme 20 de 1*animal. la présence d'une quantité insuffisante de bile dans 1*intestin peut résulter dlua mauvais fonctionnement du foie, de 1*obstruction des canaux biliaires ou d'une certaine interférence avec la circulation entéro-hépatique normale des sels biliaires, qui 25 peut se manifester, par exemple, à la suite de l'ablation chirurgicale de l'iléum. lorsque les concentrations des sels biliaires à lrintérieur de l'intestin sont réduites, soit par suite d*une obstruction biliaire, soit par suite d'une affection hépatique, le diagnostic peut souvent être fait à l'aide d'un test clinique 30 classique. Toutefois, dans quelques cas, par exemple lorsque la quantité totale de sels biliaires est réduite, un tubage et ltanalyse du contenu de l'intestin, pour rechercher les sels biliaires, ont été les seuls moyens diagnostiques pratiques. On a découvert que la présence d'une quantité suffisante 35 d'enzymes pancréatiques dans un organisme animal peut être évaluée par l'administration interne d'une quantité efficace d'un poly— peptide qui peut être hydrolyse par une ou plusieurs des endo- 71 45587 3 2118178' peptidaaes pancréatiques pour donner un résidu qui peut être absorbé par l'organisme et restitué par ce dernier. Ce résidu est absorbé puis excrété dans l'urine, dont l'analyse permet de déterminer la présence ou 1*absence du résidu» Chez les animaux 5 dont la fonction pancréatique est normale, le peptide est hydrolyse en libérant un amino-acide ou un autre résidu qui est ensuite absorbé, excrété et décelé de façon analytique. Chez les animaux dont la fonction pancréatique a été perturbée, le peptide reste sen-; ' " f siblement non hydrolyse, en sorte que l'analyse cL1; urine ne permet, 10 de déceler essentiellement aucun résidu. Cette.méthode d'essais, et les peptides intéressants à utiliser dans'sa - conduite- sont décrits' dans les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique-ÏT° 91 173 et IT0 91 176 déposées le 19 ÎTovembre 1970, la premièrie -, par P.L. DeBenneville et N.J. Greenberger, intitulée "Method^for-15 Evaluating Pancreatic Enzyme Sufficiency and Compounds Useful Therein" et la seconde par Peter L. âeBezmeville, intitulée "Syn— thetic Polypeptides". _Ce-test sera parfois appelé "test de &reeri-berger-deBenneville" dans le présent mémoire. La littérature a également suggéré l'utilisation d'esters* 20 de fluorescéine dans le diagnostic de l'insuffisance pancréatique. Dans cet essai, les esters.de fluorescéine subissent un clivage, hydrolytique en présence de certains enzymes pancréatiques en. donnant de la fluorescéine qui est absorbée et excrétée et qui peut ensuite être recherchée dans l,urine. Toutefois, on vient 25 de découvrir que la présence de bile ainsi que d'enzymes pancréatiques est nécessaire pour effectuer ce- clivage. Ainsi, l'absence . de fluorescéine dans l'urine à la suite de l'administration de l'ester de fluorescéine peut indiquer soit une insuffisance d'enzyme pancréatique , soit une insuffisance de bile, soit les deux. 30 On vient de découvrir que la sécrétion d'une quantité suffisante de bile dans un organisme an-îma.1 peut être évaluée par ltadministrâtion à l'animal d'un peptide sensible au clivage hydrolytique en présence des sécrétions d'enzymes pancréatiques, et d'un ester de fluorescéine sensible au clivage hydrolytique en 35 présence de bile et des sécrétions d'enzymes pancréatiques. Conformément à 1*invention, pour évaluer la sécrétion d'une quantité suffisante de bile, on administre par voie interne,de préférence par voie orale, à un animal, une quantité efficace d'un COFv' 71 45587 ^ . 2118178 ' peptide de formule : ' Q-NHQ'CO-Q" (I) (dans laquelle Q est tui groupe bloquant la fonction amino, HHQ1GO est une liaison amino-acide pouvant être 5 détachée du peptide par hydrolyse en présence d'une endopsptidase pancréatique, et Q" est un groupe analysable, acceptable du point de vue pliarmaco logique, pouvant être détaché du peptide par hydrolyse, en présence d'une endopeptidase pancréatique, pour donner . 10 un composé analysable qui peut être absorbé par l'animal et excrété par ce dernier) ; on administre par voie interne à l'animal une quantité efficace d'un ester dialkylique en C^ à g, de préférence un ester dialkylique en Cg à C^, de fluorescéine } puis on recueille l'urine de l'animal pendant une période suffisante de 15 temps pour permettre l'accumulation du composé analysable et de fluorescéine, et on analyse l'urine recueillie pour déterminer la quantité de composé analysable et la quantité de fluorescéine présentes dans ,l'urine. Chez des animaux dont la fonction pancréatique et la sé-20 crétion biliaire sont normales, l'analyse d'urine révèle la présence simultanée de fluorescéine et du résidu analysable provenant du peptide . Chez des animaux dont la fonction pancréatique est normale, mais la sécrétion biliaire est anormale, l'analyse d'urine révèle la présence du résidu analysable, mais la concentration en . 25 fluorescéine est insuffisante. Chez les animaux dont la fonction pancréatique est anormale, l'analyse d'urine ne révèle la présence ni de fluorescéine, ni du résidu analysable, et d'autres essais sont nécessaires pour déterminer la présence de bile en quantité suffisante. Ainsi, ce procédé permet, non seulement de-déceler 50 une insuffisance biliaire chez des animaux dont la fonction pancréatique est normale, mais il combine également en un procédé relativement simple des tests d'évaluation des sécrétions pancréatique et biliaire suffisantes. On peut utiliser une grande variété de peptides dans le 35 procédé d'application de la composition conforme à l'invention, et on peut recourir à tout peptide qui contient trois composants essentiels. le premier composant essentiel est une liaison amino- COPY 71 45587 4 2118178 ' acide susceptible de clivage hydrolytique en présence de l'une des endopeptidases pancréatiques, le second élément essentiel est un . groupe protecteur de la fonction amino de cette liaison amino-acide. le troisième élément essentiel est un groupe analysable accep- 5 table du point de vue pharmacologique qui est détaché par hydrolyse du polypeptide en présence d'un enzyme pancréatique pour forjaer un composé qui est absorbé et éliminé dans le corps, et qui est facile à doser par des techniques d'analyse quantitative, les polypeptides qui satisfont à ces conditions peuvent être rpprésentés par la . 10 formule générale : peptidases pancréatiques. Dans une forme de réalisation de l*in— vention, la liaison amino-acide qui est choisie est une liaison. 20 qui peut être hydrolysée en présence de l'un quelconque des enzymes pancréatiques dont le groupe est habituellement appelé chymotryp— sine. Par exemple, la chymotrypsine provoque le clivage d'une liaison -C0UH— ou —C00— interne, si la fonction —CO— provient de la Ir-phénylalanine ou d'ion dérivé de L-phénylalani.ne tel que la 25 Ir-tyrosine, la 1-leucine, la 1-méthionine ou le L-tryptophane. Ainsi, l'un quelconque de ces amino—acideg^eut être choisi comme liaison amino-acide (KHQ'CO dans la formule I) pour le peptide utilisé dans l'essai. De plus, attendu que la présence de trypsine (enzyme pancréatique) conduit au clivage hydrolytique d'une liaison 30 interne -CONE- ou -C00- si la fonction -CO- provient de L-lysine ou de 1-arginine, l'un quelconque de ces deux ami,no-acides peut être choisi comme liaison amino-acide_dans le peptide d'essai. (Q dans la formule I) pour protéger la fonction amino de la liaison 35 amino-acide. Généralement, on choisit un groupe acyle tel qu'un groupe alkylcarbonyle, un groupe arylcarbonyle, un groupe aralkyl— carbonyle, un groupe alkarylcarbonyle, un groupe arylsulfonyle, un Q-HHQ'CO-Q" . (I) ' 15 On peut utiliser une grande variété de groupes de blocage COPY 71 45587 5 2118178 groupe alkylsulfonyle , un groupe alkylcarbamoyle , un groupe aryl-carbamcyle, un groupe alkoxycarbonyle, un groupe aryloxycarbonyle, etc. le groupe analysable (Qn dans la formule I) doit satis-5 faire à plusieurs conditions. Premièrement, il doit être acceptable du point de vue pharmacologique j ceci veut dire qu'il ne doit pas produire d'effets indésirables dans l'organisme animal auquel le peptide est administré. Deuxièmement, il doit être détaché du peptide par hydrolyse en donnant une substance qui est absorbée • 10 dans le corps puis excrétée dans l'urine,de préférence assez rapidement. Troisièmement, la substance hydrolysée doit pouvoir être dosée par des techniques d*analyse quantitative. Tout groupe qui satisfait à'ces conditions peut être utilisé comme groupe analysable, le groupe analysable, peut former soit un ester, soit 15 "un amide avec le groupe carboxylique de la liaison amino-acide» Des peptides formant un groupe préféré intéressant à utiliser dans le procédé utilisant la composition de l'invention* répondent à la formule suivante : RCO—A -EHR'CO-B -KHZ (il) n m • 20 . [dans laquelle R est un atome d'hydrogène j un groupe phényle ; un groupe phényle substitué avec un ou plusieurs atomes dthalogènes , groupes alkyle en k C^, groupes hydroxy, groupes alkoxy en C.j à C^, groupes alkoxycarbonyle à radical alkoxy en à ou substituants analogues qui ne gênent pas l'efficacité du polypep-25 tide dans l'essai £ un groupe alkyle en à C^î- de préférence un groupe alkyle en à Cg ; un groupe alkyle en à substitué par un ou plusieurs atomes d'halogènes, groupes alkoxy en k C^, groupes hydroxy, groupes acyloxy, de préférence alcanoyloxy en C.j à ou benzoyloxy, groupes polyalkoxyalkyle, groupes phényle 30 ou des substituants analogues qui ne gênent pas l'efficacité du polypeptide dans l'essai ; un groupe alkoxy en C1 à C.., de i 1 t- préférence en 0^ à Cg ; un groupe aryloxy ayant jusqu'à 10 atomes de carbone; ou -un groupe alkylène divalent ayant jusqu'à 6 atomes de carbone, auquel cas la formule(II)doit être représentée de la 35 façon suivante t R(—CO-A -lïER'CO—B -:iHZ)„ (lia) ^ n m '2 v ou bien, lorsque le groupe de blocage dérive de l'acide oxalique, copy 71 45587 2118178 ' la formule (II)doit être représentée de la façon suivante t (C0-An-MR'C0-Bm-HHZ)2 (Ilb) f ÏÏHR'CO est la liaison amino-acide qui dérive de la L—phénylalanine, de la l-tyrosine, de la Ir-leucine, de la 5 Ir-méthionine , du L-tryptopliane, de la I-arginine ou de la Ir-' lysine j - * Z est un groupe de formule : 10 YR» (dans, laquelle R'J^at un groupe hydroxy, alkoxy en à C^> alkoxjrr. alkoxy en à Caminoalkoxy eix Cj" à Cg, amino, monoa.1IcylaMrio en à C^ dialkylamino en Cj à C^, un groupe de formule ■—EHCH^OTR* ou un sel/que le sel de sodium, de potassium ou d'ammonium du ■groupe dans lequel R" est.ua radical hydroxy j Y est un groupe de formule —CO— ou —SO2— f X est un groupe hydroxy, un groupe alkyle en C^ à 15 C^, un atome d'halogène, un groupe alkoxy en C^ à C^ ou un substituant analogue qui ne gêne pas l'efficacité du polypeptide dans l'essai j et n* est égal à 0, 1 ou 2); A et 2 sont les résidus d'amino—acides de bas 20 poids moléculaire tels que les résidus glycyle, alanyle, glycyl— glycyle,etc. et . n et m sont égaux à 0, 1 ou 2] . ■ En général, l'essai est facilité par une solubilité rela— • tivement grande du peptide dans l'organisme. Par conséquent, les 25 peptides ayant un poids moléculaire relativement faible et les peptides ayant un groupe carboxy libre ou un 3el d'un groupe carboxy sont particulièrement préférables. Des exemples de'groupes-RCO convenables comprennent les COPY 71 .45587 7 21.18178 ' groupes benzoyle, adipoyle, malonyle, succinoyle, formyle, acétyle, propiônyle, butyryle, hexanoyle, heptanoyle, octanoyle, dodéca-noyle, ac é t osalicylyle, oxalyle, éthosycarbonyle, benzyloxycar-bonyle, chlorobensoyle, iodobenzoyle, toluoyle, éthylbenzoyle, anisoyle, chloi-acétyle, éthoxypropionyle,'hydrozybutyryle f phényl-acétyle, etc. Des.exemples de groupes —NHZ convenables comprennent ceux qui dérivent des acides p-aminobensoxque, m-aminobensoxque, 4-amino-3—iodobenzoïque, 4-amino-2-hydroxybenzoxque, 4-amino-3-méthylbensoxque f 4—amino-2 , 6-diméthylbenzoxque, 4-arainohippurique , p-acainobenzènesuifonique, 4-amino-2-éthylbenzoIque, 4-amino-2-butylbenzoïque, 4—amino-2-bromobenzoxque, 4-amino-2—éthoxy-benzoïque , 3-amino-4-hydroxybenzoïque, 3-amiho-4-méthylbenzoîque, 3-amino-4-chlorobenzoxque, m—aminobenzènesuifonique, anthranilique, 4-amino-3-méthylbenzènesulfonique, 4-amino-3-hydroxybenzènesuifo-nique, etc., les sels, tels que les sels de sodium, potassium et ammonium, de ces acides, les esters alkyliques-en 0^ à C^, tels, que les esters de méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle et tertiobutyle de ces acides, les esters dfalkoxy— alkyle en à tels que les esters d ' éthoxyéthyle et de méthoxy-éthyle de ces acidea, les esters aminoalkyliques en à Cg tels que les esters de ÎT^T-diméthylaminoéthyle, morpholinoéthyle, pipéridinoéthyle, pipérazinoéthyle et B", ÏT-diéthylaminométhyle de ces acides, leurs amides et leurs alkylamides tels que lés îT,ir—diéthylamides. On préfère les acides libres et leurs sels. Des exemples d^eptides de formule( 13) qui sont inté-- . reasants à utiliser dans le test basé sur la composition de ^invention, comprennent les peptides suivants : • IjT-benzoyl-DL-phénylalanyl-p-ami.nobenzoate d*éthyle U-benzoyl-L-phénylalanylglycyl-p—aminobenzoate d1éthyle ïT-benzoyl-L-phénylalanyl-p-aminohippurate de "méthyle N—benzoyl-DL-phénylalanyl-p-aminohippurate de méthyle IT-benzoyl-Ir-phénylalanylglycylglycyl-p-aminohippurate de méthyle F-benzoyl-I-phénylalonyl-p-aminobenzoate d1éthyle H-benzoyl-Ir-phénylalanylglycylglycyl-p-aminohippurate d'ammonium . acide ÏÏT-benzoyl-DL-phénylalanyl—p-aminobensoïque acide U-benzoyl-I-phénylalanyl-p-aminobenzoxque acide U-benzoyl-DL-phénylalanyl-p-aminohippurique ^COPY 71 45587 8 2118178 acide N-benzoyl-L-phénylalanyl~p-aminohippurique adip oy1-bis(L-phénylalanyl-p-aminob enzoate)diammonique N-benzoyl-1-phénylalanyl-p-aminobenzoate de so-dium N-b enz oyl-L-ph énylalanyl-p-aminohippur ate de sodium 5 adipoyl-bis (L-phénylalanyl-p-aminobenzoate ) disodique K-acétyl-L-phénylalanyl-p-aminohippurate de sodium IT-benzoyl-L-phénylalanyl-p-aminobenzènesulfonamide IT-benzoyl-1-tyrosyl—p-aminobensoate de sodium adipoyl-bis(l-tyrosyl-p-aminobenzoate)disodique 10 N-acétyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoate de sodium N-propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoate de sodium F-butyryl—1-tyrosyl-p-aminobenzoate de sodium N-benzoyl-L-tryptophyl-p-aminobensoate de sodium H-éthoxycarbonyl-L-tyrosyl-p-ami nobenzoate de sodium 15 ÏT-benzoyl-L-tyrosyl-o-aminobenzoate de sodium H-benzoyl-L-tyrosyl-m-aminobenzoate de sodium ÏT-benzoyl—L-tyrosyl—4-amino-3-méthylbenzoate de sodium H~b enz oy1-L-leucy1-p-aminob en z o at e de sodium ÏT-benzoyl-L-méthionyl-p-aminobenzoate de sodium 20 Bien que l'isomère l.d'un peptide de l'invention soit en réalité seul clivé en présence des enzymes pancréatiques, des mélanges racémiques des peptides peuvent être utilisés sans aucune interférence avec le processus d'essai ou les résultats» Toutefois, en général, lorsqu'on utilise un mélange racémique, on doit admi— 25 nistrer une dose double du peptide. On prépare généralement les peptides intéressants dans le procédé de l'invention en bloquant tout d'abord le groupe amino de 1*amino-acide avec l'un quelconque des groupes protecteurs convenables. Diverses techniques préparatoires pour la 30 conduite de cette opération de blocage sont bien connues en pratique et peuvent être suivies dans la préparation des peptides de l'invention. Un procédé intéressant implique la réaction de 1'amino-acide avec le chlorure d'acide du groupe de blocage en présence d'un catalyseur basique ou d'un accepteur de base 35 dans un système aqueux ou non aqueux de solvants, le groupe analysable est ensuite fixé par amidation ou estérification du groupe amino-acide bloqué. Diverses techniques préparatoires qui sont 71 45587 9 2118178 ' bien connues en pratique peuvent être utilisées pour la préparation des amides et des esters. Un procédé nouveau et intéressant implique la réaction dlun anhydride mixte de l'aaino-acide bloqué avec le groupe analysable portant la fonction amino, L'anhydride mixte 5 peut avantageusement être préparé par réaction du groupe amino-acide bloqué avec le chloroformiate d*éthyle en présence d'une aminé tertiaire. Généralement, 1'anhydride mixte est ensuite amené à réagir avec un ester portant le groupe amino libre. Les techniques qui conviennent pour la préparation des peptides intéressants dans 10 la méthode d'essai/itilisant la composition de l'invention sont données dans les exemples suivants. Les esters de fluorescéine auxquels on a recours dans la méthode d'essai utilisant la composition de l'invention sont des composés bien connus, qu'on peut se procurer facilement* 15 Généralement, on prépare ces esters par réaction du sel disodique de la fluorescéine avec un chlorure d*acide convenable, Des procédés convenables de synthèse de ces esters sont décrits par J« G. Meyer-Bertenrath, "Hoppe-Soyler's Z. Physiol. Chem.", 349, 728-729 (1968), et dans les références bibliographiques citées 20 dans cet article. Parmi les esters de fluorescéine qui sont intéressants à utiliser dans cette méthode d'essai* on mentionne le dibutyrate, le dihexanoate, le diheptanoate, le dioctanoate^ le clinonancate, le didécanoate, le dilaurate, le âisyristate, le dipalmiiate de 25 fluorescéine, etc. L'essai de détermination d'une sécrétion biliaire suffisante est conduit par administration interne, généralement par voie orale, d'une dose efficace de l'un des peptides sensibles aux enzymes paneréatiques/eS'une dcse efficace de l'un des esters de 30 fluorescéine. Le peptide et l'ester peuvent être administrés simultanément ou successivement. Si le peptide et l'ester sont administrés successivement, l'un ou l'autre peut être administré le premier. Ensuite, l'urine est recueillie pendant une période convenable de temps et analysée pour déterminer la quantité du 35 fragment peptidique approprié et la quati ^ 0 j-ô x _L*izo j? ^ s o s x m s présente. On a constaté, d'une façon générale, qu'un essai correct peut être effectué lorsqu'on recueille l'urine d'environ 4 à 10 heures, et de préférence d'environ 5 à 7 heures après l'administra 71.45587 10 2118178' tion des composés d'essai. Si le pancréas secrète normalement des enzymes, la présence des enzymes pancréatiques provoque le clivage du peptide, et on récupère dans l'urine une grande quantité du résidu analysable. Si le pancréas secrète normalement-, des enzymes, 5 cependant que la sécrétion biliaire est normale, la présence d'en-, zymes pancréatiques provoque le clivage de l'ester de fluorescéine et la présence d'une quantité importante de fluorescéine libre -peut être décelée dans l'urine. Toutefois, si le pancréas sécrète normalement des enzymes, comme confirmé par la présence du. résidu . 10 peptidique analysable dans l'urine, tandis que la sécrétion"bi~ liaire est anormale, l'ester de fluorescéine n'est pas facilement clivé et on ne peut pas déceler de quantité importante de fluorescéine libre dans l'urine. En l'absence dtune fonction pancréatique normale, le peptide et l'ester de fluorescéine ne sont ni l'un ' 15 ni l'autre facilement clivés,et seule une petite quantité du -. résidu analysable ou de fluorescéine peut être décelée dans l'urine. Il y a lieu de remarquer que l'essai de détermination • . d'une sécrétion biliaire normale, au moyen de la composition de ■ " 20 l'Invention, peut être conduit dans une opération à une seule étape ou- à deux étapes j en effet, le peptide et l'ester peuvent être administrés à peu près en même temps, et la recherche du résidu analysable et de la fluorescéine peut être effectuée sur l'urine recueillie, ou bien on peut administrer le peptide, 25 recueillir l'urine et effectuer l'analyse à un moment donné, cette opération étant suivie après une période convenable de tenips (ou précédée) ds la mâaa séquence d'essai avec l'ester de flucreacéine. la quantité de peptide qu'on administre à l'animal doit 30 être suffisante pour produire un résidu analysable dans l'urine de l'animal normal. Généralement, une quantité d'environ 2 à environ 50 mg de peptide par kilogramme de poids corporel de l'animal est efficace pour la conduite de cet essai. Une gamme posologique préférée va d'environ 5 à environ 10 mg de peptide 35 par kilogramme. Chez les êtres humains, une dose d'environ 350 à environ 700 mg, par exemple mie dose d'environ 500 mg,est généralement efficace. COPY 71 45587 n 2118178 La quantité d'ester de fluorescéine que l'on administre à l'animal doit être suffisante pour produire un résidu analysable dans l'urine d'un animal normal. Généralement,, une quantité d'environ 2 à environ 50 mg de l'ester par kg de poids corporel de 5 l'animal est efficace dans la conduite de l'essai de l'invention. Une gamme posologique préférée va d'environ 5 à environ 10 mg d'ester par lcg. Chez les êtres humains, une dose d'environ 300 à environ 700 mg, par exemple une dose d'environ 500 mg, est généralement efficace. • 10 Des modes opératoires très divers peuvent être utilisés pour la conduite de l'essai de détermination d'une sécrétion biliaire suffisante selon la présente invention, le mode opératoire suivant est un exemple de ceux que l'on peut utiliser : la composition doit être administrée le matin, après un 15 déjeuner léger, exempt de matières grasses. la vessie doit être vidée avant le début de l'essai.. On administre au patient une dose orale convenable d'un peptide sensible aux enzymes pancréatiques, par exemple une' dose orale de 0,5 g pour un sujet humain, et d'un ester de 20 fluorescéine, par exemple une dose orale de 0,5 g pour un sujet humain, et on recueille toute l'urine pendant les six heures suivantes. On doit s'efforcer de recueillir un échantillon d*urine entre la cinquième et la sixième heure. De l'eau ou de la caféine peut être administrée pendant la période d'essai pour déclencher 25 la miction, mais les autres diurétiques et les médicaments doivent généralement être évités. Un repas léger sans matières grasses peut être toléré. On détermine le volume total d'urine et on réfrigère ou on congèle l'échantillon entier ou une partie aliquote, jusqurau 30 moment de l'analyse chimique. On recherche ensuite le groupe analysable et la fluorescéine dans l'urine. Par exemple, lorsque le groupe analysable e3t une aminé aromatique, on peut utiliser la méthode de Eratton-Krrshall. avec l'acide p-aminobenzoîque comrr.e témoin. 35 lorsque le groupe analysable est l'acide p-aminob enz o ïque, des individus dont la sécrétion pancréatique exocrine est normale excrètent généralement au moins 25 ?° de l'acide p-aminobenzoïque ingéré, soit environ 40 mg d'acide p-eminobenzoïque pendant la COPY 71 45587 12 2118178 période d1essai de six heures, après correction pour tenir compte de la teneur naturelle en aminés aromatiques de l'urine. La teneur naturelle peut être déterminée sur l'urine recueillie pendant six heures la veille de l'essai, ou "bien on peut choisir erbitraire-5 ment une quantité de 3 nig par six heures. La fluorescéine peut être dosée dans l'urine au moyen de la méthode de Kaffarnik et Meyer-Bertenrath ("KLin. ¥schr." 47(4):221-223, 1969) qui implique une alcalinisation de l'urine suivie d'une mesure de l'absorption à 492 nm. La teneur naturelle 10 en fluorescéine de l'urine est généralement nulle, et n'a pas à être considérée. La restitution dans l'urine de 15 i° de la fluorescéine administrée comme partie de l'ester, soit une quantité dten-viron 40 mg pendant la période d'essai, est l'indice d'une sécrétion biliaire normale. 15 La détection d'un pourcentage extrêmement faible, par exemple inférieur à 2 $ de la dose administrée dtester de fluorescéine et d'une quantité aormale du composé analysable dans l'urine, indique une insuffisance notable de la sécrétion biliaire. On peut utiliser toute méthode analytique qui permet de déterminer 20 quantitativemént la présence du groupe analysable hydrolysé [~QU dans la formule(I)ou -HHZ dans la formule (II) ] dans l*urine recueillie» Lorsque le groupe analysable est le résidu d'un acide aminob enz o ïque ou d'un acide aminobenzènesuifonique ou de l'un quelconque de leurs dérivés, la méthode de Bratton-25 Marshall, comme décrit dans "Journal of Biological Chemistry", 128+ 537 (1939) et dans "J. A. 0. A* 0*», 51, 612 (1968), constitue une technique analytique convenable. Le groupe analysable peut aussi contenir des atomes marqués* Ainsi, lorsque ce groupe 125 131 contient des atomes de I ou I , on peut utiliser un comptage 30 des rayons gamma comme méthode analytique. Le groupe analysable peut aussi être une substance colorante et sa présence dans l'urine peut ensuite être décelée par colorimétrie et par des techniques analytiques apparentées. De plus, on peut utiliser avantageusement l'une quelconque des techniques bien connues de dosage quanti-35 tatif de la fluorescéine. Les composés (peptides et esters) qui sont intéressants dans la conduite de l'essai de détermination d'une sécrétion biliaire suffisante selon la présente invention, peuvent avantageu- COPY 71 45587 13 2118178 sement être formulés et administrés sous diverses formes de compositions puar;laceutiques- Les compositiovj p havniaeeutiqucs contiennent un véhicule on ^iluv.'t non toxr'.qn-? acceptable du point de vue p]* a* •aaceutique et un ou plr.î'io'.jrD ncr.poocs uti— 5 lisos dans le .-.'^.oàe -!o^-i sol-;-. la pré.rr-.to invention. Le peptide et l'ester le fluorescéine peuvent être formulés . soit ensemble en une seule unité? coit, de préférence, séparément, en unités distinctes. On peut utiliser lui véhicule solide ou liquide. Parmi les véhicules solides que l'on peut utiliser, on 10 mentionne le lactose, la magnésie, le saccharose, le talc, la gélatine, 1'amidon, la gélose, la pectine, la gomme arabique, le phosphate de calcium, le stéarate de magnésium, l'acide stéari-que, etc. Parmi les véhicules liquides que lron peut utiliser, on mentionne un sirop, l'huile d'arachide, l'huile d'olive, 12huile 15 de sésame, l'eau, etc. Te plus, le véhicule ou dilu?nt peut contenir toute matière retardatrice connue en pratique, par exemple le monostéarate de glycéryle, le distéarate de glycéryle, etc. seul ou en combinaison avec une cire » On peut aussi formuler dans les compositions pharmaceutiques} le cas échéant, d'autres subs— 20 tances acceptables du point de vue pharmacologique telles que des édulcorants, des agents modifiant le goûty des matières colorantes, des émulsifiants, des dispersifs, des agents de mise en suspension.,, des agents épaississants, des liants? des sgents de conservation, des snti-exydants» des diluants inertes, etc. 25 Bien que la plupart des substances acceptables du point de vue pharmacologique soient inertes, il peut être avant"-eux, dans certaines circonstances, d'incorporer d'autres agents thérapeutiques dans les compositions de l'invention. Peur inhiber lîattaque des peptides par les sues gastriques, il peut r.xr»3i être avan— 50 tageux de formuler le peptide avec un anti-aeide tel que le bicarbonate de sodium ou une substance analogue .= "Les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent ordinairement environ £50 à environ 3500 mg de poptide et environ 300 à environ 3500 mg d'ester. ~Tr.e compositio- préférée contient 35 environ 350 à environ 700 mg du peptide et environ 300 à environ 700 mg de l'ester. Le composé actif représente normalement environ 1 à 95 CA du poids de la composition totale* Ordinairement, attendu COPY BAD ORIGINAL 71 45587 14 2118178 qu'il est désirable d'administrer le ou les composés actifs sous une forme assez concentrée, c'est-à-dire avec seulement la quantité de véhicule pharmaceutique nécessaire- ou convenable pour faciliter l'administration, les ingrédients actifs représentent, 5 dans la plupart des cas,une assejj forte proportion de la composition totale. Les compositions de l'invention peuvent être formulées sous l'une quelconque de formes pharmaceutiques très diverses, par exemple sous la forme d'une capsule, d'un comprimé, d'un bol, 10 d'une poudre sous emballage ou d'une suspension liquide. Par exemple, si l'on utilise un véhicule solide, la préparation peut être transformée en comprimé, placée dans une capsule de gélatine dure, sous la forme d'une poudre ou d'une pastille, ou bien transformée en une dragée ou une pastille. Si l'on utilise uq&éhicule liquide, la préparation peut être sous la forme d'un sirop, d'une solution, d'une émulsion, d'une capsule de gélatine molle, d'une ampoule ou d'une suspension liquide. Chacune de ces formulations peut être préparée à la forme posologique unitaire,, de manière aucune ou plusieurs unités contiennent une quantité de peptide 20 et/ou une quantité d'ester de fluorescéine qui conviennent pour la conduite de l'essai d'évaluation de la suffisance biliaire. Naturellement, l'importance de la dose unitaire varie avec la taille de l'animal qui doit être soumis à 1*essai. Des comprimés et capsu3.es enrobés ou non enrobés constituent les formes poso— 21" logiques unitaires préférables. Toutes les préparations pharmaceutiques de l'invention peuvent être produites au moyen des techniques classiques de la chimie phar-nacantique, par exemple par mélange, granulation et compression ou bien,à titre de variante,par mélange et dissolution 50 des ingrédients de la manière qui convient pour former le produit final désiré» l'invention, est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Sauf indications contraires, toutes les parties sort exprimées en poids et toutes les températures 35 son exprimées en degrés centigrades. 71 45587 15 2118178 •' Exemple 1 Préparation de 11 acide If-beii^oyl—L-phenylaliriir/l-p-aminobensoSque et de son gel de sodium On prépare une solution de 13,6 g cLe tertiobutylate 5 de potassium dans 100 ml de diraéthylsulfoxyde (DMSO). On ajoute à cette solution une solution de 10 g de benzoy1-L-phénylalanyl-p-aminobenzoate d'éthyle dans 50 ml de DMSO, à la température ambiante. Au bout de 5 heures, la chromâtographie en couche mince montre qu'il n'y a plus d'ester, et le mélange réactionnel est ensuite 10 versé dans un mélange de 140 ml d'acide chlorhydrique 1îT, un litre d'eau et 1,5 kg de glace. Au bout d'une demi-heure, le produit est séparé par filtration, lavé à l'eau et séché. Par recristallisation dans l'éthanol et dans l'eau,, on obtient Y g de l'acide libre, à savoir l'acide N—'benzoyl-L-phénylalanyl-p-aminobenzoïque, d'équi-15 valent neutre égal à 388 et de point de fusion égal à 245-252°0; [a]^ = +79° (1 dans le diméthylformami.de). Analyse : C io H * H" % Calculé t 71*1 5, 15 7,2 Trouvé t 70,8 5, 4 7*0 20 On prépare l'isomère DL d'une manière analogue à partir du benzoyl-DL-phénylalanyl-p-aminobenzoate d*éthyle pour obtenir une substance cristalline fondant à 248—252°C. On prépare le sel de sodium de l'acide benzoyl—L-phénylalany1—p-aminobenzoïque en neutralisent exactement l'acide libre, et en séparant le sel 25 par lyophilisation. Exemple 2 Préparation de l'acide ¥-benzoyl-l—phénylalariyl-p-aainohippurique et du sel de sodium En suivant le mode opératoire de l'exemple 1, on prépare 30 1* acide benzoyl-L-phénylalanyl-p-ar.inohippurique par hydrolyse du benzoyl-L-phénylalanyl-p-aminohippurate de méthyle. la réaction esi$ien plus rapide avec les esters hippuriques, si bien qu'elle est terminée au bout de 35 minutes à la température ambiante. Le produit fcr_d à 205-'"03°G ; [al^ = -(-70,5° 35 (1 dans le diniGtn^ylformamide) £ équivalent neutre*4c0« La forme DL est obtenue à l'état de substance solide incolore fondant à 200-202°C, l'analyse élémentaire étant correcte. Là encore, la réaction est terminée au bout de 35 minutes. 71 -45587 2118178 ' les sels de sodium des acides 1 et DL sont obtenus par neutralisation exacte des acides libres, puis sopération par lyophilisation. Exemple 3 5 Préparât Ion de 1 ' acide IT-bei~ ::o;rl-L~t;rro s.yl-u-ariinobsr.soïqiie On prépare un mélange de 13,1 g (0,1 mole) de 1-tyrosine, 7,0 g (0,05 mole) de chlorure de benzoyle et 200 ml de tétrahydro— furanne anhydre. Après agitation au reflux pendant deux heures, /035- on refroidit le mélange a la température ambiante et/separe par 10 filtration le précipité de chlorhydrate de tyrosine (11 g, 46 jailli-équivalents de Cl-). On évapore le tétrahydrofuranne et on extrait le résidu au reflux avec trois fois 100 ml de tétrachlorure de carbone qu'on jette, puis on dissout le résidu dans de l'acétate éthylique (200 tal) en éliminant par filtration les matières inso— 15 lubies. On évapore l'acétate éthylique de la solution pour obtenir 15,2 g d'un produit solide fondant à 159—162°C (93 7°)+ On récupère la tyrosine (8 g) par neutralisation avec une solution aqueuse de base alcaline, à partir du chlorhydrate. Un échantillon préparé de la même façon a un pouvoir rotatoire [«T^ à. —76° 20 (1 fo dans le diméthylformamide) . Analvse : C fi H fi N fi Calculé : 67,4 5, 3 4, ,9 Trouvé : 67,1 5, 2 4j ,8 On prépare une solution de 5,7 g (20 millimoles) de 25 ïT-benzyl-L-tyrosine et 2,04 g (20 millimoles) de IT-méthylmorpholine dans 60 ml de tétrahydrofuranne à —15°C et on ajoute à cette solution 2,08 g (20 mmoles) de chloroformiate éthylique. Au bout de 12 minutes, on ajoute 2,74 g (20 mmoles) d'acide p-aminobensoïque dissous dans 25 ml de tétrahydrofuranne et 0,38 g (2 mmoles) d'acide 30 p-toluènesuifonique et on laisse la température s'élever à 5°C. Au bout de deux heures et 40 minutes, on verse le mélange dans un litre d'acide chlorhydrique 0,1 iï froid, on agite pendant une demi—heure, on filtre et on sèche pour obtenir 8,7 g de substance fondant à 192-223°C. On recristallise le produit dons 90 ml de 35 méthanol et 40 ml d'eau pour obtenir 6 g (74 fi) d'acide lî-bensoyl-L-tyrosyl-p-arainobensoïque fondant à 240-242°C ; [a]^ = +72,3° (1 fi dans le diméthylformamide). 71 45587 17 2118178 Analyse : C fi E fi N fi Equivalent neutre Calculé s 68,3 5,0 6,9' 404 Trouvé : 68,1 5-, 1 6.7 413 Exemple J?r '•pension de l'rciJ.g '*-':gr.::oy3.-Ii-'thion>l-xî-aainobsiinoIque On ajoute 8,94 S c^e L-->'th\onine et 4#23 g&e chlorure de bensoyl© à 75 al de tétrahydrofurr -ïne et on chauffe le nu lange au reflux pendant deux heures. On refroidit le mélange, on sépare par filtx-ation le chlorhydrate de L-méthionine insoluble et on lave le résidu avec 75 tnl de tétrahydrofuranne. On refroidit la solution à -15°C et on lui ajoute rapidement 3,03 g de 17-méthyl~orpholine et 3,24 g de chloroformiate a'éthyle. Au bout de 12 minutes, on ajoute 4,11 g d'acide p-a^inooensoïque et 0,57 g d'acide p-toluène-sulfonique dissous dans 30 ral de tétranydrofurairne. Au bout de deux heures à 5°, on verse le mélange dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,1 U froid, on filtre et on recristallise dans l'acétate éthylique pour obtenir 6,4 g dtune substance solide blanche, à savoir l1 acide IT-ben:;oyl-L-méthionyl~p-aminobenzoïque, fondant à 205°C; [«= +65,7° (1 fi dans le diméthylformamide). Analyse ; C fi H fi 3ST fi S fi Calculé : 61,3 5,4 7,5 8,6 Trouvé : 61,5 5>4 7?3 8?7 Exemple 5 Préparation de l'r.oil.i •.%?-?.vt.7l—T—"vonyl— o—ariiinob?n"oJ.que" On ajouvo 13,7 g -la chlorure d'aoétyle à voie suspension de 72,4 g do I-—tyrosine dans ?0G :ul ae c et j/an/ûa'ofuranne anhydre. On agite le mélange pendant 18 heures à la température ambiante et on sépare par filuration le chlorhydrate ae tyrosine. On refroidit le filtrat à -15J0, on ajoute 20,2 g de H-méthylmorpiioiine et 21,7 g de cnloroformiate a'éthyle et on ajoute 15 minutes plus tard 27,4 g dtacide p-aainofcensoïque et 3,8 g d'acide p-toluène— sulfonique monohjrdraté. Au bout àHme demi-heure à -i5°C, on agite le mélange à 5°C pendant trois heures, puis on le ver3e dans 6 litres d'::-oide chlorhydrique 0,1 17 froid, on filtre et on sèche. On recristallise le produit brut (47 g) d'abord dans l'étha-nol, l'acétate éthylique et l'other de pétrole, puis dans une solu- COPY BAD ORsGINAL 71 45587 18 2118178 1 tion aqueuse de méthanol. Le produit recristallisé final, à savoir l'acide N-acétyl-L-tyrosyl-p-a:ninoben::,oxque (26 g), fond à 229-231°C; [«loi- c = +91,5° (1 ^ dans le diméthylformamide), équivalent de neutralisation = 367 (théorie = 342), ÏT = 7,7 $ (théorie = 8,2 f~>) « Exerrole 6 Préparation de l'acide ïï-propionyl-Ir-tyroayl-p-aminoben^oîque En suivant le mode opératoire de l'exemple 5 et en remplaçant le chlorure d'acétyle par 18,5 g de chlorure de propionyle, G on obtient 46 g de produit brut. Après deux recristallisations, comme dans l'exemple 5, le produit, à savoir l'acide N-propionyl- L-tyrosyl-p-aminobenzoxque, fond à 241-242°C ; [alotr c = +89,6 0 (1 fo dans le diméthylf ormamide) ; équivalent de neutralisation = 372 (théorie =256) j 5 Analyse : C fo . H fo ÎT f Calculé : 64,1 5*6 7,9 Trouvé : ' 63,7 5,9 7,6 Exemple 7 Préparation de l'acide N-éthoxycarbonyl~L-tyrosyl—p-aminoben- On chauffe au reflux pendant 24 heures un mélange de 36.2 g de 1—'tyrosine et de 10,9 g de chloroformiate d*éthyle dans 200 ml de tétrabydrofuranne. Après séparation du chlorhydrate de byrcsine par filtration, on refroidit la solution à -15°C et on r; lui aio-cte -C.,1 g -le îT-mét-fcylrsorpheline et 10,9 g àe chlcre-"o~iio'*>j dî'Uliylo etj, 15 minutes plus tard, 13,7 g d'r.cide p-araracc^nso 1-tvc et :>9 z (l'acide p-taluènesuifonique monohydraté, au bout '.i demi--heru.,e à -15°C, on laisse reposer la mélange oendunt 24 heures à 5°C. On le verse ensuite dans de l'eau aci-0 ïifiée -5t on extrait le précipité à consistance gommeuse dans •m litre d'acétate d'éthyle. On d-'sbydrate l'extrait sur du sulfate sr. hydre de lagné situa et or. le concentre à environ 100 ml* ?e Gui ent;raî::r la précipitation d'une substance solide. On nhatiffe la solution pour dissoudre la substance solide puis on 5 ' la refroidit à -20°C pour précipiter 20 g de produit brut. On recriatallise de nouveau ce produit dans 100 ml d'acétata éthylique» en refroidit à -20°C et on obtient 16 g d'acide IT-éhho::y- COPY BAD ORIGINAL 71 45587 19 2118178 ' c^rbonyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoïque purifie,de pouvoir rotatoire [a]^ ^ égal à +84,3° (1 f dans le clinn'thylformamide) » Analyse : C fo E f itf f Equivalent de neu- 5 tralisation Calcule : 61,3 5,4 7,5 372 Trouvé : 61,8 5,7 7,3 379- Exerrple 8 Préparation de l'acide IT-bennoyl-I-tyrosyl-4-amino-10 3 » 5-diméthrlbensoxque On dissout 4,27 g de benzoyl-L-tyrosine dans 100 ml de tétrahydrofurtmne et on refroidit la solution à -20°C. On ajoute simultanément 1,52 g de IT-méthylrnorplioline et 1,65 g de chloroformiate dtcthyle et on agite le mélange pendant 10 minutes à -15°C. 15 On ajoute à ce mélange 2,48 g d'acide 4-amino-3,5-diméthylbenzoïque et 0,28 g d'acide p-toluènesuifonique. Au bout de 48 heures à 0°C, on verse le mélange réactionnel dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,1 ÏT froid, on'sépare par filtration le précipité solide et on le recristallise dans du méthanol et de l'eau pour obtenir 4,77 g 20 d1acide N-benzoyl-L-tyrosyl-4-aaino-3,5-diméthylbenzoxque fondent à .244-248°C ; = -36,9° j équivalent de neutralisation = 426 (théorie = 432). Exemple 9 Estinction de l'essai de détermination in vivo de la sécrétion 25 biliaire On provoque chez des rats une sécrétion biliaire insuffisante ou une insuffisance de la sécrétion biliaire et de la sécrétion pancréatique exocrine, l'insuffisance biliaire est produite en ligaturant et en sectionnant le canal biliaire entre le foie 30 et le pancréas. Les rats ainsi traités seront affectés de la référence "BD1S". On produit l'insuffisance biliaire et pancréatique en ligaturant le canal biliaire commun à l'endroit où. il débouche dans le duodénum. Les rats ainsi traités seront affectés de la référence "P-BDLS". Les rats ayant subi une opération fictive 35 (laparotomie) servent de témoins. Après avoir fait jeûner les rats pendant environ 16 heures, on leur administre des doses équivalentes de fluorescéine de 3 mg/kg, sous la forme dilaurate de fluorescéine (?DL) ou de dihexanoate de copy 71 45587 20 2118178 fluorescéine (EDH) dans 0,5 ml d'huile d'olive. On leur fait absorber ensuite 6 ml d'eau ou une solution à 33 fi de bile de porc extraite des vésicules biliaires de porcs sur lesquelles on pratique des laparotomies, les rats sont replacés dans des cages à 5 métabolisme, sans accéder à la nourriture. On recueille l'urine pendant 6 heures et on y dose la fluorescéine* les rats qui ont absorbé le dihexanoate de fluorescéine de sont soumis, le lendemain, au test/ G-re'enberger-de Benneville en utilisant le peptide, comme décrit ci-dessus, pour explorer la 10 fonction pancréatique exocrine. Dans ce test, on fait absorber aux rats 31 mg de ÏST-benzoyl—L-tyrosyl-p— aminobenzoate de sodium par kilogramme, dans 1 ml d'eau plus 4 ml de ITaHCO^ à 0,5 fi* On recueille l'urine pendant 6 heures et on y dose les aminés aromatiques totales par la méthode de Bratton-Marshall. 15 le tableau suivant donne lès résultats obtenus dans ;ces essais in vivo. TABLEAU 4> Ul LT1 CO Préparation chirurgicale Nombre de rats Thérapeutique Restitution de la Restitution de PABA fluorescéine dans dans l'urine, au l'urine, ?°t au bout bout de six heures de six heures fictive 3 FBL 11,0 + 7,7 P-BDLS 2 Na-fluorés c éine 8,0 + 1,8 P-BDLS 2 FDL 0 BDLS 2 £f a.-f luo r e s c é Ine 22,3 ± 6,2 BDLS 6 PDu 0,4 +0,3 BDLS w ïTiTi -f bile 3,9 i 0,4 fictive 3 ilSI 70,2 ± 2,8 68,0 + P-BDLS o 0,3 4 0,5 4,9 + 0, ■' BDLS 2 PLil 1 , 1 ,o 80,5 ± i BDLS 3 ,?I)H + bile 4*2 ±2,1 40,2 ± 16 ' !V> a. P-BDLS - canal biliaire commxra ligaturé et sectionné pour provoquer une insuffisance prcacréatique et 'biliaire. HDIiS - canal 'biliaire ligaturé et soctioymé pour provoquer me insuffisance biliaire, mais pas d'insuffisance pancréatique& b. PABÀ acide p-aminobenzoïque. n> i—1 oo oo 71 45587 22 2118178 ' la fluorescéine libre est absorbée aisément et excrétée en présence tant de suc pancrértique que de bile. Il y a également tine excrétion de fluorescéine par des.rats ayant subi une opération fictive auxquels on a administré du dihexanoate ou 5 du dilaurate de fluorescéine. Toutefois, 1*excrétion de fluorescéine est pratiquement nulle lorsque les rats,dont la sécrétion de bile et/ou de suc pancréatique est insuffisante, absorbent des esters dialkyliques de fluorescéine. les rats., sont soumis le lendemain au test de G-reenberger-deBenne ville et les résul— 10 tats montrent que ce test est spécifique de la présence du suc pancréatique (faible restitution chez les animaux P-BD1S). les résultats donnés sur le tableau montrent l'utilité de la méthode d'essai utilisant la composition de l'invention pour évaluer une sécrétion "biliaire suffisante chez des animaux 15 dont la sécrétion d*enzymes pancréatiques est normale, lorsqu'on utilise d'autres peptides entrant dans le cadre de la formule(I) et/ou d'autres esters dialkyliques en à C^g de la fluorescéine, on obtient des résultats analogues d'évaluation de la sécrétion biliaire. 20 Exemple 10 Formulations pharmaceutiques On donne ci-après des exemples de formulations de compositions pharmaceutiques contenant un peptide sensible aux enzymes pancréatiques et un ester de fluorescéine. Dans chaque formulation, 25 les proportions des substances mentionnées sont exprimées en poids. COMPRIMES Ingrédients Parties en poids jj-benzoyl-l-phénylalanyl-p-aminobenzoate 30 de sodium 500 dilaurate de fluorescéine 500 Amidon de maïs 100 Ethylcellulose 20 Stéarate de calcium 50 35 Après mélange intime des ingrédients indiqués ci-dessus, on forme des comprimés de la manière classique, afin que chaque comprimé contienne 500 mg de peptide et 500 mg d'ester de fluorescéine. 71 45587 23 2118178 1 GAPSOIxBS Ingrédients Parties en poids N-benzoyl-1-tyrosyl-p-aminobenzoate de sodium * 500 5 Dihexanoate de fluorescéine 500 Amidon de maïs 50 Talc 50 les ingrédients indiqués ci-dessus sont agités suffisamment pour former une poudre uniforme qu'on utilise ensuite 10 'pour remplir des capsules de gélatine, du type à enveloppe dure et du type à enveloppe molle élastique. On doit choisir des capsules de dimensions telles qu'elles soient capables de recevoir une quantité suffisante de substance pour qu'il y ait 500 mg de peptide et 500 mg d'ester de fluorescéine par unité. 15 Naturellement, on peut aisément utiliser des capsules plus grandes ou plus petites pour différentes concentrations en ingrédient actif, lorsque cela est désirable ou nécessaire. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est 20 susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. 71 45587 24 2118178 ' HETOHDICAM0N3 1. Composition pharmaceutique destinée à l'évaluation de la sécrétion "biliaire chez un organisme animal, par analyse de l'urine, caractérisée par le fait qu'elle contient une quantité 5 efficace d'un peptide de formule : Q.-ITHQ'CO-Q" (dans laquelle Q est un groupe bloquant la fonction aciine, NHQ'CO est une liaison amino-acide pouvant être détachée du peptide par hydrolyse en présence d'une endopeptidase pancréatique, et Q" 10 est un groupe analysable, acceptable du point de vue pharmacolo— gique, pouvant être détaché du peptide par hydrolyse en présence d'une endopeptidase pancréatique pour donner un composé qui peut être absorbé par l'animal ét excrété par ce dernier et qui . peut être dosé dans lhirin®.) ,et une quantité efficace d'un ester 15 dialkylique en C^ à C^g de la fluorescéine, capable de libérer de la fluorescéine qui peut être dosée dans l'urine. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le peptide répond à la formule : ECO—A -NHR'CO-B -KHZ n m 20 [dans laquelle R est un atome d'hydrogènej un groupe phénylef un groupe phényle substitué avec 1 ou plusieurs atomes d'halogènes groupes alkyle en C^ à C^, groupes hydroxy, groupes alkoxy en C.j à C^, groupes alcanoyloxy en C^ à C^ ou groupes alkoxycarbonyle en C^ à C^ ; un groupe alkyle en C^ à ; un groupe alkyle en 25 C^ à C.J2 substitué Evec un ou plusieurs atomes d'halogènes, -groupes alkoxy en C^ à C^, groupes hydroxy, groupes alcanoyloxy en C^ à C^, groupes polyalkoxyalkyle ou groupes phényle ; un groupe alkoxy en C^ à C^ ; un groupe aralkoxy ayant jusqu'à 10 atomes de carbone ; ou un groupe alkylène divalent ayant 30 jusqu'à 6 atomes de carbone jHHR'CO est une liaison amino-acide dérivée de L-phénylalanine, L-tyrosine, L-leucine, L-méthionine, L-tryptophane, 1-arginine ou L-lysine j Z est un groupe de formule : 71 45587 25 2118178 YR" (dans laquelle R" est un groupe hydroxy rai groupe alkoxy en à C^, un groupe alkcxyalkoxy on à C^, un groupe dialkyl-aminoalkoxy en à C^, u^feroupe anino, un groupe monoalkylamino en à un. groupe elkylamino en 0, à C^, un groupe de f or-5 mule -NHCHgCOR" ou un sel du groupe lecuel R" est un radical hydroxy j X est un groupe de foiEmls - CO en -S02~ ; X est wx groupe hydroxy, un groupe alkyle en à 0^, un atome d'halogène ou un groupe alkoxy en C^ à j et xi* est égal 0r 1 ou 2)} À et B désignent les résidus d*amino-acides de bas poids mole— 10 culaire et m et n sont égaux à 0, 1 ou 2.]. 3« Composition suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que l'ester de fluorescéine est le dihexanoate ou le dilaurate de fluorescéine 4. Composition suivant la revendication 2, caractérisé 15 par le fait que Z est un groupe 4-oarLoxyphënyle, le sel de sodiu; de 4—carboxyphényle ou le sel d'ammonium de -1-orrboxyphényle. • . 5- Composition suivit- la reY«;i!?.2.catlea 2, caractérisée par le fait que le peptide est l*a.oMe ïT-bensoyl-Ii-. phénylalanyl-p-aminobenaoïque, l,acids îl-beraaoyl-^-t^osyl-20 p-aminobenzoïque, l'acide N-acétyl-L-tyrosyL-p-affilacbensoïquej l'acide N-propionyl-3j-tyrosyl-p* aminob en soïque ou l'aoide îMju-tyryl-Ii-tyrosyl-p-aminobenaoxqu^, leur sel de sodium ou leur sel d'ammonium.