Brevet FR2134653A1 — publié le 19721208

La présente invention est relative à de nouveaux dérivés de bléomycines portant un substituant sur l'azote ainsi qu'à leur procédé de préparation. Plus particulièrement, l'invention concerne des dérivés portant un substituant sur l'azote terminal en chaîne laté-5 raie de la 3-aminopropylaminobléomycine, de la 3—(N-4-aminobutyl)-aminopropylaminobléomycine et de la 3-(N-méthyl—N-3-aminopropyl)-aminopropylaminobléomycine ainsi qu'un procédé de préparation de dérivés de bléomycines portant un substituant sur l'azote, caractérisé en ce qu'on fait réagir de la 3-aminopropylaminobléomycine, de la 3— 10 (N-4-aminobutyl)aminopropylaminobléomycine ou de la 3-(N-méthyl-N-S-aminopropyl) aminopropylaminobléomycine sur un composé de formule R - X dans laquelle R est de l'hydrogène (sauf lorsque X représente -X ou -SO^X), un groupe alcoyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, 15 un groupe cycloalcoyle, phényle, naphtyle, aralcoyle ou un groupe fcé-térocyclique, ces groupes portant éventuellement tin substituant, et X est -C00H ou un de ses dérivés réactifs, -X (X étant un atome d'ha- 2 logène), -S0 X (X ayant la signification précitée), -NCO ou -C-0R ,2 % " (R étant un groupe alcoyle). NH 20 La 3—aminopropylaminobléomycine (I) est une bléomycine dont la chaîne latérale est une chaîne 1,3-diaminopropane. La 3-(n-4-amino-butyl)aminopropylaminobléomycine (II) est une bléomycine dont la chaîne latérale est une chaîne 3-(n-4-aminobutyl)aminopropylamine (spermidine), et connue comme "bléomycine A5'l La 3-(n-méthyl-n-3-25 aminopropyl)aminopropylaminobléomycine (III) est une bléomycine ayant un groupe n,n-bis-(3-aminopropyl)méthylamino en chaîne latérale. Ces bléomycines présentent la structure partielle figurant p.2,dans laquelle z = -nh(ch2)3-nh2 (I) -nh(ch2)3nh(ch2)4-nh2 (ii) 30 -nh(ch2)3n(ch2)3-nh2 (iii) ch3 Ces bléomycines sont des bléomycines synthétiques représentatives qu'on peut aisément préparer avec un rendement élevé en ajoutant une aminé, correspondant à la fraction aminée en chaîne latérale, à un milieu dans lequel des souches productrices de bléomycine sont 35 en culture afin de préparer la bléomycine. Les bléomycines elles-mêmes ont une activité anti-microbienne et HsH-jAjt I CH3 CH3 CH3 HO-CH -4 CH5 K> CO-EH-CH-CO-NH-CH-CH-CH-CO-NH-CH-CO en K> tn N CH—n—N OH NH W" UM-n—JN T_nTT 1 ^TvTrr^ + ï * ir 1~ ««.g. •s- CH2-NH-ÇH ÔH ^EH ^ N r* CO-Z H2NT f* HOH^O-y ' =H2A1T^ COOH COOH A*-^_/.0 OH V- 0 ——^rCH20H \j ^O^OH w OH 0C0NH2 K> tJJ 45» o Cn LU 72 15254 3 2134653 une activité anti-tumorale et sont également utilisables comme substance de départ pour la synthèse de divers dérivés de bléomycine précieux, présentant une activité anti-tumorale améliorée, une toxicité plus faible ainsi qu'une activité anti-tumorale sélective sur des 5 tumeurs de divers organes internes. A la suite de diverses recherches effectuées sur les bléomycines, la Demanderesse a maintenant découvert que le groupe amino terminal de la chaîne latérale est très réactifs et, ainsi, que les bléomycines peuvent être converties en dérivés de bléomycines carcinostati-10 ques nouveaux précieux, à l'aide de divers réactifs. La présente invention est basée sur cette découverte. On citera ci-dessous des exemples représentatifs de séquence réactionnelle pour la préparation de bléomycines portant un substituant sur l'azote, selon la présente inventions 15 la) Ib) le) Id) 20 le) If) Ig) Ih) Ii) 25 Ij) Ik) Bléomycine BLM - NH2 + BLM - NH2 + BLM - Nïï2 + BLM - NH2 + BLM - NH2 + BLM - NH2 + BLM - NH2 + BLM _ NH2 + BLM - NH2 + BLM - NH2 + BLM - NH. + Réactif R-COOH R-COX r-coor' r-con3 r-co. r-co E-CO-NJ R-CO^ r'o-co -C0 (CH ) X0 - 2 n-C0' F CH-CO^q 6^-co-^ CH-C0V Il > CH-CO R3-C-C0\ H ? CH-CO Pr oduit BLM-NH-C-R h 0 BLM-NH-C-R ii 0 BLM-NH-C-R it 0 BLM-NH-C-R h 0 BLM-NH-C-R tt 0 BLM-NH-C-R n 0 BLM-NH-C-R ii 0 BLM-NH-C-(CH„) -COOH « 2 n 0 BLM-NH-C-CHCH0-COOH n t-x 0 R blm-nh-c-ch=ch-c00h n 0 blm-nh-c-c=ch-c00h n 13 0 R 72 15254 4 2134653 r4 ,^-co hoocl_^ r4 ii) blm - nh2 + /° —* blm-nh-c0 ii) blm - nh2 + r-x III) blm - nh2 + r-so2x IV) blm - nh2 + r-nco » blm-nh-r —» blm-nh-so2-r —» blm-nh-c-nh-r It 2 0 5 v) blm - nh„ + r-c-or —» blm-nh-c-r ^ n n nh nh Dans les formules précitées, "BLM" représente le reste des bléomycines, à l'exclusion du groupe amino terminal de la chaîne la-2 térale; r et r ont les significations précitées; r' est un groupe 3 alcoyle inférieur ou un groupe phényle substitué ou insubstitué; r 10 est un atome d'hydrogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou méthylène 4 r est un atome d'hydrogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou nitro et n est un nombre entier de 1 à 7. De même, une partie des réactifs respectifs, à l'exclusion de r, correspond à x dans la formule r-x précitée. 15 Parmi ces modes de réaction, la voie la représente un procédé d'acylation directe sur l'azote des bléomycines à l'aide d'un acide carboxylique, en présence d'un carbodiimide. Les voies Ib, le, Id, le, If et Ig représentent respectivement des procédés de N-acylaoS.cn des bléomycines à l'aide d'un halogénure d'acide, d'un ester d'acide car-20 boxylique, d'un azide d'acide carboxylique, d'un anhydride d'acide carboxylique, d'un aeylimidazole et d'un anhydride d'acide mixte obtenu par réaction d'un alcoxyhaloformiate sur un acide carboxylique; Les voies Ih, Ii, Ij, Ik et II représentent des procédés de N-acyla-tion des bléomycines à l'aide d'un anhydride intramoléculaire d'un 25 diacide. Comme exemples représentatifs de composés utilisables comme réactif selon la présente invention on citera: - l'acide formique HC00H - l'acide acétique CH^COOH 30 - l'acide propionique C^H-COOH £ 5 - l'acide butyrique C^H^COOH - l'acide valérique CH^ (CH^^COOH - l'acide caprylique CH^ (CH^^COOH 72 15254 5 2134653 - l'acide laurique - l'acide crotonique - l'acide benzoïque - l'acide phénylacétique 5 - l'acide 2-naphtoîque - l'acide p-nitrobenzoîque - le chlorure d'aeétyle - le chlorure de propionyle - le chlorure de ehloroacétyle 10 - le chlorure de chloropropionyle - le bromure de bromoacétyle - le chlorure de benzoyle - le chlorure de p-nitrobenzoyle - le chlorure de phénylacétyle 15 - le chlorure de phénoxyacétyle - le cinnamate d'éthyle - le caprylate d'éthyle - le benzoyl azide - l'azide de l'acide propionique 20 - l'azide de l'acide butyrique - l'anhydride acétique - l'anhydride propionique - l'anhydride butyrique - l'anhydride octanoïque 25 - l'anhydride laurique - l'anhydride crotonique - l'anhydride phénylacétique ch3(ch2)10cooh ch3ch=chcooh /oVch2cooh ~00H COOH ch3c0c1 c2h5coci cich2coci C1CHOCH„C0C1 BrCH2C0Br C0C1 no, i®-' C0C1 (ôy-CH2C0C1 ^Q^)-0CH2C0C1 ^Q^-CH=CH-C00C?H, 2 5 ch3(ch2)6c00c2h5 c2h5oon3 c3h7c0n3 (ch3co)2o (c2h5co)2o /"ch3(ch2)2co_72o /~ch3(ch2)6co_72o ^H3(CH2)10co^20 (ch3ch=chc0)20 ( ,g>-ch2-c0)20 72 15254 2134653 - l'anhydride phénoxyacétique - l'anhydride benzoïque - l'anhydride p-nitrobenzoïque - l'anhydride nicotinique 5 - l'anhydride isonicotinique - l'anhydride furoïque - l'anhydride thénoTque - l'acétylimidazole - l'anhydride saccinique 10 - l'anhydride maléique - l'anhydride mé+hylsuccinique C0)20 m2^o)-co)2o 0-a°)2° NÔ^>-co)2O ^•0^X30^2° QLc°)2° CH3C0i.N' ch2-con 0 ch2-c0' ch-c0. Il ^ ch-co cej-ch- co^ in^-co/ - l'anhydride itaconique - l'anhydride citraconique - l'anhydride glutarique 15 - l'anhydride adipique - l'anhydride pimélique - l'anhydride subérique l'anhydride azélaïque ch =ch- co. 2 I \ ch2-c0/ ch3-c- c0x IL „> CH-CO' ^cov (ch.), y ^C0\ (CH*KC0> CCL (CH^^o^ (ch_) -CO 2 6\ 0 (ch0) c0--c0 2 7 "^co- 72 15254 7 2134653 r^V-C0\„ l'anhydride phtalique I O I ^0 co co l'anhydride 3-nitrophtalique ^2~| Q le chlorure de méthyle CH^Cl l'iodure de méthyle CH^I le bromure d'éthyle C2Hj.Br le bromure de butyle C^H^Br n CO-^ le bromure d'allyle C^^H.C^Br le chlorure de p-nitrobenzyle M^-^Q ^-CI^C le bromure de benzyle \ O /-C^Br le bromure de p-nitrobenzyle ^2-^C)~^"C'H2"frr le chlorure de méthylsulfonyle CH3S02C1 le chlorure d'éthylsulfonyle CgH^SOgCl le chlorure de benzènesulfonyle ^-S02C1 le chlorure de p-toluène suif onyle CH^-^Q^-SO^Cl le chlorure de p-chlorobenzènesulfonyle Cl-^Qi^-SO^Cl le chlorure de p-nitrobenzènesulfonyle ^2 \O r/>^VS02C1 le chlorure de p-naphtalènesuifonyle I O I O J l'isocyanate de butyle C.H N=C=0 4 7 ITisocyanate d'éthyle C2H^N=C=0 l'isocyanate de phényle ^Q^-N=C=0 l'isocyanate de cyclohexyle ^H~^-N=C=0 l'isocyanate de p-méthylphényle CH^-^Q^-N== C=0 ■ l'isocyanate d* OÉ-naphtyle ^ 72 15254 8 2134653 l'isocyanate de fi -naphtyle O O ■N=e=o le chlorhydrate du formimidate d'éthyle le chlorhydrate de 1'acétimidate de méthyle le chlorhydrate du propioimidate de méthyle le chlorhydrate de l'isobutyro-imidate de méthyle le chlorhydrate du valéro- imidate de méthyle le chlorhydrate du pélargoniimi- date de méthyle le chlorhydrate du 3-méthylamino- propioimidate de méthyle le chlorhydrate du 3-aminopro-pioimidate de méthyle le chlorhydrate du 3-diméthyl aminopropioimidate de méthyle le chlorhydrate du benzimidate de méthyle le chlorhydrate du p-méthoxy— benzomidate de méthyle le chlorhydrate du p-toluimidate de méthyle le chlorhydrate du m-nitro-benzimidate de méthyle le chlorhydrate du p—nitro- benzimidate de méthyle le chlorhydrate du phényl-acétimidate de méthyle h-c-oclh .hc1 „ 2 5 8H ch -c-och.hc1 ^ n nh 0oh -c-och_.hc1 2 5 „ 3 nh CHj ch„ ^ph-c-ocl^ .hc1 tl m ch3(ch2)3c-0ch3.hc1 nh CH^CH^ C-OCH^Cl nh ch3 nh ( ch2 ) ^-00^ . 2hc1 nh h2n(ch2)3o-och3.2hci nh ch„ ch3' n(ch2)2-c-ooh3.2hci i! nh ^O^>-C-0CH3 .HC1 nh cajo-^o^-c-oc^ .Hci nh CH,-{oVc-0CH . hc1 J \ / ff nh -c-ocïïl . \ / n io2 m (o\-c-c hc1 no .-/ÔVc-OCH . hc1 - \ / n nh /o\-ch2-c-0ch3 .hc1 nh 72 15254 9 2134653 - le chlorhydrate du m-toluimidate de méthyle - le chlorhydrate du p-toluimidate de méthyle 5 - le chlorhydrate du p-chloro- phénylacétimidate de méthyle - le chlorhydrate du p-nitrophényl acétimidate de méthyle - le chlorhydrate du cinnamoimidate 10 de méthyle - le chlorhydrate de 1' Le procédé selon la présente invention est mis en oeuvre dans un solvant choisi parmi l'eau, les alcools (par exemple le méthanol 15 et l'éthanol), les cétones (par exemple l'acétone) et leurs mélanges. Il convient de choisir le solvant en fonction du réactif utilisé. Lorsqu'on utilise comme réactif des halogénures d'alcoyle tels que l'iodure d'éthyle, des halogénures d'acyle, des halogénures d' alcoylsulfonyle, la réaction est rapide et l'utilisation de ces com-20 posés en excès provoque non seulement la mono-substitution désirée du groupe amino terminal de la chaîne latérale des bléomycines, mais encore la substitution du groupe amino intranucléaire ainsi que la di-substitution du groupe amino terminal de la chaîne latérale. En conséquence, il est habituellement préférable d'utiliser ces composés 25 à raison d'une à 1,5 mole par mole de bléomycines. Toutefois, on peut utiliser des réactifs moins actifs, qui ne provoquent pas de réactions secondaires, en une proportion pouvant atteindre environ 10 moles par mole de bléomycine. La réaction mise en jeu par la présente invention est considérée comme étant une réaction de substitution nucléophile du groupe amino terminal des bléomycines et est de préférence effectuée en milieu alcalin. Dans ce but, on peut utiliser la pyridine, le bicârbonar-te de sodium, la triéthylamine, etc.. Lorsqu'on utilise des imidates comme réactifs, il est préférable d'effectuer la réaction à un pH de 8,5 à 9,5, par addition de la substance la plus fortement basique, /ç^-C-OCRj .HCl CH3 NH C^-/oVc-0CH3 .HCl NH d-ZoVc^-C-OC^ .HCl NH N°2^}cH2-c-ocn3 .HCl NH ^C^CH=CH-C-0CH3 .HCl NH -CH -C-OCH .HCl o. i o l sh 72 15254 io 2134653 la triéthylamine. Toutefois, il faut éviter d'effectuer la réaction pendant longtemps à un pH de 10, ou plus, du point de vue de la stabilité des bléomycines. D'une façon générale, la température de la réaction peut être 5 de 10° à 25°C. Toutefois, si on utilise un réactif moins actif, il est préférable d'effectuer la réaction à 40°C environ. Par exemple, la suifonylation à l'aide de divers composés suifonyliques, à température ambiante, est menée à bonne fin en un laps de temps d'une à 4 heures^ environ. 10 Pour séparer le produit désiré, on neutralise le liquide réac- tionnel à un pH de 7 à 5 et, si nécessaire, on concentre sous pression réduite. Après ce traitement, on fait passer le liquide réac-tionnel dans une colonne remplie de CM-Sephadex C-25 (Marque pour un produit pulvérulent sec insoluble composé de perles microscopi-15 ques constituées par des composés organiques synthétiques dérivant d'un polysaccharide, le dextrane, produit et fourni par la Société Pharmacia Fine Chefticals, Inc.). Une fois adsorbé par l'adsorbant, on élue le produit de réaction à l'aide d'une solution saline aqueuse, par exemple à l'aide d'une solution de chlorure d'ammonium. On fait 20 passer la fraction d'éluat contenant le produit désiré sur une colonne remplie de carbone activé ou d'Amberlite CG-50 (marque d'une résine échangeuse d'ions, préparée et fournie par la Société Rohm and Haas Co.). Une fois adsorbé par l'adsorbant, on élue le produit à l1 aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02N (1/1 en volume) 25 ou méthanol-acide chlorhydrique 0,02N (1/1 en volume), on concentre et sèche, obtenant ainsi le dérivé désalifié d'une bléomycine portant un substituant sur l'azote. En particulier, les dérivés substitués de masse moléculaire élevée tels que la 3-(N-lauroyl)aminopropylaminobléomycine sont peu so- 30 lubies dans l'eau. En conséquence, dans ce cas, on purifie le liquide réactionnel par chromatographie, en utilisant un milieu de filtration gélifié pour solvants organiques tels que le Sephadex LH-20, le processus de désalification étant inutile. Les Idérivés obtenu^ à groupe amino ternirai portant un substituant, sont sous la forme 35 de poudre bleue, tout comme les bléomycines de départ. D'une façon générale, leurs spectres d'absorption U.V. et I.R. sont similaires à ceux des substances de départ bien que les spectres d'absorption U.T. et I.R. des dérivés contenant des chromophores particuliers tels que 72 15254 n 2134653 soient différents de ceux des substances de départ. On confirme que les produits obtenus par le procédé selon l'invention sont bien les dérivés portant un substituant sur leur groupe 5 amino terminal: par la valeur de Rf en chromâtographie en couche mince f par la différence de leur distance de migration à 1'électropho-rèse, par rapport aux substances de départ; par le fait qu'ils donnent généralement une réaction négative à la ninhydrine et par le fait que le procédé selon van Slyke indique une diminution de la te-10 neur en azote amino. Conformément au procédé selon la présente invention, on obtient les dérivés mono-substitués à titre de produit principal , ainsi qu' une petite proportion des dérivés disubstitués, suivant les conditions réactionnelles. 15 Les propriétés des chlorhydrates des dérivés de bléomycines portant un substituant sur ltazote, obtenus par le procédé selon la présente invention, sont résumées au tableap. I ci-après. Au tableau I : a Chromatographie en couche mince: 20 Adsorbant: gel de silice Système solvant : méthanol-acétate d'ammonium (solution aqueuse à 10/s - ammoniaque à 10fo (10/9/1 ) mu Distance de migration à 1'électrophorèse haute tension sur papier filtre (pH 1,9; 3000 volts) 25 xas Activité: exprimée en mcg/mg : résultats d'essais" biologiques contre Mycobacterium smegmatis 607 (valeur supérieure) et Bacillus Subtilis (valeur inférieure) /Référence: Chlorhydrate de Bléomycine A^ (exempt de cuivre) 7. TABLEAU I NO. Réactifs Dêrivés Structure de la chaîne latérale Absolution U.V. maxinum (mp) s RE (Bléomycine fie départ) Mobilité essa Réaction à la nin-lydrine "V Activité meg/rag 1 ch co. 0 ch3co>" 3-(N~acétyl)-amino propylamino bléomycine -nh(ch2)3nhcoch3 243 292 0,80 (0,64) 0,80 - 460 120 2 c„h,cox 3 0 c^co""" 3-(N-propionyl)-aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhc0c2h5 243 292 0,87 (0,66) 0,72 - 900 180 3 c h7cox c3h7co 3-(N~butyryl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhc0c3h7 240 292 0,86 (0,62) 0,71 - 1530 50 4 C7H15C% 3-(N~octanoyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch_) -nhcoc-jh, _ 15 / 1D 243 292 0,88 (0,68) 0,68 - 9600 1400 5 C11H23CQ\0 CHH23CO" 3-(N-lauroyl)~ aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhcocnh23 243 292 0,78 (0,55) 0,44 - 7560 61 6 ch3ch=chcq^ ch3ch=chco^ 3~(N-crotonyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhcoch=chch3 243 292 0,87 (0,62) 0,75 - 1850 108 7 ch -co. 1 > ch2-co^ 3-(N-succinyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhc0(ch2)2-c00h 243 292 0,85 (0,62) 0,73 - 101 • 96 8 ÇH-CO I" ^0 tH-CO^ 3-(N-maléyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3NHC0CH=CH-C00H 240 292 0,87 (0,62) 0,73 - 88 58 9 ^>0ch2c0^ och2co-- 3-(N-phënoxyacétyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2) 3NHC0CH20-^Ô^> 268 275 292 9,7,8 (0,57) 0,76 ; gr . , , . - 3500 220 NO en K> In X» NJ U> et-en ou TABLEAU I (suite) no. Réactifs Dérivés ,— * Structure de la chaîne latérale Absorption u.v. maxirrum (rap-) b Rf Bléomycine le départ) Mobilité BS3 Réaction à la nin-hydrine Activité meg/mg HHH 10 c\ (Ô^-cq/ 3-(N-benzoyl)-aminopropy1amino bléomycine -nh(ch2) 3nhco^) 238 295 0,76 (0,57) 0,77 - 1800 110 11 ®~\ n \ y (OJ-oa 3-(N-nicotinoyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3NHCO-^Ô^ 240 270 292 0,54 (0,57) 1,10 - 2200 760 12 CICKLCOv 1 0 C1CH2C0^' 3-(N-chloroacêtyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3NHC0CH2C1 243 292 0,90 (0,62) 0,70 - 760 98 13 ( "\JJ-C0) 0 s z 3-(N-thénoyl)-aminopr opylamino bléomycine -NH(CH2)3NHCO-1[s^11 • 245 275 0,87 (0,62) 0,69 - 2280 107 14 (IQLCO)2O 3-(N-furoyl)- aminopropylàmino bléomycine -NH ( CH2 ) ^CO-t^ji 292 247 0,82 (0,61) 0,68 - 1780 100 15 _ C2H5Br 3-(N-éthyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3NHC2H5 292 243 0,70 (0,63) 0,96 - 1 700 2520 16 ^o^-CH^r 3-(N-benzyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhch2- 242,5 292,5 0,76 (0,63) 0,90 - 5833 230 4 ', r r > K> tn K> en .fc» 00 K> —■ ex -Es o-u= u TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorp- tion u.v. maximum (mp) » Rf (Bléomycine ie départ) Mobilité ES) Réaction à La nin-lydrine Activité mcg/itg iBBB 17 N02- 3-(N-p-nitrobenzyl)~ aminopropylamino' bléomycine -nh(ch2) 3nhch2-^0^>-no2 246 280 0,69 (0,63) 0,95 - 1 1800 2760 18 ch3so2ci 3-(N-méthylsulfonyl) aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhso2ch3 292 0,86 (0,62) 0,73 - 501 122 19 ^c?}-so2CI 3-(N-benzënesulfonyl aminopropylamino bléomycine -NH ( CH2 ) 3NHS02-^ô^) 240 265 272 295 0,92 (0,70) 0,72 - 3500 230 20 ch3- 3-(N-p-toluène sul-fonyl)-aminopropylamino bléomycine -nh(ch2) 3nhso2-^0^)-ch3 230 290 0,77 (0,60) 0,67 - 8000 140 21 ci- 3-(N-p-chlorobenzène sulfonyl)-aminopropylaminobléomycine -NH(GH2) 3NHSO2-^Q^-ci 232 292 0,87 (0,71) 0,63 - 7010 121 22 3— (N—/3 -naphtalëne suifonyl)-aminopropylaminobléomycine -nh(ch2)3nhso2-|^|^] 228 286 0,84 (0,68) 0,64 - 4350 202 23 ^O^-N=C=0 3-(N-phénylcarbamoyl] aminopropylamino bléomycine -NH ( CH2 ) 3NHC0m-^cT) 244 283 0,79 (0,63) 0,81 - 3236 225 24 ,0-n^o 3-(N-cyclohexylcar-bamoyl)aminopropyl-aminoblêomyc ine -NH(CH2) 3NHC0NH-^ÏP) 292 243 0,78 (0,63) 0,81 - 8750 321 25 HCQC„H[. Il 2 5 NH.HC1 3-(N-formimidoyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH„) NHCH i. .3 II NH 242 292 0,58 (0,46) 0,76 - 272 74 ^ ? P ■ TABLEAU I (suite) NO. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. iriaxirtum (mp) » Rf (Bléomycine de départ) Mobilité rasa Réaction à la nin-lydrine -r Activité mcg/mg {22222 26 CHoC0CH„ 1.H01 3-(N-acëtimidoyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH„),NHCCH0 2 3 M 3 NH 243 292 0,65 (0,63) 0,96 - 1867 1080 27 C2H5C°CH3 NH.HCl 3-(N-propioimidoyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3NHCC2H5 NH 243 292 0,50' (0,46) 0,94 - 2252 986 28 C4H9C0CH3 NH.HCl . 3-(N-valéroimidoyl)-aminopropy1amino bléomycine -NH(CH2)3NHCC4Hg NH 243 292 0,78 (0,67) 0,92 - 6531 1157 29 c8h çochs NH.HCl 3-(N-pélargonimidoyl) aminopropylamino bléomycine -NH(CH„)„NHCCQH17 / J II O 1 / NH 242,5 292 0,59 (0,46) 0,86 - 29370 1443 30 -çoch3 NH.HCl 3-(N-benzimidoyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3NHC-^0^ NH 292 0,80 (0,67) 0,91 - 4423 963 31 CH,0-/ O VCOCH, ^ 1 NH.HCl 3-(N-p-méthoxy-ben-zimidoyl)-aminopropyl aminoblêomycine -NH(CH„)-NHC-( O /-OCH Ihw 247 0,60 (0,46) 0,90 - . 5230 839 32 coca3 NH.HCl, 3-(N-p-toluimidoyl)~ aminopropylamino bléomycine -NH(CH„),NHC-( O )-CH„ 2 3 UH^-7 3 241 296 0,76 (0,65) 0,190 - 7692 786 33 PH |l 3 NH.HCl 3-(N-m-toluimidoyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3nhc-^Q > NH ^CH3 290 0,79 (0,61) 0,90 ——~ 5956 789 TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maxiitum (m(4 33 RÊ (Bléomycine 3e départ) Mobilité casa r~; Réaction à la nin-lydrine Activité rrvcg/mg H 5253 34 jg)-Ç°cH m2 HH.HCI 3-(N-m-nitrobenzimi-doyl)-aminopropyl aminoblêomycine -NH(CH„)„NHC-( 0 ) 287 0,76 (0,68) 0,91 - 5790 1676 35 CH2|j0CB3 M.HCl 3-(N-phénylacé t imi-doyl)-aminopropyl aminoblêomycine -NH(CH2) 3CHCCH2^0^) . NH 243 292,5 0,76 (0,63) 0,95 - 6875 1987 36 C1-^Ô^)-CH2|Ç0CH3 NH.HCl 3- (N-p'-ehlorophényl -acé t imidoy1)-amino propylaminoblêomy-cine -NH(CH2) 3NHCCH2- 242,5 293 0,75 (0,63) 0,93 - 14975 1629 37 ( O VCH=CH-COCH0 N-/ IL 3 NH.HCl 3-(N-cinnamoimidoyl)~ aminopropylamino bléomycine -nh(ch2) 3nhcch=ch^o^) nh 245 288 0,60 (0,46) 0,90 - 9900 843 38 _ j3h.c0ch. 00 ira. hci 3- (N- ol -naphtyl-acétimidoy1)-amino propylamino bléomycine "NH(CH2)3T200 291 300 0,55 (0,46) 0,85 - 10170 1119 39 (CH_)„N(CH0)C0CH_ i Z. £. Il 5 NH.HCl 3-(N-3-Diméthylamino propioimidoyl)-aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3-NHC(CH2)2N( CH3); NH 243 : 292 0,33 (0,68) 1,18 - 1896 5145 40 CH.CO. 3 >) CH3C0 N-acêtyl bléomycine A5 -NH(CH2)3NH(CH2)4NHCOCH3 243 292 0,64 (0,21) 0,77 - 1400 340 41 CoH,C0. 2 5 0 C2H5CO^" N-Propionyl bléomycine A5 -NH(CH )3NH(CH2)4NHCOC2H5 243 292 0,66 (0,21) 0,78 — 20.00 880 TABLEAU I (suite) no. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption u.v. maxinum (mp) K> Rf (Bléomycine je départ) Mobilité as Réaction à La nin-ijdrine Activité mcg/mg BBH 42 C„H7CO. 0 C3H CO^ N-butyryl bléomycine a5 -nh(ch2)3nh(chz)4nhcoc3h? 243 292 0,66 (0,21) 0,82 - 3900 780 43 CH^CH^CO^ ch3(ch2)6co/ N-octanoyl bléomycine -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhco(ch2)6ch3 243 292 0,73 (0,23) 0,74 - 17200 2980 44 CH„CH=CHCO v 0 C^^CHCO^ N-crotonyl bléomycine -NH(CH2)3NH(CH2)4-NHCOCH=CHCH„ 243 292 0,70 (0,21) 0,78 - 4300 840 45 CH-CO. 1 /0 CH2CO^ N-Succinyl bléomycine As -NH(CH2)3NH(CH2)4-NHCO-(CH2)2COOH 243 292 0,62 (0,21) 0,79 - 200 225 46 CH-CO>. il > CH-CO N-Maléyl-bléomycirie A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4 - NHCO-CH=CHCOOH 243 292 0,66 (0,22) . 0,75 - 235 600 47 oc„2cox 0 (ô>OCH2CO^ N-Phénoxyacétyl bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4-NHCO^CH2-O-^ 268 275 292 0,65^ (0,21) 0,76 - 8500 615 48 (°>c0\ ^-co N-Benzoyl bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4-nhco-^ô^ 235 292 0,70 (0,21) 4- 0,70 ■ - 5100 680 TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maximum Cm|i) » Rf (Bléomycine 3e départ) Mobilité w Réaction à La nin-lydrine Activité rccg/wg HEH 49 n02~(ô)-c\ 0 ^co^ N-(P-nitrobenzoyl)-bléomycine a5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhc0- 247 280 0,60 (0,23) 0,76 - 16000 2300 50 co\ (o)-qx/ n-/ N-Nicotinoyl-blêomycine a5 -nh(ch2)3nh(ch2)4-nhc0-^o^) 240 292 0,68 (0,23) 0,92 - 2800 960 51 l^O^-co^ 0-«/ N-Xsonicptinoyl bléomycine a5 -nh(ch2)3nh(ch2)4-nhco-^ô^j 243 292 0,69 (0,23) 0,92 - 2700 1000 52 c1ch cov x0 cic^co^ N-Chloroacétyl bléomycine -nh(ch2)3nh(ch2)4" nhc0-ch2c1 243 292 0,74 (0,23) 0,77 - 2000 960 53 ( ^ JI-co) ,0 0 N-(2-Froyl)-blêomycine a5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhco-C35 0 248 292 0,65 (0,21) 0,74 - •4230 1090 54 A o o \ / o N-Phtalyl-bléomycine A5 -nh(ch2knh(ch2)4- nhc0-/ 0 y UOOC"^ 237 292 ' 0,71 (0,24) 0,73 MTi , - 710 2800 No. Réactifs TABLEAU I (suite) Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. rnaxinum (my) K> Rf (Bléomycine 3e départ) Mobilité Basa Réaction à La nin-lydrine Activité mcg/mg "^1 to Ln K> Cn 55 no. "0: sco//' N-4-nitroph talyl bléomycine A_ -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhco-^Q^-NQ2 hooc 238 0,64 (0,25) 0,67 390 120 56 C2H5Br N-Ethyl bléomycine A. -nh(ch2)3nh(ch 2)4nhc2h5 248 292 0,31 (0,21) 0,98 3300 7500 57 CH2=CHCH2Br N-Allyl- bléomycine A„ -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhch2~ch=ch2 243 292 0,33 (0,21) 0,95 3450 8410 58 Hv(^)-CH2Br N-( p-nitrobenzyl) - bléomycine A_ -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhch2 - no2 246 280 0,59 (0,21) 0,93 6950 3885 59 (^ JJ-co)2o N-(2(Thênoyl)-bléomycine -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhc0- ■U 245 275 0,71 (0,22) 0,78 6090 1 110 Ni OJ -fcs. O en OJ 60 CVCVl0CC\ ch3(ch2) jqco^ N-Lauroyl-blêomycine A. -nh(ch2)3nh(ch2)4-nhco-(ch2)10ch3 243 292 0,70 (0,18) 0,67 '5700 1140 61 ch3so2ci N-(Méthylsulfonyl) ■ bléomycine A„ -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhso2ch3 243 292 0,63 (0,23) 0,82 1670 680 62 »2« N-(Benzënesulfonyl)- bléomycine A. -nh(ch2) nh(ch2)4- nhso2- 240 295 0,86 (0,22) 0,78 6400 830 TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. ' maximum (mjx) B Rf (Bléomycine ie départ) Mobilité sa r~;~ Reaction à la nin-lydrine Activité meg/mg 2SS2S3 63 CH3- N-(p-Toluènesulfonyl bléomycine A5 >_-NH(CH2)3NH(CH2)4-NHSO2- 232 293 0,76 (0,24) 0,73 + 19000 1500 64 ci- N- (p-Chlorobenzène-sulfonyl )-bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- NHS02" -Cl 230 295 0,84 (0,24) 0,75 + 23000 1400 65 N-( /^-naphtalène- sulfony])- bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- NDSO2-00 230 283 0,75 (0,24) 0,71 + 26000 1500 66 C2H5N=C=0 N-(Ethylcarbamoyl)-bléomycine A5 -NH(CH2)3NH(CH2)4-NHCONHC2H5 243 292 0,73 (0,22) 0,79 + 2388 896 67 N-(Phény1carbamoy1)-bléomycine A5 -NH(CH2)3NH(CH2)4-NHCQNHH^O^) 244 287,5 0,63 ( 0,19) 0,77 + ' 4775 1100 68 N-(Cyclohexylcarba-moy1)-b1éomycine A5 -NH(CH2)3NH(CH2)4-NHCONH-^H^) 243 292 0,75 (0,22) 0,75 + 13560 1160 69 HCOC„Hc Lie? N-(Formimidoyl)-bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4-nh-c-h Ih 243 292 0,5 (0,24) 0,81 r-*1" - 11229 866 *-4 N> Ln K> en t-o O NJ OU Js» CT- en u> TABLEAU I (suite) NO. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maximum Crajji) B Rf 'Bléomycine 3e départ) Mobilité &sa Réaction à La nin-lydrlne Activité meg/mg HHH 70 CH.COCH. 3|| 3 NH.HCl N-(Ace t imidoy1)-bléomycine A5 -NH(CH2)3NH(CH2)4-NHC-CH0 L 3 243 292 0,27 (0,22) 0,91 - 3100 7425 71 C2H5g°CH3 NH.HCl N-(Propioimidoyl)-bléomycine A5 -NH(CH2)3NH(CH2)4 NH-C-C.Hc Il 2 5 NH 243 292 0,36 (0,22) 0,92 - 3186 19500 72 CH ^>CHC0CH3 CH3 IH.HCI N-(Isobutyroimidoyl) bléomycine A5 -NH(CH ) NH(CH ),- >H3 NH-C-CH L ^CH3 243 2?2 0,33 (0,22) 0,93 - 3725 17640 73 CH3(CH2)3fCH3 NH.HCl N-(Valéroimidoyl)-bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- NHC(CH„)„CH, Il 2 3 3 NH 243 292 0,43 (0,22) 0,95 - 10180 15870 74 CH,(CH ) COCH, 3 2 7 n 3 NH.HCl N-(Pélargonimidoyl) bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4 NHC(CH ) CH, Il ^ / J NH 243 292 0,49 (0,19) 0,90 - 25500 8950 75 NH.HCl N-(B enz imidoy1)-bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- NH 235 (S: 292 0,39 (0,22) 0,94 - 5199 12900 76 CH3°-(Ô)-S0CII3 NH.HCl N-(p-Mé thoxyb enz- imidoyl)- bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- BHir\°)"0CH3 NH 248 292 0,45 (0,22) 0,97 ' rr. 6500 9265 k) un n> Cn -fc» k> OU! 4=» o" en u> TABLEAU I (suite) no. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maximum (mp) B Rf (Bléomycine 3e départ) Mobilité Réaction à la nin-lydrine —^ Activité mcg/mg 77 CV NH.HCl N-(p-Toluimidoyl)-bléomycine S ~nh(ch2)3nh(ch2)4- nhc-/o)-ch3 iIH 240 292 0,43 (0,23) 0,88 - 11890 10462 78 (Dr™3 CH— NH.HCl N-(m-Toluimidoyl)-bléomycine S -nh(ch2)3nh(ch2)4- NH ^CH3 235(s) 291 0,42 (0,18) 0,89 - 10876 13330 79 ( O Vc0CH„ l.hcx N-(m-Ni trob enz imi-doyl)-bléomycine a5 -nh(chjj«ï(ch2)4- NH ^ no? 243 288 0,32 (0,22) 0,87 - 9750 17612 80 (ô)-ch2!;och3 NH.HCl N-(Phénylacët imidoy]) bléomycine a5 -nh(ch2)3nh(ch2)4-nhc-ch2-(^) NH 243 292,5 0,42 (0,22) 0,98 - 1 1 700 20900 81 cl-/ o )-ch„c0ch„ \_/ 2lj 3 NH.HCl N-(p-Chlorophény1-acétimidoyl)-bléomycine A,. -nh(ch2)3nh(ch2)4- NH|-CH2-^0^-C1 nh 242,5 292 ;5 0,40 (0,22) 0,97 - 18920 23660 82 n°2-(ô)-ch2{j0ch3 NH.HCl N-(p-Nitrophényl- • acëtimidoyl)-bléomycine A,. -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhc-ch2~^O^-n02 nh 246 283 0,31 (0,22) 0,91 - 17600 24380 83 / o Vch=chcoch3 NH.HCl N-(Cinnamoimidoy1)-bléomycine a5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- nhc-ch=ch-/ o ) îh ^ 247 287 ■ 0,44 (0,22) 0,89 r r i — 12240 8450 TABLEAU I (suite) NO. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maxinum (mp) B Rf (Bléomycine 3e départ) Mobilité ssa Réaction à la nin-lydrine r- "r Activité meg/mg HHH 84 /CH COCH 03 fc-DC1 -naphtylacêt-imidoyl)-bléomycine A5 -nh(ch2)3nh(ch2)4- k @o) 242,5 272 281 288 0,34 (0,22) 0,93 13000 8265 85 CH3 ^N(CH„)0COCH„ / 2 Z|l 3 CH3 NH.HCl N-(3-dimëthylamino-prppioimidoyl)-blêomycine A5 -nh(ch2)3nh(chg)4- NHÇ-(CH_)?N^* 3 L CH3 243 292 0,095 (0,20) 1,10 - 1690 13760 86 CH CO. 0 CH3CO^ 3-(N-Mêthyl-N-3-acêtylaminopropyl)-aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3-NHC0CH3 3 242 292 0,58 (0,30) 0,82 - 1050 800 87 C2H5C° c2h5co-^ 3-(N-Mêthyl-N-3-propionylaminopro-pyl)-aminopropyl aminobléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3NHCOC,H5 ™3 242 292 0,52 (0,24) 0,79 - 1710 525 88 ch3(ch2)]0c°xo ch3(ch2)10co-' 3-(N-Mëthyl-N-3-lauroylaminopropyl) -aminopropylaminobléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3- ch3 NHCOCjih23 242 292 0,58 (0,24) 0,69 - 19000 1100 89 CH-CO. t > CH2C0 ^ 3-(N-Mëthyl-N-3-succinylaminopjcopyl) aminopropylaminobléomycine -nh(ch2)3ij(ch2)3-ch3 NHCO(CH2)2COOH 243 292 0,64 (0,30) 0,85 - 90 68 90 CH-CO. Il > CH-CO 3-(N-Mêthyl-N-malêyl aminopropyl)-aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3-ch3 NHC0CH=CH-C00H 235(S) 292 0,61 (0,26) 0,83 r «t ■.. i - 320 1250 TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maxitrum (mp) b Rf (Bléomycine Je départ) Mobilité ses Réaction à la nin-nydrine Activité mcg/mg efhs 91 CI\ 3-(N-Méthyl -N-3-benzoylaminopropyl)-aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3-/—\ï nhco- 235 292 0,61 (0,30) 0,86 - 5620 1340 92 €>c\ co/ 3-(N-Méthyl -N-3- nicotinoylamino- propyl)- aminopropylaimino bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3-ch3 nhco-( o ) N 292 0,48 (0,24) 0,88 2000 570 93 C1CH2C0C1 3-(N-Méthyl -N-3-chloroacëtylamino-propyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3-ch3 NHC0CH2C1 242 292 0,48 (0,24) 0,80 - 1200 700 94 ' 1], Jt-CO )20 3-(N-Méthyl-N-3-thénoylaminopropyl)-aminopropylamino-bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3-CH3 „aco-0 s 245 275 0,58 (0,26) 0,77 - 6800 1170 95 no2 -( o )\co ^ 3-TN-Méthyl-N-(3-nitrophtalyl)-aminopropyl /-aminopropylaminobléomycine -NH(CH0).N(CH.) -2 3 i 2 3 ch3 no^ MHCO -\Q ) COOH 237 287 0,58 (0,26) 0,73 - 320 65 96 'H o o O O \ / O 3-(N-më thy1-N-3-phtalylaminopropyl)-aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3- CH3 nhco-Zo) COOH 292 0,57 (0,24) 0,74 - 620 680 TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maximum (mu) k) Rf (Bléomycine ie départ) Mobilité sb Réaction à la nin-aydrine Activité! mcg/mg 8hb 97 (Ô)-S02C1 3-(N-Méthyl-N-3- benzènesulfonyl- aminopropyl)- aminopropylamino bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3 CH3 NHSO^ 272 292 0,59 (0,22) 0,72 '* 6700 1500 98 Ci-^SO^ 3-(N-Méthyl-N-3-p-chlorobenzènesulfony aminopropyl)-aminopropylaminobléomycine -NH(CH2)3ljI(CH2)3-' CH3 NHS02-^0^-C1 292 0,65 (0,26) 0,69 - 17700 1400 99 ch3^)_sq2ci 3-(N-Méthyl-N-3-p- toluënesulfonyl- aminopropyl)- aminopropylamino- bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3-CH3 NHS02- 292 0,74 (0,30) 0,73 - 10000 1250 100 CHoC0CH_ 3(| 3 NH.HCl 3-(N-Méthyl-N-3- acétimidoyl- aminopropyl)- aminopropylamino- bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3- CH3 NHCCH„ Il 3 NH 242 292 0,24 (0,23) 0,96 - 3640 6750 101 (Ql-CÏ Ç°CH3 NH.HCl 3-(N-Méthyl-N-3-phénylacétimidoy1-aminopropyl)-aminopropylamino-bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3- CH3 NH 242 292 0,37 (0,26) 0,96 12750 7800 / — TABLEAU I (suite) NO. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maxinum (mfx) B Rf (Bléomycine fie départ) Mobilité BSEi Réaction à la nin-lydrine Activité rrcg/mg BHB 102 ci ~^Q^~ ch2 coch3 NH.HCl 3-(N-Méthyl-N-3-p-chlorophényl-acétimidoylaminopro-pyl)-aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3ij(ch2)3-ch3 nhc-ch2-/O Vci nh 292 0,32 (0,22) 0,89 - 19000 14000 103 N02- 3-(N-Méthyl-N-3-p- nitrobenzylamino- propyl)- aminopropylamino bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3-ch3 nhch2-^q^)-no2 246 279 0,58 (0,23) 0,95 + 7050 3500 104 CH2=CHCH2Br 3-(N-Méthyl-N-3-allylaminopropyl)-aminop ropy1amino-bléomycine -NH(CH2)3N(CH2)3-CH3 NHCH2CH=CH2 243 292 0,33 (0,21) 0,94 + 3400 7600 105 ^ H^-N=c=0 3-(N-Méthyl-N-3- cyclohexylcarbamoyl- aminopropyl)- aminopropylamino-*- bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3- 3 nhconhh^H^ 243 292 0,77 (Û,23) 0,76 + 11500 1052 106 ^ CH -CO. CH„ 0 ^ch2-co^ 3-(N-Méthyl-N-3- glutaryl-amino- propyl)- aminopropylamino-bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3- ^H3 NHC0(CH2)3C00H 243 292 0,66 (0,30) 0,83 - 1 16 79 107 CH0 CH-CO. f .0 CH^OT 3-(N-Méthyl-N-3- méthylsuccinyl- aminopropyl)- aminopropylamino- bléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3- CH3 NHCOCTLCH-COOH 2I CH3. 243 292 0,65 (0,29) . 0,82 ;r 170 220 TABLEAU I (suite) No. Réactifs Dérivés Structure de la chaîne latérale Absorption U.V. maximum (mfA) B Rf (Bléomycine ie départ) Mobilité ess Réaction à la nin-lydrine Activité meg/rng HHH 108 ch„=chchc0v 1 > CH2C0^ 3-(N-Méthyl-N-3-i t acony1aminop r opy1) -aminopropylaminobléomycine -nh(ch2)3n(ch2)3-CH3 nhcoch chc00h z 1 ch 243 292 0,69 (0,30) 0,82 - 230 315 Téjnoin 3-Aminopropylamino-blêomycine -nh(ch2)3nh2 243 292 1 + 1850 1800 Témoin Bléomycine A,. -nh(ch2)3nh(ch2)4nh2 243 293 1 + 2100 17000 Témoin 3-(N-Méthyl-N-3-aminopropy])-aminopropylamino-bléomycine -nh(ch2)3-n(ch2)3nh2 CH3 243 292 + 1900 12500 >-4 bo en K3 Cn JC» to •H KJ ■mS Ul .fc* o-en u> 72 15254 28 2134653 Les spectres d'absorption IR de sept nouveaux dérivés représentatifs, obtenus par le procédé selon la présente invention, sont représentés au dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple, dans lequel: 5 - la Fig.1 représente le spectre d'absorption IR de la 3-(N- benzyl)-aminopropylaminobléomycine (No. 16), - la Fig.2 représente le spectre d'absorption IR de la 3-(N-benzènesulfonyl)-aminopropylaminobléomycine (No. 19), - la Fig.3 représente le spectre d'absorption IR de la N-acétyl 10 bléomycine A,. (No. 40), - la Fig.4 représente le spectre d'absorption IR de la N-suc-cinylbléomycine A,. (No. 45), - la Fig.5 représente le spectre d'absorption IR de la N-(cyclo hexylcarbamoyl)-bléoraycine A^ (No. 68), 15 - la Fig.6 représente le spectre d'absorption IR de la 3-(N- méthyl-N-acétimidoylaminopropyl)-aminopropylaminobléomycine (No.100) - la Fig.7 représente le spectre d'absorption IR de la 3-(N-méthyl-N-p—chlorophénylacétimidoylaminopropyl)-aminopropylaminobléo-mycine (No. 102). 20 (Ci-dessus, les nombres entre parenthèses représentent le numér du composé figurant au tableau précité). Les dérivés de bléomycines portant un substituant sur l'azote obtenus par le procédé suivant la présente invention ne présentent pas de points de fusion, de décomposition ou d'ébullition nets et 25 inhibent les bactéries gram-positives et gram-négatives, et ont une activité anti-tumorale. De plus, ils sont solubles dans l'eau et le méthanol aqueux, forment des sels avec les acides et des produits de chélation avec le cuivre, donnent une réaction positive dans les réactions de Pauly, Ehrlich, Dragendorff et au permanganate, mais don-30 nent une réaction négative dans les réactions de Molish, Biuret, Elson-Morgan, Maltol, Fehling, Tollens, Anthrone et au chlorure fer-rique. Dans l'infrarouge, les dérivés de bléomycines portant un substituant sur l'azote présentent une zone d'absorption aux nombres d' ondes suivants: 1040-1075 cm"\ 1710-1735 cm"\ 1625-1680 em~^ et -1 35 2910-2940 cm . Ils sont caractérisés en outre par le fait qu'ils donnent, par hydrolyse acide, la L-thréonine, l'acide 2'-(2-amino-éthyl)-2,4'-bithiazole-4-carboxylique ainsi que chaque composé aminé correspondant à la portion en chaîne latérale. 72 15254 2134653 Comme le montre le tableau ci-dessus, beaucoup des nouveaux dérivés obtenus par le procédé selon la présente invention présentent une activité antimicrobienne plus élevée, vis-à-vis de Mycobacterium smegnatis 607 et Bacillus subtilis que les bléomycines de départ, et 5 ils ont également uneffet anticaneéreux tout-à-fait remarquable vis-à-vis du cancer expérimental à ascite d' Ehrlich chez les animaux. En outre,cela permet d'empêcher la dégradation enzymatique du groupe amino terminal de la chaîne latérale des bléomycines de départ. De plus, la 3-(N-succinyl)aminopropylaminobléomycine, la 10 3-(N-aeétyl)-aminopropylaminobléomycine, la N-succinylbléomycine A^, la N-acétylbléomycine A,. et la 3-(N-méthyl-N-3-succinylaminopropyl)-aminopropylaminobléomycine ne présentent pas de meilleure activité anticancéreuse dans les essais sur animaux précités, mais présentent un accroissement de coefficient chimiothérapeutique (DL^q/DEcq) par 15 comparaison avec la 3-aminopropylaminobléomycine et la bléomycine A,, comme témoins, du fait de leur plus faible toxicité. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Exemple 1 20 Synthèse de la 3-(N-crotonyl)aminopropylaminobléomycine On dissout 100 mg de chlorhydrate de 3-aminopropylaminobléomycine dans 5 ml de méthanol# On ajoute,à la solution, 0,12 ml de py-ridine et 116 mg d'anhydride crotonique, en agitant. On laisse le mélange reposer à température ambiante pendant 24 heures. On concentre 25 le liquide réactionnel sous pression réduite. On dissout le résidu dans une petite quantité d'eau. On fait passer la solution sur une colonne remplie d'une suspension de 23 ml de Sephadex CM C.25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le 30 produit à l'aide de chlorure d'ammonium aqueux 0,1M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit cherché, puis on les fait passer sur une colonne remplie d'une suspension de 7 ml de carbone actif dans l'eau, afin d'adsorber le produit cherché. Après lavage à l'eau, on élue le produit adsorbé par l'adsorbant à l'aide d'un mélange acé-35 tone-acide chlorhydrique 0,02M (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec, obtenant ainsi 85,9 mg de 3-(N-crotonyl)-aminopropylaminobléo-mycine (ayant une activité de 1850 mcg/mg à 1'encontre de Mvcobacte-rram smegmatis 607). Rendementî 82$. 72 15254 2134653 Exemple 2 Synthèse de la 3-(N-phénoxyacétyl)-aminopropylaminobléomycine On dissout 1 g de 3-aminopropylaminobléomycine dans un mélange de 13 ml d'eau et 120 ml d'acétone. On ejoute à la solution 400 mg 5 de bicarbonate de sodium et 780 mg de chlorure de phénoxyacétyle, en agitant. On laisse le mélange reposer à température ambiante pendant 4,5 heures. On ajuste le pH du mélange à- tuae valeur de 4,5 par addition d'acide chlorhydrique, on concentre le mélange sous pression réduite et on filtre le concentré. On fait passer le filtrat sur une 10 colonne remplie d'une suspension de 120 ml de Sephadex CM C-25 dans du chlorure d'ammonium aqueux 0,02M afin d'adsorber le produit cherché. Après adsorption sur l'adsorbant, on élue le produit par le chlorure d'ammonium aqueux 0,1M. On recueille la fraction d'éluat contenant le produit cherché, et on la fait passer sur une colonne 15 remplie d'une suspension de 150 ml d'Amberlite0S-50(-type H)dans l'eau afin d'adsorber le produit cherché, puis on lave successivement à l'aide de 750 ml d'acide acétique à 0,5$ et à l'aide de 750 ml d'eau. Après adsorption sur l'adsorbant, on élue le produit par un mélange acide chlorhydrique 0,02N-méthanol (1/1 en volume). On concentre 1* 20 éluat à sec sous pression réduite, obtenant ainsi 390 mg de 3-(N-phénoxyacétyl)-aminopropylaminobléomycine (ayant une activité de 3500 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607) . Rendement : 35,4$. On répète la réaction précitée, en remplaçant le chlorure de 25 phénoxyacétyle par 359 mg de chlorure de chloroacétyle, obtenant ainsi 438 mg de 3-(N-chloroacétyl)aminopropylaminobléomycine (ayant une activité de 760 mcg/mg contre Mycobacterium smegmatis 607). Rendement : 41,5$. Exemple 3 30 Synthèse de la 3-(N-butyrvl^-aminopropylaminobléomycine On dissout 100 mg de 3-aminopropylaminobléomyeine (base libre) dans 2 ml d'acétone et 0,5 ml d'eau. On ajoute à la solution 1 ml de solution acétonique contenant 20 mg d'azide de l'acide butyrique préparé à partir d'hydrazide de l'acide butyrique. On laisse le mélange 35 reposer à température ambiante pendant 14 heures, puis on le chauffe k 40°C pendant 40 minutes. On concentre le liquide réactionnel sous i pression réduite. On ajoute au résidu 10 ml d'eau. On fait passer le mélange sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex 72 15254 2134653 CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Après adsorption sur l'adsorbant, on élue le produit successivement au chlorure d'ammonium aqueux 0,1 M et au chlorure d'ammonium aqueux 0,2M. On recueille la fraction d' 5 éluat contenant le produit cherché, on traite de la même manière que dans les exemples précités, afin de désalifier le produit. On obtient ainsi 38 mg de 3-(N-butyryl)aminopropylaminobléomycine (ayant une activité de 1480 mcg/mg à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 36$. 10 Exemple 4 Synthèse de la 3-(N-propionvl)aminopropylaminobléomycine On dissout 100 mg de chlorhydrate de 3-aminopropyl aminobléomy-cine dans un mélange de 3 ml d'acétone et 2 ml d'eau. On ajoute à la solution 14 mg de 1-éthyl-3-diméthylaminopropylcarbodiimide et 10 mg 15 d'acide propionique. On ajuste le pH du mélange à 4,8 et on laisse le mélange reposer pendant 16 heures. On concentre le liquide réaction-nel sous pression réduite. On ajoute au mélange 10 ml d'eau. On fait passer le mélange sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C—25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 20 0,02N, afin d'adsorber le produit cherché. Après adsorption sur 1' adsorbant, on élue le produit à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1 M. On recueille la fraction d'éluat contenant le produit cherché, on la fait passer sur une colonne remplie de 20 ml d'Amberlite CGf-50 25 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé par 1' adsorbant, on lave le produit successivement à l'eau (100 ml), à 1' aide d'une solution aqueuse d'acide acétique à 0,5$ (100 ml) et à lr eau (100 ml), puis on élué à l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02N (1/1 en volume). On concentre 1'éluat à sec sous pres-30 sion réduite, obtenant ainsi 28 mg de 3-(N-propionyl)aminopropylamino bléomycine (ayant une activité de 900 mcg/mg à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 26,5$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 2 ci-après. 35 Au tableau 2, ainsi qu'aux tableaux 3 à 12 suivants, l'activité exprimée en mcg/mg concerne l'activité des composés à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607. TABLEAU 2 No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité j utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de réaction heures 3epha-iex CM (ml) :IMÎ4 Rendement Activité mcg/mg 1 3-(N-Acëtyl^minopropyl -aminobléomycine 100 mg Me 0H 5 ml CH CO. CH3CO ^ 0,11 ml Pyridine 0,14 ml 24 23 0,1M 50,6mg 49% 460 2 3-(N-PropionylXminopropyl -aminobléomycine 100 mg Me 0H 5 ml C2H5CO-p C2H5C0 ^ 0,12 ml Pyridine 0,08 ml 5 15 0, 1M 50,5mg 48% 900 3 3-(N-Butyryl)-aminopropylaminobléomycine 1 00 mg Me OH 5 ml C3H7CV0 C3H7CO-/ 0,22 ml Pyridine 0,24 ml 4 23 0, 1M 75,5mg 72% 1530 4 3-(N-Octanoyl)-aminopropy1-iminoblêomycine 100 mg MeOH 5 ml C7H15CO C?H CO^ 0,5 ml Pyridine 0,15 ml 5 2/3 20 0,1-0, 2M 5 6, 4mg 52% 9600 5 3-(N-Lauroyl)-aminopropyl-aminobléomycine 100 mg Me OH 5 ml C1.H23C\ CllH23CO 314 mg - 6 (ébul-li-tion) 20® - 38,4mg 34% 7560 6 3-(N-Crotonyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg feOH 5 ml CH CH=CHC0 CH3CH=CHC0/ 11 6 mg Pyridine 0,12 ml 3 23 0, 1M 85,9mg 82% 1850 7 3-(N-Suceinyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml CH CO 1 y CH2C0^ 100 mg Pyridine 0,1 ml 4 20 0, 1M 58 mg 53,9% 101 8 3-(N-Maléyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml CHC0v Il Xo CHCO / 52 mg Pyridine 0,1 ml 3 30 0,1M 7 3, 4mg 68% 88 TABLEAU 2 (suite) No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de réaction ïieure$ Sepha-âex CM (ml) SINH4 Rendement Activité mcg/mg 9 3-(N-Phénoxyacétyl)-amino-propylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml 0CH2C0 (o)-och2co/ 100 - 24 (50°C) 20 0,1-0,2M 31 mg 25,5% 3500 10 3-(N-Benzoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml (o)-^ ,7.« Pyridine 0,05 ml 3 1/3 22 0,1M 35, 5mg 33% 1800 11 3-(N-Nicotinoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml 0-con \ / 176 mg Pyridine 0,15 ml 4 15 0,2M 51, lmg 47% 2200 12 3-(N-Thénoyi)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml ( jl-CO) 0 S 125 mg Pyridine 0,1 ml 3 24 0,1M 66mg 61% 2280 13 3-(N-Furoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml (u jl-co) 0 Q 620 mg Pyridine 0,48 ml 48 23 0,05-0,1M 41, 7mg 39%. 1780 Au liquide réactionnel on ajoute 5 fois son volume d'éther. On recueille le précipité résultant par filtration et on le dissout dans le n-butanol. On fait passer la solution sur une colonne de 20 ml de Sephadex LH 20 afin d'adsprber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit à l'aide de n-butanbl. K> LU ■fc» O Cn U> 72 15254 34 2134653 Exemple 5 Synthèse de la 3-(N-benzyl)aminopropylaminobléomycine On dissout 200 mg de chlorhydrate de 3-aminopropylaminobléomycine dans un mélange de 4 ml d'eau et 12 ml d'éthanol. On ajoute à 5 la solution 0,1 ml de triéthylamine, et on ajoute 73,5 mg de bromure de benzyle, en agitant. On laisse le mélange reposer à température ambiante pendant 26 heures, puis à 3°C pendant 48 heures. On concentre le liquide réactionnel, puis on le fait passer sur une colonne remplie d'une suspension de 50 ml de Sephadex CM C-25 dans une solu-10 tion aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit à, l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M. On recueille 270 ml de la seconde moitié de l'éluat qu'on fait passer sur une colonne remplie de 35 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le 15 produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on lave le produit successivement à l'eau (175 ml), à l'acide acétique à 0,5$ (175 ml) et à l'eau (175 ml), puis on élue à l'aide d'un mélange acide chlorhydrique 0,02N-méthanol (1/1 en volume). On recueille 147 ml de la seconde moitié de l'éluat (volume total : 217 ml) et on neutralise 20 au Dovex 44 (Marque d'une résine échangeuse d'ions préparée et fournie par la Société Dov Chemical Co.). Après traitement, on concentre l'éluat sous pression réduite et on sèche, obtenant ainsi 80 mg de 3-(N-benzyl)-aminopropylaminohléomycine (activité de 5833 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 37,2$. 25 Exemple 6 Synthèse de la 3-(N-p-toluènesulfonvl)-aminopropylaminobléomvcine On dissout 100 mg de chlorhydrate de 3-aminopropylaminobléomycine dans un mélange de 2,5 ml d'eau et 4 ml d'acétone. On ajoute à la solution 20 mg de bicarbonate de sodium, et on ajoute 28,4 mg de 30 chlorure de p-toluènesulfonyfe, en agitant. On laisse le mélange réagir à température ambiante pendant 2 heures 2/3. On neutralise le liquide réactionnel et on le fait passer sur une colonne remplie d' une dispersion de 5 ml d'Amberlite IRA 400 (type Cl) dans l'eau, puis on lave la couche de résine à l'eau (10 ml). On réunit l'éluat de la 35 résine et les lavages et on fait passer sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit à l'aide de 139 ml ^4^ -; ■ 72 15254 35 2134653 d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M. On recueille 76 ml de la seconde demi—fraction de l'éluat, et on fait passer sur une colonne remplie de 10 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. On lave la couche de résine successivement à 1' 5 eau (50 ml), à l'acide acétique à 0,5$ (50 ml) et à l'eau (50 ml) et on élue à l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02N (1/1 en volume). On concentre l'éluat sous pression réduite et on le sèche, obtenant ainsi 52,8 mg de 3-(N-p-toluènesuifonyl)-aminopropylaminobléomycine (activité de 8000 mcg/mg à 1'encontre de Mycobaete-10 rium smegmatis 607). Rendement: 47$. En opérant comme décrit ci—dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 3 ci-après (page 36). Exemple 7 Synthèse de la 3-(N-phénylcarbamoyl)aminopropylaminobléomvcine 15 On dissout 200 mg de chlorhydrate de 3-aminopropylaminobléomyci- ne dans 10 ml d'eau. On ajoute à la solution 60 mg de bicarbonate de sodium, puis on ajoute, goutte à goutte, en agitant, 0,04 ml d'isocya-nate de phényle. On laisse le mélange réagir à température ambiante pendant 7 heures, puis on fait réagir à 3°C pendant 40 heures. On 20 ajuste le pH du liquide réactionnel à 3 et on filtre. On fait passer le filtrat sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C—25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'am-25 monium 0,1 M. On recueille 125 ml de la seconde moitié de l'éluat (volume total: 215 ml) et on fait passer sur une colonne remplie de 30 ml d'Amberlite CCr—50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on le lave successivement à l'eau (150 ml), à l'aide d'acide acétique à 0,5$ (150 ml) et à 1* 30 eau (150 ml) puis on élue à l'aide d'un mélange acide chlorhydrique 0.02N-acétone (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec, sous pression réduite, obtenant ainsi 90 mg de 3-(N-phénylcarbamoyl)aminopropylaminobléomycine (activité de 3566 mcg/mg à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 41,6$. 35 On répète la réaction précitée en remplaçant ledit isocyanate de phényle par 0,06 ml d'isocyanate de cyclohexyle, obtenant ainsi 40 mg de 3-(N-cyclohexylcarbamoyl)aminopropylaminobléomycine (activité de 8751 mcg/mg à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607) avec un I no TABLEAU 3 NoJ Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Tertps de réaction heures Sephadex CM (ml) :]HH4 Rendement Activité mcg/mg 1 3-(N-Ethyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg EtOH 3 ml ^0 1,5 ml C2H,_Br 15 mg Et3N 0,025 ml 16 15 0, 1M 19mg 18,6% 1700 2 3-(N-p-Nitrobenzyl)-aminopropylaminobléomycine 500 mg H20 10 ml EtOH 30 ml »02- Et3N 0,25 ml 3,5 30(50° Ç) 70 0,1- 0, 2M 90 mg 16,2% 11800 3 3-(N-Méthylsulfonyl)-aminopropylaminobléomycine 200 mg H20 2 ml Acétone 2 ml CH3S02C1 20 mg NaHC03 40 mg 10 20 0, 1M 29, 4mg 28% 501 4 3-(N-Benzènesuifonyl)-aminopropylaminobléomycine 200 mg H20 2,5 ml Acétone 4 ml ^O^)-S02Cl 34 mg NaHC03 20 mg 1 ^ 60 35 0,1M 89,7mg 41% 3500 5 3-(N-p-Chlorobenzènesulfonyl) -aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2 ml Acétone . 4 ml Cl-(5)-S02Cl 13,7 mg NaHC03 20 mg 3,5 17 0, 1M 49,7mg 43,9% 7010 6 3-(N-/3-naphtalënesulfonyl)-iminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2 ml Acétone 4 ml |^^JS02C1 17,6 mg NaHC03 20 mg 2 20 0,1M 34,9mg 30,5% 4350 Ln k> Ln Vjl) ON k> ca -t» o Ln u» 72 15254 37 2134653 rendement de 18,3$. Exemple 8 Synthèse de la 3-(N-benzimiaoyl)aminopropylaminobléomycine On dissout 100 mg de chlorhydrate de 3-aminopropyl&minobléomy-5 cine dans 25 ml d'eau. On ajoute à la solution 25 mg de chlorhydrate de benzimidate de méthyle, en agitant. On ajuste le pH du mélange à 9,2 par addition de triéthylamine. On maintient le mélange à température ambiante pendant 5 heures. On concentre le liquide réactionnel et on ajuste le pH du concentré à une valeur de 6,2. Une fois trai-10 té, on fait passer le concentré sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1 M. On recueille les fractions 15 d'éluat contenant le produit, et on les fait adsorber sur 5 ml de carbone actif. On lave le produit adsorbé à l'eau et on élue à 1' aide d'un mélange acide chlorhydrique 0,02N-acétone (1/1 en volume). On concentre l'éluat sous pression réduite et on le sèche ensuite, obtenant ainsi 45 mg de 3-(N-benzimidoyl)aminopropylaminobléomycine 20 (activité de 4423 mcg/mg à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 40,9$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise le synthèse des composés figurant au tableau 4 ci-après (pages38 et 39). Exemple 9 25 Synthèse de la N-chloroacétylbléomycine A_ On dissout 1 g de chlorhydrate de bléomycine A,. dans un mélange de 13 ml d'eau et 20 ml d'acétone. On ajoute à la solution 520 mg de bicarbonate de sodium et 330 mg de chlorure de chloracétyle, en agitant. On laisse le mélange reposer pendant une heure trois—quarts. 30 Puis on ajuste le pH du mélange à 4,5, par addition d'acide chlorhydrique. On élimine l'acétone par distillation sous pression réduite. On dilue le résidu à l'eau et on le fait p&sser sur une colonne remplie d'une suspension de 110 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorlber le produit cher-35 ché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, ©n l'élue successivement à l'aide de 220 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M et à l'aide de 580 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,2M. On recueille les fractions contenant le produit TABLEAU 4 NO. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Terrps de réaction lieure$ Sephadex CM (ml) :INH4 Rendement Activité mcg/mg 1 3-(N-Acétimidoyl)-aminopropylaminobléomycine 600 mg H20 15 ml CH„C0CHo 90 mg 3 |l 3 NH.HCl TriÉthyl aminé (pH 8,9) 10 50 0,1-0, 25M 320mg 50% 1867 2 3-(N-Formimidoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 5 ml HC-0C2H5 164 mg NH.HCl Et N (pH 9,25) 142 ' 20 0,02-0, 2M 73,8mg 70,9% 272 3 3-(N-Propioimidoyl)-amino-p ro py1aminob1é omy c ine 100 mg H20 2,5 ml C„H C-OCH 66 mg -Ml NH.HCl Et3N (pH 9,4) 5 20 0,02-0,2M 53,5mg 50,4% 2252 4 3-(N-Valéroimidoy1)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2,5 ml C4H9jj-°CH3 22 mg NH.HCl Et3N (pH 9,4) 2 20 0, 1M 35 mg 32,3% 6531 5 3-(N-Pélargonimidoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2,5 ml Acétone 2 ml C8H17Ï'°CH3 3 mg NH.HCl Et3N (pH 9,1). 3 20 0,05-0, 1M 22mg 19,7% 29370 6 3-(N-Benzimidoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2,5 ml (^>C.0CH3 25 mg NH.HCl Et3N (pH 9,2) 5 20 0, 1M 45mg 40,9% 4423 7 3~(N-p-Méthoxybenzimidoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 5 ml CH„0-(O VC.OCH» 3 W |j 3 54,5 mg NH.HCl Et3N (pH 9,3) 6,5 20 0,02-0,1M 76 mg 68,1% 5230 8 3-(N-p-Toluimidoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2,5 ml Acétone 1 ml CH3-(^)-c,qcH3 25 mg Ih.hci Et3N JpH 8,9) 5 20 0, 1M 40mg 35,9% 7692 9 3-(N-m-Toluimidoyl)aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2,5 ml Acétone 1 ml (0 ^-C-0CH3 27mg CÎH3 NH.HCl Et3N (pH 9,1) 5 20 0, IM 50mg 44,8% 5956 TABLEAU 4(suite) No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de réaction ieure^ Sephadex CM (ml) :MÎ4 Rendement Activité mcg/mg 10 3-(N-m-Nitrobenzimidoyl)-ami no p ropy1ami nofc1éomyc ine 100 mg H20 2,5ml Acétone 1 ml ( O Vc-0CH3 30 mg Ih.hci 2 Et3N (pH 9,2) 23 20 0,1M 40 mg 35,3% 5790 11 3-(N-Phénylacé t imidoy1)-aminopropylaminobléomycine 200 mg H20 5 ml (^>CH2-C-OCH3 60 mg NH.HCl Et3N (pH 9,0) 5,5 20 0,1M 70mg 32,4% 6875 12 3-(N-p-Chlorophénylacét-imidoyl)aminopropylaminobléomycine 300 mg H20 7 ml Cl-(^)-CH2ÇOCH3 190 mg NH.HCl Et3N (pH 9,1) 5 60 0,1-0,15M lOOmg 29,2% 14975 13 3- (N-CinnamoiHiidoyl) -aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 ' 2 i 5 ml Acétone 1 ml ( O VcH=CH-C-0CH„ V_/ || 3 NH.HCl 60 mg Et3N (pH 9,1) 24 20 0,02-0,2M 80,9mg 72,7% 9900 14 3-(N- C^-napht y 11 acétimidoy]) -aminopropylaminobléomycine 100 rng H20 3 ml Acétone 3 ml ^ iH2rocH3 (oTolNH,HC1 105 mg Et3N (pH 9,1) 29 20 0,02-0,3M 51,6mg 45,3% 10170 15 3-(N-3-Dimêthylaminopropio-imidoyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg H20 2,5 ml CH„ J"^N(CH) -C-OCH GH3 JSH.HCI 88 mg X— Et3N .(pH 9,0) 22 20 0,1-0,2M 30 mg 27.27 1896 -^1 K5 Un K) Cn 4* OJ vo K> U> ■£=» O Ln u» 72 15254 40 2134653 cherché et on désalifie comme décrit ci-dessus, à l'aide d'Amberlite CCr-50. On concentre l'éluat à sec, obtenant ainsi 439,6 mg de N-chloracétylbléomycine A,. (activité de 2000 mcg/mg à 1'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 41,7$. 5 En opérant comme décrit ci-dessus, on obtient, à partir de chlorure de p-nitrobenzoyle, la N-(p-nitrobenzoyl)bléomycine A^ (activité de 16000 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607), avec un rendement de 17,7$. Exemple 10 10 Synthèse de la N-octanoylbléomycine A.. On dissout 100 mg de bléomycine A^ dans un mélange de 2 ml d' éthanol et 0,5 ml d'eau. On ajoute au mélange 50 mg de caprylate d' éthyle et on maintient le mélange à 37°C pendant 16 heures. Une fois la réaction terminée, on élimine le solvant par distillation sous 15 pression réduite. On ajoute au résidu 10 ml d'eau. On extrait le mélange par 10 ml d'éther. On fait passer la couche aqueuse sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02îï, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on 20 élue successivement à l'aide de 120 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M et à l'aide de 44 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,3M. On recueille les fractions contenant le produit cherché, puis on désalifie à l'aide d'Amberlite CG-50. On concentre à sec l'éluat 25 obtenu à partir du résidu, obtenant ainsi 28,2 mg de N-octanoyl bléomycine A,. (activité de 17200 meg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 25,5$. Exemple 11 Synthèse de la N-propionylbléomycine A„ 30 On dissout 100 mg de bléomycine A^ dans un mélange de 2 ml d' acétone et 0,5 ml d'eau. On ajoute à la solution 1 ml de solution acétonique contenant 10 mg d'azide de l'acide propionique préparé à partir d'hydrazide de l'acide propionique. On laisse le mélange reposer pendant 24 heures. 35 Une fois la réaction terminée, on élimine l'acétone par distil lation sous pression réduite. On ajoute au résidu 10 ml d'eau. On fait passer le mélange sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d' 72 15254 41 2134653 ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on l'élue successivement à l'aide d' une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M et à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,2M. On recueille les frac-5 tions contenant le produit cherché et on désalifie de la manière décrite ci-dessus, à l'aide d'Amberlite CG-50. On concentre l'éluat résultant à sec, obtenant ainsi 21,4 mg de N-propionylbléomyciiie A= (activité de 2000 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendements 20,6$. 10 Exemple 12 Synthèse de la N-acétvlbléomycine A.- On dissout 1 g de chlorhydrate de bléomycine A,. dans 50 ml de méthanol. On ajoute à la solution 0,78 ml de pyridine et 0,58 ml d' anhydride acétique, en agitant. On laisse le mélange réagir à tempé-15 rature ambiante pendant 5 heures. Puis on concentre le mélange réactionnel sous pression réduite. On dissout le concentré dans une petite quantité d'eau. On fait passer la solution sur une colonne remplie d'une suspension de 110 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le 20 produit cherché. On élue la bande d'adsorption bleue, contenant le produit cherché, à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,2M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit, et on les fait passer sur une colonne remplie avec une suspension de 70 ml de carbone actif dans l'eau, afin d'adsorber le pro-25 duit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on le lave à l'eau et on élue à l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02N (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec, obtenant ainsi 552,3 mg de chlorhydrate de N-acétylbléomycine A,. (activité de 1400 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). 30 Rendement: 53,6$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 5 ci-après (pages 42 à 44). TABLEAU 5 NO. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Terrps de ré-c actior heures Bepha-iex CM (ml) ;XNH4 Rendement Activité mcg/mg 1 N-Propionylbléomycine A,. 200 mg 5 MeOH 10 ml C„H COv > C2H5OK 0,15ml Pyridine 0,13 ml 2,5 40 0,2-0,4M 107, 1 mg 51,5% 2000 2 N-Butyrylbléomycine AR 200 mg MeOH 10 ml C3H7co^O C3H7C0^ 0,34ml Pyridine 0,24 ml 0,75 30 0,1-0,2M 117,3 mg 55,9 % 3900 3 N-Octanoylbléomycine A,. 100 mg 5 MeOH 5 ml C7HI5C°\0 C7H15CO/ 295 mg Pyridine 0,1 ml 23 20 o,i- 0,3M 56,4 m{ 51 ,0% 17200 4 N-Crotonylbléomycine A,. 200 mg MeOH 10 ml CH„CH=CHC0 X0 C^CH-CHCO^ 0,22 ml Pyridine 0,17 ml 1 30 0,1- 0,2M 100,9 mg 48, 1% 4300 5 N-Succinylbléomycine A,. 100 mg MeOH 5 ml CH.COv 1 y CH^O^ - 20 mg Pyridine 0,1 ml 2,5 20 0,1M 70 mg 65,5% 200 6 N-Maléylbléomycine A^ 250 mg MeOH 10 ml CH-C0\ 1! > CHrCO^ 87 mg Pyridine 0,12 ml 2,5 40 0,1-0,5M r. 133,3 mg 49,8% » 235 TABLEAU 5 (suite) No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de ré-c action heures Sepha-lex CM (ml) :]MÎ4 Rendement * Activité mcg/mg 7 N-Phénoxyacétylbléomycine A5 300 mg MeOH 10 ml (Ô}och2co 0 1,13 g (q)-och2«X - 52 (37°C) 55 0,1-0,2M 83 mg 25,3% 8500 8 N-Benzoylbléomycine A_ 200 mg 5 MeOH 10 ml (°>c\ 0 323 mg ^ô^-co^ Pyridine 0,17 ml 1 30 0,1-0,5M 118,5 mg 55,2% 5100 9 N-(p-Nitrobenzoyl)-bléomycine A,-100 mg H20 4 ml Acétone- 4 ml 0 77 mg no2-/O\-co/ NaHC03 50 mg 1,75 20 ' 0,1-0,3M 18,7mg 17,7 % 16000 10 N-Lauroylblëomycine A,. 100 mg MeOH 5 ml CE3 P 191 mg CH3(CVlOCO Pyridine 0,06 ml 5,5 (65°C) 20 o,i- 0,5M 39, 7mg 35, 1% 5700 11 N-Nicotinoylblëomycine A_ 200 mg MeOH 10 ml N. CO^j 236 mg çr- Pyridine 0,23 ml 4 40 0,1-0,3M 137,3 mg 63,9% 2800 1?. N-Isonicotinoylbléomycine A5 200 mg MeOH ,10 ml /Ô>c°\ —0 236 mg /oYco' Pyridine 0,23 ml 6 40 0,1~ 0,3M 120,0 mg 55,2% 2700 --4 K> No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité 1 utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Tertps de réaction heure§ Sephadex CM (ml) :INH4 Rendement Activité mcg/mg 13 N-(2-Furoyl)-b lêomyc ine A,. 100 mg MeOH 10 ml ( ^ ^-C0),0 368 mg 0 Pyridine 0,3 ml 28 22 O,I- 0,3M 5 6,5mg 52,9% 4230 14 N-(2-Thénoyl)-jléomycine A_ 300 mg MeOH 5 ml ( ^Y^~C0)2° 307 mg Pyridine 0,24 ml 4,5 55 0,1-0,5M 233,1 mg 72,0% 6090 15 N-Phtalylbléomycine A_ 200 mg MeOH 10 ml ÊO 146 "8 Pyridine 0,17 ml 1,5 35 0,05-0, 1M 133,7 mg 60,5% 710 16 N-4-Nitrophtalyl-blêomycine A_ 200 mg MeOH 10 ml h°€C> Pyridine 0,21 ml 3>5 50 0, 1M 117,2 mg 51,5% 390 72 15254 2134653 Exemple 13 Synthèse de la N-bu.tyrylbléomycine A.. On dissout 100 mg de chlorhydrate de bléomycine A,. dans un mélange de 3ml d'acétone et 2 ml d'eau. On ajoute à la solution 12 mg 5 de chlorhydrate de 1-éthyl-3-diméthylaminopropylcarbodiimide et 8 mg d'acide butyrique. On ajuste le pH du mélange à 4,7 puis on laisse le mélange reposer pendant 16 heures. On concentre le liquide réactionnel à environ le tiers de son volume initial, sous pression réduite» On ajoute au concentré 10 ml d'eau. On fait passer le mélange sur une 10 colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois ads«rbé sur l'adsorbant, on élue le produit à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M. On recueille les fractions contenant le produit cherché et on 15 fait passer sur une colonne remplie de 20 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on Jave le produit successivement à l'eau ($00 ml), à l'acide acétique k 0,5$ (100 ml) et à l'eau (100 ml), puis on élue à l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02 N{1/1 en volume). On 20 concentre l'éluat à sec, obtenant ainsi 32 mg de BT-butyrylbléomycine A,_ (activité de 3900 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Exemple 14 Synthèse de la N-fp-nitrobenzvl)bléomycine A,. On dissout 1 g de chlorhydrate de bléomycine A^ dans un mélange de 20 ml d'eau et 60 ml d'éthanol. On ajoute à la solution 0,58 ml de triéthylamine, puis on ajoute 600 mg de bromure de p-nitrobenzyle, en agitant. On fait réagir le mélange à température ambiante pendant 35 heures. On concentre le liquide réactionnel et on sépare les substances insolubles par filtratioa. Une fois concentré, on fait passer le liquide réactionnel sur une colonne remplie d'une suspension de 150 ml de Sephadex G-25 dans l'eau, afin d'adsorber le produit cherché. On jette 35 ml de la première partie des fractions d'éluat, at on fait passer 27 ml de la dernière partie des fractions sur une colonne remplie de 50 ml de Sephadex CM C-25, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on l'élue successivement à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M 72 15254 46 2134653 et à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,25M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit cherché et on désalifie à l'aide de carbone actif. On concentre la solution qui en résulte, obtenant ainsi 120 mg de chlorhydrate de K-(p-nitrobenzyl) 5 bléomycine A^ (activité de 6950 mcg/mg a l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 11$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 6 ci-après (page 47). Exemple 15 10 Synthèse de la N-fméthylsulfonyl)bléomycine A.. On dissout 100 mg de chlorhydrate de bléomycine A^ dans un mélange de 4 ml d'acétone et 8 ml d'eau distillée. On ajoute à la solution 160 mg de bicarbonate de sodium, puis on ajoute 104 mg de chlorure de méthanesuifonyle, goutte à goutte, en agitant. On fait réagir le mé-15 lange à température ambiante pendant 19 heures. On neutralise le liquide réactionnel puis on le fait passer sur une colonne remplie d* une suspension de 5 ml d'Amberlite IRA 400 (type Cl) dans l'eau distillée, afin d'adsorber le produit cherché. Après adsorption sur 1* adsorbant, on lave le produit à l'eau distillée (10 ml). On réunit 20 le produit d'élution de la résine et les lavages. On fait passer le mélange sur «ne colonne remplie d'une suspension de 20 ml.de Sephadex G-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M afin d' adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on é&» le produit successivement à l'aide de 200 ml d'une solution aqueuse 25 de chlorure d'ammonium 0,1M et à l'aide de 78 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,2M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit cherché et on fait passer sur une couche de 5 œl d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. On lave la couche de résine successivement à l'eau (25 ml), à l'acide acé-30 tique à 0,5$ (25 ml) puis à l'eau (25 ml), puis on élue ensuite le produit cherché à l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02N (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec, obtenant ainsi ainsi 16,2 mg de chlorhydrate de N-(méthylsulfonyl)bléomycine A^ (activité de 1670 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607) 35 avec un rendement de 15,3$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 7 ci-après (page 48). TABLEAU 6 No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de réaction heures Sephadex CM (ml) C1NH4 Rendement Activité mcg/mg 1 N-Allylblêomycine 200 mg EtOH 4 ml H20 1,6 ml CH2=CHCH2Br 60 mg Et3N 75 mg 16 25 0,1M 0,25M 70 mg 34% 3450 2 N-Ethylblëomycine A^ 200 mg EtOH 4 ml H20 1,6 ml C2H5Br 27 mg Et3N 50 mg 8 25 0,1M 0,25M 84 mg 41,5% 3300 TABLEAU 1 No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité • utilisée) Tertps de réaction heures Sephadex CM (ml) :wiA Rendement Activité mcg/mg 1 N-Benzènesulfonyl-blëomycine A,. 200 mg H20 3 ml Acétone 4 ml @-S02Cl 34,6mg NaHCO^ 20 mg 19 30 0,1- 0,2M 27,6mg 12,6% 6400 2 N-(p-Toluènesulfonyl)-bléomycine A,. 200 mg H20 4 ml Acétone 4 ml CH3- NaHC03 60 mg 22 20 0,1-0,3M 19,5mg 8,8% 19000 3 N-(p-Chlorobenzênesulfoïiyl)-dléomycine A,. 200 mg H20 3,5 ml Acétone 4 ml Cl-^O^)-S02Cl 45 mg NaHC03 40 mg 24 40. 0,1-0,2M 75,9mg 33,8%: 23000 4 N-(/^-Naphtalënesulfonyl)-bléomycine A_ 200 mg H20 3 ml Acétone 4 ml so2ci (o) 47 mg (oS NaHC03 40 mg 4,25 50 0,1-0,2M 47, lmg 20,7 % 26000 "-4 K> C/i K> UT -fc* •N 00 IO U» 45» O» Lrt u* 72 15254 49 2134653 Exemple 16 Synthèse de la N-(éthylcarbamovl)bléomvcine A^ On dissout 200 mg de chlorhydrate de bléomycine Adans 10 ml d' eau. On ajoute a la solution 60 mg de bicarbonate de sodium, puis on 5 ajoute 0,1 ml d'isocyanate d'éthyle, en agitant, goutte à goutte» On fait réagir le mélange à température ambiante pendant 4 heures 1/3. On filtre le liquide réactionnel. On ajuste le pH du filtrat à 4. Puis on fait passer le filtrat sur une colonne remplie de 30 ml de Sephadex CM C—25, afin d'adsorber le produit cherché. TJne fois adsor-10 bé suri'adsorbant, on élue le produit successivement à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M et à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,25M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit cherché et on désalifie à l'aide de carbone actif. On obtient ainsi une solution qu'on concentre, ce qui 15 donne 100 mg de chlorhydrate de N—(éthylcarbamoyl)bléomycine A^ (activité de 2388 mcg/mg à l'encontre ie Mycobacterium smegmatis 607) Rendement: 28,6$. v On opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 8 ci-après (page 50). 20 Exemple 17 Synthèse de la N-(acétimidovl)bléomycine A,. On dissout 600 mg de chlorhydrate de bléomycine A^ dans 15 ml d* eau. On ajoute à la solution 90 mg de chlorhydrate d'acétimidate de méithyle. On ajuste le pH du mélange à 8,8 par addition de triéthylami— 25 ne. On agite le mélange à température ambiante pendant 4 heures puis on concentre au tiers du volume initial. On ajuste le pH du concentré à 4. On fait passer le liquide réactionnel sur une colonne remplie de 60 ml de Sephadex CM C-25 afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit à l'aide de 417 30 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,3M, et on fait passer 320 ml de la seconde aoitié de l'éluat sur une colonne contenant 40 ml de carbone actif. On lave la couche carbonée h l'eau et on élue à l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique G,02N (1/1 en volume). On concentre l'éluat, obtenant ainsi 410 mg de chlorhydrate de 35 N-(acétimidoyl)bléomycine (activité de 3100 meg/mg h l'en contre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 65$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 9 (pages 51 et 52). TABLEAU 8 No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité j utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de ré-actior heures Sephadex CM (ml) :INH4 Rendement Activité itcg/mg 1 N-(Phénylcarbamoyl)-bléomycine A 500 mg H20 2 ml ^Q^-N=C-0 0,08 ml NaHC0'3 120 mg 6 50 0,1-0,15M 80mg 15% 4725 2 N-(Cyclohexylcarbamoyl)-bléomycine A,. 200 mg H20 10 ml ^~H~^-N=C=0 0,05 ml NaHC03 60 mg 1 1/3 30 0,1- 0,25M 60mg 27,5% 13560 tableau 9 No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Tettps de ré-c actior heures 3epha-: lex CM (ml) *nh4 Rendement Activité mcg/mg 1 N-(Propioimidoyl)-bléomycine A,. 100 mg H2° 2,5ml C..H_C»0CH_ 2 5|| 3 NH.HCl 44mg Et3N (pH 9,1) 6,25 15 0,25M 70 mg 66% 3186 2 N-( Isobu tyro imidoy 1 )--bléomycine A„ 100 mg «2° 2,5 toL CH ^C-0CH, nH S \\ 3 3 NH.HCl Et3N (pH 9,4) 6,75 ' 15 0,25M 60mg 56% 3725 3 N-(Valéroimidoyl)™ bléomycine A 100 mg «2° 2,5 ml CH„(CHJ_C.0CH, 3 2 3 h 3 NH.HCl 21 mg Et3N (pH 9,4) 2 20 0,25M 75 mg 75% 10180 4 N-(Pélargonimidoyl)-blëomycine A,. 100 mg H2° Acétone 2,5 ml 2 ml CHQ(CH,)7C.0CH-3 2 7,| 3 NH.HCl 30 mg Et3N (pH 9,0) 2 20 0,25M 52mg 46,6% 25500 5 N-(Benzimidoyl)-bléomycine A,. 200 mg H2O 5 ml (O Vc.0CH„ \__y II 3 NH.HCl 50 mg Et3N (pH 9,1) 7 30 • 0,1-0,4M 130mg 62,5% 5199 6 N-(p-Mé thoxyb enz imidoy1 ) -bléomycine A-100 mg h2o 5 ml CH3°- -fi-0CH3 NH.HCl 54,5 mg Et3N (pH 9,4) 6,5 15 0,25M 80mg 71,7% 6500 7 N-(p-Toluimidoyl)-léomycine A,. 100 mg I2° Acétone 2,5 ml 1 ml CH3-®>-f-OCH3 NH.HCl 50 mg Et3N (PH 9,1) 4 20 0,25M 65mg 65% 11890 a N-(m-Toluimidoyl)-b lêomyc ine A,. 100 mg h2o Acétone 2,5 ml 1 ml 0T-. ^ NH.HCl 27 mg Et3N (pH 9,1) ¥ 5 20 D, 25M 53mg 47% 10876 9 N-(m-Nitrobenzimidoyl)-bléomycine A_ 100 mg V 2,5 ml £>rs / NH.HCl N02 32 mg EtN (pH 9,0) 20 15 0,1- 0,25M 60mg 53,8% 9750 TABLEAU 9 (suite) No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Tertps de réaction heures Sephadex CM (ml) 21NH4 Rendement Activité mcg/mg 10 N-(Phénylacétimidoyl)-bléomycine A_ 200 mg H20 5 ml (ô)-CH2Ç.OCH3 NH.HCl 60 mg Et3N ■ (pH 9,0) 20 20 0,25h>. lOOmg 45,3% 11700 11 N-(p-Chlorophénylacétimidoyï -bléomycine A-100 mg H20 2 ml Acétone 2 ml CI-^q^-CH2Ç.OCH3 NH.HCl 60 mg Et3N (pH 9,3) 3,5 28 0,25M 70mg 61,9% 18920 12 N- (p-Nitrophénylacétimidoyl)-bléomycine A_ 100 mg H20 2,5 ml Acétone 2,5ml »°2-(o)-CH2C.ÛCH3 ,37 NH.HCl mg Et3N (pH 9,3) 50 20 0,25M 60mg 50,9% 17600 13 N-(C innamo imidoyl)-blêomycine A_ 100 mg H20 2,5 ml Acétone 1,5 ml ■ NH.HCl Et3N (pH 8,8) 16 20 0,25M 70mg 62,6% 12240 14 N-(oi -Naphtylacétimidoyl)-bléomycine A,. 100 mg H20 5 ml Acétone 5 ml —jh2.j.0çh3 [ 0 fo J NH.HCl 105 mg ' Et3N (ptt 9,5) 9 2/3 14 . 0,25M 80mg 70,2% 13000 15 N-(3-Diméthylaminopropio-imidoyl)-bléomycine A. 100 mg H20 5 ml CH3 J N(CH,),C.0CH, caf 2!H 3 .2HC1 240 mg Et3N ' (pH 9,2) 28 40 0,25-0,5M 90mg 41,4% 13760 16 N-(Formimidoyl)-bléomycine A. 100 mg H20 2,5 ml h-c-ocuh- NH.HC1 82 mg Et3N (pH 9,2) • 124 15 0,25M 30mg 28,8% 1229 72 15254 2134653 Exemple 18 Synthèse de la 3-(N-méthyl-S-sgccinylaminopropyl)aminopropylaminobléomycine On dissout 200 mg de chlorhydrate de 3-(N-méthyl-K=3—aminopro-5 pyl)aminopropylaminobléomycine dans 10 ml de méthanol. On ajoute à la solution 0,14 ml de pyridine, puis on ajouts 85 mg d'anhydride succinique, en agitant* On agite le mélange à température ambiante pendant 2,5 heures. On concentre le liquide réactionnel sous pression réduite. On dis--10 sout le résidu dans l'eau. On fait passer la solution sur une colonne remplie d'une suspension de 40 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbl sur l'adsorbant, on élue le produit successivement à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure 15 d'ammonium 0,1M et à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure d* ammonium 0,2M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit cherché et on fait passer sur une colonne remplie de 30 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, 20 on le lave successivement à l'eau (150 ml), à l'acide acétique à 0,5$ (150 œl) et à 1' eau (150 ml) et on élue à 1* aide d'un mélange acide chlorhydrique 0,02N —acétone (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec sous pression réduite , 25 obtenant ainsi 166,9 mg de 3—(N-méthyl-N-3-succinylaminopropyl)-aminopropylaminobléomycine (activité de 90 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607 ) avec un rendement de 77,9$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la syn-30 thèse des composés figurant au tableau 1© ci-après (pages 54 et 55). TABLEAU 10 No. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Terrps de réaction îeures Bepha-iex CM (ml) :IMÏ4 Rendement Activité mcg/mg 1 3-(N-Mëthyl-N-3-acëtylami-nopropyl)-aminopropylamino-bléomycine 200 mg MeOH 10 ml CH COi ^0 0,12ml CH3or Pyridine 0,23 ml 3,5 39 0,1-0,2M 165,5 mg 80,3% 1050 2 3-(N-Méthyl-N-3-propionyl-aminopropyl)-aminopropyl-aminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml C H.C0 0 0,12 ml C2H5CO^ Pyridine 0,15 ml 3 20 0,1-0,2M 8I,8mg 78,7% 1710 3 3-(N-Méthyl-N-3-lauroyl-aminopropyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml CH(CH) ca N) 270 mg ^«"VlO00 Pyridine 0,11 ml 2,5 (reflux) 20 o,i- 0,2M 67,7mg 60,0% 19000 4 3-(N-Méthy1-N-Maléy1-aminopropy1)-amino-propylaminobléomycine 100 mg MeOH " 5 ml CH-CQ Il > CH-CO/ 70 mg Pyridine 0,28 ml 2,5 20 0,1M 75mg 65,5% 320 5 3-(N-Méthyl-N-benzoylamino-propyl)-aminopropylaminobléomycine 200 mg MeOH 10 ml \ (&/ 320 ^ Pyridine 0,23 ml 2,5 40 0,1-0,2M 167mg 77,8% 5620 6 3-(N-Méthyl-N-nicotinoyl-aminopropy1)-aminopropy1-aminoblêomycine 100 mg MeOH 5 ml ^"C\ ,75 «g Qco/ Pyridine 0,15 ml 3,5 20 0,1-0,2M 88, lmg 82,6% 2000 --4 K> Ln K> en U) 4». KJ> LU -Ê* O Ln u> TABLEAU 10 (suite) NO. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Terrps de ré-c action leures 3epha-îex CM (ml) :MÎ4 Rendement Activité mcg/irg 7 3-(N-Méthyl-N-3-thêrioyl-aminopropyl)-amino propylaminoblêomycine 200 mg MeOH 10 ml ( Cl-co>2o ^ 340 mg Pyridine 0,35 ml 2,5 30 0,1-0,2M 150mg 70% 6800 8 3-^~N-Méthyl-N-3-(3~nitro-phtalyl)-aminopropyl_/-aminopropylaminobléomycine 200 mg MeOH 10 ml n°2T£ycN) \^C0-^ 275 mg Pyridine 0,23 ml 2 35 0,1M 121,9 me 53,6% 320 9 3-(N-Méthyl-N-phtalylamino-propyl)aminopropylaminobléomycine 200 mg MeOH 10 ml 0C> 2,0 " Pyridine 0,23 ml 2 35 0,1M 165,2 mg 74,7% 620 10 3-(N-Méthyl-N-3-glutaryl-aminopropyl)-aminopropylaminobléomycine 200 mg^ MeOH 10 ml , CH„-C0v Ch£ 4 ^0 100 mg /xCH2-CO^ Pyridine 0,14ml 4 40 0,1-0,2M 140 mg 64,8% 110 11 3-(N-Méthyl-N-3-méthyl-succinylaminopropyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml CH.-CH -CO. 3 | 0 CH2-C0x Pyridine 0,1 ml 6 20 o,i- 0,2M 63mg 58,3% 170 12 3-(N-Méthyl-N-3-itaconyl-aminopropyl)-aminopropylaminobléomycine 100 mg MeOH 5 ml CH„»CH-CH -COv | ^0 CH2-C0^ Pyridine 0,1 ml » 6 20 o,i- 0,2M 52 mg 47,8% 230 •nJ K> en K> en ui VI K) —a LKJt -fca> O Cr» Ul» 72 15254 se 2134653 Exemple 19 Synthèse de la 3-(N—méthyl-N-benzènesulf onylamino'pro'py^-amino'pro'pylaminobléomycine On dissout 100 mg de chlorhydrate de 3-(N-méthyl-N-3-aminopro-5 pyl)aminopropylaminobléomycine dans un mélange de 2 ml d'acétone et 7,5 ml d'eau. On ajoute à la solution 200 mg de bicarbonate de sodium et 47 mg de chlorure de benzènesuifonyle, en agitant. On fait réagir le mélange à température ambiante pendant 24 heures. On neutralise le liquide réactionnel et on le fait passer sur une colonne 10 remplie d'une suspension de 5 ml d'Amberlite IRA 400 (type Cl). On lave la couche de résine à l'eau (10 ml). On réunit le produit d' élution de la résine et les lavages. On fait passer le mélange sur une colonne remplie d'une suspension de 20 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 15 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit successivement à l'aide de 63 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1M et 131 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,2M. ~ On recueille" "65 ml de ~ Ta " ' sécôride""'môitfé de "i ' 20 dans le chlorure d'ammonium aqueux 0,2M et on fait passer sur une couche de 10 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d' adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on le lave successivement à l'eau (50 ml), à l'acide acétique à 0,5$ 25 ( 50 ml) et à l'eau (50 ml), puis on élue à, l'aide d'un mélange acétone-acide chlorhydrique 0,02N (1/l en volume). On concentre l'éluat sous vide, sous pression réduite , obtenant ainsi 60,9 mg de 3-(N-méthyl-N—benzènesulfonylamino-propyl)aminopropylaminobléomycine (activité de 6700 mcg/mg k l'en-30 contre de Mycobacterium smegmatis 607 ) avec un rendement de 55,4$. En opérant comme décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 11 ci-après ( page 57). TABLEAU 11 NO. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) Temps de réaction heures Sephadex CM (ml) Rendement , i, i.V — Activité mcg/mg 1 3-(N-Më thyl-N-3-chloro-acêtylaminopropyl)-aminopropylaminobléomycine 1,5 g Acétone 13 ml H20 145 ml C1CH2C0C1 3 g NaHC03-5,8 g 50 250 0,1,, 0,2, 0,3M 477 mg 30,2% 1200 2 3-(N-Méthyl-N-3-p-chlorobenzènesuifonyl-aminopropyl)-aminopropyl-aminoblêomycine 300 mg Acétone 10 ml H20 3 ml Cl-^Cl 45 mg NaHC03 60 mg 24 43 0,1, 0,2M 220,3 mg 65% 17700 3 3-(N-Méthyl-N-3-p-toluènesulfonylaminopropyl) aminopropylaminobléomycine 100 mg Acétone 2 ml H20 3 ml CH3-0-S°2C1 25,2mg NaHC03 120 mg 24 20 0,1, 0,2M 49,2mg 43,6% 10000 4 3-(N-Mëthyl-N-3-p-ni tro- benzylaminopropyl)- aminopropylaminobléomycine 1 g EtOH 60 ml H20 20 ml N°2~ Et3N 0,58 ml 35 150 0,1, 0, 2M; 132 mg 12% 7050 5 3-(N-Mëthyl-N-3-allyl-aminopropyl)-aminopropyl-aminobléomycine 200 mg EtOH 4 ml H20 16 ml CH2=CHCH2Br 60 mg ) Et3N 70 mg * 16 25 0,1, 0,2M 77 mg 37,4% 3400 72 15254 sa 2134653 Exemple 20 Synthèse de la 3-(N-méthyl-N-3-phénylacétimidovlaminopropvl )-aminopropylaminobléoraycine On dissout 200 mg de chlorhydrate de 3-(N-méthyl-N-3-aminopropy]} 5 aminopropylaminobléomycine dans 5 ml d'eau. On ajoute à la solution 60 mg de chlorhydrate de phénylacétimidate de méthyle, en agitant. On ajuste le pH du mélange à 9,1 par addition de triéthylamine. On fait réagir le mélange à température ambiante, pendant 26 heures. Oii dilue le liquide réactionnel à l'eau et on fait passer sur une co~ 10 lonne remplie d'une suspension de 25 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on élue le produit successivement à l'aide de 150 ml de chlorure d'ammonium aqueux 0,1", 100 ml de chlorure d'ammonium aqueux 0,2M et 260 ml de chlorure d'an— 15 monium aqueux 0,3M. On fait passer 90 ml de la dernière fraction d' éluat dans le chlorure d'ammonium aqueux 0,3M sur Une colonne remplie de 30 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on lave le produit successivement à l'eau (150 ml), à l'acide acétique à 0,5$ (150 ml) et à l'eau 20 puis on élue à l'aide d'un mélange acide chlorhydrique 0,02K-acétone (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec, sous pression réduite, obtenant ainsi 170,8 mg de 3—(N-méthyl-N—phénylacétimidoylaminopropy]) aminopropylaminobléomycine (activité de 12750 mcg/mg à l'encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendements 78,9$. 25 En opérant commé décrit ci-dessus, on réalise la synthèse des composés figurant au tableau 12 ci-après (page 59). Exemple 21 Synthèse de la 3-(N-méthyl-W-3-.cyclphexylcarbamoylaminopropyl)-aminopropylaminobléomvcine 30 On dissout 200 mg de chlorhydrate de 3-(N-méthyl-N-3-aminopro- pyl)-aminopropylaminobléomycine dans 10 ml d'eau. On ajoute à la solution 60 mg de bicarbonate de sodium et 0,05 ml d'isocyanate de cy-clohexyle, en agitant. On fait réagir le mélange pendant 2 heures. On filtre le liquide réactionnel. On ajuste le pH du filtrat à 5,0. On 35 dilue le filtrat à l'eau et on fait passer sur une colonne remplie d'une suspension de 30 ml de Sephadex CM C-25 dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,02M, afin d'adsorber le produit cherché. Une fois le produit adsorbé sur l'adsorbant, on l'élue suc- --4 K> Ln TABLEAU 12 N3 NO. Dérivé et quantité de bléomycine de départ Solvant(ml) Réactif (et quantité utilisée) Alcali (et quantité utilisée) ( Teirps de réaction heures Sephadex CM (ml) CLNH4 Rendement Activité mcg/mg 1 3-(N-Mêthyl-N-3-acêtimidoyl-aminopropyl)-aminopropylamino-blêomycine H20 5. ml CH„C-OCH- 31| 3 30 mg NH.HCl Et3N (pH 8,8) 4 25 0,1, 0,2, 0,3M 144 mg 70% 3640 2 3-(N-Méthyl-N-3-p-chiorophênylacetimidoy1-aminopropyl)-aminopropyl-aminobléomycine Acétone 4 ml H20 4 ml cl- -cH2C-°CH3 NH.HCl Et3N (pH 9,1) 4,5 30 0,1, 0,2, 0,3M 193,4 mg 87% 19000 U> 45» O-UhR OJ> 72 15254 2134653 cessiTement au chlorure d'ammonium aqueux 0,1M et au chlorure d'ammonium aqueux 0,25M. On recueille les fractions d'éluat contenant le produit cherché et on fait passer sur une colonne remplie de 30 ml d'Amberlite CG-50 (type H) afin d'adsorber le produit cherché. 5 Une fois adsorbé sur l'adsorbant, on lave le produit successivement à l'eau (150 ml), à l'acide acétique à 0,5$ (150 ml) et à l'eau (150 ml), puis on élue à l'aide d'un mélange acide chlorhydrique 0,02N-acétone (1/1 en volume). On concentre l'éluat à sec sous pression réduite, obtenant ainsi 88 mg de 3-(N-méthyl-N-3-cyclohexylcarbamoyl-10 amihopropyl)aminopropylaminobléomycine(activité de 11500 mcg/mg à 1' encontre de Mycobacterium smegmatis 607). Rendement: 40,4$. 72 15254 2134653 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de dérivés de bléonrycines portant un substituant sur l'azote, caractérisé en ce qu'on fait réagir la 3-aminopr opylaminobléomycine ,la 3-(N-4-aminobutyl)aminopr opylamino-5 bléomycine ou 3a3-(N-méthyl-N-3-aminopropyl)aminopropylaminobléomycine sur un composé répondant à la formule R - Y dans laquelle R est de l'hydrogène sauf lorsque 1 représente —x ©a -SO^X, ou un groupe alcoyle, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé» 10 cycloalcoyle, phényle, naphtyle, arylalcoyle ou hétérocyclique, ces groupes portant éventuellement un substituant, et T est un radical -COOH ou un de ses dérivés réactifs, —X , X représentant un atome d'halogène, -S0„X dans lequel X ala signification précitée, -NCO ou 2 2 -Ç-0R dans lequel R est un alcoyle* NH 15 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction en présence d'un solvant choisi parmi l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acétone et leurs mélanges. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction en présence d'un additif choisi parmi la pyri- 20 dine, le bicarbonate de sodium et la triéthylamine. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction à une température de 10 à 25°C. 5. Dérivés de bléomycines portant un substituant sur l'azote lorsqu'ils sont obtenus par un procédé suivant 1'une quelconque des 25 revendications précédentes. 6. Nouvelles bléomycines ne présentant pas de points de fusion, de décomposition ou d'ébullition nets, inhibant les bactéries gram-positives et gram-négatives et ayant une activité antitumorale, ces bléomycines étant solubles dans l'eau et le méthanol aqueux, 30 ces bléomycines formant des sels avec les acides et des produits de chélation avec le cuivre, ces bléomycines donnant une réaction positive lorsqu'on les soumet aux réactions de Pauly, Ehrlich, Dragendorff et au permanganate, mais donnant une réaction négative lorsqu'on les soumet aux réactions 35 de Molish, Biuret, Elson-Morgan, Maltol, Fehling, Tollens, Anthrone et au chlorure ferrique, et ces bléomycines présentant, dans l'infrarouge, une zone d'absor 72 15254 62 2134653 ption aux nombres d'ondes suivants: 1040 à 1075 cm~^, 1710 à 1735 cm , 1625 à. 1680 cm~\ 2910 à 2940 cm"^, ôes bléomycines étant caractérisées en outre en ce qu'elles donnent la L-thréonine, l'acide 2'-(2-aminoéthyl)-2,4'-bithiazole-4-5 carboxylique ainsi que chaque composé tminé correspondant à la portion en chaîne latérale, par hydrolyse acide, ces bléomycines ayant une structure partielle représentée par la formule ci-après dans laquelle: p = -nh-(ch2)3-nh-10 -nh-(ch2)3-kii-(ch2)4-nh- -NH-(CH2)3-K-(CH2)3-NH-CHj Q = -COR, -C0(CH2)n-C00H, -CO-CH=CII~COOH, rCo-cH-ai^-ax)ii, -R, -SO_R, -COWHR, -C-R, I A. > * 2' ' It ' r3 NH lv C00H _C0—{oO 4 » ' —C0—C=CII—COOII '3 15 R étant un groupe alcoj'le linéaire ou ramifié, saturé on insaturé, cycloalcoyle, phényle, naphtyle, arylalcoyle ou hétérocyclique, ces groupes portant éventuellement des substituants, R"* représentant un atome d'hydrogène ou un groupe alcoyle inférieur ou méthylène, R^ représentant un atome d'hydrogène ou un groupe alcoyle inférieur 20 ou nitro et n étant un nombre entier de 1 à 7. -4 K> gh5 h 2^-^y- it n Y chp—nh-ch I I hon-ch ch2 I I cooh cooh ch3 I ch3 çhj ho-ch c o-ïjh-ch- co-nh-ch-ch-ch-co-nh-ch-co ch-I oh lj HOHaC^o^1 oh I oh v^o-^-v ch2oh V oh oh ocoe1î2 l nh I ch? I ^ ch2 Ln Ni en .U J~T co-p-q & K3 —» 0-en u>