Brevet FR2132156A1 — publié le 19721117

La présente invention concerne un procédé de préparation d'amino-acides et en particulier un procédé d'obtention d'un mutant surproducteur d'un micro-organisme normal. La L-lysine et de nombreux autres amino-acides sont des 5 agents nutritifs connus. La L-lysine en particulier est utilisée comme substance d'enrichissement des aliments en diététique et en médecine. On sait qu'elle est un constituant indispensable de l'alimentation animale. Le métabolisme des bactéries produit normalement des amino-acides. Si on cultive un micro-organisme en présence des éléments nécessaires tels que 10 le carbone, l'oxygène, l'azote, le phosphore, le soufre et certains constituants minéraux, il forme aitre autres éléments nutritifs des amino-acides nécessaires à sa croissance. On sait également que certaines souches mutantes sont capables de produire des amino-acides particuliers en quantité supérieure à celle nécessaire à leur croissance normale. On a tenté dans le 15 passé d'isoler des souches mutantes pour obtenir de la L-lvsine. Le brevet britannique n° 851 396 décrit un mutant qui produit de l'a L-lysine par culture d'un mutant de Micrococcus glutamicus présentant une anomalie nutri-tionnelle. Cependant, dans ce brevet,on obtient par rayonnement ultraviolet les mutants dont la croissance nécessite certains amino-acides. Le brevet 20 canadien n° 835 356 décrit la production de L-lysine par fermentation en isolant des souches mutantes d'organismes particuliers dont la croissance nécessite certains amino-acides. Dans ces deux brevets, les mutants nécessitent de 1'homosérine ou de la thréonine et de la méthionine ; dans les deux cas on obtient les mutants selon un procédé sortant de l'invention. 25 Les mutations chimiques sont décrites dans "Basic Bacte- riology", La Manna et Mallette, 2ème édition, William & Wilkins Company, Baltimore, 1959, pages 646 à 649. Cependant, bien que ce texte indique l'utilisation de rayons ultraviolets et de rayons X pour isoler les mutants, il ne décrit pas la combinaison d'agents inhibant à la fois un micro-30 organisme et favorisant la croissance d'une souche mutante. L'invention concerne un procédé d'isolement de souches mutantes d'un micro-organisme tel que Brevibacterium, ainsi que l'isolement de nouvelles souches mutantes. L'invention concerne également un procédé d'obtention d'amino-acides avec des rendements élevés. 35 On peut obtenir des amino-acides particuliers en quantités supérieures à la normale en traitant une culture de micro-organisme avec un antimétabolite et comme co-inhibiteur, un amino-acide de voie métabolique latérale,favorisant ainsi la croissance d'une souche mutante du micro 72 10912 2 2132156 organisme effectuant une surproduction des amino-acides. Les amino-acides ainsi produits sont synthétisés en même temps qu'un intermédiaire ou un précurseur commun de 1'amino-acide servant de co-inhibiteur. La souche mutante, après isolement de la souche parente excrète des quantités 5 d'amino-acide supérieures à celles produites au total par l'organisme parent. Plus particulièrement, selon l'invention, on traite le micro-organisme avec une combinaison d'au moins deux inhibiteurs dont l'un est un antimétabolite qui ne produit une nette inhibition de la croissance 10 qu'en présence d'un amino-acide d'une voie métabolique latérale et l'autre est un amino-acide appartenant à un groupe d'amino-acides qui est synthétisé par le micro-organisme à partir d'un intermédiaire commun. On définit généralement les antimétabolites comme des substances qui interfèrent avec l'utilisation des métabolites par un orga-15 nisme ("Basic Bacteriology", page 799) ou qui,de certaines façons, limitent ou suppriment l'une ou plusieurs des voies métaboliques de l'organisme. Cependant, les antimétabolites de l'invention agissent sur le processus métabolique d'un organisme uniquement en association avec le co-inhibiteur qui est un amino-acide de voie métabolique latérale. Lorsqu'on les utilise 20 seuls, ces antimétabolites sont sans effet. On peut par exemple utiliser des antibiotiques dans le procédé de l'invention. On peut utiliser des antimétabolites tels que la bacitracine, l'actinomycine C, l'allopurinol, l'anti-mycine, l'azasérine, la streptomycine, la pénicilline, la valinomycine, la cyclosérine, l'o-fluorophénylalanine, la/^-phénylsérine, la fluoro-3 25 tyrosine, le fluoro-6 tryptophane, la L-o-éthylthréonine, la norleucine, la norvaline et similaires. Comme précédemment indiqué, le co-inhibiteur de l'invention est un amino-acide qui est en rapport biochimique avec 1'amino-acide excrété par le mutant, c'est-à-dire un amino-acide de voie métabolique 30 latérale. Cet acide apparaît normalement dans la chaîne de biosynthèse du procédé métabolique dans lequel 1'amino-acide désiré apparaît normalement. En soumettant simplement le micro-organisme aux effets, soit de 1'antimétabolite aux doses indiquéestsoit du co-inhibiteur seul, on n'obtient que^peu d'inhibitien ; De plus des combinaisons quelconques 35 des antimétabolites et d'amino-acides n'appartenant pas à la voie biochimique ne permettent pas d'obtenir des souches mutantes. Ce n'est qu'en traitant le micro-organisme par le système combiné de l'invention qu'on obtient 1'isolement du mutant. r~ 72 10912 3 2132156 Selon l'Invention, on peut obtenir des souches mutantes à partir d'un micro-organisme parent quelconque. Les souches mutantes obtenues par traitement avec le système antimétabolite-co-inhibiteur sont celles dont la croissance nécessite 1'amino-acide désiré. Les mlcro-5 organismes appartenant à l'ordre des Eubacteriales sont particulièrement intéressants,tels que azobacterium, rhlzobium, achromobacterium, micrococcus, enterobacterium, brevibacterium, corynebacterium, bacillus, et similaires. A titre illustratif, on utilise un brevibacterium pour isoler les mutants selon le procédé de l'invention. Les brevibacteriums;sont des 10 micro-organismes en bâtonnets gram positif. Ils peuvent se développer en utilisant comme seule source de carbone les paraffines normales. On les rencontre dans les produits laitiers, le sol et divers pioduits de décomposition . Les milieux de culture utilisés pour traiter au départ le 15 micro-organisme parent tel que Brevibacterium sont connus. Ils peuvent contenir comme source de carbone une ou plusieurs paraffines normales ayant de 8 à environ 30 atomes de carbonei On utilise en particulier comme paraffines le n-octane, le n-dodécane, le n-tridécane, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadécane, le n-heptadécane, le n-octadécane et 20 similaires. D'autres sources de carbone sont des hydrates de carbone tels que le glucose, la levure, 1'hydrolysat d'amidon, les mélasses et des acides organiques comportant de 1 à 5 atomes de carbone de préférence 1 'acide acétique et l'acide propionique. On peut citer comme sources d'azote des sels minéraux d'ammonium, l'urée, l'extrait de levure ou de viande, la 25 farine de poisson, les hydrolysats de soja ou de caséine et similaires. Les sources d' éléments autres que le carbone sont les chlorures, phosphates, carbonates et sulfates de potassium, magnésium, calcium et fer. On peut également utiliser des milieux nutritifs naturels tels que de la gélose additionnée de sels. On peut utiliser des mélanges de constituants 30 nutritifs. On cultive la souche mutante en conditions aérobies en l'incubant à des températures comprises entre 20 et environ 60°C, de préférence entre 25 et 40°C. Au départ, on ensemence avec le micro-organisme parent une boîte de milieu nutritif imprégné de la combinaison de l'anti-35 métabolite et du co-inhibiteur. Le rapport pondéral de la combinaison au micro-organisme n'a pas d'importance et peut varier. De préférence,-pn utilise un excès de la combinaison On peut donc utiliser des rapports pondéraux des inhibiteurs totaux aux micro-organiàmes de 0,1/1 à 200/1 mais on préfère des rapports pondéraux de 1/1 à 10/1 72 10912 4 2132156 L'inhibition de la croissance du micro-organisme normal est mise en évidence par des zones claires à la surface de la botte. Cette inhibition apparaît dans les 17 heures qui suivent l'imprégnation. En même temps, les colonies isolées des mutants commencent à. croître. 5 On recueille ces colonies sur la boîte et on les purifie en les repiquant sur une boîte fraîche. On les soumet à des transferts multiples pour vérifier l'absence de contaminants. La fermentation des colonies purifiées de mutants est également aérobie et on peut la conduire de façon classique dans des flacons 10 de culture agités ou des cuves de culture submergées à des températures comprises entre 20 et environ 60°C à des pH d'environ 2,0 à environ 10,0 et de préférence de 5,0 à 8,0. On peut ajuster le pH en ajoutant de 1'hydroxyde d'ammonium, un hydroxyde de métal alcalin et similaires. On mélange les repiquages de mutants avec les-éléments nutritifs précités en quantités 15 appropriées pour apporter les constituants chimiques fondamentaux. Lorsque la durée normale de fermentation s'est écoulée, on recueille les amino-acides selon des procédés connus, par exemple par centrifugation, chromatographie, extraction aux solvants ou échange ionique. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention 20 seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation. EXEMPLE 1. On ensemence une culture obtenue sur n-hexadécane de 25 Brevibacterium sp sur plusieurs plaques contenant 20 g d'un mélange mixte de glucose à 0,5 % et de gélose additionnée de sel à 2,0 %. Chaque inoculum est constitué de 0,05 ml d'une solution aqueuse de l'échantillon contenant 107 organismes. On incube les boîtes pendant 17 heures à 36°C avec des disques de papier filtre contenant diverses combinaisons de 30 microgrammes 30 de cyclosérine, L-méthionine, L-thréonine et L-homosérine. Essais Anti-métabolite " Amino-acide co-inhibiteur 1 cyclosérine 0 2 0 L-homosérine _ 3 0 L-thréonine 35 4 0 L-méthionine 5 cyclosérine L-homosérine 6 cyclosérine l-thréonine 7 cyclosérine L-méthionine 72 10912 5 2132156 Dans tous ces essais, seuls les essais 6 et 7 correspondent à une inhibition de la culture comme le montrent les zones claires sur les boîtes. Les autres boîtes ne présentent que peu ou pas d'inhibition. Cet exemple montre que les deux amino-acides, la L-thréonine 5 et la L-méthionine, qui inhibent de façon efficace le micro-organisme en association avec la cyclosérine comme antimétabolite, appartiennent à la voie métabolique de la L-lysine par l'intermédiaire commun qu'est 1'hémialdéhyde aspartique. Il n'est pas possible de mettre en évidence un effet inhibiteur de la combinaison de la L-homosérine et de la cyclosérine. 10 EXEMPLE 2. En utilisant le même Brevibacterium que dans l'exemple 1, on dilue une culture,en flacon agité.dans de l'eau à une concentration suffisante pour qu'un échantillon de 0,05 ml contienne environ 1000 organismes. 15 On imprègne des boîtes de culture contenant 20 g de milieu mixte constitué de 0,5 % de glucose et de 2,0 % de gélose additionnée de sels avec 100 microgrammes/ml de cyclosérine et autant de L-thréoniiie. 1 On ensemence 5 boîtes de culture avec l'échantillon de culture dilué et on incube les boîtes à 36°C pendant 2 jours. Après la période d'incubation, 20 de nombreuses colonies se sont développées sur les boîtes. On recueille ces colonies sur les boîtes et on les repique sur gélose glucosée. On les purifie ensuite par lavage dans du tampon phosphate 0,01 M à pH 7,0 et on les dilue dans des quantités suffisantes de tampon pour obtenir 1000 organismes dans 0,05 ml (comme dans la dilution 25 initiale). On ensemence les échantillons dilués sur des boîtes de culture contenant la cyclosérine et la L-thréonine. On incube ces boîtes à la même température pendant environ la même durée que dans l'incubation initiale. Chaque culture se développe. On répète ce repiquage deux fois encore sans observer d'inhibition. 30 On place les diverses cultures des boîtes que l'on a maintenues séparées pendant les repiquages dans un flacon agité avec environ 20 g d'un milieu nutritif constitué de 0,62 % (g/100 g) de n-hexadécane, 0,2 % de glucose et 5,0 °L de gélose additionnée de sels. On conduit la fermentation à 36°C pendant 40 heures en maintenant le pR entre 5,5 et 7,5. Deux des 5 35 cultures utilisées dans la fermentation excrètent de la L-lysine. On identifie la lysine par chromatographie en couche mince en utilisant des plaques de gel de silice et un système solvant constitué de hutanol, d'acide acétique et d'eau (40/40/20). 72 10912 6 2132156 10 15 De plus, on identifie la L-lysine présente dans les cultures en flacons agités ainsi que la quantité par dosage microbiologique avec Pediococcus cerevisiae (ATCC 8042). On cultive cet organisme pendant 17 heures dans un milieu approprié, on le lave et on en réalise une suspension g saline contenant 10 organismes par ml. Dans un milieu de dosage de la L -lysine fondu contenant 2 % de gélose, on ajoute 0,1 ml de la suspension et on verse l'ensemble dans plusieurs boîtes de Pétri. On laisse la gélose se solidifier. On place des solutions de L-lysine obtenues à partir de l'organisme parent et des deux organismes mutants ainsi qu'une solution de L-lysine de concentration connue dans des cupules séparées communiquant avec la culture sur gélose. On incube ensuite à 37°C pendant 17 heures. Les diamètres des zones de croissance autour de chaque cupule sont directement proportionnels à la concentration de la lysine dans la solution. En comparant les diamètres des cultures on détermine les rendements en L-lysine à partir des cellules mutantes repiquées et ceux obtenus à partir du Brevibacterium sp. parent. Ces valeurs sont les suivantes : 20 25 30 Organisme Brevibacterium sp Mutant A Mutant B L-lysine obtenue (mg/ml) 0,5 3,0 2,0 Selon l'invention, on peut utiliser pour isoler les mutants d'un micro-organisme et obtenir 1'amino-acide désiré les systèmes aïiti-métabolite-co-inhibiteur suivants : 35 Amino-acide L-lysine L-lysine L-phénylalanine L-phénylalanine L-tyrosine L-tryptophane L-isoleucine L-méthionine L-valine Antimétabolite cyclosérine cyclosérine o-fluorophénylalanine ^-phénylsérfne fluoro-3 tyrosine fluoro-6 tryptophane L-o-éthylthréonine norleucine norvaline Co-inhibiteur L-thréonine L-méthionine L-tyrosine L-tyrosine L-tryptophane L-phénylalanine L -valine L-thréonine L-isoleucine 72 10912 7 2132156 EXEMPLE 3. On ensemence comme dans l'exemple 1 une culture de Brevibacterium sp cultivée sur n-hexadécane. Dans le système inhibiteur utilisé , 1'antimétabolite est la pénicilline et 1'amino-acide cc-inhibiteur la tyrosine. On isole une souche mutante qui, comme dans les exemples précédents, lorsqu'on la repique en l'absence du système inhibiteur, excrète une quantité de tryptophane (amino-acide correspondant: à une voie métabolique latérale) dix fois supérieure à celle excrétée par le parent sensible à l'inhibiteur. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemplesnon limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. 72 10912 8 2132156 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un mutant d'un micro-organisme excrétant un amino-acide, ce mutant excrétant 1'acide en une quantité 5 supérieure à celle nécessaire au développement normal du micro-organisme parent, caractérisé en ce que (1) on cultive le micro-organisme parent en présence de (a) un antimétabolite et (b) comme co-inhibiteur un second amino-acide relié à 1'amino-acide excrété par un intermédiaire biosynthétique commun, inhibant ainsi la croissance du micro-organisme parent et 10 (2) on isole et repique le mutant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est un Brevibacterium. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que 1'amino-acide excrété est la phénylalanine, la tyrosine, le trypto- 15 phane, 1 ' isoleucine, la méthionine ou la valine. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que 1'amino-acide excrété est la L-lysine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 1'antimétabolite est un antibiotique qui est incapable 20 seul d'inhiber la croissance du micro-organisme parent. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 1'antimétabolite est la cyclosérine. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le co-inhibiteur est la L-thréonine ou la L-méthionine. 25 8. Procédé de préparation d'un amino-acide, caractérisé en ce qu'on repique et fait fermenter le mutant obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que 1'amino-acide est la L-lysine. 30 10. Mutant excrétant un amino-acide d'un micro-organisme parent, obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il excrète 1'amino-acide en une quantité supérieure à celle normalement excrétée par son parent.