Brevet FR2133670A1 — publié le 19721201

-i- 2133670 L'invention concerne un nouvel agent anti-inflammatoire et an procédé pour préparer une substance anti-infiammatoire. On connaît déjà diverses substances anti-inflammatoires, par exempxe les stéroïdes comme la cortisone ou la dexaméthasone ; 5 des substances non-stéroïdes comme les dérivés d'acide anthranilique, les salicylates, 1'indométhacine, le benzydamine ; les sols d'or et des protéases. Cependant, à cause des nombreux effets secondaires, il a été difficile d'utiliser ces substances conventionnelles dans des 10 doses suffisamment élevées pour obtenir des activités anti-inflammatoires satisfaisantes. On a par exemple effectué des essais d'inhibition sur des oédèmes causés par la carraghénine avec diverses protéases par administration intrapéritonéale, la méthode d'administration actuellement 15 la plus couramment utilisée, et on a trouvé que, quoique toutes les protéases produisaient un effet inhibiteur appréciable sur l'oedème, une augmentation de la dose afin de renforcer cet effet provoquaient des hémorragies dans la cavité abdominale ou ascites. Cela veut dire que chaque protéase doit être administrée dans des 20 doses limitées afin d'éviter les effets secondaires. On a constaté que plusieurs protéases présentaient de telles tendances. Des exemples de telles protéases sont la trypsine, la chymotrypsine et similaires d'origine animale ; broméline, papaïne et similaires d'origine végétale ; et des protéases provenant de micro-organismes 25 tels que Streptomyces griseus, Bacillus subtilis, Aspergillus melleus, Aspergillus niger et d'autres bactéries des genres Serratia et Bacillus. En conséquence, l'invention a pour but d'obtenir une substance anti-infiammatoire, susceptible d'avoir d'excellentes activi-30 tés anti-inflammatoires et d'être substantiellement exempte d'effets secondaires. Selon l'invention, on obtient une substance anti-inflammatoire susceptible de développer des activités anti-inflammatoires intenses en doses faibles et libres d'effets secondaires tels que 35 hémorragies et ascites, même quand elles sont administrées à haute concentration. Selon l'invention, on obtient également un agent antiinflammatoire excellent contenant la substance anti-infiammatoire sus-mentionnée comme agent actif. 4-0 L'invention concerne également un procédé de préparation 72 12939 -2- 2133670 d'une substance anti-inflammatoire à partir de protéases et la substance anti-inflammatoire obtenue possède des activités antiinflammatoires plus intenses et elle n'a pas les inconvénients des protéases. 5 L'invention et ses avantages serons décrits plus en détail dans la description ci-après. L'agent anti-inflammatoire selon l'invention comprend une quantité suffisante,pour obtenir l'effet anti-inflammatoire, du produit de réaction du sang avec une protéase et un adjuvant. 10 Dans la description et les revendication ci-après, le terme "sang" ne désigne pas uniquement le sang mais également les substances obtenues à partir du sang, telles que plasma, sérum, etc*. On a découvert que la substance que l'on obtient par la réaction du sang avec une protéase (cette substance sera appelée 15 ci-après : "substance sanguine modifiée") produit des effets antiinflammatoires plus intenses en faible quantité sans provoquer d'effets nocifs et ne produit pratiquement aucun des effets nocifs en cas d'administration à dose élevée. On n'a jamais obtenu ces effets avec des protéases et on 20 les obtient uniquement par la modification du sang par l'action enzymatique des protéases. On montrera les avantages de l'invention comparé aux effets obtenus avec les diverses protéases avec les données du tableau I qui contient les effets d'inhibition sur des oedèmes de la substance sanguine. 25 On a obtenu la substance sanguine modifiée de la façon indiquée dans l'exemple 1 que l'on trouvera plus loin, par la réaction d'un sérum de vache avec une protéase obtenue à partir de Bacillus sp 0-20 (déposée à l'institut des Recherches de Fermentation de l'Agence des Sciences Industrielles et de Technologie, au 30 Japon, depuis le 20 février 1969 sous le n° de dépôt FERM-P 2J0) et par l'élimination de la protéase non réagie du produit de réaction obtenu. Méthode d'essai pour un effet d'inhibition de 50 % sur les oedèmes On dissout, ou on disperse selon les cas, les divers agents 35 anti-inflammatoires du tableau I ci-après dans un sérum physiologique et l'on administre par voie intrapéritonéale à un groupe de 6 rats ayant un poids compris entre 150 et 160 g. Dans un intervalle de 30 minutes on injecte par voie sous-cutanée 0,05 ml d'une solution à 1 % en poids de carraghénire dans du sérum physiologique ^0 dans la plante d'une patte arrière de chacun des rats. On mesure 72 12939 -3- 2133670 une augmentation du volume de ia patte après 3 heures afin de déterminer l'effet d1 inhibition sur l'oedème. On indique les doses (V/kg) pour obtenir un effet d'inhibition de 50 %• Dans cet essai on utilise du sérum physiologique comme témoin. 5 Doses nécessaires po^r inhlDltion d'oedèmes à 50 % TABLEAU I Agents anti-inflammatoires testés ED50 Substance sanguine modifiée de ±'Ex. 1 50 Protéase obtenue à partir de 10 Bacillus sp 0 - 20 1 000 Broméline 10 000 Indométhacine 2 300 Acide méfénamique 9 100 Acide flufénamique 10 500 15 Pnénylbutazone 24 000 Phénacétine 60 000 Aspirine 73 000 Cinchophène 92 000 On voit dans le tableau I que la substance sanguine 20 modifiée selon l'invention possède des activités anti-inflammatoires excellentes à des doses plus faibles que les diverses protéases qui ont servi à la comparaison. On constate q^e l'inhibition à 50 % d'oedème par la protéase obtenue à partir de Baeiilus sp 0 - 20 peut être obtenue 25 avec la substance sanguine modifiée préparée à partir de ce Bacillus en une quantité qui n'est que le 1/20 de 1a quantité" du Bacillus seul. De plus, ia substance selon l'invention est exempte d'effets secondaires, ne possède pas d'effets nocifs à une eoncen-30 tration aussi basse et ne produit que des effets secondaires très faibles en cas d'administration à dose élevée. En effet, lorsque x'on injecte par voie intrapéritonéale à un rat une dose de 500lfpar kg de substance sanguine modifiée selon l'exemple 1, on n'a pas observédes effets secondaires teJ_s 35 qu'hémorragie intrapéritonéale Ou des ascites. En outre, ia substance sanguine modifiée selon l'invention qui possède les propriétés excellentes décrites ci-dessus., exerce une action hypo-tensive et dépressive sur le système nerveux central. Ainsi en utilisant ces effets pharmacbiogiques, ii est 40 possible d'obtenir des résultats inconnus avec les agents enzymati- 72 12939 -4- 2133670 ques anti-inflammatoires conventionnels. On obtient la substance sanguine modifiée selon l'invention par les modifications du sang avec une protéase et elle est soluble dansl'eau mais insoluble dans du méthanol. Elle se présente 5 sous forme liquide ou solide contenant des peptides, des acides aminés et du sucre. La substance sanguine modifiée selon l'invention est très différente du sang, dans ce sens qu'elle possède un effet antiinflammatoire très intense tandis que le sang lui-même ne produit 10 pas de tels effets. De plus la substance sanguine modifiée selon l'invention n'a aucune activité enzymatique^qui la distingue des protéases. On utilise comme sang dans le procédé selon 1'invention, du sang dans le sens strict du mot, du plasma de sang, du sérum de sang et les diverses substances obtenues à partir du sang 15 provenant de mammifères tels que l'homme, le lapin, le rat, la vache, le cheval et des oiseaux tels que poule, canard, et d'une ceux grande variété d animaux, parmi /là de préférence le sang dans le sens strict du mot ou le sérum du sang des mammifères. Dans ces cas préférés, les plus avantageux sont le sang même et le sérum de 20 sang de la vache et du cheval, car ceux-ci sont facilement accessibles. Comme protéase pour la modification du sang, on peut utiliser les diverses protéases obtenues à partir d'animaux, de végétaux et de micro-organismes. 25 A titre d'exemple on cite comme protéases drorigine anima le, la trypsine, la pepsine, la chymotrypsine, la pancréatine, etc.. Parmi celles d'origine végétale on côte la broméline, la papaïne ; parmi celles provenant de micro-organismes on cite les protéases provenant de champignons filamenteux, des basidyomycètes, des bac->0 téries, des champignons à rayons. Des protéases obtenues à partir de champignons filamenteux sont par exemple celles de Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae, Pénicillium notatum, Rhizopus chinensis, Mucor racemosus. Des protéases de basidiomycktes sont par exemple celles de Trametes sanguinea, Llodella subpileata. Des protéases à 35 partir de bactéries sont celles de Bacillus subtilis, Pseudomonas myxogenes. Des protéases à partir de champignons à rayons sont celles de Streptomyces griseus, Streptomyces fradiase. Parmi toutes ces protéases on préfère la chymotrypsine, la broméline et les protéases à partir de Bacillus subtilis et Aspergillus melleus. 40 De plus, au lieu d'utiliser des protéases pures, on.peut aussi se 72 12939 -5- 2133670 servir de substances obtenues par modifications chimique^ selon les techniques connues,des protéases. A cette fin on modifie par voie chimique les protéases en les faisant réagir avec une substance de poids moléculaire élevée comme des polymères d'acides aminés ou 5 des polysaccharides par diazotation, par peptidation ou autres tecnniques connues, ou en faisant réagir avec une protéase une telle substance à poids moléculaire élevé possédant un groupe susceptible d'échanger un ion ou en réalisant avec une telle substance à poids moléculaire élevé possédant au moins deux groupes fonc-10 tionnels, soit une réticulation avec le groupe g-aminé d'un groupe lysine de l'enzyme, soit avec le groupe «-aminé dans la position terminale de l'atome d'azote de ce groupe, soit avec le groupe phénol de la tyrosine de l'enzyme, soit avec le groupe SH de la systéine de l'enzyme. 15 De tels procédés de modifications chimiques des proté ases sont connus. Selon l'invention on conduit les modifications du sang par une protéase habituellement à la température ordinaire ou à une température modérément élevée, de préférence entre 20 et 60°C. 20 En général le pH du milieu réactionnel dépend du type de sang et de protéase mis en oeuvre, mais dans la plupart des cas le milieu est neutre. Le rapport entre la quantité de protéases et de sang est également fonction du genre de protéase et de sang utilisé et est de préférence compris entre 200 et 2000 X de protéases par ml de 25 sang. En général la réaction est complète en un intervalle compris entre 0,5 et 5 heures pour obtenir la substance sanguine modifiée. On isole la substance sanguine modifiée de la protéase 30 et du sang qui n'ont pas réagi, si cela est le cas, et en utilisant à cette fin par exemple un solvant organique, un tamis moléculaire, une résine échangeuse d'ions, un centrifuge, un procédé de distribution à contre-courant, un procédé d'électroforèse ou une autre technique connue. On peut utiliser ces divers procédés seuls ou 35 en combinaison. Il n'est pas nécessaire d'éliminer la protéase qui n'a pas réagi du mélange réactionnel si celle-ci s'y trouve en faible quantité. De plus, au lieu de j.'éliminer, cette protéase qui n'a pas réagi peut être inactivée à l'aide de moyens physiques ou chi-40 miques tel que chauffage. Dans certains cas il n'est pas non plus 72 12939 -6- 2133670 nécessaire d'éliminer le sang qui n'a pas réagi du produit final obtenu. La suostance sanguine modifiée selon l'invention se trouve sous liquide ou solide et on la met sous les diverses formes 5 habituellement utilisées pour l'administration comme agent antiinflammatoire. Par exemple, on peut la dissoudre dans une solution physiologique' afin de l'obtenir sous forme de solution, ou on peut la mettre sous forme de cachets, de granulés ou de poudre. D'autre part on peut la mettre également sous forme de pommade. En fonction 10 du type de préparation , on peut l'administrer par voie intrapéritonéale ou orale ou on peut l'appliquer localement. L'invention est décrite ci-après dans des exemples qui ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Exemple 1 15 On ajoute à 10 litres de sérum de sang de vache, 1 g de protéase obtenue à partir des bactéries du genre Bacillus (Bacillus sp 0 - 20 comme indiqué ci-dessus). La protéase utilisée dans cet exemple a une activité protéolytique de ' 4 000 000 PU/g. L'activité protéolytique indique l'activité enzymatique de la 20 protéase par la formation d'une substance non protéique produisant une coloration de Folin qui correspond à une V de tyrosine par minute comme unité d'activité enzymatique. On chauffe la mélange pendant 4 heures à 45°C sur bain-marie à température constante. On ajoute de l'acétone au mélange réactionnel en une quantité cor-25 respondant à 70 % en poids et on soumet le mélange obtenu à une centrifugation à 3000T/minute pendant 10 minutes pour séparer l'enzyme, la protéine, etc..., qui sont écartées sous forme de précipité. On ajoute de l'acétone au liquide surnageant en une quantité de 90 % en poids et on abandonne le mélange pendant une 30 journée. On récupère le précipité obtenu par centrifugation à 3000 T/minute pendant 30 minutes et on sèche sous vide. On dissout le produit obtenu dans l'eau et on le soumet à une filtration sur gel avec une dextrane du commerce (Sephadex G-15) afin d'éliminer les substances minérales et les substances à bas poids moléculaire. 35 On lyophilise la partie du produit inhibitrice d'oedèmes qui a été contrôlée à l'aide d'un essai sur l'oedème dans le taion d'un rat, et ensuite on la lave complètement avec du méthanol afin d'éliminer toutes les substances solubles dans le méthanol. Après avoir écarté le méthanol de la portion qui n'est pas scluble 40 dans le méthanol, on obtient 25 mg d'une substance sanguine modifiée 72 12939 -7- 2ï33670 se trouvant à l'état solide. La composition de cette substance est la suivante : Composition Teneur Amino-aeide 5 (calculé sous forme de leueine) 14 % poids Amino-acide* 2 (calculé sous forme de leueine) 7° % poids Sucre (calculé comme glucose) 12 % poids 1 A w Note : 1 : quantité d'amino-acides dosés par réaction de la substance avec de la ninhydrine. *2 : quantité dfamino-acides dosés par réaction avec de la ninhydrine après hydrolyse de la substance avec HC1 6n à 110°C pendant J>6 heures. 15 La composition de 1'amino-aeide principal est : Amino-acid.es Teneur Acide aspartique 7 % en poids Acide glutamique 8 % en poids Glycine 3 % en poids 20 On dissout la substance dans du sérum physiologique obtenu à une concentration de 8 Y/ml et on l'administre par voie intrapéritonéale à des rats pesant entre 150 et 160 g. En un intervalle de 30 minutes on injecte par voie sous-cutanée 0,05 ml à H en poids de carraghénine dissous dans du sérum physiologique 25 dans la plante d'une patte arrière de chacun des rats. Oh mesure l'augmentation de volume de la patte arrière 3 heures plus tard afin de déterminer l'effet inhibiteur sur l'oedème. On trouve ainsi qu'une dose de & Y sur 150 g (poids du rapport) permet d'obtenir une inhibution de 60 % de l'oedème. On n'a pas constaté 30 d'hémorragie intra-péritonéale ou d'ascites. A titre de comparaison on a administré la protéase utilisée dans cet exemple par voie intra-péritonéale à des rats de la façon décrite ci-dessus. Trois heures après l'administration on a obtenu seulement une inhibition d'oedème à 5 % a»ee une dose de 8 ï par 150 g. Avec une dose de 35 170 V/150 g on a obtenu une inhibition d'oedème de 60 % en constatant qu'il se produit une hémorragie intra-péritonéale. Exemple 2 On ajoute à 5 ml de sérum sanguin de rat 2 mg de protéase (activité protéoiytique de /?y7/ë, déterminée comme indiqué à 40 l'exemple 1) et on secoue le mélange pendant une he^re sur nain- 72 12939 -8- 2133670 marie à température constante de 37°C- On chauffe le produit obtenu à 60°C pendant 2 heures afin d'inactiver complètement l'enzyme, et on obtient ainsi une substance sanguine modifiée selon l'invention, à l'état cru. La substance contient des peptides, des amino-acides 5 et du sucre et elle est nydrosoluble. On dissout la substance sanguine modifiée dans du sérum physiologique dans une concentration de 400 Y/ml et on l'administre par voie intrapéritonéale à des rats pesant entre 150 et 200 g à des doses de 1 ml/200 g (poids du rat) afin d'examiner l'effet 10 inhibiteur sur l'oedème produit par l'injection sous-cutanée de carraghénine dans le talon d'une patte arrière du rat. Dans les trois heures qui suivent l'administration, on obtient une inhibition de 65 % de 11oedeme avec une dose de 400 V/200g, mesurée sur la grosseur de la patte arrière. On ne constate pas 15 d'hémorragie intrapéritonéale. Par contre on ne constate pas d'effet inhibiteur sur l'oedème en cas d'administration d'un sérum qui n'a pas été modifié avec une protéase. On administre également la protéase qui sert à la modification du sérum, de la façon indiquée ci-dessus. On constate une hémorragie intrapéritonéale après l'admi-20 nistration d'une dose de 400 lT/200 g en observant un effet d'inhibition de 64 %. Exemple 3 On fait réagir 5 g de broméline avec 5 ml de sérum humain pendant 1 heure 30 à 35°C, puis on refroidit le mélange réactionnel 25 à 3°C. On ajoute de l'acétone froid de 3°C au mélange jusqu'à une concentration de 60 % en poids, et ensuite on fait centrifuger à une température au-dessous de 0°C afin d'éliminer la broméline. Le produit obtenu ne possède pas d'activités protéolytiques. Par l'élimination de l'acétone du produit obtenu sous pression réduite, 30 on obtient 2,5 mg de substance sanguine modifiée, de présentation épaisse et légèrement jaunâtre, et contenant des peptides, des amino-acides et du sucre. La substance est hydrosoluble. Ensuite on dissout la substance sanguine modifiée dans du sérum physiologique, dans une concentration de .0,5 mg/ml, que l'on 35 injecte par voie intrapéritonéale à un rat à une dose de 1 iïu/2Q0 g (poids du rat) afin d'examiner son effet inhibiteur sur l'oedème produit par l'injection sous-cutanée de dextrane dans le talon d'une patte arrière du rat. En trois heures on obtient une inhibition de 70 % de 1'oedeme. On n'observe pas d'hémorragie intrapéri-40 tonéale. 72 12939 -9- 2133670 Par contre on n'obtient aucun efi'et inhibiteur sur l'oedeme si l'on administre un sérum sanguin qui n'a pas été modifié avec une protéase de la façon décrite ci-dessus. On vérifie l'effet inhibiteur de la broméline seule sur l'oedème de la façon indiquée ci-5 dessus. On obtient une innibition de 55 % accompagnée d'ascites intrapéritonéaies importantes. Exemple 4 On fait réagir pendant 2 heures à 37°C 1000ml de sang de vache auquel on a ajouté du citrate de soude comme agerr^/feoagulant, 10 avec 1 g de protéase du commerce obtenue à partir de Bacillus subtilis. On ajoute à 10°C de l'acétone au sang ainsi traité, jusqu'à une concentration de 60 % en poids et on fait centrifuger au-dessous de 0°G le mélange obtenu afin d'éliminer les sédiments du sang, les enzymes, etc... Le liquide surnageant'est exempt d'acti-15 vités enzymatiques. On ajoute encore de l'acétone froid au liquidé surnageant jusqu'à une concentration de 80 % en poids et on obtient le précipité par centrifugation au-dessous de 0°C, ce'produit contient des peptides, des amino-acides et du sucre et il est soluble dans l'eau. 20 On dissout la quantité totale de substance sanguine modifiée dans 10 ml de sérum physiologique et on dilue la solution obtenue encore 5, 10 et 100 fois avec la. quantité initiale de sérum physiologique. On administre la solution originale et"les solutions diluées par voie intrapéritonéale à des rats dans des doses de 1 ml/200 g 25 (poids du rat) afin d'examiner l'effet inhibiteur-sur l'cedème produit par l'injection so^s-cutanée de carraghénine dans le taiori de la patte arrière de chaque rat. On obtient après 3 h'ëure-s les effets d'inhibition suivants : 80 % avec la solution originale, - ' 30 62 % avec la solution diluée cinq fois, 53 % avec la solution diluée dix fois, * 51 % avec la solution diluée' cent fois. On n'observe ni hémorragie intrapéritonéale, ni ascites. Par contre on n'observe pas-d'effet-inhibiteur si l'on ne 35 modifie pas le sang avec de la protéase de la façon ci-dessus décrite. On administre également 1a protéase du commerce de l'Exemple 3 pour déterminer l'effet innibiteur sur l'oedème. On obtient une innibition de 40 % avec une dose de I mg/200 g (poids du rat) et une augmentation de la dose jusqu'à 1,2 mg/200 g (poids du rat) 40 produit une inhibition de 51 %, ayant pour effet une hémorragie intrapéritonéale importante. 72 12939 -10- 2133670 Exemple 5 On fait réagir une protéase du commerce provenant de Aspergillus melleus avec 1 litre de sérum de vache, dans une quantité de 500 /~PU7/ml de sérum pendant 1 heure à 3Ô°C (I /PU7 est 5 la quantité de substance soiuble dans l'acide trichloro-acétique correspondant à 1 V/m de tyrosine produit à 30°C). Ensuite on ajoute de l'acétone au sérum ainsi traité jusqu'à 70 % en poids et on soumet le mélange à une centrifugation pendant 20 minutes à 3000 Tours/minute^ puis on écarte le sédiment formé et 10 on ajoute encore de l'acétone jusqu'à 95 % en poids. On abandonne le mélange ainsi obtenu pendant une journée et on le centrifuge ensuite pendant 30 minutes à 3000 Tours/minute. On isole la substance sanguine modifiée, on la sèche sous vide et on obtient 2,9 g d'une poudre brune, exempte d'activités protéoly-15 tiques. La substance contient des peptides, des amino-acides et du sucre, elle est soiuble dans l'eau mais insoluble dans le méthanol. On dissout la substance obtenue dans du sérum physiologique et on fait les essais sur des rats comme décrits dans l'exemple 1. 20 On obtient une inhibition de 5^ % avec une dose de 200 mg/kg. On n'observe ni hémorragie intrapéritonéale, ni ascites. Exemple 6 On soumet une protéase (activité protéolytique 4 000 000 /PU7/g, déterminée de la façon de l'exemple 1) provenant de 25 Bacillus sp o - 20 (voir exemple 1) à une succinylation et on fait absorber l'enzyme par un diéthylamino-éthyldextrane du commerce .(DEAF-Sephadex) afin de préparer une enzyme insoluble dans l'eau de la manière suivante : On dissout 5 mg de'protéase dans 4,5 ml d'une solution 30 tampon 0,1 molaire en borate (contenant 0,01 mole de CaClg de pH 8, et on dissout également 1 mg d'anhydride succinique dans du dioxane que l'on ajoute à la première solution et on fait réagir en agitant pendant 30 minutes. On dialyse le mélange réactionnel avec 0,005 mole de CaCl^ pendant une journée et on fait absorber 35 la substance dialysée par le diéthylamino-éthyldextrane du commerce que l'on a tamponné avec une solution tampon de oorate 0,01 molaire (contenant 0,05 mole de CaC^) à pH 8 que l'on hydrolyse et que l'on met dans une colonne. On obtient 200 mg d'une enzyme insoluble dans l'eau. 4-0 On compare la protéase de départ (protéase-I) et la protéase 72 12939 11_ 2133670 insoluble dans l'eau obtenue (protéase-2) quant à leurs activités protéolytique et estérolytique respectives de la manière suivante. On exprime j. 'activité estérolytique par la grandeur qui indique la quantité de protéase qui est nécessaire pour obtenir ^ne activité protéolytiq^e de 100. Protéase Activité protéolytique Activité estérolytique (caséine) 1 (acétyl- tyrosine éthyl- ester) 2 Protéase-1 100 100 Protéase-2 100 1,500 10 1 : méthode caséine-Polin 2 : méthode hestérine On ajoute la protéase-1 et la protéase-2 respectivement à 5 ml de sérum sanguin de lapin de manière que l'on mesure une activité sur acétyl-tyrosine éthylester de 500 mM/minute selon la 15 méthode hestérine, et on fait réagir pendant 50 minutes à 37°C» On isole la substance anti-inflammatoire du mélange réactionnel de la façon suivante : On filtre le sérum modifié avec la protéase -1 en utilisant un filtre-membrane du commerce "Diafilter G-05T" d'une Société 20 japonaise). On ajoute ml d'eau au liquide non-filtré et on filtre le liquide dilué, on obtient ainsi 8 ml de filtrat. On concentre le filtrat sous pression réduite et on obtient 5 ml d'un liquide contenant une substance anti-inflammatoire (le liquide est exempt d'activité sur 1'acétyl-thyrosine-éthylester et on le désigne ci-25 après comme échantillon l). On centrifuge le sérum sanguin modifié avec la protéase-2 pendant 10 minutes à J>000 T/minute pour écarter l'enzyme, et on obtient 4,5 ml de liquide surnageant que l'on dilue avec de l'eau afin de préparer un liquide contenant une substance anti-inflamma-30 toire. (le liquide est exempt d'activités sur l'acétyl- tyrosine-éthylester et on le désigne ci-apres comme échantillon II). Les deux sérums sanguins modifiés ainsi préparés contiennent des peptides, des amino-acides et du sucre, et ils"sont solubies dans l'eau. 35 D'autre part, on abandonne 5 ml de sérum sanguin de lapin pendant 50 minutes à 37°C afin de préparer un échantillon témoin III. On détermine les effets anti-inflammatoires de ces échantillons. On administre les échantillons I, II et III par voie intra- 72 12939 -12- 2133670 péritonéale à des rats Wister de sexe masculin pesant environ 150 g, dans des doses de 5 ml par kg (poids des rats), respectivement. En un intervalle de 30 minutes on injecte par voie sous-cutanée 0,05 ml de carraghénine à 1 % dans 1a plante d'une patte arrière 5 de chaque rat. On mesure une augmentation de la grosseur de la patte arrière dans les trois heures qui suivent l'injection. On administre du sérum physiologique de la façon décrite ci-dessus comme témoin. On observe un effet inhibiteur sur l'oedème de 62 $ avec l'échantillon I et 64 % avec 11 échantillon■II et aucun effet inhibiteur 10 avec l'échantillon III et le témoin. Exemple 7 On fait réagir 5 ml de sérum sanguin de poule avec une protéase insoluble (c'est-à-dire de la ehymotrypsine insoluble obtenue par insolubilisation de ehymotrypsine par la méthode de l'azide, 15 en utilisant de la carboxyméthylceliulose comme décrit ci-après (pendant 50 minutes à 35°C), on isole la protéase insoluble par filtration et on obtient 4,8 ml de filtrat exempt d'activité enzymatique. Le filtrat contient des peptides, des amino-acides et du suere, il est soiuble dans l'eau et insoluble dans le méthanol. 20 On administre le filtrat par voie intrapéritonéale à un rat dans une dose de 1 ml par 200 g (poids du rat) afin d'examiner l'effet inhibiteur produit sur l'oedème provoqué par une injection sous-cutanée de carraghénine dans le talon d'une patte arrière d'un rat. Dans les trois heures qui Suivent l'administration, on 25 obtient une inhibition de 68 % de l'oedème sans aucune hémorragie intrapéritonéale, on n'observe aucun effet inhibiteur à la suite de l'administration de sérum sanguin de poule qui n'a pas réagi avec la protéase insoluble. On prépare la protéase insoluble mentionnée ci-dessus de 30 la façon suivante : On ajoute de l'hydrazine à une solution de carboxyméthylceliulose dans du méthanol afin de préparer un hydrazide de carboxyméthylceliulose que l'on fait ensuite réagir avec du nitrite de sodium dans une solution d'acide chlorhydrique dilué. On fait 35 réagir ensuite le produit de cette réaction avec de la ehymotrypsine à un pH 8,7 à 5°C en agitant et on obtient de ia ehymotrypsine insoluble. Le rendement de la réaction était de 20 % calculé selon l'activité protéolytique sur la caséine. 72 12939 -13- 2133670 REVENDICATIONS 1. Agent anti-inflammatoire, caractérisé en ce qu'il contient une quantité suffisante pour obtenir un effet anti-inflammatoire, du produit de réaction d'un sang avec une protéase, et un 5 adjuvant. 2. Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sang est du sang complet, du plasma sanguin ou du sérum sanguin. 3. Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase est de la trypsine, de la pepsine, de la ehymotrypsine 10 ou de la pancréatine. 4. Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que ia protéase est de la broméline ou de la papaïne. 5. Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que ia protéase provient d'^n des micro-organismes suivants : 15 Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae, Pénicillium notatum, Rhizopus chinensis, Mucor racemosus. "6. Procédé de préparation de l'agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir le sang avec la protéase entre 20 et 60°C et ensuite on isole le produit obtenu 20 du mélange réactionnel. 7. Procédé selon xa revendication 6, caractérisé en ce que x'on fait réagir la protéase en une quantité de 200 à 2000 X par ml de sang.