Brevet FR2133927A1 — publié le 19721201

7?. 13921 1 7133927 La présente invention est relative à un procédé d'oxydation enzymatique pour la production de dérivés de l'antibiotique qu'est la céphalosporine C„ Les composés de céphalosporine auxquels on se réfère 5 dans le présent mémoire sont dénommés dans l'ensemble en se référant au céphame (voir J. Am. Chenu Soc. 1962, 84, 3400). Le terme "céphème" se réfère à la structure céphame de base avec une seule double liaison. La céphalosporine C /acide 3-acétoxyméthyl-7|3-(D-5-10 amino-5-carboxypentanamido)céph-3-ème-4-carboxylique7 peut être transformée en acide 3-acétoxyméthyl-73-aminocéph-3-ème-4-car-boxylique (acide 7-aminocéphalosporanique ou, en bref, 7-ACA) et par conséquent en analogues 7(3-acylamido de la céphalosporine C à activité antibactérienne modifiée. Cependant, la 15 N-désacylation de la céphalosporine C pose de nombreux problèmes. Bien que le 7-ACA puisse être préparé à partir de la céphalosporine C avec des rendements acceptables selon divers procédés, il n'en est pas moins nécessaire de pouvoir disposer d'autres procédés de préparation plus avantageux. 20 Le brevet belge 736.934 décrit un procédé d'oxyda tion enzymatique de la chaîne latérale du groupe 7P-amino de la céphalosporine C de façon à obtenir le dérivé que l'on peut aisément transformer en 7-ACA par N-désacylation. Selon le procédé du brevet précité, on utilise une D-amino acide 25 oxydase d'origine fongique, l'enzyme étant libérée des cellules fongiques avant l'emploi par la mise en oeuvre d'un des divers procédés entraînant une lyse des cellules. Si on le souhaite, on purifie ensuite l'enzyme, par exemple par fractionnement avec du sulfate d'ammonium. Cette lyse des cellu-30 les fongiques était considérée comme nécessaire, étant donné que les cellules intactes ne provoquaient pas la réaction souhaitée . On a découvert à présent que l'on peut oxyder la chaîne latérale sur le groupe 7P-amino de la céphalosporine C 35 en présence de cellules activées de la levure Trigonopsis varlabilis» Par le terme "activées" on veut dire dans le présent mémoire que les cellules de levure ont été soumises à certains procédés physiques et/ou chimiques qui y rendent la D-amino acide oxydase disponible pour la catalyse de l'oxyda-40 tion de la céphalosporine C mais qui ne provoquent pas de li 72 13921 2 ? 133927 10 15 20 25 bération sensible de l'enzyme, c'est-à-dire que les cellules ont été perméabilisées. Une des caractéristiques de la présente invention réside dans des cellules activées de Trigonopsis varlabllis. On décrit ci-dessous divers procédés d'activation utilisables. On décrira l'invention ci-dessous en se référant à l'oxydation de la céphalosporine C et de ses possessifs dérivés où le groupe acétate de la chaîne latérale en position 3 a été remplacé par le reste d'un nucléophile ou par un groupe hydroxy ou un atome d'hydrogène, mais il faut comprendre que les cellules activées peuvent également s'employer pour oxyder d'autres substrats de D-amino acide, à condition que ceux-ci soient susceptibles d'être oxydés par l'enzyme isolée. La présente invention a par conséquent aussi pour caractéristique un procédé de préparation de composés de céphalosporine répondant à la formule générale suivante : r.(ch2)3conh (I) c00h ou de ses sels, formule dans laquelle X désigne un groupe acétate, le reste d'un nucléophile, un groupe hydroxy ou un atome d'hydrogène et r désigne le groupe -c0.c00h ou -c00h, caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule : "00C \ 30 h3N ch(ch2)3co.nh (ii) c00h 35 40 ou un de ses sels, formule dans laquelle X possède les significations précitées, à l'action de cellules activées de Trigonopsis variabllis, dans des conditions aérobie, l'activité de catalase étant présente dans les cellules en question lorsque le groupe R dans le produit souhaité est -C0«C00H. Comme exemples de sels des composés (I) et (il), on peut citer les sels de sodium et de potassium. 72 13921 3 7133927 Une souche convenable de Trigonopsis variabilis est celle que l'on peut se procurer au Centraal Bureau voor Schimmelcultur, Baarn, Pays-Bas, sous le numéro de culture CBS 4095. 5 L'emploi de cellules activées de Trigonopsis varia bilis au lieu d'une préparation plus ou moins fortement purifiée de la D-amino acide oxydase présente plusieurs avantages pratiques. En premier lieu, on élimine le procédé de purification consommateur de temps et compliqué et on remplace celui-ci 10 par un simple procédé d'activation. En second lieu, on a constaté que l'enzyme qu'est la D-amino acide oxydase est moins aisément inhibée ou inactivée dans des cellules activées de Trigonopsis variabilis que l'enzyme isolée, lorsqu'on les utilise dans des bouillons 15 provenant de la fermentation de Cephalosporium acremonium Brotzu. Ce dernier point est d'une grande importance pratique, étant donné que pour la commodité, il est souvent souhaitable d'oxyder la céphalosporine Ç sans procéder à son isolement du bouillon de fermentation. Cet isolement est très difficile à 20 mener à bien, en raison de la nature amphotère du composé et le fait de pouvoir traiter ultérieurement la céphalosporine C sans devoir l'isoler est une caractéristique extrêmement avantageuse. On a constaté que le bouillont de fermentation, même après purification partielle, comme par élimination du mycé-25 lium et précipitation des protéines, contenait des facteurs tendant à inhiber les D-amino acide oxydases fongiques. Pour cette raison, il était nécessaire de disposer d'un grand excès d'enzyme pour assurer le déroulement d'une réaction satisfaisante. 30 Au contraire, lorsque l'on utilise des cellules activées de Trigonopsis variabilis au lieu de l'enzyme brute ou purifiée, l'enzyme semble être protégée dans une grande mesure de l'inhibition et est efficace en une quantité bien plus faible. 35 Finalement, l'emploi des cellules activées est commode en ce sens qu'il engendre un système enzymatique insoluble que l'on peut récupérer et réemployer tandis que la purification et la réutilisation de l'enzyme soluble n'est réalisable que de manière limitée. 40 Par conséquent, il est évident que l'utilisation de 72 13921 it 2133927 cellules activées pour oxyder la céphalosporine C constitue un progrès considérable de la chimie des céphalosporines. Le procédé d'activation des cellules de Trigonopsis variabilis peut s'effectuer selon diverses manières, par exem-5 pie comme décrit dans le présent mémoire. On ne connaît pas le mécanisme qui y est associé mais l'effet en est que l'enzyme voulue est rendue disponible pour l'oxydation de la céphalosporine C, tandis que les cellules intactes, non activées, ne présentent aucune activité dans cette réaction. Il faut encore 10 noter que la D-amino acide oxydase ne semble pas être libérée dans le liquide exocellulaire par le procédé d'activation : l'activité est associée aux cellules plutôt qu'au surnageant que l'on peut remplacer sans affecter l'activité. Le surnageant ne présente aucune activité de D-amino acide oxydase détecta-15 ble. De plus, on a découvert que l'activité de cellules activées équivaut sensiblement à celle de la D-amino acide oxydase qui en est libérée par lyse, par exemple par traitement aux ultrasons. L'activité de cellules activées est supé-20 rieure en présence d'inhibiteurs qui se trouvent dans les bouillons de fermentation de la céphalosporine C. On réalise le procédé d'activation en soumettant les cellules à certaines conditions modérément fortes qui ne sont cependant pas suffisamment fortes pour provoquer la lyse. 25 Comme exemples de tels traitements, on peut citer les suivants: (a) Congélation suivie d'une décongélation à un pH acide, par exemple d'environ 3 à 4 ; la congélation peut s'effectuer à une température inférieure à -10°C, par exemple d'environ -20°C 30 te pour être efficace, par exemple, elle doit se faire pendant au moins 1 heure à -20°C. (b) Traitement des cellules en phase aqueuse par un ou plusieurs solvants organiques. Comme solvants appropriés, on peut citer les cétones aliphatiques inférieures, par exem- 35 pie l'acétone; les alcools mono- et poly-hydroxylés aliphatiques et araliphatiques, par exemple le 2-phényléthanol ou des alcools inférieurs comme le n-butanol; et des hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques, par exemple le cyclohexane, le benzène ou le toluène. Le toluène constitue le solvant préféré. 40 Le traitement à une température inférieure à 60°C, par exemple 72 13921 5 2133927 à environ 37°C pendant environ 30 minutes, engendre fréquemment une activation sans provoquer de lyse substantielle. (c) Traitement par un agent tensioactif. L'agent tensioactif en question peut s'utiliser sous forme d'une solu- 5 tion aqueuse en une concentration de, par exemple, 0,01-20 %, de préférence 0,1-10 % et plus avantageusement encore, 1 % -10 % (tous les pourcentages étant en poids ou en volume selon le cas). La durée et la température de traitement peuvent être telles que décrites sous (b). Comme agents tensioactifs catio-10 niques appropriés, on peut citer les composés d'ammonium quaternaire, par exemple les halogénures de cétyltriméthylammo-nium, de cétylpyridinium et de cétyldiméthylbenzylammonium. Comme agents tensioactifs anioniques appropriés, on peut citer les sulfates d'alkyle supérieurs, par exemple ceux 15 possédant de 10 à 18 atomes de carbone, par exemple le sulfate de dodécyle. On utilise dans l'ensemble ces composés sous forme de leurs sels avec des bases minérales ou organiques, par exemple sous forme de sels de métaux alcalins ou d'éthanolammonium. D'autres agents tensioactifs anioniques intéressants aux fins 20 de la présente invention sont les sels de métaux alcalins, par exemple de sodium, d'alkylarylsulfonates ou d'huile de ricin sulfonée et les sels de métaux alcalins des acides biliaires, comme le désoxycholate de sodium. On peut aussi utiliser des agents tensioactifs non 25 ioniques, par exemple le monolaurate de sorbitan, le Triton X100 (un produit de condensation d'isooctylphénoxypolyéthoxy-éthanol et d'oxyde d'éthylène vendu par la société Rohm & Haas Company, Philadelphie, E.U.A.) ou la digitonine. (d) Traitement par des alcalis.. L'élévation du pH 30 du milieu dans lequel.la levure se trouve en suspension s'est révélée activer les cellules de façon satisfaisante. Un alcali approprié est un hydroxyde de métal alcalin en milieu aqueux, par exemple 1'hydroxyde de sodium ou de potassium, la concentration efficace étant environ N/100. On peut également uti-35 liser des hydroxydes d'ammonium quaternaire ou des carbonates de métaux alcalins. La durée et la température du traitement peuvent être celles décrites sous (b). (e) Choc osmotique. L'activation peut aussi se réaliser en soumettant les cellules de Trigonopsis à des 40 pressions osmotiques extrêmes. Les cellules peuvent, par 72 13921 6 2133927 exemple, être mises en suspension dans une solution de pression osmotique élevée, par exemple une solution de saccharose 2M tamponnée à un pH de 8, pendant une courte période de temps, par exemple 30 minutes, après quoi la suspension est rapidement 5 diluée à l'aide d'eau. Il peut être nécessaire de vérifier les conditions optimales d'activation pour le procédé d'activation choisi par des essais et par une expérimentation par erreur. Il faut comprendre que 1'activation peut être affectée par divers facteurs 10 tels que la température, la durée du traitement, le pH du milieu environnant et la concentration des réactifs. Indépendamment du procédé d'activation choisi, les cellules doivent être maintenues en contact avec de l'eau tant au cours de la totalité du stade d'activation qu'après ce processus. 15 Une comparaison par examen au microscope électronique de cellules de Trigonopsis non traitées à des cellules après activation au toluène, révèle que les cellules activées au toluène demeurent sensiblement intactes mais ont subi une modification totale de l'organisation cytoplasmique, ne peroet-20 tant plus de reconnaître les structures internes. La levure peut se cultiver par la mise en oeuvre de techniques connues. On a constaté que l'on obtient une activité de D-amino acide oxydase supérieure lorsque le milieu de culture contient de la D (ou DL)-méthionine; il est possible que ce 25 composé serve à amorcer la formation de l'enzyme. Le degré d'activité de D-amino acide oxydase dépend de manière marquée des conditions de culture. L'activité de D-amino acide oxydase peut s'estimer de la façon la plus satisfaisante en déterminant la vitesse de 30 la formation par spectrophotométrie au peroxyde d'hydrogène en utilisant la o-phénylènediamine donneuse d'hydrogène comme indicateur. En présence de peroxydase, 1'o-phénylènediamine est oxydée par le peroxyde d'hydrogène pour engendrer un colorant 35 brun. Des composés de formule (I) dans laquelle R est le groupe -C0.C00H se préparent en faisant réagir le composé approprié de formule (II) sur de la D-amino acide oxydase en présence de catalase. Cette dernière enzyme est normalement 40 présente dans les cellules de levure activée mais si cela se 72 13921 7 2133927 révèle nécessaire, on peut ajouter une quantité supplémentaire de catalase. La quantité de catalase supplémentaire nécessaire peut aisément se déterminer par des expérimentations et des essais préliminaires. La fonction de la catalase est d'empê-5 cher une décarboxylation oxydante se traduisant par la formation de composés de formule (I) dans laquelle R est le groupe -COOH, au lieu des composés souhaités (où R est le groupe -CO.COOH); les composés de formule (i) dans laquelle R est le groupe -CHO sont des intermédiaires vis-à-vis de cette 10 décarboxylation oxydante. Les composés de formule (I) dans laquelle R est le groupe -COOH se préparent en inhibant toute catalase présente dans les cellules de levure. Même lorsque la catalase a été inhibée, le produit contient en général une petite proportion 15 d'a-céto acide (R « -CO.COOH). L'inhibition peut être provoquée par des moyens chimiques ou physiques. Des inhibiteurs de catalase convenables sont l'acide ascorbique, le 3-amino-1,2,3-triazole et les azotures minéraux. Les azotures de métaux alcalins, en particulier l'azoture de 20 sodium, sont les inhibiteurs préférés. L'inhibiteur peut être présent dans le mélange réactionnel au cours de la transformation de la céphalosporine de départ en le composé souhaité ou bien il peut être utilisé pour prétraiter les cellules de Trigonopsis variabilis avant leur emploi pour la conversion. 25 Ainsi, on peut ajouter de l'azoture de sodium au mélange réactionnel en une proportion de, par exemple, 1 mM à 100 mM ou bien, si l'on souhaite éviter la présence de quantités relativement importantes d'azoture dans le milieu réactionnel, l'azoture de sodium, ou de tout autre métal alcalin, 30 peut être ajouté à une suspension des cellules de Trigonopsis activées et être laissé en contact avec elles jusqu'à ce qu'on ne puisse plus détecter d'activité de catalase sensible. La demanderesse a découvert qu'il était commode d'ajouter des quantités d'azoture de sodium allant jusqu'à des concentra-35 tions molaires, par exemple 500 mM, à une suspension de cellules dans une solution tampon et de laisser l'azoture de sodium dans cette solution pendant 15 heures à une température allant de 0°C à 40°C, par exemple une température de 4°C. La catalase dans les cellules de levure peut aussi 40 être désactivée par traitement à chaud, préalablement à l'em 72 13921 8 2133927 ploi des cellules dans le procédé de conversion. La demanderesse a trouvé que la D-amino acide oxydase et la catalase présentes dans les cellules présentaient des stabilités thermiques différentes et cette caractéristique permet d'inacti-5 ver préférentiellement la catalase. Ainsi, si les cellules sont incubées à 40-60°C, de préférence à environ 50°C, pendant au moins 3 heures, leur activité de catalase est notablement réduite, cependant que leur activité de D-amino acide oxydase subsiste. Bien que le traitement à chaud puisse s'ef-10 fectuer sur des cellules dans une simple suspension aqueuse ou tamponnée, il est particulièrement commode de soumettre les cellules au traitement, cependant qu'elles subissent simultanément le traitement par un réactif d'"activation". Par exemple, on peut réaliser le traitement d'activation avec 15 un solvant tel que le toluène, à 50°C pendant 4 heures, de façon à réaliser simultanément l'inhibition de la catalase et 1'activation des cellules. La réaction du système enzymatique des cellules activées sur le composé de formule (II) peut se réaliser 20 à un pH de 4 à 9 et, en particulier, de 6 à 8. On peut utiliser à cette fin des températures allant de la température ambiante à environ'65°C, par exemple, des températures de 30 à 40°C. Cependant, en ce qui concerne le pH et la température, il ne faut pas choisir des conditions qui entraînent 25 la désactivation de l'enzyme. Il faut de préférence utiliser un taux d'activité enzymatique non inférieur à 5 unités/mg (selon la définition qui suit) de la matière céphalosporini-que de départ isolée. Une période réactionnelle d'au moins 3 heures peut être nécessaire à ce taux. De plus courtes 30 périodes de réaction, par exemple d'une demi-heure, sont possibles avec des taux ou degrés d'activité enzymatique supérieure, par exemple de 6 - 500, de préférence environ 100 unités/mg. En général, il faut utiliser un degré d'activité enzymatique non inférieur à 10 unités/mg avec des bouil-35 Ions de fermentation de céphalosporine (soit brute, soit partiellement purifiée). Il est nécessaire de pratiquer une agitation et une aération simultanées, avec de l'air ou de l'oxygène. Les degrés d'agitation et d'aération dépendent de l'échelle 40 de l'opération. 72 13921 9 2133927 Les composés de formule (I) dans laquelle R est un groupe -CO.COOH ne sont pas très stables et il est nécessaire de choisir avec soin les conditions réactionnelles et en particulier les durées de réaction (qui doivent être courtes, par exemple 0,5 à 2 heures). Comme on l'a déjà mentionné, la céphalosporine C est difficile à extraire des bouillons de fermentation en raison de sa structure amphotère et de sa nature hydrophile. Le procédé selon l'invention peut être réalisé in situ dans des conditions appropriées (avant ou après élimination du mycé"-lium) dans un bouillon de fermentation de céphalosporine C, les composés résultants de formule (I) (X = acétoxy) étant récupérés. On réalise normalement le procédé après acidification et filtration du bouillon. On peut ensuite récupérer les composés obtenus de formule I par extraction à l'aide d'un solvant ou par adsorption sur une colonne échangeuse d ' ions". Les composés de formule (I) dans laquelle X est un groupe acétate peuvent commodément s'extraire de la solution aqueuse dans laquelle ils ont été préparés, par exemple, par acidification jusqu'à un'pH de 2,5 ou un pH inférieur et extraction par un solvant organique convenable, par exemple, l'acétate d'éthyle ou le n-butanol. De multiples extractions avec de l'acétate d'éthyle permettent de réaliser une extraction sensiblement complète, mais l'efficacité peut en être améliorée en saturant la phase aqueuse ou en la saturant sensiblement, d'un sel minéral inerte soluble dans l'eau, par exemple le chlorure de sodium. Lors de l'isolement des produits des bouillons de fermentation et des solutions aqueuses simples, on a découvert qu'un système utilisant une combinaison d'un échangeur d'ions et d'une extraction par solvant permet d'obtenir de bons résultats. Des échangeurs d'ions convenables sont les échangeurs anioniques aminés liquides de poids moléculaire élevé, vendus par la société Rohm & Haas Co. sous les marques de fabrique Âmberlite LA1, LA2 et LA3 (LA1 et LA2 sont des aminés secondaires; LA3 est une aminé primaire). Les solvants préférés pour être utilisés en combinaison avec les échangeurs anioniques liquides sont le n-butanol et l'acétate de butyle. Un système que l'on a utilisé avec des avantages 72 13921 10 2133927 particuliers pour réaliser des extractions de bouillons de fermentation de céphalosporine déprotéinisée est constitué par l'Amberlite LA1 dans du n-butanol, l'extraction étant suivie d'une réextraction par une solution de bicarbonate de sodium 5 et une extraction subséquente à l'acétate d'éthyle» Le pH du bouillon est de préférence réduit à une valeur inférieure à 6 et plus avantageusement encore à une valeur de 3 à 5 avant de procéder à l'extraction. La résine solide, Amberlite XAD2, qui est un polymère 10 de polystyrène réticulé macroréticulaire, peut aussi être utilisée pour l'extraction de composés de formule (l) dans laquelle X est un groupe acétate, à partir de bouillons de fermentation de céphalosporine bruts ou déprotéinisés. Un solvant approprié à l'élution du composé adsorbé de la résine peut être déterminé 15 par expérimentation préliminaire. Un solvant approprié dans le cas de l'acide 3-acétoxyméthyl-7|3-(4-carboxybutanamido)céph-3-ème-4-carboxylique est l'acétone. Les composés de formule (I) dans laquelle X est le reste d'un nucléophile ou est un groupe hydroxy ou un atome 20 d'hydrogène, peuvent être récupérés des milieux aqueux dans lesquels on les a préparés, d'une manière similaire à celle décrite plus haut. Cette manière dépend de la nature du groupe X et des modifications des conditions d'extraction peuvent être nécessaires. Ces conditions d'extraction peuvent aisément se 25 déterminer par des essais ou des expérimentations par erreur. Les composés de formule (I) dans laquelle R est un groupe -COOH peuvent être transformés en composés 7f3-amino correspondants en faisant réagir le 4-ester correspondant sur un composé formateur d'halogénure d'imide en transformant 30 l'halogénure d'imide ainsi obtenu en iminoéther et en décomposant ce dernier. Si on le souhaite, le groupe ester peut être séparé par hydrolyse ou hydrogénolyse, si cela se révèle approprié, de façon à engendrer l'acide 4-carboxylique. Comme composés formateurs d'halogénure d'imide con~ 35 venables,on peut citer les halogénures d'acide provenant des acides du phosphore, les composés préférés étant les chlorures, tels que, par exemple, 11oxychlorure de phosphore ou le penta-chlorure de phosphore. Ce procédé de N-désacylation est décrit plus en dé-40 tail dans les brevets britanniques n° 1.041,985 et 1.119.806, 72 13921 11 2133927 ainsi que dans le brevet belge n° 719.712. Les composés de formule (I) dans laquelle R est un groupe -CO.COOH sont de préférence réduits, par exemple en utilisant un borohydrure de métal alcalin, en composés corres-5 pondants dans lesquels R est le groupe -CH(OH)COOH, avant de procéder à l'enlèvement de la chaîne latérale modifiée selon le procédé décrit dans le brevet belge n° 719«712. Par conséquent, d'importants composés de formule (I) sont ceux dans lesquels (A) R est le groupe -CO„COOH et X est 10 le groupe acétate, à savoir l'acide 3-acétoxyméthyl-73-(5- carboxy-5-oxopentanamido)céph-3-ème-4-carboxylique et (B) R est le groupe -COOH et X est le groupe acétate, à savoir l'acide 3-ac ét oxyméthyl-7 3-(4-carboxybutanamido)céph-3-ème-4-carboxy-lique. Ces composés sont des intermédiaires clef pour la pro-15 duction de 7-ACA à partir de céphalosporine C naturelle. Le composé (B) (R = -COOH) est particulièrement important à cet égard. Les composés de départ pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention dans lesquels X est le reste d'un 20 nucléophile peuvent se préparer en faisant réagir la céphalosporine C sur un nucléophile, par exemple, la pyridine ou toute autre aminé tertiaire, comme décrit dans le brevet britannique n° 912.541; un nucléophile fixant le soufre, fixant l'azote ou minéral comme décrit dans le brevet britanni-25 que n° 1.012.943; un nucléophile fixant le soufre comme décrit dans le brevet britannique n° 1.059.562; un nucléophile fixant l'azote comme décrit dans les brevets britanniques n° 1.030.630, 1.082.943 et 1.082.962; un nucléophile fixant le soufre comme décrit dans le brevet britannique n° 1.101.423. Cette liste 30 n'est nullement limitative et n'est citée qu'à des fins purement illustratives. Lorsque X est un groupe hydroxy, le composé peut se préparer selon les procédés décrits dans le brevet britannique n° 1.121.308; lorsque X est un atome d'hydrogène, le composé peut se préparer selon le procédé décrit dans le 35 brevet britannique n° 957.569. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre la présente invention, étant entendu que ces exemples ne limitent l'invention en aucune manière. 72 13921 12 2133927 PRELIMINAIRES On a fait croître les cultures dans des récipients agitateurs et ensuite dans des fermenteurs agités, contenant le milieu décrit par Sentheshanmuganathan et Nickerson 5 (1962), J.Gen. Microbiol, 27, 465, avec de la méthionine ou de l'alanine comme source d'azote. Estimation de l'activité de D-amino acide oxydase L'activité de l'amino acide oxydase (AAO) a été déterminée par spectrophotométrie en suivant la vitesse 10 de formation du peroxyde d'hydrogène (H202). Le procédé est basé sur le couple de réaction montré dans les équations 1 et 2, (1) Amino acide + H20 + 02/~AA0_7 a-céto acide + NH^ + H202 (2) H2O2 + DH2 £~P0D_7 2H20 + D j 15 Ceperoxyde d'hydrogène en présence de peroxydase (POD) oxyde la o-phénylènediamine (DH2) donneuse d'hydrogène en un colorant brun (D). On a réalisé l'essai à 37°C dans une cuvette en verre avec une fenêtre de lumière de 1 cm et on a 20 suivi la formation du colorant brun à 420 nm. Le mélange réactionnel était constitué de 1,0 ml d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1 M de pH 8,1, de 0,5 ml d'une solution de o-phénylènediamine (o-phénylènediamine à 0,02% dans de l'eau), de 0,3 ml d'un substrat (céphalosporine C potassique à 1% ou D-25 alanine à 2% dans tampon au pyrophosphate de sodium de pH 8,1), de 0,01 ml de peroxydase (solution aqueuse à 10 mg/ml) et d'une quantité suffisante d'eau pour amener le volume final à 2,8 ml. On a amorcé la réaction par l'addition de 0,2 ml de solution d'enzyme au mélange réactionnel. On a traité 30 le blanc dans des conditions identiques en utilisant de l'eau au lieu du substrat. L'accroissement linéaire de la densité optique à 420 mn au cours des 5 premières minutes a été utilisé pour mesurer l'activité de l'AAO. 35 Dans le présent mémoire, on définit une unité d'activité d'enzyme comme étant la quantité d'enzyme qui, à 37°C et vin pH de 8,1, entraîne un changement de la densité optique de 0,001/min. Activation de Trigonopsis variabilis 40 On a centrifugé (1.400 g) pendant 5 minutes 72 13921 13 2133927 des échantillons (10 ml) d'un bouillon de fermentation de Trigonopsis variabilis et on a jeté les surnageants» On a fourni les pastilles humides des cellule cirant subi la sédimentation à divers traitements, comme -Jt ? 5 a) conservation à 4°C et mise en suspension dans de l'eau (10 ml) b) suspension d'un tampon au pyrophosphate de sodium, 0,01M, de pH 8,1 (10 ml) et traitement aux ultrasons pendant 30 minutes à 20 kHz dans un désintégrateur à ultrasons M„S.E„ 10 puis clarification par centrifugation c) congélation à -20°C pendant une durée ne dépassant pas une heure puis décongélation par repos à la température ambiante et mise en suspension dans de l'eau (10 ml) d) suspension dans les réactifs suivants (10 ml) à 4°C pendant 15 24 heures, centrifugation pendant 5 minutes à 1.400 g et remise en suspension de cellules dans de l'eau (10 ml) : Digitonine (1%, p/v) Span 20 (1%, v/v) (un agent tensio-actif, à -savoir le mono-laurate de sorbitan) 20 NaOH (N/100) Cyclohexane (95%, v/v, c'est-à-dire,9>5 ml de cyclohexane et 0,5 ml d'eau) Acétone Benzène (2%, v/v) et n-butanol (4%9 v/v) 25 n-butanol (2,5%, v/v) et toluène (1%; v/v) On a testé tous les échantillons en ce qui concerne l'activité de D-amino acide oxydasec Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau I qui suit,. T A B L EAU I 30 Traitement Conservation à 4°C Traitement aux ultrasons Congélation et décongélation Activité D«=a®ino acide oxydase unités/ml (moyenne) 0 35 Digitonine Span 20 NaOH Cyclohexane Acétone Benzène/n-butapol n-butanol/toluene 735 782 516 640 765 290 420 72 13921 14 2133927 On a effectué d'autres travaux relatifs à 1'activation de Trigonopsis variabilis, en utilisant des cultures d'activité de D-amino acide oxydase supérieure.Les agents activants étaient ; (a) des agents tensio-actifs; (b) des solvants 5 organiques; et (c) un choc osmotique. (a) Agents tensio-actifs : On a centrifugé(1400 g) des échantillons de 10 ml d'une culture en bouillon de Trigonopsis variabilis (conservée à 4°C) pendant 5 minutes et on a jeté le surnageant. 10 On a remis la pastille de cellules en suspension dans une solution à 0,1% de l'agent tensio-actif approprié dans un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M de pH 8,1, et on a procédé à iane incubation à température constante pendant une période de temps fixée. On a agité la suspension de cellules pendant 30 15 secondes au début de la période d'incubation et ensuite à des intervalles de 5 minutes au cours du déroulement de l'incubation. Dans tous les cas, les conditions d'incubation ont été les suivantes : 5 min ; 4°C 20 30 min % 4°C 5 min s 37°C 30 min ; 37°C Après l'incubation, on a refroidi la suspension de cellules (lorsque cela était nécessaire) jusqu'à 25 4°C, on l'a centrifugé (1.400 g) pendant 5 minutes et on a soigneusement séparé le surnageant par décantation et on a jeté le surnageant. On a ensuite lavé la partie de cellules par remise en suspension dans de l'eau distillée, puis on a procédé à une centrifugation d'une durée de 5 minutes et on a décanté 30 le surnageant obtenu. On a remis la partie de cellules finales en suspension dans un tampon au pyrophosphate de sodium 0,01M d'un pH de 8,1 et on a dilué la suspension de façon à obtenir une activité de 50-100 unités/ml. Toutes les déterminations de l'activité de D-amino acide oxydase ont été réalisées en se 35 servant de l'essai spectrophotométrique précédemment décrit. Tous les traitements ont été réalisés en double et le résultat final a été exprimé sous forme de valeur moyenne. La suspension finale a été examinée au mi-40 croscope et, dans tous les cas, les cellules semblaient être 72 13921 15 2133927 demeurées intactes et étaient indiscernables de cellules non traitées à un agrandissement de 900, une certaine modification de la structure interne étant cependant détectée par un microscope électronique. 5 Les activités de D-amino acide oxydase obtenues à partir des différents procédés de traitement ont été comparées à l'activité de cellules non traitées et à l'activité d'une préparation d'enzyme brute exempte de cellules. Dans ce dernier cas, on a libéré l'enzyme des cellules par dés-10 intégration aux ultrasons pendant 30 minutes à 4°C, en présence d'un tambon au pyrophosphate de sodium 0,01M de pH 8,1. L'extrait soumis au traitement aux ultrasons a été clarifié par centrifugation à 38.000 g pendant 15 minutes à 4°C avant de procéder à l'essai. Les résultats étaient les suivants t 15 TABLEAU II (a) tensio-actif activité de D-amino acide oxydase unités /ml et durée de traitement 5 min/ 30 min/ 5 min/ 30 min/ 4°C 4°C 37°C 37°C Bromure de cétyltriméthyl ammonium 2.070 3.120 2.380 2.590 Chlorure de cétylpyridi-nium 2.380 2.250 2.520 2.260 Chlorure de cétyldiméthyl-benzylammonium 2.320 2.350 2.130 2.520 Désoxycholate de sodium 1.200 1.080 j 1.010 i t 1.260 Digitonine 1.100 1.410 1.970 2.260 Dodécyl sulfate de sodium 1.980 1.870 2.090 2.160 72 13921 16 2133927 TABLEAU II (b) Témoins Activité de D-amino acide oxydase moyenne unités/ml Cellules non traitées pas d'activité détectable Préparation d'enzyme exempte de cellules 1.920 10 15 20 25 On a réalisé d'autres essais d'activation en utilisant une solution de Triton X100. On a centrifugé à 1.400 g pendant 5 minutes des échantillons (5 ml) d'un bouillon de fermentation de T. variabilis et on a jeté le surnageant. On a mis les pastilles de cellules humides ainsi formées en suspension dans vin tampon au pyrophosphate de sodium 0,1H d'un pH de 8,1 (10 ml) contenant du Triton X100. Les conditions d'activation et le traitement des cellules avant l'essai étaient comme décrits immédiatement plus haut, à l'exception que les incubatioiB ont été réalisées à 4° et 37° seulement pendant 30 minutes. Les résultats obtenus figurent dans les tableaux III a et III b qui suivent. TABLEAU III(a) Concentration en Triton X100 (%) Activité de D-amino (unités/ml) acide oxydase Activation à 4° Activation à 37° 1,0 1.680 15.600 10,0 4.200 20.800 20,0 4.600 22.000 30 35 TABLEAU III (b) 40 Témoins Activité de D-amino acide oxydase (unités/ml) Cellules non traitées pas d'activité détectable Préparation d'enzyme exempte de cellules 22.800 72 13921 17 2133927 10 15 (b) Solvants organiques On a préparé des échantillons d'un bouillon de culture de la manière décrite dans la partie (a) ci-dessus, sauf que l'on a réalisé l'incubation en présence de divers solvants organiques en deux concentra 'ClOilS différentes. Avant de procéder à l'incubation, on a remis la partie de cellules lavées en suspension dans un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M d'un pH de 8,1 et à cette suspension on a ajouté le solvant approprié (1% ou 10%) (indépendamment du fait que le mélange était ou non miscible). Les résultats figurent ci-dessus ; "n.d." indiquent l'absence d'activité détectable s T A B L E AU IV (a) Solvant Activité de D-amino acide oxydase, unités/ml et durée de traitement/temp. Conc— 5 min/ 4°C 30 min/ 4°C 5 min/ 37 °C 30 min/ 37°C Ethanol 10% n.d. . 250 210 325 n-propanol 10% 485 380 490 620 n-butanol 10% 2.770 2,300 = Benzène 1% 4.480 4.600 4.060 4.080 10% 3.900 5 0Q8Q 4.500 3,780 Toluène 1% 4.400 4,060 4.160 4.525 10% 4 o 388 4.490 ! 4.145 | 3.840 i 20 25 30 TABLEAU 17 (b) Témoins Activité de D-amino acide oxydase moyenne (unités/ml) Cellules non traitées n.d. Préparation d'enzyme exempte de cellules 3.730 35 40 D'une manière analogue, des pastilles de cellules humides obtenues à partir d'échantillons de 5 ml d'un bouillon de fermentation de T.variabilis d'un titre supérieur en D-amino acide oxydase ont été traitées par des solutions à 1% et 10% de 2-phényléthanol en mettant en oeuvre les mêmes procédés que ceux décrits ci-dessus, les incubations étant effectuées à 4°C et à 37°C pendant 30 minutes. Les résultats ob- 72 13921 18 2133927 tenus figurent ci-dessous ; TABLEAU V (a) Traitement Activité de D=amino acide oxydase (unités/ml) Activation à 4° Activation à 37° 2-phényléthanol 1% 2-phényléthanol 10% 2.000 5.800 9.200 9.600 TABLEAU V (b) Témoins Activité de D-aminô acide oxydase (unités/ml) Cellules non traitées Pas d'activité détectable Préparation d'enzyme exempte de cellules 12.000 (c) Choc osmotique On a ftilisé les solutions tampon suivantes : tris-HCl désigne le chlorhydrate de 1,l-di(hydroxyméthyl)-20 2-hydroxyéthylamine et EDTA désigne l'acide éthylènediamineté-traacétique. Les tampons (2) et (4) étaient de pression osmotique élevée en raison du fait qu'ils contenaient du saccharose 2M. TABLEAU VI (a) Tampon Tris-HCL 0,01M pH 8,0 2M saccharose MgS04 0,01M EDTA 1mM (1) + «= + - (2) + " + + - (3) + + + (4) + + + + On a centrifugé à 1.400 g pendant 5 minutes des échantillons (5 ml) d'un bouillon de fermentation de T^ 35 variabilis et on a jeté les surnageants. On a remis les pastilles humides ainsi formées en suspension dans les tampons (1) ou (3) (10 ml) et on a de nouveau procédé à une centrifugation. On a répété le procédé de lavage, on a finalement remis les pastilles de cellules en suspension dans les tampons (1), (2), (3) ou (4) (10 ml) et on a procédé à l'incubation pendant 30 minutes à 37 °C. 72 13921 19 2133927 On a ensuite dilué chaque suspension jusqu'à un volume de 100 ml à l'aide d'un tampon froid (1) ou (3) et l'on a alors prélevé des échantillons de 10 ml. Après centrifugation à 1.400 g, on a remis les pastilles de cellules en sus-5 pension dans un tampon au pyrophosphate de sodium 0,01M d'un pH de 8,1 et on a dilué avec du tampon avant de titra' l'activité. On a obtenu les résultats ci-dessous.A des fins de comparaison, on a transformé un échantillon de 5 ml du bouillon de fermentation en une préparation d'enzyme exempte 10 de cellules. TABLEAU VI (b) Tampon utilisé lors de l'incubation Activité de D-amino acide oxydase (unités/ml) (1) n.d. (2) 5.600 (3) n.d. (4) 6.050 Préparation d'enzyme exempte de cellules Cellules non traitées 23.600 n.d. Oxydation de la céphalosporine C EXEMPLE 1 25 a) On a fait croître des Trigonopsis variabi lis (C.B.S. 4095) dans un milieu synthétique contenant de la méthionine, de la manière décrite dans les préliminaires des exemples. On a récolté la suspension de cellules par centrifugation et on a retenu la masse de cellules humides. 30 On a divisé des cellules humides en quatre parties aliquotes et on les a "activées" par congélation à -20°C suivie d'une décongélation à la température ambiante. Après dilution avec de l'eau, on a obtenu une suspension de cellules à 61,7% en poids humide/volume. Lorsque l'on a titre cette sus-35 pension en utilisant le titrage spectrophotométrique précédemment décrit, on a constaté qu'elle présentait une activité d'enzyme de 32.200 unités/ml. On a dissous 40 g d'une préparation de céphalosporine C potassique présentant une pureté de 68% (c'est-40 à-dire 27,2 g de céphalosporine C potassique) dans 2 litres 72 13921 20* • ■ 2133927 d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,2M d'un pH de 8,1, contenant de l'azoture (260 mg) et dilué jusqu'à 3.990 ml à l'aide d'eau. On a équilibré la solution, contenue dans un récipient agité, à 33°C pendant 30 minutes dans un bain marie „ On a amor-5 cé la conversion en ajoutant 10 ml de la suspension de cellules précédemment décrites et on a poursuivi cette transformation pendant 3 heures en utilisant un débit d'air de 3 1/min en même temps qu'une vitesse d'agitation de 550 tpm, On a terminé la transformation par centrifugation du contenu du récipient à 10 2.100 g pendant une heure. L'analyse par chromatographie en couche mince quantitative (absorption ultraviolette) d'échantillons soutirés à certains intervalles du récipient de réaction a permis de constater que la conversion était achevée en à peu près 15 1,5 heure et que 68% de la céphalosporine C avaient été transformés en acide 3-acétoxyméthyl-70-(4-carboxybutanamido)céph-3-ème-4-carboxylique. L'activité de l'enzyme utilisée correspondait à 12,8 unités/mg de céphalosporine C (acide libre)» On a extrait le produit ci-dessus du mé-20 lange de conversion clarifié de la façon suivante ; On a ajusté deux litres du mélange de conversion à m pH de 1,5 en utilisant de l'acide chlorhydrique et on les a extraits par 8 x 1,6 litre d'acétate d'éthyle. On a évaporé sous vide les extraits à l'acétate d'éthyle réunis 25 jusqu'à obtenir un volume d'approximativement 800 ml et on les a séchés jusqu'au lendemain en utilisant du sulfate de sodium anhydre. On a davantage évaporé l'extrait à l'acétate d'éthyle séché sous vide jusqu'à un volume de 50 ml et on a ensuite lentement ajouté de l'éther de pétrole (60-80°C)sous vigoureuse 30 agitation jusqu'à obtenir un volume de 700 ml. On a séparé le précipité obtenu par filtra-tion et on a séché ce dernier sous vide sur de l'alumine de façon à obtenir de l'acide 3-acétoxyméthyl-73-(4~carboxybutanamido) céph-3-ème-4-carboxylique (9,83 g) sous forme d'un solide jaune 35 pâle présentant une pureté de 84% Z~E^m = 201 (260 nm)__7« Lorsque l'on a soumis ce solide à une analyse par chromatographie en couche minceonn'a pas pu détecter d'autres zones absorbant les ultraviolets (254 nm). Ceci correspondait à une conversion globale de la céphalosporine C potassique en produit susmention-40 né de 72%. ' 72 13921 21 2133927 EXEMPLE 2 On a récolté des cellules de T«variabilis à partir d'un échantillon d'un litre d'ur bcuillon de fermentation, par centrifugation à 2.100 g psndsnt 30 minutes à 4°C« 5 On a jeté le surnageant et on a remis la pastille de cellules en suspension dans un litre d'un tampon au pyrophosphate de sodium d'un pH de 8,1c On a ajouté des pastilles aliauotes de 100 ml de cette suspension de cellules à 10 ml de toluène dans des flacons de 250 ml. On a incubé le mélange non miscible de 10 toluène et de la suspension aqueuse de cellules sur tin agitateur rotatif (300 tpm ) à 37°C pendant 2 heures. On a ensuite refroidi les contenus des flacons jusqu'à 4°C, on les a centrifugés à 2.100 g pendant 30 minutes et on a séparé et jeté les couches surnageantes. On a ensuite remis les parties de cellules en 15 suspension dans chaque fois 100 ml d'eau distillée, on a procédé à line nouvelle centrifugation et on a séparé et jeté les surnageants. Les pastilles de cellules provenant de tous les flacons ainsi traités ont ensuite été réunies et amenées à un volume total de 200 ml avec un tampon au pyrophosphate de sodium 20 0,1M d'un pH de 8,1. On a titré cette suspension et on a constaté qu'elle présentait une activité d'enzyme de 22.880 unités/ml. On a réalisé une conversion de céphalosporine C dans des conditions identiques à celles décrites à l'exemple 1, la réaction étant amorcée par l'addition de 10,5 ml 25 de la suspension de cellules décrite ci-dessus. L'analyse par chromatographie en couche mince quantitative -d'échantillons soutirés à certains intervalles du récipient de réaction a montré que la conversion était achevée en à peu près deux heures et que 68% de la céphalospo-30 rine C avaient été transformés en acide 3-acétoxyméthyl-70- (4-carboxy-butanamido)cèph-3-ème-4-carboxylique„ Le degré d'activité d'enzyme correspondait à 9,6 unités/mg Os céphalosporine C (acide libre). EXEMPLE 3 35 On a centrifugé à 2.100 g pendant une heure e$ .à 4°C 4 ,8 litres d'un bouillon de culture provenant d'une fermentation de Céphalosporium acremonium (Brotzu) et on a retenu le surnageant. On a réglé le pH du surnageant à 4,5 avec de l'acide sulfurique et on l'a clarifié par centrifugation à 40 2.100 g pendant une heure à 4°C. On a conservé le surnageant, 72 13921 " 2133927 on a réglé son pH à 2,8 avec de l'acide sulfurique et on l'a clarifié par centrifugation de la manière décrite plus haut. On a réglé le pH du surnageant obtenu à 8,1 avec du NaOH et on l'a clarifié à nouveau par centrifugation» Ce "filtrat pro-5 téînique" (3,23 litres) contenait 22,3 g de céphaslosporine C potassique comme le révélait l'examen microbiologique. On a dilué le "filtrat protéïnique" jusqu'à un volume de 3,975 litres par l'addition d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,2M d'un pH de 8,1, contenant au total 260 mg d'azoture de sodium. 10 On a oxydé le mélange précité dans des con ditions identiques à celles décrites aux exemples 1 et 2, la réaction étant amorcée par l'addition de 23 ml d'une suspension de cellules traitées au toluène comme décrit à l'exemple 2. L'analyse par chromatographie en couche 15 mince quantitative d'échantillons soutirés à certains intervalles du récipient de réaction a montré que la conversion était achevée en l'espace d'environ 2,5 heures et que 73% de la céphalosporine C avaient éit convertis en acide 3-acétoxyméthyl-7P-(4-carboxybutanamido)céph-3-ème-carboxyliquet 20 L'activité de l'enzyme utilisée correspon dait à 25,6 unités/mg de céphalosporine C (acide libre). EXEMPLE 4 On a purifié ion "bouillon de fermentation contenant de la céphalosporine C par séparation sous filtration 25 du mycélium et des protéines (après précipitation). On a ajusté le pH du filtrat contenant 4,8 mg/ml de céphalosporine C à 8,0 avec du NaOH N et l'a clarifié par centrifugation (18.000 g). On a mélangé 5 ml de filtrat clarifié à 3 ml d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,2M, d'un pH de 30 8,0, à 1 ml d'azoture de sodium 10 ml-l et à 1 ml d'une suspension de cellules congelées et décongelées (224 uni'tés d'activité de D-amino oxydase), puis on a aéré et incubé à 33°C pendant 4 heures. L'examen du mélange obtenu par chromatographie en couche mince sur des plaques revêtues de silice développées 35 avec de l'acétone aqueuse à 80% ont montré que 90% de la céphalosporine C avaient été utilisés et pour la plus grande part transformés en acides 3-acétoxyméthyl~78-(5-carboxy-5-oxopenta-namido)céph-3-ème-4~carboxylique et 3-acétoxyméthyl-7 40 EXEMPLE 5 72 13921 23 2133927 On a dissous 40 g d'une préparation de céphalosporine C potassique présentant une pureté de 68% (c'est-à-dire 27,2 g de céphalosporine C potassique ) dans 1,5 litre d'un tampon au phosphate de sodium 0,2H d'un pH de 8,1. On a 5 ajouté 1 ml de solution de catalase présentant une activité d'enzyme de 20.000 unités. (On définit une unité d'activité d'enzyme du type catalase comme étant celle qui décompose 1 (imole peroxyde d'hydrogène/min. à un pH de 7,0 à 25°). On a dilué la solution, contenue dans un 10 récipient agité, jusqu'à 3.980 ml avec de l'eau et on l'a équilibrée à 33°C pendant 30 minutes dans un bain marie. On a amorcé la conversion en ajoutant 20 ml d'une suspension de cellules similaire à celle décrite à l'exemple 1. Lorsque l'on a titré cette suspension en se servant de l'essai spectrophotométrique 15 décrit précédemment,on a constaté qu'elle présentait une activité d'enzyme correspondant à 12.100 unités/ml. On a poursuivi la conversion pendant 2,5 heures en utilisant un débit d'air de 3 litres/minute en même temps qu'une vitesse d'agitation de 550 tpm On a terminé la conversion par centrifugation du conte-20 nu du récipient à 2.100 g pendant une heure. On a extrait le produit de la façon suivante : on a réglé le pH de 3.900 ml de mélange de conversion à 1,5 en utilisant de l'acide chlorhydrique et on a divisé le mélange en deux parties aliquotep, On a soumis chaque partie 25 aliquote à une extraction en utilisant 7 x 800 ml d'acétate d'éthyle et on a évaporé les extraits à l'acétate d'éthyle réunis des deux parties aliquotes sous vide jusqu'à obtenir un volume d'approximativement 2 litres que l'on a séché jusqu'au lendemain en utilisant du sulfate de sodium anhydre. On a en-30 suite davantage évaporé sous vide l'extrait à l'acétate d'éthyle séché jusqu'à obtenir un volume de 100 ml auquel on a ensuite lentement ajouté 600 ml d'éther de pétrole (60-80°C) sous vigoureuse agitation. On a séparé le précipité obtenu par filtra-35 tion en deux fractions et on a procédé à son séchage sous vide sur de l'alumine de façon à obtenir de l'acide 3-acétoxyméthyl-70-(5-carboxy-5-oxopentanamido) céph-3-ème~4-carboxylique sous forme d'un solide jaune pâle. Les deux échantillons de solide obtenu (6,89 g et 4,96 g) présentaient des puretés respectives 40 de 56% /~E^m = 124 (260 nm)__7 et de 50% cm = 112 (26° 72 13921 24 2133927 Ceci correspondait à une conversion globale de la céphaslospo-rine C potassique en produit précité de 25%. EXEMPLE 6 Production d'acide 3-acétoxyméthyl-7|3-(4- 5 carboxybutanamido)-céph-3-ème-4-carboxylique (1) En utilisant de l'azoture de sodium comme inhibiteur de catalase On a récolté par centrifugation à 2.100 g pendant 30 minutes à 4°C des cellules de T.variabilis provenant 10 de 2,4 litres d'un bouillon de fermentation. On a jeté le surnageant et on a remis les cellules en suspension dans 2,7 li- . très d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M d'ion pH de 8,1 On a incubé cette suspension dans un récipient agité à 37° C et on a ajouté 300 ml de toluène. On a poursuivi l'incubation 15 pendant 4 heures, période au bout de laquelle on a soumis le contenu du récipient à une centrifugation à 2.100 g pendant 30 minutes à 4°C et on a séparé et jeté les couches surnageantes. On a remis les pastilles de cellules en suspension dans un volume total de 3 litres d'eau distillée, on a répété la 20 centrifugation et on a séparé et ajouté le surnageant. On a finalement remis les cellules en suspension dans 500 ml d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M d'un pH de 8,1. On a titré la suspension de cellules en question et on a ainsi constaté qu'elle présentait une activité d'enzymes correspondant 25 à 24.000 unités/ml. On a dissous 20 g d'une préparation de céphalosporine C potassique présentant une pureté de 70% dans 2 litres d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M d'un pH de 8,1, contenant de l'azoture de sodium (1,3 g). On a équilibré 30 la solution, contenue dans un récipient agité, à 33°C pendant 30 minutes dans un bain marie. On a amorcé la conversion en ajoutant 28 ml de la suspension de cellules précédemment décrite et on l'a poursuivie pendant deux heures en utilisant un débit d'air de 6 litres/min. en même temps qu'une vitesse d'agi 35 tation de 550 ppm. On a terminé la conversion par la centrifugation du contenu du récipient à 2.100 g jusqu'au lendemain. L'activité de l'enzyme utilisée correspondait à 53 unités/mg de céphalosporine C acide. On a dissous du chlorure de sodium (150 g) 40 dans 500 ml de la solution obtenue, on a ajusté le pH à 1,5 en 72 13921 25 2133927 utilisant de l'acide sulfurique concentré et on a extrait la solution à quatre reprises avec des fractions de 200 ml d'acétate d'éthyle. On a séché les extraits réunis jusqu'au lendemain à 4°C en se servant de sulfate de magnésium. On a séparé 5 le sulfate de magnésium par filtraLion et on a évaporé sous vide l'extrait à l'acétate d'éthyle séché jusqu'à obtenir un volume d'environ 20 ml. On a séparé par filtration le précipité cristallin formé par repos à la température ambiante et on l'a séché sous vide de façon à obtenir le composé décrit dans le 10 titre (2,10 g) sous forme d'un solide blanc présentant une pureté de 92% (E^jp = 220 (260 nm'). Ceci correspondait à une conversion globale de céphalosporine C potassique en produit précité de 65%. (2) En utilisant un pré-traitement à l'azoture de sodium pour 15 inhiber la catalase. On a activé des cellules de T,variabilis de la façon décrite à l'exemple 6 (1). Avant son emploi dans la conversion, on a additionné la suspension de cellules (200 ml) d'azoture de sodium (6,5 g) et on a conservé la suspension ain-20 si obtenue jusqu'au lendemain à 4°C, On a ensuite centrifugé la suspension de cellules à 2.100 g pendant 30 minutes à 4°C et on a jeté le surnageant. On a remis les cellules en suspension dans 200 ml d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M d'un pH de 8,1 et on a répété la centrifugation. On a de nouveau 25 jeté le surnageant et on a remis les cellules en suspension dans 200 ml de tampon. On a titré la suspension et on a trouvé qu'elle présentait une activité d'enzyme correspondant à 10.600 unités/ml. On a dissous 20 g d'une préparation de cé-30 phalosporine C potassique présentant une pureté de 70% dans deux litres d'un tampon au pyrophosphate de sodium G,1M d'un pH de 8,1. On a réalisé la conversion de la fevjn décrite à l'exemple 6 (1) en utilisant 38 ml de la suspension de cellules. L'activité de l'enzyme utilisée correspondait à 52 unités/mg 35 de céphalosporine C acide. On a extrait la solution obtenue comme décrite précédemment de façon à obtenir le composé indiqué dans le titre (2,05 g) sous forme d'un solide blanc présentant une pureté de 91% (E^ = 217 (260 nm)). Ceci correspondait à une conversion globalemde céphalosporine C potassique en produit 72 13921 26 2133927 précité de 63%. (3) En utilisant un traitement à chaud pour inhiber la catalase On a activé des cellules de T.variabilis 5 de la façon décrite à l'exemple 6 (1)en utilisant une température de 50°C au lieu d'une température de 37°C. On a titré la suspension de cellules obtenue et on a constaté qu'elle présentait vine activité d'enzyme correspondant à 17 600 unités/ml. On a dissous 20 g d'une préparation de 10 céphalosporine C potassique présentant une pureté de 70% dans deux litres d'un tampon au pyrophosphate de sodium 0,1M d'un pH de 8,1. On a réalisé la conversion de la façon décrite à l'exemple 6 (1) en utilisant 38 ml de la suspension de cellules. L'activité de l'enzyme utilisée correspondait à 52 unités/mg 15 de céphalosporine C acide. On a extrait la solution obtenue comme décrit précédemment de façon à obtenir le composé décrit dans le titre (1,85 g) sous forme d'un solide blanc présentant une pureté de 92% = 22t) (260 nmN). Ceci correspondait à une 20 conversion globale de la céphalosporine C potassique en produit précité de 57%. 72 13921 2133927 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de conposés de céphalosporine de formule générale ; S. R.(Ciï2)_C0NH (D COOH ou de leurs sels, formule dans laquelle X est un groupe acétate, le reste d'un nucléophile, un groupe hydroxy ou un atonie d'hydrogène et R est le groupe -CO.COOH ou -COOH, caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule : 00C CH(CH9),C0.HH. +/ 23 H3N _N -CH2X (II) COOH ou un de seâ sels, formule dans laquelle X possède les significations précitées, à l'action de cellules activées de Trigonopsis variabilis, dans des conditions aérobies, l'activité de catalase étant présente dans les cellules en question lorsque le substituant R dans le produit souhaité est le groupe -CO.COOH. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules en question ont été activées par traitement en phase aqueuse par un ou plusieurs solvants organiques notamment par le toluène. 3.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules nnt été activées par traitement avec une solution aqueuse d'un agent tensioactif, l'agent tensioactif étant notamment présent dans la solution en question en une concentration de 0,1 à 10%, ou par congélation suivie d'une décongélation à un pH acide, notamment, par congélation à une température inférieure S -10°C, suivie d'une décongélation à un pH de 3-4, ou par traitement avec un alcali, ou par un choc osmotique. 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé (II) est soumis à l'action des cellules activées à un pli variant de 4 à 9, notamment 72 13921 2133927 à un pH variant de 6 à 8 et à une température de 30 à 40°C. 5 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on n'utilise pas moins de 5 unités d'enzyme par mg de composé de céphalosporine isolé, et notamment 5 pas moins de 10 unités d'enzyme par mg de composé de céphalosporine dans un bouillon de fermentation, l'imité d'activité d'enzyme étant la quantité d'enzyme qui, à 37°C et un pH de 8,1, entraîne un changement de la densité optique de 0,001/min. à 420 nm avec une fenêtre de lumière de 1 cm dans 3 ml d'une solution d'essai contenant 10 0,5 ml d'une solution aqueuse à 0,02 % d'o-phénylènediamine, 0,3 ml d'une solution aqueuse à 2 % de D-alanine et 0,01 ml d'une solution aqueuse de peroxydase à 10 mg/ml. 6 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la catalase dans les cellules acti- 15 vées est inhibée ou inactivée, si bien que l'on obtient un produit de formule générale (I) dans laquelle R est le groupe -COOH, la catalase étant notamment inhibée par addition d'azoture de sodium au mélange réactionnel à une concentration de 1 mM à 100 mM, les cellules activées ayant été en particulier traitées avant d'être 20 mises en contact avec le composé (II) par une solution aqueuse d'ur. azoture de métal alcalin afin d'inhiber la catalase, la solution aqueuse d'azoture de sodium allant jusqu'à une concentration molaire à une température de 0 à 40°C. 7 - Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que 25 les cellules activées ont été traitées, avant leur mise en contact avec le composé (II) de façon à inactiver la catalase sans provoquer une inactivation sensible de la D-amino acide oxydase, les cellules ayant notamment été traitées à 40-60°C pendant au moins 3 heures. 30 8 - Procédé suivant la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que les cellules ont été simultanément activées et traitées pour inhiber ou inactiver la catalase. 9 - Procédé suivant l'une quelconque' des revendications précédentes, caractérisé en ce que, suivant une variante, un composé 35 de céphalosporine de formule générale (I) possédant un groupe 7(3— (4-carboxybutanamido) est converti en un composé 7f3-amino correspondant par réaction avec un constituant formateur d'halogénure d'imide, conversion de l'halogénure d'imide ainsi obtenu en un iminoéther et décomposition de ce dernier, ou bien on convertit un 40 composé de céphalosporine de formule générale (I) possédant un 72 13921 29 2133927 groupe 7P-(5-carboxy-5-oxGpentanairiidû; en compose Jfi-axalno correspondant par réduction du groupe 7-aeylaraido en un groupe 7P-(5-ca.: • boxy-5-hydroxypentanamidc), réaction du composé réduit avec un constituant formateur d'halogénure u'imlda, conversion de l'halogé-5 nure d'imide ainsi obtenu en un iraincêï.ter et décomposition de ce dernier. 10 - Cellules activées de Trigonopsis variabilis pour utilisation dans le procédé suivant la revendication 1. 11 - Cellules activées de Trigonopsis variabilis pour utilisa-10 tion dans le procédé suivant la revendication 1, qui ont été traitées pour inhiber ou inactiver la catalase. - CABINET LAVOIX—