Brevet FR2130532A1 — publié le 19721103

u 2130532 On a déjà proposé des appareils de comptage de colonies bactériennes, dans lesquels la lumière provenant d'une source localisée est transmise à travers un milieu de culture sur la surface duquel sont formées une multitude de colonies 5 bactériennes. Les colonies bactériennes servent de lentilles pour concentrer ou focaliser des images de la source localisée de manière à former une mosaïque d'images dans un plan situé au-dessus de la surface du milieu de culture. Jusqu'à présent, on utilise un objectif de projection pour grossir et focaliser la 10 mosaïque d'images de colonies bactériennes sur un second plan image dans lequel sont disposés une série de photodétecteurs. On provoque ensuite un mouvement relatif entre le milieu de culture et le système optique pour balayer la mosaïque d'images lumineuses avec la série de photodétecteurs. La sortie puisée fournie 15 par chaque photodétecteur rencontrant une image lumineuse es.t traitée par un circuit d'inhibition immédiatement adjacent de façon que l'impulsion de sortie du détecteur qui rencontre l'image le premier soit comptée, tandis que ce circuit bloque le comptage des sorties puisées des photodétecteurs immédiatement 20 adjacents de sorte que chaque image n'est comptée qu'une seule fois. La série de photodétecteurs s'étend transversalement sur toute l'étendue radiale de la mosaïque d'images de sorte qu'on utilise une unique piste ou trajectoire de balayage circulaire de la mosaïque d'images pour obtenir un compte des colonies bae-25 tériennes. Un appareil et un procédé de comptage de colonies bactériennes de ce type ont été décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique K° 3.493.772. L'un des problèmes qui se posent avec l'appareil de comptage de colonies bactériennes de la technique antérieure ci-30 dessus cité réside en ce que ledit appareil exige un nombre relativement grand (plusieurs centaines) de photodétecteurs et de circuits de traitement de signaux associés pour couvrir un rayon d'environ 4,5 cm, c'est-à-dire le rayon d'une boîte de Pétri type, dans laquelle on cultive les colonies bactériennes à comp-35 ter. En conséquence, il est désirable de créer un procédé et un appareil permettant de compter des colonies bactériennes sur un milieu de culture avec un nombre plus réduit de photodétecteurs et de circuits associés. 40 Compte tenu de ce qui précède, l'invention a, notamment, 72 09973 2130532 pour objet de créer un procédé et un appareil perfectionnés de comptage de colonies "bactériennes. Suivant l'une des caractéristiques de l'invention, les colonies sont comptées au moyen d'une série de photodétecteurs 5 qui balaient de façon répétée la mosaïque d'images lumineuses focalisées par les colonies bactériennes, de façon qu'on obtienne une série de pistes de balayage juxtaposées. La série de détecteurs comprend à chacune de ses extrémités un détecteur sensible aux colonies qui se trouvent juste à l'extrémité de la bande ba-10 layée. Les sorties de ces détecteurs d'extrémité ne sont pas incluses dans la sommation des comptes mais sont utilisées pour inhiber les comptes de détecteurs adjacents, moyennant quoi chaque colonie n'est comptée qu'une seule fois, et moyennant quoi des colonies, qui se trouvent dans des positions chevauchant des pis-15 tes de balayage adjacentes ne sont comptées qu'une seule fois. Suivant une autre caractéristique de l'invention eom-binable avec la précédente, la série de photodétecteurs balaie une piste en spirale à chevauchement sur la mosaïque d'images lumineuses focalisées par les colonies comptées, moyennant quoi 20 des boîtes circulaires de milieu de culture sont aisément et rapidement balayées, en faisant tourner le milieu de culture autour de son centre géométrique. Suivant une autre caractéristique de l'invention, l?ap-pareil de comptage de colonies bactériennes comprend des moyens 25 pour faire tourner le milieu de culture autour de son centre géométrique et des moyens pour provoquer une translation de la série de photodétecteurs vers l'axe de rotation ou en sens inverse, au moyen d'un bras pivotant qui tourne autour d'un second axe de rotation décalé parallèlement par rapport à celui du milieu de 30 culture, moyennant quoi la série de photodétecteurs est contrainte de parcourir une piste de balayage en forme de spirale sur le milieu de culture. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre. 35 Aux dessins annexés donnés uniquement à titre d'exemple: la Fig. 1 est un schéma simplifié, en partie symbolique, représentant un appareil de comptage de colonies bactériennes auquel sont appliquées des caractéristiques de l'invention j la Fig. 2 est une vue en plan schématique de l'appareil 40 de la Fig. 1 ; 72 09973 '2130532 la Fig. 3 est un schéma simplifié sous forme de lignes montrant le chevauchement des pistes de "balayage sur la mosaïque d'images de colonies et mettant en évidence.la manière dont les photodétecteurs fonctionnent pour détecter une colonie qui che-5 vauche deux pistes de "balayage adjacentes ; la Fig. 4 est un schéma de câblage simplifié représentant le circuit de détection et de traitement logique de l'un des canaux actifs de la série de photodétecteurs, et la Fig. 5 est un schéma de câblage représentant le cir-10 cuit de sommation et de comptage d'impulsions qui permet de compter les sorties des canaux de détection et de traitement logique individuels. On va tout d'abord examiner les Fig. 1 et 2 sur lesquelles est représenté l'appareil de comptage de colonies bac-15 tériennes 1 auquel sont appliquées des caractéristiques de l'invention. l'appareil 1 comprend un plateau rotatif circulaire 2, par exemple en aluminium, présentant une ouverture centrale 3. Un épaulement 4 est prévu sur le bord de l'ouverture centrale 3 pour recevoir la périphérie extérieure d'une boîte de Pétri 5 20 contenant un milieu de culture bactérienne transparent 6 tel que de l'agar. La boîte de Pétri 5 est également transparente. Trois éléments de maintien de boîte 7 sont portés par le plateau tournant 2, à des intervalles de 120° autour de 1'épaulement 4, pour immobiliser la boîte de Pétri 5 et la maintenir sur le plateau 25 tournant 2. Trois roues sont disposées autour de la périphérie du plateau tournant 2 à des intervalles d'environ 120°. Deux de ces roues, 8 et 9, sont des roues folles, tandis que la troisième roue, 11, est une roue motrice entraînant par friction le pla-30 teau tournant 2. Un moteur 12 est accouplé avec la roue motrice 11 pour l'entraîner et un réducteur à engrenages 13 est accouplé avec l'autre extrémité du moteur pour entraîner une came de balayage 14 à son tour accouplée avec l'arbre de sortie du réducteur à engrenages 13. 35 Un système optique 15 est monté sur une structure de support pivotante 16. La structure de support pivotante 16 est commandée par un galet de came 17 maintenu en contact avec la surface du profil de la came 14. La structure de support pivotante 16 peut tourner autour d'un axe 18 parallèle à l'axe de 40 rotation 19 de la boite de Pétri 5 et espacé de cet axe 19 d'une 72 09973 4. 2130532 distance appréciable, telle que le système optique 15 soit contraint de suivre approximativement un rayon par rapport à l'axe de rotation 19 de la boîte de Pétri 5. le système optique 15 comprend une source lumineuse 21 5 telle qu'un filament incandescent 22 de dimensions relativement faibles par exemple de 2,0 mm x 1,5 mm, de manière à former une source de lumière localisée (photons). La lumière émise par la source lumineuse 21 est captée par une lentille de condensation ou condenseur 23 et est transformée en rayons parallèles dirigés 10 à travers la boîte de Pétri transparente 5, le milieu de culture bactérienne 6 et les colonies bactériennes 24 situés sur la surface du milieu de culture 6. Les colonies bactériennes 24 présentent une forme générale correspondant approximativement à celle d'une partie de sphère, de sorte qu'elles constituent des 15 lentilles spériques qui focalisent des images du filament 22 sur un plan image primaire 25 disposé quelques millimètres au-dessus de la surface du milieu 6. Le format de ces images de la source correspond sensiblement aux dimensions de la source multipliées par le rapport entre la longueur focale des lentilles-colonies, 20 f (généralement de 3 a 15 mm) et celle de la lentille de condensation 23, f£« Etant donné que la lumière provenant du condenseur 23 est parallèle, l'espacement latéral entre les images formées par des colonies différentes est égal à l'espacement des colonies réelles, quelle que soit leur longueur focale. Dans une 25 couche uniforme de bactéries, les bactéries détruites peuvent former des cratères concaves, sous la forme de lentilles sphé-riques divergentes qui focalisent des images du filament sur un plan image au-dessous de la surface du milieu. Un objectif de projection 26, qui peut être par exemple 30 un objectif de microscope de grossissement nominal 5, est disposé au-dessus du plan image primaire pour focaliser une image grossie de la mosaïque primaire d'images formées par les colonies dans un plan image projeté 27 à une distance, par exemple de 30 cm, du plan image primaire 25. Le grossissement effectif est de 1'or-35 dre de 7 et peut être modifié en ajustant la distance de projection de 30 cm. Dans le mode de réalisation pratique, non représenté, le trajet optique de 30 cm est brisé par un miroir, non représenté, pour réduire la hauteur du second plan image 27 au-dessus des images primaires. 40 Une rangée rectiligne de douze détecteurs de lumière à 72 09973 2130532 phototransistor 28 tels que des photodétecteurs Fairchild JPM 100 est montée dans le plan 27 de la mosaïque d'images projetée, ces photodétecteurs étant espacés suivant des entraxes de 2,0mm. Lorsque le plateau 2 tourne, les images formées par les colonies 5 24 coupent la rangée 28 dans une direction perpendiculaire à sa plus longue dimension. La rangée de photodétecteurs 28 comprend une paire de détecteurs de garde constituée par les deux détecteurs respectivement disposés aux extrémités opposées de la rangée, dont les sorties puisées ne sont pas comptées. Les autres 10 détecteurs, dans l'exemple choisi de 1 à n, avec n = 10, sont sensibles aux colonies présentes sur un segment du rayon de la boite de Pétri, segment qui peut avoir, par exemple, une longueur de 0,29 cm. Les dix détecteurs centraux, qui couvrent 2,0 cm, sont sensibles à des colonies présentes sur une bande d'une lar-15 geur de 0,29 cm de la surface de l'agar. Lorsqu'on fait tourner la boîte de Pétri 5, la rangée 28 est en même temps déplacée, par l'intermédiaire de la structure de support pivotante 16, le long de la trajectoire radiale 31* c'est-à-dire radialement par rapport à l'axe de rotation 19 de la boîte de Pétri 5, de sorte 20 qu'une bande en spirale d'une largeur de 0,29 cm est balayée pour couvrir la surface totale de la boîte de Pétri 5. Avec une boîte de Pétri 5 usuelle d'un rayon de 4,5 cm, le balayage exige environ quinze tours de ladite boîte pour couvrir entièrement celle-ci suivant une,spirale. Maïs l'utili-25 sation de quinze tours pour effectuer le balayage réduit le nombre de détecteurs et de circuits de détecteur nécessaires au quinzième (plus les deux détecteurs de garde) du nombre exigé par le procédé de la technique antérieure tel que décrit, par exemple dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3.493.772 précité. 30 Les photodétecteurs de la rangée 28 sont agencés de telle manière que quand l'un d'entre eux rencontre une intensité lumineuse accrue dans la mosaïque d'images et si cette intensité lumineuse croît au-dessus d'une certaine valeur de seuil déterminée par un ajustement de seuil dans le circuit électronique du 35 détecteur considéré, celui-ci émet une impulsion de sortie. Cette impulsion est appliquée à un circuit de détection et de traitement logique de signaux 33 et, de là, à un compteur 34 en vue de la sommation. Le circuit de détection et de traitement logique de signaux 33 est agencé de telle manière qu'une sortie puisée, 40 provenant d'un premier détecteur, inhibe le comptage des impul 72 09973 2130532 sions de sortie tirées des détecteurs immédiatement adjacents, de sorte que chaque image de colonie n'est comptée qu'une seule fois. La structure de support pivotante 16 et la came 14 ont 5 des dimensions telles que des pistes de balayage adjacentes de la rangée de photodétecteurs 28 se chevauchent dans une mesure égale à la largeur de la portion de piste de balayage produite par deux photodétecteurs adjacents (voir Fig. 3). Ce chevauchement de pistes de balayage successives empêche un double comptage 10 d'une image de colonie focalisée se trouvant sur la frontière entre deux pistes de balayage. Plus précisément, lorsque le détecteur de garde inférieur G- de la rangée 28 en balayant la première piste rencontre initialement l'image de colonie 35 de la Fig. 3, il émet une impulsion de sortie qui empêche la sortie 15 puisée du neme détecteur d'être comptée. Etant donné que la sortie du détecteur de garde G- n'est pas comptée, aucun compte n'est obtenu pour l'image de colonie 35 sur la première piste de balayage rencontrant cette image. Sur la seconde piste de balayage, qui chevauche la première dans une mesure égale à la largeur to-20 taie du détecteur de garde et d'un détecteur supplémentaire, le premier détecteur qui rencontre l'image de colonie 35, par exemple le détecteur n°1 ou le détecteur n° 2, produit une impulsion de sortie qui est comptée et qui empêche en outre les impulsions de sortie des canaux adjacents d'être comptées. En conséquence, 25 l'image de colonie 35 n'est comptée qu'une seule fois. On va maintenant examiner la Fig. 4 sur laquelle est représenté le circuit de détection et de traitement logique de signaux 36 de chacun des 1-n détecteurs actifs de la rangée 28. Les canaux de garde sont analogues au canal de la Fig. 4 dont 30 ils ne différent que par le fait que leurs sorties puisées ne sont pas transmises au circuit de sommation en vue du comptage. Sur la Fig. 4, la lumière provenant d'une image de colonie focalisée est incidente à l'entrée d'un photodétecteur 37 pour produire un signal électrique de sortie qui est appliqué à l'une des 35 entrée d'un amplificateur opérationnel 38. Cet amplificateur opérationnel comprend un canal de réaction positive 39 et un circuit d'ajustement de seuil 41, ce qui permet d'appliquer un potentiel de référence à son entrée en vue de la comparaison de ce potentiel avec l'entrée tirée de la sortie du photodétecteur 40 37. L'amplificateur opérationnel n'est déclenché que lorsque 72 09973 2130532 l'entrée du photodétecteur 37 atteint tm certain niveau de seuil déterminé par le circuit d'ajustement de seuil 41. Lorsque le signal d'entrée fourni par le photodétecteur dépasse le niveau de seuil, l'amplificateur opérationnel produit 5 une impulsion de sortie et est connecté de manière à fonctionner en circuit de déclenchement de Schmitt comme indiqué par la ligne en trait interrompu 42. La sortie du circuit de déclenchement de Schmitt 42 est une impulsion de tension positive, par exemple de +5 volts, d'une durée sensiblement égale à la durée prévue 10 (largeur) des images de colonie à compter, qui peut être par exemple de 500 microsecondes. Cette impulsion de sortie est indiquée par la forme d'onde (a). Une impulsion de sortie de ce circuit de déclenchement de Schmitt 42 est appliquée à un inverseur logique 43 en vue de son 15 inversion. La sortie de l'inverseur 43 est transmise à une lampe témoin 44 pour indiquer l'état du circuit de déclenchement de Schmitt. Une autre sortie du circuit de déclenchement de Schmitt 42 est transmise à un second inverseur logique 45 pour produire une impulsion de sortie ayant une forme d'onde correspondant à 20 la forme d'onde (b) représentée. Ces impulsions de sortie inversées sont transmises à des portes de canaux logiques adjacents pour inhiber le comptage d'impulsions provenant des canaux adjacents. Un échantillon de la sortie inversée du circuit de dé-25 clenchement de Schmitt 42 est transmis à un différentiateur 46 pour produire une pointe de sortie négative au début de lïïmpul-sion du circuit de déclenchement de Schmitt et une pointe positive à la fin de cette impulsion comme indiqué par la forme d'onde (c). La sortie du différentiateur 46 est transmise à un 30 troisième inverseur logique 47 pour produire une forme d'onde inversée par rapport à la forme d'onde (c). La première pointe traverse une porte 48 et parvient dans un circuit de sommation 49 sauf si des signaux d'entrée d'inhibition sont appliqués à la porte 48 à partir des canaux adjacents. 35 On va maintenant examiner la Fig.5 sur laquelle est re présenté le circuit de sommation et de comptage d'impulsions 49. Les sorties de toutes les portes 48 correspondant aux différents canaux à compter sont transmises sous condition au conducteur commun 51 par l'intermédiaire de portes 52 et de diodes 53. Les 40 impulsions individuelles, telles qu'elles sont appliquées au 72 09973 8" .2130532 conducteur commun 51, ont une amplitude de l'ordre de 5 volts et une largeur d'environ 5 microsecondes. Un compteur électronique 54 est alimenté par le conducteur commun 51 pour compter les impulsions afin d'obtenir -un compte des colonies bactériennes. 5 Pour utiliser l'appareil, on place la boîte de Pétri 5 contenant les colonies bactériennes, ou sur laquelle des cratères bactériens sont formés par les bactéries détruites, sur le plateau tournant 2. Le balayage commence en un point situé à l'extérieur du bord de la boite de Pétri 5. Le bord de l'ouverture 3 10 du plateau tournant 2 empêche la transmission de la lumière jusqu'à ce que l'axe du système optique se trouve juste à l'intérieur du bord de la boîte 5, de façon que la lumière ne soit pas réfractée sur la tranche de ce bord. Au moment où l'axe optique franchit le milieu du plateau, un commutateur à fonctionnement 15 brusque, indiqué par la ligne en trait interrompu 55, est actionné, ce qui interrompt le comptage dans le compteur 54. Après le franchissement du centre, la came 14 ramène le système optique à son point de départ où il se trouve juste à l'extérieur du bord de la boîte 5. Le compteur 54 est remis à zéro et redéclenché au 20 moyen d'un commutateur manuel avant que le balayage d'une nouvelle boîte 5 commence. On peut ajuster la cadence de balayage en réglant la vitesse du moteur 12. On obtient un compteur fiable jusqu'à des vitesses de rotation du plateau de l'ordre de 90 tr/mn (1,5 tour 25 par seconde). Le temps de balayage total correspondant est d'environ 10 secondes. L'opérateur dispose de deux réglages. Le premier est un réglage 56 d'intensité de la source lumineuse qui permet d'ajuster l'intensité d'image de seuil qui sera détectée. Un ajustement 30 à une valeur trop faible du réglage de seuil 56 entraîne le non-comptage de colonies de petites dimensions ou de colonies qui produisent des images défocalisées, tandis qu'un réglage à une valeur trop élevée augmente artificiellement les comptes par suite d'artefacts et d'irrégularités dans l'agar. Le second réglage 35 est prévu pour permettre le comptage de colonies ayant des longueurs focales différentes et pour compenser les différences d'épaisseur du milieu agar. Le réglage s'effectue en plaçant la boîte de Pétri de telle manière qu'une colonie 24 type focalise la lumière sur un écran dans le plan de la rangée de photodétec-40 teurs 28. La mise au point est alors réglée pour assurer l'ob 72 09973 2130532 tention d'un format d'image minimal et d'une intensité maximale des images. l'appareil 1 suivant l'invention permet de compter des milliers de colonies sur une seule et même boite de Pétri 5 en 10 secondes avec des précisions de l'ordre de quelques unités pour cent. 72 09973 2130532 REVENDICATIONS 1.- Compteur âe colonies "bactériennes, caractérisé en ce qu'il comprend, en combinaison, une source lumineuse pour 5 irradier les colonies "bactériennes, une rangée de moyens photodétecteurs juxtaposés capables, en réponse à cette irradiation, de détecter les colonies bactériennes et d'engendrer un signal électrique correspondant à chaque colonie bactérienne détectée, des moyens de balayage pour déplacer systématiquement la rangée 10 juxtaposée par rapport aux colonies bactériennes, de manière à assurer un balayage de celles-ci par les moyens photodétecteurs à raison d'une portion à la fois suivant une série de pistes de balayage adjacentes se chevauchant, des moyens de comptage des signaux électriques fournis par les moyens photodétecteurs et des 15 moyens photodétecteurs de garde montés aux extrémités opposées de ladite rangée, lesdits moyens de comptage étant insensibles au fonctionnement desdits moyens photodétecteurs de garde et les pistes de balayage adjacentes se chevauchant mutuellement dans une mesure sensiblement égale à la somme de la largeur de piste 20 de l'un des photodétecteurs de garde et de la largeur de piste du photodétecteur adjacent à eelui-ci, moyennant quoi des colonies bactériennes chevauchant des pistes de balayage adjacentes ne sont comptées qu'une seule fois. 2.- Compteur suivant la revendication 1, caractérisé en 25 ce que le mouvement relatif entre la rangée de photodétecteurs juxtaposés et les colonies bactériennes est une spirale à chevauchement . 3.- Compteur suivant la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens de balayage font tourner les colonies bacté- 30 riennes autour d'un axe de rotation et assurent une translation de la rangée précitée sensiblement le long d'une trajectoire qui traverse les colonies bactériennes. 4.- Compteur suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la rangée de moyens photodétecteurs juxtaposés est montée 35 sur un bras de support pouvant pivoter autour d'un axe de rotation décalé de façon sensiblement parallèle par rapport à l'axe de rotation des colonies bactériennes. 5.- Compteur suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de comptage com- 40 prennent des moyens d'inhibition pour empêcher le comptage des 72 09973 11 * 2130532 impulsions de sortie des moyens photodétecteurs adjacents au moyen photodétecteur qui fournit le premier une -impulsion de .sortie en réponse à une colonie "bactérienne, moyennant quoi un double comptage d'une même colonie bactérienne est évité. 5 6.- Procédé de comptage de colonies bactériennes sur la surface ou dans la masse d'un milieu de culture, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les opérations consistant à irradier le milieu de culture avec des photons tirés d'une source localisée, les photons étant capables, en fonction des 10 propriétés de réfraction de la lumière des colonies, de créer une mosaïque d'images individuelles de la source lumineuse dans une région située au delà du milieu de culture, à raison d'une image discrète pour chaque colonie bactérienne, à balayer la mosaïque d'images avec une rangée de moyens détecteurs de photons 15 juxtaposés suivant une série de pistes de balayages adjacentes se chevauchant dans une mesure égale à la largeur de deux détecteurs situés à l'une des extrémités de la rangée précitée, à engendrer une impulsion de sortie électrique chaque fois que les moyens détecteurs de photons détectent une image de la source 20 lumineuse, à compter ces impulsions, à bloquer le comptage des impulsions de détecteurs de photons adjacents en réponse à des images de source lumineuse chevauchant ces détecteurs de photons adjacents, moyennant quoi l'on obtient un seul compte par image et à bloquer le comptage des détecteurs de photons disposés aux 25 extrémités opposées de la rangée précitée, ce qui évite un double comptage d'image chevauchant les pistes de balayage adjacentes. 7.- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'opération de balayage consiste à balayer la mosaïque d'images suivant une piste de balayage en spirale à chevauchement. 30