Brevet FR2130730A1 — publié le 19721103

213073C La présente invention concerne des procédés pour la production cte nouvelles substances du groupe des pepstatines à partir de microorganismes produisant des pepstatines. Umezawa, un des inventeurs, et ses collaborateurs ont découvert la peps-5 tatine en tant qu'agent efficace contre les ulcères de l'estomac, les microorganismes qui la produisent ont été identifiés comme étant le Streptomyces testaceus Hamada et Okami et le Streptomyces argenteolus, variété toyonekensis. La pepstatine est un penta-peptide contenant de l'acide isovalérique U-acylé sur un atome 10 terminal de N et un acide carboxylique libre sur un atome terminal de C. (cf. J. Antibiotics, 23, 259-262, 1970, ibid., 23, 263-265, 1970). La pepstatine peut être obtenue en cultivant une souche la produisant dans un milieu nutritif contenant des peptones ou autres sources d'azote et en l'extrayant du bouillon de culture 15 pour la purifier. La pepstatine peut aussi être obtenue sous la forme de ses sels métalliques, amides ou esters, comme cela est décrit dans la demande de brevet français N° 70 21557 déposée par la demanderesse le 12 Juin 1970. Les inventeurs ont étudié les inhibiteurs de la pepsine dans le bouillon de culture des 20 souches précitées dans des conditions diverses et ils ont trouvé plus de deux substances analogues à la pepstatine, qui ont comme elle une activité antipepsinique, mais en diffèrent à l'analyse par chromatographie en couche mince sur gel de silice et dans la fraction acide gras de la pepstatine lors de la chromâtographie 25 en phase gazeuse des hydrolysats acides. Une des nouvelles pepstatines, appelée pepstatine B, est obtenue sous la forme de son ester méthylique cristallisable en fines aiguilles à partir de sa solution dans du méthanol. Son point de fusion est compris entre 254- et 255°C et son analyse 30 élémentaire donne G = 60,4 %, N = 9,74 %, H = 9,38 % alors que le calcul basé sur la formule C-z^IL-rJîr-O^ donne C = 60,6 % 3b b/ 5 9 t- -, An N = 9,82 % et H = 9,40 %. Sa rotation optique est D = -95,5° (0=0,5, acide acétique). En tant que pepstatine, elle prend une couleur bleue par la réaction de Rydon-Smith et une couleur 35 rouge par la réaction avec le chlorure ferrique d'hydroxylamine. L'ester méthylique de la pepstatine B est modérément soluble dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique, mais difficilement soluble dans l'eau, le chloroforme, le benzène, l'acétate d'éthyle et l'éther. Elle est plus soluble 40 dans le méthanol que l'ester méthylique de pepstatine. 72 11143 2 213073C L'hydrolysat acide de l'ester méthylique de pepstatine B avec HC1 à 20 % pendant 16 heures à 105°C a été extrait au moyen de l'éther et analysé par chromatographie en phase gazeuse et par chromatographie bidimensionnelle en couche mince. Dans 1' 5 extrait par l'éther on a trouvé l'acide n-caproïque. Dans la couche aqueuse, on a trouvé de la valine et de l'alanine (2/1) en plus de l'acide hydroxyamino-4 méthyl-6 heptanoïque. On peut donc estimer que la structure de la pepstatine B est le résultat de la substition de l'acide n-caproxque à la fraction 10 acide gras de la pepstatine (ayant la formule développée suivante) 15 20 25 Lors de la chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un solvant constitué par un mélange de chloroforme, de méthanol, et d'acide acétique dans une proportion de 95/4/1, la réaction colorée de Eydon-Smith donne pour l'ester méthylique de pepstatine B une valeur Ef de 0,39 et pour l'ester méthylique 30 de pepstatine une valeur Ef de 0,35. L'ester méthylique de pepstatine B a montré une activité antipepsinique égale à celle de 1' ester méthylique de pepstatine. Les inventeurs ont donc découvert N? / 5 \5/ 5 ch ch, ch ch, ch ch I \3/ 3 \3 / 3 i ch0 ch ch cho0h ch, I 2 i I i 2i | 5 c0-ra-ch-c0-]m-ch-c0-nh-ch-ch-ch2-c0-nh-ch- (L) (L) (L) ch, ch, \3 / 3 ch fH2(î)H co-nh-ch-ch-ch2-cooh 72 1114 3 5 2130730 l'ester méthylique a la même valeur Rf que la pepstatine B (0,39); On a trouvé un autre groupe de pepstatines, dont l'éther méthylique a une valeur Rf de 0,42. Cette substance antipepsini-que a été cristallisée sous la forme de fines aiguilles et le 5 produit acide de son hydrolyse, analysé par chromatographie en phase gazeuse, a donné les mêmes amino-acides et 5 acides gras contenant de 5 à 16 atomes de carbone. Les nouvelles pepstatines selon l'invention peuvent être définies comme étant des pepstatines contenant des acides gras 10 ayant de 5 à 16 atomes de G, tels que l'acide n-caproîque ou 1' acide isocaproïque, et différents de l'acide isovalérique de la pepstatine. Conformément à l'invention, on peut obtenir de nouvelles pepstatines par les opérations suivantes : une souche produc-15 trice de pepstatine est placée dans un milieu de culture contenant de la caséine, du lait écrémé et/ou de la farine de soja comme source d'azote, et l'incubation dure de 3 à 10 jours dans les conditions ordinaires nécessaires au développement des aérobies, jusçfi *à ce que l'activité antipepsinique du bouillon de 20 culture atteigne son maximum. Le principe actif peut être extrait du bouillon de culture ou de son filtrat par le n-butanol ou de la masse mycélienne par le méthanol. L'extrait ainsi obtenu est concentré de façon à donner un sirop ou des précipités jaunes Le sirop est versé goutte à goutte dans 5 à 20 volumes d'eau pour 25 former un précipité, qui est filtré, puis séché pour donner les nouvelles pepstatines à l'état brut. Les pepstatines brutes sont dissoutes dans des alcools inférieurs et estérifiées par chauffage ou en les laissant reposer pendant plusieurs heures à la température ambiante ou à une température plus élevée, en présen-30 ce d'une petite quantité d'un catalyseur d'estérification, tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide paratoluè-ne sulfonique, le chlorure de thionyle, le pentachlorure de phosphore, ou 11oxytrichlorure de phosphore, et autres similaires L'ester méthylique des nouvelles pepstatines brutes est le 35 résultat d'une estérification avec l'alcool méthylique et 3L est un mélange. La plus grande partie de l'ester méthylique de pepstatine peut être cristallisée par évaporation de la solution dans le méthanol. En analysant par chromatographie en couche mince cette fraction cristalline, on a constaté que les propor-40 tions respectives de l'ester méthylique de la pepstatine origina 72 11143 4 2130730 le et de celui des nouvelles pepstatines sont de 1/1. L'ester méthylique des nouvelles pepstatines est contenu davantage dans la liqueur mère et il peut être concentré comme suit : on recristallise les cristaux par évaporation de leur solution dans 5 le méthanol et on sépare la liqueur mère des cristaux obtenus. Dans cette liqueur mère, il n'y a presque pas d'ester méthylique de la pepstatine originale, et par évaporation de cette liqueur mère, on peut recristalliser l'ester méthylique purifié des nouvelles pepstatines sous la forme de fines aiguilles. 10 Le procédé selon l'invention comporte l'obtention de sels alcalins des nouvelles pepstatines par hydrolyse alcaline des esters de ces dernières et l'obtention des nouvelles pepstatines sous leur forme libre par neutralisation du produit de 1' hydrolyse alcaline ci-dessus. Cette hydrolyse peut être effectuée 15 de la même façon que celle décrite dans la demande de brevet français N° 7021557 du 12 juin 1970. Un de sels alcalins ainsi obtenus, le sel sodique de pepstatine B, est une poudre blanche amorphe, dont le point de décomposition est compris entre 250 et 255°C et dont le degré d'inhibition 50 % de la pepsine (LD^q) 20 est de 0,055» Contrairement à la pepstatine originale, la peps-tatinâ. B, sous sa forme libre, est une poudre blanche amorphe, obtenue par évaporation de sa solution dans un mélange de méthanol et d'eau (2/1). Elle se décompose à une température comprise on entre 210 et 220°C environ^ £»a rotation optique spécifiquej~of] ^ 25 est -85° (0=1,0 méthanol. bon spectre infrarouge est représenté à la figure 2 annexée. Elle se dissout facilement dans une solution aqueuse de butanol; éthanol, alcool^isopropylique, diméthylformamide, diméthylsulfoxyde, acide acétique ou pyridine et est légèrement soluble dans une solution aqueuse d'acétone, 50 mais difficilement soluble dans l'acétone déshydratée, le butanol déshydraté, le chloroforme, le benzène, l'éther et l'eau. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après : Exemple 1 35 place une souche de Streptomyces testaceus productrice de pepstatine dans un milieu stérilisé contenant 5,5 % de glucose 2,0 % d'huile de soja, 4,5 % de lait écrémé, 5 % de caséine de lait, 0,15 % de °,35 % de NaC^, 0,15 % de MgS0^.7H20 (pH - 6,4-5) pour un volume de 2900t. On laisse incuber pendant 40 112 heures à une température de 23 à 24°C, en aérant et en agi 72 11143 5 2130730 tant. Le principe antipepsinique contenu dans le "bouillon est l'équivalent de 2260 ^/cm3 de pepstatine. On règle le pH du bouillon à 2,5 avec de l'acide sulfurique dilué et on ajoute 3600 JL de méthanol. Après avoir agité pendant 40 minutes à une 5 température de 15 à 20°C la liqueur ainsi obtenue, on ajoute 4 % d'un adjuvant de filtration, on filtre et on lave. On obtient 6300 X d'éluat dont on règle le pïï à 10 avec de l'alcali et l'on fait évaporer le méthanol sous vide pour obtenir 1900 b de résidu aqueux. On ajoute à ce résidu aqueux 800 J, de n-butanol 10 et on règle à 7,0 le pH du mélange. Après agitation pendant 30 minutes à 20°C, on sépare 960 J, d'extrait du butanol. On règle à 3,0 le pH de cet extrait et on concentre sous vide pour donner 55 1 de sirop. On laisse tomber goutte à goutte ce sirop dans 800 X d'eau en agitant pendant 60 minutes, puis on filtre le 15 précipité qui s'est ainsi formé. Le précipité filtré est ensuite lavé et lyophilisé pour obtenir 7990 g de nouvelles pepstatines brutes sous la forme d'une poudre jaune. Le principe antipepsini-que équivalent à la pepstatine originale constitue 64 % de cette poudre. 20 On fait dissoudre 6080 g de la poudre brute obtenue dans 33 i- de méthanol et on ajoute 1,25 kg de carbone actif pour décdorer. A 38} de cette solution décolorée, on ajoute 125 cm3 d'acide sulfurique concentré et on agite pendant 2 heures et demi à une température de 60°C. On neutralise ensuite le mélange 25 réactionnel en ajoutant 0,63/ide îriéthylamine, on brasse pendant 120 minutes à une température comprise entre 50 et 60°G et on obtient ainsi une poudre blanche cristallisée. On lave cette poudre et on la sèche sous vide pour «obtenir 3230 g d'éthers méthyliques des nouvelles pepstatives, ayant un degré d'inhibi- 30 tion antipepsinique (IDcn) de 0,056f . Son point de décomposition r 1 20 est compris entre 250 et 251 °C et sa rotation optique J -p est -90° (C# 1,0, acide acétique). Cette poudre contient plus de 80 % d'ester méthylique de pepstatine B (Rf 0,39 lors de la chromatographie en couche mince). 35 Exemple 2 On fait dissoudre 3100 g d'esters méthyliques de nouvelles pepstatines obtenu à l'exemple 1 dans 130jide NaOH à 0,2 normal et de méthanol à 90 % pour saponifier pendant 2 heures. On concentre le mélange réactionnel sous vide pour faire évaporer 40 le méthanol et on obtient Tin concentré trouble. On fait dissoudre 72 11143 6 2130730 ce concentré dans 20 Jlde n-butanol saturé d'eau, puis on ajoute 15 Js d'eau et on règle le pH à 3,0 avec de l'acide sul-furiquo€.ilué. Après agitation pendant 20 minutes, on laisse tomber goutte à goutte 18 X de la couche surnageante de butanol 5 dans 270 ^ d'eau. Le précipité obtenu après agitation pendant 60 minutes est filtré et lavé avec de l'eau. On fait sécher sous vide le précipité lavé et on obtient 2500 g d'une poudre blanche. Le point de décomposition de cette poudre est compris entre 205 et 210«c et la rotation optique de cette substance est 10 C°G D^ = (G=1,0, méthanol). Le degré d'inhibition 50 % contre les pepsines (ID^0) est de 0,055 • La courbe de titrage montre que 700 mg de l'échantillon consomment 9,7 cm3 de NaOH à 0,1 normal. Exemple 3 15 On fait dissoudre 100 g des esters méthyliques de nou velles pepstatines obtenus à l'exemple 1 dans 4 Ji de méthanol absolu et on décolore la solution avec 20 g de charbon actif. On laisse reposer la solution pendant une nuit et on obtient tout d'abord 24 g de cristaux blancs. On concentre à 1, 3 X 4-, 2 X 20 de la liqueur mère à base de méthanol et il se forme alors un précipité. Ce précipité est cristallisé au bout de 60 minutes par agitation à une température de 60°C. Une second cristallisation qui dure toute une nuit donne une seconde production de 5,5 g de cristaux blancs» On fait dissoudre ces seconds cristaux 25 dans 1,5 de méthanol chaud et on traite avec du oharbon actif. On laisse reposer pendant une nuit la solution à base de méthanol et on obtient une troisième production de 12,0 g de cristaux blancs. Les trois substances cristallines ci-dessus présentent 30 les propriétés physico-chimiques suivantes : Premiers cristaux : Point de décomposition : de 250 à 251°C 20 _ _ 90,5° (c=o,5, acide acétique) ID50 = 0,05 Y 35 substance ayant un Ef de 0,35 / substance ayant un Ef de 0,39 = de 1/1 à 1/2» (chromatographie en couche mince avec pour solvant chloroforme/méthanol/acide acétique = 9^/4/1). Deuxièmes cristaux : 40 Point de décomposition : de 253 à 254°C 72 11143 7 2130730 C°Q = -91,5° (0=0,5, acide acétique) ID50 =0,05 principalement la substance ayant un Sf de 0,35 et des traces de celle ayant un Ef de 0,42 5 çhromatographie en couche mince avec pour solvant chloroforme/méthanol/acide acétique = 95/4/1). Troisièmes cristaux : Point de décomposition : de 254 à 255°C [ 10 ID = 0,05 )f 50 principalement la substance ayant un Ef de 0,39 (pepstatine B) et des traces de celle ayant un Ef de 0,42 chromatographie en couche mince avec pour 15 solvant : chloroforme/méthanol/acide acétique = 95/4/1). Le spectre infrarouge est représenté à la figure 1 annexée Analyse élémentaire (pourcentages trouvés) : 20 C = 60,14 %, H = 9,38 % et N = 9,74 % Modérément solubles dans le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide et l'acide acétique, difficilement soluble dans le méthanol (5 à 10 mg/cm3), mais plus soluble que l'ester méthylique de la pepstatine 25 originale. Exemple 4 On ensemence avec une souche productrice de pepstatine 13 0 X d'un milieu stérilisé contenant 6,0 % de glucose, 2,0 % de glycérine, 4,0 % de lait écrémé, 4,5 % de caséine de lait, 0,1 % 20 de K2HP04, 0,3 % de NaOl, 0,1 % de MgS04.7ïï2O (pH = 6,8) et on laisse incuber pendant 137 heures dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1. A 125 X de bouillon de culture contenant un principe antipepsinique équivalent à 170 g de pepstatine, on ajoute 60^ de n-butanol et on agite pendant 40 minutes à la température 35 ambiante. On sépare ensuite par centrifugation la couche de butanol, la couche d'eau et la couche solide (masse mycélienne). On lave la couche de butanol avec de l'eau et on concentre sous vide de façon à obtenir 1,5 X de sirop. On règle le pïï du sirop à 3,0 et on ajoute 7,51 de n-hexane en agitant de façon à obtenir un 40 précipité brun jaunâtre. Après une agitation durant 60 minutes, 72 11143 8 2130730 on filtre le précipité et on le lave, puis on le sèche sous vide obtenant ainsi 164 g de nouvelle pepstatine brute dont le degré d'inhibition des pepsines est égal à 0,075 Y» On fait dissoudre 150 g de nouvelle pepstatine dans 1,5 -t 5 de méthanol à 90 % à une température comprise entre 40 et 50°C et on décolore la solution avec 150 g de charbon actif. A 1,6 Xy de solution décolorée, on ajoute 1, oX d'eau à la température ambiante et on obtient un précipité sous forme de gel. On filtre le précipité, on le lave avec du méthanol à 50 % et on le lyophi-10 lise de façon à obtenir 94 g de poudre légèrement jaunâtre. Son ID^0 des pepsines est de 0,062 Y • On fait dissoudre dans du méthanol à 90 °/o et on traite deux fois avec du charbon actif comme ci-dessus. On obtient 45 g d'une poudre blanche de nouvelle pepstatine. L'ID^q de cette poudre est égal à 0,055 Y • Son point 15 de décomposition est compris entre 198 et 205°G et sa rotation optique est égale à -79° (0=1,0, méthanol). L'analyse par chromatographie en couche mince montre qu'elle contient une substance dont le Rf est de 0,35 (pepstatine), une substance dont le Rf est de 0,39 (pepstatine B et pepstatine 0) et une substance 20 dont le Rf est de 0,42o Exemple 5 Avec une souche productrice de pepstatine, on ensemence 130 1 d* un milieu stérilisé contenant 6,0 % de glucose, 2,0 % de glycérine, 1,5 % de lait écrémé, 1,5 % de caséine, 5,7 % de 25 farine de soja, 0,1 % de E^HPO^, 0,3 % de NaCl et 0,1 % de MgSO^. 7H20 (pH = 5,5) et on laisse incuber pendant 137 heures dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1» A 110 y^de bouillon de culture contenant un principe antipepsinique équivalent à 132 g de pepstatine, on ajoute 7 kg d'un adjuvant de filtration, 30 on règle le pH à 2,0 avec de. l'acide sulfurique dilué et on sépare le gâteau mycélien (33 kg, poids net) du filtrat (75 X ). On ajoute au gâteau mycélien 83Xde méthanol absolu pour obtenir une suspension qui est agitée pendant 40 minutes. On filtre la suspension et on lave par deux fois le gâteau avec 40 X de 35 méthanol à 70 On obtient 140 X d'éluat qui est du méthanol et de l'eaua». A 75 X du bouillon filtré ci-dessus, on ajoute 35 X de n-butanol et on agite pendant 15 minutes ; on sépare la couche de butanol (37X) de la couche d'eau (731)* On concentre sous vide 140 X de l'éluat ci-dessus jusqu'à ce qu'il ne reste plus 40 que 27 X de solution aqueuse et on mélange avec 37 X du butanol 72 11143 9 2130730 extrait du filtrat du bouillon. On centrifuge ce mélange pour enlever la couche d'eau et on obtient 35X d'extrait dissout dans le butanol. On règle le pH de l'extrait à 3,0 et on concentre sous vide jusqu'à ce qu'on obtienne 1,oi6de sirop. On verse 5 goutte à goutte ce sirop dans 15X d'eau et on agite pendant §0 minutes pour obtenir un précipité. On filtre le précipité, on le lave à l'eau et on sèche à une température comprise entre 60 et 70°C ; on obtient 158 g d'une poudre jaune de nouvelles pepstatines. Cette poudre à un (inhibition des pepsines) 10 de 0,072 . On estérifie la poudre ainsi obtenue avec du méthanol de la façon décrite à l'exemple 1 et on obtient 62 g d'une poudre cristalline qui est un ester méthylique de nouvelle pepstatine. Cette poudre à un II^q de 0,05^, un point de décom-poafcion compris entre 250 et 252°C et sa rotation optique est 15 C/O = ^0,6° (C=0,5, acide acétique). L'analyse par chromatographie en couche mince indique qu'elle contient principalement un ester méthylique de nouvelle pepstatine (Ef = 0,39) et des traces d'ester méthylique de pepstatine originale. On saponifie 30 g de cet ester méthylique de nouvelle 20 pepstatine dans 450 cm3 de lîaOH à 0,2 normal et de méthanol à 90 % pendant 2 heures à 60°C. Le pH du mélange réactionnel est réglé à 8,5 avec de l'acide chlorhydrique dilué et on concentre à 150 cm3 en formant un précipité blanc. On filtre ce précipité, on le lave avec du méthanol et on sèehs sous vide. On obtient 25 17,9 g d'une poudre blanche qui est un sel sodique de nouvelle pepstatine dont le degré d'inhibition est égal à 0,05 Y, dont le point de décomposition est compris entre 245 et 249°C PO et dont la rotation optique D est -84° (0=1,-0, méthanol) Sa courbe de titrage montre que 700 mg consomment 10,1 cm3 de 3 0 HCi à 0,1 normal. Exemple 6 On ensemence avec une souche productrice de pepstatine 130j(, d'un milieu stérilisé contenant 6,0 % de glucose, 2,0 % de glycérine, 4,2 % de caséine de lait, 1,0 °/o de peptones, 0,1 % de 35 K^HPO^, 0,3 % de NaCl et 0,1 % de MgSO^.TH^O (pH =7,0) et on laisse incuber pendant 132,5 heures dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1. On traite 130jtde bouillon de culture contenant un principe antipepsinique équivalant à 111 g de pepstatine de la même manière qu'à l'exemple 1 et on obtient 133 g de 4-0 nouvelle pepstatine brute ayant un degré d'inhibition des pepsines 72 11143 10 2130730 ID = 0,076 y . 50 u On traite la poudre jaune ainsi obtenu de la meie façon, qu'à l'exemple 1 et on obtient 58,5 g d'un ester méthylique de nouvelle pepstatine ayant un de 0,051 Y, un point de décom- 5 position compris entre 255 et 256°C et une rotation optique C°G2g = -95,5° (0=0,5, acide acétique). L'analyse par chromatographie en couche mince indique la présence dans une proportion de 1/1 d'une substance ayant un Ef de 0,35 et d'une substance ayant un Ef de 0,39, mais pas de substance ayant un Ef de 10 0,42, c'est à dire des quantités égales de pepstatine originale et de nouvelle pepstatine. Exemple 7 On fait dissoudre en chauffant 4,0 g de nouvelle pepstatine obtenue à l'état libre à l'exemple 2 dans 100 cm3 de métha-15 nol absolu et l'on ajoute 0,2 cm3 d'acide sulfurique concentré. On traite le mélange par reflux pendant 6 heures sur un bain d'eau bouillante et on concentre sous vide à 50 cm3» On filtre le précipité ainsi formé, on lave à l'éthanol et on sèche pour obtenir 1,6 g de poudre. On recristallise la poudre par 20 évaporation de sa solution dans /100 cm3 de méthanol absolu et on obtient 1,15 g de poudre cristallisée blanche qui est un ester éthylique de nouvelle pepstatine (ester éthylique de pepstatine B), ayant un ID,-n de 0,054^ , un point de décomposi- c 20 tion compris entre 250 et 251°C et une rotation optique [dCJ 25 de -90° (C=0,5, acide acétique). Exemple 8 On fait dissoudre en chauffant 3,0 g de la nouvelle pepstatine obtenue à l'exemple 2 dans 100 cm3 d'alcool n-propylique absolu et on ajoute 0,2 cm3 d'acide sulfurique concentré, puis 30 on estérifie pendant 6 heures à 80°G. On concentre le mélange réactionnel sous vide à 20,0 cm3, avec formation d'un précipité. On filtre ce précipité, on le lave à l'alcool n-propylique et on le sèche ; on obtient ainsi 900 mg de poudre blanche. On recristallise cette poudre par évaporation de sa solution dans 40,0 cm3 35 d'alcool propylique absolu et on obtient 480,0 mg de poudre blanche (esteç-n-propylique de pepstatine B). Ce produit à un ID^q de 0,073 ^ , un point de décomposition compris entre 218 et 220°C — 20 et une rotation optique D de -89,5° (C=0,5 acide acétique). Exemple 9 40 On fait dissoudre 3,0 g de nouvelle pepstatine obtenue 72 11143 n 2130730 à l'exemple 2 dans 100 cm3 de n'butanol absolu chaud et on ajoute 0,2 cm3 d'acide sulfurique concentré. 1'estérification dure 6 heures à 80°C et on concentre sous vide à 2,0 cm3 avec formation d'un précipité. On filtre ce précipité, on le lave au n-butanol 5 et on le sèche ; on obtient ainsi 800,0 mg de poudre blanche. On recristallise par évaporation de sa solution dans 15 cm3 de n-butanol et on obtient 340 mg de poudre blanche qui est l'ester n-butylique de pepstatine B). Son es^ 0*084 Y, son point, de décomposition est compris entre 205 et 207°C et sa rotation on 10 optique [o( I D est -88a (0=0,5, acide acétique). 72 11143 13 2130730 REVENDICATIONS 1. - Procédé de préparation de nouvelles pepstatines, caractérisé en ce qu'il consiste à ensemencer un milieu de culture contenant des sources de carbone assimilable et des sources 5 d'azote avec une souche productrice de pepstatines et à extraire les pepstatines nouvelles du milieu ainsi ensemencé. 2» - Procédé de préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à extraire les pepstatines sous forme d'esters, de sels ou autres dérivés par des techniques 10 ordinaires connues.