Brevet FR2130533A1 — publié le 19721103

La présente invention concerne un inducteur d'interféron pour les infections virales et un procédé de préparation de cet inducteur. Plus particulièrement, l'invention concerne un inducteur d'interféron obtenu par utilisation de la liqueur surnageante d'un milieu de culture 5 liquide, ou d'un liquide contenant un protoplasme désintégré drun organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertusis /G.S. tïilson et A.A. Miles : Principles of Bacteriology and Immunity, Vol. 1, page 973 (5th éd., 1964), publié par Edward Arnold Ltd. (Londres)/, et un procédé de préparation decet inducteur. 10 L'invention a pour objet un procédé de préparation d'un inducteur d'interféron à partir de la liqueur surnageante d'un milieu de culture liquide, dans lequel on a cultivé un organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertusis. L'invention a également pour objet un procédé de préparation 15 d'un inducteur d'interféron à partir d'une fraction obtenue par désintégration du protoplasme d'un organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertusis et séparation ultérieure de l'endotoxine Iipopolysacchari-que et de l'antigène-0 des composants somatiques des bactéries. L'invention concerne en outre un inducteur d'interféron obtenu 20 par l'un des procédés mentionnés ci-dessus. On connaissait jusqu'à présent des inducteurs d'interféron pour la prévention des maladies infectieuses virales d'après de nombreux rapports de recherche ; on peut citer, par exemple, Julius S. Youngner (Jour. General Physiology, 56 (1), Part 2, pages 25s-40s (1970)) et J. Vilcek (Virologr 25 Monograph, Vol. 6 Si ter fer on, publié par Springer-Verlag, 1969, Wîeirifew ï>rk, en particulier pages 21-22). A titre d'exemples typiques d'inducteurs d'interféron connus, on peut citer divers virus, des bactéries (en particulier des bactéries Gram négative^, les endotoxines lipopolysacchariques de ces bactéries, des produits métaboliques de moisissures, des polysaceharides et des acides ribonucléiques 30 en double hélice. Tous ces inducteurs d'interféron sont cependant toxiques et, lorsqu'ils sont administrés, ils ont des effets secondaires et provoquent de la fièvre ou analogue, de sorte qu'on ne les utilise pas fréquemment. Selon le procédé de l'invention, il est possible d'obtenir un inducteur d'interféron de faible toxicité et n'ayant pas d'effets 35 secondaires. On met en oeuvre le procédé selon l'invention en suivant l'un des modes opératoires donnés ci-après. (1) On soumet un organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertusis à une culture agitée à 30-37°C pendant 24 à 94 h en utilisant un milieu liquide, tel qu'un milieu de culture Cohen-Wheeler B 4497 Jap 72 09974 2 2130533 modifié (S.M.Cohen et M.W. Wheeler : Am. J. of Public Health & Nations Health, Vol. 36, pp. 371-376 (1946)). On récupère ensuite la liqueur surnageante du milieu de culture par centrifugation puis on filtre dans des conditions stériles, et on soumet le filtrat à une ultrafiltration ou 5 à une chromatographie, ce qui permet d'isoler une fraction efficace. (2) On désintègre d'abord un protoplasme de l'organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertusis mentionné ci-dessus en soumettant le protoplasme pendant 10 à 30 mn à un traitement physique, tel qu'un traitement sonique, ou à un traitement mécanique à l'aide 10 d'un agitateur ou d'une presse de type "French press"* On centrifuge ensuite le liquide contenant le protoplasme désintégré pour obtenir un liquide surnageant ne contenant pratiquement pas d'endotoxine lipopolysaccharique et d'antigène-0. On purifie le liquide surnageant ainsi obtenu par chromatographie en utilisant comme adsorbant de la DEAE-cellulose (c'est-à-dire 15 de la diéthylaminoéthylcellulose), du Sephadex (nom de marque d'une poudre insoluble anhydre composée de perles microscopiques constituées de composés organiques synthétiques dérivés du dextranne, fabriquée et vendue par la Société Pharmacia Fine Chemicals, Inc., New Jersey, U.S.A.), ou du DEAE-Sephadex, ce qui permet d'isoler la fraction efficace souhaitée. 20 (3) On cultive l'organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertusis mentionné ci-dessus à 35-37°C pendant 2 à 3 jours dans un milieu de culture approprié à la culture de Bordetella pertusis. par exemple un milieu au charbon, et on traite le protoplasme résultant comme il est indiqué ci-dessus, ce qui permet également d'isoler une fraction 25 efficace. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On soumet un organisme de phase III de Bordetella pertusis 30 à une culture agitée à 35-37°C pendant 72 h dans un milieu de culture Cohen-Wheeler modifié. Après cette culture, on centrifuge le liquide pour obtenir 1000 ml d'une liqueur surnageante. On filtre ce liquide surnageant dans des conditions stériles, ce qui permet d'obtenir 900 ml d'une fraction efficace (A). 35 Comme pour l'organisme de phase III, on obtient 900 ml d'une fraction efficace (B) en utilisant un organisme de phase II de Bordetella pertusis. 72 09974 3 2130533 Comme pour l'organisme de phase III, on obtient 900 ml d'une fraction efficace de (C) en utilisant un organisme de phase I de Bordetella pertusis. On concentre la fraction efficace (A) mentionnée ci-dessus 5 jisqu'à un volume de 50 ml, puis on purifie ce produit de concentration par chromatographie en utilisant comme adsorbant du DEAE-Sephadex A-50 pour obtenir 50 ml d'une fraction efficace. On purifie de même ensuite cette fraction efficace ainsi obtenue en utilisant du Sephadex G-50, ce qui permet d'obtenir 50 ml d'une autre fraction efficace. 10 EXEMPLE 2 On cultive un organisme de phase III de Bordetella pertusis à 35-37°C pendant 48 h dans un milieu de culture charbon-gélose (D.W. Ribbons : Methods in Microbiology, p. 4, 99 et 283 (1970), publié par Academic Press Inc., Londres-New York). On met ensuite en suspension 10 g 15 du protoplasme recueilli dans 100 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate et on soumet la suspension cellulaire obtenue, pendant 30 mn, à un traitement sonique à 10 kc pour désintégrer le protoplasme. On centrifuge ensuite le liquide contenant le protoplasme désintégré pour récupérer 90 ml d'un liquide surnageant. On traite ce liquide surnageant par chromatographie 20 en utilisant comme adsorbant du Sephadex G-150, ce qui permet d'obtenir 40 ml d'une fraction efficace (D-l). De la même manière que ci-dessus, on cultive l'organisme de phase III de Bordetella pertusis à 35-37°C pendant 72 h, ce qui permet d'obtenir 40 ml d'une fraction efficace (D-2). 25 Comme pour l'organisme de phase III, on obtient 40 ml d'une fraction efficace (E) en utilisant un organisme de phase ïfede Bordetella pertusis. Comme pour l'organisme de phase III, on obtient 40 ml d'une fraction efficace (F) en utilisant un organisme de phase I de Bordetella 30 pertusis. On centrifuge ensuite, le liquide contenant le protoplasme désintégré de l'organisme de phase I pour obtenir un liquide surnageant que l'on soumet alors à une chromatographie en utilisant comme adsorbant de la DEAE»cellulose, ce qui permet d'obtenir 30 ml d'une fraction efficace (G). Les résultats de l'étude de la production d'interféron des 35 fractions efficaces (A) à (G) obtenues dans les exemples 1 et 2 ci-dessus sont mentionnés ci-après. On effectue cette détermination comme il est indiqué dans les exemples de détermination 1 et 2. 72 09974 4 2130533 Exemple de détermination 1 Détermination des quantités d'interféron produites (essai in vitro) On mélange une solution mixte comprenant 1,4 partie en volume d'une solution saline tamponnée au phosphate et une partie en volume d'une 5 solution de Ringer avec 0,6 partie en volume d'un sérum de veau, et on ajoute au mélange résultant 3 parties en volume d'eau distillée pour préparer une solution hypotonique. En utilisant cette solution hypotonique, on dilue chacune des fractions efficaces (A) à (G) à diverses concentrations pour préparer des échantillons dilués. D'autre part, on prépare une suspension 10 cellulaire comme suit : on sacrifie par ponction cardiaque un lapin pesant 500 à 1000 g, on prélève la rate et les ganglions lymphatiques, on déchire les tissus de ces organes à l'aide de pinces pour disperser les cellules, et on met en suspension les cellules ainsi obtenues dans un milieu de culture à une concentration de 5 x 10 cellules/capsule pour rate et 15 ganglion lyphatique. Ensuite, on mélange les échantillons dilués mentionnés ci-dessus avec la suspension cellulaire et on cultive à 25°C pendant 24 h, puis on centrifuge le liquide de culture pour obtenir une liqueur surnageante, dans laquelle on détermine la quantité d'interféron produite. Les résultats obtenus dans le tableau I ci-après. 20 Le titre en interféron est exprimé par la dilution la plus élevée provoquant une inhibition à 50 % du nombre et de la taille des plaques par rapport à des échantillons témoins non traités. Exemple de détermination 2 Détermination de la production d'interféron (essai in vivo) > 25 On administre par injection intraveineuse les échantillons dilués préparés dans l'exemple de détermination 1, à une dose de 0,5 ml, à un lapin pesant 500 à 1000 g. 2-A£t 5 h après l'injection, on prélève dans le lapin, par ponction radiaque, 3 ml de sang et on étudie le sérum isolé à partir de ce sang pour déterminer la production d'interféron, de la même façon que 30 dans l'exemple de détermination 1. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau II ci-après. Comme le montrent les résultats des tableaux I et II, on peut constater que les liquides surnageants des milieux de culture et des protoplasmes désintégrés des organismes de phase III, II et I de Bordetella 35 gertusis produisent des interférons dans les essais in vitro et in vivo réalisés sur des lapins. En particulier, on observe que les liquides surnageants, obtenus à partir de l'organisme de phase III de Bordetella pertusis,ont une très faible toxicité et se révèlent comme un excellent inducteur d'interféron. 72 09974 5 2130533 On confirme également que les facteurs d'inhibition des virus dus aux inducteurs d'interféron obtenus selon l'invention ne sont pas efficaces sur des cellules embryonnaires de poulets d'espèces différentes, ont une action inhibitrice sur la propagation des virus de stomatites 5 vésiculaires et de vaccine dans des lignées cellulaires RK-13, et ont des• caractéristiques d'interféron telles qu'ils sont inactivés par 0,08 % de trypsine à 37°C, ils ne précipitent pas mÊme lorsqu'on les centrifuge avec une force de 100.000 g et ne subissent pas de dialyse à travers une poche de cellophane. 10 *"French press" : dispositif pour désintégrer des bactéries par action d'un piston se déplaçant rapidement dans un récipient cylindrique en une fois et sans agitateur. On connaît de nombreuses variantes de cette presse : voir par exemple Hughes D.H. British Journal of Expérimental Pathology Vol. 32, p. 97-1951. TABLEAU I Détermination de la production d'interféron (essai in vitro) Echantillon Concentration de l'échantillon y Titre en Cellules de rate interféron Cel.lules de gl^nglions lymphatiques 1. Organisme de phase XIX de Bordetella pertusis (1) Liquide surnageant d'un Facteur de dilution : 10 80 85 milieu de culture Facteur de dilution : 100 220 700 (fraction efficace (A) Facteur de dilution : 1000 220 680 (2) Liquide surnageant de Facteur de dilution : 100 430 330 protoplasme désintégré Facteur de dilution : 1000 -.340 310 (culture pendant 48 h) Facteur de dilution : 10000 230 330 (fraction efficace D-l) Facteur de dilution : 100000 * 100 (2) Liquide surnageant de Facteur de dilution : 100 500 * protoplasme désintégré Facteur de dilution : 1000 360 230 (culture pendant 72 h) Facteur de dilution : 10000 205 220 (fraction efficace D-2) Facteur de dilution : 100000 50 85 2. Organisme de phase II de Bordetella "pertusis (1) Liquide surnageant d'un milieu de culture (culture pendant 72 h) (fraction efficace B) Facteur Facteur de de dilution : dilution ; 100 1000 280 220 * * TABLEAU I (suite) Détermination de la production d'interféron (essai in vitro) Echantillon Concentration de l'échantillon Titre en interféron Cellules de rate Cellules de ganglions lvmphatiques (2) Liquide surnageant de protoplasme désintégré (culture pendant 48 h) i (fraction efficace E) Facteur de dilution : 100 Facteur de dilution : 1000 320 300 * * 3. Organisme de phase I de Bordetella pertusis ■ (1) Liquide surnageant d'un milieu de culture (fraction efficace C) Facteur de dilution : 20 Facteur de dilution : 100 Facteur de dilution : 500 106 320 160 17 52 72 (2) Liquide surnageant de protoplasme désintégré (fraction efficace F) Contenant 10 ^ug de solide par ml (non traité) (1 (traité à 56°C pendant 30 mn 930 1400 240 * (3) Nécrotoxine (fraction efficace G) Liquide contenant 45 /Ug de solide par ml dilué 10 fois 720 1.900 M6me liquide dilué 50 fois 630 1.900 MSme liquide dilué 250 fois 230 1.900 --4 NJ O -O xO ■fc* K) UJ O Cn UJ LO i Pas de détermination du titre /►> TABLEAU II Détermination de la production d'interféron (essai in vivo) Echantillon Concentration de l'échantillon Lapin n° Titre en interfé au bout de 2 h ron Au bout de 5 h 1. Organisme de phase III de Bordetella pertusis Liquide surnageant d'un milieu de culture (fraction efficace A) Facteur de dilution : 10 it 7 8 490 1800 50 210 2. Organisme de phase I de Bordetella pertusis (1) Liquide surnageant d'un milieu de culture (fraction efficace C) Facteur de dilution : 10 Facteur de dilution : 10 Facteur de dilution : 10 1 2 3 600 2200 2200 40 130 210 (2) Liquide surnageant de protoplasme désintégré (fraction efficace F) * y • Contenant 10 ^ug de solide par ml (non traité)* ii (traité à 56°C pendant 30 nm) 4 5 1200 1250 40 (3) Nécrotoxine (fraction efficace G) 500 ^ug/kg de poids de corps (non traité) If traité à 56°C pendant 30 mn) 6 7 340 43 40 Pas de détèrmination du titre 72 09974 9 *5 2130533 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un inducteur d'interféron pour les maladies infectieuses virales, caractérisé en ce qu'on cultive Bordetella 5 pertusis dans un milieu de culture, on récupère des fractions efficaces à partir du milieu de culture et du protoplasme des bactéries. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on récupère la fraction efficace en cultivant Bordetella pertusis dans un milieu de culture liquide, en séparant le liquide surnageant du milieu 10 de culture, en filtrant le liquide surnageant ainsi obtenu dans les conditions stériles pour obtenir un filtrat, et en extrayant le filtrat ainsi obtenu par ultrafiltration ou chromatographie pour obtenir la fraction efficace. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on récupère la fraction efficace en cultivant Bordetella pertusis dans un milieu de 15 culture liquide, en séparant le protoplasme de Bordetella pertusis du milieu de culture, en mettant en suspension le protoplasme dans une solution saline tamponnée au phosphate, en désintégrant le protoplamse, en centrifugeant le liquide contenant le protoplasme désintégré pour obtenir un liquide surnageant et en récupérant la fractinn efficace par chromatographie du liquide surnageant. 20 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on récupère la fraction efficace en c ulti vant Bordetella pertusis dans un milieu de culture solide, en recueillant le protoplasme de Bordetella pertusis à partir de ce milieu de culture, en mettant en suspension le protoplasme dans une solution saline tamponnée au phosphate, en désintégrant le proto-25 plasme dans la suspension, en centrifugeant le liquide contenant le protoplasme désintégré pour obtenir un liquide surnageant et en récupérant la fraction efficace par chromatographie du liquide surnageant. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organisme de Bordetella percusis est choisi parmi les organismes de phase III, de phase II 30 et de phase I de Bordetella percusis. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on c u11 iv e Bordetella percusis selon une technique de culture avec agitation en utilisant un milieu liquide de Cohen-Wheeler modifié à une température de 35-37°C et pendant 24 à 72 h. 35 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'on réalise la chromatographie en utilisant comme adsorbant une substance choisie parmi la DEAE-cellulose, le Séphadex et le DEAE-Séphadex. 72 09974 10 2130533 8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu de culture solide est un milieu de charbon-gélose. 9. Inducteur d'interféron préparé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les facteurs 5 d'inhibition de virus dus à cet inducteur ne sont pas efficaces pour des cellules embryonnaires de poulets d'espèces différentes, ont une action d'inhibition sur la propagation des virus de stomatite-s vésiculaires et de vaccine dans des lignées cellulaires RK-13, sont inactivés par la trypsine à 0,08 % à 37°C, ne précipitent pas même lorsqu'on les centrifuge 10 avec une force de 100.000 g et ne subissent pas de dialyse à travers une poche de cellophane.