Brevet FR2111719A1 — publié le 19720609

37^5 2111719 La présente invention concerne un médicament contenant un composant de paroi cellulaire de Pseudomonas aeruginosa et un véhicule acceptable du point de vue pharmaceutique . Plus spécialement, l'invention concerne un médicament contenant un composant 5 protéique de paroi cellulaire de Pseudomonas aeruginosa, désigné ci-après par CWP , et un véhicule pharmaceutique, qui inhibe le développement des tumeurs chez les animaux, y compris l'être humain, et qui les immunise contre une infection par Pseudomonas aeruginosa . 10 En conséquence ,1a présente invention se propose de fournir une composition anti-tumeur et de vaccin sous forme de dose unitaire contenant CWP et un véhicule pharmaceutique . La présente invention se propose encore de fournir un procédé permettant d'empêcher le développement des tumeurs chez les animaux 15 et les êtres humains ainsi qu'un procédé pour les Immuniser d'une infection due à Pseudomonas aeruginosa par administration pa-rentérale de CWP. CWP qui a tout d'abord été isolé par J.Y. Homma et ses collaborateurs est un antigène protéique sous forme de composant de 20 paroi cellulaire de Pseudomonas aeruginosa et est également appelé par les auteurs "Original Endotoxin Protein" /~J.Y. Homma; J. Bacteriol. 8£, pages 630-640, 1954; Ann. New York Acad.Sci.133 , pages 508-526 , 1966 ; Zeitschrift ftlr Allg. Mikrobiol. £3, pages 227-248 , 1968J7 • 25 Le domaine de la thérapie des tumeurs a récemment été étudiée minutieusement .Cependant, on a découvert très peu d'agents anti-tumeur efficaces freinant le développement des tumeurs sans provoquer de graves effets secondaires chez le malade . La Demanderesse a maintenant découvert qu'une administration 30 parentérale de CWP à des animaux porteurs de tumeurs inhibe le développement de ces tumeurs . CWP selon l'invention empêche fortement le développement des tumeurs provoquées par l'ascite du type sarcome 180 (S-180A) et l'ascite du type carcinome d'Ehrlich (EAC), ces deux catégories 35 ayant habituellement été utilisées comme étalon dans 1'examen préliminaire de substances anti-tumeur . Du fait que la plupart des agents anti-cancéreux connus utili- . sés cliniquement à l'heure actuelle sont efficaces pour freiner le développement des tumeurs provoquées par S-180A et/ou EAC,il s'en-40 suit que CWP est également efficace dans le traitement thérapeutique 71 37H5 2111719 d'un malade atteint de cancer . Etant donné que Pseudomonas aeruginosa, comme on le sait, présente généralement une résistance naturelle aux antibiotiques habituels, la plupart des antibiotiques connus sont inefficaces 5 pour le traitement thérapeutique ou la -prévention d'une maladie provoquée par l'infection de Pseudomonas aeruginosa . Parmi les composants bactériens de Pseudomonas aeruginosa , l'utilisation du complexe lipopolysaccharide-protéine (LPS) comme vaccin de Pseudomonas aeruginosa est déjà connu.Cependant,l'effet 10 immunisant de LPS, comme on le sait, est de type spécifique .le vaccin LPS déploie en conséquence line activité de protection sélective uniquement contre une infection due à Pseudomonas aeruginosa donnant la séro-réaction particulière . Ce fait est ion inconvénient Important que l'on rencontre dans la prévention 15 et le traitement des maladies provoquées par une infection par Pseudomonas aeruginosa . La Demanderesse a maintenant découvert que CWP est un excellent antigène de Pseudomonas aeruginosa . Il est à remarquer que CWP ne présente pratiquement pas de type spécifique et produit, 20 indépendamment de la séro-réaction de la bactérie, des effets remarquables dans le traitement thérapeutique et la prévention des maladies infectieuses provoquées par Pseudomonas aeruginosa . Un autre avantage que présente CWP, lorsqu'on l'administre, est sa faible toxicité et son faible pouvoir pyrogène qui sont 25 environ égals au dixième de celles qui provoque l'administration de LPS. En conséquence , CWP est utile comme vaccin de Pseudomonas aeruginosa . Les caractéristiques chimiques et physiques de CWP varient dans une certaine mesure suivant l'espèce de souche de bactérie 30 de Pseudomonas aeruginosa utilisée pour sa production. Dans le spectre d'absorption de la lumière, CWP présente le premier pic à une longueur d'onde de 275-280 nm, le second pic à 410-415 nm et le troisième pic à 550 m (faible). CWP contient de 10 à 16% d'azote , moins de 5# de sucres exprimé en glucose 35 selon le procédé à l'anthrone, de 0,03 à 1,7$ de sueres aminés et de 0,3 à 2,0% de phosphore . La substance appartient à une protéine acide ayant un point isoéleetrique à un pH d'environ 4,5 et est faiblement soluble dans l'eau et î^ans les solutions aqueuses d'acides minéraux ,alors qu'elle est facilement soluble «â*ns les 40 substances alcalines aqueuses . Par exemple, 1 mg de CWP est to- 71 37445 3 2111719 totalement soluble dans 0,1 ml de n-NAOH à 1/100. Au cours de l'étude immunochimique selon l'essai de diffusion sur gel d'agar-agar, il a été confirmé que CWP ne contient pas l'antigène commun à celui de LPS. 5 L'effet thérapeutique de CWP dans le but d'empêcher le déve loppement des tumeurs a été examiné au cours de l'essai suivant : •Des groupes de six souris ont reçu par voie intrapéritonéale 1 x l07 cellules d'ascite du type Sarcome 180 (S-180A) et du type carcinome d'Ehrlich (EAC). 10 Au bout de 24 heures, des solutions de CWP en diverses con centrations dans un milieu physiologique salin ont été administrées par voie intrapéritonéale une fois par jour .L'administration a duré pendant 5 jours . On a estimé l'activité anti-tumeur en déterminant le volume total des cellules groupées (VTCG) d'ascite 15 prélevé au bout de 7 jours à partir de l'inoculation de la tumeur. Les résultats sont représentés par le rapport de % de T/C, où "T" est la valeur VTCG obtenue à partir des groupes d'essai ,et "3" est la valeur "VTCG obtenue à partir du groupe témoin qui n'a été traité que par la solution saline physiologique . 20 Les essais donnent les résultats suivants : Contre S-180A , une dose efficace moyenne (DE^Q) de CWP est de 8,5 microgramme/kg de poids du corps/jour et une dose efficace à 90# (DE^q) est de 40 microgrammes/kg de poids du corps/jour . Contre EAC, une DE^q de CWP est de 8,0 microgrammes/kg de poids 25 du corps/jour et une DE^q est de 35 microgrammes/kg de poids du corps/jour . Après des administrations successives pendant 5 jours de 5 milligrammes/kg de poids du corps/jour de CWP, les souris présentent une légère diminution de poids, mais aucun animal n'est mort. 250 En conséquence, une dose léthale à 10$ (DL1Q) de CWP est supérieure à 5 milligrammes/kg de poids du corps/jour avec des administrations successives pendant 5 jours . Ainsi, un indice thérapeutique (DL^q/DE^q) supérieur à 120 est attribué à CWP. Il a été constaté que ni une substance présentant une activité •35 anti-tumeur efficace à une dose minime, ni une substance présentant une différence extrêmement grande entre la dose efficace et la dose léthale n'est comparable à celle de CWP selon la présente invention. . La toxicité aiguë (DL^q) de CWP administré par voie intrapéritonéale à une souris est de 37*5 ®g/kg de poids du corps . 2,q La préparation selon la présente invention peut être présentée 71 37445 4 2111719 en flacon ampoule contenant CWP en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable à l'état sec .Comme véhicule pharmaceutique, on peut utiliser le glucose, le mannitol, la carboxy-méthyl-cellulose, etc.. 5 La préparation, lorsqu'on l'utilise, peut être dissous dans l'eau distillée pour injection ou dans une solution saline physiologique. La solution peut être administrée par voie parentérale par injection intra-musculaire , sous-cutanée et intrapéritonéale. CWP peut également être utilisé avec les techniques de perfusion. 10 Dans le but d'immuniser l'homme contre Pseudomonas aeruginosa, il a été constaté que 3 à 5 administrations par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale de 1 à 100 microgrammes/jour de CWP à des intervalles de 2 à 3 jours ,sont souhaitables .Dans le but de traiter un malade infecté par Pseudomonas aeruginosa , 15 l'administration d'une préparation de CWP selon l'invention peut éventuellement être poursuivie si cela est nécessaire , pendant plus d'un an sans provoquer de graves effets secondaires . Compte tenu des résultats observés dans l'essai chez les animaux, que l'on a décrit plus haut, on pense que l'administration 20 parentérale de 5 à 300 microgrammes de CWP inhibe efficacement le développement des tumeurs chez l'homme . Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif, mais non limitatif, de l'invention . EXEMPLE 1 25 Préparation de CWP Une souche mutante, type la, de Pseudomonas aeruginosa N 10 est inoculée dans 20 litres d'un milieu synthétique contenant 0,5$ de glycérol, 2$ de glutamate de sodium, 0,56$ de Na2HP0^.l&HgO , 0,025$ de KHgPO^ , 0,019$ de MgSOj^HgO , 0,001$ de Ca(N0^)2 et 30 0,000005$ de FeSO^HgO . La culture aérobie de la souche dans le milieu susmentionné est effectuée à 37°C en faisant passer 0,2 litre d'air stérilisé par minute par litre du milieu, tandis que le pH du milieu est ajusté automatiquement à 7*4. Lorsque le développement entre dans 35 une phase fixe, le milieu de culture est incubé pendant trois heures supplémentaires, et l'incubation est alors interrompue . On ajoute une certaine quantité de toluène afin d'autolyser le milieu de culture . On filtre l'autolysat sur un papier-filtre. Au filtrat résultant, on ajoute 400 ml d'une solution aqueuse à 40 50# de chlorure de zinc . On isole par centrifugation le précipité 71 37445 5 2111719 résultant ,Pour solubiliser CWP, on traite le précipité par une solution aqueuse saturée de Na2HP0^ et le sépare par centrifugation . On dialyse la liqueur surnageante en utilisant de l'eau du robinet. A la solution dialysée, on ajoute de l'acétate de sodium à la con-^ centration finale de 0,1$. A la température de 0°C, on ajoute à la solution six fois son volume d'acétone (volume/volume). On recueille le- précipité résultant et le dissous dans l'eau .On soumet la solution aqueuse à une électrolyse, puis la lyophilise . On soumet la substance lyophilisée à une électrophorèse par 10 zones en utilisant une résine de chlorure de polyvinyle comme matière de support dans une solution-tampon de borate M/20 de pH 8,8. A la suite de la séparation, la substance s'avère contenir deux composants présentant des mobilités différentes , par mesure de l'absorption ultraviolette à 280 nm. La fraction correspondant au 15 composant ayant la plus faible mobilité est dialysée puis lyophilisée .La substance lyophilisée est dissoute dans une solution -tampon de Tris-HCl 0,01 M à pH 8,0 et soumise à une chromatographie sur colonne sur "Sephadex G200" . Une bande principale ainsi obtenue .est recueillie et adsorbée sur une colonne de DEAE- cellulose 20 qui a été précédemment équilibrée avec la même solution-tampon que celle sus-mentionnée . On élue ensuite la colonne à l'aide des solutions aqueuses de chlorure de sodium au moyen d'un processus par gradients . La fraction éluée avec la solution de chlorure de sodium 0,2-25 0,3M est dialysée puis lyophilisée . On obtient ainsi 300 mg de " CWP. Les propriétés chimiques de CWP sont les suivantes : N 13,8# P 1,1# 30 Sucres 0,01# Par le procédé à l'anthrone Sucres aminés 0,03# Par le procédé de Elson-Morgan Protéines 85# Par le procédé de Polin-Ciocalteu et analyse des acides aminés . Un échantillon de la souche de bactérie Pseudomonas aeruginosa 35 N 10 utilisée dans la présente invention a été déposé au "Bureau of American Type Culture Collection of U.S.A " sous la désignation ATCC 21726. EXEMPLE 2 On examine l'activité anti-tumeur de CWP sur des souris femel-40 les pesant 20 ^ 2 g de la souche D D N en ce qui concerne les as- 71 37445 2111719 cites du type sarcome 180 (S-180A) et carcinome d'Ehrlich (EAo;. Les souris sont divisées en groupes de 6. On transplante par voie intrapéritonéale aux souris des groupes les cellules des tumeurs sus-mentionnées ( 1 x 10^ cellules) . Au bout de 24 heures, 5 on injecte les solutions de CWP à diverses concentrations dans une solution saline physiologique par voie intrapéritonéale line fois par jour pendant 5 jours à chaque souris des groupes individuels . Sept jours après la transplantation , on recueille l'ascite de chacune des souris et on détermine le volume total des cellules 10 groupées qu'il contient ("VTCG). Le VTCG résultant est désigné par un pourcentage rapporté au VTCG des souris témoins auxquelles seule la solution physiologique saline a été injectée (T/C %),. Les résultats obtenus sont représentés graphiquement sur la Figure 1 du dessin annexé . 15 Sur la Figure 1, en ordonnée est porté le % de développement (T/C) et en abscisse le logarithme de la dose de CWP par kg de poids du corps des souris et par jour . La Figure 1 montre une corrélation presque linéaire entre l'inhibition de développement des tumeurs et la dose de CWP. Il a 20 également été constaté que DL^q et du CWP sont de 40 micro grammes/kg de poids du corps/jour et de 8,5 microgrammes/kg de poids du corps/jour, respectivement .Lorsqu'on administre plus de 100 microgrammes/kg de poids du corps/jour de CWP , les résultats montrent l'existence d'environ 10# de cellules- .11 a été confirmé 25 que ces cellules ne sont pas des cellules de tumeurs, mais de leucosytea polymorphonucléaires . EXEMPLE 5 On utilise dans cet essai CWP obtenu à partir de la souche mutante, type la, de Pseudomonas aeruginosa N 10. On injecte par 30 voie sous-cutanée 15 jià de CWP à des souris mâles de la souche D D N pesant 25g en moyenne.Le septième jour après l'injection,les souris reçoivent les suspensions Pseudomonas aeruginosa N 10 dans une solution à 5# de mucine de l'estomac de porc. On effectue des administrations analogues de Pseudomonas aeru-35 ginosa 703 qui diffèrent des premières en ce qui concerne la séro-réaction du LPS.Les résultats sont indiqués sur les Tableaux 1 et 2 dans lesquels les nombres de souris traitées sont inscrits aux dénominateurs et les nombres de souris mortes aux numérateurs . T A B L E A U 1 vj Souche utilisée pour l'administration Pseudomonas aeruginosa N 10 (Type Sero 5) 1*1 4> Nombres de cellules bactériennes dans 0,5 ml mucine administrée par voie intrapéritonéale d'une solution à 0,5% de à des souris Immunisées 1,5 x 107 1,5 x 105 1,5 x 105 h 1,5 x 10^ 1,5 x 103 VJ1 Groupes immunisés: 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Témoin: 5/5 T A B 4/4 L E A U 2 3/5 0/5 0/5 Souche utilisée pour 1'administration Pseudomonas aeruginosa 703 ( type Sero 12) Nombre de cellules bactériennes dans 0,5 ml mucine administrée par voie intrapéritonéale d'une solution à 0,5% de à des souris immunisées 7,5 x 107 • 7,5 x 106 ' 7,5 x 105 7,5 x 104 7,5 x 103 Groupes immunisés: 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 Témoin — 2/2 4/4 4/4 0/3 ro h-A t-* l-i vo 71 37445 2111719 Des Tableaux ci-dessus, il ressort que,, grâc® à 1 'irr~.ur.i:;-tion avec CWP obtenu à partir de Pseudomonas aeruginosa N 10,il est possible de protéger les animaux de Pseudomonas aeruginosa qui présente une séro réaction de LPS différente de celle de la première souche N10. 71 37445 9 2111719 REVENDICATIONS 1-Médicament ayant notamment des propriétés anti-tumeur et anti-infectieuses vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa, caractérisé en ce qu'il comprend à titre de principe actif,un composant 5 protéique de paroi de cellule isolé d'une souche de Pseudomonas aeruginosa . 2-Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche est une souche mutante de Pseudomonas aeruginosa N10. 3-Médicament selon la revendication 1 ou la revendication 2, 10 caractérisé en ce qu'il est formulé en poudre contenue dans des flacons ampoules,catte .poudre étant destinée à être diluée , extemporanément pour l'administration parentérale, dans de l'eau ou dans une solution physiologique .