Brevet FR2121491A1 — publié le 19720825

i 2121491 L'invention concerne un nouveau vaccin antivariolique, que l'on applique par un procédé transcutané ou similaire, de préférence par scarification, et dont la caractéristique principale est 1'absence totale d'eau et la pré-5 sentation sous forme de pommade» L'invention concerne également la préparation et l'application de ce nouveau vaccin antivariolique» Jusqu'à maintenant on a toujours'utilisé les vaccins contre la variole sous forme aqueuse et habituelle) lement liquide. Pour la stabilisation, il est nécessaire de conserver ces vaccins vivants et sensibles, à des températures très basses ou sous forme lyophilisée» La conservation à basse température n'est pas toujours possible et en tout cas coûteuse et peu commode» 15 L?application du vaccin antivariolique lyophilisé était accompagnée jusqu'à maintenant par une série d'inconvénients» Avant tout il faut réhydrater les préparations immédiatement avant usage par l'addition d'un solvant aqueux approprié. Cette opération est peu commode et peu rapide et' 20 peut être à l'origine de manipulations erronées» Le médecin chargé de la vaccination évite donc dans la mesure du possible l'application du vaccin antivariolique lyophilisé» Les vaccins contre la variole réhydratés à partir d'un lyophilisât ont en outre tendance à s'écouler sur 25 la peau en dehors de l'endroit visé, ce qui peut augmenter"surtout lors de vaccinations en masse le taux des vaccinations négatives. Un autre inconvénient est l'instabilité d'une solution de vaccin contre la variole réhydraté» On a proposé dans le brevet américain 30 n° 5 378 443 de rationaliser le transport et le stockage d'articles de provenance biologique séchés, par exemple de vaccins et de toxoïdes, en mélangeant ces substances sensibles à l'air et à l'humidité à une huile silicone, au lieu de les protéger contre l'accès de l'air et de l'humidité par des emballages in-35 dividuels soudés, préalablement évacués et remplis d'un gaz i-nerte. Ce faisant il est possible de transporter des produits biologiques en vrac. Le but de la présente invention est de simplifier et d'améliorer les conditions d'utilisation du vac-40 cin contre la variole, que l'on applique par un procédé trans- 71 15228 2 2121491 cutané, de préférence par scarification et d'éviter des sources d'erreur, en particulier l'utilisation de vaccins qui ont déjà perdu leur efficacité et l'écoulement du vaccin sur la peau en dehors de l'endroit à vacciner, et d'obtenir ainsi un 5 résultat de vaccination bien définie Pour en arriver là, il est nécessaire non seulement d'améliorer la stabilité du vaccin habituel mais aussi d'en augmenter la consistance. Théoriquement, on peut obtenir ce dernier 10 résultat par la simple addition d'une substance régulatrice de viscosité, comme par exemple la carboxyméthylcellulose ou la lanoline. Toutefois, les vaccins contre la variole visqueux ainsi obtenus sont pratiquement inutilisables et très difficiles à manipuler, parce qu'on doit les conserver à cause de la 15 présence de l'eau à une température très basse. Déjà une teneur d'eau de 2 % interdit la conservation à température normale. Une utilisation rationnelle est exclue dans ces conditions. La vaseline est également inappropriée comme excipient de pommades, car elle n'est pas résorbée et elle protège les 20 virus du vaccin contre le liquide corporel et empêche ainsi le développement de l'activité» Jusqu'à maintenant, on n'a pas pu préparer des vaccins contre la variole sous forme de pommadas qui sont normalement utilisables. Une autre condition pour obtenir un vac-25 cin contre la variole ainsi amélioré et thermostable est l'absence complète d'eau. Jusqu'à maintenant, on n'a jamais pu utiliser directement, c'est-à-dire sans réhydratation, des préparations de virus de vaccine . On a maintenant trouvé que les disper-30 sions sous forme de pommades préparées à partir d'un vaccin contre la variole lyophilisé et d'une huile silicone à grande viscosité ou une pâte de silicone forment des vaccins contre la variole praticables exempts d'eau, ayant une grande activité et en même temps très manipulable, et que l'on peut les appli-35 quer directement, sans traitement préalable, par scarification ou par un autre procédé transcutané0 L'huile de silicone d'une telle dispersion du virus de caecine dans l'huile de silicone doit" avoir à 20°C uns viscosité d'environ 30*000 à 100o000 c«Sto(Centistokes), de 40 71 15228 2121491 préférence de 50.000 à 80.000 c.St. Le procédé de préparation de ce vaccin contre la variole sous forme de pommades est caractérisé par le fait qu'on ajoute d'abord le vaccin contre la variole lyophilisé, préparé de façon habituelle, à une huile de silicone de faible viscosité et très volatile, qu'on broyé très finement le mélange et le met en dispersion, de manière à obtenir une répartition particulièrement homogène qui est la condition pour une activité régulière d'une haute valeur ; ensuite on ajoute une huile de silicone visqueuse, de préférence d'une très grande viscosité, d'une valeur de 30.000 à environ 100.000 c.St. à 20°C, de préférence de 50.000 à 80.000 c.St., on continue la mise en dispersion et ensuite on élimine la fraction de l'huile de silicone très volatile par évaporation0 Par ce procédé on obtient une répartition extrêmement homogène du vaccin antivariolique séché, ce qui est une condition essentielle de son activité en cas d'application directe. Le vaccin contre la variole ainsi obtenu présente la même stabilité que le vaccin sec lyophilisé* L'activité du vaccin contre la variole sous forme de pommade selon l'invention est inattendue, étant donné que l'huile de silicone pourrait bien isoler les particules du vaccin qu'il tient en dispersion des cellules de la peau de l'individu à vacciner de la même façon qu'elle le fait pour protéger le vaccin contre les influences destructives de l'air atmosphérique. Le contact entre les particules du vaccin et les cellules de la peau est la condition de l'efficacité du vaccin et l'isolation de l'air et de l'humidité la condition de sa stabilité. On a pu prouver l'activité du nouveau vaccin contre la variole exempt d'eau selon la présente invention, sur des volontaires. A cette fin, on a vacciné plus de 600 personnes avec le vaccin contre la variole selon l'invention, composé d'une dispersion adhésive sous forme de pommade^ de virus de vaccinia lyophilisé et d'huile de silicone de haute viscosité. Il s'agissait surtout de la revaccination que l'on fait habituellement à deux endroits différents» On pouvait ainsi très facilement traiter un endroit avec un vaccin lyophilisé habituel, tandis qu'à l'autre endroit, on a vacciné avec la pommade selon l'invention. On a appliqué les deux vaccins par 71 15228 * 2121491 scarification. Un avantage important du vaccin en forme de pommades selon l'invention est non seulement sa bonne stabilité de conservation mais aussi son mode d'application di-5 recte très facile, parce qu'il n'est nécessaire d'apporter sur la peau qu'une particule grosse comme la pointe d'une aiguille , la consistance de cette particule la faisant adhérer sur la peau, et de mettre en oeuvre une quantité de virus bien définie, tandis qu'en cas d'utilisation d'un vaccin lyophilisé 10 liquide et en suspension, il y a toujours une tendance d'écoulement sur la peau. Les vaccinations dont le nombre dépassait les 600 ont montré que la nouvelle forme du vaccin est au moins équivalente en valeur au vaccin utilisé jusqu'à maintenant. 15 Les vaccinations premières et les revaccinations se déroulent de façon identique sur une même personne. On a observé après vaccination avec la pommade toutes les réactions positives, en partant de la formation classique d'une pustule qui dans la plupart des cas ne 20 dépasse pas le diamètre de 1 cm, jusqu'à la réaction accélérée. L'invention sera décrite ci-après selon un exemple non limitatif. Exemple 25 Pommade de vaccin contre la variole a) On utilise comme produit de départ pour la préparation du vaccin, -une souche de virus de vaccine couramment employée, que l'on cultive habituellement sur la peau d'animaux. On conserve la pulpe des souches après 30 les avoir congelées à -25°C. On ajoute à une partie en poids de la substance récoltée 9 parties en poids d'un tampon selon Kc Ilvain (M 0,004), 0,4 % de phénol et 10 % d'un hydrocarbure fluoré du type Fréon, on met en suspension et on homogénéise. Après 35 avoir tué les bactéries, on soumet la suspension du virus pendant 15 minutes à une centrifugation de 1000 g. On sépare par q décantation le liquide surnageant qui contient par ml 1 x 10 pfu ("plaque forming units") de virus de vaccine et on le mélange avec un même volume d'une solution à 10 % de peptone 40 et on lyophilise le produit. 71 15278 5 2121491 b) On procède à la lyophilisation par exemple dans deB flacons à plasma de 500 ml, dans lesquels se trouvent des billes en acier inoxydable d'un diamètre compris entre 4 et 16 mm* 5 On refroidit préalablement les flacons à -70°C, ensuite on met dans chacun 100 ml du mélange de peptone et de suspension de virus et on congèle à -70°Go Conditions de séchage : Température ambiante : -50°C à 0°C _p 10 Pression : 5 ^ 10 mm de mercure, Durée : 24 heures Séchage ultérieur : de 0°C à + 30°C Pression : 2 x 10"^ mm de mercure Durée : 20 heures. 15 II faut protéger le lyophilisât contre l'action de l'oxygène ou de l'humidité jusqu'à l'incorporation des virus dans l'huile de silicone, par exemple par un gaz de protection. c) Kise en dispersion gO Dans chacun des flacons on introduit par injection à travers les bouchons en caoutchouc 25 ml d'une huile de silicone volatile (Dow Corning 200) de 0,65 CoSt» (Centistokes). On soumet les flacons sur un chariot à 25 rouleaux pendant 3 heures à un mouvement rotatif, afin de moudre finement le lyophilisât et de le disperser dans l'huile de silicone. On ajoute maintenant 200 ml d'un mélange d'une huile de silicone très visqueux (Dow Corning 200) de 30 60.000 c.St. et d'une huile de silicone à faible viscosité de 0,65 c.St. et on fait tourner les flacons encore pendant 6 heures. On vide les flacons, on sépare la dispersion des billes en acier et on la purge avec de l'azote a-35 fin d'évaporer l'huile de silicone volatile de 0,65 c.St.-et, après ce traitement la dispersion de' vaccin contre la variole présente la consistance d'une pommade qui ne changera que très faiblement dans un intervalle de températures assez large» On obtient par ce procédé une répartition 40 extrêmement homogène des virus de la variole, cë qui est une 71 15228 6 2121491 10 15 20 25 condition pour l'activité du vaccin en cas d'application directe par scarification. La détermination de la variation du titre montre que le vaccin contre la variole ainsi obtenu est aussi stable que le vaccin lyophilisé pur. d) Résultats du contrôle de stabilité Variation du titre pendant la conservation à 57°C durant 4 semaines. Titrage sur membrane Ghorio allan-tois (CAH) Pour pouvoir titrer le vaccin sous forme de pommade sur CAM, il faut une suspension aqueuse quantitative du virus. On dilue la pommade d'abord avec de l'huile de silicone de faible viscosité et ensuite on secoue vigoureusement cette dilution en présence du produit tampon selon Hc Ilvain (0,04 M). Après séparation des deux phases, on dilue encore la phase aqueuse contenant le virus et on le soumet au contrôle. Vaccin Titre valeur de départ Valeur terminale Variation logarithmique du titre Pommade de vaccin contre la variole selon l'invention directement applicable Vaccin lyophilisé (sec) à rehydrater avant l'utilisation Vaccin (liquide) officiellement contrôlé du commerce 2,4xl08pfu/gj 4, 9xl07 0,68 pfu/g 4,5xl08pfu/ml 9,0xl07 0,70 pfu/ml l,0xl08pfu/mL l,0xl02 6,0 pfu/mL 30 35 Le tableau montre qu'on peut conserver le vaccin selon l'invention aussi bien que le vaccin sec lyophilisé, tandis que le vaccin liquide présente dans les mêmes conditions une baisse de titre d'une valeur log. 6, ce qui correspond selon les normes de l'Organisation Mondiale de Santé à une perte d'activité complète. e) Vaccination contre la variole I. Essai sur le lapin 40 des dilutions de 10' "~1 On emploie la pommade sans diluer et dans 10' -2 10 -3 et 10' —4- On prépare les 71 1S ? ? 8 2121491 dilutions avec une huile de silicone de faible viscosité. Mode opératoire : 2 On scarifie des surfaces de 5 cm sur la peau des lapins et on vaccine chaque fois avec 100 mg des di-5 lutions indiquées ci-dessus. On évalue l'effet après 5 jours. Résultats î Dans les cas où on utilise de la pommade non diluée et des dilutions jusqu'à 10~^, on observe une formation de pustules qui se confondent. En cas d'emploi de la /| 10 dilution 10 , on obtient une seule pustule. II. Essai sur l'homme On dépose la pommade antivariolique obtenue selon l'exemple précédent, après la scarification habituelle de la peau, sous forme de particules grosses comme une poin-15 te d'aiguille, sur l'endroit scarifié. Le vaccin adhère bien et ne s'écoule pas. Le résultat de la vaccination correspond au minimum au résultat obtenu avec les vaccins habituellement utilisés. Les résultats de la vaccination avec le 20 vaccin selon l'invention sont au moins équivalents aux résultats que l'on obtient dans les conditions comparables optimales après vaccination habituelle avec le vaccin lyophilisé re- . hydraté. 71 15228 8 2121491 REVENDICATIONS 1. Vaccin antivariolique directement applicable, exempt d'eau, approprié à l'application par un procédé transcutané, de préférence par scarification, carac- 5 térisé par le fait qu'il est composé d'une dispersion sous forme de pommade ayant un caractère adhésif, de virus de vaccine et une huile de silicone visqueuse ou une pâte de silicone. 2. Vaccin antivariolique sous forme de 10 pommade selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est composé d'une dispersion de virus de vaccine et d'huile de silicone, la viscosité de l'huile de silicone à 20° étant comprise entre 30-000 et 100.000, de préférence entre 50.000 et 80.000 Centistokes. 15 3. Procédé de préparation d'un vaccin contre la variole directement applicable, sous forme de pommade et exempt d'eau, caractérisé par le fait que l'on a-joute d'abord au virus de vaccine lyophilisé de manière connue, une huile de silicone de faible viscosité, et très vo-20 latile, puis on broyé très finement le mélange et on le met en dispersion, et ensuite on ajoute une huile de silicone visqueuse, de préférence d'une viscosité très élevée, celle-ci étant comprise entre 30.000 et 100.000, de préférence entre 50.000 et 80.000 Centistokes, ou bien une pâte de si-25 licone, on continue la mise en dispersion et finalement, on élimine la fraction d'huile de silicone très volatile en faisant passer un gaz inerte dans la dispersion. Utilisation d'un vaccin contre la variole sous forme de pommade contenant une silicone et 30 exempt d'eau, pour l'application directe par voie trans--cutanée. 5. Vaccination contre la variole, par scarification, caractérisée par le fait qu'on utilise un vaccin contre la variole contenant de la silicone, sous forme 35 de pommade et exempt d'eau» BAD ORIGINAL