Brevet FR2124298A1 — publié le 19720922

i 2124298 La présente invention a pour objet la préparation,d'une part, d'antigènes th.ymi.ques pouvant être conservés pendant des périodes prolongées, d'autre part, de sérums et de gamma-globulines antithymocytaires, spécifiques d'une espèce animale,, par injection des antigènes thymiques de 5 cette espèce à toute espèce animale hétérologue. las antigènes thymiques et les sérums à? gamma-globulines antithyraocytaires préparés selon l'invention présentent des applications très intéressantes en médecines humaine et vétérinaire (antigénothérapie et séro- ou globulino-thérapie). 10 La préparation et le titrage des sérums, et des gamma-globulines antilymphccytaires demandent un temps très long et se heurtent à de grandes difficultés techniques : leur prix de revient est très élevé. Cependant, leur intérêt dans le domaine expéiLmental est considérable et l'étude de leurs propriétés doit permettre de développer leurs applications en médecine vété-15 linaLri ; thérapeutique immuno-dépressivs- dans certaines maladies autc-immunes et en médecine humaine. Des gamma-globulines antilymphocytaires spécifiques d'une espèce peuvent être obtenues par injection de lymphocytes de cette espèce à toute espèce hétérologue, On a maintenant trouvé que des gamma-globulines 20 antithymocytaires,ayant una activité antilymphocytaire, peuvent être obtenues de façon plus rapide et moins coûteuse en utilisant comme matière première antigène,non pas comme habituellement les lymphocytes, mais les thymocytes provenant du thymus et, de plus, chez les oiseaux, les cellules de la bourse de Fabricius. 25 L'invention a pour objet un procédé de préparation d'antigènes thymiques, constitués essentiellement de thymocytes, et qui peuvent être conservés par congélation pendant des périodes prolongées avant d'être décongelés et utilisés pour les injections. L'invention a également pour objet un procédé de préparation 30 de sérum antithymocytatre spécifique d'une espèce animale, par injection des antigènes thymiques de cette espèce, obtenus selon l'invention, à toute espèce animale hétérologue, récolte du sérum chez les animaux ainsi immunisés, et purification de celui-ci. Préparation des antigênes thymiques. 35 Le procédé de préparation d'antigènes thymiques selon l'inven tion consiste tout d'abord, après décapsulation, dégraissage, exsanguination et lavage d'un thymus prélevé sur un animal d'une espèce donnée, à libérer les 72 02948 2 2124298 thymocytes et à les séparer des autres cellules du thymus par dilacération des tissus en eau physiologique tamponnée (pH = 7,2) soit à l'aide de petites pinces recourbées, soit en dissociant directement l'organe par frotteuînt sur un premier tamis, et par filtration de la suspension obtenue, dans le 5 premier cas sur couches de gaze, dans le second cas, sur une série de tamis de plus en plus fins. On utilise, par exemple, successivement deux tamis en acier inoxydable dont le diamètre d'ouverture de mailles est, pour le premier, de 0,80 mm et, pour le second, de 0,063 mm. Selon la taille du thymus, on peut utiliser l'une ou l'autre des deux opérations (dilacération par petites 10 pinces ou sur tamis). Par exemple, pour les thymus de poulain, de veau, de pore, on utilise de préférence les tamis et accessoirement les petites pinces; pour les thymus de chien, on utilise de préférence les petites pinces. La dilacération par les petites pinces libère presque exclusivement les cellules de la zone médullaire; les tamis libèrent en plus grand 15 nombre les cellules de la zone corticale, et aussi bien les cellules libres dans l'épithélium que celles qui y sont attachées. L'utilisation des tamis permet donc l'obtention d'un rendement plus grand en thymocytes. Dans le cas où l'on utilise seulement la dilacération par les petites pinces (chez le chien par exemple) on filtre ensuite la suspension 20 cellulaire obtenue sur sept couches de gaze hydrophile. Le passage sur les tamis, ou filtres, élimine une substance muqueuse, cause d'une agglutination ultérieure des cellules au cours des lavages. Après centrifugation du filtrat ainsi obtenu, on remet en suspension le culot contenant les thymocytes, dans l'eau physiologique tamponnée, 25 et on réalise la lyse des hématies par du chlorure d'ammonium (s'il s'agit d'hématies de poulain ou de veau) et par de l'eau distillée (pour les hématies de chiens ou de porcs). On effectue ensuite deux lavages successifs en eau physiologique tamponnée (le volume de solution étant neuf fois plus grand que celui du culot primitif) avec double centrifugation,ce qui permet d'éliminer 30 les agglutinats de cellules thymiques qui auraient pu se produire. On procède à la numération des thymocytes dans la suspension obtenue, en utilisant la cellule de Malassez. ou de Thomas. Un frottis permet également de vérifier l'absence de contaminants cellulaires importants (notamment pour le thymus de veau, l'absence de cellules éosinophiles). La 8 35 suspension est alors ajustée à 1,5 x 10 cellules par ml et répartie en flacons 9 de 1 à 5 ml à raison de 1 à 3 x 10 cellules par flacon. Le procédé selon l'invention permet de conserver les antigènes thymiques obtenus,comme décrit ci-dessus, par congélation pendant de longues 72 02948 3 2124298 périodes, avant de les décongeler et de les utiliser pour les injections. La conservation des thymocytes dans ces préparations dépend essentiellement de deux facteurs critiques: - la préparation d'antigènes thymiques doit être congelée et 5 maintenue à une température de -20®C à-40cC; elle est conservée de préférence au congélateur à -30°C. - la décongélation doit être effectuée rapidement (1/2 à 1 h à 30-32°C)et accompagnée d'une dissociation par agitation sur billes sphériques en un matériau quelconque, verre ou matière plastique par exemple, d'un 10 diamètre moyen de 5 à 8 ram Si l'on emploie, à la place des billes sphériques, un agitateur mécanique à griffes ou à ailettes, le nombre de thymocytes dans la préparation après décongélation est égal à la moitié de celui que l'on obtient en utilisant des billes pour l'agitation. Production de sérum antithymocytaire. 15 Pour la production de sérum antithymocytaire selon l'invention, les antigènes thymiques, ainsi décongelés au moment de l'emploi, sont injectés à des animaux producteurs appartenant à une espèce différente de celle dont proviennent les antigènes thymiques. Avant toute immunisation, les sérums des futurs animaux 20 producteurs sont éprouvés pour vérifier l'absence de cytotoxicité propre éventuelle vis-à-vis des lymphocytes humains appartenant aux trois groupes sanguins (A, AB, 0) et vis-à-vis des thymocytes de l'espèce donatrice d'antigène. Ces épreuves sont effectuées par la méthode classique de Térasaki ou par la méthode d'Engelfriet modifiée (Cytotoxic antibodies âgainst leucocytes in 25 histocompatibility testing, 1965, p. 245, 250 Munksgaard, Copenhague). La suspension de thymocytes obtenue après décongélation est injectée aux animaux producteurs (dont le sérum a donné des résultats négatifs dans les épreuves indiquées ci-dessus), en volume variant avec le nombre de thymocytes préalablement déterminé dans la suspension. 30 De façon générale, on effectue deux injections par voie intra- 9 dermique, d'un volume de suspension contenant de 1 à 3 x 10 thymocytes dans un volume égal d'un adjuvant d'immunité, teL que l'adjuvant de Freund, les deux injections étant séparées par un intervalle de quinze jours. Les injections suivantes sont effectuées chaque semaine par voie intramusculaire, avec la 35 même quantité de cellules, mais sans addition d'adjuvant de Freund. Ces injections hebdomadaires sont poursuivies jusqu'à ce que le sérum des animaux immunisés présente un titre cytotoxique convenable, c'est-à-dire supérieur ou égal à 1/8000 (déterminé par la méthode d'Engelfriet 72 02948 4 2124298 avec un complément de lapin pur, non absorbé). Si le sérum est utilisé immédiatement, c'est-à-dire s'il n'est pas congelé pour la conservation, on le décomplémente par chauffage. Le procédé de préparation du sérum antilymphocytaire selon 5 l'invention est caractérisé essentiellement, d'une part,en ce qu'on contrôle le sérum prélevé sur les animaux producteurs en cours d'immunisation, afin de déceler notamment la présence éventuelle de complexes antigène—anticorps circulants, solubles, et, d'autre part, en ce qu'on purifie le sérum recueilli en fin d'immunisation afin de supprimer simultanément les anticorps antisérum, 10 les anticorps antisystème d'histocompatibilité et les hémaglutinines. Contrôle du sérum en cours d'immunisation. Après chaque injection hebdomadaire, on effectue trois contrôles sur le sérum prélevé de l'animal producteur. Dans un premier temps, on décèle la présence éventuelle de 15 complexes antigène-anticorps circulants solubles par la technique d'immuno-diffusion sur gélose dans un tampon au borate, de la façon suivante : Dans une boite de Pétri, on coule une première couche de gélose dissoute à raison de 2% dans un tampon au borate (pH 8,6) puis après refroidissement, on coule une deuxième couche de gélose à 1% dans le même tampon au 20 borate. Après avoir laissé reprendre en masse pendant 2 h environ, on effectue à 1'emporte-pièces des trous de 0,6 cm de diamètre séparés par un centimètre, dans la gélose, mais en veillant à ne transpercer que la première couche de gélose et à laisser la seconde intacte. On obtient ainsi un certain nombre de cupules et, dans chacune, on dépose le même volume (50 ^ul) de divers échan-25 tillons de sérum d'un même animal,prélevés à intervalles de temps réguliers, par exemple tous les sept jours. La plaque ainsi préparée est conservée à la température du laboratoire en atmosphère humide, environ 5 j, pendant lesquels s'effectue la diffusion d'un échantillon de sérum vers l'autre. 30 Après lavage par immersion pendant 3 j dans une solution physio logique que l'on change matin et soir, lavage qui élimine l'excès de protéines n'ayant pas réagi, la plaque est séchée complètement à l'aide de papier filtre appliqué sur la gélose. Quand la pellicule de gélose est bien sèche, on la lave à l'eau courante jusqu'à ce qu'elle devienne transparente et on la sèche 35 quelques instants avant d'examiner la plaque"; Cet examen est effectué à des intervalles de 24 h afin de déceler l'apparition éventuelle d'un précipité,que l'on peut reconnaître comme étant un précipité de protéines par coloration, par exemple à 1'amidoschwartz. L'apparition de ce précipité dénote la présence de complexes antigène—anticorps. 72 02948 5 2124298 Si, dans l'un des échantillons de sérum prélevé après une" injection, on décèle la présence de complexes antigène—anticorps circulants solubles, on surseoit pendant deux semaines à l'injection immunisante suivante. En l'absence de complexes antigène-anticorps, le contrôle du 5 sérum en cours d'immunisation comprend, dans un deuxième temps, la détermination du titre cytotoxique. Celle-ci est effectuée par la microméthode de Terasaki ou par la macrométhode d'Engelfriet, vis-à-vis des thymocytes de l'espèce animale donneuse d'antigène (ou des lymphocytes périphériques). Dans un troisième temps, on détermine la richesse en anticorps 10 antimembrane de thymocytes par la méthode d'immunofluorescence, après contre-coloration au bleu d'Evans. Cette méthode est effectuée : - soit sur calques minces et peu étendus d'un lobule thymique (2 calques par lame); - soit sur suspension de thymocytes fixée (4000 à 5000 thymo-15 cytes par^ul) à raison d'un dépôt de 2^u 1 à 20 jal suivant les cas (3 dépôts par lame). Les lames sont séchées soigneusement au ventilateur, à la température ambiante, ou à +4°C, puis sont conservées au congélateur à -20°C. Au sortir du congélateur, les lames sont séchées de nouveau après une heure à 20 la température ambiante, puis lavées 15 mn en eau physiologique tamponnée à pH 7,2-7,4 spéciale pour immunofluorescence (fournie par l'Institut Pasteur). On essuie le contour des calques au papier buvard, puis on dépose sur les lames une goutte (50^ul) de sérum antithymocytaire pur ou dilué, à l'aide d'une micropipette d'Eppendorf, . 25 On laisse en contact 30 mn : - à la température du laboratoire s'il s'agit de calques d'organes; - à 37°C en atmosphère humide s'il s'agit de suspensions de thymocytes. Après lavages en eau physiologique tamponnée et séchage, on dépose sur les lames une goutte (5^ul) de conjugué fluorescent dilué généra-30 lement au 1/30 en eau physiologique tamponnée. Après avoir laissé en contact 30 mn, on immerge les plaques dans une solution de bleu d'Evans à 0,1% dans l'eau distillée, pendant 5 mn; puis on les lave dans un tampon au phosphate, les essuie et les monte entre lames minces pour ultramicroscopie. On observe ensuite les préparations ainsi obtenues au micros-35 cope à fluorescence avec un condensateur contraste de phases-fluorescence associés, au fort grossissement ou en fond noir avec un fort objectif à diaphragme iris. 72 02948 6 2124298 - S'il s'agit de calques, ceux-ci ont un aspect en filet au faible grossissement qui, au fort grossissement,se révèle membranaire et cyto-plasmique; la densité de ce réseau est fonction de la richesse en anticorps antimembrane de thymocytes. 5 - S'il s'agit d'une suspension de thymocytes, un certain nombre de cellules présentent un anneau fluorescent. On détermine le pourcentage du nombre de ces cellules par référence à un sérum étalon. Purification du sérum antithymocytaire. Le procédé de préparation de sérum antithymocytaire comprend, 10 après la récolte du sérum des animaux immunisés quand celui-ci atteint un titre cytotoxique supérieur à 1/8000, une étape de purification de ce sérum qui permet d'éliminer simultanément les anticorps antisérum, les anticorps antisystème d'bistocompatibilité tissulaire et les hémaglutinines homologues et hétérologues. 15 Cette purification est effectuée en particulier selon l'invention par absorption du sérum antithymocytaire sur un polymère formé avec le gluta-raldéhyde par les protéines de sérum et de foie du (ou des) sujet(s) donneur(s) d'antigène. On prépare ce polymère soit de préférence avec le foie et le sérum de l'animal donneur de thymus, soit avec le foie d'un animal de l'espèce 20 donneuse et un pool de sérums d'animaux de la même espèce contenant les substances solubles qui auraient pu provoquer la formation d'anticorps hémag-glutinants. Par exemple, les antigènes d'un thymus de veau souillé par du sérum contenant des substances J et 0, injectés à un mouton r, peuvent avoir 25 provoqué la formation d'anticorps anti-A et anti-H humains. Dans ce cas, on utilisera un pool de sérums contenant les substances J et 0. On donne ci-dessous, à titre d'exemple, le mode de préparation de ce polymère à partir de foie et de sérum de porc. (Le polymère peut également être préparé de la rnSme façon que décrite ci-dessous à partir de foie et de 30 sérum de veau). Le foie, prélevé de préférence sur le porc donneur de thymus, est décapsulé, débarrassé des nerfs et des vaisseaux sanguins, coupé en petits dés et lavé plusieurs fois en eau physiologique tamponnée (tampon au phosphate à pH 7,4). On pèse le tissu obtenu et, à un volume de tissu, on ajoute deux 35 volumes d'eau physiologique tamponnée. On broie le mélange obtenu avec un appareil du type Turax pendant deux minutes dans la glace fondante (+4°C) et on centrifuge 10 mn, avec une accélération de 4.000 g. On dialyse le surnageant obtenu, à t4cC, contre de l'eau physiologique tamponnée, pendant une nuit. 72 02948 7 2124298 Le sérum du porc donneur de thymus ou un pool de sérums de porcs contenant la substance A (ou contenant les substances J et 0 dans le cas de sérums de veaux) est dialysé une nuit, à +4°C, contre de l'eau physiologique. 5 On détermine alors par la méthode du biuret la quantité de protéines contenues dans les solutions de foie et de sérum, obtenues après dialyse. Puis on mélange ces solutions de protéines de foie et de sérum et on y ajoute du glutaraldéhyde à 25% (vendu sous le nom de Glutaraldèhyde Practical par Eastman Kodak) dilué 5 fois, à raison de 1 partie en poids de 10 cette solution à 5% de glutaraldéhyde pour 10 parties en poids de protéines totales de sérum et de foie. Il faut déposer goutte à goutte le glutaraldéhyde sur la solution de protéines en agitant, puis laisser au repos trois heures à la température ambiante; un gel se forme alors en 10 à 30 mn. On disperse le gel obtenu dans 100 ml de tampon au phosphate 15 (pH 7,4); on le fait passer à travers une seringue équipée d'une aiguille de 1,2 à 1,5 mm de diamètre, puis on effectue trois centrifugations de dix minutes avec une accélération de 1500 g,en dispersant le gel dans 50 ml de tampon au phosphate entre la première et la deuxième centrifugation, et dans 50 ml de tampon HCl-glycine (pH 2,2 à 2,8) entre la deuxième et la troisième centri-20 fugation. Après neutralisation du gel par dispersion dans 10 ml de K^HPO^, 1M, et addition d'eau distillée, on effectue trois nouvelles centrifugations en reprenant chaque fois le gel centrifugé dans 50 ml d'eau physiologique tamponnée. A ce stade, le polymère peut être conservé dans de l'eau physiologique tamponnée, à +4°C. 25 Le procédé de purification du sérum antithymocytaire selon l'invention comprend donc l'absorption du sérum récolté chez les animaux donneurs, sur le polymère formé par le glutaraldéhyde et les protéines de sérum et de foie, préparé comme indiqué ci-dessus. Après centrifugation du polymère pour éliminer l'eau physiolo-30 gique dans laquelle il était conservé, on reprend le culot de centrifugation par le sérum à purifier. On agite 1 h environ à la température ambiante et on centrifuge 10 mn avec une accélération de 1500 g pour éliminer le polymère et recueillir, d'autre part, le sérum purifié. Le sérum ainsi purifié subit une série de contrôle pour 35 vérifier : - l'absence d'hémagglutinines : - par hémagglutination selon la technique du Dr Eyquem pour les globules rouges humains, équins et canins; 72 02948 8 2124298 - par la méthode de Dudok, de Wit et col. (J. Small animal practice, 1967, _1, n° 5, p. 287) pour les globules rouges canins; - par la technique d'hémolyse pour les globules rouges de bovins; - l'absence d'anticorps antisérum de l'espèce donneuse 5 d'antigène par immunodiffusion vis-à-vis du sérum normal de cette espèce; - l'activité antiplaquettaire; - le titre en anticorps antimembrane de thymocytes par la méthode d'immuno-fluorescence décrite ci-dessus : - sur calque de thymus : on voit disparaître, après purification du sérum, 10 une partie de la fluorescence membranaire; - sur suspension de thymocytes : on détermine le pourcentage de cellules ayant un anneau fluorescent; - sur coupe de foie et de rein, ou sur suspension cellulaire de ces organes : on doit noter l'absence d'immunofluorescence épithéliale (absence d'anticorps 15 antifoie et antirein). par électrophorèse sur acétate de cellulose, du sérum brut et du sérum purifié : il doit rester le pic des immunoglobulines G (et des immunoglobulines A chez le cheval). Préparation des globulines antithymocytaires. 20 La préparation des gamma-globulines à partir du sérum anti thymocytaire purifié et contrôlé, s'effectue selon la série d'opérations habituelles. On précipite d'abord les globulines par le sulfate d'ammonium; on utilise de préférence une solution à 40% de sulfate pour les deux espèces 25 productrices équine et ovine, et une solution à 33%. pour l'espèce productrice chevaline. (Pour le mouton, le lactate d'éthacridine permet de séparer les immunoglobulines G). On filtre sur papier le précipité obtenu et on effectue une dialyse à +4°C, d'abord contre de l'eau ordinaire pendant 3 j, puis contre de 30 l'eau salée à 3 °/00, pendant 3 j supplémentaires pour éliminer le précipité. Après centrifugation, on contrôle le produit obtenu par électrophorèse et immunoélectrophorèse et on dose les protéines par le biuret pour établir le rapport entre le titre cytotoxique et la quantité de protéines. On ajuste le titre final de façon que la quantité de protéines soit inférieure 35 ou égale à 8% (5,22% en moyenne). On opère enfin une double filtration stérilisante sur filtres Seitz C 10 et Seitz EK S^, sous air comprimé et sous rayons ultraviolets. 72 02948 9 2124298 La conservation du sérum purifié peut être effectuée soit en glycocolle à +4°C, soit par lyophilisation, soit par congélation à -30°C. Ces deux dernières méthodes conviennent seules pour la conservation des gamma-globulines. 5 Un autre objet de l'invention concerne les applications en médecine humaine et en médecine vétérinaire, d'une part des préparations antigènes de thymocytes animaux, et d'autre part ries sérums ou des gammaglobulines antithymocytaires. spécifiques d'une espèce animale. On a maintenant constaté qje les sérums et les globulines 10 antithymocytaires, spécifiques d'une espèce animale, exercent un effet cytotoxique sur les cellules sanguines blanches (lymphocytes, lymphoblastes, myelocytes, myeloblastes) de malades atteints de diverses formes et types de leucémies. Cet effet cytotoxique constitue une preuve de l'existence d'antigènes communs aux thymocytes animaux et aux cellules leucémiques. 15 On a trouvé d'autre part que, selon le caractère des leucémies, ces antigènes peuvent varier quant à leur spécificité vis-à-vis de l'espèce animale. Par exemple, certaines cellules leucémiques présentent des sensibilités qui les relient aux thymocytes de porcs, d'autres cellules leucémiques paraissent reliées aux thymocytes de veau, d'autres encore aux extraits 20 cellulaires et tissulaires de la bourse de Fabricius, d'autres enfin aux thymocytes de plusieurs espèces à la fois. On a, de plus.observé que certains sérums ou globulines antithymocytaires, spécifiques d'une espèce animale pouvaient, selon leur concentration en anticorps, selon leur nature et selon leur spécificité, exercer 25 également une activité cytotoxique sur les lymphocytes humains normaux. D'après ces constatations, la demanderesse a trouvé que les préparations antigènes de thymocytes animaux, les sérums et les gammaglobulines antithymocytaires spécifiques d'une espèce animale pouvaient avoir diverses applications. 30 Tout d'abord l'étude de la cytotoxicité vis-à-vis des cellules leucémiques de sérums antithymocytaires spécifiques de diverses espèces animales permet d'établir le diagnostic de l'antigène hétérospécifique "animal" de la cellule leucémique. Les sérums antithymocytaires animaux peuvent également être 35 utilisés comme immunodépresseurs et facteurs antirejet dans le domaine de greffes d'organes. Enfin, les sérums antithymocytaires sont utiles en médecine vétérinaire, notamment dans le traitement des maladies auto-immunitaires et des maladies inflammatoiresi à la dose injectable de 1 à 2 ml de sérum par 40 kilogramme de poids de l'animal. 72 02948 10' 2124298 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'antigènes thymocytaires animaux, pouvant être conservés pendant des périodes prolongées avant leur emploi, caractérisé par le fait que la suspension cellulaire obtenue de façon connue à partir de thymus, et de la bourse de Fabricius dans le cas des oiseaux, est 5 filtrée sur une série de tamis de plus en plus fins ou sur plusieurs couches de gaze, congelée à une température de -20 à -40°C et conservée à cette température, et qu'au moment de l'emploi elle est décongelée et dissociée par agitation sur billes sphériques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait 10 qu'on utilise des billes d'un diamètre de 5 à 8 mm. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le dernier tamis de la série utilisée a une ouverture de mailles d'un diamètre de 0,063 mm. 4. Procédé de préparation de sérum antithymocytaire spécifique 15 d'une espèce animale par injection d'antigènes thymocytaires de cette espèce à toute espèce animale hétérologue, caractérisé par le fait qu'on utilise pour les injections les antigènes préparés selon la revendication 1 et qu'on purifie le sérum récolté chez les animaux immunisés par absorption sur un polymère de glutaraldéhyde et de protéines du foie et du sérum de l'animal donneur d'anti-20 gène, ou de foies et de sérums d'animaux de la même espèce donneuse d'antigène, les sérums contenant les substances solubles quand celles-ci auraient pu provoquer la formation d'anticorps hémagglutinants. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le polymère de glutaraldéhyde et de protéines de sérum et de foie est préparé 25 en utilisant un poids de glutaraldéhyde égal au dixième du poids des protéines totales de foie et de sérum, déterminé après dialyse de la solution de protéines de foie contre de l'eau physiologique tamponnée à pH 7,4 et de la solution de protéines de sérum contre de l'eau physiologique. 6. Extraits antigènes thymocytaires préparés selon l'une des revendications 1 à 3. 7. Sérums antithymocytaires préparés selon l'une des revendications 4 et 5, et gamma-globulines préparées à partir de ceux-ci, utiles notamment en médecine vétérinaire dans le traitement des maladies anto-immunitaires et inflammatoires, et en médecine humaine dans le diagnostic de l'antigène hétérospécifique "animal" de la cellule leucémique, 35 caractérisés par le fait qu'on les prépare selon la revendication 4.