Brevet FR2118062A1 — publié le 19720728

La présente invention est relative à un nouvel antibiotique T-24146 et à son procédé de préparation. A la recherche de nouveaux antibiotiques, la demandresse a isolé divers microorganismes des sols dans de 5 nombreuses localités différentes pour examiner les antibiotiques qu'ils produisent.: La recherche ci-dessus a abouti à la constatation que certains micraorganismes produisent un nouvel antibiotique, que ces microorganismes appartiennent au genre Strep-tomyces, qu'en cultivant de tels microorganismes dans des milieux 10 appropriés, il est possible de leur faire accumuler ledit antibiotique dans le bouillon de culture et dans le mycélium et que l'antibiotique qu'ils produisent a une forte activité antitrichomonas et une faible toxicité. Ledit antibiotique a été appelé T-24146. 15 La présente invention a été réalisée sur la ba se des découvertes ci-dessus. Ainsi, la présente invention a pour objet un nouvel antibiotique T-24146 utile en médecine comme agent antitrichomonas. La présente invention a également pour objet un pro-20 cédé de préparation de l'antibiotique T-24146 nouveau et utile par culture microbienne. Pour la réalisation dudit objectif, on emploie les microorganismes appartenant au genre Strëptomyces et capables de produire l'antibiotique T-24146. Ces microorganismes compren-25 nent, par exemple, la souche numérotée T-24146 qui a été isolée à partir d'un échantillon de sol de Kyoto, Japon et peut etre utilisée très avantageusement dans la présenté invention. Les caractéristiques microbiologiques de cette souche sont les suivantes : 30 (l) Caractéristiques morphologiques : Les mycélia servant de substrat présentent une bonne ramification et leur diamètre est d'environ 0,8 micron. Ils ne forment pas de septum et ne se fragmentent pas par exemple en bacilles et cocci pendant la culture habituelle avec 35 aération et agitation. Les mycélia formant des spores présentent une ramification monopode. Ils forment des boucles ou des spirales ouvertes ou fermées à leur extrémité et constituent une longue chaîne de 10 conidies ou plus en cours de leur maturation. La 40 conidie a une surface présentant des aspérités lorsqu'on l'observe au microscope électronique et est ovale ou ellipsoïdale, 71 hk729 s '2118062 ses dimensions étant comprises entre Oj6 x 0,8 .et 0,7 x 1*2 micron. (2) Caractéristiques de culture :: Dans la> description suivante, les noms des couleurs désignés -par "Rdg." sont basés sur Ridgway's "Color Stan-5 dards and Color Nomenclature"- et les observations sont faites sur des cultures à 28°C pendant 14 jours sauf mention contraire. Les abréviations "G.", "R.", "SP" et "AM" signifient respectivement "croissance", "envers", "pigment aoluble" et "mycélium aérien1"'. 10 (a) Gélose de Czapek : G. : Modérée, formant des fissures au fond de la culture inclinée,, s'étalant uniformément brun jaunâtre à bleu verdâtre foncé. AM : Bon, blanc à vert bleuâtre (Rdg. XLII, 37"'-f). 15 R : Bleu ver.dêtrè (Rdg. XLII, 37,n-b) SP Néant.,. (b) Gélose de Czapek glucosée : G : Abondante, plissée au fonc| de la culture inclinée, brun jaunâtre. 20 ' AM : Abondant, blanc à bleu verdâtre (Rdg. XLII, 4l,M-b). R : Brun noirâtre à noir Chaetura (légèrement olive presque neutre) (Rdg. XLVI, 17"" -m). SP : Brun à brun pâle. 25 (c) Gélose de Czapek glycérinée : G : Modérée, plissée au fond de la culture inclinée, brune. AM : assez pauvre, pulvérulent, blanc à gris souris pâle (Rdg. LI, 15"m-d). 30 R : Gris-violet noirâtre (Rdg. LU, 59"'" -m) SP : Néant ou brun pâle. (d) Gélose glucosée à l'asparagine : G : Modérée, brun .pâle à vert brûnatre. AM : Modéré, pulvérulent, blanc à gris aurore 35 (Rdg. LU, 35"'" -d) R : Gris olive (Rdg. LI- 23""' -d) à vert brunâtre. SP : Brun verdâtre.: (e) Bouillon (bouillon nutritif) : G •: • En surface 40 AM : Blanc à brun pâle SP : Brun. 71 44729 3 2118062 (f) Gélose nutritive : G. : Modérée, étalée, mince, plissée au fond de la culture inclinée, brun pâle. AM : Modéré, pulvérulent, blanc à bleu verdâtre (Rdg. XLII, 4l'"-b) R. : Brun pâle à brun SP : Brun à brun foncé. Gélose nutritive glycérinée : G : Abondante, finement plissée sur toute la surface, brune. AM : Abondant, blanc à bleu verdâtre (Rdg. XLII 4l'"-b) R. : Brun à brun foncé. (h) Gélose nutritive glucosée : G et AM : Identiques à ceux de la gélose nutritive glucérinée . (i) Gélose à l'amidon : G ï Modérée, brun pâle AM : Modéré, pulvérulent, blanc à vert Gnaphalium (vert bleuâtre) (Rdg.XLVEI, 29""-d) R. : Brun pâle à gris olive (Rdg. LI, 23'"" -b) ou olive grisâtre (Rdg. XLVI, 21"") SP : Néant ou brun jaunâtre pâle (Rdg. XL, 13n,-d) (j) Oeuf entier : G. : Modérée, étalée sur toute la surface, brun foncé. AM : Modéré, pulvérulent, blanc. SP i Brun foncé. (k) Gélose à l'extrait de levure : G. : Bonne, plissée au fond, brun pâle AM : Abondant, blanc à gris Hathi (gris verdâtre) (Rdg. LII, 35"'" -b ) R. : Brun olive (Rdg. XL, 17'" -m) à brun jaunâtre (Rdg. XL, 17'" -i) SP : Brun. . (l) Tranche de pomme de terre : G. : Modérée, brune AM : Faible ou modéré, blanc SP : Brun noirâtre. 71 44729 4 2118062 (m) Tranche de carotte :. G. : Bonne, plissée, brun pâle AM : Abondant, blanc à gris Hathi (gris verdâtre) (Rdg. LU', 35"'" -b) 5 SP : Brun. (n) Lait tournesolé (37°C) G. : Circulaire, précipitée au fond dans la dernière phase de croissance, rapidement peptonisée, non coagulée, brun pâle, de-10 vient légèrement acide. (o) Gélatine (24°C) G. : Modérée, brune AM : Faible ou nul SP : brun,très faible liquéfaction 15 (p) Sérum de Loffier (37°C) : G. : Modérée, plissée AM : Modéré, blanc SP : Brun, légère liquéfaction (q) Cellulose : 20 G. : Néant ou très faible, incolore AM : Gris verdâtre, on n'observe pas de décomposition de la cellulose SP : Néant. (r) Gélose au malate de calcium : 25 G. : Modérée, mince, olive AM : Modéré, blanc à gris aurore (Rdg. LU, 35"'"_d) R. : Gris olive (Rdg.LI 23""' -b) SP : Brun verdâtre pâle. 30 (s) Gélose à la tyrosine : G. : Modérée, brune AM : Faible, blanc R. : Brun noirâtre SP : Brun noirâtre. 35 (t) Gélose peptonée : G. : Modérée, mince AM : Modéré, pulvérulent, brun clair (Rdg. LU 35'"" -d) R. : Brun à brun foncé 40 SP î Brun pâle. 71 44729 5 2118062 (3) Caractéristiques physiologiques : (a) pH optimum : Le pH de croissance est compris entre 4 et 10, le pH optimum est compris entre 7,0 et 8,0. (b) Température optimale : La température de croissance est com- (c) Aérobie (d) Hydrolyse de l'amidon : positive (domaine de croissance : 40 à 42 mm, domaine des enzymes : 18 à 23 mm) 10 (e) Réduction des nitrates (milieu de culture de Czapek et bouillon peptoné) : positive (f) Chromogénieité : positive (g) Réaction à la tyrosinase : positive (h) Décomposition de la cellulose : négative. 15 En particulier, lorsque la souche N° T-24146 est cultivée sur des milieux de culture synthétiques, les mycélia servant de substrat sont brun jaunâtre à brun verdâtre ou parfois, vert bleuâtre, sans ou avec production de pigments solubles brun pâle à brun. Les mycélia aériens sont blancs à vert 20 bleuâtre (Rdg. XLII 37'"-f) ou gris souris pâle (Rdg. LI, 15"'" -d). Lorsque la souche est cultivée sur des milieux de culture contenant des protéines, on observe la formation de pigments solubles brun pâle à brun. Par conséquent, ladite souche peut être placée dans le type chromogène. En outre, la sou-25 che donne des résultats positifs dans l'hydrolyse de l'amidon et la réduction des nitrates et provoque une forte peptonisa-tion du lait, mais une très faible liquéfaction de la gélatine. 30 sources de carbone par la souche, qui est observée par culture à 28°C pendant 10 jours, selon le procédé de Pridham et Gottlieb /Journal of Bacteriology, Vol. 59* P- 107 (1948F- 5 prise entre 20 et 45°C, la température optimale est comprise entre 30 et 37°C. Le tableau 1 suivant montre l'utilisation de 71 44729 6 2118062 , TABLEAU 1 Erythritol - + Sucrose ++ Adonitol + à ++ La.ctose /+++ D-sorbitol + Raffinose +++ i-inositol +++ Tréhalose +++ D-mannitol +++ Salicine ++ à +++ Dulcitol + Esculine + D-xylose +++ Inuline + L-arabinose + Acétate de sodium + L-sorbose + Succinate de sodium ++ D-galactose +++ Citrate de sodium ++ D-glucose +++ D-mannose +++ D-fructo&e +++ Amidon +++ Rhamnose +++ Glycérine +++ Mélibiose +++ Témoin + Maltose +++ 20 Nota : +++ Croissance abondante, ++ Bonne croissance, + Croissance modérée, + Croissance faible Croissance nulle. 25 Ainsi, les sources de carbone qui sont utilisa bles ou bien utilisées par le Streptomyces, souche n° T-24146 sont l'adonitol, le D-sorbitol, 1'i-inositol, le D-mannitol, le D-xylose, le L-arabinose, le D-galactose, le D-glucose, le D-fructose, le rhamnose, le mélibiose, le maltose, le sucrose, 30 le lactose, le raffinose, la trëhalose, la salicine, l'esculine, l'inuline, l'acétate de sodium, le citrate de sodium, le man-nose, l'amidon, la glycérine, etc. Les sources de carbone qui ne sont pratiquement pas utilisables ou pas utilisées du tout par ladite souche sont 1'érythritol, le dulcitol, le L-sorbose, 35 etc. En ce qui concerne les caractéristiques micro-tiologiques susmentionnées de la souche n° T-24146, la référence à la méthode de classification de Pridham et al /Applied Micro-biology vol. 6, p. 52 à 79, (1958)J suggère que la souche 40 n° T-24146 est classée dans les actinomycetes du type chromo 71 44729 7 2118062 gène appartenant à.un groupe bleu-spira, et la référence à Trejo, Bennett /""journal of Bacteriology, vol. 85, p. 676 à 690, (196317 suggère que la présente souche appartient à la série des viri-dochromogènes. 5 Les actinomycetes appartenant à cette série et formant des conidies ayant une surface présentant des aspérités comprennent Streptomyces viridochromogenes, S. cyaneus, S. chartreusis, S. curacoi. S, glaucescens, S. coerulescens, S. coeru-leorubidus, S. coeruloefuscus et S. bellus. 10 Cependant, Trejo et Bennett ont remarqué que les trois premiers microorganismes différents les uns des autres par la couleur de l'envers de leurs colonies, mais que Streptomyces curacoi et les microorganismes suivants indiqués ci-dessus ne peuvent pas être distingués les uns des autres d'un point de 15 vue taxonomique, bien qu'ils produisent des antibiotiques différents les uns des autres. En outre, la référence à "The Actinomycetes " /S.A. Waksman, vol. 2, page 152, (1961)7 et à Systimatik der Streptomyceten" /R. Htitter, S. Karger, A.G., (196?suggère 20 que la souche n° T-24146 est un microorganisme ressemblant à Streptomyces cyaneus, Streptomyces chartreusis et Streptomyces viridochromogenes. Cependant, Streptomyces cyaneus diffère de la présente souche par sa croissance sur cellulose, la liquéfac-25 tion de la gélatine, la réduction des nitrates, la couleur de l'envers des colonies, etc. La présente souche produit des pigments solubles d'un brun verdâtre sur gélose glucosée à l'aspara-gine et produit souvent des pigments solubles brun noirâtre et bruns respectivement sur des tranches de pommes de terre et sur 30 gélose nutritive. D'autre part, Streptomyces chartreusis produit des pigments solubles jaunes sur gélose glucosée à l'asparagine et ne produit pas de pigment soluble sur tranches de pommes de terre et gélose nutritive, et par conséquent cette espèce est différente de la présente souche. 35 De plus, les caractéristiques morphologiques et de culture de la présente souche-sont plutôt identiques à celles de Streptomyces viridochromogenes qui sont décrites dans les références bibliographiques. Ainsi, dans un but de comparaison, on cultive dans les mêmes conditions Streptomyces viridochro-40 mogenes Waksman et Henrici IFO 12337 (ATCC 13759) et la souche 71 44729 8 2118062 n° T-24146 de la présente invention, à la suite de quoi on constate qu'il n'y a pas de différence notable entre les deux souches sauf une légère différence dans la croissance et le mycélium aérien sur milieux synthétiquès. 5 Des constatations ci-dessus, on conclut que la souche n° T-24146 de la présente invention appartient taxonomique-ment à Streptomyces viridochromogenes. Cette souche n° T-24146 a été déposée à l'institute of Fermentation, Osaka, Japon, sous le n° matricule IPO 13188. 10 Tout comme les autres actinomycetes, tels que Streptomyces, les caractéristiques des souches appartenant à l'espèce Streptomyces viridochromogenes sont en général susceptibles de mutations, que la mutation soit causée spontanément ou artificiellement, par exemple avec des rayons X, des rayons ultra-15 violets, ou par action de composés chimiques mutagènes, tels que la moutarde à l'azote, la nitrosoguanidine ou les sels de métaux lourds. Dans le procédé de la présente invention, on peut employer l'un quelconque de ces mutants ou de leurs souches non cultivées à condition qu'ils produisent l'antibiotique T-24146. 20 Conformément à la présente invention, on cultive un microorganisme produisant l'antibiotique T-24146, appartenant au genre Streptomyces, tel que Streptomyces viridochromogenes n° 24146 ou ses mutants dans un milieu contenant des sources de carbone assimilables, des sources d'azote digestibles et d'autres 25 substances nutritives, te milieu de culture peut être liquide ou solide, mais le milieu liquide convient mieux. Comme sources de carbone, on utilise par exemple le glucose, le xylose, le galactose, le sucrose, la glycérine, l'inositol, le mannitol, la gelée de millet, la dextrine, l'ami-30 don, etc. Comme sources d'azote, on utilise par exemple la peptone, la farine de soja, la liqueur de trempage de maïs, l'extrait de viande, le son de riz, le son de blé, l'urée, des sels d'ammonium, et d'autres composés organiques ou minéraux contenant de l'azote. On peut incorporer dans le milieu d'autres substances, tels que 35 des sels minéraux comprenant par exemple le chlorure de sodium, les sels d'acide phosphorique, les sels de calcium, les sels de zinc, les sels de manganèse, les sels de fer et d'autres sels métalliques. On peut incorporer en outre dans le milieu, si on le désire, des huiles animales, végétales ou minérales, comme agent 40 anti-mousse. 71 44729 9 2118062 La culture des souches produisant T-24146 dans un milieu contenant ces substances nutritives peut être effectuée par une technique de culture en surface, mais elle est effectuée de préférence par culture submergée avec aération en utilisant 5 un milieu liquide. Lorsqu'on utilise par exemple Streptomyces viridochromogenes n° T 24146 comme souche productrice de T-24146, la durée de culture est avantageusement comprise entre 2 et 5 jours. Le milieu est maintenu à un pH d'environ 5 à. 9, de préférence environ neutre et la température de culture est 10 comprise entre environ 20 et 45°C de préférence entre environ 24 et 37°C. Pour récupérer l'antibiotique T-24146 produit dans le bouillon de culture et les mycélia, on utilise l'une des techniques habituelles employées pour la séparation et la 15 récupération de métabolites de microorganismes. Comme l'antibiotique T-24146 de la présente invention est une substance lipophile faiblement acide, la récupération peut être effectuée, en vertu de cette propriété, par des techniques variées. Ces techniques comprennent, par exemple 20 celle utilisant la différence de solubilité entre l'antibiotique et les impuretés, celle utilisant la différence d'affinité d'absorption, la technique de précipitation dans un solvant, celle utilisant la différence de coefficient de partage entre les différents solvants, etc. Ces techniques peuvent être utilisées 25 seules ou en combinaisons appropriées ou de façon répétée. L'antibiotique T-24146 obtenu est contenu dans la partie fluide du bouillon de culture et dans les mycélia. La fraction de l'antibiotique contenue dans le filtrat de culture augmente à mesure que la valeur du pH du bouillon de culture augmente et, au 30 contraire, la fraction de l'antibiotique contenue dans les mycélia augmente à mesure que la valeur du pH du bouillon de culture diminue. La récupération de l'antibiotique accumulé dans le filtrat de culture et les mycélia peut être effectuée avanta-35 geusement par l'un des procédés suivants: (l) en extrayant le bouillon de culture entier contenant les mycélia avec un solvant organique insoluble dans l'eau dans des conditions neutres ou faiblement acides /a pH 1 à 7, de préférence 2 à (2) en éliminant d'abord les mycélia dans des conditions faiblement acides 40 puis (a) en traitant le filtrat de culture ainsi obtenu avec un 71 44729 10 2118062 solvant organique insoluble dans l'eau dans les mêmes conditions que précédemment ou (b) en traitant les mycélia ainsi obtenus avec un solvant organique insoluble ou soluble dans l'eau dans des conditions acides ou neutres /a pH 1. à 7* de préférence 2 à 57, 5 et (3) en recueillant d'abord les mycélia dans des conditions acides /a pH 1 à 7* de préférence 2 à , et en extrayant les mycélia obtenus avec un solvant organique soluble ou insoluble dans l'eau dans les mêmes conditions acides que précédemment, puis en concentrant le. liquide extrait sous pression réduite et en ex-10 trayant finalement le produit résultant avec un solvant insoluble dans l'eau. Les solvants organiques insolubles dans l'eau pouvant être utilisés pour les extractions susmentionnées comprennent les esters d'acides tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate 15 de butyle, etc., les éthers tels que l'éther diéthylique, les hydrocarbures halogénés tels que le chloroforme, le dichlorométha-ne, etc., les hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène, etc., les alcools tels que le butanol, les cétones telles que la méthylisobutylcétone, etc., et les solvants organiques 20 hydrosolubles comprennent les cétones telles que l'acétone, les alcools tels que le méthanol, l'éthanol, etc. On lave le liquide extrait obtenu par l'un des procédés ci-dessus avec de l'acide dilué tel que de l'acide chlorhydrique dilué, de l'acide sulfuri-que dilué etc., pour éliminer les impuretés basiques puis on le lave avec une substance faiblement basique, telle qu'une solu- 25 tion de bicarbonate de sodium, une solution de bicarbonate de potassium, une solution aqueuse diluée d'ammoniac, etc., pour éliminer les autres impuretés. Puis on lave la couche de solvant organique avec de l'eau, on la deshydrate, on la concentre sous pression réduite à basse température et on ajoute au pro-30 duit résultant un solvant organique faiblement polaire tel que le n-hexane, le cyclohexane, l'essence minérale, l'éther de pétrole, etc., à la suite de quoi on obtient l'antibiotique T-24146, à l'état brut. On fait cristalliser l'antibiotique brut en 35 utilisant un solvant organique approprié. Par exemple, on dissout l'ingrédient actif dans une quantité appropriée de chloroforme ou d'acétate d'éthyle tandis qu'on élimine par filtration les impuretés insolubles dans ce solvant et on ajoute au produit résultant un solvant dans lequel la solubilité de l'ingrédient 40 actif est'faible, tel que le n-hexane, l'éther de pétrole, le 71 44729 ii 2118062 méthanol, etc., à la suite de quoi 1 'antibiotique T-24146 cristallise. On peut purifier l'antibiotique brut T-24146 également en utilisant un absorbant approprié. Comme absorbant, 5 on peut utiliser le gel de silice, l'alumine, le sephadex (Pharmacia, Suède, le Plorisil (silicate de magnésium activé, Floridin Co. E.U.A), etc. Ces absorbants sent avantageusement prétraités avec un acide approprié tel que l'acide oxalique ou l'acide 10 chlorhydrique, de façon à régler l'activité de l'absorbant à un degré approprié. Comme solvant éluant, on peut utiliser le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le benzène, le méthanol, etc., seuls ou en combinaison appropriée. L'absorbant peut être utilisé 15 dans une chroniatographie sur colonne habituelle ou dans une chro-matographie sur couche mince. L'antibiotique T-24146 ainsi obtenu présente géné ralement les caractéristiques suivantes : Propriétés physicochimiques de l'antibiotique T-24146 20 (1. Point de fusion : 168 à 173°C (décomposition) 2. Analyse élémentaire {%) : C : 71,16 à 72,63 ; H : 6,41 à 7,01 ; N 2,35 à 2,67 ; 0 : 17,11 à 18,48. 3. Poids moléculaire : 25 a) Procédé avec osmomètre à pression de vapeur : 535 ± 50 (dans l'acétate d'éthyle) b) Procédé par dosage : environ 550 /dans une solution diméthylsulfoxyde-eau (7:2)_7 4. Rotation spécifique : 30 Za_7^p = +872° + 800 (C = 0,5$ dans le chloroforme) 5. Spectre d'absorption UV : comme indiqué sur la figure 1 MpOH Amax* : environ 310 nyu, par exemple 310 + 2 nyu, plus particulièrement 309 à 310 nyu. E : 1779 à 2180 1 cm ''^ 6. Spectre d'absorption IR (dans KBr) comme indiqué sur la figure 2, /nombre d'ondes (cm-"'') et longueur d'onde (^u) en abeisses et transmission {%) en ordonnées_J7, les bandes d'absorption significatives 35 40 71 44729 2118062 principales en nombre d'ondes (cm 1) sont les suivantes: 3470, 3340, 3Ô00, 2910, 1650, 1610, 1510, 1450, 1385, 1300, 1250, 1218, 1175, 1325,1040, 987, 960. 7. Solubilité : 5 facilement soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthy le ; Soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'éther diéthylique, le benzène ; Difficilement soluble ou insoluble dans l'eau, le n-he-10 xane, l'éther de pétrole ; 8. Réactions colorées ; (a) Solution de permanganate de potassium:décolorée (b) réaction au chlorure ferrique : réaction positive (c) réaction de Dragendorff : positive 15 (d) réactif à la ninhydrine : réaction négative. 9. pKa /dans une solution diméthylsulfoxyde:eau (7;2)_7 : environ 9, par exemple 8,9 ± 0,4, plus particulièrement 8,7 à 9,1. 10^ Couleur : jaune pâle à blanc 20 11 : Chromatographie sur couche mince. (a) Solvant de développement : benzène:chloroformeméthanol (70:28:2). (b) Couche mince ï silicagel Spot Film (Tokyo Kasei, Co., Japon), immergé dans une solution à 5$ en poids 25 d'acide oxalique dans le méthanol, lavé avec du mé thanol et séché à température ambiante. (c) Procédé de détection : Bioautographie utilisant Bacillus subtilis (d) Valeur de Rf : 0,25 30 Propriétés biologiques 1. Spectre antimicrobien : Le spectre antimicrobien de T-24146 est examiné par la méthode de dilution de gélose. Les résultats sont Indiqués dans le tableau 2. 35 71 44729 13 -TABLEAU 2 2118062 5 10 15 20 25 30 35 Souche testée MIC Milieu T-24146 Métroni-dazole Tricho1-mycine Esherichia coli IFO -3044 > 100 1 Proteus vulgaris IF0-3045 > 100 1 Pseudomonas aeruginosa >100 1 IF0-3080 Staphylococcus aureus 209 P 0,5 à 1,0 > 250 >250 1 Baclllus subtilis PCI 219 0,05 - 250 1 Baclllus cereus IF0 3466 5 à 10 1 Baclllus brevis IF0 3331 2 à 5 1 Sarcina lutea IF0 3232 2 à 5 - 1 Micrococcus flavus 5 à 10 1 Mycobacterium IF0 3153 50 à 100 2 Mycobacterium smegmatis IFO 3083 50 2 Mycobacterium phlei IFO 3158 20 2 Mycobacterium sp,607 50 à 100 2 Mycobacterium bovis BC& 25 3 Pénicillium chryso-genum 20 à 50 >250 - 4 Saccharomyces cerevisiae >100 4 Candida albicans 50 >250 0,2 à 1,56 4 Aspergillus niger 100 >250 4 Trichophyton menta-grophytes 10 à 20 4 71 44729 14 2118062 10 15 20 25 30 3 4 x Nota : MIC : Concentration inhibitrice minimale Milieu 1 s Gélose nutritive, à' 37°C/ pendant 20 heures, ' . " 2 : Gélose nutritive glycérinée, à 37°C pendant 40 heures, Albumine de Kirohner X, à 37°C pendant 2 semaines, Gélose nutritive glucosée à 28°C pendant 48 heures. Albumine de kirchner dihydrogénophosphate de sodium dihydrogénophosphate de potassium sulfate de magnésium citrate de sodium acide L-aspartique glycérine sérum de cheval 2. Activité anti-protozoaire. L'activité anti-trichomonas est examinée par une méthode de dilution de milieu liquide. Le résultat est indiqué dans le tableau 3-1. Protozoaire témoin : Trichomonas vaginalis n° 4F en poids) 0,3 0,4 0,06 0,25 1,0 ' 2,0 . 10,0 Milieu : Milieu SYS' Milieu SYS L-cystéine chlorure de sodium glucose extrait de levure peptone sérum de cheval ajusté à pH 5,6, à 37°C, pendant 40 heures. ,xx . en poids 0,2 0,5 1,0 1,0 2,0 10,0 TABLEAU 3-1 35 Concentration mcg/ml 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 0,015 Degré d'inhibition de croissance - - - - ++ +++ 40 Nota - : inhibition de croissance complète, ++ : légère inhibition de croissance, 71 44729 15 2118062 +++ : croissance normale. La comparaison de l'activité anti-trichomonas de l'antibiotique T-24146 avec celle des autres substances présentant une activité anti-trichomonas est indiquée dans le tableau 3-2. TABLEAU 3-2 MIC (meg/ml) Substance Protozoaire : Trichomonasvaginalis n° 4F T -24146 0,062 à 0,125 Métronidazole 0,625 à 1,25 (0,2 à 0,3) * Trichomycine 2 à 3 (0,78 à 6,25) 10 15 20 30 Nota : x, ** : valeurs données dans la littérature, les s ouris ) toxiei diquée dans le tableau 4. 3. Toxicité aiguë (LD,_~ : dose léthale 50$ sur 50 La toxicité aiguë (LD^q sur les souris) est in- TABLEAU 4 (mg/kg) Méthode d'administration Substance T-24146 Métronidazole Trichomycine Administration orale >10.000 4.300 160 à 830 Injection hypodermique > 1.000 4. Comparaison avec les antibiotiques connus : L'antibiotique T-24146 de la présente invention est caractérisé par le fait qu'il présente une absorption significative à environ 310 nyu dans le spectre d'absorption UV, "et par conséquent on compare cet antibiotique avec les antibiotiques connus présentant une absorption significative aux environs de 310 m^u dans le spectre d'absorption UV. Les résultats sont indiqués dans le tableau 5- 71 44729 16 2118062 TABLEAU 5 Nom de l'anti-• biotique T-24146 Dénamycine Akitamycine Pérésimycine Point de fusion 168 à 173' °C (décomposition) 226 à 228 °C l80°C (décomposition 145°C + 872° + 80° + 41° +88° +695° Analyse élémentaire : ç 71,16 à 72,68 68,26 57,26 44,03 H 6, 41 à 7,01 8,71 7,68 8,31 N 2,35 à 2,67 0 1,64 8,5 6 Maximum d'absorption U.V. MeOH ^max 310 311 291, 304 319 309 E 1% 1 CI 1779 à n 2180 520 600, 700 640 278 Activité anti-protozoaire MIC : 0,062 mcg/ ml non indiquée MIC : 12,5 mcg/ml non indiquée 10 15 20 25 30 35 40 De la comparaison ci-dessus, on déduit que l'antibiotique T-24146 est un nouvel antibiotique. Comme indiqué dans les données susmentionnées, l'antibiotique T-24146 présente une activité antimicrobienne efficace à l'égard des microorganismes gram-positifs, en particulier à l'égard de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus et une activité antiprotozoaire efficace à l'égard de Trichomonas vaginalis. Ainsi, l'antibiotique T-24146 est utile pour le traitement des infections provoquées par Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ou Trichomonas vaginalis, telles que l'infection du vagin (colpitis trichomonadis) et la cystite (cystitis tri-chomonadis). L'antibiotique T-241.46 peut être utilisé oralement, parentéralement ou de façon externe sous une forme pharmaceutique appropriée, telle qu'une poudre, des comprimés, des comprimés vaginaux, des injections, des suppositoires, des ovules vaginaux ou des onguents, en mélange avec un excipient inerte 71 44729 17 2118062 pharmaceutiquement acceptable. Ainsi, des préparations utiles pour applications orales ou externes dans le cas d'infections dues aux microorganismes susmentionnés, sont, par exemple les suivantes : 5 (a) Comprimés pour administration orale : Prescription T-24146 50,0 g lactose 124,5 g amidon de mais. 60,0 g 10 amidon de maïs 12,0 g gélatine 3,0 g stéarate de magnésium 0,5 g total 250,0 g On mélange T-24146, le lactose et l'amidon de ^ maïs, on effectue une addition d'une pâte d'amidon de maïs et de gélatine, puis on mélange. Le mélange entier est soumis à un tamisage avec un tamis ayant des ouvertures de 3,68 mm et on sèche le produit obtenu à 40°C-sous vide. Les granulés obtenus sont soumis à un tamisage avec un tamis ayant des ouver- PO tures de 0,84 mm. On ajoute aux granulés obtenus du stéarate de magnésium et on transforme le mélange en un comprimé qui a un diamètre de 8,5 mm et un poids de 0,25 g. (b) Comprimé vaginal. Prescription 25 T-24146 50 g bicarbonate de sodium 235 g acide tartrique 180 g saponine 15 g méthylcellulose 8 g 30 (4000 c.p.s) huile grasse durcie 12 g 35 40 Total 500 g On mélange tous les constituants indiqués dans ladite prescription et on les soumet à un tamisage avec un tamis ayant des ouvertures de 0,25 mm. On transforme les granulés obtenus en un comprimé oval qui a un grand diamètre" de 16 mm, un petit diamètre de 8 mm et un poids de 0,5 g. La dose de l'antibiotique T-24146 à administrer varie avec les conditions des maladies, etc., et est généralement comprise entre 150 mg et 300 mg pour une administration 71 44729 18 2118062 orale, entre environ 100 mg et 200 mg pour une administration parenterale et entre environ 50 mg et 100 mg pour une administration externe pour un être humain adulte et par jour. La présente invention sera mieux c emprise à 5 l'aide des exemples suivants, dans lesquels les parties s'entendent en poids sauf mention contraire et la relation entre "parties" et "parties en volume" correspond à celle entre "grammes" et"millilitres". EXEMPLE 1 10 On introduit dans un récipient de culture ayant une capacité de 200 parties en volume, 40 parties en volume d'un milieu de culture .composé de : 15 20 25 30 {% en poids) Glucose o •i OJ amidon soluble 3,0 farine de soja 1,0 liqueur de trempage de maïs 1,0 peptone 0,5 chlorure de sodium 0,3 sulfate ferreux 0,05 carbonate de calcium 0,5 (pH 7,0) 35 On stérilise le récipient sous une pression de 1,5 atmosphère pendant 30 minutes. Après refroidissement, on inocule le milieu avec une anse de platine de mycélium de Streptomyces viridochromogenes n° T-24146 qui a été préalablement cultivé sur gélose glucosée à l'asparagine à28°C pendant 8 jours. Le récipient ainsi inoculé est incubé à 28°C pendant 72 heures, en utilisant un agitateur tournant à 220 t/mn. On filtre le bouillon de culture. Le filtrat ainsi obtenu peut inhiber complètement la croissance de Trichomonas vaginalis n° 4F, même si on le dilue 400 fois. EXEMPLE 2 On introduit dans un récipient de culture ayant une capacité de 200 parties en volume. 40 parties en volume d'un milieu de culture ensemencé composé de : 71 44729 2118062 ($ en poids) glucose 2,0 amidon soluble 3,0 farine de soja 1,0 5 liqueur de trempage de maïs 1,0 peptone 0,5 chlorure de sodium 0,3 carbonate de calcium 0,5 (pH 7,0) On stérilise le récipient sous une pression de 10 1,5 atmosphère pendant 15 minutes. Après refroidissement, on inocule le milieu avec une anse de platine de mycélium de Streptomyces viridochromogenes n° T-24146 qui a été préalablement cultivé sur gélose glucosée à l'asparagine à 28°C pendant 8 jours. Le récipient ainsi inoculé est incubé de la même 15 façon que dans l'exemple 1 à 28°C pendant 48 heures. On inocule le bouillon de culture en une quantité de 2,5$ dans 40 parties en volume du milieu de culture principal ayant la composition suivante, qu'on a préalablement introduit dans un récipient de culture ayant une capacité de 200 parties en volume et stéri-20 Usé : ($ en poids) glucose 2,0 glycérine 1,0 amidon soluble 2,0 25 farine de soja 1,0 liqueur de trempage de maïs 1,0 farine de coton 1,0 peptone 0,5 chlorure de sodium 0,3 30 carbonate de calcium 0,5 (pH 7,0) Le récipient ainsi inoculé est incubé à 28°C pendant 120 heures à l'aide d'un agitateur tournant à 220 t/mn. On récupère le bouillon de culture et on le filtre. Le filtrat peut inhiber complètement la croissance de 35 Trichomonas vaginalis n° 4F, même .è'il est dilué 800 à 1000 fois. EXEMPLE 3 On introduit dans un récipient de culture ayant une capacité de 10.000 parties en volume, 500 parties en volume du même milieu de culture ensemencé que dans l'exemple 2 et 40 on stérilise le récipient sous une pression de 1,5 atmosphère 71 44729 20 2118062 pendant 15 minutes. Après refroidissement, on inocule le milieu avec Streptomyces viridochromogenes n° T-24146 et on effectue la culture à l'aide d'un agitateur à va-et-vient à 28°C pendant 48 heures. On inocule'le bouillon de culture ainsi obtenu 5 en une quantité de 1,5$ dans 30.000 parties en volume du même milieu de culture principal que celui de l'exemple 2, qu'on a préalablement chargé dans un récipient de culture ayant une capacité de 50.000 parties en volume. Le récipient ainsi inoculé est incubé à 28°C pendant 90 heures à l'aide d'un agitateur tour-10 nant |à 280 t/mn avec une insufflation d'air de 100 litres par minute. On ajoute au bouillon de culture Hyflo Supercel (Johns Manville, E.U.A) puis on le filtre. On ajouté à 20.000 parties en volume du filtrat ainsi obtenu de l'acide chlorhydrique dilué pour ajuster le pH à une valeur de 4. On extrait ensuite le fil-15 trat avec 10.000 parties en volume d'acétate d'éthyle et avec 5000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On réunit les couches d'acétate d'éthyle et on les lave avec 3000 parties en volume d'une solution de bicarbonate de sodium à 2$ en poids, avec 2000 parties en volume d'une solution de bicarbonate de sodium 20 à 2% en poids et avec 5000 parties en volume d'eau, puis on les sèche sur du sulfate de sodium anhydre. On concentre la solution d'acétate d'éthyle sèche ainsi obtenue sous pression réduite et on ajoute au résidu de l'éther de pétrole, puis on filtre le mélange. On obtient 4 parties de poudre brute. 25 On dissout la poudre dans une petite quantité d'un mélange chloroforme:méthanol (20:1), on élimine les insolubles par filtration et on ajoute au filtrat du méthanol, à la suite de quoi on obtient une partie de poudre T-24146 cristallisée. La concentration inhibitrice minimale de cette poudre cris-30 tallisée à l'égard de Trichomonas vaginalis n° 4P est de 0,062 à 0,125 mcg/ml. EXEMPLE 4 On inocule un bouillon de culture ensemencé en utilisant le même milieu que dans l'exemple 2, dans les mêmes 35 conditions que dans ledit exemple,en une quantité de 1,5$ dans 30.000 parties en volume d'un milieu de culture principal ayant la composition suivante qu'on a préalablement chargé dans un récipient de culture ayant une capacité de 50=000 parties en volume. 71 44729 21 2118062 {% en poids) glucose 2,0 amidon soluble 3,0 farine de soja 1,0 5 liqueur de trempage de maïs 1,0 peptone 0,5 chlorure de sodium 0,3 carbonate de calcium 0,5 (pH 7,0) Le récipient ainsi inoculé est incubé à 28°C 10 pendant 24 heures, à l'aide d'un agitateur tournant à 280 t/mn avec une insufflation d'air de 100 litres par minute. On inocule 10.000 parties en volume du bouillon de culture résultant dans 100,000 parties en volume du même milieu que dans l'exemple 2 qu'on a préalablement chargé dans un récipient de culture ayant ^ une capacité de 200.000 parties en volume. Le récipient ainsi inoculé est incubé à 28°C pendant 90 heures à l'aide d'un agitateur tournant à 200 t/mn avec une insufflation d'air de 100 litres par minute. On récupère le bouillon de culture et on lui ajoute Hyflo Supercel, puis on le filtre. On ajoute à 70.000 parties en volume du filtrat résultant de l'acide chlorhydrique dilué pour ajuster le pH à une valeur de 4. On extrait le produit résultant avec 20.000 parties en volume d'acétate d'éthyle et avec 15.000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On réunit les couches d'acétate d'éthyle, on les lave deux fois avec chape; , ^ que fois 10.000 parties en volume d'eau et on les concentre à environ 2.000 parties en volume sous pression réduite. On lave le liquide concentré avec 1000 parties en volume d'une solution de bicarbonate de sodium à 5$ en poids et avec 500 parties en volume d'une solution de bicarbonate de sodium à 5$ en poids. On le lave avec de l'eau, puis on le sèche sur du sulfate de sodium anhydre. Après évaporation de l'acétate d'éthyle sous pression réduite, on lave le résidu avec de l'éther de pétrole pour obtenir 10 parties de poudre brute. On dissout la poudre dans une petite quantité d'acétate d'éthyle et on ajoute de l'éther de pétrole, puis on laisse reposer au froid. On obtient 3 parties de poudre cristallisée. La poudre cristallisée présente une concentration inhibitrice minimale de 0,062 à 0,125 mcg/ml à l'égard de Trichomonas vaginalis n° 4F. EXEMPLE 5 On ajoute Hyflo Supercel à environ 90.000 par30 71 44729 „ 22 2118062 ties en volume d'un bouillon de culture obtenu de la même façon que dans l'exemple 4, puis on filtre. A environ 70.000 parties en volume du filtrat on ajoute de l'acide chlorhydrique dilué et on extrait la solution, après avoir ajusté son pH à 2 avec 5 20.000 parties en volume d'acétate d'éthyle et avec 15.000 parties en volume d'acétate d'éthyle. D'autre part, on ajoute 5000 parties en volume d'eau et d'acide chlorhydrique dilué à environ 20.000 parties de mycélia contenant Hyflo Supercel et on extrait le mélange, 10 après avoir ajusté son pH à 2, avec 20.000 parties en volume d'acétate d'éthyle et avec 15.000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On réunit la totalité des extraits obtenus ci-dessus et on les lave avec 30.000 parties en volume d'une solution 15 aqueuse d'ammoniac diluée et avec 30.000 parties en volume d'eau, puis on concentre sous pression réduite. On ajoute au résidu du n-hexane et on le conserve au froid. On récupère le précipité résultant et on obtient 60 parties d'une poudre brute qui présente une concentration inhibitrice minimale de 0,125 mcg/ml à l'égard 20 de Trichomonas vaginalis n° 4F EXEMPLE 6 On ajoute Hyflo Supercel et de l'acide chlorhydrique dilué à environ 90.000 parties en volume d'un bouillon de culture obtenu de la même manière que dans l'exemple 4. 25 On ajuste le mélange à pH 2, on ajoute 70.000 parties en volume d'acétate d'éthyle, puis on agite pendant une heure. On filtre le produit résultant, on récupère la couche d'acétate d'éthyle du filtrat et on 3a lave avec 20.000 30 parties en volume d'une solution aqueuse d'ammoniac diluée, et 20.000 parties en volume d'eau, puis on élimine le solvant sous pression réduite. On ajoute au résidu du n-hexane et on le conserve au froid. On récupère les précipités résultants et on obtient 50 parties d'une poudre brute qui présente une concentration in-3e hibitrice minimale de 0,125 mcg/ml à l'égard de Trichomonas vaginalis n° 4F. EXEMPLE 7 On ajoute Hyflo Supercel et de l'acide sulfurique dilué à environ 90.000 parties en volume d'un bouillon de culture obtenu de la même façon que dans l'exemple 4. On ajuste le mélan-40 ge à pH 4. On l'agite pendant 30 minutes et on le filtre. On ajoute 50.000 parties en volume d'acétate d'éthyle contenant 1% en poids d'acide oxalique à environ 20.000 parties des mycélia ainsi obtenus qui contiennent Hyflo Supercel, on agite le mélange pendant 1' heure et on le filtre. On lave le filtrat avec 20.000 45 parties en volume d'une solution aqueuse d'ammoniac diluée et 20.000 parties én volume d'eau puis on le concentre sous pression réduite. On ajoute au résidu du n-hexane et on le garde au froid. On récupère -le précipité résultant et on obtient 70 parties d'une poudre brute' qui'"présente une concentration inhibitrice minima-50 le de Oj'vJSBÇj* 'raieg/foiri1 egerd dg-Trichomonas vaginalis n° 4F. 71 44729 23 2118.062 EXEMPLE 8 On dissout 10 parties de la poudre brute obtenue dans l'exemple 4 dans la partie inférieure d,'un système de- solvants-constitué de n-hexane et de méthanol (5*2). On lave la solution 5 3 fois avec chaque fois la même quantité de la fraction supérieure du système de solvants ci-dessus. On concentre la partie inférieure ainsi traitée sous pression réduite jusqu'à siccité et on obtient 9 parties de poudre-cristallisée. On ajoute du méthanol à la poudre cristallisée, puis on mélange, à la suite de 10 quoi on obtient 3 parties de cristaux bruts. Ces cristaux présentent une concentration inhibitrice minimale de 0,062 mcg/ml à l'égard de Trichomonas vaginalis N° 4F. EXEMPLE 9 On dissout une partie de la poudre cristallisée obtenue 15 dans l'exemple 3 dans 25 parties en volume d'un mélange chloroforme ?méthanol (20si) et on élimine les insolubles. La solution est utilisée comme solution échantillon.. D'autre part, on met en suspension 100 parties de gel de silice (fabriqué par Merck & Co., Allemagne de l'Ouest de dimensions comprises entre 0,044 et 0,21 20 mm) dans 200 parties en volume d'acétate d'éthyle contenant 1% en poids d'acide oxalique, puis on agite, et on filtre. On lave bien le produit résultant avec de l'acétate d'éthyle et on le sèche à température ambiante. On introduit le gel de silice ainsi imprégné dans une colonne pour effectuer une chromatographie sur 25 colonne à l'aide de chloroforme. On fait passer la solution échantillon ci-dessus sur la colonne, puis on effectue l'élution par écoulement continu d'un solvant, le solvant étant d'abord du chloroforme, et en dernier lieu un mélange chloroformes méthanol (9sl), tout en augmentant la quantité de méthanol de façon 30 continue. On recueille parmi les éluats-les fractions présentant ' une activité élevée à l'égard de Trichomonas et Bacillus subtilisj on les lave avec de l'eau, on les sèche et on les concentre sous pression réduite jusqu'à siccité. On recristallise le résidu dans un mélange chloroforme-méthanol pour obtenir environ 0,5 partie 35 de cristaux de T-24146 ayant les propriétés suivantes s Point de fusion s 168 à 173°C (décomposition) Analyse élémentaire (#) s C 71,16, 72,68; H 6,41, 6,93; N 2,38, 2,67-, 0 17,11, 17,61 Poids moléculaire s a) procédé avec un osmomètre à pres-40 sion de vapeur s 535- 50 (dans l'acétate d'éthyle). 71 44729 2118062 b) procédé par dosage s environ 550 /dans une solution diméthylsulfoxydeseau (7s2)_J7 Rotation spécifique s /x_7 jp = + 872+80°C (C=0,5$, dans le chloroforme). 5 Spectre d'absorption UV s maximum d'absorption max y r . absorption E = 1879 +200 Spectre d'absorption IR (dans KBr) : les bandes d'absorption significatives, principales en nombre d'ondes (cm~^) sont les suivantes s 3470, 3340, 3000, 29IO, 1650, 1610, 1510,1450, 1385, 1300, 1250,. 1218, 1175, 1125, 1040, 987, 960. Solubilité s Facilement soluble dans le chloroforme et l'acétate dîéthyle; Soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'éther diéthylique, le benzène; Difficilement soluble ou insoluble dans l'ea», le n-hexane, l'éther de pétrole; PO Réactions colorées s a) Solutions de permanganate de potassium : décolorée b) réactif au chlorure ferrique s réaction positive c) réaction de Dragendorff positive d) réactif à la ninhydrine s réaction négative Valeur du pKa s 9,1 /dans une solution diméthylsulfoxyde ; eau (7s2)_7. Couleurs jaune pâle Chromatographie sur couche mince s a) solvant de développement ; benzène schloroforme s méthanol (70s28s2) b) couche mince s silicagel Spot Film (Tokyo Kasei Co., Japon), immergé dans une solution d'acide oxalique à 5% en poids dans le méthanol, lavé avec du méthanol et séché à température ambiante. ^ c) Procédé de détection s Bioautographie utilisant Bacillus subtilis d) Valeur de Rf s 0,25 Activité anti-trichomonas s concentration inhibitrice minimale à l'égard de Trichomonas vaginalis N° 4F s 0,062 mcg/ml. 40 71 44729 25 2118062 EXEMPLE 10 On immerge une plaque de gel de silice (fabriqué par Merck & Co., Allemagne de l'Ouest, 0,2 x 20 x 20 cm) dans • une solution à 5$ en poids d'acide oxalique dans le méthanol, on 5 la lave avec du nséfehanol et on la sèche à température ambiante. On dissout 0,03 partie de cristaux bruts obtenus dans l'exemple 8 dans une petite quantité d'un mélange chloroforme: méthanol (20;l), et on l'applique sous forme de trait rectiligne sur le fond de la plaque. Comme révélateur, on utilise un mélange 10 benzène; chloroforme s méthanol (70;80s2).' On gratte la partie de gel de silice ayant une valeur de Rf-d'environ 0,2 qui présent e ugç activité à l'égard de Trichomonas et de Bacillus subti-lis ,/on l'extrait avec de l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait avec de l'eau et on le sèche sur du sulfate de sodium anhydre, 15 puis on élimine le solvant. On reeristalllse le résidu dans un mélange chloroforme;méthanol pour obtenir environ 0,015 partie de cristaux de T-24146. EXEMPLE 11 On dissout 0,5 partie de la poudre cristallisée obtenue 20 dans l'exemple 3 dans un petit volume de tétrahydrofurane et on fait passer la solution sur une colonne garnie avec 500 parties de Sephadex LH-20 (fabriqué par Pharmacia, Suède) qui est imprégné d'acide oxalique. On élue la colonne avec du tétrahydrofurane. On recueille les fractions présentant une acti-25 vité anti-trichomonas, on les concentre sous pression réduite et on les lave avec du méthanol. On obtient 0,3 partie de poudre jaune pâle. On fait cristalliser la poudre dans un mélange chloroforme -méthanol et on la reeristalllse dans un mélange tétrahydro-30 furane-méthanol, à la suite de quoi on obtient 0,2 partie de lamelles incolores ayant les propriétés suivantes s Point de fusion s 168 à 170°C (décomposition) Analyse élémentaire ($) s C'71,63, 71,87; H 6,8l, 6,82; N 2,35, 2,36; 0 18,44 35 Poids moléculaire s Procédé avec osmomètre à pression de vapeur s 548 (dans l'acétate d'éthyle) Rotation spécifique s Z?L7 - + 878° (C = 0,52$, dans le chloroforme). Valeur du pKa ; 8,8 /dans une solution diméthylsulfoxyde 40 ; eau (77; 22 )J. 71 44729 26 2118062 20 Spectre d'absorption UV s maximum d'absorption jffiax = 311 mji absorption E 3"^ „ = 2120 1 cm Activité anti-trichomonas s Concentration inhibitrice ^ minimale à l'égard de Trichomonas vaginalis N° 4F ; 0,062 mcg/ml. . . EXEMPLE 12 On dissout 50 parties de la poudre cristallisée obtenue dans l'exemple 3 dans une petite quantité d'un mélange tétrahydro-furanesacétate d'éthyle (ls3) et on fait passer cette solution sur une colonne garnie de 700 parties d'alumine (fabriquée par Merck & Co., Allemagne de l'Ouest, activité II à III) qui a été préalablement imprégnée d'acide oxalique. On élue la colonne avec de l'acétate d'éthyle. On recueille les fractions présentant une forte absorption de rayons ultraviolets à 310 mji, on les lave avec de l'eau, on les sèche, on les concentre sous pression réduite et on lave le résidu avec du méthanol. On obtient ainsi 25 parties de poudre jaune pâle. On fait cristalliser cette poudre dans un mélange chloroforme-méthanol, puis on la recristallise dans un mélange tétrahydrofurane-méthanol pour obtenir 20 parties de lamelles incolores dont les propriétés sont les suivantes : Point de fusion s 168-170°C (décomposition) Analyse élémentaire (#) s C 72,14, 72,06; H 6,95, 6,94; 25 N 2,38, 2,35; 0 17,77 Poids moléculaire s procédé avec osmomètre à pression de vapeur t 566 (dans l'acétate d'éthyle) Rotation spécifique s fjxj ^ = +893,3° (C=0,51& dans le chloroforme) Valeur du pKa ; 8,8 /dans une solution diméthylsuifoxyde s eau (77s22)_7 Spectre d'absorption UV : maximum d'absorption ^MeOH = 311 max ^ 35 absorption E = 2160 Activité anti-trichomonas s concentration inhibitrice à l'égard de Trichomonas vaginalis N° 4P, 0,062 mcg/ml. EXEMPLE 13 On dissout 50 parties de la poudre brute obtenue dans 40 l'exemple 3 dans une petite quantité d'un mélange tétrahydrofurane 71 kkl29 27 2118062 sacétate d'éthyle (1:3) et on fait passer la solution sur une colonne garnie de 1500 parties de gel de silice (fabriqué par Merck & Co., Allemagne de l'Ouest, de dimensioiB comprises entre 0,044 et 0,21 mm). On élue la colonne avec de l'acétate d'é-5 thyle. On rassemble les fractions présentant une forte absorption des rayons ultraviolets à 310 mji, on les lave avec de l'eau, on les sèche, on les concentre sous pression réduite et on les lave avec du méthanol. On obtient ainsi 30 parties d'une poudre brun jaunâtre. On fait cristalliser cette poudre dans un mélange 10 chloroforme-méthanol, puis on la recristallise deux fois dans vin mélange tétrahydrofurane-méthanol pour obtenir 20 parties de lamelles incolores ayant les propriétés suivantes ; Point de fusion ; 169-172°C (décomposition) Analyse élémentaire (#) ;"C 71,70» 72,09; H 6,91, 7,01; 15 N 2,37, 2,42; 0 18,48 Poids moléculaire i procédé avec osmomètre à pression de vapeur : 541 (dans l'acétate d'éthyle) Rotation spécifique s fôLJ ^2= + 892,8° (C=0,5$, dans le chloroforme) 20 Valeur du pKa s 8,7 /dans une solution diméthylsulfo- xydeseau (77s22)_7 Spectre d'absorption UV : maximum d'absorption )Me0H = 311 mjx; Amax absorption E ^ = 2180 Activité anti-trichomonas ; concentration minimale inhibitrice à l'égard de Trichomonas vaginalis N° 4P: 0,062 mcg/ml. 71 44729 28 2118062 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de l'antibiotique T-24146, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un microorganisme producteur de T-24146 appartenant au genre Streptomyces 5 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote digestible, dans des conditions aérobies, jusqu'à ce que T-24146 se soit accumulé de façon importante dans le filtrat de culture et dans les mycélia, et à récupérer l'antibiotique T-24146 qui s'y est accumulé. 10 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est Streptomyces viridochromogenes. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est Streptomyces viridochromogenes IFO 13188. 15 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on récupère l'antibiotique T-24146 dans le filtrat de culture. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on récupère l'antibiotique 20 T-24146 dans les mycélia. 6. Antibiotique T-24146, caractérisé par le fait qu'il possède les propriétés suivantes : 1) Point de fusion s 168 à 173°C (décomposition) 2) Analyse élémentaire (#) s C 71,16 à 72,68; H 6,41 à 25 7,01; N 2,35 à 2,67; 0 17,11 à 18,48 3) Poids moléculaire : a) Procédé avec osmomètre à pression de vapeur : 535+50 (dans l'acétate d'éthyle) b) Procédé par dosage : environ 550 /dans une solution 30 diméthylsulfoxydeseau (7:2)_7 4) Rotation spécifique : /x_7D2~* = +872°+80° (C=0,5# dans le chloroforme) 5) Spectre d'absorption ultraviolet ; 35 40 /Imax*1 s environ 310 mjx, plus particulièrement 309 à 310 mp. E ^ m : 1779 à 2180 1 cm " 6) Spectre d'absorption infrarouge (dans KBr) : les bandes d'absorption significatives principales en nombre d'ondes (cm""'") sont les suivantes 71 44729 29 2118062 3470, 3340, 3000, 2910, 1650, 1610, 1510, 1450, 1385, 1300, 1250, 1218, 1175, 1125, 1040, 987, 9^0.