Brevet FR2137610A1 — publié le 19721229

La présente invention concerne, d'une façon générale, la purification et/ou l'isolement d'enzymes faisant appel à la spécificité d'une enzyme vis-à-vis d'un substrat et, plus particulièrement, la purification et/ou l'isolement, à partir de mélanges complexes, d' 5 enzymes protéolytiques de type trypsine et analogues comprenants la trypsine (E.C. 3.4.4.4), la carboxypeptidase B (E.C.3.4.2.2), la pa-païne (E.C.3.4.4.10), la ficine (E.C.3.4.4.12), la thrombine (E.C. 3.4.4.13), la plasmine (E.C.3.4.4.14), la subtilopeptidase A (E.C. 3.4.4.16), 1'aspergillopeptidase A (E.C.3.4.4.17), la peptidase 10 streptococciqueA(E.C.3.4.4.18), la clostridiopeptidase B (E.C.3.4.4. 20), la bromélaîne (E.C.3.4.4.24) et l'urokinase (E.C.3.4.4.a). Une enzyme de type trypsine est ainsi définie comme une enzyme hydroly-sante appartenant à la classe 3.4.-.-. de la Commission des Enzymes (Enzyme Commission, E.C.) et présentant line spécificité vis-à-vis 19 des liaisons peptide ainsi que des liaisons ester sur les restes arginine et lysine (cf. "Report of the Commission on Enzymes" publié par "International Union of Biocheœistry", Pergamon Press, Oxford, (1961)). Les procédés connus d'isolement des enzymes utilisés suivant 20 les techniques antérieures font appel à tout un éventail de techniques distinctes qui sont utilisées en des associations déterminées de façon empirique. Ces techniques dépendent, pour la plupart, d'un paramètre moléculaire grossier de l'enzyme visée, tel, par exemple, que sa solubilité dans des solutions de sels, par exemple dans des solu- 25 tions de sulfate d'ammonium ou dans des solvants organiques miscibles avec l'eau, par exemple l'éthanol ou l'acétone, ou ses propriétés électriques telles qu'utilisées dans des procédés d'électrophorèse, de précipitation isoélectrique ou de chromatographie par échange d' ions. En outre, on a utilisé les dimensions moléculaires pour puri-30 fier des enzymes, par exemple dans des techniques de dialyse, de chromatographie par filtration sur gel et dfultrafiltration. Le choix de l'un quelconque de ces procédés, isolément ou en association, est fait, dans les techniques antérieures, pour rendre optimales la purification et la récupération de l'enzyme. On a purifié de la trypsine 35 à partir de pancréas de bovins, en utilisant des procédés plus particulièrement indiqués dans un article par M.Laskovski dans l'ouvra-ge"Methods In Enzymology", Vol. II, page 26, 1955. Suivant ce procédé, du pancréas haché est extrait par l'acide sulfurique dilué et traité 72 16331 2 2137610 par le sulfate d'ammonium en plusieurs stades distincts afin de séparer la ribonucléase et 1'alpha-chymotrypsinogène. On ajuste le pH de la solution ainsi obtenue à 3,0, et on traite par le sulfate d1 ammonium afin de précipiter le trypsinogène. On extrait ensuite cette 5 substance par une solution saturée de sulfate d'ammonium à 40%, et on reprécipite en ajoutant à nouveau du sulfate d'ammonium. Après lavage à l'aide d'une solution acidifiée de sulfate de magnésium, on dissout le trypsinogène brut dans un tampon à pH 8 contenant du CaClg et on abandonne pendant 24 heures à 4°C. On purifie ensuite la 10 trypsine ainsi obtenue par plusieurs précipitations à l'aide de sulfate d'ammonium et extractions. Ce mode opératoire est un exemple de purification de la trypsine par des procédés faisant appel aux propriétés de ses solutions. Un autre procédé utilisé suivant les techniques antérieures est 15 rapporté par Feinstein (FEBS Letters, 7s 353 /~1970J). Suivant ce procédé, on purifie la trypsine par adsorption sur une colonne d' agarose qui contient de l'ovomucoxde (protéine inhibant la trypsine obtenue à partir d'oeuf de poule) lié par covalence.La trypsine ca-talytique*ent active est séparée de la trypsine non active ainsi que 20 de 1'alpha-chymotrypsine. Cette technique est également appelée chro-matographie spécifique des enzymes par Baker (dans "Design of Active-Site-Directed Irréversible Enzyme Inhibitors" Viley, N.Î., 1967) ainsi que"chromatographie par affinité" par Cuatrecasas et al. (Proc.Nabl. Acad. Sci., U.S., 61:636 968_J7). Ces procédés diffèrent des procé— 25 dés de purification d'enzymes précédemment mis au point en ce que la spécificité biocatalytique de l'enzyme est le moyen utilisé pour réaliser la purification. On a décrit, outre les inhibiteurs macromoléculaires, des inhibiteurs à petites molécules de la trypsine et enzymes analogues (Vo-30 gel et al., Natural Proteinase Inhibitors, Academic, N.X., 1968). Les alcoyl et aryl guanidines et amidines sont des inhibiteurs connus de ce type (Mares-Guia et Shav, J. Biol. Chem. 240: 1579 (1965)). Bien qu'on ait utilisé et utilise couramment les techniques faisant appel aux propriétés des solutions pour purifier, entre autres, 35 la trypsine et enzymes analogues, ces techniques se sont révélées inefficaces à mettre en oeuvre, onéreuses et longues. Bien que le procédé d'affinité de Feinstein représente une simplification par rapport aux techniques de purification d'enzymes faisant appel aux propriétés 72 16331 3 2137610 des solutions, l'utilisation d'inhibiteurs macromoléculaires de la protéinase présente les défauts suivants. Les inhibiteurs macromoléculaires ont une spécificité étendue vis—à—vis des enzymes; en outre, ces inhibiteurs doivent être soigneusement purifiés avant de pouvoir 5 être utilisés dans des matrices ayant une affinité spécifique. De plus, il n'est pas facile de régler la concentration de ces inhibiteurs dans la matrice ayant une affinité spécifique.*C'est pourquoi continue à se manifester un besoin de prévoir des substances plus simples et des procédés plus efficaces pour obtenir ces enzymes avec 10 des rendements plus élevés et à l'état plus pur que possible à ce jour. En conséquence, la présente invention a pour buts: - de fournir un système exempt des défauts précités; - de fournir un système permettant la purification de la 15 trypsine et enzymes analogues, par utilisation de nouvelles matrices présentant une affinité spécifique; - de fournir un système permettant de purifier la trypsine et enzymes analogues à l'aide d'adsorbants présentant une affinité spécifique qui contiennent des ligands de basse masse moléculaire 20 fournissant ainsi une spécificité plus élevée et une plus grande facilité d'incorporation et de réglage de la concentration du ligand dans la matrice; - de fournir un système utilisant de nouveaux adsorbants présentant une affinité spécifique comme substances de stockage des 25 enzymes purifiées; - de fournir de nouveaux adsorbants présentant une affinité spécifique. Ces buts, et d'autres encore, sont atteints grâce à la présente invention qui fournit une matrice ou'support insoluble, ayant une 30 affinité spécifique, qui est capable defixer biospécifiquement la trypsine et enzymes analogues. Cette matrice présentant une affinité spécifique contient des composés chimiques appelés ci-après ligands qui ont une affinité pour les enzymes désirées et répondent à la structure suivante X I 35 A I R 72 16331 4 2137610 dans laquelle: @NEL Il 2 (amidinium) X - C - NH. ou - N - C - NH_ (guanidiniura) I ^ H 5 R -(CH ) Z, —0(CH ) Zj| -S-(CH ) Z, -S-S-(CH ) -Z ^ y " y * y y o il Z représentant -NH2,-COOH, I, Br, Cl, -CCI,-NCS,-NCO, -so2ci 10 et y est de 0 à A = de préférence un groupe phényle répondant à la formule ou tout groupement aliphatique ou aryl aliphatique approprié, notamment 15 benzoyle, norvalyle, cyclohexyle, hexyle et pentyle Les molécules de ligand sont fixées par covalence sur le support ou la matrice insolubles, par une molécule linéaire formant "laisse" (leash) ou attache, dite ci-après "attache". La matrice ayant une affinité spécifique ainsi obtenue est en-20 suite utilisée dans une colonne dans laquelle est introduit un extrait brut de substance contenant de la trypsine ou enzymes analogues, à partir d'une source biologique préalablement traitée pour éliminer les matières insolubles et obtenir le pH et la concentration en sel appropriés. On laisse l'extrait passer à travers la colonne, pour 25 que la trypsine ou enzymes analogues soient biospécifiquement adsor-bées par la matrice présentant une affinité spécifique et que tous les autres protéines et biopolymères de l'extrait n'ayant pas d'affinité spécifique pour le ligand passent directement à travers la colonne. Dans certains cas, il s'avère qu'un constituant peut être lé-30 gèrement retardé sur la colonne, pour diverses raisons d'ordre non-spécifique, de sorte qu'il est souhaitable de soigneusement laver la colonne à l'aide d'une substance tampon afin d'éliminer complètement toutes ces substances qui ne se fixent pas par affinité. Une fois la colonne débarrassée de ces constituants, la trypsine ou enzyme analo-35 gue spécifiquement adsorbée peut être désorbée de la colonne en faisant passer à travers cette dernière une solution contenant un composé inhibiteur soluble concurrent qui réagira spécifiquement avec l'enzy 72 16331 5 2137610 me adsorbée. Les inhibiteurs sont des substances ayant une fonctio-nalité analogue à. celle des ligands mais qui en diffèrent par leur structure, entre autres en ce qu'ils ne présentent pas d'attache ni de matrice analogues auxquelles ils sont rattachés. Lorsqu'on isole 5 certaines enzymes analogues à la trypsine, il s'est avéré utile de les désorber de la colonne par percolation avec des tampons ayant un pH acide. Si nécessaire, une colonne de filtration sur gel communique en série avec la colonne d'affinité après que les constituants étrangers sont passés à travers, permettant ainsi de débarrasser efficace-10 ment l'enzyme purifiée du composé inhibiteur soluble concurrent. Ces substances ayant une affinité spécifique fournissent également un système permettant d'emmagasiner la trypsine et enzymes analogues sans qu'elles subissent d'altération de leur activité cata-lytique. Pour ce faire, on adsorbe ces enzymes sur les substances 15 ayant une affinité spécifique, puis on conserve au froid. Une fois les enzymes adsorbées sur ces substances, elles ne peuvent subir d' auto-altération, ce qui a pour effet d'éliminer l'une des causes les plus importantes d'altération des enzymes. Les matrices ayant une affinité spécifique selon l'invention peu-20 vent être utilisées en thérapeutique clinique et/ou vétérinaire,par exemple (1) dans un agent pour la fixation ou le piégeage in vivo de la trypsine ou enzymes analogues; (2) dans un agent ou dispositif in vivo pour l'administration de trypsine ou d'enzymes analogues à des fins thérapeutiques; (3)dans un dispositif extracorporel, par 25 exemple dans un dispositif formant shunt vasculaire, pour séparer la trypsine ou enzymes analogues du sang; et (4) dans une injection ou dispositif d'administration similaire afin d'introduire dans le malade de la trypsine ou des enzymes analogues, à des fins thérapeutiques. Toute matrice appropriée peut être utilisée dans le système 30 selon la présente invention. Comme exemples représentatifs de substances appropriées, formant matrice, on citera: la cellulose et toutes ses formes affinées,1'aminoéthylcellulose, la phosphocellulose, la diéthylaminoéthylcellulose, la carboxyméthylcellulose; l'ECTEOLA cellulose, la p-aminobenzylcellulose, la polyéthylèneimino cellulose, 35 la triéthylamino cellulose; la sulfoéthyl cellulose, la guanidoéthyl cellulose, des agaroses tels que par exemple le Sepharose (Marque déposée) ou le Bio-Gel A (Marque déposée), des dextranes réticulés tels que le Sephadex (Marque déposée), des polyacrylamides réticulés 72 16331 6 2137610 tels que le Bio-gel P(Marque déposée), 11agaropectine, ainsi que du collagène réticulé ou non réticulé. Ces substances sont caractéris-tiquement insolubles dans les solutions aqueuses, sont de préférence peu hydrophobes et ont un caractère non ionique. Une matrice ayant 5 un caractère ionique ou très hydrophobe peut être gênante dans le procédé d'affinité. Les réactions de couplage appropriées pour fixer les molécules d'attache et/ou de ligand sur la matrice ou les molécules de ligand sur les composés d'attache sont généralement limitées par le milieu 10 solvant dans lequel elles peuvent être effectuées. Le choix du milieu solvant est régi par les besoins du support. Les supports polysaccha-ridiques et polyacrylamidiques sont habituellement utilisés dans 1* eau. Si nécessaire, des solvants organiques miscibles avec l'eau peuvent être utilisés en des proportions appropriées avec de l'eau, 15 par exemple des gels d'agarose peuvent être mélangés soit avec 50% d'éthylène glycol soit avec: 5C$ Bien qu'on puisse utiliser toute température de réaction appropriée, il convient d'utiliser de préférence une température de 1 à 20 30°C dans une solution tampon aqueuse ayant un pH approprié, qui peut, on non, comprendre des solvants miscibles avec l'eau. La présente invention peut être mise en oeuvre en utilisant toute réaction de couplage appropriée. Comme exemple approprié de cette réaction de couplage on citera le couplage de groupes carboxyliques avec des 25 groupes amino ou des groupes alcooliques qui peut être effectué , par exemple par l'addition de carbodiimides (de préférence de type hydro-soluble), ou par la voie d'acyl azides, d'halogénures d'acyle et d'anhydrides d'acyle par addition de réactifs appropriés. On peut coupler un ligand (ou une attache) contenant un groupe amino avec une 30 attache (ou un ligand) contenant par exemple un groupement isocyanate, isothiocyanate, chlorure de sulfonyle, halogénure d'alcoyle et amida-te de méthyle ou d'éthyle. Bien qu'on puisse utiliser toute molécule d'attache appropriée dans le système selon la présente invention, il est préférable que 35 ces molécules soient linéaires et hydrophiles ainsi qu'exemptes de groupes ioniques forts. Comme exemples représentatifs de molécules d'attache, on citera:1'acide epsilon-aminocaproïque, la bêta-alanine, le 1,6-diaminohexane, la bis(3-aminopropyl)amine, la glycine, la 72 16331 7 2137610 glycylglycine, la glycylglycylglycine, la succinamidoéthylamine, la succinamidobutylamine, la succinamidohexaméthylamine, 1'aminoéthanol, l'éther 2,2'-diaminodiéthylique ainsi que ses homologues supérieurs. La longueur moléculaire du composé d'attache utilisé doit être suf-5 fisamment gcante afin de réaliser la relation appropriée de ligand à matrice pour que puisse s'effectuer une fixation efficace de l'enzyme désirée. Dans certains cas, il s' avère qu'aucune attache n'est nécessaire , toutefois, dans la plupart des cas, le com- o posé d'attache utilisé a de préférence une longuèur d'environ 7 Angs-10 troms, ou plus. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Sauf autre indication, les parties et pourcentages sont exprimés en poids , et toutes les solutions sont des solutions aqueuses. 15 EXEMPLE I A une suspension de gel d'agarose on ajoute du bromure de cyanogène à 100 mg/ml du gel, puis on titre jusqu'à obtention d'un pH de 11,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium (NaOH) 4M. Lorsque l'absorption d'alcali cesse, on recueille le gel "activé" sur un entonnoir en ver-20 re fritté et on lave à l'aide d'un tampon au borate froid ayant une concentration de 0,1 M et un pH de 9,5. Puis on met à nouveau le gel en suspension dans un tampon au borate froid, et on mélange avec un volume égal d'une solution de 1,6-diaminohexane à 100 mg/ml de gel et on ajuste le pH à 9,5. On agite doucement le mélange ainsi obtenu, 25 pendant une nuit, à 4°C. Puis on lave le gel en le versant dans un entonnoir en verre fritté grossier et en faisant doucement passer de l'eau distillée à travers. On met 1'aminohexaméthylène-agarose obtenu en suspension dans un volume égal d'eau distillée auquel on mélange 0,2 g d'anhydride succinique/ml de gel. On ajuste le pH à 6,0 et on 30 le maintient à cette valeur par addition de NaOH 4M. Lorsque l'absorption de base cesse, on agite le mélange doucement, pendant 3 heures, à 4°C, puis on laisse reposer à cette température pendant une nuit. On lave le succinamidohexaméthyl-agarose (désigné ci-après SHA) ainsi obtenu sur un entonnoir en verre fritté grossier, comme précé-35 demment décrit. On couple le ligand, le monochlorhydrate de p-aminobenza-midine, à raison de 37 mg/ml de gel, avec les groupes succinyle du gd de SHA, par réaction dans une solution Q1M d'un carbodiimide hydroso- 72 16331 8 2137610 lubie, en faisant appel aux techniques décrites de façon plus détail lée par Hoare et Koshland (J. Biol. Chem. 242: 2447(1967)). Le car-bodiimide hydrosoluble utilisé est le monochlorhydrate de 1—éthyl—3— (3*-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC). La réaction de coupla-5 ge est effectuée dans un pH-stat automatique à pH 4,75, à l'aide d'acide chlorhydrique (HCl) 1,0 molaire. Lorsqu'on voit que l'absorption des protons cesse, on lave la suspension de gel sur un entonnoir en verre fritté, en utilisant de l'eau distillée à raison de 5 fois le volume du gel, comme précédemment décrit. La matrice ayant 10 une affinité spécifique ainsi obtenue est désignée ci-après comme un gel pBz-SîA eparfc une teneur (capacité) en ligand de 0,021 méq./ml de gel. EXEMPLE II On opère comme indiqué à l'exemple I, à cela près qu'on utilise 45 mg/ml de gel de dichlorhydrate de m-aminobenzamidine comme ligand 15 La préparation ainsi obtenue est désignée ci-après gel mBz-SHA ayant une teneur en ligand de 0,012 méq/ml de gel. EXEMPLE III On opère à nouveau comme indiqué à l'exemple I, à cela près qu' on utilise 36 mg/ml de"gel de monochlorhydrate de p-aminophénylguani 20 dine comme ligand. Le produit ainsi obtenu est désigné ci-après gel pAG-SHA ayant une teneur en ligand de 0,035 méq/ml de gel EXEMPLE IV On opère comme indiqué à l'exemple III, à cela près qu'on utili se de l'acide epsilon-aminocaproïque au lieu de 1,6-diaminohexane et 25 qu'on omet le stade de succinylation. Cette préparation est désignée ci-après gel pAG-CA. EXEMPLE V On opère comme à l'exemple IV, à cela près qu'on utilise de la bêta-alanine (acide 3-aminopropionique à 44 mg/ml de gel) à la place 30 de l'acide epsilon-aminocaproïque. Cette préparation est désignée ci après gel pAG-AA et s'avère fixer la trypsine à un degré moindre que les préparations des exemples précédents. EXEMPLE VI On opère comme indiqué à l'exemple II, à cela près qu'on utilis 35 du bromure de cyanogène à 200 mg/ml de gel et du 1,6-diaminohexane à 180 mg/ml de gel. De façon correspondante, on utilise des concentrations plus élevées d'anhydride succinique dans la succinylation d* attache et la réaction de couplage de mBz à 40 mg/ml de gel est 72 16331 9 2137610 effectuée à l'aide d'EDC 0,1 molaire. Le gel mBz-SHA obtenu s'avère avoir une concentration plus élevée en ligand par ml de gel (0,06 méq/ml de gel). EXEMPLE VII 5 On fait gonfler de l'aminoéthyl cellulose (AE-cel), contenant 0,27 méq d'amine/g de cellulose sèche, dans du bicarbonate de sodium (NaHCO^) 0,1 M, puis on lave à l'aide de NaOH 0,1 M, puis à l'aide d' HG1 0,1 M, et enfin à l'eau distillée. On traite ensuite la suspension de 10 g d'AE-cel dans 80 ml d'eau par 3 g d'anhydride succinique à 10 pH 6,0 qu'on maintient à l'aide de NaOH 4M tout en surveillant avec un pHmètre. Lorsque l'absorption de base cesse, on agite le mélange à 4°C pendant 2 heures. Après avoir soigneusement lavé la suspension à l'eau, on la mélange avec 0,93 g de mBz et on fait réagir avec 2,3 g d'EDC, comme décrit précédemment à l'exemple I. On obtient ainsi 15 une suspension quelque peu floconneuse désignée ci-après gel pAG-SA. EXEMPLE VIII On chauffe préalablement 500 ml d'éthylènediamine anhydre dans un ballon bouché, jusqu'à une température de 90°C, puis on ajoute 25 g de perles de polyacrylamide BIO-GEL p-300 sec, et on agite cons-20 tamment la suspension pendant 8 heures. On refroidit ensuite le ballon pendant une heure sur de l'eau glacée, puis on mélange la suspension de gel avec 500 ml de glace pilée. On lave ensuite le gel à 1' aide d'une solution de NaCl 0,1M sur Biïchner, jusqu'à ce que les lavages soient exempts d'éthylène diamine, comme l'indique la réaction 25 au 2,4-dinitrofluorobenzène. On fait ensuite passer le gel dans un grand bêcher en polyethylène et on ajoute une quantité suffisante de NaCl 0,1 M pour obtenir une suspension diluée. On ajuste le pH de cette suspension à 6,0 et on ajoute 25 g d'anhydride succinique, par petites portions à la fois, tout en maintenant le pH à 6,0 par addition 30 d'une solution d'hydroxyde de sodium 2N. Lorsque le pH de la suspension ne change plus, on couvre la suspension et on la laisse prendre pendant une nuit. On lave ensuite la suspension à l'aide de 10 litres de NaCl 0,1 M sur Bïïchner. On met ensuite 50 ml des perles lavées en suspension dans 50 ml d'eau distillée, on mélange avec 10 g de mBz et 35 fait réagir avec 2 g d'EDC, comme décrit à l'exemple I. Cette préparation est désignée ci-après PAE-mBz. EXEMPLE IX On utilise un tampon normalisé tris(hydroxyméthyl)aminométhane/ 72 16331 10 2137610 chlorure de potassium (TRIS 0,05M/KC1 0,5M ayant un pH de 8) pour équilibrer la colonne d'affinité , pour dissoudre les échantillons d'enzyme et pour laver la colonne d' affinité chargée d'enzyme. Une petite colonne chromatographique tubulaire (0,7 cm x 20 cm) est 5 remplie avec 7 à 8 ml de gel pBz-SHA . Après équilibrage, on charge dans la colonne 40 mg de la trypsine la plus pure accessible dans le commerce, dissoute dans environ 2 ml de tampon TRIS/KCl. Lorsqu'on fait passer sur la colonne ayant fixé la trypsine du chlorhydrate de benzamidine (Bz) 0,01 molaire dans le tampon TRIS/KCl, la trypsine 10 est désorbée par l'inhibiteur soluble et est spécifiquement éliminée par lavage, à l'état hautement purifié, exempte de toute trypsine ùégradée. On élue ensuite la colonne à l'aide d'un tampon glycine/ KCl (glycine 0,05M et KCl 0,5M, pH 3,0), ce qui ne recueille que peu ou pas de protéine. La trypsine active ainsi obtenue est pure à plus 15 de 95%, comme déterminé par le procédé de tiiration des sites actifs suivant Chase et Shav, Biochem. Biophys. Res. Comm. 29:508 (1967). Le rendement de 65% obtenu ici indique que la trypsine la plus pure pouvant être obtenue dans le commerce n'est pure qu'à 65%. On vérifie la spécificité de la substance ayant une affinité spécifique en char-20 géant 40 mg d'alpha-chymotrypsine sur une colonne pré-équilibrée, puis en lavant avec le tampon TRIS/KCl contenant Bz. L'alpha-chymotrypsine s'avère passer immédiatement à travers le gel ayant une affinité spécifique. En outre, on vérifie la spécificité de l'affinité en éluant la colonne à l'aide d'un tampon glycine/chlorure de potas-25 sium (0,05M/0,5M; pH 5,0). La colonne s' avère éluer les protéines, ce qui indique que la colonne fonctionne de façon appropriée. EXEMPLE X On opère comme indiqué à l'exemple IX, à cela près qu'on utilise, au stade de désorption, HC1 0,001M/KC1 0,5M au lieu de Bz dans TRIS/ 30 KCl pour éluer la trypsine de la colonne ayant une affinité spécifique. On obtient des résultats similaires à ceux de l'exemple IX. EXEMPLE XI On purifie de la thrombine de bovin, fournie par la Société Parke-Davis Co., sur le gel mBz-SHA ayant une concentration élevée en 35 ligand préparé à l'exemple VI, suivant le mode opératoire de l'exemple IX, à cela près qu'une colonne de Sephadex G-25 de 1,5 cm x 30 cm est reliée en série à l'orifice de sortie de l'effluent de la colonne d'affinité. La thrombine purifiée ainsi obtenue est également exempte 72 16331 11 2137610 de Bz. En poids, la thrombine de départ s'avère contenir de 1 à 2% d' enzyme active. EXEMPLE XII On remplit de gel pAG-SHA une colonne de 0,7 x 20 cm (volume du 5 lit: 8 ml environ) et on lave à l'aide du tampon normalisé THIS/KCI. On introduit dans la colonne 1 ml d'une solution de trypsine (40 mg/ ■l), puis on lave à l'aide du tampon afin d'éliminer les substances étrangères. Le gel ayant adsorbé la trypsine est ensuite conservé à 4*C afin de retarder le développement microbien sur la colonne. 10 EXEMPLE XIII On purifie de l'urokinase humaine (5000 unités Ploug), fournie par la Société Nutritional Biochemicals Corporation, sur le gel mBz-SHA ayant une teneur élevée en ligand préparé à l'exemple VI, en opérant comme indiqué à l'exemple IX, à cela près qu'on utilise de l'HCl 15 0,01 M dans du KCl 0,5M pour désorber l'enzyme de la colonne ayant une affinité spécifique. On obtient des résultats similaires à ceux de 1' exemple X. Bien qu'on ait indiqué dans les exemples des conditions particulières et des substances particulières, il est bien entendu qu'on 20 peut, dans les exemples ci-dessus, utiliser n'importe lesquelles des substances précitées, avec des résultats similaires. Outre les stades opératoires utilisés pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on peut éventuellement utiliser d'autres stades ou variantes, par exemple d'ultrafiltration, de dialyse ou de lyophi-25 lisation. En outre, d'autres substances peuvent être incorporées au système selon la présente invention, qui amélioreront les propriétés du système, ou auront un effet de synergie ou les affecteront favorablement d'une autre manière: par exemple, on peut utiliser des solvants miscibles avec l'eau pour améliorer l'efficacité du système 30 selon la présente invention. 72 16331 12 2137610 REVENDICATIONS 1. Substance à affinité spécifique,caractérisée en ce qu'elle comprend une matrice insoluble et un ligand qui répond à la formule : X dans laquelle: R ©NH0 ©NH0 » .H = -C - NIL, (amidinium) ou -N - C - Nïï^ (guanidiniun) 10 H R = -(CH2)yZ, -0(CH2)yZ, -S-(CH2)yZ ou -S-S-(CH2)y-Z Z représentant -NHg, C00H, I, Br, Cl, 0 -8c î, NCO ou SOpCl 15 et y est de 0 à 3 A étant un groupe aliphatique ou arylaliphatique. 2.Substance suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le groupe arylaliphatique est un groupe benzoyle, norvalyle ou phényle. 3.Substance suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le 20 groupe aliphatique est un groupe hexyle, cyclohexyle ou pentyle. 4.Substance suivant la revendication 1, caractérisée en ce que A est un groupe phényle. 5.Substance suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la matrice insoluble est choisie parmi la cellulose et toutes ses formes 25 affinées, l'aminoéthyl cellulose, la phosphocellulose, la diéthyl-aminoéthyl cellulose, la carboxyméthyl cellulose, l'ECTEOLA cellulose, la p-aminobenzyl cellulose, la polyéthylèneimino cellulose, la triéthylamino cellulose, la sulfoéthyl cellulose, la guanidoéthyl cellulose, lés agaroses, les dextranes réticulés, les polyacrylamides 30 réticulés, 1'agaropectine, et le collagène réticulé et non réticulé. 6.Substance suivant la revendication 1, comprenant en outre une molécule d'attache. 7. Substance suivant la revendication 6, caractérisée en ce que la molécule d'attache est choisie parmi l'acide epsilon-aminocaproï-35 que, la bêta-alanine, le 1,6-diaminohexane, la bis-(3-aminopropyl)-amine, la glycine, la glycylglycine, la glycylglycylglycine, la suc- 72 16331 13 2137610 cinamidoéthylamine, la succinamidobutylamine, la succinamidohexa-méthylamine, 1 ' aminoéthanol, l'éther 2,2'-diaminodiéthylique et se^iomologues supérieurs. 8. Substance suivant la revendication 6, caractérisée en ce O 5 que la longueur de l'attache est supérieure à 7 AngstrOms. 9. Procédé de purification de trypsine et d'enzymes analogues à partir d'un mélange brut d'enzymes, caractérisé en ce qu'on utilise, dans une colonne, une substance à affinité spécifique telle que définie à l'une quelconque des revendications précé- 10 dentes, on introduit dans cette colonne l'enzyme brute à purifier et on laisse l'enzyme passer à travers la colonne. 10. Procédé de stockage de trypsine purifiée et d'analogues de la trypsine purifiés, caractérisé en ce qu'on adsorbe lesdites enzymes sur une substance à affinité spécifique telle que définie 15 à la^evendication 1, et on conserve les enzymes adsorbées au froid. 11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on conserve les enzymes adsorbées à une température inférieure à 4°C.