Brevet FR2132800A1 — publié le 19721124

i 2132800 La présente invention concerne 1133. procédé et un appareil nouveaux et améliorés pour séparer de façon semi-automatique les lymphocytes d'échantillons de sang total dans des conditions rigoureusement stériles et avec une pureté, un rendement et une via-5 bilité très élevés. La séparation des lymphocytes d'échantillons de sang total dans des conditions rigoureusement stériles$ avec une pureté, un rendement et une viabilité très élevés est particulièrement utile pour le diagnostic d'une grande diversité de maladies humaines 10 graves, comme il est indiqué par exemple dans la demande de brevet français n° 71 36 578 du 12 Octobre 1971* i3ien qu'on connaisse une grande diversité de procédés et d' appareils pour la séparation des lymphocytes des échantillons de sang total, il semble qu'il n'existe pas de procédé ni d'appareil 15 automatiques ou semi-automatiques réalisant la séparation des lymphocytes dans des conditions rigoureusement stériles ■> Par conséquent, il risque de se produire des problèmes de contamination entre les échantillons ou similaires, ce qui rend incertaine la validité des procédés de séparation des lymphocytes» Egalement, 20 la plupart des appareils automatiques ou semi-automatiques de 1° art antérieur sont relativement complexes et coûteux et ne conviennent pas à de petits laboratoires, ou similaires» La présente invention a pour objet un procédé et un appareil semi-automatiques, nouveaux et améliorés, pour la séparation des 25 lymphocytes d'échantillons de sang total dans des conditions rigoureusement stériles. L'invention vise également un appareil de ce type de construction extrêmement simple et fiable, donc bon marché, assurant des durées prolongées de fonctionnement satisfaisant, pratique-30 ment sans entretien. L'invention vise également un procédé et un appareil de ce type permettant la séparation des lymphocytes avec une pureté, une viabilité et un rendement très élevés. Comme décrit ci-après, le procédé et l'appareil de l'inven-35 tion consistent à utiliser une seringue stérile à usage unique pour recueillir et mélanger des quantités mesurées d'un échantillon de sang et d'un agent de séparation dans des récipients respectifs. L'agent de séparation contient des particules magnétiques sensibilisées qui, lorsqu'on incube un mélange de l'échan-4-0 tillon de sang et de l'agent de séparation, réalisent le marquage 72 12419 2 2132800 des leucocytes de l'échantillon de sang à l'exclusion pratiquement des lymphocytes de l'échantillon de sang? et d'un agent de sédimentation qui facilite la sédimentation des érythrocytes de l'échantillon de sang. Après mélange et incubation de la seringue 5 remplie dans un dispositif de mélange tournant et d'incubation -et repos pour permettre la sédimentation des érythrocytes, on place la seringue sur un dispositif de transfert d!échantillon et de séparation magnétique- qui comporte un tube stérile à usage unique de transfert d'échantillon scellé au voisinage de ses ex-10 trémités, un séparateur magnétique délimitant un trajet circulaire dans lequel se trouve un champ magnétique très dense non uniforme et à travers lequel passe le tube et un dispositif de tube récepteur» Lors du fonctionnement, on raccorde la seringue et le tube récepteur aux extrémités opposées du tube de transfert en le 15 perçant par une aiguille hypodermique et on pompe le mélange d1 échantillon de sang incubé et d'agent de séparation en agissant sur le piston de la seringue dans et à travers le tube de transfert et le dispositif de séparation magnétique, ce qui provoque la rétention des leucocytes marqués dans ce dernier et un écoule-20 ment continu des lymphocytes en suspension dans le plasma sanguin à travers le tube de transfert dans le tube de réception. E'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressor-tiront de la description qui suit faite en regard des dessins annexés dans lesquels ; 25 la figure 1 représente une élévation latérale d'une seringue à usage unique utiliséé dans l'invention ; la figure 2 représente une coupe d'un récipient d'agent de séparation ; la figure 3 représente une coupe d'un récipient d'échantil-30 Ion de sang ; la figure 4- représente une élévation frontale nvec des parties découpées d'un dispositif de mélangeur tournant et incubateur ; la figure 5 représente une élévation d'un support de sédi-35 mentation ; la figure 6 représente une élévation frontale en partie coupée du'dispositif de séparation magnétique et de transfert d'échantillon ; la figure 7 représente une élévation arrière de la partie 40 de séparation magnétique de l'appareil de la figure 6 ; 72 12419 3 2132800 la figure 8 représente une vue en plan du séparateur magnétique de la figure 7 ; la figure 9 est une vue en élévation du tube de transfert d* échantillon. 5 Dans la description qui va suivre, certaines dénominations commerciales sont indiquées par des guillemets. Le sang humain total est constitué d'un mélange de globules rouges ou érythrocytes, de globules blancs ou leucocytes, de plaquettes et de plasma ou de sérum sanguin. Les globules blancs 10 sont constitués par un mélange cellulaire, par exemple d'environ 65 à 72 % de neutrophiles, d'environ 2 % à 5 % d'éosinophiles, d'environ 0 à 1 % de basophiles, d'environ 4- % à 8 % de monocytes et d'environ 20 à 50 % de lymphocytes, ces valeurs correspondant en général à la plupart des adultes en bonne santé. 15 Le rôle global du procédé et de l'appareil de l'invention est de réaliser la séparation des lymphocytes d'échantillons de sang humain total avec une pureté, un rendement et une viabilité très élevés. La pureté est le nombre de lymphocytes présents dans le produit du procédé divisé par le nombre total de globules 20 blancs ou de leucocytes présents ; le rendement est égal au nom-bre de lymphocytes par mm de produit, divisé par le nombre de lymphocytes par mur' de l'échantillon de sang total de départ ; la viabilité est égale au nombre de lymphocytes vivants dans le produit, divisé par le nombre total de lymphocytes dans le pro-25 duit. Selon l'invention, on réalise la séparation des lymphocytes de chaque échantillon de sang total en marquant les leucocytes phagocytaires, c'est-à-dire les neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles et les basophiles, d'un échantillon de sang total 30 avec des particules magnétiques sensibilisées, à l'exclusion pratiquement des lymphocytes, on sédimente et on élimine la majeure partie des érythrocytes, et on réalise la séparation magnétique des leucocytes phagocytaires ainsi marqués avec la majeure partie des plaquettes qui y adhèrent, de l'échantillon de sang to-35 tal, en laissant pratiquement la totalité des lymphocytes avec les érythrocytes résiduels et le plasma sanguin dont on extrait ensuite les lymphocytes par simple hémolyse et lavage, ou similaires . Selon l'invention, on pré lève l'échantillon de sang total *+0 au malade, en utilisant une aiguille hypodermique réunie à un 72 12419 2132800 tube "vacutainer", fabriqué et commercialisé par ^ecton, Dickinson 6c Cie de Jxutherford, i«ew Jersey, dans lequel est présente une quantité déterminée d'un stabilisant physiologique approprié et d'un anti-coagulant tel que les sels disodique ou tri-3 potassique de l'iiDTxi qui est un agent chélatant, ce qui provoque la formation pratiquement immédiate de ce qu'on peux; appeler du sang traité à l'^DT-i, ce qui stabilise de façon physiologique les globules blancs ou leucocytes de l'échantillon de sang total, et empêche la coagulation des globules rouges ou érythrocytes, 10 ceci étant un très gros avantage, i-'lus particulièrement, la leu-coadhérence, la phagocytose et l'agglutination des leucocytes phagocytaires qui permettent leur marquage par les particules magnétiques sensibilisées, nécessitent la présence d'ions positifs libres tels que des ions calcium et magnésium pour se manifester. 15 La formation immédiate, telle qu'elle vient d'être décrite, de sang traité à l'EDTA, provoque la fixation par l'E-D'lA de ces ions positifs libres, si bien que ces ions ne sont plus disponibles à l'état libre, ce qui inhibe pratiquement à ce moment la leucoa-dhésion, la phagocytose et l'agglutination. C'est-à-dire que si 20 l'on n'ajoute pas d'agent chélatant tel que l'riDTA à l'échantillon de sang total tel qu'il vient d'être décrit, ou si on ne réalise pas une réfrigération coûteuse et mal aisée de l'échantillon de sang total à basse température entre le moment où on le prélève au malade et le moment où on en sépare les leucocytes, la leucoa-25 dhérence, la phagocytose et l'agglutination des leucocytes phagocytaires apparaissent de façon non contrôlée, ce qui détruit les globules blancs et diminue de façon importante la viabilité cellulaire. Ceci provoque une contamination importante des lymphocytes par les cellules mortes, et inhibe considérablement la leucoa-30 dhérence et la phagocytose qui sont nécessaires à la séparation des lymphocytes selon l'invention avec une pureté, un rendement et une viabilité importants. On peut bien entendu remplacer cet anti-coagulant et ce stabilisant par des sels de sodium d'acides wij-tjL Dx'X'a et wxiijJ-j Dwi• 5b On amorce la séparation des lymphocytes du sang traité à l'-iïDI'À en le mélangeant avec un agent de séparation contenant les constituants suivants pour former un mélange de sang total et d' agent de séparation comme décrit en détail ci-après : a) des particules magnétiques telles que des particules d' 40 ions carbonyles, des particules de ferrite ou des particules de bad original 72 12419 5 2132800 magnétite ayant une taille comprise entre 1 et 4- microns, qui, après sensibilisation comme décrit plus en détail ci-après, réalisent le marquage des leucocytes phagocytaires et permettent leur élimination magnétique ultérieure des érythrocytes, du plas-3 ma sanguin et des phagocytes avec un emprisonnement minimum de ces derniers. b) Des ions magnésium et calcium libres sous forme de sels dissous de chlorure de calcium et de chlorure de magnésium qui ramènent la teneur ionique du sang traité à l'EDïa à sa valeur 10 d'origine en remplaçant les ions positifs fixés comme précédemment indiqué par l'EDTi)., apportant ainsi la concentration ionique optimale pour la leucoadhérence et la phagocytose. c) Une quantité minimum d'un agent anti-coagulant approprié tel que l'héparine pour empSher la coagulation du sang pendant 15 la durée nécessaire au procédé de séparation des lymphocytes. d) Un agent sensibilisant constitué de molécules à charge positive, par exemple un polyaminoacide basique ou un polypeptide tel que la poly-L-lysine, le polybrène, la poly-D-lysine, la poly-DL-lysine, ou la polyarginine ou similaires pour augmenter la 20 leucoadhérence et la phagocytose par sensibilisation ou par augmentation de la charge superficielle positive desdites particules magnétiques par adsorption sur elles. e) Une solution de glucose pour apporter l'énergie au processus de phagocytose. f) Une solution isotonique, telle que la solution saline équilibrée de iianks, ayant la même pression osmotique que le plasma sanguin, constituant une solution physiologique pour le procédé de séparation. g) Un agent de sédimentation des globules rouges constitué jO d'un agent de sédimentation de poids moléculaire élevé, tel que par exemple du "Dextran", du "Ficoll", du "PHÀ" ou similaires, en combinaison avec par exemple une petite quantité de sel mono-sodique ou disodique d'EDÏA pour activer la sédimentation des érythrocytes en provoquant leur agglomération de façon à ce qu' 55 ils tombent plus facilement au fond du courant de mélange. On réalise ensuite la séparation des lymphocytes de l'échantillon de sang total selon l'invention en incubant le mélange obtenu de l'échantillon de sang total et de l'agent de séparation pour provoquer le marquage des leucocytes phagocytaires par les 40 particules magnétiques sensibilisées, à l'exclusion pratiquement 72 12419 6 2132800 des lymphocytes, par leucoadhérence phagocytose, et agglutination, puis l'agglomération, la sédimentation et l'élimination de la majeure partie des érythrocytes, puis l'élimination magnétique des leucocytes phagocytaires ainsi marqués et de la majorité des 5 plaquettes de l'échantillon de sang total. La façon précise dont la leucoadhérence, la phagocytose et l'agglutination leucocytaire se produisent est décrite en détail dans la demande de brevet précitée. La figure 1 représente une seringue à usage unique, stérile, 10 10, constituée d'un corps transparent calibré 12, d'un piston 14 et d'un embout "Luer-Lok" 16. La seringue 10 est de préférence un "Plastipak", fabriqué et commercialisé par Becton, Dickinson et Gie de Rutherford New Jersey. Le récipient de l'agent de séparation 18 représenté dans la 15 figure 2 comporte un bouchage 20 facile à percer. Le récipient 18 contient l'agent de séparation précédemment indiqué 22. La figure 5 représente un tube vacutainer 24 qui contient un échantillon de sang humain total 16, qu'on a traité comme précédemment indiqué, cet échantillon de sang ayant été prélevé directement 20 sur le donneur dans le vacutainer, de façon classique. Le tube vacutainer 24 est fermé par un bouchage 27 facile à perforer. Lors de l'utilisation, on retire le protecteur de l'embout Luer-Lok de la seringue 10 et on fixe à ce dernier une aiguille hypodermique stérile de façon habituelle. On force ensuite cette 25 aiguille à travers le bouchage perforable 20 du récipient 18 de l'agent de séparation êt on l'introduit dans l'agent de sépara-en tion 22 en/prélevant dans la seringue 10 une quantité mesurée en agissant sur le piston 14 de façon habituelle. Ensuite, on plonge 1'aiguille de la seringue dans 1'échantillon de sang total traité 50 26 du vacutainer 24 et on en prélève pratiquement la totalité dans la seringue en le mélangeant avec l'agent de séparation. De préférence, on introduit ensuite une quantité mesurée d'air ambiant dans la seringue 10 pour réaliser un mélange approprié de l'échantillon de sang et de l'agent de séparation. Ensuite, on 55 bouche à nouveau de préférence l'aiguille de la seringue pour empêcher les fuites et conserver la stérilité. Tout ceci étant réalisé, on place la seringue remplie dans l'appareil d'incubation et de mélange tournant désigné de façon générale par 28 dans la figure 4 et constitué d'un support 50 au-40 quel est fixé un arbre d'entraînement 32. L'arbre 32 tourne dans 72 12419 7 2132800 le sens direct sous l'effet d'une source d'énergie telle qu'un moteur électrique non représenté qui est également porté par le support -ju. un bras support triangulaire 34 est fixé à l'axe dcl de façon à tourner avec lui. Le bras support comporte un dispositif de aïonta.ge de la seringue qui peut avoir la forme d'^ne pince classique et qui permet la fixation de la seringue 10 dans sa position de fonctionnenent dans le dispositif d'incubation et de mélange tournant 26. Le bras support y* est de préférence conçu pour qu'il s'arrête dans la position représentée dans o la figure -r, la seringue étant pratiquement verticale lorsque 1' axe cesse de tourner. Ztx logement 3c entoure le support pC et un dispositif de chauffage et d'alimentation i-O alimente le logement en air à 37°^-environ, provoquant ainsi l'incubation dans le logement du mélan-Vy ;:e de l'échantillon de sang et d'agent de séparation. L'incubateur .peut être un élément séparé dans lequel on place simplement le dispositif d'incubation et de mélange tournant. .ua seringue remplie lo, étant placée comme décrit dans le dispositif 26 d'incubation et de mélange tournant, et le disposi-tif d'alimentation et de chauffage par l'air 40 maintenant la température dans le logement 36 à 37°0-, on fait tourner par exemple l'axe à environ 3 t/mn pendant environ 30 minutes, en obtenant un excellent mélange de l'échantillon de sang et de 1' agent de séparation et son incubation associée au marquage des Liy leucocytes phagocytaires de l'échantillon de sang par leucoadhérence, phagocytose et agglutination comme précédemment indiqué. ensuite, on retire de préférence la seringue" 10 du dispositif d'incubation et de mélange tournant 26 et on la place comme représenté dans le support de sédimentation 42 de la figure 3 et gu on la laisse reposer par exemple pendant environ 30 minutes pour obtenir la sédimentation des érythrocytes sur le bout du piston de la seringue 10. oinon, on peut bien entendu laisser simplement la seringue 10 en place dans le dispositif d'incubation et de mélange tournant ^c pour réaliser ia sédimentation des érythrocytes. tfaoi qu'il en soit, on poursuit l'incubation pendant la sédimentation, c'est-à-aire que lorsqu'on utilise le support on le place dans un incubateur approprié non illustré. -orsque la sédimentation du mélange est terminée, on place 1a seringue lu dans l'appareil de séparation magnétique et de •+v- transfert d'échantillon représenté de façon générale par 44 dans bad or/g/nal 72 12419 2132800 les figures b, 7 et 8- Cet appareil de séparation magnétique et de transfert d'échantillon est constitué d'un support 46 comportant des pinces 4b et des guidages 50 pour placer de façon appropriée la seringue 10 comme illustré. une Dire a ' entraînement du piston de la seringue 52 traverse une encoche allongée >f ménagée dans le support 46. La tire d'entraînement z>è. bute contre la partie inférieure du piston de la seringue l'H- et peut être entraînée de façon à avoir un mouvement alternatif dans l'encoche ^ sous l'effet d'un moteur électrique '10 d'entraînement non représenté. Le dispositif de séparation magnétique désigné de façon générale par 56 dans les figures 6, 7 et 8, est constitué d'un aimant 58 en U à densité de champ élevée qui, par exemple, est un aimant "Alnico", qui est monté comme représenté à la partie ar-rière du support 46 par des supports amagnétiques 60 et 62. Les pièces polaires en acier doux 64 et 66 sont fixées comme représenté de façon appropriée quelconque aux extrémités respectives de l'aimant 58. Un noyau en acier doux 68 est porté comme représenté dans la figure 7 par les pièces polaires respectives 6^ et ^0 66 et par un support ?0 en une matière amagnétique appropriée quelconque. Une pièce de guidage en aluminium 72 est fixée de façon appropriée quelconque au noyau b8. Les bords intérieurs respectifs des pièces polaires o4 et 66 sont découpés en arc comme le montre mieux la figure 8, en 25 restant pratiquement à la même distance du pourtour du noyau circulaire 68. De plus, les bords supérieurs des pièces polaires et des noyaux et le bord inférieur de la pièce de guidage circulaire 72, sont découpés en arc, comme le montre mieux la figure 7 en réalisant une rainure de montage circulaire entourant pratiquement ^0 la pièce de guidage et le noyau. Un tube de tranfert de mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation représenté en 74 dans la figure 9 est constitué de préférence d'une longueur appropriée de tuyau de chlorure de polyvinyle stérile scellé en 7b et 78 près de ses extrémités, 22 en réalisant un volume de transfert fermé stérile 80. On place le tube de transfert 74 dans le séparateur magnétique et le dispositif de transfert du mélange, en plaçant l'extrémité 78 scellée du tube dans une encoche à cet effet du support de tube 82 (figure 6), on fait passer le tube à travers l'encoche de guidage 40 &4 du support 46 à l'arrière de ce dernier, puis on le croise » bad original 72 12419 9 2132800 autour du noyau 68 en le faisant passer dans la rainure ménagée entre le noyau, les pièces polaires 64 et 66 et la pièce de guidage 72, comme le montre mieux la figure 8, on fait repasser le tube à l'avant du support 46 à travers l'encoche ae guidage 86 s en dessous de l'élément de guidage 88, et on fixe l'extrémité scellée ?6 du tube dans l'encoche de la fixation 92, comme le montrent mieux les figures 6, y et 8. Un assemblage de tube de réception désigné par 90 dans la figure 6, est constitué d'un tube récepteur 92 qui est serré dans 10 un adaptateur 94. Le tube récepteur est de préférence constitué d'un tube vacutainer bouché et sous vide. Une aiguille hypodermique 96 traverse comme représenté, la partie supérieure 98 de 1' adaptateur 94, et lorsqu'on introduit le tube récepteur 92 dans l'adaptateur, elle perfore le bouchage facilement perforable 100 1b de celui-ci. Une aiguille hypodermique courbée ou un petit conduit similaire 102 traverse, comme représenté, la partie supérieure 98 de l'adaptateur du tube récepteur en traversant le bouchage 100, et fait communiquer le tube 92 avec l'atmosphère. Un microfiltre 104 est placé dans le conduit 102, de façon à filtrer soigneuse-20 ment l'air qui peut s'écouler dans le tube récepteur 92 lorsqu'on perfore son bouchage. Le tube récepteur 92 et l'adaptateur 94 étant en place dans les guidages 106, 108, et 110 du support 46, on voit que le mouvement ascendant de l'adaptateur provoque la perforation du tube 2b de transfert ?4 par l'aiguille hypodermique 96 au voisinage de la soudure 76 du tube, après quoi on peut bloquer l'assemblage de tube récepteur dans la position indiquée, en agissant sur le dispositif de serrage 112. Le tube de transfert 74 et l'assemblage de tube de réception 30 90 étant placés, comme décrit, dans le dispositif 44 de séparation magnétique et de transfert d'échantillon, on voit que la seringue remplie est placée de telle façon que son aiguille perfore le tube de transfert au voisinage de son extrémité soudée 74. L1 ensemble étant dans cette position et la tige d'entraînement du 3> piston étant placée dans l'encoche >4 en un point tel que le piston de la seringue 14 ne soit pas enfoncé, le fonctionnement de l'appareil 72 12419 10 2132800 tesse de déplacement de cette tige étant telle que le débit du mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation dans le tube de transfert soit d'environ 3,5 ml/mn. Lorsque le mélange s'écoule dans le tube de transfert 74 5 autour du noyau 68, les particules magnétiques ainsi que les leucocytes qu'elles ont marqués par suite de la leucoadhérence, de la phagocytose et de l'agglutination, comme décrit en détail précédemment, sont soumises au champ magnétique non uniforme intense qui s'établit dans le séparateur magnétique 56 et est illustré 10 par les lignes de force de la figure 7, qui repousse les particules magnétiques vers le bas au fond du courant et les retient dans la partie du tube de transfert enroulé autour du séparateur magnétique. Le calcul a montré qu'un champ magnétique suffisant pour créer une force vers le bas d'environ 1 000 G sur les parti-15 cules magnétiques avec une longueur du passage du tube de transfert d'environ 90 mm autour du séparateur magnétique 56 avec un débit du mélange d'environ 3,5 ml/mn, permet d'obtenir une rétention très proche de 100 % des particules magnétiques et de les éliminer ainsi efficacement du courant avec les leucocytes qu' 20 elles marquent. Lorsqu'on pompe comme décrit, le mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation de la seringue 10 dans le tube de transfert 7^, on élève la pression dans ce dernier, si bien que la partie du courant qui sort du séparateur magnétique 56 à l'ex-25 trémité du tube de transfert correspondant à la soudure 76, est pompée sous pression dans l'aiguille hypodermique 96 et le tube récepteur 92. Cette partie du courant, qui est pompée comme décrit, dans le tube récepteur 92, contient en suspension dans le plasma sanguin, un pourcentage très élevé de lymphocytes vivants 30 de l'échantillon de sang total traité et une petite quantité résiduelle d'érythrocytes, et une très faible proportion de cellules contaminantes telles que des plaquettes, des éosinophiles et/ou des basophiles. On poursuit l'opération décrite jusqu'à ce que les érythro-55 cytes ou globules rouges qui sont pratiquement sédimentés dans la partie inférieure du corps de la seringue 12, commencent à arriver juste dans la partie du tube de transfert 74 qui est généralement transparent, située après l'élément de guidage 88 comme le montre mieux la figure 6, en arrêtant alors le mouvement 40 ascendant de la tige 52 d'entraînement du piston. Ceci empêche 72 12419 u 2132800 le pompage dar.s le tube récepteur y'2 de la majeure partie des érythrooytes sédimentés dans la partie inférieure de la seringue lu. -or; ...e _e : empa re est terainé, on retire le tube récepteur ■■:d du su p.. crt et de l'adaptateur après juoi on peut séparer facile:.^.!: :»t :;e :"açon -à?Hi.ca.ce iss lymphocytes vivants de la suspension ainsi cl tenue de lymphocytes, d ' érythrocytes, de cellules contaminantes et de plasma, par simple hémolyse et lavage ultérieur -ues lymphocytes et remise en suspension a'une façon connue aes spécialistes, ue traitement d'un échantillon d-e sang total nécessite environ 10 minutes. ,.o .-s it ' on utilise le procédé et 1 ' appareil de l'invention peur séparer comme décrit, des lymphocytes d'échantillon de sang total, on oi.-ti-.-nt cette séparation avec en moyenne une pureté de : a.-; remuement d'environ oO et une viabilité d'environ yO/o, n i^n .u'on ait décrit la séparation -de lymphocytes d'échantillons ae sang, on peut utiliser le procédé et l'appareil de 1' invention pour la séparation d'autres constituants d'échantillons ôe sanf: à condition, bien entendu, eue ces constituants puissent être séparés par utilisation du dispositif de séparation magnétique. -ilen entendu, le procédé et l'appareil de l'invention peuvent s'appliquer à la séparation de constituants d'échantillons autres pue des échantillons de sang. 11 ^st entendu, que les dispositions décrites ci-dessus et per ra\;:c dessins - e-iveut. faire -l'o_ret de diverses varier te modifications ;e aétail sans sortir peur autant du ca-ure " ' invention. bad original 72 12419 i2 2132800 IiEVEIlD IJaT IQhia '0 Appareil pour la séparation des lymphocytes d'un échantillon de sang, caractérisé en ce qu'il comporte un dispositif pour recueillir et mélanger 1 ' échantillon de et un agent de p séparation contenant des particules magnétiques sensibilisées, un dispositif pour incuber le mélange obtenu a' jucent de séparation et d'échantillon de tsang pour réaliser le marquage des leucocytes de l'échantillon de sang par les particules magnétiques sensibilisées, pratiquement à l'exclusion des lymphocytes par leucoadhé-10 rence, phagocytose et agglutination, un dispositif de transfert, un dispositif de séparation magnétique associé au dispositif de transfert, un dispositif de récolte des lymphocytes, un dispositif pour raccorder le dispositif de récolte du mélange de l'échantillon de sang et d'agent de séparation, le dispositif de transit fert et le dispositif de récolte des lymphocytes en permettant le passage entre eux, un dispositif pour faire passer le mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation du dispositif de récolte de l'échantillon de sang et de l'agent de séparation à travers le dispositif de transfert et le dispositif de séparation 20 magnétique qui lui est associé, de façon à retenir pratiquement les leucocytes marqués dans le dispositif de séparation magnétique et permettre l'écoulement continu des lymphocytes à travers le dispositif de transfert dans le dispositif de récolte des lymphocytes . 25 2) .appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de récolte de l'échantillon de sang et de l'agent de séparation est constitué d'une seringue. 3) Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de transfert est constitué d'un tuyau. 50 4) Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de transfert est constitué d'une longueur de tuyau scellé au voisinage de ses extrémités, le dispositif de récolte de l'échantillon de sang et de l'agent de séparation est constitué d'une seringue prolongée par une aiguille hypodermique, le 5? dispositif de récolte des lymphocytes est constitué d'un récipient prolongé par une aiguille hypodermique, et la seringue et le récipient sont raccordés au tuyau par leurs aiguilles hypodermiques respectives qui pénètrent dans la partie intérieure fermée du tuyau en des emplacements espacés de ce dernier. 40 5) Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que bad original 72 12419 15 2132800 l'agent de séparation contient de plus un agent de sédimentation des érythrocytes et que l'appareil comporte de plus un dispositif de sédimentation pour réaliser la sédimentation du mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation, ae façon à provoquer 5 le dépôt aes érythrocytes. o) Appareil selon la revendication caractérisé en ce que le dispositif ae séparation magnétique comporte un passage courbe traversé par un champ magnétique non uniforme de densité élevée et dans lequel passe ledit tuyau. 'lu V) x-rocéaé de séparation des lymphocytes d'un échantillon de sang, caractérisé en ce qu'il consiste à recueillir un échantillon de sang et un agent de séparation contenant des particules magnétiques sensibilisées dans un dispositif de récolte d'échantillon de sang et d'agent de séparation, à mélanger et incuber '(? le mélange obtenu d'échantillon de sang et d'agent de séparation dans le dispositif de récolte pour réaliser le marquage des leucocytes de l'échantillon de sang pratiquement à l'exclusion des lymphocytes, à raccorder le dispositif de récolte et un dispositif de récolte des lymphocytes à un tube de transfert, à faire 2u s'écouler le mélange incubé d'échantillon de sang et d'agent de séparation du dispositif de récolte à travers le tube de transfert, et un dispositif de séparation magnétique associé, en retenant pratiquement les leucocytes marqués dans ce dernier et en faisant s'écouler en continu les lymphocytes à travers le tube ^ de transfert dans le dispositif de récolte des lymphocytes. a) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le dispositif de récolte de l'échantillon de sang, et de l'agent de séparation est constitué d'une seringue prolongée par une ai--'-"uille hypodermique, que le dispositif de récolte des lymphocytes .pu est constitué d'un récipient prolongé par une aiguille hypodermique, et en ce qu'on réalise le raccordement du dispositif de récolte ae l'échantillon de sang et de l'agent de séparation et le dispositif de récolte des lymphocytes par l'intermédiaire du tube de transfert en perforant la paroi du tube de transfert en ;p;> aes points espacés au moyen desdites aiguilles hypodermiques. 9) iroeédé selon la revendication y, caractérisé en ce que l'agent de séparation contient un agent de sédimentation des érythrocytes, et en ce qu'on laisse déposer le mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation dans le dispositif de récol-4u te après avoir réalisé son mélange et son incubation. 72 12419 i 2132800 10) Procédé selon la revendication o, caractérisé en ce qu' on réalise l'écoulement du mélange d'échantillon de sang et d'agent de séparation de ladite seringue en actionnant automatique-mert le piston de la seringue pour pomper le mélange qu'elle con tient dans le tube de transfert à un débit pratiquement constant