Brevet FR2119009A1 — publié le 19720804

La présente invention a pour objet un procédé permettant d'isoler à partir du placenta humain un facteur stabilisant la fibrine. Le facteur stabilisant la fibrine, également 5 désigné sous le nom de facteur XIII, joue un rôle important dans la coagulation du sang. S'il manque dans le sang, il se produit dans le cas de blessures d'importantes hémorragies secondaires, qui ont pour effet de retarder la guérison. La carence en facteur XIII peut être d'origine héréditaire ou 10 apparaître comme conséquence de maladies, par exemple de cirrhoses du foie, de carcinomes, de leucémies ou de coagulo-pathies carentielles. Ces états peuvent prendre des formes mettant la vie en danger, en particulier chez les nouveaux-nés, ainsi que chez les femmes enceintes, chez lesquelles la carence 15 en facteur XIII aboutit à des fausses couches. On peut remédier à ces états de carence par une thérapeutique de substitution. Pour cela, on a eu recours jusqu'à présent à l'utilisation de sang, de plasma ou de préparations à base de fibrinogène. Dans tous les cas, il est 20 cependant nécessaire d'infuser des volumes importants de ceux-ci, ce qui est peu souhaitable dans nombre de cas, et, de plus, cause des désagréments et des pertes de temps. En outre, les malades reçoivent inévitablement d'autres protéines, ainsi que les substances déterminant les groupes sanguins, ce qui 25 peut entraîner des phénomènes d'incompatibilité. Il était donc hautement souhaitable que l'on disposât d'une préparation qui possédât une puissante action fibrinostabilisante, fût largement exempte de protéines accessoires et ne contint pas de substances liées aux groupes sanguins. 30 On savait déjà, certes, que le facteur XIII est contenu dans le plasma sanguin et dans les thrombocytes et que l'on peut l'isoler à partir du plasma. On l'obtenait par précipitation au moyen de sulfate d'ammonium, chauffage et chromâtographie sur DEAE-cellulose. Néanmoins la concentration 35 plasmatique du facteur fibrinostabilisant est faible et le rendement du procédé indiqué est, par conséquent, bas. Le chauffage grâce auquel on sépare le facteur XIII du fibrinogène ne peut être réalisé que sur des quantités réduites. C'est pourquoi le procédé n'a pu se faire une place dans la technique. mD ORIGINAL^ j 71 46139 2 2119009 ".'De plus, le plasma est trop coûteux, en tant que matière de départ, pour obtenir le facteur XIII dans des conditions économiques. Pour la même raison, les thrombocytes ne peuvent constituer une matière de départ pour la prépara-5 tion industrielle du facteur XIII. Or, la Demanderesse a trouvé que l'on peut obtenir, avec de bons rendements, le facteur XIII fibrinostabilisant à partir du placenta humain. La présente invention a donc pour objet un procédé d'isolement du facteur XIII, procédé comportant 10 les étapes suivantes : a) à un extrait préparé, au moyen d'une solution de NaCl, à partir de placentas humains, et débarrassé des impuretés solides, on ajoute, à un pH allant de 5,0 à 7,5, de préférence égal à 6,0, une solution à environ 3 % de lactate de diamino- 15 éthoxy-acridine ("Rivanol"), b) on décompose le précipité qui s'est formé dans un milieu aqueux neutre, en utilisant de 1,5 à 3 %, de préférence 2 %, d'un chlorure alcalin, de préférence NaCl, on ajoute de 12 à 20 % en volume d'un alcool inférieur, de 20 préférence l'éthanol, puis on sépare le précipité, c ) on clarifie le surnageant, on abaisse, par addition d'eau, la teneur en chlorure alcalin à une valeur égale ou inférieure à 2 %, de préférence au voisinage de 1 %, après quoi on ajoute à la solution, à une température comprise entre -5 et 25 +5°j de préférence égale à 0°, avec un pH compris entre 5*5 et 6,5, de préférence égal à 5,8, de 12 à 20 % d'un alcool inférieur, de préférence l'éthanol, d) on dissout, à une température voisine de 0°, la fraction restante dans un tampon neutre constitué d'acide 30 éthylène-diamine-tétra-acétique et d'un hydroxyde alcalin, lequel peut contenir en outre de faibles proportions de NaCl, de NaN^ et de glucose, on élimine un résidu insoluble éventuellement présent, puis on fractionne la solution par filtrktion sur gel, 35 e ) on chromâtographie les fractions actives sur des échangeurs d'ions à base de cellulose, on élue avec une solution neutre diluée de NaCl, contenant une faible proportion d'acide £ -amino-caprol'que, après quoi on dialyse l'éluat contre un tampon neutre au phosphate de sodium, dont la concentration 40 va de 0,01 à 0,02 %, et est de préférence égale à 0,015 %> bad original 71 46139 3 21Î9009 contenant une faible quantité de glucose, f) on ajoute éventuellement un stabilisant à la solution dialysée, on la filtre dans des conditions de stérilité, on la normalise et on la lyophilise. 5 Comme exemples de stabilisants appropriés, on citera l'albumine humaine et la gélatine dégradée par hydrolyse et réticulée au moyen d'isocyanates, que l'on trouve dans le commerce sous le nom d "'Haemac cel". Le facteur fibrinostabilisant isolé conformément à 10 l'invention à partir du placenta humain ne se distingue pas par ses caractéristiques du facteur XIII des thrombocytes, mais est très différent du facteur XIII plasmatique. Les données relatives aux caractères chimiques et physicochimiques sont rassemblées dans le tableau suivant. 15 Provenance du facteur XIII Plasma Thrombocytes Placenta Coefficient de sédimentation 8,4 S 7,4 S 7,2 S Poids moléculaire 300.000 150.000-200. 000 165.000 Teneur en glucides, en % 4,9 1 >5 1,47 20 hexoses 1,9 1,2 0,98 fucose 0,2 0,0 0,0 hexosamine (N-acétylée) 1,6 0,16 0,28 acide neuraminique (N-acétylé) 1,2 0,15 0,21 25 Restes d'amino-acides en % de leur total 30 35 40 lysine histidine arginine acide aspartique thréonine sérine acide glutamique proline glycine a lan ine valine méthionine isole ucine leucine tyrosine phé ny la lan ine 1/2 cystine 6,3 2,5 5,5 10,4 7,2 7.2 12,7 5.7 7,9 4,1 7,5 2.0 4.8 7.3 5,0 3.9 ? 5.7 2. 0 6.2 12,2 5,9 5.8 10,8 4,6 7.1 5.3 9.9 2,6 5.2 6,8 4,2 4,5 1,2 5.1 1*9 6.2 12,2 6,2 6,1 11.0 4,9 7,0 5> 3 9,7 2.6 5.0 6.7 4,4 4,6 1.1 bad original 71 46139 n 2119009 On détermine l'activité du facteur fibrinostabilisant à l'aide d'une épreuve de dilution (cf. Thromb. diathes. haemorrh. 2^, 455 (1970)). On met à profit, pour cela la différence de solubilité de la fibrine réticulée et de la fibrine 5 non réticulée (par suite du manque de facteur fibrinostabilisant ) dans l'acide chloracétique à 1 %. Avec des dilutions croissantes de la solution à évaluer on provoque d'abord, à l'aide de thrombine, la formation de caillots de fibrine à partir de fibrinogène exempt de facteur XIII, puis on fait incuber 10 avec de l'acide chloracétique à 1 %. On détermine ensuite la dilution maximum pour laquelle le caillot de fibrine existe encore C'est là la concentration du facteur XIII qui est juste suffisante pour la réticulation. Avec la dilution immédiatement supérieure, le caillot de fibrine se dissout. 15 Comme substance de référence, on utilise un mélange de plasmas humains normaux. On définit comme unité l'activité du facteur XIII contenue dans 1 ml. L'activité fibrinostabllisante recherchée est calculée par le rapport entre les valeurs limites de la dilution pour le mélange de 20 plasma et pour la solution mise à l'épreuve. Comme domaine d'application pour le facteur XIII obtenu conformément à l'invention, on peut envisager tous les états de déficience en facteur XIII, par exemple les déficiences congénitales, avec les syndromes hémorragipares, les saignements 25 et les retards dans la guérison des plaies, ainsi que les insuffisances passagères en facteur XIII, par exemple après les opérations, avec les retards de la cicatrisation qui en résultent. La solution contenant le facteur XIII est injectée par la voie intraveineuse. Il est bon de débuter par une 30 quantité correspondant à l'activité facteur XIII de 250 ml de plasma humain frais. En fonction des besoins, on peut appliquer jusqu'à une quantité quadruple. L'exemple qui suit a pour but d'illustrer ila présente invention. Les températures sont indiquées en degrés 35 Celsius. EXEMPLE : On met en menus fragments 50 kg de placenta humains congelés et on les mélange avec 50 litres d'une solution à 0,5 % de NaCl. On chauffe le mélange à +10° et on centrifuge 40 le tout. A 45 litres de cet extrait on ajoute une solution à 3 % bad original 71 46139 5 2119009 de "Rivanol" (d'environ 6 à 10 g, de préférence 8 g de Rivanol pour 100 g de protéines), on met en suspension dans de l'eau neutre le précipité qui s'est formé et on ajoute une solution de chlorure de sodium jusqu'à ce que la concentration en NaCl 5 soit comprise entre 1,5 et 3 et, de préférence, égale à 2 %. Après avoir agité pendant 5 minutes, on ajoute, à une température de 10 à 25°, de préférence égale à 20°, 4,55 litres d'éthanol, puis on agite pendant encore une heure. On rejette la fraction résiduelle qui s'est formée lors de la centrifugation. 10 On clarifie au moyen de charbon actif le surnageant, dans lequel réside l'activité fibrinostabllisante, on abaisse à 1 % la concentration du chlorure de sodium par addition d'eau neutre, on refroidit la solution à 0° et on introduit, tout en agitant, 3^7 litres d'éthanol. On règle la valeur du pH à 5,8. 15 Après centrifugation, on décante le surnageant et on le rejette. On reprend la fraction restante par 100 ml d'un tampon acide éthylène-diamine-tétra-acétique/hydroxyde de sodium à pH 7,0, lequel contient 0,1 % d'acide éthylène-diamine-tétra-acétique, 1 % de chlorure de sodium, 0,1 $ d'azoture de 20 sodium et 0,5 % de glucose, et qui a été refroidi préalablement à 0°. Après passage en solution, on réajuste le pH à 7,0. Par addition de chlorure de sodium frais, on élève à 2 % la concentration en NaCl. On élimine l'insoluble par centrifugation. On fractionne le surnageant sur Sephadex et on élue à l'aide 25 d'un tampon tris-(hydroxyméthyl)-amino-méthane/HCl, qui contient 0,005 -oie/litre d'acide éthylène-diamine-tétra-acétique et 0,1 % d'azoture de sodium. On recueille l'éluat dans un collecteur de fractions. Les fractions actives réunies contiennent environ 1200 mg de protéines que l'on adsorbe sur de la 30 diéthyl-cellulose. On utilise pour cela 24 ml de DE-cellulose. Pour l'élution,on utilise 50 ml d'une solution à pH 7 de 0,6 % de chlorure de sodium et 0,1 % d'acide £-amino-caproïque. On dialyse l'éluat pendant 24 heures contre 50 litres d'un tampon à 0,015 % de phosphate de sodium, à pH 7,0, qui contient 35 5 mg de glucose par ml. On obtient à partir du produit final 241 doses, dont l'activité de chacune équivaut à celle de 250 ml de plasma frais. Cette quantité correspond à plus de 120 litres de sang. BAO 71 46139 2119009 Etant donné que l'activité de la matière de départ n'est pas toujours la même, les rendements peuvent eux aussi varier. A partir d'un produit analogue, provenant de 45 litres d'extrait placentaire, on a obtenu 147 doses, dont l'activité 5 de chacune équivalait à celle de 250 ml de plasma frais, soit en tout l'équivalent de plus de 70 litres de sang. Il résulte néanmoins des deux essais que le procédé conforme à l'invention est techniquement avantageux. l ! bad original 71 46139 7 2119009 REVENDICATIONS 1.- Procédé permettant d'isoler un facteur fibrino-stabilisant, caractérisé en ce que : a) à un extrait préparé, au moyen d'une solution 5 de NaCl, à partir de placentas humains et débarrassé des impuretés solides, on ajoute, à un pH allant de 5^0 à 7,5, de préférence égal à 6,0, une solution à environ 3 % de lactate de diamino-éthoxy-acridine ("Rivanol"), b) on décompose le précipité qui s'est formé dans 10 un milieu aqueux neutre, en utilisant de 1,5 à 3 %, de préférence 2 %, d'un chlorure alcalin, de préférence NaCl, on ajoute de 12 à 20 % en volume d'un alcool inférieur, de préférence l'éthanol, puis on sépare le précipité, c) on clarifie le surnageant, on abaisse, par 15 addition d'eau, la teneur en chlorure alcalin à une valeur égale ou inférieure à 2 %, de préférence au voisinage de 1 %, après quoi on ajoute à la solution, à une température comprise entre -5° et +5°, de préférence égale à 0°, avec un pH compris entre 5,5 et 6,5, de préférence égal à 5,8, de 12 à 20 20 #d'un alcool inférieur, de préférence l'éthanol, d ) on dissout, à une température voisine de 0°, la fraction restante dans un tampon neutre constitué d'acide éthylène-diamine-tétra-acétique et d'un hydroxy alcalin, lequel peut contenir en outre de faibles proportions de NaCl, 25 de NaN-j et de glucose, on élimine un résidu insoluble éventuellement présent, puis on fractionne la solution par filtration sur gel, e ) on chromatographie les fractions actives sur cellulose, on élue avec une solution neutre diluée de NaCl, 30 contenant une faible proportion d'acide £-amino-caproïque, après quoi on dialyse l'éluat contre un tampon neutre au phosphate de sodium, dont la concentration va de 0,01 à 0,02 %, et est de préférence égale à 0,015 contenant une faible quantité de glucose, 35 f) on ajoute éventuellement un stabilisant à la solution dialysée, on la filtre dans des conditions de stérilité, on la normalise et on la lyophilise. 2.- Procédé d'isolement d'un facteur fibrinostali-lisant, caractérisé en ce que l'on utilise comme matière de 40 départ des placentas humains.