Brevet FR2119018A1 — publié le 19720804

La présente invention se rapporte à un procédé permettant, de préparer des aminoacides à l'aide d!enzyroes. Il permet de préparer le L-tryptophane, le 5-hydroxy-L-tryptophane> le 5-méthyl-L-tryptophane et 5-amino-I.-tryptophane facilement et à bon marché. 5 Le I-tryptophane est l'un des aminoacides essentiels et le 5-hvdroxy-L-tryptophane est utilisable en tant que médicament. On sait que certains micro-organismes cultivés dans un milieu contenant -;r.e matière première du tryptophane comme l'indole ou l'acide anthranilique. produits du I-tryptophane , Mais les concentrations de ce 10 coœpcsé -jan? le milieu de culture sent très faibles lorsqu'on opère par les procédé de la teitmique antérieure. Quant aux 5-hydroxy-L-tryptophanes, on eu n'a jamais df rît de préparation biologique. La demanderes.se a maintenant trouvé que lorsqu'on taisait réagit en composé de formule générale 15 H 20 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène., un groupe hydroxy, méthyle ou amino, avec a) des ions ammonium et b) un acide choisi dans le groupe formé par l'acide pyruvique, l'acide oxalacétique, l'acide tcalique, l'oxime maléique, l'acide fumarique, l'acide glyoxylique, et l'acide lactique en solution aqueuse, 25 en présence d'une quantité efficace de tryptophanase ou d'une source de tryp-tophanase, on produisait avec des rendements très élevés un aminoacide de formule générale : H dans laquelle R a la significaticr. indiquée ci-dessus. L enzyme tryptephanase est connue pour catalyser la décomposition du L-tryptophane en indole, ammoniaque, et acide pyruvique. On peut utiliser dans l'invention une préparation d'enzyme pur mais on préfère les sourcesde BAD ORIGINAL 71 46192 2119018 tryptophanase. Ces sources peuvent consister en un bouillon dans lequel on cultive un micro-organisme capable de produire l'enzyme ou en filtrat exempt de cellule d'un tel bouillon, une suspension aqueuse des cellules, ou des cellules broyées, ou un filtrat obtenu à partir d'une telle suspension. 5 Les micro-organismes capables de produire l'enzyme existent en abondance et appartiennent aux genres Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Proteus, Citrobacter, Paracolobactrum, Sâlmonella et Kluyvera. Parmi les espèces qui conviennent on citera Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Erwinia herbicola, Pseudomonas perlurida, Xanthomonas 10 campestris, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Paracolobactrum coliforme, Salmonella gallinarum et Kluyvera citrophilla. Les milieux employés pour la culture des micro-organismes peuvent consister en milieux classiques contenant des sources de carbone et d'azote assimilables et les substances nutritives mineures usuelles avec une 15 proportion appropriée de tryptophane, de 5 hydroxy-tryptophane, de 5-méthyl-tryptophane ou de 5-amino-tryptophane. On a pu procéder à des cultures satisfaisantes sur des milieux contenant des hydrates de carbone comme le glucose, le fructose, le saccharose, le mannose, le maltose, le mannitol, le xylose, le galactose, l'amidon hydrolysé et les mélasses. On peut également 20 utiliser comme source de carbone, principale ou source de carbone supplémentaire pour des micro-organismes choisis des acides organiques comme l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide fumarique, l'acide mali-que, l'acide a-céto-glutarique, l'acide gluconique et l'acide pyruvique, des alcools comme le méthanol, l'éthanol, le propanol; et le butanol, des acides 25 gras et des hydrocarbures. La concentration de la source de carbone dans le '-milieu est normalement comprise entre 0,1 et 10 g/dl, exprimé en équivalents de glucose. L'azote peut être apporté par des sels d'ammonium d'acidesminé-raux ou organiques comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phos-phorique, l'acide nitrique, l'acide acétique et l'acide carbonique, par l'urée 30 et par l'ammoniaque en solution aqueuse ou à l'état gazeux. On utilise comme source d'azote supplémentaire, d'autres substances organiques azotées comme la liqueur de macération de maïs, l'extrait de levure, les peptones, l'extrait de viande et 1'aminé NZ. Le milieu doit également contenir des sels minéraux et des 35 substances nutritives organiques mineures qui favorisent la croissance des micro-organismes. Parmi les sels minéraux, on citera le phosphate dispotassique, le phosphate monopotassique, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, 71 46192 2119018 le sulfate ferreux, lesulfate de manganèse, le sulfate de zinc, le.sulfate de zinc, le sulfate de cuivre et le carbonate de calcium. Parmi les substances organiques connues pour activer la croissance on citera les aminoacides d'une manière générale, la biotine, les vitamines, les acides organiques, les acides 5 gras, et les substances contenant des protéines. Elles peuvent être remplacées par des substances qui fournissent l'agent actif dans les conditions de la culture, comme les extraits de viande, les peptones, l'extrait de levure, la liqueur de macération de maïs, le lait écrémé, l'extrait de chlorella et les hydrolysats de protéines de soja. 10 On doit introduire dans le milieu du tryptophane, du 5-hydroxy- tryptophane, du 5-méthyl-tryptophane, ou du 5-amino-tryptophane en proportions supérieures à 0,01 g/dl et de préférence comprises entre 0,05 et 0,5 g/dl. Le tryptophane peut être apporté sous la forme de substances nutritives organiques par exemple sous la forme d'un mélange d'aminoacides, d'un polypeptide, 15 ou d'extrait de soja. Lorsqu'on cultive le micro-organisme capable de produire la tryptophanase dans un milieu tel que décrit ci-dessus en présence d'un surfactif •l'activité enzymatique de la tryptophanase est très élévée. Parmi les surfactifs utilisables on citera des surfactifs non ioniques, anioniques, cationiques et 20 amphotères, les surfactifs non ioniques constituant les produits préférés. Parmi les surfactifs utilisables, on citera : Surfactifs cationiques: les halogénures de cétyltriméthylammonium surfactifs anioniques : 25 sulfonate d'alcool laurique alkylarylsulfonates surfactifs amphotères imidazolines surfactifs non ioniques 30 éthers polyoxyéthylénés d'alkylphénols éthers polyoxyéthylénés d'alcanols esters monoalkyliques polyoxyéthylénés de sorbitanne esters monoalkyliques de sorbitanne éthers alkyiaryliques polyoxyéthylénés 35 alkylolamides gras triélates polyoxyéthylénés. 71 46192 2119018 Les surfactifs sont en général présents dans le milieu de culture en proportion de 0,1 à 10 g/dl. La culture est effectuée dans des conditions aérobies à une température de 25 à 40°C. En cours de culture, on règle de préférence le pH 5 du milieu à une valeur de 5,5 à 8,5,/ La culture dure en général de 10 à 72 heures. Le bouillon peut être utilisé tel quel comme source d'enzyme sans élimination des cellules bactériennes. Mais on peut également utiliser comme source d'enzyme dans le procédé selon l'invention un filtrat exempt de cellules du bouillon de culture, une suspension de cellules ou une suspen-10 sion de cellules bactériennes broyées préparée par trituration, autolyse ou oscillation ultrasonique. On peut également utiliser de l'enzyme brut^ou de l'enzyme pure isolée par centrifugation, relargage, ou précipitation par un solvant. Les aminoacides de formule II peuvent être obtenus par addition 15 du composé de formule I, d'ions ammonium et de l'acide choisi, à l'état libre, à l'état de sel ou de dérivé, au milieu aqueux, en cours de culture. Les composés de formule I qu'on peut utiliser comme produit de départ dans l'invention sont l'indole, le 5-hydroxy-indole, le 5-méthyl-indole, et le 5-amino-indole qu'on introduit en proportion de 0,1 à 20 g/dl. 20 Les acides utilisés comme source de la partie alanine de l'aminoacide de formule II sont l'acide pyruvique, l'acide oxalacétique, l'acide malique, l'acide fumarique, l'oxime maléique, l'acide glyoxylique, ou l'acide lactique dont on peut également utiliser des sels ou d'autres dérivés. L'acide pyruvique, l'acide oxalacétique, l'acide malique, l'acide fumarique, l'oxime 25 maléique, l'acide glyoxylique et l'acide lactique peuvent se trouver à l'état d'acides libres, de sels par exemple de sels d'ammonium, de sodium, de potassium ou de calcium, ou d'esters par exemple d'esters méthyliques ou éthyliques; on peut encore utiliser d'autres dérivés. On utilisera de préférence les sels d'ammonium. La quantité d'acide présent dans le mélange de réaction sera de 30 préférence, exprimée en acide libre, de 1 à 200 g/1. Les ions ammonium peuvent être ajoutés en proportion de 0,1 à 20 g/dl. 1 La réaction est de préférence effectuée à un pH de 5 à 10 et à une température de 10 à 50°C. Le pH peut être maintenu par addition de carbonate de calcium, d'ammoniaque, d'un alcali caustique ou d'un tampon phosphaté. ^ Le rendement en produit final peut être accru dans une mesure considérable par addition au mélange de réaction de vitamine Bô, par exemple de phosphate de pyridoxal, de pyridoxal ou de pyridoxine et/ou d'un séquestrant 71 46192 2119018 Parmi les agents réducteurs qui conviennent on citera les acides sulfureux, le sulfite de sodium, le sulfite de potassium, le sulfite d'ammonium, l'acide thiosulfurique, le thiosulfate de potassium, le thiosulfate de sodium, le thiosulfate d'ammonium, la eystéine, le p-mercaptoéthanol et l'acide ascorbique. 5 La vitamine B6 et les agents réducteurs sont en général utilisés en proportion de 0,1 à lg/dl. Le rendement en produit final peut également être accru dans une mesure considérable par addition d'inosine au mélange de réaction. Par exemple, le L-tryptophane produit et l'inosine réagissent dans le milieu avec 10 formation d'un précipité de complexe tryptophane-inosine. Ce complexe peut être facilement décomposé en tryptophane et inosine par traitement en solution aqueuse à un pH inférieur à 4 ou séparieur à 10. Les aminoacides produits dans le mélange 15 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter; dans ces exemples, les indications de parties et de °L s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemgle_l 20 On prépare un milieu de culture contenant de 2g/l de L-tryp- tophane, 5 g/1 de KH^PO^, 0,5g/l de MgSO^, 7H^0, 2 ppm d'ions Fe et Mn, 2g/l de glycérol, 2 g/1 d'extrait de levure et 5 g/1 d'acide "Casamino", à pH 7,0; pour des fractions de 60 ml de milieu on inocule au moyen d'une boucle de \ bactéries comme indiqué dans le tableau I ci-après et on cultive à 31"C pendant 25 20 heures en secouant. On centrifuge 1 litre du bouillon de culture; on recueille les cellules bactériennes, on les introduit dans 1 litre d'une solution contenant A) 20 g d'indole, 24 g de pyruvate de sodium et 40 g d'acétate d'ammonium, pH 8,0, B) 20 g d'indole, 24 g d'acide oxalacétique et 40 g d'acétate d'ammonium, pH 8,0, 30 c) 20 g de 5-hydroxy-indole, 24 g d'acétate de sodium et 40 g d'acétate d'ammonium, pH 8,0 et D) 20 g de 5-hydroxy-indole, 24 g d'acide oxalacétique et 40 g d'acétate d'ammonium, pH 8,0. Chacune des solutions de réaction est agité à 37°C pendant 20 heures. Les quantités de tryptophane et de 5-hydroxy-L-tryptophane trouvées dans les mélanges de réaction sont rapportées dans le 35 tableau I ci-après . 71 46192 2119018 Bactéries utilisées TABLEAU I Concentration du produit final Tryptophane, g/1 5-OH-triptophane (g/1) Solution A 5 Proteus mirabilis ATCC 15290 8,0 Escherichia coli ATCC 3655 4,6 Escherichia coli ATCC 10798 5,2 10 Erwinia herbicola ATCC 21433 2,2 Erwinia herbicola ATCC 21434 2,4 Pseudomonas perlurida ATCC 490 3,4 15 Aerobacter aerogenes ATCC 8724 4,4 Aerobacter aerogenes ATCC 7256 4,0 Aerobacter liquefaciens ATCC 14460 6,0 20 Salmonella gallinarum ATCC 9148 2,1 Citrobacter freundii ATCC 8090 2,3 Citrobacter freundii ATCC 6750 2,4 25 Kluyvera citrophila ATCC 14236 3,4 Xanthomonas campestris ATCC 7381 1,8 Clostridium felsineum ATCC 13160 1,5 - Solution B 6.2 3,8 4,1 1.8 1.9 2.7 3,6 3.3 5,1 1.8 1.9 1,9 2,5 1,5 1, 2 Solution C 4,8 3,0 3.2 1,7 1,7 2.3 3,0 2,7 3,0 1,5 1.0 1.1 1,3 1,3 1,1 Solution D 4.2 2.3 2,5 1.5 1.6 2.1 2,5 2.4 2,4 1.2 0,7 0,7 . 0,9 0,5 0,8 30 A un litre du mélange de réaction d'Escherichia coli ATCC 3655, on ajoute une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium en quantité suffisante pour dissoudre le précipité de tryptophane et on filtre la solution en présence de terres de diatomées. On règle le pH du filtrat à 4,0 par HC1 et on introduit la solution dans une colonne garnie de charbon actif; le L-tryptophane est adsor-35 bé sur le charbon actif, on l'élue par de l'ammoniaque aqueuse 2N. On amène l'ékiat à sec, on lave les cristaux à l'acétone; on obtient 5,2 g de L-tryptophane cristallin pur. 71 46192 2119018 10 Exemple 2 On introduit les cellules bactériennes obtenues à partir de 100 ml des bouillons de culture des bactéries énumérées dans le tableau II ci-après à des volumes de 100 ml de solutions contenant 1,0 g/dl respectivement; de lactate de calcium, d'acide malique, d'acide glyoxylique, d'oxime maléique ou d'acide fumarique, 2,0 g/dl d'acétate d'ammonium et 1,5 g/dl d'indole; on règle le pH à 8,0 et on agite chacun des mélanges à 37°C pendant 44 heures. La concentration ai L-tryptophane produit dans les mélanges de réaction est rapportée dans le tableau II ci-après. TABLEAU_II_ Concentration en tryptophane produit avec 15 20 25 30 Erwinia herbicola ATCC 21 433 Citrobacter freundii ATCC 6750 Proteus mirabilis ATCC 15290 Pseudomonas perlurida ATCC 490 Salmonella gallinarum ATCC 9148 Escherichia coli ATCC 3655 Paracolobactrum coliforme ATCC 11605 Xanthomonas campestris ATCC 7381 Kluyvera citrophila ATCC 14 236 Aerobacter aerogenes Acide malique 0,5 1,0 3,0 0,5 1,3 1,0 1,0 0,4 0,4 0,5 Acide Acide Acide Oxyme fumarique glyoxylique lactique malique 0,3 0,7 0,7 0,8 1,0 0,5 0,5 0,3 0,6 0,8 0,2 1,0 1,0 0,7 0,7 1,0 0,9 0,6 0,4 0,8 ATCC 7256 Exemg1e_ 3_ On prépare un milieu de base contenant : liqueur de macération de maïs 2,0 ml/dl 35 KHoP0a 0,05 g/dl 2 4 MgS04, 7H20 ions Fe et Mn glycérol Extrait de levure pH. : 7,5 (par KO H) 0,05 g/dl 2 ppm 0,2 g/dl 2,0 g/dl 2,0 1,5 3,8 2.0 1,7 3,5 1.1 0, 6 1,5 1,5 0,4 1.4 1,3 0,6 1.5 1.0 0,8 0,3 1.1 1.2 71 46192 2119018 Dans ce milieu de base on introduit respectivement 0,2 g/d.1 de L-tryptophane, (milieu A), 0,2 g/dl de 5-hydroxy-L-tryptophane (milieu B), et 0,2 g/dl de 5-méftçi-fetryptqiiane (irdJieu C)des volumes de 60 ml de ces milieux sont inoculés à l'aide d'une cuillère à café d'une culture de Proteus mirabilis 5 ATCC 15 290 obtenue au préalable sur gélose inclinée au bouillon à 30°C pendant 20 heures. Les milieux A, B et C sont ensuite cultivés à 31°C pendant 20 heures en secouant. Dans chacun des bouillons cultivés A, B et C, on introduit 2,0 g/dl de pyruvate de sodium, 4,0 g/dl d'acétate de sodium et 2,0 g/dl 10 d'indole; on règle le pH des bouillons à 8,0 par de l'ammoniaque aqueuse et on agite les mélange à 37°C pendant 40 heures. Les concentrations en L-tryptophane produit dans les mélanges de réaction sont rapportées dans le tableau III ci-après TABLEAU_III_ 15 Mélange de réaction Concentration de L-tryptophane produite SII Milieu A 8>5 Milieu B 4,5 Milieu C 3,8 Exemple 4 20 On prépare un milieu de culture contenant 0,2 g/dl de L-tryptophane, 0,1 g/dl de KH2P0^, 0,05 g/dl de MgSO^, 7H2°, 2 ppm d'ions Mti et Fe, 2 ml/dl de liqueur de macération de maîs, 1 g/dl d'extrait de levure et 0,5 g /dl 25 d'acide "Casamino"; on règle le pH à 7,5 par une solution de KOH. On inocule ce milieu par Proteus morganii IFO 3848 et on culture à 31°C pendant 20 heures. On centrifuge des fractions de 100 ml du bouillon de culture; on récolte les cellules bactériennes et on les introduit dans 100 ml des solutions A, B, C et D ci-après qu'on maintient ensuite à 37°C pendant 44 heures : 30 Solution A indole 1,5 g/dl Acide pyruvique 1,5 g/dl 1 pH : 8,0 (par NH^OH) Solution B 35 indole 1,5 g/dl pyruvate de sodium 1,5 g/dl acétate d'ammonium 3,0 g/dl pH 8,0 (par NH^OH) 71 46192 2119018 Solution C indole 1,5 g/dl pyruvate de calcium 1,5 g/dl acétate d'ammonium 3,0 g/dl 5 pH 8,0 (par NH^OH) Solution D indole 1,5 g/1 pyruvate de sodium 1,5 g/dl chlorure d'ammonium 3,0 g/dl 10 pH : 8,0 (par NH^OH) Les concentrations en L-tryptophane produit dans les solutions sont les suivantes : Mélange de réaction Concentration de tryptophane produite g/1 Solution A 4, 5 15 Solution B 9,6 Solution C 8,0 Solution D 7,5 Exemple 5 20 On traite des cellules bactériennes de Proteus morganii IFO 3848 obtenues à partir de 30 litres de bouillon de culture préparé comme décrit dans l'exemple 4 par des ondes ultrasoniques à la fréquence de 20 kilo-cycles /seconde pendant 15 minutes dans un tampon phosphate 0,05 M à pH 6,0. La suspension des cellules traitées est centrifugée; on mélange le liquide sur-25 nageant avec du sulfate d'ammonium; la protéine enzymatique précipite; on purifie l'enzyme par traitement avec de la protamine, avec du Sephadex-DEAE et avec du Sephadex G-150. On ajoute 40 mg (en protéines) de l'enzyme obtenue à 100 ml d'unesolution contenant 30 indole 2,0 g/dl pyruvate de sodium 2,0 g/dl Acétate d'ammonium 4,0 g/dl Na2S03 0,2 g/dl acide éthylènediaminetétracétique 0,1 g/dl 35 phosphate de pyridoxal 0,01 g/dl pH 8,0 (par NH40H) 71 46192 2119018 15 et on maintient la solution mélangée à 37°C pendant 20 heures. On constate que le mélange de réaction contient alors 6,4 g/1 de L-tryptophane. Exemgle_6 5 On cultive Proteus morganii IFO 3848 comme dans l'exemple 4, en mélange des fractions de 100 ml du bouillon de culture avec 2,0 g d'indole, 2,0 g de pyruvate de sodium et 2,0 g d'acétate d'ammonium et on règle le pH des mélanges à 8,0 par de l'ammoniaque aqueuse. On maintient les mélanges à 37°G pendant 44 heures tels quels dans un cas, et en présence respectivement 10 de 10 mg de phosphate de pyridoxal, de 10 mg de pyridoxal et de 10 mg de pyridonxine dans les trois autres cas. La concentration en L-tryptophane trouvée dans chaque cas est la suivante : Présence de vitamines de Quantité de tryptophane la série B6 produite, g/1 Néant 5,5 Phosphate de pyridoxal 10,5 Pyridoxal 7,0 Pyridoxine 8,5 Exemple 7 On ajoute les cellules bactériennes obtenues à partir de 10 ml de bouillons de culture des bactéries énumérées dans le tableau IV ci-après, cultivées comme décrit dans l'exemple 1, à 10 ml des solutions I et II ci-après et on laisse réagir à 37°C pendant 20 heures : Solution I 25 5-méthyMndole 2,0 g/d.1 pyruvate de sodium 2,0 g/dl acétate d'ammonium 2,0 g/dl pH 8,0 (par NH^OH) Solution II 30 5-amino -indole 2,0 g/dl pyruvate de sodium 2,0 g/dl acétate d'ammonium 2,0 g/dl1 pH 8,0 (par NH^OH) Les concentrations en 5-méthyl-L-tryptophane produit dans 35 les solutions I et en 5-amino-L-tryptophane produit dans les solution II sont rapportées dans le tableau IV ci-après. 20 71 46192 11 2119018 10 Bactériei Erwinia herbicola ATCC 21433 Escherichia coli ATCC 7009 Proteus Mirabilis ATCC 15290 Aerobacter aerogenes ATCC 8724 Kluvvera citrophila ATCC 14236 TABLEAU^IV Concentration de 5-méthyl-tryptophane. k/1 5-amino-trypLophane g/I 1,2 2,5 3,0 1,5 2,0 1,5 2,8 3,5 1,8 On prépare des niiliaux de culture A, B et C. possédant les 15 compositions suivantes : 20 25 30 Const1tuant Milieu A Milieu B Milieu C L-tryptophane, g/dl 0,2 0,2 0,2 KH?P04> ft'dl 0,5 0,5 0,5 MgSO^, ;H00 g/dl 0,05 0,05 0,05 Fifieurde macération de maïs, ml/dl 6,0 6,0 6,0 Hydr-m •/3at de protéines de coia, a/dl 2,0 2,0 2,0 indoie g/dl 0 0, 05 0, 05 Sorpol W-200 0 0 1,0 PH 7,5 7, 5 7,5 5t Sorpol W-200 : marque commercial d'un détergent non ionique. On inocule des fractions de 60 ml des milieux de culture par Pioreusmirabilis ATCC 15290 cultivé au préalable sur une gélose au bouillon incliné, et on cultive à 31°C pendant 20 heures en secourant. On ajoute les cellules bactériennes obtenues à partir de 10 ml des bouillons de culture A, B et C à 10 ml d'une solution contenant 3 g/dl d'indole, 3 g/dl de pyruvate de sodium et 3 g/dl d'acétate d'ammonium, pH 8,0, et on laisse réagir à 37°C pendant 20 heures. Les concentrations en L-tryptophane produit sont les suivantes 35 1 BAD 0R1GINAU 71 46192 2119018 Milieu de culture Milieu A Milieu B Milieu C Concentration en tryptophane produit g/1 20,0 0,8 23,8 10 15 20 Exemgle_9_ On culture Aerobacter aerogenes ATCC 8724 dans des milieux contenant la quantité de L-tryptophane indiquée dans le tableau V ci-après, 0,5 g/dl de 0,05 g/dl de MgSO^, 71^0; 6,0 ml/dl de liqueur de macé ration de mats et 2,0 g/dl d'hydrolysat de protéines de soja, pH 7,5, en présence de la concentration de Sorpol W-200 indiqué dans le tableau V; On ajoute les cellules bactériennes obtenues à partir de 10 ml des milieux de culture à des solution contenant 3 g/dl d'indole, 3 g/dl de pyruvate de sodium et 3 g/dl d'acétate d'ammonium, pH 8,0 et on maintient les mélanges à 37°C pendant 20 heures. La concentration en L-tryptophane produit dans les mélanges de réaction est indiquée dans le tableau V ci-après . TABLEAU V 25 Concentration du détergent dans le milieu de culture, g/dl Concentration en tryptophane produit, g/1 concentration en tryptophane introduit dans le milieu de culture. 0,2 g/dl 16 25 28 28 0,6 g/dl 11 24 44 46 30 35 Les résultats rapportés dans les exemples 8 et 9 montrent que l'inhibition de la production d'enzyme par 1'indole est fortement contre-battue par le surfactif ajouté au milieu de culture. Exemgle 10 On cultive Proteus mirabilis ATCC 15290 et Aerobacter aerogenes ATCC 8724 dans des milieux contenant 0,6 g/dl de L-tryptophane, 0,5 g/dl de KI^PO^, 0,5 g/dl de MgSO^, 7H 0, 6 ml/dl de liqueur de macération de maîs et 2 g/dl d'hydrolysat de protéines de soja, pH 7,5, en présence de 5 g/dl des surfactifs énumérés dans le tableau VI ci-après, à 31°C pendant 20 h; on procède à des réactions à l'aide des cellules bactériennes obtenues 10 ml de bouillon de culture comme décrit dans l'exemple 8. BAD ORIGINAL 71 46192 2119018 10 15 20 25 30 35 La concentration en L-tryptophane produit dans les mélanges de réaction est rapportée dans le tableau VI. TABLEAU_VI_ Concentration en L-tryptophane produit 'g/1, par Proteus mirabilis Aerobacter aerogenes Surfactif utilisé non ioniques Liponox HCK N-l 37 30 Nissan Nonion NS-230 N-3 44 42 " " N-4 31 25 " ST-221 N-ll 46 42 " N-l2 29 20 Triton XN-100 N-32 34 30 Sorpol W-150 40 25 Nonal N-37 33 28 " 310 N-38 27 21 Pegnol 14-0 N-39 30 24 " 1500 N-42 40 32 Sorbon T-20 N-46 21 18 Tohol N-270 N-50 18 9 Nonal 104 N-51 37 28 " 208 N-52 39 28 " 813 N-53 13 8 Pegnol 16L N-59 32 25 Triton N-100 37 28 Tween 80 33 26 Cationiques Katinol HTB 11 11 Anstex C-160 13 14 Anioniques Liponal F-103 11 12 Punox P-80 13 10 Amphotères Lipomin LH 23 .18 néant 6 8 ISêSElê.ll On cultive Proteus mirabilis ATCC 15290 comme décrit dans l'exemple 10 mais en l'absence de surfactifs; on ajoute les cellules bactériennes 71 46192 2119018 obtenues à partir de 10 ml de bouillon de culture à 10 ml des solutions I, II, III et IV ci-après et on maintient les solutions à 37°C pendant 20 heures Solution I Indole 3 g/dl 5 pyruvate de sodium 3 g/dl acétate d'ammonium 3 g/dl pH 8,0 (par NH^OH) Solution II Indole 3 g/dl 10 pyruvate de sodium 3 g/dl acétate d'ammonium 3 g/dl phosphate de pyridoxal 10 mg/dl pH 8,0 (par NH^OH) Solution III 15 Indole 3 g/dl Pyruvate de sodium 3 g/dl acétate d'ammonium 3 g/dl Na2S03 0,2 g/dl pH 8,0 (par NH^OH) 1 (l Solution IV Indole 3 g/dl pyruvate de sodium 3 g/dl acétate d'ammonium 3 g/dl Na2S03 0,2 g/dl 25 Phosphate de pyridoxal 10 mg/dl pH 8,0 (par NH^OH) Les concentrations en L-tryptophane produit dans les solutions de réaction sont rapportées ci-après Solution de réaction Concentration de L-tryptdphane produite (g/1) 30 Solution I 36 Solution II 45 Solution III 40 * Solution IV 51 35 Exemple 12 On ajoute les cellules bactériennes obtenues à partir de 100 ml d'un bouillon de culture d'Aerobacter aerogenes ATCC 8724 à 100 ml des solutions suivantes et on fait réagir à 37°C pendant 20 heures : 71 46192 15 2119018 Solution I JE! III IV Indole, g/dl 3,0 3,0 6,6 6,6 pyruvate de sodium , g/dl 4,0 4,0 7,1 7 j 1 acétate d'ammonium; g/dl 4,0 4,0 7,0 7,0 Inosine, g/1 0 4,0 0 11,0 pH 8,0 8,0 8,0 8,0 Dans les mélanges de réaction, où il y a présente inosine 10 le complexe L-tryptophane-inosine précipite. On recueille le précipité et les cellules bactériennes par centrifugation, on remet en suspension dans l'eau et on règle le pH de la suspension à 1,0 par HC1 concentré; on sépare les substances solides par centrifugation. On introduit la liqueur surnageante dans une colonne garnie d'une résine échangeuse de cation sous la forme 15 NH^s le L-tryptophane adsorbé sur la colonne est élué par l'ammoniaque aqueuse. L'éluat est concentré sous pression réduite; on obtient le L-tryptophane à l^état de cristaux; La concentration ai L-tryptophane produit dans les solutions de réaction est la suivante : 20 Solution de réaction Concentration de tryptophane produite, g/1 Solution I 36 Solution II 56 Solution III 68 Solution IV 91 25 5S§®Blë_i3 On ajoute les cellules bactériennes obtenues à partir de 100 ml du bouillon de culture de Proteus mirabilis ATCC 15290 à des solutions contenant 2 g/dl de 5-hydroxy-indole, 2 g/dl de pyruvate de sodium, et 2 g/dl 30 d'ammonium, pH 8,0, en présence ou non d'inosine à la concentration de 3 g/dl et on maintient les solutions à 37°C pendant 20 heures. Dans les mélanges de réaction, on trouve les concentrations de 5-hydroxy-L-tryptophane rapportées ci-après : Inosine Concentration de 5-hydroxy-tryptophane produit» g/1 35 Absente 12 présente 28 71 46192 16 2119018 REVEND ICA T IONS 1. Procédé de préparation, d'un aminoacide de formule générale : 10 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, amino ou mêthyle, le procédé se caractérisant en ce que l'on fait réagir a) un composé de formule générale 15 II 20 dans laquelle R a la signification indiquée ci-dessus, b) des ions ammonium et c) au moins un composé choisi dans le groupe formé par l'acide pyruvique, l'acide oxalacétique> l'acide malique., l'acide fumarique, l'oxime maléique, l'acide glyoxylique, lfecide lactique, leurs sels ou autres dérivés> dans une solution aqueuse en présence d'une quantité efficace de tryptophanase ou d'une 25 source de tryptophanase jusqu'à ce que l'on ait produit 1'aminoacide de formule I qu'on isole. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule II est 1'indole, le 5-hydroxy-indole, le 5-amino-indole ou le 5-méthylindole. 30 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé de formule II, les ions ammonium et le composté c) sont présents en proportion de 0,1 à 10,0 g/dl dans la solution aqueuse. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la réaction est effectuée en présence de vitamine B6. 35 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la réaction est effectuée en présence d'un agent réducteur. 6AEX ORIGINAL^ 71 46192 2119018 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la solution aqueuse contient de 1 inosine, 7. Procédé selon la revendieatioa 1, caractérisé en ce que la tryptophanase est produite par culture d'un micro-organisme producteur de 5 cette enzyme dans un milieu de culture contenant du tryptophane, du 5-hydroxy-tryptophane, du 5-méthy l-tryptophane ou du 5-amino-tryptophane. 8. Procédé selon la revendication 7. caractérisé en ce que le milieu de culture contient un surfactif. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que 10 le surfactif est un surfactif nor; ionique. 1(). Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le micro orga^isn.e est une espèce choisie parmi les genres Escherichia, Aerobacter, Citrobacter, Erwinia. Pseudotnooaa, Xanthomonas, Proteus, Salmonella, Paracolobactrum et Kluyvera. BAD ORIGINAL