Brevet FR2142599A1 — publié le 19730202

La présente invention concerne un nouveau type de procédé d'examen simple et rapide pour la détection d'insuffisances enzymatiques affectant des hématies, et elle a plus particulièrement trait à la présence ou à l'absence de fluorescence dans des échantillons expérimentaux qui sont soumis à une lumière ultraviolette à grande longueur d'onde, en fonction de ce qu'un nucléotide de pyridine réduit ou oxydé est ou non présent dans l'échantillon d'essai. Pour autant que lton sache, rien n'indique dans la technique antérieure l'utilisation de la fluorescence d'un nucléotide de pyridine en lumière ultraviolette de grande longueur d'onde pour détecter des anomalies enzymatiques dans des hématies. En général, on a utilisé dans le passé divers colorants pour détecter ces insuffisances enzymatiques. La détection d'une insuffisance en déshydrogénase de glucose-6-phosphate par les techniques de changement de couleur d'un indicateur coloré requiert des conditions anaérobies, qui sont difficiles à maintenir et qui ne conviennent pas pour un procédé simple et rapide. D'autres essais requièrent l'utilisation d'échantillons frais de sang ou la séparation de I'hémoglobine du sang de l'enzyme, ou bien un papier spécial. Lorsque l'insuffisance enzymatique consistait en une carence en uridyl-transférase de galactose-l -phosphate, on a utilisé le bleu de méthylène comme colorant récepteur, mais ce colorant requiert des conditions anaérobies après passage à l'oxyde de carbone gazeux. La réaction est légèrement sensible à la lumière et il est nécessaire d'utiliser pour 11 essai un bain-marie éclairé. En ce qui concerne la détection de la carence en réductase de glutathion, on ne connatt pas de procédé permettant de mettre en évidence cette carence enzymatique dans des hématies. Le procédé décrit dans le présent mémoire est extrêmement simple, il ne requiert pas de conditions anaérobies, il nécessite seulement une faible quantité d'échantillon de sang, il peut titre mis en oeuvre à la température ambiante ou à 370C, ltéchantil- lon de sang ne nécessite pas autre fratchement prélevé, et le résultat est très facile à interpréter. L'invention concerne un nouveau type de procédé de détection simple et rapide de diverses insuffisances enzymatiques des hématies. L'échantillon à expérimenter, qui consiste ou bien en du sang entier, ou bien en hématies seulement, est ajouté à un mélange réactionnel contenant un nucléotide de pyridine, un tampon, un agent d'hémolyse des hématies et un substrat enzymatique. Selon la nature de la carence enzymatique que l'on recherche, le nucléotide de pyridine contenu dans le mélange réactionnel est ou bien sous la forme réduite, ou bien sous la forme oxydée. Les taches du mélange expérimental résultant sont formées sur du papier-filtre ordinaire, directement comme ligne de référence ou tache témoin, et après diverses périodes de temps. Le mélange expérimental résultant peut être gardé à la température ambiante ou mis à incuber à 370C. Après que les taches ont séché sur le papier-filtre, elles sont soumises à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, de préférence de longueur d'onde comprise entre 340 et 370 millimicrons. Les taches contenant le nucléotide de pyridine réduit produisent une fluorescence persistante sous l'effet de la lumère ultraviolette de grande longueur d'onde. Cette fluorescence reste stable pendant plusieurs jours à la température ambiante. Lorsque le mélange réactionnel contient un nucléotide de pyridine réduit et lorsque ce nucléotide réduit est oxydé dans le mélange expérimental résultant, il y a une perte de fluorescence, parce que le nucléotide de pyridine oxydé ne produit pas de fluorescence sous l'effet de la lumière ultraviolette de grande longueur d'onde. L'invention permet de déceler en particulier des insuffisances dans des hématies, par exemple des carences en déshydrogénase de glucose-6-phosphate,appelée ci-après G-6-PD; des carences en kinase de pyruvate,appelée ci-après PE ; des carences en réductase de glutathion,appelée ci-après GUSG-P, et des carences en uridyl-transférase de galactose-1-phosphate, appelée ci-après transférase. Dans son ensemble, l'invention peut être adaptée sans difficulté à la détection de nombreuses autres anomalies enzymatiques, par exemple la carence en déshJrdrogénase phosphogluconique et la carence en isomérase de phosphate de triose. héoriquement, toute carence enzymatique qui résulte soit de la réduction du nucléotide de pyridine, soit de l'oxydation du nucléotide de pyridine réduit, dans un mélange expérimental, peut autre décelée au moyen du procédé de l'invention. Le diagnostic précis de troubles résultant de ces carences enzymatiques a un grand intérêt médical, tant du point de vue des conseils génétiques que du point de vue du traitement médical. Le titrage de tous ces enzymes au moyen de procédés Jusqutà présent connus est comateux, demande du temps et requiert un équi peuvent de laboratoire qui est comateux et d'un type spécial. 1l est donc très important de trouver des procédés simples et rapides permettant une différenciation entre les insuffisances enzymatiques les plus courantes dans des hématies. L'invention concerne donc un procédé rapide et relativement simple pour la détection de l'insuffisance en G-6-PD, GSSG-R, , , transférase et autres enzymes dans des hématies. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. On utilise le même mode opératoire général dans tous les procédés d'investigation. Généralement, on ajoute une partie de sang entier ou de suspension d'hématies, habituellement un volume de 0,020 ml à 10 parties de mélange réactionnel, habituellement un volume de 0,200 ml. Immédiatement après cette addition, on peut former une tache du mélange d'essai résultant sur un papierfiltre, comme tache témoin de référence. Après des périodes déterminées d'incubation du mélange d'essai, on forme sur le papierfiltre d'autres taches avec le mélange d'essai. Après le séchage de ces taches, on inspecte le papier-filtre dans une chambre noire, sous une source pratique de lumière ultraviolette de grande longueur d'onde. ta recherche de l'insuffisance enzymatique est basée sur le fait que des quantités relativement faibles de nucléotides réduits de pyridine produisent une fluorescence intense par excitation par la lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, à une longueur d'onde comprise entre environ 340 et environ 370 millimicrons. Dans le cas de l'essai de détection de l'insuffisance en G-6-PD ou en transférase, les essais se basent sur la réduction du nucléotide de pyridine. Dans le cas de l'essai de détection de l'insuffisance en PK ou en GSSG-R, les essais se basent sur l'oxydation d'un nucléotide de pyridine réduit. Bien qu'il existe une certaine extinction de la fluorescence en présence dthémoglobine dans le sang, deux facteurs minimisent cette extinction. En premier lieu, la longueur d'onde ultraviolette d'excitation que l'on utilise dans le procédé de l'invention se trouve au-dessous de la bande maximale d'absorption de l'hémo- globine, qui est la région de Soret. De plus, le maximum d'émission pour le procédé de l'invention se situe à 465 millimicrons, ce qui est près du minimum d'absorption de l'hémoglobine. En second lieu, lorsqu'on forme une tache avec le mélange d'essai résultant sur un papier-filtre ordinaire, il existe une certaine séparation chromatographique entre l'hémoglobine du sang et les nucléotides de pyridine, et par conséquent, il en résulte une intensification considérable de la fluorescence. Dans toutes ces méthodes expérimentales, le volume de l'é- chantillon de sang à expérimenter, relativement au mélange réactionnel, peut varier dans une gamme allant d'un minimum d'une partie d'échantillon de sang à 20 parties de mélange réactionnel, jusqu'à un maximum d'une partie d'échantillon de sang pour 5 parties de mélange réactionnel. Lorsqu'un incubateur n'est pas immédiatement disponible, par exemple dans un programme de dépistage, la reaction d'essai peut être conduite à la temperature ambiante. On aonne ci-après un exemple de détection d'une carence en G-6-PD dans des hématies, illustrant l'utilisation du procédé de détection conforme à l'invention. exemple 1 Un échantillon de sang qui convient pour l'essai doit être recueilli dans un milieu acide au citrate et au dextrose (ACD) ou dans llhéparine, ou dans le sel disodique de l'acide éthylène diamine tétracétique (EDTA) ou dans un autre anti-coagulant convenable du sang. L'échantillon de sang n'est pas nécessairement frais. I1 convient mdme d'utiliser pour essai des échantillons de sang ågésde quelques semaines, conservés dans le milieu ACD à 40C. Un mélange réactionnel convenable pour la détection de la présence de G-6-PD consiste en un mélange contenant les ingrédients suivants Ingrédient en solution Concentration Quantité en dans l'eau ~~~~~~~~~~~ ml Glucose-6-phosphate 0,01 M 0,10 Nucléotide de triphosphopyridine 0,0075 M 0,10 Digitonine, solution saturée 0,20 Tampon au phosphate de potassium, pH 7,4 0,25 M 0,30 Eau 0.30 Total 1,00 ml Cet essai se base sur le fait suivant : en présence de G-6-PD dans l'échantillon de sang, le glucose-6-phosphate est oxydé pendant le processus réactionnel en 6-phosphogluconate et le nucléotide de triphosphopyridine, appelé ci-après TOPS, est réduit en nucléotide de triphosphopyridine réduit, appelé ciaprès TPSE. Etant donné que l'échantillon de sang contient éga- lement la déshydrogénase 6-phosphogluconique, le 6-phosphogluconate formé dans la réaction est oxydé en déshydrogénase 6phosphogluconique, en réduisant ainsi un supplément de TPN en TPNH. Lorsqutil est excite par la lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, le TYPER produit une fluorescence brillante. Dans le processus expérimental, on ajoute un volume de sang entier, habituellement 0,02 ml, à 10 volumes de mélange réactionnel, habituellement 0,20 ml, et on fait incuber le mélange d'essai résultant pendant 5 à 10 minutes à 370C. On forme une tache avec le mélange d'essai résultant sur un papier-filtre convenable quelconque, par exemple un papier Whatman nO 1. S'il y a une activité normale de G-6- PD, la tache formée sur le papierfiltre produit une fluorescence brillante par excitation avec la lumière ultraviolette de grande longueur d'onde. Lorsque le sang présente une carence en G-6-PD, il ntapparatt pas de fluorescence appréciable lorsqu'on soumet la tache à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 340 à environ 370 millimicrons. Une fois qu'une tache d'essai a été formée sur du papierfiltre, et après son séchage, une fluorescence est facile à déceler plusieurs jours plus tard. La méthode de détection de la présence de G-6-PD peut subir de nombreuses modifications, sans affecter les résultats. Par exemple, au lieu de faire incuber le mélange d'essai résultant à 370C, on peut laisser la réaction se développer aux températures ambiantes, ce qui donne des résultats équivalents, après une période de 10 à 15 minutes. Au lieu de papier-filtre, on peut utiliser toute matière absorbante convenable pour former des taches avec le mélange d'essai, pour autant que cette matière permet un séchage sensible des taches pour arrêter la réaction d'essai. Au lieu du sel disodique de l'acide éthylène-diaminetétracétique, on peut utiliser comme anti-coagulant l'acide libre, de meme que d'autres sels de métaux alcalins de cet acide. Attendu que la réaction se développe rapidement, mme à OOC, le temps de réaction attribué avant le début de l'essai à la tache peut varier d'un minimum de 2 minutes à un maximum de 10 à 15 minutes à 370C. Ces temps de réaction doivent être augmentés d'un facteur d'environ 1,5 lorsque la réaction a lieu à des températures ambiantes. Par exemple, au lieu du volume de 0,20 ml de solution saturée de digitonine, on peut utiliser un volume de 0,20 ml de solution à 1 % de saponine comme autre ingrédient du mélange réactionnel. Lorsqu'on effectue cette substitution, il suffit de faire incuber le mélange d'essai résultant pendant environ 5 minutes à 370C. On peut faire varier les concentrations en TPN et glucose6-phosphate sans modifier sensiblement les résultats de cette méthode d'essai. Par exemple, on peut faire varier la concentration en glucose-6-phosphate dans le mélange réactionnel dans une gamme allant de 0,2 à 30 fois la concentration indiquée dans exemple 1, la gamme correspondante de concentration de THT variant entre 0,25 et 10 fois la concentration indiquée dans l'exemple 1. Le pH du tampon au phosphate de potassium peut varier de 6,5 à 8 et sa concentration peut aller de 0,1 à 5 fois la concentration indiquée dans l'exemple 1. On peut utiliser des tampons au phosphate convenenables, autres que le tampon au phosphate de potassium. 1l n'est pas nécessaire que la solution de digitonine soit saturée, pour autant que la quantité de digitonine qui est présente dans le milieu réactionnel est suffisante pour provoquer une lyse efficace des hématies. La concentration en digitonine peut varier dune solution saturée à 10 % à une solution saturée à 100 %. Lorsqu'on utilise la saponine, la concentration en solution peut aller de 10 à 20 %. On peut utiliser d'autres agents convenables pour effectuer la lyse, dans la mesure où ils ne gênent pas la réaction d'essai. L'exemple suivant illustre la détection de l'absence de l'enzyme uridyl-transférase de galactose-1-phosphate. L'absence de cet enzyme dans le sang provoque la galactosémie, qui, si elle n'est pas traitée, entrain la cirrhose du foie, la cécité, la débilité mentale. Si cette carence en enzyme est décelée à temps, un régime exempt de galactose peut prévenir ces anomalies. ExemPle 2 On recueille dans de l'héparine un échantillon de sang destiné à l'analyse. Le mélange réactionnel, pour cet essai,comprend les ingrédients suivants : Ingrédient en solution Concentration Quantité aqueuse ~~~~~~~~~~~~~ en ml Uridine-diphosphoglucose 9,5 x 10 3M 0,2 Alpha-galactose-1-phosphate 2,7 x 10'2M 0,4 TPN 6,6 x I0'3M 0,6 Tampon d'acétate de tris, pH 8,0 0,75 M 2,0 Solution saturée de digitonine 0,8 EDTA 2,7 x 10-2M 0,03 Eau 1.97 Total 6,00 La base de détection est la suivante : lorsque du sang entier est ajouté au mélange réactionnel indiqué ci-dessus, l'uridine-diphosphoglucose tUDPG) et 1' alpha-galactose-1 -phosphate (Gal-1-P) réagissent pour former l'alpha-glucose-1-phosphate en présence de transférase. L'alpha-glucose-I -phosphate est transformé par la phosphoglucomutase, qui est présente dans le produit d'hémolyse, en alpha-glucose-6-phosphate qui, à son tour, pré- sente spontanément le phénomène de la multirotation, et, avec l'aide de l'isomérase de phospho-hexose, en bêta-glucose-6-phosphate. La déshydrogénase de glucose-6-phosphate présente dans le produit d'hémolyse, oxyde le bêta-glucose-6-phosphate en 6-phosphogluconate qui est oxydé, quant à lui, en ribulose-5-phosphate.Ces deux étapes entraient la réduction de TPN en TPNH, qui présente un phénomène de fluorescence sous l'effet de la lumière ultraviolette de grande longueur d'onde. Il n'y a sensiblement pas de fluorescence dans des essais portant sur des échantillons de sang présentant une insuffisance de transférase. Dans la méthode expérimentale, on ajoute un volume de sang entier additionné d'héparine, habituellement 0,02 ml, à 10 volumes, habituellement 0,2 ml,de mélange réactionnel. La pipette que l'on utilise pour ajouter le sang au mélange réactionnel est laissée dans le tube et le mélange expérimental résultant est mis à incuber dans des conditions aérobies à 370C. Au bout de 2 heures, on forme une tache de quelques microlitres de solution d'essai sur du papier-filtre Whatan nO 1 et on la laisse sécher à la température ambiante. Ce séchage prend habituellement 5 minutes environ. On examine la tache dans les 24 heures qui suivent le séchage en lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 340-370 millimicrons. Sous l'effet de la lumière ultraviolette de cette longueur d'onde, des taches qui résultent d'un sang normal produisent une fluorescence brillante, tandis que des taches qui proviennent d'un sang contenant insuffisamment de transférase ne produisent pas de fluorescence appréciable. Après séchage, les taches sont relativement stables pendant une durée allant jusqu'à une semaine aux températures ambiantes. On peut modifier la méthode expérimentale de plusieurs fa çons, sans affecter les résultats. On peut faire sécher des bandes formées avec du sang capillaire sur un papier-filtre ou une autre matière absorbante convenable et les placer dans un récipient approprié contenant un volume correct, (environ 10 fois le volume de sang ) de mélange réactionnel. En maintenant le papier-filtre immergé dans le mélange réactionnel, on fait incuber ce mélange pendant 2 à 3 heures à 370C. Après l'incubation, on forme une tache du mélange d'essai résultant sur du papier-filtre ou une autre matière absorbante convenable, qui permet le séchage des taches. On fait sécher la tache à la température ambiante, ce qui demande habituellement 5 minutes environ. Ensuite, on examine la tache résultante en lumière ultraviolette de grande longueur d'onde pour déceler la fluorescence, de la manière indiquée ci-dessus. Pour autant qu'il n'a pas été coagulé, du sang entier frais peut être utilisé à la place du sang additionné d'héparine dans cet essai. L'essai peut etre conduit aux températures ambiantes, avec une réduction correspondante de la vitesse de réaction dans une proportion de a moitié au tiers de la vitesse à 370C. On peut utiliser toute matière absorbante convenable au lieu de papier-filtre pour autant que cette matière permet le séchage de la tache formée sur le papier. Le temps d'incubation à 37 peut varier de 1 à 3 heures, sans affecter les résultats. Au lieu de sang entier, on peut utiliser une suspension à 50 % d'hématies dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, ce qui donne des résultats analogues à ceux que l'on obtient en utilisant du sang entier. On peut omettre d'utiliser l'acide éthylene-diamine-tétracé- tique comme ingrédient du mélange réactionnel, parce qu'il contribue seulement à favoriser le développement de la fluorescence dans le mélange d'essai. Lorsque du sang destiné à l'analyse a été recueilli dans l'EDTA pour empocher la coagulation, le mélange réactionnel doit être exempt d'EDTA. Des échantillons de sang recueillis dans de l'héparine peuvent titre conservés pendant une période de temps atteignant une semaine à la température ambiante et peuvent encore etre utilisés dans cette méthode d'essai en donnant les résultats qui équivalent à ceux d'échantillons de sang frais. La concentration de digitonine dans la solution peut varier de 10 à 100 ffi de la saturation, pour autant qu'il y a suffisamment de digitonine pour obtenir une lyse efficace des hématies. Au lieu de digitonine, on peut utiliser une solution à 1 % de saponine et obtenir des résultats équivalents. La concentration en saponine peut varier de 0,1 à 20 %, sans affecter le processus expérimental. On peut aussi utiliser d'autres agents hématolytiques convenables, pour autant qu'ils ne gênent pas la réaction d'essai. On peut faire varier la concentration en UDPG, Gal-1-P, et TPN dans le mélange réactionnel sans modifier notablement les résultats de l'essai. Ainsi, on peut faire varier chacune des concentrations correspondantes de UDPG, Gal-1-P et TPN dans une gamme allant de 0,25 à 10 fois les concentrations indiquées dans l'exem- ple 2. Le pH du tampon de tris-acétate peut varier de 6,2 à 9,2, et la gamme de concentrations peut aller de 0,1 à 3 fois la concentration indiquée dans l'exemple 2. L'exemple suivant illustre la détection d'une carence en kinase de pyruvate dans des hématies. Exemple 3 On peut utiliser des anti-coagulants tels que l'héparine, l'ACD ou l'EDTA ou d'autres anti-coagulants convenables dans la préparation d'un échantillon de sang destiné à l'analyse. L'échantillon de sang contenant un anti-coagulant est ensuite centrifugé et le plasma et le caillot sont isolés avec soin par aspiration ou par d'autres moyens convenables. Les leucocytes sont éliminés , parce que leur activité de kinase de pyruvate peut dtre normale mdme si les hématies contiennent insuffisamment de cette kinase. On ajoute 4 volumes de solution physiologique de chlorure de sodium aux hématies pour former une suspension d'hématies à 20 . La suspension d'hématies que lton obtient est alors pr8te pour l'analyse. On donne ci-après un mélange réactionnel qu'il convient d'utiliser dans la méthode d'essai. Ingrédient en solution dans Concentration Quantité en l'eau ~~~~~~~~~~~~ ml Phospho (énol)pyruvate 0,15 M (neutralisé) 0,03 (sel de tricyclohexyl ammonium Diphosphate d'adénosine (ADP) 0,03 M (neutralisé) 0,10 DPSH 0,015 M (neutralisé) 0,10 Sulfate de magnésium 0,08 M 0,10 Tampon au phosphate de potassium pH 7,4 0,25 M 0,05 Eau 0,62 Total 1,00 La base de cette méthode d'essai est la suivante lorsque la kinase de pyruvate est présente dans l'échantillon de sang, un groupe phosphate du phospho(énol)pyruvate est transféré au diphosphate d'adénosine (ADP), en formant un pyruvate et un triphosphate d'adénosine (ATP).La déshydrogénase de lactate contenue dans le produit d'hémolyse catalyse la réduction du pyruvate en lactate,avec oxydation du nucléotide réduit de diphosphopyridine (DPNH) du mélange réactionnel en nucléotide de diphosphopyridine (DPN). Etant donné que DPNH présente une fluorescence i la lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, ce qui n'est pas le cas du DPN, il y a une perte progressive de la fluorescence d'un échantillon d'essai qui dérive d'un sang normal. Dans la méthode expérimentale, on ajoute un volume de la suspension d'hématies, habituellement 0,02 ml, à 10 volumes du mélange réactionnel, habituellement 0,20 ml, et on fait incuber le mélange d'essai résultant à 370C pendant 30 minutes, après quoi on forme des taches du mélange d'essai sur du papier-filtre, comme décrit dans les exemples précédents, on les fait sécher et on les examine en lumière ultraviolette de grande longueur d'onde. Lorsque l'échantillon original de sang contient des hématies à insuffisance de kinase de pyruvate, une fluorescence brillante des taches dérivant de cet échantillon de sang persiste, tandis que des taches qui dérivent d'échantillons normaux de sang n'ont pas de fluorescence appréciable après incubation. Les ingrédients neutralisés du mélange réactionnel de l'exemple 3 peuvent être neutralisés à un pH de 7-8 avec un papierpH en utilisant de l'hydroxyde de sodium à 0,2 N environ. On utilise une lyse hypotonique pour libérer l'enzyme des hématies plutôt que la digitonine ou la saponine pour empêcher toute libération notable de l'enzyme des leucocytes qui peuvent rester dans 1' échantillon traité de sang. On peut utiliser tout agent convenable de lyse pour autant qu'il ne gêne pas la réaction d'essai. On peut faire varier la concentration des ingrédients du mélange réactionnel de l'exemple 3 sans nuire à la méthode de détection. La concentration en phospho(énol)pyruvatsel de tricyclohexylammonium) peut varier de 0,25 à 3 fois la concentration indiquée dans l'exemple 3, avec une gamme correspondante de concentrations en ADP de 1/3 à 10 fois, et une gamme correspondante en DPNH de 1/4 à 2 fois les concentrations indiquées dans l'exemple 3. ta concentration en sulfate de magnésium peut aller de 0,25 à 5 fois la concentration indiquée dans l'exemple 3, de même que les gammes correspondantes des autres ingrédients du mélange réactionnel. Le tampon au phosphate de potassium peut avoir un pH de 6,5 à 7,5 et une concentration de 0,10 à 5 fois la concentration indiquée dans l'exemple 3. La solution physiologique de chlorure de sodium destinée à la mise en suspension des hématies peut avoir une force allant d'environ 0,25 à environ + 0,25 fois la force isotonique, pour autant que la lyse des hématies a lieu dans le mélange d'essai qui en résulte. Au lieu de l'incubation du mélange d'essai à 370Ç, on peut laisser la réaction se développer aux températures ambiantes, en augmentant en conséquence la durée de réaction de 1,5 à 2 fois. ta durée de réaction admise avant le début de l'essai à la tache peut varier d'un minimum d'environ 10 minutes à un maximum d'environ 30 minutes à 370C, On peut utiliser d'autres sels hydrosolubles de magnésium au lieu du sulfate de magnésium pour autant qu'il n'y a pas d'interférence avec la réaction. On peut utiliser comme tampon divers phosphates de potassium hydrosolubles. On peut utiliser du sang frais, pour autant qu'il n'a pas été coagulé. A la place du sel disodique de l'acide éthylène-diamine tétracétique, on peut utiliser comme anti-coagulant l'acide libre, de même que d'autres sels de métaux alcalins de cet acide. L'exemple suivant illustre la détection d'une carence en GSSER dans les hématies. Exemple 4 Un échantillon de sang qui convient pour l'analyse peut outre recueilli dans l'ACD, l'EDTA ou l'héparine. Ces échantillons peuvent outre conservés pendant au moins 3 semaines sans que ceci nuise au processus expérimental. Un mélange réactionnel qu'il convient d'utiliser pour déceler une carence en GSSG-R est donné ci-après Ingrédient en solution dans Concentration Quantité en lteau ml ~~~~~~~~~~~~ mi Glutathion (oxydé) 0,053 M O,t TPNH 0,015 0,1 Tampon au phosphate de potassium, pH 7,4 0,25 M 0,6 Digitonine, solution saturée 0.2 Total 1 ml la base de cette méthode d'essai est la suivante : lorsque la réductase de glutathion est présente dans un produit d'hémolyse du sang, le glutathion oxydé (GSSG) est réduit en glutathion (GSH) et le TPNH est oxydé en TPN.Etant donné que le TPNH est fluorescent lorsqu'il est excité par une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde et que le TPN ne présente pas cette fluorescence, une baisse progressive de la fluorescence a lieu à mesure que la réaction progresse, lorsque l'échantillon de sang est normal. Dans la méthode d'essai, un volume de sang, habituellement 0,02 ml, est ajouté à 10 parties de mélange réactionnel, habituellement 0,20 ml. Des taches du mélange d'essai résultant sont for méespur un papier-filtre convenable toutes les 15 minutes et la disparition de la fluorescence est comparée avec un échantillon témoin, pendant une période convenable de temps allant jusqu'd 90 minutes, en lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 740 à environ 370 millimicrons. Une insuffisance en GSSG-R est mise en évidence par la persistance de la fluorescence d'une tache. La réaction peut entre conduite à 370C ou aux températures ambiantes. Lorsqu'on utilise des températures ambiantes, la durée de réaction peut aller de 1,5 à 2 fois la durée de réaction à 370C. On peut faire varier les concentrations des ingrédients du mélange réactionnel de l'exemple 4 sans nuire aux résultats de l'essai. La concentration en GSSG peut aller de 0,25 à 20 fois la concentration indiquée dans l'exemple 4, tandis que la concentration en TPNH peut aller de 0,5 à 2 fois la concentration indiquée dans l'exemple 4. Comme indiqué dans les exemples 1 et 2, on peut remplacer la digitonine par la saponine, et on peut utiliser dans l'exemple 4 les mimes gammes de concentrations que celles qui ont été indiquées pour la digitonine et la saponine dans les exemples 1 et 2. La concentration en tampon au phosphate peut varier de 0,10 à 10 fois la concentration indiquée dans l'exemple 4 et le pH peut aller de 6,5 à 9,5, ce qui correspond à la gamme de concentrations. On peut utiliser d'autres agents effectuant la lyse, à la place de la digitonine et de la saponine, pourvu qu'il n'y ait pas d'interférence avec le processus d'essai. On peut utiliser du sang frais pour autant qu'il n'est pas coagulé. On peut utiliser comme tampon divers phosphates de potassium hydrosolubles. A la place du sel disodique de l'acide éthylène-diaminetétracétique, on peut utiliser comme anti-coagulant l'acide libre, de même que d'autres sels de métaux alcalins de l'acide éthylène-diamine-tétracétique Au lieu de papier-filtre, on peut utiliser toute matière absorbante convenable pour former des taches à partir du mélange d'essai, pour autant que la matière permet pratiquement le séchage des taches pour arrêter la réaction d'essai. L'invention n'est pas limitée aux formes de réalisation décrites en détail, car diverses modifications peuvent y etre apportées sans sortir de son cadre. Par exemple, on peut utiliser tout sel hydrosoluble comme tampon, pourvu qu'il n'y ait pas d'interférence avec la réaction d'essai. On peut utiliser du sang frais non coagulé dans chacun des processus expérimentaux. Les processus de détection décrits dans le présent mémoire peuvent être appliqués à la détection de la présence ou de l'absence de divers autres enzymes associés avec des hématies, par l'utilisation des substrats convenables pour les enzymes particuliers recherchés, en mdme temps que tous co-facteurs ou co-enzymes requis lorsque la présence ou l'absence de l'un quelconque de ces enzymes entraine l'oxydation ou la réduction d'un nucléotide de pyridine, directement ou indirectement. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'insuffisances enzymatiques dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties d'une solution aqueuse tamponnée contenant un substrat spécifique de l'enzyme que l'on recherche, un agent effectuant la lyse des hématies et un nucléotide de pyridine à 11 état oxydé à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache du mélange d'essai résultant sur une matière absorbante convenable à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde,de manière à produire une fluorescence persistante de cette tache sous l'effet de ladite lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang qui contient l'enzyme que l'on cherche à déceler, tandis que cette tache ne produit pas de fluorescence sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsqu'elle provient d'un échantillon de sang contenant à un degré insuffisant l'enzyme que l'on recherche. 2. Procédé de détection d'une insuffisance en déshydrogénase de glucose-6-phosphate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties d'une solution aqueuse tamponnée au phosphate contenant du glucode-6-phosphate, le nucléotide de triphosphopyridine et un agent de lyse des hématies à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache de ce mélange sur une matière absorbante ; à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, de manière qu'une fluorescence persistante de cette tache soit produite par ladite lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang renfermant des hématies qui contiennent la déshydrogénase de glucose-6-phosphate, et qu'il n'y ait pas de fluorescence de ladite tache sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque cette tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent insuffisamment de déshydrogénase de glucose-6-phosphate. 3. Procédé de détection d'une insuffisance en déshydrogénase de glucose-6-phosphate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 10 parties d'une solution aqueuse contenant 1 partie de solution aqueuse 0,01 M de glucose- 6-phosphate, 1 partie de solution aqueuse 0,0075 M de nucléotide de triphosphopyridine, 2 parties d'une solution aqueuse d'agent de lyse des hématies, 3 parties d'une solution aqueuse 0,25 M de tampon au phosphate de potassium à un pH égal à 7,4 et 3 parties d'eau ; à faire réagir le mélange d'essai ce résultant ; à former une tache de/mélange sur un papier-filtre ; à soumettre la tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, de manière qutune fluorescence persistante de cette tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la déshydrogénase de glucose-6-phosphate et qu'il n'y ait pas de fluorescence de cette tache sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en ddshydro- génase de glucose-6-phosphate. 4. Procédé de détection d'une insuffisance en déshydrogénase de glucose-6-phosphate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 10 parties d'une solution aqueuse formée d'une partie de solution aqueuse de glucose-6-phosphate de molarité comprise entre 0,002 et 3, d'une partie d'une solution aqueuse de nucléotide de triphosphopyridine ayant une molarité de 0,001875 à 0,075, 2 parties d'une solution aqueuse d'un agent de lyse des hématies, 3 parties d'un tampon au phosphate de potassium ayant une molarité de 0,025 à 1,25 et un pH de 6,5 à 8,et 3 parties d'eau ; à faire réagir le mélange d'essai résultant à la température ambiante ; à former une tache du mélange d'essai résultant sur du papier-filtre et à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 340 à environ 370 millimicrons, de manière qutune fluorescence persistante de la tache soit produite par cette lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la déshydrogénase de glucose-6-phosphate et qu'il n'y ait pas de fluorescence de la tache sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en déshydrogénase de glucose-6-phosphate. 5. Procédé de détection d'une insuffisance en uridyl-transférase de galactose-1-phosphate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties d'une solution aqueuse tamponnée à l'acétate contenant de l'uridine -diphosphoglucose, le nucléotide de triphosphopyridine, 1' alpha-galactose-1 -phosphate et un agent de lyse des hématies, à faire réagir le mélange d'essai résultant, à former une tache du mélange d'essai résultant sur une matière absorbante, et à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde de manière qu'une fluorescence persistante de cette tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent l'uridyl- transférase de galactose-1-phosphate et qu'il nty ait pas de fluorescence de la tache sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies pré sentent une insuffisance en uridyl-transférase de galactose-1phosphate. 6. Procédé de détection d'une insuffisance en uridyl-trans férase de galactose--phosphate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qutil consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 10 parties d'une solution aqueuse obtenue à partir de 1/30 partie d'une solution aqueuse d'uridine-diphosphoglucose ayant une molarité de 9,5 x 1/15 partie d'une solution aqueuse d'un alpha-galactose-1-phos phate ayant une molarité de 2,7 x 10-2, 1/10 partie d'une solution aqueuse de nucléotide de triphosphopyridine ayant une molarité de 6,6 x 10 5, 1/3 partie d'une solution aqueuse de tampon au tris-acétate ayant un pH de 8,0 et une molarité de 0,75, 2/15 partie d'une solution aqueuse d'agent de lyse des hématies et 1/3 partie d'eau ; à faire réagir le mélange d'essai résultant, à former une tache de ce mélange sur un papier-filtre et à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 340-370 millimicrons de manière qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent de l'uridyl transférase de galactose-t-phosphate et qu'il n'y ait pas de fluorescence de la tache sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en uridyl-transférase de galac tose-1 -phosphate. 7. Procédé de détection d'une insuffisance en uridyl-transférase de galactose-1-phosphate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties d'une solution aqueuse formée de 1/30 partie d'une solution aqueuse d'uridine diphosphoglucose ayant une molarité de 2 x 10 3 à 9,5 x 10-2, 1/15 partie d'une solution aqueuse d'alpha-galactose-1-phosphate ayant une molarité de 0,7 x 10 2 à 2,7 x 10 , 1/10 partie d'une solution aqueuse de nucléotide de triphosphopyridine ayant une molarité de 1,6 x 10 3 à 6,6 x 10 2, 1/3 partie d'une solution aqueuse de tampon au tris-acétate ayant un pH de 6,2 à 9,2 et une molarité de 0,075 à 7,2, 2/15 partie d'une solution aqueuse d'agent de lyse des hématies et 1/3 partie d'eau : à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache du mélange d'essai résultant sur du papier-filtre et à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultra-violette d'environ 340 à environ 370 millimicrons de longueur d'onde, de manière qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent 1'uridyl-transférase de galactose1-phosphate et qu'il n'y ait pas de fluorescence de la tache sous 1 'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en uridyl-transférase de galactose-1-phosphate. 8. Procédé de détection d'insuffisances enzymatiques dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties d'une solution aqueuse tamponnée contenant un substrat spécifique de l'enzyme que l'on cherche à déceler, un agent de lyse des hématies et un nucléotide de pyridine à l'état réduit à faire réagir le mélange d'essai résultant; à former une tache de ce mélange sur une matière absorbante convenable, et à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde de manière qu'une réduction de la fluorescence de la tache apparaisse sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang contenant l'enzyme que l'on cherche à déceler, et qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang présentant une insuffisance en l'enzyme que l'on cherche à déceler. 9. Procédé de détection d'une insuffisance en kinase de pyruvate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à isoler les hématies de l'échantillon de sang, à ajouter une solution physiologique de chlorure de sodium aux hématies pour produire une suspension de ces dernières; à ajouter une partie de la suspension résultante d'hématies à 5-20 parties d'une solution aqueuse tamponnée au phosphate contenant le phospho(énol)pyruvate (sel de tricyclohexylammonium) neutralisé, du diphosphate d'adénosine neutralisé, du nucléotide de diphosphopyridine réduit et neutralisé et une source de potassium minéral ; à faire réagir le mélange d'essai résultant t à former une tache du mélange d'essai résultant sur une matière absorbante convenable ; à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde de manière qutune réduction de Hfluorescence de la tache apparaisse sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la kinase de pyruvate et qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en kinase de pyruvate. 10. Procédé de détection d'une insuffisance en kinase de pyruvate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à isoler les hématies de l'échantillon de sang; à ajouter 4 volumes de solution physiologique de chlorure de sodium aux hématies pour produire une solution à 20 ç de ces dernières ; à ajouter une partie de la suspension résultante d'hématies à 10 parties d'une solution aqueuse composée de 3 parties d'une solution aqueuse de phospho(énol)pyruvate neutralisé (sel de tricyclohexylammonium) ayant une molarité de 0,15, 10 parties d'une solution aqueuse de diphosphate d'adénosine neutralisé ayant une molarité de 0,03, 10 parties d'une solution aqueuse de nucléotide de diphosphopyridine réduit et neutralisé ayant une molarité de 0,015, 10 parties d'une solution aqueuse de sulfate de magnésium ayant une molarité de 0,08, 5 parties d'une solution aqueuse de tampon au phosphate de potassium ayant un pH de 7,4 et une molarité de 0,25 et 62 parties d'eau; à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache de ce mélange sur du papier-filtre ; à soumettre la tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 340 à 370 millimicrons, de manière qu'une réduction de la fluores- cence de la tache apparaisse sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la kinase de pyruvate et qutune fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en kinase de pyruvate. 11. Procédé de détection d'une insuffisance en kinase de pyruvate dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter un anti-coagulant à un échantillon de sang ; à centrifuger l'échantillon de sang additionné d'anti-coagulant à isoler de l'échantillon de sang le plasma et le caillot résultant ; à ajouter 3 à 5 volumes de solution physiologique de chlorure de sodium aux hématies restantes pour produire une suspension d'hématies ; à ajouter une partie de la suspension résultante d'hématies à 5-20 parties d'une solution aqueuse composée de 3 parties d'une solution aqueuse de phospho(énol)pyruvate neutralisé (sel de tricyclohexylammonium) ayant une molarité de 0,04 à 0,45, 10 parties d'une solution aqueuse de diphosphate d'adénosine neutralisé ayant une molarité de 0,01 à 0,3, 10 parties d'une solution aqueuse de nucléotide de diphosphopyridine réduit et neutralisé ayant une molarité de 0,004 à 0,03, 10 parties d'une solution aqueuse de sulfate de magnésium ayant une molarité de 0,02 à 0,4, 5 parties d'une solution aqueuse de tampon au phosphate de potassium ayant un pH de 6,5 à 9,5 et une molarité de 0,25 à 1,25 et 62 parties d'eau; à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache du mélange d'essai résultant sur du papier-filtre et à soumettre cette tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde d'environ 340 à environ 370 millimicrons, de manière qu'une réduction de la fluorescence de la tache apparaisse sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la kinase de pyruvate et qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en kinase de pyruvate. 12. Procédé de détection d'une insuffisance en réductase de glutathion dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties de solution aqueuse tamponnée au phosphate contenant du glutathion oxydé, du nucléotide de triphosphopyridine réduit et un agent de lyse des hématies ; à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache de ce mélange sur une matière convenable ; et à soumettre la tache après séchage à une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde, de manière qu'une réduction de la fluorescence de la tache ait lieu sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la réductase de glutathion et qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en réductase de glutathion. 13. Procédé de détection d'une insuffisance en réductase de glutathion dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une partie de l'échantillon de sang à 10 parties d'une solution aqueuse composée d'une partie d'une solution aqueuse de glutathion oxydé ayant une molarité de 0,033, 1 partie de solution aqueuse de nucléotide de triphosphopyridine réduit ayant une molarité de 0,015, 6 parties d'une solution aqueuse de tampon au phosphate de potassium à un pH de 7,4, ayant une molarité de 0,25, et 2 parties d'une solution aqueuse d'un agent de lyse des hématies ; à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache de ce mélange sur du papierfiltre ; à soumettre la tache après séchage à une lumière ultraviolette d'environ 340 à 370 millimicrons de longueur d'onde, de manière qu'une réduction de la fluorescence de la tache ait lieu sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la réductase de glutathion et qutune fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en réductase de glutathion. 14. Procédé de détection d'une insuffisance en réductase de glutathion dans les hématies d'un échantillon de sang, caractérisé par le fait qutil consiste à ajouter 1 partie de l'échantillon de sang à 5-20 parties d'une solution aqueuse composée d'une partie d'une solution aqueuse de glutathion oxydé ayant une molarité de 0,008 à 0,66, 1 partie d'une solution aqueuse de nucléotide de triphosphopyridine réduit ayant une molarité de 0,004 à 0,03, 6 parties d'une solution aqueuse de tampon au phosphate de potassium à un pH de 6,5 à 9,5 et ayant une molarité de 0,025 à 2,5 et 2 parties d'une solution aqueuse d'un agent de lyse des hématies à faire réagir le mélange d'essai résultant ; à former une tache du mélange d'essai résultant sur une matière absorbante convenable à soumettre la tache après séchage à une lumière ultraviolette de mande longueur d'onde d'environ 340 à 370 millimicrons, de manière qu'une réduction de la fluorescence de la tache ait lieu sous l'effet de la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies contiennent la réductase de glutathion et qu'une fluorescence persistante de la tache soit produite par la lumière ultraviolette lorsque la tache provient d'un échantillon de sang dont les hématies présentent une insuffisance en réductase de glutathion. 15. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2, 5 et 12, caractérisé par le fait que l'agent de lyse des hématies est la digitonine ou la saponine. 16. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que le tampon au phosphate est un phosphate de métal alcalin. 17. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3, 6 et 13, caractérisé par le fait que la solution aqueuse d'agent de lyse des hématies est une solution saturée de digitonine ou une solution à 1 % de saponine. 18. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4, 7 et 14, caractérisé par le fait que la solution aqueuse d'agent de lyse des hématies est une solution aqueuse de digitonine allant d'une solution saturée à 10 % à une solution saturée à 100 %, ou une solution aqueuse de saponine dont la concentration en solution va de 0,1 à 20 %. 19. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que le tampon à l'acétate est un tampon au tris-acétate. 20. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé par le fait que le tampon au phosphate est le phosphate de potassium.