Brevet FR2119008A1 — publié le 19720804

La présente invention a pour objet un procédé permettant d'isoler à partir du placenta humain un facteur stabilisant la fibrine. Le facteur stabilisant la fibrine, également 5 désigné sous le nom de facteur XIII, joue un rôle important dans la coagulation du sang. S'il manque dans le sang, il se produit dans le cas de blessures d'importantes hémorragies secondaires, qui ont pour effet de retarder la guérison. La carence en facteur XIII peut être d'origine héréditaire ou 10 apparaîtra comme conséquence de maladies, par exemple de cirrhoses du foie, de carcinomes, de leucémies ou de coagulo-pathies carentielles. Ces états peuvent prendre des formes mettant la vie en danger, en particulier chez les nouveaux-nés, ainsi que chez les femmes enceintes, chez lesquelles la carence 15 en facteur XIII aboutit à des fausses couches. On peut remédier à ces états de carence par une thérapeutique de substitution. Pour cela, on a eu recours jusqu'à présent à l'utilisation de sang, de plasma ou de préparations à base de fibrinogène. Dans tous les cas, il est 20 cependant nécessaire d'infuser des volumes importants de ceux-ci, ce qui est peu souhaitable dans nombre de cas, et, de plus, cause des désagréments et des pertes de temps. En outre, les malades reçoivent inévitablement d'autres protéines, ainsi que les substances déterminant les groupes sanguins, ce qui 25 peut entraîner des phénomènes d'incompatibilité. Il était donc hautement souhaitable que l'on disposât d'une préparation qui possédât une puissante action fibrinostabilisante, fut largement exempte de protéines accessoires et ne contint pas de substances liées aux groupes sanguins. 30 On savait déjà, certes, que le facteur XIII est contenu dans le plasma sanguin et dans les thrombocytes et que l'on peut l'isoler à partir du plasma. On l'obtenait par précipitation au moyen de sulfate d'ammonium, chauffage et chromâtographie sur DEAE-cellulose. Néanmoins la concentration 35 plasmatique du facteur fibrinostabilisant est faible et le rendement du procédé indiqué est, par conséquent, bas. Le chauffage grâce auquel on sépare le facteur XIII du fibrinogène ne peut être réalisé que sur des quantités réduites. C'est pourquoi le procédé n'a pu se faire une place dans la technique. 71 46138 2 2119008 De plus, le plasma est trop coûteux, en tant que matière de départ, pour l'obtention du facteur XIII dans des conditions économiques. Pour la même raison, les thrombocytes ne peuvent constituer une matière de départ pour la préparation industrielle du facteur XIII. Or, la Demanderesse a trouvé que l'on peut obtenir, avec de bons rendements, le facteur fibrinostabilisant à partir du placenta humain. La présente invention a donc pour objet un procédé d'isolement du facteur fibrinostabilisant, procédé selon lequel, en opérant à froid,, on franchit les étapes suivantes : a) à un extrait préparé, au moyen d'une solution de Î&C1, à partir de placentas humains, et débarrassé des impuretés solides, on ajoute, à un pH allant de 5,0 à 7,5, de préférence égal à 6,0,, une solution de lactate de diamino-éthoxy-acridine ("Rivanol" ), b) on dissout le précipité formé, éventuellement après l'avoir lavé plusieurs fois, dans une solution diluée d'un chlorure alcalin, de préférence de chlorure de sodium, d'un pH de 7,0 à 8,0,, de préférence de 7,5, Qui contient environ 5 % d'un agent complexant (par rapport au chlorure alcalin ), c) dans la solution, que l'on a au préalable débarrassée des substances insolubles et que l'on a éventuellement diluée encore, on fait précipiter des substances secondaires inactives par addition d'une base d'ammonium quaternaire, d) on isole un autre précipité à partir du filtrat au moyen de lactate de diamino-éthoxy-acridine, e) on décompose le précipité, après séparation du surnageant, par addition d'une solution diluée d'un chlorure alcalin, de préférence de chlorure de sodium, dont le pH va de 7,0 à 8,0 et est de préférence égal à 7,5 et qui contient environ ^ ^ d'un agent complexant (par .rapport au chlorure alcalin), et on sépare la phase solide, f) on ajoute, au filtrat, de 20 à 30 %, de préférence 25 %, de sulfate d'ammonium solide, on sépare le précipité au bout de plusieurs heures, on le mélange en agitant avec une solution diluée d'agent complexant pour obtenir une bouillie que l'on dialyse contre un tampon de tris-(hydroxy-méthyl)-amino-méthane (ou "tris") et d'acide chlorhydrique qui contient en plus un agent complexant et NaN^, 71 46138 2119008 g) après élimination des impuretés à pH 6,0 on filtre sur gel le dialysat restant, à un pH neutre, on sépare un précipité à partir des fractions actives au moyen de sulfate d'ammonium solide et on dissout le précipité dans un tampon 5 neutre de "tris" et EDTA (acide éthylène-diamine-tétracétique), h) on dialyse la solution contre un tampon neutre de tris- EDTA, on fait précipiter, dans la solution restante, le facteur XIII à l'état d'euglobuline à un pH de 5,0 environ, i) on dissout le précipité séparé dans une solution 10 de chlorure de sodium physiologique qui contient une petite quantité d'un agent complexant, on ajoute un stabilisant à la solution, on la filtre dans des conditions de stérilité, on la dialyse, on la normalise et, éventuellement, on la lyophilise. Comme base d'ammonium quaternaire (voir c)) on 15 utilisera de préférence le chlorure de N-cétyl-pyridinium ;on peut en outre envisager un chlorure d'alkyl-diméthyl-benzyl-ammonium ("Zephirol") et un chlorure de dichlorobenzyl-diméthyl-alkyl-ammonium ("Riseptin"). Comme exemples de stabilisants appropriés (voir i)) 20 on citera par exemple l'albumine humaine ou la gélatine qui a été dégradée par hydrolyse et réticulée par un isocyanate, telle que celle que l'on trouve dans le commerce sous le nom de marque déposé "Haemaccel" Comme agents complexants (voir b), e), f) et i)), 25 on mentionnera, surtout, l'acide éthylène-diamine-tétracétique (EDTA) et l'acide nitrilo-triacétique. Le facteur fibrinostabilisant isolé conformément à l'invention à partir de placentas humains ne présente pas de différences typiques par rapport au facteur XIII des thrombocytes 30 mais il diffère nettement du facteur XIII plasmatique. Les caractéristiques physico-chimiques et chimiques sont rassemblées dans le tableau suivant. (voir tableau page suivante) 71 46138 4 2119008 TABLEAU Source du facteur fibrinostabilisant Plasma Thrombocytes Placenta 5 Coefficient de sédimentation 8,4 S 7,4 S . 7,2 : Poids moléculaire 300.000 150.000-200.000 165.01 Teneur en glucides, en % 4,9 1>5 1,47 hexoses 1,9 1,2 0,98 f ucose 0,2 0,0 0,0 10 hexosamine (N-acétylée) 1,6 0,16 0,28 acide neuraminique (N-acétylé) 1,2 0,15 0,21 Restes d'amino-acides en % de leur total 15 lys ine 6,3 5,7 5,1 histidine 2,5 2,0 1,9 arginine 5,5 6,2 6,2 acide aspartique 10,4 12,2 12,2 thréonine 7,2 5,9 6,2 20 sérine 7,2 5,8 6,1 acide glutamique 12,7 1058 11,0 proline 5,7 4,6 4,9 glycine 7,9 7,1 7,0 alanine 4,1 5,3 5,3 25 valine 7,5 9,9 9,7 méthionine 2,0 2,6 2,6 isoleucine 4,8 5,2 5,0 leucine 7,3 6,8 6,7 tyrosine 5,0 4,2 4,4 30 phénylalanine 3,9 4,5 4,6 1/2 cystine 1 1,2 1,1 On détermine l'activité du facteur f ibrinos'tabilisant à l'aide d'une épreuve de dilution (cf. Thromb. diathes. haemorrh. 22., 455 (1970)). On met à profit, pour cela la 35 différence de solubilité de la fibrine réticulée et de la fibrine non réticulée (par suite du manque de facteur fibrinostabilisant ) dans l'acide chloracétique à 1 Avec des dilutions croissantes de la solution à évaluer on provoque d'abord, à l'aide de thrombine, la formation de caillots de fibrine à partir de 71 46138 2119008 fibrogène exempt de facteur XIII, puis on fait incuber avec de l'acide chloracétique à 1 %. On détermine ensuite la dilution maximum pour laquelle le caillot de fibrine existe encore. C'est là la concentration du facteur XIII qui est juste 5 suffisante pour la réticulation. Avec la dilution immédiatement supérieure, le caillot de fibrine se dissout. Comme substance de référence, on utilise un mélange de plasmas humains normaux. On définit comme unité l'activité du facteur XIII contenue dans 1 ml. L'activité fibrinostabili-10 santé recherchée est calculée par le rapport entre les valeurs limites de la dilution pour le mélange de plasmas et pour la solution mise à l'épreuve. Comme domaine d'application pour le facteur XIII obtenu conformément à l'invention; on peut envisager tous les 15 états de déficience en facteur XIII, par exemple les déficiences congénitales., avec les syndromes hémorragipares, les saignements et les retards dans la guérison des plaies, ainsi que les insuffisances passagères en facteur XIIIS par exemple après les opérations, avec les retards de la cicatrisation qui en 20 résultent. La solution contenant le facteur XIII est injectée par la voie intraveineuse. Il est bon de débuter par une quantité correspondant à l'activité facteur XIII de 250 ml de plasma humain frais. En fonction des besoins, on peut appliquer jusqu'à une quantité quadruple. 25 L'exemple qui suit a pour but d'illustrer la présente invention. Les températures sont indiquées en degrés Celsius. EXEMPLE : On met en menus morceaux 1500 kg de placentas humains 30 congelés (cette quantité correspond à peu près à 2400 placentas) et on mélange en agitant avec 1500 litres d'une solution de chlorure de sodium à 0,5 On chauffe à 10° le mélange obtenu et on le centrifuge. On fait précipité, à partir du surnageant dépourvu d'éléments tissulaires, la fraction ayant une activité 35 fibrinostabilisante à un pH de 5,0 à 7,5, de préférence de 6,0, au moyen d'une solution de "Rivanol" à 3 % ( , de Rivanol, par rapport aux protéines ) et on l'isole par centrifugation. BAD ORIGINAL 71 46138 2119008 On met en suspension la matière centrifugée, à pH de 7*0, dans 900 litres d'eau, on la lave et on la centrifuge de nouveau. On dissout le résidu dans 800 litres d'une solution de chlorure de sodium à 2,5 ^ qui contient encore 0,125 % 5 d'acide éthylène-diamine-tétracétique (EDTA) et dont le pH a été réglé à 7,5, l'agite et, au bout de 4 heures, on sépare la matière insoluble. On étend le surnageant à 1500 litres au moyen d'eau. On ajoute, à cette solution, 20 à 40 litres, de préférence 30 litres, d'une solution de chlorure de N-cétyl~ 10 pyridinium à 3 %, à un pH de 6,0 à 8,0, de préférence de 7,0. On fait ainsi précipiter les protéines parasites et les muco-polysaccharides. On les élimine par ceiitr if ugation. On ajoute, à la solution surnageante, 50 à 100 litres, de préférence 75 litres, d'une solution de Rivanol à 3 à la suite de quoi la fraction 15 porteuse de l'activité fibrinostabilisante précipite. Après siphonnage de la matière surnageante, on décompose le précipité de Rivanol au moyen de 100 litres d'une solution de chlorure de sodium à 5 % contenant 250 g d'acide éthylène-diamine-tétra-cétique et dont le pH est de 7,5, en l'agitant pendant 1 à 2 heures 20 On sépare par filtratlon le chlorure de Rivanol qui a précipité. Dans le filtrat on fait précipiter lentement, en agitant, le facteur fibrinostabilisant par addition de 20 à 30 de préférence de 25 de sulfate d'ammonium solide. Jusqu'à cette précipitation avec du sulfate d'ammonium 25 le traitement complémentaire des placentas doit être effectué aussi vite que possible et à des températures qui vont de 5 à 10" si l'on veut éviter que l'activité diminue trop. Le précipité produit avec le sulfate d'ammonium est séparé par centrifugation après un repos de 3 à 4 heures. 30 Pour une autre purification on mélange en agitant 800 g de la pâte de sulfate d'ammonium avec une solution 0,01 molaire d'acide éthylène-diamine-tétracétique (pH de 7,0) pour obtenir une bouillie que l'on dialyse, à 4°, contre un tampon' 0,005 molaire de tris-(hydroxyméthyl)-amino-méthane et d'acide chlorhy-35 drique (tris-HCl) (pH de 7,0) qui contient 0,005 mole de EDTA/litre de tampon et 0,05 % d'azoture de sodium. On porte ensuite le pH de la solution à 6,0. On sépare le précipité obtenu par centrifugation et on le jette. On porte le pH du surnageant à 7,0 et on le purifie sur Sephadex. Pour l'élution 40 on utilise une solution tampon 0,005 molaire de tris-HCl (pH de 7,0' bad original 71 ^6138 7 2119008 qui contient 0,005 mole d'EDTA/litre de tampon et 0,1 % d'azoture de sodium. On recueille les fractions actives après le passage et on sépare le facteur stabilisant lp fibrine par précipitation avec du sulfate d'ammonium (environ 25 g 5 par 100 ml d'éluat). On isole le précipité et on le dissout dans un tampon 0,005 molaire de tris-SDTA à pH 7,0. Après une dialyse de 2n heures contre un tampon 0,005 molaire de tris-EDTA de pH de 7.0 on fait précipiter le facteur fibrinostabilisant à l'état d'euglobine en portant le pK à 5 0. On dissout 10 le résidu obtenu par centrifugation dans 200 ml d'une solution physiologique de chlorure de sodium qui contient 0,01 mole de EDTA/litre de solution et dont le pH a été réglé à 7,0 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 H. Après addition de 1° ml de protéines humaines à 20 ^ on filtre la 15 solution dans des conditions de stérilité à travers un filtre retenant les bactéries et on la dialyse successivement contre une solution physiologique de chlorure de sodium et contre une solution physiologique de chlorure de sodium additionnée de 0,5 de glucose. On détermine ensuite l'activité fibrino-20 stabilisante de la solution en comparaison avec du plasma humain et on dilue avec une solution de chlorure de sodium contenant du glucose à un point tel que l'activité de 4 ml de la solution corresponde à 250 - 3QC ml de plasma mixte. On ajoute, en outre, encore 10 ml de protéines humaines à 20 ^ 25 par 250 rr.1 de solution diluée. Après la filtration dans des conditions de stérilité on conditionne la solution par doses de 4 ml et on lyophilise. L'activité fibrinostabilisant totale obtenue à partir de 15C0 kg de placentas fournit 2000 doses à 250 ml d'activité 30 plasmatique chacune. Pour isoler la même quantité d'activité fibrinc~réticulante à partir du plasma il faudrait d'environ 4000 a 6000 litres de sang, ce qui correspondrait à un nombre de dons de sang d'environ 3000 à 12000, chaque prélèvement étant de 500 rr.l. BAD ORIGINAL * 71 46138 8 2119008 REVENDICATION 1.- Procédé permettant d'isoler un facteur stabilisant la fibrine, procédé caractérisé en ce que, en opérant à froid, on effectue les opérations suivantes : 5 a) à un extrait préparé à partir de placentas humains au moyen d'une solution de chlorure de sodium et débarrassé des impuretés solides, on ajoute une salution de lactate de diamino-éthoxy-acridine, à pH de à 7*5.» de préférence de 6,0, 10 b) on dissout le précipité formé, éventuellement après l'avoir lavé plusieurs fois, dans une solution diluée d'un chlorure alcalin, de préférence de chlorure de sodium, d'un pH de 7,0 à 8,0, de préférence de 7,5, qui contient environ 5 $ d'un agent complexant (par rapport au chlorure 15 alcalin), c) dans la solution, que l'on a au préalable débarrassée des substances insolubles et que l'on a éventuellement diluée encore, on fait précipiter des substances secondaires inactives par addition d'une base d'ammonium quaternaire, 20 d) 'un isole un autre précipité à partir du filtrat au moyen de lactate de diamino-éthoxy-acridine, e) on décompose le précipité, après séparation du surnageant, par addition d'une solution diluée d'un chlorure alcalin, de préférence de chlorure de sodium, dont le pH 25 va de 7,0 à 8,0 et est de préférence égal à 7,5 et qui contient environ 5 % d'un agent complexant (par rapport au chlorure alcalin), et on sépare la phase solide, f) on ajoute, au filtrat, de 20 à 30 %, de préférence 25 %, de sulfate d'ammonium solide, on sépare le précipité 30 au bout de plusieurs heures, on le mélange en agitant avec une solution diluée d'agent complexant pour obtenir une bouillie que l'on dialyse contre un tampon de tris-(hydrnxy-mé£hyl)-amino-méthane (ou "tris") et d'acide chlorhydrique qui contient en plus un agent complexant et NaN^, 35 g) après élimination des impuretés à pH 6,0, on filtre sur gel le dialysat restant, à un pH neutre, on sépare un précipité à partir des fractions actives au moyen de sulfate d'ammonium solide et on dissout le précipité dans un tampon neutre de "tris" et EDTA (acide éthylène-diamine-40 tétracétique), BAS ORlGfhtAL 71 46138 2119008 h) on dialyse la solution contre un tampon neutre de tris-EBTA, on fait précipiter, dans la solution restante, le facteur XIII à l'état d'euglobuline à un pH de 5,0 environ, i) on dissout le précipité séparé dans une solution 5 de chlorure de sodium physiologique qui contient une petite quantité d'un agent complexant, on ajoute un stabilisant à la solution, on la filtre dans des conditions de stérilité, on la dialyse, on la normalise et, éventuellement on la lyophilise. 10 2.- Procédé permettant d'isoler un facteur stabilisant la fibrine, caractérisé en ce qu'on utilise des placentas humains comme matière de départ.