Brevet FR2126108A1 — publié le 19721006

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé line Denise IIAHCY et LU, Jean FLORENT et Jean LUtïËLj concerne deux nouveaux antibiotiques désignés respectivement par les numéros 23»67î RP et 23»672 RP et leur préparation par culture d'un streptomyces identifié plus complètement 5 ci-après et désigné par l'appellation STREPTOLiYCES CHRYSEUS., PS 12.370 (NRRL 3892). Les antibiotiques 23,671 RP et 23.672 RP possèdent une activité antimicrobienne importante principalement sur les germes Grain-positifs, en particulier sur les staphylocoques, ainsi que sur les mycobactéries en parti-10 culier sur la souche de bacillus tuberculeux H 37 Rv. En outre ils ont l'avantage de ne présenter, qu'une fftible t.oxicité« PROPRIETES PHYSICOCHIUQUES L'antibiotique 23.671 RP est caractérisé par les propriétés physico-chimiques suivantes : 15 Aspect : poudre cristalline blanche Analyse élémentaire : l'antibiotique 23.671 RP est composé de carbone, d'hydrogène et d'oxygène dans les proportions suivantes : C % - 58,45 - 58,6 H % = 8,6 - 8,7 O % = 31,35 - 31,55 Solubilité : L'antibiotique 23.671 RP est pratiquement insoluble dans l'eau à 20 20°G ; il est soluble dans les alcools, l'acétone, l'éther, le diméthylforma-mide et les solvants chlorés. Point de fusion (banc Kofler) : 130 - 132°C. Pouvoir rotatoire : — - 71,5° + 1,5° (c = 1, méthanol) 25 Spectre U»V. : en solution méthanolique le 23.671 RP présente un maximum 17 17 d'absorption à 285 nia (2^^ = 1,04) et un minimum à 252 na (3j^ = 0,67). La figure 1 représente le spectre U.V. du 23.671 RP en solution dans le méthanol à la concentration de 2110 jig/cm3. Spectre I.R. : (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr) 30 ce spectre est représenté par la figure 2 dans laquelle on a porté en abcisses, d'une part les longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle supérieure) et d'autre part las nombres d'ondes en cm * (échelle inférieure), et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau X sont indiquées les principales bandes d'absorption 35 infra-rouge du 23.671 SP exprimées en nombre d'ondes (cm *). 71 06492 2 2126108 TABLEAU I 3480 F 1325 épt 905 m 2980 F 1295 ra 870 f 2940 F 1260 épt 835 m 2920 épt 1235 Q 805 f 2890 m 1215 tf 780 m tF = très forte 2840 £ 1162 tF 745 tf F = forte 1735 tF 1115 F 725 t£ m " moyenne 1710 épt 1095 épt 700 f f = faible 1630 m 10C0 tF 660 épt tf = tr^s fai'ili 1455 F 1060 F 645 épt épt ~ épaulcnciit 1412 m 1035 épt 600 f 1375 F 1000 F 500 f 1350 m 9C5 épt 455 m 1345 épt 965 m 420 f 1330 m 920 m 395 f Migrations chroraato graphique s Chromatographie sur couche mince d'un mélange de icieselgel H et d'alumine H (75-25 %) dans les conditions suivantes : 20 - dépôt de 100 1.13 - développement par l'acétate d'éthyle pur, en cuve saturée à 22°C - révélation par pulvérisation d'acide sulfurique concentré, le 23,671 RP a un Rf de 0,26. Chromâtographie sur couche mince de silicagel Ilerclc F 254, 25 et développé avec le systàne acétate d'éthyle, chloroforme, acétone (1-1-1 en volumes) et révélé dans les conditions précédantes, le 23,671 RP a un Rf de 0,62. L'antibiotique 23.672 RP est caractérisé par les propriétés physico-chimiques suivantes : 30 Aspect : poudre cristalline blanche. Analyse élémentaire : l'antibiotique 23.672 RP est composé de carbone, d'hydrogène et d'oxygène dans les proportions suivantes : C % = 58,6 - 58,7 H % = 8,4 - 8,5 0 %= 32,6 - 32,8 Solubilité : l'antibiotique 23,672 RP est pratiquement insoluble dans l'eau 35 20°G ; il est soluble dans les alcools, dans l'acétone, dans l.'athor, dans 1 diméthylformaiaide et les solvants chlorés. 71 064.92 3 2126108 Point de fusion (banc Kofler); 153 - 155°G Pouvoir rotatoire : = - 71° + 1,5° (c = 1, méthanol) Spcctre U,V. : en solution méthanolique le 23.672 RP présente un maximum 5 d'absorption à 285 nm (E^ ^ = 0,67) et un minimum à 254 nm (e3 ^ = 0,40), i cm jl crû La figure 3 représente le spectre U.V. du 23.672 RP en solution dans le méthanol aux concentrations de 10,6 - 106 - 1155 |!g/cra3. Spectre I.R. : (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr) ce spectre est représenté par la figure 4 dans laquelle on a porté en abscisses, 10 d'une part des longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle supérieure) •1 et d'autre part les nombres d'ondes en cm (échelle inférieure), et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau II sont indiquées les principales bandes d'absorption infra-rouge du 23.672 RP exprimées en nombre d'ondes (cm *) 15 TABLEAU II 3450 tF 1240 m 895 f 3210 épt 1210 f 860 f - - - 2965 F 11C5 épt 830 m 2921 F 1155 tF 800 f 20 2890 épt 1135 f 777 m 2870 f 110G F 740 tf tF = très forte- 2830 cpt 1090 épt 715 tf F = forte' 2040 tf 1075 m 692 £ m = moyenne 1740 tF 1070 f 655 épt f = faible 25 1625 Cl 1055 tF 635 épt tf = très faible 1450 F 1025 épt 595 m. épt. .= épauleraent 1405 ta 995 F 545 m 1375 F 975 épt 490 a 1347 m 955 m 450 a 30 1325 El 922 épt 415 épt 1255 f 912 m Uigrations chror.iato graphique s : Ghronatographie sur couche uince d'un mélange de l.ieselgol H et d'alumine H (75 - 25 /») dans les mânes conditions que l'antibiotique 35 23.671 RP, le 23.672 HP a un Rf de 0,17. Chromatographie sur couche mince de silicagel ilerclc F 254 et développé avec l'acétate d'éthyle, le 23,671 RP a un Rf de 0,38 et développé H 71 06492 4 2126108 avec le système acétate d'éthyle, chloroforme, acétone (1-1-1 en volumes), un Rf de 0,50. ACTIVITE ANTIBIOTIQUE 5T TOXICITE A - Activité bactériostatique in-vitro 5 L'activité bactériostatique des produits 23.671 RP et 23.672 RP envers un certain nombre de germes a été déterminée par une des méthodes de dilution couramment employées à cet effet. Pour chaque germe, on a déterminé la plus petite concentration de substance qui, dans des conditions définies, empêche tout développement visible dans un bouillon nutritif approprié. 10 Les résultats des diverses déterminations sont rassemblés dans le tableau ci-dessous, où les concentrations bactériostatiques minimales sont exprimées en microgranmes de substance par cm3 de milieu d'essai. TABLEAU III 15 Organismes bactériens essayés Concentratioi-.s minimales bactériostatiques '«.g/cm3 23.671 HP 23.672 RP Staphylococcus aureus, souche Smith 0,70 0,67 20 Staphylococcus aureus, souche 133 (Institut Pasteur) 0,90 1,2 Staphylococcus aureus, souche 209 P - ATCC 6538P 0,38 0,54 Staphylococcus aureus, souche 209 P - ATCC 6538P rendue résistante à la carbomycine > 200 >200 25 Staphylococcus aureus, souche 209 P - ATCC 6538 P rendue résistante à 1'érythromycine 110 170 Staphylococcus aureus, souche 209 P - ATCC 6538P rendue résistante à la spiramycine 0,56 0,86 Staphylococcus aureus, souche 209 P - ATCC 6538P rendue résistante à la pyostacine 48 55 30 Sarcina lutea - ATCC 9341 0,05 0,07 Streptococcus faecalis - ATCC 9790 1,7 1,5 Streptococcus viridans (Institut Pasteur) 8,3 6,7 Streptococcus pyogenes hemolyticus (souche Dig 7, Institut Pasteur) 0,19 0,24 35 Diplococcus pneumoniae (souche Til, Institut Pasteur) 2,3 1,1 Bacillus Subtilis - ATCC 6633 0,15 0,35 Bacillus cereus - ATCC 6630 0,05 0,10 40 îlycobacfcerium species - ATCC 607 0,52 0,42 Liycobacterium para-sraegoatis (175 - Lausanne) 1,2 0,35 71 06492 5 2126108 Organisnes bactériens essayés ; Concentrations minimales bactériostatiques jig/eia3 23.071 RP ■ 23,672 RP 5 Escherichia coli - ATCC 9637 >200 >200 Shigella dysenteriae - Shiga L (Institut Pasteur) >200 >200 Saliaonella paratyphi A (Laçasse, Institut Pasteur) >200 >200 Salmonella schottr.iuelleri (paratyphi B) Fougenc (Institut Pasteur) >200 >200 10 Proteus vulgaris >200 >200 Klebsiella pneunoniae - ATCC 10.031 >200 >200 Pseudomonas aeruginosa (souche Bass - Institut Pasteur) >200 >200 15 Brucella bronchiseptica (Cil 387 - Wellcome Institut) >200 >200 Pasteurell-a multocida (A 125 - Institut Pasteur) >200 >200 Hycoplasma galliscpticum ) 30 >30 Ces différentes déterminations montrent que l'activité des produits 23.671 RP et 23.672 RP s'exerce essentiellement sur les germes 20 prenant lacoleration de Gram. En outre, on voit que le 23.671 SP et le 23.672 RP présentent in-vitro une résistance croisée avec la carboiaycine, 1'érythromycine, la pyostacine» nais non avec la spiranycine. B - ACTIVITE ABTITUBSRCULSUSE IK VITRO L'activité des 23.671 RP et 23.672 RP sur Llycobacterium tuberculosis H 37 Rv a été déterminée en milieu liquide de Dubos par la technique des dilutions successives. Le résultat de cette détermination figure au tableau IV. TA3L2AU IV Produit Concentration inhibitrice à l'égard de H 37 Sv (h) p. g/ml 23.671 RP 23.672 RP 0,6 (1,25) 1,25 (5 ) (*) Le premier chiffre indique la concentration à laquelle est obtenue l'inhibition principale de la culture } le deuxième chiffre (entre parenthèses), indique la concentration à laquelle est obtenue l'inhibition totale. 35 Le 23.671 HP est deux fois plus actif que le 23.672 RP. 71 06492 6 2126108 L'activité in vitro du 23.671 RP a été nesurce vis-à-vis de mycobactéries résistantes à divers antibiotiques, en vue de démontrer une éventuelle résistance croisée. Iialgré de tràs légères différences d'activité d'une souche à l'autre, le 23,671 RP garde son activité à l'égard de 5 souches hautement résistantes à la rifanpicine, à la streptomycine, è la néomycine et à la kananycine, et h l'égard de souches modérément résistantes à la vioraycirtc et à la «risélimycine. G - TOXICITE Le 23,671 SP présente une toxicité modérée et le 23,672 RP est 10 pratiquement ataxique comme en témoignent les résultats ci-après, La toxicité aigûe a été déterminée chez la souris par voie orale et par voie sous-eutanée, 23,671 RP î DL50 = 750 rag/kg s.c, = 535 mg/kg p,o, 15 23,672 RP : DL,.Q = atoxique à 2500 mg/kg s.c, = atoxique à 2500 mg/kg p,o, D - ACTIVITE AHTIi-ilCROBIEHKE IH VIVO L'activité des 2 produits sur l'infection expérimentale (par voie intrépéritonéale) à staphylocoque de la souris a été déterminée par voie orale 20 et par voie sous-cutanée. Les DC^q dans le traitement de l'infection Staphylocoçcique sont données dans le tableau V en mg/kg de poids d'animal, TABLEAU V 23,671 RP - — — 23.672 RP p.o. i l s.c. p.o. s »c • 40 i t ' 25 85 35 E - ACTIVITE ANTITUBERCULEUSE IH VTVO L'activité in vivo des 23,671 RP et 23.672 RP a été déterminée chez la souris infectée par une souche humaine virulente, 30 A des doses comprises entre 100 et 200 mg/kg s.c. et entre 100 et 250 mg/kg p,o, les antibiotiques 23,671 RP et 23.672 RP prolongent significativement la vie des animaux traités par rapport à colle fbs erimEUX témoins. BAD ORIGINAL 71 06492 7 2126108 ORGANISLJB PRODUCTEUR L'organisme producteur des antibiotiques 23,671 RP et 23,672 RP est une souche de streptomyces qui a été isolée à partir d'un échantillon de terre prélevé aux Indes et à laquelle a été attribué le numéro PS 12,370, Cette souche a été déposée au Rorthern Régional Research Lsboratory sous le 5 numéro ÎÎRRL 3892 et est librement accessible au public. Cet organisme, présentant des caractères qui n'ont pas permis de l'identifier â use esp .ce déjà décrite, doit être considéré comme une espèce nouvelle et a été désigné par l'appellation STREPTOIIYCES CHRYSEUS, Streptomyces chryseus, souche PS 12,370 forme des spores cylin-10 driques mesurant 0,3 à 0,4 y / 0,8 à 1,4 u. Les filaments sporifères sont droits ou légèrement flexueux et sont insérés le plus souvent isolément sur les filaments qui les supportent ; ils sont parfois relativement courts mai? peuvent avoir une longueur plus importante et comporter jusqu'à plusieurs dizaines de spores. Par son mode de sporulation, cette souche se classe dans 15 la section 'Rectus-Flexibilis de la classification de Pridham, Streptomyces chryseus, souche PS 12,370 se développe bien à 25°C, assez bien à 37°C, moins bien à 45°C et pas à 50°C, Il ne produit pas de pigment mélanique sur les milieu:: organiques, La coloration de son mycélium végétatif est d'un jaune soutenu, en général dans les tons jatine chrome clair 20 à jaune chrome foncé. Il forme un mycélium aérien blanc habituellement assez pauvre ; ce mycélium aérien reste blanc lorsque survient la sporulation, qui ne se développe que lentement et difficilement sur les milieux où elle apparait. Les caractères culturaux et les propriétés biochimiques de Streptomyces chryseus, souche PS 12.370 sont notés dans le tableau VII. 25 Ce sont ceux de cultures arrivées a un bon stade de développement, c'est-à-dire de 3 semaines à 1 mois à 25°C sauf indications contraires» Ces caractères ont été observés sur dos géloses nutritives et des bouillons habituellement utilisés pour détanainer les caractères morphologiques des souches de streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des géloses 30 inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans "The Actinomycetes", S.A. WAKSIÏAI?, p. 193- 197, Chro:.ica Botanica Company, Walthaia, liass., U.S.A., 1950 ; dans ce cas ils sont indiqués par la lettre W suivie du numéo qui leur a été attribué 71 06492 8 2126108 dans "The Actinomycetes". Les références ou constitutions dos autres milieux de culture sont les suivantes : - Réf. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. PRIDHAL1 et col,- Antibiotics Annual, 1956-1957, p.950 5 - Réf» B - K,L, JONES - Journal of Bacteriology - 57, 142, 1949 - Réf. C - formule W-23, additionnée de 2 % de gélose - Réf, D - "Yeast Extract Agar" - T.G, PRIDHA1I et col. - Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950 - Réf. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics 10 Annual, 1956-1957, p. 950 - Réf. F - "Uelanin formation médium" -The Actinomycetes, vol. 2, p. 333, n° 42 S.A. WAKSliAïî - The Williams and Willcins Company, Baltimore, 1961 - Réf. G - W.E. GRUNDY et col. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952 - Réf. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" » T.G. PRIDHAII et col. - Antibiotics 15 Annual, 1956-1957, p. 951 - Réf, I - correspond à la formule W-l, où à 3 % de saccharose sont remplacés par 1,5 % de glucose - Réf. J - correspond à la formule W-l, où 3 % de saccharose sont remplacés par 1,5 % de glycérine 20 - Réf. K - correspond à la formule W-18, où 3 % de saccharose sont remplacés par 1,5 % de glucose - Réf. L - correspond à la formule W-18, où le saccharose est supprimé et remplacé par de petites bandes de papier filtre partiellement immergées dans le liquide 25 - Réf. il - "lianual of lîethods for Pure Culture Study of Bacteria" de la Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., - 12. - Réf. N - "Plain Gelatin" - préparé suivant les indications du "Manual of lîethods for Pure Culture Study of Bacteria" de la Society of American Bacteriologists, Geneva, K,Y.,II^0 - 18 30 - Réf. P - Lait écrémé en poudre commercial, reconstitué selon les indications du fabricant - Réf. Q - Iîilieu indiqué pour la recherche de la production de par : H.D. TRESNER et F. DARGA - Journal of Bacteriology, 7,6» 239-244, 1958, TABLEAU VII Milieux de culture Degré de développement Mycélium végétatif (M.v.) ou Envers de la culture | Appareil aérien j (comprenant l'ensemble i du mycélium aérien et j de la sporulation) i ! Pigment soluble Observations et propriétés biochimiques i Gélose de Hickey et Tresner (Réf. A) Bon L'i.v. épais et plissé, jaune de chrome foncé. Blanc. Très pauvrement développé . Nul 1 Gélose de Bennett (Réf. B) Bon M.v. épais et plissé, jaune de chrome foncé. Blanc. Tràs légères traces. j Jaune brunâtre j très faible Gélose d' Emerson (Réf.C) Bon îl.v. épais et plissé, jaune de chrome foncé. Blanc. Tràs légères traces. Nul Gélose à 1' extrait de levuru de Pridham (Réf. D) Bon ii.v, épais et plissé, jaune do chrome foncé. IIul Nul Gélose à 1' avoine et à la tomate de Pridham (Réf.E) Bon IJ»v« épais et plissé, jaune brun clair. Blanc. Très pauvrement développé. Nul Gélose glu- cose-peptone (W-6) Bon Envers jaune brun Blanc. £ssez bien développé. Brun jaune très faible Gélose nutritive (W-5) j j Modéré lî.v. brun jaune clair Nul Nul i ...... .1. 1 •vj O es 4> VO l\) ro s-* l\D ON O co j TABLEAU VII (suite) Milieux de culture Degré de dévelop-p ement Mycélium végétatif (M»v.) ou Envers de la culture Appareil aérien (comprenant l'ensemble du mycélium aérien et de la sporulation Pigment soluble Observations et j propriétés! j biochimiques ! . i. , , j Gélose tyro-sine-extrait de levure pour formation de mélanine (Réf. F) Assez bon Envers jaune clair • Blanc. Modérément développé. Nul f 1 ! Formation !de mélâ-: iiina: négative (lectures.effectuées selc^n les recommandations de ,1'auteyr) Gélose au malate de calcium de Krainsky (Réf.G) Très modéré Envers jaune brun clair Blanc» Pauvrement développé. Nul ? Solubilisation dù malate: positive, assez bonne Gélose à 1'ovalbu-mine (W-12) Très pauvre ll.v» jaunâtre faible. Très pauvrement développé. Nul ' NUI ? i : 1 ! i ! i l 5 1 Gélose glucose-asparagine (VI-2) Moyen tl.v. jaune de chrome clair. Nul 1 Jiaune brunâ-' tre faible i Gélose glycérine- asparagine (W-3) j Assez bon 11.v. jaune de chrome foncé. Blanc. A l'état de traces. Jaun ! ! . . J 1 TABLEAU VII (suite) Milieux de culture Degré de dévelop-p crient Ilycélium végétatif (li.v.) ou Envers de la culture Appareil aérien (comprenant l'ensemble du mycélium aérien et dt la sporulation) Pigment soluble Observations et propriétés biochimiques Gélose à 1» amidon de Pridhara (Réf.H) Bon li.v. épais et plissé, jaune de chrome foncé. Blanc. Très pauvrement développé. ! lïul -Spores cylindriques mesurant 0,3 à 0,4 u / 0,8 à 1,4 fi. Filaments sporifères droits ou flexueux. -Hydrolyse de 1' amidon : positive. Gélose amidon-nitrate (W-10) Bon M.v. épais et plissé, jaune brun clair. Envers jaune de chrome foncé. Blanc. A l'état de traces. Nul Hydrolyse de 1' amidon : positive. Gélose synthétique de Czapek au saccharose (W-l) Bon M.v. épais et plissé, jaune de chrome clair. Envers jaune de chrome foncé. Blanc. Très pauvrement développé. Brun jaune faible Gélose synthétique de Czapek au glucose (Réf.I) Assez bon Envers jaune de chrome -, clair. Blanc. Très pauvrement développé. Brun jaune faible Gélose synthétique de Czapek à la glycérine (Réf.J) Bon Envers jaune de chrome foncé. Blanc. Très modérément développé. Jaune brun faible Spores cylindriques mesurant 0,3 à 0,4 \x! 0,8 à 1,4 n. Fila- j ments sporifères j droits ou flexueux j VJ O C» TABLEAU VII (Suite) Milieux de culture Degré de développement liycéliun végétatif (li.v.) ou Envers de la culture Appareil aérien (comprenant 11 ensemble du mycélium aérien et de la sporulation) Pigment soluble ... Observations et ! propriétés biochimiques Bouillon ainidon-nitrate (W-19) Assez bon Voile épais. Envers jaune. Blanc. Très modérément développé. Nul Production de ni-trites à partir des nitrates s fortement positive. Bouillon de Czapelc au saccharose (W-18) Moyen Voile blanchatre. Blanc. l'Jodérément développé. Nul Production de ni-trites à partir des nitrates : fortement positive. Bouillon de Czapek au glucosc (Réf.K) lioyen Voile blanchâtre. Blanc. Très modérément développé. Nul Production de ni-trites à partir des nitrates : fortement positive. Bouillon de Czapek à la cellulose (Héf.L) Nul Pas d'utilisation de la cellulose. Bouillon nutritif ni-trosé (Réf .11) Assez bon Voile assez bien développé . Envers jaunâtre. Blanc. liodérément développé. nui Production de ni-trites à partir des nitrates : fortement positive. Culture sur ponrae de terre (W-27) Tràs bon l-.v. très épais et très plissé, jaune de chrome. Blanc. A l'état de traces. Brunâtre faible. h-* VI hA TABLEAU VII (Suite) Ililieux de Degré de ! Ilyccliun végétatif (u.v.)i culture dévelop- ou j peinent Envers de la culture i Appareil aérien ( corap r en an t 11 en s embe du mycélium aérien et de lu sporulation) ! Observations et Pigment solubluj propriétés i biochimiques L Gélatine pure à 12% (Réf.N) Lait écrémé a) à 25°G (Réf.P) Lait écrémé b) à 37°C Gélose de Tresner et Danga (Réf.Q) Bon Bon Lfodérë Bon Colonie centrale épaisse. Envers jaune clair» Anneau jaunâtre clai.r. Anneau jaune mal développé» Il.v» jaune Blanc » , Ifoyennement développé»! Nul Blanc» Brunâtre très 1 Pauvrement développé, ! faible. Bonne liquéfaction do la gélatine Feptonisei.tion suivie du coagulation « P>.iU dû ■variation du pB. Coagulation suivie de peptoïiisa» tien. Très légère acidification du pH Production de H^Ss négative (lectures effectuées selon les rccotaniancla-tiens de 1'auteurs O ON 4> UD ro Lu K3 t-jk IPO ON O co 71 06492 2126108 Streptomyces chryseus. souche PS 12«370 présente un ensemble de caractères qui ne coïncident exactement avec aucun de ceux des souches déjà décrites» Pariai les espèces dont une description est donnée dans le 5 "Borgey's l'oRta:! of Detc. rainât ive Sactoriclogy" (7hae édition, The ••."illian* and Vil Ici;; s Company, 3aitinorc, jÇOlî ainsi que dans "The Accitiouyufetus" (tfoi.» 2, S.A. rY&3UL°J:, rhe Williams end Wilklns Company, ?Jalt lawr?., 1%i); csll- doi.L 13 "v; rapprocher.ût le plus par ses caractères e : «knis '». :3)CEgE3. 10 ;:î effet, oustk S. cl;.-/;■■■■ .-s, souche PS 12.370» ."» de" ty,-. >3g«ey produit -.i. pi._ic-rt solublt? brus: essenéielleiaent sur milieux o^nthe.., . •> as, ou ns n produit rue très faiblement, sur :■«» 1 • p • t t .s milieux orgarilqach } il iorao Lporophores droits ou fle:'.u-->i*K; i spirnj '.z. et se à spores «?£. 15 'I.-'.ite.i"els, S. ~ .htQEior.-nes montre v.n mycélium vp.cj^tatif doot -a ton est ir.co*. :/e â brunâtre eu brun jaunâtre suivant les milieux} allant au brur rouge ":*-re sur "egg média", "X ces colorations ne sont p 370 sur l'ensemble de tous les milieux, aussi bien 20 synthétiques qu'organiques, sur lesquels il a été cultivé. De plus S, achroroogenes» contrairement à S. chryseus. souche PS 12.370, forme sur "glycerol nitrate agar" un mycélium aérien atteignant une teinte grisâtre foncé, prod-tic un pigment soluble brun rougeâtre sur poiame de terre, un pigment soluble brun clair sur gélatine, et ne liquéfie cette dernière que très 25 faiblements C'est pourquoi ces deux souches, bien que se rapprochant par certains points, ne peuvent être considérées comme semblables. Le capacité de S. chryseus, souche PS 12.370 à utiliser diverses sources de carbo-e et d'azote pour assurer son développement 2 été déterminée suivant le principe de la méthode de Pridham et Gottlieb (J. of Bact. 56, 30 107-114, 194C) ; le degré de développement a été observe sur lemilieu de base indiqué par les auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sources de carbone respectivement essayées, soit S0^ (NH,^ par les diverses sources d'azote respectivement essayées, après un temps convenable d'incubation à 25°G. Les résultais sont indiqués dans le tableau VIII. BAD ORIGINAL 71 06492 15 2126108 TABLEAU VIII Sources de carbone] essayées Utilisation Sources d'azote essayées Utilisation D-Ribose positive N03*!a positive P-Xylose positive HO^Na positive L-Arabinose négative so4 ( hh4)2 positive L-Rhamnose positive P04h (1!H4)2 positive P-Glucose positive Adénosine positive P-Galactose positive Uracile négative P-Fructose positive Urée positive D-Iîannose positive L-Asparagine positive L-Sorbose négative Glycocollc positive,tardive Lactose po sitiva,tardive Sarcosine négative iialtose positive DL-Alanine positive Saccharose positive DL-Valine positive Tréhalose positive Acide DL-aspartique positive Cellobiose positive Acide L-glutamique positive Raffinose négative L-Arginine positive Dextrine positive L-Lysine négative Inuline négative PL-Serine po sitive Amidon positive DL-Thréonine positive Glycogene positive PL-lIéthionine positive,tardive Glycérol positive Taurine négative Erythritol négative L-Tyrosine positive Adonitol positive DL-Proline positive Dulcitol négative L-Mydroxyproline négative D-IIannitol positive L-Kistidine positive D-Sorbitol positive L-Tryptophane positive Inositol positive 3étaïne négative j i i 30 PROCEDE PS PRSPARATIOl: PS S ANTIBIOTIQUES 23 , 671 RP ET 23.672 PJP Le procédé de préparation dos 23,671 RP et 23.672 RP consiste essentiellement à cultiver Streptomyces chryseus, souche PS 12.370 ou ses mutants producteurs sur un milieu et dans des conditions appropriés et à séparer les produits formés au cours de la culture. 35 La culture de Streptomyces chryseus, souche PS 12.370 peut être effectuée par toute îaéthode de culture aérobie en surface ou en profondeur, 71 06492 16 2126108 mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité» On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont d'un usage courant dans l'industrie des fermentations. On peut en particulier adopter la marche suivante pour la conduite 5 des opérations : Streptomyces chryseus, DS 12.370 - stock i l culture sur gélose i V culture en fiole agitée | V culture inoculum en fementeur i i 10 v culture de production en fementeur Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance, tous ces éléments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes, tels qu'on 15 en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses. Comme sources de carbone assimilable on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le maltose, les dextrines, l'amidon ou d'autres substances hydrocarbonées comme des sucres alcools : glycérol, mannitol ou comme certains acides organiques. Certaines huiles animales ou 20 végétales comme l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources hydrocarbonées, ou leur être adjointes. Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées. Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles 25 peuvent être aussi apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'arachide, de poisson, extraits de viande, de levure, distillers' solubles, com-stecp. Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un 30 effet tampon ou neutralisant corne les phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium et de magnésium. 71 06492 17 2126108 D'autres apportant l'équilibre ioniqtse nocessaire au développement du Streptomyces chryseus, souche DS 12.370 et à l'élaboration des 230671 RP et 23 . 672 RP, coixiû les chlorures et les ?.«l£ j:s?î des métaux alcalins et alcalino-ierreux. Enfin sartains agissant plus spécialeaent comme activateurs des 5 réaction» aétaboliquos de Streptomyces chryseus $ ce sont les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse. La pfl du milieu de fomentation au départ de la culture doit être compris entre û,0 et 7,S et de préférence entre 6j5 et 7,5a La température optimale pour la fermentation est de 25-30°C, nais une production satisfai-10 santé est obtenue pour des teupératures comprises entre 23 et 33°C. L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant . trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal en 23.671 PvP et 23.672 RF est obtenu après 2 à C jours de culture, ce temps dépendant essen-15 tielleiaent du milieu utilisé. Les 23,671 RP et 23,672 RP peuvent être isolés des moûts de fermentation de la manière suivante : Le mélange des deux antibiotiques est extrait directement des moûts de fermentation par des solvants non miscibles à l'eau, tels que des 20 alcools aliphatiques ayant au moins 4 atomes de carbone comme- le butanol, des esters comme l'acétate d'éthyle, des solvants chlorés comme le dichlor-éthane, le chlorure de méthylène ou le chloroforme, des cetones comme la méthylisobutyleétone. ïl est avznt&geux d'effectuer cette opération à pH 7 ou à un pH faiblement alcalin. 25 Après filtration et décantation, le mélange brut peut être isolé à partir des solutions organiques mentionnées ci-dessus par concentration de la solution sous pression réduite, suivie d'une précipitation par un non solvant ou un mauvais solvant, tel que l'hexane. La séparation des antibiotiques 23.671 2P et 23,672 EP peut être 30 effectuée à partir des extraits organiques des moûts de fementations après concentration éventuelle de ces extraits, par l'application de techniques chroraatographiques appropriées. Une façon commode de procéder consiste à fractionner le nélange issu de l'extraction du moût par passage sur une colonne de Plorisil (silicate de magnésium) éluée par gradient de solvant avec 35 un système à base de solvants chlorés. Ce premier fractionnement guidé par analyse chroaatographique de l'eluat sur couche mince de Kieselgel (gel de silice) conduit à deux fractions : l'une A enrichie en 23.671 RP et renfermant encore du 23.672 RP, l'autre B à forte proportion de 23.672 RP et contenant encore du 23.671 RP. 71 06492 18 2126108 La fraction A est à son tour fractionnée par chronatographic sur une colonne de silicagel ou d'altciine dluée par un système de solvants de polarités croissantes. Un système convenable est représenté par un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle progressivement enrichi en acétate d'éthyle 5 ou par une série de solvants chlorés purs ou en mélange ou additionnes d'un alcool inférieur tel que le méthanol. Les fractions contenant le 2îs67i RF sont détectées par analyse chroaatographique sur couche mince de Kieselge! « Le 23,671 HP esc- enfin purifié par recristallisation dans un' r-ûleng'- êtliet-hexant suivie- ri'un levage des cristaux à l'oxyde d'isopropy'.e» 10 I„n fraction B est égaicsient fractionnée en vue te 1 ' i sel uaont 23,672 RP par un nouveau passage sur une colonne de Florisil élues ~.-±r une série de solvants de polarités croissantes à base de solvcr.*.s ci'--"-s ec d'acét&tc d'éthylet L'élution fractionnée est suivie par analyse chrocmcogre-* phique sur couche tiirice de Kicselgel et le 23.672 RP isolé :s-t purifié par 15 recristallis&tion dans le aélange éther-hexane suivie d'une recristallisation dans le tétrcchlorure de carbone. Les exemples suivants donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique. Dans ce qui suit l'activité est partout déterminée à l'aide de 20 la méthode riicrobielogique de diffusion, avec corme germe sensible Staphylococcus aureus 209 P (ATCC 6530 P) et par rapport à un échantillon de 23.671 RP semi purifié pris corne étalon de dosage et titrant 640 p.g/tag. Cette activité est exprimée en |'g/mg pour les solides. L'activit du 23.672 RP est également exprimée on ug/mg ; pour cela on a tenu compte du 25 fait que dans la méthode par diffusion le 23.671 RP est quatre fois plus actif que le 23.672 "P sur Staphylococcus aureus 209 P. Exemple 1 - On charge dans un fermenteur de 170 litres : Peptone ... 600 g 30 Extrait de viande ... 600 g Cérélose ... 1200 g Chlorure de sodium ... 600 g Gélose ... 240 g Eau de ville Complément pour 110 litres. 35 Le pH est ajusté à 7,50 avec 140 cm3 de soude 10 II. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122°C pendant 40 minutes. Après refroidissement le volume du bouillon est de 120 litres et le pK de 6,90. On BAD ORIGINAL 71 06492 19 2126108 ensemence avec 200 cm3 d'une culture en erlenneyer agité de Streptomyces chryseus, DS 12«370 (' NRRL 3692). La culture est développée à 30°G pendant 26 heures en agitant et en aérant avec de l'air stérile; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice. 5 La culture productrice est effectuée dans un fementeur de G00 litres chargé avec les substances suivantes : Distillers' solubles ... 2 kg Haricots Princesse ... 16 kg Glycérine ... 4 kg 10 Chlorure de sodium ... 2 kg Eau de ville complément pour 360 litres. Le pK est ajusté à C,25 avec '(00 cia3 de soude 10 N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122°C pendant 't-0 minutes. Après refroidissement, on ajoute au bouillon 10 litres d'une solution aqueuse stérile 15 contenant : Cérélose . ... 4 kg Le volume total du bouillon est alors de 400 litres et le pH égal à 6,90, On ensemence avec -iO litres de la culture inoculum en fementeur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est effectuée à 28°C pendant 97 heures, 20 en agitant à l'aide d'une turbine tournant à 260 tours/min. et en aérant avec un volume d'air stérile de 35 m3/h. Le pli est alors de 7,55 et le volume du mout de 370 litres. La quantité d'antibiotiques présente est de 110 ug/cni3« Exemple 2 - 10 litres de moût obtenu comme à l'exemple 1 et titrant 85 î.'.g/cia3 25 sont introduits dans une cuve munie d'un agitateur et additionnés de 900 g d'adjuvant de filtration ; l'agitation est maintenue un quart d'heure à pH 7,5. Le mélange est filtré sur un filtre équipé d'un lit de 2 kg d'adjuvant de filtration. On recueille 10 litres de filtrat. 30 Ce filtrat est extrait successivement par 4 litres et 3 litres de butanol, le mélange étant ajusté à pH 7 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 6 H. L'extrait butylique est concentré à 30°C sous pression réduite (20 nm de mercure) jusqu'à un volume de 100 cm3. 35 L'addition de 1 litre d'hexane au résidu précipite un mélange brut des 23.671 RP et 23.672 RP qui, lavé, essoré et séché, pise 2,1 g et se présente sous forme d'une poudre amorphe brune titrant 36 l'-g/mg. 71 06492 20 2126108 Exemple 3 - 380 litres de moût obtenu cornue à l'exeiaple 1 et titrant 110 mg/ cm3 sont introduits dans une cuvc munie d'un agitateur et le pH est ajusté à £ à l'aide d'une solution diluée de lessive de soude» L'agitation est maintenue 5 une demi-]?eure puis on ajoute 30 leg d'adjuvant de filtration. Le mélange est filtré sur filtre-presse et le gâteau de filtration est lavé avec 100 litres d'eau alcalinisée à pH S par de lu lessive de soude 6 N« Le filtrat dont le volume est de 380 litres est ajusté à pH 7 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 6 E, agité pendant dix minutes puis 10 extrait à contre-courant à l'aide de centrifugeuse à 2 étages par 230 litres de chlorure de méthylène. L'extrait chlorométhylénique est concentré sous pression réduite (20 mm de mercure), à 30°C, jusqu'à un volume de 1 litre. Le concentré chlorométhylénique est alors passé sur une colonne de 15 1,5 lcg de Florisil (diamètre: 7,5 cm; hauteurs 65 cm). Le concentré traverse le lit de Florisil de haut en bas en 3 heures. La colonne est ensuite lavée toujours de haut en bas avec 15 litres de chlorure de méthylène à raison de 1,5 litre/heure. Les divers effluents sont rejetés et la colonne est alors éluée par gradient de solvant en ajoutant progressivement 20 litres du mélange 20 chlorure de méthylène-méthanol (95/5 en volumes) à 5 litres de chlorure de méthylène. Le débit d'élution est de 1,5 litre/heure. L'éluat est fractionné tous les 500 cm3 ; on obtient ainsi 44 fractions. Chaque fraction est analysée par chromatographie sur couche mince par dépôt de 20 jil de solution sur une couche mince de silicagel liiiRCK F 254, 25 en cuve saturée à 22°C et evec le mélange solvant CHCl^-CH^OH (87/13 en volumes) ; les migrations sont révélées par pulvérisation d'acide sulfurique concentré. Les Rf sont les suivants : Suivant les résultats de cette analyse, on rassemble séparément les 30 fractions renfermant principalement du 23.671 SP et celles renfermant principalement du 23.672 RP puis concentre à siccité, à 30°C, sous pression réduite (20 mm de mercure) les deux solutions ainsi obtenues. On obtient ainsi 30 g de 23.671 RP brut sous forme de poudre amorphe beige clair d'un titre de 525 l'g/mg et 7 g de 23.762 RP brut sous 35 forme de poudre amorphe beige clair. Exemple 4 - 36 g de 23.671 RP brut préparés selon l'exemple 3 et titrant 815 ug/mg sont dissous par agitation dans 180 cm3 d'acétone. 23.671 RP Rf = 0,55 23.672 RP Rf = 0,45 71 06492 21 2126108 La solution acétonique est additionnée de 220 g de l'ieselgel i.ERCK F 254 (0,05-0,2 r,na), puis l'ensemble est séché à 4;1°C sous pression réduite (20 naa de mercure) pendant 4 hauri'Sr. Le résidu est déposé au sommet d'une colonne de 2 kg de Kieselgel 5 .JERCK F 234 (0,05-0,2 nan) montée dans 1'ncxane (diamètre s 5 cm § hauteurs î ia)® La colonne est lavée successivement avec - 5 litres d'hexane - à litres de mélange hexane-acétate d'éthyle (75/25 en volumes) - 1} litres de mélange hexane-acétate d'éthyle (50/50 en volumes) 10-6 litres de mélange nexane-acétate d'éthyle (25/75 en volumes)» Les effluents sont rejetés» Le colonne est alors éluée par 12 litres d'acétate d'éthyleo L'éluat est fractionné tous les 100 cra3 et les fractions sont analysées par chroraatographie sur couche mince selon la technique décriée précédemment» 15 Les fractions renfenaant le 23,671 RP sont concentrées à siccité à 30°C sous pression réduite (20 mm de mercure). On obtient ainsi 20 g d'antibiotique 23.671 EP sous forme do poudre amorphe jaunâtre titrant sensiblement ÎQOO t'g/mg» Exemple 5 - 20 16,5 g de 23,671 RP brut préparés selon l'exemple 3 et titrant 460 (ig/mg sont dissous en agitant dans 250 cm3 de chlorure de méthylènea On ajoute 250 cm3 d'oxyde d'isopropyle à cette solution chlorométhylénique0 Le mélange obtenu est alors clarifié sur filtre plissé» puis passé sur une colonne de 400 g d1alumine acidifiée à pH 4 (diamètre : 4 cm ; hauteur i 33 cm). 25 On développe la colonne par passages successifs et dans l'ordre de ï - 1° - 1 litre de mélange chlorure de méthylène-oxyde d'isopropyle (l/l en volumes) - 2° - 1 litre de chlorure de méthylène pur - 3° - 1 litre de mélange chlorure de méthylène-chloroforme (l/l en volumes) 30 - 4° - 1 litre de chloroforme pur - 5° - 1 litre de chloroforme-méthanol (9/1 en volumes). On obtient ainsi 5 fractions F^-F2~F2-F^-F^ qui sont étudiées par chromatographie sur couche mince selon la technique décrite précédemment» - La fraction F^ sans intérêt est rejetée. 35 - Les fractions F2 et F^ sont réunies et concentrées à siccité à 30°G sous pression réduite (20 mm de mercure). On obtient ainsi 8,3 g d'antibiotique 23.671 RP sous forme de poudre amorphe blanchâtre titrant 1000 |ig/mg. - Les fractions F^ et F^ sont réunies puis concentrées à siccité comme précédemment. On obtient ainsi 7,2 g d'antibiotique 23.672 EP sous 40 forme de poudre amorphe blanchatre titrant 860 p.g/mg de 23,672 RP» 71 06492 22 2126108 Exenple 6 - 20 g d'antibiotique 23,671 RP préparés selon l'exenple 5 sont dissous en agitant dans 400 cn3 d'éther éthylique, La solution obtenue est clarifié.-- par filtration sur filtre plissé, 5 Oa ajoute lentement et en agitant 1600 co3 d'hexane, Le néiangfc résultant est abandonné 2 heures à +°C» Des cristaux se déposent qui sont filtrés» laves et séchas, On obtient ainsi 13 g d'antibiotique 23,671, RP sous foœfe d'une poud.-.c cristalline blanche, Sxgopla ? - 10 y J*antibiotf que 2Z Ail IU? cristallisé, préparée l'axenpl". 6 sont ni s en suspension dans 515 cn3 d'oxyde d'isjp-ropyit po±: u. c vive agitâtic-n mi -sfentio perdant "î heures» Lu suspsnsioa est en&uite filtrée sur un filtre de verre fritte « Lu produit -L_enu est lavé, séché à 50"0 .sous pression déduite (5 ixi 15 de nercure) perdant 24 heures» On obtient ainsi 20,2 s d'antibiotique 23,671 RP sous forme l'une; poudre cristalline blo ;he titrant 1000 ]ig/ng, Exenple o - 13 g de 23,672 RP brut préparés de manière identique à l'exemple 3 20 sont dissous dans 13C0 cn3 d'acétone, La solution acétonique azt décolorée par addition de 7,1 g de noir 2 S. La solution acétonique ainsi décolorée est concentrée à siccité à 30°C sous pression réduite (20 r.u de ncrcure). Le résidu renis en solution dans 50 cn3 de benz 3»^c est verse au 25 sonnet d'une colonne de 500 g de Florisil (diar.iètre : 1,5 en ; hauteur ; 55 eu) La colonne est lavée successivement avec î - 2 litres de ber.zànc - " lieras de cMorarc de néthylàne - 2 litres de r.aélsnge chlorure de raétliyl'ine-acétate d'éthyle (95/5 en v& 1 uucs) 30-2 litres de nélange chlorure de néthylàne-acétate d'éthyle (>0/10 en vclunes) - 2 litres de nélange chlorure de néthyl^ne-acétate d'éthyle (80-20 en volumes) - 5 litres de nélange chlorure de néthylîne-acétate d'éthyle (50/50 en volunes) - 2 litres d'acétate d'éthyle On obtient ainsi plusieurs fractions qui sont analysées par chrona-35 tographie en couche nince selon la technique décrite précédennent. Les fractions riches en 23,672 RP sont réunies puis concentrées à siccité à 30°C sous pression réduite (20 un de nercure)» 71 06492 23 2126108 On obtient ainsi 4 g de 23.672 RP semi-purifié sous forme d'une poudre amorphe blanchâtre. Excopie 9 - 4 g de 23.672 RP préparés selon l'exemple G sont dissous dans 5 80 cia3 d'éther anesthésique. La cristallisation est provoquée par addition lente de 120 cm3 d'hexane. On obtient ainsi 2,5 g de cristaux blancs titrant 1000 ug/mg. Exemple 10 - G g d'antibiotique 23.672 RP cristallisé préparé selon l'exemple 9 10 sont mis en suspension dans GOO cu3 de tétrachlorure de carbone à l'aide d'une vive agitation maintenue pendant 2 heures. La suspension obtenue est filtrée sur un filtre de verre fritte . Les cristaux sont lavés avec 50 cm3 de tétrachlorure de carbone puis séchés à 40°C pendant 2 heures sous pression réduite (5 mm de 15 mercure). Le produit sec est de nouveau mis en suspension dans 150 cm3 de tétrachlorure de carbone et le mélange est chauffé à reflux pendant 1 heure» La solution obtenue agitée lentement est refroidie 15 heures à 20°G puis 24 heures à 0°C. Il se forme des cristaux qui sont filtrés, lavés et séchés 20 15 heures à 45°G sous pression réduite (5 mra de mercure). On obtient ainsi 4,2 g d'antibiotique 23.672 RP sous forme d'une poudre cristalline blanche titrant 1000 |ig/mg. La présente invention comprend également les compositions médicinales contenant au moins un des produits selon l'invention en association avec 25 tout autre produit compatible qu'il soit inerte ou lui-même physiologiquement actif. Ces compositions peuvent être présentées sous toute forme pharmaceutique appropriée à la voie d'administration prévue, La proportion du ou des produit(s) actif(s) dans ces compositions 30 peut varier selon l'effet thérapeutique recherché. En thérapeutique humaine, las nouveaux produits selon l'invention sont actifs en particulier dans les infections à staphylocoques et les affections tuberculeuses. Ils peuvent être administrés par voie orale, rectale ou parentérale, la voie orale demeurant la voie d'administration préférentielle. 35 Les doses journalières sont de 250 mg à 3 g pour un adulte. 71 06492 24 2126108 Conne compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions, le produit actif salon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes, tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions 5 peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium. Corame compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharraaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops et des élixirs contenant des diluants inertes tels 10 que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. Les compositions selon l'invention pour administration parentérale peuvent être des solutions stériles non aqueuses, des suspensions ou des 15 émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylène-glycol, le polyéthylène-glycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants en particulier des agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation peut se faire 20 de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes ou dispersées au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. 25 Les compositions pour administration rcctale sont des suppositoires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao ou la suppo-cire. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention. 30 Exemple 11 - On prépare selon la technique habituelle des comprimés doses à 100 mg de 23.671 RP ayant la composition suivante : 23.671 RP ... 0,100 g amidon de blé ... 0S090 g 35 silice colloïdale ... 0,008 g stéarate de magnésium ... 0,002 g Ces comprimés peuvent être utilisés en thérapeutique humaine à raison de 3 à 20 comprimés par jour pour un adulte. 71 06492 25 2126108 S a V E i: D I G A T I O M S 1 - L'antibiotique 23a671 RP caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'una poudra cristalline biancha fondant à 130~132°CS qu'il est insoluble dans l'eau, soluble dans les alcools, l'acétone, l'éther,, le dimé- 5 thylfomaiaide et les solvants chlorés, qu'il est composé de carbone, d'hydrogène et d'oxy;pne dans les proportions : C % — 58,45-56, 6 H % = G,6-8,7 0 % = 31,35-31,55 qu'il absorbe dans l'U.V. en solution méthanolique à 285 ma et qu'il a un pouvoir rotatoire spécifique de : 94 S 10 ~ ± 1j5° (c = 1, méthanol) 2 - L'antibiotique 23.672 RP caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une poudre cristalline blanche fondant à 153-155°G, qu'il est insoluble dans l'eau, soluble dans les alcools, l'acétone, l'éther, le dimétliylformaraide et les solvants chlorés, qu'il est composé de carbone, 15 d'hydrogène et d'oxygone dans les proportions : ' C % = 5C,6-58,7 H 7.= 8,4-8,5 0 % = 32,6-32,8 qu'il absorbe dans l'U.V. en solution méthanolique à 2G5 rua et qu'il a un pouvoir rotatoire spécifique de : = -71° + 1,5° (c = 1, méthanol) 20 3 - Procédé de préparation du produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on cultive en aérobiose Streptomyces chryseus» DS 12.370 (NRRL 3C92), ou ses mutants producteurs, sur un milieu classique convenable et sous les conditions habituelles pour ce genre de culture, puis sépare et purifie l'antibiotique formé au cours de la culture. 25 4 - Procédé de préparation du produit selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'on cultive en aérobiose Streptomyces chryseus, DS 12.370 (MRRL 3892), ou ses mutants producteurs, sur un milieu classique convenable et dans les conditions habituelles pour ce genre de culture, puis sépare et purifie l'antibiotique formé au cours de la culture. 30 5 - Composition pharmaceutique utile en thérapeutique humaine caractérisée en ce qu'elle renferme comme produit actif le produit selon la revendication 1 en association avec tout autre produit compatible lui-inemo inerte ou physiologiquement actif. 71 064.92 26 2126108 6 - Composition pharmaceutique utile en thérapeutique humaine caractérisée en ce qu'elle renferme coranie produit actif le produit selon la revendication 2 on association avec tout autre produit lui-rnênc inerte ou physioiogiquenicnt actif»