Brevet FR2130695A1 — publié le 19721103

!a présente invention concerne, dans son ensemble, des hémopeptides P1, P2,; H et S, de nouveaux pep.tides synthétiques dans lesquels l'hémopeptide ?1 a la chaîne peptidique val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys~glu-ala ; l'hémopeptide P2 5 a la chaîne peptidique val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala l'hémopeptide H a la chaîne peptidique val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala ; et l'hémopeptide S a la chaîne peptidique met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala ; de nouveaux procédés de préparation des ces hémopeptides par une synthèse échelonnée 10 et réglée, dans laquelle des amino-acides individuels de la chaîne peptidique sont attachés dans l'ordre indiqué par des liaisons peptidiques ; et des composés intermédiaires utilisés dans ces nouveaux procédés. Plus particulièrement, les nouveaux hémopeptides sont préparés soit par introduction 15 successive de chacun des aminoacides individuels, par échelons, soit par synthèse de deux ou plusieurs segments de la chaîne peptidique suivie du couplage de ces segments dans l'ordre indiqué. lies hémopeptides PI, P2, H et S sont intéressants 20 pour provoquer les libérations et/ou la synthèse de substances hormonales par des organismes vivants, et ils sont particulièrement intéressants pour la libération de l'hormone de croissance par les cellules dxjlobe antérieur de lthypophyse. Ces composés sont administrés avantageusement par injection, 25 de préférence par injection intracarotidienne, lorsquIon désire la libération et/ou la synthèse de l'hormone de croissance. les abréviations utilisées dans le présent mémoire pour les amino-acides, leurs dérivés et certains groupea 30 protecteurs préférés utilisés dans la présente invention, sont définies ci-après : 10 15 72 10503 2 Amino-acide _ 1-alanine Acide 1-glutamique l~glutamine L-histidine Ij-leucine 1-lysine 1-méthionine Ii-proline Ii-serine 1-thréonine 1-valine Dérivés : groupes protecteurs ÎT-carboxyanhydride N-thiocarb ozyanhydride Benzyloxycarb onyle (carbobenzoxy) 2130695 Abréviation ala glu gin his leu lys met pro ser thr val Abréviation NCA TCA Cbz tBOC KÏÏS OMe Tertiobutyloxycarbonyle Ester de N-hydroxysuccinimide 20 Ester méthyligue Conformément à la présente invention, on prépare des hémopeptides P1, 12, H et S par couplage graduel (par des liaisons peptidiques) de leurs amino-acides individuels respectifs, ce couplage peptidique étant conduit par réaction 25 de l'amino-acide approprié, successivement (sous la forme d'un dérivé dans lequel le groupement carboxyle est activé et tous groupes amino sont protégés), d'abord avec 11alanine (lramino-acide de l'atome terminal de carbone, c'est-à-dire l'extrémité carbosylique de la chaîne polypeptidique) 30 puis successivement avec chaque polypeptide intermédiaire résultant, ce procédé par étapes étant appelé, dans le présent mémoire, synthèse séquentielle, lorsque cette synthèse séquentielle est conduite en solution, il est ordinairement préférable d'utiliser, comme amino-acide à groupe carboxyle 35 activé, l'amino-acide ÎTCA, l'amino-acide ÏCA, l'azide d1amino-acide ou un ester activé tel que l'ester NHS de cet amino-acide. Ces procédés de synthèse séquentielle utilisant 72 10503 2130695 ÎTCA et TCA sont décrits de façon plus détaillée dans le brevet français 11° 1 :*497 535. A titre de variante, les hémopeptides P1, P2, H et S sont préparés par un procédé de synthèse séquentielle 5 en phase solide partant de l'atome terminal de carbone. Dans ce procédé, l'extrémité carboxylique de l'amino-acide terminal, à savoir, l'alanine (et celle du produit polypeptidique dans les étapes suivantes), est attaché^ar une liaison de covalence à un support de résine polymère insolu-10 ble, par exemple sous la forme de l'ester carboxylique de l'alcool benzylique lié à la résine présent dans une résine polystyrène-divinylbenzène à substitution hydroxyméthylique. Dans ce procédé erj/johase solide, -le couplage peptidique peut impliquer une condensation directe entre le groupe 15 carboxyle libre d'un amino-acide réactionnel et le groupe amino de l'alanine ou du polypeptide lié à la résine. Cette réaction est ordinairement conduite en présence d'un agent de couplage tel que le dicyclohexylcarbodiimide, bien que l'amino-acide réactionnel puisse être utilisé sous la 20 forme d'un amino-acide à groupe carboxyle activé tel que l'estei' NHS, un azide d'amino-acide, etc. Au lieu de procéder par synthèse séquentielle, on peut aussi préparer les hémopeptides P1, P2, H et S par synthèse séquencée, dans laquelle divers segments peptidiques 25 des chaînes hémopeptidiques sont formés individuellement par synthèse, puis couplés dans l'ordre convenable pour former le produit polypeptidique désiré. Ces segments peptidiques sont eux-mêmes avantageusement préparés par synthèse séquentielle en solution, d'après le mode opératoire utilisant 30 NCA, TCA, l'azide ou l'ester NHS, ou par synthèse séquentielle en phase solide en utilisant l'ester HHS à groupe carboxyle activé ou l'azide d'amino-acide ou bien, le cas échéant, un amino-acide réactionnel contenant un groupe carboxylique libre, conjointement avec un agent de 35 couplage, le nombre d'amino-acides composant les segments peptidiques utilisés dans la synthèse séquencée d'hémopep-tides P1, P2, H et S, peut varier de deux à huit, mais on 72 10503 2130695 utilise, de préférence, des segments peptidiques contenant 5 ou moins de 5 amino-acides, ce qui évite des condensations qui impliquent de plus grands segments peptidiques entraînant ■des pertes de ces fragments peptidiques supérieurs, de 5 plus grande valeur. Dans la conduite de ces synthèses séquentielles ou séquencées, impliquant une réaction entre le groupe carboxyle (ou le groupe carboxyle activé) d'un amino-acide et un groupement amino de l'autre, il est ordinairement préfé-10 rable de protéger les groupes amino de l'amino-acide ou du peptide subissant une réaction au niveau de l'extrémité carboxylique de la molécule, ainsi que d'autres groupements fonctionnels des deux corps réaçtionnels qui réagissent dans les conditions de ces synthèses. Les groupes protecteurs 15 doivent conserver leurs propriétés protectrices dans les conditions du couplage peptidique et doivent pouvoir être éliminés sélectivement sans affecter les liaisons peptidiques. Les groupes protecteurs qui doivent être éliminés après une étape particulière doivent aussi pouvoir être éliminés sé-20 lectivement sans affecter d'autres groupes protecteurs qui doivent être maintenus dans les opérations ultérieures de couplage i. Les groupes protecteurs de la fonction amino que l'on utilise ordinairement comprennent des groupes formant 25 un sel, particulièrement intéressant pour protéger des groupes amino fortement basiques, des substituants du type acyle tels que formyle, phtalyle, trifluoracétyle, toluènesul-fonyle, dibenzylphosphoryle, nitrophénylsulfényle, trityl-sulfényle, o-nitrophénoxyacétyle, etc., des substituants 30 de protection d'uréthannes tels que les substituants benzyl-oxycarbonyle (carbobenzoxy), p-méthoxycarbobenaoxy, p-nitrocarbobenzoxy, tertiobutyloxycarbonyle, 2-(p-biphénylyl)-2-propyloxycarbonyle, isonicotinyloxycarbonyle, etc., ■ des substituants du type alkylique tels que les substituants 25 triphénylméthyle, trialkylsilyle, triméthylsilyle, etc. Il est préférable d'utiliser un groupe tertiobutyloxycarbonyle (tBOG) pour protéger le groupe alpha-amino des asiino-aeides (ou pepbides) subissant la réaction à l'extrémité 72 10503 130695 carboxylique de la molécule, parce que le groupe protecteur tBOC est facile à éliminer après cette réaction et avant l'opération subséqii.ente (dans laquelle le groupe alpfra-amino lui-même subit une réaction) par l1action relativement 5 douce d'acides (par exemple l'acide trifluoracétique pendant 5 à 10 minutes), ce traitement acide dans des conditions douces n'affectant pas les groupements tels que carbo-benzoxy (Cbz) et isonicotinyloxycarbonyle utilisés pour protéger d'autres groupes amino tels que le groupe epsilon-10 amino de la lysine, et pouvant être éliminés par l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage (par exemple le gaz bromhydrique en solution dans l'acide acétique cristallisable ou le gàz fluorhydrique en présence d'anisole, pendant environ une heure). 15 les groupes de protection de la fonction carboxy lique que l'on utilise ordinairement comprennent des amides, des groupes formant un sel, des substituants ester tels que les esters méthyliques et éthyliques (que l'on préfère lorsquton désirçéffectuer ultérieurement une 20 transformation en azide en passant par l'hydrazide), l'ester benzylique et, en particulier, l'ester benzylique lié à une résine, utilisé dans la synthèse en phase solide (qui réagit directement avec l'hydrazine pour cliver le peptide de la résine et former l'hydrazide peptidique), 25 l'ester p-nitrobenzylique, l'ester tertiobutylique, etc. les groupes hydroxy ne sont habituellement pas protégés dans la synthèse des hémopeptides lorsque les réactions de couplage sont conduites en solution, bien quIon puisse utiliser des substituants tétrahydropyrannyle, bcnzyle, 30 trifluoracétyle, tertiobutyle, etc., pour cette protection, le cas échéant. Toutefois, il est habituellement préférable d'utiliser ces substituants protecteurs de l'oxygène et en particulier les groupes 0-benzyle et O-tertiobutyle lorsqu'on utilise la synthèse en phase solide pour la préparation 35 de l'hémopeptide P1, ou des segments de la chaîne contenant la serine ou la thréonine. l'atome d'azote d'imidazole de l'histiciine peut aussi être protégé, le cas échéant, de pré 72 10503 6 i i iu69S férence avec un substituant IT-hydr ocarboné (ou hydrocarboné substitué) tel que N-benzyle, N-(2,4-dinitrophényle), etc. Le choix des groupes protecteurs est dicté, en partie, par les conditions particulières de couplage, 5 par l'amino-acide et par le peptide impliqués dans la réaction. Des directives pour le choix de groupes protecteurs par ticuliers que l'on doit utiliser dans la présente invention sont donnés en détail dans le brevet français N° 1 496 536 auquel on pourra se référer. 10 Le mode opératoire général préféré pour la prépara tion de l'hémopeptide P1 est indiqué par le schéma 1 suivant 72 10503 7 2130695 Schéma 1 a la 1 | glu-KCA glu-ala 2 | a-tEOC- £-Cbz-lys-NHS a-tEOC-£-Cbz-lys-glu-ala \ p3ccooh £-Cbz-lys-glu-ala 4 | glu-KCA glu-£-Cbz-lys-glu-ala 5 | glu-KCA glu-glu-£-Cbz-lys-glu-ala 15 12 13 leu-OXe HC1 | his-TCA HBr his-leu-OMe 2HOAC | tBOC-val-NHS tBOC-val-his-lou-OMe , H2K!!H2 ' tBOC-va1-his-leu-KHNH2 hono tBOC-val-his-leu-N, ala-OMe 10 | tBOC-ser-NHS tBOC-ser-ala-OMe 11 j ser-ala-OMe FjCCOOH tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe fgccooh 1 H2!!- HNH„ tEOC-val-his-leu-ser-ala-KHNH0 16 tîîOC-val-his-leu-ser-ala-N^ ^ homo tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-C-Cbz-lys-glu-ala HP anhydre val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala HPiiiawpiA • les chiffres placés à côté des flèches correspondent aiiz exemples. 72 10503 8 2130695 le mode opératoire général préféré pour la préparation de l'hémopeptide P2 est indiqué par le schéma 2 suivant : 72 10503 s 2130695 Schéma 2 17 18 19 20 21 31 32 a la '• | gln-NCA gln-ala -tBOC-£-Chz-lys-NHS a-tBOC-f-Cbz-lys-gln-ala | f3ccooh £-Cbz-lys-gln-ala | glu-NCA glu-£-Cbz-lys-gln-ala | glu-NCA glu-glu-C-Cbz-lys-gln-ala 22 23 24 25 •28 29 i leu-OMe HC1 his-TCA his-leu-OMe*2HOAC | tEOC-val-NHS tBOC-val-his-leu-OKe H2nkh2 ala-OMe tBOC-val-his-leu-RI!NH2 26 | tBOC-ser-NHS | HONO tBOC-val-his-leu-N | 3 27 I ser-ala-OMe* F^CCOOII tBOC-val-his-*leu-ser-ala-OMe tBOC-ser-ala-OMe fjccooh ! H2knh2 tBOC-vaI-his-leu-ser-ala-NHKH„ «al tBOC-va1-his-leu-ser-ala-N^ tBOC-val-his-leu-scr-ala-glu-glu-f-Cbz-lys-gln-ala HP anhydre val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala RemnT-q-Hft î Les cliiffres placés à côté des flèches correspondent a-ux exemples. 72 10503 2*30695 Le mode opératoire général préféré pour la préparation de l'hémopeptide H est indiqué par le schéma 3 suivant : 72 10503 n 2130695 Schéma 3 ala-OMe KCl 33 | tBOC-ser-NHS tBOC-ser-ala-OMe 34 | F3CCOOH ser-ala-OMe F3CCOOH 35 a-tBOC-£-Cbz-lys-NHS a-tBOC-Ê-Cbz-lys-ser-ala-OMe leu-OMe HCl 42 | his-TCA HBr his-leu-OMe 2H0AC 43-. | tBOC-val-NHS tBOC-val-his-leu-OMe 44 | H2NNH2 tBOC-val-his- leu-NHNH., 36 (a) NaOH (b) f3ccooh , (c) PH 5^05 £-Cbz-lys-ser-ala 37 | glu-NCA glu-£-Cbz-lys-ser-ala 38 ! Slu"KCA 45' 46 HONO tBOC-val-his-leu-N., 39 40 41 yL l 1 pro tBOC-thr-NHS tBOC-thr-pro | f3ccooh thr-pro F3CCOOH ICHoOH SOClo ^ thr-pro-OMe HCl tBOC-val-his-leu-thr-pro-OMe 47 | Wi glu-glu-£-Cbz-lys-ser-ala tBOC-val-his-leu-thr-pro-NHNH2 49 48 tBOC-val-his-leu-thr-pro-N3- 50 tBOC-vs-l-his-lo;u-thr-pro-glu-glu - f-Cbz-lys-s er-ala HF anhydre val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala s Les chiffres placés à côté des flèches correspondent ara exemples 72 10503 12 2130695 le mode opératoire général préféré pour la préparation de l'hémopeptide S est indiqué par le schéma 4 suivant : Schéma 4 ala 51 ala-TCA aia-ala ala-OMe. 5^ tBOC-thr-NHS ester t-BO'C-thr-ala-OMe - 52 53 a-tBOC-f-Cbz-lys-NHS ester a-tBOC- £-Cbz-lys-ala-ala F3CCOOH -J P3CCOOH 54 55 £-Cbz-lys-ala-ala glu-NCÀ u-£-Cbz-lys-ala-a?a glu-NCA glu-glu-6-Cbz-lys-ala-ala thr-ala-OMe F3CCOOH 58 | tBOC-leu-NHS ester tBOC-leu-thr-ala-OMe 59 63 I let 1 tB£ I F3CCOOH leu-thr-ala-OMe 60 | tBOC-met-NHS ester tBOC-met- leu- thr-ala-OMe 61 I H2NNH2 tBOC-met-leu-thr-ala-NHNHo tBOC-met-leu-thr-ala-Nq 62 j HONO tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-£-Cbz-lys-ala-a"a 64 HF anhydre met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala Ppmfl-rqiiR s. Les chiffres placés à côté des flèches correspondent aux exemples. 72 10503 13 2130695 Ce mode opératoire général préféré implique la corn-binaison de la synthèse séquentielle et de la synthèse par blocs, certains segments peptidiques de la chaîne déca-peptidique étant initialement formés par le procédé par étapes, 5 soit par synthèse séquentielle en solution, soit par synthèse séquentielle en phase solide, et ces segments sont ensuite couplés dans l'ordre convenable. Dans ce mode opératoire, le substituant tBOC est utilisé pour protéger des groupements alpha-amino, le substituant Cbz est utilisé pour protéger le 10 groupe e-amino de la lizine et le substituant ester méthylique est utilisé pour protéger les groupes carboxy de ltalanine, de la leucine, de la leucine-thréonyl-alanine, de l'histidyl-leucine, de la séryl-alanine, de la thréonyl-alanine et de la thréonyl-proline ; l'ester méthylique permet aussi de 15 former les composés intermédiaires destinés à la préparation, en passant par l'hydrazide, de l'azide de tBOC-val-his-leu, de l'azide de tBQC-val-his-leu-ser-ala et de l'azide de tBOC-val-his-leu-thr-pro, Toutefois, en plus du procédé préféré, l'invention envisage également les diverses permuta-20 tions de variantes, et llutilisation d'autres groupements protecteurs qui satisfont aux critères définis ci-dessus, ces variantes impliquant de même une synthèse séquentielle en solution, une synthèse séquentielle en phase solide et des combinaisons dlune synthèse séquentiell§4t d'une synthèse 25 par blocs. Comme indiqué sur le schéma 1 donné ci-dessus, le mode opératoire général préféré pour la préparation de lrhémopeptide P1 implique, en particulier la synthèse séquentielle en solution (a) du segment pentapeptidique 30 protégé glu-glu-e-Cbz-lys-glu-ala et (b) du segment pentapeptidique protégé, à groupe carboxyle activé, de l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala. le premier pentapeptide est préparé par réaction d'alanine avec l'anhydride glu-NCA, cette réaction étant conduite par agitation énergique 35 des corps réactionne!s ensemble en solution aqueuse à un pH égal à 10,2, conditions dans lesquelles la réaction est 72 10503 14 2130695 ordinairement terminée en une à deux minutes environ. La solution alcaline est acidifiée de manière à décomposer le carbamate intermédiaire pour former une solution aqueuse de glu-ala. On ajoute un volume à peu près égal d'éthanol, aqueuse 5 et on fait reagir la solution/éthanolique de glu-ala avec lvlester lîHS d'a-tBOC-e-Cbz-lysine, tout en maintenant a le pH/environ 8,0, pour former le composé a-tBOC-£-Cbz-lys-glu-ala. Ce tripeptide protégé est amené à réagir avec l'acide trifluoracétique, de manière à éliminer le groupe protecteur 10 tBOC, pour former le tripeptide e-Cbz-lys-glu-ala, et ce tripeptide protégé est précipité en solution aqueuse par ajustement du pH à 4,1. Ce tripeptide protégé e-Cbz-lys-glu-ala est amené à réagir avec le N-earboxyanhydride de l'acide glutamique — 15 (glu-KCA), réaction qui est conduite par mise en présence des corps réactionnels en solution aqueuse sous agitation énergique à un pH égal à 10,2, conditions dans lesquelles la réaction est ordinairement terminée en une à deux minutes environ, la solution réactionnelie alcaline est acidifiée, 20 de manière à décomposer le carbamate intermédiaire, pour former une solution de glu-Cbz-lys-glu-ala qui, après réglage du pH à 10,2, est ensuite amenée à réagir sous agitation énergique avec une quantité supplémentaire de glu-NCA. lia solution ré actionne lie est acidifiée, pour décomposer le 25 carbamate intermédiaire, et le pH de la solution aqueuse est ajusté à 3,5, de manière à précipiter le pentapeptide protégé glu-glu-e-Cbz-lys-glu-ala. le segment dipeptidique terminal de l'autre pentapeptide sous la forme de son trifluoracétate méthylique, ser-30 ala-OMe-P^GCOOH, est préparé tout d'abord par réaction de l'ester méthylique d'alanine avec l'ester KHS de la N-tBOC-sérine en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines (pH, de préférence égal à 8,0), de manière à former le dipeptide tBOC-ser-ala-OMe ; ce dipeptide est 35 traité à l'acide trifluoracétique pour former le trifluoracétate de ser-ala-OMe. le tripeptide de la séquence de l'hémopeptide P1, dont 72 10503 15 2130695 la synthèse reste à faire, à savoir val-his-leu, est préparé par réaction d'ester méthylique de leucine avec le U-thio-carboxyanhydride de l'histidine (ajouté sous la foxme de son bromhydrate) en solution aqueuse sous agitation énergique 5 à un pH égal à 9,5, conditions dans lesquelles la réaction est ordinairement terminée en 20 minutes environ. la solution réactionnelle alcaline est acidifiée de manière à décomposer le thiocarbamate intermédiaire, et le pH de la solution réactionnelle acidifié est ajusté à 5,0, puis la 10 solution est filtrée pour éliminer les impuretés, et évaporée sous vide pour donner le dipeptide his-leu sous la forme de son ester méthylique ; la substance brute ainsi obtenue est purifiée par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant le mélange n-butanol:acide acétique:eau pour 15 donner le diacétate de his-leu-OMe. Ce diacétate de his-leu-OMe est amené à réagir avec l'ester KHS de la N-tBOC-valine en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à 8,0) pour former le tripeptide tBOC-val-his-leu-OMe, qu'on 20 fait réagir avec l'hydrazine, et l'hydrazide résultant est traité à l'acide nitreux, de manière à former l'azide de tBOC-val-his-leu. l'azide de tBOC-val-his-leu est amené à réagir avec le trifluoracétate de ser-ala-OMe en solution dans le diméthyl-25 formamide dans des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à 8,0)pour former le pentapeptide protégé correspondant, tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe, que l'on fait à son tour réagir avec l'hydrazine, et l'hydrazide est traité avec de l'acide nitreux de manière à former l'azide 30 de tBOC-val-his-leu-ser-ala, les deux pentapeptides protégés, glu-glu-e-Cbz-lys-gLu-ala et l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala, sont amenés à réagir en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à 8,0), de 35 manière à former le décapeptide protégé, tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-e-Cbz-lys-glu-ala. le décapeptide tBOC-val~his-leu-ser-ala-glu-glu-£~Cbz— 72 10503 16 2130695 lys-glu-ala, ou autre dérivé protégé de l'hémopeptide P1, est ensuite soumis à l'action énergique d'un acide fort (agent de clivage), par exemple un acide halogénhydrique anhydre, seul ou en solution dans un solvant organique 5 sensiblement anhydre, non hydroxylique, essentiellement non basique, approprié, par exemple le gaz fluorhydrique anhydre, le gaz bromhydrique en solution dans l'acide acétique cristallisable, le gaz chlorhydrique en solution dans l'acétate éthylique, etc., de manière à éliminer les 10 groupes protecteurs pour former l'hémopeptide val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala, c'est-à-dire l'hémopeptide P1 non substitué. Il est généralement avantageux d'utiliser, dans cette réaction de clivage sous l'action d'un acide fort, un accepteur d'ion carbonium tel que l'anisole, le 15 vératrole, le sulfure de diméthyle, la méthionine, etc., qui fixe le substituant protecteur libéré, après le clivage, sous une foime non réactive. Comme l'indique le schéma 2 donné ci-dessus, le mode opératoire général préféré pour la préparation de l'hémo-20 peptide P2 implique, en particulier, la synthèse séquentielle en solution (a) du segment pentapeptidique protégé glu-glu- &-Cbz-lys-gln-ala et (b) du segment pentapeptidique protégé, à groupe carboxylique activé, à savoir l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala. Le premier pentapeptide est préparé par 25 réaction d'alanine avec l'anhydride gln-NCA, réaction qui est conduite par agitation énergique des corps réactionnels ensemble en solution aqueuse à un pH égal à 10,2, conditions dans lesquelles la réaction est ordinairement terminée en une à deux minutes environ. La solution alcaline est 30 acidifiée de manière à décomposer le carbamate intermédiaire pour former une solution aqueuse de gln-ala. On ajoute un volume à peu près égal d'éthanol et on fait réagir la solution aqueuse éthanolique de gln-ala avec l'ester MHS de l'a-tBOC-e -Cbz-lysine, tout en maintenant le pH à environ 8,0 pour 35 former le composé a-tBOC-Ê-Cbz-lys-gln-ala. Ce tripeptide protégé est amené à réagir avec l'acide trifluoracétique, de manière à éliminer le groupe protecteur tBOC pour former 72 10503 2130695 e-Cbz-lys-gln-ala, tripeptide protégé qu'on précipite dans la solution aqueuse en ajustant le pH à 5,2. Ce tripeptide e-Cbz-lys-gln-ala est amené à réagir avec le N-c'arboxyanhydride de l'acide glutamique (glu-NCA), 5 réaction qu'on conduit en mettant les corps réactionnels en présence en solutioi)4queuse sous agitation énergique à un pH égal à 10,2, conditions dans lesquelles la réaction est ordinairement terminée en une à deux minutes- environ. On acidifie la solution réactionnelle alcaline, de manière à 10 décomposer le carbamate intermédiaire pour former une solution de glu-£-Cbz—lys—gln-ala qui, après ajustement du pH à 10,2,est amenée à réagir sous agitation énergique avec une quantité supplémentaire de glu-KCA. la solution réactionnelle est acidifiée de manière à décomposer le carbamate 15 intermédiaire, et le pH de la solution aqueuse est ajusté à 3,7, de manière à précipiter le pentapeptide protégé glu-glu-e-Cbz-lys-gln-ala. l'autre pentapeptide sous la forme protégée, à savoir le composé tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe, est préparé 20 comme indiqué ci-dessus en ce qui concerne la synthèse de l'hémopeptide P1, et ce dernier est amené à soiyfcour à réagir avec l'hydrazine, puis le produit de réaction est traité à l'acide nitreux de manière à former lTazide de tBOC-valr-his-leu-ser-ala. 25 les deux pentapeptides protégés, glu-glu-e-Cbz- lys-gln-ala et l'azide de tBOC-bal-his-leu-ser-ala, sont amenés à réagir en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcaline douces (pH de préférence égal à 8,0) pour former le décapeptide protégé tBOC-val-his-leu— 30 ser-ala-glu-glu- e-Cbz-lys-gln-ala. le décapeptide t B 0 C-val—hi s-leu-ser-ala-glu-glu-e -Cbz-lys-gln-ala, ou autre dérivé protégé de l'hémopeptide P2, est ensuite soumis à l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage, par exemple un acide 35 halogénliydrique anhydre ou en solution dans un solvant organique approprié essentiellement anhydre, non hydroxylique 72 10503 '' 2130695 et sensiblement non basique, par exemple le gaz. fluornydrique anhydre, le gaz bromhydrique en solution dans l'acide acétique cristallïsable, le gaz chlorhydrique en solution dans l'acétate éthylique, etc., de manière à éliminer les groupes pro-5 tecteurs pour former l'hémopeptide P2 non substitué, à savoir val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala. Il est généralement avantageux d'utiliser, dans cette réaction de clivage par un acide fort, un accepteur d'ion carbonium tel que l'anisole, le vératrole, le sulfure de diméthyle, la méthionine, etc. 10 qui fixe ' le substituant protecteur libéré, après le clivage sous une forme non réactivée Comme l'indique le schéma 3 donné ci-dessus, le mode opératoire général préféré pour la préparation de l'hémopeptide H implique, en particulier, la synthèse séquen-15 tielle- en solution (a) du segment pentapeptidique protégé glu-glu-e-Cbz-lys-ser-ala et (b) du segment pentapeptidique protégé, à groupe carboxyle activé, à savoir l'azide de tBOC-val-his-leu-thr-pro. Le premier pentapeptide est préparé par réaction d'ester méthylique d'alanine avec 20 l'ester MHS de la M-tBOC-sérine dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à 8,0). Le dipeptide résultant, tBOC-ser-ala-OMe, est soumis à un traitement sélectif avec un acide, de préférence l'acide trifluoracétique, de manière à éliminer le groupe 25 protecteur tBOC et à former 1!alpha-aminé libre, à savoir ser-ala-OMe» Le composé ser-ala-OMe est amené à réagir dans le diméthylformamide avec l'ester MiS de ll œ-tBOC-e-Cbz lysine pour former le composé a-tBOC-e-Cbz-lys-ser-ala-QMe. Ce tripeptide protégé réagit tout d'abord avec une solution 30 alcaline aqueuse pour hydrolyser le groupe ester méthylique î puis avec l'acide trifluoracétique, de manière à éliminer le groupe protecteur tBOC pour former le tripeptide protégé e-Cbî3-lys-ser-ala qu'on précipite en solution aqueuse en ajustant le pB à 5,05. 35 tripeptide e-Cbz-lys-ser-ala est amené à réagir avec le îf-carboxyanhydride de l'acide glutamique (glu-L'CA)., réaction qu'on conduit en mettant les corps réactionxiels en présence l'un de l'autre en solution aqueuse sous agitation énergique à un pH égal-à 10,1, conditions dans 72 10503 19 2130695 lesquelles la réaction est ordinairement terminée en une à deux minutes environ. La solution réactionnelle. alcaline est acidifiée de manière à décomposer le carbamate intermédiaire pour former une solution de glu-£-Cbz-lys-ser-ala 5 qui, après que le pH a été ajusté à 10,1, est amenée à réagir sous agitation énergique avec un supplément de glu-FCA» La solution réactionnelle est acidifiée de manière à décomposer le carbamate intermédiaire, et le pH de la solution aqueuse est ajusté à 3,6, de manière à précipiter le pentapeptide 10 protégé glu-glu-e-Cbz-lys-ser-ala. • Le segment dipeptidique terminal de l'autre pentapeptide, sous la forme de son chlorhydrate d'ester méthylique thr-pro-0M.e-HCl, est préparé tout d'abord par réaction de proline avec l'ester MIS de la ÎT-tBOG-thréonine 15 en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines (pH de préférence égal à 10 ,0), de manière à former le composé tBOC-thr-proj ce dipeptide est ensuite traité avec l'acide trifluoracétique pour former le trifluoracétate de thr-pro» Ce trifluoracétate de thr-pro est ensuite amené 20 à réagir avec le méthanol en présence de chlorure de thio-nyle (catalyseur), pour former l'ester méthylique de thr-pro qu'on sépare du mélange réactionnel sous la forme de son chlorhydrate » Le tripeptide de la séquence de l'hémopeptide 25 H, dont la synthèse reste à faire, à savoir val-his-leu, est préparé par réaction d'ester méthylique de leucine avec le U-thiocarboxyanhydride dîhistidine (que l'on ajoute sous la forme de son bromhydrate) en solution aqueuse sous agitation énergique à un pH égal à .9,5, conditions 30 dans lesquelles la réaction est ordinairement terminée en 20 minutes environ» La solution réactionnelle alcaline est acidifiée de manière à décomposer le thiocarbamate intermédiaire et le pH de la solution réactionnelle acidifiée est ajusté à 5,0, puis la solution est filtrée pour éliminer 35 les impuretés et évaporée sous vide pour former le dipeptide his-leu, sous la forme de son esteij&iéthylique ; la substance brute ainsi obtenue est purifiée par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de n-butanol: acide acétique:eau pour former le diacétate de his-leu-OMe. 72 10503 20 2130695 Ce diacétate de his-leu-OMe est araené à réagir avec l'ester NHS de la N-tBOC-valine en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines douces (le pH est ajusté à 8,0 avec de la triéthy lamine ), pour former le tripeptide tBOC-5 val-his-leu-OMe, qu'on fait réagir avec l'hydrazine, et l'hydrazide résultant est traité avec l'acide nitreux, de manière à former l'azide de tBOC-val-his-leu» L'azide de tBOC-val-his-leu est amené à réagir avec thr-pro-OMe en solution dans le diméthylformamide dans 10 des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à 8,0),pour former le pentapeptide protégé correspondant, tBOC-val-his-leu-thr-pro-OMe, que l'on fait réagir à son tour avec l'hydrazine, et l'hydrazide est traité à l'acide nitreux pour former l'azide de tBOC-val-his-leu-thr-pro. 15 les deux pentapeptides protégés, à savoir glu-glu- e-Cbz-lys-ser-ala et l'azide de tBOC-val-his-leu-thr-pro, sont amenés à réagir en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à 8,0), pour former le décapeptide protégé, tBOC-val-20 his-leu-thr-pro-glu-glu-e-Cbz-lys-ser-ala» Le décapeptide tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-£-Cbz-lys-ser-aia, ou un autre dérivé protégé de l'hémopeptide H, est ensuite soumis à l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage, par exemple un acide halogénhydri-25 que anhydre seul ou en solution dans un solvant organique anhydre approprié, non hydroxylique, non basique, par ex^-p.li le gaz fluorhydrique anhydre, le gaz bromhydrique en solution dans l'acide acétique eristallisable, le gaz cblorhydrique en solution dans l'acétate éthylique, etc», de manière à 30 éliminer les groupes protecteurs pour former l'hémopeptide H substitué, à savoir val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala» Comme l'indique le schéma 4 donné ci-dessus, le mode opératoire général préféré pour la préparation de l'hémopeptide S implique, en particulier., la synthèse séquentielle 35 en solution (a) du segment pentapeptidique protégé glu-glu-e-Cbz-lys-ala-ala et (b) du segment tétrapeptidique protégé, à groupe carboxyle activé, à savoir l'azide de tBOC-met-leu-thr-ala» le pentapeptide indiqué est préparé par réaction l'alanine avec le composé ala-'TCA, réaction qui est conduite 72 1Q503 21 2130695 sous agitation énergique des corps réactionnels ensemble en solution aqueuse à un pH égal a 9,5, conditions dans lesquelles la réaction est ordinairement terminée en 10 minutes environ. La solution alcaline est acidifiée de manière à 5 décomposer le carbamate intermédiaire pour former une solution aqueuse de ala-ala» On ajoute un volume à peu près égal d'éthanol et on fait réagir la solution éthanolique aqueuse de ala-ala avec l'ester MHS de l1 a-tEOC-e-Cbz-lysine, tout en maintenant le pH à 8,0 environ, pour former le composé a—tBOC-e-10 Cbz-lys-ala-alao Ce tripeptide protégé est amené à réagir avec l'acide trifluoracétique pour éliminer le groupe protecteur tBOC, de manière à former le composé e-Gbz-lys-ala-ala c'est-à-dire le tripeptide protégé qui est précipité en solution aqueuse par ajustement du pH-à 4,1» 15 Ce tripeptide £-Cbz-lys-ala-ala est amené à réagir avec le N-carboxy-anhydride d'acide glutamique (glu-ICA), réaction qui est conduite par mise en présence des corps réactionnels en solution aqueuse sous agitation énergique à un pH égal à 10,0, conditions dans lesquelles la réaction 20 est ordinairement terminée en une à deux minutes environ. La solution réactionnelle alcaline est acidifiée de manière à décomposer le carbamate intermédiaire pour former une solution de glu-^-Cbz-lys-ala-ala qui, après ajustement du pH à 10,0, réagit ensuite sous agitation énergique avec 25 une quantité supplémentaire de glu-NCA» La solution réactionnelle est acidifiée de manière à décomposer le carbamate intermédiaire et le pH de la solution aqueuse est ajusté à 4,1, l'eau est évaporée sous vide et la matière résiduelle est purifiée par chromatographie pour donner le pentapeptide 30 protégé glu-glu-e-Cbz-lys-ala-ala. Le segment dipeptidique terminal du radical tétra-peptidique, sous la forme de son trifluoracétate méthylique thr-ala-OKe-ï^CCOCK, est préparé tout d'abord par réaction d'ester méthylique d'alanine avec l'ester NHS de la tBOC-35 threonine en solution dans le diméthylformamide dans des conditions alcalines (pH de préférence égal à 8,0), pour former le composé tBOC-thr-ala-OKe ; ce dipeptide est traité à l'acide trifluoracétique pour former le t ri f lu or acé t at e de thr-ala-OKe, Ce dipeptide est ensuite amené à réagir en solution dans le 72 10503 2130695 diméthylformamide avec l'ester NUS de tBOC-leu pour former tBOC-leu-thr-ala-OKe ; ce.»tripeptide protégé est traité avec l'acide -trifluoracétique pour éliminer le groupe protecteur tBOC, de manière à former leu-thr-ala-OMe. Ce dernier 5 réagit ensuite avec l'ester MHS de tBOC-met en solution dans le âiméthylformamide pour former le tétrapeptide protégé t-BOC-met-leu -thr-ala-OMe que l'on fait, à son tour, réagir avec l'hydrazine^et on traite l'hydrazide avec l'acide nitreux, de maniere/former l'azide de tBQC-met~leu-thr-ala<> Le pentapeptide protégé, glu-glu-6—C"bz-lys-ala-ala est amené à réagir avec cet azide de tBOC-met-leu-thr-ala en solution dans le diméthylf ormaaiide dans des conditions alcalines douces (pH de préférence égal à. 8,0), pour former le nonapeptide protégé tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-e-Cbz-lys-15 ala-ala. Le nonapeptide tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu- £-Cbz-lys-ala-ala, ou autre dérivé protégé de l'hémopeptide S, est ensuite soumis à lraction énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage, par exemple un acide halogénhydrique 20 anhydre seul ou en solution dans un solvant organique approprié non basique, sensiblement anhydre, non hydroxylique et essentiellement non basique, par exemple, le gaz fluorhydrique anhydre, le gaz broohydrique en solution dans l'acide acétique cristallisable, le gaz chlorhydrique dans lracétate 25 éthylique, etc», de manière à éliminer les group-es protecteurs pour former l'hémopeptide S non sxibstitué, à savoir met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala. Il est généralement avantageux d'utiliser, dans cette réaction de clivage par un acide fort, un accepteur d'ion earbonium tel que l'anisole, 30 le vératrole, le sulfure de diméthyle, la méthionine, etc., qui fixe le substituant protecteur libéré, après le clivage, sous une forme non réactive» Bien qu'il soit préférable, dans la pratique de la présente invention, d'utiliser les formes protégées des 35 tétrapeptides, pentapeptides, nonapeptides et décapeptides indiqués ci-dessus, on peut aussi utiliser d'autres groupes de protection de la fonction aminé, tels que ceux qui ont été indiques ci-dessus ; en outre, le groupe carboxy de l'alanine, llatome d'azote d'imidazole de l'histidine et les 72 10503 23 2130695 groupes hydroxy de la thréonine et de la serine peuvent aussi être protégés} comme décrit dans ce qui précède« Par conséquent, les nouveaux composés peptidiques de la présente invention comprennent les hémopeptides P1, P2, H et S sous leur forme 5 propre, leurs dérivés protégés et les dérivés protégés du tétrapeptide intermédiaire met-leu-thr-ala, et des pentapeptides val-his-leu-ser-ala, glu-glu-lys-glu-ala, glu-glu-lys-gln-ala, val-his-leu-thr-pro, glu-glu-lys-ser-ala et glu-glu-lys-ala-ala, dérivés dans - lesquels les groupes alpha-amino de valine 10 et de méthionine et le groupe e-aisino de la lysine sont protégés avec des substituants protecteurs caractérisés par le fait qu'ils peuvent être éliminés sans clivage sensible des liaisons peptidiquesj et le groupe hydroxyle de la thréonine et/ou le groupe hydroxyle de la serine sont éventuelle-15 ment protégés par des groupes protecteurs caractérisés de la même façon, c'est-à-dire qu'ils peuvent être éliminés sans clivage notable des liaisons peptidiques» les hémopeptides P1, P2, H et S, leurs amides tels que val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala-NH^, "val-his-20 leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala-HHg, val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala-®2 e't met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala- ala-NHg* leurs esters tels que l'acétate de val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala, le phosphate de val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala, l'acétate de val-his-leu-ser-aïa-glu-glu-25 lys-gln-ala, le phosphate de val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala, l'acétate de val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, le phosphate de val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, l'acétate de rcet-leu—thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala, le phosphate de met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala, leurs dérivés 30 N-acyliques tels que le N-formyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala, le If-acéty1-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala j le E-forinyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala, le N-acétyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala, le ÎJ-formyl-val-his-leii-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, le N-acétyl-35 val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, le II-formy 1-iset-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala, etcOJ de même que les dérivés protégés des hémopeptides, tels que tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu- £-Cbs-lys-glu-ala, tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-s-Cbz-lys-gln--ala, tBOC-yal-his-leu-thr~pro~glu-glu-£-Cbz-lys- 72 10503 24 2130695 ser-ala, tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-e-Cbz-lys-ala-ala, sont intéressants pour provoquer la libération des substances hormonales d'organismes vivants de la classe des vertébrés, et sont particulièrement intéressants pour provoquer la libé-ration et la synthèse d'hormones de croissance par les cellules du lobe antérieur de l'hypophyse chez les mammifères, les hémopeptides P1 , P2, H et S et leurs dérivés substitués sont intéressants pour favoriser la croissance rapide et/ou maximale de mammifères, et offrent un intérêt curâtif 10 dans certains cas de nanisme « Les hémopeptides et leurs dérivés substitués sont avantageusement administrés par injection ou par absorption à travers de; membranes muqueuses (par exemple par administration sublinguale, intra-nasale, etc.) ; on peut aussi recourir à -l'administration par voie 15 orale, dans le cas de dérivés qui résistent à la digestion gastrique. Pour obtenir un effet direct sur le lobe antérieur de l'hypophyse, on procède à l'injection intra-carotidienne des hémopeptides et de leurs dérivés substitués, ordinairement à une dose d'environ 0,05 à 0,5 microgramme par kilogramme 20 de poids corporel par jour, pour obtenir la libération de l'hormone de croissance, et à une dose atteignant environ 0,1 mg par kg de poids corporel pour une dose individuelle lorsque la synthèse de l'hormone de croissance est désirable. L'invention est illustrée par les exemples sui-25 vants, donnés à titre non limitatif» Exemple 1 On dissout environ 1,78 g de L-alanine dans 200 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 1M (pH égal à 10,2), on refroidit la solution à environ 0°C et on y ajoute 30 environ 3,63 g de glu-NCA en une minute, période pendant laquelle on agite énergiquement le mélange (de préférence en utilisant un mélangeur Waring), tout en maintenant la température à. 0°C et le pH à 10,2 par addition goutte à goutte d'hydroxydQ&e potassium en solution aqueuse h/50 °/oa On laisse 35 progresser la réaction, tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0CC et le pH à 10,2, jusqu'à ce que la consommation de base ait cessé (environ une minute) ; on ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 3,0 ; et on fait barboter de l'azote dans 72 10503 25 2130695 le mélange réactionnel acidifié pendant environ 15 minutes, de manière à entraîner l'anhydride carbonique de la. solution résultante de glu-ala» La solution tampon utilisée dans cet exemple 5 est avantageusement préparée de la façon suivante : on délaie une mole d'acide borique dans 500 ml d'eau et on ajoute une quantité juste suffisante d'hydroxyde de potassium solide pour dissoudre l'acide borique ; on ajoute ensuite un supplément d'hydroxyde de potassium pour ajuster le pH à 10 ,2, 10 on dilue la solution à 990 ml, on ajuste de nouveau le pH à 10,2 et on dilue la solution à un volume final de 1000 ml« Exemple 2 On ajoute 200 ml d'éthanol à la solution aqueuse de glu-ala préparée comme indiqué -dans l'exemple 1 , et on 15 ajuste le pH à 8,0 par l'addition de solution aqueuse à 50 fo d'hydroxyde de potassium. On ajou.te, en agitant, à cette solution de glu-ala, environ 9,54 g drester KHS d' a-tBOC-e-Cbz-lys, tout en maintenant la température à environ 25°G et le pH à 8,0, par addition goutte à goutte d'une solution aqueuse 20 à 50 *fo d*hydroxyde de sodium» lorsque la consommation de base a cessé, on filtre la solution réactionnelle, on en chasse l'éthanol par évaporation sous vide et on extrait la solution réactionnelle aqueuse avec 300 ml d'acétate éthylique, de manière à extraire l'ester HHS n'ayant pas réagi, présent 25 dans cette solution» On ajuste ensuite le pH de la solution réactionnelle aqueuse à 3,7 par l'addition d'acide sulfurique concentré, et on extrait la solution acidifiée avec 3 portions de 300 ml d'acétate éthylique ; on rassemble ces phases d'extraction à l'acétate éthylique, on les déshydrate sur 30 du sulfate anhydre de sodium et on en chasse l'acétate éthylique par évaporation sous vide pour former une huile dense» La chromâtographie en couche mince sur gel de silice, effectuée en utilisant comme éluant un mélange de n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (30î20:6:24), montre que le produit 35 consiste principalement en a-tBOC-e-Cbz-lys-glu-ala, s,vec des traces (moins de 1 fi) d'une impureté se déplaçant plus rapidement» Exemple 3 On dissout cette huile ( a-tB0C-e~Gbz-lys-glu-ala) 72 10503 2130695 dans environ 50 ml de chlorure de méthylène, on refroidit la solution à 15°C, on ajoute environ 60 ml d'acide trifluoracétique et on laisse la température de mélange s'élever à environ 22°C en 5 minutes» On refroidit la solution réaction-5 nelle à 0°C, et on ajoute de l'éther,tout en maintenant la température à 0eG de manière à précipiter le trifluoracétate d* e-Cbz-lys-glu-ala» la substance précipitée est séparée par filtration, dissoute dans l'eau, le pH de la solution est ajusté à 4,1 par l'addition d'une solution aqueuse 10 d*hydroxyde de sodium 2,5 N et la substance cristalline qui se sépare est récupérée par filtration et séchée en donnant environ 4,5 g d1 e-Cbz-lys-glu-ala sensiblement pur. Exemple 4 On dissout environ 4,2'2 g df £~Cbz-lys-glu-ala 15 dans 90 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 1M (pH égalAo ,2), on refroidit la solution à environ 0°C et on y ajoute environ 1,60 g de glu-FCA en une période drenviron 0,5 minute pendant laquelle on agite énergiquement le mélange, tout en maintenant la température à 0°C et en 20 ajustant le pH à 10,2 par addition goutte à goutte d'une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium à 50 On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,2,jusqu'à ce que la consommation de base cesse j on ajoute une quantité suffi-25 santé d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 2,5'9 puis on fait barboter de l'azote dans le mélange réactionnel acidifié, pendant environ 30 minutes pour entraîner l'anhydride carbonique de la solution résultante de glu-e-Cbz-lys-glu-ala» 30 Exemple 5 On ajuste à 1C,2 le pH de la solution de glu-e-Cbz-lys-glu-ala préparée comme décrit dans l'exemple 4, à 0°C, par l'addition de solution aqueuse d'hydroxyde de potassium à 50 fi, et on ajoute environ 1 ,678 g de glu- NCA 35 à la solution en 0,5 minute environ, tout en agitant éner-giqvierûent le mélange et en maintenant la température à 0CC et le pH à 10,2 par addition de solution aqueuse d'hydroxyde de potassium à 50 On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température 72 10503 27 2130695 à 0°C et le pH à 10,2, jusqu'à ce que la consommation de "base cesse» On filtre la solution réactionnelle. On ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré à la solution filtrée pour ajuster son pH à 3,5 ; puis on sépare la matière 5 précipitée par filtration, on la lave à l'eau et on la sèche sous vide pour obtenir environ 4,9 g de glu-glu-e-Cbz-lys-glu-ala qui peut contenir jusqu'à environ 15 % d'impuretés tétrapeptidiques et 3 ^ d'impuretés hexapeptidiques» On soumet cette substance à une électrophorèse avec éeoule-10 ment libre à un pH égal à 7,0 dans .un tampon à 0,143 M de 2,6-lutidine et d'acide acétique pour obtenir environ 2,32 g de glu-glu-e-Cbz-lys-glu-ala sensiblement pur» Exemple 6 On dissout environ 4,34 g de chlorhydrate de 15 leu-OKe dans environ 240 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 1M (pH = 9,5), on refroidit la solution à environ 0°C et on y ajoute environ 10,01 g de bromhy-drate de his-TCA en 10 minutes, période pendant laquelle on agite énergiquement le mélange,tout en maintenant la 20 température à 0°C et le pH à 9,5 par l'addition goutte aqueuse à goutte dJune solution/à 50 d'hydroxyde de potassium» On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5, jusqu'à ce que la consommation de base ait cessé (environ 10 minutes),, 25 On ajoute une quantité suffisante d1acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 5,0 ; on filtre la solution réactionnelle acidifiée et la solution filtrée est évaporée à sec sous vide, la substance résiduelle, qui contient à la fois de la ÏT-histidine et l'ester méthylique de L-leucine, est soumise 30 à une chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (10:2,3:6), et on obtient environ 7,0 g de diacétate de lys-leu-OMe sensiblement pur» Exemple 7 35 On dissout environ 2,4 g de diacétate de his-leu- OKe dans 140 ml de diméthylformamide, on ajoute environ 2,23 g d'ester EHS de tEOC-val en agitant à 25°C, et on ajuste le piï de la solution à 8,0 par addition de triéthylamine» On laisse reposer la solution résiiltante pendant environ 20 heures, 72 10503 28 2130695 en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par addition de triéthylamine. On évapore la solution réactionnelle à sec sous vid-e et on dissotit la substance résiduelle dans 400 ml d'eau» On extrait la solution aqueuse avec 3 portions de 400 ml 5 de chloroforme. On déshydrate les extraits organiques rassemblés sur du sulfate anhydre de sodium, on les évapore à sec sous vide et on triture l'huile résiduelle avec de l'éther pour obtenir une substance cristallisée qu'on sépare par filtration et qu'on sèche, ce qui donne environ 1 ,96 g 10 de tBOC-val-his-leu-OMe» Exemple 8 On ajoute à enviror/è,8 g de tBOG-val-his-leu-OMe, 20 ml d'un mélange de 1:1 d'hydrazine anhydre et de méthanol» On agite le mélange résultant pendant 3 minutes à la tempé-15 rature ambiante (la dissolution est ordinairement terminée en une minute environ et un précipité se forme au bout d'environ 2 minutes), et on évapore ensuite le mélange réactionnel sous vide à une température d'environ 35°C. On ajoute environ 10 ml d'éthanol à la substance résiduelle 20 et on évapore le mélange résultantfeous vide; on ajoute ensuite environ 10 ml de diméthylformamide et on évapore le mélange résultant sous vide» la substance solide résiduelle est séchée sous vide à la température ambiante pendant une période d'environ 15 heures et cristallise 25 dans le méthanol en donnant environ 2,2 g d'hydrazide de tBOC-val-his-leu. Exemple 9 On met en suspension environ 1 ,0 g d'hydrazide de tBOC-val-his-leu préparé comme indiqué dans l'exemple 30 8, dans 30 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé, et on refroidit la suspension à une température de -40°C en la maintenant sous atmosphère d'azote anhydre pour exclure l'humidité» On ajoute à la suspension froide, sous agitation, une solution de 6,24 ml de gaz chlorhydrique 35 2N dans le tétrahydrofuranne, puis 0,3 ml de nitrite d'iso-amyle» On maintient le mélange résultant sous atmosphère d'azote anhydre à une température de -15 à -20°C pendant une période d'environ une heure, à la fin de laquelle l'hydrazide a totalement réagi en forment l'azide de tBOC-val-his-leu, 72 10503 29 2130695 comme le met en évidence une cloromatographie en couche mince sur gel de silice G- effectuée en utilisant le système de solvants' chloroforme-ethanol-eau (5:5:1). Exemple 1 0 5 On dissout environ 5,56 g de chlorhydrate de ala-OKe et environ 12,08 g d'ester MHS de tBOC-ser dans 400 ml de diméthylforraamide fraîchement dégazé» On ajuste à 8,0 le pH de la solution résultante par l'addition de diisopropyl-éthylaraine et on agite pendant une période 10 d'environ 4 heures, tout en maintenant la température à environ 25°0 et le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyl-éthylamine» On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout l'huile résiduelle dans du chlorure de méthylène et on lave deux fois la solution dans le chlorure de 15 méthylène avec une solution aqueuse d'acide sulfurique 0,2 I saturée de sulfate de sodium, une fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, deux fois avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, et, finalement, deux fois avec une solution aqueuse saturée 20 de chlorure de sodium» Après lavage, la solution dans le chlorure de méthylène est ensuite déshydratée sur du sulfate anhydre de sodium, évaporée sous vide, et l'huile résiduelle est cristallisée dan^&n mélange d'acétate éthylique et d'hexane en donnant environ 9,08 g de cristaux de 25 tBOC-ser-ala-OMe. Exemple 11 On dissout environ 6,0 g de ce dipeptide tBOG-ser-ala-OMe (à une température d'environ 0°C) dans la quantité minimale d'acide trifluoracétique, on agite la solution 30 à une température d'environ 25°C pendant une période d'environ 45 minutes, puis on ajoute la solution goutte à goutte sous agitation énergique à un grand volume d'éther (environ 100 ml)» la substance qui précipite est séparée par filtration, lavée à l'éther et séchée sous vide en donnant 35 environ 4,97 g de trifluoracétate de ser-ala-OMe» Exemple 12 On refroidit à une température de -40°C la solution réactionnelle contenant l'azide de tBOC-val-his-leu, préparé 72 10503 2130695 comme décrit dans l'exemple 9, et on y ajoute une solution de 630 mg de trifluoracétate d.e ser-ala-OMe dans 10 ml de diméthylformamide dégazé» On ajuste à 8,0 le pH de la solution résultante par addition de diisopropyléthylamine et on 5 maintient le mélange à une température comprise entre environ -20 et -15?C (en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par addi-dition de diisopropyléthylamine),pendant une période df environ 20 heures, au bout&e laquelle la réaction de formation du pentapeptide est sensiblement terminée, comme l'indique une 10 chromâtographie en couche mince effectuée sur gel de silice G en utilisant comme système de solvants un mélange d'acétate éthylique, de pyridine, d'acide acétique et d'eau (10:5:1:3). On évapore la solution réactionnelle à sec ; on triture la substance résiduelle avec de l'acétate éthylique ; et on 15 lave la matière solide résultante trois fois avec de l'acétate - éthylique, puis on Igikristallise dans un mélange d'éthanol et d'acétate éthylique pour obtenir environ 0,8 g de tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe sensiblement pur. Exemple 13 20 On ajoute 9 ml d'un mélange anhydre à 1:1 d'hy- drazine et de méthanol à environ 790 mg de tBOC-val-his-leu- ser-ala-OMe» On agite le mélange résultant à la température ambiante pendant environ 3 minutes, au bout desquelles la dissolution est sensiblement terminée, la solution résul- 25 tante est évaporée sous vide à une température d'environ 35°C ; on ajoute environ 10 ml d'éthanol à la substance résiduelle et on évapore sous vide la solution résultante. ,est de la substance residuelle/dissoute dans une quantité minimale/mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau (60:40:10) et on fait 30 passer la solution sur une colonne sèche de 50 g de silice H, de manière à éliminer les traces d'hydrazine n'ayant pas réagi (comme indiqué par chromâtographie en couche mince sur gel de silice G) puis le solvant est évaporé sous vide en donnant environ 550 mg d'hydrazide de tBOC-val-his-leu- 35 ser-ala» Exemple 14 On dissout environ 526 mg d'hydrazide de tBOC-val-his-leu-ser-ala préparé comme décrit dans' l'exemple 13, dans 100 ml de diméthylf orsiamide fraîchement dégazé j la solu 72 10503 31 2130695 tion, qu'on maintient sous atmosphère d'azote anhydre est refroidie à environ -40°C, et on ajoute environ 9,6 ml de solution dé gaz chlorhydrique anhydre 2IT dans le tétrahydrofuranne, sous agitation. On ajoute ensuite 0,12 al de nitrite d'isoamyle 5 puis on maintient le mélange résultant .à une température comprise entr^environ. -20 et -15°C pendant une période d1environ une heure, au bout de laquelle l'hydrazide a totalement réagi en formant l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala., comme mis en évidence par une chromâtographie en couche 10 mince effectuée en utilisant comme système de solvant un mélange de chloroforme-méthanol-eau(60:40:10). Exemple 15 On ajoute environ 612 mg de glu-glu-Ê-Cbz-lys-gln-aïa à la solution d'aside de tBOC-val-his-leu-ser-ala dans le 15 diméthylformamide, préparé comme indiqué dans l1exemple 14, et on agite le mélange à environ -20°C jusqu'à ce que l^azide se dissolve. On ajustqènsuite la température de la solution à -40°C, on ajuste le pH à 8 par l'addition de diisopropyléthylamine et on maintient la solution à une température comprise 20 entre environ -20 et -15°C, en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par addition de diisopropyléthylamine, pendant une période d'environ 20 heures, au bout de laquelle la réaction de formation du décapeptide est sensiblement terminée, comme indiqué par une chromatographie en couche mince sur 25 gel de silice G- effectuée en utilisant comme système de solvant un mélange de butanol, de pyridine, dt acide acétique et d'eau (30:20:6:24). le mélange réactionnel, qui contient un précipité gélatineux, est évaporé sous vide ; la substance résiduelle est triturée et lavée à l1eau j et la substance 30 lavée à lleau est dissoute dans de l'acide acétique en solution aqueuse à 50 puis on fait passer la solution sur une colonne de filtration sur gel extra-fin (de manière à séparer une petite quantité d'impureté), ce qui donne environ 474 mg de tEOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-£—Cbz-lys-glu-ala. 3 5 Exemple 16 On sèche sous vide environ 40 mg de tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glii-£-Cbz~lys-glu-ala sur du pentoxyde de phosphore pendant une période d'environ 15 heures, de manière 72 10503 32 2130695 à éliminer les traces d'eau, et on charge la matière sèche résultante dans un tube en polyéthylène contenant environ 0,3 ai d'anisole. On refroidit le mélange à une température d'environ -35°C, on condense dans le tube une mole de gaz fiuo rhydrique anhydre et on agite le mélange résultant à une température d'environ 0°C pendant une période d'environ 45 minutes. A la fin de cette période réactionnelle, on fait passer un courant d'azote anhydre dans le mélange (encore à 0°C) pour éliminer l'excès de gaz fluorhydrique. 0 la substance résiduelle esi^&aintenue sous vide à une température d'environ 25°C pendant une période d'environ 20 minutes, dissoute dans une solution aqueuse d'acide acétique, e-t la solution aqueuse d'acide acétique est lyophilis en donnant environ 41 mg d'un produit amorphe qu'on cristal-5 lise dans un mélange d'aau et d'éthanol pour obtenir le décapeptide val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala sensiblement pur. Exemple 17 On dissout environ 1,78 g de L-alanine dans 200 ml 0 de solution aqueuse de tampon au borate de potassium 1M (pH 10,2), on refroidit la solution à environ 0°C et on ajoute environ 3,63 g de gln-ÎTCA à la solution, en une minute, période pendant laquelle on agite énergiquement le mélange (en utilisant de préférence un mélangeur Waring) tout en 5 maintenant la température à 0°C et en ajustant le pH à 10,2 par l'addition, goutte à goutte, d'hydroxyde de potassium en solution aqueuse à 50 On laisse progresser la réaction, tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,2, jusqu'à ce que la 0 ecn^osrmation de base cesse, (environ 1 minute) ; on ajoute une quantité sitffisante d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 3,0 ; puis on fait barboter de l'azote dans le mélange réactionnel acidifié pendant environ 15 minutes pour entraîner 1'anhydride carbonique de la solution ré-5 sultante de gln-ala. La solution tampon utilisée dans cet exemple est pré 72 10503 33 2130695 parée de façon classique, comme décrit ci-après : on délaie une mole d'acide borique dans 500 ml d'eau et on ajoute la quantité juste suffisante d'hydroxyde de potassium solide pour dissoudre l'acide borique ; on ajoute ensuite 5 un supp3.ément d'hydroxyde de potassium pour ajuster le pH à 10,2, on dilue la solution à 990 ml, on ajuste de nouveau le pH à 10,2 et on dilue la solution à un volume final de 1000 ml. Exemple 18 10 On ajoute 200 ml d'éthanol à la solution aqueuse de gln-ala préparée comme décrit dans l'exemple 17,et on ajuste le pH à 8,0 par addition de solution aqueuse d'hydroxyde de potassium à 50 On ajoute, en'agitant, environ 9,54 g d'ester MHS d'a-tBOC-e-Cbz-lys à cette solution de gln-ala, 15 tout en maintenant la température à environ 25°0 et le pH à 8,0 par l'addition goutte à goutte d'une solution aqueuse à 50 tfo d'hydroxyde de sodium, lorsque la consommation de base a cessé, on filtre la solution réactionnelle, on en chasse l'éthanol par évaporation sous vide et on extrait 20 la solution aqueuse réactionnelle avec 300 ml d'acétate éthylique, puis on extrait l'ester de SES n'ayant pas réagi , présent dans cette solution. On ajuste ensuite le pH de la solution réactionnelle aqueuse à 3,7 par l'addition d'acide sulfurique concentré, et on extrait la solution acidifiée 25 avec trois portions de 300 ml d1acétate éthylique ; on rassemble ces dernières phases d'extraction à l'acétate éthylique, on les déshydrate sur du sulfate anhydre de sodium, et on en chasse l'acétate éthylique par évaporation sous vide pour former une huile dense. Une chromatographie en 30 couche mince sur gel de silice, effectuée en utilisant comme éluant un mélange de n-butanol, de pyridlne, d'acide acétique et d'eau (30:20:6:24), montre que le produit consiste principalement en a-tBOC-e-Cbz--lys-gln-ala avec des traces (moins de 1 Ç») d'une impureté se déplaçant plus rapidement. 35 Exemple 19 On dissout ce composé huileux (a-tBOC-e-Cbz-lys-gln-ala) dans environ 50 ml de chlorure de méthylène, on refroidit la 72 10503 '4 21 '30695 solution à 15°C, on ajoute environ 60 ml d'acide trifluoracétique et on laisse la température du mélange s'élever à environ 22°C en 5 minutes. On refroidit la solution réactionnelle à 0°C et on ajoute de l'éther/fcout en maintenant la température à 5 0°C, de manière à précipiter le trifluoracétate d'e-Cbz-lys-gln-ala. la substance précipitée est isolée par filtration, dissoute dans de l'eau, le pH de la solution est ajusté à 5,2 par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2,5M, et la substance cristalline qui se sépare est isolée par 10 filtration et séchée en donnant environ 4,5 g d'e-Cbz-lys-gln-ala, sensiblement pur. Exemple 20 On dissout environ 4,22 ^g du tripeptide e-Cbz-lys-gln-ala dans 90 ml de solution aqueuse tampon au borate 15 ■ de potassium 1M (pH = 10,2), on refroidit la solution à environ 0°C et on ajoute environ 1,60 g de glu-NCA à la solution en une période d'environ 0,5 minute, pendant laquelle on agite énergiquemen-yLe mélange tout en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,2, par l'addition goutte à 20 goutte d'une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium à 50 fi, On laisse la réaction progresser, tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,2, jusqu'à ce que la consommation de base ait cessé ; on ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré 25 pour ajuster le pH à 2,5 ; puis on fait barboter de l'azote dans le mélange réactionnel acidifié pendant environ 30 minutes, de manière à entraîner l'anhydride carbonique de la solution résultante de glu-s~Cbz-lys-gln-ala. Exemple 21 30 On ajuste à 10,2 le pH de la solution de glu-e-Cbz- lys-gln-ala, préparé comme indiqué dans l'exemple 20, à 0°C en ajoutant une solution aqueuse à 50 fi> d'hydroxyde de potassium, puis on ajoute environ 1,678 g de glu-NCA à la solution en une période d'environ 0,5 minute, tout en 35 agitant énergiquement le mélange et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,2 par l'addition de solution aqueuse à 50 fi d'hydroxyde de potassium. On laisse la 72 10503 35 2130695 réaction progresser, tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°G et le pH à 10,2, jusqu*à ce que la consommation de base ait cessé. On filtre la solution réactionnelle ; on ajoute une quantité suffisante d'acide 5 sulfurique concentré à la solution filtrée pour ajuster son pH à 3,7, puis on sépare la matière précipitée par filtration, on la lave à l'eau et en la sèche sous vide pour obtenir environ 4,9 g de glu-glu-Cbz-lys-glu-ala qui peut contenir jusqu'à environ 15 f° d'impuretés tétrapeptidiques et environ 10 3 d'impuretés hexapeptidiques. On soumet cette substance à une électrophorèse avec écoulement libre à un pH égal à 7,0 dans un tampon 0,143 H de 2,6/iutidine et d'acide acétique pour obtenir environ 2,32 g de glu-glu-Ê-Cbz-lys-gln-ala sensiblement pur. 15 Exemple 22 On dissout environ 4,34 g de chlorhydrate de leu-OMe dans environ 240 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 1M (pH = 9,5), on refroidit la solution à environ 0°C et on ajoute à cette solution environ 10,01 g 20 de bromhydrate de his-TCA en line période de 10 minutes, pendant laquelle on agite énergiquement le mélange, tout en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5 par addition goutte à goutte d'une solution aqueuse à 50 fo d'hydroxyde de potassium. On laisse la, réaction progresser 25 tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5, jusqu'à ce que la consommation de base ait cessé (environ 10 minutes). On ajoute une. quantité suffisante d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 5,0 ; on filtre la solution réactionnelle 30 acidifiée et on évapore la solution filtrée à sec sous vide. la substance résiduelle, qui contient à la fois Iiis et leu-OMe? est soumise à une chromâtographie sur gel de silice, dans laquelle on utilise comme éluant un mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (10:2,3:6) pour obtenir environ 7,0 g 35' de diacétate de liis-leu-01-Ie sensiblement pur. Exemple 23 On dissout environ 2,4 g de diacétate de his-leu-OMe 2130695 dans 140 ml de diméthylformamide, on ajoute, en agitant, à 25°C, environ 2,23 g d'ester MHS de tBOC-val et on ajuste le pH de la solution à 8,0 par l'addition de triéthylamine. On laisse reposer la solution résultante pendant une période 5 . d'environ 20 heures, en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par l'addition de triéthylamine. La solution réactionnelle est évaporée à seo sous vide et la substance résiduelle est dissoute dans 400 ml d'eau. La solution aqueuse est extraite avec trois portions de 400 ml de chloroforme. Les extraits 10 organiques rassemblés sont déshydratés sur du sulfate anhydre de sodium, évaporés à sec sous vide, et l'huile résiduelle est triturée avec de l'éther pour donner une substance cristalline qu'on isole par filtration et qu'on sèche pour obtenir 1,96 g de tBOC-val-his-leu-OMe. 15 Exemple 24 On ajoute 20 ml d'un mélange à 1:1 d'hydrazine anhydre et de méthanol à environ 2,8 g de tBOC-val-his-leu-OMe. On agite le mélange résultant pendant environ trois minutes à la température ambiante (la dissolution est or-20 dinairement terminée en une minute environ et un précipité se forme au bout d'environ deux minutes) et on évapore ensuite le mélange réactionnel sous vide à une température d'environ 35°C. On ajoute environ 10 ml d'éthanol-à la substance résiduelle et on évapore le mélange résultant ' sous vide. 25 On ajoute ensuite 10 ml de diméthylformamide et on évapore le mélange résultant sous vide. On sèche la substance solide résiduelle sous vide à la température ambiante pendant une période d'environ 15 heures, et on la recristallise dans le méthanol pour obtenir environ 2,2 g d'hydrazide de tBOC-30 val-his-leu. Exemple 25 On met en suspension dans 30 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé, environ 1,0 g d'hydrazide de tBOC-val-his-leu, préparé comme décrit dans l'exemple 24, et on re-35 froidit la suspension à une température de -40°C, en la maintenant sous atmosphère d'azote anhydre à l'abri de l'humidité. On ajoute à la suspension froide, en l'agitant, une 72 10503 72 10503 2130695 solution de 6,24 si de gaz chlorhydrique en solution 21T dans le tétrahydrofuranne, puis 0,3 ml de nitrite d'isoamyle. On maintient le mélange résultant sous atmosphère d'azote anhydre à une température de -15 à ~20°C pendant une période 5 d'environ une heure, au. bout de laquelle l'hydrazide a totalement réagi pour former l'azide de tBOC-val-his-leu, comme mis en évidence par une chromâtographie en couche mince sur gel de silice G,effectuée en utilisant le système de solvants chloroforme-éthanol-eau (5:5:1). 10 Exemple 26 On dissout environ 5,56 g de chlorhydrate de ala-OMe et environ 12,08 g d'ester ETES de tBOO-ser dans 400 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé. On ajuste le pH de la solution résultante à environ 8,0 par l'addition de 15 diisopropyléthylamine, et on agite le mélange pendant une période d'environ quatre heures, tout en maintenant la température à environ 25°C et le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine. On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout l'huile résiduelle dans du chlorure de 20 méthylène et on lave la solution dans le chlorure de méthylène deux fois avec une solution aqueuse d'acide sulfurique 0,2 lï saturée de sulfate de sodium, une fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, deux fois avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et finale-25 ment deux fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. Après lavage, la solution dans le chlorure de méthylène est séchee sur du sulfate anhydre de sodium, évaporée sous vide, et l'huile résiduelle est cristallisée dans un mélange d'acétate éthylique et d'hexane, en donnant 30 environ 9,08 g de tBOC-ser-ala-OMe en cristaux. 72 10503 2130695 Exemple 27 On dissout environ 6,0 g de ce dipeptide tBOC-ser-ala-OMe (à une température d'environ 0°C) dans la quantité minimale d'acide trifluoracétique, on agite la solution à une température d'en-5 viron 25°C pendant une période d'environ 45 minutes, puis on ajoute cette solution goutte à goutte, sous agitation énergique, à un grand volume (environ 100 ml) d'éther. La substance qui précipite est séparée par filtration, lavée à l'éther et séchée sous vide en donnant environ 4,97 g de trifluoracétate de ser-ala-OMe. 10 Exemple 28 La solution réactionnelle contenant l'azide de tBOC-val-his-leu, préparé comme décrit dans l'exemple 25, est refroidie à une température de -40°C et additionné^d'une solution de 630 mg de trifluoracétate de ser-ala-OMe dans 10 ml de diméthylformamide 15 dégazé. On ajuste à 8,0 le pH de la solution résultante par addition de diisopropyléthylamine et on maintient le mélange à une température comprise entre environ -20 et -15°C (avec ajustement périodique du pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine) pendant une période d'environ 20 heures, au "bout de laquelle 20 la réaction de formation du pentapeptide est sensiblement terminée, comme indiqué par une chromâtographie en couche mince sur gel de silice G- effectuée en utilisant comme système de solvant un mélange d'acétate éthylique, de pyridine, d'acide acétique et d'eau (10:5:1:3). On évapore la solution réactionnelle sous vide ; on 25 triture la substance résiduelle avec de l'acétate éthylique ; puis on lave la substance solide résultante trois fois avec de l'acétate éthylique et on la cristallise dans un mélange d'éthanol et d'acétate éthylique pour obtenir environ 0,8 g de tBOC-val-his-leu-ser-ala-OKe sensiblement pur. 30 Exemple 29 On ajoute 9 ml d'un mélange anhydre à 1:1 d'hydrazine et de méthanol à environ 790 mg de tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe. On agite le mélange résultant pendant environ 3 minutes à la température ambiante, période au bout de laquelle la dissolution est 35 sensiblement terminée. On évapore 3_a solution résultante à sec à une température d'environ 35°0, on ajoute environ 10 ml d'éthanol à la matière résiduelle et on évapore la solution résultante sous 72 10503 39 2130695 vide. On dissout la substance résiduelle dans une quantité minimale d'un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau (60:40:10) et on fait passer la solution sur une colonne sèche de 50 g de gel de silice H, de manière à éliminer les traces d'hydrazine n'ayant 5 pas réagi (comme indiqué par chromâtographie en couche mince sur gel de silice G-) et on évapore le solvant sous vide pour obtenir environ 550 mg d'hydrazide de tBOC-val-his-leu-ser-ala. Exemple 50 On dissout environ 528 mg d'hydrazide de tBOC-val-his-leu-ser-10 ala préparé comme décrit dans l'exemple 29, dans 100 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé ; la solution, qu'on maintient sous atmosphère d'azote anhydre, est refroidie à environ -40°C, et additionnée, sous'agitation, d'environ 9,6 mg de gaz chlorhydrique anhydre en solution 2IT dans le tétrahydrofuranne. On ajoute ensuite 15 environ 0,12 ml de nitrite d'isoamyle et on maintient le mélange résultant à une température comprise entre environ -20 et -15°C pendant une période d'environ 1 heure, au bout de laquelle l'hydrazide a totalement réagi pour* former l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala, comme mis en évidence par chromatographie en couche mince, 20 effectuée en utilisant le système de solvants chloroforme-méthanol-eau (60:40:10). Exemple 51 O11 ajoute environ 612 mg de glu-glu-s -Cbz-lys-gln-ala à la solution d'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala dans le diméthyl-25 formamide, préparé comme indiqué dans l'exemple 30, et on agite le mélange à environ -20°C jusqu'à ce que ce composé se dissolve. On ajuste ensuite la température de la solution à -40°C et son pH à 8 par l'addition de diisopropyléthylamine et on maintient -la solution à une température comprise entre environ -20 et -15°C, 30 en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine pendant une période d'environ 20 heures, au bout de laquelle la réaction de formation du décapeptide est sensiblement terminée, comme mis en évidence par une chromatographie en couche mince sur gel de silice G- effectuée en utilisant le système 55 de solvants butanol-pyridine-acide acétique-eau (50:20:6:24). Qui , - , le mélange réactionnel,/contient un précipité gélatineux, est évaporé sous vâde ; la substance résiduelle est triturée et lavée à l'eau ; puis la substance lavée à l'eau est dissoute dans une 72 10503 2130695 solution aqueuse à 50 i« d'acide acétique et on fait passer la solution sur une colonne de filtration sur gel extra-fin (de manière à séparer une petite quantité d'impureté) et on obtient environ 474 mg de tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu- e-Cbz-lys-gln-ala. 5 Exemple 32 On sèche sous vide sur du pentoxyde de phosphore environ 40 mg de tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu- e-Cbz-lys-gln-ala pendant une période d'environ 15 heures, de manière à éliminer les traces d'eau, et on introduit la substance sèche résultante dans un tube de poly-10 éthylène contenant environ 0,3 ml d'anisole. On refroidit le mélange à une température d'environ -35°C, on condense dans le tube 1 ml de gaz fluorhydrique anhydre, et on agite le mélange résultant à une température d'environ 0°C pendant une période d'environ 45 minutes. A la fin de cette période de réaction, on fait passer 15 un courant d'azote anhydre dans le mélange (se trouvant encore à 0°C) de manière à éliminer l'excès de gaz fluorhydrique. On maintient la substance résiduelle sous vide à une température d'environ 25°C pendant une période d'environ 20 minutes, on la dissout dans une solution aqueuse d'acide acétique et on lyophilise 20 la solution aqueuse d'acide acétique pour obtenir environ 40 mg d'un produit amorphe qu'on cristallise dans un mélange d'eau et d'éthanol pour obtenir le décapeptide val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala.sensiblement pur. Exemple 33 25 On dissout environ 5,56 g de chlorhydrate de ala-OMe et envi ron 12,08 g de l'ester KHS de tBOC-ser dans 400 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé. On ajuste le pH de la solution résultante à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine et on agite pendant environ 4 heures :out en maintenant la température à 30 environ 25°C et le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine. On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout l'huile résiduelle dans du chlorure de méthylène et on lave la solution méthylérxique deux fois avec une solution aqueuse d'acide sulfurique 0,2ïî saturée de sulfate de sodium, une fois avec une 35 solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, deux fois avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et finalement ceux fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. 72 10503 41 2130695 Après le lavage, on déshydrate la solution dans le chlorure de méthylène, sur du sulfate" anhydre de sodium, on évapore à sec et on cristallise l'huile résiduelle dans un mélange d'acétate éthylique et d'hexane pour obtenir environ 9,08 g de tBOC-ser-ala-OMe 5 cristallin. Exemple 54 On dissout environ 6,0 g de ce dipeptide tBOC-ser-ala-OMe (à une température d'environ 0°C) dans Is^uantité minimale d'acide trifluoracétique, on agite la solution à une température d'en-10 viron 25°C pendant une période d'environ 45 minutes, puis on ajoute la solution goutte à goutte, sous agitation énergique, à un grand volume (environ 100 ml) d'éther. la substance qui précipite est isolée par filtration, lavée à l'éther et séchée sous vide, et on obtient environ 4,97 g de trifluoracétate de Ser-ala-OMe. 15 Exemple 55 On dissout environ 2,45 g de trifluoracétate de Ser-ala-OMe et environ 5,82 g de l'ester MHS de tBOC-e-Cbz-lys dans 85 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé. On ajuste le pH de la solution résultante à 8,0 par l'addition de triéthylamine et on agite 20 pendant une période d'environ 4 heures tout en maintenant la température à environ 25°C et le pH à 8,0 par l'addition de triéthylamine. On filtre le mélange réactionnel et on évapore sous vide, on dissout le sirop résiduel dans 200 ml de chloroforme et on lave la solution chloroformique avec une solution aqueuse 25 0,1 M d'acide sulfurique, puis avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, et finalement avec de l'eau. On déshydrate ensuite la solution chloroformique lavée sur du sulfate anhydre de sodium, on évapore sous vide et on cristallise l'huile résiduelle dans un mélange d'acétate éthylique et d'éther pour 50 obtenir environ 5,15 g de tBOC- e-Cbz-lys-ser-ala-OMe cristallin. Exemple 56 On ajoute une solution d'environ 5,15 g de tBOC- e-Cbz-lys-ser-ala-OMe dans 20 ml de dioxanne à 200 ml d'eau, tout en maintenant le pH à 11,5 par l'addition d'une solution aqueuse 1l\f d'hydro-35 xyde de sodium. On agite la solution résultante à une température d'environ 25°C pendant une période de 5 heures tout en maintenant le pïï à 11,5. On chasse le dioxanne de la solution réactionnelle 72 1ÛSU3 2130695 par évaporation sous vide, on ajoute de l'eau à la solution résidue le pour ajuster le volume à environ 200 ml et on lave la solution aqueuse avec 3 portions de 200 ml d'acétate éthylique. On ajuste ensuite le pH de la solution aqueuse à 2,5 par l'addition d'acide 5 sulfurique, et on extrait la solution aqueuse acidifiée avec 3 portions de 200 ml d'acétate éthylique. les phases rassemblées d'extraction à l'acétate éthylique sont évaporées sous vide en donnant, sous la forme d'une huile résiduelle, le tripeptide tBOC-L -Cbz-lys-ser-ala. 10 On dissout cette huile résiduelle dans 15 ml de chlorure de méthylène, on refroidit la solution chlorométhylénique à environ 5°C ; on ajoute ensuite 15 ml d'acide trifluoracétique à la solution froide ;.puis on laisse la solution résultante se réchauffer à environ 25°C en une période de 5 minutes. On refroidit la 15 solution réactionnelle à 0°C, on y ajoute environ 200 ml d'éther tout en agitant, et on sépare par filtration la substance qui précipite, on la lave à l'éther et on la sèche pour obtenir le trifluoracétate d1 t-Cbz-lys-ser-ala. On dissout ce trifluoracétate d1£-Cbz-lys-ser-ala dans envi-20 ron 25 ml d'eau et on ajuste le pH à 5,05 par l'addition d'une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium, et on sépare par filtration la substance cristalline qui précipite,puis on la déshydrate pour obtenir environ 1.4 g d* £,-Cbz-lys-ser-ala. Exemple 57 25 On dissout environ 0,88 g du tripeptide;. & -Cbz-lys-ser-ala dans 20 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 1.M à (pH égay10,1), on refroidit la solution à environ 0°C et on y ajoute environ 0,36 g de glu-UCA en une période drenviron 0,5 minute, pendant laquelle on agite énergiquement le mélange (en 30 utilisant^de préférence^un mélangeur ¥aring) tout en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,1 par addition goutte à goutte d'une solution aqueuse à 50 $ d'hydroxyde de potassium. On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,1, jusqu'à ce que la 35 consommation de base ait cessé (environ 1 minute) ; on ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 2,5 et on fait barboter de l'azote dans le mélange réaction- 72 10503 43 2130695 nel acidifié pendant environ 15 minutes tout en entraînant l'anhydride carbonique de la solution résultante de glu- £-Cbz-lys-ser-ala . Exemple 38 5 On refroidit à 0°C la solution de glu-6-Cbz-lys-glu-ala préparée comme décrit dans l'exemple 31,on ajuste le pH à 10,1 par l'addition d'une solution aqueuse à 50 % d'hydroxyde de potassium, et on ajoute environ 0,38 g de glu-ÎTCA à la solution en une période d'environ 0,5 minute tout en agitant énergiquement le mélange 10 et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,1 par l'addition d'une solution aqueuse à 50 $ d'hydroxyde de potassium. On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°G et le pH à 10,1, jusqu'à ce que la consommation de base ait cessé (environ 1 minute). On 15 ajuste à 8,5 le pH de la solution réactionnelle et on filtre la solution de manière à éliminer une petite quantité de substance précipitée ; on ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré à la solution filtrée pour ajuster le pH à 3,6 ; puis on sépare par filtration la substance qui précipite, on la lave 20 à l'eau et on la sèche sous vide pour obtenir environ 1,3 g de glu-glu- £-Cbz-lys-ser-ala qui peut contenir quelques impuretés tétrapeptidiques et hexapeptidiques. On soumet cette substance à une électrophorèse avec écoulement libre à un pH égal à 7,0 dans un tampon 0,143 M de 2,6-lutidine et d'acide acétique pour 25 obtenir environ 0,2 g de glu-glu-£-Cbz-lys-ser-ala sensiblement pur. Exemple 39 On ajoute environ 10,3 g de L-proline à une solution d'environ 28,5 g de l'ester MHS de tBOC-thr dans 900 ml de diméthyl-30 formamide fraîchement dégazé ; on ajuste le pH de la suspension résultante à 10,0 par l'addition de triéthylamine ; puis on agite la suspension pendant une période d'environ 60 heures tout en maintenant la température à environ 25°C et le pH à 10,0. On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout la substance 35 résiduelle dans 900 ml d'eau et on filtre la solution de manière à éliminer une petite quantité d'impuretés, puis on ajuste à 2,5 le pH de la solution filtrée par addition d'une solution 72 10503 44 2130695 aqueuse 6N d'acide chlorhydrique. La solution aqueuse est extraite avec 3 portions de 1200 ml d'acétate éthylique et les phases rassemblées d'extraction à l'acétate éthylique sont déshydratées sur du sulfate anhydre de sodium, et évaporées sous vide en donnant 5 environ 26 g de tBOC-thr-pro amorphe. Exemple 40 On dissout environ 25 g de ce dipeptide tBOC-thr-pro (à une température d'environ 0°C) dans la quantité à peu près minimale d'acide trifluoracétique pour effectuer la dissolution ; on agite 10 la solution à une température d'environ 25°C pendant une période d'environ 7 minutes et on ajoute lentement à la solution réactionnelle, tout en agitant, environ 400 ml d'éther. On sépare par filtration la substance qui précipite, on la lave à l'éther et on la sèche sous vide pour obtenir environ 14 g de trifluoracétate 15 de thr-pro. Exemple 41 On ajoute à 200 ml de méthanol froid (température d'environ -10°C), goutte à goutte sous agitation, environ 10 ml de chlorure de thionyle. On agite la solution à -10°C pendant environ 45 minutes, 20 on y ajoute environ 10 g de trifluoracétate de thr-pro et on agite la solution résultante à une température de 25°C pendant une période d'environ 3 heures. On filtre le mélange réactionnel, on évapore à sec la solution filtrée, on triture la substance résiduelle avec de l'éther et on sépare la substance' solide amorphe 25 par filtration puis on la sèche pour obtenir environ 7 g de chlorhydrate de thr-pro-OMe. Exemple 42 On dissout environ 4,34 g de chlorhydrate de leu-OMe dans environ 240 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 30 1M (pH = 9,5), on refroidit la solution à environ 0°C et on y ajoute environ 10,01 g de bromhydrate de his-TCA en une période de 10 minutes pendant laquelle on agite énergiquement le mélange tout en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5 par l'addition goutte à goutte d'une solution aqueuse à 50 $ d'hydroxyde 35 de potassium. On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5 .que jusqu'à ce/'la consommation de base ait cessé (environ 10 minutes) ; 72 10503 45 2130695 ori ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 5,0 ; on filtre la solution réactionnelle acidifiée et on évapore la solution filtrée à sec sous vide. La substance résiduelle qui contient à la fois la 5 L-histidine et l'ester méthylique de L-leucine, est soumise à une chromatographie sur gel de silice dans laquelle on utilise, comme éluant, un mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (10:2,3:6), ce qui donne environ 7,0 g de diacétate de his-leu-OMe sensiblement pur. 10 Exemple 43 On dissout environ 2,4 g de diacétate de his-leu-Oïïe dans 140 ml de diméthylformamide, on ajoute en agitant à 25°C environ 2,23 g d'ester ïïHS de tBOO-val et on ajuste le pH de la solution à 8,0 par l'addition de triéthylamine. 15 On laisse reposer la solution résultante pendant environ 20 heures, en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par addition de triéthylamine. On évapore la solution réactionnelle à sec sous vide et on dissout la substance résiduelle dans 400 ml d'eau. On extrait la solution aqueuse avec trois 20 portions de 400 ml de chloroforme. On sèche les extraits organiques rassemblés sur du sulfate anhydre de sodium, on les évapore à sec sous vide et on triture l'huile résiduelle avec de l'éther pour obtenir une substance cristalline qu'on sépare par filtration et qu'on sèche 25 pour obtenir 1,96 g de tBOC-val-his-leu-OMe. Exemple 44 On ajoute 20 ml d'un mélange à 1:1 d'hydrazide anhydre et de méthanol environ 2,8 g de tBOC-val-his-leu-OMe. On agite le mélange résultant pendant environ trois minutes à 30 la température ambiante (la dissolution est habituellement terminée au bout d'environ une minute et un précipité se forme au bout d'environ deux minutes) pais on évapore le mélange réactionnel sous vide à une température d'environ 35°C. On ajoute environ 10 ml d'éthanol à la substance 35 résiduelle et on évapore le mélange résultant sous vide. On s joute ensuite environ 10 ml de diméthylformamide et on évapore le mélange résultant sous vide. On sèche le 72 10503 2130695 résidu solide sous vide à la température ambiante pendant une période d'environ 15 heures et on le cristalline dans le méthanol pour obtenir environ 2,2 g d'hydrazide de tBOC-val-his-leu. 5 Exemple 45 On met en suspension dans 30 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé, environ 1,0 g d'hydrazide de tBO-val-his-leu comme décrit dans l'exemple 44, et on refroidit la suspension à une température de -40°C en la maintenant 10 sous atmosphère d'azote anhydre à l'abri de l'humidité. On ajoute à la suspension froide, en agitant, une solution de 6,24 ml de gaz chlorhydrique .211 dans le tétrahydrofuranne, ' puis 0,3 ml de nitrite d'isoamyle. On maintient le mélange résultant sous atmosphère d'azote anhydre à une température 15 de -15 à -20°C pendant une période d'environ une heure, au bout de laquelle l'hydrazide a totalement réagi pour formel'azide de tBOC-val-his-leu, comme mis en évidence par la chromatographie en couche mince sur gel de silice G, effectuée en utilisant le système de solvants chloroforme-20 éthanol-eau (5:5:1). Exemple 46 On refroidit à une température de -40°C la solution réactionnelle contenant l'azide de tBOC-val-his-leu, préparé comme décrit dans l'exemple 45» et on y ajoute une solution 25 de 555 mg de chlorhydrate de thr-pro-OKe dans 10 ml de diméthylformamide dégazé. On ajuste le pH de la solution résultante à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine, et on maintient le mélange à une température comprise entre environ -20 et -15°C (avec ajustement périodique du 30 pH à 8,0 par addition de diisopropyléthylamine) pendant environ 20 heures, période au bout de laquelle la réaction de formation dvt pentapeptide est sensiblement terminée, comme mis en évidence par une chromatographie en couche mince sur gel de silice G^effectuée en utilisant comme système 35 de solvants un mélange d'acétate éthylique, de pyridine, d'acide acétique et d'eau (10:5:1:3). On évapore la solution réactionnelle sous vide ; on dissout la substance résiduelle 47 72 10503 2130695 dans l'eau et on purifie la solution par passage sur du gel "Sephadex" G—10, ce qui donne environ 0,8 g de tBOC-val-his-leu-thr-pro-OMe sensiblement pur. Exemple 47 5 On ajoute 9 ral d'un mélange anhydre à 1:1 d'hydrazine et de méthanol, à environ 790 mg de tBOC-val-his-leu-thr-pro-OKe. On agite le mélange réactionnel pendant environ 3 minutes à la température ambiante, période au bout de laquelle la dissolution est sensiblement terminée. On évapore 10 la solution résultante sous vide à une température d'environ 35°C, on ajoute environ 10 ml d'éthanol à la substance résiduelle et on évapore sous vide la solution résultante, le résidu est dissous dans une quantité minimale d'un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau (60:40:10) 15 et on fait passer la solution sur une colonne sèche de 50 g de gel de silice H, de manière à éliminer les traces d'hydrazine n'ayant pas réagi (comme mis en évidence par chromatographie en couche mince sur gel de silice G-) et on évapore le-solvant sous vide pour obtenir environ 480 mg 20 d'hydrazide de tBOC-val-his-leu-thr-pro. Exemple 48 On dissout dans 100 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé, environ 528 mg d'hydrazide de tBOC-val-his-leu-thr-pro, préparé comme décrit dans l'exemple 47 ; 25 la solution, qu'on maintient sous atmosphère d'azote anhydre, est refroidie à environ -40°C et additionnée, sous agitation, d'environ 9,6 ml de solution de gaz chlorhydrique anhydre 2ÏT dans le tétrahydrofuranne. On ajoute ensuite environ 0,11 ml de nitrite d'isoamyle et on maintient le mélange résultant 30 à une température comprise entre environ -15 et -20°C pendant une période d'environ une heure, au bout de laquelle l'hydrazide a totalement réagi poiir former l'azide de tBOC-val-his-leu-thr-pro, comme mis en évidence par une chromatographie en couche mince effectuée en utilisant.le 35 sryc'nniie de solvants chloroforae-méthanol-eau (60:40:10), Exemple 49 On ajoute environ 515 mg de glu-glu-6-Cbz-lys-ser— ala à une solution d'aaide de tBOC-val-his-leu-thr-pro 72 10503 48 2130695 dans le diméthylformamide, préparé comme décrit dans l'exemple 48, et on agite le mélange à environ -20°C jusqu'à ce que ce composé passe en solution. On ajuste ensuite la température de la solution à -40°C et le pH à 5 8 par l'addition de diisopropyléthylamine, puis on maintient la solution à une température comprise entre environ -20 et -15°C en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par addition de diisopropyléthylamine pendant une période d'environ 20 heures, au bout de laquelle la -réaction de formation 10 du décapeptide est sensiblement terminée, comme mis en évidence par chromatographie en couche mince sur gel de silice G- , effectuée en utilisant comme système de solvants un mélange acétat^êthylique-pyriàine-acide acétique-eau (10:5:1:3). On évapore sous vide le mélange réactionnel qui 15 contient un précipité gélatineux. On dissout le résidu dans une solution aqueuse à 50 i° d'acide acétique et on fait passer la solution sur une colonne de filtration sur gel fin G--25 (de manière à séparer une petite quantité d'impureté) pour obtenir environ 400 mg de tBOC-val-his-leu-20 thr-pro-glu~glu-£,-Cbz-lys-ser-ala. Exemple 50 On sèche sous vide sur du pentoxyde de phosphore, pendant environ 15 heures^ environ 40 mg de tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-Ê—Cbz-lys-ser-ala, de manière à 25 éliminer les traces d'eau, et on charge la substance sèche résultante dans un tube de polyéthylène contenant environ 0,3 ml d'anisole. On refroidit le mélange à une température d'environ -35°C, on condense dans le tube 1 ml de gaz fluorhydrique anhydre et on agite le mélange résul-30 tant à une température d'environ 0°C pendant une période d'environ 45 minutes. A la fin de cette période de réaction, on fait passer un courant d'azote anhydre dans le mélange (se trouvant encore à 0°C) de manière à éliminer l'excès de gaz fluorhydrique. On maintient le résidu sous vide à 35 une température d'environ 25°C pendant une période d'environ 20 minutes, on le dissout dans de l'acide acétique aqueux, et on lyophilise la solution aqueuse d'acide acétique pour 49 72 10503 2130695 obtenir environ 41 mg de produit amorphe, qui cristallise dans un mélange d'eau et d'éthanol en donnant le' décapeptide val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala sensiblement pur. Exemple 51 5 On dissout environ 1,33 g de 1-alanine dans 200 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 0,1 M (pH = 9,5), on refroidit la solution à environ 0°C et on ajoute à cette solution environ 2,0 g de ala-TCA en une période de 5 minutes pendant laquelle on agite le 10 mélange tout en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5 pai" addition goutte à goutte d'une solution aqueuse à 25 i° d'hydroxyde de sodium. On laisse la réaction progresser, tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 9,5, jusqu'à ce que la consommation de base 15 ait cessé (environ 5 minutes); on ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré pour ajuster le pH à 3,0 ; puis on fait barboter de l'azote dans le mélange réactionnel acidifié pendant environ 45 minutes pour entraîner l'anhydride carbonique de la solution résultante de ala-ala. 20 le tampon utilisé dans cet exemple est préparé de la façon suivante : on délaie une mole d'acide borique dans 500 ml d'eau et on ajoute la quantité juste suffisante d'hydroxyde de potassium solide pour dissoudre l'acide borique; on ajoute ensuite un supplément d'hydroxyde de potassium 25 pour ajuster le plî à 9,5? on dilue la solution à 990 ml, on ajuste de nouveau le pH à 9,5 et on dilue la solution à un volume final/f§00 ml. On dilue au dixième pour obtenir une solution 0,1 M. Exemple 52 30 On ajoute 200 ml d'éthanol à la solution aqueuse de ala-ala préparée comme décrit dans l'exemple 51 , et on ajuste le pH à 8,0 par addition d'une solution aqueuse à 25 ^ d'hydroyyde de sodium. Tout en agitant, on ajoute à cette solution de ala-ala, 35 7,15 g d'ester iHIS d'a-tB0C-6-Cba-lys, en maintenant la température à environ 25°C et le pH à 8,0 par addition goutte à 50 72 10503 2130695 goutte de solution aqueuse à 2 5 % d'hydroxyde de sodium. Lorsque la consommation de base a cessé, on filtre la solution réactionnelle, on en chasse l'éthanol par évaporation sous vide et on extrait la solution réactionnelle 5 aqueuse avec 100 ml d'acétate éthylique, de manière à extraire l'ester NHS n'ayant pas réagi, présent dans cette solution. On ajuste ensuite le pH de la solution réactionnelle aqueuse à 3,7 par l'addition d'acide suif'urique concentré et on extrait la solution acidifiée avec 3 portions de 10 100 ml d'acétate éthylique; on rassemble ces phases d'extraction à l'acétate éthylique, on les sèche sur du sulfate anhydre de sodium et on en chasse l'acétate éthylique par évaporation sous vide pour former une huile dense. Une chromâtographie enjcouche mince effectuée sur du gel de silice en utilisant comme éluant le système n-butanol-25 pyridine-acide acétique-eau (30:20:6:24) montre que le produit consiste principalement en alpha-tB0C-6-Cbz-lys-ala-ala avec des traces (moins de 1 fi) d'une impureté se déplaçant plus rapidement. Exemple 53 20 On dissout le tripeptxde a-tBOC-d-Cbz-lys-ala-ala huileux dans environ 30 ml de chlorure de méthylène, on refroidit la solution à 10°C, on ajoute environ 36 ml d'acide trifluoracétique et on laisse la température du mélange s'élever à environ 24°C en une période de 5 minutes. 25 On refroidit la solution réactionnelle à 0°C, et on ajoute de l'éther tout en maintenant la température à 0°C, de manière à précipiter le trifluoracétate d' £-Cbz-lys-ala-ala. On sépare par filtratior la substance précipitée, on la dissout dans l'eau, on ajuste le pH de la solution à 4,1 par 30 addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2,5 N et on isole par filtration les cristaux qui se séparent et on les sèche pour obtenir environ 2}0 g d' £.-Cbz-lys-ala-ala sensiblement pur. On obtient par évaporation des liqueurs-mères environ 0,7 g de substance. 35 Exc-rarte 54 On dissout environ 1,26 g d' 6-Cbz-lys-ala-ala dans 30 ml de solution aqueuse tampon au borate de potassium 1M 72 10503 51 2130695 (pH = 10,0), on refroidit la solution à environ 0°0 et on y ajoute environ 0,544 g de glu-îTCA en une période d'environ 0,5 minute pendant laquelle on agite énergiquement le mélange^tout en maintenant la température à 0°C et le pH à 5 10,0 par l'addition goutte à goutte d'une solution aqueuse à 50 d'hydroxyde de potassium. On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,0, jusqu'à ce que la consommation de hase ait cessé ; on ajoute une quantité suffisante d'acide sul-10 furique concentré pour ajuster le pH à 2,5 ; puis on fait barboter de l'azote dans le mélange réactionnel acidifié pendant environ 30 minutes de manière à entraîner l'anhydride carbonique de la solution résultante de glu-t-Cbz-lys-ala-ala. 15 Exemple 55 On ajuste à 10,0 le pH de la solution glu-£~Cbz-lys-ala-ala,préparée comme décrit dans l'exemple 54, à 0°C en ajoutant une solution aqueuse à 50 d'hydroxyde de potassium, puis on ajoute environ 0,570 g de glu-HCA à la solution en une 20 période d'environ 0,5 minute, tout en agitant énergiquement le mélange et en maintenant la température à 0°C et le pH à 10,0 par l'addition d'une solution aqueuse à 50 ^ d'hydroxyde de potassium. On laisse la réaction progresser tout en continuant d'agiter et en maintenant la température à 0°C et 25 le pH à 10,0 jusqu'à ce que la consommation de base ait cessé. On filtre la solution réactionnelle ; on ajoute une quantité suffisante d'acide sulfurique concentré à la solution filtrée pour ajuster son pH à 4,1. On évapore l'eau sous vide et on dissout la substance résiduelle solide dans 25 ml de solution 30 aqueuse à 50 fi d'acide acétique„ On soumet ensuite cette solution aqueuse d'acide acétique à une chromatographie par imprégnation d'un gel, de manière à éliminer le sel et les impuretés, et à obtenir environ 0^4 g de glu-glu- £-0bz-lys-ala-ala sensiblement pur. 35 Exemple 56 On dissout dans 200 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé, environ 2,8 g de chlorhydrate d'ala-OMe et environ 72 10503 52 2130695 6,33 g de l'ester NHS de l'ester tBOC-thr. On ajuste à 8,0 le pH de la solution résultante par l'addition de diisopropyléthylamine et on agite pendant une période d'environ quatre heures^tout en maintenant la température à environ 25°C et 5 le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine. On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout l'huile résiduelle dans du chlorure de méthylène et on lave la solution chlorométhylénique, deux fois avec une solution aqueuse 0,2 E" d'acide sulfurique saturée de sulfate de sodium, •une 10 fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, deux fois avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, et finalement, deux fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. On sèche ensuite la solution chlorométhylénique lavée sur du sulfate anhydre de sodium, 15 on l1 évapore sous/V~e^;e on cristallise l'huile résiduelle dans un mélange d'acétate éthylique et d'hexane pour obtenir environ 4,2 g de tBOC-thr-ala-OMe en cristaux. 72 10503 2130695 Exemple . 57 ■ On dissout environ 3,86 g de ce dipeptide tBOC-thr-ala-OMe (à une température à1 environ 0°C) dans la quantité minimale d'acide trifluoracétique, on agite la solution à 5 une température d'environ 25CC pendant une période d'environ 45 minutes, puis on évapore la solution à sec pour obtenir environ 4,1 g de trifluoracétate de thr-ala-OMe sous la forme d'une huile dense. Exemple 58 10 On dissout,dans 225 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé, environ 4,1 g de trifluoracétate de thr-ala-OMe et environ 4,1g de l'ester NHS de tBOC-leu. On ajuste à 8,0 le pH de la solution résultante par l'addition de diisopropyléthylamine et on agite pendant environ 4 heures tout en maintenant la température à 15 environ 25°C et le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine. On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout le résidu dans du chlorure de méthylène et on lave la solution chlorométhylénique deux fois avec une solution aqueuse d'acide sulfurique 0,2N saturée de sulfate de sodium, deux fois avec 20 une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, deux fois avec une solution aqueuse saturée de "bicarbonate de sodium et finalement deux fois avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, la solution chlorométhylénique lavée est ensuite séchée sur du sulfate anhydre de sodium, évaporée sous vide et 25 le résidu solide est cristallisé dans un mélange d'acétate éthylique et d'hexane en donnant environ 3,4 g de cristaux de tBOC-leu-thr-ala-OMe. Exemple 59 ' " • On dissout environ 3,1 g de ce tripeptide tSOC-leu-thr-ala-30 OMe (à une température d'environ 0°C) dans la quantité minimale d'acide trifluoracétique, on agite la solution à une température d'environ 25 °C pendant une période d'environ 45 minutes, puis on ajoute la solution goutte à goutte sous agitation énergique à un grand volume (environ 100 ml) d'éther. On sépare par filtra-35 tien la substance qui précipite, on la lave deux fois à l'éther et on la sèche sous vide pour obtenir environ 2,8 g de trifluoracétate de leu-thr-ala-Oi'e. 72 10503 ^ 2130695 Exemple 60 On dissout dans environ 60 ml de diméthylformamide fraîchement degazé, environ 2,8 g de trifluoracétate de leu-thr-ala-OMe et environ 2,24 g de l'ester ÎTH8 de tBOC-met. On ajuste à 8,0 le pH 5 de la solution résultante par l'addition de triéthylamine et on l'agite pendant une périod^d'environ 4 heures, tout en maintenant la température à environ 25°C et le pH à 8,0 par l'addition de triéthylamine. On évapore le mélange réactionnel sous vide, on dissout la substance résiduelle dans de l'acétate éthylique et on 10 lave la solution dans l'acétate éthylique trois fois avec une solution aqueuse d'acide sulfurique 0,1N saturée de sulfate de sodium, trois fois avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et finalement avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. Après lavage, la solution dans l'acétate éthylique est 15 séchée sur du sulfate anhydre de sodium et 1 partie de l'acétate éthylique est évaporée sous vide. le précipité volumineux qui se forme est séparé par filtration, lavé avec un peu d'acétate éthylique et séché sous vide en donnant environ 1,9 g de cristaux de tBOC-met-leu-thr-ala-Oï'îë. 20 Exemple 61 On ajoute 24 ml d'un mélange à 1:1 d'hydrazine et de diméthylformamide à environ 1,5 nig du tétrapeptide tBOC-met-leu-thr-ala-OMe. On agite le mélange résultant pendant environ 5 minutes à la température ambiante. On évapore sous vide la solution résultante. 25 à une température d'environ 35°C, on ajoute environ 60 ml de diméthylformaaide à la substance résiduelle et on-évapore à sec la solution résultante. On ajoute environ 100 ml de méthanol, on évapore sous vide le mélange résultant et on cristallise le produit résiduel dans le méthanol pour obtenir environ 1,2g d'hydrazide 30 de tBOC-met-leu-thr-ala-. Exemple 62 On dissout dans 15 ml de diméthylformamide fraîchement dégazé environ 253 mg d'hydrazide de tBOC-met—leu-thr-ala préparé comme décrit dans l'exemple 61 : en refroidit à environ -40°C 35 la solution qui est maintenue sous atmosphère d'azote anhydre et on ajoute, tout en agitant, environ 1,3 ml de solution 21\f de gaz chlorhydrique anhydre dans le tétrahydrofuranne. On ajoute 72 10503 213Q695 ensuite environ 0,068 ml de nitrite d'isoamyle et on mazntient le mélange résultant à une température comprise entre environ -20 et -15°C pendant une période d'environ 1 heure, au bout de laquelle l'hydrazide a totalement réagi pour former l'azide de tBOC-met-leu-5 thr-ala, comme mis en évidence par la chromatographie en couche mince effectuée en utilisant le système de solvants chloroforme-méthanol-eau (60:40:10). Exemple 63 On ajoute environ 315 mg de glu-glu- £-Cbz-lys-ala-ala dissous 10 dans 30 ml de diméthylformamide à la solution d'azide de tBOC-met-leu-thr-ala dans du diméthylformamide, préparé comme décrit dans l'exemple 62. On ajuste ensuite la température de la solution à -40°C et le pH à 8 par l'addition 'de diisopropyléthylamine et on maintient la solution à une température comprise entre environ -20 15 et -15°0 en ajustant périodiquement le pH à 8,0 par l'addition de diisopropyléthylamine pendant une période d'environ 20 heures, au-bout de laquelle la réaction de formation du nonapeptide est sensiblement terminée, comme mis en évidence par une chromatographie en couche mince sur gel de silice G- effectuée en utilisant le 20 système de solvants acétate éthylique-pj^ridine-acide acétique-eau (10:5:1:3). On évapore le mélange réactionnel sous vide, on triture le résidu et on le lave à l'eau, et on fait sécher la substance lavée à l'eau pour obtenir environ 875 mg de tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu- 6—Cbz-lys-ala-ala. 25 Exemple 64 On sèche sous vide environ 196 mg de tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-L-Cbz-lys-ala-ala sur du pentoxyde de phosphore pendant environ 15 heures de manière à éliminer les traces d'eau, et on charge la substance sèche résultante dans un tube de polyéthylène 30 contenant 2,4 ml d'anisole et 2|:4 g de aéthionine. On refroidit le mélange à une température d'environ -35°C, on condense dans le tube 1 ml de gas fluorhydrique anhydre et on agite le mélange résultant à une température d'environ 0°C pendant une période d'environ 45 minutes. A la fin de cette période de réaction, on 35 fait passer un courant d'azote anhydre dans le mélange (se trouvant encore à 0°C), de manière à éliminer le gaz fluorhydrique en excès. On maintient sous vide la substance résiduelle à une température 72 10503 . 2130695 d'environ 25°C pendant une période d'environ 20 minutes, on la dissout dans de l'acide acétique en solution aqueuse et on lyophilise la solution aqueuse d'acide acétique. On dissout le produit résultant dans 45 ml d'eau, on ajoute 5 ml de mercapto-éthanol 5 et on chauffe le mélange à 45° pendant une période d'environ 24 heures. On évapore la solution réactionnelle à sec sous vide ; on dissout le résidu dans de l'acide acétique en solution aqueuse à 50 fi ; on fait passer la solution sur une colonne de filtration sur gel puis on la lyophilise pour obtenir environ 75 mg de met-10 leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala. 72 10503 2130695 Rj;VEirDIC/lr'IOI3 1. Procédé de préparation d'un héifiopeptide, choisi dans le groupe comprenant les hémopeptides PI, P2, H et S, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à coupler ensemble 5 par des liaisons peptidiques en utilisant la synthèse séquentielle ou la synthèse par blocs, les composants amino-acides dans l'ordre approprié, comme indiqué ci-après : val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala pour l'hémopeptide P1 ; val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala pour l'hémopeptide P2 ; val-his-leu-thr-pro-10 glu-glu-lys-ser-ala pour l'hémopeptide H ; et met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala pour l'hémopeptide S ; les groupements fonctionnels, présents dans les amino-acides ou peptides et pouvant réagir dans les conditions de ce couplage, étant protégés par des substituants non réactifs pendant ce couplage et pouvant être éli-15 minés sans affecter les liaisons peptidiques ou un autre substituant protecteur retenu dans la réaction subséquente de couplage ; de manière à former l'hémopeptide protégé correspondant contenant des substituants protecteurs, puis à soumettre l'hémopeptide protégé à l'action d'un agent de clivage capable d'éliminer ces subs-20 tituants pour former ledit hémopeptide. 2. Procédé de synthèse de l'hémopeptide P1y de structure val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala ; de synthèse de l'hémo- de synthèse de lshémo-= , peptide P2 de structure vaI-his-1eu-ser-ala-glu-glu-lys-g .nz-ala ;/ peptide H,de structure val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala ; 25 et de synthèse de l'hémopeptide S,de structure met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala, à partir d'un dérivé protégé de ces hémopeptides dont les groupes fonctionnels sont protégés par des substituants pouvant être éliminés par l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent ^e clivage sans attaquer sensiblement 30 les liaisons peptidiques, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre l'hémopeptide protégé respectif, P1, P2, H et S, à l'action énergique de clivage de l'acide fort. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir respectivement le dérivé pro- 35 tége tEÛC-val-liis-leu-ser-ala-glu-glu- s -Cbs-lys -glu-ala s le composé protégé tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu- s-Cbz-lys-gln-ala, le composé protégé tBOC~val~his-leu-thr~pro-glu-glu- e-Cba-lys-ser-ala et le composé protégé tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu- 56 72 10503 2130695 e -Cbz-lys-ala-ala,avec du gaz chlorhydrique sensiblement anhydre pour former respectivement"l'hémopeptide P1, l'hémopeptide P2, l'hémopeptide H et l'hépopeptide S. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le 5 fait qu'il consiste à faire réagir la L-alanine avec le composé glu-NCA pour former le dipeptide glu-ala, à faire réagir le dipeptide glu-ala avec le composé a-tBOC- e-Cbz-lys-ffiïS pour former le tripeptide protégé a-tBOC- e-Cbz-lys-glu-ala, à faire réagir ce tripeptide avec l'acide trifluoracétique pour éliminer le 10 substituant tBOC de manière à former le composé e-Cbz-lys-glu-ala, à faire réagir ce dernier composé avec glu-NCA pour former le tétrapeptide protégé glu- e-Cbz-lys-glu-ala, et à faire réagir le composé glu- e-Cbz-lys-glu-ala avec le composé glu-NCA pour former le composé glu-glu- e-Cbz-lys-glu-ala ; à faire réagir le 15 composé leu-OMe avec le composé his-TCA pour former l'ester de dipeptide his-leu-OMe, à faire réagir cet ester de dipeptide avec tBOC-val-NHS pour former l'ester de tripeptide protégé tBOC-val-his-leu-OMe, à faire réagir cet ester de tripeptide protégé avec l'hydrazine, puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'aci-20 de nitreux pour former l'azide de tBOC-val-his-leu ; à faire réagir le composé ala-OMe avec le composé tBOC-ser-NHS pour former le composé tBOC-ser-ala-OMe, à faire réagir ce dernier avec l'acide trifluoracétique de manière à cliver le substituant tBOC pour former le composé ser-ala-OMe, à faire réagir le .composé ser-ala-OMe 25 avec l'azide tBOC-val-his-leu pour produire l'ester de pentapeptide protégé tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe, à faire réagir cet ester de pentapeptide protégé avec l'hydrazine, puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'acide nitreux pour former l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala ; et à faire réagir cet azide de tBOC-30 val-his-leu-ser-ala avec le composé glu-glu- e-Cbz-lys-glu-ala pour former le décapeptide protégé tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-£ -Cbz-lys-glu-ala ; et à faire réagir ce décapeptide protégé avec le gaz fluorhydrique anhydre pour former l'hémopeptide Pl. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le 35 fait qu'il consiste à faire réagir la L-alanine avec gln-NCA pour former le dipeptide gln-ala, à faire réagir le dipeptide gln-ala avec le composé a-tBOC-£-Cbz-lys-NHS pour former le tri- 59 72 10503 2130695 peptide protégé a-tBOC-£ -Cbz-lys-gln-ala, à faire réagir ce tripeptide avec l'acide trifluoracétique de manière à éliminer le substituant tBOC pour former le composé e -Cbz-lys-gl£-ala, à faire réagir ce dernier composé avec glu-NCA pour former le tétra-5 peptide protégé glu-e-Cbz-lys-gln-ala, et à faire réagir le composé glu-e -Cbz-lys-gln-ala avec le composé glu-NCA pour former le composé glu-glu-e -Cbz-lys-gln-ala ; à faire réagir le composé leu-OMe avec his-TCA pour former l'ester de dipeptide his-leu-OMe, à faire réagir cet ester de dipeptide avec le composé tBOC-val-NHS 10 pour former l'ester de tripeptide protégé tBOC-val-his-leu-OMe, à faire réagir cet ester de tripeptide protégé avec l'hydrazine, puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'acide nitreux pour former l'azide de tBOC-val-his-leu ; à faire réagir le composé ala-OMe avec tBOC-ser-NHS pour former le composé tBOC-ser-ala-OMe, à faire 15 réagir ce dernier avec l'acide trifluoracétique povu/cliver j.e substituant tBOC de manière à former le composé ser-ala-OMe, à faire réagir le composé ser-ala-OMe avec l'azide de tBOC-val-his-leu pour produire l'ester de pentapeptide protégé tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe, à faire réagir cet ester de pentapeptide protégé avec 20 l'hydrazine, puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'acide nitreux pour former l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala; et à faire réagir l'azide de tBOC-val-his-leu-ser-ala avec le composé glu-gLu- s-Cbz-lys-gln-ala pour former le décapeptide protégé tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu- e-Cbz-lys-gln-ala ; et à faire réagir 25 ce décapeptide protégé avec le gaz fluorhydrique anhydre pour former l'hémopeptide p2. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir le composé ala-OMe avec le composé tBOC-ser-HHS pour former le dipeptide protégé tBOC-ser-ala-30 OMe, à faire réagir ce dipeptide avec l'acide trifluoracétique de manière à cliver le substituant tBOC pour former le composé ser-ala-OMe, à faire réagir le composé ser-ala-OMe avec le composé a-tBOC- e-Cbz-lys-NHS pour former le tripeptide protégé a-tBOC-e -Cbz-lys-ser-ala-OMe, à faire réagir ce tripeptide avec une 35 base alcaline aqueuse pour hydrolyser le groupement ester méthylique et à faire réagir le produit d'hydrolyse avec l'acide trifluoracétique pour éliminer le substituant tBOC de manière à former" 60 72 10503 2130695 le composé e-Cbz-lys-ser-ala, à faire réagir ce dernier composé avec le composé glu-NCA pour former le tétrapeptide protégé glu_£ -Cbz-l^s-ser-ala et à faire réagir ce dernier avec glu- NCA pour former/composé glu-glu-£-Cbz-lys-ser-ala ; à faire .réagir" le 5 composé leu-OMe avec his-TCA pour former l'ester de dipeptide his-leu-OMe, à faire réagir cet èster de dipeptide avec tBOC-val-ItHS pour former l'ester de tripeptide protégé tBOC-val -his-leu-OMe, à faire réagir cet ester de tripeptide protégé avec l'hydrazine,puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'acide nitreux 10 pour former l'azide de tBOC-val-his-leu ; à faire réagir le composé pro avec tBOC-thr-NHS pour former le composé tBOC-thr-pro, à faire réagir ce dernier avec l'acide trifluoracétique de manière à cliver le substituant tBOC pour former le dérivé thr-pro, à faire réagir ce dernier avec un agent de méthylation pour former le 15 dérivé thr-pro-OMe, à faire réagir ce dernier avec l'azide tBOC-val-his-leu pour produire l'ester de pentapeptide protégé tBOC-val-his-leu- thr-pro-OMe, à faire réagir cet ester de pentapeptide protégé avec l'hydrazine, puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'acide nitreux pour former l'azide de tBOC-val-his-leu-thr-20 pro ; puis à faire réagir cet aziae de tBOC-val-his-leu-thr-pro avec le composé glu-glu-e-Cbz-lys-ser-ala pour former le décapeptide protégé tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-e-Cbz-lys-ser-ala ; et à faire réagir ce décapeptide protégé avec du gaz fluorhydrique anhydre pour former l'hémopeptide H. 25 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir la l-alanine avec le composé ala-TCA pour former le dipeptide ala-ala, à faire réagir ce dernier avec l'ester a-tBOC- e-Cbz-lys-NHS pour former le tripeptide protégé a-tBOC- e-Cbz-lys-ala-ala, à faire réagir ce tripeptide 30 avec l'acide trifluoracétique de manière à éliminer le substituant tBOC pour former e-Cbz-lys-ala-ala, à faire réagir ce dernier composé avec glu-NCA pour former le tétrapeptide protégé glu-£ -Cbz-lys-ala-ala, et à faire réagir le composé glu- e-Cbz-lys-ala-ala avec glu-NCA pour former le commosé glu-glu- e-Cbz-35 lys-ala-ala ; à faire réagir le composé ala-OMe avec l'ester de tBOC-thr-NHS pour former l'ester de dipeptide protégé tBOC-thr-ala-OMe, à faire réagir cet ester de dipeptide protégé avec l'acide 61 72 10503 2130695 trifluoracétique pour cliver le substituant tEOC de manière à former thr-ala-OMe, à fairejréagir thr-ala-OMe avec- l'ester tBOC-leu-ITBS pour produire l'ester de tripeptide protégé tBOC- leu-thr-ala-OMe, à faire réagir ce dernier avec 1'acidefcrifluor-/d.© 5 acétique / manière à cliver le substituant tBOC pour former leu-thr-ala-OMe, à faire réagir ce dernier avec l'ester tBOC-met-NHS de manière à former tBOC-met-leu-thr-ala-OHe, à faire réagir cet ester de tétrapeptide protégé avec l'hydrazine, puis à faire réagir l'hydrazide résultant avec l'acide nitreux pour former l'azide 10 tBOC-met-leu-thr-ala ; et à faire réagir cet azide tBOC-met-leu-thr-ala avec glu-glu- e-Cbz-lys-ala-ala pour former le nonapeptide protégé tBOC-met - leu-thr-ala-glu-glu-e-Cbz-lys-ala-ala ; et à faire réagir le nonapeptide protégé avec le gazjfluorhydrique anhydre pour former l'hémopeptide S. 15 8. Un composé du groupe comprenant des amides, "esters et dérivés analogues K-acyliques de l'hémopeptide P1 (le décapeptide ayant la structure val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala) ; et les dérivés protégés de l'hémopeptide P1, ses amides, ses esters et ses dérivés IT-acyliques analogues, par exemple val-his-leu-ser-20 a la-glu-glu-lys-glu-ala-l®2 et îT-acétyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys -glu-ala . synthetique 9. Décapeptide val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala/, caractérisé par le fait qu'on l'obtient en soumettant l'un de ses dérivés protégés à l'action énergique d'un acide fort utilisé comme 25 agent de clivage, les groupements fonctionnels du dérivé protégé de ce décapeptide étant protégés par les substituants qui peuvent en être détachés par l'action énergique de l'acide fort de clivage sans que les liaisons peptidiques présentes dans la molécule soient sensiblement affectées, ce composé activant la libération 30 de l'hormone de croissance par les cellules du lobe antérieur de l'hypophyse, l'acide fort utilisé comme agent de clivage de preference étant/le gaz fluorhydrique anhydre. 10. Un composé compris dans le groupe des amides, esters et dérivés analogues E-acyliques de l'hémopeptide P2 (le décapeptide 35 ayant la structure val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala) ; et les dérivés protégés de l'hémopeptide P2, ses amides, esters et dérivés analogues E-acyliques, en particulier val-his-leu-ser-ala- 7? 10503 b2 11 2130695 glu-glu-lys-gln-ala-lït^, et R-aeétyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala. 11. Décapeptide val-his~leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln~ala synth tique, caractérisé par le fait qu'on l'obtient en soumettant l'un 5 de ses dérivés protégés à l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage, dérivé protégé dont les groupes fonctionnels sont protégés par les substituants qui peuvent en être détachés par clivage sous l'action énergique de l'acide fort sans affecter notablement les liaisons peptidiques présentes dans la 10 molécule, ce décapeptide synthétique activant la libération de l'hormone décroissance par des cellules du lobe antérieur de l'hypophyse, l'acide fort utilisé commo'agent de clivage étant,par exemple,le gaz fluorhydrique anhydre. 12. Un composé compris dans le groupe de l'hémopeptide H 15 (lo&écapeptide de structure val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser- ala) ; de ses amides, esters et dérivés U-aeyliques ; et de ses dérivés protégés, par exemple l'hémopeptide H val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, le composé val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-sei'-ala-rŒ!^ et le composé acétate de val-his-leu-thr-pro--glu-20 glu-lys-ser-ala. 13. Bécapeptide val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala synthétique, caractérisé par le fait qu'on l'obtient en soumettant l'un de ses dérivés protégés à l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage, les groupements fonctionnels du 25 dérivé protégé du décapeptide étant protégés par des substituants qui peuvent en être détachés par l'action énergique d'un acide fort de clivage sans affecter sensiblement les liaisons peptidiques présentes dans la molécule,ce décapeptide activant la libération de l'hormone de croissance par des cellules du lobe an-30 térieur de l'hypophyse. 14. "Un composé compris dansp-e groupe comprenant l'hémopeptide S (le nonapeptide ciejformule met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala) ; ses amides, esters et dérivés ÎT-acyliques, et ses dérivés ■crotégés, par exemple l'hémopeptide S met-leu-thr-ala-glu-glu-lys- 35 ala-ala, le composé met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala-HH^ et le composé î:!-aeétyl--met-leu-thr-ala~glu-glu-lys-ala-ala. 72 10503 63 2130695 15. ïTonapeptide synthétique met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala, caractérisé par le fait qu'on l'obtient en soumettant l'un de ses dérivés protégés à l'action d'un agent de clivage» par exemple le gaz fluorhydrique anhydre, les groupes fonctionnels 5 'du dérivé protégé du nonapeptide étant protégés par des substituants qui peuvent en être détachés par l'action de l'agent de clivage sans affecter notablement les liaisons peptidiques présentes dans la molécule, ce nonapeptide activant la libération de l'hormone de croissance par les cellules du lobe antérieur de" l'hypo-10 physe. 16. Dérivés protégés du décapeptide val-his-leu-ser-ala-glu- glu-lys-glu-ala, caractérisés/par le fait que les groupements fonc-xItjl déc&peptide tionnels/sont protégés par des substituants qui peuvent en être détachés par l'action énergique d'un acide fort utilisé comme agent 15 de clivage, par exemple le dérivé de structure tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu- e-Cbz-lys-glu-ala. 17. Pentapeptide glu-glu-lys-glu-ala et val-his-leu-ser-ala-, et leurs dérivés protégés, utiles notamment dans le procédé de la revendication 1. 20 18. Dérivés protégés du décapeptide val-his-leu-ser-ala-glu- glu-lys -gln-ala, caractérisés par le fait que les groupements fonctionnels du décapeptide sont protégés par des substituants qui peuvent en être détachés sans affecter notablement les liaisons peptidiques, par exemple le dérivé protégé du décapeptide tBOC-25 val-his-leu-ser-ala-glu-glu- £-Cbz-lys-gln-ala. 19. le pentapeptide glu-glu-lys-gln-ala et ses dérivés protégés utiles notamment dans le procédé suivant la revendication 1. 20. Composé de décapeptide suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il a la structure chimique ÎT-formyl- 30 val-his-le u-s er-ala-glu-glu-lys-gln-ala. 21. Dérivés protégés du décapeptide val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, caractérisés par le fait que les groupements fonctionnels de ce décapeptide sont protégés par des substituants qui peuvent en être détachés par l'action énergique d'un acide fort 35 utilisé comme agent de clivage, le dérivé protégé du décapeptide étant par exemple, i;BOC-val-his~leu-thr~pro-glu-glu- £ -Cbz-lys-ser-ala . 72 10503 2130695 22. Les pentapepticl.es glu-glu-lys-ser-ala et val-his-le u-thr~pro et leurs dérivés protégés, utiles notamment dans le procédé suivant la revendication 1. 23. Dérivés protégés du nonapeptide met-leu-thr-ala-glu-glu-5 lys-ala-ala, caractérisés par le fait que les groupements fonctionnels de ce nonapeptide sont protégés par des substituants qui peuvent en être détachés par faction énergique d'un acide fort utilisé comme agent de clivage, le dérivé protégé du nonapeptide étant,par exemple, tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-e-Cbz-lys-ala-ala. 10 24. Le pentapeptide glu-glu-lys-ala-ala et le tétrapeptide met-leu-thr-ala et leurs dérivés protégés, utiles notamment dans le procédé suivant la revendication 1. 25. Médicament caractérisé par le fait qulil contient un composé conforme à lIune quelconque des revendications 8 à 16, 18, 20, 15 21 et 23.