Brevet FR2137911A1 — publié le 19721229

i 2137911 La présente invention se rapporte à l'acide bléomycinique et à un procédé pour sa préparation. La bléomycine, antibiotique à action antitumorale, constitué par un glycopeptide basique soluble dans l'eau et séquestrant par chélation un cuivre 5 bivalent, est produite par Streptomyces verticillus et a été découverte par Omezawa, l'un des présents inventeurs, entre autres, en 1966 et est décrite dans le périodique "Journal of Antibiotics" 19A, page 200, 1966, dans un article de Umezawa, Maeda, Takeuchi et Okami. 16 sortes de bléomycines incluant la diméthylsulfopropylamino-3-bléomy-10 cine (bléomycine Â£) et la guanidinobutyl-amino-4-bléomycine (bléomycine B2) ont été produites et isolées par des méthodes classiques de culture qui sont décrites dans le journal précité, page 210. Parmi ces diverses sortes de bléomycines, les bléomycines Aj, A2, A,. et B2 ont été utilisées pour le traitement des tumeurs cancéreuses,des tumeurs cérébrales et des lymphomes sous la forme 15 d'un complexe de bléomycines. Par hydrolyse, la formule chimique des bléomycines a été déterminée comae suit : on a constaté que la formule chimique de chaque type de bléomycines est différente par son groupe amino terminal "R" dans la formule. L'acide bléomycinique de l'invention est le composé qui présente les 20 composants suivants quand il est partiellement hydrolysé, R étant le groupe -OH. CO - NH - CH - CO - NH - CH - CH - CH - COOH I III 25 NH - ÇH2 CH CH - OH N. CH_ OH CH„ COOH 30 35 40 f» HO - NH2- CH - CO - NH - CH2 - CH2—k OH hoh2C'/^O-^7 OH br OH °C0NH2 OH OH CO - R 72 17323 2 2137911 Les diverses bléomycines ont le même noyau de base, mais comportent différentes chaînes latérales d'amines. L'activité microbienne, l'activité anti-tumorale et les autres activités physiologiques des bléomycines sont très différentes suivant la structure de la chaîne latérale d'amines du groupe "R". 5 Lorsqu'une souche d'actinomycètes productrice de bléomycine est ino culée et est cultivée sur un milieu nutritif, les bléomycines peuvent être produites sous la forme d'un complexe de bléomycines Aj, A^, B2 etc . Lorsque, au cours de cette culture, on ajoute une aminé correspondant à la chaîne latérale d'amines de la bléomycine voulue, la bléomycine ayant 10 1'aminé correspondante peut être produite. Toutefois, selon la nature de la biosynthèse, le type de 1'aminé relié au noyau de base de la bléomycine est limité par sa structure, de sorte que le type de bléomycine résultant est, lui aussi, limité. En conséquence, s'il était possible de faire réagir chimiquement l'a-15 cide bléomycinique avec une aminé, il devrait être possible d'obtenir divers nouveaux types de bléomycines synthétiques en plus de celles, déjà connues préparées par la biosynthèse et on pourrait s'attendre à des progrès remarquables dans les traitements médicaux, notamment, à un renforcement de l'action anti-tumorale et anti-cancéreuse. 20 La demanderesse a étudié la possibilité d'utiliser une réaction avec des enzymes pour ne couper que la chaîne latérale sans modifier le noyau de base, mais elle a constaté qu'il ifétait pas possible d'utiliser la bléomycine comme substrat pour des enzymes hydrolytiques courantes, telles que la pepti-dase, la protéase, la pepsine, 1' d-chymotrypsine, la pronase, la phytine et 25 l'acylase, et qu'aucun sectionnement de la chaîne latérale ne se produisait. La demanderesse a également fait des recherches pour trouver un microorganisme capable de produire une enzyme destinée à couper la chaîne latérale de la bléomycine, dans le vaste domaine des bactéries, des actinomycètes et des moisissures. 30 Le résultat de ces recherches est la découverte que le mycélium spé cifique des moisissures a une activité de décomposition élevée et qu'un nouvel acide bléomycinique est présent dans le produit de réaction. L'acide bléomycinique préparé par l'invention est un nouveau composé qui n'a pas été découvert dans la nature. 35 En conséquence, l'un des buts de l'invention est de fournir un nouvel acide bléomycinique. Un autre but de l'invention est d'apporter un procédé pour préparer un nouvel acide bléomycinique. L'invention se propose également de produire le type de bléomycine 40 désiré par réaction entre un acide bléomycinique et une aminé donnée. 72 17328 3 2137911 Le nouvel acide bléomycinique de l'invention peut être préparé par hydrolyse de bléomycine en présence du mycélium de Fusarium genus ou de Helmin-thosporium, ou d'un système d'enzymes de ceux-ci ou encore, d'un milieu le contenant. 5 La souche utilisée pour la présente invention est une espèce de Fungi Imperfecti qui appartient soit au genre Fusarium, tel que Fusarium roseum selon la classification Link émendée par Snyder et Hansen IFO 7189 (numéro auquel correspond le n° ATCC 20352, pour le dépôt à " l'American Type Culture Collection") (W.C. Snyder, H.N. Hansen., "American J. Bot." Vol. 32 pages 10 657, 666 (1945) ), genre parmi lequel on connaît le Fusarium roseum selon la classification Link émendée par Snyder et Hansen IFO 8502 (ibid) , (numéro auquel correspond le n° ATCC 20355), le Fusarium anguioides Sherbakoff IFO 4467 (numéro auquel correspond le n" ATCC 20351), (H.W. Wollenweber., Die Fusarien page 61, Berlin 1965) etc., et, soit au genre Helminthosporium tel que 15 Helminthosporium Zonatum, Ikata et Yoshida IFO 6678 (numéro auquel correspond le n" ATCC 20353), (Ikata Yoshida BYOGAICHUZASSHI, (Japon) Volume 30, n° 7, page 209 (1943) ), et Helminthosporium Zonatum Ikata et Yoshida IFO 7521 (ibid) (numéro auquel correspondle n° ATCC 20354). Ces souches peuvent être cultivées dans un milieu aérobie pour moisis-20 sures. La productivité de l'enzyme n'est pas sérieusement affectée par la nature de la sarce de carbone ou d'azote. C'est ainsi, par exemple, que le rendement en mycélium et en enzyme est augmenté quand la souche croît dans un milieu à forte teneur en glucose, constituant la source de carbone, et contenant de la peptone ou une infusion 25 à froid de maïs comme source d'azote. Il est possible d'utiliser le mycélium ou le bouillon de culture du mycélium pour l'hydrolyse de la bléomycine en vue de produire l'acide bléomycinique. Toutefois, lorsqu'on utilise une enzyme purifiée ayant une grande activité, la formation d'impuretés peut être diminuée et la concentration en 30 substrat peut être augmentée, en même temps que la durée de la réaction peut être abrégée. La période de croissance de la souche est, de préférence, comprise entre 48 et 72 heures et la température optimale est de 25 à 30°C pour une culture aérobie en remuant sous une alimentation d'air, le pH optimal étant de 35 6 à 7. Pour l'hydrolyse de la bléomycine, on met en suspension ou on dissout le mycélium ou l'enzyme mentionné ci-dessus dans une solution tampon de phosphate de potassium et on la mélange avec une solution de bléomycine contenue dans une solution tampon de phosphate de potassium, puis on fait réagir le mé-40 lange pendant 2 à 10 heures. 72 17328 4 2137911 La condition optimale d'hydrolyse de la bléomycine se situe entre 25 et 45°C dans une solution tampon de phosphate de potassium à 0,05 M ayant une concentration de 0,1 à 0,5 % en substrat à un pH de 7 à 8. Le point final de la réaction d'hydrolyse peut être déterminé par la 5 diminution de l'activité anti-microbienne du substrat de bléomycine, mesurée par un essai en godet en utilisant le Mycobactérium 607, ou par un changement de l'indice sur une chromatographie en couche mince. Après la réaction, on élimine l'impureté et on adsorbe le produit sur une résine échangeuse d'ions faiblement acide, telle que l'Amberlite IRC-50H 10 (marque déposée de la société Rohm & Haas Co), celle-ci étant ensuite lavée avec de l'eau, et éluée avec de l'acide chlorhydrique dilué, puis neutralisée et déminéralisée. La déminéralisation peut être effectuée en adsorbant le produit sur du charbon actif (charbon actif pour la chromatographie) puis en lavant celui-ci 15 avec de l'eau, avant de l'éluer avec un mélange à 50 % d'acétone et d'aciée chlorhydrique â 0,02 N. La déminéralisation peut aussi être effectuée en adsorbant le produit sur une résine échangeuse d'ions (Amberlite CG-50H ; marque déposée de la société Rohm & Haas, Co.) qui est ensuite lavée avec de l'acide acétique à 20 0,2 % ou avec de l'eau, puis est éluée avec un mélange à 50 % de méthanol et d'acide chlorhydrique 0,02N. L'effluent déminéralisé est soumis à une concentration et à un séchage, puis est dissout dans du chlorure d'ammonium 0,05 M, puis on charge le produit avec du CM-Sephadex C-25 (marque déposée d'une poudre insoluble sèche composé# de grains microscopiques qui sont des composés 25 organiques synthétiques provenant du polysaccharide "Dextran" fabriqué et vendu par la société "Pharmacia Fine Chemicals, Inc'.') tamponné avec du chlorure d'ammonium à 0,05 M, le chlorure d'ammonium s'écoulant vers le bas en entraînant ainsi uniquement l'acide bléomycinique. On recueille le produit et on le déminéralise par le procédé indiqué 30 ci-dessus. On concentre la solution et on la sèche à 40°C sous une pression réduite, ce qui donne, avec un rendement élevé, une poudre pur.e de chlorhydrate de l'acide bléomycinique. Pour confirmer la nature de l'acide bléomycinique, on procède aux essais suivants : 35 L'acide bléomycinique résultant est hydrolysé par l'acide chlorhydrique 6N, â 105°C pendant 24 heures, puis on développe le produit hydrolysé par un procédé d'électrophorêse sur papier â haute tension et par la méthode de chromatographie sur papier. Un essai de réaction à la ninhydrine de ce chromatogramme sur papier du 40 produit hydrolysé de l'acide bléomycinique donne la même configuration que la 72 17328 5 2137911 bléomycine originale B2, a l'exception de la tache correspondante à la chaîne latérale d'aminé. En conséquence, les produits hydrolyses se composent de l'acide 2'-(2-aminoéthyl)-2,4'-bithiazole-4-carboxylique, de L-thrëonine, de l'acide ami-5 no-4-hydroxy-3-mëthyl-2-n-valérique de fc-hydroxy-histidine et de l'acide P-(amino-4-carboxy-6-méthyl-5-pyrimidin-2-yl)-propionique, de L-fr- aminoalanine de L-gulose et de carbamoyl-3-0-D-mannose. En traitant l'acide bléomycinique résultant avec le catalyseur de la résine échangeuse d'ions fortement acide (Amberlyst 15, marque déposée) aux 10 finB de méthanolyse, puis en soumettant le produit à une triméthylsilatation, et en le mesurant par la méthode de chromatographie en phase gazeuse, on trouve que le produit contient 1 mole de chacun des composants de L-gulose et de carbajaoyl~3-0-D-manaose. Quand on estérifie l'acide bléomycinique résultant dans le méthanol 15 en présence d'acide chlorhydrique comme catalyseur, puis quand on le réduit avec LiBH^ dans du tétrahydrofuranne anhydre, et qu'on procède à une nouvelle hydrolyse en présence d'un acide, on constate qu'un alcool s'est formé par réduction du groupe carboxyle de l'acide 2'-(2-aminoéthyl)-2,4'-bithiazol-4-carboxylique de l'acide amino terminal de l'acide bléomycinique. 20 On mélange la solution aqueuse de l'acide bléomycinique résultant (95 mg/2,4 ml) avec 5 équivalents de éthyl-l-(diméthylamino-3-propyl)-3 carbodiimi-de et 10 équivalents de sulfate d'agmatine en refroidissant avec de la glace, puis on règle le pH du mélange à 7 et on le laisse réagir pendant une nuit à 5°G. On charge le produit de la réaction dans une colonne garnie avec du CM-25 Sephadex C-25, et on procède à une élution avec une solution de chlorure d'ammonium à 0,63-0,65 M pour obtenir 8 mg de bléomycine ayant une activité antimicrobienne de 3015 U/mg à l'égard de Mycrobactérium 607. Le comportement chromatographique et le résultat de l'analyse du produit acide hydrolysé confirment que la bléomycine résultante est identique à la 30 bléomycine B£• L'activité antimicrobienne de la bléomycine est de 3094 U/mg. Ces résultats confirment que le produit résultant est bien l'acide bléomycinique recherché. Le chlorhydrate de l'acide bléomycinique est soluble dans l'eau mais 35 n'est que faiblement soluble dans le méthanol, l'acide acétique, le diméthyl sulfoxyde et est insoluble dans l'éthanol, l'acétate d'éthyle, l'acétone et 1'éther. Les propriétés physico-chimiques de ce composé sont les suivantes : Point de fusion 228 - 230°C (décomposition) 40 M 436 = 81,50 ^C= °'1' H20) 72 17328 6 2137911 10 Analyse élémentaire : C : 40,80 %, H : 5,29%, N : 16,45 % 0 : 24,78 1, S : 4,53%, Cl : 3,37 %, Cu : 4,78 % Le spectre d'absorption en ultra-violet du chlorhydrate de l'acide bléomycinique est légèrement différent de celui de la bléomycine de départ, et est représenté sur la figure 1, qui montre que le maximum d'absorption se situe 1 % respectivement à 246 m^u et à 292 nyu et que le coefficient d'absorption E j ^ est respectivement de 140 et 137,5. Le spectre d'absorption en infra-rouge du produit, mesuré sous la forme d'une pastille de bromure de potassium est indiqué sur la figure 2, qui montre que les bandes se situent à 3350, 1720, 1670, 1640, 1580, 1460, 1365, 1050 et 770 (cmrl). L'acide bléomycinique donne une réaction de Pauly et Ehrilich positive, mais la réaction à la ninhydrine, la réaction de Sakaguchi, la réaction ^ de Drangendorf, la réaction de Tollens, la réaction au chlorure ferrique et la réaction de Fehling et Molisch sont négatives. L'acide bléomycinique présente un R^ de 0,78 en chromatographie sur couche mince utilisant du gel de silice G et après développement avec le système méthanol ; acétate d'ammonium à 10 % et ammoniaque à 10 % dans les proportions 2° 10 : 9 : 1 et présente aussi un R^ de 0,46 en chromatographie sur couche mince après développement avec le système n-propanol i pyridine ; acide acétique , et eau, dans les proportions 15 : 10 : 3 : 12. L'acide bléomycinique présente un coefficient R^ de 0,86 en chromatographie sur papier utilisant un^filtre Toyo n° 51 dont le développement est réalisé avec du chlorure d'ammonium à 10 %, et il présente également un coefficient Rm de 0,65 dans 1'électrophorèse sur papier sous 3000 V pendant 40 minutes , en procédant au développement avec le système acide formique , acide acétique et eau dans les proportions 25 : 75 : 900 ( le coefficient R^ de l'alanine est 1). L'essai en coupelle sur Mycobacterium 607, montre que l'activité antimicrobienne du produit est relativement faible, n'étant que de 159 U/mg comparativement à celle de la bléomycine standard A^, qui est de 1000 U/mg. Toutefois, divers nouveaux composants de bléomycine peuvent être préparés en utilisant l'acide bléomycinique résultant. C'est ainsi, par exemple, qu'on peut faire réagir cet acide bléomycinique avec les aminés voulues pour obtenir divers types de composés nouveaux de bléomycine dont la chaîne latérale comporte les aminés correspondantes. Ces nouvelles bléomycines peuvent avoir une excellente activité antimicrobienne contre le Mycobacterium 607 et peuvent être différentes des bléomycines connues. L'acide bléomycinique réagit aussi avec la bènzylamine pourdonner la benzyl—a-mino-bléomycine. 72 17328 7 2137911 Les résultats expérimentaux de l'activité biologique de la benzylamino-bléomycine (le groupe amino terminal R étant le groupe benzylamino) vont être décrits maintenant comparativement à ceux de la bléomycine mentionnée ci-dessus. 5 Préparation de la benzylamino-bléomycine On dissout 1*8,6U mg (0,038 mmole) d'acide bléomycinique et ^5»31 mg (0,38 mmole) de benzylamine dans un litre d'eau et on refroidit la solution entre 0 et -5°C, puis on y incorpore 28,1+0 mg (0,19 mmole) d'un carbodiimide soluble dans l'eau, après quoi on règle le pH de la solution à U,5 avec l'acide chlo-10 rhydrique 6N, et on la laisse réagir pendant 30 minutes en remuant. Après la réaction, on maintient le mélange entre 0 et 5°C pendant 2h h. On sépare la benzylamino-bléomycine résultante et on la purifie de la même manière qu'on prépare la bléomycine à partir de l'acide bléomycinique, pour obtenir 15»2 mg de benzylamino-bléomycine ayant une activité microbienne 15 de 3250 mcg:ml à l'égard du Mycrobacterium 60J. L'analyse chromatographique et l'analyse des produits hydrolysés confirment que le produit est bien de la benzylamino-blécanycine. Expérience 1 On administre la benzylamino-bléomycine ou bléomycine B2 ci-dessus â 20 des souris mâles ICR-JCL par injections intraveineuses de 10mg/kg/jour pendant 10 jours successifs, puis les souris sont élevées pendant 5 semaines après la dernière injection, avant de subir une dissection pour préparer des échantillons des poumons droits et gauches, qui sont examinés au microscope . Le degré de dégénération fibreuse de chaque échantillon de poumon est indiqué dans le 25 tableau ci-après : TABLEAU I 1 : r 72 17328 8 2137911 POUMON SOURIS 10 11 12 13 lU 15 16 Bléomycine Br 10 Benzylamino Bléomycine POUMON - SOURIS, TOTAL 17 18 19 20 - + + H- Bléomycine B^ G + / - / 5 1 3 1 D \ \ - / + / h 3 3 0 Benzylamino G \ / + / 8 1 1 0 Bleu^y yiiit; D \ / + / 7 3 0 0 15 20 25 bléomycine B^. La toxicité de la benzylamino-'bléomycine était inférieure à celle de la ycine B,. Expérience 2 Le benzji l'action inhibitrice suivante à l'égard d'une culture de cellule.de ïïëte, (ligne de cellules S^bb) Le benzylamino-bléomycine et la bléomycine B^ présentent respectivement 30 Concentrations Action inhibitrice 6 3 '1,5 (mcg/ml) 35 Bléomycine B^ 92 33 Benzylamino- bléomycine 92 73 38 1^0 où l'action inhibitrice est égale g S ~ Co Y 100 c3 " Co 72 17328 9 2137911 C étant le nombre relatif de cellules au premier jour, O tg étant le nombre relatif de cellules au troisième jour après l'addition de la blécœycine (3mcg/ml en fin de compte), étant le nombre de cellules en contrôle négatif au troisième jour. 5 La benzylamino-bléomycine et la bléomycine Bg ont été respectivement essayées s- but une culture de cellules de Yoshida (selon la méthode décrite par M. Hori et Col. dans le "Journal of Antibiotics" Ser. A, vol. 16, N° 1 page 1.) Les résultats ont été les suivants : «» 10 Concentrations Action inhibitrice 5 2,5. 1,25 0,625 (mcg/ml) Bléomycine Bg 7^,9 56,0 3^,0 8,6 15 Benzylamino-bléomycine 83,5 55,^ 28,2 11,1 Ces résultats mettent en évidence l'efficacité de la benzylaminobléomycine contre les tumeurs. LeB exemples qui suivent, qui n'ont bienentendu aucun caractère limitatif, 20 feront mieux comprendre les particularité^ de l'invention. Exemple 1 On règle à 6 le pE d'un milieu de culture composé de 5? de glucose, de 0,1# de peptone, de 0,05? d'une décoction de maïs, de 0,03 ? de sulfate de magnésium, de 0,1? d'hydrophosphate de potassium, de 0,01? de chlorure de so-25 dium, de 0, 01? de chlorure de calcium et de 0,001 ? de chlorure ferrique, et on introduit 10 ml de ce milieu.dans un flacon de Sakaguchi de 100 ml qu'on stérilise à 120°C sous la pression d'une atmosphère pendant 15 minutes. Dans ce milieu, on inocule, $u moyen d'une boucle de platine une souche v de Fusarium roseum,classification Link émendé par Snyder et Hausen (IFO 71Ô9) 30- (numéro auquel correspond le N° ATCC 20 352), déposée f s. l'Institut pour la fermentation (Osaka, Japon), cultivée en pente puis sous secousse à 27°C pendant 72 heures. D'autre part, on introduit 100 ml du même milieu dans un flacon de Sakaguchi de 500 ml qu'on stérilise dans les mêmes conditions. On ajoute 0,2 ml de spores du milieu résultant à chaque milieu et on cultive sous secousse. 35 On recueille le bouillon de culture 3 jours après l'inoculation, on le filtre pour recueillir 15 g/1 de mycélium. On met en suspension 100 g de ce mycélium dans 200 ml d'une solution tampon de phosphate de potassium à 0,02 M ayant un pH de 7, puis on brise la masse de mycélium à basse température et on la sépare par une séparation centrifuge classique à froid à 19000 G. 72 17328 10 2137911 On mélange le liquide surnageant ainsi obtenu avec du sulfate d'ammonium solide pour obtenir une solution saturée à 75 % et on dissout 2,3 g de l'enzyme précipitée dans la solution tampon de phosphate de potassium ayant un pH 7» puis on procède à une purification par dialyse avec la même solution tampon 5 pour obtenir la solution d'enzyme. On dissout 5 g de bléomycine B2 dans une sdition tampon de phosphate de potassium à 0,05 M et on incorpore cette solution d'enzyme pour faire une quantité totale de 500 ml de solution. On fait réagir le mélange à 35°C pendant deux heures et on l'introduit dans une colonne de 2 cm de diamètre et de 50 cm 10 de long, garnie avec de l'Amberlite IEC-50H (marque déposée) afin d'adsorber le produit. Après lavage à l'eau, on soumet le produit à une élution par l'acide chlorhydrique 0,2 N et on neutralise l'effluent, puis on l'introduit dans une colonne de 2cm de diamètre et de 20 cm de long, garnie avec un charbon actif pour 15 la chromatographie afin d'adsorber le produit. Après lavage à l'eau, on soumet le produit à une élution avec un mélange à 50 % d'acétone et d'acide chlorhydrique puis on concentre l'effluent et on le sèche à Uo°C sous une pression réduite. On dissout le résidu dans une petite quantité de chlorure d'ammonium 0,05 M, et on l'âdsorbe sur du CM-Sephadex C-25 20 (marque déposée) qui a été tamponné avec du chlorure d'ammonium à 0,05 M. On fait passer du chlorure d'ammonium à 0,05M à travers la couche pour séparer l'acide bléomycinique. On recueille la solution d'acide bléomycinique et on la déminéralise, on la concentre et on la sèche à ÎJ0°C sous une pression réduite pour obtenir 900mg 25 de poudre de chlorhydrate de l'acide bléomycinique fondant à 228-230°C (décomposition Exemple 2 On cultive une souche de Helminthosporium zonatum Ikata et Yoshida IFO 7521,^numéro auquel correspond le numéro ATCC 20 35*0 déposée à l'Institut de la fermentation (0SAKA, Japon) selon le procédé de l'exemple 1 pour obtenir 30 une- masse de mycélium. On mélange 200 g de cette masse de mycélium et 10 g de bléomycine avec 250 ml d'une solution tampon de phosphate de potassium 1M ayant un pH de 7>5 et 10 ml de toluène, puis on ajoute une quantité suffisante d'eau pour obtenir 500 ml de solution. On agite ce-mélange, puis on le laisse reposer à 37°C pen-35 daût 12 heures. On filtre la solution de réaction sous une pression réduite, puis -on la lave avec de l'eau, avant d'introduire le filtrat dans une colonne de 2,6cm de diamètre et de 70 cm de long, garnie de résine échangeuse d'ions connue sous le nom Amberlite IRC-50H (marque déposée) afin d'adsorber le produit. Après lavage à l'eau, on fait subir au produit une élution par de l'acide Ii0 chlorhydrique 0,2 N, puis on règle le pH de l'effluent à 7 avant de l'introduire COPY 72 17328 n 2137911 dans une colonne de 2,6 cm de diamètre et de 70 cm de long, garnie d'Amberlite CG 50 H(marque déposée) pour adsorber le produit. Après lavage avec de l'acide acétique à 0,2 %, on fait subir au produit une élution par le mélange de 50 % de méthanol et d'acide chlorhydrique 0,02 N. 5 On concentre l'effluent et le sèche à U0°C sous pression réduite. On dis sout le résidu dans du chlorure d'ammonium à 0,05 M et on l'âdsorbe sur du CM-Sephadex C-25. On fait passer du chlorure d'ammonium à 0,05 M à travers la couche pour recueillir la solution d'acide bléomycinique. On concentre cette solution et on 10 la sèche sous une pression réduire pour obtenir 3,5 g de poudre de chlorhydrate de l'acide bléomycinique ayant un point de fusion de 228-230°C (décomposition). Exemple 3 On cultive une souche de Fusarium anguioides Sherbakoff IFO kkèj,(numéro auquel correspond le N° ATCC 20351) déposée à l'Institut de la fermentation 15 (Osaka, Japon), selon le procédé de l'exemple 1 pour obtenir 10 g de mycélium par litre de bouillon de culture. On dissout 100 g de cette masse de mycélium et 5 g d'un complexe de bléomycine dans 2,5 1 d'une solution tampon de phosphate de potassium à 0,05M, puis on y incorpore 5inl de toluène et on agite convenablement, avant de laisser 20 le mélange reposer à Uo°C pendant 12 heures. On élimine les matières insolubles de la solution de réaction pour obtenir un filtrat clair. On purifie ce filtrat selon le procédé de l'exemple 2 pour obtenir 1,1 g d'une poudre de chlorhydrate de l'acide bléomycinique ayant un point de fusion de 228 à 230°C (décomposition) COPY 72 17328 12 2137911 REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de l'acide bléomycinique ayant un point de fusion de 228 à 230°C (décomposition), dont l'analyse élémentaire révèle la composition suivante : C: i*C',80f, H: 5,2.9%, N: î.6,k5%, 2^,78%, S b,53%, 5 Cl: 3,31% et Cu: i+,78^, qui est soluble dans l'eau, très peu soluble dans le méthanol, l'acide acétique et le diméthylsulfoxyde, est insoluble dans l'étha-nol, l'acétate d'éthyle, l'acétone et l'éther, donne des réactions de Pauly et Ehrlich positives, mais dont les réactions dans la ninhydrine, les réactions de Sakaguchi, de Dragendorf, de Tollens, la réaction au chlorure ferrique, et la 10 réaction de Fehling et Molish sont négatives, qui présente un maximum d'absorption des rayons ultra-violets à 2k6 mji et à 292 iap. et des bandes d'absorption des rayons infra-rouges à 3350, 1720, 1670, 16U0, 1580, 1W0, 1305, 1050 et 770 cm —* , est hydrolysé pour produire de l'acide 2'-(2-aminoéthyl)-2,lf-'-bithia-zole-U-carboxylique, de la L-thréonine, de l'acide -amino-^-hydroxy-3~méthyl-2-15 valérique, de la $ -hydroxy-histidine, de l'acide f3 -amino-/à-(amino-^-carboxy-6-méthyl-5_pyrimidin-2-yl) propionique, de la L-/^-amino-alanine, du L-gulose et du carbamoyl-3-O-D-mannose, caractérisé en ce qu'on hydrolyse la bléomycine en présence d'une masse de mycélium ou d'enzymes. 2._ Procédé de préparation de l'acide bléomycinique, qui consiste à bydro-20 lyser la bléomycine en présence d'une souche de mycélium du genre Fusarium ou Helminthosporium ou d'un système d'enzymes de celles-ci. 3.- Procédé de préparation de l'acide bléomycinique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de Fusarium roseum selon la classification Link émendée par Snyder et Hansen IFO 7189 (numéro auquel correspond le n° 25 ATCC 20352, pour le dépôt à l'American Type Culture Collection), ou IFO 8502 (numéro auquel correspond le N° ATCC 20 355)» ou le Fusarium anguioides Sherbako IFO kk6f (numéro auquel correspond le N° ATCC 20 351), et en ce que la souche d'Helminthosporium est 1'Helminthosporium zonatum Iketa et Yoshida IFO 6678 (numéro auquel correspond le N° ATCC 20 353) ou IFO 7521 (numéro auquel corres-30 pond le N° ATCC 20 35^)» qui sont toutes disponibles. U.- Procédé de préparation de l'acide bléomycinique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une solution d'enzyme de Fusarium genus ou d'Helminthosporium genus. 5.- Procédé de préparation de l'acide bléomycinique selon la revendication 35 1, caractérisé en ce qu'on procède à l'hydrolyse de la bléomycine dans une solution tampon de phosphate contenant de 0,1 à 0,5 % de substrat de bléomycine. 6.- Procédé de préparation de l'acide bléomycinique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on procède à l'hydrolyse entre 25 et ^5°C, et à un pH de 7 à 8 en solution tampon. 1+0 7>~ Nouvel acide bléomycinique ayant un point de fusion de 228-230°C 72 17328 13 2137911 (décomposition), dont l'analyse élémentaire révèle la composition suivante C:U0,80?, H: 5,29?, N:16,^5?, 0:2^,78?, S: h,53%, Cl:3,37? et Cu:4,78?, qui est scluble dans l'eau, peu soluble dans le méthanol, l'acide acétique, le diméthylsuifoxyde, est insoluble dans l'éthanol, l'acétate d'éthyle, l'acétone 5 et l'éther, donne une réaction de Pauly et Ehrlich positive, mais dont les réactions dans la ninhydrine, au chlorure ferrique, et les réactions de Sakaguchi, Dragendorf, ïollens et Fehling et Kolish sont négatives, qui a un maximum d'absorption des rayons ultra-violets à 2h6 nyi et 292 mp et présente des bandes d'absorption aux rayons infra-rouges à 3350, 1720, 1670, 16^+0, 10 1580, 1^60, 1365, 1050 et 770 cm , qui produit par hydrolyse de l'acide 2'-(2-aminoéthyl)-2-k'-bithiazol-^-carboxylique de la L-thréonine, de l'acide amino-U-hydroxy-3-méthyl-2-n-valérique, de la ^-hydroxy-histidine, de l'acide -/I - amino—^-(amino-U-carboxy-6-méthyl-5-pyrimidin-2-yl) propionique, de la L-/^-amino-alanine, du L-gulose et du carbamoyl-3-0-D-mannose. 15 8.- Procédé de préparation d'une bléomycine donnée, caractérisé en ce qu'on hydrolyse de la bléomycine en présence d'une masse microbienne ou d'une enzyme, et en ce qu'on la fait réagir avec une aminé. 9.- Procédé de préparation d'une bléomycine donnée selon la revendication 8, caractérisé en ce que la bléomycine est la benzylamino-bléomycine qui a été 20 préparée en hydrolysant de la bléomycine et en la faisant réagir avec de la benzylamine. 10.- A titre d'antibiotique les bléomycines résultant de la mise en oeuvre du procédé selon l'un des revendications 8 et 9-