Brevet FR2120073A1 — publié le 19720811

\ 2120073 Il est connu que des a-amylases peuvent être inhibées par diverses substances de "bas poids moléculaire, par exemple l'acide salicylique et l'abiscisine [voir T. Hëmberg et J. Larsson, "Physiol. Plant." _1^, 861 ( 1 961 ), et T. Hemberg,, nÂcta Chem. 5 Scand." 21_, 1665 (1967)]. On sait en outre qu'il existe également des substances de plus haut poids moléculaire, qpî peuvent inhiber l'activité de quelques amylases de façon. non spécifique, par adsorption physique [T. Chrzaszcz, J. Janicfcx, "Bioch. Z." 260. 354 (1933) et "Bioch. J." 28, 296 (1934)] osa 10 par dénaturation et précipitation de l'enzyme [B. S. Millerr E. Kneen, "Arch. Biochem." IJj, 2§1 (1947), D. H. Struhmeyer et M. H. Malin, "Biochem. Biophys. Acta" 184. 643 (1969)]. On a observé, en outre, qu'il est possible de séparer du blé par élution avec de l'eau distillée une substance qui 15 réduit l'activité de l'amylase salivaire pour la production de dextrine, tout en n'exerçant qu'une faible influence sur l'activité de l'amylase pancréatique [E. Kheen, R.M. Sandstedt, "Arch. Bioch." % 235 (1946)]. Un inconvénient des substances décrites réside dans le 20 fait que l'inhibition de l'amylase n'est pas spécifique ou que l'activité ihhibitrice des substances décrites est faible, en particulier vis-à-vis des amylases pancréatiques (comme -quèlques essais l'ont montré), c'est-à-dire que des inhibitions pratiquement totales des amylases (jusqu'à 90 c/° et plus) ne 25 sont obtenues que pour des rapports très élevés de l'inhibiteur à l'enzyme. Des inhibiteurs d'amylases ont déjà, fait l'objet de la demande de brevet français îî° 71 03140 du 29 Janvier 1971 déposée par la Demanderesse,dans laquelle.il est démontré qu'avec desf 30 aqueuses d'électrolyte, de -préférence des acides dilués, ou. principalement des mélanges d'eau et d'alcools en à de préférence à des pH acides, on peut extraire du blé (M.ê êgrugé» farine ou gluten de blé) en de forts rendements, us. inhibiteur d'amylase pancréatique, de grande activité, qui ne comporte 35 pas les inconvénients mentionnés. Cette substance ainsi obtenue inhibe déjà à plus de 90 $ 1 'amylase^pancréatique pour de très faibles rapports de l'inhibiteur à l'enzyme. 71 47019 2120073 la présente invention concerne des inhibiteurs de glu-cosidases dérivés d'actinomycètes, à savoir, en particulier, des inhibiteurs de glucosidases,de préférence d'enzymes digestifs hydrolysant les glucides, ces inhibiteurs étant dérivés d'actino-5 mycètes. Ils sont formés par des micro-organismes de l'ordre des actinomycétales,appartenant fen particulier aux familles des Streptomycetaceae, Thermoactinomycetaçeae, Mikromonosporaceae, Focardiaceae , principalement ceux de la famille des Actino-planaceae. Ils sont produits dans une proportion particulièrement 10 grande par des souches des genres Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces, Chainia, Pilimelia, Planomonospora et Actinobifida. Pour la caractérisation des souches actives, on utilise les méthodes décrites ci-après. 15 On isole, d'une façon connue, d'échantillons de sol, des souches de l'ordre des actinomycétaies,notamment des familles des Streptomycetaceae et des Actinoplanaceae, ou bien on se procure dans des collections des souches de cet ordre. Par des repiquages de ces souches, on ensemence des ballons de culture 20 contenant des solutions nutritives, qui permettent le développement de ces souches. On peut utiliser, par exemple,la solution nutritive à base de glycérine et de glycocol, proposée par von Plotho, contenant 2 fo de glycérine, 0,25 f° de glycocolle, 0,1 fo de chlorure de sodium, 0,1 % de phosphate dipotassique, 25 0,01 de sulfate ferreux FeSO^.7 H20, 0,01 ^ de sulfate de magnésium MgS0^.7IL>0 et 0,01 $ de carbonate de calcium. Pour accélérer la croissance, on ajoute de préférence à cette solution nutritive des sources complexes de carbone, par exemple un extrait soluble de maïs ou de la farine de soja ou un 30 extrait de levure ou encore des hydrolysats de protéines, par exemple des aminés 1TZ ou des mélanges de ces substances. On doit alors .ajuster le pH de la solution. On préfère que le pH initial de la solution nutritive soit compris entre 6,0 et 8,0, notamment entre 6,5 et 7,5. 35 lia glycérine de la solution nutritive peut être rempla cée également par d'autres sources de carbone, par exemple du glucose ou du sucre de canne ou par de l'amidon, ou des mélanges 71 47019 2120073 de ces substances. On peut aussi remplacer le glycocolle par d'autres sources d'azote, par exemple l'extrait de levure, la farine de soja, les aminés HZ, le produit "Pharmamedia", etc. les concentrations des sources de carbone et d'aàote, 5 de même que les concentrations des sels peuvent varier entre de larges limites, le sulfate ferreux, le carbonate de calcium et le sulfate de magnésium peuvent aussi manquer totalement. On verse, par exemple, 100 à 200 ml de la solution nutritive dans une fiole d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, on la 10 stérilise d'une façon connue, on l'ensemence avec la souche à étudier et on fait incuber la fiole à 15-60°C, de préférence à 24-50°C, sur une secoueuse mécanique. Si un développement a lieu dans la culture, ce qui apparaît généralement au bout de 1 à 10 jours, le plus souvent au bout de 3 à 5 jours, on 15 prélève Tin échantillon de, par exemple, 5 ml et "on sépare le mycélium de cet échantillon par filtration ou c entrifugation. On utilise O à 100^.1 de ces bouillons de culture dans les essais décrits ci-après et on calcule le pouvoir inhibiteur par millilitre. les mycéliums sont extraits deux fois avec, à 20 chaque fois, 5 volumes (par rapport au volume de mycélium) d'acétone, puis une fois avec 5 volumes d'éther diéthyliquè, on fait sécher sous vide à 20°C le résidu mycélien extrait et on extrait la poudre sèche de mycélium ainsi obtenue avec 4 à 8 parties en poids de diméthylsulfoxydé (DKSO). 25 On rassemble les deux extraits (acétone et éther) et on les concentre rapidement par évaporation à sec sous vide. On reprend le résidu de ces extraits avec le" produit d'extraction au diméthylsulfoxyde de la poudre sèche et on utilise 0 à 100 {il du mélange obtenu dans les essais décrits 30 ci-après. Test à l'amylase Une unité d'inhibiteur d'amylase (1 UIA) est définie comme représentant la quantité d'inhibiteur qui inhibe à 50 deux unités d'amylase. Une unité d'amylase (UÀ) est la quantité 35 d'enzyme qui scinde en une minute dans les conditions expérimentales indiquées un micro-équivalent de liaisons glucosidiques de l'amidon. les micro-équivalents de liaisons scindées sont 71 47019 4 2120073 déterminés par colorimétrie avec l'acide dinitro-salicylique, comme micro-équivalents de sucre réducteur formé, et on les exprime en micro-équivalents de maltose à l'aide d'une courbe d'étalonnage du maltose. Pour la conduite de l'essai, on ajoute à 5 0,1 millilitre de solution d'amylase (20-22 UA/ml), 0 à 400 ng d'inhibiteur ou 0 à 100 ni de la solution de culture à tester, ou d'extraits mycéliens^dans 0,4 ml d'une solution de pH égal à 6,9, formée d'un tampon de glycérophosphate de sodium (0,02 M) et de chlorure de calcium (0,001 M) et on laisse la température 10 s'équilibrer pendant environ 10 à 20 minutes au bain-marie réglé à 35°C. On fait ensuite incuber à 35°C pendant 5 minutes avec 0,5 ml d'une solution d'amidon à 1 ?of préalablement chauffée à 35°C [amidon soluble de la firme Merck, Darmstadt, N° 1252], puis on ajoute 1 ml de réactif à l'acide dinitro-15 salicylique [d'après P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, "Meth. Enzymol.", tome 1, page 149]. Pour le développement de la couleur, on chauffe le mélange pendant 5 minutes au bain-marie bouillant, puis on le laisse refroidir et on l'additionne de 10 ml d'eau distillée. On mesure l'extinction à 540 nm par rapport à 20 tin blanc contenant les mêmes ingrédients, sauf l'amylase. Pour interpréter le résultat, on lit sur une courbe étalon d'amylase, préalablement enregistrée, l'activité d'amylase encore disponible après l'addition de l'inhibiteur, et on en déduit le pourcentage d'inhibition de l'amylase utilisée. On construit la courbe du 25 pourcentage d'inhibition en fonction du quotient : |ig d'inhibiteur * UA 11** * par rapport à la substance sèche ** unités d'amylase dans le .milieu non inhibé de la même 30 série on lit le point d'inhibition à 50 ^ sur la courbe et on le convertit eh UIA par mg d'inhibiteur. Test à la saccharase Une unité d'inhibiteur de saccharase (UIS) est définie 35 par la quantité d'inhibiteur nécessaire pour inhiber à 50 ^ deux unités de saccharase. Une unité de saccharase (US) est la quantité d'enzyme qui scinde en une minute, dans les conditions 71 47019 5 2120073 expérimentales indiquées ci-après, une micromole de saccharose en glucose et fructose. Les micromoles de saccharose scindées sont dosées par colorimétrie à l'acide dinitrosalicylique sous la forme du glucose et du fructose formés,et leur quantité est 5 déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage de glucose/fructose. Pour la conduite du test, on ajoute à 0,1 ml de solution de saccharase (0,3-0,4 US/ml)(saccharase solubilisée extraite de muqueuses intestinales"de porcs, d'après B. Borgstrom et A. Dahlquist, "Acta Chem. Scand." 1_2 (1958) page 1997), 0-400 [ig 10 d'inhibiteur ou 0-50 |il de la solution de culture de l'extrait mycélien à tester, dans 0,1 m^ide tampon de maléinate de sodium 0,1 M (pH 6,0) et on laisse la température s'équilibrer pendant environ 10-20 minutes au bain-marie réglé à 35°C. Ensuite, on fait incuber pendant 60 minutes à 35°C avec 0,2 ml d'une solution de 15 saccharose 0,056 M préalablement chauffée à 35°0 (saccharose de la firme Merck, Darmstadt, 11° 7652)jpuis on ajoute 0,5 ml de réactif à l'acide dinitro-salicylique (d'après P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, "Meth, Ensymol." tome 1, page 149). Pour développer la couleur, on chauffe le mélange pendant 5 minutes au bain-20 marie bouillant puis on le refroidit et on l'additionne de 5 ml d'eau distillée. On mesure l'extinction à 540 nm par rapport à un blanc correspondant ne contenant pas de saccharase. Pour l'interprétation, on détermine sur la courbe d'étalonnage les unités de saccharase encore disponibles après 25 l'addition de l'inhibiteur, et on en déduit le pourcentage de l'inhibition de la saccharase utilisée. On trace la courbe du pourcentage d'inhibition en fonction du quotient : |ig d'inhibiteur * US ** 30 * par rapport à la substance sèche **unité^de saccharase dans un mélange non inhibé de la même série, on lit sur la courbe le point d'inhibition à 50 7° et on le convertit en unités d'inhibiteur de saccharase par milligramme d'inhibiteur. 35 Test à la maltase Une unité d'inhibiteur de maltase (UIM) est définie comme la quantité d'inhibiteur capable d'inhiber à 50 deux unités de 71 47019 6 2120073 maltase. Une unité de maltase (UK) est la quantité d'enzyme qui scinde en une minute^dans les conditions expérimentales indiquées ci-après, un micro-équivalent de liaison glucosidique dans le p-nitrophényl-a-D-glucopyrarxoside. Les milli-équivalents 5 de liaison scindée sont déterminés par photométrie sous la forme des milli-équivalents de p-nitrophénolate. Pour la conduite du test, on équilibre la température de 0,05 ml de solution de maltase (0,09-0,12 TM/ml) (maltase solubilisée extraite de muqueuses intestinales de porcs, 10 d'après B. BorgstrSm et A. Dahlquist, "Acta Chem. Scand." 12 (1958) page 1997, ou maltase sous la forme d'un produit de lyophilisation de suc pancréatique humain) additionnée de 0-400 ng d'inhibiteur ou 0-20 p.1 de la solution de culture à tester ou de l'extrait mycélien dans 0,05 ml de tampon de 15 maléinate de sodium 0,1 M (pH 6,0) pendant environ 10-20 minutes au bain-marie réglé à 35 °C. Ensuite, on fait incuber à 35°0 pendant 30 minutes avec 0,1 inl d'une solution, préalablement chauffée à 35°C, à 0,4 de p-nitrophényl-a-D-glucopyranoside (firme Serva, Heidelberg, H° 30 716) dans un tampon de maléinate 20 de sodium 0,1 M, à un pH égal à 6, puis on arrête la réaction par addition de 2 ml de tampon tris 0,565 M (pH 7,6). On mesure immédiatement l'extinction à 403 nm par rapport à un blanc préparé de la même façon, sans addition de maltase. Pour l'interprétation, on détermine sur la base d'un 3 25 coefficient d'extinction moléculaire égal à 13,2 x 10 pour l'anion p-nitrophénolate, à un pH égal à 7,6, les unités de maltase encore disponibles après l'addition, d'inhibiteur et on en déduit le pourcentage d'inhibition de la maltase utilisée. On trace la courbe du pourcentage d'inhibition en 30 fonction du quotient : ng d'inhibiteur * UM ** * par rapport à la substance sèche ** unités de maltase dans le mélange non inhibé 35 on lit sur la courbe le point d'inhibition à 50 fi et on le convertit. en unités d'inhibiteur de maltase par mg d'inhibiteur. Etant donné que dans cet essai simple de routine, on travaille avec un substrat artificiel et non avec le substrat 71 47019 2120073 spécifique de la maltase (maltose), on recherche en outre l'activité d'inhibition de la maltase des substances actives, dans un test à la maltase gui est plias coûteux et qui a été décrit par Dahlquist("Enzym. biol. clin." JM_, 52/1970). Dans ce test, 5 on mesure par coloriraétrie la quantité de glucose produite par action de la maltase sur le maltose par voie enzymatique à l'aide d'oxydase de glucose, de peroxydase et de dianisidine. Tous les inhibiteurs de maltase décrits dans le présent mémoire exercent également un effet d'inhibition dans ce test. 10 Au moyen de la méthode décrite ci-dessus, on a étudié toute une série de souches de diverses familles et de divers genres de l'ordre des actinomycétales. On a constaté chez les diverses familles et les divers genres des activités inhibi-trices de glucosidases qui, bien que parfois faibles, ont quand-15 même été nettes. En ce qui concerne le rendement, les souches qui ont donné les résultats les plus favorables appartiennent à la famille des Streptomycetaceae et en particulier à la famille des Actinoplanaceae. Au sein de ces familles, on a découvert des souches 20 efficaces, en particulier dans les genres Streptomyces, Actino-planes,Ampullariella et Streptosporangium. Parmi les souches expérimentées, celles qui sont -indiquées ci-dessous se sont montré particulièrement efficaces dans l'un ou plusieurs des tests effectués. COPif 71 47019 8 TABLEAU I 2120073 Uuméro de souche la ITora Action Amylase inhibitrice Kaltase Saccharase Dé signât ic parti-culiè] | F0 de Dn collec-| tion ^e • se ELI se Ei-I se S M SB 2 CBS 951.70 Ampullariella regularis +++ + SB 5 H 952.70 n +++ SB 11 H 955.70 Actinoplanes spec. +++ +++ SB 12 ti 956.70 n +++ . SB 18 ii 957.70 n +++ +++ + ++ ++ ++ SB 27 » 958.70 n +++ SB 46 n 959.70 n +++ SE 5 H 960.70 Actinoplanes ' spec. ++ ++ SE 21 n 953.70 Ampullarielia regularis 1 ■! -I1 SE 39 n 954.70 n +++ SE 50 SE 55 « n 961.70 962.70 Actinoplanes spec. n +++ ++ ++ + +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ SS 26 n 963.70 Streptosporan-gium album ++ SS 45 n 964.70 " spec. ++ SS 51 n 965.70 n » ++ ++ SS 53 . n 966.70 " roseum ++ +■+ St 19 ATCC 3319 Streptomyces flaveolus ++ St 50 CBS 693.69 Streptomyces heimii + St 67 n 432.59 Streptomyces tendae ++ ++ St 45 n 434.51 Streptomyces aureofaciens + RT 36 n 228.65 Chainia rubra + RT 33 n 295.66 " poonensis + ST 12 - fIRRL B-2286 Streptomyces murinus +++ + 71 47019 9 2120073 TABLEAU I (suite) Numéro de la souche Fom Action Amylase inhibitrice Maltase Saccharase Désignation partiel lière | ÏT° de î collec-i-~~tion SC EH SC EH SC EM 3T 51 CBS 498.68 Streptomyces fradiae ++ 3T 3 ïffiRL 2.580 Streptomyces chrysomallus' ++ ST 1 ATCC 11523 n ++ SS 55 CBS Streptospo-rangium -roseum ++ SS 59- t> " amethysto-genes ++ SS 62 11 " roseum ++ AT 8 KCC-A 0027 " viridalbum ++ AT 11 n .1 0025 " album ++ AT 13 CBS 19064 Ampullarielia campanulata +++ AT 14 » 19364 " regularis +++ SE 89 n " spec. +++ SE 100 n Planomono spora spec. ++ ++ AT 4 » 191.64 Ampullariella digitata ■ + ++ AT 9 KCC-A 0028 Streptosporan-gium vulgare + ++ -H- AT 10 . ATCC 19190 " indianensis ++ ++ SE 103 CBS Actinoplanes spec. -H- HIT 6 it Actinobifida chromogena. ++ HIT 2 tl n n +-H- AT 2 » 367.66 Actinoplanes utahensis + SE 101 CBS Planomonospora parontospora + SK 2 n Pilimelia spec. ++ SE 82 n Actinoplanes speco +++ +++ ++ ++ ++ ++ SA 28 ii Ampullariella digitata + + 71 k7019 10 2120073 TABLEAU I (suite) Numéro de la souche Nom ■ 1 1 i Action inhibitrice Amylase Maltase Saccharase Désignation particulière N° de collec-■ tion • SC EM SC EM SC EM SA 8 CBS Actinoplanes spec. +++ AI 7 ATCC 12428 Streptosporan-gium roseum ++ 3E 45 CBS Ampullar i ella regularis + ATCC = Amercian Type Culture Collection CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn NBB1 = Culture Collection Unit, Fermentation Section, Northern Utilization Research Branch , Peoria, Illinois, USA KCC = Culture Collection, Research Division, Kaken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japon SC = Solution de culture EM = Extrait mycélien + = nette activité -H- = forte activité +++ = très forte activité 71 47019 n 2120073 TABIEAO II Streptospo-rangium album SS 26 Streptospo-rangium spec. SS^45 Streptospo-rangium. spec. SS 51 Date d'isolemeni b 2.8.1967 8.11.1968 9.11.1968 Méthode Frottis de sol sur nlaaue Frottis de so3 sur plaaue . Frottis de sol sur plaaue Origine Rhon, Heidelstein, pelouse, entre des blocs de basalte, pH 3,9 Kenya, plantation de café près de fîuiru, pH 5,4 Kenya, plantation de café près de Ruiru, pH 5,4 de la Blanc Blanc—crème ^ Blanc—crème jaunâtre ou rosé .iaunâtre ou rosé •Mycélium substrat 0,5—1,2 p., cloisonné 0,4-1,2 n 0,4-1,2 n, cloisonné Forme des sporanges Sphériques, parfois ridés et. déformés Sphériques, lisses Sphériques, lisses, quelques formes déficientes sont également ridées et irrégulières Diamètre des sporanges 3-7 n 3-11 H 3-11 \i Forme des spores + sphérique à oblongue le plus - s auvent '+ ovale ~~ le plus souvent + ovale , parfois sphé-riaue Dimensions des suores 0,6-0,9 x 0,6-1.3 H 0,7-1,1 x 1.0-1.7 u 0,7-1,0 x 0.8-1.7 u Présence de flagelles Disposition des spores dans le sporange Chaînes en spirale Chaînes en spirale Chaînes en spirale Conidies, spores du substrat, etc. Mélanine P3H -> CPC - Ty - Gel -i - ïEH -" CPC - Ty «' Gel -J - ÏEH -) CPC -/ Ty -( " Gel -/ Réduction des nitrates + (faible) Liquéfaction de la frélatine + + + Peptonisation du lait + 71 47019 12 2120073 TASIBAD II (suite) Streptospo- Streptospo- Streptospo- rangium album rangium spec. rangium spec. SS 53 SS 45 SS 51 Croissance à : 20°C + + + 26 °C ++ ++ ++ 32°C - ++ . + +(+) 37°C — + + 42 °C - - - Tolérance du chlorure de so dium : 2 7* + C. faible ++ ++ 3 ?° — ++ ++ 4 fo — - + + 7 7> - - - Hydrolyse de l'amidon + + 71 47019 13 2120073 TABLEAP II (suite) Streptospo-rangium roseum SS 26 Actinoplanes sttec. SE 5 SE 55 Date d'isolement 9.11.1968 16.12.1969 31.12.1969 Léthode Frottis de sol sur plaaue Pollen Pollen Origine Kenya, plantation de café près de- Suiru PH 5,7 Kenya, plantation de café près de Ruiru, pH 5,£ Kenya, fljoro, station expérimentale d'Eldoret, PH 5.1 de la so- r.Txrrin,lim lution Rose 0,4-1,3 R 0,3—1,3^, cloisonné [Iy^clium de la so__ lution 0.4 - 1.2 n Forme des sporanges Sphérique, parfois légèrement ridée Irrégulière Diamètre des sporanges 3-10 [x - Environ '4-12 u Forme des spores Le plus souvent + ovale + sphérique Dimensions des spores 0,7-1,1 x 1.0 - 1.9 n Environ 1 p. Présence de fia-selles Disposition des spores dans les sporanges Chaînes en spirale Chaînes enchevêtrées, chaînes de spores également parallèles et rectilignes par places 0 onidie s, spores du substrat, etc. Sur CPC : spores du substrat le plus souvent sphériques (+), de diamètre attei-gant environ' 2 n, individuelles ou associées, terminales ox. intercalaires • Mélanine PSH -CPC -Ty -Gel - CPC -Ty - CPC + Ty + Réduction des nitrates + 71 47019 U 2120073 ■ MBIEAU II (suite) Streptospo-rangiuia roseum SS 53 Actinoplanes spec. SB 5 SE 55 Liquéfaction de la gélatine + Peptonisation du lait + Oroissan.ee à : 20 °C 26°0 32 °C 37 °C 42 °C ++ ++ + ++ ++ ++ ++ îolérance du chlorure de sodium : 2 fo 3 7" 4 fo 7 f + (+) + • Hydrolyse de 11amidon + + 71 47019 is 2120073 - TABLEAU II (Suite) Ampullarielia regularis SB 2 Ampullariella regularis SB 5 Ampullariella regularis SE 21 Date d'isolement 2.7.1966 3.7.1966 17.12.1969 méthode Pollen Pollen Pollen Origine ITeuhof, circonscription de Pulda, terre prélevée sous de la paille en décomposition, en lisière de ohamp, pH 5,7 iîeuhof, circonscription de Fulda, terre prélevée sous de la paille en décomposition, en lisière de champ. pH 5.7 Kenya, plantation de café près de Ruiru pH 5,3 Mycélium 0,3-1 H, large 0,3-1 0,3- 1 it Forme des sporanges en forme de bouteille, de cylindre ou de bourse en forme de bouteille, de cylindre ou de bourse en forme de •bouteille, de cylindre ou de bourse Dimensions des sporanges 4 - 10 x . 7 - 18 u 3,5 - 7 x 6 - 14 u 3,5 - 9 x 6 - 13 U Forme des spores bâtonnets bâtonnets bâtonnets Dimensions des spores 0,5 - 0,7 x 1.5 - 2.2 u 0,5 - 0,7 x 1.5 - 2.2 u 0,5 - 0,7 x 1.5 - 2.2 u Présence de flagelles iiophotrich.es Lophotriches Lophotriches Disposition des spores dans les sporanges Chaînes parallèles rectilignes -Chaînes parallèles rectilignes Chaîne parallèles rectilignes Gonidies, spores du substrat, etc. Mélanine CPC Ty - - Gel -) CPC Ty - - Gel - j CPC + Ty + Réduction des nitrates + + . Liquéfaction de la gélatine + + Peptonisation du lait + + + Eïydrolyse de l'amidon + + + droissance à : 20°C 26°C 32 °C 37 °C 42 °C ++ ++ -H- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 71 47019 's 2120073 TABLEAU XI (suite) Ampullariella regularis SE 39 âc t iïxoplane s spec. SB 1.1 Actinoplanes spec. SB 12 Date d'isolement 22.12,1969 9.11 . 'i 966 9,11.1966 i-îéthode Pollen Pollen Po3.1en Origine Kenya, plantation de café près de Ruiru, pH 5,6 Circonscription de Esohwege, près Fran-kershausen, "Hielocher" pH 7.7 Ârfurt, circonscription de Oberlahn, terre exposée au soleil sur rochers PH 7,3 Mycélium. 0,3-1 fx 0,3 - 1,3 y., cloisonné 0,3- 1,2 ix Forme des sporanges Forme de bouteille, de cylindre ou de bourse + sphérique à surface ridée, parfois irrégulière Dimensiongâes sporanges 3 - 10 x 5 - 16 u 3,5 - 12p, Forme des spores bâtonnets ± sphéricme Dimensions des spores 0,5 - 0,7 x 1.5 - 2.2 u environ 1 - 1.3 U Présence de fia-selles Lophotriches Spores mobiles Disposition des spores dans les sporanges Chaînes paraile s rectilignes Chaînes enchevêtrées Conidies, spores du substrat, etc. CPC : hyphes larges (environ 1,3 n) cloisonnées à distance d1 environ 2,5-4 [x, optiquement denses (cellules latentes?) Mélanine CPC + Ty + CPC - + Gel +, CPC - ) Ty - } + Gel + J Réduction dès nitrates + Liquéfaction de la gélatine + + Peptonisation du lait _ + + Hydrolyse de l'amidon + + + 71 47019 n 2120073 TABLEAU II (suite) Ampullariella Actinoplanes Actinoplanes regularis spec. spec. SI? 39 SB 11 SB 12 Croissance à : 20°C ++ ++ ++ 26°C ++ 4*+ ++ 32 °C ++ - -H- ++ 37 °C ++ + ++ 42 °C •M mm 71 47019 2120073 TABLEAU II (suite) Actinoplanes spec. SB 18 Actinoplanes spec. 33 27 Actinoplanes spec. SB 46 Actinoplanes spec. SE 50 )ate d'iso-Lement 4.12.1966 8.12.1966 3.3.1967 22.12.1969 Méthode Pollen Pollen Pollen Pollen Drigine Hattenheim, Rheingau, champ de pommes de terre dans la "Sandaue", pH 8,0 Kuhkopf, domaine de protection . de la nature, Altrhein, pré-bois sous pâturage, nH 7.6 ïïeuhof, circonscription de Fulda, pelouse, en bordure de chemin, pH 6,1 Kenya, plantation de café près de Ruiru, pH 6,2 Mycélium 0,3-1,3 [A, cloisonné . 0,2-1,1 [j. 0,3-1,4 H, cloisonné 0,4-1,3 V Forme des sporanges Irréguliëre , ridée , gib-beuse + clavifor-me ou ovale à cylindrique , parfois irrégulière , surface ridée Irrégulière , lobée ,' gib-beuse Irrégulière , gib-beuse , ridée Dimensions les sporan-' e;eg 6—16 (J. 4-16 |i 6-20 il 4-13 \i Forme des spores + sphériques, présentant parfois un renflement appendiculé + sphériques + sphériques ± sphériques Dimensions des scores 1 - 1.7 u 1-1.3 u environ 1.2-2 u environ 1 U Présence de flagelles Aigrettes de flagelles Spores mobiles Disposition des spores dans les sporanges Chaînes enchevêtrées Chaînes faiblement enchevêtrées, parfois parallèles et rectilignes Chaînes enchevêtrées, parfois p«-rn"n èlfin Chaînes enchevêtrées, parallèles par places Conidies, spores du substrat, etc. Spores sur substrat de CPC ; jusqu'à 3 n de diamètre, individuelles ou intercalaires, groupées à plusieurs en chaînes - 71 47019 19 2120073 TABIE AU II (suite) Actinoplanes spec. SB 18 Actinoplanes spec. SB 27 Actinoplanes spec. SB 46 Actinoplanes spec. SE 50 Kélanine G PC Ty - + Gel +, CPC -) Ty - -Gel -J CPG -\ Ty - - Gel -/ CPC + } + Ty +} Réduction ies nitrates + Liquéfaction le la gélatine + + Peptonisation lu lait + + + + ïydrolyse de L'amidon + + + + Croissance à : 20°C 26 °C 32 °G 37 °C 42 °C ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 71 47019 ao 2120073 IABBAÏÏ II (suite) Actinoplanes spec. SA 8 Actinoplanes spec. SE 82 Actinoplanes spec. SE 103 Date d'isolement 26.6.1966 26.2.1971 2.3.1971 Méthode Pollen Pollen Pollen Origine Harburg, compost du jardin bo-tannique Ceylan, terre de plantation de caoutchouc Corse, près de Ste Trinité, Terre prélevée sous des chênes-lièges Mycélium 0,3-1,3 H 0,3-1,3 |x Forme des suoranges Irrégulière Irrégulière Irrégulière Dimensions des* sporanges 7-15 x 9-18 5-14 M- environ 5-13 H Forme des spores Plus ou moins sphériques Plus ou moins sphériques Plus ou moins sphériques Diamètre des spores environ 1,5 H environ 1 - 1,4 n environ 1 n Présence de flagelles Mobile Rapidement mobile Disposition des spores dans les sporanges Chaînes enchevêtrées Chaînes enchevêtrées Mélanine Ty + \ Gel + i + CPC - j Rédxiction des nitrates + (très peu) Liquéfaction de la gélatine + Peptonisation du lait + 71 47019 21 2120073 TABLEAU II (suite) Streptosporan-gium roseum SS 55 Streptosporar gium amethystoge-nes SS 59 vStreptosporan-gium roseim SS 62 Date d'isolement 10.11.1968 i 0 • 1 1.1968 10.1.1.1968 Méthode Frottis de sol sur plaque Fi-ottis de sol sur plaaue Frottis de sol sur plaaue Origine Kenya, terre de plantation de café près de It.ii.ru Kenya, terre arable près de ITjoro Kenya, terre arable près de Njoro Mycélium 0.4-1.2 u 0,^-1.2 u Forme des srioran^es SDhc-riciue snhérique snnerj.que Dimensions des sporanges 3-10 n 3-15 p 3-10 H Forme des spores presque tou-.iours ovales presque toujours ovales Dimensions des spores environ 0,8 x 1^-1,2 u • environ 0,8-1,1 x 1-1.5 U Mélanine - ■ - - Réduction des nitrates -H- - ++ Liquéfaction de la gélatine + + Peptonisation du lait + + + Hydrolyse de l'amidon + + + Croissance à 37°C 42 °C + + + Tolérance du chlorure de sodium 2 f> 3 f 4 f> + + + 71 47019 22 2120073 TABLEAU II (suite) Ampullarielia digitata SA 28 Ampullari e 11e regularis SE 45 Ampullariella st»ec. SE 89 Date d'isolement 10.11.1967 23.12.1969 27.2.1971 î-'iéthode Mycélium. de chamoignon Pollen Pollen Origine Circonscription de Amcmau, Kar-burg, terre de chaumes Kenya, terre de plantation de café près de Ruiru Ceylan, terre Kycélium 0,3 - 1 H Forme des sporanges Très étroite et relativement longue , irrégulière dans la partie distale et parfois également dans la partie latérale, parfois digitée , claviforme ou digitifor-me Forme de bouteille ou de cylindre, souvent étroitement allongée + cylindrique parfois également transverse , souvent inégale à l'extrémité distale, gib-beuse , parfois également irrégulière et lobée , avec quelques éléments di-gités Dimensions des sporanges 2-7 x 4-13 \i 4-10 x 6—17p. 5-12 x 6-16 p Forme des spores bâtonnets bâtonnets bâtonnets mobiles Disposition des spores dans les sporanges Rangées parallèles Rangées parallèles Mélanine Ty - ) Gel - f + CPC +) Ty + Réduction des nitrates + Liquéfaction de la gélatine + Peptonisation du lait + + 71 47019 23 2120073 'JÂBIJ3AU II (suite) Planomono spora spec. SÊ 100 Planomono spora parontospora SE 101 Pilimelia .spec. SX 2 Date d'isolement 1.3.1971 27.2.1971 28.1.1968 Méthode Pollen Pollen Poils de souris Origine Oorse, au Noi'd d'Aleria, terre de pépinières Ceylan, pelouse karburg, terreau, Schuler-nark Mycélium 0.3-0,7 "U Forme des sporanges Etroitement allongés, très densément juxtaposés en rangées parallèles doubles sur le mycélium aérien, hyphes aériennes arquées sur le côté convexe, fixées directement par leur base Sphériques, piri-formes, ovales, munis d'une cc-lumelle qui pénètre dans le. sporange comme prolongement du sporangiophore jusqu'au tiers environ du diamètre des sporanges ou même davantage Dimensions des sporanges - environ 1-1,3x 3-4.5 U Environ 7-15 Forme des spores Bâtonnets, souvent légèrement recourbés Dimenaions des 3pores 0,35-0,45 x 0.8-1.5 u Présence de flagelles Aigrettes de flagelles, mobiles Disposition des spores dans les sporanges latérale (ou aussi subpolaire), spores disposées en chaînes qui partent en touffes de la colu-melle Mélanine Ty + Réduction des nitrates + Liquéfaction de ' la gélatine + Peptonisation du lait + Croissance à 32 °C 37 °C + 71 47019 24 TABLEAU III 2120073 SB 2 SB 5 SB 11 3-élose casamino-peptone-Czapek (CPC) 1 ) CR Très "bonne 2) MS Orangé 3) PS gélose jaunâtre 4) Spg.+++ ; aspect givré 5) C. plate, lisse CR Bonne M3 Orangé-jaune PS Gélose jaunâtre Spg. - ; initialement + C. fortement veinée CR bonne IIS Belle couleur orangée en dégradé PS Gélose jaunâtre Spg. - C. à protubéren-ces sinueuses 3-élose-peptone-Cîzapek (PC) CR très bonne MS Orangé, d'aspect givré PS. Spg. ++ C. Plate, parfois gibbeuse CR bonne à très bonne MS ■ Rouge-orangé PS. Gélose jaunâtre Spg. - CR bonne MS Orangé en dégradé PS Gélose jaune . doré Spg. - Gélose 3zapek (Cz) CR Moyenne MS orangé PS Gélose légèrement ocre Spg. ++ CR Moyenne MS Orangé pâle PS Gélose légèrement jaunâtre Spg.- CR Bonne MS Orangé brunâtre PS - Spg.— G-élose au lait (Ca) CR Bonne MS Orangé brunâtre PS Gélose brunâtre Spg. - J caséine peptonisée CR Très bonne MS Orangé brunâtre PS Gélose brun doré Spg. - ; caséine peptonisée CR Très bonne PIS Orangé brunâtre passant au brun terne PS Gélose brun- jaune Spg. - ; caséine peptonisée G-élose à la tyro-sine (Ty) CR moyenne à bonne MS brun' rou- geâtre PS Gélose brun rougeâtre, faible dissolution de cristaux Spg. + ; aspect givré CR faible MS brun PS Gélose brune, dissolution de cristaux Spg. - CR moyenne MS orangé pâle PS -, cristaux de tyrosine non dissous 71 47019 25 2120073 TABJSAÏÏ III (suite) SB 2 SB 3 SB 11 Gélose aux CR bonne CR bonne CR bonne. flocons Lo Orangé bru I-:S Orangé bru Î-IS Orangé-ocre d'avoine nâtre nâtre et à la PS - PS - PS - levure (HàH) Spg +++ Spg + Spg - G-élose à l'amidon CR moyenne à bonne MS incolore à ocre pâle PS -Spg - 1) CR = croissance 2) MS = mycélium du substrat 3) PS = pigment soluble 4) Spg = sporanges 5) C = forme de la colonie 71 1*7019 26 2120073 TABLEAU III (suite) SB 12 SB 18 SB 27 CE. très bonne CR très bonne CR bonne à très Gélose bonne casamino- KS Brun orangé HS Brun-rouge ES Orangé bril oeptone- intense lant, puis orangé- Uzapek • brun (CPC) PS Gélose PS Gélose brune PS Gélose brun- 3 aunâtre-bru- jaune nâtre Spg. + Spg.+(+) Spg. + C. Aplatie avec C. Aplatie, ner C. Aplatie, rele des stries vures radiales vée en bour radiales, rele et rides relet au cen vées en "bour tre, d'aspect relet au centre gercé par V places Gélose CR très bonne CR très bonne CR bonne à très peptone- MS rouge-brun bonne Dzapek MS Brun MS Orangé-ocre (PC) PS gélose PS Brun PS Gélose jaunâtre brun doré Spg. - Spg. ++ Spg. - Gélose CR bonne CR bonne CR bonne Gzapek MS Orangé à MS brun-rouge MS rouge-brun (Cz) orangé bru nâtre PS Gélose ver- PS Gélose brun PS Gélose légère dâtre à jau rougeâtre ment ocre ne fluores cent Spg. - Spg. ++ ; aspect Spg. - givré CR très bonne CR très bonne CR très bonne Gélose MS Orangé-brun MS Orangé-brun MS Orangé brunâtre au lait PS Gélose brun PS Gélose brun PS Gélose brun (Ca) doré doré doré Spg. -JCaséine Spg.++ (non cons Spg. + (non cons peptonisée tant) ; caséine tant) ; caséine peptonisée peptonisée Gélose à CR moyenne CR moyenne-bonne CR moyenne-bonne la tyro- MS brun MS brun-orangé MS brun-ocre sine (Ty) rougeâtre PS gélose brune; PS gélose brun- PS - dissolution • dissolution de orangé ; disso de cristaux ++ cristaux ++ lution de cris taux ++ Spg. - Spg. - Spg - 71 47019 27 2120073 TABLEAU III (suite) SB 12 SB 18 SB 27 Gélose aux flocons cl1 avoine et à la levure (HaH) CR bonne MS Orangé pâle PS -Spg. + CR bonne KS Brun-rouge PS brun-rouge Spg. ++ CR bonne MS brun-orangé PS -Spg.- G-élose à l'amidon CR moyenne à bonne MS Orangé brunâtre pâle • CR moyenne à bonne MS Orangé brunâtre pâle CR moyenne à bonne Orangé brunâtre pâle PS - . Spg. + PS -Spg.-H- PS -Spg ++- 71 47019 28 2120073 TABLEAU III (suite) SB 46 0Î3 -M SB 19 ; 50 Gélose Casa-mino-peptone-Czapek (CPC) CR bonne MS Orangé} puis orangé brunâtre PS Gélose légèrement jaunâtre Spg. t colonxes. ifeïll'rl- dialea CR bonne MS Brun-orangé PS Gélose j aunâtre Spg. + CR b o line MS Brun-rouge ' PS Gélose brun doré-brun-rouge Spg.-H- ; aspect givré CR très bonne MS Brun PS Gélose brun à brun j aunâtre Spg. - Gélose peptone- . Czapek (PC) CR bonne MS orangé PS gélose jaune doré Spg. - CR très bonne MS brun foncé PS Brun Spg. + . CR très bonne MS brun foncé rougeâtre PS brun foncé Spg. ++, aspect givré sur le mycélium du substrat CR très bonne MS brun PS brun foncé Gélose Czapek (Ca) CR bonne MS brun' orangé PS gélose de couleur ocre CR bonne MS orangé PS orangé à légèrement jaunâtre CR bonne MS rouge- brun PS rouge CR très bonne MS Brun- rouge PS brun doré Spg. - Spg ++, aspect givré sur le mycélium du substrat Spg. + Gélose au lait (Ca) CR très bonne MS orangé PS gélose de couleur dorée Spg. - ; caséine peptonisée CR bonne MS orangé- brun PS brun Spg. -, caséine peptonisée • CR bonne MS orangé- brun PS brun foncé Spg. -, caséine non peptonisée CR bonne MS brun- orangé PS brun foncé, caséine peptonisée 71 47019 29 2120073 TABLEAU III (suite) SB 46 SE 21 SB 39 SE 50 ïélose à CR Bonne CR moyenne CR moyenne - CR moyenne La tyro I-IS Brun K3 brun fon I-IS brun I-IS foncé, sine (Ty) cé foncé comme la PS gélose gélose PS brun fon PS brun PS brun- brun doré; cé foncé noir, cris dissolu Cristaux de taux de tion des tyrosine tyrosine cristaux non dissous non dis ++ sous Spg. - aPg» -» cris taux de ty- rosine non dissous Gélose CR bonne mx flo MS brun cons d'à- - orangé voine et PS, - _ à la le Spg. - Spg. ++ Spg. + vure (HaH) Gélose CR bonne "Bmerson"(E) MS brun (gélose PS brun à la le Spg. ++ Spg. - vure et à 1'amidon) Gélose à CR moyenne CR moyenne CR moyenne l'amidon à bonne à bonne à bonne MS Orangé Orangé Orangé bru brunâtre brunâtre nâtre terne terne terne, hydrolyse de l'amidon+ PS - PS - Spg. + Spg. + + Spg. + 71 4701$ 30 2120073 TA3IEAU III (suite) SB 5 SE 55 SE 103 aélose casa-.nino-peptone-Gzapek (CPC) CR bonne I-IS orangé Ms* - PS orangé à légèrement jaunâtre, Surface de la colonie muci-lagineuse, brillante, en petits tubes inclinés CR bonne I-IS brun-rouge foncé " Ks -PS brun-jaune CR très bonne MS orangé PS Jaunâtre- brunâtre Spg. - ïélose flocons d1avoine-levure (HaH) CR bonne MS orangé CR bonne MS brun-orangé Ms - PS brun clair' CR très bonne MS brun PS - Spg. ++,aspect givré 3-élose "Smerson" (E) CR bonne MS Orangé Ms -PS - Surface de la colonie muci-lagineuse CR très bonne MS orangé PS - Spg. ++, aspect givré Gélose au lait (Oa) CR bonne MS orangé PS orangé à jaunâtre, caséine non peptonisée, peptonisation insignifiante juste au-dessous du mycélium CR bonne KS brun-orangé PS brun, caséine non peptonisée, peptonisation insignifiante au bout d1environ - deux mois Gélose O'sapek (Ca) CR bonne MS orangé, surface mucilagi- neuse humide PS - CR bonne MS orangé PS - CR très bonne KS orangé-jaune PS -Spg. - -M, 71 47019 31 2120073 TABLEAU III (suite) SiS 5 313 55 SE 103 G-élose à la tyrosine (Ty) CH faible à moyenne I-io incoloi"e à orangé pâle PS - Cristaux de tyrosine non dissous Cil moyenne 113 brun foncé PS brun-noir Cristaux de tyrosine non dissous Gélose peptone -Czapek (PC) CR très bonne ES brun rougeâ-tre foncé PS brun foncé Gélose à l'amidon CR moyenne à bonne I-IS brun orangé terne PS -Spg + • * Ks = mycélium de la solution 71 47019 * 2120073 -î!ABIEJUJ III (suite) SS 45 SS 51 SS 53 G-élose ca- samino- peptone- Czapek (CPC) CR moyenne (à bonne) I-IS Brun rou-geâtre Ms -PS - Colonies plates de 6 mm de diamètre au "bout de 9 semaines CR moyenne (à bonne) HS Brun rou-geâtre Ms -PS - Coloniés plates de 6 mm de diamètre au bout de 9 semaines CR bonne MS Brun clair terne Hs blanc PS brunâtre Colonies plates, sans mycélium de solution dans la partie centrale G-élose aux flocons d'avoine et à la levure (HaH) CR bonne * MS rouge-brun. Ms +, blanc et rose PS légèrement jaunâtre à j aunâtre-ver-dâtre Spg + . CR bonne MS rouge-brun Ms +blanc et rose PS légèrement jaunâtre tirant sur le verdâtre Spg + CR bonne à très bonne MS brun-pourpre à brun-rouge Ms ++, blanc sal plus rose PS brun-rouge pourpre Spg ++ Gélose "Emerson" (E) CR bonne MS rouge Ms - PS légèrement jaunâtre tirant sur le verdâtre CR bonne MS rouge-brun Ms +, faible, blanc PS blanc à légèrement brunâtre-jaunâtre CR bonne IIS brun-rouge Ms ++, rose PS brun-rouge Spg ~i—f~ G-élose au lait (Ca) CR bonne MS rouge brunâtre terne PS gélose jaune cas é irierpept oni- Sée- Ms - CR bonne MS rouge brunâtre terne Ms - PS gélose jaune doré Caséine peptonisée CR bonne ES brun clair terne Ms - PS gélose brun-jaune Caséine peptonisée 71 47019 33 2120073 TABLEAU III (suite) SS 45 SS 51 SS 53 G-élose à la levure, au glucose et à l'extrait de sol (EGE) CR bonne KS rouge brunâtre I-Is +, couche plus mince PS jaune doré tirant sur le' verdâtre CR bonne MS rouge-brun Ks +, blanc PS jaune tirant sur le verdâtre CR bonne I-IS rouge vineux brunâtre Hs ++, rose PS brun-jaune rougeâtre G-élose à 11extrait de fumier (Wi) CR moyenne (à bonne) Ms ++, blanc et rose Spg + CR moyenne (à bonne) Ks, ++, rose Spg + 71 47019 3* 2120073 KABJBâP III (suite) SA 8 SE 82 SS 26 Gélose casa-raino-peptone-Ozapek (CPC) CR très bonne MS orangé PS jaunâtre- brunâtre Spg + CR bonne MS brun PS brun CR bonne MS incolox-e à ocre pâle PS -Spg - Colonie plate avec quelques stries radiales et des bourrelets concentriques Gélose pep-tone- Czapek (PC) CR très bonne MS orangé PS jaunâtre- brunâtre Spg + Gélose aux flocons d'a-vojjae et à la levure (HaH) CR bonne MS Brun PS - Spg + CR très bonne MS Orangé à orangé brunâtre PS' légèrement j aunâtre-bru-nâtre CR bonne à moyenne MS incolore Ms faible, blanc PS - Spg + Gélose "Smerson" (E) CR très bonne MS brun-orangé PS Brun CR moyenne •MS incolore Ms + blanc PS - Gélose au lait (Ca) CR très bonne MS brun-orangé PS gélose brun doré Spg. +, caséine peptonisée CR bonne MS incolore Ms -PS - Caséine peptonisée Gélose Czapek (Cz) CR bonne MS orangé-brun PS brun-jaune SDg - CR bonne MS oi'angé-rouge PS jaunâtre Gélose à la tyrosine (Ty) CR moyenne MS noire PS noire Cristaux de tyrosine dissous Spg - Gélose à la levure, au glucose et à l'extrait de sol (HGE) CR bonne MS brun PS brun-jaune Spg + CR bonne MS incolore Ms +, blanc PS - 71 47019 35 2120073 TABLEAU III (suite) SA 8 SE 82 SS 26 Gélose à 1'extrait de fumier (I'îi) CR moyenne IIS brun, terne Ms + blanc Spg. + 71 47019 56 2120073 TA3I3AU III (suite) SS 55 SS 59 SS 62 Gélose oasamino- peptone- Cza"oek (CPC) CR bonne, colonie plate I'ÏS brun clair Ms blanc PS légèrement brun clair CR bonne, colonie plate ES brun clair terne Ms blanc PS - Gélose au lait (Ca) CR bonne ES brun clair terne Ms -PS - caséine peptonisée CR bonne MS brun foncé Ms - PS brun—jaune .cristaux violets, caséine ■peritonisée CR bonne MS brun clair terne Ms - PS gélose brun-jaune, caséine peptonisée Gélose à la tyrosine (Ty) CR bonne MS brun Ms blanc PS- Cristaux de tyrosine dissous CR bonne MS brun foncé Ms -PS brun Cristaux de tyrosine dissous CR bonne MS brun Ms faible, blanc PS brun Cristaux de tyrosine dissous Gélose aux flocons d'avoine et à la levure (HaH) CR bonne à très bonne MS brun-rouge Ms rose sale PS brun-rouge CR bonne MS brun foncé Ms faible, blanc Spg.— PS brunâtre, nombreux cristaux violets CR bonne à très bonne MS brun-rouge Ms rose sale .PS brun-rouge Gélose "Emerson" (E) CR bonne MS brun-rouge Ms rose et blanc PS brun-rouge CR bonne MS.brun foncé Ms- PS brun-jaune, cristaux violets CR bonne MS bran-rouge Ms faible, couche plus mince, parfois plus épaisse et de couleur rose PS brun-rouge Gélose à la levure, au glucose et a l'extrait de sol (HGE) CR bonne MS brun-rouge Ms rose PS brun-jaune CR bonne MS brun foncé Ms - PS brun-jaune, cristaux violets CR bonne MS rouge foncé Ms rose PS brun-jaune 71 47019 37 . 2120073 TA3IBAÏÏ III (suite) " ' SA 28 SE 45 SE 89 Gélose casamino- peptone- Czapek (CPG) CR bonne à très bonne MS brun-rouge au début, puis brun foncé à noir PS olive foncé Spg - CR bonne I-IS brun-rouge PS brun-rouge vif Spg 4- CR bonne MS orangé brunâtre PS -Spg + Gélose peptone-Czapek (PC) CR bonne à très bonne I-IS- brun-rouge au début puis brun foncé à noir PS olive foncé Spg - - Gélose Czapek (Cz) CR moyenne à bonne, colo- . nies plates MS brun orangé PS légèrement ocre Spg +, parfois d'aspect givré CR bonne MS rouge-brun PS rouge brunâtre Spg -H-, aspect givré CR bonne MS brun foncé PS brun légèrement jaunâtre Spg ++, aspect givré Gélose au lait (Ca) CR très bonne MS brun-noir PS olive foncé à noir verdâtre Spg -, caséine peptonisée CR bonne MS "briHirrorangé PS brun " *" Spg +, caséine peptonisée Gélose à la tyrosine (Ty) CR moyenne à bonne MS brun PS -Spg - Cristaux de tyrosine dissous sous le mycélium CR moyenne MS brun PS brun foncé Spg - Cristaux de tyrosine non dissous Gélose aux flocons d'avoine et à la levure (HaH) CR bonne MS brun foncé PS légèrement brunâtre Spg + CR bonne Spg ++, d'aspect givré sur le mycélium du substrat CR bonne à. très bonne ES orangé PS - Spg -H-, aspect givré 71 47019 ?8 2120073 TiBBiAD III (suite) SE 28 SE 45 SS 89 Gélose "Emerson" __ CR bonne à très bonne MS brun à brun-noir PS ocre tirant sur le verdâtre Spg + . • CR très bonne MS orangé PS - Spg ++, aspect givré 71 47019 39 2120073 nsnm ni (suite) SE 100 SE 101 SIC 2 Gélose Casamino- peptone- Czapek (CPC) _CR bonne I-IS Ocre pâle Ms -H-, blanc PS - CR bonne MS rouge Ms faible, blanc PS - Gélose Czapek (Cz) CH. bonne MS incolore Ms -H-, blanc PS- CR moyenne MS incolore à rose Ms +,blanc Gélose "Emerson" (E) CR- bonne ES incolore à ocre pâle Ms ++,blanc PS - •CR bonne MS rouge pâle à rouge, diminuant ensuite Ms-PS - Gélose aux floconsd'avoine et à la levure (HaH) CR bonne MS ocre pâle Ms -H,blanc PS - ■ CR bonne MS rose Ms -H-, rose sale PS jaunâtre- . brunâtre Spg ++ CR moyenne MS brun PS- Gélose au lait (Ca et Ca/2) CR relativement bonne MS jaune doré, surface mamelonnée PS -Spg - Caséine pepto- ' nisée Gélose à la tyrosine (Ty) . CR bonne MS jaune doré brunâtre à orangé-jaune PS brun-jaune à brun rougeâtre Spg - Cristaux de tyrosine dissous 71 47019 2120073 "TABES AU IV Croissance sur diverses sources de carbone s32 m 3b11 sb12 sb18 sb27 sb46 sb21 se39 se50 se55 Glucose ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -H- . Fructose ++ ++ ++ ■++ ++ ++ ++ _> t, -t j, | f TT II TT Saccharose ++ ++ ■++ ++ ++ ++ ++ ++ -H- ++ Manni-toi 4*+ ++ ++ ++ ++ ++ ++ — -H- ++ L-ara-êinose ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ' ++ ++ feaffi-faose — ~ ++ — — — — — + + flnosi-^tol — — ++ — ++ ++ ++ — — — D-xy-lose ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++++++ ++ Croissance aussi bonne ou meilleure que sur le glucose + Croissance plus mauvaise que sur le glucose, meilleure que sur la gélose au^êels minéraux, exempte de sucre - Croissance comme sur la gélose aux sels minéraux, sans source de carbone 71 47019 2120073 Les souches indiquées sur le tableau I proviennent de collections connues de souches, par exemple de l1American Type Culture Collection ou du Centraalbureau voor Schimmel— culturea,ou bien elles ont été déposées sous les numéros CBS 5 indiqués sur le tableau I au Centraalbureau voor Schimmel-cultures à Baarn, Pays-Bas. Les tableaux II.et III indiquent quelques caractéristiques des souches décrites. Pour obtenir les inhibiteurs de glucosidases, on 10 cultive les souches indiquées ci-dessus dans les solutions nutritives décrites dans ce qui précède. On doit alors considérer le fait que pratiquement chaque souche nécessite pour la production optimale une solution nutritive de compositions différentes du point de vue qualitatif et quantitatif, 15 Après incubation pendant un à dix jours à 15-60°C, de préférence à 24-50°C, dans des ballons agités par secousses ou dans des appareils de fermentation de diverses dimensions, le mycélium est séparé de la solution de culture et après l'apparition de l'inhibiteur, le principe actif est 20 concentré à partir de la solution de culture ou du mycélium. On obtient les inhibiteurs à partir des bouillons de culture par lyophilisation ou pré ©ipitat ion avec des sels ou des solvants organiques hydrosolubles (par exemple des . alcools inférieurs et des cétones) ou par adsorption des subs-25 tances actives sur des échangeurs d'ions. On obtient les inhibiteur^ partir des mycéliums par extraction avec des solvants organiques, par exemple des alcools, des cétones, des éthers, des esters et des sulfoxydes, A cette fin, le milieu de fermentation est centrifugé 30 à 3000-20 000 tr/mn, de préférence à 6-10 000 tr/mn pendant 10 à 60 minutes, de préférence pendant 30 minutes, ou bien filtré, de préférence sous pression, et avec l'aide d'auxiliaires de filtration, par exemple de cellulose pour clarification, ' et il est ainsi divisé en bouillon de culture et résidu 35 de mycélium. Pour isoler l'inhibiteur du bouillon de culture, on peut procéder de diverses façons : 71 47019 42 2120073 (a) Concentration des bouillons de culture sous pression réduite (10 à 50 mm de mercure)à des températures du bain de 20 à 100°C, de préférence 40 à 80 °C, entre environ 1/5 et 1/50 du volurse-initial. L'extrait concentré est filtré ou centrifugé 5 et le filtrat clair (liqueur surnageante claire) est éventuellement lyophilisé après relargage préalable. (■b) Précipitation des inhibiteurs dans le bouillon de culture (ou dans les bouillons de culture concentrés comme en (a)) par addition de solvants organiques solubles dans l'eau, 10 par exemple des alcools oi^Ûes cétones, de préférence le métha-nol, l'éthaaol, l'acétone, jusqu'à une teneur de 60 à 90 /£. Etant donné ;que des impuretés inactives sont précipitées à une faible concentration en solvant, ce procédé de précipitation convient particulièrement bien pour la précipitation fractionnée 15 en vue de-la séparation des.impuretés indésirables. (c) Séparation des inhibiteurs par relargage des extraits (ou des extraits concentrés comme indiqué en (a)), par exemple avec le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, etc. Le précipité formé est recueilli par centrifugation ou 20 -filtration et lavé directement avec de l'acétone et de l'éther, puis séché sous vide, ou dialysé dans l'eau après redissolution, et lyophilisé. (d) Adsorption des inhibiteurs sur des échangeurs d'ions. 25 Ce procédé convient pour isoler des inhibiteurs qui portent des charges en raison de leur nature chimique. La désorption de l'inhibiteur est effectuée par variation de la force ionique ou du pH du milieu d'élution. A côté de l'inhibiteur, les bouillons de culture 30 contiennent souvent des impuretés indésirables. La séparation de ces impuretés peut être effectuée de diverses façons, par exemple par dénaturation à la chaleur des impuretés dans le cas d'inhibiteurs qui sont stables à la chaleur, ou par dialyse à travers des membranes correspondantes dans le cas 35 d'inhibiteurs de bas poids moléculaire, le3 impuretés indésirables étant retenues par la membrane, ou bien par distillation fractionnée (voir b) ou par adsorption des impuretés sur 71 47019 2120073 des échangeurs ioniques. Pour séparer les inhibiteurs des mycéliums, on procède par-extractions multiples du mycélium avec des solvants organiques, de préférence en effectuant deux extractions de 5 10 à 20 minutes avec trois à cinq volumes d'acétone (par rapport au volume humide du mycélium) puis une extraction de 5 à 10 minutes avec de~l'éther. Le mycéliunjéxtrait de cette façon est séché sous vide puis extrait sous agitation avec 3-10 parties en poids de diméthylsulfoxyde pendant deux à huit heures, et 10 finalement centrifugé à 10 000-20 000 tours/mn. Les produits d'extraction à l'alcool et à l'éther sont concentrés à sec sous vide et repris avec la phase d'extraction au diméthylsulf oxyde. Au lieu d'extraire la poudre sèche de mycélium avec 15 du diméthylsulfoxyde, on peut aussi l'extraire pendant une période prolongée, de préférence pendant 12 à 24 heures, . avec de l'eau ou des solutions diluées d'électrolyte. Les nouvelles substances se dissolvent bien dans l'eau. Un groupe d'inhibiteurs est stable à la chaleur à des valeurs .20 neutres de pH, stable aux acides à un pH égal à 2, stable aux bases alcalines à un pH égal à 12, et se dialyôe lentement. Ces inhibiteurs ne sont pas inactivé & .par la trypsine et la pepsine, et de leur part, il n'y a pas d'inhibition des enzymes mentionnés. Ils ne fixent pas les colorant typiques 25 des protéines et ils ne présentent pas d'absorption caractéristique dans la région ultraviolette, jusqu'à 250 nm. Ces inhibiteurs ne sont pas inactivés par l'urée et le P-mercapto-éthanol. D'après des estimations effectuées par filtration sur gel, le poids moléculaire de ces inhibiteurs est supérieur à 30 500, mais inférieur à 6000 . Lors de laècission hydrolytique, on obtient des monosaccharides, par exemple le glucose. Ces découvertes montrent que ces inhibiteurs sont des oligosaccha-rides ou des polysaccîj|xrides ou leurs dérivés. Les meilleurs inhibiteurs de ce groupe ont des ac-35 tivités inhibitrices, vis-à-vis de l'amylase, de 8000 UIA/mgc Un"autre groupe d'inhibiteurs est stable à la chaleur et n'est pas dialysable otr ne l'est que peu» Ces inhibiteurs sont plus ou moins rapidement inactivés par la trypsine. •cqpyJ i 71 47019 2120073 De même, l'urée et le (3-mercapto-éthanol Inactivent la plupart de ces inhibiteurs. Ces derniers sont vraisemblablement/âSostances de caractère pepfcidique. Les meilleurs inhibiteurs de ce groupe ont des activités 5 inhibitrices vis-à-vis de l'amylase de 80 TJIA/mg. Il est connu que chez les animaux et les êtres humains, après absorption de substances nutritives et d'aliments contenant des glucides (par exemple l'amidon de céréales, la fécule de pomme de terre, les fruits, les jus de fruits, le chocolat), 10 des hyperglycémies se manifestent et sont dues à une décomposition rapide des glucides par des glucosidases (par exemple les amylases salivaire et pancréatique, des maltases, des saccharases) d'après le Schéma suivant : . . Glucose et Amidon et Amylase Maltase 15 glycogène ^ Maltose 7 Saccharase saccharose ^ Glucose + fructose Ces hyperglycémies sont particulièrement intenses et soutenues chez les diabétiques. Chez les sujets adipeux, 20 l'hyperglycémie alimentaire entraîne souvent une sécrétion particulièrement forte d'insuline, qui conduit, quant à elle, .une a une plus grande accumulation ey moindre décomposition des matières grasses. Ces hyperglycémies sont souvent suivies d'une hypoglycémie chez des personnes adipeuses à nutrition normale 25 par suite de la sécrétion d'insuline. Il est connu que des hypoglycémies, aussi bien que le séjour du chyme dans l'estomac, la activent/production de suc gastrique, qui déclenche ou favorise quant à lui l'apparition d'une gastrite, d'un ulcère gastrique ou d'un ulcère du duodénum. 30 La Demanderesse vienij&e découvrir que des inhibiteurs de glucosidases conformes à l'invention, obtenus et isolés au moyen des procédés indiqués ci-dessus, réduisent considérablement 1'hyperglycémie, 1'hyperinsulinémie et l'hypoglycémie alimentaires, après absorption d'amidon de blé ou de 35 saccharose ou de maltose par des rats et/ou des êtres humains, 71 47019 « 2120073 et accélèrent le passage dans l'estomac des glucides mentionnés. Il est en outre connu que des glucides, en particulier le saccharose, sont scindés dans la cavité buccale par des microorganismes et que le développement d'une carie dentaire est ainsi 5 favorisé. Les inhibiteurs de glucosidases conviennent donc comme thérapeutique pour les indications suivantes : adiposité, hyperlipémie (athérosclérose), diabète, état prédiabétique, gastrite, ulcères gastriques, ulcères du duodénum 10 et caries. Posologie : 100 - 100 000 UIA/kg ou 2,5-250 ÏÏIK ou 100-10 000 UIS, une ou plusieurs fois par jour avant et/ou pendant et/ou après les repas, par voie orale. 15 Formes de préparation : Comprimés, dragées, capsules, solutions, suspensions, granulés, gomme à mâcher, pâtes dentifrice et addition à des aliments et/ou des substances nutritives renfermant des glucides. La toxicité de quelques-uns de ces inhibiteurs des 20 glucosidases est extrêmement faible. La substance active des exemples 14 et 37 été supportée sans symptômes à une posologie de 5 x 10^ TJIA/kg de souris ou de-rat, par voie orale. Par injection intraveineuse, les souris et les rats tolèrent 10^ Ulâ/kg. Il est également avantageux d'utiliser des combinaisons 25 des inhibiteurs conformes à l'invention avec les agents antidiabétiques connus administrés par voie orale (dérivés p-cy-totrope de sulfonylurée et/ou biguanidines influençant la glycémie ). Exemple 1 30 On ensemence avec un millilitre d'une pré-culture (obtenue dans la même solution nutritive à laquelle sont inoculées de cultures sur gélose aux flocons, d'avoine dans des tubes inclinés) de la souche SB 2, chacun de trois flacons d'Erlen-' meyer d'un litre de capacité, contenant 200 ml d'une solution 35 nutritive renfermant 2 °/o d'amidon, 1 /î de glucose, 0,5 i- d'amines ÏÏZ, 1,0 fi d'extrait de levure, 0,4 de CaCO^ (stérilisation : 30 minutes, 121°C ; pH ajusté à 7»2 avant la stérilisation) et 71 47019 46 2120073 on fait incuber ces fioles à 28°C sur une secoueuse mécanique circulaire. Après une durée de culture de 5,5 jours, on rassemble les contenus des trois fioles et on sépare le mycélium par centri fugation. On obtient 425 ml d'une liqueur surnageante contenant 5 100 UIA/ml. la liqueur surnageante centrifugée est concentrée à 60 ml sur un évaporateur rotatif sous un vide de 15-20 mm de mercure et à une température du bain d'environ 37°C. la solution visqueuse est incorporée sous agitation dans 8 volumes (480 ml) 10 d'éthanol. le précipité formé est recueilli par centrifugation, redissous dans 60 ml d'eau et dialysé pendant 6 heures vis-à-vis d'eau distillée, le dialysat est lyophilisé. Rendement : 1,6 g titrant 19 x 10^ UIA/g. Exemple 2 15 Dans un milieu analogue à celui de l'exemple 1, on obtient 440 ml de liqueur surnageante/centrifugée titrant 100 UIA/ml. Ces 440 ml de liqueur surnageante centrifugée sont concentrés à 100 ml sur un évaporateur rotatif, la solution 20 . concentrée est incorporée sous agitation dans huit volumes (800 ml) d'éthanol, le précipité est recueilli par centrifugation et après deux lavages à l'acétone et un lavage à l'éther, il est séché sous vide à la température ambiante. Rendement : 2,2 g, titrant 15 x 10^ UIA/g. 25 Exemple 3 Dans un milieu analogue à celui de 1'exemple 1, on obtient après culture pendant 5 jours 500 ml d'une liqueur surnageante centrifugée titrant 120 UIA/ml. Ces 500 ml sont lyophilisés directement. 30 Rendement : 7,1 g titrant 8,3 x 10^ Ulâ/g. Exemple 4 On ensemence avec 1 ml d'une pré-culture (obtenue dans la même solution nutritive inoculée à partir de cultures sur gélose Czapek-peptone-caséine en petits tubes inclinés) 35 de la souche SB 12, chacune de trois fioles d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, contenant 200 ml d'une solution nutritive renfermant 3 r> de glycérine, 3 de farine de soja, 0,2 55 de 71 47019 47 2120073 CaCO^ (stérilisation : 30 minutes, 121°C ; pH égal à 7,2 après la stérilisation) et on fait incuber les fioles pendant 3 jours à 28°C sur une secoueuse mécanique circulaire. Après l'incubation, on i-assemble les contenus des fioles et on sépare le mycélium 5 par centrifugation. On obtient 500 ml de liqueur surnageante titrant 450 UIA/ml. On ajoute par portions sous agitation 250 g de sulfate d'ammonium à la liqueur surnageante, puis on centrifuge le mélange pendant 10 minutes à 12 000 tr/mn. On dissout le précipité dans 10 100 ml d'eau distillée, et on ajoute à la solution, sous agitation, 4 volumes (400 ml) d'acétone. On obtient un précipité qui se dépose correctement. On le sépare en décantant le liquide, et on le lave deux fois avec de l'acétone et une fois avec de l'éther, puis on le sèche sous vide. 15 Rendement î 13,4 g titrant 10 x 10^ UIA/g. Exemple 5 On dissout dans 100 ml d'eau un précipité obtenu comme dans l'exemple 4 après précipitation au sulfate d'ammonium, et on le dialyse pendant 6 heures vis-à-vis d'eau distillée. 20 On obtient un dialysat qu'on congèle et qu'on lyophilise. Rendement : 1,5 g titrant 80 UIA/mg. Exemple 6 En ensemençant une fiole d'Erlenmeyer d'un litre de capacité avec 120 ml d'une solution nutritive suivant l'exemple 1, 25 obtenuQ^ar culture en petits tubes inclinés de la souche St 19, on obtient, après une culture d'une durée de 3 jours à 28°C sur une secoueuse mécanique rotative, une solution de culture qui titre 25 UIA/ml. Exemple 7 30 Si l'on fait incuber un milieu conforme à l'exemple 4 pendant 3 jours à 32°C, on obtient après filtration du mycélium un filtrat de culture qui titre 350 UIA/ml. Exemple 8 Si l'on ensemence en suivant le mode opératoire de 35 l'exemple 4 une solution nutritive suivant l'exemple 1, on obtient après incubation pendant 3 jours à 28°C des filtrats de culture qui titrent 270 UIA/ml. 71 47019 2120073 exemple 9 On ensemence avec un millilitre de pré-culture (obtenue comme dans l'exemple 1) de la souche SB 5 chacune de six fioles d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, contenant chacune 100 ml d'une solution nutritive renfermant 3 ^ de glucose, 3 7 de farine 5 de soja, 0,2 p de CaC0„ (stérilisation : 30 minutes, 12.1 °C ; pH ajusté à 7,2 après la stérilisation) et on les fait incuber pendant 4 jour^à 28°C sur des secoueuses mécaniques circulaires. On rassemble les contenus des fioles et on sépare le mycélium par centrifugation. les 500 ml de liqueur surnageante que l'on 10 obtient, titrant 150 UIA/mlTsont congelés et lyophilisés. *Z Rendement : 6,9 g titrant 11 x 10 UIA/g. Exemple 10 "- On ensemence 24 fioles contenant chacune 120 ml d'un milieu suivant l'exemple 4, avec une pré-culture de la souche 15 SB 11 (obtenue conformément à l'exemple 4) et on les fait incuber pendant 5 jours à 28°G ; on obtient ainsi après centrifugation 2,0 litres d'une liqueur surnageante titrant 1,1 UIM/ml. Ces deux litres sont concentrés à 200 ml sur un évaporateur rotatif. les 200 ml de concentré sont dialysés pendant 24 heures 20 dans un tube de dialyse de Yisking (du type 27/100 FT, Union Carbide Corporation), vis-à-vis de 2 litres d'eau distillée, à la température ambiante. Le milieu externe contenant l'inhibiteur est concentré à 100 ml dans l'évaporateur rotatif,et le concentré est ajouté goutte à goutte sous agitation à 900 ml d'éthanol 25 absolu. Le précipité pratiquement inactif que l'on obtient est séparé par centrifugation et jeté, et la liqueur surnageante alcoolique est concentrée à 30 ml à l'évaporateur rotatif. Un millilitre de ce concentré contient 70 UIK/ml. Pour purifier davantage cette solution, on la fait 30 passer sur une colonne d'échangeur anioniaue ("Amberlite" IRA 410, forme acétate, dans de l'acétate d'ammonium 0,05 M, pH 7, colonne de 2,5 x 20 cm), on rassemble les fractions actives et on les filtre sur gel de "Sephadex " G- 75 dans l'eau. Les fractions actives de la filtration sur gel sont con-35 centrées à 12 ml. Un millilitre de cette solution contient 150 UIM/ml. 71 47019 49 2120073 Le mycélium (environ 500 ml) est extrait deux fois avec un litre d'acétone et une fois avec un litre d'étïier, les extraits sont rassemblés, puis ils sont concentrés à sec sous vide à l'évaporateur rotatif. Le résidu msrcélien est séché 5 sous vide à 20°C et la poudre sèche du mycélium que l'on obtient (environ 51 g) est ensuite extrait^pendant deux heures avec 150 ml de diméthylsulfoxyde à la température ambiante. Après centrifugation (30 minutes, 15 000 tr/mn),oh reprend la phase d'extraction à l'acétone et à l'éther, concentrée à 10 sec, avec la liqueur surnageante d'extraction au diméthylsufoxyde de la poudre sèche de mycélium. Rendement : 120ml titrant 3 UIM/ml. Exemple 11 . .. On ensemence une fiole d'Erlenmeyer d'un litre deca-15 pacité avec 120 ml d'une substance nutritive, suivant 1 'exemple"!"^ en procédant comme indiqué dans l'exemple 9, et on la fait incuber pendant 6 jours à 28°C sur une secoueuse mécanique circulaire ; on obtient ainsi -un filtrat de culture qiti titre 0,9 UIM/ml. 20 Exemple 12 On ensemence avec 2 ml d'une pré-culture (obtenue conformément à l'exemple 1) de la souche SB 27 chacune de cinq fioles d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, contenant 120 ml d'une solution nutritive renfermant 2,5 f° d'amidon, 0,5 ï° de 25 glucose, 0,5 d'amines ÏÏZ, 1,0 f» d'extrait de levure et 0,4 ?° de CaCO^ (stérilisation : 30 minutes, 121°G ; pH ajusté à 7,2 avant la stérilisation) et on les fait incuber pendant 4 jours à 28°C sur une secoueuse mécanique circulaire ; on obtient ainsi,après avoir rassemblé les contenus des ballons 30 et séparé le mycélium par centrifugation, 500 ml de liqueur surnageante titrant 70 Ulil/ml. La liqueur surnageante centrifugée est congelée et lyophilisée. Rendement : 7,7 g titrant 3,5 x 103 UIA/g. Exemple 13 35 Si l'on ensemence un milieu conforme à l'exemple 1 avec 2 ml d'une pré-culture de la souche SB 18 (obtenue comme indiqué dans l'exemple 1), on obtient après incubation pendant 71 47019 50 2120073 trois joitrs à 28°C,un bouillon de culture qui contient 1100 UIA/ml, 0,17 UIM/ml et 1,0 TJIS/ml. Exemple 14 Si l'on ensemence cinq appareils de fermentation 5 expérimentale contenant chacun huit litres de solution de culture suivant l'exemple 1avec 120 ml d'une pré-culture (obtenue conformément à l'exemple l),.on obtient, après incubation sous agitation et sous aération pendant 65 heures/^3S litres de bouillon de culture après rassemblement des bouillons de 10 fermentation et séparation du mycélium. Ces 30 litres de bouillon de culture centrifugé (0,57 UIM/ml, 6,2 UlS/ml et 8000 UIA/ml) sont concentrés sous un vide de 20 mm de mercure et à une température du bain de 100°C, à un volume de 5 litres, le concentré est additionné de 4 volumes (20 litres) d'acétone sous agitation, 15 et le précipité noir onctueux que l'on obtient est rassemblé par centrifugation à 6000 tr/mn pendant 30 minutes ; le précipité est dissous dans 2,5 litres d'eau et la solution de.couleur noire est agitée avec 500 g de résine "Amberlite" IRA 410 humide (forme acétate, pH 7) pendant 60 minutes. Par centrifu-20 gation pendant 10 minutes à 6000 tr/mn, on sépare la solution en une liqueur surnageante et un sédiment d'Amberlite". La liqueur surnageante est agitée encore trois fois, de la même façon, avec à chaque fois 500 g de résine "Amberlite" pendant 60 minutes, puis avec encore 500 g de résine "Amberlite" pendant 25 environ 15 heures. Après ce traitement, la liqueur surnageante a une couleur jaune clair , tandis que les impuretés noires se sont fixées sur l'échangeur ionique. Après avoir rassemblé les résidus de résine "Amberlite", on les lave deux fois avec 1,5 litre d'eau et on rassemble les eaux de lavage et la 30 liqueur surnageante contenant l'inhibiteur. La liqueur surnageante rassemblée avec les eaux de lavage est concentrée à un litre dans l'évaporateur rotatif sous un vide de 15 mm de mercure et à une température du bain de 80°C, puis le concentré est ajouté, sous agitation intense, à 10 litres d'acétone. Il se forme alors 35 un précipité blanc floconneux, qu'on sépare au filtre-presse, qu'on.lave à l'acétone et à l'éther et qu'on sèche sous vide. Rendement : 150 g d'une poudre blanche titrant 1 x 10^ -UIA/g et 450 UlS/g. 71 47019 2120073 Exemple 15 Si l'on remplace, dans une solution nutritive suivant l'exemple 1, le glucose par d'autres sucres ou d'autres alcools glucidiques et si l'on ersesience des fioles sou^égitation contenant 5 chacune 120 ml de solution de culture, avec 1 ml de pré-culture de la couche SB 18 (obtenue conformément à l'exemple 1), on obtient,après culture pendant 3 à 4 jours à 28°G sur des secoueuses mécaniques circulaires, des solutions de culture présentant les concentrations suivantes en inhibiteur 10 d'amylases. Additif, 1 f de aU , . * ' bout de bout de a^-u trois jours quatre jour3 15 Sucre de canne 5 400 10 500 lactose 9 100 '4 600 Maltose 7 500 13 600 Galactose 9 100 10 200 Glucose 7 000 9 700 Sorbitol 2 600 10 200 20 Mannitol 8 500 8 700 Inositol 4 800 5 600 Amidon 6.400 10 200 Exemple 16 En ensemençant et en faisant incuber une solution 25 nutritive contenant 3 f de farine de soja, 2 fo d'amidon, 1 fo de glucose et 0,2 f> de CaCO^ d'après l'exemple 15, on obtient après fermentation pendant 4 jours un bouillon de culture titrant 5 600 UIA/ml. Exemple 17 30 En ensemençant et en faisant incuber un milieu conforme à l'exemple 13 avec une variante morphologique de la souche SB 18, à savoir la souche SB 18/5, on obtient après fermentation pendant quatre jours un bouillon de culture titrant 27 400 UIA/ml. 35 la souche SB 18/5 a été déposée au Centraalbureau voor Schimmelculture3 à Baam sous le îT° CBS 613.71. 71 47019 52 2120073 Exemple 18 En ensemençant et en faisant incuber un milieu suivant l'exemple 13 avec une variante morphologique de la souche SB 18, à savoir la souche SB 18/4, on obtient après fermentation 5 pendant 4 jours un bouillon de culture titrant 13 900 UIA/ml. la souche SB 18/4 à été déposée au Centraalbureau voor Schimmelcultures à Baarn sous le 11° CBS 612.71. Exemple 19 En ensemençant et en faisant incuber une solution 10 nutritive contenant 2 f d'amidon, 1 f de glucose, 0,3 ci- de glycocolle,0,25 f d'extrait soluble de maïs, 0,4 f de farine de soja, 0,1 f° de chlorure de sodium, 0,1 f de phosphate dispotassique, 0,01 7 de sulfate ferreux et 0,01 fo de carbonate de calcium suivant l'exemple 12, on obtient après incubation 15 pendant 3 jours un bouillon de culture titrant 2900 UIA/ml. Exemple 20 En ensemençant deux fioles contenant un milieu suivant l'exemple 1 avec un millilitre d'une pré-culture de la souche SB 46 et en faisant incuber pendant quatre jours à 28°C 20 .sur une secoueuse mécanique circulaire, on obtient après centrifugation 250 ml de liqueur surnageante titrant 250 UIA/ml. On ajoute à ces 250 ml de liqueur surnageante 150 g de sulfate d'ammonium par portions et en agitant, puis on centrifuge pendant 15 minutes à 10 000 tr/mn. On dissout le 25 résidu dans 12 ml d'eau, et on dialyse la solution pendant trois heures vis-à-vis d'eau distillée. le dialysat (volume de 20 ml) est précipité avec 6 volumes (120 ml) d'acétone au bain de glace, le précipité est séparé au filtre-presse et lavé à l'acétone et à l'éther, puis séché sous vide. 30 Rendement : 0,28 g titrant 220 x 10^ UIA/g. Exemple 21 En ensemençant une fiole d'Erlenmeyer d'tin litre de capacité contenant 120 ml d'une solution nutritive suivant • l'exemple 1 avec 2 ml d'une pré-culture de la souche SE 5 35 (obtenue comme dans l'exemple 4) et en faisant incuber pendant 7 jours sur une secoueuse mécanique circulaire à 28°C, on obtient un bouillon de culture titrant 0,09 UIM/ml. 71 47019 5 3 2120073 On ajoute au-mycélium 50 ml d'acétone, on homogénéise pendant une minute sur l'appareil d'homogénéisation "Ultraturrax" (firme Janke u. Kunkel, Stauffen, Breisgau) puis on centrifuge à 3000 tr/mn pendant 10 minutes. On extrait le résidu encore 5 une fois de la même façon avec 50 ml d'acétone puis une fois avec 50 ml d'éther, on rassemble les trois extraits et on les concentre pratiquement à sec dans l'évaporateur rotatif sous un vide d'environ 10 à 20 mm de mercure et à une température du bain de 37°C. On sèche le résidu mycélien sous vide puis on 10 y ajoute 15 ml de diméthylsulfoxyde, on l'homogénéise pendant 2 minutes dans l'appareil "Ultraturrax" et on l'extrait pendant deux heures sous agitation (agitateur magnétique). Ensuite, on centrifuge pendant 30 minutes à 20 000 tr/mn. .par décantation On séparé ensuite/Le produit d'extraction au diméthylsulf oxyde 15 du mycélium,/ l'ajoute au produit d'extraction à l'acétone et à l'éther et on agite pendant environ 30 minutes (agitateur magnétique). On centrifuge encore pendant 10 minutes à 20 000 tr/mn et on expérimente la liqueur surnageante claire, en tant qu'extrait mycélien. On trouve 0,14 UIM/ml. 20 Exemple 22 En ensemençant et en faisant incuber deux fioles agitées par secousses suivant l'exemple i," contenant, chacune 160 ml de milieu, avec un millilitre d'une pré-culture (suivant l'exemple 1 ) de la souche SE 21, on obtient après centrifugation 200 ml 25 d'une liqueur surnageante titrant 360 UIA/ml. la liqueur surnageant^fcentrifugée est additionnée centrifugée, par portions, sous agitation, de 100 g de sulfate d'ammonium/ le précipité est dissous dans 20 ml d'eau, puis reprécipité avec deux volumes (environ 40 ml) d'acétone, le précipité est 30 lavé avec de l'acétone et de l'éther puis séché sous vide, Rendement : 2 g titrant 25 x 10^ UIA/g. Exemple 23 • En ensemençant et en faisant incuber un milieu suivant l'exemple 14 avec des pré-cultures de la souche SE 21, on obtient 35 après fermentation pendant 65 heures des bouillons de culture titrant 140 UIA/ml. i ,\ 71 47019 54 2120073 Exemple 24 En ensemençant une fiole d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, contenant 120 ml d'une solution nutritive de même composition que dans l'exemple 4, avec 1 ml d'une pré-culture 5 suivant l'exemple 1 de la souche SE 39 et en faisant incuber, conformément à l'exemple 1, on obtient après fermentation pendant 3 jours seulement une solution de culture titrant 50 UIA/ml Exemple 25 10 Si l'on remplace dans un milieu suivant l'exemple 24 la. glycérine par du glucose, on obtient au bout de 3 jours des solutions de1culture titrant 60 UIA/ml. exemple 26 . . . Si l'on modifie dans une opération conforme a l'exemple 24 la solution nutritive de l'exemple 1 en remplaçant l'amidon 15 par" du glucose, on obtient après incubation pendant 3 jours des sçlutions de culture titrant-140 UIA/ml. Exemple 27 " En ensemençant 5 fioles d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, contenant chacune 120 ml de solution nutritive ren- 20 fermant 3 f> de glucose, 0,5 f° d'smines HZ, 1,0 fo d'extrait de levure, 0,4 f« de CaCO^ (stérilisation ï 30 minutes, 121 °C y pH ajusté à 7,2- avant la stérilisation) avec 1 ml d'une pré- culture de la souche SE 39 (préparée conformément à l'exemple 4) et en faisant incuber pendant 3 jours sur une secoueuse mécanique 25 circulaire à 28°C, on obtient après centrifugation 500 ml d'une liqueur surnageante titrant 160 UIA/ml. les 500 ml de liqueur surnageante sont précipités sous agitation avec 6 volumes (3 litres) d'acétone, le précipité brun- clair est séparé au filtre-presse, lavé à l'acétone et 30 à l'éther, piiis séché sous vide. Rendement : 3,5 g titrant 13,5 x 10^ UIA/g. Exemple 28 En ensemençant une fiole d'Erlenmeyer contenant 120 ml d'une solution nutritive suivant l'exemple 4 avec un millilitre ' / 35 d'une pré-culture de la souche SE 50 (pré-culture obtenue suivant l'exemple 4) et en faisant incuber, également, suivant l'exemple 4, on obtient au bout de cinq jours une solution de £qpy 71 47019 2120073 culture titrant 1,0 ÏÏIS/ml. Exemple 29 En suivant le mode opératoire de l'exemple 28, nais en utilisant la solution nutritive de l'exemple 1, 5 on obtient après incubation pendant 5 jours une solution de culture titrant 26 000 UIA/ml, 0,18 Ullï/ml et 1,8 ÏÏIS/ml. Eremple 30 En suivant le mode opératoire de l'exemple 29, mais en chargeant dans les fioles 200 ml de milieu, on 10 obtient après incubation pendant 5 jours une solution de culture titrant 24 500 UIA/ml, 0,18 UIIî/ml et 2,1 ÏÏIS/ml. Exemple 31 En suivant le mode opératoire de l'exemple 28, mais en utilisant une solution nutritive contenant 2 fi d'amidon, 15 1 fi de glucose, 0,3 fi de glycocol, 0,25 fi d'extrait soluble de maïs, 0,4 fi de farine-de soja, 0,1 fi de chlorure de sodium, 0,1 fi de phosphate dipotassique, 0,01 fi de sulfate de magnésium, 0,01 fi de carbona-te de calcium et 0,01 fi de sulfate ferreux, on obtient après fermentation pendant 3 jours une solution 20 de culture titrant 12 900 UIA/ml. Exemple 32 En remplaçant dans une";-solution nutritive suivant l'exemple 1 le glucose par d'autres sucres ou alcools gluco-sidiques et en procédant à l'ensemencement et à 3.'incubation, 25 comme indiqué dans l'exemple 28, on obtient des solutions de culture présentant les concentrations suivantes en inhibiteurs d'amylases. Additifs (1 fi) UIA/ml au bout UIA/ml au bout de trois jours de cinq jours ~n Sucre de canne - 23 000 lactose rf-CM 000 - Haitose 23 500 - Galactose 31 o o - Glucose 41 000 - Sorbitol 24 000 — I-Iannitol 33 000 - Inositol 21 000 — Amidon 33 900 — 71 47019 2120073 exemple 55 Si l'on remplace dans une opération suivant l'exemple 28 la glycérine par du glucose, on obtient des solutions de culture titrant 350 UIA/ml. 5 Exemple 54 Si l'on remplace dans une opération suivant 1'exemple 28 l'amidon par du glucose, on obtient des solutions de culture titrant 660 UIA/ml. Exemple 55 10 Si l'on remplace dans des opérations suivant l'exemple 29 les aminés NZ par d'autres sources complexes d'azote, on obtient après fermentation pendant trois jours des solutions de culture titrant les unités d'inhibiteurajd'amylases/indiquées ci-après. 15 Substance de remplacement UIA/ml Farine de soja 13 500 Extrait soluble de poisson 16 800 Tryptone 25 200 Extrait de viande 32 700 20 "Pharmamedia" 23 100 Exemple 36 Si l'on ensemence un milieu suivant l'exemple 29, avec une variante morphologique de la souche SE 50, à savoir la souche SE 50/12, on obtient après fermentation pendant 25 trois jours des bouillons de culture titrant 51 500 UIA/ml. Exemple 37 En ensemençant cinq appareils de fermentation expérimentale contenant chacun. 8 litres de solution de culture suivant l'exemple 1, mais additionnée de 0,1 fo en volume d'agent 30 anti-mousse "Bayer" E 100, avec 120 ml d'une pré-culture (obtenue suivant l'exemple 1) de la souche SE 50 et en faisant incuber sous agitation et avec aération pendant 65 heures à 28°C, on obtient,après avoir rassemblé les milieux de fermentation et séparé le mycélium, 24 litres de bouillon de culture 35 titrant 13 000 UIA/ml et 6 UlS/ml. le bouillon de culture est concentré à un litre par évaporation sous vide de 20 mm de mercure et à une température du bain de 100°C. le concentré de cotileur noire est centrifugé à 15 000 tr/mn pendant 60 minutes, 71 47019 57 2120073 la liqueur surnageante foncée est chargée sur une colonne de résine "Amberlite" IRA 410 (9 cm de diamètre, 50 cm de hauteur, résine "Amberlite" IRA 410 sous la forme acétate, pH 7, dans de l'eau), élude avec 50 ml d'eau par heurs, et recueillie/en 5 fractions de 20 ml dans le collecteur de fractions, les fractions de couleur jaune clair, contenant l'inhibiteur (au total 300 = 6 litres) sont rassemblées, concentrées à tua litre sur l'évaporateur rotatif et ajoutées goutte à goutte sous agitation énergique dans 10 litres d'alcool absolu, ce qui provoque la 10 formation d'un précipité floconneux presque, blanc. On sépare le précipité au filtre-presse, on le lave à l'alcool absolu puis à l'éther, et on le sèche sous vide. Rendement : 60 g d'une poudre blanche titrant 3 x 10^ TJIA/g et 400 UlS/g. Exemple 58 15 la séparation de la majeure partie des impuretés inac tives, notamment le colorantfoncé ,peut être aussi effectuée par précipitation avec des volumes égaux de méthanol. A cette fin, on concentre à 1,2 litre 26 litres du bouillon de culture (43 000 UIA/ml) centrifugé (obtenu conformément à l'exemple 20 37, mais additionné de 0,02 ^ en volume d'agent antimousse "Bayer Silicon E") par évaporation sous vide de 20 mm de mercure à une température du bainJLe 100°C. la solution de couleur noire intense est additionaée d'un volume égal (1,2 litre)de méthanol sous agitation, et il se forme un 25 précipité noir floconneux. On le filtre sur filtre plissé et on ajoute goutte à goutte le filtrat de couleur brune (2,2 litres) à 10 litres d'alcool absolu, sous agitation énergique. Il se forme un précipité brun clair qu'on s.épare au filtre-presse, qu'on lave à l'acétone et à l'éther et qu'on sèche 30 sous vide. Rendement : 185 g d'une poudre de couleur ocre clair, titrant 3700 UIA/mg. . Pour parfaire la purification, on dissout le précipité total (185 g) dans 250 ml d'eau et on fait passer la solution 35 de couleur brun foncé sur une colonne de 5 x 75 cm de résine "Amberlite11 IRA410 forme acétate, pH 7)« On procède à l'élu-tion avec de l'eau, on jette comme produit de tête les 500 premiers 71 47019 se 2120073 millilitres d'éluat, et on garde les 5 000 ml suivants d'éluat presque incolore renfermant l'activité inhibitrice. On les concentre à 200 ml sur l'évaporateur rotatif, et on en sépare l'inhibiteur par addition goutte à goutte à deux litres 5 d'éthanol absolu, filtra^tion du précipité au filtre-presse après lavage et séchage sous vidq/a l'éthânol et à l'éther. Rendement : 80 g d'une poudre blanche . titrant 8000 UIA/mg. Exemple 59 En ensemençant une fiole d'Erlenmeyer d'un litre de 10 capacité contenant 120 ml d'une solution nutritive suivant /ml d'une pré-culture de la souche SE 55 (préparée conformément à l'exemple 4) et en faisant incuber la culture sur une secoueuse mécanique circulaire à 28°C pendant 6 jours* on obtient après séparation du mycélium un bouillon de culture 15 qui titre 30 UIA/ml, 0,15 UHl/ml et 0,5 UlS/ml. Si l'on extrait le mycélium suivant l'exemple 20, on obtient un produit d'extraction titrant 15 UIA/ml, 0,17 UIM/ml et 0,5 UlS/ml. Exemple 40 20 En suivant le mode opératoire de l'exemple 39, mais en utilisant une solution nutritive suivant l'exemple 1, on obtient une solution de culture titrant 60 UIA/ml, 0, 16UIIf/ml et 0,65 UlS/ml et un extrait mycélien titrant 30 UIA/ml, 0,16 UIM/ml et 0,35 UlS/ml. 25 Exemple 41 En ensemençant une solution nutritive suivant l'exemple 59, dérivée d'une culture en petits tubes inclinés sur gélose aux flocons d'avoine de la souche SS 26 et en faisant incuber la culture suivant l'exemple 40 pendant 5 jours, on obtient, 50 après séparation de la solution de culture et extraction du mycélium suivant l'exemple 21, un extrait titrant 0,14 UIH/ml. Exemple 42 En suivant le mode opératoire de l'exemple 41 et en utilisant une culture de la souche SS 45, on obtient un extrait 55 mycélien titrant 0,1 UIK/ml. Exemple 45 En suivant le mode opératoire de l'exemple 41 et en utilisant une culture de la souche SS 53, on obtient un bouillon 71 47019 2120073 de culture titrant 0,05 UIM/ml, et un extrait mycélien titrant 0,07 Ulîl/ml. Exemple 44 En ensemençant une fiole d'Erlonnieyer d'un litre de 5 capacité contenant 120 ml d'une solution nutritive renfermant 0,5 fi de peptone-bacto, 0,5 fi d'extrait de viande, 0,2 fi d'extrait de levure, 0,03 /'■ d'hydrolysat de caséine, 1 fi de i-ino-sitol, 1 fi. de sorbitol, 1 fi de D-mannitol, 1 fi de glucose, 0,1 cfi de phosphate dipotassique, 0,05 fi de sulfatée magnésium, 10 0,05 fi de chlorure de potassium et 0,01 fi de sulfate ferreux, dont le pH a été ajusté à 7,2, avec mie culture sur gélose inclinée (préparée suivant l'exemple 1) de la souche SS 51, on obtient,après culture sur une secoueuse mécanique circulaire à 28°C pendant 7 jours, une solution de culture titrant 0,072 UIM/ 15 ml et un extrait mycélien (préparé suivant l'exemple 21) titrant 0,054 UIM/ml. Exemple 45 En ensemençant une solution nutritive suivant l'exemple 4, avec une culture en petits tubes inclinés sur gélose aux 20 flocons d'avoine de la souche ST 19 et en faisant incuber suivant l'exemple 4 pendant trois jours, on obtient après séparation du mycélium une solution, de culture titrant 20 UIA/ml. Exemple 46 Kéthode expérimentale de détermination de l'activité des 25 inhibiteurs de glucosidases chez le rat et l'homme Pour provoquer une'hyperglycémie et une hyper-insuli-némie alimentaires après absorption de glucides, on fait absorber à des rats (n = 6) 2,5 g d'amidon ou de maltose ou de.saccharose en solution ou en suspension, par kg, par voie orale (animaux 30 témoins). On fait absorber à chacun de six autres rats, en plus de l'un des glucides mentionnés ci-dessus, un inhibiteur de glucosidases,à la dose indiquée par voie orale. On détermine la glycémie à de courts intervalles de temps après 1'administra-" tion de glucide , sur le sang prélevé dans le plexus des veines 35 rétro-orbitales, au moyen de l'appareil auto-analyseur ("Technicon ® ", selon Hoffman : "J«, Biol. Chém." 120. 51 (1937)). 71 47019 ÔO 2120073 Pour provoquer une hyperglycémie alimentaire chez l'homme, on administre par voie orale 50 g d'amidon par sujet soumis à l'essai, sous la forme d'une suspension aqueuse. On détermine la glycémie immédiatement après le début de 5 l'essai, puis à de courts intervalles de temps, comme indiqué ci-dessus, dans le sang capillaire prélevé au bout des doigts. Dans un autre essai, on ajoute la substance active à la suspension d'amidon. Dans le sérum de six rats, dont un groupe reçoit 2,5 g 10 d'amidon par kg par voie orale (témoins) et les autres groupes reçoivent en outre un inhibiteur de glucosidases ,on détermine l'insuline à de courts intervalles de temps, après-l'administration de glucide. Le dosage de l'insuline dans le sérum est effectué par 15 radio-immunologi'après la méthode aux deux'anticorps de Haies et Randle ["Biochem. J." 88, 137 (1963)]. Les dosages d'amidon dans les voies gastro-intestinales chez le rat sont effectués à de courts intervalles de temps après administration par voie orale de 300 mg d'amidon par 20 rat. A cette fin, on prépare les segments individuels des voies digestives après avoir sacrifié les animaux, on lepinces et on dose sous la forme de glucose, après hydrolyse acide, l'amidon non digéré que ces voies contiennent. Tableau I relatif à l'exemple 46 25 Glucose sanguin en mg fi (valeur moyenne +1 s) de rats à jeun à divers instants après l'administration par voie orale d'amidon + la substance active de l'exemple 5. Ijj 60 minutes Témoin sans amidon 61 + 16 70 + 3,4 30 Témoin avec amidon 140 + 11 145 + 15 Amidon + 25 000 IJIA/kg 106 + 20 128 + 11 Tableau II relatif à l'exemple 46 Glucose sanguin en mg fi> (valeur moyenne +1 s) chez des rats à jeun à divers instants après l'administration par 35 voie orale d'amidon + la substance active de l'exemple 14. 71 47019 61 2120073 1 5 2Ç)_ 60 minutes Témoin sans amidon 72 + 8,5 78 + 12 69 + 12 Témoin avec amidon 159 + 28 153 + 36 164 + 7,9 Amidon + 25 000 UIA/kg 95+3,7 95 + 8,7 96 + 7,2 5 Tableau III relatif à l'exemple 46 Glucose sanguin en mg fi (valeur moyenne + 1 s) chez des rats à jeun, à divers instants après l'administration par voie orale d'amidon + la substance active de l'exemple 37 15 2Ç> 60 minutes •jO Témoin sans amidon 72 + 8,5 78 + 12 69 + 12 Témoin avec amidon 159+28 153+36 164+7,9 Amidon + 25 000 UIA/kg 83 + 6,5 105 + 5,2 104 + 6,5 P ar raï)Por^ au témoin ' ' J avec glucide 15 Tableau 17 relatif à l'exemple 46 Glucose sanguin en mg fi chez un sujet humain en bonne santé,/%pr^e:aàcSâ^^raT:ion orale d'amidon + la substance active de 1'exemple 37. 0 15 30 60 - 90 mn 20 Amidon sans s\ibstance active 106 1 28 1 50 1 46 136 Amidon + 60 000 UIA/sujet 100 112 108 110 104 Tableau Y relatif à l'exemple 46 Glucose sanguin en mg fi- (valeur moyenne +1 s) chez 25 des rats à jeun à divers instants après administration par voie orale de maltose + la substance active de l'exemple 10. 15 22 60 on Témoin sans maltose 70 + 6,7 81+15 72 + 9,6 Témoin avec maltose • 160 + 13 153 + 11 172 + 13 30 Maltose + 1,5 UlS/kg 120 + 13 124 + 12 134 + 9,-4 71 47019 62 2120073 Tableau VI relatif à l'exemple 46 Glucose sanguin en mg c/~ (valeur moyenne + 1 s) chez des rats à jeun à divers instants après administration par voie orale de saccharose + la substance active de l'exemple 14. • 15 50 60 mrx Témoin sans saccharose 61+16 77 + 4?7 70+5,4 Témoin avec saccharose 125+14 129+7,9 155+8,5 Saccharose +50 UIS/kg 104 + 4,1 116 + 8,4 115 ± 5 10 P P :==== P Par rapport au témoin avec glucide- Figures 1 à 5. relatives à l'exemple 46 les figures 1 à 5 montrent la teneur moyenne en amidon 15 en milligrammes (ordonnées)/rat(n = 6) dans l'estomac (figure 1), l'intestin grêle (figure 2) et le gros intestin (figure 5) à différents instants (minutes), (abscisses), après administration par voie orale de 500 mg d'amidon brut de blé par rat, au moyen d'une sonde oeusophagienne. Sur les figures 1 à 5, les 20 courbes (1) illustrent les résultats obtenus pour les animaux témoins (groupe 1), dans le cas de l'amidon sans inhibiteur d'amylase, tandis que les courbes (2) illustrent les résultats obtenus chez les animaux recevant une dose égale d'amidon avec addition de 1000 UIA d'inhibiteur d'amylase (groupe 2). 25 Résultat la quantité d'amidon de blé contenue dans l'estomac (figure 1) entre 15 et 60 minutes après l'administration est bien plus faible (p 71 47019 63 2120073 Flores 4 à 6. relatives à l'exemple 46 les figures 4 à 6 illustrent la variation de la glycémie en mg/100 ml (ordonnées) (figure 4), la concentration de l'insuline à réaction imaunologiaue en [aS/ml de sérum (ordonnées) 5 (figure 5) et la concertration en acides^ras non estérifiés en micro-valences^litre- de plasma (ordonnées) (figure 6), par rapport à la valeur initiale (0) en fonction du temps (abscisses) après administration par voie orale de 60 g d'amidon bouilli à un sujet humain. la courbe (1) montre l'allure des 10 paramètres mentionnés (glycémie, insuline du sérum, acides gras non estérifiés du plasma) dans l'essai témoin, la courbe (2) montre la variation de ces paramètres après administration d'une dose égale d'amidon avec addition de 0,25 méga-UIA d'inhibiteur d'amylase, la Courbe (3) montrant les variations des 15 paramètres indiqués après addition de 0,5 méga-UIA d'inhibiteur d'amylase à 60 g d'amidon bouilli, par personne. Résultat Après hyperglycémie temporaire entre 0 et 30 minutes sur la figure 4, la glycémie s'abaisse nettement au bout de 45-180 20 minutes au-dessous de la valeur initiale. En raison de l'hyperglycémie initiale, la concentration en insuline dans le sérum dans le cas de l'essai témoin (cûurBe"~ 1) -augmente rapidement. L'addition de 0,25 (courbe 2) et 0,5 (courbe 3) méga-UIA à l'amidon a pour effet que 1'hypoglycémie (figure 4) de même 25 que l'hyperinsulinémie (figure 5) diminuent fortement. Le comportement des acides gras non estérifiés du plasma est à peu près le même dans les trois essais. Tableau 711 relatif à 1'exemple 46 Insuline du sérum en pE/ml (valeur moyenne + 1s) chez 30 des rats à jeun à différents instants après l'administration par voie orale de 2,5 g d'amidon + la substance active de l'exemple 14 î n = 6. Dans cet essai, la teneur en insuline du sérum chez les rats à jeun, sans absorption d'amidon, est de 6 + 1 jjE/ml, 71 47019 2120073 M'ombre de minutes après l'absorption d'amidon Amidon seul Amidon + 1 5 52 + 29 17 + 8 5 10 72 + 20 7i~±~4 20 44 ± 28 16+7 30 25+8 17+3 45 30 + 5 13 + 6 60 21+8 W±q 10 120 9 + 3 10+3 180 8+2 9 + 2 Tableau VIII 'relatif à l'exemple 46 20 Insuline du sérum en jjE/ml (valeur moyenne + 1 s ) chez des rats à jeun à différents instants après 1-'absorption par 15 voie orale de 2,5 g d'amidon + la substance active de l'exemple 37 ; n = 6. Dans cet essai, la teneur en insuline du sérum chez les rats à jeun, sans absorption d'amidon, est de 6 + 1 [iE/ml. Nombre de minutes après l'absorption d1 amidon Amidon seul Amidon +10 000 UXA/kg 5 52 + 29 18 + 8 10 72 1+ ro o 24 + 11 25 20 44 + 28 11 + 5 30 25 + 8 13 ± 3 45 30 ± 5 18 ± 7 60 21 + 8 15 ± 5 120 9 ± 3 13 ± 5 30 180 8 ± 2 11 ± 5 P P P par rapport au témoin avec glucide Exemple 47 35 En ensemençant des fioles d'Erlenmeyer contenant les milieux indiqués sur le tableau avec les souches correspondantes et en 71 ^7019 s5 2120073 faisant incuber aux températures indiquées sur des secoueuses mécaniques circulaires, on obtient après plusieurs jours des solutions de culture et après traitement suivant l'exemple 21,des extraits mycéliens qui renferment les activités indiquées sur le tableau suivant. TABLEAU relatif à l'exemple 47 N° de la Souche Solution de Activité du filtrat de Activité de l'extrait my Désigna cu.L-cure Temp-,: Durée - de1 culture, U./ir.l célien suivant 1'exemple 21 tion du U° en col Kom de la Voir exem Quantité, Quantité dans la d'incu- la cul- Inhibition de Inhi-'bition Inhibi-'tion de îJ/rnl .'laboratoire lection * souche « "bation, °C • ture, ' Inhibi Inhibi 'Inhibition " ple; ml fiole J VU4.-I 3 l'amy de la la saccha tion de tion de de la sac d'Erlen lase maltase rase l'amy la mal charase meyer, ml lase tase ST 50 ;bs 693.69 Streptomyces heimii 4 30 200 28 4 0,06 S? 67 il 432.59 " tendae 44 30 ' 200 , 28 4 0 O ro O 0,25 ST *-5 " 434.51 " aureofaciens 4 30 200 28 4 0 0 0 ro ET 56 ir 228.65 Chainia rubra 44 30 200 ' • 28 ' 4 0,005 ; RT 33 295.66 " poonensis 44 30 200 28 5 ■1 0,003 ! ST 12 ÎJHRL B-2286 Streptomyces 1 30 200 28 -■ 3 500 0,008 murinus | ' ST 51 :bs 498.68 " fradiae 44 30 200 28 4 70 ST 3 NERL 2580 " chrysomallus 4 30 200 28 5 20 st 1 4tcc 11523 ■1 n 4 30 200 28 5 20 SS 55 i :bs 624.71 Streptosporan-gium roseum 1 120 1000 28 1 6 aoo SS 59 (1 «23.71 " ametfcystcgaaes 1 120 1000 . 28 6 70 SS 62 » 625.71 " roseum 1 120 1000 28 6 150 at 8 kcc- A. 0027 " viridalbum 4 " 120 1000 28 ' 4 150 at 11 tt " 0025 " album 4 120 1000 28 4 100 at 13 ; 3ES 190.64 Ampullariella 4 120 1000 28 6 >2000 carapanulata at 14 II 193.64 " regularis 4 120 1000 28 4 500 SE 89 •t 619.71 " spec. 1 120 1000 28 6 >2000 SE 10C It 622.71 Pianomonospora 1 120 1000 28 6 50 50 spec. > 1 • vi i-* -e> v] o vo CT\ o% i\d ro o o vi TABLEAU relatif à l'exemple 47 (suite) Activité du filtrat de N° de ld souche Désignation du laboratoire H° en collection lïom de la souche at 4 at 9 at 10 tt n se 103 hn 6 hn 2 at 2 se 101 sk 2 se 82 il ii se 45 sa 28 sa a at 7 cbs 191.64 kcc-A 0028 atcc 19190 il t! cbs 616.71 " 602.71 " 603.71 " 367.66 621.71 620.71 615-71 n " 618.71 617.71 " £11.71 atcc 12428 Voir Juaiif-èjœm- tité, pie; ml Ampullariella digitata Streptosporan- giutt vulgare indiaaeaeia II Actinoplanes spec. Actinobifida chromogena n n Actinoplanes utahensis Pianomonospora parontospora Pilimelia spec Actinoplanes spec. Ampullariella regularis " digitata Actinoplanes spec. Streptosporan- glum roseum Solution de culture 4 4 1 44 1 44 44 4 4 1 1 4 Quantité dans la fiole d'Erlenmeyer, ml 120 120 120 120 120 120 120 120 1 120 120 120 120 120 120 120 120 Tempv d'incubation, °0 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 28 28 28 28 28 50 50 28 28 •.28 28 : 28 ' 28 ! ; 28 28 28 Durée de la culture, jours culture. ïï/ml Ixihihi-tion de l'amylase 6 5 4 5 4 5 4 7 5 5 4 5 5 200 30000 Inhibition de la maltase 0,003 0,003 0,010 0,008 0,002 Inhibition de la oacchar-rase 0,5 0,4 0,5 0,3 0,8 0,8 Activité do l'extrait mycélien suivant l'exsuinle 21 ïï/ml Inhibition de l'amylase Inhibition de la maltase Inhibition de la saccharase 200 35000 200 50 0,004 0,006 0,010 0,003 0,003 1,5 0,25 0.5 1,r> 3,0 0,8 0,6 0,5 0,2 vi h-* 4> vi o h-* vo CTv rv> h* ï\d o o V] Vjsl 71 47019 68 v 2120073 "ksyekd icat j ons 1. Application d'actinomycètes, notamment d'Actinoplanaceae et de Streptomycetacea.e, à l'obtention d'inhibiteurs de glucosidases. 5 2, Inhibiteurs de glucosidases, de préférence des voies digestives, caractérisé par le fait qu'ils sont dérivés d'acti-noniycètes, de préférence d'Actinoplanaceae et de Streptomycetaceae, 3. Inhibiteurs suivant la revendication 2, caractérisés par le fait qu'ils inhibent la saccharase et/ou la maltase et/ou 10 1'amylase. 4. Procédé de production d'inhibiteurs suivant l'une des revendications 2 et 3, caractérisé^pa2^e-fait qu'on prépare ces inhibiteurs à partir d'actinomycètes, notamment d1 Actinoplanaceae'"' et Streptomycetaceae, par des moyens connus. 15 5. Nouveau produit destiné à être utilisé notamment comme médicament et/ou produit alimentaire, caractérisé par le fait qu'il contient des inhibiteurs stiivant l'une des revendications 2 et 3. 6. Médicaments suivant la revendication 5, caractériség^ar 20 le fait qu'ils contiennent en outre des solvants ou des diluants indifférents du point de vue pharmaceutique.