Brevet FR2130267A1 — publié le 19721103

la présente invention concerne un procédé d'obtention de l'héliomycine, un antibiotique qui trouve des applications sous forme d'une pommade à pour le traitement des brûlures, de formes variées de pyodermite, ainsi que dans la cosmétique 5 médicinale, l'héliomycine possédant simultanément des effets antibactériens et vaso-constricteurs. On connaît déjà un procédé de préparation de l'héliomycine à partir de cultures du champignon Actinomyces flavochromogenes var. heliomycini. On effectue la culture initiale par un procédé en 10 profondeur sur un milieu de composition pondérale suivante : farine de soja 1,0^; amidon 1,5 à. 2,0/*; phosphate monopotassique 0,1/0? chlorure de sodium 0,3$; carbonate de calcium 0,3^; graisse de cachalot (blanc de baleine) 0,t?£; eau q.s.p. 100$. le même milieu peut être utilisé pour la culture du mycélium 15 d'ensemencement. On sépare par filtration le mycélium de la liqueur de culture obtenue. On extrait l'antibiotique à l*acétone à partir d'un mycélium d'un degré d'humidité voisin de 60fo en poids» On effectue cette extraction quatre fois. Pour chaque extraction on introduit 20 l'acétone à raison de 3 litres par kilogramme de mycélium humide. On rejette le premier extrait, qui est peu actif, tandis qu'on ajoute à un mélange des second et troisième extraits un volume double d'eau distillée. On utilise le quatrième extrait pour l'extraction secondaire du mycélium de la fermentation suivante0 25 On sépare par filtration l'héliomycine cristalline précipitée et on la lave à l'eau distillée. Si le produit brut sèche mal à cause d'une impureté d'huile on le lave additionnellement à l'éther de pétrole0 Le rendement est de 3f° en poids d'héliomycine brute, calculé 30 par rapport au mycélium humide. Le produit brut contient de 80 à 85/^ en poids d'héliomycine., Un inconvénient du procédé connu drobtention de l'héliomycine à partir d'une culture d'Actinomyces flavochromogenes var. heliomycini est la haute variabilité de la souche. En cas de ' 35 réensemencements fréquents et d'un stockage prolongé cette culture se scinde en souches actives et peu actives.Sont douées de la meilleure capacité d'accumuler l'antibiotique dans leur mycélium 72 09002 2 2130267 les souches dont les colonies croissant sur un milieu organique solide sont exemptes de mycélium aérien, tandis que sur un milieu minéral elles présentent un mycélium aérien pauvre et dégagent un pigment brun-marron. Pour toutes les raisons indiquées, le rendement en antibiotique brut est bas (3f° en poids, calculés par rapport au mycélium humide,daœ lecagÊL1 utilisation des variantes actives de la culture d'Actenomyces flavochromogenes var. beliomycini). La présenta invention a pour but d5 éliminer 1*inconvénient précité. On s'est donc proposé, à cet effet, d'élever le rendement en produit final par utilisation d'une souche nouvelle* On est parvenu à résoudre ce problème du fait que dans un procédé d'obtention de l'antibiotique héliomycine, du type comprenant les opérations suivantes : préparation d'une semence de culture productrice d'héliomycine, ensemencement sur un milieu nutritif, fermentation, séparation du mycélium et isolement du produit final, suivant l'invention on utilise en tant que culture productrice d'héliomycine la souche 1T° 6383 Actinomyces variabilis var. roseolus dont les propriétés culturales , morphologiques et physiologiques sont les suivantes : sur un milieu minéral Gauzé ÎT° 1 elle forme un mycélium aérien gris abondant, le mycélium immergé étant incolore; elle colore le milieu en rose-brun pâle ou en violet-brun; ses sporophores étant en spirales à deux ou quatre spires, les spores étant revêtues de longs filaments; sur un milieu organique G-auzé 11° 2 le mycélium aérien est d'abord de couleur crème et ensuite grise, le mycélium immergé présentant une couleur allant du jaune-brunâtre au brun foncé; sur un milieu Czapek et Lindenbein le mycélium aérien est gris et abondant, le mycélium immergé étant brun; sur une gélose glucose-asparagine le mycélium aérien est pauvre, d'abord de couleur crème et ensuite grise, le mycélium immergé est jaune-brunâtre, ne colore pas le milieu et, sur les milieux nutritifs liquides à la température de 28°C, assimile bien le lactose, le galactose, le saccharose, modérément le glucose et peu le dulcitol; ladite souche étant extraite du sol et sélectionnée par voie naturelle et irradiation aux rayons ultra-violets* 72 09002 ' 2130267 On met en oeuvre le procédé proposé de la manière suivante. On utilise en tant que culture de départ la souche 11° 6383 Actinomyces variabilis var. roseolus. Cette culture se distingue de la culture H° 2915 Actinomyces flavochromogenes var. heliony-5 cini, précédemment décrite, par la formation d'un mycélium immergé brun et de pigments solubles de teinte rose-brunâtre ou violette-brune en cas de croissance sur milieux synthétiques, ainsi que par une sporulation abondante du mycélium aérien gris sur "ces milieux. On effectue la culture de départ par le procédé en profondeur 10 sur un milieu soja-amidon.. Ce même milieu peutêtre utilisé pour la culture du mycélium d'ensemencement. L'antibiotique est contenu dans le mycélium que l'on sépare par filtration de la liqueur de culture0 On extrait l'antibiotique 15 à l'acétone à pa.rtir d'un mycélium dont le degré d'humidité est d'environ 60^ en poids. On procède à cette extraction quatre fois. Pour chaque extraction on introduit l'acétone à raison de 3 litres par kilogramme de mycélium humide. On rejette le premier extrait, qui est peu actif, tandis que l'on ajoute à un mélange des deuxième 20 et troisième extraits un volume double d'eau distillée. On utilise le quatrième extrait pour l'extraction secondaire du mycélium de la fermentation suivante. L'héliomycine cristalline précipite. On la sépare par filtration, on la lave à l'eau distillée„ Si l'antibiotique brut sèche mal à cause d'une impureté 25 d'huile, on le lave additionnellement à l'éther de pétrole. Le rendement est de 4^ en poids d'héliomycine brute, calculé par rapport au mycélium humide. Le produit brut contient 80 à 85/j en poids d'héliomycine, calculés par rapport au produit cristallin chimiquement pur. 30 L'avantage du procédé de l'invention réside dans l'utilisation d'une souche nouvelle plus productive, la souche F0 6383 Actinomyces variabilis var. roseolus, dont la mise en oeuvre permet d'augmenter le rendement en héliomycine cristalline jusqu'à 4î? en poids, calculé par rapport au mycélium humide„ 35 Exemple Pour obtenir des spores on fait croître, pendant 10 jours à 28°C, la souche II0 6383 Actinomyces variabilis var. roseolus dans 72 09002 4 2130267 des éprouvettes en position inclinée, contenant le milieu synthétique (xauzé ÎJ° 1. Pour obtenir du mycélium d'ensemencement on some les spores de la culture dans des fioles coniques 3 3 Erlenmeyer de 500 cm , contenant chacune 100 cm d'un milieu 5 nutritif de composition pondérale suivante : farine de soja 1 ,0> amidon 1 ,0>o chlorure de sodium 0,3^ carbonate de calcium 0,3/j 10 phosphate monopotassique 0,1L^ eau q.s.p. 100 cm^ pH du milieu après stérilisation : 7,0. On cultive le mycélium d'ensemencement dans les fioles pendant 2 jours à une température de 28°C sur des secoueuses 15 fonctionnant à 200 tr/mnu On introduit 5/' en poids de mycélium obtenu dans des fermetures l'ensemencement d'une capacité de 45 litree, contenant 20 litres d'un milieu nutritif de composition pondérale suivante : farine de soja 1,0',"..' 20 , amidon 1 ,0 cp MaCl 0,3?° CaCO^ 0,3% kh2PO4 0,1 % graisse de cachalot 25 (blanc de baleine) 0,1 vî eau q„s.p* 100^ pH du milieu après stérilisation : 7,0, On stérilise pendant 45 minutes à la température de !20°C. Ensuite on procède à la culture à la température de 28°C, sous 30 une pression de 0,3 à 0,5 atmosphère, avec admission d'air à raison de 1 litre par litre de milieu et par minute, l'agitateur tournant à 300 tr/mn0 Au bout de 48 heures de croissance on transfère la culture dans des.fermenteurs. 35 On place dans des fermenteurs de 500 litres de capacité un milieu nutritif de composition pondérale suivante : 72 09002 2130267 famine de soja amidon laCl CaCO^ 1 ,Ofo 2,0 $ o,y-/o graisse de cachalot (blanc de baleine) eau 0,11o q.s0p. 100$ pH du milieu après stérilisation : 7?0. Régime de stér ilisation : 45 minutes à la température de 12Q°C-On distribue les semences à partir d'appareils d'ensemencement à raison de 20 litres de semence pour 500 litres de milieu (5 à 7$ On effectue la fermentation à la température de 28°C5, sous une pression de 0,3 à 0,5 atmosphère en admettant l'air à raison de î litre par litre de milieu et par minute, l'agitateur tournant à 300 tr/mn. la fermentation dure 96 à 120 heures. On filtre 300 litres de liqueur de culture et on obtient environ 30 kg de mycélium dont le degré d'humidité est d'environ 60?^ en poids. On extrait le mycélium quatre fois à l'acétone. Pour chaque extraction on introduit l'acétone à raison de 3 litres par kilogramme de mycélium humide (90 litres). On rejette le premier extrait, qui est peu actif, et on ajoute à un mélange des second et troisième extraits un volume double d'eau distillée (360 litres) l'héliomycine cristalline brute précipite, on la sépare par filtration et on la lave à l'eau distillée„ Si du fait d'une impureté d'huile l'héliomycine se prête mal à la dessiccation, on la lave additionnellement avec un volume d'éther de pétrole 5 à 10 fois supérieur par rapport à l'héliomycine cristallisée brute. Rendement : à partir de 30 kg de mycélium humide (60$ d'humidité) on obtient 1200 grammes d'héliomycine brute contenant 80 à 85$ en poids d'héliomycine, calculés par rapport au produit cristallisé chimiquement pur cristallisé,. en poids de semence). 72 09002 6 2130267 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple» En particulier, elle comprend tous les moyens- constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l1esprit de l'invention et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivant. 72 09002 7 2130267 -REVEBDICATIOKS- 1.- Procédé d'obtention d'un antibiotique constitué par l'héliomycine, du type comprenant les étapes suivantes : préparation d'une semence de culture productrice d'héliomycine, ensemencement sur un milieu nutritif, fermentation, séparation du mycélium et 5 isolement du produit final à partir dudit mycélium, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que culture productrice d'héliomycine la souche I!° 6383 Actinomyces variabilis var. roseolus présentant les propriétés culturales, morphologiques et physiologiques suivantes: sur un milieu minéral G-auzé îî° 1 elle forme un mycélium aérien gris 10 abondant, le mycélium immergé est incolore et colore le milieu en une teinte rose-brunâtre pâle ou violette-brune, ses sporophores sont en spirales à deux quatre spires, les spores sont revêtus de longs filaments; sur un milieu organique G-auzé M0 2 le mycélium aérien :-st d'abord de couleur' crème et ensuite grise, le mycélium ' : Lrnergé présentant une couleur allant du jaune-brunâtre au brun foncé; sur un milieu Czapek et Lindenbein le mycélium aérien est ris et abondant, le mycélium immergé étant de couleur brune; sur ;i„e gélose glucose-asparagine le mycélium aérien est pauvre, d'abord de couleur crème et ensuite grise, le mycélium immergé 20 est 3aune-brunâtre, ne colore pas le milieu et, sur milieux nutritifs liquides à la température de 28°C, assimile bien le lactose, le galactose, le saccharose, modérément le glucose et faiblement le dulcitol; ladite souche étant extraite du sol et sélectionnée par voie naturelle et : rradiation aux rayons 25 ultraviolets. 2.- L'héliomycine antibiotique, utile notamment pour ses effets antibactériens et vaso-constricteurs, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé suivant la revendication 1 c