Brevet FR2121367A1 — publié le 19720825

La présente invention concerne une nouvelle substance antibiotique dnommée après pyracrimycine A et son procédé de préparation0 La pyracrimycine A est une substance cristalline blanche ayant des propriétés caractéristiques, telles que point de fusion et spectres d'absorption infrarsuge et ultravlelet. On peut égalment enregistrer des spectres de rGsonance magnétique protonique et spectres de masse du ccmposé de l'invention.Sur la base de ces données et conjointement avec l'analyse élémentaire et le poids moléculaire, on peut attribuer à la pyracrimycine A la formule développée suivante ce qui correspond au 1-pyrroline-2acrylamide ou ss(pyrrolinyl-2)-acrylamide On peut préparer la pyracrimycine A en cultivant Streptomves eridani n'Sp. (ATCC 21619 ) dans un milieu aqueux et l'isoler du milieu en même temps queun autre métabolite, désigné ci-après sous le nom de pyracrimycine B.La séparation de la pyracrimycine A et de la pyracrimycine B, qui ne possède pas d'activité antibiotique, peut s'effectuer par traitement du mélange brut des deux métabolites avec des hydrocarbures inferieurs chlorés chauds, tels que par exemple, le chloroforme, dans lequel la pyracrimycine A est sensiblement insoluble, Dans la préparation de la pyracrimycine A, on cultive l'organisme en conditions aerobies dans un milieu nutritif aqueux approprie pour la croissance dudit organisme, ledit milieu con- tenant une source de carbone et une source d'azote et des sels minéraux.On poursuit la culture dans de conditions favorables à la croissance du micro-organisme pendant un temps suffisant pour produire une accivité antibiotique sensible Par exemple, on peut utiliser pour le contrôle de l'activité antibiotique l'essai à la plaque de gélose sur disque de papier avec E0 coli. On peut isoler la pyracrimycine A ainsi produite par des procédés classiques, tels que séparation du mycélium par filtration,puis extraction avec un solvant organique dans lequel la pyracrimycine A est soluble et qui nVest pas miscible avec le milieu aqueux On peut obtenir le mélange brut de pyracrimycines A et B par addition d'un grand excès d'6ther de pètrole à l'extrait organique après lavage par de l'eu alcaline puis concentration.On purifie ensuite le m'ange des deux m6tabolites en les mettant en sus pension dans le methanol, en filtrant les impuretés insolubles, en concentrant le flltrat et en refroidissant la solution jusque ce que la cristallisation soit totale, On réalise une séparation des seux produits par le traitement ei-deseus mentionné avec an solvant organique chloré. La substance antibiotique selon l'invention est utile contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Le tableau I ciraprès illustre l'activité antimicrobienne, exprimée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) L'une des caractéristiaues '.es plus importantes du nouvel antibiotique selon l'invention réside en ce que, on observe pratiquement pas le developpement de souches résistantes dans les essais in vitre. Cette propriété est très importante lorsque l'on prévoit une application topique d?une substance antibiotique, puisque dans ce cas, il faut tenir compte dune utilisation largement etendue du mdi cament. L'utilisation poussée d?un médicament antibactérien peut conduire non seulement à l'apparition de mutants résistants chez un patient donné, mais également à la prolifération des souches ésistantes.Il est donc évident qutun médicament qui inhibe le developpement des souches résistantes offre des avantages indubiables, en particulier lorsqu'on l'utilise pour les applications locales poussées0 Dans le cas présent, la substance antibiotique selon l'invention peut être facilement incorporée dans des pommades avec des supports et liants pharmaceutiques habituels, tels que lanoline, paraffine de pétrole, vaseline de pétrole, eau, agents émulsiflants et épaississants0 On peut hydrogener la pyracrlmycine A en solution dans un alcanol inférieur par les borohydrures métalliques, par exemple, le borohydrure de sodium, en un dihydrodérivé auquel on peut, d'après ses propriétés physiques, attribuer la structure du ss (pyrrolidinyl-2)-acrylamide Ce composé est également doué d'astivité antimcrobienne. Dans un essai caract6riatique in vitre, il Inhibe la creissance de souches d'Escherichla coli à une concentration de 50 @/ml. Descrfotion de Streptomyces cridant n.Sp. ATCG 21619 On préfére pousser Streptomyces cridani sur divers milieux standard après Gottlieh et Shirlibg, dans Int Journal of Systematic Bactericlage 16, p. 313, 1966. Qualques Autres milieux pauvant aussi être utiles, comme la montre le tableau II ni-après, qui indique les odractériatiques de culture et caractéristiques physiologiques de la souche productrice. La température la plus appropriée pour le développement des colonies est environ 20 9 environ 45 C et plus particu- lièrement de 28 à 37 C. Le mycélium aérien est produit par 5. eridani seulement sur gélose de farine d'avoine et d.e pomme de terre, Sur ce dernier, le mycélium aérien produit est rare et l'on n'observe pas de sporulation; sur la-gelose à la farine d'avoine, le mycélium aérien est blanc velouté avec des hypnes longs flexibles et granifies ayant un diamètre environ 1,3 . Les hyphes aériens produisent des sporpoheres en spirals assez fermes de longueurs différantes. Les spcres ont des dimensions j'environ 1-1,3 x 13,-1,6 .Le tableau III ci-desseus indique les rnsultats de l'eszai de l'utilisation des sources de carbone selon Pridham et Gottlieb, dans Journal cf Bacteriology 56 p. 107, 1948. T A B L E A U III Utilisation des composés cerbonés par Streptomyces eridani n.Sp. ATCC 21619 Source de carbone croissance Saccharose Xylose ++ Arabinose ++ Inositol Raffinose +4 Mannitol ++ Fructose ++ Rhamnose ++ Cellulose Glucose (témoin positif) ++ ++ : Utilisation fortement positive Pas d'utilisation. Production de 12 antibiotique et isolement Pour la production de la substance antibiotique selon l'invention, on cultive la souche de Streptomyces eridani n. Sp ATCC 21619 en conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux jusqu'à ce que le milieu contienne une activité antibiotique substantielle. A titre d'exemple, un milieu végétatif pour la culture agitée en flacon peut avoir la compo- sition suivante extrait de viande de boeuf 5 g/1 extrait de levure 5 g/l peptone 5 g/1 hydrolysat enzymatique de caséine 3 g/l dextrose 20 g/l chlorure de sodium 1,5 g/l eau du robinet q.s.p. 1000 ml On agite les flacons pendant environ 48 à 50 heures à une terpérature d'environ 28 à 30 C sur une secoueuse à va-etvient.On utilise cette culture comme incolum que l'on ajoute au milieu végétatif des cuves à fermentation. A cet effet, on inocule, dNs une cuve à fermentation, 4 1 d'un milieu de composition suivante extrait de viande de boeuf 4 g/l paptone 4 g/1 NaCl 2,5 g/1 extrait de levure 1 g/1 extrait de soja 10 g/1 dextrose 20 g/1 CaCO3 5 g/1 eau q.s.p. 1000 ml avec 8 % de la culture en flacons agités et on maintient sous agitation à 800 tr/mn et à un taux d'agitation de iv/v/mn pendant environ 24 heures à une température environ 28-30 C. Les operations de fermentation ultérieures sont effectuées dans des cuves à fermentation contenant 10 1 d'un milieu ayant pratiquement la même composition que ci-dessus avec 50 g/l de dextrose. On inocule ce milieu avec 1 litre de la culture sur milieu végétatif ci-dessus et on le maintient à environ 28-30 C avec agitation à 800 tr/mn et aération à 1v/v/mn. On détermine périodiquement l'activité antibiotique en utilisant ltessai à la plaque de gélose sur disque de papier, utilisant E, coli comme micro- organisme d'essai. Le maximum d'activité est atteint après 48 heures de fermentation. On filtre le bouillon de fermentation avec 2% de Hyfle-Super Cel et on jette le géteau de mycélium. Après addition de 20% de NaCl, on extrait le filtrat deux fois avec la moitié de son volume de butnol, en combine les extraits, on lave avec un faiole volume d'eau faiblement alcaline, et on concentre à 1/5ème de son volume initial. On obtient une précipitation de sels minéraux centenant moins de 1% de pyracrimycine en refroidissant les solvants concentres pendant quelques heures à 4 C ; on sépare les sels par filtration et on concentre à nouveau la solution jusqu'7 un faible volume.On obtient le mélnge brut de pyracrimynines A et B en ajourant un gres excès d'éther de pétrole aux extraits concentrée. le nradent brut a un degré de pureté d'environ 10-35%, les pyrascimycires A et B étant présentes seraiblement dans les prémortions de fil. On wet le produit en suepensino dans le m6tharel chaud (10 g, 500 ml) et en sépare les matières insolubles tar filtration. On traite la solution par le chrton amtif pour separer lea imouretés, on concentre jusqu'à ce que la cirstallisation commence et on refridit jusqu'à eriatailisation totale ; les deux m6tabolites cristallisent ensembLe en donnant on Froduit ayant un degré de pureté total d'environ 95 %.On ef'fectue une separation des deux métabolites par traitement du produit par le chloroforme au bain-marie pendant 1 heure, la pyracrlmycine A contenant seulement 1 à 2 % de pyracrimycine B est rocueillie et la pyrearimycine B cristallise après contentration de la solution ablorormique jusqu'à un faible volume. Une oristallisation finale dans le méthanol donne le produit purs Propriétés de la pyracrimyeine A La pyracrimycine A est une substance cristalline blanche, F. 215-216.C.Le produit se révèle être unique dans les chroma tcgraphiessur papier et en couche minoe; les valeurs de Rf obtenues avec divers systèmes solvants sont indiquées dans le tableau IV ci-après. la mlarcanalyse élémentaire donne les valeurs suivantes C 60,99, H 7,50%, N 20,20%, qui sont en accord avec la formule moléculaire C7H10N2O (trouve : C 60,85, H 7,30, N 20,27), poids moléculaire 38,17- Le produit est légèrement. baeique, presque insolable dans les solvants organiques courants, à l'oxcoption du dim6thylaulfoxyde et du diméthyl-= formamide et légérement soluble dans les acIdes dilués et le méthanol. Le spectre de l'absorption infrarouge, dans les huiles minérales, présentke des bandes caractérietiques à 3250, 3050, 1670, 1620, 4500 et 972 cent qui sont en accord avec la structure du ss9pyrrolioyl-@)-acrylamide. Le spestre de l'absorption infiowouge, en pastile dans ce nujoi, est représenté à la figure 1 du dessin annexé. le spectre d'absorption utiraviolet, en solution da.ns le méthanol, présente un macimm à 235 m (# = 22,000). Le titrage potentiemetriqaue dans un mélange eau-méthylcellosolve 1;4 pr l'anide chlerhydrique 0,1 N indique une fonction basique iontsable ayant un pK de 5,4 Le spectre de résonande magnétique protonique en solution dans le d6-DMSO est enregistre avec un spectromètre Varian A-60 à 60 mégacycles de la manière hbitdelle en utilisant le tétraméthylailane comme échantillon interne. Les picz d'absorption caractéristique principaux se présentant aux fréquences suivantes, en unités # : 1,87 (multiplet), 2,67 et 3,90 (deux triplets), 6,44 et 7,16 (deux doublets). Le spectre de resonance magnétique protonique est repré- sente à la figure 2 des dessins annexes, Le spectre de masso obtenu à 70 eV est représenté à la figure 3 des dessins annexes, Le spectre de masse de la pyracrimycine A est enregistre avec spectromètre de masse Hitachi-Perkin Elmer RMI-61 et confirme le poids moléculaire de 138, 17 par le pic M+ à m/e = 138 Préparation de la dihydropyracrimycine A A une solution de 0,5 g de pyracrimycine A dans 300 ml d'éthanol anhydre refroidie au bain de glace, on ajoute 0,25 g de borohydrure de sodIm. On mintient la solution à environ 4cC pendant 2 heures et à la température ambiante pendant 12 heures en agitant Après décomposition de l'excès de NaBH4 par HCl à 10%, on dilue la solution éthanolique par l'eau et ensuite on évapore sous pression reduite. Après alcalinisation par le carbonate de sodium à 10, la solution aqueuse résiduelle est extraite à fond par l'acétate d'éthyle. Après séchage des extreits et concentration à siceité, on obnient 0,1 g d'un produit fortement hydroscopique qui est la dihydropyracrimycine A. Le composé presente les propriétés suivantes : Analyse pour C7H12N2O Trouvé : C 59,45 ; H 8,80 ; N 19,60 Calculé : C 59,98 ; H 8,63 ; N 19,98 Poids moléculaire, c@nfirmé par le spectre de masse 149,19. Chromat@graphie en couche min@e sur plaque de gel de silice : Rf=0,6 (acétate d'éthyle, acide acétique, eau 3:1:1. Bande caractéristique du spectre infrarouge dans le nujol : 3300, 3130, 1680, 1620 et 990 cm-1. Titrage potentiométrlque dans l'eau par HCl 0,1 N pK 9,4 Le spectre de P.M.R. dans le d6-DMSO presente les pics caractéristiques suivants, en unités #, qui confirment la réduction de la double liaison car@one-azote dans la 2-pyrroline : 5,92 (doublet), 6,55 (doublet de doublets). TABLEAU U Activité antimicrobienne de la pyracrimycine A Micro-organisme C I M #/ml Staphylococcus aureus 209 P 20 Staphylococcus aureus Tour 20 Streptococcus hemolyticus C 203 20 Diplococcus pneumoniae UC 41 10 Candida albicans SKF 2270 100 Trichophyton mentagrophytes SKF 17410 100 Mycobacterium tuberculosis H 37 Rv ATCC 9360 10 Proteus vulgaris X19 ATCC 881 10 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 50 Escherichia coli SKF 12140 10 Escherichia coli M. Leod ATCC 10536 20 Escherichia coli M. Leod ATCC 10536-Caf/R 20 Escherichia coli M. Leod ATCC 10536-Tetra/R 20 Escherichia coli M. Leod ATCC 10536-Strepto/R 10 Escherichia coli M. Leod ATCC 10536-Neo/R 10 Escherichia coli M.Leod ATCC 10536-Kana/R 10 T A B L E A U II Caractéristique de culture et caractéristique physiologique de Streptomyces eridani n.Sp ATCC 21619 Milieu de Mycélium Mycélium Pigment Caractéristiques culture végétatif aérien soluble physiologiques Gélose à la farine Bonne croissance, Blanchâtre, traces Crème à ambre d'avoine surface régulière, clair couleur crème Milieu n 2 selon Bonne croissance, Absent Ambre brun Gottlied et Shirling légèrement ridée, ambrée Gélose à la farine Croissance modérée, Blanc velouté, Absent d'avoine (milieu surface lisse, pas très abondant n 3 de Gottlied et hyaline Shirling) Gélose glycérol- Bonne croissance, Absent Absent asparagine surface lisse, (milieu n 5 de crème Gottlied et Shirling) Gélose de Hickey et Bonne croissance, Absent Ambre brun profond Tresner légèrement vidée, brune Gélose de Bennett Bonne croissance, Absent Ambre brun surface ridée, ambre brun Gélose de Czapek- Croissance modé- Absent Absent glucose rée, surface lisse, jaune paille T A B L E A U II (suite 1) Milieu de Mycélium Mycélium Pigment Caractéristiques culture végétatif aérien scluble physiologiques Gélose glucose- Bonne croissance, Absent Traces, asparagine surface lisse crème avec aspect cireux, crème Gélose nutritive Croissance rare, Absent Ambré surface mince lisse, ambrée Gélose à la pomme Bonne croissance, Blanchâtre, traces Brun clair de terre surface légèrement ridée, brun clair Gélose amidon Groissance modérée.Absent Jaune paille Bonne hydrolyse (milieu n de surface lisse, Gottlied et jaune paille Shirling) Gélose peptone- Groissance modérée, Absent @ Production extrait de levure- surface lisse, d'H2S fer brune (milieu n 6 de Gottlieb et Shirling) Gélose à la tyros@ne Bonne croissance, Absent Brun noir sur Réaction à la (milieu n 7 de surface ridée, les bords de la tyrosinase positive Gottlieb et Shirling) brun noir culture forte production de pigment mélanoïde T A B L E A U II (suite 2) Milieu de Mycélium Mycélium Pigment Caractéristiques culture végétatif aérien soluble physiologiques Gélose au malate Bonne croissance, Absent Absent Forte digestion du de Ca surface lisse, ma@ate de Ca jaune paille Gélatine Absent Liquéfaction Bouillon au nitrate Brun foncé Réduction du nitrate Lait de tournesol Anneau brun Absent Pas de peptonisation pas de coagulation Gélose au lait Bonne croissance, Absent Brun, pas très Pas d'hydrolyse écrémé surface lisse soluble dans de la caséine le milieu T A B L E A U IV Comportoment chromatographique de la pyracrimycine A. Système solvant. Rf Butanol saturé d'eau 0,60 Butnol saturé d'eau + 2 pour cent d'acide p-toluene sulfonique 0,29 ButaNol saturé d'eau + 2 pour cent d'ammoniac 0,53 Butancl saturé d'eau 0,14 Chlorure d'ammonium à 20 pour cent 0,71 Butanol-méthanol-sau 40:10:20 + 1,07 pour cent 0,65 en poids de m6thylorange Butanol-méthanol-eau 40:10:30 0,71 Eau-acétone 1: 0,52 Acétate d'éthyle saturé d'eau 0,00 Chloroforme-m6thanol 9:1 (TLC) 0,22 Chromatographie sur papier : chromatographie sur Wh 1, anti- Diotique visualisé sur plaques de glose ensemencées avec So aureusO T.L.C. : chromatographie en ecuche mince sur plaques de gel de silice, tache décelée en lumiére ultraviclette. REVENDICATIONS 1 Nouvelle substance douée d'activité antibiotique, dénommée pyracrimyoine A, caractérisée par les propriétés suivantes - F. 215-216 C formule développée - poids moléculaire 138,17 - spectre d'absorption ultraviolet bande caracté ristique à 235 m (# = 22,000) en solution dans le méthanol - spectre d'absorption dans l'infrarouge : bandes caracteristiques à 3250, 3050, 1670, 1620, 1500 et 972 cm-1 - spectre de résonance magnetique protonique t pic à m = 138 e analyse centesimale après séchage sous vide couché carbone ........... 60,99 hydrogène ......... 7,50 azote ............. 20,20 oxygène (par différence) 11,31 2.Nouveau composé consistant en dihydrodérivé de la substance selon ia revendicationlet répondant à la formule développée 3. Pr@@édé pour la production de pyracrimycine A, caractérisé en ce que l'on cul@@@e Strept@myces eridan@ n.Sp. ATCC 21619 dans un milieu nutritif aqueux c@ntenant des sources assimilables de carbone, d'azote et des sels mineraux en conditions aérobies submergées jusqu@à @e que le mil@eu présente une activité antibactérienne sen@@ble due à la pyracrimycine A. 4. Pr@@édé pour la production de pyracrimycine A qui consiste à cultiver Strept@myces eridam n.Sp. ATCC 21619 dans un milieu nutritif aqueux c@ntenant des sources assimilables de carbone et d'azcte et des sels minéraux en conditions aérobies submergées pendant 20 à 120 heures à une température d'environ 20 à environ 45 C et à ré@uperer l'antibl@tique ainsi produit. 5. Procedé sel@n la revendication 4, caractérisé en ce que l'on recueille l'antibictique du bouillon de fermentation par filtration du bouillon, extraction de l'activité antibiotique du filtrat par un solvant non miscible à l'eau et séparation de la substance douée d'acti#ité antibiotique des autres métabolites au moyen de leurs solubilités différentes dans un hydrocarbure inférieur chlcré. 6 Procédé de préparation de la dihydropyra@rimycine A, caractérisé en ce que l'@n fait réagir le composé selon la revendication 1 avec un borohydrure métallique en solution dans un alcanol inférieur à une température variant entre environ 0 et environ 30 C pendant 2 à 18 heures. 7 A titre de médicaments nouveaux utiles comme antibiotiques n@tamment contre les bartéries à Gram positif et à Gram négatif, les substances antibi@tiques selon les revendications 1 et 2. 8. Compositionsthéra@eutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédients actifs, un médicament selon la revendication 7 e t m support p@armaceutiquement acceptable. 9. For@es pharmaceutiques appropriées pour l'administration des compositions selon la re@endication 8.