Brevet FR2133634A1 — publié le 19721201

La présente invention a pour objet un procédé industriel de préparation des acides désaxyribonucléiques dits ADN hautement polymérisés.- La matière première utilisée industriellement le plus 5 couramment est la laitance de poisson dont on connaît depuis longtemps la teneur élevée en acide désoxyribonucléique. Dans les spermatozoïdes, l'ADN est combiné à des protéines basiques, histones ou protamines, dont il convient de se débarrasser. Il est classique de procéder à l'élimination des lipides par les 10 solvants classiques, tels que l'alcool à 90° et l'acétone et de procéder à la dégradation des protéines par la soude caustique ou le chlorure de sodium employé à haute concentration. Certains procédés industriels ont fait, en outre, appel à l'action de la chaleur pour opérer la séparation des protéines, mais il devient 15 alors difficile d'éviter les risques inhérents à l'action de la chaleur iors de la séparation des deux chaînes de la molécule d'ADN par rupture des bases qui forment des ponts entre elles, même si l'on procède ensuite à un refroidissement ayant pour but de provoquer un réappariement - difficile à contrôler des deux 20 chaînes de la molécule.- On sait également d'une manière générale que la présence du phénol favorise l'action séparatrice des protéines par rapport aux acides nucléiques et que l'obtention d'ADN a été réalisée au laboratoire, en traitant des suspensions nucléo-protéidiques par 25 un volume égal de phénol pur. Mais les conditions de traitement dans ces procédés de laboratoire ne permettent pas de réaliser une fabrication dans des conditions suffisamment économiques et pratiques pour justifier une application industrielle.- Les travaux qui ont abouti à la présente invention ont 30 permis de déterminer certaines conditions dans lesquelles des rendements industriels satisfaisants peuvent être obtenus.- Les substances traitées, débarrassées de leurs lipides et préalablement soumises à l'action du chlorure de sodium sont, suivant l'invention, traitées par le procédé présentant les 35 caractéristiques ci-après : On utilise comme agent de déprotéinisation, pour libérer l'ADN, du phénol, non plus pur et en large excès comme dans certains procédés de laboratoire, mais seulement en quantité suffisante pour que la massé contenant la matière nucléo— 72 12/32 2 2133634 protéidiques en suspension soit saturée de phénol, plus un léger excès. Un petit excès de phénol ajouté volontairement à l'ensemble ainsi saturé facilite la dénaturation et la précipitation lente de la protéine libérée et le passage en solution de l'ADN.-5 La substance traitée est, préalablement à la déprotéinisa- tion par l'action du phénol, traitée par une solution de chlorure de sodium 2M, de préférence additionnée d'une faible quantité de fluorure de sodium inhibiteur des nucléases. Ce traitement salin a pour effet de libérer les molécules nuclé-protéidiques et de 10 favoriser l'action ultérieure du phénol.- Après traitement phénolique la solution visqueuse d'ADN, contenant en suspension la protéine dénaturée, est additionnée d'une matière telle que la bentonite, la célite, une terre d'infu-soires ou analogue pour faciliter la séparation par tous moyens 15 physiques tels que sédimentation, filtration sur filtre-presse ou centrifugation. De préférence, on utilise de la célité en présence de bentonite, ce dernier produit ayant un effet protecteur contre les nucléases.- Pendant l'ensemble du procédé la température est de préfé-20 rence inférieure à 25° et, en tout cas, largement inférieure à celle susceptible de produire une dégradation de la molécule (80° environ).- A titre d'exemple de fabrication, on pourra procéder comme suit : 25 Exemple de fabrication : 100 Kgs. de laitance de "hareng" congelés à -25° sont hachés grossièrement et traités par moitié de leur volume d'alcool à 95°. L'alcool élimine une fraction importante de lipides, variable d'ailleurs avec l'espèce de poisson d'où provient la laitance.-30 Le broyât obtenu est laissé au contact de l'alcool à la température ambiante pendant 24heures au minimum, après quoi il est égoutté, puis essoré sur filtre-presse (le solvant étant envoyé à la récupération).- Le résidu d'essorage broyé à nouveau plus finement est mis 35 en contact avec trois fois son volume d'une solution de chlorure de sodium 2M additionnée de 0,Q45M de fluorure de sodium. Le liquide épais et déjà très visqueux est agité lentement pendant une heure environ. Cette agitation est répétée plusieurs fois avant la phase opératoire suivante : 72 12732 3 2133634 Après 24 à 48heures, à la température ambiante on double le volume avec de l'eau distillée saturée par du phénol fraîchement distillé (75g. de phénol par litre d'eau) à laquelle on a ajouté du phénol en quantité suffisante pour assurer une saturation com-5 plète de l'ensemble constitué par la suspension phénolique, soit un excès de phénol de 25 g. par litre.- Le degré de saturation de l'eau en phénol, suivant la température, est donné dans les Tables de Constantes.- Le mélange est alors soigneusement homogénéisé par une agita-10 tion de 15 minutes qui est renouvelée plusieurs fois en 24heures. La solution visqueuse d'ADN tenant en suspension les protéines dénaturées est ensuite additionnée d'un peu de bentonite et d'une quantité plus importante de célite, ce qui a pour effet de provoquer la sédimentation lente de la fraction protéidique; notamment 15 on pourra employer en mélange 1 % de célite et 0,5 % de bentonite en suspension dans de l'eau distillée mesurée en quantité suffisante pour compléter le volume total à 1.000 litres.- On laisse le mélange au repos pendant un ou plusieurs jours, permettant ainsi à la protéine dénaturée de se séparer par sédi-20 mentation. On peut accélérer ou compléter le processus par passage au filtre-presse ou centrifugation.- Le liquide surnageant ou le filtrat, clair ou légèrement trouble, est versé dans un volume égal d'alcool à 95°. L'ADN polymérisé précipite en longues fibres blanches. Ces fibres 25 recueillies sont ensuite lavées avec des solutions alcooliques de titre croissant pour éliminer le chlorure de sodium entraîné et l'excès de phénol. On termine par un lavage à l'alcool à 95° et l'on sèche sur tamis ventilé en s'aidant d'un chauffage modéré ou en pratiquant un vide partiel.-30 Le rendement en ADN polymérisé est excellent; il est de l'ordre de 5 % de la masse traitée. L'analyse a donné les résultats moyens suivants : 15 % d'humidité, 11,50 à 13 % d'azote, 7,1 à 7,8 % de phosphore, moins de 0,5 $ de protéine résiduelle. L'absorption spécifique £ /P en lumière ultra-violette était de 35 l'ordre de 6400 à 6B00; 1'hyperchromicité variait de 28 à 36 %. La masse moléculaire déterminée par diffusion de la lumière était toujours supérieure à 2,5 x 10^ .- 72 12732 4 2133634 - REVENDICATIONS - 1.- Procédé d'obtention d'acides désoxyribonucléiques hautement polymérisés à partir de substances vivantes telles que la laitance de poisson, préalablement débarrassées des lipides et soumises à un traitement par sel alcalin, caractérisé par le fait 5 que l'on utilise, comme agent de déprotéinisation, pour libérer l'ADN, le phénol en solution aqueuse, la quantité de phénol étant suffisante pour que la masse contenant la matière nucléo-protéidique en suspension soit saturée de phénol, plus un léger excès.- 10 2.- Procédé suivant 1, caractérisé par le fait que la solu tion aqueuse de phénol contient environ 75 gr. de phénol par litre d'eau.- 3.- Procédé suivant 1 et 2.caractérisé par le fait que la suspension totale de matière nucléo-protéidique dans la solution 15 aqueuse de phénol est additionnée d'environ 25 gr. de phénol par litre.- 4.- Procédé suivant 1 caractérisé par le fait que le traitement préalable alcalin est opéré au moyen d'une solution de chlorure de sodium, de préférence additionnée de fluorure de 20 sodium.- 5.- Procédé suivant 1 et 4 caractérisé par le fait que le traitement alcalin est opéré au moyen d'une solution à environ 2M de chlorure de sodium et environ 0,045 M de fluorure de sodium par litre.- 25 6. - Procédé suivant 1 caractérisé par le fait qu'après traitement phénolique la solution visqueuse d'ADN contenant en suspension la pr&téine dénaturée est additionnée d'un adjuvant de séparation par voie physique tel que la bentonite, la célite ou la terre d'infusoire.- 30 7.- Procédé suivant 1 et 5 caractérisé par le fait que l'adjuvant de séparation est de la célite additionnée d'une moindre quantité de bentonite.- 8.- Procédé suivant 1 et 6 caractérisé par le fait que l'adjuvant de séparation est constitué d'environ 1 % de célite 35 et 0,5 % de bentonite.- 9.- Procédé suivant 1 caractérisé par le fait que pendant l'ensemble du procédé, la température est de préférence inférieure à 25" et en tout cas maintenue au-dessous de 80° C.-