Brevet FR2133748A1 — publié le 19721201

-1- 2133748 La mononucléose infectieuse est une maladie virale assez commune se produisant surtout chez les adolescents. Le diagnostic de cette maladie est basé essentiellement sur l'identification d'un anti-corps dans le sérum sanguin du malade, qui agglutine les 5 globules rouges du sang de mouton ou de cheval. En certaines circonstances, l'anticorps peut aussi agglutiner les hématies de boeuf. Cependant, comme des personnes normales possèdent parfois des anticorps ayant des propriétés similaires, il est nécessaire d'absorber ces anticorps naturels avant de pouvoir conclure que la réaction 10 d'agglutination est due uniquement aux anticorps spécifiques de la mononucléose. La présence de l'anticorps spécifique de la mononucléose peut être démontrée en faisant des dilutions en série du sérum du patient dans des tubes à essai, ou par simples contrôles microsco-15 piques (slide tests). Suivant le procédé original de dilution en série, du tissu de rein de cobaye broyé est ajouté au sérum à examiner pour absorber les anticorps naturels, non spécifiques. Les tissus de rein de cobaye ne sont toutefois pas la matière idéale pour ce but, car celle-ci ne peut absorber qu'une partie des anti-20 corps naturels, tandis qu'elle peut parfois enlever une partie de l'anticorps spécifique de la mononucléose. Puisque l'absorption avec du rein de cobaye seulement ne peut rendre l'essai rigoureusement précis, le procédé utilise simultanément une autre absorption. Cette absorption de confirmation est basée sur le fait que les 25 hématies de boeuf ont un effet inverse sur le sérum du malade, comparativement au tissu de rein de cobaye, c'est-à-dire qu'elles absorbent l'anticorps spécifique de la mononucléose, et laissent intacts les anticorps naturels. Après que ces deux absorptions simultanées ont été faites sur le sérum à examiner, on prépare dans 30 des éprouvettes deux dilutions en série du sérum, et on ajoute une certaine concentration d'une suspension d'hématies de mouton dans les tubes (les hématies de cheval peuvent également être utilisées). Si les globules s'agglutinent après absorption du sérum avec du rein de cobaye, mais ne le font pas après absorption de eonfirma-35 tion avec des hématies de boeuf, la réaction est considérée comme étant due à l'anticorps spécifique de la mononucléose, et le diagnostic de mononucléose infectieuse peut être établi. Dans le cas contraire, c'est-à-dire s'il n'y a pas d'agglutination après l'absorption avec du rein de cobaye, mais s'il reste quelque degré ^0 d'agglutination après l'absorption de confirmation, cela est dû 72 13207 -2- 2133748 aux anticorps naturels, non spécifiques. Ce procédé de dilution en tubes a été récemment simplifié par la mise au point d'un examen microscopique, parce que l'essai en tubes avec des dilutions et centrifugations est d'une exécution 5 assez laborieuse. Le principe de la plaque porte-objet du microscope ressemble à l'essai en tubes, mais au lieu de ceux-ci on utilise cette plaque, et le sérum du patient n'est pas dilué. Dans la pratique, on dépose deux gouttes de sérum sur une plaque porte-objet de microscope (ou un fond correspondant). On ajoute à la 10 première goutte du rein de cobaye très finement broyé, et à la seconde goutte des stromas d'hématies de boeuf. Ces stromas sont préparés par hémolyse des hématies de boeuf, et en enlevant l'hémoglobine. Après im certain temps bref, des hématies de mouton (ou, très fréquemment, de cheval) sont ajoutées aux deux gouttes. Dans 15 les cas positifs, une agglutination visible se forme généralement dans l'espace de 1 à 2 minutes. Les critères pour l'interprétation de cet essai sont les mêmes qu'avec le procédé des tubes. Comme le tissu de rein de cobaye ne donne pas satisfaction dans l'absorption et qu'une absorption de confirmation est néces-20 saire pour rendre l'essai spécifique, un absorbant meilleur a pendant longtemps été cherché. Un tel absorbant a été trouvé en 1955. On l'a préparé en détruisant les parties de la mambrane d'hématie de mouton qui portent le récepteur pour l'anticorps de la mononucléose, mais en même temps en laissant intacts les récepteurs pour 25 les anticorps naturels. Cela peut être effectué par une variété d'enzymes protéolytiques (au mieux par la papaïne), ainsi que par une neuraminidase. Les hématies de mouton ainsi traitées aux enzymes sont excellentes pour l'absorption, car l'élimination des anticorps naturels est complète, sans aucun effet sur l'anticorps 30 de la mononucléose. Ce principe agit très bien dans le procédé par dilution en tubes. Cependant, le procédé a aussi des inconvénients car les hématies de mouton traitées sont instables, comme l'est la papaïne. Cela nécessite de nouvelles préparations de l'absorbant pour chaque jour d'essais.rPour cette raison cet essai, très bon 35 théoriquement, n'est pas largement utilisé dans la pratique courante. On a maintenant découvert qu'il est possible de surmonter le problème de l'instabilité. Le nouveau procédé selon l'invention possède une plus grande spécificité et une sensibilité et il est . également plus simple que les essais actuels sur plaque qui sont 40 basés sur le principe de la double absorption. Dans ce procédé, on 72 13207 -> 2133748 traite une grande quantité d'hématies de mouton avec une enzyme, le traitement, les globules sont soigneusement lavées avec une soluté physiologique (0,9 % en poids de NaCl), et ensuite hémolys On enlève l'hémoglobine et on prépare une fine suspension des 5 stromas en résultant. On traite d'abord les globules avec une enzy et ensuite seulement on les hémolyse^ car la membrane des globule est ainsi distendue dans les hématies intactes, et par suite aisé ment accessible à l'enzyme. La fine suspension de stromas est sts pendant au moins plusieurs mois, surtout si un agent de conserva-10 tion approprié lui a été adjoint, et la suspension n'intervient ] dans la réaction finale-d'agglutination, puisque la suspension n Comme ce procédé sur plaque est à la fois spécifique et' simple, avec une bonne stabilité des réactifs, on peut l'utiliseï 15 dans des cas où on n'a pas d'accès commode à un laboratoire séro-logique. Ce procédé revient aussi moins cher que celui à deux absorbants. Plus de deux mille échantillons de sérum provenant de malades atteints de mononucléose infectieuse et de personnes nor-20 maies, en bonne santé, ont été examinés suivant ce procédé, et l£ grande spécificité et sensibilité de celle-ci a été ainsi prouvée. Les réactifs suivants sont nécessaires pour ce procédé : a) le sérum sanguin à examiner, b) l'absorbant, 25 c) le sang de mouton. Le sérum est extrait de tout le sang en laissant celui-c se coaguler. Après avoir été séparé du caillot, le sérum est chax à 56°C pendant 15 minutes pour détruire le complément. L'absorbant est préparé de la façon suivante : le sang 30 de mouton est mis dans un milieu anticoagulant pour empêcher la formation d'un caillot. Les globules sanguins sont lavés quatre fois avec une solution à 0,9 % de NaCl, en centrifugeant les globules entre chaque lavage. Une partie des globules de sang de mon ton est mélangée à quatre parties d'une solution à 0,9 % de NaCl 35 et on ajoute ensuite une partie de la solution de papaïne (celle-est préparée en dissolvant un gramme de papaïne sèche dans 100 ml de tampon de phosphate de 0,15 m, pH 5)4 j et à cette solution il est ajouté 0,5 m de cystéine pour activer l'enzyme). Le mélange est mis en incubation dans un bain d'eau à 37°0, jusqu'à ce que 40 les récepteurs de mononucléose soient détruits (habituellement ÇOPY 72 13207 -4- 2133748 60 à 120 minutes). Après ce traitement les globules sanguins sont lavés plusieurs fois avec 0,9 # de NaCl,après quoi on ajoute une partie égale de solution de digitonine (2,5 mg de digitonine dans 1 ml d'eau). Les hématies s'hémolysent et on lave les stromas en 5 résultant au moins cinq fois en centrifugeant la suspension à 12 000 T/minute pendant 15 minutes chaque fois. Les stromas lavés sont amenés à former une suspension (habituellement 10 à 20 %) dans une solution à 0,9 % de NaCl qui est tamponnée à pH 7,2 avec un tampon de phosphate de 0,02 m. Comme agent de conservation, on 10 a ajouté de l'azide de sodium dans une proportion de 1 à 2000. Le sang de mouton est mis dans un milieu anticoagulant (par exemple solution d'Alsever). Dans la pratique l'essai est conduit de la façon suivante. . On dépose une goutte de sérum à examiner sur un support convenable 15 (par exemple une plaque porte-objet d'un microscope). On ajoute une goutte de l'absorbant et on mélange soigneusement ces deux j gouttes à l'aide d'une baguette d'application en verre ou en bois. Après une minute d'incubation à la température ambiante, on ajoute une goutte de sang de mouton, que 11 on mélange à nouveau en incli-20 nant légèrement la plaque de côté et d'autre dans les deux sens pour achever de mélanger les globules avec les liquides. Une agglutination apparaîtra au bout de 1 à 2 minutes si l'échantillon contient des anti-corps de mononucléose. COPY 72 13207 -s- 2133748 REVENDICATIONS 1- Procédé de préparation d'un absorbant stable pour le diagnostic de mononucléose infectieuse à partir de sérum sanguin dans lequel on traite des globules rouges de sang d'un mammifère 5 avec une enzyme protéolytique ou une neuraminidase afin de détruire les récepteurs de mononucléose, procédé caractérisé en ce que l'on hémolyse les hématies par addition d'un agent hémolysant, on sépare l'hémoglobine des stromas en résultant et on prépare une fine suspension des stromas dans du sérum physiologique, cette suspension 10 étant exempte de globules sanguins qui gênent le diagnostic. 2- Procédé selon la revendication 1, dans lequel on traite des globules rouges de sang de mouton avec l'enzyme protéolytique ou la neuraminidase. 3- Procédé selon la revendication 1, dans lequel on traite 15 des globules rouges de sang de cheval avec l'enzyme protéolytique ou la neuraminidase. 4- Procédé selon la revendication 1, dans lequel on lave le: globules rouges avec du sérum physiologique, et on hémolyse après le traitement à 1'enzyme. 20 5- Procédé selon la revendication 1, dans lequel on ajoute un agent de conservation à la fine suspension des stromas. 6- Procédé selon la revendication 5, dans lequel on ajoute l'azide de sodium comme agent de conservation. 7- Procédé selon la revendication 1, dans lequel on utilise 25 une solution aqueuse de digitonine comme agent hémolysant. 8- Procédé de diagnostic de la mononucléose infectieuse à partir du sérum sanguin à l'aide de stromas d'hématies obtenus conformément au procédé de la revendication 1 et utilisé comme absorbant, caractérisé en ce qu'on mélange le sérum sanguin à 30 examiner avec l'absorbant exempt de globules sur une plaque et on ajoute ensuite du sang de mammifère pour vérifier si l'agglutination a lieu, ce qui indique alors que des anticorps de mononucléose sont présents. 9- Procédé selon la revendication 8, dans lequel on utilise 35 comme sang de mammifère du sang de mouton dans un milieu anticoagulant. —GOPY