Brevet FR2123167A1 — publié le 19720908

La présente invention concerne un procédé de protection des volailles et des porcs contre l'action de micro-organismes du type Pasteurella. Selon ce procédé, on administre aux volailles et aux porcs une dose efficace de composés de formule dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical tétra hydro furylacétylamino. Les volailles et les animaux domestiques sont susceptibles d'être infectés par divers germes pendant leur croissance et de devenir malades. Les volailles ou poulets peuvent être infectés par la Pasteurella multocida et cette infection est souvent mortelle. Par ailleurs, les porcs peuvent être infectés par divers micro-organismes du type Pasteurella, par exemple la Pasteurella multocida et contractent ainsi des maladies subaiguës ou chroniques.Or on a observé que les composés définis ci-dessus présentent une action préventive et thérapeutique très efficace pour lesvolailles et les porcs qui sont infectés par des micro-organismes du type Pasteurella. Les composés en question ont une action anti-bactéricide remarquablement efficace vis-à-vis des divers micro-organismes du type Pasteurella, par exemple Past.hemolytica, Past. multocida, Past.pastis et Past. tplarensis, en particulier Past. multocida. Ces composés peuvent être conditionnés en doses efficaces selon des méthodes connues en combinaison avec les divers véhicules et/ou adjuvants usuels. Selon un mode de réalisation particulièrement approprié, on ajoute aux aliments des poulets et des porcs un médicament en poudre contenant comme ingrédient efficace, 2 à 10 % en poids de l'un quelconque des composés susmentionnés que l'on a dispersé dans un excipient par exemple la farine de mals, le lactose, l'amidon, le talc et produits analogues. Il peut également être administré commodément sous forme de médicament liquide associé à un agent mouillant, un agent solubilisant, un agent tensio-actif, par exemple le polyo xyéthylène glycol, la carboxyméthylcellulose sodique, la gly cérine et produits analogues, ou en suspension par exemple dans une décoction d'écorces d'acacia. La dose efficace de ces composés est comprise normalement entre 10 et 200 mg, de préférence entre 50 et 180 mg. Quand on les ajoute aux aliments de la volaille ou des porcs, on le fait dans les proportions respectives de 0,005 à 0,01 % du poids et 0,01 à 0,02 % du poids des aliments. La durée de la période d'administration de ces composés varie en fonction de la gravité des symptômes, cependant, une durée d'administration dans des conditions normales d'environ 7 à 30 j est suffisante. L'effet du produit devient apprdciable à partir du quatrième ou cinquième jour après la première admi nistration, ces composés protègent donc très efficacement les poulets et les porcs contre les maladies provoquées par les micro-organismes du type Pasteurella. Les points de fusion et les concentrations minimales inhi- bitrices (CMI) in vitro des composés selon l'invention vis-à-vis de la Pasteurella multocida sont indiqués sur le tableau 1 ci après. On voit d'après les indications fournies que ces composés ont une action antibactéricide très puissante. (Tableau 1, voir page 3). La concentration minimale inhibitrice est déterminée de la manière suivante : on ajoute à un milieu de culture dit wbouil- lon de triptosoya" (milieu de culture obtenu en dissolvant 17 g de tripton, 3 g de peptone de soya, 2,5 g de glucose, 2,5 g de phosphate acide de potassium et 5 g de chlorure de sodium dans 1 litre d'eau, dont le pH est égal à 7,3), 10 % de son volume de sérum de vache.On dissout séparément le produit selon l'invention dans du diméthylaulfoxyde et on ajoute la solution au milieu ci-dessus à raison de 2 volumes % dudit milieu, c'est-à dire 25 /ml. Ce milieu est dilué à diverses concentrations conformémentvà des procédés déjà connus. À l'aide d'une seringue, on inocule v ml de chacun de ces milieux de culture à des con centrations variées, une goutte d'un liquide contenant des ger mes cultivés dans le milieu préparé à l'origine (ne contenant pas le produit selon l'invention) pendant 20 h, opération suivie de 48 h de traitement dans un incubateur à 3700. Ensuite, on vérifie la turbidité de chaque milieu de culture pour apprécier si les germes se sont propagés. Tableau I Concentration inhibitrice minimale (in vitro) I R: H B r -COCH,-1H I Point de fusion Point de fusion 133 - LoC 174,5 - 5,50C 133 - 4 C 174,5 - 5,5 Microorganisme Aspect : Aspect : Bspect : Bspect : colomnaires aciculaires Pasteurella 4,0 1,0 multocida On a démontré par des expériences avec les souris que les produits selon l'invention ont une activité trba stable quand ils sont administrés à des animaux.Si ces produits sont administrés par voie orale à des souris de souche C3H, dont le corps pèse environ 18 g, et qui ont été infectées artificiellement par des Pasteurella multocida inoculées dans leurs cavités abdominales, les doses efficaces à 50 % (ED 50) sont celles indiquées sur le tableau 2 (voir page 8 ). I1 est évident, d'après ce tableau, que l'action de ces composés est notablement supérieure à celle des composés analogues comportant des groupes NH2 ou -NHCO R en seconde position sur le noyau d'oxadiazole. On mesure et détermine la ED50 de la manière suivante : on cultive des souches de Pasteurella multocida p-1059 dans un bouillon de triptosoya contenant 5 % de sang de lapin pendant 20 h à 37 C, et on inocule 0,2 ml de chaque solution diluée au millionième de cette culture dans la cavité abdominale de souris (âgées de 4 semaines, pesant 15 à 18 g). Immédiatement après l'inoculation mentionnée ci-dessus, par une seringue, la dose à administrer de chaque produit est broyée dans un mortier d'agathe, mise en suspension dans une décoction d'écorce d'acacia et 0,4 ml de ce produit sont administrés par voie orale à chaque souris. Un groupe d'essai comprend 5 souris. D'après le nombre de souris survivant 5 j après cette dernière inoculation, on calcule la ED 50 par le procédé de Behrens-Kaerber. On observe de plus que les composés de la présente invention possèdent les propriétés très intéressantes ci-après a général, les dérivés du nitrofurane sont difficilement solubles dans l'eau et, quand ils sont administrés par voie orale à des animaux, ils ne sont que faiblement absorbés par leurs intestins. Par conséquent, seule une faible proportion du produit administré passe dans le sang des animaux. Au contraire, les composés selon l'invention sont plus solubles dans l'eau que les dérivés connus du nitrofurane et peuvent passer dans le sang des animaux auxquels ils sont administrés en atteignant des concentrations plus élevées.Les solubilités des produits selon l'invention et leurs concentrations dans le sang des rats auxquels ils ont été administrés par voie orale sont comparées dans le tableau 3 (voir page 9 ) avec les résultats semblables concernant des composés analogues hors du cadre de l'invention. La concentration dans le sang est mesurée comme suit Chacun des produits est mis en suspension dans une décoction d'écorce d'acacia à 5 %, à raison de 10 mg/ml et administré par voie orale à des rats mâles pesant environ 150 g chacun, à là dose de 100 mg/kg. Àu bout de 2, 3, 8, 24 et 48 h après cette administration, on anesthésie ces rats à l'éther et on prélève leur sang du coeur à l'aide d'une seringue. Un groupe d'essai est constitué par trois rats. On centrifuge le sang après coagulation et on sépare la phase de sérum que l'on conserve à -200C. La concentration de chaque produit dans le sérum est déterminée par un essai biologique. Le milieu pour essai biologique (qui est préparé en dissolvant 0,6 ffi de peptone, 0,3 % d'extrait de levure, 0,15 % d'extrait de viante et 1 * d'agar-agar dans liteau distillée et en ajustant le pH de la solution à 7) est stérilisé et maintenu à 500C. On ajoute et mélange audit milieu 2 ml de Nain03 à 1 %, 3,8 ml de bleu de méthylène à 0,1 % et 0,2 ml de liquide d'essai contenant des germes (qui est préparé en cultivant de l'Escherichia coli 8057 dans un bouillon normal pendant 20 h à 370C) pour 100 ml dudit milieu, et on verse 2 ml de chacun des mélanges dans des tubes à essai de diamètre intérieur 7 mm.On laisse le milieu de culture se coaguler en le laissant reposer à la température ambiante pendant environ 30 mn. On superpose, à chaque fois, à ce milieu, dans chaque tube à essai, 0,2 ml du composé à essayer dilué à diverses concentrations normales 16, 8, 4, 2, 1, 0,5; 0,25; 0,125, 0,062; 0,031; 0,016 et 0,008 Y /ml) c'est-à-dire qu'on superpose un échantillon dans chaque groupe de trois tubes à essais. Ensuite, on laisse le produit pénétrer dans le milieu en le laissant dans un réfrigérateur pendant 2h, opération suivie d'une incubation à 370C pendant une nuit.La longueur de la zone d'inhibition, dans laquelle le bleu de méthylène n'est pas réduit, est mesurée pour tous les tubes à essais, de manzè- re à obtenir une courbe étalon à partir de laquelle on calcule la concentration du produit dans chaque sérum. De plus, les doses léthales à 50 % (IID 50) des composés selon l'invention sont très élevées, démontrant de manière concluante la très grande sécurité de ces composés. Les LD 50 des composés selon i' invention, flottant et en suspension dans une décoction aqueuse à 5 * d'écorce d'acacia, déterminées lorsqu'elles sont administrées par voie orale à des souris du type C3H pesant chacune environ 18 g sont indiquées sur le tableau 4 (voir page 6). Ces indications mettent en évidence la très faible toxicité de ces produits. Comme on l'a indiqué, les produits selon l'invention ont non seulement une activité anti-bactérienne considérable in vitro, mais empêchent toute infection par Pasteurella multocida beaucoup plus efficacement que les dérivés analogues du nitrofurane quand ils sont administrés à des poulets et des porcs. De plus, ces composés ont une action immédiate; une très faible toxicité et, par conséquent, de grandes marges de sécurité. Par conséquent, ces produits peuvent protéger très efficacement les poulets et les porcs de toute infection par Pasteurella. Exemple 1 : On ajoute les produits selon l'invention aux aliments de poulets âgés de 14 j. Un groupe d'essai est cons Tableau 4 Toxicité Composé LD50 (mgkg) Composé ID50 (mg/kg) oP O i 4 CH - C X 1,373 1,646 Oi,J titué par 10 poulets. Le second jour de l'administration, on inocule à chaque poulet par une injection intramusculaire dans la patte gauche, 0,2 ml d'une culture diluée au 1/10 000, pour inoculation, de Pasteurella multocida cultivée dans un bouillon de triptosoya contenant 10 * de sang de lapin pendant 24 h. L'administrtion de ce produit est continuée pendant 5 j après l'inoculation et on détermine l'action de ce composé par la proportion de poulets survivants. Les résultats sont indiqués sur le tableau 5 ci-après (voir page 10 ). Plus précisément, les poulets nourris avec un aliment contenant 0,01 * des produits selon l'invention sont protégés de l'infection et survivent dans les proportions de 100 % et 90 %, tandis que ceux nourris avec des aliments contenant 0,005 * de l'un ou l'autre de ces produits survivent dans la proportion de 60 %. Ea opposition nette avec ce qui précède, les poulets auxquels on administre des produits témoins antérieurement connus sont tous infectés et meurent. Exemple 2 : On administre de façon continue à des pourceaux métis originaires du Berkshire, et devant être vendus à un poids unitaire de 90 kg, un produit selon l'invention mélangé à leurs aliments dans la proportion de 0,015 %. On a choisi trente pourceaux provenant de quatre portées de même âge et les a subdivisé en dix groupes d'essai, chacun comportant trois pourceaux. Les essais ont commencé le 73ème jour après leur naissance et on a déterminé le nombre de jours nécessaires pour qu'ils atteignent 90 kg, l'assimilation des aliments et les lésions pulmoniares de ces pourceaux. Les résultats obtenus ont confirmé que les pourceaux auxquels on a administré les produits selon l'invention ont permis d'obtenir des résultats bien supérieurs -à ceux obtenus avec les groupes témoins aux aliments desquels on avait ajouté les produits témoins, sans parler du groupe nourri uniquement avec les aliments de base. Plus précisément, le nombre de jours nécessaires pour que les pourceaux atteignent le poids de 90 kg était moindre pour les groupes d'essai nourris avec les produits selon l'invention. Le macro-examen anatomopathologique des poumons des pourceaux après leur abattage confirmait l'action considérable des produits selon l'invention, les dites lésions pulmonaires étant moins importantes avec les groupes traités qu'avec les groupes témoins. De plus, une étude bactériologique effectuée sur ces pour ceaux a permis de déceler des micro-organismes du type Pasteurella parmi les pourceaux des groupes témoins, mais aucun de ces micro-organismes n'a été décelé dans les poumons des pourceaux des groupes d'essai traités par les produits selon l'invention. (Tableau 6, voir pages 11 et 12). Tableau 2 ED50 avec des souris infectées par Pasteurella multocida o Ln Ln Ln \I 0 m 8 X X X X 800 400 E 100 50 m de l'invention souris ayant survécu 5/5 3/5 1/5 0/5 U souris de E a > O Ln Ln A0 El)50 (mg/kg) cu o Composé de l'invention souris ayant survécu p souris a s d Or H Q, a, CH d ccoCHÇIH m h X 68 Composé de ~ 8 ~ ayant q, Q > 2/5 0/5 0/5 P bD P uo LA az souris de 8 3 3 R 3 3 Q 3 r R 466 Composé de l'invention souris ayant survécu 0/5 0/5 0/5 souris de l'essai 8 flLo très U iN R 4 n14 n &num; p~v o v tout S t ux 11 " H LY ,, - L tV bO ç o b: &commat; m o o rd V e O rd 8 e 8 c)S ò 2 4 S > 2 Xo ffi N N N o o o o Tableau 3 Concentration dans le sang du rat (# /ml) o ui 03 D T I o o o o k O 0 0 d 1 rl cu -jruj o o cu r I r cn cu O 0 h a après * S Pa tion du composé Ldd c n n a > 7-r I cu Composé de Ô Ln o co o 28,2 O 0,15 0,12 0,08 0,02 0,0I6 Composé o o vs 11,0 O 6,3 5,6 2,1 ------ H OJ O (M uo p cx, M GOQ 3,2 O 0,03 0,027 0,04 0,024 0,016 0NwJLoCH = C u témoin 7,5 O 0,025 0,02 0,016 0,016 ÂO,016 ' 1t' NHCOCH3 o vo 1 st vO xa cu V 2 ffi 2 R 2 0 2 O sO oO VO V Tableau 5 m I jmkm I I I Composé O O O à la Nombre de Nombre de poulets ournture k-C oPI Composé de l'invention 0,01 10 100 (%) oJLCH jazz O O 0,005 10 O MS- r r r r r r r 0,005 k 60 rl 0go O O O O O 0o r R 4 0 O O O O O O O 0,01 H 10 O m e q e mP: a1 8 EI 4 2 m 4 m &verbar; m Ft m v 2 4 2 O 2 wo 2 o D $ v A o > o Tableau 6 1 d 1 o -p d I-r a, m ;f - u M rt de l'invention Composé N Alimentation ^ J n ~ C AOh-u mX 1-r d II II rf Iin H R:: 0 r O O nO N KE r I=I o o MI I rc\ ms & o X sO O N o P3 d d II $ " lonnage) Nombre moyen de jours après la naissance début 73 73 73 73 fin B 169+7,0 c o\ H I ,, ~R ~ saine pour porter à 95+6,3 96+6,8 99+7,5 110+7,4 90 kg le poids de chaque porc oids moyen Début 20,6+3,5 20,5+3,8 20,5+3, n (M du corps (kg) 0N 90,2 t9 O 0J^ O à suivre ,6n o h O o, P g e ra n h o n n oR Y o e so d O tQ O X X 4D A A 4 o c) e > 2 h h 02 p h h . &commat; P 06 o N o d H d a o A-d r A Cs o n n o o n ni rl X P; xo rl h A h o h o X X rò 4 p h so h e o f3 =1 Sd o o A o tQ &commat; r P4rl X C4 rl O O r1 O X O O h p n h h&commat;t h o wp xo^ d t9 ,Q h n h .91 W e O bD i S X A X d X fl o o U o 40S o: &commat; u ti t o PiX Tableau 6 (suite) d o -ri ;t O cO a, In a\ t cdm cd (U K\ U) O N\ n par jour 732,63 726,04 703,03 634,54 o e nourriture par cl v porc (kg) aux de conversion de la o/Q\ U L I Lésion Ps B naire db 3 I I O ormale 5 6 2 3 H 0 . A e n X 4 ~ m t0 tD O m l ~ VS sM CU v KE v r n U &commat; n h d o n a A n &commat; X &commat; &commat; (D o h o h a n H > ,-=;, Pa ed d g R h 4 O O A u} &commat; i dD S h S hi h h Z h d h o o o 0 hd, > S ha . Q S H H rl 4 bO o o r1 4-d X o n n nS d hç o (D Z S h &commat; d s &commat; n hç n a Q hS X O h o o o h ^ El. Eh n n oR d G m &verbar; a o o A O Vg Ed - R E V E N D I C A T I O N S 10- Médicament destiné à protéger les volailles et les porcs contre des micro-organismes du type Pasteurella, notamment la Pasteurella multocida, caractérisé par le fait qu'il comprend un composé de formule dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical tétrahydrofurylacétylamino. 2.- Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la dose efficace administrée aux volailles et/ou aux porcs à protéger, varie entre 10 et 200 mg. 3.- Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est ajouté à la nourriture des animaux pour être administré par voie orale.