Brevet FR2122498A1 — publié le 19720901

La présente invention concerne les hormones stéro'fdes commandant les métamorphoses des insectes, et plus spécialement un procédé pour leur obtention et leur utilisation particulière comme insecticides dans un but biologique, 5 Parmi les hormones de métamorphose des insectes concernées par la présente invention, certaines étaiént déjà connues dans le passé, comme la crustecdisone (ou ecdistérone), la makistérone A et l'ecdlsone.-Une autre, la muristérone, qui sera définie plus en détail ci-après, n'a jamais été décrite ou identifiée précédemment. 10 La crustecdisone, ou hexahydro-2p,3p,14a;20RJ22R,25 50- OH 20 a été antérieurement isolée pour la première fois chez un crustacé, le Jasus Calandei, (Chem. Com. 1966, page 37), en quantité correspondant à 2 mg d'hormone pure pour une tonne de crustacés. Elle a également été trouvée dans le Bombyx Mori (ver à soie), en même temps que l'ecdisone. Elle est 25 aussi présente chez l'insecte Antherea pernyi (200 mg obtenus à partir de 31 kg de nymphes). Elle a été isolée à partir de la plante Podocarpus elatus, avec des stérols comme impuretés, (Chem. Com, 1966, page 905) à raison de 0,05 % en poids de la matière végétale (Chem. Com. 1968, page 971). On l'a aussi trouvée dans le P. macrophyllus (T, Let. 1968, page 3883), ainsi que 30 dans le Polypodium vulgare L. (de 0,07 % à 1,0 % du poids sec5 Phytochemistry 9, 1247 (1970). La makistérone A. autrement dit l'hexaliydroxy-2p,3p,14a,20R,22R, 25 méthyl-24 5-g-cholestène-7 one»63 de formule : 72 01595 2 2122498 a été trouvée dans le Podocarpus macrophyllus. en quantité de 0,001 % (T. Let. 1969, page 3887). Egalement dans le groupe des stéroîdes polyhydroxylés, l'ecdisone, de formule : OH l i a été isolée et identifiée pour la première fois par A. Butenandt, P. Karlson et leurs collaborateurs (Ann. Chem. 662,1 (1963)). C'est de là que sont parties les recherches concernant les propriétés de ces stéroîdes, et leurs effets sur le cycle biologique des insectes. Dans les dernières années, la littérature technique, en particulier les brevets, a décrit divers procédés pour la préparation de ces hormones. Cependant, le problème essentiel, et jusqu'à maintenant non encore résolu, est celui de leur production sur un plan industriellement admissible, c'est-à-dire avec des rendements élevés et pour des prix de revient raisonnables. Dans la pratique, tous les procédés antérieurement étudiés ont comme inconvénients d'être très coûteux, et surtout très complexes. 72 01595 3 2122498 Il a maintenant été trouvé, et cela constitue l'objet de la présente invention, que ces hormones peuvent être obtenues, tant à l'état pur que sous forme d'extrait partiellement purifié, et en quantités industriellement et économiquement acceptables, par extraction de plantes de 5 la famille des Convolvulacées, de la tribu des Ipomées, du genre Calonyction (Choisy) Hallier f. Il a en particulier été trouvé que l'extraction des hormones stéroîdes en question donne des résultats particulièrement intéressants avec des plantes parmi celles mentionnées ci-dessus, poussant à l'état sauvage dans la zone montagneuse subtropicale comprenant la région sud-himalayenne 10 de l'Inde, connues sous le nom indigène de "Kaladana", terme qui recouvre en réalité plusieurs espèces similaires dont la classification est discutée. En réalité, selon la publication "Chopra's Indigenous Drugs of India, U.N. Dhur & Sons Private Ltd, Calcutta, 1958, page 51, il s'agit du végétal désigné scientifiquement sous le nom de "Ipomea Hederacea" (I.P.)". 15 Contrairement à cette opinion, d'après le J. Pharm. Se., Vol. 56, n° 6, page 771, 1967, dans le texte d'un article de Gupta, la Kaladana serait le nom communément attribué à l'Ipomoea muricata» Par ailleurs, dans le "British Pharmaceutical Codex 1949", page 459, il est dit que la Kaladana est constituée par les graines desséchées d'Tpomoea hederacea. 20 La Kaladana intéressante dans le cadre de la présente invention est une plante appartenant certainement à la famille, à la tribu et au genre indiqués précédemment, et présentant les caractères suivants : Liane vivace à branches volubiles très longues ramifiées, tendres mais ligneuses à leur base, avec un ou deux sillons longitudinaux 25 garnis de rangs serrés de pointes tendres courtes légèrement recourbées vers le bas, à extrémités arrondies et non piquantes. Voisine de C. muricatum (L) G. Don, elle en diffère par ses feuilles alternantes, à pointes en forme de coeur, ni lobées, ni sagittéés, à bords légèrement ondulés et sinueux et d'assez grande taille (jusqu'à 25 cm 30 de long et 22 cm de large), à pétiole de longueur comprise entre la moitié et le tiers de la longueur de la feuille et avec à la base un court renflement légèrement velu. Les fleurs sont au nombre de deux ou trois, sur un pédoncule axi11aire, avec une corolle en forme de cône allongé, blanchâtre plus court 35 que chez le C. muricatum (environ 7 cm), un bord en entonnoir légèrement pentalobé d'environ 8 cm de diamètre, de couleur mauve ou rose plus ou moins foncée, s'ouvrant la nuit, étamines et pistil ne dépassant pas hors de la corolle, un calice à lobes pointus et serrés, mais s'ouvrant en devenant ovales et légèrement divergents lors de la maturation de la capsule. 72 01595 2122498 La capsule est tombante en forme de coeur, contenant de deux à quatre graines, en forme de gousse (face externe bombée et face interne aplatie), à surface granulée, duveteuse, ayant en moyenne 7 mm de long et 6 mm de large. 5 Au point de vue de son habitat, la plante pousse naturellement dans la région montagneuse pré-himalayenne de l'Inde et du Pakistan oriental jusqu'à une altitude de 1500 m. Un remède, formé par les graines, est utilisé localement comme purgatif, la poudre étant également employée comme fébrifuge. Afin d'éviter toute incertitude, les figures annexées repré-10 sentent respectivement : - la figure 1, un rameau de la plante en question, avec feuilles et fleurs, - la figure 2, les capsules de graines à maturité, - les figures 3 et 4, les graines, respectivement de profil 15 et de face. Comme il a été dit plus haut, l'invention concerne les hormones stéroîdes énumérées, capables d'agir sur les métamorphoses des insectes. Le point le plus important de- l'invention est le fait que, en partant des portions de Kaladana riches en les hormones considérées, et 20 en particulier des graines, il est possible d'obtenir ces hormones en quantités importantes, pour un prix de revient acceptable sur le plan économique et industriel. Un second point de l'invention réside dans la possibilité d'isoler, à partir d'un extrait de Kaladana, par un procédé rapide et simple, 25 et avec des rendements élevés, par exemple 0,5 % à 1 % par rapport aux graines fraîches, les hormones elles-mêmes à un degré très élevé de pureté. Selon un aspect de l'invention, on a pu identifier et isoler, à partir de l'extrait de Kaladana, une substance nouvelle, ayant également la structure d'un stéroîde polyhydroxylé, à laquelle on a donné le nom de 30 "muristérone", et dont les propriétés et caractéristiques seront précisées dans la suite de la présente description. Selon un aspect non moins important de l'invention, il a été trouvé que l'extrait obtenu à partir de la Kaladana possède un pouvoir insecticide puissant, de type biologique et à gamme d'application étendue, possédant en 35 outre, secondairement, un pouvoir répulsif important vis-à-vis des insectes. En dehors de leur capacité de protection des cultures agricoles, les stérols polyhydroxylés faisant l'objet de l'invention trouvent des applications dans les domaines pharmaceutiques et vétérinaires, déjà explorés par les techniques antérieures. 72 01595 2122498 En ce qui concerne tout d'abord le procédé d'extraction appliqué à la Kaladana, à partir de certaines portions de la plante, en particulier les graines, ces portions sont séchées, par l'air ou par d'autres agents convenables, puis broyées dans un moulin de façon à obtenir une farine 5 grossière, qui est ensuite dégraissée à froid par un solvant organique, de préférence l'éther de pétrole ou une essence légère (passant à 80-90°C), pour la débarrasser des graisses qu'elle contient. Le produit est ensuite extrait, complètement par un mélange formé d'un hydrocarbure aliphatique chloré solvant, d'un alcool aliphatique 10 et d'une base azotée. L'extraction est de préférence répétée plusieurs fois à la température ordinaire et sous agitation, puis avec le seul solvant aliphatique chloré seul, toujours sous agitation et à la température ambiante. Dans le cas d'un procédé discontinu, le total de ces extractions dure environ douze heures. Il est de toute façon considéré comme achevé lorsque 15 l'essai de Liebermann pour la reconnaissance des stéroîdes se révèle négatif sur le dernier extrait. Bien entendu, l'extraction peut être effectuée par un procédé continu, suivant les modalités bien connues des spécialistes de cette question. Les extraits sont réunis, et évaporés à petit volume à une 20 température ne dépassant pas 40°C. Il se sépare du produit concentré, laissé au repos, un produit cristallin qui sera dans la suite appelé "cristallisât total T"v et contient les hormones recherchées. Le mélange d'extraction du produit comprend, comme" il a déjà été dit : 25 (a) Un hydrocarbure aliphatique chloré solvant, qui est de préférence le chloroforme, bien que l'on puisse également employer le tétrachlorure de carbone, le chlorure de méthylène ou le trichloréthylène ; (b) Un alcool aliphatique contenant dans sa molécule de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence le méthanol ; 30 (c) Une base azotée, qui est l'ammoniaque ou une aminé. Les rapports mutuels entre les divers constituants du mélange sont choisis en fonction des composants du mélange lui-même. Dans le cas du mélange chloroforme-méthanol-ammoniaque, les proportions en volumes sont de 9 : 0,9 : 0,1. 35 II doit être bien entendu que des modifications et variantes peuvent être apportées à ces indications, tant en ce qui concerne les solvants et réactifs employés pour l'extraction, que pour les conditions de celle-ci, 72 01595 2122498 qui constitue par elle-même une opération bien connue dans la spécialité considérée. Pour identifier les hormones stéroîdes contenues dans le "cristallisât total T", celui-ci est d'abord lavé à froid par une petite 5 quantité de chloroforme, puis séché et analysé. L'examen chromatographique sur couche mince de gel de silice G, en employant comme solvant un mélange chloroforme-éthanol-eau (50 : 19 : 1), et comme révélateur des taches le réactif vanilline-acide sulfurique, en chauffant à 120°C pendant 10 minutes, montre que le précipité 10 cristallin mentionné contient divers composants, parmi lesquels la crustecdisone et la makistérone A. Parmi les autres taches, on note : une tache bleue, avec Rf = 0,22, une tache violette, avec Rf = 0,20, caractéristique de la makistérone A, et une tache jaune, avec Rf = 0,15, caractéristique de la crustecdisone. 15 En rapport avec la tache bleue mentionnée, il a été trouvé que le cristallisât total T contient, en dehors de la crustecdisone et de la makistérone A, d'autres stérols polyhydroxylés, parmi lesquels on trouve en quantités notables, aussi bien l'ectisone qu'une substance nouvelle : la muristérone. 20 On désigne sous le nom de muristérone un nouveau stérol polyhydroxylé, dont les propriétés confirment l'appartenance à la famille des stérols polyhydroxylés, décrits plus haut. Le nouveau stérol polyhydroxylé est caractérisé par les propriétés suivantes : 1°) Son spectre d'absorption à 1'infrarouge dans leKBr présente 25 des maxima caractéristiques pour des nombres dlondes de3600-3200, 1660, 1630 cm ^ ; 2°) Le spectre d'absorption ultraviolet dans le méthanol — —20 présente une A. max = 235 mm (£-= 9050). Le pouvoir rotatolre est ]_ «_/_ = 4- + 49,6°—ia(c = 1,02 dans la pyridine). Le produit, traité par l'acétone en présence d'une faible 30 quantité d'un catalyseur acide, par exemple l'acide phosphomolybdique, donne un mélange de mono- et de di-acétonides, que l'on peut séparer par chromato-graphie sur une colonne de gel de silice, en éluant par le mélange chloroforme-éthanol dans le rapport 99 : 1 d'abord, puis dans le rapport 98,5 : 1 ensuite (rapports en volume). Avec le rapport 99 : 1, on obtient le dl-acétonide. 35 Celui-ci est acétylé par l'anhydride acétique dans la pyridine, en donnant un mono-acétate de di-acétonide, fondant à 208-214° (au banc de Kofler), après recristallisation dans l'hexane. Par élution avec le mélange chloroforme- 72 01595 7 2122498 éthanol à 98,5 : 1,5 on obtient le mono-acétonide, qui est acétylé de la même façon que le précédent, en donnant un mélange de tri-acétate et de di-acétate du mono-acétonide. Ces derniers sont séparés par chromatographie sur alumine, en éluant successivement par les mélanges chloroforme-éthanol 5 d'abord à 99 : 1, puis à 98,5 : 1,5. On obtient dans le premier cas le tri-acétate de mono-acétonide, fondant à 255-260°C (au Kofler) après recristallisation dans le mélange acétate d'éthyle-hexane, et dans le second cas le di-acétate de mono-acétonide, fondant à 140-144°C après recristallisation dans l'hexane. 10 Comme il a été indiqué plus haut, la présente invention fait aussi connaître un procédé rapide et avantageux pour l'isolement des hormones mentionnées. Le cristallisât total T, contenant la fraction des stérols polyhydroxylés, est étudié par chromatographie sur couche mince, avec le 15 système de solvants : chlorure de méthylène:25, méthanol:5, benzène:5, réactif à la vanilline à 3 % dans l'alcool + 0,5 ml d'acide sulfurique concentré, pendant 10 mn à 120°C. Il est soumis à un procédé de séparation basé sur les différences de solubilité des différentes substances dans l'eau et dans les solvants organiques. C'est ainsi que, en traitant par l'eau distillée, 20 au besoin à chaud, le cristallisât total T (exempt d'alcaloïdes), la crustecdisone (ou ecdistérone) passe dans la solution aqueuse. On répète plusieurs fois l'opération jusqu'à ce qu'un examen chromatographique sur couche mince montre que l'intensité de la tache jaune de la crustecdisone a diminué, dans la fraction insoluble dans l'eau (A), jusqu'à être devenue nettement plus 25 faible que celles de la tache violette de la makistérone et de la tache bleue. Les solutions aqueuses, enrichies en crustecdisone (ecdistérone) sont additionnées de méthanol jusqu'à obtention d'une concentration en méthanol de 40 "L en volume, puis évaporées au 1/5 de leur volume. Par refroidissement, il se sépare une fraction contenant la makistérone A et la 30 crustecdisone en proportions sensiblement égales, comme le montre l'examen chromatographique sur couche mince, effectué comme précédemment. Ce produit (C) est séparé du concentrât par filtration. Les eaux sont évaporées à sec à basse température, et le résidu est recristallisé à plusieurs reprises dans un mélange méthanol : acétone (rapport) 1 : 5, jusqu'à pureté chromatographique. 35 La crustecdisone (ecdistérone) ainsi obtenue fond à 239-242°C (avec décompo- — _2o sition) et possède un indice de réfraction ]_ a_/D = + 59°+ 1° (c = 1 dans le méthanol). Traité par un excès d'anhydride acétique dans la pyridine à froid, il donne un dérivé acétylé fondant à 153-157°C. 72 01595 8 2122498 La partie restée insoluble dans l'eau (A) du cristallisât, telle quelle, c'est-à-dire encore imbibée d'eau, est reprise par le méthanol pur, et à chaud. Après refroidissement à la température ambiante, on filtre l'insoluble (B). La solution méthanolique aqueuse obtenue contient, comme 5 le montre l'étude chromatographique sur couche mince, le reste de la crustecdisone présente dans la fraction insoluble dans l'eau du cristallisât total, en même temps que l'ecdisone. On effectue la purification de l'ecdisone en profitant de la moindre solubilité de ce produit dans l'eau. De cette façon, par de simples cristallisations répétées dans l'eau distillée, on obtient 10 l'ecdisone à l'état parfaitement pur. Ses caractéristiques chimiques et physiques sont les suivantes : Point de fusion : 160-163°G. Le liquide de fusion, après solidification, fond de nouveau à 230-240°C. — —20 Indice de réfraction : l_ = + 65,7 + 1° (c " 1,033 dans l'éthanol). 15 \ max = 242 nm long £= 11960). Par traitement acide à chaud pendant 1 h, on observe deux nouveaux maxiaa à 244 et 297 nm. ^ max (KBr) = 3650-3100, 1650, 1450, 1385, 1055 et 880 cm-1. Par ailleurs, par traitement de l'ecdisone dans la pyridine par un excès d'anhydride acétique à froid, on obtient un dérivé tri-acétylé 20 fondant à 85-95°C. En partant de l'insoluble (B), on isole à l'état pur la makistérone "A" par cristallisations répétées du résidu, une première fois par le méthanol seul, et ensuite, jusqu'à pureté chromatographique, par le méthanol à 1 I d'eau. La makistérone "A" ainsi obtenue a un point de fusion — —20 de 258-260°C et un indice de réfraction ]_ ot =4-65+1° (c = 0,5, dans le 25 méthanol). La makistérone "A", également traitée par l'anhydride acétique dans la pyridine, donne un dérivé acétylé fondant à 237°C. Les eaux mères provenant des diverses cristallisations sont réunies, et évaporées à sec à basse température (D). Ce résidu (D) est réuni au résidu (C) et l'ensemble est dissous dans le méthanol. La solution est évaporée à sec sous vide à basse 30 température. Le résidu (E) ainsi obtenu est soumis à une nouvelle séparation, soit tel quel, soit après réunion au cristallisât total (T) d'une nouvelle opération. On peut également utiliser le résidu (D) et le résidu (C) pour l'extraction à l'état pur des autres stérols polyhydroxylés contenus dans 35 le cristallisât total T. L'étude chromatographique du résidu (D), effectuée selon la technique mentionnée plus haut, montre la présence d'une tache, pour Rf=0,23 72 01595 9 2122498 environ, de couleur verte, indiquant la présence de la nouvelle substance, à savoir la muristérone. Il a été trouvé que celle-ci pouvait être isolée, dans le résidu (D), par chromatographie sur gel de silice. Elle est contenue dans les fractions éluées par le chloroforme contenant de 5 % à 10 % en 5 volume de méthanol. Par évaporation à sec de ces fractions éluées. on obtient un résidu qui, par recristallisation dans l'acétate d'éthyle, donne un produit cristallin de point de fusion corrigé de 227-230°C, très soluble dans l'eau et de formule brute Co^H.o0_. 27 42 7 10 Traitée par l'anhydride acétique dans la pyridine, la muristérone donne un dérivé tétra-acétylé qui, cristallisé dans un mélange à volumes égaux hexane-acétate d'éthyle, possède un point de fusion, corrigé, de 236-238°C. Les exemples sui vont suivre sont donnés uniquement à titre 15 d'illustrations de l'invention, et ne la limitent à aucun degré. EXEMPLE 1. 20 kg de graines de Kaladana sont broyées dans un moulin 2 à disques, muni d'un tamis à 30 mailles au cm . Le produit broyé est dégraissé, 20 par épuisement à froid par l'essence légère (P.E. de 60 à 90°C). Il suffit de 3 extractions successives, chacune avec 35 litres d'essence, avec agitation et pendant 5 h. Le produit ainsi traité est extrait ensuite, en agitant, deux fois par 60 litres d'un mélange chloroforme-méthanol-ammoniaque aqueux, suivant des rapports en volume respectifs 90 : 9 : 1. Toute l'extraction 25 demande douze heures, à la température ambiante. On effectue ensuite deux extractions successives, chacune de trois heures avec 50 litres de chloroforme et en agitant, également à température ambiante. A chaque fois, le liquide d'extraction est séparé du produit traité, pour être filtré sous vide. 30 Tous les extraits sont réunis et concentrés sous pression réduite à une température non supérieure à 40°C, jusqu'à un volume total de 10 litres. Le produit ainsi concentré est abandonné au repos au réfrigérateur pendant quelques jours, jusqu'à ce qu'il ne se sépare plus de produit cristallin. Le produit séparé est filtré par aspiration, lavé sur le filtre 35 avec un peu de chloroforme, puis à l'éther de pétrole, et enfin séché sous vide. On peut obtenir d'autres quantités de produit brut par une nouvelle concentration des eaux mères et séjour au réfrigérateur. On recueille 140 g de produit. 72 01595 2122498 L'étude chromatographique sur couche mince de gel de silice G, en employant comme solvant un mélange chloroforme-éthanol-eau (rapports 80 : 19 : 1) et comme révélateur des taches, le réactif vanllline-acide sulfurique, avec chauffage à 120°C pendant 10 on, montre les taches déjà mentionnées, les Rf 5 des composés formés étant respectivement de : 0,22 (tache bleue) ; 0,20 (tache violette) ; et 0,15 (tache jaune). EXEMPLE 2. On met en suspension dans 1 litre d'eau distillée 120 g de 10 cristallisât total (T) obtenu conformément à l'exemple 1. La suspension est maintenue en agitation par un procédé mécanique pendant 1 h, à une température de 25°. Ce tençs écoulé, la suspension est filtrée par aspiration. Le filtrat est conservé à part, tandis que le gâteau de filtration est soumis à une série de traitements successifs par l'eau, dans les conditions indiquées précédémment. 15 On utilise pour chaque traitement la même quantité d'eau, soit 1000 ml. Après le quatrième traitement, l'examen chromatographique sur couche mince, effectué suivant la technique décrite précédemment) montre que la tache jaune de la crustecdisone, sur le produit (10 g) obtenu après les lavages par l'eau, est notablement plus pâle que la tache violette de 20 la makistérone "A", et que la tache bleue de l'ecdisone. Les eaux de filtration réunies (4000 ml) sont additionnées de 1600 g de méthanol. La solution obtenue est évaporée sous vide à une température de 35°C, jusqu'à un volume de 1100 ml environ. Le produit concentré est refroidi dans la glace, et on sépare par filtration le produit cristallin 25 (30 g) précipité. Ce produit (C) est examiné par la méthode chromatographique en couche mince déjà indiquée à plusieurs reprises. On constate qu'il est formé de makistérone "A" et de crustecdisone. Les eaux mères de (C) sont amenées à sec sous pression réduite à une température inférieure à 35°C. 30 Le résidu est recristallisé à plusieurs reprises dans un mélange méthanol- acétone dans le rapport 1:5, jusqu'à pureté chromatographique. La crustecdisone (ecdistérone) ainsi obtenue présente les caractéristiques physiques et chimiques indiquées à l'exemple 2. La portion insoluble dans l'eau du cristallisât totd (A) 35 tel quel, c'est-à-dire encore imbibé d'eau, est reprise par le méthanol pur, sur un bain-marie à 50°C. Après refroidissement à la température ordinaire, on filtre le produit séparé (B). On constate à l'examen chromatographique 72 01595 2122498 comme ci-dessus que le filtrat méthanolique dont le produit (B) a été séparé contient de la crustecdisone et de l'ecdisone. On sépare l'ecdisone en évaporant à sec sous vide le filtrat à basse température (35°C). Le résidu de 1'évaporation est soumis à des cristallisations répétées dans l'eau 5 distillée. Au moins trois cristallisations sont nécessaires pour obtenir un produit chromatographiquement pur. 1500-ml d'eau sont nécessaires pour 7,5 g de résidu. Le produit séché sous vide final est recristallisé dans l'acétate d'éthyle. L'ecdisone obtenue a un point de fusion de 230-240°C, 10 avec les autres caractéristiques physiques et chimiques précédemment indiquées. Le résidu insoluble (B), pesant environ 15 g, est cristallisé une première fois dans le méthanol (50 ml), puis jusqu'à pureté chromatographique, dans le méthanol contenant 1 % d'eau en volume. Le produit ainsi obtenu est la makistérone "A". Il possède les caractéristiques chimiques précédemment 15 indiquées. Les eaux mères de toutes les diverses cristallisations sont réunies, et évaporées à sec sous vide à une température inférieure à 35°. Le résidu obtenu (D) est joint au résidu (C), et l'ensemble est dissous dans le méthanol. La solution est évaporée à sec sous vide à basse température, et le résidu (E) obtenu est soumis à une nouvelle séparation, soit tel quel, .soit après réunion 20 à un cristallisât total (T 1) d'une nouvelle opération. Le résidu (D), pesant 21 g, est mélangé à 50 g de gel de silice (de grosseur comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm), et introduit dans une colonne garnie de 600 g du même gel de silice. On commence par éluer avec un mélange chloroforme-méthanol dans le rapport 95 : 5. Le résidu sec de ces éluats est 25 rejeté. Les quatre élutions suivantes sont effectuées sur chloroforme-méthanol dans le rapport 90 : 10 (1 litre). Leur résidu, examiné par chromatographie sur couche mince, montre la présence de la nouvelle substance "à tache verte". Ce résidu est à nouveau soumis à une chromatographie jusqu'à pureté absolue dans une nouvelle colonne comme ci-dessus, mais en éluant uniquement avec le 30 mélange chloroforme-méthanol 95 : 5. Les nouveaux éluats, évaporés à sec, laissent un résidu qui, recristallisé dans l'acétate d'éthyle, donne un produit fondant à 227-230°C (P.F. corrigé). Spectre infrarouge : \l max (KBr) 3600-3200, 1660, 1630 cm *. \ max ultraviolet (dans le méthanol) : 236 mu. D.0. 0,994 — —20 52,58 ml (£' 9050) - / a_/£ = + 49,6° + 1° (c = 1,02 dans la pyridine). 35 EXEMPLE 3. Triacétate de_crustecdisone. On dissout 0,15 g de crustecdisone (ecdistérone) obtenue dans l'exemple 2, dans 5 ml de pyridine anhydre, et on traite par 2 ml d'anhydride 72 01595 2122498 12 acétique pendant 24 h à la température ambiante. On verse la solution dans un mélange d'eau et de glace. Le précipité est filtré, séché, et recristallisé à plusieurs reprises dans un mélange hexane-acétate d'éthyle. On obtient 0,056 mg d'un solide cristallisé fondant à 153-157°C qui est identifié comme 5 le triacétate de crustecdisone. Analyse. C % H % Trouvé 63,64 8,36 Calculé pour C H 0 HO 63'46 8'33 C33 50 10' 2 ^ ]_ a_* + 59° + 1° (c * 1 dans le méthanol) (Aust. J. Chem., 22, 1045 (1969) indique 198,5-199°C pour le semi-hydrate, et fajl° * + 59°). EXEMPLE 4. 15 Triacétate de makistérone. 0,2 g de makistérone obtenu dans l'exemple .2 est traité comme indiqué au sujet de la crustecdisone. Après cristallisation dans le mélange hexane-acétate d'éthyle, on obtient 0,15 g de triacétate de makistérone, fondant à 237° (Tet. Lett. 3883 (1966) Indique 210-213°). 20 Analyse. C % H % Trouvé 65,38 8,40 Calculé pour ^ ^ 34 52 10 25 on J_ = 74° + 1° (c = 1 dans le méthanol). EXEMPLE 5. Triacétate d^ecdisone. 0,10 g d'ecdisone obtenu dans l'exemple 2 est traité comme indiqué précédemment. Le résidu solide est chromatographié sur silice, en éluant 30 par le mélange chloroforme-méthanol 99 : 1. Les différentes fractions sont réunies et recristallisées dans l'hexane. On obtient 45 mg d'un solide amorphe fondant à 85-95°C. EXEMPLE 6. 35 Tétracétate de muristérone. 300 mg de muristérone, obtenus comme il a été décrit à l'exemple 2, sont dissous dans 4 ml de pyridine et additionnés de 2 ml d'anhydride acétique. On laisse au repos 24 h à la température ambiante. La masse 72 01595 13 2122498 est versée dans un excès d'eau. Le produit qui se sépare est séché et purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (0,05-0,2), et élué par le mélange chloroforme-méthanol 98 : 2. Le résidu obtenu par évaporation des éluats est recristallisé dans un mélange à volumes égaux hexane-acétate 5 d'éthyle. Il fond à 236-238°C. La spectrographie infrarouge donne des maxima caractérisés à : 3600-3300, 1740, 1720, 1680, 1250 cm"1. Comme il a déjà été dit, une propriété particulièrement importante du susdit cristallisât total obtenu conformément à l'invention est son 10 activité insecticide, donc de protection des cultures agricoles. Des expériences à échelle pratique, avec des solutions contenant de 0,1 % à 0,2 % de cristallisât total ont démontré cette efficacité insecticide de protection des cultures sur les insectes nuisibles de diverses classes, par exemple les lépidoptères (en particulier Pieris brassicae (Papillon du chou) et Bombyx mori (ver à soie)} 15 et les coléoptères (en particulier le Doriphora decemlineata (Doryphore), et d'autres). Il est également à conseiller d'associer le principe actif à des agents dispersants convenables, afin d'assurer une répartition uniforme du principe actif lui-mSme. Les compositions peuvent également contenir des 20 substances synthétiques ou naturelles à rôle synergique, renforçant ou élargissant la gamme d'efficacité de la composition. Un aspect non moins important de l'insecticide biologique à game étendue d'applications de l'invention est sa haute spécificité, et par suite son innocuité vis-à-vis des autres formes de vie végétale et/ou animale. 72 01595 14 2122498 ^_Ç_Y_?_N_;D_X Ç A T X O N S 1. Procédé d'extraction d'hormones stéroîdes de la métamorphose des insectes, caractérisé en ce que cette extraction est effectuée sur des 5 végétaux du genre Calonyction (Choisy) Hallier f., de la tribu des Ipomées, de la familles des convolvulacées. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'extraction est effectuée sur la plante poussant à l'état sauvage dans la zone montagneuse subtropicale comprenant la région sud-himalayenne de l'Inde, 10 et connue sous le nom de "Kaladana". 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que des graines de ladite plante, préalablement grossièrement broyées et dégraissées par un hydrocarbure solvant, sont extraites à fond par un mélange comprenant un hydrocarbure aliphatique chloré, un alcool aliphatique en C^-C^, et une base azotée, 15 le produit de l'extraction étant ensuite concentré et lavé à fond, avec séparation d'un résidu cristallin (cristallisât total). 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'hydrocarbure aliphatique chloré est choisi parmi le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le chlorure de méthylène et le trichloréthylène, la base 20 azotée étant l'ammoniaque ou une aminé aliphatique. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le mélange d'extraction est formé de chloroforme, de méthanol, et d'ammoniaque, dans des rapports 9 : 0,9 : 0,1. 6. Procédé suivant la revendication 3 pour l'extraction à l'état 25 pur de stéroîdes polyhydroxylés, en particulier de crustecdisone pure, caractérisé par les stades suivants : a) le cristallisât total est repris par l'eau distillée, la crustecdisone passant dans la phase aqueuse en laissant un résidu (A) insoluble dans l'eau; b) le résidu (A) est lavé à plusieurs reprises pour extraction sensiblement totale de la crustecdisone, 30 vérifiée par chromatographie; c) les solutions aqueuses sont réunies et additionnées de méthanol jusqu'à concentratbn de 40%- en méthanol, et évaporées à chaud jusqu'au cinquième de leur volume initial, le produit concentré étant refroidi avec séparation d'une fraction solide (C); d) la phase liquide est évaporée à sec et le résidu est recristallisé à plusieurs reprises dans un 35 mélange méthanol-acétone dans le rapport 1 : 5, jusqu'à obtention de crustecdisone chromatographiquement pure. 72 01595 2122498 7. Procédé suivant la revendication 6, en particulier pour l'extraction d'ecdisone pure, caractérisé par les stades suivants : a) ledit résidu insoluble (A) est repris à chaud par le méthanol pur, ce qui donne après refroidissement une solution contenant toute l'ecdisone et la crustecdisone restant 5 éventuellement, et une phase insoluble (B) contenant toute la makistérone "A"; b) la solution dans le méthanol résultante est soumise à des cristallisations répétées dans l'eau distillée jusqu'à obtention d'ecdisone parfaitement pure. 8. Procédé suivant la revendication 7, en particulier pour l'extraction de makistérone "A", caractérisé en ce que la phase insoluble (B) 10 est soumise à des cristallisations répétées, la première fois dans le méthanol pur, et les suivantes dans le méthanol contenant 1% d'eau jusqu'à obtention de makistérone "A" chromatographiquement pure. 9. Procédé suivant la revendication 8, en particulier pour l'extraction de muristérone pure, caractérisé par les stades suivants : a) les eaux 15 mères provenant des diverses cristallisations sont évaporées à sec à basse température; b) le résidu (D) ainsi obtenu est soumis à une séparation par chromatographie sur une colonne de gel de silice, en utilisant comme éluant du chloroforme contenant de 5% à 10% en volume de méthanol; c) les éluats sont évaporés à sec, et le résidu est recristallisé dans l'acétate d'éthyle pour 20 donner la muristérone cristallisée d'un point de fusion corrigé de 227° à 230°C.