Brevet FR2110362A1 — publié le 19720602

La présente invention concerne un antibiotique nouveau et efficace et ses dérivés qui sont actifs vis-à-vis de nombreux microorganismes. Elle a trait plus particulièrement à un antibiotique Î3S-4-54-5 nouveau et efficace et à ses dérivés acylés, 5 à leur procédé de fabrication, à la composition pharmaceutique les renfermant et à leur application thérapeutique pour le traitement d'infections. L'invention a donc pour objet l'antibiotique WS-4-54-5 efficace et ses dérivés acylés qui sont actifs vis-à-vis de nom-10 breux microorganismes, notamment de microorganismes gram négatif par exemple vis-à-vis des espèces Escherichia et Salmonella. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication de l'antibiotique ÏÏS— L'invention concerne encore des compositions pharmaceutiques renfermant, en tant qu'agents antibactériens actifs, l'an-20 tibiotique ÏÏS-4-54-5, ses dérivés acylés et leurs sels. L'invention a aussi pour objet l'application desdits produits pour le traitement des maladies infectieuses provoquées chez l'homme et chez l'animal par des bactéries. D'autres objets et caractéristiques avantageux de la pré-25 sente invention ressortiront plus .clairement de la description qui suit. L'antibiotique de la présente invention est obtenu par un procédé de fermentation dans des conditions contrôlées, mettant en oeuvre une nouvelle espèce de Streptojnyces dénommée 30. streptomyces sapporonensis. Le microorganisme Le microorganisme servant à la préparation du nouvel antibiotique I7S-4-54-5 est une espèce de Streptomyces récemment découverte, isolée d'un échantillon de sol provenant de la ville 35 de Sapporo au Japon. Une culture de l'organisme vivant a été déposée et ajoutée à une collection permanente de culture en réserve à 1 ' "American Type Culture Collection", sous le ÎT° ÀTCC 21532 et est désignée ci-après sous le nom de Streptomyces sapporonensis. 40 II est cien évident que, pour la production du nouvel 71 36469 2110362 2 antibiotique, l'invention n'est pas limitée à l'utilisation dé l'organisme particulier présentement décrit ou des organismes répondant pleinement aux caractéristiques microscopiques et de croissance décrites ici que l'on présentera à titre d'illustra-5 tion. L'invention couvre également l'utilisation de. mutants produits à partir de l'organisme décrit par des moyens conventionnels tels que les rayons X, les radiations ultraviolettes, l'ypérite, etc... le streptomyces sappononensis ATCC 21532 présente les pro-priétés morphologiques, macroscopiques, microscopiques et biochimiques suivantes: Morphologie microscopique: la morphologie du Streptomyces sapporonensis ATCC 21532, lorsqu'il est cultivé sur gélose-sucrose-nitrate et sur gélose ammonium-amidon à 30°C pendant 15 10 à 14 jours, est indiquée ci-dessoias. L'hyphe aérien est long et droit et présente un verticille. le conidium est en forme de chaînette. Caractéristiques culturales et physiologiques : les caractéristiques culturales et physiologiques de la nouvelle souche 20 de Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 dans un. certain nombre de milieux sont énumérées ci-après. L'observation a été faite après incubation pendant 10 à 14- jours à 30°C. Sauf,indication contraire, la période et la température d'incubation sont les mêmes que celles décrites. 25 Gélose de Czapek : croissance blanche,, pâle; pas de mycélium aérien; pas de pigment soluble. Gélose amidon-ammonium : croissance orangée pâle par petites colonies avec une surface orangée pâle; pas de mycélium aérien; pas de pigment soluble. L'action diastatique est faible. 30 Gélose asparagine-glncose : croissance brune par petites colonies : mycélium aérien mince et blanc poudreux; pas de pigment soluble. Gélose malate-calcium; croissance blanche; mycélium aéiien mince, brun pâle, poudreux blanc; pas de pigment soluble. 35 Gélose-tyrosine : croissance brun fonea par petites colo nies; pas de mycélium aérien; pas de pigment soliïble. Bouillon gélosé; croissance en colonies, jaune pâle; mycélium aérien poudreux blanc; pas de pigment soluble. Gélose de Bennett : croissance du type colonies, brune 40 avec une surface plane et plissée; mycélium aérien mince et 71 36489 2110362 3 poudreux bla-oc ; pas de pigment soluble. Cette culture se développe aussi bien à 37°C qu'à 30°C. Glucose-bouillon : croissance en amas blancs précipités; pas de mycélium §érien; pas de pigment soluble. 5 Solution glucose-Czapek : croissance blanche en colonies, précipitée; pas de mycélium aérien; pas de pigment soluble. Lait tournesolé : croissance pâle, pas de mycélium aérien; pas de pigment soluble. On note une légère peptonisation et une coagulation négative. 10 Piqûre sur gélatine 1 (15-20°C, 20 jours d'incubation) Croissance pâle; pas de mycélium aérien; pas de pigment soluble. Onobserve une faible liquéfaction positive. Fragment de pomme de terre : croissance en colonies brun pâle avec surface plissée; mycélium aérien ba?un pâle poudreux; 15 pas de pigment soluble. Cellulose : aucune croissance. Conditions de croissance optimales : température : 25-37°C ; pH=6-8. Utilisation de sources de carbone l'utilisation des 20 sources de carbone a été réalisée selon la méthode Pridham- Gottlieb. L'observation a été faite après me incubation de 7 jours à 30°C. Source de carbone Croissance Xylose - 25 Arabinose - Mannose - Fructose - Glucose ± Ehamnose - Suerose - Lactose - Tréhalose + Raffinose - Mannitol - Inositol + Salicine - Témoin négatif - Note : ie symbole "+" signifie utilisation, utilisation probable et pas d'utilisation. 30 35 71 36469 4 2110362 L1 antibiotique On obtient le nouvel antibiotique WS-454-5 de la présente invention en cultivant le Streptomyces sapporonensis sus-mention-né dans un milieu nutritif dans des conditions aérobies submer-5 gées contrôlées. Une grande variété de milieux nutritifs peuvent être utilisés au cours des divers stades de croissance du processus fermentatif. On a trouvé que l'on obtient les meilleurs résultats en utilisant un milieu aqueux renfermant une source de carbone as-10 similable et une source d'azote assimilable ou une matière pro-téinique. Comme sources assimilables, on peut citer les polyalcools et les mono-, di- et polysaccharides, tels que les produits suivants: glucose, fructose, maltose, lactose, sucrose, sucre, 15 amidon, amidon de maïs ou de blé, dexfcrine, mélasses, glycérol et similaires. Par sources d'azdbe assimilable appropriées et matières pro-téiniques on entend des sources d'azote naturelles telles que la liqueur de trempage du maïs, la farine de soja, l'huile de 2° soja, la farine de graine de coton, la farine de gluten, la farine de maïs, la levure séchée, l'extrait de levure, le pep-tone, les liqueurs peptoniques animales, l'extrait de viande, l'hydrolysat de caséine, etc... ainsi que des sources d'azote minérales et organiques, telles que les sels d'ammonium (par ^5 exemple nitrate d'ammonium, sulfate d'ammonium, phosphate d'ammonium, et£...), urée et similaires. Les sources de carbone et les sources d'azote, bien qu'elles soient avantageusement utilisées en mélange, n'ont pas besoin d'être mises en oeuvre sous forme pure, étant donné que les bubstances moins pures contenant des traces de facteurs de croissance et des quantités considérables de substances nutritives minérales conviennent également pour cet usage. On peut, si on le désire, incorporer au milieu des sels minéraux tels que le carbonate de calcium, le phosphate de sodium ou de potas-35 sium, le chlorure de sodium ou de potassium, un sel de magnésium, un sel de cuivre et similaires. On peut, le cas échéant, introduire dans le milieu de fermentation, surtout lorsqu'il se forme beaucoup de mousse dans le milieu de culture, un anti-pousse tel que la paraffine liquide, de l'huile animale, de 40 l'huile végétale, de l'huile minérale, des silicones, etc... 71 36489 , 2110362 5 Ainsi qu'il est recommandé pour la fabrication courante d'autres antibiotiques, on préfère, pour la fabrication du nouvel antibiotique, des conditions aérobies submergées. Pour la préparation de quantités plus faibles de l'antibiotique, la 5 culture submergée peut être féalisée dans de petits vases ou bouteilles qui sont secoués ou agités par un dispositif mécanique approprié. Cependant, la fermentation d'importants volumes du milieu nutritif ensemencé peut avoir lieu dans de grandes cuves ou récipients servant habituellement dans l'industrie 10 de la fermentation. Pour la fabrication de grandes quantités de 1'antibiotiquà, il est préférable d'utiliser la forme végétative des microerganismes pour l'ensemencement des cuves ou des récipients afin d'éviter un retard de croissance dans le procédé de fabrication de l'antibiotique. Il est par conséquent 15 souhaitable de produire d'abord un inoculât végétatif du microorganisme en ensemençant une quantité relativement faible du milieu de culture à l'aide de spores ou de la forme mycélienne du microorganisme et de transférer ensuite aseptiquement l'inoculât végétatif dans de grandes cuves. Le milieu dans lequel est 20 produit l'inoculât végétatif peut fùre identique ou différent du milieii servant à la fabrication de l'antibiotique. L'agitation et l'gération du milieu de culture peuvent être réalisées de différentes manières. £'agitation peut être assurée par une hélice ou un système d'agitation mécanique si-25 milaire, par rotation ou agitation du fermenteur, par un système de pompage ou par passage d'air stérile à travers le milieu. L'aération peut être accomplie par passage d'air stérile à travers le mélange de fermentation. Habituellement, la fermentation est conduite à une tempé-30 rature d'environ 25°C à 37°C, préférablement à environ 30°C pendant une période de 30 à 50 heures. A l'issue de cette période, il s'est formé une quantité importante de l'antibiotique. Pour isoler l'antibiotique WS-4-54-5, le mycélium peut être séparé du bouillon de culture par les moyens habituels, par 35 exemple par centrifugation ou par filtration. La majeure partie de l'antibiotique se trouve dans le filtrat. L'antibiotique peut être récupéré à partir du filtrat de manière conventionnelle, par exemple par la technique d'extraction ou d'adsorption qui sert habituellement à la récupération des autres antibio-4-0 tiques. 71 36489 6 2110362 On peut réaliser l'extraction en traitant le filtrat à l'aide d'un solvant organique pour l'antibiotique, par exemple à l'aide de pyridine, d'un alcool tel que le méthanol, l'étha-nol, le butanol, etc... ou à l'aide de solutions aqueuses d'un 5 solvant organique miscible à l'eau, par exemple un alcool aqueux comme le méthanol, l'éthanol et le butanol aqueux. On peut également utiliser un mélange d'alcool et d'autres solvants organiques tels qu'une cétone (par exemple l'acétone), un hydrocarbure halogéné (par exemple le chloroforme), un ester alcoylé 10 d'acide gras (par exemple acétate d'éthyle), du benzène, de la pyridine et similaires. En variante, l'antibiotique peut être récupéré à partir du filtrat à l'aide d'un adsorbant tel que la terre de diatomée, l'alumine activée, le gel de silice, le charbon actif, l'acide 15 silicique et similaires. L'antibiotique adsorbé sur ledit adsorbant est facilement élué en utilisant un solvant organique approprié dans lequel il est soluble, tel que la pyridine, l'alcool, l'alcool aqueux ou un mélange d'alcool et d'un autre solvant organique. 20 Un moyen convenable pour l'isolement de l'antibiotique de l'extrait ou de l'éluat consiste à évaporer le solvant jusqu'à obtention d'un volume relativement faible et à précipiter l'antibiotique par addition d'un solvant approprié dans lequel l'antibiotique est insoluble. 25 L'antibiotique est purifié par recristallisation ou par chromatographie. Comme solvants pouvant être utilisés pour la recristallisation, on peut par exemple citer l'acétone, l'acétone aqueuse, un alcool (par exemple méthanol, éthanol), de l'alcool aqueux, l'acétate d'éthyle et similaires. Les adsorbanfcs 30 servant à la récupération de l'antibiotique peuvent également être utilisés efficacement pour la purification par chromatographie. Comme éluants, on peut se servir de ceux pouvant être utilisés pour la récupération de l'antibiotique. Les propriétés de l'antibiotique WS-4-54-5 qui est isolé 35 de cette manière sont mentionnées ci-après. L'antibiotique ¥5—4-54-5 possède les propriétés physiques et chimiques suivantes. Le \7S—4-54-5 cristallise sous forme de cristaux blancs et basiques. Il est soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol et 40 dans la pyridine, modérément soluble dans l'acétone et l'acétate 71 3648$ 7 2110362 d'éthyle et insoluble dans l'éther, le chloroforme, le benzène et le n-hexane. Le poids moléculaire tel que déterminé par spectrographie de masse est,égal à 502. 5 Le pouvoir rotatoire est le suivant J = 63» 5° (0=1,00 % en poids/volume dans le méthanol). L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes : carbone =47,44 hydrogène = 6,16; azote = 9,36; oxygène (par différence)= 37,04. 10 Les valeurs précédentes, lorsqu'on les utilise pour le calcul de la formule empirique du I7S-4545, fournissent la formule brute G12H18N20^. Les réactions colorées du WS-4545 sont les suivantes: positives aux tests de Fehling et de îiolisch; décoloration d'une 15 solution de permanganate de potassium; légèrement positives avec le chlorure ferrique; négatives aux test-s de Tollen et d'Ehrlich et à la ninhydrine. L'antibiotique WS-4545 a été soumis à une chromatogra-phie en couche mince sur gel de silice (mis sur le marché sous 20 la dénomination "Kieselgel G" par la Société Merck) avec divers systèmes de solvants de développement. Comme agent de coloration, on s'était servi d'une solution à 1% de permanganate de potassium contenant 2% de carbonate de sodium et leurs valeurs Bf ont été déterminées comme suit : 25 Tableau : Les valeurs Rf du WS-4545 Systèmes de solvants Bf n-butanol:acide acétique:eaux (4:1:5) 0,41 n-butanol:pyridine: eau (4: 1 : 1) 0,55 •50 chloroforme : métîxaxiol (5 : -1) 0,39 acétate d'éthyle : méthanol (1 : 1) 0,63 benzène :méthanol: chloroforme (1:1:1) 0,41 ^ ^Note : La couche supérieure de ce mélange a été utilisée. L'antibiotique WS-4545 cristallise sous différentes formes ci'isl-allines suivant les conditions utilisées pour la cristallisation. On a déterminé par examen microscopique que les cristaux produits à l'exemple 1 appartiennent au système rhom-40 bique et les cristaux de l'Exemple 2 au système monoclinique. 10 71 36489 2110362 8 Les cristaux de ces systèmes possèdent les propriétés indiquées ci-après. L'analyse par di. fraction aux rayons X fournit les résultats suivants ? Cristal produit Cristal produit dans l'exemple 1 dans l'exemple 2 Système cristallin rhombique monoclinique Distance réticulaire a=11,7 A a=10,1 A,^} = 101° b=12,7 A b=10,9 A c= 8,8 A c= 6,6 A Masse volumique 1,54 g/cnr' 1,46 g/cm^ Le cristal du système rhombique fond à 18^-189°C (décomposition). Le spectre ultra-violet représenté sur la figure 1 des dessins annexés n© présente pas d'absorption spécifique. A la figure 1, la longueur d'onde en m M est portée en abscisses i % 15 et en ordonnées on a porté les valeurs correspondantes. Le spectre infr-a-roage (fréquence en abscisses exprimé en cm"'' et coefficient de transmission en ordonnées, exprimé en %) avec mise en suspension dans du Slujol, reproduit en figure 2, indique — 'I des pics aux fréquences suivantes (cm~ ): 20 3400, 3300, 3160, 2900, 2840, 1703, 1670, 1450, 1390, 1370, 1295, 1260, 1220, 1195, 1140, 1120, 1080; 1050; 970, 960, 935, 895, 870, 820, 785, 725, 680. Le cristal dyéystème monoclinique fond à 188-191°C (décomposition). Le spectre ultra-violet tel que représenté en 25figure 3 n'indique aucune absorption spécifique. Le spectre infra-rouge représenté en figure 4 avec mise en suspension dans du Fujol, indique des pics aux fréquences suivantes (cm ): 4500, 3400,3270; 2900 , 2840, 1685, 1640, 1455, 1417, 1375, 1330,1300, 1260, 1245, 1210, 1160, 1135, 1125, 30 1105, 1085,1050, 1010, 995, 980, 940, 920, 900, 885, 870, 840, 805, 795, 760, 725, 690, 675. Des cristaux appartenant à de tels systèmes cristallins différents sont aisément convertibles en une forme ou une autre par addition d'un petit fragment de l'un des cristaux à la solu-35 tion de l'autre cristal peu avant la formation des cristaux au cours de l'opération de cristallisation. Autrement dit, lorsque des cristaux du système rhombique sont recristallisés dans un solvant, par exemple dans de l'eau chaude, dans de l'éthanol aqueux chaud, dans de l'acétone chaude, dans du méthanol ou 40 de l'éthanol chaud, l'addition d'un petit fragment de cristal 71 36489 ? 2110362 du système monoclinique à la solution avant la formation de précipités dans la solution produit des cristaux du système monoclinique. D'autre part, lorsque des cristaux du système monoclinique sont recristallisés dans un solvant, par exemple dans 5 de l'eau chaude, dans de l'éthanol aqueux chaud ou dans de l'acétone chaude, l'addition d'un petit fragment des cristaux du système rhombique à la solution avant la formation de précipités dans la solution fournit des cristaux du système rhombique . 10 L'existence de ce fait permet de conclure que les cristaux du système rhombique et du système monoclinique se trouvent en relation de polymorphisme. Le spectre de résonance magnétique nucléaire de l'antibiotique ïïS-4545 donne les signaux suivants^ (ppm) ; solution 15 de DMS0-d6 et TMS comme référence interne] 20 25 8,81 3H singulet 7,45 - 7,67 2H multiplet 6,30 - 6,87 2H multiplet 6,10 - 6,40 2H multiplet 6,09 1H doublet 5,58 1H triplet 4,95 1H multiplet 4,93 1H singulet 4,87 1H doublet 4,63 1H multiplet 3,27 1H singulet 1,38 1H singulet 1,05 1H singulet Grâce à la diffraction des rayons X et également par 30 interprétation des propriétés physiques et chimiques précitées, la structure chimique ci-après peut être attribuée avec certitude à l'antibiotique 17S-4545 de l'invention. Structure chimique : 35 H2(/> H2CJ 2 xo CH0 il 2 C — oh ! .C. 40 M g\ Diom * 900 —lï— I hc-oh ho-i-oh-, I 3 ch2oh - 00 7 8! -m 71 36489 10 2110362 Nom chimique : 1-(1,2,3-trihydroxy-2-méthyl)propyl-5-méthylène-6-hydroxy-7,9-dioxo-2-oxa-8,1O-diazabicyclo /~4,2,2 J décane. On a trouvé que l'antibiotique WS-4-54-5 produit confor-5 mément à l'invention présentait un spectre antibiotique spécifique, déployant une activité extrâement efficace vis-à-vis des bactéries gram négatif telles que les espèces Escherichia, Salmonella et Shigella. Par ailleurs, il est à noter que cet antibiotique, administré par injection et introduit dans le 10 sérum à une concentration relativement élevée est éliminé dans l'urine à une concentration élevée. Par conséquent, cet antibiotique présente de l'utilité pour le traitement de maladies infectieuses provoquées chez l'homme et chez l'animal par de telles bactéries, en particulier par administration par injec-15 tion. On décrit ci-après les essais antibactériens ainsi que les essais portant sur la concentration dans le sérum et sur l'élimination par voie urinaire. Concentration inhibitrice minimale (M.IC.) : Le test de IÎ.I.C. a été réalisé par la méthode habituel-20 ie de dilution de l'agar (gélose) utilisant un milieu d'agar-infusion de coeur pour les bactéries, un milieu glucose-bouillon pour les mycobactérdes et un milieu à base d'extrait de malt pour les champignons et la levure, que l'on incube pendant 24-à 72 heures à 30°C. La valeur H.I.C. est exprimée en concentra-25 tion minimale de WS-4-54-5 (mcg/ml) qui inhibe la croissance des microorganismes. Les résultats sont les suivants. Microorganisme d ' essai Escherichia coli Salmonella typhosa 30 Shigella flexneri Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea Proteus vulgaris 35 Mycobacterium phlei Candida albicans Pénicillium chrysogenum Effet protecteur dans le cas d'infections de souris expérimentales : M.I.C. (mcg/ml) 25 - 50 25 - 50 12,5 - 25 ^200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 71 36469 2110362 L'activité in vivo du WS-4545 vis-à-vis d'un E. coli résistant aux autres antibiotiques, a été étudiée sur des souris mâles de la souclie ICR pesant chacune 27 à JO g. Chaque groupe expérimental■comprenait 10 animaux. Les microorganismes infec-5 tants ont été cultivés pendant une nuit dans un bouillon BHI à 37°C. On a inoculé C,T ml le culture par voie intrapérito-néale et le traitement a été effectué par. voie sous-cutanée en une seule fois, une heure après l'infection. Dans ces conditions, les animaux-frémoins infectés non traités ont péri en 10 l'espace de 48 heures. Les animaux expérimentaux ont été observés pendant 10 jours et on a noté la mort ou la survie et les résultats ont été calculés en fonction des doses à effet moyen (ED^q). Les résultats sont les suivants : Souche Antibiotique ■^50 (mg/souris) E.coli 312 •7S-4545 3,05 Chloramphenicol >28 E.coli 320 •TS-4545 0,87 Streptomycin e 17,09 E.coli 323 -73-4545 4,05 Kanamycin e >28 E.coli 324 '78—4545 0,69 Tetracycline 00 CVJ \ E.coli 335 ïïS-4545 0,88 acide Halidixique 0,54 Concentrations dans le sérum et élimination par voie urinaire chez des volontaires en "bonne santé après administration intra-30 musculaire : Les concentrations dans le .sérum et dans l'urine ont été déterminées chez cinq volontaires en bonne santé. Cinq volontaires mâles, adultes pesant entre 60 et 75 kg ont reçu chacun par voie intramusculaire deg&oses uniques de 1.000 mg et 55 de 500 mg de -78-4545. Des échantillons de sang ont été prélevés 0,5, 1, 2, 5 et 5 heures après l'administration. Des échantillons d'urine ont été collectés à des périodes de 0-1, 1-3? 3-6, 6-8^ 8-10 et de 10-24 heures après l'administration. Les concentrations de I7S-4545 dans 1s sérum et dans l'urine ont 40 été titrées par la méthode dite "cup method". Les résultats 71 36489 12 2110362 sont les suivants : Urine 0-1 h. 1-3 h. 3-6 h. 6-8 h. 8-10 h. 10-24 h. Total (mcg/ml (%) *nrw 620 1256 459 221 97 54 qzl n 500®B(189ô) (38%} (22%) (8%) (495) (5%) ' innrw 1501 2266 1256 726 393 75 oa « 1000mg (20%) (11%) (4%) (5%) >4'8 Sérum 1/2 h. 1 il. 2 h. 3 h. 5 h. (mcg/ml) 500 mg 14,7 13»7 15,6 1000 mg 31,1 31,9 21,6 18,8 15,0 15 Une autre propriété extrêmement importante du v/S-4545 est qu'il s'est avéré présenter une toxicité extrêmement faible. Toxicité aiguë (administration unique) 20 KL50 (mg/kg)* Espèce Souris Rat Sexe mâle Eemalle mâle Eemelle I.V. >2000 >2000 >2000 ->2000 î.p. s.c. >4000 >4000 >4000 >4000 >4000 >4000 >4000 >4000 p.o. >4000 >4000 >4000 ^4000 25 Les animaux ont été observés pendant 7 jours après 11 administration. Dérivés acylés améliorés de l'antibiotique ;7S-4545 On a trouvé que l'antibiotique WS-4545 qui possède des groupes hydroxyles peut être facilement acylé à l'aide d'un 30 agent d'acylation pour produire les dérivés acylés correspondants. Autrement dit, on fait réagir Ibantibiotique 7S-4545 avec un acide carboxylique ou son dérivédmctif pour former un ester dudit acide carboxylique avec le WS-4545. Il s'ensuit qu'un dérivé acylé de 1'antibiotique WS-4545 35 peut être préparé par acylation de l'antibiotique WS-4545 à l'aide d'un agent d'acylation. L'agent d'acylation susceptible d'être utilisé dans l'invention est un acide carboxylique qui peut être représenté par la formule [TLji R-OH dans laquelle R représente un 40 groupe acyle carboxylique et son dérivé réactif sur le groupe 71 36489 2110362 13 carboxyle, tel qu'un acide carboxylique aliphatique, un acide carboxylique aromatique, un acide carboxylique hétérocyclique et leurs dérivés réactifs sur le carboxyle. Plus particulièrement, l'acide carboxylique aliphatique 5 est représenté par la formule "u II_/ : R-OH dans laquelle R est un groupe carbonyle hydrocarboné aliphatique saturé ou insaturé tel qu'un alcanoyle (par exemple acétyle, propionyle, buty-ryle, isobutyryle, valéryle, isovaléryle, pivaloyle, 2-éthyl-butyryle, caproyle, palmitoyle, stéaroyle, etc..) comportant 2 10 à 20 atones de carbone et un alcenoyle (par exemple acryloyle, méta-acryloyle, crotonoyle, oléoyle, linoléoyle, linolénoyle, etc...) comportant 2 à 20 atomes de carbone, ou bien un groupe carbonyle cyclohydrocarboné aliphatique saturé ou insaturé tel qu'un cycloalcane carbonyle (par exemple cyclohexyl carbonyle) 15 et un cycloalcène carbonyle (par exemple cyclohexényl carbonyle) ou un carbonyle d'hydrocarbure aliphatique substitué par un cyclohydrocarbure aliphatique tel qu'un cycloalcanealcanoyle (par exemple cyclohexylacétyle, cyclohexylpropionoyle, etc...) comportant 7 à 13 atomes de carbone. §0 Par ailleurs, la fraction hydrocarbonée aliphatique du- dit acide carboxylique aliphatique peut être linéaire ou ramifiée et interrompue par un hétéroatome tel que 11 oxygène ou le soufre. -De tels exemples sont les méthoxyacétyle, méthylthioa-cétyle, butylthioacétyle, méthoxycarbonyle, éthoxycarbonyle, 25 cyclohexylthioacétyle, etc... L'acide carboxylique aromatique est représenté par la formule II : R-OH, dans laquelle R est un groupe aryloyle (par exemple benzoyle, toluoyle, xyloyle, naphtoyle, etc...) ou un carbonyle hydrocarboné aliphatique aryl-substitué tel 30 qu'un aralcanoyle (par exemple phénylacétyle, phénylpropionyle, hydratropoyle,. etc...) et un aralcénoyle (par exemple cinna-moyle, etc...). La fraction hydrocarbonée aliphatique (par exemple alcane ou alcène) possédant 1 à 6 atomes de carbone dudit carbonyle hydrocarboné aliphatique aryl-substitué (à 35 savoir aralcanoyle et aralcénoyle) peut être interrompue par un hétéroatome tel que l'oxygène et le soufre et de tels exemples sont les phénoxyacétyle, phénylthioacétyle, etc... L'acide carboxylique hétérocyclique est représenté par la formule /. U_7 : R-OH dans laquelle R est un carbonyle à no-40 yau hétérocyclique, tel qu'un noyau mono-hé^érocyclique et 71 36489 w 2110362 di-hétérocyclique, ou un carbonyle à noyau hétérocyclique accolé au benzène, ledit noyau hétérocyclique renfermant 5 ou 6 maillons et contenant au moins un hétéroatome tel que l'azote, l'oxygène ou le soufre, et par exemple les groupes nicotinoyle, 5 isonicotinoyle, 2-furoyle, 2-thénoyle, benzofuroyle, benzo-thénoyle, etc... ou un carbonyle hydrocarboné aliphatique (par exemrjle alcanoyle ou alcénoyle substitué par ledit noyau hétérocyclique ou par ledit noyau hétérocyclique accolé au benzène, tel qu'un groupe 10 IH (ou 2H) tétrazoljlacétyle, thiénylacétyle, furylacétyle, 3-benzothiazolylacétyle, 2-oxo-3-benzothiazolylacétyle, 3-indolylacét$eQ morpjiolino acétyle, etc... et ladite fraction hydrocarbonée aliphatique (à savoir alcane ou alcène) peut être interrompue par un hétéroatome tel que l'oxygène et le 15 soufre et possède 1 à 6 atomes de carbone. Dans l'acide carboxyliquà aliphatique, l'acide carboxylique aromatique et l'acide carboxylique hétérocyclique susmentionnés, la fraction hydrocarbonée aliphatique (c ' edt-à-dire alcène, alcane, cycloalcane et cycloalcène), le noyau aromati-20 que (aryle) et le noyau hétérocyclique peuvent être substitués par un ou plusieurs substituants éventuels tels qu'un halogène (chlore, brome, fluor , etc..) un alcoxy,(méthoxy, éthoxy, etc.) un amino, un acylamino (par exemple acétylamino), un acyloxy (par exemple acétoxy), un nitro, un hydroxy, etc... 25 Des exemples illustratifs de tels acides sont les sui vants : acide chloracétique, acide trichloracétique, acide trichloropropionique, bensolylglycine, acide bromobenzoïque, acide chlorobenzoïque, acide nitrobenzoïque, acide méthoxyben-zoïque, acide 3,4~diméthoxybenzoïque, acide 3,4—diméthylbenzoï-30 que, acide 3,4-,5-triméthoxybenzoïque, acide 3,4—diméthoxycinna-mique, acide 4—chlorocinnamique, acide chlorophénjipropionique, acide chlorophénoxyacétique, acide 5-nitrofurann-2-carboxylique, acide 5-chlorobenzofurann-2-carboxylique, acide 5-chloro-2-oxo-3-benzothiazolyl acétique, etc... 35 Des exemples de dérivés réactifs de l'acide carboxylique II sont les halogénures d'acide (par exemple chlorure d'acide, bromure d'acide, etc..) des anhydrides d'acide (par exemple l'anhydride d'acide avec un acide alcoyl sulfurique, un acide alcoylphosphorique, un acide carboxylique aliphatique ou aroma-4-0 tique etc...), des amides d'acide (par exemple amide avec un 71 36489 15 2110362 imidazole, amide avec un imidazole 4-substitué, etc..), les esters (par exemple un ester méthylique, un ester éthylique, un ester cyanométhylique, un ester p-nitrophénylique, etc...) et l'azide diacide. Dans le cas de l'utilisation de l'acide 5 carboxylique en. tant que tel ou sous forme de son sel (par exemple sel de sodium, col de potassium, etc...) il est préférable d'utiliser au cours de la réaction un agent de condensation. Des exemples d'agents de condensation sont le dicycloliexylcarbodiimide, l'acide polyphosphorique, le polypho 10 phate d'éthyle, le phosphate d'isopropyle, etc... La réaction est habituellement conduite dans -un solvant inerte tel que l'eau, l'acétone, le dioxanne, 1'acétonitrile, la pyridine, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le tétrahydro furanne, le dichlorure d'éthylène, le diméthylsulfoxyde, le 15 diméthylformamide, le diméthylacétamide, etc...). Une substance basique (par exemple un carbonate de métal alcalin, un carbonate acide de métal alcalin, une trialcoylamine, de la pyridine, etc...) peut au besoin être présente au cours de la réac tion. La température de réaction n'est pas particulièrement 20 limitée mais la réaction s'effectue habituellement sous refroi dissement ou à la température ambiante. Le composé acylé peut être isolé et purifié par des moyens conventionnels. Il est bien évident qu'au cours de la réaction d'acylation de l'invention, il peut se former le dérivé monoacylé, le 25 dérivé diacylé ou le dérivé triacylé de l'antibiotique 1S-4-54-5 ou leurs mélanges suivant la quantité d'agent d'acylation utilisée dans la réaction. Ainsi, le 7S-4-54-5 est acylé à l'aide d'un agent d'acyla tion dans une proportion d'un équivalent molaire par rapport 30 à ladite substance de départ, de maaièz-e à fournir essentielle ment le dérivé monoacylé de celui-ci. L'aeylation du ¥3-4-54-5 à l'aide d'environ deux équivalents molaires d'un agent d'acylation conduit principalement au dérivé diacylé de celui-ci. Lorsqu' on traite le ïïS-4-54-5 avec plus de trois équivalents mo-35 laires d'un agent d'acylation, il se forme principalement le dérivé triacylé de celui-ci. Dans le cas de la production d'un mélange de dérivés mono-, di- et tri-acylés au cours de la réaction, chacun des dérivés acylés peut être isolé du mélange réactionnel par un moyen classique, par exemple par chromato-^0 graphie ou cristallisation. Au surplus, le dérivé monoacylé 10 20 30 7136489 ie 2110362 peut être acylë avec au moins un équivalent molaire d'un agent d'acylation possédant un radical acyle autre que celui du dérivé monoacylé en vue de l'obtention du dérivé di- ou tri-acylé. Pour des raisons de commodité, on peut également fournir une explication de cette réaction en utilisant comme suit la structure chimique. La réaction d'acylation de l'invention peut également être représentée par la formule réactionnelle suivante : ch oh oh 0bltt H | Il P11 c c 00 c 0, 00 / \ ho0 hh 2| I h2c\ ^0 + r-oh fil H2® 3jH ho0 co 2 v „/ o C nh 0 ce HH 15 H-c-OH h-c-or-r-r I l ho-c-ch-, ho-g-ch-, ! 3 i 3 ch2oh ch2ori [m] (où R^ est un groupe acyle, Rjj et Rjjj sont de l'hydrogène ou . un groupe acyle). Dans la formule ci-dessus, le dérivé monoacylé de l'antibiotique WS-4-54-5 peut être le composé fllll où R_ est un i j X groupe acyle et R.^ et Rjjj sont de l'hydrogène; le dérivé 25 diacylé peut être le composé £lll]dans lequel R-j- et R^ sont un groupe acyle et Rjjj est de l'hydrogène; et le dérivé triacylé peut être le composé f IIIJ dans lequel R^., et Rjjj - sont un groupe acyle. En outre, les dérivés acylés de l'antibiotique WS-4545 (c'est-à-dire l'ester d'acide carboxylique du ¥3-4545) préparés dans les exemples suivants peuvent également être illus-trée.wComme suit par la structure chimique de formule [ill] . Composé de formule |IIl7 35 40 N° d'exemple R-I eii riii 1 acétyle h h 2 propionyle h h 3 palmitoyle h h 4 crotonoyle h h 71 36489 17 2110362 Composé de formule III B° d'exemple EI RII RIII 5 * cyclohexyl carbonyle H H 5 6 acétyle acétyle acétyle 7(A) "butyryle H H 7(B) butyryle butyryle H 10 8 benz oyle H H 9 p-cliloro-benzoyle H H 10 m-bromo-benzoyle H H 15 11 p-bromo-benzoyle H H 12 3,4-diméth.yl-benzoyle H H 13 p-acétoxy-benzyle H H 20 14 p-chloro- pîiénoxy- acétyle H H 15 cinnamoyle H H 16 -ph.ényl-propion7/-le H H 25 17(A) benzoyle benzcyL®- benzoyle 17(B) benzoyle benzoyle H 18 nicotinoyle H H 19 2-thénoyle H H 30 20 5-ctLloro-2-oxo-3-benzotM.azoli-nyl acétyle H 8 H 21 (A'0 2-furoyle H H 21 (B) 2-furoyle 2-furoyle H 35 22 p-bromo-benzoyle acétyle acétyle 23 p-bromo-benzoyle benzoyle benzoyle 24 • m-bromo-benzoyle acétyle acétyle 40 71 36489 ia 2110362 Le dérivé acylé ainsi préparé du WS-4545 est absorbé dans un organisme par administration cS?ale à une concentration beaucoup plus élevée que celle du WS-4545 et peut être transformé en WS-4545 qui est actif vis-à-vis des bactéries pathogènes. 5 En conséquence, les dérivés acylés sont utiles en tant qu'antibiotique, efficace par administration orale, pour le traitement de maladies infectieuses chez l'homme et chez les animaux. Ceci est mis en évidence par les essais pharmacologiques sui-vants. Elimination par voie urinaire après administration orale chea 10 les rats, (voir Tableau, page suivante). Concentration dans le sérum et élimination par l'urine après administration orale des dérivés acylés du "WS-4545 chez des volontaires en bonne santé : Les concentrations dans le sérum et dans l'urine ont été 15 déterminées chez trois volontaires en bonne santé. A trois volontaires adultes, mâles pesant 60 à 75 kg, on a administré par voie orale un échantillon à des doses uniques de 1000 mg et de 500 mg. Des prélèvements de sang ont été faits 1, 2, 5, ^ et 8 heures après l'administration. Des échantillons d'urine ont 20 été collectés pendant les périodes de 0-1, 1-3, 3-6, 6-9 et 9-24 heures après l'administration. Les concentrations du WS-4545 dans le sérum et dans l'urine ont été titrées par la "cup-method". Le même essai d'élimination par l'urine a été effectué sur l'antibiotique WS-4545. Les résultats sont les suivants. 25 Exemple ÏÏT° Dérivé acylé 0-1 h urine (mcg/mL) 1-3 3-6 6-9' ' 3-24 Total (%) 1 Acétyle 292 (5,2%) j— ? — 540 (8%) 141 (2,8%) 64 (3,6%) 19,6 8 Benzoyle 608 (10,6® 1199 930 ( 30,3%) ( 20,0%) 389 (8,5%) 64 (4,7%) 74,3 2 Propionyle 285 (3,8%) 1380 1385 (11,7%)(14,3%) 717 1(7,3%) 170 (7,7%) 43,8 7(Ai) Butyryle 401 (5,9%) 2770 1386 458 (34,0%)(19,1%)(5,3%) 77 (5,4%) 69,6 30 35 3 Palmitoyle (|^%) 57,5 0ao|) 0-2 11 2-4 4-6 6~8 S"10 10-2-4- Total Qn 40 WS—4545 ,58j0 56,5 50,0 23,5 9,5 o Q 545 (0,8%) (1,1%) (0,5%) (0,4%) (0,3%) 2}9 Exemple F° Dérivé acylé du "JS-4545 0 - 3 h. 3-6 h 6 - 24 h. Total me g/ml °/o me g/ml % meg/ml % mg OJ /,J 8 Benzoyle 7112 57,4 3569 13,1 718 12,7 15,31 80,5 15 Cinnamoyle 75?C 3'-i-, 5 8350 23,7 796 14,6 13,10 72,8 7(A) Butyryle 16660 61,4 9389 20,7 506 12,3 15,04 94,0 9 p-chlorobenzoyle 9273 78,2 6352 18,7 '640 16,7 19,34 113,7 12 3, diméthyl-beusoyle 3466 42,8 11947 36,8 962 19,0 15,7S S8,5 3 palmitoyle 3331 33,4 15686 43,0 1400 28,2 16,72 104,5 5 cyclohexyl-carbonyle 16703 71,6 4358 19,5 411 9,3 17,67 100,3 Témoin ( -JB-4y+5) 1057 8,3 1455 5,8 442 9,7 4,72 24,1 VI Ul ON 4> CD vo .Ji o Bote î Animal : Bat-SB, 170 à 200 g Dose : 100 mg/kg Titrage : Les concentrations du C/S-4545 dans l'urine ont été titrées par la "cup method" au moyen de l'Escherichia coli. ro h-* i—^ o Kj4 ON hO 71 36489 2110362 Exemple H° Dérivé acylé sérum (mcg/ml) 1 h 2 h 3 Ta. 5 h 8 h 8 Benzoyle 25,2 25,8 20,1 14,0 14,0 7(A) Butyryle 16,9 20,7 15,7 5 Palmitoyle 12,4 16,6 15,1 11,9 Pour des raisons de commodité et la nette caractérisisa-tion de l'antibiotique WS-4545 et de ses dérivés acylés, toutes 10 les formules mentionnées plus haut peuvent être représentées par la formule (IV) suivante : CH, 0R- / C 15 Ho0 I H2C \lH I CO / CO G - HH 20 [v,] V HC-ORo I ^ HO-C-CH-, i * CH20R1 dans laquelle R^, R2 et R^ sont de l'hydrogène ou un groupe acyle. 25 Les composés selon l'invention peuvent etre conditionnés en vue de l'administration selon tout moyen convenable comme pour d'autres substances antibiotiques. C'est ainsi que la composition de l'invention peut être utilisée sous la forme de préparations pharmaceutiques, par 30 exemple sous forme solide, semi-solide ou liquide, lesquelles contiennent la substance active i/S-4545 et/ou son dérivé acylé en mélange avec un véhicule ou un excipient pharmaceutique organique ou minéral convenant aux applications externes ou pa-rentérales. L'ingrédient actif peut par exemple être mélangé 35 avec les excipients usuels en vue de la confection de comprimés, de dragées, de capsules, de suppositoires, de solutions, d'é-mulsions, de suspensions aqueuses et d'autres formes d'utilisation appropriées. Les véhicules susceptibles d'être utilisés sont le glucose, le lactose, la gomme arabique, la gélatine, le mann±M, l'amidon en pâte, le trisilicate de magnésium, le 40 71 36489 2,, 2110362 talc, l'amidon de maïs, la kératine, la silice colloïdale, la fécule de pompe de terre, l'urée et d'autres excipâits susceptibles d'être utilisés pour la confection de préparations sous forme solide, semi-solide ou liquide et, en outre, des corps 5 auxiliaires des stabilisants, des agents épaississants, des colorants et des parfums. Les compositions de 11 invention peuvent également renfermer des agents de conservation ou bactério-statiques, ce qui permet de conserver l'activité de 11 ingrédient actif dans les préparations recherchées. La substance active 10 V/S-4545 et/ou son dérivé acylé est incorporée aux compositions de l'invention à vuae dose suffisante pour produire l'effet thérapeutique recherché sur l'état ou le syndrome d'infection par bactéries. Bien que le dosage ou la quantité thérapeutiquement efficace du composé varie et dépende, également de l'âge et de 15 l'état de chaque patient individuel à traiter, on administre généralement une dose journalière d'environ 0,5 à 5 g, préfé-rablement de 1 à 2 g de' l'ingrédient actif pour traiter les maladies contre lesquelles l'antibiotique ou ses dérivés sont efficaces. 20 Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention, mais sans aucunement la limiter. - Fabrication de l'antibiotique WS-4545 - EXEMPLE 1 On a préparé des flacons de 500 ml, chacun d'eux conte-25 nant 100 ml du milieu végétatif suivant dans de l'eau de robinet : 30 35 Amidon 2 0/. / ' Levure séchée 1 % Farine de graine de 1 % coton Farine de gluten 1 % Farine d'arachide 1 0/ KHpPO^. 2 ,18 et /O ITa^HPO, . 12Ho0 d- 1 ,43 o/ J° On a utilisé six flacons. Ce milieu a été stérilisé par chauffage pendant environ 30 minutes à environ 120°C dans un autoclave et refroidi. Chaque flacon a été ensemencé de spores et de mycélium de Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 qui ont été cultivés sur de la gélose inclinée. L'organisme a été cultivé dans le milieu pen-40 dant une période de 48 heures à environ 30°C sur un appareil à 71 36489 2110362 22 secousses. D'autre part, 20 1. d'un milieu de fermentation contenant les mêmes ingrédients que ci-dessus ont été introduits dans une cuve en inox de 30 1. Le milieu a été stérilisé par chauffage 5 sous pression pendant environ 30 min. à environ 120°C. Au milieu de fermentation refroidi, on a inoculé, dans des conditions aseptiques, la culture d'inoculât végétatif décrite ci-dessus à raison de 3 % Par rapport au volume du milieu et on a fait croître l'organisme pendant 48 heures à 30°G. Pendant 10 la période de croissance, le "bouillon a été agité à l'aide d'une hélice tournant à 300 t/min. et.on a fait passer de l'air stérile à travers le bouillon de culture à raison d'environ 20 1. d'air par minute. A la fin de la fermentation, le bouillon de culture a été 15 filtré en vue de l'élimination du mycélium, la filtration étant facilitée par addition au bouillon d'un pourcent de "fîadiolite" (adjuvant de filtration mis sur le marché sous cette dénomination par Showa Chemical Company). Le filtrat a été ajusté à pH 7 et additionné de 500 g de charbon actif. 20 Le mélange a été agité pendant 5 min. et le gâteau de charbon actif a été ensuite recueilli par filtration. 10 litres d'eau ont été ajoutés à ce gâteau, le mélange a été agité et le gâteau de charbon actj £ à été recueilli par filtration. Le gâteau de charbon acti'f renfermant l'antibiotique efficace a 25 été ensuite soumis, avec agitation pendant 5 minutes, à une extraction à l'aide de 5 !• d'acétone aqueuse à 50 %. Cette opération d'extraction a été effectuée deux fois. La couche d'acétone aqueuse combinée a été concentrée en fournissant une substance sirupeuse. 30 On a fait passer ladite substance à travers une colonne garnie de cellulose et l'élution a été effectuée avec du butanol aqueux. Les fractions successives ont été recueillies pour analyse. Les fractions présentant une activité anti-microbienne ont été réunies et concentrées pour donner une substance hui-35 leuse jaune. On a fait passer ladite substance huileuse à travers une colonne garnie d'acide silicique. Après lavage de la colonne avec du chloroforme, on a procédé à l'élution avec un mélange de chloroforme et de méthanol (5:1). Des fractions successives ont été recueillies pour analyse. Les fractions 40 présentant une activité anbimicrobienne ont été réunies et 71 36489 2110362 concentrées. Le résidu a été lyophilisé en donnant 350 mg de poudre "blanche. La poudre a été dissoute dans 20 ml d'acétone chaude. La solution acétonique a été maintenue dans un réfrigérateur en donnant 300 mg de 11 antibiotique WS-4545 sous for-5 me de cristaux (système rhombique). EXEMPLE 2 Une quantité de 1 % de "Radiolite" a été ajoutés à un bouillon de culture obtenu selon l'exemple 1 et le tout a été filtré. On a ajouté 400 g de charbon actif à 14 1. du filtrat 10 dont le pH a été ajusté à 7 et le mélange a été agité pendant 20 minutes. Après filtration du mélange, le gâteau de charbon actif a été lavé avec 5 1 d'eau et ensuite soumis à une extraction à l'aide de 3 !• d'un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol (5:1). Ladite opération d'extraction a été effectuée 15 deux fois. Les extraits ont été combinés et concentrés sous pression réduite jusqu'à un volume d'environ 50 ml. Le concentrât (substance sirupeuse) a été additionné de 20 ml d'acétone et la solution acétonique a été filtrée en vue de l'élimination des impuretés. Le filtrat a été concentré. Le résidu a 20 été séché et on l'a fait passer ensuite à travers une colonne garnie de gel de silice et remplie de chloroforme, puis on a fait passer du chloroforme à travers la colonne pour éliminer les impuretés. L'élution a été effectuée avec de l'acétone. Des fractions successives ont été recueillies aux fins d'analyse. 25 Les fractions présentant une activité antimicrobienne ont été réunies et concentrées pour donner 1,25 S* cristaux blancs. Les cristaux ont été réduits en poudré, par addition d'une faible quantité de méthanol et la poudre a été ensuite recristallisée dans de l'acétone en fournissant 1 g. de l'antibiotique 30 WS-4545 sous forme d'aiguilles blanches (système monoclinique). EXEMPLE 3 On a préparé six flacons de 500 ml, chacun d'eux renfermant 100 ml du milieu végétatif suivant dans d3 l'eau du robinet : 35 Amidon 2 % Farine de graines de coton 1 % Farine de gluten 1% MgCl2.6H20 1 % KH2P0,+ 2,18 % 40 Na2EP04.12H20 1,43 % 71 36489 24 2110362 Ce milieu a été stérilisé de façon conventionnelle et chaque flacon a été ensemencé de spores et de mycélium de Streptomyces sapporonensis ATCC-21532. L'organisme a été cultivé dans le milieu à environ 30°C pendant 48 heures sur un 5 appareil à secousses. On a introduit 20 1. d'un milieu de fermentation renfermant les mêmes ingrédients que ci-dessus dans une cuve en inox de 30 1. Le milieu de culture a été stérilisé par chauffage sous pression pendant environ 30 minutes à environ 120°C et 10 refroidi. On a inoculé au milieu, de façon aseptique, la culture d'inoculât végétatif décrit ci-dessus dans une proportion de 3 % par volume du milieu et on a fait croître l'organisme pendant 48 heures à 30°C. Pendant la période de croissance, le bouillon a été agité à l'aide d'une hélice tournant à 300 t/ 15 min. et on a fait passer de l'air stérile à travers le bouillon de culture à raison d'environ 20 1 d'air stérile par minute. Après achèvement de la fermentation, on a filtré le bouillon de culture pour éliminer le mycélium, la filtration étant facilitée en utilisant 1 % de "Radiolite". Le filtrat a été ad-20 ditionné d'environ 200 g. de charbon actif et le mélange a été agité pendant 10 minutes. Après filtration du mélange, 10 1. d'eau ont été ajoutés au gâteau de charbon actif et le mélange a été agité puis filtré. Un mélange de 4 1 d'acétate d'éthyle et de 2 1 d'éthanol a été ajouté au gâteau de charbon actif 25 recueilli, le mélange a été agité pendant 10 minutes et ensuite filtré en donnant un filtrat et le gâteau de charbon actif. Ce gâteau a été encore traité par un mélange de 2 1 d'acétate d'éthyle et de 1 1 de méthanol pour donner un filtrat. Les deux filtrats ont été réunis et concentrés an donnant une substance 30 sirupeuse. Le sirop a été additionné de 100 g de "Radiolite" et le mélange a été séché sous pression réduite à 30°C. Le mélange séché a été soumis à une extraction à l'aide d'ion mélange de 300 ml d'acétone et de 100 ml de méthanol. Cette opération d'extraction a été effectuée deux fois. L'extrait ainsi obtenu a 35 été combiné et concentré en donnant un résidu huileux, jaune. On a fait passer cette substance huileuse à travers une colonne garnie d'acide silicique, puis on y a fait passer du chloroforme pour éliminer les impuretés. L'élution a été effectuée avec un mélange de chloroforme et de méthanol (5:1). Les fractions ^ présentant une activité antimicrobienne ont été réunies et 71 36489 2110362 25 concentrées. On a laissé reposer le concentrât, après quoi on a obtenu 900 mg de cristaux prismatiques blancs. Lesdits cristaux ont ét^feeristalisés dans un mélange de méthanol et d'acétone en donnant 800 mg de 1 'antibiotique WS-4545 sous 5 forme de cristaux, lequel a été identifié au WS-4545 produit dans 1 * exemple 1. -Préparation des dérivés acylés de l'antibiotique US-4545- L'antibiotique WS-4545 ci-dessus a été également utilisé comme substance de départ désignée ci-après par "substance 10 WS-^-545" Èour la préparation des dérivés acylés. EXEMPLE 1 A une solution de substance WS-4545 (100 mg) dans de la pyridine (0,5 ml), on a ajouté goutte à goutte de l'anhydride acétique (0,5 ml) refroidissant à -10°C et on a agité le mé-15 lange pendant 3 heures. Au mélange réactionnel on a ajouté de l'eau glacée et la solution a été soumise à. une lyophilisation. La substance lyophilisée a été cristallisée dans un mélange d'acétone et d'éther pour fournir des cristaux qui ont été recristallisés dans de l'acétone pour donner 50 mg d'ester acéti-20 qiie de la substance WS-4545 sous forme de prismes fondant à 213-215°C. Analyse : c^hpqoohp q tt it Calcul-é : 48,83 5,36 8,14 trouve : 48,91 5,81 8,08 25 EXETIPLE 2 A une solution de substance WS-4545 (12,08 g) dans de la pyridine (48 ml), on a ajouté goutte à goutte de l'anhydride propionique (7,8 g) sous agitation et en refroidissant entre -5 et -10°C, ce qui a pris 1,5 heure. Le mélange réactionnel a été 30 additionné d'eau (100 ml) après une nuit de repos et la solution a été concentrée sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans de l'eau (100 ml), la solution a été lavée avec de l'acétate d'éthyle et ensuite concentrée sous pression réduite. Le résidu a été recristallisé dans de l'acétate d'éthyle en four-35nissant 4,6 g d'ester propionique de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 178-179°C. Analyse : nH22®208 CHU Calculé : 50,27 6,19 7*82 40 Trouvé : 50,18 6,25 7,51 71 36489 2110362 26 E3ŒMPLE 5 A une solution de la substance WS-4545 (6,04 g) dans de la pyridine (30 ml), on a ajouté goutte à goutte du chlorure de palmitoyle (5,81 g) tout en agitant et en refroidissant 5 dans bain d'eau glacée, ce qui a pris une heure. Le mélange a été agité à la même température pendant une heure, puis pendant une heure supplémentaire à la température ambiante. Le mélange réactionnel a été additionné d'eau froide (60 ml) et la solution a été concentrée sous pression réduite. Le résidu a 10 été dissous dans de l'acétate d'éthyle et la solution a été lavée à l'eau, avec de l'acide chlorhydrique à 2,5 %, une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et de l'eau respectivement et ensuite séché sur sulfate de magnésium. Le solvant a été chassé par distillation et le résidu a été recristallisé 15 deux: fois dans un mélange d1 acétonitrile et d'éther dsopropy-lique en donnant 5 g. de palmitate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux; incolores fondant à 156-157°C. Analyse : COQH/lQN^0Q 23 46 ^ S 0 H ^ 20 Calculé : 62,20 8,95 5,18 Trouvé : 62,14 9,17 5,05 Selon un procédé sensiblement identique à celui décrit dans les exemples ci-dessus, on a obtenu, comme le montrent les exemples 4 à 5, les dérivés acylés (à savoir un ester d'acide 25 carboxylique) de la substance WS-4545. EXEMPLE 4 Substance de départ Substance WS-4545 : 3,02 g Anhydride crotonique :3,02 g 20 Solvant pour la recristallisation mélange d'acétonitrile et d'éther isopropylique Dérivé acylé ester crotonique de la substance WS-4545, aiguilles incolores, rendement : 1,0 g, pt. de fusion 148-150°C. 35 AnalySe : °16H22]Î208 G H N Calculé : 51,88 5,99 7,56 Trouvé î 51,92 6,09 7,40 ETOVÏPLE 5 Substances de départ 40 Substance WS-4545 : 3,0 g 10 15 71 36489 27 2110362 Chlorure dé cyclohexanecarbonyle : 1,6 g Solvant pour la recristallisation Acétate d'éthyle Dérivé•acylé 5 Ester d'acide cyclohexanecarboxylique, prismes in colores, rendement : 1,5 S, Pt. de fusion : 183-185°C. (décomposition). Analyse : C^oHosITo0n 19 28 2 8 c n ÎST Calculé : 55,33 6,84 6,79 Trouvé : 55,07 6,86 6,60 EXEMPLE _5 A une solution de la substance ïïS-4545 (500 mg) dans de la pyridine (2 ml), on a ajouté goutte à goutte de l'anhydride acétique (2 ml) à la température ambiante et le mélange a été agité pendant 5 heures. On a séparé les cristaux en plaçant le mélange réactionnel dans de l'eau glacée. Les cristaux ont été récoltés par filtration, lavés à l'eau et ensuite recristallisés dans du méthanol en donnant 600 mg de triacétate de la substance WS-4545 sous forme de prismes incolores fondant à 247-250°C (décomposition). Analyse : C^gH^O^]^ c H If Calculé : 50,46 5,65 6,54 Trouvé : 50,42 5,55 6,73 25 EXEMPLE 7 (A) A une solution de la substance WS-4545 (30,2 g) dans de la pyridine (90 ml), on a ajouté goutte à goutte, sous agitation, de l'anhydride n-butyrique (17,4 g) à la température ambiante, ce qui a pris une heure et le mélange a été agité pen-30 dant une heure. De l'eau a été ajoutée au mélange réactionnel et la solution a été concentrée sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle et la solution a été lavée avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium, puis avec de l'eau et séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant a 35 été chassé par distillation sous pression réduite et le résidu a été lavé avec de l'éther isopropylique en donnant des cristaux bruts. Les cristaux ont été recristallisés dans un mélange d'acétate d'éthyle et de benzène en fournissant des cristaux qui ont été lavés avec de l'éther isopropylique et séchés pour don-40 ner 24,3 g de n-butyrate de la substance WS-4545 sous forme de 20 71 36489 28 2110362 cristaux incolores fondant à 139-140°C. Analyse : C16H24N2°8 0. H W Calculé : 51,60 6,50 7,52 5 trouvé : 51,53 6,58 7,34 (B) La liqueur-mère obtenue au cours de l'opération de recristallisation ci-dessus a été condensée sous pression réduite. Le résidu a été chromatographié sur une colonne garnie de silicagel et l'élution a été conduite avec un mélange de 10 chloroforme et de méthanol (15:1). L'éluat a été concentré sous pression réduite et le résidu a été recristallisé dans un mélange d'acétate d'éthyle et de benzène pour fournir 2 g. de di-n-butyrate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 160,5-162^5» 15 Analyse : ^20^30®2°9 c h sr Calculé : 54,29 6,83 6,33 Trouvé : 54,10 6,84 6,16 exemple 8 20 A une solution de la substance \7S-4545 (12,08 g) dans de la pyridine (36 ml), on a ajouté goutte à goutte, à la température ambiante et sous agitation, du chlorure de benzoyle (6,7 g) ce qui a pris une heure. Le mélange a été agité pendant une heure supplémentaire, puis additionné d'eau. La solu-25 tion a été concentrée sous pression réduite et le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle. La solution a été lavée à l'eau, avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et de l'eau respectivement et séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant a été chassé par distillation sous pression réduite et le résidu a été recristallisé dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther pour donner 12 g de benzoate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 135°C. Analyse : C^H22IT20g C H N Calculé : 56,15 5,46 6,89 Trouvé : 55,92 5,42 6,69 EXEMPLE 9 A une solution de la substance WS-4545 (2 g) dans de la pyridine {-6 ml) on a ajouté goutte à goutte du chlorure de p-40 chlorobenzoyle (1,4 g) en refroidissant dans un bain d'eau 30 35 71 36489 29 2110362 glacée, ce qui a pris environ 30 minutes. On a laissé reposer le mélange à la même température pendant une heure, après quoi on a retiré le "bain et poursuivi la réaction pendant 3 heures. De l'eau glacée Ç>0 ml) a été ajoutée au mélange réactionnel et 5 la solution a été soumise à une extraction par de l'acétate d'éthyle. La couche d'acétate d'éthyle a été lavée à l'eau, avec une solution aqueuse à 2 % de "bicarbonate'de sodium et de l'eau respectivement et séchée sur sulfate de magnésium. L'acétate d'éthyle a été chassé par distillation et le résidu a été recris-10 tallisé dans de l'acétate d'éthyle, cette opération de recristallisation étant effectuée deux fois en fournissant 0,9 g de p-chlorobenzoate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 135-137°C. Analyse : Ci9H2iG1]*208 15 C H M" Cl Calculé : 51,84 4,79 6,34 8,03 Trouvé : 51,67 4,75 6,23 8,30 Selon un mode opératoire sensiblement identique à décrit dans les exemples 8 et 9 ci-dessus, on a obtenu, 20 le montrent les exemples 10 à 16, les dérivés acylés (à un ester d'acide carboxylique) de la substance WS-4545. exemple 10 Substances de départ Substance ïïS—4545 : 6,04 g 25 Chlorure de m-bromobenzoyle : 4,8 g Solvant pour la recristallisation acétate d'éthyle Dérivé acylé m-bromobenzoate de la substance WS-4545, aiguilles 30 incolores, rendement : 6 g, pt. de fusion 138°C. Analyse : C^oH2^N2Br0g CHU Calculé : 47,02 4,36 5,77 Trouvé 46,96 4,35 6,04 35 exemple 11 Substances de départ Substance WS-4545 : 6,04 g Chlorure de p-bromobenzoyle : 4,8 g Solvant pour recristallisation 40 acétate d'éthyle celui comme savoir 71 36489 2110362 ~ 30 ' Dérivé acylé p-bromobenzoate de la substance WS-4545, aiguilles incolores, rendement : 6,8 g, pt. de fusion : 144(145°C, spectre R.M.ÏÏ. : V(ppm) = 1,96 - 2,33 (triplet) 5 EZEMP1E 12 Substances de départ substance WS-4545 : 3,0 g chlorure de 3,4-diméthylbenzoyle : 1,85 S Solvant de recristallisation 10 acétate d'éthyle Dérivé acylé 3,4-diméthylbenzoate de WS-4545, cristaux incolores, rendement 1 1,8 g, pt. de fusion : 128-130°C Analyse : C21H26ÎÎ2°8 15 0 H II Calculé : 58,06 6,03 6,45 Trouvé : 58,30 6,26 6,32 EXEMPLE 13 Substances de départ 20 Substance WS-4545 : 2,0 g chlorure de p-acétoxybenzoyle : 1,6g Solvant pour recristallisation mélange d'acétate d'éthyle et de benzène Dérivé acylé 25 p-acétoxybenzoate de la substance WS-4545, cristaux inco lores, rendement : 0,5 g, pt. de fusion : 130-132°C, spectre R.M.ÎT. : T (ppm). 7.68 (singulet 3H) 2.69 (doublet 2H) 30 1,94. (doublet 2H) spectre IR : 1760 cm EXEMPLE 14 Substances de départ Substance WS-4545 : 2,4 g 35 chlorure de p-chlorophénoxyacétyle : 2,6 g Solvant pour recristallisation acétate d'éthyle Dérivé acylé p-chlorophénoxyacétate de la substance W5-4545, aiguil-40 les soyeuses, incolores: rendement : 1,3 g, pt. de fusion : 128- 71 36489 2110362 31 131°C Analyse : C20H23C1ïï2O9 C H H" 01 Calculé •: 51,02 4,92 5,95 7,53 5 Trouvé : 50,78 4,88 5,97 7,60 EXEMPLE 15 Substances de départ substance US-4545 ï 3,0 g chlorure de cinnamoyle : 1,9 g 10 Solvant pour recristallisation mélange de chloroforme et d'éther (1:1) Dérivé acylé Cinnamate de la substance Ï7S-4545, prismes incolores, rendement : 1,5 g, pt. de fusion : 150°C (décomposition), 15 Analyse : C^H^ïT^Og CHU Calculé: 58,33 5,59 5,48 Trouvé : 58,16 5,62 6,20 EXEMPLE 16 20 Substances de départ substance ÏÏS-4545 '• 3,0 g chlorure de /®-phénylpropionyle : 1,7 g Soï&nt p§ur recristallisation acétonitrile ^5 Dérivé acylé yS-phénylpropionate de la substance WS-4545, aiguilles incolores, rendement : 1,6 g, pt. de fusion : 153°C (décomposition) . Analyse : 30 c H ï! Calculé : 58,06 6,03 6,45 Trouvé : 57,95 6,18 6,31 EXSFPLE 17 (A) A une solution de la substance WS-4545 (6,04 g) dans 35 de la pyridine (18 ml), on a ajouté, goutte à goutte, à la tea-pérature ambiante et sous agitation, du chlorure de benzoyle (7 g), ce qui a pris une heure. Le mélange a été agité pendant une heure supplémentaire et abandonné pendant une nuit. On a ajouté de l'eau au mélange réactionnel et chassé le solvant par dis-40 tillation sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans 71 36489 32 2110362 de l'acétate d'éthyle, La solution a été lavée à l'eau, avec une solution aqueuse de "bicarbonate de sodium et avec de l'eau respectivement,et séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant a été distillé sous pression réduite et le résidu a été ad-5 sorbé sur du gel de silice dans une colonne. Le composé recherché qui était adsorbé sur le gel de silice dans la colonne a été élué avec un mélange de chloroforme et d'acétate d'éthyle (9:1). L' éluat a été concentré sous pression réduite et le résidu a été recristallisé dans du "benzène en fournissant 1,02 10 g de tribenzoate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 165°C. ' Analyse : C33H50N2°10 C H N Calculé : 64,49 4,92 4,56 15 trouvé : 64,19 4,88 4,36 (B) Après élution du tribenzoate de WS-4545 comme indiqué plus haut, la colonne de gel de silice a été une nouvelle fois éluée avec un mélange de chloroforme et de méthanol (19:1)« L'éluà; a été concentré et le résidu a été recristallisé dans 20 du chloroforme en fournissant 2,01 g de dibenzoate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 20."0C. Analyse : ^26^26^2®9 C H N Calculé : 61,17 5,13 5,49 25 trouvé : 61;30 5,12 5,45 EXEMPLE 18 A une solution de la substance WS-4545 (2,0 g) dans de la pyridine (12 ml), on a ajouté de l'anhydride nicotinique (0,8 g) en refroidissant dans un bain d'eau glacée et on a agi-30 té le mélange pendant 1,5 heure. Après cela, on a retiré le bain de refroidissement et agité une nouvelle fois le mélange réactionnel pendant 5 heures. De l'eau a été ajoutée au mélange réactionnel et la solution a été concentrée sous pression réduite. Le résidu a été soumis à une extraction par de l'acéta- 35 "te d'éthyle et la couche d'acétate d'éthyle a'.été. lavée^avèûoune solution aqueuse de bicarbonate de sodium et séchéa sur sulfate de magnésium. L'acétate d'éthyle a été éliminé par distillation et le résidu a été recristallisé dans de l'acétate d'éthyle en fournissant 0,8 g de nicotinate de la substance WS-4545 sous 40 forme de cristaux jaune pâle fondant à 143°C. 71 36489 2110362 33 Analyse : C18H21°8N3 -OH N Calculé : 53,07 5,20 -10,32 Trouvé : 52,79 5,33 10,09 5 D'une manière sensiblement identique à celle décrite dans l'exemple 18 ci-dessus, on a obtenu, comme le montrent les exemples 19 et 20 suivants, les dérivés acylés (à savoir un ester d'acide carboxylique) de la substance WS-4545. EXEMPLE 19 10 Substances de départ Substance WS-4545 : 3,02 g chlorure de thiophénoyle : 1,57 g Solvant pour recristallisation mélange d'acétate d'éthyle et de benzène 15 Dérivé acylé 2-thiophènecarboxylate de la substance WS-4545' sous forme de cristaux, rendement : 2,27 g, â-e fusion : 125°C. Analyse : C^^H^I^SOg C H ÏT 20 Calculé : 49,51 4,89 6,79 trouvé : 49,45 4,70 6,57 EXEMPLE 20 Substances de départ substance WS-4545 : 1,0 g ^5 chlorure de 5-chloro-2-benzothiaaolinone-3-acétyle :0,75g solvant de recristallisation mélange d1acétonitrile et d'acétate d'éthyle Dérivé acylé 5-chloro-2-benzothiazolinone-3-acétate de la substance WS-4545, lamelles incolores, rendement : 0,7 g, Pt. de fusion: 159-160°C (décomposition). Analyse : G^-]H^O0îîjSCl C H N S Cl Calculé : 47,77 4-,20 7,96 6,07 6,72 55 Trouvé : 47,84 4,34 8,04 6,33 6,79 EXEMPLE 21 (A) A une solution de la substance WS-4545 (3,02 g) dans de la pyridine (18 ml), on a ajouté goutte à goutte du chlorure de 2-furoyle (1,43 g) en agitant et en refroidissant entre 40 -5 et -10°C, ce qui a pris 30 minutes. Le mélange a été agité 71 36489 j» 2110362 à la même température pendant 2 heures, après quoi on a ajouté de l'eau (40 ml). Le solvant a été chassé par distillation sous pression réduite et le résidu a été dissous dans de l'eau La solution a été lavée avec de l'acétate d'éthyle et ensuite 5 saturée de chlorure de sodium. La solution a été soumise à urre extraction par de l'acétate d'éthyle et la couche d'acétate d'éthyle a été lavée avec une solution aqueuse de "bicarbonate de sodium et séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant a été distillé sous pression réduite et le résidu, a été recris 10 tallisé dans un mélange d'acétate d'éthyle et de "benzène en fournissant 0,93 g de 2-furoate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 125°C. Analyse : C^^HgQÏÏpO^ C H ÎT 15 Calculé : 51,51 3,09 7,07 Tr&uvé : 51,32 5,03 7,11 (B) La liqueur-mère obtenue au cours de l'opération de recristallisation ci-dessus a été concentrée sous pression réduite, le résidu a été adsorbé sur du gel de silice dans une 20 colonne et l'élution a été conduite avec un mélange de chloroforme et de méthanol (15:1). L'éluat a été concentré sous près sions réduite et le résidu a été recristallisé dans un mélange de chloroforme et de méthanol en donnant.0,6 g de di-2-furoate de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fon-25 dant à 183-184°C. Analyse : G22H22H2C>11 C H |T Calculé : 53,88 4,52 5,71 Trouvé : 53,66 4,33 5,53 30 EXEMPLE 22 A une solution de p-bromobenzoate de la substance WS-4545 (1,0 g) obtenu dans l'exemple 11, dans de la pyridine (3 ml), on a ajouté goutte à goutte de l'anhydride acétique (3,0 ml) sous agitation à la température ambiante, ce qui a pris 35 20 minutes. Le mélange a été agité pendant 4 heures supplémentaires à la température ambiante et ensuite additionné d'eau. La solution a été concentrée sous pression réduite et le résidu a été dissous dans de l'eau. La solution a été lavée à l'eau, avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et 40 de l'eau respectivement, et séchée sur sulfate de magnésium. 71 36489 55 2110362 le solvant a été distillé sous pression réduite, le résidu a été adsorbé sur du gel de silice dans une colonne et l'élu-tion a été effectuée avec un mélange de chloroforme et d'acétate d'éthyle (8:2). L'éluat a été concentré sous pression ré-5 duite en fournissant des cristaux "bruts. Ils ont été recristallisés dans un mélange d'acétate d'éthyle et de "benzène en donnant 0,5 g de dérivé di-acétyl-p-bromobenaoyle de la substance WS-4545 sous forme de cristaux incolores fondant à 210°C. Analyse : G^E^^S 10 ~ ' CHU Calculé : 48,52 4,43 4,92 Trouvé : 48,56 4,78 4,47 EXEMPLE 23 A une solution de p-bromobenaoate de la substance US-15 4545 (2 g) dans de la pyridine (6 ml), on a ajouté, goutte à goutte, du chlorure de benzoyle (1,45 g) sous agitation à la température ambiante, ce qui a pris 30 minutes. Le mélange a été agité pendant'cinq heures supplémentaires à la température ambiante et abandonné pendant une nuit. Le mélange réactionnel 20 a été additionné d'eau et concentré sous pression ./réduite. Le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle et lavé à l'eau, avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et de l'eau. Après séchage de la solution, le solvant a été distillé sous pression réduite. Le résidu a été adsorbé sur du gel 25 de silice dans une colonne, l'élution a été conduite avec du chloroforme et l'éluat a été concentré saus pression réduite en fournissant des cristaux bruts. Ceux-ci ont été recristallisés dans de l'acétate d'éthyle pour donner 1,51 g de dérivé di-benzoyl-p-bromobenzoyle de la substance I7S-4545 sous forme d'ai-30 guilles fondant à 177-178°C. EXEMPLE 24 A une solution du m-bromobenzoate de la substance \7S-4545 (2,0 g) obtenu dans l'exemple 10, dans de la pyridine (6 ml), on a ajouté, goutte à goutte, de l'anhydride acétique 35 (40 ml) en agitant et en refroidissant, ce qui a pris 30 minutes. Le mélange a été agité pendant 3 heures supplémentaires et abandonné dans un réfrigérateur pendant une nuit. On a ajouté de l'eau au mélange réactionnel et concentré la solution sous pression réduite, Le résidu a été lavé à l'eau et séché en 40 fournissant des cristaux bruts (2,2 g). Ceux-ci ont été 1 71 36489 2110362 36 recristallisés dans de l'acétone en fournissant le dérivé di-acétyl-m~bromobenzoyle de la substance WS-4545 sous forme de cristaux fondant à 217-218°0. exemple 25 5 Préparation d'une injection. On a pesé les quantités d'antibiotique 13-4545 stérile et d'urée stérile requises. Celles-ci ont été uniformément mélangées et réparties dans des fioles ou ampoules qui renfermaient 250 mg de l'ingrédient actif. On a hermétiquement scellé les ampoules pour en exclure 10 les bactéries. Chaque fois que l'on a eu besoin du contenu des fioles, on a introduit dans la fiole une quantité appropriée d'eau apyrogène stérile et on a administré le contenu de la fiole. EXEMPLE 26 15 Une formulation appropriée pour comprimés comprend : Parties (1) Benzoate de la substance WS4545 2 (2) Mannitol 90 (3) Amidon 6 20 (4.) Stéarate de magnésium 2 •fxfmpt.T: 27 "Une formulation appropriée pour suppositoires comprend : Parties (1) Acétate de la substance WS-4545 2.500 25 (2) Ethylènediaminotétraacétate disodique dihydraté 900 (3) "Witepsol H 12" (marque déposée) 124.000 71 36489 J7 2110362 REVENDICATIONS 1. Antibiotique dénommé WS-4545 possédant les propriétés physiques et chimiques suivantes : a) cristaux basiques et blancs ; 5 b) soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol et la py ridine, légèrement soluble dans l'acétone et dans l'acétate d'éthyle et insoluble dans l'éther, le chloroforme, le benzène et le n-hexane; c) le poids moléculaire tel que déterminé par spectro-10 graphie de masse est de 302; d) le pouvoir rotatoire spécifique est63,5° (c = 1,00 °/a en poids/volume dans le méthanol); e) l'analyse élémentaire donne les valeurs suivantes (%):- carbone = 47,44, hydrogèhe = 6,16, azote = 9,36 et oxy- 15 gène (par différence) = 37,04; f) la formule empirique est g) la réaction colorée est positive aux tests de Fehling et de Molisch, avec décoloration d'une solution de permanganate de potassium, réaction légèrement positive avec le chloru- 20 pe ferrique et négative aux tests de Tollen et d'Ehrlich et à la ninhydrine; h) la valeur Rf est de 0,41 (n-butanol:acide acétique: eau s? 4:1:5), de 0,55 (n-butanol:pyridine:eau = 4:1:1), de 0,39 (chloroforme:méthanol = 5:1), de 0,65 (acétate d'éthyle: 25 méthanol =1:1) et de 0,41 (benzène:méthanol:chloroforme = 1:1:1); i) le spectre de résonance magnétique nucléaire donne les valeurs suivantes (îr(ppm) : solution DïïS0-d6, étalon interne: TïIS) : 8,81 (3H singulet), 7,45-7,67 (2H multiplet), 6,30-6,87 (2H multiplet), 6,10-6,40 (2H multiplet), 6,09 (1H doublet), 5§8 (1H triplet), 4,95 (1H multiplet), 4,93 (1H singulet), 4,87 (1H doublet), 4,63 (1H multiplet^ }3,27 (1H singulet), 1,38 (1H singulet) et 1,05 (1H singulet); j) dans les cristaux appartenant aux systèmes rhombiques ^ le point de fusion est de 187-189°C (décomposition); la diffraction des rayons X fournit les valeurs suivantes: distance ré-ticulaire : a= 11,7 A, b= 12,7 A et c= 8,8 A poids spécifique : 1,54- g/cm^; le spectre ultra-violet est représenté en fig. 1; le spectre infra-rouge en fig. 2 donnant des pics aux fré 71 36489 2Î1Ù362 38 1450, 1390, 1370, 1295, 1260, 1220, 1195, 114-0, 1120* 1080, 1030, 970, 960, 935, 895, 870, 820, 785, 725, et 680; dans les cristaux appartenant aux systèmes monocliniques, le point de fusion est.de 188-191°C (décomposition); la 5 diffraction des rayons X indique une distance réticulaire : a= 10,1 A, jh = 101°, b = 10,9 A et c= 6,6 A, poids spécifique: 1,46 g/crn^; le spectre ultra-violet est représenté en fig. 3; le spectre infra-rougs de la figure 4.indique des pics aux fréquences suivantes (ci"'') : 3500,. 3400, 3270, 2900, 2840, 1685, 10 1640, 1«55j 1417, 1375, 1330, 1300, 1260, 1245; 1210, 1160, 1135, 1125, 1105, 1085, 1050, 1010, 995, 980, 940, 920, 900, 885, 870, 840, 805, 795, 760, 725, 690 et 675. 2. Dérivés acylés de l'antibiotique WS-4545 selon la revendication 1. 15 3. Dérivé mono-, di- ou tri- acylé selon la revendication 2 de l'antibiotique WS-4545. 4. Dérivé acylé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le groupe acyle est un groupe acyle carboxylique provenant d'un acide carboxylique aliphatique, arons- 20 tique ou hétérocyclique. 5. Dérivé acylé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le groupe acyle est un groupe acyle carboxylique choisi parmi un carbonyle hydrocarboné aliphatique, un carbonyle cyclohydrocarboné aliphatique, un carbo- 25 nyle arylique, un carbonyle à noyau hétérocyclique ou un carbonyle à noyau hétérocyclique accolé à du benzène; ou un carbonyle hydrocarboné aliphatique substitué par un cycldhydrorar-bure, un aryle, un noyau hétérocyclique ou un noyau hétérocyclique accolé au benzène, la partie hydrocarbonée aliphatique 30 du groupe acyle harboxylique ci-dessus étant linéaire ou ramifiée et, éventuellement interrompue par un hétéroatome tel que l'oxygène ou le soufre et chacun des acylés carboxyliques ci-dessus étant, le cas échéant, substitué par des substituants éventuels. 35 6. Dérivé monoacylé selon la revendication 3, caractéri sé en ce que 1'acyle est un alcanoyle ou un alcénoyle. 7» Dérivé monoacylé selon la revendication 3, caractérisé en ce que 1'acyle est un cycloalcane carbonyle. 8. Dérivé monoacylé selon la revendication 3, caractéri- 40 sé en ce que 1'acyle est un aryl carbonyle ou un aryl carbonyle substitué. 71 36489 2110362 39 9. Dérivé monoacylé selon la revendication 3, caractérisé en ce que 1'acyle est un aralcanoyle ou un aralcénoyle, ladite partie arylée étant le cas échéant substituée par un ou plusieurs substituants éventuels et ladite partie hydrocarbonée 5 aliphatique étant éventuellement interrompue par un hétéroatome . 10. Dérivé monoacylé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l1acyle est un carbonyle à noyau hétérocyclique, un carbonyle à noyau hétérocyclique accolé au benzèhe ou un alca- 10 noyle substitué par un tel noyau hétérocyclique, ledit noyau hétérocyclique étant un cycle à cinq ou six chaînons renfermant au moins un hétéroatome choisi parmi l'oxygène, l'azote ou le soufre et chacun desdits groupes acylés carboxyliques hétéro-cycliques étant au besoin substitué par un ou plusieurs subs- 15 tituants éventuels. 11. Dérivé monoacylé selon la revendication 3» caractérisé en ce que l'acyle est un groupe acyle "carboxylique choisi parmi les groupes acétyle, propionyle, butyryle, palmitoyle, crotonoyle, cyclohexylcarbonyle, benzoyle, p-chlorobenzoyle, 20 m-bromobenzoyle, p-bromobenzoyle, 3,4-diméthylbenzoyle, p-acétoxybenzoyle, jh -phénylpropionyle, p-chlorophénoxyacétyle, cinnamoyle, nicotinoyle, 2-thénoyle, 2-furoyle et 5-chloro-2-r oxo-3-benzothiazolinyl-acétyle. 12. Dérivé diacylé selon la revendication 3, caractérisé 25 en ce que l1acyle est un alcanoyle, un aryl carbonyle ou un carbonyle à noyau hétérocyclique comportant cinq à six chaînons. 13» Dérivé diacylé selon la revendication 3» caractérisé en ce que 1'acyle est un acétyle, un butyryle, un benzoyle ou un 2-furoyle. 30 14-, Dérivé triacylé selon la revendication 3, caractérisé en ce que 1'acyle est un alcanoyle, un aryl-carbonyle ou un aryl-carbonyle substitué. 15. Dérivé triacylé selon la revendication 3, caractérisé en ce que 1'acyle est un acétyle, un benzoyle, un p-bromo- 35 benzoyle ou un m-bromobenzoyle. 16. L'antibiotique WS-4545 ou un de ses dérivés acylés selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le composé est représenté par la formule 71 36489 2110362 00 HH dans laquelle , R2, R^ sont de l'hydrogène ou un groupe acyle. 17» Procédé pour l'obtention de l'antibiotique WS-4545 15 et de son dérivé acylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 caractérisé en ce qu'on soumet le Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 ou ses mutants étroitement apparentés à une fermentation dans des conditions aérobies contrôlées dans un milieu nutritif ou qu'on acyle l'antibiotique WS-4545 à l'ai-20 de d'un agent d'acylation. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que pour l'obtention de l'antibiotique WS-4545 la fermentation s'effectue dans un milieu nutritif aqueux renfermant du carbone et de l'azote assimilables ou une substance protéique. 25 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la fermentation est conduite pendant une durée de 30 à 50 heures à une température d'environ 25°C à 37°C, de préférence à environ 30°C. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce 30 qu'il comprend la récupération de l'antibiotique WS-4545 par extraction à 1'aide d'un solvant organique de 11 antibiotique tel que la pyridine, un alcool, un alcool aqueux ou m mélange d'alcool et des autres solvants organiques. 21. Procédé pour l'obtention de l'antibiotique WS-4545 35 selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend l'isolement et la purification dudit antibiotique . 22. Antibiotique du type WS-4545 produit par un procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 21. 40 23. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce CH0 OR-, Il 2 i 3 h2C / h2c \ \ hh co O- y h-c-or. 10 ho-c-ch-, ! * CHpOR. 71 36489 „ 2110362 que le dérivé monoacylé de l'antibiotique WS-4545 est préparé par acylation dudit antibiotique avec un équivalent molaire d'un agent d'acylation. 24. Procédé selon la revendication 17» caractérisé en ce 5 que le dérivé diacylé de l'antibiotique WS-4545 est préparé par acylation dudit antibiotique avec environ deux équivalents molaires d'un agent d'acylation ou par acylation ultérieure du dérivé monoacylé de l'antibiotique obtenu dans la revendication 23 avec au moins un équivalent molaire d'un agent d'acylation. 10 25/ Procédé selon la revendication 17» caractérisé en ce que le dérivé triacyléde l'antibiotique ÏÏS-4545 est préparé par acylation dudit antibiotique avec plus de trois équivalents molaires d'un agent d'acylation ou par acylation ultérieure du dérivé monoacylé de l'antibiotique obtenu dans la revendication 15 23 avec au moins un équivalent molaire d'un agent d'acylation. 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 a 25} caractérisé en ce que l'agent d'acylation est un acide carboxylique représenté par la formule : R - OH où S est un groupe acyle carboxylique tel qu'un acide carboxylique alipha-20 tique, un acide carboxylique aromatique ou un acide carboxylique hétérocyclique ainsi que leurs dérivés réactifs sur le carboxyle . 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que l'agent d'acylation est un acide 25 carboxylique représenté par la formule : S = OH et son dérivé réactif sur le carboxyle, H étant un groupe acyle carboxylique choisi parmi un carbonyle hydrocarboné aliphatique, un carbonyle cyclohydrocarboné aliphatique, un aryl carbonyle, un carbonyle à noyau hétérocyclique ou un carbonyle hétérocyclique 30 accolé au benzène ou un carbonyle hydrocarboné aliphatique substitué par un cyclohydrocarbure, un aryle, un noyau hétérocyclique ou un noyau hétérocyclique accolé au benzène, la partie hydrocarbonée aliphatique du groupe acyle carboxylique ci-dessus étant linéaire ou ramifiée et au besoin interrompue par 55 un hétéroatome tel que l'oxygène ou le soufre et chacun des acylés carboxyliques ci-dessus étant au besoin substitué par des substituants éventuels. 28.- Dérivés acylés de l'antibiotique 7S-4545 préparés par un procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 40 26. 71 36489 42 2110362 29. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce què l'on prépare l'antibiotique WS-4545 et son dérivé acylé qui peuvent être représentés par la formule : 0Ho 0RZ y 2 | : 3 C . C: ——■—GO / v HpC NH IV 10 h c 00 2 \ / . 0 —G- KH hc-0r2 hgc-ch-, 5 A !H20R^ 15 dans laquelle R^, R2 et R^ sont de l'hydrogène ou un groupe acyle. 30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 29, caractérisé en ce que l'on prépare 35antibiotique ¥3-454-5 de formule IV où R^, R2 et R^ sont de 1'hydrogène. 20 31. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'on prépare le dérivé monoacylé de l'antibiotique WS-4545 de formule IV où R^ est un groupe acyle carboxylique et R2 et R^ sont de l'hydrogène. 32. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce 25 que l'on prépare le dérivé diacylé de l'antibiotique WS-4545 de formule IV où R et R2 sont un groupe acyle carboxylique et R^ est de l'hydrogène. 33. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'on prépare le dérivé triacylé de l'antibiotique WS-4545 30 de formule IV où R^, Rp et R^ sont des groupes acylés carboxylique s. 34. Antibiotique WS-4545 selon la revendication 16 caractérisé en ce que R^, R2 et R^ sont de l'hydrogène. 35- Dérivé monoacylé de l'antibiotique WS-4545 selon la 35 revendication 16, caractérisé en ce que R^ est un groupe acyle et Rg et R,, sont de l'hydrogène. 36. Dérivé diacylé de l'antibiotique 7S-4545 selon la revendication 16, caractérisé en ce que R^ et R^ sont un groupe acyle et R^ est de l'hydrogène. 40 37. Dérivé triacylé de l'antibiotique WS-4545 selon la 71 36489 2110362 4-3 revendication 16, caractérisé en ce que R^, R^ e,fc sont un groupe acyle. 38- Application du produit selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'une composi-5 tion thérapeutique qui renferme, à titre d'ingrédient actif, 1 * antibiotique WS-4-54-5 et/ou m ou plusieurs de ses dérivés acylés avec un véhicule ou un excipient pharmaceutique. 39. Comprimé, pilule, capsule, suppositoire, solution, émulsion, suspension aqueuse pour l'administration parentérale 10 selon la revendication 38.