Brevet FR2115090A1 — publié le 19720707

La présente invention est fondée sur la découverte de propriétés pharmacologiques précieuses qu'offrent certains composés, les uns nouveaux, d'autres déjà signalés dans la littérature, composés que l'on conviendra de qualifier de cis-stilbénoides a-nitrés. I1 s'agit de composés répondant à la formule générale dans laquelle chacun des symboles R et R1 représente, indépendamnent de l'autre, un noyau carbocyclique ou hétérocyclique pentagonal, hexagonal ou heptagonal qui est relié par un de ses atomes de carbone au pont éthylénique et qui peut porter un ou plusieurs substituants de la classe constituée par les atomes et groupements amine, nitro, halogène, alcoyle, aralcoyle, alcoxyle, aralcoxyle, hydroxyle et méthylène-dioxyle ainsi que par les chaînes carbonées définissant avec R ou R1 un système aromatique polycyclique. L'invention concerne les médicaments qui contiennent ces composés ci-stilbénoIdes a-nitrés au titre de principes actifs et plus particulièrement ceux qui contiennent les composés répondant à la formule dans laquelle X représente l'un des noyaux ainsi que les composés pour lesquels X représente un noyau benzénique et l'un au moins des deux noyaux X et Y porte au moins un substituant de la classe constituée par F, Cl, CH3, OCHD, COOH, N02 et le groupe -O-CH2-O- formant pont entre deux atomes de carbone nucléaires voisins. De plus, l'invention comprend les fluoro-21, fluoro-3', fluoro-4', nitro-4', diméthoxy-2',5', diméthoxy-2',4', dichloro-2',6', chloro-4 et chloro-3 cis-a-nitro stilbènes ainsi que le cis-nitro-l (-furyl)-2 éthylène et le p,p'-bis (cis-c-nitro-styryl )benzène. L'invention comprend en outre un procédé de préparation des composés cis-stilbénoides qui répondent à la première formule ci-dessus et pour lesquels R représente le phényle, un chlorophényle ou un dichlorophényle par application de la méthode de Robertson (J. org. chem., 1960, 2S, 47),c'est-à-dire par condensation de phényl nitrométhane, d'un chlorophényl nitrométhane ou d'un dichlorophényl nitrométhane et d'une imine du type des bases de Schiff ayant pour noyau le noyau R1 ou X, avec cette caractéristique que l'alcoyle relié à l'azote iminique est le propyle normal, grâce à quoi l'opération est facilitée et le rendement amélioré.Les phényl nitrométhanes s'obtiennent plus ou moins difficilement, selon la nature des substituants présents sur le noyau, par action du nitrite d'argent sec sur l'halo- génure de benzyle correspondant, en solution éthérée et anhydre à l'abri de la lumière. La suite des opérations est illustrée par les schémas suivants Le procédé peut, plus particulièrement, être exécuté comme il ressort de l'exposé, donné ci-après, de sa conduite, à titre d'exemple, à l'échelle du laboratoire. Les températures sont en degrés centigrades danstout le mémoire. a) Phényl nitrométhane Dans un ballon de 1 litre, plongé dans un bain de glace, on a introduit 0,1 mole de nitrite d'argent et 250 cm3 d'éther anhydre séché sur des fils de sodium. La suspension est agitée magnétiquement et, des que sa température avoisine 00, on ajoute goutte à goutte 0,05 mole de l'ha- logénure de benzyle porteur de substituant en solution dans 200 cm3 d'éther anhydre séché sur des fils de sodium. Dès le début de l'introduction, on opère à l'abri de la lumière et on veille à ce que la tenpérature du mélange réactionnel ne dépasse pas 50; sinon, il se forme concuremment un ester nitreux. Lorsque la totalité de lthalo- génure de benzyle a été introduite, on abandonne le mélange réactionnel pendant 24 heures à la température ambiante et à l'obscurité, avec agitation, Après cela, on filtre le précipité minéral (nitrite d'argent n'ayant pas réagi et halogénure d'argent formé), on le lave abondamnent à l'éther puis on lave la phase éthérée à l'eau, jusqu a neutralité, on sèche sur du sulfate de sodium et on évapore sous vide.Le liquide mobile résiduel constitue le dérivé nitré cherché; on peut le distiller sous vide pour obtenir un échantillon de grande pureté. Toutefois, le produit brut est obtenu avec un degré de pureté suffisant qui permet de l'employer pour la réaction suivante sans purification ultérieure. Les rendements en phényl nitrométhane sont de l'ordre de 80F,. b) Benzylidène n-propylamine. Dans un petit ballon à fond rond on introduit 0,1 mole d'aldéhyde aromatique puis de la n-propylamine en large excès (0,5 mole)de façon à déplacer l'équilibre entre la base de Schiff à former et ses constituants respectifs. On chauffe pendant 5 minutes au bain-marie vers 40 puis abandonne pendant 15 minutes sans chauffage. On chasse ensuite sous le vide de la trompe à eau l'excès de -propylamine et l'eau formée. La base de Schiff obtenue est généralement liquide et est suffisamment pure pour être utilisée sans purification ultérieure. Le spectre infrarouge indique une réaction totale et quantitative, par l'absence d'une bande C et la présence d'une bande C=N vers 1642 cm-1. c) Cis a-nitro stilbène. A une solution de 0,1 mole du phényl nitro méthane obtenu selon a dans 25 cp d'acide acétique cristallisable, on ajoute 0,1 mole de la base de Schiff obtenue selon b . Après chauffage d'une minute au bain-marie bouillant, on refroidit rapidement et on abandonne à la température ambiante de 1 à 48 heures selon la réactivité de l'aldéhyde et en fonction de la facilité de précipitation du dérivé nitro stilbénique. Si l'amorçage de la cristallisation est difficile, on recourt aux artifices classiques tels que l'addition d'un peu de méthanol ou d'eau ou encore le grattage des parois du récipient. Après début de précipitation, on porte au réPrigérateur et on abandonne jusqu'à cristallisation complète. On essore et recristallise l'a-nitro stilbène dans le méthanol. Les rendements s'échelonnent de 30 à 80% en produit pur. EXEMPLES 1 à 25 En opérant comme il vient d'être décrit, on a pu préparer a) Les a-nitro stilbènes identifiés dans le tableau I ci-après par la nature des substituants dans la formule et par leur point de fusion (mesurés, après recristallisation dans le méthanol, sur un appareil de BUchi-Tottoli). TABLEAU U Exemple Point de substituants et leur position sur les noyaux fusion 3 4 5 2' 3' 4' 5' 6' 1 74 2 OCH3 118 3 OCH3 149 4 F 68-69 5 F 71-72 6 F 750 7 Cl 870 8 Cl 108 9 # N02 156 10 COOH 266-267 (bloc ma quenne) 11 OCH3 OCH3 T A B L E A U I (suite et fin) Exemple Point substituants et leur position sur les noyaux de 3 4 5 2' 3' 4' 5' 6' fusion 12 OCH3 OCH3 112 13 OCH3 OCH3 105 14 OCH3 OCH3 122 15 O-CH2-O 126 16 Cl Cl 133 17 Cl Cl 110,5 18 Cl 106 19 Cl Cl 127 20 CH3 79 b) Les composés a-nitro stilbéno/C5ides qui répondent à la formule et sont identifiés, dans le tableau II, par la signification de X et par leur point de fusion déterminé comme ci-dessus. Tableau II (page suivante) T A B L E A U II Exe,nple X de Pont de fusion 21 Ài 120-121 22 X (ÀÉÉ 114 23 4 88" 24 À 120-1210 25 ?290 02N . . 26 À 78" Les résultats de l'analyse centésimale ont donné, pour C, H, N, C1, F, O et S, des valeurs en bon accord avec les valeurs théoriques (moins de 0,3 % avec celles-ci). Les composés des exemples précédents ont été soumis à une expérimentation qui a ais en lu-nière des effets biologiques. On a recherché plus spécialenent leur cytotoxicité "in vitro"et leur action antitumorale "in vivo" comme il va maintenant être décrit. Cytotoxicité in vitro. On a utilisé des cellules issues d'un clone de fibroblastes de hamster, en l'espèce de la lignée continue PHK 21/13; cette lignée est faiblement branEformée et peu tumorigène, mais sa transformation par des virus oncogènes à ADN ou à ARN s 'ac- compagne d'une augmentation de 10 à 100 fois du pouvoir tunorigène et, disposant ainsi de plusieurs clones de cellules à des degrés différents de transfornation sur lesquels on peut comparer l'activité des inhibiteurs, on a choisi le clone RB 12 cité ci-dessus. Ce clone est issu d'une transformation par le virus de Rous, souche de Bryan. On l'a employé comparativement au clone de départ non transformé. Les cellules ont été détachées par trypsination et mises en culture dans des bottes de Pétri de 35 mm de diamètre à raison de 5.105 cellules par bolte dans 2 ml de milieu ETC 10. Elles se sont mises alors à protiférer, tendant à former un tapis qui adhère au support. Après 12 à 24 heures, les substances à essayer ont été ajoutées à des concentrations de 2, 5, 10, 20 et 50 pId/litre. Les composés non actifs à ces concentrations ont également été mis à l'épreuve aux concentrations de 100 et 200 p /.litre. Les substances ont d'abord été dissoutes dans du diméthyl sulfoxyde à la concentration de 10 &num;4/litre puis diluées de 10 en 10 dans des solutions aqueuses de NaCl à 0,85"",. Ces dilutions ont été utilisées immédiatement, du fait de la formation de fins précipités. On a observé l'aspect des cultures au microscope inversé après l'addition des substances. Au début de 1'expé- rimentation, un paramètre quantitatif de croissance a également été mesuré 48 heures après la mise en culture; les cellules ont été détachées par de la trypsine et comptées. L'inhibition a ainsi été déterminée par le pourccntage de cellules dans les boîtes traitées rapporté à celui des cellules de témoin non traité.Lorsque l'action des substances essayées a été bien caractérisée, on s'est limité à définir par les symboles suivants des degrés dans les modifications morphologiques des cultures observées au microscope inversé, 15 à 24 heures après l'addition des produits Détachement complet des cellules, + Arrondissement de toutes les cellules, encore adhérentes au support (arrêt de la multiplication cellulaire tumorale) + Présence de quelques cellules arrondies ; peu de multi plication des cellules ; o Pas de différence avec les témoins. L'état des cultures a également été vérifié 48 et 72 heures après l'addition des produits. Les résultats les plus significatifs sont consignés ci-après dans le tableau III T A B L E A U III Exem- Cellules C 13/RB 12 ple N Cellules C 13 transformées par virus de Rous 1 inhibition ++ à 10 ssM inhibition ++ à 10 uM inhibition + à 10 " inhibition + à 10 " 2 { Inhibition ++ à 20 " {inhibitiion ++ à 20" inhibition + à 1O " inhibition o à 10 'inhibition ++ à 50 " {inhibition ++ à 50 4 inhibition + à 10 " inhibition + à 10 inhibition ++ à 50 " inhibition ++ à 50 inhibition + à 50 " inhibition + à 10" 5 {inhibition ++à 50 " {inhibition ++ à 50 " inhibition + à 10 " inhibition + à 10 " 6{inhibition ++ à 50 " {inhibition ++ à 50 " inhibition + à 10 " inhibition + à 10 inhibition ++ à 50 " inhibition ++ à 50 " 8 inhibition ++ à 10 " inhibition ++ à 10 " 9 inhibition ++ à 5 " inhibition + à 5 " inhibition ++ à 10 " inhibition + à 10 " inhibition + à 10 10 {inhibition ++ à 50 " finhibition ++ à 50 11 inhibition + à 5 " inhibition + à 5 inhibition ++ à 10 " inhibition ++ à 10 " inhibition + à 10 " inhibition + à 10 " inhibition ++ à 50 " inhibition ++ à 50 " 13 inhibition ++ à 50 " inhibitin ++ à 50 inhibition + à 10 " inhibition + à 10 " inhibition ++ à 50" inhibition ++ à 50 15 inhibition ++ à 10 " inhibition + à 10 16 inhibition + à 10 " inhibition + à 10 { inhibtion ++ à 50 " inhibition ++ à 50 " 17 inhibition ++ à 50 " inhibition ++ à 50 " 18 inhibition + à 10 " inhibition + à 10 " {inhibition ++ à 50 " {inhibition ++ à 50 " T A B L E A U III (suite) Exem Cellules C 13 Cellules C 13/RB 12 ple No Cellules C 13 transformées par virus de Rous inhibition + à 10 UM inhibition + à 10 uM 20 {inhibition ++ à 50 " { inhibition ++ à 50 " inhibition ++ à 10 " 21 inhibition ++ à 5 " inhibition + à 5 inhibition + à 5 " inhibition + à 5 " 22 {inhibition ++ à 10 " {inhibition ++ à 10 " 23 inhibition + à 50 " inhibition ++ à 50 " 24 inhibition + à 50 " inhibition ++ à 50 " inhibition + à 2 " inhibition + à 2 " 25 inhibition + à 5 " inhibition + à 5 " inhibition ++ à 10 " inhibition ++ à 10 " inhibition + inhibition O à 5 " 26 inhibition + à 10 " inhibition + à 10 " inhibition ++ à 50 " inhibition ++ à 50 " Action antitumorale in vivo On a utilisé la souche de carcinome ascitique Krebs II. Des souris Swiss adultes (2 à 3 mois), d'un poids variant de 25 à 30 g ont recu, par voie intrapéritonéale, 108 cellules de Krebs II mises en suspension dans du PBS ou tampon salin au phosphate de Dulbecco et Vogt (J. Exper. Med., 99, 167, 1954), le volume injecté étant de 0,1 ml 24 heures après, les composés des exemples ont été administrés par la même voie sous forme de suspensions préparées de la manière suivante avec l'aide de méthyl cellulose "Methocel" de Dow Chemical. Chaque composé est pesé et broyé au mortier, 1 goutte/ ml d'éthanol est ajoutée pour mouiller les cristaux puis la solution de "Methocel" (4000 centipoises) à 0,5 % dans du PBS est ajoutée goutte à goutte, jusqu'à émulsification complète. La concentration du composé dans la suspension a été calculée de façon que 0,35 ml soit injecté à chaque souris. Le même volume de solution-de "Zethoceln est administré au lot témoin. 4 à 5 souris par lot ont été utilisées. Les animaux ont été sacrifiés le septième jour et on a mesuré le volume d'ascite ainsi que sa variation par rapport à celui du lot témoin. Les résultats les plus significatifs sont consignés ci-après dans le tableau IV T A B L E A U IV Exemple N Activité sur la souche N d'ascite Krebs II (108 cellules) Remarques 1 Actif à 40 mg/kg Pas d'effet toxique (pas d'ascite) apparent 2 Actif à 82 mg/kg Dose toxique comprise (pas d'ascite) entre 200 et 500 mg 8 Actif à 165 mg/kg Action toxique à la même (55 % de résorption) dose (rein, intestin) Il Actif à 40 mg/kg Effet toxique inconstant 15 Actif à 82 mg/kg Ascite 5 % par rapport au témoin 25 30%dtinhibition à 33 mg/kg REVENDICATIONS 1.- Médicament contenant un composé cis-stilbènoide a-nitré qui répond à la formule générale dans laquelle chacun des symboles R et R1 représente, indépendamment de l'autre, un noyau carbocyclique ou hétérocyclique pentagonal, hexagonal ou heptagonal qui est relié par un de ses atomes de carbone au pont éthylénique et qui peut porter un ou plusieurs substituants de la classe constituée par les atomes et groupements amine, nitro, halogène, alcoyle, aralcoyle, alcoxyle, aralcoxyle, hydroxyle et méthylène-dioxyle ainsi que par les charnus carbonées définissant avec R ou R1 un système aromatique polycyclique. 2.- Médicament selon la revendication 1, qui contient un composé répondant à la formule dans laquelle X représente l'un des noyaux 3.- Médicament selon la revendication 1, qui contient un a-nitro cis-stilbène répondant à la formule dans laquelle l'un au moins des noyaux Y et Z porte au moins un substituant de la classe constituée par F, C1, CH3 OCH3, COOH, NO2 et le groupe -0-CH2-0- formant pont entre deux atomes de carbone nucléaires voisins. 4.- Médicament à action cytostatique contenant un composé de la classe constituée par les méthyl-4', méthoxy-2', fluoro-4', chloro-4', nitro-4', carboxy-4', diméthoxy-2',3' et méthylène-dioxy-3',4' &alpha;-nitro cis-stilbènes ainsi que par les cis-nitro-1 phényl-1 &alpha;-naphtyl-2, &alpha;-furyl-2, &alpha;-thényl-2 et cyclohexyl-2 éthylènes. 5.- Médicament à action antitumorale contenant un composé de la classe constituée par les méthyl-4', méthoxy-2', chloro-4', diméthoxy-2',3' et méthylène-dioxy-3',4' &alpha;-nitro cis-stilbènes. 6.- Composé du groupe constitué par les fluoro-21, fluoro-3', fluoro-4', nitro-4', diméthoxy-2', 3' diméth&alpha;y -2',4', dichloro-2',4' chloro-4 et chloro-3 cis &alpha;-nitro stilbènes, le cis-nitro-1 (&alpha;-furyl)-2 éthylène et le P.P'-bis-(cis-&alpha;-nitro- styryl)benzène. 7.- Procédé de préparation d'un composé cis stilbdnolde répondant à la formule générale et pour lequel R est le phényle, un chlorophényle ou un dichlorophényle tandis que R1 a la signification indiquée dans la revendication 1, procédé selon lequel on condense du phényl nitrométhane, un chlorophényl nitrométhane ou un dichlorophényl nitrométhane avec une imine du type des bases de Schiff ayant R1 ou X pour noyau, avec cette caractéristique que l'alcoyle relié à l'azote iminé est le propyle normal.