Brevet FR2130586A1 — publié le 19721103

La présente invention concerne un procédé de production enzymatique de céphalexine à partir d'acide 7-acylamino-d ésa c ét oxy-c éphalo sporan i que. La Demanderesse a découvert un procédé de production 5 de l'acide 7-amino-céphalosporanique (ci-après désigné par abréviation 7-ADCA) à partir d'acide 7-acylamino-désacétoxy-céphalosporanique par désacylation enzymatique. En outre, la Demanderesse a découvert un procédé de fabrication enzymatique de céphalexine à partir de 7-ADCA. Toutefois, conformément à 10 ces procédés, l'isolement et la purification du 7-ADCA sont assez incommodes en raison de la nature amphotère et hydroso-luble du composé, et par conséquent la production économique de la céphalexine est un problème assez difficile. La Demanderesse a découvert que la céphalexine se 15 produit, sans isoler le 7-ADCA comme intermédiaire, à partir de l'acide 7-acylamino désacétoxy-céphalosporanique provenant de la pénicilline et de dérivé de phénylglycine, en utilisant un enzyme provenant de Bacillus megaterium B-400 FERM-P n° 748. 20 Les caractéristiques taxonomiques du précédent micro organisme sont similaires à celle de Bacillus megaterium var. penicillalyticum ATCC 14 945, sauf sur les points suivants : Liquéfaction de la gélatine FERM-P n° 748 ATCC.14 945 presque pas de liquéfaction lentement liquéfié Lait de tournesol réduction du pigment pas de réduction vire à l'alcalin (observé à 30°C pendant 30 jours) Gélose et pomme de terre formation d'un pigment brun hydrosoluble pas de formation de pigment (à 30°C pendant 30 jours) Production d'acide à partir de mannose production positive production négative 72 10172 2 2130586 Par conséquent, la souche Bacillus megaterium B-400 se rapporte à une souche nouvelle et elle est déposée à l'Institut pour l'Industrie microbiologique et la technologie, Agence des sciences industrielles et de la Technologie, Japon, et ajoutée à sa collection permanente sous le n° de dépôt FERM-P N° 748. / La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation de céphalexine caractérisé en ce qu'on traite un composé de formule I : A-NH- (I) COOM 10 dans laquelle A représente un groupe phénylacétyle ou phénoxy-acétyle et M un atome d'hydrogène ou un atome de métal alcalin, et un dérivé de phényl-glycine de formule II : H-CO-R (II) nh2 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe choisi parmi les groupes amino, glycyle, leucyle, alanyle, 15 méthyle et éthyle, avec un enzyme provenant d'une souche du micro-organisme Bacillus megaterium B-400 FERM-P ïï° 748 puis l'isolement de la céphalexine du mélange réactionnel. Le but de la présente invention est qu'on produit l'importante substance antibiotique la céphalexine à partir 20 de l'acide 7-acylamino-désacétoxy-céphalosporanique, par trans-acylation enzymatiqtfe sans isoler et purifier le 7-ADCA. On effectue la synthèse d'un dérivé de céphalospo-, rine, représenté par la formule I (et désigné ci-après par abréviation comme DCe I) à partir de pénicilline produite par 72 10172 3 2130586 fermentation telle que la pénicilline G et la pénicilline V, et qu'on la produit par ce que l'on désigne comme procédé d'allongement du cycle par un procédé en lui-même connu de chauffage au reflux d'oxyde, d'ester de pénicilline avec le 5 sulfonate de p-toluène dans un solvant organique inerte, l'oxyde d'ester de pénicilline réagit avec un phosphate d'ha-logénoalcane ou un ortho-phosphate substitué en position o-, dans un milieu organique inerte. On peut utiliser le DCe I ci-dessus sous la forme 10 d'un sel avec un cation qui n'inhibe pas l'action enzymatique. Ce sel est habituellement hydrosoluble et est celui d'un métal alcalin comme le sodium ou le potassium. Le dérivé de phénylglycine de formule II (ci-après désigné par abréviation comme PG II) ou l'un de ses sels, 15 réagit avec le groupe amino en position 7 du 7-ADCA, pour fournir un groupe -aminophényl-acéto-amide. Dans ce cas, le groupe carboxyle de la phénylglycine peut être remplacé par un groupe réactif quelconque. La phénylglycine, la phényl-glycinamide, la phénylglycylglycine, la phénylglycyl-leucine, 20 la phénylglycyl-alanine, l'ester méthylique de la phénylglycine, l'ester éthylique de la phénylglycine et analogues, sont utilisés de préférence. Parmi les composés précédents, on peut utiliser un composé insoluble ou difficilement soluble dans l'eau en général, comme sel hydrosoluble sans avoir d'effet 25 défavorable sur l'action enzymatique. Le PG II ou l'un de ses sels se présente comme isomère optique, on peut naturellement l'utiliser sous la forme d'un compose optiquement actif. Comme exemple de micro-organisme qui produit une 30 désacylase et qui fournit un enzyme de l'acylation de-la position 7, groupe amino de 7-ADCA, on peut signaler celui désigné précédemment comme Bacillus megaterium B-400 FERM-P N° 748. Un enzyme selon la présente invention implique un bouillon de culture ou un filtrat du micro-organisme Bacillus 35 megaterium B-400 FERM-P N° 748 qui produit la désacylase et l'acylase de la position 7 du groupe amino de 7-ADCA, et la préparation de l'enzyme qu'on en fait. Cet enzyme présente une 72 10172 4 2130586 activité de désacylase et une activité d'acylase en position 7 du groupe amino de 7-ADCA. On utilise de préférence un bouillon de culture avec ou sans concentration, La préparation de l'enzyme peut se faire par des processus d'isolement et de 5 purification connus. Par exemple, on peut obtenir un enzyme brut par addition de sel à saturation ou semi-saturation comme le sulfate d'ammonium ou le chlorure de sodium à un bouillon de culture concentré ou non. Ou bien on peut le précipiter par addition d'un solvant organique miscible à l'eau comme le 10 méthanol, l'éthanol ou l'acétone. On peut éliminer des impure- . tés à faible poids moléculaire par dissolution de l'enzyme brut dans l'eau et dialyse avec uné membrane semi-perméable. En outre, des impuretés à faible poids moléculaire, des matières colorées, des impuretés protéiniques et analogues, dans 15 les filtrats de culture peuvent être facilement séparées par un procédé tel que la chromâtographie par absorption, la chro-matographie par échange d'ions ou la filtration sur gel. La solution d'enzyme obtenue par ces processus de purification peut être concentrée sous vide ou lyophilisée pour fournir 20 une préparation d'enzyme en poudre, ou bien on peut directement l'utiliser pour la réaction enzymatique. S'il est nécessaire de purifier l'enzyme, on peut appliquer efficacement les processus de raffinages de protéines comme l'absorption, la filtration sur gel ou analogues. 25 Conformément au procédé selon la présente invention, on prépare le DCe I et le PG II avec un enzyme provenant de Bacillus megaterium B-400, FERM-P N° 748, qui produit une désacylase et une acylase pour la position 7 amino du 7-ADCA pour donner la céphalexine. Le pH optimal pour cet enzyme est proche 30 de pH 7-8 et par conséquent la réactiçn de trans-acylation s'effectue de préférence à pH 7-8 pour permettre la réaction» Dans ce but, le milieu réactionnel doit être réglé à pH 7-8 ou bien on effectue de préférence la réaction dans une solution tampon à pH 7-8. La réaction peut s'effectuer à 30-45°C envi-35 ron et de préférence à 45-40°C. La réaction enzymatique précédente est, bien que variable en fonction des conditions appliquées, généralement de 1 à 10 heures. Lorsque le mélange 72 10172 5 2130586 réactionnel révèle la plus grande puissance de formation de la céphalexine, la réaction doit naturellement être achevée. On peut isoler la céphalexine obtenue à partir du mélange réactionnel liquide selon un procédé connu appliqué ! 5 dans le cas de l'isolement de la céphalexine. Par exemple, on effectue l'ultra-filtration du liquide réactionnel de façon à éliminer la protéine et l'enzyme de poids moléculaire élevé, ' on règle le pH à 2-3 par addition d'acide et on lave à l'acé- • tate d'éthyle, à l'acétate de butyle, à la méthyl-isobutyl- [ 10 cétone ou avec un solvant organique analogue non miscible à ! l'eau, pour éliminer le DCe I qui n'a pas réagi. On règle en j outre la couche aqueuse à pH 1 par addition d'acide, on l'extrait avec un solvant organique non miscible à l'eau comme la méthyl-isobutyl-eétone, et après que la couche de solvant j 15 organique a été déshydratée, on concentre la couche organique ! pour précipiter la céphalexine comme sel d'acide. En variante, ' on dissout ce sel d'acide dans l'eau, et on traite cette solution avec une résine échangeuse d'anion, en présence d'un solvant organique non miscible à l'eau, puis on soumet la couche 20 aqueuse à concentration ou à la lyophilisation, ou bien on règle la solution aqueuse du sel d'acide à pH dé 4,5 environ par addition d'une base, ce qui isole la céphalexine à l'état libre. En variante, selon le passage du liquide réactionnel à travers une résine échangeuse d'anion et l'élution avec une 25 solution acide comme une solution aqueuse d'acide acétique ultérieurement, la céphalexine, le DCe I et le PG II qui n'ont pas réagi peuvent être avantageusement élués. On concentre les fractions qui contiennent la céphalexine, on dissout dans l'eau et on règle à pH 4,5, puis on peut isoler la céphalexine à 30 l'état libre. De plus, on peut aussi transformer la céphalexine libre en un sel non toxique tel qu'un sel d'un métal-alcalin selon des processus connus. i Procédé de titrage de la céphalexine : On peut titrer, microbiologiquement la puissance ou 35 l'activité de la céphalexine à 37°C pendant 16 heures selon le procédé de la coupelle ou du disque en papier utilisant le I Bacillus subtilis PCI-219 comme organisme d'expérience. 1 I 72 10172 e 2130586 La présente invention sera illustrée en référence aux exemples ci-dessous, mais diverses opérations réaction-nelles et processus de séparation qu'on peut appliquer selon le présent procédé ne sont pas limités à ceux présentés dans 5 les exemples. EXEMPLE 1 t- (1) Préparation de l'enzyme. On introduit 20 litres d'un milieu aqueux (pH 7) constitué par 1 $ de polypeptone, 1 ?£ d'extrait de viande et 10 0,5 "h de chlorure de sodium dans une cuve de fermentation de 30 litres, stérilisés â 120°0 pendant 20 minutes, on inocule avec 200 ml d'une culture de semence de Bacillus megaterium B-400 FERM-P K° 748, antérieurement cultivée dans le même milieu à 30°C pendant 24 heures puis on cultive à 30°C pendant 15 48 heures, avec aération à 20 litres/minute, agitation à 300 tours/minute. Après fermentation, on chasse le micro-organisme par centrifugation pour obtenir 17,4 litres d'un filtrat de culture. On concentre le filtrat jusqu'à' 1/3 du volume à 30-35°0 et on ajoute du sulfate d'ammonium jusqu'à saturation à 20 80 °fo au concentré obtenu. On sépare le précipité formé et on le dissout dans l'eau distillée, après quoi on le désale par passage dans une colonne de "Sephadex G-25" (marque déposée, produit de Pharmacia C°, Upsalla, Suède). On soumet la solution d'enzyme désalée à lyophilisation pour obtenir 24,3 g. 25 de préparation d'enzyme. (2) Préparation de céphalexine. On dissout 20 mg de 3-méthyl-7-phénoxy-acétamide- i. épham-4-carboxylate de sodium et 80 mg du chlorhydrate de l'ester éthylique de D-phénylglycine dans 10 ml d'un tampon 30 de phosphate 0,1 molaire (pH 7,5). On ajoute à cette solution 100 mg de la préparation d'enzyme obtenue ci-dessus et on fait incuber à 37°0 pendant 5 heures. On fait goutter le liquide réactionnel sur une plaque chromatographique en couche mince de dérivé cellulosique et.on développe avec un système solvant 35 de n-butanol-acide acétique-eau (3:1 : 1) et on trouve une tache de céphalexine en Rf 0,65. 72 10172 7 2130586 On règle le liquide réactionnel à pH 2 avec de l'acide chlorhydrique 1N, on lave avec de l'acétate d'éthyle pour éliminer le 3-méthyl-7-phénox.y-aoétamide-,A?-cépham-4~ carboxylate de sodium qui n'a pas réagi et le rendement en 5 céphalexine est titré comme 9,1 EXEMPLE 2 (1) Préparation de l'enzyme. On introduit 20 litres d'un milieu aqueux (pH 7»0) constitué par 0,5 de glucose, 0,3 i° de glycérine, 0,1 $ 10 d'extrait de viande et 1,0 $ de peptone dans une cuve de fermentation de 30 litres stérilisée à 120°C pendant 20 minutes, on inocule avec 200 ml d'une culture de semence de Bacillus megaterium B-400 FERM-P N° 748, préalablement cultivé dans le même milieu à 30°C pendant 24 heures, puis on cultive à 30°C • 15 pendant 72 heures, avec aération de 20 litres/minute, agitation de 300 tours/minute. Après fermentation, on élimine le micro-organisme par centrifugatioh. On concentre le filtrat jusqu'à 1/3 de son volume à 30-35°0 et on ajoute de l'acétone jusqu'à 60 # du volume. On filtre le précipité et on sèche pour obtenir 20 25,5 g de préparation d'enzyme. (2) Préparation de céphalexine. On dissout 0,01 mole (3*4-5 g) de 3-méthyl-7-phényl-acétamide-A^-cépham-4-carboxylate de sodium et 10 g de chlorhydrate de l'ester éthylique de B-phénylglycine dans 1 litre 25 de tampon de phosphate 0,1 molaire (pH 1,5)» On ajoute à cette solution 10 g de préparation d'enzyme obtenue précédemment et on fait incuber à 37°C pendant 5 heures. On fait passer le mélange réactionnel à travers un ultra-microfiltre et on concentre sous dépression à la moitié du volume environ. On règle 30 le concentré à pH 2,5 avec addition d'acide trifluoro-acétique et en refroidissant par de la glace, on lave à l'acétate d'éthy- ■2 le pour éliminer le 3-taéthyl-7-phénylacétamide épham-4- carboxylate qui n'a pas réagi, on concentre encore sous vide jusqu'au quart du volume. On règle alors la solution concentrée 35 à pH 1 avec de l'acide trifluoroacétique, on extrait de façon répétée avec de la méthyl-isobutyl-cétone. On recueille la couche du solvant organique et on concentre après déshydrata 72 10172 8 2130586 tion sur gel de silice. On traite le résidu avec de l'éther éthylique et on obtient le trifluoro-acétate de céphalexine sous forme de poudre rosée. On dissout ce sel dans 5 ml d'eau, on règle à pH 4,5 5 avec de la triéthylamine à la température de la glace. On ajoute 10 ml d'acétone à la suspension obtenue et on recueillie le précipité par filtration, on lave avec de l'acétone aqueuse à 80 i> refroidie par de la glace. Après séchage, on obtient 33,2 mg de céphalexine poudreuse blanche (rendement 9,6 ). 10 Rotation optique £c Spectre UV : absorption à 261 et 237 m/* . EXEMPLE 3 On introduit 100 ml d'un milieu aqueux (pH 7,0) constitué par 0,5 $> de glucose, 0,3 $ de glycérine, 1 $ d'ex-15 trait de viande, 1 ^ de polypeptone et.0,5 i> de chlorure de sodium dans un Erlenmeyer de 500 ml stérilisé à 120°0 pendant 20 minutes, on inocule avec Bacillus megaterium B-400 FERM-P N° 748 puis on cultive à 30'°G pendant 48 heures. Après la culture, on règle le filtrat à pH 7,5 avec NaOH 1N, on ajoute 20 50 mg de 3-fléthyl-7-phénylacétamide-A^-cépham-4-carbox.vlate de sodium et 100 mg du chlorhydrate de l'ester éthylique de D-phénylglycine, puis on fait incuber à 37°C pendant 5 heures. On étudie le mélange réactionnel sur couche mince chromatogra-phique en dérivé de cellulose avec développement par le mélange 25 de n-butanol-acide acétique-eau (3:1:1) et on reconnaît une tache de céphalexine en Rf 0,66. On règle ce mélange réactionnel à pH 2 avec HC1 IN, on lave à l'acétate d'éthyle pour éli-miner le 3-méthyl-7-phénylacétamide -A épham-carboxylate qui n'a pas réagi. La proportion de céphalexine titrée est de 30 19,4 1o. EXEMPLE 4 On remplace le chlorhydrate d'ester éthylique de D-phénylglycine de l'exemple 3 par l'ester méthylique de D-phénylglycine, pour donner un rendement de formation de céphalexi-35 ne de 13,4 EXEMPLE 5 On répète l'exemple 3, à ceci près qu'on utilise la 72 10172 9 2130586 D-phénylglycylamide à la place de chlorhydrate d'ester éthylique de D-phénylglycine. On obtient dans le mélange réactionnel un rendement de 14,6 i° en céphalexine. EXEMPLE 6 5 On répète l'exemple 3» à ceci près qu'on utilise la D-phényl-glycylglycine à la place du chlorhydrate d'ester éthylique de D-phénylglycine. La production de céphalexine dans le liquide réactionnel. est en proportion de 9,6 $>. 72 10172 10 2130586 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de céphalexine.caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de céphalosporine représenté par la formule : A-NH- 0 5 dans laquelle A représente un groupe phénylacétyle ou phé- noxyacétyle et M représente un atome d'hydrogène ou d'un métal alcalin, avec un dérivé de phénylglycine représenté par la formule : CH-CO-R (II) • NH2 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, ou un groupe choisi parmi les groupes amino, glycyle, leucyle, alanyle, méthyle et éthyle, en présence d'un enzyme provenant d'un micro-organisme Bacillus megaterium B-400 FERM-P N° 748. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir 1 mole du composé (i) avec 1 à 10 moles du composé (II) et que la réaction s'effectue à 35-40°C à pH 7-8 pendant 1—10 heures. (I) C00M 10 2. 15