Brevet FR2119086A1 — publié le 19720804

i 2119086 Cette invention concerne des nouveaux agents antibiotiques et leur préparation. Plus particulièrement, cette invention concerne deux nouveaux antibiotiques azotés, désignés arbitrairement ici par A-201A et A-201B. 5 On prépare les antibiotiques de cette invention en cultivant l'organisme Streptomyces capreolus, souche NRRL 3817, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion. On isole les antibiotiques du bouillon de fermentation par partage dans un solvant classique non miscible, tel 10 que chloroforme, et on sépare le mélange par chromatographie sur colonne sur un adsorbant actif tel que gel de silice et on fait l'élution par l'acétone et un mélange (9:1) acétone;méthanol, respectivement. On effectue la purification de A-201A par recris-i allisation dans l'acétone froide. L'antibiotique A-201B est une 15 h .lie à la température ambiante, et on l'obtient en concentrant le solvant d'élution acétonesméthanol (3:1). Les nouveaux antibiotiques de cette invention, A-201A et 2-A01B, possèdent une activité antibactérienne, antifongique et anti-amibienne. Les nouveaux antibiotiques de cette invention sont des 20 composés azotés ne contenant pas de groupements titrables. Les indications relatives à la caractérisation données ci-après concernent l'antibiotique A-201A sous forme d'une substance .cristalline, et l'antibiotique A-201B sous forme d'une substance liquide à la température ambiante. On isole et on caractérise 25 commodément les antibiotiques sous ces formes. L'antibiotique A-201A est un composé cristallin blanc fondant à environ 170-72°C lorsqu'il est cristallisé dans l'acétone. Il est très soluble dans les alcools, soluble dans l'acétone, le chloroforme et l'acétate d'éthyle. Il est insoluble dans l'eau, 30 les hydrocarbures et l'éther. Le titrage électrométrique de A-201A dans le diméthylforma-mide à 67 pour cent a mis en évidence un pH initial de 7,", et a montré qu'il n'existait pas de groupements titrables dans la gamme de pH de 3,5 à 13,5. 35 La microanalyse donne la composition élémentaire approximative suivante (%)de A-201A î C ï 55,20 ; H: 6,72 ; N : 10,45 ; O : 28,05, et le poids moléculaire déterminé par spectroscopie de masse est d'environ 693. Dans le spectre infrarouge de A-201A, sous forme d'un composé 40 cristallin dans une solution chloroformique(Fig. 1), les bandes 71 46604 2 2119086 discernables que l'on observe dans le spectre d'absorption infrarouge - dans la gamme de 2,0 à 15,0 microns sont les suivantes : 2,96 (large), 3,45, 3,53, 5,09, 6,06, 6,26, 6,33, 6,40, 6,67, 6,92, 7,06, 7,15, 7,28, 7,46, 7,60, 7,76, 7,92, 8,10, G,30, 5 8,60, 8,87, 9,06, 9,14, 9,32, 9,54,9,65, 10,12, 10,23, 10,59, 11,01, 11,30, 11,60, et 12,00 microns. Le spectre d'absorption ultraviolette de A-201A dans une solution d'eau et d'éthanol à 95 pour cent présente un maximum d'absorption à environ 208 m/s , avec un coefficient d'extinction, 1 O/ 10 E, ° de 53 5 et un maximum d'absorption à environ 275 m/t/, CItt T avec un coefficient cPextinction, E. de 490. X cm Un diagramme de poudre par diffraction des rayons X du composé c-istallin A-201A utilisant la radiation du chrome filtré par 0 - vanadium et une longueur d'onde de 2,2896 A pour calculer les 15 stances " entre les plans donne les valeurs suivants : d I/I 14,0 0,20 9,5 0,05 6.7 1,00 20 5,0 0,50 4,5 - 0,05 4,2 0,10 3.8 0,05 3,5 0,10 2 5 Le comportement du composé cristallin A-201A à la chroma- tographie sur papier est représenté par les valeurs du données dans la liste ci-dessous. Les valeurs du ont été obtenues dans les systèmes solvants indiqués, dans chaque cas avec du papier Whatman N° 1. La localisation de l'antibiotique sur le chroma-30 togramme a été déterminé par bioautographe avec Sarcina lutea comme organisme test. 71 k66Qk 3 2119086 Système solvant Valeur de 1 0,87 2 0,89 3 0,88 5 4 O,44 5 Oj.47 6 0,48 7 0,70 8 0,87 10 9 0,88 10 0,13 11 0,83 '"'"La valeur du R_ est définie comme le rapport de la distance parcourue par l'antibiotique depuis l'origine à la distance 15 parcourue par le front du solvant depuis l'origine. Légende concernant les systèmes solvants ; 1. 3utanol saturé d'eau 2. Butanol saturé d'eau plus 2 % d'acide p-toluènesulfonique 3. Butanol saturé d'eau plus 2 % d'acide p-toluènesulfonique plus 20 2 % de pipéridine 4. Méthylisobutylcêtone saturée d'eau 5» Méthylisobutylcêtone saturée d'eau plus 2 % d*acide p-toluènesulfonique 6. Méthylisobutylcêtone saturée d'eau plus 2 % de pipéridine 25 7. Eau:méthanol:acétone (12:3:1) . On ajuste le pH de cette solution à 10,5 avec NH^OH et ensuite on l'abaisse à 7,5 avec H3P°4* 8. Ethanol à 80 pour cent avec 1,5 % de NaCl. Le papier est imprégné d'une solution de sulfate de sodium 1 M. 30 9. Méthanol : HCl 0,1 N {2:1} 10. Benzène saturé d'eau 11. Eauïéthanol:acide acétique Des chromatographes en couche mince du composé cristallin A-201A développés sur plaques de gel de silice (plaques de gel 35 de silice F-254 Bririkman) ont donné les valeurs de R_ suivantes : R Système solvant f Détecteurs Acétate d'éthyle:éthanol (4:1) 0,49 (Réactif naphtorésorcinol, Acétate d'éthyle:éthanol (1:1) 0,83 j^SO^, lumière UV ou bio- (autographe 71 46604 4 2119086 Le pouvoir rotatoire spécifique de S-201A est /5- 129,6° (C =1, méthanol). D Le spectre RMN du composé cristallin A-201A indique rn présence de groupements méthyle en 4-5, de liaisons aromatiques, 5 et de groupements hydroxyle. Le composé A-201A acétylé contient environ 21,17 pour cent de groupements acétyle, et le spectre RMN indique la présence de A-201A triacétylé. L'antibiotique A-201B est une huile incolore à brun clair, à 25°C. Il est soluble dans les alcools, l'acétone, le chloroforme, 10 st l'acétate d'éthyle, et est insoluble dans l'eau, les hydrocarbures et l'éther. On peut l'éluer commodément d'une colonne de gel de silice avec un mélange acétone:méthanol (9:1). Le titrage électrométrique de A-201B dans le diméthylformamide o :;7 pour cent a indiqué un pH initial de 7,3, et a indiqué qu'il 15 * listait pas de groupements titrables dans la gamme de pH de 3 à 13,5. Une microanalyse donne la composition élémentaire approximative suivante (%)de A-201B : C - 65,41 ; H = 9,03 ; N = 5,76 ; 0 = 17,78, et le poids moléculaire déterminé par la méthode osmotique de la 20 pression de vapeur est d'environ 417. Dans le spectre infrarouge de A-201B dans une solution chloro- forj*iqu« -Fig.> 2) les bandes discernables observées dans le spectre d'absorption infrarouge dans les limites de 2,0 à 16,0 microns sont les suivantes : 2,77, 3,05, 3,45, 3,51, 5,90, 6,05, 6,20, 25 6,60, 6,06, 6,95, 7,10, 7,30-7,40, 0,30, 8,90-9,00, 9,64, 10,10, 11,20, 12,30 et 15,23 microns. Le spectre d'absorption ultraviolette A-201B dans une solution éthanol à 95 pour cent:eau présente un maximum d'absorp- 1 % tion à environ 222 mù , avec un coefficient d'extinction E. ° de ■ 1 cm 30 515 ; un maximum d'absorption à environ 242 m/» , avec un coef- T ficient d'extinction, Er de 405 ? un maximum d'absorption à om ^ çj environ 327 mAi , avec un coefficient d'extinction de E. * de 1 cm 150 ; et, un maximum d'absorption à environ 340 mJU , avec un 1 °a coefficient d*extinction E, de 225. 1 cm 35 Le comportement de A-201B à la chromatographie sur^papier est représenté par les valeurs de R^ données ci-après. Les valeurs de R^ ont été obtenues dans les systèmes solvants indiqués avec, dans chaque cas,du papier Whatman N° 1. La localisation de l'antibiotique sur le chromatogramme a été déterminée par 40 bioautographe à l'aide de Sarcina lutea. comme organisme test. 71 46604 5 2119086 Système solvant Valeur de R- 1 0,65 2 0,92 a^La définition de est la même que précédemment. 5 Légende des systèmes solvants : 1. Eau saturée de méthylisobutylcêtone, plus 2 % d'acide p-toluènesulfonique et 1 % de pipéridine 2, Ethanol à 80 pour cent avec 1,5 % de NaCl. Le papier est imprégné d'une solution de sulfate de sodium 1M. 10 Les nouveaux antibiotiques de cette invention ont une action inhibitrice sur la croissance des organismes microbiens, bactéries ot champignons, qui sont pathogènes pour les animaux et les ;. 15 La concentration inhibitrice minimale des nouveaux anti- î.»l ;-tiques de cette invention, exprimée en microgrammes psrr millilitre, déterminée par le test de dilution en tube, pour un certain nombre d'organismes représentatifs est donnée dans la liste du Tableau I ci-après. 71 46604 6 2119086 Activité Organisme test TABLEAU I des antibiotiques A-2Q1A et A-2Q1B Concentration inhibitrice minimale (mcq/ml) 5 A-2 01A Staphvlococcus aureus 1,56 Streptococcus faecalis 12,50 Erwinia amvlovora 12,50 Botrvtis cinerea 100,00 10 Trichophvton mentagrophtetes 25,00 Xanthomonas phaseoli 50,00 LactobaciJus casei 12,50 Leuccnostoc citrovorum 0,20 V-brio metschnikovii 25,00 15 Mvcobacterium avium 1/56 Diplococcus pneumoniae 6,2 5 Neisseria meningitidis ^25,00 Mvcoplasma crallisepticum 0,78 Pasteurella hemolvtica 50,00 20 Pasteurella multocida 3,12 Escherichia coli 50,00 Escherichia insidioa 50,00 Salmonella spp. 50,00 Candida tropicalis N.T. 25 Ceratocvstis ulmi N.T. Fusarium oxvsporium N.T. F. lvcopersici Verticillium albo-atrum N.T. a*N.T. = non testé. 30 L'antibiotique A-201A a une activité in vivo contre les infections à Mvcoplasma crallisepticum chez les poulets. Par exemple, lorsqu'on injecte 5 mg de A-201A par voie sous-cutanée dans des cous de poulets infectés par l'organisme, l'activité est démontrée par la diminution du nombre de lésions des sacs 35 aériens. Lorsqu'on l'administre par voie orale à une dose de 100 mg/kg, le mélange d'antibiotiques A-201 est efficace dans le traitement de jeunes rats infectés par Entamoeba histolytica. Le mélange d'antibiotiques A-201 est également efficace à 40 50 mg/kg, par voie intraperitonéale, pour juguler les infections A-201B 6,25 25,00 2 5,00 0,39 3,12 50,00 N.T.a) N.T?. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. ^>100,00 100,00 N.T. y, 100,00 50,00 0,39 50,00 12,50 71 46604 7 2119086 à Borrelia novyi chez: la souris. L'antibiotique A-201A administré par injection sous-cutanée à des souris, possède une activité antimicrobienne in vivo contre les organismes infectieux ; par exemple : les valeurs de la DE^ 5 (dose efficace pour protéger 50 % des animaux test ) dans des infections illustrâtives sont les suivantes lorsqu'on utilise une dose : Staphvlococcus aureus, 6,5 mg/kg ; Diplococcus pneumoniae, 100 mg/kg ; Streptococcus pyogenes C203, 12 mg/kg. La toxicité de l'antibiotique A-201A est : DL^0 (i.p.) 400 mg/kg chez la 10 souris. L'antibiotique A-201A est également efficace en ce qu'il inhibe la croissance des micro-organismes qui contribuent au développement des maladies du périodonte. Par exemple, une solution de A-201A présente une activité antimicrobienne contre 15 les organismes formateurs de plaques comme il est illustré dans le système test suivant : on ensemence des tubes de bouillon nutritif contenant 5 % de saccharose avec un microorganisme cariogène. rn immerge des baguettes de verre dans le milieu et l'on met les tubes à l'incubation à 37°C pendant une nuit au 20 bout de laquelle il se forme une plaque en une couche 'principalement des cellules et du dextrane) à la surface des baguettes. On transporte ensuite les baguettes dans des solutions contenant diverses concentrations de A-201A et on les laisse en contact avec l'antibiotique pendant 5, 10 et 15 minutes. Lorsque la 25 durée appropriée s'est écoulée, on rince les baguettes deux fois avec de l'eau stérile, désionisée, et on les immerge dans du milieu non ensemencé contenant 5 % de saccharose. Après avoir laissé incuber pendant une nuit à 37°C, on ajoute à chaque milieu du bleu de bromothymol. On met la croissance en évidence en notant 30 les changements de coloration,laquelle passe du bleu au j^une en raison de la production d'acide par les organismes lorsqu'ils se développent dans un milieu contenant du saccharose. D-ans le test avec A-201A on a utilisé deux Streptococci spp. cariogènes, à savoir A-31036 et A-31037. La croissance des deux organismes 35 a été inhibée par A-201A à une concentration de 1,0 % lorsque la solution est demeurée en contact avec la baguette test pendant cinq minutes". En outre, Vantibiotique A-201A inhibe la croissance des micro^cç^nnismes cariogènes dans un test de dilution en bouillon. 40 Par exemple, on a trouvé la concentration inhibitrice minimale BAD original^* 71 46604 8 2119086 (CIM) suivante en A-201A pour les organismes test- décrits. Concentration inhibitrice minimale (CIM) Organisme test mcg/ml 5 Streptococcus mutans, NCPC 10449 1,0 (National Collection Type Culture, London) Streptococcus sp. (non identifié) 2,0' S ouche-A3103 6 1.0 Streptococcus sp. (non identifié), 1,5 Souche-A3103 7 Bâtonnet filamenteux, (non identifié), 2,5 Souche-A3103 8 L'incorporation de A-201A a une pâte dentifrice appropriée, 15 à un gel, à une poudre, etc ou à un liquide pour bains de bouche, ou tout autre préparation pour l'hygiène buccale peut constituer une méthode efficace pour inhiber le développement des caries dentaires. Sinon, on peut appliquer une solution de A-201A à une concentration appropriée à la surface dës gencives et des dents 20 à l'aide d'un tampon convenable. On a également trouvé que l'antibiotique A-201A est efficace en ce qu'il favorise la croissance des animaux. Lorsqu'on ajoutait A-201A à la ration de base de poulets âgés de 4 jours, en cours de croissance, à raison de 50,0 g/tonne, les gains de poids et 25 les rendements alimentaires se trouvaient améliorés en l'espace de 10 jours. Les poulets recevant l'antibiotique A-201A en mêifce temps que la ration de base prenaient 160 g tandis que les poulets ne mangeant que la ration de base gagnaient 148 grammes. En outre, les rendements alimentaires étaient améliorés au point 30 que les poulets recevant l'antibiotique A-201A n'avaient besoin que de 1,38 îfcg de nourriture par kg de gain de poids ; tandis que les poulets ne mangeant que la ration de base avaient besoin de 1,52 kg de nourriture pour chaque kg de gain de poids. On obtient les nouveaux antibiotiques de cette invention en 35 cultivant une souche de Streptomycète productrice de A-201 dans un milieu de culture convenable dans des conditions aérobies en immersion jusqu'à ce que le milieu de culture renferme une activité antibiotique importante. On peut récupérer les antibiotiques en utilisant diverses méthodes d'isolement et de puri-40 fication couramment utilisées et connues dans la technique. ^AD original 71 46604 9 2119086 Le milieu de culture contenant l'antibiotique fournit un mélange antibiotique comportant les antibiotiques A-201A et A-201B. On peut séparer chacun des antibiotiques l'un de l'autre et les autres constituants mineurs du mélange de fermentation. On peut 5 obtenir l'antibiotique A-201A sous forme cristalline par chroma-tographie et cristallisation. On peut obtenir l'antibiotique A-201F sous forme d'une huile à la température ambiante par chromato-graphie. On a identifié l'actinomycète utilisé selon cette invention 10 pour la production du mélange antibiotique comme étant une souche de Streptomvces capreolus Higgens et on l'a déposé sans restriction quant à la possibilité d'en disposer, à la collection permanente de culture du Northern Utilization Research and Development Laboratory, Agriculture Research Service, United States Department 15 of Agriculture, Peoria, Illinois, et on lui a attribue le N° matricule NRRL 3S17. On a isolé la souche d'un échantillon de terre recueilli au Vénézuela. On a isolé l'organisme de l'échantillon de terre en mettant des portions de l'échantillon en suspension dans de l'eau distillée stérile et en étalant la suspension en 20 stries sur de l'agar nutritif. On a mis les plaques d'agar nutritif ensemencé à l'incubation à 25°-35°C jusqu'à ce que l'on note un développement. A la fin de la période d'incubation, on a repiqué des colonies d'organismes producteurs de A-201 à l'aide d'une anse de platine stérile gtir des tubes d'agar inclinés. On a 25 ensuite mis les tubes d'agar inclinés à l'incubation pour obtenir des quantités convenables d'inoculum pour la production de A-201. Les caractéristiques morphologiques principales de la souche de Streptomvces capreolus productrice de A-203 utilisée dans cette invention, sont les suivantes : les spores lisses, de forme 30 ovale à légèrement cylindrique, sont disposées en longues chaînes, flexueuses, entrelacées, généralement à raison de 10-50 spores par chaîne, certaines chaînes ayant plus de 50 spores par chaîne. Les dimensions des spores se situent entre 1,0005 à 2,01/i sur 0,67 à 1,005 microns. Les spores en masse vont du blanc au jaune 35 ou au rouge sur divers milieux. /Shirling, E.B. and Gottlieb, Inter. Bull. Svstemic Bacteriol., 16, 313-40 (1966)7. On peut mettre cette culture dans les groupes blanc, jaune et rouge de Tresner & Backus, Applied Microbiolocrv. 11, 335-8 (1963) . L'analyse de la paroi * cellulaire selon le mode opératoire de 40 Becker et al., App. Microbiol., 12, 421-3 (1964), indique 71 46604 10 2119086 la présence du méso-isomère de l'acide diaminopimélique. La culture est négative à la mélanine. La culture est capable d'avoir un bon développement à des températures d'incubation de 35°C ou plus. Les autres Streptomvces.spp. analogues à la souche productrice 5 de A-201 sont Streptomvces alboflavus et Streptomvces canescus. Cependant, Streptomvces alboflavus produit un pigment de type mélanine et Streptomvces canescus produit des spores globuleuses. Les méthodes utilisées dans les études taxonomiques de la souche de Streptomvces capreolus NRRL 3817 productrice de A-201 10 sont celles recommandées pour l'International Streptomvces Project pour la caractérisation des espèces de Streptomvces /Shirling and Gottlieb, ibid.7. Les résultats des études taxonomiques sont résumés dans les paragraphes qui suivent. Les noms de couleur ont été attribués selon la méthode de l'Inter Society Color 15 Council, National Bureau of Standards (ISCC. NBS) /Kelly, K.L. and Judd, D.B., U.S. Department of Commerce, Cire. 553 (1955)_7. Les lettres entre parenthèses se rapportent aux ensembles de couleurs » et les lettres et chiffres soulignés aux désignations de couleur de Tresner and Backus, ibid. Les nombres entre crochets se rap-20 portent aux ensembles de couleurs de Maerz, A., and Paul, M.R., Dictionarv of Color, McGraw Hi.ll, New York (1950) . Les numéros ISP se rapportent aux milieux de l'International Streptomvces Project média, dont chacune des compositions est donnée dans Shirling et Gottlieb, ibid. Les observations ont été faites après 25 incubation à 30°C pendant quatorze jours, sauf spécification contraire. MORPHOLOGIE MICROSCOPIQUE. CARACTERISTIQUES DE -CULTURE ET PHYSIOLOGIE DE STREPTOMYCES CAPREOLUS NRRL 3817 Morphologie microscopique - Les spores sont de forme ovale à 30 légèrement cylindrique et sont disposées en longues chaînes flexueuses, entrelacées, au nombre de 10-50 rpores, ou plus, par chaîne. La surface des spores apparaît lisse au microscope électronique. Les dimensions des spores se situent de 1,005 à 2,0yU sur 0,67 à 1,005 microns. 35 Caractéristiques de culture Gélose purée de tomates - farine d'avoine - Bon développement avec mycélium aérien pauvre et spores (W) blanc b. Envers brun grisâtre jaunâtre clair /Ï3B57. Pas de pigment soluble. Czapek gélosé - bon développement avec mycélium aérien 40 pauvre et spores (R) jaune orangé pâle 3ca, /Î0B37. Envers jaune 71 46604 ii 2119086 pâle /ÏOB27. Pas de pigment soluble. Extrait de levure gélosé - Développement abondant, sans mycélium aérien ni spores. Envers rose jaunâtre vif /2f97. Pas de pigment soluble. 5 Gélose de Bennett - Développement abondant sans mycélium aérien ni spores. Envers rouge modéré /3Hlo7. Pas de pigment soluble. Gélose nutritive - Développement assez important sans mycélium aérien ni spores. Envers brun grisâtre clair. Pas de pigment 1° soluble. Gélose d'Emerson - Bon développement sans mycélium aérien ni spores. Envers jaune grisâtre foncé /13K37. Pas de pigment soluble. Gélose à l'asparaqine qlucosée - Bon développement sans 15 mycélium aérien ni spores. Envers rose jaunâtre vif. Pas de pigment soluble. Malate de calcium gélosé - Sur ce milieu le développement était si pauvre que l'on n'a pu attribuer aucune couleur. Gélose à la tyrosine - Développement assez bon avec mycélium 20 aérien peu développé et spores (Y) jaune pâle 2db /1i'"17. Envers jaune vert pâle /lOBl7. Pas de pigment soluble. Milieu ISP 2 - Développement abondant sans mycélium aérien ni spores. Envers orangé rougeâtre grisâtre /ïlAQj. Pas de pigment soluble. 25 Milieu ISP N° 3 - Développement assez bon avec mycéliu-1 aérien assez important et spores (R) rose jaunâtre grisâtre 5cb /4A97. Pas de pigment soluble. Milieu ISP H° 4 - Développement peu important avec mycélium aérien peu développé et spores (W) blanc b. Envers jaune vert 30 pâle /10b17. Pas de pigment soluble. Milieu ISP N° 5 - Sur ce milieu le développement était si pauvre que l'on n'a pu attribuer de couleur, Caractéristiques physiologiques : Liquéfaction de la gélatine - négative 35 Réduction des nitrates - positive Production de pigment de type mélanine - (a) Gélose extrait de levure fer peptonée - négative (b) Bouillon à l'extrait de levure tryptoné - négative BAD ORfGfNAt. 71 46604 12 2119086 Températures requises : Entre 26 et 30°C on observe seulement une croissance végétative. A 37°C on voit une croissance végétative bonne. A 4349°C on observe une croissance végétative bonne et un 5 mycélium aérien bien développé. Il n'y a pas de développement à 55°C. Influence de la variation du pH sur la couleur du substrat - Pas d * influence Le Tableau II résume les résultats des essais d'utilisation 10 du carbone effectués sur la souche de Streptomvces capreolus NRRL 3817 productrice de A-201. Les symboles utilisés dans le Tableau ont les significations suivantes : + = utilisation (+) = utilisation probable 15 (-) = utilisation douteuse - = pas d'utilisation TABLEAU II Utilisation du carbone par S. capreolus souche NRRL 3G17 Source de carbone Réponse 20 L-arabinose (-) Céllobiose + i-inositol (-) D (+) xylose + D mannitol - 25 D (-) fructose (-) D (+) raf f inose - Saccharose (-) L (+) rhamnose - Dextrose + 30 Témoin (pas de carbone) - Comme on l'a indiqué antérieurement, on peut cultiver Streptomvces capreolus,souche NRRL 3817 dans un milieu de culture pour obtenir les antibiotiques A-201A et A-201B. Le milieu de.culture peut être l'un de nombreux milieux différents. 35 cependant, pour des raisons d'économie de production, de rendement maximal et de facilité d'isolement, certains milieux ont la préférence. Généralement, un milieu à plusieurs constituait s dans lequel se trouvent disponibles plusieurs sources de glucides et d'azote, constitue le meilleur milieu de développement. Le glucide 40 provient de sources telles que dextrines, mêlasses, glucose, BAD ORIGINAL T 71 46604 13 2119086 glycérol, etc. Les mélanges d'acides aminés, les peptones, etc, sont de bonnes sources d'azote. La farine de soja fournit à la fois le glucide et l'azote. Des sels minéraux nutritifs entrent également dans la compo-5 sition des milieux de culture et ils comprennent les sels "habituels fournissant les ions sodium, potassium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chlorure, bromure, nitrate, carbonate, etc. L'addition de sels de magnésium et de fer, de préférence sous forme de sulfates, a un effet particulièrement bénéfique sur la 10 production du mélange d'antibiotique A-201. De même que cela est nécessaire à la croissance et au développement des autres micro-organismes, il faut de même ajouter des oligo-éléments essentiels au milieu de culture pour cultiver les organismes de cette invention. On ajoute habituellement ces oligo-éléments sous 15 forme d'impuretés présentes dans les autres ingrédients ajoutés au milieu de culture. L'organisme utilisé pour produire A-201A et A-201B peut se développer dans une large gamme de pH. Par exemple, les pH des divers milieux qui peuvent être utilisés pour cultiver l'organisme 20 peuvent varier de pH 6,2 à pH 7,2. Comme c'est le cas avec la plupart des Streptomycètes, le milieu s'alcalinise peu à peu et peut atteindre un pH d'environ 6,5 à 8,0 pendant la durée de la croissance. Cependant, au moment de la récolte à la fin de la période de croissance le pH est habituellement d'environ 6,8 à 25 7,2. On utilise de préférence la fermentation aérobie en immersion dans de grands réservoirs profonds pour produire de grandes quantités de mélange d'antibiotiquesA-201. On peut obtenir de petites quantités de ces antibiotiques par culture agitée en 30 flacon. Dans la production de ce mélange antibiotique il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif car il intervient une phase latente lorsqu'on ensemence des grands réservoirs avec les spores de l'organisme. On transfère ensuite 1'inoculum végétatif dans les réservoirs plus grands. Le milieu utilisé pour le dévelop-35 pement de 1'inoculum végétatif peut être identique à celui utilisé pour les fermentations en grand, mais d'autres milieux peuvent également être employés. On peut cultiver l'organisme producteur de A-201 à des températures comprises entre 30°C et 50°C. Il semble que l'obten-40 tion des rendements les plus élevés en antibiotiques ait lieu 71 46604 14 2119086 à une température comprise entre 35°C et 40°C. On peut suivre la production de l'activité antibiotique au cours de la fermentation en examinant l'activité antibiotique du bouillon de fermentation vis-à-vis d'organismes connus comme 5 étant sensibles à l'antibiotique. L'un des organismes test utiles dans cette invention est Bacillus subtilis. On peut effectuer le bio-essai par la méthode des disques de papier ou par celle des plaques de gélose. On fait passer de l'air stérile dans le milieu de culture 10 pour obtenir un développement plus efficace de l'organisme et une plus grande production d'antibiotique. Le volume d'air aspiré à travers le milieu de culture par minute est habituellement d'au moins 10,0 pour cent du volume de milieu de culture. Généralement, plus le volume d'air que l'on fait passer dans le 15 milieu de culture est grand,jusqu'à la quantité qui produit une agitation houleuse, plus le développement est important et plus la production d'antibiotique est élevée. Habituellement, la production maximale d'activité antibiotique est obtenue environ en 72-120 heures. 20 On peut récupérer les antibiotiques A-201 dans le milieu de culture et les séparer des autres substances qui peuvent être présentes, par les méthodes de filtration, d'attraction et d'adsorption. Le liquide contenant l'activité antibiotique est séparé du milieu où a été faite la culture, par filtration. On 25 élimine le mycélium solide. Dans cette opération on utilise habituellement un adjuvant de filtration courant. On extrait les antibiotiques A-20ÎAet A-201B du filtrat à l'aide d'un solvant classique non miscible. Avant de partager le mélange antibiotique dans le solvant on ajuste le pH du filtrat à environ 8,5 avec 30 une solution d'hydroxyde de sodium 5 N. Après extraction, on récupère le mélange antibiotique A-201 brut en évaporant le solvant sous vide, ce qui laisse un résidu sec que l'on dissout à son tour dans le méthanol. La dissolution dans le méthanol est incomplète, et l'on sépre alors par filtration la matière 35 non dissoute et ôft.. la jette. On réduit la solution méthanolique résultante à siccité sous vide, et l'on dissout le résidu séché ainsi obtenu dans le chloroforme. On ajoute cette solution à 5 volumes d'éther de pétrole, et il se forme un précipité qui contient l'activité antibiotique. On sépsre par filtration le 40 mélange d'antibiotiques A-201A et A-201B brut précipité et on 71 46604 15 2119086 le reprend à sec sous vide. On peut séparer le mélange d'antibiotique A-201A et A-201B et les isoler sous forme de substances définies. On dissout le mélange d'antibiotiques dans 10 volumes de chloroforme et on le 5 chromatographie sur une colonne garnie de gel de silice (Grâce 62, Davison Chemical Company), et on fait ainsi une séparation en antibiotiques A-201A et A-201B sous forme px'atiquement pure. Sinon, on peut chromatographier le mélange antibiotique sur une colonne garnie d'une substance chromatographique telle que 10 alumine activée, charbon activé, etc, pour obtenir séparément chacun des antibiotiques sous une forme pratiquement pure. On purifie ultérieurement l'antibiotique A-201A, obtenu par la méthode chromatographique, en le recristallisant dans un solvant approprié. L'antibiotique A-201B, tel qu'il a été obtenu par la 15 méthode chromatographique, est un liquide à la température ambiante. La méthode chromatographique de séparation du mélange antibiotique en chacun de ses constituants est décrite plus complètement ci-après. 20 On reprend à sec sous vide le -mélange antibiotique brut obtenu comme précipité dans l'opération de partage g-ac éther de pétrole - chloroforme, on le dissout dans l'acétone, et on l'introduit au sommet d'une colonne garnie dt gel de silice tel"- que celui vendu sous le nom de Grâce 62 (Davison Chemical Co.). 25 on garnit la colonne en y introduisant le gel de silice sous forme de suspension dans une solution 1:1 de chloroforme et d'acétone et en laissant le gel de silice se déposer normalement au fur et à mesure que le véhicule s'élimine par écoulement. Lorsque la substance de garnissage est déposée on lave la colonne 30 avec trois volumes de solution 1:1 de chloroforme et d'acétone. Après avoir appliqué la solution chloroformique de mélange antibiotique à la colonne, on lave de nouveau la colonne avec un volume d'une solution 1:1 de chloroforme et d'acétone, et on élue avec l'acétone pour séparer l'antibiotique A-201A. On sort 35 l'éluat de la colonne par incréments et on en détermine l'activité antibiotique. On rassemble les fractions qui contiennent l'activité antibiotique et on évapore à sec sous vide. On reprend le résidu dans l'acétone chaude, on filtre la solution, et on refroidit le filtrat à -20°C pendant huit heures. Le précipité 40 qui se forme dans la solution acétonique froide est ""BAD 0RlGlNAt~ 71 46604 16 2119086 l'antibiotique A-201A. On sépare les cristaux par filtration et on les sèche sous vide. On soumet la colonne de gel de silice dont on a séparé toute l'activité de l'antibiotique A-201A par élution avec l'acétone, à une. élution par une solution 9;1 d'acé-5 tone et de méthanol. On recueille progressivement l'éluat et on en détermine l'activité antibiotique. On rassemble les fractions présentant une activité antibiotique et on évapore à sec. Le résidu est un liquide qu'on lave à son tour par l'acétone et qu'on évapore de nouveau à sec. Le liquide exempt de solvant 10 est l'antibiotique A-201B, qui est une substance huileuse incolore à brun clair. Comme indiqué antérieurement, le mélange antibiotique A-201 est actif contre les organismes PPLO (c'est-à-dire les organismes du type à pleuropneumonies)et diverses espèces des genres 15 Pasteurella, Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus; etc, et possède une activité inhibitrice contre divers agents phytopathogènes. Par conséquent, on peut utiliser l'antibiotique A-201A purifié dans n'importe quelle composition convenable couramment utilisée pour le traitement des animaux ou des plantes 20 infectée a. Par exemple, on peut injecter A-201A sous forme d'une solution à des porcs infectée pair Pasteurella spp. ou bien l'ajouter à la nourriture des animaux ou bien à l'eau,pour traiter l'infection. L'antibiotique A-201B, comme indiqué ci-dessus, a une activité antibactérienne et on peut l'utiliser pour traiter 2 5 et juguler les agents pathogènes tels que Erwinia aarylovora (Feu du poirier) en ajoutant l'antibiotique A-201B à des cd impositions classiques de pulvérisation foliaire couramment appliquées aux poiriers pour traiter et juguler la bactérie. En outre, A-fîOlB a une activité antifongique et peut être utilisé pour 30 arrêter le développement des champignons tels que Botrytis cinerea, agent pathogène qui infecte diverses plantes d'ornement et diverses plantes agricoles. Cette invention est illustrée plus en détail par les exemples suivants : 35 EXEMPLE 1 FERMENTATION DE L'ANTIBIOTIQUE A-201 EN FLACQKfS SOUS AGITATION On a ensemencé des spores ?e Streptomvces capreolus, NRRL 3817, sur gélose nutritive inclinée ayant la composition suivante : £§AD ORIGINAL 71 46604 17 2119086 Extrait de levure crélosé Ingrédient Quantité Glucose 5 g Extrait de levure 10 g 5 Gélose 20 g Eau, distillée 1 litre On a ensemencé la gélose inclinée avec les spores de NRRL 3817 et on a mis à l'incubation pendant six jours à 30°C. Une fois les cultures sur gélose inclinée bien développées on les a 10 recouvertes d'eau distillée stérile et on les a grattées avec une anse stérile pour détacher les spores. On a agité énergiquement la suspension de spores résultante pour obtenir une répartition homogène et on a utilisé 1 ml de la suspension pour ensemencer 100 ml d'un milieu de culture pour développement végétatif, ayant 15 la composition suivante : Milieu d'ensemencement végétatif Ingrédient Quantité Dextrose 15 g Farine de soja 15 g 20 Solides de macération de maïs 5 g CaC03 2g NaCl 5 g Eau, du robinet 1 litre On a stérilisé le milieu pour développement végétatif en le 25 passant à l'autoclave à 120°C pendant 30 minutes avant de faire 1'ensemencement. On a fait la culture sur le milieu végétatif ensemencé pendant 48 heures à 30°C en secouant continuellement sur une secoueuse rotative fonctionnant à 2 50 tpm. 30 On a mis des portions de 100 millilitres du milieu de production ayant la même composition que celle détaillée précédemment pour 1'inoculum végétatif dans des flacons d'Erlenmeyer de 500 ml et on les a stérilisés à 120°C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi les flacons, on les a ensemencés avec des 35 portions de 5 ml du milieu végétatif incubé comme il a été décrit dans le paragraphe précédent. On a secoué le milieu de fermentation des cultures de production pendant 72 heures à 30°C sur une secoueuse rotative fonctionnant à 250 tpm. Le pH du milieu ensemencé était approxima-40 tivement de 7,0. Le pH a augmenté progressivement au cours de la 71 46604 18 2119086 fermentation et était d'environ 7,5 au moment de la récolte. On a extrait l'activité antibiotique du bouillon de fermentation par des méthodes bien connues dans la technique. EXEMPLE 2 5 A. FERMENTATION DES ANTIBIOTIQUES A-201 EN RESERVOIR D'ENVIRON DEUX CENT CINQUANTE LITRES. On a ensemencé des spores de Streptomvces capreolus NRRL 3817, sur une gélose nutritive inclinée ayant la composition suivante : Ingrédient Quantité 10 Glucose 5 g Extrait de levure 10 g Gélose 20 g Eau, distillée q.s. 1 litre On a mis la gélose inclinée ensemencée à l'incubation à 15 environ 30°C pendant environ 5 jours, et on y a alors ajouté une petite quantité d'eau distillée stérile et l'on a gratté doucement la surface de la gélose avec une anse de fil de platine stérile pour détacher les spores et obtenir une suspension aqueuse. On a utilisé 0,5 ml de la suspension ainsi obtenue pour 20 ensemencer 50 ml d'un milieu de culture végétative stérile ayant la composition suivante : Ingrédient Quantité Dextrose 15 g Bactopeptone 10 g 25 Glycérol 10 g Airiber ALB1*. 10 g Mélasses brutes épaisses 5 g Nadrisol^ 10 g Eau, distillée q.s. 1,litre Amber ALB est le nom commercial d'un produit du type albumine de lait des Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin 55039. 2) Nadrisol est le nom commercial de produits solubles séchés de distillerie du maïs de National Distillers Products Company, New York. 35 On a ajusté le pH de ce milieu de culture à 7,0-7,2 avec de l'hydroxyde de sodium 5 N avant de le stériliser. Après n. la stérilisation, le pH du milieu était de 6,5-6,6. On a mis ce milieu de culture végétative ensemencé pendant 72 heures à environ 30°C en agitant constamment sur une secoueuse rotative fonctionnant 71 46604 19 2119086 à 250 tpm. On a introduit une portion de 20 ml de 1*inoculum végétatif ainsi préparé dans 400 ml d'un milieu de croissance végétative au second stade ayant la môme composition que celle indiquée 5 ci-dessus. On a cultivé cet inoculum de second stade pendant environ 48 heures à 30°C, avec agitation constante sur une secoueuse rotative fonctionnant à 2 50 tpra. On a ajouté 42 litres d'un milieu de culture végétative stérile (seed-bump) ayant la composition détaillée ci-dessus pour 10 le milieu de croissance végétatif de premier stade, additionné de 0,2 g d'un agent antimoussant par litre de milieu, à un réservoir de fermentation après stérilisation à 120°C pendant 30 minutes. On a ajouté environ 400 ml de 1'inoculum végétatif de second stade au milieu de culture végétative stérile (seed-bump). 15 On a effectué la fermentation du milieu de culture végétative stérile (seed bump) pendant environ 24 heures à environ 30°C avec un agitateur tournant à la vitesse de 135 tpm et avec un débit d'dération de 18,4 litres/minute. Après environ 24 heures de fermentation, on a utilisé environ 8,0 litres de la culture en 20 réservoir, faite sur milieu de culture végétative stérile (seed-bump) pour ensemencer 946 litres d'un milieu de promotion stérile ayant la composition suivante : Ingrédient Pourcent. (pds/vT Agent antimoussant 0,02 2 5 Dextrose 5,00 Gruaux de soja 1,50 Mélasses.brutes épaisses 0,30 Carbonate de calcium 0,25 Eau, distillée q.s.p. 100,00 30 On a maintenu la température de la fermentation à environ 30°C à une vitesse d'agitation (tournante)d'environ 250 tpm et un débit d'aération de 396 litres/minute. On a laissé la fermentation se faire pendant environ 48 heures, au bout desquelles on a ajouté une solution stérile de 472 kg de dextrose dans 42 litres d'eau. 35 On a poursuivi la fermentation pendant environ encore 48 heures, on l'a arrêté et on a procédé à la récolte. B. ISOLEMENT DU MELANGE ANTIBIOTIQUE On a filtré 900 litres de bouillon de fermentation obtenu comme il est décrit dans la partie A ci-dessus avec 27 kg d'un 40 adjuvant de filtration commercial (Hyflo super-cel), et on a BAD ORIGINAL 71 46604 20 2119086 ajusté le pH du filtrat à 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 5 N. On a extrait le filtrat alcalin deux fois avec un demi-volume de chloroforme. On a rassemblé les extraits chloro-formiques et on a évaporé à sec sous vide. On a dissout le résidu 5 résultant dans 2 litres de méthanol, et on a séparé les particules insolubles par filtration et on les a éliminées. On a évaporé le filtrat méthanolique à sec sous vide. On a dissous le résidu résultant dans 470 ml de chloroforme, et on l'a ajouté à 10 litres d'éther de pétrole ; opération au C. DIVISION DU MELANGE ANTIBIOTIQUE A-201 On a dissous 63 grammes du mélange antibiotique A-201 brut, 15 obtenu comme il est décrit en B précédemment, dans 500 ml de chloroforme. On a garni une colonne chromatographique mesurant 7 cm x 60 cm de gel de silice (Grâce 62, Davison Chemical Co.) mis en suspension dans un mélange 1:1 de chloroforme et d'acétone. On a laissé le véhicule s'éliminer par écoulement en laissant le 20 gel de silice se tasser. On a introduit la solution chloroformique de mélange antibiotique A-201 brut au sommet de la colonne, et on a laissé la solution antibiotique traversër le lit de gel de silice. Après écoulement des 500 ml de chloroforme de la colonne, on a lavé le lit de gel de silice avec 10 litres d'un mélange 1:1 25 de chloroforme et d'acétone. On a jeté l'effluent et le liquide de lavage. On a alors fait passer de l'acétone sur la colonne et l'on a recherché l'activité antibiotique de l'éluat. On a rassemblé les fractions qui contenaient une activité antilx otique et on 30 a évaporé à sec sous vide. On a ajouté environ 500 ml d'acétone au résidu ainsi obtenu. On a réchauffé la solution et ensuite on l'a laissé reposer une nuit à -20°C.pour permettre la cristallisation de l'antibiotique A-201A. On a séparé les cristaux par filtration et on les a séchés sous vide pour obtenir 13,3 grammes 35 d'antibiotique A-201A ayant un point de fusion de 170-172°C. ^AD ORIGINAL 71 46604 21 2119086 Après 1'élution de l'antibiotique A-201A, on a fait passer un mélange (9:1) d'acétone et de méthanol sur- la colonne et on l'a séparé en fractions dont on a recherché l'activité antibiotique. On a rassemblé toutes les fractions d'éluat qui présentaient "5 une activité antibiotique et on a évaporé à sec sous vide pour obtenir environ 5 grammes d'antibiotique A-201B sous forme d'une huile blanc sale à brun clair à 25°C. 71 46604 22 2119086 REVENDICATIONS 1. La substance antibiotique A-201A, composé cristallin blanc soluble dans les alcools, l'acétone, le chloroforme et l'acétate d'éthyle et insoluble dans l'eau, les hydrocarbures, et 5 l'éther ? fondant à environ 170-72°C ? ayant une composition approximative de 55,20 pour cent de carbone, 6,72 pour cent d'hydrogène, 10,45 pour cent d'azote, et 28,05 pour cent d'oxygène ayant un poids moléculaire apparent déterminé par spectroscopie de masse égal à 693 ; ayant un maximum d'absorption ultraviolette 1 % 10 d'environ 208 , avec un coefficient d'extinction, E^ de 535, et un maximum d'absorption à environ 275 mju> , avec un T Of ' coefficient d'extinction, E^ de 490 ; et ayant, lorsqu'elle est dissoute dans le chloroforme, les bandes discernables suivantes dans le spectre d'absorption infrarouge : 2,96 (large), 3,45, 15 3,53, 5,89, 6,06, 6,26, 6,33, 6,40, 6,67, 6,92, 7,06, 7,15, 7,28, 7,46, 7,60, 7,76, 7,92, 8,10, 3,30, 8,60, 8,87, 9,06, 9,14, 9,32, 9,54, 9,65, 10,12, 10,23, 10,59, 11,01, 11,30, 11,60 et 12,00 microns . 2. La substance antibiotique A-201B, une huile à 2 5°C, 20 soluble dans les alcools, l'acétone, le chloroforme et l'acétate d'éthyle, et insoluble dans l'eau, les hydrocarbures et l'éther y ayant une composition approximative de 65,41 pour cent de carbone, 9,03 pour cent d'hydrogène, 5,76 pour cent d'azote, et 17,78 pour cent d'oxygène ; ayant an poids moléculaire apparent déterminé 25 par la méthode osmotique de la pression de vapeur égal à 417 ? ayant un maximum d'absorption ultraviolette d'environ 222 m/U / 1 % . avec un coefficient d'e^tiriction, E_ de 515, un maximum ' i cm d'absorption à environ 242 vcyif, avec un coefficient d'extinction, E, de 405, un maximum d'absorption à environ 327 m//, avec 1 cm 1 % ^ 30 un coefficient d'extincticr., E, ° de 150, et un maximum d'absorp- jl cm 1 % tion à environ 340 nyU , avec \zï. ooofficient d'extinction, E °cm de 225 ; et ayant, lorsqu'elle esc dissoute dans le chloroforme, les bandes discernables suivantes dans le spectre d'absorption infrarouge : 2,77, 3,05, 3,45, 3,51, 5.90, 6,05, 6,20, 6,60, 6,86, 35 6,95, 7,10, 7,30, 7;40, S,30, 8,90, 9,00, 9,64, 10,10, 11,20, 12,30 et 15,23 microns„ 3. Méthode de production des antibiotiques des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle consiste à cultiver l'organisme Streptomvces capreolus. souche NRRL 3817, dans un 40 milieu de culture liquide contenant des sources assimilables de ^ original 71 46604 23 2119086 carbone, de l'azote et des sels minéraux, dans des conditions aérobies en immersion jusqu'à ce qu'une activité antibiotique importante soit communiquée audit milieu de culture par ledit organisme. 5 4. Méthode d'isolement des antibiotiques des revendications 1 et 2 sous forme de substances séparées, caractérisée en ce qu'elle consiste à faire passer l'activité antibiotique produite selon la revendication 3 dans un solvant non miscible ; à évaporer ledit solvant non miscible pour le séparer de ladite 10 activité antibiotique • à faire passer ladite activité antibiotique en solution dans un solvant ; à adsorber l'activité antibiotique contenue dans la solution sur un adsorbant chromatographique ; et à faire une élution fractionnée de chaque antibiotique séparément dudit adsorbant chromatographique. BAD ORIGINAL