Brevet FR2138843A1 — publié le 19730105

La présente invention concerne un procédé d'isolement de la saramycétine dans des bouillons de fermentation. La rarampc8tine est un antibiotique polypeptidique, antibactérien et antifongique décrit dans le brevet britannique nO 914.683 et le brevet allemand nO 1.222.670. On l'obtient par fermentation de Streptomyces saraceticus, de préférence sur un milieu contenant de la farine de soja, du sucre roux, un concentré d'infusion de mats, du phosphate monopotassique et de l'huile de lard comme agent antimousse. Jusqu' ce jour, les procédés d'isolement servant å séparer la saramycétine du bouillon de fermentation impliquaient l'acidification du bouillon de fermentation avec du sulfate d'aluminium et de l'acide phosphorique å pH 4 et l'élimination du myceliumpar filtration. On extrait le mycelium contenat"1'antibiotique avec du butanol en utilisant environ un tiers du volume du boulon entier d'origine. On évapore l'extrait dans le butanol clarifié au trentiere environ de son volume d'origine. On sépare le précipité par filtration et on le sèche en obtenant un solide brut. On purifie ensuite l'antibiotique en traitant le produit brut dans le méthanol avec de l'oxyde d'aluminium, en extrayant ce produit d'une solution dans le butanol avec une base aqueuse (pH 7,5), en acidifiant la solution alcaline b pH 3,5, puis en extrayant l'antibiotique par séparation contre-courant avec du butanol et de l'eau (3 ou 4/1). On purifie ensuite l'antibiotique par chromatographie dans le butanol et l'eau sur une colonne de gel de silice ou une colonne de terre de diatomées contenant de l'eau, puis on le purifie-fi1nalement par chromatographie dans le méthanol sur une colonne d'oxyde d'aluminium basique. Dans le procédé préféré de l'art antérieur, (1) on traite l'oxyde d'aluminiul'antibiotique brut (de la premiers extraction par le butanol), puis (2) on extrait le-précipité obtenu de la solution de butanol avec une base aqueuse (pH 7,5) (extraction par partage) ; on acidifie la solution alcaline å pH 3,5 et on extrait par le butanol ; (3) on chromatographie ensuite la solution de butanol sur une colonne de gel de silice ; (4) on dissout les fractions les plus actives de (3) dans le méthanol, et on les introduit dans une colonne de chromatographie préparée avec du méthanol et de l'oxyde d'aluminium basique (désactivé par addition de 15 7. d'eau). Cette technique, malaisée-à l'échelle du laboratoire ou à l'échelle pilote, ne convient pas en pratique industrielle. La demanderesse a découvert qu'on peut isoler la saramycétine formée du bouillon de fermentation brut selon une technique relativement simple et efficace qu'on peut facilement conduire à l'échelle tdustrielle, dans laquelle les stades essentiels sont une extraction du gâteau de filtre brut, obtenu à partir du bouillon de fermentation total, avec du méthanol, extraction du concentré aqueux obtenu (à partir de l'extraction par le méthanol) avec-du butanol, et passage d'une solution de l'antibiotique brut (pur à 20-35 Z) ainsi obtenue, sur une colonne de chromatographie, pour obtenir un produit pur à 80 X ou plus. Cette technique en trois stades permet d'obtenir un produit au moins aussi pur que celui obtenu selon les techniques antérieures. De plus, le procédé en trois stades de l'invention est nettement plus simple, meilleur marché et plus efficace que les techniques de l'art antérieur et on peut le conduire à l'échelle industrielle. Le procédé de l'invention d'isolement de la saramycétine, forme par fermentation de Streptomyces saraceticuiq consiste à mettre en suspension le gateau de filtre obtenu à partir du bouillon de fermentation dans du méthanol, à récupérer et neutraliser l'extrait méthanolique, puis à en chasser le méthanol en obtenant un concentré aqueux, à extraire le concentré aqueux au butanol, à neutraliser puis à concentrer l'extrait dans le butanol, à mélanger le concentré dans le butanol avec un solvant non polaire pour précipiter un produit brut ayant une pureté d'environ 20 à environ 35 Z, puis à purifier encore le produit en en faisant s'écouler une solution sur une colonne chromatographique contenant de l'oxyde d'aluminium partiellement désactivé pour former un produit ayant une pureté d'environ 80 7. ou plus. De préférence, on isole la saramycétine obtenue du bouillon de fermentation en mettant en suspension le gâteau de filtre obtenu à partir du bouillon de fermentation contenant la saramycétine dans le méthanol, ou dans un mélange de méthanol et d'eau (dans lequel le rapport du méthanol à l'eau est compris entre environ 50/1et environ 15/1), après avoir éliminé le méthanol et ajusté le pH du concentré restant dans la gamme d'environ 3,2 à environ 3,7, à extraire le concentré avec du butanol ou un mélange de butanol et d'eau (dans lequel le rapport du butanol à l'eau est compris entre environ 20/1 et environ 6/1), à ajuster le pH de l'extrait dans le butanol dans une gamme voisine de la neutralité (7,0 - 7,5), à mélanger l'extrait dans le butanol avec de lthexane ou -d'autres solvants non polaires, tels que l'éther, le benzène, le xylène, le cyclohexane ou l'heptane, pour précipiter la saramycétine brute ayant une pureté d'environ 20 à environ 35 Z, puis à purifier le produit brut à 80 % ou plus, en le faisant passer à travers une colonne de chromatographie contenant de l'oxyde d'aluminium partiellement désactivé. Dans le procédé de l'invention, lorsqu'on recueille le produit de fermentation, on refroidit le bouillon de fermentation à envtzbn 25-50C et, de préférence, environ 15 - 100C, on élimine la mousse en ajoutant des agents antimsusse, tels que le Dow-Corning AF Antifoam ou de l'huile de lard. On ajoute du sulfate d'aluminium ou un sel d'acide, tel que le phosphate d'aluminium, sous forme d'une solution aqueuse en apportant d'environ 2,6 à environ 8,5 g d'additif par litre de bouillon, un acide minéral tel que l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique pour abaisser le pH du milieu du voisinage de la neutralité à environ 3,7 à environ 3,2 et, de préférence, environ 3,5.On filtre le bouillon ainsi traité et on met le gâteau de filtre obtenu en suspension dans environ 0,5 à environ 1,2 et, de préférence environ 0,6 à environ 1,0 volume de méthanol ou de mélange de méthanol et d'eau. On agite la suspension dans le méthanol pendant environ 0,5 à environ 2 h et, de préférence, entre 1,0 et 1,2 h et on filtre. On ajuste le pH de l'extrait dans le méthanol au voisinage de la neutralité (6,5 - 7,5), de préférence à 7,0, avec une solution aqueuse de base et on concentre l'extrait dans le méthanol, par exemple sous vide, pour éliminer pratiquement la totalité du méthanol en obtenant un concentré aqueux.On ajuste le pH du concentré dans la gamme d'environ 3,2 à environ 3,8, de préférence à environ 3,5 avec un acide, tel que l'acide phosphorique (75-85 %), puis on extrait le concentré acidifié trois à six fois, de préférence trois fois, chaque fois avec 0,5 à environ 1,0 volume, et mieux 0,75 volume de butanol. On regroupe les extraits dans le butanol et on les ajuste à un pH voisin de la neutralité (7,0 - 7,5) avec une solution aqueuse de base, et on concentre sous vide à une température maximale de 45"C à environ 1/10 du volume. On ajoute pour précipiter le produit brut, d'environ 2 à 6 volumes, et mieux environ 3 volumes d'hexane.On refroidit la suspension, par exemple à 5-lO0C, pendant environ 1 à 2 h, puis on filtre le produit brut et on le lave 8 la'hexane dans un-destccateur sous vide. On sèche le gâteau obtenu entre environ 35 à environ 45cl, de préférence à 400C, jusqu'à poids pratiquement constant. Le produit brut obtenu a une pureté de 20 à 35 Z ou plus. On purifie encore le produit brut, directement, par chromatographie en utilisant de l'oxyde d'aluminium partiellement désactivé, sans qu'il soit nécessaire de réaliser une extraction par partage ni d'utiliser une colonne de distribution comme il est nécessaire dans les techniques de l'art antérieur. On désactive l'alumine en incorporant d'environ 13 à environ 18 % d'eau, et mieux environ 15 %. On peut utiliser des colonnes ayant un rapport de la hauteur au diamètre très variable, par exemple compris entre environ 1/1 et 3/1. On dissout dans le méthanol la poudre brute à traiter pour obtenir une solution à environ 3 à environ 6 %, et mieux de 4 à 5 Z, et on la fait passer à travers la colonne d'alumine, en obtenant immédiatement le produit après le volume de déplacement.On recueillie les fractions qui contiennent l'antibiotique de pureté élevée et on les concentre à un volume d'environ 1/15 à environ 1/25, et mieux à un volume d'environ 1/20, on précipite le produit en ajoutant un solvant non polaire, tel que l'hexane ou un mélange d'acétone et d'hexane (de préférence 50/50). On répartit le précipité sur une plaque et on le seche à poids constant obtenant une poudre blanchâtre à très légèrement beige. On peut préparer la saramycétine en cultivant Streptomyces saraceticus. La culture est aérobie, mésophile et caractérisée par un mycelium très ramifié. Pans le stade de fermentation, on a observé que Streptomyces saraceticus cultive bien en utilisant de nombreuses sources d'azote, telles que la farine de soja, la farine de coton, la farine de poisson, des peptones, des levures, des résidus solubles séchés de distillation et des hydrolysats de caséine. Sur des milieux synthétiques, les aminoacides isolés tels que l'alanine, l'arginine, l'acide glutamique, la lysine et la valine ont une bonne croissance. On peut utiliser dans les cultures de nombreuses sources de carbone, tenues que le glucose, le saccharose, l'amidon, le lactose, le maltose et le mannitol.Cependant, de préférence, le milieu de production de l'antibiotique contient 2 7. de farine de soja, 2 Z de sucre roux, 0,5 Z de concentré d'extrait de mats, 0,1 Z de phosphate monopotassique et de l'huile de lard comme agent antimousse. D'autres caractérisstiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d-'un exemple de réalisation. FXEkE'Lt I. Fermentation Le milieu utilisé dans tous les-stades du procédé de fermentation a la composition suivante Infusion de mats 0,5 Z Nutrisoy 2,0 Z Sucre roux 2,0 Z Phosphate monopotassique 0,1 Z Huile de lard 0,2 Z On ajuste le pH du milieu à 7,0 avant stérilisation. Pour préparer l'inoculum, on repique une partie d'une culture sur gélose inclinée de Streptomyces saraceticus NRRL 2.831 dans 50 ml de milieu dans un erlenmeyer de 250 ml. Après 48 h à 28"C sur un agitateur tournant, on transfère la culture dans 1 1 de milieu dans un erlenmeyer de 4 1. Après 48 h sur un agitateur tournant, on utilise la culture pour ensemencer 3.000 1 de milieu contenus dans une cuve. On laisse la culture se poursuivre en aérant et agitant de façon appropriée pendant 48 h à 28 C. A ce moment, on utilise les 3.000 1 du stade de germination pour ensemencer le fermentateur de production en obtenant un volume final de 37.850 1.Dans des conditions d'aération et d'agitation appropriées, il se produit de la saramycétine et cette production atteint un maximum après environ 96 h-à 28oC. Durant les stades de germination et de production, on contrôle la mousse en utilisant, soit de l'huile de lard, soit de l'Ucan Lubricant LB625. Il. Isolement du produit Pour recueillir le produit, on abaisse la température du bouillon à environ 10-15*C et on abat la mousse en ajoutant de l'AF Antifoam Emulsion de Dow Corning. On ajoute du sulfate d'aluminium, par exemple sous forme d'une solution à 30 X, en apportant 5,2 g de sulfate d'aluminium par litre de bouillon. Le pH, qui était à l'origine de 7,4, est alors de 4,3-4,6 et on l'abaisse à 3,5 en ajoutant de l'acide sulfurique à 280g/l.On filtre le bouillon, dont on a ainsi ajusté le pH sur un filtre tournant sous vide à prérevetement, en utilisant environ 2 à 5 Z d'Hyflo, s'il et nécessaire. On met le gâteau de filtre en suspension dans 0,5 à 1,0 volume de méthanol.On agite la suspension pendant environ 1 h, puis on la filtre sur un filtre sous vide rotatif à prérevêtement. On ajuste l'extrait dans le méthanol à pH 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium à 50 Z et on concentre sous vide jusqu'à ce que le méthanol soit chassé en laissant un concentré aqueux. On ajuste le pH de ce concentré à 3,5 avec de l'acide phosphorique à 85 Z, et on extrait trois fois avec une quantité de n-butanol égale aux 3/4 du volume. On regroupe les extraits dans le butanol et on ajuste le pH à 7,0-7,5 avec de l'hydroxyde de sodium à 50 Z et on concentre sous vide à une température maximale de 45C à environ 1/10 du volume.Qu'il apparaisse ou non des solides dans le concentré, on ajoute 3 volumes de n-hexane pour précipiter complètement le produit brut. On refroidit la suspension à 5-100C pendant environ 1 à 2 h, et on filtre le produit brut, puis on le lave avec de l'hexane froid sur un filtre sous vide en céramique. On sèche le gâteau sous vide à 400C jusqu'à poids constant. A partir de 38.000 1 de bouillon, on obtient 10 à 12 kg d'une poudre beige clair à beige foncé. L'analyse de cette poudre donne les résultats suivants Essai microbiologique 90 u/mg Soufre Z 3,5 Absorption ultraviolette (MeOH) : E 1% à 220 m/u 190 1 cm Ceci correspond à une pureté d'environ 30 à 35 Z. On poursuit la purification de la poudre brute pure à 30 % ou plus en un produit ayant une pureté de 80 X ou plus par chromatographie sur de l'oxyde d'aluminium partiellement désactivé. L'alumine utilisée est de l'alumine basique Woelt, qu'on a désactivée en incorporant 15 % d'eau, On utilise une colonne ayant un rapport de la hauteur au diametre de 2 à 1. On dissout 18 poudre à traiter dans le méthanol en formant une solution à 4 - 5 Z et on la fait passer sur la colonne d'alumine ; on obtient immédiate- ment le produit après le volume de déplacement. On regroupe les fractions qu'on estime contenir l'antibiotique de pureté élevée, et on les concentre au 1/20 de leur volume, on précipite le produit en ajoutant 5 volumes d'un mélange 50/50 d'acétone et d'hexane. On étale rapidemen-t le produit surune plaque et on sèche à poids constant sous vide à 400C ; on obtient une poudre blanchâtre très légèrement beige. Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'etre décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif, sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement de la saramycétine produite par la fermentation de Streptomyces saraceticus, caractérisé en ce qu'il ccnsiste à mettre en suspension le gâteau de filtre obtenu à partir de bouillon de fermentation avec du méthanol, à récupérer et neutraliser l'extrait dans le méthanol, puis à chasser le méthanol en laissant un concentré aqueux, à extraire le concentré aqueux avec du butanol, à neutraliser puis à concentrer l'extrait dans le butanol, à mélanger le concentré dans le butanol avec un solvant non polaire pour précipiter un produit brut ayant une pureté d'environ 20 à environ 35 X, puis à purifier le produit en en faisant s'écouler une solution à travers une colonne de chromatographie contenant de l'oxyde d'aluminium partiellement désactivé pour obtenir un produit ayant une pureté d'environ 80 Z ou plue. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on conduit la mise en suspension dans le méthanol en utilisant du méthanol ou un melange de méthanol et d'eau dans un rapport d'environ 50/1 à environ 15/1. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajuste le pH du concentré aqueux obtenu après le stade d'extraction du méthanol dans la gamme d'environ 3,2 à environ 3,7. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mélange le concentré dans le butanol avec de l'hexane pour précipiter le produit brut. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prépare le gateau de filtre qu'on met en suspension, en refroidissant le bouillon de fermentation à une température comprise dans la gamme d'environ 25 à environ 5 C, en acidifiant le bouillon pour abaisser le pH dans la gamme d'environ 3,7 à environ 3,2 et en filtrant le bouillon pour obtenir le gStesu de filtre. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on désactive à 15 Z l'oxyde d'aluminium utilisé. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on conduit le stade d'extraction par le butanol en utilidant du butanol ou un mélange de butanol et d'eau dans le rapport d'environ 20/1 à environ 6/1.