Brevet FR2125209A1 — publié le 19720929

La présente invention a pour objet des procédés de synthèse et de séparation des esters polyphosphoriques de la thiamine, notamment des esters comportant au moins 4 atomes de phosphore en chaîne linéaire. La présente invention a, de plus, pour objets l'application thérapeutique, à titre de médicaments, des esters polyphosphoriques de la thiamine ayant au moins 4 atomes de carbone formant une chaîne linéaire, ces esters ayant d'une part des propriétés antistaphylococciqueset d'autre part une action neuromusculaire permettant de les utiliser comme défatigants. Parmi les dérivés polyphosphoriques de la thiamine, appelée également vitamine B1 ou aneurine, on connaît dejà le pyrophosphate connu sous le nom de cocarboxylase et le triphosphate de thiamine. Un des buts de l'invention est la production d'esters de degré supérieur, contenant 4 atomes ou plus de phosphore fixés sur la fonction alcool du groupement thiazol de la thiamine. Certains auteurs ont montré que les procédés connus de synthèse des drivés phosphoriques de la thiamine conduisaient à des mélanges contenant des dérivés ayant plus de trois atomes de carbone. Suzooki-Ziro et autres dans le Journal of Biochemistry - 1957, volume 44, page 783 ont montré que le triphosphate de thiamine synthétique contenait, à l'état de traces, des polyphosphates d'ordre supérieur à 3, qui pouvaient être séparés par chromatographie Stqparmi lesquels ils ont identifié le tétraphosphate et le pentaphosphate de thiamine. Henri ROUX et autres, dans le Bulletin de la Société de Chimie Biologique 1948 - tome 30, pages 592 et 1949 - tome 31, page 235 ont dé- crit un procédé de synthèse de dérivés polyphosphoriques de la thiamine voisin de celui qui fait l'objet de l'invention. Ils ont montré que les dérivés polyphosphoriques obtenus étaient des esters amides comportant deux chaînes linéaires phosphoriques fixées l'une sur la fonction alcool du groupement thiazol et l'autre sur la fonction amine du groupement pyrimidine de la thiamine. Le procédé suivant l'invention diffère de ex procédé antérieur par les méthodes de fractionnement utilisées et par le résultant atteint car il aboutit non pas à des esters amides mais à des esters ayant une seule chaîne polyphosphorique linéaire fixée sur la fonction alcool de la thiamine. Ces esters sont isolés en quantités suffisantes pour permettre l'étude des propriétés therapeutiques. Les diverses étapes du procédé selon l'invention, étudié en laboratoire, notamment Les méthodes de fractionnement par cristallisation fractionnée et par chromatographie sur résines éehangeuses d'ions peuvent être facilement industrialisées. La description ci-après du procédé utilisé en laboratoire est donnée à titre d'exemple sans aucun caractère limitatif. Dans un flacon bouché à l'émeri et muni d'une tubulure à dégagement latérale plongeant das un godet de mercure, on verse 100 cm3 d'oxychlorure de phosphore. Le flacon est maintenu à 0 C pendant que lton ajoute 3 à 4 cm3 d'eau distillée par fractions de 0,5 cm3, à intervalles de temps de plusieurs minutes. On répète l'hydratation les jours suivants de la même manière jusqu'à ce que le taux d'hydratation atteigne 18 %. dans l'intervalle entre les hydratations le flacon porté à une température de I'ordre de OC. Au bout de quelques jours, la viscosité augmen te et atteint dés valeurs comprises entre 1,6 et 5 poises. I1 est alors prêt à l'emploi pour la réaction de phosphorylation suivante. Dans un flacon bouché à l'émeri on fait réagir du chiorydrate de thiamine et de l'oxychlorure de phosphore hydraté à raison de i ml d'oxychlorure par gramme de chlorhydrate de thiamine. On maintient à OC pendant deux meures environ pour modérer la vitesse de la réaction puis à la température ambiante pendant 10 heures environ. On obtient une liqueur transparente et visqueuse qui est reprise par l'acétone anhydre. On obtient un précipité blanc visqueux, qui est séparé par décantation puis lavé avec de l'acétone à 1 % d'eau. Le précipité est ensuite dissous dans l'eau et pureté dans l'acétone pour supprimer l'excés d'oxychlorure de phosphore restant.Le précipité est séparé par centrifugation et dissous dans une solution aqueuse dont le pH est maintenu aux environs de 4,8 à l'aide d'une solution de carbonate de soude. Cette valeur du pH assure une meilleure séparation des formes minérales et organiques. On réalise ensuite un premier fractionnement de cette solution par cristallisation fractionnée dans l'acétone. Lorsque le but du procédé est la préparation d'esters polyphos phoriques de degré élevé, on conserve la première fraction qui précipite dans laquelle la teneur en esters de degré élevé est la plus grande. Sur;cette fraction et éventuellement sur d'autres fractions si on désire séparer des esters polyphosphoriques de degré inférieur, on réalise un fractionnement plues poussé par chromatographie sur résines échangeuses d'ions. On utilise une résine anionique, ayant une granulométrie comprise entre 200 et 40Q mesh, sous forme de chlorure, placée dans une colonne ,de 20 cm de longueur. Chaque fraction précédement séparées par cristallisation fractionée est dissoute dans l'eau et la solution est amenée à un pH voisin de 7,2. A ce pH, la thiamine est encore stable et l'ionisation des fonc- tions acides des esters polyphosphoriques est suffisante pour assurer une bonne fixation sur les résines. On utilise environ 500 ml d'eau par gramme de précipité. Après que le précipité a été fixé sur les résines,on le fractionne en lavant les résines par un éluant, au moyen dsun disposi- tif permettant d'obtenir un gradient d'élution linéaire. L'éluant est un mélange IICL/NaCL de concentration finale HCL , 0,025 N et NaCl = 0,5M. Les dernières fractions sont celles qui contiennent les esters polyphosphoriques de degré élevé. Si l'on cherche à produire uniquement ces derniers esters à l'état pur on conserve les dernières fractions entraînées par l'éluant le plus concentré. On les neutralise à pH voisin de 6 pour éviter l'hydro- lyse qui pourrait se produire en demeurant au pH acide qui est celui des effluents sortant des résines. On précipite chaque fraction par l'acétone. On sépare chaque précipité par centrifugation et on le remet sépare ment en solution pour recommencer une deuxième chromatographie sur résines anioniques dans une colonne de longueur 40 cm. La concentration finale de l'éludant est plus faible HCL = 0,017 N NaCL r 0,35 M Cette deuxième chromatographie est destinée à parfaire la pureté des produits. Les fractions sont recueillies séparément, précipitées par l'acétone et le précipité est séparé par centrifugation. Les précipités produits par les dernières fractions sont des esters polyphosphoriques de la thiamine, ayant plus de 3 atomes de phosphore en chaîne linéaire, à l'état sensiblement pur. Ces esters se presentent sous la forme de microcristaux très hygroscopiques que l'on conserve à l'abri de l'air à une température comprise entre 0 C et 4-C. I1 a été vérifié que les produits obtenus étaient des esters, ctest-à-dire que la chaîne polyphosphorique était fixée sur la fonction alcool et que la fonction amine était libre. Cette vrification a été conduite en utilisant la technique connue de désamination nitreuse de la thiamine. On additionne à froid, successivement, 1 ml de NaNO2 à 10 % et 5 ml de S04H2 au demi à une solution de 2,5 mg d'ester dans 2,5 ml d'eau. On maintient pendant 10 minutes dans un bain réfrigéré. On rajoute ensuite 8 ml de S04H2, 1/2 et l'on porte au bain-marie à 1000 pendant 30 minutes. Après avoir éliminé les vapeurs nitreuses par-ébuIlition, on observe le spectre deabsorption en ultraviolet d'une solution diluée. Si la fonction amine est libre, la thiamine est transformée en oxythiamine qui présente, à pH acide, deux maxima d'absorption à 2550 X et 2650 A. On constate que, dans toutes les fractions, on obtient, après désamination nitreuse, le spectre ultraviolet caractéristique de l'oxy- thiamine ce qui démontre bien que la fonction amine est libre. La pureté des produits obtenus à été contrôlée par électropho rèse de zone à très haute tension. On opère à 3000 Volts pendant 30', en présence de témoins minéraux et organiques : orthophosphate, pyrophosphate, tripolyphosphate, trimétaphosphate de sodium, sel de Graham et cocarboxylase. On a également contrôlé la pureté des produits par chromatographie sur papier en utilisant un solvant acide (eau, isopropanol, acide trichloracétique et ammoniaque.) Le temps de migration est de 12 heures. Ces deux méthodes fournissent des spots parfaitement individualisés qui confirment un bon degré de pureté des produits. Sur les électrophorégrammes l'ester triphosphorique migre au delà de la cocarboxylase et les esters polynphspheriques de degré supérieur à 3 migrent au delà de l'ester triphosphorique. Sur les chromatogrammes l'est triphosphori- que migre à un niveau inférieur à celui de la cocarboxylase et les esters polyphosphoriques de degré supérieur à 3 migrent à des niveaux d'autaiit plus décroissants que leur nombre d'atomes de phosphore est élevé. L'hydrolyde des esters, suivie de l'analyse de la teneur en phosphore facilement hydrolysable et en phosphore total, confirae qu'un seul atome de phosphore est lié au noyau, les autres étant hydrolysés. I1 s'agit donc bien d'esters. L'étude des dérivés de dégradation après hydrolyse, à pH = 4,5, pendant une heure, à 100 C, a donné les résultats suivants : pour l'ester triphosphorique: ester triphosphorique non hydrolysé o 30 ss cocarboxylase : 69 % ester monophosphorique t 1% peur l'ester tétraphosphorique: ester tétraphosphorique non hydrolysé : 27 % ester triphosphorique : 55 ss cocarboxylase : 17 % ester monophosphorique: Tous ces dérivés sont donc des esters à chatne polyphosphorique linéaire. Le procédé suivant linvention permet donc de produire des dés rivé s polyphosphoriquesde la thiamine ayant une chatne polyphosphorique linéaire fixée par covalence sur la fonction alcool du noyau thiazol de la thiamine. Ces dérivés sont donc des esters polyphosphoriques, dont la formule générale est t L'utilisation d'une résine anionique permet de séparer à l'état sensiblement pur les esters triphosphoriques, tétraphosphoriques, pentaphosphorique etc... APplications thérapeutioues des esters tétraphosphoriques de la thiamine. Un essai d'activité antistaphilococcique de lester tétraphos phorique de la thiamine a été effectué in vivo sur des souris MLÂ(IP). L'infestation est réalisée par voie veineuse à l'aide de staphylococcus Aureus 133 (I.P.P.). On injecte à chaque souris 0,5 ml d'une dilution d'une culture de 7 heures contenant environ 107 germes par ml La solution d'ester tétraphosphorique est alors injectée et cette opération est répétée de 24 heures en 24 heures pendant trois jours soit 4 injections au total. L'administration est sous-cutanée, la dose est de 1 ml/Kg de poids. Les animaux témoins ne rçoivent aucun traitement. Le 5ème jour, les animaux sont sacrifiés, les reins prélevés, broyés et on effectue une numération des germes par la méthode des dilutions en milieu gélosé : au mannitol non sélectif. Les tableaux ci-après donnent les résultats comparatifs, relatifs à 40 souris, exprimés en germes. TABLEAU I - Animaux témoins. a) FEMELLES. Dilutions T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 10-1 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 Décès Décès 10-2 " " " " " " " " 10-3 " " " " " " " " 10-4 1340 " " " 1920 " " 700 10-5 150 800 800 300 200 700 800 52 10-6 21 130 144 12 21 74 85 2 b) MALES. Dilutions T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 10-1 > 2000 > 2000 > 2000 inci- > 2000 > 2000 Décès Décès Décès Décès dent 10-2 " " " " " 10-3 " " " " " 10-4 t, i " n 10-5 1300 " 300 1350 62 10-6 100 400 30 110 7 TABLEAU II - Animaux traités -1 mg/Kg de poids a) FEMELLES Dilutions B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 10-1 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 800 > 2000 > 2000 Décès 10-2 " " " " " 1800 62 " " 10-3 2000 " " " " 60 9 " " 10-4 160 " " 420 " 5 2 " 2000 10-5 20 400 300 130 300 0 0 400 180 10-6 6 54 40 8 20 0 0 53 91 b) MALES. Dilutions B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 10-1 > 2000 > 2000 > 2000 21 > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 Décès Décès 10-2 " " " 3 " " " " 10-3 " " " 0 " " " " 10-4 " " 1200 0 " " 210 1100 10-5 400 1200 10 0 2600 1310 16 108 10-6 91 103 3 0 260 110 1 9 Ces tableaux démontrent une action antistaphylococcique. Le nombre de décès est divisé par deux. Le nombre moyen de germes trouvés pour une dilution de lo-6, s'élève à 87 chez les animaux témoins tandis qu'il n'est que de 45 chez les animaux traites. Cette activité antimicrobienne est un résultat surprenant. Cette propriété n'a pas été signalée pour les esters polyphosphoriques connus de degré inférieur : cocarboxylase et ester triphosphorique. Au contraire, on sait que la cocarboxylase est un facteur de croissance du staphylocoque. Les esters polyphoshoriques de la thiamine ayant au moins 4 atomes de phosphore sont utilisables également comme remèdes défatigants. Les expériences suivantes démontrent que ces produits présentent des propriétés pharmacodynamiques intéressantes dans ce domaine. Des expériences ont été effectuées sur des chiens dont on enregistre les contractions musculaires après injection d'esters polyphosphoriques de la thiamine de degré supérieur à 4 ou de mélanges d'esters polyphosphoriques. On obtient un enregistrement oscillographique présent tant de grandes ondes d'interférence des pointes élémentaires et un ryth me de Piper s'amorce qui traduit une-synchronisation des rythmes tétaniques. Ces expériences démontrent l'activité neuromusculaire des esters polyphosphoriques de la thiamine de degré supérieur à 4. Cette action se traduit;par des crises tétaniques avec rythme earactéristiqee des courants d'action et tendance à la synehronisaton des rythmes tétaniques. D'autres expsriences ont montré que les esters polyphosphoriques de la thiamine présentaient une action complexante vis à vis des ions so- dium et potassium, cette action étant plus importante dans le cas du se- dium. ksintensité de cette action complexante, exprimée en pourcentage d'ions sodium ou potassium qui sont dissimulés dans une solution par l'ad- dition d'esters polyphosphoriques de la thiamine, est comparable à celle connue des acides polyphosphoriques minéraux et de l'ordre de 10 %. On a également observé que l'addition d'esters polyphosphori ques de la thiamine provoque une très forte réduction du courant entrant sodium et très peu de modifications du courant sortant potassium au niveau du noeud de Ranvier d'une fibre myélinisée isolée. Cette propriété s'explique par l'action complexante qui intervient au niveau des trans- ports actifs d'ions sodium et potassium à travers des membranes. Ces propriétés neurousculaires sont très supérieures à celles fournies par d'autres dérivés polyphosphoriques connus comme défatigants, notamment l'A.T.P. ou adénosine triphosphorique. LtA.T.P. a également une action sur le métabolisme des glucides. Des expériences ont montré que les esters polyphosphoriques de la thiamine ont également une action inhibitrice sur la glycolyse du sang de chien normal et sur l'activité de l'hexokinase. REVENDICATIONS. 1 - Procédé de synthèse d'esters polyphosphoriques de la thiamine, carac- térisé par la suite d'opérations suivantes I - on fait agir de ltoxyehlorure de phosphore hydraté sur du chlorhydrate de thiamine à la température ambiante; - on précipite par l'acétone anhydre, on sépare le précipité et on le dissout dans une solution aqueuse ayant un pH de l'ordre de 4,8; - on effectue une cristallisation fractionnée à l'acétone; - on dissout séparément les fractions dans une solution aqueuse ayant un pH de tordre de 7,2 et on les fractionne par chromatographie sur résines anioniques avec élution à gradient linéaire; - on recueille séparément les fractions, et on les neutralise à pH de l'ordre de 6;; - on précipite séparément chaque fraction par lacétone, on sé pare chaque précipité et on recommence dans les mêmes conditions, une séparation par chromatographie sur résines anioniques avec elution à gra dient linéaire et les fractions sont neutralisées, précipitées à l'acAto- ne et les précipités recueillis sont des esters polyphosphoriques de la thiamine. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction de phosphorylation est produite en utilisant environ 4 millilitres d'oxy- chlorure de phosphore hydraté par gramme de chlorhydrate de thiamine, en maintenant le mélange à une température voisine de 0 pendant une durée minimum d'une heure environ puis à la température ambiante pendant une durée d'environ 10 heures. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'éluant uti lisé pour les fractionnements par chromatographie sur résines est un mé- lange d'acide chlorhydrique et de chlorure de sodium. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentra tion finale de l'éluant utilisé pour le premier fractionnement est de l'ordre de 0,025 N en HCL et de 0,5 M pour NaCL. 5 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentra tion finale de l'éluant utilisé pour le deuxième fractionnement est de l'ordre de 0,017 N en HCL et de 0,35 M en NaCL. 6 - Application thérapeutique de ltester tétraphosphorique de la thiamine, caractérisée en ce que cet ester est utilisé comme agent antistaphylo coccique. 7 ~ Application thérapeutique des esters polyphosphoriques de la thiamine ayant au moins 4 atomes de phosphore en channe linéaire, caractérisée en ce que ces ester s sont utilisés comme médicaments défatigants par suite de leurs propriétés complexantes vis à vis des ions sodium et potassium et leur action neuromusculaire.