Brevet FR2133984A1 — publié le 19721201

Les sirops de sucre sont très utilisés dans l'industrie de la boulangerie, de la confiserie et des boissons, par exemple. Ces sirops contiennent, généralement, du saccharose (sucre de canne) ou des produits renfermant 5 du dextrose, obtenus par hydrolyse de l'amidon, comme principal agent sucrant, lorsqu'on désire un sirop gui est plus sucré que celui que l'on obtient à partir du saccharose, on utilise un sirop de sucre inverti. Ce sirop est produit par hydrolyse acide du saccharose pour former un mélange 10 contenant environ 50 de glucose (dextrose) et environ 50 % de fructose (lévulose). Bien que le glucose soit un peu moins sucré que le saccharose, le fructose est plus sucré que le saccharose, en sorte que la sucrosité globale est augmentée, comparativement au saccharose. 15 II est bien connu que le dextrose peut être transf-ormé en fructose dans des conditions alcalines. Cette transformation présente un grand intérêt dans la production des sirops de sucre. Toutefois, la transformation alcaline n'a pas obtenu de succès industriel, du fait que 20 la réaction alcaline confère un taux indésirablement élevé de substances minérales.au sirop produit, ces substances minérales étant coûteuses à éliminer, le sirop n'est pas acceptable si les substances minérales n'ont pas été éliminées. 25 la technique antérieure s'est alors tournée vers la transformation enzymatique du glucose en fructose. On a constaté que les espèces Pseiidomonas hvdrophila. Streptomyces flavovireus, Streptomyces echinatur. Streptomyces achromogenus. Streptomyces albus. etc., 30 pouvaient être cultivées dans des milieux nutritifs appropriés pour former des enzymes doués de propriétés d'isomérase du glucose. Ces procédés antérieurs n'on-pas obtenu de succès industriel, soit parce que les rendements en enzyme sont trop faibles, dans la production 35 de l'enzyme, soit parce que les rendements en fructose sont trop faibles lorsque l'enzyme est utilisé pour traiter le glucose. On a découvert ensuite que Streptomyces olivaceus NIÏRL 3583 pouvait être utilisé pour produire une isoniérase 72 14062 2 2133984 de glucose convenable du point de vue industriel, dont les rendements en enzyme sont supérieurs à ceux que l'on obtient avec les organismes utilisés antérieurement. l'invention concerne un procédé -de production 5 d'isomérase de glucose,qui consiste à cultiver dans des conditions aérobies une souche de Streptomyces olivaceus NRRL 3916, dans un milieu contenant des substances nutritives appropriées, puis à en séparer l'enzyme. L'organisme donne de plus grands rendements en enzyme désiré que les 10 organismes utilisés antérieurement. L'organisme intéressant à utiliser dans la présente invention est identifié à l'espèce Streptomyces olivaceus conformément aux méthodes bien connues de détermination. La souche particulière de Streptomyces olivaceus intéressante 15 à utiliser dans la production de la nouvelle isomérase de glucose a été déposée à la "Northern Utilisation Research and Development Division", service de recherche agronomique du Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, et on lui a attribué 20 le numéro NRRL 3916 d'identification. Streptomyces olivaceus NRRL 3916 est préparé par mutation ultraviolette de Streptomyces olivaceus NRRL 3583, conformément à des procédés bien connus. Toutefois, il est surprenant de constater que cette forme mutante est 25 capable de produire des rendements en isomérase de glucose plus élevés que ceux de la culture de laquelle elle provient. L'organisme Streptomyces olivaceus NRRL 3916 est maintenu en cultures inclinées sur gélose nutritive et peut 30 se développer dans un milieu contenant des substances nutritives appropriées. Le milieu contient de préférence du xylose et une source d'azote. Il contient aussi, de préférence, d'autres glucides et d'autres sels minéraux. Des exemples de glucides comprennent l'amidon de maïs, 35 le dextrose, le lactose, le son de froment, etc. Dec exemples de sources d'azote comprennent la peptone, l'extrait de levure, l'extrait de viande, les amino-acides, les extraits 72 14062 3 2133984 solubles de maïs, etc. Des exemples de sels minéraux comprennent le chlorure de sodium, le sulfate de magnésium, etc. Ces glucides, ces sources d'azote et ces sels minéraux sont bien connus en pratique. le xylose utilisé dans le 5 milieu de culture peut se présenter sous une forme purifiée, ou bien sous la forme d'une substance brute contenant du xylose. L'organisme est de préférence cultivé dans des conditions de fermentation en immersion pendant environ 10 20 à environ 50 heures à une température d'environ 15 à environ 35°C. Aux températures inférieures à environ 1 5°C et à des températures supérieures à environ 35°C, le rendement en enzyme désiré devient très faible. La température préférée de développement va d'environ 25 à environ 15 3 5°C. On utilise, de préférence, des conditions de pression atmosphérique, mais des pressions supérieures et inférieures à la pression atmosphérique peuvent être utilisées, le cas échéant, sans que ceci présente d'avantages ou d'inconvénients particuliers. Le pH initial du milieu de culture doit aussi 20 être compris entre environ 6,8 et environ 7,1 • L'isomérase de glucose de la présente invention est formée^lu sein des cellules bactériennes qui se développent pendant sa production. Les cellules peuvent être séparées par filtration du' bouillon de fermentation et utilisées directement 25 comme source d'isomérase de glucose. A titre de variante, les cellules peuvent être séparées par filtration puis rompues par des moyens bien connus. Les cellules rompues résultantes et leur contenu libéré peuvent être utilisés comme source d'isomérase de glucose. En outre, les cellules 30 peuvent être rompues sous l'action des ultra-sons ou par homogénéisation, par exemple, et les débris peuvent être séparés par centrifugation. La liqueur surnageante peut; être utilisée directement comme source d'isomérase de glucose, ou bien elle peut être lyophilisée en une poudre 35 fine en vue de son utilisation subséquente. L'enzyme peut aussi être isolé de la liqueur surnageante mentionnée ci-dessus, au moyen d'agents précipitants bien connus, par 72 14062 4 2133984 exemple l'éthanol ou le sulfate d'ammonium. l'activité de production de fructose de l'isomé-rase de glucose de la présente invention peut être titrée par la méthode suivante : poids/volume de glucose) par lente addition sous agitation de 625 g de glucose anhydre à 300 ml d'eau distillée chaude. On laisse refroidir la solution à la température ambiante et 10 on ajoute 125 ml d'une solution aqueuse de concentration 1M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane à un pH égal à 8,5, 125 ml de solution aqueuse de sulfate de magnésium de concentration 1M et 50 ml de solution aqueuse de chlorure cobalteux de concentration 0,025M. On dilue ensuite 15 le mélange résultant à un litre avec de l'eau distillée. un échantillon de 10 ml de la solution de glucose indiquée ci-dessus. On ajoute une quantité suffisante de l'enzyme à titrer pour produire une réduction de la rotation spécifique, 20 comme défini ci-après, d'environ 2,9 à environ 7,5°. le contenu de la fiole est ensuite dilué à 25 ml avec de l'eau distillée et le mélange résultant est mis à incuber à 60°C pendant deux heures, la réaction est ensuite arrêtée par l'addition d'un millilitre de solution aqueuse d'acide 25 perchlorique, à une concentration de 0,5M. le mélange est ensuite centrifugé à 15 000 tr/mn pendant 20 minutes et la rotation optique (en degrés) de la liqueur surnageante est mesurée par des techniques bien connues. On effectue un blanc par le même procédé, mais en l'absence d'enzyme. 30 On mesure également la rotation optique du blanc, la p C rotation spécifique [a]D de l'échantillon ou du blanc est 2a, c'est-à-dire deux fois la rotation optique observée, le pourcentage de transformation du glucose en fructose est calculé d'après la formule suivante : 5 Méthode de titrage de l'isomérasé de glucose On prépare une solution aqueuse à 62,5 fo (en On introduit dans une fiole jaugée de 25 ml 35 Pourcentage de transformation du glucose H ~ Toi x 100 72 14062 2133984 Cette méthode de titrage est également utilisée pour mesurer l'activité en -unités d'isomérase de glucose, une unité d'isomérase de glucose étant la quantité d'enzyme capable de transformer-une mieromole de glucose en fructose 5 par minute dans les conditions du titrage, l'activité enzymatique, exprimée en unités d'isomérase de glucose dans l'échantillon d'enzyme soumis au titrage, est calculée d'après la foimule suivante : microgrammes de fruc- 10 UIB/ OU UIff/, X , - 'gramme litre mg ou ml d'enzyme utilise. On calcule les microgrammes de fructose formé en multipliant la valeur de pourcentage de transformation g du glucose calculée ci-dessus par 6,25 x 10 . 15 l'invention est illustrée en détail par les exemples suivants î Exemple 1 On charge une culture de Streptomyces olivaceus NRR1 3916 dans une fiole d'Erlenmeyer à trois chicanes con-20 tenant 50 ml d'un mélange aqueux renfermant 1,0 ?0.e xylose, 0,3 d'amidon de maïs,. 1,0 de peptone, 0,5 i° d'extrait de boeuf, 0,05 i° d'extrait de levure, 0,5 de chlorure de sodium et 0,05 i° de sulfate de magnésium. Tous les pourcentages indiqués ci-dessus sont donnés sur une base poids/ 25 volume. On ajuste le pH du milieu à 7,0 avec de l'laydroxyde de sodium, le contenu inoculé de la fiole est ensuite agité sur une secoueuse rotative pendant 24 heures à 30°C. Au bout de la période d'incubation de 24 heures, on transfère un millilitre de la culture d'inoculum dans 30 une fiole d'Erlenmeyer à trois chicanes contenant 50 ml d'un mélange aqueux renfermant 0,7 de xylose, 0,3 i° d'amidon de maïs, 1,0 fo de peptone, 0,5 $ d'extrait de boeuf, 0,25 f3 d'extrait de levure, 0,5 de chlorure de sodium et 0,05 io de sulfate de magnésium, tous ces pourcentages 35 étant exprimés sur une base poids/volume. On ajuste le pH à 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium. le contenu inoculé de la fiole est ensuite agité sur une secoueuse rotative 72 14062 6 2133984 pendant 48 heures à 30°C. Les cellules bactériennes sont ensuite séparées par filtration du bouillon de fermentation résultant, et oh trouve qu'elles titrent 2952 UIG/l. On répète le mode 5 opératoire décrit ci-dessus en utilisant l'organisme Streoptomyces olivaceus NRRL 3583 connu et on n'obtient que 2561 UIG/l. Ceci démontre l'amélioration du rendement en enzyme que l'on obtient au moyen du procédé de la présente invention. 10 Exemple 2 On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant une culture de Streptomyces olivaceus NRRL 3916 et on obtient un rendement en enzyme de 2937 UIG/l, ainsi qu'en utilisant une culture antérieure de Streptomyces 15 olivaceus NRRL 3583, qui donne un rendement en enzyme de 2373 UIG/l seulement. Là encore, le. procédé de la présente invention donne un plus fort rendement en enzyme , comparativement à la technique antérieure. L'isomérase de glucose que l'on obtient au moyen 20 du procédé de l'invention est intéressante pour transformer le glucose en fructose, autrement que dans les conditions de titrage. Cette transformation est décrite dans l'exemple suivant : Exemple 3 25 On mélange une solution aqueuse de glucose contenant 49,2 % (poids/volume) de glucose avec quelques cellules bactériennes développées conformément au mode opératoire de l'exemple 1 décrit ci-dessus. On utilise les cellules en une quantité d'environ 4 UIG/gramme de glucose dans la 30 solution de glucose. On fait réagir le mélange résultant à 60°C pendant 20 heures tout en maintenant le pH à 7,7-7,9. Le titrage du glucose dans la solution résultante démontre que la transformation de glucose en fructose est de 40,2 fi . 72 14062 7 2133984 KEVBKDICATION Procédé de production d'une isomérase de glucose, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver dans des conditions aérobies une souche de Streptomyces olivaceus NRK1 3916 dans un milieu contenant des substances nutritives appropriées, puis à séparer l'enzyme du milieu de culture.