Brevet FR2133981A1 — publié le 19721201

La présente invention concerne un procédé de préparation du complexe cuivrique du 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phéna zinol et le produit ainsi obtenu. Jusqu'à présent, on a préparé le complexe cuivrique du 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol en combinant une solution saturée de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol (myxine) dans un solvant organique approprié, et une solution saturée d'un sel de cuivre II dans le même solvant. Les solvants organiques qui ont été utilisés comprennent l'acide acétique, l'acétonitrile, le méthanol, l'éther, le chloroforme, etc. On prépare facilement le précurseur, le 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phéna- zinol par méthylation sélective de l'iodinine (5,10-dioxyde de 1,6-phénazinol), par exemple par traitement du sel monosodique de l'iodinine avec un agent de méthylation comme le sulfate de diméthyle dans un solvant organique inerte.Lorsqu'une solution de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol est combinée avec une solution de sel cuivrique, par exemple l'acétate cuivrique, il se forme un complexe de cuivre II qui contient une mole de cuivre pour deux moles de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol. D'autres sels cuivriques appropriés comprennent ceux des acides faibles dont la valeur'du pKa est d'environ 4,2 ou supérieure, comme ceux des acides propionique ou benzoïque et ceux d'acides minéraux, comme le sulfate cuivrique, qui doivent être utilisés dans un système solvant tamponné pour éviter des conditions fortement acides. Puisque le produit final est isolé du milieu réaction nel par précipitation, il faut utiliser un solvant ou un mélange solvant dans lequel à la fois le 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1- phénazinol et le sel cuivrique sont plus solubles que le complexe formé par leur réaction. On conduit cette réaction à la température ambiante ou bien à des températures supérieures pour faciliter la dissolution des réactifs et diminuer la quantité assez importante de solvant nécessaire. Dans le complexe cuivrique préparé par le procédé à solvant organique, 90 96 des particules ont une dimension inférieure à 10 microns et habituellement inférieure à 5 microns, les 10 96 restant ayant une dimension inférieure à 20 microns. Cependant, au repos, les particules ont une forte tendance à former des aggrégats dont les dimensions vont de 400 à 600 microns. Pour réaliser une surface spécifique plus importante et assurer une solubilité suffisante de façon à atteindre un degré efficace d'activité physiologique dans diverses préparations pharmaceutiques, le complexe cuivrique de 5,10-dioxyde de 6méthoxy-1-phénazinol doit présenter une distribution particulaire initiale de 5-20 microns. Cependant, du fait que la matière est sensible à la chaleur, au choc et à l'électricité statique, les moyens classiques de désaggrégation, par exemple le broyage par projection ou l'usure, sont trop dangereux. Le procédé précédent de préparation du complexe cuivrique de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol (désigné ciaprès par abréviation "myxine de cuivre" présente, comme il a été signalé, plusieurs inconvénients sérieux. En premier lieu, en raison de la faible solubilité de la myxine dans les solvants organiques, il est nécessaire de disposer d'un grand volume de solvant pour la formation du complexe. Le solvant préféré, l'acétonitrile, est inflammable et son application conjointement avec la myxine de cuivre est dangereuse. En outre la myxine ellemême est très inflammable et sensible aux décharges électrostatiques. En second lieu, le produit initial de myxine de cuivre est une suspension très fine qui rend à la fois la filtration et les lavages difficiles et fastidieux.De plus, les particules de myxine de cuivre, comme il est signalé précédemment, ont une forte tendance à former au repos des agrégats de 400 à 600 microns, ce qui affaiblit leurs propriétés chimiothérapeutiques. Comme cette matière est dix fois plus sensible à l'explosion par choc que le trinitrotoluène, les opérations de broyage sont des processus très dangereux. L'un des buts de la présente invention est donc de fournir un procédé de préparation de myxine de cuivre qui surmonte les lacunes et évite les dangers du processus antérieur. La présente invention concerne l'utilisation de l'eau comme milieu réactionnel dans un procédé perfectionné de préparation de myxine de cuivre. La Demanderesse a découvert que la réaction dans l'eau de la myxine et du sel cuivrique peut s'effectuer jusqu'à achèvement avec formation d'une suspension so lide. Cela offre un procédé sûr, rapide de préparation de myxine de cuivre avec un rendement élevé comme solide cristallin à écoulement libre qui ne s'aCglomère pas au repos. Le produit résultant est plus pur que le produit analogue préparé en utilisant des solvants organiques et, selon des études analytiques, présente une stabilité thermique d'au moins 10 96 supérieure. La présente invention concerne donc un procédé de fabrication du complexe cuivrique du 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1phénazinol qui comporte la réaction de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy1-phénazinol avec un sel cuivrique hydrosoluble, dans un système aqueux. Chimiquement, le cuivre peut exister sous forme ionisée selon deux états : l'état réduit, c'est-à-dire cuivreux ou cuivre I, avec une valence +1, et l'état oxydé, c'est-à-dire cuivrique ou cuivre II, dont la valence est +2. Comme la myxine est peu soluble dans l'eau, on ajoute les cristaux de myxine à l'eau et on les met en suspension par agitation. Une certaine quantité de myxine passe en solution, comme le montre la coloration rosée qui apparat dans l'eau. Alors que la concentration de la myxine n'est pas un facteur critique par lui-même, son facteur limitatif est l'augmentation résultante de la viscosité jusqu'à un taux élevé inacceptable pour une concentration de 100 g par litre ou plus. La gamme de concentration préférée est de 8 à 20 g de myxine par litre d'eau. Dans ce procédé, on peut utiliser un sel cuivrique quelconque soluble dans l'eau. Toutefois, puisque lors de la formation d'un complexe métallique de myxine de cuivre, il se forme également l'acide correspondant au fragment anionique des sels cuivriques, et puisque le complexe métallique de myxine de cuivre est moins stable dans les conditions de forte acidité, il est préférable d'utiliser un sel cuivrique d'acide faible. Des exemples comprennent les sels d'un acide quelconque dont le pKa est d'environ 4,2 ou supérieur. Des exemples d'acides en sont les acides alcanoiques inférieurs, par exemple acétique, propionique, etc., l'acide benzoïque et analogues. Un sel cuivrique préféré est l'acétate cuivrique monohydraté. On charge de préférence le sel dans l'eau sous la forme solide. Bien qu'il ne soit pas nécessaire d'avoir une gamme particulière de concentration, cette concentration doit être telle qu'elle fournisse environ des quantités équimolaires ou, de préférence un excès de sel cuivrique. La proportion molaire entre la myxine et le sel cuivrique doit être environ équimolaire et, de préférence, avec un léger excès du sel cuivrique, par exemple 0,75 mole de myxine pour 1,25 mole du sel cuivrique, pour assurer la réaction complète de la totalité de la myxine présente dans la suspension aqueuse. La température et la durée de la réaction ne constituent pas des facteurs critiques. La température peut être comprise entre la température ambiante (20-25 C) et 90-95 C et son choix est basé sur d'autres considérations comme la solubilité du sel et la durée de la réaction. On note l'achèvement de la réaction à l'apparition d'une suspension noir-verdâtre du complexe cuivrique de la myxine et l'absence totale d'une quelconque tache rouge de myxine. Suivant une forme préférée de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on fait réagir le 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol avec un sel cuivrique hydrosoluble, à 75-800C pendant 2 heures, on sépare le produit de l'eau par filtration et on sèche le produit obtenu sous pression réduite à 50-600C. La myxine de cuivre présente un degré élevé et un large spectre d'activité anti-microbienne à l'égard des infections topiques in vitro et in vivo. En particulier, la myxine de cuivre démontre un degré d'activité élevé vis-à-vis d'une grande variété de bactéries à réaction de Gram à la fois positive et négative, de champignons, de protozoaires et de vers. Ce large spectre d'activité anti-microbienne s'est manifesté par l'efficacité de la myxine de cuivre comme agent chimio-thérapeutique pour lutter contre des infections topiques. L'activité anti-microbienne de la myxine de cuivre, préparée conformément au procédé de l'invention, est établie in vivo à l'égard d'une souche représentative de bactérie et in vitro à l'égard d'infections dues à une levure et à un champignon. Le tableau suivant indique l'efficacité anti-microbienne Activité anti-microbienne de myxine de cuivre préparée dans l'eau Organisme In vivo DE50 en mcg/ml S. agalactiae 4 In vitro Concentration minimale inhibitrice en mcg/ml Statique -cide C. albicans 12 12 M. canis 0,8 24 L'exemple unique suivant illustre la présente invention. EXEllPLE A 4 litres d'eau chauffés au préalable à 500C, on ajoute 50 g de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol et 50 g d'acétate cuivrique monohydraté. On chauffe la suspension à 800C en agitant et on conserve pendant 2 heures à 75-80 C. On arrête le chauffage mais on maintient l'agitation jusqu'à ce que la température réactionnelle tombe à 350 C. On filtre le produit, on lave avec de l'eau (3 x 100 ml), puis à l'acétone (3 x 100 ml) et finalement avec "Skelly B" (1 x 500 ml), solvant du pétrole constitué essentiellement de n-hexane et dont le point d'ébul- lition est de 60-680C. Le produit, après séchage pendant une heure à 500C sous 0,1 mm et refroidissement à la température ambiante, passe à travers un tamis à mailles d'acier de 0,84 mm d'ouverture. on poursuit le séchage pendant 24 heures à 600C et sous une pression de 0,1 mm. Le produit est une poudre cristalline noirverdâtre, rendement 55 g (98 96 par rapport à la myxine) titrant 99,9 96 de myxine de cuivre. La gamme de répartition dimensionnellf peut évidemment être modifiée en se basant sur des facteurs comme la vitesse d'agitation et la température réactionnelle. La gamme peut aller de 5 à 50 microns, avec une préférence pour 15-40 microns. La myxine de cuivre préparée en utilisant l'eau comme milieu réactionnel se caractérise comme suit a) elle n'est pas hydratée; b) la température de décomposition est de 252,40C (basée sur les exothermes d'un calorimètre à balayage différentiel); c) H, décomposition, cal/gramme = 220,6 d) bandes révélatrices d'absorption du spectre infrarouge : 1365 cm (dans le "Fluorolube") ; 1059, 776, 578 cm (dans le "Nujol"). "Bluorolube" est une marque déposée de Rooter Chemical pour un polymère de chlorure de trifluorovinyle, "Nuåol" est une marque déposée de Plough pour un pétrolatum liquide. On analyse par spectroscopie d'émission électronique induite (EEI), un échantillon de myxine de cuivre préparé comme ilest décrit ci-dessus en utilisant l'eau comme milieu réactionnel, et un échantillon préparé conformément au procédé avec solvant organique utilisant l'acétonitrile. La position de la bande en EEI (en électrons-volts) pour un atome de carbone, d'oxygène, d'azote et de cuivre dans la molécule dépend de l'environnement chimique de l'atome. Donc la spectroscopie EEI est une mesure de la structure chimique. Puisque les spectres des atomes dans les deux échantillons sont superposables, aux erreurs expérimentales près, les atomes doivent être dans le même environnement chimique. Donc, les échantillons ont la même structure chimique. On a déterminé les efficacités chimio-thérapeutiques par comparaison des résultats d'études de diffusion sur gélose de formules de crème et d'onguent contenant 0,5 96 de myxine de cuivre préparée respectivement dans l'acétonitrile et dans l'eau. La formule de l'onguent est la suivante Composants grammes/100 grammes Myxine de cuivre 0,51 "Cosmetic Liquid 687 Ligot" 7,00 "Petrolatum (Ultima White)" du Codex 92,49 La formule de la crème est composée de Composants 96 en poids Alcool stéarylique 12,5 "Petrolatum Perfecta" 10,0 "Myrj 52" 4,0 Propylène glycol 12,0 Eau 61,5 "Cosmetic Liouid 687 Light" est un hydrocarbure saturé en C1 En utilisant comme organisme d'expérience Staphylococcus aureus 209, la myxine de cuivre préparée à partir d'acétonitrile produit de plus larges zones d'inhibition dans l'expérience de diffusion sur gélose que la myxine de cuivre préparée dans l'eau. Ces résultats montrent une dissolution plus lente et un taux de diffusion plus faible pour la myxine de cuivre préparée dans l'eau, ce qui est le signe d'une structure cristalline plus stable. Une quelconque différence d'activité est attribuée à des différences de forme cristalline puisque, comme déterminées ci-dessus par spectroscopie d'émission électronique induite, les matières ont les mêmes structures chimiques. Ce dégagement d'activité plus lent est utile dans des situations dans lesquelles l'irritation est un problème, par exemple dans le cas de la mammite bovine. - REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication de complexe cuivrique de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol, caractérisé en ce qu'on fait réagir dans un système aqueux le 5,10-dioxyde de 6-méthoxy1~phénazinol avec un sel cuivrique hydrosoluble. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on le conduit à une température comprise entre la valeur ambiante et 90-95 C. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise moins de 100 g de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol par litre d'eau. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise de 8 à 20 g de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1phénazinol par litre d'eau. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise des quantités environ équimolaires jusqu'à un léger excès de sel cuivrique par rapport au 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1 -phénazinol. 6 - Procédé selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce que le sel cuivrique hydrosoluble est l'acétate cuivrique monohydraté. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir le 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol avec un sel cuivrique hydrosoluble, à 75-800C pendant 2 heures, on sépare le produit de l'eau par filtration et on sèche le produit obtenu sous pression réduite à 50-60 C. 8 - Procédé de fabrication de préparations qui présentent une activité antimicrobienne, caractérisé en ce qu'on mélange le complexe cuivrique de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1phénazinol préparé conformément à l'une des revendications 1 à 7, comme substance active, avec des véhicules solides ou liquides, non toxiques, inertes, thérapeutiquement compatibles, couramment utilisés dans ces préparations, et/ou des excipients. 9 - Compositions présentant une activité anti-microbienne, caractérisées en ce qu'elles contiennent un complexe cuivrique de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy-1-phénazinol, préparées conformément à un procédé selon la revendication 8, et un véhicule. 10 - Complexe cuivrique de 5,10-dioxyde de 6-méthoxy1-phénazinol, caractérisé en ce qu'il est préparé conformément à un procédé selon l'une des revendications 1 à 6.