Brevet FR2134531A1 — publié le 19721208

La présente invention a pour objet un procédé pour la réalisation d'analyses dans le domaine de la chimie organique ainsi que des appareils pour la mise en oeuvre de ce procédé. On connaît la haute activité spécifique des enzymes : ils peuvent 5 par suite être utilisés avantageusement dans le domaine analytique. Au cours de ces dernières années, les enzymes ont été utilisés de plus en plus dans des buts analytiques, et aujourd'hui personne ne peut douter de leur utilité dans le domaine des analyses chimiques. Les raisons en sont bien connues : les enzymes sont des réactifs hautement spécifiques permettant 10 le dosage d'une substance sans nécessiter des procédés de séparation longs et fastidieux quand la substance est mélangée à d'autres similaires à la première du point de vue chimique ; les enzymes permettent de mettre en oeuvre les réactions dans des conditions physico-chimiques douces, par conséquent sans qu'il se produise de transformation secondaire des substances, même si 15 elles sont très réactives ; de plus, les réactions catalysées par les enzymes sont très rapides comparativement à celles catalysées par les catalyseurs chimiques habituels. Dans un premier temps, on a utilisé les enzymes, avant tout pour les . analyses bio-médicales, du fait des fonctions biologiques des substrats natu-20 rels d'enzymes ; ensuite leur utilisation a été étendue à d'autres domaines, comme l'industrie pharmaceutique, l'analyse des aliments, l'industrie agraire, le contrôle de la production industrielle, etc ... En dépit des avantages sus mentionnés, l'emploi des enzymes dans les domaines analytiques est toujours limité à quelques cas dans lesquels les 25 enzymes utilisés sont facilement disponibles et de faible coût. En fait, une analyse de routine nécessite de très grandes quantités d'enzyme, qui dans certains cas ne sont pas disponibles, et ces quantités sont souvent obtenues à un prix inacceptable. De plus-, les enzymes, qui doivent être utilisés dans des buts analytiques doivent être de grande pureté afin 30 d'être très spécifiques, et ceci accroît d'autant leur coût. De plus, la tendance est aujourd'hui à l'automatisation des analyses de routine et un analyseur automatique nécessite des quantités élevées de réactifs. On a maintenant découvert, ce qui est un objet de la présente invention, un procédé basé sur 1'emploi de structures particulières obtenues en rendant 35 les enzymes insolubles et qui peut être appliqué à n'importe quel enzyme. 72 14800 2 2134531 mr Le procédé ci-dessus permet la préparation de réactifs enzymatiques insolubles, qui peuvent ensuite être récupérés et utilisés à plusieurs reprises . Le procédé selon l'invention fournit un enzyme ou des composés enzy-matiques sous la forme d'un réactif insoluble, qui est stable, reproductible et utilisable de manière facile et simple. En fait, selon le procédé ci-dessus mentionné, on prévoit des zones réactionnelles dans lesquelles on place des filaments enrobant des réactifs enzymatiques qui possèdent des caractéristiques remarquables de solidité et de régularité ; ces zones réactionnelles peuvent être facilement réalisées, les filaments étant obtenus de n'importe quelle manière ; par suite, ils peuvent être facilement utilisés dans de petites colonnes de verre ayant une forme en Y, qui peuvent être insérées dans un circuit d'auto analyseur et ne risquent pas de se boucher. Un avantage décisif de la méthode ci-dessus, par rapport aux autres méthodes possibles pour rendre les enzymes insolubles également par liaison covalente entre 1'enzyme et les matériaux servant de support, consiste dans le fait que, selon l'invention, il est toujours possible de choisir un matériau fibreux capable d'éviter l'attaque microbienne du support, qui pourrait détruire toute activité enzymatique. L'enzyme, placé dans le filament, peut être utilisé comme un enzyme soluble : il peut être utilisé, soit pour doser la concentration d'une substance qui est un support d'enzyme, soit pour doser un inhibiteur réversible qui temporairement rend l'enzyme inactif, soit pour doser un activateur qui accroît l'activité enzymatique. Les enzymes ou composés enzymatiques mentionnés ci-dessus, enrobés dans des filaments, sont particulièrement utiles dans l'automatisation des analyses, avant tout des analyses séquentielles'multiples. Dans certains cas, à savoir quand les composés obtenus par des modifications enzymatiques peuvent être dosés facilement et de manière univoque par des méthodes physico-chimiques , on peut construire un analyseur qui fonctionne pratiquement sans réactif (par exemple, dans le dopage de l'acide urique au moyen d'uricase enrobé dans un filament, il suffit de déterminer la différence de densité optique à 293 entre une fraction d'un échantillon de référence, qui n'est pas mis en contact avec la fibre enzymatique et une fraction de l'échantillon qui traverse la fibre). 72 14800 3 2134531 Un autre avantage du procédé selon l'invention réside dans le fait que l'activité enzymatique s'arrête quand la solution sort de la colonne contenant le réactif enzymatique insoluble : par suite il n'est pas nécessaire d'ajouter des composés dénaturants pour arrêter ou détruire l'enzyme comme cela 5 se produit quand celui-ci se trouve à l'état soluble. De plus, selon la méthode ci-dessus, il est plus facile d'utiliser différents enzymes de manière à catalyser des réactions ultérieures, les enzymes étant incorporés dans le même polymère ou dans des polymères différents. Par exemple, lorsqu'on étudie des composés d'hydrolyse enzymatique 10 qui donnent lieu à la "formation de glucose, on peut construire un appareil automatique dont le circuit comprend une colonne interchangeable contenant le filament enrobant l'enzyme hydrolytique approprié ( -galactosidase pour la lactose, invertase pour la saccharose, glucoamylase pour la maltose, naringi-nase pour la naringine, etc ...) ; la colonne ci-dessus est suivie d'une colon-15 ne dans laquelle on place un filament enrobant une glucose-oxydase ou un pero-xydase. Les structures filamenteuses utilisables et la méthode d'enrobage de l'enzyme sont celles décrites dans le brevet italien n° 836 462, selon lequel les fibres enrobant l'enzyme peuvent être préparées à partir de solutions de 20 polymères capables de donner des fibres dans lesquelles on disperse des composés enzymatiques sous la forme de petites gouttelettes de l'ordre de grandeur de celles des émulsions. L'émulsion ainsi obtenue peut être filée à l'état humide ou sec pour donner lieu à la formation de fibres présentant, à l'intérieur, de très petites 25 cavités dans lesquelles se placent les enzymes qui sont séparés du milieu environnant par line très fine membrane. Cette membrane empêche la rupture de l'enzyme ou sa disparition dans la masse réactionnelle ; de toute manière elle permet à l'enzyme d'exercer son action catalytique. Parmi les polymères qui peuvent enrober les enzymes, on peut mentionner le nitrate, les polymères cel-30 lulosiques estérifiés et éthérifiés, les polyoléfines, les terpolymères et copolymères obtenus à partir d'acrylonitrile, d'acrylates, méthacrylates, esters vinyliques, chlorure de vinyle, chlorure de vinylidène, styrène et de plus les polyamides, le butyral de polyvinyle, etc ... Si l'on utilise des enzymes du commerce, on peut les purifier davantage de manière à éliminer les 35 interférences d'impuretés éventuelles indésirables. 72 148GÔ 2134531 Généralement les enzymes voulus sont préparés et purifiés selon des méthodes connues utilisées dans le domaine enzymatique par le choix de la source la plus appropriée. Le coût de la purification, bien qu'il soit élevé, n'influence pas 5 notablement les coûts de l'analyse, du fait de l'efficacité de la méthode d'enrobage et de la durée qui en résulte de l'activité du filament. Un domaine dans lequel l'application analytique des enzymes selon la présente invention est remarquable, est celui des analyses bio-médicales dont la diffusion et l'importance dans des buts de diagnostic s'accroissent conti-10 nuellement. Pour ces applications particulières, il est nécessaire de disposer de méthodes simples et t-rès bon marché. En utilisant les composés enzymatiques ci-dessus mentionnés, on peut réaliser cet objectif même au moyen d'appareils de laboratoire.très modestes. Les;exemples suivants permettent d'illustrer l'invention, sans toute-15 fois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Dosage de glucose. Dans un réacteur on dissout sous agitation 10 g de triacétate de cellulose (Fluka), dans 101 g de chlorure de méthylène. 20 Séparément, on prépare la solution enzymatique : on dissout 25 mg d'oxydase de glucose (Bochringer, degré de pureté I, cat. N° 15423 EGAB) et 5 mg de peroxydase (Bochringer, degré de pureté I, cat. N° 15301 EPAA) dans _2 15 ml d'un tampon de glycérol-phosphate (pH = 7,0 - 0,1 M) + EDTA (10 M) mélange (20 : 80 volume/volume). 25 On ajoute la solution enzymatique à la solution de polymère et l'é- mulsion des deux phases s'obtient par forte agitation pendant 30' à 0°C. On verse l'émulsion dans un petit creuset maintenu à -6°C et on la file sous pression d'azote. Le filament est coagulé dans le toluène à la température ambiante et est récupéré sur une bobine. Il est séché sous vide à 0°C pendant 30 quelques heures pour éliminer le toluène. i La fibre ainsi obtenue, maintenue dans un tampon de phosphate (pH = 7,0 - 0,1 M)à 4°C, a conservé inchangée son activité initiale au bout de 3 mois. Un échantillon de la même fibre a été placé dans une colonne thermosta-tisée à 37°C (0 = 5 mm, h = 330 mm) : la quantité de fibre est d'environ 35 0,35 g/ml. 72 14800 2134531 La fibre a été lavée au moyen d'un courant d'eau déionisée à 30 ml/h jusqu'à rendre négligeable sa conductibilité électrique. On a utilisé la méthode de Trinder (J. Clin. Pathol. 22, 1969, 158-161) du fait que la matière colorante utilisée, à Ravoir l'adrénaline, n'était 5 pas conservée par la fibre, tant sous forme oxydée que sous forme réduite. On a fait passer dans la colonne des échantillons et modèles avec un débit de 4 ml/h, en maintenant un pH de 5,6 au moyen d'un tampon d'acétate (0,3 M). La concentration d'adrénaline s'est accrue de 0,07 à 0,21 % en la dissolvant dans de l'HCl à 0,1 N. En utilisant les conditions sus-mentionnées 10 on a obtenu des résultats identiques à ceux de l'essai effectué avec un enzyme libre (voir figure 1) où on porte en abcisses des yM g de glucose ( h——t = 25) et en ordonnées les ext/inctions à 500 m —t = 0,1). Au moyen de cette petite colonne, en utilisant toujours la même fibre enzymatique, on a réalisé 200 dosages d'ingrédients dont 120 sur des fluides biologiques. 15 EXEMPLE 2 Dosage de lactose. En travaillant dans les conditions de l'exemple 1 on prépare un filament enrobant 250 unités de levure - galactosidase par g de fibre (1 unité représente la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 M de 0NP6 par minute à 20 25°C). On prépare une colonne contenant un échantillon de fibre, toujours analogue à celui de l'exemple 1. On fait passer des solutions types de lactose etiéchantillons, convenablement dilués dans du lait, additionnées d'adrénaline et maintenues à un pH 25 de 6,0, dans une première colonne contenant de la f?- galactosidase enrobée et dans une seconde contenant un oxydase et péroxydase de glucose enrobé A la sortie de la dernière colonne, le liquide est coloré et passe dans la cellule d'écoulement continu d'un colorimètre mesurant le O.D. à 500 mJA . Le passage des échantillons est alterné avec le lavage au moyen d'un -3 ++ -3 30 tampon de phosphate (0,01 M , pH = 6) contenant 10 M Mg et 10 M EDTA. En utilisant le système ci-dessus on a réalisé plusieurs analyses de lactose au cours d'un mois, afin d'obtenir des valeurs reproductibles. Un système analogue a été essayé pour l'analyse de la saccharose et de la maltose en utilisant l'enzyme hydrolytique approprié. 72 14800 2134531 EXEMPLE 3 On prépare un filage d'uricase (Bochringer cat. 15074 ELAC) enrobant 0,4 mg d'enzyme par gramme de polymère. On introduit un échantillon de la fibre ci-dessus dans une petite colonne de verre ; la solution à analyser 5 passe à travers la fibre et l'acide urique est oxydé en allantoïne. On déter mine l'extinction de la solution à 293 mJ{ avant et après son contact avec l'enzyme. La différence est proportionnelle à la quantité d'acide urique. Un échantillon analogue de fibre enzymatique a été utilisé pendant 10 3 semaines environ, l'activité décroissant d'environ 25.% par rapport à l'activité initiale. EXEMPLE 4 Dosage de lactate." En procédant comme à l'exemple 1, on réalise le filage d'une déhydro 15 génase lactique (Bochringer cat. 15371 ELAC) dissoute dans un tampon de phos -2 -2 phate (pH = 7,0) contenant 10 M EDTA et 4 x 10 M éthyl mercaptan. La fibre renfermait 1 mg d'enzyme par gramme et a été utilisée dans une colonne avec un débit de 2 ml/h. On a déterminé l'extinction à 340 mM du NAD réduit qui s'est formé au cours de la réaction. 20 Au bout de deux semaines l'activité est toujours restée bonne et constante. EXEMPLE 5 Dosage de l'urée. En travaillant dans les conditions de l'exemple 1, on réalise un 25 filage d'uréase (Serva) enrobant 100 mg d'enzyme par gramme de fibre. La fibre enzymatique est utiliséedansune colonne ; dans l'effluent on dose l'ammoniac par la méthode phénol-hypochlorite (M.W. Weatherburu, Anal. Chem. Vol. 39, N° 8, 971 (1957) ). La fibre a donné des résultats reproductibles et stables pendant 3 semaines d'utilisation. La droite type est représentée 30 à la figure 2, où sont portés en abscisse les d'urée (i—^—i = 2) et en ordonnée l'extinction à 550 m/{ ( f—^—I = 0,1) 72 14800 7 2134531 EXEMPLE 6 Dosage de L-arginine. En travaillant conformément à l'exemple 1, on réalise le filage d'une arginase(Schuchardt cat. AR 094) enrobant 50 mg d'enzyme par gramme de fibre. 5 En utilisant une partie de la fibre ci-dessus et un échantillon de fibre enrobant l'uréase tel que décrite à l'exemple 5, on a pu réaliser une méthode semi-automatique de dosage de L-arginine. Les échantillons qui ont été analysés, après être passés à travers la première colonne contenant l'arginase dans laquelle l'argine est séparée 10 en ornithine et urée, sont envoyés dans la seconde colonne contenant de l'uréase dans laquelle l'urée est décomposée en ammoniac et dioxyde de carbone. On dose l'ammoniac de l'effluent selon l'exemple précédent. EXEMPLE 7 Dosage de L-sérine. 15 En opérant conformément à l'exemple 1, on réalise un filage de tryp- tophan-synthétase obtenu par extraction et purification de cellules de E. Coli. La fibre enrobe 2070 unités d'enzyme par gramme (1 unité est constituée par la quantité d'enzyme produisant 0,1 /K M de L-tryptophan en 30' à 37°C). Une partie de cette fibre est utilisée dans la colonne à travers laquelle passent 20 les échantillons et les modèles contenant la L-sérine. Ces solutions sont additionnées de : 2 mg/ml d'indole, de tampon de phosphate au pH = 7,8 , de 2/\g/ml de phosphate de pyridoxal et de 40.-t(g/ml de glutathione réduite. Le L-tryptophane produit est dosé dans l'effluent en utilisant la 25 méthode de Spies et Chambers (Anal. Chem. 21, 1249 (1949) ) : la quantité de tryptophane est proportionnelle à la L-sérine présente. EXEMPLE 8 Dosage de 20-chétostéroïdes. En utilisant une méthode analogue à celle de l'exemple 1, on prépare 30 un filage de déhydrogénase 20 /^)-hydroxystéroïde (Bochringer cat. 15339 ENAI). La fibre enrobe 1 mg d'enzyme par gramme. Elle est utilisée en colonne de manière à doser la cortisone en mesurant la disparition de NADH à 340 m M . La fibre est utilisée pour plusieurs dosages, et la réponse est légèrement inférieure à celle obtenue en utilisant un enzyme dissous ; cependant elle 35 est proportionnelle à la concentration en cortisone. 72 14800 2134531 REVENDICATIONS 1. Procédé pour effectuer des analyses dans le domaine de la chimie organique en utilisant des enzymes pour synthétiser ou décomposer le produit à analyser en un ou plusieurs composés qui sont dosés par les méthodes physiques, chimiques ou physico-chimiques habituelles, caractérisé en ce que le produit à analyser, tel quel ou en mélange, est envoyé dans au moins une zor.e réactionnelle où il est soumis à l'action d'enzymes incorporés dans des fibres constituées d'un matériau polymérique et en ce que les produits obtenus sont soumis à un dosage quantitatif. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone réactionnelle contient des enzymes enrobés dans des fibres aptes à décomposer le composé à analyser. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé à analyser traverse une ou plusieurs zones successives contenant un ou plusieurs enzymes, identiques ou différents, aptes à décomposer progressivement les composés de chaque zone précédente en des composés plus simples, l'un au moins des composés de décomposition étant ensuite dosé quantitativement. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit à analyser ou un mélange le contenant est envoyé dans plusieurs zones réactionnelles où il est soumis à des actions de scission et/ ou de synthèse au moyen d'enzymes particuliers enrobés dans des fibres constituées en matériau synthétique ou artificiel. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on choisit l'enzyme dans la classe-constituée par la glucose-oxydase, laP -galactoxydase, l'uricase, la déhydrogénase lactique, l'uréase, l'arginase, la J3 -hydroxystéroïde-déhydrogénase et en ce que la fibre est constituée en matériaux polymériques choisis parmi les nitrates, les polymères cellulosiques estéprifiés ou éthérifiés, les polyoléfines, les polymères et copolymères obtenus à partir d'acrylonitrile, acrylates, méthacryla-tes, esters de vinyle, chlorure de vinyle, chlorure de vinylidène, styrène, polyamides et butyral de polyvinyle. 72 1480Û 9 2134531 6. Appareils utilisables pour l'analyse des composés organiques ou pour le contrôle des procédés par un dosage analytique des composés organique caractérisés en ce qu'ils comprennent des zones de réaction pourvues d'enzyme enrobées dans des fibres constituées de matériaux polymériaues synthétiques ou artificiels.