Brevet FR2085693A1 — publié le 19711231

Cette invention concerne une substance hormonale ayant la propriété d'abaisser la sérocalcémie chez les mammifères. Plus particulièrement, l'invention concerne une substance hormonale ayant la propriété d'abaisser la sérocalcémie chez les mammifères, substance hormonale qui est isolée par extraction d'une glande endocrine de l'anguille Anguilla japonica, ainsi qu'un procédé d'extraction de cette substance. On sait déjà que les glandes thyroïde et parathyroîdes des mammifères jouent un rôle important dans le métabolisme du calcium. P.F. Hirdch et al ont signalé dans "Endocrinology", 73,244 (1963) que la thyrocalcitonine, en tant qu'hormone abaissant la sérocalcémie des mammifères, a été extraite de la glande thyroïde de rat. I1 a été également confirmé que la thyrocalci tonine - est présente dans les glandes thyroïdes de mammifères tels que chiens, singes, porcs et vaches, et chez l'homme. Récemment, on a trouvé des substances polypeptidiques analogues à la thyrocalcitonine dans d'autres organes que Ira glande thyroïde c'est-à-dire dans un tissu appelé corps ultimobranchial, chez les oiseaux, les poissons et les amphibiens. Ces substances sont utilisées cliniquement dans le traitement de llostéopétrose et des maladies gérontologiques. Sur la base du fait que tous les tissus sécréteurs dans lesquels ces substances sont présentes, se sont révélés étre positifs au. Bleu de Toluidine (ils sont colorés en violet rougeatre), les présents inventeurs ont trouvé qu'il existe un tissu positif au Bleu de Toluidine dans la paroi du vaisseau sanguin représenté par la veine cave qui longe l'oesophage de l'anguille dans la direction du coeur tout en étant fixé à la paroi de 1'oesophage. On a fait une administration d'un extrait du tissu à des rats, à la suite de laquelle on a observé une diminution de la sérocalcmie. En outre, les présents inventeurs ont trouvé qu'un tissu sécréteur, dans lequel est présente la même substance efficace péricardique que précédemment, existe dans une membrane/de coeur d'anguille. Cependant, l'existence de ce tissu sécréteur dans cet endocarde, n'a pas été confirmeelorsque les recherches ont été effectuées sur ce sujet selon la méthode de coloration au Bleu de Toluidine. Autant qu'on le sache il n'a pas été signalé de cas parallèle où I'existence de tissus sécréteurs,dans lesquels cette substance péricardiques efficace soit présente, ait été signalée dans les membranes / de coeurs d'oiseaux, de-poissons ou d'amphibiens, On a déterminé, pour obtenir les résultats représentés dans le Tableau 1, la sérocalcémie et les activités de l'hormone réductrice de la sérocalcémie par unité de tissu sécréteur d'anguilles sexuellement adultes descendant à 1a mer pour le frai et de jeunes aiguilles non encore parvenues au stade du frai, que l'on a capturées en Novembre dans la Tone River.Il ressort des résultats obtenus que les anguilles adultes présentent toutes, comparativement aux jeunes anguilles, des valeurs faibles à -la fois pour la sérocalcémie et pour l'activité Tableau 1 No. Poids Sérocalcémie Activité (g) (mg/dl) (MRO Glande Anguille 1 115 13,3 3 4,3 jeune 2 159 13,0 3,1 3 140 14,2 5,6 Anguille b 192 11,4 1,5 adulte 5 200 12,4 0,9 6 205 12,8 2,8 Sur la base des résultats précédents, les présents inventeurs ont découvert que la teneur en hormone dans le tissu sécréteur de l'anguille est temporairement accrue à un certain stade du développement dans le cas où l'anguille est élevée dans lteau de mer ou dans une solution aqueuse de sel commun de composition similaire, et que l'on peut récupérer une hormone réductrice de la sérocalcémie dont l'activité par unité de tissu sécréteur est élevée, en utilisant comme matière première d'extraction le tissu sécréteur de l'anguille audit stade de développement. Dans les dessins annexés, la Figure 1 est un graphique représentant la relation qui existe entre la durée de l'élevage (jours)de l'anguille dans l'eau de mer dont la concentration est diluée à la moitié, la sérocalcémie et la pression osmotique du sérum, la Figure 2 est un graphique représentant-la relation qui existe entre la durée de l'é@evage (jours) de l'anguille dans l'eau de mer de concentration diluée à la moitié et l'importance de l'action réductrice de la sérocalcémie par unité du tissu sécréteur; les Figures 3-4 sont des graphiques représentant respectivement les spectres IR (méthode au KBr) et W du présent échantillon (échantillon 199 &gamma;/ml, #maxH2O = 277 m E1cm1% = 8,04) ayant 70 MRC u/mg; la Figure 5 est un graphique représentant une substance (70 MRC u/mg) obtenue en la traitant par le Sephadex G-75; et la Figure 6 est un graphique représentant une substance (Z5 MRC u/mg) en la traitant par la carboxyméthylcellulose (CM cellulose). La Figure 7 est un graphique représentant une substance obtenue en traitant ultérieurement la substance obtenue de la Figure 5 par la CM cellulose. Les substances obtenues selon la présente invention sont des polypeptides très analogues à la thyrocalcitonine tant que ce sont celles qui sont capables d'abaisser la teneur en calcium des sérums des mammifères. Les présentes substances sont obtenues sous la forme d'une poudre blanche, et elles ont les propriétés physicochimiques exposées ci-après. (1) Solubilité dans les solvants Soluble dans liteau mais insoluble dans divers solvants organiques. (2) Aptitude à la dialyse, filtration limitative à laide de filtres à membrane (produits de Nihon Shinku Gijutsu K.K.) Capable de traverser le G 10 T (une substance ayant un poids moléculaire de 10000 ou moins peut le traverser). Incapable de traverser le G 10 H (une substance ayant un poids moléculaire de 1000 au moins peut le traverser. (3) Poids moléculaire 3000 - 4500 Méthode de détermination Onprend la sérumalbumine de vache (poids moléculaire 6700) et la Basitracine (poids moléculaire : 1423) comme substances de référence. Les poids moléculaires des présentes substances sont calculés à partir des proportions relatives, aux positions d'élution, des présentes substances efficaces et des substances de référence, telles qu'on les obtient respectivément en effectuant des filtrations de leur gel avec Sephadex G-75, G-50 et G-25. (4) Réactions colorées Positives à la réaction à la ninhydrine,à la réaction de Sakaguôhi, à la réaction diazo et à la réaction de Crieg-Liebig. (5) Précipitant Précipitables par addition de précipitants de protéine comme l'acide trichloroacétique et l'acide perchlorique. (6) Désactivées par l'action d'enzymes protéolytiques telles que nagase et chimotrypsine. conditions de désactivation Mise à réagir avec l'enzyme à raison de 1/50 (en poids) de la présente substance dans une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH = 6,8) à 370 C pendant 2 heures. (7) Composition en amino-acides Amino-acides jirnole Amino-acides Zmole lysine 0,0636 alanine 0,0760 histidine 0,0041 cystéine NH3 0,0816 valine 0,0807 acide alginique 0,0256 méthionine acide aspartique 0,0638 isoleucine 0,0312 thréonine 0,0229 leucine 0,0691 sérine 0,0384 tyrosine 0,0052 acide glutamique 0,0792 phénylalanine 0,0192 proline 0,0207 glycine 0,0846 (8)Les valeurs de développement des présents produits déterminées dans l'électrophorèse à disque (les produits sont ceux obtenus dans 1'Exemple 7 qui sera mentionné ci-après) sont les suivantes :: Echantillon A (100 &gamma;) B (50 &gamma;) C (150 &gamma;) D (150 &gamma;) E (150 &gamma;) Conditions de phorèse 3mA, 60 min. 8mA,435 min. 6mA, 80 min. 6mA, 40 min. 6mA, 40 min. Gel Gel de référen- Gel acide Gel acide Gel acide Gel acide ce (pH 8,9-9,0) comprenant comprenant comprenant comprenant de l'urée 6M de l'urée 6M de l'urée 6M de l'urée 6M (pH 4,4) (pH 4,4) (pH 4,4) (pH 4,4) Solution de Solution Solution Solution Solution Solution développement tampon de tampon tampon de tampon de tampon de tris-glycine d'acétate ss-alanine et ss-alanine et ss-alanine et (pH 8,6) de sodium d'acide d'acide d'acide (pH 4,7) acétique acétique acétique (pH 5,0) (pH 5,0) (pH 5,0) Couleur Rouge Noir Rouge Rouge Rouge Ponceaux Amido Ponceaux Ponceaux Ponceaux valeur de 0 (origine) Rv.M. = RV.M. = RV.M. = RV.M. = développement 0,4-0,45 0,5 0,5 0,5 V.M. = Vert de méthyle (9) Lorsque l'on administre la présente substance à des animaux d'essai (rats malles), on observe une diminution des valeurs du phosphore et du magnésium, en plus de la diminution de la teneur en calcium du sang. (10) Contenant une liaison bisulfure qui est instable à l'oxydation, ladite liaison bisulfure n'étant pas stable à une base relativement forte. (il) Rotation spécifique : saJ D = -20 C (C = 0,4 %, H20) /échantillon de 123 (12) Chromatographie en couche mince Echantillon (61 MRC U/mg) Solvant de développement : n-butanol : pyridine : eau : acide acétique (15 : 10 : 12 : 3) Porteur : Abisel (Marque commerciale) (Asaki Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha) Réactif de développement : Réactif de Daidon Smith Valeur du développement : Rf = 0,46 - 0,71. Procédé d'extraction de la présente substance 1. Matière première (a) Une portion du vaisseau sanguin veine cave longeant l'oesophage de l'anguille dans la direction du coeur tout en étant fixée à la paroi de l'oesophage. Plus particulièrement, la portion qu'il est préférable de prélever est la portion d'oesophage coupée sur une longueur convenable avant et après le coeur, par exemple, une longueur d'environ 2 cm dans chacune des deux directions par rapport au coeur. Le tissu ainsi prélevé peut etre utilisé soit tel quel soit sous la forme dtun produit dégraissé et séché. On peut préparer le produit,dégraissé et séché, selon un procédé connu utilisé dans le traitement des viscères des animaux. Dans le but d'éliminer des quantités traces d'ions métalliques parmi lesquels l'ion Ca, il est souhaitable, dans ledit traitement, d'utiliser l'acétone contenant de l'acide éthylène diamine tétra-acétique.Par exemple, on déshydrate le tissu d'anguille précité en le plongeant dans l'acétone contenant de 1'EDTA pendant une longue durée et ensuite en le dégraissant par le chloroforme. On plonge de nouveau le produit résultant dans l'acétone pendant une longue durée et ensuite on le sèche à l'air pour obtenir un produit sec. (b) Comme matière première pour l'extraction, on peut utiliser péricardique le coeur ou la membrane/d'anguille, tel quel, en ne le soumettant à aucun traitement ultérieur. Il est préférable d'utiliser celuici sous la forme d'un produit séché, Les modes opératoires d'obtention du produit séché sont les mêmes que ceux mentionnés en (a). Répartition des tissus efficaces dans l'anguille Tissu Poids U/tissu mU/tissu mU/N protéini (mg) (mg) que (&gamma;) (a) Tissu contenant la veine cave attachée à l'oesophage 170,3 1,6 9,4 5,9 (b) Membrane pericardique 107,7 6,6 61,5 26,5 (a) + (b) 239,6 9,6 40,1 38,7 La capacité réductrice de la teneur en calcium d'une substance hormonale réductrice de la sérocalcémie, obtenue à partir d'une anguille, c'est-à-dire une valeur de l'activité de calcitonine obtenue selon la méthode de titrage telle qu'elle est exposée ci-après, a été comparée, en étant exprimée en poids corporel de 1 kg, avec celles roncontré@s dans les ti@@us sécrét@ure d'autres animaux comme il est décrit dans un rapport de D.H. Copp, C.C Parkins : "Parathyroid Hormone and Thyrocalcitonin (Calcitonin)" Amsterdam Excerpta Medica Foundation, 78 (1968). Les résultats obtenus sont ceux représentés dans le Tableau qui suit. On note d'après ledit Tableau que dans le cas de l'anguille, l'activité efficace de la substance hormonale réductrice de la sérocalcémie extraite d'un tissu sécréteur d'anguille est très élevée lorsqu'elle est transformée en une valeur correspondant à 1 kg de poids corporel. Par exemple, on peut voir dans ce Tableau que pour obtenir, selon la présente invention, une substance efficace ayant une activité de calcitonine correspondant à la thyrocalcitonine récupérée dans la glande thyroïde d'un porc, environ 2-4 anguilles suffisent dans ce but. Tissu sécréteur mU/tissu mU/poids corporel (1 kg) Rat Glande thyroïde 100-300 200-800 Porc " 20000-40000 250-500 Chien " 5000-20000 400-800 Volaille Glande ultimobran chiale 200-700 500-800 Dindon " 2200 450-900 Canard sauvage " 4-10 3-9 Grenouille comestible " 0,4 172 Saumon W 1000-1500 100-200 Requin " 500-1000 250-500 Membrane péri- Anguille cardique et tissu 9550 39750 comprenant la veine cave attachée à l'oesophage voisin La détermination de l'activité réductrice de la teneur en calcium d'une substance hormonale réductrice de la sérocalcémie, extraite d'un tissu sécréteur d'anguille, a été effectuée selon une méthode telle que celle mentionnée ci-après. On neutralise par l'hydroxyde de sodium un extrait obtenu en extrayant par l'acide chlorhydrique 0,2 N un tissu constituant un organe sécréteur d'anguille, dans lequel se trouve une substance hormonale réductrice de la sérocalcémie . on dilue l'extrait 2,4,6,8,10 et 20 fois avec une solution d'acétate de sodium 0,1 N et d'albumine à 0,1 %. On fait à chacun des rats males une injection intramusculaire avec 0,5 ml de chacune des dilutions. Après une heure, on tue tous les rats pour recueillir leur sang respectif et on détermine la valeur ee la teneur en calcium du sérum de chaque sang selon la méthode de spectrométrie atomique. D'autre part, on dilue un produit étalon Research Standard (un produit ayant 8 MRC U/mg produit par Armour Pharm.Co.), qui est un extrait obtenu à partir de glande thyroïde de porc, de manière à avoir des dilutions de 30, 60, 90, 150, 180 et 240 mU/O,5-ml, respectivement. On fait à des rats males une injection intramuscu- laire avec 0,5 ml de chacune des dilutions. En suivant le même mode opératoire que précédemment, on détermine la valeur de la teneur en calcium de chaque sang. A partir de l'activité du produit étalon Research Standard correspondant, on détermine l'activité de la substance hormonale réductrice de a sérocalcimic dans l'extrait d'anguille précité. Les anguilles sont élevées de préférence tout d'abord dans l'eau de mer ou dans une solution aqueuse de sel commun de composition similaire. Par exemple, on peut utiliser de l'eau de mer, de l'eau de mer artificielle ou de lteau salée. Généralement, les anguilles sont capables de vivre à la fois dans l'eau de mer et dans l'eau douce. Cependant, les anguilles capturées dans I'eau douce risquent d'étire tuées lorsqu'elles sont laissées directement dans l'eau de mer ou dans des solutions aqueuses dont la concentration en sel commun est sensiblement équivalente à celle de l'eau de mer. C'est pourquoi il est préférable de diluer l'eau de mer ou de régler la concentration en sel commun dans une solution aqueuse de sel commun de manière à ce que les anguilles destinées à y être élevées ne puissent entre tuées.Par conséquent, on peut réaliser convenablement l'élevage d'anguilles dans une solution aqueuse ayant une concentration en sel commun équivalente à environ 1/3 - 2/3 de celle de l'eau de mer. Ainsi, une activité potentielle de calcitonine par le tissu sécréteur est temporairement accrue lorsque les anguilles sont élevées dans l'eau de mer ou dans une solution aqueuse de sel commun de composition similaire. Ainsi, la relation existant entre la durée d'élevage (jours) d'anguillesélevéesdans l'eau de mer diluée au-demi, la valeur de la sérocalcémie et la pression osmotique du sérum est telle que représentée sur la Figure 1. La valeur de la sérocalcémie et la pression osmotique continuent toutes deux à augmenter jusqu'au 5ème jour environ après le début de la période d'élevage, et ensuite elles commencent à diminuer. Comme le montre la Figure 2 l'activité de la substance efficace atteint par unité de tissu sécréteur/ a un rythme inférieur à celui de la valeur de la sérocalcémie ou de la pression osmotique, la valeur maximale le 10 - 15ème jour après le commencement de l'élevage, et ensuite l'activité commence à diminuer. Par conséquent, il est souhaitable d'arrêter l'élevage au moment où l'on a jugé que la teneur en calcitonine augmente et atteint la valeur maximale, et ensuite de prélever un tissu sécréteur du corps de l'anguille. La durée d'élevage est de préféW rence 10 - 17 jours, bien qu'il existe une différence individuelle parmi les anguilles. On a prélevé sur des anguilles qui ont été élevées dans de l'eau de mer ou dans de l'eau salée et sur des anguilles qui ne sont pas d'élevage, du tissu constituant la veine cave attachée à l'oesophage au voisinage du coeur, et la péricardique membrane / , et on en a effectué la détermination de l'activité par unité de tissu sécréteur, de poids corporel et d'azote protéique, Les résultats so sont ceux représentés dans le Tableau suivant.On voit dans ce Tableau que dans chaque cas l'activité est augmentée de 2-3 fois du fait que les anguilles ont été élevées dans l'eau de mer ou dans une solution aqueuse de sel commun analogue à celle-ci. MRC U/tissu tgC mU/mg MRC mU/N protéinique ( t) (Méthode de la foline) Eau douce 2,2 - 4,1 8,0 - 29,8 1,6 - 5,2 Eau de mer au 1/2 6,6 - 9,2 29,7 - 53,0 7,6 -11,5 Eau de mer au 1/3 5,8 - 9,0 30,1 - 51,2 8,1 -12,3 (Durée d'élevage : 13 jours) Cependant, étant donné que le liquide d'extrait contient diverses protéines de contamination, il est souhaitable de purifier ultérieurement le liquide en en éliminant lesdites protéines de manière appropriée. On peut appliquer une technique d'élimination desdites protéines directement à l'extrait précité pour précipiter les protéines, en éliminant ainsi les protéines précipitées simultanément avec d'autres solides présents dans ledit extrait. Sinon, on peut appliquer la technique à un liquide d'extrait obtenu en éliminant lesdits solides dudit extrait. En outre, on peut soumettre la poudre brute précitée à une purification àltaide de cette technique. On peut adopter un mode opératoire classique couramment utilisé dans la séparation et la purification des protéines. 2. Extraction On soumet tout d'abord les matières premières mentionnées précédemment à un traitement d'extraction. Comme solvant d'extraction utilisé ici on trouve des mélanges solvants constitués d'eau et de solvants organiques hydrophiles, par exemple, alcools inférieurs en C1-C4, acétone, phénol, dioxane, pyridine, tétrahydrofurane, méthyl cellosolve, diméthylformamide, diméthylsulfoxyde, etc... .On peut également utiliser des acides dilués comme l'acide chlorhydrique, l'acide acétique, l'acide oxalique, etc..., ou bien l'eau. Dans ces solvants aqueux, aucune limitation de la teneur en eau n'est particulièrement requise. En outre, on ajoute de préférence de laurée (habituellement environ 4-8 moles) auxdits solvants d'extraction. En outre encore, il est préférable d'ajouter des agents réducteurs tels que la cystine ou la vitamine C auxdits solvants d'extraction dans le but d'empêcher l'oxydation au moment de l'extraction. Comme cas typique préféré, on peut mentionner un mélange solvant comportant de l'urée 8 M, de la cystine 0,lNet de l'acide chlorhydrique 0,2 N. Dans la pratique de l'extraction, il est suffisant de plonger une matière première à la température ordinaire dans le solvant d~'extraction précité, en agitant. 3. Purification On concentre sous pression réduite un liquide d'extrait obtenu en séparant et en éliminant les solides, qui sont des fragments de tissu de la matière première, de l'extrait ainsi obtenu, et on le lyophilise pour obtenir une poudre brute. Par exemple, on précipite les diverses protéines de contamination en ajoutant au liquide d'extrait précité des solvants organiques hydrophiles tels que par exemple alcools inférieursen C1-C4, acétone, phénol, dioxane, pyridine, tétrahydrofurane, méthyl cellosolve, d iméthylformamide, diméthylsulfoxyde, etc... On peut ajouter au liquide d'extrait précite des sels minéraux solubles tels que chlorure de sodium, sulfate d'ammonium, etc... Dans le cas où l'on ajoute de l'acide trichloracétique ou de l'acide perchlorique au liquide d'extrait précité, on peut obtenir un précipité comprenant essentiellement une substance efficace désirée. Lorsqu'on disperse le précipité dans l'eau, le constituant efficace désiré se dissout dans l'eau. En en éliminant les résidus insolubles par séparation, on peut améliorer la pureté du constituant efficace pour qu'elle soit de 2-5 fois la pureté du constituant avant son traitement de purification. Dans ce cas, si la valeur du pH de l'eau est excessivement faible, les diverses protéines de contamination sont solubilisées de manière indésirable. Dans le cas où ladite valeur du pH est excessivement élevée, la liaison disulfure contenue dans le constituant efficace devient instable. C'est pourquoi, on ajuste de manière appropriée le pH de l'eau à 5,0-7,0, très préférentiellement à 6,0 en vue de l'élimination de diverses protéines de contamination. On peut éliminer les protéines de contamination de la substance brute efficace selon une filtration en gel contenant du Séphadex ou du Biogel (toutes deux marques commerciales), ou bien selon une chromatographie par échange d'ions utilisant une Séphadex pour échange d'ions ou une cellulose pour échange d'ions. Les exemples de Séphadex compr@nnent par exemple les G-25, G-50, G-75, et G-100; les Biogel comprennent par exemple les P-2, P-4, P-6, p-10, CM-2 et C;4-30, les Séphadex pour échange d'ions comprennent par exemple CM-Séphadex et SE-Séphadex; et les celluloses pour échange d'ions comprennent, par exemple la CM-cellulose et la DEAE-cellulose. Etant donné qu'un liquide obtenu en éliminant les diverses protéines de contamination précitées contient des sels, on soumet habituellement le liquide à un traitement de dessalage utilisant des résines échangeuses d'ions ou d'autres modes opératoires classiques. On peut encore purifier la substance obtenue selon le mode opératoire mentionné précédemment en lui appliquant des techniques de purification telles que par exemple, filtration de gel, électrophorèse, partage à contre-courant, chromatographie en couche mince, etc... La présente invention est illustrée avec référence aux exemples exposés ci-après. On a déshydraté 505 g de tissu constituant la veine cave attachée à l'oesophage près du coeur, que l'on a prélevé sur environ 2000 anguilles, 3 fois en répétant une opération consistant à plonger ledit tissu dans 3 litres d'acétone contenant 90 mg d'EDTA à 50 C pendant 5 heures. Ensuite, on a répété 3 fois une opération consistant à plonger le tissu déshydraté dans 2 litres de chloroforme à 50 C pendant 2 heures. On a répété 3 fois la même opération de déshydratation que précédemment mais en utilisant 2 litres d'acétone. On a séché les tissus résultants à l'air pour obtenir 110 g d'un produit séch6. On a soumis 110 g du produit séché ainsi obtenu à une extraction, où l'on a plongé ledit produit à la température ordinaire dans I litre d'acide chlorhydrique 0,2 N contenant 480 g d'urée et 17,5 g de cystine et on a agité pendant 2 heures. Au liquide d'extrait on a ajouté 2 litres d'un mélange solvant d'acétone et d'acide acétique (1:1), et on a ensuite ajouté un liquide mixte comprenant 28 ml d'eau salée 1 M et 3 1 d'acétone. On a séparé par centrifugation (9000 t.p.m.., 15 minutes) les protéines de contamination précipitées. Au liquide limpide surnageant on a ajouté 5 litres d'éther exempt de peroxyde hydrogène, et on a agité énergiquement le mélange pour en précipiter une protéine de poids moléculaire inférieur composée essentiellement d'une substance efficace désirée.Seul le précipité est récupéré par séparation centrifuge (9000 t.p.m., 15 minutes). On a lavé ce précipité 2 fois avec 400 ml d'un mélange solvant d'éther et d'acétone (1:1) et ensuite on l'a dissous dans 1 litre d'acide acétique a 20% contenant 1,75 g de cystine. A la solution on a ajouté 50 g de sel commun de manière à ce que la concentration finale soit de 5%. On a agité énergiquement la solution pour former un précipité. On a séparé le précipité par centrifugation (9000 t.p.m., 15 minutes). Au liquide limpide surnageant on a ajouté 170 ml d'acide trichloracétique à 45% pour amener la concentration finale à 7,5%, ce qui a fait commencer la précipitation d'une substance efficace désirée. On a récupéré le précipité par séparation centrifuge (9000 t.p.m.1 15 minutes), et ensuite on a LsaVo le précipité recueilli avec 200 ml d'éther et on l'a dissous dans 500 ml d'acide chlorhydrique 0,02 N. On a fait passer la solution d'acide chlorhydrique contenant la substance efficace désirée sur une colonne (2 cm x 30 cm) garnie d'une résine échangeuse d'ions du type Amberlite IRA 400, à un débit de 150 ml/heure, absorbant ainsi divers sels contenus dans la solution sur ladite résine échangeuse d'ions. Finalement, on a fait passer 50 ml d'eau distillée à travers la colonne pour obtenir un éluat dessalé contenant la substance efficace désirée. On concentre cet éluat et on le lyophilise pour obtenir 800 mg d'une poudre brute de substancefprmonale réductrice de la sérocalcémie. Exemple 2 On a dispersé 1,0 g d'une poudre brute (6w5 Wmg ) de substance brmonale réduetrice de la sérocalcémie, que l'on a obtenue selon le mode opératoire exposé dans l'Exemple 1, dans 100 ml d'un mélange solvant de butanol, d'acide acétique et d'eau (6Q:15:25), et on a effectué l'extraction en agitant à 4e C pendant 1 heure. Ensuite, on a ajouté 30 ml de butanol, 110 ml d'eau et 3,75 ml de pyridine au mélange d'extraction, et on a agité le mélange résultant et ensuite on l'a laissé reposer, grâce à quoi la solution a été divisée en deux couches. Une couche butanolique supérieure, dans laquelle se trouve la plus grande partie d'une substance efficace désirée, s'est séparée d'une couche inférieure A la couche inférieure on a ajouté 100 ml d'une couche supérieure d'un mélange solvant de butanol, d'acide acétique, d'eau et de pyridine (6:1:9:0,25), et on a laissé reposer le mélange après agitation. On en a séparé une couche butanolique supérieure. On a traité une couche inférieure trois fois en répétant la même opération que ci-dessus. On a réuni les couches supérieures ainsi séparées, et on a concentré la couche obtenue par réunion, sous pression réduite. On a lavé le produit concentré avec de l'éther et ensuite on l'a dissous dans 25 ml d'eau.On a lyophilisé les solutions pour obtenir 105 mg d'une poudre efficace désirée. Ensuite, on a dissous 105 g de la poudre ainsi obtenue dans 5 ml d'une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,7). La solution a été passée sur une colonne (2,0 cm x 80 cm) garnie de Séphadex G-75 et tamponnée avec une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,7), et éluée à raison de 12 ml/heure avec ladite solution tampon utilisée comme éluant. On a recueilli l'éluat résultant sous forme de fractions de 4 ml chacune. On a déterminé l'activité biologique de chaque fraction sur le rat, le résultant étant qu'une substance efficace désirée s'est trouvée éluée dans les fractions NO 65-85. On a alors réuni ces fractions, et on a concentré la fraction réunie sous pression réduite et on l'a lyophilisée pour obtenir 24 mg (98 U/mg) d'une poudre efficace désirée. Exemple 3 péricardiques On a déshydraté 120 g de membranes/obtenus en séparant des portions de myocardes de coeurs prélevés sur environ 1000 péricard q anguilles, en plongeant lesdites mem)ranes a eOCS pendant S heures das un litre d'acétone cont-nant 20 mg d'EDTA. On a répété trois fois ce traitement de déshydratation. Ensuite, on a dégraissé le produit déshydraté en le plongeant dans 800 ml de chloroforme à 50 C pendant 2 heures. On a répété ce traitement de dégraissage 2 fois.On a encore déshydraté le produit dégraissé dans les mêmes conditions que précédemment mais en utilisant un litre d'acétone,et on arépété ce traitement déshydratant trois fois On a séché à l'air le produit déshydraté pour obtenir 36 g d'un produit séché. On a extrait 36 g du produit séché ainsi obtenu en agitant pendant trois heures à la température ordinaire dans 1,2 litre d'acide chlorhydrique 0,2 N contenant 500 g d'urée et 18,0 g de cystine. On a centrifugé le mélange (9000 t.p.m., pendant 15 minutes) pour en séparer le solide. On a lavé le solide séparé avec 500 ml du solvant d'extraction précité, et on a réuni les liquides de lavage au liquide d'extrait dont on a séparé le solide par la séparation centrifuge effectuée antérieurement. Au 1,7 litre du liquide extrait ainsi obtenu on a ajouté 250 ml d'acide trichloroacétique à 45%, et ensuite on a séparé le précipité résultant par centrifugation (9000 t.p,m,, 15 minutes). On a dispersé le précipité dans 50 ml d'eau (pH 6,5),et on a éliminé les insolubles par séparation centrifuge (5000 t.p.m., 10 minutes). On a lyophilisé le liquide surnageant obtenu pour avoir 450 mg (1,8 MRC U/mg) d'une substance hormonale brute efficace. Exemple 4 @. On a prélevé du tissu constituant la veine cave attachée à péricardique l'oesophage au voisinage du coeur et la membrane / sur environ 3000 anguilles. On a soumis la matière première ainsi obtenue mêmes traitements de dégraissage et de déshydratation que dans l'Exemple 3 pour obtenir 255 g d'une poudre séchée. On a extrait 255 g de cette poudre en agitant pendant deux heures à la température ordinaire dans 2 litres d'acide chlorhydrique 0,2 N contenant 960g d'urée et 35 g de cystine. Ensuite, on a ajouté au liquide d'extrait 4 litres d'un mélange solvant constitué d'acétone et d'acide acétique (1:1) et on a encore ajouté 6 litres d'un liquide mixte constitué de 56 ml d'eau salée 1M et de 6 litres d'acétone , et on a-agité énergiquement le mélange. On a éliminé les protéines de contamination précipitées par séparation centrifuge (9000 t.p.m., 15 minutes). Au liquide surnageant résultant on a ajouté 10 litres d'éther exempt de peroxyde, et on a agité énergiquement le mélange, ce qui a entraîné la formation d'un précipité de protéine de bas poids moléculaire composé d'une substance efficace désirée. On a recueilli le précipité par séparation centrifuge (9000 t.p.m., 15 minutes).On a lavé le précipité recueilli deux fois avec 500 ml d'un mélange solvant d'éther et d'acétone (1:1) et ensuite on l'a lyophilisé pour obtenir 17,8 g (1,0 U/mg) d'une poudre brute de substance efficace désirée. Exemple 5 On a homogénéisé 700 mg de la poudre brute du produit désiré obtenuedans l'Exemple 4 avec 80 ml d'un mélange solvant de butanol,d'acide acétique et d'eau (12:3:5), et on a effectué une extraction en agitant pendant deux heures. Ensuite,à un liquide surnageant d'où l'on a éliminé les insolubles par séparation centrifuge (3000 t.p.m, 10 minutes) on a ajouté 24 ml de butanol, 28 ml d'eau et 3 ml de pyridine, et on a agité le mélange et ensuite on l'a laissé reposer, ce qui a entraîné la division de la solution en deux couches. On en a séparé une couche supérieure butanolique dans laquelle se trouve la plupart d'une substance efficace désirée. A la couche inférieure on a ajouté 80 ml d'une couche supérieure d'un mélange solvant de butanol, d'acide acétique, d'eau et de pyridine (6:1:9:0,25), et on a agité le mélange et ensuite on l'a laissé reposer. On en a séparé une couche essentiellement butanolique. On a encore traité cette couche inférieure trois fois de la même manière que précédemment. On a réuni les couches supérieures ainsi obtenues et on les a concentrées sous pression réduite. On a lavé ce résidu de concentration avec de l'éther, et ensuite on l'a dissous dans 4 ml d'une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,7). On a fait passer la solution sur une colonne (2,0 cm x 80 cm) garnie-de Séphadex G-75 et tamponné avec une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,7), et on a élu à raison de 12 ml/heure en utilisant la solution tampon précitée comme éluant.On a recueilli l'éluat résultant en fractions de4,5ml chacune. On a déterminé 1' activité biologique de chaque fraction obtenue sur le rat, le résultat étant qu'une substance efficace désirée s'est trouvée éluée dans les fractions numéro 63-82. On a donc réuni ces fractions et on les a concentrées sous pression réduite et ensuite lyophilisées pour obtenir 2,1 mg (24 U/mg) d'une poudre de substance efficace désirée. Exemple 6 péricardique On a obtenu 350 g de membrane/par prélèvement sur environ 3000 anguilles en en séparant cas portions de myocarde. On a effectué les mêmes traitements dégraissants et déshydratants que ceux exposés dans l'Exemple 3 pour obtenir 105 g d'un produit séché de meZ n a soumis 105 g du produit séché ainsi obtenu à des traitements de la même manière que dans l'Exemple 1, si ce n'est que l'on a soumis un précipité obtenu après traitement par l'acide trichloroacétique, à une séparation centrifuge (9000 t.p.m., 15 minutes) pour obtenir 700 mg d'un précipité. On a lavé ce précipité avec 100 ml d'éther et ensuite on l'a dissous dans 28 ml d'eau, et après élimination des insolubles par séparation centrifuge (5000 t.p.m., 10 minutes), on l'a lyophilisé pour obtenir 350 mg (8 MRC U/mg) d'une poudre brute de substance hormonale e fficace. Exemple 7 On a dissous 350 mg de la poudre brute obtenue dans l'Exemple 6 dans 3 ml d'une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pli 4,7). On a fait passer la solution sur une colonne (3,0 cm x 100 cm) garnie de Séphadex G-75 et on a élué à raison de 9 ml/heure avec la solution d'acétate d1 ammonium 0,2 M (pli 4,7) utilisée comme éluant. On a recueilli l'éluat résultant en fractions de 4 ml chacune. On a déterminé l'activité biologique de chaque fonction obtenue, et on a constaté qu'une substance efficace hormonale réductrice de la sérocalcémie s'était trouvée éluée dans les fractions nO 50-60. On a alors réuni ces fractions.On a concentré sous pression réduite la fraction réunie et on lta lyophilisée pour obtenir 45 mg d'une poudre brute. Ensuite, on a dissous 45 mg de la poudre dans 1 ml d'une solution de formate d'ammonium 0,01 M (pli 4,37). On a fait passer la solution sur une colonne (1,0 cm x 5,0 cm) garnie de carboxyméthyl cellulose (CMC), et on a élue- à raison de 4,5 ml/heure par étape en utilisant 70 ml d'une solution de formate d'ammonium 0,01 M (pS 4,37), 60 ml d'une solution de formate d'ammonium 0,01-0,2 M, 30 ml d'une solution de formate d'armnonium 0,2 M, et 40 ml d'une solution de formate d'ammonium 2,o M.On a recueilli l'éluat résultant en fractions de 2 ml chacune On a réuni les fractions n0 50-65, dans laquelle la substance efficace de type calcitonine s'est - trouvée éluée, comme il est confirmé par détermination de 1' activité biologique sur chaque fraction. On a concentré sous session réduite la fraction de réunion et ensuite on l'a lyophilisée pour obtenir 22 mg (220 MRC U/mg) d'une poudre de substance efficace hormonale. Exemple 8 On a élevé 200 anguilles à 200 C pendant 12 jours dans une eau de mer artificielle ayant une concentration moitié de celle de l'eau de mer (eau de mer artificielle deVAfT HOFF). Ensuite, on a prélevé sur les anguilles ainsi élevées, les tissus cons tituant la veine cave attachée à l'oesophage au voisinage du péricardiques coeur, et les membranes/. On a soumis la matière première prélevée deux fois à une opération de déshydratation dans laquelle on plonge la matière à 50 C pendant trois heures dans 400 ml d'acétone contenant 10 mg d'EDTA. Ensuite, on soumet le produit déshydraté deux fois à une opération de dégraissage dans laquelle on plonge le produit à 50 C pendant une heure dans 300 ml de chloroforme.En outre, on a répété deux fois l'opération de déshydratation dans les mêmes conditions que précédemment mais en utilisant 300 ml acétone. On a séché à l'air le produit déshydraté pour obtenir 14 g (activité 235 MRC U/g) d'une poudre séchée. Exemple 9 On a fait un élevage de 800 anguilles à 200 C pendant 13 jours dans une solution aqueuse de sel commun M/3. Immédiatement après, on a prélevé les tissus constituant la veine cave attachée à l'oesophage au voisinage du coeur et sur les anguilles élevées. On a traité la matière prélevée de la même manière que celle décrite dans 1'Exemple 8 pour obtenir 68 g (activité : 208 MRC U/g) d'un produit séché. Exemple 10 On a traité 50 g du produit séché obtenu dans l'Exemple 9 par le même procédé que dans l'Exemple 6 pour obtenir 365 mg (activité :21,5 MRC U/mg) d'une poudre d'une substance hormonale efficace. Exemple 11 On a traité 250 mg de la poudre obtenue dans l'Exemple 10 de la même manière que dans l'Exemple 2, si ce-n'est que l'on a recueilli l'éluat en fractions de 8 ml chacune dans un tube à essai. En se basant sur la détermination du pouvoir d'absorption à 277 myy et de 1' activité biologique sur chaque fraction, on a réuni les fractions n 15-2C, 36-54 etc 55-70, et on a concentré la fraction de réunion et ensuite on l'a lyophilisée pour obtenir 79,5mg (activité . 81,2 MRC U/mg) d'une poudre d'hormone. Exemple 12 On a dissous 100 mg (activité : 24,8 1^EC U/mg) d'une poudre obtenue de la même manière que dans l'Exemple 10 dans 1 ml d'une solution de formate d'ammonium 0,01 M (pH 4,4). On a fait passer la solution sur une colonne (1,0 cm x 5,Q cm) garnie de carboxyméthyl cellulose et tamponné par une solution de formate d'ammonium 0,01 M (pH 4,4), et on a élué en continu à raison de 4,5 ml/heure en utilisant 70 ml d'une solution de formate d'ammonium 0,01M (pH 4,4), 60 ml de ladite solution tampon mais 0,01-0,2 M, 30 ml de ladite solution tampon mais 0,2 M, et 40 ml de ladite solution tampon mais 2 M. On a recueilli l'élut résultant en fractions de 2 ml chacune. En se basant sur les résultats des déterminations du pouvoir d'absorption à 277 mfi et de l'activité biologique de chaque fraction, on a réuni les fractions n 56-70. On a lyophilisé la fraction rassemblée pour obtenir 28,5 mg (activité : 86,4 MRC U/ mg) d'une poudre d'une hormone réductrice de la sérocalcémie. REVENDICATIONS 1. Une substance hormonale capable d'abaisser la sérocalcémie chez les mammifères et ayant les propriétés suivantes (a) poudre colorée en blanc, (b) soluble dans l'eau mais insoluble dans les divers solvants organique s, (c) traversant un filtre à membrane qu'une substance ayant un poids moléculaire de 10.000 ou moins peut traverser, et ne traversant pas un filtre à membrane qu'une substance ayant un poids moléculaire de 1000 ou moins peut traverser, (d) poids moléculaire de 3.000 à 4.500, (e) positive à la réaction à la ninDydrine, à la réaction de Sakaguchi, à la réaction d'un diazo, et à la réaction de Crieg-Liebig, (f) précipitable par addition de réactifs précipitants comme l'acide trichloroacétique et l'acide perchlorique, (g) désactiveepar les enzymes protéolytiques telles que nagase et chimiotrypsine, (h) ayant la composition en amino-acides suivantes lysine 0,0636 tmole alanine 0,0760 histidine 0,0041 cystéine - NH3 0,0816 valine 0,0807 acide algini que 0,0256 méthionine - acide aspartique 0,0638 isoleucine 0,0312 thréonine 0,0229 leucine 0,0641 sérine 0,0384 tyrosine 0,0052 acide glutamique 0,0792 phénylalanine 0,0192 proline 0,0207 glycine- 0,0846 (i) contenant une liaison disulfure qui n'est stable ni à ltoxydation ni à un alcali relativement fort, (j) ayant un pouvoir de rotation spécifique de / 7 23= -20 C (C = 0,4 %, H2O) [123 /mg] (k) ayant des données de développement de l'électrophorèse à disque échantillon : 150 &gamma; conditions : 6 mA, 40-- 80 minutes Gel : gel acide avec incorporation d'urée 6 M Solution de développement : solution tampon d'acide acétique et de ji-alanine Couleur : rouge Ponceaux Valeur du développement : I\.M. = 0,5 (1) et ayant pour tonnées de chromatographie en couche mince Echantillon (61 MRC U/mg) Solvant de développement n-butanol : pyridine : eau : acide acétique (15 : 10 : 12 : 3) Support : Abisel (Nom commercial) (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha) Réactif de développement :Réactif de Daidon Smith Valeur dû développement : Rf = 0,46 - 0,71. 2. Un procédé pour produire la substance telle qu'oxposéc dans la revendication 1 qui consiste à extraire le coeur, en particulier péricardiqué la membrane et/ou un tissu constituant la veine cave attachée à ltoesophage près du coeur de l'anguille, ou bien leurs formes dégraissées, séchées, par un mélange solvant d'un solvant organique hydrophile et d'eau, ou d'un acide dilué ou d'eau et à éliminer les protéines de contamination de l'extrait résultant ou d'un liquide extrait obtenu en séparant les solides dudit extrait. 3. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel les anguilles utilisées sont des anguilles élevées 10 - 17 jours dans l'eau de mer ou dans une solution aqueuse de sel commun de composition similaire à celle-ci. 4. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel les agents d'extraction sont des alcools inférieurs en C1 - C4 , l'acétone, le phénol, le dioxane, la pyridine, le tétrahydrofurane, le méthyl cellosolve, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acide chlorhydrique, l'acide oxalique ou l'eau. 5. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel l'agent d'extraction est l'acide chlorhydrique 0,2 N contenant de l'urée (4-8 M), et de la cystine (0,1 N) ou de la vitamine C. 6. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel on ajoute au liquide extrait de l'acide trichloracétique ou de l'acide perchlorique pour précipiter une substance efficace sous forme d'un précipité et on disperse le précipité dans une solution aqueuse ayant un pli de 5,0 - 7,0. 7. Un procédé selon la revendication 6, dans lequel on lyophilise le liquide dans lequel on a dispersé la substance efficace. 8. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel on dcr;sale ensuite le produit obtenu, à l'aide d'une résine échangeuse d'ions, et on concentre et on sèche le produit dessalé. 9. Un procédé selon la revendication 8, dans lequel on traite ensuite le produit obtenu, à laide d'une résine échangeuse d'ions Sephadex. 10. Un procédé de production d'une substance telle qu'elle est décrite dans la revendication 1, qui consiste à extraire un produit séché du coeur d'anguille ou du tissu voisin, par l'acide chlorhydrique 0,2 N contenant de l'urée (8 M) et de la cystine (0,1 N), à ajouter un mélange acétone-acide acétique, et de l'acétone contenant du sel commun au liquide d'extraction résultant pour former un précipité, à ajouter de l'éther au liquide surnageant résultant pour former un précipité, à centrifuger le précipité, à laver à l'éther le précipité séparé et ensuite à sécher le précipité. Il. Un procédé de purification du produit obtenu selon la revendication 10, qui consiste à extraire ledit produit par un mélange liquide de butanol, d'acide acétique et d'eau tout en l'homogénéisant avec celui-ci, à séparer les insolubles, à ajouter un mélange liquide de butanol, d'eau et de pyridine au liquide surnageant résultant, ce qui entraîne la séparation du liquide d'extraction en deux couches, à ajouter encore du butanol, de l'acide acétique, de l'eau et de la pyridine à la couche inférieure, à répéter la séparation du liquide d'extrait en deux couches, supérieure et inférieure, à réunir les couches supérieures, à concentrer la couche supérieure obtenue par réunion, à dissoudre le produit concentré dans une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pli 4,7) et à traiter la solution résultante par une résine 12.Un procédé de production du produit tel qu'il est défini dans la revendication 1, qui consiste à extraire un produit séché de coeur d'anguille ou de tissu voisin, en le plongeant dans de l'acide chlorhydrique 0,2 N contenant de l'urée (8 M) et de la cystine (0,1 N), à ajouter un mélange liquide d'acétone et d'acide acétique, et de l'acétone contenant du sel commun pour former un précipité, à ajouter de l'éther au surnageant pour former un précipité, à ajouter au précipité de l'acide acétique contenant de la cystine (0,1 N), à ajouter encore du sel commun, à séparer le précipité résultant, à ajouter de l'acide trichloroacétique au liquide surnageant jusqu'à ce que la concentration finale atteigne 7,5 %, à disperser le précipité résultant dans de l'eau pour séparer le précipité, à lyophiliser le liquide surnageant résultant et à traiter une solution du produit lyophilisé par une résine échangeuse d'ions. 13. Un procédé de purification du produit obtenu selon la revendication 12, qui consiste à extraire ledit produit par un mélange liquide de butanol, d'acide acétique et d'eau, à ajouter un mélange liquide de butanol, d'eau et de pyridine au liquide d'extraction pour le séparer en deux couches, une couche supérieure et une couche inférieure, à ajouter un mélange liquide de butanol, d'acide acétique, d'eau et de pyridine à la couche inférieure à répéter la séparation précédente en couches supérieure et inférieure, à réunir les couches superieures, à concentrer et à, sécher la couche supérieure obtenue par réunion, à dissoudre ensuite la poudre résultante dans une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M et à traiter la solution résultante pàr une résine. 14. Un procédé de production de la substance telle qu'elle est définie dans la revendication 1, qui consiste à extraire un produit séché de coeur d'anguille ou de tissu voisin en le plongeant dans i'acide chlorhydrique 0,2 N contenant de l'urée (8 M) et de la cystine (0,1 N), à ajouter de l'acide trichloracétique au liquide d'extraction résultant, à disperser le précipité résultant dans l'eau et à lyophiliser le liquide surnageant résultant.