Brevet FR2081544A1 — publié le 19711203

La présente invention concerne des extraits lymphocytaires propres à la préparation de sérums immunodépresseurs non-toxiques, à partir desquels on peut isoler une immunoglobuline G immunodépressive antilymphocytaire (A.L.G.)dépourvue de toxicité. Tes propriétés de sérums immunodépresseurs (immuno suppresseurs),en particulier de sérums antilymphocytaires (B.L.S) ont été étudiées depuis quelque temps à propos du problème du rejet d'homogreffes dans la chirurgie de transplantation. Ce reJet est dA à l'incompatibilité immunologique entre le receveur et le donneur de l'homogreffe et les tentatives qui ont été entreprises pour lutter contre le rejet ont fait intervenir l'étude de la compatibilité tissulaire et le choix de tissus plus compatibles, ainsi que l'administration de certains médicaments immuno dépresseurs. I1 a été trouvé que le sérum antilymphocytaire qui est obtenu chez les mammifères par réaction à une introduction parentérale de lymphocytes ou d'antigènes lymphocytaires suppri niait le rejet d'homogreffes chez les mammifères. Des sérums antilymphocytaires de plusieurs origines ont été essayés sur divas animaux et un problème auquel on s'est heurté est que des sérums particuliers ont certaines actions préjudiciables et souvent toxiques, par exemple une action d'anticorps contre les hématies et les plaquettes sanguines (thrombocytes), en plus de leur action immunodépressive. Ces effets secondaires nuisibles ont paru entre en rapport avec la nature des tissus. lies thymocytes (c'est-àdire des lymphocytes du thymus) de rongeurs et de l'homme, des fragments subcellulaires et en particulier les membranes de cellules comme les thymocytes, ainsi que les extraits 80- lubles de ces thymocytes et notamment l'extrait particulier qui est appelé thymosine, ont été utilisés pour produire des sérums immunodépresseurs qui ne soient pas toxiques. De même, on a aussi utilisé la thymosine de veau. Mais les quantités de lymphocytes que l'on peut obtenir à partir de thymus ne sont pas suffisantes pour une production commerciale économique de sérums immunodépresseurs. La source de lymphocytes humains la plus commode est le sang mais les sérums immunodépresseurs qui sont formés contre ces cellules et même contre les membranes de ces cellules sont toxiques et ils provoquent en particulier une diminution notable du nombre des globules rouges et des plaquettes sanguines de l'animal auquel ils sont administrés, par exemple par agglutination, lyse et autres mécanismes. La Demanderesse a trouvé que l'on pouvait utiliser des extraits solubles de lymphocytes de sang humain comme source immunogène pour préparer un sérum antilymphocytaire immunodépresseur à partir duquel peut votre isolée une A.L.G. immunodépressive, tous deux étant dépourvus de la toxicité qui est normalement caractéristique du sérum antilymphocytaire obtenu avec des extraits fragmentaires de lymphocytes de sang humain ou avec les cellules entières. Ainsi, la présente invention a pour objet une préparation stérile propre à la formation d'un sérum antilymphocytaire immunodépresseur non-toxique, sur un mammifère autre que l'homme, comprenant un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain, extrait qui est isotonique avec le sang du mammifère devant être utilisé Une forme particulièrement intéressante de cette préparation est un extrait immunogène soluble et stérile, ie lymphocytes de sang humain, qui comprend principalement un mélange de composants macromoléculaires dont chacun a un poids moléculaire inférieur à1 000 000 et supérieur à 10 000, ce mélange ayant une teneur en protéines comprisse entre 50 et 100%, une teneur en lipides inférieure à 30% et de préférence inférieure à 10% et une teneur en glucides inférieure à 20o, pourcentages qui sont rapportés au poids de l'extrait sec à l'exclusion des sels, en entendant ici par sels les substances de l'extrait qui ont un poids moléculaire inférieur à 5 000. Les poids moléculaires et les pourcentages qui viennent d'être donnés peuvent varier entre les limites indiquées suivant des facteurs tels que l'état de santé et l'age du sujet humain ou les conditions de la culture cellulaire à partir de laquelle sont obtenus les lymphocytes sanguins. lie poids moléculaire des composants macromoléculaires sera avantageusement compris entre 10 000 et 200 000 etilsera de préférence inférieur à 100 000, par exemple égal à 60 000 environ. lie terme immunodépresseur ou immunosuppre s seur, qui est appliqué ici au sédum antilymphocytaire (A.L.S.) ou à l'immunoglobuline G antilymphocytaire (A.li.G.), signifie le pouvoir de diminuer l'intensité d'une réaction de l'organisme contre un tissu incompatible, c'est-à-dire un tissu étranger ou bien le propre tissu de 1' organisme s'il devient incompatible; ainsi, la signification qui est donnée au terme immunosuppression comprend spécifiquement la prolongation de la vie de greffes, en particulier d'homo- greffes, à la suite d'une transplantation, ainsi que le traitement de maladies auto-immunes comme l'ophtalmie dite sympathique. De même, le terme non-toxique, qui est appliqué ici à l'A.D.S ou à l'A.L.G, signifie que le sérum ou l'immunoglobuline provoquent peu ou ne provoquent pas d'agglutination lorsqu'ils sont mélangés avec des hématies humaines, ni de saignement et peu ou pas de chute du nombre des thrombocytes chez la souris 18 heures après une injection intrapéritonéale de 1 ml de l'A.li.S. ou de l'A.L.G. On entend par extrait antigénique "soluble", le fait qu'une solution de 10 mg de cet extrait dans 1 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,85% en poids par volume, observée à l'oeil nu, apparat comme étend une solution limpide. De préférence, l'extrait ne comprendra pas de particules supérieures à 0,22 micron, ce qui peut Etre facilement obtenu par centrifugation i 100 000 g pendant 30 minutes et filtration sur un filtre Millipore (nom de marque) GS à pores de 0,22 micron, bien qu'il soit à noter qu'en général une centrifugation qui a été effectuée dans les conditions indiquées est suffisante par elle m8me pour éliminer toutes les particules de dimension supérieure à 0,22 micron. Cette invention comprend aussi un procédé de préparation d'un extrait immunogène stérile et soluble de lymphocytes de sang humain, tel qu'il a été précédemment défini, procédé selon lequel on lyse les lymphocytes et on isole l'extrait soluble du lysat puis on rend l'extrait stérile et isotonique avec le sang du mammifère que l'on doit utiliser. Une source appropriée de lymphocytes de sang humain peut autre une collection de lymphocytes cultivés, initialement obtenus à partir de sang frais puis cultivés sur un milieu nutritif convenable jusqu'à ce qu'ilssoient utilisés. Toutefois 1une caractéristique particulièrement avantageuse de l'invention est que les lymphocytes du sang devant être utilisés peuvent être aisément isolés de sang humain frais, que l'on peut assez facilement se procu rer. Cela peut être fait d'une manière connue quelconque mais il est commode de citrater le sang, de le recalcifier et de le défibrineravant la sédimentation des érythrocytes. Les lymphocytes sont ensuite séparés du liquide surnageant et les érythrocytes résiduels sont éliminés. La lyse des lymphocytes peut se faire suivant toute technique traditionnelle de lyse de cellules telle qu'une lyse mécanique, par exemple par les ultra-sons ou par cavitation intracellulaire, pour réaliser la rupture des cellules. il est cependant préférable de procéder à la lyse des lymphocytes au moyen d'agents physicoachirniques, par exemple de tampons hypertoniques, puis d'agiter mécaniquement le lysat visqueux pour le disperser avant d'isoler l'extrait, ou au moyen d'agents physico-chimiques tels que des tampons hypotoniques associés avec une agitation mécanique favorisant la lyse. Ainsi, du point de vue de la commodité de la production, de la quantité des lots et de 11 activité du produit, il est préférable de réaliser la lyse avec des solu- tiors Je tamponnage aqueuses hypertoniques ou hypotoniques. Plus particulièrement , une lyse hypertonique ou hypotonique comprend la mise en suspens ion des lymphocytes dans un tampon aqueux, hypotonique ou hypertonique, et la désagrégation des débrits de cellules par cisaillement au moyen d'un homogénéiseur approprié, par exemple un homogénéiseur Dounce (Jencons Ltd., Londres) fonctionnant à raison de 50 à 100 coups du mouvement alternatif du piston. il peut se faire que l'homogénéiseur de Dounce s'avère inefficace pour réaliser une désintégration satisfaisante des débrits de cellules, auquel cas on peut essayer un autre type d'homogénéiseur. Dans ces cas, l'homogénéiseur de Silverson (Silverson Machines Ltdw, Londres) se montre en général satisfaisant s'il est utilisé pendant 2 minutes environ à une vitesse moyenne. On peut utiliser n'importe quel tampon connu comme milieu approprié pour une lyse hypotonique ou hypertonique mais le pH d'un tampon quelconque sera de préférence de 7,5 environ. Des tampons particulièrement convenables sont ceux indiqués dans les exemples qui sont donnés ciaprès. La lyse par la technique des ultra-sons peut être réalisée de la manière décrite dans la littérature (voir à ce sujet la référence nO 8 à la fin de la présente description), qui consiste essentiellement à soumettre une suspension des lymphocytes dans un tampon aqueux à l'action d'ondes ultrasoneres dans ur oscillateur d'ultra-sons pendant une période pouvant varier de 1 à 30 minutes. De même, on peut exécuter de manière connue la lyse par cavitation intracellulaire, par exemple en soumettant une suspension des lymphocytes dans un tampon aqueux à pH 7,6 environ, à une forte pression d'azote, par exemple une pression de 35 à 70 bars mais de préférence de 50 à 60 bars, dans un récipient en acier encore appelé bombe à azote, puis en supprimant la préssion, ce qui provoque la rupture des lymphocytes. On peut encore procéder à la lyse des lymphocytes en soumettant ceux-ci à l'action d'une solution aqueusesd'un thiocyanate d'ammonium ou de métal alcalin, de préférence une solution 1,3 à 3M de thiocyanate de potassium, le sel de sodium convenant aussi très bien. La lyse des cellules se fait alors aussitôt et donne une suspension très visqueuse qu'on peut ensuite diluer avec une solution aqueuse de chlorure de sodium et disperser dans un homogénéiseur. Pendant toute la durée des opérations qui sont mises en jeu dans la lyse des lymphocytes et dans les stades suivants d'isolement de l'extrait, on maintient une température basse afin d'éviter des réactions secondaires et la perte de matière qui en résulterait, par exemple une dégradation par les enzymes. Une température de O à 100C, de préférence de 4 C environ,s'est montrée favorable. Après la lyse des lymphocytes humains, il est nécessaire d'isoler l'extrait soluble, ce qui implique la séparation du matériel soluble d'avec la matière insoluble du lysat et, si l'on a utilisé un thiocyanate pour réaliser la lyse, il faut en outre éliminer l'ion thiocyanate par une méthode usuelle quelconque; quand on parle d'isole lement de l'extrait, cela comprend donc ce genre d'opération. Avant d'utilIser l'extrait pour préparer le sérum lymphocytaire sur un mammifère autre que l'homme, il est nécessaire aussi d'assurer que cet extrait soit isotonique avec le sang du mammifère et qu'il soit stérile, cette dernière condition pouvant être réalisée par une opération de stérilisation séparée ou bien grâce à une ou plusieurs des opérations qui sont mises en jeu dans l'isolement lui-mme. L'isolement de la fraction soluble du lysat peut se faire par toute méthode connue de séparation du matériel cellulaire soluble d'avec les débrits de cellules insolubles mais on l'effectue de préférence par ultra-centrifugation, laquelle peut être suivie ou non d'une filtration de la fraction soluble à travers une membrane. L'ultra-centrifugation peut être avantageusement exécutée avec une accélération centrifuge de ÇO 000 à 150 000 g pendant 20 à 50 minutes, ce qui sépare le matériel soluble du lysat d'avec la matière fragmentaire qui est principalement formée de membranes, noyaux et autres fragments subcellulaires. Si l'ultra-centrifugation n'accomplit pas la séparation voulue de la matière soluble du lysat d'avec la matière insoluble, on pourra procéder à un autre mode de séparation par filtration à travers une membrane, par exemple une membrane Millipore (nom de marque) GS à pores de 0,22 micron, ce qui élimine tous les constituants fragmentaires résiduels et en même temps stérilise efficacement l'extrait. Si l'on a utilisé un thiocyanate dans la lyse des cellules, l'ion thiocyanate peut être commodément éliminé par dialyse Si l'on a utilisé un tampon hypertonique pour réaliser la lyse des cellules, les sels qui constituent ce tampon peuvent aussi Titre éliminés commodément par dialyse et il pourra astre utile également, bien que cela ne soit pas nécessaire, de dialyser la fraction soluble lorsque celle-ci a été obtenue par une lyse hypotonique, pour ajuster la teneur en sels de cette fraction. La dialyse a en outre l'avantage supplémentaire d'éliminer les composants à bas poids moléculaire qui n'apparaissent pas contribuer à l'immunogénicité de l'extrait final.La dialyse est en général exécutée contre une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,85 % en poids par volume. Comme opération supplémentaire et facultative, la fraction soluble peut aussi Qtre concentrée par un moyes connu quelconque mais, avantageusement, par ultrafiltration. Cette opération peut également permettre d'éliminer les protéines à bas poids moléculaire, suivant la dimension des pores de la membrane utilisée, mais cette dimension ne sera en aucun cas suffisarnent grande pour que les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 10.C00 puissent traverser la membrane et soient exclues. La filtration sur membrane peut se faire avant la dialyse ou la concentration si on procède à ces opérations et après la centrifugation mais elle sera avantageusement faite après ces opérations si celles-ci donnent des traces de matière insoluble, et après le stockage de l'extrait si nécessaire. La nature chimique de 11 extrait soluble peut être déterminée par toute méthode commode. La teneur en protéines peut autre évaluée d'après le rapport entre la densité optique à 260mu et la densité optique à 280 mF (voir la référence N03 à la fin de la présente description), les densités optiques étant mesurées par ltexamen de dilutions appropriées dans un spectrophotomètre Unicam (marque déposée)S.P. 80 Cettteneur sera de préférence déterminée par la méthode de Lorry (référence N04 à la fin du présent mémoire), qui est fondée sur l'intensité de la coloration bleue obtenue par la réaction des protéines avec le réactif utilisé dans cette méthode.La teneur en lipides peut autre évaluée d'après la solubilité dans le chloroforme d'un hydrolysat acide de l'extrait (référence N0 5), hydrolyse acide qui peut être commodément effectuée avec de 1' acide chlorhydrique, et la teneur en glucides peut titre déterminée par la méthode à l'anthrone (référence NO 6), méthode fondée sur l'intensité de la coloration que donne la réaction des glucides avec l'anthrone. Le poids moléculaire des composants macromoléculaires de l'extrait est déterminé par des études d'ultracentrifugation, en vue de mesurer le coefficient de sédimentation et d'en déduire un poids moléculaire empirique par l'équation Halsall (référence NO 1). La présente invention comprend ausaLun sérum antilymphocytaire immunodépresseur stérile, isotonique et non-toxique, formé contre un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain, tel que précédemment décrit, sur un mammifère autre que l'homme. Ainsi, on peut utiliser ces extraits solubles pour produire un sérum antilymphocytaire en les injectant à des mammifères autres que l'homme, qui pourront votre avantageusement des mammifères de l'ordre des Périssodactyles ou de l'ordre des Artiodactyles, par exemple le mouton, la chèvre, le boeuf, le porc ou le cheval, suivant un programme d'immunisation appropr46. En particulier, ces extraits peuvent servir à immuniser des lapins ou des chevaux par la méthode de Lance (référence N 7) qui consiste essentiellement en une injection intramusculaire de l'extrait dans l'ajuvant complet de Freund, c'est-à-dire une émulsion eau-dans-l'huile formée par la phase d'extrait liquide dispersée dans une huile minérale, par exemple une huile paraffinique, contenant aussi des bactéries tuées par la chaleur, injection qui est suivie d'une série de quatre injections intraveineuses étendues sur six semaines. Des antibiotiques, en particulier de la streptomycine et de la polymyxine,peuvent être ajoutés à l'antigène pour diminuer des effets secondaires préjudiciables. On obtient le sérum antilymphocytaire qui a été formé chez le mammifère immunisé en saignant l'animal et en coagulant le sang . Après avoir séparé le coagulum, on peut inactiver le sérum,par exemple en le chauffant entre 50 et 650C, pour inactiver les enzymes susceptibles de l'abtmer et tout complément qui pourrait geler l'utilisation de la fraction d'A.L.G. et les essais effectués sur cette fraction. L'antisérum (A.L.S.) peut ensuite être fractionné en vue d'obtenir l..I.u., qui comprend la majeure partie de l'immunoglobuline G de l's.L.S., suivant les techniques connues de fractionnement de sérums. Le fractionnement peut se faire par toute méthode connue pour l'obtention d'immunoglobulines à partir d'antisérums et nombre des méthodes utilisées sont applicables à la récupération de l'immunoglobuline G à partir de l's.L.S. selon cette invention. En général, le procédé de fractionnement comprend la séparation des globulines d'avec les albumines de l'A.L.S., l'élimination des hémolysines et des hémoagglutinines éventuellement présentes et l'isolement de l'immunoglobuline G mais 2e fractionnement peut aussi se faire par des techniques d'immunoabsorption dans lesquelles, par exemple, il se forme un complexe anticorps-antigène qui est ensuite dissocié en donnant l'anticorps cherché sous la forme d'immunoglobuline G. L'immunoglobuline G peut encore être obtenue directement de la source sanguine par une technique de plasmaphorèse. La séparation des globulines est commodément effectuée par fractionnement avec un sel, qui est de préférence le sulfate d'ammonium ou de sodium, et les hémolysines et les hémoagglutinines peuvent être enlevées par absorption par un stroma d'hématies, d'une manière discontinue ou bien dans une colonne de grains de gélose contenant le stroma. L'immunoglobuline G peut autre isolée des globulines, ou bien directement de l'A.L.S. par une ou plusieurs des techniques connues, qui sont par exemple des techniques d'électrophorèse comme l'électrodécantation, la centrifugation de zone , la chromatographie par échange d'ions en discontinu ou dans une colonne contenant par exemple un échangeur d'anions à base de polysaccharides comme la DEAE-cellulose ou le produit DEAE-Sephadex (nom de marque, Pharmacia Ltd., Uppsala, Suède), la chromatographie deux clusion réalisée d'une manière discontinue ou dans une colonne, la chromatographie de partage sur des gels de matières minérales comme le phosphate de calcium ou encore la précipitation sélective de protéines avec le n-octanoSque (voir la référence NO 15) ou avec de l'alcool (Réf.l). La forme usuelle de présentation de lA.L.S. ou de l'A.L.G. comme produit à usages thérapeutiques est une solution aqueuse , isotonique et stérile, contenant normalement de 5 à 10 % en poids par volume de protéines et 0,85 % de chlorure de sodium, avec de préférence un stabilisant tel que le glycocolle. Une autre forme de présentation est une poudre lyophilisée contenant les mêmes additifs et avec laquelle on reconstitue la solution avec de l'eau stérile aussit8t avant l'emploi. L'administration se fait en général par injection intramusculaire, ou mieux par infusion intraveineuse après dilution éventuelle avec un soluté physiologique normal si cela est nécessaire. lies doses quotidiennes sont normalement comprises entre 3 et 20 mg de protéines par kilogramme de poids corporel et il sera donc courant de donner depuis 1 ml environ par jour, de la solution stérile ci-dessus, pour un enfant, Jusqu'à 15 ml par jour dans le cas d'un adulte, les doses exactes étant laissées à la discrétion du médecin traitant. La présente invention comprend ainsi une préparation stérile et isotonique d'une immunoglobuline G antilymphocytaire, immunodépressive et non-toxique, qui a été obtenue par fractionnement d'un sérum anti-lymphpcytaire immunodépresseur, non-toxique, formé contre un extrait immunogène soluble de lymphocites de sang humain sur un mammifère autre que l'homme, ainsi que les méthodes qui viennent d'entre décrites pour préparer cette immunoglobuline G et cet antisérum. L'invention comprend en outre le sérum antilymphocytaire et l'immunoglobuline G qui ont été préparés par les méthodes décrites ici. Les exemples suivants, qui ne limitent nullement la portée de cette invention, ne sont donnés que pour décrire celle-ci plus en détail. EXEMPLE 1 : Préparation d'un extrait antigénique soluble de lymphocytes de sang humain par lyse hypotonique. On centrifuge du sang humain frais à 1000 g pendant 30 minutes pour former un"caillot blanc" comprenant une couche de globules blancs et de plaquettes à la surface des globules rouges, caillot que l'on mélange avec du citrate de sodium pour empêcher la coagulation . Lorsque cela est requis, on en recalcifie 200 ml en ajoutant du chlorure de calcium pour permettre à la coagulation de se faire.Le coagulum de fibrine est séparé mécaniquement et la suspension de cellules est traitée avec un mélange de 50 ml de dextranne à 6 h en poids par volume (poids molé- culaire 110.000) , 10 ml d'acide d'éthylènediamine-tétra-acéti que ≈10% en poids par volume et 0,238 g d'héparine, ceci pendant une heure à la température ordinaire. Ce traitement produit la sédimentation des érythrocytes et on fait passer le surnageant riche en leucocytes sur une colonne de perles de polystyrène pour en isoler les lymphocytes.On élimine ensuite les érythrocytes résiduels en ajoutant une quantité suffisante de sérum de poulet qui agglutine les érythrocytes humains, puis en centrifugeant à faible vitesse. 97 % des cellules obtenues sont de petits lymphocytes ayant un haut degré de viabilité (98 %) comme le montre l'absence de coloration au bleu de trypan, qui indique que les membranes des cellules sont encore semi-perméables (voir la référence NOlO à la fin de la description). Examinée au microscope, la préparation lymphocytaire apparat comme n'étant pas contaminée par des thrombocytes ou des érythrocytes. On centrifuge à 500 g pendant 10 minutes une suspension des cellules contenant 5 x 109 lymphocytes, puis on remet la pastille formée en suspension dans 20 ml d'un tampon aqueux hypotonique froid (40C environ) à pH 7,4, contenant 0,01 M de chlorure de sodium, 0,01 M de 2-amino- 2-(hydroxyméthyl)-propane-1,3diol et 1,5 mAI de chlorure de magnésium.On laisse reposer la suspension pendant 30 minutes à 40C puis on la transfère dans un homogénéiseur (Dounce) à cylindre et piston de verre étroitement ajustés,qui est maintenu dans un bain d'eau glacée. lies cellules sont alors soumises à une action de cisaillement dans cet homogénéiseur jusqu'à un degré de lyse d'au moins 80 %, degré que l'on détermine en examinant au microscope des échantillons préle- vés de temps en temps. On centrifuge ensuite le lysat de cellules à 100.000 g pendant 30 minutes et on recueille le liquide surnageant limpide. Ce surnageant à les caractéristiques suivantes (1) Solubilité c'est une solution claire à l'examen visuel et elle reste claire lorsqu'on la concentre Jusqu'à 10 mg de protéinespar ml, par ultrafiltration suivie d'une reconstitution après lyophilisation et quand la teneur en chlorure de sodium est portée à 0,85 % en poids par volume; il traverse un filtre Millipore GS,ce qui indique l'absence de particules ayant une dimension supérieure à 0,22 micron. (2) Teneur en protéines environ 52 % du poids sec de matières solides y com pris les sels tels que définis précédemment; cette teneur est évaluée par la méthode de Lowry (référence N04) dans laquelle l'intensité de la coloration bleue produite est mesurée avec un spectrophotomètre & BR 750 millimicrons. (3) Teneur en lipides environ 7,4 % du poids sec de matières solides y com pris les sels tels que précédemment définis. Cette teneur est évaluée d'après la solubilité dans le chloroforme (référence N05). On hydrolyse un échan tillon de l'extrait dans de l'acide chlorhydrique normal pendant 2 heures à 1000C, puis on lyophilise l'hydrolysat et on soumet le résidu a' une extraction avec un mélange de 3 parties en volume de chloroforme et 1 partie en volume de méthanol ; on extrait en suite la solution avec 1 volume d'eau, on lyophilise la phase chloroformique et on pèse le résidu. (4) Teneur en glucides environ 1,3 % du poids sec de matières solides y compris les sels tels que définis précédemment.La teneur totale en glucides est déterminée par la méthode à l'anthrone (référence N06). On traite un échantillon à 1000C pendant 10 minutes avec de l'acide sulfurique à 85 % en présence d'anthrone et on mesure l'intensité de la couleur produite avec un spectrophotomètre à 620 millimicrons. (5) Poids moléculaire le mélange des constituants a un poids moléculaire, déterminé par des études d'ultracentrifugation (réfé rence Nô?), qui se situe pour la majeure partie d'entre eux aux environ de 100.000, bien qu'il y ait une certaine quantité de matière de poids moléculaire plus élevé,allant jusqu'à 1.000.000 mais ne dépassant pas cette valeur. (6) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide l'extrait se révèle comme étant un mélange de nombreuses protéines ; il se sépare en vingt bandes environ, mais dont aucune n'indique la présence d'un constituant prédominant. Ces résultats ont été obtenus par les méthodes de Davis et de ses collaborateurs (référence N02). EXEMPLE 2 : Préparation d'un extrait antigénique soluble de lymphocytes de sang humain par extraction chimique. On isole les lymphocytes d'un sang humain frais par la méthode qui a été décrite dans l'exemple 1. On refroidit à 40C la suspens ion des lymphocytes ainsi obtenue et on la traite avec 1 volume d'une solution aqueuse,froide,de thiocyanate de potassium 2 M. il se forme aussitôt un gel qu'on laisse reposer pendant une heure à 4 C puis que lton disperse dans 4 volumes de soluté physiologique normal tamponné au phosphate, dans un homogénéiseur de Silverson (marque déposée, Silverson hlachines Ltd., Londres), et on centrifuge la suspension à 100.000 g pendant 30 minutes. L'ion thiocyanate est éliminé par dialyse du surnageant contre un soluté physiologique tamponné au phosphate, et tout précipité éventuellement formé est rejeté. Pour terminer, la solution est filtrée sur un filtre Millipore GS à pores de 0,22 micron et le filtrat est recueilli. Ce filtrat a sensiblement les mêmes propriétés que l'extrait de l'exemple 1,sauf que la teneur en protéines est plus élevée. EXEMPLE 3 : Préparation d'immunoglobuline G immunodépressive -antihumaine g non-toxique. On utilise un extrait antigénique soluble de lymphocytes de sang humain de l'exemple 1 ou de exemple 2 pour produire un antisérum de lapin immunodépresseur antihumain. On immunise selon le programme de Lance des lapins blancs de Nouvelle Zélande et des lapins de Californie pesant de 2,2 à 3 kg. On effectue une injection intrauusculaire (I.X.) de l'antigène à 10 m4/ml dans l'adjuvant complet de Freund (F.C.h.) auquel on a ajouté 100 unités par ml de streptomycine et de polymyxine, puis on effectue successivement quatre injections intraveineuses (I.V.),suivant le programme qui est indiqué dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Programme des injections Jour antigène Saignée O I.M. 0,5 ml + 0,5 ml FCA - 14 I.V. 0,5 ml 21 I.V. 0,25 ml 10 ml 28 I.V. 0,25 ml 35 I.V. 0,5 ml 10 ml 46 - 15-20 ml A chaque saignée le sang retiré des animaux est rassemblé et on le laisse coaguler. Le sérum est inactivé par chauffage à 560C pendant 30 minutes, puis on le laisse refroidir et on procède à son fractionnement en le traitant d'abord à deux reprises avec du sulfate d'ammonium pour enlever la majeure partie de l'albumine et en absorbant ensuite les protéines autres que l'immunoglobuline G sur le produitDEAE - Sephanex. L'A.L.G. ainsi obtenue présente les caractéristiques suivantes : (i) Poids moléculaire: 160.000, déterminé par la méthode d'Balsall (référence N 1); au cours de l'ultracentrifugation, un seul com posant est observé, qui se sédimente en une fraction 7 S (unités Svedberg). (2) Toxicité (a) On titre des dilutions en série de l'A.L.G. par l'agglutination a 'hématies humaines (référence N 10 );à des dilutions de protéines jusqu'à 7 pour 24, l'A.L.G. (initialement à 2 % de protéines en poids par volume) agglutine les hématies humaines. (b) On titre des dilutions en série de l'A.L.G. par l'agglutination de thrombocytes humains (référence N 11);d des dilutions de protéines jusqu'à 1 pour 12 l'.L.G. (initialement à 2 % de protéines en poids par volume) agglutine les thrombocytes humains. (c) On injecte par la voie intrapéritonéale à des souris blanches de Suisse des prélèvement de 1 ml contenant 60 mg d'.L.G. (poids sec), au bout de 18 heures on prépare des frottis de sang et on sacrifie les souris ; les frottis présentent au microscope un nombre de thrombocytes normal et on n'observe pas d'hémorragies à l'examen après dissection. (3) Cytotoxicité sur des dilutions en série de l'A.L.G. on examine le pouvoir d'attaque des membranes de lymphocites, qui rend les membranes perméables au bleu de trypan, en présence du complément de cobayes (référence N012); à la dilution de 1 dans 48, la solution d'.L.G. (initialement à 2 % de protéines en poids par volume) rend perméables 50 56 des lymphocytes du milieu exa miné. (4) Inhibition de la formation de rosaces sur des dilutions en série de l'.L.G. on examine le pouvoir d'inhibition de la formation de rosaces d'hématies de mouton avec des lymphocytes humains (référence N013);à une dilution de 1 dans 32.000, l'A.L.G. (initialement à 2 56 de protéines en poids par volume) inhibe la formation de rosaces au taux de 25 %; EXEMPLE 4 : Préparation d'un extrait antigénique soluble de lymphocytes de sang humain par lyse hypotonique. On isole les lymphocytes de sang humain frais selon la méthode qui a été décrite dans l'exemple 1 on soumet la suspension de cellules,qui contient 6 x 10 lymphocytes, à une lyse hypotonique par la méthode de l'exemple 1 et on sépare les débris de cellules solides par centrifugation à 100.000 g pendant 30 minutes.On recueille le surnageant clair et on le filtre sur une membrane Millipore GS à pores de 0,22 micron, puis on dialyse le filtrat contre un soluté physiologique tamponné au phosphate, comprenant une solution aqueuse d'un mélange de 0,85 56 en poids par volume de chlorure de sodium, 0,107 56 de phosphate disodique anhydre et 0,039 56 de phosphate monosodique , la dialyse étant poursuivie pendant 24 heures à la température de 40C, et on le concentre ensuite par ultrafiltration sur une membrane Diaflo UM 10 Amicon N.V.Mechelaarstraat 3 Oosterhout (B.B.), Hollande, qui arrête les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 10.000. La teneur en matières solides de l'extrait, à l'exclusion des sels tels qu'ils ont été définis précédemment, comprend 80 % de protéines par rapport au poids sec de 11 extrait, avec de petites quantités de lipides , de glucides et d'acides nucléiques. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de cet extrait présente une large bande d'absorption aux environs de 240-320 mF, avec une bande plus intense au voisinage de 210 TL. Le rapport entre les densités optiques. à 280 mp et 260 mp est égal à 0,85.A l'ultracentrifugation l'extrait se présente comme étant un mélange complexe dont la plupart des constituants ont des poids moléculaires compris entre 50.000 et 150.000. EXEMPLE 5 : Préparation d'un extrait immunogene soluble de lymphocytes cultivés, provenant initialement de sang humain, par lyse hypotonique. On recueille les lymphocytes de sang humain et on les purifie conme dans l'exemple I puis on fait des cultures de ces cellules après stimulation avec de la phytohémagglu tlnine, suivant aes méthodes bien connues (voir la référence N014 à la fin de la description). On maintient les cultures dans un milieu contenant 10 % en poids par volume de sérum de veau foetal et on les récolte suivant les besoins. Les cellules sont lavées à plusieurs reprises dans une solution aqueuse à 0,85 % en poJ ar volune de chlorure de sodbn avant d'être soumises à la lyse. On procède à la lyse des lymphocytes de la manière qui a été décrite dans l'exemple 1 puis on recueille l'extrait soluble, on le dialyse et on le soumet à l'ultrafiltration comme dans l'exemple 4. L'échantillon obtenu a une teneur en protéines de 75 % de son poids sec à l'exclusion des sels tels qu'ils ont été définis. Le spectre ultraviolet présente un maximum d'absorption au voisinage de 280 Ap? typiquo des pro téines et indiquant que laeteneur en nucléotides est faible. On observe à 1 'ultracentrifugation analytique une gamme de poids moléculaires, la plupart des constituants ayant des poids moléculaires voisins de 60.000 (voir la référence N01), tandis que l'électrophorèse sur un gel de polyacrylamide (référence N02) indique que l'extrait est un mélange de plusieurs protéines et qu'il est semblable pour 11 essentiel à l'extrait de l'exemple 2. EXEMPLE 6 : Préparation de sérums immunodépresseurs non-toxi ques, contre les lymphocytes de sang humain,avec l'extrait qui a été obtenu par lyse hypotonique. On injecte à trois lapins, comme dans l'exemple 3, un extrait soluble de lymphocytes de sang humain qui a été préparé de la manière décrite dans exemple 4. On recueille le sang 46 jours après le début du programme d'immunisation, on le coagule et on inactive comme dans l'exemple 3 les sérums obtenus. Les sérums ne provoquent pas d1hémorragies internes lorsqu'ils sont injectés à des souris (1 ml par voie intrapéritonéale) et ils ne diminuent pas non plus la teneur en thrombocytes du sang de la souris. Ils n'agglutinent pas les thrombocytes humains et dans les tests d'agglutination des lymphocytes, de cytotoxicité, d'inhibition de la formation de rosaces et d'hémagglutination, ils donnent les titres qui sont indiqués dans le tableau II ci-dessous.Ces essais ont été effectués comme dans l'exemple 3, avec des cellules humaines, sauf que les titres représentent des dilutions des sérums entiers, non fractionnés. TABLEAU II Lapin Agglutination Hémagglutination Cytotoxicité Inhfbi- des tion de la lymphocytes formatai de ~~~~~~~~~~~~~~~~ de rosaces 1 1/32 1/192 1/48 1/32000 2 1/32 1/24 > 1/2 1/16000 3 1/96 1/12 > 1/2 1/8000 Les sérums ont aussi été examinés par immunofluorescence en vue de déterminer la plus forte dilution pour laquelle on pourrait observer que des anticorps de ces sérums se lient aux lymphocytes humains, les anticorps étant décelés au moyen de gamma-globuline chèvre-anti-lapin marquée à la fluorescéine. Dans cet essai, les sérums 1, 2 et 3 ont donné les titres respectifs 1/32, 1/256 et 1/256. EXEMPLE 7 : Préparation de sérums immunodépresseurs non toxiques, contre les lymphocytes de sang humain, avec l'extrait préparé au thiocyanate. On centrifuge à 500 g pendant 10 minutes, pour réaliser la sédimentation des cellules, une suspension de cellules contenant 5 x îo9 lymphocytes de sang humain, obtenue de la manière qui a été décrite dans l'exemple 1. On rejette le surnageant et on remet les cellules en suspension dans une solution aqueuse 2 M de thiocyanate de potassium à 4 C, puis on procède aussitôt à la lyse des cellules, ce qui donne une suspension très visqueuse, qu'on dilue avec un égal volume d'une solution aqueuse à 0,85 % en poids par volume de chlorure de sodium, en agitant énergiquement, dans un homogénéiseur de Silverson (Silverson Machines Ltd., Londres).On centrifuge ensuite la suspension à 100.000 g pendant 30 minutes et on fait passer le surnageant à travers une membrane Millipore GS à pores de 0,22 micron, toute l'opération étant effectuée à la température de 4 C. On élimine le thiocyanate par une dialyse poussée contre une solution aqueuse à 0,85 % en poids par volume de chlorure de sodium puis on injecte 1' extrait à deux lapins, comme dans 11 exemple 3. On recueille le sang 46 jours après le début du programme d'immunisation, on le coagule et on inactive comme dans l'exemple 3 les sérums ainsi obtenus. Ces sérums ont des propriétas semblables à celles des sérums de l'exemple 6, sauf qu'ils n'agglutinent pas les érythrocytes humains et que les titres, dans tous les essais immunologiques contre les lymphocytes, sont un peu inférieurs. Les titres qui ont été obtenus dans les divers essais sont donnés dans le tableau III ci-dessous. TABI AU III Lapin Agglutination Zémagglutina- Cytotoxi Inhibition des tion cité de la forma lymphocytes tion de rosaces ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ rosaces 1 1/32 > 1/6 > 1/2 > 1/4000 2 1/8 > 1/6 > 1/2 > 1/4000 les sérums ont aussi été examinés par immunofluorescence comme dans l'exemple 6. Les titres qui ont été obtenus dans cet essai sont respectivement 1/128 et 1/32. EXEMPLE 8 : Médicament contenant 1' immunoglobuline G antilymphocytaire (A. L. G.) L'A.L.G. qui a été obtenue de la manière décrite dans l'exemple 3, à la concentration de 7 % en poids par volume dans une solution aqueuse à 0,85 % en poids par volume de chlorure de sodium et à laquelle on a ajoute du mertbiolate à la concentration de 1/10.000 en poids par volume, est stérilisée par filtration sur une membrane Millipore GS à pores de 0,22 micron et elle est mise aseptiquement dans des ampoules, chaque ampoule contenant 100 mg de protéines d'A.L.G. (détermination par l'essai au biuret, voir référence N 16).Sur des échantillons de ce produit mis en ampoules, on a effectué des essais de stérilité, de pyrogénicité et.de toxicité anormale sur des animaux de laboratoire, et un certain nombre d'essais normalisés d'activité et de réactions non-spécifiques. Ce produit convient pour l'administration par la voie intraveineuse à une dose de 20 mg par kilogramme du poids du malade. Références (Réf). Réf. 1 : Halsall; Nature; 215: 880, 1967 Réf. 2 : B.J. Davies; 1964 Ann. N.Y. Acad.Sci. 121 : 404 Réf, 3 : E. Layne "Methods in Enzymology" Vol. III: p.454, Ed. Colowick & Kaplan, Academic Press. Réf. 4 : O.H. Lowry et al; 1951, J. Biol. Chem. 193: 265. Réf. 5 : Folch, Lees & Sloane Stanley ; Ded. Proc., 13 209, 1954. Réf. 6 : Dreywood; Ind. Eng. Chem. (Anal. Ed.); 18: 499,1946. Réf. 7 : E.M. ace et al; 1968; Immunology 15: 571 Réf. 8 : "Handbook of Experimental Immunology" Ed. D.M. Weir, Blackwell Scientific Publications Ltd., Oxford, 1967. Réf. 9 : A.E.R. Thomson et al; 1966 Brit. J. Haematol. 12: 433 Réf. 10 p. ex. K.James et al; 1969 immunochemistry6:659 Réf. 11: Réf. 12 : H.Ri. Abaza et al; 1966 Rev. Franc. Etud. Chem. Biol. 11: 821 Réf. 13 : J.F. Bach et al; 1969 Transplantation 8: 265 Réf. 14 : "Cell & Tissue Culture" by J. Paul, 3rd édition, E. & S. Livingstone, Edinburgh & BR London, 1965. Réf. 15 : Steinbuch and Audrin; 1969 Arch. Biochem, Biophys. 134: 279 Réf. 16 : Beggett-Bailey; 1967 "Techniques in Protein Chemistry" Elsevier. Réf. 17 : Nezlin. R.S.; 1970 "Biochemistry of Antibodies", Plenum Press. pp.28-29. REVENDICATIONS 1.- Un procédé de préparation d'un sérum antilymphocytaire immunodépresseur non-toxique, caractérisé par le fait que l'on injecte à un mammifère autre que l'homme une préparation stérile comprenant un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain, préparation qui est isotonique avec le sang du mammifère choisi, on retire le sang de l'animal, on en récupère le sérum et on rend ce sérum stérile et isotonique avec le sang humain. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lton injecte une préparation comprenant principalement un mélange de composants macromoléculaires dont chacun a un poids moléculaire inférieur à 1.000.000 et supérieur à 10.000, ce mélange ayant une teneur en protéines comprise entre 50 et 100 %, une teneur en lipides inférieure à 30 % et de préférence inférieure à 10 * et une teneur en glucides inférieure à 20 %, pourcentages qui sont rapportés au poids de l'extrait sec, non compris les sels tels qu'ils ont été définis. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on injecte l'extrait par la voie hypodermique. 4.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on injecte l'extrait par la voie intraveineuse ou intramusculaire. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la préparation comprend une émulsion eau-dans-l'huile dont la phase dispersée est formée par l'extrait. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on injecte l'extrait à un mammifère de l'ordre des Périssodactyles ou de l'ordre des Artiodactyles. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on injecte l'extrait à un cheval. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'on inactive le sérum en le soumettant à une température de 50 à 65 C. 9.- Procédé selon l'une quelconque des reven dications 1 à 8, caractérisé par le fait que l'on prépare l'extrait immunogène en soumettant à une lyse des lymphocytes de sang humain, en isolant l'extrait soluble du lysat et en rendant cet extrait stérile et isotonique avec le sang du mammifère qui doit autre utilisé. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que les lymphocytes de sang humain sont obtenus à partir de sang frais. 11.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que les lymphocytes sont obtenus à partir d'une culture cellulaire de sang humain. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait que l'on procède à la lyse des lymphocytes par voie mécanique, au sein d'un tampon. 13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait que l'on effectue la lyse par des ultrasons au sein d'un tampon. 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait que l'on effectue la lyse avec un agent ayant une action physicochimique, associé à une agitation mécanique. 15.- Procédé selon la revendication 14, carac térissé par le fait que l'agent physicochimique comprend un tampon hypertonique en solution aqueuse. 16.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que 11 agent physicochimique comprend une solution aqueuse d'un sel de l'acide thiocyanique. 17.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'agent physicochimique comprend un tampon hypotonique en solution aqueuse. 18.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 17, caractérisé par le fait que l'on isole l'extrait soluble du lysat par centrifugation. 19.- Procédé selon la revendication 18, caractérisé par le fait que l'on centrifuge à une accélération centrifuge de 60.000 à 150.000 g pendant 20 à 50 minutes. 20.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 19, caractérisé par le fait que l'on procède une filtration sur une membrane après avoir centrifugé. 21.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 19, caractérisé par le fait que l'on stérilise I' extrait en le filtrant sur une membrane. 22.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 21, caractérisé par le fait que les opérations de préparation de l'extrait immunogène sont exécutées aux environs de 4 C. 23.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé par le fait que l'on fractionne le sérum antilymphocytaire en vue d'obtenir une immunoglobuline G antilymphocytaire stérile, non-toxique et immunodépressive chez l'homme et isotonique avec le sang humain. 24.- Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que l'on sépare les globulines des albumines en fractionnant le sérum avec un sel et on isole l'immunoglobuline G. 25.- Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que l'on fractionne le sérum avec du sulfate d'ammonium. 26.- Procédé selon lune quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé par le fait que l'on isole l'immunoglobuline G des globulines par une technique discontinue, au moyen d'un échangeur d'anions. 27.- Procédé selon la revendication 26, caractérisé par le fait que l'on utilise un échangeur d'anions à base d'un polysaccharide, en particulier la DEAEcellulose ou le produit DEAE-Sephadex. 28.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé par le fait que l'on isole l'immunoglobuline G des globulines par immuno-absorption. 29.- Un procédé de préparation d'un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain, propre à la formation, sur un mammifère autre que I'homme, d'un sérum antilymphocytaire immunodépresseur, non-toxique, procédé caractérisé en ce que l'on soumet à une lyse des lymphocytes de sang humain, on isole l'extrait soluble du lysat et on rend cet extrait stérile et isotonique avec le sang du mammifère devant eAtre utilisé. 30.- Un procédé de préparation d'une immunoglobuline antilymphocytaire immunodépressive, non-toxique, caractérisé par le fait que l'on fractionne un sérum antilymphocytaire, ou bien le sang contenant ce sérum, qui a été formé contre un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain sur un mammifère autre que l'homme. 31.- Un sérum antilymphocytaire immunodépresseur, stérile et non-toxique, qui a été formé contre un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain sur un mammifère autre que l'homme, ce sérum étant isotonique avec le sang humain. 32.- Un extrait immunogène soluble, stérile, de lymphocytes de sang humain, propre à la formation, sur des espèces de mammifères autres que l'homme, d'un sérum antilymphocytaire immunodépresseur, non-toxique. 33.- Un extrait immunogène soluble, stérile, de lymphocytes de sang humain, comprenant principalement un mélange de composants macromoléculaires dont chacun a un poids moléculaire inférieur à 1.000.000 et supérieur à 10.000, ce mélange ayant une teneur en protéines comprise entre 50 et 100%, une teneur en lipides inférieure à 30 % et une teneur en glucides inférieure à 20 O/o, pourcentages qui sont portés au poids de l'extrait sec, non compris les sels tels qu'ils ont eté définis. 34.- Une immunoglobuline G antilymphocytaire immunodépressive, stérile et non-toxique, qui a été obtenue par fractionnement d'un sérum antilymphocytaire immunodépresseur non-toxique, formé contre un extrait immunogène soluble de lymphocytes de sang humain sur un mammifère autre que l'homme. 35.- Médicament liquide stérile, comprenant une immunoglobuline G antilymphocytaire ou un sérum antilymphocy- taire selon la revendication 34 ou 31, respectivement, en association avec du glycocolle comme stabilisant, médicament qui est isotonique avec le sang humain. 36.- Médicament lyophilisé stérile, comprenant une immunoglobuline G antilymphocytaire ou un sérum antilymphocytaire selon la revendication 34 ou 31, respectivement, en association avec dl glycocolle comme stabilisant.