Brevet FR2070093A1 — publié le 19710910

La présente invention concerne des enzymes et plus particulièrement une substance enzymatique qui a une activité fi-brinogénolytique et fibrinolytique. Cette substance enzymatique a aussi des effets anticoagulants. On est porté à croire qu'il 5 en est ainsi pour partie en raison de son activité fibrinogénoly-tique (c'est-à-dire que les effets anticoagulants paraissent résulter partiellement de la desctruction du fibrinogene et de l'effet inhibiteur des produits de dégradation du fibrinogene sur la formation de la fibrine à partir du fibrinogene subsistant), et 10 pour partie en raison de la destruction des autres facteurs de coagulation sensibles à une attaque protéolytique, comme les facteurs Y et VIII. On a en effet découvert que l'appareil sporifère ou chapeau mûr du champignon Armillaria mellea est la source d'une 15 utile substance enzymatique qui fait l'objet de la présente invention. Armillaria mellea croît en parasite ou saprophyte sur les arbres partout en Angleterre et dans diverses régions du monde. L'aspect de ce champignon est en résumé le suivants Chapeau d'un diamètre de 5 à 15 cm, d'abord arrondi, 20 puis aplati et finalement creux au centre. Coloration variant du jaunâtre au brun foncé. Pied d'une longueur de 7,5 à 15 cm et d'une épaisseur pouvant atteindre 13 mm. Anneau blanchâtre. Lamelles de couleur blanchâtre à chair, adnées ou légèrement décurrentes. Spores incolores au microscope,de 8 à 9 microns x 5 à 6 microns. 2? Les fructifications sont récoltées dans les conditions les plus favorables pour l'obtention de la substance enzymatique environ du mois d'août jusqu'aux premières gelées. Après la récolte, les fructifications doivent être conservées à environ -25°C ou même à une température plus basse jusqu'à exécution du procédé d'isole-30 ment décrit ci-dessous. On a découvert que la substance enzymatique ne peut être obtenue de tous les spécimens d'Armillaria mellea. Ainsi, on a obtenu la substance enzymatique à partir d'un peu plus d'un tiers (environ 50 sur un total d'eiviron I4O) des échantillons du champi-35 gnon cueilli en 1969 en Angleterre. Les raisons pour lesquelles certains champignons ne contiennent pas la substance enzymatique n'ont pas été élucidées. Les échantillons d'Armillaria mellea accessibles au public et apportant la substance enzymatique sont; (1) le spécimen identifié sous l'indice FPRL 6H par le Ministry !fO of Technology, Forest Products Research Laboratories, Princes 70 34803 2 2070093 Risborough, Aylesbury, Buckingham.sh.ire, Angleterre (référence de la Demanderesse ACC 3659) et mis par ce service à la disposition _ du Public, et (2) le spécimen identifié simplement par le nom "Armillaria mellea" 5 par le Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas (référence de la Demanderesse ACC 3253)» et mis à la disposition du Public par cet organisme. L'invention a pour obj.et cette substance organique qui est une peptidyl-peptide-hydrolase (ou peptide-peptido-hydro-10 lase) et qui est appelée ci-après"protéase AM". La protéase AM a les propriétés suivantes. (1) Elle catalyse la dégradation hydrolytique du fibrino- gène et de la fibrine, c'est-à-dire qu'elle a une activité fibrino-génolytique et une activité fibrinolytique respectivement; l'activi-15 té de la protéase AM in vitro a été déterminée par les essais classiques suivants. (a) Incubation de la protéase AM avec du fibrinogene purifié et addition de thrombine aux aliquotes à divers intervalles. Le temps nécessaire pour faire disparaître la fonction de coagula- 20 tion est une indication de l'activité fibrinogénolytique. (b) Incubation de caillots de fibrine,formés au préalable avec de la protéase AM, et mesure de la vitesse de disparition du caillot. La mesure peut être facilitée par la préparation de caillots à partir de fibrinogene marqué au i12^ et par mesure du 25 dégagement de la radio-activité. On peut déterminer ainsi un indice d'activité fibrinolytique. (c) Mélange de la protéase AM, de thrombine et de fibrinogène et observation de la durée d'existence du caillot formé. On peut ainsi mesurer l'activité fibrinogénolytique et l'activité fi- 30 brinolytique de la protéase AM. On détermine l'activité in vivo de la protéase AM chez les animaux d'essais (lapins) en mesurant l'effet sur le taux de fibrinogène chez les animaux et sur le taux de protéase dans le plasma. On peut déterminer la première grandeur en mesurant l'ac-35 croissement de la durée de coagulation du sang complet ou du plasma en comparaison du temps de coagulation d'un témoin ou du temps de coagulation avant le traitement*lors d'une addition d'une quantité normalisée de thrombine. Cette quantité peut être déterminée comme décrit en l(b). M) (2) La protéase AM se comporte comme un constituant uni 70 34803 3 2070093 que lors du passage sur une colonne d'un gel de dextrane réticulé (celui vendu sous le nom de "Sephadex" G 150) qui est perméable aux protéines d'un poids moléculaire atteignant ifOO.OOO. Le volume de tampon (éluant)dans lequel la protéase AM quitte la colonne 5 correspond à celui nécessaire pour éluer une protéine d'un poids moléculaire d'environ 30«000- Cet éluant est un tampon 0,3M NaCl 0,05 M tris(hydroxyméthyl)aminométhane/HCl à pH 7,4 de la composition suivante: (l'élution étant exécutée à environ 2°C) Chlorure de sodium 17 >5 g/litre dans l'eau 10 Tris(hydroxyméthyl)aminométhane 6,05 g/litre dans l'eau Acide chlorhydrique 1M en quantité suffisante pour porter le pH à 7,4. (3) La protéase AM se comporte comme un constituant uni que lors de la sédimentation à 26 x lO^xg dans la cellule d'une 15 ultracentrifugeuse analytique. Le coefficient de sédimentation de la protéase AM dans le tampon 0,3M NaCl 0,05M tris(hydroxyméthyl) aminométhane/HCl à pH 7,4/ivoir (2) ci-dessus/ à 20°C, c'est-à-dire la constante S£qW est d'environ 2,35 x ÎO""^ seconde . (if) Un seul constituant est décelable par électrophorèse 20 de la protéase AM dans un gel de polyacrylamide et ce constituant a une migration correspondant à une Y-globuline. Le gel de polyacrylamide présente un rapport acrylamide : bisacrylamide de 150:1 et 1'électrophorèse est exécutée pendant 1 heure à raison p "" p ^ de 2 mA/em , le tampon utilisé ,/pH ^,3» p-alanine-acide acétique 25 (0,3M27 consistant en p-alanine (26,73 g/litre dans de l'eau) et étant ajusté jusqu'à un pH de *f,3 par addition d'acide acétique glacial. (5) L'amino-acide N-terminal de la protéase AM est l'iso- leucine. 30 (6) La protéase AM dégrade facilement la caséine à pH 7 en donnant des fragments solubles dans l'acide trichloro-acétique, et le degré de digestion est beaucoup moindre que celui assuré par la trypsine, la chymotrypsine ou la plasmine. La protéase provoque une dégradation faible de l'albumine du sérum ou de la Y-globuline 35 même lors d'une incubation prolongée. Elle provoque une dégradation importante du fibrinogène. Elle n'a aucune action sur les substrats de bas poids moléculaire (par exemple l'ester méthylique de l'a-N-acétylglycyl-L-lysine, l'ester méthylique de l'a-N-acétyl-L-lysine, l'ester méthylique de l'a-N-a-toluènesulfonyl-L-arginine, kQ l'ester éthylique de l'a-iï-acétyl-L-tyrosine ou l'ester éthylique du 70 34803 2070093 L-tryptophane) qui sont d'usage courant pour caractériser les enzymes du type de la trypsine ou de la chymotrypsine. Cet enzyme agit sur'la chaîne p de l'insuline oxydée et fait apparaître les radicaux amino terminaux- suivants: tyrosine, lysine et dans une 5 mesure limitée leucine, l'enzyme différant sous ce rapport aussi (voir ci-dessus) de la trypsine et de la chymotrypsine. La protéase AM isolée de la façon décrite ci-dessous se révèle essentiellement homogène eu égard aux critères biophysiques courants, à savoir les propriétés de sédimentation, les pro-10 priétés d'électrophorèse.et le comportement lors de la filtration sur gel ou dans une colonne échangeuse d'ions. Dans tous les cas, l'homogénéité se traduit par l'apparence d'une zone étroite de protéine présentant une répartition symétrique presque gaussienne autour d'un pico II est néanmoins possible que la protéase AM soit 15 vol mélange d'enzymes isofonctionnels étroitement apparentés. L'invention a aussi pour objet un procédé pour préparer la protéase AM suivant lequel, successivements (i) on broie ou on divise autrement en petites particules des fructifications mûres d'Armillaria mellea et on soumet le produit 20 à l'extraction par l'eau pour obtenir .un extrait aqueux; (ii) on précipite les protéines contaminantes non désirées de l'extrait aqueux au moyen d'au moins un solvant organique miscible à l'eau pour une valeur appropriée de la température, du pH et de la force ionique et on élimine les protéines précipitées 25 de manière classique; (iii) on précipite la protéase AM brute de sa solution par addition d'au moins un solvant organique miscible à l'eau à cette solution savoir la solution subsistant après élimination des protéines non désirées en (ii^/; 30 (iv) on purifie-partiellement la protéase AM brute par chromatographie, et (v) . on purifie la protéase AM impure résultante au moyen dsun tamis moléculaire. Il convient de noter que sauf indication contraire, 35 toutes les opérations ci-dessus sont exécutées à une température d'environ 2°C. Les opérations ci-dessus sont décrites plus en détail ci-après* (i) Gomme indiqué ci-dessus, les fructifications d'Armillaria mellea se trouvent généralement dans l'état conve-HO nable de maturité à la fin de l'été et en automne» Elles sont 70 34803 5 2070093 mûres d'août à novembre en Angleterre. A ce stade, les fructifications sont jaunes à brun foncé et sont plutôt plates ou légèrement déprimées. Comme on l'a indiqué, les fructifications peuvent être obtenues à partir des échantillons accessibles au public 5 n°ACC 3659 (FPRL 6H) et ACC 3253 ("Armillaria mellea" du Centraal-bureau voor Schlmnielcultures, à Baarn aux Pays-Bas) et constituent les sources de la protéase AM. Les fructifications mûres peuvent être homogénéisées avec de l'eau dans un mélangeur mécanique à une température de 2 à 4°C.Le 10 mélange est alors séparé par filtration ou centrifugation et les deux phases,(c'est-à-dire la phase aqueuse et la phase solide) sont conservées. La majeure partie de la protéase AM passe dans la phase aqueuse à ce stade. Eventuellement, la phase solide peut être, soit (a) lyophilisée, broyée avec du C02 solide puis extraite par 15 l'eau à une température de 2 à ^"C,- soit (b) broyée avec un abrasif approprié, comme du sable, et de l'eau à une température de 2 à k°C, le mélange résultant étant ensuite séparé par filtration ou centrifugation. Dans un cas comme dans l'autre, une certaine quantité de protéase AM est généralement obtenue dans le second extrait 20 aqueux. L'extrait aqueux ou les extraits aqueux combinés suivant le cas sont alors lyophilisés pour la conservation ou bien amenés directement au stade (ii). L'extrait aqueux peut s'assombrir dans une certaine mesure. Ce phénomène est probablement dû à l'action d'une polyphénol oxydase. Cet assombrissement peut être inhibé 25 par travail en atmosphère d'azote lorsque la chose est possible et par incorporation à l'eau d'extraction d'au moins un inhibiteur de tyrosinase, par exemple du benzoate de sodium 10"^ à 10" " M ou de l'ascorbate de sodium 10à 10-!+ M. (ii) Les solvants organiques miscibles à l'eau convenant 30 pour la précipitation des protéines indésirées sont,par exemple les alcanols comptant jusqu'à 3 atomes de carbone ou les alcanones comptant jusqu'à ^ atones de carbone, comme l'éthanol, le n-propa-nol, l'isopropanol ou l'acétone, de même que leurs divers mélanges» Ces solvants organiques peuvent être utilisés éventuellement avec 35 un éther dialkylique comptant jusqu'à 5 atomes de carbone, comme l'éther diéthylique. La précipitation est exécutée généralement de -10 à +10°C et en particulier de -2 à +2°C,à un pH de 5 à 7 suivant la nature du solvant mis en oeuvre. Il convient de ne pas utiliser un excès du solvant parce qu'il en résulte une précipita-ko tion de la protéase AM elle-même avec les protéines non dési 70 34803 6 2070093 rées. Les protéines.non désirées précipitées sont séparées de manière classique, par exemple par filtration ou centrifugation. (iii) Des solvants orgainiques appropriés pour la précipita tion de la protéase AM brute sont ceux indiqués en (ii). Les con-5 ditions de température et de pH sont semblables à celles précisées en (ii). La protéase AM brute qui est précipitée est recueillie de manière classique, par exemple par filtration ou centrifugation, après quoi elle est éventuellement et de préférence lavée avec un solvant convenable, comme de l'éthanol aqueux à 70$ volume/volume 10 glacé. La protéase ÀM brute peut éventuellement ensuite être soit (a) dissoute dans de l'eau distillée glacée puis lyophilisée, soit (b) lavée successivement de -2 à +2°C avec de l'éthanol anhydre et de l'éther diéthylique, puis séchée sous vide à une température de -2 à +2°C. 15 (iv) La protéase AM brute ainsi obtenue contient encore des quantités relativement importantes de protéines indésirées et certaines d'entre elles peuvent être éliminées par exploitation des différences d'affinité entre la protéase AM et les protéines indésirées à l'égard de certaines matières chromatographiques pro-20 presà l'échange de cations,, par exemple les matières contenant des radicaux carboxyméthyle unis à une matrice de polysaccharide, comme il en est de la carboxyméthylcellulose. La colonne est éluée à l'aide d'un tampon aqueux d'un pH de 5 à 7, par exemple de 6,et à une température d'environ 2°C. De manière générale, la protéase 25 M impure ainsi obtenue (contenant encore une certaine quantité de protéines non désirées) est éluée après le pic principal des protéines non désirées. Les fractions éluées contenant la protéase AM impure peuvent être concentrées, par exemple par dialyse sous pression. ' 30 (v) Les impuretés protéiques non désirées restantes sont éliminées de la protéase AM impure au moyen d'un tamis moléculaire à environ 2°C à l'aide d'une colonne ou d'une membrane d'un polymère hydrophile réticulé ayant les propriétés d'un tamis moléculaire pour un poids moléculaire d'environ 30.000. Les polymères ap-35 propriés sont?par exemple les dextranes réticulés, comme celui vendu sous le nom de "Sephadex" G75? les gels de polyacrylamides, comme celui vendu sous le nom de "Bio-gel", les agaroses, comme ceux vendus sous le nom de "Sagarose" et de "Sepharose". La protéase AM impure obtenue au stade (iv) est dissoute dans un petit volume d'un tampon à un pH de 6 à 8, par exemple de 7, comme 70 34803 7 2070093 un tampon C. 3M chlorure de sodiun-phosphate à pli 7 à environ 2°C, puis la solution est mise au contact de la colonne ou de la membrane à environ 2°C. La colonne est alors éluée à l'aide d'un tampon identique ou semblable à environ 2°C,de sorte que la protéa-5 se AM s'élève avant les protéines qui la contaminent. L'éluat contenant la protéase AM peut être concentré par dialyse sous pression. Dans le cas d'une membrane, les protéines contaminantes, le solvant et les électrolytes traversent la membrane, tandis que la protéase AM ne la traverse pas, et il est préférable d'empêcher la protéase 10 AM de sécher complètement,parce qu'elle est alors difficile à séparer de la membrane. La solution de protéase AM du côté où elle est appliquée sur la membrane peut alors être concentrée par dialyse sous pression. L'invention a de plus pour objet un procédé de pré-15 paration de la protéase AM suivant lequel successivement: (i) on homogénéise les fructifications mûres d'Armillaria mellea avec de l'eau dans un mélangeur mécanique à une température de 2 à 1+°C, on sépare le mélange résultant par filtration ou centrifugation de manière à obtenir une phase solide et une phase 20 aqueuse (A), et éventuellement, soit (a) on lyophilise la phase solide, on broie le produit lyophilisé avec du dioxyde de carbone solide et on soumet le produit résultant à l'extraction par l'eau à une température de 2 à ^°C pour former une phase aqueuse (B), soit (b) on broie cette phase solide avec du sable ou un abrasif 25 semblable et de l'eau à une température de 2 à 1f°C et on sépare le mélange résultant par filtration ou centrifugation de manière à obtenir une phase aqueuse (C)^ lorsque la chose est possible, les opérations indiquées en (i) étant éventuellement exécutées en atmosphère d'azote et l'eau d'extraction contenant éventuellement 30 au moins un inhibiteur de tyrosinase, par exemple du benzoate de sodium 10"3 à 10-ifM ou de l'ascorbate de sodium 10~3 à 10-lfM; (ii) on précipite les protéines contaminantes indésirées de la phase aqueuse (A), .(B). ou (C) en y ajoutant au moins un solvant organique choisi parmi les alcanols comptant jusqu'à 3 atomes 35 de carbone et les alcanones comptant jusqu'à ^ atomes de carbone • de même que leurs mélanges, éventuellement en présence d'un éther dialkylique comptant jusqu'à 5 atomes de carbone, à une température de -2 à +2°C et à un pH de 5 à 7, puis on élimine par filtration ou centrifugation les protéines non désirées précipitées de maniè-ifO re à obtenir une solution contenant la protéase AM; BÀD ORIGINAL 70 34803 8 2070093 (iii) on précipite la protéase AM brute par addition à cette solution comprenant la protéase AM d'au moins un solvant organique choisi parmi les alcanols comptant jusqu'à 3 atomes de carbone et les alcanones comptant jusqu'à !+ atomes de carbone,de même que leurs 5 mélanges,éventuellement en présence d'un éther dialkylique comptant jusqu'à 5 atomes de carbonepà une température de -2 à +2°C et à un pH de 5 à 7 et on collecte la protéase AM brute précipitée par filtration ou centrifugation, puis éventuellement et de préférence on lave la protéase AM brute au moyen d'éthanol aqueux à 70^ en 10 volume/Volume glacé et ensuite éventuellement soit (a) on dissout la protéase AM brute dans de l'eau distillée glacée et on lyophilise la solution, soit (b) on lave la protéase AM brute à une température de -2 à +2°C successivement avec de l'éthanol anhydre et de 1'éther "di éthylique, après quoi on sèche le produit sous vide à une température de -2 à +2°C; (iv) on purifie partiellement la protéase AM brute en la chromatographiant sur une matière chromatographique échangeuse de cations qui contient des radicaux carboxyméthyle unis à une matrice de polysaccharide, par exemple la carboxyméthylcellulose, 20 la matière étant éluée à l'aide d'un tampon aqueux d'un pH de 5 à 7, par exemple de 6,à environ 2°C, puis on concentre les fractions éluées contenant la protéase AM en exécutant une dialyse sous pression, et (v) on purifie la protéase AM impure ainsi obtenue en la 25 dissolvant dans un petit volume d'un tampon à un pH de 6 à 8, par exemple de 7, à environ 2°C, puis on amène la solution résultante à environ 2°C au contact d'une colonne ou d'une membrane d'un polymère hydrophile réticulé ayant des propriétés de tamis moléculaire pour un poids moléculaire d'environ 30.000 et ensuite, soit on élue 30 la colonne avec le même tampon ou un tampon semblable à environ 2°C et on concentre par dialyse sous pression l'éluat contenant la protéase AM, soit dans le cas de la membrane, on fait passer les protéines contaminantes et la majeure partie du solvant et de l'électrolyte à travers la membrane, puis on recueille la 35 résultante de protéase AM du côté d'application de la membrane et éventuellement on concentre cette solution- par dialyse sous pression. L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de la protéase AM,suivant lequel on cultive le mycélium **0 d'Armillaria mellea sur un milieu nutritif à environ 25°C, puis on BAD ORIGINAL 70 34803 9 2070093 isole la protéase AM du mycélium résultant par un procédé décrit ci-dessus, la différence étant qu'on remplace les fructifications mûres par le mycélium résultant. On peut cultiver le mycélium par culture en surface 5 à environ 25°C sur un milieu nutritif comprenant du maïs et du moût. Des échantillons appropriés d'Armillaria mellea sont par exemple ceux portant les numéros de référence ACC 3253 et 3659 de la Demanderesse. La protéase AM est de préférence conservée en solu-10 tion aqueuse à environ -25°C. L'invention a de plus pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant de la protéase AM,ainsi qu'un diluant ou véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques peuvent se présenter 15 sous une forme convenant pour la perfusion intraveineuse ou in-tra-artérielle systémique ou pour l'injection intraveineuse ou intra-artérielle locale. Des compositions appropriées sont des solutions aqueuses à injecter stériles contenant 0,05 à 1,0 mg de protéase AM par ml, par exemple 0,25 mg de protéase AM par ml. Les 20 compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent des diluants ou véhicules classiques et sont obtenues suivant les procédés traditionnels. Elles peuvent éventuellement contenir un agent stabilisant comme de l'albumine de plasma d'origine humaine et peuvent contenir éventuellement aussi un agent analgésique connu. 25 Les compositions pharmaceutiques de l'invention peu vent être utilisées: CL) pour le traitement de la thrombose artérielle; (2) pour le traitement de l'embolie artérielle, par exemple de l'embolie des artères rénales ou mésentériques et en •nartieulier 30 des artères de la jambe, de même que de l'aorte à sa bifurcation ; (3)pour le traitement de la thrombose veinale profonde,et (if)pour le traitement de l'embolie pulmonaire. Il est utile d'envisager le mode d'utilisation de la 35 protéase AM du point de vue: (a) de la thérapie systémique et (b) de la perfusion intravasculaire locale. (a) Thérapie systémique par la protéase AM La résistance du plasma humain à l'effet de la protéa-kO se AM varie d'un individu à l'autre et il en est de même de la ré 70 34803 10 2070093 sistance du plasma d'une espèce d'animal à l'autre. Cette résistance varie aussi chez le même individu à mesure du traitement systémique du patient humain par la protéase AM. Une certaine dose est nécessaire pour surmonter la majeure partie de l'inhibiteur 5 de circulation.Cette dose est déterminée surtout par titrage préalable L'effet qui est mesuré est un accroissement du temps de coagulation provoqué par la protéase AM par rapport au temps de coagulation provoqué par l'inhibiteur. Dans la plupart des cas, la dose est âe 0,05 à 5 mg âe protéase AM par kg et par heure. Lorsque la protéase AM a produit son effet optimum sur le plasma, l'effet peut être entretenu par des administrations intraveineuses intermittentes de protéase AM. Cette administration est nécessaire parce qu'on constate que l'inhibiteur pénètre à nouveau dans la circulation et ramène les temps de coagulation vers leur valeur normale, ce qui indique uneperte de l'activité enzymatique. On a constaté que l'activité thrombolytique se maintient par une administration d'environ 10$ de la dose initiale âe la protéase AM d'heure en heure pendant les deux heures suivantes, puis par une administration diminuée jusqu'à moins de 1% de la dose initiale de la protéase AM'toutes les deux ou trois heures. La réduction de la dose ramenée à une unité de temps nécessaire pour entretenir l'activité est due probablement à un ralentissement du retour de l'inhibiteur dans la circulation. La durée du traitement par la protéase AM dépend de l'âge du ou des caillots et de leur dimension. Le traitement systémique est poursuivi jusqu'à signe d'amélioration clinique, c'est-à-dire rétablissement de la pulsation et amélioration de la carnation du membre dans lequel la circulation a été entravée par la thrombose artérielle. Cb) Perfusion intravasculaire locale de protéase AM Une perfusion locale de protéase AM serait utile dans le cas d'une occlusion thrombotique d'une grosse veine périphérique âe même que dans des vaisseaux thromboses intervenant dans le circuit de Scribner pour la dialyse rénale ou dans un segment approprié d'une artère qui a été bloquée par un caillot. Une telle perfusion locale offre l'avantage que la dose pourrait être beaucoup moindre que pour la thérapie systémique, c'est-à-dire de 1/80 à 70 34803 ii 2070093 1/100 de la dose systémique . Il n'est, alors pas nécessaire d'apprécier la teneur en inhibiteur dans le sang du patient. Il est possible d'administrer une dose fixe, par exemple de 5 à 10 ml, (contenant 1/80 à 1/100 de la dose systémique) par injection à 5 l'aide d'un cathéter dans la partie de la veine distaie par rapport à l'occlusion. Le cathéter peut être laissé en place pendant 10 minutes avant que son contenu soit aspiré. L'opération peut être répétée deux ou trois fois et dans la plupart des cas, le caillot est alors dissous. La même technique convient dans le 10 cas d'une arthère accessible qui est totalement oblitérée par un caillot, la différence étant alors que le cathéter est inséré en position proximale par rapport aux segments oblitérés. La protéase AM,telle qu'elle est obtenue à partir d'Armillaria mellea.contient un métal. On a constaté que la pré-15 sence d'un métal,mais non nécessairement du métal présent dans la substance telle qu'elle est isolée cl ' Armill srl a mellea. est essentielle pour l'activité enzymatique. L'apoensyme peut être obtenu par traitement de l'holoenzyme, c'est-à-dire de la protéase AM, au moyen d'acide éthylènediamine tétra-acétique 10~^ M (pH 7) 20 pendant 30 minutes à 4°C. L'excès d'acide éthylènediaminé tétra-acétique est éliminé par dialyse contre un tampon 0,05 M tris-(hydroxyméthyl)aminométhane/HCl a pH 7,4 de la composition suivante: Tris(hydroxyméthyl)aminométhane 6,05 g/litre dans de l'eau Acide chlorhydrique 1M, quantité suffisante 25 pour porter le pH à 7,4 L'activité enzymatique peut être rétablie par traitement ++ de l'apoenzyme en milieu aqueux au moyen d'ions Co , Zn , Ni**, Fe++ et (une activité enzymatique étant dans ce dernier cas rétablie dans une moindre mesure) Cu : lesproduits obtenus 3^ par le traitement sont appelés ci-après "protéase AM modifiée". L'invention a de plus pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une protéase AM modifiée et un diluant ou véhicule inerte non toxique, pharaaceutiquement acceptable. Des compositions et modes d'administration convena-35 bles sont les compositions et modes décrits ci-dessus à propos de la protéase AM elle-même. L'invention est illustrée par les exemples suivants: 35XEMP LE 1 ■* Stade (i) 1+0 On homogénéise 100 g de fructifications mûres 70 34803 12 2070093 d'Armillaria mellea dans un mélangeur vendu sous le nom de "Atomix" M.S.E. à 2°C avec 150 ml d'eau. On mélange le produit d'homogénéisation avec encore 150 ml d'eau, on agite le nouveau mélange à 2°C pendant 30 minutes, puis on le centrifuge. On con-5 serve à 2°C la phase liquide collectée par centrifugation jusqu'à ce qu'on exécute la poursuite du traitement (voir ci-dessous). On lyophilise le résidu solide, on broie le produit en une poudre fine avec du dioxyde de carbone solide, on soumet le mélange à une extraction par 150 ml d'eau à 2°C et on centrifuge l'extrait. 10 On combine la fraction liquide collectée par centrifugation avec celle indiquée ci-dessus. (Note: l'extrait aqueux pourrait être utilisé directement au stade suivant ou bien pourrait être lyophilisé en vue de la conservation. La protéase AM est extraite en majeure partie, à savoir pour environ 75$>lors de 1'homogénéisait tion avec l'eau). Stade (ii) On ajuste la solution aqueuse à pH 6,0 au moyen d'acide acétique M et on refroidit la solution à 2°C au bain réfrigéré. On ajoute lentement à la solution aqueuse V?0 ml d'étha-20 nol à 2°C. On agite convenablement le mélange pendant l'addition, mais en évitant de former de la mousse. On maintient la température à 2°C. Au terme de l'addition, on maintient le mélange à 2°C pendant 1 heure, puis on sépare le précipité résultant par centrifugation (2000 x g) pendant 30 minutes à 2°C. On rejette 25 le résidu solide et on utilise la phase liquide centrifugée au stade (iii). Stade (iii) On introduit la fraction liquide centrifugée obtenue au stade (ii) dans le bain réfrigéré et on y ajoute lente-30 aient kÇO ml d'éthanol. Au cours de l'addition, on laisse la température tomber jusqu'à -5°C. Comme au stade (ii), on agite le mélange convenablement,mais en évitant de former de la mousse. Au terme de l'addition, on agite le mélange pendant 1 heure à -5°C. Ensuite, on centrifuge le mélange et on jette la fraction 35 liquide. On met le résidu solide en suspension dans 75 cil d'un mélange éthanol-eau à 70% volume/volume à -5°C et on centrifuge la suspension. On dissout le résidu solide à 2°C dans 30 ml d'eau, puis on congèle la solution à -70°C et on la lyophilise. ( Note: on retrouve à ce stade environ 90 à 95 % de l'acti-kQ vité initiale et le produit lyophilisé constitue environ 5% du 70 34803 13 2070093 poids de la matière de départ solide à ce stade, c'est-à-dire obtenue à partir de l'extrait aqueux). Stade (iv) On lave 100 g de carboxyméthylcellulose microgranu-5 laire "Whatman" (vendue sous le nom de "Whatman" CM 52) avec un tampon au citrate de sodium 0,025 M d'un pH de 6,0 jusqu'à ce que les liqueurs de lavage aient un pïï de 6,0. On prépare ce tampon en ajustant une solution de 7,35 g de citrate trisodique dihydra-té par litre d'eau jusqu'à un pH de 6,0 par addition d'acide chlorhydrique 2M. On tasse ensuite la carboxyméthylcellulose amenée à l'équilibre dans une colonne de 2,5 cm x 3° cm. On verse sur la colonne à 2°C 2 ml d'une solution comprenant 200 mg du produit lyophilisé du stade (iii) dans le tampon au citrate précité. On élue la colonne à 2°Q à l'aide du tampon au citrate à raison d'environ 20 ml/heure et on recueille des fractions de 5 ml. On observe l'absorbance de l'éluat en lumière de 280 nyu, ce qui permet de connaître la position de tous les pics protéiques (les protéines ont un pic d'absorption à 280 nyu). On observe l'activité enzymatique, c'est-à-dire l'activité protéolytique de la façon précisée en (l)(c). Un pic important d'une matière absorbant la lumière ultraviolette sans activité protéolytique précède le pic des fractions protéolytiquement actives (c'est-à-dire contenant la protéase AM), ces dernières fractions étant suivies d'autres fractions non protéolytiques qui absorbent la lumière ultraviolette. On concentre les fractions recueillies en les soumettant à une dialyse sous pression à 2°C au moyen de membranes vendues sôus le nom d'Amicon TJM10. ( Note: suivant la qualité de la carboxyméthylcellulose qui varie quelque peu, la matière pro.téique,y compris la protéase AM»peut être isolée dans un pic distinct avec un taux de purification d'environ 20 fois ou dans des circonstances moins favorables avec un taux de purification de 5 à 10 fois. On retrouve jusqu'à 90% de la protéase AM admise à la colonne. Il peut être nécessaire de modifier la concentration en sel de l'éluant pour compenser les variations de propriétés des différents lots de carboxyméthylcellulose). Stade (v) On fait gonfler 10 g du produit vendu sous le nom de "Sephadex" G75 en perles pendant 2*f heures dans un excès d'un tampon au chlorure de sodium 0,15M et au phosphate de sodium 0,05M d'un pH de 7,0. La composition du tampon est la suivante: 70 34803 2070093 Chlorure de sodium 8,53 g/litre dans de l'eau Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté 7,8 g/litre dans de l'eau Solution d'hydroxyde de sodium 2M peur ajuster le pH à 7,0. 5 On tasse le Sephadex gonflé dans une colonne de 1,5 cm x 20 cm et on lave la colonne avec environ 100 ml du tampon au phosphate à 2°C pendant 2 heures. On introduit dans la colonne 2 ml d'un échantillon concentré de l'éluat obtenu au stade (iv). On élue la colonne à 2°C à l'ai-10 de du tampon au phosphate ci-dessus à raison d'environ 20 ml/heure et on recueille des fractions de 2 ml. On observe l'activité protéolytique des fractions comme précisé au stade (iv) ci-dessus et on constate que l'activité se retrouve dans le premier pic de protéine éluée. Ce premier pic est suivi d'un second appor-15 tant une protéine non protéolytique. On combine les fractions actives , on les dialyse contre de l'eau à 2°C et on les lyophilise. Le produit lyophilisé obtenu est la protéase AM. ( Note: le taux de purification varie de 2 fois à 5 fois et il est en général d'autant plus faible que le stade (iv) est 20 plus efficace). Le taux de purification global aux cinq stades est de 300 fois à 500 fois et on retrouve ainsi environ 70# de l'activité protéolytique initiale. EXEMPLE 2 - 25 On prépare un inoculum de mycélium d'Armillaria mellea ACC 3253 de la façon suivante: On ensemence ml d'agar-agarsu malt à 2% dans un flacon de culture plat (200 ml) au moyen d'une boucle stérile apportant une certaine quantité d'une culture principale d'Armilla-30 ria mellea (entretenue) sur agar-agar au malt dans des tubes à essai. On soumet le flacon et son contenu à l'incubation à 25°C pendant l*f jours. On introduit dans le flacon de l'eau distillée stérile (30 ml) et au moyen d'une aiguille stérile, on gratte le mycélium aérien pour obtenir une suspension de ce mycélium. 35 On introduit des flocons de maïs cuits (200 g) dans des bocaux en verre (2 litres). On ajoute du moût de brasserie sans houblon (densité 1,182) en un volume suffisant pour que le niveau rejoigne la surface du maïs. On ferme chaque bocal au moyen dîune feuille d'aluminium, puis on passe les bocaux et leur kO contenu à l'autoclave à 120°C sous une pression de 1,05 kg/cm . 70 34803 15 2070093 Après refroidissement, on ajoute un supplément de moût de manière que le moût atteigne la partie supérieure de la couche de maïs. On passe les bocaux et leur contenu à l'autoclave à 120°C pendant 20 minutes. 5 Après refroidissement jusqu'à la température ambian te, on ensemence le milieu consistant en maïs et en moût au moyen de la suspension de mycélium d'Armillaria mellea (5 ml), on exécute l'incubation à l'obscurité à 25°C pendant 12 semaines et ensuite à la lumière pendant semaines. On racle la couche superficielle 10 de mycélium qui s'est formée et on la broie avec du dioxyde de carbone solide pour obtenir une poudre. On ajoute du tampon au phosphate d'un pH de 7,*f (2 ml) à la poudre. Le tampon est une solution de dihydrogénophosphate de sodium 0,1M et de chlorure de sodium 0,L5M dont le pH est ajusté a 7,b par une addition d'hy-15 droxyde de sodium en solution 2M. On centrifuge le mélange et on conserve le liquide surnageant. On obtient ainsi une solution aqueuse contenant la protéase AM. On ajoute 100 yulitres de la solution aqueuse ci-dessus contenant la protéase AM à 0,5 ml d'une solution de fibri-20 nogène humain (95$ de protéine coagulable, 3 mg/ml dans une solution physiologique tamponnée au phosphate contenant du phosphate 0,1M et ayant un pH de 7,1*), puis on ajoute 10 ^ulitres d'une solution de thrombine de boeuf (50° unités N.I.H./ml +) dans le même tampon. Le caillot formé subit la lyse en environ 90 secon-25 des. Ce résultat démontre que la solution aqueuse obtenue contient un enzyme fibrinolytique. + National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, E.U.A. 70 34803 2070093 REVENDICATION S. 1 - La protéase AM. 2 - Procédé pour préparer la protéase AM, caractérisé en ce que successivement: 5 (i) on broie ou on divise autrement en petites particu les des fructifications mûres d'Armillaria mellea et on soumet le produit à l'extraction par l'eau pour obtenir un extrait aqueux; (ii) on précipite les protéines contaminantes non désirées de l'extrait aqueux au moyen d'au moins un solvant organique mis- 10 cible à l'eau pour une valeur appropriée de la température, du pH et de la force ionique et on élimine les protéines précipitées de manière classique; (iii) on précipite la protéase AM brute de sa solution par addition d'au moins un solvant organique miscible à l'eau à cette 15 solution; (iv) on purifie partiellement la protéase AM brute par chromatographie, et (v) on purifie la protéase AM résultante au moyen d'un tamis moléculaire. 20 3 - Procédé pour préparer la protéase AM, caractéri sé en ce que successivement:' (i) on homogénéise les fructifications mûres d'Armillaria mellea avec de l'eau dans un mélangeur mécanique à une température de 2 à lf°C, on sépare le mélange résultant par filtration ou cen- 25 trifugation de manière à obtenir une phase solide et une phase aqueuse (A), et éventuellement, soit (a) on lyophilise la phase solide, on broie le produit lyophilisé avec du dioxyde de carbone solide et on soumet le produit résultant à l'extraction par l'eau à une température de 2 à *f°C pour former une phase aqueuse (B), 30 soit (b) on broie cette phase solide avec du sable ou un abrasif semblable et de l'eau à une température de 2 à *f°C, et on sépare le mélange résultant par filtration ou centrifugation de manière à obtenir une phase aqueuse (C)j lorsque la chose est possible, les opérations indiquées en (i) étant éventuellement exécutées en 35 atmosphère d'azote et l'eau d'extraction contenant éventuellement au moins un inhibiteur de tyrosinase, par exemple du benzoate de sodium 10~3 ^ io-IfM ou de l'ascorbate de sodium 10 à 10-lfM; (ii) on précipite les protéines contaminantes indésirées de la phase aqueuse (A), (B) ou (C) en y ajoutant au moins Tin sol- ifO vant organique choisi parmi les alcanols comptant jusqu'à 3 atomes 70 34803 2070093 de carbone et les alcanones comptant jusqu'à 4- atomes de carbone de même que leurs mélanges, éventuellement en présence d'un éther dialkylique comptant jusqu'à 5 atomes de carbone à une température de -2 à +2°C et à un pH de 5 à 7, puis on élimine par filtration ou 5 centrifugation les protéines non désirées précipitées, de manière à obtenir une solution contenant la protéase AM; (iii) on précipite la protéase AM .brute par addition à cette solution comprenant la protéase AM d'au moins un solvant organique choisi parmi les alcanols comptant jusqu'à 3 atomes de carbone et 10 les alcanones comptant jusqu'à atomes de carbone de même que leurs mélanges,éventuellement en présence d'un éther dialkylique comptant jusqu'à 5 atomes de carbone à une température de -2 à +2#C et à un pH de 5 à 7 et on collecte la protéase AM brute précipitée par filtration ou centrifugation, puis éventuellement et de préférence 15 on lave la protéase AM brute au moyen d'éthanol aqueux à 70$ en volume/volume glacé et ensuite éventuellement soit (a) on dissout la protéase AM brute dans de l'eau distillée glacée et on lyophilise la solution, soit (b) on lave la protéase AM brute à une température de -2 à +2°C successivement avec de l'éthanol anhydre et 20 de l'éther diéthylique, après quoi on sèche le produit sous vide à une température de -2 à +2°C; (iv) on purifie partiellement la protéase AM brute en la chromatographiant sur une matière chromatographique échangeuse de cations qui contient des radicaux carboxyméthyle unis à une ma-25 trice de polysaccharide, par exemple la carboxyméthylcellulose, la matière étant éluée à l'aide d'un tampon aqueux d'un pH de 5 à 7, par exemple de 6, à environ 2°C, puis on concentre les fractions éluées contenant la protéase AM en exécutant une dialyse sous pression, et 30 (v) on purifie la protéase AM impure ainsi obtenue en la dissolvant dans un petit volume d'un tampon à un pH de 6 à 8, à environ 2°C, puis on amène la solution résultante à environ 2°C au contact d'une colonne ou d'une membrane d'un polymère hydrophile réticulé ayant des propriétés de tamis moléculaire pour 35 un poids moléculaire d'environ 30.000 et ensuite, soit on élue la colonne avec le même tampon ou un tampon semblable à environ 2°C et on concentre par dialyse sous pression l'éluat contenant la protéase AM, soit dans le cas de la membrane, on fait passer les protéines contaminantes et la majeure partie du "solvant et de bO l'électrolyte à travers la membrane, puis on recueille la solution 70 34803 2070093 résultante de protéase AM du côté d'application de la membrane et éventuellement, on concentre cette solution par dialyse sous pression. - La protéase AM obtenue par le procédé suivant la 5 revendication 2 ou 3. 5 - Procédé pour préparer la protéase AM, caractérisé en ce qu'on cultive le mycélium d'Armillaria mellea sur un milieu nutritif à environ 25°C, puis on isole la protéase AM du mycélium résultant par le procédé suivant la revendication 2 ou 10 3, la différence étant qu'on remplace les corps fructifiants par le mycélium obtenu. 6 - La protéase AM obtenue par le procédé suivant la revendication 5* 7 - Composition pharmaceutique,caractérisée en ce 15 qu'elle comprend de la protéase AM et un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, inerte et non toxique. 8 - La protéase AM modifiée comme défini ci-dessus. 9 - Procédé de préparation de la protéase AM modifiée, caractérisé en ce qu'on traite X'apoenzyme correspondant à la ++ ++ ++ 20 protéase AM en milieu aqueux au moyen d'ions Co , Zn , Ni , Tt ^ rx Fe ou Cu . 10 - Composition pharmaceutique,caractérisée en ce qu'elle comprend de la protéase AM modifiée comme défini ci-dessus, ainsi qu'un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, 25 inerte et non toxique.