Brevet FR2106626A1 — publié le 19720505

La présente invention concerne une substance ayant des propriétés d'induction des enzymes et des propriétés hypotensives, et un procédé de préparation de cette substance . A la suite d'études comparatives sur les capacités d'induc-5 tion des enzymes d'animaux ordinaires et d'animaux exempts de germes, la Demanderesse a trouvé que la capacité d'induction des enzymes d'un animal exempt de germes est inférieure à celle d'un animal ordinaire comparable . Une autre étude portant sur le mécanisme mis en jeu a conduit à la découverte que lorsqu'on cultive 10 un microorganisme isolé des matières fécales d'un rat albinos ordinaire, il s'accumule, tant intracellulairement qu'extracellu-lairement , un nouveau peptide qui amplifie l'induction de la traru- • saminase de la tyrosine et influence également d'autres inductions d'enzymes par la cortisone . 15 Cette observation a été suivie d'autres recherches ,qui ont conduit à la découverte que la nouvelle substance ci-dessus (désignée ci-après par FAIC ou facteur amplificateur de l'induction par la cortisone) est douée non seulement d'une capacité d'induction d'enzyme ,mais possède aussi d'excellentes propriétés hy-20 pocensives , et que le PAIC est spécifiquement produit par une bactérie appartenant à la Famille des Entérobactériacées . Par le terme "induction par la cortisone" utilisée tout au long de la description et des revendications de cette invention , on entend une induction d'enzyme par la cortisone . 25 Le but de cette invention est de fournir un nouveau facteur amplificateur de l'induction par la cortisone, qui est un peptide. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation d'un nouveau facteur amplificateur de l'induction par la cortisone par culture d'un microorganisme de la Famille des 30 Entérobactériacées . Un autre but de l'invention est de fournir des facteurs amplificateurs purifiés A et N de l'induction par la cortisone,et un procédé permettant de les préparer . Un autre but de l'invention est de fournir un nouveau peptide 35 présentant une activité hypotensive . Ces buts ainsi que d'autres apparaîtront aux spécialistes à partir de la description qui suit . Dans les Figures annexées : la Fig.l est un spectre d'absorption ultra-violette dans l'eau 40 du facteur amplificateur de l'induction par la cortisone (FAIC) de l'invention ; 71 33524 2 2106626 la Fig.2 est un spectre.d'absorption infra-rouge du FAIC par la méthode du disque de KBr; la Fig.3 est ion spectre d'absorption ultra-violette dans l'eau du FAIC-A purifié ; ' 5 la Fig.4 est un spectre d'absorption infra-rouge du FAIC-A purifié par la méthode du disque de KBr; les Fig.5 à 7 sont des graphiques montrant que le FAIC possède une capacité d'induction de l'enzyme ; la Fig.8 est un diagramme d'élution du FAIC-N et du FAIC-A; 10 la Fig.9 (9-a,9~b et 9-c) est un graphique montrant l'activité hypotensive du FAIC-N, du FAIC-A et du FAIC-A purifié ; la Fig.lO est un chromatogramme sur papier du FAIC-A . La plupart des microorganismes de la famille des Entérobactériacées utilisables dans la présente invention sont connus des 15 spécialistes .La présente invention se propose de couvrir l'utilisation de n'importe quel microorganisme de la famille des Entérobactériacées ayant la capacité de produire un facteur amplificateur de l'induction par la cortisone . Des exemples représentatifs de ces microorganismes sont donnés ci-dessous . Ces microorganismes 20 ont été déposés à 1' "Institute of Applied Microbiology,Tokyo Uni-versity ,N° 1-1, 1-chrome, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, Japon et à 1'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA . Conformément à l'invention, le FAIC est produit par le procédé 25 consistant à cultiver un organisme producteur de FAIC de la famille des Entérobactériacées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone, de l'azote et des sels minéraux et à récupérer le FAIC à partir du bouillon de culture obtenu .Plus précisément, le FAIC est produit en cultivant l'organisme producteur 30 de FAIC de la famille des Entérobactériacées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone, de l'azote et des sels minéraux , en extrayant les cellules qui se sont multipliées par l'eau ou par une solution saline pour obtenir un extrait bactérien aqueux, en déprotéinisant cet extrait, en faisant adsorber 35 l'extrait sur du charbon actif en milieu faiblement'acide,en éluant l'adsorbat par un mélange alcali-acétone, en neutralisant puis en concentrant l'éluat, en soumettant le concentrât à une ehromato-graphie sur colonne sur un gel de dextrane et en recueillant les fractions ayant une,activité inductrice de la transaminase de la 40 tyrosine .Les bactéries de la famille dss Entérobactériacées qui 71 33524 3 2106626 sont utilisées selon l'invention sont les microorganismes appartenant aux genres Escherichia, Aerobactes,Klebsiella, Paracolobac-trum,Alginobacter,Erwinia,Serratia,Salmonella, Proteus et Shigel-la.Comme exemples de ces espèces, on peut citer Escherichia Coli, 5 Erwinia aroideae,Erwinia Carotovora, Serratia marcescens,Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus morganii, Aerobactes aeroge-nes etc.. On cultive ces microorganismes dans les conditions ordinaires de la culture des espèces communes de bactéries . 10 La séparation et la récupération du FAIC_ du bouillon de culture s'effectuent de la manière suivante . Tout d'abord, on centrifuge le bouillon de culture on le filtre pour obtenir les cellules que l'on met en suspension ensuite dans l'eau ou une solution saline, telle que le sérum physiologique ,puis on soumet içj la suspension à un traitement approprié tel que destruction soni-que, ce qui extrait une substance bactérienne .On réunit de préférence cet extrait au filtrat ou au liquide surnageant précédemment obtenu par filtration ou centrifugation,après quoi on dépretéi-nise par addition,par eaempûe d'acide perchlorique et d'acide trichlor- 20 acétique, et centrifugation .Le liquide surnageant est ensuite rendu faiblement acide, de préférence à pH 3 à 7, et l'on ajoute du charbon actif à ce liquide acide, de façon à faire adsorber le FAIC contenu dans le liquide sur le charbon . A ce charbon imprégné de FAIC ,on ajoute un mélange alcali-25 acétone, de préférence un mélange d'hydroxyde de potassium 0,2 N et d'acétone(dans un rapport 1:1 en volume ), pour éluer le FAIC du charbon . Ensuite, on neutralise et concentre l'éluat .On effectue. une chromatographie sur colonne du concentrât sur un gel de dextrane, et recueille les fractions ayant une activité induc-;0 trice de la transaminase de la tyrosine . Pour recueillir la fraction active, on administre par voie intrapéritonéale à des rats albinos mâles ( souche wister-Imamichi) chacune des fractions éluées de la colonne de gel de dextrane, et on sacrifie les animaux après un délai de 5 heures .On mesure 35 l'activité de la transaminase de la tyrosine du f.oie suivant le mode opératoire de l'expérience I comme il est décrit ci-dessous. On rassemble les fractions actives présentant une activité inductrice de la transaminase de la tyrosine . Le FAIC selon la présente invention a une activité amplifica-40 trice de l'induction des enzymes par la cortisone, et en particu 33524 4 2106626 lier de 1'induction de la transaminase de la tyrosine, et on peut l'utiliser à la place de la cortisone ou en combinaison avec elle pour diminuer la quantité de cortisone à utiliser, laquelle a divers effets secondaires malgré ses effets pharmaceutiques bénéfiques. Le FAIC selon l'invention a aussi une activité hypotensive . On peut utiliser le FAIC soit sous la forme de la solution de FAIC telle quelle préparée comme indiqué ci-dessus, soit sous la forme d'une solution concentrée appropriée .Dans un essai sur l'animal utilisant le rat albinos, le dosage est de préférence de 0,2 à 2,0 de D.O.^gQ/ml/lOO g de poids du corps en administration orale ou intraveineuse . La solution de FAIC obtenue comme ci-dessus peut être lyophilisée pour le stockage . Le FAIC obtenu de la manière ci-dessus peut subir une nouvelle purification par diverses techniques connues telles que la chromatographie sur résine échangeuse d'ions, la chromatographie sur papier , la chromatographie en couche mince etc.., utilisées seules ou en combinaison .Le FAIC ainsi obtenu a les propriétés suivantes : a-C'est une poudre légèrement jaunâtre et fortement hygros-copique . b-Il est aisément soluble dans l'eau en donnant une solution transparente, et donne des réactions positives à la ninhydrine, au réactif Folin-Ciocalten et à l'acide cystéine-sulfurique . c-Il présente les spectres d'absorption ultra-violet et Infrarouge selon les Fig.l et 2, respectivement, montrant une absorption caractéristique dans l'ultra-violet à 263 np dans l'eau et dans 1 ' infra-rouge à 3300, 1650, 1530,1390,1040 et b30 cm""'1' par la méthode du disque de KBr. d-Il ne se prête pas à l'analyse élémentaire, car il subit une décomposition en deux stades, ce qui rend difficile de déterminer la composition élémentaire du FAIC. e-Sa masse moléculaire est supposée être comprise entre la masse moléculaire de la vitamine B12 (1357) et celle du cytochrome C (13.000) mesurées par la méthode au gel de dextrane . Bien que la composition du FAIC ne puisse être établie,les propriétés physicochimiques ci-dessus suggèrent qu'il s'agit d'une peptide .En dehors des propriétés physicochimiques ci-dessus ,1e FAIC a les propriétés biologiques suivantes . 71 33524 5 2106626 Expérience 1 On administre par voie intrapéritonéale à des rats albinos mâles normaux, (souche Wister-Inamichi ) un millilitre d'une solution de FAIC, (diluée à l'eau jusqu'à ce que l'absorbance de la 5 solution à 260nju soit de 2,000), et après 3 heures on sacrifie les rats .On prélève les foies et les homogénéise avec une solution de sucrose à 10$, ce qui fournit une solution de l'enzyme .A 0,2 ml de la solution d'enzyme obtenue, on ajoute 0,5 ml de tampon au phosphate de potassium 0,2M (pH 8), 0,2 ml de tyrosine (dans une 10 solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N, équivalent à 5/u mole)0,lml « de HC1, 0,4 N, 0,1 ml de phosphate de pyridoxal (équivalant à 50j^g ) et 0,8 ml d'eau . On préincube le mélange à 37°C pendant 5 minutes puis on y ajoute 0,1 ml d'acide -cétoglutarique (équivalant à 10 p. mole) et incube pendant 10 minutes .On stoppe la 15 réaction par addition de 0,5 ml d'acide trichloracétique à 25# . Puis on dose l'acide p-hydroxyphény1pyruvique .La Fig.5 montre les résultats obtenus ,et, à titre de comparaison , les résultats obtenus par administration d'une solution de sérum physiologique servant de témoin . Sur la Fig.5, l'activité d'induction de la transa-20 minase de la tyrosine du foie est exprimée par l'absorbance à 700mp . Expérience 2 On administre par voie intrapéritonéale à des rats mâles albinos normaux pesant de 200 à 250 g (quatre rats dans chaque grou-25 pe, souche Wister-Imamichi) un millilitre d'une solution de FAIC (diluée par l'eau jusqu'à ce que l'absorbance de la solution à 260 mu soit de 2,000).On trouve que l'activité de la transaminase de la tyrosine du foie est maxima 5 heures après l'administration comme le montre la Fig.6. 30 Expérience 3 On administre par voie intrapéritonéale à des rats albinos mâles normaux pesant 250 à 300 g (quatre rats dans chaque groupe, souche Wister-Imamichi ) pour déterminer la relation entre le niveau de la dose et l'activité de l'enzyme transaminase de la tyro-35 sine .On trouve que celle-ci est maxima lorsqu'on administre 1 ml de solution de FAIC ayant une concentration de 2,000 exprimée par l'absorbance à 260r^u ,comme le montre la Fig.7. Expérience 4 On n'observe pas l'induction de la transaminase de la tyrosine ^0 chez des rats albinos adrénalectomisé lorsque le FAIC est ad 71 33524 6 2106626 ministré seul, alors que l'on trouve que la transaminase de la tyrosine est fortement induite par administration du FAIC en association avec la cortisone (Triamcinolone) comme le montre le Tableau l.Dans cette expérience , le FAIC est administré à la même dose que dans l'expérience 2, et la triamcinolone est administrée à la dose de 1 mg/100 de poids du corps du rat albinos . TABLEAU 1 nombre de rats albinos activité de la transmission de la tyrosine (unités/mg) sérum physiologique 3 0,31 + 0,02 FAIC 3 0,49 4- 0,06 Triamcinolone 4 5,07 + 0,85 Triamcinolone FAIC 4 7,13 0,86 15 20 25 30 Lorsqu'on soumet à une chromatographie sur une colonne de Dowex-50 ( forme H, vendue par la Société Dow Chemical Company ) 2,5 cm de diamètre x 10 de long, vitesse d'écoulement 3 ml/10 minutes) du FAIC ayant les propriétés physiologiques et biologiques ci-dessus ,on observe que le FAIC se compose d'au moins 2 constituants de propriétés physiologiques légèrement différentes . Dans la présente invention , le constituant qui est élué par HC1 0,01 N est désigné par "FAIC N " , et le constituant qui est élué par NH^OH 2N est désigné par "FAIC A " . La Fig.8 donne les diagrammes d'élution des deux constituants, et l'absorbance de chacun des constituants à 260 mja (représentée par la ligne o —— o— ), l'absorbance différentielle à 4l5mja et à 380 mjx après réaction à l'acide cystéine -sulfurique (représentée par la ligne tx ), et 11 absorbance à 750 mp. après la réaction de Folin-Ciocalteu (représentée par la ligne X X- ). Le Tableau 2 ci-dessous indique diverses propriétés chimiques de ces constituants . TABLEAU 2 FAIC-N FAIC-A 35 Ninhydrine Folin Orcinol Anthrone Elson-Morgan D0260//^°2b0 fluorescence + + +++ +++ 1,3 +++ -!—h++ ++++ + 3,8 ++ 71 33524 7 2106626 Le FAIC -N et le FAIC-A présentent tous deux une activité d'amplification de la transaminase de la tyrosine du foie et des inductions de la transaminase des amino-acides à chaîne ramifiée chez le rat albinos adrénalectomisé ,tandis que chez le rat al-5 binos normal, seul le FAIC-A présente une activité d'induction de la transaminase de la tyrosine du foie > et seul le FAIC -N présente une activité inhibitrice de l'induction de la déshydrogénase de la sérine du foie produite par l'administration de glucagon. Le FAIC-A n'affecte pas l'induction de la déshydrogénase de la sé-10 rine du foie . De même, le FAIC-N et le FAIC-A n'affectent pas l'induction . de la transaminase de la tyrosine par administration de glucagon ou d1insuline . Ces résultats sont donnés dans le Tableau 3. Dans cette ex-15 périenne ,on administre le FAIC-N et le FAIC-A à la dose de 1 ml d'une concentration de 2,000 exprimée en absorbance à 260 mji, et on administre du glucagon et de l'insuline à la dose de lOOug et une unité respectivement, pour 100 g de poids de corps du rat albinos . Les rats albinos (souche Wister-Imamichi, mâle, quatre 20 rats dans chaque groupe) sonu sacrifiés cinq heures après l'administration et soumis à la détermination de la capacité d'induction de l'enzyme . TABLEAU 3 Agents administrés Activité de transaminase la tyrosine la de Activité de la déshydrogénase de la serine Activité de la transaminase sur des amino-acides à chaîne ramifiée Sérum physiologique 0,21 + 0,04 0,47 + 013 - FAIC-N 0,20 + 0,02 - - FAIC-A 0,99 + 0,11 - - i—! id p FAIC-N + FAIC-A 0,99 + 0,14 - - pH M 0 Glucagon 0,48 + 0,04 0,72 + 0,03 - rï ta o et Glucagon + FAIC-N 0,56 + 0,09 0,33 + 0,04 - Glucagon + FAIC-A 0,45 + 0,07 1,02 + 0,04 - •H .a Insuline 0,71 + 0,08 - - Insuline + FAIC-N 0,67 + 0,06 - - ■p (d Pi Insuline + FAIC-A 0,55 + 0,11 — M i o +> Sérum physiologique (témoin) 0,27 + 0,05 __ o . 0) FAIC-N 0,23 + 0,01 - - i—! cd •' S FAIC-A 0,21 + 0,01 - ~ \ Triamcinolone 2,54 + 0,17 - 12,0 + 0,19 Triamcinolone + FAIC-N 4,06 + 0,31 - 21,5 + 2,6 ta 0 Triamcinolone + FAIC-A 4,03 + 0,30 - 28,8 + 0,3 M •H Xi Triamcinolone + FAIC-N + 3,94 + 0,28 - - Rat al! mise FAIC-A LU UL> en K> 4s» oc hO O O o K> a- 71 33524 9 2106626 Le FAIC-N et 1e FAIC-A présentent aussi une activité hypoten-sive lorsqu'on les administre par voie parentérale mais leurs modes d'action sont manifestement différents . Le FAIC-N présente une activité hypotensive passagère sem-5 blable à celle de la bradykinine,tandis que le FAIC-A présente une activité hypotensive passagère suivie d'une activité hypotensive continue .Les Fig.9-a et 9-b montrent ces activités hypotensives . Dans la chromatographie sur papier par la méthode ascendante en utilisant un système solvant n-butanol:acide acétique:eau 10 (4:1:5) en volume) comme agent de développement, le FAIC-A présente trois taches qui se colorent par la ninhydrine et deux taches qui O présentent une fluorescence sous une radiation de 3000 A . La Fig.10 montre le Rf de chacune de ces taches .Le constituant physio-logiquement actif du FAIC-A (c'est-à-dire du FAIC-A purifié) corres-15 pond à la tache positive à la ninhydrine ayant un Rf de 0,15-0,20 et la masse moléculaire du constituant déterminée par la méthode au jrel de dextrane (Sephadex g-25 vendu par Pharmacia Co., colonne de 1,8 cm x 65- cm, vitesse d'écoulement 10 gouttes/minute,élution à l'eau)est supposée entre la masse moléculaire de la vitamine B12 20 (1357) et celle de l'inhibiteur de la trypsine (6000). La composition élémentaire à l'exception du soufre et de l'oxygène,est C,30, 32#, H,5,23#* N, 12,77# .Les propriétés chimiques et les résultats du dosage des amino acides du FAIC -A purifié sont donnés dans le 25 Tableau 4. Le FAIC-A présente également les spectres d'absorption ultra-violette et infra-rouge représentés sur les Fig.3 et 4, respectivement , qui montrent une adsorption caractéristique dans la région ultra-violette à 263 mp dans l'eau, et dans la région infrarouge à 3180, 1650, 1400, 1050, 785 et 520 cm"1 par la méthode 30 du disque de Kbr . TABLEAU 4 Propriétés chimiques Composition en amino-acides (méthode ftein-Moore,nombre d'amino-acides par molécule) ninhydrine * ++ acide aspartique 3 35 Elson-Morgan - acide glutamique + glutamine 12-13 orcinol - glycine 7 anthrone - alamine 2 phosphore organique - cystéine 3 fluorescence - méthionine 4 40 x Le réactif à base de ninhydrine se prépare en dissolvant 50 mg 71 33524 10 2106626 de niiihydrine dans un mélange de 30 ml d'éthanol,10 ml d'acide acétique et 4 ml de collidine, et l'on détermine la réaction colorée au bout de 5 minutes à 80 °C. La Fig.9~s œontre l'activité hypotensive du FAIC-A purifié. 5- EXEMPLE 1 On prélève un morceau d'excrément de l'anus d'un rat albinos mâle (souche Wister-Imamichi) et l'homogénéise dans 20 ml de sérum physiologique .L'homogénéisât obtenu est ensuite cultivé sous agitation dans le milieu à l'agar Trypto Soya (fourni par Nissui 10 Seiyaku Co., Ltd, Japon) à 37°C pendant 12 heures, et l'on utilise l'inoeiilum ainsi obtenu pour inoculer une surface inclinée d'agar, on inocula une zone de la colonie obtenue identifiée comme Proteus mirabilis Havser (N-3)ATCC-21721 , par le procédé décrit dans "Laboratory Methods in Microbiology " et dans "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" ,dans un milieu d'un volume total de 3000 ml contenu dans 15 flacons de Sakaguchi, par portions égales, constitué de 1,5# de trypticase ( fourni par Baltimore Biological Laboratory), 0,5# d'extrait de levure, 0,5# de chlorure de sodium, 0,25# de glucose, 0,25# de phosphate dipotassique, le milieu étant 20 ajusté à pH 7*3 par de l'hydroxyde de sodium et stérilisé sous 1 kg/cm2 pendant 10 minutes, et l'on cultive les milieux sous agitation, pendant 24 heures à une température de 27°C. On utilise ensuite la culture obtenue pour inoculer 60 1 d'un milieu stérilisé ayant la même composition que ci-dessus contenu dans un appareil 25 de fermentation de 100 1. En même temps, on ajoute au milieu une petite quantité d'huile de soja comme agent anti-mousse . On effectue ensuite la culture à une température de 27°C et sous une pression interne de 0,5 à 0,8 kg/cm2 pendant lb heures tout en introduisant de l'air à une vitesse de 30 litres/minute 30 et en agitant à 200 tours/minute .A la fin de cette période de culture, la turbidité du bouillon dé culture, mesurée par l'absorbance à 660 mu (parcours lumineux 1 an) de ce bouillon dilué cinq fois, est de 0,825. Après avoir terminé la culture, on centrifuge en continu le bouillon de culture à 10.000 tours/minute, pour recueillir les cellules microbiennes ,et on les met en suspension dans 10 1 de sérum physiologique .On centrifuge à nouveau la suspension à 10.000 tours/minute pendant 20 minutes pour recueillir les cellules lavées .On met ensuite les cellules en suspension dans du sérum 40 physiologique pour faire un total de 5 litres, et on soumet la sus 71 33524 n 2106626 pension à des vibrations de 20 kilocycles par portions de 50 ml. On centrifuge ensuite la suspension ainsi traitée à 10.000 tours/ rhin pendant 10 minutes et on ajoute au liquide surnageant de l'acide perchlorique à 10# jusqu'à une concentration de 2#.On refroidit 5 le mélange, et on la déprotéinise par centrifugation . On ajoute ensuite la solution déprotéinisée à un pH de 5 à 5,5 par addition d'hydroxyde de potassium aqueuse 5N, et on centrifuge pour éliminer le perchlorure de potassium . On ajoute au liquide surnageant du charbon actif dans la proportion de lg pour 200 ml de liquide sur-10 nageant, puis on agite pendant 30 minutes pour adsorber le FAIC sur charbon actif . On centrifuge le mélange à une vitesse de 3000 tours/minute pendant 10 minutes pour recueillir le charbon actif qu'on lave ensuite à l'eau et extrait deux fois par 400 ml d'un mélange 50:50 (en volume) hydroxyde de potassium 0,2 N/acé-15 tone . On concentre l'extrait sous pression réduite pour éliminer l'acétone, le neutralise par l'acide perchlorique à 2# et le concentre sous pression réduite à 100 ml .On filtre ce concentrât ,ce qui donne un filtrat transparent jaune . On soumet ensuite le filtrat obtenu à une chromatographie sur 20 colonne en utilisant du Sephalex G-10 (colonne de 5 cm de diamètre x 70 cm de long ,vitesse d'écoulement de 20 ml/heure), et on recueille des fractions de 20 ml en utilisant de l'eau distillée comme solvant pour l'élution. On administre par voie intrapéritonéale à des rats albinos 25 mâles normaux (souche Wister-Immamichi) .Chacune des fractions s'é-luant de la colonne de gel de dextrane, et sacrifie les animaux après un délai de 5 heures .On mesure l'activité d'induction de la transaminase de la tyrosine du foie suivant le mode opératoire de l'expérience 1, décrite ci-dessus .On rassemble les fractions actives 30 ayant une activité d'induction de la transaminase de la tyrosine (fractions N° 26-34).On concentre sous pression réduite les fractions combinées 26 à 3^ qui contiennent le FAIC et on les lyophilise, ce qui donne 800 mg de FAIC sous forme d'une poudre fortement hy-groscopique . 35 Exemple 2 On inocule avec chacun des organismes indiqués dans le Tableau 5 ,500 ml d'un milieu constitué de 1,5# de peptone,0,5# d'extrait de levure,0,5# de chlorure de sodium,0,25# de glucose et 0,25# de phosphate dipotassique (pH 7*3) *et le cultive pendant 20 heures 40 à une température de 27°C. On traite dans chaque cas le bouillon de culture de la même manière que dans l'Exemple 1,ce qui donne les résultats indiqués dans le Tableau 5. TABLEAU 5 ORGANISME RENDEMENT Jt TAUX D'INDUCTION DE LA TRANSAMINASE DE LA TYROSINE ** NUMEROS ATCC Escherichia coli IAM 1016 10(14,1) 1,93 Escherichia coli IAM 1253 10(18,1) 1,74 Erwinia aroidae IAM 1068 15 (1,46) 2,4 Erwinia carotovora IAM 1024 10(0,86) 2,0 Serratia marcescens FERM-P N° 297 15(2,14) 1,98 ATCC 21717 Proteus mirablis OM-1 15(5,40) 3,0 ATCC 21718 Proteus vulgaris YO-1 20(4,26) 2,32 ATCC 21719 Proteus morganii AA-2 15(4,90) 3,45 ATCC 21720 Aerobacter aerogenes IAM 1183 15(1,84) 1,9 *. Quantité de FAIC dans le liquide (déterminée par absorbance à 2 60 mv) . jfcjfc Moyenne de 3 cas. Le taux d'induction produit par l'administration de sérum physiologique est désigné par "1". 71 33524 13 2106626 REVENDICATIONS 1 - Facteur amplificateur de l'induction parla cortisone provenant d'un organisme de la famille des Entérobactériacées, caractérisé en ce que : a) ce facteur est une poudre légèrement jaunâtre et forte- 5 ment hygroscopique. b) ce facteur est aisément soluble dans l'eau en donnant une solution transparente jaune, et il donne des réactions positives à la ninhydrine, au réactif Folin-Ciocalteu et à l'acide cystéine-sulfurique. 10 c ) ce facteur présente les spectres d'absorption ultravio lette et infra-rouge selon les Fig. 1 et 2, respectivement, et il présente une absorption caractéristique dans l'ultra-violet à 263 mju dans l'eau, et dans 1 'infra-rouge à 3300, 1650,1530,1390, 1040 et 830 cm-1 par la méthode du disque de KBr. 15 d) ce facteur ne se prête pas à l'analyse élémentaire car il subit une décomposition en deux stades, qui rend difficile la détermination de sa composition élémentaire e) on présume que la masse moléculaire de ce facteur mesurée par la méthode au gel de dextrane, est située entre celle de la 20 vitamine B12 (1357) et celle du cytochrome C (13000). 2 - Facteur d'amplification de 1'induction par la cortisone tiré d'un organisme du genre choisi parmi ESCHERICHIA, Aerobacter, Klebsiella, Paracolobactrum, Alginobacter, Erwinia, Serratia, Salmonella, Proteus et Shigella, caractérisé en ce que : ^ a) ce facteur est une poudre légèrement jaunâtre et forte ment hygroscopique. b) ce facteur est aisément soluble dans l'eau en donnant une solution jaune transparente, et il donne des réactions positives à la ninhydrine, au réactif de Folin-Ciocalteu et à l'acide cystéine-sulfurique. c) ce facteur présente les spectres d'absorption ultraviolette et infra-rouge selon les Fig. 1 et Fig.2 , respectivement, et il présente une absorption caractéristique dans l'ultraviolet à 263 mji dans l'eau, et dans 1 'infra-rouge à 3300, 1650, 1530, 1390, 1040 et 830 cm 1 par la méthode du disque de Kbr. d) ce facteur ne se prête pas à l'analyse élémentaire car il subit une décomposition en deux stades qui rend difficile la détermination de la composition élémentaire. e) on présume que la masse moléculaire de ce facteur, mesu 71 33524 14 2106626 rée par la méthode au gel de dextrane, est intermédiaire entre celle de la vitamine B12 (1357) et celle du cytochrome C (13000). 3 - Facteur amplificateur de 1'induction par la cortisone provenant d'un organisme choisi parmi Escherichia coli, Erwinia aroi-5 deae, Erwinia carotovora, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus morganii et Aerobacter aerogenes, caractérisé en ce que : a) ce facteur est une poudre légèrement jaunâtre et fortement hygroscopique, 10 b) ce facteur est aisément soluble dans l'eau en donnant •une solution jaune transparente, et donne des réactions positives à la ninhydrine, au réactif Folin-Ciocalteu et à l'acide cystéine-sulfurique. c) ce facteur présente les spectres d'absorption ultra-15 violet et infra-rouge selon les Fig. 1 et 2 respectivement, et présente une absorption caractéristique dans la région ultra-violette à 263 dans l'eau et dans la région infra-rouge à 3300, 1650, 1530, 1390, 1040 et 830 cm-1 par la méthode du disque de KBr. d) ce facteur ne se prête pas à l'analyse élémentaire car 20 il subit une décomposition en deux stades, ce qui rend difficile la détermination de sa composition élémentaire. e) on présume que la masse moléculaire de ce facteur mesurée par la méthode au gel de dextrane est intermédiaire entre celle de la vitamine B 12 (1357) et celle du cytochrome C (13000). 25 4 - Facteur amplificateur A de l'induction par la cortisone (FAIC-A) purifié dérivant d'un organisme de la famille des'Entérobactériacées, caractérisé en ce que : a) ce facteur A a un Rf de 0,15 à 0,20 dans le système solvant n-butanol : acide acétique : eau (4:1:5), 30 b) on présume que la masse moléculaire de ce facteur A mesu rée par la méthode au geli de dextrane est intermédiaire entre celle de la vitamine B 12 (1357) et celle de l'inhibiteur de la trypsine (6000), c) la composition élémentaire de ce facteur A est C :30,32# 35 H : 5*23 %, N : 12,77 %> non compris le soufre et l'oxygène. d) ce facteur A donne unè réaction positive à la ninhydrine des réactions négatives au réactif d'Elson-Morgan, à l'orcinol et à l'anthrone ; il ne contient pas de phosphore organique et ne présente pas de fluorescence? e) ce facteur A est un peptide contenant des amino-acides dans la proportion de 3 acides aspartiques, 12 à 13 acides gluta- 71 33524 15 2106626 mique et glutamine, 7 glycines, 2 alamines, 3 cystéines et 4 mé- thionines, la détermination étant faite par analyse des aminoacides par la méthode Stein-Moore, et f) ce facteur A présente les spectres d'absorption ultra- 5 violette et infra-rouge sion les Fig. 3 et 4, respectivement, et il présente une absorption caractéristique dans 1'utra-violet à 263 mu dans l'eau et dans 11infra-rouge à 3.180, 1650, 1400, 1050, -1 785 et 520 cm par la méthode du disque de KBr. 5 - Procédé de préparation d'un facteur amplificateur de 10 1'induction parla cortisone, caractérisé en ce qu'on cultive un organisme produoteur de FAIC de la famille des Entérobactériacées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone, de l'azote et des sels minéraux et en ce qu'on isole ce facteur amplificateur du bouillon de culture obtenu. 15 6 - Procédé de préparation d'un facteur amplificateur de 1'induction par la cortisone, caractérisé en ce qu'on cûltive un organisme producteur de F A I C de la famille des Entérobactériacées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone, de l'azote et des sels minéraux, on extrait les cellules ayant prolifé-20 ré par de l'eau ou une solution de sel, de façon à obtenir un extrait bactérien , on déprotéinise cet extrait, on absorbe cet extrait sur du charbon actif en milieu faiblement acide, on élue l'adsorbat par un mélange alcali-acétone, ce qui fournit un éluat, on neutralise et on concentre cet éluat, on soumet le concentrât à une 25 chromatographie sur colonne sur un gel de dextrane, et on recueille les fractions ayant une activité d'induction de la transaminase de la tyrosine. 7 - Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la solution de sel est du sérum physiologique. 30 8 - Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'on effectue la déprotéinisation par addition d'un acide choisi parmi l'acide perchlorique et l'acide trichloracétique. 9 - Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu faiblement acide a un pH de 3 à 7. 35 10 - Procédé de préparation d'un facteur amplificateur de l'inductionpar la cortisone , caractérisé en ce que l'on cultive un organisme producteur de FAIC de la famille des Entérobactériacées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone, de l'azote et des sels minéraux, on filtre le bouillon de culture, ce 40 qui donne des cellules microbiennes et un filtrat, on extrait les cellules par l'eau ou par une solution de sel, ce qui donne un ex 71 33524 16 2106626 trait bactérien aqueux, on combine l'extrait bactérien aqueux et le filtrat, on déprotéinise l'extrait et le filtrat combinés, on adsorbe le mélange sur du charbon activé en milieu faiblement acide on élue l'adsorbat avec un mélange alcali-acétone, ce qui fournit 5 un éluat, on neutralise puis concentre 1'éluat, on soumet le concentrât à une chromatographie sur colonne sur un gel de dextrane, et on recueille les fractions présentant une activité d'induction de latransaminase de la tyrosine. 11 - Procédé de préparation d'un facteur amplificateur 10 de 1'induction par la cortisone, caractérisé en ce qu'on cultive un micro-organisme producteur de FAIC de la famille des Entérobactériacées dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, de l'azote et des sels minéraux, on centrifuge le bouillon de culture ce qui donne des cellules microbiennes et un liquide surna-15 géant, on extrait les cellules à l'eau ou par une solution de sel ce qui donne un extrait bactérien aqueux, on combine l'extrait bactérien aqueux et le liquide surnageant , on déprotéinise l'extrait et le liquide surnageant combinés, on fait adsorber le mélange sur charbon actif en milieu faiblement acide, on élue l'adsorbat par 20 un mélange alcali-acétone, ce qui donne un éluat, on neutralise puis concentre l'éluat, on soumet le concentrât à une chromatographie sur colonne sur un gel de dextrane et on recueille les fractions présentant une activité d'induction de la transaminase de la tyrosine. 25 12 - Procédé suivant l'une quelconque dés revendications 6, 10 et 11, caractérisé en ce que le mélange alcali-acétone est constitué de volumes égaux d'hydroxyde de potassium 0,2 N et d'acétone. 13 - Facteur amplificateur A purifié suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ce micro-organisme est choisi parmi 30 les genres Escherjchia, Aerobacter, Klebsiella, Paracolobactrum, Alginobacter, Erwinia, Serratia, Salmonella, Proteus et Shigella. 14 - Facteur amplificateur A purifié suivant la revendication 4, caractérisé en ce que cet organisme est choisi parmi Escherichia coli, Erwinia aroideae, Erwinia carotovora, Serratia, marcesens, 35 Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus morganii et Aerobacter aerogenes.