Brevet FR2060025A1 — publié le 19710611

' 2060025 La présente invention concerne la culture de levures en utilisant des hydrocarbures comme source principale de carbone assimilable. On connaît des systèmes pour la culture aérobie continue 5 de microorganismes utilisant des hydrates de carbone comme source principale de. carboné assimilable et on a proposé, plus récemment, des systèmes analogues de culture continue utilisant des hydrocarbures comme source principale de carbone assimilable. L'utilisation d'hydrocarbures qui sont faiblement solubles 10 dans le milieu nutritif aqueux accroît le problème pour obtenir irne opération économique. Un facteur principal dans le coût de tout procédé de fermentation aérobie réside dans le prix de l'aération et étant donné que les microorganismes croissant sur des hydrocarbures nécessitent essentiellement plus d'oxygène que 15 lorsqu'ils croissent sur des hydrates de carbone, il en résulte un développement du système de transfert de masse et d'oxygène le plus efficace. On a proposé d'accroître les taux de transfert d'oxygène et d'améliorer ainsi le rendement par unité de volume de l'espace du dispositif de fermentation dans des procédés de 20 fermentation aérobie continue utilisant des hydrates de carbone comme source de carbone en augmentant la pression de travail du dispositif de fermentation. Les pressions envisagées pour de tels procédés sont comprises dans la gamme de 10 à 20 atmosphères. Dans les procédés de fermentation industrielle à grande 25 échelle, le prix des récipients sous les pressions nécessaires et la puissance souhaitable pour fournir et maintenir de telles pressions altèrent d'une façon considérable le prix de revient du procédé. Récemment, on a proposé un système pour mettre en oeuvre des fermentations aérobies dans lequel la quantité de 30 l'air ou de l'oxygène dissout dans la liqueur de fermentation est accrue en dissolvant l'air ou l'oxygène dans la liqueur dans une chambre de mélange munie d'agitateurs rotatifs sous une pression supérieure à celle fournie par la fraction supérieure de la liqueur de fermentation, c'est-à-dire sous une 35 pression de plusieurs kg/cm^, puis en conduisant la fermentation dans plusieurs tubes qui présentent des étranglements, comme des plaques perforées, qui maintiennent une contre-pression. De tels dispositifs, utilisant plusieurs tubes dans lesquels la fermentation est réalisée, présentent de nombreux 70 24453 2 2060025 inconvénients .car ils permettent -seulement une opération essentiellement discontinue ou une fermentation continue à écoulement plus -saccadé qui.,, bien qu'elle s.oit acceptable si l'on évacue un constituant désiré, implique' une construction coûteuse par unité -5 de: volume .des contenus • au..dispositif de fermentation. En vue de pallier-à ces inconvénients,; le dispositif de fermentation le plus classique de type vat a obtenue une grande acceptabilité dans l'industrie de la fermentation» Par dispositif de fermentation de type vat', on entend des dispositifs de f srmentation com. 1Q. prenant une enveloppe creuse fermée qui peut être en forme de capsule ou de .sphère» Ges dispositifs de fermentation sont munis de moyens pour introduire l'inoculum, les sels nutritifs, les sources de carbone assimilable, l'air ou- l'oxygène et- tout autre constituant essentiel pour un dispositif particulier subissant une feïmentation et comportent des organes de prélèvement pour le bouillon de l'effluent du dispositif de fermentation• L'agita tion du contenu du dispositif de fermentation peut être réalisée • -au moyen d'organes de ventilation ou au moyen, dé systèmes d'aéra tion avec de l'air* 20 Pour autant qu'on le sache, on n'a pas proposé jusqu'à présent d'utiliser des pressions élevées dans des fermentations continues, à grande échelle dans des dispositifs de "fermentation de.type vat utilisant des hydrocarbures comme source de carbone• ies procédés de fermentation en continu, qui ont été proposés en 25 utilisant des hydrocarbures comme source de carbone, ont été réalisés avec une pression du dispositif- de fermentation à la pression atmosphérique ou à une pression .proche de la pression atmosphérique « : On a maintenant trouvé qu'en réalisant un procédé de fermen 30 tation en 'continu dans un dispositif de fermentation du type vat en utilisant des hydrocarbures comme source principale de carbone assimilable, on obtient des avantages lors du fonctionnement avec seulement une pression modérément élevée du dispositif de - fermentation* Il est possible non seulement d'obtenir une amélio 35 ration significative -dans les résultats, corr-'e cela est exprimé en poids de cellules sèches mais, également-, une amélioration importante dans le rendement peut être•obtenue en comparaison avec une opération à la pression atmosphérique ou proche de la pression atmosphérique» ïar rendement,-on entend le rapport du 40 poids de cellules sèches dans le bouillon de fermentation au 70 24453 3 2060025 au poids des hydrocarbures assimilés. L'augmentation observée dans le rendement est surprenante et procure des conditions avantageuses pour le prix de revient global du procédé car le rendement est une mesure de l'efficacité avec laquelle les hydrocar-5 bures assimiblables sont transformés en matières cellulaires, le prix de ces hydrocarbures étant un facteur significatif dans le coût global du procédé. L'invention crée un procédé de culture d'une levure qui consiste à cultiver en continu line levure consommant un hydrocar-10 bure dans un dispositif de fermentation de type vat en présence d'un milieu nutritif aqueux et d'un substrat hydrocarboné qui constitue la source principale de carbone assimilable, la culture étant mise en oeuvre en présence d'un gaz contenant de l'oxygène libre et avec une pression élevée absolue du dispositif de 2 15 fermentation comprise dans la gamme de 1,5 à 4,0 kg/cm , de pré- p férence de 2 à 3kg/cm . On entend dans l'invention par pression du dispositif de fermentation la pression moyenne du dispositif de fermentation, c'est-à-dire la pression dans l'espace de gaz au-dessus du 20 bouillon, ou la pression à la sortie de la mousse du dispositif de fermentation, si le récipient est totalement rempli, plus la moitié de la pression hydrostatique des contenus fluides. Bien qu'il y ait des avantages particuliers dans la mise en oeuvre sous une pression accrue du dispositif de fermentation, 25 en général à la pression choisie le système est optimal, par exemple en ce qui concerne les taux d'aération, la concentration en hydrocarbures et les concentrations en sels nutritifs, de sorte que l'organisme choisi croît dans le milieu environnant le plus favorable » 30 Une des caractéristiques les plus surprenantes de l'inven tion réside dans le fait qu'il y a seulement dans la gamme de pression relativement étroite mentionnée ci-dessus une augmentation dans le rendement, même dans la gamme de pressionsabso- p lues comprise entre 2 et 3 kg/cm , le rendement tend vers la 35 valeur maximale et décroît ensuite. toutefois, on a établi par l'expérience que dans la gamme totale de pressions absolues comprise entre 1,5 et 4kg/cm- , la productivité exprimée en poids de cellules sèches peut être accrue et même qu'il y a avantage à opérer à la pression la plus 70 24453 4 2060025 élevée en fonction de la productivité, ceci équilibrant les inconvénients de réduction du rendement* Par conséquent, il n'y a pas d'avantages pratiques ou économiques à opérer à des près-sions absolues supérieures à 4 kg/cm • 5 La pression de travail désirée est avantageusement appli quée en réglant 1'alimentation du gaz comprimé contenant de 1'oxygène au dispositif de fermentation et/ou en appliquant des étranglements appropriés sur la sortie de gaz du dispositif de fermentation* 10 Bien que la puissance nécessaire pour obtenir et maintenir les pressions modérément élevées du dispositif de fermentation . de l'invention constitue tua prix de revient supplémentaire pour le procédé, ce prix de revient supplémentaire peut être réduit, conformément à l'invention, en utilisant au moins une partie de 15 l'énergie des gaz de sortie du dispositif de fermentation pour contribuer à obtenir et maintenir la pression désirée* Ceci peut être avantageusement réalisé en utilisant les gaz de sortie du dispositif de fermentation pour eiigendrer au moins une partie de la puissance du système de compression utilisé pour alimenter le 20 gaz contenant de lroxygène au premier dispositif de fermentation ou tout autre ensuite* A titre de variante comme moyen pour réduire les exigences de puissance d'un dispositif de fermentations multiples, suivant l'invention, les gaz de sortie de l'un ou de plusieurs des 25 dispositifs de fermentation opérant à la pression élevée désirée des dispositifs de fermentation sont utilisés au moins en partie pour satisfaire aux besoins de gaz contenant de l'oxygène d'un dispositif de fermentation ultérieure placé en cascade avec le premier* Ce mode de réalisation trouve une application particu-30 lière dans un dispositif dans lequel les gaz de sortie totaux de l'un ou de plusieurs dispositifs de fermentation agissant à des pressions relativement élevées dans la gamme désirée passent dans un dispositif de fermentation supplémentaire agissant à une pression relativement inférieure* Bien que les te-35 neurs relativement faibles en oxygène des gaz de sortie à pression élevée peuvent donner liéu à une productivité médiocre dans le dispositif de fermentation supplémentaire dans lequel ils passent, cette tendance est équilibrée par une économie dans les exigences de puissance et par une économie sur le nom-40 bre des dispositifs de fermentation nécessaires pour obtenir 70 24453 5 2060025 une productivité totale donnée. Le procédé de l'invention est particulièrement approprié pour la culture de levures sur un substrat hydrocarboné consistant essentiellement en hydrocarbures à chaîne droite et pour 5 récupérer ensuite des cellules de levure, par exemple par centri-fugation de l'effluent du dispositif de fermentation-suivie par un séchage pour obtenir un produit sec utile comme complément pour l'alimentation d'animaux. Habituellement, les hydrocarbures à chaîne droite, présents 10 dans les matières premières de l'invention, sont constitués d'al-canes, toutefois, les hydrocarbures à chaîne droite peuvent être présents sous la forme d'hydrocarbures éhtyléniques, de même on peut utiliser un mélange contenant des alcanes et des hydrocarbures éthyléniques à chaîne droite. 15 Des matières premières appropriées pour le procédé de l'invention comprennent des fractions de n-alcanes renfermant \ au moins 90 $ en poids de n- alcanes obtenus par traitement au taxais moléculaire d'une fraction de distillation d'origine pétrolière, par exemple du kérosène ou des gas-oils. 20 De préférence, on utilise une fraction obtenue à partir du pétrole ayant un poids moléculaire moyen correspondant au moins à 10 atomes de carbone par molécule. L'expression levures, utilisée dans l'invention, désigne des mélanges de levures. 25 Les levures utilisées dans l'invention sont classées confor mément à l'ouvrage "The Yeasts - a Taxonomic Study" par Lodder et Kreger-van Rij (1952) publié par : "lorth Holland Publishing Company (Amsterdam). La levure utilisée est, de préférence, de la famille des 30 Cryptococcaceae notamment de la sous-famille des Cryptococcoi- deae. Toutefois, si on le désire, on peut employer, par exemple, des levures ascosporogènes de la sous-famille des Saccharomycoi-deae. Les genres préférés de la sous-famille des Cryptococcoi-deae sont Torulopsis (également connue sous le nom de Torula), 35 Gandida et ^rycoderma. Les espèces de levures préférées sont indiquées ci-après. On préfère, en particulier, employer les souches spécifiques ayant les numéros de référence indiqués, ces numéros de référence se rapportent à la souche CBS détenue par wthe Cen- 70 24453 6 2060025 traal. Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Hollande", à la souche Gr.:l détenue par "the Commonwealth kycological Institute, Kew, Angleterre" et à la souche NÇYC détenue par "the National Collection of Yeast Cultures, Nutfield, Angleterre". 10 15 20 25 30 Espèce Candida brumptii " blankii 11 • cac.oii " catenulata " ciferrii " clausenii " hum.ic ola " intermedia " krusei, " lipolytica Souche préférée CBS No. 2078; No.599 GMI No. 93743 NGYC No.376; No.153 GMI No. 83350. NCYC No.458 35 " melibiosi 11 melibiosica " parapsilosis " pulcherrima " rugosa 11 stallatoidea 11 . tropical is . " utilis Debaryomyces kloeckeri Hansenula anomala Pichia guilliermondii Rhodotorula glutinis Torulopsis famata " magnoliae Des espèces ci-dessus, on préfère en particulier Candida lipolytica et Candida tropicalis. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants : EXEMPLE 1 On cultive en continu Candida lipolytica dans un dispositif de fermentation de type vat muni d'un moyen d'agitation ayant NCYC No. 4 CMI No.2331 CBS No.2084; No.. 2031 70 24453 7 2060025 une capacité de travail de 20 litres, en utilisant comme substrat hydrocarboné un mélange de n-alcanes ayant 11 à 14 atomes de carbone par molécule. Après line période initiale de démarrage au cours de laquelle la culture atteint la concentration désirée des 5 cellules de levure pour une opération continue, une charge continue d'un milieu aqueux minéral et d'un substrat hydroearboné commence à maintenir un taux de dilution du bouillon de 0,1. La température est maintenue à 30° G et le pH du bouillon à pH 5>5 par addition continue d'ammoniaque. 10 Le milieu aqueux minéral utilisé présente la composition suivante : (NH4)2HP04 2 g KCi 1,15 g MgS04,7H20 0,65 g 15 ZnS04 0,17 g MnS04,4H20 0,045g î'eS04,7H20 0,068g eau de ville 200 ml extrait de levure 0,025g 20 eau distillée jusqu'à 1000ml Le bouillon est agité énergiquement tandis que de l'air passe avec un taux et une pression désirée pour maintenir la pression du dispositif de fermentation à la valeur nécessaire. Trois essais sont réalisés avec trois pressions différentes 25 du dispositif de fermentation. Le premier essai est conduit avec une pression du dispositif de fermentation très proche de la pression atmosphérique et ne constitue pas un essai conforme à l'invention. Les conditions de mise en oeuvre et les résultats sont indiqués au tableau I (page 9 ). 30 Bans l'exemple ci-dessus, on voit que même lorsque les autres conditions du procédé sont maintenues pratiquement constantes, la pression du dispositif de fermentation variant, on obtient une augmentation importante dans la productivité, exprimée par le poids de cellules sèches et un accroissement du ren-35 dement. EXEMPLE 2 Dans cet exemple, l'augmentation de la pression de travail est accompagnée :(a) par le réglage du taux d'alimentation en hydrocarbures pour assurer que la fermentation ne devienne pas 70 24453 8 2060025 limitée en hydrocarbures, (b) par le réglage de la composition du milieu nutritif afin d'éviter une limitation de ce milieu nutritif et (c) lorsque cela est nécessaire par le réglage du taux d'air pour assurer d'éviter une limitation en oxygène. On p 5 utilise des augmentations de pression absolue de 0,5 kg/cm dans p la gamme de 1,5 à 3 kg/cm . On cultive en continu Candida lipolytica dans un dispositif de fermentation de type vat muni d'un moyen d'agitation ayant une capacité de travail de 1800 litres, en utilisant comme sub-10 strat hydrocarboné un mélange de n-alcanes ayant 10 à 14 atomes de carbone par molécule. Après une période initiale de démarrage au cours de laquelle la culture atteint une concentration désirés des cellules de levure pour l'opération en continu, une charge continue du milieu nutritif aqueux et du substrat hydrocarboné 15 commence à maintenir un taux de dilution du bouillon de 0,15. La température est maintenue à. 32°C et le pH du bouillon à pH 5,5 par l'addition continue d'ammoniaque. Le milieu minéral aqueux utilisé pendant la période de p fonctionnement sous 1,5 kg/cm a la composition de celui donné à 20 1'exemple 1. Comme indiqué ci-dessus, les concentrations en sels sont accrues avec les augmentations de pression par incrément au cours dé l'essai pour assurer que le système n'a pas de limitation en milieu nutritif. 25 Le bouillon est agité vigoureusement, tandis que de l'air est introduit à un taux permettant d'assurer que le système n'a pas de limitation en oxygène. La vitesse de l'agitateur est constante pendant l'essai et est de 320 tours/mn. L'essai est continué pendant une période prolongée légère-30 ment supérieure à 2000 h. A l'origine, la pression moyenne abso- o lue du dispositif de fermentation est de 1,5 kg/cm , elle est 2 p p portée à 2 kg/cm puis à 2,5 kg/cm et, enfin, à 3 kg/cm avec des intervalles au cours de l'essai. Les résultats obtenus sont indiqués au tableau II 35 (page 10 ). Il y a lieu de remarquer que sous une pression absolue moyén- p ne du dispositif de fermentation de 3 kg/cm , le rendement qui a été augmenté avec une pression accrue commence à diminuer bien que la productivité exprimée en poids de cellules sèches augmen 70 24453 9 2060025 te encore. Tableau i : Essai 1 2 3 : : taux d'alimentation en : hydrocarbure g/1 35,4 34,9 34,8 : : taux d'alimentation du : milieu 1/h 1,9 1,9 1,9 : : température °G 30 30 30 : : taux de dilution 0,1 0,1 0,1 : : -pH 5,5 5,5 5,5 : : taux d'aération v/v/mn 0,5 0,5 0,5 : : pression d'admission de l'air kg/cm2 1,3 1,7 2,1 : : pression du dispositif de fermen- : tation kg/cm2 1,1 -1,5 2,0 ; : (c'est-à-dire la pression absolue : moyenne du dispositif de fermen- - : tation en kg/cm2) : poids de cellules sèches g/1 10,2 12,6 13,2 : : rendement 0,57 0,62 0,72: : utilisation d'hydrocarbure 0,49 0,60 0,53: : oxygène dissout dans le bouillon saturation 1" ap; srox. 3 1" \ 70 24453 10 2060025 TABLEAU IX i pression absolue • : moyenne du dispo- • • î sitif de fermen- • • : tation p kg/cm 1,5 2 2,5 3 : : taux d'alimenta- • • : tion en hydro- : carbure g/1 17,0 20,0 r— C\j 30,5 î : taux d'alimenta- : tion du milieu 1/h 270 260 270 270 : : taux d•air v/v/mn 0,75 0,74 0,85 1,07 : : poids de cellules : sèches g/l 13,9 17,7 21,6 26,2 : : rendement 0,87 0,91 0,92 0,89 : 70 24453 n 2060025 BEVEHDIOATIOMS 1 - Procédé de culture d'une levure caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en continu une levure consommant un hydrocarbure dans un dispositif de fermentation de type vat en présence 5 d'un milieu nutritif aqueux et d'un substrat hydrocarboné qui constitue la source principale de carbone assimilable, la culture étant mise en oeuvre en présence d'un gaz-contenant de 1'oxygène libre et à une pression absolue élevée du dispositif de fermentation comprise dans la gamme de 1,5 à 4,0 kg/cm • 10 2 _ Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la pression absolue du dispositif de fermentation est comprise dans la gamme de ^ à 3 kg/cm • 3 - Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la pression choisie du dispositif de fermentation, 15 le taux d'aération, la concentration en hydrocarbures et la concentration en sels nutritifs sont rendus optimals pour créer l'environnement le plus favorable pour la croissance de la levure sUtt bissant la culture» 4 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caracté-20 risé en ce que les gaz de sortie du dispositif de fermentation sont utilisés pour engendrer au moins une partie de la puissance du compresseur employé pour fournir le gaz contenant de l'oxygène au dispositif de fermentation» 5 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, carac-25 térisé en ce que le substrat hydrocarboné est une fraction de n-alcanes contenant au moins 90 c/a en poids de n-r-alcanes obtenus par traitement au tamis moléculaire de kérosène ou de gas-oils d'origine pétrolière» 6 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, carac-30 térisé en ce que la levure cultivée appartient à la famille des Cryptococcaceae• 7 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la levure est du genre Candida» 8 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 7, catac-35 térisé en ce que la levure est une souche de Candida lipolytica» 9 - La levure obtenue par le procédé de culture conforme |i l'une des revendications 1 à 8.