Brevet FR2081386A1 — publié le 19711203

458,1 ' 208,236 L'inhibiteur de kallicréine et de trypsine, appelé ci-après IKT (vendu sous la marque "Trasylol (S)" par la firme Farbenfabriken Eayer Aktiengesellschaft, leverKusen) constitue depuis de nombreuses années un médicament d'un intérêt tout particulier, pour combattre 5 principalement des processus inflammatoires et des troubles de la coagulation. L'inhibiteur IKT s'accumule à de très fortes doses dans les reins, ce qui a pour conséquence de réduire assez rapidement le taux d'inhibiteur IKT dans le sang. C'est pourquoi on s'est efforcé 10 de découvrir des dérivés de l'inhibiteur IKT, qui s'accumulent moins fortement dans les reins et qui donnent, par conséquent, un taux sanguin élevé de plus longue durée. La Demanderesse vient de découvrir que les dérivés acyliques de l'inhibiteur HIT satisfont à un haut degré à cette condition. 15 On entend désigner par dérivés acyliques, dans le présent mémoire, tous les dérivés de l'inhibiteur IKT dans lesquels les groupes £-aminc des restes de lysine de l'inhibiteur en positions 26, 41 et 46 de même que le groupe amino de l'arginine N-terminale de l'inhibiteur IKT, sont partiellement ou totalement 20 acylés, à savoir : tant par des restes acide carboxylique que par des restes acide sulfonique. Le nombre d'agents d'acylation que l'on peut utiliser est très grand. A titre d'exemples, on mentionne les composés suivants : Anhydride d'acide acétique, 25 Chlorure d'acétyle, Liacétyle, Ester thioéthylique de l'acide trifluoracétiaue, N,S-diacétyl-2-aminoéthanethioI, Acétate nitrophénylique, 30 Acide Trinitrobenzènesulfonique, ÎT-acétylimidazole, ÎT-triflucracétylimidazele, Anhydride d'acide tétrafluorosucciniaue, Anhydride d'acide trifluoracétiaue, S J Ester p-nitrophénylique de la Il-acétylalanine, Lactone de 1'hcmosérine, Chlorure de benzyloxycarbonyle, N-éthoxycarbonvl-pntalimide. bad original copy 70 45891 ?08i:?35 /-1 Les nouveaux composés conformes à l'invention sont tout aussi bien tolérés que l'inhibiteur de kallicréine et de trypsine. Un avantage essentiel des nouveaux composés réside dans le fait qu'ils ne sont pas très fortement accumulés dans les reins et 5 qu'ils donnent pour- cette raison un taux sanguin élevé de longue durée. Les nouveaux composés sont,en outre ,éliminés avec l'urine et sont donc particulièrement intéressants à utiliser dans le cas de maladies des voies urogénitales. Ils possèdent par ailleurs la même activité que l'inhibiteur IKT lui-même. 10 - Cette activité s'exprime en unités d'inhibiteur UI. Une unité UI correspond à l'inhibition de l'activité d'un mg de trypsine, mesurée avec le p-nitroanilide'de la I-a-benzoyl-BL-arginine comme substrat dans les conditions normales suivantes : volume total : 3 ml 15 température : 25°C parcours de la lumière : 1 cm 1 mg de' substrat dans 1 ml d'eau distillée + 10 milliunités de trypsine dans de. l'acidg^hlorhydrique 0,001F + x ml de solution d'inhibiteur 20 on ajuste à 3,0 ml -avec un tampon de triéthanolamine 0,2M à un pH de 7,8 . on ajoute 0,02 mole de chlorure de calcium. On obtient les nouveaux composés en transformant tout d'abord d'une façon connue l'inhibiteur IKT avec des enzymes, par exemple 25 la trypsine, en un complexe d'inhibiteur IKT et de l'enzyme [Chauvet et Acher, "J. Biol. Chemistry" 242 (1967), page 4274]. On fait ensuite réagir" ce complexe avec les agents d'acylation mentionnés ci-dessus. L'enzyme est libéré ,d'une façon connue, des' complexes ainsi obtenus de composé acylique et d'inhibiteur IKT 30 [voir l'article mentionné ci-dessus]. On obtient alors les dérivés acyliques de. l'inhibiteur IKT sous une forme relativement pure, mais- on les soumet de préférence aux opérations connues de purification, par exemple par filtration sur gel ou par chromâtographie par échange ionique. 35 La liaison, effectuée dans ce procédé, de l'inhibiteur IKT à-un enzyme et la libération ultérieure de l'enzyme sont nécessaires pour empêcher une acylation du centre réactif de l'inhibiteur IKT. (ï1 70 45891 3 2081":? à Les dérivés acyliques,conformes à 1'invention,de l'inhibiteur IKT peuvent être utilisés en médecine pour les mêmes indications que celles pour lesquelles on utilise 1'inhibiteur IKT lui-même depuis de nombreuses années avec un grand succès. Les formes d'ap-5 plication et les doses à appliquer; correspondent également dans une large' mesure à celles qui sont connues pour l'inhibiteur IKT. EXEMPLE 1 On dissout 50 mg d'inhibiteur IKT et 188 mg de trypsine dans 30 ml d'un tampon de NaHCO^ 0,1M refroidi à la glace (0°C), 10 à un pH égal à 8,5 (ajusté avec de l'hydroxyde de 'sodium 2N). La solution est additionnée de petites quantités de trypsine,ou d'inhibiteur IKT,jusqu'à ce qu'on ne puisse plus constater d'activité d'inhibition de la trypsine,ou d'activité trypsique,sur des échantillons de 0,05 ml. La solution ainsi obtenue du complexe 15 IKT-trypsine est laissée au repos pendant 2 heures à 0°0 avec 0,5 g d'anhydride d'acide maléique en poudre fine et le pH de la solution est maintenu à 8,5 par addition continue d'hydroxyde de sodium 2N. Vers la fin de la réaction de saponification (qui se reconnaît à une forte rétrogradation de la consommation d'hydroxyde 20 de sodium), on ajoute un supplément de 0,5 g d'anhydride d'acide maléique, soit au total 2 g en 4 portions. Lorsque le pH s'est stabilisé après la dernière addition d'anhydride maléique, on ajoute 18,5 g d'urée à la'solution, jusqu'à une concentration finale de 6M, et on ajuste le pH à 1,9 avec de l'acide chlor-25 hydrique 2IT, ce qui provoque la précipitation de l'acide maléique et d'une partie de la trypsine modifiée. En vue de la précipitation complète de la trypsine modifiée, on introduit 2,5 g de sulfate d'ammonium dans la suspension refroidie à O^C. Le,précipité est ensuite isolé par centrifugation, en refroidissant, la solution 30 claire surnageante est versée par décantation, additionnée de 2 ml de tampon'de triéthanolamine 0,2M à un pH de 7,8, et neutralisée avec de l'hydroxyde de sodium 2N (pH 7-8). La solution neutre contenant le dérivé de tétramaléoyle de l'inhibiteur IKT, à côté de petites quantités d'acide maléique et de complexe 35 modifié de IKT-trypsine, est chargée sur une colonne de "Sephadex G—50", qui a été préalablement équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,02M à un pH de 6,0. Le fractionnement d'après la grandeur des molécules s'effectue avec le même tampon que l'agent 70 45891 4 208122b éluant. La fraction contenant le dérivé de tétramaléoyle de l'inhibiteur IKT est concentrée à un volume d'environ 5 ml dans un appareil rotatif d' évaporation sous vide à une température du bain de 20°C et débarrassée des sels à l'aide d'une colonne de 5 "Bio-gel-P-2", et. on utilise alors l'eau distillée comme agent éluant. On lyophilise la fraction débarrassée des sels du dérivé de tétramaléoyle de l'inhibiteur IKT. Rendement : par rapport à la quantité utilisée de IKT naturel, le rendement en tétra(maléoyl)—IKT lyophilisé est de 84 f°, ce "10 composé ayant une activité spécifique de 3,3 UI/mg. "RXFlMPT.Ti 2 En suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, on prépare par réaction du complexe IKT-trypsine avec la moitié de la quantité d'anhydride maléique indiquée dans &et exemple, le 15 dérivé tri(maléoyi)-IKT, à côté duquel il se forme encore le composé tétra(maléoyi}-IKT. Après fractionnement par filtration sur gel sur une colonne de "Sephadex G-5Q*", on charge 300 à 500 du mélange des- produits réactionnels sur une feuille d'acétate de cellulose, qui est imprégnée d'une solution tampon de borate 0,Q5M 20 à un pH de 8,0. La durée détablissement du chromatogramme par électrophorèse est d'une heure, sous tension de 6 volts/cm. On obtient deux bandes qui sont caractérisées par des distances de migration de 0,56 pour le composé tétra(maléoyi)-IKT et de 0,64 pour-*.le composé tri(maléoyi)-IKT, comparativement à une 25 distance de migration de 1,0 pour l'inhibiteur IKT naturel. Par une électrophorèse pratique utilisant par exemple un gel de polyacrylamide comme support, on peut obtenir les deux dérivés de l'inhibiteur IKT à une plus grande échelle. Rendement : par rapport à la quantité utilisée d'inhibiteur IKT 30 naturel, le rendement en matière lyophilisée s'élève à 85 f°, avec une activité spécifique de 3,3 Ul/mg. Le rapport du composé tétra- au composé tri(maléoyl)-IKT est de 2/3 à 1/3. EXEMPLE 3 On dissout-200 mg d'inhibiteur IKT et 715 mg de trypsine , 35 dans 50 ml de tampon refroidi à la glace et on prépare le complexe IKT-trypsine par un procédé analogue à celui qui est décrit dans l'exemple 1. La solution du complexe IKT-trypsine est transformée 70 45891 5 2081.*>26 par réaction avec 2 g d'anhydride d'acide succinique, ajoutés en 4 portions, en composé tétra(succinyl)-IKT. Après la précipitation de la trypsine modifiée avec du sulfate d'ammonium, on isole le précipité par filtration et on ajuste le pH du filtrat 5 à 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium 8N. On charge cette solution sur une colonne de "Sephadex G—50" qui a été équilibrée avec de l'acide acétique 0,0TM. On utilise de l'acide acétique 0,01M comme éluant. On lyophilise la fraction contenant le composé tétra(succinyl)-IKT. 10 Rendement : comparativement à la quantité utilisée de IKT naturel, le rendement en composé tétra(succinyl)-IKT lyophilisé (dans ■ plusieurs essais) s'élève à 80-90 fo, avec une activité spécifique de 3,3-3,7 UI/œg. EXEMPLE 4 " - 15 On transforme 200 mg d'inhibiteur IKT, au moyen d'un procédé analogue à celui de l'exemple 1, avec 715 mg de trypsine en complexe IKT-trypsine. La solution du complexe est transformée par réaction avec 2 g d'anhydride d'acide acétylmercaptosuccinique,. ajoutés en 4 portions, en un mélange de tétra-, tri-, di- et 20 mono(acétylmercaptosuccinyl)-IKT, dont on peut isoler les composants individuels par des procédés connus d'électrophorèse. Rendement : par rapport à la quantité utilisée d'inhibiteur IKT naturel, le rendement en matière lyopholisée est de 80 . avec une activité spécifique de 3,3-3,7 Ul/mg. 25 EXEMPLE 5 On fait réagir 50 mg d'inhibiteur IKT et 188 mg de trypsine au moyen d'un procédé analogue à celui de l'exemple 1, pour former le complexe IKT-trypsine. On ajoute à la solution du complexe 2 g d'anhydride d'acide carboxyméthylmercaptosuccinique en 4 30 portions. Après addition d'urée et acidification du mélange réactionnel avec de l'acide chlorhydrique 21 à un pH égal à 2,0, on ajoute de l'acide trichloracétiqûe jusqu'à ce que la concentration finale ait atteint 3 La trypsine modifiée précipitée est isolée par filtration et le filtrat est ajusté à un pH égal à 35 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium 8N. La solution est chromatogra-phiée sur une colonne de "Sephadex G—50" qui a été équilibrée avec de l'acide acétique 0,01M, et la fraction contenant l'inhibiteur V" 70 45391 6 2081236 TKT modifié est lyophilisée, l'inhibiteur IKT modifié est divisé conformément au procédé décrit dans l'exemple 2, par électrophorèse sur une feuille d'acétate de cellulose, en tétra(carbôxyméthyl-mercaptosuccinyl)-IKT et tri(carboxyméthylmercaptosuccinyi)-IKT. 5 Rendement : sur la base de la quantité utilisée d'inhibiteur IKT naturel, le rendement en tétra- et tri(carboxyméthylmërcàpto-succinyl)-IKT lyophilisé s'élève à 65 i°, avec une activité spécifique de 3,3-3,7 Ul/mg. . " * ' r . _ "RypiMPLE .6- 10 On mélange convenablement une solution de 50 mg d'inhibiteur IKT naturel et 190 mg de trypsine dans 15 ml de tampon de' NaHCO^ 0,1M à un pH égal à 8,5, avec une solution de 50 mg de chlorure de 1-diméthylaminonaphtalène-5-sulfonyle dans 7,5 ml d'acétone et on fait incuber le mélange réactionnel pendant 18 heures à 20°C. 15 Ensuite, on acidifie le mélange réactionnel avec de l'acide chlorhydrique 2N à un pH égal à 2,0 et on ajoute de l'acide trichloracétique jusqu'à ce que la concentration finale ait atteint 3 Après un repos de courte durée, on isole par filtration la trypsine modifiée, et on charge le filtrat sur une colonne de 20 "Sephadex G--50" qui a été équilibré^avec une solution diluée d'acide formique à un pH égal à 2,0. Les fractions sont éluées avec de l'acide formique à un pH égal à 2,0 et la solution contenant le complexe 1-diméthylaminonaphtalène-5-sulfonyl-IKT est lyophilisée. Rendement': par rapport à la quantité utilisée d'inhibiteur IKT 25 naturel, le rendement en poly(1-diméthylaminonaphtalène-5-sulfonyle)-IKT lyophilisé s'élève à 35 f°, avec une activité spécifique de 3,3-3,7 Ul/mg. EXEMPLE 7 On ajoute en 2 heures,sous agitation énergique, à la solution 30 de 50 mg d'inhibiteur IKT naturel et de 190 mg de trypsine dans 30 ml de tampon de ÏTaHCO^ 0,1M à un pH égal à 8,5» 2 g de chlorhydrate de thiolactone de l'homocystéine, par portions de 0,5 g, en opérant sous atmosphère d'azote. Après addition d'urée jusqu'à ce que la concentration finale ait atteint 6M, et après . 35 addition d'acide trichloracétique jusqu'à ce que la concentration finale ait atteint 3 f°, on continue d'opérer sans atmosphère d'azote. On laisse le mélange réactionnel reposer un instant, 70 45891 7 2081."'36 puis on isole le précipité par filtration et on ajuste le pH du filtrat à 6,0 avec de l'hydroxyde de sodium 8N. On effectue le fractionnement par filtration sur gel de "Sephadex G-50" conformément à la méthode décrite dans.1'exemple 1. On lyophilise 5 la fraction contenant le mélange de poly ( a-amino- "*( -mercapto-butyryl)-IKT. Rendement : par rapport à la quantité utilisée d'inhibiteur IKT naturel, le rendement en poly(a-amino--mercaptohutyryl)-IKT lyophilisé sf élève à 60 $>, avec une activité spécifique de 10 3,3-3/7 Ul/mg. •# t 70 45391 s 2081336 REYEHDICAÎIOUS 1. Nouveaux dérivés acyliques de l'inhibiteur de kallicréine et de trypsine. 2. Procédé de préparation de dérivés acyliques de l'inhibiteur 5 de kallicréine et de trypsine, caractérisé par le fait qu'on transforme l'inhibiteur de kallicréine et de trypsine en un complexe avec un enzyme, on traite le complexe avec des agents d'acylation et on décompose d'une façon connue le complexe de dérivés acyliques d'inhibiteur de kallicréine et de trypsine et d'enzyme 10 ainsi obtenu. 3. Médicament contenant ou consistant en des dérivés acyliques d'inhibiteur de kallicréine et de trypsine. ».