Brevet FR2059471A1 — publié le 19710604

La présente invention se rapporte aux lignées cellulaires ; elle comprend plus particulièrement une lignée de cellules hépatiques humaines hétéroploides et des cultures de ces cellules. On sait que certains types de tissus humains peuvent être cultivés in vitro sous forme de cultures de tissus, et que certains de ceux-ci passent à l'état de lignées cellulaires que l'on peut multiplier et faire passer à plusieurs reprises, ceci à une échelle admissible. Les cellules qui ont subi des modifications chromosomiques importantes et ont pris un caractère hétéroploide sont particulièrement utiles, car ces lignées sont continues et on peut les faire passer et les multiplier sur une très grande échelle, un nombre de fois pratiquement illimité ; on obtient ainsi une base pour la production à l'échelle industrielle de virus et des vaccins correspondants.Plusieurs types de virus pathogènes envahissent le foie et s'y multiplient, et il était donc absolument nécessaire d'obtenir une lignée cellulaire continue pouvant maintenir les virus de ce genre. Jusqu a présent, seules des lignées de cellules diploides fibroblastiques ont été obtenues à partir de cellules hépatiques mais celles-ci n'ont qu'une durée de vie limitée et on ne connaissait pas de lignées cellulaires hétéroploides dérivant de cellules hépatiques humaines, conservant leurs caractéristiques, qui permissent aux chercheurs d'étudier la nature de certains germes pathogènes dans les cellulès en question, de les multiplier en cultures continues et de pouvoir ainsi produire des matières antigéniques à partir des virus propagés et isolés, à des fins de vaccination et de diagnostic. L'un des objets de la présente invention est de fournir une lignée cellulaire de ce genre, plus particulièrement une lignée de cellules épithéliales hépatiques humaines qui contient du glycogène et ressemble, à la fois par sa morphologie et par son activité biochimique, aux cellules hépatiques fonctionnelles in vivo. Cette invention comprend ainsi une lignée de cellules épithéliales hépatiques hétéroploides d'origine humaine, comme la lignée WRL 68, qui forme des ilots nonconfluents ou des amas séparés quand on la cultive sur milieu nutritif, dont la morphologie ressemble de très près à celle des hépatocytes du foie humain et dont le temps de duplication ne dépasse pas 24 heures, qui donne une production accrue de glycogène en présence de 1 % de glucose dans le milieu et oui est apte à maintenir des virus. La lignée cellulaire EL 68 est déposée à la ellcome~Collection of micro-organisms and Cultures, Beckenham, Huent, Angleterre, ainsi qu'avec "the American type Culture Collection?! ,à Rockville, bjaryland, Etats-Unis d'Amérique (ATCC accession number CL 48). Le type de lignée cellulaire conforme à la présente invention est hétéroploide, c'est-à-dire que le nombre de chromosomes typiquement humains est, dans une proportion très importante, non-diploïde ou anormal, allant d'environ 63 à 91, le nombre modal étant d'environ 72. Au microscope optique, les cellules présentent un aspect polygonal et épithéliolde, et elles ressemblent aux hepåtocytes. En vue de rendre plus facilement compréhensible et de mettre en vue les principaux caractères des cellules, les éléments des cellules de la lignée WRL68, visibles au microscope optique et au microscope électronique, seront, à titre d'exemple, décrits en regard du dessin annexé, dans lequel : La figure 1 est un dessin représentant des amas séparés de cellules, présentantleurs caractéristiques principales visibles au microscope optique, sous un agrandissement de 2400. La figure 2 représente ce que l'on observe sur une coupe passée au microscope électronique, avec un agrandissement de 19.000. Sur la figure 1, les cellules (C) présentent des noyaux arrondis (N), contenant jusqu'à 5 nucléoles (NI). Le cytoplasme (CP) entoure chaque noyau (N). La figure 2 montre que, sous le microscope électronique, on constate que dans ces coupes le cytoplasme (CP) contient un grand nombre de granules (MB), constitués probablement de matières lipidiques. Les mitochondries (IZl) sont très nombreuses, ainsi que les grains de glycogène (GL). L'aspect au microscope électronique ressemble donc de très près à celui des hépatocytes humains typiques, et présente de grandes diffé rences avec la structure habituelle des fibroblastes. Cette lignée cellulaire, ainsi que des lignées qui lui sont pratiquement identiques et que les spécialistes peuvent obtenir par modification ou clonage de la présente lignée décrite, sans qu'il se produise une altération notable des caractéristiques morphologiques et fonctionnel- les de celle-ci ou de la culture, font partie du domaine de la présente invention. Le moyen le plus simple pour obtenir une lignée cellulaire conforme à l'invention, est de faire appel au dépôt public qui a été indiqué mais il n'est nullement impossible ni improbable de pouvoir produire par d'autres méthodes ou d'obtenir par un hasard tout aussi inattendu des lignées cellulaires épithéliales hépatiques hétéroploides humaines, qui lui soient pratiquement identiques sous leurs aspects morphologique et fonctionnel.De telles lignées cellulaires, pratiquement identiques du point de vue fonctionnel, équivalent biologiquement à la lignée cellulaire JRL 68 et elles font donc partie du domaine de la présente invention La Demanderesse suppose que la lignée cellulaire WHL 68 a été obtenue à la suite d'une transformation spontanée, absolument inattendue et originale, lorsque du tissu hépatique d'embryon humain fut trypsine et maintenu dans un milieu minimal essentiel d'Eagle (Eagle H., Science, 1959, 130, 432) additionné de 10 50 de sérum bovin, à 37 pendant quelques mois. La lignée cellulaire se cultive facilement dans les milieux courants. il est commode d'utiliser les milieux essentiels minimal ou basal d'Eagle (Eagle ., J. Exp. Med., 1955, 102, 595), car il est facile de se les procurer, Comme d'habitude, on peut leur ajouter du sérum bovin, en particulier du sérum de veau. il est préféable que les quantités habituelles d'amino-acides et de vitamines soient à peu près doublées. On peut également utiliser le milieu 199 (Morgan J.F. et coll, Froc. xoc. Exp. Biol. Med., 1). Le temps de développement est généraXemenb d'environ 15 heures dans des conditions favorables, par exemple à 37 . La lignée cellulaire ne forme pas de couches continues, mais se développe sous la forme d'îlots ou d'agglomérats non-confluents qui ressemblent aux lobules hépatiques. Les dimensions habituelles de ces agglomérats vont approximativement de deux à trois mm. Du point de vue biochimique, les lignées cellulaires conformes à l'invention produisent du glycogène, tout comme les cellules fonctionnelles du foie, autrement dit les hépatocytes. Comme toutes les souches hétéroploides humaines continues, elles se montrent oncogènes lorsqu'on effectue l t épreuve des abajoues du hamster. On peut utiliser les lignées cellulaires pour la culture de divers virus humains et animaux. Ces virus comprennent des virus à ADN, comme le virus de la vaccine, des adénovirus et le virus de l'herpès, des virus à ARN, comme le virus de la poliomyélite, des echovirus-adaptés aux cellules Héla, le virus paragrippal 1 (Sendai), le virus de l'entérite infectieuse des félidés, et des arbovirus, comme le virus Semliki Forest et le virus Sindbis. la présente invention comprend aussi un procédé de culture dlune lignée de cellules épithéliales hépatiques humaines hétéroploïdes, telle que définie plus haut, procédé selon lequel on maintient les cellules dans un milieu de culture nutritif, ainsi qu'un procédé de culture de virus, procédé qui consiste à inoculer à la lignée de cellules hépatiques humaines hétéroploides, ou à une culture de ces cellules, un virus auquel les cellules sont sensibles, pis à cultiver la lignée cellulaire telle que définie plus haut. L'invention comprend en outre une culture de cellules ou une culture de virus correspondantes, en association avec un milieu de culture nutritif Les virus qui sont obtenus de cette manière con viennent pour d'autres opérations connues On peut par eem- ple les faire passer dans des cultures de cellules identi- ques ou différentes, de façon à obtenir une souche purifiée ou atténuée et un vaccin vivant Le matériel viral anti génique cultivé conformément à ltinvention peut également être inactivé selon les procédés couramment utilisés pour la production de vaccins inactivés.Les vaccins vivants ou inactivés sont généralement présentés avec un véhicule pour usages pharmacettiquesS sous une forme solide ou liquide Une autre possibilité consiste à utiliser la li gnée cellulaire conforme à la présente invention en vue de la recherche, par exemple pour étudier les processus métaboliques qui se déroulent dans le foie, ou bien pour produire le glycogène ou les enzymes normalement produites par le foie in vivo. D'autre part, ces cellules peuvent jouer le rôle d'hôtes pour des virus de l'hépatite humaine que l'on n'a pas réussi jusqu'à présent à cultiver in vitro, quelles que soient les conditions de culture. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer la présente invention. EXEMPLE 1 On transfère un échantillon de la lignée cellulaire hépatique hétéroploide JEL 68, représentant à peu près de 105 à 106 cellules dans des flacons à prélèvement plats d'une capacité de 30 ml, contenant le milieu essentiel minimal d'Eagle, additionné de 10 % en volume par volume de sérum de veau. Au bout de trois jours à 370, on observe un développement maximum des agrégats.On met 0,5 ml d'une suspension d7adénovirus Il dans du milieu basal d'Eagle, contenant environ 104 DICT 50 (doses infectieuses pour les cultures de tissus) en contact avec les cellules et on -laisse l'adsorption du virus se poursuivre pendant une demi-heure. On élimine ltexcès de virus par lavage avec du liquide d'entretien (sans sérum), et on fait incuber la culture à 370 Au bout de 3 jours, on observe un effet cytopathique typique des adénovirus. On soumet alors la culture à une congélation-décongélation, pour libérer le virus des cellules. On élimine par filtration les débris cellulaires, puis on met en évidence la présence du virus dans le milieu par hémagglutination avec des érythrocytes de singes patas. Le titre est égal à 128, ce chiffre représentant la dilution maximum pour laquelle il se produit encore l'hémagglutination. On cultive également les souches 4, 5, 7 et Il d'adénovirus sur la lignée cellulaire. On obtient des titres satisfaisants. EXEMPLE 2 On adsorbe la souche Lister du virus de la vaccine sur une culture de la lignée de cellules hépatiques hétéroploides, de-la manière décrite à l'exemple 1. On observe un effet cytopathique typique après incubation pendant 24 heures à 37a. La lignée cellulaire est également sensible à la souche Jenner du virus de la vaccine, et on observe un effet cytopathique analogue. EXEMPLE 3 On cultive également avec succès, sur la lignée de cellules hépatiques hétéroploides WEL 68, de la manière décrite dans les exemples précédents le virus de la poliomyélite, les echovirus 2, 7, 9, 11, 15, 17, 20, 23 et 25, préalablement adaptés à des cultures de cellules HeLa, le virus de Sendai, le virus herpétique, le virus de l'entérite infectieuse des fé-lidés, le virus de San Carlos, et des arbovirus, comme le virus Semliki Forest et le virus Sindbis. Ces virus ont un pouvoir antigénique satisfaisant après adaptation à la lignée de cellules hépatiques humaines hétéroploides. On peut, par conséquent, cultiver ces virus, et d'autres virus sensibles, sur une telle lignée cellulaire, et les présenter comme vaccin avec un véhicule pour usages pharmaceutiques après une inactivation ou une atténuation appropriée, selon les procédés bien connus. REVENDICATIONS 1.- Unc lignée de cellules épithéliales hépatiques humaines hétéroploides, telle que la lignée WFL 68, qui forme des îlots non-confluents ou des amas séparés quand on la cultive sur un milieu nutritif, dont la morphologie ressemble de très près à celle des hépatocytes du foie humain et dont le temps de duplication ne dépasse pas 24 heures, qui donne une production accrue de glycogène en présence de 1 % de glucose dans le milieu et qui est apte à maintenir des virus. 2.- Lignée de cellules épithéliales hépatiques humaines hétéroploides selon la revendication 1, telle que représentée par les figures 1 et 2 du dessin annexé. 3.- lignée de cellules épithéliales hépatiques humaines hétéroploldes telle que déposée à 1'American Type Culture Collection sous le numéro de classement CL 48, ou un équivalent biologique de celle-ci, consistant en une lignée cellulaire du même type, pratiquement identique du point de vue fonctionnel. 4.- Un procédé de culture d'une 7ignée de cellules épithéliales hépatiques humaines hétéroploides, telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on maintient les-cellules dans un milieu de culture nutritif. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu essentiel minimal ou basal d'Eagle ou le milieu 199. 6.- Procédé selon la-revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu du sérum bovin. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le sérum est du série de veau. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendica tions 4 à 7, caractérisé en ce que la proportion d'a-mino- acides et de vitamines est environ le double de la proton tion habituelle. 9.- Culture cellulaire d'une lignée de cellules pithéliales hépatiques humaines hétéroploides, caractérisée en ce qu'elle comprend une lignée cellulaire telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, en association avec un milieu de culture nutritif. 10.- Culture de cellules préparée par un procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8. 11. Culture de cellules selon la revendication 9 ou 10, comprenant des cellules qui se multiplient sous forme d'plots ou agglomérats séparés ressemblant aux lobules hépatiques. 12.- Culture de cellules selon la revendication 11, comprenant des flots ou agglomérats séparés, dont la dimension moyenne est de 2 à 3 mm ou d'environ 3 mm. 13- Un procédé de culture de virus, caractérisé en ce que l'on inocule à une lignée cellulaire ou à une culture de cellules, telles que spécifiées à l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 9 à 12, un virus auquel les cellules sont sensibles et on cultive la lignée cellulaire dans un milieu de culture nutritif, tel que spécifié dans l'une quelconque des revendications 4 à 8. 14.- Culture de virus préparée par le procédé selon la revendication 13. 15.- Culture virus comprenant une lignée ou une culture de cellules telles que spécifiées dans l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 9 à 12, infectée par des virus auxquels les cellules sontsensibles, en association avec un milieu de culture nutritif. 16.- Un procédé de préparation de vaccins contenant des antigènes viraux, caractérisé en ce qu'on cultive un virus par le procédé selon la revendication 13 et qu'on présente les antigènes viraux sous une forme inactivée ou atténuée, en association avec un véhicule pour usages pharma celtique s 17.- Les vaccins viraux qui ont été préparés par une méthode comprenant un procédé selon la revendication 16.