Brevet FR2103608A1 — publié le 19720414

L'invention concerne des vaccins humains et vétérinaires à vaporiser. Les brevets "britanniques Nos. 837«465 e"t 994-734 décrivent des produits pharmaceutiques à vaporiser, pour lesquels un ! 5 agent thérapeutique pulvérulent est dispersé dans un gaz transporteur liquide. Ainsi formulé, l'agent thérapeutique peut être introduit, à l'aide d'un vaporisateur comme aérosol dans les voies respiratoires supérieures, par l'intermédiaire du rhinopharynx. Selon les deux brevets, on utilise une substance 10 tensio-active non ionique liquide pour former et maintenir la dispersion. Fait étonnant, on a constaté que, pour disperser j des produits prophylactiques secs (antigènes) dans un gaz transporteur j liquide, on peut utiliser de la lécithine, substance qui n'est ni liquide j ni non ionique. 15 En concordance avec ce qui précède, l'invention con cerne des vaccins humains et vétérinaires à vaporiser, caractérisés en ce que des antigènes secs sont dispersés dans un gaz transporteur liquide à ; l'aide de lécithine. \ Par "antigènes", il y a lieu d'entendre par la suitetanl 20 les antigènes viraux que bacfériens, tant les virus ; morts que les virus atténués et las bactéries, ainsi que les toxoïdes. Des bactéries, des mycoplasma et des virus de genres très divers peuvent être transformés en vaccins conformes à l'invention. On peur citerj souches d'influenza diverses, par exemple A^ Aïchi, 25 Japon, A2 Hongkong, Angleterre, B Johannesbourg, B Massachussets, B-Pays-Bas, souches de para-influenza, par exemple les genres 1, 2 et 3, souches des adénovirus, par exemple les genres 3» 4 et 7» virus de la rougeole, virus de la poliomyélite, bactéries de tétanos, de diphtérie et de coqueluche, Adéno-virus, Réovirus, virus bronchitiques infectieux, 30 virus de la diarrhée virale bovine, virus de l'influenza chevaline, Rhinovirus, virus de Rhinopneumonitique, virus de la pseudo-peste aviaire, virus laryngo-trachéitique infectieux, virus de l'Herpès canin, virus de l'Herjbès félin, virus 5e Miyagawanella, virus de Panleucopénie, virus de la maladie des chiens, virus rabique, virus pseudo^ rabique, virus de la 35 peste porcine, virus de la fièvre aphteuse, virus de la vaccine, virus du Blue tongue, Pasteurella multocida, Coccus , tels que Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, Streptococcus, Diplococcus pneumoniae, puis Escherichie, par exemple Escherichia coli, Salmonella, bactéries de Coryne, Actinobacillus, Haemophilus, Neisseria, Proteus, Pseudomonas et 40 autres. 71 31004 2 2103608 Les vaccins conformes à l'invention comprennent tant les vaccins monovalents que les vaccins polyvalents. Les antigènes à incorporer dans les vaccins s'obtiennent de façons connues. 5 Les virus s'obtiennent par multiplication sur des oeufs couvés ou dans des cultures de cellules, éventuellement précédés d'une atténuation dans de tels milieux ou dans des animaux. Les bactéries s'obtiennent généralement à partir de cultures artificielles. 10 Le matériau antigène virulent peut être tué avec les moyens connus, tels que de la formaldéhyde, de la yj-propiolactone, des rayons ultra-violets et par traitement thermique. Le matériau antigène peut au besoin être pnrlffé suivant des techniques usuelles. 15 Les antigènes doivent être transformés â l'état sec en un vaccin conforme à l'invention. A cet effet, ils sont soumis à cryo-dessiccation et ensuite, éventuellement, à second séchage. Toutefois, cela n'est pas toujours nécessaire et dépend des conditions dans lesquelles le matériau est traité après la cryodessiccation. Le post-séchage peut être 20 omis si l'absorption d'humidité est exclue. Le second -séchage s'effectue en con»er**nt les antigènes pendant quelques jours dans le vide au-dessus d'un moyen fortement hygroscopique, tel que de l'acide sulfurique concentré, CaCO^, Na2S0^, silicagel, P2O5 et autres. La durée du traitement peut être réduite en 25 augmentant légèrement la température jusqu'à par exemple environ 35 à 50*C. Les vaccins à vaporiser conformes à l'invention s'obtiennent en faisant disperser des antigènes secs dans un gaz transporteur liquide, à l'aide de lécithine. Il est efficace de mélanger là suspension d'antigènes 30 avec de la lécithine avant la cryodessiccation. Ainsi, on obtient d'une façon simple un mélange intime. Toutefois, il est également possible de mélanger les antigènes avec la lécithine aparès cryodessiccation. D'une façon générale, la quantité de lécithine nécessaire' pour la dispersion des antigènes est d'au minimum 1 mg par milli- 55 litre- de liquide de vaccin. Pour obtenir une grande stabilité, la quantité' r de lécithine est de préférence augmentée jusqu'à 10 mg par millilitre. Toutefois, il est possible d'utiliser de plus- grandes quantités, par exemple d'au moins 100 mg par millilitre. La limite supérieure est déterminée par la solubilité dans le gaz transporteur liquide. Pour des buts 40 pratiques, on choisit la quantité dé lécithine entre 1 et 100 mg par 71 31004 5 2103608 millilitre et, de préférence, entre environ 10 et 100 mg par millilitre. Il est évident que pour obtenir une bonne stabilité de la suspension, la quantité d'antigène par millilitre joue un rôle. En tous cas, la quantité de lécithine nécessaire se laisse facilement déterminer. A cet effet, on 5 mélange l'antigène avec le gaz transporteur liquide dans un rapport donnant la concentration requise, éventuellement avec addition de,par exemple ,10 mg de lécithine par millilitre de suspension. Après obtention d'une suspension homogène, on détermine le temps s'écoulant avant que le matériau mis en suspension ne se soit déposé. Si ce temps est court, on 10 peut augmenter la stabilité par addition d'une quantité additionnelle de lécithine. Comme gaz transporteurs, on peut utiliser les gaz usuels en pharmacie liquides â la température ambiante normale sous pression. Comme tel, on peut citer: les hydrocarbures halogénés, tels que du 15 dichlorodifluorométhane, du dichlorotétrafluoro-éthane, du trichloro-monofluorométhane, du dichloromonofluorométhane , du monochlorodifluoro-méthane, du trichlorotrifluoro-éthane, du difluoro-éthane, du monochloro-trifluoro-éthane, des hydrocarbures, tels que du butane, de 1'isobutane, du propane et autres ou leurs mélanges. Comme gaz transporteur, on peut 20 également utiliser les mélanges de gaz et les gaz liquides sous pression à la température ambiante normale. Tout en étant importante pour tous les vaccins, l'invention importe notamment pour les vaccins protégeant les organes respiratoires, du fait que pour cette catégorie, les antigènes peuvent être 25 transportés par un vaccin conforme à l'invention à l'endroit où se produit l'infection à combattre par le vaccin. Plus en particulier, l'invention importe pour les vaccins administrés contre l'jnfluenza, du fait que ceux-ci sont destinés à combattre l'infection la plus fréquente de l'appareil respiratoire. 30 L'invention peut être expliquée en détail à l'aide des exemples suivants. 1. Vaccin monovalent. A une quantité de 4.000 oeufs embryonnés fut inoculé, suivant la route allantoïdienne, du virus d'influenza de la souche A^ 35 Hongkong, qui était adaptée à l'oeuf et à la souris suivant la formule MK^EjM-igEy (MK = Monkey Kidney, E = oeuf (route allantoïdienne) M=souris). Après :±naubation pendant 2 jours à une température de 35*C, les oeufs •furent refroidis â une température de 4*C pendant 16 jours, et l'on obtint le liquide allantoïdien. Le volume obtenu était de 30 litres. 40 Le virus fut purifié par centrifugeage à nombre de 71 31004 4 2103608 tours bas et à nombre de tours élevé à respectivement 1.300 et 50.000 g, la dernière opération étant effectuée dans un centrijûgeurdit de Sharples, à vitesse de passage de 1,5 litre par heure. Le Sédiment du centrifugeage à nombre de tours élevé fut remis en suspension dans un tampon de phos-5 phore isotonique à pH de 8.0. A une gravité de 1.300 g, on chassa des impuretés par centrifugaage. Pour obtenir 1'inactivation, on ajouta, en poids, 0,03$ et ensuite 0,02$ de yg-propiolactone. Le volume à 5 litres fut dialysé contre l'eau pendant trois jours, opération pour laquelle on utilise le volume décuple d'eau. Le liquide de dialyse fut renouvelé une 10 fois. On ajouta au dialysat de la lécithine de soya dans une quantité de 4 100 ÏÏ.L de virus (Unités internationales d'hémag- glutination, voir Bulletin de l'Organisation Mondiale de la Sauté, annexe 2, 1968, stadardisation biologique, pt. 3.4.2). Le tout fut soumis â cryo-15 dessiccation dans un cryodessiccatèun de Leyboldt, type G04. Le matériau sec ainsi obtenu subit un séchage secondaire au-dessus de ^2^5 ^ans Ie vide, après quoi la substance sèche fut mise en suspension dans, en volume, 40$ de dichlorodifluorométhane et 60$ de trichloromonofluorométhane. Le produit ainsi obtenu contenait 1.500 ïï.I. de virus par millilitre. 20 2. Vaccin bivalent. A une quantité de 4.000 oeufs embryonnés fut inoculé, suivant la route allantoïdienne, du virus d'influenza souche A^-Aïchi, qui était adaptée â l'oeuf suivant la formule g- Après incubation pendant 2 jours à une température de 35*0, les oeufs furent refroidis à une 25 température de 4*C pendant 16 heures et l'on obtint le liquide allan-toïdien. Le volume obtenu était de 30 litres. Le virus fut purifié par centrifugeage à un nombre de tours bas et à un nombre de tours élevés â respectivement 1.300 et 50.000 g, la dernière opération étant effectuée dans un centrifugeurdit de 30 Sharples à vitesse de passage de 1,5 litre par heure. Le sédiment obtenu après le centrifugeage à nombre de tours élevé fut remis en suspension dans un tampon de phosphate isotonique à pH 8.0, contenant 0,01 M de citrate. A une gravité de 1.300 g, on chasse les impuretés par centrifugeage. Afin d'obtenir 1'inactivation, on ajouta, en poids, 0,03$ et 35 ensuite 0,02% de yjj-propioilactone. Le liquide (volume 5 litres) fut dialysé contre l'eau pendant trois jours, opération pour laquelle on utilisa le volume décuple d'eau. Le liquide dialysé fut renouvelé une seule fois. A une quantité de 3.000 oeufs embryonnés fut inoculé, suivant la route allantoïdienne, du virus d'influenza souche B-Massa-40 chusetts, qui était adaptée à l'oeuf suivant la formule E^. 71 31004 5 2103608 Après incubation pendant 3 jours à une température de 33*C, les oeufs furent refroidis et on obtint le.liquide allantoïdien. Le volume était de 22 litres. Le virus fut purifié par centrifugeage â un nombre de tours élevé et bas.à respectivement 1.300 et 50.000 g, la 5 dernière opération était effectuée dans un centrifugeiirdit de Sharples à vitesse de passage de 1,5 litre par heure. Le sédiment obtenu après le centrifugeage â nombre de tours élevé fut remis en suspension dans un tampon de phosphate isotonique â pH 8.0. A une gravité de 1.300, on chassa toujours des impuretés par centrifugeage. Afin d'obtenir l'inacti-10 vation, on ajouta, en poids, 0,03% et ensuite 0,02$ de ^J-propiolactone. Le liquide (volume 3»5 litres) fut dialysé contre l'eau pendant trois jours, opération pour laquelle on utilisa le volume décuple d'eau. Le liquide de dialyse fut renouvelé, une seule fois. Après dialyse, les deux résultats furent mélangés. 15 Le rapport entre les quantités de virus de la souche A^ et de la souche B était de 3 s 2. On ajouta 1 mg de lécithine par 100 ÏÏ.I. de virus. Le tout fut soumis à cryodessiccation dans une machine de Leyboldt du genre G04, après quoi la substance sèche fut mise en suspension dans, 20 en volume, de 40$ de dichlorodifluorométhane et 60$ de trichloromonofluoro-méthane. Le produit ainsi obtenu contenait 1.500 ÏÏ.I de virus A^ et 1000 ÏÏ.I'i de virus B par millilitre. 71 31004 6 2103608 REVENDICATIONSi I. Vaccins à vaporiser humains et vétérinaires, caractérisés en ce que des antigènes secs sont dispersés, à l'aide de lécithine, dans un gaz transporteur liquide. 5 2. Vaccins à vaporiser selon la revendication 1, carac térisés en ce que des antigènes sont dispersés contre les infections des organes respiratoires. 3. Vaccins à vaporiser selon la revendication 2, carac térisés par la dispersion d'antigènes d'influenza. 10 4. Vaccins à vaporiser selon l'une des revendications 1 à 3» caractérisés en ce qu'ils contiennent au minimum 1 mg de lécithine par ml. 5. Vaccins à vaporiser selon la revendication 4, carac térisés en ce qu'ils contiennent 1 à 100 mg de lécithine par ml. 15 6. Vaccins à vaporiser selon la revendication 5» carac térisés en ce qu'ils contiennent 10 à 100 mg de lécithine par ml. 7. Procédé permettant de préparer des vaccins humains et vétérinaires, caractérisés en ce que des antigènes secs sont dispersés, â l'aide de lécithine, dans un gaz transporteur liquide. 20 8. Procédé selon la revendication 7» caractérisé en ce que des antigènes sont dispersés contre les infections des organes respiratoires. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par la dispersion d'antigènes d'influenza. 25 10. Procédé selon l'une des revendication 7 M» carac térisé en ce qu'ils contiennent au moins 1 mg de lécithine par ml de liquide de vaccin. II. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on utilise 1 à 100 mg de lécithine par ml de liquide de vaccin. 30 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on utilise 10 â 100 mg de lécithine par ml de liquide de vaccin.