Brevet FR2075994A1 — publié le 19711015

On a déjà signalé que des extraits à l'acétone de graines d'avocat possèdent une activité bactéricide à l'égard du Staphylococcus aureus, du Bacillus subtilis, de l'Aspergillus glaucus, du Pénicillium notatum et de l'Achromobacter perolens. En outre, l'extraction de graines d'avocat à l'éther de pétrole produit une cire brute qui empêche la croissance du liTicro- coccus pyogenes et de la Sarcina lutea. Toutefois, les extraits d'avocat essayés étaient à l'état brut, et l'on n'avait pas pu isoler le composé produisant l'inhibition. On a maintenant découvert que des méthodes convenables d'extraction et d'isolation appliquées à des graines et à des fruits d'avocat permettent d'obtenir tout un groupe de composés dont les structures sont très analogues et qui possèdent tous une longue channe aliphatique dont une extrémité n'est pas saturée et dont l'autre est fortenent oxygénée. La formule générale des composés de ce groupe peut être la suivante: où B est un radical saturé oléfinique (double liaison) ou acéty lénique (triple liaison). Il apparat que ce groupe de composés est entièrement nouveau et n'a jamais été décrit dans la littérature scientifique. On a en outre constaté que le 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca16-ène possède des propriétés bactéricides marquées et inhibe certaines bactéries gram-positives à la dose de 4 g/ml, en particulier le Staphylococcus aureus. Ce composé s'est révélé thermo-résistant. Son activité bactéricide ne diminue pas après stérilisation. Il ne s'agit donc pas seulemen-s d'un. bact;éricide utile toutes les fois que l'on rencontre du Staphylococcus aureus ou d'autres bactéries comme indiqué ci-après, raais également lorsque ces bactéries se trouvent dans des denrées alimentaires soumises à des processus thermiques, par exemple des puddings. Le tableau I ci-après montre un certain nombre des composés du groupe isolés à partir de graines et de fruits d'avocat et, parmi eux, le 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène dont l'effet a été expérimenté sur diverses bactéries. Les chiffres indiquent le diamètre en min de la zone d'inhibition, mesuré après 48 heures d'incubation. TABLEAU I Bacillus subtilis NCTC 3610 Bacillus cereus NCTC 7587 Salmonella typhi NCTC 8393 Shigella dysenteriae NCTC 4837 Staphylococcus aureus oxford Candida albicans Saccharomyces cerevisiae ATCC 7752 Saccharomyces cerevisiae S 288c COMPOSES TESTES O R G A N I S M E S T E S T E S o\ I 0 I' 1 I P a3 -d e r *r t I a 0 1 6 f I I P I - V t Hc=o-(cH2) 1-1H-CH20H-CH2OOOCH3 I - - - - - - OH Il H2C=CH(OH2)îî?HCH2OtH2OnOOCH3 - - - - 12 10 18 9 OH OH III Hc=c-(cH2)11- - 10 - 9 - 14 OH OH Iv H2c=cH-(cH2)11-cH-oH2-CH-cH2OH to OH OH 1 Hc=c-(0H2) î?HcH2?HCH2O-.COH3 1 N I I I t O-.COCH3COCH3 a I 9 1 P c -I VII Hc=c-(oH2)11-9-cH2-oH-cH20-cOcH3 12 15 - - 14 - - O O n OH u g: Y= O u O O ≈ V VIII H2C=CH-(0H2)11-C1-0H2-CH-CH2O-COCH3 G = 15 - N 16 V d O O o X c'lX6 OH O g N V NS O C o m sw O m I : V = mN O = 8 V o = = X A x V O x m &verbar; 0m el V De V OE N Vo I O~d 0 t~0 q O ~ O v X J - X - l N CU eu c eu v N D M O O U V lffi X V I n u X I N v ew H H H !o H H H H H H H > :: TABLEAU I (Suite) Bacillus subtilis NCTC 3610 Bacillus cereus NCTC 7587 Salmonella typhi NCTC 8393 Shigella dysenteriae NCTC 4837 Staphylococcus aureus oxford Candida albicans Saccharomyces cerevisiae ATCC 7752 Saccharomyces cersvisiae S 288c COMPOSES TESTES O R G A N I S M ES T E S T E S Ix H2C-cH2-(0H2) 1 1CHCHOHOHCH20H - - - - - - OH OH X H3C-CH OH 3 - - - - - - XI HO=O-( OH2)11-C=CH-OH=CH - - - - - - - O XII H2C=OH-(0H2)1 îC=CNHYH=CH 10 - - - Il - - o v cq c o VE x u v : v c)o x ll v ú l o x = l o v v - o l - o v J u v u OJ mN V V U I V V O &verbar; I I OJ n 8 N X H H H F: X H Ce tableau montre que des organismes gram-positifs sont for- tement affectés par le 1,2, 4-trihydroxy-n-heptadeca-l 6-ène (IV du tableau), et à un moindre degré par différents autres composés. Le tableau II ci-après montre la sensibilité de divers micro-organismes au 1,2,4-trihydroxy-n-heptadeca-16-ène après 18 à 40 heures, les micro-organismes étant cultivés en milieu liquide, tandis que le tableau I montrait les bactéries en milieu solide. TABLEAU II Sensibilité de divers micro-organismes au compose n IV du Tableau I Organismes Concentration minimale inhibitoire en eg/ml Après 18 heures Après 40 heures Bacillus subtilis NCTC 3610 2 7,8 Bacillus cereus NCTC 7587 7,8 7,8 Staphylococcus aureus oxford 16 31 Saccharomyces cerevisiae ATCC 7752 31 125 Procédé d'isolation du 1,2,4-trihydroxy-n-heptadca-16-ène Substance brute (I.lethode A) Deux kilogs de graines d'avocat sont broyés et séchés pour donner environ un kilog de substance sèche. Celle-ci est extraie à la benzine, au benzène, au chloroforme ou par un solvant ana logue (environ 20 volumes).Le solvant est récupéré par évaporation jusqu'à ce qu'il reste environ 20 graines d'un extrait huileux. Celui-ci est dissous dans environ un litre d'hexane chaud, et on le laisse reposer pendant une nuit à environ 50 Le précipité est rassemblé par filtration ou centrifugation. Lorsque l'extraction se fait à partir de la chair de l'avocat, un échaudage préliminaire est nécessaire (environ un quart d'heure à 1210). Substance brute (Méthode B) A un volume d'huile brute d'avocat, on ajoute deux volumes de méthanol. Après avoir agité pendant environ une demi-heure, la fraction méthanol est séparée et évaporé. La purification de l'extrait brut est réalisée en le faisant passer en solution dans du chloroforme sur une colonne de gel de silice de 0,05 à 0,2 mm. Une élution se fait à l'aide d'un gradient de chloroforme et de méthanol. La dernière fraction à éluer, lorsque le pour centage de méthanol dans le chloroforme est de 4, contient un mélange de 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène et de son analogue acétylénique. La séparation entre ces deux composés est obtenue par addition de nitrate d'argent (dissous dans de l'eau) à un poids égal du mélange (dissous dans du méthanol) et mélangeage des deux produits pendant deux heures. Le composé acétylénique est dissous sous forme d'acétylure. L composé oléfinique est séparé du liquide surnageant par centrifugation et est finaleluent purifié à l'éther. Méthode d'essai du 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène. Organismes. Des bactéries sont cultivées sur de la dextrose provenant d'extrait de boeuf (B.E.D.), de l'agar ou du bouillon (0,5 de bacto-peptone, 0,3% de bacto-extrait de boeuf, 0,5% de dextrose). Les levures sont cultivées sur un msslange- de peptone, d'extrait de levure et de dextrose (P.Y.E.D.) de l'agar ou du bouillon (0,5 de bacto-peptone, 0,3% d'extrait de levure et 2 de dextrose). Les essais sont effectués dans le me milieu. Zone discoïdale d'inhibition. Chaque composé est dissous dans du CHCL3 (1OmEA/m1) et 5 de la solution sont transférés sur un disque stérile de 6 mm de diamètre en papier filtre Whatman N 3, de façon que chaque disque contienne 0,05 mg du composé. A des disques témoins, on ajoute 5 l de CHCL3. Les disques sont laissés au repos pendant environ trois heures pour permettre au solvant de s'évaporer. Une suspension contenant environ 3.000 cellules par ml est préparée en lavant des cultures vieilles de trois jours. 0,1 ml d'une telle solution est transféré à une botte de Petri contenant 10 ml d'un milieu solide et est réparti régulièrement à l'aide d'une tige de verre. Trois disques contenant chacun 0,05 mg du composé testé et un disque témoin sont placés dans chaque boîte et soumis immédiatement à l'incubation à une température appropriée. Le diamètre de la zone d'inhibition autour du disque est mesuré au bout de 48 heures. Concentration minimale inhibitoire. Des essais de dilution en série permettent de déterminer la plus petite quantité nécessaire pour obtenir l'inhibition. Le procédé utilisé est celui qui est décrit par Kavanagh (Analytical Microbiology 1963, page 126, N.Y. Academic Press). Etant donné que les composés testés ne se dissolvent pas facilement dans l'eau, on dissout 20 mg de chaque composé dans 1 mi d'éthanol absolu et l'on ajoute 0,05 ml (contenant 1 mg du composé) au premier tube à essai. On ajoute 0,05 ml d'éthanol au premier tube à essai de la série témoin. Transformation de différents composés du groupe en 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène. La matériau brut qui se précipite au refroidissement (Métho- de A) ou est extrait au méthanol de l'huile brute (Méthode B) contient l'analogue acétylénique du 1,2,4-trihyaroxy-n-heptadéca- 16-ène ainsi que du composé dans lesquels le groupe OH est acétylé dans une ou plusieurs positions. Pour obtenir le composé voulu, on réalise une hydrogénation sélective en utilisant du noir de palladium dans de la pyridine. Après filtration, les substances sont versées dans du méthanol. On ajoute une solution aqueuse de potasse, en quantité suffisante pour amener le pH de la solution à environ 10-12. Après avoir maintenu le mélange à la température ambiante pendant environ deux heures, on réalise une extraction à l'éther. Après évaporation de l'éther, la purification finale est réalisée sur des eolonnes de gel de silice comme décrit précédemment. REVENDICATIONS 1. Bactéricide constitué par du i,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène, ayant la formule 2. Bactéricide suivant la revendication 1, extrait et isolé à partir de graines et de fruits d'avocat. 3. Procédé pour obtenir du 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca 16une à partir de graines et de fruits d'avocst, caractérisé par les étapes suivantes: a) broyage et séchage des graines; b) extraction par un solvant organique; c) séparation de l'extrait brut par refroidissement de la solution; d) séparation du brut à partir d'huile brute par extraction au méthanol; e) purification sur des colonnes de gel de silice; f) séparation du produit oléfinique (bactéricide) de son analogue acétylénique par utilisation de nitrate d'argent. 4.- Procédé pour transformer les composés de formule géné- rale où B est un radical saturé oléfinique (double liaison) ou acétylénique (triple liaison), en 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène; caractérisé en ce que le pH du mélange brut est porté à 10-12. 5. Procédé pour transformer des composés de la formule générale suivant la revendication 4 et ayant une triple liaison,en 1,2,4-trihydroxy-n-heptadéca-16-ène, caractérisé par une hydrogénation sélective avec utilisation de noir de palladium dans de la pyridine.