Brevet FR2087989A1 — publié le 19720107

la presente invention concerne un nouvel antibiotique antifongique dénommé BH 890, son procédé de préparation par fermentation, des modes opératoires pour l isoler et le concentrer sous différentes formes å partir de ses solutions brutes, et des modes opératoires pour le purifier. L'invention concerne également les applications thérapeutiques des nouveaux produits qui sont actifs vis-à-vis de divers champignons, et dont les effets comme antifongiques spécifiques vis-à-vis de microrganismes particuliers, ainsi que leurs propriétés chimiques et phys-iques, les differencient des antifongiques antérieurement connus. On realise la formation du nouvel antifcngique dénomme par la demanderesse eH 890, pendant la culture, dans des conditions réglées, d'un streptomycète isolé à partir d'un échantillon de terre forestiers recueillie en Pennsylvanie. Une culture viable du nouveau microrganisme a éte déposée à l'établissement Culture Collection Laboratory, Northern gtilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, et elle a été ajoutée à sa collection permanente. Elle est disponible librement à son lieu de collection sous le numéro d'enregistrement NRRL 3609. la description et l'identification de ce nouveau microrganisme, conservé à la collection des cultures de Lederle Laboratories, Pearl River, New York, ont été assurées par le Dr. H. D. Tresner, desdits Laboratoires. Les observations ont éte effectuées au sujet des caractéristiques culturales, physiologiques et morphologiques de la culture selon les modes opératoires décrits en détails par Shirling et coll., ["Methods for Characterization of Streptomyces Species", Internat. Journ of Syst. bacteriol., 16: 3136340, (1966) 7. Les milieux utilisés dans l'étude ont été choisis parmi ceux qui sont préconisés par Pridhamet coll, /-' Selection of Media for Maintenance and Iaxonomic Study of Streptomyces", Antibiotics Annuai (1956-1957), pages 947-953 7, pour la culture des streptomycètes.Les détails en sont indiqués dans les tableaux I-IV annexés, et une description générale de la culture est présentée ci-dessous Les couleurs descriptives à notations subdivisées sont empruntées à Jacobson et coll., ["Color Harmony Manual", 3e édition, Container Corp of America, Chicago (1948) 7. Abondance de la croissance Bonne sur la plupart des milieux , légère sur la gelose-solution de Caper. Couleur du mycélium aérien et/ou des spores en masse Mycélium aérien blanchâtre à grisâtre ou marron ; masses de spores en teintes grisâtres, allant de brun clair voilé (2 ge) à naturel (2 dc) à brun clair ardoise (2 ig) à grs voile (2 fe) à brun beige (3 ig). Sporulation légère à abondante selon le milieu. Pigments solubles Pas de formatin de pigment soluble sur les milieux utilises. Couleur de l'envers En teintes jaunâtres à grisâtres à verdâtre foncé. Réactions physiologiques diverses Nitrates réduits en nitrites en bouillon au nitrate organique liquéfaction complète de la gélatine en 14 jours ; pas de production de pigments melanordes sur gélose-pepton-fer , tolère jusqu à 7 % de NaCl dans le milieu de croissance. Utilisation de la source de carbone selon la méthode de Pridham et coll. ["The Utiliz-ation of Carbon Sources by Some Actinomycetales as an Aid for Species Determination'. J. Bacteriol. 56.107-114 (1948),,7, comme suit ' utilisation moyenne à bonne de l-arabinose, d-fructose, i-inositol lactose demannitol, d-melibiose, d-raffinose, l-thamnose, salicine, d-tréhalose, d-xylose et glucose, pas d'utilisation dgadonltol, de d-melezitose et de saccharose. Micromorphologie Mycélium aérien abondant, donnant naissance à courtes channes spiraléescompactes de spores globeuses à cylindriques courtes, de dimensions 0,5-0,6 /u x 0,9-1,1 /u ; surface des spores, lisse, ainsi que déterminé par microscopie électronique à grosstssement de 8000. D'après les car-actéristiques générales observées, la culture appartient au genre Streptomyces. La sporulation grisâtre, les cheines spirales de spores lisses et l'absence de pigment mélanoide rattache la culture à un groupe relativement important d'espèces de Streptomyces. Cependant, certaines caractéristiques telles que ses spirales compactes de spores globeuses à, eventuellement, cylindriques courtes, permettend de supposer une relation étroite avec les espèces du complexe de type hygroscopique de Streptomyces. Lorsqu'on effectue des comparaisons avec des éléments de ce groupe, il devient évident quela nouvelle culture en diffère par le fait qu elle est depourvue de la nature fortement hygroscopique des masses de-spores normalement associees à S. hygroscopicus.En outre, les spores de la dernière culture présentent d'une manière typique un aspect cylindrique court et phalangiforme, rresner et coll. / "Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicus-like Complex". Appl. Microbiol. 15.637-639, (1967)], tandis que celles de NRRL 3609 sont le plus frequemment globeuses. On trouve, cependant, une ressemblance très frappante avec l'espèce Streptomyces mislonensis, Cercos et coll ["Misionina: antibiotico poliénico producido par Streptomyces misionensis n. sp Revista de Investigaciones Agricolas 16:5-28 (1962) 7. On observe un accord satisfaisant dans la couleur des spores, la morphologie des sporophores, la forme des spores, la configuration de surface des spores, la production de pigment mélanoide et les schémas d'utilisation des sources de carbone. De plus, les caracteristiques telles que le lieu de croissance, la couleur du mycélium végétatif et l'aspect tacheté de l'envers des cultures sur certains milieux, sont remarquablement similaires.Lorsqu'on effectue des comparaisons avec les descriptions publiées et/ou des cultures de référence d'autres espèces, on nentrouve aucune qui ressemble plus étroitement à la culture de l'invention que S. misionensis. Par suite, on considère NRRL 3609 ci-aprés comme une souche de ladite espèce. Il est entendu que, pour la production du nouvel antifongique de l'invention, on n'est pas limité à l'organisme particulier précité ni aux organismes qui répondent entièrement aux caractéristiques de croissance et aux caractéristiques microscopiques précitées qui ne sont indiquées quwà des fins d'illustration. En fait, on desire inclure dans le cadre de l:invention l'utilisation des mutants produits à partir de l'organisme décrit ci-dessus par divers moyens, tels que les rayons X, les radiations ultraviolettes, les moutardes à l'azote, l'exposition aux phages, et analogues, et l'invention prévoit explicitement leur utilisation. Procédé de fermentation On peut effectuer la culture de l'organisme S. misionensis dans une grande variété de milieux de culture liquides. Les milieux qui sont utiles pour la production du nouvel antibiotique, comprennent une source assimilable de carbone telle que l'amidon, le sucre, les mélasses, le glycérol et autres une source assimilable d'azote, telle que protéines, hydrolysats de protéines, polypeptides, amino acides, liqueur de macération de mais, et autres ; et des anions et cations mineraux, tels que potassium, sodium, calcium, sulfate phosphate, chlorure, et autres.Les éléments à l'état de traces, tels que bore, molybdène, cuivre, et autres, sont apportés en tant qu'impureteJ des autres constituants des milieux. On assure l'aération dans les réservoirs et les flacons en forçant de l'air stérile a travers ou sur la surface du milieu de fermentation. Une agitation complémentaire dans les réservoirs est assuree par un agitateur mécanique. On peut ajouter, si cela est nécessaire, un agent anti-moussant, tel que de l'octadécanol à 1 % dans l'huile de saindoux. Prparation de l'inoculum On prépare un inoculum de S. misionensis en flacons à secousses en inoculant 100 ml d'un milieu liquide stérile dans des flacons de OU tni au moyen de produits de raclage ou de lavage de spores à partir de la culture sur gélose inclinée.On utilise ordinairement le milieu suivant Cérélose 20 g Farine de soja 10 g Liqueur de macération de mai-s 5 g Carbonate de calcium 3 g Eau, qsp 1 000 ml On fait incuber les flacons à une température comprise entre 25 et 290C, de préférence à 280C, et on les agite vigoureusement sur une secoueuse rotative pendant 30 à 48 heures On utilise ces inocula de 100 ml pour inoculer des lots de 1 litre et de 12 litres du même milieu dans des fermenteurs en verre, respectivement de 2 litres et de 20 litres. On aère la bouillie d'lino culum avec de l'air stérile en poursuivant la croissance pendant 30 à 48 heures. On utilise ces lots d'inocula pour inoculer des réservoirs fermenteurs. Fermentation en reservoirs Pour la production de BH 890 dans des reservoirs fermenteurs, on utilise régulièrement le milieu de fermentation suivant Amidon 52,5 g Farine de mais 14,5 g Liqueur de macération de mets 15,0 g Carbonate de calcium 935 g Sulfate d'ammonium 6,75 g Caséine 3,0 g Farine de graines de coton 2,5 g Chlorure d'ammonium 2,0 g Sulfate de manganèse 0,10 g Eau, qsp 1.000 ml On ajoute de l'huile de saindoux au milieu en une quantité de 0,8 /' en volumes, On inocule chaque réservoir avec environ 3 7 de l'lnoculum prépare comme decrit ci-dessus.On assure l'aération au débit de O,D à 1,0 litre d'air stérile par litre de bouillon par minute et on agite le mélange de fermentation au moyen d'un agitateur entraîné à 300-800 tours par minute On maintient la température à 25-29 C, en général à 285C. On poursuit ordinairement la fermentation de 60 à 90 heures supplémentaires et, alors, on récolte finalement la bouillie de fermentation. Mode ou oratoire d'isolement Après la fin de la fermentation, on filtre la bouillie de fermentation contenant 1 agent antifongique de l'invention, de préférence avec addition de terre d'infusoires ou d'un autre adjuvant de filtration courant quelconque Normalement, on Lave Le tampon de gâteau de filtration mycélien avec une petite portion d'eau. On rejette le filtrat ainsi que les eaux de lavage On extrait l'antifonique à partir du gâteau mycélien avec du méthanol en utilisant environ 1 litre de méthanol par 2,5 à 3.0 litres de bouillie liquide. Ordinaiiement une seconde extraction du gâteau avec une plus petite porion de méthanol assure ut extraction complète.On combine les extraits et on Les concentre en une phase aqueuse sous pression réduite, On laisse reposer la phase aqueuse pendant une nuit à 40C. il se forme au repos un produit solide brut contenant les composés que l'on désigne sous les noms de BH 890 &alpha; et BH 890 3- On recueille le solide et on le lave avec de l'acétone. On sèche tout d abord le solide lave,, à l'air et, ensuite, on le sèche sur de l'anhydride phosphorique ou un autre agent desséchant sous pression réduite. On prépare le composant a à partir d'une portion de la substance brute ainsi obtenue, par recristallisations répétées. Essentiellement, on élimine le composant ss comme impureté en recueillant le composant ni purifié sous forme isolee. On effectue les recristallisations en dissolvant une portion du BH 890 brut dans du diméthylformamide et en filtrant la solution. On peut également utiliser d'autres solvants tels que, par exemple, le diméthylacétamide et le dimethylsulfoxyde. On utilise l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'ethyle et l'eau pour precipiter l'antifongique. Ordinairement, en plaçant le mélange dans une "chambre froide" (température au voisinage de 0-5 C), on on assure une précipitation complète. On recueille le solide cristallisé par filtration et on le lave av-ec de l'eau et avec de l'acétone, puis on le sèche à l'air On repète ordinairement deux fois le processus de recristalli sation afin d'obtenir un BH 890 purifié exempt du composant ss. On prépare le composant ss à partir d'une portion de BH 890 brut en séparant la substance en composants a et ss par distribution en solvants à contre-courant. Un système de solvants utile est constitué d'acétate d'éthyle, de sec-butanol, de méthanol et d'un tampon dans Je rapport de 900 à 303, de 160 à 600 volumes, respectivement. On prepare le tampon en combinat o,3 ml de triéthylamine avec 2 litres d'eau en amenant le pH à 7,5 avec de l'acide acétique glacial et en effectuant une dilution à 2400 ml avec de l'eau.Avec un appareil de distribution à contre-courant à 200 tubes, une quantité d environ 300 transferts est suffisante pour obtenir une bonne separatlon des composants On peut suivre la progression de la séparation en relevant les résultats des lectures de la densité optique à 303 u et en les portant sur un graphique en fonction du nombre de tubes On combine les fractions appropriées, on concentre le liquide et on Le lyophilise pour isoler les deux composants ni et ss. Caractéristiques physiques On peut distinguer les deux composants BH 890 &alpha; et BH 890 p par un choix de caractéristiques physiques. Les échantillons analytiques des deux composants sont essentiellement exempts de cendres. On sèche le BH 890 &alpha; sous pression réduite dans un appareil de séchage Abderhalden sur de 1 acétone bouillante pendant 16 heures et on sèche le BH 890 ss sous pression reduite sur P205 au-dessus d'acétone bouillante pendant une nuit. Les composants BH 890 &alpha; et BH 890 b contiennent les éléments carbone, hydrogène et oxygène pratiquement selon les pourcentages suivants en poids BH 890 &alpha; BH 890 ss Carbone 58,52 57,78 Hydrogène 8,73 7,74 Azote 1,78- 1,59 Oxygène (par diffé rence) 30,97 32,89 Le composant ni n'a pas de point de fusion distinct. On réalise un spectre d'absorption infrarouge de BH 890 &alpha;, dans une pastille de RBr, de manière courante.Il présente une absorption caractéristique dans la région infrarouge du spectre aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns 3,00, 3,42, 5,85, 6,13, 6,40, 6,48, 6,68, 6,87, 7,17, 7,57, 8,45, 8,87, 9,35, 9,65, 9,95, 10,02, 11,10, 11,35, 11,82, 13,35 et 14,37. On représente la courbe infrarouge à la figure 1 des dessins annexes. Le composant a en méthanol montre les maxima d'absorption ultraviolette à 230 m (E1cm1% = 315) 279 m (E1cm1% = 298) 290 m (E1cm1% = 588) 302 m (E1cm1% = 905) 318 m (E1cm1% = 815) Le bH 890 x fournit un équivalent de neutralisation de 936 lorsqu'on le titre dans l'acide acétique glacial avec l acide perchlorique et un équivalent de neutralisation de 962 lorsqu'on le rite dans la pyridine en utilisant l'hydroxyde de tétrabutylammonium. On détermine le pouvoir rotatoire spécifique de BH 890 &alpha; dans divers solvants et on présente les valeurs ainsi obtenues dans le tableau V immédiatement ci-après. TABLEAU V Pouvoir rotatoire specifique de BH 890 &alpha; dans divers solvants Solvant Concentration [&alpha;]25D Diméthylformamide 1,988 % + 19,2 Diméthylsulfoxyde 1,031 % + 5,8 Acide acétique glacial 0,863 % + 10,4 Pyridine 0,930 % + 18,2 Le composant B nia pas de point de fusion défini. On réalise un spectre d absorption infrarouge de BH 890 ss, dans une pastille de KBr. a une manière courante Il présente une absorption caractéristique dans la région de l'infrarouge du spectre aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns 3,00, 3,45, 5,85, 6,36, 6,70, 6,90, 7,25, 8,50, 9,40, 10,00, 11,85, 13,33 et 14340.On représente la cour-be infrarouge à la figure 2 des dessins annexés Le composant ss en méthanol montre les maxima d'absorption ultraviolette à : 230m (E1cm1% = 370) 278 m (E1cm1% = 320) 289 m (E1cm1% = 616) 302 m (E1cm1% = 934) 318 m (E1cm1% = 840) On détermine le pouvoir rotatoire spécifique de BH 890 b dans divers solvants et on présente les valeurs ainsi obtenues dans le tableau VI suivant. TABLEAU VI Pouvoir rotatoire spécifique de BH 890 ss dans divers solvants Solvant Concentration [&alpha;]25D Diméthylformamide 0,747 % - 4,03 Diméthylsulfoxyde 0,951 % - 18,7 Acide acétique glacial 0,993 % - 8,07 Pyridine 1,038 % - 9,7 L'antifongique BH 890 se cistingue clairement des autres antifongiques par les valeurs de caractérisation indiquées ci-dessus et par son activite antifongique. On présente les résultats d'essai de l'activité in vitro de ce nouvel antifongique dans le tableau ci-après qui montre la concentration inhibitrice minimale requise pour inhiber la croissance de mtcrorganismes reprësentatifs dans un milieu nutritif. TABLEAU VII Activité antifongique in vitro de BH 890* Organisme Concentration inhibitrice minimale g/ml Candida albicans 300 (E83) 2 Cryptococcus neoformans SP (E138) 2 Epidermophyton floccosum ATCC 10227 (E139) 1 Microsporum audouini AICC 14057 (E140) 2 Nicrosporum canis ATCC 10214 (E55) 5 Microsporum Gypseum ATCC 14683 (E130) 2,5 Phialophthora jeanselmei NIH 8724 (E16) 5 Trichophyton rubrum (E97) 2,5 Trichophyton tonsurans NIH 662 (E10) 2 Trichophyton mentagrophytes (Ell) 2,5 Technique type de dilution en gélose En outre, BH 890 est extrêmement actif in vitro vis-à-vis d'organismes pathogènes,comprenant des souches de Blastomyces dermatitidis et Coccidioides immitis qui provoquentdes mycoses, siégeant en profondeur. Activité vis-à-vis des champignons responsables de mycoses en profondeur Organisme et souche Concentration g/ml Inhibitrice minimale* Fongicide** Coccidioides immitis Inhibitrice minimale Fongicide 658 0,78 1,56 660 0,78 1,56 691 0,20 0,20 Blastomyces dermatidis 5,10 0,39 0,39 5,17 0,39 1,S6 5,27 0,20 0,20 L9Amphotericine B,utilisée comme témoin, est inhibitrice des trois souches de Coccidioides immitis 0,2 à 0,39 g/ml et fongicide à 0,39 à 0,78 g/ml L'Amphotéricine B, utilisée comme temoin, est inhibitrice des trois souches de Blastomyces dermatidis à 0,1 à 0,2 /ug/ml et fongicide à 0,39 à 1,56 /ug/ml. Concentration requise pour inhiber la croissance de l'organisme Concentration requise pour détruire l organlsme. L'antifongique BH 890 est acrif in vivo contre Candida albicans et Cryptococcus neoformans Le nouvel antifongique est à cet égard utile comme agent thérapeutique prometteur pour- le traitement des infections fongiques provoquées par lesdits microorganismes On peut utilement employer le nouvel antifongique pour traiter ou combattre ces infections par application topique ou par administration par voie parentérale ou encore par ingestion par voie buccale L'utilité du nouvel antifongique est démontres par son pouvoir d'enrayer les infections létales généralisées provoques par lesdits organismes ou accompagnanr leur présence chez la souris On a effectue des essais avec C. albicans chez des souris femelles de l'espèce Carwotth Farms CF 1 pesant chacune environ 20 g, infectées par voie intraveineuse par une dose létale de dilution 120 dune culture de 24 heures de lyorganisme sur un bouillon de soja "Tripticase". On traite les souris infestées avec BH 890 à diverses doses par injections sous cutanées5 une heure après l'infection ou par injections sous-cutanées une heure après l'infection suivies par une seconde dose 4 heures plus tard. On enregistre la taille de chaque groupe de souris et le nombre de souris survivantes 6 jours après 1 infection. TABLEAU VIII Activité de BH 890, dwe 1 Amphotéricine et de la Nystatine chez les souris infectées par Candida albicans Nombre de souris survivantes/Nombre de Dose sous-cutanée souris total 14 jours après le début de l'infection mg/kg BH 890 Amphotéricine Nystatìne 800 22/30 (7o) 400 15/20 (75) 10/10 (100) 200 10/30 (33) 6/20 (30) 27/30 (90) 100 8/20 (40) 3/10 (30) 15/20 (75) 50 12/30 (40) 3/20 (25) 15/30 (30) 25 0/10 (0) - 2/20 (10) 12 0/20 (0) 0/10 (0) 3/30 (10) Dose efficace moyenne, mg/kg (a) 200 (140-290) 200 (estimation) 60 (40-70) Témoins infestés non traités 58/60 (97 %) souris meurent en 3 jours après le début de l'infection (temps de survie moyen . 1,3 jour). (a) Limites de certitude entre parenthèses. Les courbes de l'effet en fonction de la dose ne sont pas parallèles. On effectue l'essai avec C. Neoformans chez des souris femelles de l'espèce Carworth Farms CF 1, pesant chacune environ 20 g, infectées par voie intraveineuse avec une dose létale d'une culture de l'organisme de 24 heures sur un bouillon de soja "Trypticase". On traite les souris infectées avec le BH 890 en diverses doses par injections sous cutanées une heure après l'infection ou par injections sous-cutanées une heure après l'infection suivies par une seconde dose 24 heures plus tard. On observe le rapport entre le nombre de souris survivantes et le nombre total de souris et on le note 7 jours après l'infection. Dans le tableau IX cí-desssous, on illustre l'activité de BH 890 vis-à-vis de C. neoformans. TABLEAU IX Activité de BH 890, de l'Amphotéricine et de la Nystatine chez les souris infectées par Crytococcus Neoformans Nombre de souris survivantes/Nombre de souris total 7 jours après le début Dose sous-cutanée de l'infection mg/kg BH 890 Amphotéricine Nystatine 800 41/50 (82) 48/50 (96) Toxique 400 29/30 (97) 17/20 (85) 10/10 (100) 200 47/60 (78) 39/50 (78) 55/60 (92) 100 23/30 (77) 12/20 (60) 26/30 (87) 50 37/60 (62) 35/50 (70) 40/60 (67) 25 1/10 (10) - 13/30 (43) 12 - 13/30 (43) 17/50 (34) Dose efficace moyenne, mg/kg (a) 77 (24-250) 20 (12-32) 24 (18-32) Témoins infectés non traités 104/120 (87 %) souris meurent entre le 2ème et le 7ème jour après le début de l infection. (a) Limites certaines à 95 % entre parenthèses. Les courbes de l'effet en fonction de la dose ne sont pas parallèles. On décrit ltinvention avec plus de détails en se référant aux exemples particuliérs suivants nullement destinés à limiter ladite invention dans son cadre et son esprit. EXEMPLE 1 Préparation de l'inoculum on prepare un milieau type, utilisé pour faire croître l'inoculum primaire, selon la formule suivante CérAlose 20 g Farine de soja 10 g tiqueur de macération de maîs 5 g Carbonate de calcium 3 g Eau, qsp 1.000 ml On utilise des spores recueillies par lavage ou par raclage à partir d'une culture sur gélose inclinée de S. mtsionensis pour inoculer deux flacons de 500 ml, contenant chacun 100 ml du milieu stérile précité. On place ensuite les flacons sur une secoueuse rotative et on les agite vigoureusement pendant 48 heures à 28 C. On transfère l'inoculer résultant dans le flacon à un fermenteur en verre de 19 litres environ, contenant 12 litres du milieu stérile On aère le fermenteur en verre avec de l'air stérile en effectuant la croissance pendant 48 heures environ, puis on utilise à la fin de cette période le contenu du fermenteur pour ensemencer un réservoir de fermentation de 300 litres. EXEMPLE 2 Fermentation On prépare un milieu de fermentation selon la formule suivante Amidon 52,5 g Farine de mets 14,5 g Liqueur de macération de matis 15,0 g Carbonate de calcium 9,5 g Sulfate d'ammonium 6,75 g Caséine 3,0 g Farine de graines de coton 2,5 g Chlorure d'ammonium 2,0 g Sulfate de manganèse 0,10 g Eau, qsp 1.000 ml On utilise de l'huile de saindoux dans le milieu en une quantité de 0,8 % en volumes On stérilise le milieu de fermentation à 120 C avec de la vapeur d'eau sous une pression de 9 kg pendant 45-60 minutes. Le pH du milieu après la stérilisation est de 6,6 environ. On inocule 3GO litres de milieu stérile dans un réservoir de fermentation de 400 litres avec 12 litres d!inoculum, préparé comme décrit à l'exemple 1.On effectue la fermentation à 280C en utilisant une huile mise dans le commerce sous le nom de Hodag LG-8 comme agent de destruction des mousses. On assure lSaération au débit de 0,5 litre d'air stérile par litre de bouillie de fermentation par minute. On agite la bouillie avec un agitateur entrainé à environ 300 tours par minute A la fin de la durée de fermentation pendant environ 66 heures, on récolte la bouillie de fermentation. EXEMPLE 3 Isolement On filtre 300 litres de bouillie fermentée avec environ 2 % (en poids/volume) d9un adjuvant de filtration en terre d'infusoires et on lave le tampon de filtration avec environ 300 litres d'eau. On rejette les filtrats combinés avec lqeau. On agite le gâteau de filtration lavé dans environ 100 litres de méthanol pendant environ une demi-heure. On filtre la suspension et on lave le gâteau avec une quantité supplémentaire de 20 litres de méthanol.On concentre la liqueur de lavage mérhanolique et le filtrat combiné en une phase laqueuse (à volume environ 6 litres) et on laisse reposer ledit concentrat pendant une nuit à 4 C. On recueille par centrifugation un solide biréfringent qui se brme au repos et on le lave avec de l'acétone. On élimine l'acétone résiduelle par évaporation à l'air et on sèche le solide sur P205, sous pression réduite. Le solide cristallisé séché de BH 890 brut pèse 118 g. EXEMPLE 4 Préparation de BH 890 n On dissout une portion (40 g) de BH 890 brut, obtenu selon l'exemple précédent, dans 150 ml de diméthylformamide et on filtre le mélange. On ajoute de l'acétate d'éthyle au filtrat jusqu'à ce que le "point de trouble" soit atteint. On ajoute environ 150 ml d'eau, puis on ajoute une quantité supplémentaire de 150 ml d'acétate d'éthyle en agitant. On laisse reposer le mélange résultant pendant une nuit à 4 C. On recueille par filtration le solide coloré en jaune clair qui se forme et qui se trouve en suspension dans le système à deux phases et on le lave tout d'abord avec de l'eau, puis avec de l'acétone. Le solide séché à l'air pèse 29 g. On recristallise la substance brute deux nouvelles fois en la dissolvant d'abord dans le diméthylformamide et en répetant le mode opératoire précité à partir de ce moment. On obtient après trois recristallisations environ 4,4 g de BH 890 a purifié ayant les caractéristiques physiques et chimiques décrites ci-dessus. EXEMPLE 5 Préparation de BH 890 P On utilise le BH 890 brut, obtenu selon l'exemple 3, comme substance de départ et on le sépare en ses composants a et p par distribution dans des solvants à contre-courant. Le système de solvants est composé d'acétate d'éthyle, de sec-butanol, de méthanol et dsun tampon (900:303:160::600 en volumes), le tampon étant préparé en agitant ensemble de la triéthylamine (6,3 ml) et de l'eau (2 litres), en amenant le pH à 7,5 avec de l'acide acétique glacial et en diluant à 2400 ml avec de l'eau. On effectue la distribution à contre-courant dans un appareil à 200 tubes en utilisant 10 ml de phase inférieure et 10 ml de phase supérieure par tube et 310 transferts. On place la charge dwéchantillon dans les 15 premiers tubes en préparant une solution saturée de BH 890 dans 150 ml de phase inférieure er 150 ml de phase supérieure, en obtenant une charge nette de 350 mg. Au bout de 310 transferts, on retire une portion de 1/2 ml de phase inférieure à partir de tubes choisis.On dilue chaque échantillon avec 10 ml de méthanol et on détermine sa densité optique à 303 m/u. On obtient une courbe présentant d'abord un pic mineur puis un pic majeur en réunissant par tracé les densités optiques en fonction du numéro des tubes. Les tubes numéros 85 à 120 comprennent le BH 890 p et les tubes numéros 113 à 150 comprennent le BH 890 ni On combine les tubes appropriés et concentre les liquides séparément en une phase aqueuse, on la filtre et on la lyophilise.On triture chacun des solides obtenus par lycphilisation avec de l'acétone, on le filtre, on le lave avec de l'acétone une nouvelle fois et, ensuite, on le sèche à leair. On obtient 1-échantillon de pureté analytique, de BH 890 p pesant 38 mg, et celui de BH 890 ni pesant 140 mg. EXEMPLE 6 Préparation de comprimés contenant le BH 890 On incorpore le composé anti-androgénique, BH 890, dans un comprimé pharmaceutique type selon la formulation suivante Par comprimé Ingrédient mg. pour 10.000 comprimés, g BH 890 50 500 Lactosé 225 2250 Amidon de maïs (pour mélange) 50 500 Amidon de mats (pour pâte) 25 250- Stéarate de magnésium 5 50 355 3350 On mélange ensemble l'ingrédient actif, BH 890, le lactose et l'amidon de mats.On met en suspension dans l'eau lFamidon de de ais pour pâte en une proportion de 100 g d'amidon de mats pour 800 ml d'eau et on chauffe la suspension ainsi obtenue en l'agitant pour former une pâte. On utilise ensuite la pâte résultante pour granuler le mélange en poudre. On utilise une quantité dleau supplémentaire si cela est nécessaire. On fait passer les granules humides par un tamis de 2,38 mm de côte d'ouverture et on les sèche à 49 C environ. On fait passer les granules secs par un tamis de 1,2 mm de côté d'ouverture et on les lubrifie avec du stéarate de magnésium. On comprime ensuite le produit de granulation en obtenant des comprimés (poids d'un comprimé : 355 mg) dans une machine à former des comprimés, convenable. Chaque comprimé contient 50 mg d'ingrédient actif. EXEMPLE 7 Prépara ion de capsules a enrobage dur, contenant le BH 890 On peut administrer le BH 890 sous forme de capsules à enrobage dur. Une formulation qui s avère utile pour préparer lesdites capsules est la suivante Ingrédient Par capsule pour 1000 capsules, g BH 890 50 50 Lactose 90 90 Stéarate de magnesium 1 1 141 141 On mélange l'ingrédient actif le lactose et le stéarate de magnésium. On utilise le mélange résultant pour remplir des capsules à enrobage dur, de dimension convenable avec un poids de remplissage de 141 mg par capsule. EXEMPLE 8 Préparation d'une suspension pour l'administration par voie buccale, contenant le BH 890 Ingrédient Quantité (en poids/volume BN 890 1,00 Gel de silicate de magnésium-aluminium (Veegum) 0,50 Saccharose 60,00 Néthylparabène 0,08 Propylperabène 0,02 Parfum qs Eau distillée, qsp 100,00 On dissout les parabènes et le saccharose dans environ 2/3 du volume final d'eau distillée à 80 C, et on ajoute, en agitant le Veegum. On refroidit la suspension à 40 C. On ajoute l'ingrédient actif et le parfum, en agitant. On amène la suspension refroidie à son volume final avec de 1 eau distillé. La suspension assure 50 mg de l'ingrédient actif par dose de 5 ml de suspension. EXEMPLE 9 Préparation d'une suspension injectable contenant le BH 890 On peut incorporer le constituant actif, BH 890, dans une suspension injectable selon la formulation suivante Ingrédient Quantité % (en poids/volume BH 890 5,0 Polyéthylèneglycol 4000, selon la Pharmacopee des Etats-Unis d'Amérique (U.S.P.) 4,0 Chlorure de sodium (U.S.P.) 0,90 Alcool benzylique, qualité pour réactif 0,90 Eau pour injection , qsp 100,00 On prépare le véhicule en mélangeant ensemble tous les ingrédients précités excepté le BH 890. On rend stériles le véhicule et l'ingrédient actif micronisé par des moyens convenables. On prépare une dispersion de l'ingrédient actif dans le véhicule en délayant 1 n ingrédient actif tout d'abord avec une portion du véhicule et en ajoutant ensuite la portion restante du vehicule en agitant. Une dose de 1 ml de ladite suspension assure 50 mg d'ingrédient actif. Dans les tableaux X et XI annexés, on représente les résultats des essais d'activité des préparations du BH 890 destinées à l'administration par voie buccale, effectués au moyen de souris, en les comparant aux résultats obtenus avec d'autres agents antifongiques. R E V E N D I C A T I O N S 1. A titre de composé industriel nouveau, un antibiotique antifongique dénommé BH 890 et ses formes BH 890 a et BH 890 ss et leurs mutants. 2. L'antibiotique BH 890 , caractérisé par ses propriétés suivantes (a) il est actif pour inhiber la croissance des champignons, et dans sa forme cristallIsée essentiellement pure (b) il présente les valeurs d'analyse élémentaire suivantes : C, 58,52 H, 8,73 ; N, 1,78 ; O, 30,97 (c) il présente des maxima en ultraviolet à : 230 mlu (E 1% = 315) 279 mu (E1 cm = 298) , 290 m/u (E1cm1% = 588) ; 302 m1u (E1 cm = 905) 318 m (E1cm1% = 815); et (d) il présente un spectre d'absorption infrarouge caractéristique montré à la figure 1 annexée. 3. L'antibiotique BH 890 a dans sa forme essentiellement pure. 4. Les sels de l'antibiotique BH 890 &alpha;. 5. L'antibiotique BH 890 ss, caractérisé par ses propriétés suivantes (a) il est actif pour inhiber la croissance des champignons, et sous sa forme cristallisée essentiellement pure (b) il présente les valeurs d'analyse élémentaire suivantes : C, 57,78 H, 7,74 ; N, 1,59 ; 0, 32,89 (c) il présente des maxima en ultraviolet à : 230 m (E1cm1% = 370), 278 m (E1cm1% =320) ; 289 m (E 1cm1% = 616); 302 m (E1cm1% =934) 318 m (E1cm1% = 840); et (d) il présente un spectre d'absorption infrarouge caractéristique montré à la figure 2, annexée. 6. L'antibiotique BH 890 p dans sa forme essentiellement pure. 7. L'antibiotique BH 890 p sous forme de sels. 8. Procédé de préparation de l'antibiotique BH 890, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on cultive une souche des Streptoinyces misionensis, productrice de l'antifongique BH 890, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne notable soit conférée audit milieu par suite de la production de l'antifongique BH 890, et, éventuellement, on effectue un traitement complémentaire du milieu de culture 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue le traitement complémentaire en isolant le produit antifongique BH 890. 10. Compositions pharmaceutiques renfermant l'antibiotique BH 890 sous les formes définies à l'une quelconque des revendications 1 à 7. 11. Formes pharmaceutiques appropriées à l'administration des compositions selon la revendication 10, notamment les comprimés et les capsules, administr-és par voie buccale, et Les préparations topiques ou injectables. 12. Compositions à usage vétérinaire, renfermant lsantlbiotique BH 890 sous les formes définies à l'une quelconque des revendications 1 à 7.