Brevet FR2081468A1 — publié le 19711203

Il est connu que des a-amylases peuvent être inhibées par diverses substances de bas poids moléculaire, par exemple l'acide salicylique et l1"Abiscisin" LT. Hemberg, J. Larsson, "Fhysiol. Plant." 14, 861 (1961) ; T. Hemberg, "Aeta. Ctem. Seani." 21» 1665 5 (1967)]. Il est ,en outre,connu qu'il existe également des substances de haut poids moléculaire, qux peuvent; inhiber l'; activité de quelques amylases de façon non spécifique par adàorptioî; physique [T. Chrzaszcz, J. Janicki, "Bioch. Z." 26C. 354 (*933) et "Bioch. J." 28, 296 (1934)] ou par dénaturation et précipitation de l'enzyme 10 [B.S. Miller, E. Kneen, "Arch. Biochem." j_2, Ï5'- (1947) ; B. H. Struhmeyer, M. H. Malin, "Biochem. Biophys. Acta" 184. 643 ('?69)J. On a en outre observé qu'il est possible d'extraire du blé, par élu-tion à l'eau distillée, une substance qui réduit l'activité de transformation en dextrines que possède l'amylase de la salive, mais in-15 fluence peu l'activité de l'amylase pancréatique LE. Xneen, M. Sandstedt, "Arch. Bioch." % 235 (1946)]. Un inconvénient des substances décrites réside dar-= le fait que l'inhibition de l'amylase n'a pas un caractère spécifique -;u bien que l'activité inhibitrice des substances décrites est faible 20 en particulier vis-à-vis des amylases pancréatiques, comme ici essais appropriés l'ont montré, c'est-à-dire que des inhibition? presque complètes des amylases (jusqu'à 90 % et même plus} ne sont atteintes que pour des rapports inhibiteur : enzyme très élevés [voir figure 1 ; cette figure montre l'allure de l'inhibition e: La Demanderesse vient de découvrir qu'on peut extraire du 30 froment [froment broyé, farine de froment ou gluten de fromentj avec des solutions aqueuses d'électrolytes, de préférence ies acides dilués ou principalement avec des mélanges d'eau et d'alcool (alcools en C,| à C-ç), de préférence à des valeurs acides de pH, en de forts rendements, un inhibiteur très actif de l'amylase pancréa-35 tique qui ne comporte pas les inconvénients mentionnés. La substance ainsi obtenue inhibe déjà l'amylase pancréatique k de très faibles rapports inhibiteur : enzyme, l'inhibition pouvant dépasser 90 % (figure 1). La même substance inhibe également,à un haut degré, 71 03140 2 2081468 l'amylase salivaire. D'autres hydrolases,dans la mesure où elles ont été expérimentées, par exemple la trypsine, la pepsine, la chymo-trypsine et la ribonucléase, ne sont pas inhibées par cet inhibiteur. Le gluten de froment, mentionné ci-dessus entre autres 5 matières premières, constitue la fraction protidique du froment, que l'on obtient comme sous-produit de l'extraction de l'amidon de froment ["Hagers Handbuch der pharmazeutxschen Praxis", tome I, (Verlag Julius von Springer, Berlin, 1925, page 332) ; M. J. Blish in M. L. Anson, J. T.. Edsall, "Advances in Protein Chemistry", vo-10 lume II (Academic Press, New-York, 1945, page 337)]. La nouvelle substance est incolore et se dissout bien dans l'eau, dans les acides et les bases dilués ainsi que dans les solutions aqueuses d'alcools. Le spectre d'absorption ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1 # de l'inhibiteur est reproduit sur la figure 15 2. Le maximum d'absorption se situe à 278 nm. La substance n'est pas soluble dans l'éther, l'acétone et les alcools absolus. Le nouvel inhibiteur n'est pas dialysable. La substance est précipitable à l'acide trichloracétique à 2-5 le précipité est soluble dans l'eau, et il retient encore 60 à 80 fo de l'activité initiale. La 20 substance est lentement inactivée par les protéases ( pepsine, trypsine, chymotrypsine). Des solutions de la substance sont relativement stables aux acides (jusqusà un pH de 1 à 2) mais instables aux bases alcalines : l'incubation à 37°C dans le carbonate de sodium 0,15 M à un pH de 11,4 occasionne une perte d'activité de 80 $>. 25 Des solutions aqueuses neutres de 13 inhibiteur sont stables jusqu'à des températures de 85°C. Toutefois, à partir de 90°C, il se produit une inactivation de l'inhibiteur d'amylase augmentant rapidement à mesure que la durée d'incubation croî"6 (l'inactivation est mesurée dans un tampon au glycérophosphate 0,02 M et au chlorure de calcium 30 0,001 M à un pH de 6,9). L®inhibiteur n'est pas inactivé par l'addition d'urée jusqu'à une. concentration de 2 moles par litre,et il est inactivé à 50-60 % jusqu'à une concentration de 8 moles par litre. Ces décotivertes permettent de conclure que l'inhibiteur d'amylase est un polypeptide. 35 Le pouvoir inhibiteur des meilleures substances inhibitrices s'élève, par rapport à l'amylase du pancréas de porc, à 700-800 unités d'inhibiteur d'amylase pancréatique (TJIA pancréatique) et 71 03140 3 2081468 par rapport à l'amylase salivaire, à 900-1000 unités d'inhibiteur d'amylase salivaire (UIA salivaire),par mg. La forte activité de cet inhibiteur même par rapport à l'amylase pancréatique (figure 1, courbe A) le distingue de l'inhibiteur décrit par Kneen ["Arch. Bio-5 chem." f), 235 (1946)] (figure 1, courbe B) qui inhibe bien l'amylase salivaire avec un pouvoir d'environ la moitié, à savoir 500 UIA salivaire par mg d'inhibiteur, mais qui n'est que peu actif vis-à-vis des amylases pancréatiques (moins de 10 UIA pancréatique/mg) et qui peut difficilement inhiber plus de 80 de l'activité d'amylase 10 pancréatique (figure 1, courbe B) même dans le cas de fortes additions. Une unité d'inhibiteur d'amylase (1 UIA) est définie par la quantité d'inhibiteur qui inhibe à 90 rf° une unité d'amylase. (On a choisi une inhibition à 90 fo à cause de la meilleure possibilité 15 d'interpolation dans la détermination du pouvoir inhibiteur). L'inhibition totale est atteinte de façon asymptotique (voir figures 1 et 3). Une unité d'amylase est la quantité d'enzyme qui libère,en une minute, dans les conditions expérimentales indiquées ci-dessous,1 microéquivalent de liaisons glucosidiques de l'amidon. Les microvalences 20 de la liaison rompue sont déterminées par colorimétrie comme microvalences des sucres réducteurs formés, en présence d'acide dinitro-salicylique, et on les exprime par les microvalences d'équivalents de maltose à l'aide d'une courbe d'étalonnage du maltose. Pour la conduite de l'essai, on additionne 0,1 ml de solution d'amylase (20 25 à 22 UA/ml) avec 0 à 400 p.g d'inhibiteur dans 0,4 ml de tampon au glycérophosphate de sodium 0,02 M,en présence de CaCO^ 0,001 M,à un pH égal à 6,9, en laissant l'échantillon s'équilibrer pendant 10 à 20 minutes au bain-marie à 35°C. Ensuite, on fait incuber à 35°C pendant 5 minutes en présence de 0,5 ml d'une solution d'amidon à 1 %, 30 préalablement chauffée à 35°C [amidon soluble de la firme Merck, Darmstadt, N° 1252] puis on ajoute 1 ml de réactif à l'acide dinitro-salicylique [d'après P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, "Meth. Enzymol.", tome 1_, page 149]. Pour le développement de la couleur, on chauffe le mélange pendant 5 minutes au bain-marie bouillant, puis on le 35 laisse refroidir et on l'additionne de 10 ml d'eau distillée. On mesure l'extinction à 540 nm par rapport à un blanc préparé d'une façon correspondante, sans amylase. Pour l'interprétation des 71 03140 4 2081468 résultats, on détermine l'activité d'amylase qui reste après l'addition de l'inhibiteur, d'après une courbe d'étalonnage de l'amylase établie au préalable, et on en déduit le pourcentage d'inhibition de l'amylase utilisée. Le pourcentage d'inhibition est 5 représenté graphiquement comme fonction du quotient : [ig d'inhibiteur + TJA++ dans lequel le signe + signifie que le poids est calculé sur une base sèche et le signe ++ désigne le nombre d'imités d'amylase 10 dans la charge non inhibée de la même série (voir figure 1) ; le point d'inhibition à 90 $ est lu sur la courbe, puis converti en ÏÏIA/mg d'inhibiteur. L'extraction de l'inhibiteur conforme à l'invention de la farine, de la mouture ou du gluten de froment, s'effectue,conformé-15 ment à l'invention,soit (A) avec des mélanges d'eau (10 à 90 de préférence 30 à 70 fo) et d'alcool (alcools inférieurs solubles dans l'eau tels que le méthanol, l'éthanol, le propanol ou l'isopropanol), soit (B) avec des solutions aqueuses diluées d'électrolytes, de préférence des acides aqueux dilués, à des pH de 1 à 5, de préférence 20 à des pH de 2 à 4, soit encore (C) avec des mélanges d'eau et d'alcool de la composition indiquée en A, mais a des pH acides de 1 à 6, de préférence de 2 à 4 (en présence d'acides minéraux ou d'acides organiques). Pour effectuer cette extraction, on homogénéise une partie 25 en poids de farine, de mouture ou de gluten de froment avec 1 ,5 à 5 parties en poids, de préférence 2 à 4 parties en poids, du milieu d'extraction correspondant, pendant 1 à 2 minutes, puis -on agite pendant 0,5 à 4 heures ( de préférence 1, à 2 heures) à la température ambiante (20 à 25°C). Ensuite, on filtre le mélange ou on le 30 centrifuge à 3000-6000 g pendant 10 à 20 minutes. Le résidu est réextrait éventuellement avec 1 à 2 parties en poids du milieu d'extraction, comme indiqué ci-dessus, puis centrifugé ou filtré. On rassemble les liqueurs surnageantes ou les filtrats, on les neutralise dans le cas d'une extraction acide, de préférence avec une so-35 lution ammoniacale concentrée, et on les débarrasse par filtration ou centrifugation des protéines inertes qui précipitent lors de la neutralisation. Contrairement aux extraits aqueux de farine de 71 03140 5 2081468 froment qui sont bien capables d'inhiber très efficacement les amylases salivaires, mais non les amylases pancréatiques (figure 3, courbe D), les extraits préparés conformément à l'invention d'après les procédés A à C déploient une activité inhibitrice extrêmement 5 forte même contre les amylases pancréatiques (figure 3, courbes A, B, C). La figure 3 montre l'inhibition de 2,2 unités d'amylase pancréatique de porc par un extrait de farine de froment (A) éthano-lique à 66 $>, (B) aqueux-acide (pH 3), (C) aqueux-éthanclique à 30 % (pH 3) et (D) aqueux-neutre. On extrait alors,pendant une heure,à 10 20°C,à chaque fois une partie en poids de farine de froment avec 4 parties en poids de milieu d'extraction. Le procédé que l'on préfère utiliser pour la préparation de l'inhibiteur d'amylase conforme à l'invention est l'extraction de milieu aci.de farine ou de gluten de froment avec des alcools aqueux en /, 30 a 15 70 $ de méthanol ou d'éthanol, pH 2 à 4) (procédé C). Ce procédé donne de plus forts rendements en inhibiteurs que le procédé d'extraction avec des alcools aqueux/^eirti'e (procédé A) et possède, par rapport aux charges aqueuses acides d'extraction (procédé B),l'avantage d'une plus faible viscosité de la charge et, par conséquent, 20 d'une manipulation plus facile par agitation, centrifugation ou filtration. En outre, dans ce procédé, on évite l'extraction concomitante d'une amylase présente dans la farine de froment, non susceptible d'inhibition, alors qu'on observe cette extraction dans les procédés A et B, en sorte qu'une inactivation ou une séparation 25 de l'amylase végétale n'est pas nécessaire. On obtient des rendements 5 à 8 fois plus forts que dans le cas de l'utilisation de farine de froment, lorsqu'on utilise le gluten comme matière première. Un autre avantage réside alors dans la meilleure aptitude à la filtration et à la centrifugation des 30 charges d'extraction,de même que dans la plus forte activité spécifique avec laquelle on obtient l'inhibiteur d'amylase lorsqu'on utilise le gluten comme matière première. L'isolement de l'inhibiteur des solutions d'extraction correspondantes (préalablement neutralisées dans les procédés B et 35 C) peut s'effectuer de diverses façons : a) concentration des extraits à environ 1/5-1/10 du volume initial sous pression réduite (10 à 20 mm de mercure) à des températures 71 03140 6 2081468 atteignant 40°. L'extrait concentré est filtré ou centrifugé et le filtrat clair (ou la liqueur surnageante claire) est lyophilisé après élimination préalable des sels. b) précipitation à l'acétone des inhibiteurs des extraits. Ce pro-5 cédé convient principalement pour des extraits encore fortement alcooliques (concentration en alcool supérieure à 60 fo) , parce que de tels extraits permettent seuls d'obtenir des précipitations relativement totales avec des volumes d'acétone qui ne sont pas trop grands. La précipitation s'obtient en versant 1 partie en 10 volume de la solution à précipiter dans 2 à 4 parties en volume d'acétone (suivant la teneur en alcool de la solution d'extraction à précipiter). On sèche sous vide à la température ambiante, la substance inhibitrice filtrée à la trompe, après lavage avec de l'alcool absolu. 15 c) précipitation des inhibiteurs dans les extraits (ou les extraits concentrés selon (a) ) par addition d'alcools inférieurs jusqu'à ion pourcentage en volume de 95 pour l'éthanol, 90 pour le n-propanol ou 80 pour l'isopropanol. Même avec le méthanol à 95 i°, on peut précipiter l'inhibiteur d'amylase, quoiqu'en de plus 20 faibles rendements que dans le cas de l'utilisation des alcools mentionnés ci-dessus. Etant donné que dans le cas de faibles concentrations en alcool, on précipite des substances inactives d'accompagnement (par exemple des protéines), le procédé de précipitation convient 25 aussi pour la précipitation fractionnée. d) relargage de l'inhibiteur d'amjrlase des extraits (ou des extraits concentrés selon (a)), par exemple avec le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium, etc. e) précipitation à basses températures de l'inhibiteur d'amylase 30 d'extraits de teneur déterminée en alcool. A cet effet, on ajuste tout d'abord les extraits à des concentrations en alcool de 10 à 50 de préférence de 20 à 40 puis on les maintient pendant plusieurs heures (8 à 24 heures) à une température inférieure à 0°C, de préférence entre -10 et -20°C. L'inhibiteur se-dépose 35 alors convenablement et la liqueur surnageante claire peut être enlevée. Le précipité restant est isolé par centrifugation entre -10 et -20°C. Une partie en volume du sédiment est immédiatement lavée avec environ 10 parties en volume d'éthanol absolu ou 71 03140 7 2081468 environ 5 parties en volume d'isopropanol absolu, de préférence à froid (0°C), puis séchée à la température ambiante, de préférence sous vide. Le procédé convient aussi pour la précipitation fractionnée à diverses températures. 5 II est connu que chez les animaux et les êtres humains, après l'absorption d'une nourriture contenant des glucides (amidon de céréales, fécule de pomme de terre), il apparaît des hyperglycémies alimentaires qui sont dues à une dégradation rapide des glucides par des amylases (amylases salivaire et 10 pancréatique) et des maltases d'après le schéma suivant : . . , amylaaes „ , maltas.es Amidon —=*- maltose *- glucose ou glycogène Les hyperglycémies sont particulièrement prononcées et durent très longtemps chez les diabétiques. Chez des sujets adipeux, l'hyper-15 glycémie alimentaire provoque souvent une sécrétion particulièrement forte d'insuline, qui conduit quant à elle à une plus grande accumulation des graisses et^une dégradation réduite de ces substances. Il apparaît que l'inhibiteur d'amylase conforme à l'invention, 20 isolé d'après le procédé décrit ci-dessus, réduit notablement l'hyperglycémie alimentaire^comme le montre un essai d'absorption d'amidon de froment portant sur six personnes saines (voir essai de l'exemple 5). L'inhibiteur convient,par conséquent,comme agent thérapeutique pour les indications suivantes : 25 adiposités, athérosclérose, diabète et prédiabète. Posologie : 5000 à 1 000 000 unités d'inhibiteur d'amylase une ou plusieurs fois par jour, avant et/ou pendant les repas, par voie orale. Formes de 30 préparation:comprimés, dragées, solution, suspension, granulés et comme addition à des aliments contenant de l'amidon. La toxicité de cet inhibiteur est faible. Une quantité de 1,7 x 10® unités d'inhibiteur d'amylase pancréatique par kg de sou-35„ ris par voie orale est supportée sans symptômes. Il est avantageux d'utiliser également des combinaisons avec les anti-diabétiques connus administrés par voie orale 71 03140 8 2081468 (dérivés f3-cytotropes de sulfonylurée et/ou "bigua.nl des abaissant la glycémie ). Exemple 1 On ajuste à un pH égal à 3-3,5»avec de l'acide chlorhydrique, 5 1 kg de farine de froment homogénéisée avec 2 litres d'éthanol à 66 io au même pH , et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, on centrifuge pendant 10 minutes à 6000 tours/ minute (20°C), on conserve la liqueur surnageante et on réextrait le résidu avec 2 autres litres d'éthanol à 66 $ à un pH égal 10 à 3-3,5, comme indiqué ci-dessus. Les liqueurs surnageantes rassemblées sont neutralisées avec de l'ammoniaque concentrée et les protéines inertes séparées par floculation sont éliminées par centrifugation (6000 g, 10 minutes). La liqueur surnageante claire légèrement jaunâtre (2,8 litres) est concentrée à environ 1/10 de son 15 volume (300 ml) sous un vide d'environ 20 mm de mercure et à une température de 40 à 50°G, elle est débarrassée par une nouvelle centrifugation des protéines précipitées et,après dialyse pendant 8 heures vis-à-vis d'eau distillée, à la température ambiante, elle est congelée puis lyophilisée. 20 Rendement : 10 g de substance titrant 140 000 UIA pancréatique/g de lyophilisât (ce qui équivaut à 7,5 g de substance inhibitrice sèche titrant 185 000 UIA pancréatique/g) Exemple 2 On homogénéise 1 kg de farine de froment avec 4 litres 25 d'éthanol à 30 $ dans un appareil "Starmix", on ajuste le pH du mélange à 3-3,5 avec de l'acide chlorhydrique et on l'agite à la température ambiante pendant 60 minutes. On centrifuge le mélange à 6000 tours/minute pendant 10 minutes, on ajuste le pH de la liqueur surnageante à 6,8 avec de l'ammoniaque concentrée et on élimine par 30 centrifugation les protéines inertes. On laisse reposer la liqueur surnageante pendant environ 16 heures à -15°C, on verse par décantation la solution surnageante limpide et on recueille ensuite le sédiment précipité dans des tubes de centrifugeuse préalablement refroidis à -15°C (centrifugeuse réfrigérante "Zêta1120,10 minutes, 35 6000 tours/minute). On ajoute de l'éthanol absolu glacé (en opérant dès lors à la température ambiante), on lave à l'alcool absolu et on sèche à l'étuve à vâde. 71 03140 9 2081468 Rendement : 10 g de substance titrant 160 000 UIA pancréatique/g (ce qui correspond à 8 g de substance inhibitrice sèche titrant 200 000 UIA pancréatique/g). Exemple 5 5 On homogénéise 200 g de farine avec 800 ml d'eau, on ajuste à un pH de 3,3 avec de l'acide chlorhydrique et on agite pendant 30 minutes à la température ambiante. Ensuite, on centrifuge pendant 30 minutes à 10 000 g, on neutralise la liqueur surnageante trouble avec de l'ammoniac et on centrifuge de nouveau à 10 000 g pendant 1 0 30 minutes. Les 600 ml de liqueur surnageante trouble sont additionnés dans de 1100 ml d'alcool absolu, filtré^ puis l'inhibiteur est précipité / le filtrat avec cinq autres litres d'éthanol absolu. On lave le précipité avec de l'éthanol absolu et on le sèche sous vide. 15 Rendement : 1,5 g de substance titrant 90 000 UIA pancréatique/g de lyophilisât. Exemple 4 On homogénéise 500 g de farine de froment avec 2 litres de méthanol à 75 pendant 2 minutes, on agite pendant 1 heure à la 20 température ambiante, puis on filtre sur deux filtres plissés de grand diamètre. Le filtrat clair (1,6 litre) est versé goutte à goutte sous agitation dans 4 parties en volume (= 6,4 litres) d'acétone. L'inhibiteur se dépose alors au fond du récipient en flocons blancs épais. La liqueur surnageante claire est versée par déeanta-25 tion et le sédiment de couleur blanche est repris dans de l'éthanol absolu, lavé et finalement séché sous vide à la température ambiante. Rendement : 12 g de substance titrant 40 000 UIA pancréatique/g. Exemple 5 L'action antihyperglycémique de l'inhibiteur d'amylase est 30 mise en évidence dans l'essai suivant : Six personnes en bonne santé reçoivent par voie orale,dans un essai témoin,100 g d'amidon de céréales sous la forme i'une suspension aqueuse. On détermine la glycémie juste avant le début de l'essai et à de courts intervalles de temps, jusqu'à 3 heures après 35 l'administration d'amidon, avec l'appareil auto-analyseur "Technicon selon Hoffman, "J. Biol. Chem."120. 51 (1937). Dans deux autres essais, on administre par voie orale aux six mêmes personnes, en 71 03140 10 2081468 suivant le même mode opératoire, juste avant l'ingestion d'amidon, l'inhibiteur d'amylase absorbé dans de la gomme adragante. Exemple 6 On introduit par portions dans 50 litres de méthanol à 30 5 en agitant énergiquement, 10 kg de gluten (par exemple du "gluten vital", de la firme Crespel und Deiters, Ibbenbttren, Westphalie). On ajuste ensuite le pH à 3S5 avec de l'acide chlorhydrique à demi concentré, et la viscosité de la solution s'élève alors temporairement. On agite pendant 45 minutes puis on neutralise avec de l'am-10 moniaque à demi concentrée.- Il se produit alors une floculation. On centrifuge pendant 10 minutes à environ 2000 tr/mn et on refroidit à -10°C la liqueur limpide de centrifugation. le précipité séparé à froid par floculation se dépose correctement en seize heures environ. La solution limpide surnageante est versée par décantation, le sé~ 15 diment est recueilli dans une centrifugeuse réfrigérante à -5°C, puis séché sous vide à la température ambiante après lavage à l'alcool et à l'éther. Rendement : 180 g de substance titrant 775 000 UIA pancréatique/g d'inhibiteur. TABLEAU relatif à l'exemple 5 : variation du taux de glucose dans le sang, en $ de la valeur initiale pour six personnes en bonne santé soumises à l'essai (valeur moyenne + 1 s) à différentes époques après ingestion d'amidon de céréales faisant suite à l'administration de l'inhibiteur d'amylase. (s = écart type) 15 30 45 60 90 120 180 mn Essai témoin avec 100 g d'amidon +22+13 +43+12 +35+17 +22+25 +23+14 +14+ 9 +4+7 55 000 UIA + 100 g d'amidon + 2+7 +22+13 +23+16 +17+20 +1 6+19 +13+11 -5+4 110 000 UIA + 100 g d'amidon +13+ 6 +12+10 +11+14 +1 3+13 +11+8 + 8+6 +5+4 P P (P = probabilité d'erreur) 71 03140 12 2081468 REVENDICATIONS 1 - Inhibiteur d'amylase de caractère polypeptidique, caractérisé par le fait qu'il est extrait du froment, qu'il possède une forte activité contre l'amylase pancréatique et l'amylase sali- 5 vaire et qu'il n'inhibe pas la trypsine, la chymotrypsine, la pepsine et la ribonucléase. 2 - Inhibiteur d'amylase suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est extrait du gluten. 3 - Procédé de préparation de l'inhibiteur d'amylase 1O suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que de la farine ou de la mouture ou du gluten de froment est extrait avec des mélanges à 10-90 io d'alcool (en C^ à C^) et d'eau ou avec des solutions aqueuses d'électrolytes à des pH de 1 à 7,et l'inhibiteur d'amylase est isolé de l'extrait'au moyen de procédés connus.