Brevet FR2059515A1 — publié le 19710604

La présente invention concerne la production de vaccins dans lesquels l'antigène est un organisme du genre pleuropleumonie (PP10) qui a été cultivé dans un milieu de culture contenant un composant de sérum fractionné qu'on peut ob-5 tenir à partir du sérum de veau. Les PPLO envisagés par la présente invention sont Mycopiasma pharyngis, M. hominis, Me Salivarium. M. fermentens, M. orale (type 2), souches "T", M. arthritidis, M. bovigeni talium, M. gallisepticum, M. canis, M. mycoides, M. agalactiae, M; spumans, M. plumonis, 10 M. neurolyticum et particulièrement M. pneumoniae. Plus particulièrement l'invention comprend la réduction ou l'élimination, du sérum de veau, du facteur anaphylactique qui y est présent da façon inhérente et qui autrement peut être transporté dans le vaccin. 15 On sait depuis longtemps que des personnes souffrant de symptômes analogues à la pneumonie ne sont pas infectées par les pneumocoques classiques mais présentent un syndrome de "pneumonie primaire atypique". Des études approfondies pendant les vingt dernières années ont montré que cette maladie est 20 causée par un PPLO qui est désigné sous le nom de Mycoplasma •pneumoniae ou agent d'Eaton0 II est de taille assez petite pour ne pas être éliminé par filtration, mais il a une organisation cellulaire et n'est pas rangé dans la catégorie des viruss Bien que le taux de mortalité de cette maladie soit extrêmement 25 faible, elle a fréquemment un effet incapacitant sur les personnes infectées. En conséquence, des tentatives ont été faites pour reproduire le M. pneumoniae en quantité permettant la préparation d'un vaccin pour immunisation contre l'organisme. Les premiers essais de croissance de M. pneumoniae 30 pour la préparation de vaccins ont montré les meilleurs résultats de croissance avec des milieux contenant du sérum de chevalo Toutefois, comme ce milieu nutritif n'est en général pas considéré comme pleinement acceptable pour l'injection paren-térale chez l'homme, on a essayé de le remplacer par d'autres 35 milieux nutritifs mais ces essais ont eu pour résultat une faible croissance incubative du M. pneumoniae ou ont introduit d'autres difficultés qui ne les rendent pas pratique. 70 25963 2 2.059515 Des essais de ce genre sont mentionnés dans un article intitulé "An Inactivated Mycoplasma Pneumoniae Vaccine" de K.E. Jensen et coll., paru dans JAMA 194» 248-252 (1965). On a utilisé un milieu de culture contenant l'extrait chloroformique 5 de jaunes d'oeufs de poule embryoïmés et on a obtenu une bonne croissance de M„ pneumoniae » mais un vaccin médicalement acceptable en provenance de cette source n'est pas accessible au public. D'autres vaccins expérimentaux ont été faits en cultivant le M. pneumoniae dans un milieu de culture contenant du sérum de 10 veau comme ingrédient essentiel, mais il est apparu que le sérum de veau contient un ou des facteurs sensibilisants qui sont fréquemment transférés dans le vaccin. Des essais sur cobayes ont montré que ce dernier type de vaccin peut causer une réaction de choc anaphylactique fatale et ne conviendrait pas pour 15 l'injection chez l'homme® La présente invention réside dans la découverte que le ou les facteurs de choc anaphylactique fatal ou paralysant dans le sérum de veau, sont réduits à un niveau non décelable, dans un essai in vivo de choc anaphylactique extrêmement sen-20 sible, si on effectue des opérations soigneusement contrôlées dans un ordre déterminé. Chaque opération seule est insuffisante pour éliminer les facteurs anaphylactiques, mais on a trouvé que leur application successive donne un vaccin PPLO exempt d'ana-phylaxie attribuable au composant de sérum de veau utilisé dans 25 le milieu de production ou au composant de sérum de cheval uti-' lise dans le milieu employé au moement de l'isolement original d'un cas clinique humain. Les opérations du procédé selon l'invention sont : (1) un prétraitement du sérum de veau ; (2) une culture de PPLO dans un domaine de pH choisi ; et (3) un lavage 30 contrôlé de la culture de PPLO. Le sérum de veau utilisé dans la mise en oeuvre de la présente invention est le produit ordinaire obtenu dans le commerce, il est de préférence inactivé par chauff âge à environ 56°C pendant 20 à 60 (de préférence 30) minutes de façon clas-35 sique selon la technique antérieure0 Sauf pendant cette période de chauffage et pendant le traitement selon la présente invention, le sérum doit être maintenu entre 0 et -20°0 et de préférence à -20°C environ. BAD N original! 70 25963 3 2059515 1. Prétraitement du sérum de veau Le prétraitement selon l'invention a pour but d'éliminer le plus possible le(s) facteur(s) présent(s) dans le sérum entier de veau, cause de réaction anaphylactique chez l'hôte. 5 Gela est obtenu en général par un traitement de fractionnement qui sépare du sérum certaines substances; protéiniques sans toucher à l'aptitude du sérum fractionné à supporter la croissance du PPLO. En fait, on a trouvé comme caractéristique supplémentaire de l'invention que le prétraitement améliore substantielle lement l'aptitude du sérum à supporter la croissance du PPLO, apparemment par élimination de facteurs inhibiteurs de croissance du sérum entier de veau. Alors que des concentrations supérieures à 10 $ du sérum entier dans le milieu de culture diminuent la croissance du PPLO, des concentrations supérieures 15 à 10 $> du sérum de veau traité produisent une augmentation de la croissance du PPLO. Les prétraitements envisagés dans le procédé de l'invention sont par exemple la précipitation de protéine par (a) des sels comme le sulfate d1 ammonium ou (b) un traitement ther-20 mique. (a) En pratique, le prétraitement au sulfate d'ammonium selon l'invention comporte l'addition d'environ 250-300 mg de sulfate d'ammonium par ml de sérum entier de veau, de préférence environ 278 mg/ml progressivement avec agitation, l'ad-25 dition demandant environ 1 à 5 minutes. On continue à agiter pendant 2-10 minutes, de préférence environ 5 minutes et on ajuste le pH dans l'intervalle de 6,0 à 8,0 et de préférence à pH 6,8 en utilisant un acide minéral concentré comme l'acide chlorhydrique 5-12 N. 30 Cette suspension est alors mélangée ou agitée à une vitesse moyenne pendant 1-24 heures, de préférence environ 4 heures pour assurer une précipitation maximale par le sulfate d'ammonium. Le précipité est ensuite séparé par filtration et/ou centrifugation. On centrifuge à environ 8000 à 12000 G pendant 35 5 à 20 minutes dans un appareil comme la centrifuge modèle Spinco L2-65 en utilisant un rotor ÎT° 19 à environ 10 000 t/mn. Le liquide surnageant est dialysé pendant 12 à 48, de préférence 24, heures en utilisant une cartouche de cellulose 70 25963 4 2059515 classique choisie pour le passage du sulfate d1ammonium. Après cela, il est dialyse contre une solution de phosphate tamponnée ayant un pH de 6,5-7,5» de préférence environ 6,8 et une force ionique d'environ 0,15 jusqu'à ce qu'lireste moins d'environ 5 10 y g/ml de (NH^)+, ce qui normalement demande environ 16 à 48 heures. Après cette dialyse, la fraction de sérum est stérilisée par filtration. Un procédé de filtration convenable consiste à utiliser d'abord un préfiltre "Millipore" puis un 10 filtre "Millipore" de 0,45^ - 0f22p 0 Cette fraction de sérum est utilisée dans le milieu de culture comme expliqué ci-après. EXEMPLE 1(a) A 1075 ml de sérum de veau à 5°C (préalablement 15 traité à chaud) on ajoute peu à peu en agitant 299 g (278 mg/ml) de sulfate d'ammonium. On agite pendant 5 minutes et on ajuste le pH à 6,8 avec l'acide chlorhydrique 10 I. La suspension est agitée à 5°C pendant 4 heures puis centrifugée dans un rotor ÎT° 19 à 11 000 20 t/mn (10 minutes). Les liquides surnageants sont décantés et réunis. Le tout est dialysé dans 4 sacs (17,5 x 2,5 cm plat) pendant 24 heures contre l'eau courante du robinet puis pendant 16 heures contre une solution saline tamponnée de phosphate consistant en 7 g NaCl, 1,7 g Iîa2EP0^, 0,2 g ITaHgPO^, HgO par 25 litre d'eau. Les contenus des sacs de dialyse sont réunis, le volume final étant d'environ 1600 ml. On filtre alors le tout à travers une combinaison préfiltre de 14-2 mm de diamètre "Millipore" 0,45 y* Le filtrat est réparti en flacons, à raison d'environ 75 ml/flacon. 30 Le tableau I illustre l'effet du prétraitement au sulfate d'ammonium sur l'aptitude du sérum de veau à supporter la culture de PPLO dans un milieu de culture tel que décrit dans l'exemple 2, comme on la détermine par l'analyse pour DIJA. 70 25963 5 2059515 Tableau X Effet du prétraitement au sulfate d'ammonium sur l'aptitude du sérum de veau à supporter une culture LNA mcg/100 ml concentration du sérum $ Milieu 5,0 10,0 Sérum entier de veau 123 103 Sérum de veau prétraité 83 180 (b) Une variante de prétraitement selon l'invention pour éliminer le facteur anaphylactique du sérum entier de veau comporte le traitement de ce dernier à température élevée0 Comme on l'a déjà dit, le sérum est chauffé de façon classique à en-5 viron 56-60°C pendant 20-60 minutes. Selon une caractéristique de la présente invention, on a trouvé qu'un chauffage à 65-70°C pendant 30_60 minutes, de préférence environ 60 minutes réduit de façon importante le(s) facteur(s) anaphylactique(s) présent(s). Bien que la totalité du (des) facteur(s) toxique(s) ne soit pas 10 éliminée par ce traitement thermique, le produit, comme celui provenant de la précipitation au sulfate d'ammonium décrit ci-dessus, est plus à même de subir les autres opérations de détoxification selon l'invention. Le tableau II démontre clairement l'efficacité du 15 traitement thermique selon l'invention pour diminuer le(s) facteur(s) anaphylactique(s) présent(s) dans le sérum entier de veau. Le tableau montre une comparaison de la capacité de sensibilisation du sérum entier de veau qui a été soumis soit au traitement classique d'inactivation, soit au traitement 20 thermique selon l'invention telle qu'elle est mesurée par l'inverse des dilutions de sérum auxquelles 50 $ de cobayes sensibilisés subissent une anaphylaxie fatale. 70 25963 6 2059515 Tableau II Matière sensibilisante sérum entier de veau Attaque sérum entier de veau £56 °C, pendant 30' ^ 65 °C pendant 60| chauffé à 56°C pendant 30 mn chauffé à 65°G pendant 60 mn 111000 1:199 1:325 1:159 Gomme on l'observe ci-dessus le traitement thermique réduit grandement le(s) facteur(s) anaphylactique(s) présent(s). Ce prétraitement sert aussi à éliminer des inhibiteurs de croissance du sérum entier, comme on l'avait trouvé dans le pré-5 traitement au sulfate d'ammonium, permettant ainsi un rendement plus élevé de croissance de PPLO par volume unitaire de sérum de veau et permettant aussi des concentrations plus élevées de sérum par volume unitaire de milieu de culture. Le tableau III illustre l'effet de la température et 10 du temps de chauffage sur l'aptitude du sérum de veau à supporter la croissance de PPLO comme décrit dans la section (2) ci-après, telle que déterminée par l'analyse pour DMA.. Tableau III Effet du prétraitement thermique sur l'aptitude du sérum de veau à supporter la croissance de M. pneumoniae Traitement 3)UA (mcg/100 ml) Temp. (°C) Temps (min) Concentration du sérum.($) "5 10 20 56 30 81 71 48 60 30 116 46 16 65 30 106 186 65 60 100 223 — 70 30 — 187 272 70 25963 7 2059515 TBTBMPIB l(b) Une 'bouteille de sérum entier de veau à -20°G est immergée dans un bain d'eau maintenue à 65°C. Après 1 heure, la phase mobile du sérum, représentant environ 75 du volume total, 5 est décantée d'un résidu protéinique gélatineux. La phase mobile est le sérum prétraité utilisé dans le milieu de culture pour la propagation du PPLO. 2. Culture de M. -pneumoniae 1 f) La seconde opération dans le procédé selon l'invention est la culture du PPLO dans un milieu contenant un sérum de veau prétraité. Ces sérums de veau prétraité sont utilisés de façon classique dans un milieu nutritif connu pour la eulture du PPLOo Un de ces milieux nutritifs est celui mentionné par R.MC Chanock et coll. dans Proc. Natl0 Acad. Soi. £8, 41-49, (1962). Au lieu du sérum de cheval utilisé par Chanock, le sérum de veau prétraité selon l'invention est ajouté à une concentration de 5-20 $> (v/v) du volume final du milieu de base. L'incubation est conduite de façon classique, par 20 exemple en suivant le procédé décrit dans la référence Chanock et coll. Le PPLO peut être cultivé sur verre ou autres surfaces comme par exemple des bouteilles de verre Blake ou Brockway ou dans des bouteilles contenant des billes de verre 25 de 4-5 mm de diamètre„ On peut aussi faire une culture en masse dans un appareil de culture à disques empilés. Il est aussi possible de cultiver le PPLO en culture submergée.classique„ Indépendamment des conditions physiques, une des caractéristiques de l'invention est l'ajustement du pH du mi-50 lieu de fermentation. Comme on le voit d'après le tableau 17 la quantité de croissance est affectée de façon nette par de petites variations de pH0 On a trouvé que le maximum de croissance se produit avec un pH initial situé entre environ 7>0 et 8,0, de préférence à environ 7»5-8,0. 35- L'agent préféré pour ajuster le pH est un bicarbonate de métal alcalin comme le bicarbonate de potassium ou de sodium mais on peut utiliser d'autres méthodes de contrôle du pH comme un système tampon compatible. 70 25963 a 2059515 Tableau IV Influence du pH sur la croissance de M. pneumoniae dans un milieu à 5 de sérum entier de veau Désignation de l'échantillon DUA mcg/100 ml pH de récolte couche supérieure ¥-1, pas de bicarbonate 36,5 6,7 6,75 ¥-2 H 58,5 6,8 7,0 ¥-3 3! 48,0 6,75 6 ,8 ¥-4 SI 54,5 6,9 6,9 ¥-5 SI 51,5 7,0 7,1 ¥-6, ticairbonate 170,0 7,5 7,5 ¥-7 H 161,5 7,15 7,25 ¥-8 13 150,0 7,2 7,4 ¥-11 it 118,0 7,65 7,7 ¥-12 31 123,0 7,5 7,55 Tout en ayant un effet sur le potentiel de croissance du sérum comme démontré par le tableau IY, le pH a aussi un effet sur l'efficacité antigénique<> Il est essentiel que le pH du milieu de culture soit à 6,8 ou au-dessus, de préférence dans 5 l'intervalle 7,0-7,2 au moment de la récolte de façon à assurer 1'efficacité antigénique maximale de la préparation de vaccin. m rH in ON Tableau V m o C\J Effet du pH sur l'efficacité antigenique de M. Pneumoniae a\ en o a-lo CN o r- Essai N° Durée DNA (mcg/100 ml) d'incubation (attaché au verre) 36°0 (jours) pH de la récolte Titre d'extinction antigénique chez le cobaye (CR50) 1 « Etude 4 36,0 6,8 1 Î 263 Antigénique 6 44,5 5,8 1 : 83 DNA-IV 8 42,0 5,4 1 : 32 2 o PL-gc *17 bicarbonate (7,5 ¥> p/v) ajouté à 3,0 ml/100 ml 1 (bicarbonate) (pas de bicarbonate) 0 0 7,5 7,8 2 (.bicarbonate} (pas de bicarbonate) 8,0 7,5 7,1 7,85 1 : 2 C 1 3 (bicarbonate} (pas de bicarbonate) 60,0 58,0 6,7 7,5 1 : 3 1 : 10 4 (bicarbonate} (pas de bicarbonate) 54,0 80,0 5,9 7.1 ■> : 5 1 s 27 5 (bicarbonate} (pas de bicarbonate) 30,0 109,0 5,5 6,85 ■6 1 1 î 40 6 (bicarbonate} (pas de bicarbonate) 130,0 6,1 1 : 25 7 (bicarbonate} (pas de bicarbonate) 145,0 5,9 1 : 13 70 25963 10 2059515 Un procédé type de fermentation est le suivant utilisant le produit de 1*exemple l(a) ou l(b)/ EXEMPLE 2 On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante ; ml 5 Bouillon Difco PPLO 70,0 10,0 20,0 4*0 2,0 Extrait de levure, 25 % p/v aqueux Sérum de veau de l'exemple 1 NaHCO^ 7,5 $ p/v aqueux Glucose, 50,0 4> p/v aqueux 10 Ce milieu est réparti as ept iquement dans des: bouteilles de 910 g à faces plates (comme- Brockwat ou Blake) de façon que chacune contienne 100 ml„ Le PPLO utilisé était obtenu initialement d'un cas clinique humain de pneumonie atypique 15 (souche 1482, Fr .4) et un. passage subséquent a été identifié comme MAS-27 ; il y a eu 5 passages avant culture dans le milieu ci-dessus» Chaque bouteille est ensemencée avec 10 ml de l'organisme (P5) et l'incubation est effectuée à 36-37°C avec les bouteilles à plat et immobiles. passage (P6) est observée au microscope et montre un nombre modéré de colonies de PPLO attachées à la surface de verre du récipient de culture (les colonies de PPLO sont de taille petite et moyenne). Les fluides infectés du passage 6 sont passés dans 25 un milieu frais (P7) de la composition décrite ci-dessus. Le passage 8 est fait à partir des fluides du passage 7 après incubation de trois j ours, L'observation microscopique du passage 7 montre une couche confluente de colonies de PPLO (qui sont de taille petite à grande) attachées à la surface du verre, 30 Après quatre jours d'incubation à 36-37°C en position horizontale immobile, on récolte les bouteilles représentant le huitième passage. 20 Après deux jours d'incubation, la culture de ce sixième ^BAD ORIGINAL Tableau VI Oulture de M. pneumoniae dans les milieux indiqués, après incubation à 36°C Essai 1° Milieu Durée d'incubation DÏÏA, meg/100 ml à 36°0 Pavillon + verre Bouillon Verre Lavage de la récolte &B-1A sérum entier de veau à 5 $ 7 jours 308 92 162 18 GB-1B sérum entier de veau à 5 i* 7 jours 305 100 205 22 GB»2 fraction de sulfate d ' ammonium à 20 io 4 jours 438 200 143 3 70 15^03 3. Lavage de la culture de PPLO On récolte les PPLO en décantant le milieu surnageant et en lavant la culture collée au verre avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant du thimérosal et du formaldé-5 hyde. Le milieu surnageant et les lavages sont jetés sauf pour une petite quantité du liquide résiduaire du second lavage dans lequel la culture est en suspension. En général deux lavages supplémentaires de la suspension de PPLO sont effectués en ultracentrifuge à 15 000 - 30 000 G à 0 - 10°0o 10 EXEMPLE 3 La couche surnageant dans chacune de 27 "bouteilles (Brockways de 910 g) est décantée et jetée. Les organismes attachés au verre sont lavés deux fois (100,0 ml/bouteille/ 15 lavage) avec la solution saline tamponnée au phosphate décrite dans l'exemple l(a) contenant en plus des concentrations finales de forunldéhyde et thimérosal. à environ 90 à 100 mcg/ml et 50-60 mcg/ml respectivement. On laisse trois à quatre ml du second liquide de lavage dans chacune des 27 bouteilles et les 20 organismes attachés au verre sont grattés de la surface avec des pièces de caoutchouc stérile attachées à des tiges de verre en utilisant des techniques aseptiques. Le liquide restant dans chaque bouteille est enlevé avec une pipette sérologique stérile et tous ces liquides sont rassemblés. 25 La récolte réunie est lavée dans une ultracentrifuge Spinco (modèle L, rotor ïï° 20) deux fois à 15 000 t/mn pendant une heure à 4°C. Après le dernier lavage, le volume de fluide est ajusté à 45 ml (1/60 du volume originel de la récolte) en utilisant la solution saline tamponnée au phosphate contenant 30 du formaldéhyde et du thimérosal. Les concentrats pré et post-Spinco sont titrés pour DNA sédimentable et pour les protéines non dialysables. mcg DUA/ml mcg protéines/ml Pré-Spinco(20X) 51»8 non disponible 35 Post-Spinco (60X) 148,0 2304,0 Les résultats des titrages de DMA et protéines s ont indicatifs de la teneur en organisme PPLO total attaché à la surface. 70 25963 13 2059515 Le concentrât post-Spinco ci-dessus est directement utilisable comme vaccin. A cet effet, 0,05 ou 1,0 ml serait injecté par voie intramusculaire ou bien de concentrât serait réparti et scellé dans des récipients à dose simple ou multi-5 pie. Pour prouver qu'un vaccin préparé à partir de PPLO cultivé dans un milieu contenant les fractions de sérum de veau selon l'invention est entièrement ou substantiellement exempt de facteur(s) sensibilisant(s) du sérum de veau, on a fait des 10 essais d'anaphylaxie sur des cobayes des deux sexes pesant entre 375 et 450 gQ Ces animaux ont été sensibilisés par injection sous-cutanée du vaccin. On a fait trois injections avec lin intervalle de 4 - 6 jours entre deux injections0 Trente à trente cinq jours après la dernière injection sensibilisante, 15 les animaux ont reçu une injection prédéterminée de sérum entier de cheval ou de veau administrée intracardialement. On observe alors chez les animaux les symptômes usuels de choc anaphylactique ; frottage du nez, éternuement (1+) ; toux, suffocation et impossibilité de se tenir debout (2+) ; paralysie des 20 membres partielle ou totale (3+) ; mort (4+). Des, cobayes ayant reçu des injections de sensibilisants connus ainsi que des animaux ja'ayant reçu aucune injection ont été pris comme témoins o Les résultats de ces essais sont montrés dans le tableau VII. Tableau YII --4 O ■Réaction de choc anaphylactique de cobayes sensibilisés avec les vaccins PPLO Eaton indiqués hO Un *o O u> Substance sensibilisante Substance d'attaque Choc anaphylactique jmortel non mortel A. PPLO cultivé dans un milieu contenant du sérum de veau fractionné précipité à (NH^)gSO^ 1. échantillon SV-16 2. 3 o 4. 5 o SV-17 171-1 171-2 171-3 Bo PPLO cultivé dans un milieu contenant du sérum en« tier d© cheval C. Témoins 1. aértun entier de veau 2o sérum entier de cheval 3i aucune injection sérum entier de veau sérum entier de chev&L sérum entier de veau sérum entier de cheval sérum entier de veau 0/11 0/10 0/12 0/12 0/12 6/6 5/6 6/6 0/12 o o 0 100 83 100 0 0/11 2/10 1/12 0/12 0/12 1/6 0/6 0/12 0 20 8 0 0 17 0 0 Réactions jj-o.fr 11/11 8/10 11/12 12/12 12/12 0/6 0/6 12/12 ir 100 MA /ml 100 37,5 6,8 80 35,8 7,35 92 34,0 7,0 100 35,7 5,6 100 35,6 6,1 0 5,0 ? * Nombre d'animaux répondants/nombre d'animaux attaqués, pH de la récolte ro o VJI vo ui h-* VJI 70 25963 15 2059515 T.e tableau VIT montre que l'emploi d'un vaccin obtenu en cultivant le PPLO dans la fraction du sérum de veau selon l'invention n'a occasionné aucune mort. Il s'est produit occasionnellement une réaction non fatale mais seulement du type mineur 111+" ou"24". 70 25963 16 2059515 REVENDICATIONS 1o Procédé de préparation d'un vaccin PPLO (genre pleuropneumonie) non anaphylactique caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes : (a) élimination du sérum entier de veau, par fraction-5 nement, des facteurs anaphylactiques et inhibiteurs de croissance ; (b) propagation du PPLO dans un milieu de culture contenant le sérum de veau fractionné à un pH contrôlé ; (c) lavage, récolte et concentration du PPLO. 10 20 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le PPLO est Mycoplasma pneumoniae 0 3o Procédé de préparation d'un vaccin PPLO non anaphylactique caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes : 15 (a) traitement du sérum entier de veau avec 250-300 mg de sulfate d'ammonium par millimètre de sérum entier de veau et séparation du précipité de la partie surnageante* (b) propagation du PPLO dans tin milieu nutritif contenant 5-20 fe de partie surnageante à pH 7,0-8,0 ; 20 (c) lavage, récolte et concentration du PPLOo 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le PPLO est Mycoplasma pneumoniae « 5. Procédé de préparation d'un vaccin PPLO non anaphylactique caractérisé en ce qu'il comprend les opérations 25 suivantes : (a) chauffage du sérum entier de veau à 65-70°0 pendant 30-60 minutes et décantation de la phase mobile ; (b) propagation du PPLO dans un milieu nutritif contenant 5-20 io de la phase mobile à pH 7,0-8,05 30 (c) lavage, récolte et concentration du PPLO. 6. Procédé selon la revendication 5 ? caractérisé en ce que le PPLO est Mycoplasma pneimoniae» 7o Sérum de veau fractionné pour emploi dans la culture de PPLO, caractérisé en ce qu'il est préparé en traitant 35 du sérum, entier de veau avec 250-300 mg de sulfate d' ammoaima/ial de sérum de veau à pH 6-8, en séparant le précipité et en di-alysant le liquide surnageante 70 25963 17 2059515 8. Sérum de veau fractionné pour emploi dans la culture de PPLO, caractérisé en ce qu'il est préparé en chauffant du sérum entier de veau à 65-70°C pendant 30-60 minutes et en séparant la phase mobile utile résultante d'une 5 phase gélatineuse 0