Brevet FR2073280A1 — publié le 19711001

lies sérums antilymphocyt air e s humains existant actuellement, et qui possèdent diverses applications thérapeutiques, sont obtenus par immunisation d'un animal, par exemple le cheval, grâce à l'action d'antigènes provenant de cellules lymphocytaires d'ori-^j|. gine humaine. Ces cellules sont par exemple obtenues à partir de lymphe humaine, de sang humain, d'organes humains riches en lymphocytes, ou encore de cultures cellulaires in vitro de lymphocytes humains. Il est évidemment difficile de se procurer des quantités im-10 portantes d'antigènes d'origine humaine, ce qui augmente fortement le prix des sérums antilymphocytaires actuels et réduit considérablement leurs possibilités d'utilisation. L'invention a pour objet un sérum antilymphocytaire caractérisé par le fait qu'il est obtenu par immunisation d'un animal à 15 l'aide d'antigènes provenant de cellules lymphocytaires d origine simienne. Bien" qu'il existe certaines similitudes entre les antigènes d'origine simienne et les antigènes d'origine humaine, il était possible de penser qu'un tel sérum réalisé sous l'action d'anti-20 gènes simiens, n'aurait que peu ou pas d'activité antilymphocytaire chez l'homme. Or, il a été constaté que non seulement l'activité du sérum est' comparable à celle des sérums déjà connus, mais que le titre en anticorps du sérum selon l'invention est notablèment -supérieur aux titres des sérums déjà connus. 25 les antigènes simiens permettant la fabrication du sérum pro viennent de préférence de primates anthropoïdes tels que le chimpanzé, ou de catarrhiniens (cercopithecidae, hylobatidae, posgidae), en particulier des macaques ou des babouins. Il est également possible d'utiliser des platyrrhiniens. Les antigènes de type lympho-30 cytaire sont de préférence extraits du thymus de ces animaux, mais bien entendu toute autre source de ces lymphocytes peut être utilisée. Ainsi,- d'autres organes comme la rate, les ganglions, peuvent être utilisés, de même que la lymphe ou le sang des singes en question. La source d'antigènes pourrait également provenir de cultu-35 res cellulaires in vitro de lymphocytes simiens. L'invention concerne également un procédé de fabrication dù sérum antilymphocytaire, ce procédé étant notamment caractérisé par le fait que l'on injecte à un animal tel que le cheval des antigènes à base de lymphocytes d'origine simienne, provenant de pré-40 férence d'animaux tels que les ijaçaques, les cercopithèques et les 69 43729 2 2073280 "babouins, qu'on récolte le sérum, obtenu par saignée de l'animal, et qu'on purifie ensuite le sérum.. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparai-tront plus en détail à la lecture de la description suivante faite 5 à titre d'exemple non limitatif. La préparation des antigènes est effectuée à partir de thymus frais de macaque rhésus. Ces thymus sont traités par broyage ou par désagrégation à la trypsine, à la suite de quoi la matière broyée est mise en suspension puis centrifugée. Les antigènes obte-10 nus par centrifugation sont purifiés par des lavages dans des solutions convenables par exemple des solutions isotoniques de chlorure de sodium. Les antigènes ainsi purifiés sont ensuite mis en suspension dans des adjuvants d'immunité, par exemple un mélange de Freund. 15 A titre de variante les antigènes peuvent également être ad- sorbés sur de la di-éthyl-amino-éthyl cellulose, des sels d'aluminium, des sels de corraghen, des huiles inter-estérifiées, ou autres. Cette adsorption peut être précédée,, ou non, d'une libération des antigènes par désintégration cellulaire limitée, en uti-20 lisant divers procédés tels que les ultrasons, la congélation, la lyse sur glycocolle» Les antigènes purifiés sont ensuite injectés à un animal qui peut être un équin, un bovin, ou un ovin» En bon état de santé, l'immunisation à l'aide de l'antigène lymphocytaire peut être ef-25 fectuée par exemple et à titre non limitatif selon le procédé suivant : Jour 0 :- injection de 1 milliard de cellules lymphocytaires vivantes mélangées à volume égal à l'adjuvant de Freund par voie sous-cutanée en un point. 30 - injection de 1 milliard de cellules lymphocytaires vivantes par voie intradermique en plusieurs points. Jour 19 injection de 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. Jour 20 :- injection de 4 milliards de cellules lymphocytaires 35 vivantes par voie intraveineuse. Jour 21 :- injection de 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. Jour 30 injection de 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. 40 Jour 45 :- injection de 2 milliards de cellules lymphocytaires 69 43729 3 2073280 vivantes par voie intraveineuse. Le maintien de l'immunisation de l'animal se poursuit ensuite par injection tous les quinze jours d'au moins 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. 5 A partir du 45ème jour d'immunisation, l'animal producteur peut être saigné sur flacon sec ou sur flacon hépariné. Le sérum (ou le plasma) ainsi obtenu est fractionné en vue d'isoler les anticorps antilymphocytaires. On procède par exemple et à titre non limitatif de la façon suivante : 10 Avant de procéder à la purification de ce sérum ou plasma, on élimine les activités parasites provenant notamment des hémag-glutinines et des anticorps antiprotéïques. Dans ce "but on adsorbe les hémagglutinines sur des hématies humaines et on épuise les anticorps antiprotéïques par adsorption sur du plasma humain. 15 Ces opérations peuvent "bien entendu également être effectuées après purification du sérum au lieu de l'être avant. On précipite ensuite les immunoglobulines antilymphocytaires à 1'aide par exemple de sulfate d'ammonium à 40-48 % ou à 1'aide de l'alcool à "basse température et à concentration appropriée ou 20 à l'aide d'une adsorption sur DEAE Sephadex. La précipité est recueilli par centrifugation. On effectue une dialyse par exemple dans une membrane en cellophane à 4° C contre de 1 eau ordinaire pendant 24 heures environ, puis, contre une solution isotonique de chlorure de sodium pendant encore 24 heures. On additionne le 25 dialysat d'une solution de phosphate tampon au pH 6,9. On stérilise enfin par filtration à travers des disques convenables, tels que des filtres Seitz (filtres E.K.S.). L'activité est contrôlée par un test de cyto-toxicité des lymphocytes humains et un test d'agglutination. On détermine la 30 dilution active par cm3 de solution d'immunoglobulines et on constate que la dilution minimale active in vitro est de 1/1024. Des contrôles de stérilité, d'innocuité et d'activité des anticorps sont effectués in vitro et in vivo selon des méthodes adéquates. 35 Le sérum ou les anticorps purifiés obtenus selon l'inventron peuvent être utilisés chez l'homme lorsqu'on désire diminuer ou supprimer la réaction immunitaire cellulaire et humorale et lorsqu'on recherche une inhibition du taux et de l'activité des lymphocytes. 40 . Plus précisément le sérum antilymphocytaire simien à usage 69 43729 4 2073280 humain peut être utilisé préventivement et curativement pour ralentir ou supprimer les mécanismes de rejet des greffes rénales, hépatiques, cardiaques, cutanées, etc.. 69 43729 5 2073280 REVENDICATIONS 1. Sérum antilymphocytaire caractérisé par le fait qu'il est obtenu par immunisation d'un animal à l'aide d'antigènes provenant de cellules lymphocytaires d'origine simienne. 5 2. Sérum selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'on immunise un animal à l'aide d'une préparation de cellules lymphocytaires obtenue à partir d'organes riches en lymphocytes tels que le thymus, la rate, les ganglions. 3» Procédé selon 1'une quelconque des revendications 1 et 2, 10 caractérisé par le fait que les animaux fournissant les cellules lymphocytaires sont des primates anthropoïdes. 4. Sérum selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les animaux fournissant les cellules sont des singes catarrhiniens. 15 5. Sérum selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les animaux fournissant les cellules sont des singes platyrrhiniens. 6. Sérum selon 1'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les animaux fournissant les lymphocytes 20 sont des macaques. 7. Sérum selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les singes fournissant les lymphocytes sont des cercopithèques. 8. Sérum selon 1'une quelconque des revendications 1 et 2, 25 caractérisé par le fait que les singes fournissant les lymphocytes sont des babouins. 9. Sérum selon 1'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'animal immunisé est un équin, un bovin, ou un ovin. 30 10. Procédé de fabrication d'un sérum selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'on injecte à un animal: Jour 0 - Un milliard de cellules lymphocytaires vivantes purifiées mélangées à volume égal à l'adjuvant de Sreund par voie sous-cutanée en un point. 35 - Un milliard de cellules lymphocytaires vivantes par voie intradermique en plusieurs points. Jour 19 - 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. Jour 20 - 4 milliards de cellules lymphocytaires vivantes 40 par. voie intraveineuse. 69 43729 6 2073280 Jour 21 - 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. Jour 30 - 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. 3 Jour 45 - 2 milliards de cellules lymphocytaires vivantes par voie intraveineuse. 11. Procédé selon' la revendication 10 caractérisé par le fait qu'on maintient 1'immunisation de l'animal par injection environ tous les quinze jours d'au moins 2 milliards de cellules lympho- 10 cytaires. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 11,•caractérisé par le fait que l'on adsorbe les anticorps antiprotéines humains et les hémagglutinines vis-à-vis des hématies humaines à l'aide respectivement de plasma humain et d'hématies 15 humaines, que l'on élimine les précipités formés par centrifugation, que l'on précipite le surnageant par exemple au moyen de sulfate d'ammonium, que l'on effectue une dialyse, que l'on ajoute une solution de sulfate tampon au dialysat, puis que l'on effectue une filtration stérilisante.