Brevet FR2104732A1 — publié le 19720421

Ces dernières années, l'asparaginase a fait l'objet d'un intérêt croissant parce qu'on a découvert que cet enzyme a une activité antitumorale. Kidd a démontré dès 1953 que du sérum de cobaye injecté à des souris et à des rats causait une régression de certains types de lymphomes transplantés tandis que les sérums d'un certain nombre d'autres animaux n'avaient pas d'effet (Journal of Experimental Medicine 98 (1953), page 565). Pendant les années qui ont suivi immédiatement, on pensait que l'effet du sérum de cobaye dépendait d'un mécanisme immunologique, mais en 1956 on a démontré que ce n'était pas le cas (Transplant. Bull. 3, (1956), page 142, Cancer Research 16 (1956), page 338). Au début des années 1960, on a cherché et trouvé une relation entre la teneur en asparaginase du sérum de cobaye et son effet antilymphomatique (Nature, 191 (l961) page 1114, Journal cf Experimental Nedicine 118 (1963) page 99, Journal of Nat. Cancer Inst. 35 (1965) > page 967). On a trouvé antérieurement de la L-asparaginase dans le sérum de l'agouti (un rongeur d'Amérique du Sud), chez trois autres rongeurs, dans la levure, le Bacillus coagulans, l'E. coli et la Serratia marcessens. L'enzyme de levure n'a pas d'effet sur les tumeurs. Lg. ccli contient deux asparaginases distinctes dont une seule a un effet antitumoral et on peut favoriser la formation de celle-ci par culture anaérobie. L'effet thérapeutique de l'enzyme a été décrit dans plusieurs articles, par exemple J. Exptl. Med. 125 (1967), page 17; Cancer 19 (1966) page 1813; J. Mn. Med. Assoc. 202 (1967) page 2616, ce qui montre clairement sa valeur clinique. Selon ce qui a été publié jusqu'ici, les effets secondaires apparaissent peu nombreux et relativement modérés à condition que l'en- zyme soit hautement purifié. Par contre, les préparations enzymatiques impures donnent des effets secondaires très nuisibles. Selon des expériences très récentes faites sur des souris et des rats, 1' enzyme a aussi une activité immunosuppressive marquée, c'est-à-dire que le rejet de greffes de peau est appréciablement retardé. les procédés de préparation actuellement connus sont aspécifiques, compliqués et coûteux. Aussi, dans certains cas, on a cessé le traitement à cause d'une pénurie d'enzyme. Le coût d'un mois de ce traitement était voisin, récenunent, de F 200 000. On a obtenu une préparation homogène à l'ultracentrifugation et à l'immuno-électrophorèse par une série d'étapes qui comprennent une dénaturation thermique, un fractionnement de sels, une filtration de gel, une chromatographie sur diéthylaminoéthylcellulose et hydroxyapatite. Ce procédé est extrêmement coûteux à l'échelle industrielle. C'est pourquoi le procédé spécifique de purification selon l'invention qui fournit de grandes quantités d'enzyme hautement purifié a une importance particulièrement grande. L'invention est basée sur le fait que certains inhibiteurs spécifiques peuvent entre liés sélectivement et réversiblement à l'asparaginase. Si l'on lie de tels inhibiteurs à une matrice, on peut ainsi obtenir un adsorbant spécifique et sélectif pour la préparation d'enzyme pur, spécialement d'asparaginase. L'asparaginase est sélectivement adsorbée sur l'inhi- biteur-adsorbant et non peut facilement la libérer par traitement au moyen d'électrolytes forts. Ce traitement se fait de façon discontinue ou dans une colonne. L'enzyme L-asparaginase est inhibée de façon réversible par la D-asparagine et par des dérivés d-N-alcoylés de la D,L-asparagine (Biochem. Biophys. Acta, 40 (1960) pages 92 à 98). En partant de cela, on a d'abord couplé la D-asparagine à une substance porteuse insoluble, appelée ici matrice, pour adsorber spécifiquement-la L-asparaginase. Malgré les tentatives que l'on a faites pour accroStre le rendement de couplage en utilisant différentes substances à titre de matrice, par exemple le dextrane réticulé ou l'agarose, ou en augmentant la quantité de gel par unité de volume, on n'a obtenu aucun adsorbant efficace. On suppose que cela est lié à des emDêchements stéri Selon l'invention ques./le groupe actif est lié à la matrice par l'intermédiaire d'un segment de molécule de longueur telle que l'influence stérique de la matrice sur le développement du complexe inhibiteurasparaginase est affaiblie ou éliminée. Etant donné que les possibilités de contact entre enzyme et inhibiteur sont notablement améliorées de cette manière, on obtient un adsorbant quant une capacité notable. La préparation d'un adsorbant spécifique peut se faire, par exemple, en deux étapes selon le procédé au bromure de cyanogène décrit dans Nature 214, 1302, (1967) et 215, 1491 (1967), l'activation de la matrice étant suivie d'un couplage de l'inhi- biteur avec la matrice activée. L'une des conditions que doit remplir la substance à lier est de contenir au moins un groupe amine libre. Pour cette raison, on peut choisir avantageusement la putrescine comme pont pour la synthèse de l'inhibiteur - autrement dit, on peut coupler l'inhibiteur sous la forme de N (t-amino-n-butyl) asp aragine . Dans cette synthèse, on remplace le premier groupe amino de la D-asparagine par du chlore grtce à un processus de diazotation en présence d'un grand excès de sel ordinaire. Puis, à 30 C pendant 9 j ours, on couple l'amide chlorosuccinique obtenue à de la putrescine en grand excès. De cette manière, l'un des groupes amino reste libre pour servir ensuite au couplage avec de l'agarose activée (marque commerciale "Sepharose" 63). Matrice activée produit stable lié = adsorbant spécifique de l'asparaginase Exactement de la meme façon, on peut aussi faire des couplages similaires avec, par exemple, des dérivés de l'acide glutamique b la place des dérivés de l'asparagine. Ainsi, la substance correspondante à coupler répondra à la formule Cette structure est apparue très appropriée à la séparation de l'asparaginase contenue dans d'autres mélanges. Il est apparu que d'autres dérivés contenant des ponts plus longs étaient aussi préférables dans certains cas et, de façon générale, on a obtenu de bons résultats avec des dérivés aminés de diacides répondant à la formule générale (CH2)n (COOL)2 de sorte que la substance à coupler répond généralement à la formule dans laquelle Y est un groupe alcoyle ou alcoyle substitué, X est un groupe amino ou hydroxyle, et n est un nombre entier. Le groupe réactif est couplé à une matrice par l'intermédiaire de Y ou d'un ou plusieurs autres agents de pontage. Les figures montrent des courbes d'éluvion relevées au cours d'un essai chromatographique avec une colonne contenant de l'agarose et un inhibiteur et qui a un diamètre de 32 mm et une hauteur de 38 mm. La courbe en trait discontinu représente la distribution d'activité. On fait tous les essais dans un tampon borate 0,05 M ayant un pH de 8,6 et contenant du NaCl 0,30 M et 0,006% de NaN. Les figures montrent des courbes concernant la colonne équilibrée par le tampon - la figure 1 sans addition de l'inhibiteur, - la figure 2 avec addition de D-asparagine (0,001M), et - la figure 3 avec addition de L-glutamine (0,001M). Avec l'adsorbant préparé de cette manière, on peut adsorber spécifiquement la matière active provenant de l'E. ccli (figure 1). Pour empêcher une adsorption aspécifique de matière non intéressante, on ajoute du sel ordinaire au tampon d'équilibrage. Toutefois, la constante de complexe est probablement très faible étant donné que l'activité enzymatique est fortement retardée au lieu d'être fermement liée à l'adsorbant. On peut facilement effectuer la désorption avec un tampon contenant du sel ordinaire 2 M. Etant donné que lton pourrait aussi obtenir le retardement de l'activité enzymatique en faisant varier la concentration d'ions dans le tampon d'équilibrage, il apparatt qu'en fait c'est une question d'effets spécifiques et non de simples effets d'échange d'ions par addition d'un inhibiteur à la solution tampon.L'inhibiteur est amené à la solution tampon à une concentration molaire, 0,001 M, si faible que l'on pourrait négliger la concentration ionique à cet égard. Butant donné que la D-asparagine a une capacité d'inhibition trois fois plus forte que la L-glutamine sur la L-aspa- raginase d'E. coli, il existe une limite où la D-asparagine a encore un effet d'inhibition tandis que la L-glutamine cesse pratiquement d'avoir un effet. Cela est illustré par les figu res 2 et 3 et une autre indication montrant qu'il existe une adsorption spécifique est que la D-asparagine à la m8me faible concentration molaire, 0,001 M, peut servir à la désorption spé- cifique de l'activité enzymatique. Bien entendu, la préparation de l'adsorbant spécifique peut aussi s'effectuer d'autres façons. La caractéristique essentielle de l'invention est que l'on lie un inhibiteur à un polymère de manière qu'il devienne facilement accessible à l'enzyme. On peut y procéder en insérant un chainon plus ou moins long entre la matrice et l'inhibiteur. REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation et de purification de l'as paraginase à laide d'un adsorbant, selon lequel on met en contact avec l'adsorbant une solution contenant de l'asparaginase, ainsi que, éventuellement, d'autres substances, de façon discontinue ou continue, caractérisé en ce que l'adsorbant contient un inhibiteur d'asparaginase répondant à la formule générale dans laquelle Y est un groupe alcoyle ou alcoyle substitué, X est un groupe amino ou hydroxyle et n est un nombre entier, cet inhibiteur étant relié à une matrice par Y ou par un agent de réticulation supplémentaire, de manière que l'asparaginase soit adsorbée par interaction avec l'inhibiteur et que l'adsorption puisse être totalement ou partiellement supprimée par désorption sans que les conditions d'adsorption de protéines biologiquement inactives vis-à-vis de l'inhibiteur soit appréciablement affectées et de manière à permettre une régénération complète ou presque complète de l'adsorbant et de l'enzyme à partir du complexe lié à la matrice. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que n vaut 1 ou 2 et qu'ainsi l'inhibiteur d'asparaginase est l'acide asparaginique ou l'acide glutamique ou un dérivé de ceux-ci. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on lie l'inhibiteur à une matrice constituée par un hydrate de carbone formateur de gel. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on lie l'inhibiteur à une matrice formée d'hydrate de carbone réticulé. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on lie l'inhibiteur à une matrice formée d'agar-agar ou d'agarose. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on lie l'inhibiteur à une matrice formée de dextrane réticulé. 7. L'asparaginase obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.