Brevet FR2096870A1 — publié le 19720303

L'invention a pour objet un nouveau vaccin vétérinaire permettant l'immunisation simultanée contre la rage et la brucellose. On connaît déåà des vaccins de la rage obtenus par exemple de façon classique, par culture du virus in vivo sur cellules de lapins ou sur embryons de canards, ou encore in vitro sur des broyats de cellules d'embryons de souris, de rats ou de lapins, ou encore de poulets. On connaît d'autre part, différents procédés de fabrication de vaccins contre la brucellose, consistant généralement à cultiver différentes souches de Brucella en phase rugueuse ou en phase lisse, ces souches étant ensuite inactivées par du formol ou inhibées par des antibiotiques. Toutefois, on n'a pas, jusqu'à ce jour, utilisé de vaccin bivalent se composant d'une valence antirabique et d'une valeur antibrucellique. En effet, les vaccins contre la rage, qui sont d'une fabrication difficile, exigent des conditions de conservation particulières. On pourrait donc penser que le mélange d'un tel vaccin antirabique avec une valence antibrucellique risquait de compromettre la conservation et l'efficacité du vaccin antirabique. La présente invention a permis de constater, d'une façon surprenante, qu'il n'en était rien, et a donc pour objet un vaccin permettant d'immuniser simultanément contre la fièvre aphteuse et la brucellose, caractérisé par le fait qu'il comporte à la fois une suspension aqueuse d'antigènes antibrucelliques et une suspension aqueuse d'antigènes antirabiques. Suivant une forme de réalisation préférée de ce vaccin les antigènes antibrucelliques sont constitués par des bactéries de souche RENOUX H 38 ou MAC EVEN 45-20 inactivées au formol, ou à l'aide d'un autre antiseptique, ces antigènes étant fixés sur un gel tel qu'un gel d'xydroxyle d'alumine. De préférence, les Brucella inactivées sont soumises à un lavage en vue d'éliminer le formol ayant servi à l'inactivation. n estégalement possible d'utiliser des suspensions aqueuses de Brucella de souche Buck B 19 vivantes ou inactivées. Un vaccin particulièrement stable et efficace peut être réalisé Si l'on utilise une valence antirabique constituée d'un virus de la rage vivant ou inactivé obtenu par culture d'une souche de virus de la rage sur une culture d'une lignée cellulaire NIL ou d'une lignée cellulaire provenant d'un organe de mustlide ou d'une souche cellulaire de diploïde de primate, la culture s'effectuant dans un ou plusieurs milieux liquides de culture successifs dont le dernier au moins est exempt de sérum. Comme milieu de culture, le milieu de culture MAC PHERSON-STORER peut être utilisé. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la phase aqueuse contenant en suspension les antigènes vivants peut être dispersée dans une phase huileuse jouant le rôle d'adjuvant. Cette phase huileuse peut être constituée d'une huile minérale ou végétale peu oxydante telle par exemple que l'huile de paraffine, l'huile d'olive, l'huile d'arachide, l'huile de noyau, ou encore une huile animale telle que la lano linge. Si nécessaire, des anti-oxydants tels que la vitamine E peuvent être ajoutés à l'huile utilisée. La dispersion de la phase aqueuse dans l'huile peut s'effectuer à la manière connue sous forme d'émulsion eau-dansl'huile réalisée à l'aide d'émulsionnants conventionnels tels qu'un ester de propylène glycol et d'acide gras, du mono-oléate de sorbitol, dn mono-oléate de manitol, du mono-oléate de propylène-glycol, etc... Dans un mode de réalisation préféré d'un vaccin ainsi dispersé dans une phase huileuse, l'émulsion huileuse de la suspension aqueuse d'antigènes peut être à son tour dispersée à l'aide d'un émulsionnant de type huile-dans-l'eau dans une autre phase aqueuse continue contenant également des antigènes. On peut ainsi combiner, à l'aide d'une phase huileuse, dont le volume est relativement faible par rapport à celui des deux phases liquides, les avantages présentés par le conditionnement huileux des vaccins et les facilités d'injection des vaccins en phase aqueuse. Dans un exemple non limitatif de préparation d'un vaccin bivalent selon l'invention, on opère de la manière suivante : a) Préparation de la valence brucellique. On réalise une culture en phase lisse de Brucella abortus souche Renoux H 38, ce qui permet d'obtenir une suspense de Brncella ayant une concentration de 900 milliards par ml. Cette culture peut être effectuée sur milieu nutritif solide, ou sur milieu nutritif liquide. On vérifie durant la culture que la souche reste en phase lisse, et l'on élimine, au besoin, les phases rugueuses apparues. Les bactéries sont ensuite inactivées par adjonction de 0,5 % de solution de formol à 40 % que l'on laisse agir pendant une semaine à 37 C. La suspension d'antigènes est ensuite centrifugée puis lavée plusieurs fois à l'eau, ce qui permet d'obtenir- une suspension à une concentration de 900 milliards de Brucella par ml, qui est exempte de traces de formol libre. b) Préparation de la valence rage On procède à l'inoculation à l'aide d'un virus rabique fixe d'une suspension de cellules de lignée NIL placée dans un milieu de culture Mac Pherson-Stoker, et l'on conserve cette suspension dans une étuve à 370cl Après un temps de culture compris entre 48 et 60 heures, on obtient un liquide virulent qui est centrifugé et inactivé par adjonction de ss-propiolactone dilué à 1 pour 4000, que l'on laisse agir pendant 24 heures à OOC, puis pendant deux heures à 37 C. Les suspensions de chacune des deux valences antibrucellique et antirabique sont ensuite isolément dispersées dans une phase huileuse constituée par de l'huile de vaseline Codex et contenant 8 % en poids d'un émulsionnant eau-dans-l'huile constitué par du mono-oléate de sorbitol. Chaque émulsion eau-dans-l'huile s'effectue à raison d'un volume de suspension aqueuse d'antigène pour 2,3 volumes de phase huileuse. Les deux phases huiléuses ainsi obtenues sont à leur tour dispersées dans une même solution aqueuse d'antigène antibrucellique, à raison d'un volume de phase huileuse pour 2,3 volumes de dispersion aqueuse d'antigènes. Cette dispersion s'effectue en réalisant une émulsion huile-dans-l'eau obtenue en ajoutant à la phase aqueuse continue 2 % en poids d'un émulsionnant huile-dans-l'eau constitué par un dérivé polyoxyéthylèné de mono-oléate de sorbitol. On procède ensuite au mélange des deux émulsions huile-dans-l'eau obtenues. Ce mélange peut être effectué par exemple à raison de 3 volumes de valence brucellique et de 2 volumes de valence de la rage. D'après les expériences qui ont été effectuées une inoculation de 10 à 20 ml du mélange ainsi obtenu permet d'immuniser efficacement un bovin contre la brucellose et la ragt REVEND ICAT IONS 1. Vaccin permettant d'immuniser simaltanément contre la brucellose et la rage, caractérisé par le fait qu'il est composé d'une suspension aqueuse d'antigènes antibrucelliques et une suspension aqueuse d'antigène antirabique. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il contient un adjuvant sous forme d'une phase huileuse dans laquelle est dispersée une suspension d'antigènes vivants. 3. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la suspension aqueuse d'antigènes antibrucelliques est réalisée à partir de bactéries de souche Renoux H 38 ou Mac Even 45/20 inactivées au formol. 4. Vaccin selon la revendication précédente caractérisé par le fait qu'il ne comporte pas de formol libre. 5. Vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est constitué par des suspensions d'antigènes dans une phase aqueuse dispersée dans une phase huileuse à l'aide d'un émulsionnant sous la forme d'une émulsion eau-dans-l'huile. 6. Vaccin selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'émulsion huileuse est elle-même dispersée sous forme d'une émulsion huile-dans-l'eau dans une phase aqueuse continue, contenant un antigène. 7. Vaccin selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les phases aqueuses continues et discontinues contiennent chacune un type d'antigène. 8. Vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les antigènes antirabiques sont obtenus par culture d'une souche de virus de la rage sur une culture de cellules choisies dans le groupe constitué par les cultures d'un lignée cellulaire provenant d'un organe de mustélidé ct les cultures d'une souche cellulaire de cellules diploïdes de primates et de lignées cellulaires de type connu sous la dénomination NIL, ladite culture s'effectuant dans un ou plusieurs milieux de culture appropriés dont le dernier, au moins ne contient pas de sérum.