Brevet FR2104761A1 — publié le 19720421

i 2104761 La présente invention concerne un procédé perfectionné pour la préparation d'un antivenin et plus particulièrement la préparation d'une composition d'anfivenin à partir de fractions de globuline obtenues chez des hôtes préalablement hypeirimmunisés. L'invention concerne en particulier la 5 préparation d'antivenins améliorés efficaces contre le venin de serpents venimeux de la famille des crotalidés en général et également contre le venin de la vipère de Malaisie (Ancistrodon Rhodostoma),ainsi que celui de certains serpents du genre Miçrurus,tels que le serpent corail d'Amérique du Nord. 10 Jusqu'à présent, on utilisait largement les antisérums pour s'opposer aux effets nuisibles du venin chez les victimes de morsures de serpents. On. préparait les antisérums à partir du sang de certains hôtes, en particulier le cheval,préalablement hyperimmunisé contre les effets du venin d'une ou plusieurs espèces de serpents. Dans la préparation de ces 15 antisérums, on provoquait chez l'hôte la production des anticorps désirés correspondant aux antigènes d'un venin par inoculation répétée à des doses croissantes de venin jusqu'à ce que l'hôte hyperimmunisé ait acquis une réserve d'anticorps contre le venin. On recueillait alors le sang de l'hôte hyperimmunisé pour 20 l'utilisation dans la préparation d'un sérum antivenin. Dans cette préparation, le sang était d'abord défribiné et on séparait les globules rouges et les autres débris des cellules par agglutination puis centrifugation ou filtration. Le sérum clarifié résultant contient des constituants 25 protéinés ainsi que les anticorps désirés. Ces anticorps sont associés à la fraction de globuline du sérum. Malheureusement, dans la technique antérieure, on ne pouvait pas isoler de manière efficace la fraction de globuline avec les anticorps désirés. On traitait doncles morsures de serpents au moyen du sérum 30 total ou concentré. Cette utilisation, sans élimination des constituants protéinés mentionnés ci-dessus, introduit des problèmes graves associés avec les réponses allergiques chez les individus sensibles. Comme l'administration d'antivenin de serpent est une technique d'urgence, il ne convient pas d'avoir à s'informer sur les sensibilités allergiques de la victime, 35 sans parler du danger d'empoisonnement vis-à-vis du risque potentiel de choc anaphylactique en cas d'allergie soupçonnée. 71 22503 2 2104761 En outrer dans le cas d'un sérum complet qui, à la différence des fractions de globuline, peut entraîner une contamination virale potentielle, il est à conseiller d'éliminer le risque de cette contamination par des moyens tels qu'un traitement thermique avant l'administration. Mais ce traitement 5 thermique peut rendre le sérum visqueux et non homogène, ce qui présente des difficultés si l'on doit faire passer ce produit à travers un filtre bactériologique. On a suggéré de préparer un antivenin comprenant la fraction de globuline du sérum par précipitation de la fraction de globuline du sérum 10 obtenue chez des lapins hyperimmunisés,en utilisant du sulfate d'ammonium ou d'autres sels neutres. On peut séparer ce précipité du reste du. sérum et ensuite le mettre en suspension dans une solution aqueuse. Mais dans cette opération, il s'est révélé nécessaire de disposer de moyens pour séparer le sel ajouté en vue de la remise en suspension de la globuline. Ceci a été 15 réalisé par dialyse de la fraction de globuline avec de l'eau distillée ou du chlorure de sodium en solution aqueuse. Même lorsqu'on l'obtient, 1'antivenin préparé à partir de fractions de globuline isolé par précipitation par un sel a un titre si faible contre le venin que leur utilisation n'est pas utile dans la pratique. Ainsi, on a donc continué à utiliser pour saliver des 20 vies le venin complet ou concentré même avec les risques attenants de réactions allergiques et analogues. L'invention a donc pour objets:un.antivenin ayant un titre élevé; un antivenin de serpent éliminant le risque de réactions allergiques et les dangers de transfert viral chez la victime de la morsure de serpent; et 25 un procédé pour obtenir avec un rendement et une spécificité élevés une fraction de y-globuline contenant des anticorps vis-à-vis du venin de divers serpents; d'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit. La demanderesse a découvert selon l'invention que l'on peut 30 préparer un antivenin de titre élevé en isolant la fraction de globuline des anticorps du sérum clarifié obtenu à partir du sang d'hôtes hyperimmu-nisés par précipitation par l'éthanol. Dans la mise en oeuvre de l'invention, on traite de manière classique le sang d'un hôte approprié qui a été hyperimmunisé contre un 35 certain venin, en suivant les étapes de défibririation, coagulation des globules rouges et clarification ultérieure. On dilue le sérum clarifié résultant par l'eau dans le rapport de 1 à 3 parties d'eau par partie de 71 22503 3 2104761 sérum. La température du mélange résultant est maintenue à -1°C pour éviter la décomposition de la fraction de globuline désirée. On ajoute ensuite une quantité suffisante d'un acide pharmacologiquement acceptable pour ajuster le pH du mélange à environ 7,4-7,8. Ensuite, on agite, de 5 préférence, doucement le mélange pendant au moins 12 h pour assurer la précipitation complète de la fraction de globuline-anticorps, en maintenant constamment la température à 1°C ou moins. On ajoute ensuite suffisamment d'éthanol pour effectuer la précipitation de la fraction globuline-anticorps désirée. Il est préférable de continuer à agiter doucement pendant l'addition 10 de l'éthanol pour assurer la précipitation complète de la fraction désirée et,en outre,que l'éthanol soit ajouté par petites portions plutôt qu'en une seule fois. On notera que la quantité et le mode d'addition de l'éthanol ne sont essentiels que dans la mesure où l'on désire effectuer une précipitation complète du sérum qui a été obtenu et traité par des étapes délicates et 15 longues. Il est donc préférable que l'éthanol utilisé représente environ au moins 66% en volume du sérum dans le mélange lorsque l'addition de l'éthanol est terminée. Ainsi, si chaque volume de sérum a été dilué par 3 volumes d'eau et on utilise comme précipitant une solution aqueuse d'éthanol à 50% en volume dans l'éthanol, on ajoute alors suffisamment de 20 solution d'éthanol pour que le mélange contienne 20% en volume d'éthanol. L'utilisation d'éthanol supplémentaire n'a pas d'utilité pratique. Lorsque cette précipitation initiale est terminée, on sépare le précipité de la liqueur surnageante de n'importe quelle manière appropriée, bien que la centrifugation se 'soit révélée la plus avantageuse. On jette la 25 liqueur surnageante et on recueille le précipité brut de globuline-anticorps. Sans laisser sécher le précipité humide, on le met en suspension dans une solution aqueuse isotonique physiologique à une concentration suffisante pour réaliser la suspension presque totale de la fraction de globuline-anticorps. De préférence, on utilise suffisamment de solution 30 isotonique pour que la concentration du précipité soit d'environ 0,5 à environ 1,0% en poids de la solution isotonique. Comme précédemment, on maintient la température à 1°C ou moins et on ajuste suffisamment d'un acide ou d'une base pour ajuster le pH juste au-dessous de la neutralité et, de préférence, dans la gamme de 4,7-5,1. 35 Les acides pharmacologiquement acceptables que l'on peut utiliser pour ajuster le pH comprennent l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique et les analogues. En général, il est souhaitable 71 22503 4 2104761 d'utiliser des acides, tels que l'acide chlorhydrique, qui forment un sel neutre par neutralisation avec la soude caustique qui est la base préférée. On peut également utiliser d'autres bases, telles que le carbonate de sodium. En général, on peut utiliser avec succès pour ajuster le pH n'importe quel 5 acide ou base comprenant des anxons et des cations que l'on rencontre dans le cycle de Kreb^ Lorsque l'on a ainsi ajusté le pH, la majeure partie de la fracEion de globuline-anticorps est en solution. On filtre ensuite, de préférence, ou on centrifuge le mélange comprenant la fraction de globuline-10 anticorps pour séparer éventuellement les matières insolubles étrangères. On ajuste ensuite le pH de la solution surnageante au voisinage de la neutralité par addition d'une base pharmaceutiquement acceptable. On ajoute ensuite de l'éthanol en agitant doucement lentement ou par petites portions jusqu'à ce que la concentration de la solution soit d'au moins 25% 15 en volume d'éthanol. On recueille le précipité formé en le séparant de la liqueur mère par des moyens appropriés, tels que filtration ou centrifugation. On dissout le précipité ainsi obtenu encore humide dans une solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH voisin de la neutralité et, de préférence, un pH de 7,3. Si on le désire, on peut améliorer les qualités de conservation 20 de la fraction de globuline-anticorps dans la solution saline par addition d'un agent de conservation, tel que le "Thimersol",et d'un stabilisant, tel que la glycine. Si on l'estime nécessaire, on peut faire passer la solution de la fraction globuline-anticorps dans la solution saline tamponnée à travers un filtre bactériologique, tel qu'un filtre de Seitz et la conserver 25 à température réduite ou la congeler pour améliorer ses qualités, de conservation. Ou bien, si on le préfère, on peut lyophiliser la solution globuline-anticorps dans la solution saline pour augmenter sa durée de vie et ensuite la reconstituer avant l'utilisation. Pour l'utilisation, on détermine le pouvoir de la substance, au 30 moyen de dosages par antagprrisme,à des souris auxquelles on a injecté des doses létales de diverses forces. Après détermination du titre, on peut utiliser la substance pour le traitement de la morsure de serpent par injection intramusculaire d'une dose calculée pour neutraliser au moins la quantité de vtëain à laquelle on suppose que la victime a été soumise. 35 L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. 71 22503 5 2104761 EXEMPLE Oïl immunise par le toxoîde de tétanos précipité par l'alun un jeune bouc adulte qui a été mis en quarantaine pendant 14 jours. L'antigène utilisé pour hyperimmuniser le bouc est du venin de vipère de Malaisie ayant une activité de 248 unités/ml. On mélange l'antigène avec un égal 5 volume d'adjuvant de Freund complet et on injecte le mélange antigène- adjuvant en quatre points de chaque patte de derrière de l'animal. Le schéma d'immunisation utilisé est le suivant : 1er jour 10 ml 10 9ème jour 20 ml 19ème jour 30 ml 30ème jour 20 ml Le bouc est ensuite exsanguiné, on recueille le sang et on 15 isole le sérum de la manière habituelle. A 0,5 litre du sérum, on ajoute 1,5 litre d'eau apyrogène froide et on ajuste le pH à 7,6 par HCl 6N. On refroidit le mélange à 1°C et on agite doucement pendant une nuit. Après cette période mûrissage, on ajoute goutte à goutte de l'éthanol à 50% en volume au mélange agité doucement jusqu'à ce que la concentration en éthanol 20 atteigne 20% en volume. Il se forme une faible quantité de précipité que l'on sépare par centrifugation à 4500 tr/mn pendant 30 mn. On recueille le précipité et on le met en suspension dans une solution isotonique physiologique froide préparée à partir d'eau àpyrogène contenant 0,95% en poids de NaCl, jusqu'à une concentration d'environ 0,5 à 1,0%. On ajuste ensuite le 25 pH à 5,1 par HCl 6N. On centrifuge la suspension résultante à nouveau à 4500 tr/mn pendant 30 mn jusqu'à ce que l'insoluble se soit déposé. On ajoute ensuite à la solution surnageante une solution aqueuse diluée de NaOH pour ajuster le pH à 7,3. On ajoute ensuite de l'éthanol goutte à goutte en agitant doucement jusqu'à ce que la solution ait une concentration 30 d'environ 25% en volume. Il se forme une faible quantité de précipité que l'on sépare par centrifugation à 4500 tr/mn pendant 30 mn. On recueille le précipité et on le dissout dans une solution saline tamponnée à pH 7,3 par un tampon en phosphate. 71 22503 6 2104761 REVENDICATIONS 1. Dans un procédé pour la production d'antivenin de serpent dans lequel on précipite une fraction de globuline contenant les anticorps contre un venin de serpent à partir du sérum clarifié obtenu sur un hôte hyperimmunisé, le perfectionnement caractérisé en ce qu'on isole la fraction 5 globuline-anticorps du sérum par précipitation à l'éthanol. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la précipitation à une température de 1°C ou moins. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en suspension un précipité initial de fraction de proétine globuline- 10 anticorps dans une solution aqueuse isotonique physiologique à un pH de 4,7-5,1, en maintenant la température à 1°C ou moins et on ajoute de l'éthanol par portions jusqu'à ce que la précipitation de la fraction globuline-anticorps soit complète et on recueille ladite fraction de globuline-anticorps et on la dissout dans une solution saline aqueuse tamponnée au 15 phosphate. 4. Procédé pour récupérer et isoler une fraction d'antivenin globuline-anticorps d'un sérum clarifié obtenu sur un hôte hyperimmunisé, caractérisé en ce que l'on dilue chaque volume de sérum avec 1 à 3 volumes d'eau, on ajuste le pH à environ 7,4-7,8, on fait mûrir ladite solution 20 ainsi ajustée à une température de 1°C ou moins pendant environ 12 h en agitant doucement, on précipite la fraction d'antivenin globuline-anticorps par l'éthanol, on met en suspension le précipité résultant dans une solution isotonique aqueuse physiologique pour dissoudre la fraction d'antivenin globuline-anticorps à une température de 1°C ou moins, on ajuste le pH à 25 4,7-5,1, on sépare les impuretés indissoutes, on ajuste le pH de la solution contenant la fraction d'antivenin globuline-anticorps au voisinage de la neutralité et on précipite la fraction d'antivenin globuline-anticorps par 1'éthanol. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on 30 met en suspension 1'antivenin globuline-anticorps dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant des agents de conservation et des stabilisants. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on lyophilise ledit antivenin dans la solution saline tamponnée au 35 phosphate.