Brevet FR2059552A1 — publié le 19710604

La présente invention concerne un nouvel antibiotique dénommé janiémycine et son procédé de préparation. Le microrganisme utile pour la préparation de la janiémycine est une souchë de Streptomyces désignée ci-aprèa 5 sous le nom de Streptomyces macrosporeus ATCC 21388. Une. culture de l'organisme vivant a été déposée à la collection de cultures de l1 American 3Jpe Culture Collection (Rockville, Maryland), où elle est disponible. On a attribué à ce microrganisme le n° ATCC 21388. 10 Pour l'isolement et la caractérisation du microrganisme on agite un échantillon de sol dans l'eau distillée stérile et on l'étalé sur une plaque de gélose nutritive contenant 1% de galactose. Le milieu a la composition suivante : Gélose 15 g 15 S accharose 10 g Galactose 10 - g Acide citrique 1,2 g (nh4)2hpo4 0,4 g KC1 0,08 g 20 MgClg , 6H20 0,418 g MnClg , 4H20 0,036 g FeCl-j , 6HgO 0,023 g ZnCl^ , ÔHgO 0,021 g CoCl2 , 6H20 0,004 g 25 Eau distillée qsp 1.000 ml. On ajuste le milieu à pH 7,0 et on le stérilise à l'autoclave à 121°C pendant 30 minutes. Après incubation à 25°C pendant 7 à 10 jours, on isole sur la plaque des colonies de Streptomyces macrosporeus ATCC 21388. On fait ensuite pousser 30 ces colonies dans un milieu de composition suivante : Extrait de viande de boeuf 1,5 g Extrait de levure 3?° g Peptone 6,0 g Dextrose 1,0 g Eau distillée qsp 1.000 ml. Le milieu est passé à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes. 70 27085 2 2059552 10 15 L'organisme appartient à la série à spores gris de Pridham (Pridham, T.G., C.W. Hesseltine et R.G. Benedict. Les spores sont produits en chaînes, sur dés sporophores* formant des spirales primitives à étendues, les spores sont filamenteux et gbbeux à suly-gloteuxcomme le montre l'examen au microscope électronique. Les caractéristiques de culture de Streptomyces macrosporeus ATCC 21^88 sont les suivantes : . , Pas de production de pigment mélanoïde sur gélose peptone-fer ou autres milieux organiques. Le tableau I ci-après illustre quelques unes des caractéristiques de croissance de Streptomyces macrosporeus sur des milieux standards. TABLEAU I Caractéristiques de croissance de Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 Milieu (1) 20 Gélose à la levure-extrait de malt Gélose à la farine d'avoine 7 ,1oure Mycélium aérien blanc tournant au gris. Envers incolore. Pas de pigment soluble '• 14 ,jours Bonne sporulation, grise(2).Envers jaune-brun. Pas de pigment soluble. Croissance mince, incolo- Croissance mince re à frange blanche, centre grisâtre.Envers : incolore. Pas de pigment soluble. 25 Gélose sels minéraux- Mycélium aérien gris amidon. . avec frange. Envers : olivâtre ôlair légère sporulation grisâtre à marge irradiée. Envers vert-jaunâtre clair. Sporulation grise(2) Envers jaune-brun à noir-verdâtre(olivâtre ). . Pas de pigment soluble.' Gélose glycérole-•50 asparaginè pas de sporulation. Envers.incolore. Pas de pigment soluble, Sporulation gris clair(2). Envers incolore à brun-jaunâtre clair. Pas de pigment soluble. (l) - Ces milieux sont des milieux standards utilisés- dans la taxonom.iedes Streptomyces et recommandés par international 35 Streptomyces Project for standardizing culture descriptions, Leur composition est donnée dans "Methods. for Characteriza-tion of Streptomyces Speciés", par E.B. Shirling et D. Gottlieb, International J. Syst. Bacterioi, .16 (3) pages 313-340 1966. 70 27085 3 2059552 (2) -La désignation précise de la couleur est gris-brunâtre clair (63) ISCC-NBS (Kelly, K.L. et D.B. Judd. * The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names." National Bureau of Standards Circular 553, U.S. Department of Commerce (1955)) ou référence de couleur 5 f"e dans le Color Harmony Manual (Fourth Color Harmony Manuai. Container Cor-5 poration of America, Chicago, Illinois, Editeurs s Taylor, H.D., Knoche, L. et Granville, W.C. (1950)). Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 est capable d'utiliser les sources de carbone suivantes, dans les essais classiques selon Pridham et Gottlieb : glucose, mannitol, inositol, 10 xylose, arabinose, rhamnose, fructose, galactose et tréhalose. La croissance n'est pas entretenue par le sorbitol, le raffinose, le mélobiose,le saccharose et le lactose (Pridham, T.G. et Gottlieb, D. Utilization of Carbon compounds by some Actinomycetaies as an aid for species détermination. J. Bacteriology 56, 107-114 (1948)). 15 II hydrolyse faiblement l'amidon, il est moyennement capable d'hydrolyser les protéines et peut hydrolyser le malate de calcium. Le microrganisme réduit les nitrates et supporte le sérum à 9%. Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 produit un 20 antibiotique doué d'activité contre les bactéries. Cet antibiotique a été désigné sous le nom de janiémycine. La janiémycine est une substance basique et forme des sels avec, les acides. On peut citer à titre d'exemples de ces sels les halogénures, les acétates et les sulfates. 25 Pour produire la janiémycine, on fait pousser Strep tomyces macrosporeus ATCC 21388 de préférence à 25°C, en conditions aérobies submergées^ dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrate de carbone assimilable et une source d'azote. On effectue la fermentation pendant environ 144 heures au bout desquelles 30 l'antibiotique s'est formé. Lorsque la fermentation est terminée on ajoute un adjuvant de filtration au bouillon que l'on filtre. On extrait l'antibiotique du gâteau de mycélium par le méthanol. L'antibiotique ne se trouve pas uniquement dans le gâteau de mycélium, 35 mais également dans le filtrat. On extrait donc-le filtrat par le n-butanol saturé d'eau. On concentre sous vide les extraits butanolique et méthanolique,"de manière à obtenir des suspensions aqueuses de chacun d'eux. On les combine et oh extrait par le n-butanol saturé d'eau. On concentre sous vide la couche de 70 27085 4 2059552 jnéthanol jusqu'à un volume minimum et on dilue le concentrât avec au moins 10 volumes d'acétone. Il se foripe un précipité insoluble dans l'acétone que l'on recueille par filtration ou centrifugation puis on sèche sous vide pour obtenir une poudre marron clair amorphe. On peut encore purifier la poudre insoluble dans l'acétone par une distribution à contre courant dans quatre tubes dans le mélange n-butanol-HgO. On retrouve la majeure partie de l'activité dans les phases n-butanol des deux premiers tubes. L'élimination du solvant donne un solide amorphe. On peut encore purifier cette substance par chromato-graphie sur gel de silice en éluant d'abord par le mélange propano 1-butano 1 et ensuite avec le mélange propano-butano 1 *NHij.OH N Ce dernier système"solvant élue en fin de compte la substance active qui est un solide amorphe lorsqu'elle est exempte de solvant On effectue une purification ultérieure par chroma-tographie sur un tamis moléculaire du type polysaccharide vendu par Pharmacia Fine Chemicals, Inc. New Market, New Jersey, sous le nom de Sephadex G-50, dans le diméthylsulfoxyde. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On ensemence des tranches de gélose à la pate de tomate-farine d'avoine avec Streptomyces macrosporeus ATCC 21^88. On incube pendant 10 à 14 jours et ensuite on les utilise pour inoculer 25 ml d'un milieu aqueux à la farine de soja contenus dans des fioles d'Erlenmeyer de 125 ni. La composition du milieu de germination est la suivante : Farine de soja (4S de Staley) 15,0 g Purée de pommes de terre déshy- 15,0 g dratée Glucose 50,0 g CoClg , 2Hg0 0,005 g CaCO^ 10,0 g Gélose 2,5 g Eau distillée qsp 1.000 ml. On stérilise le milieu pendant 50 minutes à 121°C sou 1,05 kg de pression de vapeur. On incube les flacons de germination à 25°C pendant 72 à 96 heures sur une secoueuses rotative fonctionnant à 280 tours/minute avec une course de 5 cm. 70 27085 5 2059552 Conditions de fermentation On effectue un transfert de 5# en volume, du. flacon de germination dans des flacons d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du même milieu utilisé dans le flacon de germination, sauf que la gélosç est supprimée. On incube les flacons de fermentation et on agite comme les flacons de germination. On prélève des échantillons à 4 et 6 jours-. On les examine après séparation du mycélium par centrifugation et extraction du mycélium avec un volume de méthanol égal à celui de la liqueur surnageante. On examine la liqueur surnageante et l'extrait méthanolique par chromatographie sur papier et essai microbiologique. Pour la chromatographie, on dépose des quantités appropriées sur des feuilles de papier Whatman n° 1 et on développe les chromato-grammes avec un système solvant n-butanol-eau-acide acétique, 4:5il en volume. On utilise comme solvant la phase supérieure de ce système solvant. Dans ce système la janiémycine a un Rf de 0,13. On décèle l'antibiotique par bioautographie contre Staphylococcus aureus 209P. Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 dans une cuve en acier inoxydable de 38 litres avec les milieux et les conditions opératoires décrits ci-dessous. 1er stade Inoculum : Culture de Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 conservée par lyophilisation dans le lait et croissance sur une tranche de gélose à la pâte de tomate^-farine d'avoine. On met en suspension la croissance de surface d'une tranche dans 11 ml d'une solution à 0,01# d'un agent antimousse vendu sous le nom de Dupanol et on utilise 3 ml de cette suspension comme source d'inoculum. Exemple 2 On fait fermenter l'eau de 30 litres de culture de Le milieu a la composition suivante : Farine de soja (4s de Staley) Purée de pommes de terre déshydratée Glucose 15,0 g 15,0 g 50,0 g 0,005 g 10,0 g 2,5 .ucose CoClg , 2H20 CaCO-j Gélose Eau distillée qsp 1.000 ml 70 27085 6 2059552 On incube 50 ml de ce milieu dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml pendant 96 heures à 25°C sur une secoueuse rotative fonctionnant à 280 tours/minute avec une couche de 5 cm. gème stade Inoculum s 50 ml de 1®inoculum du prémier stade. Milieu s comme dans le premier stade. On incube 1.000 ml de milieu contenant 1'inoculum dans un ballon de 4.000 . ml pendant 96 heures à 25°C sur une secoueuse alternative fonctionnant à 120 tours/minute avec une course de 5 cm. 3ème stade Inoculum s 2.000 ml de 1®inoculum du deuxième stade. Milieu s Farine de soja (4S de Staley)' j50»0 g Cérélose 20,0 g CaCO^ 10,0 g Agent antimousse (Ucon LB 625) 0,5 g Eau.distillée qSp 1.000 ml. On incube 30 litres du milieu contenant l'inoculum pendant 144 heures, en agitant. On aère également le bouillon à une vitesse superficielle de l'air de 30,5 cm/mn pendant les 12 premières heures et ensuite à 122 cm/mn. On obtient 113 litres de bouillon de fermentation auquel on ajoute 5,6 kg d'auxiliaire de filtration suivant, adjuvant de filtration vendu sous le nom de Hyflo et on sépare la substance insoluble par filtration pour obtenir 6,6 kg de gâteau de mycélium. On extrait le gâteau trois fois avec des portions de 53 litres de méthanol. On filtre le gâteau entre les extractions. On combine les extraits méthanoliques et on concentre sous vide jusqu'à 5 litres pour éliminer le méthanol. On extrait la suspension aqueuse résultante une fois avec 6 litres de n-butanol saturé d'eau et deux fois avec des portions de 2 litres de n-butanol s£uré d'eau. On obtient 92 litres de filtrat que l'on ajuste à pH 7,0 par l'acide chlorhydrique concentré et oh l'extrait trois fois avec des portions de 30 litres de n-butanol saturé d'eau. On combine la couche butanolique (75 litres) avec la couche butanolique (6 litres) obtenues dans l'extraction du gâteau de mycélium. 70 27085 7 2059552 On réunit les fractions de butanol et on concentre sous vide pour séparer le butanol. On extrait à nouveau la substance aqueuse résultante (6 litres) avec une portion de 6 litres de n-butanol saturé d'eau et deux fois ensuite avec 5 les portions de 2 litres de n-butanol saturé d'eau. On réunit les couches butanoliques pour obtenir 10 litres d'extrait butanolique. On concentre cet extrait sous vide jusqu'à environ 2 litres. On ajoute au concentrât butanolique environ 40 litres d'acétone, ce qui provoque l'apparition d'un précipité amorphe. 10 On recueille le précipité par filtration ou centrifugation et on le sèche sous vide jusqu'à poids constant (9,7 g). On dissout 5,55 g de la poudre insoluble dans l'acétone ainsi obtenue (1900 unités de dilution par mg ou du/mg, déterminéespar double dilution en tube avec Staphylococeus 15 aureus 209P) dans un mélange équilibré eau/n-butanol (100 ml de chaque phase) et on la purifie par distribution à contre-courant dans quatre tubes avec phase inférieure en mouvement. Les quantités et activités de substance dans ehaque phase sont les suivantes î Phase Poids Activité (S. aureus n-Butanol, tube 1 0,488 g 5100 du./mg. n-Butanol, tube 2 0,500 g 4200 n-Butanol, tube 3 0,245 g 1100 n-Butanol, tube 4 0,231 g 220 eau, tube 1 0,390 g 8 eau, tube 2 0,738 g 8 eau, tube 3 1,200 g 11 eau, tube 4 ki2Q_S_ 4_ Total 4,982 g 5xl06 du. 3° La substance intéressante est contenue pour la plupart dans les phases butanoliques du premier et du deuxième tubes. Exemple 3 On peut effectuer une purification partielle de la ^ janiémycine par chromatographie sur gel de silice. Par exemple, on dissout dans un mélange n-propanol/n-butanol (2:3) 779 ®g de substance partiellement purifiée par distribution entre solvant, comme à l'exemple 2, et on place la solution sur une 70 -27085 8 2059552 colonne de 200 g de gel de silice imprégnée de ce système solvant. L'élution avec ce système donne 183 mg de substance de faible activité. Une élution ultérieure par le système n-propanol/n-butanol/ NH|jOH N (2:3:4) donne encore 80 mg de substance faiblement active 5 puis 97 mg de substance riche en janiénjycine. On peut avantageusement suivre la chromatographie par lf'absorption de l'effluent à 254 nyu. Exemple 4 On chromatographie la substance riche en janiémycine 10 (76 mg) obtenue dans le procédé décrit à l'exemple 3 dans, le diméthylsulfoxyde sur une colonne de 2,5 x 80 cm garnie d'un tamis moléculaire du type polysaccharide, vendu sous le nom de Sephadex G-50 (fin). On suit l'effluent par l'absorption à 254 nyu et on situe les fractions (environ 1,7 ml par fraction) 15 contenant la substance active par essai sous disque. On trouve à la majeure partie de l'activité dans les fractions 100-132 qui correspondent à un pic dans la courbe d'enregis trement, centré sur la fraction 114. On combine les fractions 100-132 et on évapore à siccLté sous vide pour obtenir 35 mg d'un- solide 20 amorphe ayant une activité de 5*500 du./mg. Exemple 5 On purifie encore la substance riche en janiémycine (175 mg) obtenue par le procédé décrit à l'exemple 4, par chromatographie préparative en couche mince sur gel de silice, 25 élution par le mélange n-propanol/n-butanol/ammoniac N (2:3:4). On recueille une bande à Rf 0,04-0,15 et oh élue l'antibiotique du gel de silice par le même système solvant. On sépare le solvant et oh dissout le résidu dans le diméthylsulfoxyde. L'addition de méthanoi précipite l'antibiotique. La. reprécipita-30 tion comme précédemment donne 40 mg de solide amorphe après séchage sous vide. La substance préparée de cette manière a une activité de 5*000-6.000 du./mg. Analyse : C. 47 49 % H. 5,30 % N. 13,Q7 % UV: A max dans le diméthylsulfoxyde aqueux à 99#; 239 et 272 nyu. UV: \ max dans l'ammoniaque 0,15 N (pH*»8) 253 nyu. Rf (papier filtre Whatman n° 1, système n-butanol-acide acétique eau 4:1:5) 0,13. Rf (papier filtre Whatman n° 1, système n-butanol-pyridine-eau 4:3:7) 0,85. 70 27085 9 2059552 Le spectre infrarouge de la Janiémycine est représenté à la figure unique du dessin annexé. L'électrophorèse à pH 3,3 en présence de formamide à 30 # sépare trois constituants antibiotiques. On calcule des 5 mobilités en électrophorèse en utilisant la safranine 0 comme - indicateur cathodique et l'Apalon comme indicateur électroosmo-tique, de + 85, + 44 et + 12 pour les trois constituants. Exemple 6 On effectue des essais de double dilution en tube 10 avec plusieurs microrganismes. L'antibiotique utilisé dans cette étude a une pureté équivalente à la substance obtenue à l'exemple 4 (fractions 100-132). On détermine ainsi les concentrations inhi bitrices minimales. On obtient les résultats suivants : Microrganisme CIM M/ml) ^ Staphylocoecus aureus 209P 0,12 Streptococcus pyogenes C203 0,01 Baclllus subtilis ATCC 6633 0,2 Sarcina lutea ATCC 9341 0,16 Diplococcus pneumoniae Type 3 ATCC 6303 0,12 20 Escherichia coli ATCC IO536 >100 Candida alblcans CBS 35H >100 Mycobacterium tuberculosis BCG 30*5516 ^ 25,0 Trichomonas vaginalis SC 8560 >25,0 gp. x Culture Squibb Exemple 7 On injecte par voie intrapéritoniale à des souris des doses de 1000 DL^Q de Streptococcus pyogenes C203, et on administre l'antibiotique par voie sous-cutanée 1 heure et 5 heures après l'infection. L'antibiotique utilisé dans cette étude est équivalent en pureté à la substance obtenue à l'exemple 4 (fractions 100-132). Il suffit d'une dose d'environ 0,5 mg./kg de la préparation d'antibiotique pour protéger 50 % des souris contre la mort. 70 27085 10 2059552 REVENDICATIONS, 1. Procédé pour la production d'un antibiotique dénommé janiémycine et de ses sels, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 dans un milieu nutritif aqueux comprenant un hydrate de carbone assimi- 5 lable et une source d'azote organique assimilable en conditions aérobies submergées jusqu'à ce que le milieu contienne une activité antibiotique notable. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive la souche aux environs de la température ambiante. ~10 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on poursuit la culture pendant plusieurs jours. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on cultive la souche à environ 25°C. 5. Nouvelle substance antibiotique dénommée janiémycine, . 15 caractérisée en ce qu'elle possède les propriétés suivantes : ;y- a) analyse élémentaire C 47,49 % H 5,30 % N 13,5 % ' * b) spectre I.R. tel que représenté sur la figure unique du dessin ... annexé c) Rf environ 0,13 dans le système n-butanol-acide acétique-eau 4:1:5 20 d) Rf environ 0,85 dans le système n-butanol-pyridine-eau 4:3:7 e) elle est composée de 3 constituants antibiotiques ayant des mobilités électrophorétiques de + 85, + 44 et + 12, avec la Safranine 0 comme indicateur cathodique et l'Apalon comme indicateur électroosmotique 25 f) spectre UV en solution neutre, maxima à environ 239 et environ 272 nyu g) spectre UV en solution basique, maximum à environ 253 nyu. 6. Compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédient actif l'antibiotique selon ■50 la revendication 5 ou un d® ses sels d'addition d'acide. 7. Formes pharmaceutiques appropriées pour l'administration des compositions selon la revendication 6.