Brevet FR2103394A1 — publié le 19720414

. 1 • 2103394 La présente invention concerne une substance antibiotique - et des procédés pour sa production. La kanamyeine est un antibiotique obtenu par fermentation et dont l'utilité est bien établie pour le traitement des mala-5 dies infectieuses. Il a été cliniqueraent et expérimentalement démontré que la kanamyeine est un antibiotique intéressant et efficace pour le traitement d'infections provoquées par des bactéries Gram-positi-ves» des bactéries Gram-négatives et des myeobaetéries elle est médicalement malcommode et n'élimine pas complètement la gêne, puisque, même alors, le volume du médicament est important et que la viscosité de la solution rend difficile l'écoule-25 ment dans une seringue et la dissipation dans les tissus. Par conséquent, il est fortement nécessaire de mettre au point une forme nouvelle et plus soluble de kanamyeine qui permette la formulation de doses thérapeutiquement efficaces sans qu'on se heurte aux problèmes rencontrés jusqu'à présent de solubilité et 30 de viscosité. Les buts de la présente invention sont de proposer : - des sels de kanamyeine ayant de meilleures caractéristiques de solubilité et de viscosité ; - un sel de kanamyeine pouvant servir à l'obtention de for-35 mulations ou de compositions à divers niveaux de pH sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des additions séparées d'un acide pour ajuster le pH } 71 30007 2 2103394 - un procédé pour préparer des oM.orhydrat.es cristallins de kanamyeine, qui sont des sels comportant 1 à 4 moles d'acide • . - «k chlorhydrique par mole"de kanamyeine base ; - des compositions ou formulations thérapeutiques de kana™ 5 mycine ayant de meilleures caractéristiques de viscosité. La Demandere s s a visât de trouver que l'on peut préparer des compositions ou f©xïmUations thérapeutiques de la kanamyeine en utilisant du chlorhydrate cristallin .de kanamyeine, et que ces formulations ont de meilleures caractéristiques de solubilité et 10 de viscosité qui, les rendent extrêmement intéressantes et utiles pour le traitement^ en particulier par administration hypodermique ou parentérale,- de maladies infectieuses. P»t exemple, l'équivalent thérapeutique d'une dose de 2 g de Kanamyeine base, qui né-oessite un volume d'environ 6 ml d'eau lorsqu'on effectue l'ad-15 ministration sous forme du sulfate, peut être administré sous forme du tétrachlorhydrate dans un volume d'environ 4 ml, ce qui réalise une diminution de volume d'environ un tiers. La kanamyeine, antibiotique apparenté ou générateur, est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique M-0 2 931 798. 20 Ce brevet précité décrit la préparation par fermentation des deux formes, A et B, de kanamyeine. La Demanderesse vient de trouver que l'on peut préparer et récupérer la kanamyeine sous forme d'un sel cristal]in dérivant de l'acide chlorhydrique, et ayant un degré choisi de neutralisa-25 tion. Les formes cristallines des chlorhydrates salins de kanamyeine se caractérisent par de meilleures propriétés physiques et chimiques, comme par exemple la solubilité et la pureté et ces formes conviennent donc particulièrement bien pour servir dans le domaine médical* 30 En gros, on prépare les divers chlorhydrates salins de la kanamyeine à partir d'une solution de kanamyeine base. Cette solution n'est pas nécessairement une solution pure, mais il peut s'agir d'une suspension dans laquelle la phase liquide contient un peu de kanamyeine en. dissçlution. On ajuste ensuite à 1laide 35 d'acide chlorhydrique le pH de la solution oontenant de la kanamy-cine jusqu'au pH naturel du composé particulier que l'on doit précipiter. 71 30007 3 2103394 On peut préparer les chlorhydrates salins de la kanamyeine sous forme d'un monochlorhydrâte, d'un dichlorhydrate, d'un tri-chlorhydrate ou d'un tétrachlorhydrate en mettant la kanamyeine "base en suspension dans de l'eau et en ajoutant de l'acide chlo-5 rhydrique jusqu'à un niveau de pH correspondant à la neutralisation successive des groupes amino de la kanamyeine "base. En portant le pH du mélange à une valeur d'environ 4» on assure une neutralisation complète des groupes amino» On prépare le trichlop-hydrate , à un pH d'environ 6,4-6,5» cependant que l'on forme le 10 dichlorhydrate et le mono-chlorhydrate salins à an pH d'environ 7,2-7*4 et 8,1-8*3î respectivement. Par conséquent» on forme les chlorhydrates respectifs en ajustant le pH de la solution au pH naturel du composé voulu et en précipitant ensuite le sel voulu. On peut obtenir le produit cristallin, qui est soluble dans 15 le milieu aqueux où. il est formé, par précipitation et cristallisation par des techniques classiques. On peut ajouter à la solution des solvants miscibles à l'eau afin de réaliser un état avoir-sinant la sursaturation .. On peut utiliser n'importe quel solvant miscible à l'eau et dans lequel le chlorhydrate de kanamyeine 20 est relativement insoluble. Comme exemple de tels solvants, on peut citer le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le diméthylformamide, le n-butanol, l'iBopropanol, etc., et aussi des mélanges de ces solvants. On ajoute lentement le solvant à la solution aqueuse à une 25 température comprise entre le voisinage de la température ambiante et le point d'ébullition du solvant, de préférence jusqu'à une température d'environ 60°C. Selon les conditions de température, de choix du solvant, de vitesse d'addition, etc., le précipité va se former sous forme de la matière cristalline ou sous forme d'un 30 semi-solide analogue à une huile qui se transforme spontanément en la forme cristalline lorsqu'on le laisse au contact du solvant surnageant. On a trouvé que l'utilisation de températures légèrement élevées facilite la formation des cristaux. En gros, les températures auxquelles on peut former les sels peuvent se situer 35 entre environ 20°0 et environ 60°C, selon le choix du solvant, et de préférence entre 20°C et environ 50°C. 7T 30007 4 2103394 La formation des cristaux peut /être facilitée par l'addition de cristaux d'ensemencement du chlorhydrate salin voulu à la solution avant que ne commence la précipitation. Pour précipiter le chlorhydrate, on ajoute le solvant de 5 précipitation en une quantité suffisante pour obtenir une récupération pratiquement totale de la kanamyeine base présente. Des rapports appropriés entre l'eau et le solvant ne présentent pas un caractère étroitement critique, pourvu que l'on excède la solubilité du sel dans le mélange eau-solvant. Il a été trouvé que 10 l'on peut efficacement précipiter du chlorhydrate de kanamyeine à partir d'un mélange eau-isopropanol lorsque le rapport entre l'eau et l'alcool est d'environ 1:10, et à partir d'un solvant comprenant de l'eau, du méthanol et On illustre l'amélioration des caractéristiques de solubilité et de viscosité du chlorhydrate de kanamyeine en comparant le débit d'écoulement et l'aptitude à s'écouler dans une seringue dans le cas de diverses compositions ou formulations. On formule 20 trois solutions de kanamyeine de façon à fournir une dose normalisée d'environ 525 mg d'activité de kanamyeine base par ml de solution à pH 4,0. On prépare la première solution en mettant du sulfate de kanamyeine en suspension dans de l'eau et en ajustant le pH à 4»0 à l'aide d'acide ohlorhydrique concentré. On prépare 25 la seconde solution, en dissolvant simplement des cristaux de té-trachlorhydrate de kanamyeine dans de l'eau. Le pH naturel de la solution résultante est de 4,0. On prépare la troisième solution en mettant du sulfate de kanamyeine en suspension dans de l'eau et en ajustant le pH à 4,0 à l'aide d'acide sulfurique. On dé-30 termine la viscosité en mesurant le temps d'écoulement depuis la marque 0 jusqu'à la marque 4 ml d'une pipette de 5 ml. On détermine l'aptitude à l'écoulement dans une seringue en remplissant une seringue hypodermique par une aiguille H0 22. Les résultats obtenus sont présentés au tableau I ci-après. 71 30007 5 2103394 TABLEAU I Yiscosité (temps d'écoulement) Aptitude à l'écou lement dans une aeri ngge 5 (1)6 secondes ; 6 secondes } 6,5 secondes Difficile de remplir une seringue _(2) 4>5 secondes ; 4»5 secondes ; 5,0 se- S'écoule facilement condes (3) 25 secondes ; 27 secondes ; 25,0 se- Ne s'écoule pas -10 condes trop visqueux Seule la seconde solution a une visoosité assez faible pour pouvoir servir de solution injectable au niveau d'activité voulu. Des essais en vue de former des sels similaires avec l'acide phos-phorique, l'acide acétique et l'acide citrique ont donné des ré-15 sultats négatifs ®n raison de la faible solubilité et/ou d'une viscosité élevée. Les sels cristallins de kanamyeine sont facilement solubles dans l'eau et, par dissolution dans l'eau, ils fournissent des solutions qui ont un pH caractéristique du soluté particulier. 20 Par exemple, lorsqu'on dissout le tétrachlorhydrate salin dans de l'eau à la concentration d'utilisation, c'est-à-dire à environ 500 mg d'activité par ml de solution, le pH est d'environ 4-4,2. Il a été trouvé que le pH ne varie pas beaucoup lorsque la concentration passe d'environ 100 à environ 500 mg d'activité par ml 25 de solution. De façon similaire, le trichlorhydrate, le dichlorhydrate et le monochlorhydrate sont des sels qui donnent dès solutions ayant un pH d'environ 6,6 ; 7,3 et 8,3, respectivement. Par commodité, on désignera ci-après une solution ayant une 30 activité d'environ 500 mg de kanamyeine base par ml comme étant une solution normale. On a identifié les cristaux de tétrachlorhydrate par diverses techniques et notamment par analyse à l'aide de rayons X. Le spectre suivant de diffraction de poudre a été obtenu en utilisant 35 le rayonnement de Ou avec un filtre de nickel dans un appareil Général Electric pour l'étude de la diffraction des poudres ; dans cet appareil, l'échantillon de poudre est contenu dans un tube capillaire de 0,5 mm. Le tableau II ci-après présente, dans le cas du tétrachlorhydrate de kanamyeine, les intensités relatives 40 des raies du spectre de diffraction des rayons X et les distances 71 30007 e 2103394 o d entre plans réticulaires"(en A) obtenues à partir des distances entre les raies. TABLEAU II ; Distance entre plans réticulaires Intensités relatives [I d (A) I/I, 10,0 0,30 8.2 0,30 7.3 • 0,90 6,75 0,50 10 6,40 0,30 5,85 0,50 5,5 0,50 5,3 " 0,25 5,0 0,30 15 4,75 0,40 4,25 0,70 4,0 0,50 3,75 1,00 3,60 0,20 20 3,50 0,40 3.2 0,40 Bande 3.0 0,30 2,77 0,25 2,70 0,10 25 2,63 0,30 2,55 0,10 2,48 0,10 2,43 0,30 2,38 0,30 30 2,3 0,20 Bande 2,24 . 0,20 Bande 2.1 0,10 Bande 2.03 0,30 1,89 - 0,20 . . - 35 1,87 0,20 1,82 0,10 1,77 0,10 Bande 7î 30007 7 2103394 TABLEAU II (Suite) 10 15 Distance entre plans réticulaires 1,70 1,68 1,64 1,61 1,57 1,54 1,52 Le tableau III suivant présente des propriétés physiques caractéristiques du tétraohlorhydrate de kanamyeine préparé comme décrit dans le présent mémoire. Le tableau IV présente les activités, titrées ou estimées, pour 4 lots de tétrachlorhydrate de kanamyeine. TATVIÏBATT TTT Intensités relatives iAi 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 20 Lot pH à 25°C 20 mg/ml Point de fusion (décomposition) Solubilité dans H20 à 25°C Couleur 1 4,1 215°C 2 g/jflil Blanc crème 2 4,0 215°C 2 g/ml Blanc crème 3 4,0 215°C 2 g/ml Blanc crème 4 4,0 215°C 2 g/ml Blanc crème TAflTVBATT TV 25 Titrage de 1*activité du tétrachlorhydrate de kanamyeine Lot Titre estimé Résultat du titrage 1 730 mig*/mg 725 mig/mg 2 730 mig/mg 725 mig/mg 30 3 730 mig/mg 730 mig/mg 4 730 mig/mg 735 mig/mg * mig : microgramme. Ces lots de tétraohlorhydrate de kanamyeine se caractérisent comme étant des cristaux en forme de bâtonnets ayant une rotation 35 optique de : 71 30007 8 210.3394 [o]j5 = 108,3" et ayant un poids moléculaire théorique de 626,5» On a trouvé que le tétrachlorhydrate de kanamyeine présente chez les souris une toxicité (dose léthaïe moyenne ou DL^q) qui 5 est comparable à la toxicité du sulfata de kanamyeine. On prépare du tétrachlorhydrate cristallin de kanamyeine en dissolvant 200 g de kanamyeine base dans un mélange de 130 ml d'acide chlorhydrique concentré et 100 ml d'eau® A la solution ré-10 sultante, on ajoute environ 15 g de charbon actif, et l'on agite doucement le mélange à 37°C pendant 30 minutes environ. On ajoute ensuite 330 ml de méthanol au mélange et l'on sépare le charbon par filtration. On obtient une solution limpide que l'on chauffe à 50°C environ et l'on ajoute 330 ml d'isopropanol à la solution. 15 On laisse la solution se refroidir lentement en l'agitant périodiquement jusqu'à achèvement de la cristallisation. On sépare par filtration le précipité cristallin et on le sèche sous vide à 40°C. Le rendement est de 230 g (93,3 $ de la théorie) d'une matière cristalline qui donne une solution ayant un pH de 4,2 par 20 dissolution dans l'eau à une concentration suffisante pour fournir environ 500 mg d'activité de kanamyeine base par ml de solution, c'est-à-dire une solution normale. Exemple 2 On prépare du dichlorhydrate cristallin de kanamyeine en 25 dissolvant 30 g de kanamyeine base dans 20 ml d'eau. A la solution résultante, on ajoute 9,76 ml d'acide chlorhydrique concentré, lentement at en agitant. On ajoute 50 ml de méthanol à la solution que l'on filtre ensuite. Après sa filtration, on chauffe la solution à 50°C. On chauffe à 50°C, 50 ml d'isopropanol et l'on ajoute 30 lentement cet alcool à la solution filtrée tout en agitant. On continue à agiter durant 10 minutes. On place la solution résultante dans une pièce glacée durant 2 heures, au bout desquelles la cristallisation est quasi totalement aohevée. Après l'avoir conservé durant 16 heures environ à 4°0 environ, on sépare le produit 35 cristallin par filtration et on le sèche à 40°C sous vide. Cette manière donne une solution ayant un pH de 7,3 par dissolution dans de l'eau à une concentration suffisante pour fournir une solution 7;1 30007 9 2103394 normale. L'analyse de teneur en chlorure indique 1.1,89 # à 12,07 % (la teneur théorique est de 12,6 #). Exemple 3 On prépare du triehlorhydrate de kanamyeine en mettant envi-5 ron 30 g de kaiisaiyniae base en suspension dans 15 ml d'eau et en y ajoutant lentement environ 14,65 ml d'acide chlorhydrique concentré o Après dissolution de la totalité d© la kanamyeine, on ajoute 50 ml de méthanel à la solution, et l'on filtre la solution pour enlever les débris éventuels. Après la filtration, le chlo-10 rhydrate de ka^amyolne commence à former des cristaux. On sépare les cristauxs on leg lave avec 30 ml environ de méthanol et on les sèche sous video L© rendement est de 31,2 g de cristaux en forme de bâtonnets0 Par dissolution dans l'eau à la concentration donnant une solution normale, les cristaux donnent un pH de 6,6. 15 L'analyse des eristaux indique une teneur de 9,12 % d'azote et 15,45 i° de chlorure. Les teneurs théoriques en azote et en chlorure du trichlorhydrate de kanamyeine (sous forme du monohydrate) sont de 9» 20 On obtient le monochlorhydrate salin de kanamyeine en mettant environ 30 g de kanamyeine base en suspension dans 30 ml d'eau et en y ajoutant 4,88 ml d'acide chlorhydrique concentré tout en maintenant entre 20°C et^0°C la température du mélange réactionnel. On ajoute ensuite/50 ml de méthanol à la solution résultante. On 25 agite le mélange durant 5 minutes, puis on le filtre. On ajoute à la solution filtrée un mélange de 50 ml de chlorure de méthylène et de 80 ml d'isopropanol, et l'on chauffe le mélange résultant sur un bain-marie bouillant, en agitant, jusqu'à une température d'environ 60°C à laquelle oommence la oristallisa-30 tion. On retire le mélange du dispositif de chauffage, on le laisse refroidir et cristalliser. On chauffe à nouveau la solution à une température de 50°0-60°C et l'on ajoute lentement 20 ml d'isopropanol. On laisse ensuite la solution reposer à la température ambiante durant 15 35 heures environ. Puis on la filtre, on lave les cristaux au méthanol, et. on les sèche sous,.vide-pour obtenir 24,8 g d'un produit formé dé petits csristaux. aciculaires. Un titrage biologique montre que 7T 30007 10 2103394 le produit a une activité de 890 microgrammes/mg. Par dissolution dans l'eau, le produit cristallin donne un pH de 8,3. L'analyse chimique du produit indique une teneur de 10,74 % d'azote et 7,20 tfo de chlorure, à comparer avec les valeurs théo-5 riques de 10,65 i° et 6,73 tf°t respectivement. Exemple 5 On prépare également le tétrachlorhydrate de kanamyeine en mettant de la kanamyeine hase en suspension dans de l'eau et en ajustant le pH de la suspension à 4,0 à l'aide d'acide chlorhydri-10 que concentré. On prélève des portions aliquotes, de 2 ml chacune, de la solution résultante et on les place dans une série de tubes. On utilise des solvants miscibles à l'eau pour obtenir un volume final de 12 ml à 14 ml. On forme des cristaux de tétrachlorure de kanamyeine avec les solvants suivants : éthanol, acétone, diméthyl-15 formamide, n-butanol et isopropanol. L'analyse des cristaux dans l'infrarouge correspond bien à ce qu'on attend du produit voulu. Exemple 6 On prépare une composition thérapeutique en mélangeant 70 ml d'acide chlorhydrique concentré avec 30 ml d'eau. On refroidit le 20 mélange résultant jusqu'à 25°C environ et l'on mélange avec 0,20 g d'acide citrique anhydre, 0,135 g de p-hydroxybenzoate de méthyle et 0,015 g de p-hydroxybenzoate de propyle. On maintient la température de la solution entre 20°C et 30°C tout en y ajoutant de la kanamyeine base. Lorsqu'on a ajouté environ 90 g de kanamyeine 25 base, on ajoute 0,99 g de méta-bisulfite de sodium, puis on ajoute le reste de kanamyeine base (soit au total 115 g de kanamyeine base). On ajuste le pH de la solution résultante à 4,5 et l'on complète le volume à 200 ml. On filtre ensuite la solution et on la conditionne en des lots de 4 ml. 30 La quantité de kanamyeine base que l'on utilise comprend un excès d'environ 5 $ en se fondant sur une activité de 910 micro-grammes/mg. Exemple 7 On prépare une composition thérapeutique en dissolvant 0,102 g 35 de p-hydroxybenzoate de méthyle, 0,0113 g de p-hydroxybenzoate de propyle, 0,15 g d'acide oitrique anhydre et 1,5 g de chlorhydrate de xylocaine dans 55 ml d'eau. A la solution résultante, on ajoute 71 30007 n 2103394 0,75 g de métabisulfite de sodium et 108 g de tétrachlorure cristallin de kanamyeine. On ajuste le pH de la solution à 4,5 avec une solution normale d'hydroxyde de sodium, et l'on complète à 150 ml le volume par addition d'eau désionisée. 71 30007 12 2 T 0 3394 REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer des chlorhydrates de kanamyeine qui sont des sels cristallins, caractérisé en ce qu'on dissout la kanamyeine dans de l'eau, on ajoute de l'acide chlorhydrique à la 5 solution pour ajuster/Le pH de la solution au pH naturel du chlorhydrate choisi, on précipite le sel choisi, et l'on récupère ce sel. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on précipite le sel choisi en ajoutant, à la solution ajustée à une 10 température comprise entre 20°C et 50°0, un liquide miscible à l'eau et dans lequel le sel choisi est insoluble» 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on précipite le chlorhydrate salin ohoisi, en ajoutant à la solution un solvant exerçant un effet de précipitation et qui est choisi 15 dans le groupe constitué par le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le diméthylformamide, le n-butanol, 1*isopropanol et leurs mélangea. 4. Chlorhydrates cristallins de la kanamyeine. 5. Tétrachlorhydrate cristallin de la kanamyeine, caractérisé en ce qu'il présente dans l'eau une solubilité d'environ 2 g/ml 20 et en ce que son spectre de diffraction des rayons X présente des raies ayant les intensités relatives ci-après et permettant de O calculer les distances entre plans réticulaires (en A) indiquées ci-après : Distance entre plans réticulaires Intensités relatives 25 d (A) lAi 10,0 0,30 8,2 0,30 7,3 0,90 6,75 0,50 30 6,40 0,30 5,85 0,50 5,5 0,50 5,3 0,25 5,0 0,30 35 4,75 0,40 4,25 0,70 4,0 0,50 3,75 1,00 71 30007 ■ 13 Distance entre plans r^miia-tr*a d (A) 3.60 3,50 3?2 3.0 2,77 2,70 2 ? 63 2,55 2,48 2,43 2,38 2,3 2,24 2.1 2,03 1,89 1,87 1,82 1,77 1,70 1,68 1,64 1.61 1,57 1,54 1 *52 2103394 Intensités -ralati-gaa m± 0,20 0,40 .. 0,40 Sande 0,30 0,25 0,10 0,30 0,10 0,10 0,30 0,30 0,20 Bande 0,20 Bande 0,10 Bande 0,30 0,20 0,20 0,10 0,10 Bande 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10