Brevet FR2068515A1 — publié le 19710827

La présente invention concerne la préparation de lignées cellulaires, la culture de virus dans ces cellules,et des vaccins contenant ces virus. En raison des difficultés qui accompagnent l'utilisation de 5 cultures primaires pour le développement de virus, ainsi que du coût élevé de ces cultures et de leur sensibilité limitée, le développement de nouvelles lignées cellulaires destinées à être utilisées dans la recherche médicale et pour la production de vaccins a fait l'objet de recherches considérables. Les lignées 10 cellulaires qui ont été découvertes sont nombreuses, mais elles se prêtent en nombre relativement restreint à une utilisation autre que dans la recherche, en raison de leur tendance à l'insta-bilité et du développement de caractéristiques indésirables. La Demanderesse vient de découvrir qu'il est possible, en 15 utilisant une technique soigneusement réglée, de produire une nouvelle lignée cellulaire à partir de foie d'embryon humain, qui peut être euxoivée en série et qui offre l'avantage d'être du'type diploïde. Pour produire une lignée cellulaire de foie d'embryon humain 20 conformément à l'invention, on désagrège du foie d'embryon humain, on met les cellules en suspension dans un milieu de culture, on remplace ce milieu par du milieu frais lorsqu'il devient acide, et on laisse se former une nappe confluente de cellules fusiformes de la lignée cellulaire. 25 On désagrège tout d'abord les cellules de foie qu'on se pro pose de cultiver. Un moyen pratique d'y parvenir consiste à procéder par trypsinisation, le traitement avec une solution de tryp-sine étant de préférence conduit à environ 20°C et en deux ou trois cycles de trypsinisation. La trypsine pèut ensuite être 30 inactivée, par exemple par addition de sérum de foetus de veau, et on lave deux fois la suspension cellulaire dans le milieu de culture en procédant à une légère centrifugation à basse ^températures. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu de croissance dont la base est de préférence le milieu essentiel minimal. 35 de Eagle, qu'on combine avantageusement avec environ 10 à 15 % de sérum de foetus de veau inactivé à la chaleur, en incorporant divers additifs. Le procédé préféré de culture de la suspension de cellules (population mixte) dans le milieu de croissance consiste à placer des échantillons égaux de la suspension dans des tubes 70 3081.1 2 2068515 de Leighton munis d'une lamelle couvre-objet et à les faire incuber à environ 35°C. le milieu de culture est de préférence remplacé lorsque son pH devient acide» ce que l'on fait habituellement tous les 3 ou 4 jours® Il suffit d'habitude d'une période 5 de 5 à 7 jours pour que la nappe eonfluente de la nouvelle lignée cellulaire se forme, cependant que d'autres cellules initialement présentes ne parviennent pas à survivre. En suivant soigneusement le mode opératoire, il est possible d'obtenirs d'une eanière reproductible, la nouvelle lignée 10 cellulaire qui a été déposée au Département de Contrôle des Pro-. duits Imnnmologiques du Conseil de Recherche Médicale, "Médical Research Council's Division of Immunologieal Products Control", Hampstead, Londres et dans la collection A.I.C.C. sous le numéro matricule CL99. La lignée cellulaire présente les caractéristiques 15 suivantes : 1. Elle forme des couches monocellulaires de cellules fu-siformes qui peuvent être traitées en sous-culture et qui se prêtent à plusieurs passages» Un substrat de collagène n'est paa requis . , 20 2. Il n'y a pas d'hépatocytes ni de cellules dérivées de la série hématopoïétique. 1"examen au microscope électronique montre que les cellules ne sont pas des fibroblastes. 4. L'étude chromosomique des cellules montre qu'elles sont 25 diploïdes. 5. La suspension de cellules peut être conservée dans de 1'azote liquide. Lfinvention .concerne également un système de culture de cellules comprenant des cellules de la lignée cellulaire d'embryon 30 humain dans un milieu nutritif qui- convient pour la croissance ou la conservation de cellules de mammifères dans une culture de tissu. 11 est possible d'utiliser la nouvelle lignée cellulaire pour la culture d'une grande variété de virus comprenant les adé-35 no-virus, par exemple des types 2, 3, 4, 5, 7 et 17, les virus de San Carlos, par exemple des typés 3, 6', 8 et'49, lés ECHO-virus, par exemple du type 11, les ARBO-virus du groupe A, par exemple le virus de Sindbis, les virus de la variole, par exemple le virus vaccinal, des myxovirus et des paramyxovirus, par exemple les vi 70 30813 3 2068515 rus de la grippe tels que le virus A2 de la grippe (type A2/Sin-gapour/1/57), les Pi corna -virus, par exemple les virus de la poliomyélite tels que le polio-virus de Satin du type 1, et l'hémo-virus AR-17 (isolé par Parke Davis and Co.). On envisage en ou-5 tre, l'utilisation de la ligne cellulaire pour la multiplication d'ARBO-virus et de certains autres virus RUA, ainsi que d'un représentant du groupe du virus de l'herpès et d'autres virus DIJA. Ainsi, du sérum humain obtenu de volontaires et contenant à coup sûr le virus infectieux MS1 de. l'hépatite, a été inoculé à un 10 système de culture comprenant des cellules de la lignée cellulaire, et les résultats indiquent la production d'un effet cytopatholo-gique analogue à l'effet cytopathologique produit par 1*hémovirus AR-17 qui peut être cultivé dans ce système, l'utilisation de la nouvelle lignée cellulaire pour la culture de ce type de vi-15 rus de l'hépatite, entre autres, est donc envisagée conformément à l'invention et offre un intérêt particulier du fait qu'on a é-choué jusqu'à présent dans la recherche de cellules qui conviennent pour la culture de ces virus. Par conséquent, il y a lieu de remarquer que la présente 20 invention concerne également un procédé de culture de virus, qui consiste à maintenir une culture viable de cellules dérivées de la lignés cellulaire de foie d1 embryon humain dans un milieu nutritif de culture, à inoculer la culture avec*"un virus auquel les cellules sont sensibles et à cultiver le virus dans le milieu. 25 les cellules peuvent être cultivées de toute manière pratique et le milieu nutritif utilisé pour la croissance de nombreux virus peut être avantageusement le même que le milieu décrit jusqu'à présent pour le développement de la lignée ce! 1 ni aire. Toutefois, d'autres virus peuvent nécessiter un milieu nutritif différent, 30 pour donner une croissance satisfaisante. Il y a lieu de remarquer que la production de vaccins entre également dans le cadre de la présente invention. Pour produire des vaccins correspondants à partir de virus cultivés conformément à l'invention, il est nécessaire de traiter ensuite les vi-35 rus au moyen de procédés connus. Ainsi, on peut cultiver un virus pour obtenir un produit final antigénique qui peut être incorporé dans un vaccin sous une forme posologique se prêtant à l'administration, et que l'on peut aussi utiliser pour produire des anticorps destinés à l'immunisation passive. Des virus développés sur 70 30813 4 2068515 la nouvelle lignée cellulaire peuvent être utilisés pour produire des vaccins vivants, morts ou atténués en fonction de la nature du virus lui-même, les vaccins peuvent être formulés dans divers milieux, et on utilise habituellement une solution saline isoto-5 nique, éventuellement en combinaison avec divers additifs, par exemple des agents tampons, les vaccins peuvent être administrés par diverses voies parentérales, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée. l'invention est illustrée par les exemples suivants: 10 Exemple 1 : Production de la lignée cellulaire Des foies d'embryons humains obtenus sur des foetus âgés de 10 à 22 semaines, dégagés par hystérotomie abdominale, sont traités avec une solution à 0,2 ^ de trypsine à une température de 20°G pendant 20 minutes. On effectue deux à trois cycles de tryp-15 sinisât ion, la trypsine est inactivée par addition de sérum de foetus de veau, înactivé à la chaleur, de manière à obtenir une concentration finale de 20 la suspension cellulaire est lavée deux fois dans le milieu de culture en utilisant une légère cen- / trifugation à 500-600 tr/mn pendant 5 minutes à 4°C. 20 les cellules (population mixte) sont mises en suspension dans un milieu de culture consistant en une quantité d'environ 85 i° de milieu essentiel minimal de Eagle, 15 % de sérum de foetus de veau inactivé à la chaleur, 0f 15 % de bicarbonate de sodium, 100 unités par millilitre de pénicilline, 100 ng/ml de streptomy-25 ci ne et 25 unités/ml de nystatine , et elles sont introduites sous la forme d'échantillons de 2 ml contenant environ 8x10 cellules par. millilitre, dans des tubes de leighton munis d'une lamelle couvre—objet, qu'on met à incuber à 35°C. le milieu de culture est remplacé au bout de 3 à 4 jours, lorsque son pH est de-30 venu acide. Au bout de 5 à 7 jours, on obtient une nappe conflu-ente de cellules fusiformes ne présentant pas d'hépatocytes ni de cellules de la série hématopoïétique. 1* examen au microscope électronique montre- que ces cellules fusif ormes ne sont pas des fibroblastes typiques. Leur étude 35 chromosomique montre qu'elles sont diploîdes (avec apparitions de rupture et de nombres subdiploïdes et polyploldes qui sont.acceptables pour des cellules diploîdes, bien que les résultats concernant les nombres subdiploïdes tendent à être un peu élevés.). bad original 70 30813 5 2068515 les suspensions cellulaires peuvent être conservées dans de l'azote liquide en utilisant soit le diméthylsulfoxyde, de préférence à 20 % en volume/volume, ce qui donne une concentration finale de 10 % de suifoxyde, soit le glycérol à 5-10 5 Exemple 2 : Sub-culture de la .lignée cellulaire les cellules sont retirées du récipient initial de culture , où elles adhèrent solidement au verre, par désagrégation, par exemple en utilisant la trypsine, puis en procédant à un grattage. Ainsi, on ajoute 1 ml de trypsine à 0,2 % à chaque tube et 10 on laisse le tube à la température ambiante pendant environ 6 minutes ; l'excès de trypsine est versé et jeté, et on ajoute 2 ml d'un milieu de croissance composé d'environ 85 $ de milieu essentiel minimal de Eagle, 15.$ de sérum de foetus de veau inactivé à la chaleur, 0,15 % de bicarbonate de sodium, 100 unités/ml de 15 pénicilline, 100p.g/ml de streptomycine et 25 unités/ml de nys-tatine... On laisse les tubes à la température ambiante pendant encore 6 minutes environ, pour permettre l'enlèvement de la nappe cellulaire. Toutes cellules restantes qui adhèrent sont ensuite détachées par grattage de la lamelle couvre-objet avec une fi-20 ne tige de verre recourbée et la suspension cellulaire résultante est aspirée à l'aide d'une pipette de Pasteur, les échantillons de 1ml de la solution cellulaire résultante sont introduits dans deux tubes propres et le volume est ajusté à 2 ml dans chaque tube avec le milieu de culture. On obtient une couche monocellulaire 25 confluente en 2 à 3 jours environ. Par culture en série de la manière décrite, les cellules montrent typiquement un diagramme de croissance tout à fait normal jusqu'à la 32ème réplique, mais à partir de la 33ème sub-culture, on observe une phase de sénescence caractérisée par une vi-30 tesse réduite de croissance et une plus forte granularité. le tableau I suivant donne des résultats typiques de l'étude chromosomique de la ligne cellulaire par examen de lames portant des cellules en métaphase, préparées à divers stades, de passage, et illustre la persistance du type chromosomique diploïde des cel-35 Iules par culture en série. BAD ORIGINAL TABLEAU I O Rupture s totales 2/50 3/100 1/50 Autres x-up~ Autres tures pos- aberra-sibles• tions 0/100 1/100 0/50 uj o 00 K3 O O co en en 70 30813 7 2068515 Exemple 3 : Procédé général de culture de virus en lignée cellulaire La suspension du virus est diluée en série dans une solution tamponnée au phosphate en utilisant 0,2 ml de dilution à —2 x —3 5 10 ou à 10 de la suspension de virus dans le cas de tubes de Leighton ou de tubes de culture de tissu, et 0,4 ml de dilution à —2 —3 3 10 ou 10 dans le cas de fioles médicales de 28,3 cm . On laisse se produire l'absorption du virus sur la nappe cellulaire pendant 30 minutes à 35°C et on ajoute ensuite le milieu de culture 10 composé d'environ 85 % de mil jeu essentiel minimal de Eagle, 15 % de sérum de foetus de veau inactivé à la chaleur, 0,15 # de bicarbonate de sodium, 100 unités/ml de pénicilline, 100 n g/ml de streptomycine et 25 unités/ml de .nystatine . Les tubes ou les fioles sont soumis quotidiennement à un examen de l'effet cytopathologi-15 que, et le virus est récolté lorsque les cellules ont été affectées à un taux d'environ 75 Le titre du virus que l'on obtient 6 7 peut être situé dans la gamme de 10~ à 10~' par millilitre. Exemple 4 : Culture d'hémo-virus AR-17 en lignée p-eThiifli-re On prépare un virus AR-17 d'ensemencement à partir de cellu-20 les infectées de Détroit, de type 6Y292(558), cette matière représentant le 11ème transfert de culture tissulaire du virus. Six jours après l'inoculation , les cultures montrent une nette dégénérescence et c'est à ce moment qu'on les récolte. Les cellules et le liquide sont recueillis puis rapidement congelés et décongelés 25 à trois reprises. Les débris cellulaires sont isolés par centri-fugation à 1500 tr/mn pendant 10 minutes et le liquide surnageant obtenu est conservé à -55°C en quantités de 1 ml. Le virus d'ensemencement, dilué à 1:2 dans une solution saline tamponnée au phosphate et inoculé en quantités de 0,2 ml à des couches monocellu-30 laires de la lignée cellulaire de foie d'embryon humain dans des flacons de 28,35 ml, produit un effet cytopathologique 7 à.9 jours après 1'inoculation.. Le virus récolté après le passage primaire —3 a typiquement une valeur de dose infectieuse DITC^q égale à 10, mais il ne peut pas être transféré au-delà du premier passage. 35 Exemple 5 s Culture du virus de San Carlos Type 3. en jH+mée cellulaire On prépare un virus d'ensemencement de San Carlos Type 3 à partir d'un virus qui a subi cinq passages dans des hépatocytes primaires d'embryon humain. On récolte des cultures 4 jours après BAD ORIGINAL 70 308H A n ZUUO l'inoculation, au moment où environ 75 % des cellules ont été ci • fectées. On recueille les cellules et le liquide et on les trait5 comme décrit pour le virus AR-17 dans l'exemple 4. Le titrage de cette çùbstance dans des cultures primaires de cellules de foie 5 2 5 embryonnaire humain donne typiquement un titre DITC^q de 1o 9 par 0,1 ml. Exemple 6 : Titrage de souches de virus en lignée cellulaire Le titrage de plusieurs souches de virus dans la ligne cellulaire de foie d'embryon humain donne des points de virage ana™ 10 logues à ceux que l'on obtient dans la souche de cellules diploîdes humaines d'origine pulmonaire, désignée par ¥1—38. Le tableau II* suivant donne des résultats typiques de ceux que l'on obtient. TÀ'RT.'RâTT TT 15 Virus Titre DITC50 ;iog10/ml) 1 Lignée cellulaire de foie d'embryon hu- mnin Cellules pulmonaires ¥1 38 20 ECHÔ-virus type 11 1 , 8,2 8,3 Polio-virus de Sabin, type t 7,1 6,7 i Adéno-virus, type J 5,2 6,0 | jVirus de Sindbis M - 6,8 ! * \ L BAD ORIGINAL 70 30813 9 2068515 BEmmioAiioss 1. Procédé de production d'une lignée cellulaire de foie d'embryon humain, caractérisé par le fait qu'il consiste à désagréger un foie d'embryon humain, à mettre les cellules en suspen- 5 sion dans un milieu de croissance, à remplacer ce milieu par du milieu frais lorsqu'il devient acide et à laisser se former une nappe confluente de cellules fusiformes de la lignée cellulaire. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la désagrégation est effectuée par trypsinisation. 10 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la trypsinisation est effectuée à environ 20°G. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on utilise deux ou trois cycles de trypsinisation. 15 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisé par le fait que la base du milieu de croissance est le milieu essentiel minimal de Eagle. 6. Procédé suivant la revendication 5S caractérisé par le fait que le milieu de croissance contient du sérum de foetus de 20 veau inactivé à la chaleur, 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que les cellules de la -lignée cellulaire de foie d'embryon humain sont traitées en sub-cultura par passages en série dans du milieu de croissance frais® 25 8. lignée cellulaire de foie d'embryon humain, obtenue au moyen d'un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 4 précédentes. 9.lignée cellulaire de foie d'embryon humain possédant les caractéristiques de cellules déposées dans la Collection Americai— 30 ne des Cultures Types sous le numéro matricule CL99, et au Département de Contrôle des Produits Immunologiques du Conseil de Recherche Médicale. 10. Système de culture cellulaire, caractérisé par le fait qu'il comprend des cellules de la lignée cellulaire de foie d'em- 35 bryon humain de référence A.T.C.C. n° C199 dans un milieu nutritif qui convient pour le développement ou la conservation de cellules de mammifères en culture de tissu. BAD ORIGINAL 70 30813 10 2068515 11. Système de culture cellulaire, caractérisé par le fait qu'il comprend des cellules de la lignée cellulaire de foie d'embryon humain désignée par A.T.C.C. n° CL99 inoculé avec un virus capable d'une multiplication dans ces cellules, et un milieu 5 nutritif apte à entretenir le développement du système de cellules virales. 12. Système de culture cellulaire suivant 11une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé par le fait que le milieu nutritif contient le milieu essentiel minimal de Eagle additionné 10 de sérum de foetus de veau inactivé à la chaleur» 13. Procédé de culture d'un virus, caractérisé par le fait qu'il consiste à maintenir une culture viable de cellules provenant de la lignée cellulaire de foie d'embryon humain de référence A.T.O.C . n° CL99 dans un milieu nutritif de culture, à inoculer la 15 culture avec ua virus auquel les cellules sont sensibles et à cultiver' le virus "dans le milieu de culture. 14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé par le fait que. le virus- est du groupe comprenant des adéno-virus, des -virus de San Carlos, des lOHQ-virus, des ARBO-virus du groupe A, 20 des virus de là variole, des mysovirus 9 des paramyxovirus, des Picorna-virus et 1'hémovirus AR-17. 15. Procédé' suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que le virus appartient au groupe comprenant les adéno-virus des types 2, 3, 4, 5, 7 et 17, le virus de San Carlos des types 3, 25 6„ 8 et 49, 1'SCH0-virus du type 11, le virus de Sinâbis, le virus vaccinal, le virus A2 de la grippe et d'autres virus de la grippe, le polio-virus de Sàbin du type 1 et d'autres virus poliomyéllti—, ques3 et l'hémovirus AR-17. 16. Yirus cultivé au moyen d'un procédé suivant l'une 30 quelconque des revendications 13, 14 et 15. 17. Nouvelle substance antigénique, caractérisée par le fait \ qu'elle peut être obtenue à partir d'un virus cultivé au moyen du procédé suivant 1'une quelconque des revendications 13, 14. on 15• BAD ORIGINAL