Brevet FR2106582A1 — publié le 19720505

La présente invention se rapporte à une nouvelle substance biosynthétique, dénommée substance MM 4550 et aux procédés pour sa production. L'invention concerne en conséquence la substance MM 4550 5 et ses sels non toxiques, cette substance étant un solide acide ne présentant pas de spectre ultra-violets caractéristique ; sous la forme de son sel de baryum, cette substance présente le spectre d'absorption des infra-rouges représenté sur le dfessin annexé ; ladite substance inhibe l'action de dégradation de la 10 pénicilline et de la céphalosporine des enzymes bêta-lactamases. (Sur le dessin, on a porté en ordonnées le facteur de transmission en % et en abscisses le nombre d'ondes par cra"^). L'invention concerne également un procédé pour la préparation de la substance MM 4550, ce procédé consistant à cultiver 15 un« souche productrice de substance MM 4550 de Streptomyces olivaceus ou une souche mutante de celle-ci dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux, puis à récupérer la substance MM 4550 à partir du mélange. 20 De préférence, on utilise Streptomyces olivaceus ATCC 21379, 21380, 21381 et 21382. Ces souches sont obtenues à partir de divers échantillons de sol et ont été identifiées comme étant Streptomyces olivaceus. Elles ont été également déposées sous les références BRL 923, 925, 927 et 929 dans la collection de 25 la Société Beecham Research Laboratories, Brockham Park, Betchworth, Grande Bretagnee La culture est de préférence effectuée dans des conditions aérobies à 20 - 35° C, plus spécialement à 30 - 31"C, dans un milieu nutritif à un pH de 7 environ. Judicieusement, la cul-30 ture est effectuée pendant un temps allant jusqu*à 7 jours, en particulier pendant environ 2 jours. La substance MM 4550 peut être récupérée à partir du milieu par des méthodes d'échange d'ions, par chromatographie, par filtration sur gel et par des méthodes similaires. 35 Les quatre souches référencées ATCC 21379 - 21382 ont été examinées dans différents milieux pour déterminer leurs caractéristiques de développement, de production de mélamine, de morphologie des spores et de tests physiologiques comme l'hydrolyse de l'amidon, la liquéfaction de la gélatine et la réduction 40 des nitrates. En conséquence, elles ont été identifiées comme 71 33361 2 2106582 étant Streptomyces olivaceus. Dans la pratique, la substance MM 4550 peut être produite en développant d'abord la culture de microorganisme à utiliser sur un milieu nutritif convenable pour permettre la sporulation. Un milieu extrait de levure -5 glucose - gélose est particulièrement judicieux pour l'espèce Streptomyces olivaceus et, après inoculation, on fait incuber la culture à 28° C pendant 1 à 2 semaines. Les spores sont ensuite séparées du milieu par lavage avec de l'eau stérile et cette suspension de spores est ensuite utilisée pour inoculer 10 un milieu nutritif aqueux dans lequel l'organisme se développe et produit la substance MM 4550. Une telle culture peut être utilisée pour inoculer une seconde charge de milieu de culture liquide pour la production de MM 4550. Le milieu de fermentation doit contenir des sources de car-15 bone assimilable et d*azote assimilable, ainsi que des sels inorganiques. Comme sources d'azote, convenables, on peut citer l'extrait de levure, la farine de soja, l'extrait de viande, la farine de graine de coton, les substances solubles séchées de distilleries du malt, les amino-acides simples, les hydrolysats 20 de protéine et l'azote de l'ammonium et de nitrates. Comme sources de carbone convenables, on peut citer le glucose, le lactose, le maltose, l'amidon et le glycérol. Des rendements améliorés en substance MM 4550 peuvent être obtenus par l'incorporation au milieu de divers sels métalliques, par exemple 25 des sels de manganèse ou de cobalt, et par l'addition de craie. Après une durée de fermentation allant jusqu'à 7 jours, on récolte le milieu de fermentation et on extrait ensuite le produit, qui est la substance MM 4550, du milieu de fermentation. On peut également effectuer la fermentation par des méthodes 30 d'écoulement en continu. On constate que la substance active MM 4550 est présente principalement dans le fluide de culture, une très faible quantité étant retenue dans les cellules microbiennes. Après la séparation du mycélium par rapport à la liqueur à la fin de la 35 période de culture, par exemple par filtration, on peut obtenir un degré notable de purification de la substance MM 4550 en amenant la liqueur en contact avec une matière échangeuse d'à-nions, par exemple avec une cellulose échangeuse d'ions, puis par élution de la substance absorbée MM 4550 à partir de celle-40 ci. La solution obtenue peut être débarrassée des sels par de 71 3"^1 3 2106582 nouveaux processus d'échange d'ions. Suivant une variante, la purification initiale de la liqueur peut être effectuée par séparation par chromatographie sur une colonne de cellulose ou sur une colonne de matière échangeuse de cations comme 5 l'Amberlite CG50, qui est traversée plus rapidement par la substance MM 4550 que par les impuretés. On peut obtenir également un certain degré de purification du filtrat de culture par fil-tration sur un gel de "Sephadex G15" ou "G25". Après traitement par un ou plusieurs des processus précités, 10 la fraction aqueuse purifiée résultante peut être lyophilisée de façon à donner une préparation solide de substance MM 4550. Cette préparation et les bouillons de culture clarifiés peuvent être purifiés par diverses méthodes d'extraction. La substance active MM 4550 est relativement stable dans un moût de fermen-15 tation clarifié à un pH acide ou neutre. Dans des fractions aqueuses partiellement purifiées, la stabilité est beaucoup plus faible et en outre une certaine dégradation se produit pendant 1•évaporation sous pression réduite ou pendant la lyophilisation. En conséquence, les préparations solides obtenues sont contami-20 nées par des produits de dégradation de la substance active. Toutefois, la stabilité pendant le traitement est améliorée pair l'addition de borate. Les caractéristiques de filtration sur gel de la substance MM 4550 et sa faculté à traverser une membrane de dialyse in-25 diquent que la substance a un poids moléculaire assez faible. Par électrophorèse, la substance MM 4550 subit une migration de 18 cm vers l'anode sur un papier Whatman 3MM d'une longueur de 40 cm, avec des rouleaux de papier recouverts de cellophane de 10 cm de longueur au total, et une tension appliquée 30 de 3000 volts pendant 25 minutes (environ 60 volts/cm), avec un agent tampon pyridine-acide acétique à un pH de 5,3. Composition de l'agent tampon s acide acétique 0,067M réglé à un pH de 5,3 par de la pyridine. Dans le cas d'une chromatographie en couche mince sur des feuilles de chromatogrammes en cellulose et d'un 35 développement par un agent tampon acétone/pyridine-acétate (tampon d'électrophorèse) (2:1), MM 4550 a une valeur R d'envi-ron 0,85. La position de la substance MM 4550 sur les chromatogrammes ou électrophérogrammes peut être déterminée par bio-autographie 40 ou par pulvérisation avec un réactif d'Ehrlich (300 mg de 4- 71 33361 4 2106582 diméthylamino-benzaldéhyde en solution dans 9 ml d'HCl concentré + 9 ml d'éthanol + 54 ml de n-butanol). La substance MM 4550 réagit pour donner une couleur bleue. Cette substance MM 4550 peut être détectée et mesurée dans les moûts de fermentation et 5 pendant l'isolement par un test de diffusion dans une plaque de gélose. De la gélose nutritive en fusion à 45° C est ensemencée avec une souche convenable produisant de la bêta-lactamase de Klebsiella aerogenes, puis mélangée avec une quantité suffisante d'une solution stérile de pénicilline G pour fournir une concen-10 tration de pénicilline G dans la gélose de 10 jug/ml. On verse ensuite la gélose dans une boite de Pétri et, après solidification, on découpe dans la couche de gélose des trous ou logements cylindriques uniformément espacés en utilisant un outil en métal stérilisé. 15 On introduit les solutions à tester dans les trous. On fait ensuite incuber la plaque à une température constante entre 27°C et 37°C. Pendant la période d'incubation, la substance MM 4550 de la solution d'essai diffuse hors du trou dans la gélose et assure en cet endroit l'inhibition de l'action de la 20 bêta-lactamase introduite dans la gélose avec les cellules de Klebsiella. La pénicilline G est ainsi protégéè contre une destruction par la bêta-lactamase et est présente selon une concentration suffisante pour empêcher le développement de Klebsiella. Dans les parties de la gélose vers lesquelles MM 4550 n'a pas 25 diffusé selon une concentration suffisante, la pénicilline G est détruite par la bêta-lactamase, en permettant un développement dense de Klebsiella. Des zones circulaires claires d'inhibition du développement de Klebsiella sont ainsi formées autour des trous contenant la substance MM 4550, la taille de chaque 30 zone dépendant de la concentration en substance MM 4550 dans la solution soumise à l'essai. Suivant une variante, la quantité de substance MM 4550 présente dans une solution peut être estimée en déterminant le degré d'inhibition de la vitesse d'hydrolyse de la pénicilline G 35 par la bêta-lactamase, la vitesse de réaction initiale étant mesurée en présence et en l'absence de la matière soumise à l'essai. La vitesse d'hydrolyse de la pénicilline G est déterminée par titrage micro-iodométrique de l'acide pénicilloîque formé. Le large spectre d'activité de la substance MM 4550 contre 40 diverses bêta-lactamases cliniquement importantes est illustré 71 33361 5 2106582 dans le tableau I ci-après, qui indique pour chaque préparation d'enzyme le pourcentage d*inhi.bition de la vitesse d'hydrolyse de la pénicilline G résultant de l'incorporation de la substance MM 4550 au mélange réactionnel d'enzyme. Les quantités d'enzy-5 mes dans les mélanges réactionnels sont capables d'hydrolyser la pénicilline G à une vitesse de 0,1-0,2 pg/ml/minute dans les conditions de l'expérience. On fait incuber les préparations d'enzymes à 37#C avec 10 )ig/ml de pénicilline G à un pH de 7,0 (agent tampon phosphaté M/20) à la fois en l'absence de subs-10 tance MM 4550 et également en présence de MM 4550, selon une dilution de 1:625 du moût ou bouillon de fermentation clarifié. TABLEAU I Inhibition de la vitesse de réaction pendant la période initiale de 10 minutes 15 Source de bêta-lactamase % d'inhibition * • • • Escherichia coll souche Bll 86 : Escherichia coli souche HS 23 : 20 Klebsiella aerogenes souche Al 83 : iProteus vulgaris souche A 51 : Pseudomonas pyocyanea souche A 13 ; Bacillus cereus souche B569/H 68 : Staphylococcus pyogenes souche A 0 : • 25 Staphylococcus pyogenes souche H 18 : m m Dans chaque cas, l'inhibition est de nature progressive et elle augmente avec le temps de contact de l'enzyme avec l'inhibiteur, comme indiqué dans le tableau II ci-après, dans lequel 30 on a indiqué le pourcentage d'inhibition de la vitesse de réaction initiale (hydrolyse de la pénicilline G) après pré-incubation de l'enzyme avec l'inhibiteur, pour des temps croissants. (VOIR TABLEAU II PAGE SUIVANTE) On peut montrer également que l'inhibition n'est pas inver-35 sée par l'addition d'un excès de substrat ou par dialyse. La nature irréversible et progressive de l'inhibition de la bêta-lactamase causée par une faible concentration de MM 4550 est nouvelle et différente de celle causée par certaines pénicillines. Des essais séparés ont montré que MM 4550 n'est pas un 40 poison général dés enzymes. 71 33361 e 2106582 TABLEAP II Inhibition progressive des bêta-lactamases par MM 4550 (%) Source de bêta-lactamase Période de 5 Pré-incubation (minutes) : 0 30 60 120 . • Escherichia coli souche Bll 19 92 92 • • • Escherichia coli souche HS 21 43 44 - : 10 Klebsiella aerogenes souche Al 9 36 39 • • • Proteus vulgaris souche A 0 12 12 - : Bacillus cereus souche B569/H 0 26 60 70 ; Staphylococcus pyogenes souche A 0 : 30 40 60 : Staphylococcus pyogenes souche H 0 - 20 30 : 15 • « On a constaté que la substance MM 4550, sous forme de son sel de baryum plus purifié, a des propriétés antibactériennes en plus de ses propriétés d'inhibition de la bêta-lactamase. Des préparations brutes de substance MM 4550 ont une activité 20 antibactérienne, mais celle-ci est plus faible que celle du sel de baryum. Parmi les souches sur lesquelles cette activité a été mesurée, on peut citer Staphylococcus aureus Oxford et Klebsiella aerogenes. Des recherches ont montré qu'il existe un synergisme anti-25 bactérien entre la substance MM 4550 et les pénicillines ou céphalosporines. L'invention concerne donc une composition antibactérienne renfermant une pénicilline ou une céphalosporine, ou encore un sel non toxique de celle-ci, et la substance MM 4550, conjoin-30 tement à un véhicule ou support non toxique pharmaceutiquement acceptable. La pénicilline ou la céphalosporine peut avoir une activité contre les bactéries Gram-positives ou à large spectre, ou bien peut déjà avoir une certaine résistance aux diverses bêta-35 lactamases produites pair des bactéries pathogènes. Les compositions renferment les véhicules ou supports non toxiques pharmaceutiquement acceptables usuels, par exemple des matières de charge inertes, des liants,'des lubrifiants, etc... pour comprimés et sirops pédiatriques, et de l'eau stérile pour 40 préparations parentérales, ou des capsules ou gélules de géla 71 33361 2106582 tine. Le synergisme antibactérien entre la substance MM 4550 et une pénicilline est illustré par les données expérimentales figurant dans le tableau III ci-après, qui indique les effets de 5 la substance MM 4550 sur les concentrations inhibitoires minimales d'ampicilline pour un certain nombre de souches de bactéries pathogènes cliniquement importantes :- TABLEAU III Concentration inhibitoire minimum 10 ( pg/ml) d'ampicilline 15 25 + La substance MM 4550 était présente selon une concentration égale au dixième de celle du moût de fermentation clarifié actif utilisé pour l'expérience. Ce moût de fermentation ne présentait pas d'activité antibiotique lors d'un essai portant sur lui seul, avec la même concentration, contre les huit bactéries 30 essayées. Des données illustrant le synergisme antibactérien entre la substance MM 4550 et une céphalosporine sont indiquées dans le tableau IV ci-après, qui indique les effets de la substance MM 4550 sur les concentrations inhibitoires minimales en cépha-35 losporine contre diverses bactéries pathogènes produisant de la bêta-lactamase. (VOIR TABLEAU IV PAGE SUIVANTE) Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif permettront de mieux comprendre comment l'invention peut être mise en 40 oeuvre. Souche de bactéries Ampicilline Ampicilline seule avec substance MM 4550+ Klebsiella aerogenes A 100 2,5 Klebsiella aerogenes E70 250 10,0 Proteus mirabilis 8 1000 5,0 Proteus mirabilis 11 1000 2,5 Proteus mirabilis 889 1000 2,5 Staphylococcus aureus Russell 500 2,5 Staphylococcus aureus H 500 2,5 Staphylococcus aureus 1517 1000 25 71 33261 2106582 TABLEAU IV Concentration inhibitoire minimale ( jig/ml) de la céphalosporine. 5 Souche de bactéries Céphalosporine seule Céphalosporine avec MM 4550+ Klebsiella aerogenes T201 500 50 Klebsiella aerogenes Oxy B 12,5 2,5 10 Escherichia coli Bll 250 50 Escherichia coli T506 12,5 5,0 Proteus vulgaris D 500 12,5 Proteus vulgaris E 500 5,0 15 20 25 + même signification que pour le tableau III. Exemple 1 On développe Streptomyces olivaceus BRL 923, BRL 925 et BRL 929 (ATCC 21379 - 21382) chacun pendant 7 jours à 28°C sur des milieux de"gélose solide dans des flacons médicinaux plats de 250 ml, le milieu à base de gélose ayant la composition suivante : Constituant Quantité (q/1) Extrait de levure 10,0 Glucose 10,0 Gélose 15,0 On ajuste le pH du milieu à 6,8 avant la stérilisation. On prépare ensuite une suspension de spores de chacune des trois cultures par lavage de la culture avec 35 ml d'eau stérile contenant 0,02% de "Tween 80". On utilise 0,5 ml de chacune de ces suspensions de spores pour inoculer des charges de 20 ml de milieu de fermentation stérile dans des flacons coniques de 100 ml fermés avec des tampons de gaze et de coton hydrophile. La composition du milieu de fermentation était la suivante: Constituant Quantité (q/1) Extrait de levure 4,0 Glucose 20,0 Extrait de malt 10,0 On ajuste le pH du milieu à 8,0 et on stérilise ensuite le milieu à l'autoclave à 120° C pendant 15 minutes. Après inocu-40 lation, on fait incuber les flacons de fermentation à 28° C sur 30 35 71 33361 9 2106582 un agitateur rotatif à 240 tours-minute avec une excentration ou un bras de 32 mm pendant 4 jours» On clarifie ensuite le moût de fermentation provenant de chaque flacon par centrifugation et on titre les parties qui surnagent pour déterminer l'activité 5 de la substance MM 4550 par le test de diffusion dans une plaque de gélose comme décrit précédemment. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après :- Culture Diamètre de la zone d'inhibition (mm) 10 BRL 923 17,0 BRL 925 19,3 BRL 929 20,9 Exemple 2 On prépare une suspension de spores de Streptomyces 15 olivaceus BRL 923 (ATCC 21379) comme décrit dans l'exemple 1 et on l'utilise pour inoculer des charges de 20 ml de milieu de fermentation dans des flacons coniques de 100 ml fermés avec des tampons de gaze et de coton hydrophile. La composition du milieu de fermentation A était la suivante 20 Constituant Quantité (q/1) Monochlorhydrate de L-arginine 2,5 Lactose 20,0 K2HP04 1,5 NaCl 3,0 25 MgS04.7H20 1,0 Fe2(S04)3 0,05 CuS04.5H20 0,003 ZnS04.7H20 0,003 MnS04.4H20 0,002 30 Le pH du milieu a été ajusté à 7,0 avant la stérilisation par autoclavage pendant 15 minutes sous une pression de 1,05 Kg/cm2. Les milieux B, C et D sont identiques au milieu A, sauf que les sources d'azote ci-après remplacent le monochlorhydrate de L-arginine : 35 Milieu B - L-tyrosine Milieu C - nitrate de sodium Milieu D - sulfate d'ammonium. Après incubation pendant 4 jours à 28° C sur un agitateur rotatif à 240 tours-minute avec une excentration de 32 mm, on 40 titre le moût de fermentation clarifié provenant de chaque 71 33361 10 2106582 milieu pour déterminer l'activité de la substance MM 4550 par la méthode de diffusion dans la plaque de gélose, ce qui donne les résultats suivants Milieu Diamètre de la zone d'inhibition (mm) 5 A 22,1 B 21,6 C 13,7 D 12,9 Exemple 3 10 On prépare une suspension de spores de Streptomyces olivaceus BRL 923 (ATCC 21379) comme décrit dans l'exemple 1 et on l'utilise pour inoculer des charges de 20 ml de milieu de fermentation stérile dans des flacons coniques de 100 ml. Le milieu a la composition suivante : 15 Constituant Quantité (q/1) L-tyrosine 1,0 Glucose 1,0 K2HP04 2,0 Fe2(S04)3 0,05 20 CUS04.5H20 0,003 MnS04.4H20 0,004 On ajuste le pH du milieu à 7,0 avant la stérilisation pendant 15 minutes sous une pression de 1,05 kg/cm2. On fait ensuite incuber les flacons à 28° C sur un agitateur rotatif 25 à 240 tours-minute avec une excentration de 32 mm. Après incubation pendant des périodes de 20 heures, 44 heures, et 68 heures, on enlève les flacons en double et on titre le moût clarifié de chacun d'eux pour déterminer l'activité de la substance MM 4550 par la méthode de diffusion dans une plaque de gélose. 30 On obtient les résultats ci-après :- Période d'incubation Diamètre moyen de la zone (mm) (heures) 20 15,6 44 28,0 35 68 30,5 Exemple 4 On cultive des spores de Streptomyces olivaceus BRL 923 (ATCC 21379) sur un milieu du type extrait de levure/glucose-gélose comme décrit dans l'exemple 1. On ajoute 50 ml d'eau 40 stérile désionisée contenant 0,02% de "Tween 80" à une culture 71 33361 " ?1°6582 sur milieu solide dans une* bouteille de Roux et on met les spores en suspension par agitation. On ajoute ensuite la suspension de spores, à titre d'inoculum, à un milieu au stade de germes stérilisé, dans un fermenteur en acier inoxydable de 5 100 ml. La composition du milieu au stade de germes est la suivante Constituant Quantité (g/1) Farine de soja 10,0 Glucose monohydraté 20,0 10 Pour contrôler la formation de mousse, on ajoute au milieu de fermentation, avant la stérilisation, 50 ml de "Pluronic L81" à'10% v/v dans l'huile de soja. On stérilise le milieu par la vapeur d'eau dans le fermenteur pendant 20 minutes à 120°C. On agite la culture au stade de germes a 140 tours-minute avec un 15 agitateur à disque à aubages d'un diamètre de 19 cm environ et on fait arriver de l'air stérile à raison de 75 litres/minute à travers une tête de pulvérisation à extrémité ouverte. Le récipient de culture est équipé de chicanes. On règle la température à 28° C et, après incubation dans ces conditions pen-20 dant 45 heures, on ajoute 2,5 litres de cette culture de germes, à titre d'inoculum, à 50 litres de milieu de fermentation stérile dans un fermenteur en acier inoxydable de 90 litres. Le milieu de fermentation a la composition suivante :-Constituant Quantité (q/1) 25 L-tyrosine 1,0 Glucose monohydraté 1,0 K2HP04 2,0 Fe2(S04)3 0,05 CuS04o5H20 0,003 30 MnS04.4H20 0,05 On ajuste le pH du milieu à 7,0 avant la stérilisation, en utilisant une solution diluée d'acide chlorhydrique, pour contrôler la formation de mousse, on ajoute avant la stérilisation 100 ml de "Pluronic L81" à 10% v/v dans l'huile de soja. On 35 stérilise le milieu par la vapeur d'eau dans le fermenteur pendant 20 minutes à 120°C. On agite le milieu de fermentation à 430 tours-minute avec un agitateur à disque à aubages d'un diamètre de 12,5 cm, le fermenteur étant équipé de chicanes. On fait arriver de l'air stérile par une tête de pulvérisation 40 ouverte à son extrémité, à raison de 50 litres/minute, et on 71 33361 12 2106582 règle la température à 30°C. On poursuit l'incubation dans ces conditions pendant 48 heures. A divers moments pendant la fermentation, on prélève au fermenteur des échantillons de la culture et, après clarification, on titre par la méthode de diffu-5 sion sur une plaque de gélose, avec les résultats suivants Age de la culture Diamètre de la zone (heures) d'inhibition (mm) 6 O 12 • 14,9 10 24 23,5 36 24,5 48 26,7 On clarifie le moût de fermentation récolté par centrifu-gation et on stocke la fraction claire qui surnage à 5°Co 15 On concentre 300 ml du moût clarifié à 30 ml dans un éva- porateur sous vide rotatif. On introduit le concentré dans une colonne de 5 cm x 240 cm de résine échangeuse de cations "Amberlite IRC50" équilibrée avec une solution tampon au borate (0,1% p/v de Na2B40y.l0H20, pH 8). On effectue l'élution de la 20 colonne avec la solution tampon au borate et on recueille l'éluat en fractions de 25 ml. On concentre les fractions réunies, représentant 250 ml, à 20 ml., en utilisant un évapora-teur sous vide rotatif, puis on élimine le sel sur une colonne d'Amberlite XAD-1 de 2,5 cm x 45 cm. Par élution avec de l'eau 25 désionisée, on recueille des fractions de 10 ml et on réunit les fractions actives, ce qui donne 80 ml de solution qui est lyophilisée en donnant 56 mg de poudre blanche. La purification obtenue est quintuplée, sur la base de l'activité, par rapport au total des solides dissous du moût récolté. 30 Exemple 5 On effectue une fermentation en utilisant Streptomyces olivaceus BRL 923 (ATCC 21379) d'une manière identique à celle indiquée dans l'exemple 4, sauf que le milieu de fermentation avait la composition' ci-après :-35 Constituant Quantité (q/1) Farine de soja ("Arkasoy 50") 10,0 Glucose monohydraté 20,0 MnS04.4H20 0,05 On récolte le produit de la fermentation après 48 heures 40 et on clarifie par centrifugation. On titre le moût clarifié 71 33361 13 2106582 par la méthode de diffusion dans une plaque de gélose et on constate qu'il donne une zone d'inhibition de 28,6 mm. On agite 10 litres du moût clarifié avec 3 kg en poids (humide) de cellulose échangeuse d'ions "Whatman DE 23" sous forme d'acétate. 5 On filtre la bouillie formée et on sépare par élution la substance MM 4550 de la résine avec 3 litres de solution 0,5 M de sulfate de sodium, ce qui donne un extrait de substance MM 4550 avec un rendement de 80% à partir du moût de récolte clarifié. On concentre cet extrait à 80 ml dans un évaporateur sous vide 10 rotatif, la plus grande partie du sulfate de sodium étant précipitée. On filtre le concentré, puis on le fait passer dans une colonne de 5 cm x 150 cm de résine Amberlite XAD-2. On effectue 1'élution de la colonne avec de l'eau désionisée et on recueille l'éluat par fractions de 20 ml. Les fractions actives réunies, 15 représentant 500 ml, sont concentrées à 30 ml par ultrafiltra-tion en utilisant une membrane Amicon UM-05. On lyophilise ensuite le concentré, ce qui donne 100 mg de poudre blanche ayant une activité spécifique de la substance MM 4550 représentant environ 33 fois celle des solides dissous totaux du moût de 20 récolte clarifié. Exemple 6 On effectue une fermentation en utilisant Streptomyces olivaceus ATCC 21379 d'une manière identique à celle indiquée dans l'exemple 4, sauf que le milieu de fermentation a la 25 composition ci-après Constituant Quantité (q/1) Farine de soja ("Arkasoy 50") 10,0 Glucose monohydraté 20,0 Craie (carbonate de calcium précipité) 0,2 30 Chlorure de cobalt (CoCl2.6H20) 0,001 On ajoute du "Pluronic L81" à 10% v/v dans l'huile de soja (300 ml) pour éviter la formation de mousse. On récolte le produit de la fermentation après 48 heures et on clarifie par cen-trifugation. On titre le moût clarifié par la méthode de diffu-35 sion dans une plaque de gélose, ce qui donne une zone d'inhibition de 33,0 mm. On agite 100 litres du moût clarifié avec 12kg en poids humide de cellulose échangeuse d'ions "Whatman DE 32" sous forme d'acétate. On filtre la bouillie et on effectue l'é-lution de la substance MM 4550 par rapport à la cellulose avec 40 12 litres de sulfate de potassium 0,5M. On concentre l'extrait 71 33361 " 2106582 à 6 litres dans un évaporateur à film ascendant sous vide, au-dessous de 30° C. On précipite la plus grande partie du sulfate de potassium par l'addition de 12 litres d'acétone. On filtre la solution et on concentre à 200 ml par évaporation sous vide 5 au-dessous de 30°C. On charge le concentré dans une colonne de 76 mm x 2 m de résine "Amberlite XAD-2", on élue avec de l'eau désionisée et on recueille l'éluat par fractions de 140 ml. On réunit les fractions actives, détectées par le test de diffusion dans la gélose (2,2 litres) et on concentre à 275 ml par ultra-10 filtration en utilisant une membrane Amicon UM-05 (diamètre 150 mm) sous une pression d'azote de 4,2 kg/cm2o On lyophilise le concentré, ce qui donne 2,2 g. de poudre brune. On fait dissoudre 1 gramme de poudre (activité 32 unités/ mg) dans 1 litre de sulfate de sodium 0,2 M et on mélange avec 15 1 litre de sulfate acide de tétra-n-butyl-ammonium à 2% p/v dans le dichlorométhane. On sépare la phase dichlorométhane par gravité et on concentre à 20 ml. On ajoute ensuite 400 ml d'éther de.pétrole 40-60° C et on recueille le précipité par centrifuga-tion. On fait redissoudre le précipité dans le dichlorométhane 20 (10 ml) et on extrait avec 10 ml d'eau contenant 80 mg d'iodure de baryum et 70 mg de carbonate de baryum. On sépare les phases, on filtre la phase aqueuse et on ajuste à un pH de 6,5. On lyophilise la solution, ce qui donne une poudre jaune. On lave le solide avec de l'acétone pour séparer par dissolution l'iodu-25 re de baryum en excès, et on récupère le solide jaune pâle par centrifugation, puis on le sèche sous vide. Le rendement est de 13 mg avec une activité de 320 unités/mg. Exemple 7 (a) On introduit un mélange de 125 mg d'ampicilline, trihy-30 drate, et de 125 mg de substance MM 4550 dans des capsules de gélatine, en vue d'un usage par voie orale. (b) On prépare des mélanges semblables à ceux décrits sous (a) avec de la phénéthicilline et de la propicilline. (c) On introduit un mélange de 250 mg du sel de sodium de 35 1 *ampicilline et de 125 mg de substance MM 4550 dans une ampoule, dans des conditions stériles, et on scelle l'ampoule. Pour l'emploi, on ajoute de l'eau stérile pour injection, ce qui donne une préparation pour administration parentérale. Des modifications peuvent être apportées aux modes de mise 40 en oeuvi;e décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de l'invention. 71 33361 15 2106582 REVENDICATIONS 1.- Substance MM 4550 et ses sels non toxiques, cette substance étant un solide acide sans spectre ultra-violets caractéristique, ayant sous la forme de son sel de baryum le spectre 5 d'absorption des infra-rouges représenté sur le dessin annexé, et inhibant l'action de dégradation de la pénicilline et de dégradation de la céphalosporine des enzymes bêta-lactamases. 2.- Procédé pour la préparation de la substance MM 4550 suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive une 10 souche productrice de substance MM 4550 de Streptomyces olivaceus ou une souche mutante de celle-ci dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux, puis on récupère la substance MM 4550 à partir du mélange. 15 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise Streptomyces olivaceus ATCC 213 79, 21380, 21381 ou 21382. 4.- Procédé suivant la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on effectue la culture dans des conditions aérobies à 20°- 20 35° C, de préférence à 30° - 31° C. 5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue la culture pendant un temps allant jusqu'à 7 jours, de préférence pendant environ 2 jours. 25 6.- Substance MM 4550, caractérisée en ce qu'elle est pré parée par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 5. 7.- Composition antibactérienne, caractérisée en ce qu'elle renferme une pénicilline ou une céphalosporine, ou encore un 30 sel non toxique de celle-ci et la substance MM 4550, conjointement à un support, véhicule ou excipient non toxique pharmaceutiquement acceptable.