Brevet FR2102208A1 — publié le 19720407

Le pancréas humain excrète toute une série d'enzymes qui présentent une grande importance pour la digestion. Un dosage d'activité de ces enzymes qui sont libérées dans le duodénum, donne des éclaircissements au sujet du fonctionnement du pancréas, et présente une grande importance pour le diagnostic, en particulier lorsqu'il s'agit d'une pancréatite, difficile à déceler. Pour pouvoir réellement diagnostiquer une pancréatite chronique, il faut pouvoir réaliser le dosage des concentrations en enzymes du pancréas dans le suc duodénal, d'une façon aussi simple, aussi sûre et aussi rapide que possible. Conformément à un procédé usuel jusqu a présent, le suc duodénal était-prélevé chez le patient à l'aide d'une sonde flexible, et sa teneur en acides gras libres était recherchée, après incubation avec un substrat tel que la trioléine, par exemple. Cette méthode prend énormément de temps et elle est désagréable pour le patient ; en outre elle est entachée d'un grand nombre de sources d'erreurs. I1 est connu par la revue "Klin.Wschr." 47, pages 221223, (1969) d'administrer par voie orale des diesters incolores de la fluorescéine et d'acides gras à longue channe, en particulier d'acide laurique, sous la forme de capsules solubles dans l'intes- tin grêle, ce qui fait que le diester nonrésorbable et insoluble dans l'eau est hydrolysé dans l'intestin grêle par voie enzymatique pour donner lieu à la fluorescéine résorbable qui parvient dans l'urine par l'intermédiaire des reins, et peut-être dosée dans l'urine par photométrie ou par fluorométrie. Ce procédé, -qui constitue sans aucun doute un grand progrès dans le diagnostic des affections du pancréas, ne pouvait permettre d'atteindre-une bonne préeision que si l'on recueillait l'urine pendant environ 10 heures à la suite de l'administration de la préparation, et si on ntalalysait l'urine qu'ensuite, car la dissociation du diester de fluorescéine par les estérases-pancréatiques, se déroule relativement lentement. La Demanderesse a trouvé à présent que l'on peut éliminer les inconvénients précités et obtenir des résultats sensiblement meilleurs et plus rapides, si l'on utilise à la place des diesters de la fluorescéine, les monoesters de celle-ci avec des acides gras contenant de 11 à 16 atomes de carbone, de préférence avec l'acide laurique. Ces monoesters sont nouveaux et sont préparés à l'aide d'un procédé nouveau. Parmi les esters d'acides gras supérieurs de la fluorescéine, l'on n'avait menti-onné jusqu a présent que l'ester de l'acide caprique (Fleisher et Schwartz, Abstr. Papers 156th ACS- Meeting 1968, Biol. 269) ; toutefois, celui-ci est utilisé exclusivement pour le dosage automatique in-vitro de la lipase dans le sérum. L'utilisation de monoesters de la fluorescéine, qui répondent à la formule I ci-dessous, pour le dosage in-vivo de la fonction pancréatique, est toutefois nouvelle et représente une amélioration précieuse pour le diagnostic médical. Par ailleurs l'on ne dispose d'aucune indication au sujet des propriétés physiques de l'ester oaprique de la fluorescéine, non plus qu'au sujet de son procédé de préparation. La présente invention a en conséquence pour objet des composés qui répondent à la formule générale I ci-après dans laquelle R représente un radical aliphatique saturé ou non, compre nant de 10 à 15 atomes de carbone, ainsi que les sels de ces composés avec des bases pharmacologiquement adéquates. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés répondant à la formule générale I cidessus, lequel est caractérisé en ce que l'on fait réagir de la fluorescéine avec une mole d'un dérivé réactif d'un acide carboxylique qui répond à la formule générale II ci-après R - C00H (il) dans laquelle R a la même signification que ci-dessus, et en ce que l'on transforme éventuellement ensuite le produit de formule I obtenu de la sorte, en l'un de ses sels, par action de bases pharmacologiquement appropriées. La préparation des monoesters de fluorescéine qui répondent à la formule générale I ci-dessus, a lieu en faisant réagir la fluorescéine suivant un rapport molaire 1:1 avec des dérivés réactifs d'acides carboxyliques qui répondent à la formule générale II, dans un solvant inerte, de préférence le chloroforme, éventuellement en chauffent. La réaction pe être accélérée par l'addition d' amines tertiaires ou aromatique telles que la tri éthyl amine ou la pyridine, par exemple. Parmi les dérivés réactifs, l'on peut mettre en oeuvre, par exemple, les chlorures d'acides ou les imidazolides. Une monoestérification orientée procure des difficultés appréciables sur le plan technique, en sorte qu'elle n'a encore jamais été effectuée jusqu a présent. La fraction des diesters de la fluorescéine que l'on obtient, mais que l'on ne souhaitait pas obtenir, peut à présent être supprimée dans une très grande mesure, conformément à l'invention, en mettant la fluorescéine en suspension dans du chloroforme, en lui ajoutant un chlorure d'acide de formule II et en ajoutant ensuite goutte-à-goutte au milieu réactionnel, de la pyridine en excès pouvant atteindre le triple du volume du milieu réactionnel. Le filtrat de ce mélange réactionnel contient, outre un peu de fluorescéine et de diester de fluorescéine, principalement des composés de formule générale I qui peuvent être aisément purifiés par chromatographie. L'on peut également préparer conformément à l'invention, des moncesters comprenant moins de 10 atomes de carbone. Parmiles bases pharmaeologiqllement appropriées, les bases de la série alcaline telles que les hydroxydes de calcium et de magnésium conviennent particulièrement bien. L'on comprendra aisément que les composés de formule générale I peuvent également se présenter dans les structures tautomèresvlcon- nues dans la littérature, de la fluorescéine. Les monoesters de fluorescéine conformes à l'invention, qui répondent à la formule générale I, sont des substances insolubles dans l'eau, de couleur jaune pâle, qui ne sont pas résorbées et qui sont scindées dans l'intestin grêle, de façon spécifique par les estérases du pancréas, en acide gras et en fluorescéine résorbable. La fluorescéine résorbée est excrétée dans l'urine; la concentration en fluorescéine qu'on y trouve constitue une mesure de la fonction pancréatique. Les composés de formule générale I conformes à l'invention conviennent particulièrement bien en tant que substrats des enzymes précitées, la matière colorante quinonique que représente la fluorescéine étant libérée sous une forme résorbable. En pareil cas, c'est la réaction suivante qui a lieu Monoester incolore d' Enzyme fluorescéine acide gras et de fluo- + pancréatique u + 1 acide rescéine conforme à la + 1 H20 formule générale I La fluorescéine résorbée peut être dosée quantitativement dans le sérum ou dans l'urine, par exemple à l'aide d'une mesure de fluorescence ou d'une mesure d'absorption. En outre, les esters ~d'acid monocarboxyliqu et de fluorescéine présentent les avantages suivants par rapport à l'état de la technique: 1. En raison de leur faible poids moléculaire, les esters de formule I d'acidesmonocarboxyliqueset de fluorescéine sont dosés à 25 % de moins sans que le taux de fluorescéine dans l'organis- me diminue. 2. Comme seule une liaison ester doit être scindée, la mise en évidence de faiblactivites'en est rendue nettement plus sensible. 3. Apparemment, les monoesters sont scindés par les estérases pancréatiques, sensiblement plus rapidement que ne le sont les diesters, ce qui est tout-à-fait surprenant, et après l'hydrolyse dans le duodénum dans des conditions comparables, ils sont excrétés environ deux fois plus vite que les diesters ; ceci entralne un razuurcissement sensible de la durée de collecte de l'urine, car l'excrétion de la fluorescéine est terminée au bout de très peu d'heures. Comme les diesters sont vraisemblablement scindés en deux stades par différentes enzymes, par des voies qui ne sont pas encore connues avec précision, la corrélation établie plus haut était jusqu'à présent relativement incertaine.Cette incertitude ne subsiste pas dans le cas des monoesters conformes à l'invention, qui sont vraisemblablement décomposés en un seul stade réactionnel par les estérases pancréatiques. Les monoesters de la fluorescéine sont mis en oeuvre de préférence sous des formes de préparations galéniques telles que des comprimés, des dragées, des capsules ou des gouttes, qui contiennent en outre les adjuvants galéniques usuels tels des charges, des correcteurs du goût, entre autres, par exemple. L'on préfère en outre des formes qui contiennent l'ester à l'état finement divisé (par exemple sous forme microniséeou en suspension). Les. prépa- rations solides telles que les dragées ou d'autres types de comprimés recouverts d'une couche de vernis, peuvent également comporter des revêtements solubles dans l'estomac ou dans l'intestin grêle. Pour réaliser dès l'abord le milieu alcalin qui règne lors de la dissolution dans le duodénum, il est également possible d'ajouter des sels tampons qui ajustent le pH à 7,5-8,5, après la dissolution. Sous l'une de ses formes de préparation, l'agent de diagnostic conforme à l'invention, qui contient des monoesters d'acides gras et de fluorescéine, comprenant de ll à 16 atomes de carbone, est ingéré à un moment donné par le patient ; à des intervalles de temps déterminé l'on dose d'une manière connue en elle-même la fluorescéine dans l'urine, après l'hydrolyse des fractions conjuguées, par photométrie ou par fluorométrie. L'excrétion d'enzymes pancréatiques n'a lieu que si le pancréas est stimulé par l'absorption d'aliments ; il est en conséquence relativement facile de doser tout d'abord la résorption élémentaire,qui est fréquemment régligeable, à jeun, de la fluorescéine et de comparer ensuite cette valeur avec le résultat que l'on obtient après stimulation du pancréas, par exemple après un déjeuner d'épreuve . La valeur obtenue de la sorte est en relation directe avec l'activité enzymatique du pancréas. En cas d'insuffisance du pancréas, des quantités de fluorescéine inférieures à la valeur normale, sont décelées dans le sang et dans l'urine. Pour doser une réaction de référence individuelle, en raison de l'excrétion partielle variable par l'intermédiaire de la bile, il est possible d'administrer au patient, à titre comparatif, une unité de comparaison qui contient, à la place d'un monoester de fluorescéine, de la fluorescéine non-estérifiée ; cela rend la méthode d'évaluation plus sensible encore. Il va de soi que l'on peut également utiliser à la place de la fluorescéine, une autre matière colorante dont le comportement à l'excrétion est analogue. En pareil cas, il est possible d'administrer le monoester conjointement avec la matière colorante. L'invention sera décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui vont suivre, qui sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, et n'ont aucun caractère limitatif. EXEMPLE 1 Monoester de l'acide laurique et de la fluorescéine L'on ajoute 4,36 g (0,02 mole) de chlorure de l'acide laurique à 6,65 g (0,02mole)de fluorescéine dans 150 ml de chlorofor me. L'on ajoute ensuite lentement, goutte-à-goutte, une solution de 4 ml de pyridine dans 30 mi de chloroforme, tout en maintenant la température entre 10 et 200C, sous une agitation vigoureuse. L'on sépare ensuite, par filtration, du produit solide onctueux, de couleur jaune-rouge, l'on évapore le filtrat et on le reprend par une faible quantité de chloroforme. L'on purifie la solution obtenue par chromatographie sur du gel de silice (de chez Merck, granulométrie : 0,2-0,05 mm) à l'aide d'un mélange de développement constitué par du chloroforme et de l'ester acétique dans un rapport 2:1.Le ma?oester de l'acide laurique et de la fluorescéine est en tratné pratiquement avec le front et se sépare à l'état très pur Après évaporation et recristallisation du résidu dans de l'éther de pétrole, l'on obtient du monoester de l'acide laurique et de la fluorescéine, dont le point de fusion est de 109-111 C, avec un rendement de 45 % de la théorie. EXEMPLE 2 L'on obtient,en procédant comme décrit à l'Exemple 1 Le monoester de l'acide palmitique et de la fluorescéine (point de fusion : 80-820C) avec un rendement de 26 % de la théorie ; l'ester de l'acide undécénique (10) et de la fluorescéine (point de fusion : 103-1040C) avec un rendement de 41 % de la théorie; L'ester de l'acide und6canoTque et de la fluorescéine (point de fusion: 96-98"C) avec un rendement de 42 % de la théorie; L'ester de ltacide trídécanoSque et de la fluorescéine (point de fusion:113-115 C) avec un rendement de 40 ffi de la théorie ; Le monoester de l'acide octanoique et de la fluorescéine (point de fusion: 850C) avec un rendement de 30 ss de la théorie, et le monoester de l'acide nonanoique et de la fluorescéine, avec un rendement de 40 SR; de la théorie ; ce composé fond à 880C. (Rendement caleulé sur la base de la fluorescéine qui a réagi). REVENDICATIONS 1. Composés caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I ci-après dans laquelle R représente un radical aliphatique saturé ou non, compre nuant de 10 à 15 atomes de-carbone, ainsi que les sels de ces composés avec des bases pharmacologiquement assimilables. 2. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu il est constitué par le monoester de l'acide laurique et de la fluorescéine. 3. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu il est constitué par le monoester de l'acide palmitique et de la fluorescéine. 4. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'ester de l'acide undécénique (10) et de la fluorescéine. 5. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'ester de l'acide undécanolque et de la fluorescéine. 6. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu il est constitué par l'ester de l'acide tri décanoSque et de la fluorescéine. 7. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par le monoester de l'acide octanolque et de la fluorescéine. 8. Composé de formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu il est constitué par le monoester de l'acide nonanolque et de la fluorescéine. 9. Procédé de préparation de composés répondant à la formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce que 1 on fait réagir la fluorescéine avec ure mole d'un dérivé réactif d'un acide carboxylique qui répond à la formule générale II ci-après R - COOH (11) dans laquelle R a la même signification que ci-dessus, et l'on transforme ensuite, si on le désire, le produit de formule I obtenu de la sorte, en l'un de ses sels à l'aide de bases pharmacologiquement appropriées. 10. Procédé de préparation de composés répondant à la formule générale I selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir la fluorescéine avec une mole du dérivé réactif d'acide carboxylique de formule générale II, sous la forme d'une suspension dans du chloroforme, en ce que l'on ajoute à cette suspension de la pyridine en excès à raison d'une à trois fois le volume du mélange réactionnel, et en ce que l'on transforme ensuite d'une manière connue, si on le désire, le produit de formule I obtenu de la sorte, en l'un de ses sels à l'aide de bases pharmacologiquement assimilables.