Brevet FR2081581A1 — publié le 19711210

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé MM. PENASSE Lucien, BARTHELEMY Pierre et Madame HASBISS Denise, a pour objet un procédé de purification d'enzymes. L'invention à plus précisément pour objet un procédé de purifi-5 cation d'enzymes du type asparaginase, et, en particulier, de la L-asparaginase possédant une activité antitumorale. On sait que la L-asparaginase isolée de Serrâtiamarcesans et d'Escherichia Coli possède une forte activité antinéoplasique. On sait également que pour effectuer un traitement efficace 10 des tumeurs, tout en évitant les effets secondaires, il est nécessaire que la L-asparaginase, possédant l'activité enzymatique recherchée, soit d'une grande pureté. On connaissait déjà des procédés de purification de la L-asparaginase. C'est ainsi que l'on peut effectuer une telle purifi-15 cation, par chromatographie sur colonne ou par précipitation fractionnée avec un sel minéral tel que le sulfate d'ammonium ; mais ces procédés ne présentent pas un grand intérêt sur le plan industriel et, de plus, dans le cas de l'emploi d'un sel minérs.1, on se heurte au problème de l'élimination de traces minérales dans le produit 20 purifié qui entraîne une opération supplémentaire de dialyse. On peut également effectuer la purification de la L-asparaginase par chauffage,à une température de 55°C,pendant dix minutes,d'une solution enzymatique ; cette méthode décrite dans le brevet français n° 1 585 246, permet la dénaturation d'une grande partie des protéï-25 nés présentes initialement et,de,ce fait,la précipitation de ces dernières que l'on peut facilement éliminer. Toutefois,bien qu'en raison de sa simplicité technique, cette méthode soit intéressante, elle ne permet pas l'obtention d'une L-asparaginase possédant une pureté suffisante•du fait de la difficul-30 té à avoir une température homogène du milieu. Afin de remédier à ces inconvénients, la demanderesse a trouvé un procédé de purification de L-asparaginase. Ce procédé consiste essentiellement à faire précipiter l'enzyme subi une purification préliminaire/ ayant /;par addition, sous agitation, a'un mélangé de glycerol et 35 d'alcool éthylique dans une solution aqueuse de L-asparaginase. Un tel procédé permet une précipitation lente et progressive favorisant, notamment la purification de l'enzyme et la formation de cristaux. 70 10333 2081581 La purification selon ce procédé peut être effectuée à une température comprise entre 0°C et 25°C et.de préférence entre 0QG et 5°C. Par ailleurs, la proportion de glycérol et d'alcool éthylique 5 utilisée, peut varier entre : 1 partie de glycérol pour 5 parties d'alcool éthylique et 3 parties de glycérol pour 5 parties d'alcool éthylique. Dans un mode d'exécution actuellement préféré, on utilise de préférence 1,5 à 2 parties de glycérol pour 5 parties d'alcool 10 éthylique et on ajoute les solvants organiques en 2 temps c'est-à-dire, dans un premier temps le glycérol puis dans un deuxième temps l'alcool éthylique. la solution aqueuse de L-asparaginase de départ peut être préparée par toutes les méthodes connues. Il est bien entendu, d'une 15 part, que la purification,selon le procédé de l'invention,peut être effectuée aussi bien sur des solutions de L-asparaginase de haute activité enzymatique que sur des solutions de très basse activité et, d'autre part, que dans le cas de l'emploi d'une solution peu riche en enzymes, il est possible d'appliquer plusieurs fois le pro-20 cédé de l'invention. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemple I : On ajoute entre 0°C et 5°C, sous agitation, dans 5 cm3 d'une 25 solution aqueuse de L-asparaginase brute à pH = 5,5 renfermant 1785 U.I. de L-asparaginase et 19 mg de protéine (soit une activité spécifique de 94 U.I./mg) 1,5 cm3 de glycérol puis 5 cm3 d'alcool éthylique. On agite encore pendant deux heures trente minutes à la même 30 température puis isole le précipité formé, par centrifugation. L'analyse du précipité obtenu est effectuée après redissolution de ce dernier dans l'eau. On obtient ainsi un mélange contenant 1 400 U.I. de L-asparaginase et 11 mg de protéines (soit une activité spécifique de 127 U.I./ 35 mg). Rendement : 78,5 Exemple II : A 5 cm3 d'une solution aqueuse de L-asparaginase brute à pH = 5»5 renfermant 5 255 à"a.sparaginase et 40,8 mg de protéines 70 10333 3 2081581 (soit une activité spécifique de 128,5 U.I./mg) refroidie au bain d'eau glacée, on ajoute successivement, sous agitation, 2 cm3 de glycérol puis 5 cm3 d'éthanol. On maintient encore pendant cinq minutes, sous agitation, puis laisse reposer une nuit à une tempéra-5 ture comprise entre 0°C et 5°C. On isole ensuite le précipité par centrifugation puis dissout ce dernier dans l'eau pour l'analyse. On obtient ainsi une solution contenant 5 100 U.I. de l-asparaginase et 23,2 mg de protéines (soit une activité spécifique de 220 U.I./ mg). Rendement : 97,2 10 Exemple III : A partir de la même matière première que dans l'exemple II et en opérant,à 20°C, dans les mêmes conditions, on obtient un produit cristallisé en fines aiguilles qui contient 5 130 U.I. de 1-aspara-ginase et 24,8 mg de protéines (soit une activité spécifique de 15 207 U.I./mg). Rendement : 97,7 %. 70 10333 4 2081581 REVENDICATIONS 1° Procédé de purification ^'enzymes du type asparaginase et, en particulier, de la L-asparaginase possédant une activité .antitumorale, /purification préliminaire, par caractérisé en ce que l'on fait précipiter 1 'enzyme ayant subi une/ 5 addition, sous agitation, de glycérol et d'alcool éthylique dans une solution aqueuse de L-asparaginase. 2° Procédé selon la revendication 1° caractérisé en ce que l'on effectue 1'.addition de glycérol et d'alcool éthylique à une température comprise entre 0°C et 25°C et de préférence entre 0°C et 5°C. 10 3° Procédé selon la revendication 1° caractérisé en ce que la proportion de glycérol et d'alcool éthylique utilisée varie entre 1 partie de glycérol pour 5 parties d'alcool éthylique et 3 parties-de glycérol pour 5 parties d'alcool éthylique. 4° Procédé selon la revendication 1° caractérisé en ce que l'on 15 ajoute successivement dans la solution aqueuse de L-asparaginase, le glycérol puis l'alcool éthylique.