Brevet FR2092756A1 — publié le 19720128

La présente invention eoneerne des composés destinés à guérir les atteintes des aux radiations, ainsi que son procédé de fabrication. I1 est connu que la biosynthèse du ADN dans les cellules des êtres humains et des mammifères est gravement compromise par les radiations ionisantes. On sait aussi, qutune telle biosynthèse est indispensable pour la division cellulaire et qu'ainsi l'inhibition de la biosynthése du ADN provoque l'impossibilité de la division cellulaire et conduit finalement à la mort des cellules. Récemment, le diagnostique et le traitement du début du cancer ont fortement attiré l'attention du monde médical et ont élargi l'emploi de différents traitements tels que ceux qui emploient des radotions ionisantes, des préparations pharmacologiques et des opérations ev-rZrgicales. Nais le traitement par radiations et le traitement pharmacologique sont généralement accompagnés par toutes sortes d'effets secondaires, particulièrement de nature inhématologique lorsque la division cellulaire est la plus active. I1 est donc souvent impossible de continuer le traitement anticancéreux à cause de graves effets econdaires, tels que leucopenia, une diminution anormale des globules blancs du sang. Il est donc hautement souhaitable de disposer d'une substance appropriée pour protéger et guérir les atteintes par radiations et une telle substance doit être capable de combattre les effets secondaires du traitement ar'- cancéreux. Il existe, pourtant, quelques médicaments protecteurs, par exemple des composés sulfhydrilés que réagissent avec les radicaux libres formés dans le corps humain par les radiations ionisantes et qui sont efficaces seulement lorsq':'ils sont administrés avant l'irradiation aux rayons X mitais il existe peu de substances capables de guérir les atteintes ffloar radiation lorsqu'elles sont administrées après les irradiations, De tels médicaments sont appelés "régénérateurs" et se distinguent des protecteurs. Aujourd'hui, c'est une substance régénératrice qu'on demande pour guérir les effets secondaires sévères qui accompagnent le traitement anticancéreux par radiations ionisantes, tels que les rayons X ou les rayons gamma du cobalt60 Jusqu'à maintenant, on ne connaît guère de substances capables de guérir l'inhibition de la biosynthèse du ADN et l'on a seulement pu confirmer le fait que du ADN de poids moléculaire élevé, isolé de certaines espèces, est efficace pour guérir les atteintes par radiations dans les cellules ou animaux irradiés. Il est très difficile d'utiliser la préparation de ADN isolé d'êtres humains pour guérir les atteintes par radiations, car il est bien difficile d'obtenir de tels tissus humains en tant que sources de ADN . Il faut donc considérer que pour l'emploi pratique de préparations d'ADN en tant que médicament, 1'ADN doit être isolé à partir d'autres espèces que les êtres humains. En outre, il peut exister un certain danger héréditaire pour les êtres humains lorsqu'on utilise de 1 'ADN hétérologue à poids moléculaire élevé en tant que médicament. Il est donc nécessaire d'utiliser un ADN de poids moléculaire plus faible, compris entre 200 000 et 500 000 pour éviter un tel danger héréditaire de mutation génétique,car on sait que de tels ADN de plus faible poids moléculaire ne peuvent pas provoquer une transformation génétique même dans les systèmes de bactéries. Il est connu que dans les animaux supérieurs, 1'ADN n'est pas présent à l'état libre, mais en combinaison avec l'histone, une protéine basique. Il est également possible que l'inhibition de la biosynthése de l'ADN ou la coupure fibrale de l'ADN dues aux radiations pzIsrt; gtre provoquées secondairement par les dommages causés à la protéine basique liée à l'ADN. On considère en conséquence qu'il est nécessaire non seulement de guérir les atteintes à la molécuale ADN ou l'arrêt de la biosynthèse de l'ADN mais aussi celles qui atteignent l'histone, protéine basique liée à 1'ADN et qui modifie la fonction biologique de ce dernier, ceci pour obtenir la guérison la plus efficace des atteintes subies par les mammifères irradiés. Il est tout à fait impossible d'utiliser une histone hétérologue en provenance d'autres animaux que les êtres humains pour guérir les atteintes par radiations à la moitié histone, car on ne peut pas éviter des réactions allergiques sévères dans les êtres humains auxquels on aurait administré une protéine hétérologue (réaction antigèe-anticorps). On sait, d'un autre coté que des acides aminés ou des polyamines de faible poids moléculaire de l'ordre de quelques centaines ne peuvent pas provoquer des réactions antigène-anticorps chez les mammifères. La présente invention a pour objet un composé pour guérir les atteintes par radiations7 composé caractérisé en ce qu'il est constitué par une polyamine basique et de l'acide désoxyribonucléique. Se basant sur les faits énumérés cidessus, il est à penser que l'administration de composés artificiels ADN et de polyamines basiques sans réactions antigènes ou d'acides polyaminés basiques qui ressemblent aux complexes naturel ADN et protéine basique, histone, serait plus efficace que la simple administration de l'ADN seul contre les atteintes par radiations. L'invention s'étend à un procédé de fabrication de composés d'ADN et de polyamine basique ou d'acides polyaminés basiques ci-dessus, caractérisé par les étapes suivantes : dissoudre un ADN ayant un poids moléculaire compris entre 200 000 et 500 000 isolé à partir de spermes de poisson tel que saumon, la truite ou à partir d'organes internes tels thymus, le foi ou le rein de mammifères comme le veau, de jeunes porcs, et des polyamines basiques ou des acides polyaminés basiques d'une quantité égale à 1/25 ou 1/50 du poids de l'ADN, séparément dans une solution diluée de chlorure de sodium (0,0015 N) ou une solution mixte de chlorure et de citrate de sodium (0,0015 N et 0,00015 M). On ajuste ensuite la valeur du pH de chaque solution à 7 exactement avec une solution d:hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique 0,1 N ; les solutions sont mélangées et mises à réagir, puis on abandonne le mélange à 370 C pendant environ 6 à 18 heures. On aJoute alors environ 5 fons le volume d'alcool à 99 5t au mélange réactiounelp on laisse reposer 30 mn, on sépare le précipité blanc obtenu par centrifugation à 5000 t/mn pendant 10 mn.On ajoute deux fois son volume d'éthanol à 99 io au précipité obtenu en agitant, on resoumet le mélange à une centrifugation à 5000 t/mn pendant 10 mn et l'on recristallise le précipité obtenu dans l'éthanol ou l'éther éthylique pour obtenir le composé ADN : polyamine basique ou acide polyaminé basique. les propriétés physiques et chimiques du composé formé de ADN et de polyamine basique ou d'acide polyaminé basique, conformément à ce procédé, sont les suivantes (1) Poids moléculaire 200 000 à 500 000 (2) temps de sédimentation 12 s ou plus (3) poids spécifique 1,650 - 1,700 (4) viscosité n sp/c = 3 x 1O-4 6 x (5) déviation optique spécifique tan0 = 5-3 - 1O-3 o (6) spectre d'absorption Emar = 2600 Ao - 2675 A (7) apparence poudre cristalline incolore (8) solubilité soluble dans 11 eau et les solutions salines diluées (0,015 N), insoluble dans l'éthanol, l'acétone et l'éther éthylique. L'effet curatif du produit conforme à la présente invention contre les atteintes par radiations a été testé selon deux méthodes. D'abord, par la méthode qui consiste à utiliser des cellules de tissus cultivées en cultivant les cellules d'origine humaine de cellules de foie Chang avec un MEM d'Eagle (milieu essentiel minimal) additionné de 10 % de sérum de veau dans une boite de pétri en verre pendant deux semaines jusqu'à formation de colonies visibles, puis à évaluer la restauration des cellules irradiées par rayons X après atteinte par radiations. Comme les cellules mortes sont incapables de former des colonies visibles, les effets de guérisons des composés conformes à l'invention ont été évalués en comptant les colonies visibles. les cellules de foie de Chang ont été soumises à l'irradiation de 200, 400, 600 et 800 R par des rayons X de 300 KVP et on évalue le nombre de cellules survivantes après deux semaines par comptage des colonies. En comparaison avec le groupe de contrôle sans addition de ADN, les groupes additionnés de ADN seul ont montré une faible augmentation d'environ 1,5 fois, du nombre de colonies à chaque dose de radiations. D'autre part, le complexe de l'ADN et de spermidine, qui est une des p(lyamines basiques a montré une efficacité marquée lorsau'il a été abouté à la culture immédiatement après l'irradiation X des celllalese Le nombre des colonies a été augmenté de quatre fois par rapport à celui du groupe de contrôle. Deuxièmement , l' effet de guérison des composés de l'invention a été testé par des expériences sur des souris entièrement irradiées par rayons X. Les souris utilisées étaient de race ddn, femelles, d'un poids de 20 à 25 g es radiations utilisées étaient : 550 R d'irradiation totale de 300 KVP. Au groupe de contrôle de souris a été injecté immédiatement après l'irradiation X une solution saline diluée (0,015 N NaCl et 0,0015 M de citrate qui était le solvant du complexe ADN/polyamine b?sique. Les injections furent répétées trois fois par semaine. Le deuxième groupe reçut une injection de ADN de sperme de hareng d'un poids moléculsire de 200 000 à une dose de 25 X g/g de poids rar voie intrapéritonale immédiatement après l'irradiation X. Les injections furent répétées 5 fois par semaine pendant 4 semaines Le troisième groupe a reçu des injections avec le complexe de ADN de sperme de hareng d'un poids moléculaire de 200 000 et de spermidine, une polyamine basique. Les proportions en poids du complexe étaient de 50 ADN et 1 spermidine. La dose de complexe injecté par voie intrapéritonale immédiatement après l'irradiation était de 25 g ADN équivalent par g de poids et les injections furent répétées trois fois par semaine pendant 4 semaines Le quatrième groupe reçut des injection- du même complexe ADN et spermidine mais le rapport pondéral était de 25 ADN et 1 spermidine. Les injections furent réalisées de la même façon que dans le groupe 2s Le cinquième groupe reçut des iriections de complexe ADN et spermidine, le rapport pondéral étant cette fois-ci de 10 ADN et 1 spermidine.Les injections ruent réalisées de la môme façon que dans le groupe 2. tes résultats sont montres dans le tableau 1 donnant le nombre de souris le nombre de souris ayant survécu après 30 jours après l'irradiation X 550 R et la durée moyenne de vie des souris irradiées, dans chaque groupe expérimental. TABLEAU 1 Nombre Souris ayant survécu durée de Groupe de 30 jours. vie souris ombre moyenne (jours) 1. solution saline diluée 48 8 6,3 13,75 2. ADN de faible poids moléculaire 25 g équ. ADN/g 48 9 19,5 15,88 3. complexe ADN : spermidine (50 : 1) 259qg équ. ADN/g 40 14 34,0 19,25 4. complexe ADN : spermidine (25 : 1) 25)eg équ. ADN/g 48 15 31,0 16,17 5. complexe ADN spermidine (10 o 1) 25 g ADN équ./g 40 14 34,0 18,43 l'injection du seul ADN était sensiblement inefficace pour le rapport de survie dans l'expérimentation sur souris irradiées entièrement par une dose supérieure à la dose LD50 Mais, on a reconnu que l'injection du complexe ADN et spermidine à des rapports pondéraux différents était suivie d'une augmentation de plus du double dans la survie des souris, d'une augmentation de la durée de vie moyenne et montrait un effet extrême sur les animaux d'expérience, en comparaison avec le groupe de contrôle. EXEMPLE 1 0,5 g de spermidine (C10H26N4 ; poids moléculaire 202,27) et 10 g de ADN d'un poids moléculaire d'environ 50C 000 extrait de spermes de saumon furent séparément dissous dans un mélange de 0,01 M de chlorure de sodium et 0,014 M de citrate de sodium et chaque solution fut ajustée au pK de 7,0 par addition de 0,1 N d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique 0,1 N. Puis, ces solutions furent bien mélangées pour provoquer la réaction et abandonnée au repos à 370 C pendant 18 heures.On a ajouté alors 5 volumes de 99 apÓ d'alcool et on a abandonné au repos pendant 30 mn. le précipité blanc obtenu fut séparé par centrifugation à 5 000 t/mn pendant 10 mn, puis additionné de deux volumes d'alcool éthylique 99 % sous agitation et centrifugé de nouveau à 5 000 t/mn pendant 10 mn. Le précipité recueilli est recristallisé dans l'alcool éthylique et l'on obtient 1094 g d'une poudre cristalline incolore. EXEMPLE 2 0,2 g de trichlorhydrate de spermidine (C7H19N3 ; poids moléculaire 145925) et 10 g de ADN d'un poids moléculaire moyen de 500 000 extrait de spermes de hareng sont dissous séparément dans un mélange 0,015 M chlorure de sodium et 0,0015 M de citrate de sodium les solutions sont ajustées au pH de 7 par l'hydroxyde de sodium 091 N ou 19acide chlorhydrique 0,1 N. Ces solutions sont intimement mélangées pour réagir et abandonnées au repos à 370 C pendant 18 heures. On ajoute ensuite 5 volumes d'alcool éthylique à 99 % et ion abandonne 30 mn. le précipité blanc obtenu est recueilli par centrifugation à 5 000 t/mn pendant 10 mn, additionné de deux fois son volume d'alcool éthylique à 99 %, re^entrifugé pendant 10 mn à 5 000 t/mn. le précipité est recristallisé dans l'éther éthylique et l'on obtient 1091 g du produit désiré sous forme d'une poudre cristalline incolore. EXEMPLE 3 0,5 g de cadavérine (C5H14N4 ; poids moléculaire 102,18) et 5 g ADN d'un poids moléculaire moyen de 300 000 extrait du thymus de veau sont dissous séparément dans du chlorure de sodium 0,01 LT et les solutions obtenues sont mélangées pour réagir et abandonnées au repos à 370 C pendant 36 heures. le mélange réactionnel est traité comme à l'exemple 1 et l'on obtient 5,3 g du produit désiré sous forme d'une poudre cristalline incolore. EXEMPLE 4 i g de polylysinen un acide polyamine basique, et 10 g de ADN d'un poids moléculaire moyen de 200 000 extrait du thymus de veau sont dissous séparément dans le chlorure de sodium 001 M et les solutions obtenues sont mélangées et abandonnées pendant 18 heures à 370 C. le mélange réactionnel est traité comme à l'exemple 1 et l'on obtient 1051 g au produit désiré sous forme d'une poudre cristalline incolore EXEMPlE 5 0,1 g de polyarginine, un acide polyaminé basique, et 5 g de ADN d'un poids moléculaire moyen de 500 000 extrait de spermes de saumon sont dissous séparément dans du chlorure de sodium 0,01 M puis les solutions obtenues sont mélangées et abandonnées au repos pendant 18 heures à 370 C. Le mélange réactionnel est traité comme à l'exemple 1 et l'on obtient 5 g du produit désiré sous forme d'une poudre cristalline incolore. Bien entendu l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits, à partir desquels on pourra prévoir d'autres variantes de réalisation sans pour cela sortir du cadre de 1' invention0 REVENDICATIONS 10 - Composé pour quérir des atteintes par ra- diations, composé caractérisé en ce qui est constitué par une polyamine basique et de l'acide désoxyribonucléique. 20 - Procédé de fabrication d'un composé capable de prévenir et de guérir des atteintes par irradiation conforme à la revendication i à partir d'acide désoxyribonu cléique et d'une amine basique, procédé caractérisé en ce qu'on dissout l'acide désoxyribonucléique et l'amine basique séparément dans une solution diluée de chlorure de sodium contenant éventuellement du citrate de sodium, on mélange les solutions obtenues pour les faire réagir, on abandonne au repos le mélange réaction nel à 37 C entre 6 et 36 heures, on ajuste les valeurs de pH du mélange à 7,0, on ajoute de l'alcool au mélange et on recueille le précipité formé par centrifugatior.