Brevet FR2068458A1 — publié le 19710827

La présente invention concerne un nouvel glucoside antibiotique et un procédé pour obtenir celui-ci. Conformément à l'invention, le nouvel glucoside antibiotique, oui a pour formule brute , renferme à titre d'aglucor.e la chromomycinone soudée sur trois radicaux de désoxyo-sen, dont deux sont identifiés à l'oliose et l'olivose. Le produit précité a la -formule développée suivante : OMe ÛMe OU Ledit glucoside antibiotique est une substance pharmacolo-ginuement active et utilisable comme médicament pour le traitement de néoplasies malignes. L'invention comprend donc également un médicament contenant-à titre de principe actif, le "glucoside antibiotique précité". Le mécanisme d'action attribué à l'antibiotique en question consiste à inhiber la synthèse des ARÎI (acides ribonucléicues) qui est cous là dépendance des A DM (acides dé:;oxyribonucléiques ) et qui a pour siège des systèmes biologiques variés, notamment les bactéries grampositives et résistant aux acides, les cellules tumorale.';, etc. Le glucoside antibiotique se présente sous la forme d'une poudre amorphe de couleur jaune, facilement '-oluble dans les alcool"- et 1er. esters, difficilement solible dans l'eau, avec un point de fusion de 162 à lo-5 °C (avec décomposition). Le pro-îéc'é d'obtention dv nouveau glucoside antibiotique conforme à l'invention consiste à faire incube?1 une culture d'Aeti nomycer: oli vo-.ari abilis sp. now. productrice du glucoside antibiotique, sur un milieu nutritif contenant des sources de ORIGtNAt 70 28757 2 2068458 carbone, d'azote et sels minéraux communément utilisés, à séparer le mycélium à l'issue de la cultivation, à ajuster la solution native par acidification à. un pH compris entre 2 et 4 puis extraire le glucoside antibiotique par un solvant organique, à concentrer l'extrait par évaporation, à faire précipiter le produit visé dans la solution ainsi concentrée, à l'aide d'un solvant organique, et à isoler le produit visé, la culture d'Actinomyces divovariabilis sp. now productrice de glucoside antibiotique, présentant les caractères morphologiques et propriétés physiologiques suivants : les sporophores unitaires ou groupés en touffes ont la forme de spirales quel que soit le milieu et prennent naissance sur des courtes ramifications ; les spirales sont serrées et revêtent l'aspect de pelotons : les spores sont oblongues et ovales à cuticule lisse ; on observe sur le milieu minéral n°l •>ause une croissance modérée, les colonies sont planes, profondément enfoncées dans la gélose, le mycélium aérien est développé de façon modérée., présente un aspect pelucheux de couleur gris foncé : les filaments immergés sont de couleiir olive gris ; le pigment soluble est absent ; on observe sur le milieu organique n° 2 "-ause une croissance modérée, le mycélium aérien est pelu-cheux, faiblement développé, de couleur violet grisâtre ; le -mycélium immergé est de couleur olive foncé ; le milieu est coloré au ton des filaments immergés ; on observe sur un milieu contenant de la tyrosine une croissance modérée, le mycélium aérien est faiblement développé, de couleur gris ; le mycélium immergé est de couleur ombre foncé ; ne produit pas de mélanine ; ne liquéfie pas la gélatine ; peptonise le lait au 20-ème jour ; dégage H^S ; n'hydrolyse pas l'amidon ; ne réduit pas les nitrates. Il est avantageux de faire incuber la culture d'Actinomyces olivovariabilis sp. now. sur un milieu de la composition suivante en masse : farii.e de soja 2, amidon 2 à i:, glucose 0 à 2, chlorure de sodium 0,5, carbonate de calcium 0,5, sulfate d'ammonium 0,4, phosphate monopotassique ou phosphate dipotassique 0,C^, le reste étant de l'eau, le.pH du milieu étant de 6,b à 7,0, ainsi que sur un milieu de la composition suivante- en ^ masse : liqueur de macération du mais (corn-steep), 1 (poids brut), amidon 2,C, glucose 2,0, chlorure de sodium 0,5., carbonate de calcium 0,5> sulfate d'ammonium 0, 4, le reste étant de l'eau, le p:I ru milieu étant de 6,8 à 7,0. BAD OFH&JfclAl 70 28757 3 2068458 Pour l'extraction du glucoside antibiotique à partir de la liqueur de eulturè après la séparation du mycélium., il est rationnel d'utiliser en tant que solvant organique l'acétate d'éthyle ou le butanol. 5 Pour la précipitation du produit désiré, il est préférable d'utiliser en tant que solvant organique l'éther diéthylique, l'hexane. En vue de l'obtention du glucoside antibiotique chromatogra-phiquement pur, on fait subir au produit visé isolé une purifica-10 tion par chromatographie sur colonnne et en couche mince, en se servant comme sorbant du gel de silice et comme solvants des mélanges chloroforme-méthanol ou benzène-acétone. Le procédé objet de l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante. 15 Une culture d'Actinomyces olivovariabilis sp. now. sert de culture productrice du nouvel glucoside antibiotique. Cette nouvelle espèce d'actinomycète que le Demandeur a isolé présente les caractères morphologiques suivants. Les sporophores unitaires ou groupés en touffes sont en forme de spirales quel 20 que soit le milieu et prennent naissance sur de courtes ramifications. Les spirales sont fortement serrées, ont 1 à J boucles, revêtent parfois l'aspect de pelotons ; les spores sont oblongues et ovales à cuticule lisse. On observe sur le milieu minéral n° 1 -:ause une croissance 25 modérée, le.? colonies sont planes, profondément enfoncées dans la gélose. Le mycélium aérien est développé de façon modérée, pelucheux, de couleur gris foncé (à peu près A 2 d'après Bondartsev, W5 d'après Prauser). Le mycélium immergé est de couleur olive gris, noisette foncé (H 1 ; K 5 d'après Bondartsev ; 30 CÔ5-5 m d'après Prauser). Le pigment soluble est absent. Sur le milieu Czapek et CP 1 Kras~ilnikov, le caractère de la croisoanoe présente des écarts peu importants par rapport au milieu susmentionné. Sur le milieu à base de glucose et d'asparagine, on observe 55 une bonne croissance, le mycélium est pelucheux, développé de façon modérée de couleur gris. Les filaments immergés sont de couleur olive foncé, bai foncé (b 6, Tï 4 d'après Bondartsev). Quelquefois le milieu se colore légèrement au ton des filaments immergés. 40 Sur le milieu à base de glycérine et d'asparagine, on obserBAD ORIGINAL 70 28757 4 2068458 ve une bonne croissance, les colonies sont mamelonnées, parfois fendillées. Le mycélium aérien n'existe pas. Les filaments immergés sont de couleur beige ( L / d'après Bondartsev). Le pigment soluble est absent. 5 Sur le milieu amidonné ammoniacal, on observe une croissance modérée. Le mycélium aérien est pelucheux, développé de façon modérée, de couleur gris. Le mycélium immergé est de couleur olive gris, parfois brun foncé ( L 5 d'après Bondartsev ; o,5 r d'après Prauser). Le pigment soluble est absent. 1C Sur le milieu à base d'avoine, on observe une bonne crois sance. Les filaments aériens sont pelucheux, développés de façon modérée, de couleur gris foncé tirant sur le vert (J 5 d'après Bondartsev, C6r d'après Prauser). Les filaments immergés sont de couleur bai foncé, olive foncé. Le milieu est légèrement coloré 15 au ton des filaments immergés et acquiert quelquefois avec,l'âge une coloration framboise pâle. Sur le milieu organique n° 2 Gause, on observe une croissance modérée. Le mycélium aérien est pelucheux, faiblement développé, de couleur violet grisâtre ou gris pâle (a3> a6, d'après 20 Bondartsev). Le mycélium immergé est de couleur olive foncé, bai foncé. Le milieu est coloré au ton du mycélium immergé. Sur le milieu contenant de la tyrosine on observe une croissance modérée. Le mycélium aérien est faiblement développé, de couleur gris. Le mycélium immergé est de couleur ombre foncé.(P2 25 d'après Bondartsev), bai foncé. Ne produit pas de mélanine. Les propriétés physiologiques de la nouvelle espèce sont les suivantes.: ne liquéfie pas la gélatine.; peptonise le lait au 20-ème jour ; dégage ;.n1hydrolyse pas l'amidon ; ne réduit p.as les nitrates. - . 30 L'assimilation des sources de carbone sur le milieu Pridham- "ottlieb est la suivante : •'îlucose +++- • . . . . arabinose. - xylose -«-+ 35 rhamnose - ... raffinose -. - maltose saccharose ■ - . ■. ...... ; marmite - . - ... . 40 inosite L+ BAD ORIGINAL 70 28757 2068458 On a décelé dans la liqueur de culture de 1'actinomycète un pigment du type anthocyane. Au cours des investigations, on a mis en évidence une forte hétérogénéité de la culture, qui s'est traduite par la formation 5 spontanée d'une grande quantité de variantes morphologiques et physiologiques présentant des caractères invariables. On ensemence un milieu nutritif par la culture susmentionnée d'Actinomyces oli-/o--rariabilis sp. n?v et on conduit la fermentation pendant 130 à 1^3 heures à une température de 2; à 2o °C. 10 Ensuite, on sépare par filtration le mycélium du bouillon de culture et on acidifie le filtrat avec de l'acide chïorhydrique.. sulfurique, ou avec n'importe quel autre acide minéral jusqu'à un p!I compris entre 2 et 4, après quoi on extrait le produit visé par un solvant organique, par exemple l'acétate d'éthyle, l'acéta-15 te de butyle, le butanol, etc. Il est préférable d'effectuer l'extraction par de l'acétate d'éthyle ou du butanol. S'il s'agit de l'obtention du produit final ^.'une qualité plus haute, on soumet l'extrait à un traitement par une solution aqueuse de bicarbonate de sodium, après quoi on acidifie la phase aqueuse a^ec un 20 acide minéral (chïorhydrique, sulfurique ou n'importe quel autre) jusqu'à un pH de 2 à 4 puis on extrait derechef par un solvant organique. On réduit le volume tït l'extrait obtenu par évaporation jusqu'à un volume aussi petit que possible et on précipite le 25 produit visé par un solvant organique, notamment l'hexane, l'étrier de pétrole, l'éther diéthylique, etc. Les résultats les plu- favorables sont obtenus si l'on utilise l'hexane ou l'éther diéthyli-que. En vue de l'obtention du glucoside antibiotique chromatogra-30 phicuement pur, on le soumet à une purification complémentaire succès-rivement par ohromatographie sur colonne et en couche mince, en x;tilisant comme sorbant le gel de silice et comme solvants les mélanges chloroforme-méthanol (9:1) ou benzène-acétone (1:1). La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exem-35 pie': suivants d'-.xécution du procédé d'obtention du glucoside antibiotique. Exemple 1. Un milieu nutritif présentant la composition suivante en 1 en poids : farine de soja 2,0 ; amidon 2,0 ; glucose 2,0 : ^0 chlorure de sodium 0,5 S carbonate de calcium 0,5 ; sulfate BAD ORIGINAL 70 28757 6 2068458 d'ammonium 0,4 ; phosphate acide dipotassique 0,04, et placé dans un appareil d'une capacité de 100 litres a été ensemencé par une culture d'Actinomyces olivovarrî abilis engagées à raison de 5 à 10": en volume. La fermentation a été conduite pendant 140 heures à une température de 2o à 2b °C. Ensuite, on sépare le mycélium par filtration et on acidifie 40 litres du filtrat obtenu par de l'acide chïorhydrique à 10 % jusqu'à un pH de 2 à 2,5 (1" sur un potentiomètre). L'extraction est effectuée à trois reprises par de l'acétate : d'éthyle (15,10 et 7 litres), les extraits à acétate d'éthyle réunis sont lavés à l'eau en vue d'éliminer l'excès d'acide (le pK de l'eau de lavage est d'environ 5) puis concentrés par évaporation sous vide jusqu'à 0,ldu volume primitif. Le produit concentré est épuisé à trois reprises par une solution aqueuse à 5 % d'hydrogénocarbonate de sodium (1 ; 0,5 et 0,3 litre). On acidifie l'extrait par de l'acide chïorhydrique à 10 % jusqu'à un pH de 2 à 2, 5 (déterminé potentiométriquement), après quoi on extrait trois fois par de l'acétate d'éthyle (0,4 litre et deux fois 0,2 litre). Les extraits à acétate d'éthyle réunis sont lavés à l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et concentrés . par évaporation. On fait précipiter l'antibiotique par un volume décuple d'hexane. Le précipite qui en résulte est séparé par filtration, lavé avec de l'hexane puis séché. Le rendement en produit, visé brut est de 3 g. On place 0,5 g de glucoside antibiotique brut, dissous dans un mélange chloroforme-méthanol (9:1), dans une colonne (15 x 'oo) garnie de 30 g de silicagel exempt d'ions fer. La révélation et l'élution sont effectuées par le même mélange. L'analyse des fractions obtenues est opérée par la méthode 0 de chromatographie en couche mince avec le même système des solvants. Les fractions contenant le glucoside antibiotique sont réunies, évaporées à siccité sous vide, dissoutes dans un petit volume d'acétate d'éthyle puis déposées sur des plaques avec du solicagel. Après séchage on procède à la chromatographie avec le système de solvantr; susmentionné s A partir de la zone ayant le coefficient de distribution Rf compris entre o,55 et 0,6 on obtient le glucoside antibiotique chromâtographiquement pur par élution avec du méthanol suivie d'une concentration sous vide et d'une réprécipitation par de l'hexane au sein d'acétated'éthyle. On isole le glucoside antiBAD ORIGINAL 70 28757 " 2068458 biotique sous la forme d'une poudre amorphe de couleur jaune, facilement soluble dans les alcools méthylique et éthylique, les esters, difficilement solubles dans l'eau. F l62-l65°C ( avec décomposition). Calculé : C 3-', •>-; ; H ',02 Pour C, t: ,r :2" O' Trouvé " : C 5.',90 ; h "',02 ^ o 2b L'équivalent déterminé par titration au moyen d'une solution 0, 1 N d'hydroxyde de sodium, en milieu de mélange méthanol-ben--zène, est de 10'3- On a calculé pour C52""'6°24~ 1084. " 20 49- 2° (0,5 : éthanol). \ metnano1 230 ; 2dC-'X ^ ' max i ^ 31'7 ; 330 (épaulement ; 412 nm ( Z ' 17^ ; 30O ; 59.5 ^0) 1 cm V (huile de vaseline, cm "*") 3^00-3450: 1'20: 1535: 1580 ; 1520 , 1180 : 10^C ; 1010 ; 910 : 8^0: Exemple 2. On conduit le processus comme dans l'exemple 1 jusqu'à l'étape d'extraction du glucoside antibiotique. L'extraction est opérée trois fois par du butanol (12 litres, 8 litres et 5 litres). Les extraits réunis sont lavés avec un petit volume d'eau puis concentrés par évaporation sous vide jusqu'à 0,3 Le résidu est dissous dans une faible quantité diacétate d'éthyle puis pré ipité par addition d'éther diéthylique. Le rendement en glucoside antibiotioue e~t de 2,'z g. En vue de l'obtention de l'antibiotique chromatographiauement pur. on effectue la purification comme dans l'exemple 1.- BAD ORIGINAL 70 28757 b 2068458 r : v e h p i c ft t i c :■! e 1. Un glucoside antibiotique ayant pour formule brute P ij n S2 ' '3' 2k, ledit glucoside antibiotique étant c a r a c t é -r i s é en ce qu'il renferme à titre d'aglucone la chroirornycinone soudée sur trois radicaux dedésoxyoses, dont deux sont identifiés à l'oliose et 1'olivose. 2 Un procédé d'obtention du glucoside antibiotique c a r a c-t é r i s é en ce qu'on fait incuber une culture d'Actinomyces olivovariabilis sp. now. productrice du glucoside antibiotique sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote et sels minéraux communément utilisés à l'issue de la cultivation on sépare le mycélium, on acidifie le filtrat de la liqueur de culture jusqu'à un pK compris entre 2 et après quoi on extrait le glucoside antibiotique par un solvant organique, on concentre l'extrait par évaporation, on fait précipiter le produit visé par addition dans la solution ainsi concentrée d'un solvant organique et on i.-ole le produit visé, la culture d'Actinomyces ol ivovariabilis sp now. productrice du glucoside antibiotique présentant les caractères morphologiques et propriétés physiologiques suivantes : les sporophores unitaires ou groupés en touffes sont en forme de spirales quel que soit le milieu et prennent naissance sur de courtes ramifications ; les spirales sont serrées, revêtent l'aspect de pelotons : les spores sont oblongues et ovales à cuticule lisse ; on observe sur le milieu minéral n° 1 îauce une croissance modérée, les colonies sont planes, profondément enfoncées dans la gélose, le mycélium aérien est développé de façon modérée, pelucheux, de couleur gris foncé ; le mycélium immergé est de couleur olive gris ; le pigment soluble est absent ; on observe sur le milieu organique n° 2 "îause une croissance modérée, le mycélium aérien est pelucheux, faiblement développé, de couleur violet grisâtre : le mycélium immergé est de couleur olive foncé ; le milieu est coloré au ton du mycélium immergé ; on observe sur un milieu contenant de la tyrosine une croissance modérée ; le mycélium aérien est faiblement développé, de couleur gris : le mycélium immergé est de couleur ombre foncé ; ne produit pas de mélanine ; ne liquéfie pas la gélatine ; peptonise le lait au 20-ème jour ; dégage HgS ; n'hydrolyse pas l'amidon ; ne réduit pas les nitrates. 3- Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'en tant que milieu nutritif, on utilise un milieu de BAD ORDINAL 70 28757 9 2068458. la composition suivante en % en poids : farine de soja 2 : amidon 2 à 4 ; glucose 0 à 2 ; chlorure de sodium 0,5 ; carbonate de calcium 0,5 ; sulfate d'ammonium 0,4 ; phosphate acide monopotas-sique ou dipotassique C-,04 : le reste étant de l'eau ; le pH du milieu est de 6,8 à C. 4. Un procédé selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'en tant que milieu nutritif, on utilise un milieu de la composition suivante en % en poids : liqueur de macération du mais 1,0 (poids brut) ; amidon 2,0 ; glucose 2,0 : chlorure de sodium 0,5 ; carbonate de calcium 0,5 ; sulfate d'ammonium 0,4 ; le reste étant de l'eau ; le pH du milieu est de 6,S à ",G. 5. Un procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'en vue de l'extraction du glucoside antibiotique on utilise, en tant que solvant organique, l'acétate d'éthyle, le butanol. 6. Un procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'en -'ue de la précipitation du produit visé,on utilise en tant que solvant organique, 1'éther di éthylique, 1'hexane. 7. Un glucoside antibiotique obtenu par le procédé tel que défini suivant l'une quelconque des revendications 2 à 6. 8. Médicament, notammment pour le traitement des néoplasies malignes, caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, un glucoside antibiotique tel que défini suivant l'une quelconque des revendications 1 et BAOÔRIG1NAL