Brevet FR2060322A1 — publié le 19710618

-1 2ÔéÛ322 La présente invention se rapporte d'une manière générale aux substances antibiotiques et concerne plus particulièrement de nouveaux antibiotiques de la famille de la rifamycine, à savoir la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV, la 27-déméthoxy-5 27-hydroxyrifamyeine B, et la 25-désacétyl-27-déméthoxy-27-Iiydroxy-rifamyeine, ainsi qu'un procédé pour leur préparation par fermentation de certains mutants de Streptomyces mediterranei qui possèdent la propriété de produire ces antibiotiques directement dans le bouillon de culture. 10 La souche produisant la 27-déméthoxy-27-hydroxy- rifamycine a été obtenue à partir d'une culture de"Streptomyces mediterranei, producteur de la rifamycine B, après traitement mutagénique par la N-méthyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine. Les colonies survivant au traitement mutagénique ont été isolées et 15 soumises à des essais dans des fioles à fermentation; on a contrôlé l'aptitude des cultures à Inhiber la croissance de Pseudomonas reptilivora NKBL-B-6, cultivé sur de la gélose d'ensemencement de Penassay à pH 7,2. Dans ces conditions, la rifamycine B ne possède pas d'acitivité raicrobiologique et on peut 20 isoler les souches productrices de la 27-déméthoxy-27-hydroxyri-famycine SV. L'un de ces nouveaux.mutants qui s'est avéré particulièrement efficace dans la production de la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine avec des rendements élevés, a reçu le n° de code interne S-955. La souche a été déposée à la collection de 25 microorganismes des E.U,A ÂTCC sous le "n° 21".411» • La souche S-955j .sur les milieux classiques de culture du genre Streptomyces, conserve la taxonoraie initiale de Streptomyces mediterranei. On n'observe que qeulques différences dont les plus importantes sont : 50 1°) l'absence d'hyphes aériens et de conidies 2°) une coloration différente du pigment soluble. Le tableau I ci-après rapporte les.caractéristiques de culture sur des milieux variés, comparativement à celles de la, souche ATCC 13.685 de Streptomyces mediterranei> productrice de la 35 rifamycine B. Caractéristiques de culture comparatives de Streptomyoes mediterranei ATCC 13.685 efc souche S-955 ATCC 13.685 ' S-955 Mycélium végétatif Mycélium aérien Pigment s0lubie Mycélium végétatif- Mycélium aérien' Pigment s0lubie Gélose à l'amidon hyalin à beige blanc rosâtre jaunë vert à beige jaune brun h brun absent brun foncé Gélose au glucose-malate de Ca hyalin à beige blanc rosâtre Jaune pâle orangé à. brun orangé absent brun orangé Gélose au glycé-rol-malate de Ca hyalin à belge blanc légère- rement orangé. rare, orangé pâle brun orangé absent beige ; orangé Gélose de Bennett hyalin à jaune orangé blanc rosâtre. jaune brun très pâle brun jaune à brun frouge absent rouge■pâle VI O ro va 00 ro oc rv> fO O 0Y O Kj4 i\d ro 70 27828 3 2060322 ■Les milieux mentionnés dans le tableau ci-dessus ont la composition ci-après : Gélose à l'amidon - amidon soluble : 10 g, KH^PO^ :1g; MgSO^, 7H20 :1 g; NaCl: 1 g; (NH4)2S04: 2g; FeSO^THgO, MnCl2,4ff20,ZnS04, 7H2 5 0,001 g chacun; géloae Difco : 20g; eau" distillééî eoraplé^nt'à 1 litre.Après stérilisation à 120°C pendant 20 mn,pH : 6,7 à 6,8. Gélose au glucose et malate de Ca - glucose : 20 g; malate de . Ca : 10 g; NH^Cl : 0,5 g; K-gHPO^ : 0,5 g; gélose Difco : 15 g; eau distillée : complément à 1 litre. Après stérilisation à 115°C 10 pendant 15 mn, pH : 6,5. ■ ■ - Gélose au glycérol et malate de Ca - glycérol : 10- g; malate de Ca : 10 g; NH^Cl : 0,5 Si KHgPO^ : 0,5 Si gélose Difco : 15 g; eau distillée : complément à 1 litre. Après stérilisation à 115°C pendant 15 mn : pH 6,5 à 6,6. 15 Gélose de Bennett - glucose : 10 g ; extrait de levure : 1 g; extrait de boeuf : 1 g; N-Z-amine A : 2 g; gélose 15 g; eau distillé : complément à 1 litre. Après stérilisation à 120°C pendant 20 mn, pH : 6,7 à 6,8. Le mode opératoire consiste à cultiver Strep-20 tomyces mediterranei S-955 dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote assimilables et les sels minéraux essentiels, jusqu'à ce que le milieu présente une activité antibiotique notable; on extrait alors la 27-déméthoxy-27-hydroxy-rifamycine du milieu. Plus précisément, le mutant est cultivé en 25 culture submergée agitée et aérée à une température de 2# à 3>2°C et de préférence au voisinage de 28°C. On peut utiliser comme sources de carbone les hydrates de carbone et autres dérivés ci-après : le glucose, le galactose, le lactose, le saccharose, le maltose, le glycérol, le mannitol etc. Comme sources d'azote j50 utilisables on citera par exemple les aminoacides et leurs mélanges, les peptides, les protéines et leurs hydrolysats, par exemple les peptones, les extraits de levure,, la farine d';arachides, la farine de scja, les' liqueurs de macération dé maïs, les solubles de poissons, les extraits de viande, les fractions 35 aqueuses de graines de céréales. La fermentation peut être conduite pendant une durée de 12 à l80\heures. Le pH de départ qui est en général d'environ èfk. diminue en cours de fermentation jusqu'à 5,5-5,8. En général, on obtient les meilleurs résultats au bout de 150 à l60 heures de fermentation. Dans ces durées: de 70 27828 4 2060322 fermentation, le rendement en 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine est excellent. Eh fin de fermentation, on peut isoler la' 27-démé-thoxy-27-hydï'oxyrifamycine par le mode opératoire suivant : on filtre le milieu de fermentation à pH compris entre 6,2 et 8,4. 5 On acidifie ië pH entre 1 et 5 et on l'.extrait par un solvant non miscible à l'eau comme l'acétate d'éthyle, 1*acétate de butyle, le butanol, le chloroforme. On évapore ensuite le solvant jusqu'à petit volume et on précipite les produits par addition d'hexane, d'heptane bum autre hydrocarbure aliphatique comme 10 l'éther de pétiole, la ligroîne etc. Le mélange de produits obtenu, peut être fractionné par des techniques usuelles parmi lesquelles les plus intéressantes sont la chromatographie sur une colonne de gel de silice en éluant à l'aide d'acétone et de chloroforme, la chromatographie sur "Sephadex", en éluant 15 avec des solutions aqueuses tamponnées à un pH de 4 à 7 ou la distribution à contre courant. Pour cette dernière technique de fractionnement, le système de solvants consistant en un tampon au phosphate (pH 5,5 à 7,0) comme phase stationnaire et l'acétate d'éthyle comme phase mobile donne satisfaction. Après fraction-20 nement et purification, on peut identifier les produits suivants: la 27-déméthoxy-27-hydroxyr 1 famyc ine SV la 27-déméthoxy-27-hydroxyrlfâinycine B la 27-déméthoxy-27-hydroxy-25-désacétylrifamycine SV Les caractéristiques de'ces produits sont indi-25 quées dans l'exemple 3 ci-après, avec un mode opératoire permettant de les isoler. Les composés décrits dans la présente demande possèdent une bonne activité antibactérienne. Et on notera tout particulièrement leur activité sur- certaines bactéries Gram-néga-30 tives comme Fusibacteriura Fus!forme I.S.S. A titre d'exemple, la concentration minimale d'inhibition de la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV est de 0,05 gamma/ml,. Les exemples suivants-illustrent l'invention sans toutefois la limiter; dans ces exemples lés indications de 35 parties et de % s'entendent en poids sâuf -mention contraire. Exemple 1- On fait pousser la souche S-955 pendant 6 à 8 jours sur de la gélose de Bennett et on fait incuber à 28°C. Avec la culture obtenue sur la gélose inclinée, on inocule deux fioles 70 27828 5 2060322- 10 d'Erlenmeyer de 500 ml en conditions stériles. Les fioles contiennent 100 ml du milieu végétatif de composition ci-après : extrait de boeuf 5 g extrait de levure 5 g peptone 5 g hydrolysat de caséine 3 g glucose 20. g NaCl ' 1,5 g eau de ville qsp 1 litre On règle le pH à 7,2 par NaOH. Après stérilisation (20 mn à 120°C) le pH est de 6,6 à 6,8. Les fioles inoculées dans ces conditions sont placées sur un agitateur alternatif à 28°C pendant 72 heures. Le contenu de ces deux fioles est utilisé comme inoculum par introduction dans un 13 préfermenteur de 10 litres contenant 4 1 du milieu végétatif de composition ci-dessus. L'incubation est réalisée à 28°C en agitant à .750 tours/mn et en aérant au débit de 1 volume/v/mn. Après 30 heures de culture, on obtient un volume de 7 à 10# de cellules tassées. 20 Dans le stade suivant, on utilise un fermenteur en verre de 10 litres contenant 4 litres du milieu ci-après : farine d'arachides 25 g farine de soja 5g (NH^gSG^ 9,5 g 23 .MgS04,7H20 0,85g glucose - 95 g glycérol. 40 g kh2po4 1 g propylène glyeol 5 g 50 CaCO^ 8,5 g diéthylbarbiturate de N'a 1,7 g CuS04,5H20 * 2,8 mg FeS04,7Hg0 8,5 mg ZnS04,7H2Q 42,5 mg 35 MnSO^, 4H20 3*4 mg CoCl2,6H20 1,7 mg (NH^gîfey^^O 0,85 mg eau de ville qsp 1 litre 70 27828 6 2060322 Le milieu, au pH réglé à 7,8 par NaOH, est stérilisé pendant 60 mn à 120°C. Après stérilisation, le pH est de 6,3-6,4. On utilise comme inoculum une quantité représentant 5# de la quantité contenue dans le préfermenteur. 5 La fermentation est effectuée à 28 °C en agi tant à 750 tours/mn et en aérant au débit de 1 v/v/mn. Pour abattre.les mousses, on utilise le "Silicone A". Le bouillon de culture prend en cours de fermentation une coloration rouge brun sombre caractéristique. Au bout de 160 heures environ 10 de culture, on obtient un volume de 20 à 25$ de cellules tassées; le pH du bouillon est de 6,2 et l'activité antibiotique la plus forte est atteinte (1.500-1.800 gamma/ml de 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV). On récolte alors le bouillon. 15 Exemple 2 On prépare dans une fiole,sous agitation, « une culture de Streptomyces mediterranei S-955* obtenue comme décrit dans l'exemple 1. Pour la préculture, on coule dans un fermenteur en verre de 10 litres contenant 4 litres du milieu 20 suivant r . . glucose 5 g liqueur de macération de mais 15 g CTaCO^ 1,65 g MgS04,7H20 0,35 g 25 kh2po4 0,33 g FeS04,H20 3,3 mg ZnS04,7H20 . 16,5 mg MnS0lj.,4H20 1,3 mg eau de ville qsp 1 litre 30 Le milieu,dont le pH est réglé à 7,5 est stérilisé 50 mn à 120°C. Après stérilisation, le pH est de 6,4, La culture est ineubée à 28°C sous une agitation de 750 tours/mn et une. aération au débit de 1 v/v/mn. Pour abattre les mousses, on utilise le "Silicone À11. Après 38 heures de culture, le 35 volume des cellules tassées représente 6 à 8 % ùu volume total. On-utilise- un inoculum égal à 1.0# pour un fermenteur en verre de 10 litres contenant 4 litres du milieu de fermentation "ci-après liqueur de macération de maïs 35 g (NH4)2S04 9,5 g MgSOv 7H20 0,85 g 70 27828 2060322 7 glucose 100 g diéthylbarbiturate de Na 1,5 g ' CaCO^ ' • - 9,5 g • • PeS04,7H20 • ' •' 8,5 mg 5 . ZnS04,7H20 . : ; 42,5 mg MnS04,4H20 • •' 3,4 mg CuSO^,5H20 -- 2,8 mg CoCl2,6H20 • 1,7 mg eau de ville - qsp 1 litre Le pH est réglé à 7,8 par NaOH et le milieu stérilisé 50 mn à 120°C. Après stérilisation, le pH est de 6,3-6,4. La fermentation est conduite à 28°C dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, pendant 160 heures. A la récolte, le pH du bouillon de fermentation est de 6,4 et la 13 quantité de 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycinê SV est dé 1.000 gamma/ml. Au bouillon de fermentation (d'un volume de 4 litres environ) obtënu comme décrit dans l'exemple 2, on ajoute 8 g d'ascorbate de sodium afin de maintenir les substances anti- A ■*- > » biotiques sous leur forme réduite et de l'hydroxyde de sodium 20 en quantité suffisante pour porter le pH à la valeur de 7,5. Le bouillon est ensuite filtré sous vide à l'aide d'agents filtrants. Le mycélium est lavé à l'eau. Le filtrat et les lavages sont extraits à deux reprises par 4 litres d'acétate d'éthyle après acidification à pH 2,5. On concentre les extraits combinés 25 sous vide jusqu'à volume final d'environ 300 ml. Un refroidissement de la solution provoque la précipitation d'impuretés colorées qu'on élimine par filtratfcm. La solution claire est ensuite concentrée sous vide à volume final de 100 ml environ et coulée dans 1 litre d'éther de pétrole. Après fil'tration et séchage, on 30 obtient 7 g. d'un précipité de couleur jaune 'qu'on dissout dans les premiers tubes d'un appareil de Craig et qu'on fractionne par distribution, à contre-courant-en utilisant.comme;• phase stationnaire une solution M/15" de tampon au phosphate à pH 6,5' contenant l°/0o d -ascorbate de sodium et.comme phase mobile 35 1 ' acétate d'éthy-le. Après■ 290. transferts., 11 analyse par spectro.photométaie et par chttmatograçbie révèle ,la; présence de- la 27-déméthoxy-27-hydroxy-25-désacétylrifamyc.ine. SV et .dé la. 27-déméthoxy-27-hydroxyrifa-mycine B:dans les tubes 20 à 50. On combine le' contenu des tubes 70 27828 2060322 70 à 100, on acidifie la phase aqueuse à pH 35 et on extrait le produit dans l'acétate d'éthyle» Les phases organiques et les extraits combinés sont lavés à l'eau, concentrés sous vide à volume de 30 ml et coulés dans l'éther de pétrole. On obtient ^ un précipité de 2,5 g de 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV. Le contenu des tubes 20 à 50 est combiné et les produits extraits et précipités comme ci-dessus. On jette un mélange d'environ 1 g . sur une colonne de 100 g de "Séphadex G 25" et on élue par un tampon au phosphate M/15 à pH 6,5. Les fractions obtenues à 10 partir de la colonne sont analysées par chromatographie en couche mince. Les 100 premiers ml d'éluat sont rejetés. Les 120 ml suivants sont recueillis car ils contiennent la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine B qu'on extrait dans l'acétate d'éthyle après acidification du tampon; on obtient la substance anti-biotique par concentration du solvant et cristallisation : rendement : 300 mg. A partir de la fraction suivante, on obtient-la 27-déméthoxy-27-hydroxy-25-désacétylrifamycine SV par extraction dans l'acétate d'éthyle à. pH acide, concentration du solvant et précipitation dans l'éther de pétrole. On obtient 200 mg 2o de précipité séché. Les propriétés des 3 composés sont les suivantes : 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamy2ine B Analyse C^gH^NOj^ calculé : C : 61,5; H : 6,38; N : 1,88# 25 trouvé : C : 61,06; H : 6,08; N : 2,06# point de fusion : le produit brunit à 24o°C et n'est pas fondu à 300°C *" ' "I sprectre infrarouge (dans le Nujol): bandes principales, cm~ : 3400, 2900(11.), 2830(n.), 1725, 1650, 1580, 1550, 1530, l462(n.), 1375(n.), 1315, 1260, 1205, 1170, 1095, 1070, 1045, 975, 947, 50 913, 860, 795, 860, 795, 720. sprectre U.V. (dans un tampon à pH 7,38) A raax - 423 m/i eÏ-* = 215 / 1 cm X max =' 302 myu Ei^Cm ^ 35 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV Analyse élémentaire C^gH^NO^HgO calculé : C : 61,6; H : 6,7; N : 2,0# trouvé C : 61,1; H : 6,7; N : 2,2# 70 27828 9 2060322 HgO (méthode de Vidal Fisher) calculé : 2,5# trouvé : 2,09# point de fusion : le produit se décompose à 160°C. 5 sprectre infrarouge, (dans le Nujol) - bandes principales (cm-'*") : 3^50, 2900(n.), 2830(n. ), 1720, 1660, 1600, 1550, l462(n,), 1375( 1325, 1290, 1260, 1220, 1155, 1095, 1050, 1020, 970, 9^7, 920, 897, 845, 802, 788. spectre U.V. (dans un tampon à pH 7,38) 10 X max = 445 m/U . = 200 / 1 cm X max = 313 nyu E^cm = 325 pKa (déteiminé par spectrophotométrie en solution dans le mélange eau/méthanol, 95*5) î 1,5 15 25-désacétyl-27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV . Analyse élémentaire : C34°11N calculé : C î 63,6;. H : 6,75j N : 2,18# trouvé : C : 63,1; H : 6,5 ; N : 2,23# point de fusion : le produit se décompose à 170°C. sprectre infrarouge (dans le Nujol) ; bandes principales (cm-1) : 3400, 2900(n.), 2830(n.}, 1730, 1645, 1605, 1550, 1500, l462(n,), 1410, 1375(n.), 1320, 1265, 1220, 1200, 1167, 1110, 1080, 1060, 1010, 977, 947, 920, 895, 825, 800. spectre tJ-V. X max = 440 m /U = 210 / 1 cm X max = 311 myu Ei^cm = ^35 70 27828 10 2060322 REVENDICATIONS 1. Nouvelle ■ substance antibiotique consistant en 27-démé-thoxy-27-hydroxyrifamycine SV, caractérisée en ce qu'elle possède les propriétés suivantes: F 160°C, décomposition; spectre d'absorp- 5 tion ultraviolet en solution tampon à pH 7,8:maxima à 445 nyu (E^m=200) et 313 nyu (E^m=325) groupement acide, pKa 1,5:spectre d'absorption infrarouge dans le Nujol, maxima à 3450, 2900, 2830, 1720, 1660, 1600, 1550, 1462, 1375, 1325, 1290, 1260, 1220, 1155, 1095, 1050,'1020, 970, 947, 920, 897, 845, 802, 788 cm"1; analyse 10 élémentaire pondérale approchée, C:6l,l#, H:6,7#, N:2,2#. 2. Nouvelle substance antibiotique consistant en 27-déméthoxy-27-hydroxy-rifamycines B, caractérisé en ce qu'elle possède les propriétés suivantes : brunit à 240°C mais solide jusqu'à 300°C; spectre d'absorption ultraviolet en solution tampon à pH 7,8: 15 maxima à 423 nyu (E^m=215) et 302 nyu (E^fm=269) spectre d'absorption infrarouge dans le Nujol, maxima à 3400, 2900, 2830, 1725, 1650, 1580, 1550, 1530, 1462, 1375, 1315, 1260, 1205, 1170, 1095, 1070, 1045, 975, 947, 913, 860,/795, 720 cm"1; analyse élémentaire pondérale approchée, C:6l$, H:N:2#. 20 3. Nouvelle substance antibiotique consistant en 25-désacé- tyl-27-déméthoxy-27-fcydroxyrifamycine SV, caractérisée en ce qu'elle possède les propriétés suivantes : F 170°C, décomposition: spectre d'absorption ultraviolet en solution tampon à pH 7,8: maxima à 440 nyu (EiQm=210) et 311 nyu (E1^jn=335); spectre d'absorption 25 infrarouge dans le Nujol: maxima à 3400, 2900, 2830, 1730, 1645, 1605 1550, 1500, 1462, 1410, 1375, 1320, 126$, 1220, 1200, 1167, 1110, 1080, 1060, 1010, 977, 947, 920, 895, 825, 800 cm"1; analyse élémentaire pondérale approchée, C:63$, H:6,5#, N:2,2#. 4» Procédé pour préparer la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine, 30 caractérisé" en ce que l'on cultive un Mutant de Streptomyces mediterranei possédant le numéro de code 21.-411 de 1 'ATCC et capable de produire la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable et des sels minéraux essentiels, 35 en culture submergée aérobie et agitée, Jusqu'à ce que ledit milieu présente une activité antibiotique notable, après quoi on isole- la 27-déroéthoxy-27-h.ydroxyri f amycine du milieu. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ee que l'on effectue la culture à une- température de 24 k 32°C avec un pH de départ de 6,4 pendant une durée maximale de 180 h.. 70 27828 2060322 11 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on isole sélectivement du milieu la 27-déméthoxy-27-hydro-xyrifamycine SV, la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine B et la 25-désacétyl-27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV. 5 -7. Procédé selon la revendication 5> caractérisé en ce que l'on filtre"le milieu contenant la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine à un pH d'environ 6,2 ; à 8,4, on règle le pH du milieu séparé à une valeur acide comprise entre 1 et 5 environ et on extrait le milieu par un liquide organique, ce qui donne un extrait de la 10 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine. 8. Procédé selon la revendication J, caractérisé en ce que le liquide organique est l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, lé butanol ou le chloroforme. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que 15 l'on isole la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycitie .du liquide organique, on fractionne et on purifie la 27-déméthoxy-27-hydroxyri-"famycine pour en isoler la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine SV, la 27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine B et la 25-désacétyl-27-déméthoxy-27-hydroxyrifamycine. 20 Nouveaux médicaments, utiles notamment pour la lutte contre les infections à bactéries Gram-négatives, caractérisés en ce qu'ils consistent en composés selon les revendications' 1 à 3. 11. Compositions thérapeutiques caractérisées aice qu'elles contiennent comme substances actives les composés sexon les reven- 25 dications 1 à • 12. Formes pharmaceutiques appropriées pour l'administration des compositions thérapeutiques sëLon la revendication II.