Brevet FR2060327A1 — publié le 19710618

î 2060327 La présente invention a pour objet un prodédé de préparation de "choline-diphosphate de cytidine à pureté élevée utile comme réactif biochimique, ainsi qu'une préparation médicinale pour le traitement des maux de tête, etc. Un objet de l'invention est ,de produire de la choline-diphosphate de cytidine par un procédé de fermentation efficace et économique, avec de bon rendement, à un prix de revient peu élevé et à l'échelle industrielle. un coenzyme se rapportant à un métabolisme lipidique, chez les êtres vivants.. Ce composé peut être représenté par la formule structurale suivante : cytidine peut être séparée de la levure (Science Yol. 124, page 81 - 1956) ou peut être préparée par une méthode synthétique (Journal of Biological Chemistry, vol. 222, pages 185-191- 1956)'. Toutefois, la choline-diphosphate de cytidine est difficile à produire à l'échelle industrielle car les rendements obtenus par les méthodes de production actuelles sont inacceptablement faibles et entraînent des prix de fabrication élevés qui peuvent être prohibitifs. Par conséquent, malgré son utilité intéressante, la choline-diphosphate de cytidine est peut utilisée dans la pratique. Il est donc clair qu'il est important de fournir un Il est connu que la choline-diphosphate de cytidine est On a découvert récemment que la choline-diphosphate de 70 28403 2 2060327 procédé de production d'une préparation purifiée de choline-diphosphate de cytidine, donnant de bons rendements, à bas prix de revient et pouvant être réalisé à l'échelle industrielle. . L'invention fournit un procédé pouvant être utilisé à 5 l'échelle industrielle pour produire-de la choline-diphosphate de cytidine avec de bons rendements et à bas piix, dans lequel on effectue une culture dans une liqueur de réaction aqueuses, à savoir un milieu nutritif, contenant : a) au moins un composé de la classe constituée par de 10 la choline, la phosphoryl-choline et leurs dérivés fonctionnels ; b) au moins un composé de la classe constituée par la cytidine, le 5'-monophosphate de cytidine (appelée ci-après "CMP"), le 5'-diphosphate de cytidine (appelée ci-après "GDP"), : le 5'-triphosphate de cytidine (appelée ci-après "CTP"), et 15 leurs dérivés fonctionnels ; c) des enzymes d'au moins un type de la classe constituée par les levures, les bactéries comprenant les Actinomycetes et les moisissures ; d) l'ion phosphate et 20 e) au moins l'ion magnésium ou manganèse. Cette culture peut être effectuée à la pression atmosphérique et à des températures normales en utilisant un appareillage classique. Les matières brutes de départ, la cytidine, le CMP, le 25 CDP ou le CTP sont des composés connus disponibles dans le commerce et elles peuvent être préparées par synthèse. En outre, la cytidine ou le CI€P peut être préparé par une décomposition enzy-matique de l'acide ribonucléique. On peut également préparer le CDP ou le CTP par phosphatation du C^îP. Toutes ces matières peu-30 vent être utilisées dans la présente invention à ï'étàt libre ous sous forme de sels non toxiques, c'est-à-dire acceptables en pharmacie, tels que le sel de sodium, le sel de baryum, etc. On produit la choline à l'échelle industrielle et elle est facilement disponible dans le commerce. Elle peut être 35 utilisée sous la forme de ses sels acceptables en pharmacie, 70 28403 3 2060327 par exemple sous forme de chlorure, de bromure,.de citrates, de gLuconates, etc. On peut préparer la phosphoryl-choline par phos-photatian du chlorure de chôLine, et elle est disponible dans le commerce sous la forme de chlorure ou de sel de chlorure, comme 5 la choline. Toutes les formes mentionnées ci-dessus peuvent être » - utilisées dans la présente invention. On peut,,en>outre, également utiliser des dérivés fonctionnels qui servent*de substituants de la choline et de la phosphorylcholine. . la concentration de la choline, du CMP, du CDP, du CTP, 10 de la cytidine ou dé la phosphorylcholine n'est pas particulièrement critiquej excepté qu'ils doivent être présents en quantités efficaces, c'est-à-dire en quantités permettant la production de la quantité désirée du produit, la choline-diphosphate de cytidine. En général, il est recommandé d'utiliser la cytidine, le 15 CMP, le* CEP, et (ou) le'CTP en quantités comprises entre environ 1 g/litre à 1 000 g/litre, sous la forme d'acide libre de préférence entre 5 g/litre et 30 g/litre. On utiliser de préférence la choline et (ou) la phosphoryl-choline à des concentrations comprises entre 0,5 g/litre et 50 g/litre. 20 On peut fournir les besoins en ion phosphate en ajoutant des phosphates inorganiques, tels que : -KHgPO^, K2HP04, K3P04, Ua2HP0, NaH2P04'f et Ha^PO^ etc. ou encore, en ajoutant l'acide libre, par exemple l'acide . phosphorique, qui peut.ensuite être neutralisé par un alcali . 25 approprié tel que NaOH, KOH, MH^OH, ou autre composé analogue, c'est-à-dire en formant in situ.le phosphate. Dans certains cas, par exemple quand on utilise CTP ou la phosphoiylchloine, il n'est pas nécessaire d'ajouter d'ion phosphate comme additif séparé, l'ion phosphate nécessaire étant fourni par le CTP ou 30 la phosphorylchiine. 70 28403 4 2060327 lia concentration en ion phosphate n'est pas particulièrement critique et peut varier entre de larges limites suivant les besoins de l'opérateur. Dans tous les cas, il est recommandé pour obtenir des résultats maxi.ma que le milieu de culture aqueux con-5 tienne de 2 g/iitre à 200 g/litre"d'ion phosphate sous forme de PO^ et de préférence de 10 g/litre à 40 g/litre. La concentration en ion magnésium et (ou) manganèse de préférence fournie sous forme de sels inorganiques, par exemple, le sulfate de magnésium, le sulfate de manganèse, etc. est de 10 préférence comprise entre environ 0,001..g/litre et 3 g/litre. Dans les cas où on n'utilise pas l'enzyme à l'état purifié, on incorpore lé magnésium ou le manganèse avec la préparation d'enzyme, c'est-à-dire sans aueune addition spéciale. Dans tous les cas, on comprendra que les.gammes indiquées 15 ci-dessus sont données seulement pour définir les modes de traitement préférés et ainsi, il-peut être recommandé dans des cas-particuliers de s'écarter de ces données. La levure, les bactéries et (ou) la moisissure sont fournies dans la présente invention sous une forme telle que les 20 systèmes enzymatiques des cellules des levures, des bactéries et (ou) des moisissures peuvent être facilement mises en liberté dans la liqueur aqueuse dans les conditions utilisées pour effectuer la culture. On peut préparer des échantillons appropriés de levure, de bactéries ou de moisissures par séchage, plasmolyse, 25 traitement par un solvant tel que l'acétone, ou autre solvant analogue, extraction, traitement par un agent tensio-actif, traitement aux ultrasons ou autre traitement. Il est de préférence recommandé d'utiliser les cellules de levure, de bactéries ou de moisissures obtenus comme sous-produits dans les fermentations 30 industrielles et soumises à un traitement de séchage par l'acétone. On peut naturellement utiliser également une liqueur d'extrait obtenue en traitant la levure, les bactéries ou les moisissures par une rupture mécanique, un traitement aux ultrasons, un traitement enzymatique, par bactériolyse, etc. On peut.utiliser 35 dans la présente invention diverses sortes de bactéries, de 70 28403 5 2060327 moisissures et de levures indiquées ci-après comme exemple mgjs non à titre limitatif : Brevibacterium ammoniagenes ATCG 6872 Es chéri ch. ia coli ATGG 21148 ~ 5 Serratia marcescens ATGC 2123 Aerobacter aerogenes ATCC 21 217 Corynebacterium glutamicum ZTCC 13287 Arthorbacter simplex ATGG 15799 Micrococus sodonensis ATCC 11880 10 . Pseudomonas fluorescens ATCC 21256 Bacillus subtilis .ATCC 15512 Nocardia globerula ATCC 21022 Streptomyces ambofaciens ATCC 15154 Pénicillium chrysogenum ATCC 15241 15 Aspergillus terreus ATCC 1012 Aspergillus flavus ATCC 13698 G-ibberella f ujikuroi ATCC 20136 Bhizopus delemar ATCC 20134 Mucor javanicus ATCC 15242 20 ' Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 Saccharomyces lactis ATCC 12425 Torulopsis sphaerica ATCC 8549 Zygosaccharomyces major (Synonyme : Saccharomyces rouxii) ATCG 15249 25 Kloeckera africana ATCC 16512 v Candida guilliermondii ATCC 9058 Suivant un mode de mise en oeuvre préféré du. procédé de l'invention, on ajoute à la liqueur de réaction aqueuse au moins un sucre fermentable tel que le gL ucose, le fructose, le sucrose, le maltose, etc. Oh obtient ainsi des rendements supé-30 rieurs en chloine-diphosphate de cytidine. On utilise de préférence le sucre fermentable à une concentration comprise entre 70 28403 6 2060327 environ 5 g/litre et 100 g/litre de liqueur de réaction aqueuse. Après avoir préparé la liqueur de réaction en mélangeant les composants décrits ci-dessus, on ajuste le pH à 5,0 - 9,0, et de préférence entre 7,0 - 7,2 avec l'acide et l'alcali approprié. 5 On peut effectuer la culture à des températures normales ou légèrement élevées, par exemple, comprises entre 20 et 55°, jusqu'à ce que se forme une quantité importante de choline-diphosphate de cytidine. La durée de.la formation de la culture dépend de la température et du pH utilisés pour former la culture, mais elle 10 est en général comprise entre environ une demi-heure et 10 heures. On peut mettre en évidence la production de choline-diphosphate de cytidine par une chromâtographie par couches minces, ou autre méthode analytique appropriée. La culture terminée, on retire les bactéries, les moi-15 sissures ou les matières solides de la liqueur de culture-, puis on sépare la choline-diphosphate de cytidine et on la récupère suivant la méthode bien connue.utilisant une résine écbangeuse d'ions, coc:ae expliqué en détails dans les exemples ci-après. Les exemples suivants illustrent la présente invention. 20 EXEMPLE ,1 On effectue une culture à 30°0 pendant 4 heures, dans un flacon de 250 ml de foraie conique contenant 30 ml d'une liqueur de réaction (pH 7,0) composée de 7,38 mg/ml de sel diso-dique de CMP^ 24 mg/ml de choline, 10 mg/ml de glucose, .100 mg/ 25 ml de cellules séchées à l'acétone de Brevibacterium ammoniagenes ATGG 6872, 11,6 mg/ml de phosphate monopotassique, 20 mg/ml de phosphate dipotassique et 2,96 mg/ml de sulfate de magnésium (MgSO^^HgO). La choline-diphosphate de cytidine se forme et s'accumule à une concentrâtion de 3,8 mg/ml dans la liqueur de 30 culture. On ajuste le pH de 1,2 litre de filtrat contenant 3,8 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine, obtenu en éliminant les matières solides de la liqueur de culture, à 8,5, avec une solution de EOH 0,5 ET. On fait passer le filtrat dans une colonne 35 de résine écbangeuse d'anions fortement basique de Doirtex 1x2 70 28403 7 2060327 ("type acide formiquè). Après lavage de la résine à l'eau, on fait passer une solution d'acide formique dans la colonne en augmentant progressivement la concentration d'acide formique (jusqu'à 0,04 îï max.). On recueille une fraction de choline-diphosphate 5 de cytidine .par élution -suivant la méthode d'élution appelée par gradients et on l'absorbe sur des poudres"de charbon. On réalise ensuite 1'élution avec de l'acétone, puis on concentre l'éluat et on le sèche. On obtient 1,3 g de poudres de choline-diphos-phate de cytidine. 10 "FHŒMPItB 2 On répète l'exemple .1, excepté qu'on n'utilise pas de glucose. On", obtient 0,3 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine. Quand on effectue la culture dans la liqueur de réaction en omettant en-plus d'utiliser le sel disosique de CMP qui est le subs-15 trat et la choline, on ne décèle pas de choline-diphosphate de cytidine -moins de 0,05 mg/ml), ; EXEMPLE 3 On répète l'exemple 1, excepté qu'on utilise 4 mg/ml de cytidine à la place di sel disosique de CMP de l'exemple 1, On 20 obtient 0,5 - 0,6 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine, ' EXEMPLES 4-19 On répète l'exemple 1, excepté qu'on utilise à.la place des cellules de Brevibacterium amoniagenes de l'exemple 1, des cellules des espèces indiquées dans le tableau I ci-après et 25 séchées à l'acétone. Lès résultats obtenus sont les suivants. 70 28403 8 2060327 TABLEAU I J Exemple n° So uch.es Quantité, de choline-diphosphate de cytidine fop-mée . (mg/ml) 4 Escherichia coli ATOC 21148 2,5 - 5 Serratia marcescens ATCC 21213 0",7 6 Aerobacter aerogenes ATCC 21217 0,6 7 Coiynebacterium glutamicum ATCC 13287 0,9 8 Airthrobacter simples ATCC 15799 0,7 9 Micrococus sodonensis ATCC 11880 0,5 10 Pseudomonas fluoréscens ATCC 21256 o;? 11 Bacillus subtilis ATCC 15512 °»6 12 Tïocardia globerula ATCC 21022 o;8 13 Streptomyces ambofaciens ATCC 15154 °»8 14 Pénicillium chrysogenum ATCC 15241 °»9 15 Aspergillus terreus ATCC 1012 o;e 16 Aspergillus flavus ATCC 13698 o;5 17 G-ibberella fujikuroi ATCC 20136 1,2 18 Rhizopus delemar ATCC 20134 0,5 19 Mucçr javanicus ATCC 15242 o;s 70 28403 9 2060327 mMPT.-B on On répète l'exemple 1, excepté qu'on utilise 8,1 mg/ml de CDp, à.la place du sel disosique de CMP de l'exemple 1. On obtient 4i1 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine, 5 EXEMPLE 21 On répète l'exemple 1, excepté qu'on utilise 9,7 mg/ml de CTP à la place du sel. disosique de CMP de l'exemple 1. On obtient 4,1 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine. EXEMPLES 22 - 37 10 On forme la choline-diphosphate de cytidine en quantités presque égales à celles des exemples 4-19 avec chacune des souches décrites, ici quand on effectue la culture dans 5 ml de liqueur de réaction, dans un tube à essai, tout en agitant, de la manière décrite dans les exemples 4 - 19, excepté qu'on utilise 15 à la place de CMP, 8,1 mg/ml de CDP ou 9,7 mg/ml de CTP. EXEMPLE 38 On effectue une culture à 30°C pendant 4 heures dans un flacon conique de 250 ml contenant 30 ffll d'une liqueur de réaction (pH 7,0) ayant la composition suivante : 8,1 mg/ml de CDP, 20 24 mg/ml de choline, 10 mg/ml de glucose, 100 mg/ml de levure de boulanger séchée, 11,6 mg/ml de phosphate monopotassique, 20 mg/ml de phosphate dipotassique et 2,96 mg/ml de MgSO^.SHgO. La choline-diphosphate de cytidine se forme et s'accumule à une concentration de 4,2 mg/ml dans la liqueur de culture. 25 On ajuste le pH de 1,2 litre de filtrat contenant 4,2 mg/ml de choline-diphosphate de.cytidine obtenu en éliminant les matières solides de la liqueur de culture, à 8,5 avec une solution de KQH 0,5 ïf. On fait passer le filtrat dans une colonne de résine échangeuse d'anions fortement basique, de Dowex 1x2 30 (type acide formique). Après lavage de la résine à l'eau, on fait passer une solution d'acide formique dans la colonne en augmentant progressivement la concentration d'acide formique (jusqu'à 0,04 IT .max.). On recueille une fraction de choline-diphosphate de cytidine par élution suivant la méthode d'élution par gradients 35 et on absorbe sur des poudres de chafcon. On effectue ensuite 70 28403 10 2060327 l'élution avec de l'acétone, et on concentre l'1 éluat puis on le sèche. On obtient 1,8 g de poudres de choline-diphosphate de cytidine. EXEMPLE 39 5 On répète l'exemple 38, excepté qu'on n'utilise pas de glucose. On obtient 0,4 mg/ml de diphosphate de cytidine* Quand on réalise la culture dans la liqueur de réaction exempte également de CDP et de choline, on ne décèle pas de choline-diphosphate de cytidine (moins de 0,05 mg/ml). 10 EXEMPLE 40 On répète l'exemple 38, e±cepté qu'on utilise à la place du CDP de l'exemple 38, 9,7 mg/ml de CTP. On obtient 4,3 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine. EXEMPLES 41 - 46 15 On répète l'exemple 38, excepté qu'on utilise à la place de la levure de boulanger séchée de l'exemple 38, les cellules séchées à l'acétone des espèces indiquées dans le tableau 2. Les résultats obtenus sont les suivants : TABLEAU 2 i Exemple n° Souches Quantité de choline diphosphate de cytidine formée (mg/ml) 41 Saccharomyces Cerevisiae ATCC 15248 3,7 42 Saccharomyces lactis ATCC 12425 2,3 43 Torulopsis sphaerica ATCC 8549 2,8 44 Zygo,saccharomyces major (Synonyme, Saccharomyces rouxii) ATCC 15249 2,1 45 Kloeckera africana ATCC 16512 1,2 46 Candida guilliermondii ATCC 9058 1,1 70 28403 n 2060327 mMPT.iaa m - R» On répète les exemples 41 - 46, excepté qu'on utilise à la place du CDP des exemples 41 - 46, 9,7 mg/ml de CTP. les résultats obtenus sont les suivants î .TABLEAU 3 Exemple n° - Souches Quantité de choline diphosphate de cytidine formée (mg/ml) 47 "• Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 3,6 - 48 Saccharomyces lactis ATCC 12425 3,3 ■ 49 Torulopsis sphaerica' ATCC. 8549 3,1 50 . Zygo saccharomyces major;.' ATCC 15249 (Synonyme : Saccharomyces rouxii) 1,7 51 Kloeckera africana ATCC 16512 1,2 52 . t Candida guilliermondii ATCC 9058 1,3 5 EXEMPLE 53 On effectue une culture à 30°C pendant 4 heures dans un flacon conique de 250 ml contenant 30 ol d'une liqueur de réaction (pH 7,0) ayant la composition : 7,38 mg/ml de sel disosique de CMP, 24 mg/ml de choline, 10 mg/ml de glucose, 100 mg/ml de 10 levure dé boulanger séchée, 11,6 mg/ml de phosphate monopotassique, 20 mg/ml de phosphate dipotassique, 2,96 mg/ml de HgSO^. 2Hg0. La choline-diphosphate de cytidine se forme et s'accumule à une concentration de 4,0 mg/ml dans la liqueur de culture. 70 284103 12 2060327 On ajuste le pH de 1,2 litre du filtrat contenant 4,0 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine obtenu en éliminant les matières solides de la ligueur de culture, à 8,5, avec une solution de KOH 0,5 N. On fait passer le filtrat dans une colonne de 5 résine échangeuse d'anions fortement-basique, de Dowex 1 x 2 (typé acide formique). Après lavage de la résine à l'eau, oh fait passer une solution d'acide formique dans la colonne en augmentant progressivement la concentration de l'acide formiqué (jusqu'à 0,04 ïï max.). On recueille une fraction de choline-diphos-10 phatè de cytidine par élution suivant la méthode d'élution appelée par gradients, puis on l'absorbe sur des poudres de charbon. . On effectue ensuite 1'élution avec de l'acétone, puis on concentre l'éluat et on le sèche, On obtient 1,8 g de poudres de choline-diphosphate de cytidine. 15 EXEMPLE 54 On répète l'exemple. 53, excepté qu'on n'utilise pas de glucose. On obtient 0,4 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine. Quand on effectue la culture dans la liqueur de.réaction en omettant en outre d'incorporer le CMP et la choline, on ne. décèle pas 20 de choline-diphosphate de cytidine (moins de 0,05 mg/ml). EXEMPLES 55-60 On répète l'exemple 53, excepté qu'on utilise à la place de la levure de boulanger séchée. de l'exemple 53, des cellules séchées à l'acétone des espèces indiquées dans l'exemple IV. Les 25 résultats obtenus sont les suivants : * 70 28403 15 2060327 TABLEAU 4. Exemple «° Souches Quantité de choline diphosphate de cytidine formée (mg/ml) 55 Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 3,6 56 • Saccharomyces lactis ATCC 12425 2,2' 57 Torulopsis sphaerica ATCC 8549 2,8 58 Zygosaccharomyces major ATCC 15249 (Synonyme : Saccharomyces rouxii) 2,1 59' Kloeckera africana ATCC 16512 1,3 60 Candida guilliermondii ATCC 9058 1,1 EXEMPLE 61 On effectue une culture à 30°C pendant 4 heures dans un flacon conique de 250 ml contenant 30 ml d'une liqueur de réaction (pH 7,0) ayant la composition suivante : 7,38 mg/ml de sel 5 disodique de CMP, 72,4 mg/ml de phosphorylcholine, 10 mg/ml de glucose, 100 mg/ml. de levure de boulanger séchée, 11,6 mg/ml de phosphate monopotassique, 20 Gvt/ol de phosphate dipotassique, 2,96 mg/ml de MgSO^^HgO. De la choline-diphosphate de cytidine se forme et s'accumule à une concentration de 3,8 mg/ml dans la 10 liqueur de culture. On ajuste le pH de 1,2" litre du filtrat contenant 3,8 mg/ml de choline-diphosphate de cytidine obtenu en éliminant les matières solides de la liqueur de culture, à 8,5, avec une solu— Uon de K0H 0,5 On fait passer le filtrat dans une colonne de 15 résine échangeuse d'anions fortement basique, de Dowex 1x2 70 28403 14 2060327 (type acide fornique). Après lavage de la résine à l'eau, on fait passer une solution d'acide formique dans la colonne en augtaentant progressivement la concentration de l'acide formique (jusqu'à 0,04 F max.). On recueille une fraction de choline-diphosphate 5 de cytidine par élution suivant la méthode d'élution appelée par gradients et on l'absorbe sur des poudres de charbon. On réalise ensuite l'élution avec de l'acétone, et on concentre l'éluat puis on le sèche. On obtient 1,7 g de poudres de choline-diphosphate de cytidine. 70 28403 15 2060327 REVETOIGATIONS 1. Procédé de préparation de choline-diphosphate de cytidine, caractérisé en ce gu'on effectue une culture dans une li-» ' gueur agueuse contenant : 5 a) au moins un composé de la classe constituée de là choline, de la phosphoiyl-choline et de leurs dérivés fonctionnels ; b) a y. moins un composé de la classe constituée de la cytidine, du 5*-monophosphate.de cytidine, du 5'-diphos- 10 phate de cytidine, et du 51-triphosphate de cytidine ; c) des enzymes de bactéries contenant des levures d'Actinomycetes ou des moisissures ; ' d) l'ion phosphate et e). au moins l'ion magnésium ou manganèse, et en ce 15- gu'on récupère la choline-diphosphate de cytidine de la li gueur de culture» 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce gue la ligueur de réaction agueuse contient en plus au moins un sucre fermentable. 20 ' 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce gu'on réalise la culture à une température comprise entre environ 20°C et 55°C. 4* Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce gu'on réalise le traitement de culture à une température comprise 25 entre environ 20°C et 55°C. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce gue le pH de la ligue ur de réaction agueuse est comprise entre environ 5,0 et .9,0. 6. Procédé sleon la revendication 2, caractérisé eh ce gue le 30 pH de la ligueur de réaction agueuse est compn.se entre environ 5,0 et 9*0. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce gu'au moins ' un composé de la classe constituée, est la choline et 28403 16 2060327 au moins un composé de la classe constituée, le 5'-monophosphate de cytidine. " Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que au moins un composé de la classe constituée est la choline, et au moins un composé/de la classe.constituée, la cytidine. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que au moins un composé de. la classe constituée est la choline, et au moins un composé de la classe constituée, le 5'-diphosphate de cytidine. " Procédé selon, la revendication 1, caractérisé en ce que.au moins un composé de la classe constituée est la choline, et au moins un composé de la classe constituée est le 5'-tri-phosphaté de cytidine. Procédé selon la revendication 1., caractérisé en ce que l'ion phosphate est fourni par un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate dipotassique. Procédé selon la revendication. 1, caractérisé en ce que des enzymes de bactéries.contenant des levures d'Actinomy-cetes ou des moisissures, comprennent du sulfate de magnésium. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sucre fermentable est le glucose. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on recueille la choline diphosphate de cytidine en faisant passer un filtrat contenant la choline-diphosphate de cytidine dans la liqueur de réaction aqueuse, dans une colonne de résine échangeuse d'ions. . Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que des enzymes de bactéries contenant des levures d'Actino-mycetes ou des moisissures sont au moins un membre de la classe comprenant : 70 28403 17 2060327 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 Escherichia coli ATCC 21148 _ Serratia marcescens ATCC "2123 Aeîobacter aerogenes ATCC 21'217 5 Corynebacterium glutamicum ATO© 13287 Arthrobacter simplex ATCC 1579® Micro cocus sodonensis ATCC 1188 G1 Pseudomonas fluorescens ATCC 2125® ' Bacillus subtilis ATCC 15512 10 Nocardia globerula ATCC 21022 Streptomyces ambofaciens ATCC 15154 Pénicillium chrysogenum ATCC 15241 Aspergillus terre us ATCC 1012 Aspergillus flavus ATCC 13698 15 ~ Çfibberrella fujikuroi ATCC 20136 Rhizopus delemar ATCC 20134 Mucor javanieus ATCC 15242 Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 Saccharomyces lactis ATCC 12425 20 Torulopsls sphaerica ATCC 8549 Zygosaccharomyces major (Synonyme : Saccharomyces rouxii.) ATCC 15249 Kloeckera africana ATCC 16512 Candida guilliermondii ATCC 9058,