Brevet FR2059715A1 — publié le 19710604

La présente invention concerne un procédé pour la production de L-tryptophane par fermentation. On sait que divers micro-organismes produisent le L-tryptophane à partir de précurseurs du tryptophanes tels que l'acide anthranilique, l'acide 5 3-indolepyruvique ou l'indole (voir brevet des E.U.A. n° 3.036.958, n° 3.296.090, n° 3.385,762 et n° 3.293.141). Cependant;, ces procédés microbiologiques de la technique antérieure ne sont pas satisfaisants pour la production à l'échelle industrielle parce que les matières premièress acide anthraniliques indole et . acide 3-indolepyruviquejsont très coûteuses. 10 La demanderesse a découvert selon l'invention que certains micro-organismes appartenant aux genres Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium et Micrococcus, et résistants au 5~méthyl-DL-tryptophane produisent'une grande quantité de tryptophane lorsqu'on les cultive dans un milieu nutritif qui ne contient aucun des précurseurs du tryptophane. Bien 15 que l'on sache qu'une souche d'Escherichia coli résistante au 5-méthyl=DL-tryptophane produise du L-tryptophane lorsqu'on la cultive en l'absence de précurseurs du tryptophane, la quantité de L-tryptophane produite est.si faible qu'elle ne peut être décelée que par chrornatographie sur papier. Le procédé selon 1'inventionspour la production de L-trypto-20 phane,consiste à cultiver un micro-organisme appartenant au genre Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium ou Micrococcus, résistant . au l 5-méthyl-DL-tryptophane et capable de produire du tryptophane, sur un milieu nutritif contenant au moins une Source de carbone assimilable, au moins une source d'azote assimilable, et des agents nutritifs minéraux et organiques, 25 en conditions aérobies, et à recueillir le L-tryptophane ainsi produit. Les micro-organismes que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention appartiennent au-genre Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium ou Micrococcus, sont résistants au 5»méthyl-Dl=tryptophane et sont capables de produire du L—tryptophane directement à partir d'une 30 source de carbone, lorsqu'on les cultive sur un milieu nutritif. On peut isoler des souches de ces micro-organismes à partir de sources naturelles, ou bien on peut facilement les obtenir en utilisant un ou plusieurs des procédés mutagènes classiques à partir de cultures de réserve. On peut accroître l'aptitude des micro-organismes ci-dessus à produire le L-trypto-35 phane en conférant aux micro-organismes des propriétés, telles que le besoin de phénylalanine et/ou de tyrosine, ou la résistance aux composés ayant une formule de structure analogue à la phénylalanine ou à la tyrosine. On peut 70 31103 2 2059715 également introduire ces propriétés par un ou plusieurs des procédés classiques d'induction de mutation. Des exemples de micro-organismes résistants au 5-méthyl-DL-tryptophane et capables de produire du tryptophane comprennent : Brevibacterium flavum AJ-3246 (ATCC 21427), AJ-3296 (FERM P-652), et AJ-3247, 5 dérivés de Brevibacterium flavum ATCC 14067 et nécessitant de la phénylalanine et de la tyrosine pour leur croissance; Corynebacterium acetoglutamicum AJ-3292 (FERM P-648) et AJ-3293 (FERM P-649), dérivés de Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 et AJ-3293 et nécessitant de la phénylalanine et de la tyrosine pour leur croissance1, Microbacterium ammoniaphilum AJ-3294 (FERM P-650), 10 dérivé de Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 et nécessitant de la phénylalanine et de la tyrosine pour sa croissance, Micrococcus glutamicus Aj-3295 (FERM F-651) dérivé de de Micrococcus glutamicus ATCC 13032. Le numéro de référence FERM désigne le numéro de classement du micro-organisme au "Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, 15 Ministère du Commerce et de l'Industrie, au Japon . Les souches ayant ces numéros de collection sont à la. disposition, du. public. Le tableau I ci-dessous montre la croissance d'un micro-organisme qui est résistant au 5-méthyl-DL-tryptophane et d'un micro-organisme qui n'est pas résistant, lorsqu'on les cultive sur des milieux contenant diverses quan-20 tités de 5-méthyl-DL-tryptophane. Les milieux de culture sont des milieux nutritifs à la gélose contenant, par litre, 5 g de glucose, 1,5 g de sulfate d'ammonium, 1 g de phosphate monopotassique, 3,0 g de phosphate dipotassique, 1,5 g d'urée, 0,1 g de sulfate de magnésium, 0,001 g de chlorure de calcium, 1 g d'aminoacide de la caséine, 50 mg de L-tyrosine, 50 mg de L-phénylalanine, 25 30fc*de biotine, 100 y de Vitamine B^, 1 ml d'une solution aqueuse d'oligo-éléments, 20 g de gélose et la quantité de 5-méthyl-DL-tryptophane indiquée dans le tableau I ci-dessous et ajusté à pH 7,0. La solution aqueuse d'oligoéléments contient par litre 88 mg de Na,B 0 ,10B 0, 37 mg de (NH.),Mo_0„,, l H IL 4 o 7 4H2Os 970 mg de FeCl3,6H2Os 8800 mg de ZnSO^ 7^0, 270 mg de CuS04,5H20 et 30 72 mg de MnCl2,4H20. On place le milieu nutritif dans des boîtes de Pétri de 8,5 cm de diamètre et on inocule chaque milieu avec 5,0 x 10^ cellules de Brevibacterium flavum AJ-3246 (ATCC 21427) ou 3,5 x 10^ cellules de Brevibacterium flavum (ATCC 14067, et on les cultive à 30°C pendant 96 heures. On compte le nombre de colonies formées sur les milieux. Dans le tableau I 35 ci=dessous, le symbole ++ indique la présence de plus de 1000 colonies sur une plaque, le symbole + indique la présence de plus de 100 colonies, et le symbole - indique l'absence de colonies. 70 31103 3 2059715 TABLEAU I Quantité de 5=méthyl= DL=tryp tophane ajoutée ( y /ml) Nombre de colonies formées Brevibacterium flavum ATCC 21427 Brevibacterium flavum ATCC 14067 * 0 -H- -H- . 100 -H- ++ 300 ++ 4-4- 400 -H- + 500 ++ 20 600 -H- - 700 + - 800 + — 900 80 - 1000 50 Comme il ressort du tableau I ci-dessus, une souche résistant 20 au 5-méthyl-DL-tryptophane peut pousser sur des milieux contenant certaines quantités de 5-méthyl-DL-tryptophane, sur lesquels la croissance de Brevibacterium flavum ATCC 14067 est totalement inhibée. Selon l'invention, les micro-organismes qui forment plus de 100 colonies,lorsqu'on inocule 3,5 à 5,0 x 10^ cellules du micro~organisme 25 sur un milieu contenant 500 y/ml de 5-méthyl=DL=tryptophane,sont définis comme micro-organismes résistant au 5~méthyl=DL=tryptophane. Le milieu de culture,utilisé pour produire le L-tryptophane dans le procédé de l'invention, peut être un milieu tout à fait classique. Il comprend au moins une source de carbone assimilable, au moins une source 30 d'azote assimilable, et les oligp-éléments habituels. A titre d'exemples de source de carbone, on peut citer les hydrates de carbone,, tels que glucose, fructose, maltose, hydrolysat d!amidonhydrolysat de cellulose eu mélasses les acides organiques, tels qu'acide acétique ou succinique, les alcools, tels que le glvcérol et les hydrocarbures, tels que les n=paraffines. Les 35 sources d'azote utilisables comprennent le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d!ammonium,, le chlorure d'ammonium ou le gaz ammoniac. Le milieu comprend généralement des sels minéraux, tels que des sels d'aeide phosphe- 70 31103 4 205Ô715 rique, de magnésium,, de calcium, de fer ferreux, de manganèse et d'autres sels métalliques d'oligo^éléments. Lorsque l'on utilise des mutants qui ont besoin d'agents nutritifs, ceux=ci doivent être présents dans le milieu. Les aminoacides, les vitamines, 1 ® "Aj i-Eki" (nom de marque d'un hydrolysat de 5 soja), les extraits de levure, les peptones et le casaminoacide sont de préférence présents pour une bonne croissance bactérienne. Le milieu de culture pour le procédé de l'invention ne comprend aucun des précurseurs spécifiques de la biosynthèse du tryptophane, tels qu'acide anthranilique, indole ou acide 3-indolepyruvique. 10 La fermentation dans le procédé de l'invention s'effectue à un pH compris entre 5 et 9, à une température de 20 à 40°C, en conditions aérobies pendant 24 à 72 heures. Le pH du milieu de culture peut être ajusté par addition de carbonate de calcium stérile, d'ammoniaque ou de gaz ammoniacs ou d'acides minéraux ou organiques pendant la fermentation. L'isolement du 15 L-tryptophane, produit dans le bouillon de culture,peut s'effectuer par les procédés classiques. Le tryptophane produit dans le procédé de l'invention, est identifié avec le L-tryptophane par ses valeurs de Rf dans la chromatographie sur papier, sa réaction d'Ehrlich et son essai microbiologique avec Leuconostoc 20 mesenteroides ATCC 8042. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 25 On prépare un milieu de culture contenant 10 g/dl de glucose, 3 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,1 g/dl de phosphate monopotassique et 0S04 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 2 ppm d'ion ferreux et 2 ppm d'ion manganèse, 200 y/1 de Vitamine B-^, 300 gll de biotine, 5 g/dl de carbonate de calcium, 2 ml/1 d'"Aji=-Eki", 0,1 g/dl de casaminoacide, 125 mg/1 de L=tyrosine, 30 et 250 mg/1 de L~phénylalanine, ajusté à pH 7,0. On place 20 ml du milieu dans des flacons de 500 ml sur une secoueuse et on inocule avec des souches des micro-organismes indiquées dans le tableau II ci^dessous. On cultive chaque milieu à 30°C pendant 72 heures en agitant, et on trouve que les bouillons de culture contiennent les quantités de L-tryptophane indiquées dans le 35 tableau II suivant. 70 31103 5 2059715 TABLEAU II 5 10 Souches cultivées Quantité de L-tryptophane produite (mg/1) Coryn. ^acetoglutamicum ATCC-15806 0 Coryn. acetoglutamicum AJ-3292 11,0 Coryn. acetoglutamicum AJ-3293 186,0 Microbact. ammoniaphilum ATCC-15354 0 Microbact. ammoniaphilum AJ-3294 254 Brev. flavum AJ-3296 456 Micrococcus glutamicus ATCC-13032 0 Micrococcus glutamicus AJ-3295 23,5 On recueille les bouillons de culture de Brevibacterium flavum AJ-3296, on sépare les cellules bactériennes et le carbonate de calcium solide 15 '.par centrifugation et on fait passer 10 litres de la solution résultante sur une colonne garnie d'une résine échangeuse de cations sous la forme hydrogène, vendue sous le nom de Diaion SK 104. Après lavage, on introduit sur la colonne de l'ammoniaque aqueuse 0,5 N pour éluer le L-tryptophane et on concentre l'éluat à siccité sous pression réduite. On dissout les cristaux bruts de 20 L-tryptophane dans une faible quantité d'éthanol à 50% chaud, on traite par le noir décolorant et on refroidit la solution éthanolique. On obtient 2\6 g de L-tryptophane cristallisé pur. EXEMPLE 2 25 On prépare un milieu de culture contenant 10 g/dl de glucose, 4 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,1 g/dl de phosphate monopotassique, 0,04 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 2 pp d'ion ferreux et 2 ppm d'ion manganèse, 200^/1 de Vitamine B^, 300£"/l de biotine, 5 g/dl de carbonate de calcium, 2 ml/1 d'"Aji-Eki", 031 g/dl de casaminoacide, 150 mg/1 de L=tyrosine 30 et 250 mg/1 de L-phénylalanine, ajusté à" pH 7,0. On place 3 ml du milieu dans des tubes à essai et on inocule au moyen d'une boucle en platine avec une souche de l'un des micro-organismes indiquée dans le tableau III ci-dessous. On cultive chaque milieu à 30°C pendant 72 heures avec agitation et on trouve que les bouillons de culture contiennent les quantités de L-tryptophane 35 indiquées dans le tableau III ci-dessous. 70 31103 6 2059715 TABLEAU III Souches Résistance au 5-méthyl-DL-tryptophane Quantité de L-tryptophane produite (mg/1) Brevibacterium flavum ATCC-14067 non Brevibacterium flavum AJ-3246 (ATCC 21427) oui 51s4 Brevibacterium flavum AJ-3247 oui 72,0 70 31103 7 2059715 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production de L=> tryptophane par fermentation,, caractérisé en ce que l'on cultive un micro^organisme appartenant à l'un des genres Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium et Mbcrococcus, » résistant au 5-méthyl-DL-tryptophane et capable de produire du tryptophane, 5 en conditions aérobies sur un milieu nutritif ne contenant aucun précurseur du truptophane et contenant au moins une source de carbone assimilable, au moins une source d'azote assimilable et des agents nutritifs organiques et oligo-éléments et on recueille le L-tryptophane produit. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 ladite source de carbone assimilable est un hydrate de carbone. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit.micro-organisme appartient à une espèce choisie parmi Brevibacterium flavum, Corynebacterium acetoglutamicum, Microbacterium ammoniaphilum et Micrococcus glutamicus. 15 4; Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est choisi parmi Brevibacterium flavum 21427 (FERM-P-652), Corynebacterium acetoglutamicum (FERM-P-648) et (FERM-P-649), Microbacterium ammoniaphilum (FERM-P-650) et Micrococcus glutamicus (FERM-P-651).