Brevet FR2085426A1 — publié le 19711224

L'invention concerne généralement une enzyme nouvelle produite par l'Arthrobacter luteus 110V. spO et qui est capable de lyser les parois des cellules de levure. L'invention concerne aussi un procédé de lyse des parois de cellules de levure au moyen d'une enzyme produite par l' & throbacter luteus nov. sp. On fabrique de nombreuses sortes de levures à usage alimentaire et industriel parmi lesquelles la levure de surplus provenant des brasseries On considère que la disponibilité des substances incluses dans la cellule de levure est accrue par la suppression des parois de cellule et c'est pourquoi on a proposé divers procédés permettant d'éliminer les parois de cellules de levure0 Parmi ceux-ci, le traitement enzymatique semble avoir plus d'avantages que les traitements physiques et chimiques énergiques, par exemple les traitements par la chaleur, par les acides concentrés et par les alcalis concentrés, car les premiers protègent les substances incluses contre une destruction appréciable. Le suc digestif de Stescargot Helix pomatia, les enzymes produites par le Brevibacterium lyticum nov. Spo et les enzymes produites par le Streptomy-ces specieswsont connus comme agents capables de lyser enzymatiquement les parois de ceilules de levure. Les procédés de lyse des parois de cellules de levure au moyen des préparations enzymatiques mentionnées ci-dessus ne sont effica- ces que dans certaines conditions et ils ne sont pas considérés comme satisfaisants à cause de certains défauts. Par exemple, il faut utiliser une forte concentration d'enzyme et une température de réaction relativement élevée, choisir des stades de croissance de la levure et/ou effectuer un prétraitement des cellules de levure par desthiodérivés comme le mercaptoéthanol pour lyser efficacement les parois de cellules des levures viables. En outre, ces microorganismes perdent facilement leur capacité de production des enzymes. L'un des buts del'invention est de fournir un procédé qui surmonte ces inconvénients. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé permettant de lyser enzymatiquement les parois de cellules de levure et dans lequel on utilise une enzyme produite par l'rthrobacter luteus nov. Sp. Un autre but de l'invention est de fournir une enzyme qui est produite par l'Arthrobacter luteus novO spO et qui est capable de lyser des parois de cellules de levure Selon l'invention, sous un aspect de celle-ci,on prévoit en résumé un procédé de lyse des parois de cellules de levure qui consiste à exposer les parois de cellules de levure à une enzyme produite par 1'Arthrobacter luteus nov. sp. Selon l'invention, sous un autre aspect de celle-ci, on pré voit-en résumé une enzyme produite par 1' Ârthrobacter lut eus nov. sp. et qui est capable de lyser les parois de cellules de levure. Vu ce qui précède, on a fait des efforts pour obtenir une enzyme qui lyse les parois de cellules de levure tout stade de croissance sans prétraitement ; l'invention est basée sur la découverte d'après laquelle l'Arthrobacter luteus nov. spO produit une enzyme qui lyse facilement les parois de cellules de levure sans aucun traitement. Etant donné que cette enzyme peut s'appliquer non seulement à la levure morte, meis encore à une levure viable à tout stade de développement et qu'elle peut être produite facilement par llor- ganisme dans un milieu simple comme celui qui contient des cellules de levure seulement, cette enzyme semble avoir de nombreux avantages industriels0 En outre, cette enzyme possède aussi une activité lytique vis-à-vis des parois de cellules de levure qui sont séparées du contenu cellulaire, de sorte que l'on peut l'utiliser pour traiter des parois résiduaires de cellules de levure et les transformer en matières à moindre poids moléculaire ou en liquides. Sur les dessins La figure 1 est une photographie montrant des préparations de parois de cellules de levure avant le traitement par l'enzyme de l'invention la figure 2 est une photographie montrant les parois de cellules de levure après le traitement par 11 enzyme selon l'invention. Les caractéristiques de l'Arthrobacter luteus nov. sp. qui sert à produire enzyme selon l'invention, sont les suivantes Bâtonnets, 0,6-1,0 sur 0,8-10,0 microns. On observe des cellules courbes gonflées en forme de massue et une ramification rudimentaire des cellules0 Dans les cultures anciennes, les cellules prennent une forme de bâtonnets courts ou une forme coccoide, mesurant 0,6-0,8 sur 0,8-1,0 micro et parfois de forme irrégulière. On observe des cystites quand on les cultive à 37 Oc. Il ne se forme pas de spores. Gram-positif dans les cultures jeunes. Dans les cultures anciennes, on observe des cellules gram-négatives comprenant- par- fois des granules gram-positifs ,outre des cellules gram-positives. Non résistant à l'acide. Non motive. Colonies sur agar-agar nutritif : circulaires, lisses, entières, en relief, brillantes, jaunes, butyreuses0 Dans les cultures anciennes, on observe des colonies profondes filamenteuses. Colonies sur agar-agar au glutamate : croissance rare, circulaire, lisse, filamenteuse, plate, blanche, opaque, les colonies ne se développent guère mieux dans le milieu qu'à la surface du milieu. Culture inclinée sur agar-agar nutritif : croissance modérée, filiforme, brillante, lisse, jaune. Dans les cultures anciennes, le bord devient filamenteux. Culture inclinée sur agar-agar au glutamate : croissance rare, duveteuse, blanche, opaque, milieu inchangé. Bouillon nutritif : turbidité modérée avec sédiment jaune, pas de pellicule0 Barreau de gélatine nutritive : liquéfaction lente lait BeCoPo : acide, coagulation. Formation de nitrite à partir du nitrate. Pas de formation d'indole. Hydrolyse de l'amidon. Essai au rouge méthyle : faiblement positif. Essai Voges-Proskauer : négatif Pas de formation d'ammoniac à partir de la peptone. Pomme de terre : croissance modérée, jaune Acide mais pas de gaz à partir de llarabinose, du xylose, du glucose, du mannose, du fructose, du galactose, du lactose, du maltose, du saccharose, du tréhalose, du sorbitol, du glycérol, de la salicine, de 1' D(-méthylglucoside, de l'inuline, de la dextrine et de l'amidon. Pas d'acide ni de gaz à partir du mannitol, du raffinose, du rhamnose et de l'inositolO le succinate est utilisé comme source unique de carbone, mais le citrate n'est pas utilisé. La paraffine est utilisée, mais le phénol ou le m-crésol n'est pas utilisé. légère formation d'uréaseO La cellulose n'est pas attaquée. Pas de formation de pigment bleu sur culture inclinée sur agaragar à la nicotine. Bouillon NaCl : bonne croissance jusqu'à 7% de NaCl. croissance dans certains cas cas 8%. Température optimale de croissance : 30-370C. Pas de croissance à 52 C pH optimal de croissance : entre 7,0 et 8,0. Catalase : positive. Ne survit pas pendant 10 minutes à 720C dans le lait écrémé, Facultativement anaérobie. Source : eaux résiduaires de brasserie. L'organisme diffère des brevibactériacées, lactobacillacées, propionibactériacées, du listeria ou de l'Srysipelothrix qui sont considérés comme ayant certaines similitudes avec l'organisme, par la ramification, la réduction du nitrate, la production de gaz, la motilité ou la réaction de la catalase. Il diffère aussi du Corynebacterium, du Microbacterium ou du Cellulomonas qui sont considérés comme étroitement apparentésà l'organisme, par le fait qu'il présente une division cellulaire du type à flexion et n' pas de granule métachromatique, ni d'activité de cellules, Daprès ces catactéristiques, l'organisme semble appartenir au genre Arthrobacter décrit dans le manuel de Bergey (7ème édition). Dans le genre Àrthrobacter, on a considéré que l'organisme était similaire à l'h. oxydans et à l'A. aurescens en ce sens qu' qu'il utilise le nitrate et les sels d'ammonium, qu'il hydrolyse l'amidon et qu'il réduit le nitrate,mais on lla trouvé différent des deux espèces, par les caractéristiques suivantes: A. luteus nov sp a. oxydans A. Aurescans Bouillon croissance modé- croissance croissance nutritif rée, sédiment abondante, an- modérée. sé jaune snulaire, sédi sédiment cou ment blane leur crème Culture inclinée duveteux, blanc filifgorme. filiforme, agar-ager au blanc jaune glutamate Culture luclinée Crcissance rare, croissance croissance agar-agar blanche abondante, pig- lante st nicotine ment blau rare Lait au tourae- Acide coagu- peptonisation anneau jaune sol lation lente, slcalin pâle, alcalin Hydrogène Pas de formation pas de formation formation sulfuré Capacité de Acide Gaz :Acide Gaz Acide Gaz :fermentation arabinose | - - - - xylose + - - - - glucose + - + - + mannose : + n - - fructose + - + - - galactose + - - - - lactose + - - - - maltose + - - - - saccharose + - + - # mannitol - - - - - glye érol + - - - - inuline + - - - - amidon + - - - - Température 30-37 25 20-32 optimale de croissance C Source eau réeiduaire fenilles de terre de brasserie tabac + formation, t légère formation,- pas de formation0 On considère donc l'organisme comme une espèce nouvelle et on propose de l'appeler Arthrobacter luteùs. L'organisme a été déposé à l'institut de Recherches sur les Fermentations à Chiba (Japon) sous la désignation "Ko Hatsu Ken Ki n 15311(1968). D'autres caractéristiques de l'organisme sont indiquées dans "2hue Journal of General and Applied Microbiology", volume 15, nO 3, pages 317 à 326 (Tokyo 1969). L'enzyme produite par cet organisme et capable de lyser les parois de cellules de levure peut être obtenue par divers procédés que l'on utilise géneralement pour obtenir des exo-enzymes microbiennes par culture de micro-organismes, à condition que le milieu de culture contienne de la biotine et un polymère de glucose contenant une liaison p -1,3. On peut obtenir un tel milieu de culture sous la forme d'un milieu qt comprend des cellules de levure ou leur contenu qui contient ces substances, ou bien en ajoutant ces substances ou des matières contenant ces substances à un milieu de culture avant ou pendant la culture. Dans un mode d'exécution de l'invention, on peut obtenir le milieu de culture en ajoutant à un milieu de base de la biotine ou une matière contenant de la biotine, par exemple des cellules de levure, de l'extrait de levure ou des déchets de mélasse lorsque le milieu de base ne contient pas de biotine, et enoutre, un polymère de glucose contenant une liaison p -1,3 ou une matière contenant ce polymère de glucose, par exemple des cellules de levure, des parois de cellules de-levure ou de l'extrait de Poria Cocos, d'Eisenia Bicyclis ou de Laminaria Hyperborea. Comme milieu de base, on peut utiliser tout milieu de culture usuel, par exemple (1) un milieu de culture usuel contenant du sulfate de magnésium et du phostate de potassium, par exemple un milieu d'extrait de viande, un milieu de peptone ou un milieu d'extrait de levure, ou (2) un milieu de culture totalement ou partiellement synthétique contenant une source de carbone, une source d'azote, une source de sels minéraux et de la thiamine. Bien entendu, un milieu comprenant des cellules de levure ou leur contenu peut contenir des hydrates de carbone, des composés azotés, des sels métalliques ou des sels minéraux et/ou des vitamines ajoutées. On ajuste dans la gamme alcaline, en dessous de 10,5 le pH du milieu contenant de la biotine et le polymère de glucose,et on stérilise le milieu. On inocule dans le milieu le bouillon d'Arthrobacter luteus préalablement cultivé dans le même milieu ou dans le milieu généralement connu pour le développement de bactéries, par exemple un milieu d'extrait de viande, et on conduit la culture à 10-45 C, de préférence à 30-350C, pendant 8-120 heu res,dans une gamme de pH de 5,0-9,5 avec aération et/ou agitation. Il est désirable que le pH du bouillon de culture soit maintenu alcalin pendant toute la durée de la culture. On peut séparer l'enzyme formée du bouillon par les méthodes généralement connues en enzymologie, si nécessaire. Dans l'invention, pour lyser des parois de cellule de levure, on peut utiliser (I) le bouillon de culture et (II) certains produits que l'on obtient en traitant le bouillon de culture. Des -exemples de ces produits (II) sont : (a) des liquides de culture exempts de cellules bactériennes, (b) des précipités bruts d'en zymes ou poudres d'enzymes que l'on obtient en précipitant une fraction d'enzymes par un agent capable généralement d'amener une enzyme à se déposer de sa solution, par exemple des sels minéraux comme le sulfate d'ammonium ou un solvant organique soluble dans l'eau, par exemple l'alcool éthylique ou- l'acétone, (c) des solutions aqueuses ou tamponnées de la poudre d'enzymes et (d) des fractions actives obtenues par tous procédés qui peuvent servir à fractionner ou à isoler des enzymes comme la filtration sur gel ou l'échange d'ions. L'enzyme de l'invention, purifiée par le procédé décrit cidessus ou une fraction active du bouillon de culture apparaît comme une seule protéine d'enzyme et est caractérisée par sa propriété remarquable de lyser les parois de cellules de levure. L'enzyme semble nouvelle et on propose de l'appeler "Zymolyase". L'activité lytique de la nouvelle enzyme peut parfois astre renforcée lorsqu'on l'utilise avec certaines enzymes tell s qu'une glucanase ou une protéinase. L'enzyme selon l'invention, avant purification, contient une enzyme auxiliaire produite par l'Arthrobacter luteus nov. sp. et en conséquence, elle est plus acrive que l'enzyme purifiée. Afin de lyser les parois de cellules de levure au moyen de la nouvelle enzyme, on peut utiliser divers procédés. Par exemple, on ajoute la solution d'enzyme à une suspension aqueuse ou tam- ponnée à 0,1-5,0% de cellules de levure,à un pH de 4,0-12,0, de préférence de 7,0-7,5 et on fait incuber le mélange à 15c50C, de préférence à 30-400C, un temps suffisant pour lyser les parois de cellules de levure, par exemple pendant 0,1-5 heures)avec agita et les cellules de levure, mortes ou vivantes, se lysent très facilement.Les cellules de levure à -traiter peuvent être à tout stade de croissance et on peut aussi utiliser, dans le présent procédé, des cellules de levure prétraitées par des agents chimiques ou par la chaleur, L'enzyme utilisée dans l'invention présente son pH optimal entre 7,0 et 7,5 et elle est relativement stable à des pH de 6,0-11,0.L'enzyme perd son activité par incubation à 600C pendant 5 minutes et son activité est inhibée par des agents de dénaturation de protéines comme le chlorure mercurique, le laurylbenzènesulfonate de sodium et le nitrate d'argents On estime le degré de lyse des parois de cellules de levure de la façon décrite ci-aprèsO On mélange 1 ml de solution d'enzyme, 3 ml de suspension aqueuse de levure de brasserie (5mg de matière sèche/ml), 5 ml de tampon phosphate M/15 (pH 7,5) et 1 ml d'eau et on fait incuber à 25 C. pendant 2 heures agitation. On détermine la densité optique du mélange réactionnel à 800 m 0 m Dans un mélange de référence, on remplace la solution d'enzyme du système réactionnel ci-dessus par 1,0 ml d'eau. On calcule d'après l'éauation suivante le pourcentage de réduction de densité optique (D.O.) causé par la lyse des parois de cellules de levure: * de réduction de la D.O. = D.O. de référence -D.O. du mélange réactionnel x 100 D.O. de reference Etant donné que le pourcentage de diminution de la DaO est proportionnel à la concentration d'enzyme dans une gamme de 0-60*, il faut diluer la solution d'enzyme dans la gamme citée plus haut pour déterminer avec précision si son activité lytique est trop élevée. Une fois que les parois de cellules sont complètement digéw rées, on observe généralement qu'une diminution de D00. de 7C;, en raison de la présence des inclusions cytoplastiques. Bien qus l'on observe de légères variations de cette valeur selon les souches de levure utilisées, on considère une diminution de 70% de la D.O. comme Degré 100 de lyse des parois de cellules de levure0 On utilisera dans l'exemple suivant cette désignation "degré de lyse de parois de cellules de levure". Il est endendu que ces exemples servent d'illustration et ne limitent pas la portée de l'invention. EXEMPLE 1 On inocule le milieu indiqué au Tableau 1 avec de l'Arthrobacter luteus préalablement cultivé pendant un jour dans un milieu d'extrait de-viande et on cultive à 30 C, pendant 24 heures, avec agitation0 On soumet à la centrifugation le bouillon de culture obtenu. TABLEAU 1 Levure de brasserie lyophilisée : 3,0 g K2HPO4 : 0,1 g MgS04.7H20 . 0,1 g eau 100 ml (pH 8,5) Comme le montre le Tableau 2, des cellules viables de levure de diverses souches sont lysées après incubation avec le produit qui surnage. TABLEAU 2 Souche de levure Degré de lyse des parois: : de cellules de levure : daccnaromyces carlsoergensis : 40 :Saccharomyces carlsbergensis 0 40 Saccharomyce cerevisiae : 48 :Saccharomyces ellipsoideus . 40 Saccharomyces pastorianus : 104 :Saccharomyces turbidans : 50 levure de brasserie 97 levure de saké (Kyokai-6 go) : 121 levure de boulanger : 51 Endomycopsis capsularis 83 Saccharomycodes ludwigii 111 Nematospora coryli 63 lipomyces starkeyi 11 Candida utilis . 40 Torulopsis colliculosa 44 .Brettanomyces anomalus : 59 EXEMPLE 2 On inocule dans du moût de la levure de brasserie de fermentation de fond et on la cultive à 23,50C.Aù bout de 48, 72, 96 et 144 heures d'incubation, on retire des portions du bouillon de culture et on les centrifuge pour obtenir des cellules de levure à divers stades. Après lavage à l'eau, on met les cellules de levure en suspension dans de l'eau (5 mg de matière sèche/ml). On incube ces suspensions de cellules de levure avec le produit qui surnage et qui est obtenu dans l'exemple 1 et on estime dans chaque cas le degré de lyse des parois de cellules de levure0 Les résultats sont indiqués au Tableau 3. Ici, les cellules des cultures de 48, 72, 96 et 144 heures correspondent respectivement aux cellules à la phase logarithmique moyenne, à la phase logarithmique tardive, à la phase stationnaire précoce et-à la phase stationnaire. TABLEAU 3 Temps de culture Degré de lyse des parois de (heures) cellules de levure 48 100 72 97 96 99 144 94 EXEMPTE 3 On inocule le même milieu avec de l'Arthrobacter luteus pré alablemen cultivé pendant un jour dans le milieu indiqué au tableau 4 et on cultive à 300C, pendant 2 jours, avec agitation. TABLEAU 4 '11glucan" de levure 0,5 g : extrait de levure 1,0 g MgSO4. 7H2O O, i g eau (pH 8,5) : 1QO ml On soumet le bouillon de culture obtenu à la centrifugation. On mélange ensemble 2 ml du produit qui surnage, 3 ml de la suspension de levure de brasserie (5 mg de matière sèche/ml) et 5 ml de tempon phosphate M/15 (pH 7,5) et on fait incuoer à 250C, pendant 3 heures, en agitant. Le taux de lyse de parois de cellules de levure est de 133%. EXEMPLE 4 On inocule le milieu de culture du Tableau 5 avec de l'Arthrobacter luteus préalablement cultivé dans de l'extrait de viande pendant. 1 jour et on cultive à 300C, pendant 24 heures, avec agitation. TABLEAU 5 : Levure de brasserie pressée i 7,0% : NH4N03 0,2 % : K2HPO4+ : : MgSO4. 7H2O : 0,1 9,5): 0,1% On soumet le bouillon de culture obtenu à la centrifugation0 On relargue le produit qui suinage (3,2 litres) avec du sulfate d'ammonium solide à une saturation de 0,395o On lyophilise le précipité récolté par centrifugation pour obtenir 7,4 g d'une poudre brun grisatre. Pour préparer-la solution d'enzyme, on dissout 0,25 Ce la poudre dans 100 ml de tampon phosphate M/100 : 0,1% (pH 7,5). On mélange ensemble 1 ml de la solution d'enzyme, 3 ml de suspension de levure de brasserie (5 mg de matière sèche/ml), 5 ml de tampon phosphate M/15 (pH 7,5) et 1 ml d'eau et on fait incuber à 250C pendant 2 heures avec agitation. Le taux de lyse des parois de cellules de levure par la solution d'enzyme est de 91 %. EXEMPLE 5 On inocule le milieu du Tableau 6 avec de l'Arthrobacter luteus préalablement cultivé dans un milieu d'extrait de viande pendant 1 jour et on cultive à 300C pendant 24 heures avec agistation. TABLEAU 6 Levure de brasserie sèche : 2,0% extrait de levure : 0,2 * NH4NO3 0,2 % K2HPO4 1,0 % MgSO4.6H2O 0,1 % Fe2(SO4)3.XH2O (ph 9.5) 0,05 % On soumet à la centrifugation le bouillon de culture obtenu0 On traite le produit qui surnage avec du sulfate d'ammonium solide à une saturation de 0,395. On lyophilise le précipité recueilli par centrifugation pour obtenir une préparation brute d'enzyme. On dissout la préparation brute d'enzyme dans une petite quantité d'eau et on chromatographie sur une colonne de "Sephadex G-100".On élue avec de l'eau0 On rassemble et on concentre les fractions d'effluent qui ont une activité lytique sur les cellules viables de levure. On chromatographie le concentré sur une colonne de cellulose "CM" équilibrée par un tampon phosphate 1/100 (pH 6,0), On libère l'enzyme absorbée qui lyse les cellules viables de levure en utilisant un tampon phosphate 1/100 M (pH 7,5) contenant du NaCl 0,3 M. La répartition de lteffluent montre une pointe d'activité de lyse des cellules viables de levure qui coincide avec celle des protéines Cette préparation d'enzyme ne contient pas les activités de glucanase /3-1,3 et ss ss-1,6- On lyophilise l'enzyme obtenue.On examine l'homogénéité de l'enzyme purifiée à l1ultra-centrifugation. La phase d'ultra-centrifugation est effectuée avec enzyme en solution à 2% (en protéine) dans un tampon phosphate 1/15 M (pH 7,5). L'enzyme purifiée présente seulement une pointe pendant la durée d'une opération de 100 minutes à 60 000 tours/mn. EXEMPLE 6 On met en suspension dans un tampon phosphate 1/15 M la prépa rations due parois de cellules que l'on obtient en désagrégeant des cellules de levure de brasserie dans un appareil de désintégration Mickle On mélange 3 ml de la suspension de parois de cellules de levure et 2 ml de la solution d'enzyme et on fait incuber à 250C. Après 15 minutes d'incubation, les parois des cellules de levure sont complètement lysées. Les figures 1 et 2 montrent des parois de cellules respectivement avant et après l'incubation. EXEMPLE 7 On tire du bouillon de culture d'Arthrobacter luteus deux pré- paration de glucanase. L'une (glucanase-1) n'est pas absorbée par une colonne de résine échangeuse de cations à un pH de 6,0 et l'am- tre (glucanase-2) est absorbée sur la même colonne à un pH de 6, et libérée à un pH de 7,5.On détermine l'effet synergique de l'en- zyme et de ces préparations de glucanase sur la lyse de cellules viables de levure. les résultats sont indiqués au Tableau 8. TABLEAU 8 : Enzyme : Système réactionnel * Glucanase-1 O X X O O X O * * : Glucanase-2 : X 0 O : X : O : X ; 0 : 0 Enzyme selon l'invention X X O X O O O Lyse de *** levure viable - # ++ # ++ +++ +++ * O=Addition ** X= pas d'addition *** - pas de lyse + :lyse. EXEMPLE 8 On ajoute plusieurs sources de carbone à des milieux contenant 1,0 % d'extrait de viande, 0,2 % de NH4N03, 0,1 % % de K2HP04 et 0,1% de MgSO4. 7H2O On ajuste les milieux à un pH de 9,0 et on les stérilise, On inocule les milieux avec de l'Arthrobacter luteus et on cultive à 300C avec agitation0 L'activité du bouillon de culture dans la lyse des parois de cellules de levure est indiquée au Tableau 90 Dans cet exemple ainsi que dans les suivants, activité visà-vis des cellules viables de levure est estimée L'activité est déterminée comme décrit ci-aprèsO On mélange 3 ml de suspension aqueuse de levure de brasserie (5 mg de matière sèche/ml), 6 ml de tampon phosphate 1/15 M (pH 7,5) et 1 ml d'une solution d'enzyme et on fait incuber le mélange à 250C pendant le temps fixé, puis on le soumet à un examen microscopique. 11 activité est exprimée par les symboles suivants - pas de lyse + lyse observée ++ une grande partie ou la totalité de la paroi de cellule de levure est lysée. TABLEAU 9 Source de carbone ajoutée : Groupement ss-1,3 Activité : - Monosaccharide : glucose non : mannose non : - xylose non -Disaccharide : maltose non : laminaribiose oui : ++ cellobiose non gentiobiose non -Polysacharide: pachyman oui ++ laminaran oui ++ mannan non : dextrine : non : - chitine non amidon non : Comme le montrent les résultats ci-dessus, on observe seulement une activité remarquable dans un milieu qui contient un polymère de glucose contenant une liaison ss-1,3, EXEMPLE 9 On prépare des milieux en ajoutant diverses sources organiques d'azote à des milieux contenant 0,5 % de pachyman, 0,2 % de NH4NO3, 0,1 % de K2HPO4 et 0,1 % de MgSO4 . 7H2O. On ajuste le pH des milieux à 9,0 et on stérilise. On inocule les milieux avec de l'Artnrobacter lut eus et on cultive à 30 C avec agitation. Le Tableau 10 indique l'activité de chaque bouillon de culture obtenu TABLEAU 10 Source d'azote ajoutée : Activité : Extrait de levure f+ Extrait de viande ++ Peptone ("Difco") Bacto-tryptone("Difco") Bacto-casitone ("Difco") EXEMPLE 10 On prépare des milieux contenant 0,01 % de glucose, 0,1 % d'asparagine, 0,1 % de K2HPO4 et 0,1 % de MgS04.7H20 et contenant ou non de la biotine, de la thiamine et de la laminarine soluble et on ajuste le pH à 9,0. On inocule alors les milieux avec de l'Arthrobacter luteus et on cultive. Le Tableau 11 indique la multiplication de la bactérie et l'activité du bouillon de culture. Au Tableau 11, les symboles + et - dans la colonne "matière ajoutée" indiquent respectivement qu'on ajoute et qu'on n'ajoute pas cette matière. TABLEAU 11 Milieu Matière ajoutée Multiplication Activité n Biotine Thiamine Laminaran (20 g/1) (400 g/1) (0,5 %) 1 - - + - 2 - + - ++ 3 - + + +++ 4 + - ~ + 5 + + - ++ 6 + - + + 7 + + + ++ ++ 4 5 EXEMPLE 11 On prépare des milieux contenant 0,01 % de glucose, 0,2 % de NH4 NO3, 0,1 % de K2HP04, 0,1 % de MgSO4. 7H2O, 20 g/1 de biotine et 400 g/1 de thiamine et contenant chacun des polymères de glucose indiqués au Tableau 12, on ajuste le pH à 9,0 et on stérilise. On inocule les milieux avec de l'arthrobacter luteus et on cultive. L'activité du bouillon de culture obtenu est indiqué au Tableau 12. TABLEAU 12 : Source de carbone ajoutée : activité Laminaribiose ++ Laminaritriose ++ Laminarine soluble ++ Laminarine insoluble ++ Pachyman ++ R E V E N D i C A T i O N S 1.- A titre de produit industriel nouveau, la zymolase, qui est l'enzyme produite par l'Arthrobacter luteus nov. sp. et capable de lyser les parois de cellules de levure. 2.- Une enzyme selon la revendication 1, à l'état de mélange avec la glucanase. 3.- Une enzyme selon ltune des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que la glucanase est produite par l'Arthrobacter luteus nov. sp. 4.- Un procédé de préparation de la zymolase, caractérisé par le fait que l'on cultive un organisme de l'espèce Arthrobacter luteus dans un milieu qui contient de la biotine et un polymère de glucose contenant une liaison ss-1,3 de manière à accumuler dans le milieu une enzyme ainsi formée. 5.- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le pH initial du milieu est alcalin. 6.- Un procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé par le fait que l'on maintient le pH du milieu entre 5,0 et 9,5 pendant la culture. 7.- Un procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on maintient un pH alcalin. 8.- Un procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractéri- sé par le fait que le milieu contient des cellules de levure formant au moins une partie des sources de biotine et de polymère à groupement 5-1,30 9. -Un procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé par le fait que le milieu contient le contenu de cellules de levure formant au moins une partie de la source de biotine. 10.- Un procédé de lyse de parois de cellules de levure caractérisé par le fait que l'on expose ces parois à l'action d'une enzyme produite par l'Arthrobacter luteus nov. sp. 11.- Un procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que les parois de cellules de levure sont sous la forme d'un constituant de levure morte ou viable et que l'on met la levure en contact avec l'enzyme. 12,- Un procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé par le fait que les parois de cellules de levure sont sous la forme de la matière même des parois de cellules. 13.- Un procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé par le fait que l'enzyme est sous la forme d'un bouillon de culture obtenu par culture de l'Arthrobacter luteus nov. sp. ou bien d'un filtrat ou d'un produit surnageant tiré du bouillon de culture, ou bien d'une poudre sèche.