Brevet FR2073339A1 — publié le 19711001

î 2073339 La présente invention est relative à des polypeptides nouveaux et à un procédé pour leur fabrication. De façon plus concrète, elle vise des polypeptides apparentés aux hormones adrénocorticotropiques ainsi qu'un procédé industriel de fabri-5 cation de tels polypeptides. Dans le schéma et dans la totalité de la description, les abréviations Sar, Albu, Tyr, Ser, Met, Glu, His, Phe, Arg, Try, Gly, Lys, Pro et V^al représentent des restes de sarcosine, d'acide a-amino-isobutyrique, de L-tyrosine, de L-sérine, de L-10 méthionine, d'acide L-glutamique, de L-histidine, de L-phényl-alanine, de L-argine, de L-trypophane, de glycine, de L-lysine, de L-proline et de L-valine et le mot "reste" utilisé plus haut désigne un radical qui provient de 1'a-amino acide correspondant par élimination du groupe OH du radical carboxyle et de l'atome 15 d'hydrogène d'un groupe a-amino; par :.exem|>îe si l'on se réfère pour débuter à la L-lysine de formule /"CHg(NHg.){CH^)CHNHgG00H_7j ]par exemple, la L-lysine pouvant être également représentée par la formule NHg-A-COOH (où NHg désigne un radical a-amino) , un radical de formule -NH-A-CO- est appelé un "reste de L-lysine" 20 et est désigné par l'abréviation "Lys" , les abréviations utilisées pour d'autres a-amino acides mentionnés ci-dessus ayant la même signification que celle qu'on a donnée au sujet de la L-ly-'sine. La présente invention vise des polypeptides pris 25 dans le groupe de composés représentés par la formule générale (I): X-Tyr-Ser-Jtfet-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P (où X représente un radical sarcosyle ou a-amino isobutyryle et P est un membre du groupe comprenant* 30 ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-LysOH, Pro-Val-Lys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOB et Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH, les amides non substitués correspondants, les sels d'addition avec tin acide correspondants qui sont physiologiquemént acceptables et les complexes métalliques correspondants. Dans la totalité dé l'exposé, y 35 co&pris les exemples et les revendications, l'expression "amide non substitué" désigne "un polypeptide dont l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal est aminé, c'est-à-dire converti en groupe -CONHg". Les produits obtenus conformément à la présente 40 invention sont des polypeptides nouveaux et leur activité 70 40468 2073339 adrénocorti cotrope les rend extrêmement précieux pour'préparer des médicaments utilisés en médecine ou dans l'art vétérinaire. Les composés complexes métalliqués des peptides, en particulier, sont remarquables par la durée de leur efficacité ainsi que par 5 3eur solubilité médiocre. Les composés de la présente invention peuvent également être utilsés comme produits intermédiaires pour la production de médicaments possédant une chaîne plus longue d'aminoacidës. On obtient les nouveaux polypeptides par le procédé • 10 de fabrication connu , les aminoacides pouvant être fixés ensemble dans l'ordre de succession spécifié ci-dessus. En d'autres termes, on obtient les polypeptides de la présente invention en faisant réagir de la sarcosine, de l'acide a-amino-isobutyrique ou un fragment de peptide contenant X dans l'ordre de succession 15 spécifié ci-dessus (où l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal est activé) avee un fragment de polypeptide correspondant au reste.de la séquence des aminoacidës décrite ci-dessus, les groupes fonctionnels qui ne participent pas à.la réaction étant avantageusement protégés. > • 20 L'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la sarcosine, de l'acide a-amino-isobutyrique ou d'un fragment de peptide contenant X peut être activé par exemple par la formation d'un anhydride d'acide, par la formation d'un anhydride mixte à la suite d'une réaction avec un dérivé d'un acide organi-25 que à empê'chement stérique, comme par exemple le chlorure de pivaloyle, ou avec un dérivé d'acide carbonique, comme par exemple le chloroformiate dtéthyle, ou bien il peut être activé par-la formation d'un ester actif, par exemple un ester nitrophénylique . tel ~que l'ester p-nitrophénylique,ou d'un ester phénylique 30 chloré, par exemple l'ester pentachlorophénylique et l'ester 2,4,5-1ri chlorophénylique, ou par la formation d'un azide, ou encore par l'utilisation d'un agent de condensation , comme par exemple le M,N'-dicyclohexylcarbodiimide ou le N,N'-earbonyl-bis-imidazole. 35 Les groupes fonctionnels libres qui ne participent pas à la réaction sont avantageusement protégés, plus spécialement par des radicaux qu;'il est facile d'éliminer par hydrolyse ou réduction. Ainsi, en ce qui concerne l'atome d'azote du groupe 40 terminal a-amino de la L-sarcosine ou d'un acide a-amino- 70 h0468 2073339 isobutyrique, on recommande des substituants protecteurs tels que les radicaux benzyloxycarbonyle, tertio-butoxycarbonyle, tertio-amyloxycarbonyle, p-méthoxyphénylsulfonyle; etc. Parmi ces radicaux, on préfère les radicaux benzyloxycarbonyle. et tertio-5 butpxycarbonyle pour le but envisagé. Le substituant destiné à. protéger le groupe £-amino-de la L-lysine est par exemple ion radical benzyloxycarbonyle, tertio-butoxycarbonyle, cftlôrobenzyloxycarbonyle, etc. , et les radicaux préférables sont les radicaux benzyloxycarbonyle et 10 tertio-butoxycarbonyle. L'atome de carbone du;groupe carboxyle terminal de ce qu'on a appelé ci-dessus "Tin fragment de polypeptide correspondant au reste de la séquence des aminoacides " peut être protégé par .un substituant protecteur,connu, comme un groupe 15 alkyle inférieur (par exemple méthyle ou tertio-butyle) et un groupe aralkyle -(par exemple un groupe benzyle). Le substituant, protecteur destiné à protéger le groupe guanidino de la L-arginine comprend un groupe, nitro, toryle, etc.., un groupe nitro étant préférable. Le groupe 20 guanidino de L-arginine peut être protégé par l'addition d'acide chlorhydrique à un tel-groupe. ' Pour protéger le groupe V^-amino de l'acide L-gluta- mique, on peut faire appel à des substituants protecteurs tels que les groupes tertio-butyle, benzyle, etc.. , mais le groupe 25 Y -carboxyle de l'acide L-glutamique ou.le groupe guanidino de L-arginine peuvent ne pas- être.protégés pendant la réaction. Les polypeptides obtenus par la réaction de condensation comportent généralement des groupes amino protégés et des groupes carboxyliques protégés dans leur molécule .-La conversion 30 d'un groupe amino protégé en un groupe libre et la conversion d'un groupe carboxyle. protégé en un groupe carboxyle libre sont exécutéesd'une manière connue par traitement.avec un agent d'hydrolyse ( par exemple l'acide fluorhydrique, l'acide tri-' fluoracétique,etc.) ou avec un agent réducteur ( par exemple du 35 sodium métallique en présence d'ammoniaque liquide, etc..). Tous les procédés précités peuvent être mis en oeuvre pour former des liaisons peptidiques selon la présente invention, mais lesprocédés utilisés dans les exemples ci-dessous sont particulièrement avantageux. 70 40468 V 2073339 Comme mentionné plus haut, il existe plusieurs possibilités de synthèse en ce qui concerne les polypeptides de la présente invention. Selon l'un des procédés, par exemple, un dérivé protégé d'un tripeptide de formule: X-Tyr-SerOH (dans laquelle X a la même signification que ci-dessus, l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la L-serine est activé et le groupe fonctionnel libre ne participant pas à la réaction est protégé)est condensé avec un dérivé protégé d'un polypeptide de formule: H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P'-NHg (où P' est un membre choisi dans le groupe formé par ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-LysOH,•Pro-Val-Lys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOH et Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH,et tout groupe fonctionnel ne participant pas à la réaction est protégé ), les amides non susbtitués correspondants et les sels correspondants d'addition avec un acide , après quoi on élimine les iUbstituants protecteurs. Dans ce procédé, il est préférable que l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la L-sérine soit activé ■» par la formation d'un ester actif, par la formation d'un azide ou par l'utilisation d'un agent de condensation et, après la réaction de condensation, les groupes amino et carboxyle protégés du produit de""condensât!on ainsi obtenu sont libérés par utilisation d acide fluorhydrique. Conformément au procédé qu'on vient de décrire, on obtient un tricosapeptide selon la présente invention de la manière représentée sur le tableau 1 ci-dessous. Dans la totalité de la description, les symboles Z et BOC représentent respectivement un groupe carbobenzyloxy et un groupe tertio-butoxycarbonyle, et le symbole OtBu représente un groupe Y -carboxyle de 1'acidfe Lrglutamique qui est protégé par un groupe tertio-butyle. 70 40468 5 2073339 Tableau 1 Z- Sar- Tyr~ Ser-N ^ + N0o S Z l I I I H-Met-Glu-Hi s-Phe-Arg- Try-Gly-iy s-P ro-Val- G-ly-ly g»-Z N.Q_ NO. ■ Z • I i I , Lys-Arg-Arg-P ro-Val-Lys-Val-Tyr-NH ^ ÎÏO_ Z * ! I 2 I Z-Sar-ïyr- Ser-Met-G-lu-Hi S-Phe- A^g-Try-Gly-Lys-Pro-2 2 N0o N0o Z I i i l I Val-Gly-tys—.Lys-Arg-Ârg-Pro-Val-Iiys-Val-Tyr-KH^ | HF v H-Sar-Tyr-Ser-M et-Slu-Hi s-Phe-Arg-ï'ry-Gly-I Dans le tableau 1, X a la même signification que ci-dessus. Le dérivé tripeptide représenté dans le tableau 1 peut être préparé ,..par exemple, par le mode de synthèse représenté dans le tableau 2, et l'heneicosapeptide peut être préparé, par exemple , par le procédé décrit dans la demande de brevet allemand n° 18 811/1968. Tableau g Z-Sar-N + TyrQGH Z-Sar~ïyrûGH^ nh5-KH2-H2O hno,/ Z- 8ar- Tyr-iî -i- H-Ser-QGH ! 3 J Z-Sar-ïyr-SerOCH3 NH2-nh2-H2O HNO. •V 2 H-Sar-Tyr-Ser-N „ A 70 40468 e 2073339 On peut également préparer les polypeptides de la présente invention par condensation d'un dérivé protégé d'un tétrapeptide de formule X-Tyr-Ser-Met (dans laquelle X a la même signification que ci-dessus, le groupe fonctionnel libre 5 ne participant pas à la réaction est protégé et l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la L-méthionine est activé) sur un dérivé protégé de l'un des polypeptides H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P' (où P' a la même signification que ci-dessus, et les groupes 10 fonctionnels ne participant pas à la réaction sont protégés), les amides non substitués correspondants et les sels d'addition avec un acide correspondants,et en libérant ensuite les groupes amino et carboxyle protégés. Bien entendu, le polypeptide libre résultant peut être converti en un sel d'addition avec ion acide 15 ou en un complexe avec un métal lourd, pouvant être toléré au point de vue physiologique. Dans ce procédé, il est préférable que l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la L-méthionine soit activé par la formation d'un ester actif, par la formation d'un 20 azide, ou par 1!utilisation d'un agent de condensation et, après la réaction de condensation, les groupes amino et carboxyle protégés du polypeptide*-ainsi obtenu sont libérés par l'utilisation d'acide trifluoracétique ou d'acide fluorhydrique. Selon ce procédé, un tétracosapeptide de la présente 25 invention est obtenu de la manière représentée dans le tableau 3. a 70 40468 7 2073339 Tableau 3 BOC-X-Tyr-Ser-Met-N^ + OtBu BOC BOC I II H-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys- BOC I Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OtBu 1 OtBu BOC I I BOC-X-Tyr-Ifet-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-BOC BOC BOC i l ! Gly-Ly s-Ly s-Arg-Arg-'-Pr o-Yal-Lys-V al-Tyr-Pr o-OtBu CF-COOH • \' 3 " X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val- "i Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH (Dans le tableau ci-dessus, Pro-OtBu représente un groupe carboxyle estérifié- par un groupe tertio-butyle ), Selon le procédé de la présente invention, on peut également obtenir un polypeptide en faisant réagir un dérivé 5 -protégé d'un décapeptide de formule X-Tyr-Ser-Met-Giu-His-Phe-Arg-Try-GlyOH (dans laquelle X a la même signification que ci-dessus, les groupes fonctionnels libres ne participant à la réaction sont protégés par des substituants protecteurs et l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la glycine 10 est activé) avec un dérivé protégé d'un polypeptide de formule H-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P' (où P' est un membre choisi dans le groupe comprenant Pro0H,Pro-Val0H, Pro-Val-LysOH, ProVal-Lys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOH et Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH et les groupes fonctionnels ne participant pas à la réac-15 tion sont protégés par des substituants protecteurs) , avec son amide non substitué ou avec un sel d'addition avec un acide correspondant, et en éliminant les groupes protecteurs du polypeptide ainsi obtenu. Dans ce procédé, il est préférable que l'atome de 20 carbone du groupe carboxyle terminal de la glycine soit activé 10 15 20 30 70 40468 8 2073339 par la formation d'un ester actif, par la formation d'un azide, par l'utilisation d'un agent de condensation, par la formation d'un anhydride d'acide actif ou par la formation d'un anhydride mixte, après la réaction de condensation, les groupes amino et carboxyle protégés du produit de condensation résultant étant libérés par l'utilisation d'acide trifluoracétique ou d'acide fluorhydrique. Selon ce procédé, un polypeptide selon la présente invention est obtenu de la manière représentée dans le tableau 5. Tableau 5 0 OtBu . H IIC1 I I © BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-ïyr-G-ly-O © Z BOC BOC BOC ©@ i i I J - Cl H 0-Ly s-Pr o-V al-G-ly-Ly s-Ly s-Arg-Arg-Pr o-V al-Ly s- Yal-BH2 (D : OtBu N=C=H- BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-G-lu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro- C1 ©Cl © • BOC BOC H © H © BOC . . i I I I I ; 25 V al-G-ly-ly s-Ly s-Arg-Ar g-Pr o-V al-Ly s-V al-HH 2 CF,C00H j . H-Sar-Tyr-Ser-Met-G-lu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-V al-Gly-iys-Lys-Arg-Arg-Pr o-Val-Lys-Val-NH2 Le sel d'addition avec ion acide correspondant, 35 mentionné ci-dessus, est par exemple un sel d'addition avec un acide minéral ( par exemple un chlorhydrate , un sulfate ou un sel analogue) et un sel d'addition avec un acide organique (par exemple un acétate, un formiate ou un sel analogue). La réaction de condensation est généralement con-40 duite en présence d'un solvant approprié. Ce solvant peut être 70 40468 2073339 par exemple, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde, qui peuvent être anhydres ou hydratés, ou bien un mélange de ces solvants avec , par exemple, le chloroforme, le dioxanne, le dichlorométhane ou le tétrahydrofuranne. 5 La température réactionnelle est généralement com prise entre environ -20°C et 30°C, bien qu'on puisse conduire la réaction en chauffant ou en refroidissant. Les deux substances entre lesquelles doit être formée une liaison amide sont généralement utilisées en des quantités 10 stoechiométriques, mais lœproportions peuvent être modifiées à volonté. Généralement, lorsque la portion peptidique fixée sur l'atonie d'azote du groupe terminal est de dimension relativement petite, on obtient des rendements et des résultats meilleurs quand on utilise un excès de cette portion. 15 Lorsque la réaction est terminée, on peut récupérer le produit final par des procédés qui sont classiques. Selon lès conditions de la réaction, on obtient ce nouveau composé sous la forme d'une base ou d'un sel. Lorsqu'on obtient le composé sous forme d'un sel, 20 oh peut former la base d'ione manière classique et on peut la faire réagir avec un acide convenant au point de vue thérapeutique pour obtenir le sel correspondant. Un tel acide peut être un acicte minéral, comme par exemple un hâlogénure d'hydrogène (par exemple l'acide chlorhydrique ou l'acide bromhydrique), l'acide 25 perchlorique, l'acide nitrique, l'acide thiocyanique, l'acide sulfurique ou 11 acide phosphorique, ou bien ion acide organique comme, par exemple, l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide glycoliqae, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide succi-30 nique , l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide anthra-nilique, l'acide einnamique, l'acide naphtalène-suifonique ou l'acide sulfanilique. Le produit final ainsi obtenu peut être converti en un complexe métallique par des procédés qui sont connus. Par 35 exemple, on fait réagir une solution aqueuse du polypeptide obtenu comme décrit ci-dessus avec un sel ou un hydroxyde ou encore un oxyde d'un ou plusieurs métaux tels que le cuivre, le nickel, le cobalt et le fer, puis on ajuste le pH du mélange résultant entre environ 6 et 8, ce qui détermine la formation 40 d'un complexe d'un métal lourd, médiocrement soluble, entre le -jafi n ii —k 70 40468 10 2073339 composé métallique et le polypeptide précité. Parmi les divers complexes métalliques pouvant être ainsi obtenus, le complexe de zinc est particulièrement remarquable par son activité prolongée. 5 Le polypeptide obtenu par le procédé de la présente invention peut être administré sous des formes pharmaceutiques diverses £ dans lesquelles il se présente sous forme de mélanges avec des excipients organiques ou minéraux acceptables en pharmacie«, Des excipients appropriés sont les substances qui ne 10 réagissent pas avec le polypeptide précité, comme la gélatine, le lactose, le glucose, le chlorure de sodium, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, l'alcool benzylique, les gommes, le polyalkylène glycol, la vaseline blanche, le cholestérol, etc.,, ainsi que d'autres excipients 15 médicaux de types classiques. i Les compositions pharmaceutiques précitées peuvent j se présenter sous la forme de tablettes, de tablettes enrobées ' de sucre», d'onguents, .de poudresa de crèmes, de suppositoires, de solutions i, de suspensions et d'émulsions. Ces nouvelles { 20 préparations peuvent être stérilisées et/ou contenir des auxiliai res tels que des agents de conservation, des stabilisants, des agents mouillants et des émulsionnants. Les nouvelles préparations peuvent en outre contenir d'autres substances ayant un - - effet thérapeutique. 25 Le composé selon la présente invention peut ê,tre utilisé par voie orale ou parentérale, mais il' semble qu'on obtienne des résultats thérapeutiques meilleurs quand on l'ad- \ — i ministre en remplacement de 1'hormone adrénocprticotropique par voie, parentérale, par exemple par injection intramusculaire, j 50 intraveineuse et hypodermique. La dose posologique est variable, 5 mais, dans le cas/polypeptide, on administre habituellement, une j quantité d'environ 0,01 à 1 mg par jour , en une ou plusieurs fois. Dans le cas du complexe de zinc, on administre le composé ■ à raison d'environ 0,1 à 1 mg , par jour, en une ou deux fois. 35 On comprendra mieux la présente invention à la lecture des exemples qui vont suivre. A 70 40468 H 2073339 Exemple 1 (1) Z-Sar-Tyr-OCH-j Dans 400 ml d'acétonitrile, on met en suspension 28 g de chlorhydrate de Tyr-OCH^ et , tout en refroidissant avec de la glace, on ajoute 16,8 ml de triéthylamine. Après 30 minutes, on- introduit 22,4 g de Z-SarOh et 24,8 g de dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange tout en refroidissant avec de la glace pendant 2 heures. On laisse le mélange de réaction dans un réfrigérateur pendant la nuit et, le matin suivant, on ajoute une ou deux gouttes d'acide acétique. On filtre le mélange pour éliminer la dicyclohexyl-urée ainsi formée et on chasse l'acétonitrile du filtrat par distillation. On ajoute 500 ml d'acétate d'éthyle au résidu et on filtre pour âéparer les matières insolubles. On lave le filtrat avec de l'acide chlorhydrique IN et ensuite avec une solution aqueuse à 5% de bicarbonate de sodium, après quoi on fait sécher sur du sulfate de sodium aihydre.On chasse l'acétate d'éthyle par distillation sous pression réduite et on recristal lise le résidu cristallin dans un mélange d'éïhanôl et d'éther. Le rendement est de 28 g (ou 70g)j P.P." 155°-157°C; (a) +4,8(c=l,0, dans le diméthylformamide); Analyse élémentaire: Calculé pour C21H24^6N2 : C ^2,99* H 6,04; N 7*00', ; Trouvé: C 63,14; H 6,12; N 6,85. . (2) Z-Sar-Tyr-NHNHg Dans un mélange de 100 ml de méthanol et de 20 ml de diméthylformamide, on dissout 20 g de Z-Sar-Tyr-.OCH^ , puis on ajoute 12,5 ml d'hydrate d'hydrazirie. On laisse le mélange reposer pendant 50 heures , puis on récupère les cristaux résultants par filtration et on les met en suspension dans 200 ml de.méthanol. On fait bouillir la suspension et , après refroidissement, on recueille les cristaux par filtration. Le rendement est de 18,8 g (ou 94$) ; P.F. 221°C (déc.); (a) +7,4(c=1,0, dans le diméthylformamide); Analyse élémentaire: Calculé pour C2oH24°5N4 ' C 59*99 l H 6,04; N 13*99. * Trouvé : C 59*86; H 6,08; N 13,96 (3) Z-Sar-Tyr-Ser.OCH^ On dissout 8 g de Z-Sar-Tyr.NHNHg dans un mélange de 80 ml de diméthylformamide et de 40 ml de HC1 2N, puis on refroidit le mélange à -10°C. Tout en agitant ce mélange, 70 40468 12 . , . L 2073339 on y ajoute 5 ml de NaNO^ 5N, en 5 minutes, et -ensuite 200 ml d'eau glacée. On extrait l'huile précipitée par de l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec NaHCO^ à 5$ et avec de l'eau. On ajoute la solution d'azide ci-dessus à un mélange 5 de 3*12 g- de H-Ser.OCH^ HCl et de 2,8 ml de triéthylamine dans 50 ml d'acétate d'éthyle. On agite le mélange à 3°C pendant 24 heures, puis on le concentre à siccité. On solidifie le résidu en ajoutant de l'éther et on le lave avec de l'acétate d'éthyle, ce qui donne le composé désiré fondant à 159°C. 10 ; (4) Z-Sar-Tyr-Ser-NH.NHg On dissout 4,68 g de Z-Sar-Tyr-Ser-OCH^ dans un mélange comprenant 15 ml de diméthylformamide et 100 ml de méthanol, puis on" ajoute 2,5 ml d'hydrate d'hydrazine. On laisse 15 3e mélange reposer à la température ambiante pendant 70 heures et on le filtre pour récupérer lé précipité résultant, analogue à un gel. On laisse le précipité se transformer de nouveau en gel dans un mélange de diméthylformamide et dé méthanol. On filtre pour récupérer lé gel et on le sèche. Le rendement est 20 de 4,1 g (ou 87,5$) ; P.F. 215°C, avec décomp.(185°C, agglomération); (a)^2'^ =+4,4° (c=l,0, diméthylformamide); Analyse élémentaire: Calculé pour C23^30°7N5 : C ^6,54; H 6,19; N 14,33 ; Trouvé: C 55,14; H 6,03; N 14,44..- 25 ' (5) OtBu N0o Z I ! ! Z-Sar-Tyr-Ser-Met-&lu-ffis-Phe-Arg-Try-&ly-Lys-Pro-Z Z IO„ 10, z I I I 2 I I 30 Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH On ajoute 7,5 ml d'acide trifluoracétique contenant 1;% d'acide thioglycolique à 998 ml de 35 OtBu N02 BOC-Met-Glu-His-Phe-Arg Z Z Z N0o N0o Z I Mi l I Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-40 Pro-OH ( voir par exemple la demande de brevet allemand n° 70 ^0468 13 2073339 18 811/1968 pour un procédé de préparation d'un tel peptide). On dissout le peptide en secouant le mélange à la température ambiante pendant 20 minutes , après quoi on chasse environ la moitié de l'acide trifluoracétique par distillation 5 sous pression réduite. On ajoute 50 ml d'éther sec et on récupère le précipité incolore ainsi formé par filtration, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On dissout la poudre résultante dans 9 ml de diméthylformamide et , bout en refroidissant avec de la glace, on neutralise la solution en ajoutant 1,28 ml d'une 10 solution à 10$ de triéthylamine dans du diméthylformamide. Par ailleurs, on dissout 211 mg de Z-Sar-Tyr-Ser-NHNHg dans 9 ml de diméthylformamide et on ajoute 0,3 ml de HC1 6N à la solution. On refroidit.le mélange à -10°C et, tout eh agitant vigoureusement, on introduit goutte à goutte 0,15 ml 15 d'une solution aqueuse 4N de nitrite de sodium. Après 20 minutes» on neutralise le mélange avec 2,55 ml d'une solution à 10$ de triéthylamine dans du diméthylformamide et on sèche sur du sulfate de sodium anhydre. On ajoute Cette solution à la solution de dérivé d'heneicosânepeptide préparée comme ci-dessus, à -5°C, 20 puis on agite le mélange à la même température pendant 4 heures et ensuite à 5°C pendant ,20 heures. On ajoute 150 ml d'acétate d'éthyle contenant 0,1$ d'acide thioglycolique et on recueille le précipité résultant par filtration. On dissout ce précipité {'sous forme d'une poudre) dans un mélange (60:20:6:11:0,1) 25 d'acétate d'éthyle, de pyridine , d'acide acétique, d'eau et d*acide thioglycolique, puis on fait passer la solution sur une colonne de gel de silice £2 x 21cm) et on développe le chroma-togramme en utilisant un mélange de solvants identique, à celui qui précède. 50 On réunit les fractions :de 90 ml à JQO. ml et on chasse l'acétate d'éthyle par distillation, puis on ajoute de l'eau froide. On récupère le précipité résultant et on le lave avec une solution aqueuse à 1$ d'acide acétique, contenant 0,1$ d'acide thioglycolique, puis on le lave à l'eau et on le 35 sèche. Le rendement est de 582 mg (ou 56$); P.P. 190°-194°C, ■> pA C avec décomposition(156°C, agglomération); (a) D ' = -32,4° ( c=l,0, dans le diméthylformamide); Analyse élémentaire : Calculé pour C176^57046N4^S, ôHgO : C 55,40; H 6,51; N 15,64; s 0,8$; Trouvé: C 55,15; H 6,34; M 15,85; S 0,82. 20 70 40468 U 2073339 (6) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val- Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Vâl-Lys-Val-Tyr-Pro-ÔH Dans 3 ml d'acide trifluoracétique contenant 2 ml d'anisol et 0,2 ml d'aelde thioglycolique, on dissout 700 mg de — — OtBu N02 Z | I * I -Glu-His-Pûe-Arg-Try-Gly-lys-Pro-Val-Gly- Z-Sar-Tyr-Ser-Met' | î ! 2 i 2 S Lys-Ly s-Arg-Arg~Pr o-Tal-Ly s-Yal-Ty r-Pr o-OH et, après introduction de 25 ml d'acide fluorhydri que , on agite le mélange à 3°C pendant 50 minutes. On chasse l'acide fluorhy-drique par distillation sous pression réduite et on sèche le résidu sous pression réduite dans un dsœiccâteur contenant des ^ granules d'hydroxyde de sodium. On dissout le résidu séché dans 30 ml d'eau et on fait passer la solution sur une colonne (2 x 30cm) de résine "Amberlite IRA-400" (forme acétate). On réunit 1?éffluent et les liqueurs de lavage et on concentre jusqi'à environ 20 ml, puis on ajoute 0,2 ml d'acide thioglycolique. On chauffe le mélange à 50°C pendant 12 heures et on porte la solution à un volume de 200 ml avec de l'eau. On fait ensuite passer la solution sur une colonne (2 x 40cm) de carboxyméthyl cellulose qu'on lave avec de l'acétate d'ammonium 0,1M et qu'on élue ensuite 2 5 par la technique faisant appel à un gradient d'élution , la concentration du sel augmentant de 0,1M à 0,5M. Le polypeptide désiré sort dans les fractions d'une concentration comprise entre environ 0,2 et Ô,3M, fractions qui sont réunies et lyophy-lisées. Ce procédé donne 350 mg de (sarcosine"1") p(l-24)cortico-2° tropine; = -77,2° (concentration 0,5$, acide acétique à 1#) ; électrophorèse sur papier (pH 1,9) 9*3 cm. On constate une sécrétion de stéroîdes considérable chez des rats auxquels on a Injecté un tel produit. Exemple 2 N0 Z a) 12 I Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val- 70 40468 15 2073339 Z Z N0o NO„ Z I .1 I . I I Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NH2 A une solution de 140 mg (0,3 millimole) de Z-Sar-Tyr-5 Ser-NHNHg dans un mélange de 0,2 ml de HC1 6N et de diméthylformamide, on ajoute 0,1 mole de nitrite de sodium 4N, à -10°C, puis on agite le mélange pendant 30 minutes à -10°C. On neutralise le mélange de réaction avec 0,17 ml de triéthylamine et on le sèche sur NagSO^ anhydre. 10 On filtre la solution de l'azide et on ajoute le filtrat à une solution froide, dans le diméthylformamide,de : - - N0o Z Z Z N0o N0- 1 I l l I I H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-15 * Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NH2 , qu'on prépare avec 655 mg (0,2 millimole) de OtBU N0o Z Z I l l l BOC-Met-Glu-His-Phe-Àrg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-20 Z N0o N0o Z . I I I I - Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NHg en utilisant de l'acide trifluoracétique, par le procédé connu. On agite le mélange pendant 6 heures à -10°C et encore pendant 10 heures à 0°C. On 2ç-' ajoute au mélange de réaction la solution addtionnelle d'azide préparée à partir de 60 mg dé.l'hydrazide correspondant, de la manière décrite ci-dessus. Après avoir laissé le mélange reposer pendant 24 heures à 0°C, on précipite, le produit désiré en ajoutant 50 ml d'éther refroidi par de la glace, ce qui donne une poudre fine. On recueille la poudre par filtration et on la purifie ensuite par chromatographie sur une colonne de gel de silice, de la manière habituelle. Rendement 630 mg (85$); P.P. 205 - 210°C (décomp.) (agglomération entre 170 et l80°C), _ ' (a)E^ =-31° (c=0,5 dans le diméthylformamide), R '2 = 0,6, R_^ = PÎ? ** h, ^ 0,74, Rf =0,90. Analyse élémentaire: Calculé pour cxy6H237^46 Njj^S,4HgO : C 55*6; H 6,5; N 16,3; S 0,87 : Trouvé: C 55,4; H 6,5; N 16,0; S 0,78. 30 70 k0k68 2073339 (2). H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Iry-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NHg On prépare un mélange à partir de 500 mg du trico- . sapeptide préparé dans l'exemple 2 (1), de 0,75 ml d'anisol, 5 de 0,05 ml d'acide thioglycolique, de 1500 mg de méthionine, de 750 mg de tryptophanne et de 2 ml de CF^COOH. On agi.te le mélange à 0°C pendant 60 minutes, puis on chasse l'acide fluo-rhydrique résiduel et CP^COOH sous pression réduite. On reprend le résidu dans 25 ml d'eau et on lave 10 la solution à trois reprises,, en utilisant chaque fois 20 ml d'eau. On fait passer la couche aqueuse à travers une colonne de 75 ml de résine "Amberlite IRA-400" (forme acétate) et on lave la colonne avec une solution aqueuse à 0,"1 * pO 310 mg d'une poudre légère incolore. (a) ^ = -74,0° 30 (c=0,5 dans une solution àqùe'usè à 1% d'acide acétique), m^N Na°H W (E lcm ) 28^5 ^25,0), 290(25,«);"Rf4=0,54 électrophorèse sur papier/pyridine-AcOH-IUO (1:10:89, en volume) = à1"2^ -ACTH. • .La structure chimique du polypeptide ainsi obtenu 35 est également confirmée par un analyseur d'aminoacides. Exemple 3 (1) Z-Albu-Tyr-NHNHg 70 40468 2073339 A une solution de 23 g de H-Tyr-OCH^ dans 14 ml de triéthylamine et 400 ml d1acétonitrile, on introduit 19 g de Z-AlbuOH et 20 g de dioyclohexyl carbodiimide à 0°C, puis on agite la solution à la même température pendant 24'heures. On filtre ensuite le mélange de réaction et on concentre le filtrat à siccité. On dissout le résidu dans 400 ml d'acétate d'éthyle, puis on lave la solution avec de l'acide chlorhydrique IN, une solution aqueuse à 5# de bicarbonate de sodium et de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium et on fait évaporer sous vide, ce qui laisse un résidu sirupeux, avec un rendement de 32g. On dissout ce résidu sirupeux dans 200 ml de méthanol et on ajoute 14 ml d'hydrate d'hydrazine à la solution. Après avoir laissé le mélange à la température ambiante pendant la nuit, on élimine le solvant par évaporation sous vide, ce qui laisse un produit solide cristallin. On recristallise ce produit solide dans du méthanol aqueux et on obtient 27 g de 1 ".'hydra-zide désiré fondant à 144-149°C (déc.) . R^=0,6l. Analyse élémentaire pour Calculé: C 60,85; H 6,32; N, 13,52; Trouvé : C 60,66,* H 6,58; N 13,58. (2) Z-Albu-Tyr-SerOCH^ On dissout 12,42 g de Z-Albu-Tyr-NHNHg dans un mélange comprenant 100 ml de diméthylformamide et 60 ml d'acide chlorhydrique 2N. On ajoute au mélange 8 ml de nitrate de sodium 2N à une température comprise entre -5°C et -10°C, ce qui demande 5 minutes. On dilue ensuite le mélange de réaction avec 300 ml d'une solution aqueuse, saturée de chlorure de sodium glacée i On extrait à deux reprises l'azide qui a été àinsi préparé, en utilisant chaque fois 200 ml d'acétate d'éthyle refroidi par de la glace» On lave l'acétate d'éthyle avec une solution aqueuse à 5$ de bicarbonate de sodium refroidie par de la glace, et une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, puis on sèche sur du sulfate de sodium. On ajoute cette solution d'azide- à un mélange préparé à partir de 80 ml d'acétate d'éthyle, 20 ml de diméthyl--formamide, 4,7 g de H-Ser-OCH^.HCl et 4*2 ml de triéthylamine, puis on agite le mélange à 0°C pendant 46 heures. On lave le mélange de réaction avec une solution aqueuse à 4$.de bicarbonate de sodium, avec de l'acide chlorhydrate IN et avec de l'eau. Après séchage de la phase organique sur du sulfate de 70 40468 18 2073339 sodium, on chasse ls solvant par évaporation sous vide. On cristallise le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole» ce qui donné 9,7 g du composé désiré fondant à 169,5-170,5°C (déc.) . R/1 = 0,54, (a)|8 =-43,0(c=l,0, dans ç le méthanol); Analyse élémentaire pour Cg^H^OgN^: Calculé: C 59,87; H 6,23; N 8,38 ; Trouvé: C 59,83; H 6,13; N 8,61. (3) Z-Albu-Tyr-Ser-NHNHg 10 A une solution de 9g de Z-Albu-Tyr-Ser-OCH^ dans 100 ml de méthanol, on ajoute 10 ml d'hydrate d'hydrazine, puis on maintient le mélange à la température ambiante pendant 10 heures. On chasse le solvant par évaporation sous vide et on cristallise ensuite le résidu dans l'éther. Le rendement est de 15 8,2 g d'un produit fondant à 1^9,5-151°C (dec.); Rf1= 0,18; (a)lP -^8,0° (c=l,0 dans le diméthylformamide). Analyse élémentaire pour Cg^HgçjOfNfj : Calculé : C 56,66; H 6,00; N 14,73. N0o Z I 2 I Z-'Albu-Tyr-Ser-Met-ŒLu-His-Phe-Arg-Try-Gly-lys-Pro-Z Z N0o N0, Z f H t l I Yal-G-3y-Lys-iys-Arg~Arg-Pro-VaX-Lys-Val-Tyr-Pro0H (4-1) ' OtBu N0, Z f \ ! On dissout 3,4g de BQO-Met-(Ru-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Z Z N0, NÔ, Z I I I 2 ! 2 I Pr o-Val-G-ly-Ly s-Èy s-Arg-Âx-g-Pr o-Val-Ly s-Val-Tyr-Pr oCH dans 30 ml d'acide trifluoracétique refroidi par de la glace et contenant 0,1 ml d'acide thioglycolique et on agite à 15°C pendant 25 minutes. On concentre la solution à environ 10 ml sous vidé et on détermine la précipitation du produit en ajoutant 35 100 ml d'éther. On filtre pour recueillir le précipité qu'on sèche sur de l'hydroxyde de sodium , sous vide. On dissout la poudre sèche dans 20,'ml de diméthylformamide et on ajoute 0,5 ml de triéthylamine à la solution, après quoi on refroidit à -20°C. (*)- 20 25 70 40468 2073339 (4-2) On dissout 633 mg de Z-Albu-Tyr-Ser-NHN^ dans un mélange de 15 ml de diméthylformamide et de 1 ml d'acide chlorhydrique 6N, puis on ajoute à la solution 0,4 ml de nitrite de sodium 4N, à -5°C. on agite le mélange pendant 20 minutes à -5°C et on y ajoute 0,9 ml de triéthylamine refroidi par de la glace, après quoi on sèche sur du sulfate de sodium. On filtre la solution séchée et on ajoute le filtrat à la solution obtenue dans le procédé (4-1) décrit ci-dessus. On agite le mélange total pendant 6 heures à -10°C, et ensuite pendant 10 heures à 0°C. On ajoute au mélange de réaction une solution d'azidefraîche obtenue à partir de 320 mg de Z-Albu-Tyr-Ser-NHNH^ par les mêmes procédés que ci-dessus, après quoi on agite le mélange pendant encore 24 heures à 0°C. On détermine la précipitation du produit par l'addition d'éther glacé et on filtre pour recueillir le précipité. On dissout ce, dernier dans un mélange (60:20:6:11) d'acétate d'éthyle, de pyridine, d'acide acétique et d'eau, puis on fait passer la solution dans une colonne d'un gel de silice qu'on élue avec le même solvant. Le composé apparaît rapidement-. On recueille la fraction principale et on Ta sèche sous vide. On ajoute de l'eau glacée au résidu résultant, ce qui donne une poudre microcristalline fine qu'on recueille par filtration et qu'on lave avec de l'acide acétique à 1# et ensuite avec de l'eau. On obtient 3,2 g de produit fondant à 170°C (déc.; 145°C, agglomération)] (a)jn^ -31,6° (c=0,5 dans le diméthylformamide) ; R^ = 0,0; Rf' = 0,55. (5) H-Albu-Tyr-Ser-Met-Glu-His~Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys^Val-Tyr-ProOH ' On traite 3g du produit obtenu dans le paragraphe (4-2) ci-dessus avec de l'acide fluorhydrique anhydre et,on le purifie en utilisant le procédé décrit dans l'exemple 1 11 (6) . Le rendement est de 1,7 g j R^ = 0,55j electrophorese sur papier : pH 1,9 (tampon acide acétique-acide formique; 500V, 60 minutes) = -9,0 cm (= a ACTH), (a)^= -8l,.l° (c=l,0, dans l'acide acétique à 1%); l'analyse des aminoacides donne: \ (acide chlorhydrique 5,7N, 110°C, 24 heures, hydrolysat): Lys 3,9 (4), His 1,0(1), Ar.g 2,9(3), Ser 1,0(1), Glu 1,0(1), Pro 2,9(3), Gly 2,0(2), Albu 0,9(1), Val 2,8(3), Met 0,9(1), Tyr 1,9(2), Phe 1,0(1). Le composé est converti en un sel d'addition avec l'acide chlorhydrique correspondant ou en un sel 70 40468 2073339 d'addition avec l'acide acétique correspondant d'une manière connue en soi. Exemple 4 5 (1) BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNHg A unesolution préparée à partir de 4,13 S de H-Tyr-Met-OCKj , de 100 ml d'acétonitrile et 10 ml de diméthyl-fcrmamide, on ajoute 2,3 g de B0C-Sar^-0H et 2,3 g de dicyclo-hexylcarbodiimide, tout en agitant, à 0°C. On agite le mélange 10 pendant 24 heures à 0°C puis pendant 10 heures encore à 20°C. On filtre: le mélange pour séparer la dicyclohexyl urée formée et on concentre le filtrat à siccité sous vide. On dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle chaud et on lave la solution avec une solution aqueuse à 4$ dë bicarbonate de soude et avec 15 de l'eau. On concentre la solution lavée à un faible volume et-on ajoute de l'éther au mélange.restant. On filtre pour recueillir le produit qui précipite et on le recristallise dans un mélange de méthanol et d'éther ce qui donne 4,8 g de produit. (R-1 = 0,3). il ' 20 On dissout le produit dans un mélange ehaud de -méthanol et de diméthylformamide et on ajoute, à cette solution, 2 ml d'hydrate d'hydrazine. On recueille ensuite le mélange par filtration , puis on le lave avec de l'eau et avec de 1'éthanol, ce qui donne 4,3 g de l'hydrazide recherché.-, R^'1 = 0,0 ; 25 B.f = 0,55. (2) OtBu I BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH 30 On ajoute 1,7 ml de nitrate de sodium IN , à 0°C, à une solution préparée avec 900 mg de BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNHg, 10 ml de diméthylformamide et 4 ml d'acide chlorhydrique IN, puis on agite le mélange de réaction pendant 5 minutes. On y ajoute 50 ml d'une solution aqueuse saturée d'acétate d'éthyle 35 glacé et de chlorur.e de sodium glacé. On extrait la couche aqueuse à deux reprises avec de l'acétate d'éthyle glacé. On combine les phases organiques réunies, on les lave avec une solution aqueuse glacée à 4$ de bicarbonate de sodium et on sèche sur de l'acétate de sodium. On ajoute la solution séchée 40 à une solution préparée à partir de 1 g d'un sel d'acide acétique 70 40468 2073339 OtBu \ de H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH , 0,4 ml de triéthylamine et 30 ml de diméthylformamide, puis on fait évaporer 1.'acétate d'éthyle sous vide à 10°C,0n agite la solution résultante à 3°C pendant 12 heures. On ajoute unesolution supplémentaire, d'azide (préparée à partir de 500 mg de BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNHg comme décrit ci-dessus) et on agite le mélange de réaction à 5°G pendant encore 24 heures. On dilue le mélange de réaction arec 500 ml d'acétate d'éthyle glacé, ce qui donne un précipité amorphe. On recueille ce précipité par filtration et on le lecristallise dans un mélange de diméthylformamide et de méthanol, ce qui donne le produit purifié avec un rendement de 1,4 g; (a)p1 -19,0° (c=l dans le diméthylformamide); R^=0,30; R"^=0,75. ^ (3) H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hus-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-NHg A une solution préparée à partir de 0,74 g de 10 20 OtBu t BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly 0H et de diméthylformamide,* on ajoute 0,5 ml d'acide chlorhydrique glacé IN, à 0°C. On précipite le chlorhydrate en ajoutant 5 ml d'acétate d'éthyle glacé. On recueille le précipité par centrifugation et on le lave avec de l'acétate d'éthyle , après quoi on le ^ sèche sous vide. On dissout la poudre résultante dans un mélange comprenant 50 ml de diméthylformamide et 20 ml de pyridine, après quoi on ajoute à ce mélange d'abord 1,1 g de tosylate de BOC BOC BOC I II 30 :.H-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-NHg et ensuite 400 mg (de dicyclohexyl carbodiimide. On agite le mélange pendant 4 jours à 10°C. Après avoir concentré la solution sous vide jusqu'à un volume de 20 ml, on ajoute 500 ml d'acétate d'éthyle , ce qui donne un précipité amorphe qu'on recueille par centrifugation 35 et qu'on lave avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther. On x dissout la substance dans une solution aqueuse à 50^ (en volume) de tétrahydrofuranne, puis on fait passer la solution à travers une colonne de résine "Amberlite IRA-400" (3x30cm) , après quoi on élue avec le même solvant. On chasse le solvant par évapora-40 tion et on lyophilise la solution aqueuse, ce qui donne une ma—k 70 40468 22 2073339 poudre légère, avec un rendement de 1,92 g . On dissout 100 mg de l'eicosapeptide ainsi obtenu, dont les groupes amino et carboxyle libres sont protégés , dans' 2 ml d'acide trifluoracétique à 90%, puis on maintient la 5 solution à la température ambiante pendant 1 heure. On chasse l'acide trifluoracétique par évaporation et on dissout le résidu dans de l'eau, après quoi on fait passer la solution à travers une colonne (0,5 x 2ocm) de résine "Amberlite IRA-400" (forme acétique). On dissout le produit de l'élution dans 10 ml d'eau 10 puis on le'fait passer sur une colonne de carboxyméthyl cellulose (1 x 20cm) , qu'on élue avec un tampon à l'acétate d'ammonium, en appliquant la méthode du gradient d'élution, de 0,1M à 1M, au pH 6,8. L'éicosapeptide pur est élué avec le tampon à environ 0,3 M. On concentre le produit de l'élution sous vide jusqu'à 3,5 un faible volume et on le lyophilise .jusqu'à un poids constant. pp Le rendement est de 70' mg. (cOry = -6l° (c=0,5 dans l'acide acétique à 1^); R ^ = 0,0; R ' = 0,5, i. •- ' - . Exemple 5 20 (1) BOC-Albu-Tyr-NHWHg A une solution de 23 g de H.Tyr-OCH^.HCl et de 14 ml (te triéthylamine dans 400 ml d'acétonitrile, on ajoute 20 g de BOC-Albu.OH et 22 g de dicyclohexyl carbodiimide , à 0°C, puis on agite la solution à Q°C pendant 24 heures. On filtre le 25 mélange de réaction et on fait évaporer le filtrat à siccité. On dissout le résidu dans 400 ml d'acétate d'éthyle et on lave ensuite la solution dans l'acétate d'éthyle, avec de l'acide chlorhydrique IN, du bicarbonate de sodium à 52» et de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium et on fait évaporer sous vide, 30 ce qui laisse 31 g d'un résidu sirupeux. On dissout ce résidu dans 200 ml de méthanol et on ajoute 14 ml d'hydrate d'hydrazine à cette solution. Après avois maintenu le mélange à la température ambiante pendant 12 heures, on chasse le. solvant par évaporation sous vide , ce qui donne un produit solide cristallin. 35 On recristallise ce produit solide dans du méthanol aqueux, ce qui donne 28 g de l'hydrazide. R,f1=0,64 ; Analyse: Calculé pour c18h28°5N4 : C 56,82; H 7,42; N 14,73; Trouvé: C 56,73; H 7,51; N 14,76; • 70 40468 2073339 (2) BOCnAlbu-Tyr-Ser-OCH^ On dissout î6 g de BOC-Albu-Tyr-NHNHg dans un mélange comprenant 100 ml de diméthylformamide et 60 ml de HC1 2N, puis on introduit 6 ml de nitrite de sodium 2N,entre 5 -5°C et -10°C, ce qui demande 7 minutes. On dilue ensuite le mélange de réaction avec 300 ml d'eau glacée saturée de NaCl. On extrait l'azide séparé avec de l'acétate d'éthyle glacé, à deux reprises, en utilisant chaque fois 200 ml df 'acétate. On lave la solution dans l'acétate 10 d'éthyle avec une solution aqueuse glacée à 5% de bicarbonate dëL sodium et avec de l'eau saturée de NaCl, puis on la sèche sur du sulfate de sodium. Oh ajoute cette solution d'azide à une solution de 7,8 g de H-Ser-OCH^ et de 7,5 ml de triéthylamine dans 150 ml 15 dlacétate d'éthyle, puis on agite le mélange à 0°C pendant deux jours. On lave le mélange de réaction avec une-solution , aqueuse à 4$ de bicarbonate de sodium, avec de l'acide chlorhydrique IN et avec de l'eau. On sèche la phase organique sur 20 NagSO^ et on élimine le solvant sous vide. La cristallisation du résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole donné 10,8 g-de BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH-j Rj,1 = 0,58j' Analyse élémentaire: Calcule pour C22H33°8N3: C 56,52; ' H 7,12; N 8,99; Trouvé: C 56,44; H 7,23; 25 N 9,13. (2) BOC-Albu-Tyr-Ser-NHNHg A une solution de 10 g de BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH^ dans 100 ml de méthanol, on ajoute 10 ml d'hydrate d'hydrazine 30 et on maintient le mélange à la température ambiante pendant 8 heureâ. On chasse le solvant par évaporation sous vide et on cristallise le résidu dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole. Le rendement est de 9,3 S* Rf^* ^ 0,21'. Analyse élémentaire: Calculé pour C2i^3®i7N5 : ^ 53,95; H 7,12; N 14,98; Trouvé : C 53,80; H 7,41; N 14,83. (3) H-Albu-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro OH 24 70 40468 2073339 (3*1) Constituant aminé On dissout 600 mg d'un sel d'addition de OtBu . BOC BOC BOC I I I I H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-BOC . I Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OtBu avec l'acide tétraacétique et 0,27 ml de triéthylamine dans un mélange comprenant 2 ml dè diméthylformamide et 1 ml de pyridine. On refroidit la solution à -5°C. (3-2) Solution diazide. Dans une solution préparée à partir de 200 mg de BOC-Albu-Tyr-Ser-Met-NHNHg et de 4 ml de diméthylformamide, on introduit 0,3 ml d'acide chlorhydrique 4N, tout en agitant, à -10°C. On agite le mélange pendant 10 minutes à -10°C. (3-3) Couplage On ajoute la solution d'azide ci-dessus à line solution dans le diméthylformamide dù constituant aminé, puis on agite le mélange à 0°C pendant 40 heures. On concentre la solution sous "vide jusqu'à un faibie volume, et on la dilue avec 20 ml d'eau glacée. On recueille le précipité formé par centrifugation, on le lave avec de l'eau et avec de l'éther ,'et on obtient ainsi 730 mg d'une, poudre jaunâtre amorphe. On traite ;cette poudre avec de l'acide trifluoracétique par tin procédé Identique à celui qui est décrit dans l'exemple 4 (3). On purifie le produit résultant en utilisant Une colonne de caboxyméthyl cellulose, de la manière décrite dans 1Texemple 4 (3), cce qui donne le peptide désiré. La structure du peptide est confirmée par un analyseur d'aminoacides. Exemple 6 On dissout 10 mg de (sarcosine1) P (1-24) cortico-■tropine , préparée dans l'exemple 1 (6) dans 5 ml d'eau distillée. On ajoute à cette solution 74 mg de ZnClg en solution dans 2 ml d'eau et 30 mg de Na2HP0^, 121^0 en dissolution dans 2 ml d'eau. On dilue la solution résultante avec de l'eau jusqu'à un volume de 20 ml et on ajuste son pH à 8,0 - 8,5, tout en agitant. On recueille le gel précipité par centrifugation, ce qui donne un complexe de zinc de (sarcosine1) p(1-24) corticotropine. 70 40468 25 15 2073339 REVENDICATIONS 1. Polypeptide caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les polypeptides ayant pour formule générale: X-L-tyrosyl-L-séryl-L-me'thionyl-L-glutainyl-L-histidyl-L-/ phenylalanyl-L-arginyl-In-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L- 5 prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-l-arginyl-Ii-arginyl-P- (où le symbole Xreprésente tin groupe sarcosyle ou a-amino-isobutyryle et P„représente un membre appartenant au groupe suivant: 10 L- proline, L-prolyl-L-valine, L-prolyi-L-valyl-L-lysine, 1- prolyl-L-valyl-l-lysyl-l-valine, l-prolyl-L-valyl-L- lysyl-L-valyl-l-tyrosine and L-pr oly 1-i-valy1-L-lysy 1-1-valyl-L-tyrosyl-L-proline), leurs amides non substitués, leurs sels d'addition avec un acide physiologiquement acceptable, et leurs complexes avec un métal lourd. 2. Polypeptide slon la revendication 1, caractérisé par le fait que X est un groupe sarcosyle et P est la L-pcdLyl-L-Vàlyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine. 3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que X est un groupe sarcosyle et P est la L-prolyl-L-valyl-L-fysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L'-proline. fy. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que X est un groupe a-amino-Isobufcyryle et P est la L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine. 5. Polypeptide selon la revendication .1, • caractérisé par le fait que X est un groupe a-amino-isofeutyryle et P est la L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline. 6. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le sel d'addition avec un acide physiologiquement acceptable est un sel d'acide acétique ou d'acide chlorhydrique . 7. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le complexe avec un métal lourd est un com- \ plexe de zinc. 8. Polypeptide caractérisé par le fait qu'.il est choisi parmi les polypeptides répondant à la formule: sarcosyl- 20 25 50 35 70 40468 26 2073339 L-tyrosyl-L-seryl-L-methiobyl-L-gentamyl-L-histidyl-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L- prolyl-L-valyl-glycyl-L-iysyl-L-ly syl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine amide, leurs sels avec l'acide acétique ou avec l'acide chlorhydrique et leurs complexes avec le zinc. 9. Polypeptide, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les polypeptides de formule : sarcosyl- L-tyrosyl-L-séryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-* pheny lal'any 1-L-arginyl-L- try p t ophany 1-gly cyl-L-ly syl-L-proly1-L-valyl-glycyl-l-lysyl-L-lysyl-l-arginy1-L-axginyl-L-prolyl-L-valyl—L-lysyl-l-valyl-L-tyro^yl-L- proline i leurs sels avec l'acide acétique ou avec l'acide chlorhydrique et leuis complexes avec le zinc. 10. Polypeptide, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les polypeptides répondant à la formule: a-amino isobutyryl-L-tyrosyl-Jj-seryl-L-methionyl-L-glutaniyl-L-histidyl-L~phéï3ylalanyl-L-a,rginyl-L-tryptophanyl-glycyl-l-ly sy1-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-iysy1-L-arginy1-L-arginyl-L-prolyl-rL-valyl-L-lysyl-Ii-valyl-L-tyrosine amide, leurs sels avec l'acide acétique, leurs sels avec 1'acide chlorhydrique et leurs complexes avec le zinc. 11. Polypeptide, caractérisé-par le fait qu'il est choisi parmi les polypeptides ayant pour formule; sarcosyl--L-tyrosyl-L-séryl-l-methionyl-lj-glutainyl-L-histidyl-L- phê ny lalany 1-L- arg ir^y 1-L- try p t ophany 1-gly cyl-L-ly sy 1- L-proly1-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-Iysyl-L-arginy1-L- arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-Ii-tyrosyl-L-proline, leurs sels avec l'acide acétique, leurs sels avec l'acide chlorhydrique et leurs complexes avec le zinc. 12. Procédé de préparation d'un polypeptide pris dans le groupe comprenant les,polypeptides représentés par la formule générale : X-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl- 10 70 40468 87 2073339 L-hist;Ldyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-;glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P (où X est un groupe sarcosyle ou p-amino-isobutyryle et P est un membre du groupe suivant : L-prolirne-L-prolyl-L-valine,L prolyl-L-valyl-L-lysine, L-proly 1-L-valy1-L-lysy1-1- valine, L-proly1-L-valy1-L-lysy1-L-valy1-L-tyrosine et L-prolyi-L-valy1-L-lysy1-L-valy1-L-tyrosyl-L-proline). leurs amides non substitués, leurs sels d'addition avec un acide physiologiquement acceptable et leurs complexes avec un métal lourd, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir un dérivé protégé d'un tripeptide de formule X-L-tyrosyl-L-sérine (où X représente un groupe sarcosyle ou a-amino-isobu-tyryle, l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la L-sérine est activé et l'atome d'azote du groupe a-amino terminal de la sarcosine ou de l'acide a-amino-butyrique est protégé par un substituant protecteur)' avec un membre.-pris dans le groupe que forment les dérivés protégés d'un polypeptide représenté par la formule : L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P1 (ou P' est choisi dans le groupe suivant: L-proline, L-prolyl-L-valine, L-prolyl-L-valyl-L-lysine, L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valine, L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine et L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin.e, les groupes ê-amino de la L-lysine sont protégés par des substituants .'protecteurs, et chacun des groupés Y-earboxyle de l'acide L-glutamiqûe, l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal et le groupe guanidino de L-arginine peuvent être protégés par un substituant protecteur), ou bien un amide.non substitué ou encore un sel d'addition avec un acide d'un tel polypeptide, et, si on le désire, à convertir le polypeptidelibre résultant en un sel d'addition avec un acide physiologiquement acceptable ou en un complexe avec un métal lourd. 35 13. Procédé de préparation d'un polypeptide pris , ciins le. groupe comprenant les polypeptides représentés par la formule générale : X-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-40 arginyl-P ( dans laquelle X représente un groupe sarcosyle ou 20 70 40468 28 2073339 a-amino-isobutyryle, et P est un membre du groupe suivant: L-proline, L-prolyl-L-valihe, L-prolyl-L-valyl-L-lysine, L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valine, L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine et L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline),leurs amides non susbstitués, leurs sels d'addition -, avec un acide physiologiquement acceptable et leurs complexes avec un métal lourd, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir un dérivé protégé d'un tétrapep-tide de formule générale X-L-tyrosyl-irséryl-L-méthionine (où X représente un groupe sarcosyle ou a-amino-isobutyryle , l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal de la L-méthionine est activé et l'atome d'azote du groupe a-amino terminal de la sarcosine ou de l'acide a-amino-isobutyrique est protégé par un substituant protecteur) avec un membre du groupe que forment les dérivés protégés d'un polypeptide de formule : I>—glutamyl-l-histidyl—L—phenylalanyl—L-arginyl—L-trypto-phany 1-gly cyl—L—lysyl—L-proly 1-L-valy 1-gly cyl-L-ly syl-L- lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P' p» est un membre choisi *-dans le .groupe suivant : L-proline, L-prolyl- L-valine, L-prolyl-L-valyl-L-lysine., L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valine, L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-.tyrosine et L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valy1-L-tyrosyl-L-proline , les groupes 14. Procédé de préparation d';un polypeptide pris dans le groupe comprenant les polypeptides représentés par la formule générale : X-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L- glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycy 1-L-lysy 1-L-proly 1-L-valy 1-gly cyl-L-ly syl-L-lysyl-L- 70 40468 2073339 15 arginyl-L-arginyl-P ( où X représente un groupe sarcosyle ou a-amino-isobutyryle et P est un membre pris dans le groupe suivant : L-proline, L-prolyl-L-valine, L-prolyl-L- 5 valy1-L-lysine, L-proly1-L-valy1-L-ly sy1-1-valine, L-proly 1- L-valy1-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine and L-proly1-L-valy1-L- lysy1-1-valy1-L- tyrosyl-L-proline), leurs amides non substitués, leurs sels d'addition avec un acide physiologiquement acceptable et leurs complexes avec un métal lourds ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on fait réagir un dérivé protégé d'un décapeptide de formule générale : X-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycine ( où X représente un groupe sarcosyle ou a-amino isobutyryle, l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal dé la glycine est activé, l'atome d'azote du groupe a-amino de la sarcosine ou de l'acide a-amino-isobutyrique est protégé par un substituant protecteur et le groupe Y-carboxyle de l'acide L-glutamique peut être protégé par un substituant 2q protecteur ) avec un membre pris dans le groupe comprenant les dérivés protégés d'un polypeptide de formule : L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyeyl-L-arginyl-L-arginyl-P' (dans laquelle P' représente un membre du groupe suivant : 25 L-proline, L-prolyl-L-valine, L-prolyl-L-valyl-L-lysine, L-proly1-L-valy1-L-lysyl-L-valine, L-proly1-L-valy1-L- ly sy1-L-valyl-L-tyro sine and L-proly1-L-valy1-L-lysy1-L- valyl-l-tyrosyl-L-proline, gcaapas ae la 3° L-lysine sont protégés par un substituant protecteur et chacun des atomes de carbone du groupe carboxyle terminal et du groupe guanidino de la L-arginine peut être protégé par un substituant protecteur) , ses amides non substitués et un sel d'addition avec un acide correspondant, à libérer les groupes amino et carboxyle protégés et, si on le désire, à convertir le poly- ^ peptide libre résultant en un sel d'addition avec un acide physiologiquement acceptable ou en un complexe avec un.métal lourd. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendica-21,0 tions 12 à 14, caractérisé par le fait que 3e symbole X 70 40468 2073339 représente un groupe sarcosyle . 16. Procédé selon'l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé par le fait que le symbole X représente un groupe a-amino isobutyryle. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé par le fait que le symbôle P représente la L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12. à 16, caractérisé par le fait que le symbole P représente là L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18 , caractérisé par le fait que le sel d'addition avec un acide acceptable est un sel d'acide acétique ou d'acide chlorhydrique. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisé par le fait que le substituant protecteur de- 1'atome d'azote du groupe a-amino terminal de la sarcosine ou de l'acide a-amino-isobutyrique est protégé par un groupe benzyloxycarbonyle où par un groupe tertio-butoxycarbonyle, le groupe Y-carboxyle de l'acide L-glutamique est protégé par un groupe tertio-butyle , les groupes guanidino de la L-arginine sont protégés par des groupes nitro et les groupes £-amino de la L-lysine sont protégés par des groupes benzyloxycarbonyle ou tertio-butoxycarbonyle. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé par le fait que l'atome de carbone du groupe carboxyle terminal est activé par la formation d'\on ester actif, par la formation d'un"azlde ou par l'utilisation d'un agent de condensation» 22. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le groupe carboxyle terminal est activé par la £>rmation d'un anhydride d'acide ou.par la formation d'un anhydride mixte. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 et 14, caractérisé par le fait que les groupes amino et carboxyle protégés sont libérés par l'utilisation d'acide fluorhydrique. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé par le fait qu'on libère les groupes amino et les groupes carboxyle protégés en utilisant l'acide trifluoracétique. 70 40468 31 2073339 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, 17 et 19 à 23, caractérisé par le fait que le polypeptide est un membre appartenant au groupe que forment les polypeptides qui sont représentés par la formule: sarcosyl- ^ L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-grutamyl-L-histidyl-L-phényl-alanyl-L-arginyl-Lr-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine-amide, leurs sels d'addition avec l'acide acétique, leurs ;sels d'addition avec l'acide chlorhydrique et leurs complexes avec le zinc. 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15 et 18 à 23, caractérisé par le fait que'on choisit le polypeptide dans le groupe que forment les polypep- peptides représentés par la formule : sarcosyl-L-tyrosyl-L-15 séryi-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-; arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyeyl-L- | lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L- i valyl-L-tyrosyl-L-proline, leurs sels avec l'acide aeétique, leurs sels avec l'acide chlorhydrique et leurs complexes avec 20 le zinc, 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, 16, 17 et 19 à 23, caractérisé par le fait que | le polypeptide appartient au groupe que forment les polypeptides qui sont représentés par la formule: a-amino-isobutyryl-L-25 tyrosyl-L-séryl-L-méthiQnyl-L-glutamyL-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-I L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl- ■j L-valyl-L-tyrosine,( leurs amides non substitués, leur sels j avec l'acide acétique, leurs sels avec l'acide ohlorhydrique, { 30 et leurs complexes avec le zinc. i 28. Procédé selon l'une quelconque des revendica tions 12 à 14, 16 et 18 à 23, caractérisé par le fait que le polypeptide est pris dans le groupe que forment les polypeptides qui sont représentés par la formule :ct-amino-isobutyry 1-L-tyrosyl-35 L-séryl-L-méthionyl-l-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-1- arginyl-i-tryptophany1-glycy1-L-lysy1-L-proly1-L-valy1- glycy1-L-lysy1-L-lysy1-L-arginyl-L-arginy1-L-proly1-L- 70 40468 2073339 valyl-L-lysyl'-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline, leurs sels avec l'acide acétique, leurs sels avec l'acide chlorhydrique et leurs complexes de zinc.