Brevet FR2068424A1 — publié le 19710827

L'invention concerne un procédé pour la purification à l'échelle industrielle d'inhibiteurs de la kallilrré- ine et de la trypsine à partir de solutions aqueuses de ceux-ci, pour obtenir un produit à usage thérapeutique injectable directement, meme à doses élevées, par exemple par perfusion intraveineuse lente. Des procédés pour l'extraction et la purification de ces inhibiteurs sont par exemple décrits dans les brevets allemands n0 950 959 ; 954 284 ; 956 097 ; 1 011 576 ; 1 014 288 ; 1 14u 352 au nom de ParbenSabriken Bayer .G0 et dans le brevet français nO 1 566 777 déposé le 15 mars 1968 au nom de la demanderesse0 Dans le passé, la purification de l'inhibiteur de la kallikrdine et de la trypsine, extrait d'organes d'animaux, jusqu'à un degré de pureté acceptable aux fins thérapeutiques, était effectuée au moyen de résines échangeuses d'ions appropriées, ou à l'aide de réactifs spécifiques, tels que les acides picrique, sulfosalicylique ou tannique, avec formation de complexes suivie d'une scission.Ces procédés impliquaient des opérations longues et relativement laborieuses, surtout du fait de la nécessité d'opérations successives de séparation. Or, on a découvert que cet inhibiteur est soluble à un pH neutre ou légèrement acide, compris entre 5,5 et 7, dans des solutions pratiquement saturées de sels minéraux, par exemple, de chlorure de sodium et qu'on peut le faire précipiter quantitativement à partir de ces solutions, à la température ambiante, par abaissement du pH jusqu'à des valeurs comprises entre 1 et 3. Le procédé selon l'invention pour la purification d'inhibiteurs de la kallikréine et de la trypsine, mis en oeuvre à la température ambiante, comprend les opérations suivantes : a) addition à la solution aqueuse de l'inhibiteur brut, à un pH compris entre 5,5 et 7 et sous agitation d'un sel inorganique, jusqu'à un degré de saturation compris entre 80 * et 100 ;; b) filtration c) déplacement du pH du liquide de filtration jusqu'à une valeur comprise entre 1 et 3, par addition d'un acide minéral, ce qui produit une précipitation quantitative de l'inhibiteur d) filtration et récupération de l'inhibiteur ainsi pré oipité e) mise en suspension à la concentration voulue dans un véhicule aqueux rendu bactériostatique par un agent de conservation approprié et dissolution par neutralisa- tion ; et f) filtration stérilisante0 Le liquide de filtration obtenu constitue la solution d'inhibiteur qui se prête à une utilisation thérapeutique. I1 est important de noter que le produit obtenu est caractérisé par l'absence de substances susceptibles de provoquer des réactions allergiques et un choc anaphylactique, ainsi que de substances pyrogènes. En outre, il y a lieu de noter que le produit obtenu est parfaitement incolore, notamment si l'on répète le traitement de solubilisation et de précipitation ultérieure du principe actif, et que l'on peut préparer avec ce produit des solutions aqueuses en toutes concentrations voulues. Le rendement quantitatif du produit est très élevé, pratiquement supérieur à 80 ffi par rapport à l'activité initiale, même à la suite de précipitations répétées, avec un degré de pureté supérieur à 10 fois environ la pureté du produit de départ. On comprendra mieux le procédé faisant l'objet de l'invention à partir de 11 exemple suivant. Exemple Une solution aqueuse d'inhibiteur de la kalli kréine, contenant 23 000 KIU/ml , avec une pureté de 1 KIU/ug de résidu sec organique, est saturée de chlorure de sodium à raison de 357 g/l, à la température ambiante et sous agitation0 Après avoir maintenu l'agitation pendant 3 h au moins, on ajoute de la "Celite" , agent qui favorise la fil ration, et l'on filtre sur un entonnoir Buchner. On lave la plaque filtrante avec une solution saturée de chlorure de sodium. Le premier et le second filtrats réunis sont amenés à un pH dgal à 2 par addition de EC1 1 : 1 en volume. On laisse reposer pendant 12 h en armoire frigorifique. On filtre sur Buchner, après addition de 11Celite", et on lave la plaque filtrante avec une solution saturée de chlorure de sodium. Le précipité recueilli sur le filtre est ensuite mis en suspension dans une quantité d'eau convenablement calculée pour l'obtention de la concentration finale voulue. On neutralise par NaOH à 40 % et on filtre pour éliminer la "Celite" O On obtient finalement une solution d'inhibiteur ayant une pureté de l'ordre de 1 KIU/O1 pug de substance organique sèche. le rendement obtenu est de 95 % par rapport à l'activité initiale. I1 est du reste bien entendu que le mode de réalisation de l'invention qui a été décrit ci-dessus, à propos de l'exemple présenté, a été donné à titre purement indicatif et nullement limitatif et que de nombreuses modifications peuvent Entre apportées sans que l'on s'écarte pour cela du cadre de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la purification d'un inhibiteur de la kallikréine possédant également un effet anti-tryptique et obtenu à partir de tissus animaux, ledit procédé étant mis en oeuvre à la température ambiante et étant caractérisé par le fait : qu'on ajoute à la solution aqueuse d'inhibiteur brut, à un p11 compris entre 5,5 et 7 et sous agitation un sel inorganique, jusqu'à un degré de saturation compris entre 80 et 100 % qu'on filtre et qu'on abaisse le pH du filtrat jusqutà une valeur comprise entre 1 et 3, par addition dtun acide minéral, ce qui provoque une précipitation quantitative de l'inhibiteur ; qu'on récupère l'inhibiteur ainsi précipité par filtration ; qu'on le met ensuite en suspension à la concentration voulue dans un véhicule aqueux rendu bactériostatique par un agent de conservation approprié : qu'on rend ensuite ledit inhibiteur soluble dans ledit véhicule aqueux par neutralisation de ce véhicule ; et qu'on filtre enfin la solution obtenue pour éliminer les impuretés non solubles qu'elle contient. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'on utilise comme sel organique le chlorure de sodium. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'on utilise comme acide minéral l'acide chlorhydrique.