Brevet FR2100975A1 — publié le 19720324

i 2100975 L'invention a pour objet une nouvelle 'classe de polypeptides, ayant notamment une activité biologique, ainsi que leur procédé de préparation,, Elle concerne également les applications comme médicaments de ces nouveaux polypeptides. 5 Plus particulièrements l'invention concerne de nouveaux polypeptides dont la structure est caractérisée par un heptapeptide à C terminal, qui peut être lié à un ou deux amino a-cides initiaux. Les polypeptides de l'invention ont une struc-10 ture figurée par la formule suivante dans laquelle les aminoacides sont représentés par les symboles couramment employés dans la chimie des polypeptides en référence à la configuration optique "L" : X - Trp - Ala - Val - Gly - His - Leu - Mat - NH2 15 dans laquelle X est choisi parmi le groupe comprenant : l'hydrogène, le radical d'un acide carboxylique» d'un aminoacide ou d'un dipeptide, leurs dérivés protégés et leurs sels. L'invention a également pour objet le procédé de préparation des polypeptides ayant la formule ci-dessus. 20 II existe de nombreuses possibilités de réali sation de la synthèse des peptides de l'invention, qui consiste essentiellement dans la condensation d"1aminoacides ou de polypeptides protégés, de sorte que le polypeptide résultant présente la succession d'aminoacides de la formule précitée, cette condensa-25 tion étant, réalisée selon des modes opératoires connus en soi, dans la chimie des polypeptides. Les aminoacides et les polypeptides qui de temps en temps sont condensés ont leurs groupes amino et carboxyle non engagés dans la formation de la liaison peptidique convenable-30 ment bloqués par un groupe protecteur susceptible d'être éliminé par acidolyse ou par hydrogénolyse ou par d'autres méthodes connues. On peut employer les groupés protecteurs suivants pour assurer la protection du groupe amino, par exemple : tosyle (p-toluènesulfonyle), carbobenzoxy (carbobenzyloxy), carbo-35 tert-butoxy, p-nitrocarbobenzoxy, trityle (triphénylméthyle), formyle, trifluoracétyle et d'autres groupes couramment employés dans la chimie des polypeptides. On peut employer les groupes protecteurs suivants pour la protection du groupe carboxyle, par exemple : méthyle, éthyle, tert-butyle, benzyle, p-nitrophényle 71 27602 2 2100975 et d'autres groupes couramment employés dans ce domaine de protection. On effectue la condensation du groupe amino d'une molécule et du groupe carboxyle d'une autre molécule, afin 5 de former la liaison peptidique, selon les modes opératoires courants, connus dans la chimie des polypeptides, par exemple, par l'intermédiaire d'un dérivé d'acyle convenablement activé, tel qu'un anhydride mixte, un azide, un ester p-nitrophénylique, un ester 2,4,5-trichlorophénylique ou un ester N-hydroxy-succinimi-10 dylique, ou encore par condensation directe entre le groupe amino libre et le groupe carboxyle libre, en présence d'un agent de condensation convenable, tel qu'un carbodiimide choisi parmi les composés du groupe formé par le dicyclohexylcarbodiimide, le l-cyclohexyl-3-morpholinyl-carbodiimide et d'autres composés connus 15 dans la littérature technique. On peut effectuer la condensation dans un solvant convenable du groupe des N,N-dialcoylformamides, des nitriles aliphatiques inférieurs et des ryridines, par exemple, le diméthyl-formamide, l'acétonitrile et la pyridine. La réaction commence de 20 -20°C jusqu'à la température ambiante et elle est terminée à une température comprise entre la température ambiante et 35°C après une durée comprise entre 12 heures et 10 jours. Les produits obtenus en mettant en oeuvre l'invention présentent une forte activité biologique polyvalente. En 25 particulier, il a été trouvé que les produits de l'invention ont une influence élevée sur la pression circulatoire systémique et une activité stimulante sur l'utérus, sur le côlon, sur l'iléon et sur la sécrétion gastrique ; en outre, ils ont une action hyper-glycémiante. 30 Des essais effectués, dans le cadre de l'inven tion, "in vitro" sur l'utérus chez des rattes en période d'oestrus ont montré que les composés suivants, selon l'invention, ont une très forte action contracturante, avec un seuil de 30-100 picog/ml Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^, Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu— 35 Met-NHg et Boc-Gln-Trp-Àla-Va1-Gly-His-Leu-Met-NH^ et qu'ils présentent .une activité 3 à 5 fois supérieure à celle de la bradykini-ne et 2 à 3 fois supérieure à celle de l'ocytocine, aussi bien en intensité qu'en durée. Les exemples suivants sont donnés pour illustrer 71 27602 3 2100975 ITinvention plus en détail sans nullement la limiter ni dans son cadre ni dans son esprit. EXEMPLE 1 Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Met-NHU 5 On laisse réagir 15»7 g de Boc-Val-Gly-OEt (R. de Castiglione, "Il Farmaco", Ed. Sci. 2^., p. 664, 1969) pen- . dant 40 minutes dans 60 ml d'un mélange acide chlorhydrique/acide acétique 1,33 N. On fait évaporer ensuite le solvant sous vide, on délaie le résidu avec de lféther diéthylique anhydre et on 10 sèche le produit sous vide sur de l'hydroxyde de potassium et de l'anhydride phosphorique. On obtient 11,05 g de H^-Val-Gly-OEt. Cl", sous forme d'une mousse solide ; E-^ 2 * 1»05 Leu. à. une solution de 8,76 g de Boc-Àla (E. Schndae], "Liebigs Ànn. Chem." 702, p. 188, 1967) dans 80 ml de tétrahydro-15 furane anhydre, on ajoute une solution de 11,05 g de +H2-Val-Gly-OEt.Cl"" dans 80 ml de tétrahydrofurane anhydre. On refroidit le mélange réactionnel à 0°C et on y ajoute 5,14 ml de N-méthylmor-pholine, suivis de 5,32 g de N-hydroxysuccinimide et, ensuite, de 9,55 g de dicyclohexylcarbodiimide. 20 On laisse reposer le mélange réactionnel à 0°C pendant 2 heures et pendant une nuit à la température ambiante. On chasse le tétrahydrofurane par évaporation et on reprend le résidu avec de l'acétate d'éthyle bouillant. On sépare la dicyclo-hexylurée par filtration et on lave la solution organique avec de 25 l'acide chlorhydrique IN à 0°C, de l'eau, une solution à 5 % de bicarbonate de sodium et enfin avec de l'eau. On sèche le mélange obtenu sur du sulfate de sodium, on fait évaporer le solvant et, par cristallisation à partir d'acétate d'éthyle, on obtient 10 g de Boc-Âla-Val-Gly-OEt, 30 fondant à 165-167°C [aj^ m - 23,5° (c = 1, en diméthylformamide). On laisse réagir 8 g de Boc-Alâ-Val-Gly-OEt pendant 40 minutes dans 30 ml d'un mélange acide chlorhydrique/ acide acétique 1,33 N. On fait évaporer le solvant sous vide, on délaie le résidu avec de l'éther diéthylique anhydre et on sèche 35 le produit sous vide sur de l'hydroxyde de potassium et de l'anhydride phosphorique. On obtient le produit de formule +H2-Ala—Val-Gly-0Et.Cl~, fondant à 188-190°C ; E1.2 - <>,83 Leu î [ 5° (c = 1, en diméthylformamide). Oh fait dissoudre 0,746 g de Boc-Trp dans 10 ml 71 27602 4 2100975 de tétrahydrofurane anhydre, on refroidit la solution à - 15°C et on y ajoute 0,274 ml de N-méthylmorpholine en même temps que 0,32 ml de chloroformate d'isobutyle. Après 7 minutes à - 15°C, on y ajoute une solution préalablement refroidie de 0,76 g de 5 +H2-Ala-Val-Gly-0Et .Cl" dans 5 ml de diméthylformamide anhydre contenant 0,274 ml de N-méthylmorpholine. On règle la température pendant une durée de 3 heures de - 15°C à la température ambiante, puis on laisse reposer le mélange réactionnel à la température ambiante pendant une nuit. On filtre le mélange réactionnel, on 10 fait évaporer le solvant sbus vide, on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle contenant du méthanol, on lave la solution avec de l'acide chlorhydrique IN à 0°C, avec une solution à 5 % de bicarbonate de sodium, puis avec de l'eau. On sèche le mélange obtenu sur du sulfate de sodium et on fait évaporer le solvant. 15 Par cristallisation à partir de méthanol-éther, on obtient 1,16 g de Boc-Trp—Ala-Val-Gly-OEt, fondant à 200°C ; £aj * - 16,2° (c = 1, en diméthylformamide). On met en suspension 1,12 g de Boc-Trp-Ala-Val-Gly-OEt dans 10 ml d'éthanol et on effectue sa saponification par addition de 5 ml d'hydroxyde de sodium. Après 20 2 heures à la température ambiante, on dilue le mélange avec de l'eau, on le lave 2 fois avec de l'acétate d'éthyle, on l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique IN à 0°C et on extrait le produit avec de l'acétate d'éthyle contenant une certaine quantité de méthanol. On le lave avec de l'eau, on le sèche sur du sulfate de 25 sodium, on fait évaporer le solvant et on fait cristalliser le résidu à partir d'acétate d'éthyle. On obtient 0,85 g de Boc-Trp-Ala-Val-Gly, fondant à 150°C ; " - 14,4° (c = 1, en dimé thylformamide). On fait dissoudre 5,39 g de Boc-His-NH-NH^ 30 (E. Schr6der et coll., "Liebigs Ann. Chern." 656. p. 190, 1962) dans 30 ml de diméthylformamide anhydre, on refroidit la solution à - 25°C, puis on y introduit goutte à goutte 33,3 ml d'un mélange acide chlorhydrique/tétrahydrofurane 2,IN, suivis de 2,38 ml de nitrite de tert-Butyle. Après 10 minutes à - 30°C, on y introduit 35 goutte à goutte 9,8 ml de triéthylamine. On ajoute ensuite le mélange réactionnel à une suspension, préalablement refroidie à - 30°C, et obtenue en dissolvant 5,96 g de +H2-Leu-Met-NH2.C1"" (Bernardi et coll. "Gazz.Chim. Ital.", 2k* P* &53, 1964) dans 25 ml de diméthylformamide anhydre, en refroidissant et en ajoutant 71 27602 5 2100975 2,0 ml de-triêthyl^EiaSo .. ... - ' v v On secoue lo ^êlrir^ réacti-onnsl, pendsnt 15 minutes à - 25°v. st on; 1-3. fâsirtv.":.vat ^--ait-3. -pendant- 2" jours à - 10°G. On ajoat-s 1 ?al ûè triétliylas&rr.von maintient -la solu= 5 tion pendant 5 jour© à 0°^, On vctsc- r;v?.ni->s 1s" isélsalge réaction-» nel dans de l'éther et on dissent le précipité formé dans ds l'acétate d'éthyle- on le l?v:- c«"-3e uas solat.ioa d'acide borique 0,5 H et» ensuite» avec uns solution à 5 % de bicarbonate de sodirr-'„ 10 Après séchage sur du sulfate de scdiuais, conc©n=> trstion jusqu'à un faible vcluas ©t précipitation avec de 1*étherp on obtient 7*6 g de Boc^His-Leu^ïfe^MHg. Par reeristsllisation à partir d'acétate d'éthyle, on obtient lséchantillon analytiquep fondant à 159~l6l°0j 15 [aj = - 29,9° (c = lp en diEéthylforraaadde)0 On fait réagi.-.,1 4S02 g de Boc~His~Leu~M@t~MK2 pendant 30 minutes à la température ©znfeiante airee 40 al dcun mélange d'acide chlorhydriqus/aeide;acétique 1P33 H» On fait évaporer le solvant et on reprend le résidu a?ee de 15éther dié= 20 thylique anhydre. Après séchage sous vide6- on obtient 3*95 g de ""l^-His-Leu-Met-NH^«Cl"s que l'on dissout -dans du méthanol et que l'on élue à travers une colonne de .résine sise dans" le commerce sous le nom d'Amberlite IR-45COH"). On obtient 3 g de tripeptide sous forme de base libre, fondant à 65«-703G ; [aJ^ " ~ 39?1° 25 (c = 1, en diméthylformamide.) ; E-^ ^ -1*21 Leu. • ■ : On fait dissoudre.0,82 g de Boe-Trp-Ala-Val-Gly et 0,18 g de N-hydroxysueeini.mide dans 2' ml de diméthylformamide anhydre ; après refroidissement à 0°C, on y â"j'oute 0,32 g de dicyc.lohexylcarbodiimide,. On maintient le Mélange réactionnel 30 pendant 2 heures à 0°C et pendant 1 heure à la -température ambiante. On sépare la dicyclohexylurée par filtration dans un ballon contenant 0,61.4 g de His-Leu-Met—NHg ;et on utilise 3 ml de diméthylformamide anhydre pour le lavage." Après 22 heures à la température ambiante, on filtre la solution et, ensuite, on la eoncen— 35 tre jusqu'à faible volume. Par dilution avec de .l'acétate d'éthyle^ on obtient 1,30 g de J3oc.-Trp-Ala-V.al-Gly-His-Leu-Met-NH2"» fondant à 21.9-221°C, qui, par .rëcristallisation-à partir de méthanol, fournit le produit fondant à 231°C ; 'E^ ^ = 0*46 Leu, £aj ^ » - 17»4° (c » l,en diméthylformamide). On fait réagir 0,50 g de 71 27602 6 2100975 Boc—Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^ pendant 40 jaiuutfcô a la température ambiante avec 10 ml d'un, mélange acide chlorhydrique/ acide acétique 1,33N auquel on a ajouté 2 ml d'acide formique à 99 %. pour faciliter la uiiae «în solution. On concentre la solution 5 sous vide et on la dilu-- avec de l' V her. On obtient 0,48 g de +H2-Trp->AIa-Val-Gly-4nc'::; + v 'J«i^iet-NH2.2Cl", fcadans à 195-205°C (avec décomposition) ; ? - C,S3. On- fait dissoudre le produit X. p ^ ainsi obtenu dans du méthanol st on l'élue à travers une colonne d'Amberlite IR-45(OH"") pour obtenir la base libre correspondante 10 Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH^. EXEMPLE 2 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH,-, On fait dissoudre 246 mg de Boc-Gln et 115 mg de N-hydroxysuccinimide dans 2 ml de diméthylformamide anhydre, 15 on refroidit la solution à û°C et on y ajoute 206 mg de dicyclo-hexylcarbodiimide. On laisse rejoter le mélange pendant 2 heures à 0°C et pendant 2 heures à la empérature ambiante. On filtre directement le mélange dans un ballon contenant 895 mg de +H2~Trp-Ala-Val-Giy-His(H+)-Leu-Met---'..^ , ^.C1~, et en employant 2 ml de 20 diméthylformamide pour les lavages, o.n ajoute 0,48 ml de tri-à-butylamine et on laisse reposer le mélange pendant une nuit à la température ambiante. On filtre le mélange, on le concentre jusqu'à faible volume et on le dilue avec de l'éther diéthylique. On fait recristalliser le précipité à partir de méthanol. On ob-25 tient 700 mg de Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi3-Leu-Met-NH2, fondant à 218—219°C ; E1j2 = 0,38 Leu ; £aj jj4 = - 11,6° (c = 1,-en diméthylformamide), '■ ' • On fait réagir 0,57 g de Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-nh2 pendant 40 minutes à la température ambiante~ 30 avec 10 ml d'un mélange acide chlorhydrique/acide acétique 1,33 N auquel on a ajouté 2 ml d'acide formique à 99 % pour faciliter la solubilisation. On concentre la solution et on la dilue avec de l'éther. On obtient 0,47 g de +H2-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met-NH,.2C1~, fondant à 185-190°C (avec décomposition) ; 35 Ei 2 = 0,76 Leu » M •= - 4,3° (c = 1, en diméthylformamide). On dissout le produit, ainsi obtenu, dans du méthanol et, par élution à travers une colonne d'amberlite IR>-45(0H~) on obtient la base libre correspondante Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NE^. 71 276Q2 7 2100975 EXEMPLE 3 Val-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Met-NH^ En opérant de la même manière que celle décrite à l'exemple 2, par condensation de Boc-Val avec ^-Trp-Ala-Val-5 Gly-His(H+)-Leu-Met-NH2 *201", on obtient Boc-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, fondant à 225-226°C ; [aj^ = - 17,2° (c = 1, en diméthylformamide) ; E-^ 2 = 0»38 Leu, qui fournit l'octapeptide libre correspondant Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHLj ; E^ 2 e 0,76 Leu. 10 EXEMPLE 4 Phe-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Met-NH^ En opérant de la même manière que décrit à l'exemple 2, par condensation de Boc-Phe avec H^-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met-NH2*2Cl~, on obtient Boc-Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-15 Leu-Met-NH2 ï fondant à 228-230°C ; [aJ J;4 = - 13,5 (c = 1, en diméthylfonnamide) ; E-^ 2 = 0,3# Leu, qui fournit l'octapeptide libre correspondant Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Ni^, 2 ~ 0,76 Leu. EXEMPLE 5 20 Asn-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Met-NH^ En opérant de la même manière, qu'à l'exemple 2, "J* H" par condensation de Boc-Asn avec ^-Trp-Ala-Val-Gly-His(H )-Leu- Met-NH2.2C1~", on obtient Boc-Asn-Trp—Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 » 2 3 0,38 Leu, qui fournit l'octapeptide libre correspondant 25 Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^ ; E-^ ^ = û>76 Leu. EXEMPLE 6 Asn-Gln-Tr p-Al a-V al-Glv-His-Le u-Met-NH^ A une solution de 200 ®g de Boc-Asn-ONp et de 515 mg de +H2-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met-NH2.2Cl~ dans 30 4 ml de diméthylformamide anhydre, on ajoute 0,24 ml de tributy-lamine. Après 4 jours à la température ambiante, on verse la solution dans de l'acétate d'éthyle et on fait recristalliser le précipité à partir de méthanol-éther. On obtient 270 mg de Boc-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH^, fondant à 230-231°C ; 35 £ En opérant comme décrit à l'exemple 1, à partir de 100 mg du produit précité, on obtient 95 mg de +H2-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met-NH2.2Cr", fondant à 200°C (avec décom 71 27602 8 2100975 position) p4 « - 24,4° (c = 1, en hexaméthylphosphotriamide) E-^ 2 " 0»72 Leu. Le produit, ainsi obtenu, dissous dans le méthanol et élué à travers une colonne de résine Amberlite IR-45(0H~) fournit le polypeptide libre correspondant Asn-Gln-Trp-Àla-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2. 71 27602 9 ,2100975 a s v s h p-1 c. à t i a n s 1. Procédé.pour préparer les'polypeptides de formule générale suivante : X-Trp-Ala-V a1-Gly-His-Leu-Met-NH2 5 dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant : l'hydrogène, le radical acyle d'un acide earboxylique/ d'un aminoacide et d'un dipeptide, leurs dérivés protégés et leurs sels, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on condense un composé choisi entre un aminoacide et un polypeptide avec un autre composé choi-10 si entre un aminoacide et un polypeptide dont- les groupes amino et carboxyle, non engagés dans la formation de la liaison pepti-dique, sont convenablement bloqués par un groupe protecteur ap- •" proprié, de manière à obtenir le polypeptide ayant la succession désirée d'aminoacides. 15 2. A titre de produit industriel nouveau, un polypeptide de formule générale suivante î X-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^ dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant : l'hydrogène, le radical acyle d'un acide carboxylique, d'un aminoacide 20 et d'un dipeptide, leurs dérivés protégés et leurs sels. 3. Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NI^ 4. Boc-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-Met-NH2 5. +H2-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Le u-Met-NH2.201" 6. Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Nï^ 25 7. Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-nh2 8. +H2-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met- NH2.2C1" 9. Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^ 10. Boc-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Nl^ 30 11. +H2—Val-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met- NH2.2C1 35 NH2.2C1" 12. Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 13. Boc-Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-KH2 14. +H2-Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His (H+ ) -Leu-Met- 15. Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^ 16 . Bo c-As n-T rp-Al a-Va 1- Gly-H i s-Le u-Me t-NI^ 17. +h2-Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu-Met- NH2.2cr 71 27602 10 2100975 10. Asn-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-Met-NH2 19. Boc-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His~Leu-Met-NH 2 20. +H2-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(H+)-Leu- Met-NH2.2C1~ 5 21. Compositions pharmaceutiques renfermant un ou plusieurs polypeptides salon l'une quelconque des revendications 2 à 20, en association avec un véhicule convenable. 22. Présentations pharmaceutiques en vue de l'administration des compositions selon la revendication 22, no-10 tamment par voie orale et parentérale. i COPY