Brevet FR2092031A1 — publié le 19720121

12'-;55 ' . . 2092031 La présente invention concerne un procédé d'isolement ; de l'allergène protéique actif d'une substance déterminant l'allergie, ainsi que l'allergène actif obtenu au moyen de ce procédé. 5 II est bien connu que des patients allergiques présentant les symptômes d'une hypersensibilité immédiate peuvent être désensibilisés par des injections d'extraits de la substance à laquelle ils sont allergiques. Ainsi, des'extraits de pollen d'herbes peuvent être utilisés pour traiter des malades atteints 10 du rhume des foins et des extraits de poussière de ménage sont utilisés pour certains cas d'asthme allergique. De nombreux autres extraits sont utilisés pour le traitement des allergies correspondantes. .. On suppose que le degré de désensibilisation que l'on 15 atteint est à un certain degré une fonction de la quantité de substance déterminant l'allergie qui est contenue dans la dose injectée. Toutefois, le principe déterminant l'allergie est habituellement un composant secondaire de la matière susceptible d'extraction, et il semble probable que dans quelques cas, la 20 grande quantité de substance ne déterminant pas l'allergie, présente dans l'extrait, rend impossible, du point de vue phy-sique^de concentrer l'extrait dans une mesure suffisante pour élever la concentration en allergène à des taux intéressants. Ceci démontre la nécessité d'une opération de purification. 25 Dans certains cas, il peut être désirable de préparer un extrait d'une substance déterminant l'allergie, sous une forme insoluble. La purification de l'allergène actif est alors habituellement essentielle, parce qu'une grande quantité de la matière contaminante exerce un effet solubilisant,et un procédé per-50 fectionné est nécessaire pour .obtenir le degré désiré de purification. Il a été démontré que certains allergènes sont de nature protéique et ne tirent pas leur activité d'un glucide acsocié (Eing, Kornian et Lichtenstein, "Biochenistry", yô 1S92, 1967). Dans de nombreux cas, un glucide forme la majeure partie de la substance contaminante des extraits. Une forme désirable de procédé de purification sépare donc la matière pro- CQPY 71 12455 2 2092031 téique du glucide. la présente invention concerne un procédé d'isolement de l'allergène protéique actif d'une substance déterminant l'allergie, procédé qui consiste à traiter la substance déterminant 5 l'allergie avec un phénol aqueux, à séparer la phase phénolique résultante de la phase aqueuse résultante et à précipiter la matière protéique dissoute dans la phase phénolique. Dans une forme préférée de mise en oeuvre du procédé de l'invention, la substance déterminant l'allergie est tout d'abord 10 extraite d'une manière connue avec un solvant capable d'extraire la matière protéique de la matière déterminant i'allergie, les solvants qu'il convient d'utiliser sont habituellement aqueux, mais des solvants principalement organiques tels qu'une solution aqueuse de pyridine sont également intéressants dans certains 15 cas. l'extrait résultant peut ensuite être traité pour éliminer une certaine partie des substances contaminantes non protéiques, par exemple par dialyse, précipitation ou filtration sur gel (une description plus complète des techniques d'extraction dont on dispose est donnée dans un article de J.IJ. Newell, "Journal 20 of Ulergy", Toi. 13, 1942, pages 177-203 et en particulier page 187). Dans cette forme de réalisation de l'invention, l'extrait protéique partiellement purifié de la substance déterminant l'allergie, que l'on obtient comme indiqué ci-dessus, est ensuite traité avec une solution aqueuse de phénol, la phase phé-25 nolique résultante est séparée de la phase aqueuse résultante et la matière protéique dissoute est précipitée dans la phase phénolique. Dans le présent mémoire, l'expression "substance déterminant l'allergie" désigne toute substance qui donne lieu à 50 une réaction allergique chez un patient qui est sensible à cette substance. Des exemples courants de substances déterminant l'allergie comprennent les pollens de plantes telles que la fléole des prés, l'ivraie vivace et le dactyle pelotonné, la poussière de ménage, les moisissures, les poils d'animaux ou la fourrure 35 et des étoffes, mais on en connaît de nombreux autres exemples. la première étape du procédé de l'invention est le traitement de la substance déterminant l'allergie, ou de préférence 71 12455 3 2092031 une fraction riche en protéine d'ion extrait aqueux de ladite substance, avec du phénol, l'objet de ce traitement est de provoquer la répartition des composants solubles dans le phénol aqueux et des composants solubles dans l'eau de la substance déterminant 5 l'allergie ou de l'extrait de cette substance entre la phase phénolique et la phase aqueuse. Pour obtenir une répartition efficace, on préfère traiter la substance déterminant l'allergie ou l'extrait de cette substance avec le phénol aqueux à un§ftempé-rature supérieure à la température ambiante, par exemple entre 50 et 100°C, de préférence entre 60 et 70°C. Une température particulièrement convenable lorsqu'on traité des extraits aqueux de substance déterminant l'allergie se situe entre 65 et 67 °C. néanmoins, le procédé peut être mis ery6euvre entièrement à la température ambiante ou à une température plus basse, le cas échéant, 15 pourvu que la température ne soit pas assez abaissée pour que la phase phénolique se solidifie. Pendant le traitement avec la solution aqueuse de phénol, le mélange est de préférence agité pour faciliter la répartition entre la phase phénolique et la phase aqueuse. 20 les quantités relatives d'eau et de phénol que l'on uti-" lise dans le traitement de substances déterminant l'allergie ou d'extraits de ces substances peuvent varier dans de très larges limites. Généralement, on préfère utiliser un mélange phénolique aqueux qui donne des proportions à peu près égales d'eau et de 25 phénol lorsque la substance déterminant l'allergie ou l'extrait de cette substance est ajouté . Ainsi, si cette substance elle-même doit être traitée, (bien que ce procédé ne soit généralement pas adopté à cause de l'inconvénient de la forte proportion de substance contaminante que l'on rencontre), on utilise des 30 proportions à peu près égales d'eau et de phénol. Si l'on traite un extrait aqueux de la substance déterminant l'allergie, on utilise d'autant moins d'eau dans le mélange aqueux de phénol. En fait, lorsqu'on traite des extraits aqueux de substances déterminant l'allergie, il peut suffire d'ajouter le phénol lui-même, de 35 l'extrait aqueux apportant/lui-meme suffisamment d'eau pour une répartition efficace des composants solubles. le pH auquel le traitement de la substance déterminant l'allergie ou de l'extrait 71 12455 4 2092031 de cette substance avec le phénol aqueux est effectué, n'est pas déterminant» Toutefois, on préfère opérer avec un extrait aqueux tamponné de la substance déterminant l'allergie ayant un pH de 7 à 9, par exemple égal à 8 environ. 5 la seconde étape du procédé de l'invention consiste en la séparation de la phase aqueuse et de la phase phénolique. la séparation des phases peut être facilitée par centrifugation, le cas échéant. Il peut arriver qu'un précipité se forme à l'interface pendant le traitement initial, et on doit l'éliminer en 10 même temps que la phase aqueuse, de manière à laisser la phase phénolique aussi limpide que possible. Le cas échéant, la phase phénolique peut être réextraite avec de l'eau, là encore de préférence à une température élevée, sous agitation } la température est ensuite réduite à la tempé-15 rature ambiante en vue d'obtenir une répartition aussi complète que possible des composants solubles. la phase aqueuse est de nouveau séparée de la phase phénolique en même temps que tout précipité qui peut se former à l'interface. Il n'est généralement pas nécessaire de réextràire plus 20 d'une fois la phase phénolique avec de l'eau, bien que pour une séparation particulièrement convenable des composants hydroso-lubles et des composants solubles dans le phénol aqueux, le procédé décrit ci-dessus puisse être répété aussi souvent qu'on le désire jusqu'à ce qu'il ne reste pas de phase phénolique. 25 la troisième étape du procédé de l'invention est la récupération des composants protéiques dissous dans la phase phénolique. Oette récupération peut être effectuée par précipitation, par addition d'un assez grand excès d'un anti-solvant de la substance protéique, c'est-à-dire un liquide dans lequel 30 les protéines sont sensiblement insolubles. Un anti-solvant qui convient à cette fin est le méthanol, mais on peut en utiliser d'autres, tels que l'acétone. Généralement, on préfère conduire l'étape de précipitation à des températures relativement basses. Ainsi, la phase phénolique est habituellement tout d'abord re-35 froidi^èt l'anti-solvant est ensuite ajouté dans un état refroidi, la période de temps nécessaire pour obtenir une précipitation complète varie conformément à la température et à 1'anti-solvant 71 12455 5 2092031 que l'on utilise. Généralement, on préfère consacrer mie période de temps de quelques, heures à l'étape de précipitation, le précipité peut être recueilli par tout procédé classique, par exemple par centrifugation.. A titre de variante, le phénol peut être isolé 5 de la solution, soit par extraction à l'éther, soit par dialyse vis-à-vis d'acide acétique dilué : la protéine est ensuite isolée par lyophilisation. On peut démontrer que la substance protéique obtenue conformément à l'invention est sensiblement exempte de substances 10 contaminantes telles que des glucides, et qu'elle consiste pres-qu^fentièrement en protéines. On peut constater également que la substance protéique précipitée est un allergène actif, par des essais dermatologiques sur des patients sensibles. la présente invention concerne donc un allergène protéique 15 actif, chaque fois qu'on l'obtient au moyen du procédé décrit dans le présent mémoire, l'allergène peut être utilisé dans le traitement de désensibilisât!on de patients allergiques et, dans ce cas, il peut être administré aux patients en mélange avec un véhicule acceptable du point de vue parentéral. les véhicules qu'il 20 convient d'utiliser comprennent des solutions isotoniques de sel ou d'un tampon, des véhicules huileux et d'autres substances bien connues en pratique. Au besoin, on peut incorporer dans la préparation à administrer des adjuvants convenables tels que la tyrosine, l'administration se faisant généralement par injection 25 sous-cutanée, et les doses posologiques varient conformément à l'état allergique du patient. l'exemple suivant illustre l'une des formes de réalisation de la présente invention. jjXEI-IPLB 30 On-chauffe à 65-67°C un extrait à 10 c/» en poids/volume de pollen de dactyle pelotonné dans un tampon au phosphate 0,01 I-l, à un pH égal à S, et on ajoute un volume égal de phénol aqueux à 90 à la même température. On agite le mélange pendant 30 minutes à cette tempe-rature, on le refroidit rapidement et on le 55 centrifuge pour faciliter la séparation des phases, la phase aqueuse supérieure est éliminée par succion et la petite quantité de précipité formé§à l'interface est éliminée en même temps, la 71 12455 6 2092031 phase phénolique est réextraite avec deux tiers de son volume d'eau et l'opération est répétée. lia phase aqueuse finale est ajoutée à celle qui a été isolée précédemment et leur mélange est soumis à une dialyse poussée vis-à-vis d'eau de ville, pour 5 éliminer tout phénol résiduel,puis il est finalement lyophilisé. La phase phénolique est traitée avec un excès de trois volumes de méthanol refroidi à la glace, puis on la laisse reposer pendant environ 16 heures. Le précipité est recueilli par centrifugation, lavé deux fois avec du méthanol pour éliminer 10 le phénol résiduel, puis redissous dans un tampon au" phosphate 0,01 M. et lyophilisé. . „ . Il ressort du tableau I que Xe procédé permet de séparer efficacement le glucide de la protéine du fait que la phase phénolique contient pratiquement la totalité de la matière 15 protéique. Il ressort du tableau II que toute l'activité de l'allergène est récupérée dans la phase phénolique, comme indiqué par l'essai dermatologique des extraits correspondants chez des sujets humains allergiques. 20 TATtTifiAU I Quantités de protéine et de glucide dans différents extraits La protéine est dosée par la méthodè de Lowry et Collaborateurs ("J. Biol. Chem." 193. 265, 1951) et le glucide est dosé par la méthode de Dubois et Collaborateurs ("Anal. Chem." 25 28, 250, 1956). Substance Protéine, 5* G-lucide, % Extrait aqueux non traité 64 34 Phase aqueuse de l'extrait aqueux traité au phénol 16 56 Phase phénolique de l'extrait aqueux traité au phénol 97 4 71 12455 7 2092031 TABLEAU II Recherche du pouvoir allergène de différents extraits chez des su.iets humains Une substance à une concentration de 50 pg/ml est injectée dans la peau de patients sensibles à des herbes, ainsi qu'une solution saline de phénol, comme témoin. Les chiffres reproduits sont les aires d'irritation qui sont mesurées au bout de 10 minutes et exprimées en mm^. Numéro du patient Extrait aqueux non traité, 50 jig/ ml Phase aqueuse de substance traitée au phénol, 50 (og/ml Phase phénolique de la substance traitée au phénol, 50 |ig/ml Solution saline de phénol 1 55 2 84 1 2 23 5 32 3 3 82 3 57 4 4 20 2 51 0 Total 180 10 224 8 Total moins le témoin 172 2 216 71 12455 8 2092031 HETOKDICATIOHS 1. Procédé d'isolement de l'allergène protéique d'une substance déterminant l'allergie, caractérisé par le fait qu'il consiste à traiter la substance allergène ou un extrait de cette substance avec du phénol aqueux, à séparer la phase phénolique résultante 5 de la phase aqueuse et à précipiter l'allergène protéique dissous dans la phase phénolique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance déterminant l'allergie ou son extrait est agité dans du phénol aqueux à une température de 50 à t00°G. 10 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'un extrait de la substance déterminant l'allergie est agité dans du phénol aqueux à une température de 65 à 67 °0. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on utilise des proportions sensiblement égales d'eau et de phénol. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'allergène protéique dissous est précipité dans la phase phénolique par addition de méthanol ou d'acétone. 20 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'étape de précipitation est conduite à une température inférieure à 20°C. 7. Procédé d'isolement de l'allergène protéique d'une substance déterminant l'allergie sous une forme sensiblement exempte 25 d'impureté de type glucidique, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à extraire la substance déterminant l'allergie avec un solvant aqueux tamponné à un pH de 7 à 9, à éliminer toute substance solide de l'extrait aqueux résultant, à ajouter du phénol ou du phénol aqueux à l'extrait aqueux, à agiter le 30 mélange résultant, à séparer la phase aqueuse de la phase phénolique avec tout précipité formé à l'interface, à précipiter la matière protéique dissoute dans la phase phénolique par addition d'un non-solvant de l'allergène protéique et à récupérer l'allergène protéique ainsi précipité. 55 8. Un allergène protéique obtenu au moyen d'un procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes.