Brevet FR2068465A1 — publié le 19710827

La présente invention concerne des agents de désensibilisation ou d'immunisation utiles pour le traitement des états d'hypersensibilité ou d'allergie, ainsi qutun procédé pour la préparation de ces agents. I1 est bien connu que certains individus sont allergiques ou hypersensibles à certaines matières allergènes comme les pollens, la poussière des maisons, la fourrure des chats, les céréales et une foule autres substances communes. Ces individus peuvent souffrir alune gêne aiguë par suite de leurs états allergiques qui peuvent se manifester par des maladies comme l'asthme, le rhume des foins, l'eczéma, une dermatite et des migraines. Par conséquent, on continue à travailler en vue de trouver des traitements appropriés qui vont soulager les souffrances du patient allergique. Une technique qui a été utilisée dans le passé pour traiter les états allergiques consiste en la thérapie dite de "désensibilisation". Au patient subissant ce traitement, on administre des doses répétées et progressivement croissantes d'un extrait de la matière ou des matières allergènes particulières auxquelles ce patient est sensible. A la fin du traitement, la résistance naturelle du patient à l'allergène est habituellement grandement augmentée , probablement par suite de la formation d'anticorps dans son organisme, formation stimulée par ltestrait administré. Comme on le comprendra, ce traitement de désensibilisation présente certains inconvénients, dont le risque de l'administration par inadvertance d'une dose dangereusement élevée d'allergène ne constitue pas le moindre inconvénient, ce qui aboutirait à une réaction d'anaphylaxie générale chez le patient. I1 a été suggéré qu'il serait possible de surmonter ce problème s'il était possible de modifier la matière allergène de façon à réduire son caractère allergène par rapport à ses propriétés de désensibilisation et/ou d'immunisation. En d'autres termes, si l'on pouvait rendre inoffensive la matière allergène, ou tout au moins la rendre moins nuisible au patient sensible, tout en conservant en même temps son aptitude à stimuler la production d'anticorps, on pourrait faire disparaitre l'un des inconvénients principaux du traitement de désensibilisation. Belon la présente invention, on fournit un procédé pour la préparation d'une matière allergène modifiée, procédé qui comprend la réaction d'une matière allergène avec un polyaldéhyde, une polycétone,un carbodiimidè, une épihalogénhydrine. ou un cyanate minéral, étant bien entendu que lorsque l'on utilise un cyanate minéral, on effectue la réaction dans des conditions acides. à matière allergène de départ que l'on modifie selon le procédé de la présente invention peut s'obtenir à partir d'une substance contenant de l'allergène comme le pollen, par extraction de la substance contenant l'allergène à l'aide d'un solvant approprié, habituellement aqueux, d'une façon connue. L'extrait d'allergène obtenu de cette façon consiste principalement en protéine ou glucoprotéine, habituellement contaminée par des hydrates de carbone libres. On purifie ensuite habituellement l'extrait d'allergène en enlevant certaines des impuretés, par exemple par une dialyse, une précipitation ou une filtration sur gel, et l'on; peut ensuite traiter selon le procédé de l'invention la matière allergène purifiée résultante.Une description plus poussée de certaines des techniques disponibles peut se trouver dans un article de J. N. Newell dans le "Journal of Allergy", Volume 13, 1942, pages 177 à 203, en particulier à la page 187. Dans un autre mode opératoire utile d'extraction, on traite la matière contenant l'allergène ou son extrait aqueux par du phénol aqueux et l'on récupère l'extrait d'allergène de la phase phénolique. les corps à faire réagir, du type polyaldéhyde ou polycétone, qui se situent dans le cadre de la présente invention, comprennent des dialdéhydes et des dicétones ainsi que les aldéhydes et cétones supérieurs. Généralement, parmi les polycetones et les polyaldéhydes que l'on peut utiliser, la Demanderesse préfère utiliser des dialdéhydes, par exemple ceux ayant 2 à environ 24 atomes de carbone dans leur molécule. le dialdéhyde peut être aliphatique, cycloaliphatique, hétérocyclique ou aromatique, et il peut avoir une structure à chaire droite ou à chaire ramifiée, et il peut s'agir par exemple du glyoxal, du 1,3-propanedial, du 1,4-butanedial, duglufaraldéhyde et d'azur dialdéhydes ayant 14 à 24 atomes de carbone dans leur molécule. Un dialdéhyde particulièrement préféré est le glutaraldéhyde. Le terme "carbodiimide" utilisé dans le présent mémoire concerne des composés de formule (I) R - N = C = N - R' (I) (où R et R' , identiques ou différents, sont chacun un radical aliphatique, aromatique ou hétérocyclique) et leurs sels. les carbodiimides préférés pour servir dans la présente invention sont hydrosolubles et il s'agit par exemple du métho-p-toluènesulfonate de 1 -cyclohexyl-3- (2-morpholinoéthyl)-carbodiimide. Tel qu'utilisé dans le présent mémoire, le terme "épihalogénhydrine" concerne des composés de formule (II) (où X est un atome d'halogène, en particulier un atome de brome ou de chlore). La Demanderesse trouve que l'on obtient de bons résultats avec l'épichlorhydrine. Comme exemples de réactifs fournissant des ions cyanate minéral, on peut mentionner les cyanates de métaux alcalins, en particulier le cyanate de potassium ; et les cyanates de métaux alcalino-terreux. En règle général, les protéines des allergènes sont assez résistantes à la dénaturation et l'on peut habituellement les chauffer jusqu'à des températures relativement élevées sans qu'il se produise de dénaturation. Le procédé de la présente invention peut ainsi s'effectuer sur une large gamme de températures bien qu'en pratique il ne va en général pas autre nécessaire ni opportun d'excéder une température d'environ 1000C. Lorsque l'on utilise des dialdéhydes, on préfère opérer à une température inférieure à 370C et en pratique la Demanderesse préfère effectuer la réaction à la température ambiante dans chaque cas, c'est-à-dire au voisinage de 200 à 250C. Lorsqu'on utilise des dialdéhydes, il convient d'éviter des conditions extr & es de réaction afin de réduire la formation de sous-produits inopportuns tels que ceux que l'on obtient par auto-condensation des aldéhydes. Dans le cas de polyaldéhydes et de polycétones, le pH auquel il convient de mettre en oeuvre le procédé de la présente invention n'est pas fondamental ou critique. Une gamme des pH appropriés se situe entre environ 4 et environ 8, et l'on préfère un pH d'environ 5. Il convient d'éviter des valeurs très faibles du pH afin de diminuer la possibilité d'une auto-condensation des aldéhydes. De façon similaire, dans le cas d'une épihalogénhydrine et de carbodiimides, on peut effectuer la réaction à n'importe quel pH commode,bien que la Demanderesse préfère éviter des valeurs extrêmes du pH. Pour l'épihalogénhydrine, la réaction se poursuit régulièrement à des pH alcalins, de façon appropriée à un pH d'environ 8. Dans le cas du carbodiimide, on effectue de préférence la réaction à des pH acides et de façon appropriée à un pH voisin de 5. La réaction de la protéine allergène avec un réactif du type cyanate minéral dans le procédé selon la présente invention doit être effectuée à des pli acides et de préférence à un pH voisin de 5. On pense que les réactifs utilisés dans le procédé selon la présente invention jouent le rôle d'agents de réticulation de ltallergène, en formant des liaisons inter-moléculaires et/ou intra-moléculaires. Ainsi, bien que les matières allergènes de départ soient hydrosolubles, les allergènes modifiés produits selon la présente invention ne sont habituellement que faiblement solubles. La solubilité des allergènes modifiés semble dépendre du degré de réticulation, qui peut varier à son tour selon des facteurs comme la nature et la quantité du réactif utilisé et les conditions de réaction.La Demanderesse ne connatt pas de procédé empirique pour déterminer à l'avance les caractéristiques de solubilité des allergènes modifiés produits et, par conséquent, les variables nécessaires pour que la ou les réactions donnent un produit ayant la solubilité voulue doivent être déterminées par une expérimentation par tâtonnements.Cela constitue une question de routine, cependant, et ne devrait présenter que-peu de difficulté pour les experts en la matière. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la Demanderesse fournit une préparation pharmaceutique m9dife comprenant la matière allergène/preparee par le procédé ci-dessus décrit, et un excipient ou véhicule acceptable par voie parentérale. Des excipients appropriés comprennent des solutions salines isotoniques ou des solutions de tampons, des excipients ou véhicules huileux et d'autres matières bien connues en pratique. Si on le désire, on peut inclure un adjuvant comme la tyrosine, une alumine, l'hydroxyde d'aluminium ou du phosphate d'aluminium. La matière allergène modifiée s'administre généralement par injection sous-cutanée. La posologie va varier selon l'état allergique du patient. En général, lorsqu'on prépare des compositions pharmaceutiques selon la présente invention, l'allergène modifié doit être une matière ayant une solubilité réduite par rapport à celle de la matière de départ, mais cette matière produite doit être suffisamment soluble in vivo pour présenter les caractéristiques voulues de libération. La Demanderesse trouve qu'une façon de réaliser cela consiste à utiliser un allergène modifié faiblement soluble et absorbé sur de l'alumine ou sur des matières similaires. le degré de solubilité de la matière allergène réticulée est modifié par absorption sur l'alumine et l'on peut obtenir par une expérimentation de routine les meilleures caractéristiques de libération in vivo. Lors de l'administration parentérale des allergènes modifiés selon la présente invention à des animaux, il a été trouvé qu'il se forme des niveaux ou taux appréciables d'anticorps dans la circulation, l'anticorps ayant une spécificité à l'égard de l'allergène non modifié. les matières modifiées et soumises à des essais n'ont provoqué aucune réaction anaphylactique chez des animaux hypersensibles. EXEMPLE 1 Préparation à l'aide du glutaraldéhyde d'un dérivé insoluble d'allergène. On traite un extrait partiellement purifié de pollen de pied-de-coq contenant 10 mg de protéine par ml dans 5 ml d'une solution de 0,1 X de tampon d'acétate de sodium à pH 5,3 avec 5 ml d'une solution à 0,5 0 de glutaraldéhyde et l'on agite à la température ambiante durant 30 minutes. On enlève pas centrifugation le précipité formé et on le lave à l'eau distillée pour enlever la matière soluble résiduelle. On met finalement ce précipité en suspension dans une solution saline contenant du phénol en vue de ltemmagasinage. Essai du caractère allergène On administre la suspension de pollen insolubilisé, à la concentration de 10 mg par ml, par une pique effectuée dans la peau de personnes allergiques et sensibles aux herbes. En même temps, on administre par pitre dans d'autres zones de la peau des mêmes personnes la matière de départ et la solution saline contenant du phénol, respectivement. On mesure au bout de 10 minutes les zones ou surfaces constituant une trace, et l'on 2 exprime ces zones dans le tableau I en mm . On peut voir que la matière insolubilisée présente, à deux cents fois la concentration de la matière de départ, simplement le dixième de son caractère allergène : le caractère allergène conservé est ainsi négligeable lorsqu'on le compare à celui de la matière de départ. Essai de caractère immunogène On émulsionne la matière insolubilisée et la matière de départ, respectivement, dans de l'adjuvant complet de Ereund pour obtenir des concentrations de 1 mg/ml. A des groupes de cobayes, on injecte par voie sous-cutanée 0,5 ml de l'une ou l'autre des émulsions. Au bout de 22 jours, on place les animaux sur leur flanc et on les pince en des endroits démunis de poils et l'on effectue dans les zones pincées une série d'in- jections intradermiques (O,t ml) d'une dilution en série d'ex- trait purifié de pollen de pied-de-coq. On injecte immédiatement par voie intraveineuse 0,4 ml d'une solution à 5 ss de "Bleu Ciel Pontamine" Au bout de 20 minutes, on mesure les diamètres des traces et on les note au tableau II. On peut voir que la matière traitée par le glutaraldéhyde produit non seulement des anticorps qui réagissent avec la matière de départ, mais que cette matière traitée constitue un agent immunisant bien plus efficace que la matière de départ. TABLEAU I Patient n Extrait de pollen de Extrait de pied Solution pied-de-coq insolubi- de coq purifié saline lisé, 10 mg/ml 50 g/ml de phénol. 1 21 84 12 2 16 32 9 3 13 57 23 4 15 51 4 Total 65 224 48 Total moins ce qui correspond i à la solution saline de phénol 17 176 TABLEAU II Cobaye Matière Diamètre (mm) de la trace pour la quantité n immuni- d'extrait de pollen de pied-de-coq injectée sante ar voie intradermiaue (0,5 mg) 100 g 10 g 1 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 1) Extrait de 15 0 0 0 0 0 2) pollen de 16 0 0 O 0 0 ) pied de coq purifié 17 O O O O O 16 16 O O O O O 5) 14 0 0 0 0 0 0 0 O O O 5) Extrait de 12 10 9 0 0 0 6) Extraitde 7 pied-de-coq 14 13 12 12 10 S trait par 16 14 12 11 8) 9) glutaraldé- 12 10 0 0 0 0 10) hyde 12 9 O O O O EXEMPLE 2 Préparation d'un allergène traité par du carbodiimide On dissout 50 g de matière, qui a été obtenue par extration de pollens d'un mélange de plantes herbacées et qui a été partiellement purifiée par traitement avec une solution aqueuse de phénol, puis précipitation de la protéine de la phase phénolique, de façon à enlever la plupart des hydrates de carbone et de la matière à bas poids moléculaire, dans 5 ml d'un tampon 0,5 M de borate, pH 8,85. On ajoute lentement 5 ml d'une solution à 2 % de métho-p-toluènesulfonate de 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide et l'on agite la solution à la température ambiante durant 16 heures environ. On sépare par centrifugation le précipité qui s'est formé, on le lave trois fois avec le tampon de borate et on le met en suspension dans la solution saline de phénol. Essai du caractère allergène On injecte une suspension de la matière d'essai et d'une solution de la matière de départ, toutes les deux dans une solution saline de phénol, ainsi que le milieu lui-meme,respectivement, par pitre dans la peau de patients allergiques et sensibles aux plantes herbacées. On mesure au bout de 10 minutes les surfaces des traces obtenues. le tableau III montre les résultats de l'essai de caractère allergène TABLEAU III Patient nO Extrait de pollen Extrait de pol- Solution drun mélange de len d'un mélange saline de plantes herbacées, de plantes her- phénol 50 pg/ml bacées traité par le carbodiimide 1 12 O 0 2 3 2 O 3 8 O 0 4 12 O O 5 15 O O 6 62 3 O Total t12 5 0 les chiffres ci-dessus indiquent les surfaces des traces obtenues (mm2). Essai de caractère immunogène On immunise des cobayes, en double, par injection souscutanée d'une émulsion contenant la matière d'essai dans de l'adjuvant complet de Freund. On immunise un groupe similaire de cobayes avec de la matière de départ non modifiée et mise de la m8me façon dans l'adjuvant. Au bout de 21-28 jours, on pince les animaux pour les fixer sur leur flanc débarrassé des poils, et l'on effectue dans la zone pincée une série d'injections intradermiques (0,1 ml) d'une dilution en série de-la matière de départ en terminant avec une solution saline normale. On injecte immédiatement par voie intraveineuse 0,4 ml d'une solution à 5 % de "lIeu Ciel Pontamine".Au bout de 20 minutes, il se forme des traces de couleur bleue en certains des sites de l'injection intradermique, ce qui indique la présence dlanti- corps ayant de la spécificité pour la matière de départ. On mesure et enregistre les diamètres des traces obtenues. le tableau IV enregistre les résultats des essais de caractère immunogène, TABLEAU IV Cobaye Matière im- Diamètre de la trace ou marque (mm) pour la n) munisante quantité d'extrait de pollen d'un mélange 5 mg de plantes herbacées injectée par voie intra dermique 1 Extrait de 14 12 10 9 8 8 2 pollen de 14 13 10 9 8 - 3 plantes her- 16 14 12 10 9 9 4 bacées mélan- 14 13 10 - - - iffées 5 Extrait de t4 12 10 10 9 6 pollen d'un 12 10 - - - - 7 mélange de 12 10 9 9 9 - 8 plantes herba - - - - - - cées traité par du carbo diimide Il ressort des résultats présentés aux Tableaux III et IV qu'il y a production de taux plus élevés d'anticorps par immunisation à l'aide de l'allergène modifié par le carbodiimide, mais que le caractère allergène de la matière est négligeable. EXEMPLE 3 On dissout dans 5 ml de tampon de phosphate 0,01 M (pH 8,0) SOmgd'une matière qui a été extraite de pollens de plantes herbacées mélangées, et qui a été partiellement purifiée de fa çon à en enlever la plupart des hydrates de carbone et de la matière à bas poids moléculaire. On ajoute lentement 1 ml de 1-chloro2,3-époxypropane, et l'on agite le mélange durant 16 heures environ à la température ambiante. On sépare par centrifugation le précipité qui s'est formé, on le -lave avec le tampon de phosphate et on le met en suspension dans la solution saline de phé- nol. Essai de caractère allergène On injecte par piqûre dans la peau dé patients allergiques et sensibles aux plantes herbacées une suspension de la- matière dressai et une solution de la matière de départ, toutes deux dans la solution saline de phénol, ainsi que ce milieu lui-m8me, respectivement.On mesure au bout de 10 minutes les surfaces des traces obtenues. le tableau V montre les résultats des essais du caractère allergène : TABLEAU V Patient Extrait de Extrait de pollen d'un mélange Solution n pollen d'un de plantes herbacées traité par saline mélange de l'épichlorhydrine de plantes her- (1 mg/ml) phénol bacées 0 Az/ml) 1 1 62 0 0 2 15 1 O 3 12 O o 4 8 2 O 5 3 Q O 6 12 O O Dotal 112 3 0 les chiffres indiquent les surfaces des traces obtenues (mm2). Essai de caractère immunogène On immunise des cobayes, en double, par une injection sous-cutanée d'une émulsion contenant la matière d'essai dans de l'adjuvant complet de Ereund. On immunise un groupe similaire de cobayes avec de la matière de départ non modifiée et additionnée de la même façon que l'adjuvant. Au bout de 21 - 28 Jours, on fixe par des pinces les animaux sur leur flanc dont on a enlevé les poils et l'on effectue dans la zone pincée une série d'injections intradermiques (0,1 ml) d'une dilution en série de la matière de départ en terminant par une solution saline normale. On injecte immédiatement par voie intraveineuse 0,4 ml d'une solution à 5 % de "Bleu Ciel Pontamind' Au bout de 20 minutes, il se forme des traces de couleur bleue dans certains des sites de l'injection intradermique, ce qui indique la présence d'anticorps ayant de la spécificité pour la matière de départ. On mesure et enregistre les diamètres des traces obtenues. les résultats de l'vessai de caractère immunogène sont présentés au tableau VI. TABLEAU VI Cobaye matière immu- Diamètre de la trace (mm pour la quantité n nisante d'extrait de pollen de mélange de plantes herbacées injectée par voie intradermique 100 10 1 O 4 O 0,01 g 0,001 1 Extrait de pol- 14 - 13 10 2 lend'unm4lan- 16 14 12 10 9 9 3 ; ge de plantes 14 13 10 9 8 4 : herbacées (5mg) 14 12 10 9 8 8 5- Extrait de pol- 12 10 - - - 6 len d'un mélan- 10 i 7 ge de plantes i - - - - 8 herbacées trai- 10 i - - I - té té par l'épi- chlorhydrine(5mg) 9 & Extrait de pol- 12 - - 10 ; len d'un mélan- 14 12 9 - I ~ ~ 11 ge de plantes 12 11 9 - - 12 ; herbacées 14 12 9 (0,5 mg) 13 Extrait de pol- 10 8 - - 14 len de plantes - - - - - 15 herbacées traité 10 8 - -- - s 16 par l'épichlor- - - hydrine (0,5 mg) Il ressort des résultats ci-dessus qu'il y a production de taux décelables d'anticorps par immunisation à l'aide des allergènes traités par l'épichlorhydrine, cependant que le caractère allergène est réduit à un niveau négligeable. EXEMPLE 4 On dissout dans 10 ml de tampon 0,01 M , pH 8,0 , 50 mg de la matière qui a été extraite de pollen de pied-de-coq. On ajoute lentement 1 ml de 1-bromo-2:3-époxy-propane (épi bromhydrine) et l'on agite le mélange durant 16 heures environ à la température ambiante. On sépare par centrifugation le précipité qui s'est formé, on le lave avec le tampon de phosphate, et on le met en suspension dans la solution saline de phénol. Les résultats des essais biologiques sont présentés aux Tableaux VII et VIII. les modes opératoires des essais sont identiques à ceux de exemple 3. Il y a production de niveaux décelables de taux d'anticorps par immunisation , alors que le caractère allergène est réduit à des niveaux négligeables. TABLEAU VII Caractère immunogène de l'allergène traité par l'épibromhydrine Cobaye Matière immuni- Diamètre de la trace (mm) pour une quan n0 sante tité d'extrait de pollen de pied-de coq injectée par voie intradermique 100 g 10 g 1 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 1 Extrait de pollen 16 10 - - - - 2 de pied-de-coq 16 10 - - - - 3 (0,5 mg) 16 10 - - - - 4 Extrait de pied- 14 10 - I - - 5 de-coq traité par 14 10 - - - - 6 l'épibromhydrine 15 10 i - - (0.5 mg) TABLEAU VIII Caractère allergène de l'allergène traité par l'épibromhydrine Malade Extrait de pied-de-- Extrait de pollen de Solution n0 coq pied-de-coq traité à saline (1 O0 Ag/ml) 1' épibromhydrine de 100 AF/ml) phénol 1 9 0 0 2 18 0 O 3 22 O O 4 21 0 O Total 70 0 O EXEMPLE 5 Préparation d'un allergène modifié par du cyanate On purifie partiellement un extrait aqueux de pollens provenant de plantes herbacées mélangées (agrotis vulgaire, genet à balais, pied-de-coq, cretelle des prés, avoine élevée, fétuque, vulpin, pâturin des prés, flouve odorante et houlque laineuse) par traitement avec une solution aqueuse de phénol, puis précipitation de la protéine de la phase de phénol pour enlever la plupart des hydrates de carbone et des matières à bas poids moléculaire. On dissout 50 mg de la protéine allergène résultante partiellement purifiée dans 5 ml d'eau et l'on ajuste le pH à 8 par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. On ajuste ensuite le pi à 5,0 au moyen d'acide acétique, on ajoute 0,2 g de cyanate de potassium, et l'on agite le mélange à la température ambiante durant 16 heures environ. Il se forme un précipité que l'on lave de façon répétée avec un tampon de phosphate à pi 8 et que l'on met ensuite en suspension dans une solution saline de phénol. Essai du caractère allergène On administre par piqûre dans la peau de patients allergiques et sensibles aux plantes herbacées une suspension de l'al- lergène modifié par le cyanate,préparéecomme ci-dessus, une suspension de l'extrait d'allergène partiellement purifié et non modifié (tous deux dans la solution saline de phénol) et le milieu de solution saline de phénol lui-mEme. On mesure les surfaces des traces obtenues au bout de 10 minutes et ces traces sont exprimées dans le Tableau IX en mm2. On peut voir que l'allergène modifié par le cyanate présente un caractère négligeable d'allergène par rapport à la matière non modifiée. TABLEAU IX Malade Extrait de pollen Extrait de pollen Solution nO d'un mélange de d'un mélange de saline plantes herbacées plantes herbacées, de 50 Ag/ml traité au cyanate phénol i m 1 ml 1 12 4 0 2 3 2 0 3 8 6 0 4 12 3 0 5 15 5 O 6 62 24 0 Total 112 44 0 Essai de caractère immunogène On immunise des cobayes, en double, par une injection souscutanée d'une émulsion contenant l'allergène, modifié au cyanate, dans de l'adjuvant complet de Breund. On immunise un jeu similaire de cobayes avec la matière de départ non modifiée et comportant de l'adjuvant de la même façon. Au bout de 21-28 jours, on maintient les deux jeux d'animaux par des pinces sur leur flanc débarrassé des poils et l'on effectue dans la zone pincée une série d'injections intradermiques (0,1 ml) d'une dilution en série de la matière de départ en terminant par une solution saline normale. On injecte immédiatement par voie intraveineuse 0,4 ml d'une solution à 5 ffi de"Bleu-Ciel Ibntamine8! Après 20 minutes, il se forme des traces de couleur bleue sur certains des sites de l'injection intradermique, ce qui indique la présence d'anticorps ayant une spécificité pour la matière de départ. On mesure dans ce cas encore les diamètres des traces et on les note au Tableau X. On peut voir que l'allergène modifié par du cyanate conserve la spécificité d'immunisation caractérisant la matière de départ. TABLEAU X Cobaye matière immu- Diamètre de trace (mm) pour la quantité n0 nisante d'extrait de pollen de plantes herbacées mélangées injecté par voie intradermique 100 g 10*g 1 O 1 O 01 0 O*QO1g 1 Extrait de pol- 14 12 10 9 8 8 2 len de plantes 14 13 10 9 8 3 herbacées mélan- 16 14 12 10 9 9 4 gées (5 mg) 14 13 10 - - - 5 Extrait de pol- 12 9 7 - - 6 len de plantes 12 9 7 - - - 7 herbacées mélan- 10 - - 8 gées, traité au 12 cyanate (5mg) 9 Extrait de pol- 14 12 9 10 len de plates 12 11 9 - - 11 herbacées mélan- 14 12 9 12 gée, 12 9 - - - (0,5 mg) EXEMPLE 6 Afin d'obtenir-une confirmation des résultats des essais biologiques, on répète le mode opératoire de l'exemple 5. On enregistre au tableau XI les résultats de l'essai du caractère allergène de l'allergène modifié, et les résultats des essais du caractère immunogène de l'allergène modifié par le cyanate sont notés au Tableau XII. TABLEAU XI Malade Extrait de pollen de Solution n plantes herbacées mé- plates heracées mo- saline langées 100 g/ml difiées, traité au de cyanate 2 mg/ml 1 23 1 1 2 6 0 0 3 2 0 0 4 19 O O Total 50 1 1 les chiffres indiquent les surfaces des traces obtenues (mm2) TABLEAU XII Cobaye Matière immunisante Diamètre de la trace mm pour la n0 quantité d'extrait de pollen de plan- tes herbacées mélangées injectée par voie intradermique 100 g 10 g 10 g, 0,1 g 0,01 g 0,01 g 0,001 g 1 Extrait de pollen de 12 10 9 ~ 8 - - .2 plantes herbacées mé- 12 10 7 3 - - -~ 3 langées (5 mg) 12 10 8 - 1 4 12 10 9 - - - 5 Extrait de pollen de 12 10 - q - - 6 plantes herbacées mé- 12 9 - - - - 7 langées, traité au cya- 14 12 9 2 8 nate (5 mg) 14 10 - - - - 9 Extrait de pollen de 14 10 10 plantes herbacées mé- 12 11 11 langées (0,5 mg) 10 9 - - - - 12 - - - - - 13 Exrait de pollen de 12 11 8 15 angées traité au cya- 10 - j 16 nase (0,5mg) -- - -- - - i EXEMPLE 7 Traitement de l'extrait de pollen par le phényl-glyoxal Mode opératoire On ajoute une solution à d'hydrate de phényl-glyoxal, dissous dans du tampon de phosphate 0,01 M (pH 8) à un volume égal de 50 mg de matière qui a été extraite de pollen de pied-de-coq et qui, après purification par traitement avec du phénol, a été dissout dans le meme tampon. On effectue la réaction à la température ambiante pendant 24 heures.Il se forme un précipité que llon lave de façon répétée avec du tampon de phosphate à pH 8 et que l'on met ensuite en suspension dans une solution saline de phénol. Essai du caractère allergène On administre par piqûre dans la peau de patients allergiques et sensibles aux plantes herbacées une suspension de la matière modifiée par du phényl-glyoxal et préparée comme ci-dessus, une suspension de l'extrait de pied-de-coq traité par du phénol et non modifié (les deux dans une solution saline de phénol) et le milieu de solution saline de phénol lui-m8me. On mesure les zones des traces obtenues au bout de 10 minutes et on les exprime en 2 mm au tableau XIII. TABLEAU XIII Malade Extrait de pollen de Extrait traité par Solution n0 pied-de-coq le phénylglyoxal saline de 50 ml 1 m mol phénol 1 35 0 O 2 3 19 2 1 Total 91 6 1 Essai de caractère immunogène On immunise des cobayes, en double, par injection souscutanée d'une émulsion contenant la matière modifiée par le phénylglyoxal dans de l'adjuvant complet de Freund. On immunise un groupe similaire de cobayes avec la matière de départ non modifiée etadditiounée de la meme façon de l'adjuvant complet. Au bout de 28 jours, on fixe les deux jeux d'animaux par des pinces sur leur flanc débarrassé des poils et lton effectue dans la zone pincée une série d'injections intradermiques (0,1 ml) dune solution en série de la matière de départ en terminant par une solution saline normale. On injecte immédiatement par voie intraveineuse 0,4 ml d'une solution à 5 % de"Bleu Ciel Ponta mine".Au bout de 20 minutes, il se forme des traces de couleur bleue à certains des sites de l'injection intradermique, ce qui indique la présence i!anbicorDs ayant une spécificité pour la matière de départ. les zones présentant des traces sont-mesvrées et notées au Tableau XIV. TABLEAU XIV Cobaye Matière immunisante Diamètre de la trace (mm) pour la n0 quantité a'extrait de pollen de pied-de-coq injectéepar voie intra dermi ue 100 g 10pg 1pg 0,1 g 0,01 g 0,001 1 Extrait de pollen 14 14 10 10 9 7 2 de pied-de-coq 14 12 8 7 6 3 (5 mg) 12 11 10 9 7 4 12 11 9 9 8 1 Extrait de pollen 12 li 2 de pied-de-coq 3 traité au phényl- 12 - - 4 glyoxal (0,5 mg) - - - - - - EXEMPLE 8 Traitement de l'extrait de pollen par la nitroindanedione Mode opératoire On ajoute 1 ml d'une solution à 0,5 ffi de 2-nitro-indane 1 ,3-dione dans de l'eau à 9 ml d'extrait de pollen de pied-de-coq qui a été purifié par traitement avec du phénol et a été dissous dans du tampon au phosphate 0,01 M (p11 8). On agite le mélange durant 16 heures environ à la température ambiante .Il se forme un précipité que l'on lave de façon répétée avec le tampon de phosphate à pH 8 et que l'on met ensuite en suspension dans une solution saline de phénol. Essai du caractère allergène On administre par piqûre dans la peau de patients sensibles aux plantes herbacées une suspension de la matière modifiée par la nitroindanedione, préparée comme ci-dessus, une suspension de l'extrait non modifié (tous deux dans la solution saline de phénol) et le milieu de solution saline de phénol lui-mme, respectivement. On mesure au bout de 10 minutes les surfaces 2 des traces obtenues et on les exprime en mm au tableau XV. TABLEAU XV Malade Extrait de pollen de Extrait traité à la Solution n pied-de-coq nitroindanedione saline de 50 g/ml 1 mg/ml phénol 3 8 2 O 4 5 1 0 Total 27 5 7 1 Essai du caractère immunogène On immunise des cobayes, en double, par une injection souscutanée d'une émulsion contenant la matière modifiée par la nitroindanedione dans de l'adjuvant complet de Breund. On immunise un groupe similaire de cobayes avec la matière de départ~non modifiée et additionnée de la même façon de l'adjuvant complet. Au bout de 28 jours,on fixe les deux groupes d'animaux par des pinces sur leur flanc débarrassé des poils et l'on effectue dans la zone pincée une série d'injections intradermiques (0,1 ml) d'une dilution en série de la matière de départ en terminant avec une solution saline normale. On injecte immédiatement par voie intraveineuse 0,4 ml d'une solution à 5 % de"Bleu Ciel Pontamine" Au bout de 20 minutes, on mesure les traces obtenues et on les note au Tableau XVI. TABLEAU XVI Gobaye Matière immunisante Diamètre de la trace (mm) pour une quan n tité d'extrait de pied-de-coq injecté par voie intradermique 100 g 10 g 1 g 0,01 g 0,01 g 0,001 g 1 Extrait de pollen 13 13 9 9 - 2 de pied de coq 13 1 13 5 4 7 3 (0,5 mg 12 1 11 10 9 8 4 12 11 9 9 8 1 Extrait de pollen 10 - - - - 2 de pied-de-coq 14 11 - - - - 3 traité à la nitro- 14 11 ~ ~ ~ ~ 4 indanedione (0,5mg) 9 - - - - - EXEMPlE 9 Traitement de l'extrait de pollen par le glutaraldéhyde et absorption subséquente dans de l'hydroxyde d'aluminium Mode opératoire On ajoute 1 ml de solution à 5 ss de glutaraldéhyde à 9 ml d'un extrait aqueux contenant 1 mg de pollen de flouve odorante par ml, à pH 5,3. On agite le mélange à la température ambiante durant 3 jours. On ajoute 6 ml d'une solution à 2 % d'hydroxyde d'aluminium et l'on agite le mélange durant une heure.Après centrifugation, on lave le précipité à deux reprises dans du tamcon de phosphate 0,01 TI(pH 8)et trois fois dans de i'eau distillée, et finalement on remet en suspension pour obtenir une concentration de 1 mg de pollen par millilitre de solution saline de phénol. On répète le mode opératoire sans l'addition du glutaraldéhyde, la suspension finale servant de témoin dans l'essai de spécificité immunisante. Essai de caractère allergène On administre par piqûre dans la peau de patients allergiques sensibles aux plantes herbacées une suspension de la matière ci-dessus, une solution de l'extrait de pollen non modifié (tous deux dans une solution saline de phénol) et le milieu de solution saline de phénol lui-m8me,respectivement. On mesure les surfaces des traces obtenues au bout de 10 minutes et on les exprime en 2 mm au Tableau XVII. TABLEAU XVII Malade Extrait aqueux Extrait de pollen de Extrait de pol- Solu nO de pollen de flouve odorante, trai len de flouve tion flouve odorante té par le glutaraldé- odorante non saline 50 pg/ml hyde et adsorbé dans traité et adsor- de l'alumine 1 mg/ml bé dans l'alu- phénol mine 1 m mol 1 17 2 6 0 2 2 0 3 0 3 6 0 3 0 Total 25 2 12 0 Essai de la spécificité immunisante On immunise des cobayes, en double, par une injectIon souscutanée de la matière modifiée par le glutaraldéhyde et adsorbée dans l'alumine. On immunise un groupe semblable de cobayes avec de l'extrait de pollen de flouve odorante , non modifié et adsorbé dans l'alumine, à une concentration de pollen de 1 mg/ml. Au bout de 21 jours, on effectue une injection de rappel et l'on prélève du sang sur les animaux 10 jours plus tard. On effectue une réaction d'anaphylaxie cutanée passive sur les sérums par injection de dilutions en série par voie intradermique dans une zone pincée des flancs d'un groupe de cobayes. On administre ensuite par voie intraveineuse aux cobayes l'ex- trait aqueux de flouve odorante non modifié , contenant 0,4 ml de solution de "Bleu Ciel Pontamine",5 heures plus tard (extrait "agresseur"). les résultats obtenus avec différentes concentrations de l'antigène "agresseur" sont présentés au Tableau XVIII dans le cas de la matière modifiée et au Tableau XIX dans le cas de la suspension témoin sans glutaraldéhyde. TABLEAU XVIII Cobaye n Extrait aqueux de pollen Diamètres des traces en mm de flouve, lyophilisé pour une dilution de sérum de ("agresseur" ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ i 1 1 il Solution 5 25 125 625 3125 saline 1 1 mg/ml 22 20 16 10 - - 2 100 Ag/ml 20 17 13 - - - 3 10 pg/ml 20 18 - - - - 4 5 pg/ml 14 - - - - TABLEAU XIX Cobaye n Extrait aqueux de pollen Diamètres des traces en mm de flouve, lyophilisé pour une dilution de sérum de ("agresseur") 1 1 1 1 1 Solution 5 25 125 625 3125 saline 5 1 mg/ml 25 16 - - - - 6 100 pg/ml 20 18 16 - - - I 7 10 /ml - - - - - - 8 5 g/ml - - - - - - I On peut voir que le traitement par le glutaraldéhyde conduit à une plus grande formation d'anticorps par comparaison avec ce qu'on obtient à partir de la matière non traitée, bien qu'il y ait diminution de l'activité allergène. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'une matière allergène modifiée, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la réaction d'une matière allergène avec un polyaldéhyde, une polycétone, un carbodiimide, une épihalogénkydrnne ou un cyanate minéral, étant bien entendu que lorsqu'on utilise un cyanate minéral on effectue la réaction dans des conditions acides. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir la matière allergène avec un dialdéhyde. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dialdéhyde utilisé est le glutaraldéhyde ou le phénylglyoxal. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir la matière allergène avec une dicétone. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la dicétone utilisée est la 2-nitroindane-1,3-dione. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce quton fait réagir la matière allergène avec un carbodiimide ou une épihalo génhydrine. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on utilise l'épichlorhydrîne ou 1'épibromhydrine. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise le métho-para-toluène-sulfonate de i-cyclohexyl-3-(2- morpholinoéthyl) carbodiimide. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir la matière allergène avec un cyanate minéral. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le cyanate minéral utilisé est le cyanate de potassium. 11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction à un pH d'environ 5. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction avec le carbodiimide au voisinage de pH 5 et l'on effectue la réaction avec l'épihalogénhydrine au voisinage de pi 8. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction dans la gamme des pli de 4 à 8, et de préférence au voisinage de pli 5. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matière allergène est un extrait allergène d'un ou plusieurs pollens. 15. Une matière allergène modifiée, caractérisée en ce qu'elle est préparée par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 16. Une matière allergène modifiée, caractérisée en ce quelle comprend une protéine ou une glucoprotéine allergène qui est réticulée à l'intérieur ou à l'extérieur de la molécule, à l'aide d'un polyaldéhyde, une polycétone, un carbodiimide, une épihalogénhydrine ou un cyanate minéral, cette matière allergène modifiée étant quasi totalement insoluble dans l'eau ou n'étant que peu soluble dans l'eau et ayant un caractère allergène limité par rapport à la protéine ou la glucoprotéine allergène non réticulée, cette matière modifiée étant capable de produire des anticorps ayant une spécificité croisée pour la protéine ou la glucoprotéine allergène non réticulée. 17. Matière allergène modifiée selon la revendication 16, caractérisée en ce qutelle est réticulée par l'action du glutaraldéhyde, du phénylglyoxal, de la 2-nitroindane-1 ,3-dione, de ltépichlorhydrine, de ltépibromhydrine, du 1 -cyclohexyl-3- (2- morpholinoéthyl) carbodiimide ou du cyanate de potassium. 18. Une composition pharmaceutique , caractérisée en ce quelle comprend une matière allergène modifiée selon la revendication 15, 16 ou 17, ainsi qu'un véhicule ou excipient acceptable pour une administration parentérale. 19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18, caractérisée en ce que cette composition comprend un adjuvant. 20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'adjuvant est la tyrosine, l'alumine, l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium. 21. Composition pharmaceutique selon la revendication 19, sensiblement comme décrite à l'exemple 9.