Brevet FR2092875A1 — publié le 19720128

La présente découverte concerne un procédé pour la préparation de substances complexes capables de provoquer la libération ou la formation d'interféron et/ou de protéines inhibitrices de virus dans des animaux ou des cultures de tissus infectés par un virus, qui restreignent la reproduction de ces virus ou d'autres virus infectant l'animal ou la culture de tissus. Il a été établi que tous les virus contiennent des chaînes d'acide nucléique constituées de purines et pyrimidines attachées à un ribose ou un désoxyribose, qui sont liées entre elles par des molécules d'acide phosphorique. Il est également connu que l'acide nucléique viral se multiplie par formation d'une chaîne double ou triple d'acide nucléique qui plus tard se sépare, avec formation de nouvelles chaînes bi-ou tricaténaires qui se séparent de nouveau, et le processus se répète. Des cellules infectées peuvent parfois produire un mécanisme de défense dont la production est provoquée par la présence d'un acide ribonucléique étranger à chaîne multiple. Des acides nucléiques bicaténaires fabriqués à partir de mo pécules de polyribonucléotides de cytosine complexées à des molécules de polyribonucléotides dthypoxanthine (nomenclature de Inman et Baldwin, J. Mol. Biol. 5,172,1962) sont efficaces pour provoquer la libération et/ou la formation d'interféron. Des acides nucléiques tricaténaires, tels ceux formés par la copolymérisation d'un acide polsedénylique avec un acide polynridylique, ou la copolymérisation d'un acide polycytidylique avec un acide polyinosinique quand le mélange n'est plus équimoléculaire; sont également effectifs. La possibilité fut envisagée d'augmenter cette action inductrice par une augmentation de la complexité de l'inducteur, obtenue par l'incorporation d'un troisième polymère capable de se lier aux groupes phosphates libres-ou aux atomes réagissants de ces groupesqui font partie d'acides nucléiques à chaîne unique ou multiple. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, en référence aux dessins annexées dans lesquels: - la figure 1 montre la séquence dans le temps de la résistance animale à une attaque virale après administration de divers inducteurs. - la figure 2 montre 1 t effet de différentes concentrations diéthylaminoethyl dextrane (DEAE-D) sur la puissance inductrice d'interféron d'un polymère d'acide nucléique, cette puissance étant mesurée par la résistance de l'animal inoculé par des doses léthales de virus. La présente invention rend compte d'autres inducteurs capables de provoquer la formation d'interféron pour une période de temps plus longue et vise surtout à établir un procédé efficient pour la production de complexes de ce type, avec résultat uniformes et reproductibles. Elle est basée sur l'interaction de substances polycationiques tel que le diéthylaminoéthyl dextrane avec des polymères d'acides nucléiques. le DEAE-D est un polymère du diéthylrminoethyl glucose (DEAE-G) de poids moléculaire variant de 105 à ioS, préférence. de 104 à 107, chargé positivement, c'est à dire cationiquement. Ce polycation a la propriété de se lier à des atomes chargés négativement et, en particulier, à l'acide phosphorique d'acides nucléiques tant mono-que pluricaténaires. Certains polynucleotides et analogues tels que les polyribonucléotides de cytosine ( poly-C), polyribonucléotides d'hypoxan- thine (poly-I), acide polyaddnylique (poly-A), acide polyuridylique (poly-U), copolymère de pyrane, DEAE-D et autres polycations sont obtenus dans le commerce ou peuvent être fabriqués au laboratoire. On part de polymères d'acides nucléiques monocaténaires lequels sont dissous, de préférence à une concentration de 1 mg/ml dans une solution aqueuse contenant des sels de sodium, potassium ou autres, à un pH de 7,0 à IO,O,de préférence proche de 7,2, tamponné par du tris (hydroxy-méthyl-amino ) -éthane additionné d'acide chlorhydrique et maintenu à une température proche de +200C. le DEAE-D est dissous dans une solution aqueuse à une concentration de 20 mg/ml .En général, il convient de dissoudre le polymère d'acide nucléique à une concentration de 100 ou 200 microgrammes/mI dans une solution 0,15 molaire en ClSa et 0,02 molaire en tris (hydroxy-méthyl-amino)-éthane, pH 7,0, ou autre tampon à une température comprise entre OOC et 900G, de préférence entre 200C et 600C. La réaction steffecteen ajoutant lentement un volume égal de DEAE-D à une solution diluée d'acide nucléique, ou inversement.Les acides nucléiques de polyinosine (I) et polycytidine (C) sont préférés ainsi que des homologues et analogues tels que les copolymères du pyrane et les polymères d'acide acrylique et d'acide méthacrylique. Après la complexion du polycation avec chacun des acides nucléiques monocaténaires, une polymérisation de ces acides nucléiques monocaténaires en une chaîne double est réalisée.Ceci est obtenu en mélangant les deux solution d'acides nucléiques à chaîne unique complexés auparavant: ou bien deux complexes formés auparavant entre deux acides nucléiques monocaténaires et un polycation (DEAE-D ou autre ) peuvent être mélangés, ou bien un complexe formé auparavant entre un acide nucléique monocaténaire et le polycation peut être mélangé avec un acide nucléique libre non complexé avec un polycation, pour achever la formation désirée en chaîne double (ou triple). En effet, en plus d'une polymérisation entre deux polynucléotides libres, deux combinaisons sont possibles. Premièrement, une seule des deux chaînes d'acide nucléique (poly-I ou poly-C) est d'abord recouverte avec du DEAE-D, et, en second lieu, chacun des deux polynucléotides est d'abord lié au polycation (DEAE-D ou autre). La formation d'interféron induite dans un hôte par l'injection d'acides nucléiques bicaténaires complexés à un polycation de la manière décrite est nettement plus prolongée que la formation d'interféron résultant de l'injection des mêmes acides nucléiques bicaténaires libres. Ceci est démontré par les résultats rapportés sur la figure 1. Cette figure montre la susceptibilité ou résistance d'un hôte à une attaque virale au cours du temps, quand une seule chaîne d'acide nucléique (I ou C) est recouverte du polyca tion DEAE-D et, également, quand les deux chaînes d'acide nucléique sont couvertes avec ce polycation allant formation d'un complexe à chaîne double. Les polynucléctides furent injectés à une dose de 50 m cro- grammes et l'attaque virale effectuéeaprès 1,3,5,7 et 9 jours. La figure 1 démontre que l'effet protecteur du poly 1:0 est maximum un jour après l'injection du polymère et nulle 7 jours plus tard. Un effet retard prend place avec le (DEAE-D + I) : C, où la résistance maximale prend place 3 jours après l'injection de ce polymère. Avec le (DEAE-D + I):(DEAE-D +C) c'est-à-dire (I recou vert):(C recouvert), la protection maximale apparaSt encore plus tard, 5 à 9 jours après l'injection de cet inducteur. Par ailleurs, pour obtenir non plus un effet retard mais une exaltation de l'induction ou de la libération d'interféron, l'acide nucléique et le polycation doivent être complexés de la façon suivante: d'abord l'acide nucléique bi-ou tricaténaire est formé et ensuite seulement cet acide nucléique à chaîne multiple peut être uni au polycation, en particulier le DEAE-D. les propor tions relatives de polycation nécessaires pour obtenir un complexe à pouvoir d'induction plus élevé sont bien inférieures à celles indiquées dans la procédure déjà décrite, où les meilleurs résul tats étaient obtenus quand des quantités égales en poids ou même un excès du polycation étaient utilisées pour recouvrir les aci des nucléiques monocaténaires, de façon à ne précipiter aucun des composants du complexe final.En utilisant un acide désoxyribonu cléique (ADN) à chaîne unique, il a été démontré que le poids mo léculaire de l'acide nucléique a une influence sur la quantité de DEAE-D nécessaire pour le précipiter ou former un colloïde (Maes et al.,3 3Biochem.Acta,134, 269,1967). Dans le cas de I:C, il fut trouvé qu'il n'existe pas de différences fondamentales entre ce complexe ARN et le ADN natif, mais que les proportions de polyca tion nécessaires pour obtenir des effets caractéristiques sont beaucoup moins élevées, puisque le poids moléculaire du ARN est plus petit.L'addition de DEAE-D au poly I:C dans les proportions finales (en poids) de 0,1; 0,2; 0,4 et 1,0 provoquèrent la forma tion d'un colloïde pour les deux premières proportions, un gros précipité apparut à la proportion 0,4 et l'état colloïdal fût retrouvé à la proportion 1,0. Quarante microgrammes de poly I:C furent inoculés à des souris et comparés aux mêmes doses du complexe après son recouvre ment par du DEAE-D dans les proportions mentionnées ci-dessus. L'attaque virant fut effectuée de 1 à 5 jours plus tard. La figure 2 démontre que, pour la proportion 0,4 l'effet inducteur du poly I:C est totalement masqué. Des trois combinaisons restantes, la proportion 1:10 est supérieure au poly I:C libre et confère une meilleure protection aux animaux inoculés avec du virus, jusqu'au 5ième jour après l'administration de cet inducteur. L'examen des résultats du challenge effectué au 5ième jour montre que le retour à l'état colloidal par excès de polymère cationique donne une légère protection contre une infection virale: la proportion 1:1 est en effet meilleure que la proportion 1:2,5. Ainsi donc, une production maximale d'interféron apparaît quand le DEAE-D est ajouté à l'acide nucléique bicaténaire dans la proportion 1:10, en poids. Des concentrations supérieures tendent à précipiter le complexe et induire une quantité moindre d > in- terféron, et partant, une protection moindre contre une infection virale. La quantité de polycation nécessaire pour obtenir les meilleurs résultats varie avec le type de polycation utilisé. Dans les réactions de complexion, des polycations autres que le DEAE-D peuvent être utilisés, tels que le diméthylaminoéthyl dextrane, le diéthylaminodthyl dextrane et autres dérivés possédant le poids moléculaire requis. Des polymères d'acidesaminés basiques tels que la polyornithine et la polylysine, ou des protéines naturelles basiques tels l'histone et la protamine ainsi que la lysozyme et en outre des polyélectrolytes cationiques synthétiques tels que le bromure d'hexadiméthrine peuvent être utilisés. Tous ces agents servirent de façon adéquate comme chaîne cationique recouvrant les acides nucléiques inducteurs d'interféron. Ceci fut démontré en utilisant un inducteur moins puissant.Un complexe de poly A:U -tricaténaire- donne une proportion faible contre une attaque virale, mais la résistance augmente quand ce complexe est additionné de polymères cationiques. le tableau i donne le pourcentage de résistance observé chez des animaux challengés avec une létale de virus, mais inoculés d'abord avec du poly A:U complexé avec divers polymères cationiques. La résistance à l'infection fut comparée à celle obtenue après 1' administration du même acide tricaténaire complexé avec du DEAE-D; cette dernière résistance )ut considérée comme égale à 100%. TABlEAU I COMPARAISGN DE L'EFFICACITE DE DIFFERENTS PODYMERES CATSONIQUES Complexes inoculés Nombre de .ours de 1'attaque virale 1 .iour 4 jours A:U + DEAE-D 100% 100% + protamine 70so 85% + histone 60% 70% + bromure d'exadiméthrine 6049 70% + polyornithine 55% 60% + polylysine 55% 45% + lysozyme 45% 60% A:U seul 5% 0% De même, bien qu'il ait été principalement question des po lymères d'acides inoslniques et cytidyliques (I::C) qui sont les meilleurs inducteurs connus jusqu'à présent, d'autres acides poly nucléiques (homopolymères et hétéropolymères) peuvent être utilisés, tels ceux d'adénine, d'uracile, de xanthine, de guanine, de dihy drouracile (respectivement désignés A,U,X,G,DHU), ou ces polynu cléotides et leurs copolymères, I et C inclusivement, tels A:U, A:I, ou les nucléotides partiellement déphosphorylés tels CpA, CpU, CpC et d'autres analogues d'acides nucléiques tels le copo lymère de pyrane et les polymères d'acide acrylique et méthacryli que, compris dans l'dchelle de pH située entre le point isoélec trique de ces polynucléotides et leur point de dégradation ou dis sociation. les réactifs peuvent être utilisés sous forme soluble ou dispersés dans un milieu isotonique pour la préparation de vaccins et produits injectables pour immunisation et protection contre les maladies virales. les.complexes formés peuvent être isolés des liquides réagissants par des techniques conventionnelles de centrifugation, ultracentrifugation, précipitation, chromato graphie, adsorption, etc. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisations décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équiva lents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons,si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. BE;ENDI CATIONS 1. Procédé pour la préparation de complexes agissant de façon à provoquer la formation et/ou la libération d'interféron et/ ou de protéines inhibitrices de virus, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un premier réactif choisi dans le groupe composant les acides nucléiques mono-,bi- et tricaténaires et leurs analogues,possédant des points réagissants de nature négative ou anionique,avec un second réactif constitué par un polymère possédant des points réagissants de nature positive ou cationique et choisi soit dans le groupe formé par les dialboylaminoalcoyl- dextranes, de manière en soi connue, mais en choisissant le rapport pondéral d oylamino d'ålcoylaminoalcoyl-dextrane/acida nucléiques inférieur à environ 1/1 et non voisin de O et de 1/2,5, leurs homologues et analogues, soit dans le groupe formé par les polymères synthétiques d'acides aminés possédant des points réagissant cationiques tels que la polylysine et la polyornithine, soit des protéines naturelles basiques tels que l'histone et la lysozyme, soit enfin dans le groupe formé par les polyélectrolytes cationiques synthétiques tel que le bromure d'hexadiméthrine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit acide nucléique bi-ou tricaténaire est formé par copolymérisation in situ de deux polynucléotides monocaténaires. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce.qu'un polynucléotide nonocaténaire déjà complexé à un polycation est polymérisé avec un autre acide nucléique monocaténaire. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un polynucléotide monocaténaire déjà complexé avec un polycation est polymérisé avec un acide nucléique monocaténaire déjà complexé avec un polyélectrolyte cationique. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polycaton précité-possède un poids moléculaire entre 103 et 108 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit poids moléculaire est compris entre 104 et 107 7. Procédg selon la revendication 1, caractérisé en ce que le complexe précité est préparé par interaction dans un milieu aqueux à un pH compris entre le point isoélectrique et le point de dégradation ou dissociation des polynucléotides, à une température entre 0 C et 900 C, en présence d'au moins un sel métallique d'un acide minéral. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le pH est approximativement entre 7,0 et 7,2 et la température est entre 200 C et 60 C. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le sel métallique est le chlorure de sodium. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'acide minéral précité est l'acide phosphorique. 11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le tampon est le tris (hydroxyméthyl-amino)-éXhane, porté à un pH adéquat par addition de HCl. 12. Complexes susceptibles d'agir de façon à provoquer la formation et/ou la libération d'interféron et/ou de protéines inhibitrices de virus, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.