Brevet FR2066944A1 — publié le 19710813

Il est déjà connu que l'enzyme appelé l-asparaginase est doué d'activité anti-tumorale et a été utilisé avec succès dans le traitement de certaines leucémies et de certains lymphcmes. Certains types de cellules leucémiques requièrent une source ex-5 térieure de 1'amino-acide appelé L-asparagine pour leur métabolisme. et,.attendu que la L-asparaginase est un enzyme capable de détruire cet amino-acide par hydrolyse en acide aspartique, on a constaté qu'elle est intéressante pour le traitement de ces cellules malignes. 10 Dans le traitement de la leucémie à la L-asparaginase, une • dose relativement grande de l'enzyme est requise pour que le traitement connaisse une rémission complète ; toutefois, dans de nombreux cas, on a observé qu'une rechute finit toujours par se.'produire, Une difficulté que l'on rencontre lorsqu'on utilise la L-15 asparaginase réside dans l'élimination rapide de l'enzyme du sang du récepteur» Un autre facteur important du traitement à la L-asparaginase réside dans le fait que l'enzyme est sujet à une déna-turation rapide et à une baisse subséquente de l'activité biologique. Ces facteurs, liés au faible apport de l'enzyme, font que 20 tout procédé capable de réduire la vitesse de déhaturation et l'augmentation de la stabilité de l'enzyme dans la circulation sanguine serait d'un grand secours. L'invention concerne un procédé de traitement de la leucémie et des lympliomes. Elle concerne aussi un proeédé de traitement 25 de la leucémie basé sur l'utilisation de L-asparaginase immobilisée ou emprisonnée L'invention concerne en outre la préparation d'une composition renfermant la L-asparaginase emprisonnée dans line matrice d'un gel résineux synthétique. 30 La présente invention est basée sur la découverte suivante : La L-asparaginase peut être immobilisée ou emprisonnée dans une matriee d'un gel résineux synthétique tout en continuant de déployer son activité biologique, notamment son aetivité anti—tumorale. La nouvelle composition de l'invention se prépare par oc— 35 clusion physique de l'enzyme soluble dans le réseau d'un polymère synthétique fortement réticulé, par polymérisation du monomère en présence de L-asparaginase. 70 38715 2 2066944 L'enzyme utilisé dans la pratique de l'invention est la L-asparaginase d'Escherichia coli. EG-2. Le polymère synthétique utilisé dans la présente invention doit être polymérisable dans un milieu aqueux et doit être capa-5 ble de former un réseau fortement réticulé pour emprisonner la molécule de L-asparaginase. Des exemples de polymères synthétiques qui conviennent pour l'occlusion de l'enzyme comprennent ceux qui dérivent du glucose,;tels que les dextranes, les polymères d1amino-acides, les polymères de caprolactame, 1'acide poly-10 acrylique," le polystyrène, le polyéthylène, le polypropylène, la cellulose régénérée, etc. On a constaté que le polyacrylamide réticulé convient particulièrement pour emprisonner la L-asparaginase, en ce qu'il est capable de se polymériser en milieu aqueux et de former une structure de gel fortement réticulé. Les compo-15 sitions de l'invention contenant la L-asparaginase emprisonnée s« préparent par polymérisation d'acrylamide et d'un agent de réticulation en présence de 3renzyme. L'agent de réticulation qui s'est montré particulièrement intéressant à utiliser dans la présente invention est le 1T, Nr-méthylène-bis-acrylamide. D'autres agents 20 de réticulation qui sont intéressants pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent le méthylène-bis-éthylène, le méthylène-Ms-propylène, le méthylène_bis—styrène^ le divinylbenzène, etc. En présence de radicaux libres, 1'acrylamide se copolymérise très facilement avec le 1,H'-méthylène-bis-acrylamide. On compte parmi 25 les initiateurs de radicaux libres pour la réaction de polymérisation, les systèmes catalytiques d'oxydo-réduction et des systèmes photochimiques. Parmi les systèmes droxydo-réduction engendrant des radicaux libres que l'on peut utiliser, on mentionne les per-sulfates r chlorate s,, perborates, et perearbonates de métaux alca-30 lins et d'ammonium. Les initiateurs photochimiques de radicaux libres que l'on peut utiliser dans la pratique de l'invention comprennent la riboflavine seule ou en combinaison avec le persulfate d'ammonium. Les compositions de l'invention dans lesquelles la L-aspa-35 raginase est immobilisée contiennent 50" à 5G 000 Unités Internationales d'enzyme par gramme de polymère. Une Unité Internationale représente 1'activité qui libère de la L-asparagine une micro-mole d'ammoniac par minute. Le nombre total de grammes de gel polymère , g'est—à—dire la quantité de monomère plus l'agent de réti- 70 38715 3 2066944 eulation, que l'on utilise,peut varier de 0,25 à 50 g par 100 ml de gel et,de préférence,de 5 à 30 g par 100 ml de gel. La composition du polymère que l'on utilise dans la préparation de la phase gélifiée de l'invention contient généralement 0,25 à 50 $ 5 d'acrylamide monomère et,de préférence,5 à 25 $ en poids. L'agent de réticulation utilisé représente généralement 0,25 à 40 $ et, de préférence ,0,50 à 20 Des concentrations de catalyseur de 0,5 à 10 fo sur la hase du monomère conviennent pour la préparation des polymères de l'invention. 10 Une polymérisation utilisant un initiateur d'oxydo-réduc tion engendrant des radicaux libres est conduite par addition d'acrylamide monomère et de l'agent de réticulation à une solution aqueuse de L-asparaginase qui est tamponnée à un pH basique, par exemple supérieur à 8,0. A ce pH, il est désirable d'utiliser 15 un système spécial de catalyseur redox de polymérisation, consistant en un persulfate additionné d'activateurs aminés, par exemple de té tramé thyl- éthylène-diamine , triéthanolamine, N,ÏT-diméthyl-1,3-propanediamine. La polymérisation est déclenchée par application de chaleur et elle est réglée par refroidissement. Le mélan-20 ge réactionnel est chauffé à 35-45°C pour déclencher la polymérisation. La polymérisation photochimique est effectuée par addition d'acrylamide monomère et d'agent de réticulation à une solution aqueuse de l'enzyme tamponnée à un pH légèrement basique, par exem-25 pie de 7,0 à 7,6. Pour catalyser la photopolymérisation, on ajoute de la riboflavine ou une combinaison de riboflavine et d'un persulfate et on expose le mélange réactionnel à une source lumineuse, Attendu que 1'oxygène inhibe la réaction de polymérisation, on peut faire barboter de l'azote dans le mélange réactionnel soit 30 avant, soit après l'addition de l'enzyme, mais de préférence après l'addition et la dissolution de l'enzyme, et la réaction est conduite sous une atmosphère d'azote. Pour inhiber la dénaturation de l'enzyme pendant la réaction exothermique de polymérisation, le mélange réactionnel est placé dans un bain de glace pendant 35 la polymérisation. Le produit solide gélifié est désagrégé à la main et amené à traverser un tamis approprié, par exemple d'environ 0,29 mm d'ouverture de maille. Le gel est lavé avec la solution tampon.pour éliminer l'enzyme adsorbé, dont l'occlusion est total* ou partielle. 70 38715 4 2066944 Exe mule 1. On ajoute à 1 ml de solution d'asparaginase contenant 120 Unités Internationales, 4 ml de tampon tris (pH 8,6) (0,1 M) et 0,32 g d'acrylamide monomère. On ajoute 0,073 g de NjH'-méthylè-5 ne-bis-acrylamide et on agite le mélange réactionnel jusqu'à ce que la dissolution soit complète, c'est-à-dire en 5 minutes environ. On ajoute à cette solution 0,01 ml de tétraméthyl-éthylè-nediamine et 5 mg de persulfate d'ammonium. Après séjour pendant 15 minutes à la température ambiante, on provoque la polymérisa-10 tion par chauffage dv. mélange réactionnel à 35-45°C pendant environ 5 à 20 minutes ; la réaction èst ralentie par immersion du flacon contenant le mélange réactionnel dans un bain de glace. Au bout de 10 minutes à 2-3°C, on laisse reposer le mélange réactionnel pendant 2 heures à la température ambiante» On divise le gel 15 solide à l'aide d'une spatule et on le fait passer a travers un tamis de 0,29 mm d'ouverture de maille,, les particules de gel sont lavées avec 10 volumes- de tampon.de tris-HCl 0,1 M-(pH 8,6), à huit reprises, jusqu'à ce qu'onn'obser've plus d'absorption ultraviolette au-dessus de. 220 mji dans les eaux de lavage. La compo-20 sition immobilisée est liophylisée et conservée à 4°C. Le volume total de produit réactionnel est' de 10 ml, titrant 2 Unités Internationales par ml de gel. Exemple 2. On ajoute 2 g de L-asparaginase contenant 300 000 Unités 25 Internationales à une solution de 80 ml d'eau contenant 6 g d'acrylamide monomère et 2 g de N,N'-méthylène-bis-acrylamide. Lorsque la dissolution est complète, le volume est ajusté à 100 ml par addition de tampon au phosphate 0,1 - M (pH 7,4)» Pour catalyser la photopolymérisation, on ajoute 12 mg de riboflavine et on 30 éclaire la solution avec une lampe G. S. de 250 watts à rayons infrarouges, équipée d'un réflecteur. La polymérisation est conduite sous atmosphère d'azote et à 5°C pendant environ 2 heures. Le gel solide est divisé à l'aide d'ùne spatule et on le fait passer, à travers un tamis de 0,29 mm d'ouverture de maille. Les par-35 ticules de gel sont lavées dix fois avec un tampon au phosphate 0,1 M pour éliminer totalement l'enzyme soluble.Le gel humide a un volume de 220 ml et contient 200 Unités Internationales par ml de gel. 70 38715 5 2066944 Exemple 3. On.dissout 6 g de L-asparaginase titrant 100 Unités Internationales par mg dans 45 ml.de tampon au, phosphate 0,1 M, à un pH de 7,4. lorsque la dissolution est terminée, on ajoute 10 g 5 d'acrylamide, 2,5 g de. Nj.ïP-méthylène-bis-acrylamide et 12,5 mg de riboflavine. On purge le mélange à l'azote pendant plusieurs minutes. On ajoute 25 mg de persulfate d'ammonium et on maintient à 25°C pendant 30 minutes en présence d'une lampe G-. E» de 250 watts à rayons infrarouges, équipée d'un réflecteur. Le gel ré-10 sultant est amené à traverser un tamis de 74 microns d'ouverture de • maille et il est lavé par épuisement avec une solution de chlorure de sodium 0,10 M jusqu'à ce qu'on nf observe plus d'absorption dans une analyse en lumière ultraviolette à. environ 220 mfJj. Ce polymère a une concentration en gel de 21 et un volume de gel ^5 à l'état humide de 250 ml ; cette substance titre 150.Unités Internationales par ml de gel. asparaginase immobilisée conservent leur activité biologique pendant une plus longue période de temps que l'enzyme libre. En uti-20 lisant des méthodes normalisées de titrage, par exemple la méthode au réactif de ïïessler, pour le dosage de l'ammoniac libéré par l'action enzymatique de la L-asparaginase sur l'asparagine, on obtient les résultats suivants. les compositions de la présente invention contenant la L- TABLEAU I 25 Activité de la L-asparaginase immobilisée Activité résiduelle, fo turs Asparaginase libre Durée, jours 30 35 t 5 11 19 26 34 100 80 60 41 29 20 100 S\ 83 78 66 64 Asparaginase a une concentration de 8 % dans le gel. 70 38715 6 2066944 L'analyse graphique de ces résultats montre que la période de demi-vie es^ d'environ 1"5 jours pour l'asparaginase li bre et d'environ 68 jours pour l'asparaginase immobilisée. Rien n'indique que les propriétés enzymatiques de''la matière immobili-5 sée diffèrent d'une façon quelconque de celles de la L-asparaginase libre correspondante. La L-asparaginase immobilisée dans une matrice de poly-acrylamide est expérimentée chez des souris C3H présentant des lympliomes sous-cutanés 6C3HEB. On injecte à un groupe de cinq 10 souris, par voie intrapéritonéale, le. septième jour du développement de la' tumeur,, 0,5 ml d'une composition contenant environ 90 Unités Internationales d'asparaginase préparée conformément à l'exemple 2. Un autre groupe de cinq souris est traité de la même façon le dixième jour» On examine les animaux chaque jour pour dé-15 celer des signes de régression de la tumeur par mesure des dimensions de cette dernière. Les résultats sont reproduits sur le tableau II. TABLEAU II 20 Traitement- à la L-asparaginase immobilisée du lymphome 6C3HEP • P Dimensions de la tumeur (mm ) Traitement L-asparaginase, L-asparaginase, Aucun septième jour dixième jour traitement 7e jour 350 370 • 340 25 10e jour " 0 - 480 450 17ejour 0 0 580 La régression totale de la tumeur du lymphome s'obtient avec une injection de L-asparaginase immobilisée lorsque l'injee-30 tion est effectuée dans la cavité péritonéale 7 à 10 jours après 1'implantation de la tumeur* . L'administration de L-asparaginase immobilisée avant 11 implantation de la tumeur s'est révélée être efficace en empêchant la propagation des cellules tumorales. L'examen des viscères des 35 souris traitées avec la L-asparaginase immobilisée montre que l'effet de 1 ' asparaginase peut être observé pendant ' plusieurs-jours, ce qui se reflète dans l'étendue de la métastase. Les résultats suivants ont été obtenus chez des souris 03ii traitées par injection intrapéritonéale de 0,25 ml de L-asparagihase immobili— 70 38715 7 2066944 sée contenant 45 Unités Internationales de l'enzyme, plusieurs jours avant l'implantation de la tumeur„ Sur le tableau III, le premier chiffre indique l'apparition de la métastase et le second chiffre correspond au nombre de souris traitées et examinées, TABLEAU III Pancréas' Rein Foie Pas de traitement 2/2 2/2 1/2 Traitement, 2e jour 0/3 0/3 0/3 Traitement, 3e jour . 0/3 0/3 0/3 Traitement, 4 j our 0/3 0/3 0/3 Traitement, 5e j our 1/3 0/3 0/3 La L-asparaginase immobilisée est disponible pendant une 15 période de temps de plusieurs j ours en quantité suffisante pour empêcher la croissance de petits nombres de cellules tumorales disséminées dans l'organisme. Le traitement d'un sujet atteint de leucémie avec les compositions de L-asparaginase Immobilisée de la présente invention 20 peut être effectué de toute manière 'pratique qui permet à la conw' position d'entrer en contact avec le système circulatoire. Les compositions de la présente invention peuvent être administrées par voie parentérale, par exemple la composition de L-asparaginase immobilisée peut être injectée dans la cavité périt'onéale pour 25 provoquer la régression du lymphome. A titre de variante, on peut utiliser d'autres procédés, par exemple on peut faire passer le sang en circulation à travers un dispositif contenant 1'asparaginase immobilisée et provoquer l'élimination efficace de l'aspara-gine sanguine. 30 La posologie du principal ingrédient actif destiné au trai tement de la leucémie ou du lymphome dépend de l'âge, du poids et de l'état général du sujet traité, ainsi que de l'état particulier et de sa gravité. Une dose minimale de 50 Unités Internationales de L-asparaginase par kg de poids corporel du sujet s'est révélée 35 être efficace en permettant la régression du lymphome,' et cette . posologie peut être administrée en une seule injection intrapéri-tonéale. 70 38715 8 2066944 BEVEMDICATIOHS 1. Composition caractérisée par le fait qu'elle contient de la l-asparaginase emprisonnée dans un copolymère gélifié d'acrylamide et de Hjïï'-méthylène-bis-acrylamide. 5 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que 50 à 50 000 Unités Internationales de L-asparaginase sont emprisonnées par gramme de copolymère gélifié d'acrylamide et de ÎTjN'-méthylène-bis-acrylamide. 3o Composition suivant la revendication 1, caractérisée 10 par le fait que le copolymère se compose de 0,25 à 50 % en poids d'acrylamide et de 0,25 à 40 $ en poids de N,U*-méthylène-bis-acrylamide„ 4» Médicament caractérisé par le fait qu'il contient une composition suivant l'une quelconque des revendications 1, 2 et 15 3, intéressant notamment pour le traitement de la leucémie. 5» Médicament caractérisé par le fait qu'il contient une composition suivant la revendication 1, ayant au moins 50 Unités Internationale s de L-asparaginase„ 6„ Composition caractérisée par le fait qu'elle comprend 20 de la L-asparaginase emprisonnée dans un polymère fortement réticulé, pouvant être obtenu par polymérisation dans un milieu aqueux „ 7. Composition suivant la revendication 6, caractérisée par le fait que le polymère est un copolymère d'acrylamide.