Brevet FR2059476A1 — publié le 19710604

-1- 2059476 La présente invention concerne un procédé de production de l'enzyme L-arginase à activité élevée. Ce procédé consiste à cultiver dans des conditions aérobies et dans un milieu nutritif aqueux, une souche capable de produire la L-arginase et 5 appartenant aux espèces Pseudomonas ou Froteus. La L-arginase ou L-arginine uréehydrolase (enzyme n° 3-5-3.1) est une enzyme capable d'hydrolyser la L-arginine en L-orni-thine et urée. On la trouve dans divers tissus animaux et végétaux. 10 Bien qu'on ait récemment étudié cette enzyme pour ses activités physiologiques telles que 11inhibition de la synthèse du DNA, on connaît mal ses propriétés. A cause de la difficulté de production économique à grande échelle de cette enzyme, on l'utilise très rarement. 15 La L-arginase étant une enzyme intracellulaire, il est nécessaire d'isoler le contenu des cellules d'un microorganisme produisant de la L-arginase généralement par destruction du protoplasme ou sinon par rupture des parois de la cellule. On effectue généralement ceci durant le stade initial de la prépa-20 ration de L-arginase, après isolement des microorganismes. Bien que quelques fongus et ferments aient une activité L-arginase, il faut un temps et des efforts considérables pour isoler et extraire de la L-arginase de leurs cellules. De plus, il se produit une diminution importante de l'activité L-arginase 25 durant 11 étape d1isolement.• L'invention a pour but un procédé pour la production à grande échelle de L-arginase d'activité élevée, à un coût raisonnable. Le procédé, objet de l'invention, utilise certaines souches appartenant aux espèces Proteus et Pseudomonas qui ont une ac-30 tivité L-arginase élevée. Lorsqu'on utilise des bactéries Protéus et Pseudomonas, on peut aisément séparer les éléments des cellules de ces micro-organismes. En particulier, on peut aisément rompre les parois des cellules de Pseudomonas et isoler les éléments des cellules. L'invention a pour objet un procédé pour la production de L-arginase qui consiste à cultiver des cellules d'une souche produisant de la L-arginase choisie dans le groupe des espèces Proteus et Pseudomonas dans des conditions aérobies et dans un milieu nutritif aqueux , à séparer les cellules du milieu et à 70 24519 2059476 recueillir la L-arginase dans ces cellules. On peut adapter ce procédé à la production de L-arginase à grande échelle» La L-arginase obtenue a une activité élevée et son prix de revient est modique. 5 Suivant l'invention, on cultive de façon aérobie, pendant environ 6 à 30 heures, des cellules d'une souche de Proteus ou Pseudomonas produisant de la L-arginase9 à me température d'environ 20° à 40°C et à un. pH d'snvir-oii 5 à 9» On sépare ensuite les cellules du milieu et on isole la L-arginase des 10 cellules. Les bactéries utilisables suivant l'invention comprennent toute souche produisant de la L-arginase appartenant aux espèces Proteus et Pseudomonas. Toutefois, on préfère selles appartenant aux espèces Proteus vulgaris et Pseudomonas cruciviae. Des 15 souches avantageuses sont le Proteus valgaris de référencé "ATCC n° 19181" et le Pseudomonas cruciviae de référence "ATCC 21283".Ces souches sont déposées au laboratoire d'"American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, ÏÏ.S.A". Le milieu nutritif aqueux contient au moins une source d'azote 20 assimilable. Cette source d'azote assimilable peut être une source naturelle d'azote telle que des extraits de viande, peptones, liqueur de macération de blé, amines-ÎTZ, liqueur de macération de soja, extraits de ferment, hyd.rolysat de caséine et divers acides aminés tels que l'acide glutamique,? On peut 25 aussi utiliser des sels minéraux pour fournir de l'azote assimilable ; des sels typiques sont les sels d'ammonium et lés nitrates de sodium et de potassium. On peut ajouter au milieu nutritif diverses vitamines telles que la biotine et des substances minérales essentielles bien 30 connues en fermentation. Nombre de ces produits en trace sont déjà présents dans des additifs typiques tels que la liqueur de macération de blé, et il n'est pas alors nécessaire de les ajouter séparément. On effectue généralement la culture dans des conditions aéro-35 bies à 20-40°C pendant 6 à 30 heures et avantageusement environ 20 heures, à'un pH de 5 à 9, en agitant ou en aérant et en agitant jusqu'à l'obtention d'une croissance substantielle du microorganisme. Dans ces conditions, on peut produire 8-20 g/1 de cellules humides dans le milieu. Lorsque la culture est 40 terminée, on centrifuge le bouillon de culture ou on le filtre 70 24519 -0- 2059476 pour séparer les cellules. On rompt les parois des cellules et on détruit le protoplasme par une méthode appropriée pour obtenir une solution à activité L-arginase. Cn rompt avantageusement les parois des cellules au moyen d'un oscillateur ultra-5 sonique et de la pression. On peut purifier la L-arginase dans la solution par un procédé approprié couramment utilisé pour la purification des enzymes, par exemple précipitation par du sulfate d'ammonium, précipitation par un solvant, chromatogra-phie sur résine échangeuse d'ions ou sur adsorbants et procé-10 dés analogues. Dans les exemples ci-dessous, l'activité de la L-arginase est exprimée en U.I (unités internationales). Une activité de 1 U.I /ml est l'activité d'un bouillon de culture dans lequel 1 ml de bouillon décompose 1 jmole de L-arginine en une minute. 15 L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit qui représente à titre d'exemples non limitatifs plusieurs modes de réalisation de l'invention. Exemple 1. On cultive des Proteus vulgaris (ATCC n° 19181) dans un milieu 20 liquide contenant 5 % de liqueur de macération de blé à 28°C pendant 20 heures avec aération et agitation. On l'utilise comme culture d'ensemencement. On inocule cette culture dans le rapport volumique 1/10 à un milieu (1 Kl) contenant 2 % de bouillon en poudre, 0,5 % d'extrait de levure, 0,25 % de ïTaCl, 25 0,01 % de MgSO^, 7^0, et ayant un pH de '7,2. Ce milieu est contenu dans un fermentateur. On effectue la culture à 30°C pendant 18 heures sous une aération de 200 1/mn et une agitation de 110 tours/minute pour obtenir une activité enzymatique de 0,9 U.I/ml (de bouillon de culture), On centrifuge les cellules 30 pour obtenir 18,6 kg de cellules humides» On met les cellules en suspension dans une solution tampon au phosphate (0,01 M ; pH = 8,0) et on les détruit au moyen d'un homogénéiseur "Mantongaurine". On centrifuge le résidu des cellules pour obtenir une solution brute ayant une activité L-arginase de 35 0,4- U.I/mg-protéine. On purifie la protéine enzymatique en soumettant l'extrait à un traitement par Mn** éliminant l'acide nucléique, à une précipitation fractionnée par du sulfate d'ammonium, à une chromâtographie sur cellulose DSAE, "Cephadex CM" et "Biogel", etc. On obtient ainsi de la L-arginase ayant une 70 24519 -4- - 2059476 activité de 43 U.I/mg-protéine (rendement environ 23 %). Exemple 2. On cultive des Proteus vulgaris (ATCC n° 19181) comme décrit dans 11 èxemple 1 pour obtenir une culture d'ensemencement. On 5 inocule cette culture, dans le rapport volumique 1/10, à un milieu (3 1) contenant 20 % d'acide glutamique, 0,5 % de casami-no acide, 0,23 % de NaCl, 0,03 % de EHgPO^, 0,03 % de IC^HPO^ , 0,05 % de MgSO^, 7H20, 4,7 mg/1 de MnCl2,4H20, 0,3 mg/l**de Ca Glg 30 mg/1 de ZnSO^ , 6,0 mg/1 de PeCl^ et 4,3 mg/l de Cu 10 SO^^HgO. Ce milieu est contenu dans un fermentateur en forme de jarre de 3 litres. On ajuste le pH du milieu à 7>2. On effectue la culture à 30°C pendant 12 heures sous une aération de 3 1/mn et une agitation de 450 tours/ma, pour obtenir une activité enzymatique de 0,5 U.I/ml» On centrifuge les cellules pour 15 obtenir environ 60 g de cellules humides. On met ces~ cellules en suspension dans une solution tampon au phosphate de pH 8,0 et on les traite pendant 10 minutes avec un oscillateur ultra-sonique de 10 Kc pour détruire les cellules. On centrifuge les cellules pour obtenir une solution d'extrait brut ayant une ac-20 tivité de L-arginase de 0,3 U.I/mg-protéine. On traite 1sextrait comme décrit dans l'exemple 1 pour purifier l'enzyme. On obtient la L-arginase avec une activité de 35 U»I/mg-protéine (rendement environ 20 °/o). Exemple 3« 25 On cultive des Pseudomonas cruciviae (ATCG 21283) ainsi que décrit dans l'exemple 1 pour obtenir une culture d'ensemencement® On inocule cette culture, dans un rapport volumique de 1/10, dans 100 1 d'un milieu renfermant 5 % de liqueur de macération de blé contenu dans un fermentateur de 200 1. Le pH est de 7,2. 30 On effectue la culture à 30°C pendant 15 heures sous une aération de 60 1/mn et une agitation de 150 tours/mn, pour obtenir une activité enzymatique de 0,2 U.I/ml (de bouillon de culture)® On centrifuge les cellules pour obtenir 23 kg de cellules humides. On traite ensuite ces cellules comme décrit dans 1'exem-35 pie 1 et on les purifie» On obtient de la L-arginase ayant une activité de 36 U.I/mg-protéine (rendement environ 18 °/o) a Bien entendu l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention. 70 24519 2059476 - REVi^DICATIOffS - 1.- Procédé de production, de L-arginase caractérisé en ce qu'on cultive des cellules d'une souche produisant de la L-arginase choisie dans le groupe des espèces Proteus et -Pseudomonas , dans un milieu nutritif aqueux, on sépare lesdites cel-5 Iules dudit milieu et on isole la. L-arginase desdites cellules. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la souche appartient au groupe des Proteus vulgaris ou des Pseudomonas cruciviae. 5.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce 10 que la souche est choisie dans le groupe formé par le Proteus vulgaris ATCC n° 19181 et le Pseudomonas cruciviae ATCC n° 21285. 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications-1 à 5, caractérisé en ce que le milieu nutritif renferme une source d'azote assimilable. 15 5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue la culture dans des conditions aérobies pendant environ 6 à 30 heures, à une température d'environ 20 à 40°G et à un pH d'environ 5 à 9. 6.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 20 5, caractérisé en ce qu'on sépare le protoplasme du milieu par centrifugation. - 7.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on isole la L-arginase des cellules en détruisant le protoplasme sous l'effet d'ondes ultrasoniques 25 et/ou de la pression. 8.- L-arginase obtenue par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7.