Brevet FR2060090A1 — publié le 19710611

Cette invention concerne généralement la préparation de solutions d'homopolymères polynucléotides. Plus précisément, elle concerne un procédé amélioré pour préparer des solutions concentrées de complexes d'acides polyinosinique et polycytidilique, 5 connus sous les noms de poly I et poly C respectivement, et également des solutions poly I:C. Ensemble sous la forme poly I:C il» forment un complexe synthétique à deux filaments, qui est utile comme agent induisant un interféron. On prépare couramment les solutions de poly I:C en mélan-10 géant ensemble des solutions de poly I et de poly C, en présence d'une solution saline, par exemple de CaCl2 0,1 M, à un pH d'environ 7, à la température ambiante ou en chauffant légèrement. Lorsqu'on mélange ensemble une solution de poly I et une solution de poly C ayant des concentrations supérieures à 0,1 pour cent 15 pds/v il se forme un gel granuleux, translucide, épais. Ledit gel possède des caractéristiques d'écoulement extrêmement mauvaises. Si on le laisse reposer à la température ambiante pendant environ une à deux semaines, ce gel se clarifie finalement en un liquide très visqueux. Le poly I:C préparé de cette manière n'est 20 pas stérile et doit être ensuite stérilisé s* il est destiné à un usage parentéral. Le gel a également facilement tendance à être contaminé par des microorganismes pendant l'opération de cuisson précitée. En outre, la viscosité élevée des solutions de poly I:C dont les concentrations sont supérieures à 0,1 pour cent en pds/v 25 peut exclure l'administration parentérale et en aérosol en raison des mauvaises caractéristiques d'écoulement précitées. On décrit désormais un procédé amélioré pour la préparation de solutions aqueuses, stériles, concentrées d'acides polyinosini-que :polycytidilique, qui consiste à dissoudre chacun desdits 30 polymères séparément dans une solution saline tamponnée, à corabiner lesdites solutions séparées pour former des complexes troubles, gélatineux, et à chauffer lesdits complexes jusqu'à ce que des solutions stériles, s'écoulant bien, limpides soient formées. Les propriétés physiques de ces solutions les rendent plus appropriées 35 à l'administration médicamenteuse par injection ou aérosol avec des propriétés d'activité biologique et de toxicité restant essentiellement inchangées. On peut réaliser le procédé amélioré de cette présente invention qui permet la préparation de solutions concentrées de poly I:C de 40 concentration allant jusqu'à 3 pour cent en pds/v, en passant par 70 26827 2 2060090 les stades suivants : (a) On disperse l'acide polyinosinique dans de l'eau purifiée, de préférence distillée dans du verre, à environ deux fois la concentration désirée dans la solution d'acide polyinosinique 5 finale et on le chauffe à une température d * environ 50 à environ 60° C jusqu'à ce que la dissolution soit complète. Le temps nécessaire à la dissolution est d'environ 10 à environ 30 minutes selon la concentration désirée pour la solution d'acide polyinosinique. On ajoute alors à cette solution approximativement un 10 volume égal de mélange aqueux sel-tampon, par exemple solution 0,2 M en NaCl - 0,02 M en phosphate tampon, pour tamponner la solution à environ pH 6,5-7,5, le pH préféré étant d'environ 7,0. (b) On disperse l'acide polycytidilique à la concentration voulue et on le dissout dans une solution aqueuse sel-tampon, par 15 exemple une solution 0,1 M en NaCl - 0,01 M en phosphate tampon, pour tamponner la solution à pH 6,5-7,5, le pH préféré étant d'environ 7,0. (c) On mélange des volumes égaux de solutions d'acide polyinosinique et d'acide polycytidilique de concentrations égales,à la 20 température ambiante,et on les agite jusqu'à ce qu'elles soient homogènes. Il en résulte un gel poly IsC translucide épais. (d) On chauffe ensuite le gel précité pendant environ 10 à environ 20 minutes à une température d'environ 115 à environ 135° C. Toutefois, les conditions préférées sont de 15 minutes à 125° C. 25 Pour ce stade on peut utiliser un autoclave à vapeur ou un autre container hermétique pour s'assurer la stérilité et être sûr que le liquide ne bout pas. On laisse refroidir la solution lentement. La solution résultante est limpide, à écoulement libre, elle est stérile et sa vis- 30 cosité est abaissée. On n'a pas encore totalement compris les mécanismes mis en jeu dans le nouveau procédé. Cependant, il a été démontré que l'on peut préparer des solutions poly IsC de cette manière en raison du fait que la rupture thermique de la double hélice, formée par le poly I avec le poly C est réversible. 35 Le .chlorure de sodium présent dans la solution a une influence sur la pente des filaments de poly I et poly C et assure la formation, d'une double hélice. A côté d'un tampon de phosphate on peut utiliser d'autres systèmes tampon pour obtenir le pH désiré, par exemple un tampon 40 de tris-hydroxyméthyl aminométhane 0,01 M à 0,05 M. Le choix du 70 26827 3 2060090 tampon n'est pas essentiel pour la présente invention et est connu de l'homme de l'art. Ces solutions sont utiles dans la stimulation d'un interfé-ron et peuvent être administrées sous forme de brouillards 5 aérosols ou en injections intraveineuses. Ce procédé commode rapide pour formuler des solutions aqueuses stériles de poly I:C a facilité la formulation du complexe polymère en aérosol pour l'administration par inhalation à l'homme. Le poly lie ainsi formulé est facilement distribué par de simples 10 atomiseurs sous 4,7 atmosphères sous forme d'aérosol où la taille des gouttelettes est de 5-15/V , qui peuvent facilement atteindre les passages profonds des voies respiratoires supérieures et inférieures.On a montré que la mise sous forme d'aérosol n'a pas d'effet sur le pouvoir du poly IsC à induire un interféron. 15 Les Exemples suivants sont donnés à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme des limites de cette invention, pour lesquelles de nombreuses variations sont possibles dans le champ et l'esprit de l'invention. EXEMPLE I 20 Préparation de Poly I;C 10 mg/ml On disperse un gramme de poly I dans approximativement 50 ml d'eau distillée dans du verre et on chauffe à 60° C jusqu'à dissolution. On ajoute alors une solution de tampon de NaCl 0,2 M-phosphate 0,02 M pour amener le volume à 100 ml, obtenant 25 une concentration en poly I de 10 mg/ml et un pH d'environ 7,0. On disperse un gramme de poly C et on le dissout dans assez de tampon de NaCl 0,1 M-phosphate 0,1 M pour amener le volume à 100 ml. La concentration en poly C est de 10 mg/ml et le pH de la solution d'approximativement 7,0. 30 On mélange des volumes égaux, soit de chacun 100 ml, de la solution de poly X et de la solution de poly C, à la température ambiante et on agite jusqu'à homogénéité ; il en résulte un gel translucide épais. On met ensuite le gel mentionné ci-dessus dans une bombe de 35 verre hermétique et on chauffe à 125° C pendant 15 minutes et on laisse refroidir à la température ambiante. La solution poly I C résultante contenant 5 mg/ml de poly I et 5 mg/ml de poly C, est limpide ou n'est que légèrement opalescente, elle s'écoule librement et présente une viscosité fortement réduite comparative-40 ment à la substance non traitée. 70 26827 4 2060090 EXEMPLE II On prépare également des solutions contenant du poly I:C, 15 mg/ml de poly I et 15 mg/ml de poly C par le mode opératoire tel qu'il est esquissé dans l'Exemple I. 5 EXEMPLE III Le Tableau suivant contient des indications comparatives pour les produits du procédé de la technique antérieure et du nouveau procédé. 70 26827 5 2060090 Aspect général POLY I:C 10 mg/ml Procédé de la technique antérieure gel granuleux troublé, en particules Nouveau procédé liquide dispersant légèrement la lumière 10 Débits relatifs (a) 1590 sec. 353 sec. Dispersion de la lumière (E400 m/Lt ) 0,184 0,074 15 Passage de la seringue, pas d*écoule- calibre minimal de l'aiguille ment, 18 25 Taille des particules non "aérosolable" 5-15yf d'aérosol (distributeur à 20 à 4,7 atm) DL50 (aiguë, IP, souris) 75 mg/kg 75 mg/kg Dose efficace minimale 1 mg/kg 5Ç pour un interféron (souris) 1 mg/kg Tempa d ' ôcoulesaertt dw -tampon 30 (a) Temps d'écoulement de la sclution à 1% Ecoulement mesuré sur * 85 mm dans un tube de matière plastique de diamètre intérieur de 2,5 mm; pression de 180 mm. Les indications précédentes font clairement remarquer que les propriétés physiques sont exaltées dans le nouveau procédé par 35 rapport au procédé de la technique antérieure. Elles montrent également que l'activité biologique et la toxicité demeurent inchangées. • • ■ /. . • 70 26827 2060090 REVENDICATIONS 1. Un procédé amélioré pour la préparation d'une solution aqueuse concentrée, stérile, d'acidespolyinosinique:polycytidilique, caractérisé en ce que l'on dissout chacun desdits polymères sépa- 5 rément dans une solution sel-tampon à environ pH 6,5 à 7,5, l'on combine lesdites solutions séparées pour former un complexe gélatineux, trouble et l'on chauffe ledit complexe jusqu'à ce qu'une solution limpide, s*écoulant librement soit formée. 2. Un procédé selon la revendication 1, pour préparer une 10 solution aqueuse, stérile, de complexe acid66 polyinosinique: polycytidilique ayant une concentration totale d'environ 0,5 à 3 pour cent en pds/v dudit complexe, ledit procédé étant caractérisé par les stades consistant ; (a) à disperser l'acide polyinosinique dans l'eau et à chauffer 15 ladite dispersion à une température d'environ 50 à 60° C jusqu'à ce que la dissolution soit complète et à ajouter approximativement un volume égal de solution sel-tampon à environ pH 6,5 à 7,5; (b) à dissoudre l'acide polycytidilique dans la solution sel-tampon à environ pH 6,5 à 7,5 jusqu'à ce que la concentration soit 20 sensiblement la même que celle desdites solutions d'acide polyinosinique; (c) à mélanger des volumes égaux desdites solutions d'acide polyinosinique et d'acide polycytidilique et à agiter jusqu'à ce qu'il se forme un gel homogène; et 25 (d) à chauffer ledit gel pendant environ 10 à 20 minutes à environ 115 à 135° C.