Brevet FR2104751A1 — publié le 19720421

( i 2104751 On sait depuis plusieurs années que le venin de la vipère de Malaisie (Ancistrodon Rhodostoma) contient un composant utile comme anticoagulant. Plus récemment, on a découvert que ce oomposé se comporte en pratique comme un coagulant du sang. Le 5 constituant, analogue à la thrombine, visé par l'invention forme un polymère non réticulé de fibrine qui est facilement éliminé par le tissu rétiouloendothélial et/ou le système fibrinolytique de l'organisme, ce qui diminue ou épuise le fibrinogènesanguin. Ce constituant a donc un effet anticoagulant. 10 Malheureusement, le procédé de purification connu dans la technique antérieure laisse beaucoup à désirer. Le meilleur procédé connu à ce jour comporte une technique chromatographique en deux stades, nécessitant deux colonnes ayant un garnissage différent et deux solutions tamponnées différemment avec, dans 15 les deux stades, des salvants d'extraction ayant des propriétés différentes. Le substrat le plus couramment utilisé dans le premier stade de ce procédé chromatographique est la triéthylaminoéthylcel-lulose qui, malheureusement, ne donne pas des résultats fidèles et facilement reproductibles. Surtout, la solution de venin ainsi 20 purifiée contient encore la totalité du facteur hémorragique qui est le composant le plus dangereux du venin de vipère. Dans tous les cas, la solution de venin ainsi fractionnée doit subir une purification complémentaire selon un procédé semblable, en utilisant une solution tamponnée différemment de la fraction active 25 de la première séparation et un substrat de colonne différent. La présente invention concerne un procédé simplifié de préparation du constituant, analogue à la thrombine, pur du venin d'Ancistrodon Rhodostoma, un procédé de fractionnement de ce venin, ainsi qu'un procédé simple d'isolement de la fraction ayant une 30 activité analogue à celle de la thrombine de ce venin purifié. Selon l'invention, on place une solution aqueuse diluée limpide de venin brut d'Ancistrodon Rhodostoma tamponnée à pH 7,0 - 0,5 et du chlorure de sodium, afin que la teneur totale en sel soit comprise entre 0,15 et 0,5 mole, dans une colonne conte-35 nant un tamis moléculaire, on élue ladite colonne avec une solution aqueuse contenant les mêmes nature et quantité de tampon et de sel que la solution de venin par petites fractions et on réunit les fractions contenant le constituant analogue à la thrombine. Dans un 71 19348 2 2104751 mode de réalisation préférentiel, on réunit les fractions contenant le constituant se comportant comme la thrombine allant de la première fraction contenant ledit constituant à la fraction contenant la quantité maximate de constituant actif et on réunit les fractions 5 suivantes contenant ledit coagulant actif. On peut soumettre la seconde récolte à une nouvelle chromâtographie après concentration dans un stade séparé pour augmenter le rendement global du nouveau procédé d'isolement, ou on peut combiner la seconde récolte avec une fraction neuve de matière brute à traiter selon le procédé de l'invention. Dans la présente description, on entend par venin "brut" le venin n'ayant pas été préalablement traité, soit par c'. ïon!atogra(Dhiet Vnt par d'autres .techniques chimiques. Par conséquent, il contient les autres protéines précédemment dénommées dans la technique fraction I-VIII contenant le facteur hémorragique et les fractions V et VII, c'est-à-dire celles ayant des caractéristiques physicochimiques semblables à celles du facteur coagulant qu'on isole selon l'invention. Le procédé de l'invention élimine complètement du venin brut ces 20 fractions et composants indésirables et il n'est pas nécessaire de procéder à un traitement préalable par échange d'ions. D'autre part, l'exprôssion "venin brut" telle que définie ci-dessus, ne signifie pas que le venin ne doit pratiquement pas avoir été manipulé avant le stade de fractionnement : on peut le centrifuger 25 pour éliminer tes sédiments, le lyophiliser pour améliorer sa stabilité et bien sûr il est nécessaire de le dissoudre pour réaliser la solution aqueuse diluée limpide utilisée. La solution aqueuse du venin brut peut oontenir entre 5 et 20# en poids de venin dans la solution tampon décrite. En ■jo pratique la solution est constituée d'environ 10# en poids de venin dans de l'eau, ayant une molarité saline totale de 0,15 - 0,5, la concentration molaire étant obtenue par 0 à 100# de chlorure de sodium et 100# à 0# du tampon nécessaire pour que le pH de la solution soit de 7,0 - 0,5. On utilise la même solution de tampon et ^ de chlorure de sodium avec la même concentration de chaque composant comme liquide de fractionnement, sans qu'elle contienne bien sûr de venin. 71 19348 ( 3 2104751 Comme précédemment indiqué, la solution de venin doit avoir une certaine concentration saline totale. Cettç concentration peut être obtenue partiellement par le tampon ou partiellement par le chlorure de sodium. On peut utiliser uniquement l'un 5 de ces composants mais dans un mode de réalisation préférentiel du procédé de l'invention, les deux composés sont présents, correspondant ohacun à environ 50# de la molarité souhaitée de la solution-tampon. Bien qu'on puisse utiliser de nombreux tampons pour obtenir un pH de 7,0 - 0,5, on préfère utiliser un tampon au 10 phosphate de sodium car il convient en physiologie, et il est facile à se procurer et à utiliser. On peut utiliser ce tampon seul c'est-à-dire sans utiliser de chlorure de sodium comme électrolyte additionnel et inversement, on peut utiliser le chlorure de sodium seul car il forme une solution ayant un pH compris 15 dans la gamme appropriée. Le procédé de l'invention consiste essentiellement en une filtration unique sur gel en un seul stade. On peut choisir le gel utilisé dans ce procédé parmi les matières inertes utilisées comme tamis moléculaires. Dans un mode de réalisation préférentiel, 20 la matière la plus appropriée pour le garnissage de la colonne utilisée dans le procédé de l'invention est un gel de dextranne partiellement réticulé ou un gel de polyacrylamide. On peut facilement se procurer ces matières de poids moléculaires élevés et des matières analogues sous forme pulvérisée; elles se gélifient facilement 25 lorsqu'on les place dans l'eau et ont la propriété de fractionner le mélange de protéines présent dans le venin de serpent. Comme il est bien connu de l'homme de l'art, on fait passer initiallement le solvant de fractionnement à travers la colonne pour éliminer le volume vide de la colonne. Ce volume 30 est caractéristique de chaque gel et ne dépend d^onc que des dimensions de la colonne. Après passage du volume vide, il y a élution des fractions contenant les protéines qu'on recueille par petites fractions et dont on détermine le pouvoir coagulant selon le prooédé décrit par Esnouf et Tunnah dans Brit. J.Haemat., 35 vol. 13, page 581 (1967). On réunit les fractions ayant un pouvoir coagulant les isolant ainsi des autres matières protéiniques qui sont présentes dans le venin brut. Dans un mode de réalisation préi- 71 19348 4 2104751 férentiel, on détermine quantitativement le pouvoir coagulant du constituant analogue à la thrombine et on ne réunit que les fractions allant de la première fraction ayant ce pouvoir à la fraction ayant le pouvoir coagulant maximal. Cet ensemble a environ 60# du pouvoir total initial et une pureté remarquable; le second ensemble contient 25# du constituant, analogue à la thrombine, présent au départ dans le venin. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'un exemple de réalisation. EXEMPLE a)On prépare une solution à 10# en dissolvant 500 mg de venin brut solide d'Ancistrodon Rhodostoma dans une solution tampon aqueuse contenant 0,1 M de phosphate de sodium à pH 6,8, 0,1 M de chlorure de sodium et 0,1# de chlorobutanol. On clarifie cette solution par centrifugation à 7000 tr/mn pendant 20 mn dans un oentrifugeur réfrigéré et on élimine le sédiment. b) On garnit une colonne de chromatographie en verre de 3»4 cm de diamètre sur une hauteur de 112 cm avec une suspension d'un gel de dextranne partiellenent réticulé préparé de la façon suivante: On met en suspension 100g de pondre de gel sec { Sephadex G-100 (commercialisé par Pharmacian, Ltd.) dans 5 litres d'une solution tampon obtenue en dissolvant 8,2g". de phosphate disodique, 5>8g de phosphate de sodium monohydraté, 5*85g de chlorure de sodium et 1,0g de chlorobutanol par litre d'eau distillée apyrogène. On laisse reposer la suspension pendant une nuit. On élimine le surnageant et on lave le gel avec le même tampon phosphaté 0,1 M à pH 6,8 jusqu'à ce qu'il soit débarrassé des pyrogènes. On garnit alors la colonne avec le gel, on lave à nouveau avec la même solution tampon jusqu'à ce que l'éluat et l'éluant aient des pH et des conductivités identiques. c )0n introduit la scQubion ds a ) ci-dessus en haut de la colonne de gel. On élue la colonne par du tampon au phosphate 0,1 M à pH 6,8 contenant du chlorure de sodium 0,1 M et 0,1 # de chlorobutanol. On recueille l'éluat par fractions de 5 ml et on détermine l'absorption de chaque fraction à 280 nyu, en utilisant le tampon phosphaté comme blanc. Le volume d'exclusion, 71 19348 2104751 5 ( indiqué par un pio d'absorption correspond au tiers environ du volume total de la colonne et est suivi par le- premier pic principal contenant le composant actif. On réunit les fraotions individuelles contenant le composant actif et on soumet la 5 solution à une filtration stérile sur une membrane millipore de 0,22 yU. On prélève des échantillons pour les essais de oontrôle tels que l'activité, les pyrogènes, la stérilité globale, la toxioité, le pouvoir hémorragique, la composition de l'excipient et 1'identification. On constate qu'à partir de la 10 première fraction ayant le pouvoir coagulant, ce pouvoir augmente progressivement puis diminue dans les fractions suivantes. Les fractions correspondant à l'augmentation du constituant actif contiennent 60# de l'activité initiale tandis que les fractions suivant le maximum contiennent environ 25# du constituant,analo-15 que à la thrombine, présent au départ. Les deux ensembles des fractions recueillies sont étudiés séparément. On compare le premier ensemble de fractions contenant le constituant analogue à la thrombine à un échantillon pur précédemment indentifié du constituant analogue à la thrombine isolé 20 du venin d'Ancistrodon Rhodostoma obtenu selon les procédés précédemment connus et on constate leur identité dans le procédé d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide utilisant des gels à 7.0# à pH 8,9 décrits .par Ornstein dans Armais of N.Y. Acad. of Sciences, volume 121, page 321 (1964); des Rf volumiques iden-25 tiques selon le procédé de diffusion en gel d'Ouchterlony décrit dans Arkiv Kemi. Minerai. Geol. 2ôB, 1 ( 1948 ^une seule ligne immunolo-gique pour les deux échantillons sans qu'il y ait formation d'arCj ce qui correspond à une identité immunologique; et en utilisant un ultracentrifugeur muni d'un analyseur optique on constate que les 30 coefficients de sédimentation sont identiques, ce qui correspond au même poids moléculaire. Cependant, on constate que le pouvoir spécifique de l'échantillon obtenu selon le procédé de l'invention est légèrement inférieur mais on obtient un rendement supérieur. Le temps de thrombine montre qu'il n'y a aucune différence dans 35 le pouvoir coagulant des deux échantillons et le facteur hémorragique est totalement absent. 71 19348 2104751 6 Lorsque dans l'exemple oi-dessus on remplace le gel de dextranne par du Bio-Gel, qui est un gel de polyacrylamide commercialisé par Bio-Rad (Richmond Californie ), on obtient le même rendement en constituant analogue à la thrombine ayant la 5 même pureté. _ On voit que le procédé de l'invention simplifie considérablement le mode d'isolement de la composSfcion coagulante active du venin de serpent. En particulier, on voit qu'une seule chroma-tographie suffit pour obtenir un produit pur qu'on ne pouvait ob-10 tenir jusqu'alors que par un procédé en deux stades, qu'on obtient un constituant ayant une activité, un poids moléculaire , un pouvoir anticoagulant identiques et concordant dans tous les procédés d'identifications physiques et chimiques. Il est particulièrement remarquable et surprenant qu'une simple chromâtographie permette 15 d'obtenir un constituant, analogue à la thrombine, purifié, et d'activité élevée, directement utilisable à partir de venin de serpent non traité. La fraction coagulante isolée obtenue selon le procédé de l'invention ne contient pas de facteur hémorragique et on peut 20 la mettre en oeuvre de façon habituelle pour préparer un produit injectable; la solution obtenue peut être trop concentrée et nécessiter une dilution par une solution saline ou l'eau. Une concentration convenant à l'injection contient entre 50 et 200 unités de constituant analogue à la thrombine par ml de solution alors que. 25 le procédé de l'invention peut conduire à des concentrations de 500 unités/ml et plus. En raison de l'étonnante efficacité du procédé de purification et d'isolement de l'invention et du fait de l'absence des facteurs hémorragiques et des autres fractions indésirables, 30 la solution obtenue se prête à la purification finale ^>rès réglage de la concentration. Bien entendu, le tampon et les solutions salines ajoutés à la solution de venin doivent être apyrétiques et on utilisera comme tampon des sels non toxiques. Pour cette raison, on utilise comme tampon des sels convenant en physiologie en 35 quantités donnant une concentration utile en physiologie correspondant par exemple à une solution isotonique. Si on le désire, on peut ajouter initialement à la solution de venin un conservateur ou 71 19348 7 2104751 l'ajouter ensuite à la fraction coagulante isolée purifiée si on désire la stocker ou prolonger sa longévité. De nombreux conservateurs conviennent à cet effet, par exemple l'alcool benzylique, le p-hydroxybenzoate de méthyle et/ou de propyle, le chlorobutanol et similaires. Généralement, 0,05 à. 1,0# d'un tel conservateur suffit pour assurer une conservation normale. Comme précédemment indiqué, le pH de la solution de venin convenant à l'isolement de la fraction coagulante est tamponné à 7,0 - 0,5- On peut admettre de petits écarts mais un pH inférieur à environ 6,0 ou supérieur à 8,0 nuirait à la stabilité des protéines du venin. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédé qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif sans sortir du cadre de l'invention. 71 19348 8 2104751 REVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement du constituant analogue à la thrombine du venin d'Ancistrodon Rhodostoma caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à placer une solution aqueuse diluée limpide de venin brut tamponnée à un pH de 7,0 - 0,5 et ayant une 5 molarité totale en sels minéraux comprise entre 0,15 0,5# dans une colonne garnie d'un tamis moléculaire, à éluer ladite colonne avec une solution aqueuse contenant les mêmes sels à la même concen' tration que la solution de venin par petites fractions et à rassembler les fractions ayant une activité analogue à celle de la 10 thrombine. 2» Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit tamis moléculaire est un gel de dextranne partiellement réticulé. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 15 que ladite molarité de la solution aqueuse de venin est obtenue entre 0 et 100# avec du chlorure de sodium et entre 100 et 0# avec du tampon au phosphate de sodium. 4. Procédé selon la revendication 3» caractérisé en ce qu'on utilise ledit chlorure de sodium et ledit phosphate de sodium 20 en proportions environ équimoléculaires. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on remplace lesdites petites fractions comprises entre la première fraction possédant ladite activité analogue à celle de la thrombine et la fraction ayant l'activité maximale et qu'on 25 rassemble séparément les fractions venant après ces premières fractions rassemblées jusqu'à la fraction n'ayant qu'une faible activité analogue à la thrombine.