Brevet FR2077297A1 — publié le 19711022

L'invention concerne des combinaisons chimiques entre des substances biologiq.uem.ent actives et des polymères époxydés. Les protéines, les nucléines et leurs produits d'hydrolyse, les aminoacides, peptides et nucléotides ainsi qu'un 5 grand nombre d'autres substances présentes dans les cellules vivantes, dans les humeurs ou dans des sucs végétaux peuvent être classés comme électrolytes amphotères contenant à la fois des groupes fonctionnels basiques et acides. Dans ces substances biologiquement actives rentrent les enzymes, les hormones 10 et d'autres régulateurs biologiques et métabolites. Dans les cellules vivantes, les enzymes catalysent la dépolymérisation de macromolécules biologiques, l'hydrolyse d'esters et d'amides, les oxydations et réductions biochimiques, l'hydratation et la déshydratation du composé, etc.. Dans cer-15 tains cas, on ne peut réaliser ces réactions qu'avec une grande difficulté, ou le plus souvent pas du tout, par les méthodes courantes de chimie organique. Il est donc très important de pouvoir aussi utiliser rationnellement les propriétés des enzymes. 20 Les enzymes sont très coûteux et instables. Il est donc très utile de pouvoir lier l'enzyme à un polymère support insoluble de façon que l'on puisse facilement la récupérer. Il serait ainsi possible d'utiliser le polymère-enzyme ainsi insolubilisé et granulé dans des couches de réacteur. 25 Les enzymes et autres protéines combinées à une subs tance polymère chimiquement résistante, mais pouvant gonfler dans l'eau, peuvent aussi servir à adsorber spécifiquement des substances qui forment des complexes réversibles avec la protéine combinée. Bien entendu, ce principe peut servir aussi pour 30 d'autres systèmes, par exemple des peptides, des acides nucléiques et d'autres substances ayant la propriété de former des complexes réversibles. En faisant varier le poids moléculaire, le degré de réticulation, etc. du polymère, on peut obtenir différents degrés de dureté, de possibilités de gonflage, etc. 35 convenant à des usages différents. On obtient ainsi des distances variables entre les groupes actifs. Toutefois, on peut aller jusqu'au cas limite extrême et combiner les enzymes'ou d'autres substances biologiquement actives à des polymères solubles et avoir ainsi la possibilité de conduire des réactions discon- t \ i 71 02188 2 2077297 tinues ou continues avec différents parcours de circulation. Par exemple, la solution de polymère peut circuler de façon continue entre les étages d'adsorption et d'élution d'un dialy-seur à plusieurs cellules. 5 II est important que la substance biologiquement inté ressante, par exemple l'enzyme, soit ancrée au polymère dans des conditions aussi modérées que possible et de façon que l'activité primitive soit conservée au maximum ou éventuellement améliorée. Etant donné que les substances considérées sont très 10 dissemblables par leur stabilité et leur réactivité, il est nécessaire de posséder et de pouvoir choisir plusieurs méthodes différentes de combinaison. On pourra choisir la méthode de combinaison la plus avantageuse et la plus appropriée au but pour chaque substance active particulière. 15 L'invention est relative à un procédé de combinaison chimique entre des substances biologiquement actives, spécialement celles qui contiennent des groupes aminé, imine, amide, imide et carboxyle et un polymère époxydé. La réaction de combinaison chimique s'effectue dans un milieu où. la substance bio-20 logiquement active ne perd pas ses propriétés caractéristiques, par exemple l'activité enzymatique, la propriété de combiner ou d'inhiber spécifiquement d'autres substances. On conduit de préférence la réaction dans une solution aqueuse tamponnée. Dans ce contexte, l'expression "substances biologiquement actives" 25 comprend les aminoacides, nucléotides, enzymes, inhibiteurs et activeurs d'enzyme, hormones, supports physiologiques d'enzymes • et d'hormones, antigènes, anticorps et autres protéines plasma-tiques, substances.de groupe sanguin, antibiotiques et dérivés biologiquement actifs de toutes ces substances. 30 On peut préparer le polymère époxydé en traitant un polymère hydroxylé par des ép oxyde s non ionogènes (oxiranes) contenant au moins deux groupes fortement réactifs dans le polymère. On peut alors transférer le produit chimiquement réactif dans un milieu convenant à une nouvelle réaction sur les 35 substances biologiquement actives. Le déroulement de la réaction pour un hydrate de carbone comme l'agarose, la cellulose, etc. et 1'épichlorhydrine et un composé aminé en milieu alcalin peut être représenté par la formule : R0H + 01-CHo-CH-CHo > R-0-CHo-CH-CHo + HCl N/2 ' 2\/2 71 02188 3 2077297 dans laquelle R représente un hydrate de carbone, par exemple la cellulose, l'agarose, le textrane, etc.. On peut aussi préparer le polymère époxydé en faisant réagir un polymère à groupe amide, par exemple une polyacrylami-5 de ou une polyacrylamide réticulée ou un dérivé de celle-ci sur un époxyde bifonctioimel, par exemple un bis-époxyde. Si le polymère activé est un gel granulé insoluble, on le lave, de préférence sur un filtre. De façon correspondante, on débarrasse par dialyse un polymère soluble d'un excès 10 d'épichlorhydrine. Pour combiner chimiquement la substance biologiquement active, on conduit dans un milieu tampon approprié la réaction : r-o-ch2-oh-œ[2 + h2hb ^ r-o-ch2-ch-ch2-hh-b 15 N0 OH dans laquelle B représente la substance biologiquement active, protéine, etc.. Par contre, quand on effectue la combinaison avec le groupe carboxyle, le déroulement de la réaction de combinaison 20 est le suivant : R-0—CHg-CH-CHg + B-COOH ^ R-O-CHg-CH-CHg-OCO B OH et avec un diépoxyde à longue chaîne et une aminé, le produit 25 finalement obtenu est : R-0-CHo-CH- 0H-CHo-ÏÏH B OH OH Pour une polyamide, le déroulement de la réaction dans 30 la combinaison d'une aminé soluble est le suivant : r-conh2+x-ch2-ch-ch2 — > r-co-m-ch2-ch2-ch-ch2 \> oy 35 R-C0-EH-CH2-CH-CH2 + HgKB > R-CO-M-OHg-CH-^M B V Ôh X étant, pair exemple, un halogène ou un groupe oxirane et R représentant le polymère. Ici, on combine la substance biologiquement intéressante 71 02188 4 2077297 B au polymère S par un long chaînon flexible hydrophile qui n'empêche pas la substance biologiquement importante d'exercer ses réactions normales sur les autres substances biologiquement importantes, par exemple la liaison de l'enzyme si B est un irihi- 5 biteur et si l'enzyme constitue avec B un complexe moléculaire en solution libre. Dans le cas où. B est une enzyme, il est plus probable que même à l'état combiné, elle conservera son fort effet catalytique quand le segment de liaison est long et a des caractéristiques hydrophiles. 10 On peut aussi préparer le polymère époxydé à partir d'un polymère contenant des groupes hydroxyle en position 1, 2, par exemple en passant par l'ester de tosyle et en traitant ensuite par le méthylate de sodium. 15 20 S02 °H H r ! I ^Ci? chlorure de tosyle —;0 H .Ce: ■ C— 0 ^ ^ ^-o- c^ & 0H 0H * NaOCHj ^ C _ ? ? „ G=r C 0 après quoi la combinaison a lieu 25 R t TT TT NH TT j J 0^ HgER ~c i , C C ^ C C i t H 0H 30 ou H H i I 0 - 0 35 0 +H00C-R ^ T i „ 0*£=- On peut aussi par exemple oxyder un éther alcoylique insaturé. 71 02186 5 2077297 H H H H =rn à - h Cs== peroxyde ou peracide A A G — , organique Y Y *- 0 OH- OH 1 i i d » 0 5 CH CH^U tl CH2 après quoi la combinaison s'effectue comme ci-dessus. Pour mieux clarifier l'invention et la rendre plus fa-10 cile à comprendre, on citera maintenant plusieurs exemples et applications. Exemple 1 Activation du sépharose 6B par 1 ' épichlorhydrine On lave du sépharo se 6B sur un filtre de verre avec 15 de l'eau distillée. On transfère alors le gel extrait dans un ballon à fond rond et on ajoute NaOH 1n ainsi que 11 épichlorhy-drine. Une fois que la réaction d'activation a eu lieu sous agitation extrêmement vigoureuse pendant 1 heure à 60°C, on élimine l'excès d'épichlorhydrine au moyen d'eau distillée jusqu'à un 20 pH neutre. On peut conserver le gel activé dans ce milieu à 5°C. Exemple 2 Comhinajnon d'un inhibiteur de trypsine de so.ia (STI) avec le aépharose 6B activé selon l'invention On fait réagir du sépharose 6B activé tamponné par 25 le bicarbonate pH 9»5 sur un inhibiteur de trypsine de soja (2PI) dissous dans le même tampon. La combinaison se fait à la température ambiante sous agitation modérée et avec un temps de réaction de 20 heures. On lave soigneusement le produit obtenu avec un tampon de combinaison, un tampon acétate pH 3»û contenant 30 NaCl 1M et finalement avec un tampon TRIS pH 7,9. Exemple 3 Combinaison de la trypsine avec le sépharose 6B activé selon 1'invention On fait réagir de la trypsine dissoute dans un tampon 35 bicarbonate pH 9,0 sur du sépharose 6B. La combinaison et le lavage du produit obtenu se font comme dans l'exemple 2. Exemple 4 Purification de la trypsine On pompe une solution de trypsine, partiellement pu 71 02188 6 2077297 rifiée, à travers une couche en colonne formée d'agarose comme inhibiteur (STI combiné au sépharose 6B). On lave alors la colonne avec un tampon faiblement alcalin jusqu'à ce qu'on n'obtienne plus de matière absorbant les rayons ultra-violets dans 5 l'éluant. En éluant la colonne au moyen d'un tampon qui a un pH acide, on obtient une pointe d'ultra-violet (pointe de désorp-tion) que l'on examine pour déterminer l'activité de trypsine. On détermine celle-ci au moyen de benzoylarginine-p-nitroanalide (BAPA) comme substrat en mesurant la variation d'extinction à 10 405 nia. L'activité spécifique de trypsine de la pointe de dé-sorption est 177# de celle de la matière première. On calcule la capacité de l'inhibiteur agarose en ce qui concerne la fixation de la trypsine; elle est d'environ 1 mg 15 de trypsine par ml de gel inhibiteur. L'expérience révèle que le STI combiné au sépharose au moyen d'époxydes selon l'invention reste actif après la combinaison, c1 est-à-dire que le gel inhibiteur est oapable de former un complexe avec la trypsine active et on peut alors décom-20 poser le complexe pour obtenir l'enzyme libre d'activité complète. Exemple 5 Purification de l'inhibiteur de t-rypsine de so.ia On laisse passer une solution d'inhibiteur de trypsine partiellement purifié à travers une couche en colonne formée 25 de trypsine combinée à du sépharose 6B. Une fois que le gel a . été lavé, on élue l'inhibiteur combiné au moyen d'un tampon ayant un pH acide. On examine alors la pointe de désorption obtenue pour déterminer l'inhibiteur de trypsine, ce que l'on fait en faisant incuber une solution d'essai et de la trypsine et en 30 déterminant ensuite l'activité de trypsine obtenue de la même façon que dans l'exemple 4* On trouve que la pointe de désorption obtenue a une grande activité d'inhibiteur de trypsine. On calcule que la capacité du gel de trypsine est de 1 mg de STI par 3 ml de gel 35 de trypsine. On démontre aussi que la trypsine combinée selon l'invention conserve son activité de formation d'un complexe avec ion inhibiteur actif de trypsine à l'huile de soja. L'inhibiteur de trypsine libre obtenu après la décomposition du complexe 71 02188 7 2077297 enzyme-inhibiteur présente une forte activité. Exemple 6 I. Activation de la cellulose. II. Combinaison d'un inhibiteur avec la cellulose activée. III. Adsorption de trypsine sur 5 l'inhibiteur cellulose I. On traite un ester tosylique de cellulose par le méthylate de sodium (Mo de Na dans le méthanol) à environ -20°C (mélange de glace et de sel ordinaire) pendant 1 heure 30 minutes. On lave le produit avec du méthanol, de l'eau et un 10 tampon bicarbonate ayant un pH de 8,8. II. On fait réagir l'inhibiteur de trypsine de soja sur la cellulose pendant un jour entier à la température ambiante. On élimine l'excès d'inhibiteur par lavage avec un tampon bicarbonate ayant un pH de 8,8, un tampon acétate ayant un pH 15 de 3»0 et finalement un tampon bicarbonate ayant un pH de 7,8. III. On ajoute une préparation de trypsine à l'inhibiteur-cellulose à un pH de 7,8. Après lavage, on désorbe l'enzyme de l'adsorbant avec un tampon en milieu acide, l'enzyme obtenue a une grande activité spécifique. 20 Exemple 7 I. Activation de l'agarose (sépharose) par 11 épibromhydrine II. Combinaison d'un inhibiteur de trypsine à l'agarose activé III. Adsorption de la trypsine sur l'inhibiteur-agarose I. On met de l'agarose en suspension dans NaOH 1n 25 et on ajoute de 11 épibromhydrine en agitant à 60°C. Le temps de réaction est d'une heure. On lave le produit obtenu avec de l'eau et un tampon de combinaison. II. On fait réagir l'inhibiteur de trypsine de soja sur l'agarose activé pendant un jour entier à la température 30 ambiante à tin pH de 9,5. On élimine l'inhibiteur non combiné par lavage avec un tampon bicarbonate ayant un pH de 9»5» un "tampon acétate ayant un pH de 3» 0 et un tampon Tris ayant un pH de 7,8. III. On ajoute de la trypsine partiellement purifiée 35 (trypsine commerciale) à 1 'inhibiteur-agarose à un pH de 7*8. On élimine la protéine non adsorbée par lavage et on désorbe l'enzyme adsorbée à tin pH acide. L'enzyme désorbée contient une activité spécifique de trypsine correspondant/environ 2 fois l'activité de la source. ;i 02Î88 2077297 On peut récupérer 1 ml d5inhibiteur-agarose ayant ad-sorbe 1 mg de trypsine que l'on peut récupérer et qui garde son activité. Exemple 8 5 la Activation de la polyacrylamide réticulée au moyen de hi-époxy-de II. Combinaison de l'Inhibiteur, de trypsine au gel activé XXIq Adsorption de la trypsine sur le gel inhibiteur I. On laisse réagir, pendant 20 heures à la tempéra-10 ture ambiante, de la polyacrylamide réticulée équilibrée avec un tampon bicarbonate à un pH de 9»5 sur un bis-époxyde, en agitant dans un récipient fermé. On lave le produit à l'eau et avec un tampon de combinaison ayant un pH de 9» 5» II. On fait réagir l'inhibiteur de trypsine de soja 15 sur le gel activé à un pH de 9,5 pendant un jour entier à la température ambiante. On élimine l'inhibiteur non combiné en lavant avec un tampon bicarbonate qui a un pH de 9,5, un tampon acétate qui a un pH de 3,0 et un tampon Tris qui a un pH de 7,8. III. On ajoute de la trypsine à l'inhibiteur-gel à 20 un pH de 7,8. On élimine l'enzyme non adsorbée par lavage et on désorbe 1'enzyme adsorbée à un pH acide. L'enzyme obtenue• est entièrement active. 10 ail d'inhibiteur-gel adsorbent 400 sig d'enzyme que l'on peut récupérer avec une persistance complète de l'activité. §AD ORIGINAL 71 02188 9 20/7297 REVENDICATIONS 1. Procédé de combinaison chimique entre des polymères et des électrolytes amphotères et des substances biologiquement actives comme les aminoacides, nucléotides, enzymes, 5 inhibiteurs d'enzymes et activeurs d'enzymes et d'autres substances qui forment spécifiquement des complexes avec les enzymes comme les hormones, les supports physiologiques d'hormones et d'autres substances formant spécifiquement des complexes avec les hormones, les antigènes, les anticorps et d'autres protéines 10 de plasma, les substances de groupe sanguin, les phytohémagglu-tinines, les antibiotiques et les dérivés biologiquement actifs de ces substances contenant au moins un groupe amino ou imino, y compris par exemple les groupes amido, imido, amidino, guani-dino, hydroxylamino et hydrazino, les dérivés hydroxylés ou car-15 boxylés et dérivés biologiquement actifs de ces substances, caractérisé en ce qu'on introduit d'abord des groupes époxyde dans un polymère hydrophile, puis on effectue la combinaison dans un milieu où la substance biologiquement active conserve totalement ou partiellement son activité. 20 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met un polymère contenant un ou plusieurs groupes hydrozyle, carboxyle, amino, imino, y compris par exemple les groupes amido, imido, amidino, guanidino, hydr^xylamina^et^hydrazino en contact avec -une épihalogénhydrine ou un ^is-^^po~xy^.e,/ 25 ou un polyépoxyde supérieur et on laisse réagir de manière à introduire des groupes époxyde dans le polymère, après quoi on élimine du polymère époxydé 1'époxyde à faible poids moléculaire inaltéré et on effectue la combinaison en mettant le polymère en contact avec la substance biologiquement active. 30 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 1'épihalogénhydrine est 1'épichlorhydrine. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 1'épihalogénhydrine est 1'épibromhydrine. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé 35 en ce que le bis-époxyde répond à la composition CH0 CH - X - CH CH0 xo' dans laquelle X représente /"-0-(CHg)uj-Tp-O ou ™-e chaîne hydro 71 02188 50 2077297 « carbure, par exemple (Cil2)n, a -valant de préférence de 0 à 5» m de 2 à 4 et £ de 1 à-3» 6, Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit les groupes oxirane dans un polymère con- 5 tenant des groupes hydroxyle adjacents, en passant par des esters de tosyle et en traitant ensuite par un alcoolate alcalin. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit les groupes oxirane par oxydation de doubles liaisons. 10 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le polymère est insoluble. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est un ami, no acide ou dérivé de celui-ci. 15 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est un mononucléotide, un oligonucléotide, un acide nucléique ou un dérivé de ceux-ci. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 1 à 8, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est une enzyme ou un dérivé d'enzyme. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est une substance qui forme spécifiquement des complexes avec 25 les enzymes ou un dérivé d'une telle substance, de sorte qu'on obtienne un adsorbant spécifique des enzymes. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est une hormone ou un dérivé d'hormone, de sorte que 1 ' on ci)tient 30 un adsorbant spécifique des substances porteuses d'hormones ou autres substances formant spécifiquement des complexes avec les hormones. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la substance biologiquement active 35 est une substance qui forme sp s ci _ x ^. ,i emen t des complexes avec les hormones, de sorte que l'on obtient un adsorbant spécifique des hormones. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la substance biologiquement active 71 02188 n Jw'72S, est un anticorps, de sorte que l'on obtient an adscrban-• spécifique de l'antigène correspondant. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la substance biologiquement active 5 est un antigène, de sorte que l'on obtient un adsorbant spécifique de l'anticorps correspondant. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polymère hydrophile est un polysaccharide ou un dérivé de polysaccharide. 10 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le polysaccharide est l'agar-agar, particulièrement 1'agarose ou un dérivé de celui-ci. 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le polysaccharide est la cellulose ou un dérivé de 15 celle-ci. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le polysaccharide est le dextrane ou un dérivé de celui-ci, par exemple un dextrane réticulé. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 1 à 8, caractérisé en ce que le polymère hydrophile est un polyalcool réticulé ou dérivé de celui-ci, le polyalcool étant par exemple le sorbitol ou l'alcool polyvinylique. 22. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polymère hydrophile est un co- 25 polymère hydrolysé réticulé d'acétate de polyvinyle et d'un autre composé insaturé comme le styrène. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5» caractérisé en ce que le polymère hydrophile est un acide polyacrylique éventuellement réticulé ou un dérivé d'acide poly- 30 acrylique contenant des segments de molécule répondant à la formule : ?1 h - C - G - Rg COX 35 dans laquelle , Rg et Rj représentent H ou un groupe alcoyle ou aryle et X est un groupe hydrophile, par exemple 0R^, NHR^, 0-R^-0H, O-R^ÏÏHg» NHR^OH, NHR^NHg, R^ représentant l'hydrogène," un groupe alcoyle ou aryle qui contient éventuellement des groupes 0H, HHg et des ponts éther. 71 02188 12 2077297 24. Procédé selon la revendication 23» caractérisé en ce que le dérivé d'acide polyacrylique est une polyacrylamide réticulée insoluble. 25. Procédé selon l'une des revendications 23 et 24» caractérisé en ce que le dérivé d'acide polyacrylique est un ester réticulé insoluble hydroxylé d'acide polyacrylique. 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on effectue la combinaison dans un milieu où. la teneur en eau atteint au moins 70$.