Brevet FR2106557A1 — publié le 19720505

?1 33190 2106557 La présente invention concerne un nouveau procédé de séparation et de purification de protéines contenues dans des cellules microbiennes et plus particulièrement un procédé de séparation et de purification de protéines utilisant des techniques de filtra-5 tion sur gel et de précipitation au point isoélectrique permettant d'isoler des protéines cellulaires de pureté élevée à partir de cellules microbiennes brutes avec un rendement élevé. L'invention concerne également un procédé de pré-traitement de cellules microbiennes soumises au procédé ci-dessus de façon à augmenter consi-10 dérablement le taux d'extraction des protéines. Les protéines contenues dans les cellules microbiennes sont bien plus nutritives que les protéines végétales, et constituent donc une source intéressante de protéines, et on a déjà utilisé les protéines de certaines cellules microbiennes telles que les 15 cellules microbiennes assimilant les hydrocarbures du pétrole pour l'alimentation partielle du bétail et des poissons. Cependant, l'utilisation indirecte des protéines microbiennes pour l'alimentation du bétail et des poissons n'apporte qu'un degré d'utilisation insatisfaisant et il est souhaitable de les uti-20 liser directement pour l'alimentation des humains bien qu'elles ne soient pas directement consommables en raison de leur mauvaise di-gestibilité due aux parois cellulaires dures et à leur odeur particulière. Donc, il est très souhaitable de trouver un procédé de sépara-25 tion et de purification des protéines cellulaires microbiennes et du point de vue industriel de trouver un procédé efficace et économique. La présente invention concerne donc un procédé d'isolement et de récolte de protéines cellulaires très purifiées avec unrende-30 ment élevé. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressorti-ront de la description qui va suivre faite en regard des dessins annexés. Sur ces dessins, 25 la figure 1 représente un schéma de fonctionnement d'un exemple de séparation et de purification de protéines selon l'invention; la figure 2 est un graphique représentant la digestibilité des protéines obtenues selon l'invention par rapport à la caséine du lait de vache; ' ■ 2 2106557 la figure 3 représente un graphique illustrant le taux d'extraction des protéines par rapport au nombre d'extraction; et la figure 4 représente un graphique montrant le taux d'extraction des protéines en fonction de la vitesse d'extraction. La présente invention est caractérisée en ce qu'elle comporte un stade d'extraction pour extraire les protéines cellulaires en traitant les cellules microbiennes par une solution alcaline diluée, un stade de filtration sur gel pour dessaler et éliminer les substances de faible poids moléculaire de la solution extraite et un stade de précipitation au point isoélectrique pour séparer et recueillir les protéines cellulaires souhaitées. L'invention concerne également un procédé comportant un pré-traitement des cellules microbiennes par une- solution acide augmentant considérablement le taux d'extraction des protéines cellulaires. On connaît un procédé d'extraction des protéines cellulaires microbiennes utilisant une solution saline ou alcaline pour extraire les protéines; des recherches poussées ont conduit la Demanderesse à découvrir qu'une solution alcaline diluée est préférable à cet effet. Les bases qu'on peut utiliser comme solvant (agent d'extraction) sont l'hydroxyde de sodium, la carbonate de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde d'ammonium, l'urée, la mono-méthylamine ou la diméthylamine, et parmi elles l'hydroxyde de so^ dium et le carbonate de sodium sont particulièrement efficaces. Bien que la concentration de la solution alcaline puisse être choisie librement, on préfère qu'elle soit comprise dans la gamme de 2 à 6 %. Dans le cas de l'hydroxyde de sodium et du carbonate de sodium, on préfère une concentration de 2 à 4 Dans ces conditions, on peut obtenir l'extraction efficace sans qu'il soit nécessaire de rompre les parois cellulaires, comme c'est le cas dans l'extraction classique des protéines cellulaires microbiennes, qui utilise par exemple un procédé de rupture par ondes sonores ou ultra-sonore s, un dégraissage à l'acétone, une autolyse dans le toluène, ou similaires. Selon l'invention, on dessale et on élimine les composés de bas poids moléculaire par filtration sur gel avant de séparer les protéines de la solution extraite ou extrait. Lorsqu'on sépare les protéines en utilisant la précipitation au point isoélectrique ou une évaporation de l'extrait, la pureté des protéines obtenues risque d'être altérée par des polysaccharides, des sels de bas poids moléculaire et des amino acides donnant aux protéines une ;30PY " 71 33190 3 2106557 couleur désagréable et une odeur particulière, si bien quTon ne peut les utiliser comme aliment de l'homme. Bien que pour éviter ces inconvénients on ait utilisé une dialyse contre de l'eau, cette dialyse est longue, nécessite de grandes quantités d'eau et 5 n'est pas économique. La Demanderesse a montré qu'un procédé de filtration sur gel est plus efficace pour dessaler et éliminer les substances de faible poids moléculaire. Bien que le procédé de filtration sur gel soit connu en soi comme procédé de fractionnement des protéines, 10 et qu'on l'ait utilisé pour l'isolement et la purification des enzymes microbiennes à l'échelle du laboratoire, on n'a pas utilisé ce procédé à l'échelle industrielle pour traiter les protéines de cellules microbiennes entières. La Demanderesse a montré que pour divers organismes, on peut fractionner la solution d'extrait 15 de protéines cellulaires en deux fractions contenant l'une les protéines et l'autre les sels minéraux ainsi que les substances de bas poids moléculaire par filtration sur gel. De façon connue, on conduit la filtration sur gel en faisant écouler l'extrait contenant des substances de poids moléculaires 20 différents à travers une colonne garnie de particules de gel ayant des propriétés de tamis moléculaire. Il existe diverses catégories de gels filtrants, telles que des particules de gel filtrant du type dextrane, des particules de gel filtrant de type acrylamide, etc. Les produits filtrants de type dextrane sont connus par la 25 série commerciale des Sephadex qu'on synthétise à partir du dextrane par réticulation. En réglant le taux de réticulation, on peut modifier la densité du réseau constitutif du dextrane réticulé de façon à modifier l'effet de tamis moléculaire à la demande. Le Sephadex est vendu par Pharmacia Inc., Suède, et a la structure 30 chimique probable suivante : (Voir formule page 4). Le séphadex possède un caractère hydrophile excellent et un pouvoir gonflant remarquable mais est insoluble dans l'eau. De plus, ce gel filtrant n'est pas toxique si bien qu'il constitue 35 la matière préférée. Bien qu'on puisse modifier comme il convient la taille de maille du gel filtrant,, il est préférable qu'il ait une taille de maille correspondant à un poids moléculaire d'environ 2 000. Si on utilise un gel filtrant ayant une taille de maille plus grande, la récupération des;protéines diminue. 40 Le Sephadex G-25 a une taille de maille correspondant à des COPY 71 33190 4 2106557 -CH, H I H |/Cqr°x/ C OH H C — 0 — CH0 i\i i / i -i HA C — C H/CcrrO^ nU | , -y / n„H \ H OH C | i C — 0— CH, | \ n rtS I c, HO V i H /Ces- 0 H HO 6 OH H C-— o- IV 1 ' 10 ÇH2 HO jj ^ HC — OH CH, l ^ * H 0 HO ' ' H 15 -0^CHo CHoh H G — 0 — CH | 2 I N h r\S I 2 Ï/C-1T V » I ° ?A—°n,h °^hJ'C-°-°h2 f-gHJio'C_0_ Il H0 I I H OH H OH 20 HCH, HC-OH CH, I 2 OH 25 poids moléculaires d'environ 3 500 à 4 500, il constitue donc un des gels filtrants préférables. Le gel doit avoir une tailïe de maille correspondant à des poids moléculaires d'environ 2 000 à 5 000. On peut utiliser un gel de type acrylamide tel que le Biogel, 30 en particulier le Biogel P-6 (Produit de Biorad Inc., U.S.A.). Ces gels sont hydrophiles et ont une taille de maille correspondant à • des poids moléculaires d'environ 2 000 à 5 000. On peut facilement séparer la fraction protéïque de la fraction de bas poids moléculaire en faisant passer l'extrait protéïque à travers une colonne 35 cylindrique garnie des particules de gel ci-dessus. On neutralise l'extrait à un pH d'environ 6 à 9 et en particulier de 6 à 7 avant ou après filtration sur gel. H suffit que la quantité de solvant éluant, tel que l'eau, soit de 2 à 3 fois la quantité d'extrait ce qui nécessite une 40 quantité d'eau bien moindre que le procédé classique de dialyse à 11 33190 5 2106557 l'eau ordinaire et rend le procédé de l'invention plus économique. On peut maintenir constant le rendement du fractionnement en utilisant une colonne ayant une longueur de plus de 30 à 40 cm, quel que soit le diamètre, et on peut utiliser des colonnes de 5 grand diamètre bien que le gel filtrant de type dextrane précédemment indiqué tende à moisir, ce qu'on peut empêcher par un lavage à l'NaOH 0,01N toutes les 100 opérations de fonctionnement continu, et l'entretien est assez facile. Le coût du fractionnement est faible car le fonctionnement continu pendant une durée prolongée 10 compense le prix relativement élevé du gel filtrant. On réalise le stade de précipitation au point isoélectrique en ajustant le pH de l'extrait de protéines à la valeur choisie en ajoutant un acide après dessalage et élimination des substances de bas poids moléculaire provoquant ainsi la précipitation de la 1$ partie protéïque. La précipitation au point isoélectrique des protéines est bien connue, mais on l'utilise rarement pour réaliser la séparation efficace des protéines cellulaires microbiennes totales constituées de diverses protéines ayant des propriétés physico-chimiques différentes, et on considérait qu'il était impossi-20 ble de réaliser une précipitation efficace de la majeure partie des protéines cellulaires à un pH déterminé car chaque protéine a un point isoélectrique propre et on considérait qu'il n'existe pas de point isoélectrique caractéristique des protéines cellulaires microbiennes. Cependant, les recherches ayant conduit à la 25 présente invention prouvent qu'il existe un point isoélectrique auquel 90 c/o des protéines du micro-organisme précipitent. Bien que le point isoélectrique puisse légèrement varier selon la nature du micro-organisme, la composition du milieu de culture et les conditions de culture, le point isoélectrique est situé dans une 30 gamme d'environ pH 5-3. On choisit le point isoélectrique dans la gamme ci-dessus pour obtenir le rendement maximal en protéines selon le type de micro-organisme utilisé, la composition du milieu de culture, et les conditions de culture. Finalement, on soumet les protéines précipitées dans le stade 35 ci-dessus à un lavage, une filtration et un séchage classiques donnant des protéines blanches, sans saveur ni odeur, très purifiées. On sépare facilement le précipité et la solution surnageante en laissant reposer pendant une faible durée et après décantation on peut sécher les protéines recueillies. 40 Selon l'invention, on peut augmenter le taux d'extraction par 3âl la solution alcaline diluée en traitant avant l'extraction-les ... cellules microbiennes par une solution acide appropriée. La solution acide est constituée d'un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique d'un acide 5 organique tel que l'acide citrique, l'acide succinique, l'acide fumarique, l'acide adipique, l'acide maléïque, l'acide malique, l'acide oxalique, l'acide formique, l'acide acétique et l'acide propionique. L'acide chlorhydrique et"l'acide~surfurïque \nori"toxiques,~~eco"^-" 10 noxniques et donnant une extraction efficace conviennent particulièrement bien. Grâce au pré-traitement des cellules microbiennes par la solution acide, les parois cellulaires se rompent ce qui facilite l'extraction des protéines cellulaires. Bien qu'on puisse obtenir 15 la rupture des parois cellulaires de façon mécanique, en utilisant par exemple un broyeur à billes, un dispositif à ondes sonores ou ultrasonores, ou un dégraissage dans l'acétone "ou une autolyse dans le toluène, le traitement ci-dessus par une solution acide est supérieur aux procédés classiques car il est simple et très 20 efficace. Un autre avantage du traitement acide est qu'il diminue le temps nécessaire à l'extraction des protéines par la solution alcaline. On conduit le traitement acide dans des conditions appropriées. Bien qu'on obtienne un résultat meilleur avec un acide concentré 25 à température élevée pendant des durées prolongées, il est nécessaire de choisir les conditions appropriées car lorsque les conditions sont trop sévères les protéines peuvent être dégénérées et décomposées ce qui diminue le rendement en protéines. De préférence, la concentration de l'acide est comprise dans la gamme de 30 0,03 à 2N et, mieux, de 0,2 à 0,6N. La température et la durée du pré-traitement acide ne sont pas limitées de façon particulière mais on conduit de préférence le traitement entre 80 et 130°C pendant 10 à 60 minutes. La présente invention s'applique à des micro-organismes tels 35 que les levures, les bactéries, les champignons, les algues et les protozoaires. On peut citer comme exemple de micro-organismes assimilant le gaz naturel, les paraffines, les hydrocarbures aromatiques et d'autres hydrocarbures, des levures appartenant aux genres Candida et Torulopsis et des bactéries appartenant aux genres 40 Pseudomonas, Ba cil lus, Metanomonas et Micrococcus. On peut égale- COPY 71 7 2106557 ment utiliser des levures se développant dans les sucres, les acides organiques, les alcools et d'autres sources de carbone non hydrocarbonées telles que les levures du genre Saccharomyces. On peut utiliser des bactéries du genre Baci11us et Escherichia. des 5 algues telles que les chlorelles et des protozoaires tels que les paramécies. On peut utiliser des cellules sèches ou des cellules humides. Comme le montre la figure 1, qui illustre un exemple dTun procédé de séparation et de purification de protéines cellulaires 10 microbiennes, on disperse 100 parties (en poids de cellules sèches) de levure brute (Candida Lipolytica) 1 dans 400 parties d'acide chlorhydrique 0,4N, 21, pour préparer une suspension à 20 fo de levure. On chauffe la suspension à 100°C. pendant 20 minutes. Ensuite, on ajoute au mélange contenant les cellules micro-15 biennes pré-traitées une solution de soude, 26, à 3 fp en poids pour réaliser l'extraction 3* Dans cette extraction, on ajuste la teneur en cellules à 5 % en poids, on ajuste la concentration en hydroxyde de sodium à 2 %, et on maintient le mélange à 35°G pendant 2 heures. 20 Lorsque l'extraction est terminée et qu'on a dilué la suspension avec de l'eau à une concentration de 5 on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré à 35 % pour neutraliser exactement à pH 7,0. On soumet la suspension neutralisée à une centrifugation 5 pour éliminer le résidu 14, obtenant ainsi une solution extraite 25 de protéines 6. On soumet alors la solution, extraite de protéines à la filtration sur gel 7 pour la dessaler et éliminer les substances 16 de bas poids moléculaire. On garnit une colonne pour filtration sur gel de Sephadex G-25 et on l'alimente en eau 15. La colonne utilisée dans cet exemple a 11,5 de diamètre et 30 30 cm de long. On ajoute à la fraction protéïque obtenue 8 de l'acide chlorhydrique concentré à 35 f>, 17, pour réaliser la précipitation 9 au point isoélectrique. On règle le pH à 4,25 - 0,5» On élimine par décantation 10 un surnageant 18. On met alors le précipité en suspension dans l'eau 19 pour le laver et éliminer les 35 impuretés. Après élimination du surnageant par décantation, on sèche les protéines obtenues pour obtenir les protéines purifiées 18. Le rendement des protéines dans cet exemple est de 75 % et leur pureté est de 91 %, Les protéines obtenues dans le procédé de l'invention ont la 40 même digestibilité que la caséine du lait de vache/ ' qui est une COPY 71 331 protéine naturelle dans des essais de digestion artificielle utilisant de la pepsine et de la trypsine. La figure 2, montre les résultats d'essais de digestion comparés de levures de pétrole, de protéines cellulaires purifiées et de caséine, dans lesquels le 5 mélange réactionnel est constitué de 2 200*mg d'échantillon, 20 mg de trypsine, de solution de tampon au phosphate de potassium 0,05M (pH 7,6) et le volume total est de 100 ml. On conduit la digestion à 37°C en agitant dans un bain à température constante. La courbe (a) représente la digestibilité des protéines puri-10 fiées obtenues selon l'invention à partir de Candida lipolytica; la courbe (b) la digestibilité de protéines obtenues selon l'invention à partir de Torulopsis S.P; la courbe (c) la digestibilité de Candida lipolytica; la courbe (d) la digestibilité de Torulopsis S.P.: et la courbe (e) la digestibilité de la caséine du lait 15 de vache. L'invention est illustrée par les exemples suivants. Dans ces exemples suivants les stades de traitement ne sont pas décrits en détail, le procédé dans son ensemble étant identique à celui expliqué en regard de la figure 1. Il va cependant de soi qu'on peut 20 modifier le procédé illustré dans la figure 1 sans sortir du cadre de l'invention. Par exemple, on peut conduire le stade de neutralisation 4 après le stade de séparation par centrifugation 5» EXEMPLE 1 - On fait tremper 1 kg de cellules sèches de Candida lipolytica 25 dans 20 1 de solution aqueuse à 3,5 $ de soude caustique et on ex- * trait la protéine à 35°C pendant 4 heures en agitant. On sépare par centrifugation l'extrait du résidu, et on ajuste le pH au voisinage de 8 par addition d'acide chlorhydrique, on fait passer l'extrait sur une colonne de filtration sur gel garnie de Sephadex 30 G-25 pour le dessaler et éliminer les substances de bas poids moléculaire, on élue par une quantité d'eau égale à 2 à 3 fois la quantité d'extrait, on sépare la fraction protéïque et on la re-cueille. On ajoute à la fraction protéïque de l'acide chlorhydrique pour 35 précipiter la majeure partie des protéines au pH isoélectrique de 4,2. On sépare les précipités obtenus de la solution surnageante, 0n sèche pour obtenir 380 g de poudre blanche sans saveur ni odeur. La teneur en protéines (pureté) de la poudre obtenue est de 94 % et la teneur en sucres de 5 elle est facilement digérée 40 par la pepsine et la trypsine comme la caséine du lait de vache. 71 33190 9 2106557 La teneur en protéines de la levure brute est de 52 %, et on peut purifier et récupérer 67 fo des protéines (rendement). EXEMPLE 2 - On traite exactement comme dans l'exemple 1, 1 kg de cellules 5 sèches de Pseudomonas S.P. (ayant une teneur en protéines de 71 %) (pH isoélectrique 4,6) en obtenant 510 g (rendement 65 %) de protéines cellulaires ayant une pureté de 90 %. dont la digestibilité est semblable à celle de la caséine du lait de vache. EXEMPLE 3 - 10 On soumet au même traitement d'isolement et de purification des protéines que dans l'exemple 1, 1 kg de cellules sèches brutes de Saccharomyces cerevisiae (levure de boulangerie), teneur en protéines 23,3 On ajuste le pH à 4,6 pour réaliser la précipitation au point isoélectrique, en obtenant 175 g (rendement 75 %) 15 de protéines cellulaires ayant une pureté de 96 %. EXEMPLE 4 - On fait tremper dans 4000 ml d'acide chlorhydrique 0,4N 1 kg de cellules sèches de Candida lipolytica et on chauffe à 100°C pendant 20 minutes, on ajoute alors 15 % de cellules à une solu-20 tion aqueuse à 19 % d'hydroxyde de sodium et on extrait les protéines à 35°C en agitant pendant 1 à 2 heures. On dilue la suspension avec de l'eau jusqu'à obtention d'une concentration en levure de 5 7o et on sépare l'extrait du résidu par centrifugation, et on ajuste le pH à 8-9 par addition d'acide chlorhydrique on fait pas-25 ser l'extrait sur une colonne de filtration sur gel garnie de Sephadex G-25 pour le dessaler et éliminer les substances de bas poids moléculaire, on élue par un volume d'eau égal à 2 à 3 fois l'extrait, on sépare la fraction protéique et on la recueille. On ajoute à la fraction protéique de l'acide chlorhydrique pour 30 précipiter la majeure partie des protéines au pH isoélectrique de 4,2. On sépare le précipité ainsi formé du surnageant, on le sèche en obtenant 75 parties de poudre blanche sans saveur ni odeur. On analyse la poudre ainsi obtenue qui a une teneur en protéines (pureté) de 91 qui est digérée de façon efficace par la 35 pepsine et la trypsine comme la caséine du lait de vache. La teneur en protéines de la levure brute'est de 51 c/of on obtient donc un rendement de 68 °/o de protéines purifiées et récupérées. EXEMPLE 5 - On traite exactement comme décrit dans l'exemple 4, des cellu-40 les fraîches de Torulopsis S.P. immédiatement après culture, et 71 33190 10 2106557 on obtient un rendement en protéines cellulaires purifiées d'environ 70 /», la pureté du prçduit est d'environ 90 L/o et sa digestibilité est semblable à celle de la caséine. EXEMPLE 6 - 5 On traite exactement comme décrit dans l'exemple 4, des cellules sèches de Pseudomonas S.P. en obtenant un rendement de 68 "/ EXEMPLE 7 - " ' 10 On isole et on purifie les ^.wtéines de levure de boulangerie brutes fraîches (Saccharomyces cerevisiae) selon la technique utilisée dans l'exemple 4, en obtenant un rendement en protéines cellulaires de 73 avec une'pureté de 96 %. EXEMPLE 8 - 15 On ajoute à 1 kg de cellules fraîches de levure de pétrole, Torulopsis S.P. (ayant une teneur en eau voisine de 79 ?<>) de l'acide sulfurique pour obtenir une concentration finale de 0,2N" et une concentration en cellules de 20 %, et on chauffe pendant 1 heure à 100°C. 20 Après refroidissement, on ajoute une solution aqueuse d'hydro-xyde de sodium jusqu'à obtention d'une concentration finale de 3 fo, et on extrait à 35°C pendant 1 heure. La concentration en le-f vure de l'extrait est de 15 Ensuite on dilue l'extrait par de l'eau jusqu'à obtention d'une 25 concentration en levure de 5 $ puis on le soumet à une centrifugation pour séparer le liquide surnageant. Le même traitement que dans l'exemple 1 donne 57 g d'une poudre de protéines blanche sans couleur ni odeur avec une pureté de 92 % (rendement 7° fa). Les figures 3 et 4 illustrent les effets de pré-traitements 30 sur le taux d'extraction des protéines. La figure 3 illustre les résultats d'essais de pré-traitements classiques, la courbe (f) représente le taux d'extraction en l'absence de pré-traitement ; la courbe (g) le taux d'extraction selon le procédé de dégraissage à l'acétone; la courbe (h) le taux d'extraction par broyage au 35 carborundum; et la courbe (i) le taux d'extraction par autolyse dans le toluène. Dans les expériences ci-dessus, les conditions d'essai de l'extraction alcaline sont une concentration des cellules du genre Torulopsis de 10 fô, une concentration en base de 4 % d'hydroxyde de sodium, une température de chauffage de 35°C 40 et une durée de chauffage de 3 heures/une extraction. COPY 3 31 § Ô 13- 71 d:îlv 2106557 Dans la figure 4, la courbe (j) représente tin taux d'extraction d'un pré-traitement de 20 minutes à 100°C par de l'acide chlorhydrique 0,4N, la courbe (k) le taux d'extraction d'un pré-traitement de 20 minutes par de l'acide chlorhydrique 0,4N, les courbes 5 (1) et (m) les taux d'extraction en l'absence de pré-traitement. Les concentrations en levure et en hydroxyde de sodium sont respectivement de 10 $ et 2 et la température est maintenue à 35°C. Le micro-organisme utilisé dans les essais des courbes (k) et 10 (1) est Candida lipolytica et celui des essais des courbes (j) et (m) appartient au genre Torulopsis. Comme le montrent les résultats des figures 3 et 4, le taux d'extraction des protéines augmente remarquablement pour des durées brèves lorsqu'on soumet les cellules microbiennes à un pré-15 traitement acide avant l'extraction alcaline. Lorsqu'on le compare aux pré-traitements classiques illustrés par la figure 3, on voit que le pré-traitement selon l'invention est supérieur. Bien entendu, la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre purement explicatif mais nullement limitatif et 20 elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. * COPY 71 33190 12 2106557 REVENDICATIONS 1 - Procédé de séparation et de purification de protéines cellulaires microbiennes caractérisé én ce qu'il consiste - à soumettre des cellules microbiennes constituées de levures, 5 bactéries, champignons, algues ou protozoaires à un traitement d'extraction alcaline par une solution alcaline contenant de 2 à 6 °J0 en poids de base pour extraire les protéines contenues dans lesdites cellules microbiennes; - à séparer les substances insolubles dans la solution extraite 10 obtenue; - à faire passer la solution extraite avec un éluant dans une colonne garnie de particules de gel filtrant hydrophile ayant des mailles correspondant à des poids moléculaires d'environ 2 000 à 5 000, séparant ainsi les protéines désirées des substances de bas 1$ poids moléculaire, des sels et des autres contaminants; - à réaliser une précipitation au point isoélectrique de la fraction de protéines obtenue à un pH de 3 à 5 pour précipiter les protéines désirées; et - à séparer et à recueillir lesdites protéines précipitées pour 20 obtenir des protéines très purifiées. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite base est l'hydroxyde de sodium ou le carbonate de sodium. ' 3 - Procédé de séparation et de purification de protéines cellulaires microbiennes, caractérisé en ce qu'il consiste : 25 - à traiter des cellules microbiennes constituées de levures. $ * bactéries, champignons, algues ou protozoaires, par une solution acide concentrée entre 0,03 et 3N pour rompre les parois desdites cellules microbiennes; - à soumettre lesdites cellules microbiennes à un traitement 30 d'extraction alcaline avec une solution alcaline contenant 2 à 6 % en poids de base; - à séparer les substances insolubles de la solution extraite obtenue ; - à faire passer la solution extraite avec un éluant dans une 35 colonne garnie de particules d'un gel filtrant hydrophile ayant des mailles correspondant à des poids moléculaires d'environ 2 000 à 5 000, séparant ainsi les protéines désirées des substances de bas poids moléculaire, des sels et des autres contaminants; - à réaliser la précipitation au point isoélectrique de la 40 fraction de protéines obtenue dont on a ajusté le pH entre 3 et 71 33190 13 2106557 5 pour précipiter les protéines; et - à séparer et à recueillir lesdites protéines précipitées de ladite fraction pour obtenir des protéines très purifiées. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que 5 ladite base est l'hydroxyde .de sodium ou le carbonate de sodium. 5 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite solution acide est constituée d'acide chlorhydrique ou d'acide suifurique. 6 - Procédé de séparation et de purification de protéines cel-10 lulaires microbiennes caractérisé en ce qu'il consiste : - à traiter des cellules microbiennes de levures, bactéries, champignons, algues ou protozoaires par une solution acide de 0,03 à 2N pour rompre les parois desdites cellules microbiennes; - à soumettre les cellules microbiennes à un traitement d'ex-15 traction alcaline par une solution alcaline contenant de 2 à 6 $ en poids de base pour extraire les protéines contenues dans lesdites cellules microbiennes; - à neutraliser l'extrait obtenu à un pH d'environ 6 à 9; - à séparer les substances insolubles dudit extrait par centri-20 fugation; - à faire passer la solution extraite obtenue simultanément avec un éluant dans une colonne garnie de particules d'un gel filtrant hydrophile ayant des mailles correspondant à des poids moléculaires d'environ 2 000 à 5 000, éliminant ainsi de ladite solution 25 extraite les substances de bas poids moléculaire les sels et les autres contaminants ayant un poids moléculaire inférieur à 2 000 pour obtenir une fraction protéïque; - à soumettre ladite fraction protéïque à une précipitation au point isoélectrique à un pH compris entre 3 et 5 pour précipiter 30 les protéines désirées; - à séparer lesdites protéines précipitées de ladite fraction; - à laver lesdites protéines pour éliminer les contaminants; et - à sécher la poudre de protéines obtenue. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent filtrant est du dextrane réticulé. 8 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit agent filtrant est du dextrane réticulé. 35 9 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit agent filtrant est du dextrane réticulé.