Brevet FR2059561A1 — publié le 19710604

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin contre la fièvre aphteuse (vaccin antiaphteux). On connatt déjà des procédés de préparation de vaccins à partir de virus aphteux inactivés. Selon ces procédés on multiplie le virus sur la muqueuse linguale de bovins vivants (O. Waldmann, G. Pyl, K.O. Hobohm et H. Moehlmann, Zbl. Bakt. I.. Orig. 148, 1, 1941), sur la muqueuse linguale isolée de bovins in vitro (H.S. Frenkel, Bull. Off. Int. Epiz. 28, 155, 1947 et 39, 91 (1953)) > en cultures de cellules primaires en monocouche provenant de reins de veaux (B. Ubertini, B.L. Nardelli, A.Dal Prato, G. Panina et G. Santero (1963), Zbl.Vet. Med. 93 - loti), et en cultures de cellules en monocouche ou en suspension provenant de reins de petits hamsters (Macpherson et Stoker, Virology 16, 147, 1962). Des vaccins ainsi obtenus conviennent pour immuniser des animaux à sabots fendus, tels que des bovins, des porcs, des moutons et des chèvres, contre la fièvre aphteuse. Pour cultiver le virus aphteux naturel sur la muqueuse linguale de bovins vivants (Procédé de Waldmann), il faut toutefois un grand nombre de bovins susceptibles d'avoir la fièvre aphteuse et la culture est interdite dans la plupart des pays producteurs de vaccins anti-aphteux, pour des raisons prophylactiques, étant donné que l'obtention du virus naturel dans des abattoirs spéciaux présente le risque permanent d'une propagation de l'épidémie. La culture du virus aphteux suivant le procédé de Frenkel rencontre souvent des difficultés considérables parce qutil faut, dans ce cas, disposer .continuelle- ment de quantités suffisantes de la muqueuse linguale isolée provenant de bovins fratchement abattus.La culture du virus aphteux en cultures de tissus, en particulier en-cultures "monocouches", est très coûteux et prend beaucoup de temps pour une production à l'échelle industrielle. Enfin, des vaccins anti-aphteux obtenus à partir des virus aphteux que l'on a cultivés sur des lignes de cellules hétérologues, par exemple sur la ligne de cellules provenant de reins de petits hamsters, impliquent le risque de produire des phénomères allergiques ches les animaux vaccinés à la suite d'une vaccination répétée et même de la première vaccination. L'invention concerne donc un procéde de préparation d'un vaccin anti-aphteux par culture de virus aphteux, procédé selon lequel on décompose superficiellement par enzymes des estomacs nettoyés de ruminants, on met en suspension le tissu décomposé, on multiplie le virus aphteux dans cette suspension, on l'adsorbe sur de l'hydroxyde d'aluminium et on le désactive de manière connue, ou bien on désactive d'abord le virus et on y ajoute ensuite un adjuvant. Le procédé conforme à l'invention convient à la culture en masse de virus aphteux et à la production à une grande échelle de vaccins anti-aphteux. Le procédé est simple et bon marché et les produits bruts sont disponibles de manière presque illimitée. Suivant le procédé de l'invention on cultive le virus aphteux sur un tissu homologue. Le vaccin préparé à partir de celui-ci ne produit aucun phénomène allergique. Le vaccin est efficace, stable et bien compatible. Pour la réalisation du procédé conforme à l'invention on part d'estomacs de ruminants. On sait que les estomacs de ruminants sont constitués de plusieurs parties dont les plus importantes sont la panse, le bonnet, le feuillet et la caillette. On utilise avantageusement les estomacs de bovins et en particulier la panse et le feuillet. Conformément à un mode de réalisation préféré, on lave les estomacs à liteau froide, après avoir retiré ceux-ci des animaux abattus; on enlève les piliers de la panse, les feuilles du feuillet et les parties exemptes de villosités du fond de l'estomac - le poids total de ces parties, en fonction de la taille du bovin est compris entre environ 1 et 1,5 kg - et on enlève les coches de graisse qui y adhèrent. Après lavage et brossage dans de l'eau tiède et ensuite dans de l'éthanol à 70 %, on recueille les pièces de tissus dans une solution isotonique de chlorure de sodium contenant dés antibiotiques (solution de lavage à antibiotiques) et on les réduit en petits morceaux, par exemple au moyen d'un moulin à viande ayant un diamètre d'ouvertures compris entre 6 et 10 mm. Comme solution saline isotonique contenant des anti- biotiques (solution de lavage antibiotiqués) on utilise, de préférence, une solution de chlorure de sodium physiologique contenant, par litre, 300 mg de streptomycine et 210 mg de pénicilline et dont le pi est de 7,4. Au lieu de la streptomycine et de la pénicilline on peut utiliser aussi d'autres antibiotiques, tel que le chloramphénicol. On lave la bouillie de tissus avec la solution de chlorure de sodium physiologique jusqu'à ce que le liquide de lavage résultant ne soit que faiblement troublé et on la décompose ensuite avec une solution d'une enzyme protéolytique, filtrée dans des conditions stériles, de préférence une solution de trypsine, à 28 - 4000, de préférence à 3700. On utilise avantageusement de 0,1 à 0,5, de préférence 0,25 %, de trypsine dans une solution de chlorure de sodium physiologique tamponnée. Pour 200 g de bouillie de tissus, on utilise environ 500 ml de solution de trypsine. La durée de l'action de trypsine est d'environ 20 à 100 minutes, de préférence de 60 à 90 minutes. On interrompt l'action de la trypsine au moyen de sérum bovin ou d'un autre inhibiteur de trypsine, tel que l'inhibiteur de poumons, l'inhibiteur de soya et l'ovomucoide (inhibiteur de trypsine à partir d'oeufs de poule). Lorsqu'on utilise du sérum bovin, il faut veiller à ce que le sérum provienne de bovins qui n'ont pas été encore vaccinés contre la fièvre aphteuse. On peut éliminer la trypsine de la bouillie de tissus aussi par lavage avec la solution de chlorure de sodium physiologique. Après le traitement par la trypsine on stérilise la pâte de tissus en la traitant pendant 2 heures avec la solution de stérilisation contenant l'antibiotique. Après cela, on décante avec précaution la substance surnageante. Cette opération et toutes les autres étapes s'effectuent dans des conditions strictement stériles. On lave ensuite la bouillie de tissus avec le milieu de Patty, on la place, dans des conditions stériles, dans un récipient fermé pourvu d'un agitateur et on lui inocule une suspension de virus aphteux représentant un dixième de son volume. La solution de stérilisation contenant l'antibiotique contient, par exemple, 750 mg de streptomycine, 1320 mg de pénicilline et 310 mg de nystatine ainsi que 9,6 g de phosphate disodique par litre, mais la constitution peut varier dans des limites étendues. Le pH d'une telle solution est de 7,8. Par 200 g de bouillie de tissus, on utilise environ 600 ml de la solution de stérilisation contenant l'antibiotique. Comme virus aphteux à utiliser dans le procédé conforme à l'invention on mentionnera tous les types courants de virus, par exemple, les types de virus européens 0, A et C, les types de virus sud-américains 0, A et C, les types africains SAT 1, 2 et 3 ainsi que les types asiatiques, par exemple Asia 1. On porte ensuite le mélange de culture à environ 5 fois son volume avec du milieu de Patty modifié, on porte le pH à 7,6 - 7,8 avec une solution d'hydrogéno-carbonate de sodium à 10 % et on agite la suspension obtenue à 370C et à une vitesse de 60 t/mn. On y introduit, en même temps, un mélange filtré dans des conditions stériles et constitué de 95 parties d'oxygène et de 5 parties d'anhydride carbonique et on sature continuellement le mélange de culture avec de l'oxygène et de l'anhydride carbonique Ele milieu de Patty (Am. J.Vet. Res. 21, 144 (1960)) correspond à la solution saline stabilisée de Hanks (Henks' balanced salt solution) (Hanks et Wallace, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. t, 196 (1949)), qui contient, d'après Patty, en plus 10 % de sérum bovin, o,o6 mg de pénicilline par ml et 0,1 mg de sulfate de dihydro-streptomycine par ml. Conformément à l'invention, on augmente la teneur en antibiotique : celle en pénicilline à 0,460 mg/ml et celle en sulfate de dihydrostreptomycine à 0,3 mg/mJl. 12 heures après le début de la mise en culture et ensuite à des intervalles de 6 heures on ajoute, par litre de suspension, environ 20 ml d'une solution de culture à antibiotiques qui est obtenue, par exemple, en dissolvant 7,5 g de base de streptomycine et 12 g de pénicilline dans un milieu de virus VM 3, additionné de 0,18 % de glucose. Le milieu de virus VM 3 a la constitution suivante 8,00 g de chlorure de sodium par litre 0,30 g de chlorure de potassium par litre 0,18 g de chlorure de calcium par litre 0,09 g de chlorure de magnésium par litre et 2,00 g d'hydrogéno-carbonate de sodium par litre. (Schwobelet Siedentopf, Zbl. Bakt. I t81, 3 (1961)). On complète cette solution à 1000 ml avec une solution de VM 3 contenant 0,18 ffi de glucose et on porte le pH à 7,9 8,0 au moyen d'une solution tampon. On peut choisir aussi la composition suivante pour cette solution 7,5 g de base de streptomycine par litre 12,0 g de pénicilline par litre et 9,6 g d'hydrogéno-phosphate disodique par litre. On porte le pH de cette solution à 7,9. On vérifie continuellement le pH du mélange de culture et, le cas échéant, on l'ajuste à 7,6 - 7,8 par addition d'une solution d1hydrogéno-carbonate de sodium & 10 %. Au bout de 25 à 40 heures on intronpt la culture de virus et on refroidit la suspens ion à 40C. Pour détruire les cellules et obtenir les virus se trouvant dans les cellules, on traite le mélange au moyen d'un vibro-mélangeur, puis on centrifuge la suspension de virus pendant environ 10 minutes à une vitesse de 3 000 t/mn. On ajoute de 0,2 à 2 % de chloroforme à la substance surnageante trouble et on la secoue énergiquement, tout en refroidissant, pendant 10 minutes. Après une autre centrifugation pendant 10 minutes à 3 000 t/mn, on obtient un extrait presque clair que l'on peut utiliser comme antigène pour la préparation de vaccins anti-aphteux. On établit la teneur en virus de ltextrait obtenu sur des souris. A cet effet, on vaccine, par voie intrapéritonéale, 20 souris âgées de 5 à 7 jours environ, dans une narcose par éther, avec 0,10 ml de dilutions virales 10 3, 10 4, 10 5, 10-6, 10-7 et 10-8. L'essai dure 7 jours. Les morts avant le cinquième jour ne sont pas considérées parce que la durée d'incubation est au moins 5 jours. On établit les points finals à 50 % des dilutions individuelles d'après Reed et Münch (Amer. J. Hyg. 27, 493 (1938)). Le titre viral est donné par DL50/ml qui signifie la quantité de virus qui fait succomber 50 % de souris. Pour la préparation du vaccin on ajoute à la suspension contenant le virus soit de l'hydroxyde d'aluminium, soit du phosphate d'aluminium, d'un pH compris entre 7,7 et 8,3, la teneur en hydroxyde d'aluminium ou en phosphate d'aluminium étant comprise entre 0,1 et 3,0 %, de préférence entre 0,4 et 1,0, puis on inactive la suspension de manière connue, par exemple au moyen du formaldéhyde ou du ss-propiolactone - avantageusement en présence de 0,1 à 3,5 %, de préférence de 3 %, de saponine - ou bien oh l'inactive au moyen d'une de ces méthodes et on la transforme ensuite en une suspension du type "l'eau dans l'huile" au moyen d'un adjuvant.A cet effet convient, comme composante d'huile, par exemple la vaseline liquide pure et, comme émulsionnant, le sesqui-oléate de sorbitane ou le mono-oléate de polyhydroxy-éthylène-sorbitane. L'examen du vaccin ainsi préparé porte sur l'innocuité, ltefficacité et la stabilité. INNOCUITS, L'examen portant sur l'innocuité s'effectue par injection sous-cutanée de 0,1 ml du vaccin conforme à l'invention à 100 souris. On observe les animaux pendant une durée de 14 jours. Le vaccin est considéré comme inoffensif si les animaux ne présentent pas de signes de la maladie pendant cette durée d'observation. EFFICACITE. On effectue l'essai d'efficacité du vaccin préparé conformément à l'invention sur des bovins âgés d'un an. On leur administre, par la voie sous-cutanée, 5,0 ml de produits conformes à l'invention et on les infecte, 21 jours post vaccionationem, avec 104 DL50 pour souris/ml des types de virus correspondants par la muqueuse linguale. En même temps, on infecte de la même manière des animaux témoins. Il apparalt que les vaccins conformes d l'invention protègent les bovins contre la fièvre aphteuse d'une façon généralisée. Les animaux témoins, cependant, qui n'ont pas été vaccinés contractaient, d'une façon généralisée, la fièvre aphteuse. STABILITE. Les vaccins préparés conformément à l'invention ont été emmagasinés pendant une année à 4 - 6"C et ils conservent après cette durée, toute leur efficacité. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention, EXEMPLE 1 On recueille 200 g-de matière de panse nettoyée (tissu total de piliers ) dans une solution saline isotonique contenant l'antibiotique (solution de lavage à antibiotique) et on la réduit en petits morceaux au moyen d'un moulin à viande. On lave la bouillie de tissus obtenue avec une solution de chlorure de sodium physiologique, on ajoute 500 ml d'une solution de trypsine à 0,25 % et d'un pH de 7,9 et on maintient le tout à 370C pendant 60 minutes. On interrompt l'action de la trypsine au moyen de 20 ml de sérum bovin naturel. On infecte ensuite le mélange d'essai avec 50 ml d'une suspension du virus aphteux du type sud-américain O dont le titre viral est de 10-7 DL50 pour souris/ml et on complète le mélange à 1000 ml avec du milieu de Patty modifié. On porte le pH à 7,6 au moyen due 20 ml de solution d'hydrogéno-carbonate de sodium à 10 % et on agite la suspension obtenue à 370C et à une vitesse de 60 t/mn.On vérifie le pH continuellement et on le corrige, si cela est nécessaire. Au bout de 12 heures, puis à des intervalle de 6 heures, on ajoute de la solution de culture contenant l'antibiotique. Après une durée d'incubation de 30 heures on interrompt la culture de virus et on refroidit le mélange à 40C. Pour faciliter 11 extraction du virus on détruit les cellules par traitement au moyen d'un vibro-mélangeur et on centrifuge la suspension de virus pendant 10 minutes à 3000 t/mn. On secoue ensuite énergiquement la substance surnageante avec 1 % de chloroforme pendant 10 minutes tout en refroidissant et on centrifuge de nouveau pendant 10 minutes à 3000 t/mn. On ajoute 230 ml d'une suspension d'hydroxyde d'aluminium à 2 % à 720 ml de la suspens ion de virus obtenue dont le titre viral est de 10 7,3 DL50 pour souris/ml, on ajoute en outre 30 ml d'une solution de saponine à 10 % 10 ml d'une solution tampon de glycocolle de pH 9,2 et 10 ml d'une solution de formaldéhyde à 5 , et on l'inactive pendant 96 heures à 260C. On obtient au total 1000 ml d'un vaccin anti-aphteux à partir de 200 g de matière de départ. On examine ce vaccin sur de jeunes souris âgées de 5 à 7 jours et il s'est avéré inoffensif. EXEMPLE 2 Conformément à l'exemple 1 on prépare à partir de matière de panse une suspension de tissu où l'on inocule le virus aphteux du type sud-américain A (titre viral 10 7,6 DL50 pour souris/ml). On interrompt la culture du virus au bout de 36 heures. Le titre viral de ce mélange est de 10 7'3 DL pour souris/ml. Récolte et préparation du vaccin s'effectuent conformément àl'exemple 1. Ce vaccin aussi stest avéré inoffensif dans l'essai sur de jeunes souris. EXEMPLE 3 Conformément à l'exemple- 1 on décompose de la matière de panse avec 0,25 -% de trypsine, on interrompt l'action de la trypsine au moyen de 20 ml de sérum bovin et on y inocule le virus aphteux du type sud-américain C (titre viral 1 -7 2 DL50 pour souris/ml). Après une durée de culture de 32 heures on récolte le virus (titre viral 10 6,8 DL50 pour souris/ml) et on en prépare un vaccin conformément à l'exemple 1. Dans l'essai sur de jeunes souris ce vaccin est inoffensif. EXEMPLE 4 On mélange un vaccin trivalent contre les types O, A et C à partir de parties égales des vaccins monovalents obtenus conformément aux exemples 1, 2 et 3 et on examine, son efficacité, par la voie sous-cutanée, sur 12 bovins âgés d'un an, à une dose de 5,0 ml. 21 jours post vaccinationem, on infecte ensuite les muqueuses linguales de 4 j-eunes bovins avec le type de virus 1' 4 jeunes bovins avec le type de virus A24 et 4 jeunes bovins avec le type C, chacun d'un titre de 10 DL50 pour souris/ml de types correspondants de virus. Les animaux vaccinés sont immunisés contre les 3 types de virus, mais les animaux témoins également infectés contractent une façon généralisée la fièvre aphteuse du type avec lequel ils ont été infectés. Ctest donc que le vaccin conforme à l'invention s'avère fortement efficace. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un vaccin contre la fièvre aphteuse par culture de virus aphteux, caractérisé en ce qu'on décompose superficiellement par enzymes des estomacs de ruminants, on met en suspension le tissu décomposé, on multiplie le virus aphteux dans cette suspension, on l'adsorbe sur de 1 lthydroxyde d'aluminium et on l'inactive de manière connue, ou bien on l'inactive d'abord, puis on y ajoute un adjuvant. 2. Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu'on utilise des panses et des feuillets de bovins. 3.- Procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'on utilise la trypsine pour la décomposition enzymatique des tissus 4. Vaccin contre la fièvre aphteuse préparé par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.