Brevet FR2061605A1 — publié le 19710625

la présente invention concerne un procédé destiné à la séparation et l'isolement sélectifs de polypeptides d'un liquide biotique. Elle a plus particulièrement trait à un procédé de séparation dans lequel on utilise une résine macro-réticulaire. 5 Des procédés de préparation d'un type de résine macro- réticulaire qui peuvent être utilisés avec intérêt dans la présente invention sont décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n° 3 322 695, 3 147 214, 3 326 875 et dans les brevets britanniques n° 932 1.25 et 932 126. On renvoie également à la 10 demande de brevet français n° 6 929 685 du 29 Août 1969 déposée par la Demanderesse. Le procédé de la présente invention comporte des étapes qui consistent à faire entrer un liquide biotique, duquel la matière en particules grossières a été de préférence éliminée par exem-15 pie par tamisage ou par filtrage, en contact avec une quantité appropriée de résine macro-réticulaire, puis à laver avantageusement la résine avec de l'eau ou une solution d'un sel, et finalement à éluer la substance polypeptidique avec une solution composée d'eau, d'une substance ionisante et d'un solvant organique de fai-20 "ble poids moléculaire qui est miscible aux deux autres composants. On entend par "liquide biotique" des fluides extra-cellulaires qui constituent une partie de l'organisme vivant ou de l'environnement de cet organisme. Le sérum sanguin, l'urine, la sève, la salive, les sécrétions glandulaires, le suc gastrique et les 25 milieux de culture ou bouillons nutritifs destinés à la culture de bactéries, de champignons et de levures, sont des exemples de ces liquides extra-cellulaires. On fait entrer également dans cette définition des liquides que l'on obtient par broyage, macération, traitement à l'ébullition, traitement aux ultrasons 30 ou autres façons de désintégrer et d'extraire des cellules pour obtenir la matière hydrosoluble, comme on le fait fréquemment avec des feuilles ou des plantes entières, des graines, des organes et des glandes d'animaux , des colonies bactériennes et le mycélium, et les spores de champignons ou de levures. Cette définition en-35 globe également des mélanges réactionnels qui contiennent des polypeptides. 70 32431 2 2061605 Dans la plupart des cas, la substance polypeptidique que l'on désire est présente à faible concentration dans le liquide biotique, qui contient habituellement des cellules, des spores et des détritus qui sont souvent difficiles à filtrer ou à éli-5 miner d'une autre façon. Il y a habituellement en solution des molécules organiques relativement petites telles que des amino-acides, des sucres et des polysaccharides, de l'urée, des sels et des acides gras ou leurs sels, le procédé de 1*invention implique la séparation sélective de substances polypeptidiques 4e 10 tels mélanges liquides et permet leur isolement, souvent sous une forme plus concentrée. La résine macro-réticulaire est utilisée de préférence sous la forme de perles, dont le diamètre va d'environ 100 microns à plusieurs millimètres, pour la commodité de la manipulation, 15 bien qu'on puisse utiliser des perles plus petites et de la résine en poudre. La nature macro-réticulaire des perles sèches peut être définie par leur surface spécifique , leur porosité (pourcentage en volume de pores) et la répartition des diamètres des pores. 20 Les procédés connus donnent des substances dont les surfaces spé-cifiques vont de 5 à 1 000 m /g, la porosité va de 10 à environ 75 i° en volume et les diamètres des pores vont de 0,001 à 1 micron. On a constaté d'une façon générale que toute matière dont la surface spécifique est supérieure à 10 m par g, dont la poro- OC sité excède 35 f° et dont les diamètres des pores sont principalement compris dans la gamme de 0,01 à 1 micron, est capable d'ad-sorber des quantités appréciables de polypeptide, ce qui permet de l'utiliser conformément à la présente invention. Pour jouer le râle d'adsorbant dans des solutions aqueuses, 30 les perles doivent être utilisées à l'état humide, notamment s'il s'agit de polymères aromatiques. On les humidifie aisément en les faisant tremper dans un solvant organique miscible à l'eau, par exemple le méthanol, l'éthanol, l'acide acétique, l'acétone,le dioxanne ou le glycol, puis en déplaçant le solvant avec de 35 l'eau. Les perles humides sont alors prêtes à être utilisées. Toutes les perles qui entrent dans la définition donnée ci-dessus sont intéressantes, mais on a remarqué que dans le cas 70. 32431 3 2061605 des perles les plus efficaces selon l'invention, notamment pour des molécules de grandes dimensions, la perle subit une expansion de volume de 50 ou plus de 50 fo par rapport au volume initial de la perle anhydre dans le méthanol et que 90 $ de cette expansion 5 subsistent lorsque le méthanol est déplacé par l'eau. Ceci signifie que la surface spécifique et le diamètre des pores augmentent proportionnellement par rapport à la perle anhydre. Cette expansion constitue donc une caractéristique préférée du polymère. Des résines de ce type ont une bonne stabilité à l'état de perles 10 et montrent un grand pouvoir adsorbant. Du point de vue chimique, on a trouvé deux types de résines qui sont intéressantes dans le procédé de séparation selon l'invention : (1) des copolymères de divinylbenzène,styrène et éthyl-vinylbenzène et (2) des copolymères de triméthacrylate de trimé-15 thylolpropane et de dimethacrylate de triméthylolpropane. Les copolymères de divinylbenzène comprennent au sens large, des copolymères de divinylbenzène additionnés de styrène, des polymères de divinylbenasne du commerce, qui contient 60 $ de divinylbenzène et 40 $ d'éthylvinylbenzène, cette définition s'é-20 tendant à des polymères de divinylbenzène purifié , lequel contient 96 $ de divinylbenzène et 4 ^ d'éthylvinylbenzène. De même, les copolymères de triméthacrylate de triméthylol-propane et de diméthacrylate de triméthylolpropane et d'esters acryliques et méthacryliques entrent dans cette définition ainsi 25 que les polymères de tétraméthacrylate de pentaérythritol. La classe particulièrement préférée de résine macro-réticulaire destinée à être utilisée dans la présente invention peut être définie sur la base d'un polymère ou d'une résine réticulée ayant une surface spécifique supérieure à environ 200 m /g, une 30 porosité supérieure à 40 $ et des diamètres de pores entrant principalement dans la gamme de 0,01 à 1 micron, et montrant une expansion en volume de pHue de 50 $ dans le méthanol, et comprenant ( 1 ) environ 30 $ ou plus de 30 $ de motifs de divinylbenzène 35 ainsi que des motifs d'éthylvinylbenzène et de styrène,ou (2) environ 90% ou plus de 90.$ de motifs de triméthacrylate de triméthylolpropane en même temps que des motifs de diméthacrylate de triméthylolpropane. 70 32431 4 2061605 Conformément à la présente invention, le liquide biotique peut être mis en contact avec la résine macro-réticulaire de toute manière pratique. Par exemple, la résine peut garnir une colonne chromatographique à travers laquelle on fait passer le 5 liquide ; à titre de variante, la résine peut être immergée dans un certain volume de liquide , puis éliminée par exemple t par filtration ou par centrifugation. Une fois que le polypeptide a été adsorbé, seules des petites quantités en sont enlevées par un lavage prolongé à l'eau, ou par 10 des lavages avec des solutions de sel ou des solutions tampons, comme on en utilise en vue de l'élution dans la technique antérieure avec diverses autres variétés de matières adsorbantes. De même, un lavage avec des alcools inférieurs ou des mélanges d'alcool et d'eau n'élimine en général qu'une faible proportion 1 5 du polypeptide adsorbé. Il y a lieu de remarquer que des polypeptides doués d'activité biologique, c'est-à-dire des enzymes, ont une stabilité variable lorsqu'ils sont adsorbés sur la résine et que certains peuvent subir des modifications, notamment dans leur structure 20 tertiaire, modifications qui peuvent conduire à une dénaturation. Par exemple, la combinaison de l'a-amylase avec une résine du type du divinylbenzène peut être séchée sous vide et après conservation pendant une longue période de temps, elle peut être éluée en recouvrant essentiellement en totalité l'activité enzymaiique. 25 Toutefois, si on la laisse reposer sous l'eau, on note une dénaturation appréciable au bout d'un jour. Toutefois, l'activité peut être^réservée sans modification, en maintenant la résine immergée dans la solution d'un sel. Par conséquent, il est souvent désirable, quoique pas toujours néces-30 saire, de laver la résine après que l'adsorption a été effectuée avec des solutions de sels de faible concentration , par exemple une solution de chlorure de sodium à 1-5 $, plutôt qu'avec de l'eau pure pour éliminer le milieu biotique initial. Ces solutions de lavage peuvent être neutres ou bien, si on le désire, 35 elles peuvent se trouver à un pH voisin du point isoélectrique du polypeptide. De même, la stabilité est favorisée par l'utilisation de basses températures, au-dessous d'environ 10°C, dans le processus 70 32431 5 2061605 d'adsorption. Des peptides plus petits, qui n'ont pas une structure tertiaire importante, peuvent habituellement être récupérés sans modification. Pour isoler le polypeptide de la matière adsorbante macro-5 réticulaire, on a constaté qu'un type particulier d'éluant est indispensable. Conformément à la présente invention, l'éluant est une solution d'un sel dans l'eau et dans un solvant organique miscible à l'eau. On a constaté que l'eau seule ou des solutions aqueuses de 10 sels ou de tampons n'effectuent pratiquement pas d'élution des polypeptides adsorbés. Une solution de 50 $ d'eau et 50 $ de méthanol n'élue qu'une très petite quantité, généralement moins de 5 $, du polypeptide adsorbé ; et le méthanol pur ou le méthanol à 20 $ n'en élue essentiellement pas. Par conséquent, le mé-15 lange éluant, comme défini ici, exerce comme on le constate un effet très spécifique et tout à fait inattendu. En général, un sel ionisable ou tampon qui est soluble dans le système choisi d'eau et de solvant organique peut être utilisé dans la solution d'éluant. On peut utiliser des sels solubles 20 des métaux alcalins ou alcalino-terreux, par exemple des halogé-nures, notamment des chlorures, des sulfates, des phosphates, des acétates et des citrates. On peut aussi utiliser des sels d'ammonium quaternaire, notamment les halogénures. On peut effectuer un isolement satisfaisant de la protéine en utilisant les 25 sels suivants, mentionnés à titre d'exemple : LiCl, UaCl, CaC^, KCL, ïïa^PO^, KH^PO^ , Na^HPO^ , ÎTa^SO^, chlorure de benzyl-triéthylammonium, chlorure d'octylphénoxyéthoxyéthyldiméthyl-ammonium, acétate de sodium et citrate de sodium. Il y a lieu de remarquer que des cations ou des anions par-30 ticuliers contribuent parfois à la dénaturation de protéines à grandes molécules telles que les enzymes. Ceci est particulièrement vrai en ce qui concerne les ions quaternaires de haut poids moléculaire. Par conséquent, le choix du sel dans chaque cas dépend du polypeptide que l'on doit séparer et du degré auquel on 35 désire en maintenir l'activité biochimique. Etant donné qu'il est habituellement désirable d'éliminer le solvant organique après l'élution, les solvants miscibles à 70 32431 6 2061605 l'eau les plus intéressants sont les alcools inférieurs (méthanol, éthanol, 1-propanol et 2-propanol) et l'acétone. En outre» des solvants tels que 1!acétonitrile ? le nitrométhane ou l'éthylène-glycol peuvent aussi être intéressants dans des applications spé-5 ciales. Il est évident que les conditions les plus favorables pour une séparation particulière dépendent de la nature chimique de la résine, du polypeptide, du solvant et du sel, mais en général la concentration du sel peut aller d8 environ 0,02 I a 2 M, et le 10 volume relatif de solvant organique peut aller d'environ 25 $ à 70 io de la solution. la quantité d'un sel donné qui peut être dissoute est naturellement fonction du solvant organique particulier qui a été choisi et de son rapport avec l'eau dans le solvant mixte. En géné-15 ral, on préfère des concentrations plus fortes du sel, bien que ceci nécessite d'utiliser une plus basse concentration en solvant organique s, car on obtient un motif d'élution qui est plus net. Une solution de solvant organique à 50 $ dans l'eau, contenant 0,1 à 1 mole dsun sel donné, effectue habituellement l'élu-20 tion de la plupart des protéines. Si le sel porte un anion polyvalent, comme cs est le eas des mélanges tampons de phosphats, il est habituellement suffisant d'utiliser une concentration de 0,03 à 0,07 mole, en raison de la plus grande force ionique. Lorsqu'on utilise de grandeS/^uantité s de solvant organique, 25 il convient de s!assurer que la protéine est soluble 'dans 1© mélange, si elle est disponible sous la forme pure. Par ailleurs, de faibles concentrations en solvant organique ralentissent l'élution et compliquent le problème de l'instabilité de la structure tertiaire, qui est vitale pour l'activité de la protéine. 30 Parmi les divers solvants organiques, le méthanol, par exem ple, assure un® séparation correcte dans une large gamme de concentrations» Les solvants moins polaires tels que 1'éthanol et le 2-propanol sont toutefois utilisés plus avantageusement à des concentrations inférieures à environ 60 $. De préférence, la 35 quantité de solvant peut aller d'environ 40 à 55 $ en volume. On décrit ci-après la préparation des résines macro-réticulaires. 70 32431 7 2061605 Les diverses résines préparées comme décrit dans ce qui suit se sont montrées très intéressantes à utiliser dans le procédé de 1'invention. Résine A On charge un mélange de 35 g de styrène, 35 g de divinyl-5 benzène technique, 104 g de kérosène désodorisé, 55 g de toluène et 1,5 g de peroxyde de benzoyle dans une solution de 8,8 g de chlorure de sodium, 5,1 g de résine "Amberlite"W-1 (sel d'ammonium d'nn copolymère de styrène et d'anhydride maléique , Rohm and Haas Co., Philadelphie), 1,4 g de bicarbonate de sodium et 10 0,06 g de gélatine dans 250 g d'eau. On agite le mélange jusqu'à ce que la phase organique soit dispersée sous la forme de fines gouttelettes, puis on le chauffe à 80°C pendant cinq heures. Le mélange de liquides est éliminé par aspiration des perles de polymère que l'on obtient, puis les perles sont lavées abon-15 damment avec du méthanol, jusqu'à ce que l'addition de la liqueur de lavage à de l'eau ne montre pas de trouble. On les sèche ensuite à l'air pour obtenir 59 g de perles sphériques blanches et opaques, puis on les tamise pour obtenir la granulométrie correcte dans la gamme de 0,149 à 0,84 mm. 20 Résine B On prépare les mélanges suivants de phase huileuse et de phase aqueuse et on les introduit dans une fiole de 3 litres : Phase huileuse : Divinylbenzène 122,5 g 30 25 redistillé, qualité technique, (60 io de divinylbenzène et 40 fo d'éthyl-styrène) Styrène Kérosène désodorisé o-dichlorobenzène • Peroxyde de benzoyle 122,5 g 364 g 361 g "5,25 g Phase aqueuse : Eau désionisée 875 ml 30,8 g 35 Chlorure de sodium Bicarbonate de sodium "Amberlite"¥-1 Gélatine comestible "Knox" 17,85 g 0,21 g 4,9 g 70 32431 8 2061605 On utilise un agitateur à palettes tournant à 175 tr/mn. On transforme le mélange en une suspension uniforme, puis on chauffe la suspension pendant 16 heures à 80°C. les perles de polymère que l'on obtient sont lavées quatre fois avec un litre 5 d'eau désionisée, trois fois avec un litre d'éthanol (éthanol dénaturé 2B) et trois fois avec un litre de toluène. On transvase les perles dans une colonne chromatographique et on les lave avec du méthanol jusqu'à ce qu'elles soient exemptes de toluent. Le méthanol en excès est éliminé par succion et les perles sont chauffées 10 au reflux avec une solution de 50 g d'hydroxyde de potassium dans 1,4 litre d'éthanol pendant 7 heures. On les débarrasse de l'hydroxyde de potassium par lavage dans la colonne avec de l'é-thanol, et on les sèche à l'air. On les tamise pour obtenir les fractions suivantes : 21,7 g de perles supérieures à 1,00 mm ; 15 158,7 g de perles comprises entre 0,297 et 1,00 mm ; 56,4 g de perles inférieures à 0,297 mm. Résine C On prépare une solution homogène dans un flacon de 12 1 à partir de 6 000 g d'eau, 180 g de chlorure de sodium, 6 g de 20 gélatine et 72 g d'une solution aqueuse à 12,5 $ en poids de polyacrylate de sodium. On ajuste le pH de la solution à 8-9 avec une solution aqueuse concentrée d'ammoniac. On introduit dans le réacteur un mélange de 900 g de triméthacrylate de triméthylolpropane du commerce, 9 g de peroxyde de lauroyle et 2 100 g 25 de toluène. (On constate par chromatographie en phase gazeuse et liquide que le triméthacrylate de triméthylolpropane du commerce contient 92 $ de triester et 8 $ de diester, c'est-à-dire le diméthacrylate de triméthylolpropane). La dispersion de liquide organique dans une phase" aqueuse est préparée à la température 30 ambiante à 80 tr/mn en effectuant des cycles d'agitation et d'arrêt d'agitation jusqu'à ce qu*il ne reste qu'une phase de gouttelettes et une phase aqueuse en l'absence d'agitation. La formation de la dispersion prend environ 15 minutes. Les gouttelettes sont polymérisées sous atmosphère d'azote à 65°0 pendant 20 heures, 35 en sphères opaques pleines qui sont lavées et séchées. Le rendement en copolymère séché est de 896 g, soit 99,5 f° de la théorie. 70 32431 9 2061605 Résine D On utilise dans la préparation des résines A et B, un système mixte de solvants aliphatique et aromatique, le solvant de la préparation de résine A est le kérosène désodorisé et le toluène ; pour la résine B , il s'agit de kérosène désodorisé et de o-dichlorobenzène. La série de la résine D, au contraire, se prépare avec un seul solvant organique, à savoir le 4-méthyl-2-pentanol. La quantité de divinylbenzène et de solvant s'exprime par un pourcentage du monomère total utilisé. TABLEAU I Caractéristiques des résines A. B et G Résine Surface spécifique (m2/«) Porosité ($ en volume) Distribution des diamètres des pores ($) Volume apparent de 1 g de résine, (ml) moins de 0,01 micron 0,01 à 0,1 micron 0,1 à 1,0 micron dans l'air dans le méthanol dans l'eau A ' 270 60 16 48 36 4,0 6,3 . 5,4 B 500 43 12 79 9 2,85 5,75 4,9 ' C - 450 55 19 76 5 3,0 5,9 5,4 O OJ NJ -t* CjO tO O o o o en 70 32431 2061605 TABLEAU II Préparation et caractéristiques des résines divinylbenzéniques de la série D 10 Résine Divinylbenzène Solvant ($) Surface spécifique (rn^/g) Porosité, % en volume D-1 10 45 16 47 D-2 20 45 52 52 D-3 30 45 53 57 D-4 50 33 340 40 D-5 50 40 209 53 EXEMPLE 1 L'a-amylase, enzyme produit par Bacillus subtilis , cons- titue un excellent principe actif pour des essais d'adsorption, car il possède une remarquable stabilité dans diverses conditions 15 ambiantes, notamment la température. Le liquide biotique que l'on utilise est le filtrat d'un bouillon de fermentation enzymatique préparé dans l'ensemble conformément au procédé enseigné par le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2 530 210. Ce produit, sous la forme stabilisée présentant une activité normalisée, est 20 vendu dans le commerce par la Firme Rohm and Haas Co., Philadelphie, sous le nom de "Rhozyme GC Extra". Le filtrat brut de la culture est une solution stable de couleur brune qui, en plus de l'a-amylase, contient au moins deux protéases, d'autres protéines, des glucides, des amino-acides, 25 des polypeptides et des sels provenant du milieu nutritif. La teneur en matières sèches est d'environ 10 $. L'activité enzymatique de l'a-amylase se détermine en mesurant la réduction de viscosité d'une solution de fécule de pomme de terre à la gélatine à un pH de 6,7 après 0,1 à 0,3 heure 30 d'incubation à 70°C. L'activité s'exprime en unités FM, qu'on appelle aussi unités Rhofon. Cet essai est également décrit dans "Test Methods for DetermirringDiastatic Activity" (Fascicule 1T° T-40A, Rohm and Haas Co., Philadelphie). Le liquide biotique utilisé dans cet exemple a une activité de 9 000 Unités FM par 35 ml. On détermine le taux en équilibre d'a-amylase porté par chacune des résines. D'abord, les perles de polymère sont 70 32431 12 2061605 préalablement traitées par trempage dans du méthanol pendant environ 30 minutes, en remplaçant ensuite le méthanol par de l'eau exempte de chlore. Les perles sont ensuite mises en contact avec le filtrat contenant l'enzyme et on les laisse s'équilibrer 5 avec ce filtrat. On détermine ensuite la quantité adsorbée d'enzyme, les résultats étant donnés sur le Tableau III. TABLEAU III Adsorption de l'a-amylase sur divers polymères de divinylbenzène 10 Résine Adsorption (Unités EM/g de résine) A 166 300 B 300 000 15 C 150 000 D~1 34 600 D-2 19 600 D-3 44 800 D-4 19 200 20 B-5 31 400 Les résultats montrent que toutes ces résines, répondant à la définition générale donnée selon l'invention, varient largement quant à leurs caractéristiques, et adsorbent des quan-25 tités importantes d'a-amylase, qui est une grande molécule dont le poids moléculaire est égal à environ 100.000. L'a-amylase cristalline, préparée au moyen des procédés doiînés dans la littérature, titre 3 100 unités EM par mg de protéine. Ceci signifie qu'à l'équilibre, avec 1 g de résine de la série 3) (base 30 sèche), la quantité adsorbée d'amylase est de 6 à 15 mg et avec la classe préférée de résines de l'invention (résines A, B et C), la quantité adsorbée va de 50 à 100 mg, ce qui montre une • différence d'un facteur dix. Bien que ces résultats s'obtiennent en utilisant le fil-35 trat d'un bouillon de culture contenant l'enzyme de B. subtilis , le milieu non filtré contenant des bactéries, des spores et des débris nutritifs peut être tout aussi bien utilisé, et en fait, 70 32431 13 2061605 ce procédé permet de simplifier considérablement l'isolement des exo-enzymes de ce type, ainsi que de concentrer ces derniers. Une fois que l'enzyme a été adsorbé, il n'est éliminé qu'en faibles quantités par un lavage prolongé à l'eau ou par des 5 lavages avec des solutions de sel ou des solutions tampons, comme on en utilisait pour l'élution dans la technique antérieure avec certaines autres variétés d'adsorbants. De même, un lavage avec des alcools inférieurs ou des mélanges d'alcool et d'eau n'élimine qu'une faible partie de l'enzyme. 10 EXEMPLE 2 On agite 20 ml du filtrat de bouillon de fermentation de B. subtilis pendant deux heures avec 1 g de résine A, préalablement traitée comme dans l'exemple 1. On isole les perles par fil-tration et les lave avec de l'eau exempte de chlore. La détermina-15 tion de l'activité d'a-amylase et de la teneur en protéine sur le filtrat et les eaux de lavage montre par différence que la résine a adsorbé environ 280 mg de protéine, et 144 000 unités FM d'activité. Le polymère humide est placé dans une colonne d'environ 20 1 cm de diamètre intérieur, et on ajoute un agent d'élution composé d'une partie de méthanol et d'une partie de solution de chlorure de sodium 0,2 M, en maintenant l'alimentation et l'écoulement de manière qu'il reste sur la colonne au moins un volume d'éluant égal au volume du lit. On fait passer 100 ml à travers la 25 colonne en une période de deux heures. On dose ensuite la protéine dans l'effluent par la méthode au biuret [Methods in Enzymology, Yolume 3» page 450 (Academic Press, 1957)] et on dose l'activité d'amylase. On trouve environ 140 000 unités FM d'activité et 160 mg de protéine. 30 Un dosage des matières sèches sur le filtrat enzymatique initial montre qu'il y a environ 2 g de matière non volatile (protéine, amino-acides,sels, glucides) dans les .20 ml utilisés. Un dosage des matières sèches par rapport à l'a-amylase éluée montre la présence de moins de 200 mg de matières sèches en plus 35 du sel utilisé dans l'éluant. La quantité restante de 1,8 g de substances non volatiles se retrouve dans le courant sortant des. lavages initiaux à l'eau. 70 32431 2061605 Ceci montre que l'enzyme est sélectivement adsorbé sur la résine et peut en être isolé presque quantitativement. EXEMPLE 3 On charge 1 g de résine A avec 86 000 unités FM d'acti- 5 vité d'a-amylase comme décrit dans 1'exemple 2. On sèche ensuite la résine en la plaçant dans un évaporateur rotatif et en éliminant l'eau sous vide poussé. On la laisse ensuite reposer à la température ambiante. Au bout de 10 jours» on la place dans une colonne et on procède à son élution en utilisant une solution de méthanol 10 à 70 $, contenant 0,067 mole de ÎTaCl. On récupère 84 000 unités FM d'activité, soit 98 fo de l'activité initiale. Ceci montre que l'enzyme porté par la résine reste stable, et ne perd pas sa configuration active. l'exemple 1, pendant 2 heures avec 20 ml de filtrat enzymatique qui contient 172 000 unités FM d'activité d'a-amylase et 510 mg de protéine (par dosage au biuret ). On transvase la résine dans une colonne et on la lave à l'eau» On rassemble les eaux de lavage 20 et le. filtrat enzymatique récupéré pour former une fraction appelée fraction DF non absorbée. Elle a une activité de 28 000 unités FM et contient 230 mg de protéine, la colonne contient ensuite 280 mg de protéine et présente 144 000 unités FM d'activité. Elle est éluée à la température ambiante avec du méthanol à 50 fa 25 contenant 0,03 mole de NaCl et on analyse chaque fraction de 10 ml pour doser la protéine et l'activité d'amylase, les résultats étant reproduits sur le tableau IV. TABLEAU IV Elution de l'a-amylase avec une 30 solution de FaCl 0.03 M dans le méthanol à 50$ Fraction Unités mg de protéine Activité spécifique EXEMPLE 4 15 On agite 1 g de résine A, préalablement traitée comme dans FM Fraction DF initiale 172 000 510 340 35 Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3 Fraction 4 Fraction 5 15 000 60 500 19 600 12 380 6 650 80 40 14,5 9,5 7,0 1 510 1 350 1 305 950 190 70 32431 15 2061605 Le tableau IY montre qu'une purification d'un facteur 4 à 5 de l'enzyme, sur la base de la protéine totale pouvant être dosée au biuret, peut être effectuée avec une bonne récupération totale et sans dilution indésirable. L'éluat peut être 5 débarrassé du méthanol en utilisant le vide, à la température ambiante, pour obtenir une solution stable de l'enzyme. EXEMPLE 5 En procédant comme dans l'exemple 2, on charge de la résine A avec de l'a-amylase, enzyme de B. subtilis.(ll y a lieu 10 de remarquer toutefois que dans l'essai 17, on utilise une résine différente et que,dans l'essai 16, on utilise un bouillon de culture non filtré). Le tableau V récapitule les résultats obtenus en utilisant diverses solutions d'éluant contenant de l'eau, un solvant et un sel. TABLEAU V Elution de l'a-amylase avec divers éluants Mélange d'éluant Résine Activité(unités FM) Protéine (mg)— Essai • Volo Solvant" i* Bel Molarité Résine . Résine Résine Résine — n° (ml) chargée éluée chargée éluée 1 50 CH^OH 50 NaCl 1,9 1 8*1: .000 81 000 CjJ NJ Js» 2 10 CH^OH 70 acétate de. Na 1,0 . 1 132. 000 120 150 258 116. OU 3 80 CH^OH 50 Na2S0lf •0,07 1 116 800 103 000 . 260 •180 b 90 CH3OH 70 acétate de Na 2,0 1 125 300 98 300 «260 201 5 50 CH-jOH 50 CaClg 0,9^ 1 137.^00 98.070 258 185 6 100 CH3OH KC1 1,0 " • 1 159 900 157 000 285 175 7. 9V ch3oh 3 50 •NaCl 0,03 1 155 950 12V 000 260 157 CTv 8 90 CH. OH 3 50 CaCl2 . 0,1 1 161 250 111,000 285 212 9 73 CH^ÔH 50 *Hy aminé' 1622— 0^22 1 13^. 600 102 000 — 10 75 ch3OH 50 BTEAC- o.,o^ 1 lU6 800 129.500 11 100 CgH^OH 50 1Sorenson— 0,033 o,5 65 000 66 000 12 100 CHo0H 3 50 Sorenson^ 0,033 o,5 56 900 1+3 600^- 81 80 K) O O 13 12 c2h5°h 70 NaCl' O-^ 1 76 200 5*+ 000 1— ik 1C2 CgH^OH 50 •NaCl 1,0 10 1 0 0 0 0 0 985 000 ' mm mm mm O n5 3 i-C^H^OH 70 NaCl 0,9 1 76 200 38 000 — — — mmmm _ O Ln TABLEAU V (Suite) Mélange d'éluant Résine Activité (unités FM) Protéine (me)— Essai n° Vol. (ml) Solvant $ Sel Molarité (g) Résine chargée Résine éluée Résine Résine chargée éluée 16 50 CÏÏL0H 3 70 Citrate de Na 0,03 1 69 100 40 150— (_Aj 17£ 10 CH,C0CH, 3 3 50 . "Sorenson"— 0,033 2— 10 700 9 000 NJ CO — Dosée par la méthode au Muret. *b — Le produit "Hyamine 1622" est le chlorure d'octylphénoxyéthoxyéthyl-diméthylammonium, vendu par la Firme Rohm and Haas Co.,Philadelphie. £ BTEAC = chlorure de benzyltriéthylammonium. a — Le tampon de ''Sorenson" consiste en FapHP04 et KHgPO , chacun à la concentration de 1 /1 5 M, en mélange à 60:40 , le pH étant ajusté à 8 avec ae 1' hydroxyde4de sodium. Ce tampon est mélangé dans les proportions appropriées avec un solvant organique. — On récupère également 74 $ de protéase adsorbée de B. subtilis. f ✓ — On utilise un bouillon enzymatique non filtré. & La résine est un polypère contenant 3 $ de divinylbenzène, 2 $ d'éthylstyrène, et 95 $ de styrène, ayant une surface spécifique d'environ 10 m2/g et une porosité de 67 $. ^ Millilitres de résine humide. "O O o o en 70 32431 2061605 les résultats du. tableau-V montrent que l'addition de petites quantités seulement d'une grande variété de sels, comme déjà défini, au solvant aqueux-organique, permet des taux élevés de.récupération d'enzyme actif. En contraste avec ce qui précède, on a constaté 5 que l'eau et les solutions aqueuses de sels ou de tampons n'effectuent pas d'élution de l'enzyme» Une solution de méthanol à 50 exempte de sel, n'élue que 5 $ de l'activité.enzymatique, et le méthanol pur ou le méthanol à 20 $ n'élue essentiellement aucune activité. Le mélange d'élution, comme défini , exerce par conséquent 10 un effet très spécifique et tout à fait inattendu. TTX WMSLB 6 Une colonne de 7,9 cm de diamètre et 120 cm. de hauteur est garnie de 3 820 ml (660-700 g) de perles de résine B, qui a été soumise à un trempage préalable dans de 1'éthanol anhydre (alcool 15 dénaturé 2B). Les perles sont lavées à l'eau et le niveau d'eau est ajusté au sommet de la colonne. On fait passer à travers la colonne un bouillon non filtré d'enzyme bactérien provenant de Bacillus substilis , titrant 24 700 unités M par g, à un débit d'environ 80 ml par minute jusqu'à ce que 3 500 g aient été chargés. 20 On fait ensuite passer 7 000 g d'eau à travers la colonne à un débit de 150 à 200 ml par minute, puis on fait encore passer 11 000 g d'eau pour assurer un lavage complet. On recueille le courant sortant. Le courant sortant total contient 3 620 000 unités FM, se trouvant presque en totalité dans les 7 000 premiers grammes 25 d'eau de lavage» en laissant adsorbées sur la colonne 82 830 000 unités FM d'activité. On fait ensuite passer à travers la colonne l'éluant composé d'éthanol anhydre à 50 % (alcool dénaturé 2B) dans l'eau, contenant 5,66 $ de chlorure de sodium , à la température ambiante à un débit 30 de 120 à 130 ml par minute, et on recueille des fractions, représentant chacune environ 1 000 g d'éluant. Le dosage d'activité de ces fractions donne les valeurs de récupération reproduites sur le tableau YIe 70 32431 19 2061605 TABLEAU VI Elution à la température ambiante de 1'a-amylase Fraction d1éluat Poids .(«) Unités FM , total Unités FM par g fo de la quantité adsorbée 5 1 988 0 0 0 2 999 415.000 415 . 0,5 3 993 38 150 000 38 400 46 4 987 20 000 000 20 300 24 5 1 068 9 725 000 9-100 12 10 6 1 181 5 200 000 4 400 6 7 992 2 340 000 2 350 3 8 1 007 ■i \ 460 150 1 -450 2 9 r 117 1 072 320 960 1 10 975 635 000 650 0,8 15 Totaux 10 308 78 997 470 — 95,5 Après que 1'éthanol a été éliminé de la fraction 3, la fraction contient 76 000 unités FM par gramme, c'est-à-dire une concentration de trois fois le taux d'activité du bouillon chargé sur la colonne. 20 On refroidit 10 ml d'un éluat analogue contenant 16 400 unités FM d'activité par g, on ajoute 15 ml d 'éthanol (2B) froid et 0,1 g d'amidon de maïs, et on laisse le mélange se sédimenter pendant 10 minutes. L'enzyme précipité est filtré en donruant 125,3 mg de poudre sèche qui a une activité de 950 unités FM par mg. 25 Ceci est à comparer avec environ 3 000 unités FM par mg'dans le cas de l'a-amylase cristallisée . Les éluats sont exempts de cellules, de spores et de sous-produits tels que glucides et amino-acides. On obtient un motif d'élution encore plus net lorsqu'on effectue l'élution à une température élevée, à savoir à environ 30 40°. L'élution de cet enzyme est relativement insensible au pH et peut être effectuée entre des valeurs de pH de 6 et 9, sans qu'il y ait de différences notables. EXEMPLE 7 On a constaté que la protéase fongique dérivée d'Aspergillus 35 oryzae [Bergkvist, Acta Chem. Scand., 17, 1521 (1963)] est sensible auxsystèmes dféluants de la présente invention. Bien que la récupération de la protéine par élution avec un mélange de méthanol à 70 32431 20 2061605 50 io et de tampon de Sorenson à 50 % (pH 8) soit pratiquement quantitative, la récupération de l'activité est inférieure à 20 Toutefois, cet exemple illustre que lorsque l'élution est effectuée à 0-5°, on récupère dans 1'éluat une bien plus grande quantité 5 de l'activité en place sur la colonne. Après traitement préparatoire, on agite un gramme de résine A, (en particules de 0,149 à 0,297 mm) avec 20 ml d'une solution contenant 500 mg de protéase d'Aspergillus oryzae (430 mg de protéine) pendant une heure, la suspension de perles est transvasée dans une 10 colonne chromatographique de petites dimensions, sur laquelle elle est lavée à l'eau (50 ml) à 0°C. l'analyse de l'eau de lavage montre que 278 mg de protéase fongique (262 mg de protéine) ont été adsorbés. la colonne est entourée d'une chemise à travers laquelle on fait circuler de l'eau glacée pour maintenir la tempé-15 rature à 0-5°. l'enzyme est élué avec un mélange glacé .de méthanol (50 iô) et de tampon de Sorenson à un pH égal à 8 (50 fo). On recueille 50 ml d'éluat et par mesure de la viscosité à la gélatine et dosage de la protéine au biuret, on constate que 1'éluat contient environ 200 mg de la protéase fongique, soit 74 de l'activité 20 initiale. On a également constaté qu'un autre procédé d'amélioration de la stabilité vis-à-vis de l'élution consiste à utiliser une plus faible quantité de solvant organique (par exemple du chlorure de lithium 1 M dans le méthanol à 25 fo) , mais l'élution est plus lente et le taux; de récupération n'est pas aussi bon. 25 EXEMILE 8 On prépare une portion de 20 g de résine B (en particules de 0,149 à 0,297 mm) par trempage dans de 1'éthanol (2B) suivi d'un lavage à l'eau de ville. la résine est ensuite placée dans une colonne d'environ 2,5 cm de diamètre„ 30 On fait passer un litre d'un bouillon filtré de culture dè Bacillus subtilis ajusté à un pH de 5,85 à travers la résine à un débit de 5 à 6 ml par minute. Le bouillon a été préparé selon le procédé décrit dans le brevet des Pays-Bas n° 6 707 740 et contient comme principe actif la protéase bactérienne alcaline dé-35 crite par DeLange et Collaborateurs, "J. Biol. Chem'.', 243 , 2134 (1968). Son activité est déterminée par l'augmentation des chromo-phores solubles dans l'acide trichloracétique par traitement de 70 32431 21 2061605 l'azocaséine avec l'enzyme à un pH égal à 8,5 pendant 20 minutes à 40°C. le litre de bouillon de culture contient 14 550 000 unités d'activité de protéase. la colonne est ensuite lavée avec 850 ml d'eau à un débit 5 de 8 ml par minute, l'analyse du courant sortant et des eaux de lavage montre que l'activité protéolytique a été adsorbée à 97 sur la résine. la colonne est ensuite éluée avec une solution ajustée à un pH égal à 9,5 avec de l'ammoniaque, contenant 2,8 $ de STaCl dans un 10 mélange à 1 :1 d'éthanol et d'eau, la solution passant à un débit de 5 à 6 ml par minute, les résultats étant reproduits sur le Tableau VII. TAB1EAÏÏ 711 Elution de la protéase bactérienne alcaline Fraction d'éluat Volume (ml) libre total d'unités d'activité Nbre d'unités d'activité par g i<> de la quantité adsorbée 1 22 3 190 000 145 000 22,5 2 23 4 600 000 200 000 32,5 3 22 2 508 000 114 000 17,8 4 31 1 410 500 45 500 10,0 5 31 446 400 14 400 3,2 6 40 88 000 2 200 0,6 7 100 25 000 250 0,2 Totaux 269 12 267.900 — 86,8 Il y a lieu de remarquer que les fractions d'éluat 1 à 6, représentant 169 ml, contiennent 86,6 $ de l'activité de protéase 25 adsorbée. Par conséquent} on obtient une concentration d'environ cinq fois, même avant que l'alcool soit éliminé, et le produit est exempt de matière étrangère. EXEMPLE 9 On prépare une colonne à partir de 10 g de résine C, et 30 on fait passer à travers la colonne 550 ml (12 650 000 unités d'activité) de bouillon filtré de culture B. subtilis de l'exemple 8 à un débit d'environ 2 ml par minute. On lave la colonne avec environ262 ml d'eau, l'analyse du courant sortant et des eaux de lavage montre que l'activité protéolytique a été adsorbée à 72 $> 35 sur la résine. la colonne est ensuite éluée avec l'éluant utilisé dans l'exemple 8, les résultats étant reproduits sur le Tableau VIII. 70 32431 2061605 TABLEAU VIII Elution de la protéase bactérienne alcaline Fraction Volume Kbre total d'unités Nbre d'unités d'ac- de la d'éluat (ml) d'activité tivité par g quantité adsorbée 5 1 18 875 000 48 700 9,5 2 20 3 800 000 191 000 41,4 3 21 2 500 000 - 118 000 27,3 4 21 880 000 42 200 9,6 5 20 280 000 14 000 3,0 10 6 20 88 000 4 400 • 1,0 7 55 83 000 1 510 0,9 totaux 175 8 506 000 — 92,7 EyravrPT.E m 15 La pepsine, principale protéase rencontrée dans l'estomac, poids moléculaire 35 000 , pl inférieur à 1) est caractérisée par une absorption des rayons ultraviolets à 278 mji , que l'on peut utiliser pour suivre 1'adsorption et la désorption. Une solution de pepsine (400 mg) dans le tampon de Me Ilvaine 20 à un pH égal à 3,5 (50 ml) est mise en contact avec 1 g de résine B pendant 7 heures, sous agitation. La matière adsorbée, correspondant à 300 mg (397 unités d'acitivité), est éluée avec de 1'éthanol aqueux à 1;1 contenant 5,5 $ de NaCl. L'éluant contient 192 mg de pepsine (238 unités d'activité), ou 64 f° de la matière adsorbée. 25 TiiTMELE 11 De la gamma-chymotryp sine (poids moléculaire 24 000 5 pl égal à 8), protéase pancréatique, est placée sur la résine B (1 g) et sur la résine C (1 g). On effectue des titrations par la méthode de dosage de la protéine au biuret en utilisant l'albumine de boeuf 30 comme étalon. Chaque résine adsorbé environ 150 mg (sur la base de l'albumine de boeuf). On utilise deux éluants : de l'éthanol aqueux à 1 ;1 contenant 5?5 i° de ïïaCl ; et de l'éthanol aqueux à 50 % contenant de l'acide chlorhydrique à une normalité de 0,0054 N et 4,56 $-de chlorure de sodium. La chymotrypsine ne se dissout pas 35 dans le premier éluant, mais elle se dissout dans le second. Dans chaque cas, de faibles quantités de l'enzyme sont éluées. En faisant varier la composition de l'éluant, comme décrit ci-dessusr on peut 70 32431 25 2061605 récupérer de plus grandes quantités de matière adsorbée. EXEMPLE 1 2 La phosphatase de venin de serpent hydrolyse les 5'-phos-phates de nucléoside en nucléosides correspondants. En utilisant 5 la méthode^ de dosage au biuret , on constate que 50 mg de la résine B ont adsorbé 5,2 mg de cette phosphatase. L'élution avec de l'éthanol aqueux à 1 :1 contenant 5,5 $ de NaCl donne un taux de récupération de 52 io de la phosphatase adsorbée,, EXEMPLE 15 10 On étudie également la gélatine (collagène partiellement hydrolyse) et deux protéines du sang, la sérum-albumine (poids moléculaire 70 000,pl ^al à 4,7) et la gamma-globuline (poids moléculaire 150 000), en utilisant 1 g de résine B au moyen du procédé de 1'exemple 10. 15 Environ 50 mg de gélatine sont adsorbés ; 162 mg de sérum- albumine sont adsorbés; et 135 mg de gamma-globuline sont adsorbés. La récupération de ces protéines peut être effectuée au moyen d'un éluant dans la gamme de compositions mentionnée ci-dessus ; en tenant compte de ce que les protéines le plus fortement 20 adsorbées requièrent généralement des compositions plus strictes pour que l'élution soit complète. EXEMPLE 14 La vasopressine (poids moléculaire 1055) est une hormone polypeptidique obtenue par extraction de la glande pituitaire 25 postérieure. Une solution de cette hormone dérivée du porc contenant 2,04 mg de protéine pouvant être dosée au biuret dans 5 ml d'eau distillée, est agitée par secousses avec 50 mg de résine B pendant 24 heures. La résine est ensuite placée dans une colonne de 6 mm de diamètre et lavée avec sept volumes d'eau. Le courant sortant de 30 la colonne contient 0,15 mg de protéine pouvant être dosée au biuret. La colonne est ensuite éluée avec 10 ml d'une solution d'éthanol et d'eau à 1 :1 contenant 5,66 $ de NaCl. Par dosage au biuret, on constate que 1'éluat contient 1,76 mg de protéine, ce qui indique un taux de récupération de 93 % de la protéine adsorbée. 35 EXEMPLE 15 L'hormone adrénocorticotrophique (ACTE, poids moléculaire 20 000, pl 4,7) en une quantité correspondant à 6,1 mg de protéine 70 32431 24 2061605 pouvant être dosée au biuret , est dissoute dans 5 ml d'eau distillée. Cette solution est chargée sur une colonne contenant 50 mg de résine B, comme dans l'exemple 14» le courant sortant de la colonne contient environ la moitié de la protéine, en sorte qu'une 5 moitié est adsorbée sur la résine» Après élution avec l'éluant de l'exemple 14, on récupère la totalité de la protéine chargée sur la colonne. EXEMPLE 16 On ajoute 1 g de résine A à 40 ml de HaOH 0,00625 F. 10 De l'insuline (hormone pancréatique, poids moléculaire 6.000) est ensuite ajoutée en quantité de 200 mg , agitée pendant 7 heures, et laissée au repos pendant environ 17 heures. La résine est ensuite transférée dans une colonne de 9 nm de diamètre , puis lavée. Le dosage au biuret du courant sortant montre que 160 mg 15 d'insuline ont été adsorbés. La colonne est éluée avec 50 ml de méthanol aqueux à 50 à 0,05 M dans le phosphate disodique. L'analyse de 1'éluat montre que 116 mg d'insuline ont été récupérés, soit 72 °?<> de l'insuline adsorbée. EXEMPLE 17 20 Le cytochrome C (poids moléculaire 13 000 pl égal à 10,65) est un pigment d'hématine consistant en protéines liées à un fragment d'hématine, à savoir la porphyrine. Le motif d'hématine conduit à de fortes valeurs d'absorption de la lumière ultraviolette à 550 mji qui donne une solution d'un rouge brillant. 25 200 mg de cytochrome C sont dissous dans 40 ml de chlorure de sodium 0,1875 M et la solution est agitée par secousses pendant 25 heures avec 1 g de résine B préalablement traitéee La phase liquide est alors incolore, ce qui indique 1'adsorption totale du cytochrome C, qui correspond à 102 unités d'activité. 30 Le mélange est ensuite transféré dans une colonne de 9 mm de diamètre. Le pigment d'hématine est élué de la colonne avec 35 ml d'un mélange d'éthanol et d'eau à 1;1, contenant 5,66 $ de îîaCl. L'éluant contient 100 unités d'activité, dont la plus grande partie se trouve dans les 25 premiers ml d8éluat, ce qui donne un taux 35 de récupération de 98 70 32431 25 2061605 EXEMPLE 18 Le sulfate de chondroïtine est un mucopolysaccharide contenant une protéine attachée à un squelette sulfaté de poly-saccharide , et c'est un représentant de la classe des poly-saccharides animaux. Lorsqu'une solution de sulfate de chondroïtine est agitée avec la résine B, cette substance n'est pas adsorbée comme le montre l'analyse avec le bleu de toluidine 0. Ceci démontre que des mélanges contenant des mucopoly-saccharides en présence de protéines peuvent être traités conformément à la présente invention sans interférence due à cette classe courante de composés. 26 2061605 70 32431 BEYEEDICATIONS 1- Procédé de séparation d'un polypeptide d'un liquide aqueux, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire entrer un liquide aqueux contenant un polypeptide en contact avec une résine macro-réticulaire ayant une surface spécifique au moins égale à environ 5 10 m^/g, une porosité comprise entre environ 0,001 et 1 micron, pour effectuer 1'adsorption du polypeptide sur la résine macro-réticulaire, puis à. faire entrer la résine macro-réticulaire en contact avec un éluant consistant essentiellement en de l'eau, un solvant organique miscible de faible poids moléculaire et un composé 10 ionisant soluble dans le mélange d'eau et de solvant pour éluer le polypeptide de la résine macro-réticulaire. 2- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la résine macro-réticulaire consiste essentiellement en un copolymère de divinylbenzène et de styrène, d'éthylstyrène ou de leurs mé- 15 langes, ou en un copolymère de triméthacrylate de triméthylolpropane et de diméthacrylate_àe triméthylolpropane. 3- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la résine macro-réticulaire a une surface spécifique d'au moins 2 environ 200 m ./g, une porosité comprise entre environ 40 et 75 f° en volume, un diamètre moyen des pores compris entre environ 0,01 et 1 20 micron, et une expansion en volume d'au moins 50 f° lorsqu'elle est placée dans le méthanol, la résine macro-réticulaire consistant essentiellement en un copolymère ayant des macromolécules réticulées de contenant au moins environ 30 f> de motifs/divinylbenzène ainsi que des motifs d'éthylstyrène, des motifs de styrène ou leurs mélanges, 25 ou bien au moins environ 90 f de motifs de triméthacrylate de triméthylolpropane ainsi que des motifs, de diméthacrylate de triméthylolpropane . 4- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en outre à laver la résine macro-réticulaire avec une 30 solution consistant essentiellement en de l'eau et moins d'environ 5 f° d'un sel, après que la résine a été mise en contact avec le liquide aqueux, mais avant que la résine macro-réticulaire n'ait été mise en contact avec l'éluant. 5- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait 35 qu'il consiste en outre à maintenir la résine en contact avec la solution de lavage avant l'élution. 70 32431 27 2061605 6- Procédé suivant la revendication 4 caractérisé par le fait que la température est inférieure à environ I0°C. 7- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en outre à sécher la résine macro-réticulaire 5 après qu'elle a été mise en contact avec le liquide aqueux, mais avant que la résine macro-réticulaire n'ait été mise en contact avec l'éluant. 8- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à volatiliser le solvant organique après 10 élution. 9- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'éluant contient entre environ 25 et 70 i° en volume de solvant organique et entre environ 0,02 et 2 moles de sel. 10- Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le 15 fait que le solvant organique est le méthanol, l'éthanol, le 1-propanol, le 2-propanol, l'acétone, l'acétonitrile, le nitro-méthane, 1'éthylène-glycol ou un mélange de ces solvants. 11- Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que le composé ionisant est le chlorure de lithium, le 20 chlorure de sodium, le chlorure de calcium, le chlorure de potassium, le phophate trisodique, le phosphate monopotassique, le phosphate disodique, le sulfate de sodium, le chlorure de benzyl-triéthylammonium, le chlorure d ' octylphénoxyéthoxyéthyldimé.thyl-ammonium, l'acétate de sodium, le citrate de sodium-ou tm mé*--' 25 lange de ces composés. 12- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le liquide aqueux est un milieu de culture ou un bouillon nutr itif/c une^' aciérie, un champignon ou une levure, ou le sang ou un composant du sang, l'urine, la sève, la salive, le suc gas- 30 trique ou des sécrétiohs glandulaires, ou un extrait de cellules désintégrées, ou un mélange réactionnel qui contient un polypeptide. 13- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à séparer la matière en particules du liquide 35 aqueux avant sa mise en contact avec la résine macro-réticulaire. 70 32431 28 2061605 14- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le polypeptide est une protéine, telle qu'un enzyme, ou bien le polypeptide est une hormone, ou un pigment de 1'hématine.