Brevet FR2070068A1 — publié le 19710910

i 2070068 La présente invention a trait à "une nouvelle substance antibiotique utile, dénommée ci-après la négamycine, et à sa préparation. Plus spécialement, elle a trait à sa production par fermentation et à des méthodes pour sa récupération et sa purification. La présente invention englobe cet agent bactéricide et ses sels en solutions diluées, sous forme de concentrés bruts, sous forme de solides bruts et sous forme de solide pur. Cette substance est efficace pour l'inhibition de Pseudomonas« Salmo-nella, Klebsiella et Staphylococci. Cette substance a une faible toxicité et présente un effet thérapeutique sur des infections de Pseudomonas et autres organismes sensibles chez des souris. Cette substance est utile dans la guérison d'infections de Pseudomonas et autres organismes sensibles chez l'homme et les animaux:» La présente invention fournit, à titre de produit nouveau, une substance antibiotique (et ses sels) qui, efficace dans 1' inhibition de Pseudomonas. Salmonella» Klebsiella et Staphylococ-ci , est soluble dans l'eau et pratiquement insoluble dans le méthanol, l'éthanol, le butanol, 1'éthylacétate, le butylacétate, le chloroforme, et le benzène, ne présente pas d'absorption maximum de lumière ultraviolette de 220 à 400 m^o. , donne des réactions positives à la ninhydrine, au tétrazole rouge et à Rydon-Smith, et des réactions négatives à Safcaguchi et Molich, présente des bandes d'absorption dans la région infra-rouge du spectre quand elle est en pastilles avec du bromure de potassium aux nombres d'ondes suivants en cm*"'' : 34-30,3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820, 720 est optiquement active , (bt ^ ^ » + 2,5° (c2, HgO), a pour formula moléculaire C^HgQU^O^, montre trois valeurs gK de 3,55» 8,10, 9j75 et a la structure suivante s CH2-CH-CH2 -CH-CH2 -C-HE-îf-CH2 -C00H 1 1 1 11 I nh2 OH EH2 0 3 Dans le dessin annexé, la figure 1 est le spectre d'absœ-p^-tion d ' infra-rouge de la négamycine prise avec du bromure de potassium, et la fig. 2 est le spectre de résonance magnétique nucléaire de la négamycine dans DgO» Il est fourni selon la présente invention le procédé pour la production de la négamycine antibiotique qui consiste à cultiver une souche de Streptomyces purpeofuscus dans un milieu nutritif sous des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une quanti 70 16701 2 2070068 té importante de négamycine se soit accumulée dans ladite solutionc L'organisme produisant l'antibiotique de la présente invention a été découvert par la demanderesse et a été isolé 5 d'un échantillon de sol recueilli à Myogisan, Préfecture de Gunma, JAPON, en Âoïït 1964 ; il a reçu le numéro de laboratoire M890-G2® La négamycine a également été isolée de deux autres souches qui ont reçu les numéros de laboratoire MA.91-M1 et MA104-M1„ La souche ÎT® MA91-M1 a été isolée d'un échantillon de sol re-10 cueilli à Nojiriko, Préfecture de ÏTagano, JAPON en Janvier 1965, et la souche N0 MA104-M1 a été isolée d'un échantillon de sol recueilli à Sakomachi, ville de Tokushima, JAPON, en Février 1965» Ces souches ont de nombreuses propriétés communes avec la souche n° M890-C2 et également avec le Streptomyces purpeofuscus0 Bieà 25 souche N° M890-C2 a les caractères suivants ; sous le microscope un substrat de mycélium bien ramifié se développe directement en mycélium flexueux sans ramification en verticille, ni formation de spirales 5 la surface de's spores ést lisse. Caractères sur divers milieux (la-désignation des couleurs 30 est donnée entre parenthèses conformément au ™ Color Harmony Manual" de la "Container Corporation of América")1 1) sur milieu Glycerol-gélose de Czapek mis en incubation à 27°C : une croissance jaune pale à brun-jaunâtre foncé (brun d'épice 4 ni) forme un abondant mycélium aérien de couleur gris 35 clair 5 un pigment brunâtre à brun rougeâtre pâle est produit j 2° sur milieu glucose de Krainsky-gélose d'asparagine mis en incubation à 27°C : une croissance brun-jaunâtre (havane pour bagages 4 ne) à brun-jaunâtre foncé (brun girofle 3 ni) produit tin mycélium aérien blanc-jaunâtre à gris brunâtre clair; le pig-40 ment soluble est d'un brun faible ; 70 16701 3 2070068 3) sur un milieu gélose-malate de calcium mis en incubation à 2.7°G, une croissance brun-grisâtre (fauve, 4 ig) produit un mycélium aérien blanc grisâtre à gris clair peu développé. Pas de pigment soluble. le malate de calcium autour de la crois- 5 sance est fortement solubilisé au bout de 3 jours d'incubation ; 4) en solution de peptone contenant 1,0% de nitrate de sodium, mise en incubation à 27°C : croissance incolore à brun jaunâtre pâle sans mycélium aérien. Pas de pigment soluble ou un petit peu de pigment brun. On observe me faible réduction 10 du nitrate ; 5) sur tampon de pomme de terre mis en incubation à 27°C: croissance plissée brun jaunâtre pâle (or clair 2 ic) à brun jaunâtre (érable jaune 3 ng), ensuite brun jaunâtre foncé (brun girofle 3 pl) à noir. Pas de mycélium aérien. Faible pigment 15 soluble brunâtre ; 6) sur plaque de gélose d'amidon mise en incubation à 27°0: une croissance brun jaunâtre pâle à brun jaunâtre (brun épice 4 ni) produit un mycélium aérien de couleur blanc jaunâtre à gris clair. Pigment soluble brunâtre à brun rougeâtre pâle. Hydrolyse 20 positive de l'amidon ; 7) sur milieu nutritif de gélose mis en incubation à 37°C: pas de croissance en 14 jours d'incubation ; 8) sur milieu nutritif de gélose mis en incubation à 27°C: une croissance brun rougeâtre pâle (rouge brique 6 % ng) ne pro- 15 duit pas de mycélium aérien et produit un pigment soluble brun rougeâtre pâle ; 9) sur un milieu de sérum de Loeffler coagulé mis en incubation à 37°0: pas de croissance en 14 jours d'incubation ; 10) sur un morceau de gélatine cultivé à 20°C ï une crois- 30 sance incolore à brun jaunâtre pâle ne produit pas de mycélium aérien et produit un pigment soluble de couleur brune à brun foncé. La liquéfaction de la gélatine est forte ; 11) sur du lait écrémé mis en incubation à 37°0 : une croissance incolore ne produit ni mycélium aérien ni pigment soluble. 35 Après coagulation complète du lait après 4 jours d'incubation, il se produit une lente peptonisation ; 12) sur milieu de gélose de tyrosine mis en incubation à 27°C: une croissance incolore ou grise à brun foncé produit un mince mycélium aérien de couleur blanche à blanc grisâtre.. Une 40 détermination de l'activité de tyrosinase est difficile à cause 70 16701 4 2070068 de la pigmentation noirâtre du pigment soluble ; 13) sur cellulose (papier filtre) mise en incubation à 27° C; rare croissance sans décomposition de la cellulose } 14) utilisation d'hydrates de carbone sur milieu Pridham-5 Gottlieb de base, mis en incubation à 27°C s croissance positive avec amidonf dextrine, glycérol, galactose, glucose, sucrose, maltose et mannose. Croissance négative avec inositol, lactose, marmitol, raffinose, rhamnose, inuline, sorbitol, fructose, xy-lose, arabinose, salicine et dulcitol. 10 i,eS caractères de la souche U° M890 -C2 peuvent être résumés comme suit : elle appartient au genre Streptomyces à mycélium aérien ne formant ni spirales ni verticilles ; la surface des spores est lisse ; sur des milieux divers elle forme une croissance brun jaunâtre foncé avec mycélium aérien gris ou gris clair à 15 gris brunâtre clair : elle ne forme pas de pigment soluble, ou très peu de pigment soluble brun légèrement rougeâtre ; la croissance inverse vire au noir pendant les jours de l'incubation ; sur gélose nutritive à 27°C elle forme une croissance brun rougeâtre et un pigment soluble brun rougeâtre ; elle forme un pigment 20 de mélanine, hydrolyse l'amidon et a une activité protéolytique relativement forte,. Ces propriétés sont conformes à celles de Streptomyces purpeofuscus lamaguchi et Saburi décrit dans 1' International Journal of Systématic Microbiology, 18, 364, 1968® (Doutefois, la souche ÏT° M890-C2 n'utilise pas de lactose et de 25 xylose qui soni? utilisées par Streptomyces purpeofuseus. D'autre part9 une autre souche ÎT° 1ÎA104—M1 utilise la xylose. Bien que les souches productrices'de négamycine isolées par la demanderesse aient des différences mineures avec les espèces connues de Streptomyces purpeofuscus 6 elles ont été considérées comme fai-30 sant partie de ces dernières. En outre, la demanderesse a confirmé que la culture-type de Streptomyces purpeofuscus (ISP 5283) produisait de la négamycine. Sur la production d'antibiotiques au moyen de Streptomyces purpeofuscus Yamaguchi et Saburi, il n' y a eu qu'une simple description (J. of Général and Applied Mi-35 erobialogy, 1, 201-234/ précisant que son filtrat de culture présentait une inhibition contre les trichomonas, les basctéries Gram-positives, et les bactéries résistant aux acides. Il n'y a pas eu de description de production d'antibiotiques actifs contre des bactéries Grain-négatives. Par conséquent, bien que Streptomyces purpeofuscus soit un® espèce connue, il n'y a jamais 70 16701 5 2070068 /^observation sur une production de négamycine jusqu'à la présente invention. Comme on le sait bien, Streptomyces n'est généralement pas stable et donne facilement des mutants et des àba?rants, artifi-5 ciellement ou naturellement, Streptomyces purpeofuscus dans la présente invention comprend la totalité de ces mutants et aberrants qui produisent de la négamycine, c'est à dire, ceux qui ne peuvent pas être différenciés de façon absolue de Streptomyces purpeofuscus et qui produisent de la négamycine» 10 La quantité de négamycine est déterminée par une méthode ordinaire par plaque cylindrique en employant de la négamycine pure comité étalon et l'organisme sensible, comme par exemple E. colli K12« Pseudomonas aeruginaosa, etc® ». Le Streptomyces purpeofuscus producteur de négamycine 15 produit de la négamycine quand il est cultivé dans des conditions convenables. Un bouillon de fermentation contenant de la négamycine est préparé en inoculant des spores ou du mycélium de l'organisme producteur de négamycine dans un milieu approprié et en cultivant ensuite dans des conditions aérobies. Pour la produc— 20 de négamycine, la culture àur un milieu solide est possible, mais pour la production de grandes quantités la culture dans un milieu liquide est préférable» N'importe quelle température de fermentation dan* l'intervalle où peut se développe!? l'organisme producteur de négamycine et où il peut produira de la négamycine 25 peut être employée, bien que 25 à 32°C soient préférables. Des milieux consistant en genres connus de sources nutritives pour actinomycètes sont utiles pour la production de négamycine» Paj? exemple, des produits industriels comme la peptone, l'extrait de viande, 1'aminé N-Z , la caséine, la farine de soja, 30 l'infusion de céréales, la farine d'arachides, la farine de graines de coton, le. nitrate de sodium, le nitrate d'ammonium, le sulfate d'ammonium et autres substances azotées telles que le son de blé, le son de riz , etc... sont utiles comme source d'azote. Les produits que l'on peut trouver dans le commerce, comme 35 par exemple le glucose, le glycérol, l'amidon, le maltose , la dextrine, le su^crose, le lactose, les huiles de soja et autres hydrates de carbone ou autres graisses à l'état pur ou brut sont utiles comme source de carbone. On peut également ajouter'du chlorure de sodium, du phosphate de sodium ou de potassium, du 40 carbonate de calcium. Des traces de sels métalliques peuvent 70 16701 6 2070068 être ajoutées, si nécessaire. N'importe quels genres de constituants pouvant être utilisés par les organismes producteurs de négamycines pour la production de négamycine sont utiles. la fermentation est poursuivie jusqu'à accumulation im-5 portante de négamycine. Par exemple, des spores et des mycélium sur la culture de Streptomyces purpeofuscus ont été inoculés dans un milieu consistant en glucose, 2%,. amidon, 2%, farine de soja, 2%, extrait de levure, 0,5%,chlorure de sodium , 0,25%, carbonate de calcium, 0,35%, CuSO^^O, 0,0005%, MhCl2o7H0, 0,0005%, ZnS04„ 10 THgO, 0,005 % (ajusté à pH 7»0), et cultivés avec agitation à 27°C. On a observé l'accumulation de négamycine en 3 à 8 jours, par exemple, 20/a.g/cm3 au 3ème jour, 108^g/ em3 (pH 7»4) au 6ème jour, 185/tcg/ cm3 (pH 7,6) au 7ème jour, 12^ug / cm3 (pH 7,8) au 8ème jour. 15 La négamycine est relativement stable dans sa solution a- queuse» Par exemple, après chauffage de solution de négamycine à 5 mg/cm3, de divers pH (c'est-à-dire 1,8, 7»2, 9,2) à 60°0 pendant 30 minutes, 91% restaient sans décomposition. Quand on maintenait 2 mg/em3 de solution de négamycine de pH divers à 20 27°C pendant une semaine, les pourcentages suivants de négamycine restaient sans décomposition : 86% à pH 2,25,80% à pH 4,90, 76% à pH 7, 15, 89% à pH 9,0, 79% à pH 10, 2o Il est fourni, selon la présente invention, des procédés pour 1'extraction et la purification de la négamycine o La néga-25 mycine est soluble dans l'eau et existe principalement dans la partie liquide du bouillon de fermentation. La négamycine se trouvant dans le bouillon n'est pas tranéférée du bouillon à des solvants organiques tels que le butanol, l'acétate d'éthyle, 1' éther, le chloroforme , le benzène . 30 A^rec les adsorbants, la négamycine peut être obtenue du bouillon fermenté ou de sa solution liquide. Le carbone actif est un des adsorbants préférés« La négamycine adsorbée sur du carbone actif peut être éluée efficacement par du méthanol aqueux, du butanol aqueux, de l'acétone aqueux. Elle est plus facilement 35 éluée si l'élution est faite à l'état acide avec de l'acxte chlo-rhydrique» Bien que la négamycine ait un groupe d'acide carbo-xylique, comme elle a deux groupes basiques, toute la molécule est basique et adsorbée par une résine échangeuse de cations. Un procédé à résine échangeuse de cations est la méthode la plus con-40 venable pour extraire la négamycine du bouillon fermenté ou de sa 70 16701 7 2070068 solution aqueuse. Toutes sortes de résines ayant un groupe d'acide earboxylique ou un groupe d'acide sulfonique sont utiles et elles peuvent être employées sous forme de H, sous forme de sodium, sous forme de potassium, sous forme d'ammonium, ou sous forme mélangée. 5 La négamycine adsorbée sur la résine échangeuse de cations peut ê-tre éluée avec un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, etc.«mais de préférence encore avec de l'ammoniac a-queuse. La négamycine, qui a un groupe d'acide earboxylique, peut être adsorbée aussi par une résine échangeuse d'anions. Par exem-10 pie DOWEK 1X2 (marque de fabrique de Dow Chemical Go.,Etats TJnds) sous forme OH adsorbe la négamycine, et la négamycine adsorbée est éluée avec de l'acide chlorhydrique dilué. Toutefois, une résine échangeuse d'anions ayant un groupe basique faible, telle que 1* Amberlite IR 45 (marque de fabrique de Ehom & Haas Go., Etat s Unis) 15 sous forme OH peut être employée pour la neutralisation de solution acide de négamycine sans adsorption importante de cet antibiotique. Le mycélium dans le bouillon fermenté peut être éliminé par filtration ou centrifugation. Le bouillon fermenté renfermant du mycélium peut également être amené directement à une co-20 lonne de résine sans qu'il soit nécessaire de procède!? à l'enlèvement du mycélium, si l'on a eu soin d'éliminer, par filtration à travers un filet métallique, les particules de grandes dimensions susceptibles d'empêcher le passage à travers la colonne. Dans une des méthodes convenant pour isoler la négamycine 25 du bouillon fermenté de Streptomyces purpeofuscus : le bouillon fermenté est filtré ou centrifugé et le filtrat, ou la portion surnageante, est envoyé à travers une colonne de résine échangeu-s§&e cations sous forme 70% et une fois la colonne lavée avec de l'eau, la négamycine adsorbée a été éluée avec 2% de Mïï^ 50 OH dans de l'eau, et l'éluat contenant la négamycine est concentré sous pression réduite pour éliminer l'ammoniac ; la solution concentrée est passée à travers une colonne de Dowex 1x2 sous forme OH, et après lavage à l'eau la négamycine sur la résine est éluée avec du HGL 0,5 It ; l'éluat contenant la négamycine 35 es"k neutralisée avec une résine IR 45 sous forme OH et concentré sous pression réduite jusqu'à siccité, en donnant une poudre brute de chlorhydrate de négamycine ; cette poudre brute de chlorhydrate élst dissoute dans de l'eau et envoyée à travers une résine telle que 1*Amberlite CG-50 (marque de fa-40 brique de Rhom et Haas Go., Etats-Unis) sous forme et la 70 16701 8 2070068 chromatographie est développée avec de l'eau ou du ÏÏH^OH à 0,1%} les fractions contenant la négamycine sont évaporées sous vide, en donnant une poudre blanche de négamycine pure ; si la pureté n'est pas suffisante, on répète la chromatographie. Sur la base 5 des propriétés basiques, la négamycine peut être précipitée par addition d'un acide insoluble dans l'eau, par exemple, l'acide picrique, 18acide p-hydroxyazobenzène-p'—sulfonique, etc... La négamycine se cristallise sous forme de sel d'acide p-hydroxy-10 azobenzène-p9-sulfonique. La négamycine dans ces sels insolubles dans l'eau peut être séparée des acides par les méthodes connues pour séparer une base d'un acide insoluble dans l'eau ; par exemple, le p-hydroxyazobenzène-p'—suifonate de négamycine est traité avec SCI dans l'éthanol, et du chlorhydrate de négamycine précipi-15 te-. Un acide insoluble dans l'eau tel qu£ Targitol 4, Targitol 7 (Union Carbide & Carbon Chemical Co„) et du laurylsulfonate de sodium peuvent également être employés pour la précipitation de la négamycine. La négamycine purifiée par les méthodes décrites ci-des-20 sus est obtenue sous forme de poudre blanche. Elle est facilement soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol les esters, le benzène. La négamycine en solution aqueuse présente une absorption finale, mais non une absorption maximale, de lumière ultra—violette de 220 à 400 m 0 Elle est amphotère 25 présentant une forte propriété basique et une faible propriété acide. Sous 3500 ¥ et un tampon pH 1,8 (acide formique-acide acétique-eau, 25/75/900 en volume) la négamycine se déplace de 12 cm vers la cathode, et en prenant la mobilité de l'alaMne comme étant 1,09 la mobilité de la négamycine est 1, 4. Elle 30 forme des sels d5 addition acides avec 11 acide chlorhydrique, 1'acide sulfuriqu®3 l'aeide p-hydroxyazobenzène—p'-sulfonique, l'acide picrique0 stc.c. La négamycine ayant un groupe d'acide earboxylique forme également des sels métalliques et des esters. Elle donne des réactions positives à la ninhydrine, des réactions 35 Rydon-Smith et négatives à 1e anthrone et à Skaguchi. Chauffé à 105°C.dans du HC1 6M pendant 6 heures, l'hydrolysat a présenté plus de 3 produits de ninhydrine ( les produits principaux sont trois) o 'Trois produits principaux d.'hydrolyse sont y -hydro-xy-f) - lysine, U,ÎJ®-diméthylhydrazine et méthyiains » De la sar-40 cosine et de 1 ' acide 1—méthylhydraginoacétique sont obtenus comme produits mineurs d'hydrolyse0 70 16701 9 2070068 La majeure partie de la négamycine purifiée a fondu graduellement à partir de 75°C et s'est décomposée avec production de mousse à 110-120°C. Le résultat suivant a été obtenu par analyse élémentaire : calculé pour .HHpO: G 38,02, H 8,5*1, 5 H 19,71, 0 33,77 ; trouvé : C 37,78, H 8,62, N 18,94, 0 31,70. Gomme équivalent de titrage on a obtenu 287 • Du p-hydroxyazoben-zène-pf-suifonate de négamycine est obtenu sous forme de cristaux jaune-orange, point de fusion 180-182°G avec décomposition, qui présente environ 1/3 de l'activité anti-bactéries de la né-10 gamycine et qui a donné les résultats d'analyse suivants : calculé pour G9H20N404(G12H10H204S)2 2H20 : G 47,13, H 5,27, N 13,33, 0 26,64, S 7,63 : trouvé s G 47,09, H 5,16, BT 13,20, 0 25,53, S 9, 01. La négamycine a trois pK titrables comme suit : 3, 55, 0,10, 9,75* Dans le spectre infra-rouge de négamycine prise avec 15 du bromure de potassium, des bandes d'absorption ont été observées aux longueurs d'ondes suivantes en cm : 343(^,^200, 3050, 2950, 1660, 1590,1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890£~"72D. Le p-hydroxya-zobenzène-p'-sulfonate de négamycine présente des bandes d'ab-sorption aux longueurs d'ondes suivantes en cm : 3550, 3400,3350, 20 3250, 3200, 3050, 2950, 1730, 1690, 1600, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280-1100, 1060, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280-1100, 1060, 1030, 1010, 990, 960, 945, 900, 880, 850, 800, 715, 680. Dans ce sel la bande pour l'acide earboxylique est mon-trée à 1730 cm • Le spectre infra-rouge de l'ester méthyle de 25 négamycine montre les bandes aux longueurs d'ondes suivantes en cm"1 : 3400, 3200, 3000, 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445,1400, 1220,1140, 1050, 1000, 960, 890, 720 „ La bande pour le groupe ester est à 1740 et 1220 cm""''» La structure déjà montrée a été proposée par la demanderes-30 Se comme étant la négamycine sur la base de la spectrographie de masse de l'ester méthyle de négamycine et.de l'ester triacétyle de négamycine et de la détermination de structures de produits d'hydrolyse. La négamycine inhibe la croissance d'organismes Gram-néga-35 tifs et positifs. Quand l'effet anti-bactérien a été essayé par la méthode des bandes de gélose en employant un extrait de vian-de-gélose de peptone, les organismes suivants ont été inhibés aux concentrations suivantes (le contenu d'une boucle de platine) de bouillon de culture nutritif de 20 heures a été mis en bandes ; les valeurs entre parenthèses sont les concentrations d'inhibition 70 16701 10 2070068 partielle) : Staphylococcus aureus 209p 50^g/cm3 j Staphylococcus aureu3 193 12,5/-Lg/cm3 (6,12/^/cm3) î Staphylococcus aureus Smith 50 ,j^g/cm3 ; Sarcina lutea PCI-1001 12', ^g/cm3 5(1,56^g/cm3) ; Bacillus aubtilis HBBL-B558 25/^g/cm3 (12,^/g/cm3) ; E.coli K12 5 3,12/tfcg/cm3 (1 j^^g/cmS) ; E.coli NIHJ 12,^ig/cm3 (3,12^g/cm3) i Shigella flexneri 12,f^ 12^g/cm3; Klebsiella pneumoniae PGI 602 12,^^/cm3 (6.25 Ag/cm3) îSeratia marscesceaa 12,5/«g/cm3 (6,25y^g/cm3); Rroteus vulgaris 0X19 6,25/t«-g/om3î Proteus rettgeri (GÏÏ311) 12,^g/cm3 (6,2^g/cm3)j 10 Pseudomonas aeruginosa (Nô 2) 12,5y^/cm3 ; Pseudomonas aerugino-sa n° 3 25^g/cm3 (12,5/^/^3) ; Pseudomonas fluorescens 6, 25y«*g/cm3 (3, 12^t.g/Gm3) i Mycobacterium smegmatis 607 100 yOg/cm3. Quand le bouillon de culture nutritif de.20 heures était dilué 1000 fois et que le contenu d'une boucle de platine était 15 mis en bandes, on observait alors l'inhibition de croissance à des concentrations la moitié de celles décrites ci-dessus. Dans de la gélose de peptone à 0,5 % l'effet d'inhibition était plus fort que sur la gélose nutritive et les organismes suivants étaient inhibés aux concentrations suivantes (les valeurs entre 20 parenthèses sont les concentrations d'inhibition partielle) : S.aureus 209p 1,56/*g/em3 ; S .lutea PCI 1001 5»9',t6/cm3 (2,5 yfg/cm3) ; B. subtilis KRBL-B 558 12,5/ 12,5/^g/cm3 (3» 12/^g/cm3) ; pH 7,0 3,12yAg/cm3 (1,56^^3); pH 0,0 1,56/(^g/cm3 4 0,78/^g/cm3) î pH 9,0 1,56/t^g/cm3 (0,78 ^g/cm3). Dans une méthode par plaque cylindrique en employant de la gélose de peptone à 0,5 % et E.coli K12, 2^g/cm3 de 4.Q négamycine ont présenté les diamètres d'inhibition suivants aux pH suivants pH 6,0 16 mm ; pH 7,0 20 mm ; pH 8,0 21 mm. 70 16701 n 2070068 La négamycine a une toxicité faible. L'injection intraveineuse de 4-00 mg/kg a provoqué la mort de souris. Aucun, signe toxique n'a été observé quand 200 mg/kg ont été quotidiennement injectés intrapéritonéalement à des souris pendant 30 jours. 5 Elle n'a pas de toxicité à retardement. L'injection intramusculaire de 50 mg/kg à des lapins a donné une forte concentration dans le sang, par exemple 10C^tg/cm3 une heure après l'administration, et 80% ont été excrétés dans 1( urine en 24 heures, ce qui indique une forte concentration dans 10 l'urine, par exemple 4480^g/cmj dans l'urine prélevée 1 à 2 heures après l'injection. Ces résultats suggèrent l'effet positif également "in vivo". Effectivement, il a été confirmé que la négamycine était efficace contre l'infection de Pseudomonas n°12, Klebsiella pneumoniae S-1802,Salmonella typhosa 63 et Staphilo-15 coccus aureus Smith S-424 chez des souris. Les contre ces infections ont été 4,4, 5»0, 2,5 et 12,5 mg/kg respectivement, quand 10 MLD ont été injectées péritonéalement et que la négamycine a été donnée en injection sous-cutanée immédiatement et 6 heures après l'infection. 20 Comme décrit ci-dessus, la négamycine est une substance anti-bactérienne ayant une toxicité faible et inhibant des bactéries Gram-po s itive s et Gram-négatives y compris les Pseudomonas. Cet antibiotique est facilement différencié des antibiotiques connus par ses résultats d'analyse, son spectre infra-rouge, sa 25 propriété amphotère, son comportement à 1'électrophorèse à haute tension et sa structure « La négamycine est donc nettement un nouvel antibiotique. Comme montré par la structube, l'hydrolyse de la négamycine donne de l'acide 1-méthylhydrazino-acétique dont on a découvert 30 qu'il se convertissait en îf,îf'-diméthylhydrazine. La demanderesse a découvert que l'acide 1-méthyl-hydrazi-noacétique inhibait la trans-aminase acide glutanique-pyruvate et avg.it une toxicité pour le foie. La négamycine n'a pas une telle toxicité} toutefois , en considération de l'hydrolyse 35 possible, la négamycine doit être injectée pendant de courtes périodes pour traiter les infections sensibles. La négamycine est également employée localement pour traitement d'infections superficielles telles des infections de la peau et des muqueuses. En outre, la négamycine est utile pour la synthèse d'analogues de 40 négamycine• 70 16701 12 2070068 les propriétés de la négamycine sont maintenant clairement exposées, et par conséquent, sur la base des propriétés révélées par la présente invention, des procédés pour la production de cet antibiotique sont faciles à imaginer, les exemples sont donnés ci-après. Toutefoiss la présente invention n'est pas limitées à ces exemples» La présente invention comprend toutes modifications des procédés décrits ici® l^rEMPLB -1 - 125 cm3 dcun milieu contenant 2% de glucose, 2% d'amidon, 2% de farine de soja, 0,5% d'extrait de levure, 0,25% lïaCls 0,35% CaCOv 090005% C-aS04O5H20, 020005% îfaGlgoyHgO, et 0,0005% SnSO^. yHgÇ'ont été mis dans un flacon secoueur de 500 cm3° Après ajustement dupH à.7S0S ee milieu a été stérilisé à 120°C pendant 20 minuteso A ce milieu^ 2,5 cm3 de bouillon cultivé avec agitation pendant 2 jours de la souche n° M890-C2 ont été inoculés a-septiquement» Le milieu pour la culture de l'ensemencement contenait 1% de glucose, 1% d9amidon5 0,75% d'extrait de viande, 0,75% de peptones 093 % IaGl§ 091% MgS04«7H20s 0,0007% GuSO^i. 5H20D00001% JieS0i|_e7H209 090008% Madge7H20, et ©§0002% ZnS04o?H gOs Un seeouage à 130 coups par minute a été donné pendant la période de fermentation (5 jours) et la température a été maintenue à 27°Co Ce bouillon de culture a été centrifugé pour séparer les mycéliums et 6000 cm3 de filtrat ont été obtenus des soixante flacons o Ce filtrat contenait 35 -&g/cm3 de négamycine c On a fait passer le filtrat à travers une colonne (diamètre 30 mm) contenant 400 cm3 d°Amberlite IRC-50 (forme Ma 70&) o Après lavage à l°eaii3 la négamycine a été éluée avec de l'ammoniac a-queu.se à 20%o La fraction active de 600 cm3 a été concentrée sous pression réduite s et on a obtenu 144 cm3 de solution concentrée (pH 9-}4s 800j;.-g/cm3) o La solution concentrée a été envoyée à travers une colonne (diamètre 16 mm) contenant 60 em3 de Dowex 1X2 (forme OH) » Après lavage avee 200 c®3 d8eau, la négamycine a été éluée avec 0,5 K® SCI» Après neutralisation avee de 15Amberlite IR-45 (forme OH), la fraction active a été séchée sous pression réduite. On a obtenu 300 -fflg de poudre brute de chlorhydrate de négamycine (pureté 21%) EŒMPLB 2 - Une poudre "brute (300 mg) de chlorhydrate de négamycine obtenue dans l'Exemple 1 a été dissoute dans 10 o®3 d'eau. 70 16701 13 2070068 Cette solution a été envoyée à travers une colonne (diamètre 16 mm) contenant 60 cm3) d'Amberlite CG-50 (forme lîïï^), suivie d* eau distillée. L'écoulement de sortie actif a été trouvé dans les fractions 57-96. Des fractions 57-74 on a obtenu 25 mg (pu-5 reté 69/xg/mg) de poudre de négamycine légèrement jaunâtre. Des fractions 75-85 on a obtenu 20 mg de poudre incolore de négamycine pure. Des fractions 86-96 on a obtenu 19 mg (pureté 910 y*«g/mg)u 10 EXEMPLE 3 - Divers genres de résines échangeuses d'ions ont été essayé» pour l'isolement de la négamycine. Le filtrat de bouillon de 200 cm3 obtenu par la technique indiquée dans l'Exemple 1 a été envoyé à travers une colonne (diamètre 10 mm) contenant 10 cm3 15 d'une résine. La colonne a été lavée avec 50 cm3 d'eau, et ensuite éluée comme montré ci-dessous. Dans tous les cas aucune activité n'a été décelée dans les écoulements de sortie et l'eau employée pour le lavage de la colonne. Les résultats sont donnés ci-dessous. 20 25 Résine échangeuse d'ions • • ■ • i Type :Elution —t- m • » * • Récupération de : négamycine Amberlite IRC-50 : Forme H x2% NELOH : 45% 1 Amberlite IRC-50 • • N Ha 70% :2% EH40H • • 52% : Amberlite IRC-50 : m Na 70% î1N HG1 • • 29% t Amberlite IRC-50 : N MH470% :2% KH40H • • 55% j .Amberlite IR-120 : H H :2% HH4OH • • 45°/o t Lewatit SP-100 • • • • N H î2% NH40H • • « • • • 50% s TTSrEMPT.IE 4- - 30 Le milieu de 10 litres, contenant les mêmes constituants que ceux indiqués dans l'Exemple 1, a été placé dans un fermen-tateur en verre de 20 litres. Après stérilisation, 500 cm3 du bouillon cultivé avec agitation de la souche n° M890-C3 ont été inoculés aseptiquement. La fermotation a été effectuée à 27°C 35 pendant 90 heures sous aération et agitation. Ce bouillon de culture (pH 7,4-) a été centrifugé pour séparer les mycéliums et on a obtenu 6460 cm3 (41^/tg/cm3) de filtrat • Ce filtrat a été envoyé à travers une colonne (diamètre 30 mm) contenant 400 cm3 d*Amberlite IRC-50 (forme ïïa 70%). Après lavage avec 3000 cm3 40 d'eau, la négamycine a été éluée avec de l'ammoniac à 2%. L'éluat 70 16701 14 2070068 20 30 actif de 400 cm3 a été séché sous pression réduite, et on a obtenu 685 mg (pureté 150//ig/cm3) de poudre brûnatre de négamycine brute. - 5 102 mg de négamycine ont été dissous dans 8 cm3 d'eau contenant 15% d'éther monoéthyle d'éthylène-glycol. A cette solution, on a ajouté 106 mg de p-hydroxy-azobenzène-p'-sul-fonate de sodium. Ce mélange a été chauffé à 50°C pour se dissoudre, et on a ensuite ajouté 0,5 cm3 de HC1 1K pour ajuster 10 le pH à 3o Après stockage en réfrigérateur, on a obtenu 49 mg de cristaux jaune-orange^, qui ont été recristallisés à partir du solvant mixte (eau 4,5 cm3 et méthanol 0,5 cm3). Vingt-huit mg de cristaux jaune-orange ont été obtenus, point de fusion 180-182°C (déc.). Ces cristaux avaient 34% d'activité de néga-10 mycine libre contre E.coli K12. Analyse s calculé pour C^H^qN^ (C12H10S204S)2<>2H20 î C 47,13, H 5,27, H" 13,33, O 26,64, S 7,63? trouvé : C 47,09, H 5,16, N 13,20, 0 25,53, S 8,01. KX KMFT.K 6 — Un milieu (130 litres) contenant 3% de glucose, 1% d'amidon 2% de farine de soja, 0,5 % de levure séchée, 0,35 % de CaCO^, 0,0005 % de CuS04.5H20, 0,0005 % de MnCl2.7H20, et 0,0005 % de ZnSO^ 25 v ^ ture de la souche M 890-C2. L'agitation à 200 t/mn et l'aération de 25 litres d'air par minute ont été effectuées pendant la période de fermentation (113 heures), et la température a été maintenue à 27°C. Le bouillon de culture de 110 litres (pH 7,^,63 g/cm3) a été filtré à l'aide de 8 kg de "terre d'infusoires après ajustement du pH à 4,9 avec 1 litre de HC1 6ÎT. On a obtenu au total 117 litres de filtrat en comprenant l'eau utilisée pour le lavage du filtre. Ce filtrat a été envoyé à travers une colonne contenant 6,5 litres d'Amberlite IRC-50 (forme ^^70%).Après lavage à l'eau, la négamycine a été éluée avec de l'ammoniac 0,5 35 Ef. L'éluat actif de 3 litres a été concentré à 495 cm3 (3520^/*-g/cm3) sous pression réduite. Ce concentré a été passé à travers une colonne contenant du Dœx 1X2 (type OH) » Après lavage avec 350 cm3 d'eau , la négamycine a été éluée avec du HC1 0,5®". L'éluat actif de 180 cm3 70 16701 15 2070068 a été neutralisé avec de l'ammoniac 3U. On a obtenu après séchage une poudre j aune-brunâtre (5,5 g.) de négamycine brute (pureté 29jJ^mg).. Le rendement global a été 23,4 %• EXEMPLE 7 5 3,4 g de la poudre à 29,4% de pureté obtenue dans l'Exem ple 6 ont été dissous dans 22 cm3 d'eau et le pH a été ajusté à 8,8. Oette solution a été appliquée à une colonne (diamètre 26 mm) remplie de 250 cm3 d'Amberlite CG-50 (forme îIH^) « Après lavage avec 500 cm3 d'eau, on a fait passer 0,1% ïîïï^OH à travers 10 la colonne. La négamycine a été trouvée dans les fractions 69 à 81. Des fractions 69-73 on a obtenu 233 mg (pureté 90%) de poudre de négamycine jaunâtre pâle. Des fractions 74—77 ou a obtenu 383 mg de aégamycine pure. Des fractions 78-81 on a obtenu 395 mg de négamycine pure. 15 Sont inclus dans le domaine de la présente invention la négamycine et les sels d'addition acides de négamycine avec des acides organiques et inorganiques tels que l'acide chlorhy-drique, l'acide sulfurique, l'acide bromhydrique, l'acide phos phorique, l'acide nitrique, l'acide citrique, l'acide maléique, 20 l'acide malique, l'acide tartarique, l'acide benzoïque, l'acide cinnamique, l'acide ascorbique, l'acide acétique, l'acide picrique, l'acide p-hydroxy-azobenzène-p'-sulfonique, l'acide phytique l'acide livopimarique 6-8a-cis-endosuccinique, l'acide suifastique, l'acide glycolique et l'acide mandélique. Pour des fins 25 thérapeutiques on se sert de sels d'acides non toxiques, mais les sels d'acides toxiques, par exemple l'acide p-hydroxyazoben-zène-p'-sulfonique, sont utiles dans des techniques d'isolement, par exemple comme précipitants hors de solutions aqueuses, et pour des fins de désinfection où la toxicité n'a pas grande 30 importance. Quand on le désire, pour des fins spécifiques et pour les rendre pharmaceutiqueœent compatibles, on peut mélanger aux composés de la présente invention d'autres médicaments tels que des antihistamines, des médicaments suifa (par exemple, 35 suifapyridine, suifabenzamide, sulfacétamide, sulfanilamide, sulfadiazine, sulfathiazole, suifapyrazine, suifaguanidine, suifathalidine, suifasuxidine, suifisoxazole, sulfamylon, phtalyL sulfacétamide, JT*-3,4-dimethylbenzoylsulfanilamide, benzylsulfa-nilamide, et N'-2-(2-quinoxalyl)sulfanilamide), des agents lipo-40 tropiques (en particulier méthionine, choline, inositol et beta- 70 16701 16 2070068 sitosterols et des mélanges de ces agents)} des stimulants du système nerveux central (par exemple aspirine,salicylamide, gen-tisate de sodium, p-acétylaminophéno1, phénacétine, codéine, des laxatifs (par exemple9 phénol-phtaléine), des sédatifs (par 5 e^.emples baxbiturates, bromures), des sels de pénicilline (par exemple pénicilline G de potassium,, pr oc aine, pénicilline Gs pénicilline G de 1-éphénaiaine, pénicilline G de dibenzylaminë ; ces combinaisons sont particulièrement utiles pour permettre mie variation de la distribution des taux sanguins obtenus ) s 10 phénoxyméthyl-pénici 11 ine et ses sels, d'autres agents antibiotiques (par exemples streptomycine , dihydrostreptomycine s kanamy-cinej bacitra.cines polymixine, tyrothricine , érythromycine ? chlortétracyeline , oxytétracycline 3 tétracycline s oléandomycine9 chlor a&phénicols magnamycine $ novobiocine, cyclosérines néomycine 15 dans certains cas de telles combinaisons attaquent une gamme plus large d®organismes et présentent une efficacité synergique2 ou bien assurent une toxicité diminuée pour une efficacité égale) des vitamines (par exemple vitamines 1» A^, B^s Bgs BgS et des membres de cette familles, l'acide folique et des membres de 20 cette famille§ vitamines 09 Dgs et E), des hormones (par exemple g cortisone, hydrocortisone s. 9~iH~f luorocortisone 5 9-e^ Sluoreliydrocortisones prednisone et prednisolone)5 des agents an aboli que s (par exemple, 11,17 ™dihydroxy-$ - c^ 70 16701 2070068 - REVENDICATIONS - 1. - Substance antibiotique, efficace pour inhiber Pseudomonas , Salmonella, Shigella. Klebsiella, E» coli, Staphylooocci, caractérisée en ce qu'elle est soluble dans l'eau, insoluble 5 dans le métlianol, l'éthanol, le butanol, les esters, le chloroforme , le benzène, ne présente pas de maximum d'absorption de la lumière ultra—violette de 220 à 350 myj-, donne des réactions, d'une part, positives à la ninhydrine et aux réactions Rydon-Smith et, d'autre part, négatives à l'anthrone et à Sakaguchi, 10 est amphotère, présente trois pK tels que 3,55, 8,10, 9,75, forme des sels acides d'addition comprenant chlorhydrate, sulfate, p-hydroxyazobenzène-p'-sulfonate, forme un ester méthyle, est OÙ optiquement active, (°0j) " +2,5° (c2, HgO) a la formule C9H20ÏW présente des bandes d'absorption dans la zone infra— 15 rouge du spectre quand elle est en pastilles avec du bromure de —1 potassium, aux longueurs d'ondes suivantes en cm : 34-30, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820, 720, et a la structure suivante ï CH0-CH-CH0-CH-CH0—C—HH—F-CHq-COOH I 2 | 2 | 2 11 1 2 20 MH2 OH NH2 O CH^ 2» - Procédé pour la préparation de l'antibiotique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche de Streptomyces purpeofuscus dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone contenant une substance nutritive azotée, 25 dans des conditions aérobies, jusqu'à ce qu'une activité antibactéries importante soit impartie à la dite solution, et à récupérer ensuite le dit antibiotique de la solution. 3.- Procédé de la revendication 2, caractérisé en ce que l'organisme est Streptomyces purpeofuscus AoToC.C. 21470. 30 4. - Procédé de la revendication 2, caractérisé en ce que l'antibiotique est récupéré de sa solution aqueuse par adsorption sur une résine échangeuse de cations, avec ensuite élution. 5o — Procédé de la revendication 2, caractérisé en ce que l'antibiotique est récupéré de sa solution aqueuse par adsorp- 35 tion sur du carbone, avec ensuite élution. 60 - Procédé de la revendication 2, caractérisé en ce que l'antibiotique est récupéré de sa solution aqueuse par adsorption sur une résine échangeuse d'anions fortement basique, et ensuite élution» 40 7. - Procédé de la revendication 2, caractérisé en ce que 70 16701 18 2070068 l'antibiotique est récupéré d'une solution aqueuse par précipitation avee un acide insoluble dans l'eau et ensuite séparation d'avec 1'acideo 8. - Procédé selon l'ensemble des revendications 2 et 3, 5 caractérisé en ce que l'on emploie l'ammoniac pour 1*élution de l'antibiotique adsorbé.