Brevet FR2081530A1 — publié le 19711203

Les enzymes qui scindent la L-glut aminé (L-glutamine-amido-hydrolase E. C 3j»5."î.2.) sont très répandus dans la nature. On les a trouvés dans l'organisme de mammifères et dans divers microorganismes. On a encore très peu de renseignements sur les propriétés 5 chimiques, 'biologiques et thérapeutiques des L-glutaminases. Une étude comparative de l'effet enzymatique in vitro de diverses préparations (pH optimal de l'effet enzymatique, activation par des ions) a permis de conclure que les L-glutaminases sont des protéines différentes. Toutefois, une comparaison chimique exacte 10 de diverses L-glutaminases n'a pas encore été possible, parce que la pureté et la quantité des préparations jusqu'à présent produites n'ont pas suffi à cette fin ["Arch. Biochem. Biophys." 108. pages 143 à 149 (1964)]. L'enrichissement et la stabilisation d'une L-glutaminase obtenue à partir de bactéries (Pseudomonas 15 GG 13) ont été tentés en vue d'expérimenter l'activité thérapeutique contre des tumeurs ["Arch. Biochem. Biophys." 108. pages 143 à 149 (1964)], mais ceci n'a pas permis d'obtenir des préparations dont la quantité et la pureté conviennent pour des essais effectués sur des animaux ou dans des conditions cliniques. Certains 20 des essais antérieurs visant à obtenir des L-glutaminases sont résumés ci-après : (a) Ramadan, El Asmar et Greenberg ont cultivé Pseudomonas GG 13 dans une solution nutritive dont le pH a été ajusté à 7*0 et dont la composition est la suivante : 25 acide L-glutamique 0,4 $ glucose 0,4 ^ (NH4)2SO4 0,4 * K^HPO^ 0,115 # kh2po4 0,063 i° 30 MgS04 0,014 1° PeSO. 0,0006 fo 4 MnS04 0,0006 $ NaCl 0,0006 1° dans un appareil de fermentation à échelle dû laboratoire, dans 35 des conditions d'aération, à 30°C. A une densité cellulaire de 1>5 mg/l (appelée poids sec de cellules), les cellules sont isolées par centrifugation et congelées à -15°0. Pour obtenir la 7105814 2 2081530 L-glutaminaSe* on décompose aux ultra-sons 500 g de cellules congelées, on les extrait et on les isole par eentrifugation. Après avoir éliminé par extraction et précipitation les substances inertes qui l'accompagnent,on obtient 41»5 mg d'un enzyme enrichi 5 titrant 80 unités par milligramme, en traitant la solution surnageante par fractionnement au sulfate d'ammonium et^electrophorèse par zones ["Arch. Biochem. Biophys." 108, pages 143 à 149 (1964)}. Hartman a décomposé 4540 g de cellules congelées d'Escherichia coli B provenant d'une culture dans une solution nutritive composée 10 de peptone, d'extrait de levure, de glucose et de sels minéraux (culture pendant 16 heures dans des conditions d'aération à 37°C), en utilisant les ultra-sons, et il a obtenu par eentrifugation une solution exempte de cellules. Il a extrait de cette solution 4,9 mg d'un enzyme enrichi titrant. 1540 unités par milligramme, 1 5 par chromatographie sur colonne de diéthylaminoéthyl-cellulose, fractionnement au sulfate d'ammonium, chromatographie sur colonne de "Sephadex", et électrophorèse ["J. Biol. Chem."245. pages 853 à 865 (1968)]. Ces résultats montrent qu'il est difficile, en principe, 20 d'obtenir les quantités d'enzyme requises en thérapeutique, par application des procédés d'emploi courant dans la chimie des enzymes. Ceci est dû au fait qu'il est pratiquement impossible, dans le cas de la glutaminase, d'effectuer la chromatographie sur colonne et 1'électrophorèse à une échelle industrielle. 25 Par ailleurs, la labilité connue de la plupart des enzymes nécessite l'utilisation des deux procédés indiqués ci-dessus, pour tout enrichissement que l'on désire obtenir. la Demanderesse vient de découvrir que la souche Pseudomonas aureofaciens ATCC 15985 forme une très grande quantité d'une 30 L-glutaminase intracellulaire qui diffère,par certains détails,de celle que l'on a examinée dans ce qui précède. Une propriété surprenante et imprévisible de la nouvelle L-glutaminase obtenue à partir de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 réside dans le fait qu'on peut l'extraire de cellules bactériennes et l'enrichir à 35 une échelle industrielle, par des procédés simples. Les propriétés différentes des L-glutaminases les plus importantes étudiées jusqu'à présent, sont mises en évidence par 71 05814 3 2081530 les résultats d'essais suivants : 1 . Différences entre la L-glutaminasè de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 et la L-glutaminase de Pseudomonas GG 13 [Ramadan, El Asmar, Greenberg, "Arch. Biochem. Biophys." 108. 5 pages 143 à 149 (1964)] : (a) le pH optimal de l'effet enzymatique et la réduction de cet effet vers un pH de 5,0 et un pH de 9,0 sont différents (voir figure unique du dessin annexé). (b) la L-glutaminase dérivée de Pseudomonas GG 13 perd la 10 moitié de son activité à 40°C en moins de 15 minutes, tandis que la L-glutaminase dérivée de Pseudomonas aureofaciens reste complètement stable dans ces conditions. (c) la L-glutaminase dérivée de Pseudomonas GG 13 peut être précipitée dans des solutions, au moyen de méthanol froid ; 15 la L-glutaminase dérivée de Pseudomonas aureofaciens perd son activité dans ces conditions. 2.Différences entre la L-glutaminase dérivée d'organes de mammifères et la L-glutaminase dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 [H.A. Krebs,"Biochem. J.", 2% , 1951 (1935) ; J.D. 20 KLingman, P. Handler,"J. Biol.Chem.", 2£2, 370 (1958) ; F. V. Sayre, E. Roberts, "J. Biol. Chem.", 235. 1128 (1958)] : (a) la L-glutaminase dérivée des reins de chiens a un optimum de pH compris entre 7,9 et 8,1 ; elle est totalement inactive à un pH de 6,0. La L-glutaminase dérivée de Pseudomonas 25 aureofaciens ATCC 13985 possède,à un pïï égal à 6, environ 80 °f° de son activité enzymatique maximale qui se situe à un pH égal à 7,5 (voir figure unique du dessin annexé). (b) le chlorure de sodium inhibe la glutaminase de mammifères, mais non celle qui provient de Pseudomonas aureofaciens 50 ATCC 13985. (c) En contraste avec l'enzyme dérivé de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985, la glutaminase de mammifères est rapidement inactivée en solution aqueuse en l'absence d'anions polyvalents . 35 3. Différences entre la L-glutaminase dérivée de Clostri- dium welchii et la L-glutaminase dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 [D.E. Hughes, D.H. Williamson, "Biochem. J." £1_, 45 71 05814 4 2081530 (1951)]. La L-glutaminase dérivée de Clostridium welchii a un effet optimal à un pH égal à 5 et,sous ce rapport, elle diffère notablement de la glutaminase de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 (voir figure unique du dessin annexé). 5 4. Différences entre la L-glutaminase de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 et la L-glutaminase dérivée de E. coli B [S.C. Hartman, "J. Biol. Chem." 243. 853 (1968) ; A. Meister et Collaborateurs, "J. Biol. Chem." 215. 441 (1955)]: (a) la glutaminase dérivée d'Escherichia coli B a un 10 effet optimal à un pH égal à 5. Une nette réduction de l'activité apparaît déjà à un pH égal à 7. (b) la glutaminase dérivée d'Escherichia coli n'a pas d'activité de L-asuaraginase. tandis que la "L-glutaminase dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 a une spécificité vis-à-vis 15 du substrat d'environ 60 c'est-à-dire que dans des conditions expérimentales entièrement analogues, l'enzyme dérivé de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 libère de la L-asparagine environ 60 i° de la quantité d'ammoniac libérée de la L-glutamine. Les différences entre les diverses L-glutaminases, comme 20 indiqué ci-dessus,démontrent que la glutaminase dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 conforme à l'invention est une protéine nouvelle qui, manifestement, ne diffère pas des glutami-nases déjà connues en ce qui concerne ses qualités enzymatiques, mais en diffère par ses autres propriétés chimiques. 25 La préparation, conformément à l'invention, de la L-gluta minase dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 est décrite ci-après. Une unité de L-gLutaminase correspond à la quantité d'enzyme qui élimine une micromole d'ammoniac de la L-glutamine à 30 37°C et à un pH égal à 7,4, en une minute. La production de L-glutaminase à l'échelle industrielle, en des rendements satisfaisants, est effectuée par culture de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 dans des conditions d'aération, à 30°C et à un pH égal à 7,0, dans une solution nutritive de 35 composition suivante : 71 05814 5 2081530 acide L-glutamique 0,8 $ glycérol 0,£ $ K^HPO. 4 0,115 # kh2po4 0,063 $ 5 MgS04 0,014 1° Peso. 4 0,0006 MnS04 0,0006 1o NaCl 0,0006 $> acide lactique 0,3 * 10 Après incubation pendant 17 à 20 heures dans des cultures agitées par secousses, on obtient des solutions de culture conte- 3 nant 8 unités de l-glutaminase par cm . A titre de comparaison, l'utilisation de cette souche de bactéries dans la solution nutritive décrite par Ramadan, El Asmar et Greenberg pour Pseudomonas 3 GG 13, ne donne que 2 unités d'enzyme par cm . Par ailleurs, la culture de Pseudomonas GG 13 dans la solution nutritive conforme à l'invention donne 1,6 unité d'activité de l-glutaminase 3 3 par cm , comparativement à 0,8 unité par cm au cas où la culture est effectuée dans la solution nutritive décrite par les auteurs 20 mentionnés ci-dessus. Dans le procédé de culture décrit ci-dessus pour des cultures agitées par secousses, on remarque que la valeur de pH de la culture en cours de développement, qui est, à l'origine, de 7,0, se déplace vers la gamme alcaline et s'élève entre 8,0 25 et 8,2 lorsque le développement maximal des bactéries a été atteint. Toutefois, lorsque le procédé est mis en oeuvre dans un appareil de fermentation en verre à l'échelle du laboratoire, on constate qu'un pH d'environ 8,0 est déjà atteint à 35 % seulement de la croissance maximale que l'on peut obtenir dans des cultures agitées 30 par secousses. Une prolongation de la culture aboutit pratiquement à un arrêt de la croissance, tandis que la valeur de pH continue de croître. La teneur en L-glutaminase de ces solutions de culture n'est que d'environ 3 unités par cm . Des mesures visant à maintenir le pH des cultures en appareil de fermenta-35 tion, après qu'une valeur de 7,7 a été atteinte, dans la gamme de 7,5 à 7,7 par des additions fréquentes d'acide chlorhydrique dilué , comme cela a été reconnu, permettent de vaincre l'inhibition de la croissance des organismes, mais ne conduisent BAD ORIGINAL 71 05814 6 2081530 pas à une élévation de la teneur en L-glutaminase. Par contre, on est surpris de constater qu'il est possible d'accroître non seulement le développement des bactéries, mais en même temps leur teneur en L-glutaminase à environ 8 unités par cm de bouil-5 Ion de culture, en introduisant de l'anhydride carbonique gazeux dans les cultures en cours de développement dans l'appareil de fermentation. Après eentrifugation de la solution de culture, le sédiment de bactéries contenant la totalité de l'activité de L-glutaminase.est remis en suspension dans un peu d'eau, floculé 10 avec de l'acétone, lavé avec de l'acétone pure, puis séché sous vide. Les cellules ainsi obtenues ont une teneur en glutaminase de 1 à 2 unités par milligramme. L'enzyme brut peut en être extrait avec des solutions tampons. Le problème du pH n'est pas déterminant 15 dans ce cas, mais l'extraction à un pH égal à 5 s'est révélée être avantageuse, parce que la matière cellulaire extraite est plus facile à isoler par eentrifugation dans un milieu faiblement acide. On peut obtenir une L-glutaminase brute ayant une teneur de 4 à 5 unités par milligramme à partir des extraits, par précipi-20 tation à l'acétone et avec des diols et/ou des polyéthers qui conviennent pour le fractionnement. Une addition fractionnée de diols et/ou de polyéthers hydrosolubles et l'isolement des sédiments résultants se sont montrés particulièrement favorables à un enrichissement ultérieur. Les diols qu'il convient d'utiliser 25 sont les diols hydrosolubles en à Cg, dont un groupe hydroxyle peut être alkylé. par exemple les isomères du butane-diol, le pentane-diol- (1,5)» 11 hexane-diol- (2,5), le 2-métliylpentane-diol-(2,4), le 3-méthoxy-butanol, etc. Les ether-s polyvalents qu'il convient d'utiliser compren-30 nent les polyalkylènss-glyeols de poids moléculaire compris entre 400 et 6000. Peur la mise en oeuvre du procédé, il est pratique d'effectuer uns combinaison de fractionnements avec les divers solvants ou polyalkylène-glyeols. La concentration en ions hydrogène pendant le fractionnement ne joue, pas un rôle déterminant 35 pour le succès de l'opération, mais ce fractionnement doit être conduit dans une gamme dans laquelle l'enzyme est stable en solution aqueuse, c'est-à-dire à un pH de 4 à 9. La L-glutaminase BAD ORIGINAL 71 05814 2081530 qui peut être préparée conformément au procédé de l'invention a un point isoélectrique compris entre 7 et 8. Dans cet intervalle, la solubilité dans l'eau est minimale et une précipitation peut être obtenue à ce pH, avec une quantité relativement faible 5 d'agent précipitant. Evidemment, l'enzyme coexiste dans la cellule avec de nombreuses autres protéines. Ces dernières influencent les limites de précipitation et la solubilité de la fraction désirée. Etant donné qu'il n'est pas toujours possible, selon l'état actuel de la tech-10 nique, de maintenir entièrement constante la proportion de protéines indésirables accompagnant l'enzyme pendant la préparation de la glutaminase brute, de faibles différences des limites de précipitation d'un lot à un autre peuvent exister au cours d'un fractionnement. Toutefois, les limites de précipitation les plus 15 avantageuses peuvent être déterminées aisément par des expériences préliminaires. La proportion non constante des protéines accompagnant l'enzyme nécessite d'effectuer un développement de ces protéines par l'addition d'amides capables de dissoudre les liaisons par ponts d'hydrogène, afin de rendre le fractionnement plus 20 sélectif. Les amides qu'il convient d'utiliser comprennent l'urée, la guanidine, le formamide, etc. Les avantages du procédé conforme à l'invention, comparativement aux procédés connus, par exemple la précipitation de la L-glutaminase au sulfate d'ammonium, résident dans les points sui-25 vants : 1. On peut obtenir de grandes quantités d'une L-glutaminase nouvelle, au moyen du procédé conforme à l'invention, avec Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985. 2. On peut faire porter le traitement sur pratiquement 30 toute quantité de matière première. 3. Le procédé met en oeuvre des solutions aqueuses relativement concentrées. L'enzyme est facile à séparer de ces solutions par précipitation avec des solvants ou par lyophilisation. 4. Tout excès de diols ou de polyalkylène-glycol est 35 facile à éliminer par lavage à l'acétone et/ou par séchage sous vide. 71 05814 8 2081530 L'activité spécifique de L-glutaminase de grande pureté, dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985, n'est pas encore exactement connue. Le procédé conforme à l'invention pezmet d'atteindre ce degré de pureté par tout nombre désiré de répétitions. 5 La L-glutaminase conforme à l'invention est ainsi un produit préliminaire qui convient pour la préparation de L-glutaminase cristallisée à l'état pur. La L-glutaminase conforme à l'invention est destinée à être utilisée comme agent thérapeutique contre des tumeurs qui dé-10 pendent,à un degré particulier,de la L-glutamine disponible pour leur croissance. Elle est utilisée sous la forme de solutions aqueuses injectables isotoniques, qui sont administrées par voie intraveineuse. La cristallisation de la L-glutaminase est effectuée de 15 façon pratique par dissolution d'une préparation pure dans un peu' d'eau et addition d'un solvant jusqu'à ce qu'un trouble apparaisse. La cristallisation de l'échantillon a lieu après un certain temps. La cristallisation réuasit particulièrement lorsqu'elle est conduite en présence du substrat, c'est-à-dire la L-glutamine 20 ou aussi la L-asparagine, et lorsqu'on utilise le 2-méthylpentane-diol-(2,5) comme agent précipitant. L'incorporation de métaux lourds dans les cristaux, en vue de l'analyse structurale par ' les rayons X,est également possible. Le molybdate de sodium s'est montré particulièrement convenable à cette fin. Il n'est pas pos-25 sible d'accroître l'activité spécifique de l'enzyme par une ou plusieurs cristallisations. Exemple 1 Une culture inclinée sur gélose (gélose "Bacto-Penassay", Difco) de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985, effectuée à 30°C, 3 30 est mise en suspenëion dans 4,0 cm d'une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 On inocule 100 cm d'une solution stérile à 2,0 $ en volume d'eau de macération de maïs (pH 7,0), 3 qui a été clarifiée par filtration, avec 2,0 cm de cette suspension de bactéries et on maintient la solution inoculée sur une 35 secoueuse mécanique dans une fiole d'Erlenmeyer d'un litre de capacité, à 30°C pendant 8 heures. La culture agitée par secousses 71 05814 9 2081530 que l'on obtient ainsi est utilisée comme matière d'inoculation de cultures en appareil de fermentation. En utilisant une solution d'hydroxyde de sodium 1U, on ajuste à un pH égal à 7,0 8 litres d'une solution nutritive de 5 composition suivante : acide L-glutamique 64 g glycérol 48 g acide lactique 24 g K2HP04 9,2 g 10 ^^4 5'05 S MgS04 1,12 g FeS04 0,048 g MnS04 0,048 g NaCl 0,048 g 15 eau de ville 8,0 litres On stérilise ensuite cette solution dans un appareil de fermentation en verre» de 10 litres de capacité, à 115°C pendant 30 minutes 3 et, après refroidissement, on inocule avec 25 cm d'une culture, agitée par secousses, de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 comme 20 décrit ci-dessus. Le mélange en cours de fermentation est aéré à 30°C avec un débit de 4 litres d'air par minute, l'agitateur tournant à 200 tr/mn. La valeur de pH de cette culture en appareil de fermentation s'élève de 7,0 à 7,5 au bout de 5 à 6 heures. On introduit ensuite 1,5 litre/mn d'anhydride carbonique gazeux 25 dans la culture en cours de développement, pendant une période supplémentaire de 14 heures. Après ce laps de temps, la valeur de pH s'est élevée à environ 8,0. L'activité de L-glutaminase de la 3 solution de culture est de 8,3 unités par cm . Les cellules bactériennes sont ensuite isolées par centri-30 fugation du bouillon de culture et remises en suspension dans de l'eau distillée, à un volume de 0,32 litre. Pour faire floculer les bactéries, on verse cette suspension dans 8 litres d'acétone, on ajoute encore 4 litres d'acétone et on laisse la matière cellulaire floculée se sédimenter. La solution surnageante est ensuite 35 versée par décantation, le précipité est lavé sur un filtre à vide avec de l'acétone fraîche et, finalement,il est séché sous 71 05814 2081530 vide à 30°C. On obtient de cette façon 35,6 g de matière cellulaire sèche ayant une activité de L-glutaminase de :1,63 unité par milligramme. Exemple 2 5 On mélange 8 litres du bouillon de culture obtenu comme décrit dans l'exemple 1 avec 8 litres d'acétone, en agitant énergi-quement. On laisse se sédimenter la matière cellulaire floculée, on verse ensuite la solution surnageante claire, on lave le précipité deux fois avec des portions de 4 litres d'acétone fraîche, 10 on le lave de nouveau sur un filtre à vide avec une petite quantité d'acétone et, finalement, on le sèche sous vide à 30°C. On obtient 39 g de matière cellulaire sèche ayant une activité de L-glutaminase de 1,2 unité par milligramme. 71 05814 ,, 2081530 Exemple 5 Préparation de la glutaminase brute par précipitation à l'acétone On met en suspension 1200 g de matière cellulaire titrant 1.5 unité par milligramme de substance, dans 21 litres de tampon 5 au citrate M/15 à un pH égal à 5,0, on agite la suspension à la température ambiante pendant 2 heures, puis on la centrifuge à 20 000 g en refroidissant. On mélange la solution surnageante avec une quantité égale d'acétone et on isole le sédiment précipité par eentrifugation à 3000 tr/mn après repos pendant 1 heure. On 10 le lave ensuite avec de l'acétone et on le sèche. On répète de la même façon l'extraction des cellules. Rendement : 321,2 g ; unités par milligramme : 4,2 ; rendement, en unités : 75»2 Exemple 4 15 Préparation de L-glutaminase enrichie par précipitation au 2-méthylpentane-diol-(2,4) On dissout 321,2 g de glutaminase brute titrant 4,2 unités par milligramme dans 6,4 litres de tampon au citrate M/15 à un pH égal à 5,0, on clarifie la solution à 20 000 g et on la mélange 20 lentement avec 6,4 litres de 2-méthylpentane-diol-(2,4), tout en agitant. On isole le sédiment formé par eentrifugation à 3000 tr/mn, on le lave à l'acétone et on le sèche. Rendement : 44,0 g ; unités par milligramme : 21,0 ; rendement rapporté aux unités : 68 $. 25 Exemple 5 Préparation de glutaminase brute par précipitation au polyéthylène-glycol On met en suspension 5,0 g de matière cellulaire titrant 1.6 unité par milligramme de substance, dans 100 ml de tampon 30 au phosphate à un pH égal à 7,5, on agite la suspension à la température ambiante pendant 2 heures et on la centrifuge à 20 000 g. On mélange la liqueur surnageante avec 150 ml d'une solution aqueuse de polyéthylène-glycol à 50 % (poids moléculaire 1550) et on la centrifuge après repos pendant 1 heure. On lave le sédi-35 ment avec de l'acétone et on le sèche. Rendement : 0,564 g ; unités par milligramme : 8,0 ; rendement rapporté aux unités: 56 71 05814 12 2081530 Exemple 6 Fractionnement fia d'une L-glutaminase enrichie (a) On dissout 6,7 g de L-glutaminase titrant 21 unités par milligramme, dans 134 ml de tampon au phosphate M/15 à un pH égal 5 à 7,5 et on mélange la solution, après clarification, avec une solution aqueuse à 50 1° de polyéthylène-glycol (poids moléculaire 1550). Le sédiment formé est isolé par eentrifugation, lavé à l'acétone et séché. On l'appelle fraction A. Les fractions B et C s'obtiennent à partir de la solution surnageante, d'une manière 10 analogue. Les proportions quantitatives ressortent du tableau suivant : 15 Fraction ml de solution de polyéthy-lène-glycol Rendement en mg U/mg U/préci-pitation Rendement, % rapporté aux unités A 0-67 210 16,3 3425 2,43 B 67 - 80 199 22,5 4480 3,18 C 80 -120 3250 27,2 88400 62,70 20 (b) On dissout 1 g de L-glutaminase titrant 27,2 unités par milligramme,dans 20 ml de tampon au borate à un pH égal à 8,7 et on fractionne la solution, après clarification, à 20 000 g avec du 2-méthylpentane-diol-(2,4) en suivant les indications données en (a). Les proportions quantitatives ressortent du ta-25 bleau suivant : Fraction ml de 2- méthyl pentane-diol Rendement en mg U/mg U/préci-pitation Rendement, rapporté aux unités A 0-10 47 14,0 6,58 2,4 B 10 - 14 290 8,1 2370 8,7 C 14 - 18 377 13,7 5160 19,0 D 18-25 48 112,0 5380 19,8 Exemple 7 Fractionnement d'une L-glutaminase brute (a) On met en suspension 478,5 g de matière cellulaire titrant 2,15 unités par milligramme de substance, en procédant comme indiqué dans l'exemple 6(b), dans 9»5 litres de tampon au citrate 71 05814 2081530 M/15 à un pH égal à 5,0, on extrait la suspension et on la centrifuge. On obtient 8,2 litres de solution surnageante qu'on fractionne à l'hexane-diol-(2,5) en procédant comme indiqué dans l'exemple 6(b)- Le tableau suivant indique les proportions quan-5 titatives : 10 Fraction ml d'hexane-diol-(2,5) Rendement en g U/mg U/préci-pitation Rendement, % rapporté aux unités A 0-6150 70,5 0,83 58515 5,69 B 6150-10250 34,7 9,20 319000 31,1 C 10250-14350 32,2 4,00 128000 12,5 15 (b) On dissout 30,0 g de L-glutaminase titrant 9,2 unités par milligramme,dans 600 ml de tampon au phosphate M/15 et, après clarification à 20 000 g, on fractionne la solution comme indiqué dans l'exemple 6(a) avec une solution à 50 $ de polyéthylène-glycol. Les résultats quantitatifs ressortent du tableau suivant : 20 _ , 25 Fraction ml de solution de polyéthylène-glycol Rendement en g U/mg U/préci-pitation Rendement, > rapporté aux unités A 0-360 .2,4 43,3 104000 37,7 B 360-450 1,2 24,3 29000 10,5 C 450-510 2,0 15,0 30000 10,9 (c) On dissout 2,2 g de L-glutaminase titrant 43,3 unités par 30 milligramme, dans 44 ml de tampon au borate à un pH égal à 8,5 et, après clarification., à 20 000 g, on fractionne la solution avec du 2-méthyl-pentane-diol-(2,4) en procédant comme indiqué dans l'exemple 6(b). Le tableau suivant indique les proportions quantitatives. 71 05814 14 2081530 Fraction ml de 2-riié-thyl-pentane diol-(2,4) Rendement en mg U/mg U/préci-pitation Rendement, % rapporté aux unités A 0-22 210 11,67 2450 2,6 B 22-44 440 15,67 6900 7,2 C 44-66 559 81,67 44050 46,2 D 66-110 100 7,50 750 0,8 Exemple 8 Fractionnement d'une glutaminase "brute avec le 3-méthoxy-butano 1 On met en suspension 50 g de matière cellulaire titrant 1,6 unité par milligramme de substance, dans 1 litre de tampon 15 au citrate M/15 à un pH égal à 5,0, on agite la suspension à la température ambiante pendant 2 heures et on centrifuge à 20 000 g. Après deux extractions effectuées de cette façon, on obtient 920 ml de solution surnageante. Par fractionnement avec le 3-méthoxy-butanol, en procédant comme dans l'exemple 6(b), on obtient une 20 fraction principale qu'on précipite entre l'addition de 6900 ml et l'addition de 11 500 ml de solvant. Exemple 9 On dissout 251 g de glutaminase brute, titrant 3»6 unités par milligramme, dans 5 3-itres de tampon au borate à un pH égal 25 à 8,5 et on fractionne la solution conformément aux indications données dans l'exemple 6, avec du polypropylène-glycol (poids moléculaire 620). Le tableau suivant indique les proportions quantitatives : 30 Fraction ml de polypropylène-glycol/ 100 ml de s olution Rendement en g U/mg Rendement en $ 55 A o o 16,4 2,5 4,2 B 30 - 45 5,65 54,0 55,9 Exemple 10 On fractionne de nouveau 5,65 g de glutaminase titrant 40 54 unités par milligramme, avec du polypropylène-glycol (poids moléculaire 620). Les proportions quantitatives ressortent du tableau suivant : BAD ORIGINAL 71 05814 2081530 Fraction ml de polypropylène-glycol/ 100 ml de solution Rendement en mg U/mg Rendement en % A o i o 505 30,0 5,0 B 30 - 35 420 65,8 9,1 C 35 - 40 1200 84,2 34,1 D 40 - 45 1000 94,2 30,9 Exemple 11 On fractionne 1,5 g de L-glutaminase enrichie, titrant 83 unités par milligramme, sur une colonne de 90 cm de longueur et 15 3,0 cm de diamètre. La colonne est garnie de "Sephadex" G- 200 ; on utilise comme solvant un tampon 0,05M de tris-(hydroxyméthyl)-amino-méthane à un pH égal à 8,0, de molarité égale à 0,1M par rapport au chlorure de sodium, avec une addition d'éthyl-mercuri-thiosalicylate de sodium 1:80 000. On obtient une fraction prin-20 cipale titrant 135 unités par milligramme, dont la teneur ne peut pas être augmentée par un autre fractionnement. Cette fraction se révèle uniforme à 1*électrophorèse et à l'immuno-électrophorèse. Exemple 12 On dissout 50 mg de L-glutaminase titrant 135 unités par 25 milligramme, dans 1 ml d'une solution aqueuse saturée de glutamine, et on ajoute du 2-méthylpentane-diol-(2,5) jusqu'à ce qu'un trouble se développe. L'échantillon est totalement cristallisé après repos au réfrigérateur pendant trois jours. Les cristaux sont isolés par eentrifugation et lavés deux fois avec de l'éthanol 30 aqueux à 60 $ et une fois avec de lléthanol pur. Le rendement est de 36 mg. La préparation contient 135 unités par milligramme. La non-spécificité de la L-asparaginase atteint 91 unités par milligramme. L'activité spécifique ne peut pas être élevée par une autre recristallisâtion. 35 Exemple 13 On dissout 50 mg de L-glutaminase titrant 128 unités par milligramme,dans 1 ml d'une solution à 3 % de molybdate de sodium dans le tampon au tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane à un pH égal à 8,5» et on ajoute du 2-méthylpentane-diol-(2,5) jusqu'à ce que 40 la solution devienne trouble. L'échantillon est totalement crisBAD ORIGINAL 71 05814 16 2081530 tallisé après repos dans un réfrigérateur pendant 4 jours. * L'aspect exterieur des cristaux diffère notablement de celui des cristaux que l'on obtient conformément à l'exemple 12. Le traitement est effectué comme dans l'exemple 12. Le rendement 5 est de 28 mg; unités par milligramme = 131. La non-spécificité la L-asparaginase atteint 87 unités par milligramme. Dans ce cas également, l'activité spécifique ne peut pas être élevée par une autre recristallisation. 71 05814 2081530 - REVENDICATIONS - 1. L-glutamihase dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985. 2. L-glutaminase cristallisée, dérivée de Pseudomonas 5 aureofaciens ATCC 13985. 3. Application de Pseudomonas aureofaciens à la production de L-glutaminase cristallisée ou non cristallisée. 4. Procédé de production de L-glutaminase cristallisée ou non cristallisée, caractérisé par le fait qu'on traite à l'acétone 10 les cellules de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985, on extrait les cellules ayant subi ce traitement préalable avec de l'eau ou des solutions tampons, et on isole l'enzyme de l'extrait résultant, d1 une manière connue. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le 15 fait qu'on enrichit l'enzyme provenant de l'extrait,au moyen de solvants. 6. A titre de médicament nouveau, une L-glutaminase cristallisée ou non cristallisée dérivée de Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985.