Brevet FR2070053A1 — publié le 19710910

i 2070053 Société dite s J.K. AND SUSIE L. WÂDLEY RESEARCH INSTITUTE AND BLOOD BANK "Procédé de purification de la L-Asparaginase" La présente invention se rapporte à un procédé de purification de la L-Asparaginase produiteà partir d'un organisme microbien. En 1953 on a observé que le sérum du cobaye provoque la ré-5 gression de certains types de tumeurs chez les souris et les rat^ Huit ans plus tard, l'agent anti-tumoral du sérum du cobaye a été identifié comme étant la L-A.sparaginase. Par l'expression L-Aspa-raginase on entend ici l'enzyme L-Asparagine amidohydrolase ayant le numéro à la Commission des Enzymes 3.5.1.1. (Enzyme Commission 10 Kumber). l'analyse a montré que le cobaye normal donne-seulement 30 Unités internationales environ de L-Asparaginase ce qui rend trop élevé le prix du produit pharmaceutique pour l'administrer aux êtres humains. Une Unité Internationale (U.I.) de L-Asparaginase 15 est la quantité qui libérera un micromole de -wrij de i-Asparagine par minute à 372C et au pH 8. La posologie humaine peut demander l.uuu.uuu U.I. ou plus par jour par personne. La production de telles doses exigerait que le sérum soit extrait de 30.UU0 cobayes ou davantage par jour par personne à traiter avec ce sérum. 20 Le coût des cobayes étant d'environ 10 F par tête, le prix d'une dose par jour pour une seule personne se monterait à environ 300.OOu ï1 de cobaye, somme à laquelle il faut ajouter les frais de transformation de la grande quantité de sérum. Depuis 1964, on sait que la L-Asparaginase isolée de Escherichia 25 coli (S.coli) présente ég-lement des propriétés anti-tumorales. Or a proposé -plusieurs procédés rour prép-rer de la T-^spnrari- BAD OBK5INAL 69 18778 2 2070053 nase à partir de. .ï.ccli. l.z E.coli est normalement cultivé ";ann. un milieu nutritif, tel des solutions de gélose ce graine dé soja trypticase, de peptone ou de Kornberg. Le ï.coli après avoir été cultivé pendant une période de 15 à 20 heures est recueilli et 5 les enzymes contenus dans les cellules bactériennes après la rupture des cel±ules par sonication sont purifiées par divers procédés tels que ceux proposés par Mashburn et Wristorï (1966) Eature 211, 1403 et Mashburn et Wriston (1964) Arch. Bioch. Biophys. 105,451. 10 Plus particulièrement un processus de purification caracté ristique comporte le traitement de la suspension de cellules rompues par un volume de 0,05 de MnClg M pour précipiter les parois des cellules rompues et les acides nucléiques. Le précipité est ensuite séparé de la partie surnageante par centrifugationliaL-As-15 paraginase de la partie surnageante est ensuite précipitée en amenant la solution à 2M par l'addition de (^H4') ^ ^04 et en ajustant le pH de la solution à 8,0 avec iiiH40H. Le précipité est éliminé par centrifugation et l'a partie surnageante est amenée à 4M par l'addition de (i\iH4)2 S0^ et le pH est ajusté à 8,0 par 1' 20 addition de WH40il, ce qui donne un précipité contenant la L-Asparaginase qui est enlevé par centrifugation et redissous par dis-lyse en présence d'un tampon de phosphate de sodium 0,05M ayant un pH de 8,6. La solution d'enzyme dialysée est encore purifiée par chromatographie sur colonne. Plus particulièrement, la L-Ab-25 paraginase est éluée d'une colonne d'hydroxylapatite, qui a été équilibrée avec du tris-HCl 0,05M ayant un pH de 8,6. L'élution peut être effectuée avec du phosphate de sodium 0,10M ou du phosphate de potassium 0,1OM. L'effluent contenant la L-Asparaginase peut être de plus purifié par élution à partir d'une colonne de 30 diéthylaminoéthyle de cellulose (DEAE-cellulose) avec une solution de chlorure de sodium, dont la concentration varie entre 0,06M et 0,2M. En résumé, l'organisme microbien est, après culture dans'un milieu nutritif, traité pour rompre les parois des cellules bac-35 tériennes ce qui libère les enzymes contenues dans les cellules bactériennes. La solution contenant la L-Asparaginase est ensuite traitée par le sulfate d'ammonium pour précipiter la L-Asparaginase et d'autres protéines qui sont ensuite redissouter par dialyse en présence - d'une solution tampon, solution ' sr.rye-40 cialysre est, ensuite purii'ice :ar ■! t v.-;ato;i •. r.l.ie poi i : BAD ORIGINAL 69 18778 3 2070053 la L-Asparaginase des autres protéines. Les procédés employés précédemment pour produire la L-Aspa-raginase à partir des organismes microbiens, n'ont donné, après purification de la L-Asparaginase, qu'environ 10 à 15 % de la L-5 Asparaginase des cellules bactériennes initiales. De plus, l'activité spécifique (pureté) de la L-Asparaginase est inférieure à 200 Unités internationales (U.I.) par milligramme de protéine. C'est une pureté inférieure à 50 %. La L-Asparaginase produite dans le commerce à partir des milieux nutritifs qu'on utilise 10 maintenant et purifiée par les procédés courants, coûte environ 200.000 p par million d'U.I. ce qui rend le produit trop coûteux, sauf pour de petites expériences sur les animaux. Une partie des grands frais peut être attribuée au stade pénible et long de la redissolution de la L-Asparaginase par dia-15 lyse après précipitation dans une solution saline e't à la séparation par chromatographie de grandes quantités de solution. En outre, bien que la L-Asparaginase de faible pureté éluée de la colonne chromatographique ou des colonnes chromatographi-ques puisse être .utilisée pour le traitement des animaux, elle 20 contient trop d'impuretés y compris de 1'endotoxine et du pyrogène pour être administrée avec sécurité aux êtres humains, en grandes quantités, sans qu'il se produise des effets secondaires nuisibles. L'invention vise un procédé de purification de la L-Aspara-25 ginase à partir d'un mélange contenant un organisme microbien rompu qui donne de la L-Asparaginase, comprenant les stades d'addition au mélange contenant 1-' organisme .microbien rompu, d'une quantité suffisante d'un solvant organique miscible à l'eau, pour précipiter les parois des cellules et d'autres constituants 30 indésirables de l'organisme présents dans le mélange, sans précipiter la L-Asparaginase de la solution. Les parois cellulaires précitées et les autres constituants indésirables précipités sont séparés de la partie surnageante et une quantité suffisante de solvant organique miscible à l'eau est ajoutée à la partie surna-35 geante pour précipiter la L-Asparaginase. Le précipité et la partie surnageante sont ensuite séparés et le précipité est mis en. suspension dans une solution tampon. La L-Asparaginase de la solution tampon est ensuite séparée par chromatographie des autres constituants précipités avec la L-Asparaginase. 69 18778 4 2070053 L'invention vise également la séparation chromatographique par séquence dans deux colonnes, dont l'une a une résine, échan-geuse d'anions et l'autre une résine échangeuse de cations. L'invention vise également l'élimination de tout endotoxine 5 et pyrogène résiduels d'une solution de L-Asparaginase, en ajustant le pH, en chauffant, refroidissant, en mettant en contact avec du charbon actif et en filtrant. L?invention fournit un procédé de préparation de la L-Asparaginase avec une pureté de SO % ou plus (déterminée par ultra-10 centrifugation, électrophorése et par chromatographie). La L-Asparaginase aura une activité spécifique (qui est une mesure de la pureté) supérieure à 420 U.I. par milligramme de protéine et I sera à peu près libérée d'endotoxine et de pyrogène, ce qui la rend sure pour l'administration aux êtres humains. De plus, les 15 longs stades de dialyse contenant des solutions de la L-Aspara-girtase et du traitement chromatogrephique de grandes quantités de liquide sont éliminés. L'exemple suivant illustre l'invention. Exemple I On a préparé un milieu nutritif servant à la culture d'un 20 organisme microbien par dilution de 20 litres d'une liqueur de macération de maïs, particulièrement Corn Steepwater (Co^n Products GO., ITew York, jfo.Y.),; à 60 litres avec de l'eau désionisée qui avait été ajustée à un pH de 7,0 à 7,5 par de l'hydroxyde de potassium. On élimine le lourd précipité qui se forme pendant le 25 réglage du pH de la solution de Corn Steepwater par filtration et on filtre à nouveau le filtrat, après l'avoir chauffé jusqu' au point d'ébullition. On dilue ensuite le filtrat obtenu à 400 litres avec de l'eau désionisée et stérilisé à la vapeur. On cultive des E.coli (obtenu à l'Institut de Recherches Wadley, Dal-30 las, Texas5 et identifié sous la forme de leur souche HAP) aéro-biquement pendant 12 à 18 heures à 37 20 dans le milieu nût'riti£. ci-dessus. On récolte les cellules de E.coli par centrifugation à 5CC et on les remet en suspension dans un tampon de phosphate de po-35 tassium 0,02M, pH 8. On maintient également la solution tampon à 5§Q.S et cette température est maintenue pendant tous les stades décrits ci-dessous. On utilise une quantité suffisante du tampon de phosphate de potassium pour préparer une solution contenant entre 8 et 10 % (poids sec) de suspension de cellule. On rompt. 40 la suspension de cellule par une technique de production de sons. 69 J8778 5 2070053 A la suspension de cellule rompue on ajoute lentement, en agitant, de l'éthanol absolu à 0,50 en volume, on agite le mélange obtenu pendant 30 minutes et on le laisse reposer pendant encore une heure. 5 On élimine par centrifugation un précipité r'e parois cellu laires et d'autres constituants indésirables qui s'est formé après addition de l'éthanol. A la partie surnageante on ar'oute de l'éthanol absolu (initial) à 0,75 volume comme précédemment, on recueille le précipité obtenu de L-Asparaginase et d'autres 10 protéines par centrifugation et on le met en suspension dans un tampon de phosphate de potassium 0,01M à 0,15 en volume (initial), pH 8,5- On élimine les constituants non solubles par centrifugation et on fait passer une fraction surnageante qui contient environ 30 g de protéine et ce la L-Asparaginase à bOû.GOû U.I. 15 sur une colonne ce diéthylaminoéthyle cellulose de 9 cm x 1 20 cm (DEAE cellulose, ïïhatman Ilicrogranulaire DE - 52) qui a été équilibrée par un tampon de phosphate de potassium 0,01M, au pH 8,5. Après adsorption de la solution d'enzyme on effectue une élution à gradient linéaire en ajoutant 5 litres de tampon de phosphate 20 de potassium 0,5M, pH 8,5 dans une chambre de mélange contenant cinq litres de ta .pon de phosphate de potassium 0,03M au pH de 8,5. Le débit de l'effluent provenant de la colonne de cellulose DEAE est de 300 à 400 ml/heure. On a analysé l'activité de. l'As-paraginase et la teneur en protéine sur des parties de fractions 25 d'effluent. Les fractions ayant une activité spécifique élevée sont rassemblées, le pH de la masse d'enzyme est abaissé à 5,0 par addition goutte à goutte d'acide acétique glacial et la protéine est précipitée avec de l'éthanol à 1,2 en volume. Apres centrifugation, le résidu de protéine est mis en suspension dans 30 un volume minimum dë tampon d'acétate de sodium 0,05M, pH 5»0. Les constituants non solubles sont éliminés par centrifugation et 100 ml de fraction surnageante, contenant environ 1,5 g de protéine et de la L-Asparaginase à 140.000 U.I. sont appliqués à une colonne de carboxyméthyle Séphadex de 4 cm x 70 cm ( CM Sé-35 phadex C-50, Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey) qui a été équilibrée avec un tampon de sodium d'acétate 0,05M au pH 5,0. Après acsorption de la solution d'enzyme, on effectue une élution à gradient linéaire en ajoutant 00 ml d'une solution d'acétate de sodium 0,0? et de '1 ,,5 ai; p'i S,0 4,1 " T.-"'- n "• p -r ~j./ ->>- ; - r- -- ' CAD or™"*- 69 18778 6 2070053 de sodium 0,05M au pH 5,0. Le débit de l'effluent provenant de la colonne est de 30 à 40 ml/h et on recueille des fractions de 15 ml. On détermine l'activité de l'Asparaginase et la teneur en protéines sur des parties aliquotes de fractions d'efficients. Les 5 fractions ayant l'activité spécifique Ià~pius élevées/Réunies et concentrées en ajoutant de l'éthanol à 1,2 en volume. Après centrifugation, le résidu de protéine est dissous dans un volume minimum de tampon de phosphate 0,01M, pH 8,0, contenant du glucose à 0,2 %. Les constituants non solubles sont éliminés par centri-10 fugation. Pour éliminer 1'endotoxine et le pyrogène restant, le pH de la fraction surnageante est ajusté d'abord à 5,0 par addition goutte à goutte d'acide acétique glacial et ensuite à 6,8 » 6,9 en ajoutant une solution concentrée de KOH. Le mélange trouble ,est ensuite chauffé pendant 15 à 20 minutes à 50§C, refroidi 15 et centrifugé. La fraction "surnageante obtenue est intimement mélangée avec du ÏFuchar C-190 1 ( The Matheson Co), (noir de carbone, 1,5 g de noir de carbone par 100 millilitres de fraction surnageante), on laisse séjourner au froid pendant 30 minutes et on filtre sur un filtre stérile à millipores. La solution stérile d' 20 enzyme peut ensuite être stockée à l'état congelé ou séchée par congélation pendant plusieurs mois sans perte importante d'activité. On pense que lors de l'élimination de 1'endotoxine et .du pyrogène résiduels, l'ajustement du pH de la fraction surnageante 25 à 5,0, comme mentionné ci-dessus, sépare temporairement les molécules d'endotoxine et de pyrogène de la L-Asparaginase. Les molécules d'endotoxine et de pyrogène séparées sont ensuite éliminées en quantités importantes par élévation du pH à 6,8 - 6,9 et par l'addition de noir de carbone. La suspension est chauffée à 502C 30 pour contribuer à l'élimination des constituants indésirables et. ensuite refroidie avant l'addition du noir de carbone pour empêcher la destruction de la L-Asparaginase par ce dernier. La suspension ne doit pas être chauffée à une température dépassant. 55sinon la L-Asparaginase peut être détruite. Si le mélange 35 est centrifugé après le refroidissement de la suspension et avant l'addition du noir de carbone le stade de centrifugation peut être éliminé. Pourtant l'élimination du noir de carbone devient alors plus difficile car le filtre utilisé pour cette élimination s'obstrue de matériau autre que le noir de • *: v'- -r-'t rr, 40 suspension r.ans la solution. BAD ORIGINAL 69 18770 7 2070053 Le Tableau I ci-dessous donne en détails les caractéristiques déterminées par l'analyse des produits présents pendant les divers stades de la production et de la purification de la L-Asparaginase comme décrits à l'exemple I. Tableau I Stade de purification Volume total Protéine total tJ. I. total (L-Asparaginase) Enri- Récu-chis- péra-se- tion ment tota-mg pro- (x) le téine Activité spéc. U.I./ Suspension des cellules rompues Fractionnement à l'éthanol Chromatographie avec cellulose DEAE et concen- . tration Chromatogra ohie avec CM-Séphadex et concentration 40.000 b. OOu 320 30 1.500.000 30.vuu 4.800 780 750.000 600.000 450.000 350.000 0,5 20 93 450 40 186 900 80 60 47 L'utilisation d'alcool comme agent de précipitation pour les parois cellulaires rompues et les autres constituants indésirables d'organismes microbiens est bien meilleure que celle des autres agents de précipitation tels que le sulfate d'ammonium, car les solutions contenant de la L-Asp?raginase n'ont pas besoin d'être dialysées pour enlever le sel, ce qui réduit de beaucoup le prix de la fabrication de la L-Asparaginase. De plus on obtient des rendements plus élevés en L-Asparaginase relativement plus pure par le stade de chromatographie suivant. L'éthanol est également avantageux pour les stades ultérieurs consistant à effectuer la concentration de la L-Asparaginase à partir des solutions de protéine très diluées, notamment à un pH bas. D'autres avantages de l'utilisation d'éthanol résident dans le fait qu'il peut être appliqué sur une vaste gamme de température jusqu' à 372C, que la contamination bactérienne ne pose aucun problème, comme c'est le cas avec les sels, et qu'une vaste gamme de pH (4 à 10) peut être tolérée. De plus, on a trouvé que l'enzyme est précipité à des concentrations en alcool plus faibles quand le pH est abaissé. Tandis que l'éthanol (sous forme absolue ou diluée avec de l'eau) est un solvant organique miscible à l'eau préféré, divers autres solvants tels que les suivants peuvent être employés seuls 69 18778 8 2070053 ou en association soit sous la forme absolue soit dilués avec de l'eau en proportions diverses: méthanol, propanol, isopropanol, dioxane, tétrahydrofurane, et acétone. Les solvants organiques miscibles à l'eau permettent ^de rea-551iser les stades décrits ci-dessus car les constituants bactériens ont des solubilités différentes dans les solvants organiques miscibles à l'eau» A de basses concentrations des solvants organiques, les constituants les moins solubles et les parois cellulaires de l'organisme rompu précipiteront de la solution. En ajou-10 tant davantage de solvant organique, on atteint une concentration à laquelle une partie importante de la L-Àsparaginase précipite de la solution. Quand un solvant organique miscible à l'eau, autre que l'éthanol, est utilisé comme agent pour précipiter les parois cellulaires et concentrer la L-Asparaginase, on peut avoir 15 besoin de proportions autres que celles décrites plus haut et/ou de conditions opératoires différentes. La quantité"à utiliser peut être facilement déterminée en ajou+ant une petite quantité du solvant à la suspension cellula:re rompue, et ensuite en remet+ant en suspension le précipité, afin de réaliser un essai sur la L-20 Asparaginase par le procédé habituel. Si une quantité injustifiée de L-Asparaginase est présente dans le précipité, c'est que la quantité de solvant doit être abaissée. Si des quantités relativement petites de L-Asparaginase sont présentes dans le précipi+é, cêest que la quantité de solvant peut être augmentée pour que 25 toutes les parois cellulaires et les autres constituants indésirables moins solubles que la L-Asparaginase soient éliminés de la solution. En variante, on peut suivre un autre procédé, dans lequel une quantité suffisante du solvant organique .est d'abord ajoutée au 30 mélange contenant un organisme microbien rompu ee qui donne de la L-Asparaginase et la fait précipiter avec les parois cellulaires et les autres constituants indésirables présents dans le mélange. Le résidu précipité contenant la L-Asparaginase est éliminé de la fraction surnageante, et extrait avec le tampon pour éliminer 35 ainsi la L-Asparaginase en laissant un résidu contenant les parois cellulaires et les autres constituants indésirables. Ce résidu peut être éliminé par filtration ou par centrifugation. De même en employant une résine chromatographique d'échange anionique comme la cellulose DEAE à un seul stade de purification, 40 précédé ou suivi par 11élution de la L-Asparaginase d'une colonne 69 18778 9 2070053 contenant une résine d'échange cationique, une séparation plus petite de la L-Asparaginase es+ réalisée parce que la probabilité de la séparation des molécules de protéines ayant des charges similaires est augmentée par l'utilisation de résines ayant des 5 charges différentes. En particulier, alors que plusieurs protéines seront éluées dans la même fraction, d'une résine d'échange anionique, par exemple parce qu'elles possèdent environ les mêmes charges négatives, les mêmes protéines peuvent prendre une charge positive 10 d'ampleur nettement différente et donc peuvent être séparées quand elles sont éluées d'une résine d'échange cationique, et vice-versa. Par conséquent, les protéines éluées dans la même fraction, de la première colonne, peuvent être séparées dans une seconde colonne où. l'on utilise une résine d'une charge diffé-15 rente. Parmi les résines d'échange anionique qu'on peut employer on citera la cellulose -DEAE, le Séphadex-DEAE, le Biogel-DEAE, la cellulose -TEAE (cellulose-triéthylamine) et le Sephadex-QAE. Les résines d'échange cationique suivantes peuvent être em-20 ployées : Sephadex-CM, Sephadex-SE, Cellulose-CM, Biogal-CM, Cellulose d'acide phosphonique, cellulose - sulfoéthyle, et Am-berlite/ÎRC-50 ou IRC-50 (XE-64). Les résines "Sephadex" peuvent être obtenues de Pharmacia Fina Chemicals, Inc., les résines "Biogel" de Bio-Râd Laborato-25 ries, Richmons, Californie, et les résines "Amberlite" de Rhom et Haas, Philadelphis, Pennsylvanie. Les spécialistes comprendront que les microorganismes peuvent être rompus par diverses techniques autres qu'une technique par production de sons, à savoir, l'utilisation de presse hydrau-30 lique, presse à vis, d'ondes ultrasonores, d'homogénéiseurs, de dispositifs à vérin utilisant des gaz comprimés, ainsi que des broyeurs et des agitateurs mécaniques. 69 18778 10 2070053 Revendications 1 - Procédé de purification de la L-Asparaginase à partir d' un mélange contenant un organisme microbien rompu qui donne de la L-Asparaginase, caractérisé en ce qu'on, ajoute au mélange conte- 5 nant l'organisme microbien rompu une quantité suffisante d'un solvant organique miscible à l'eau, pour précipiter les parois des cellules et d'autres constituants indésirables de l'organisme présents dans le mélange sans précipiter la L-Asparaginase de la solution; on sépare les parois des cellules précipitées et 10 les autres constituants indésirables du mélange contenant la L-Asparaginase; on ajoute à la fraction surnageante contenant la L-Asparaginase une quantité suffisante d'.un solvant organique miscible à l'eau pour précipiter la L-Asparaginase; on sépare la L-Asparaginase précipitée de la solution; on met le précipité en 15 suspension dans une solution tampon; et on sépare par chromatographie la L-Asparaginase des autres constituants qui précipitent avec elle. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare la L-Asparaginase chromatrographiquement par élution sur 20 une première colonne chromatographique, puis par élution sur une seconde colonne chromatographique, l'une des colonnes chromato-graphiques contenant une résine d'échange anionique et l'autre une résine d'échange cationique. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 25.1a résine d'échange anionique est de la cellulose diéthylamino- éthylique et la résine d'échange cationique une résine carboxy-méthylique. 4 - Procédé selon la revendication 3,•caractérisé en ce qu'en outre: on concentre la L-Asparaginase contenue dans la solution 30 recueillie pendant l'élution de la L-Asparaginase sur, la.première colonne chromatographique par addition à cette solution d'une quantité suffisante de solvant organique miscible à l'eau pour précipiter la L-Asparaginase; on sépare le précipité contenant la L-Asparaginase de la fraction surnagean+e; et on met ce précipité 35 contenant de la L-Asparaginase en suspension dans une solution tampon pour l'envoyer sur la seconde colonne chromatographique. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu' en outre: on concentre la L-Asparaginase éluée de la seconde colonne chromatographique en ajoutant une quantité suiYifc&nie o'un 40 solvant organique miscible à l'eau à la selu+ioi- ■'•^0'>-i"i " je de la BAD ORIGINAL 69 18778 n 2070053 seconde colonne/contenant la L-Asparaginase pour précipiter celle-ci; on dissout la L-Asparaginase précipitée dans une solution tampon et on ajuste le pH de la solution d'abord à 5,0 et ensuite entre environ 6,8 et 6,9 pour précipiter les impuretés résiduel-5 les, s'il y an a; on chauffe la solution de L-Asparaginase et des impuretés précipitées jusqu'à une température d'environ 50°C pour précipiter encore toute impureté résiduelle; on refroidit la solution de L-Asparaginase et des impuretés précipitées et on la centrifuge pour éliminer tout précipité; on mélange intimement 10 la solution d'Asparaginase avec environ 1,5 .g de noir de carbone par 100 millilitres de la solution et on filtre le mélange pour en éliminer le noir de carbone avec ses constituants indésirables adhérents. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, 15 après le refroidissement de la solution de L-Asparaginase et avant son mélange intime avec le noir de carbone, on enlève le précipité de la solution de L-Asparaginase. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en outre on concentre la L-Asparaginase qui se trouve dans la solu- 20 +ion recueillie pendant la séparation chromatographique en ajoutant une quantité suffisante d'un solvant organique miscible à l'eau pour précipiter la L-Asparaginase; on sépare le précipité de L-Asparaginase de la fraction surnageante; on met le précipité en suspension dans une solution tampon; on ajuste le pH de la 25 solution tampon contenant la L-Asparaginase d'abord à 5,0 et ensuite entre environ 6,8 et 6,9; on chauffe le mélange à une température d'environ 50°C, on refroidit le mélange contenant la L-Asparaginase, on ajoute au mélange du stade précédent environ 1,5 g de noir de carbone par 100 millilitres du mélange, et on 30 filtre le mélange contenant le noir de carbone po'ur éliminer le charbon actif et les autres constituants indésirables. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que après refroidissement du mélange et après addition de noir de carbone au mélange, on élimine le précipité.formé dans le mélange. 35 9 - Procédé de purification de la L-Asparaginase d'un mélange contenant un organisme microbien rompu qui donne de la L-Aspara-ginase^caractérisé en ce qu'on ajoute au mélange contenant l'or- j ganisme microbien rompu une quantité suffisante d'un solvant organique miscible à l'eau pour précipiter les parois cellulaires 40 et les autres constituants indésirables de l'organisme dans le 69 18778 12 2070053 mélange sans précipiter la 1-Asparaginase de la solution. 10 - Procédé de purification de la L-Asparaginase d.'une solution en contenant,caractérisé en ce 're la L-Asparaginase en ajoutant à la solution v d'un solvant 5 miscible à l'eau pour précipiter la L-Asparaginase et en séparant L-Asparaginase précipitée de la fraction surnageante. 11 - Procédé selon la revendication 10, qui comporte le stade de mise en susoension du précipité dans une solution .tampon. 10 lution en contenant, caractérisé en ce qu'on concentre la L-Asparaginase de la solution en contenant en ajoutant une quantité suffisante d'un solvant organique miscible à l'eau pour précipi- » ter la L-Asparaginase; on'sépare le précipité de L-Asparaginase de la fraction surnageante; on met ce précipité en suspension 15 dans une solution tampon; on ajuste le pH de la solution tampon contenant la L-Asparaginase d'abord à 5,0 et ensuite entre environ b,6 et 6,9; on chauffe la suspension à une température d'environ 50§C; on refroidit le mélange contenant la L-Asparaginase; on additionne au mélange environ 1,5 g de noir de carbone par 20 100 millilitres du mélange; et on filtre le mélange contenant le noir de carbone pour éliminer celui-ci et les autres constituants indésirables. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que après refroidissement du mélange et addition de noir de car- 25 bone on élimine le précipité formé dans le mélange. 14 - Procédé de purification de la L-Asparaginase d'un mélange contenant un organisme microbien rompu qui donne de la L-Asparaginase, caractérisé en ce qu'on additionne àu mélange contenant l'organisme microbien rompu une quantité suffisante d'un 30 solvant organique miscible à l'eau pour précipiter la L-Asparaginase avec les parois des cellules et les autres constituants indésirables présents dans le mélange; on sépare le précipité obtenu de la fraction surnageante obtenue; on met le précipité en contact avec une solution tampon ce qui extrait la L-Asparaginase 35 et on sépare par chromatographie la L-Asparaginase des autres constituants qui ont été extraits dans la solution tampon. 15 - Procédé selon l'une des revendications 2, 4, 5,7,9A caractérisé en ce que le solvant organique miscible dans l'eau est l'éthanol. 12 - Procédé de purification de la L-4sparaginase d'une so-