Brevet FR2091909A1 — publié le 19710121

L'invention concerne le domaine de l'immunologie, et plus particulièrement celui de la cytotoxicité. L'invention a pour objet général un proc@dé pour multiplier l'activité d'un @nticorps dirigé contro un @ntigène celluleire hormal ou anormal, notamment un @ntigèn@ leucémique ou tumoral, sur lequel on fi@@ un premier typs d'anticorps corr@spondant dudit antigènè, l@dit prccéd@ @@tant car@ctérisé en ce qu'on ajoute consécutivement un deuxièm@ typs d'@nticorps @irigé contre lesdits anticorps du premier typs déjà fixés. Le procédé de l'invention c@nstitu@ une application nouvelle, à savoir une application à des @ntigènes @normaux, en p@rti@u- lier à des antigènes leucémiques ou tumoraux, de moy@ns connus dans leur princip@ par la t@chnique antérieure, qui peut être illustrée par les docum@nts ci-après. L'arti@le de DRESSER D.W. WCRTIS @H. @@ so fo @n @ntiglobulin sérum to detect cells producing @@ti@oby with low homolytic @f- ficiency". Nature, 1965, vol. 208,p.859 et suiv@ntes, d@@rit l'aug- mentation de l'efficacité hémolytique gr@ce à l'utilisation d'un antiglobuline. L'article de J. STERZL et I. RIHA, dans la même revuc, à la page 858, établit @ussi le principe de l'augmentation de l'activité hémolytique par addition d'une @ntiglobuline lorsque la cellule cible est un globule rouge.Une mise e@ évidence similaire résulte des travaux de HU@@@@REY J.H. "H@@olytic efficiency of rabbit Ig Gr anti-Forsman antibody and its augm@ntation by anti-rabbit Ig Gr". Hature 1967, Vol. 216.1295, ainsi que de ROMEYN J.@ et ROSS S. "anti-immunoglobulin control of im@un@ hemolysis" H. of immunol. 1969 vol. 102,1242.Dans @@ d@rni@r @rticle, notam@@nt, les @uteurs étudi@nt le type des globules rouges et l'influence de la nature des @nticorps, untilisés comme s@nsibilisat@ns des cellules et comm@@@@ntiglobuline. Les const@t@tions f@it@s/antéri@urement @@@ le choi@ de l'immuno@lobuline dans l'hémolyse indir@@t@ @@ sont pas immédi@- tement trans os@bles au cas de la cytotoxicit@ indir@@t@. On @ seulement tr@uy@ que c@rt@@@@s combinaisons d'immunoglobulines augmentent l'h@molys@ @lo@s que d'autr@s inhibont e@tte d@rnière. D'aill@urs, lorsqu@ la cellule cible est une cellule nu@léé@, l'activité cytotoxique n'augmente pas dans la m@sure où l'on @urait pu le supposer. Une telle constation @ été faite par FASS L. et HERB@R@AN D.B. @@ cytotoxic antiglobulin t@chnique for assay of antibodies to histocompatibility antigens". J. of Immunol, 1969 v@l. 102,140.Les@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@d'augmemter l@ @@@totoxicité s@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@nt une@@@@@@@@@@@@ (artis@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@ De @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@un invonv@@@@@nt fon@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ôtre @is en @@uvre in vivo, du @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ ti@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@La combinaison de globulines pr@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ir done ôtre appliquée in vivo en particulier ch@@@@@@@@@. Le procédé de @@invention se distingue de cette technique connue par le fait @u'il s'applique à des antigènes anormaux, en parti@ulier à des antigènes leucémiques ou tumoraux et qu'il permet d'obt@nir des aug@@ntations de l@ cytotoxicité beaucoup plus él@vées que celles cu'on aurait pu prévoir. De plus, l'invention élimine l'in@onvénient majeur de la technique ant@ri@u- re et propose un procédé utilisable in vivo. L'intérêt du @@rocéd @@ l'invention r@side dans @@ fait qu'il permet de tire@ l@ @@illeur parti possible des @nticor@s dirig@@ contre les @ntigè@es cellulaires. @insi, le procéd@ présente un @ntérêt p@rticuli@r lorsaue la quantit@ utilisable d@@@@@ier type d'anticorps est limit@e : c'est le cs @ar @@emple du s@rum @ntily@@@ocy@@@@@ où l'on est limité par l@@difficult@ de trouver des lymphocytes hum@ins pour immuniser les chev@@@ et où l'on est limit@@@@@@lement @@r les quanti@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ risque. Dans un tel ces l'invention permet de @@ti @@@@@@@@@@@@@ctivite du @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ar in@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@gammoglohulines de cheval. @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ un tel antis@@um @@ut être @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ un tel @nti@@@@@@@@@@@@@@@@utilisé suns d@nger @@@@@@@@@@@@@@@@ corps ne sont pas @@@@@@@@contre des @ntigènes du r@@@@veur. Il @@xiste un autre @@@ où l@@pr@@ @@ de l'invention p@ut @tre utilisé avec profit, c'est celui où les enticorps injectés in vivo sont dirigés contre des antigènes qui ont la propriété d'être rores et discrets à 1 surface de la cellule vise : ce peut Ure le cas d'un amtiserum dirige contre das entigènes leucémiques un tumoraux. L'addition d'une antiglobuline permet de multiplier l'efficacité des prcalces anticorps et accroit les possibilités d'aplication des traitements d'immnothér@@ie passive des leucéaics. Les orpériences déjà réalisées ent montré, "in vitro, l'efficacité du procédé. Pour les techniques d'ex@drinentation du procédé de l'invention les cellules sont sensibilisees par des anticorps contre les antigènes de la surface cellulaire ou lion désire étudier, puis lavées et mises on contact avec des anticorps dirigés contre les immunoglobines déjà fixées sur les collales. L'invention @@@@ illustrés par la d@@@@@tion ci-après qui concerne les expériences réalisees et les résultats obtenus, avec des anticorps de rat dirigés soit contre les antif,ènes normaux des cellules de la lignés de souris DBA/2, soit contre le antigènes de transplantation spécifiques de la leucémle de Charlotte Friend et du cérum de lapin enti-gamme globulines de ret. Les posultats obtenus sont présentés en cérérence aux figures 1 à 4 des dessins auboxés qui cont des @@@@iques font la légende est définie en détail à la fin de la présente description. Les antisérums Les antisérums n 311 "rat C.F. anti cellules normales DBA/2", N 352 "C57B1/6 enti cellules normules 38@/2" et N 315 "Lapin Fauve de sourgegne anti collulos normales DBR/2" ont été obtenus par des injections répétées intrapéritonéales de cellule de rate normale de souris DBA/2. L'antiséram N 369" rat C.F. anti antigène de transplantation spécifique de le lencémie de Charlotte Friend" a été obtenu per des injections répétées intropéritonéules d'un mélange de cellules de rte léucémique DBA/2 induite dons le virus de Charlotte Friend et d'antisérun N 311 ("rat C.F. ant cellules normales DBA/2") en excès, selon la technique décrite précédement [KCTTA R. "The passise immunotheropy of nurine loukacmie. I - production of antisers against loukaomie antigens" Rev. Europ. ctud. clin. Biol. 1970, 15.] Cet antisérum ne montro aucune activité cytotoxique contre les cellules normales DBA/2 tandis que son titre en cytotoxicité et du 1/16ème contre des cellules leucémiques de Charlotte Friend sur DBA/2. L'antisérum W 332 "Lapin anti gamma-globulines de rut" a été obtenu par des injections répétées de garme-globulines de rat préparées par précipitation au sulfate d'ammonium. Tous les sérume sont prélevés par ponction cordian@@ et conservés à - 20 C. Toutes les dilutions de sérum sont faites dans du milieu de culture 199. Les sérumes de mat et de lapin dont décomplémentés avant emploi par chauffage pendant 50 minutes à 56 C. lies cellules cibles On a utilise comme cellules cibles des cellules normales de ganglious lymphotiques et des cellules de rate de sourie DBA/2 porteuses de la leucésio de Charlotte Friond. Ces deux types de cellules ont été mis en suspension dans du milieu de culture 199 additionné de 1% du sirun de souris normal ou de liquide d'ascite non immun. Le complément On a utilisé du sérum de cobaye frais, congelé, conservé à - 700C, t dilué au 1/3 dans du milieu 199. Solution de Bleu Trypen Un mélange de 0,2% de bleu Trypan dilué dans l'eau distillés (4 volumes) et de cnlorure de sodium a' 4,25% dans l'eau distillée (1. volume) est préparé au moment de l'emploi Technique des assais Des dilutions en série de l'antiserum de rat utilisé peur la sensibilisation des cellules et de sérum normal de rot sont préparées avec de milieu 199. On prévoit généralement un volume de 1 ml pour chaque dilution. Une suspension de cellules cibles à 106 collules/ml est ajoutée, volume à volume a chaque dilution. Le mélange est agité et laissé à la température de la pièce pendant 50 minutes. Puis les collules sont contrifugées avec précaution et le surnageant est éliminé. lies cellules sont remetses on suspension dons un petit volume de milieu 199 et leur concentration amenée à 106 cellules/ml par une dilution appropriée. On mat 0,1 mi de chaque suspension cellulaire en présence de 0,1 ml de sérum de lapin anti gamme-globulinc de rat dilué au 1/20ème, 0,1 ml de sérum normal de lapin dilué au 1/20ème ou 0,1 ml de milieu 199 additionné de 1% de sérum normal de s@uris. Les deux derniers tubes servent de témoins. Le mélange est agité et laissé 30 minutes a la t@mpérature de la pièce. Puis on ajoute 0,1 ml de sérum de cobaye dilué au 1/3 dans du milieu 199 à chaque tube co@me source de compl@ment, Les tubes sont dgit@s et placés à 37 C pendant 45 @inutes, après quoi ils sont transférés dans la glace fondante et on ajout@ im@@@iatoment av@nt le comptag@ 0,1 @l de la solution de bleu Trypan. Le pourcentage de cellules mortes ou viventes est estimé à partie d'environ 250 cellules pour chaque tube. Calcul du @@pourcentage de cytotoxicité" La méthode pour calculer le pourcentage de cytotoxicité a été décrite en détail dans l'article de @MOTTA R. "Utilisation du test d'inhibition de cytotoxicité pour le dosage de l'antigène de greffe "in vitro" chez la souris". Rov. Franç. Etud. clin. biol. 1968 - 13,713. @ L'@ctivité cytotoxique d'un @ntisérum de rat en présence de sérum de lapin anti gamma-globulines de rat, de sérum de lapin normal et de milieu 199 est calculée par rapport au témoin correspendant où les cellules ont été "sensibilisées" par du sérum normal de rat. Le pourcentage de cytotoxicité est défini de l@ façon suivante : %de mortalitédansle spécimen-%de mortalité dans le témoin correspon@ant 100 x 100 - % de mortalit@@dans le témoin correspondant. Le titre d'un antisérum est défini comme la dilution de l'@n- tisérum qui donne un pourcentage de cytotoxicité ég@l @ 50%. RESUITATS Augmentation @e l'@ctivité cytotoxique @nvers les antigènes des cellules normales On a tudié l'aug@@ntat@ on de l'effic@cité cutotoxique de serum de rat enti-cellules norm@les de souris (@ S. N 311) @n- vers des cellules normales de g@@@lions ly@ph@@tiques en pr@sence de sérum de lapin anti-gem@@-globulines de rat (A.@ @ 322), de sérum normal de lapin @t de milieu 199. La figure 1 @ontre les résalt@ts obtonus. Sur cette figure, les pourcentages d@/cytotoxicité sont port@s en ordonnées, et les dilutions de l'antis@rum @ 311 sont porté@s en abs@isses. Si l'on compare le titre de l'antisérum @ 311 en prés@nce de l'an tiglobuline à calui des @@@@@@@@@@@@@@@@@@@ut voi@@@@@@@ iglo @ul@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@it @u @@@@@32 à@@@@@@@@ @v@@ d'@@@@@@@lo@s @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @ssay@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@multipl@@@@@@@@@@ @r @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@t@@@ion @@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ ut@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@inos de @@@@@@@ @nt@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@lobul@@@@@@@@@@332 @@@@1@@@@@@ction de cytotoxici@@ pro @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@anti-cellules DRA/2 @@@@@@@@@@, @@@ 1 figure 2, l@@ @our@@ntag@@@ de cttotoxicit@ sont portés @n@@@@donnéo@@@@les dilutions de l'@@tisérum @@@ 314 sont portées @n @bscisses. @ l@ figure 3, 1@s pourcontages de cytotoxicité sont @ortés @@ @@donné@@ et l@s dilutions de l'entis@rum N 352 sont portées en @bsisses. Les figures 2 et 3 montrent que l'@ntiglobuline n'infinence pas la reaction de cytotoxicité lorsque celle-ci n'est p@s due à des anticorps de rat @t @@ f@it rend très improbable qu l'antiglobuline agisso par l'action syn@rgique d'un fact@ur @e toxici té non spécifique ou par @@pport d'une fr@ction th@@@@@@@ble du complément. Augmentation @@ @@ cytotoxicit@ envers les anti èn@@ de transplan- tation de l@ l@uc@@i@ de C@@@rlotte Friend Dans le but de savoir si l'@@tiglo@uline est @ussi effi@@ce @u @ive@@ des @ntigenes de tr@nsplantations loucé@@iqu@@ qu'au niveau des anti@@@@@@@@@@@@ on a@@tudié l'action de l'ant@s@rum @@ 332 sur @@'@ctivit@ cytotoxique d'un@ sirum de rat@@@cif@@@ des @@@@@@@@@@@@@tr @@@@@@@@@@tions @@ 1@ l@ucénie d@ Ch@@@@@@ Friend sur des @@llul@@ de @@@te @@ souris DBA/2 port@us@s de la l@uc @@@ de @@@ riotte Friend. Les @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@par le v@@@@ de @riend @ont plus son@@ibl@s un f@@t@@r toxique pré@@@@@ d@@@@ 1 @@@um de l@pin que @@@ cellul@s no@@ les. Duis le but d'@vi@@@@@@@un@ @ventu@lle @@@@@@t@tion @@ @@totoxicit @@@@@@@@@@tre @@@@@@@@@@ à l'action non @@@@@@@@@@@@ d'un @@@@@@@ toxique on@@@@@@@@@@@@, @bsorbé l'@@ti, lobuline @@@@@@@@@@@nor@@ 1 @vec un @@@@@@@@@@@ le de cellules de rate leucenique indait par le virus de @riend sur DBA/2. On a utilisé la même méth@de de test que celle décrite précédomment. La figure 4 @ontro l'augmentation de l'activité cytotoxique de l'antisérum N 389 en pr@sence d'a@tigl@buline. A la figure 4, les pourcentages de cytotoxicit@ sont portés en ordonnées et les dilutions de l'antis@rum N 389 sont portées en abscisses. L'augmentation du titre est de l'ordr@ de 32/fois et parfois atteint des niveaux plus élevés. Les rés@ltats ci-dessus montrent que l'utilisation d'une antiglobuline est efficace pour augmenter très notablement la cytotoxicité immune dans le cas où l'on applique un t@l procédé à des antigènes l@ucémiques. l'efficacité du procédé est lic à la réaction immunologique entre les anticorps fixés sur la cellule et l'@ntiglubuline. Les mécanismes par lesquels cette réaction p@ut provoquer ou faciliter la mort de la cellule ne sont pas @ncor@ complètement élucid@s à l'heure actuelle, @@@is il est clair que des oxplications théoriques sortent du cadre de cette description et des revendications annexées. Le résult@t positif @nregistré avec l'utilisation d'une antiglobuline sur les antigènes de transplantation l@ucémique de la leucémie de Charlotte Friend illustre l'application du procédé de l'invention aux entigèn@s l@ucémiques de transplantation faibles chez la souris @t chez l'homme. LEGENDE DES FIGURES Fig. 1 Cytotoxicité excrcée par de l'antisérum de rat anti-cellules normales DBA/2 (A.S. N 311) sur des cellules normales de ganglions lymphati@ues DBA/2. en présonce d'antiglnbulino de lapin antigamm@-glo- buline de rat (A.S. N 532) en présence de sérum normal de lapin (témoin). buline de rat (A.S. N 332) en présence de sérum normal de lapin (témoin). antisérum de rat n 311 seul (témoin). Fig. 2 Cytotoxicité exercée par un @ntisérum de lapin anti-cellules normales DBA/2 (A.S. N 314) sur des cellules normales de ganglions lymphatiques DBA/2. en présence d'antigl@buline de lapin antigamma-gl@bu- lino dc rat (A.S.N 332) en présence de s@rum normal d@ lapin (témoin) antisérum de lapin N 314 seul (témoin). Fig. 3 Cytotoxicité exercée par un antisérum de souris C57Bl/6 anticellules normales DBA/2 (A.S. N 352) sur des cellules do ganglions lymphatiques DBA/2. en présence d'antiglobuline de lapin antigammaglobuline de rat (A.S. N 332). en présence de sérum normal de lapin (témoin) antisérum de souris N 352 seul(témoin) Fig. 4 Cytotoxicité ex@r@ée par un @ntisérum de rat anti-antigène l@ucémique de Charlotte Friend (A.S. N 389) sur des cellu les d@ rate DBA/2 l@ucémiques induites par l@ virus de Char lottc Friand. en présonce d'antiglobuline de lapin anti-gamma-globulino de rat (A.S. N 332). en présence de sérum normal de lapin (témoin) antis@rum de rat N 389 seul (témoin) REVENDICATIONS 1. Procédé pour multiplier l'activité d'un anticorps diri@@ contre un antigène cellulaire normal ou anormal, notamment un antigène leucémique ou tumoral, su@ laquel on fime un premier type d'anticorps corr@spondant audit antigène, ledit procéd@ étant caracterisé en ce qu'on ajoute cons@e@tivement un deuxième type d'enticcrps dirigé contr@ les dits @nticorps @@ pre@i@r type déjà fixés. 2. Procédé selon la revendication 1, car@cti@is@@en ce @ue la cellule cible et l'antisérum anticellule ap@@rti@nnent les espèces animales différentes. 3. Application d@ procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, au trditement immunodépresseur, @n particuli@r chez l'homme, caractérisée en ce que après avoir @@@iristr@ du sérum antilymphocytaire, on injecte un antiserum antig@@@@aglobulines de cheval. 4. Application du procedé selon l'une des revendications 1 ou 2 pour au@menter l'activité d'anticorps dirigés contre des antigènes l@ucémiques ou tumoraux, caractérisde @n ce que, après avoir administrés un antisérum dirigé contre lesdits antigènes, on injecte une antiglobuline diri@ée contre l'antis@rum administré. 5. Application selon la revendication 4 au traitement des leucémies par immunothé@apie passive. 6. Antisérum mis en oeuvre dans le proc@@@ selon l'une des revendications 1 ou 2 ou dans les applications selon l'une @uel- conque des revendication 3 à 5 dudit procédé.