Brevet FR2091913A1 — publié le 19710121

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique antibatbérien et antifongique} qui sera dénommé ci-après grisorixine, pour plus dc simplicité; elle conoerne également un procédé pour son obtention, par isolément à partir du myoélium d'un actinomycète du genre Etreptomyoes. La griserixine correspond à la formule brute G40H68O10 . Son point de fusion F est de 75 à 80 C, déterminé au microsoope à point de fusion et il présente une valeur (&alpha;)20 J égale à 16 , mesuré en solution à 4% dans l'acétone. La grisorixine est apparue comme voisine de la polyéthérine A. Un certain nombre de remarques seront tout dlabord dites au au jet du êtrephomyces producteur; sa morphologie varie avec le milieu sur lequel il est cultivé. On a constaté que sur Crapeck-glucose, cascharose, amidon ou glycérol la mycélium végétatif est blanc translucide, le mycélium aérien poudreux blanc virant rapidement au gris - sr milieu de Sauton, milieu de Jensen, sur glose au malt, sur milieu à l'extrait de viande et eau peptonée la eroissance est médiocre, les colonies très petites, le mycélium aérien nul et la sporulation très faible;; sur pommes de de terre nutritives, carotteset protéine de colza, la croissance est rapide, la sporulation abondante. Le mycélium sérien poudreux, d'abord blanc, vire rapidement au gris. Le revers des cultures est généralement blanc ou jaune pâle, Sur aucun milieu il n'y a production de pigment. La gélatine est lentemont liquéfiée. Hieroseopiquement le mycélium végétatif apparaît indivis et ramifié de l de diamètre. Le mycélium adrien est formé d'hyphes sporulantes ramifiées et courtes. Les spores sont ovoïdec de di mension 0,6 x 1,5 . Les travaux effectués ont montré que la grisorixine était obtenue dans des conditions particulièrement Favorables en l'ise- lant sur du mycélium frais obtenu sur pommes de terre nutritives, par culture sur agitateur ou au fermenteur, par extraction et purification par chromatographie sur gel de silice. le procédé d'obtention de la grisorixine sur pomme de terre nutrive, est caractérisé en ce que, pour préparer un milieu de culture, on fait bouillir 20 parties an poids de pommes de ter ra dans ioe parties d'eau, on filtre les pommes de terre pour séparer la pulpe, on ajoute an jus pour 100 parties, 2 parties en poids de saccharose, et 0,3 partie en poids de corn stcop, de tourteau de soja ou de colza, de farine de soja ou de colza, ou d'extrait alcoolique de soja, que lton répartit le jus-mi lLeu ainsi obtenu dans des récipients de type erlenmeyer de vo lume environ quintuple de celui de jus introduit, on autoclave pendant 20 minutes à 118 C, on ensemence chacun des récipients R la manière usuelle avec une culture sur milieu solide du Streptomys de dix jours, que l'un réalise la culture on sept jours sur agiteteur à 27 C, puin l'on filtre pour récolter environ 20g de mycélium frais par litre du jus de culture, on essore le mycélium et on l'extrait à deux reprises-rar l'étha- nol à 95% à raison de 5 millilitres d'éthanol par gramme de mycélium frais, on éyapore l'éthanol à une tompérature d'environ 200C sous la pression réduite correspondante, on redissout l'ex- trait dans 10 volumes d'acétate d'éthyle, on lave l'acétate d'éthyle à deux reprises par l'eau distillée et on l'évapore, on solubilise le résidu dans 15 à 20 ml d'alcool absolu additionné d'un excès, environ 50 volumes, d'éther, on élimine le précipité formé, on concentre la fraction éthérée et on la reprend par un excès environ 50 volumes, de benzène, on sépare les insolubles et on purifie la fraction benzénique contenant la grisorixine brute par chromatographie sur gel de silice. Dans ces conditions, le rendement en antibiotique par rapport à la matière sèche est de l'ordre de 10%. Pour purifier la grisorixine contenue dans le produit brut ci-dessus, on opère par chromatographie sur colonne de gel de silice (par exemple Silicagel ME:CK : 0,05 - 2 mm), avec comme éluant soit un mélange à 70% (vol) d'éther et 30% (vol) d'éther de pétrole, soit un mélange, en volumes, de 70% de cyclohexane et de 50% d'acétate d'éthyle. Pour obtenir la grisorixine avec une pureté suffisante, c' est-à-dire cristallisable sans impureté, on effectue deux chromatographies sur colonnes successives. L'évaporation sous vide d'une solution éthérée (70% éther, 30% éther de pé@@ole) de grisoixine fournit l'antibiotique solon l'invention sous forme d'une mousse blanche solide. La grisorixine selon l'invention correspond à la structure ci-après, définie par cristallographie Son analyse élémentaire est la suivante Calculée Trouvée C % : 67,76 67,38 H % : 9,67 10,17 O % : 22,57 22,45 Son spectre infrarouge (dans KBr) présente les principales rales d'absorption ci-après comme en le voit sur la courbe des figures la et 1b où on a représenté le spectre infrarouge d'un échantillon de grisorixine, lr:s fréquences étant en abscisses (cm-) : 3500 à 3440 (bande-large I), 2980 TI), 2950 (TI), 2895 (I), 1745 (M), 1725 (M), 1475 (M), 1390 (M), 1290 (F), 1272 (F), 1228 (F), 1210 (F), 1120 (M), 1085 (I), 1068 (M), 1047 (M), 1020 (F), 1120 (@), 1085 (I), 1068 (M), 1047 (M), 1020 (F), 962 (I), 930 (M), 903 (F). où TI signifie très intense, I signifie intense M signifie moyenne et F signifie faible. Le spectre infrarouge (CCL4, VARIAN A-60) présente comme on le voit sur la courbe de figure 2 - un massif très large entre 0,5 et 2,8 ppm (55 protons) - un singulet à 3,33 ppm (3 protons - OCR3 ) - un massif entre 3,33 ppr ct 4,5 ppn (8 protons) - un massif centré à 6,55 ppm (2 protons). En vue de son- utilisation pratique, on peut mettre la grisorixine sous forme de sels cristallisables, tels que ceux de sodium ou de potsssium. A cet effet, à une solution de grisorixine dans l'alcool dilué (50% d'eau en volume) on joute une solution de soude N/10 jusqu'à pH 8-9. On évapore sous vide le mélange réactionnel. Le résidu est dissous dans du méthanol et la solu tion filtrée. A cette solution, on ajoute de l'eau jusqu'à léger trouble, On laisse évaporer à l'air. Les cristaux de sel de sodium précipitent et sont filtres.On obtient des cristaux blancs F = 242 - 2460C (microscops a' point de fusion) Analyse élémentaire : Calculée Trouvée C % : 65,73 65,76 H % : 9,24 9,57 M % : 3,15 3,18 Par les mêmes moyens la sel de potassium de la grisorixine pcut te obtanu ; il présente comme le sel de sodium de grands avantages d'utilisation du fait de leur solubilité dans l'eau. On a décrit ci-après les résultats donnés par la grisorixine tels qu'ils ont été obtenus sur bactéries, levures, champignons, animaux et cultures, Dans ces essais le titrage de la grisorixinc a été réalisé par la méthode des dilutions en milieu liquide. Les bactéries et les levures ont été éprouvées en eau peptonée glucoséc. nuant aux champignons, ils ont été éprouvés sur un milieu de culture qui permet une bonne croissance de tous les microorganismes utilisés et qui a la composition suivante glucose 20g peptone 6g extrait de levure 1g corn stoop 4g Na CI O,5g Mg S04, 7 H2O G,5g K@H2PO4 1g Fe DO4, 7 H20 10 ng eau distilléc g.s.p. 1 1 Lorsque tous les éléments ont été dissous, le milieu a été filtré, amené a pli = 6,5 avec RO2 CO3, réparti en tubes à esseis, puis stérilisé 10 mn à 1100C. Les chamgignons pathogènes de l'homme et des animaux ont été incubés à 370C ct les parasites végétaux à 250C. Les lecturcs ont été faites après 48 h, 4 t 8 jours de culture. En opérant dans ces conditions, les doses d'antibiotique minimales inhibitrices exprimées en microgrammes par millilitre de milieu de culture, ont été les suivantes : Escherichia coli > 200 Proteus vulgaris > 200 Salmonella chol@rae > 200 Pseudomonas aeruginosa > 200 Bacillus subtilis 0,1 Staphylococcus aur@us 0,4 Streptococcus pyogenes 0,5 Mycobactériun chelonii 2 Streptomyces antibioticus 2 Saccharomycee@ cerevisiae 1 Candida albicans 20 Geotrichum candidun 50 Cryptococ@us neoformans 25 Trichophyton mentagrophytes 25 Mycrosporum canis 50 Blastomyces dermatidis 12 Sporotrichu@ shencki 50 Madurella mycetoni 12 Penicillium roqueforti 1 Aspergillus ochraceus 50 Endothia parasitica 1,5 Cercospora beticola 2 Rhizoctonia solani 12 Phoma betae 20 Schlerotinia sclerotiorum 0,7 Pythium ultimun 50 Phytophtora infestans 100 Fusarium alii 50 Monilia laxa 0,7 Phomopsis mali 0,3 Botrytis cincrea 0,3 Verticillium albatrum 0,3 Epichloe typhina 6 Holminthosporium festucae 20 Dactylium dendroïdes 50 Trichothecium roseu@ 0,7 Colletotrichum lindemuthianum 1,5 Ascochyta pisi 1,5 Pour la souris, la DL50 est de 15 mg par kg de poids vif lorsque 11 antibiotique est administré par voie sous cutanee. A autopsie, au niveau du foie, on observe dos plages de dégéné- rescence importantes. L'analyse biochimique dc ces foies décèle des taux énormes de taurine. ta A des doses plus élevées (25 mg/kg) la nort des souris sur- viout en une à deux heures avec des aymptomes d'esphyrie. Le contrôla de l'activité succino déshydrogénasique au niveau des organes et tissus, met en évidence un blocage de cette enzyme. La grisorixine/montré sur les cellules tunoreles Me La n culture, un effet cytotoxique avec destruction cellulaire a la dose d 10 g g/ml et un effet inhibiteur sur 1 croissance ct la multiplication de ces cellules à la dose de 1 meg/ml. La grisorixine on solution aqueuse, à partir de la concentration dc 0,2%. , inhibe la germination de la plupart des graines, ce qui correspond à un effet phytotoxique intéressant. La grisorixine exerce une action hcrbicide, notamment lors qu'elle est administrée en pulvérisation sur les plants, ce qui provoque non seulement des retards de croissance mais aussi des brûlures importantes. On signalera à ce sujet que la grisori xne, administrées en pulvérisation à la dosc de 0,2%. sur haricot infocté préalablement par Colletotrichun lindemuthianum, entrave totalement l'évolution de la maladie. Si la dose est aux environs de 0,1%. > on obtient une évolution beaucoup plus lente et plus faible de la maladie et encore une bonne croissance du haricot. REVENDICATIONS 1. Produit antibiotique, antibactérien et antifongique isolé du mycélium de Streptomyces caractérisé en ce qu'il correspond à la formule brute C40, H68O10, présente un point Ne fusion de 5 à 800C détermine an microscope de fusion et un dj20 égal à 15 en solution à 4% dans l'acétono, à la structure suivaate déterminée par cristallographie 2.Procédé pour la préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour préparer un milieu de culture, on fait bouillir 20 parties en poids de pommes de terre dans 100 parties d'eau, on filtre les pormes de terre pour séparer la pulpe, on ajoute au jus pour 100 parties, 2 parties en poids de saccharose et 0,3 partie. en poids de corn steep, de tourteau de soja ou de colza, de farine de soja ou de colza, ou d'extrait alcoolique de soja, que l'on répar ti t le jus-milieu ainsi obtenu dans axes récipients type erlenmayer de volume environ quintuple de celui du jus introduit,on autoclave pendant 20 minute à 1180C, on ensemence chacun des récipients à la manière usuelle avec une culture sur milieu solide du streptomyces de six jours, que l'on réalise la culture an sept jours sur agitateur à 270,puis B'on filtre pour récolter environ 20g de mycélium frais par litre du bus de culture, on essore le mycélium et on l'extrait à deux reprises par l'éthanol à 95% à raison de 5 millilitres d'éthanol par gramme de mycélium frais, on évapore l'éthanol å une température d'environ 200C sous la pression réduite correspondante, on redissout l'extreit dans 10 volumes d'acétate d'éthyle, on lave l'acétate d'éthyle à deux reprises par l'eau distillée et on l'évapore, on solubilise le résidu dans 15 à 20 ml d'alcool absolu additionné d'un excès,environ 50 volumes, d'éther, on élimine le précipité formé, on concentre la fraction éthérée et on la reprend par un exces, environ 50 volumes, de benzène, on sépare les insolubles et on purifie la fraction benzénique contenant la grisorixine brute, par chro-Latographie sur gel de silice.Dans ces conditions, le rendement en antibixtime par rapport à la matière sèche est de l'ordre de 10%. 3. Procéda selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on extrait le produit du brut par deux chromatographies successives sur colonnes de gel do silice l'éluant étant un mélange A 70% (vol.) d'éther et 30% (vol) $d'éther de pétrole, 4. procédé selon la revendication 1 caractérise en ce qu'on extrait le produit du brut nar deux chromatographies successives sur colonnes de gel de silice l'éluant étant un mélange, en volumes, de 70% de cyclohexane et de 30% d'acétate d'éthyle. 5. Application du produit selon la revendication 1 con- autibactérien. 6. Application du produit selon la revendication 1 com ne fongicide. 7. Application du produit -selon la revendication 1 comme antibiotique. 3. Le sel de sodium du composé selon la revendication 1. 3. Le sel de potassium du composé selon la revendication 1.