Brevet FR2065658A1 — publié le 19710806

La présente invention concerne un nouvel antibiotique, appelé lipoxamycine, ainsi qu'un procédé pour sa préparation à l'état brut et sa purification. la lipoxamycine peut être obtenue suivant l'invention sous 5 forme d'un mélange en contenant, et appelé ci-après lipoxamycane brute. On peut obtenir cette lipoxamycine brute en cultivant d^r. • un milieu nutritif aqueux un actinomycète producteur de cette, lipoxamycine brute. Ce produit, ainsi que la lipoxamycine pure (U-26,146D), est amphotère et a pour propriété d'inhiber le 10 développement des bactéries G-ram-positives et G-ram-négatives, telles que Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. Streptococcus faecalis. Streptococcus hemolyticus. Piplococcus pneumoniae. Escherichia coli, Proteus vulgaris. KLebsiella pneumoniae. Salmonella schottmuelleri et Pseudomonas aeruginosa. la lipoxamycine brute ou purifiée est 15 également activ.e contre divers champignons tels que Geotrichum sp.. Hormodendrum compâctum. Phialophora verrueosa. Crvptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum. Sporotrichum schenkii. l'ionosporium apiospermum. Trichophyton rubrum. Trichophyton interdigitale et Microsporum canis. 20 la lipoxamycine brute ou purifiée peut être utilisée,seule :u en combinaison avec d'autres antibiotiques,pour empêcher le dévelo"-^ pement ou réduire le nombre des bactéries et des champignons, comme 9 indiqué ci-dessus, dans divers milieux ambiants. On peut, pai l'une ou l'autre . exemple, les employer/comme desinfectants sur divers accessoires 25 à usage dentaire ou médical qui peuvent être contaminés par Staphylococcus aureus. On peut les utiliser comme antifongiques dans des produits de conservation industrielle, par exemple comme produits de rinçage antifongiques pour le linge après blanchissage, et pour l'imprégnation des papiers et des "tissus. On peut aussi les 30 employer pour supprimer le développement fongique de microorganismes sensibles dans des essais sur plaque ou dans d'autres milieux biologiques. l'invention est décrite en référence au dessin annexéf dans lequel : 35 la figure 1 représente le spectre d'absorption infrarouge de sulfate de lipoxamycine anhydre en suspension épaisse dans de l'essence minérale ; 70 15355 2 2065658 la figure 2 est la reproduction d'un chromatogramme sur papier du bouillon de fermentation'- et la figure 3 est la reproduction d'un chromatogramme sur papier obtenu à partir de. la lipoxamycine brute et de la lipoxamycine pure, ir On indique ci-après les propriétés physiques et chimiques 6e la lipoxamycine brute, salifiée en sulfate. Analyse élémentaire : Trouvé : C, 54,30 1° ; H, 9,01 1<> ; N, 6,36 # ; .S, 3,75 & Pouvoir rotatoire : 10 , = (c ~ 0*408, dans le diméthylsulfoxyde). Point de fusion : 154-1 55°C (décomposition). Spectre ultraviolet : & max = 209 (dans le méthanol) ® = 5600 et 275 avec épaulement 6 = 63 15 Titrage : Poids équivalent : 209 avec une première cassure de la courbe à 437» Titrage en retour dans de l'éthanol à 60 On trouve pKa^ = 6,8 et pE^ = 9?8„ Spectre infrarouge : le spectre d'absorption infrarouge de la 20 lipoxamycine brute et anhydre, en suspension épaisse dans de l'essence minérale,ne peut être distingué du spectre d'absorption infrarouge de la lipoxamycine pure , anhydre, tel que représenté sur la figure 1 . On indique ci-après les propriétés physiques et chimiques 25 de la lipoxamycine brute, sous forme de base libre.. Analyse élémentaire : Formule brute Calculé : C, 61,26 # ; H, 9,74 1° ; N, 7,52 f ; 0, 21,48 #. "Trouvé : 'C, 61,75 61,27 * ; H,' 9,70 9,72 % ; n, 7,47 # ; 30 o, 21',40 Point de fusion : 6&-70°C (décomposition). Pouvoir rotatoire : [cc]^ = -2° (c i 0,877, dans du méthanol.) Spectre infrarouge : lia lipoxamycine brute,à l'état-de base libre , 35 présente un spectre d'absorption infrarouge caractéristique lorsqu'on l'examine en suspension épaisse dans de l'essence minérale. On indique ci-après une liste des raies de ce spectre, les longueurs 70 15355 3 2065658 -1 d'onde sont exprimees en cm Les intensités des raies sont signalées respectivement les lettres "S", "M" et et sont évaluées en fonction du dans le voisinage des raies. Une raie "S" est du même ordre ri'in-5 tensite que la raie la plus forte dans le spectre ; une rai-' est d'une intensité comprise entre un tiers et deux tiers de raie la plus intense et les raies sont d'une intensité inférieure à un tiers de celle de la raie la plus brillante. Ces évaluations sont faites sur la base d'une échelle de trsnsmittanse 10 en pour cent. L'indication "ép." signifie qu'il y a un épaulement. 15 3340 (¥) 1460 (S) (essence) 1155 (W) 3280 (¥) 1410 (M) 1135 (¥) 3150 (¥) 1375 (S) (essence) 1090 (M) 2930 (S) (essence) 1365 (M) (ép.) 1050 (¥) 0 0 OA CM (S) (essence) 1325 (w) 975 (¥) 2840 (S) (essence) 1300 (¥) 960 (¥) 1700 (S) 1240 (¥) 890 (¥) 1650 (M) (ép.) 1220 (w) (ép.) 770 (V) 1640 (M) 1213 (¥) (ép.) 725 (v:> 1567 (M) 1200 (M) 20 On indique ci-après les propriétés physiques et chimique du sulfate de lipoxamycine pure. Analyse élémentaire : Formule brute : C^H^gN^O^, 1/2 ^SO^ 25 Calculé : C, 54,13 # ; H, 8,85 % ; N, 6,64 ; S, 3,80 £ Trouvé : C, 54,18 ; H, 8,93 & ; N, 6,27 # ; S, 3,72 Point de fusion : 153,3°C (décomposition). Pouvoir rotatoire : [°0^ = -10° (c = 0,696, diméthylsulf oxyde ) Spectre ultraviolet : dans le méthanol, la lipoxamycine pure pr Àmax. = 208 ; €=5 450 et 275 (ép.) ; €= 63. Spectre infrarouge : Le spectre d'absorption infrarouge de la lipoxamycine pure et anhydre, mise en suspension dans une pâte d'essence minérale? est reporté à la figure 1 du dessin annexé 35 La lipoxamycine pure fournit des raies de longueurs d'onde suivantes, exprimées en cm~^. 70 15355 4 2065658 10 3380 : (M) 1 442 (S) 1129 (S) o m C\J (M) • 1427 (S) 1109 (S) O -vt- o (S) (ép.) • 1410 (s) 1082 (S) 2760 (M) 1375 (S) 1059 (S) 2670 (M) 1364 (s) 1032 (S) 2040 (w) 1330 (M) 973 (M) 1700 (S) 1307 (M) 938 (W) 1667 (S) . 1267 (M) 917 (¥). 1660 (s) 1255 (M) 885 (W) 1612 (M) 1238 (M) 861 (W) 1517 (M) 1217 (M) 800 (W) 1498 (M) 1196 (M) " 728 (M) 1465 (S) 1164 (s) 685 (M) Solubilité : 15 à 25°C. ILjO CH^ÛH '1 mg/ml, 10 mg/ml (à chaud) Diméthylformamide 5 mg/ml Méthylpyrrolidone 5 mg/ml 20 Diméthylsulfoxyde 15 mg/ml On obtient la lipoxamycine pure à partir de la lipoxamycine brute par répartition à contre-courant dans.un appareil de Craig. l'actinomycète qu'il convient d'utiliser conformément à 25 l'invention pour la production de la lipoxamycine brute est Streptomyces virginiae var. lipoxae. var. nova, l'une des caractéristiques de cett§/souche est la production de la lipoxamycine brute. Une sous-culture de ce microorganisme vivant a été déposée auprès"de l'association intitulée-Northern Utilization and Research r 30 Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. Elle a été classée dans la collection permanente et elle est sans restriction à la disposition du public sous le N0 ÏTRR1 3630. le microorganisme suivant l'invention a été étudié et carac-35 térisé par Aima Dietz de la Société dite The Upjohn Research Laboratories. Si l'on compare, dans la bibliothèque"Ektachrome"de la collection Upjohn, le Streptomyces virginiae var. lipoxae var. nova 70 15355 5 2065658 avec d'autres espèces de Streptomyces. on constate que ce produit est des plus semblablesà Streptomyces virginiae. souche NA255-B8 étudiée par' G-rundy et - ses collaborateurs [voir "Ahtibiotics and Chemotherapy, vol. 2, pages 399-408 (1952)]. l'identité de cette 5 nouvelle variété est confirmée par des examens microscopiques et macroscopiques tels que décrits dans ce qui suit. Les différences existant entre la culture type et le nouveau produit isolé du sol est suffisante pour justifier la désignation de ce dernier comme une nouvelle variété. 10 On décrit ci-après le microorganisme. On compare Streptomyces virginiae var. lipoxae avec Streptomyces virginiae. souche KA255-B8 de &rundy et ses collaborateurs . Caractéristique de couleur. Le mycélium aérien est nuancé 15 de rose. Absence de pigments mélaniques. L'aspect sur diapositive Ektachrome est indiqué dans le tableau I. Les caractéristiques de couleur par rapport à des échelles de référence sont indiquées dans le tableau II. On peut classer ces cultures dans la série des rouges (R) de Tresner et Backus [Appl. Microbiol. JJ. (1962) 20 pages 335-338] et, sur l'un des milieux, dans leur série des blancs. Résultats de l'examen au microscope. Spores lisses, de profil rectangulaire. Surface des spores striée,avec beaucoup de détails de surface. Chapelets de spores rectilignes ou en spirale ouverte et lâche, jusqu'à une spirale en tire-bouchon 25 à l'extrémité du chapelet de spores [RF, RA, S au sens indiqué par Pridham et ses collaborateurs dans Appl. Microbiol. Vol. 6 (1958) pages 52-79]. -s Caractéristique^ au point de vue culture et biochimie. Voir tableau III ci-après. 30 Utilisation du carbone. L'aptitude de la culture à se dévelop per aux dépens de composés du carbone a été déterminée dans le .milieu synthétique de Pridham et G-ottlieb [J. B acteriol. ,vol. ^6_ (1948) pages 107-114] et dans leur milieu modifié [voir International Journal of Systematic Bacteriology, vol. J_6 (.1966) pages 313-340]. 35 En milieu de Pridham et G-ottlieb, les deux cultures se développent bien sur D-xylose, L-rarabinose, D-galactose, D-glucose, D-mannose, maltose, cellobiose, dextrine, amidon soluble, glycérol 70 15355 6 2065658 et acétate de sodium ; la culture du type pousse bien, et celle de la variété pousse modérément,sur rhamnose et sur D-fructose. Les deux cultures poussent modérément sur sucrose, lactose, raffinose, dulcitol, D-mannitol, D-sorbitol et inositol, ainsi que sur le milieu. 5 de basq&ans composé carboné. Sur inuline et sur tartrate de sodiurr, la culture du type pousse modérément ; le développement de la varie-té est médiocre. Sur salicine, la culture du type a une croissance médiocre, celle de la variété,une croissance modérée. Sur citrate de sodium et succinate de sodium, la culture du type a une crois-10 sap.ce médiocre, tandis que la culture de la variété pousse bien. Aucune des deux cultures ne pousse sur phénol, crésol, formiate de sodium, oxalate de sodium ou salicylate de sodium. Dans le milieu modifié, les deux cultures se développent à peine sur le milieu de base sans composé de.carbone, elles ont une bonne crois-15 sance sur le témoin avec glucose, une croissance douteuse sur le c D-fructose et n'ont aucune croissance sur le sucrose, 1'inositol, le D-mannitol, le raffinose et la cellulose. La culture du type ne se développe nullement sur L-arabinose ou.D-xylose ; la culture de la variété pousse passablement sur L-arabinose et bien sur 20 D-xylose. La culture du type a une croissance douteuse sur rhamnose ; la culture de la variété n'a aucune croissance. Température. Les deux souches poussent bien à des températures de 18 à 28°C. La croissance est médiocre à 37°C et, à 55°C, on n'en observe en 24 heures que des traces. 25 Source. Ce microorganisme provient du sol. Culture du type. Streptomyces virginiae souche ÎTA 255-B8, Grundy et ses collaborateurs. Variété type. Conformément à la règle 21 du Code International de Nomenclature des Bactéries [Intern. J. System. Bacteriol» vol. J_6 30 (1966) pages 459-490], il est convenu que l'espèce type soit choisie comme variété type. Variété nova. Streptomyces virginiae var. lipoxae var. nova. Les caractéristiques de Streptomyces virginiae var. lipoxae sont indiquées dans les tableaux suivants : 35 Tableau I : Aspect de Streptomyces virginiae var. lipoxae et de Streptomyces virginiae sur diapositives "Ektachrome" 70 15355 2065658 Tableau II : Caractéristiques de couleur prises pour référence, de Streptomyces virginiae et Streptomyces virginiae var. lipoxae. A. Caractéristiques de couleur sur trois milieux de gélose -5 B. Couleur du'mycélium aérien en masse. Tableau III : Caractéristiques de cultures de S. virginiae v. lipoxae et de S. virginiae. TABLEAU I Aspect de Streptomyces virginiae var. lipoxae et de Streptomyces 1 0 virginiae sur diapositives Ektachrome* Milieu à la gélose S. virginiae v. lipoxae S. virginiae ÎTA255-B8 Milieu de Bennett R Rose Rose 15 V Jaune tan Jaune tan Sucrose de Czapek R Rose pâle Rose pâle V Incolore Incolore Maltose-tryptone R Blanc à peine rosé Blanc rosé V Brun Brun 20 Peptone-fer R Pas de croissance en surface Pas de croissance en surface V Brun Brun Tyrosine à 0,1 ^ R Rose pâle Rose V Rouge Rouge ' | 25 Caséine-amidon R Rose Rose J V Rose-jaune tan Rose-jaune tan | Dans le tableau ci-dessus, on indique par convention : R = recto V = verso 30 * Ektachrome est une marque déposée par la Société américaine Eastman Kodak Go. et par sa filiale française Kodak-Pathé S.A. Voir Dietz, A., "Ektachrome Transparencies as Aids in Actino-mycete Classification", "Annals of the New York Academy of Sciences", vol. 60- (1954) pages 152-154. TABLEAU II Caractéristiques de couleur de référence pour Streptomyces virginiae et Streptomyces virginiae var. lipoxae A. Caractéristiques de couleur sur trois milieux à la gélose Milieu à la gélose Color Harmony Manual, 3ème éd. 1948* EBS Circular 553, 1955** S. virginiae v. lipoxae S. virginiae NA255-B8 - S. virginiae v. lipoxae S. virginiae ' NA255-B8 Milieu de Bennett R 5dc(g) 5fe(g) tOgm ; . 63m V 2gc(g) 2gc (g)' 90gm 90gm P 2ge(g) 3ge(g) 90gm 79m 94m , Sucrose de Czapek R 2dc(g) 3dc(g) 93 gm ■ V 2dc(g) 3dc(g) 93 gm - Malt o s e-1 rypt one Jr R 5ba(g) 5ba(g) ■ ■ . 9m 9m" V 3ie(g) 3gc(g) . 76m 77g 76gm P 31g (g). 2gc(m) 77gm 90gm O Cn LU cn Cn 00 Dans ce tableau, on adopte par convention les références suivantes : R = recto ; V = verso ; P = pigment ;.(g) = brillant ; (m) = mat. * Jacobson, E., G-ranville W.C. et Foss. C.E. "Color Harmony Manual", 3ème éd. (1948) Container Corporation of America, Chicago, Illinois (U.S.A.). ** Kelly, L.K., et Judd. D.B. "The ISCC-EBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names. U.S. Dept. Comm. Cire. 553 (1955). K) O O Ln O en 00 70 15355 9 2065658 TABLEAU II (Suite) B. Couleur en masse du mycélium aérien (Tresner et Backus *) (Shirling et G-ottlieb **) Milieu à la gélose S. virginiae v. lipoxae S virginiae UA255-B8 Milieu de Bennett 5 de gamme des rouges 5dc gamme des rouges Sucrose de Czapek 3ca gammé des rougés 4e c gamme des rouges Maltose-tryptone 5cb gamme des rouges b gamme des blancs Extrait de levure de -bière-extrait de malt (ISP-2) 5ge gamme des rouges 5dc gamme des rouges Flocons d'avoine (ISP-3) 5ge gamme des rouges 5ec gamme des rouges Sels minéraux-amidon (ISP-4) 5dc gamme des rouges 5dc gamme des rouges- Glycérol-asparagine (ISP-5) 5cb gamme des rouges 5cb gamme des rouges * Tresner, H.D. 'et Backus, E.J. System of Color Wheels For Streptomycete Taxonomy. Appl. Microbiol. Vol. j_}_ (1962) pages 335-338. ** Shirling, E.B. et G-ottlieb D. Methods for Characterization of Streptomyces species. International^Journal of Systematic Bacteriology. Vol. 1_6 (1966), pages 313-340. TABLEAU III 'Caractéristiques de cult.ure de S. virginiae v. lipoxae s et S. virginiae Milieu à la gélose , S. virginiae v. lipoxae S. virginiae NA255-B8 Peptone-fer R Pas de croissance aérienne Pas de croissance aérienne " V Brun Brun AC Pigments mélaniques Pigments mélaniques Mal&te de calcium R Rose pale Rôle pâle V Incolore Incolore AC Pas de pigment Pas de 'pigment Malate non solubilisé Malate non solubilisé Glucose-asparagine R Rose saumon pâle Rose saumon pâle V Crème Crème % AC Pas de pigment Pas de pigment Lait écrémé R Une trace rose pâle incolore ou une trace rose pâle V Jaune brun Jaune à jaune brun AC Pigment j aune brun Pigment jaune brun Caséine légèrement solubi Caséine légèrement solubilisée ■ lisée Tyrosine R Rose pâle Rose pâle V Brun fauve Jaune brun AC Pigment j aune brun Pigment j aune Tyrosine solubilisée Tyrosine solubilisée *^4 O in LU Lr Cn NJ o o en O-en oo \ TABLEAU III (suite) Milieu à la gélose v. lipoxae S. virginiae NA255-B8 Xanthine R Rose pâle Rose pâle Y Jaune Jaune AC • Pigment jaune pâle Pigment jaune pâle Xanthine solubilisée au Xanthine solubilisée au - cours de la croissance cours de la croissance . Extrait de levure de bière- R Rose Rose Extrait de malt V Jaune brun J aune AC Pigment j aune pâle Pigment jaune pâle Caséine-amidon R. Rose Rose Y Rose-jaune brun Rose-jaune brun AC L'amidon est hydrolysé -L'amidon est hydrolysé Amidon nutritif R Blanc rosé Blanc rosé Y Jaune crème Jaune crème AC Pigment jaune pâle Pigment j aune■pâle dextrose de Sabouraud / R Blanc rosé Une trace blanc Y Jaune brun Jaune AC Pigment j aune Pigment j aune Milieu de Bennett R Rose Blanc,une trace rosée Y Jaune brun Jaune AC Jaune brun Jaune «^1 O Cn u> Ln tn K> O o> en o-en œ TABLEAU III (Suite) Milieu à la gélose S. virginiae S. virginiae v. lipoxae NA2 55-B8 Sucrose de Czapek R Rose Rose-jaune brun V G-ris rosé G-ris rosé AC - Maltose-tryptone R Blanc rosé Blanc rosé V Brun Jaune brun AC Brun J aune brun Peptone - extrait de levure R Pas de croissance aérienne Pas de croissance aérienne de bière - fer (ISP-6) V Brun Brun AC Présence de pigments méla Présence de pigments mélaniques niques Tyrosine (ISP-7) R Rose Rose V Jaune brun Jaune tirant légèrement sur le brun AC Pas de pigment Pas de pigment Milieu à la gélatine Tel quel R — — AC Pigment brun jaunâtre au- Pigment brun jaunâtre au-dessus, dessus, jaune brun au-des jaune brun au-dessous sous Pas de liquéfaction Pas de liquéfaction Avec produit nutritif R ' - —. . ■ . AC Pigment brun jaunâtre au- Pigment brun jaunâtre au-dessus, dessus, jaune brun au- jaune brun au-dessous dessous Pas de liquéfaction Pas de liquéfaction TABLEAU III (Suite) Milieu à la gélose S. virginiae v. lipoxae S. virginiae NA255-B8 O en Ul Bouillon de culture en cn Nitrate synthétique -i R AC* Croissance compacte à la base Nitrate non réduit en ni-trite Croissance compacte à la base Nitrate non réduit en nitrite Nitrate nutritif R AC Croissance aérienne blanche sur anneau de surface Croissance compacte à la base Pigment jaune brun Nitrate non réduit enni-trite Croissance aérienne blanche sur anneau de surface Croissance compacte à la base Pigment jaune brun Nitrate non réduit en nitrite Lait de tournesol / R AC Croissance aérienne blanche très légèrement rosée sur anneau de surface bleu Pas de peptonisation Pas de coagulation pH7,5 Croissance aérienne blanche très légèrement rosée sur anneau de surface bleu Pas de peptonisation Pas de coagulation pH 7,6 R = recto ; V = verso ; AC = autres caractéristiques. O o Un a* en oo 70 15355 14 2065658 la lipoxamycine brute suivant l'invention est formée lorsque le microorganisme qui l'élabore est cultivé en milieu nutritif en aqueux et/ fermentation, aérobie submergée .Bien entendu, il va de soi que pour la préparation de quantités limitées, on peut employer 5 des cultures superficielles en flacons. On cultive le microorganisme dans un milie'u nutritif contenant une source de carbone, par exemple un hydrate de carbone assimilable,et une source d'azote, par exemple un-composé d'azote assimilable ou une matière protéinique. Des sources de carbonq4>référées suivant l'invention comprennent le 10 glucose, le sucre roux, le sucrose, le glycérol, l'amidon, l'amidon de maïs, le galactose, la dextrine, les mélasses et autres produits analogues. Des sources d'azote préférées comprennent la liqueur de macération du mai's, la levure, la levure de bière autolysée avec des produits solides du lait, la farine de soya, la farine de graines 15 de coton, la farine de maïs, les produits solides du lait, le produit de digestion pancréatique de la caséine, les drèches, la farine de poisson, les liqueurs de peptones animales, la viande et les rognures d'os, etc. On peut utiliser avantageusement une combinaison de ces sources de carbone et de ces sources d'azote. Il 20 n'est point besoin d'ajouter aux produits en fermentation des métaux à l'état de traces, par exemple du zinc, du magnésium, du manganèse, du cobalt, du fer, etc., du fait qu'on utilise,comme •constituants de ces milieux, de l'eau du réseau de distribution d'eau potable et des ingrédients non purifiés. 25 La fabrication de la lipoxamycine brute suivant l'invention peut être effectuée à toute température conduisant à une croissance satisfaisante du microorganisme, par exemple entre environ 18 et 40°C et, de préférence, entre environ 25 et 30°C. Habituellement, la production optimum du composé e^t obtenue en l'espace d'en-30 viron 2 à 10 jours, le milieu reste normalement assez proche de la neutralité, pH 7, ou légèrement alcalin au cours de la fermentation. Le pH final dépend en partie des tampons éventuellement présents, et en partie du pH initial du milieu de culture qu'on règle avantageusement à environ 6 à 8 avant la stérilisation. 35 Si l'on effectue la culture dans de grands récipients ou de grands bacs, il est préférable d'utiliser la forme végétative plutôt que. là forme sporulée du microorganisme pour l'inoculation, 70 15355 15 2065658 afin d'éviter un important temps mort dans la production du nouveau composé et, par conséquent, une utilisation non rentable du matériel. Il est donc désirable de produire un inoculum végétatif dans une culture en bouillon nutritif en inoculant la culture 5 par une partie aliquote d'un sol ou d'une culture en biseau. Lorsqu'on s'est ainsi procuré un inoculum jeune, actif et végétatif, on le transfère a'septiquement dans de grands récipients ou bacs. Le milieu dans lequel on produit 1*inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour la production du nouveau composé 10 ou être,au contraire, différent de celui-ci. Il suffit qu'il soit tel qu'on obtienne une croissance satisfaisante du microorganisme. La lipoxamycine pure et"la lipoxamycine brute suivant l'invention sont des composés amphotères et leurs sulfates sont relativement insolubles dans les hydrocarbures, chlorés ou non. 15 La lipoxamycine pure et à l'état de base libre, telle qu'utilisée ici,est la forme de lipoxamycine qui existe au voisinage d'un pïï de 7,5-8,5, elle est soluble dans les solvants et peut être extraite suivant les divers modes opératoires décrits ci-après. Bien que cette appellation de "base" ne soit pas correcte du point de vue 20 technique, puisque cet antibiotique est amphotère, on l'utilise néanmoins pour des questions de commodité, parce que la faiblesse de la fonction acide permet à cette forme de réagir comme le ferait, » dans de nombreux cas, une base libre. Il en est de même pour la définition donnée à la lipoxamycine brute sous forme de base libre. 25 On obtient ces bases libres, de lipoxamycine brute ou purifiée, en dissolvant un sel de ces composés, par exemple le sulfate, dans RaOH dilué, jusqu'à un pH d'environ '8,5, puis en extrayant la base libre de cette solution au moyen d'acétate d'éthyle. On peut appliquer toutes sortes de procédés pour l'iso-30 lement et la purification de la lipoxamycine brute par exemple l'extraction par solvants,la répartition liquide-liquide dans -un appareil de Craig, l'emploi d'absorbants et la chromatographie sur colonne. Pour la production industrielle, on préfère opérer par extraction par solvantsdans la mesure où. cela demande moins de 35 temps et moins de frais et où l'on obtient des rendements plus élevés. Suivant un procédé d'obtention préféré, on sépare d'abord 70 15355 16 2065658 le mycélium et les produits solides non dissous de la bouillie de fermentation par des méthodes classiques, par exemple, par filtration avec emploi d'un auxiliaire de filtration ou par centrifuga-tion. Le moût filtré (ou le moût centrifugé) est extrait avec un ^ solvant de la lipoxamycine brute. On préfère, à ce titre, le chlorure de méthylène. On concentre sous vide l'extrait de chlorure de méthylène contenant la lipoxamycine brute. On mélange alors ce concentré avec un acide minéral ou organique pour provoquer la précipitation de la lipoxamycine comme produit cristallin brut. Si 10 l'on se 'sert d'acide sulfurique pour précipiter la.lipoxamycine brute, on isole un sulfate brut, cristallisé, de cette lipoxamycine. On peut appliquer cette méthode dans des cas où il n'est pas nécessaire d'obtenir une grande pureté ou un dédoublement de la lipoxamycine brute. 15 On peut extraire la lipoxamycine brute du moût filtré par l'emploi d'autres solvants, par exemple de méthylisobutyl-cétone, d'acétate de butyle, de chloroforme, d'acétate d'éthyle ou de butanol. Suivant un autre mode de réalisation, on peut également 20 recueillir la lipoxamycine brute du moût filtré par adsorption sur des résines échangeuses de cations, ces résines pouvant être du type acide carboxylique ou du type acide sulfonique» Des résines du type acide carboxylique et convenant à la mise en oeuvre de l'invention comprennent les résines d'acides polyacryliques obtenues \ 2 5 par copolymérisation d'acide acrylique et de divinylbenzène, suivant le mode opératoire indiqué page 87 de l'ouvrage de Kunin, "Ion Exchange Resins"f2ème éd. , (1958), John Wiley & Sons, Inc. Des résines échangeuses de cations de ce type sont vendues sous les marques "Amberlite IRC-50" et "Zeokarb 226". Des résines du 30 type acide sulfonique utilisables pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent des résines de polystyrène sulfonées au noyau, réticulées avec du divinylbenzène, et qui sont obtenues suivant le mode opératoire indiqué page 84 de l'ouvrage précité. Des résines échangeuses de cations de ce type acide sulfonique sont vendues 35 sous les marques "Dowex-50", "Amberlite IR-120", "Ualcite HCR", "Chempro C-20", "Permatit Q" et "Zeokarb -225". 70 15355 17 2065658 On élue la lipoxamycine brute de la résine au moyen d'un acide, avantageusement à un pH inférieur, au pKa de la résine échangeuse de cations utilisée-. On obtient des résultats satisfaisants à un pH d'environ 1 à 6 , On règle l'éluat à environ 5. pH 7,5 à 8,5 avec une base, par exemple de l'hydroxyde de sodium, ou avec une' résine échangeuse d'anions du type fortement basique, et l'on extrait la lipoxamycine brute avec un solvant non miscible à l'eau, suivant le procédé décrit ci-dessus. On obtient des résines échangeuses d'anions appropriées à cet usage par chloro-10 méthylation, suivant le procédé décrit pages 88 et 97 cle l'ouvrage de Kunin précité, du polystyrène réticulé, si on le désire, par du divinylbenzène, préparé suivant le mode opératoire indiqué page 84 de l'ouvrage précité et par quaternisation avec de la triméthylamine ou de la diméthyléthanolamine suivant le mode opé-15 ratoire indiqué .page 97 de l'ouvrage précité. Des résines échangeuses d'anions de ce type sont commercialisées sous les marques "Dowex-2", "Dowex-20","Amberlite IBA-400", "Duolite A-102" et "Permatit S-1". On peut également recueillir la lipoxamycine brute sui-20 vant l'invention à partir de moût de céréales et autres solutions aqueuses, par adsorption sur un adsorbant à activité de surface, par exemple sur duTlorisil", silicate synthétique du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique K° 2.393-525, et vendu par la Société dite Eloridin Company, du charbon actif ou une 25 résine décolorante, puis en éluant le produit ainsi adsorbé au moyen d'un solvant. On peut utiliser l'un quelconque des solvants indiqués ci-dessus. Une résine décolorante^appropriée est la 'Permatit DR", décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 2 702 263. 30 On peut réaliser une nouvelle, purification de la lipoxamy cine brute, telle qu'obtenue ci-dessus, par recristallisation dans un solvant, par exemple dans du méthanol. On peut effectuer la séparation de la lipoxamycine. pure de la lipoxamycine brute par répartition à contre-courant dans 35 un appareil de Craig. Par exemple,en soumettant le ^-toluène- suif onate de lipoxamycine brute'à 195 transferts entre les phases 70 15355 18 V 2065658 d'un système d'acétate d'éthyle, d'éther monométhylique d'éthylène-glycol et d'eau dans le rapport .2:1-:1, dans un appareil de Craig. avec 10 ml/phase, on constate que la lipoxamycine, débarrassée des impuretés de la lipoxamycine brute, se trouve du côté de la plus 5 plus faible répartition du sommet de répartition. On réunit le contenu de tubes ne contenant que de la lipoxamycine pure, comme le montre la chromâtographie sur papier décrite ci-après, et on évapore sous vide pour obtenir un résidu solide qu'on retransforme en sulfate de lipoxamycine par traitement avec de l'acide sulfu-10 rique aqueux. On peut purifier la lipoxamycine brute suivant l'invention, ainsi que la lipbxamycine déjà purifiée et séparée de celle-ci, par des transferts successifs de la forme protonique à la forme non protonique et vice versa, plus spécialement en faisant inter-15 venir d'autres types de traitements tels que,par.exemple, des r extractions et lavages par solvant, la chromatographie et l'extraction fractionnée liquide-liquide. De cette manière, on peut utiliser des sels de lipoxamycine brute ou de lipoxamycine purifiée pour isoler ou purifier davantage la lipoxamycine brute ou la li-20 poxamycine, respectivement. Par exemple, on peut transformer la lipoxamycine brute, ou la lipoxamycine purifiée, en un sel insoluble tel que le sulfate, qu'on peut ensuite soumettre à des traitements de purification et utiliser pour régénérer la lipoxamycine brute, ou la lipoxamycine purifiée, par traitement avec un alcali. 25 Au-dessus d'environ pH 10, on forme avec des bases fortes des sels alcalins de lipoxamycine brute ou purifiée. A ce degré d'alcalinité, la dégradation en fragments dépourvus d'activité antibiotique est rapide, mais ces sels existent réellement. Si. l*on opère rapidement et â basse température, on peut 30 laver des solutions aqueuses de ces sels alcalins avec un solvant non miscible à l'eau, puis revenir au sulfate insoluble dans l'eau. • On peut utiliser les sels de lipoxamycine brute ou de lipoxamycine purifiée pour les mêmes applications biologiques que 35 la base libre de lipoxamyçinebrute.ou purifiée, ou encore, on peut les utiliser pour augmenter la pureté de la lipoxamycine brute ou de -la lipoxamycine purifiée, comme décrit ci-dessus. 70 15355 2065658 On peut préparer des sela acides déterminés, en neutralisant la base libre avec l'acide approprié, jusqu'au-dessous d'environ pH 7,5. et, avantageusement, jusqu'à environ pH 2 à pH 6. Des acides appropriés à cet usage sont, par exemple, les 5 acides chlorhydrique , sulfurique, phospiiorique, acétique, succinique, citrique, lactique, maléique, fumarique, pamoïque, cholique, palmitique, mucique, camphorique, glutarique, glycolique, phtalique, tartrique, laurique, stéarique, salicylique, 3-phényl-salicylique, 5-phénylsalicylique, 3-méthylglutarique, orthosul-10 fobenzoïque, cyclohezanesulfamique, cyclopentanepropionique, 1,2-cyclohexanedicarboxylique, 4-cyclohexènecarboxylique, octadé-cénylsuccinique, octénylsuccinique, méthanesulfonique, benzènesul-fonique, hélianthique, chrome-III-diammonio-tétrathiocyanique, diméthyldithiocarbamique, sorbique, monochloracétique, undécyléni-15 que, 4'-hydroxyazobenzène-4-sulfonique, octadécylsulfurique, picrique, benzoïque, cinnamique et autres acides analogues, La lipoxamycine à l'état brut ou purifié est active contre Escherichia coli et peut être utilisée pour réduire, arrêter et supprimer, dans les fabriques de papier, la formation de produits 20 mucilagineux, grâce à son action contre ce microorganisme. On peut également l'utiliser pour prolonger la vie de cultures de Trichomonas foetus. Trichomonas hominis et Trichomonas vaginalis en les débarrassant de toute contamination par Escherichia coli. De plus, ces nouveaux composés peuvent être utilisés comme anti-25 fongiques dans les empeignes de chaussures, suivant les indication du brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3 130 505. En outre, ces nouveaux composés étant actifs contre Cryptococcus neoformans. on peut les utiliser pour le traitement des pigeonniers afin d'inhiber ce champignon que l'on a trouvé dans la fiente de pigeon. 30 (Journal of the American Médical Association, Vol. 191, N° 4, 25 Janvier 1965, pages 269-274). Enfin, les nouveaux composés suivant l'invention peuvent être utilisés pour rincer et éponger les paillasses, les rayons et le matériel dans des laboratoires de microbiologie, 35 Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. Tous les pourcentages sont indiqués en poids, et toutes les pro 70 15355 ,0 2065658 portions de mélange de solvants sont indiquées en volumes, sauf indication contraire. Exemple 1 A. Fermentation 5 On utilise une souche de Streptomyces virginiae var. lipoxae. NREL 3630, prélevée dans un sol, pour 1'inoculation dans des erlenmeyers de 250 ml,contenant 100 ml de milieu d'ensemencement stérile constitué par les ingrédients suivants : Glucose monohydraté 25 g 10 ' Pharmamedia* 25 g Eau potable du réseau urbain q.s.p. 1 litre * le produit appelé Pharmamedia est une qualité industrielle de farine de graines de coton, fabriquée par Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas, U.S.A. 15 le pH de pré-stérilisation du milieu d'ensemencement est de 7,2. On cultive le milieu ensemencé pendant trois jours à 26-28°C sur un agitateur rotatif de Gump,tournant à 250 tr/mn. On se sert du milieu d'ensemencement tel que préparé ci-dessus pour inoculer des erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml 20 d'un milieu de fermentation stérile constitué par les ingrédients suivants : Glucose monohydraté 60 g/l Farine de soya en poudre fine et dégraissée 20 g/l levure de bière 2,5 g/l Chlorure d'ammonium 5 g/l Chlorure de sodium 3 g/l Eau potable du réseau urbain q.s.p. 1 1 On effectue l'inoculation'des erlenmeyers de fermentation à raison de 5 ml d'inoculum pour 100 ml de milieu de fermentation. v 30 le pH de pré-stérilisation du milieu contenu dans les erlenmeyers de fermentation est de 7,2. On cultive pendant 5 jours à une température de 28°C sur un agitateur rotatif, de Gump,tournant à 250 tr/mn. la production maximale de lipoxamycine brute dans une fermentation en erlenmeyer est en général réalisée en l'espace 35 de 2 à 3-jours, après quoi le titre de. l'antibiotique diminue progressivement. Dans une telle fermentation, choisie à titre d'exem- - 70 15355 21 2065658 pie, le moût agité dans la fiole titre 3,3 unités biologiques/ml de lipoxamycine brute au bout de deux jours, 6,3 UB/ml de lipoxamycine brute après trois jours et 4,0 UB/ml de lipoxamycine brute après quatre jours de fermentation. La méthode de titrage utilisée 5 ci-dessus et dans toute la suite de la description est une méthode par disque de diffusion dans la gélose, en utilisant comme microorganisme Saccharomyces pastorianus. On cultive ce micro-organisme sur milieu de Gray (glucose 30 g, extrait de levure 7 g, 5 g, gélose 20 g, eau 1000 ml) et on soumet à l'incubation pendant 10 16 à 18 heures à 28°C. L'unité d'activité biologique ou U.J3. est définie comme étant la quantité d'antibiotique nécessaire pour obtenir une zone d'inhibition de 20 mm à partir d'un disque d'un diamètre de 12,7 mm, traité par 0,08 ml de solution à examiner. B. Extraction 15 On filtre un moût entier(4 900 ml) d'une fermentation échelonnée comme décrit ci-dessus, titrant 4,6 UB/ml de lipoxamycine brute, par titrage vis-à-vis de S. pastorianus. avec l'aide d'une terre de diatomées.On lave le gâteau sur filtre avec 10 i<> de son volume d'eau. On réunit le moût filtré et la liqueur de 20 lavage(4 300 ml titrant 4,0 UB/ml). On règle ce mélange à un pH d'environ 8,5 avec une solution à 50 $ d'hydroxyde de sodium et on extrait à deux reprises avec un volume moitié moindre de chlorure de méthylène. On rejette la couche aqueuse et on concentre les extraits,réunis,par évaporation sous vide jusqu'à environ 25 19 litres. On mélange soigneusement ce concentré avec 10 litres d'acide sulfurique normal et on laisse reposer jusqu'au lendemain. La lipoxamycine brute,cristallisée sous ffrrme de sulfate, se sépare à l'interface des deux couches et on la recueille par filtration. On obtient 98,5 g de lipoxamycine brute, cristallisée 30 sous forme de sulfate (48 UB/mg,par mesure vis-à-vis de.S. pastorianus ). G. Purification On recristallise de la lipoxamycine brute et cristallisée sous forme de sulfate tel qu'obtenu ci-dessus, à plusieurs reprises 35 dans du méthanol pour obtenir des flocons cristallins blancs s'agglomérant parfois en billes. Cette cristallisation fournit une préparation particulièrement pure du sulfate, de lipoxamycine 70 15355 22 V 2065658 dite "brute". Exemple 2 - Préparation de la lipoxamycine pure à partir de la lipoxamycine brute. On soumet la lipoxamycine brute ,telle qu'obtenue ci-dessus 5 sous forme de sel recristallisé, à une répartition à contre-courant afin d'en séparer la lipoxamycine pure. On transfome le sulfate de lipoxamycin^'brute" en £-t oluène suifonate de cette même lipoxamycine brute en combinant des proportions équimolaires du sulfate de lipoxamycine brute (421 mg) et du sel de baryum de l'acide 10 toluènesulfonique (240 mg) dans 40 ml de méthanol. On chauffe alors ce mélange, on le refroidit,on le centrifuge pour éliminer BaSO^ et on évapore sous vide, à sec, le produit centrifugé. On prépare une solution de ce résidu dans de l'acétate d'éthyle très chaud, on refroidit cette solution pour former le js-toluène-15 sulfonate de lipoxamycine brute cristallisée (première récolte r de 200 mg, E = 120-122°C et seconde récolte, de 240 mg). On introduit 2 g de ce £-toluènesulfonate de lipoxamycine brute dans les cinq- premiers tubes et l'on effectue 195 transferts entre les phases d'un système formé d'acétate d'éthyle, d'éther monométhyli-20 que d'éthylèneglycol et d'eau dans le rapport 2:1:1, dans un appareil de répartition automatique vde Craig, dans une phase de 10 ml. On isole la lipoxamycine sous sa forme pure à partir de cet appareil de Craig en réunissant et évaporant sous vide les tubes appropriés (numéros 40-49 du présent exemple) que la 25 chromatographie sur papier indique comme étant constitués uniquement par de la lipoxamycine pure. On fait cristalliser le produit restant au moyen d'acétate d'éthyle pour obtenir 43 mg de j>-toluène-sulfonate de lipoxamycine. On prépare le sulfate de lipoxamycine à partir d'une solution aqueuse du'sel de l'acide £-toluène-30 sulfonique par addition d'acide sulfurique et filtration du sulfate de lipoxamycine résultant. On fait recristalliser ce sulfate de lipoxamycine à partir du méthanol. Exemple 3 En remplaçant par le sel de baryum de Ieacide j>-bromo-35 benzènesulfonique l'acide toluènesulfonique de l'exemple 2# on obtient la lipoxamycine brute à l'état de £-bromobenzènesulfonate. 70 15355 23 2065658 Exemple 4 En remplaçant par le sel de baryum de l'acide acétique l'acide £-toluènesulfonique de l'exemple 2, on obtient la lipoxamycine brute sous forme d'acétate» 5 Exemple 5 En dissolvant la lipoxamycine brute à l'état de sulfate, telle qu'obtenue dans l'exemple 1, dans de l'hydroxyde de sodium dilué et jusqu'à un pH d'environ 8,5, puis en extrayant cette solution avec de l'acétate d'éthyle, on obtient la lipoxamycine 10 brute sous sa forme de base libre cristallisée. Exemple 6 Si l'on traite la lipoxamycine brute sous forme de base libre, telle qu'obtenue dans l'exemple 5, avec de l'acide oxalique, on obtient la lipoxamycine brute sous forme d'oxalate. 15 Exemple 7 Si l'on remplace par de l'acide iodique l'acide oxalique de l'exemple 6, on obtient la lipoxamycine brute sous forme d'iodate. Exemple 8 20 Si l'on remplace par de l'acide chlorhydrique l'acide oxalique utilisé dans l'exemple 6, on obtient la lipoxamycine brute sous forme.de chlorure. Exemple 9 On obtient les sels de lipoxamycine pure suivant les 25 mêmes modes opératoires que ceux indiqués dans les exemples ci-dessus pour la préparation de sels de lipoxamycine brute. Exemple 10 ^ Si l'on remplace par du sulfate de lipoxamycine pure le sulfate de lipoxamycine brute de l'exemple 5, on obtient 30 de la lipoxamycine pure, cristallisée sous forme de.base libre. On effectue la chromatographie sur papier des produits d'isolement et de purification tels que décrits ci-dessus en utilisant un mélange solvant constitué par du n-butanol et de l'eau dans le rapport 4:96 avec 0,25 ia d'acide £-t oluène sulfonique 35 pendant 5 heures. On soumet la feuille de papier à 1'autographie biologique de la manière standard, en utilisant S. pastorianus. Les mélanges solvants utilisés suivant la figure 3 du dessin 70 15355 \ 2065658 annexé sont les suivants : I. ïi-butanol et eau, rapport 84:16, 16 heures. II. n-butanol et eau, rapport 84:16, + 0,25 $ d'acide jD-toluènesulfonique, 16 heures. 5 III. n-butanol, acide acétique et eau (2:1:1), 16 heures» IV. 2 fo de pipéridine (en vol./vol.) dans un mélange de n-butanol et eau (84:16), 16 heures. V. n-butanol et eau (4:96), 5 heures. VI. n-butanol et eau (4:96) + 0,25 fi d'acide jo-toluène-10 sulfonique, 5 heures. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux seuls modes de réalisation ci-dessus décrits,qui ne l'ont été qu'à titre d'exemples. - ~ 70 15355 2065658 HEVEHDICATIOJ^-. . _ 1. Mélange antibiotique appelé lipoxamycine brute, titrant au moins 3,3 unités biologiques/ml: et caractérisé par les propriétés suivantes : . 5 - effet inhibiteur de la croissance de divers champignons et de bactéries, tant Grau-positives que Gram-négatives ; - chromatogramme sur papier d'une bouillie de fermentation tel que représenté à la figure 2 du dessin annexé ; - composition suivant l'analyse élémentaire : 10 C = 61,75 - 61,27 fi H = 9,70 - 9,72 fi îî = 7,47 fi 0 = 21,40 fi - pouvoir rotatoire 15 [a]p^. = -2° (c = 0,877, dans le méthanol) ; - F = 68,70°C (avec décomposition) - spectre d'absorption IR de la suspension dans une émul-sion consistante d'essence minérale : bandes d'intensité forte (f) ou moyenne (m) 20 2930 (f) (huile) 1650 (m) (épaulement) 1410 (m) 2900 (f) (huile) 1640 (m) 1375 (f) (huile) 2840 (f) (huile) 1567 (m) 1365 (m) (épaulement) 9 1700 (f) 1460 (f) (huile) 1200 (m) 1090 (m) 25 et,sous forme de sulfate, - composition suivant l'analyse élémentaire C = 54,30 fi ^ H = 9,01 fi r N = 6,36 fi 30 S = 3,75 fi - intervalle de fusion = 154-155°C (avec décomposition) - pouvoir rotatoire [a]^ = -7° (c = 0,408, dans le méthanol) - spectre ÏÏV dans le méthanol : •se X . = 209, coefficient molaire d'extraction £ = 5600 2-? n max ' et 275 (épaulement); £ = 63 ; - poids équivalent (ou nombre proportionnel) : 209 avec une première rupture à 437. 2065658 2. Mélange antibiotique suivant la revendication 1,à l'état sec, caractérisé en ce qu'il titre au moins 48 U.B./mg suivant l'essai avec Saccharomyces pastorianus. 3. Mélange antibiotique suivant la revendication 1, carac- 5 térisé en ce qu'il est sous forme sensiblement pure. 4. Mélange antibiotique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous forme cristallisée et sensiblement pure. 5. Composé choisi dans le groupe constitué par le mélange antibiotique,ou lipoxamycine brute, suivant la revendication 1, et *10 ses sels d'addition d'acide. ' ~ 6. Mélange antibiotique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par le sulfate. 7. Composé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est sous forme sensiblement pure, 15 8. Composé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est sous forme cristallisée et sensiblement pure. 9. Mélange antibiotique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par le £-toluènesulfonate. 10. Composé suivant la revendication 9, caractérisé en 20 ce qu'il est sous forme cristallisée et sensiblement pure. 11. la lipoxamycine pure, caractérisée à l'état de sulfate par les propriétés suivantes : - effet inhibiteur de la croissance de divers champignons et de bactéries, tant "Grain-positives que Gram-négatives ; \ . 25 - solubilités, à 25°C, dans le'S solvants suivants : - HgO - méthanol 1 mg/ml (.10 mg/ml au voisinage de l'ébul-lition) - diméthylformamide 5 mg/ml 30 . ■ - méthylpyrrolidone 5 mg/ml - diméthylsulfoxyde 15'mg/ml Produit relativement insoluble dans les hydrocarbures, . chlorés ou non ; - composition suivant l'analyse élémentaire 35 - v . . C = 54,18 f" ' H = 8,93 1° N = 6,27 i° S = 3,72 1o i 70 15365 70 15355 2065658 - P za- 153,3°C (avec décomposition) 25 - pouvoir rotatoire [ - spectre W dans le méthanol t = 63. ^ rnax = 208 £ 450 avec épaulement à 275, 12. Lipoxamycine suivant la revendication 11, caracté-risée en ce qu'elle est à l'état pratiquement pur. 13. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi dans 1o le groupe constitué par la lipoxamycine suivant la revendication 11 et ses sels d'addition d'acide« 14. Composition suivant-la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de sulfate. 15. Lipoxamycine suivant la revendication 14, caracté- -] 5 risée en ce qu'elle est sous forme cristallisée et pratiquement pure. 16. Procédé pour la préparation d'un mélange antibiotique suivant la revendication 1, caractérisé en.ce que l'on cultive, dans un milieu nutritif aqueux et dans des conditions 20 aérobies, un microorganisme produisant de la lipoxamycine brute, jusqu'à ce que cette production lui confère une activité antibiotique t importante, et en ce qu'on isole du milieu de culture la lipoxamycine brute. 17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en 25 ce que l'on cultive, comme micro-organisme, Streptomyces virginiae var. lipoxae. 18. Procédé suivant les revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'on utilise unrmilieu nutritif contenant un hydrate de carbone comme source de carbone assimilable et une source d'azote as- 30 similable. 19. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé ,en ce qu'on effectue l'isolement en filtrant le milieu, en extrayant le filtrat avec un solvant,non miscible à l'eau, de la lipoxamycine brute et en séparant la lipoxamycine brute 35 de la solution obtenue. 20. Procédé pour la préparation de lipoxamycine pure, caractérisé en ce qu'on soumet la lipoxamycine brute, telle que définie dans la revendication 1, à une répartition à contre-courant, et en ce qu'on isole la lipoxamycine ainsi débarrassée des impuretés de la lipoxamycine brute.