Brevet FR2105243A1 — publié le 19720428

i 2105243 La présente invention concerne un procédé d'extraction d'un» urokinase, condensée, purifiée de l'urine humaine à l'échelle industrielle .On sait que l'urokinase est une enzyme présente en faibles quantités dans l'urine humaine et qui s'est révélée efficace pour traiter diverses formes de thrombose car, lorsqu'on l'injecte dans le corps humain par voie intraveineuse , elle peut dissoudre la fibrine d'origine pathologique ou les coagulats fi-brineux obstruant les vaisseaux sanguins . Pour l'extraction de l'urokinase de l'urine humaine, on peut utiliser divers milieux tels que métaux lourds,sulfate de baryum, acide silicique et ses sels, et divers échangeurs d'ions . En cherchant un procédé plus efficace que les procédés connus, la Demanderesse a découvert un procédé qui est plus efficace que tous les procédés connus, et dont la mise en oeuvre est simple . Le procédé suivant l'invention se caractérise en ce qu'il comporte une opération d'adsorption de l'urokinase de l'urine humaine sur un matériau qui n'a jamais été utilisé pour l'extraction de l'urokinase, à.savoir une fibre synthétique à base d'acrylonitrile ou des tissus constitués de cette fibre tels que "Bonnel" (marque commerciale de Mitsubishi Bonnel) ,"Exlân" (Marque commerciale de Japan Exlan ) ou "Kashimiron n (marque commerciale d'Asahi Kasei). La description de la fibre qui va suivre s'applique également aux tissus constitués de cette fibre . La fibre synthétique à base d'acrylonitrile que l'on utilise selon l'invention est tellement bon marché et facile à se procurer qu'elle peut être jetée après usage, et elle ne nécessite pas de prétraitement avant son emploi . Si l'on souhaite cependant éliminer de la fibre des salissures peu importantes , on atteint ce but simplement en effectuant un trempage préliminaire de la fibre dans l'eau et en l'agitant . Un traitement similaire pourra être utile pour éliminer des bulles d'air emprisonnées par les fibres avant de mettre les fibres au contact de l'urine . Les fibres présentent une efficacité suffisante en faibles quantités, et l'urokinase adsorbée sur celles-ci pouvant être aisément séparée, le procédé selon l'invention est économiquement supérieur à tous les procédés classiques . Une autre caractéristique du procédé selon l'invention réside dans le fait qu'il économise la main-d'oeuvre pour la collecte de l'urine, ou même la rend inutile . Plus précisément, la main-d'oeuvre considérable nécessitée 71 31434 2 2105243 par la collecte de l'urine peut être remplacée par la simple collecte de fibres à base d'acrylonitrile petites et légères recouvrant l'urinoir ou garnissant une partie du tuyau d'évacuation relié au bas de l'urinoir .Ainsi, le procédé de l'invention sera extrêmement utile pour l'extraction industrielle de l'urokinase . Le mode opératoire du procédé selon l'invention est en gros le suivant: on met l'urine humaine en contact avec les fibres synthétiques à base d'acrylonitrile, de façon à ce que l'urokinase de l'urine s'adsorbe sur ces fibres, que l'on sépare et lave à l'eau pour éliminer l'urine résiduelle . On effectue ensuite l'élu-tion en utilisant une solution alcaline .Comme la composition de l'urine est fortement influencée par l'ingestion de nourriture ou d'eau, par l'exercice, l'heure ou le climat, il est difficile de définir un pH normal de l'urine, mais on suppose qu'il est compris en général entre 4,8 et 7,5 (Hidenobu Majima,"Physiology", publié par Bunkôdo, 1968). Dans cette gamme de pH de 4,8 à 7,5 ,l'urokinase peut s'adsorber sur des fibres synthétiques d'acrylonitrile ,mais la gamme de pH de 5,5 à 6,5 est préférable pour avoir un meilleur rendement . Lorsque par exemple on utilise pour l'élution de l'urokinase àdsorbée une solution aqueuse d'ammoniac à 4#, on obtient un taux d'élution de Le contact entre l'urine et les fibres synthétiques d'acrylonitrile est rendu plus efficace si l'on utilise le mode opératoire ci-dessus après avoir traité l'urine à température ordinaire de façon à ajuster son pH à une valeur de 7,5 à 9,5, ou de préférence à 8,5 ,et avoir éliminé les sédiments formés . La solution contenant de l'urokinase ainsi obtenue est condensée ou purifiée à l'état de préparation convenant a des fins médicales .11 est bien connu que l'on dispose, pour la condensation, des procédés suivants: relargage au moyen de sulfate d'ammonium, sédimentation par un solvant organique ,1e "Diaflo" (marque commerciale d'U.S. Amicon ) .Pour la purification, on peut utiliser divers échangeurs d'ions, mais on obtiendra une urokinase de haute pureté par un autre contact avec des fibres synthétiques d'acrylonitrile. Dans ce qui suit, on mettra spécifiquement en évidence l'ad-sorption sélective de l'urokinase avec des fibres synthétiques d'acrylonitrile . Le.Tableau 1 donne les rendements en urokinase obtenus à partir de diverses fibres en mettant en contact 2 g de fibres avec 3 1 d'une urine ayant un pH de 6,0. On lave les fibres à l'eau , et on élue ensuite l'urokinase en utilisant une solution 71 31434 3 2105243 aqueuse d'ammoniac à 4#. Tableau 1 -Rendements en urokinase fibres constituant principal rendement (X) coton absorbant cellulose 8 "TEVIRON" (marque commerciale de Teijin,fibre synthétique de chlorure de polyvinyle) chlorure de vinyle 15 "BONNEL" acr y 1 oni tri le 89 Le Tableau 1 montre la supériorité du procédé selon l'invention en ce qui concerne le rendement en urokinase . Le Tableau 2 compare les procédés classiques et le procédé selon l'invention . Tableau 2-Comparaison entre les procédés classiques et celui de l'invention . milieu absorbant rendement % activité spécifique (U/mg) sulfate de baryum 70 800 gel de silice 54 525 cellulose phosphorée 79 310 c arb oxymé thylcellulose 35 297 "Amberlite " 1RC-50 (marque coœaerciale de Rhom and Haas Co) 88 508 "Bonnel" 91 3800 Il ressort clairement du Tableau 2 que le procédé de l'invention donne un rendement en urokinase plus élevé que les procédés classiques . Par ailleurs, il faut noter que les adsorbants connus jusqu'à présent adsorbent non seulement l'urokinase, mais aussi de grandes quantités d'impuretés , de sorte que la pureté du produit de l'élution est faible, et que la valeur de ces adsorbants repose simplement sur le fait qu'ils condensent l'urokinase à partir de l'urine . Il ressort clairement des Tableaux 1 et 2 que le procédé selon l'invention est un excellent procédé, caractérisé non seulement par la possibilité d'éluer à l'état condensé, mais aussi par une ijaute sélectivité de l'adsorption de l'urokinase . Les unités d'urokinase ont été déterminées par le procédé à la plaque de fibrine recommandé par Plong et ses collaborateurs / J. Plong, Biochem Biophys. Acta, vol.24, page 278 (1957) _/ 11 31434 4 2105243 Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention . EXEMPLE 1 On ajuste à pH 8,5, en agitant, un fort volume d'urine fraîche 5 provenant de nombreuses personnes en bonne santé , en utilisant de l'hydroxyde de sodium à 10$. On sépare par filtration le sédiment obtenu, ou on l'élimine par centrifugation . Puis on ajoute peu à peu de l'acide chlorhydrique 6N en agitant énergiquement pour ajuster le pH à 5>5 * après quoi on ajoute immédiatement du "Bonnel" à raison 10 de 70 g pour 100 litres d'urine puis on agite énergiquement .On rassemble dans un grand entonnoir le "Bonnel" ainsi mis en contact avec l'urine et on le lave à l'eau jusqu'à ce que l'eau de lavage soit incolore et transparente . Puis on exprime l'eau de lavage .On sépare alors par élution au moyen de 2 1 d'une solution aqueuse d'ammoniac 15 à k% l'urokinase adsorbée sur les fibres .On ajoute à l'éluat , en agitant, du sulfate d'ammonium, jusqu'à 60# de la saturation . On poursuit l'agitation pendant une heure, on recueille le précipité par centrifugation pendant 30 minutes sous 20000 G , on le dissout dans 500 ml d'eau, puis on le soumet à une dialyse jusqu'au lendemain ,en 20 utilisant une quantité d'eau eent fois supérieure .La solution ainsi obtenue contient environ 85# de l'urokinase de l'urine initiale , et son activité spécifique est d'environ 4000 unités/mg . EXEMPLE 2 • On ajoute peu à peu, en agitant énergiquement, de l'acide ehlor-25 hydrique 6N à une solution brute d'urokinase préparée suivant .l'Exemple 1 , pour l'ajuster à pH 5,5. Aussitôt après, on introduit du "Bonnel1' dans la solution brute d1 urokinase , à raison de 100 g pour 1 litre de cette solution , et on l'y agite intensément . La suite du traitement est la même que dans l'Exemple 1, et l'élution s'effectue 30 en utilisant 1 litre d'une solution aqueuse d'ammoniac "à K%,après quoi on opère comme dans l'Exemple 1. La solution finalement obtenue contient environ %Q% de l'urokinase présente dans la solution brute d'urokinase , et son activité spécifique est supérieure à 13.000 unités/mg. 35 EXEMPLE 3 On ajoute 100 g de kaolin à 100 litres d'urine fraîche dont on a éliminé le sédiment par filtration, puis on agite énergiquement le Mélange . On recueille le kaolin par séparation centrifuge, et on le lave jusqu'à ce que l'eau de lavage devienne incolore et transparen-te.Puis on sépare l'urokinase adsorbée sur le kaolin par élution au 7131434 5 2105243 moyen'de 3 litres d'une solution aqueuse d'ammoniac à 4#, et on la soumet à une dialyse jusqu'au lendemain . On ajoute la solution brute d'urokinase ainsi obtenue à pH 5,5 en utilisant de l'acide chlorhydrique 6N . On ajoute ensuite 45 g de morceaux de tissu d' "Exlan" (marque commerciale de Japan Exlan), et l'on agite soigneusement . On suit alors le mode opératoire de l'Exemple 1. En particulier, on effectue l'élution au moyen d'i litre d'une solution aqueuse d'ammoniac à Puis l'on procède comme à l'Exemple 1. La solution ainsi obtenue contient environ 75# de l'urokinase présente dans la solution brute, ou environ 40# de celle présente dans l'urine initiale , et son activité spécifique est supérieure à 10.000 unités/mg. 71 31434 6 2105243 REVENDICATIONS 1-Procédé d'extraction de l'urokinase à partir d'un liquide contenant cette urokinase, caractérisé en ce que l'on met un matériau comprenant des fibres synthétiqaes à base d'acrylonitrile en 5 contact avec ce liquide jusqu'à ce qu'une proportion importante ae cette urokinase soit adsorbée sur ce matériau, et en ce que l'on sépare l'urokinase adsorbée de ce matériau par élution . 2-Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que 1 on élue l'urokinase au moyen d'une solution alcaline . 10 3-Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajuste le pH du liquide à une valeur de 5,5 à 6,5 avant l'adsorption de l'urokinase . 4-Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les fibres sont sous la forme d'un tissu .