Brevet FR2061611A1 — publié le 19710625

Par catécholamines, on entend en chimie clinique- la nora-drénaline (NA), l'adrénaline (A) et la dopamine. Les métabolites les plus importants en quantité et, présentement, quant.au diagnostic, sont la métadrénaline, la normétadrénaline ainsi que les acides 5 phénolcarboxyliques acide 4-hydroxy-3-méthoxymandélique (HMMS ou VMS = acide vanilline-mandélique), 1?acide vanillique (VS) et l'acide homovanillique (KVS). La séparation de ces métabolites est augmentée dans diverses maladies, par exemple en cas de phéochromo-cytome, neuroblastome et ganglioneurone. 10 Le métabolite de sérotonine le plus important du point de vue diagnostic est l'acide 5-hydroxyindolacétique (HIES). La séparation du HIES est fortement augmentée par exemple en cas de 'bronchocarcinome et de carcinoïdé de l'intestin grêle. Il existe d'innombrables méthodes pour détecter ces méta-15 bolites. Les méthodes fluorimétriques et spectrophotométriques appliquées le plus souvent à l'heure actuelle offrent certains inconvénients. Elles sont, soit relativement.simples, mais non spécifiques et, par conséquent, peu probantes, ou spécifiques, mais alors très compliquées et associées à une grande dépense de travail. 20 On connaît en outre un procédé dans lequel on peut déter miner à l'aide d'échangeurs de cations et traitement alcalin consécutif les métabolites porteurs de groupes aminés métadrénaline (= métanéphrine) et normétadrénaline (= normetanéphrite). Ces métabolites ne se déposent toutefois en plus grand 25 nombre qu'en cas d'attaque. Le HMMS par contre, se dépose aussi dans l'intervalle sans attaque de manière accrue. La détection simultanée du HMMS est difficile parce que dans l'urine, il y a encore beaucoup d'autres phénols qui forment des colorants avec les réactifs envisagés et parce que les échangeurs d'ions basiques ne 30 fixent pas spécialement les acides phénolcarboxyliques en présence des sels de l'urine. Les procédés purement chromatographiques, par rapport à ces procédés opérant à l'aide d'échangeurs de cations, ont l'avantage que plusieurs métabolites peuvent être décelés spécifiquement en 35 même temps côte à côte. D'après la littérature, on connaît plusieurs méthodes chromâtographiques sur papier et sur couche mince 2 70 31346 2061611 pour la détermination de ces métabolites. Dans ces procédés connus viennent généralement après l'extraction de l'urine un séchage, une filtration et une concentration de l'extrait obtenu, ensuite on exécute une séparation chromâtographique sur pa-5 pier ou sur couche mince avec silica gel ou cellulose.» La détermination des métabolites se fait dans tous les,cas de manière connue en soi avec un réactif coloré, en l'occurrence, la coloration étant comparée à un standard», \ ;: Il a déjà aussi été proposé d'abandonner le prétraitement 10 de l'urine avant l'application sur une souche de cellulose. Ceci représente effectivement une simplification considérable, mais ne donne que des séparations non satisfaisantes étant donné que d'autres constituants de l'urine (par exemple des sels et de l'urée) déforment les zones séparées. En outre, seul le HMMS 15 peut être décelé icis en l'occurrence son identification restant encore relativement incertaine» De même, l'estimation quantitative est entachée d'un grand facteur d'incertitude et on ne peut déterminer, qu'une séparation vraiment fortement augmentée de HMMS» La limite inférieure de détection se situe à environ 20 10 mg io/joxir ;. la valeur normale se situe toutefois à 3-4 mg °/ot d'où déjà des valeurs voisines ou inférieures, à 10 mg $ par jour devraient pouvoir être décelées. On vient présentement de découvrir, chose surprenante, que par l'emploi d'un agent de sorption spécial) on peut obtenir 25 des chromatogrammes non perturbés avec une grande netteté des zones et une excellente séparation. Ce qui est étonnant, c'est que 1'urine peut être directement appliquée à l'agent dé sorption, sans prétraitement quelconque. En outre, les limites de-détermination des métabolites sont très basses. On dispose ainsi d'un 30 procédé particulièrement avantageux pour la détermination simultanée des métabolites de catécholamine et de sérotonine. Le nouveau procédé est extrêmement simple dans son exécution et concerne tous les métabolites diagnostiquement âmportaarfes à cet égard. L'identification et l'estimation .quantitative des subs-35. tances séparées chromatographiquement peuvent se faire avec une grande sûreté. . ■ ._ L'invention a pour objet par conséquent un procédé de détermination des métabolites de catécholamine et de sérotonine dans les liquides corporels par séparation chromâtographique 70 31346 3 2061611 sur couche mince et teinture du chromatogramme avec des réactifs colorés de manière connue en soi, qui se caractérise en ce qu'on emploie comme agent de sorption de la cellulose imprégnée de polyéthylène-imine. Pour le développement du chromatogramme, 5 d'après le nouveau procédé, on utilise tout au moins dans la première séparation un mélange acide consistant de préférence en au moins trois composants® Il convient que lragent d'élution contienne à côté d'au moins 5 ai° d'eau au moins un autre solvant appartenant au moins à un des groupes suivants : 10 A) des solvants non miscibles à l'eau ou seulement miscibles à celle-ci dans une mesure négligeable ; B) des solvants miscibles à l'eau et aussi à des solvants organiques ; 0) des acides, de préférence des acides alcane-carboxyliques 15 inférieurs. En tant que liquide corporel, on envisage surtout 1'urine0 En principe, les examens peuvent cependant aussi être exécutés avec d'autres liquides corporels appropriés, par exemple du liquide cérébrospinalo 20 Comme agent de sorption, on utilise la cellulose courante imprégnée avec de la polyéthylène-imine pour les applications chromatographiques (cellulose-PEI)« On peut toutefois aussi imprégner une c-ellulose quelconque convenant pour les applications chromatographiques, de préférence de la cellulose microcristal-25 line, de manière connue avec de la polyéthylène-imine (cfo par exemple Biochimica Biophysica Acta, ïome 61, pages 852-854 ^£""1962_7) « Ceci se réalise le plus simplement avec la solution aqueuse commerciale à environ 50 $> de polyéthylène-imine» On mélange cette solution, éventuellement après dilution avec de 30 l'eau désionisée, de manière intensive avec la celluloseo La suspension ainsi obtenue peut être directement employée pour le couchage des plaques0 la quantité de polyéthylène-imine sur l'agent de sorption est d'environ 0,15 à 10 °/o en poids, de préférence d'environ 0,5 à 3*5 35 II est important qu'ici on n'utilise pas de cellulose- PEI neutralisée à l'acide chlorhydrique, comme c'était courant en chromatographie. Il est au contraire important que, d'après la présente invention, on utilise me cellulose-PEI qui ne contient pas de contre-ion fortement fixé. C'est pourquoi, la 70 31346 2061611 cellulose BEI devra avantageusement se présenter ou bien sous la forme libre ou bien sous la forme OH, ou ne contiendra que des anions qui possèdent un coefficient de sélectivité inférieur à celui de l'anion chlorure» le coefficient de sélectivité est 5 comme on le sait, une mesure de l'affinité relative des ions envers l'échangeur. A cet égard, des anions appropriés sont par exemple le formiate, l'acétate, le propionate, le butyrate. la composition de l'agent éluant employé exerce de même une influence sur la séparation des chromatogrammes0 II s'est 10 avéré particulièrement avantageuxs du moins pour la première séparation de l'urine, de mettre en jeu un mélange acide se composant de plusieurs composants, de préférence d'au moins 3 constituants. Une addition d'eau d®au moins 5 7° en volume, de préférence entre 5 et 20 °/ot s'est avérée particulièrement favorable, 15 Les séparations désirées s8 obtiennent particulièrement bien quand on utilise des agents d'élution qui contiennent à côté de l'eau au moins un solvant non miscible à l'eau ou seulement dans une mesure négligeable, au moins un solvant miscible aussi bien à l'eau qu'avec des solvants organiques et au moins un acide, 20 de préférence un acide alcane-carboxylique inférieur® La propor-tion de l'acide par rapport au mélange total varie généralement entre 1 et 40 ^ en volume2 de préférence entre environ 5 à 20 fo en volume. Des solvants non miscibles à l'eau ou alors seulement 25 miscibles dans une mesure négligeable (groupe A) sont par exemple les hydrocarbures chlorés comme le chloroforme et le chlorure de méthylène, les alcools aliphatiques ayant plus de 3 atomes de carbone, par exemple les butanols ou les alcools amy-liques, les esters comme par exemple l'ester acétique ou d'autres 30 esters d'acides earboxyliques aliphatiques inférieurs, en particulier l'acide acétique, par exemple l'acétate de butyle ou d'iso-amyle, les éthers, le benzène et ses dérivés tels que le toluène et le xylène» Comme solvants miscibles à l'eau et aux solvants orga-35 niques (groupe B), on peut employer dans le but proposé par exemple des alcools aliphatiques inférieurs comme en particulier le méthanol, l'éthancû, le n- et 11 isopropanol, les cétones, en particulier l'acétone ou la méthyléthylcétone, le dioxane, le 70 31346 5 2061611 tétrahydrofuranne, l'acétonitrile, la pyridine, la diméthylfor-mamide et le diméthylsulfoxyde. Gomme acides, on envisage, de préférence l'acide formique, l'acide acétioue ou l'acide pro-nionique, ou des acides carboxyliques substitués comme l'acide 5 méthoxyacétique. Avec les acides minéraux les séparations se font généralement moins bien. A condition de renoncer à la séparation simultanée des métabolites moins polaires, par exemple de l'acide homovaniliques on peut aussi chaque fois laisser de côté un des groupes cités 10 plus haut de solvants (A ou B) dans le mélange des agents d'elution. D'après une forme de réalisation particulièrement préférée, on utilise comme éluant un mélange de chloroforme/n-butanol/éthanol/acide acétique glacial/eau dans un rapport volu-15 métrique de 10/55/5/15/15» D'autres mélanges appropriés sont par exemple : n-butanol/isopr panol/acide acétique glacial/eau dans un rapport volumétrique de 60/10/15/15 ou encore de 40/30/15/15 ; n-butanol/ester acétique/acide acétique glacial/eau dans un rapport volumétrique de 60/10/15/15 ; n-butanol/acide acétique glacial/ 20 eau dans un rapport volumétrique de 70/15/15 ; n-butanol/éthanol/ acide acétinue glacial/eau dans un rapport volumétriaue de 60/5/ 10/?5. la viscosité du mélange d'agents éluants doit être à 20°C entre 0,2 et 5 ; l'intervalle d'ébullition doit se situer 25 entre 30 et 150°CS Comme d'après le procédé conforme à l'invention la séparation par les éluants se fait généralement deux fois, on peut chaque fois mettre en jeu pour 1a. seconde séparation également un mélange basique d'éluants. Dans chaque cas, il.est important 30 que tout d'abord l'urine, vu qu'elle est appliouée sans prétraitement, soit séparée sur la Cellulose-PEI avec un mélange acide d'éluants» le traitement ultérieur du chromatogramme, en particuJier aussi en cas de chromatogranhie bidimensionnelle, peut par contre se faire aussi avec d'autres éluants, neutres 35 ou basiques. On obtient des séparations particulièrement bonnes par exemple quard on utilise comme mélanges basiques d'éluants ceux qui contiennent les constituants cités plus haut pour les éluants acides, en l'occurrence la fraction acide étant simple 70 31346 6 2061611 ment remplacée par une "base» de préférence de l'ammoniac. L'éluant basique devra donc aussi contenir à côté de la base avantageusement entre 5 et 20 $ d'eau,, au moins un solvant non miscible à l'eau ou seulement peu miscible avec celle-ci 5 (groupe A) et au moins un solvant du groupe B (solvants miscibles à l'eau et aux solvants organiques)» Un mélange dçester acétique/n-butanol/isopropanol/hydroxyde d'ammonium à .25 $ ayant un rapport en volume de 30/20/25/25 donne par exemple satisfac-tion0 Toutefois, ici également un des groupes de solvants A ou B 10 peut être laissé de côté9 étant donné que "oour beaucoup de problèmes, une séparation suffisante se fera néanmoins chloroforme/n-butanol/éthanol/hydroxyde d'ammonium aqueux à 25 $ 15 dans le rapport en volume de 20/30/30/15/10 ; ester acétique/n-butanol/isopropanol/hydroxyde d'ammonium à 25 1° dans un rapport en volume de 30/20/25/25 I n-butanol/acétone/hydroxyde d'ammonium à 25 i° /eau dans ua rapport en volume de 70/10/10/10 ; n-butanol/méthyléthylacétone/hydroxyde d'ammonium à 25 $»/eau dans 20 un rapport en volume de 30/40/15/15 ; acétate d'isoamyle/iso- propanol/hydroxjrde d'ammonium à 25 i° dans un rapport en volume de 30/45/25 » isopropanol/hydroxyde df ammonium à 25 i° dams im rapport en volume de 80/20® la préparation des plaques de chromâtographie sur 25 couche mince à employer dans la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention se fait de manière usuelle en soi. la suspension d'agent de sorption est appliquée avec un instrument d1étalement ' usuel sur les substrats de verreT les feuilles de matières synthétiques, les feuilles métalliques ou autres matériaux appro-30 ' priés. 1'épaisseur de la couche d'agent de sorption se situe généralement entre 50 et 200 p.» Les plaques sont ensuite séchées pendant plusieurs heures à la température ordinaire ou pendant un temps plus court à température élevée, par exemple quelques minutes à 80-120°C. Gomme la couche est sensible à la lumière, il 35 convient de conserver les plaques à l'abri de la lumière « L'exécution du nouveau procédé se fait d'une manière courante en soi. L'urine est appliquée sans prétraitement sur la couche d'agent de sorption. Pour la détermination quantitative,• 70 31346 7 2061611 on dilue dans certains cas l'échantillon d'urine avec de l'eau de préférence désionisée, pour avoir des volumes comparables et faciliter le calcula Avantageusement, on complète par exemple la séparation de 24 heures chaque fois au litre pleine 5 De chaaue échantillon' d'urine on armlinue environ 1 à 5 pl ; il se recommande de sécher entre-terms au cas où l'on arplinue plus de 2 jil en un point» Il confient d'appliauer à côté de 2 à 3 échantillons d'urine chaaue fois une solution standard.» ï'our le développement, on installe les plaques (une 10 ou plusieurs) dans des chambres courantes qui contiennent le mélange d'agents éluants» Avantageusement, on ferme la chambre pendant le développement avec une plaque de recouvrement» Généralement, le front d'agents d'élution a atteint le bord supérieur de la "olanue (8,5 cm de hauteur d'ascension pour une 15 dimension de plaque de 10 x 10 ou de 20 x 10 cm) après environ 1 à 2 heures» le plus avantageusement vient après le séchage un second dével^ppement de la même manière, éventuellement aussi en employant un -autre éluant ou un éluant basique» ?0 Pour la mise en évidence des matières contenues du li quide testé et du standard, on pulvérise ensuite de manière habituelle en soi un réactif coloré» Normalement, ces réactifs colorés sont employés à des concentrations d'environ 0,1 à 1 fot le plus souvent sous une forme stabilisée» le plus fréquemment, 25 on utilise des p-nitranilines diazotées, par exemple du fluoro-borate de o-nitrophényl-diasonium» de 3.'acide 4-diazo-benzène— sulfoninue, du fluoroborate de 4-diazo-n-nonoéth.yl-o-toluidine, du fluoroborate de 4-diazo-N,N-diéthyl-aniline, de la 4-diazo-ïï-éthyl-N-({3-hydroxyéthyl)-aniline ; on a dé.jà employé aussi du 30 chlorure de 2,6-dichloronuinone dans ce but» Lors de la pulvérisation, on veillera à ce que la couche d'agent de sorption soit tout juste humidifiée, parce nu'autrement les zones peuvent se mélanger» Après le séchage, par exemple quelques minutes à 90°C ou pendant des temps plus longs en rapport à des températures 35 plus basses, on évalue le chromatogramme en lumière incidente et en lumière transmise. La hauteur et la coloration des taches des chromatogrammes d'urine sont comparées à celles des solutions standard. L'acide vanillique, la métadrénaline, la normétadréna- ba° original 70 31346 8 2061611 line et l'acide méthoxyhydroxvmandélique présentant des colorations bleues et l'acide homovanilliaue des colorations bleu clair ou cas où l'on a utilisé comme réactif coloré du fluoroborate de n-nitro--Dhényl-diazoniuïïio L'acide hydroxyindolacétiaue 5 est par contre dans ce cas coloré en rouge. Les nuantités séparées pathologiques de métabolites de catécholamine et de. sérotonine sont ainsi reconnues avec sûreté® T1 convient fréquemment de contre-vérifier les chroma-togrammçs obtenus, en particulier en cas de résultats positifs, 10 par chromatographie bidimensionnelle» On augmente ainsi dans une mesure considérable la spécificité étant donné que les taches obtenues en chromatographie unidimensionnelle sont encore une fois séparéeso A cause de médicaments ou aussi d'aliments, on peut rencontrer des perturbation^ dans la détermination des mé— 15 tabolites parce nu®il peut aussi y avoir d'autres métabolites qui, dans l'agent d'çlution choisi, possèdent dans certains cas la même valeur de Rf„ C'est pourquoi, il se recommande souvent de contre-vérifier un résultat positif par chromatographie bidimensionnelleo On peut alors décider avec sûreté si, le' cas 20 échéant, la valeur plus grande n'est pas simplement simulée par superposition dsune autre substance contenue dans le liquide corporel examinée La chromatographie bidimensionnelle est avantageusement exécutée aussi dans chaque dimension deux fois» Ici également, 25 on peut éventuellement employer dans la seconde dimension et/ou lors du second développement chaque fois un agent d'élution basiqueo En chromatographie bidimensionnelle, on partage avantageusement la plaque de couche mince en deux parties et on 30 développe d8abord deux échantillons d'urine séparés spatialement et une solution standard, de manière courante en soi® Ensuite, on applique un autre standard et la chromatographie dans la seconde dimension se fait ensuite de manière connue. Les taches ainsi obtenues des échantillons d'urine peuvent alors être identifiées 55 avec facilité par les deux taches correspondantes des solutions standard, donc par deux coordonnées» Le cette manière on peut également exécuter la détermination quantitative des substances séparées avec une grande sûreté» BAD ORIGINAL 70 31346 9 2061611 Par la présente invention, il est donc devenu possible rsour la première fois d'exécuter une détection et une estimation quantitative côte à côte des métabolites tant de catécholamine nue de sérotonine, sans que doive se faire au préalable un trai-5 tement de l'urine, ce qui exclut une source supplémentaire d'erreurs» Le nouveau procédé, en raison de sa simplicité et de sa rapidité, convient aussi bien pour l'exécution d'examens en série aue -oour des estimations individuelles en cas de conditions pathologiaues» Les basses limites de détection rendent le 10 nouveau procédé utilisable pour les problèmes et les diagnoses différentielles les plus diverses» Préparation des plaques à couche mincee On ajoute 3 litres d'eau désionisée à 150 g d'une solution anueuse à 50 % de polyéthylène-imine« On transvase la 15 solution dans un récipient plus grand et on la complète avec de l'eau désionisée à 17,5 kg en tout* A cette solution de polyéthylène-imine, on ajoute 4-,8 kg de cellulose microcristalline « On met le mélange en suspension dans un appareil mélangeur à grande vitesse Pendant 20 secondes» Avec la suspension obtenue, 20 on enduit des plaques de verre d'un format de 20 x 20 ciru On règle l'appareil applioateur à une épaisseur de couche de 250 p.. On sèche les plaques à environ 90°C en étuve ou durant une nuit à la température ambiante. L'épaisseur de couche est d'environ 80 à 120 ji. 25 Au lieu de cellulose microcristalline, on peut employer aussi toute autre cellulose convenant pour les applications chromatographiques sur couche mince» La quantité de polyéthylène-imine par rapport à l'agent de sorption total est d'environ 1,5 "1° en poidso 30 Exécution du procédé Exemple 1 Application comme test clinique pour la détection d'une séparation rénale accrue de métabolite de catécholamine et de sérotonine» 35 L'urine récoltée pendant 24 heures d'un patient est portée avec de l'eau distillée à un, deux ou.trois litres complets. On applique ponctuellement 2 pl d'urée par litre de ce mélange sur le Ions- côté d'une plaque de verre à la cellulose-PEI de 10 70 31346 2061611 10 x 20 cm à une distance de 1,5 cm du bord inférieure Entre les divers points d'application, on respecte un écartement de 1,5 cm. Toutes les deux prises d'essai d'iirine, on applique une solution standard (dont la composition est donnée au tableau suivant) ; 5 de cette manière, chaque crise d'urine est voisine d'une solution standard et l'on neut appliquer sur une plaque 8 prises d5urine* La plaque est alors développée deux fois avec le mélange d'agents d'élution chloroforme/butanol/éthanol/acide acétique glacial/eau (5/55/10/15/15) jusqu'au bord supérieur de la 10 plaque. On sèche alors la plaque et on la pulvérise avec une solution 0,05 molaire de tétrafluoroborate de p-nitrobenzène-diazonium dans une solution aqueuse 0,3 molaire de NagCO^,, Après un court chauffage, les divers métabolites anparaissent séparés sous forme de taches diversement colorées. On détermine sur la 15 base de l'intensité des colorations et de la dimension des taches si une des prises d'urée contient un métabolite à une concentration sunérieure à celle du standard. On prépare le standard par dissolution dans de l'eau des métabolites en question. Le standard correspond à la région 20 normale supérieure (à l'exception de la métadrénaline et de la normétadrénaline qui, pour une meilleure caractérisation, ont été ajoutées en une quantité supérieure). La composition du standard ainsi que les hauteurs d'ascension des diverses substances standard dans l'éluant employé ressortent du tableau suivant : 25 Tableau I Substance Acide vaniilique 30 Acide homovanil-lique Métadrénaline Normétadrénaline Acide 5-hydroxv-35 indolacé- tique Acide méthoxy-hydroxy-mandélique Réaction colorée bleu bleu clair bleu bleu rouge bleti Hauteur d'as-cension (cm) 8,1 7,8 7,4 6,7 6.1 3.2 Concentration dans le stan-dard (mg/l) 10 15 5 10 10 -s. -*»S BAD ORIGINAL 70 31346 n 2061611 Dans le cas présent, toutes les Tiri^ps d'unne VR.1 sltUP^P *3 1. ' -.îl"fcsi?3.0UT 'iB "* 8 1 ntÇ"nTV^l 1 e nC"P— mal o Exemple ? îïp'ti ti on r^ini —nuirt1' t^tivp de T-i nn ^ •Ses i.tPR On "PT,p"p?iT*p "tout; d1 aboWl den ut"* on~* ^t^ind^Td ds noTnr)os i4"-? on et d» eonnentrâtion suivante? : Tableau II ST 1 ST 2 ST 3 ST 4 ST 5 Acide varîlli^ue 10 15 20 30 50 .Acide homovanillique 15 22,5 30 45 75 î.'l p -f; q r> « n a! ire 5 7,5 10 15 p5 TO'Q-pni^-Hq/^-r»f 5 10 15 25 Ac'de 5—hvdrnrvin-dol^cétioue 10 15 20 30 50 .A c i de 4 - h vri r oxtr- ^ -m p th o y v- m^nd plinue 10 1K- ?n 30 On anr>linue alternativement chaîne fols 2 pl d'urine ^p.r 1 i t^e d° s^parat4 on d'un .iour et chaoup foi? des diverses solutions standard en concentration croissante -le la manière décrite h l'exemple 1. On développe la, nlaoue et l'on exécute la r°ac+ Quatre des prises d'urine employées montrent rour les 6 métabolites indiqués des valeurs dans l'intervalle normal, tandis -me, pour une prise, oui a obtenu une addition d'acide homovanillique, on a trouvé une concentration plus grande qui doit être rangée entre le standard 2 et le standard 3 (tache bleu clair)» Geci correspond à l'addition de 25 mg/l d'acide homovanillique à cette prise d'urine» Exemple 3 Chromatographie bidimensionnelle Une plaque de verre à couche de cellulose-PEI comme BAD ORIGINAL ' 70 31346 12 2061611 décrit plus haut, d'un format 10 x 20 cm, est partagée par un trait de crayon en deux moitiés de format 10 x 10 cm. Sur la partie gauche ainsi obtenue de la plaque, on applique chaque fois à un écartement de 1,5 cm du bord gauche et du bord inférieur au 5 moins 4 Jil d'une urine non traitée» Sur la moitié droite de la plaque on opère de même, mais.ici, on applique à une distance de 15 mm à côté du point d'application de l'urine 2 p.1 d'une solution standard (St 3 de l'exemple 2)» On développe la plaque avec le long côté vers le bas de la manière usuelle avec l'agent 10 d'élution chloroforme/butanol/éthanol/acide acétique glacial/ eau (5/55/10/15/15) deux fois jusqu'au bord supérieur de la plaque» Après nouveau séchage intermédiaire, on applique sur l'en- -droit d'application de l'urine dans la partie gauche de la plaque, ou aussi près de celle-ci, 2 pl de la solution standard 3» 15 Ensuite, on développe la moitié gauche de la plaque perpendiculairement à la première direction de développement jusqu'à l'extrémité supérieure, autrement dit jusqu'au trait de crayon, deux fois (avec séchage intermédiaire) avec le mélange d'élution ester acétique/n-butanol/isopropanol/hydroxyde d'ammonium 20 aqueux h 25 f° (30/20/25/25)» On rend visible les taches obtenues par pulvérisation avec une solution 0,05 molaire de fluoroborate de p-nitro-phényl-diazonium. Chaque tache peut être caractérisée nettement par les solutions bidimensionnelles conjuguées à l'aide de 2 25 coordonnées» Dans le cas présent, il est apparent que la séparation plus grande d'acide hydroxyméthoxymandélique (tache bleue) établie dans un chromatogramme unidimensionnel antérieur est simulé par un autre métabolite de même hauteur d'ascension» la 30 tache d'acide hydroxyméthoxymandélique dans le chromatogramme bidimensionnel se situe dans l'intervalle normal, tant par la teinte que par la dimension,, Exemple 4 De la manière décrite à l'exemple 1, on examine des 35 urines de 24 heures» S'écartant en l'occurrence de l'exemple 1, la solution standard a été remplacée par un standard de composition suivante : 'HMMS, HIES, HVS et VS à des concentrations pour chacun d'eux de 5 mg/l. > BAD ORIGINAL 70 31346 13 2061611 Après développement et coloration des chromatogrammes comme à l'exemple 1, anparaît l'image suivante : Parmi les 100 urines, 22 urines contiennent environ 5 mg/l de HIES, 2 urines contiennent environ 7 mg/l de HIES, le 5 restant des urines contenant moins de 5 mg/l de HIES. Toutes les urines nui contiennent 5 mg/l de HIES ou. nlus sont ehromatoffra-phiées bidimensionnellement comme décrit à l'exemple 3. Il s'avère ainsi hup dans un seul cas dans le chromatogramme unidi-mensionnel un accroissement en HIES de plus de 5 mg/l a été 10 simulé. 21 des urines examinées -contiennent d'après l'estina-tion du chromatno-r>amme unidi.mensi onnel 5 mpr/l ou moins de HMMS. Une épreuve ultérieure par chromatographie bidimensionnelle a montré que dans 5 cas, dans la chromato/rraphie unidimenstonnelle, 15 il y a eu une substance perturbatri.ce à la hauteur de HMMS qui a été séparée t»ar la chromatographie bidimensionnelle. Il ressort de ceci que la séparation se situe à l'intérieur de l'intervalle normal. Ainsi, donc 16 seulement des 100 urines examinées montrent effectivement une lé^è-^e sép^nfi on de HMMS, oui a du être véri-20 fiée par d'autres tests. le HYS n'a été découvert que -dans 10 des 100 urines par la grandeur et l'intensité des taches bleu clair. Dans beaucoup d'urines, on trouve dans la chromatographie unidimensionnelle peu en-dessous des taches de HVS une substance se colorant en 25 rouge. Pour être complètement sûr nue cette substance se colorant en rouge ne recouvre pas une tache se rapportant au HYS, on ajoute aux prises d'urines en question chaque fois 5, 10, 15 et 20 mg de HYS/l. Il apparaît, après le développement du chromatogramme, que la détermination de HYS dans le procédé conforme à l'inven-30 tion n'a pas été défavorablement influencée par cette substance se colorant en rouge, parce que les différences de concentration se voyaient bien. Dans un cas, une substance qui se teint en rouge se situe exactement à la hauteur de HVS. Mais le chromatogramme bidimensionnel a montré que l'urine considérée ne contenait 35 pas de quantités importantes de HYS. Dans aucune des 100 urines examinées, le procédé conforme à l'invention n'a montré un signe de séparation pathologique. Ceci démontre qu'on ne doit pas s'attendre à des résultats positifs faux. Ceci est d*autant plus digne d'être signalé que les urines bad original 70 31346 14 2061611 provenaient de patients qui n'avaient pas été préparés en vue de l'essai en ce qui concerne la diète ou la prise de médicaments» Des résultats négatifs faux ne sont pas de même possibles à cause de la grande sensibilité de détection du procédé conforme 5 à l'invention. Exemple 5 Estimation semi-quantitative de la séparation rénale de métabolites de catécholamine et de sérotonine» On prépare des solutions standard de composition et 10 concentration indiquées à 18exemple 2. Dsune urine qui était remarquable par la teneur élevée en acide homovanillique,on applique alternativement chaque fois 2 pi d» urine par litre de séparation quotidienne et chaque fois une des diverses solutions standard à une concentration croissante 15 de la manière décrite à l'exemple 10 On développe la plaque et l'on effectue la réaction colorée comme décrit à l'exemple 1» A l'aide des standards à concentration variable, on peut estimer avec une grande certitude et sans difficulté la quantité séparée des divers métabolites» L'urine, d'après l'intensité de la tache 20 d'acide homovanillique, se rangeait entre le standard 2 et le standard 3 (tache bleu clair). Ceci correspond à une teneur de 25 mg/l d'acide homovanillique dans cette prise d'urée. 15 70 31346 2061611 Revendications o Procédé de détermination des métabolites de catécholamine et de sérotonine dans les linuides corporels riar séparation chromatogra^hinup sur couche mince et teinture du chromatogramme ?vec des réactifs colorés usuels, caractérisé en ce nu'on utilise comme agent de sorption une cellulose convenant nour Ipb s"p-olications chromatograohi cjups , iirmrégnée avec de-la polyéthylène-imine. o Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise de la cellulose microcristalline imprégnée avec de la p olyé thy1ène-im ine„ « Procédé selon l'une des revendications 1 et ?, caractérisé °n ce nu'on utilise comme agent d'élution un mélange constitué uar au moins 3 solvants„ o Procéd» se"1 on l'une des revendications 1 à 3> caractérisé en ce nue la chromatographie est exécutée toujours deux f^is» „ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4» caractérisé en ce qu'au moins la première séparation est effectuée à l'aide d'un mélange acide d'agents d'élution. „ Procédé ^e"1 on l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce nue la. seconde séparation chromatographique, en particulier, pour la e bidimensionnelle, est effectuée à l'aide d'un mélange basinue d'agents d'éintiono o Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'en tant qu'agent d'élution acide, on utilise un mélange nui contient à côté d'au, moins 5 ,J» d'eau toujours au moins un autre solvant appartenant aux groupes suivants : des solvants non miscibles à l'eau ou oui le sont seulement' dans une mesure négligeable ; b) des solvants miscibles aussi bien avec l'eau qu'avec des solvants organioues ; c) des acides, de préférence des acides alcane-carboxyliques inférieurs. . Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 et 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent d'élution acide un mélange de chloroforme/n-butanol/étbanol/acide acétique glacial/ eau dans le rapport de 10/55/5/15/15. BAD ORIGINAL 70 31346 16 2061611 9» Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 et 6, caractérisé en ce nu'on utilise comme agent d'élution basique un mélange qui contient à côté d'au moins 5 °/° d'eau toujours au moins un autre solvant appartenant aux groupes suivants : 5 a) des solvants non miscibles à l'eau ou qui le sont seule ment dans une mesure négligeable ; b) des solvants miscibles aussi bien avec l'eau qu'avec des solvants organiques ; c) une base, de préférence une base volatile comme l'ammoniac» 10 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4j 6 et 9» caractérisé en ce qu'on utilise comme agent d'éluant basiaue un mélange d'ester acétique/n-butanol/isopropanol/hydroxyde d'ammonium aqueux à 25 1° dans un rapport de 30/20/25/25«~ 11® Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé 15 en ce au'on utîlise,comme liquide corporel, de l'urine non prétraitée0- BAD ORIGINAL