Brevet FR2081565A1 — publié le 19711210

L'invontion conc@rn@ l@ domaine de l'immunologi@ et a plus particulièrement pour objet unpprocédé perfectionné pour la production d'anticorps. L'invention conc@r@@ aussi les antiséra sus c@ptibles d'ôtre obtenus par un tel procédé et leurs applications thérap@utiques, @n particulier pour le traite@@nt, par immunothérapie de c@rtains types d@ leucémies et autres affections malignos. On a déjà proposé d'appliquer l'immunothérapie aux aff@c- tions malignes [Gorer et Amos, Cancer Res. 16,338 (1956)],mais la mise @n oeuvre d'une t@lle méthode s'est hourtée à de graves obstacles, t@ls que la toxicité des fortes quantités des immunosé ru@s injectés et la manifestation fréquente des phénomènes de facilitation [Voisin, P.165 in Intern. Sy@p. on Immunopathology, Mont@-Carlo, Schwabe & Co. And Grun@ & Stratton, ed. New-York,1955 et CHARD, Immunology, 1968,14,583.] L'immunothér@pie de certaines affections malignes chez l'animal somble cepe@dant conduire à des succès qui ont été rapportés dans la littérature. En général, l'a@tisérum est injecté @n même temps que les c@llules, dans le cas des l@ucémies greffables, ou que le virus, dans le cas des leucémies virales [Britta Wahr@n J. Nat. Canc@r Inst. 41, 931 (1968)]. Dans le cas où l'immunothérapie passive est appliquée à une affection maligne bi@n établie, on a ainsi pu observer des régressions plus ou moins importantes ou des retards du développement de l'affection. Les recherches antérieures ont permis de mettre en évidence de façon sûre que les anticorps actifs dans le rejet des tumeurs ou des@@ucémies sont les anticorps cytotoxiques, capables de fixer le complément [Winn, J. Immunol, 1960, 84.530; Phillips M.E. Rother V. et Rother K. J. Immunol,1968,100 493] alors que les anticorps non cytotoxiques, ont, à l'inverse un eff@t facilitant (Chard, Cité supra). On a également montré qu'il était capital de tenir compt@ du rapport entre la quantité d'anticorps cytotoxiques injectés et le nombre de cellu l@s cibles, prés@ntes à ce moment dans l'organisme.Les résultats de la technique antérieure montrent done que, si l'on @spèr@ atteindr@ une officacité acc@ptable, un traitement par immunothérapie passive doit satisfaire à deux conditions principales. La première est que le traitement permette d'injecter sans danger une grande quantité d'anticorps cytotoxiques. La seconde est que l'immunothérapie ne tienne compte que des anticorps cytotoxiques spécifiques des néoantigènes notamment leucézigues, sinon des anticorps dirigés contre des antigènes communs aux cellules normales et leucémiques sont immédiatement absorbés par les cellules normales de l'organisme. On sait en outre que l'injection d'un antigène et de l'anticorps correspondant déprime ou annule la reponse de cet antigène et que le rapport entre la quantité d'angigène et l'an- ticorps injectés est déterminant. On peut consulter à cet égard les articles de G.W. Siskind, Fh. Dunn et J.G. Walker 1,Studies on the control of antibody synthesie (II. Effect of antirSen dose and of suppression by passive antibody on the affinity of antibody synthetized) J. Expor. Med, 1968 127,55 et de Dixon, Jacot Guillarnod et mac Conamey J. exper.Med. 1967 125,1119. D'autres référonces bibliographiques pertinentes illustrant l'art anterieur sont les articles suivants - Göran Möller, Journal of the national cancer Institute, Vol. 30, N 6, Juin 1963 p. 1153 à 1175 et 1177 à 1203. - Jean-Charles Cerottini, Batricia J. Mac Conabroy et Franc J. Dixon, The Journal of immunology, Vol 103, N 2 Août 1969. - Neil I. Brody, J. Geoffrey Walker et Gregory W. Siskind J Studios on the Control of antibody synthesis (interaction of antigenic compotition and suppression of antibody formation by passive antibody on the immune response ) J. Exper . Med. 1967]. D'autres documents illustrant l'art antérieur sont cités dans les articles précités et sont introduits dans la présente description à titre de référence. L'invention a pour objet un procédé pour l'obtention d'antisera hautement spdcifiques, en mottant à profit la technique générale connue d'injection associée d'un antigène et de l'anticorps correspondant, laquelle provoque une réponse immunitaire très affaiblie contre ledit antigène. Un autre objet de l'invention est un procédé pour la production d'anticorps après un traitement imunologique sé lectif dit de "masqusge". Un autre objet de l'invention est un antisérum dirigé contre un éve tuel antigène d'affection maligne, tel qu'un antigène leucémique ou de tumeur. Un autre objet de l'invention est un antisérum hautement spécifique des antigènes leu@emi@ues. Un autre objet de l'invention est un sérum antilymphocytaire, appliqué comme immuno dépresseur. D'un@ façon générale, l'invention concerne un procédé pour la production d'@nticorps contre un antigène ayant en lui-même une faible action immunogène et qui est seulement disponible sous forme @'un mélange antigénique dudit antigène avec d'autres substances antigéniques présentes en pr@dominance dans ledit mélange, ledit procéd@ étant caract ris@@ en ce qu'@n immunise un animal avec ledit melange antigénique associé à un fort excès d'anticorps dirigés contre lesdites autres substances antigéniques, ce qui perment de recueillir de manière connue un antisérum. Le procédé de l'invention est applicable d'une façon gen@- rale à tous les cas où l'on ne dispose que d'un mélange d'antigènes comprenant un antigène peu immunogène et fortement contaminé par d'autres antigènes. Grâce à l'invention il est possible de déprimer sélectivement la production des anticorps diriges contre les antigènes contaminants même si ceux-ci sont immunologiquement dominants. @insi qu'on l'a mentionné précédement, le procédé proposé implique un masquage immunologique sélectif. L'obtention de résultats positifs par un tel proc@dé n'était nullement prévisible car l'homme de l'art n'ignore pas le caractére hautement aleatoire des extrapolations dans un tel don@ine. Il y a lieu de noter que, si l'effet de masquage immunologique selon l'invention n'est pas absolument total dans la pratique, car les anticorps obtenus sont toujours accompagnés d'une certaine quantit@ d'anticorps non d-sir@s, le procédé permet d'obt@nir par animal une quantité absolue d'anticorps intéressants plus importante et d'économiser les produits utilis@s pour absorber les anticorps non d sirés. Pour chaque système d'immunisation, le rapport antigèneanticorps à injecter estbien entendu à d@finir exp@rimentalement par des essais pr@limin@ires, les quantités valables pour une espèce animale et pour un complexe antigènique donné n'étant pas directement transposables d'un cas à l'autre. Si le mélange injecté est trop riche @@ @@ticorps, on ob ti@nt @n définitive des sérums cont@@ant @es anticorps injectés passivement, et @@ r@vanche, si le @élange injecté est trop pauvre @@ anticorps, @@ réalise une immunisation active contre les antigènes nermaux. Des @xpéri@nces préalables doivent done @tr@ @ntreprises dans chaque cas particuli@r d'application pour définir les ga@@es optimales du rapport antigène-anticorps. Pour la mise on o@uvre du procéd@ de l'invention lorsqu'on désire obtenir un antisérun dirigé contre un éventu@l antigène l@ucémique ou de tum@ur, on injecte à l'animal un @@lange de c@llules l@ucéniques et d'antisérun anti-c@llules normales, auquel cas seuls les antigènes présents sur les cellules l@ucé- niques et abs@nts sur les cellules normales sont capables d'i@- muniser l'animal avec officacité. L'invention peut recevoir d'autres applications, par ex@mple pour l'obtention de sérum antilymphocytaire utilisé comme immu nodépress@ur. On sait que l'immunisation d'un animal par l@s lymphocytes provoque la formation d'anticorps dirigés contre les antigènes portés par les lymphocytes souls mais aussi contre les antigènes communs aux lymphocytes et aux globules rouges. Les anticorps de de cernier type sont dangeroux et provoquent une hémolyso lorsqu'ils sont injectés. Lors des injections massives de sérum anti lympho@ytaire, on doit au préalable les absorber sur des globules rouges. Solon l'invention l'immunisation d'un cheval, par ex@mple avec un mélange de lymphocytes et d'anticorps de cheval antiglobules rouges, est susce@tible de fournir un anti-séru@ plus pauvre @n anticorps hémolytiques et plus riche tant @@ valeur relative qu'en valeur absolu@ on anticorps spécifiquement antilymphocy tair@s. L'invention sera illustrée ci-après dans son application à la production d'un antis@rum hautement spécifique des antigènes leucémiques. Dans c@ cas, on injecte à un animal d'une ligné@ donnée des collules l@uc@miques proverant d'une autre lignée ou d'une autre @spèce, associées à une quantité connu@ d'antisérum produit dans la même lignée que l'animal recev@ur et dirigé contre les c@llu- les normales de la lignes ayant fourni les cellules l@ucémiques. Un tol procédé de production d'antisérum a été expérimenté sur trois espèces animales, la souris, le rat et le lapin et les résultats obtenus montrent le caractère général de son application à de nombreuses espèces animales, y compris l'homme. Les résultats rapportés ci-après montront que l'invontion permet d'obtenir des antisérums spécifiques des antigènes tumoraux après une absorption sur un nombre faible de cellules normales afin d'éliminer la petite quantité d'anticorps dirigés contre des antigènes normoux. le procéde de l'invention s'ap plique donc avec avantages dans tous les cas où l'on a ces difficultés à se procurer une grande quantité de cellules norma les et où l'on désire un antisérum totalment z débarrassé ce ses enticorps anti-cellules mormales. En outre, on considérant soulement les anticorps antiantigènes leucémioues, on a trouvé que l'invention permet dtob- tenir d'un animal donné une quantitl absolue d'anticorps plus importa lita, au moins dans la cas do la souris et du lapin. L'invention pur set ainsi un intérôt particulier dans son application aux antihènes faiblement antigéniques. On sait à cot égard d'après les observations antérioures en insunologie que l'injection ee quantités massives dc cellules ne fait que provoguer un phénomène de compétition antigénique antre les anti- gènos normaux, nombreux et fortoment antigé iques et les antigènes rares et pou antigénigues, à l'avantage despremiers. Dans de telles conditions, l'injection simultende d'anticorps anti-antigènes normaux, comme le prévoit l'invention, permot de tirer le meillour parti des entigènes faiblement antigé ques. Un tel procédé pout en particulier être utilisé dans cas des cellules louc6miques humaines. On décrira maintonant dos exemples do aise on oeuvre du procédé de l'invention concernent deux types de leucémies. D'und part, la loucémie de la lignse DBA/2 LL210 greffable, chimio induite à l'origine, reprdsentant lo cas d'une leucémie faiblement antigémique, du moins pour ce qui concorne son sptitude à provoquer des anticorps sérioues [MATHE G. CLARKE D.A. und CASWELL E.[Ann. N.Y. Aéad. Sei. 101,80 (1962)] d'autre part, la leucémie virale induite sur la linee DBA/2 par le virus de Charlotte Friend, représontant le cas d'une loucémie fortement antigéniqie [Old. Boyso an Lilly Cancer Reso1963 23,1063. Cellules injectées pour les immunisations - Cellules de rate de souris normale de la lignée @BA/2 (# N). - Cellules de rate de souris DBA/2 ayant reçu une injection intrapéritonéale, de cellule L 1210, le prélèvement ayant @u lieu un jour avant la mort prévue de l'animal (# L1210). - Cellules de rate de souris DBA/2 ayant reçu 9 jours auparavant une injection I.P. de 0,2 ml de surnageant à 35% de rate leucémique induite par le virus de Charlotte Friend (# LVC). Lorsque les cellules doivent @tre mises en contact avec un antisérum ou du sérum normal avant l'injection, on a abandonné le mélange une heure à la température de la pièce et 2 heures à 4 C. Dans tous les cas, la quantité d 'anticorps injectés reste en rapport avec la quantité de cellules inject es. Ce rapport est choisi d@ telle sorte au 70 à ci 60 des anticorps restent dans le surnageant après la mise en contact avec les cellules injectées. L'antiserum possédant l'activité cytotoxique voulue est obtenu par dilution avec du sérum normal correspondant. Après la mise @n contact cellule-antisorum, la suspension ost partagée en deux et l'une des moitié est soumise à une congélation-décongélation. Cette derniè@@ suspension sert ou groupe d'animaux recevant les c@llules tu@es. Les suspensions cellulaires contenant du sorum normal ou seulement du milieu tyrode subiss@nt le même traitement. Test de cytotoxicité On a utilisé la technique décrite par R. MOTTA Rev. Franc. Etud. clin. biol. 1968 13,713]. On se référera done a c@tt@ publication pour les détails opératoires relatifs à c@tt@ technique et pour la définition des milieux et réactifs utilisés. Les antisérums de @at et de lapin sont décomplémentés avant dosage par passage à 56 C pendant 30 minutes. Dans un tub@ à hémolyse, on place 0,1 ml de la dilution d'antiserum en milieu 199, et 0,1 ml de suspension de cellule de rate à 106 ~ ml en milieu 199. On laisse @n contact 30' à la température de la pièce.0n ajoute alors 0,1 ml de sérum de co- baye dilué au 1/3 en milieu 199. On porte à 37 C au bain-marie, pendant 45'.Le taux de mortalité est estimé par la prise du bleu trypan (on ajoute 0,1 ml par tube d'un mélange composé de 4 volu m@s d'une solution à 0,2 % de bleu trypan dans l'eau distill@@ et de l volume d'une solution de @@Cl à 4,@5 % dans de l'@au distil lé@). Deux tubes témoins re@oivent du sérum norm@l @@ souris C57Bl/6 à la place de l'antisérum. Deux tubes t@@oins de sérum de cobaye d@c@mpl@menté par passage a 36 C pend@nt 30' et deux tubes témoins ne recev@nt ni antisérum, ni sérum de souris normal sont pr vus dans chaque dosage. Interprétation des rés@ltats Pour un tube de réaction donne, on connait le pourc@ntage de mortalit@ brute fourni directement par le pourcentage de cellules prenant le bleu de Trypan. On connaît d'autre part le "pourcentage de mortalité de base" fourni par le pourcentage de cellules prenant le bleu de Trypan dans les tubes t@moins comprenant du sérum normal.On calcule le "pourcentage de cytotoxicité" par la relation suivante : %de cytotixicité = 100 x ########################################## Mesure de l'activité cytotoxique d'un antisérum Pour c@ractériser l'activité cytotoxi@ue des antisérums, deuxcritères ont été retenus : - le titre de l'antisérum défini comme étant la dilution de l'antisérum qui fournit un pourcentage de cytotoxicité de 50 % dans les conditions de l'exp@rience et contre un type de c@llules déterminé, - le nombre maximal de cellules que pourrait tu@r l ml de l'anti@@ru@ dans les conditions optimales de dilution.On obtient ce nombre grâce @ la courbe du pourcentage de cytotoxicité @n fonction de l dilution de l'antisérum ; en @ffet le pourcentage de cytotoxicité dans un tube de réaction donn, multipli@ par le nombre total de cellulescibles pras@ntes dans ce tube, donne le nombre total de cellul@s que la quantité d'antisérun prés@nt dans ce tube @ été capable de tu@r. Il @xiste une @ilution de l'antiser@@ pour laquelle le rapport ##################### est le plus grand.On cal- cule le nombre de cellules qu'aurait pu tuer l ml d'antisérum à cett@ dilution. Système allogénique Animaux immunisés : Chaque groupe est constitué de 5 à 6 souris, mâles, de la lignse C57 Bl/6, âgées de 8 a 10 semaines. Antisérum utiliaé pour le "masquge des sites sntigéniques normaux des cellules injectées" : Antisorum de souris C57Bl/6 mâles, hypérimmunnides contre des cellules de rate normale de souris de la lignée DBA/2. Le protocole d'hyperimmunisation est 1 même Que celui utilisé pour les 18 groupes de l'expérience. Ttre de cytotoxicité : 1/1024 contre des collules de rato DBA/2 normals. Protocole d'immunisation des groupes de souris : 4 injections I.P. de 5.105 animal, ospacées de 5 jours, 10 jours après la quatrième injection, chaque souris est saignée au sinus re- troorbital, Vingt jours plus tard, chaque animal reçoit une seconde série d'injections avec des doses oroissantes de cellules : 1 , 2, 4 et 8 x 106 animal, ospacées cic 5 jours. Dix jours après la huitième injection, les animaux sont saignés à mort. Absorption d'un antisérum par des quantités variables de collules : L'antisérum et les collules sont laissées ou contact pendant 2 heures, à la température de la pièce puis mie nuit à 4 C. Les collules sont onsuite contrifugées pondant 20 mintes à 4.000 t/mn ; lo surnageant rocueilli est conservé à - 20 C. L'activité cytotoxique du surnsgeant est mesurée dela même façon que pour un antisérum ordineire. Chaque surnogeant est dosé doux à trois fois contre chaque type de cellules-cibles. Le nombre total de collules que les anticorps domeurés dans lo surnageant auraient pu tuer est calculé à partir de la moyenne. Système hétérologue Cas où le donnour d'antisérum est le rat Animaux immunisés : chaque groupe est constitué de 3 rats C.F. femelle, agôs de 3 à 10 semaines. Antisérum (on obrévistion A.S.) utilisé pour le marquage des sites antigéniques des cellules injectses : antisérum de rat C.F. hypérimmunisé par 8 injections de cellules de rate normale DBA/2. Titre en cytotoxicité : onviron 1/2560 (A.S. anti # N). Antisérum de rat C.F. hyperimmunisé par 8 injections de collules de rate de souris portouses de la loucémie de Cherlotto Friond. Trtro de cytotoxieité : environ 1/2560 (A.S. anti o L.V.C.). Protocole d'immunisation des groupes de rats : chaque animal reçoit 8 injections intrapéritonéales, régulièrement espacécs de 5 jours. Pour chacune des cinq premières injections, chaque animal reçoit 3.106 # @n I.P. associé à 1/6 de ml d'A.S. ou de sérum normal (on abréviation S.H.). Les trois dernières injections sont r@spectivement de : 6.106 # + 1/3 de ml d'A.S. ou de S.@./animal 12.106 # + 2/3 " " " 24.106 # + 4/3 " " " La saignée a lieu 10 jours après la dernière injection par ponction cardiaque et les sérums réunis e@p@ols dans chaque groupe. La mise en contact des cellules avec l'antiserum av@nt l'injection est cenduite de la même manière que dans le cas du systèm@ isogénique. Tous les groupes reçoivent des cellules tuées par congélation-décongélation. Cas où le donneur d'antisérum est le lapin : Animaux immunisés : chaque groupe est constitué par d@ux lapins, mâl@s, fauves de Bourgogne, d'un poids moyen de 3 kg, âgés de 12 à 15 semaines. Antisérum utilisé pour le masquage des sites antigéniques des cellul@s injectées : chacun des antisérums "anti-# N", "anti-# L1210" ou "anti-# L.V.C." est constitué par la réunion des antisérums donnés par deux lapins hyperimmunisés par 8 injections en quantit@ croissante, soit de cellules normales de rate DBA/2 (titre @n cytotoxicité : 1/128e), de cellules de rateL1210 (titre @n cytotoxicité : 1/256e), de cellule de rate L.V.C. (titre en cytotoxicité : 1/256 e). Protocole d'immunisation des groupes de lapins : chaque lapin reçoit 8 injections, regulièrement @spac@es de 5 jours : 5 injections I.-. de 20.106 #, puis 3 injections respectivement de 40, 80 et 160.106 # animal. Dans le cas du sérum normal ou de l'antisérum de lapin anti-cellules normales @BA, 0,3 ml de sérum est associé à 20.106 ; pour les antisérum L1210 et anti-L.V.C., 0,15 ml d'A.S. sont associés à 20.106#. La sai@n@e @ lieu 10 jours après la der@ière injection, par ponction cardiaque. Tous les groupes reçoivent des cellules tué@s par cong@- lation-décongélation. RESULTATS Système allogenique : souris @BA/2 - souris C57Bl/6 Dix huit groupes de souris C57Bl/6, mâles, réparties au hasard sont constitués et immunisés selon le protocole décrit plus haut, avec l'un des six typ@s de cellules suivantes : - cellules de rate DBA/2 normales, vivantes ou tuées - cellules de rate DBA/2 porte@ses, de L 1210, @ivantes ou tu@es, - cellules de rate DBA/2 porteuses de L.V.C. vivantes ou tuées, Chaque type précité de c@llules est injecté à 3 groupes de souris, associé soit à de l'antisérum C57Bl/6 anti #N DBA/2, à du sérum normal C57Bl/6 (témoin) ou à du milieu de tyrode s@ul (témoin). Chaque groupe de souris @ été saigné deux f@is : - une pr@mière saignée, au sinus rétroorbital, après 4 injections (immunisation simpl@), - une seconde saignée, à mort, après 8 injections (hyperimmunisation). A chaque fois le serum d'un groupe de souris est réuni @n "pool" et son activité cytotoxique testée contre des cellules "N", "L1210" et "L.V.C.". Les résultats ainsi obtenus sont consignés dans le tableau I so trouvant on fin de description. Persistance des anticorps injectés : @@ no s@mble pas que les anticorps injectés chez les groupes I, IV, VII, X, XIII et XVI, persistent de façon déc@lable au moment de la saignée, di@ jours après la dernière immunisation puisque le groupe IV donne un sérum dépourvu de tout off@t cytotoxique après hyperimmunisation. Les anticorps décolés dans les groupes I, VII, X, XII et XVI doivent donc être considérés comme produits @ctivement par les animaux. Influence de l'antisérum injecté : La quantité d'antiserum choisie pour "masquer" les sites antigéniques normaux des cellules injectées s'avère suffisante dans le cas de l'immunisation simple (groupes I, IV, VII, X, XIII, XVI) et dans le cas de l'hyperimmunisation (groupe IV) lorsque les cellules injectées sont des cellules normales tuées. Il no semble pas qu'il y ait de différence significative de la répens@ entre les groupes témoins recevant les injections @n milieu de tyrode soul ou en mili@u de tyrode additionne de serum normal de s@uris. Influence de la cong@lation des c@llules : Après 4 injections, le fait que les cellules soi@nt vivantes ne joue aucun rôle dans l'immunisation lorsque l'injection est fait @n milieu de tyrode (@ili@u pauvre) : groupes III t VI, IX et XII, XV et XVIII ou que les c@llules inj@ct@es sont des c@llules normales : groupes II et V. @ar contre, les injections de c@llules viv@n- tes sont plus antig@niques lorsque les c@llules s@nt des c@l- lules l@ucomiques et @u@ l@ mili@@ d'injection conti@nt du sérum de souris normal : groupes VIII et XI, groupes XIV et XVII. On ne note pas de telles diff rences chez les groupes témoins où la quantité de c@llules inject@es est de toute façon suffisa@te pour saturer les possibilites de r@pons@ immunol@gi- que des animaux. Après 8 injections, on constate aussi une r@@ons@ diffé r@nte des groupes I, et IV, VII et X, XIII et XVI. Antigénicité des diff@r@nts types de cellules injectés. Après 4 injections, les c@llules normales se révèl@nt plus antigéniques que les c@llules l@ucémiques L1210 ou L.V.C., toutefois, l'int@nsit@ de la r@@onse sérique ne saurait constituer une mesure précise de cette antig@nicité. Après 8 injections, les groupes témoins (injection en mi li@u de tyrode s@ul ou additionn@ de sérum normal) présent@nt des titres d'activite cytotoxiques du même ordre, correspondant probabl@m@nt a la r@ponse immunolo@ique maxi@@le, physio- logiquement possible dans les conditions de l'exp@rience. Spécificité du "mas@uage immunologique" après hyp@rimmunisation Les résultats obt@ @us chez les groupes ayant re@u des c@llules tuées, seront s@@ls r@t@nus co@@@ si@nific@tifs. Groupes immunisés avec la L1210. Les antisérums des groupes immunisés par des c@llules normales ou des cellules L1210 mon- trent la même efficacité cytotoxique contr@ les cellules normales que contre des c@llules L1210. D'un@ part, les group@s VII et X montrent que l'ad@inistration d'A.S. anti #@@@ prime dans les mêmes prop@rtions la réponse co@tre les antigènes port@s par les cellules normales et c@@x portés par les c@llules L1210. Ces résultats @@ p@rmettent d@nc pas de mettre en @vidence une antigénicité, propre aux cellules L1210, déc@lable sérologique ment. Groupes immunisés avec des cellules L.V.C. Les quatres groupes témoins XIV, XV, XVII et XVIII fourniss@nt des antiserumsd@nt l'activité cytotoxique est s@nsibl@n@@t la même contre des c@l- lules normales que contre des c@llules L.V.C. ; par contre, les groupes XIII et XVI qui ont r@çu de l'antisérum C57Bl/6 anti c@llules no@@ales momtrent une activit@ très @@duite contr@ les c@llules normales. L'activite cytotoxique des groupes XIII et XVI contre les c@llules L.V.C. s@mbl@ à pr@mière vue léger@ment diminu@e par rapport aux groupes témoins : il n'en est rien car une@partie de l'activité des antisérums des groupes t@moins contre les c@llu- les L.V.C. est due à des anticorps dirig@s contre des antigènes portés à la fois par les c@llules normales et L.V.C. et, par conséquent, non specifiques de ces d@r@ièr@s. Ce groupe d'anticorps est très important dans l s antiserums des groupes témoins et semble très faible dans les antisérums des groupes XIII et XVI. Ce groupe d'anticorps s@ra dénommé : "A.C. anti N" et par opposition, le groupe d'anticorps diriges contre des antigènes présents uniquement sur les c@llules L.V.C. sera app@lé : "A.C. anti L.V.C.". Il a sombl important de connaître l'activité cytotoxique du groupe des "A.C. anti L.V.C." dans la m@sure où s@ul ce groupe ne sera pas absorbé par les tissus normaux dans le cas d'une immunothérapie passive d'une l@u@@mie L.V.C. sur DBA/2. L'activité cytotoxique des "A.C. anti N" présentsdans un antisérum p@ut être @esurée directement par dosage contre des c@llules normales qui, par définition, no comportent que des "antigènes normaux". Pour co@@afitre l'activité du groupe des "A.C. anti L.V.C." s@ul, on a procéde à des dosages de l'antisérum sur des c@llu- les L.V.C. après absorption sur des quantités connues de c@llu- les normales DBA/2. Les figures 1 et 2 montr@nt le résultat d'une t@lle expérience. Deux antiserums "C57Bl/6 anti DBA/2 L.V.C." (A.S. N 178) et C57Bl/6 anti (DBA/2 L.V.C. + A.S. C57Bl/6 anti DBA/2) (A.S. N 175) ont été absorbes par des cellules soit DBA/2 L.V.C. soit DBA/2 N, on quantité variable. L'activité cytotoxique diri gée contre des cellules DBA/2 L.V.C. est mesurée après chaque absorption. Deux principales r@marques p@uvent être faites : 1) l'A.S. N 175 est totalement insonsible à l'absorption par des c@llu- les normales alers que l'A.S. N 178 perd 75% de son activité dans les mêmes conditions; 2) il faut @nviren 4 f@is plus de c@llules L.V.C. pour annuler une même activité cytotoxique dans le cas de l'A.S. N 175 que dans c@lui de l'A.S. N 178. Ces deux observations se c@nfirment mutu@ll@ment et conduisent à penser que l'administration passive d'a@tisérum anti c@llules normales p@rm@t d'obtemir, dans le cas de la l@ucémie de Charlotte Friend, des anticorps dirigés presqueuniquement contre les antigènes leucémiques, alors que lors d'une immunisation classique le groupe des "A.C. anti L.V.C." représente@ environ 25% de l'activité cytotoxique. Système hétérologue : souris - rats Huit groupes de 3 rats C.F., répartis au hasard, sont constitués et immunisés selon le protocole décrit plus haut. Chaque groupe reçoit des cellules DBA/2 normales, L1210 ou L.V.C. associées à du sérum de rat anti cellules DBA/2 normales, anti L.V.C. sur DBA/2, ou du sérum de rat normal. Ces differentes associations et les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau II. Groupes immunisés avec des c@llules L 1210 Comme les souris C57Bl/6, les rats C.F. n@ reconnaissent pas d'antigène spécifique à la surface des cellules L1210. L'antisérum fourni par le groupe IV est aussi peu actif contre les c@llules L1210 que contre les c@llules normales. Groupes immunisés avec des c@llules L.V.C. Si l'on compare les antisérums des groupes VI et VII, on voit que l'administration d'antisérum anti L.V.C. déprime fortement la réaction contre les cellules normales et les cellules L.V.C. alors qu l'administration d'antisérum anti-c@llu- les normales déprime plus fortement le réaction contre les cellules normales que contre les c@llules L.V.C.. Il f@ut tout@- fois noter que l'activité anti-c@llules L.V.C. dans l@ sérum du groupe VI, a s@@sibl@ment diminué par r@pport a celle du groupe VIII. Enfin, il est difficile de déterminer la part des anticorps injectés passivement, dans l'activité des antisérums pré levés chez les groupes ayant reçu des anticorps (groupes I, IV et VI) et l'on ne p@ut exclure l'hypothèse qu'une partie de l'activité de ces antisérums contre les cellules normales ne soit due aux anticorps anti-cellules normales injectés passivement. Système hétérologue : souris - lapin Seize lapins sont répartis au hasard @n huit groupes de deux et immunisés selon le protocole décrit plus haut. Chaque groupe reçoit l'un des trois types de c@llules suivant : c@llules normales DBA/2, c@llules L1210, cellules L.V.C. sur DBA/2 associé à l'un des quatre types de sérum de lapin suivants : anti-c@llules DBA/2 normales, anti-c@llu- les L1210, anti-c@llules L.V.C. sur DBA/2 et sérum normal de lapin. Les differentes associations et les résultats obt@nus sont indiqués dans le tableau III. Groupes immunisés avec des cellules L1210 Les sérums du groupe III montrent que l'administration de sérum anti-c@llules normales diminu@ la répons@ contre les cellules normales et contre les c@llules L1210. En outre, que l'antisérum ait été obtenu par inj@ction de c@llules normales (groupe II) ou de cellules L1210 (groupe V) l'officacité cytotoxique est toujours sensiblement double contre des c@llu- les normales que contre des c@llules L1210. Ces deux observations confirmont le fait que les conditions d'expéri@nce ci-dessus no permettent pas de mettr@ on évidence une antigénicité spécifique des cellules L1210. Un fait non expliqué est la très faible efficacite de l'antisérum anti-L1210 à déprimer la ré@onse immunitaire (groupe IV). Groupes immunisés avec des cellules L.V.C. Les résultats obtenus sont directement comparables à ceux obtenus dans le système allogenique. Le groupe IV, qui a reçu du sérum anti-c@llules normales, ne voit pas sa réaction contre les c@llules L.V.C. diminuer par rapport à c@lle du groupe VIII. Par opposition, le groupe VII qui a r@çu du sérum anti L.V.C. voit l'ensomble de sa réponse immunitaire diminuer. Les figures 1 et 2 des dessins anne@@s sont des graphiques dans l@s@uels on a porté en ordonn@es le pourcentage d'activit cytotoxi@u@ perdue après absorption par un nombre accru de c@llules. Le @ombr@ total de c@llules tu@es par le volume absorb d'antis ru@ a la dilution @@tim@l@ @st choisi comme r@@f@rence 100%.En abciss@s, on a port les multiples du nombre @@ cellules tu@es par l'anti@ rum non @bsorb @t utilis@es pour l'absorption. La figur@ 1 @st relative a l'antis@ru@ @ 178 : C57 Bl/6 anti (DBA2 LVC #). Elle indique l'activité cytotoxique dudit antis@rum après absorption par des quantités variables de c@llules normales DBA2 (les v@l@urs correspo@dantes étant représent@@s par des croix) ou de c@llules DBA2LVC (les va l@urs ét@nt représontées par des points). La figure 2 est relative à l'antis@rum N 175 C57 Bl/6 anti (DBA2 LVC #) + AS C57 Bl/6 anti DBA2 normal #). Elle représ@@te l'activité cytotoxique dudit antisérum après absorption par des quantites variables de cellules normales DBA2 (valeurs repr@sent@@s par des croix) ou des cellules DBA2 LVC (valeurs r@pr@sent@es par des points). L'examen compar@tif des deux courbes (figure 1 et figure 2) permet de mettr@ @n @vi@@nce l'activit@ cytotoxique globale des anticorps dirigés contre les @ntigè@@s spécifiques de la leuc@nie de Charlotte Friend. L'@ntisérum 17@ (figure 1) obtenu de façon classi@u@ et servant de t@@oin correspond à l'antiséru@ produit par l@ groupe XVIII du tableau I. Le dosage décrit de cet a@tisérum sur des cellules LVC montre @u'un ml de cet antis ru@ peut tuer 10@,4.106 c@llules leucémiques. Son ahsor@tion totale par des cellules normales DBA2 montre que 25% au maximum de son activité contre les c@llules l@ucémiques de@@ure. L'antisérum 175, obtenu par le procéd, de l'invention conserve 100@ de son activité cytotoxique contre les cellules leucémiques. Ladit@ activité @t@it au d@part de 92,2 x 106 c@llules tu@@s (voir groupe XVI du tableau I). Ces @@s lt@ts montrent que l@ proc@@ de l'invention a permis d'augmenter la t@@@ur @n anticorps @p cifiques par un fact@ur au @oins @@@l à 4. En outre l'antis rum obtenu selon l'invention est très pauvre @n anticorps ré@gissant avec les c@llules normales DBA2. TABLEAU I ACTIVITE CYTOTOXIQUE DE SERUM DE SOURIS C57Bl/6 IMMUNISEES AVEC DES DELLULES DE SOURIS DBA2 LEUCE@I@UES OU NORMALES, MORTES O@ VIVANTES, ASSOCIE@S A DIFFER@@TS SERUMS DE SOU@IS N TYPE DE TYPE DE ACTIVITE CYTOTOXI@UE ACTIVITE CYTOTOXI UE @@RES groupe CELLULES SERUM APRES 4 INJECTIONS # 8 INJECTIONS # INJECTEES C57Bl/6 # N # # L.V.C. # N # # L.V.C. INJECTE DBA2 L 1210 DBA2 DBA2 L 1210 DBA2 I #N anti 0 0 0 20,2x106 16,0x106 10,9x106 vivantes DBA2@ II " s.normal 51,2x106 23,7x106 7,7x106 890,9x106 327,7x106 102,4x106 III " rion 39,7x106 33,3x106 12,8x106 512,0x106 593,9x106 102,4x106 IV tuéos anti DBA2 0 0 0 0 0 0 V " s.normal 25,0x106 23,0x106 7,7x106 512,0x106 337,9x106 102,4x106 VI " rion 17,3x106 14,4x106 4,0x106 409,6x106 276,5x106 28,8x106 VII #N L1210 anti vivant@s DBA2N 0 0 - 16,0x106 16,0x106 VIII " " s.normal 6,4x106 - - 307,2x106 378,9x106 IX " " rion 2,6x106 2,0x106 - 2@6,5x107 614,4x106 TABLEAU I suite ACTIVITE CYTOTOXIQUE DE SERUM DE @@URIS C57Bl/6 I@ UNISEES AVEC DES CELLULES DE SOURIS DBA2 LEUCERIQUES OU NORMALES, MORTES OUVIVA@TES, ASSOCIE@S A DIFFER@@TS SERUMS DE SOURIS N TYPE DE TYPE DE ACTIVITE CYTOTOXIQUE ACTIVITE CYTOTOXIQUE @PRES GROUPE CELLULES SERUM APRES 4 INJECTIONS # 8 INJECTIONS # I@JECTEES C57Bl/6 # N # # L.V.C. # N # # L.V.C. INJECTE DBA2 L1210 DBA2 DBA2 L1210 DBA2 X anti tu@es DBA2N 0 0 - 4,1x106 8,0x106 XI " tuées s;normal 1,6x106 2,2x106 - 716,8x106 1024,0x106 XII " " rien 4,3x106 2,9x106 - 276,5x106 614,4x106 XIII C/LVC anti vivantes DBA2N 0 - 0 5,6x106 - 266,2x106 XIV " s.normal 37,1x106 - 27,5x106 409,6x106 - @09,9x106 XV " s.normal 3,3x106 - 3,0x106 460,8x106 - 230,4x106 XVI " tuées anti 0 - 0 4,6x106 - 92,2x106 DAB2N XVII " " s.normal 3,3x106 - 2,1x106 153,6x106 - 102,4x106 XVIII " " rien 2,6x106 - 2,0x106 153,6x106 - 102,4x106 TABLEAU II Activité cytotoxique de sérum de rats immunisés par des c@llules de souris associées à différents anti-sérums de rats N Type de c@llules Sérum injecté @ctivité cytotoxique # groupe injectées contre des c@l- contr@ des c@l- Contre des cel lules normales lules L1210 lules L.V.C. DBA2 sur DBA2 I normale rat anti #N 3,4 x 106 ### 2,0 x 106 # 1,5 x 106 # II " rat anti # 2,3 x 106 --- 1,4 x 106 L.V.C. III souris normal rat 23,0 x 106 16,0 x 106 35,2 x 106 IV L 1210 rat anti # N 2,1 x 106 2,0 x 106 -- V " souris normal 44,8 x 106 28,2 x 106 -- VI L.V.C. rat anti # N 3,5 x 106 --- 17,9 x 106 VII " rat anti # L.V.C 2,2 x 106 --- 1,6 x 106 VIII " souris normal rat 10,6 x 106 --- 64,0 x 106 # @xprimé on nombr@ de cellules tuées par l ml d' A.S. à la dilution optimale de l'antisérum ## chaque val@ur est la moyenn@ obt@nue après 3 dosagos au moins. TABLEAU III Activité cytotoxique du sérum de lapin après immunisation par des collules de souris ass@ci@es @ différents antisérums de lapins N Type de c@llu- Type de N du Activité cytotoxique # groupe les injectées sérum lapin contre des contre des contre les c@l c@llules c@llules lules L.V.C. DBA2 norma- L1210 sur DBA2 les I normales anti # ler lapin 5.106 # ### 1.106 # 4.106 # normale 2ème lapin 5.106 1.106 5.106 II " sérum normal ler lapin 125.106 64.106 80.106 2ème lapin## --- --- -- III L.1210 anti # ler lapin 7.106 8.106 -- norm@le 2ème lapin## --- --- -- IV " anti # ler lapin 85.106 33.106 -- L 1210 2ème lapin 47.106 24.106 -- V " sérum normal ler lapin 194.106 65.106 -- 2ème lapin 56;;106 29.106 -- TABLEAU III (suite) Activité cytotoxique du sérum de lapin après immunisation par des cellules de souris associ@@s à diff@r@nts antisérums de lapins N Type de c@llu- Type de N du Activité cytotoxique # groupe les inj@ct@es serum la@in inj@cté contre des contre des contre des c@llules c@llules c@llules L.V.C. DBA2 normales L 1210 sur DBA2 VI L.V.C. anti # l@r lapin 5.106 --- 43.106 normale 2ème lapin 9.106 --- 115.106 VII " anti # l@r lapin 6.106 --- 13.106 L.V.C. 2ème lapin 2.106 --- 2.106 VIII " sérum normal l@r lapin 13.106 --- 42.106 2ème lapin 27.106 --- 94.106 # oxprim@ @n nombre de c@llules tirées par ml d'A.S. à la dilution optimale de l'antisérum. ## lapin accidenté pendant l'oxpéri@nce. ### chaque valeur est la moyenne obt@nue après 3 dosages au moins. REVENDICATIONS 1. Procéde pour la production d'anticorps contre un antigène ayant en lui-même une faible action immunogène et qui est s@ul@- ment disponible sous forme d'un mélange antig@nioue dudit antigène avec d'autres substances antigéni@ues présentes en prédominance dans ledit mélange, ledit procédé étant caract@risé en ce qu'on immunise un animal avec ledit mélange antigénique associé à un fort excès d'anticorps dirigés contre lesdites autres substances antigéniques, ce qui permet de recu@illir un antisérum, par les moyens habituels. 2. Procédé selon la revendication 1, caract@ris@ en ce qu'on détermine par des essais préliminaires, le rapport opti@al antigène-anticorps du mélange injecté, en fonction de l'espèce traitée et du m@lange antigènique en cause. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 pour l'obtention d'un antisérum dirigé contre un éventu@l antigène d'affection maligne, tel qu'un antigène leucémique ou de tum@ur caractéris@@n ce qu'on inj@cte à l'animal un mélange de c@llules malignes, en particulier de c@llules l@ucémiques, et d'antisérum anticellules normales. 4. Procedé selon la revendication 3 caract@risé @@ ce qu'on injecte @ un animal d'une lignés donnée des c@llules l@uc@mi@ues provenant d'une autre lignée ou d'une autre espèce, associées à une quantit@ connue d'antisérum produit dans la même ligné@ que l'animal r@c@veur et dirigé contre les c@llules normales de la lignée ayant fourni les cellules leucémiques. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'on immunise un animal vis-à-vis d'une l@ucémie faiblement antigénique. 6. Procédé s@lon la révendication 1 pour l'obtention d'un sérum antilymphocytaire utilisable comme immunodépresseur, caracterisé en ce qu'on immunise un animal, tel qu'un cheval, avec un mélange de lymphocytes et d'anticorps dudit animal dirigés centre les antigènes port@s par d'autres organes humains que les lymphocytes, tels que les globules rouges humains normaux. 7. Antiséra suscoptibles d'être obt@nus par le procédé s@lon l'une quelconque des reverdications 1 à 5, @n particulier des antisera dirigés contre des antigènes leucémiques. 8 . Serum antilymphocytaire susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 6.