Brevet FR2070858A1 — publié le 19710917

La présente invention a trait à lue préparation-test et à un procédé pour la nise en évidence et la détermination de catéchols dans des liquides aqueux. La mise en évidence précise et la détermination de catéchols dans des humeurs, par exemple dans l'urine, le sérum etc, ont une grande importance pour le contrôle e t la mise en valeur du traitement thérapeutique de maladies avec des composés qui sont des catéchols ou qui peuvent otre métabolisés en catéchols. Lorsqu'on utilise, par exemple, la L-dopa pour le traitement du parkinsomisme on a avantage à surveiller ce traitement par détermination des catéchols dans l'urine, pour être certain que le dosage est respecté. D'autre part, on peut faciliter la fixation du dosage et l'utilisation du médicament par le malade par détermination sel quantitative de catéchols dans l'urine. Les hôpitaux et les méde- cins peuvent aussi avoir avantage à faire des analyses routinières des humeurs du corps pour déterminer les catéchols afin de se rendre compte si un malade å -oris un médicament contenant un catéchol ou étant métabolisé en catéchols.D'autre part, on a proposé d'utiliser l'élévation des valeurs normales de la sécrétion de dopamine (une catécholamine) comme indicateur pour la présence de mélanomes et d'autres néoplasmes de la crête ganglionnaire céphalique. Ainsi l'observation d'une concentration accrue de catéchol dans les humeurs peut servir de signal pour d'éventuelles affections malignes de la médullosurrénale. Lorsqu'on administre la m-dopa à des malades atteints de ,ar- kinsonisme, on retrouve dans l'urine un peu de L-dopa inchangée en meme temps que la dopamine, l'acide o-dihydroxyphénylacétique (DOPAC), l'acide dihydroxy-mandélique (DOMAC), la norépinxéphrine, l'épinéphrine, la normetanéphrine, la métanéphrine, l'acide vanillinemandélique et l'acide hoinovanillicue. Parmi ces composés, ia L-dopa, la dopamine, DOPAC, DOMAC, la norépinéphrine et l'épinéphrine, sont des catéchols, c'est-à-dire des composés avec un radical o-dihydroxy- phényle. Des procédés connus pour la mise en évidence et la détermination de catéchols ne se sont pas montrés entièrement satisfaisants étant donné qu'ils ne sont pas utilisables pour des tests commodes et simples, du fait qu'ils nécessitent des opérations d'adsorption, d'extraction ou des mesures de la fluorescence Les méthodes de tests colorimétriques connus ou bion ne perme-ttent pas de différentiation satisfaisante entre les catéchols et les autres composés présents dans les h humeurs, ou bien elles sont compliquées et non reproductibles.Parmi les méthodes de tests colorimétriques connus pour les catéchols, la méthode dans laquelle on emploie un sel ferreux hydrosoluble dans une solution tampon, permet la meilleure différentiation; cependant, cette méthode de test n'est pas satisfaisante, parce que, du fait @ de de son insta- bilité se matérialisant par un changement de couleur prématuré pendant le stockage, elle n'est pas applicable à des supports en matière absorbante. Les critères pour une méthode de test simple sont ainsi une mise en oeuvre commode, une bomie possibilité de différentiation, la possibilité d'obtenir des résultats rapidement reproductibJes et une préparation simple et commode sous forme stable et durable pour le stockage. On a maintenant trouvé que la stabilité et l'utilité pratique des compositions pour tests color:imétriques pour des catéchois contenant une solution de sels ferreux tamponnée, peuvent être nettement améliorées par l'utilisation d'une alcanolamine comme tampon, De cette manière il est possible de préparer la préparation-test, d'imprégner avec celle-ci un support en matière absorbante et de dessécher le support ainsi imprégné, après quoi celui-ci reste stable pendant des durées de stockage longues précédent l'utilisation, par exemple pendant 6 à 9 mois. D'autre part, on peut stocker la préparation- test après la préparation et avant l'imprégnation de la matière absorbante pendant plus de 3 mois. On peut préparer la préparation test de la présente invention, en mélangeant une solution contenant un composé ferreux hydrosoluble, avec une solution aqueuse du tampon d'alcanolamine à un pH entre environ 8,0 et 8,5. Ensuite on peut imprégner et dessécher un support en matière as- sortante avec la préparation-test ainsi préparée, après quoi on peut effectuer le test désiré. On peut effectuer le test comme suit: ou bien on plonge le support imprégné avec la préparation-test et desséché dans l'échantil- lon, ou bien on place une goutte de l'échantillon sur le support imprégné avec la préparaticn-test et desséché. La présence de catéchols est mise en évidence par la formation rapide d'uns coloration rougeâtre jusqu'à co@leur de lavande, L'expression "catéchol" a trait à des combosés contonant un gro dihydroxyphényle, dans lequel les groupes hydroxy se trouvent en position ortho l'un par rapport à l'autre. comme matières absorbantes appropriées à l'utilisation comme supports de la préparation-test, on peut employer une substance capable, du ait de la capillarit6, de tirer un liquide vers le haut. Comme support approprié, on peut eiter, par exemple, du papier filtre, du feutre, des bandes absorbantes de céramique, des fibres de verre tissées et des paillassons de verre etc. La matière absorbante est généralement découpée en bandes étroites après l'imprégnation avec les réactifs pour faciliter l'empaquetage en pétltes bouteilles ou en d'autres récipients. Une prépation typique selon la présente invention contient environ.1,9 à environ 4 g de sulfate ferreux heptakydraté pour lOJ rnd d'eau contenant une quantité d'acide suffisante pour éviter la formation de sels ferreux basiques, d'autrepart une quantité suffisante d'un agent anti-oxydant ou d'un stabilisateur, pour éviter l'oxyda- tion des ions ferreux, et environ 5 à 25 parties en volume d'un tampon d'alcanolamine par partie en volume de la solution contenant le sulfate ferreux. L'acide utilisé est avantageusement un acide inorganique fort, tel que, par exemple, un acide halogènehydrique, par exemple l'acide chlorhydrique ou l'acide bromhydrique. On utilise avantageusement l'acide chlorhydrique.La quaiiM:té del'acide n1 est pas critique; habituellement on emploie environ 1 del'acide d'un acide ml pour 1,5 g de sulfate ferreux heptahyaraté. Comme antioxydant ou comme stabiliseur , on utilise avantagea- sement du bisulfite de sodium; on peut aussi utiliser d'autres composés à activité analogue, telle que, par exemple, le bisulfite de potassium, l'acide ascorbique, le thioglycolate de sodium, lN de sodium etc comme agents anti-oxydants. On utilise l'hydrosulfite environ 0,4 à environ 60 mg d'agent antioxydant pour 10 ml de préparation-test- Pour complexer les ions ferreux, on ajoute un complexifiant. Comme complexifiants appropriés, on peut citer des sels de métal alcalin d'hydroxyacides organiques. On utilise de préIérence des citrates de métal alcalin, par exemple le citrate de sodium. En général on nécessite environ 1 g de citrate pour 3 g de sulfate ferreux heptahydraté. L'utilisation selon l'invention d'un tampon d'aleanolamine a pour consequence qu'on obtient une préparation-test stable avec laquelle on peut effectuer des réac-tions colorées reproductibles. Comte tannons qui se sont montrés appropriés pour le présent but, on peut citer des alcanolamines inférieures et des alcane inférieur-diolamines dans lesquelles 1; groupes alcoyle inférieurs contiennent 1 à 6 atones de carbone. Comme représentants typiques de ces substances, on peut citer le tris-(hydroxyméthyl)aminométhane, le 2-amino -2-méthyl-l- propanol; le 2-amino-2-méthyl-1,3-propandiol et l'éthanolamine, le tris-(hydroxyméthyl)aminométhane étant préféré. Le tampon est fixé à un pH entre 8,0 et 8,5, avantageusement 8,2 et 8,3 par addition d'un acide à 2-a solution aqueuse du tampon On utilise avantageusement le même acide présent dans la solution de sel ferreux. Comme tarnoon on utilise avantageusement un tampon de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 2M ou 3H. Comme sels ferreux hydrosolubles appropriés pour le présent but, on peut citer des sels ferreux inorganiques dont la couleur et les réactions chimiques ne gênent pas, par exemple le bromure ferreux, le chlorure ferreux, le nitrate ferreux, le sulfate ferreux etc. On utilise de préférence du suLfate ferreux heptahydraté. La. solution du tampon et la solution de sulfate sont mélangées de telle façon que pour une partie en volume de solution de sulfate, on utilise environ 5 à 25 parties en volume de- solutions de tampon0 Cette proportion peut être variée selon la quantité de catéchols présents dans le liquide du test. le support absorbant est imprégné avec la solution du test, puis desséché. la quantité de la composition du test sur le support n'est pas critique tant qu'une quantité suffisante est présente pour assurer une réaction colorée visible. Le support imprégné est alors plongé dans l'échantillon ou une petite goutte de l'échantillon est placée sur le support imprégné. lorsque la coloration du support imprégné présente une teinte rougeâtre jusqutà couleur de lavande, alors les catécnols sont présents. La réaction est instantanée et la coloration peut êtrediscernée dans l'espace d'environ 30 secondes à 1 minute. Exemple 1 Une première solution est préparée comme snit: On ajoute 5 g de bisulfite de sodium à uno solution de 7,5 g de sulfate ferreux heptahydraté dans onviron 400 ml d'eau contenant 5 ml d'HCL l N. Ensuite on dissout 2,5 g de citrate de sodium dans la solution ainsi obtenue. La solution est enxuite amenée avec de l'eau à un volume de 1 litre. Une deuxième solution est préperée comme suit: Une solution de 242,2 g de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane dans 900 ml d'eau distillée est amenée à un pH de 8,2 à 8,3 avec HCl. 6H et diluée avec 1 litre d'eau distillée. On mélange une partie en volume de la première solution avec 10 parties en volume de la deuxième solution. Avec le mélange obtenu des solutiens, on imprègne des feuilles de papier pour chrometographie Whatman No. 3, puis on dessèche à l'air. Les feuilles sont ensuite découpées en bandes de 0,62 x 5,1 cm. Le test est effectué comme suit: on plonge 1/4 à 1/3 de la bande tectée dans l'échantillon, on sort de nouveau la bande de l'échantillon et on obsorve la coloration de la bende après une durée allant environ jusqu'à 60 secondes. Par comparaison de la coloration avec un standard, on peut effectuer une détermination semi-quantitative tes catéchols. Exemple 2 On prépare une première solution comme décrit dans l'exemple 1. La deuxième solution est préparée comme suit: On amène une solution de 178 g de 2-amino-2-méthyl-l-propanol dans 900 ml d'eau diotillée avec HCl 6N à un pH de 8,2 - 8,3, et on dilue la solution ainsi obtenue avec de l'eau distillée jusqu'à un volute de 1 litre. Une partie en volume de la première soluti on est mélangée avec 10 parties en volume de la deuxième solution. On.prépare des bandes de contrôle comme décrit dans l'exemple t et effectue des tests, également comme décrit dans l'exemple 1. Exemple 3 La première solution est préparée selon les données de l'exemple 1. La deuxième solution est obtenue comme suit: on amène une solu- tion de 312 g de 2-amino-2-méthyl-l,3-propanediol dans 900 rnl d'eau distillée avec HCl 6N à un pH entre 8,2 et 8,3, puis on dilue avec de l'eau distillée à 1 litre. On mélange une partie en volume de la première solution avec 10 parties en volume de la deuxième solution. On prépare deF bandes de test et on effectue des tests comme décrit dans l'exemple 1. Exemple 4 La première solution est préparée selon les données de l'exemple 1. La deuxième solution est obtenue comme suit: on amène une solution de 122 g d'éthanolamine dans 900 ml d'eau distillée avec HCl 6N à un.pH entre 8,2 et 8,3 et on dilue ensuite avec de l'eau distillée à un volume de 1 litre. On mélange une partie en volume de la première solution avec 10 parties en volume de la deuxième solution, La préparation de bandes de test et la réalisation des tests se font comme décrit dans l'exemple 1. Rovendiestions 1. Préparation-test pour la détermination de catéchols, caractérisée en ce'qu'elle contient un sel ferreur hydrosoluble bans une solution aqueuse acide, un complexifiant peur les Ions terreux, un antioxydant et un tampon consistant en une alcanol inférieur-amine ou une alcane inférieur-diolamine à un pH entre 8,0 et 8,5. 2. Agent diagnostique pour la détermination de catéchols, con- slstant en une bande d1une matière absorbante imprégnée avec une préparation-test selon la revendication 1. 3. Préparation-test et agent diagnostique selon l'une des re vendîcations 1 et 2, caractérisée en ce que le tampon est le tris (hydroxyméthyl)aminoéthane. 4. Préparation-test et agent diagnostique selon l'une des revendicationsl, 2 et 3, caractérisée en ce que le complexifiant est le citrate de sodium et l'antioxydant et le bisulfite de sodium. 5. Préparation-test et agent diagnostique suivant l'une dos revendications 1 à 4, caractériseo en ce que le sol ferreux hydrosoluble est le sulfate ferreux heptahydraté. 6. Préparation suivant l'une des revendicatione 1 à 5, caractérisée en ce que la solution contient un mélange d'environ 5 à 25 parties en volume d'une solution contenant le tris-(hydroxy méthyl)-aminnométhane au p11 8,0 - 8,5 pour une partie en volume d'une solution contenant environ 1,9 à environ 4 g de sulfate ferreux heptahydraté pour 100 ml d'eau, environ l ml d'acide chlorhydrique lN pour 1,5 g de sulfate ferreux heptahydraté, environ 0,4 à environ 60 mg de bisulfite de sodium pour 10 ml de préparation test et environ 1 g d'un citrate de métal alcalin pour 3 g de sulfate ferreux heptahydraté. 7. Procédé pour la préparation d'une préparation test et d'un agent diagnostique suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on réalise un mélange avec vn sel ferreux hydro- soluble en solution aqueuse acide, un complexifiant pour les ions ferreux, un agent antioxydant et un tampon consistant en une alcanol inférieur-amine ou une alcane inférieur-diolamine au p11 8,0 - 8,5, et en ce qu'on imprègne une bande d'une matière absorbante avec le mélange ainsi préparé de manière à former l'agent diagnostique. 8. Procédé pour la détermination de catéchols dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'on amène l'échantillon liquide en contact avec un agent diagnostique suivant l'une des revendications 2 à 6. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise comme échantillon liquide de l'urine humaine. 10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que les catéchols à déterminer sont la T-dopa ou ses métabolites de catéchols. 11. Procédé pour la détermination semi-quantitative de caté chols dans les échantillons liquides, caractérisé en ce qu'on amène un agent diagnostique suivant l'une des revendications 2 à 6 en contact avec l'échantillon et en ce qu'on détermine l'intensité de la couleur ainsi produite.