Brevet FR2108094A1 — publié le 19720512

La présente invention concerne des substances anti-tumeur, et plus spécialement des substances anti-tumeur insolubles dans l'eau préparées à partir de cellules lysées de streptocoques hémolytiquef ainsi que leur préparation. 5 Les cellules vivantes de streptocoques hémolytiques ont une re marquable action destructrice des cellules des tumeurs. Il est indiqué, dans le brevet japonais îj° 6690/1968, qu'on obtient une préparation anti-tumeur utilisable (désignée par PCB-45) en faisant incuber les cellules de streptocoques hémolytiques en suspension dans un mi -10 lieu basai de Bernheimer (désigné ci-après par BBM) contenant une pénicilline à une concentration relativement grande à une température d'environ 37°C pendant environ 20 minutes, puis en soumettant les cellules en suspension à un traitement thermique à 45 °C environ pendant 30 minutes environ de façon à réduire la toxicité et à augmenter 15 considérablement l'activité sur les cellules des tumeurs. Le brevet britannique N° 1 153 113 indique qu'on obtient le même résultat par les mêmes modes opératoires mais en utilisant la céphalosporine C ou la cyclosérine à la place de la pénicilline. La substance anti-tumeur préparée en utilisant la céphalosporine C est désignée ci-après par 20 CEB-45 et celle qui est préparée avec la cyclosérine est désignée par CYB-45. Bien que les préparations obtenues par ces procédés soient supérieures, quant à leur activité anti-tumeur, elles ne sont pas avantageuses du point de vue de la forme de préparation. C'est-à-dire 25 qu'elles présentent des inconvénients en ce sens qu'elles provoquent une inflammation et une fièvre temporaire chez le malade ainsi qu'une certaine douleur au site d'administration. Ces inconvénients proviennent d'un composant que contiennent les cellules, en particulier le cytoplasme et la membrane des cellules. 30 L'autre part, il a été mentionné un grand nombre de procédés permettant d'obtenir des préparations contenant des substances antitumeur sous forme d'une fraction hydrosoluble provenant des cellules de streptocoques hémolytiques. On sait qu'on obtient une telle préparation en extrayant des cellules avec de l'eau ou une solution 35 aqueuse d'un sel minéral, et en ajoutant un solvant organique à l'extrait afin de précipiter les substances anti-tumeur (brevet japonais I\° 1647/1963), en lysant les cellules avec une enzyme lytique comme la lysozyme, la cellulase ou la protéase et en recueillant la frac- COPY 2 71 34773 2108094 tion hydrosoluble comme composant actif (brevet britannique 1163865), et en relargant l'extrait avec du sulfate d'ammonium pour obtenir une fraction active sous forme de précipité (compte-rendu oral d'octobre 1969, 28ème Congrès de la "Japan Cancer Society"). 5 Toutes les préparations anti-tumeur obtenues suivant les procé dés ci-dessus proviennent de fractions hydrosolubles des cellules de Streptococci, et leur activité anti-tumeur n'est pas suffisante en comparaison de celle de PCB-45 qui est une préparation de cellules de streptocoques. De plus, ces préparations contiennent également de 10 nombreux composants autres que les substances anti-tumeur qui peuvent provoquer une inflammation, de la fièvre ou de la douleur. La présente invention se propose de fournir un nouveau type de préparation anti-tumeur insoluble dans l'eau. la présente invention a encore pour but de fournir une prépara-15 tion anti-tumeur qui est insoluble dans l'eau mais qui ne provoque ni inflammation, ni fièvre, ni douleur, tout en maintenant une bonne action destructrice sur les cellules de tumeurs. Suivant l'invention, et d'après des études poussées effectuées par la Demanderesse, on obtient une préparation anti-tumeur ne pré-20 sentant pas les inconvénients énumérés ci-dessus en lysant des cellules de streptocoques hémolytiques à l'aide d'une enzyme lytique, et en recueillant du lysat une fraction insoluble dans l'eau. Ainsi, la fraction insoluble dans l'eau est constituée par la membrane du pro-toplaste d'un streptocoque hémolytique. 25 La présente invention sera expliquée ci-après plus en détail. Les streptocoques hémolytiques utilisables dans l'invention sont quelconques pour autant que leurs cellules aient une activité anti-tumeur, bien que la présente invention soit expliquée ici dans le cas de 1' utilisation de souches de Streptococcus hemolyticus telles que Strep-30 tococcus hemolyticus Su (ATCC ïï° 21060), Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC N° 21059), Streptococcus hemolyticus C203S (ATCC W° 21546), Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC ïï° 21547) et Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC ïï° 21548). La culture des streptocoques hémolytiques est effectuée par des procédés classiques dans un milieu tel 35 qu'un bouillon d'infusion de viande et un milieu d'extrait de levure. Les cellules vivantes en culture sont recueillies et lavées habituellement avec une solution saline physiologique ou une solution tampon appropriée. 71 34773 3 2108094 Comme enzyme lytique utilisée dans la présente invention, on envisage celles produites par des bactéries et des actinomycètes, ou préparées à partir du lysat de streptocoques infectés par des bacté-riophages. Par exemple, il est recommandé d'utiliser les enzymes 5 suivantes: (1) l'enzyme lytique préparée à partir du lysat du Streptococcus sp. Groupe C (ATCC M"0 21597) infecté par le Bactériophage ATCC N° 21597. (2) l'enzyme L-11 produite par Flavobacterium sp. (ATCC IT°21044). 10 (3) une enzyme lytique produite par Streptomyces albus IFO 3422 (ATCC ÏT° 3381 ). (4) une enzyme lytique produite par Streptomyces rutgersensis IAM 0085 (ATCC N° 3350)! (5) une enzyme lytique produite par Streptomyces griseus. 15 la préparation des enzymes lytiques a déjà été décrite dans la littérature. Par exemple, on peut préparer une enzyme lytique à partir du lysat de bactéries infectées par des bactériophages selon un procédé décrit dans le Journal of Biochemistry, Volume 57, page 67' (1965). Une enzyme lytique peut être préparée à partir du bouillon 20 de culture d'un microorganisme selon un procédé décrit dans Biochemistry, volume 5, page 2764 (1966). Lorsque l'enzyme contient une protéase qui pourrait avoir un effet nuisible sur l'activité anti-tumeur, il est préférable de la purifier pour la débarrasser de la protéase avant utilisation. 25 Le traitement lytique des cellules de streptocoques hémolytiques par l'enzyme est effectué dans un milieu dans lequel les cellules sont en suspension. Comme milieu, on peut utiliser une solution hy-pertonique de citrate de sodium, de succinate de sodium ou de saccharose, bien qu'on puisse également utiliser une solution saline com-30 prenant une autre solution tampon convenable. Le pH du milieu peut varier suivant l'enzyme utilisée, et il est de préférence compris entre 6 et 8", en particulier pour maintenir les substances anti-tu-meur stables durant le traitement. La température et la durée varient également suivant le type d'enzyme utilisée, mais elles sont généra-35 lement comprises entre 10 et 40°C pour la température et entre 10 et 120 minutes pour la durée, de préférence entre 10° et 30°C et 10 et 60 minutes respectivement, en particulier pour empêcher la réduction de l'activité des substances actives. 71 34773 4 2108094 A la fin de la lyse, les substances actives sont séparées sous forme d'une matière insoluble dans l'eau provenant du lysat, par exemple par centrifugation, puis lavées avec un liquide convenable comme line solution saline physiologique, une solution tampon appro-5 priée ou de l'eau distillée. les substances anti-tumeur ainsi obtenues se sont révélé être la fraction de la membrane du protoplaste, qui résiste à la lyse, de streptocoques hémolytiques, à la suite d'un examen au microscope électronique avec un grossissement de 60 000. La fraction ne contient 10 ni paroi de cellule ni cytoplasme dans lesquels sont renfermées les substances provoquant des effets secondaires, et ne présente aucun inconvénient tel qu'une inflammation, de la fièvre et de la douleur, que l'on rencontre dans la technique antérieure. Son activité antitumeur est très supérieure à celle des substances actives hydrosolu-15 bles dans la préparation de la technique antérieure. Les propriétés et l'activité des substances seront démontrées dans les exemples et essais de la présente demande. La fraction anti-tumeur ainsi obtenue est administrée sous la forme d'une suspension dans un milieu convenable acceptable du point 20 de vue physiologique comme le milieu basai de Bernheimer et line solution saline physiologique. Etant donné que la fraction active est relativement instable à l'état de suspension même lorsqu'elle est conservée dans un réfrigérateur, elle est soumise à une lyophilisation pour former une prépa-25 ration anhydre. Sa suspension dans le milieu ci-dessus est de préférence soumise à une lyophilisation de façon à obtenir une préparation qui peut être facilement utilisée en ajoutant la quantité nécessaire d'eau distillée. On peut obtenir une préparation anhydre plus stable par lyophilisation d'une suspension contenant un amino-acide 30 ou un sucre comme stabilisant à raison de 1 à 50 fois le poids à sec de la fraction active. Comme amino-acide, on peut envisager l'alanine, l'acide aspartique, la citrulline, la cystéine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, 1'hydroxyproline, 1'isoleucine, la leucine, l'ornithine, la proline, la sérine, la thréonine, la valine, etc.. 35 Comme sucre, on peut envisager le saccharose, le raffinose, le lactose, le dextrane, l'amidon soluble, etc. Les exemples suivants illustrent la présente invention. Sauf in-dicatijn^contraire, les pourcentages indiqués sont exprimés en poids 71 34773 5 2108094 l'abréviation "BBM" utilisée ici désigne le milieu basai de Bernheimer dont la composition est: 675 mg de maltose, 6 ml de solution aqueuse à 20 fo de phosphate monopotassique dont le pH est ajusté à 6,9 à 7,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium, 12 ml d'une solution 5 aqueuse à 2 % de sulfate de magnésium heptahydraté et 66 ml d'eau distillée. Exemple 1 On procède à la culture de la souche Streptococcus hemolyticus Su (ATCC ïT° 21060, souche presque avirulente) dans un bouillon d'in-10 fusion de viande à 37°C pendant 24 heures. On inocule 100 ml de la culture dans 2 litres d'un milieu à base d'extrait de levure à 5 f° que l'on a préparé en dissolvant 100 g d'un extrait de levure (vendu par Ebios Yakuhin Co., Ltd) dans 1,5 litre d'eau distillée, en ajustant le pH de la solution à 7,4 à l'aide d'une solution d'hydroxyde 15 de sodium, en chauffant à 100°C pendant 60 minutes et en refroidissant, en filtrant la solution refroidie, en ajoutant de l'eau au filtrat pour compléter jusqu'à 2 litres, et en stérilisant pendant 10 minutes dans de la vapeur d'eau sous 1 kg/cm2, et on effectue la culture à 37°C pendant 20 heures. On refroidit le bouillon résultant 20 avec de la glace et le centrifuge pour obtenir les cellules, que l'on lave à deux reprises avec une solution saline physiologique froide. On met les cellules lavées en suspension dans du BBM et on ajuste l'absorbance à 8,00 à 660 millimicrons. L'absorbance montre que la suspension contient 5 mg des cellules, exprimé en poids d'extrait 25 sec de cellules dans 95- ml de la suspension. On centrifuge 20 ml de la suspension des cellules tout en refroidissant et on met les cellules séparées en suspension dans 20 ml d'une solution aqueuse 0,5 M de citrate de sodium préparée par mélange de 5 parties en volume d' une solution aqueuse 1 M, 1 partie en volume de solution tampon 0,2 M 30 en phosphate (pH 7,2), 1 partie en volume de solution aqueuse a 2 % de thioglycocate de sodium et 3 parties en volume d'eau distillée. On ajoute à la suspension 80 mg d'une enzyme lytique préparée à partir du lysat de Streptococcus sp. Groupe C ATCC U° 21597 infecté par le Bactériophage ATCC ïï° 21597-b, selon le procédé décrit dans le 35 Journal of Biochemistry, volume 57, page 67 (1965). On maintient la suspension à 25°C pendant 30 minutes, on la refroidit à là glace et la soumet à une centrifugation à 10 000 g pendant 30 minutes pour séparer les précipités. On lave les précipités à deux reprises avec 71 34773 6 2108094 une solution saline froide et les met en suspension dans 20 ml de BBM contenant le sel potassique de pénicilline G à une concentration de 27 000 unités internationales (ïïl)/ml. la préparation anti-tumeur ainsi obtenue contient des substances actives insolubles ayant une 5 absorbance de 0,88 à 660 millimicrons. Exemple 2 On répète l'Exemple 1 mis à part que l'on remplace la souche Streptococcus hemolyticus Su par la souche Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC N° 21059) et on obtient une préparation anti-tumeur conte-10 nant des substances actives ayant une absorbance de 0,90 à 660 millimicrons . Exemple 3 On répète l'Exemple 1, excepté que l'on remplace la souche Streptococcus hemolyticus Su par la souche Streptococcus hemolyticus 15 C203S (ATCC K° 21546), et on obtient une préparation anti-tumeur ayant une absorbance de 0,96 à 660 millimicrons. Exemple 4 On répète l'Exemple 1, excepté que l'on utilise la souche Streptococcus hemolyticus S-43. (ATCC ÏT° 21547) comme streptocoques 20 hémolytiques et on obtient une préparation anti-tumeur ayant une absorbance de 0,92 à 660 millimicrons. Exemple 5 On répète l'Exemple 1 excepté qu'on utilise la souche Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC N° 21548) comme streptocoques hé-25 molytiques, et on obtient une préparation anti-tumeur ayant une absorbance de 0,95 à 660 millimicrons. Exemple 6 On prépare une culture de cellules de Streptococcus hemolyticus Su (ATCC N° 21060, souche presque avirulente) de la même manière que 30 celle décrite dans l'Exemple 1. On met les cellules en suspension dans du BBM et on règle l'absorbance à 9,20 à 660 millimicrons, ce qui correspond à une concentration en cellules anhydres de 6 mg/ml. On ajoute 40 ml de la suspension à 8 ml d'une solution saline physiologique contenant du sel potassique de pénicilline G à une concentra-35 tion de 1,6 x 10^ ui/ml, et on fait incuber à 37°C pendant 20 minutes. Ensuite, on soumet la suspension à un traitement thermique à 45°C pendant, 30 minutes et on refroidit immédiatement. La suspension résultante correspond à PCBr45 indiqué précédemment. Le PCB-45 con 71 34773 7 2108094 tient 5 mg/ml de cellules de streptocoques (cellules anhydres) (absorbance : 8,00 à 660 millimicrons. les cellules sont séparées de 20 ml de la suspension par cen-trifugation, et mises en suspension dans 20 ml de solution de citra-5 te de sodium à 0,5 M. A la suspension résultante, on ajoute 80 mg d' une enzyme lytique obtenue à partir du lysat de Streptococcus sp. Groupe C ATCC N° 21597 infecté par le Bactériophage ATCC ÏT° 21596-b. On maintient la suspension à 25°C pendant 30 minutes, on la refroidit avec de la glace et la soumet à une centrifugation pour séparer les 10 précipités, les précipités sont ensuite soumis aux mêmes opérations qu'à l'Exemple 1. On obtient une préparation anti-tumeur ayant une absorbance de 1,20 à 660 millimicrons. Exemple 7 A 20 ml de PCB-45 préparé à l'Exémple 6, on ajoute 80 mg d'une 15 enzyme lytique obtenue à partir d'un lysat de Streptococcus sp. •Groupe C ATCC N° 21597 infecté par le Bactériophage ATCC ÎT° 21597-b. On obtient une préparation anti-tumeur ayant une absorbance de 0,98 à 660 millimicrons par les mêmes opérations ultérieures qu'à l'Exemple 1 . 20 Exemple 8 On soumet à la centrifugation 20 ml de PCB-45 préparé comme à l'Exemple 6. On met les cellules séparées en suspension dans 20 ml de solution aqueuse 0,5 M de citrate de sodium. On ajoute la suspension à 160 mg d'une enzyme lytique partiellement purifiée obtenue à 25 partir d'un bouillon de culture de Streptomyces albus IFO 3422 (ATCC 3381) (la peptidase a été retirée suivant un procédé décrit dans Biochemistry, volume 5, page 2764 (1964)., et on la maintient à 37°C pendant 40 minutes, la refroidit à la glace et la soumet à une centrifugation pour séparer les précipités. 30 On obtient une préparation anti-tumeur ayant une absorbance de 1,05 à 660 millimicrons en traitant les précipités comme à l'Exemple 1 . Exemple 9 A la préparation anti-tumeur obtenue à l'Exemple 1, on ajoute 35 un volume égal de solution aqueuse à 1 fo&e DL-méthonine, et on introduit dans des ampoules 2 ml du mélange. On refroidit les ampoules jusqu'à -30°C pendant 2 heures, puis les soumet à la lyophilisation sous pression réduite de 0,01 mm de mercure pendant 20 heures tout 71 34773 2108094 en maintenant la température du contenu de façon qu'elle ne dépasse pas 20°C. Après séchage, on ferme hermétiquement les ampoules immédiatement après avoir ramené la pression à la pression atmosphérique avec de l'air séché. On obtient ainsi une préparation anti-tumeur 5 anhydre. Exemple 10 Le précipité obtenu par les mêmes opérations qu'à l'Exemple 6 est mis en suspension dans 20 ml de BBM ne contenant pas de pénicilline. On ajoute à la suspension obtenue un volume égal de solution 10 aqueuse à 1 fa de DL-méthonine, et la soumet à une lyophilisation suivant les mêmes opérations qu'à l'Exemple 9 pour obtenir une préparation anti-tumeur anhydre. Exemple 11 On répète l'Exemple 10 excepté qu'on utilise la L-arginine à 1 5 la place de la DL-méthionine. On obtient une préparation anti-tumeur anhydre. Exemple 12 On répète l'Exemple 10 excepté qu'on utilise le saccharose à la place de la DL-méthionine, et on obtient une préparation anti-tumeur 20 anhydre. Dans le "but de comparer l'activité anti-tumeur de la préparation suivant la présente invention ainsi que l'inflammation et la douleur qu'elle occasionne à celles des préparations selon la technique antérieure, on effectue, dans les exemples témoins suivants, 25 des préparations selon la technique antérieure. Exemple témoin 1 On met en suspension des cellules de souche de Streptococcus hemolyticus Su (ATCC N° 21060) dans du BBM contenant du sel potassique de pénicilline G- à une concentration de 27 000 Ul/ml. On laisse 30 incuber la suspension à 37°C pendant 20 minutes, puis on la soumet à un traitement thermique à 45°C pendant 30 minutes. Le PCB-45 ainsi obtenu a une absorbance de 8,00 à 660 millimicrons (voir Exemple 6). Exemple témoin 2 On répète l'Exemple témoin 1 excepté qu'on utilise la céphalo-35 sporine C ( céphaloridine) à la place de la pénicilline. Le CEB-45 ainsi obtenu a une absorbance de 8,00 à 660 millimicrons. Exemple témoin 3 On répète l'Exemple témoin 1 excepté qu'on utilise la cyclosé- 71 34773 9 2108094 rine à la place de la pénicilline. Le CYB-45 ainsi obtenu a une absorbance de 8,00 à 660 millimicrons. Exemple témoin 4 On broie des cellules de souche Streptococcus hemolyticus Su 5 (ATCC K° 21060) à l'aide d'un moteur avec de la poudre d'alumine, et on extrait avec une solution tampon au phosphate (pH 7,2). On ajoute lentement de l'acétone froide à l'extrait pour obtenir des précipités. On obtient une préparation anti-tumeur en dissolvant les précipités séchés dans de l'eau distillée. 10 Exemple témoin 5 On obtient une préparation anti-tumeur en recueillant le liquide surnageant du lysat de la souche de Streptococcus hemolyticus Su (ATCC K° 21060) selon le mode opératoire décrit à l'Exemple 1. Exemple témoin 6 15 On met en suspension dans l'eau distillée des cellules de sou che Streptococcus hemolyticus Su (ATCC ÏT° 21060) et on les broie à l'aide de poudre de verre dans un homogénéiseur de cellules Braun (Braun Co., Allemagne). On recueille le liquide surnageant par centrifugation du mélange résultant et le dialyse dans un manchon en 20 Cellophane en utilisant une solution aqueuse de sulfate d'ammonium. On recueille par centrifugation une fraction précipitant à line saturation entre 50 et 80 % du sulfate d'ammonium. On soumet la fraction à une dialyse en utilisant de l'eau distillée pour obtenir une préparation anti-tumeur. 25 Essai 1 Cet essai concerne la propriété d'inflammation des préparations selon la présente invention et selon la technique antérieure à titre de comparaison. Méthode d'essai 30 Les préparations obtenues dans quelques exemples et exemples témoins déjà décrits ont été injectées chacune par voie sous-cutanée dans le dos de souris mâles de souche ddY (poids moyen: environ 28,5 g) suivant la quantité indiquée dans le Tableau I. Au bout de trois heures, on a injecté une solution de Bleu d'Avans à 0,5 7<> au 35 même endroit. Au bout de 30 minutes, on tue les souris, on les écor-che et on examine leur peau pour déterminer la fuite du pigment. 71 34773 '° 2108094 Echantillon 10 Echantillon I : Préparation de 1'Exemple 1 Echantillon II : Préparation de 1'Exemple 2 Echantillon III : Préparation de 1'Exemple 3 Echantillon IV : Préparation de 1'Exemple 4 Echantillon V : Préparation de 1'Exemple 5 Echantillon VI : Préparation de 1'Exemple 6 Echantillon VII : Préparation de 1'Exemple 8 Echantillon VIII: Préparation de 1'Exemple témoin 1 Echantillon IX : Préparation de 1'Exemple témoin 2 Echantillon X : Préparation de 1'Exemple témoin 3 Echantillon XI : Préparation de 11 Exemple témoin 4 Echantillon XII : Préparation de l'Exemple témoin 5 Echantillon XIII: Préparation de 1'Exemple témoin 6 15 Résultat les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau I. Echantillon 20 TABLEAU I Dose administrée, microgrammes Présente invention I 30 II 30 III 30 25 IV 30 V 50 VI 50 VII 30 Technique antérieure 30 VIII 100 IX 100 X 100 XI 70 XII 50 35 XIII 20 Remarque Nombre de souris présentant une fuite de pigment/nombre de souris essayées 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 Les doses indiquées sont exprimées en poids d'extrait sec. Dans le cas des Echantillons I à VII et XI à XIII, les doses sont les quantités de substances actives obtenues 71 34773 11 2Î08094 à partir de 100 ug (poids à sec) de cellules de Streptocoques, et dans le cas des Echantillons VIII à X, il s' agit des quantités de cellules de Streptocoques. Essai 2 5 Cet essai concerne les propriétés pyrogènes. Méthode et Echantillon d'essai. Les préparations utilisées dans l'Essai 1 sont injectées chacune par voie intraveineuse dans l'oreille de lapins (souche Japanese White), et on mesure la température rectale à des intervalles de 1 10 heure jusqu'à 12 heures après l'injection. Résultat Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau II dans lequel on note que l'élévation de température, dans le cas des Echantillons I à VII, est au plus de 0,5°C, alors que dans le cas des 15 Echantillons VIII à XIII, elle est supérieure à 1°C. TABLEAU II Echantillon Dose administrée, Temps écoulé après l'administration, heures microgrammes 1 20 0 . 1 4 ■ 8 12 Présente invention 25 30 35 I 150 38,8 38,9 38,9 39,3 39,1 300 38,8 38,7 39,2 39,2 39,1 750 39,3 39,6 39,5 39,4 39,3 1500 39,0 39,5 39,5 39,4 39,3 II f5o 38,8 38,9 38,8 38,9 38,8 III 150 39,0 39,0 38,9 39,2 39,0 IV 150 38,9 39,1 39,1 39,2 3.9,2 V 150 39,1 39,1 39,4 39,4 39,3 VI 150 39,3 39,2 39,3 39,1 39,1 VII Technique antérieure 150 38,9 38,9 39,0 39,0 39,2 VIII 500 38,8 38,8 40,7 40,1 38,9 IX 500 39,0 38,9 41,0 39,9 39,6 X 500 39,0 38,9 40,9 40,2 39,2 XI 350 38,6 38,6 40,3 38,9 38,7 XII 250 39,2 39,2 41,1 40,1 39,8 XIII 100 39,1 39,1 40,7 39,3 39,3 71 34773 12 2108094 Remarque : Les doses indiquées sont exprimées en poids d'extrait sec. Dans le cas de l'Echantillon I, les doses sont les quantités de substances actives obtenues à partir de 500, 1000, 2500 et 5000 microgrammes, respectivement,(poids à sec) 5 de cellules de streptocoques, et dans le cas des Echantil lons II à VII et XI à XIII, à partir de 500 microgramiues (poids à sec) de cellules. Dans le cas des Echantillons VIII à X, les doses sont les quantités de cellules de streptocoques. 10 Essai 3 Cet essai concerne la douleur provoquée par les préparations. On injecte chacune des préparations utilisées à l'Essai 1 par voie intra-péritonéale à des souris mâles âgées de 5 semaines de la souche ddY (poids moyen: 20,6 g, chaque groupe comprenant 5 souris). 15 On examine soigneusement le comportement des souris pendant une heure après l'injection. Les souris ayant reçu les préparations selon l'invention ne présentent pas de comportement anormal, mais celles ayant reçu les préparations utilisées comme témoins présentent, à divers degrés, le syndrome dit de Writing, par exemple un tortille-20 ment du corps avec aplatissement de l'abdomen et allongement éventuel des pattes arrière. Essai 4 Cet essai concerne l'activité anti-tumeur. Des cellules de carcinome d'ascites de Ehrlich sont inoculées 25 par voie intrapéritonéale à des souris mâles de souche ddY, âgées de 5 semaines, en une quantité de 10^ cellules par souris (10 souris par groupe). Les Echantillons I à III, V, VIII à XIII tels que ceux utilisés dans l'Essai 1 et l'Echantillon XIV qui est la préparation de l'Exemple 10 sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris 30 24 heures après l'inoculation, à raison de 0,1 ml par souris, une fois par jour pendant 4 jours. Au bout de 40 jours, on détermine l'activité anti-tumeur d'après le nombre de survivants de chaque groupe. Comme groupe témoin, on injecte seulement du BBM contenant du sel potassique de Pénicilline 35 & ( 27 000 Ul/ml). Les résultats sont indiqués dans le Tableau III. 71 34773 13 2108094 TABLEAU III Echantillon Dose administrée, Nombre de survivants par rapport au nombre de souris microgrammes traitées 5 Présente invention I 75 7/10 II 75 6/10 III 75 6/10 V 75 5/10 10 XIV 75 . 7/10 Technique antérieure VIII 250 10/10 IX 250 10/10 X 250 10/10 15 XI 175 1/10 XII 125 1/10 XIII 50 3/10 Témoin (BBM contenant la pénicilline) G/10 Remarques : Les doses indiquées sont exprimées en poids d'extrait 20 sec. Dans le cas des Echantillons I à III, V et XI à XIV, les doses sont les quantités de substances actives obtenues à partir de 250 microgrammes (poids à sec) de cellules de streptocoques, et dans le cas des Echantillons VIII à X, il s'agit des quantités de cellules de Streptocoques. 71 34773 14 2108094 REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de substances anti-tumeur, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre à une lyse des cellules de streptocoques hémolytiques à l'aide d'une enzyme lytique, et à re- 5 cueillir les substances anti-tumeur à partir du lysat sous forme d' une fraction insoluble dans l'eau. 2 - Procédé de préparation de substances anti-tumeur, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer une culture de streptocoques hémolytiques dans un milieu choisi parmi un milieu de bouillon d'in- 10 fusion de viande et un milieu d'extrait de levure, à recueillir les cellules, à soumettre à une lyse les cellules à l'aide d'une enzyme lytique et à recueillir une fraction insoluble dans l'eau à partir du lysat. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les 15 streptocoques hémolytiques sont choisis parmi la souche Streptococcus hemolyticus Su (ATCC K° 21060), la souche Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC N° 21059), la souche Streptococcus hemolyticus 203S (ATCC 21546), la souche Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC K° 21547) et la souche Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC ÏT° 21548). 20 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 1' enzyme lytique est obtenue à partir d'un bouillon de culture d'un micro organisme choisi parmi Streptomyces albus IF0 3422 (ATCC K° 3381), Streptomyces rutgersensis IAM 0085 (ATCC N° 3350), Streptomyces gri-seus. 25 5 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'en zyme lytique est l'enzyme L-11 produite par Plavobacterium sp. (ATCC N° 21044). 6 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme lytique est line enzyme obtenue à partir du lysat de Streptococ- 30 eus sp. Groupe C (ATCC ÎT° 21597) infecté par le Baxtériophage ATCC N° 21597-b. 7 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la lyse est effectuée dans un milieu aqueux hypertonique contenant du citrate de sodium, du succinate de sodium et du saccharose. 35 8 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la lyse est effectuée à une température de 10 à 40°C pendant 10 à 120 minutes. 71 34773 15 2108094 9 - Produit obtenu par le procédé selon la revendication 1. 10 - Préparation anti-tumeur caractérisée en ce qu'elle contient les substances anti-tumeur obtenues suivant la revendication 1 et un milieu acceptable physiologiquement. 5 11 - Préparation anti-tumeur selon la revendication 10, carac térisé en ce que le milieu physiologiquement acceptable, est choisi parmi le milieu basai de Bernheimer et une solution saline physiologique . 12 - Préparation anti-tumeur selon l'une quelconque des reven-10 dications 10 à 12, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme d'un • solide lyophilisé. 13 - Préparation anti-tumeur caractérisée en ce qu'elle contient les substances anti-tumeur produites selon le procédé de la revendication 1 et un stabilisant choisi parmi un amino-acide et un sucre. 15 14 - Préparation anhydre anti-tumeur selon la revendication 13, caractérisée en ce que le stabilisant représente de 1 à 50 fois le poids à sec des substances anti-tumeur obtenues selon le procédé de la revendication 1. 15 - Préparation anhydre anti-tumeur suivant la revendication 20 13, caractérisée en ce que 1'amino-acide est choisi parmi l'alanine, l'acide aspartique, la citrulline, la cystéine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, l'hydroxyproline, 1'isoleucine, la leucine, l'ornithine, la proline, la sérine, la thréonine et la valine. 16 - Préparation anhydre anti-tumeur selon la revendication 13, 25 caractérisée en ce que le sucre est choisi parmi le saccharose, le maltose, le raffinose, le lactose, le dextrane et l'amidon soluble. 17 - Médicament ayant notamment une action anti-tumeur caractérisé en ce qu'il contient comme principe actif un produit obtenu par le procédé selon la revendication 1.