Brevet FR2085628A1 — publié le 19711231

Cette invention concerne de nouveaux dérivés de l'insuline, c'est-d-dire l'insuline substituée en position N-terminale par la proline ou la glycine, ainsi qu'un procédé de préparation de ces dérivés d'insuline et des compositions thérapeutiques qui les contiennent - Il a été découvert qu'une telle substitution par la proline ou la glycine conduit à un produit présentant une augmentation de la durée d'activité de l'hormone.La cause de cette augmentation n' est pas parfaitement élucidée mais on a pensé que c'était le résultat d'une plus grande résistance offerue par les groupements proline et glycine à la scission par les hivers enzymes, comme l'aminopepeidase, présentes dans le corps dont l'action entraîne la digestion plus ou moins rapid-e des formes d'insuline couramment disponibles. Cette digestion nécessite des injections relativement fréquentes afin de maintenir le taux requis d'insuline chez les sujets diabétiques pour combattre l'hyperglycémie associee ê cette maladie. Grâce à la présente invention on disposera d'un produit qui limite la nécessité de ces injections fréquentes et qui ainsi simplifie grandement le traitement de la maladie. L'-importance de la réduction du nombre d'injections requises est évidente et bien reconnue dans la technique.En dehors des aspects de pure commodité, la réduction du danger d'infection qui résulte d'injections fréquentes, habituellerrnt administrées par le patient lui-mEme, réduit nettement les risques impliqués par ce craitement. Le développement d'une forme d'insuline ayant l'activité prolongée décrite a donc fait l'objet d'une activité de recherche considérable pendant plus de 30 ans. Parmi les insulines d'origine animale appropriées que l'on peut employer comme produits de départ dans la préparation des produits selon cette invention, on peut mentionner des insulines comme celles qui sont tirées des glandes de pancréas des cochons, du bétail, des baleines, des poissons et autres. On préfère tout particulièrement l'insuline qui est tirée des glandes de pancréas des cochons et qui est couramment appelée insuline de porc. On peut préparer les insulines prolyl- et glycyt-substituées de cette invention par acylation de ces insulines par des esters actifs de proline d N-protégé et de glycine à N-protégé, comme l'ester p-nitro-phOnylique de la tert-butyloxycarbonyl-L-proline, ou l'ester p-nitrophénylique de la tert-butyloxycanyJ -N- glycérine. Si on le désire, on peut employer dans l'étape diecylation d'autres esters actifs de tert-butyloxycarbonyl-l-proline ou N-glycine, comme les esters N-hydroxy succinyliques, tes esters phényliques, ou les esters phényliques substitués, par exemple les esters phényliques substitués négativement, tels les esters thiophényligues, les esters nitrophényliques, les esters dinitrophényliques, les nitrophénylthioesters, les esters cyanophényliques, les esters phényliques halogénés, etc... . La méthode d'acylation précédente conduit ion de dérivés protégés de prolyl-ou de glycylinsuline, le dérivé particulier que l'on obtient dépendant, comme on le verra dans les exemples, des proportions relatives de produits réagissants employés. On peut éliminer le groupement protecteur, par exemple le groupement tert-butyloxycarbonyle1 pour obtenir comme produit final l'insuline prolyl-ou glycyl-substituée. Il est préférable d'éliminer le groupement protecteur par traitement à l'acide trifluoroacétique, mais on peut employer toute méthode connue dans la technique, par exemple le traitement par un acide halohydrique (tel les acides bromhydrique ou chlorhydrique) dans l'acide acétique, ou d'autres traitements acides connus. Au lieu d'utiliser les produits proprement dits de cette invention, c' est-à-dire l'insuline prolyl-ou glycyl-substituée, pour le traitement des diabétiques, on peut employer divers complexes et compositions de ces produits, afin de prolonger encore la durée d'action de ces dérivés de prolylinsuline.Ainsi on peut faire réagir les insulines prolyl-ou glycyl-substituées de cette invention avec un sel de zinc comme le chlorure de zinc, de préférence en présence d'un agent tampon comme un acide organique (par (par exemple l'acide acétique, succinique, ou citrique) et un hydroxyde de métal alcalin, de façon à obtenir une prolyl-ou glycylinsuline zinc; ou bien avec un sel de zinc comme ci-dessus plus une protéine alcaline comme la protamine, l'histone ou la globine, de façon à obtenir les insulines protamine , histone et globine-prolyl ou glycyl zinc. La'préparation de ces complexes et compositions est bien connue dans la technique.En outre, on peut utiliser toute autre méthode connue dans la technique par -laquelle Le point isoélectrique de la prolylinsuline est porté a celui du pH du sang. Pour préparer des compositions acceptables par voie parentérale selon cette invention, incorpora*t de la prolyl-ou glycylinsuline, on peut employer 11 une quelconque des nombreuses méthode bien connues de préparation des compositions connues qui contiennent de I1 insuline. Par exemple, on peut dissoudre la prolyl-ou glycylinsuline dans de l'eau stérile à un pH d'environ 2 à environ 4 (de préférence d'environ 2,5 à environ 3,5). La concentration de la prolyl-ou glycylinsuline doit être telle que l'on obtienne environ 40 unités à environ 500 unités de prolyl-ou glycylinsuline par ml de solution finale.Il est préférable d'ajouter à la solution un agent de préservation tel que le phénol ou le m-crésol, au mieux à une concentration d'environ 0,05% a environ 0,5% en poids. On peut aussi incorporer un agent qui assure l'isotonicité, comme la glycérine, au mieux à une concentration d'environ 0,15% en poids. A l'usage, les compositions qui contiennent les insulines de cette invention sont ordinairement administrées aux diabétiques par voie sous-cutanée à une dose d'environ 0,25 ml à environ 2 ml (de préférence environ 1 ml), ce qui fournit une dose d'environ 20 unités à 1000 unités (de préférence environ 250 unités} de prolylinsuline. I1 faut bien entendu comprendre que, dans le trai tement du diabète, il n'y a pas de dose "standard" et qu'une dose donnée doit dans tous les cas être adaptée abesoide l'individu considéré. Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail. Exemple 1 tert-Butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline ("t-Boc-L-prolylinsuli ne") On dissout de l'insuline (porc) provenant de BOVO INDUSTRIE A/S (1,2 g, 200 t moles) dans 20 ml d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, et à cette solution on ajoute une solution d'ester p-nitrophényl ique de tert-butyloxycarbonyl -L-prol ine dans la pyridine (0,2 g; 600 moles/2 ml). On agite le mélange réactionnel à la température ambiante à pH constant (8,5) avec régulation au pH-stat. Le mélange réactionnel consomme 2,5 équivalents de base (NaOH 0,25 N) en un laps de temps de 2 heures, après quoi il n'y a plus d'addition. On porte le mélange à un pH de 5,5 à l'aide de 2 ml d'acide chlorhydrique 6N et on le concentre à- sec sous vide à la température ambiante. On dissout le résidu, une huile, dans 20 ml d'eau dont on ajuste le pH à 5,5, et on concentre de non veau à sec sous vide. On met le résidu en suspension dans 50 ml d'éthanol et on fait décanter le surnageant colloïdal du solide. On met le solide en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthyle puis on le filtre et on le lave à l'acétate d'éthyle et on le sèche dans un dessicateur. Le produit, un solide (1,0 g), est soluble dans une solution diluée de bicarbonate. On hydrolyse un échantillon de cette substance dans de l'acide chlorhydrique EN sans ammoniac" et on mesure de façon quantitative les amino acides de l1hydrolysat > . Les résultats sont donnés dans le Tableau cidessous. Exemple 2 L-prolylinsuline On met en suspension un échantillon (500 mg) de la préparation ci-dessus (t-Boc-L-prolylinsuline) dans 4 ml d'acide trifluoroacétique et on laisse reposer pendant 20 minutes à la température ambiante, temps pendant lequel la dissolution se produit. On dilue la solution avec 50 ml d'éther anhydre et ontwwitole précipité insoluble par deux fractions de 50 ml d'éther anhydre, et on filtre. On dissout le solide dans 10 ml d'eau et on filtre pour éliminer toute substance insoluble. On porte le filtrat (pH 2) à un pH de 5,5 à l'aide de diéthylamine et on le laisse reposer à 50 C pendant une nuit.On sépare le précipité par centrifugation et on la lave successivement avec 10 ml d'eau et deux fractions de 10 ml d'éthanol, et enfin avec 50 ml d'acétate d'éthyle! puis on le sépare par filtration et on le sèche sous vide à la température ambiante. Le produit (380 mg) est soluble dans loe solutiom d'acide chlorhydrique 0,01 N et de bicarbonate. On soumet un échantillon hydrolysé dans l'acide chlorhydrique 6N "sans ammoniac", à l'analyse quantitative des aminoacides, et les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau ci-dessous. Exemple 3 di - (tert-Butvloxvcarbonyl -L-prolyl) insuline On dissout de l'insuline (porc) provenant de NOVO INDUSTRIE A/S (1,2 g; 200fi moles) dans 20 mi d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, on ajuste le pH à 8,5 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N, et à cette solution on ajoute une solution d' ester p-nitrophényl ique de tert-butyloxyearbonyl-L-proline dans la pyridine (0,4 g; 1,1 mmole). On agite le mélange à la température ambiante et on maintient le pH à 8,5 par régulation au pH-stat. On laisse la réaction se poursuivre pendant 5 heures, temps pendant lequel six équivalents de base sont consommés. On ajuste le mélange réactionnel à un pH de 5,5 à l'aide de 2,5 m1 d'acide chlorhydrique 6N, puis on le concentre sous vide à la température ambiante. On lave le résidu avec 10 ml d'eau et on filtre la substance insoluble. On remet celle-ci en suspension dans 10 ml d'eau et on filtre. On met le produit insoluble en suspension dans 50 ml d'éthanol, où la substance forme dabord des masses agglutinées gommeuses qui deviennent peu à peu solides au-dessous d'un liquide surnageant olloîdal . On fait décanter le surnageant et on met le résidu solide en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthyle, puis on filtre et enfin on lave avec ce solvant. Après séchage dans un dessicateur à vide le produit pèse 828 mg. Du surnageant alcool on obtient encore 75 mg. Le produit se dissout lentement dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et facilement dans le bicarbonate dilué. Une analyse quantitative des aminoacides de l'hydrolysat d'un échantillon de ce produit donne les résultats répertoriés dans le Tableau ci-dessous. Exemple 4 di-L-Prolylinsuline On met en suspension la di-prolylinsuline protégée ci-dessus (500 mg) dans 4 ml d'acide trifluoroacétique anhydre pendant 20 ninutes, temps pendant lequel la dissolution se produit. On dilue la solution avec 50 ml d'éther anhydre et on traite deux fois le précipité qui se forme par 50 ml d'éther anhydre. On filtre le solide et on le dissout dans 10 ml d'eau. On filtre la solution pour éliminer toute matière non dissoute et on traite le filtrat par la triéthylamine pour porter le pH de la solution à 5,5.Après repos pendant une nuit à 50 C, on centrifuge le précipité et on le lave successivement avec une fraction de 10 ml d'eau, avec deux fractions de 10 ml d'éthanol, et enfin avec une fraction de 50 ml d'acétate d'éthyle, puis on le filtre et on le sèche dans un dessicatear à vide. Le produit (400 mg) est soluble dans 1'acide chlorhydrique 0,01 N et dans une solution diluée de bicarbonate. On soumet l'hydrolysat d'un échantillon qui est traité par l'acide chlorhydrique 6H "sans ammoniac", pendant 16 heures à la température du reflux, à une analyse quantitative des aminoacides,et les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau ci-dessous. TABLEAU COMPOSITION EN AMINO ACIDES DES DERIVES D'INSULINE AMINO ACIDE INSULINE t-Boc#-L-prolyl- L-Prolyl di-tert- di-L (porc) INSULINE INSULINE Boc-L- Prolyl prolyl INSULINE INSULINE ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ (Ex.l) (Ex.2) (Ex.3) (Ex.4) Acide aspartique 3 3 3 3 3 Thréonine 2 2 2 2 2 Sérine 3 3 3 3 3 Acide glutamique 7 7 7 7 7 Proline 1 2 2 3 3 Glycine 4 4 4 4 4 Alanine 2 2 2 2 2 Cystine 3 3 3 3 3 Valine 4 4 4 4 4 Isoleucine 2 2 2 2 2 Leucine 6 6 6 6 6 Tyrosine 4 4 4 4 4 Phénylalanine 3 3 3 3 3 Histidine 2 2 2 2 2 Lysine 1 1 1 1 1 Arginine 1 1 1 1 1 Ammoniac 6 6 6 6 6 # t-Boc - butyloxycarbonyle tertiaire Exemple 5 Tert-butyloxvcarbonvlqivcylinsuline ("t-Boc-glycyl-insuline") On dissout de l'insuline (porc) provenant de NOVO INDUSTRIE A/S (1,2 g; 200* moles) dans 20 ml d'un mélange en parties égales de pyridine et d'eau, et à cette solution on ajoute 180 mg (600 T moles) d'ester p-nitrophénylique de tert-butyloxycarbonyl-Nglycine dans 2 ml de pyridine. On agite le mélange réactionnel à la température ambiante et à pH constant (8,5) jusqu'à ce que l'addition de base (NaOH 0,25 N) ne soit plus nécessaire pour maintenir cette valeur de pH. On ajuste alors le pH du mélange réactionnel à 5,5 à l'aide d'acide chlorhydrique 6N et on concentre à sec sous vide à la température ambiante.On dissout le résidu, une huile, dans 20 ml d'eau, on ajuste le pH de la solution résultante à 5,5 et on la concentre de nouveau à sec sous vide et à la température ambiante. On met le résidu en suspension dans 50 ml d'éthanol et on met de cOté le surnageant collotdal. On met le solide restant en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthyle, puis on le filtre et on le lave à l'acétate d'éthyle et on le sèche dans un dessicateur. Le produit est soluble dans une solution diluée de bicarbonate et peut former des sels solubles avec d'autres cations par addition avec précaution jusqu'à un pH voisin de 7. Exemple 6 Glvcvlinsuline On met en suspension la préparation ci-dessus (t-Boc-glycylinsuline) dans de l'acide trifluoroacétique anhydre (1 g/lo ml) jusqu'à ce que la dissolution se produise, puis on laisse reposer pendant environ 20 minutes. On dilue la solution avec 100 ml d'éther anhydre et on triture le précipité successivement avec deux fractions de 100 ml d'éther anhydre, puis on filtre. On dissout le solide dans 25 ml d'eau et on le centrifuge pour éliminer toute matière non dissoute. On décante le surnageant et on l'ajuste à pH 5,5 à l'aide de triéthylamine, puis on laisse reposer pendant une nuit à 50 C. On centrifuge le solide qui se sépare et on le lave successivement avec 10 ml d'eau et avec deux fractions de 10 mi d'éthanol, et enfin avec un peu d'acétate d'éthyle, puis on filtre et on sèche dans un dessicateur X vide à la température ambiante. Le produit est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et une solution de bicarbonate. Exemple 7 Di-tert--butoloxYcarbonylglycyl) insuline On dissout de l'insuline (porc) provenant de NOVO INDUSTRIE A/S (1,2 g; 200 T moles) dans 20 ml d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, et on ajuste à 8,5 le pH de la solution à l'aide d'une solution 0,25 N d'hydroxyde de sodium. Tout en maintenant ce pH par régulation au pH-stat à l'aide d'hydroxyde de sodium 0,25 N, on ajoute une solution de 1200 moles d'ester p-nitrophénylique de tert-butyloxy-carbonylglycine (360 mg/2ml) dans la pyridine, et on maintient le mélange à pH 8,5 jusqu'à ce que l'addition de base ne soit plus nécessaire. La réaction est complète au bout de 5 Heures, temps pendant lequel six équivalents de base sont consommés.On ajuste le pH du mélange réactionnel à 5,5 Q l'aide d'acide chlorhydrique 6N et on le concentre sous vide à la température ambiante. On lave alors-deux fois le résidu avec 10 ml d'eau et on le filtre. On met en suspension le produit insoluble dans 50 ml d'éthanol et on sépare la matière solide, qui se forme peu à peu, du surnageant colloïdal par décantation. On met en suspension le solide dans de l'acétate d'éthyle (50 ml), on le filtre et enfin on le lave avec ce solvant. On sèche le produit dans un dessicateur à vide. Le produit se dissout facilement dans le bicarbonate et se dissout lentement dans l'acide chlorhydrique 0,01 N. Exemple 8 Diglycylinsuline Pour la préparation de la diglycylinsuline, on dissout la di(t-Boc-glycyl) insuline décrite ci-dessus à l'Exemple 7, dans l'acide trifluoroacétique anhydre (1 g/iO ml), et on laisse reposer pendant environ 20 minutes en solution à la température ambiante. On dilue alors la solution avec 100 ml d'éther anhydre et on triture le précipité deux fois avec 100 ml d'éther anhydre. On filtre le solide et on le dissout dans 20 ml d'eau. On élimine par filtration ou centrifugation toute matière non dissoute et on ajuste la solution limpide à un pH de 5,5 t l'aide de triéthyl amine Après repos pendant une nuit à 50 C, on centrifuge le solide qui se sépare et on le lave successivement avec 10 ml d'eau, deux fois 10 ml d'éthanol et enfin 50 ml d'acétate d'éthyle, puis on le filtre et on le sèche dans un dessicateur-à vidè. Le produit est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et dans une solution diluée de bicarbonate. Exemple 9 Insuline de porc L-proPyl zinc cristalline On met en suspension dans 12,5 ml d'eau 250 mg de la L,prolyl insuline préparée par la méthode de Exemple 2, et on les dissout en ajustant le pH à 2,3 par addition d'acide chlorhydrique 1 N. On ajoute a la solution 1 g de chlorure de sodium et un peu d'adjuvant de filtration (marque déposée HyElo). On filtre le précipité qui se forme et on le lave avec une solution de chlorure de sodium à 8 %. On dissout le précipité dans 25 mi d'eau distillée et on ajuste le pH à 7,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium 1 N. On ajoute de l'acétone jusqu a une concentration finale de 25 %. On filtre la solution pour éliminer une petite quantité d'impuretés en utilisant le Hyflo pour faciliter la filtration.A la solution filtrée on ajoute 1,2 mi de tampon citrate, de pH 5,4 (à partir de 5 g d'acide citrique dans 10 ml d'eau et de 2,5 g d'hydroxyde de sodium dans 5 ml d'eau,dilués à 30 ml avec de l'eau}. Enfin, on ajoute 0,25 ml d'une solution de chlorure de inc à 20 % et on ajuste le pH à 6. On gratte les parois du ballon et on maintient le mélange à la température ambiante jusqu'd ce qu'une partie appréciable de l'insuline modifiée apparaisse sous forme cristalline. Plusieurs jours au réfrigérateur (5 C) rendent la cristallisation complète.On filtre alors les cristaux de L-prolylinsuline zinc et on les lave avec de l'acétone diluée,enfin avec de l'acé- tone, et on les sèche à l'air. Exemple 10 Glycylinsuline zinc En suivant la méthode de l'Exemple 9, mais en substituant une quantité équivalente de glycylinsuline, préparée par la méthode de l'Exemple 6, à la Lprolylinsuline, on obtient de la glycylinsuline zinc cristalline. Exemple Il Solution de L-prolylinsuline zinc pour injection Pour préparer 170 litres d'une solution stérile de L-prolyl- insuline zinc contenant 80 unités de l'insuline par ml, on suit la méthode suivante On introduit 125 kg d'eau pour injection dans un réacteur discontinu. On ajoute 2720 g de glycérine, 170 cm3 de phénol redistillé (100 %) et 170 cm3 de solution d'acide chlorhydrique 1 N, et on-mélange soigneusement la solution. On met en suspension 600 g de L-prolylinsuline zinc dans à peu près 9 litres d'eau pour injection. On agite ce mélange et on ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1N pour dissoudre les solides et ajuster le pH entre 2,6 et 2,8.On ajoute alors la solution d'insuline résultante au réacteur discontinu et on mélange soigneusement. On ajoute suffisamment d'eau pour injection pour porter le poids total de la solution à environ 165 kg. On ajuste le pH entre 2,6 et 2,8 à laide d'acide chlorhydrique 1 N et on ajoute suffisamment d'eau pour injection pour porter la solution finale à 170 litres. On stérilise la solution par filtration sous pression sur papier filtre en acier inoxydable et on l'introduit, dans des conditions stériles, dans des fioles de verre de 10 cm3. Exemple 12 Solution de glycylinsuline zinc pour injection En suivant la méthode de Exemple il, mais en substituant une quantité équivalente de glycylinsuline zinc à la L-prolylinsuline zinc, on obtient une solution de glycylinsuline zinc pour injection. Exemple 13 L-rolylinsuline protamine zinc Pour préparer 1000 litres de L-prolylinsuline protamine anc, on utilise la méthode suivante (a) on introduit dans un réacteur discontinu 450 kg d'eau pour injection. On ajoute 8000 g de glycérine, 500 cm3 de phénol redistillé (100%) et 500 cm3 de solution d'acide chlorhydrique 1N. On ajoute alors 850 cm3 de solution de chlorure de zinc (200 mg de zinc par cm ), et on mélange soigneusement la solution. On ajoute 3400 g de L-prolylinsuline zinc et 1000 g de sulfate de protamine, et on agite le mélange résultant. On ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1N pour porter le pH à 2,9 - 3,0 et pour dissoudre les solides. On ajoute alors suffisamment d'eau pour injection pour porter la solution finale à 500 litres et on stérilise la solution par filtration sous pression et on recueille la L-prolylinsuline protamine zinc dans des bouteilles de 20 litres destinées à l'opération de remplissage. (b) On introduit 500 kg d'eau pour inspection dans un réacteur discontinu. On ajoute 2.200 g de phosphate monosodique anhydre, 8.800 g de glycérine et 2.200 cm3 de phénol redistillé (100%), et on mélange la solution résultante. On ajoute alors suffisamment d'eau pour injection pour porter la solution totale à 550 1 et on mélange la solution. On ajuste le pH de la solution tampon résultante de telle sorte que, par mélange avec un volume égal de la solution de L-prolylinsuline protamine zinc, on obtienne un pH de 2,9 - 3,0. Ceci se fait en ajoutant soit de l'acide chlorhydrique 1N soit de l'hydroxyde de sodium 1N. On stérilise la solution tampon par filtration sous pression et on la recueille dans des bouteilles de 20 litres. (c) En utilisant un appareil approprié on remplit des fioles 3 3 de 10 cm avec 5 cm3 de la solution stérile de L-prolylinsuline protamine zinc de l'étape a, et 5 cm3 de la solution tampon stérile de l'étape b. Exemple 14 L-prolvlinsuline NPH Pour préparer 500 litres de L-prolylinsuline NPH, on suit la méthode suivante (a) On introduit 200 litres d'eau pour injection dans un réacteur discontinu, on ajoute 4000 g de glycérine, 375 g de méta-crésol fraîchement distillé, 162,5 cm de phénol redistillé (100 O et 250 cm3 d'acide chlorhydrique 1N, et on mélange la solution résultante. On ajoute 30 cm3 de solution de chlorure de zinc (200 mg de zinc par cm3 > et on brasse soigneusement le mélange résultant. On ajoute 1700 g de L-prolylinsuline zinc et 168 g de sulfate de protamine,etonagite le mélange résultant. On ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1N pour porter le pH à 2,7 - 3,0 et pour dissoudre la totalité des solides.On ajoute alors suffisamment d'eau pour injection pour porter la solution à un poids de 245 kg et on ajuste le pH à 2,7 - 3,0 à l'aide d'acide chlorhydrique IN. On ajoute alors suffisamment d'eau pour injection pour porter la solution finale à 250 litres et on mélange soigneusement la solution. On stérilise la solution par filtration sous pression. (b) On introduit 200 litres d'eau pour injection dans un réacteur discontinu. On ajoute 1400 g de phosphate monosodique anhydre, 5600 g de glycérine, 525 g de méta-crésol fraîchement 3 distillé et 227,5 cm de phénol redistillé (100%), # et on mélange la solution résultante. On ajoute suffisamment d'eau pour injection pour porter la solution à un poids de 250 kg et on mélange la solution. On ajuste le pH de la solution tampon de telle sorte que, par mélange avec une quantité égale de la solution préparée à ltétape a , on atteigne un pH de 2,7 à 3,0. On utilise à cet effet de l'acide chlorhydrique 1N ou de l'hydroxyde de sodium 1N. On stérilise alors la solution par filtration sous pression. (c) En utilisant l'appareil approprié, on remplit des fioles 3 de 10 cm3 avec 5 cm de la solution tampon stérile obtenue à l'étape b, et 5 cm3 de la solution stérile de L-prolylinsulineprotamine-zinc de l'étape a. Exemple 15 Préparation de L-prolylinsuline zinc à action prolongée On prépare une solution de L-prolylinsuline zinc à 1%, de citrate de sodium 0,05 M, de 470 mcg d'ion zinc (fourni par le chlorure de zinc) par cm3, et de chlctuse drJ: eodigm 7%,, ayant un pH de 6,0 - 6,1. A partir de cette solution on obtient par cristallisation stérile des cristaux de L-prolylinsuline zinc a action prolongée. Pour obtenir une réponse plus prompte, on peut combiner les cristaux d'insuline à action prolongée, préparés comme décrit ci-dessus, à diverses combinaisons de L-prolylinsuline zinc amorphe stérile contenant 2 mcg de zinc par unité. Une telle combinaison donne aussi bien une réponse prompte qu'unie action prolongée. On prépare la L-prolylinsuline zinc amorphe stérile en ajoutant à une solution stérile d'insuline à 1% 470 mcg d'ion inc (fourni par le chlorure de zinc) par cm, et en ajustant le pH 7,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium IN. On fait précipiter l'insuline amorphe et on la recueille dans des conditions stériles. REVENDICATIONS 1. Un polypeptide choisi dans le groupe comprenant la L-prolylinsuline, la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline, la diglycylinsuline, ainsi que leurs formes à N protégé et que leurs complexes, où les groupements prolyle ou les groupements glycyle sont présents en positions N-termina3ei de > molécule d'insuline. 2. Un composé selon la revendication 1, dénommé L-prolylinsuline. 3. Un composé selon la revendication 1, dénommé di-Lprolylinsuline. 4. Un composé selon la revendication 1, dénommé tert-butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline. 5. Un composé selon la revendication 1, dénommé ditert- butyloxyearbonyl-L-prolyl)insuline. 6. Un composé selon la revendication 1, dénommé glycylinsuline. 7. Un composé selon la revendication 1, dénommé diglycylinsuline. 8. Un composé selon la revendication 1, dénommé tert-butyloxy carbonylglycylinsuline. 9. Un composé selon la revendication 1, dénommé di-(tertbutyloxycarbonylglycyl)insuline. 10. Un composé selon la revendication 1, choisi dans le groupe comprenant les complexes protamine, histone, globine, zinc, protamine zinc, histone zinc, globine zinc et NPH Z d'un élément du groupe comprenant la L-prolylinsuline, la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline et la diglycylinsuline, où les groupements prolyle et glycyle sont présents en positions N-terminaleB de la moécule d'insuline. 11. Un procédé de préparation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant la L-prolylinsuline, la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline, la diglycylinsuline,ainsi que leurs complexes et que leurs dérivés prolyle à N-protégé et glycyle à N-protégé, procédé qui comprend l'acylation de l'insuline par un ester actif de L-proline à N-protégé ou de glycine à N-protégé et, si on le désire, la réaction de l'insuline prolyl-ou glycyl-substituée ainsi obtenue avec un sel de zinc et/ou une protéine alcaline 12. Le procédé de la revendication il, dans lequel on acyle l'insuline par un ester actif de tert-butyloxycarbonyl-L-proline pour former la tert-butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline ou la di (tert -butyloxycarbonyl-L-prolyl) insuline. 13. Le procédé de la revendication 11, dans lequel on acyle l'insuline par un ester actif de tert-butyloxycarbonyl glycine pour fouiner la tert-butyloxycarbonyl glycylinsuline ou la di-(tertbutyloxycarbonylglycyl)insuline. 14. Le procédé de la revendication 12, dans lequel on traite la tert-butyloxycarbonyl-L-proline par un acide pour former la L-prolylinsuline. 15. Le procédé de la revendication 12, dans lequel on traite la di(tert-butyloxycarbonyl-L-prolyl)insuline par un acide pour former la di-L-prolylinsuline. 16. Le procédé de la revendication 13, dans lequel on traite la tert-butyloxycarbonylglycylinsuline par un acide pour former la glycylinsuline. 17. Le procédé de la revendication 13, dans lequel on traite la di-(tert-butyloxycarbonyl)glycylinsuline par un acide pour former la diglycylinsuline. 18. Le procédé de la revendication 11, dans lequel on traite par un sel de zinc l'insuline prolyl-ou glycyl-substituée pour former la L-prolylinsuline zinc ou la glycylinsuline zinc. 19. Le procédé de la revendication 11, dans lequel on traite par une protéine alcaline l'insuline prolyl-ou glycylsubstituée. 20. Le procédé de la revendication 11, dans lequel on traite par un sel de zinc et une protéine alcaline l'insuline prolyl-ou glycyl-substituéo. 21. Une composition pharmaceat qe comprenant un composé selon la revendication 1 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.