Brevet FR2088038A1 — publié le 19720107

i 2088036 La présente invention se rapporte à la multiplication de virus aphteux sur des cellules d'origine porcine, entretenues en lignée continue telles que la cellule isolée par l'institut Bactériologique de Rio de Janeiro, et désignée sous 5 le nom de "cellule I.B.R.Elle concerne également la préparation, à partir des virus ainsi cultivés, d'un vaccin antiaphteux destiné spécialement à l'espèce porcine. La demanderesse a étudié en particulier des cellules provenant de l'institut de Bactériologie de Rio de Janeiro, réfé-10 rencées I.B.R. 2 clone 3, et a trouvé qu'elles constituent un excellent substrat pour la multiplication du virus aphteux devant servir à la préparation d'un vaccin» Toute autre cellule de lignée porcine, ayant un coefficient de multiplication suffisant, peut être utilisée. 15 On peut caractériser l'appartenance d'une souche de cellules à l'espèce porcine pour l'établissement du caryotype d'une part, et par des tests immunologiques, d'autre part-. Le caryotype effectué sur la cellule I.B.R. a donné une moyenne de 36 chromosomes, nombre qui correspond au caryotype 20 Le test immunologique peut être le suivant : un sérum de lapin immunisé par des cellules I.B.R. agglutine les hématies de porc, mais n'agglutine pas les hématies d'autres espèces: bovins, ovins, cobayes et hamsters. 25 L'origine porcine de la cellule I.B.R. ou de toute autre cellule porcine ayant les mêmes caractères que la cellule I.B.R. fait qu'elle convient particulièrement bien à la préparation de vaccin antiaphteux destiné à cette espèce, car elle évite ainsi les dangers de sensibilisation consécutifs à l'utilisation de vaccins ■jO obtenus à partir de cellules hétérologues, tels que vaccin de Fren-kel obtenu à partir de virus multiplié sur tissu de bovins ou vaccin BHK obtenu à partir de virus multiplié sur cellules de hamsters. La cellule I.B.R. peut être conservée en azote liquide y5 et au congélateur à -80°C. Elle se multiplie en monoc-ouche avec les milieux de culture usuels : base saline de Hanks ou Earle enrichie avec des extraits de levure, de l'hydrolysat de caséine ou de lactalbumine; milieu semi-synthétique de Stocker ou milieu 70 17053 2 2088038 synthétique type 199. Ces milieux usuels sont additionnés de 5 à 10$ de sérum de porc, de veau ou de cheval. On ajuste la quantité de liquide de culture cellulaire O aux environs de 0,4 ml par cm de surface de monocouche. 5 Le coefficient de multiplication cellulaire entre cha que subculture est de 3 à 10 suivant la nature du milieu de culture et la durée de culture. Il est recommandé de limiter le nombre de subcultures afin de garantir une bonne stabilité de la lignée cellulaire 10 I.B.R. En production courante, on ne dépasse pas 10 subcultures successives à partir du stock de cellules d'origine. Cha maintenant découvert que le virus de la fièvre aphteuse se multiplie de façon satfaisante sur les cellules I.B.R. et que les suspensions de virus ainsi obtenues peuvent 15 servir à la préparation d'un vaccin dont le pouvoir immunogène pour le porc est supérieur à celui des virus multipliés sur d'autres cellules hétérologues, les caractères de ces suspensions (pouvoir de fixation du complément, titre infectieux) étant par ailleurs identiques. 20 procédé de préparation d'un vaccin antiaphteux à partir de virus multiplié sur cellules de lignée porcine telles que la cellule I.B.R. est le suivant: On prélève des cellules I.B.R. d'un stock conservé par congélation à -l80°C, et on les cultive en monocouches, en flacons 25 stationnaires type Boîtes de Roux, ou en flacons roulants, en utilisant un milieu classique, par exemple, une base saline de Hanks additionnée d'extrait de levure ou d'hydrolysat de lactalbumlne, complémentée par 5 à 10# de sérum de porc, de bovin ou d'équin. On inocule le substrat cellulaire obtenu par un virus 30 inoculum constitué par de la lymphe de porc contaminé, ce virus ayant subi plusieurs passages successifs sur cellules I.B.R. ou toute autre cellule telle que cellule primaire de rein de porc, cellule porcine entretenue en lignée continue ou toutes cellules hétérologues sensibles au virus aphteux : Cellule BHK, culture ^5 primaire de rein de veau, par exemple. Le nombre de passages peut aller de 4 à 20, mais on utilise, de préférence, les virus ayant subi 4 ou 5 passages en culture cellulaire, afin de respecter les recommandations de l'Office International des Epizooties (1969), 70 17053 3 2088038 On a déterminé la durée optimale de culture du virus d'après l'optimum de multiplication et d'antigénicité en fonction, d'une part, de la cinétique de multiplication et, d'autre part, des résultats des tests immunologiques effectués sur animaux de 5 laboratoire ou sur porcs. La détermination de l'optimum de multiplication est effectuée en utilisant comme critères le pouvoir infectieux et des réactions sérologiques quantitatives. Le pouvoir infectieux est déterminé sur des cultures 10 primaires de rein de porcelet, ou de foetus de bovin, ou de cellule I.B.R. par la méthode dite de l'effet cytopathogène, ou par l'aptitude à former des plages de lyse sous couche d'agar. Le /T rj titre infectieux optimal est alors de 10 à 10' pour 0,1 ml. Le titre infectieux peut également être déterminé par titrage 15 sur cobayes ou sur souris. Les qualités sérologiques sont déterminées d'après les tests dits de fixation du complément et leurs résultats sont exprimés par la dilution d'antigène qui fixe 100# de 2 unités de complément ou par la dilution d'antigène qui fixe 50# de 2 unités 20 de complément admises dans la réaction. Les antigènes ainsi préparés fixent 100# de 2 unités de complément, jusqu'à une dilution du 1/4 ou 1/8,pouvant aller jusqu'au l/32ème. Ces réactions sérologiques de fixation du complément peuvent être effectuées sur du virus brut ou sur du virus préala-25 blement purifié par les fréons ou par les hydrocarbures halogénés. On a ainsi trouvé que la durée de culture optimale pour les virus peu adaptés (4ème à 6ème passage ) est habituellement de lôheures, mais- peut varier suivant les virus, entre 10 et 20 heures. Avec les virus qui ont subi un plus grand nombre de 30 passages en culture cellulaire, soit 20 passages par exemple, la durée de culture est habituellement raccourcie et ramenée aux environs de 8 heures pouvant varier suivant les virus entre 6 et 12 heures. D'autre part, d'après les résultats des tests immunolo-35 giques, on a trouvé que la qualité du virus produit est fonction du nombre de cellules vivantes dans le substrat de culture: l'optimum est de 300.000 à 600.000 cellules par cm2 de monocouche, ce qui est atteint après 3 ou 4 jours de culture pour une suspension de départ de 40.000 à 60.000 cellules par cm2. 70 17053 2088038 15 Après récolte, les suspensions virales sont débarrassées des débris cellulaires, stérilisées bactériologiquement par des procédés de filtration ou par des traitements chimiques, tels que traitements au chloroforme, au trichloréthylène. 5 Après stérilisation, les suspensions cellulaires sont inactivées par le formol à raison de 0,20 à 0,30g #D de formal-déhyde pure, et à température de 36°C. L'inactivation peut également être effectuée par la glycidaldéhyde à raison de 0,05 à la température de 25°C pendant 16 heures, ou par 1'acétyl-éthy-]_o lène-imine. Les techniques d'inactivation ont été décrites dans l'article de M. DURAND (Bull. Off. Int. Epiz., 1968, 69 (3-4), 429-465). Le virus inactivé est ensuite émulsionné dans un excipient huileux, afin d'obtenir une émulsion eau-dans-l'huile ou huile-dans-eau ou une émulsion mixte huile-dans-eau-dans-huile. Dans ce dernier cas, on ajoute au mélange classique: mayoline additionné de 10# d'un oléate d'anhydrohexitol dénommé Arlacel, un émulsifiant qui peut être de type tween ou toute autre substance capable de provoquer une émulsion de type huile-dans-eau, en particulier un mélange spécial d'éther polyglycolique d'alcool gras dénommé Emulgine. Les émulsions sont contrôlées d'après leur résistance à la centrifugation, leur résistivité, l'observation microscopique, leurs caractéristiques de diffusion dans l'eau, et leur 25 temps d'écoulement à travers une aiguille de calibre déterminé. L'innocuité du vaccin est ensuite contrôlée sur l'espèce porcine. On détermine l'activité antigène du vaccin sur la même espèce, d'après les normes publiées par l'Office International •jO des Epizooties (J. POUL, Bull. Off. Int. Epiz. 1964, 6l, 1233 et M. GIRAUD, Bull. Off. Int. Epiz. I969, 71, 285-306). Exemple de production de vaccin antiaphteux sur cellule IBR : Les cellules IBR récoltées après trypsinisation sont _ -mises en suspension dans un milieu glycériné ou additionné de /T diméthyl-sulfoxyde à raison de 1 à 2.10 cellules par ml„ Après répartition en ampoules scellées, ces cellules sont congelées à l'aide d'un cryostat assurant une baisse régulière de température, puis stockées en azote liquide ou en congélateur à -80°C. 20 70 17053 5 2088038 Au moment de l'emploi, une ou plusieurs ampoules sont décongelées au bain-marie à 37°C, les cellules sont mises en suspension dans le milieu de culture à raison de 80.000 cellules par ml. Le milieu de culture cellulaire utilisé est constitué 5 par une base saline de Hanks (ou de Earle) additionnée de 0,5# d'hydrolysat de lactalbumine, de 0,1# d'extrait de levure, de 0,1# de glucose, de 5 à 10# de sérum de porc, (ou de veau, ou de poulain) et de 0,1 # de bicarbonate de sodium. De la trypsine, par exemple Difco 1/300, est ajoutée à ce milieu après dilution à 10 raison de 0,25# dans une solution saline, tamponnée, exempte de sel de calcium et de magnésium. La suspension cellulaire à 80.000 cellules par ml en milieu nutritif est répartie en flacons stationnaires ou en flacons 2 roulants à raison de 0,4 ml par cm de surface. La quantité de o 15 cellules inoculées par cm de surface disponible est alors d'environ 3°.000 cellules. Les surfaces ainsi ensemencées sont conservées à l'étuve durant 3 à 4 jours, la vitesse de rotation des flacons étant de 1 tour en 5 minutes, pour permettre la constitution d'un tapis cellulaire continu et dense. 20 Le nombre de cellules atteint alors 500.000 à 600.000 2 cellules par cm de surface. Le milieu nutritif pour les cellules est éliminé et remplacé par une solution de trypsine 1/300 à 2,5# dans une solution saline tampoftnée. L'action enzymatique se poursuit à 37°C 25 pendant 8 heures. La suspension cellulaire çn milieu trypsine est diluée avec le milieu nutritif additionné de sérum pour obtenir à nouveau une suspension cellulaire de 80.000 cellules viables par ml. On effectue de la même façon plusieurs subcultures, 30 en nombre tel que la multiplication de la masse cellulaire soit suffisante pour assurer un lot de production, soit 10 au maximum. La surface cellulaire obtenue étant suffisante, on com-aence alors la culture du virus; Le milieu nutritif cellulaire est éliminé et remplacé r 35 par un milieu identique, mais exempt de sérum et additionné de l'inoculum de virus. La quantité de milieu de culture utilisée 2 pour la 'multiplication virale est de 0,1 ml par cm de surface cellulaire. Le virus inolpulum est dilué de telle façon que le 1 -5 _6 nombre d'unités infectieuses par ml soit de 10 ^ à 10 70 17053 6 2088038 On poursuit la culture virale durant 12 heures. Après ce temps la totalité du tapis cellulaire est détruit par le virus, les cellules sont lysées.La suspension virale est immédiatement refroidie à +4°C. Cette suspension virale est centrifugée 5 e't filtrée afin d'éliminer les débris cellulaires, puis soumise à 1'inactivation par le formo^, la glycidaldéhyde ou l'acéthyl-éthylène-imine. Après contrôle d!inactivation, cette suspension virale est émulsionnée dans un mélange huileùx; composé d'huile minérale 10 et d'émulsifiants, pour obtenir le vaccin. On peut également réunir dans un même vaccin plusieurs suspensions de virus de types différents et obtenir, par exemple, un vaccin trivalent. 15 Exemples de formules de vaccin trivalent; Formule n°l - Emulsion type eàu-dans-huile de virus inactivés par la glycidaldéhyde. Suspension virale type 0. . . . . . . . 100 ml Suspension virale type A.....................100 ml 20 Suspension virale type C. ......... .100 ml Glycidaldéhyde. . . .0,01^ Mayoiine (huile de vaseline) 2^0 ral Oleate d* anhydrohexitol 30 ml (Arlacel A) 25 Formule n°2 - Emulsion type eau-dans-huile de virus inactivés par le formol. Suspension virale type 0. Suspension virale type Suspension virale type C 30 pormaldéhyde Mayoiine (huile de vaseline), Oléate d1anhydrohexitol (Arlacel A)... JO ml Formule n°3 - Emulsion mixte de virus inactivés par la glycidaldéhyde . 35 Suspension virale type 0....... 100 ml Suspension virale type A ICO ml Suspension virale type C. 100 ml Glycidaldéhyde. » „ „ . 0S 015g Mayoiine (huile de vaseline) ■ 2'.'2,5ml Oléate d'anhydrohexitol(Arlacel A) V, mi 100 ml 100 ml 100 ml 0,06 g 270 ml BA0 or/gin*. COPY 70 17053 7 2088038 Emulgine (mélange spécial d'éther poly- glycolique d'alcool gras) 7,5 g Fomule n°4- Emulsion du type huile-dans-eau de virus inactivés par la glycidaldéhyde 5 Suspension virale type 0... 100 ml Suspension virale type A 100 ml Suspension virale type C 100 ml Glycidaldéhyde. 0,015g Mayoiine (huile de vaseline)... 270 ml 10 Emulgine (mélange spécial d'éther polygly- colique d'alcool gras) ~50 ml Pour toutes ces formules, la posologie habituelle pour assurer l'immunisation d'un porcelet de 30kg est de 35ml de vaccin trivalent. Cette posologie correspond à 2 000 000 à 4 000 000 de 15 cellules virales par dose vaccinante monovalente. On donne dans le tableau I annexé les caractéristiques physiques de deux vaccins 1 et 2 qui sont, l'un (l) une émulsion de type mixte et l'autre (2) une émulsion de type eau-dans-huile, et les réactions constatées chez les animaux ayant reçu ces vac-20 cins, soit par voie intra-musculaire, soit par voie sous-cutanée. Dans le tableau II annexé, sont donnés les résultats des tests de l'activité antigène de trois vaccins 1, 2 (monovalents)et 35 (trivalent). On voit d'après ces tableaux que le type de l'émulsion 25 utilisée, (eau-dans-huile ou émulsion mixte) a une grande incidence sur l'intensité des réactions locales, la tolérance à 1'émulsion mixte étant supérieure à la tolérance à l'émulsion eau-dans-huile, mais n'intervient pas de façon notable sur l'intensité de 1'immunité. 30 On a ainsi montré que la cellule I.B.R. constitue un substrat permettant la culture du virus aphteux et l'obtention de vaccins antiaphteux d'une excellente qualité immunogène pour l'espèce porcine et supérieurs aux vaccins obtenus avec d'autres cellules, par exemple, avec la cellule B.H.K. /voir pour les vaccins 35 obtenus avec cellules B.H.K. l'article publié dans le Bull. Off. Int. Epizooties, 1969» 71 (3-4), 285-3067. 70 17053 8 2088038 R_E_V_E_N_D_I_C_A_T_I_0_N_3 1 - Procédé de préparation d'un vaccin antiaphteux destiné à l'espèce porcine, caractérisé par le fait qu'on cultive le virus aphteux sur des cellules d'origine porcine, entretenues en lignée continue, et qu'après multiplication du virus et stérilisa- 5 tion des suspensions virales obtenues, on inactive celles-ci de façon connue et on émulsionne les virus inactivés avec un excipient huileux. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules d'origine porcine appartiennent à une 10 souche isolée par l'Institut de Bactériologie de Rio de Janeiro, et sont dénommées "cellules I.B.R. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'on cultive le virus aphteux sur monocouches cellulaires de 300.000 à 600.000 cellules d'origine por- p 15 cine par cm de surface. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que les virus servant à inoculer le milieu de culture proviennent de lymphe de porc. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par 20 le fait que les virus servant à l'inoculation ont subi 4 à 20 passages successifs sur cellules porcines ou toutes cellules sensibles au virus aphteux. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la durée de culture des virus sur cellules 25 d'origine porcine varie de 20 heures pour les virus peu adaptés (4 passages) à 6 heures pour les virus bien adaptés (20 passages). 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'on utilise,pour émulsionner les virus inactivés, un mélange d'éthers polyglycoliques d'alcools gras. 30 8 - Vaccin antiaphteux destiné à l'espèce porcine, carac térisé par le fait qu'on l'obtient par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6. T_A_B_L_E_A_U I Aspect macroscopique PH Vaccin 1 Type C, émulsion mixte homogène fluide 8,18 Résistivlté 153i"' cm Goutte sur l'eau s étale, très miscible Viscosité à la seringue aiguille de: 30/15 poids : 100g temps d'écoulement pour 10ml : 32s. Tolérance intramusculaire absence de granules huileux 1 mois après la vaccination absence de siîgpes inflammatoireg. rolérance sous cutanée oedème lac alise, se résorbant dans les jours qui suivent„ O O en UJ "-a h-1 M Vaccin 2 Type C, émulsion eau-dans-huile homogène visqueux 7,78 12500c cm ne s'étale pas non miscible temps d'écoulement pour 10ml supérieur ou égal à 15mn présence de réactions inflammatoires avec hui-lome 1 mois après vaccination oedème localisé mais important,se résorbant incomplètement K> O 00 00 O UJ 00 TABLEAU II RESULTATS Volume Durée d'immunisation Dose d'épreuve ( + ) Durée d'épreuve Lésions primaires Généralis aticns Vaccin 1 monovalent, type C 1 ml 28 jours virus C 10 000 DI 50 (porc) 8 jours 3E3E 7/9 0/9* Vaccin 2 monovalent, type C 1 ml 28 jours virus C 10 000 DI .50 (porc) 8 jours 2/9 0/9 Vaccin 3 trivalent, 3 ml 28 jours virus 0 10 000 DI 50 (porc) virus A 10 000 DI 50 (porc) virus C 10 000 DI 50 (porc) 8 jcHars 8 jours . 8 jours 1/5 2/5 5/9 0/5 0/5 0/9 * Nombre d'animaux présentant des lésions généralisées sur nombre d'animaux en expérience. ** Nombre d'animaux ayant présenté des lésions primaires au point d'inoculation du virus d'épreuve, sur nombre d'animaux d'expérience. (+)= la dose d'épreuve est exprimée en DI 50 (porc) c'est-à-dire en doses infectieuses 50$ pour le porc. ro o co oo o u> 00