Brevet FR2088100A1 — publié le 19720107

La présente invention se rapporte à un procédé de métachromasie qui permet la mise en évidence simultanée de la distribution intracellulaire de 1'ARN dans les tissus animaux et végétaux. La connaissance de la distribution de 1'ARN dans les cellules, ainsi que des modifications survenues dans cette même distribution, aussi bien dans la mitose que dans les différents processus pathologiques, est d'une importance particulière pour la biologie cellulaire. Dans ce but, on utilise de nombreuses méthodes dans la pratique. Ainsi, il existe certaines méthodes de métachromasie qui utilisent la propriété du bleu de toluidine et de l'azur A, I,II à òrme-r des associations colorées en rouge avec l'acide ribonucléique, les polysaecharidez acides et les graisses acides; toutefois, ces méthodes se sont a1es dépourvues de spécificité et de sélectivité. Dans ce but, on utilise la propriété de la pyronine à colorer en rouge les structures cellulaires de nature ribonucléique; toutefois, celleci ne permet pas de mettre en evidence l'ARN chromosomique et ne donne pas non plus d'indication sur la structure du nucléole. Enfin, on connaît des méthodes qui 'tllisent la microscopie électronique, d'autres l'autoradiographie, avec de l'uridinc traitée au tritium (H3) comme précurseur dans la biosynthèse de l'ARN, mais les deux procédés sont laborieux et exigent des appareils croûteux. Cette invention élimine les inconvénients des méthodes mentionnées cidessus, par le fait qu'elle introduit un procédé de mise en évidence de la distribution intracellulaire de 1'ARN, basé sur une réaction métachromatique, spécifique pour 1'ARN. Le procédé consiste à utïliser la propriété des colorants basiques du groupe de la thionine et surtout du bleu de toluidine, à colorer en rouge toutes les structures cellulaires de nature ribonucléique. t'étude porte sur pTép1raton des / microscopiques, préalablement traités au méthanol chlorhydrique, suivie d 'un traitement avec des ions uranyle. La spécificité du procédé est basée sur le fait que le traitement des coupes de tissus animaux et végétaux au méthanol chlorhydrique bloque les groupements -COOH (par méthylation) et les groupements -O-SO3H (par méthanolise) des polysaccharides acides en les empêchant ainsi d'intervenir dans la réaction métachromatique. De même, le colorant utilisé en solution hydroalcoolique empêche la réaction métachromatique des graisses acides cellulaires, étant donné que les moindres quantités d'alcool éliminent la métachromasie provoquée par ces graisses. Le traitement des produits avec des ions uranyle dans les conditions de travail de ce procédé, montre que seulement 1'ARN cellulaire, grâce aux groupements phosphate de sa molécule, forme des complexes métachromatiques stables avec le colorant, colorés en rouge, les autres structures cellulaires de nature non-ribonucléique se colorant orthochromatiquement, c'est-à-dire en bleu clair. Comme test pour l'application de ce procédé, on a choisi du foie de souris et de rat, de l'hépatome de rat, des larves de Chironomus tetans et de Drosophilla melanogaster et des morceaux de racines de certaines espèces végitales. On donne ci-dessous un exemple d'application du procédé selon l'invention : Des petits fragments de tissu animal (volume 1-2 mm ), des larves ou des pointes radiculaires (longueur 2-3 'mn) sont maintenus pendant 12-24 heures et à la température de 5-8 C dans une des solutions fixatives suivantes I. Solution d'acide chromique à 0,5 % ............. 8 ml Acide acétique glacial ............................... 0,4 ml Formol à 40 Z ..................... 1,6 ml II.Nitrate de cobalt............................... 0,1 Nitrate d'uranyle .............................. 0,1 Solution bichromate de potassium à 5 % ................ 3 ml Alcool éthylique ............................. 6 ml Ether éthylique ................................ 2 ml Formol à 40 % .................................. 4 ml Acide acétique glacial .......................... 1 ml La solution fixative se prépare au moment de l'utilisation, avec des substances pures pour analyses. Après la fixation, on lave les échantillons à l'eau froide, on les deshydrate, on les introduit dans la paraffine et on les sectionne en coupes de 3 a 5 microns, selon la technique usuelle. Après le déparaffinage, on divise les préparations en deux groupes : A et B. Les préparations du groupe A sont introduits pendant 20 minutes à la tempé " nethanelique a 50% " rature de 60 C dans une solution/de HC1 0,1 N, on les lave et on les déshydrate. Les préparations du groupe A ainsi traités, aussi bien que ceux du groupe B sont ensuite soumis au même traitement, à savoir : on introduit les préparations dans trois bains successifs de méthanol absolu et on les garde pendant une heure à 37O C dans du méthanol absolu contenant 0,8 ml de HC1 concentré (D = 1,19)pour 100 ml d'alcool.Après ce laps de temps, on retire les préparations on les lave au moins dix fois avec de l'eau distillée refroidie à 5-8 C, ensuite, on les introduit dans une solution d'acétate d'uranyle à 0,5-1 % dans du méthanol à 30 %, dans laquelle on les garde pendant une heure à la température du laboratoire; on lave ensuite les coupes au moins dix fois avec de l'eau refroidietà 5 - 8 C et on les garde, pendant dix minutes, à la température du laboratoire dans une solution tamponnée au pH = 3,4 - 3,6, ainsi préparée Solution 0,1 M d'acétate de sodium cristallisé ....... 12,5 ml Solution 0,1 M d'acide phosphorique ................... 8 ml Solution 0,1 M d'acide citrique ............................. 4 ml Eau bidistillée .................................. 45,5 ml Méthanol absolu ...................................... 30 ml ( le pH s'établit sur la solution sans méthanol) Enfin, on introduit les /préparations directement dans la solution de colorant fraîchement préparée, obtenue par la dissolution de 5 à 10 mg 7 de bleu de toluidine O (Merck) dans la solution tamponnée ci-dessus et gardée a la température du laboratoire, pendant 45-48 heures. Après ce laps de temps on retire préparationa les / , on les lave et on les déshydrate, ensuite on les monte dans du baume du Canada ou de préférence dans une résine synthétique. L'examen microscopique des ainsi obtenus montre que toutes les structures cellulaires de nature ribonuc aique sont colorées en rouge. Ainsi, 1'ARN cytoplasm-j-4 apparaît sous forme de nombreux grains extremement petits, colorés en rouge. L'ARN chromosomique se distingue sous forme de grains rouges disposés le long des chromosomes colorés en bleu lavande. L'ARN à partir des chromosomes gigantesques des glandes salivaires de Chironomus et Drosophilla se présentent sous forme de grains rouges disposés en bandes transversales. 1'ARN nucléolaire se trouve sous forme de grains rouges de différentes dimensions, enfoncés dans la matrice nucléolaire, elle aussi colorée en rouge. Le procédé peut aussi être appliqué avec succès à l'étude du comportement du nucléole pendant la mitose, problème actuel dans la biologie cellulaire pouvant donner des indications importantes sur la variation de la forme, du volume, de la structure et du nombre des nucléoles dans les processus de czncé- risation; il fournit également des précisions liées à la fonction des chromosomes organisateurs de nucléoles, ainsi qu'à l'origine des micronucléoles, nucléolines et caryosomes. REVENDICATION Procédé de détermination de la distribution intracellulaire de 1'ARN (cytoplasmique, chromosomique et nucléofaire', caractérisé en ce qu'il consiste à colorer des coupes de tissus animaux et végétaux fixées, avec du bleu de toluidine en solution tamponnée hydroalcoolique à la concentration de 5 à 10 mg %, coupes préalablement traitées à l'alcool méthylique contenant 0,8 ml % d'acide chlorhydrique puis avec une solution hydroalcoolique d'acétate d'uranyle à 0,5 - 1 g 7.