Brevet FR2100518A1 — publié le 19720324

Le cytochrome C est un pigment respiratoire cellulaire constitué par un noyau porph-rinique contenant du fer et par une partie protéique. Sa teneur en fer est de 0,45 p. 100 et son pois moléculaire est voisin de 12.000. I1 est présent dans toutes les cellules vivantes où, en combinaison avec des enzvmes spécifiques (réductases ou oxydases) et en présence d'accepteurs o de donneurs d'électrons, il joue un rôle fondamental dans les phénomènes d'oxydoréduction indispensables à la vie des cell-les. Son fer passe alternativement de la valence +2 (ferrocytoclirome) à la valence + 3 (ferricytochrome).C'est pour ses propriétés oxydo-réductrices que le cytochrome C est actuellement utilisé en thérapeutique par voie parentérale. Pour cette utilisation il est absolument nécessaire d'obtenir un-cytochrome C dépourvu de toute contamination par des protéines étrangères. La Demanderesse a mis au point une technique originale de purification permettant d'éliminer les protéines étrangères et d'obtenir un cytochrome C approprié à 1' usage par voie parentérale.L'invention vise donc un procédé faisant intervenir une technique de séparation à l'aide d'un gel po lyacfl-lamide-agarose sous forme de perles calibrées, d'un diamètre compris entre I00 et I60 f Elles sont constituées par une trame tridimensionnelle de polyacrylamide plus ou moins serrée suivant la concentration en acrylamide et par un gel d'agarose qui se distribue à l'intérieur des mailles de- polvacrvlamide. La plus ou moins grande finesse de la trame de polyacrylamide joue le rôle de tamis moléculaire, seules les molécules dont la taille est inférieure à celle des mailles pouvant entrer dans le gel et être de ce fait plus ou moins retardées au cours de leur passage sur la colonne de gel, les plus petites sortant les dernières. Par contre les molécules trop grosses sont exclues du gel et sortent dès que le volume de l'éluat est égal au volume de la solution contenue entre les perles L'on a fait la constatation que le gel à uEliser de préférence est celui qui contient 6 p I00 d'acrlamlde et f p. I00 d'agarose. D'autres gels, en particulier le gel qui contient 6 p. I00 d'acrylamide et 2 p. I00 d'ayarose peuvent également être utilisés, mais le cytochrome est moins bien séparé.Dans le cas du gel à 6 p. I00 acrx71amide - 4 p. I00 d'agarose toutes les molécules protéiques étrangères sortent de la colonne de gel bien avant le cytochrome qui est nettement séparé. L'éluat recueilli est dialysé pour éliminer le tampon puis lyophilisé. N'importe quelle solution tampon peut etre utilisée, mais il est préférable que sa force ionique soit comprise entre O,OT X et 0,05 M et que son pH se situe entre 7 et 8. EXEMPLE Préparer ne colonne de gel de I00 mm de diamètre et de I.500 mm de hauteur de la façon suivante : prélever 10 litres de gel hydraté et les mettre en suspension dans 2.500 litre de solution tampon tris-hydroxy-aminométhane-acide chlorhydrique 0;05 M à pH 7,4. Agiter 30 minutes puis verser cette suspension sur un entonnoir situé au-dessus de la colonne déjà remplie à moitié par la solution tam pon, la suspension étant agitée mécaniquement sur l'entonnoir. De cette manière les perles se sédimentent naturellement et de façon homogane. Laisser s'écouler le tampon puis verser-sur la-surface du gel la solution de cytochrome (I0 g dans 20 ml de solution tampon). Lorsque celui-ci a pénétré dans le gel, verser à nouveau 20 ml de solution tampon, laisser couler la colonne puis alimenter avec la solution tampon. Kler le débit d'écoulement à I20 mlXheu- re. La première fraction protéique qui sort de la colonne contient toutes les protéines étrangères. Le cytochrome C sort en une deu rième fraction nettement séparée de la première. Cette fraction colorée ne contient que du cytochrome. Recueillir cette fraction, la dialyser puis après filtration sur plaque stérilisante, le lvophi- liser stérilement. REVENDICATIONS I - Procédé pour l'obtention de Cytochrome C pur à partir de solutions de Cytochrome C souillées d'impuretés protéiniques, caractérisé en ce que l'on fait passer la solution impure sur une colonne de gel de perles de polyacr-lamide-agarose et à ne recueillir que la fraction colorée qui contient le cytochrome C pur. 2 - Procédé selon I, caractérisé en- ce que les perles sont calibrées à I00-I60r. 3 - Procédé selon I et 2, caractérisé en ce que les proportions d'acrvlamide et d'agarose dans le gel sont de 6 % et de 4 % respectivement. 4 - Cytochrome C purifié, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon I à 3.