Brevet FR2073443A1 — publié le 19711001

-1- 2073443 L'invention concerne une composition de streptokinase chimiquement liée à un support de carbohydrate ainsi que son procédé de fabrication. La streptokinase est un enzyme connu pour son pouvoir dissol-5 vant de divers types de caillots sanguins, aussi bien dans le corps humain, qu'in vitro. Cependant on rencontre un certain nombre de difficultés dans l'emploi de cet enzyme dans les traitements thérapeutiques. Les anticorps de la streptokinase se trouvent présents dans le sang de pratiquement tous les êtres 10 humains, mais le niveau ou "titre" de ces anticorps varie dans de larges mesures d'un individu à un autre. Pour qu'un traitement par la streptokinase se révèle efficace, il est donc nécessaire de titrer le sang du patient, afin de déterminer la dose initiale convenable d'enzyme, suffisante pour neutraliser les anticorps 15 présents dans le sang et pour fournir un niveau convenable de streptokinase, susceptible de fonctionner comme on le désire, tout en évitant les effets nuisibles d'une dose excessive de streptokinase. De plus, au cours dû traitement, la concentration des anti-20 corps spécifiques à cet enzyme, augmente chez le patient, de sorte qu'un traitement ultérieur à la streptokinase peut nécessiter une dose accrue de celle-ci. Une dose ultérieure peut aussi se révéler dangereuse, car le patient peut être sensibilisé à cet enzyme, et subir une grave réaction allergique. 25 Les doses de l'enzyme doivent tout d'abord être convenables pour dissoudre efficacement les caillots de sang, et elles doivent être administrées de façon répétée ou continue, généralement par infiltration intraveineuse, puisque l'enzyme est métabo-lisé par le corps humain, en un temps relativement court. 30 Le besoin s'est donc fait sentir pour une substance présentant l'activité de la streptokinase, de stabilité accrue dans le corps humain, et moins susceptible d'être neutralisée par les anticorps présents dans le sang, afin de rendre, possible une diminution de la dose et de la fréquence de son administration. 35 Une telle diminution a également pour effet de réduire le danger des réactions allergiques et autres effets secondaires.- Les compositions de l'invention, qui répondent- à ces qualités, comprennent une partie en poids de streptokinase chimiquement 70 41485 2073443 liée à 1 à 500r de préférence 10 à 200, parties en poids, d'un support de carbohydrate. Ces compositions présentent l'activité de la streptokinase, au point de vue de leur pouvoir dissolvant, mais leur stabilité dans le sang est améliorée et elles sont 5 moins susceptibles d'être inactivées par les anticorps du sang, comparativement à la streptokinase libre. De ce fait, il devient souvent inutile de titrer le sang du patient, et l'on peut plus facilement utiliser une dose standard pour dissoudre les caillots de sang ou traiter les embolies ou autres affections sem-10 blables. De préférence, la streptokinase est liée par liaisons cova-lentes au support de carbohydrate qui est dispersible ou soluble dans l'eau, de sorte que le produit chimique formé puisse former des solutions colloïdales dont les particules sont de dimensions 15 inférieures à environ 2 microns» De telles solutions colloïdales de streptokinase chimiquement liée à un carbohydrate, sont directement injectables et peuvent circuler librement dans le sang sans provoquer d'effets secondaires notoires dus au blocage des capillaires et petits vaisseaux sanguins. La streptokinase chi-20 miquement liée est ainsi amenée au contact du caillot sur lequel elle agit. La streptokinase est produite à partir de diverses souches de Streptococcus hemolyticus comme les streptocoques du groupe A et du groupe Lancefield C. La culture du streptocoques sélec-25 tionnés et l'isolement de la streptokinase brute, se font de façon usuelle. On peut éliminer les pyrogènes de la préparation de streptokinase, comme décrit dans le brevet américain n° 3.255.094. Les milieux constituant le support, ou la matrice de la strep-30 tokinase, selon l'invention, sont des carbohydrates comme la cellulose, le dextrane, l'amidon, les dextrines, ou autres poly-saccharides, ayant de préférence un poids moléculaire d'environ 70o000 à 500.000. Par le terme "carbohydrates", on désigne aussi, ici, les dérivés de carbohydrates, y compris les dérivés conte-35 nant un métal alcalin, des polymères contenant des carbohydrates, comme les copolymères de sucrose et d'épichlorhydrine, les carbohydrates éthérifiés par des groupes aminoalkyles, comme le groupe aminoéthyle, et des dérivés carboxylés, comme les carboxyéthyl- 70 41485 -3- 2073443 cellulose, c arboxyméthyld extr ane et autres carboxyalkylcarbo-hydrates, tels que le carboxypropyldextrane et autres dérivés semblables, le support de carbohydrate est de préférence chimiquement modifié, afin de fournir des sites de liaisons pour la 5 streptokinase. Un support de carbohydrate contenant des groupes acides car-boxylés, comme les carboxyalkylcarbohydrates, peut être transformé en azothydrure, comme décrit dans l'exemple 1 ci-après. On fait ensuite réagir directement 1'azothydrure avec la strepto-10 kinase, généralement à basse température, entre environ 0°C et 10°G, pour obtenir un produit d'addition à liaisons covalentes, de la streptokinase et du carbohydrate, de formule E —j^(CH2)n0 — E' , où E est le carbohydrate, relié par un 15 atome d'oxygène au motif entre crochets, B' est la streptokinase reliée au même motif par un azote aminé ou un soufre du groupe sulfhydryle, ces atomes de la streptokinase étant considérés avant réaction de ce composé, et n est un nombre entier positif, de préférence égal à 1 ou 2. 20 Selon m autre procédé pour former une liaison chimique entre un support de carbohydrate carboxylé et la streptokinase, on ajoute un diorganocarbodiimide à un mélange du support de carbohydrate et de streptokinase, comme décrit dans les exemples 4- à 6 ci-après, pour former un produit dans lequel les groupes carbo- 25 nyles des acides carboxyliques sont directement reliés à la streptokinase, de préférence aux atomes d'azote aminé de celle-ci. le support de carbohydrate peut être relié par liaisons covalentes à la streptokinase, comme décrit dans l'exemple 3, par l'intermédiaire d'une triazine de formule : 30 ^Cl S % Cl G 35 Les liaisons covalentes entre carbohydrate et streptokinase s'établissent par 11 intermédiaire du motif entre crochets, suivant la formule : 70 41485 2073443 R' R y—*x C N X où R et R' ont la même signification que précédemment et X est un atome d'halogène, d'hydrogène ou un radical hydrocarbure mono-10 valent, ne contenant pas plus d'environ 4- atomes de carbone. Lorsque X est un halogène, il peut aussi être substitué par un groupe R ou R1. Le support de carbohydrate peut encore être chimiquement lié à la streptokinase, au moyen du bromure de cyanogène, comme dé-15 crit dans l'Exemple 6. La réaction est généralement effectuée en milieu alcalin, par exemple à un pH d*au moins 7,5» de préférence 11. Les compositions de l'invention peuvent être appliquées pour dissoudre des caillots de sang par administration d'une solution 20 colloïdale dans la région du caillot, ou en faisant circuler le sang ou plasma à travers un lit d'une composition insoluble de l'invention. Dans ce cas, il est généralement préférable d'utiliser des particules de plus grandes dimensions, généralement visibles. Selon un mode de réalisation d'un circuit in vitro, des 25 particules mobiles de l'invention sont placées dans une cartouche, reliéepar une extrémité à une tubulure d'entrée du sang ou plasma ou autre solution, qui passe à travers la composition de particules et traverse généralement un filtre à la sortie. On peut, si on le désire, prélever directement le sang du patient, puis 30 le lui administrer après traitement. Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des colonnes usuelles de réaction, ou encore on peut imprégner la composition de l'invention dans une matrice, comme du silicone élastomère, que l'on incorpore dans une tubulure à travers la-35 quelle on fait passer le fluide à traiter. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. 70 41485 -5- 2073443 10 15 20 25 30 Exemple 1 On chauffe à reflux pendant 4 heures, 10 g du sel de sodium de carboxyméthyl-dextrane, d'un poids moléculaire moyen en poids d'environ 100.000, 15 ml d'HGl concentré et 250 ml de méthanol. On chasse le solvant par distillation sous vide, et on forme une suspension du résidu dans 50 ml de méthanol. On ajoute une solution à 20 % d'hydrazine dans le méthanol et on agite jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité "blanc. On agite le précipité pendant 4 heures, on filtre et on sèche. On forme une suspension de 5 g de ce précipité dans 150 ml d'HCl à 2 %, on refroidit entre 0 et 5°G, et on ajoute lentement, tout en agitant, une. solution diluée d'acide nitrique en excès. le précipité obtenu est lavé au méthanol. Il se compose surtout de dextrane, contenant des motifs -CB^C ——liés aux atomes d'oxygène du dextrane, et on le désigne sous le nom d'azoë-hydrure de dextrane. Après lavage, on le redissout dans une solution aqueuse de phosphate disodique, environ 0,05 à 0,1 M, et de chlorure de sodium à 0,9 % en poids, dont le pH est ajusté à environ 7,0. la concentration de 1'azothydrure de dextrane est ajustée à environ 25 a 50 mg par ml de la solution tampon de phosphate. On dissout de la streptokinase purifiée dans cette solution, à la concentration d'environ 100.000 unités d'enzyme par ml de solution et on laisse reposer pendant environ 12 heures Q-'unité d'enzyme étant définie selon les normes des Instituts Nationaux de la Santé). On fait passer le mélange ainsi obtenu sur un tamis moléculaire composé, par exemple, de dextrane réticulé ou de poly-acrylamide, vendus sous les dénominations commerciales respectives de Sephadex 150 ou Sephadex 200 et Biogel P. Le filtrat obtenu est une solution de dextrane, lié par liaisons covalentes à la streptokinase, à travers le motif entre crochets tif par un atome d'oxygène, et H' est la streptokinase, probablement liée en majeure partie par ses atomes d'azote aminé. La streptokinase libre est absorbée par le tamis moléculaire et peut être récupérée par lavage ultérieur. où E est le dextrane, lié au mo- 70 41485 -6- 2073443 10 15 20 25 30 Le produit ainsi obtenu dissout les caillots de sang, et présente une meilleure stabilité à température ambiante ou élevée, On peut aussi séparer la streptokinase libre de la composition de destrane-streptokinase, liés par liaisons covalentes, en précipitant la streptokinase libre par le sulfate d'ammonium, puis en éliminant le précipité par filtration ou centrifugation. On peut éliminer le sel en excès, et autres substances ioniques de la solution de dextrane-streptokinase, par dialyse ou tout autre procédé usuel. On obtient des résultats semblables en répétant le processus de l'exemple 1 avec un carboxyéthyldextrane de poids moléculaire moyen en poids d'environ 300.000, à la place du sel de sodium de carboxymétbyldextrane. Après avoir préparé 1'azothydrure de dextrane qu'on filtrej on obtient de bons résultats en le dissolvant jusqu'à saturation dans une solution 0,05 M de tris-Çhydroayméthyl) ami nométhane tampon, de pE environ 8,0, la streptokinase purifiée étant introduite dans cette solution, et agitée pendant environ 16 heures. Exemple 3 A - On dissout un dextrane de poids moléculaire d'environ 200.000, dans une solution saturée de bicarbonate de sodium. On ajoute du trichlorure de cyanogène à une concentration correspondant à environ une mole de trichlorure par mole de groupe -ONa présent sur le dextrane. Après agitation pendant environ 1 heure à température ambiante, on filtre le mélange pour éliminer toutes substances insolubles, puis on dialyse en présence de bicarbonate de sodium en solution saturée,' pour éliminer le trichlorure en excès. On ajoute la streptokinase purifiée en quantité convenable pour obtenir environ 100.000 unités d'enzyme par ml de solution contenant le produit de réaction trichlorure de cyanogène-dextra-ne dissous, et on laisse le mélange réagir pendant environ 14 heures à 5°C. On sépare toute streptokinase libre du composé co-valent dextrane-streptokynase obtenu, en faisant passer la composition sur un tamis moléculaire, ou.par précipitation au sulfate d'ammonium. comparativement à la streptokinase libre 70 41485 -7- 2073443 Le produit obtenu présente un pouvoir dissolvant vis à vis des caillots de sang, et une stabilité accrue comparativement à la streptokinase libre. B - On obtient des résultats semblables en remplaçant le dex-5 trane par un polymère contenant du suerose (tel que le copoly-mère de sucrose et d'épichlorhydrine vendu sous la dénomination commerciale de Ficoll par la Société dite Pharmacia of Uppsala) de poids moléculaire moyen en poids de 400.000, ou en remplaçant le trichlorure de cyanogène par l'un des composés A à G désignés 10 ci-après, tous de formule générale : X I N N 15 Cl—G G Cl ïr où X représente l'un des radicaux suivants : Composé A bromure 20 B méthyle C hydrogène D isopropyle E n-butyle 3? iodore 25 G allyle Exemple 4 On introduit environ 30 à 50 mg de carboxyméthyl-cellulose dans un flacon d'Erlenmeyer de 25 ml et on y ajoute de l'acide chlorhydrique dilué, goutte à goutte, pour ajuster le pH, entre 30 4 et 5* On ajoute ensuite entre 3 et 5 mg de dicyclohexylcarbo-diimide et 0,2 à 0,5 mole de tétrahydrofurane, comme agent solubilisant, puis on agite pendant 12 à 16 heures, le pH étant maintenu égal ou supérieur à 4, pat addition périodique de bi-•carbonate de sodium. 35 Le produit obtenu est filtré, lavé à l'eau, puis remis en suspension dans 2 ml de phosphate de potassium tampon 0,10 M, à pïï 6,5, auquel on ajoute ensuite 2 ml de NaCl aqueux 0,5 M, contenant 2 mg de streptokinase purifiée. Le produit formé contient 70 41485 -8- 2073443 de la cellulose qui est liée à la streptokinase à travers le motif entre crochets de la formule : R' 5 où R est la cellulose liée-par un atome d'oxygène libre et R' est la streptokinase. On pense que la majeure partie des liaisons de la streptokinase se font par ses atomes d'azote aminé. Le produit obtenu présente un pouvoir de décomposition des 'lo caillots de sang. On obtient des résultats semblables en remplaçant la carboxy-méthyl-cellulose par un copolymère carboxyméthylé de sucrose et d'épichlorhydrine de poids moléculaire moyen en poids d'environ 400.000. 15 Exemple 5 On obtient des résultats semblables à ceux de l'exemple 4 en remplaçant le dicyclohexylcarbodiimide par le 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl)-4-éthylcarbodiimide méthyl-p-toluène-suifonate ou le 4-morpholinodiméthylaminopropylcarbodiimide, en l'absence 20 de tétrahydrofurane. Exemple 6 On obtient des résultats semblables à ceux de l'exemple 4 en employant l'un quelconque des carbodiimides suivants, en présence de tétrahydrofurane.ou de tout autre agent solubilisant, si né-25 cessaire : carbodiimide diméthylcarbodiimide diéthylcarbodiimide diisopropylcarbodiimide 30 di-sec-butylcarbodiimide diphénylc arb odi imide dibenzylc arbodiimide di oc tylc arb odi imide 1-é thoxyé thyl-3-ami noé thylc arb odiimide. 35 Exemple 7 On dissout 2 g de bromure de cyanogène dans 50 ml d'eau distillée, dont le pïï est ajusté à 11,5 par addition d'une solution aqueuse de soude. On ajoute 2 g de dextrane de poids moléculaire R CH2C / 70 41485 -9- 2073443 moyen en poids de 500.000, et on agite la suspension avec un agitateur aimanté pendant environ 1/2 heure. On précipite le dextrane par addition d'éthanol à 50 %, puis on centrifuge et lave à l'éthanol absolu. L'excès d'éthanol est chassé sous vide. 5 On dissout 500 mg du produit obtenu, dont la structure n'est pas exactement connue, dans 5 ml de phosphate de sodium 0,10 M, tampon de pH 7»5> et on ajoute 5 mg de streptokinase. On agite pendant 16 heures, tout en maintenant la température à 4°G. Le produit obtenu se compose de dextrane chimiquement lié 10 à la streptokinase, et son pouvoir de dissolution des caillots de sang est semblable à celui de la streptokinase. On obtient des résultats semblables en substituant un copoly-mère du commerce de sucrose et d'épichlorhydrine au dextrane, dans l'essai décrit ci-dessus. 15 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. 70 41485 -10- 2073443 - BEVHroiOAEtQKB - 1 - Composition caractérisée en ce qu'elle consiste en 1 partie en poids de streptokinase chimiquement liée à 1 à 500 parties en poids d'un support de carbohydrate. 5 2 - Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la streptokinase est liée par liaisons covalentes au support de carbohydrate. 3 - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que ledit support comprend du dextrane. 10 4- - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que ledit support comprend un polymère contenant du sucrose. 5 - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce qugiedit support comprend de la cellulose. 6 - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en 15 ce que ledit support de carbohydrate est modifié par des groupes contenant de l'acide carboxylique. 7 - Composition suivant la revendication 6, caractérisée en ce que ledit support est un carbohydrate modifié par des groupes c arb oxyalkylé s. 20 8 - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que 10 à 200 parties en poids du support de carbohydrate sont présentes pour 1 partie en poids de streptokinase. 9 - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que la streptokinase est reliée au carbohydrate par l'inter-25 médiaire du motif entre crochets dans la formule : E- //° (CH2)nC - E' où E est le carbohydrate lié par un de ses atomes d'oxygène, E' est la streptokinase liée par un de ses atomes et n est un 30 nombre entier positif. 10 - Composition suivant la revendication 9, caractérisée en ce que n est égal à 1 ou 2. 11 - Composition suivant la revendication 10, caractérisée en ce que le support se compose de dextrane carboxyalkylé. 35 12 - Composition suivant la revendication 10, caractérisée en ce que le support est un copolymère carboxyalkylé de sucrose et d'épichlorhydrine. -11- 70 41485 207344? 10 15 20 25 30 13 - Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que la streptokinase est liée au carbohydrate par l'intermédiaire du motif entre crochets dans la formule : où R est le carbohydrate relié par un atome d'oxygène, R' est la streptokinase et X est un radical hydrocarbure monovalent ne contenant pas plus de 4- atomes de carbone, ou un atome d'hydrogène, ou d'halogène, ou un groupe R ou R*. 14 - Composition suivant la revendication 13» caractérisée en ce que le support est un copolymère de sucrose et d'épichlorhydrine . 15 - Composition suivant la revendication 13» caractérisée en ce que le substituant X est un atome de chlore. 16 - Procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir un carbohydrate avec du bromure de cyanogène, en milieu alcalin, pour obtenir un produit dont on fait ensuite réagir 1 à 500 parties en poids avec 1 partie en poids de streptokinase pour former un produit d'addition de carbohydrate et de streptokinase chimiquement liés. 17 - Produit d'addition à liaisons chimiques, obtenu selon le procédé suivant la revendication 16o 18 - Composition suivant la revendication 17» caractérisée en ce que l'on fait réagir de 10 à 200 parties en poids du produit de la réaction avec 1 partie en poids de streptokinase. 19 - Composition suivant la revendication 18, caractérisée en ce que l'on obtient le produit de la réaction en un milieu alcalin à un pH d'au moins 11. 20 Procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir 1 à 500 parties en poids d'un carbohydrate comportant des groupes R* -12- 70 41485 2073443 reliés aux atomes d'oxygène dudit carbohydrate, avec 1 partie en poids de streptokinase, pour former un produit d'addition à liaisons covalentes, du carbohydrate et de la streptokinase, où n est un nombre entier positif. 5 21 - Procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir de 1 à 500 parties en poids du produit de réaction d'un carbohydrate et d'un diorganocarbodiimide, avec 1 partie en poids de streptokinase pour former un produit d'addition à liaisons covalentes dudit carbohydrate et de la streptokinase. 10 22 - Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que ledit carbodiimide appartient au groupe des dicyclohexyl-carbodiimide, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl)-4-éthylcarbodiimide méthyl-p-toluène-sulfonate, et 4-morpholino-diméthylaminopropyl-carbodiimide. 15 23 - Procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir de 1 à 500 parties en poids du produit de la réaction d'un carbohydrate et d'un composé de formule : / 01 20 Cl C •H=C ^ X où X est un atome d'halogène ou d'hydrogène ou un radical hydrocarbure ne contenant pas plus de 4 atomes de carbone, avec 1 par- ^5 tie en poids de streptokinase, pour former un produit d'addition à liaisons covalentes, dudit carbohydrate et de la streptokinase. 24 - Procédé de dissolution de caillots d* sang présents dans un être vivant, caractérisé en ce que l'on met au contact du caillot sanguin une composition comprenant 1 partie en poids 30 de streptokinase chimiquement liée à 1 à 500 parties en poids d'un support de carbohydrate. 25 - Procédé suivant la revendication 24, caractérisé en ce que ladite composition est directement administrée à l'être vivant sous forme d'une suspension colloïdale de particules de 35 dimensions inférieures à environ 2 microns.