Brevet FR2101095A1 — publié le 19720331

La présente invention a pour objet une composition thérapeutique notamment pour le traitement des affections provoquées par les hyperhistaminémies, ainsi que des prou dés de pPUparation de cette composition. On sait déjà que le sérum foeto-placentaire possède un pouvoir anti-histaminique et lton estimait que ce pouvoir était du à une enzyme spécifique, la diamine-oxydase ou histaminase dont le taux négligeable dans le sérum normal est beaucoup plus élevé au cours de la grossesse. Des essais ont été faits pour purifier cette enzyme dont on soupçonnait 11 existence, notamment par R. KAPPELER ADLER, Clin. Chim. Acta 2 191-193 (1965), qui ont opéré à partir de placenta perfusé par solubilisation dans Nacl à 1% et précipitation en présence de sulfate d'ammonium. Cette purification a été ensuite poursuivie par J.K. SMITH, Biochem. J. 103 110-119 (1967), par certains procédés de chromatographie.Les extraits obtenus étaient contaminés, notamment par la méthémoglobine, et aucune action thérapeutique de ces extraits nta été démontrée. La présente invention se propose de fournir une composition thérapeutique permettant le traitement de l'hyperhistaminémie et qui soit susceptible notamment d'être obtenue à partir de placenta humain brut congelé, permettant ainsi une fabrication à grande échelle de cette composition. L'invention a pour objet une composition thérapeutique, notamment pour le traitement de lthyperhistaminémie, caractérisée par le fait qu'elle contient une diamine-oxydase obtenue à partir du placenta humain par élimination quasi-complète de l'hémoglobine et de ses dérivés, ladite diamine étant formée d'un mélange de quatre formes moléculaires dont les poids moléculaire-s sont des multiples entiers de un à quatre de 125.000 - 5.000 > ladite diamine-oxydase étant caractérisée par le fait qu'elle catalyse l'oxydation de 1 t histamine, de la putrescine et de la cadavérine, mais non 11 oxydation de la phényléthylamine et de la tyramine. Dans une variante particulière de l'invention, la diamineoxydase est mélangée à du sérum ou du plasma. Dans une autre variante de l'invention, la composition peut comporter des ions Mn++. Enfin la composition peut avantageusement comporter des gammaglobulines et/ou des antihistaminiques de synthèse. L'association de la diamine-oxydase avec des gammaglobulines renforce l'activité antiallergique de la gammaglobuline seule en introduisant un mode d'action complémentaire. En effet, les gammaglobulines humaines d'origine de sang veineux ou placentaire ne renferment pas de diamine-oxydase, ou seulement des traces audessous du seuil d'action. De plus, il est possible de réaliser une association de diamine-oxydase et d'albumine 5% humaine. L'action est stabilisante et l'albumine constitue un excellent support de lyophilisation. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de composition thérapeutique pour le traitement de l'hyperhistami- némie, caractérisé par le fait que l'on broie une certaine quantité de placenta, que l'on lave le placenta ainsi broyé à l'acétone de préférence à basse température, que l'on met la poudre obtenue en suspension dans une solution de NaGl , que l'on sépare ensuite la solution de la suspension, et que l'on effectue des précipitations fractionnées à l'alcool éthylique. Dans une variante de ce procédé, la solution, avant précipitation à I'éthanol, peut être acidifiée avec HC , le précipité ainsi obtenu étant remis en solution dans Nazi. Conformément à l'invention, il est possible de poursuivre la purification en dissolvant le précipité après l'avoir éventuellement lyophilisé puis en soumettant cette solution à des électrophorèses ou des chromatographies. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention appa raîtront en se référant à la description suivante ainsi qu'au dessin annexé, dans lequel - la figure 1 représente un graphique montrant la cinétique de la décomposition de l'histamine par l'histaminase placentaire A313. - la figure 2 représente, sur un graphique, l'inhibition de l'activité histaminique par excès d'extrait placentaire. - la figure 3 représente, sur un graphique, l'influence des ions métalliques sur la cinétique de lX décomposition de l'hista- mine. - la figure 4 reprVdente, sur un graphique, les actions comparées sur l'histdrnine, la putrescine et la cadavérine. - la figura 5 représente, sur un graphique, l'activation de l'histomlnase par le manganèse et l'hémoglobine. - la figure 6 représente, sur un graphique, l'influence du temps de préincubation sur l'activité histaminasique. - la figure 7 représente, sur un graphique, l'oxydation de l'histamine par l'histaminase placentaire en présence de plasma humain. PREPARATION DE LA COMPOSITION Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on broie 100 grammes de placenta congelé, débarrassé au maximum des cordons ombilicaux, que l'on lave quatre fois par 100 ml d'acétone à - 200 C. On effectue ensuite une lyophilisation et l'on obtient en moyenne environ 17,4 grammes de poudre acétonique lyophilisée. Cette poudre, conservée à - 250 C, est stable. 8,7 grammes de cette poudre sont mis en suspension dans 100 ml de NaCI S 1% à + 40C. Le temps optimal d'extraction est de quatre heures. Cette suspension est ensuite centrifugée vingt minutes à 20.000 g à + 4 C. On obtient ainsi une solution A. La solution A est ensuite traitée à l'alcool par exemple jusqu'à obtenir 30% d'alcool (% en volume d'alcool à 950) et l'on obtient alors un précipité A3. Le surnageant est éliminé et le précipité A3 est dissous dans 120 ml de solution Nacl à 1%. Une nouvelle précipitation à l'alcool éthylique est faite à environ 10% d'alcool, ce qui permet d'obtenir un nouveau précipité A31. Le surnageant S31 est ensuite précipité à 30% d'alcool, ce qui permet d'obtenir un précipité A313 qui, une fois lyophilisé, pèse 1,056 g. L'obtention de ce précipité A313 a permis d'éliminer la majeure partie de l'hémoglobine. La purification peut se poursuivre à partir du précipité A313 par électrophorèse ou par chromatographie sur CM Séphadex. Dans ce but, le précipité A313 est lyophilisé puis dissous dans NaCi à 1%. On effectue ensuite, soit des électrophorèses par exemple à pH 6,2 ou pH 6,8, soit des chromatographies sur CM Séphadex C-50 à pH 7 pour éluer l'histaminase en retenant l'hémo- globine restante. Le tableau I indique les caractéristiques des différents extraits précités, l'activité histaminase étant définie comme la quantité d'histamine oxydée en trois heures d'incubation à 37 C par 1 mg de protéine, les protéines des extraits étant dosées par spectrophotométrie à 280 mp. TABLEAU I Rapport des Activité Activité Nature de densités histaminase correspondant à l'extrait optiques à en umole 100 g de placenta 408 mu et 3h/mg de congelé 280 mu protéine Solution A 1,85 0,00034 14,6 Précipité A313 0,93 0,00496 35,8 A partir du précipité A313 Electrophorèse 6,2 0,0158 12,2 Electrophorèse 6,8 0,62 0,0333 14,3 Chromatographie CM-Séphadex C-50 0,40 0,0212 16,8 p/2 = 0,60 Le rapport des densités optiques entre 408 mu et 280 mu des différents extraits enzymatiques en solution permet de mesurer la richesse des groupements hème d'un extrait (plus ce rapport est élevé, plus. l'extrait enzymatique a une teneur élevée en hémoglopine). L'activité histaminase a été précédemment définie. L'activité correspondant à 100 g de placenta est la quantité 'histamine (en umole) oxydée en trois heures d'incubation à 370 C par l'histaminase extraite de 100 g de placenta congelé. Dans une variante, au lieu de préparer l'extraitA313, on part du surnageant à pH 7,2 à 30% d'alcool que l'on acidifie avec HCl normal jusqu'à un pH 6,2. Le précipité ainsi obtenu est remis en solution dans NaCl à 1%. On continue ensuite la précipitation fractionnée à l'alcool, comme précédemment. L'extrait final lyophilisé qui est obtenu est désigné par M313. La purification des extraits A313 ou M313 peut être poursuivie comme représentée sur le tableau ci-dessous. TABLEAU II A313 M313 Chromatographie sur CM Séphadex C-50 s, Solution Cm t Adsorption sur phosphate de manganèse et élution Solution Mn Chromatographie sur DEAE-cellulose ; Solution De Dans ce tableau, on agit par exemple de la manière suivante 2 g de M313 sont dissous dans 30 ml de tampon phosphate 0,10 M + 10-4 en Mn C12, le pH étant de 6,80. Cette solution est déposée sur une colonne de CM Séphadex C-50 (40 cm x 5,6 cm) équilibrée avec le même tampon.L'élution par le tampon de même pH et de même force ionique est rapide. Les fractions protéiques qui migrent les premières jusqu'à un rapport de densité optique égal à 0,80 sont rassemblées et la solution récupérée est désignée par CM. On ajoute ensuite à 100 ml de la solution CM, 20 ml d'une solution Mn Cl2 0,5 M, le pH étant réajusté à 6,8, l'adsorption s'effectuant en trente minutes à + 40 G sous agitation et étant suivie d'une centrifugation. Le précipité ainsi obtenu est repris dans 100 ml de tampon phosphate 0,10 M pH 6,80 et agité, puis centrifugé. Le précipité est éliminé et on obtient le surnageant ou solution Mn. 40 ml de l'extrait Mn sont ensuite déposée sur une colonne de faible hauteur de DEAE-cellulose équilibrée avec le tampon phosphate 0,20 M pH 6,8 (+ 10 4M en Mn C12). La colonne est lavée avec ce même tampon, puis on effectue une élution et lton récupère la solution active De. Le tableau III groupe les caractéristiques de ces différents extraits successifs. TABLEAU III Volume R 408/280 As (1) Taux de Ag % de récuou purifi- (1) pération Poids cation (2) Placenta Congelé 1 kg 0,00008 Extrait au Na Cl 2000 ml 1,80 0,00022 2,4 82 Précipité 5,09 g 1,18 0,00695 36,2 121 149% alcoolique /1000 ml Chromatogra phie sur CM 438 ml 0,47 0,01650 2,0 41 34% Séphadex (CM) Fixation sur phosphate de 312 ml 0,30 0,02040 1,4 8,6 21% manganèse (Mn) Chromatogra phie sur DEAE 390 ml 0,17 0,12300 6,0 7,1 82% cellulose (De) (1) Ag et As : activité histaminase globale et spécifique exprimée en umole d'histamine oxydée en trois heures d'incubation à à 370C(pour 1 mg de protéines pour As). (2) Le % de récupération est calculé par rapport à l'étape précé dente. Dans une autre variante permettant une purification particulièrement poussée, on part de l'extrait M313 en évitant la chromatographie sur CM Séphadex et en reprenant cette solution M313 dans un tampon phosphate à pH 6,8 que l'on soumet à une agitation de trente minutes à + 4 C, puis à une centrifugation. Le surnageant SA obtenu est ensuite soumis à une fixation en bain sur DEAE-cellulose, à une agitation et à une centrifugation, le culot résultant de cette centrifugation étant repris dans un tampon phosphate, agité 40 minutes à + 40 C puis centrifugé. Le surnageant BDe obtenu est précipité à (NH4)2 SO4 à - 80 C pendant dix huit heures, à la suite de quoi on effectue une centrifugation et l'on reprend le culot, désigné BS06.On effectue ensuite une solution de BS06 dans un tampon phosphate contenant 20% de saccharose. On ajoute 8 ml de Mn Cl2 0,5 M pour 40 ml de solution BS06 et le pH est ajusté à 6,8. On agite cette solution pendant 30 minutes à + 4 C et l'on effectue une centrifugation, dont le culot est repris par 40 ml de tampon phosphate, agité pendant 40 minutes à + 4 C puis centrifugé. Le surnageant BMn est précipité au (NH4)2 SO4 à 0,6 de saturation à - 10 C pendant dix huit heures, à la suite de quoi on effectue une nouvelle centrifugation permettant d'obtenir un culot désigné BMS06. Ce culot est chromatographié sur DEAE-cellulose et l'on obtient en définitive l'extrait MDe. Le tableau IV est une illustration schématique de cette autre variante et le tableau V indique les caractéristiques des différents extraits obtenus successivement. TABLEAU IV M313 Surnageant SA culot Surnageant cul I t Surnageant BDe culot 1 Surnageant ,Culot BS06 t Surnag I Surnageant culot ;;Surna t culo Surnageant j culot BMS BMS'~ i Extrait MDe t i-i TABLEAU V Nature de l'ex- $ 408/280 (1) As (2) Taux de % de récupé trait enzymati- purifica- ration de que tion l'activité globale Placenta 0,00008 Extrait au Na 01 1,80 0,00022 2,4 100 % Précipité alcoo lique N313 1,40 0,0690 720 150 % BS06 0,80 0,0850 9000 63 % BMn 0,54 0,1310 1440 50 % BMS06 0,36 0,1310 1440 25 % MDe 0,07 0,2940 3200 5 % Extrait et purification de l'histaminase placentaire t:(1) 408 R 280 est le rapport des densités optiques mesurées à 408 mu et à 280 mu des différents extraits enzymatiques. (2) As est l'activité histaminasique spécifique mesurée en umole d'histamine oxydée en 3 heures d'incubation à 37 C, par mg de protéines. PROPRIETES DES DIFFERENTS EXTRAITS L'action de l'extrait A313 sous forme d'une solution dans 120 ml de Na C1 à 1% de 1,056 g de précipité A313 sur l'histamine a été étudiée. La figure 1 montre une représentation graphique de la cinétique de la décomposition de l'histamine par cet extrait. L'expérience est réalisée à pH 6,8 et à 37 C Le milieu réactionnel (lOml) contient 3 ml d'extrait A313, et au temps 0, six microgrammes d'histamine par ml. L'oxydation de l'histamine est mesurée par la méthode utilisant le disulfonate d'indigo en présence de péroxydase, l'activité histaminase étant mesurée par variation de densité optique du disulfonate oxydé à 615 mu. En ordonnée du graphique de la figure I est portée l'histamine oxydée en PO-2 en micromole par ml, alors que l'abscisse porte le temps d'incubation en heures. I1 a été constaté, quel que soit le degré de purification de l'extrait, que pour une concentration d'histamine supérieure à une concentration optimale, l'activité antihistaminique diminue très nettement. En se référant à la figure 2, on voit, pour un milieu réactionnel identique à celui de la figure 1, que la concentration optimale d'histamine est de 6 ug par ml. Sur la figure 2, figure en ordonnée l'activité histaminase qui est la quantité d'histamine oxydée exprimée en 10 2 umole par ml de milieu réactionnel en 3 heures d'incubation. En abscisse, figure la concentration initiale en histamine en microgrammes par ml. On a constaté, comme on peut le voir sur la figure 3, que l'activité histaminasique n'est pas modifiée par la plupart des cations ; seul l'ion Mn++ augmente nettement l'activité histaminase. Dans cet exemple, le milieu réactionnel est le même que précédemment, la concentration en ions métalliques étant de 10-11 moles par litre. En ordonnée figure la quantité d'histamine oxydée en 1O 2 moles par ml, et en abscisse figure la durée d'incubation en heures. On voit sur la figure 4 tracée pour l'extrait De, que cet extrait, de même que les autres extraits tels que CM > Mn, oxyde l'histamine, la putrescine, la cadavérine, mais n'oxyde pas la phényléthylamine et la tyramine. Les cinétiques d'oxydation des trois diamines par l'extrait De présentent un même temps de latence. On voit sur ces courbes, pour lesquelles l'abscisse représente la concentration en diamine et l'ordonnée représente la quantité de diamine oxydée, qu'il y a inhibition par excès de substrat avec l'histamine alors que cette inhibition n'existe pas avec la putrescine et la cadavérine. Les essais ont permis de constater que l'extrait De ne contient qu'une seule diamine oxydase dégradant l'histamine, la putrescine et la cadavérine. L'influence de I'hémoglobine-et du manganèse sur l'activité histaminasique a été étudiée et représentée sur le graphique de la figure 5. Ces essais ont été faits avec l'extrait MDe récupéré après chromatographie sur DEAE-cellulose avec des tampons ne contenant pas de manganèse ni d'hémoglobine. On voit que l'hémo- globine plus le manganèse potentialisent nettement l'activité de lthistaminase, cette activité étant représentée par la courbe ayant la plus forte pente et qui se situe nettement au-dessus de la courbe en trait interrompu qui représente l'activité à laquelle il faudrait théoriquement s'attendre en présence des ions manganèse et de l'hémoglobine. L'oxydation des diamines aliphatiques, du type NH2 (CH2)n-NH2, a été étudiée. Aux concentrations employées, ces diamines ne présentent pas d'inhibition et seules la putrescine et la cadavérine sont d'excellents substrats, les autres diamines n'étant pratiquement pas oxydées, en dehors de l'histamine bien sûr. De même la phényléthylamine, la tyramine, la tryptamine, la sérotonine ne sont pas oxydées dans l'histaminase placentaire. I1 en est de même des acides aminés tels que la lysine, l'arginine, la citrulline et l'ornithine. La 4-picolylamine est par contre un bon substrat, alors que la 3-picolylamine n'est pas oxydée. La détermination des poids moléculaires de lehistaminase placentaire a été effectuée par chromatographie sur tamis moléculaire (Bio-Gel ASM). L'histaminase apparat comme un mélange de quatre formes moléculaires qui sont des multiples (de 1 à 4) de 125.000 + 5.000. Comme déjà décrit ci-dessus, l'oxydation de l'histamine par l'histaminase présente un temps de latence et les essais ont montré que ce temps de latence augmente avec le degré de purification de lthistaminase. Le temps de latence n'est pas modifié par addition de manganèse, d'hémoglobine ou d'hémoglobine saturée en oxygène. Le temps de latence diminue ou peut même s'annuler à condition d'effectuer une préincubation de l'histaminase. On voit sur la figure 6 que pour l'extrait MDe ce temps diminue suivant le temps de préincubation. Sur cette figure, la courbe A correspond à l'extrait non préincubé, alors que les courbes B,C,D,E, correspondent à respectivement 3, 4, 5 et 6 heures de préincubation. Toutefois il a été découvert que l'enzyme peut être activée sans temps de latence dans les conditions suivantes : pE voisin de 6,8 - présence de saccharose, par exemple 20% (la saccharose stest avérée avoir une action de stabilisant, de même que le glycocolle) - présence d'un antiseptique tel que le chloroforme à 1% maintien entre 15 et 20-heures (par exemple 18 heures) à. environ 373 C - lyophilisation ultérieure. MESURE DE L'ACTIVITE HISTAMINASIQUE EN PRESENCE DE SERUM OU DE PLASMA. Compte tenu du fait que le dosage au disulfonate d'indigo en présence de péroxydase est un dosage très indirect, il a été décidé de doser l'histamine résiduelle selon la technique décrite par HUFF, DAVIS et BROWN (J. Lab. and Clin. Med. 1966, 67). Les résultats sont représentés sur a figure 7 dont le graphique porte en abscisse le temps d'incubation en heures, et en ordonnée l'his- tamine oxydée en ug par ml. Les essais sont faits en présence de plasma humain (7 ml pour 10 ml de volume réactionnel) avec 20 ug par ml d'histamine, l'incubation s'effectuant à 370 C. L'extrait utilisé est l'extrait BMS06. La courbe A montre les résultats en l'absence d'hémoglobine et de manganèse, alors que la courbe B de pente supérieure, correspond aux essais effectués en présence d'hémoglobine (0,1 mg par ml) et de manganèse Mn++ (10-4 M). On constate que le serum seul n'oxyde absolument pas l'histamine, même en présence d'hémoglobine et de manganèse. Par contre, l'histaminase en présence de plasma oxyde l'histamine. Cette oxydation est activée par le manganèse et l'hémoglobine qui jouent en fait le rôle de cofacteurs de la diamine oxydase. REVENDICATIONS 1. Composition thérapeutique, notamment pour le traitement de l'hyperhistaminémie, caractérisée par le fait qu'elle contient une diamine oxydase obtenue à partir du placenta humain par élimination quasi complète de l'hémoglobine et de ses dérivés, ladite diamine étant formée dVun mélange de quatre formes moléculaires dont les poids moléculaires sont des multiples entiers de 1 à 4 de 125.000 + 5.000, ladite diamine oxydase catalysant 17 oxydation de l'histamine de la putrescine et de la cadavérine, mais non 17Oxy- dation de la phényléthylamine et de la tyramine. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ladite diamine oxydase est obtenue à partir du placenta par lavage à l'acétone, suivi d'une mise en suspension dans une solution de chlorure de sodium, elle-même suivie d'une élimination de la suspension et de plusieurs précipitations fractionnées à l'alcool éthylique de ladite solution. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée par le fait qu'avant la précipitation à l'alcool éthylique, la solution est acidifiée à l'acide chlorydrique, le précipité ainsi obtenu étant remis en solution avec du chlorure de sodium. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisée par le fait que la purification de la diamine oxydase est poursuivie par électrophorèse et/ou chromatographie et/ou adsorption puis élution. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée par le fait qu'elle comporte du sérum ou plasma. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 5 > caractérisée par le fait qu'elle comporte des ions Mn++ 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée par le fait qu'elle comporte au moins une gammaglobuline et renforce l'activité antiallergique de la gammaglobuline. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait qu'elle comporte de l'albumine 5% humaine. 9. Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée par le fait qu'elle comporte un stabilisant tel que 20% de saccharose, un antiseptique tel que 1% de chloroforme, ladite composition étant ajustée à un pH de 6,8, maintenue 18 heures à 370 C puis lyophilisée. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée par le fait qu'elle comporte au moins un antihistaminique de synthèse. 11. Procédé de préparation de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que l'on broie une certaine quantité de placenta, que l'on lave le placenta ainsi broyé à l'acétone, de préférence A basse température, que l'on met la poudre obtenue en suspension dans une solution de Na Cl, que l'on sépare ensuite la solution de la suspension et que l'on effectue des précipitations fractionnées à l'alcool éthylique. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on effectue ensute une chromatographie, que l'on adsorbe la solution ainsi obtenue sur phosphate de manganèse avant élution puis chromatographie sur DEAE-cellulose. 13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on reprend ensuite la solution dans un tampon phosphate agité, puis centrifugé, que l'on soumet le surnageant obtenu à une chromatographie suivie d'une agitation et d'une centrifugation, et que l'on reprend dans un tampon phosphate le culot résultant de cette centrifugation, ce tampon étant agité, puis centrifugé, à la suite de quoi l'on recueille le surnageant. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que le surnageant est précipité au sulfate d'ammonium puis centrifugé, le culot résultant étant récupéré. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que ledit culot est repris dans un tampon phosphate contenant de la saccharose et du chlorure de manganèse, la solution ainsi obtenue étant agitée puis centrifugée 3 à la suite de quoi on reprend le culot dans un tampon phosphate, on agite et on centrifuge, pour recueillir ensuite le surnageant. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que le surnageant est précipité au sulfate d'ammonium puis centrifugé, à la suite de quoi l'on récupère le culot. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que le culot est chromatographié, l'extrait de cette chromatographie étant ensuite recueilli.