Brevet FR2073293A1 — publié le 19711001

La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un inhibiteur de processus pathologiques, capable notamment d'inhiber le pe:nent de leucémies et d'autres cancer.;. L'invention a également pour objet le? inhir.itsurs ";rCs quso?-:c-:,""H par ce procédé, ainsi que les applications tliér&peucirjieis d3 cï? iïihib_v":, dans le traitement des leucémies et des cancers, chez ls«aimai c-t chez 1 * homme. Au cours d'expériences antérieures; les inventeurs ar.t déjà pu montrer que le virus leucémique ir.urin (virus de Prienà, virus es Sauschs?) se retrouve activé dans le précipité obtenu à partir de préparations de cellulss. infectées brutes, traitées par le polvéthyiène-glycol„ Cette constatation a conduit les inventeurs à supposer l'existence d'un inhibiteur qui pourrait; dans la préparation brute, entraver l'activité du virus„ La présente invention vise à la conception d'un procédé permettant de préparer un tel inhibiteur, susceptible d'être exploité pour inhiber les processus pathologiques de leucémies ou d'autres cancers, en particulier ceux de type leucémique. L'invention propose un procédé de préparation d'un inhibiteur de processus pathologiques qui se caractérise essentiellement en ce que l'on soumet une préparation cellulaire à une première précipitation en milieu neutre, on sépare le précipité obtenu du liquide surnageant, on soumet ledit liquide à une seconde précipitation en milieu acide et l'on sépare le précipité obtenu par cette seconde précipitation du liquide surnageant, ce dernier-contenant ledit inhibiteur. Un inhibiteur efficace peut être obtenu par ce procédé en partant de cellules pathologiques, par exemple d'une suspension de cellules animales cultivées in vivo et infectées par le virus leucémique. Toutefois, il est apparu que le procédé peut être appliqué efficacement en utilisant non seulement des cellules infectées comme dans les expériences antérieures des inven-» teurs, mais également des cellules de tissus normaux, non pathologiques. Ainsi, selon des modes de réalisation particuliers du procédé objet de l'invention, la préparation cellulaire est constituée par une suspension de cellules obtenues : 1°/ à partir de tissus normaux (non pathologiques), et de préférence de tissus lymphoïdes, 2°/ à partir de cultures in vitro de cellules dérivées de tels tissus, B 3528 AT BAD ORIGINAL 69 45776 2 2073293 " La première précipitation effectuée en milieu neutre dans le j.ro;ââê selon 1'invention peut être provoquée avantageusement par mise en contact d® :: la préparation cellulaire avec un alcool „ et plus particulièrement avec le polyéthylène-glycol, utilisé de préférence jusqu'à une concentration comprise entre § pour 100 et 20 pour 100 dans le raêlange. La seconde précipitation est effectuée sur le liquide séparé après la première,, On opère de préférence à un pH acide compris entre 0 et 4. Un "G réactif préféré est l'acide si1ico-tungstique, avantageusement ajouté au liquide traité dans une proportion comprise entre 50 et 75 pour 100,. L'invention couvre par ailleurs, en plus des inhibiteurs tels qu®obtenus par ce procédé, leurs applications thérapeutiques au traitement, préventif ou cura tif„ de leucémies animales ou humaines ou de cancers, et noteraient de cancers de type analogue à la leucémie. L'invention est illustrée ci-après par la description d'un mode de mis2 en oeuvre particulier- ehoisi & titre d'exemple non limitatif» La préparation cellulaire est ici obtenue à partir de cultures in vivo de cellules animales infectées» et plus précisément à partir de rates de souris leucémiques (infectées par le virus de Friend) qui sont misesen suspension dans une solution physiologique,, La suspension cellulaire» contenant environ 100 mg (poids à l'état humide) par millilitre, est soumise à des cen-trifugations répétées pour éliminer les cellules intactes et les débris cellulaires» selon des techniques connues. On assure par exemple deux centrifugft-25 tions successives de 10 mn à 5 000 tr/mn puis 10 000 tr/mn. L'extrait cellulaire ainsi obtenu est soumis à une première précis pitation, provoquée par addition de polyéthylène-glycol connu sous la dénomination commerciale de "Carbowax $000". Le polyéthylène-glycol est incorporé progressivement à la préparation jusqu3à ce que sa concentration dans le 30 mélange soit .égale à 5 % (en poids), Après contact pendant 3 heures à 4°C, le mélange est soumis à une centrifugation à 10 000 tr/mn pendant 20 mn, à 4°C, afin de séparer le précipité formé par la réaction. Ce dernier est éliminé. Le liquide surnageant, séparé du précipité par la centrifugation précédente, est alors additionné d'un volume égal d'une solution d'acide 35 silico-tungstique. Pans le cas particulier décrit, ce réactif est préparé à partir des sels sodiques correspondants : 26,7 g de HagSiO^, 8 H^O et 397 g de Na^WO^, 2 HgO sont dissous dans 2,5 1 d'eau, on ajoute 75 ml d'acide sulfuri-que concentré et l'on porte à l'ébullition à reflux pendant 5 heures ; la B 3528 AT BAD ORIGINAL 69 45776 ^ 2073293 solution obtenue est filtrée puis refroidie et portée à un volume de 5 1 par addition d'eau. L'addition d'acide silico-tungstique au liquide surnageant de la première précipitation provoque une seconde précipitation qui s'effectue à un 5 pH de l'ordre de (1,0), Le mélange est laissé en contact pendant me nuit à une température de 0 à 4°C. La séparation du précipité formé s'effectue ensuite par centrifugation à 10 000 tr/mn pendant 30 minutes à une température de 4°C. Le liquide surnageant recueilli après cette centrifugation est neutralisé par addition d'alcali concentré (solution de soude) jusqu'à un pH 10 de 7)0. Par dialyse contre de l'eau distillée, il est ensuite purifié, et en particulier débarrassé des sels qui peuvent avoir été introduits par le traitement, puis lyophilisé. Le produit obtenu constitue l'inhibiteur brut. Il peut être soumis à des purifications ultérieures. L'inhibiteur obtenu selon l'invention est distinct de l'interféron 15 et des inducteurs connus d'interféron (polyribonucléotides synthétiques, complexes d'acide nucléique et de polysaccharides) dont les propriétés antileucémiques avaient déjà été mises en évidence. On l'a injecté à des souris, à la dose de 10 à 100 microgrammes, 4 jours avant une dose relativement élevée de virus leucémique. Cette dose de virus a été choisie de façon à provoquer 20 une leucémie chez 100 % des animaux inoculés, avec splénomégalie, présence de cellules leucémiques dans le sang circulant et mort des animaux dans un délai de deux mois. Aucun de ces troubles n'est apparu chez les souris ayant reçu l'inhibiteur brut 4 jours avant le virus. Le même mode opératoire a été repris en utilisant des suspensions 25 cellulaires préparées, non plus à partir de cellules infectées mais à partir de cellules dérivées de tissus lymphoïdes normaux (rates, thymus ou ganglions lymphatiques notamment) et maintenues en culture in vitro (qu'il s'agisse de cultures cellulaires de première intention ou de lignéescontinues) ou à partir de broyats ou d'extraits des mêmes tissus, qui peuvent être prélevés chez 30 l'animal ou chez l'homme. Par ailleurs, l'invention n'est naturellement pas limitée aux réactifs utilisés dans le mode de réalisation particulier décrit ci-dessus à titre d'exemple, bien que celui-ci ait donné des résultats particulièrement intéressants. Ainsi, le polyéthylène-glycol préconisé pour la première préci-35 pitation effectuée en milieu neutre peut être remplacé par d'autres alcools ou d'autres solvants organiques de même que l'acide silico-tungstique, pour la seconde précipitation, peut être remplacé par un autre acide, permettant de préférence d'opérer à un pH compris entre 0 et 4. La température maintenue B 3528 AT 69 45776 4 2073293 entre 0 et 4°C lors des différentes étapes du procédé peut également varier dans de plus larges limites, mais il y a intérêt à conserver une basse température, comprise par exemple entre -10 et + 10°C. L'efficacité de l'inhibiteur ainsi préparé permet d'envisager son 5 emploi non seulement pour la lutte contre le virus leucémique chez l'animal, mais également chez l'homme, par exemple pour le traitement des leucémies elles-mêmes ou pour la prévention de leur rechute après chimiothérapie et radiothérapie. L'inhibiteur selon l'invention peut également servir au traitement 10 de tumeurs cancéreuses diverses, solides ou liquides, en particulier au traitement des tumeurs cancéreuses de type analogue aux leucémies, telles que certains sarcomes. ' Ainsi, par exemple, des résultats expérimentaux ont montré que l'inhibiteur empêchait in vitro la transformation sarcomateuse de cellules normales de souris soumises à l'action du virus du sarcome murin de Moloney, B 3528 AT 69 45776 2073293 r s y e h p i c a r i o k s 1°/ Procédé de préparation d'un inhibiteur d-a processus pathologiques caractérisé en ce que l'on soumet taxe pr^iaï-atim ceiiu.- =ire ï. V2.e prem-ère précipitation ei: milieu neutre, on sépare le précipité .:htenu ci; liquide surnageant, on soumet ledit liquide à uns seconde précipitation en -.dieu acide et l'on sépare le précipité obtenu par cette secorcs préciy: tisa du liquide surnageant, ce dernier contenant ledit inhibiteurs 23/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladit-préparation est me suspension de cellules ce tissus normaux, et de préférence de tissus lymphoïdes» 30/ procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite suspension est préparée à partir de cultures de cellules dérivées desdits tissus, prélevées chez l'animal ou chez l'homme, et maintenues en culture in vitro» 4°/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite préparation est obtenue à partir de cultures cellulaires infectées par un virus, notamment de type leucémique. 50/ procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la première précipitation, en milieu neutre, s'effectue au moyen d'un alcool, et notamment de polyéthylène-glycol. 6°/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la précipitation en milieu acide s4effectue à iai pH compris entre 0 et 4. 7°/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la précipitation en milieu acide s'effectue au moyen d'acide silic.o-tungstique. 8°/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les précipitations sont effectuées à une température comprise entre -10 et + 10°C, et de préférence de l'ordre de 0 à 4°C. 9°/ Inhibiteur de processus pathologiques tel qu'obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10°/ Application de l'inhibiteur selon la revendication 9 à la prévention et au traitement de leucémies chez l'animal ou chez l'homme. B 3528 AT BAD ORIGINAL h9 fi.i:- 2073293 11°/ Application. de l'inhibiteur selon la revendication 9 à la jx-éveaxion et au traitement de cancers, ec notamment de certains sarcomes.; 12°/ Application de l'inhibiteur selon la revendication 9 à I-exaltation des fonctions de défense de l'organisme. B 3528 AT/mz BAD ORIGINAL