Brevet FR2092060A1 — publié le 19720121

La présente invention concerne de nouveaux composés anti-bactériens ainsi que des procédés permettant de les obtenir. Elle a trait en particulier à de nouveaux 3-nucléotides de lincomycine et à leurs dérivés apparentés, ainsi qu*à des dérivés apparentés 5 aux célesticétines. les composés de la présente invention peuvent être représentés par.la formule suivante : „,R ch3 9 , A T ' HO / e ■3-0 X021 ) \3 2 / oh dans laquelle Y désigne un groupe -SE dans lequel R est un groupe alkyle en C^ à Cg» un groupe » -S-CH2-CÏÏ2-0-C H ou un groupe -S-Œ^CH^-OH, est'un atome d'hydrogène» ou un 10 groupe cis— ou trans-alkyle inférieur en à Cg ; R^ est un atome d*hydrogène» un groupe méthyle ou éthyle j X est un groupe hydro-xyle» un atome de chlore» de "brome, d*iode ou un groupe -OR^ dans lequel R^ est un groupe alkyle en à Cg, chacun étant en configuration (R) ou (.S) ; et Z est un groupe -5T—phosphate de nucléo-15 side dont le nucléoside peut être l*adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine ; ainsi que les sels de ces composés» 71 13813 -2- 2092060 Des exemples de groupes alkyle en à G g comprennent les groupes méthyle, éthyle, propyle* butyle, pentyle* hexyle, heptyle et octyle et leurs formes isomères, Les nouveaux composés de la présente invention s*obtiennent 5 par incorporation d'un composé, comme défini dans la formule I* dans laquelle Z occupant la position 3 de la molécule est un atome d'hydrogène (composé appelé ci-après "substance-mère") dans un milieu de fermentation contenant des organismes du genre Stre-ptom.vces«. puis transformation du composé en un nouveau 3-10 nucléotide* comme décrit ci—dessus, le procédé de la présente invention permet d'obtenir également en quantités variables des esters 3-pho s pho ri que s des substances-mères* Oes esters 3-phosphori-ques sont faciles à distinguer des 3—aucléotides de la présente invention* parce que les 3—phosphates ne présentent pas de maxi mum 15 d'absorption dans leur spectre ultraviolet* et parce qu'ils ne sont pas hydrolysés en la substance-mère par la diestérase de venin de serpent (phosphodiestérase de venin) ou la diestérase splénique. Ainsi, comme décrit de façon détaillée dans ce qui suit* la présence des 3-nucléotides est décelée dans les procédés de récupéra— 20 tion de la présente invention par analyse ultraviolette et par le test à la diestérase de venin de serpent. La diestérase de venin provoque,par exemple,la scission de l,adénylate de clindamy— cine en clindamycine et en 5'-phosphate d'adénosine. La présence initiale de 3-nucléotides dans des bières en 25 cours de fermentation est déoelée par ,l*utilisation d*un test à la phosphatase en milieu alcalin, comme indiqué ci—après. Toutefois* ce test ne permet pas de différencier les 3-phosphatës des 3—nucléotides* et ces derniers passent inaperçus, sauf dans d*au— très essais* comme indiqué ci-dessus. 30 Les composés de la présente invention* bien qu'ils ne mon trent pas d*activité antibactérienne in vitro contre £>. aureus et Sarcina lutea» sont activés lorsqu*ils sont utilisés in vivo, par exemple contre S. aureus. On suppose que cette activation in vivo est comparable à la production de lincomycine, composé apparenté* 35 par contact du composé 3-nucléotide de la lincomycine avec une phosphatase alcaline* in vitro. 71 13813 -3- 2092060 25 35 Les composés du type de la lincomycine* appelés ci-après matières premières ou substances-mères» peuvent être obtenus au moyen de procédés décrits dans divers brevets, diverses publications et diverses demandes de brevets» Les références bibliographiques sont les suivantes : Lincomycine Composés de formule I dans laquelle ! 10 T = —SCH_ à -SC~H. 6 13 R,-= cis-,ou trans-alkyle ayant jusqu*à 8 atomes de carbone brevet des Etats-Unis d*Amérique U° 3 086 912 brevet des Etats-Unis d*Amérique ÏT° 3 380 992 brevet des Etats-Unis d*Amérique ÏT° 3 380 992 précité 15 20 R2 = hydrogène ou groupe alkyle en CQ X = (S)0H ou OR^ X = (R) ou (S) Cl ou Br X = (R) ou (S)I Célesticétine Désalicétine 30 40 brevet des Etats-Unis d'Amérique BT° 3 380 992 précité brevet des Etats-Unis d*Amé-rique F0 3 380 992 précité brevet belge E° 676 202, , brevet des Etats—Unis dtAméri-que JT° 3 496 163 brevet des Etats-Unis dlAmérique ÎT° 3 496 163 précité brevet des Etats-Unis dtAmé-rique ÏT° 2 928 844 brevet des Etats-Unis dlAmérique ÏT° 2 851 463 La 4,-dépropyl-4l-éthyl-lincomycine, dans laquelle T est un groupe -SCH^, R^ est un groupe trans-éthyle, R2 est un groupe CEj et X est un groupe (R)0H dans la formule I, peut être préparée au moyen du procédé décrit dans les exemples 1 et 2 du brevet des Etats-Unis d*Amérique F0 3 359 164* dans lequel ce composé est appelé lincomycine B» La 1*-déméthyl-1*-éthyl-lincomycine, dans laquelle Y est un groupe -SCH^, R^ est un groupe trans-n-propyle* R2 est un groupe éthyle et X est un groupe (R)0H dans la formule I, peut être préparé§4u moyen du procédé décrit dans les exemples 1 et 2 du brevet des Etats-Unis dtAmérique ÏT° 3 359 163, dans lequel ce composé est appelé lincomycine C. La 1*—déméthyl—lincomycine, dans laquelle T est un groupe —SCH^, R.| est un groupe trans-n—propyle, R2 est un atome d'hydro 71 13813 -4— 2092060 gène et X est un groupe (H.)OH dans la formule I* peut être préparée au moyen du procédé décrit dans l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique ÎT° 3 329 568, dans lequel ce composé est appelé lincomycine D. 5 Parmi les composés indiqués ci-dessus, le composé 7(S)— chloro-7-déoxylincomycine est également connu à l'heure actuelle bous le non générique de "clindam.ycine". Les composés apparentés de lincomycine ou les composés analogues, et la célesticétine, comme décrit ci—dessus, peuvent être 10 transformés en 3—nucléotides, comme représenté par la formule I, par incorporation de la substance-mère dans un milieu de fermentation contenant un organisme du genre Streptomyces» Par exemple, par addition de chlorhydrate de clindamycine à un milieu de fermentation contenant l'organisme Stre-ptomyces coelioolor Miller, HRBL 15 3532, on obtient les nucléotides de la clindamycine# La fermentation destinée à la production des nouveaux composés de la présente invention peut être conduite dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies en immersion» Il y a lieu de remarquer également que pour la préparation de quantités 20 limitées de 3-nucléotides* on peut utiliser des cultures en surface et des flacons» L'organisme utilisé dan.s la fermentation est cultivé dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un glucide assimilable et une source d'azote, par exemple un composé azoté assimilable ou une matière protéinique» 25 Les sources préférées de carbone comprennent le glucose* le sucre non raffiné, le saccharose, le glycérol, l'amidon, l,amidon de maïs, le lactose, la dextrine, les mélasses, etc. Les sources préférées d'azote comprennent 1*extrait soluble de maïs, la levure, la levure de brasserie autolysée additionnée de lait en poudre, 30 la farine de soja, la farine de graines de cotonnier, la farine de maïs, le lait en poudre, le produit de digestion pancréatique de la caséine, les extraits solubles de distillerie, les liqueurs pep— tonées animales, les déchets de viande et d'os, etc» On peut utiliser avantageusement des combinaisons de ces sources de carbone 35 et d'azote» Des métaux à l*état de traces,par exemple zinc* magnésium, manganèse, cobalt, fer* etc», ne nécessitent pas d'être ajoutés aux milieux de fermentation* parce que de lJeau de ville 71 13813 -5- 2092060 et des ingrédients non purifiés sont utilisés comme composants du milieu. la production des nouveaux composés de 1*invention peut être effectuée à toute température entraînant la croissance satisfai— 5 santé de la culture de Stre-ptomyces♦ par exemple entre environ 18 et 40°C, et de préférence entre environ 20 et 37°0. lorsqu'on procède à une fermentation en présence d*un organisme du genre Stre-ptomyces» comme décrit ci-dessus» pour préparer des nucléotides de la lincomycine ou un composé apparenté* comme 10 défini dans le présent mémoire* ou un composé de célesticétine, la substance-mère de la lincomycine ou de la célesticétine (non nucléotide) peut être ajoutée avant 1*inoculation du milieu de fermentation. A titre de variante, la substance-mère peut être ajoutée par petites portions pendant le cycle de fermentation, 15 pour autant que 1*addition n'est pas faite trop tard au cours du cycle de fermentation* pour obtenir la transformation désirée de la totalité de la substance—mère ajoutée» La durée de l*addition de la substance-mère et les quantités ajoutées peuvent être déterminées aisément pour cloaque fermentation par addition de la 20 substance-mère jusqu'à ce qu*on observe une certaine toxicité vis-à-vis de la fermentation* par exemple 1*Inhibition de la formation de 3-nucléotides. De même, s'il reste de la substance-mère à la fin du cycle de fermentation* on doit utiliser dans des fermentations subséquentes des taux plus faibles de substance-mère* et/ou 25 modifier la durée de 1*addition. Etant donné que 1*activité antibactérienne in vitro vis-à—vis de S. lutea de la substance-mère est perdue lors de la transformation en un 3—nucléotide, la présence d'activité aatibactérienne résiduelle in vitro dans une culture ou un extrait de culture 30 24 heures après l'addition de la substance-mère,est la preuve que 1*aptitude de la culture ou de l'extrait de culture à transformer la substance-mère a été dépassée ou que le taux de composé ajouté est trop fort et inhibe le micro—organisme dans le processus de transformation. L'activité antibactérienne in vitro mentionnée ci— 35 dessus peut être déterminée par un essai effectué sur une lame microbiologique normale* vis-à-vis du micro-organisme Sarcina lutea» le. 71 13813 -6- 2092060 On peut utiliser divers procédés pour isoler et purifier les nouveaux composés de la présente invention,, par exemple une extraction par solvant, une distribution liquide/liquide dans un appareil de Craig, une extraction par échange ionique en phase 5 liquide ou une adsorption sur une substance adsorbante convenable* par exemple le carbone» et une chromâtographie sur colonne. Dans un procédé préféré d1isolement» les nouveaux composés 3—nucléotides sont isolés d'un milieu en cours de fermentation» comme décrit dans le présent mémoire, par un processus de filtration. le 10 filtrat est ensuite amené à passer sur une substance absorbante convenable» par exemple du carbone activé ou la résine "Amberlite XAD—2" (copolymère non—ionique à pores macroscopiques de styrène réticulé avec une résine divinylbenzénique vendue par la firme fîohm and Haas Company). On prépare cette résine par polymérisation 15 en suspension de copolymères de styrène et de divinylbenzène en présence d'une substance qui dissout bien le copolymère (voir "J.A.C.S." 84* 306, 1962) pour éliminer les impuretés hydrosolubles qui peuvent gêner l'étape subséquente de chromâtographie* la résine est éluée avec un mélange d'eau et de solvants organiques 20 miscibles à l'eau» par exemple un mélange d'eau et d'alcools inférieurs» d'eau et de cétones inférieures» etc. l'éluat provenant du carbone ou de la résine "Amberlite XAD-2" est ensuite amené à passer à travers une colonne de chromâtographie contenant une résine d'échange anionique» par exemple une résine "Dowex—1n (X—4) 25 sous la forme acétate (résine vendue par la firme Dow Chemical Company» Midland» Michigan). On recueille des fractions de la colonne de chromatographie et on titre leur activité vis-à-vis du micro—organisme S. lutea avant et après le traitement des fractions. avec une phosphatase alcaline comme indiqué ci-après. On ras' 30 semble les fractions ayant la plus forte activité vis-à-vis de S. lutea dans l'essai en présence de phosphatase alcaline» on les concentre puis on les soumet à une distribution à contre—courant dans un appareil de Craig en utilisant un système de solvants consistant en n—butanol et en eau (1:1* volume/volume). Les frac— 35 tions qui montrent le maximum d'absorption ultraviolette, et qui sont hydrolysées par la phosphodiestérase de venin de serpent-» sont recueillies en donnant une préparation.contenant un mélange 71 13813 -7- 2092060 de 3-nucléotides. Ge mélange peut être soumis à des opérations de " séparation pour isoler les 3—nucléotides individuels. Un procédé préféré de séparation pour isoler les 3—nucléotides individuels d'un mélange de ces composés utilise une chro— 5 matographie sur colonne de "DEATi-Sephadex" (Pharmacia Fine Chemicals* Inc., Piscataway, ÎT.J., TJ.S.A. ou Pharmacia, TJppsala» Suède). La colonne est éluée avec l'acétate de tris—(hydroxymé— thyl)-aminométhane (IHAM). On analyse des fractions par examen de l'activité vis—à—vis de S. lutea avant et après le traitement 10 à la phosphatase alcaline et par analyse spectrale ultraviolette au pH initial de la fraction, et à un pH acide (environ 2*0). On rassemble les fractions douées d'activité "biologique vis—à—vis de S. lutea après le traitement à la phosphatase alcaline» et montrant une absorption dans le spectre ultraviolet* Chaque produit 15 de rassemblement des fractions contient un seul 3-nucléotide» en même temps que des substances indésirables. Le tampon à ltacétate de THâM est éliminé de ces fractions rassemblées, par passage des— dites fractions sur une colonne contenant la résine "Amberlite XAD-2** la colonne étant garnie en présence d1eau. Après lavage de la co-20 lonne avec de l*eau, on procède à son élution avec une solution aqueuse de méthanol (méthanol aqueux à 80 $ environ). On recueille des fractions d'environ 20 ml chacune et on les analyse en lumière ultraviolette. Les fractions qui montrent une absorption de lumière ultraviolette sont combinées et concentrées à sec j_ttsqu*à 25 formation d*un résidu. Le résidu est dissous dans un alcool inférieur, par exemple le méthanol» et la solution est additionnée d'éther pour former un précipité d*un composé 3—nucléotide» comme défini par la formule I. Comme l'indique la formule I, le.fragment 3-nucléotide des nouveaux composés de la présente invention est 30 le 3-(5*-cytidylate), le 3—(5'-adénylate), le 3—(5*-uridylate) ou le 3—(5*-guanylate). Les nucléotides peuvent aussi être séparés par chromatogra-phle de partage sur "Dicalite" (terre de diatomées) en présence de systèmes de solvants consistant en eau et en un solvant non 35 miscible à l*eau. Les 3—nucléotides de la lincomycine et les 3—nucléotides des composés apparentés à la lincomycine sont essentiellement inactifs 71 13813 -8- 2092060 vis-à-vis des "bactéries,, in vitro» Ainsi* ces 3-nucléotides nouveaux sont mis en évidence par ltessai d*activité biologique vis-à-vis de S. lutea après traitement des échantillons avec une phosphatase alcaline. Ear exemple, le mélange réactionnel consiste en 5 0,5 ml de tampon tris (0,5 M), à un pH de 8,0, 0,5 ml de phosphatase alcaline (1 mg/ml), sous la forme d*une solution-mère préparée dans le tampon tris (0,5 M) à un pH de 8,0, et 0,05 ml (environ 50 microgrammes) de 3-nucléotides de lincomycine* Ce mélange réactionnel est mis à incuber pendant environ 16 heures à 10 28°C. Des exemples d* organisme s du genre Stre-ptomvces que l*on peut utiliser pour préparer les nouveaux composés de l*invention comprennent S. coelicolor 1945* URRL 3531 ; S. coelicolor MSller NRRL 3532 ; et S. venezuelae NRRL 3527. Ces cultures peuvent être 15 fournies, sans restriction, par "Northern Utilization and Researoh. Division", Agricultural Research Service, ministère de l'agriculture des Etats—Unis d*Amérique, Peoria* Illinois» U*S*A. les nouveaux composés de 1*invention sont des composés ampho-tères et peuvent exister sous différentes formes ioniques confor— 20 mément au pH du milieu. A un faible pH, les composés existent sous la forme du sel d1addition d*un acide* ils existent sous la forme d*un zwiterrion à un pH élevé* et à un pH encore plus fort, ils existent sous la forme d*un 3el métallique. Les sels d*addition d*acides comprennent les sels dfaddition diacides organiques ou 25 minéraux forts ayant un pK égal ou inférieur à celui d*un phosphate» par exemple les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, etc. Les sels d *acide et les sels métal ligues, comprennent les sels de métaux alcalins (sodium et potassium de même que l*ion 30 ammonium) et de métaux alcalino—terreux (calcium, magnésium, zinc et aluminium) que l*on obtient par neutralisation d*une forme acide avec la base appropriée, par exemple lthydroxyde d* ammonium, les hydroxydes ou alcoolates de sodium et de potassium, les hy— droxydes de calcium ou de magnésium, etc. Les sels acides et neu— 35 très comprennent aussi des sels dtamines obtenus en neutralisant une forme acide avec une aminé basique, par exemple les mono—, di— et trimé thy lamine s * les mono—, di- et triéthylamines, les mono—, 71 13813 -9- 2092060 di- et tripropy lamine s (forme iso et forme normale), ltéth.yldimé-thylamine, la benzyldiéthylamine» la cycloh.ezylam.ine» la benzyl— aminé, la dibenzylamine» la F,ïTT —dibenzyléthylènediamine-, la bis— (ortho-méthoxyphénylisopropyl)aminé, et des aminés aliphatiq_u.es 5 inférieures, cycloaliph.atiqu.es inférieures et araliphatiques inférieures analogues» les radicaux aliphatiques et cycloaliphati— ques inférieurs contenant jusqu'à 8 atomes de carbone ; dès aminés hétérocyclique s telles que la pipéridine, la morpholine» la pyrrolidine, la pipérazine et leurs dérivés alkyliques inférieurs 10 dont le groupe alkyle inférieur contient 1 à 8 atomes de carbone» par exemple 1-méthylpipéridine» 4-éthylmorpholine» 1-isopropyl— pyrrqlidine» 1»4-diméthylpipérazine» 1-n-butylpipéridine» 2-méthyl— pipéridine et 1—éthyl—2—méthylpipéridine ; des aminés contenant des groupes de solubilisation dans l*eau et des groupes hydrophiles» 15 par exemple mono-, di— et triéthanolamines» éthyldiéthanolamine, n—butylmonoéthariolamine» 2—amino—1—butanol» 2-amino—2—éthyl—1 ,3— propanediol, 2-amino-2-méthyl—1-propanol, tris—(hydroxyméthyl)— aminométhane» phénylmonoéthanolamine» p—tertio-amylphényldiéthanol— aminé, et galactamine» N-méthylglucamine» H—méthylglucosamine, 20 éphédrine, phényléphrine» épinéphrine» procaîne ; lrhydroxyde de tétraéthylammonium ; et la guanidine* Les diverses formes peuvent être utilisées de façon interchangeable» mais dans la plupart des cas» on préfère utiliser la forme de zwiterrion t 0 nh ch3 oh 71 13813 -10- 2092060 (dans laquelle R^ F R^t X, T et Z ont les définitions données ci-dessus), et la forme du sel d'ammonium. Les composés de la présente invention permettent le traitement thérapeutique d'êtres humains et d'animaux porteurs d*orga-5 nismes microbiens pathogènes sensibles (bactéries et autres micro-parasites) et le traitement prophylactique d'un hôte sensible à une maladiey par administration à l'hôte d'esters de 3-nucléotides ou d'un sel acceptable du point de vue pharmacologique de ces composés* 10 Les compositions de la présente invention sont intéressantes de la même manière que la lincomycine et la célesticétine* pour le traitement d'êtres humains, d'oiseaux et d'animaux présentant _ divers états pathologiques. Les compositions permettent d'administrer 1*ingrédient thérapeutique par voie orale et parentérale 15 pour le traitement systémique. Les compositions permettent de traiter l'amygdalite* la pneumonie, l'otite, la conjonctivite, les furoncles, les anthrax et d'autres états infectieux d1êtres humains» dus à la présence de bactéries. Ohez les animaux» les compositions peuvent être utilisées en prophylaxie., Par exemple, 20 des rats peuvent être protégés de Stre-ptococcus vi-riflapa pendant l'expédition. Des animaux nourris à la viande peuvent être soumis à un traitement prophylactique pour accroître leur gain de poids» Des mammifères porteurs d'un protozoaire parasite de la classe des sporozoaires, ordre des Ooccidies (microparasites pro-25 duisant la coccidiose) peuvent être traités par administration des compositions de la présente invention. Par exemple^ du bétail infecté par E. zurnii» E. bovis-, E. illipsordalis j des moutons et des chèvres infectés par E. narva* E. faurei j des porcs infectés par E. deblieg^i, E. s cabra* et Isos-oora suis ; des chiens 30 et des chats infectés par Isospora bigemina» Isosnora fe"i ,i f=t - E. cani s» E. ffil ini j des volailles infectées par E. te-na^l «. ; des lapins infectés par E. steedae-» E. nfii-fnran^ j et des visons infectés par E. mustelae, peuvent être traités de cette façon* 71 13813 -11- 2092060 Les compositions sont également intéressantes pour le traitement de maladies dues à des représentants du genre Mycoplap""», dont les formes les plus couramment connues sont les organismes PPLO (organismes responsables de maladies du type pleuropneumonie), 5 par exemple M. homiriis. M. salivarium. M, mycoides. M. hyopneumonia. M. hyorhinis. M. gallisepticum, M. arthritidis. et les autres espèces pathogènes poux l'home e-c les animaux, y eoapris les doues- tiques tels que moutons, chiens, bovidés, porcs, volailles (par exemple poulets, dindons, canards et oies) et les animaux de labo-10 ratoire (par exemple rats et souris). Les compositions peuvent être appliquées au traitement des infections rénales et d'autres infections lorsque des formes L de bactéries Grram-négatives et G-ram-positives sont présentes, par exemple les formes L de P. mirabilis. 15 Les 3-nucléotides et leurs sels décrits dans le présent mé moire sont présentés en vue de l'administration orale ofe parentérale sous des formes posologiques unitaires solides et liquides, par exemple comprimés, capsules, poudres, granulés, pilules, solutions et suspensions parentérales stérilisées et solutions et suspensions 20 orales, et des émulsions du type huile-dans-eau. On prépare des poudres en subdivisant les 3-nucléotides en particules de finesse convenable et en les mélangeant avec un diluant subdivisé de la même façon. Le diluant peut être un glucide comestible tel'que l'amidon ou le lactose. Il est avantageux d.'ajout#* 25 un edulcorant ou un sucre de même, qu'une substance aromatique. Des granulations sèches destinées à être reconstituées avec de l'eau s'obtiennent en utilisant des diluants hydrosolubles.-Un mélange en poudre de 3-Q.ucléotide finement divisé et d'un diluant hydroso-luble tel que saccharose, glucose,etc., est mouillé avec un liant 30 tel qu'un mucilage de gomme arabique ou une solution de gélatine et amené à traverser un tamis pour former des granulés que l'on fait sécher. Il est avantageux qu'un agent épaississant ou un agnt de mise en suspension tel que la méthylcellulose soit présent de même qu'un agent mouillant et une essence aromatique. 35 On obtient des capsules en préparant un mélange en poudre comme indiqué ci-dessus et en garnissant avec cette poudre des enveloppes de gélatine mises en forme. Il est avantageux d'utiliser BAL» ORIGINAL 71 13813 -12- 2092060 comme adjuvant dans l'opération de garnissage un lubrifiant tel que le talc, le stéarate de magnésium Ott le stéarate de calcium, qui est ajouté au mélange en poudre avant l'opération de garnissage . 5 On obtient des comprimés en préparant un mélange en poudre en le granulant à l'état humide, ou à sec ou en formant des disques, en ajoutant un lubrifiant et en comprimant le mélange. Le mélange en poudre se prépare par mélange du 3-nucléotide convenablement subdivisé avec un diluant ou une base telle que l'amidon, le lac-10 tose, le kaolin, le phosphate dicalcique, etc. Le mélange en poudre peut être granulé par mouillage avec un liant tel qu'un sirop de maïs, une solution de gélatine, une solution de méthylcellulose ou un mucilage de gomme arabique et en faisant passer le mélange à travers un tamis. A titre de variante du procédé de granulation, 15 le mélange en poudre peut être transformé en disques, à savoir par passage dans la machine de formation de comprimés, et les comprimée de grandes dimensions (disques) que l'on obtient sont subdivisés en granulés. Les granulés peuvent être lubrifiés pour empêcher l'adhérence aux matrices de formage des comprimés, par addition 20 d'acide stéarique, d'un stéarate, de talc ou d'une huile minérale. Le mélange lubrifié est ensuite transformé en comprimés. Le comprimé peut avantageusement être pourvu d'un revêtement protecteur consistant en un revêtement étanche de gomme-laque, un revêtement de sucre et de méthylcellulose et un revêtement brillant de cire 25 de çarnauba. Des liquides destinés à l'administration par voie orale s'obtiennent sous des formes posologiques unitaires telles que sirops et élixirs,dont chaque cuiller à café de composition contient une quantité prédéterminée de 3-nucléotide pour 1'administra-30 tion. On prépare un sirop en dispersant le 3-nucléotide dans une solution aqueuse de saccharose convenablement parfumée. De même, on prépare un élixir en utilisant un véhicule hydro-alcoolique. Les élixirs sont des véhiculés avantageux à utiliser lorsqu'on dé-35 sire une solution d'un composé montrant une faible solubilité dans l'eau et une bonne solubilité dans un milieu aqueux*-àlcoolique. Pour l'administration par voie parentérale, on peut.préparer 71 13813 -13- 2092060 des formes posologiques unitaires liquides stériles. Dans la préparation de la forme parentérale, une quantité mesurée du. 3-nucléotide est placée dans une fiole ; la fiole et son contenu sont stérilisés, puis scellés. Cette fiole peut avantageusement être 5 accompagnée d'une fiole contenant de l'eau stérilisée comme véhicule servant à la formation d'une suspension ou d'une solution (en fonction de la solubilité dans l'eau du composé) avant l'administration. Il est avantageux que l'eau stérilisée contienne en solution un agent de mise en suspension, un anesthéel^ue local et des 10 agents tampons. A'titre de variante, une suspension parentérale d'action prolongée peut être préparée par mise en suspension du 3-nucléotide dans une huile végétale acceptable par'voie parentérale, avec ou sans addition d'adjuvants. 15 . L'expression "forme posologique unitaire" utilisée dans le présent mémoire désigne des unités discrètes du point de vue physique qui conviennent comme doses unitaires pour des sujets humains, chaque unité contenant une quantité prédéterminée de substance active calculée en fonction du dosage désiré en association avec 20 'le diluant, le support ou le véhicule pharmaceutique requis. Les prescriptions concernant les nouvelles formes posologiques unitaires de la présente invention sont dictées par les facteurs suivants, et en dépendent directement : (a) les caractéristiques remarquables de la substance active et l'effet thérapeutique particulier que 25 l'on recherche et (b) les limitations inhérentes à la technique de formulation de cette substance active pour l'usage thérapeutique, comme indiqué en détail dans le présent mémoire,ceci constituant des particularités de la présente invention. Des exemples de formes posologiques unitaires convenables, conformément à la présente 30 invention, comprennent des comprimés, des capsules, des paquets de poudre, des granulés, des pastilles, des cuillêrées à café, des cuillerées à soupe, des doses mesurées au compte-gouttes, des ampoules, des fioles, des combinaisons multiples d'un nombre quelconque de ces formes, et d'autres formes comme décrit dans le pré-35 sent mémoire. Des formes posologiques unitaires formulées avec un véhicule pharmaceutique convenable contiennent, dans les exemples préférés de réalisation, 25 à 500 mg de 3-nucléotide ou de ses sels 71 13813 -14- 2092060 acceptables du point de vue pharmacologique par dose posologique unitaire et 5 à 65 i° en poids/volume pour des préparations parentérale s. La quantité de 3-nucléotide ou de sels de ce composé que 5 l'on doit administrer dépend de l'âge et du poids du patient, de la maladie particulière à traiter et de la voie dradministrâtion. Pour un traitement systémique, on préfère une dose d*environ 1 à environ 50 mg/kg/jour. Le procédé et les produits de la présente invention sont 10 illustrés par les exemples suivants, donnée à titre non limitatif Tous les pourcentages y sont exprimés en poids et toutes les proportions du mélange de solvants sont indiquées en volume,sauf indication contraire. Exemple 1 3-nucléotides de la clindamycine 15 A. Fermentation Une souche de Streptomyces coelicolor Mtiller, NRRL 3532, extraite du sol, est utilisée pour inoculer une série de fioles d'Erlenmeyer de 500 ml, contenant chacune 100 ml d'un milieu stérile d'ensemencement à base des ingrédients suivants :•- 20 Glucose monohydraté 25 g/l "Pharmamedia" 25 g/l Eau de ville, quantité suffisante pour compléter à 100 ml * Le produit "Pharmamedia" est une farine de graines.de 25 cotonnier de qualité industrielle produite par la firme Trader*s Oil Mill Company, Port Worth, Texas. La culture dans les fioles agitées par secousses est effectuée pendant 3 jours à 28°C, sur une secoueuse rotative. L'inoculum d'ensemencement (5 ml), préparé-comme ci-dessus, 30 est utilisé pour inoculer chaque fiole d'Erlenmeyer de 500 ml d'une série de ces fioles contenant chacune 100 ml de milieu stérile de fermentation à base des ingrédients suivants : 71 13813 -1 5- 2092060 Extrait de levure 2,5 g/l NZ-amine B* 5,0 g/l Glucose monohydraté 20 g/l Nitrate de sodium 3 g/l 5 Phosphate dipotassique 1 ' g/l Sulfate de magnésium 0,5 g/l Chlorure de potassium 0,5 g/l Sulfate ferreux 0,01 g/l Eau de ville le reste 10 * Produit vendu par la firme Difco Laboratories, Détroit, Michigan. Il s'agit d'une peptone brute en poudre obtenue par digestion pancréatique de la caséine. On ajoute 100 mg/l de chlorhydrate de clindamycine au bouillon contenu dans les fioles de fermentation, 24 heures après"l'ino-15 culation. La fermentation du contenu des fioles est obtenue par culture pendant 24 heures à 28°C sur une secoueuse rotative. La réaction de transformation dans la fiole de fermentation est suivie d'an* ■•sur* de la perte d'activité de clindamycine, cette aesure 20 étant effectuée d'après une courbe d'étalonnage correspondant à S. lutea. Environ 100 % de la quantité ajoutée dé clindamycine prennent une forme non douée d'activité .antibactérienne in vitro, en 24 heures environ. L'essai avec S. lutea est effectué de la façon suivante : cet essai a lieu "sur de la gélose tamponnée à un pH de 25 6-8 avec un tampon au phosphate (0,1 M) de pH égal à 7,0. Un volume unitaire (0,08 ml) de solution contenant la substance à titrer est placé sur un disque d'essai de 12,7 mm qui est ensuite disposé sur une plaque de gélose ensemencée avec le Bicro-organlaae mr lequel porte l'essai. La plaque est mise à incuber à 37°C pendant 30 18-24 heures. L'activité ahtibactérienne in vitro est démontrée par l'existence d'une zone d'inhibition de croissance entourant le disque. L'activité antibactérienne peut être exprimée quantitativement en microgrammes de substance-mère (ou sous la forme de lincomycine ou de* clindamycine) par ml, par la réaction linéaire 35 qui^xiste entre le logarithme de la dose et le diamètre de la zone, relativement à l'étalon et conformément à la technique. La présence de 3-nucléotide de olindaœyciae est déterminée d'abord par incubation 71 13813 -16- 2092-060 du milieu inactif avec une phosphatase alcaline à un pH de 8,0 dans le tampon tris, puis par expérimentation du mélange réac-tionnel vis-à-vis de S. lutea. comme indiqué ci-dessus. B. Isolement 1 ) Filtration et absorption sur résine non-ionique 5 Le milieu de fermentation indiqué ci-dessus est développé dans un bac de fermentation pour produire 490 1 de milieu de fermentation contenant les 3-nucléotides de clindamycine. Ces derniers sont isolés du bouillon entier d'abord par filtration de ce bouillon avec 10 kg de terre de diatomées utilisée comme auxiliaire 10 de filtration. Le résidu de filtration est lavé à l'eau. L'eau de lavage et le bouillon limpide sont rassemblés et le mélange rassemblé est traité avec une substance adsorbante, par exemple du carbone ou de la résine "Amberlite AXD-2" (venduefear la firme Rohm and Haas Company) pour éliminer les impuretés hydrosolubles qui tendent 15 à réduire l'efficacité de la chromâtographie subséquente. La colonne d'absorption est préparée par délayage d'environ 22 kg de substance adsorbante ("Amberlite XAD-2") dans l'eau en versant la suspensior*&ans une colonne de verre (de 5» 08 cm de diamètre intérieur) , en laissant la suspension se sédimenter à la pression atmos-20 phérique, puis en faisant s'écouler la phase liquide. On fait passer le mélange de bouillon limpide et d'eau, comme indiqué ci-dessus, à travers la colonne à un débit d'environ 1 l/minute. La colonne est lavée à l'eau. On jette 100 1 de l'eau de lavage. La colonne est ensuite éluée avec 120 1 de solution aqueuse à 60 $ de 25 méthanol (éluat I) et 100 1 de solution aqueuse à 95 i° de méthanol (éluat II). L'éluat I est ensuite traité pour isoler les 3-nucléotides de clindamycine, tandis que 1'éluat II est jeté. 2) Absorption sur résine d'échange ionique L'éluat I mentionné ci-dessus est chromatographié sur une 30 colonne chromâtographique d'échange anionique. La colonne est garnie avec 22 kg de "Dowex-1 " (X-4) sous la forme acétate, vendue par la firme Dow Chemical Company, Midland, Michigan. Le pH de 1'éluat I est ajusté à 10,0 avec une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium et la solution alcaline est amenée à passer à travers la 35 colonne de chromatographié. Le liquide usé sortant de la colonne est concentré à seo ; le rendement est de 877 g.de substance contenant les 3-nueléotides de clindamycine. Cette substance est appelée 71 13813 -17- 2092060 "substance A". la colonne est ensuite lavée avec 100 1 d'eau et éluée avec 70 1 de solution aqueuse 5 i° d'acide acétique. Les produits d'élution à l'acide acétique sont concentrés et le concentré résultant est lyophilisé; le rendement est de 89,4 g de 5 substance contenant des 3-nucléotides de clindamycine. Cette substance est appelée "substance B". C. Purification 1) Absorption sur résine non-ionique. Une portion principale(776 g) de "substance A" obtenue 10 comme décrit ci-dessus est dissoute dans 1,5 1 d'eau. Le pH de la solution est ajusté à 7,5 avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré et ceiîte solution est amenée à passer sur une colonne contenant 2 1 de résine "Amberlite XAD-2". La colonne est lavée avec 6 1 d'eau. L'eau de lavage est recueillie en trois fractions de 2 1 15 (¥-1 , W-2, ¥-3). La colonne est ensuite éluée avec une solution aqueuse à 90 $ de méthanol. Des fractions de 20 ml sont recueillies et soumises à un essai d'activité vis-à-vis de S,, lutea avant et après le traitement à la phosphatase alcaline. Des fractions numérotées de 61 à 250 sont rassemblées et concentrées à sec ; on ob-20 tient 52 g de substance contenant des 3-nucléotides de clindamycine. Cette substance est appelée "ADA-10.1". Les fractions ¥-2 et ¥-3 mentionnées ci-dessus et les fractions numérotées de 1 à 60 provenant de la colonne de résine "Amberlite XAD-2" mentionnée ci-dessus, sont rassemblées et amenées 25 de nouveau, à passer sur la même colonne de résine Amberlite XAD-2 qui est au préalable régénérée avec 15 1 d'eau (fraction ¥-1 obtenu.® comme décrit ci-dessus), puis éluées avec 4 1 de méthanol absolu. On obtient trois fractions, à savoir la fraction méthanolique 1=1 la fraction méthanolique 2 = 1 1 ; et la fraction méthanolique 30 3=31. Ces fractions sont soumises à un essai d'activité vis-à-vis de S. lutea avant et après le traitement avec la phosphatase alcaline. La fraction méthanolique 2 est concentrée à sec ; elle donne 12,63 g de substance contenant des 3-nucléotides de clindamycine. Cette préparation est appelée "ADA-11.1". 35 La fraction méthanolique 3 est concentrée à sec ; elle donne 0,7 g de substance contenant des 3-nucléotides de clladasycin*• Cette préparation est appelée "ADA-11.2". 71 13813 -18- 2092060 Les préparation® ÂDA-10.1, ADA-11.1 et ADA-11.2, toutes préparées comme indiqué ci-dessus, sont rassemblées pour donner la préparation ADA-37.1; (.64*7 g). Cette préparation contenant les 3-nucléotides de clindamycine est encore purifiée par distribution 5 à double contre-courant comme indiqué si-après. 2) Distribution à double contrg-courant On dissout une portion (2Î g) de préparation "ADA-37.1" indiquée ci-dessus dans 100 ml de la phase supérieure et 10 ml de la phase inférieure d'un système de solvants consistant en 10 n-butanol et en eau (1:1 volume/volume). La solution est ajoutée dans les tubes centraux d'un appareil de distribution à double contre-courant, entièrement en verre (CDCD) (100 tubes). Après 48 transferts, on recueille la phase supérieure et la phase inférieure sous forme de fractions de 50 ml. On effectue un total de 15 100 transferts. Les fractions recueillies et la substance contenue dans les tubes de l'appareil CDCD sont analysées de manière à déterminer l'activité vis-à-vis de la _S. lutea avant et après le traitement avec la phosphatase alcaline. En utilisant les mêmes conditions que ci-dessus, on effectue 20 deux autres distributions dans l'appareil CDCD, en utilisant à chaque fois 21 g de la préparation ADA-37.1. Dans chacune des trois distributions indiquées ci-dessus, on effectue le rassemblement de fractions indiqué ci-après : Rassemblement I Fractions numéro 20 à 50 du collecteur de 25 phase inférieure Rassemblement II Phase inférieure, et phase supérieure restant dans l'appareil CDCD Rassemblement III Fractions numéro 5 à 35 du collecteur de phase supérieure 30 Le produit rassemblé I des trois distributions est concen tré à sec. Le résidju obtenu est dissoras; dans du méthanol absolu et la solution obteame mélangée avesc de l'éther. Le précipité résultant est isoijl par- filtratiom et séché ; le rendement est de 7,12 g. Cette préparation n'est jtes poursuivie davantage. 35 LeSj prodffiits rassemblés II et III des trois distributions SflSit; traités coiame indiqué ci-dessus pour le produit rassemblé Ij Ift renctement est de 13»6 g de substance provenant du produit ras 71 13813 -19- 2092060 semblé II, appelé "ADA-39.2" et 0,49 g de substance provenant du produit rassemblé III, appelé "ADA-39.3". Les préparations ADA-39.2 et ADA-39.3 consistent en 3-nucléotides de clindamycine essentiellement purs comme mis en évidence par l'inactivité vis-5 à-vis de S. lutea avant le traitement avec la phosphatase alcaline, et par l'activité vis-à-vis de S. lutea après traitement avec cette phosphatase. la présence de clindamycine après le traitement à la phosphatase est mise en évidence par chromatographié en couche mince. 10 D. Séparation des 3-nucléotides de clindamycine par chromatographié les 3-nucléotides de clindamycine obtenus comme indiqué ci-dessus sont séparés en les 3-nucléotides .individuels par chromatographié sur "DEAE-Sephadex". On prépare la résine en délayant 500 g de "DEAE-Sephadex" (A-25) avec de l'eau pendant environ une 15 heure, la résine est séparée par filtration et agitée avec une solution aqueuse 0,5 N d'hydroxyde de sodium pendant 2 heures, la résine est de nouveau isolée par filtration et lavée à l'eau jusqu'à ce que le pH de l'eau de lavage soit pratiquement neutre, la résine lavée est ensuite agitée avec de l'acide acétique en solu-20 tion aqueuse 0,5 lî pendant 2 heures, et finalement lavée jusqu'à un pH neutre. la résine préparée comme décrit ci-dessus est introduite dans une colonne de verre dans laquelle on la laisse se sédimenter à la pression atmosphérique, la colonne est "lavée avec 4 1 d'eau, 25 puis avec 4 1 de solution aqueuse à 0,1 fo de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane (THAM). la substance de départ (ADA-39.2, 13»0 g) est dissoute dans 100 ml d'eau, le pH est ajusté à 9,0 avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré. Cette solution est ensuite introduite par la partie 30 supérieure de la colonne, la colonne est éluée successivement de la façon suivante : 1) 15 1 d'acétate de THAM 0,05 M (préparée par dissolution de 6,05 g de THAM dans 800 ml d'eau, ajustement du pH à 8,0 avec de l'acide acétique cristallisable, puis ajus- 35 tement du volume à 1 l). 2) 40 1 de tampon d'acétate THAM 0,1 H, pH 8,0 3) 20 1 de tampon d'acétate THAM 0,2 M, pH 8,0 71 13813 -20- 2092060 4) 20 1 de tampon d'acétate THAM 0,3 M, pH 8,0 On recueille des fractions de 20 ml. On obtient les fractions suivantes à partir de chaque tampon. Fractions 1-722 à partir du tampon 0,05 M 5 Fractions723-2920 à partir du tampon 0,1-M Fractions 2921-3985 à partir du tampon 0,2 M Fractions 2985-5000 à partir du tampon 0,3 M. Certaines fractions sont analysées par recherche de l'activité vis-à-vis de JL lutea avant et après le traitement à la 10 phosphatase alcaline,et par les spectres ultraviolets du courant sortant de la colonne, tel qu'on l'obtient,et à un pH acide (environ 2,0). On effectue les rassemblements suivants : Rassemblement I 15 Fractions 850-965 Volume : environ 2300 ml -» / \ A. mai. (a.) Spectre ultraviolet : pH neutre, 7,0 270 (3,72) pH acide, 2,0 279 (5,40) pH basique, 11,0 271 (3,72) 20 Rassemblement II Fractions 1240-1535 Volume : environ 5200 ml 1 / \ Amai. (a; Spectre ultraviolet : pH neutre, 7,0 261 (11,4) pH acide, 2,0 255 (11,25) 25 pH basique, 11,0 258 (11,25) Rassemblement III Fractions 1550-1680 Volume : 2600 ml 1 / \ Amax. (a) Spectre ultraviolet s pH neutre, 7,0 262 (3,60) 30 pH acide, 2,0 262 (3,64) pH basique, 11,0 261 (2,82) Rassemblement IV Fractions 1771-2125 Volume : 7000 ml > , » Amax. (aj 35 Spectre ultraviolet : pH neutre, 7,0 254 (3,74; ép. 278 pH acide, 2,0 254 (3,66) ép. 278 pH basique, 11,0 264 (3,20) 71 13813 -21- 2092060 (a) Isolement par chromatographié du 3-(5'-cytidylate) de clindamycine présent dans les produits rassemblés I On prépare la colonne avec 150 ml à'"Amberlite" XAD-2.On fait passer sur la colonne les produits rassemblés It préparés comme 5 décrit ci-dessus, à un débit de 6 ml par minute» On recueille la solution usée en 116 fractions de 20 ml» Aucune fraction ne montre de maximum dans le spectre ultra-violet et toutes sont jetées* La colonne est ensuite lavée avec 900 ml d'eau (fractions 117 à 161)» L'eau de lavage est également jetée» La colonne est ensuite éluée 10 avec du méthanol en solution aqueuse à 80 fo. Les fractions sont analysées en lumière ultraviolette. Les résultats obtenus sont les suivants : K° de la fraction Amax» (a) 162 Pas de maximum ultraviolet dans le spectre 163 Pas de maximum ultraviolet dans le spectre 164 Pas de maximum ultraviolet dans le spectre 165 Pas de maximum ultraviolet dans le spectre 166 Pas de maximum ultraviolet dans le spectre 167 271 (9,9) 168 271 (161,8) en 271 (168,05 170 271 (61,6) 171 271 (19,4) 172 271 (3,6) 173 271 (1,0) 174 271 (0,3) 175 271 (0,15) On rassemble les fractions 167 à 172» On évapore la solution pour former un concentré aqueux qu'on lyophilise } le rendement 35 est de 750 mg de 3-(5'-cytidylate) de clindamycine» On dissout 500 mg de cette préparation dans 5 ml de méthanol et on mélange la solution avec de 1'éther j on obtient 400 mg de 3-(5t—cytidylate) de clindamycine de formule suivante x 71 13813 2092060 B1 = -CÏÏ2CH20H3 z » Résultats analytiques t Calculé pour C2yH^Nç0.j2PSCl : C = 44,48 ; H = 6,17 ; N = 9,60 ? 0 = 26,39 J S = 4,39 J Cl = 4,87 i P = 4,25 Trouvé i C s= 45,62 f 45,86 } H = 6,99 i I K = 9,80 } S = 3,61 j Cl = 3,90' j 4,04 i P = 3,44» 71 13813 -23- 2092060 10 Poids moléculaire : Calculé pour Cg^H^-Nt-O^PSC! : 729» 5 Trouvé : 742 (osmométrie de la tension de vapeur, dans le méthanol). Titrage poten'tiométrique Dans lreau : pKa' =7,7 poids équivalent 587 Rotation spécifique s [a]2^ = +61° (c, 1, eau) Spectre infrarouge : Les spectres infrarouges,en suspension dans une huile minérale et en pastille dans KBr, donnent les résultats suivants j 15 Fréquence de "bande (cm" 1) Intensité Fréquence de "bande (cm"-') Intensité Fréquence de "bande (cm"') Intensité 3340 S 1490 S 992 S 3240 S 1455 (huile) S 967 M 20 2930 (huile) S 1375 (huile) S 933 M 2860 (huile) S 1365 (ép.) S 886 S 2730 (ép.) M 1282 S 853 M 1717 M 1215 3 805 (ép») M 25 1650 S 1095 S 787 S 1610 (ép.) S 1070 S 720 (huile) S 1520 S 1050 S En pastille dans KBr 30 Fréquence de "bande Intensité (cm~') Fréquence de "bande (cm"'') Intensité Fréquence de "bande . Intensité (cm-'') 3400 S 1530 (ép.) M 1045 S 3210 S 1520 S 990 M 3100 (ép.) S 1490 S 965 M 35 2955 S 1455 M 930 M 2925 ? 1395 M 882 M 2870 M 1380 M 850 M 2790 M 1286 M 800 (ép.) M 40 1640 1615 1575 (ép.) S S M 1215 1083 1065 S S S 785 700 M M 2092060 les intensités de bandes des spectres infrarouges, mentionnées dans le présent mémoire, sont désignées par les lettres "S", "M" et "V", respectivement, et sont données par approximation en fonction des fonds au voisinage des bandes. Une bande "S" est du même 5 ordre d'intensité que la bande la plus forte du spectre 5 des bandes "M" se situent entre un et deux tiers de l'intensité de la bande la plus forte et des bandes ont une intensité inférieure au tiers de l'intensité de la bande la plus forte. Ces estimations sont faites sur la base d'une échelle de pourcentages de transmission. 10 L'abréviation(ep.")désigne un "épaulement". Spectre ultraviolet : mesuré dans l'eau aux pH suivants : Amax. a pH 2,0 279 13,16 9 600 PH 7,0 269 9,37 6 835 15 pE 11,0 271 9,10 6 638 Réactions avec les enzymes Phosphatase alcaline brute le traitement avec la phosphatase alcaline donne la clindamycine identifiée par chromatographié en couche mince (gel de silice, 20 acétate éthylique-acétone-eau (8s5:1 volume/volume)). Diestérase de venin le traitement avec une diestérase de venin donne la clindamycine identifiée par chromatographié en couche mince (comme ci-dessus). - En plus de la clindamycine, le 5'-phosphate de cytidine est égale-25 ment produit. (b) Isolement par chromatographié du 3-(5'-adénylate) de clindamycine dans les produits rassemblés II On prépare la colonne à partir de 400 ml de résine "Amberlite XAD-2". On fait passer les produits rassemblés II .sur la colonne 30 à un débit de 15 ml/minute. On lave la colonne avec 4 1 d'eau» La liqueur usée et la liqueur aqueuse de lavage ne montrent pas de maximums ultraviolets et sont jetées. La colonne est éluée avec du méthanol en solution aqueuse à 80 %. Les fractions sont analysées en lumière ultraviolette. On obtient les résultats suivants : 71 13813 71 13813 2092060 E° de la fraction ^ max. Ça) 5 260fpas de maximum 10 260 (0,18) 12 260 (0,46) 14 260 (0,47) 15 260 (230,0) 16 260 (632) 17 260 (628) 18 260 (540) 19 260 (405) 20 260 (280) 21 • 260 (230) 22 260 (135) 23 260 (80) 24 260 (55) 25 260 (31,5) 26 260 (26,4) 27 260 (12,8) 28 260 (9,0) 29 260 (5,5) 30 260 (3,65) 31 260 (2,60) 32 260 (2,0) 33 260 (1,55) 25 On rassenible les fractions 15 à 21» On mélange la solution avec 1500 ml d'acétone. La substance précipitée est recueillie et séchée ; on obtient 2,1 g de 3-(5'-adénylate) de clindamycine ayant la structure suivante : 71 13813 -26- 2092060 R1 = CH2CH2CH3 oh oh Le 3-(5'-adénylate) de clindamycine a les propriétés chimiques et physiques suivantes : Résultats analytiques : Calculé pour ^ ^PSCl : Q » 44*63 I H « 6,05 î N = 13,07 ; S = 4,28 ; Cl = 4,72 ; P » 4,11 71 13813 -27- 2092060 Trouvé : C = 44,77 ; H = 6,66 ; N = 12,57 ; S = 4,65 î Cl = 4,38 ? P = 3,52 Poids moléculaire : Calculé pour C2gH glT ^SCl : 753,5 Trouvé : 726 (osmométrie de la tension de vapeur, dans le méthanol). Titrage potentiométrique : Dans l'eau : pKa' -1,6 poids équivalent = 620 Rotation spécifique : = +62,9° (c, 1,04, eau) Spectre infrarouge : les spectres infrarouges,en suspension dans une huile minérale et en pastille dans KBr,donnent les résultats suivants : En suspension dans l'huile minérale 15 Fréquence Fréquence Fréquence de bande de bande de bande (cm~^ Intensité (cm"' ) Intensité (cm"1) Intensité 3300 S 1470 4 P* MD S 1065 S 3240 S 1450 (huile) S 1050 S 2940 (huile) S 1445 (ép.) S 987 S 2920 (huile) s 1435 (ép.) S 965 S 2845 (huile) s 1417 S 927 M 1680 (ép.) s 1373 (huile) S 885 S 1653 s 1363 (ép.) S 853 M 1635 s 1327 S 817 M 1595 s 1298 S 795 S 1570 s 1245 (ép. ) S 717 (huile) S 1510 s 1215 S 5 10 71.13813 -28- '2092060 Sa -pastille dans KBr Fréquence de bande (cm~1) Intensité Fréquence de bande (cm"') Intensité Fréquence de bande (cm--' ) Inter 5 3340 S 1637 S 1313 S 3270 S 1593 S 1085 S 3220 S 1570 M 1065 S 2950 M 1510 M 1045 S 2920 S 1470 M 986 M 10 2865 M 1453 M 927 M 1682 S 1415 M 885 M 1675 S 1375 M 852 M 1660 S 1325 M 815 M 1650 S 1295 M 795 M 15 1645 S 1245 (ép, .) M 717 H S-pectre ultraviolet : mesuré dans l1 eau aux pH suivlnts : Amax» a £_ pH 2,0 257 16,76 12 628 pH 7,0 261 16,67 12 560 20 pH 11,0 261 16,87 12 711 Réactions avec des enzymes Phosphatase alcaline brute le traitement avec la phosphatase alcaline donne la clindamycine identifiée par chromatographié en couche mince (gel 25 de silice, acétate éthylique-acétone-eau (8t5t1 volume/volume))• Diestérase de venin Le traitement avec une diestérase de venin donne la clindamycine et le 5'-phosphate d'adénosine. Activité in vivo 30 Le 3-(5'-adénylate) de clindamycine n'a pas d'activité antibactérienne in vitro vis-à-vis de S. lutea» Toutefois, il est actif in vivo (souris, S.Q», S. aureus)» avec une dose DCj-q de 30 mg/kg» (c) Isolement par chromatographié du 3-(5'-uridylate) de clindamycine 35 présent dans les produits rassemblés HI On prépare la colonne à partir de 150 ml de "Amberlite XAD-2*» On fait passer les produits rassemblés IH sur la colonne à un débit de 10 ml/minute» On lave la colonne avec 1 1 d'eau» La liqueur usée 71 13813 -29- 2092060 et la liqueur aqueuse de lavage ne montrent pas de maximum dans le spectre ultraviolet. la colonne est ensuite éluée avec du métiianol en solution aqueuse à 80 f», les fractions sont analysées en lumière ultraviolette. On obtient les résultats suivants s 5 N° de la fraction A max. (a) 2 Pas de maximum 4 261 (0,25) 5 261 (0,97) 6 261 (107) 10 *7 1 261 (248) 8 261 (75) 9 261 (18) 10 - ' 261 (2,5) 11 261 (0,87) 15 On rassemble les fractions 6 à 9» On concentre la solution à sec. On dissout le résidu dans du méthanol et on mélange cette solution avec de l'éther pour obtenir un précipité j le rendement est de 740 mg de 3-(5,-uridylate) de clindamycine répondant à la formule suivante s = ch2CH2CH3 71 13813 -30- 2092060 z » OH OH 'Le 3-(5'-uridylate) de clindamycine a les propriétés chimiques et physiques suivantes : Résultats analytiques Calculé pour Cg^H^N^O ^PSCl s 5 C = 44,27 ; H = 6,33 j N = 7,68 ; 0 = 28,49 f S = 4,39 f Cl = 4,86 j P = 4,24 Trouvé : C = 44,62 ; H = 6,19 J N = 7,79 ? S = 4,04 f Cl = 4,32 ; P » 4,22. Poids moléculaire 10 Calculé pour C^H^l^O^^PSCl : 732,5 Trouvé : 764 (osmométrie de la tension de vapeur dans le méthanol). Titrage? potentiométrique Dans l,!eau î pEa' =7,6 15 poids équivalent = 576 Rotation spécifique [a]2|, +79*5® (c, 0,99, eau) Spectre Infrarouge Los- spectres infrarouges,en suspension dans une huile miné-20 raie et ©a pastille dans Or,donnent les résultats suivants : 71 13813 -31- 2092060 En suspension dans une huile minérale Fréquence Fréquence de bande de bande (cm-') Intensité (cta~^ Intensité Fréquence de bande ( cm ) Intensité 5 3330 S 1660 (ép.) S 1060 S 3080 S 1545 S 990 S 2950 (huile) S 1515 S 885 S 2920 (huile) S 1455 (huile) S 850 S 2840 (huile) S 1375 (huile) S 810 S 10 1750 (ép.) M 1260 S 763 S 1680 S 1215 S , 720 (huile) S En pastille dans KBr 15 Fréquence Fréquence de bande de bande (cm""') Intensité (cm-1 ) Intensité Fréquence de bande (cm*"^ ) Intensité 3410 S 1685 S 990 M 3260' (ép.) S 1512 M ... 965 M 3100 M 1458 M 883 M 2960 S 1380 M . - . 850 M 20 2920 S 1260 S 808' M 2865 M 1215 S 760 M 2800 M 1085 S 70 5 M 1700 (ép.) S 1060 S Spectre ultraviolet s mesuré dans l'eau aux pH suivants ; 25 Amax. a . JL - pH 2 ,0 261 11, 18* 8 189 pH 7,0 262 ' 11, 44 8 379 pH 11,0 262 ' 8, 90 6 519 Réaction avec des enz.vmes 50 Phosphatase alcaline "brute Par traitement avec une phosphatase alcaline, on obtient la clindamycine identifiée par chromatographié;en couphe mince, (gel de silice, acétate d'éthyle-acétone-eau (Ss5r1 volume/volumme))» Diestérase de venin 35 Par traitement avec une diestérase de venin, on obtient la clindamycine et le 5'-phosphate d'uridine. 71 13813 -52- 2092060 Activité la vivo Le 3- ( 5 '-uridylate) de clindamycine nta pas d'activité anti-bactérienne vis-à-vis de Sarcina lutea in vitro» Toutefois, il est actif in vivo (S.Q*, souris, S, aureus)» avec une dose DC^q 5 de 37 mg/kg* (d) Isolement par chromatographié du 3-(5*-guanylate) de clindamycine présent dans les produits rassemblés IV On prépare la colonne à partir de 200 ml de "Amberlite XAD—2"* On fait passer les produits rassemblés IV sur la colonne à un débit 10 de 20 ml/minute» On lave la colonne avec 3 1 d'eau* La liqueur usée et la liqueur aqueuse de lavage ne montrent pas de maximum dans l'ultraviolet* La colonne est éluée avec une solution aqueuse-de méthanol à 80 Des fractions sont analysées en lumière ultraviolette. On obtient les résultats suivants : 15 N° de la fraction A. max* fa) * ép» = épaulement On rassemble les fractidns 7 à 10* On mélange cette solution avec 1 1 d'acétone pour obtenir un précipité ; le. rendement est 30 de 1,2 g de 3-(5'-guanylate) de clindamycine de formule suivante t 2 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Pas de maximum Pas de maximum 20 25 254 (0,56) j ép»* 278 254 (260) j ép* 278 254 (740) j ép» 278 254 (400) j ép» 278 254 (168) ; ép.,278 254 (50) j ép» 278 -254 (11,5) f ép» 278 254 (3,2) i ép» 278 254 (1,16) j ép» 278 71 13813 -33- 2092060 ch3 I n. \L / CONH- CHa I H-C-Cl I —CH V SCHa oh Rt = CH2CH2CH3 le 3- ( 51 -gp.any la t e ) de cliMamyciiie a les propriétés chimiques et physiques suivantes r 71 13813 -34- 2092060 10 15 Résultats analytiques Calculé pour CggH IT^O.j^PSCl i C = 43,71 ? H = 5,85 ; N" = 12,74 j 0 = 25,00 j S = 4,16 ; Cl = 4,61 ; P = 4,03 Trouvé : C = 43,69 H = 6,34 5 N = 11,62 j S « 3,63 J Cl = 4,15 i P = 3,81. Poids moléculaire Calculé pour CggH^^H^O^^SCl : 769,5 Trouvé i 750 (osmométrie de la tension de vapeur, dans le méthanol) Titrage potentiométrlque Dans l'eau : pKa1 = 7,6 poids équivalent = 721 Rotation spécifique [a]2! » +69° (c, 1,0, eau) 20 Spectre infrarouge — — ■ lies spectres -et en pastille dans KBr,donnërrtrles résultats suivants : En suspension dans l'huile minérale minérale 25 30 Fréquence de bande (cffl ) Intensité 3330 S 3220 S 2920 (huile) S 2845 (huile) S 1684 S 1675 S 1635 S 1630 S 1595 S 1565 S Fréquence de bande (cm"1) 1530 1457 S 1409 M 1375 (huile) S Intensité S 1365 1315 1250 (ép») 1215 1080 (ép.) 1065 S M S S S S Fréquence de bande (cm"1) 1050 (ép.) 987 Intensité 963 925 885 855 795 780 717 (huile) 680 S M M M S M M M M M 71 13813 Fréquence -35- Bn pastille dans KBr Fréquence 2092060 Fréquence de bande (cm-1) Intensité de bande (cm"1) Intensité de bande (cm~^) Intensité 5 3420 S 1570 S 1065 S 3240 (ép.) S 1530 M 1045 S 2950 S 1450 M 985 M 2920 S 1405 M 925 M 2865 S 1380 M 885 M 10 1685 S 1355 M 855 M 1635 S 1255 (ép.) .M 800 M 1630 S 1210 S 780 M 1595 S 1080 s" Spectre ultra-violet : mesuré dans" l'eau aux pH suivants 15 X max. a JL pH 1,0 256 277 ép. 14,49 9,69 11 150 7 456 pH 7,0 254 273 ép. 16,18 11,21 12 450 8 626 pH 11,0 259 13,95 10 734 20 266 13,78 10 603 25 30 35 Réaction avec des enzymes Phosphatase alcaline brute . Par traitement avec une phosphatase alcaline, on obtient la clindamycine identifiée par chromatographié en couche mince (gel de silice, acétate éthylique-acétone-eau (8t5*1 volume/volume))» Diestérase de venin Par traitement avec une diestérase de venin, on obtient la clindamycine et le 5'-phosphate de guanosine» Activité in vivo le 3-(5'-guanylate) de clindamycine n'a pas d'activité anti-r bactérienne contre Sarcina lutea in vitro. Toutefois, il est actif in vivo (S.Q., souris, S. aureua) avec une dose de 26 mg/kg» Exemple 2 En remplaçant le micro-organisme S. coelicolor MUller NKR1 3532 de l'exemple 1 par le miero-organisme Strep-tomyces venezuelae NRRi 3527, on obtient les 3-nucléotides de clindamycine décrits dans 11 exemple 1. 2092060 Exemple 3 En remplaçant la clindamycine par la lincomycine dans le milieu de fermentation de l'exemple 1, on obtient les 3-nucléotides de lincomycine dont les fragments nucléotide sont les mêmes que ceux 5 qui sont décrits dans l'exemple 1. Exemple 4 En remplaçant la clindamycine par la 1'-déméthylclindamycine dans le milieu de fermentation de l'exemple 1, on obtient les 3-nucléotides de 1'-déméthylclindamycine dont les fragments nucléo-10 tide sont les mêmes que ceux qui sont décrits dans l'exemple 1. •Rramplfi 5 En remplaçant la clindamycine par la 1'-déméthyl-4'-dépropyl-4'-pentylclindamycine dans le milieu de fermentation de l'exemple 1, on obtient les 3-nucléotides de 1 '-déméthyl^'-dépropyl^'-pentyl-15 clindamycine dont les fragments nucléotide sont les mêmes que ceux qui sont décrits dans l'exemple 1. Exemple 6 En remplaçant la clindamycine par la 4t-dépropyl-4'-éthyl-lincomycine dans le milieu de fermentation de 1*exemple 1, on obtient 20 les 3-nucléotides de 4'-dépropyl-4'-éthyl-lincomycine dont les fragments nucléotide sont les mêmes que ceux qui sont décrits dans 11 exemple 1 » Exemple 7 En remplaçant la clindamycine par la 1'-déméthyl-1'-éthyl-25 lincomycine dans le milieu de fermentation de l'exemple 1t on obtient les 3-nucléotides de 1'-déméthyl-1'-éthyl-lincomycine dont les fragments nucléotide sont les mêmes que ceux qui sont décrits dans 1'exemple 1» Exemple 8 30 En remplaçant la clindamycine par la 1'-déméthyl-lincomycine dans le milieu de fermentation de l'exemple 1, on obtient les 3-nucléotides de 1'-déméthyl-lincomycine dont les fragments nucléotide sont les mêmes que ceux qui sont décrits dans l'exemple 1« Exemple 9 35 En remplaçant la clindamycine par la célesticétine dans le milieu de fermentation de l'exemple 1, on obtient les 3-nucléotides de célesticétine dont les fragments nucléotide sont les mêmes que 71 13813 71 13813 -37- 2092060 ceux de l'exemple 1. Dans les exemples suivants, comme ci-dessus, les fragments nucléotide des composés de ces exemples sont les mêmes que ceux qui sont décrits dans l'exemple 1, c'est-à-dire les fragments 5 cytidylate, adénylate, uridylate et guanylate. Exemple 10 Sel d'ammonium du 3-nucléotide de lincomycine On dissout un 3-nucléotide de lincomycine sous la forme d'un zwitterion dans une quantité minimale d'eau et on dilue la solution avec une quantité égale d'éthanol. On refroidit la solu-10 tion dans un "bain d'eau glacée, puis on la sature d'ammoniac gazeux» On évapore la solution à sec à 30°C sous un vide poussé. On dissout le résidu dans une quantité minimale de méthanol et on dilue la solution avec 5 volumes d'éther pour précipiter le 3-nucléotide de lincomycine sous la forme du sel d'ammonium» 15 Exemple 11 Solution aqueuse administrée en gouttes par voie orale 3-nucléotide de lincomycine 100 g Propylparaben 0,25 g Méthylparaben O,75 g Acide sorbique 1,0 g 20 Hydroxyde de sodium, solution aqueuse 4N, quantité suffisante pour un pH de 7,5 Eau désionisée, quantité suffisante pour 1000 ml Exemple 12 Sirop 25 On prépare une composition orale aqueuse contenant 400 mg d'un 3-nucléotide de lincomycine dans un volume de 5 ml, à partir des ingrédients suivants : 3-nucléotide de lincomycine 800 g Méthylparaben , U.S.P. 7,5 g 30 Propylparaben , U.S.P. 2,5 g Acide sorbique 10 g Sel de sodium de la saccharine 6,5 g Glycérine 3000 ml Gomme adragante en poudre 100 g 35 Essence d'orange (parfum) 10 g Colorant orangé "E.D, et C." 7,5 g Hydroxyde de sodium, solution aqueuse 4N, quantité suffisante pour un pH de 7*5 71 13813 -38- 2092060 Eau désionisée, quantité suffisante pour 10 000 ml A la place du 3-nucléotide de lincomycine des exemples 11 et 12, on peut utiliser un 3-nucléotide de 7(S)-chloro-7-déoxy-lincomycine substitué, de même que les sels hydrosolubles d'un 5 3-nucléotide de 7(S)-chloro-7~déoxylincomycine, par exemple les sels de métaux alcalins, y compris le sel d'ammonium» Les formulations aqueuses des exemples 11 et 12 sont particulièrement intéressantes comme préparations pédiatriques et peuvent être administrées par voie orale aux même doses posologiques que la 10 lincomycine. Exemple 13 Capsules On prépare 1000 capsules de gélatine dure en deux parties, destinées à l'administration par voie orale,contenant chacune ;>50 mg d'un 3-nucléotide de 1'-déméthylclindamycine, à partir des 15 types et des quantités suivants d'ingrédients : 3-nucléotide de 1'-déméthylclindamycine 350 g Amidon de maïs 50 g Talc 25 g Stéarate de magnésium 2,5 g 20 On mélange intimement les ingrédients, puis on les encapsule de la manière usuelle. Les capsules décrites ci-dessus sont intéressantes pour le traitement systémique d'une infection chez des êtres humains adultes,par administration orale d'une capsule toutes les 4 heures* 25 En utilisant le procédé décrit ci-dessus, on prépare des capsules de la même façon, avec un 3-nucléotide de 1'-déméthylclindamycine en quantités de 50, 125, 250 et 500 mg,en remplaçant les 350 g utilisés ci-dessus par 50, 125, 250 et 500 g d'un 3-nucléotide de 1'-déméthylclindamycine. 30 Exemple 14 Comprimés On prépare un millier de comprimés destinés à l'administration par voie orale, contenant chacun 500 mg d'un 3-nucléotide de 1'-déméthy1-4'-dépropy1-4'-pentylclindamycine à partir des types et des quantités d'ingrédients mentionnés ci-après : 35 3-nucléotide de 1'-déméthy1-4'-dépropy1-4'- pentylclindamycine 500 g lactose 50 g 71 13813 -39- .2092060 Amidon de maïs 65 g Stéarate de magnésium 3 g Vaseline liquide légère 3 g On mélange intimement les ingrédients et on les transforme 5 en disques» Les disques sont rompus par passage à travers un tamis de 1.19 mm d'ouverture de maille» Les granulés résultants sont ensuite transformés en comprimés, chaque comprimé contenant 500 mg d'ingrédient actif» Les comprimés obtenus comme indiqué ci-dessus sont intéressants 10 pour le traitement systémique d'infections chez des êtres humains adultes, par administration orale d'un comprimé toutes les 4 heures» En utilisant le procédé décrit ci-dessus, excepté qu'on réduit la quantité d'ingrédient actif à 200 g, on prépare des comprimés contenant 200 mg d'ingrédient actif» 15 Exemple 15 Préparation parentérale On prépare une préparation aqueuse stérile destinée à l'injection intramusculaire, contenant dans 1 ml, 300 mg d'un 3-nucléotide de célesticétine, à partir des types et des quantités d'ingrédients suivants : 20 3-nucléotide de célesticétine 300 g Alcool benzylique 9 g Eau pour injection, quantité suffisante pour 1000 ml Le médicament stérile est dispersé dans un véhicule stérile à base d'alcool benzylique et d'eau et la dispersion est introduite 25 dans des ampoules, puis les ampoules sont scellées. Exemple 16 Aliment pour les animaux On prépare 1000 g d'un mélange alimentaire à partir des types et des quantités d'ingrédients indiqués ci-après : 3-nucléotide de 4'-dépropy1-4'-éthyl-linconycine 20 g 30 Farine de soja 390 g Farine de poisson 400 g Huile de germe de blé 50 g Mélasses de sorgho 140 g On mélange .les ingrédients ensemble et on les transforme en 35 pastilles» La composition peut 'être donnée comme aliment à des animaux de laboratoire, à savoir des rats, des souris, des cobayes et des 2092060 lapina, à des fine prophylactiques pendant une expédition» Pour les animaux de plus grande taille, la composition peut être ajoutée à l'alimentation régulière de ces animaux en une quantité calculée de manière à délivrer la dose désirée d'ingrédient actif» 71 13813 -40- 71 13813 -41- 2092060 Exemple 17 Préparation parentérale. On prépare une composition aqueuse stérile destinée à l'injection par voie intramusculaire, contenant dans 1 ml»300 mg d'un 3-nucléotide de lincomycine,à partir des types et des quan-5 tités d'ingrédients indiqués ci-après : 3-nucléotide de lincomycine 300 g Alcool benzylique 9 g Eau pour injection, quantité suffisante pour 1000 ml 10 Le médicament stérile est dispersé dans^ un véhicule stérile à base d'alcool benzylique et d'eau et la dispersion est'introduite dans'des fioles, puis les fioles sont scellées. Exemple 18 Chlorhydrate de 7-déoxy-7(S)-méthoxylincomycine Partie 18-A : N-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide 15 méthylique. 3 On maintient sous agitation dans 25 cm de méthanol une suspension de 2,35 g de 6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-a-thio-lincosaminide méthylique (VI). On ajoute ensuite à la suspension 2,04 g d'anhydride acétique. Après agitation à la température 20 ambiante pendant une heure, on chasse le solvant sur un évapora-teur rotatif à 40°C, sous pression de 7 mm. La substance solide résultante est ensuite chromatographiée sur une colonne de gel de 71 13813 -42- 2092060 silice de 4,8 x 94 cm, en utilisant comme système de solvants un mélange d'alcool méthylique et de cl^oçoforme à 1:10. La silice pèse 750 g. Après une première f^Qtion de 1000 ml, on recueille des fractions de 50 ml. On-rassemble .les fractions 5 31 à 85 et on les évapore à sec pour obtenir 3,2 g de N-acétyl-7(S)-méthoxy-7-déoxv-a-thiolincosaminide méthylique (VII) sous la forme d'une matière solide amorphe incolore ayant un poids moléculaire, mesuré par spectrométrie de masse, de 309, comparativement au poids moléculaire calculé de 309,38.. 10 Les composés aziridino de formule VI utilisés comme matières premières peuvent être obtenus par déshydrohalogénation de 7(S)-chloro-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique (voir brevet belge n° 705 427 et demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n°692 727 du 22 décembre 1967 déposée par Robertï). ^iiKJî®IEYËBT et Fred~KÀQÏN-15 La déshydrohalogénation est effectuée avec du carbonate de sodium anhydre par chauffage au reflux dans le diméthylformamide (brevet belge n° 732 352 : demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 725 531 du 30 Avril 1968 déposée par Barney J. MAffERLEUT et Fred KAGAN. Partie 18-B : 7-d.éoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique 20 (VIII) (6,8-didéoxy-7-0-méthyl-6-amino-1-thio-L-threo- a-D-galacto-octopyranoside méthylique) CH3 OMe NHa 0H VIII 71 13813 -43- 2092060 On chauffe au reflux modéré sous agitation au bain d'huile à 145°C pendant environ 16 heures une solution de 3,2 g de 7-déoxy-7(S )-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (VII) dans 25 g d'hydrate d'hydrazine. Le solvant est chassé aussi complètement que 5 possible de la solution incolore, par distillation dans un bain d'huile réglé à 100°C sous pression de 15 mm, et finalement sous un vide poussé, pour donner le 7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosa— minide méthylique sous la formé d'un sirop incolore. Le sirop est chromatographié sur 750 g de gel de silice dans une colonne de 10 4,8 x 97 cm, en utilisant comme système de solvants un mélange de méthanol et de chloroforme à 1:10. Après une première fraction de 1,4 1, on recueille des fractions de 50 ml.. On rassemble les fractions 281 à 600 et on les évapore à sec, ce qui donne 2,06 g de 7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincoBaminide méthylique (VIII) 15 qui d.onne, par cristallisation dans l'acétonitrile, des aiguilles incolores ayant les caractéristiques suivantes : Point de fusion : 154-155°C [œ] = +260° (c, 0,5634, HgO) Analyse : '" 20 Calculé pour C.j qH^ O^NS : C = 44,92 ; H = 7,92 ; N = 5,24 ; S = 12,00 ; OMe = 11,61 Trouvé : C = 45,20 ; H = 7,96 ; N = 5,08 ; S. = 12,19 ; OMe = 11,86 Poids moléculaire calculé = 267,35 25 Poids moléculaire trouvé^ (speçtrométrie de masse) = 267» Partie 18-C : Chlorhydrate de 7-déoxy-7(S)-méthoxylincomycine. 71 13813 -44- 2092060 CHS OMe C II O NH HO • HC1 N_J/I SMe OH Pr = n-propyl IX On ajoute sous agitation 2,89 g de triéthylamine à une suspension de 2,7 g de chlorhydrate d'acide trans-1-méthyl-4- On continue d'agiter jusqu'à ce que la totalité de la substance solide soit dissoute ; le mélange réactionnel est ensuite refroidi dans un bain de glace et de méthanol à -5°C, et un précipité de chlorhydrate de triéthylamine apparaît. On ajoute ensuite 1,78 g 10 de chloroformiate d'isobutyle goutte à goutte, en maintenant^la température du mélange réactionnel entre -5° et -3°C. Un supplément de chlorhydrate de triéthylamine précipite et on poursuit l'agitation à -5°C pendant 20 minutes. On ajoute au mélange réactionnel résultant 1,74 g de 7-déoxy-7(S)-méthozy-g-thiolincoqgminide méthy- "2T 15 lique (VIII) en solution dans 10 cm d'eau. A mesure que la matière solide se dissout, la température s'élève à environ 0°C et on continue d'agiter pendant deux heures, sans poursuivre la congélation du bain de refroidissement. Le solvant est ensuite chassé sur un évaporateur rotatif à 40°C sous un vide de 15 mm, ce qui donne un 20 résidu visqueux de couleur brune. On dissout ce résidu dans de l'acide chlorhydrique dilué et on extrait la solution (pH 2) deux 71 13813 -45- 2092060 fois avec du chloroforme, puis on lave les extraits rassemblés une fois avec de l'eau. La phase aqueuse contenant l'eau de lavage est ajustée à un pH égal à 11 avec de 1'hydroxyde de sodium (solution aqueuse à 50 f°) saturé de chlorure de sodium, puis elle est 5 extraite trois fois avec du chloroforme. Les extraits chloroformi-ques rassemblés sont déshydratés sur du sulfate anhydre de sodium et concentrés à sec, ce qui donne 1,76 g d'une matière solide amorphe de couleur tan. Cette substance est chromâtographiée sur 750 g de gel de silice dans une colonne de 4,8 x 94 cm, en utilisant 10 comme système de solvants un mélange de méthanol et de chloroforme à 1:15. Après une première fraction de 1,3 1, on recueille des fractions de 50 ml. Les fractions 60 à 80 .sont rassemblées et concentrées à sec en donnant la 7-déoxy-7(S)-méthoxylincomycine sous la forme de la base libre, qui est un sirop pratiquement incolore. 15 Cette base libre est reprise dans une solution aqueuse diluée d'acide-chlorhydrique et la solution résultante est filtrée et lyophilisée en donnant 801,4 mg de chlorhydrate de 7-déoxy-7(S)-méthoxylincomycine sous la forme d'une matière solide amorphe incolore ayant les caractéristiques suivantes : 20 [a]D = +117° (c, 0,9626, H20) Analyse : Calculé pour C.j ^KLjgOgN^S.HCl : C = 49,93 ; H = 8,16 ; N = 6,13 î S = 7,02 Trouvé (valeur corrigée compte tenu de la présence de 5,14 % d'eau) 25 C = 49,44 ; H = 7,99 ; - N = 6,20 ; S = 6,48 Poids moléculaire calculé pour la base libre anhydre : 420,57 Trouvé (spectrômétrie de masse) : 420 La 7-déoxy-7(S)-méthoxylincomycine ainsi produite peut être soumise aux procédés de la présente invention pour former 30 les 3-nucléotides nouveaux correspondants de la présente invention. Exemple 19 Variante du procédé de production de 7-déoxy-7(S)- méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (VIII) Partie 19-A : N-acétyl-6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-2,3,4-tri-0-acétyl-a-thiolincosaminide méthylique (Z) 71 13813 _46_ 2092060 CHa X 3 On ajoute sous agitation 10 cm d'anhydride acétique à une solution de 2,0 g de 6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-a- ■z thiolincosaminide méthylique (Yl) dans 20 cm de pyridine et on laisse le mélange réactionnel reposer à la température ambiante 5 pendant environ 2 heures. On chasse aussi complètement que possible la matière volatile du mélange réactionnel, sur un évaporateur rotatif à 40°C sous un vide de 7 mm, et finalement sous un vide poussé, pour obtenir une substance solide incolore, la substance solide résultante est dissoute dans du chloroforme, agitée avec 10 une solution aqueuse de chlorure de cadmium pour éliminer la pyridine, filtrée, puis la phase chloroformique eBt lavée deux fois à l'eau et déshydratée sur du sulfate anhydre de sodium. Par élimination du solvant sur un évaporateur rotatif à 40°C sous un vide de 7 mm, on obtient le N-acétyl-6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-15 2,3,4-tri-0-acétyl-a-thiolincosaminide méthylique (2) sous la forme d'une matière solide cristalline incolore qui pèse 3>1 g. Par recristallisation dans un mélange d'acétate éthylique et de "Skelly-solve B" (hexane technique), on obtient des aiguilles prismatiques incolores ayant les caractéristiques suivantes : 20 Point de fusion : 173,5-175°C [a]D = +222° (c, 0,912, CHCl^) 71 13813 -47- 2092060 Analyse : Calculé pour C^H^^OgîTS : C = 50,61 ; H = 6,25 ; N" = 3,47 ; S - 7,95 Trouvé : 5 C = 50,43 ; H = 6,33 ; N = 3,41 ; s = 8,31 Poids moléculaire calculé : 403,45 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) : 403. Partie 19-B : ÏT-acétyl-2,3,4-tri-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (Xl) 10 On chauffe au reflux modéré dans un bain dlhuile à 130°C pendant 6 heures un mélange de 5 g de ÎT-acétyl-2,3*4-0-triacétyl-6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique "Z *z (X), 50 cm de méthanol et 5 cm d'acide acétique cristallisable. On chasse le solvant de la solution incolore à 40°C sous un vide 15 de 7 mm sur un évaporateur rotatif, ce qui donne un sirop jaune pâle qui cristallise. On reprend les cristaux en les dissolvant dans du chlorure de méthylène, on lave la solution avec du bicarbonate de sodium en solution aqueuse saturée, puis avec de l'eau, et on la déshydrate ensuite sur du sulfate anhydre de sodium. En 20 chassant le solvant comme indiqué ci-dessus, on obtient le N-acé-tyl-2,3,4-tri-0-acétyl-7(S)-méthoxy-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XI) sous la forme de cristaux incolores (5,31 g). Par cristallisation dans un mélange d'acétate éthylique et de "Skelly-solve B" on obtient de fines aiguilles incolores ayant les pro-25 priétés suivantes : Point de fusion : 235-236°C [a]D = +205° (c, 0,9952, CHCl^) Analyse : Calculé pour C^ gHggOgïFS : 30 C = 49,64 ; H = 6,71 ; N = 3,22 ; S = 7,36 ; OMe = 7,13 Trouvé : C = 49,77 5 H = 6,92 ; F = 3,65 î S = 7,90 ; OMe = 7,38 Poids moléculaire, calculé : 435,49 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) : 435 35 Par hydrazinolyse au moyen du procédé de la partie 18-B, on obtient le 7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (VIII). 71 13813 -48- 2092060 Exemple 20 Variante de l'exemple 18 Partie 20-A : N-acétyl-2,3»4-tri-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XI) et N-acétyl-2 , 3 » -di-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide 5 méthylique (XII) AcNH CHa CH: AcQ OMe AcNH- r N \0Ac /5Me I ÛAc OMe Y \ MjAc A* I OAc XI • XII On ajoute 50 cm d'anhydride acétique sous agitation à 26,61 g de H-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide •z méthylique (VII) dans 100 cm de pyridine et on laisse reposer le mélange réactionnel pendant environ 16 heures à la température 10 ambiante. On chasse ensuite les substances volatiles par distillation sur un évaporateur rotatif à 40°C sous un vide de 7 nim et finalement sous un vide poussé. On dissout le résidu dans du chloroforme et 'on lave la solution avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium. On lave la phase aqueuse" avec du chloro-15 forme et on agite les extraits chloroformiques rassemblés avec du chlorure de cadmium en solution aqueuse pour éliminer la pyridine. On isole le précipité par filtration et on le lave correctement avec du chloroforme, puis on sépare la phase chlorofor-mique, on la lave deux fois à l'eau et on la déshydrate sur du 20 sulfate anhydre de sodium. En chassant le solvant sur un évaporateur rotatif à 40°C sous un vide de 7 mm, on obtient un sirop de 71 13813 -49- 2092060 couleur jaune pâle qui cristallise au repos. Par recristallisation dans un mélange d'acétate éthylique et de "Skellysolve B", on obtient le produit sous la forme de petites aiguilles incolores aplaties, ayant les caractéristiques suivantes : 5 Point de fusion : 245-247°C [oc]D = +202° (c, 0,7142, CHC13) Analyse : Calculé pour C^gH^gOgNS : C = 49,64 ; H = 6,71 ; N = 3,22 ; S = 7,36 ; OMe = 7,13 10 Trouvé : C = 49,24 ; H = 6,75 ; N = 3,34 ; S = 7,52 ; OMe = 7,17 Poids moléculaire calculé : 435,49 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie" de masse) : 435 la méthode de distribution à contre-courant de Craig 15 utilisant un système de solvants à base d'éthanol, d'eau, d'acétate éthylique et de cyclohexane dans la proportion de 1:1:1:1, montre que la substance indiquée ci-dessus contient 70 % de N-acétyl-2,3,4-tri-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XI) et 30 fo de N-acétyl-2,3-di-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-20 méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XII). Après 500 transferts, les fractions des tubes 225 à. 310 sont rassemblées (valeur .£ = 1,14) et évaporées à sec ; par recristallisa bien dans un mélange d'acétate éthylique et de "Skellysolve B", on obtient le ÏT-acétyl-2,3, 4-tri-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-g-thiolincosaminide méthylique (XI) 25 sous la forme de fines aiguilles incolores identiques au produit de la partie 19-B. les fractions des tubes 115 à 120 (valeur E = 0,59) sont rassemblées et évaporées à sec et, par recristallisation dans un mélange d'acétate éthylique et de "Skellysolve B", on obtient 30 le ÎI-acétyl-2,3-di-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosami-nide méthylique (XII) sous la forme de très grosses aiguilles incolores ayant les caractéristiques suivantes : Point de fusion : 189-190°C [«In = +275° (c, 1,0188, CHC1,) V J 71 13813 -50- 2092060 Analyse : Calculé pour C^gH^OgNS : C = 48,84 ; H = 6,92 ; N = 3,56 ; S = 8,15 ; OMe = 7,89 Trouvé : 5 c = 48,71 ; H = 7,11 ; N = 3,93 ; S - 7,96 ; OMe = 7,98 Poids moléculaire calculé : 393,46 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) : 393. Partie 20-B Acétylation du N-acétyl-2,3-di-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XII) 10 On ajoute 10 cm d'anhydride acétique sous agitation à une solution de 200 mg de N-acétyl-2,3-di-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XII) dans 20 cm^ de pyridine et on laisse reposer le mélange réactionnel à la température ambiante pendant environ 16 heures.On-chasse le solvant 15 de la solution réactionnelle incolore sur un appareil rotatif à 140°C sous un vide de 7 mm et finalement à 40°C sous un vide poussé. Le résidu sirupeux est dissous dans du chloroforme, la solution est lavée avec une solution aqueuse diluée d'acide chlorhydrique (0,5 N), deux fois avec de l'eau, avec une solution saturée de bicarbonate 20 de sodium et deux fois avec de l'eau, puis la solution est déshydratée sur du sulfate anhydre de sodium. Le solvant est ensuite chassé sur un évaporateur rotatif à 40°C/7 mm en donnant le N-acétyl-2,3,4-tri-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XI) sous la forme d'un sirop incolore qui cristallise au repos. 25 Par hydrazinolyse des produits de la partie 20-A et de la partie 20-B, on obtient le 7-déoxy-7(S)-méthoxy-o-thiolincosaminide méthylique (VIII). Exemple 21 Variante de l'exemple 18 Partie 21-A : N-acétyl-6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-a-thiolineo-30 saminide méthylique (XIII) 71 13813 -51- 2092060 XIII On ajoute sous agitation 2,04 g d'anhydride acétique à une solution de 2,3 g de 6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-a-thio- •Z lincosaminide méthylique (VI) dans 25 cm d'alcool isopropylique. La majeure partie de la substance solide semble passer en solution 5 et être remplacée par formation d'une nooveXLe eaoseanoô saline» Le mélange réactionnel est agité pendant environ 16 heures à la température ambiante, puis filtré , et le résidu est lavé avec de l'alcool isopropylique et séché à l'état humide à 60°C sous un vide de 15 mm. On obtient 2,26 g de N-acétyl-6,7-aziridino-6-déami-10 no-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique sous la forme de lamelles incolores ayant les propriétés suivantes : Point de fusion : 145°C [a]D = +253° (c, 0,7916, H20) Analyse : 15 Calculé pour C^H^gO^NS : C = 47,63 ; H = 6,91 ; $ =. 5,05 ; S = 11,56 Trouvé; C = 47,57 ; H = 6,71 ; N = 5,23 ; S = 11,29 Poids moléculaire calculé : 277,34 20 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) : 277. Partie 21-B s N-acétyl-7-déoxy-7(S)-méthoxy-a-thiolincosaminide (VII) Par traitement de N-acétyl-6,7-aziridino-6-déamino-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XIII) avec du méthanol et 4g l'aoide acétique au reflux, on obtient le N-a o é tyl-7-dé oxy-7(3) -ciéthoxy- 25 oc-thiolincôsaminide méthylique (VII) Identique au produit dé la par» tie 18-A. 71 13813 -52- 2092060 Exemple 22 Chlorhydrate de 7-déoxy-7(S)-éthoxylincomycine Partie 22-A: H-acétyl-7-déoxy—7(S)—éthoxy—g-thiolincosami ni de méthyli que (XIV) CHa OEt AcNH SMe OH XIY 5 Par traitement du N-acétyl-6,7—aziridino—6-déaminb—7—déoxy- g-thiolincosaminide méthylique (XIII) avec de ltéthanol et de l1acide acétique au reflux modéré, on obtient le U-acétyl-7-déoxy-7(S)-éthoxy-1-thio-a-lincosaminide méthylique (XIY) sous la forme d*un sirop ayant un poids moléculaire, déterminé par spectrométrie 10 de masse, de 323 comparativement au poids moléculaire calculé de 323,41. Partie 22-B: N-acétyl-2,3,4-tri-O-acétyl-7—déoxy-7(S)-éthoxy—a— thiolincosaminide méthylique (XV) et N-acétyl-7—déoxy— 7(S)—éthoxy-2,3-di-O—acéty1—a—thiolincosaminide mé-15 thylique (XYl) 71 13813 -53- 2092060 ch3 ch3 XV XYI Par traitement du. N-acétyl-7-déoxy-7(S)-éthoxy-g-thiolinco-saminide méthylique (XIV) avec 1*anhydride acétique et la pyridine au moyen du procédé de la partie 20-A» on obtient le ÏT-acétyl-2,3,4-5 tri-0-acétyl-7-déozy-7(S)-0-éthyl-g-thiolinco3ami ni de méthylique (XV) ainsi qu*une faible quantité de N-acétyl-2,3-di-0-acétyl-7-déoxy-7(S)-éthoxy-g-thiolincosam.inide (XYl). Les produits (isolés sur un appareil de Craig par 500 transferts en utilisant un mélange éthano1:e au t ac etat e éthylique:cyclohexane (1t1t1t1) comme système 10 de solvants) sont caractérisés de la façon suivante : Mélange : point de fusion 197-199°C [a]D = +247° (c, 0,665, CHC15) Analyse i Calculé pour C^ ^ O^NS : 15 0= 50,76 ; H = 6,95 ; H = 3,12 ; S = 7,13 5 OEt = 10,02 Trouvé : C = 50,42 ; H = 7,07 ; N = 3,18 ; S = 7,37 ; OEt ='11,85 Produit XY pur (E = 1,59) 1 point de fusion 254-255°C Mjj = +199° (c, 0,8638, CHC15) 20 Analyse : Calculé pour C^H^^OglîB x C = 50,76 ; H = 6,95 ; ' K = 3,12 ; S = 7,13 5 OEt = 10,02 Trouvé : C = 50,75 ; H = 7,06 ; 1 = 3,37 ; S = 7,31 5 OEt = 10,25 71 13813 -54- 2Q92060 Poids moléculaire calculé t 449*52 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) i 449 Produit XVI pur (K = 0,87) : point de fusion 215*5-216,5°.. [cc]D = +261° (c, 1,0448, CHC13) 5 Analyse î Calculé pour C^^H^gOgUS 1 C = 50,11 ; H = 7,17 ; N = 3,44 ; S = 7,87 Trouvé : C = 50,17 ; H = 7,30 j N = 3,50 ; S = 7,62 10 Poids moléculaire calculé : 407*48 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) x 407 Partie 22-C : 7-déoxy-7(S)-éthoxy-a-thiolinoosaminide méthylique (XVII) ch3 XVII 15 3n soumettant les produits de la partie 22—B* c*est—à-dire le mélange, le produit XV pur ou le produit XVI pur#à une hydrazi— nolyse, on obtient le 7-déoxy—'7(S)— éthoxy—a—'thiolinoosaminide méthylique (XVII) ayant les caractéristiques suivantes t Point de fusion 194-196°0 20 [a]D = +252° (c, 0,7438, H20) Analyse j Calculé pour C, ..IL-O^NS : 11 23 5 C = 46,95 ; H = 8,24 ; F = 4,98 ; S = 11*40 Trouvé : 25 G = 46*66 î S » | H = 5,26 ; S » 11,33 71 13813 -55- 2092060 Poids moléculaire calculé i 281,37 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 281 Partie 22-D t Chlorhydrate de 7-déoxy-7(S)-éthoxy lincomycine (XVTII) Me I Me = méthyle 5 Et = éthyle XVIII Pr = propyle En suivant le mode opératoire de la partie 18-C, on transforme le 7-déoxy—'7(S)—éthoxy—a-thiolinoosaminide méthylique (XVTI) en chlorhydrate de 7-déoxy—7(S)—éthoxylincomycine ayant les carac-10 téristiques suivantes : Point de fusion t solide amorphe incqlore [a]D = +109° (c, 0,9824, H20) Analyse j Calculé pour C^H^gOgl^S »HC1 t 15 c = 50,99 J H =8,35 ; N = 5,95 ; Cl = 7,53 ; S = 6,81 j OEt = 9*57 Trouvé (valeurs corrigées compte tenu de la présence, de 5,07 % d*eau) t C a 50,54 5 H = 8,19 ; H = 5,63 ; Cl = 7,61 j S = 6,95 } OEt = 10,16. 71 13813 -56- 2092060 Exemple 25 Partie 23-A : H-acétyl—'7~déoxy-7(S)-propoxy-<>-thiolincosaniinide méthylique (XIX)f N-acétyl-2»3>4~tri—O-acétyl-7-déozy-7(S)-propozy-a-thiolinoosaminide méthylique (XX) et N-acétyl-7-déoxy—'7(S)—propoxy-2,3-di-0~ acétyl—a-thiolinoosaminide méthylique (XXI) i ch3 ch3 xix XX ch3 + OPr acnh HO SMe OAc 2X1 Par traitement du N-ac é t yl- 617-az iridino—6—d é amino—7—d é oxy-g-thiolinoosaminide méthylique (XIII) avec du propanol et de 1*acide 71 13813 -57- 2092060 acétique sous un reflux modéré, on obtient le ïï-acétyl-7-déoxy-7(S)-propoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XIX) à partir duquel on obtient, par acétylation avec 1*anhydride acétique dans la pyridine au moyen du procédé de la partie 22-B, le ïï-acétyl-2»3>4-5 tri-0-acétyl-7(S)-propoxy-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XX) contenant une faible quantité de N—acétyl—2,3-di-0-acétyl-7(S)-propoxy-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthylique (XXI) ayant les caractéristiques suivantes : Mélange t point de fusion 240—242°C 10 [a]D +207° (c, 0,9054, CHCl^ Analyse : Calculé pour C2QR^0glflS t C = 51,81 ; H = 7,17 ; N = 3,03 ; S = 6,92 ' Trouvé : 15 C = 51,41 ; H = 7,33 ; N -= 3,16 j S = 6,92 Poids moléculaire calculé i 463*60 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 463 Composé XX pur j point de fusion 241,5-242,5°C 20 [ Analyse t Calculé pour C2QH^^0gUS : C = 51,81 ; H = 7,17 5 N = 3,03 ; S = 6,92 Trouvé j 25 C = 51,77..; H = 7,02 ; H = 3,37 ; s = 6,84 Poids moléculaire calculé t 463,60 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) 463 Partie 23—B : 7-déoxy—7(S)—propoxy—a—thiolinoosaminide méthylique (XXII) 71 13813 -58- 2092060 XXII Par hydrazinolyse des produits indiqués ci-dessus (partie 23—A), on obtient le 7-déoxy-7(S)—propoxy-a—thiolinoosaminide (XXII). Partie 23-C t Chlorhydrate de 7-déoxy-7(S)-propoxylincomycine (XXIIl) ch3 •NH OPr ■HC1 XXIII Par acylation avec 1*acide trans-1-méthyl-4-propyl-L-2—pyr— rolidinecarboxylique au moyen du procédé de la partie 18-C, on obtient le chlorhydrate de 7-déoxy—7(S)-propoxylincomycine (XXIIl). 71 13813 -59- 2092060 Exemple 24 Partie 24—A j H-ac étyl-2,314-tri—O-ac étyl—7-déoxy—7(S)-isopropoxy— g-t3iioliricosamlni.de méthylique (XXIV) CHs X2XV En suivant le mode opératoire de la partie 19—B» et en rent-plaçant le méthanol par l,alcool isopropylique., on obtient le lï-acétyl-2,3,4—tri-O-acétyl—7-déoxy—7(S)-laopropoxy—o-thlolin posa— miaide méthylique (XXIV) ayant les caractéristiques suivantes t Point de fusion t 253-254°C [oc]d-+192° (c, 0,535* 0H015) An al .va fi : Calculé pour C^H^OgNS ; C = 51*81 j H = 7*17 j H = 3*03 j S = 6,92 Trouvé t C = 51*96 ; H = 7*07 s N = 3,19 ï S = 6*61 Poids. moléculaire calculé t 463*6 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 463 Partie 24—B : 7-déoxy-7(S)-isopropoxy-a—thiolincosaminide (XXV) 71 13813 -60- 2092060 ch3 iPr = Isopropyle XXV Par hydrazinolyse du composé XXIY (Partie 24—A), on obtient le 7-déoxy-7 ( S )-isopropoxy-a-tiiiolincosamirLide méthylique ayant les caractéristiques suivantes x Point de fusion 213°C C oc] jj +225° (c, 0*376* H20) Analyse t Calculé pour C^H^O^KS x C = 48,79 j H = 8*53 i H" = 4*74 ; S = 10*86 Trouvé t C = 48,52 j H = 8,55 J S = 5,26 ; S = 10,84 Poids moléculaire calculé t 295*40 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 295 Partie 24-C x Chlorhydrate de 7-déozy-7(S)-isopropozylincomycine (XXVI) ;• 71 13813 -61- 2092060 -XXVI En suivant le mode opératoire de la partie 18-C» on transforme le composé XXVI (Partie 24—C) en chlorhydrate de 7—déoxy— 7(S)-isopropoxylincomycine ayant les caractéristiques suivantes t 5 Point de fusion t amorphe [a]D + 81° (c, 0,898, H20) Analyse > Calculé pour Cg-jH^QOgK^SJïCl t C = 51*99 J H = 8,52 ; N = 5,78 j S = 6,61 ; Cl = 7*31 10 Trouvé (après correction pour tenir compte de la présence de 4*36 # d*eau) t ■ C = 51,72 }H= 8,33 î H = 5*59 J S = 6,35 î 01 = 7*29 Poids moléculaire calculé (hase libre) î 448,62 Trouvé t 448 15 Activité i à peu près la même que la lincomycine Exemple 25 Partie 25-A t N-acétyl—2,3 j 4-tri-0-acétyl-7-déoxy-7(S J-cyclohexyl-oxy-a—thiolinoosaminide méthylique (XXVII) 71 13813 -62- 2092060 ch3 OCyclohexyte AcNH Ac£ . OAc ^ \| y SMe OAc XXVII En suivant le mode opératoire de la partie 19—B et en remplaçant le méthanol par le cyclohexanolj, on obtient le K—acétyl-2,3 j 4—t ri-O-ac éty 1-7-d é oxy—7 ( S )-cyclohexyloxy-o5-t3oiolincosaminide 5 méthylique (XXVTI) ayant les caractéristiques suivantes t Point de fusion x 266—268°C [a]D +163° (c, 1,055 ? CHCl^) Analyse r Calculé pour C2^H^0gïTS x 10 C = 54*85 ; H = 7*41 ; U = 2,78 j S = 6,37 Trouvé : C = 54*93 i H = 7*53 J N = 2*87 i S = 6*65 Poids moléculaire calculé t 503*61 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 503 15 Partie 25-B x 7(S)-cycloh.exyloxy—7-déoxy—a—thiolinoosaminide méthylique (XXVIII) 71 13813 -63- 2092050 CH3 NH2 OCyclohexyle SMe XX7III Par hydrazinolyse du composé XXVil (Partie 25—A)* on obtient le 7(S)—cyclohexylo:xy—7-déoxy—a—thiolinoosaminide méthylique (XXVIII). 5 Partie 25-C t Chlorhydrate de 7(S )-cyclohexyl—7-déoxy lincomycine Me I •HC1 OH En suivant lé mode opératoire de la partie 19—C, on transforme le 7(S)-cyclohexyloxy—'7-déozy-cc-thiolinoosaminide méthylique (XXVIII) en chlorhydrate de 7 ( S )-cyclohexyloxy-7-*déoxylinoomycine . 71 13813 -64- 2092060 Exemple 26 • " Partie 26-A : Iï-acétyl-7-déoxy—7(S)-2t-hydroxyéthoxy—oG-thiol±Jàco-saminide méthylique (ZZIX) et le F-acétyl-2,J,4-tri-0-acétyl-7(S)-2 *-acétoxyéthoxy—'7-déoxy—o-thiolinoo— 5 saminide méthylique (XXX) XXIX XXX En suivant le mode opératoire de la partie 18-A et en remplaçant le méthanol par le 2—hydroxyéthanol* on obtient le 1-acétyl— 7-déoxy—7(S)-2î-hydroxyéthoxy-a-thiolinoosaminide méthylique (XXIX) 10 qui, lorsqu'il est acylé au moyen du prDcédé de la partie 20-Atmaia avec chauffage au bairwoarie bouillant pour former le produit entièrement acylé, on obtient le H-acétyl-2,3,4—'tri—0-acétyl—'7(S)— 2*-acétoxy-éthoxy-7-déoxy—a-thiolincosaminide méthylique ayant les caractéristiques suivantes : 15 Point de fusion : 223-225°0 , [a]D +172° (c, 1*010, CHCl^) ' ' 71 13813 _65_ 2092060 Analyse t Calculé pour C21H^^0^NB t C = 49*69 ; H = 6,55 ; IT = 2,76 ; S = 6,32 Trouvé : 5 C = 49*56 j H = 6,63 ; N = 2*90 ; S = 6,63 Poids moléculaire calculé t 507,55 Poids moléculaire trouvé t 507 Partie 26—B : 7-déoxy-7(S)-2 î-hydroxyéth.ozy-a~thiolincosaminide méthylique (XXXI) CH3 NHs ■ HO/ o 0CH2CH20H 0H SMe 10 XXXI Par hydrazinolyse du ïï-acétyl— 2,3,4—'tri—O-acétyl-7-déozy—'7(S)— 2*-acétoxyéthoxy-a-thiolinoosaminide méthylique (XXXI), on obtient le 7—déozy-7( S )—2 l-hydroxyéthoxy—a—thiolincosaminide méthylique ayant les caractéristiques suivantes i 15 Point de fusion t 178*5-179*5°C [a]D +243° (c, 0*662, H20) ygi» j Calculé pour C^ÏÏ2^0gîTS t C = 44*43 } H « 7*80 ; S = 10,78 j M" = 4,71 20 Trouvé 1 C = 44*40 } H « 7*99 î S = 10*51 t F = 4*60 Poids moléculaire calculé t 297,37 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) i 297 71 13813 -66- 2092060 Partie 26—C : Chlorhydrate de 7—déoxy-7(S)—2*—hydroxyéthoxyliûco— mycine wfthyliqM (uni) XXXII En suivant le mode opératoire de la partie 18—C* on trans— 5 forme le 7-déoxy-7(S)-2,-hydroxyéthoxy~a~thiolincosaminide méthylique (XXXI) en chlorhydrate de 7-déoxy—7 ( S )—2 *-^aydrozyétho3ylin— comycine ayant les caractéristiques suivantes t Point de fusion t amorphe [a]D 105° (o, 1,102» H20) 10 Analyse t Calculé pour *HC1 t G = 49,32 ; H =8,07 f H = 5,75 ; S = 6,58 j Cl = 7,28 Trouvé (après correction pour tenir compte de la présenoe de 2*11 # d4eau) i 15 0= 49*61 } H = 7*85 ; H = 5,54 ; S = 6,46 } Cl = 7,26 Poids moléculaire calculé ("base libre) t 450,59. Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 450 Activité i environ le 1/3 de celle de la lincomycine» 71 13813 -67- 2092060 Exemple 27 Partie 27-A i N-acétyl-7—déoxy-7(S)-2 t-Hnéthoiyéth.ozy-a—thiolinoosaminide méthylique (XXXIII) et N-acétyl—2,3,4-tri~ 0-acétyl-7-déoxy—7(S)-2'-méthozyéthozy-a-thioliiico-5 samird.de méthylique (XXXrV") AcNH CHa CHS 0CH2CH20Me AcNH- et OCHaCHaONe kl), SMe OMe Ymu XXXIV En. suivant le mode opératoire de la partie 18-A, mais en remplaçant le méthanol par le 2-méthoxyéthanol, on obtient, le îf-^acé-tyl—7—déoxy—7(S ).—2t-métho3:yéthoxy—a—thiolinoosaminide méthylique 10 (TOTIT) qui, par acétylation au moyen du procédé de la partie 20—At mais par chauffage au bain—marie bouillant pour former le produit entièrement acétylé , donne le ÎT—acétyl—2,3 *4—tri—0-acétyl—7-:' éosy-7(3 )-2 t-méthozyéthoxy—o-thlol i ncosami nide méthylique (33X17) qui est caractérisé de la façon suivante t 15 Point de fusion t 222—223°C [a]D +177° (c, 1,079* CHCl^) . • Analyse t Calculé pour C20H^^0^0NS t - - - . . . . 0 = 50,09..} H = .6,94 ; B = 2,92 -, S = 6,69 J OMe = 6,47 • 20 Trouvé i v " .. " ' . C = 50,13 ; H = 7,00 j N = 2,77 5 S = 6,33 ; OMe = 7*28. Poids moléculaire calculé x 479*54 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse)î479 TM -68" 2092060 Partie 27—B : 7-déoxy-7(S)—2*-méthoxyéthyl—a-thiolinoosaminide méthylique (XXXV) XXXV Par hydrazinolyse de ÏT-acétyl-2*3*4-tri-0-aoétyl-7-déo:xy~7(S)— 5 2 t-niéthoxyéthoxy—a-thlolincosainjuaide méthylique (X3XEY) , on obtient le 7-déozy-7(S)-2ï-méth.oxyéth.oxy-a-thiolinoosaminide méthylique (XXXV) ayant les caractéristiques suivantes I Point de fusion t 178-179°C [a]D +231° (c, 0,827, H20) 10 AnaJI^rifl : Calculé pour C^B^OgHS t C = 46,28 ; H = 8,09 \ H = 4,50 \ S = 10,30^ Trouvé t C = 46,57 ; H = 8,32 ? H = 5*01 ; S = 10,70 15 Poids moléculaire calculé t 311*40 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) i 311 Partie 27—C : Chlorhydrate d« 7-4é«xy-7(3)-2 '-aétlMxylttoxy-lincomycine arftfayliq*» (XXX7I) 71 13313 -69- 2092060 XXXVI En suivant le mode opératoire de la partie 18-C, on transforme le 7—d é oxy-7 ( S ) —2 * -mé thoxyé tho xy-ct-thi o linco s aminid e méthylique (XXXV) en chlorhydrate de 7~déoxy-7(S)-2*-méthoxyéthoxylincomycine 5 ayant les caractéristiques suivantes t Point de fusion : amorphe [a]D +87° (c, 0,575, H20) Analyse : Calculé pour Cg-jH^QO^IïLjS.HCl : 10 C = 50,33 5 H = 8,25 ; N = 5,59 ; s = 6,40 ; Cl = 7*08 Trouvé (après correction pour tenir compte de la présence de 4*17 ?» d*eau) t C = 50,47 5 H = 8,60 ; N = 5,26 ; S = 5,86 ; Cl = 7*50 Poids moléculaire calculé (base libre) : 464*62 15 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 464 Activité t environ le 1/3 de celle de la lincomycine Exemple 28 7-déoxy-7(S)-hydroxy—et-thiolinoosaminide méthylique (XXXVTI)' (6-amino-6,8—didéoxy—L-thréo—cc-B-galacto—octo— pyranoside méthylique) 71 13813 -70- 2092060 ch3 oh nh2 XXXVTI Partie 28-A t N-acétyl-7—déozy—7(S)-hydroxy—a—thiolincosaminid© méthylique (XXXVTIl) (6-acétamido-6,8—didéoxy—L-thréo-a-D-galacto-octopyranoside méthylique ) 5 X3COTII On ajoute à une solution de 2,35 g de 6,7-aziridino-6-déamino— 7-déoxy-a-thiolineosaminide méthylique (Yl) dans 25 cm? d'eau* 2*04 g d4anhydride acétique et on laisse reposer la solution à la température ambiante pendant environ 16 heures. On évapore ensuite la solu— 71 13813 .71. 2092060 tion à sec sur un évaporateur rotatif à 40°0/7 mm pour obtenir un sirop incolore qu'on chromatographié sur 750 g de gel de silice dans une colonne de 4,8 x 98 cm en utilisant comme système de solvants un mélange de méthanol et de chloroforme à 117* Après une 5 première fraction de 550 ml, on recueille des fractions de 50 ml# On rassemble les fractions 90 à 160 et on les évapore à sec pour obtenir 2,3 g de N-acétyl-7—déoxy-7(S)—hydroxy-a-thiolinoosaminide méthylique sous la forme d'une substance solide incolore qui cristallise dans le méthanol sous la forme de bâtonnets incolores ayant 10 les caractéristiques suivantes t Point de fusion : 218-219°C [a]D +260° (c, 1,0296, H20) Analyse t Calculé pour C^H2^0gNS : 15 C = 44,73 ; H = 7,17 ; H" = 4,74 ; S = 10,86 Trouvé : C ~ 44,89 ; H = 7,02. ; N = 5,16 ; S = 10,64 Poids moléculaire calculé t 295,36 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 295 20 Partie 28-B : Déacétylation La substance cristallisée dans la partie 28-A est rassemblée avec les liqueurs-mères et le mélange est concentré à sec av «a évaporateur rotatif à 40°C/7 mm en donnant 2,01 g de substance solide qu'on chauffe pendant environ 16 heures au reflux modéré 25 avec 40 cm? d'hydrate d'hydrazine, sous agitation. Le solvant est chassé de la solution incolore sur un évaporateur rotatif sous pression de 7 mm dans un bain d*huile à 120°C. Le résidu cristallin incolore que l'on obtient par recristallisation dans le méthanol, donne le 7-déoxy-7(S)-hydroxy-a-thiolincosaminide méthylique 30 (XXXVII) sous la forme de paillettes incolores ayant les caractéristiques suivantes : Point de fusion t 211-212°C [a]D +280° (c, 0,7728, H20) Analyse t 35 Calculé pour C^H^ gO^NS i 0 = 42,67 ; H = 7*56 j N" = 5,53 ? S = 12,66 Trouvé : ' C = 42,81 ; H = 7,69 ; N = 5,85 5 S = 12,73 71 13813 2092060 Poids moléculaire calculé : 253*32 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse) t 253 Exemple 29 I—acétyl-2,3 > 4-tri—0-acétyl—7( S)-éthoxy-7—déoxy-a—thio— lincosaminide méthylique (XV) et U-acétyl-2,3,4—tri-O-5 acétyl-7(S)-acétoxy-7-déoxy-a-thiolincosaminide méthy lique (XXXIX) CHa CHa OEt -OAc AcNH- et AcNH J- — u (ry! SMe OAc / —■ V SMe OAc XV XXXIX En suivant le mode opératoire de la partie 19~B, mais en remplaçant le méthanol par de l'éthanol, on obtient le N—acétyl—2*3*4— 10 tri-Q-acétyl-7(S)—éthoxy-7—déoxy—a—thiolinoosaminide méthylique (XY) identique au produit de la partie 22—B et une faible quantité de N-acétyl-2,3,4-tri-0-acétyl—7( S')—acétoxy-7-déoxy—a—thiolinoosaminide (XXXIX) que l*on peut séparer au moyen du procédé de distribution à contre-courant de Craig en utilisant un mélange d'éthanol, 15 dteau, d*acétate éthylique et de cyclohexane dans la proportion de 1:1:1»1,5 comme système de solvants* en 500 transferts. Le composé secondaire (XXXIX) est obtenu dans les tubes numéros 140 à 200 (K = 0,52) et le composant principal (XV) est obtenu dans les tubes numéros 260 à 330 (K = 1,43). Le composant secondaire (XXXIX) cris— 20 tallise dans 1*acétate éthylique sous la forme d*aiguilles res ayant les caractéristiques suivantes : 71 13813 -73- 2092060 Point de fusion 312-313°C [a]D +182° (c, 0,5898» CHŒl^) Analyses j Calculé pour CiqHOg0^0îîS : 5 C = 49,22 ; H ='6^31 5 ïf = 3»02 ; S = 6,92 Trouvé î . • , C = 49,17 j"H = 6,51 ; B = 3,08 ; S = 6*81 Poids moléculaire calculé t 463,50 Poids moléculaire trouvé (spectrométrie de masse ) : 463 10 En soumettant le composant secondaire à une hydrazinolyse, on obtient le 7—déoxy—7(S)—hydroxy—a—thiolinoosaminide méthylique (XXXVTI) identique au produit de la partie 28—B. Exemple 30 Partie 30-A r N-acétyl-2*,2,3,4-tétra—0-acétyl—7—0—méthyl—1—thio— 15 a-lincosaminide 2{-hydroxyéthylique (Xl) XL On laisse reposer 1,0 g de 1—thio-a—célestosaminide 2*—hydro— xyéthylique (exemple 3 du brevet des Etats-Unis d*Amérique ÏT° 3 255 174) pendant- environ 16 heures en solution dans 25 cm de py— 20 ridine et-12 cm d*anhydride acétique» En chassant le solvant sous vide» on obtient une huile incolore qu*on dissout dans du chloroforme, puis on lave la solution à lJeau* avec une solution aqueuse 71 13813 -74- 2092060 diluée d'acide chlorhydrique, de l'eau, une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium» puis de l'eau» et n la âieMyâlBt# sur du sulfate anhydre de sodium» En chassant le solvant sous vide* on obtient 2,03 g d'un sirop qui» par cristallisation un aé-5 lange d'acétate éthylique et de "Skellysolve 33%-donne le ïf-aoétyl— 2' ,2,3,4-tétra-0-acétyl-7-0-méthyl-1—thio—ct-linoosaminide 2#-4jy— droxyéthylique (formule XL) sous la forme de prismes incolores fondant à 14-3-144 °C. Le "Skellysolve B" est une marque d'hexane technique* 10 Analyse t Calculé pour °211B:350113^ 1 C = 49»68 j H = 6»54 J B = 2,76 ; S = 6,32 ^ Trouvé t 0 » 49*66 ; H = 6,50 j N = 2,91 j S = 6*34 % 15 [ Partie 30-B t ÎT-acétyl—2» 3,4—tri-O-acétyl-7—0~méthyl-1—thio-o-et p-linco samin ides méthylique s (XII et XLIl) XLI On ajoute une solution de 5*05 g (1,62 om^) de brome dans X 20 100 cnr de chloroforme en 30 minutes environ» au moyen d'une ampoule à robinet dont la pression est égalisée* dans des conditions anhydres» à une solution sous agitation de 10 g de B^-aoétyl—2»2,3»4—tétra—O- 71 13813 _75_ 2092060 acétyl-1-thio-a-célestosaminide 2'-hydroxyéthylique préparé au ■z. moyen du procédé de la partie 30-A, dans 200 cm de chloroforme, D1 abord, la couleur du broa* disparaît iaaédiataaaat s ensuite , une couleur rouge—orangé intense se développe» Après agi— 5 tation pendant encore 30 minutes à la température ambiante, on chasse le solvant sur un évaporateur rotatif à 40°C sous un vide de 7 mm, ce qui donne un résidu sirupeux de couleur orangé-jaune. On redissout ce résidu dans du chloroforme, on chasse le solvant sous vide et on répète 1*opération jusqu*à ce que le distillât 10 devienne incolore, en laissant un résidu amorphe jaunâtre de té— tracétate de 1 -bromo-7-0-méthyl-(3-lincosamine de formule i X1III ; Le résidu est dissous dans 200 cm de.. diméthylformamide anhydre, on ajoute 4,5 g de thiourée et on agite le mélange réaction-15 nel (solution incolore) pendant environ -16 heures à la température ambiante. Il se forme ainsi les sels d^isothiouronium de formules ï 71 13813 -76- 2092060 CH: CHsO et AcNH« AcQ NHa+Br" OAc NHS+ Br" OAc XLIY . • XLV Sans isoler ces sels et.après refroidissement au bain de 3 glace# on ajoute lentement 100 cm .d'eau* puis 8*3 g de. carbonate anhydre de potassium, 10,6 g de bisulfite de sodium et 28 g (12,3 cm ) 5 d'iodure de méthyle, On agite énergiquement le mélange au moyen d'un agitateur magnétique pendant 3 heures, et on retire le bain de refroidissement au bout de 20 minutes* Les substances -volatiles sont chassées sous vide à 40°0 et finalement à 80°C sous un vide inférieur à 1 mm. Le résidu jaune 10 est dissous dans un mélange de chloroforme et d?eau* la phase aqueuse est extraite avec du chloroforme et les extraits chloro— formiques rassemblés sont lavés deux fois avec de l'eau et déshydratés sur du sulfate anhydre de sodium.» Par élimination du solvant sous vide* on obtient un résidu amorphe incolore (6*48.g). -15 Une chromatographié en couche mince (acétone : "Skellysolve, Bn 1*1) montre une zone principale de produit et une zone secondaire de légèrement supérieures» Cette substance est chromatographiée sur gel de silice (1*2 kg, colonne de 5*8 x 90 cm) dans le système acétone:"Skellysolve Bn 20 1:1,5. Après une première fraction de 500 crn^* on recueille auto— 3 matiquement des fractions de 50 cm et l'élution des substances est suivie à 'une chromatographié en couche mince. Les fractions numérotées de 145 à 173 correspondent à la substance de plus fort* 71 13813 -77- 2092060 les fractions 185 à 310 correspondent au produit principal et les fractions 174 à 184 correspondent à un mélange des deux* En chassant le solvant sous vide des fractions 145 à. 173 rassemblées» on obtient un sirop incolore (570 mg) qui donne par 5 recristallisation dans un mélange d'acétate éthylique et de "Skellysolve B" le ÏT-acétyl—2,3*4-tri—0-acétyl—'7—10-méthyl—1—■thio-a-lincosaminide méthylique en petits prismes incolores fondant à 212-213°C, sans abaissement du point de fusion,en mélange avec 1*échantillon de l*exemple 31 (partie 31-C) fondant à 211,5-213°Q* 10 et duquel il ne peut également pas être distingué par analyse infrarouge , résonance magnétique nucléaire et par le spectre de masse,' ainsi que par la rotation optique* En chassant le solvant sous vide des fractions 185 à 310 rassemblées, on obtient une substance solide amorphe légèrement 15 jaune (4,23 g) qui donne par cristallisation le F—acétyl—2, 3 » 4- tri-0-acétyl—7-0-méthyl—1-thio-p—lincosaminide méthylique en prismes incolores fondant à 187-188°C. Analyse i Calculé pour C^gH^gOQNS : 20 C = 49,64 ; H = 6*71'j B = 3,22 ; S = 7,36 î MeO = 7,13 Poids moléculaire i 435*49 Trouvé t C = 49,73 J H = 6,95 ; 1=3,18 j S = 7,64 j MeO = 7*41. [a]D +24° (c, 0,7484, CHC15) 25 Poids moléculaire t (spectrométrie de masse, M+) 435 Le rendement total d*Introduction du groupe -SMe (e*est—à— dire les anomères a + p) est de 49*2 fo (6,7 d*a, 42*5 i» de p) le rapport a/|3 étant de 1i6,35» Le (3-anomère peut être recyclé dans la partie 30—B et peut 30 améliorer ainsi le rendement total en 1*0—anomère qui est plus désiré. Partie 30-C i On répète le mode opératoire de la partie 30-B en remplaçant le méthylformamide par le triamide hexaméthylphosphorique (Me2Ïr) ^P=0 , 35 ce qui donne un rendement total de 65*5 i° (22*7 i° et 42,8 io de p), le rapport a/p étant ainsi de 1t1,9. 71 13813 2092060 -78- Partie 30-D-1 t 7-0-méthyl— 1-tMo-a-lincosaminide méthylique (XLYI) XLYI On dissout le tétracétate de 7—10-méthyl-1-thio—a-linoosaminide méthylique (1,46 g) dans 50 cm d*hydrate d*hydrazine et on ohauffe 5 la solution au reflux modéré, au bain d*huile à 155°C pendant 24 heures. Le solvant volatil est ensuite chassé aussi complètement que possible par distillation à 110°0/15 mm* ce qui donne un résidu cristallin incolore qui est trituré avec de l*acétonitrile anhydre* La substance solide est isolée par filtration et séchée. Par cris— 10 tallisation dans un concentré d*éthanol à 95 on obtient 430 mg de 7—10-méthyl— 1-thio—a-lincosaminide méthylique hémihydraté ("Polymorph I") sous la forme d*aiguilles incolores aplaties fondant à 126-126,5°0. Analyse t 15 Calculé pour C10H2^OgHS»l/2H20 t C = 43,46 j H = 8,03 J F = 5,07 ; S = 11,60 j OMe = 11*23 Poids moléculaire (anhydre) x 267»35 Trouvé t 0 = 43*63 ; H = 8,30 j F = 5,18 j S = 11,67 ; OMe = 11 ,74 ; pKa* = 7*1 20 Ect]D +263° (c, 0,8284, H20) Poids moléculaire (spectrométrie de masse, M+) x 267 71 13813 2092060 Partie 30-D-2 i On répète le mode opératoire de la partie 30-D-1* à la différence qu*on effectue la cristallisation lentement dans une solution plus diluée dans de l*éthanol à 95 /°» On obtient le 7—0— 5 méthyl-1-thio—a-lincosaminide méthylique hémihydraté sous la forme de paillettes incolores fondant à 162—163°C ("Polymorph II"), les deux formes polymorphes ont un comportement chromatogra— phique identique (R^ = 0*21 par chromatographié en couche mince sur gel de silice dans un mélange de méthanolichloroforme à 1t15 10 en volume), les points de fusion mixtes des formes I et II sont les suivants t .1 et II point de fusion 126—126,5°C II et II point-de fusion 162—163°C I et II point de fusion 162-163°0 15 Ainsi* en présence de la forme II* la forme I est transformée en la forme II à une certaine température inférieure à 162°C. Partie 30-E i Chlorhydrate de 7-O-méthyllincomycine (21YII) ■ hc1 schs XL7ÏI Un mélange de 3*08 g de chlorhydrate diacide 4-trana—propyl— 20 hygrique et de 75 cm^ d*acétonitrile est agité au moyen d'un agi— rz . . tateur magnétique dans une fiole de 500 cm à trois tubulures* équipé d'un tube déshydratant et d*un thermomètre s'enfonçant au-dessous 71 13813 2092060 de la surface du liquide. Par addition de 3,31 g de triéthylamine, la substance solide est rapidement dissoute en donnant une solution de couleur tan pâle. Par refroidissement à -5°C dans un bain de glace et de mé— 5 thanol, un précipité incolore de chlorure de triéthylammonium se sépare. Sans isoler le précipité, on ajoute 2,02 g (ï»94 cm ) de chloroformiate d'isobutyle à une vitesse telle que la température ! reste entre —5 et +8°C, aptes quoi on continue d*agiter à —5°C pendant 15 minutes. 10 On ajoute alors rapidement 2*0 g de 7—O—méthyl-1—thio—a- Iincosami.ni.de méthylique dans 25 cm d'eau à la solution mixte d*anhydride indiquée ci—dessus, ce qui donne une solution de couleur tan pâle qu'on agite à 0°G pendant 45 minutes. Par chromatographié en couche mince (gel de silice, acétate éthylique:acétonet 15 eau 8:5s1 en volume), on ne détecte que des traces d'un sucre aminé résiduel, et une nouvelle zone principale de égal à 0,4, Le solvant volatil est chassé sous vide à 40°0, le pH de la solution résiduelle aqueuse de couleur tan est ajusté à 10 par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (N), le mélange est 3 20 extrait trois fois avec des portions de 100 cm de chloroforme et les extraits rassemblés sont lavés à l'eau et déshydratés sur du sulfate anhydre de sodium. En-éliminant' le solvant sous vide à 40°0, on obtient une substance solide amorphe de couleur tan (2,32 g). Par chromatographié sur gel' de silice (450 g, colonne de 25 3,8 x 95 cm) dans le système méthanol:chloroforme 1:15 en volume, *■ *5 x après une première fraction de 250 cm suivie de fractions de 25 cm"' que l'on recueille automatiquement, on obtient la 7-O-méthyllinco— mycine dans les fractions 44-70» 'en chassant le solvant sous vide* sous la forme d'un sirop incoloré (2,20 g). On dissout ce sirop "Z 30 dans 5 cm^ d'eau sous agitation et en ajoutant de l'acide chlorhy— drique (concentré) pour ajuster le pH à 3» on filtre la solution sous vide, on lave le verre fritté avec de l'eau (3 cm ) et on refroidit le filtrat et les eaux de lavage dans un bain de glaoe et 3 de méthanol. On ajoute, sous agitation, 200 cm d'acétone* puis 3 35 100 cm d'éther, ce qui donne un précipité cristallin incolore qu'on reçueiHJ e et qu'on sèche dans un dessiccateur à vide à la température ambiante. On obtient la substance solide (1*71 g) sous la forme 71 13813 ^ 2092060 de petites paillettes incolores allongées fondant à 155-Ï57°C. Anal va p. : Calculé pour C^E^OgU^S-HOl i C = 49*95 j H = 8,16 ; ïï = 6,15 ; S = 7,02 ; Cl = 7,76 î OMe = 6,79 5 Poids moléculaire (base libre) i 420,57 Trouvé (valeurs corrigées pour tenir compte de la présence de 4,85 fa d*eau) : C = 50,09 ; H = 8,22 } H = 6,02 ; S = 7,20 j Cl = 7,46 ; OMe = 7»05 Ca]D +145°0 (c, 1,065, H20) 10 pKa' = 7,6 Poids moléculaire (spectrométrie de masse, M+ de la base libre) : 420 .La 7(R)-0-méthyllincomycine ainsi obtenue peut ensuite être traitée au moyen du nouveau procédé de la présente invention pour donner le 5-nucléotide correspondant. 15 Exemple 51 Partie 51—A—1 t ÏT—acétyl—2—0-acétyl—5 » 4-0—isopropylidène—1-thio—a— lincosaminide méthylique (XLVTII) On acétyle 5 g de 6-ÎT,7-0-éthylidyne~3,4-0-isopropylidèn9~!-20 thio—a-lincosaminide méthylique (exemple 1—C du brevet des Etats- Unis d*Amérique ÏT° 5 557 527) par repos pendant une nuit à la tem— 3 3 pérature ambiante dans un mélange de 25 cm de pyridine et de 12 cm dtanhydride acétique. En chassant le solvant sur un évaporateur ro 71 13813 -82- 2092060 tatif sous vide à 40 °C* on obtient un sirop jaune pâle qu*on dissout dans du chloroforme, on lave la solution à l'eau* avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium* de nouveau avec de l*eau, puis on la déshydrate sur du sulfate anhydre de sodium* 5 Une chromatographié en couche mince (gel de silice# méthyléthyl— cétoneiacétoneteau 75:25t10 en volume) révèle l'absence de la substance de départ, et la formation d*une nouvelle zone de légèrement supérieur. En chassant le solvant sous vide à 40°Gt on obtient le 2-0-acétyl~6lT*7-0-éthylidyne-3>4-0-isopropylidène-10 1—thio—a-lincosaminide méthylique sous la forme d*un sirop pratiquement incolore dont on ne peut pas provoquer la cristallisation. On ajoute 75 cm d'eau à un pH égal à 7 et, en agitant au moyen dtun agitateur magnétique,, on chauffe le mélange au bain-marie bouillant. Au bout de 6 heures* le solvant est chassé sous vide à 15 40°G en donnant une matière solide cristalline incolore (5*95 g) qu'on chromatographié sur de la silice (600 g, colonne de 4,8 x 79 cm) dans le système méthanolichloroforme 1t7 (en volume). Après une première fraction de 650 cm , on recueille automatiquement des ■5 fractions de 25 cm» l'élution étant suivie d'une chromatographié 20 en couche mince. La substance désirée est présente dans les fractions 35 à 41* En chassant le solvant* on obtient une matière solide amorphe incolore (1,57 g)* Par recristallisation dans un mélange d'acétone et de "skellysolve B1'(hexane technique)* on obtient des aiguilles incolores de ÏT-acétyl—2-0-acétyl-3 » 4-O-isopropylidène— 25 1-thio—a—line0saminide méthylique fondant à 178-179°C. Analyse 1 Calculé pour C^gH^O^NS t C = 50*92 ; H = 7,21 $ H = 3,71 ; S = 8*49 f poids moléculaire 377*46 Trouvé t 30 C = 50*50 j H = 7*20 ; N = 3,77 ; S = 8,50 [a]D +194° (c* 0,7342* 0HC13) Poids moléculaire (spectrométrie de masse M+) r 377 Partie 31—A-2 t On répète le mode opératoire de la partie 31—A—1, à la dif— 35 férence que le solvant est chassé après une période de chauffage de 2 heures (au lieu de 6 heures). Le rendement en H—acétyl-2—0— acétyl—3,4—0—isopropylidène—1-thio—a-lincosaminide méthylique est 71 13813 2092060 porté à 60*5 f»* Partie 31—B r IT—acétyl—2—0—acétyl—7—0—méthyl—3*4—O—isopropylidène— 1-thio—a-lincosaminide méthylique (XT,TY) XLIX 5 On chauffe 1,0 g (1 mole) de ÎT-acétyl-2—0—acétyl-3»4-0-iso-. ' T. propylidène-1-thio-a—lincosaminide méthylique* 37*6 g (16*5 cm * 100 moles) d*iodure méthylique et 3>1 g (5 moles) d1oxyde chargent et on agite au reflux modéré pendant 16 heures. On chasse 1*iodure méthylique sous vide à 40°0 et on extrait correctement la poudre 10 résultante de couleur gris—jaune,avec du chlorure de méthylène. En chassant le solvant sous vide* on obtient un sirop jaune (1*09 g)* Ce produit brut est soumis à une distribution à contre-courant (500 transferts) dans le système acétate éthyliqueiéthanolieautcy— clohexane à 1 j 11112 en volume, en utilisant des volumes égaux de 15 la phase supérieure et de la phase inférieure» On constata Inexistence d*un pic principal de K égal ài3*34* qui correspond à la courbe théorique. : En éliminant le solvant des fractions rassemblées de la substance de K égal à 0*34* on obtient 250 mg d*un sirop qui cris-20 tallise au^çepos. Par recristallisation dans un mélange d*acétate éthylique/de "skellysolve B* on obtient le ÏT—ac é tyl—2—O—ac é tyl—7—0— méthyl-3,4—O-isopropylidène—1 -thio-a-lincosaminide méthylique sous 71 13813 -84- 2092060 la forme d'aiguilles inodores tronquées» fondant à 152-154°C (160 mg). Une seconde recristallisation dans le même mélange de solvants donne le produit pur fondant à 152*5—154°C. Analyse : 5 Calculé pour 0.| .yH^O^NS i 0 = 52»15 ; H = 7,47 ; F = 3,58 ? S = 8,19 ; Poids moléculaire = 391*48 Trouvé > 0 = 52»24 î H = 7»48 ; S = 3*92 ; S = 7,98 10 Poids moléculaire : (spectrométrie de masse, M+) 391 [a]D +188° (c, 1,185» CHOlj)» 71 13813 -85- 2092060 Partie 31-C i N-acétyl-7-0-méthyl-1-thio-a-lincosaminide méthylique et son triaeétate CHa ro 0 II ch3c-nh vx S-Alkyle OH On agite 10C mg de U-acétyl-2-0-acétyl-3,4-0-isopropylidene- 3 3 1-thio-a-lincosaminide méthylique avec 20 cm d'eau et 5 cm 5 d'acide chlorhydrique en solution aqueuse 1 H à la température ambiante pendant environ 16 heures. On neutralise la solution par agitation avec 3 g de carbonate d'argent, on isole la substance solide pat filtration et on la lave avec de l'eau, puis on évapore à sec le filtrat et les zones de lavage sur un évaporateur rotatif 10 à 60°/7 mm, ce qui donne le N-acétyl-7-0-méthyl-1-thio~a-linco- saminide méthylique sous la forme d'un sirop incolore qui ne cristallise pas. On le caractérise en outre par transformation en triaeétate» 3 3 On ajoute 5 cm de pyridine et 3 cm d'anhydride acétique, on agite énergiquement le mélange jusqu'à ce que le sirop se soit 15 dissous, et on le laisse reposer à la température ambiante pendant environ 16 heures. On chasse ensuite le solvant aussi complètement que possible à 40"°0 sous un vide inférieur à 1 mm, ce qui donne un mélange cristallin de couleur tan qu'on dissout dans du chloroforme, on lave la solution avec de ltacide chlorhydrique en solution 71 13813 -86- 2092060 aqueuse (N/10), de l'eau, une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, de l'eau, puis on la déshydrate sur du sulfate anhydre de sodium» Eh obasMKt le solvant sous vide, on obtient le N-acétyl-2,3,4-tri-0-acétyl-7-0-méthyl-1-thio-a-lincosaminide 5 méthylique sous la forme d'une substance solide cristalline pratiquement incolore qui se sépare du mélange d'acétate éthylique er-" n de Skellysolve B en prismes incolores de petites dimensions, fondant à 211,5-213°C. MeO =7,13 ; poids moléculaire 435*49 Trouvé : C = 49,72 j H = 6,77 ; N = 3,36 ; S = 7,27 ; MeO = 7,08. [ 15 Poids moléculaire (spectrométrie de masse, M+) 435 A la place de l'iodure méthylique, on peut utiliser les iodures éthylique, propylique, butylique, isobutylique, butyliaue secondaire et tertiobutylique pour former les composés analogues 7-0-alkyliques inférieurs correspondants. 20 A la place du chlorhydrate d'acide 4-propylhygrique (chlorhydrate d'acide 1-méthyl-4-trans-propyl-L-2-pyrrolidinecarbo-xylique), on peut utiliser les chlorhydrates d'autres acides L-2-pyrrolidinecarboxyliques de formule : Analyse : Calculé pour C^gH^gOgNS i 10 C = 49,64 ; H = 6,71 ; F =3,22 j S = 7,36 ; n 25 dans laquelle désigne de l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur» par exemple raéthyle ou éthyle, et est un atome d'hydrogène 71 13813 -87- 2092060 ou un groupe alkyle inférieur, par exemple méthyle, éthyle, propyle,. butyle, pentyle, hexyle, heptyle et octyle et leurs formes isomères, ou bien un groupe cycloalkyle inférieur, par exemple cyclopentyle, cyelohexyle et cyclohexylméthyle pour former les composés de 5 formule suivante s i' ,n - ch3 ch3o - nh - dans laquelle R2 et ont les définitions données ci-dessus, les composés de lincomycine que l'on obtient peuvent être transformés en nouveaux 3—nucléotides correspondants au moyen des nouveaux procédés de la présente invention. 71 13813 ^ 2092060 REVENDICATIONS 1. Nouveau composé, et ses sels, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : un groupe -SR dont le symbole R désigne un à Cg, un groupement 0 -S-CHg-CHa-O-iU^ ; -S-CH^-CB^—OH | ou bien OR dans lequel R est un groupe alkyle en C.j à Cg, et ses formes isomères ; R^ est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur cis ou trans en C^ à C^, R^ est un atome d'hydrogène, un groupe CH^ ou j X est un groupe OH, un atome de chlore, de brome, d'iode ou un groupe -OR^ dont le symbole R^ est un groupe alkyle en C^ à Cg, chacun étant en configuration (R) ou (S) ; et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine» 2« Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme du zwitterion. dans laquelle T est groupe alkyle en C^ 71 13813 -89- 2092060 3. Composé suivant la revendication 1, et ses sels, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule i dans laquelle Y, et R2 ont les définitions données dans la revendication 1 et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine» 4» Composé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : II 0 OH 71 13813 -90- 2092060 ch3 dans laquelle Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine, ce composé pouvant se présenter sous la forme de ses sels, 5 5» Composé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule ; 71 13813 -91 2092060 dans laquelle Z est un groupe 51-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine et R^ est un groupe méthyle, 6. Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : Halogéno dans laquelle le radical halogéno désigne le chlore ou le brome et Y, R.j, R2 et Z ont les définitions données dans la revendication 1, ce coqiposé pouvant se présenter sous la forme de ses sels» 7» Composé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule s 71 13813 -92- 2092060 CHs \ CHa C- II O NH- Cl dans laquelle Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou 1'uridin® et B.^ 1111 groupe méthyle, ce composé pouvant 3e présenter sous la forme de ses sels. 8, Composé suivant la revendication 6, caractérisé par le . fait qu'il répond à la formule : CHa NH- Cl 71 13813 _93_ 2092060 dans laquelle Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uri-dine et R^ est un groupe méthyle. 9» Composé suivant la revendication t, caractérisé par le 5 fait qu'il répond à la formule j dans laquelle le radical halogéno désigne le chlore ou le "brome } R^ est un groupe méthyle j R^ est un groupe pentyle et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l*adénosine, la guano sine, la cytidine ou l'uridine., ce composé pouvant se 10 présenter sous la forme de ses sels* 71 13813 -94- 2092060 10» Composé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule i CHa \ / CHs C- tl O NH ■CI OH dans laquelle R^ est un groupe méthyle ; R^ est un groupe pentyle et Z est un groupe 5'—phosphate de nucléoside dont le,nucléoside est l'adénosine, la guanosine, là cytidine ou l'uridine, ce cocaposé pouvant se présenter sous la forme de ses sels* 71 13813 -95- 2092060 11. Composé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : dans laquelle Z est un groupe 51-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine j R^ est un groupe méthyle et est un groupe pentyle. 71 13813 -96- 2092060 12. Composé suivant la revendication 1r caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : dans laquelle le radical halogéno représente le chlore ou le "brome Rj est un groupe méthyle ; est un groupe pentyle j est un atome d'hydrogène ; et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine, ce composé pouvant se présenter sous la forme de ses sels. 71 13813 -97- 2092060 13» Composé suivant la revendication 12, caractérisé par le fait quTil répond à la formule : OH dans laquelle R^ est un groupe méthyle ; R^ est un groupe pentyle et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dans lequel le 5 nucléoside est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou lluridine, ce composé pouvant se présenter sous la forme de ses sels» 71 13813 2092060 14. Composé suivant la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : dans laquelle est un groupe méthyle ; R^ est un groupe pentyle et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside 5 est l'adénosine, la guanosine, la cytidine ou l'uridine* 15» Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que T est un groupe -SCH^, R1 est un groupe propyle, R2 est un groupe CH^, X désigne le chlore et Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est la cytidine,. 10 l'adénosine, l'uridine ou la guanosine» 71 13813 _99_ 2092060 16» Procédé de préparation d'un, composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à incorporer un. composé de formule : Ra (dans laquelle , R^f X et T ont les définitions données dans la revendication 1) dans un milieu de fermentation contenant un organisme du genre Stre-ptorgyces » 71 13813 -100- 2092060 17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le fait qu'il consiste à incorporer un composé de formule : CHa -N \n-C3H7 / CH3 NH H0 Cl I \ SCHa 0H dans un milieu de fermentation contenant l'organisme Streptomyces coelicolor Muller ME1 3532 pour former des composés de formule : CHa 71 13813 _,01_ 2092060 dans laquelle Z est un groupe 5'-phosphate de nucléoside dont le nucléoside est choisi entre l'adénosine, la guanosine, la cytidine et l'uridine. 18. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le 5 fait qu'il consiste à incorporer un composé de formule : dans un milieu de fermentation contenant l'organisme Streptomyces venezuelae KRBL 3527 pour former un composé de formule t 71 13813 _102_ 2092060 dans laquelle Z est un groupe 5'—phosphate de nucléoside dont le nucléoside est choisi entre l'adénosine, la guanosine, la cytidine et l'uridine» 19» Procédé pour isoler un composé de formule ; 71 13813 2092060 (dans laquelle R2, Z, X et T ont les définitions données dans la revendication 1), d'un milieu de fermentation contenant un organisme du genre Streptomyces, caractérisé par le fait qu'il consiste à filtrer le milieu de fermentation j à absorber le 5 filtrat résultant sur une substance absorbante convenable pour éliminer les impuretés hydrosolubles j à isoler de la substance absorbante 1'éluat résultant par chromatographié sur une résine d1échange anionique j à soumettre des fractions de résine d,échange anionique à une distribution à contre-courant } et à séparer par chromatogra-10 phie les trois nucléotides individuels» 20. Composition thérapeutique, caractérisée par le fait qu'elle contient, ou qu'elle est constituée par, un composé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à. 15»