Brevet FR2087990A1 — publié le 19720107

La présente invention concerne un nouvel antifongique, dénommé BK217, et deux formes particulières sous lesquelles il est isolé. Elle concerne également son procédé de préparation par fermentation, des modes opératoires pour l'isoler et pour le concentrer à partir de ses solutions brutes, ainsi que pour le purifier, dans chaque forme respective. L'invention concerne également les applications thérapeutiques des nouveaux composés précités et leurs applications aux soins d'hygiène, et à la désinfection en général Elle concerne enfin les applications des nouveaux antifongiques en thérapeutique vétérinaire. L2invention vise notamment les antifongiques précites sous formes diluées, sous forme de concentrats bruts et sous forme cristallisée pure, Les nouveaux produits sont actifs contre divers champignons comprenant Cryptococcus neoformans et Trichophyton tonsurans. Les effets des nouveaux antifongiques sur des micro organismes spécifiques ainsi que leurs propriétés chimiques et physiques, les différencient des antifongiques précédemment connus Les nouveaux antifongiques, que la demanderesse a dénommés BK217ss et BK217w, se forment au cours de la culture dans des conditions contrôlées deune nouvelle souche de Streptoverticillium cinnamoneus. On a isolé ladite nouvelle souche productrice d'antifongiques à partir d'un échantillon de terre recueillie dans le Montana.Une culture viable du nouveau micro- organisme a été déposée à l'établissement Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, et elle a été ajoutee à sa collection permanente. Le public peut se la procurer librement à son lieu de dépôt sous le numéro d'enre- gistrement NRRL 3594. La description et l'identification dudit nouveau micro-organisme conserve à la collection de cultures de Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company à Pearl River, New York, ont été fournies par le DrO Ho Do Tresner, desdits Laboratoires On indique ci après une description générale de l'organisme Streptoverticillium cinnamaneus, NRRL 3594, fondée sur les caractéristiques du diagnostic observées0 Les couleurs descriptives gradues et les designations des- couleurs des différents fragments sont empruntées à Jacobson et colle "Color Harmony Manual" 3e édition (1984), Container Corporation of America, Chicago, Illinois. Abondance de la croissance Modérée à bonne sur la plupart des milieux; très bonne sur géloses purée de tomate-farine d'avoine et pomme de terre-dextrose; légère et restreinte sur gélose-solution de CzapekO Couleur du mycélium aérien et/ou des spores en masse Mycélium aérien blanchtre; masses de spores en teintes rosées, allant de Bisque (4 ec) à Pêche poudrée (5 ec) à Rose chair (5 ca) à Rose perle (3 ca) à Teint halé (4 gs). Sporulatlon légère à abondante selon le milieu0 Pigments solubles Jaunâtres à jaunâtre-brun lorsqu'ils sont présents; absents sur plusieurs milieux. Couleur de l'envers En teintes jaunâtres à jaunâtre-brun sur la plupart des milieux0 Réactions physiologiques diverses Nitrates non réduits; liquéfaction complète de la gélatine en 7 jours; pas de production de pigments mélanoides sur gélose-peptone-fer. Utilisation des sources de carbone, selon la méthode de Pridham et Gottlieb [J.Bacteriol. 56 107-114 (1984)], comme suit: utilisation moyenne à bonne de dextrose, d-tréhalose, i-inositol et galactose; utilisation médiocre ou pas d'utilisation de d-xylose, lactose, d-fructose, adonitol, l-arabinose, d-mannitol, d-mélezitoses d-mélibiose, d-raffinose, -rhamnose, salicine et saccharose0 Tolère au maximum 7% de NaCl dans son milieu de croissance0 Micromorphologie Des chaînes de spores se forment en branches biverticillées à partir de longs hyphes traînants, Spores elliptiques à allongées de dimensions: 0,6-0,7 p x 1,0-1,3 . Surface des spores, lisse, ainsi que déterminé par microscopie électronique à grossissement de 8000. La nature biverticillée des sporophores de NRRL 3594 la place du point de vue taxonomique dans le genre Strepto- verticillium. En outre, les spores rosées de l'organisme l'appa rentent à un petit groupe diespeces biverticillées. Lorsqu'on effectue une confrontation générale avec les cultures de référence desdits organismes, on trouve que NRRL 3594 correspond le plus étroitement pour toutes les autre- caractéristiques essentielles aux souches de S. cinnamoneus. Par suite, on considère ci-après NRRL 3594 comme une souche de ladite espèce0 On a effectué les observations des caractéristiques culturales, physiologiques et morphologiques de la culture selon les modes opératoires indiqués en détails par Shirling et Gottlieb [Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16: 313-340 (1966)]. On a choisi les milieux utilisés dans cette étude parmi ceux qui sont préconisés par Pridham et coll. [Antibiotics Annual 1956-1957, po 947-953] pour la culture des actinomycètes. Les observations relevées sont indiquées en détails dans les tableaux I, II, III et IV annexés. Les couleurs descriptives gradues et leur notation sont empruntées à 'tColor Harmony Manual', précité. Il est entendu que, pour la production des nouveaux antifongiques, leinvention n'est pas limitée à ltorganisme précité particulier ni aux organismes qui répondent entièrement aux carac- téristiques de croissance et aux caractéristiques microscopiques qui sont indiquées ci-dessus à titre d'illustration seulement, En fait, on désire comprendre dans le cadre de ltinvention l'utilisation des mutants produits à partir de l'organisme décrit ci-dessus par divers moyens, tels que les rayons X, les radiations ultraviolettes, les moutardes à l'azote, l'exposition aux phages et analogues, Processus de fermentation On peut effectuer la fermentation de l'organisme S. cinnamoneus NRRL 3594 dans une grande variété de milieux de culture liquides0 Les milieux qui sont utiles pour la production du nouvel antifongique comprennent une source assimilable de carbone, telle quvamidon, sucre, mélasses, glycérol, et autres; une source assimilable d'azote, telle que protéines, hydrolysats de protéines, polypeptides, amino-acides, liqueur de maceration de mais, et autres; des aniqns et cations minéraux, tels que potassium, sodium, calcium, sulfate, phosphate, chlorure et autres0 Les éléments à l'état de traces sont apportés en tant qu'impuretés des autres constituants des milieux0 L'aération dans les réservoirs et les flacons est effectuée en forçant de l'air stérile à travers ou sur la surface du milieu de fermentation0 On assure une agitation complémentaire dans les réservoirs par le moyen d'un agitateur mécanique On peut ajouter, si cela est nécessaire, un agent anti-moussant. Préparation de l'inoculum On prépare un inoculum en flacons à secousses à partir de Streptoverticillium cinnamoneus NRRL 3594 en inoculant 100 ml d'un milieu liquide stérile dans des flacons de 500 ml avec des produits de raclage ou de lavage de spores provenant de la culture sur gélose inclinée, Le milieu suivant est ordinaire utilisé : : Cérélose 20 g Farine de soja "X200" 10 g Liqueur de macération de mals 5 g Carbonate de calcium 3 g Eau q. s. p. 1000 ml On fait incuber les flacons à la température de 24-303C, de préférence à 280C, et on les agite vigoureusement sur une secoueuse rotative pendant 30 à 48 heures0 On utilise les inocula de 100 ml pour inoculer des lots de 12 litres du meme milieu dans des fermenteurs en verre de 20 litres0 On aère la bouillie de fermentation avec de l'air stérile en poursuivant la croissance pendant 30-48 heures.On utilise lesdits lots d'ino- cula pour inoculer des réservoirs de fermentation0 Fermentation en réservoires Pour la production d antifongiques dans des réservoirs de fermentation, on utilise de préférence le milieu de fermentation suivant Cérélose 10 g Farine de soja "X200" 10 g "Prograsol"* 5 g Chlorure de sodium 5g Carbonate de calcium 1 g Eau q. s. p. 1000 mi t* Résidus solubles de distillation du mais mis dans ie commerce par la firme Publiker Industries, Philadelphie, Pennsylvanie). On inocule chaque réservoir contenant le milieu précité stérilisé avec 3 à 9% de l'inoculum décrit ci-dessus. On assure l'aération à raison de 0,5 à 1,0 litre d'air stérile par litre de bouillie de fermentation par minute, et on agite le mélange de fermentation au moyen deun agitateur entraîné à 200-800 tours par minutez On maintient la température à 24-30 C en général à 28 C. On poursuit d'ordinaire la fermenstation pendant 48 heures à 200 heures, et ensuite on récolte la bouillie fermentée. Mode opératoire d'isolement Après la fin de la fermentation, on filtre la bouillie fermentée contenant les antifongiques de l'invention, de préférence avec addition de terre d'infusoires ou d'un autre adjuvant de filtration courant quelconque. Normalement, on lave le mycélium aérien et le tampon de filtration avec une petite portion d'eau On rejette le filtrat et les eaux de lavage.On lave le gateau mycélien en le délayant da.ns du chloroforme et on extrait les antifongiques avec di: méthanol en utilisant environ 1 litre de méthanol par quantité de 5 à 7 litres de bouillie liquidez On concentre l'extrait méthanolique en une phase aqueuses et il se forme un produit solide brut contenant les composants BK217&alpha;, BK217ss et BK217&gamma;;. On recueille le produit solide et on le lave en le délayant avec de l'acétone et on le sèche sur de l'anhydride phosphorique ou sur un autre agent desséchant ordinaire sous pression réduite et à la température ambiante, On extrait une portion du solide précité avec de l'isopropanol et on évapore l'extrait à siccité0 On purifie le résidu par chromatographie sur colon.ne dealumine en utilisant le méthanol comme éluant et les modes opératoires types, et on fait suivre par une recristallisation répétee en obtenant le BK217a purifie, Pour obtenir le BK217ss et le BK217&gamma;;, on extrait une autre portion du solide précité avec du méthanol et on ajoute l'extrait méthanolique à environ deux volumes d'éther diéthylique, en entraînant la précipitation au BK217ss. On isole le solide et on le sèche et on le purifie d'abord par chromatographie sur colonne de Sephadex LH20 en utilisant 80% de methanol dans l'eau. On purifie ensuite davantage le BK217ss par l'utilisation d'une distribution dans des solvants à contre-courant en suivant les techniques ordinaires et en utilisant des systèmes de solvants à deux phases types, On seche le résidu de extrait méthanolique précité en obtenant le BK217&gamma; semi-pur. On peut également puri- fier ce composant d'une manière supplémentaire par distribution à contre-courant en suivant les techniques ordinaires et en utilisant des systèmes de solvants à deux phases types. On peut distinguer les nouveaux agents antifongiques de l'invention, le BK217ss et le BK217&gamma;, par des caractéristiques physiques choisies0 Les échantillons analytiques des deux compo- sants contiennent les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène, pratiquement selon les pourcentages en poids moyens suivants BK217ss BK217&alpha; Carbone 58,95 60,22 Hydrogène 8,17 8,24 Azote 1,17 1,62 Oxygène (par différence) 31,81 29,36 Cendres néant 0,56 Le composant BK2î7Çi n'a pas de point de fusion distinct On représente un spectre d'absorption infrarouge type du BK217ss, préparé dans une pastille de KBr, à la figure 1 des dessins annexés.Ce composant présente une absorption caractéristique dans la region infrarouge du spectre aux longueurs d'onde suivantes exprimées en microns : 2,97, 3,43, 5,79, 6,12, 6,35 6,69, 6,92, 7,28, 7,70, 8,63, 9,43, 11,1, 11,85, 14,39 Le composant ss en methanol montre les maxima d'absorption ultraviolette à 303 mu (E1cm1% = 228) épaulement 318 mu (E1cm1% = 460) 333 m (E1cm1% = 733) 350 m (E1cm1% = 745) Le pouvoir rotatoire spécifique de BK217ss est [&alpha;]D25 = -10.3 (# 0,4 ) (C = 0,5 en diméthylformamide). Le BK217ss contient de la mycosamine, qui. est un sucre amine connu et décrit dans la littérature, comme une partie de sa structure moléculaire0 Le BK217ss fournit les résultats suivants dans des essais de coloration choisis0 Réponses de BK217ss aux essais de coloration Essai Réponse Molish + Ninhydrine 2,4-Dinitrophénylhydrazine + Acide sulfuriaue concentre violet intense, brun au repos Le composant BK217&gamma; n'a pas de point de fusion distinct, On représente un spectre d'absorption infrarouge type du BK217&gamma; ;, préparé dans une pastille de KBr, à la figure 2 des dessins annexés0 Ce composant présente une absorption dans la région infrarouge du spectre aux longueurs d'onde suivants exprimées en microns : 2,97, 3,43, 5,87, 6,15, 6,40, 6,92 (épaulement), 7,23, 8,59, 9,41, 9,91, 11,87, 13,26, 14,42. Le composant &gamma; en méthanol montre des maxima d'absorption ultraviolette à 345 mu (E1cm1% = 326) épaulement 361 m (E1cm1% = 672) 379 mu (E1cm1% = = 1136) 405 mu (E1cm1% = 1286) Le pouvoir rotatoirespécifique de BK217w est de [&alpha;]D25 = + 231 (# 0,5 ) (C = 0,5 en diméthylformamide). Le BK217w contient de la mycosamine comme partie de sa structure moléculaire. Le BK217w fournit les résultats suivants dans des essais de coloration choisis. Réponses de BK217&gamma; aux essais de coloration Essai Réponse Molish + Ninhydrine 2,4-Dinitrophénylhydrazine + Acide sulfurique concentre bleu, viole t au repos. En outre, le BK217 est extremement actif in vitro vis-à-vis d'organismes pathogènes, comprenant des souches de Blastomyces dermatitidis et de Coccidioides immitis qui sont responsables de mycoses siégeant en profondeur. Activité vis-à-vis des champignons produisant des mycoses à siège profond Organisme et souche Concentration en g/ml Coccidioides immitis Minimale inhibitrice* Fongicide 658 6,25 50 660 6,25 25 691 6,25 6,25 Blastomyces dermatitidis 5,10 5,17 0,05 5,27 L'Amphotéricine B, utilisée comme témoin, est inhibitrice vis-à-vis des trois souches de Coccidioides immitis à 0,2 à 0,39 g/ml et fongicide à 0,39 à 0,78 g/ml. L'Amphotéricine B, utilisée comme témoin, est inhibitrice vis-à-vis des trois souches de Blastomyces dermatitidis à 0,1 à 0,2 g/ml et fongicide à 0,39 à 1,56 g/ml. * Concentration requise pour inhiber la croissance de l'organisme. **Concentration requise pour détruire l'organisme Les nouveaux composés de l'invention sont utiles comme agents antifongiques et ils possèdent une activité antifongique à large spectre in vitro vis-à-vis de divers micro organismes de laboratoires types, ainsi que déterminé par la technique de dilution en gelose sur plaque striée0 Dans cette technique de determinaticn, on prépare des solutions du compose soumis à contenant 2,5 mg dudit compose par ml de ladite solution0 En cbservant des techniques stériles, on réalise des dilutions en serine à raison de deux fois avec chaque solution soumise à l'essai. On ajoute ensuite 1 ml de chacune des solutions initiales et de chacune des dilutions en série à 9 ml d'un milieu de gélose asparagine-extrait de viande stérile chaud capable de supporter la croissance des cultures d'essai de champignons0 On laisse ensuite refroidir en disques de Pétri les solutions de gélose nutritive stérile types contenant les différentes dilutions des composés soumis à l'essai, ainsi que les dilutions témoins convenables et comparables ne contenant pas de composé soumis à l'essai, en formant ainsi des plaques de gelose solidifiées0 On prépare les champignons dressai anaiogues aux levures et destinés à L'utilisation en les faisant cotre pendant une nuit dans un bouillon On récolte les spores des champignons filamenteux à partir des cultures à maturité sur gélose inclinée, et on les met en suspension dans une solution saline physiolo- gique stérile On place ensuite le contenu d'une boucle de platine de chacune des suspensions vivantes résultantes, en employant des techniques stériles dans des stries pratiquées sur la surface de chacune des plaques de gélose et on fait ensuite incuber les plaques striées résultantes.Après une duree deterX minée, on inspecte chaque strie sur chacune des plaques par un examen visuel et on note le degré éventuel de croissance fongique. La concentration inhibitrice minimale (exprimée en microgrammes par millilitre) est définie en tant que concentration du composé soumis à leessai provoquant l'inhibition complète de la croissance de chaque organisme particulier. Dans une opération représentative, on représente la concentration inhibitrice minimale des composés de l'invention vis-à-vis des micro-organismes de laboratoire types, déterminée dans lYessai de détermination décrit ci-dessus, dans le tableau V ci-dessous :: TBBLEAU V Concentration minimale Organisme inhibîtrice (ug/ml) BK217ss BK217&gamma; Candida albicans Ea3 1 0,5 Cryptococcus neoformans Ei38 0,5 0,5 Microsporum canis ATCC 10214 5 5 Microsporum gypseux ATCC 14683 100 25 Phialophora jeanselmi E16 50 > 10 Trichophyton mentagrophytes E11 25 5 Trichophyton rubrum E97 25 10 Trichophyton tonsurans E10 10 5 L'activité antifongique élevée in vitro des nouveaux composés de invention les rend utiles seuls, ou en combinaisons avec autres agents antifongiques pour empecher la croissance ou pour réduire le nombre d'organismes tels que Gryptococcus neoformans et Trichophyton tonsurans, présents dans divers milieux Ils sont ainsi utiles dans des savons, shampoings et dans des compositions topiques pour le traitement des plaies et des brû- lures. Ils sont également utiles dans des solutions de lavage à usage hygiénique et sanitaire, notamment pour le lavage des mains et le nettoyage d'installations ou de mobilier dans des pièces ou dans des laboratoires contaminés L'utilité des nouveaux antifongiques de ltinvention est également démontrée par leur pouvoir de combattre les infections létales généralisées dues à Cryptococcus neoformans chez la souris.On effectue lissai avec C neoformans chez des souris femelles de souche Carworth Farms CFl, pesant chacune environ 20 g, infectées par voie intraveineuse avec une dose létale d'une culture de leorganisme de 24 heures en bouillon de soja "Trypticase". On traite les souris infectées avec le BK217ss ou le BK217w à des doses variées par injections sous-cutanées une heure après l'in fection. Dans les tableaux VI et VII ci-après, on rassemble les résultats obtenus avec le BK217ss et le BK217&gamma;; vis-à-vis de C. neofarmans, par comparaison avec la nystatine, qui est un agent antifongique bien connu On observe que le BK217ss aussi bien que le BK217w sont nettement plus actifs que la nystatine, T A B L E A U VI Dose administrée par voie Nombre de souris survivantes/ sous-cutanée (mg/kg de nombre total de souris poids du corps) 3 jours après l'infection BK217ss Nystatine 200 5/5 50 -- 2/5 12 5/5 3 5/5 -= 0,8 2/5 0,2 0/5 Souris témoins infectées non traitées : 1/20 T A B L E A U VII Dose administrée par voie Nombre de souris survivantes/ sous-cutanée (mg/kg de nombre total de souris poids du corps) 7 jours après l'infection BK217w Nystatine 400 -- 10/10 100 -- 6/10 50 10/10 1/10 12 10/10 1/10 3 îo/îo -- 0,8 2/10 - 0,2 2/10 - Souris témoins infectées non traitées : 0/20 L'antifongique BK217R est egalement actif in vivo contre Candida albicansO On effectue l'essai avec CO albicans chez des souris femelles de souche Carworth Farms CFl, pesant chacune environ 20 g, infectées par voie intraveineuse avec une dose létale dpune dilution 1:20 deune culture de l'organisme de 24 heures en bouillons de soja "Trypticase".On traite les souris infectées avec le BK217ss à des doses varies par injections sous cutanées une heure après l'infection. Dans le tableau VIII cidessous, on rassemble les résultats obtenus avec le BK217ss contre C. albicans par comparaison avec la nystatine, On note de nouveau que le BK217ss est nettement plus actif que la nystatine, T A B L E A U VIII Dose administrée par voie Nombre de souris survivantes/ sous-cutanée (mg/kg de nombre de souris total poids du corps 6 jours après l'infection BK217ss Nystatine 200 0 4/5 50 -- 4/5 12 4/5 0/5 3 5/5 0,8 /5 0,2 0/5 Souris témoins infectees non traitées : 0/20 L'invention est décrite ci-après avec plus de détails en référence aux exemples suivants nullement destinés à limiter ladite invention dans son cadre et son esprit. EXEMPLE 1 Préparation de l'inoculum On prépare un milieu type, utilise pour faire croître l'inoculum primaire, selon la formule suivante Cérélose 20 g Farine de soja X200 10 g Liqueur de macération de mais 5 g Carbonate de calcium 3 g Eau q.s.p. 1000 millilitres On utilise des spores recueillies par lavage ou par raclage à partir d'une culture sur gélose inclinée de S. cinnamoneus NRRL 3594 pour inoculer deux flacons de 500 ml, contenant chacun 100 ml du milieu stérile précité0 On place ensuite les flacons sur une seooueuse rotative et on les agite vigoureusement pendant 48 heures à 28 C. On transfère l'inoculum résultant dans le flacon à un fermenteur en verre de 20 litres contenant ,2 litres du milieu stérile.On aère le fermenteur en verre avec de l'air steriie en effectuant la croissance pendant 48 heures environ, puis on utilise à la fin de cette période le contenu du fermenteur pour ensemencer un réservoir de fermentation de 300 litres0 EXEMPLE 2 Fermentation en réservoir Or prépare un milieu de fermentation selon la formule suivante Cérélose 10 g Farine de soja X200 10 g "Prograsol" 5 g Chlorure de sodium 5 g Carbonate de calcium 1 g Eau q.s.p. iOOO mil.lilitres On sterilise 300 litres du milieu de fermentation précite dans un réservoir de fermentation en acier inoxydable de 400 litres, a 120 C avec de la vapeur d'eau sous une pression de 6,8 kg, pendant 55-60 minutes, On refroidit le milieu à 28 C (par chemise à circulation d'veau réfrigérantes et on introduit aseptiquement 12 litres d'inocculum préparé comme décrit à l'exemple 1, dans le réservoir. On effectue la fermentation à 28 C, l'aération étant assurée a un débit de 0.5 litre d'air stérile par litre de bouillie de fermentation par mite, On agite la bouillie de fermentation au moyen d'un agitateur antraîné à 200 tours par minute. De temps à autre, lorsque cela est nécessaire, on ajoute de l'huile mise dans le commerce sous ie nom de Hodag LG-8 comme agent destructeur de mousses. Au bout de 66 heures de fermentation environ, on recolte la bouille fermentée. EXEMPLE 3 Isolement du BK217&alpha; brut et préparation du BK217&alpha; cristallisé On filtre 300 litres de bouillie fermentée avec environ 2% (en poids/volumes) d'un adjuvant de filtration à base de terre d'infusoires et on lave le tampon de filtration avec environ 30 litres d'eau. On rejette le filtrat ainsi que les eawc de lavage On lave le gâteau mycélien en le délayant avec environ 50 litres de chloroforme, on filtre la suspension et on rejette le chloroforme On extrait le gâteau lave en le mettant en suspension dans environ 50 litres-de méthanol en agitant pendant environ une demi-heure.On filtre ladite suspension et on lave le gâteau avec une quantité supplémentaire de 20 litres de méthanol0 On réunit le filtrat et les liqueurs de lavage et cn rejette le gâteau mycélium usé. On concentre les extraits methancliques combinés en une suspension aqueuse (volume de 4 litres), dont les solides contlennent un mélange des trois composants antifongiques : BK217&alpha;, BK217ss et BK217&gamma;. On centrifuge la suspension et on délaie les solides dans l'acétone. On décante le surnageant et on sèche le résidu lourd (BK217&alpha; brut) sur de l'anhydride phosphorique sous pression réduite à la température ambiante, poids 25,3 go On extrait une portion (20g) du BK217&alpha; brut en le délayant 6 fois, dans chaque cas avec 200 ml d'isopropanol. On évapore l'extrait à siccité et on le dissout dans environ 150 mi d'éthanol. On élimine le résidu insoluble par filtration et on le rejette. On charge 75 ml de l'extrait éthanolique sur une colonne d'alumine (de 60 g) et on lave la colonne avec 240 mi deethanol.puis on l'élue avec 500 ml de méthanol.On suit le progrès de l'élution par contrôle de la densité optique de l'effluent à 235 et à 300 m . On recueille les fractions contenant le BK217a et on les concentre pratiquement à siccité. On dissout le résidu solide dans leethanol et on filtre la solution, On concentre le filtrat clair jusqu'à environ 4 ml. On précipite le BK217&alpha; purifié lorsqu'on ajoute de l'éther diéthylique au concentrat ethanoliqueO On isole le solide ayant précipité par centrifugation et on le lave avec de l'éther diéthylique. On dissout le precipite lave dans 5 ml de butanol saturé d'eau et on ajoute de l'éther diéthylique jusqu'à ce qu'un solide cristal.lise commence à se former, On laisse reposer la suspension résultante pendant une nuit à 4 C. A la fin de cette période, on separe par filtration le BK217&alpha; cristallisé, on le lave avec de l'éther diethylique et on le sèche sur P2O5 sous pression réduite à la température ambiante, poids 270 mgO EXEMPLE 4 Isolement du BK217ss brut et du BK217&gamma; brut On filtre 300 litres de bouillie fermentée avec environ 2% (en poids/volumes) d'un adjuvant de filtration à base de terre d'infusoires et on lave le tampon de filtration avec environ 30 litres d'eau. On rejette le filtrat ainsi que les eaux de lavage0 On lave le gâteau mycélien en le delayant avec environ 50 litres de chloroforme, on filtre la suspension et on rejette le chloroforme.On extrait le gâteau lave en le mettant en suspension dans environ 50 litres de méthanol et en agitant pendant environ une demi-heure. On filtre ladite suspension et on re-extrait le gteau avec 20 litres supplémentaires de méthanol. On réunit les extraits et on rejette le gâteau mycélien usé. On concentre les extraits méthanoliques combinés (volume de 78 litres) en une suspension aqueuse (volume de 15 litres) dont les solids contiennent un mélange de BK217&alpha;, BK217ss et BK217&gamma; On centrifuge la suspension et on délaie les solides deux fois dans en utilisant chaque fois 20 litres d'acétone. On extrait le résidu humide restant avec deux portions de 2,0 litres de méthanol et on ajoute l'extrait méthanolique combine à 8,0 litres d'éther diéthylique.On sépare e précipité qui se forme, constitué par le BK217ss brut, par centrifugation et on le sèche sur de ltanhydride phosphorique sous pression réduite à la température ambiante, poids 21,9 gO On purifie le BK217ss brut comme décrit à l'exemple 5. On sèche le résidu de BK217w brut, provenant de l'extraction méthanolique précitée, sur de l'anhydride phospho rique sous pression ambiante à la température ambiante, poids 29,1 g. On purifie le BK217&gamma; brut ainsi obtenu, comme décrit à l'exemple 6. EXEMPlU Préparation de BK217ss On met en suspension 10 g de BK217ss brut, obtenu comme décrit à l'exemple 4, dans 60 ml de diméthylsulfoxyde et on extrait la suspension avec 485 ml de méthanol à 80% dans l'eau. On sépare la substance insoluble par centrifugation On charge la solution clalre sur une colonne de Sephadex LH20 (1 kg) [On prépare le Sephadex en vue de son utilisation en le délayant avec lu methanol à 80 dans l'eau] et on élue la colonne avec du méthanol à 80% dans l'eau. On suit le progrès de solution par le contrôle de la densite optique de l'effluent à 350 et 405 m . On réunit les fractions contenant le BK217ss et on les concentre sous pression réduite en une phase aqueuse. On recueille le précipité par centrifugation et on le lave deux fois avec de l'eau. On obtient environ 0,7 g de BK217ss.On peut rejeter les fractions contenant le BK217&gamma;, obtenues après l'élution de BK217ss, ou les conserver en vue de a récupération ultérieureg comme décrit à l'exemple 6 (mode opératoire différent). On purifie de manière supplémentaire une portion (0,56 g) de BK217ss par l'utilisation de la distribution en solvants à contre-courant. Le système de solvants comprend 2 parties de méthanol, 2 parties de chloroforme et 1 partie de tampon d'acétate de sodium 0,1 M à pH 4,6 On effectue la distribution à contrecourant dans un apparell à 20G tubes en utilisant 10 ml de phase supérieure et 10 ml de phase inférieure par tubez On dissout le BK217ss à purifier dans 30 ml de la phase inférieure et on le charge dans les trois premiers tubes0 On effectue 200 transferts0 A la fin des transferts, on prélève des échantillons de chaque tube et on determine la densité optique à 350 et 405 mu On réunit les tubes appropriés contenant le BK217 et on évapore leur contenu en une phase aqueuse.On sépare le précipité par centrifugation et on le lave deux fois avec de l'eau. On sèche la substance microcristalline ainsi obtenue sur P205 sous pression réduite à la température ambiante. Le rendement en BK217ss pur est de 89 mgO EXEMPLE 6 Préparation de BK217&gamma; On purifie une portion (100 mg) de BK217&gamma; brut, obtenu comme décrit à l'exemple 4, en utilisant des techniques de distribution à contre-courant et en suivant essentiellement le mode opératoire de l'exemple 5. On dissout l'échantillon dans 70 ml de phase inférieure et 35 ml de phase supérieure et on le charge dans les 7 premiers tubes0 Le rendement en BK217&gamma; est d'environ 20 mg. (Mode opératiore différent) : On réunit les fractions contenant le BK217 provenant de la colonne de Sephadex 1H20 et on les évapore sous pression réduite jusqu'à ce qu'un solide finement cristallise commence à précipiter On recueille le solide par centrifugation et on le lave trois fois avec des portions de méthanol et ensuite avec de l'eau Après séchage sur P2O5 sons pression réduite à la température ambiante, on obtient 0,11 g de BK217# purifié. T A B L E A U IX Toxicité aiguë du composant BK217# chez la souris Nombre de souris tuées/nombre total de souris Dose unique après l'administration de la dose, par voie mg/kg scus-cutanée buccale intrapéritonéale 400 4/10 9/20 100 13/20 5/20a 25 6/20 0/20 15/15 6 2/20 0/10 15/15 1,5 0/20 15/15 0,4 0/,9 # 0/15b 0,1 0/20 a Une dose de 100 mg/kg neest pas létale dans un essai conse- cutif avec des souris infectées b Une dose de o,a mg/kg n'est pas létale dans un essai @@@@@- cutif avec des souris infectées EXEMPLE 7 Préparation de comprimés contenant le B217 On incorpore le composé BK217 dans un comprime pharmaceutique type selon la formulation suivante Ingrédient Par comprimé Pour 10000 comprimés mg g BK217 50 500 Lactose 225 2250 Amidon de mals (pour mélange) 50 500 Amidon de maïs (pour pâte) 25 250 Stéarate de magnésium 5 50 335 3350 On mélange ensemble l2ingrédient actif, BK217, le lactose et l'amidon de mars, On met en suspension dans l'eau lsamidon de maïs pour pâte en une proportion de 100 g dtamidon de maïs pour 800 ml d'eau et on chauffe la suspension ainsi obtenue en l'agitant pour former une pâte, On utilise ensuite la pâte résultante pour granuler le mélange en poudre, On utilise une quantité dteau supplémentaire si cela est nécessaire0 On fait passer les granules humides par un tamis de 2,38 mm de côté d'ouverture et on les sèche à 490C environ.On fait passer les granules secs par un tamis de 1,2 mm de côté d'ouverture et on les lubrifie avec du stéarate de magnésium. On comprime ensuite le produit de granulation en obtenant des comprimés (poids dtun comprimé : 355 mg) dans une machine à former des comprimés, convenable, Chaque comprimé contient 50 mg d'ingrédient actif. EXEMPLE 8 Préparation de capsules à enrobage dur, contenant le BK217 On peut administrer le BK217 sous forme de capsules à enrobage dur, Une formulation qui s'avère utile pour préparer lesdites capsules est la suivante Ingrédient Par capsule Pour 1000 capsules, BK217 50 50 Lactose 90 90 Stéarate de magnésim 1 1 141 141 On mélange l'ingrédient actif, le lactose et le stéarate de magnésium. On utilise le mélange résultant pour remplir des capsules à enrobage dur, de dimension convenable avec un poids de remplissage de 141 mg par capsule. EXEMPLE 9 Préparation dtune sus~ension pour l'administration par voie buccale, contenant le BK217 Ingrédient Quantité % (en poids/volumes) BK217 1,00 Gel de silicate de magnésiumaluminium (Veegum) 0,50 Saccharose 60,00 Méthylparabène 0,08 Propylparabène 0,02 Parfum qs Eau distillée, q.s.p. 100,00 On dissout les parabènes et le saccharose dans environ 2/3 du volume final d'veau distillée à 8000, et on ajoute, en agitant, le Veegum. On refroidit la suspension à 40 C. On ajoute l'ingrédient actif et le parfum, en agitant0 On amène la suspension refroidie à son volume final avec de l'eau distillée. La suspension assure 50 mg de lsingrédient actif par dose de 5 ml de suspension0 EXEMPLE 10 Préparation d'une suspension injectable contenant le BK217 On peut incorporer le constituant actif, BK217, dans une suspension injectable selon la formulation suivante : Ingrédienr Quantite % (en poids/volumes) BK217 5,0 Polyéthylèneglycol 4000, selon la Pharmascopée des E.U.A. (U.S.P.) 4,0 Chlorure de sodium (UOSoPo) 0,90 Alcool benzyliqueg qualité pour reactif 0,90 Eau pour injection, q.s.p. 100,00 On prépare le véhicule en mélangeant ensemble tous les ingrédients précités excepté le BK2170 On rend steriles le véhicule et lYingrédient actif micronisé par des moyens convena bleso On prépare une dispersion de l'ingredient actif dans le véhicule en délayant l'ingredient actif tout d'sabord avec une portion du véhicule et en ajoutant ensuite la portion restante du véhicule en agitant. Une dose de 1 ml de ladite suspension assure 50 mg d'ingrédient actif0 REVEND I C A T IONS 1. A titre de composé industriel nouveau, un antifongique dénommé BK217, et ses formes BK217&alpha;, BK217ss et BK217# et leurs mutants. 2. L'antifonique BK217ss, caractérisé par ses propriétés suivantes: (a) Il est actif pour inhiber la croissance des champignons, et, dans sa forme cristallisée essentiellement pures (b) IL a un pouvoir rotatoire de [&alpha;]D25 = -10,3 (#0,4 ) (C = 0,5 en diméthylformamide); (c) Il a les valeurs suivantes à l'analyse élémentaire: C, 58,59; H, 8,17; 0, 31,81; N, 1,17; 303 m (E1cm1% = 228) épaulement, 318m (E1cm1% = 460), 333 mu (E1cm1% = 733), 350 mu (E1cm1% = 745); et (e) Il présente un spectre deabsorption infrarouge caractéristique montré à la figure 1, annexée, 3. L'antifongique BK217ss dans sa forme essentiellement pure. 4. L'antifongique BK217#, caractérisé par ses propriétés suivantes (a) Il est actif pour inhiber la croissance des champignons, et. sous sa forme cristallisée essentiellement pure; (b) Il a un pouvoir rotatoire de [&alpha;]D25 = +231 (#0,5 ) (C = 0,5 en diméthylformamide); (c) Il a les valeurs suivantes à l'analyse élémentaire: C, 60,22; H, 8,24; 0, 29,36; N, 1,62; (d) Il a des maxima d'absorption ultraviolette à 345m (E1cm1% = 326) épaulement, 361 m (E1cm1% = 672), 379m (E1cm1% = 1136), 405 m (E1cm1%= 1268); et (e) Il présente un spectre d'absorption caractéristique montré à la figure 2, annexée0 50 L'antifongique BK217#, dans sa forme essentiellement pure. 6. Procédé de préparation de l'antifongique BK17, ledit procedé étant caractérisé en ce qu'on cultive une souche de Streptoverticillium cinnamoneus productrice de l'antifongique BK217, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusque ce qu'une activité antibactérlenne notable soit conférée audit milieu par suite de la production de l'antifongique BK217, et, éventuellement, on effectue un traitement complémentaire du milieu de culture, /. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on effectue ie traitement complémentaire en isolant le produit antifongique BK2170 8.Compositions pharmaceutiques renfermant leanti fongique BK217 sous les fournies définies à d'une quelconque des revendications 1 à 5. 90 Formes pharmaceutiques appropriées à l'adminis- tration des compositions selon la revendication 8, notamment les comprimés et les capsules, administrés par voie buccale, et les préparations topiques ou injectables, 10. Compositions à usage vétérinaire, renfermant l'antifongique BK217 sous les formes définies à l'une queiconque des revendications 1 à 50 11. Applications de l'antibiotique BK217 aux soins d'hygiène et comme produit sanitaire notamment sous forme de savons, de shampooings, de compositions désinfectantes, de solutions de lavage corporel et de nettoyage dtinstallations et de locaux,