Brevet FR2100517A1 — publié le 19720324

On sait que l'on prépare le lysozyme commercial à,partir de matières premières telles que notamment le blanc.d'oeuf par èristai:lsation de la base à pH 9-10, en présence de chlorure de sodium. Malgré des recristallisations successives les produits obtenus contiennent toujours des protéines étrangères et en particulier de l'ovalbumine. Ainsi, ces produits ne peuvent être utilisés pour l'usage parentéral.: La Demanderesse a mis au point une technique originale de purification, permettant d'éliminer efficacement-les protéines étrangères. A ceteffet, l'invention vise une technique de séparation à l'aide d'un gel polyacrylamide aga'rosse sous forme de perles calibrées, leur diamètre étant compris entre 100 et 160 1 .Ces perles sont constituées par une trame tridimensionnelle de polyacrylamide, plus ou moins serrée suivant la concentration en acrylamide et par un gel diagarose qui se distribue à l'intérieur des mailles de polyacrylamide. La plus ou moins grande finesse de la trame de polyacrylamîde joue le rôle de tamis moléculaire et, seules les molécules dont la taille est inférieure à celle des mailles pourront entrer dans le gel et seront de ce fait plus ou moins retardées eu cours de leur passage dans la colonne de gel, les plus petites sortant les dernières. Par contre les molécules-trop grosses seront exclues du gel et sortiront dès que le volume de l'éluat sera égal au volume de la solution contenue entre les perles. On a constaté au surplus que le g à utiliser pour la purifi- cation du lysozyme est celui qui contient 6 p. 100 d'acrylamide et 4 p. 100 d'agarosé. Toutes les molécules prot-éiques étrangères sortent de la colonne de gel bien avant le lysozyme, qui est retardé et nettement séparé. L'éluat recueilli, ne contenant que le lysozyme, est dialysé pour éliminer le tampon, et lyophilisé. N'importe quelle solution tampon peut être utilisée, mais il est préférable que sa force ionique soit comprise entre 0,01 M et 0,05 M et que son pH se situe entre 7 et 8. EXEMPLE : Préparer une colonne de gel de 100 m m de diamètre et de 1.500 mm de hauteur de la façon suivante : prélever 10 litres de gel hydraté et les mettre en suspension dans 2,500 1 de solution tampon tris-hydroxyamino-méthane-acide chlorhydrique 0,05 M à pH 7,4 agiter 30 minutes, puis verser cette suspension sur un entonnoir situé au-dessus de la colonne déjà remplie à moitié par la solution tampon, la suspension- étant agitée mécaniquement sur l'entonnoir. De cette manière les perles se sédimentent naturellement et de façon homogène. Laisser s'écouler le tampon, puis verser sur la surface du gel la solution de lysozyme (10g. dans 20 ml de solution tampon).Lorsque celui-ci a pénétré dans le gel, verser a nouveau 20 ml de solution tampon, laisser couler la colonne, puis alimenter avec la solution tampon. Règler le débit d'écoulement à 120 ml/heure. Les protéines étrangères sont éliminées dans les 1000 premiers ml d'éluat, et le lysozyme ne sort que lorsque le volume d'élution est voisin de 1.500 ml. Recueillir les 200 ml d'éluat qui contiennent le lysozyme. Dialyser et lyophiliser. Le lysozyme ainsi obtenu ne contient aucune trace de protéine étrangère décelable par électrophorèse sur gel d'acrylamide et par les immuno électrophorèses effectuées avec des immunosérums de lapin anti-ovalbumine, anticonalbumine et anti-blanc d'oeuf de poule. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour l'obtention de lysozyme pur à partir de solutions de lysozyme souillées d'impuretés protéiniques, carac térisé en ce que l'on fait passer la solution impure sur une colonne de gel de perles de-polyacrylamide-a'garose et à ne recueillir l'éluat qu'après passage d'un volume de-solution environ égal au volume des perles, cet éluat contenant le lysozyme pur. 2 - Procédé selon 1, caractérisé en ce que les perles sont calibrées à 100-160 . 3 - Procédé selon 1 et 2, caractérisé en ce que les proportions d'acrylamide et d'agarose dans le gel sont de 6 e et de 4 %, respectivement. 4 - Lysozyme purifié, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon 1 à 3.