Brevet FR2077560A1 — publié le 19711029

La présente invention se rapporte à des agents qui sont extrêmement utiles et sensibles pour poser le diagnostic clinique des hépatomes primaires, et pour les distinguer des maladies hépatiques à métastases et autres. Plus précisément, l'invention se rapporte à de nouveaux agents de diagnostic sérologi-5 ques pour la détermination des hépatomes primaires qui sont à base d'anti-atl-foetoglobuline, ainsi qu'à des procédés pour préparer ces agents de diagnostic sérologiques et à des méthodes de diagnostic qui sont fondées sur l'utilisation de ces agents. Initialement, on a découvert que le sérum des foetus de certains bestiaux 10 contient une sorte de oCl-globuline qui a été nommé ot 1-foetoglobuline (Fetuine) (K.O. Pedersen, Nature 154, 575 (1944). Ensuite, on a découvert que cette substance particulière existe aussi dans le sérum des foetus de différentes espèces animales et qu'elle est spécifique à chaque espèce. Ces découvertes ont été suivies de la constatation que cette même substance existe également 15 dans le sérum du foetus humain (C.G. Bergstrand et al, J. Clin & Invest. 8 174 (1956). Récemment il a également été démontré par des réactions de séro-préci-pitation que 1' a.-1-foetoglobuline apparaît dans le sérum des patients ayant des hépatomes primaires (Yu. S. Tatarinov, Vop. Med. Khim, 11 (2) 20 (1965) et d'autres). Il a été suggéré que la présence ou l'absence d'dl-l-foetoglobu-20 line pouvait être un indice pour établir le diagnostic des hépatomes primaires. Pendant les années suivantes, la Demanderesse a fait des recherches poussées sur le mécanisme fondamental de ces cancers, afin de découvrir si le métabolisme des patients affligés de telles maladies cancéreuses est analogue à celui du foetus et s'il existe un lien étroit entre 1 bt-l-foetoglobuline et les hépa-25 tomes primaires. Ces efforts ont été, dans une large mesure, concentrés sur le développement de meilleurs agents de diagnostic pour des usages cliniques. Ces efforts viennent d'être récompensés par la découverte de procédés rapides et précis pour diagnostiquer et pour déterminer quantitativement ces cancers, qui ne nécessitent pas le recours à -des opérations chimiques compliquées et coû-30 teuses, ni l'utilisation d'équipements complexes. En conséquence, l'un des buts de l'invention est de fournir un agent de diagnostic ayant une grande sensibilité pour la détection de ces maladies, qui ne produit qu'un nombre réduit de résultats positifs douteux et qui présente un degré élevé de fiabilité. 35 Un autre but de l'invention est de fournir une anti-ctl-foetoglobuline purifiée qui est importante pour la préparation des agents de diagnostic de la présente invention. Une particularité marquante de la présente invention réside dans l'utilisation d'anti-c*. 1-foetoglobuline, c'est-à-dire de l'anticorps qui peut être 40 obtenu en immunisant des animaux avec l'antigène développé par l'o^l-foetoglobu- 70 45703 2 2077560 line à partir de l'ascite ou Une autre particularité importante de l'invention réside dans le procédé utilisé pour préparer cette anti- cf. 1-foetoglobuline purifiée. C'est ainsi 10 qu'on utilise le liquide ascitique ou le sérum provenant d'un patient ayant un hépatome ou le sérum du foetus humain pour immuniser un animal, puis on prélève un échantillon sanguin de cet animal. On sépare le sérum de cet échantillon sanguin, puis on mélange 1'antisérum avec du sérum humain normal, ou bien avec un immunoadsorbant insoluble obtenu en traitant un sérum humain normal avec, 15 par exemple, de l'aldéhyde glutarique. En variante, le liquide ascitique ou le sérum ci-dessus est préalablement purifié par une séparation fractionnée des protéines et la fraction otf.-foetoglobuline résultante est utilisée pour immuniser un animal. Ensuite, un échantillon sanguin est prélevé de cet animal et le sérum est séparé. 20 Une autre particularité importante de l'invention réside dans le procédé de préparation de 1'oC 1-foetoglobuline purifiée qui consiste en une dialyse du liquide ascitique ou du sérum d'un patient,ayant un hépatome primaire par rapport à de l'acrinol, le précipité résultant de cette dialyse étant purifié par une technique de fractionnement des protéines. 25 Etant donné que la première hypothèse a consisté, comme il a été mention né ci-dessus, à suggérer que la présence ou l'absence d' o( 1-foetoglobuline pouvait être utilisée pour un diagnostic discriminatoire des hépatomes, un certain nombre de chercheurs ont tenté à établir l'immunodiagnostic dés hépatomes primaires. Toutefois, jusqu'à ce jour aucun agent de diagnostic satisfaisant n'a 30 été découvert et, de ce fait, l'immunodiffusion et les techniques immuno- électrophorétiques restent, à l'heure actuelle, des procédés universels utilisés dans de nombreuses applications d'immunodiagnostic dans lesquels elles sont adoptées par une sorte d'analogie. L'immunodiffusion peut être classée en une technique à simple diffusion et en une technique à double diffusion. La techni-35 que à simple diffusion est une méthode de diagnostic dans laquelle un tube contenant l'antigène, l'anticorps et le milieu de diffusion, dans trois couches distinctes, produit une bande de précipitine dans la couche centrale comprenant ledit milieu de diffusion au niveau correspondant au rapport optimal antigène-anticorps et ce niveau est utilisé comme mesure de diagnostic. Cette technique 40 est généralement connue sous le nom de méthode Oudin. La technique à double 70 45703 3 2077560 diffusion, appelée méthode d'Ouchterlony, consiste à placer l'anticorps dans une cavité centrale et à placer l'antigène dans un certain nombre de cavités satellites, ces cavités ayant été percées dans une couche d'agar placée sur une plaque, après quoi, un anneau de précipitine apparaît à la position corees-5 pondant au rapport optimal antigène-anticorps comme il vient d'être décrit ci-dessus à propos de la technique à simple diffusion, et cet anneau de précipitine est utilisé pour le diagnostic. La méthode d'Oudin, dans laquelle un anneau de précipitine se développe à un niveau qui est déterminé par les coefficients de diffusion et les concentrations de l'antigène et de l'anticorps, 10 est avantageuse pour le dosage quantitatif de l'antigène. Par contre, la méthode d'Ouchterlony se révèle plus utile pour faire une discrimination entre différents antigènes. L'immuno-électrophorèse est une combinaison d'une électrophorèse ordinaire et de l'immunodiffusion ci-dessus. En conséquence, lorsque l'anticorps est 15 placé parallèlement à la direction de migration de l'antigène qui a été fractionné linéairement, un anneau de précipitine se développe à l'emplacement carespondant au rapport optimal, comme ci-dessus, et cet anneau de précipitine est utilisé pour le diagnostic. Ce procédé a notamment une excellente repro-ductibilité. 20 Toutefois, ces méthodes de diagnostic n'ont pas été spécialement dévelop pées pour un diagnostic discriminatoire de la maladie à laquelle s'attache l'invention et bien que pouvant être appliquée à celle-ci, chacune de ces méthodes a de nombreux inconvénients parmi lesquels on peut mentionner un pourcentage élevé de résultats positifs douteux, des équipements coûteux, ainsi 25 que des procédures longues et compliquées qui sont indispensables pour établir le diagnostic nécessaire. Par contre, l'invention apporte un procédé plus spécifique et plus simple qui.'permet d'établir,en un temps limité, le diagnostic d'un grand nombre de patients. Les études faites par la Demanderesse en vue de remédier à ces nombreux 30 inconvénients ont conduit à la découverte qu'en dissolvant l'anti-çC 1-foetoglobuline dans un milieu de support et en lui permettant de se solidifier dans un état dispersé ou en provoquant l'adsorption de l'anti-!Xl-foetoglobu-line sur un milieu de support et en la dispersant sous cette forme dans un milieu de dispersion, on peut obtenir un agent de diagnostic utilisant direc-35 tement le liquide ascitique ou le sérum d'un patient comme échantillon, sans avoir recours à des procédures compliquées. La Demanderesse a également réussi à préparer des agents de diagnostic qui restent stables même après une période de conservation prolongée, qui sont moins susceptibles de donner des résultats positifs douteux, et qui constituent un test avantageux pour la recherche 40 d'hépatomes primaires. L'invention est le point culminant de la découverte et 70 45708 4 2077560 des recherches ci-dessus. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront de la description qui va suivre. En premier lieu, la description suivante concerne la préparation d'un agent de diagnostic conforme à l'invention, cette préparation consistant à 5 dissoudre l'anticorps, c'est-à-dire 1'anti-OC1-foetoglobuline dans un milieu de support et à laisser cette solution àe solidifier dans un état diffusé. C'est ainsi, notamment, qu'on prépare l'agent de diagnostic particulier considéré en utilisant de 11foetoglobuline pour immuniser un animal, en dissolvant 1'antisérum résultant avec un milieu de support, et en y ajoutant 10 un tensio-actif, un colorant et un agent de conservation, le cas échéant, et en permettant au mélange de se solidifier dans un état diffusé. Le milieu de support pouvant être utilisé pour la mise en pratique de l'invention est une substance ayant un coefficient de diffusion élevé et qui, pour la commodité de la discrimination, a un degré de limpidité ou de clarté satis-15 faisant. Parmi les substances satisfaisant aux conditions ci-dessus, on peut citer l'agar, la dextrine, l'amidon, la. pectine et d'autres polysaccharides ainsi que diverses protéines, dont la gélatine. De préférence, on utilise l'agar, -un gel de polyacrylamide et l'amidon. Le tensio-actif utilisé selon l'invention a pour but de diminuer le .nombre de résultats positifs douteux^ attribuables 20 à des sérums hypercholestériques dans les applications cliniques, et peut être choisi parmi les substances comprenant les tensio-actifs anioniques, tels que l'oléate de sodium, le laurylsulfate de sodium, 1'octylsulfate de sodium, le stéarylsulfate de sodium, 1'alkylbenzène sulfonate de sodium, le dialkylsulfo-succinate de sodium, etc..; les tensio-actifs cationiques tels que l'acétate 2 5 de dodécylamine, les halogénures de benzyldiméthylalkylammonium, les halogénu-res de cétylpyridinium, etc... et les tensio-actifs non ioniques tels que les esters des acides gras du polyoxyéthylène, du polyoxyéthylènesorbitane, les éthers alcools supérieurs du polyoxyéthylène, les éthers polyoxyéthylènealkyl-aryliques, les.dérivés polyéthyléniques de l'huile de ricin, etc... ainsi que 30 la lécifline, la saponine, l'acide taurocholique, etc... Parmi ces tensio-actifs, les esters des acides gras du polyoxyéthylènesorbitane (type Tween) qui sont non ioniques, sont particulièrement avantageux. Un colorant peut être utilisé pour faciliter l^iagnostic. Ce colorant peut, par exemple, être le bleu Evans, le bleu de toluidine, le vert brillant, le bleu brillant FCF, le bleu Alcian, 35 le bleu patenté, le bleu de trypan ou le noir d'amide 10B Ponceau 3R. Parmi ces colorants, le bleu patenté et le bleu de trypan sont particulièrement avantageux. Comme agents de conservation, on peut utiliser divers composés phéno-liques tels que le crêsol, le chlorothymol, le thymol, l'ester de l'acide para-oxybenzoïque, etc...; des composés mercuriques organiques, tels que le thiméro-40 sal, l'acétate de phénylmercure, le borate de phénylmercure, etc..., le 70 45703 5 2077560 chlorobutanol et d'autres alcools, l'azide de sodium, etc... Un mode de mise en pratique de la présente invention sera décrit en détail ci-après. Tout d'abord, afin de stabiliser l'agent de diagnostic, on prépare une solution-tampon ayant un pH et une force ionique prédéterminés. Cette solution-5 tampon est, de préférence, une solution Tris-HCl-saline ou une solution de glycine et de chlorure de sodium, bien que les solutions-tampons à base de citrate, de phosphate, de borate ou de barbiturate puissent également être utilisées. En ce qui concerne la concentration de ces solutions-tampons, elle s'échelonne entre une faible acidité et une faible alcalinité, c'est-à-dire 10 dans la gamme des pH comprise entre 6,5 et 8,5. Le pH optimal se situe entre 7,2 et 8,2. La solution-tampon ci-dessus est maintenue à une température comprise, de préférence entre 50 et 56° C et on dissout le milieu de support dans cette solution. Il est préférable d'ajouter le milieu de support de façon à obtenir une concentration finale comprise entre 1 et 15 % en poids/volume. 15 D'autre part, on dissout 1'antisérum préparé comme il a été décrit ci- dessus dans la même solution-tampon que ci-dessus à une concentration finale de 1 à 10 % en poids/volume, et on mélange la solution résultante à la solution-tampon-support préparée ci-dessus, puis on y incorpore le tensio-actif et l'agent de coloration à des concentrations finales de 0,01 à 0,20% en poids/vo-20 lume et 0,001 à 0,005 % en poids/volume respectivement. Dans le cas où le tensio-actif est l'acide taurocholique, la concentration finale doit être de 0,2 à 0,5 % en poids/volume. A la composition ainsi préparée, on ajoute l'agent de conservation jusqu'à ce qu'une concentration finale de 0,1 % en poids/volume soit atteinte. Après avoir suffisamment mélangé, on 25 verse une partie de cette composition dans un récipient approprié dans lequel on la laisse solidifier. Ensuite, on prépare la plaque d'immunodiffusion voul en produisant des cavités dans la composition solidifiée, cavités à partir de quelles le sérum d'essai peut diffuser. Il est bien évident que dans la pratique de l'invention, les procédures précédentes peuvent être modifiées entre des 30 limites évidentes pour les techniciens avertis. Le récipient dans lequel on verse et conserve cet agent doit être entièrement transparent et doit pouvoir être fermé hermétiquement pour éviter l'é-vaporation. De plus, ce récipient doit être conçu pour pouvoir être facilement manipulé. Un récipient satisfaisant à ces conditions est un récipient trans-35 parent incolore en matière plastique dans lequel il est recommandé de verser l'agent de diagnostic jusqu'à un niveau de 2 mm, après quoi, les opérations précédentes peuvent être exécutées et le diagnostic, ainsi que la détermination quantitative selon l'invention, peuvent être conduits très facilement, rapidement et avec précision. C'est ainsi que, lorsqu'on permet à un échan-40 tillon de sérum d'un patient de diffuser sur la plaque d'immunodiffusion ci- 70 45708 6 2077560 dessus, il se forme un anneau de précipitine spécifique lorsque des protéines antigéniques sont présentes. Des cas de cancers primaires du foie peuvent ainsi être décelés par ce test. L'aire de l'anneau de précipitine ainsi formé est proportionnelle à la quantité de protéines antigéniques et, par conséquent, 5 l'estimation quantitative des antigènes peut s'effectuer en déterminant simplement le diamètre de l'anneau. Des hépatomes primaires peuvent être facilement détectés en utilisant trois préparations de sérum, à savoir, une préparation normale, une préparation décuple et une préparation centuple. Etant donné que l'agent de diagnostic obtenu de la manière décrite ci-dessus permet de 10 quantifier l'antigène, il est particulièrement avantageux, car il permet de déterminer facilement les progrès ou l'état des hépatomes primaires. La description qui va suivre se rapporte à un mode de réalisation de l'invention dans lequel 1 '-anti-^ 1-foetoglobuline qui est l'anticorps, est adsorbée sur un milieu de support qui est ensuite dispersé dans un milieu de dispersion. 15 Pour obtenir cet agent de diagnostic, on adsorbê d'abord l'anti- Pour provoquer l'adsorption de l'anti- o^l-foetoglobuline sur ce milieu de support ou ce véhicule, selon l'invention, on disperse d'abord le véhicule dans une solution-tampon appropriée, on ajoute 1'antisérum à la dispersion résultante, puis on secoue soigneusement. 35 Aux fins de l'invention, diverses solutions-tampons peuvent être utilisées. C'est ainsi, par exemple, qu'une solution tampon Tris-HCl-saline et une solu-tion-tampon de chlorure de sodium et d'aminoacide, ainsi qu'une solution de barbiturate ou de Citrate, de phosphate ou de borate peut être avantageusement utilisée. Il est préférable que le véhicule ci-dessus soit ajouté dans une 40 proportion suffisante pour obtenir une concentration finale dè 0,2 à 5% en 70 45708 7 2077560 poids/volume. La quantité d'antisérum dépend de la quantité d'anti-cK 1-foetoglobuline. D'une manière générale, on dissout préalablement l'antisérum dans la solution-tampon ci-dessus à une concentration finale comprise entre 1 et 10 % en volume/volume et dans le cas de l'anticorps purifié, on le dissout 5 dans la solution-tampon ci-dessus à une concentration finale de 0,1 à 1% en volume/volume et on ajoute la solution au mélange ci-dessus, puis on procède à une agitation suffisante. De cette manière, l'anti-o^l-foetoglobuline contenue dans l'antisérum est adsorbée par le véhicule et l'on obtient une combinaison anti- 0(l-foeto-10 globuline-véhicule. On sépare ensuite cette combinaison d'anti- cC 1-foetoglobuline de son véhicule, par exemple par centrifugation et, après lavage, par exemple avec la même solution-tampon que ci-dessus, on procède à une dispersion dans un milieu de dispersion. Ce milieu de dispersion est avantageusement l'une des solutions-15 tampons mentionnées ci-dessus. A ce propos, on utilise un agent de dispersion approprié pour assurer une dispersion plus uniforme de la combinaison anti-ot 1-foetoglobuline-véhicule et pour maintenir 1'anti-d1-foetoglobuline adsorbée. L'agent de dispersion mentionné ci-dessus est avantageusement choisi parmi des substances telles que l'albumine, la peptone, la gélatine, l'agar, 20 la saponine, l'acide arginique, le polyvinylpyrrolidone, l'acide polyphospho-rique, le sérum, etc... En plus de ces agents de dispersion, divers tensio-actifs peuvent aussi être utilisés. Des résultats satisfaisants peuvent être obtenus en utilisant un tel agent dans une proportion de 0,1 à 1 % en poids/volume . 25 Pour faciliter le diagnostic, un agent de coloration peut être incorporé dans l'agent de diagnostic. Comme agent de coloration, les colorants mentionnés ci-dessus peuvent être invariablement utilisés, le bleu patenté et le bleu de trypan donnant des résultats satisfaisants. Etant donné que l'agent de. diagnostic de l'invention est très souvent 30 conservé pendant de longues périodes de temps, il est avantageux d'y incorporer une petite quantité d'un agent de conservation qui peut être l'un de ceux mentionnés plus haut. Il est à noter que la combinaison d'anti-o( 1-foetoglobuline et d'un véhicule est avantageusement dispersée à une concentration finale comprise entre 35 0,5 et 5 % en poids/volume, et qu'au dernier stade, la dispersion est réglée à un pH compris entre 6,5 et 8,5 et, de préférence à un pH de 8,2 à 8,5. L'agent de diagnostic ainsi obtenu est supérieur à l'agent de diagnostic mentionné précédemment, c'est-à-dire à l'agent préparé en dissolvant le même antisérum avec un milieu de support et en lui permettant de se solidifier dans 40 un état diffusé, notamment en ce que celui-ci permet d'effectuer le diagnos 70 45708 8 2077560 tic en une période de temps plus courte. En ce qui concerne les deux sortes d'agents de diagnostic selon l'invention, il est important, pour augmenter la sensibilité de détection de la maladie afin de diminuer le pourcentage des résultats positifs erronés et pour assurer une grande fiabilité en ce qui concerne l'estimation quantitative, d'obtenir une anti-c\ 1-foetoglobuline purifiée. Pour atteindre ce but, il est avantageux d'éliminer, dans toute la mesure du possible, les impuretés ascitiques ou du sérum d'un patient souffrant d'un hépatome primaire ou du sérum foetal. En premier lieu, les explications suivantes sont adaptées pour le cas où les liquides ascitiques ou le sérum d'un patient ayant un hépatome primaire ou le sérum foetal est utilisé pour immuniser un animal qui est ensuite saigné, puis le sérum est séparé de l'échantillon sanguin et l'antisérum résultant est adsorbé dans du sérum humain normal. C'est ainsi que le liquide ascitique ou le sérum provenant d'un patient souffrant d'un hépatome primaire ou le sérum d'un foetus est additionné par exemple, à une quantité équivalente de sérum physiologique, suivie de l'addition d'une quantité égale d'adjuvant complet de Freund (fabriqué par Dico). Après émulsion, on utilise ce mélange pour immuniser un animal. L'animal peut, par exemple, être un lapin, un cheval ou un boeuf. Le procédé consistant en une injection sous-cutanée dans les coussins plantaires d'un lapin est particulièrement avantageux. On répète les injections à des intervalles de temps donnés, puis après qu'un gain suffisant a été déterminé par une titration des anticorps, on saigne l'animal et on sépare le sérum. Le sérum résultant est adsorbé avec du sérum humain normal ou avec 1'immunoadsorbant insoluble mentionné ci-dessus pour obtenir un antisérum spécifique. L'antisérum utilisé dans la pratique de la présente invention a, de préférence, une concentration élevée en anti-3 Dans le procédé décrit ci-dessus, étant donné que le liquide ascitique ou le sérum d'un patient ayant un hépatome primaire ou le sérum foetal contient diverses protéines, telles que l'albumine, la Jfglobuline, etc..., en plus de I'o(l-foetoglobuline, il se forme, quand les animaux sont immunisés avec le liquide ascitique ou le sérum, des anticorps correspondant à ces diverses protéines sériques, en plus de l'anti-1-foetoglobuline. En conséquence, il est nécessaire d'absorber cet antisérum avec une grande quantité de sérum humain normal. Toutefois, l'anti- 70 45708 9 2077560 variante, peut être dispersée dans un milieu de dispersion après avoir été ad-sorbée sur un milieu de support ou un véhicule afin de préparer un agent de diagnostic satisfaisant. Toutefois, il est préférable, après l'adsorption, de soumettre l'antisé-5 rum à une étape supplémentaire de purification. La description suivante concerne la manière dont le liquide ascitique ou le sérum d'un patient ayant un hépatome primaire ou bien le sérum foetal est d'abord purifié par une technique de fractionnement des protéines, après quoi, la fraction de^ 1-foetoglobuline résultante est utilisée pour immuniser un ani-10 mal qui est ensuite saigné, puis le sérum est séparé de l'échantillon sanguin ainsi recueilli. Ainsi, le liquide ascitique ou le sérum provenant d'un patient souffrant d'un hépatome primaire, ou d'un sérum foetal est purifié par une technique de fractionnement classique des protéines sériques. Parmi les techniques de fractionnement connues, utilisables, on peut citer la méthode de 15 Cohn, la méthode modifiée de Spiro, le fractionnement au sulfate d'ammonium, la filtration sur gel, la chromatographie sur colonne, le fractionnement isoélectrique, 1'électrophorèse, la filtration sur membrane, etc... Toutes ces techniques peuvent être utilisées séparément ou en combinaison. On dissout la fraction de 1-foetoglobuline ainsi obtenue, par exemple 20 dans une quantité égale d'une solution saline physiologique, suivie d'une addition de l'adjuvant complet de Freund (Difco) afin d'émulsionner celle-ci. On immunise ensuite les animaux avec l'émulsion formée. Ces animaux peuvent, par exemple, être des lapins, des porcs, des bovins et des chevaux. On préfère les lapins dont les coussins plantaires sont des sites de choix pour l'inocula-25 tion sous-cutanée. On répète les injections à des intervalles appropriés, en suivant constamment l'augmentation de la concentration des anticorps. Quand la concentration des anticorps atteint son maximum, on perce la veine de l'oreille pour recueillir des échantillons de sang tous les deux jours. La concentration des anticorps atteint sa.valeur de pointe en l'espace d'environ une à 30 deux semaines après l'injection. Ensuite, on sépare le sérum et on le mélange avec une petite quantité de sérum humain normal, ou son gel pour obtenir l'anti-o(, 1-foetoglobuline désirée. Comme il a été décrit ci-dessus, la pratique de l'invention ne nécessite qu'une très petite quantité de sérum humain normal pour absorber l'antisérum. 35 C'est ainsi-, par exemple, que lorsque le sérum n'a pas été purifié, il suffit d'utiliser des quantités au moins égales de sérum humain normal et d'antisérum. Par contre, dans le procédé de l'invention, il suffit de 0,1 à 0,35 partie de sérum humain normal par partie d'antisérum. De plus, le titre ou la concentration des anticorps de l'antisérum obtenu par le procédé selon l'invention, 40 ' comparativement aux antigènes standard, est de 2 à 8 fois supérieure à celle bad ordinal 70 45708 10 2077560 de 1'antisérum brut. En procédant comme décrit ci-dessus, on peut obtenir un degré élevé de purification par les techniques indiquées ci-dessus. En outre, le procédé selon l'invention ne présente pas les inconvénients 5 qui, jusqu'à présent, étaient inévitables. C'est ainsi que l'utilisation d'une grande quantité de sérum humain normal constituait non seulement un inconvénient du point de vue commercial, mais risquait aussi de diminuer la concentration des anticorps par coprécipitation d'anti-^1-foetoglobulines. De plus, ces procédures n'étaient pas suffisantes pour surmonter la difficulté de l'absorp-10 tion de l'anti-(X 2-macroglobuline et des substances analogues. En revanche, l'invention rend possible l'obtention d'un antisérum de haute qualité en n'utilisant que des quantités extrêmement petites de sérum humain normal. De plus, il n'y a pratiquement aucune contamination avec de l'anti- Le but du présent agent de diagnostic peut, en général, être entièrement atteint en utilisant l'anti- OQ-foetoglobuline ci-dessus de la manière décrite plus loin. Toutefois, quand on désire obtenir un agent de diagnostic de qualité ex-25 ceptionnelle, par exemple à des fins de recherche, il devient nécessaire de traiter la 1-foetoglobuline à un degré de pureté extrême. Les procédures nécessaires pour la préparation de ces o^l-foetoglobulines de haute qualité entrent aussi dans le cadre de l'invention. On va procéder maintenant à la description d'une technique de purification 30 dans laquelle les liquides ascitiques ou le sérum provenant d'un patient humain ayant un hépatome primaire ou le sérum d'un foetus humain est dialyse par rapport à l'acrinol, le précipité résultant de la dialyse étant purifié par un fractionnement des protéines. C'est ainsi que le liquide ascitique ou le sérum d'un patient ayant un 35 hépatome primaire ou le sérum d'un foetus humain est dilué avec de l'eau jusqu'à 3 à 5 fois son volume initial, puis est dialysé par rapport à une solution aqueuse à 0,1-0,01 % en poids/volume d'acrinol. La dialyse est avantageusement exécutée par rapport à l'acrinol et le sérum ou le liquide ascitique en tant que phase interne, pendant environ 24 heures. 40 Ensuite, cette solution d'acrinol est centrifugée ou traitée autrement bad original 70 45708 11 2077560 pour obtenir le sédiment. Ce sédiment est une 0( 1-foetoglobuline relativement pure. Toutefois, étant donné que ce sédiment contient aussi de petites quantités d'impuretés, incluant de l'albumine, elle peut être traitée par une technique de purification fractionnée classique dés protéines pour obtenir 5 une rjt 1-foetoglobuline encore plus pure. Parmi les techniques de purification applicables, on peut citer le fractionnement au sulfate d'ammonium, la dialyse, la chromatographie en colonne, la filtration sur membrane, le fractionnement isoélectrique et d'autres techniques pouvant être pratiquées soit séparément, soit au besoin en combinaison. Les meilleurs résultats possibles peuvent être 10 obtenus en procédant comme suit : On dissout d'abord le sédiment mentionné, par exemple dans une solution saline physiologique ou dans une solution-tampon et après avoir éliminé les matières insolubles, on dialyse la solution par rapport à une solution-tampon (force ionique :0,03 à 0,04 M et pH 4,5 à 5,5). Cette solution-tampon peut 15 par exemple, être une solution d'acétate, une solution Tris-HCl-saline, une solution de chlorure de sodium et de glycine, une solution de barbiturate, de citrate, de phosphate ou de borate. On fait ensuite passer le dialysat dans une colonne de carboxyméthyl-cellulose (force ionique 0,003-0,04 M; pH 4,5-5,5) et on l'élue de 0,03-0,04M à 0,2 M. De cette manière l'A1-foetoglobuline 20 désirée est éluée de la colonne, en partant à environ 0,055 M. Les fractions résultantes sont rassemblées et on obtient une 1-foetoglobuline pure. La chromatographie en colonne ci-dessus peut être exécutée non seulement avec de la carboxyméthyl-cellulose, mais aussi avec d'autres matières, telles que la DEAE-cellulose, la TEAE-cellulose, etc... Cette chromatographie est de préférence 25 exécutée de façon répétée, c'est-à-dire deux fois ou plus, l'une au moins des opérations étant exécutée sur de la carboxyméthyl-cellulose. Etant donné que les procédures ci-dessus conduisent à une forme de 1-foetoglobuline pratiquement pure, qui est presque complètement exempte de protéines contaminantes, ce procédé est le procédé de purification des antigè-30 nés le plus avantageux jamais conçu pour la préparation du présent agent de diagnostic aux fins de recherches théoriques pour les raisons suivantes : ainsi donc, l' On connaît les procédés suivants pour recueillir et purifier l'^l-foeto-40 globuline : 70 45708 12 2077560 1) Bergstfcand et Czar utilisent des sêrums de foetus comme matière première et fractionnent ceux-ci par électrophorèse. Ils trouvent l' 5 par une technique d'ultra-centrifugation (Scand. J. Clin. 1 Lab. Invest. vol.9, p. 277 (1957). 2) David et ses collaborateurs fgnt passer deux fois un sérum ombilical à travers une colonne de Sephadex G-200, puis lui font subir une élution avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,1 M, Il a été rapporté qu'ils 10 ont noté que la concentration de pointe d' 1-foetoglobuline coïncideavec celle de la transférrine et de l'albumine (j. Clin. Invest.,45 (1966). 3) Hirai et ses collaborateurs provoquent l'adsorption de sérum foetal sur une colonne de DEAE-cellulose (pH 5,5, 0,02 M) et procèdent à une élution par rapport à 0,2 M, le résultat étant que 1'^1-foetoglobuline est éluée à 15 l'épaulement de la pointe d'albumine. Cette fraction a ensuite été adsorbée sur une colonne de CM-cellulose (pH 4,8 et 0,02M) puis on a procédé à une élution à 0,5 M. On obtient ainsi trois pointes, celle de 1'oC 1-foetoglobuline étant la troisième. La seconde moitié de cette pointe est re-chromatogra-phiée pour obtenir une seule pointe de«.tfoetoglobuline (rapport lu le 1er 20 octobre 1969 devant "the Society of Electrophoretic Researchers". Toutefois, ces rapports ne font que confirmer l'existence de 1'^1-foetoglobuline ou la production d' ci 1-foetoglobuline sous des formes brutes, ces procédés ne conduisant pas à de l'OÉ 1-foetoglobuline de haute qualité. Or, pour être utilisée comme matière première pour un agent de diagnostic 25 des hépatomes primaires dans la recherche, 1'(A1-foetoglobuline doit avoir une pureté particulièrement élevée, cette pureté ayant une grande influence sur la précision de l'agent de diagnostic. Pour les raisons qui précèdent, la Demanderesse a procédé à des études poussées visant à obtenir de 1' c*. 1-foetoglobuline très pure et, en particulier, 30 à développer un procédé pour éliminer les impuretés et, notamment, l'albumine, de la façon la plus positive et au moindre frais. Ces études ont finalement conduit à la découverte qu'on peut obtenir une et 1-foetoglobuline pure en procédant d'abord à une dialyse de sérums d'autres matières contenant de l'(Xl-foe-toglobuline par rapport à de l'acrinol puis, en fractionnant le dialysat par 35 des procédures qui sont classiquement suivies pour la purification fractionnée des protéines. La présente invention est l'aboutissement de ces découvertes et offre un procédé extrêmement utile pour la préparation d^l-foetoglobuline de haute qualité sans avoir recours à des procédures compliquées. Les données cliniquës se rapportant à l'utilisation des agents de diagnostic de la présente 40 invention sont indiquées ci-après . 70 45708 13 2077560 Les résultats connus en utilisant un agent de diagnostic des hépatomes primaires conforme à l'invention préparé en utilisant un milieu de support sont indiqués dans le tableau 1. Il y avait au total 63 cas, dont la plupart ont été diagnostiqués au "National Cancers Center Hospital" et comprenant 5 à la fois des patients internes et externes. Ils se sont divisés en 12 cas d'hépatocarcinomes primaires (dont 11 cas ont été établis par des biopsies). 15 cas d'hépatocarcinomes métastasiques, 15 cas de cirrhose, 22 cas d'hépatite et un cas d'hépatangiome. Les résultats quantitatifs d'antigènes pour les cas positifs qui ont montré des anneaux de précipitine et les résultats obtenus 10 par la technique de diagnostic classique sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 1 Maladies Nombre de cas diagnostiqués Nombre de cas positifs Hépatocarcinomes primaires 12 11 Hépatocarcinomes métastasiques 15 0 Hépatocirrhose 15 0 Hépatites 22 0 Hépatoangiome 1 0 Initiales du patient Age Y.Y 23 M.T. 65 S.W. 60 N.S. 58 S.H. 8 M.S. 12 K. W 65 H.A. 19 K.M. 62 B.I. 62 S.I. 3 on utilise un liquide ascitique * * méthode d'Ouchterlony * * * U/ml =0,3 ^/ml TABLEAU 2 VI o -O Ul VJ o CD Sexe Antigène (U/ml) S Résultats obtenus par le procédé classique * * S 9 Ô S 5 Ô î> è 1,600 9 11 150 ("15,000 L 1,050 1,000 2,826 5 300 1,300 130 f + + + + + du sérum est utilisé dans les autres cas rv> o vi ui es o 70 45708 15 2077560 Il ressort du tableau ci-dessus que dans les cas où le diagnostic fourni par l'agent selon l'invention est positif, la méthode de diagnostic classique n'a pas permis d'identifier la maladie quand la concentration d'antigène est inférieure à 10 ji/ml. 5 Quand on utilise un agent de diagnostic des hépatomes primaires selon l'in vention qui a été préparé en utilisant un milieu de support, les procédures simples suivantes permettent de diagnostiquer facilement, en peu de temps, la maladie. En effet, il suffit de faire tomber une goutte de cet agent de diagnostic sur une lamelle de microscope, puis de mélanger un échantillon frais 10 de sérum avec cet agent. Au cours de ce mélange, il se produit une réaction d'agglutination spécifique lorsque le patient a un hépatome primaire. Il apparaît à la lumière des données cliniques qui suivent, qu'une comparaison entre cet agent de diagnostic particulier et l'agent de diagnostic précédemment décrit préparé en utilisant un milieu de support révèle que tous les hépatomes 15 primaires sont positivement détectés et ce, indépendamment du fait que l'on utilise du sérum ou du liquide ascitique. VI Procédé de support ;• O Initiales du Echantillon Résultat du 1 Diamètre de bande en mm Facteur de dilution; patient présent procédé nombre de fois Ul VJ M.S. S.Y. Sérum 6,0 ' 5,7 00 00 O oo C.Y. H"" 4,0 sérum original Y. S. ft + 4,2 ti K.N. 4* 4* 6,2 x8 K.Y. 4*. 4,0 sérum original ■A.S, 4- 4* 7,3 * ; X8 N.S. '+ 4- 6,0 x8 E.S. Liquide 4* + 4" 12,3 x8 M ON ascitique ; S.Y. ii 4- 4- ' 7,5 x8 Homme sain ' Sérum 0,0 (Note 1) Les données ci-dessus ont été obtenues ail "National Cancers Center". (Note 2) Les résultats sont indiqués dans le tableau comme suit : - négatif + faiblement positif + + positif et 4- + + fortement positif O VJ V] Ul OS o 70 45708 17 2077560 Les exemples suivants, qui n'ont bien entendu aucun caractère limitatif, feront mieux comprendre les particularités de l'invention. Préparation d'un agent de diagnostic avec un milieu de support. EXE MPI,E 1 5 A une solution-tampon Tris-HCl-saline (pH 7,2) on ajoute de l'agar raf finé à une concentration finale de 1,5 % et on chauffe le mélange jusqu'à dissolution complète de l'agar, puis on maintient la solution à 55° C. Séparément, on a absorbé de l'antisérum de lapin avec 0,35 partie de sérum humain normal jusqu'à ce que l'on obtienne une concentration finale de 3 % en 10 volume, puis on y incorpore l'agar préparé ci-dessus. Ensuite on ajoute du Twean 80, du bleu patenté et de l'azide de sodium en quantités suffisantes pour obtenir respectivement les concentrations finales suivantes :0,01%, 0,001 °Â et 0,1 7o. Après que ces additifs ont bien diffusé, on verse le mélange dans un récipient préchauffé sur une hauteur de 1 mm. Après solidifi-15 cation, on forme des cavités de 3 mm de diamètre à des intervalles prédéterminés et on utilise la préparation résultante comme plaque d'agar immunolo-gique. EXEMPLE 2 A une solution-tampon de chlorure de sodium et de glycine (pH 8,2), on 20 ajoute de l'agar raffiné à une concentration finale de 1 % en poids/volume, puis on procède à un chauffage à 50 %. Séparément, on ajoute de l'antisérum de cheval à cette même solution en une quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 4 % en poids/volume suivie d'un chauffage à 50° C. On mélange les deux solutions et on y ajoute une quantité de taurocholate de 25 sodium suffisante pour obtenir une concentration finale de 0,3 Ensuite, on ajoute du bleu trypan et du chlorobutanol au mélange ci-dessus jusqu'à l'obtention des concentrations finales respectives suivantes : 0,002 % et 0,3%. Après la diffusion des additifs, on verse le mélange dans un récipient. Après solidification, on y perce des cavités pour obtenir une plaquette d'agar immu-30 nologique. On ajoute du chlorure de sodium à une solution-tampon d'acide Tris ou d'acide aminé (pH 6,5-8,5) afin de préparer une solution isotonique et on y ajoute les substances suivantes jusqu'à obtention des concentrations finales indiquées. 35 Exemple Milieu de Concentra- Tensio-actif Concentra- n° support tion finale tion finale % % Gel synthétique de poly-acrylamide Pectine 5 Dextrine • 6 Amidon 7 ' Agar 1,5 Oléate de ,0,1 sodium 1,3 Bromure d'al- 0,05 kyltriméthyl-ammonium 1,5 monolaurate de 0,1 polyoxyéthylènesorbitane 1,0 saponine 0,03 1,2 sulfate de 0,15 myristyl-sodium Agent de Concentra- Agent de ' Concentra- coloration tion finale conservation tion finale % % -Vl O -P-U1 XI O CD Vert brillant Bleu patenté Bleu alcian Bleu Trypan Bleu brillant 0,002 Thymol 0,1 0,001 Acétate de phénylmercure 0,02 0,003 Nitrure de 0,1 sodium 0,001 Borate de 0,01 phénylmercure 0,004. Thimérosal 0,01 ro o xj vi ui o\ o 70 45708 19 2077560 Préparation de l'agent de diagnostic avec un milieu faisant office de véhicule. EXEMPLE 8 Dans 10 ml d'une solution-tampon de chlorure de sodium et de glycine (pH 8,2)j on disperse 1,5 g d'Amberlite IR 45 broyée et purifiée dont la granulométrie est comprise entre 1 et 3 p, puis on y ajoute une quantité optimale de anti-0( 1-foetoglobuline. On secoue l'ensemble à 4° C pendant deux heures, ce qui a pour résultat que 1'anti-&1-foetoglobuline est adsorbée sur le milieu de support, puis on procède à une séparation par centrifugation. On centrifuge deux fois le sédiment d'Amberlite IR 45 couvert d'anti-oL 1-foetoglobuline, en utilisant la même solution-tampon que ci-dessus à laquelle on a ajouté 0,3 % en poids/volume d'albumine et 0,1 % en poids/volume d'azide de sodium. Après lavage, on disperse le véhicule et 1'anti-0^1-foetoglobuline dans environ 90 ml de la même solution-tampon dont on règle le pH à 8,2. Un complément de cette solution-tampon est ajouté pour obtenir un volume total de 100 ml. EXEMPLE 9 Dans 5 ml d'une solution Tris-HCl-saline, (pH 8,2) on disperse 1,5 g d'Amberlite IRA 411 broyée et purifiée dont la granulométrie se situe entre 1 et 3 ji, puis on y ajoute une quantité optimale d'anti-o!. 1-foetoglobuline fractionnée et 0,01 g de bleu patenté. On secoue l'ensemble à 4° C pendant deux heures, ce qui provoque l'adsorption de 1'anti-K 1-foetoglobuline. On centrifuge l'ensemble, puis on centrifuge deux fois 1'anti-foetoglobuline-aniberlite IRA 411 résultante en utilisant la même solution-tampon que ci-dessus à laquelle on a ajouté 0,5 % en poids/volume de sérum de lapin normal et 0,1 % en poids/volume d'azide de sodium. Après lavage, on disperse le sédiment dans environ 90 ml de la même solution-tampon que ci-dessus dont on règle le pH à 8,5. Une quantité supplémentaire de cette même solution-tampon est utilisée pour porter le volume total de la dispersion à 100 ml. EXEMPLE 10 Dans 8 ml d'une solution-tampon de chlorure de sodium et de phosphate (pH 8,5) on disperse 0,25 g de latex de polystyrène, dont la granulométrie est de 0,8 ji, puis on ajoute une quantité optimale de sérum d'anti-^ 1-foetoglobuline. On secoue le mélange à 37° C pendant une heure, ce qui provoque l'adsorption de l'anti- gtl-foetoglobuline sur le véhicule. On centrifuge l'ensemble, puis le composé résultant anti-OCl-foetoglobuline-latex est centrifugé deux fois, en utilisant la même solution-tampon que ci-dessus à laquelle on a ajouté 0,1 % en poids/volume d'azide de sodium. Après lavage, on disperse 1'anti-O^l-foetoglobuline-latex dans environ 90 ml de la même solution-tampon que ci-dessus et on règle le pH dé la dispersion à 8,5. Une certaine quantité supplémentaire de cette même solution est utilisée pour porter le volume total 70 45708 20 2077560 total de la dispersion à 100 ml. EXEMPLE 11 On purifie du kaolin par précipitation fractionnée à une granulométrie de 1 à 3 et on disperse 2 g de ce kaolin purifié dans 10 ml d'une solution-5 tampon de borate et de chlorure de sodium, puis on y ajoute une quantité optimale d'anti- « 15 Préparation de 1 'anti-o(.l-foetoglbbuline. EXEMPLE 12 A une partie en poids du sérum d'un patient ayant un hépatome primaire, on ajoute deux parties d'une solution à 0,03 M d'acétate de zinc, puis on procède à une dissolution dans l'éthanol. On règle la solution éthanolique à 28 % en 20 volume et son pH à 6,4 et on laisse reposer à -5° C pendant 14 heures. On centrifuge ensuite la solution et on enlève la phase surnageante. On ajoute à cette phase une solution de 0,02 M d'acétate de baryum et on règlejle mélange pour obtenir une solution éthanolique à 25 % en volume en ajustant le pH à 6,7. On laisse cette solution reposer à -5° C pendant deux heures, et à la fin 25 de ce temps, on la centrifuge. On enlève la phase surnageante et on l'utilise pour préparer une solution éthanolique à 40 % en volume que l'on laisse ensuite reposer à nouveau à -5° C pendant deux heures. On centrifuge cette solution et on enlève la phase surnageante dont on prépare une solution éthanolique à 40 % en volume qu'on laisse reposer à -10° C pendant 14 heures, et à la fin de ce 30 temps, on récupère le précipité résultant. On dissout ce précipité dans une solution de citrate de sodium et on la dialyse par rapport à l'eau à 4° G pendant quelques jours, et à la fin de ce temps, on lyophilise le dialysat pour obtenir l'antigène. On utilise une quantité prédéterminée de cet antigène pour immuniser des 35 lapins par la méthode de l'adjuvant complet et quand la concentration en antigène a atteint le niveau désiré, on saigne les lapins et on sépare le sérum. A ce sérum on ajoute 0,2 volume de sérum humain normal et on laisse le mélange reposer à 37° C pendant une heure puis, à 4° C pendant une nuit. Au matin suivant, on centrifuge le mélange pour obtenir le sérum d'anti- oi'l-foeto-40 globuline désiré. 70 45708 21 2077560 On procède comme ci-dessus, mais en utilisant un immunoadso rbant à la place de sérum humain pour obtenir le même résultat. Cet immunoadsorbant est préparé comme suit : On règle le pH de 10 ml de sérum humain normal à 5,5 avec une solution-5 tampon d'acétate. On ajoute ensuite 1 ml d'aldéhyde glutarique et on laisse reposer pendant trois heures. Après addition de la solution-tampon de phosphate, on procède à une centrifugation et on recueille le précipité. On lave ce précipité plusieurs fois avec la solution-tampon ci-dessus et on le met en suspension dans cette solution-tampon. 10 EXEMPLE 13 A une partie du sérum d'un patient, on ajoute une partie d'une solution-tampon à 0,1 M de phosphate et de chlorure de sodium (pH 7,2), puis on procède à une addition progressive de deux parties d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium en agitant, ce dont résultent des précipités. On laisse 15 l'ensemble reposer pendant une nuit à 4° C et,au matin, on procède à une centrifugation à 8000 t/mn pendant 20 minutes. On dialyse la phase surnageante par rapport à l'eau à 4° C pendant quelques jours et, à la fin de ce temps, on lyophilise le dialysat pour obtenir l'antigène désiré. On utilise cet antigène pour immuniser des porcs, puis on procède au même 20 traitement que dans l'exemple 12. L'antisérum résultant est absorbé avec 0,35% en volume de sérum humain normal pour obtenir le sérum d'anti- xl-foetoglobu-line désiré. EXEMPLE 14 Un échantillon de 5 ml du liquide ascitique d'un patient ayant un hépatome 25 primaire est passé dans une colonne (3 x 100 cm) de Sephadex G-200, puis est ensuite élue avec une solution Hs-HCl-saline (pH8) à la vitesse de 20 à 25 ml/h. Les fractions correspondant à la % -globuline (seconde pointe) et à l'albumine (troisième pointe) sont traitées par la méthode d'Ouchterlony pour confirmer la fraction d'o£1-foetoglobuline qui est recueillie. On dialyse cette 30 fraction en utilisant de l'eau comme phase externe à 4° C pendant quelques jours et on concentre le dialysat sous vide en utilisant un sac de collodion pour obtenir l'antigène voulu. On utilise cet antigène pour immuniser des lapins, puis on procède aux mêmes traitements que ceux décrits dans l'exemple 12. L'antisérum résultant 35 est absorbé avec 0,2 % en volume de sérum humain normal pour obtenir le sérum d'anti-cSl-foetoglobuline recherché. EXEMPLE 15 Or. purifie l'antigène obtenu dans l'exemple 15 au moyen d'un appareil de fractionnement isoélectrique. A cette fin, on fait passer l'antigène dans une 40 colonne à gradient de sucrose contenant 0,5 % en volume d'ampholyte ayant un pH 70 45708 22 20/7560 -de 3-10 et.pendant que la colonne est maintenue à 4° C, on applique une tension de 700 V pendant deux jours. Après cette séparation, ron rassemble les fractions dont le pH est"compris entre 4,2 et 4,5 et on les dialyse à 4° C pendanÇ^uel-ques jours en utilisant de l'eau comme phase externe. On concentre ensuite » 5 le dialysat sous vide en utilisant un sac de collodion pour obtenir l'antigène désiré. On utilise cet antigène pour immuniser des lapins qui sont ensuite traités comme décrit dans l'exemple 12. L'antisérum résultant est mélangé à 0,1% en volume de sérum humain normal pour obtenir le sérum d'anti- Préparation de 1' ot 1-foetoglobuline. EXEMPLE 16 On dilue 50 ml d'un échantillon du liquide ascitique d'un patient ayant un hépatome primaire avec de l'eau de façon à multiplier par 4 le volume initial 15 et on dialyse l'échantillon ainsi dilué par rapport à 5 litres d'une solution à 0,1% en poids/volume d'acrynol pendant 24 heures. On centrifuge la solution d'acrynol à 4000 t/mn et on dissout le sédiment en le secouant dans 53 ml d'une solution saline physiologique. On centrifuge cette solution une seconde fois à 4000 t/mn „ On dialyse la phase surnageante par rapport à une solution-20 tampon d'acétate (force ionique 0,04, pH 5), et on fait passer le dialysat dans une colonne de carboxyméthyl-cellulose (pH 5, force ionique 0,04) qui est éluée à 0à2M. Etant donné que l'élution de 1'oi1-foetoglobuline commence à environ 0,055 M, on recueille cette fraction. On répète la procédure ci-dessus deux fois pour obtenir une seule fraction d'ci 1-foetoglobuline. 25 Alors que la concentration de 1'$1-foetoglobuline dans le liquide asciti que initial est de 3146 U/ml (50 ml), la concentration finale est de 600 U/ml (200 ml), ce qui représente une récupération de 70 %> en poids/volume. Par ailleurs, alors que la concentration initiale d'albumine est de 7 623 mg/ml (50 ml), il est impossible de détecter de l'albumine dans la plaquette immunologique 30 au stade final. EXEMPLE 17 On dilue un échantillon de 50 tal de liquide ascitique d'un patient ayant un hépatome primaire avec de l'eau de façon à multiplier son volume initial par 4 et on procède à une dialyse par rapport à 5 litres d'une solution à 35 0,05 % en poids/volume d'acrynol pendant 24 heures. On centrifuge le dialysat à 3000 t/mn et on dissout le sédiment en secouant dans 50 ml d'une solution saline physiologique. On centrifuge cette solution une seconde fois à 3000 t/mn. On divise la phase surnageante par rapport à une solution Tris-HCl-saline (0,03 M, pH 4,5) et on fait passer le dialysat dans une colonne de DEAE-cellu-40 lose (pïï 4,5, force ionique 0,04) et on procède à une élution à 0,2 M. On BÂD OFUGINAl 70 45708 23 2077560 traite l'éluat de la même façon dans une colonne de CM-cellulose pour obtenir une seule fraction d'ot1-foetoglobuline. Alors que la concentration en 1-foetoglobuline du liquide ascitique initial est de 2500 unités/ml (50 ml), la concentration finale est de 400 u/ml (180 ml), ce qui représente une récupération de 60 % en poids/volume. Accessoirement, alors que la concentration initiale d'albumine est de 7,915 mg/ml (50 ml), il est impossible de détecter, au stade final, de l'albumine dans la plaquette immunologique. 70 45708 24 2077560 REVENDICATIONS 1.- Agent de diagnostic des hépatomes primaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par de 1'anti-^l-foetoglobuline. 2.- Agent de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il 5 se présente sous la forme d'une préparation solidifiée et dispersée obtenue en dissolvant 1'anti-t(l-foetoglobuline dans un milieu de support. 3.— Agent de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une dispersion obtenue en formant une combinaison anti-0(l-foetoglobuline-support, laquelle est ensuite dispersée dans un milieu 10 de dispersion. 4.- Agent de diagnostic selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent dispersé et solidifié est obtenu en dissolvant 1'anti-flO-Hroetoglobuline dans un milieu.de support avec addition d'un tensio-actif, d'un colorant et d'un agent de conservation. 15 5.- Agent de diagnostic selon la revendication 3, caractérisé en ce que la dispersion est obtenue en adsorbant l'anti-°(l-foetoglobuline sur un milieu de support pour obtenir une combinaison anti-{(l-foetoglobuline-support, laquelle est ensuite dispersée dans un milieu de dispersion avec un colorant et un agent de conservation. 20 6.- Agent de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que I'anti-0(l-foetoglobuline a été préparé en inoculant de l'dl-foetoglobuline à des animaux. 7.- Agent de diagnostic selon les revendications 2 et 4, caractérisé en ce que le milieu de support est une substance choisie dans le groupe comprenant 25 les polysaccharides et les protéines. 8.- Agent de diagnostic selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polysaccharide est une substance choisie dans le groupe comprenant l'agar, la dextrine, l'amidon et la pectine. 9.— Agent de diagnostic selon la revendication 7, caractérisé en ce que la 30 protéine est un gel synthétique d'un polyacrylamide. 10.— Agent de diagnostic selon les revendications 3 et 5, caractérisé en ce que le milieu de support est une substance choisie dans le groupe comprenant un adsorbant et une résine échangeuse d'ions. 11.- Agent de diagnostic selon la revendication 10, caractérisé en ce que 35 1*adsorbant est une substance choisie dans le groupe comprenant le latex de polystyrène et le kaolin. 12.— Agent de diagnostic selon la revendication 10, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions est une substance de condensation du formaldéhyde avec des acides phénol- et phénylsulfoniques. 70 45708 25 2077560 13.- Agent de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 3, 5, 10, 11 et 12, caractérisé en ce que le milieu de support se compose de particules sphériques dont le diamètre se situe entre 0,5 et 3 y.. 14.- Agent de diagnostic selon les revendications 3 et 5, caractérisé en 5 ce que le milieu de dispersion est une substance choisie dans le groupe comprenant une solution-tampon et une solution-tampon contenant un agent de dispersion. 15.- Agent de diagnostic selon la revendication 14, caractérisé en ce que la solution-tampon est une solution choisie dans le groupe comprenant des 10 solutions-tampons de chlorure de sodium et de glycine, des solutions Tris-HCl-saline, les solutions-tampons de phosphate et chlorure de sodium et les solutions-tampons de borate et chlorure de sodium. 16.- Agent de diagnostic selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent de dispersion est l'arginine. 15 17.- Agent de diagnostic selon les revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le colorant est une substance choisie dans la groupe comprenant le bleu patenté, le bleu trypan, le vert brillant, le bleu brillant FCF et le bleu alcian. 18.- Agent de diagnostic selon les revendications 4 et 5, caractérisé en 20 ce que l'agent de conservation est une substance choisie dans le groupe comprenant l'azide de sodium, le chlorobutanol, le thymol3 l'acétate de phénylmercure et le thimérosal. 19.- Agent de diagnostic selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif est une substance choisie dans le groupe comprenant le 25 tween 80, l'acide taurocholique, l'oléate de sodium, le monolaurate de poly-oxyéthylène-sorbitane et la saponine. 20.- Agent de diagnostic selon les revendications 2 et 4, caractérisé en ce que l'anti-1-foetoglobuline est contenue dans la préparation dans une proportion s'échelonnant entre 1 et 10 7 en poids/volume, tandis que le milieu de 30 support est contenu dans la préparation dans une proportion s'échelonnant entre 1 et 15 7o en poids/volume. 21.- Agent de diagnostic selon les revendications 3 et 5, caractérisé en ce que la combinaison anti-o^l-foetoglobuline-support est contenue dans la dispersion dans une proportion s'échelonnant, entre 0,5 et 5 % en poids/volume. 35 22.- Agent de diagnostic selon la revendication 4, caractérisé en ce que le tensio-actif, le colorant et l'agent de conservation sont respectivement contenus dans la préparation dans une proportion s'échelonnant entre 0,01 et 0,2 % en poids/volume, entre 0,001 et 0,005 7» en poids/volume et 0,1 °L en poids/volume. 40 23.- Agent de diagnostic selon la revendication 5, caractérisé en ce que le bad original 70 45708 26 2077560 colorant et l'agent de conservation sont contenus dans la dispersion dans une proportion s'échelonnant entre .0,01 et 0,2 % en poids/volume et entre 0,001 et 0,005 % en poids/volume. 24.- Procédé de préparation de l'agent de diagnostic des hépatomes pri-5 maires selon la revendication 1, qui consiste à dissoudre 1'anti-î(l-feotoglo- buline dans, un milieu de support et à lui permettre de. se solidifier dans un état diffusé. 25.- Procédé selon la revendication 1, qui consiste a adsorber l'anti-^1-foetoglobuline sur un milieu de support pour obtenir une combinaison anti-0(l- 10 foetoglobuline-support, laquelle est ensuite dispersée dans un milieu de dispersion. 26.— Procédé selon la revendication. 24,-qui consiste en outre à ajouter un tensio-actif,' un colorant et un agent de conservation. 27.- Procédé selon la revendication 25, qui consiste en outre à ajouter 15 un colorant et un agent de conservation. 28.- Procédé selon les revendications 24 et 26, caractérisé' en ce que le milieu de support est une substance choisie dans le groupe comprenant les poly-saccharides et les protéines. . 29.- Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que le poly-20 saccharide est une substance choisie dans le groupe comprenant l'agar, la dex-trine, l'amidon et la pectine. 30.- Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la protéine est un gel synthétique d'un polyacrylamide. 31.- Procédé selon les revendications 25 et 27, caractérisé en ce que le 25 milieu de support est une substance choisie dans le groupe comprenant un adsorbant et une résine échangeuse d'ions. 32.- Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'adsorbant est une substance choisie dans le groupe comprenant le latex de polystyrène et le kaolin. 30 33.- Procédé selon la revendication 31» caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions est une sbustance dè condensation du formaldéhyde avec des acides phénol- et phénylsulfoniques. 34.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 25, 2/, 31, 32 et 33, caractérisé en ce que le milieu de support se compose de particules Sphéri- BAD ORIGINAL 70 45708 27 2077560 riques, dont le diamètre est compris entre 0,5 et 3 fi. 35.- Procédé selon les revendications 25 et 27, caractérisé en ce que le milieu de dispersion est une substance choisie dans le groupe comprenant une solution-tampon et une solution-tampon contenant un agent de dispersion. 5 36.- Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que la solution- tampon est une solution choisie dans le groupe comprenant les solutions-tampons de chlorure de sodium et de glycine, les solutions Tris-HCl-salines, les solution de phosphate et de chlorure de sodium et les solutions de borate et de chlorure de sodium. 10 37.- Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'agent de dispersion est l'arginine. 38.- Procédé selon les revendications 26 et 27, caractérisé en ce que le colorant est une substance choisie dans le groupe comprenant le bleu patenté, le bleu trypan, le vert brillant, le bleu brillant FCF et le bleu alcian. 15 39.- Procédé selon les revendications 26 et 27, caractérisé en ce que l'agent de conservation est une substance choisie dans le groupe comprenant l'azide de sodium, le chlorobutanol, le thymol, l'acétate de phénylmercure et le thimérosal. 40.- Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le tensio-20 actif est une substance choisie dans le groupe comprenant le t'ween 80, l'acide taurocholique, l'oléate de sodium, le monolaurate de polyoxyéthylène-sorbitane et la saponine. 41.- Procédé selon les revendications 24 et 26, caractérisé en ce que l'anti-cQ-foetoglobuline est aontenue dans la préparation dans une proportion 25 s'échelonnant entre 1 et 10 % en poids/volume et le milieu de support est contenu dans cette préparation dans une proportion comprise entre 1 et 15 % en poids/volume. 42.- Procédé selon les revendications 25 et 27, caractérisé en ce que la combinaison anti- °^l-foetoglobuline-support est contenue dans la dispersion 30 dans une proportion s'échelonnant entre 0,5 et 5 % en poids/volume. 43.- Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le tensio-actif, le colorant et l'agent de conservation sont respectivement contenus dans la préparation dans une proportion s'échelonnant entre 0,01 et 0,2 % en poids/volume, de 0,001 à 0,005 % en poids/volume et 0,1 % en poids/volume. 35 44.- Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le colorant et l'agent de conservation sont respectivement contenus dans la dispersion dans une proportion s'échelonnant entre 0,01 et 0,2 °L en poids/volume et entre 0,001 et 0,005 °L en poids /volume. 45.- Procédé de préparation d'une anti- Ot-l-foetoglobuline utilisée pour la 40 préparation d'un agent de diagnostic des hépatomes primaires, caractérisé en 70 45708 28 2077560 ce qu'il consiste à injecter le liquide ascitique ou le sérum d'un patient ayant un hépatome primaire à des animaux, à saigner ces animaux, à séparer le sérum du sang et à le mélanger ensuite avec du sérum humain normal ou avec un immunoadsorbant afin d'éliminer les impuretés. 46.- Procédé selon la revendication 45, caractérisé en ce que l'on purifie préalablement le liquide ascitique ou le sérum par une technique de fractionnement des protéines. 47.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on dialyse préalablement le liquide ascitique ou le sérum par rapport à l'acrynol, et on purifie le précipité résultant du dialysat par une technique de fractionnement des protéines. 48.- Procédé selon les revendications 46 et 47, caractérisé en ce que la technique de fractionnement des protéines est une technique telle que la méthode de Cohn, la méthode de Spiro modifiée, le fractionnement au sulfate d'ammonium, la filtration sur gel, la chromatographie en colonne, le fractionnement isoélectrique, 1'électrophorèse et la filtration sur membrane. 49.- Procédé selon la revendication 47, caractérisé en ce que l'acrynol est contenu dans une solution aqueuse dont la concentration se' situe entre 0,1 et 0,01 % en poids/volume.