Brevet FR2060002A1 — publié le 19710611

La présente invention a pour objet un procédé de préparation de peptides renfermant un groupe de cystine. Dans la synthèse des peptides supérieurs on s'est déjà servi maintes fois du groupe trityle pour protéger inter-5 médiairement la fonction thiol de la cystéine. Pour transformer des peptides contenant des groupes de cystéine protégés en S, en peptides comportant un groupe de cystine, on élimine le groupe trityle au moyen d'acides forts ou de sels de mercure, ou d'argent et l'on oxyde ensuite, par exemple avec l'oxygène de l'air, 10 l'iode ou le di-iodo-éthane. On peut aussi couper la liaison S— tritylique au moyen de l'iode dans l'éthanol ou le méthanol (voir J»Chem«Soc.74 (1952), page 1862 ; Helvetica Chimica Âcta 51 (1968), pages 2061 à 2064). Cette méthode ne peut cependant s'appliquer qu'aux peptides relativement petits et dont les 15 groupes amino etcarboxy sont protégés étant donné que les peptides supérieurs, surtout ceux qui ne sont pas protégés aux groupes amino et carboxy, ne sont plus solubles dans le méthanol. De surcroît, l'oxydation avec l'iode dans le méthanol, même lorsque l'iode est en excès, est très lente (une heure à 20 la température ambiante) et elle donne naissance à des esters méthyliques de peptides comme produits secondaires. D'un autre côté, on croyait devoir éviter l'emploi de l'eau car on supposait que le groupe S—trityle résistait à l'oxydation par l'iode dans des solvants contenant l'eau, ce qui ressort de J.Àmer.Chem. 25 Soc. 87 (1965), pages 4925 et 4927, où Z-Cys (ïrit)-Cys(DPM)-IJH~ NH^et H-Âla-Gly-Val-Gys(Trit)-Ser-0CH^ s'unissent au moyen de l'iode dans ledioxanne contenant de l'eau, en donnant l'hepta-peptide correspondant.Si l'on évitait d'ajouter de l'eau aux sovants organiques c'était aussi parce que la méthionine et la 50 tyrosine sont attaquées par l'iode dans des solvants contenant l'eau (voir Helv»Chim.Acta,51 (1968), pages 2061 à 2064). Or, la D-emanderesse a trouvé que l'élimination du groupe S-trityle et l'oxydation simultanée en peptides cystini-ques sont beaucoup plus rapides, à la température ambiante dans 35 l'acide acétique aqueux que, par exemple, dans le méthanol. Dans ces conditions la méthionine et la tyrosine ne sont pas oxydées. L'invention a donc pour objet un procédé de préparation de peptides cystiniques, selon lequel on élimine le groupe trityle d'un peptide ayant au moins un motif de S-trityl-cystéi-40 ne,'par oxydation avec de 1 à 2 équivalents molaires, de préféBAD ORIGINAL 70 12814 2 2060002 rence t, d'iode dans l'acide acétique aqueux, de préférence à 4-0-95 %• Le rendement dépend de la teneur en eau .de l' acide acétique et de la proportion d'iode ajoutée (voir tableau 1). 5 Tableau 1 .. . Elimination du groupe S—trityle et oxydation simultanée de de H-Leu-Cys(Trit)-Gly—OK. avec l'iode dans l'acide acétique donnant le peptide cystinique.correspondant (durée de réaction : 15 minutes, à la température -ambiante). 10 Î5 20 Le tableau 1 montre que lè rendement diminue lorsque la concentration de l'acide acétique augmente. Chose surprenante, un excès d'iode dans l'acide acétique réduit également le rendement. Par contre, la méthionine n'est attaquée que très len-25 tement dans l'acide acétique aqueux. Même au bout d'une heure, deux gouttes d'une solution décinormale de I/KI ne sont pas entièrement décolorées par 100 mg'de méthionine dans 10 ml d'acide acétique à 40%, tandis que la couleur brune de l'iode disparaît complètement déjà au bout, de 5 secondes en solution 30 aqueuse. L'oxydation est effectuée, avantageusement, avec une solution aqueuse décinormale de ^/KIou une solution décinormale de 'Ig et d'acide acétique. On dissout, ou met en suspension, les dérivés de S-trityl-cystéine dans l'acide acétique 35 aqueux et on y ajoute la solution d'iode. ' On"agite pendant -15 minutes-à la température ambiante et on-traité le produit ultérieurement de manière appropriée. Si cela est nécessaire, des solvants stables vis-à-vis de l'oxydation, tels que- le dioxanne, le méthanol ou l'éthanol, peuvent être- ajoutés" comme 40 uni s s ours. ' • v BAD ORIGINAL Acide acétique Equivalent d'iode . Rendement à 50 % 1 92 %, à 50.% 1,5 - 87,7 % à 80 % 1 89,2,% à 90 % . ' 1 83,6 % à 95 % ■ 1 80,3 % à 95 % 1,5 29,5% à 100 % 1 18,7 % à 100 % 2 . 30,0 % 70 12814 3 2060002 Les peptides contenant le groupe de S-trityl-cystéine peuvent coirncvter, comme autres motifs, tous les acides aminés, sous leur forme L ou D, que l'on trouve dans les peptides naturels. On peut également mettre en jeu des acides {3-aminés, 5 tels que la (3-alanine, ou d'autres acides aminés d'origine synthétique ou semi-synthétique, tels que 1'a-méthyl-alanine , 1 ' a-méthyl-3.4-dihydroxy-L-phényl-alanine et la 0-chloro-L-alanine. D'autres groupes fonctionnels peuvent être protégés, le cas échéant, suivant des méthodes usuelles dans la chimie 10 de peptides (voir E. Schroder et K. Lilbke, The Peptides, New-York et Londres 1965, tome I, en particulier pages 3 à 75)» Les produits obtenus conformément à l'invention peuvent être utilisés comme médicaments ou comme produits intermédiaires convenant à la fabrication d'autres peptides 15 intéressants comme agents thérapeutiques, par exemple l'ocyto-cine, la vasopressine, l'insuline et la thyréocalcitonine. Les abréviations utilisées dans le présent mémoire pour désigner les acides aminés sont en accord avec les règles de la nomenclature internationale. On se sert en outre des 20 abréviations suivantes ï Boc « tertio-btityloxy~carbonyle Trit » trityle ( » triphényl-méthyle ) ONB = ester 4-nitro-benzylique DCC » dicyclohexyl-carbodi-imide 25 DCEâ. » dicyc 1 ohexyl-aminé Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans en limiter la portée. EXEMPLE : I. Leu-Cys-Gly 30 Leu-Cys-Gly 1. B o c-Cys(Trit)-Gly-OHB A une solution, refroidie à -10°C, de 40,2 g de Boc-Cys(Trit)-OH on ajoute 25,4 g de H-Gly-ONB.HBr et 12,25 ml de triéthyl-amine, on agite pendant 10 minutes à -10°C et on 35 ajoute ensuite une solution de 19,3 g de DCC dans du chlorure de méthylène. On agite pendant 4 heures à 0°C et on laisse reposer pendant la nuit à la température ambiante# Le lendemain on sépare le précipité par essorage et on concentre le filtrat sous vide. On dissout la matière restante dans de l'acétate 40 d'éthyle, en secoue avec de l'acide citrique binormal, une solu*» 70 12814 £§§60002 tion de bicarbonate de s©â.iaain£ este dBE^Idrëalf} sHrsxûLfate de sodium et on concentre •leg::stâiiibitemsx&aEcfefcafeseAj é&ihjêLe-.»: On dissout 1 ' huile restante - /danB";:des.O. 'iacéiroim.".fe0tosn^aslirûïûatogra-phie sur alumine (•Woelm,>-lkeHtaEeO^'^ -JfeCTOi0.g 5 d'un produit huileux (87 %9oidbI lœspiiamt&t^êbhéaoïdapœl jadka? 3ihrQ$r matographie en couche mihfeœi:ânontrte qxfei:\ceaipisQduiikriEMÈcfcâjsn défini, c'est-à-dire uniqueeud'Em si onnfxad: nO .'ïexld'è'l s-b 2. Tosylate )s-G^feHRîfe of> oasûëos'h On dissout 4,6^ giîâH de 10 l'acide trifluoro-acétique=o|nî§rdâ?eI,OQGiï£sL'a5.s^ a?^Bosmi-Psniianf)f une heure à la températui,KÎ!ii)alg.âs1fcr e& teBrjKB&ïicséiitre ensuite sous vide. On distille ^ssaiistfeiîfe^k cfîcdfe tsk&c $£fe â*'Sl4ii£|d3»]et on dissout la matière res&aKt^aàaaifeHilo'îSiaétatfea'JdB!r4-tiiSstos.arQb. y ajoute 1,7 g de monôhydrate d'aci(^^-^7jOrU&aè-^ilfonique 15 et on précipite le tosyïà^fi) j^rO dje l'éthpr. Rendement : 3,7 g (71 ,5 ^^-â^3kîEtBiB.e fusion 137-140°C, Ccx]-p=+ 37,95° (c =2, dans—3?e™mé%hstB©lr)-ir~——-~ 3» Boc-Leu-Cy^^'tiitOg-O-fy'-^MB)gb ÛO (B) A. une solutiotè,o®^&3aM.!liè ^aMî?(^I 1s4£^^jCflis>s3Dc-Leu-20 OH dans 100 ml de chlortf^^^stin^)^^è^i©ii«iI œ^Digre ^n^^csaSutioiÊ, également refroidie, des 7*% dfeJMM^.a3iÇ)iutèq®-iB-H£S)iîi5tQ.cfii!iU3â5 de méthylène. On laisse reposfeœispn^iÊtt 2ê ïssaiteshià ^©"fcfldîîîasèpare le précipité par essorac^g^ ®5i dras'fiïiSîidâQ: Jaf>iB±]efci3£ffib seftÊuESîf sa joute 25 g de tosylatede Jg> d^Bcfel-^liyl-aminé. 25 On laisse reposer le mésleaxgBC y&iï^®ïitsdL®) iSii1?ïldsEïïy:-fiHe^s^3£igéjeteur, le lendemain on ai^ocfoiBïSïfcife c^asiQtfgii^ëï la matière restante à un paœ,t!agïS,ï&îtasD l'eau. On secoue la phase d'aeÊtsfesiai'séS^gîS^'cQ2fci!£ënaë?eritr!:cSQiei>Jlr 1 , on la sèche et on la concentre. On triture la matière «ESSg^fg&gfce 30 avec l'éther. - (è? S0) gai f8S ; tfneaGJixaeH OÇ Rendement : 25 /&;rgacÇSfflu$&)riD P a ; .eau J3 .yfcXoJ- 94 9Jrfîri'iqnxoà£ e^rejms __ ■xti A une suspension de 25 f© g de Boc—Xeu—Cys( Tritfji —Gly- 0NB dans 120 ml d'un mélange %sFd'io^lanri^^t^^^à^Y'ô/^1 on ajoti- , , , » , , al oitaoonao riO ^IsioBlg .siraxtfèo.s te goutte à goutte, en 4 heures environ, ib,b ml de "lessive de , , . -> ,, sdae-x a'xâxd-Bfff sf iamuna no d'à -ph.br soude binormale (la thymolphtaieme sert d1 indicateur). L'addi— . , , si .oitoeono.Q nQ °ieild-à! I 4© , tion terminee, on neutralise/de l'acide citrique omormal et on . ^ ;rrr bI xir.Q'Tèiîxiïi actoyj di d"saoo asl , concentre sous vide. On soumet la matiere restante a un partage 798 103 ^ é SUpjdàofi OJ&XOS ' I 3IÏBÔ 0£ BAD ORIGINAL 70 12814 5 2060002 entre l'acétate d'éthylfce et l'acide citrique binormal. On lave la phase d'acétate d'éthyle à l'eau, on la sèche sur sulfate de sodium et on la concentre. On dissout la matière restante dans l'acide trifluoro-acétique. Après un repos 5 d'une heure on élimine bien l'acide trifluoro-acétique par distillation sous vide ^t on distille encore deux fois avec de l'éther. On triture la matière restante avec une solution d'acétate de sodium, à la suite de quoi il précipite une substance cristallisée que l'on sépare par essorage et recris-10 tallise' dans de l'alcool à 70 %. Rendement : 13,8 g (75 %)• Point de fusion : 161—165°C. [oc]jj=-2,2 (c = 1, dans l'acide acétique glacial). Chromatographie en couche mince : produit unique. 5» Leu-Cys-Gly ,0,5 CH^COOH Leu-Cys-Gly 15 (a) On ajoute 15 ml d'eau et 10 ml d'une solution décinormale de Ig dans l'acide acétique glacial à une solution 20 de 551,7 mg de H-Leu-Cys(Trit)-Gly-OH. 1 HgO (-j miiiimole) dans 5 ml d'acide acétique glacial. On agite le mélange réactionnel pendant 15 minutes à la température ambiante et on le concentre ensuite sous vide. On soumet la matière restante à un partage entre l'eau et l'éther. On agite la phase aqueuse avec de 25 l'Amberlite IR 45 (chargée d'ions d'acétate) jusqu'à ce qu'on ne puisse plus déceller d'ions iodure dans la solution. On sépare l'échangeur par essorage, on concentre le filtrat sous vide, on triture la matière restante avec de l'éther et on essore. 30 Rendement : 281 mg (92 %). Point de fusion 212-215°C" (avec décomposition). Chromatographie en couche mince : produit unique. (b) On ajoute 5 ml d'eau et 10 ml d'une solution aqueuse décinormale de Ig/KX à une solution de 551,7 mg de 35 H-Leu-Cys(Trit)-Gly-OH. 1 HgO (1 millimole) dans 5 ml d'acide acétique glacial. On concentre le mélange réactionnel sous vide et on soumet la matière restante à un partage entre l'eau et l'éther. On concentre la phase aqueuse sous vide. On élimine les constituants minéraux de la matière restante par filtration 40 dans l'acide acétique à 5% sur Sephadex G 10 (colonne de 70 12814 6 2060002 90 x 1 ,5 cnr). Rendement : 277 mg (91 #>)• La chromatographie en couche mince montre que le produit est "bien défini et identique à la matière obtenue selon 5 (a).-5 II» Val-Cys-Ala Val-Cys-Ala 1. Boc-Val-Cys(Trit)-OH.. DCHA On ajoute 10 ml de NaOH binormale à me suspension de 7,25 g de S-trityl-cystéine (20 millimoles) dans 40 ml de 10 dioxanne, on agite jusqu'à ce que tout soit dissous et on ajoute ensuite 3,15 g de Boc-Val-Osu (10 millimoles). On agite pendant une journée à la température ambiante et le lendemain on concentre le mélange réactionnel neutralisé. On soumet la matière restante à un partage entre l'acétate d'éthyle et 15 l'acide citrique binormal. On sépare par essorage la S-trityl-cystéine en excès qui précipite, on secoue la phase d'acétate d'éthyle avec de l'eau, on la sèche sur sulfate de sodium et on la concentre. On obtient 8,3 g d'une, huile. On dissout cette huile-dansl'éther et on élimine 20 par filtrat ion la matière insoluble. On ajoute ensuite: DCHJL jusqu'à ce que la réaction devienne basique, on élimine encore une fois la matière insoluble par filtration et on préedpite le sel de DCHA au moyen d'éther de pétrole. Rendement : 5,7 g (76,6%), amorphe, chromatographie 25 en couche mince : produit bien défini. 2. Boe-Val—Cys(Trit)—Ala- 0KB On secoue une solution de 5,7 g de Boc—Val-Cys(Trit)— OH. DCHA (7,66 millimoles) dans de l'acétate d'éthyle avec de l'acide citrique binormal et de l'eau, on la sèche sur sulfate 30 de sodium et on la concentre. On dissout la matière restante dans du chlorure de méthylène et on ajoute 3,74- g de tosylate de H-Ala-ONB (9,4 millimoles). Tout en agitant, on ajoute, à 0®0, 1,24 ml de triéthylamine (9,1 millimoles), 2,1 g de ÏT-hy-droxy-succinimide (18,2 millimoles) et une solution froide de 35 2,0 g de DOC dans le chlorure de méthylène. On laisse reposer pendant 2 heures à 0JC et pendant la nuit à ia température ambiante et on effecture le traitement ultérieur comme décrit sous I 1. On recueille ainsi 5,15g du produit (87,5 %) de la quantité théorique ; point de fusion 175 - 177"C. 40 On purifie la substance en la dissolvant dans BAD ORIGINAL 70 12814 7 2060002 1'acétate d'éthyle et en la chromatographiant sur alumine neutre (Yîoelm, stade d'activité I). Rendement : 4,0 g (68 °/o). Point de fusion : 185-186°G. [a]jy=-19,6° (c = 2, dans le diméthyl formamide). 5 3- H-Val-Cys(Trit)-Ala-0H, 2,5 CH^COOH On hydrolyse 6,6 g de Boc-Val-Cys(Trit)-Ala-0ïïB, comme décrit sous I 4, avec do la lessive de soude normale et on traite ensuite avec do l'acide trifluoro-acétique. Traitement complémentaire comme décrit sous I 4. 10 Rendement : 4,6 g, recristallisation dans un mélange d'acide acétique glacial et d'éther, point de fusion 146-147°0. 4. Val-Cys-Ala , 1 CHjCOOH, 1 EgO 15 Val-Cys-Ala On ajoute 10 ml d'une solution décinormal de Ig et d'acide acétique glacial à une suspension de 683,8 mg de H-Val-Cys(Trit)-Ala-OH, 2,5 C-H^COOH dans 30 ml d'un mélange d'acétate d'éthyle et d'eau (1:2), on agite pendant 15 minutes 20 à la température ambiante et on traite ultérieurement comme décrit sous I 5 (a). Rendement : 285 mg (86,5 %)• Point de fusion : 227-230°C (avec décomposition). Chromatographie en couche mince produit unique. » 70 12814 8 2060002 i E ! T B I D I C » T I O I Procédé de préparation de poptides cystiniqueg, caractérisé en ce qu'on traite un peptide ayant au moins un groupe de S-trityl-cystéine avec de 1 à 2 équivalents molaire d'iode dans de l'acide acétique aqueux.