Brevet FR2106482A1 — publié le 19720505

La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un vaccin vivant contre la bursite infectieuse des poules (Gumboro-disease). La bursite infectieuse est une maladie des poules 5 qui est répandue dans le monde entier et qui affecte surtout les animaux jeunes de la deuxième à la sixième semaine de leur vie. Ces animaux souffrent de diarrhées et d'hémorragies dans leur musculature et ils présentent des inflammations accompagnées de saignements et de nécrose, de la Bursa fabricii 10 organe attenant au rectum. Ils meurent ou bien leur croissance est retardée car ils utilisent mal leur nourriture et les pertes sont importantes, surtout dans les élevages de volailles engraissées pour la consommation. On a déjà essayé de préparer un vaccin contre 15 la bursite infectieuse par des passages sur des oeufs de poule embryonnés mais cela est difficile à réaliser car souvent le virus de la bursite ne peut plus se multiplier après 3 ou 4 passages sur la culture d'oeufs. Si l'on réussit dans quelques cas, la teneur en virus est très faible et la suspension 20 de virus ne convient pas pour la préparation d'un vaccin. Or, la Demanderesse a trouvé un procédé de préparation d'un vaccin vivant contre la bursite infectieuse des poules, selon lequel on adapte le virus de la bursite, en utilisant des agents immuno-suppresseurs, par environ 18 à 25 25 passages en série sur des souris nouvellement nées, ce qui, en même temps, atténue le virus, et on en extrait le virus atténué avec lequel on prépare un vaccin de la manière habituelle . De préférence, on choisit des souris blanches 30 ou de la race Mastomys natalensis, âgées de 1 à 3 jours, et, pour procéder à l'extraction, on sacrifie les animaux infectés à l'état moribond ou on les traite aussitôt après leur mort Le virus de la bursite infectieuse est avantageusement isolé de la Bursa fabricii de poules atteintes de 35 bursite, en homogénéisant la bourse et en centrifugeant le produit homogénéisé, et la suspension contenant le virus, ainsi obtenue, est injectée par voie intrapéritonéale à des souris nouvellement nées. On peut aussi faire précéder l'injection d'un ou plusieurs passages sur des oeufs. Les souris 40 de 1 à 3 jours reçoivent une dose d'environ 0,05 ml de la 71 32926 2 2106482 suspension de virus, dont la concentration en virus est d'au moins 102 "oeufs-ID^0" par millilitre. Un "oeuf-ID^0" est défini par la concentration du virus qui cause la mort de 50 % des embryons de poules infectés ou qui cause des 5 modifications spécifiquement dues au virus. Une "souris-IDr--" est définie de la même manière. Après l'infection, on injecte aux souris, par voie sous-cutanée, un agent immuno-suppresseur, ce qui diminue la résistance naturelle des animaux et favorise l'apparition 10 des symptômes cliniques de l'infection. Des agents immuno- suppresseurs appropriés sont, par exemple, des corticostéroîdes tels que la cortisone, 1'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la 6-méthyl-prednisolone, le dexaméthason et le paraméthason, ainsi que les esters de ces composés qui 15 peuvent être utilisés en thérapeutique, des anti-métabolites tels que la 6-mercaptopurine, des agents alkylants comme le cyclo-phosphamide et enfin les sérums antilymphocytaires et les globulines antilymphocytaires. Suivant la substance utilisée, la dose est de 50 à 500 gammas par souris ; dans 20 le cas de corticostéroîdes, elle peut être par exemple de 100 à 200 gammas par souris. Après quelques jours, les animaux infectés montrent des signes de paralysie. Dans cette phase on les sacrifie et on les homogénéise avec du sérum physiologique 25 pour obtenir un extrait de 10 à 20 Pour précipiter les protéines présentes, on secoue l'extrait avec un agent précipitant approprié, par exemple avec un hydrocarbure halogène, tel que le chloroforme, pendant 1 heure, et on laisse reposer pendant environ 18 à 24 heures aux environs de + 4°C. On éli-30 mine ensuite par centrifugation les protéines précipitées et on utilise le liquide contenant le virus pour le passage suivant sur lès souris. Le temps entre l'infection et l'apparition des signes de paralysie diminue à mesure que le nombre des passages 35 augmente, d'environ 8 jours au début, jusqu'à 4 à 6 jours. Bien qu'on ne puisse plus réduire ce temps en poursuivant les passages, le virus est tout à fait bien adapté aux souris et après environ 18 à 25 passages, il est atténué pour des poulets de tout âge. 71 32926 3 2106482 La préparation immuno-suppressive est injectée aux animaux jusqu'au dixième ou douzième passage environ, ensuite cela n'est plus nécessaire. Pour préparer le vaccin, on ajoute un colloïde 5 protecteur à l'extrait de souris privé des protéines, par exemple du lait écrémé ou la solution d'infusion préparée selon le brevet de la République Fédérale d'Allemagne N° 1.118.792 (produit vendu dans le commerce sous le nom de marque Haemaccel) qui contient un dérivé de gélatine, la 10 concentration de ce colloïde variant avec la substance utilisée, et étant de préférence de 1,0 à 5,0 $, et la suspension de virus contenant le colloïde protecteur est ensuite lyophilisée. Le vaccin sec contient par dose à inoculer de 10?'^ Ce à 10 "souris-ID^Q1' de virus infectieux de la bursite et 15 pour immuniser les poulets, on le dissout dans leur eau de boisson. Pour obtenir une plus rapide consommation de cette eau, il est bon de priver les poulets d'eau pendant une à deux heures avant la vaccination. Les exemples suivants, sans limiter la portée de 20 l'invention, décrivent celle-ci plus en détail. EXEMPLE 1 : On prépare un produit homogénéisé à partir de la bursa fabricii de poules spécifiquement atteintes de bursite et on inocule avec ce produit des oeufs de poules embryonnés. 25 On ouvre un oeuf dont l'embryon est mort le quatrième jour après l'infection, on en retire l'embryon avec le liquide allanto-amniotique qui l'enveloppe, on homogénéise et on extrait avec du sérum physiologique. On secoue l'extrait pendant 1 heure avec 10 # en volume de chloroforme puis on cen-30 trifuge pendant 5 minutes à 3000 tours par minute. Le liquide séparé contenant le virus est ensuite injecté par voie intra-péritonéale, à la dose de 0,05 ml, à des s.ouris de deux jours (premier passage chez les souris). La teneur en virus, pour 0,05 ml est de 102-'^ oeufs-ID^Q. Après l'infection avec le 35 virus, on procède sur chaque souris à une injection sous-cutanée de 100 gammas d'hémi-succinate de prednisolone sous la forme du sel sodique, et huit jours après l'infection apparaissent les premiers symptômes nets de paralysie et de troubles de l'équilibre. On sacrifie alors les souris pour 40 procéder au second passage sur les souris et on homogénéise 71 32926 4 2106482 avec une solution physiologique de chlorure de sodium pour obtenir un extrait à 10 %. On secoue cet extrait pendant 1 heure avec 10 % en volume de chloroforme et on centrifuge pendant 5 minutes à 3000 t/minute. pour le deuxième passage 5 on prend des souris de 1 jour, que l'on traite chacune aussi, par voie sous-cutanée, après l'infection, avec 100 gammas du sel sodique d'hémisuccinate de prednisolone. Après l'apparition de symptômes marqués de paralysie, on tue les souris et on extrait le virus comme dans le cas du premier passage, 10 pour procéder au troisième passage. On continue les passages sur les souris jusqu'au douzième,et le treizième passage est effectué pour la première fois sans injection de cortico-stéroïde, sur des souris âgées de 1 jour. Les premiers symptômes spécifiques de la maladie sont observés le 4ème jour 15 après l'infection. Le traitement ultérieur des souris sacrifiées, l'extraction du virus et la continuation des passages sont effectuées de la manière décrite. On infecte par la voie intrapéritonéale 10 souris âgées de 2 jours, chacune avec 0,05 ml de la pré-20 paration virale provenant du 20ème passage sur les souris et après 5 jours, au point culminant de la phase de paralysie, on les tue et on les homogénéise avec une solution physiologique de NaCl pour obtenir un extrait à 20 %. On secoue l'extrait pendant 1 heure avec 10 $ en volume de chloroforme 25 et après avoir laissé reposer le mélange pendant 18 heures à +4°C, on centrifuge pendant 5 minutes à 3000 t/minute. On mélange 100 ml du liquide séparé contenant le virus avec 50 ml du produit Haemaccel, on met le mélange dans des ampoules à raison de 5 ml par ampoule et on le lyophilise. La teneur en 30 virus du vaccin sec, après remise en suspension et dilution 1 1 au volume initial, est de 10'' souris-ID^g/ml. EXEMPLE 2 : On a montré l'innocuité et l'activité du vaccin contre la bursite infectieuse préparé selon l'invention par 35 des passages sur des souris nouvellement nées en procédant à deux essais sur des poussins de 8 et 12 jours qui n'avaient pas de germes spécifiques pathogènes pour les poules, ni leurs anticorps (poussins dits SPP). Dans le premier essai, on immunisa 75 poussins SPP 71 32926 5 2106482 à l'âge de 8 jours, chacun avec 10^'^ souris-ID de virus de la bursite du 20ème passage, avec leur eau de boisson, sans qu'il apparaisse de réactions de vaccination cliniquement reconnaissables. Deux semaines après l'immunisation, l'indice 5 de protection moyen, déterminé par des tests de neutralisation du virus dans le sérum des animaux vaccinés, dilué dans le rapport de 1 à 10, était de 102'1. Dans le test de neutralisation du virus, on détermine la teneur en anticorps du sérum en neutralisant 10 les anticorps dans le sérum à des concentrations en virus décroissantes puis en les examinant avec du virus non neutralisé sur les jeunes souris. Le point terminal de 50 % est déterminé par les méthodes de calcul statistique habituelles. L'indice de protection du sérum est le rapport du titre du virus 15 dans l'essai témoin au titre du mélange du virus et de 1'antisérum, par exemple : , 10~6,5/0,05 ml on2,1 Indice de protection du sérum = 10"^*V°#05 ml Jusqu'à la huitième semaine après la vaccination, l'indice de 3 2 2 0 20 protection du sérum s'éleva à Î0 ' et tomba ensuite à 10 ' à la I6ème semaine après la vaccination. Comme les poussins SPF avaient un indice de protection du sérum contre le virus de la bursite, avant la vaccination, de presque 10°, cela prouve un fort développement d'anticorps pendant au moins 16 semaines 25 après la vaccination, ce qui indique une bonne protection contre une infection. Dans le deuxième essai,: on a immunisé, avec leur eau de boisson, 80 poussins SPP à l'âge de 12 jours, chacun 5 8 avec 10^' souris-IDj-0 de virus de la bursite du 25eme passage, 30 sans observer non plus aucune réaction clinique de vaccination. L'indice de protection du sérum des poussins vaccinés (sérum dilué au dixième) était, deux semaines après 1'immuni-3 4 sation, de 10 en moyenne, et quatre semaines après la 2 8 vaccination, il était de 10 ' . Ces deux déterminations de 35 l'indice protecteur indiquent une bonne production d'anticorps et donc une protection suffisante eontre une infection. Ces deux essais montrent que les vaccins qui ont été préparés selon l'invention sont efficaces et sans danger. 71 32926 6 2106482 EXEMPLE 3 : A partir du 63ème passage sur des oeufs d'un virus de la bursite infectieuse préparé selon les méthodes habituelles, on a comparé les titres de virus des 67ème au 73ème 5 passages avec les titres des I6ème au 22ème passages sur des souris nouvellement nées, en effectuant les passages sur les oeufs par inoculation de la cavité allantoîque d'oeufs qui ont été préalablement incubés pendant 6 jours. Les embryons qui sont morts du 3ème au 6ème jour après l'inoculation 10 ont été homogénéisés avec le liquide allantoîque qui les entoure. On a centrifugé l'extrait embryonnaire pendant 5 minutes à 3000 tours/minute et on a utilisé chaque fois le liquide séparé contenant le virus comme agent d'infection pour le passage suivant. Le titre du virus a été déterminé par 15 dilution du liquide séparé de l'extrait à des puissances de 10 et inoculation d'oeufs de poules préalablement incubés pendant 6 jours, à la dose de 0,1 ml par oeuf. Sur les embryons qui sont morts entre le 2ème et le 12ème jour après l'infection, ainsi que sur tous les embryons survivants 20 mais qui présentaient des modifications spécifiques au virus, on a déterminé le titre du virus par une méthode de calcul statistique. Les passages sur les souris nouvellement nées ont été effectués selon la méthode décrite à l'exemple 1 25 mais sans injection d'un corticostéroîde et pour les titrages de virus on a injecté par la voie intrapéritonéale les dilutions de virus à des souris de 1 à 2 jours. Les jeunes souris qui tombaient malade avec des symptômes de paralysie dans les 21 jours après l'infection ont été considérées ccame 30 étant infectées par le virus. Dans le tableau suivant, les titres de virus pour 1 ml de l'extrait embryonnaire non-dilué sont comparés avec ceux de l'extrait à 20 % de souris nouvellement nées. (tableau page suivante) 71 32926 7 2106482 TABLEAU Passages Titre du virus/ml Passages sur Titre du virus/ml sur d'extrait souris d'extrait de oeufs embryonnaire nouvellement souris à 20 % 5 non-dilué nées 67 10-4'0 16 10-6*9 68 10~4'5 17 10-5'8 69 10~4'8 18 10-6>1 70 10-5'° 19 10~6>5 10 71 10"5'5 20 10-7'1 72 10-5*5 21 l0-6,8 73 10-5,3 22 10-7-5 Ces valeurs montrent que les extraits de jeunes souris dilués à 20 % contiennent plus de virus que les 15 extraits non-dilués d'embryons de poules, à savoir de une à deux puissances de 10 en plus. 71 32926 8 2106482 REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un vaccin vivant contre la bursite infectieuse des poules, caractérisé par le fait que l'on adapte et on atténue en même temps le virus de la 5 bursite, en utilisant des immuno-suppresseurs, par des passages en série sur des souris nouvellement nées, et on en extrait le virus atténué avec lequel on prépare un vaccin de la manière habituelle. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé 10 par le fait que l'on opère sur des souris blanches ou de la race Mastomys natalensis, âgées de 1 à 3 jours. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que pour procéder à l'extraction on sacrifie les souris infectées alors qu'elles sont sur le 15 point de mourir ou bien on les traite aussitôt après leur mort. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on utilise des corticostéroîdes comme immuno-suppresseurs, en particulier de la prednisolone ou ses esters utilisables à des fins médici-20 nales. 5.- Les vaccins vivants contre la bursite infectieuse des poules qui ont été préparés selon l'une quelconque des revendications précédentes.