Brevet FR2108117A1 — publié le 19720512

La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de fabrication de phényl-L-alanines 3,4- di-substituées et plus particulièrement à un nouveau procédé de fabrication de ces alani-nes à l'aide de microorganismes. 5 La dihydroxy-3,4-phényl-L-alanine (ci-après désignée sous le nom de "L-dopa") est connue comme un médicament spécifique dans le traitement de la maladie de Parkinson. La méthoxy-3-hydroxy-4-phényl-L-alanine et la diméthoxy-3,4-phényl-L-alanine constituent d'importantes matières industriel-10 les de départ pour la production de la "L-dopa", et on peut s'attendre à une action pharmaceutique de ces composés. Il est connu que les dérivés disubstitués en 3,4 de la phényl-L-alanine, représentées par la formule générale 15 CH2-CH-C00H (I) NH0 2 et R , identiques ou différents, reorésentent un atome d* 2 hydrogène ou un groupe méthyle, pourvu que R ne soit pas un mé- "I 20 thyl-e lorsque R est un atome d'hydrogène, ont été, les uns et les autres, fabriqués précédemment par des procédés physiques et chimiques, ou par un procédé de dédoublement optique utilisant des enzymes ; ils sont synthétisés par voie chimique pour obtenir un mélange de phényl-L-alanine 3,4-disubstituée (ci-après désignée 25 sous le nom de "type L") et de phényl-D-alanine 3,4-disubstituée (ci-après désignée sous le nom de "type-D"). Dans le cas du procédé de dédoublement optique, toutefois, il n'est pas possible df obtenir un rendement en "type L" supérieur à 50% à moins que le "type D", qui est obtenù comme sous-produit, ne soit transformé 30 en "type L" par racémisation. Par conséquent, la mise en oeuvre de la méthode de dédoublement ootique est très défavorable à 1' échelon industriel. Pour l'obtention de la "L-dooa" par fermentation, on a proposé un orocédé, dans lequel des dérivés de la L-tyrosine, par 35 exemole la N-formyl-L-tyrozine est mise à réagir avec une polyphé-nol-oxydase obtenue à partir de moisissures (Charles J. STH et Coll. "Journal of American Chemical Society 91, 6204-1969) et un procédé dans lequel le catéchol est condensé avec un acide aminé particulier, comme par exemple la tyrosine, la sérine, la cystéine 40 et d'autres produits équivalents en utilisant une tyrosine-phénol- 71 35165 2 2108117 lyase qui peut être obtenue à partir de bactéries. (YAMADA, OGATA et coll. "Biochemical and Biophysical Research Communieations" 34, 266-1969). La demanderesse a trouvé comme résultat de ses recherches 5 sur des microorganismes ayant le pouvoir de transformer des dérivés 3,4-disubstitués de l'acide phényl-pyruvique en dérivés 3,4-di-substitués de la phényl-L-alanine, que la transaminase qui peut catalyser la transamination entre l'acide phénylpyruvique 3,4-disubstitué et un acide aminé peut être obtenue par l'emploi d'en— 10 zymes de microorganismes ayant le pouvoir de transamination entre l'acide phénylpyruvique 3,4-disubstitué et le donneur du radical aminé» De tels' microorganismes sont notamment choisis parmi les bactéries des classes Pseudomonas, Alcaligones, Bacillus, Micro-coccus, Sai'Cina, Mycobacterium, Nocardia, Brevibacteriuhi, Staphylo-15 coccus, Arthrobacter, Gluconobacter et Achromobacter, comprenant les moisissures qui font partie des classes Aspergillus, Pénicillium, Mucor, Helicostylum et Trametes et comprenant les levures faisant partie des classes des Rhodotorula,' Candida et Saccharomy-ces. 20 Sur la base de la découverte précédente et d'investiga tions ultérieures, la demanderesse est parvenue à fabriquer d'une façon avantageuse et industrielle des dérivés 3,4-disubstitués de phényl-L-alanine représentés par la formule générale (I) donnée plus haut. 25 La présente invention réalise un procédé de préparation de phényl-L-alanine 3,4-disubstituée de formule générale R10 R20 ch2-çh-cooh (I) 30 NH0 N 1 2 où R et R , identiques ou différentes, représentent un atome d* 2 1 hydrogène ou un Tiéthyle, pourvu que R ne soit pas méthyle, quand R représente un atome d'hydrogène, caractérisé en ce que l'on tran- saminé l'acide phénylpyruvique 3,4-disubstitué de formule générale 35 R1Ô 2 Vv R0—/'A C^-CO-COOH (il) où R et R ont la même signification que ci-dessus, avec un donneur du radical aminé au moyen d'enzymes de microorganismes qui peuvent catalyser la réaction de transamination entre l'acide phényl-40 pyruvique 3,4-disubstitué et un donneur du radical aminé, lesdits 71 35165 3 2108117 microorganismes étant choisis parmi les bactéries Pseudomonas, Alcaligones, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Mycobacterium, Nocardia, Brevibacterium, Staphylococcus, Arthrobacter, Gluconô-bacter et Achromobacter, comorenant les moisissures qui font par-5 tie des classes des Asoergillus, Pénicillium, Mucor, Hélicastylum et Trametes et comprennent les levures des types Rhodotorula, Candida et Saccharomyces. . Dans la mise en oeuvre du procédé de la présente invention on cultive une des bactéries, moisissures ou levures, décri-10 tes ci-dessus, dans un milieu de culture contenant du glucose, du sucrose, du maltose,.du lactose, un produit d'hydrolyse de l'amidon et des produits similaires seuls ou en mélange comme source de carbone, contenant un extrait de viande, une .peptone, une polypeptone, l'acide casaminique, une liqueur d'infusion à froid 15 de grains de céréale, des sels d'ammonium, des hydrolysats de protéines et des produits similaires seuls ou en mélange comme source d'azote. Le milieu contient du chlorure de sodium, du phosphate, un ion métallique, une vitamine et un agent de Croissance, et il est maintenu à une température de 25° à 40°C pendant 20 20 à 120 heures, pour donner un enzyme à l'aide duquel les composés de formule générale (IX) peuvent être convertis avec un fort rendement en composés de la formule générale (I) en présence des bactéries ou de la levure ou du mycélium des moisissures, ou de leurs bouillons de fermentation. 25 Bien que ces conditions optimales de fermentation puis sent varier selon le type de microorganismes, les résultats des essais de reproductibilité des produits en présence de ces micro-organismes sont les suivants. Dans le cas des bactéries, lfinoculation eêt effectuée 30 dans le milieu de culture contenant en poids 0,5% d'extrait de viande, 1 % de peptone et 0,5% de chlorure de sodium et le milieu est cultivé à une température de 30°C pendant 48 heures. Les comoosés de formule générale (II) sont mis à réagir, en présence du magma bactérien humide obtenu, avec 1'amino-acide à 37°C, pendant une 35 heure® Dans le cas des moisissures ou des levures, celles-ci sont inoculées dans le milieu de culture contenant 2,5% en poids d'extrait de malte et cultivé dans les mêmes conditions que ci—dessus; le magma ou mycélium obtenu est broyé dans un mortier en verre pour donnpr une solution d'enzyme. Les composés de formule générale (II) 40 sont mis à réagir, en présence de la solution d'enzyme, avec 1» 71 35165 2108117 aminoacide dans les conditions décrites ci-dessus. Les quantités des composés, obtenus par la formule générale (I), sont respectivement déterminées d'une façon quantitative de la façon suivante. 5 La dihydroxy-3,4-phényl-L-alanine est estimée par la méthode au trihydroxyindol décrite dans la littérature (EULER, U.S. von : Hormones dans le sang, Academic Press - 1961). _4 La diméthoxy-3>4-phényl-L-alanine et la méthoxy-3-hydro- xyAphényl-L-alanine sont transformées en esters N-trifluoroacétyl-10 n-butyliques par une méthode décrite dans la littérature (Charles W. GREHEK et Coll., "Analytical Chemistry 37 (3), 383, 1965). L* ester N-trifluoroacétyl-n-butylique est déterminé quantitativement par une chromatographie liquide-gaz. De ces résultats d'analyse, on détermine respectivement les activités enzymatiques des micro-15 organismes qui sont obtenus à partir des bactéries, des moisissures et des levures. Les résultats obtenus par la détermination des activités enzymatiques sont représentés dans les tableaux I, II et .III. Dans les tableaux I, II et III, l'unité d'activité enzy— 20 matique est exprimée par la quantité d'enzyme qui produit 1 mg du composé représenté par la formule générale (I) à une température de 37°C pendant une heure. Comme ensemble d'ingrédients pour la réaction enzymatique, on en utilise un dans lequel on ajoute à la solution d'enzyme résultant de 1 ml de la solution de culture une 25 solution ayant la composition suivante : 0,5 M solution tampon au phosphate 0,5 ml 0,01% Phosphate de pyridoxal 0,5 ml (en poids par volume) 1/16 M L-glutamate de potassium 0,5 ml 30 1/16 M L-aspartate de potassium 0,5 ml 1/8 M Composé reorésenté par la 1,0 ml formule générale (II) et on amène le volume final à 5 ml. Dans les tableaux I, II et III, "Composé A", "Comoosé B" 35 et "Composé C" représentent respectivement le 3f4-dihydroxyphényl-L-alanine, la 3-méthoxy-4 hydroxyphényl-L-alanine et la 3,4-dimé-thoxyphényl-L-alanine. La quantité d'enzyme produite dans 100 ml du bouillon de fermentation des différentes bactéries, moisissures 0u levures est 40 exprimée par le nombre d'unités précédemment définies. TABLEAU I Quantité d*enzyme produisant le composé obtenue à partir des bactéries Nom des bactéries N° de classification Quantité d'enzymes (un.ités/100 ml) Composé(A) Composé (B) Composé (C ) Pseudomonas aeruginosa IAM* 1 1007 62 31 58 Pseudomona9 dachunhae M 1048 56 45 40 Pseudomonas desmolytica tl jlt 1 1508 42 41 41 Pseudomonas fluorescens IFU 3903 39 10 22 Pseudomonas azotoformans IAM 1603 54 22 41 . Pseudomonas ovalis u 1002 44 39 46 Pseudomonas melanogonurn ti 1554 55 40 23 Bacillus cereus ù 1029 1 1 17 19 Alcaligones faecalis H 1015 98 53 69 'Micrococcus varians II 1314 21 29 28 Micrococcus lysodeikticus II 1056 36 26 20 Barcina lutea tl mtO 1099 1.5 10 12 Brevibacterium ammoniager es ATCC 6872 14 10 16 Nocardia corallina IFO 3338 14 13 16 Mycobacterium phlei II 3158 16 13 17 Staphylococcus aureus IAM 1011 29 20 25 Arthrobactor simplex n 1660 43 38 35 Gluconobacter suboxydans n 1828 27 . 10 18 Achromobacter cycloclaste S M 1013 58 26 37 *T *2 *3 Institut de Microbiologie.Appliquée - Université de Tokio - Tokio - Japon-Institut des Fermentations, Osaka, Japon Collection de Cultures type Américain, 12301, Parklaun Drive, Rockville -Maryland 20852,U.S.A. L.M Uï I-* ON Ul en ro i-A o 00 à TABLEAU II Quantité d'enzyme produisant le composé obtenue à partir des moisissures Nom des moisissures N° de classification Quantité.d 'enzymes (unités/100 ml) Composé (A) Composé (B> Composé (C) Aspergillus oryzae IAM 2600 30 22 27 Aspergillus fumigatus " 2004 18 10 14 Aspergillus flavus » 2007 33 17 16 Pénicillium ochro-chloron •' 7099 29 40 39 Pénicillium thomii " 7006 17 10 12 Pénicillium expansum » 7229 46 30 24 Pénicillium duclauxi " 7010 51 18 50 Pénicillium cyclopium » 7146 69 53 66 Pénicillium roqueforti " 7241 13 42 35 Pénicillium notatum " 7367 30 15 14 Helicostylum piriforme » 6228 34 23 28 Trametes pini " 9007 16 10 20 Mucor racemosus " 6123 54 46 48 TABLEAU III Quantité d'enzyme produisant le composé obtenue à partir des levures Nom de la levure N° de classification Quantité d'enzymes (uni tés/100 ml) Composé (A) Composé (Bl Composé (C) Rhodotorula glutinis IFO 0667 Candida guilliermondii IAM 4412 Saccharomyces cerevisiae " 4195 12 15 10 18 12 22 10 16 17 h-^ U1 c\ VJl ON IV) O GO XI 71 35165 , .2108117 Comme il est décrit ci-dessus, de nombreux microorganismes produisent d'une façon efficace la transaminase qui peut transformer le composé représenté par la formule générale (l) en composé représenté par la formule générale (II) par réaction de tran-5 samination ; on en déduit qu'il est très avantageux que la transaminase puisse7 être appliquée à un procédé industriel de préparation des composés représentés par la formule générale (l). Dans ce cas, la solution du magma ou du mycélium broyé, le magma ou le mycélium séché, le magma ou le mycélium humide de ces microor-10 ganismes ou le bouillon de'fermentation de ces microorganismes peut être utilisé pour la réaction de transamination comme s'il s'agissait de la transaminase. On trouve également des microorganismes tels que Pseudomonas dachunhae qui libèrent du magma bactérien -une grande quanti-15 te de transaminase qui peut ainsi être isolée en la relarguant avec du sulfate d'ammonium. La transaminase ainsi préparée peut convertir les composés représentés par la formule générale (II) en composés représentés par la formule générale (I) en présence du donneur de radical aminé. 20 Les températures, valeur de pH, et temps de réaction préférables Dour mener à bonne fin le procédé de la présente invention sont respectivement 25? à 45°C, 6,5 à 10,5, et 20 à 60 heures. Comme exemoles de donneurs de radical aminé qui peuvent 25 être utilisés dans la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, on peut citer l'acide L-glutamique, la L-alanine, 1* acide L-aspartique, la glycine seuls ou en mélange, les peptones ou des hydrolysats de protéine tels que l'hydrolvsat de protéine de blé. 30 Les composés représentés par la formule générale (I), qui sont obtenus comme il est exoliqué ci-dessus, peuvent être facilement récupérés par acidification de la solution de réaction à l'acide d'un acide minéral, séparation du magma ou du mycélium et de la protéine soluble de la solution de réaction, extraction de 35 l'acide cétonique n'ayant pas réagi à 1' aide de solvants organiques tel que l'acétate d'éthyle, ensuite par concentration de la solution résultante purifiée et puis en employant la précipitation au point isoélectrique, des résines échangeuses d'ions ou des adsorbants. 40 Parmi les composés obtenus représentés par la formule 71 35165 8 2108117 générale (i), la 3-éthoxy-4-hydroxyphényl-L-alanine ou la 3,4-diméthoxyphényl-L-alanine peuvent être transformées en "L-dopa" d'une pureté optique de 100% avec un fort rendement par un procédé courant de déméthylation de ces composés. 5 Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention, les pourcentages étant exprimés en poids. EXEMPLE 1 Une souche de Alcaligones faecalis IAM 1015 est inoculée 10 dans 5 litres d'un milieu de culture comprenant 0,5% de glucose, 0,5% d'acide casaminique, 0,5% d'extrait de levure, 0,1% de phosphate monopotassique et 0,05% de sulfate de magnésium et est cultivée sous agitation et aération, la valeur initiale du pH étant de 7,0, à une température de 30°C pendant 64 heures. Le magma 15 bactérien est séparé de la liquêur de culture par centrifugation. 35 g du magma humide obtenu sont mis en suspension dans 300 ml d'une solution dont la valeur du pH est amené à 7,5 en dissolvant dans de l'ammoniaque aqueuse 3 g d'acide 3,4-dihydroxyphénylpyru-vique, 3 g d'acide L-glutamique et 3 g d'acide L-aspartique, qui 20 est ensuite maintenue à 30°C sous agitation. Après 18 heures, le magma bactérien et la protéine sont éliminés de la liqueur de réaction et le liquide de réaction est mis en contact avec du charbon actif. La "L-dopan adsorbé est éluée à l'eau, puis l'éluat est concentré puis ensuite laissé au repos dans un endroit froid pour 25 obtenir 1,4 g de cristaux bruts de 3,4-dihydroxyphényl-L-alanine. On obtient pour recristallisation de la "L-dopa" brute dans l'eau 1,0 g de "L-dopa" pure. Son spectre d'absorption infrarouge et son chromatogramme en couche mince montre que la "L-dopa" pure correspond au produit de référence pris comme étalon. 30 £a_7^2« -13,2° (C » 3,86 dans 1 N-HCl, 1 = 1). EXEMPLE 2 Une souche de Pseudomonas dachunhae IAM 1048 est inoculée dans 10 litres d'un milieu de culture contenant 2% de glucose et 1% d'une liqueur d'infusion à froid de grains de céréale et est 35 cultivée sous agitation et aération, la valeur initiale du oH étant de 7,0 et à une température de 30°C pendant 70 heures. Le magma bactérien est séparé de la liqueur de culture par centrifugation. On mène a bonne fin une réaction de transamination et une purification comme dans l'exemple 1 en employant 36 g du magma hu-40 mide obtenu.» On obtient 0,75 g de "L-dopa". D'autre part, on ajoute 71 35165 9 2108117 7 kg de sulfate d'ammonium à environ 10 litres du liquide de culture et le liquide de culture est laissé au repos pendant 2 heures ; la protéine précipitée est extraite par filtration et est dialysée oour obtenir une solution d'enzyme. La solution d'en-5 zyme ainsi obtenue est mélangée avec une solution dans laquelle on a dissout 3 g d'acide 3^4-dihydroxyphénylpyruvique et 3 g d'acide asoertique dans de l'ammoniaque aqueuse pour amener la valeur du pH de la solution à 7,4, le volume total de la solution étant complété à 300 ml ; le tout est maintenu à la température de 30°C 10 pendant 25 heures. La réaction étant menée à bonne fin, la orotéi-ne est séparée de la solution et la solution est purifiée comme il est décrit dans l'exemple 1 pour obtenir 0,62 g de cristaux purs de "L-dopa". Le spectre d'absorption infrarouge et le chromatogram-me en couche mince des cristaux montrent que les cristaux corres-15 pondent au produit de référence pris comme étalon. /7 EXEMPLE 3 Une souche de Candida quilliermondii IAM 4412 est inoculée dans 5 litres du milieu de culture décrit dans l'exemple 2 et 20 est cultivée sous agitation et aération avec une valeur de pH initial de 5,0 et à une température de 30°C pendant 67 heures. Le magma qui est séparé du milieu de culture par centrifugation est broyé dans un mortier en verre pour obtenir une solution d'enzyme. Cette solution d'enzyme est mélangée avec une solution de 3 g d' -25 acide 3,4-dihydroxyphényl pyruvique, 3 g d'acide L-glutamique et 3 g d'acide L-aspartique dissouts dans de l'ammoniaque aqueuse oour amener la valeur du pH de la solution à 7,4, le volume total de la solution étant complété à 300 ml» Une réaction de transamination et une purification sont menées à bien comme il est décrit dans 30 l'exemple 1 pour obtenir 0,33 g de cristaux purs de "L-dopa". Le spectre d'absorotion infrarouge et le chromatogramme en couche mince des cristaux montrent que les cristaux correspondent au produit de référence pris comme étalon. [ aj^2 . -12,6° (C = 2,65, dans 1 N-HCl, 1 = 1) 35 EXEMPLE 4 Une souche d'Alcaligones faecalis IAM-1015 est inoculée dans 400 ml du milieu de culture comprenant 1% de glucose, 3% de polyoeotone, 0,3% de chlorure de sodium, 0,15% de phosphate de oo-tassium et 0,01% de sulfate de magnésium et est cultivée sous agi-40 tation a une valeur initiale de dH de 7,0 et à une temoérature de * . 4 71 35165 10 2108117 30°C pendant 48 heures. Le liquide de culture est mélangé avec 2 litres d'une solution dans laquelle on a dissout 12^0 g d'acide 3,4-diméthoxyphényl pyruvique, 6,5 g d'acide glutamique et 6,5 g d'acide L-aspartique dans une solution aqueuse d'hydroxyde de po-5 tassium 1N pour amener la valeur du pH à 8,3, et la solution obtenue est maintenue à la température de 32°C sous agitation pendant 40 heures, puis la valeur du pH de la solution est amenée à une valeur de 2,5 avec une solution d'acide chlorhydrique aqueux à 10% et est centrifugée. La solution surnageante obtenue est con-10 centrée sous pression réduite jusqu'à l'obtention d'un volume total d'environ 600 ml. La solution obtenue est lavée 2 fois avec environ 300 ml d'une solution d'acétate d'éthyle pour extraire et récupérer l'acide 3,4-diméthoxyphényl pyruvique n'ayant pas réagi. La'couche aqueuse est concentrée jusqu'à l'obtention d'un 15 volume d'environ 300 ml,, puis la valeur de son pH est amenée à 4,5 et est laissée au repos pendant une nuit pour obtenir 7,5 g de cristaux bruts de 3,4-diméthoxyphényl-L-alanine. La 3,4-diméthoxyphényl L-alanine restant dans les eaux mères est adsorbée sur du charbon actif et l'adsorbat est élué à l'eau, puis l'éluat est concentré 20 et enfin mis au repos dans un endroit froid pour récupérer 1,8 g de cristaux bruts. . On a-trouvé par chromatographie gazeuse que la pureté de ces cristaux bruts était respectivement de 89% et de 94%. Ces cristaux bruts sont dissouts dans 100 ml d'une solution aqueuse 25 d'acide chlorhydrique à environ 2% et lavés avec de l'acétate d' éthyle pour obtenir des cristaux blancs, puis les cristaux blancs sont recristallisés deux fois par la méthode de précipitation au point isoélectrique. Les cristaux blancs obtenus sont recriatalli-sés une nouvelle fois dans l'eau pour obtenir 5,5 g de cristaux 30 purs de 3,4 diméthoxyphényl-L-alanine, ce qui est confirmé par une chromatograohie en couche mince et une chromatographie gazeuse. Les propriétés physiques et chimiques des cristaux obtenus sont les suivantes : Point de fusion 203,0° à 209,9°C (décomposition) 35 Pouvoir rotatoire [ » -5,75° (C = 3,30, dans 1 N-HCl, 1=1) Spectre d'absorption 3230 Les cristaux sont traités avec de l'acide bromhydrique, ' COpy 71 35165 n puis déméthylés oour obtenir la "L-dopa" d'une pureté optique de 100%. fixj26 = -12,7° (C = 3,56, dans 1 N-HCl, 1 = 1) EXEMPLE 5 5 Une souche de Pénicillium cycloDium IAM 7146 est inocu lée dans un litre d'un milieu de culture comprenant 2% de glucose et 1% d'une liqueur d'infusion à froid de grains de blé et est cultivée sous agitation à une valeur initiale du pH de 5j0 et à une temoérature de 30° pendant 90 heures et le mycélium obtenu est é-10 liminé par filtration du liquide de culture® 12 g du mycélium obtenu sont broyés dans un mortier pour obtenir une solution d'enzyme. Cette solution d'enzyme obtenue est mélangée avec une solution dans laquelle on a dissout 6,5 g d'acide 3,4-diméthoxyphényl pyruvique, 6,5 g d'acide L-glutamique et 6,5 g d'acide aspartique dans 15 une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium 1N et la valeur du pH est amenée à 8,5, et le volume total est amené à 2,5 litres ; ce mélange est maintenu à une"température de 30°C sous agitation pendant 36 heureso Pendant la réaction, la valeur du pH de la solution obtenue est maintenue à 8,3 à l'aide d'une solution aqueuse 20 d'hydroxyde de potassium 1N et d'une solution d'acide chlorhydrique aqueux à 10%. Le mycéliumet la protéine sont éliminés de la solution de réaction par centrifugation et la solution est purifiée par le procédé décrit dans l'exemole 4 pour obtenir 2,9 g de 3,4-dimé-25 thoxyp'nényl-L-alanine pure. Le soectre d'absorption d'infrarouge et le point de fusion des cristaux purs correspondent à ceux du produit obtenu dans l'exemple 1» Z~a_7j55'5 = -5,92° (C = 4,88, dans 1 N-HCl, 1 = 1) 30 EXEMPLE 6 Une souche d'Alcaligones faecalis IAM 1015 est inoculée dans 500 ml d'un milieu de culture comorenant 1% degLUcose, 3% de polypeptone, 0,3% de chlorure de sodium, 0,15% de phosphate de notassium et 0,01 g de sulfate de potassium et est cultivée sous 35 agitation à une valeur initiale du oH de 7,0 et a une température de 30°C pendant 48 heures. Le liquide de culture est mélangé avec 2 litres d'une solution dans laquelle on a dissout 15,0 g d'acide 3-méthoxy-4-hydroxyohényl pyruvique, 15,0 g d'acide L-glutamique et 15,0 g d'acide L-asoar-tique dans une solution aqueuse d'hydroxyde 40 de potassium 1N pour amener le pH à une valeur de 8,5 et la solution COPY 71 35165 12 2108117 obtenue est maintenue à une température de 30° sous agitation pendant 20 heures, puis la valeur du pH de la solution est amenée à 2,5 à l'aide d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 10% et est centrifugée. La solution surnageante obtenue est concen-5 trée sous pression réduite jusqu'à l'obtention d'un volume total d'environ 300 ml. Ensuite, la solution obtenue est filtrée et le filtrat est lavé deux fois avec le même volume d'acétate d'éthyle que celui du filtrat pour extraire et récupérer l'acide 3-méthoxy-4-hydroxyphényl pyruvique. La valeur de pH de la couche aqueuse est 10 amenée à 4,5 et la couche aqueuse est mise à reposer pour une nuit dans un endroit froid pour obtenir 5,2 g de cristaux bruts de 3-mé-thoxy-4-hydroxyphényl-L-alanine. La pureté des cristaux est de 90% d'après une détermination par chromatographie gazeuse. Les cristaux sont dissouts dans 100 ml d'une solution aqueuse d'acide chlo-15 rhydrique à environ 2% et lavés avec de l'acétate d'éthyle. Les cristaux traités comme ci-dessus sont recristallisés 2 fois par le procédé de précipitation au point isoélectrique pour obtenir des cristaux blancs purs. Les cristaux blancs purs sont à nouveau recristallisés dans l'eau et on obtient 3,6 g de cristaux de 3-métho-20 xy-4-hydroxyphényl-L-alanine reconnus purs par chromatographie en couche mince et par chromatographie gazeuse. Les propriétés physiques et chimiques de ces cristaux sont les suivantes : Point de fusion 208°-212°C (décomoosition) o K 25 Pouvoir rotatoire £oc_7j-, * -5,60 (C = 3,05 dans 1 N-KCl, 1 s 1) Spectre d'absorption 3280 (NHg+) infrarouge (la pou- 1 dre est empâtée dans 1627 (C00~) £ cm"* J une huile de paraf-30 fine pure dite nujol) Les cristaux sont traités avec de l'acide bromhydrique puis déméthylés pour obtenir la "L-dopa" d'une pureté optique de 100%. = -12,3° (C = 3,56 dans 1 N-HCl, 1 = 1) 35 EXEMPLE 7 Une souche de Pseudomonas melanogonum IAM 1554 est inoculée dans 500 ml d'un milieu de culture contenant 0,2% de glucose, 0,5% d'acide casaminique, 0,5% d'extrait de levure, 0,3% de phosphate dipotassique et 0,1% de phosphate monopotassique et est cul-40 tivée sous agitation à une valeur initiale du pH de 7,0 et à la température de 30°C pendant 48 heures. Le liquide de culture est 71 35165 13 2108117 mélangé avec une solution dans laquelle on a dissout 15,0 g d' acide 3-méthoxy-4-hydroxyphényl pyruvique, 15;0 g d'acide L-glutamique et 15,0 g_d'acide L-aspartique dans une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de potassium pour amener le pH à une valeur de 5 8,3 ; on ajoute à la solution obtenue 1,0 rag de phosphate de py-ridoxal, le volume total est amené à 2,5 litres et le tout est maintenu à la température de 30°C. Après 40 heures, on récupère, comme il est dit dans l'exemple 6, 4,8g de 3-méthoxy-4-hydroxyphé~ nyl-L-alamine sous forme de cristaux purs. Le spectre d'absorption 10 infrarouge et le point de fusion des cristaux purs correspondent a ceux du produit obtenu dans l'exemple 1. /"ajp5 = -5,63° (C = 3,07 dans 1 N-HCl , 1 = 1). 71 35165 2108117 REVENDICATIONS 1» Procédé de préparation de phényl-L-alanines 3,4-disubstituées représentées par la formule générale R10 r2o —.ch2-çh-cooh ( i ) nh2 12 où R et R , identiques ou différents, représentent l'atome 2 d'hydrogène et le radical méthyle, pourvu que R ne soit pas •j un méthyle quand R est un atome d'hydrogène, caractérisé en ce que des dérivés 3,4-disubstitués de l'acide phénylpyruvique, de formule générale R10 -CH0-CO-C OOH (II) 1 2 \—/ ^ où R et R ont la même signification que ci-dessus, sont transaminés en présence de donneurs du radical aminé, à l'aide d'enzymes de microorganismes, qui peuvent catalyser la transamination entre l'acide phénylpyruvique 3,4-disubstitué et les donneurs du radical aminé, lesdits microorganismes étant choisis parmi les bactéries Pseudomonas, Alcaligones, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Afycobacterium, Nocardia, Brevibacterium, Staphylococcus, Arthrobacter, Gluconobacter et Achromobacter, les moisissures des classes des Aspergillus, Pénicillium, Mu-cor, Helicosttlum et Tramates et levures des types Rhodotorula, Candida et Saccharomyces. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le donneur du radical aminé est l'acide L-glutamique, la L-alani-ne, l'acide L'aspartique, la glycine, les peptones et les hydro-lysats de protéines seuls ou en mélange. 30 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la bactérie est Alcalinoges faecalis. 4» Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la bactérie est Pseudomonas dachunhae. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la bactérie est Pseudomonas melanogonum. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la moisissure est Pénicillium cyclopium. 7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la 71 35165 15 2108117 levure est Candida guilliermondii. 8. Procédé selon une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la transamination est conduite entre 25° et 45°C avec un pH de 6,5 a 10,5, en 20 à 60 heures. 9) Procédé selon une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'enzyme est employé sous la forme de solution, de magma ou/et de mycélium broyés de microorganismes. 10. Procédé selon une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'enzyme est employé sous forme de magma ou/et de mycélium séché de microorganismeso 11. Procédé selon une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'enzyme est employé sous la forme du bouillon de fermentation des microorganismes. 12<> Procédé selon une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'enzyme est employé après sa purification.