Brevet FR2070125A1 — publié le 19710910

La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique qui est utile comme agent de labilisation des lysosomes dans le traitement du cancer et concerne, plus particulièrement, une nouvelle composition pharmaceutique contenant de la lipoprotéine-lipase en tant que substance active en 5 combinaison avec un véhicule acceptable du point de vue pharmaceutique. A l'heure actuelle, la chimiothérapie du cancer est confrontée avec une variété infinie de problèmes non résolus. C'est ainsi par exemple que, dans le traitement conjoint du cancer par des interventions chirurgicales et par la radiothérapie, on ne sait pas encore exactement quelles techniques donnent 10 les meilleurs résultats. De plus, grand nombre de cancers ne réagissent pas à la radiothérapie ou ne peuvent pas être enlevés par voie chirurgicale, et même les cancers qui réagissent dans une certaine mesure à ces thérapeutiques donnent lieu à des rechutes après le traitement. Il semble tout à fait possible, en se fondant sur les progrès récents de la technologie, qu'un grand 15 nombre de ces problèmes ne tarderont pas à trouver une solution, au moins partielle, par une utilisation accrue d'agents anti-cancéreux ou d'agents carcinostatiques ayant une action sur les tumeurs malignes. On espère que ces nouveaux agents auront un effet considérable sur le contrôle des dimensions, de l'étendue et de la forme d'un grand nombre de cancers et qu'ils 20 renforceront aussi l'efficacité des techniques de traitement existantes. On vient de découvrir que les lysosomes jouent un rôle important pour accélérer la dégénération et la décomposition des cellules cancéreuses quand le cancer est traité avec un agent anti-cancéreux. Plus précisément, on vient de découvrir que les lysosomes contiennent des enzymes appartenant au groupe 25 des hydrolases qui sont capables de dissoudre le composant cellulaire du cancer et que la séparation de ce composant peut être accélérée par la présence de lipoprotéine-lipase . En conséquence, l'un des buts de la présente invention est de fournir une nouvelle composition pharmaceutique qui est utile comme agent de labili-30 sation des lysosomes dans le traitement du cancer. Un autre but de l'invention est d'apporter une composition pharmaceutique qui utilise la lipoprotéine-lipase comme substance active. Enfin, l'invention se propose aussi de fournir un procédé pour produire de la lipoprotéine-lipase pure. 35 Selon l'invention, on prépare la lipoprotéine-lipase par addition d'un agent de précipitation à un bouillon de culture obtenu en cultivant une souche de Mucor produisant de la lipoprotéine-lipase pour obtenir un dépôt de l'enzyme brute. Cette enzyme brute est ensuite purifiée par filtration sur gel. 40 Selon la présente invention, on utilise par exeraple, Mucor javanicus 70 36514 2 2070125 comme souche productrice de lipoprotéine-lipase. Cette souche est cultivée par un procédé de culture classique dans un milieu connu. On filtre le bouillon de culture et on ajoute un agent de précipitation au filtrat afin de précipiter la fraction active de celui-ci. Parmi les agents de précipitation propres à 5 être utilisés dans ce procédé, on peut citer le sulfate d'ammonium, l'acide benzoïque, le méthanol, l'éthanol et l'acétone. L'enzyme active brute peut être précipitée en amenant le bouillon de culture à un indice de saturation d'Osborn compris entre 0,1 et 0,4 avec du sulfate d'ammonium. L'enzyme brute obtenue par le procédé ci-dessus peut être purifiée par 10 filtration sur gel en utilisant un produit tel que celui commercialisé sous la dénomination Sephadex et, le cas échéant, peut être purifiée davantage par dialyse et/ou au moyen de résines échangeuses d'ions. C'est ainsi, par exemple-, qu'un bon procédé de purification est le suivant: 15 On dissout l'enzyme brute dans une petite quantité d'eau et on la dialyse par rapport à l'eau. On fait passer le liquide dialysé à travers une colonne de Sephadéx G-75 et on recueille la fraction active, puis on la traite avec de la CM-cellulose. On fait passer ensuite le liquide traité deux fois à travers une colonne contenant du Sephad ax G-200 et on recueille les fractions actives 20 pour obtenir de la lipoprotéine-lipase extrêmement pure. Les propriétés chimiques et physiques de la lipoprotéine-lipase obtenue par le procédé selon l'invention ne sont pas encore entièrement déterminées, mais les résultats d'essais suivants montrent son utilité comme agent de la-bilisation des lysosomes dans le traitement du cancer. 25 On recueille des cellules du sarcome d'Yoshida prélevées le quatrième jour après l'implantation dans la cavité péritonéale de rats albinos Donryu. On décompose ces cellules dans un homogénéiseur et la fraction contenant les mitochondries, qui renferme une grande partie des lysosomes déposés par l'action centrifuge, est mise en suspension dans un milieu contenant une solution 30 tampon d'acide chlorhydrique à 0,001 MEDTA et à 0,25 M-saccharose. On ajoute de la lipoprotéine-lipase à ce milieu que l'on cultive pendant 30 minutes à 30° C, après quoi, on mesure l'activité libre des lysosomes dans le milieu (acide-déoxyribonucléase, p -glucuronidase). On compare l'activité enzymatique avec l'activité libre de la lipoprotéine-lipase observée 35 dans le milieu par comparaison avec une activation de 100 °L quand du Triton X-100 (concentration finale 0,1 °L) a été ajouté au bouillon de culture. Il ressort de ces essais que l'activité libre de 1'acide-déoxyribonucléase et de la -glucuronidase dans le milieu augmente lorsque la concentration de la lipoprotéine-lipase ajoutée au milieu de culture est augmentée. L'ac-40 tivité libre atteint approximativement son maximum à la concentration de 70 36514 3 2070125 125 {/ml de lipoprotéine-lipase. De plus, on a pu démontrer que les lysosomes sont rendus labiles par la lipoprotéine-lipase et que l'activité de cette dernière sur les lysosomes présente sa valeur la plus élevée à un pH de 7,5. Aucune activité lysosomique n'est observée dans la lipoprotéine-lipase 5 quand on la chauffe à 100° C pendant 30 minutes ou à 60° C pendant 10 minutes. Quand on combine la lipoprotéine-lipase avec des médicaments anti-can-céreux classiques, elle tend à stimuler leurs propriétés anti-cancéreuses. C'est le cas par exemple lorsqu'on associe la lipoprotéine-lipase à la Mitomycine C. 10 Au quatrième jour après l'implantation des cellules de sarcome d'Yoshida dans les rats Donryu, on injecte de la lipoprotéine-lipase dans la cavité péritonéale. Les composants cellulaires, à l'exclusion des noyaux des cellules de la tumeur, sont collectés respectivement une heure et deux heures après l'administration. Ces cellules sont centrifugées pendant 40 minutes à 75 000 g 15 On mesure le sédiment obtenu, dose 1'acide-déoxyribonucléase, la |J-glucuronidase et l'acide-phosphatase dans le liquide surnageant et détermine l'activité par cellule. On injecte la Mitomycine C par voie sous-cutanée, à la dose de 5 mg/kg, une heure après l'administration de la lipoprotéine-lipase Une heure plus tard, on mesure l'activité des enzymes hydrolytiques des cellu-20 les de la tumeur. On mesure aussi l'influence sur les cellules du sarcome d'Yoshida traitées par la lipoprotéine-lipase et/ou par la Mitomycine C comparativement à l'activité de diverses enzymes lysosomiques. Temps après injection de la lipoprotéine-lipase (LPL) et de la Mitomycyne-C (MMC) (h) ; ! Enzymes j Fraction | hydrolytiques j f 1 Témoin LPL seulement MMC seulement LPL et MMC * 12 1 1 Acide-Deoxyribonuclease j Fraction sédimentable: a) libre b) liée c) totale 2,5- 0,3 6,9- 0,8 9,4- 0,6 2,9 * 0,6 7,1 { 0,3 10,1 - 0,8 3,4 - 0,6 10,1 î 1,7 13,6 - 1,4 2,8 ï 1,4 9,4 l 1,3 12,2 - 1,6 3,8 - 0,7 8,2 i 0,8 12,0 - 0,9 Fraction non sédimentable : totale 0,6- 0,2 1,1 - 0,2 0,8 - 0,3 3,o;î 1,3 2,0 * 0,8 -glucuronidase Fraction sédimentable: a) libre b) liée c) totale 2,8^ 0,3 8,6- 1,5 11,5* 1,2 2,5 î 0,3 11,1 î 0,4 13,6 - 1,9 3,8 ï 0,2 13,1 - 0,9 17,0 - 0,7 2,0 - 0,3 12,2 ~ 0,9 14,1 - 1,2 4,9 - 0,6 12,9 - 1,3 17,8 ï 1,6 Fraction non sédimentable : totale 0,5* 0,2 1,0 - 0,2 0,8 - 0,1 0,5 t 0,2 2,2 - 0,8 Acide-Phosphatase Fraction sédimentable: a) libre b) liée c) totale ; 1,8± 0,2 0,2- 0,007 2,0* 0,1 2,0 - 0,3 0,4 - 0,1 2,4 - 0,1 2,9 - 0,1 0,5 i 0,1 3,3 - 0,3 2,7 - 0,3 0,6 - 0,2 3,3 0,1 3,2 - 0,3 0,8 - 0,2 4,0 - 0,5 Fraction non sédimentable : totale 0,5± 0,07 0,6 ±. 0,02 0,7 ± 0,03 0,7 ± 0,07 1,3 ± 0,2 La mitomycine C a été injectée une heure après la lipoprotéine-lipase. Activité enzymatique ( moyenne + erreurs standard). Acide-déoxyribonuclease en pg total P libéré par 1,10^ cellules/15 mn P> - glucuronidase en jug p-nitrophénol libéré par 1,10? cellules/15 mn Acide-phosphatase dans 100 Jig p-nitrophénol libéré par l#lû7 cellules/15 mn 70 36514 5 2070125 La composition selon l'invention peut être administrée par voie orale ou rectale ou par injection hypodermique, intramusculaire ou intraveineuse, mais l'administration orale est la plus favorable. Comme véhicule non toxique du point de vue physiologique pouvant être 5 utilisé pour préparer la composition de l'invention, on peut adopter les diluants, les liants, les agents de désintégration et les lubrifiants couramment utilisés en pharmacie. Plus précisément, on peut utiliser des diluants solides, tels que le lactose, le sucre blanc, le carbonate de calcium, le kaolin, le silicate de magnésium et d'alumine, l'hydroxyde d'aluminium et le carbonate 10 acide de sodium; et des diluants liquides, tels que l'eau, comme liants d'injection, par exemple sous la forme de solution de gomme arabique, de gélatine, de dextrose, d'alginate de sodium, d'éthanol et d'eau distillée, comme désin-tégrateurs, on peut citer l'amidon, le carbonate de calcium et le carbonate d'hydrogène; et comme lubrifiants, le stéarate de calcium, le stéarate de 15 magnésium, le talc, le polyéthylène-glycol et le monostéarate de polyoxyéthy-lène. Il n'y a aucune restriction particulière en ce qui concerne le mode d'administration,et la composition selon l'invention peut être administrée sous la forme d'une poudre, ou encore^ de granules, de comprimés ou de 20 comprimés à effet retard, de capsules, d'un liquide ou sous d'autres formes orales. EXEMPLE On mélange 20 g de l'enzyme brute obtenue par addition d'éthanol à une culture de Mucor javanicus avec 200 ml d'eau pendant 20 minutes à 4-6° C . On 25 centrifuge ce mélange à 12 500 g pendant 15 minutes à 2° C et on sépare le liquide surnageant. On amène le liquide surnageant à un indice de saturation Osborn de 0,1 à 0,4 avec du sulfate d'ammonium en agitant constamment et lentement. Après avoir laissé le mélange reposer pendant une nuit à 3° C, on le centrifuge à 12 500 g pendant 15 minutes et on observe la formation d'un pré-30 cipité. On dissout ce précipité dans 20 ml d'eau et on le laisse dialyser par rapport à de l'eau froide pendant une journée. On centrifuge la solution dialy-sée à 12 500 g pendant 15 minutes pour éliminer le précipité. On fait passer la solution obtenue auparavant à travers une colonne de Sephadex G-75 (5 x 80 cm) à 4-6° C, introduit constamment dans la colonne une solution tampon de phos-35 phate à 0,01M (KH2P0^ et N^HPO^, pH é.0) et maintient la vitesse d'élution à 60 ml/h. On recueille des fractions de 10 ml et on analyse leur teneur en protéines et l'activité de la lipase. On centrifuge les fractions de lipase ainsi obtenues à 12 500 g pendant 15 minutes» On place le liquide surnageant obtenu ci-dessus dans une colonne 40 (5 x 40 cm) de CM-cellulose qui a été équilibrée avec une solution tampon à 70 36514 6 2070125 OjOlM de phosphate. On lave cette colonne avec la même solution tampon sous un débit de 100 ml/h et on recueilled.es fractions de 19 ml. On combine les fractions enzymatiquement actives et on les centrifuge à 12 500 g pendant 15 minutes pour éliminer le précipité. 5 On fractionne le liquide surnageant dans une colonne (5 x 61 cm) de Sephadex G-200 en utilisant une solution tampon de phosphate à 0,01M comme éluant et on maintient la vitesse d'élution à 30 ml/h. On obtient une pointe de protéine présentant une activité lipolytique. On combine les fractions ayant une activité lipolytique et on les purifie par centrifugation à 12 500 g. On 10 soumet le liquide surnageant à une chromatographie dans une colonne de Sephadex G-200 dans les conditions indiquées ci-dessus. On dialyse les fractions présentant une activité lipolytique par rapport à de l'eau froide et on les lyophylise pour obtenir de la lipoprotéine-lipase pure. La lipoprotéine-lipase ainsi obtenue s'est révélée être un agent de 15 labilisation des lysosomes quand on l'utilise pour traiter les cellules cancéreuses enlevées de mammifères saignés à chaud. Sa fonction comme agent de labilisation des lysosomes s'est révélée renforcer effectivement l'action carcinostatique ou anti-cancéreuse des antibiotiques connus et s'est révélée être un adjuvant efficace dans le traitement du cancer ou du carcinome. 20 II va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées à l'exemple représenté et décrit, sans sortir pour autant du cadre de l'invention. 70 36514 7 2070125 REVENDICATIONS 1.- A titre de médicament utilisable comme agent de labilisation des lysosomes, une composition renfermant de la lipoprotéine-lipase en combinaison avec un véhicule pharmaceutique. 5 2.- Procédé de préparation de lipoprotéine-lipase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche de Mucor productrice de lipoprotéine-lipase, à ajouter un agent de précipitation au bouillon de culture de façon à produire un dépôt d'enzyme brute et à purifier cette enzyme brute par filtra-tion sur gel. 10 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite sou che de Mucor productrice de lipoprotéine-lipase est Mucor javanicus. 4.- Procédé selon les revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on soumet l'enzyme brute à une nouvelle purification par dialyse par rapport à l'eau et puis à un passage sur une résine échangeuse d'ions.