Brevet FR2088231A1 — publié le 19720107

L'invention a pour objet un médicament immuno-stimulant, permettant d'augmenter l'immunité non spécifique de l'organisme, notamment pour le traitement des affections tumorales, ainsi que les procédés de préparation de ce médicament. 'invention a pour but de fournir un tel médicament qui soit d'une fabrication économique et dont les étapes sont faciles à contrôler, et qui présente une activité, sous forme de l'accroissement de l'immunité non spécifique de l'organisme, supérieure à celle des médicaments immuno-stimulants connus, tels que par exemple le B.C.G ou les produits. à base de corynebactéries. le médicament selon l'invention, est caractérisé par le fait qu'il se compose d'ine suspension, par exemple, aqueuse, de bactéries du genre Brucella inactivées dont 10 à 5G co sont entières, les autres étant sous forme d'un lysat bactérien. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, on utilise la souche de Brucella abortus B 19, en phase lisse. Toutefois, des résultats satisfaisants peuvent être obtenus à l'aide d'autres souches de Brucella, par exemple des souches appartenant aux espèces abortus, melitensis ou suis. Dans une variante de l'invention, un antiseptique, tel que du merthiolate de soude par exemple, peut être ajouté à la suspension aqueuse. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel médicament, caractérisé par le fait qu'on cultive une souche de Brucella, de préférence la souche Brucella abortus B 9 en phase lisse, que l'on récolte et lave la culture bactérienne, pour en faire une suspension dans l'eau distillée à une concentration de 1 à 10 mg de poids sec par ml, qu'on inactive les bactéries, qu'on lyse cette suspension, de préférence par action des ultrasons, jusqu'à obtenir la rupture de 5 à 90 4 des cellules et qu'éventuellement on ajoute un antiseptique. La rupture des cellules peut être obtenue par action physique ou action chimique, l'action phi situe pouvant comprendre l'action des ultrasons, le broyage par billes de verre, ou encore l'action d'un liquide environnant d'unecomposition contrastant fortement avec la teneur de la matière cellulaire. 'action chimique peut s'effectuer à l'aide d'enzymes tels que la trypsine la papaïne ou la pepsine, ainsi qu'à l'aide d'acides tel que l'acide trichloracétique et de bases. Les médicaments ainsi préparés peuvent coraprendre par exemple de 1 à 5 mg de produit bactérien elL poids sec par ml. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante faite à titre d'exemple non limitatif. PREMIER EÌ'IPlE DE PREPARATION : Pour préparer un médicament selon l'invention, on cultive une souche lisse de Brucella abortus B 19 sur milieu solide Albimi-Agar en boîte de Roux pendant une durée de 72 heures à 370 C. On sépare ensuite les bactéries du milieu grâce à l'action de billes de verre, la concentration au broyage~étant de 8 mg sec par ml. Les bactéries sont ensuite lavées par centrifugation et mises en suspension dans de l'eau distillée. On effectue ensuite l'inactivation des bactéries à la chaleur et on contrôle la stérilité du produit obtenu. Cette suspension est ensuite soumise à l'action des ultrasons sur un appareil du type H.S.E à 20 kilocycles par seconde pendant deux fois vingt minutes. Un contrôle de rupture effectué à l'hématimètre après cette lyse permet de constater que 85 % des cellules ont été détruites. Un antiseptique tel que du merthiolate de soude peut éventuellement être ajouté. DEUXIEME ZIPPE DE PREPARAlION Les bactéries de la souche Brucella abortus B 19 lisse cultivées comme dans l'exemple précédent, sont récupérées à l'aide de billes de verre et d'eau physiologique, les cellules étant lavées trois fois par centrifugation, à la suite de quoi le culot est mis en suspension dans l'eau pysiologique, le poids de matière sèche étant compris entre 1 et 2 mg par ml. On effectue ensuite une lyse de cette suspension à la trypsine, à pli 8, la dose de trypsine étant de 0,05 mg par ml. Cette lyse se poursuit pendant 24 heures à 40 C.La trypsine est ensuite inactivée par un inactivateur spécifique tel que l'iniprol et la concentration bactérienne est ajustée entre I à 5 mg par nl. ES SUR 9UR LES TUMEURS EXPERIMENTALES DE SOURIS Dans un premier essai, un certain nombre de souris subissent une inoculation de 106 cellules de la teneur greffée carcincric u Ehrlich. A la suite de cette inoculation, les témoins retirent entre 12 et lu jours. Les souris traitées reçoivent 4 :Olz avant l'inoculation une quantité de médicament correspondant à 500 microgrammes de matière sèche par voie intrapéritorléale. On obtient une prolongation du délai de survie des souris traitées de plusieurs jours et même dans certains essais une absence d'évolution tumorale sur quelques animaux. Cet essai a été fait comparativement avec l'administration du B.C.G et de corynebactérium parvun ou anerobium, pour lesquels les résultats sont inférieurs. Les résultats obtenus avec le médicament selon l'invention sont également supérieurs aux résultats obtenus avec des Brucella non lysées. Dans un autre essai, pour une même inoculation de la tumeur, les injections du médicament ont été faites, la première 4 jours avant l'inoculation, la seconde, 3 jours après et la troisième, 7 jours après l'inoculation. On a constaté 50 % de survies chez les souris traitées. De bons résultats ont également été obtenus pour des injections effectuées seulement après l'inoculation de la tumeur, respectivement 3, 5 et 7 jours après cette inoculation. Le médicament selon l'invention est donc indiqué comme immuno-stimulant en association avec un traitement spécifique. les injections du médicament selon l'invention peuvent etre faites par exemple pendant des périodes de 15 jours séparées par des périodes de traitement spécifique, parexemple à raison d'une injection de 1 à 5 ml tous les deux jours durant ces périodes de 15 jours. REVENDiCTi0NS 1. Médicament immuno-stimulant, caractérisé par le fait qu'il se compose d'une suspension de bactéries Brucella inactivées dont 10 à 50 yo sont entières, les autres étant sous forme de lysat bactérien. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les bactéries sont des Brucella abortus B 19. 3. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la suspension comporte en outre un antiseptique. 4. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la teneur en produit bactérien est comprise entre 1 et 5 mg(poids sec) par ml. 5. Procédé de préparation du médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on cultive une souche de Brucella, que l'on récolte et lave la culture bactérienne pour en faire une suspension aqueuse dont la concentration en matière sèche est de 1 à 10 mg par ml, qu'on inactive les bactéries et qu'on lyse la suspension jusqu'à obtenir la rupture de 50 à 90 ,b des cellules. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on ajoute un antiseptique tel que du mertniolate de soude. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que la lyse des bactéries s'effectue par l'action des ultrasons. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que la lyse des bactéries s'effectue par l'action d'une enzyme telle que la trypsine. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, utilisant des Brucella abortus B 19, caractérisé par le fait que la souche de Brucella est cultivée en phase lisse. 10. Procédé selon les revendications 7 et 9, caractérisé par le fait que la suspension de bactéries est soumise à l'action des ultrasons sur un appareil du type h.S.E à 20 kilocycles par seconde pendant deux fois 20 minutes. 11. Procédé selon les revendications 8 et 9, caractérisé par le fait que la suspension est soumise à l'action de la trypsine, à pH 8, la dose de trypsine étant de 0,05 mg par ml pendant une durée de 24 heures à 400 C, à la suite de quoi la trypsine est inactivée par un inactivateur spécifique.