Brevet FR2092137A1 — publié le 19720121

L'invention concerne la préparation d;un vaccin pour poussins et plus particulièrement un procédé pour la préparation d'un vaccin désactivé pour 1'immunisation de poussins contre la maladie de Marek (désignée ci-après simplement par "MD"). La maladie de Marek est une maladie virale se propageant dans la lymphe qui est extrêmement contagieuse et se répand principalement dans des groupes de jeunes poussins. En conséquence, la maladie a été reconnue comme un genre de leucémie l^mphoïde. Mais, Biggs distingue cette maladie de la leucémie des poussins (l96l) et appelle cette maladie maladie de Marek", après que Marek l'ait découverte pour la première fois • Au Japon, la maladie de Marek s:est répandue depuis environ 1965 et a provoqué une mortalité importante et des pertes économiques dans des élevages commerciaux de poussins. En outre, il est à noter que la maladie de Marek a été utilisée comme un modèle pour les recherches sur le virus cancéreux des humains• En ce'qui concerne un vaccin vivant contre MD, il a jusqu'à maintenant été proposé d employer une culture de tissus de reins de poussins (A.E. CHURCHILL)„ Toutefois, dans le rapport de CHURCHILL n'a pas été mentionnée une évidence illustrant la capacité non virulente des vaccins préparés par lui. Bien plus, il faut noter que l'emploi de rein de poulet comme un milieu pour la culture du virus MD présente de tels inconvénients qu'il exige des opérations compliquées qui sont désavantageuses du point de vue industriel et qu:il.est accompagné par un risque d'induction défavorable du virus de leucémie de poussins sauvages dans les vaccins MD produits. A la suite des travaux de CHURCHILL divers essais ont été faits pour préparer un vaccin MD vivant. Cependant, du fait que, dans un vaccin vivant, l'activité vaccinale ne peut être maintenue que dans les conditions où des cellules infectées par le virus MD sont vivantes, les vaccins vivants MD présentent certains défauts inhérants. Par exemple, pour pouvoir stocker des vaccins vivants MD pour une longue période de temps, ils doivent être maintenus dans des conditions impératives, telles que des températures très basses, causant des difficultés pour leur stockage ou leur transport. En -outre, il est particu- 71 11806 2092137 lièrement à noter que, si les virus MD de vaccins sont suffisamment actionnés et si leur activité de provocation de la maladie est éteinte, il y a un certain risque à ce que le virus non virulent puisse provoquer une mutation en retour, intéressant le 5 problème de la sécurité. Dans le domaine de la production de vaccins, il a été généralement proposé de réaliser un vaccin non actif de sorte que les défauts mentionnés ci-dessus d'un vaccin vivant puissent.être éliminés. A ce sujet, il est à noter que le virus 10 MD est du type associé à la cellule. Ainsi, la production d'un vaccin MD inactivé a été hors de considération, même parmi les spécialistes. Cependant, une étude approfondie a montré, conformément à l'invention, qu'un vaccin MD désactivé par une métho-15 de d'inactivation ordinaire est efficace comme vaccin immunisant pour MD. L'invention a pour objet un vaccin désactivé contre la maladie de Marek caractérisé par ce qu'il comprend un virus de la maladie de Marek qui a été cultivé dans un milieu 20 de culture comprenant un tissu d'embryon d'un oiseau choisi parmi le groupe d'oiseaux ressortissant à l'espèce oie et oiseaux ressortissant à l'espèce poule, ce virus de la maladie de Marek n'étant pas infectieux. Une recherche appronfondie a été faite concer-25 nant un milieu de culture convenable pour l'isolation, l'adaptation et la propagation du virus MD. On a trouvé que les tissus d'embryon d'oiseaux ressortissant aucgroupes oie et poule, tels que poussins, cailles; canards, dindons et faisans, conviennent tous pour ce but. Cette découverte a été la base d'une série de 30 recherches relatives aux vaccins MD. A ce propos, il a été constaté, d'une manière précise, que les virus prélevés sur des oiseaux infectés autres que les poussins, par exemple les dindes, ne doivent pas être dénommés virus MD, mais devraient être dénommés plus généralement virus contre l'herpès. Cependant, par sim-35 plification ils seront dénommés ci-après virus MD. D'autre part, conformément à la présente invention, il est prévu -un procédé pour la préparation de vaccins MD désactivé,caractérisé en ce qu'on cultive un virus de la maladie de Marek isolé dans un milieu de culture comprenant un tissu 40 d'embryon d'un oiseau choisi dans les groupes mentionnés plus 71 11806 2092137 haut, et l'on procède ensuite à la désactivation. Dans la pratique de la présente invention, l'isolation du virus MD à partir des oiseaux infectés et l'adaptation, la croissance et la propagation de l'agent cytopathogé-5 nique associé à la cellule et isolé, peuvent être effectués par les procédés ordinaires bien connus" Les cultures de cellules ainsi obtenues peuvent également être inactivées par les procédés ordinaires, par exemple par un traitement à la formaldéhyde ou par congélation 10 et dégel. A ce sujet, comme indiqué précédemment, on observe le fait surprenant que le virus MD associé à la cellule est infectieux après avoir été inactivé et efficace pour l'immunisation de poussins contre le MD. Les cultures de tissus d'embryons inactivé 15 de virus MD sont mis en forme de vaccins inactivés MD commerciaux. Comme décrit ci-dessus, conformément à la présente invention, on peut préparer simplement et économiquement un vaccin MD inactivé ayant une activité immunisante. En 20 outre, il est particulièrement avantageux qu'un vaccin conforme à la présente invention puisse éliminer complètement la manifestation de la maladie, en opposition au vaccin vivant MD traditionnel, avec lequel existe un risque que le virus virulent puisse provoquer des mutations en retour contraire à la sécurité. 25 Les exemples suivants sont donnés comme illus tration de la présente invention sans limiter l'étendue de son domaine. EXEMPLE 1 : un embryon de canard âgé de treize jours a été décapité, amputé et vidé et ensuite haché. Une solu-30 tion de Hanks oontenant 0,25 % de trypsine lui a été ajoutée, opération suivie par un traitement conforme à la procédure ordinaire pour disperser les cellules. La dispersion obtenue a été soumise à une centrijÇugation à basse vitesse pour éliminer la phase aqueuse et elle a été ensuite mise en suspension dans une 35 solution de culture de Eagle contenant 10 % de cérum de veau 6 3 à une concentration d'environ 1 X 10 cellules par cm . La suspension ainsi obtenue a été versée par 3 fractions de 100 cm dans des flacons de Roux ayant chacun une 3 capacité de 1000 cm . Ils ont été déposés dans un incubateur kO à 37° C pendant 24 heures. Après cela, la culture de tissus 71 11806 2092137 dans les flacons de Houx a été inoculée avec une suspension de cellules infectées par le virus MD à une concentration environ 5 3 1 X 10 cellules par cm . On a laissé séjourner dans un incubateur à 37° C pendant 48 heures. Ensuite, la solution de culture a 5 été retirée et à sa place on a versé une solution de Eagle. La culture a été poursuivie jusqu'à ce qu'on obtienne un effet cytopathique (CPE) dans la totalité des cellules. L'opération de culture a été ensuite terminée, après quoi la suspension de culture a été retirée des flacons. Dans le flacon on a ajouté 10 cm"' d'une solution d' éthylènediaminetétraacétate de sodium à 0,02 %, suivie par un repos de 20 minutes à la température du local. On a alors détaché et retiré les cellules fixées à la paroi du flacon et on les a ajoutées à la suspension de culture qui en avait été retirée. On a examiné chacune des suspensions *5 de culture de tissus d'embryons infectés ainsi obtenues du point de vue de diverses propriétés en accord avec le règlement sur l'approbation des vaccins. A la suspension de culture de tissus d'embryons infectés, on a ajouté de la formaldéhyde à une concentration de 0,025 % et l'on a chaufé à 37° C pendant 24 heures. Après quoi, on a laissé au repos dans un équipement refroidi à k° C jusqu'à ce que le pouvoir infectieux du virus MD ait été complètement éteint. Le produit a été mis sous la forme commerciale de vaccin MD désactivé. 25 Par exemple, on a ajouté du phosphate d'alumi nium à la culture désactivée en suspension dans la formaldéhyde 3 ci-dessus mentionnée, à une concentration de 3 mmg par cm, pour obtenir un produit A. D'Autre manière, on a ajouté à la suspension une quantité d'équivalents d'adjuvant de Freund, pour 30 obtenir le produit B sous la forme d'une émulsion du type eau-dans-huile . En vue de confirmer l'effet immunisant de vaccin désactivé MD conforme à la présente invention, on a effectué des essais employant chacun 100 poussins. Le muscle de la région 3 35 fémorale du poussin a été inoculé avec 0,5 cm du vaccin désactivé MD, à trois reprises. Deux semaines après l'inoculation les poussins ont été élevés en commun avec des poussins atteints du MD dans le même local pendant 150 jours. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 '. 71 11806 5 2092137 TABLEAU 1 Type de vaccin Age du poussin à l'inoculation (en jours) Taux de mortalité dû à MD 5 1ère inoculation 2ème inoculation 3ème ino-culation 1 A 3 10 17 6 7 l4 21 4 10 B 3 10 17 . 3 7 l4 21 4 A Contrôle 27 15 (non inoculation) NOTA : les poussins malades et morts ont été soumis à l'autopsie et examinés et ils ont tous été constatés atteints de MD. 20 Comme le montre le tatieau 1, les deux types de vaccin MD désactivé préparés en employant des tissus d'embryons de canards ont montré la même activité significative de prévention contre MD. EXEMPLE 2 : La suspension de tissus d'embryons infectée par vi-25 rus MD, préparée de la même manière que dans l'exem ple 1, a été soumise à congélation et dégel (C). Elle a été traitée par ondes sonores, 150 W, 20 KC, pendant 2 à 15 heures (D) ou séchée par congélation (E) . Les trois types de suspension ainsi obtenus ont été examinés et on a constaté qu ' i3s n ' éàient 30 pas infectieux. On a ajouté à chacun d'eux une quantité équivalente d'adjuvant de Freund. Ainsi, les trois types de vaccin à adjuvant étaient préparés. EXEMPLE 3 : en employant ces tissus d'embryons de cailles, âgés de 13 jours, et des tissus d'embryons de poulets, 35 âgées de 11 jours, on a préparé deux types de vaccins MD de la même manière que décrit dans l'exemple 1. On a ajouté à chacun 3 du phosphate d ' aluminixim à la concentration de 2,5 mmg par cm pour obtenir les vaccins (F) et (G). En vue de trouver l'effet immunisant des vac-cins MD, des essais ont été effectués. Chacun des vaccins (F) et 71 11806 2092137 (G) a été inoculé à trois reprises à des poussins de 7 jours, l4 jours et 21 jours. Deux semaines après l'inoculation, ils ont été élevés en commun avec des poussins atteints de MD pendant l40 jours. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 TABLEAU 2 10 * 15 Type de vaccins Nombre de poulets testés Taux de mortalité par MD A 100 2 C 100 5 D 100 11 E 100 5 F 100 8 G 100 3 Contrôle(non inoculé) 100 31 EXEMPLE 4 : En utilisant des tissus d'embryons de dindes et de 20 faisans, on a opéré comme dans l'exemple 1, de ma nière similaire, 1'eflfet supérieur de prévention à l'égard de MD a été observé. Comme indiqué, le vaccin MD désactivé a une activité supérieure pour l'immunisation de poussins contre MD 25 de manière analogue à celle des vaccins vivants MD. En outre, il est à roter que les vaccins MD désactivés conformes à la présente invention présentent un avantage remarquable du point de vue de la sécurité par comparaison avec les vaccins MD vivants traditionnel s. 71 11806 2092137 REVENDICATIONS 1°) Vaccin désactivé contre la maladie de Marek caractérisé en ce qu'il comprend un virus de la maladie de Marek qui a été cultivé dans un milieu de culture comprenant un tissu d'embryon d'un oiseau choisi dans le groupe d'oiseaux ressortissants au type oie, et d'oiseaux ressortissants au type poule, ce virus de la maladie de Marek n'ayant pas de caractère infectieux 2°) Vaccin conforme à celui de la revendication 1, caractérisé en ce que les oiseaux ressortissants au type oie sont le faisan, le dindon et le canard. 3°) Vaccin conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que les oiseaux ressortissants au type poule sont la caille et le poussin. 4°) Procédé pour la préparation d'un vaccin contre la maladie de Marek conforme à 1'une quelconque des revendications 1 à 3i caractérisé en ce qu'on cultive et isole le virus de la maladie de Marek dans un milieu de culture comprenant un tissu d'embryon d'un oiseau choisi parmi- les groupe d'oiseaux ressortissants au type oie et d'oiseaux ressortissants au type poule, après quoi l'on procède à la désactivation. 5°) Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce qu'on éffectue l'isolation du virus de la maladie de Marek dans un tissu d'embryon de canard, de poulet, de caille, de dindon ou de faisan, en utilisant une matière infectée par la maladie.