Brevet FR2092076A1 — publié le 19720121

) 71 14303 1 2092076 la „r>isenfce invention concerne une nouvelle classe de composés provoquant la formation d'interféron, qui sont des N-oxydes a'acides ribonucléiques à double chaîne naturels, un procé 'I pour leur préparation et les compositions pharmaceuti-5 eues constituées par ces composés ou les renferment. Les acides ribonucléiques a double chaîne (a.SoH.) prove-u.jit d'une large diversité de sources possèdent comme on a pu le dé.r:cnrrer une activité anti-virale chez les animaux» Les a.R.K. à double chaîne peuvent être extraits de particules de 10 virus présentes chez certains champignons infectés, par exemple chez certaines des Penicillia, notamment P.chrysogenum, P» stoloniferum, P» funiculosum et P. cyaneofulvum, et ces A.R.N„ montrent une activité anti-virale. On a cité dans la littérature d'autres virus à partir des-15 quels des A.R.N. à double chaîne à activité anti-virale peuvent être extraits. Il s'agit du virus jaune de la betterave su-crière, du virus nain du riz, du Reovirus 3 et d'au moins un virus d'insecte polyédrose cytoplasmique (bien que dans ce dernier cas les auteurs ne citent pas la source précise des 20 virus de polyédrose cytoplasmique - Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 132 0 2, 196S)» En plus des sources précitées, des /-..R*N. à double chaîne ayant une activité anti-virale ont été extraits de la forme réplique du phage de KS2 de E. coli, de la forme réplique du 2 5 phage de MU9 de E. coli et de la forme réplique du phage de Pseudomonas aeruginosa. Il a été confirmé, dans la majorité des cas précités, que l'action anti-virale des A.R.N. à double chaîne est due à la stimulation de la production d'interféron dans les cellules ani-30 maies. Ainsi, ce n'est pas 1*A0R.N. à double chaîne lui-même qui est l'agent anti-viral actif, m=,is plutôt l'interféron qui est produit par les cellules en réponse à l'administration de 1'A.R.N.. Pour cette raison, il est probablement plus exact de dénommer les A.R.N. à double chaîne des "agents générateurs 35 d'interféron" plutôt que des "agents anti-viraux". Cn sait que les acides ribonucléiques à double chaîne peuvent être intéressants en prophylaxie, et à un moindre degré pour le traitement des infections virales chez l'homme et les animaux. Toutefois, certaines constatations suggèrent que 40 l'emploi en médecine d'A.R.K» à double chaîne d'origine naturel- " bad ori©#i1k\copv 71 14303 2 2092076 le peut être limité, étant donné que l'A.R.N. à double chaîne, sous la forme sous laquelle il est extrait de sources naturelles, présente certains effets secondaires toxiques, qui semblent être d'autant plus apparents que les doses augmentent» 5 L'invention repose sur cette constatation que certains dérivés d'acide ribonucléique à double chaîne d'origine naturelle sont moins toxiques que les A.R.N. parents ou originaux, tout en conservant une bonne activité en ce qui concerne la formation d'interféron. 10 L'invention est matérialisée dans des N-oxydes d'acides ribonucléiques naturels à double chaîne et dans les sels de ceux-ci, ces N-oxydes et ces sels étant eux-mêmes à double chaîne. Les sels considérés suivant l'invention peuvent être des sels d'ammonium ou des sels de métaux alcalins (par exemple de 15 sodium ou de potassium), des sels formés avec des bases organiques comme des aminés et des sels formés avec des matières organiques polybasiques comme la polylysine et le dextrane D.E.A.E. L'expression "acides ribonucléiques naturels à double chaîne" utilisée ici désigne seulement les acides ribonucléiques 20 à double chaîne dérivés de sources naturelles, par exemple ceux indiqués précédemment, et ne couvre pas les acides ribonucléiques à double chaîne synthétiques comme l'acide Polyinosinique: Polycytidylique (Poly I:Poly C), l'acide Polyadénylique:Polyuri-dylique (Poly A: Poly U) ou l'acide Polyguanylique:Polycytidyli-25 que (Poly G: Poly C). En outre, le terme "à double chaîne" se rapporte à la caractéristique selon laquelle deux molécules d'acide ribonucléique séparées sont associées par une liaison hydrogène prévue entre certaines ou la totalité des bases le long de chaque molécule. Ces acides ribonucléiques à double 30 chaîne sont relativement inertes à l'action de la ribonucléase, contrairement à la variété à une seule chaîne. L'identité chimique des N-oxydes suivant l'invention sera aisément comprise par les techniciens familiarisés avec la structure des acides ribonucléiques. Un acide ribonucléique est un 35 polynucléotidea La molécule est formée par des unités ribose-phosphate se répétant, constituant un squelette dorsal, avec une base pyrimidine ou purine fixée sur chaque fraction de molécule ribose. Dans les acides ribonucléiques naturels auxquels l'invention se rapporte, l'une de quatre bases différentes est fixée 40 sur chaque fraction de molécule sucre, à savoir l'adénine, la 71 14303 3 2092076 10 15 20 25 30 35 cytosine, 1'uracile et la guaninec Les radicaux des bases de la molécule d'acide ribonucléique sont représentés par les formules: 0H l •il 1 adénine (A) cytosine (C) uracile (U) guanine (G) Dans chacune des formules qui précèdent, la valence libre de l'atome d'azote est fixée sur un sucre du squelette de l'acide nucléique. Les A.R.N. diffèrent dans leur poids moléculaire et au point de vue séquence des bases le long du squelette sucre/ phosphatée Dans les acides ribonucléiques à double chaîne, deux A.R.N„ à une seule chaîne sont associés par des liaisons hydrogène entre les bases, une base adénine de l'un dieux étant reliée par un hydrogène à une base uracile de l'autre, et une base cytosine de l'un étant reliée par un hydrogène à une base guanine de 1'autre. Théoriquement, les radicaux des bases indiqués ci-avant peuvent être convertis chacun en un N-oxyde (composé oxydé sur l'azote) :- 40 Ainsi, en théorie, les N—oxydes d'A.R.N. à double chaîne suivant l'invention peuvent être divisés en cinq groupes hypothétiques :- (a) Ceux dans lesquels 1'adénine est la seule base oxydée, (b) Ceux dans lesquels la cytosine est la seule base oxydée, (c) Ceux dans lesquels la guanine est la seule base oxydée, (d) Ceux dans lesquels 1'uracile est la seule base oxydée, (e) Ceux dans lesquels deux ou plusieurs des quatre bases sont oxydées. Toutefois, dans la pratique, il semble que les bases 71 14303 4 2092076 uracile ne soient pas oxydées à un degré important et, à moins que l'on n'emploie des conditions d'oxydation sélectives douces, les bases adénine, guanine et cytosine sont toutes oxydées à un degré plus ou moins grand dans la même moléculeo 5 En outre, il est évident que pour un acide ribonucléique à double chaîne donné, divers degrés d'oxydation sont possibles, allant des N-oxydes dans lesquels seule une très faible proportion des sites bases oxydables totaux est oxydée à ceux dans lesquels la majorité des sites bases oxydables sont oxydés. Des 10 recherches ont montré que, lorsque le degré d'oxydation augmente, c'est-à-dire lorsque de plus en plus de bases sont oxydées, la molécule à double chaîne a de plus en plus tendance à se séparer en une substance à une seule chaîne. Etant donné que l'invention concerne simplement les N-oxydes qui sont eux-mêmes 15 à double chaîne, il s'ensuit que les N-oxydes suivant l'invention présentent au moins certains sites bases non oxydés sur la longueur de la molécule. On utilise une méthode empirique pour mesurer le degré - d'oxydation des W--oxydes à double chaîne suivant l'invention. 20 Le spectre aux ultra-violets d'un acide ribonucléique à double chaîne naturel présente une forte crête d'absorption à 258 nyu et une faible absorption à 230 nju . Au fur et à mesure que les bases de la molécule à double chaîne sont de plus en plus oxydées, l'absorption à 230 mju augmente, tandis que l'absor-25 ption à 258 mp diminue. Ainsi, le rapport entre les valeurs des crêtes d'absorption est une mesure du degré d'oxydation sur N de l'acide ribonucléique à double chaîne, c'est-à-dire que le rapport : absorption à 230 mu , , ,. r *=■ augmente quand le degre d'oxydation 30 absorption à 258 mp croît (NB. Ce rapport sera écrit ci-après )• Deux autres paramètres utilisés pour mesurer le degré d'oxydation des substances suivant l'invention sont l'hyperchro-35 micité de la substance et sa valeur Tm. Ces paramètres sont obtenus en enregistrant l'absorption aux ultra-violets de la substance à une fréquence particulière, tout en augmentant graduellement la température de la substance0 L'absorption des ultra—violets d'un A.RoN. à double chaîne ou à 258 mju est 40 toujours inférieure à l'absorption à la même fréquence de la 71 14303 5 20920/6 même substance sous une forme à une seule chaîne. Egalement, lorsque la température de la substance à double chaîne est augmentée, la liaison hydrogène entre les chaînes devient de plus en plus faible, jusqu'à ce que finalement les chaînes se 5 séparent» XI s'ensuit que la valeur d'absorption des ultraviolets d'une substance à double chaîne diminue quand la température augmente. La différence entre les deux extrêmes d'absorption, exprimée en pourcentage de l'absorption de la substance à double chaîne, est dénommée "hyperchromicité" de 10 cette substance. Comme expliqué, quand on représente l'absorption des U.V". à 258 mp des N-oxydes suivant l'invention par rapport à la température, on constate que l'absorption est plus grande aux températures élevées qu'aux températures plus basses. L'augmenta-15 tion d'absorption est graduelle et il est possible de déterminer la température à laquelle l'absorption est située à mi-distance entre l'absorption de la substance à double chaîne et celle de la substance à une seule chaîne. Cette température est dénommée la Tm du N-oxyde et dépend du degré d'oxydation, et on constate 20 que la Tm diminue quand le degré d'oxydation augmente. En outre, un N-oxyde spécifique suivant l'invention peut 'être hydrolysé pour dégrader la substance en ses constituants nucléotides individuels (à la fois oxydés et non oxydés). Les rapports relatifs entre les bases non oxydées et les bases oxy-25 dées peuvent ensuite être calculés, en fournissant ainsi une caractérisation directe des N-oxydes suivant l'invention» Si l'on résume ce qui précède, on peut écrire que l'invention concerne une nouvelle classe de dérivés d'A.R.N. à double chaîne, à savoir les N-oxydes. Cette nouvelle classe de N-30 oxydes renferme un grand nombre de N-oxydes différents, qui diffèrent en ce qui concerne le nombre de bases oxydées, c'est-à-dire le degré d'oxydation» On a constaté que deux paramètres, à savoir le rapport d'absorption des ultra-violets à 230 mp relativement au rapport à 258 nyu et la Tm, peuvent être employés 35 comme mesure du degré d'oxydation, tandis que les rapports relatifs entre les bases non oxydées et oxydées peuvent être calculés directement» Ainsi, bien que l'invention couvre tous ces N-oxydes d'A.R.N. à double chaîne et leurs sels, qui sont eux-mêmes à 40 double chaîne, une sous-classe spécifique de N-oxydes suivant 6 9 0 Q ^ n ~ £ 71 14303 ~ l'invention, qui présentent une bonne activité anti-virale vis-à-vis d'une large gamme de virus et qui sont moins toxiques que les A.R.N, d'origine, est formée par ceux dénommés acides ribonucléiques N-oxydés à double chaîne et leurs sels, dans lesquels 5 les bases uracile ne sont sensiblement pas oxydées, de 5 à 40% des bases adénine sont oxydées, de 5 à 60% des bases cytosine sont oxydées, et de 5 à 70% des bases guanine sont oxydéeso Le caractère à double chaîne des N-oxydes est perdu aux degrés d'oxydation élevés, mais il n'est malheureusement pas possible 10 de définir une limite supérieure universellement applicable du degré d'oxydation, au delà duquel une substance à une seule chaîne est obtenue. Cette limite supérieure dépend de nombreux facteurs, notamment de la température et de l'identité de 1'A.R.N. de départ® 15 La présente invention concerne également un procédé pour la préparation des N-oxydes d'A.R.N. à double chaîne suivant l'invention et de leurs sels, ce procédé consistant à faire réagir un acide ribonucléique à double chaîne ou un sel de celui-ci avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracide. 20 A titre de peracides convenables, on peut citer l'acide peracétique, perbenzoîque, monoperphtalique ou m-chloroperbenzoï-que. Parmi ces peracides, il est préférable d'utiliser l'acide m-chloroperbenzoïque étant donné que la réaction évolue de façon régulière et pouvant être contrôlée dans le cas de cette subs-25 tance. La réaction est habituellement effectuée dans un solvant convenable de l'A.R.N. à double chaîne. Les solvants convenables sont habituellement légèrement alcalins, afin de faciliter la dissolution de l'A.R.N. ; par exemple, l'acétate de potassium 30 dans l'eau et l'éthanol à un pH d'environ 8 constitue un milieu de réaction convenable. Dans ce cas, le produit est obtenu sous la forme du sel de potassium. La température à laquelle la réaction est effectuée n'est pas critique pour la mise en oeuvre de l'invention0 II est 35 préférable d'éviter les températures très basses, auxquelles la réaction évolue d'une façon extrêmement lente, et les températures très élevées, auxquelles il existe un risque grave de destruction de la nature à double chaîne de l'A.R.N. D'une façon générale, on constate que la température ambiante (envi-40 ron 20-25° C) convient, bien qu'une température allant de 5° à BAP ORIGINAL 71 14303 \ 2092076 50° C puisse également convenir. La durée de la réaction varie selon le degré d'oxydation requis et la température du mélange réactionnelo Quand on utilise une température de réaction d'environ 20° C et de l'acide 5 m-chlcroperbenzoîque comme agent d'oxydation, le degré d'oxydation du produit augmente graduellement en une période de plusieurs heures. Dans ces conditions, généralement au bout de 16 heures, on obtient des N-oxydes à une seule chaîne, mais on comprendra que le temps précis au bout duquel des substances 10 à une seule chaîne sont obtenues est très variable selon les autres paramètres de la réaction. Les N-oxydes suivant l'invention peuvent être récupérés à partir du mélange réactionnel par précipitation par un antisol-"*"vanto Un antisolvant convenable pour les N-oxydes est l'étha-15 nolo Le précipité lui-même est judicieusement recueilli par centrifugation. On peut appliquer au produit suivant l'invention n'importe quels processus usuels de purification des acides nucléiques et opérer par exemple par chromatographie et électro-phorèse» 20 II doit être souligné que selon une certaine évidence on peut suggérer que les A.R.N. obtenus à partir de certaines sources naturelles sont en fait des mélanges de deux ou plusieurs A.R.N. Quand on les sépare par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide par exemple, certains des A.R.N. fongiques se 25 séparent jusqu'en 5 bandes. Ainsi, on comprendra que l'invention couvre les N-oxydes de ces mélanges d'A.R.N» et qu'il est parfois possible de séparer les N-oxydes eux-mêmes en deux ou plusieurs bandes distinctes par électrophorèse. Comme indiqué précédemment, les N-oxydes à double chaîne 30 suivant l'invention peuvent déclencher la production d'interféron chez les animaux et chez l'homme et sont généralement moins toxiques que les --i.R.M. d'origine dont ils sont dérivés, ce qui est mis en évidence par des études de toxicité chez les animaux comme les souris, tout en conservant une bonne activité anti-35 virale. Etant donné que l'interféron est essentiellement un agent anti-viral non spécifique, il s'ensuit que les N-oxydes suivant l'invention sont intéressants dans la prophylaxie et le traitement d'une large gamme d'infections à virus telles que celles dues au virus "Coxsackie", au virus de la forêt Semliki, 40 au virus de la variole vaccinique, au virus de la fièvre aphteuse, 71 14303 8 2092076 au virus de la stomatite versicolore, au virus de la rage et au virus de la grippe. Suivant un autre de ses aspects encore, l'invention concerne donc une composition pharmaceutique renfermant un ou plu-5 sieurs des N-oxydes à double chaîne des acides ribonucléiques à double chaîne ou des sels non toxiques de ceux—ci, en mélange avec un ou plusieurs véhicules, supports ou excipients pharma-ceutiquement acceptableso La composition suivant l'invention peut être présentée sous 10 forme d'aérosol, par exemple pour administration intranasale, sous forme injectable pour administration intrapéritonéale, ou sous une forme convenant à des applications locales, bien qu'évidemment la présentation utilisée soit adaptée à la nature de l'infection. En général, les compositions suivant l'inventicn 15 sont plus efficaces pour la prophylaxie des infections virales, bien qu'elles soient également efficaces pour le traitement de ces infectionso Bien que les N-oxydes et les compositions suivant l'invention soient particulièrement utiles comme agents anti-viraux, 20 ils présentent également une utilité comme agents immunosuppres-seurs ou comme adjuvants pour renforcer la réponse-d'immunisa-tionc La présente invention sera mieux comprise à la lecture de certaines de ses réalisations, décrites dans les exemples donnés 25 ci-après à titre non limitatif :- Exemple N° 1 On cultive Pénicillium chrysogenum A.T.C.Co 10o002 comme suit : Aqar-aqar de sporulation 30 Tableau 1 Glycérol 7,5 g./i Mélasse noire 7,5 g./i Extrait de levure 5,0 g°/i NaCl 10,0 g./i MgS04.7H20 0,005 g./i kh2po 0,006 g./l Fe2(S04)3(NH4)2S04.24H20 0,0016 g./l CUS04.5H20 0,0001 g./l CaS04 0,25 go/l Agar-agar 20,0 g./l n 14303 9 2092076 On complète le milieu avec de l'eau déminéralisée et on ajuste le pH à 6,6. On ajoute 40 ml de milieu à des flacons médicinaux de 227 g qui sont bouchés avec du coton hydrophile et stérilisés pendant 15 minutes à 121° C» 5 On inocule les carottes à partir de la culture de base, qui est en masse terreuse, et on fait incuber à 26° C jusqu'à ce qu'on obtienne une bonne sporulation» Cultures en flacons sur orge. On stérilise des flacons de Thompson bouchés avec du 10 coton hydrophile contenant 150 g d'orge en grains entiers pendant 2 heures à 121° C. On met les spores provenant d'une carotte de 227 g en suspension dans 25 ml d'une solution contenant du glycérol, 3,0% en poids, et de 1'asparagine, 0,1%, et on utilise pour inoculer cinq flacons d'orge à chacun desquels 15 on ajoute encore 50 ml du milieu de suspension» On fait incuber les flacons à 26° C et on secoue à la main chaque jour, jusqu'à obtenir une bonne sporulation, ce qui prend habituellement 3 à 4 jours. Les flacons peuvent être stockés plusieurs mois à 2 — 3° C. 20 Milieu de fermentation Tableau II Glycérol 0,5 Glucose O,5 Tryptone 0,25 25 Peptone bactériologique 0,25 Extrait de levure 0,125 Liqueur de macération de grain 1,25 K2hpo4 0,1 NaCl 0,5 30 Agent anti-moussant 0,03 pH ajusté à 7,0 L'agent utilisé est du Pluronic L81, 10%, dans l'huile de soja. Le milieu est complété avec de l'eau ordinaire» Semence végétative 35 On stérilise 75 ml du milieu de fermentation par la vapeur d'eau dans un fermenteur à chicanes en acier inoxydable de 100 ml» On utilise une suspension de spores obtenue en ajoutant 100 ml d'eau stérile contenant 0,01% de Tween 80 à un flacon d'orge et en secouant pour inoculer le fermenteur, que l'on fait 40 incuber pendant 56 heures à 26° C avec aération et agitation. 71 14303 1C 2092076 Fermentation On stérilise 1500 ail du milieu de fermentation par l.a vapeur d'eau dans un fermenteur complètement à chicanes, en acier inoxydable, de 20G0 ml. On inocule avec 7 5 ml de semence vvlcé-5 tative et on fait incuber à 26° C jusqu'à 5 jours, en aérajut et en agitant. On clarifie la totalité du bouillon de fermentation (1500 ml) par centrifugation (Modèle SARR 5036, Westfalia Separator Ltd) et on rejette le mycélium. On ajoute au filtrat de cultu-10 re refroidi 300 g d'acide ribonucléique du commerce, sel de sodium, en solution dans 20 1 d'eau, puis on acidifie le mélange à un pH de 4,0 en utilisant de l'acide sulfurique, 25% v/v, et on ajoute un adjuvant de filtration formé par une terre d'infusoires, 0,5% p/v (Dicalite 438, Berk Chemicals Ltd.)0 15 Après agitation pendant 30 minutes, on filtre le mélange en utilisant un filtre-presse. On lave les solides retenus dans le filtre-presse avec 100 1. d'agent tampon au citrate à pH 4,0 (1.205 g de citrate trisodique et 1.235 g d'acide citrique par litre), que l'on rejette» On extrait les solides lavés avec une 20 solution de bicarbonate de sodium à 2% p/v (150 1.) en recyclant la solution pendant une heure à travers le filtre-presse. On concentre l'extrait ainsi obtenu à 5 1. par filtration sur une membrane (membrane Millipore VS, surface totale 32,5 2 dm ) et on clarifie le concentré par centrifugation pendant une 25 heure à 23.000 g . On provoque la sédimentation des particules analogues à un virus à 186o000 g (rotor Beckman type 42) et on purifie par le processus suivant : On remet des boulettes de particules brutes analogues à un virus en suspension dans une solution tampon (tris(hydroxyméthyl) 30 aminométhane 0,01M / chlorure de sodium 0,15 M contenant 10 jig/ ml de pénicilline G et 50 Jig/ml de néomycine) et on élimine les impuretés à l'état de particules par centrifugation à 12.000 g pendant 30 minutes. Une nouvelle purification est effectuée en déposant la suspension en couche sur du saccharose, 10%, et en 35 centrifugeant immédiatement à 186.000 g pendant 90 minutes, les boulettes étant remises en suspension et centrifugées à 12.000 g comme précédemment. On libère ensuite l'acide ribonucléique à double chaîne à partir des particules analogues à un virus purifiées par traite-40 ment avec un détergent, on ajoute du phénol : dodécylsulfate de bad original 71 14303 ii 2092076 sodium pour donneer une concentration de 0,1% p/v, et on extrait la suspension à 37° C pendant 45 minutes avec un même volume de phénol saturé d'agent tampon. On sépare les phases par centrifugation à 500 g et on effectue d'autres extractions par le phé-5 nol à la température ambiante jusqu'à ce qu'on obtienne une interface limpide entre deux extractions successives. Quand la déprotéinisation est complète, on élimine le phénol par extraction avec de l'éther, et on précipite l'AoR.N. à double chaîne par l'addition de deux volumes d'éthanol absolu, en ayant d'a-10 bord amené la solution à 0,2 M par rapport à l'acétate de sodium. On stocke le mélange à -20" C pour compléter la précipitation et on peut laisser la substance sous cette forme jusqu'à ce qu'on en ait besoin, ou bien on peut la reconstituer dans l'agent tampon tris et liophiliser. 15 On fait dissoudre de l'A.R.No à double chaîne (20 mg) obte nu de cette manière d'ans de l'acétate de potassium 0,4 M, à pH 8,2 (20 ml) et on ajoute une solution d'acide m-chloroper-benzoique (500 mg) dans l'éthanol (10 ml). On laisse la solution à 20° C pendant une heure, puis on ajoute de l'éthanol 20 (60 ml)o On sépare le précipité d'A.R.N. N—oxydé obtenu de cette manière par centrifugation et on lave avec de l'éthanol. On fait dissoudre un échantillon du précipité d'A.R.N. N-oxydé dans une solution aqueuse 0,4 M d'acétate de potassium à pH 8,2 et on mesure le rapport A 230 mp . On mesure ensuite 258 mji 25 le rapport A mP pour la substance de départ formée par 258 nra l'A.R.N. à double chaîne, et on compare les deux résultats : A 230 myt pour la substance de départ A.R.N. à double chaîne = 0,45 A 253 ^ Pour le produit oxydé sur N = 0,57. 30 On^soumet ensuite un second échantillon du produit N—oxydé à une séparation par chromatographie sur une colonne de Sepharose 2B (filtration sur gel)c On effectue cette opération en utilisant une colonne de 90 cm de longueur, d'un diamètre intérieur de 2,5 cm et d'un volume approximatif de 500 ml« On 35 effectue l'élution dans la colonne en direction du haut avec une solution contenant du chlorure de sodium (0,15 M), l'agent tampon tris (0,05 M) et du chlorure de magnésium (0,005 M), à un pH de 7,5, selon un débit de 0,4 ml par minute. On recueille des fractions de 7,2 ml et on les titre pour déterminer leur 40 teneur en produit N-oxydé, estimée par le pouvoir d'absorption 71 14303 12 2092076 des ultra-violets à 258 mji. On constate que le produit est élue de la colonne de Sepharose 2B dans les mêmes fractions que celles observées pour la substance de départ A.R.N. à double chaîne, ce qui indique que le produit N-oxydé a le même poids molé-5 culaire et la même forme générale que la substance de départ et est par suite entièrement à double chaîne. On soumet ensuite un troisième échantillon du produit N-oxydé à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. On effectue cette opération en utilisant un gel d'acrylamide à 4% 10 et un agent tampon contenant du tris, 0,04 M; de l'acétate de sodium 0,02 M; de l'EDTA de sodium, 2nM; et de l'acide acétique pour amener le pH à 7,8. On effectue l'opération dans un tube d'un diamètre intérieur de 6,35 mm et d'une longueur de 10 cm environ à 20" C. On applique un courant jusqu'à 10 v/cm à 15 5 mA/gel pendant 1 à 3 heures. On évacue le gel et on colore avec une solution de bleu de méthylène et on observe les bandes. On répète le processus pour la substance de départ A.R.N. à double chaîne et on compare les résultats. On observe des différences entre les bandes obtenues dans les deux cas. La bande 20 principale dans le produit N—oxydé subit juste un déplacement sur le gel, tandis que la substance de départ présente une mobilité plus grande et se sépare en 3 bandes. Ceci semble indiquer une agrégation accrue du N-oxyde par rapport à la substance de départ. 25 On examine un quatrième échantillon du produit N-oxydé afin d'obtenir son hyperchromicité et sa valeur Tm. On effectue les mesures dans des cellules de 1 cm en utilisant un spec-tromètre Unicara SP 800 B et une solution de l'échantillon dans une solution aqueuse 0,03 N de chlorure de sodium contenant 1% 30 d*éthylèneglycol. On élève la température de la solution de 0,5° C par minute, et on représente l'absorption des ultraviolets en fonction de la température. On constate que le produit N-oxydé a une valeur Tm de 79° et une hyperchromicité de 34,6%. 35 Le produit N-oxydé assure la protection des souris lors d'une administration par voie intrapéritonéale selon une concentration de 10 T et de 100 T par souris, en administrant 24 heures plus tard le virus de 1'encéphalomyocardite par la même voie. Les résultats sont les suivants : -40 (Tableau page suivante) 71 14303 13 2092076 TABLEAU I 5 10 Dose de : Dose de : Mortalité après Mortalité après N-oxyde : virus : 12 jours chez les 12 jours chez les • : animaux recevant animaux ne recevant • • ♦ • : le N-oxyde pas de N—oxyde lO r 10"'4 : 5/10 9/10 10 r : lO"5 • • : 0/10 8/10 100 f 10-5 • • : 2/10 8/10 Une protection est également obtenue pour les souris con-15 tre le virus Semliki Forest et le virus Coxsackie: - Activité du N-oxyde contre le virus Semliki Forest (SFV) et le virus Coxsackie (COX) TABLEAU XI : Dose de : Dose de : Mortalité après Mortalité après 12 : : N-oxyde : virus : 12 jours chez les jours chez les ani-: • • • : animaux recevant maux témoins ne re-ï » • • • : le N-oxyde cevant pas de î • • m • 0 • • • N-oxyde : • • 10 T ïSFV 10~3 : 9/10 10/lO Ï : 10 T ï SFV 10"4 î 8/10 10/10 : : 10 m • T îSFV • • 10-5 : 5/10 10/10 ï • m : lO f :C0X 10"1 : 6/10 10/10 ï : 10 ■f îCOX 10"2 : 5/10 7/10 : : 10 • • r :C0X • • 10-3 : 2/10 4/10 î • • On étudie/au produit N—oxydé sur la réponse d'immunisation 35 des souris comme suit: - On immunise des souris par injection intraveineuse d'une suspension à 10% de globules rouges du sang de mouton. On injecte simultanément le composé testé par la même voie. On titre l'effet du composé le troisième jour par la tech-40 nique "d'hémolyse localisée en gel". Ce processus est une ver- 71 14303 14 209207 6 sion modifiée du "Jerne Plaque Assay", décrit la première fois par Jerne, Norden et Henry ("Cell Bound Antibodies", Wistar Inst. Press, Philadelphie, 1963, page 109 - Ed. Amos et Koprowskil On tue les souris et on prélève les rates. On effile 5 celles—ci séparément pour libérer les cellules lymphoïdes. On réunit les rates de 5 souris pour chaque composé essayé. Après dilution convenable dans un milieu de culture, on mélange 0,1 ml de suspension de cellules de la rate avec de l'agar-agar liquide et les globules rouges du sang de mouton et on verse dans 10 une boîte de Pétri pour former une mince couche. Après 2 heures d'incubation à 37° C, l'anticorps s'est diffusé dans l'agar-agar environnant à partir de certaines des cellules. On ajoute un complément (sérum de cobaye) pour la lyse des globules rouges de sang de mouton dans les zones où l'anticorps est présent. 15 Après une nouvelle incubation pour permettre la lyse des globules rougest on place les lames sous un compteur de colonies (grossissement avec une source de lumière indirecte) et on compte les zones de lyse ("plaques")o Elles apparaissent sous forme de zones claires par rapport au fond opaque des globules rouges 20 non dissous. On compte les cellules dans un échantillon de suspension de cellules après dépôt sur une lameo Les résultats sont exprimés sous forme de cellules formant plaques (PFC) par million de cellules de rate ou par rate® 25 L'effet du composé ("indice immunologique") est exprimé par £\ le rapport PFC/10 chez les animaux traités : ceux du groupe témoin (dosés avec une solution saline). Ainsi un rapport de ltO ne représente aucun effet. Au-dessous de 1,0 ceci correspond à un effet imraunosuppresseur et au—dessus à un effet d'ad-30 juvant. Résultats î Indice immunologique:- à 10 Y = 1,07 à 100 7= 2,29. Le produit N-oxydé présente par conséquent un effet d'adjuvant S sur la réponse d'immunisation. La toxicité de la substance de départ A.R.N. à double chaîne et celle du produit N—oxydé sont comparées en utilisant des souris. Les détails expérimentaux importants sont les suivants:-Animaux : Souris 40 Souche : Charles River - France S.PoF. BAD ORIGINAL 71 14303 15 2092076 Sexe : Condition ï Gamme de poids ï Volume administré 5 Diluant : N°/dose ï Pas de diète 20 - 25 g. 0,1 ml/10 g de souris Eau stérile pour injection (sans pyrogène) 6 RESULTATS TABLEAU IXI 10 15 20 25 Dosage Mortalité chez les sou- : ris recevant la substance de départ Mortalité chez les souris recevant le produit N-oxydé 30 mg/kg 3/6 - la mort se produit 24 à 72 h aprè s 1'admi-nistration 0/6 16 " 2/6 » 0/6 12-8 » 0/6 " 0/6 10,4 » 0/6 " 0/6 8 " 0/6 " 0/6 Symptômes toxiques. A.R.N. double chaîne - léthargie - exsudations autour du nez 30 et des yeux, peau fripée, diarrhée A.RoN. modifié -"anesthésie" pendant environ 2 minutes après 1 * administration. Bonne condition pendant toute la période d'observation. Ces résultats montrent clairement que le produit N-oxydé 35 est moins toxique chez la souris que la substance de 'départ. Exemple N" 2 On oxyde la substance de départ A.R.N. à double chaîne obtenue dans l'exemple n* 1 avec de l'acide m-chloroperbenzoïque et en utilisant les mêmes conditions que celles décrites dans 40 l'exemple n° 1, sauf que le temps de réaction est augmenté 71 14303 16 2092076 jusqu'à 2,5 heures. Le rapport A 230 "jP pour la substance de 258 nju départ et le produit est mesuré comme dans l'exemple N° 1. A 230 mp pour la substance de départ = 0,45 ; 258 mju 5 p 230 mp pCur le produit N-oxydé = 0,61 258 mu On fractionne le produit sur du Sepharose 2B comme dans l'exemple n° 1. L'élution de la fraction principale a lieu dans les mêmes fractions que celles observées pour la substance de départ A.R.N. à double chaîne. 10 Une électrophorèse sur gel d'acrylamide en utilisant la méthode de l'exemple n° 1 donne des résultats similaires à ceux décrits pour le produit de l'exemple n* lo Le produit a une Tm de 77,5° et une hyperchromicité de 34,6%, les deux paramètres étant mesurés comme dans l'exemple 15 n° I» Il assure la protection des souris à 10 T et 100 T contre le virus de 1'encéphalomyocardite, le virus Semliki Forest et le virus Coxsackie; les résultats importants pour le virus de 1'encéphalomyocardite sont les suivants:-20 TABLEAU IV 25 Dose de composé Dose de virus Mortalité après 12 jours chez les animaux recevant le composé Mortalité après 12 jours chez les animaux témoins ne recevant pas de compose 30 35 îo r 10 nr îoo -r 10 10 10 -4 -5 -5 5/10 1/40 1/10 9/10 8/10 8/10 CSFV) Activité du N-oxyde contre le virus Semliki Forest/et 1 Coxsackie (COX) : e virus (Tableau page suivante) Indice immunologique : 10 T , 0,63; 100 T , 1,26 (mesuré comme dans l'exemple n° 1). Des- études de toxicité chez la souris effectués comme dans l'exemple n° 1 révèlent une toxicité réduite par rapport à l'A.R.N. à double chaîne non modifié. Les résultats obtenus sont identiques à ceux donnés dans l'exemple n 40 Exemple n6 3 BAD ORIGINAL 71 14303 17 2092076 TABLEAU V Dose de : Dose de : Mortalité après Mortalité après 12 : N-oxyde : virus : 12 jours chez les jours chez les ani-: 5 • : animaux recevant maux témoins ne re-: • • : du N-oxyde cevant pas de ï • • N-oxyde : 10 r ïSFV lff3 : 8/10 10/10 : 10 -r î SFV 10~4 : 8/10 10/10 : 10 lO r îSFV • • LO 1 O V» : 4/10 10/10 Ï • • 10 r :C0X 10"1 : 7/10 10/lO Î 10 r :C0X lO-2 : 5/10 8/10 : 10 r :C0X 10" 3 ï 2/10 5/10 : 15 • • • • On oxyde la substance de départ A.R.N. à double chaîne obtenue comme dans l'exemple n° 1 avec de l'acide m-chloroper-benzoïque en utilisant les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple n° 1, sauf que la durée de la réaction est aug-20 mentée jusqu'à 5 heures. Ici encore, on mesure les divers paramètres en utilisant les processus de l'exemple n° 1: — A 258 m|a Pour substance de départ = 0,45 A 230 mp. pQur produit N-oxydé = 0,67 258 mu 25 On fractionne le produit sur du Sepharose 2Bj la fraction principale subit une élution dans les mêmes fractions que celles - it observées pour la substance de départe Une électrophorèse sur gel d'acrylamide donne des résultats similaires à ceux décrits pour le produit de l'exemple n* le 30 Le produit a une Tm de 75" et une hyperchromicité de 34,1%. Il assure la protection des souris à 10 et JLOO contre / le virus EMC:- (Tableau page suivante) Indice immunologique : 10 T , 1,30; 100 T , 1,17. 35 Exemple n" 4 On oxyde la substance de départ A.R.N. à double chaîne obtenue comme dans l'exemple n" 1 avec de l'acide m-chloroperben-zoïque en utilisant les mêmes conditions que celles décrites précédemment dans l'exemple n" 1, sauf que la durée de la réac-40 tion est portée à 16 heureso à 71 14303 18 2092076 TABLEAU VI 5 Dose de composé Dose de virus Mortalité après 12 jours chez les animaux recevant le composé Mortalité après 12 jours chez les animaux témoins ne recevant pas de composé 10 10 r lOO T io-4 10~4 2/10 1/10 10/10 10/10 A Iggmjj Pour la substance de départ * 0,45 ; A hp pour le produit N—oxydé = 2,22. On fractionne le produit sur du Sepharose 2B. Le produit 15 subit une élution sous forme d'une seule fraction avec un volume d'élution qui est environ le triple de celui observé pour la substance de départ non modifiée» Le produit est essentiellement à une seule chaîne et a une hyperchromicité de 10%, sans Tm définie. 20 11 n'assure qu'une faible protection pour les souris à lO / contre le virus EMC. Indice immunologique : 10 T , 1,10. Exemple n* 5 On examine les N-oxydes obtenus dans les exemples n' 1, 2 et 3 (désignés par INT 9, INT 10 et INT 14 respectivement) pour 25 déterminer les taux de bases et le degré d'oxydation. Les taux de bases sont déterminés par hydrolyse d'acide ribonucléique à double chaîne et de son produit d'oxydation sur N, INT 9, 10 et 14, dans NaOH 0,3N à 37* C pendant 18 heures. On neutralise l'hydrolysat avec NH4C1 et on sépare le mé-30 lange de nucléotide 2', 3* phosphates sur une colonne Dowex 1x8 (tamis 200-400) éluée avec des concentrations croissantes en acide chlorhydrique. On élue les acides cytidyliques avec de l'acide chlorhydrique 0,003 N, les acides adényliques avec HC1 0,005N, les acides uridyliques avec HC1 0,007N et les aci-35 des guanidyliques avec HC1 0,1N. On combine les fractions contenant chaque nucléotide et on calcule les concentrations en nucléotide à partir de l'absorption des ultra-violets. Les N-oxydes de purines et de pyrimidi-nes sont dégradés par des produits à la fois alcalins et acides 40 aqueux qui n'absorbent pas les ultra-violets (J. Gangloff et n 14303 19 2092076 J.Bo Ebel, Bull. Soc. Chim. Biolc 1968, 50, 2335) et ainsi ne peuvent pas être déterminés directement,. Composé : Temps de D : rj-action : Taux de bases ï % de bas es : d'oxyda- : oxydées : tion sur a :N (heures) • A U C G A U C G 10 A.R.N. à : 0 :0?97 1,04 :0,98 : 1,00 : 0 : 0 : 0 : 0 double chaîne (non oxydé) : INT 9 : 1 :0,80 1,00 :0, 74 î0, 72 : 20 : 0 : 26 : 28 INT 10 2,5 :0, 75 1,00 :0,70 :0,72 : 25 : 0 : 30 : 28 15 INT 14 : 5 :0, 70 1,00 :0,45 :0,36 : 30 : 0 : • • • • 55 : 64 a L'uridine 2', 3' phosphate total obtenu dans chaque cas par hydrolyse d'une quantité prédéterminée de produits d'oxydation sur N est identique à celui obtenu à partir de la même quantité 20 d'A.R.N. à double-chaîne non modifié. Ainsi, en tenant compte de l'observation selon laquelle, dans des conditions d'oxydation identiques, l'acide polyribouridylique ne subit pas d'oxydation à un degré notable, on parvient à cette conclusion que les résidus uracile d'^.RoN. à double chaîne ne sont pas oxydés, et 25 les pourcentages d'oxydation indiqués pour les autres bases sont calculés sur ce principe» Exemple N° 6 Données biologiques. A. Protection contre le virus de 1 *encéphalomyocardite (EMC). 30 On administre des injections intrapéritonéales de 10 p.g et 10C jag de l'A.R.N. oxydé sur N, INT 9, 10, 14 et"6 (produits des exemples N° 1, 2, 3 et 4 respectivement) dans NaCl 0,15M à des souris de la souche CD1 pesant de 16 à 20 g. 24 heures plus tard, on administre à ces souris des dilutions variables d'EMC, 35 également par voie intrapéritonéale. Les taux de mortalité au bout des 12 jours suivants pour les animaux traités par le N-oxyde et les animaux témoins non traités sont déterminés. (Voir tableau page suivante) £ 71 14303 20 2092076 Composé Dose par: LDSO Mortalité après souris : de virus 12 jours chez 12 jours ch-:-s (pg) : administré les animaux les .inima . ayant reçu le témoins n ' s y .snt N—oxyde pas reçu de N—oxyde 10 10 °/10 16/20 100 : 10 2 , 16 , Vio / 20 10 : 20 6/10 9/9 1 : 32 . • 5/10 20/20 2,5 : 32 4/10 2°/20 INT 9 5 : 32 3/io 20/20 (Exemple 10 : 32 3/10 20/20 1) 20 : 32 8/10 20/20 40 : 32 6/10 20/20 80 : 32 3/8 20/20 10 : 100 5/io 9/10 10 : 200 7/10 10/io 10 : 2000 10/10 10/io .10 : 1 1 /10 5/10 10 : 10 3/20 25/30 10 0 : 10 . 1/ io 25/30 1 : 32 8/10 ; 20/20 2,.5 : 32 5/io 20/20 INT 10 5 : 32 8/io 20/20 (Exemple 10 : 32 9 /10 20/20 2) 20 : 32 7/10 20/20 40 : 32 3/ 10 __ . 20/20 80 : 32 b/io.. 20/20 10 : .100 14 / 2.0 iq/20 10 : 1000 10/10 10/10 INT 14 10 10 2 VIO i9/20 (Exemple 3) 100 : 10 1/ 10 19/20 INT 6 10 10 5 /10 16/20 (Exemple 4) - * bad original 71 14303 21 2092076 B. Effet du temps d'administration du médicament sur la protection contre EMC<> On administre par voie intrapéritonéale comme précédemment à la fois du N-oxyde d'A.R.No (10 jo,q par souris) et le virus 5 EMC (lO LD5Q), mais on fait varier le temps d'administration du médicament par rapport à celui du virus considéréo Composé Temps d'administration par s Mortalité après : rapport au temps d'injec 12 jours : 10 tion du virus 3 jours avant 6/10 : 1 jour avant 3/10 : INT 9 2 heures avant 1/10 ; 15 (Exemple 1) 1 jour après 8/10 : 3 jours avant 6/10 : 1 jour avant 3/10 : INT lO 2 heures avant 1/10 : 20 (Exemple 2) 1 jour après 9/10 î 19/20 des animaux témoins recevant le même virus, mais sans médicament, meurent en 12 joursQ 25 C. Protection contre les virus Cocksackie B1 (COX) et Semliki Forest (SFV)„ On administre des injections intrapéritonéales de lO p.g d'INT 9 (Exemple I) dans NaCl 0,15M à des souris de la souche CD1 pesant de 16 à 20 grammes,, 24 heures plus tard, on admi-30 nistre aux souris des dilutions variables de COX et SFV, également par voie intrapéritonéale. Les taux de mortalité pour les 12 jours suivants, pour les animaux traités et les animaux témoins non traités, sont les suivants : (Voir tableau page suivante) 35 D. Etudes de toxicité chez la souriso Voie intraveineuse. On compare la toxicité de la substance de départ A.R.N0 à double chaîne et celle du produit N-oxydé INT 9 (Exemple 1) et INT 10 (Exemple 2) chez la souris femelle de la souche Charles 40 River France S0P.F. pesant 20-25 g. On administre les acides 71 14303 22 2092076 Virus LD,-0 de virus: Mortalité après Mortalité après : administré : 12 jours pour les 12 jours chez les : : animaux recevant animaux témoins ne : 5 : du N-oxyde recevant pas de : N-oxyde : 50 : 5/10 11/11 : 500 : 8/10 10/10 : 10 SFV 5.000 : 9/10 10/10 : 50.000 î 10/10 10/10 : 0,4 : 2/10 4/10 : COX 4 : 5/10 7/10 15 40 î 6/10 10/10 : nucléiques par voie intraveineuse dans 0,2 ml d'eau stérile sans pyrogène. 20 : Dose A.R.N. à double INT 9 INT lO chaîne non mo (Exemple 1) (Exemple 2) difié Mortalité Mortalité : 8 0/6 0/6 0/6 25 ï 10,4 0/6 0/6 0/6 : 12,8 0/6 0/6 0/6 : 16 2/6) se 0/6 0/6 : 30 3/6ÎP 0/6 0/6 30 Voie intrapéritonéale On compare la toxicité de la substance de départ A.R.N. à double chaîne et celle du produit N-oxydé INT 9 (exemple 1) chez la souris de la souche CD1 pesant de 16 à 20 grammes0 On 35 administre les acides nucléiques par voie intrapéritonéale dans NaCl 0,15M„ (Voir tableau page suivante) Des modifications peuvent être apportées aux modes de mise en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, 40 sans s'écarter de l'invention. 71 14303 23 2092076 : Dose : (rrig/kg) à double chaîne non modifié — mortalité après 10 jours INT 9 (Exemple 1) : Iiortalité après 10 : jours : : 10 C/fe ND : : 20 C/8 0/2 : : 40 6/8 0/2 : : 60 5/8 ND : : 70 ND 0/2 : : 80 8/8 ND : : 110 8/8 ND : : 120 ND 0/3 : : 125 8/8 ND : : 150 7/8 0/2 : : 200 ND 1/2 : BAD ORIGINAL 71 14303 2092076 REVENDICATIONS 1.- N-oxydes d'acides ribonucléiques à double chaîne naturels et leurs sels, ces N-oxydes et ces sels étant eux-mêmes à double chaîne. 5 2.- N-oxydes et sels de ceux-ci suivant la revendication lt caractérisés en ce que les bases uracile sont sensiblement non oxydées, de 5 à 40% des bases adénine sont oxydées, de 5 à 60% des bases cytosine sont oxydées et de 5 à 70% des bases guanine sont oxydées. 10 3.- Procédé pour la préparation de N-oxydes d'acides ribo nucléiques à double chaîne naturels et de leurs sels, caractérisé en ce qu'on traite un acide ribonucléique à double chaîne naturel ou un sel de celui-ci avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracideo 15 4.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le peracide est l'acide m-chloroperbenzoxque. 5.- Procédé suivant la revendication 3 ou 4f caractérisé en ce que l'acide ribonucléique à double chaîne naturel est obtenu à partir d'un virus fongique0 20 6.- Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'acide ribonucléique à double chaîne naturel est obtenu à partir de Pénicillium chrysogenum. 7.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'on traite l'acide ribonucléique à 25 double chaîne naturel ou un sel de celui-ci avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracide pendant un laps de temps suffisant et à une température suffisante pour oxyder de 5 à 40% des bases adénine, de 5 à 60% des bases cytosine et de 5 à 70% des bases guanine, tout en laissant les bases uracile sensiblement 30 non oxydées» 8.- N-oxydes d'acides ribonucléiques à double chaîne naturels et leurs sels, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 7.