Brevet FR2104755A1 — publié le 19720421

/ i 2104755 On sait depuis plusieurs années que le venin de certaines vipères telles qu'Ancistrodon Rhodostoma contient un composant anticoagulant. Plus récemment, on a découvert que ce composant se comporte en pratique comme un coagulant du sang. Le constituant analogue à la thrombine, visé 5 par l'invention, forme un polymère non réticulé de fibrine qui est facilement éliminé par le tissu réticulo-endothélial et/ou le système fibrinolytique de l'organisme, ce qui diminue ou épuise le fibrinogène sanguin. Ce constituant a donc un effet anticoagulant. Malheureusement le procédé de purification connu dans la 10 technique antérieure laisse beaucoup à désirer. Le meilleur procédé connu à ce jour comporte une technique chromatographique en deux stades, nécessitant deux colonnes ayant un garnissage différent et deux solutions tamponnées différemment avec dans les deux stades des solvants d'extraction ayant des propriétés différentes. Le substrat le plus couramment utilisé dans le 15 premier stade de ce procédé chromatographique est la triéthylaminoéthyl- cellulose qui malheureusement ne donne pas des résultats fidèles et facilement reproductibles. Surtout, la solution de venin ainsi purifiée contient encore la totalité du facteur hémorragique qui est le composant le plus dangereux du venin de vipère. Dans tous les cas, la solution de venin ainsi fractionnée 20 doit subir une purification complémentaire, par exemple selon un procédé semblable de chromatographie utilisant une solution tamponnée différemment de la fraction active de la première séparation et un substrat de colonne différent. La présente invention a donc pour objets : un procédé simplifié 25 de préparation du constituant analogue à la thrombine pur du venin de vipère Ancistrodon Rhodostoma; un procédé reproductible d'isolement de la fraction analogue à la thrombine d'un tel venin; et un procédé d'isolement en un stade de l'activité analogue à celle de la thrombine d'un tel venin purifié. Selon l'invention, on place une solution aqueuse diluée limpide 30 de venin brut de vipère tamponnée à pH 7,5 - 8,1 dans une colonne garnie de perles d'agarose couplé à de l'agmatine, en éluant la colonne avec une solution de chlorure de sodium à gradient linéaire tamponnée à pH 8,1 - 0,1 et on réunit les fractions contenant le constituant ayant une activité semblable à celle de la thrombine. On entend par agarose couplé à l'agmatine 35 des perles d'agarose unies par liaison covalente à de l'amino-4 butyl- guanidine (agmatine). L'agmatine est un inhibiteur concurrent du constituant ayant une activité semblable à celle de la thrombine du venin de vipère et empêche l'élution hors de la colonne du constituant actif jusqu'à ce que la 71 205*1 2104755 2 presque totalité des autres matières protéiniques soit éluée, lorsqu'on utilise une solution de chlorure de sodium à gradient linéaire convenablement tamponnée ayant une molarité de 0,01 à 1,0. Dans la présente description, on entend par "venin brut" le 5 venin qui n'a pas été préalablement traité par d'autres techniques chromato-graphiques ou chimiques. Par conséquent, il contient les autres protéines précédemment nommées fractions I-VIII contenant le facteur hémorragique et les fractions V et VII, c'est-à-dire celles ayant des caractéristiques physico-chimiques semblables à celles du facteur coagulant qu'on isole 10 selon l'invention. Le procédé de l'invention élimine complètement du venin brut ces fractions et composants indésirables et il n'est pas nécessaire de procéder à un traitement préalable par échange d'ions. D'autre part, l'expression "venin brut" ne signifie pas que le venin ne doit pratiquement pas avoir été manipulé avant la séparation en un stade de l'invention; on peut le 15 centrifuger pour éliminer les sédiments, le lyophiliser pour améliorer sa solubilité et bien sûr il est nécessaire de le dissoudre pour pouvoir l'utiliser sous forme de solution aqueuse diluée, limpide. Si on le désire, on peut soumettre la solution de venin à un prétraitement par le sulfate d'ammonium pour en éliminer certaines protéines indésirables. Cependant, comme on le 20 verra ci-après, ce traitement n'est pas nécessaire. La solution aqueuse de venin brut peut contenir entre 0,5 et environ 5,0% en poids de venin dans la gamme de pH convenablement tamponnée. Le tampon qu'on préfère pour réaliser cette solution est un sel non toxique de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, bien qu'on puisse utiliser à sa place 25 d'autres tampons non toxiques. On préfère un tampon non toxique car on utilise également le même tampon dans le solvant d'élution, et il en reste une partie dans la fraction protéinique isolée dont l'activité est semblable à celle dé la thrombine. Généralement, l'éluat est si pur qu'on peut l'utiliser directement à des fins médicales, bien qu'il soit généralement nécessaire de. 30 le diluer, car une solution injectable convenable contient généralement entre 50 et 200 unités par ml (définies selon Owren dans Acta Medica Scandinavia, Suppl. 194 de 1947) d'activité analogue à celle de la thrombine, tandis que le présent éluat contient souvent plus de 500 unités/ml. Selon un mode de réalisation général de l'invention, on verse 35 la solution aqueuse diluée tamponnée de venin brut sur les perles d'agarose qu'on a préalablement traitées par l'agmatine. On élue alors la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à gradient linéaire tamponnée à pH 8,1 - 0,1 avec du chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane ou un autre tampon non toxique convenant à l'usage pharmaceutique. On recueille l'éluat par petites fractions et on rassemble les fractions contenant le 71 20541 2104755 3 I constituant ayant une activité semblable à celle de la thrombine. Ces fractions contiennent environ 80% de l'activité semblable à-celle de la thrombine du venin brut. Dans un mode de réalisation préférentiel, on recueille les fractions en refroidissant, c'est-à-dire à une température 5 inférieure à 10°C. On prépare les perles d'agarose couplé à l'agmatine, de manière connue, à partir de perles d'agarose du commerce. On place alors les perles dans une colonne où elles se comportent comme un garnissage permettant la séparation chromatographique; elles retiennent de façon extrêmement efficace la protéine active du venin et, de façon bien moins 10 prononcée, les autres protéines. Lors de l'élution avec le gradient linéaire décrit ci-dessus, ces autres composants sont élués avant que n'apparaisse la fraction active, ce qui fournit un produit isolé extrêmement pur ayant une activité semblable à celle de la thrombine, prêt à être injecté après dilution à la concentration souhaitée. Des diluants appropriés sont l'eau, 15 les solutions salines ou une solution diluée de chlorhydrate de tris- (hydroxyméthyl)aminométhane. On peut également ajouter cette dernière solution lorsque les fractions réunies de 11éluat ont un pH ne convenant pas à l'injection intraveineuse pour laquelle on préfère un pH voisin de 7 ou légèrement supérieur. 20 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On couple de l'agmatine à du Sépharose 4B (agarose en perles 25 commercialisé par la Société Pharmacia Ltd., Suède) selon le mode opératoire de Guatrecasas et coll. décrit dans Proc. Natl. Acad. Sci., U.S. 61 , 636 (1968) si ce n'est qu'on maintient le pH à 11,0 pendant 15 minutes pendant l'activation de 1'agarose au bromure de cyanogène et qu'on réalise la réaction de couplage dans du chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 30 à pH 8,5 en utilisant 0,149 g de sulfate d'agmatine par ml d'agarose ayant sédimenté. La teneur en azote de l'agmatine - agarose ainsi préparée est de 3,1 - 0,1%. Dans une colonne de chromatographie de 1,9 cm de diamètre garnie des perles d'agmatine-agarose ci-dessus sur une hauteur de 13 cm, on introduit 35 une solution de 1,0 g de venin brut lyophilisé de vipère de Malaisie (Ancistrodon Rhodostoma) dans 100 ml de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)-aminoinéthane 0,005 mole de pH 7,5. On élue alors la colonne à température ambiante à un débit de 60-80 ml/h avec une solution de chlorure de sodium 71 20541 4 2104755 à gradient linéaire correspondant à 500 ml de solution 0,01 mole, et 500 ml de solution 0,5 mole, les deux solutions étant tamponnées à pH 8,1 avec du chlorhydrate de tris(hydroxymêthy1)aminomëthane. On recueille l'éluat par fractions de 5 à 7 ml au moyen d'un collecteur de fractions automatique 5 réfrigéré. Les 400 premiers ml de l'éluat sont presque totalement inactifs, alors que les fractions suivantes sont très fortement actives et ne contiennent en dehors du composant coagulant souhaité que des constituants inertes. Les fractions réunies contenant le constituant actif contiennent légèrement plus de 80% de l'activité semblable à celle de la thrombine 10 présente au départ et 90% des fractions recueillies ont une activité spécifique de 1200 (activité spécifique = unités/ml/A^.?11 ). 280 nm Lorsqu'on remplace le Sepharose utilisé dans le procédé ci-dessus par du Bio-gel A-15m (agarose commercialisé par la Société Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie) les fractions réunies obtenues ont la 15 même activité et la même pureté que ci-dessus. On obtient également les mêmes résultats lorsque la limite supérieure du gradient de concentration est constituée par du chlorure de sodium 1 mole. On compare les fractions réunies contenant le constituant ayant une activité semblable à celle de la thrombine avec un échantillon pur 20 précédemment identifié du constituant isolé ayant une activité semblable à celle de la thrombine de venin de vipère obtenu selon les procédés préalablement utilisés : les deux échantillons se révèlent identiques par électro-phorèse sur gel de polyacrylamide lorsqu'on utilise des gels à 7,0% à pH 8,9 décrit par Ornstein dans Annals of N.Y. Acad. of Science, volume 121, 25 page 321 (1964) montrant des mobilités électrophorétiques identiques; par filtration sur gel avec du Sephadex G-100, ce qui indique des poids moléculaires identiques; ainsi que par détermination des propriétés enzymatiques, à savoir la spécificité et le pouvoir enzymatique y compris des essais in-vivo d'abaissement du taux de fibrinogène. L'appréciation du pouvoir 30 coagulant par mesure du temps de thrombine ne montre pas de différence entre les deux échantillons qui sont tous deux totalement exempts de facteur hémorragique. Les deux échantillons provoquent la coagulation du fibrinogène plasmatique purifié. 71 20541 2104755 5 / EXEMPLE 2 On centrifuge pour la clarifier une solution de 50-mg de venin lyophilisé de Bothrops atrox dans 5 ml de tampon 0,01 mole de l'exemple 1 à pH 8,1 - 0,1 et on l'introduit sur une colonne de 1 x 15 cm d'agmatine-5 agarose. On élue la colonne à température ambiante à un débit de 20-30 ml/h avec un volume égal à cinq fois le garnissage de la colonne du tampon ci-dessus à pH 8,1 - 0,1 et avec un gradient linéaire de chlorure de sodium correspondant à 150 ml du tampon ci-dessus et 150 ml du même tampon rendu 0,3 mole par du chlorure de sodium. On recueille des fractions de 5 ml cornue 10 dans l'exemple 1. On détermine l'activité semblable à celle de la thrombine des fractions séparées. Lorsqu'on dresse une courbe de l'activité en fonction des numéros des fractions, on observe trois pics d'activité distincts. Bien que les produits correspondant à ces trois pics aient une activité 15 semblable à celle de la thrombine, seul celui correspondant au troisième pic forme un caillot avec du fibrinogène purifié et est donc très semblable au constituant obtenu dans l'exemple 1. EXEMPLE 3 20 On reprend le mode opératoire de l'exemple 2 avec du venin d'Echis carinatus, on obtient deux pics d'activité semblable à celle de la thrombine. Les deux constituants correspondant à ces pics ont une activité semblable à celle décrite dans l'exemple 1. 25 EXEMPLE 4 On reprend le mode opératoire ci-dessus avec un échantillon plus dilué de venin de Crotalus adamanteus, on isole de ce venin la fraction ayant une activité semblable à celle de la thrombine des autres fractions protéiniques associées, et on l'obtient sous une forme très purifiée. 30 On voit que le procédé de l'invention simplifie considérablement l'isolement du composant coagulant actif du venin de serpent. En particulier, il convient de noter qu'une seule chromatographie par différence d'affinité permet d'obtenir un produit pur qu'on ne pouvait préalablement obtenir que selon un procédé en deux stades, et donnant un produit ayant un pouvoir, 35 des dimensions moléculaires, et une activité anti-coagulante identiques, et conçarable en ce qui concerne les autres identifications physiques et chimiques. Il est particulièrement remarquable et surprenant qu'une simple chromatographie par différence d'affinité permette d'obtenir un constituant 71 20541 6 2104755 purifié, de pouvoir élevé et directement utilisable, ayant une activité semblable à celle de la thrombine à partir de venin de serpent n'ayant pas subi de traitement préalable. En raison de la remarquable efficacité du procédé de purification 5 et d'isolement de l'invention et du fait que la solution obtenue peut être directement utilisée aux fins médicales souhaitées après ajustage de la concentration, on voit qu'on devra réaliser la concentration en tampon et en sel de la solution de venin à partir de produits apyrogènes et en utilisant comme tampons des sels non toxiques. Pour cette raison, on utilise comme 10 tampons des sels convenant en physiologie en quantités telles qu'on réalise une concentration physiologique correspondant par exemple à une solution isotonique. Si on le désire, on peut ajouter un conservateur à la solution de venin au départ, ou à la fraction coagulante isolée purifiée si on désire 15 la stocker ou lui apporter une durée de conservation prolongée. De nombreux conservateurs conviennent à cet effet, tels que l'alcool benzylique^le p-hydroxybenzoate de méthyle et/ou de propyle, le chlorobutanol et similaires. Généralement de 0,05 à 1,0 % d'un tel conservateur suffit à assurer un stockage normal. 20 Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de 1'invention. 71 20541 i i 2104755 REVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement du constituant ayant une activité semblable à celle de la thrombine du venin de vipéridés, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à introduire une solution aqueuse diluée, linçide de venin brut, tamponnée à pH 7,5 - 8,1, dans une colonne garnie de perles d'agarose couplé avec de l'agmatine, à éluer la colonne par une solution de chlorure de sodium à gradient linéaire tamponnée à pH 8,1 - 0,1 et à réunir les fractions contenant le constituant ayant une activité analogue à celle de la thrombine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de ladite solution de venin brut contient entre 0,5 et 5% en poids de venin. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit gradient linéaire de la solution de chlorure de sodium débute à 0,01 mole et se termine à 1,0 mole, et de préférence débute à 0,01 mole et se termine à 0,5 mole. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite solution de venin et ledit liquide éluant sont tous deux tamponnés par un sel non toxique de tris(hydroxyméthyl)aminométhane. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit sel non toxique est le chlorhydrate.