Brevet FR2070696A1 — publié le 19710917

1_ 2070696 La présente invention concerne un procédé de préparation de 1-sérine-hydrolase sous forme d'une préparation d'activité élevée, consistant à cultiver une souche pouvant produire de la 1-sérine-hydrolase appartenant aux espèces Arthrobacter, Corynebacterium ou 5 Sarcina dans un milieu nutritif aqueux, à en isoler les cellules et à récupérer la 1-sérine-hydrolase de ces cellules. la 1-sérine-hydrolase (appelée également l-sérine-hydrolatase ou 1-sérine-désaminase; enzyme ÏT° 4, 2, 1 , 13) est un enzyme pouvant hydrolyser la 1-sérine en acide pyruvique et ammoniac . A 10 ce jour, on sait très peu de choses sur les propriétés, la production microbiologique et les caractéristiques physiologiques de cet enzyme. La demanderesse a découvert que certains microorganismes appartenant aux espèces Arthrobacter, Corynebacterium et Sarcina sont 15 capables de produire de la 1-sérine-hydrolase. On a signalé que la 1-sérine-hydrolase inhibe le développement des cellules tumorales chez la souris. Selon le procédé de la présente invention, on obtient des préparations de 1-sérine-hydrolase à l'échelle industrielle. Ces prépa-20 rations de 1-sérine-hydrolase peuvent être utilisées pour préparer de l'acide pyruvique à partir de la 1-sérine. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de 1-sérine-hydrolase qui consiste à cultiver des cellules d'une souche produisant de la 1-sérine-hydrolase choisie parmi' les Arthro-25 bacter, Corynebacterium et Sarcina dans un milieu nutritif aqueux, à séparer les cellules de ce milieu et à isoler la 1-sérine-hydrolase de ces cellules. Les souches préférentielles produisant la 1-sérine-hydrolase sont Arthrobacter ureafaciens, Arthrobacter citrens, Arthrobacter globi-30 formis, Arthrobacter Histidinovolans, Corynebacterium oleophilus, Corynebacterium simplex, Corynebacterium rathayi, Sarcina flava, Sarcina lutea, Sarcina subflava et Sarcina ureae. Conformément à l'invention le procédé d'obtention de préparations de 1-sérine-hydrolase consiste à cultiver en aérobiose dans un mi-35 lieu nutritif aqueux pendant 6 à 30 heures environ des cellules d'une souche produisant de la 1-sérine-hydrolase d'Arthrobacter,de Corynebacterium ou de Sarcina à une température comprise entre 20° et 40°C environ, à -un pH compris entre 5 et 9 environ, puis à séparer les cellules du milieu et à isoler de celles-ci la préparation 40 de 1-sérine-hydrolase,, 70 33401 -2- 2070696 L'invention concerne également l'utilisation dans le procédé ci-dessus d'une souche productrice de 1-sérine-hydrolase choisie parmi le groupe des Arthrobacter ureafaciens "ATCC N° 7562", Arthrobacter citrens "ATCC N° 11624" , Arthrobacter globiformis "ATCC 5 N° 8010" , Arthrobacter histidinovolans "ATCC N° 11442", Corynebacterium oleophilus "ATCC U° 15108", Corynebacterium simplex ■ ATCC H° 6946" , Corynebacterium rathayi "ATCC H° 13659", Sarcina flava " ATCC N° 21550" , Sarcina lutea "ATCC ÏT° 15176" , Sarcina subflava "ATCC F0 7468" et Sarcina ureae "ATCC ÎT° 6473"» 10 Les micro-organismes utilisés dans le procédé de fermentation de l'invention sont constitués par une quelconque des souches appartenant au genre Arthrobacter, Corynebacterium et Sarcina pouvant produire de la 1-sérine-hydrolase dans un milieu nutritif aqueux. On préfère, en particulier, les souches d'Arthrobacter ureafa-15 ciens, d'Arthrobacter citrens, d'Arthrobacter histidinovolans, d'Arthrobacter globiformis, Corynebacterium oleophilus, Corynebacterium simplex, Corynebacterium rathayi, Sarcina flava, Sarcina lutea, Sarcina subflava et de Sarcina ureae. On peut se procurer la plupart de ces souches à 1'"American Type 20 Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland", 'et les souches précitées sont fournies sans restriction. Selon le procédé de l'invention, on effectue de préférence la culture en inoculant un milieu nutritif aqueux contenant une source d'azote assimilable telle que de l'extrait de viande, une pepto-25 ne, l'infusion de maïs, la NZ-amine, l'infusion de soja, l'extrait de levure, l'hydrolysat de caséine, divers acides aminés tels que ltacide glutamique ou leurs mélanges, avec une souche produisant de la 1-sérine-hydrolase appartenant au genre Arthrobacter, Corynebacterium ou Sarcina. On peut utiliser également comme source d'azo-30 te assimilable des sels minéraux tels que 'des nitrates. On peut également introduire dans le milieu de fermentation diverses vitamines telles que la biotine et des éléments minéraux essentiels bien connus de l'homme de l'art. On conduit généralement les cultures eh aérobiose entre 20 et 35 40°C à un pH de 5-9 pendant 6 à- 30 heures (de préférence 10 à 20 heures) en secouant. Dans ces conditions, les cellules des microorganismes précités croissent rapidement dans le milieu ( 5 à 20 gl de cellules humides). Lorsque là culture est terminée, on sépare les cellules, de préférence par centrifugation, et on- les détruit 40 de façon convenable pour en extraire une solution brute contenant 70 33401 ~3" 2070696 la 1-sérine-hydrolase. le procédé préférentiel de destruction des parois cellulaires consiste à utiliser un homogénéiseur tel que l'homogénéiseur dit "Monton-G-aulinen0 On effectue la purification de la 1-sérine-hydrolase dans l'ex-5 trait suivant un procédé classique de purification des enzymes, par exemple en précipitant par le sulfate d'ammonium, en précipitant par un solvant, ou par chromatographie sur diverses résines échangeuses d'ions et des adsorbants et similaires» Dans les exemples ci-dessous, l'activité enzymatique est expri-10 mée en III (unité internationale)« Une activité de 1 Ul/ml correspond à l'activité d'un milieu dont 1 ml décompose 1 ji mole de substrat de 1-sérine en une minute. Comme précédemment indiqué, tous les micro-organismes ATCC indiqués dans les exemples, sont fournis au public sans aucune restric-15 tion» l'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et de quelques exemples non limitatifs représentant des modes de réalisation de l'invention. "RyRMPLE 1 :- On cultive une souche d1Arthrobacter histidinovo-20 lans ( "ATCC M"0 11442") dans un milieu aqueux contenant 5% d'infusion de maïs à 30°C pendant 18 heures en aérant et en agitant pour obtenir une culture d'ensemencement» On utilise cette culture pour ensemencer dans un rapport volumique de l/lO, mille litres de milieu contenant 1 f» de peptone, 1 $ d'extrait de levure et 0,5 f» de 25 phosphate bipotassique dont le pH est amené à 7,2 dans un fermen-teur de deux mille litres» On conduit la culture à 30°C pendant 18 heures en aérant à 200 litres/minute et en agitant à 110tours/minute pour obtenir un milieu de culture ayant une activité de 1,56 ïïl/m.l. On sépare par centrifugation les cellules ainsi cultivées 30 pour obtenir 18,6 kg de cellules humides. On met les cellules humides en suspension dans une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 8,0) et on les détruit au moyen d'un homogénéiseur dit "Monton-Gauline" „ On centrifuge le mélange obtenu pour obtenir un extrait brut ayant une activité enzymatique de 0,7 Ul/mg de protéines. On 35 réalise la précipitation fractionnée de cette solution par le sulfate d'ammonium, on la traite par la DEAE-cellulose et l'hydroxy-apatite pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité spécifique de 92 ÏÏI/mg de protéines avec un rendement de 12 £ environ. 70 33401 -4- 2070696 EXEMPLE 2 On cultive une souche d*!Arthrobacter ureafaciens" (ATCC N° 7562) de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation enzymatique ayant une activité de 0,72 Ul/ml» On obtient 18,5 kg de cellules humides. On détruit les cellules comme dans l'exemple 1 pour obtenir un extrait brut ayant une activité spécifique de 0,2 ïïl/mg de protéines. On traite la solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité spécifique de 40 Ul/mg de protéines avec un rendement de 12 foa EXEMPLE 3 On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche d'"Arthrobacter citrens " (ATCC ET0 11624") pendant 20 heures pour obtenir un milieu de culture ayant une activité de 1,19 Ul/ml. On recueille 15»2 kg de cellules humides que l'on détruit comme dans l'exemple 1 pour obtenir un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifique de 0,3 ïïl/mg de protéines. On traite la solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une 1-sérine-hydrolase ayant une activité spécifique de 89 Ul/mg de protéines avec un rendement de 35 %• EXEMPLE 4 :- On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche d'"Arthrobacter globiformis" (ATCC N° 8010") pour obtenir un milieu de culture ayant une activité de 1,56 Ul/ml de milieu, On sépare 20,0 kg de cellules humides que l'on détruit pour obtenir un extrait brut ayant une activité spécifique de 0,4 Ul/mg de protéines. Par purification de la solution extraite comme dans l'exemple 1, on obtient une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité spécifique de 82 Ul/mg avec un rendement de 23 $. EXEMPLE 5 : - On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de "Corynebacterium oleophilus (ATCC îf° 15108)" pour obtenir un milieu de culture ayant une activité enzymatique de 0,67 Ul/ml. On obtient 12,3 kg de cellules humides que l'on détruit comme dans l'exemple 1 pour obtenir vin extrait brut ayant une activité enzymatique de 0,2 Ul/mg de protéines. On purifie la solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité spécifique de 98 Ul/mg de protéines avec un rendement d'environ 11 EXEMPLE 6 ;- On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de "Corynebacterium simplex (ATCC N° 6946)" pour obtenir un milieu de culture ayant une activité enzymatique de 0,24 Ul/ml. On détroit les 16,0 kg de cellules humides obtenues pour obtenir BAD ORIGINAL ! 70 33401 -5- 2070696 ■un extrait enzymatique "brut ayant une activité spécifique de 0,1 ïïl/mg de protéines. On traite la solution extraite de la même façon que dans 1*exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-séri-ne-hydrolase ayant une activité de 56 Ul/mg de protéines avec un rendement de 8 fo. •RTRMPLE 7 :- On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de "Corynebacterium rathayi (ATCC N° 13659)" pour obtenir un milieu de culture ayant une activité enzymatique de 0,25 Ul/ml. On détruit les 16,7 kg de cellules humides obtenues pour obtenir un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifique de 0,1 Ul/mg de protéines. On traite la solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine hydrolase ayant une activité de 47 Ul/mg de protéines avec un rendement de 17 %. EXEMPLE 8 ;- On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de "Sarcina flava (ATCC F® 21550)" pour obtenir un milieu de culture ayant une activité de 0,76 Ul/ml» On détruit les 15,2 kg de cellules humides obtenues pour obtenir un extrait brut ayant une activité enzymatique de 0,36 Ul/mg de protéines. On traite la solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité spécifique de 92 Ul/mg de protéines avec un rendement d'environ 12$ EXEMPLE 9 î- On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de "Sarcina lutea (ATCC ÏT° 15176)" pour obtenir un milieu de culture ayant une activité enzymatique de 0,72 Ul/ml. Par séparation des cellules ainsi cultivées, on obtient 16,2 kg de cellules humides que l'on détruit pour obtenir un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifique de 0,21 Ul/mg de protéines.On traite cette solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité de 42 Ul/mg de protéines, avec un rendement de 12 EXEMPLE 10 :- On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de Sarcina subflava ("ATCC ÎT° 7468)" pour obtenir un milieu de culture ayant une actitité enzymatique de 0,55 Ul/ml. Par séparation des cellules ainsi cultivées, on obtient 15,8 kg de cellules humides que l'on détruit pour obtenir un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifique de 0,2 Ul/mg de protéines. On traite cette solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une acti vité de 45 Ul/mg de protéines, avec un rendement de 15 70 33401 -6- 2070696 "BTBMPT/R il On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 une souche de "Sarcina ureae (ATCC ÏT° 6473 ") pour obtenir un milieu de culture ayant une activité enzymatique de 0,48 Ul/ml„ Par séparation des cellules ainsi cultivées, on obtient 18,5 kg de cellules humides que l'on détruit pour obtenir un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifique de 0,15 Ul/mg de protéines.On traite alors cette solution extraite de la même façon que dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation de 1-sérine-hydrolase ayant une activité de 36 Ul/mg de protéines, avec un rendement de 10$ » Cette préparation inhibe également le développement des cellules tumorales de la souri s Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits ; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention. 70 33401 -7- 2070696 - REVENDICATIONS- 1.- Procédé d'obtention d'une préparation de 1-sérine-hydrolase caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des cellules d'une souche produisant de la 1-sérine-hydrolase choisie parmi le groupe des Arthrobacter , Corynebacterium et Sarcina dans un milieu nutritif 5 aqueux, à séparer les cellules dùdit milieu et à séparer la préparation de 1-sérine-hydrolase des cellules» 2o- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche produisant la 1-sérine-hydrolase est choisie parmi le groupe d'Arthrobacter ureafaciens, d'Arthrobacter citrens, d1Arthrobacter 10 globiformis, d'Arthrobacter histidinovolans, Corynebacterium oleophilus, Corynebactérium simplex, Corynebacterium rathayi, Sarcina flava, Sarcina lutea, Sarcina subflava et Sarcina ureae, 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche produisant la 1-sérine-hydrolase est choisie parmi le groupe 15 d'Arthrobacter ureafaciens "ATCC N° 7562" , d'Arthrobacter citrens "ATCC ÎT° 11624" , d1Arthrobacter globiformis " ATCC N° 8010" et d'Arthrobacter histidinovolans "ATCC M'0 11442"» 4®- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche produisant la 1-sérine-hydrolase est choisie parmi le groupe 20 de Corynebacterium oleophilus "ATCC N° 15108" , Corynebacterium simplex "ATCC N° 6946" et Corynebacterium rathayi "ATCC N° 13659"» 5.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la . souche produisant la 1-sérine-hydrolase est choisie parmi le groupe de Sarcina Flava "ATCC N° 21550" , Sarcina lutea "ATCC N° 15176", 25 Sarcina subflava "ATCC N° 7468" et Sarcina ureae "ATCC 1° 6473"« 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif aqueux contient une source d'azote assimilable. 7.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on conduit la culture en aérobiose pendant environ 6 à 30 heures à 30 une température comprise entre environ 20 et 40°C à un pH compris entre environ 5 et 9. 8.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare les cellules du milieu par centrifugation» 9.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ré-35 cupère la préparation de 1-sérine-hydrolase des cellules par destruction du protoplasme desdites cellules dans un homogénéiseur»