Brevet FR2104762A1 — publié le 19720421

22S91 - i - 2104762 la présente invention concerne de nouveaux antibiotiques d'amino-glycosides appelés gentamicine B, gentamicine B^-^t gentamicine X, leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables et leurs procédés de préparation. Ces antibiotiques exercent des 5 activités antibactériennes, antiprotozoaires et anthelminthiques. La présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques contenant au moins un de ces antibiotiques et/ou un autre antibiotique d'amino-glycoside appelé gentamicine A, des procédés de préparation de ces compositions, ainsi que des procé-10 dés d'utilisation de ces antibiotiques, la gentamicine A exerce une activité antiprotozoaire et anthelminthique. On peut obtenir ces antibiotiques par un procédé de fermentation pour la préparation de gentamicine. La préparation, l'isolation et la purification de la gentamyoine est décrite dans 15 le brevet américain n° 3.091.572. La gentamyoine, connue actuellement sous le nom de gentamicine, a été décrite dans ce brevet comme composant antibiotique principal et elle est désignée dans la présente spécification par "composant C" ou "gentamicine C". Dans ce brevet, on se réfère aux antibiotiques BA-3 (fraction A) 20 et BA-3 (fraction B) formés simultanément et qui, en mélange l'un avec l'autre, exercent une faible activité antibactérienne. C's antibiotiques ont été séparés de la gentamicine C. En adoptant un système chromatographique particulier décrit ci-après, on a trouvé que les substances décrites dans le 25 brevet américain n° 3.091.572 comme antibiotiques BA-3 (fraction A) et BA-3 (fraction B) formés simultanément, ne sont pas de simples entités en eux-mêmes, mais qu'ils représentent, ensemble, un mélange d'au moins quatre composants. Un procédé perfectionné pour la résolution de ce mélange d'antibiotiques formés simulta-30 nément en ses composants (appelés ci-après gentamicine A, gentamicine B, gentamicine B^ et gentamicine X) a permis de découvrir que chaque, membre de ce groupe possédait des caractéristiques d'utilisation surprenantes et inattendues. La gentamicine A a été isolée antérieurement sous forme 35 pure, elle a fait l'objet d'examens chimiques et biologiques et l'on a trouvé qu'elle exerçait une activité antibiotique assez faible. A présent, on a trouvé la caractéristique d'utilisation 71 22591 - 2 - 2104762 assez surprenante de la gentamicine A, notamment son utilité en tant qu'agent anthelminthique et antiprotozoaire. Jusqu'à présent, la gentamicine B, la gentamicine B-^ et la gentamicine X n'ont jamais été isolées l'une 4e lrautre. On a trouvé que ces substan-5 ces possédaient certaines propriétés intéressantes en tant qu'antibiotiques, agents anthelminthiques et agents antiprotozoaires. jïin outre, la gentamicine B et la gentamicine B^ possèdent de remarquables propriétés antibactériennes. Les antibiotiques gentamicine A, gentamicine B, gentamicine et gentamicine X exercent 10 des effets secondaires nettement réduits. C'est pourquoi, il est avantageux d'employer la gentamicine B et la gentamicine B^ pour le traitement d'infections bactériennes au cours d'une période prolongée. Lors du traitement de l'helminthiase, qui est aggravée par une infection bactérienne ou une infestation protozoaire, les 15 antibiotiques gentamicine A, gentamicine B, gentamicine B-^ et gentamicine X peuvent être d'une valeur très intéressante. Du point de vue structural, les antibiotiques gentamicine B, gentamicine B-^, gentamicine X et gentamicine A sont analogues l'un à l'autre, comme le montre la formule (II) qui illustre 20 la disposition moléculaire globale sans tenir compte des considérations spatiales. 25 hh2 (II) 30 Gentamicine A = ^2 = H E3 = 0H S4 = H Gentamicine B R, = OH R„ = H R., = NH0 R. = CH, 1 3 2. 4 3 Gentamicine R^ = OH R^ = CH^ R^ = R^ = CH^ Gentamicine X Rn = ÏIH0 10 = H R, -= OH - R. = CH~ J. . ê. d 0 4 3 35 Les composés die la présente invention forment aisément des produits d'hydratation et de solvatation qu'il est extrêmement difficile de décomposer. En conséquence, les constantes physiques 71 22591 - 5 - 2104762 pour la gentamicine À, la gentamicine B et la gentamicine B-^ sont baséeB sur des produits d'hydratation ou de solvatation relativement stables. De. plus, bien que la gentamicine B et là gentamicine B^ forment des produits de solvatation éthanoliques cristal-5 lins, elles ne donnent pas des points de fusion reproductibles, mais elles ont plutôt tendance à ramollir et à devenir finalement des liquides visqueux dans un très large intervalle de températures. La gentamicine X n'a pas encore été obtenue sous forme cristalline5 elle est isolée sous forme d'un solide amorphe blanc qui ne pos-10 sède pas non plus un point de fusion distinct. Les antibiotiques décrits dans la présente spécification possèdent pratiquement les propriétés physiques indiquées au tableau I ci-après s (s toutes les valeurs en oxygène sont obtenues par différence). TABLL AU I Composés physiques Nj Composé Analyses élémentaires Calculé 3€ Trouvé Analyses Sels sulfates D*J\ ■2 S K) K> Cn G-entamicine A Calculé pour C18H36I4010'1°5H20 C = H = 01 = 43,63 7,93 11,31 37,13 1 43,60 7,86 11,56 37,16 + 136° (C = 1.0,H2O) + 96° (C = 0. 3 jHg.0) Gentamicine B Calculé pour C H C19H38 N4°10-C2H50H Ji 47,70 es, 41 10,60 33,29 C = H = = 0 = 47,78 8,38 10,59 33,25 + 155° C (C = 0.3,H90) H ^ F S = 30,35 + 116° = 6,59 (C = 0,3 ?EuO) = 7,49 * = 8,48 i l Gentamicine B^ Calculé pour C20H40K4°10 *C2H50H C H ET 0 = 47,22 = 8,34 = 10,41 = 34,03 N1 = 0X = 48,68 8,56 10,32 32,44 + 161° C (C = 0.3,H90) H ^ I S = 31,26 + 117° 6,83 (C = 0.3,H^0) 7,34 * 8,72 Gentamicine X C19H381:Î4010 C = H = % = 0 = 43,54 7,22 9,90 39,34 + 154e (C = 0.3,H90) H ^ H S C = 31,96 + 121e 6,57 (C = 0.3,H,,0) u,b4 8,70 KJ O 42* —I o ro 71 22591 - 5 - 2104762 la gentamicine A, là gentamicine B, la gentamicine B-^ et la gentamicine X ont des spectres caractéristiques d'absorption des rayons infrarouges dans de l'huile minérale•(Nujol) comme l'indiquent la figure 1 (gentamicine A), la figure 3 (gen-5 tamieine B), la figure 5 (gentamicine B-^) et la figure 7 (gentamicine X). Ces spectres sont ceux des antibiotiques respectifs sous forme de sels sulfates. Ces antibiotiques possèdent également des spectres caractéristiques de résonance magnétique nucléaire indiqués par 10 la figure 2 (gentamicine A), la figure 4 (gentamicine B), la figure 6 (gentamicine B^) et la figure 8 (gentamicine X). Tous les spectres de résonance magnétique nucléaire sont ceux des bases libres d1 antibiotiques5 toutefois, les échantillons de gentamicine A et de gentamicine X sont des produits d'hydratation et ceux 15 de la gentamicine B et de la gentamicine B^ sont des produits de solvatation éthanoliques. On obtient ces spectres en utilisant un spectromètre "Varian A-TO-A" ("Varian Associates", Palo Alto, Californie) avec environ 0,4 ml d'une solution (concentration s environ 20 mg/ml) de l'antibiotique dans de l'oxyde de deutérium 20 (I^O). Ces spectres sont enregistrés en parties par million à partir du sel de sodium de l'acide 3-(triméthylsilyl)-propane-suif onique (norme interne). Le tableau II reprend les crêtes les plus caractéristiques des figures 1, 3, 5. et 7 respectivement. 25 TABLEAU II Bandes significatives d'absorption des rayons infrarouges Sulfate de gentamicine A 2^9-3,8 yu (fort, très large) 6,85 yu (Hujol) 3,35 yu (Nujol) 7,25 /u (Nujol) 30 3,55 /u (Nujol) 8,50-10,75 /u (très fort, * ' très large) 4,83 /u (faible, large) 12,95 /U (très faible, • ' ' large) 6,17 yu (moyen) 13,88 yu (faible, large) 6,53 yu (moyen) 71 22591 - 6 - 2104762 2,95 -3,40 3,51 5 4,85 6,16 3,25 /U /U /U /U /U 6,55 6 ,83 /U /U 10 15 20 25 35 2 >95 3,38 3,50 4,85 6,16 6,55 6,83 3,0 - 3,37 - 3,25 3,3 3,51 3,65 -4,33 4.82 5,94 6,17 6,54 6.83 /U /U /U /U /U /U ■u /U /U /U /u /u /U /u /U Sulfate de gentamicine B moyen-fort, laxge) 7,26 /U îTujol) Hujol) faible, moyen) moyen) Fujol) r 7,75 /u 8,75-9,75 large ) 10,28 12,95 /u /U 13,90 px (lujol) (faible) yu (fort, très large) (faible-moyen) (très faible, large) (faible, large) Sulfate de gentamicine B^ moyen-fort, Nujol) Nujol) faible, moyen) moyen) Nujol) large) 7,25 /u 7,75 /u large) 10,27 /u 10,75 /u 13,05 /u 13,90 /u Sulfate de gentamicine X fort, large) Nujol) moyen, large) faible, large) faible, saillie) moyen) moyen) Nujol) (Nujol) (faible) 8^75-9,75^ (fort, très large) (f aible-moyen) (faible) (très faible, large) (faible, large) (Nujol) (faible-moyen) px (très fort, large) (laxge, saillie) (faible, large) (très faible, large) (Nujol) (très faible). 7,25 /u 7,75 /u 8,7-10,0 10,30 /u 11,50 yU 13,03 /u 13,90 yu 15,08 yu 30 la gentamicine À, la gentamicine B, la gentamicine B-^ et la gentamicine X comportent des groupes amino ou amino substitués pour en former des sels d'addition acide avec des acides organiques et inorganiques. Si un sel de ce type dérive d'un acide polybasique, il peut contenir des groupes acides libres et/ou des groupes acides neutralisés par d'autres bases telles que, par exemple, les bases de métaux alcalins. L'expression "sel non toxique", utilisée dans la présente spécification, désigne des sels ne donnant pas lieu à des effets secondaires préjudiciables lors- 71 22591 - 7 - 2104762 qu'ils sont administrés aux doses habituelles. En règle générale, on peut former les sels d'acides inorganiques en ajoutant une quantité d'acide dilué (1,0 N) à une solution aqueuse de la base antibiotique pour régler le pH de la solution à environ 4,5, 5 après quoi on soumet la solution obtenue à une lyophilisation. C'est ainsi que, par le procédé ci-dessus, on forme des sels d'addition acide avec l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et analogues, y compris les sels de métaux alcalins des acides dibasiques et tribasiques. En règle générale, 10 les sels d'acides inorganiques sont solubles dans l'eau, mais pratiquement insolubles dans les solvants organiques. Toutefois, ces sels (par exemple, les chlorhydrates) peuvent avoir une solubilité très limitée dans des solvants organiques polaires tels que, par exemple, les acides carboxyliques d'hydrocarbures, y com-15 pris les acides dibasiques tels que, par exemple, l'acide succi-nique, l'acide tartrique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide glutarique et analogues 5 on les prépare habituellement en faisant réagir une solution aqueuse de l'antibiotique avec une quantité stoechiométrique d'acide et en lyophilisant la solu-20 tion obtenue ou en précipitant le produit avec un solvant organique miscible tel que, par exemple, l'acétone, le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le méthanol ou analogues. De même, on peut préparer des produits de solvatation de sels d'addition acide des antibiotiques. On peut également obtenir des antibiotiques 25 d'amino-glycosides, à savoir la gentamicine B et/ou la gentamicine B-^ et/ou la gentamicine X, répondant à la formule moléculaire globale (I) 30 35 nh2 (I) qui est la gentamicine B lorsque R^ représente un groupe hydroxy, R2, u** atome d'hydrogène et R^, un groupe amino, la gentamicine 71 22591 - 8 - 2104762 B-^ lorsque R^ représente un groupe hydroxy, > Ie groupe méthyle et R^ , un groupe amino, de même que la gentamicine X, lorsque S-, ✓ J- représente un groupe amino, R2, un atome d'hydrogène et R^, un groupe hydroxy, sous forme libre ou sous forme de dérivés phar-5 maceutiquement acceptables! ce procédé consiste à séparer au moins un de ces antibiotiques sous forme libre ou sous forme d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable à partir d'un mélange comprenant au moins un de ces antibiotiques, puis éventuellement transformer un composé libre ainsi obtenu en ses dérivés ou un 10 dérivé ainsi obtenu sous forme libre ou encore un dérivé en un autre. On effectue la séparation suivant des procédés connus. On effectue avantageusement la séparation par des procédés chroma-tographiques, par exemple, par chromatographie en colonne. De préférence, comme adsorbant, on emploie le gel de silice. 15 Ce mélange comprend, par exemple, la gentamicine B et/'ou la gentamicine B-^ et/ou la gentamicine X en mélange avec au moins un autre antibiotique tel que, par exemple, la gentamicine A et/ou la gentamicine C. On peut obtenir un mélange comprenant les gentamicines 20 B, B^, X, A et C, par exemple, par fermentation de Micromonospora purpurea et Micromonospora echinospora, ainsi qu'on l'a décrit dans la spécification du brevet américain n° 3.091.572. De préférence, on soumet le mélange ainsi obtenu à une séparation chroma-tographique en colonne en utilisant la couche inférieure d'un 25 système solvant constitué de méthanol, de chloroforme■et d'hydro-xyde d'ammonium comme solvant d'élution. Avant la chromatographie, on mélange des volumes égaux des solvants, on les laisse décanter et on sépare les couches. On élue tout d'abord la gentamicine C, également connue sous le nom de "G-aramycin" (marqué commerciale 30 de la "Schering Corporation", Bloomfield, Jtfew-Jersey) (constituée de trois composants C-^, C-^a et C2), puis on élue successivement la gentamicine B-^, la gentamicine X, la gentamicine B et finalement, la gentamicine A. On décrira ci-après d'une manière plus détaillée un 35 procédé de séparation d'un mélange du type précité. Au terme de .la fermentation, on extrait les antibiotiques du bouillon de fermentation et, à cet effet, on adsorbe tout 71 22591 _g_ 2104762 le complexe antibiotique du bouillon de fermentation sur une résine échangeuse de cations, de préférence, du type de 1*"Amberlite", par exemple, 1' "Amberlite IRC-50". On utilise, avantageusement la résine dans le cycle ammonium et l'on élue le mélange 5 antibiotique brut avec de l'hydroxyde d'ammonium dilué. On décolore l'éluat en le faisant passer à travers une colonne contenant du charbon décolorant ou, de préférence, en le faisant passer à travers une colonne d'une résine échangeuse d'anions, en particulier, une résine du type de 1' "Amberlite IRA." mentionné ci-des-10 sus. Pour décolorer l'éluat de la résine "IRC-50", on utilise, de préférence, la résine "IRA-401S" dans le cycle hydroxyle. Après C la décoloration, on concentre l'éluat sous vide en une solution contenant environ 30 à environ 60 i° de solides, cette solution étant conservée en vue du traitement ultérieur. La solution con-15 tient alors tous les antibiotiques formés au cours de la fermentation, pratiquement dans le rapport obtenu. Les composants de gentamicine "C" constituent environ 60 à environ 80 # du mélange, tandis que les antibiotiques formés simultanément constituent le reste. Lès lors, afin d'obtenir les antibiotiques formés simulta-20 nément, il est avantageux d'éliminer au moins partiellement la gentamicine C. Il existe un nombre important de résines appropriées à cet effet. Parmi ces résines, il y a les résines échan-geuses d'anions, par exemple 1* "Amberlite IRA-400", 1' "Amberlite IRA-401", le "Dowex 1-X2" et le "Dbwex 2-X4" ("Amberlite" 25 étant une marque commerciale de la "Rohm and Haas Company", Philadelphie, Pennsylvanie, tandis que "Dowex" est un nom commercial de la "Dow Chemical Company", Midland, Michigan). En règle générale, les résines poreuses du type des aminés quaternaires fortement basiques sont utiles. La Demanderesse préfère utiliser le 30 "Dowex 1-X2" dans le cycle hydroxyle. Les composants de gentamicine C en sont sélectivement désorbés en utilisant de l'eau déminéralisée çiyant une résistance d'environ 50.000 à environ 150.000 ohms. La colonne peut être avantageusement raccordée en série et par un pont de conductivité à un collecteur automatique de frac-35 tions de telle sorte qu'une nette élévation de la conductibilité de l'effluent actionne le collecteur de fractions. De la même manière, une perte de conductibilité (élévation de la résistance), 71 22591 - 10 - 2104762 suivie d'une nette élévation de la conductibilité, amorce l'étape consistant à recueillir une nouvelle fraction. La prudence (à un important degré) à laquelle fonctionne cette colonne, permet de régler la quantité de gentamicine "G" restant dans le mélange 5 des antibiotiques formés simultanément et, à un certain degré, elle influence défavorablement l'efficacité de la colonne ultérieure utilisée poux séparer, l'un de l'autre, les antibiotiques formés simultanément. Les antibiotiques formés simultanément sont élués de 10 la colonne de "Dowex 1-X2" après les composants de gentamicine C, tandis que l'éluat aqueux est concentré sous vide à un volume approprié, puis il est soumis à une lyophilisation. A ce stade, il est avantageux de dissoudre le mélange antibiotique dans du méthanol chaud et de le refroidir tout en exposant la solution 15 à l'air. La gentamicine A adsorbe l'anhydride carbonique de l'air en formant un sel carbonate peu soluble qui cristallise dans la solution méthanolique et est éliminé par filtration, pour être ensuite séché sous vide. On concentre le filtrat en un résidu et on le dissout dans environ trois volumes de la phase inférieure 20 d'un mélange de solvants constitué de méthanol, de chloroforme et d'hydroxyde d'ammonium dans le rapport volumétrique de lslsl. On verse la solution ci-dessus par le sommet d'une colonne de dimensions appropriées et constituée, de préférence, de gel de silice, puis on élue la colonne en utilisant le mélange 25 de solvants décrit ci-dessus à un débit réglé. On peut obtenir la gentamicine B et la gentamicine sous forme cristalline en dissolvant les résidus des fractions appropriées de la colonne dans de l'éthanol et en les concentrant sous vide en un résidu, puis en dissolvant à nouveau le résidu dans de-l'éthanol et en 30 évaporant à nouveau la solution jusqu'à ce qu'on obtienne une suspension cristalline. Ce procédé donne de la gentamicine B et de la gentamicine B^ pratiquement pures sous forme de produits de solvatation éthanoliques contenant environ 1 mole d'éthanol par mole d'antibiotique, La gentamicine X est habituellement obtenue 35 sous forme d'un solide amorphe et, à cet égard, elle se comporte de la même manière que les composants de gentamicine "C". A titre de variante, tout le mélange antibiotique pro- 71 22591 - u - 2104762 venant de la colonne de "HRA—401S" et qui comprend les composants de gentamicine C, peut être soumis à une chromatographie dans une colonne de gel de silice. Toutefois, la séparation effectuée par cette technique n'est pas aussi nette que celle obtenue lorsque 5 la majeure partie de la gentamicine "C" et de la gentamicine A sont éliminées avant la chromatographie sur du gel de silice. Après l'élimination des composants de gentamicine C, la gentamicine A, la gentamicine B, la gentamicine B-^ et la gentamicine X peuvent être lyophilisées et utilisées sous forme d'un 10 mélange afin d'exercer un effet antibactérien, antiprotozoaire et/ou anthelminthique. Exemple 1 A. Isolation, à partir du milieu de fermentation, de la gentamicine C et des antibiotiques formés simultanément 15 On règle le pH du bouillon de fermentation obtenu comma décrit dans le brevet américain n° 3-091.572 à 2,0 avec de l'acide sulfurique 6 N. On agite le mélange pendant environ 30 minutes et on le filtre à travers un filtre de dimensions appropriées préalablement enduit d'une couche d'environ 2,5 cm d'un produit 20 auxiliaire de filtration. On règle à nouveau le pH du filtrat à environ 7 avec de l'hydroxyde d'ammonium 6 lî et l'on ajoute de l'acide oxalique pour abaisser le pH à environ 4. Cette quantité d'acide oxalique est habituellement suffisante pour précipiter les ions calcium du bouillon de fermentation sous forme d'oxalate 25 de calcium insoluble. On règle le pH à environ 7 avec de l'hydroxyde d'ammonium 6 îï et l'on agite le mélange pendant une période d'environ 1 à environ 4 heures à environ 20 - 35°C. On filtre à nouveau le mélange en utilisant un filtre de dimensions appropriées et préalablement enduit; on conserve le filtrat. On adsorbe 30 le mélange antibiotique sur du "IRC-50" (cycle ammonium) en utilisant environ 10 g de résine par litre du volume du bouillon initial. On lave la résine avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce qu'elle soit incolore, puis on élue les antibiotiques avec de l'hydroxyde d'ammonium 2 S. On concentre l'éluat sous vide en une 35 solution contenant environ 50 ?£ de solides. B. Séparation des composants de gentamicine C à partir de la gentamicine A, de la gentamicine B, de la gentamicine B-^ et de la gentamicine X 71 22591 - 12 - 2104762 On charge 1,3 m3 de résine "Dowex 1-X2" (cycle hydroxy-le) dans une colonne chromatographique propre de 91 cm de diamètre, d'au moins 244 cm de haut et reliée à un collecteur de fractions par un pont de conductivité„ On pompe de l'eau déminérali-5 sce à travers le lit de résine, jusqu'à ce que l'effluent ait une résistance d'au-moins 65.000 ohms. On charge une solution aqueuse d'environ 120 litres contenant environ 60 kg de solides (provenant de l'étape A) dans la colonne et on adsorbe le mélange antibiotique en laissant passer la solution antibiotique à tra-10 vers la colonne à raison d'environ 2 litres par minute. On développe la colonne avec de l'eau déminéralisée à raison d'environ 2 litres par minute et on recueille les fractions en fonction de la conductibilité de l'éluat. Spécifiquement, on recueille environ 7 fractions dont le volume varie d'environ 15 14 à environ 750 litres. Les cinq premières fractions constituant environ 500 litres contiennent la masse des composants de gentamicine C. Les deux autres fractions constituant environ 1500 à 1600 litres contiennent la masse de gentamicine A, de gentamicine B, de gentamicine B-^ et de gentamicine X. On combine les deux 20 dernières fractions, on les concentre sous vide en un faible volume et on les soumet à une lyophilisation ou à un séchage par pulvérisation. Lorsqu'on doit employer un mélange des antibiotiques formés simultanément, le produit lyophilisé ou séché par pulvéri-25 sation suffit. C. Isolation de gentamicine A On dissout 19,8 kg du produit de fermentation dont on a éliminé la majeure partie de gentamicine C (étape B), dans 45 1 de méthanol chaud. On clarifie la solution par filtration. On 30 refroidit la solution à la température ambiante en l'exposant à l'air- et on y ensemence de la gentamicine A. La gentamicine A cristallise sous forme d'un sel carbonate incolore que l'on fil-.tre, qu'on lave modérément avec du méthanol et que l'on sèche à 80°C sous; vide, pour obtenir 1.119 g du produit de cet exemple. 35 On combine la liqueur mère et les produits de lavage, on les concentre en un résidu sôus vide et on les soumet à une chromatographie comme décrit à l'étape D. 71 22591 2104762 - 13 - D. Séparation chromatographique de gentamicine B, de gentamicine B^ et de gentamicine X On remplit deux colonnes chromatographiques de 152 cm x 10 cm, reliées en série et contenant du gel de silice (par ex-5 emple le "Baker Silica Gel" pour chromatographie), que l'on a préalablement conditionné par contact avec la phase inférieure d'un mélange lîlîl de chloroforme, de méthanol et d'hydroxyde d'ammonium concentré. On prépare une solution de 750 g du résidu de l'étape C dans un volume minimum (environ 2 1 de la couche 10 inférieure du mélange de solvants décrit ci-dessus). On verse la solution antibiotique par le sonimet de la première colonne et l'on élue cette dernière à raison d'environ 3 à environ 4,5 litres par heure, en recueillant des fractions d'environ 2 litres. On contrôle l'effluent par chromatographie en minces couches sur 15 des plaques de gel de silice en utilisant le même système solvant que celui employé dans la colonne. On combine les fractions contenant des antibiotiques analogues et on les évapore en un résidu. Lorsque la quantité de gentamicine B éluée diminue progressivement, on élue la colonne avec un mélange comprenant des volumes 20 égaux de méthanol et d'hydroxyde d'ammonium concentré, afin d'épurer la colonne. On dissout les fractions contenant la gentamicine B et la gentamicine B-^ dans de l'éthanol et on les concentre en un résidu. En répétant l'étape ci-dessus, on obtient line suspension cristalline du produit de solvatation éthanolique de genta-25 micine B et de gentamicine B-^. Lorsqu'on effectue la séparation chromatographique ci-dessus, on obtient les produits dans les quantités et l'ordre indiqués ci-après ; G-entamicine C \ G-entamicine B^ ; 198,6 g 30 Gentamicine B^ - 42,0 g Z~a_Z^ = 157° Gentamicine B1 ^ Gentamicine X ) 67,8 g Gentamicine X 12,3 g ~ 153,8° Gentamicine X 35 Gentamicine B 74,9 Gentamicine B 85,8 g Z~a_7r^ = ^2' Gentamicine B \ Gentamicine A ) 165,0 g 71 22591 - 14 - t - 2104762 Les fractions contenant des mélanges d'antibiotiques peuvent être soumises à une nouvelle chromatographie pour donner plusieurs fractions individuelles". Exemple 2 5 Préparation de sulfate de.gentamicine A On dissout 5 g de gentamicine A dans 25 ml d'eau et on règle le pH de la solution à 4,5 avec de l'acide sulfurique 1 N. On traite la solution- avec environ 50 mg de charbon décolorant pendant environ 15 minutes et on filtre. On verse le filtrat dans 10 environ 300 ml de méthanol, tout en agitant vigoureusement, on poursuit l'agitation pendant environ 10 - 20 minutes-et on filtre. On lave le précipité avec du méthanol et on le sèche à environ 60°C sous vide, pour obtenir le produit de cet exemple. De la même manière, on peut préparer le sel sulfate de 15 gentamicine B, de gentamicine B^ et de gentamicine X. Pour préparer les-sels sulfates d'un mélange de gentamicines A, B, B^ et X, on traite le produit lyophilisé ou séché par pulvérisation de l'exemple 1 (étape B) comme décrit dans cet exemple. Exemple 5 20 Préparation de chlorhydrate de gentamicine B-^ On dissout 5 g de gentamicine B-^ dans 1.000 ml d'eau. On prépare une colonne contenant 500 g d'une résine échangeuse d'ions faiblement basique dans le cycle chlorure, de préférence, 1' "IE-45" (marque commerciale de la "Rohm and Haas" ,• Philadel-25 phie, Pennsylvanie). On fait passer la solution antibiotique à travers la colonne, puis on ajoute 500 ml d'eau. On concentre l'effluent à 100 ml sous vide et on le lyophilise pour obtenir le produit de cet exemple. De la même manière, on peut également préparer le sel 30 chlorhydrate de gentamicine A, de gentamicine B et de gentamicine X. Sous un autre aspect opératoire, l'invention concerne la lutte contre les infections bactériennes chez les animaux, en administrant, à un animal présentant une infection de ce type, 35 une quantité thérapeùtiquement efficace d'au moins un des antibiotiques gentamicine B, gentamicine B-^, gentamicine X et leurs dérivés non toxiques pharmaceutiquement acceptables, par exemple, 71 22591 - 15 - 2104762 les sels d'addition acide, les produits de solvatation et les produits d'hydratation de ces composés. Sous un autre aspect opératoire encore, l'invention concerne le traitement des infections bactériennes chez les ani-* 5 maux en administrant, à un animal présentant une infection de ce type, une quantité thérapeutiquement efficace d'un mélange contenant, comme ingrédients actifs principaux, une ou plusieurs des substances, à savoir la gentamicine B, la gentamicine B-^, la gentamicine X ou leurs dérivés non toxiques pharmaceutiquement 10 acceptables, par exemple, leurs sels d'addition acide, leurs produits de solvatation et leurs produits d'hydratation. Sous un autre aspect opératoire encore, l'invention concerne la lutte contre les infections protozoaires et/ou les infestations helminthiques en administrant, à un animal présen-15 tant ces infections ou ces infestations, une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un des antibiotiques gentamicine À, gentamicine B, gentamicine B^, gentamicine X et leurs dérivés non toxiques pharmaceutiquement acceptables, par exemple, leurs sels d'addition acide, leurs produits de solvatation et leurs 20 produits d'hydratation. Sous un autre aspect encore, l'invention concerne le traitement des infections protozoaires et/ou des infestations helminthiques, en administrant, à un animal présentant ces infections ou infestations, .une quantité thérapeutiquement efficace 25 d'un mélange contenant, comme ingrédient actif principal, une ou plusieurs des substances, à savoir, la gentamicine A, la gentamicine B, la gentamicine B^ et la gentamicine X ou leurs dérivés non toxiques pharmaceutiquement acceptables, par exemple, leurs sels d'addition acide, leurs produits de solvatation et leurs 30 produits d'hydratation. La gentamicine A et la gentamicine X et, dans une plus faible mesure, la gentamicine B et la gentamicine B-^ sont efficaces contre des protozoaires tels que l'Entamoeba histolytica, l'Histomonas meleagridis, le Trichomonas foetus et le Trichomonas 35 vaginalis. L'Histomonas meleagridis est le parasite protozoaire provoquant l'entérohépatite, appelée "typhlo-hépatite" ou "tête noire" chez les dindons. Cette maladie pose de sérieux problèmes 71 22591 2104762 - 16 - économiques dans l'industrie de l'élevage des dindons. Le Trichomonas vaginalis est l'organisme pathogène le plus fréquemment associé aux cas d'infections vaginales humaines et il est habituellement un organisme pathogène extrêmement difficile à éliminer. 5 La gentamicine A, la gentamicine B, la gentamicine B^ et la gentamicine X sont également des agents anthelminthiques efficaces contre des vers tels que, par exemple, le Syphacia obveata. Il est surprenant de constater que ces substances, à 10 savoir, la gentamicine A, la gentamicine B, la gentamicine et la gentamicine X, possèdent des propriétés antiprotozoaires intéressantes. Il a été mentionné que la gentamicine C dont la structure est apparentée à celle des antibiotiques précités, n'exerce qu'une légère activité contre le T. vaginalis à des doses quel-15 que peu élevées. Dans "American Journal of Tropical Medicine and Hygiene", 15, 885 (1965), Albach et al ont mentionné que la gentamicine G était relativement inefficace contre l'E. histoly-tica. Tous ces antibiotiques à base de gentamicine sont des membres d'une classe de composés chimiques parfois appelés "amino-20 glycosides". Cette classe englobe des antibiotiques connus tels que la néomycine, la kanamycine, la streptomycine et la paromo-mycine. Seule la paromomycine est connue pour son activité antiprotozoaire à un degré important. De plus, à l'exception de la paromomycine, la gentamicine A, la gentamicine B, la gentamicine 25 B^ et la gentamicine X sont les seuls amino-glycosides actuellement connus pour leur activité anthelminthique à des doses suffisamment utiles. Compte tenu de ces propriétés, la gentamicine A, la gentamicine B, la gentamicine B-^ et la gentamicine X peuvent être 30 utilisées in vitro dans des solutions de lavage à usage hygiénique, par exemple, pour le nettoyage des équipements de laboratoires contaminés par des protozoaires du type précité. Cette remarque est particulièrement vraie pour les dessus des tables de laboratoires, de même que pour les cages et les enclos pour ani-35 maux dont il est souhaitable d'éliminer"les espèces bactériennes et protozoaires parasites susceptibles. En raison de leur activité in vivo, les composés de la présente invention peuvent être uti 71 22591 - 17 - lisés en mélange avec l'eau potable ou la nourriture des animaux en vue de traiter des animaux domestiques ou de laboratoires présentant des infections bactériennes intestinale-3, des infections protozoaires intestinales et des infestations helminthiques 5 ou des combinaisons de ces infections dans lesquelles les organismes d'infection sont susceptibles vis-à-vis des composés de l'invention. Ces composés sont particulièrement utiles pour les troubles intestinaux étant donné qu'ils ne sont pas fortement absorbés par les voies gastro-intestinales. Dès lors, d'importan-10 tes concentrations de l'agent thérapeutique peuvent être ingérées sans provoquer des manifestations toxiques chez l'hôte et, en même temps, cet agent peut être présent en quantités suffisantes pour détruire ou au moins inhiber sensiblement l'organisme d'infection. Pour combattre les inféctions bactériennes généralisées 15 (systémiques), on effectue l'administration de l'antibiotique par des voies autres que la voie orale, de préférence, par injection. ACTIVITE ANTIBIOTIQUE IN VITRO Le tableau III ci-après reprend la concentration inhi-bitrice minimum in vitro de la gentamicine B, de la gentamicine B^ 20 et de la gentamicine X comparativement à celle de la kanamycine antibiotique connue, toutes sous forme de bases libres, vis-à-vis d'une variété de micro-organismes gram-positifs et gram-négatifs. Les essais sont effectués dans un bouillon de boeuf/levure à un pH de 7,4. 71 22591 - 18 - 2104762 TABLEAU III Concentration ixihibitrice •minimum ( me g/ml ) Organisme G-entamicine B G-entamicine B1 G-entamicine X Kanamycine 5 Aerobacter aerogenes 0,08 0,08 - 3 Bacillus subtilis 0,8 3,0 0,03 '0,3 Escherichia coli 0,03—0,3 0,08—0,3 0,3 5 Klebsiella pneumoniae 3,0 3,0 0,75 1 10 Pseudomonas aeruginosa 0,03—0,08 0,08 0,3—0,75 • 62,5 Sarcina lutea 0,3 0,3 - 4 Staphylococcus aureus 0,3—3,0 0,3—3,0 0,08—0,75 0,25 15 Streptococcus pyogenes 3,0 3,0 0,3—0,75 50 Shigella sp M324 5,0 5,0 Salmonella sp.l 0,8 0,3 0,75 Salmonellâ sp.2 0,8 0,3 - 20 Salmonella sp.B 0,8 0,3 - ACTIVITE ANTIBIOTIQUE ICT VIVO On détermine l'activité protectrice de la gentamicine B, de la gentamicine B^ et de la gentamicine X en administrant les composés respectifs 'par voie sous-cutanée 1 heuré après l'ad-25 ministration d'une dose d'un organisme pathogène d'infection et en comptant les animaux survivants 48 heures après l'infection. Les animaux témoins infectés et non traités meurent en une période d'environ 18 à 24 heures. En règle générale, on administre 5-7 doses à des souris pesant environ 20 g par groupe de 7 - 10. 30 Les valeurs PL^q sont reprises au tableau IV ci-après. 71 22591 - 19 - 2104762 TABLEAU IV Activité protectrice des gentamicine s B, et X chez la souris ' Gentamicine B Gent^icine X Staphylococcus aureus G-ray 20,0 30,0 4,0 Staphylococcus aureus W 50,0 50,0 Staphylococcus aureus Smith 5,0 2,5 Streptococcus pyogenes C 15,0 18,0 _ Salmonella paratyphi B 5,0 4,0 Pseudomonas aeruginosa SC 2,0 2,0 7,0 Escherichia coli SC - - 1,5 TOXICITE AIGUË On détermine la toxicité aiguë de la gentamicine B, 20 de la gentamicine B-^ et de la gentamicine X chez des souris mâles "CF-l" ("Carworth Parms") pesant environ 20 g chacune. Les résultats de ce test sont repris au tableau V ci-après : TABLEAU V 25 30 Toxicité aiguë de la gentamicine B, de la gentamicine B^ et.de la gentamicine X Voie ^50 Gentamicine B Gentamicine Bn Gentamicine X Intraveineuse 228 230 225 Intrapéritonéale 1750 1600 > 1000 sous-cutanée > 1500 >1500 Orale > 250 > 250 71 22591 2104762 - 20 - ACTIVITE II VITRO CONTEE LE TRICHOMONAS VAGINALIS Le tableau VI reprend l'activité in vitro des composés de la présente invention vis-à-vis du T. vaginalis. Le procédé de test est pratiquement celui décrit par E.J. Schnitzer dans "Expérimental Chemotherapy", volume 1, pages 289 - 331, "Academic Press", New-York (1963). TABLEAU VI Composé Concentration minimum Concentration mortelle de suppression à 99?é minimum (mcg/ml) (mcg/ml) 24 heures 48 heures 24 heures 48 heures G-entamicine A 10 5-10 25 10 G-entamicine B 25 25 > 250 25 Gentamicine B^ 25 10-25 > 250 25 Gentamicine X - 2,5 - 10 Garamycine (marque déposée) 250 100 > 250 100 STS - "Simplified Tripticase Sérum Médium", "Baltimore Biological Laboratories", Baltimore, Maryland. Contre l'Entamoeba hystolytica, la gentamicine X possède une concentration inhibitrice minimum de 4 mcg/ml (48 heures) et -une concentration mortelle minimum de 7 mcg/ml (48 heures). ACTIVITE ANTHELMINTHIQUE IN VIVO La gentamicine B et la gentamicine X exercent une activité anthelminthique contre le Syphacia obvelata lorsqu'elles sont testées dans des groupes de sept souris mâles "Millerton" pratiquement par les procédés décrits par O.E. Standen, pages 701 - 8S2 dans "Expérimental Chemotherapy", Volume 1. 71 22591 2104762 - 21 - TABLEAU VII Composé mg/kg/2 our $ dans le régime Infection ¥> Charge moy Gentamicine B 259 0,25 0 0 5 Gentamicine B 100 0,0625 0 0 Gentamicine B 39 0,02 0 0 Gentamicine B 8 0,008 67 29,5 Gentamicine X 310 0,25 0 0 Gentamicine X 62 0,05 83 27 10 Témoins 0 0 100 53 Témoins 0 0 100 22 Témoins 0 0 75 6,8 Les données reprises au tableau VII indiquent que la 15 gentamicine B exerce une activité anthelminthique contre le Syphacia obvelata à une dose minimum de 39 mg/kg/jour lors d'une administration à des souris mâles "Millerton". La gentamicine X est totalement efficace à une dose de 310 mg/kg/jour et partiellement efficace à une dose de 62 mg/kg/jour, pratiquement dans 20 les mêmes conditions de test. INCIDENCE REDUITE L'ATAXIE La gentamicine B et, dans une plus faible mesure, la gentamicine B-^ possèdent une propriété très inhabituelle dans les antibiotiques à base d'amino-glycosides. Lorsqu'ils sont 25 soumis aux procédés de test décrits par Yieinstein, V-agman et Taber dans "Aritimicrobial Agents and Chemotherapy", 1965, pages 227 - 231, chacun de ces composés nécessite des périodes d'administration sensiblement plus longues à des doses élevées pour provoquer une altération du "réflexe de redressement" et l'appa-30 rition d'ataxie. Il semble qu'il y ait une relation fortuite entre des doses élevées d'antibiotiques du type des amino-glycosides administrés pendant une période prolongée et les lésions vestibulaires dont un des premiers symptômes est l'ataxie. Les résultats de test du tableau VIII démontrent que, comparativement 35 à la gentamicine C (Garamycine), la gentamicine B et la gentamicine B-^ peuvent être utilisées à des doses sensiblement supérieures à la dose thérapeutique normale. De plus, elles peuvent 71 22591 - 22 - l - • > 2104762 être utilisées à ces doses pendant une période sensiblement supérieure à celle normalement requise pour éliminer les infections sans provoquer d'ataxie, avec un minimum, voire aucune manifestation toxique. TABLEAU VIII Toxicité chronique chez les chats après un dosage sous-cutané .journalier Dose Nombre Nombre moyen de jours Antibiotique (mg/kg/jour) de chats écoulés jusqu'à l'ataxie 10 Gentamicine B-, 240 1 21,0 X 60 4 69,0 40 4 1Q8,0 Garamycine 60 8 13,5 (marque commerciale 40 11 17,5 déposée) 20 5 31,4 15 Gentamicine B 240 1 21,0 60 4 81,0 40 4 >312s 3£ Etude terminée| 2 des 4 chats n'ont pas été atteints d'ataxie au terme de la période de 385.jours; le nombre indiqué est la 20 médiane tronquée. ACTIVITE PROPHYLACTIQUE DE LA GENTAMICINE A CHEZ LES DINDONS CONTRE L'HISTOMONAS MELEAGRIDIS On administre la gentamicine A à des groupes de dindons à des doses de 5, 10 et 15 mg par dindon et par jour, en solution 25 aqueuse. Deux jours après l'administration du médicament, on procède, chez les dindons, à une inoculation orale de 500 Heterakis gallinae ova (support hôte intermédiaire d'Histomonas). Un seul groupe de dindons reçoivent 0,035 i° de gentamicine A dans leur nourriture pendant 6 jours. Dans chaque essai, on prend également 30 des animaux témoins infectés non traités. On poursuit le test pendant 12 jours et l'on pratique l'autopsie des oiseaux le 13ème jour. L'infection se manifeste habituellement principalement en .deux zones, à savoir le caecum et le foie, qui sont les zones examinées au cours de l'autopsie. 35 Suivant les résultats obtenus "dans le test ci-dessus, la gentamicine A exerce une activité prophylactique chez les dindons contre l'Histomonas meleagridis à une dose minimum de 10 mg 71 22591 - 23 - 2104762 par oiseau, tandis que les témoins non traités sont infectés. Les formes de réalisation tangibles de la présente invention (c'est-à-dire la gentamicine A, la gentamic-ine B, la gentamicine B^ et la gentamicine X) sont appropriées pour une 5 administration orale, topique ou parentérale. Lors d'une administration par voie orale, on peut les combiner sous forme de comprimés, de capsules, d'élixirs et analogues ou on peut même les administrer avec la nourriture animale. C'est dans ces formes de réalisation tangibles de la présente invention sont les plus effi-10 caces en tant qu'agents anthelminthiques et antiprotozoaires. Cette remarque est particulièrement vraie lorsqu'on les utilise pour le traitement de l'amoebiase intestinale ou de diarrhées non spécifiques. Les composés de la présente invention peuvent être incorporés dans une unité de dosage comme unique ingrédient actif 15 ou ils peuvent être combinés en unités de dosage avec d'autres ingrédients actifs tels que, par exemple, des agents antianxiété, sachant que les infections et les infestations provoquent fréquemment des réactions d'anxiété chez les espèces animales. Lorsque l'espèce animale doit être traitée par voie orale, les formes 20 de réalisation tangibles de la présente invention sont administrées à raison d'environ 10 à environ 100 mg, de préférence, de 20 à 70 mg par kilo du poids du corps et par jour, de préférence, en environ 2 à environ 4 doses. Pour l'administration topique, les formes de réalisa-25 tion tangibles de la présente invention peuvent être combinées dans des crèmes, des onguents, des suppositoires et analogues. Ces formes de dosage doivent contenir environ 1 à environ 10 / d'antibiotique et elles doivent être administrées à l'endroit de l'infection environ 2 à environ 4 fois par jour. 30 Lors du traitement d'infections bactériennes, les anti biotiques gentamicine B, gentamicine B^^ et gentamicine X peuvent être utilisés en quantités d'environ 2 mg à environ 20 mg, de préférence, de 5 à 15 mg par kg du poids du corps. Comme on l'a indiqué ci-dessus (voir tableau VIII), en 35 raison de leur faible potentiel ataxique, la gentamicine B et la gentamicine B^ peuvent être utilisées, de préférence, pour traiter les Infections bactériennes profondes, en particulier, celles 71 22591 - 24 - 2104762" «1 qui se sont avérées réfractaires à d'autres agents antibactériens. Il est préférable d'administrer la gentamicine B et/ou la gentamicine B^ par voie parentérale en doses comprises entre 2 et environ 10 mg par kg du poids du corps et par jour, en doses 5 divisées. Chaque fois qu'il est fait mention de l'utilisation des antibiotiques gentamicine A, gentamicine B, gentamicine B-^ et gentamicine X, on englobe également l'utilisation de leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, en particulier, leurs 10 sels d'addition acide, de même que les produits de solvatation et d'hydratation de tous ces composés. Comme on l'a mentionné ci-dessus, les antibiotiques peuvent être appliqués sous forme de compositions. On peut préparer ces compositions en mélangeant l'ingrédient actif avec un 15 support pharmaceutique approprié tel que, par exemple, la géla-■ tine,- le lactose, le talc, l'acide stéarique, l'acacia, les gommes ou une matière cellulosique, un polyalcoylène, les glycols, la gelée de pétrole, des agents de désintégration tels que le maïs ou l'amidon, des agents lubrifiants ou de démoulage tels 20 que le stéarate de magnésium, le carbonate de calcium, l'eau aromatisée, les alcools benzyliques, les sirops, les mucilages pharmaceutiques, les élixirs, les agents colorants, les teintures, les essences, les milieux huileux, l'eau stérile ou les solutions isotoniques de sérum physiologique, les agents de conservation 25 tels que le méthyl-paraben, le propyl-paraben, l'acide benzoïque, , de même que les agents antimicrobiens non toxiques. Les exemples ci-après illustrent certaines des différentes formes de dosage dans lesquelles les formes de réalisation tangibles de la présente invention peuvent être combinées. 30 Formulation I SOLUTION PARENTEKALE mg/ml ml/10 ml G-entamicine B (sous forme de sulfate) 40 à 200 mgs 400 - 2000 Méthyl-paraben 1,8 mg 18 mg ■Propyl-paraben 0,2 mg 2 mg 35 Eau pour injection, pour compléter à 1,0 ml 10,0 ml. calculés sur une pureté théorique à 100 71 22591 - 25 - 2104762 On place 70 fi de l'eau pour injection dans un récipient de mélange approprié et l'on chauffe à 70°C. On ajoute le méthyl-paraben et le propyl-paraben et l'on mélange jusqu'à dissolution. On refroidit la solution ci-dessus à 25 - 30°C. On fait passer un 5 courant d'azote à travers la solution. On ajoute la gentamicine B (sous forme de sulfate) et l'on mélange jusqu'à dissolution. On porte la solution au volume final. On fait passer la solution à travers un filtre de stérilisation approprié en adoptant des techniques aseptiques appropriées. On verse la solution dans des réci-10 pients stériles appropriés en adoptant des techniques appropriées de remplissage aseptique. Formulation II SOLUTION PARENTERALE mg/ml mg/10 ml Gentamicine A (sous forme de sulfate) 40 à 200 mgs 400 - 2000 15 Méthyl-paraben 1,80 18,00 Propyl-paraben 0,20 2,00 Bisulfite de sodium 3,20 32,0 Edétate disodique (à deux molécules o H O o o •> H d1 eau) 20 Acide acétique glacial 1,25 12,50 Acétate de sodium 2,50 25,00 Propylène-glycol 100 à 400 1000-4000 Eau pour injection, pour compléter à 1,0 ml 10,00 ml. calculés sur une pureté théorique à 100 fi. 25 On place 70 de l'eau pour injection dans un récipient de mélange approprié et on chauffe à 70°G. On ajoute le méthyl-paraben et le propyl-paraben, puis on mélange jusqu'à dissolution. On refroidit la solution ci-dessus à 25 - 30°C. On fait passer un courant d'azote gazeux à travers la solution. On ajoute l'édétate 30 disodique à deux molécules d'eau, l'acétate de sodium et l'acide acétique glacial, puis on mélange convenablement. On arrête l'injection d'azote, on ajoute le bisulfite de sodium et l'on mélange jusqu'à dissolution. On ajoute le propylène-glycol et on mélange convenablement. On ajoute la gentamicine A (sous forme de sulfate) 35 et l'on mélange jusqu'à dissolution. On porte la solution au volume final. On fait passer la solution à travers un filtre approprié de stérilisation en adoptant des techniques aseptiques appropriées. 71 22591 - 26 - 2104762 On verse la solution dans des récipients stériles appropriés en adoptant des techniques aseptiques également appropriées. Formulation III SOLUTION PARËNTERALE mg/ml mg/lOO ml 5 G-entamicine B-^ (sous forme de sulfate) 40 à 200 mgs 4000-20.000 Méthyl-paraben 1,80 180 Propyl-paraben 0,20 20 Bisulfite de sodium 3>20 320 Edétate disodique (à deux molécules 0,10 10 d'eau) 10 Acide acétique glacial 1,25 - 125 Acétate de sodium 2,50 250 Eau pour injection, pour compléter à 1,00 ml 100 ml. s calculés sur une pureté théorique à 100 15 On place 70 $ de l'eau pour injection dans un récipient de mélange approprié et on chauffe à 70°C. On ajoute le méthyl-paraben et le propyl-paraben, puis on mélange jusqu'à dissolution. On refroid-it la solution ci-dessus à 25 - 30°C. On fait passer un courant d'azote gazeux à travers la solution. On ajoute l'édétate 20 disodique à deux molécules d'eau, l'acétate de sodium et l'acide acétique; on mélange convenablement. On arrête l'injection d'azote, on ajoute le bisulfite de sodium et l'on mélange jusqu'à dissolution. On ajoute la gentamicine B-^ (sous forme de sulfate) et on mélange jusqu'à dissolution. On porte la solution au volume final. 25 On fait passer la solution à travers un filtre approprié de stérilisation en adoptant des techniques aseptiques appropriées. On verse la solution dans des récipients stériles appropriés en adoptant des techniques appropriées de remplissage aseptique. Formulation IV 30 SIROP ORAL par litre Gentamicine A (sous forme de sulfate) 100 g 36 Sucre granulé standard 550 Solution de sorbitol 200 Eau? pour compléter à • 1 litre. 35 £ calculés sur une pureté théorique à 100 tfo. 71 22591 - 27 - 2104762 Oïl ajoute la gentamicine A (sous forme de sulfate), le sucre granulé et la solution de sorbitol à environ 350 ml d'eau contenue dans un récipient de mélange approprié. On mélange jusqu'à ce qu'on obtienne une solution. On ajoute de l'eau en une 5 quantité suffisante pour compléter à 1 litre. On fait passer la solution à travers un filtre de clarification approprié. Formulation V SIROP ORAL par litre Gentamicine B (sous forme de sulfate) 100 g H 10 Suore granulé 100 Sirop de glucose ■ t 44 Solution de sorbitol 400 Glycérine 50 Alcool 50 15 Eau, pour compléter à 1 litre. s calculés sur une pureté théorique à 100 $. On ajoute la gentamicine B (sous forme de sulfate), le sucre granulé, le sirop de glucose, la solution de sorbitol, la glycérine et l'alcool à environ 500 ml d'eau contenue dans un 20 récipient de mélange approprié. On mélange jusqu'à ce qu'on obtienne une solution. On ajoute de l'eau en une quantité suffisante pour compléter à 1 litre. On fait passer la solution à travers un filtre de clarification approprié. Formulation VI 25 CREME TOPIQUE Gentamicine A (sous forme de sulfate) Acide stéarique Monostéarate de propylène-glycol Myristate d'isopropyle 30 Monopalmitate de polyoxyéthylène-(20)-sorbitan Solution de sorbitan Eau, pour compléter à s calculés sur une pureté théorique à 100 tfc. On ajoute l'acide stéarique, le monostéarate de propy-35 lène-glycol, le myristate d'isopropyle et le monopalmitate de polyoxyéthylène-(20)-sorbitan dans un récipient de mélange approprié. On chauffe à 80°C jusqu'à ce qu'on obtienne une masse fondue, puis on mélange. par kilo 10 g - 100 gs 60 g 100 80 60 20 1 kg. 71 22S91 - 28 - 2104762 Formulation VII CREME TOPIQUE par kilo G-entamicine B (sous forme de sulfate) 10 g - 100 g"" Alcool cétylique/stéarylique éthoxylé 20 g 5 Alcool cétylique 35 Alcool stéarylique 35 Pétrolatum 200 Huile minérale 50 Eau, pour compléter à 1 kg. ^ 36 calculés sur une pureté théorique de 100 %. On verse l'alcool cétylique, l'alcool stéarylique, l'alcool cétylique/stéarylique éthoxylé, le pétrolatum et l'huile minérale dans un récipient de mélange approprié. On chauffe à 80°C jusqu'à ce qu'on obtienne une masse fondue, puis on mélange. On 15 ajoute la gentamicine B (sous forme de sulfate) dans environ 95?^ de l'eau chauffée à 80°C dans un récipient de mélange approprié, puis on mélange. On ajoute la phase cireuse fondue à la phase aqueuse et l'on mélange tout en refroidissant à environ 4-0°C. On ajoute une quantité d'eau suffisante pour compléter à 1 kilo, puis 20 on mélange jusqu'à refroidissement. Formulation VIII ONG-UENT TOPIQUE par kilo G-entamicine B-^ (sous forme de sulfate) 10 g - 100 gH Pétrolatum blanc, pour compléter à 1 g 2 5 S ' r ' / calculés sur une pureté théorique de 100 On fait fondre et on chauffe le pétrolatum à 50°C dans un récipient de mélange approprié. On élimine une partie du pétrolatum fondu -et l'on forme une bouillie de la gentamicine B-^ (sous forme de sulfate). On fait passer la bouillie à travers un mélan-30 geur colloïdal approprié et l'on mélange jusqu'à ce qu'on obtienne une dispersion uniforme. On ajoute la bouillie mélangée au reste du pétrolatum fondu et on mélange jusqu'à refroidissement. 71 22591 - 29 - 2104762 Formulation IX COMPRIMES ABC Mélange de Comprimé à Comprimé à Comprimé à 10 mg 25 mg 100 mg 5 G-entamicines A, B, B-, et X (sous forme de sulfates) 17,50 mg 43,75 mg 175,00 mg Lactose, poudre impalpable 197,50 171,25 126,00 Amidon de maïs 25,00 25,00 35,00 10 Polyvinyl-pyrrolidone 7,50 7,50 10,50 Stéarate de magnésium 2,50 ' 2,50 3,50 250,00 250,00 350,00 S calculés sur une puissance de 60 %, plus un excès de 5 15 On prépare une bouillie constituée du mélange de genta- micines A, B, B^ et X (sous forme de sulfates) de l'exemple 1 (étape B), de lactose et de polyvinyl-pyrrolidone. On sèche la bouillie par pulvérisation. On ajoute l'amidon de maïs et le stéarate de magnésium, puis on mélange. On forme des comprimés en 20 ■ utilisant un équipement approprié à cet effet. Formulation X GBLULËS DURES A B C Gélule à 10 mg Gélule à 25 mg Gélule à 100 mg Gentamicines A, B, B-, et X (sous forme de 25 sulfates) 17,50 mg s 43,75 mg * 175,00 mg s Lactose, poudre impalpable 231,50 205,25 124,25 Stéarate de magnésium 1,00 1,00 0,75 s calculés sur une puissance de 60 $, plus un excès de 5 30 On place le mélange de gentamicines A, B, et X (sous forme de sulfates) et du lactose dans un récipient de mélange approprié, puis on mélange. On fait passer les poudres mélangées à travers un malaxeur. On verse les poudres mélangées et malaxées dans un récipient de mélange approprié et on mélange à 35 nouveau. On forme un mélange préalable du stéarate de magnésium avec une partie de la charge ci-dessus. On ajoute le mélange pré 71 22591 - 30 - 2104762 alable de stéarate de magnésium â la charge et l'on mélange. On remplit des gélules vides en utilisant un équipement approprié à cet effet. Formulation XI 5 BOL Bol à 100 mg Mélange de Gentamicines A, B, B-, et X (sous forme de sulfates) 175,00 mg Lactose 4335,00 10 Amidon de maïs prégélatinisé 1080,00 Stéarate de magnésium 90,00 Eau 100,00 ml. 35 10000,00 S 15 calculés sur une puissance de 60 %, plus un excès de 5 7-. On place le mélange de gentamicines A, B, B^ et X (sous forme de sulfates), du lactose et une partie de l'amidon de maïs (par l'expression "amidon de maïs prégélatinisé", on entend de l'amidon de maïs partiellement hydrolysé) dans un récipient de 20 mélange approprié, puis on mélange. On prépare une pâte d'une partie de l'amidon de maïs et l'on utilise cette pâte pour préparer une masse humide des poudres ci-dessus. On tamise la masse pour obtenir des granules. On sèche les granules. On réduit les granules séchés à une- granulométrie spécifique. On ajoute le stéarate 25 de magnésium, on mélange et comprime les granules en comprimés en utilisant un équipement approprié à cet effet. Formulation XII BOL Bol à 5 g Mélange de . 30 G-entamicines A, B, et I (sous forme de 8250,00 mg sulfates) Lactose, poudre impalpable 8560,00 Polyvinyl-pyrrolidone 900,00 Stéarate de magnésium 90,00 Amidon de maïs 200,00 "3E 18.000,00 S r ' j calculés sur une puissance de 60 °fo, plus un excès de 5 °/<>. 71 22591 - 31 - 2104762 On prépare une bouillie constituée du mélange de gentamicines A, B, B^ et X (sous forme de sulfates), de lactose et de polyvinyl-pyrrolidone. On sèche la bouillie par pulvérisation. On ajoute l'amidon de maïs et le stéarate de magnésium, puis on 5 mélange. On forme des comprimés eh utilisant un équipement approprié à cet effet. Formulation XIII SOLUTION PAfiBNTBRALE mg/ml G-entamicine X (sous forme de sulfate) 40 à 200 mg s 10 Méthyl-paraben 1,8 mg Propyl-paraben 0,2 mg Eau pour injection, pour compléter à 1,0 ml. S calculés sur une pureté théorique de 100 fo. On place 70 rb de l'eau pour injection dans un récipient 15 de mélange approprié et on chauffe à 70°C. On ajoute le méthyl- paraben et le propyl-paraben, puis on mélange jusqu'à dissolution. On refroidit la solution ci-dessus à 25 - 30°C. On fait passer un courant d'azote gazeux sur la solution. On ajoute la gentamicine X (sous forme de sulfate) et on mélange jusqu'à dissolution. On por-20 te la solution à son volume final. On fait passer la solution à travers un filtre approprié de stérilisation en adoptant des techniques aseptiques appropriées. On verse la solution dans des récipients stériles appropriés en adoptant des techniques appropriées de remplissage aseptique. 25 Formulation XIV NOURBITHRB ANIMALE _£ Mélange de Gentamicines A, B, B^ et X (sous forme de sulfates) 10 s Farine de soya 400 30 Farine de poisson 400 Huile de germe de froment 50 Mélasses de sorgo 140. * calculés sur une pureté de 100 $. On mélange convenablement tous les ingrédients ci-dessus 35 et on les comprime en pastilles d'une dimension appropriée déterminée d'après l'animal à traiter. On mélange les pastilles avec le régime habituel des animaux en une quantité calculée de telle 71 22591 - 32 - 2104762 sorte au'une quantité d'environ 10 à environ 100 mg par kilo du poids du corps soit consommée journellement par l'animal. Cette composition peut être incorporée à la nourriture d'animaux de laboratoires, par exemple, des souris,, des rats, des lapins, des 5 chats, des chiens et analogues. A titre de variante, le mélange d'antibiotiques ou un seul membre de ce mélange peut être mélangé à sec avec la nourriture habituelle des animaux de façon à obtenir une dose thérapeutique dans une ration journalière normale. Ce procédé est parti-10 culièrement avantageux lorsque les antibiotiques sont utilisés pour exercer un effet prophylactique, ainsi qu'on l'a décrit précédemment pour les dindons. Formulation XV SUPPOSITOIRE' Suppositoire à 5 mg 15 Mélange de G-entamicines A, B, B-^ et X (sous forme de sulfates) 5 mg s Eau 10 ml Granules de gélatine 20 mg Glycérine 65 mg. £ 0 s calculés sur une pureté théorique de 100 fo. On dissout le mélange de gentamicines A, B, B^ et ï (sous forme de sulfates) dans de l'eau et l'on ajoute la glycérine tout en a,gitant. Enfin, on ajoute la gélatine et l'on chauffe le mélange tout en agitant, jusqu'à ce qu'il soit homogène» On trans-25 fère le mélange dans des. moules préalablement refroidis et on le laisse congeler. Cette formulation est suffisante pour préparer 20 suppositoires à 5 g. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent 30 d'être décrits uniquement à titre d'exemple(s) non limitatif(s) s ails sortir du cadre de l'invention. 71 22591 3 2104762 REVENDICATIONS 1. Antibiotique dfamino-glycosides, à savoir la gentamici ne Bf la gentamicine et la gentamicine X, répondant à la formule moléculaire globale : (I) HO R, ces antibiotiques étant appelés gentamicine B lorsque représente un groupe hydroxy, R2, un atome d'hydrogène et R^ un groupe amino, gentamicine B^, lorsque représente un radical hydro xy, Rg, le groupe méthyle et R^, un groupe amino, ainsi que gentamicine X lorsque R^ représente un groupe amino, Rg, un atome d'hydrogène et R^, un radical hydroxy, sous forme libre ou sous forme de dérivés pharmaceutiquement acceptables, 2. Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est un produit de solvatation ou d'hydratation. 3« Composé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est un sel d'addition acide non toxique qui, lorsqu'il dérive d'un acide polybasique, peut contenir des groupes acides libres et/ou des groupes acides neutralisés par -d'autres bases. 71 22591 34 2104762 4. Procédé en vue d'obtenir des antibiotiques d'amino- glycosides répondant à la formule moléculaire globale (I) : ces antibiotiques étant appelés gentamicine. B lorsque représente le radical hydroxy, R2, un atome d'hydrogène et R^, un groupe amino, gentamicine B, lorsque R^ représente le radical hydroxy, R2, le groupe méthyle et R^, un groupe amino, ainsi que gentamicine X lorsque R^ représente un groupe amino, R2 un atome d'hydrogène et R^, le radical hydroxy, sous forme libre ou sous forme de dérivés pharmaceutiquement acceptables, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à séparer au moins un des antibiotiques sous forme libre ou sous forme d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable, à partir d'un mélange comprenant au moins un des antibiotiques et éventuellement transformer un composé libre ainsi obtenu en ses dérivés ou un dérivé ainsi obtenu sous forme libre ou encore un dérivé en un autre. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation par des procédés chromatographique S o 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'on utilise une chromatographie en colonne. 7. Procédé suivant l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que, comme adsorbant, on emploie le gel de silice. 71 22591 55 2104762 8» Procédé suivant l'une des revendications 4 à 7, carac térisé en ce que le. mélange comprend de la gentamicine B et/ou de la gentamicine B^ et/ou de la gentamicine X en mélange avec au moins un autre antibiotique, par exemple, la gentamicine A et/ou la gentamicine C. Jâi Procédé suivant l'une des revendications 4 à 7, carac térisé en ce que le mélange comprend la gentamicine B, la gentamicine B.j et la gentamicine X. JL2.» Procédé suivant l'une des revendications 4 à 9, carac térisé en ce que, comme solvant pour la séparation chromatographique, on emploie la phase inférieure d'un système solvant constitué de méthanol, de chloroforme et d'hydroxyde d'ammonium dans le rapport volumétrique d.e 1:1:1. 11» Composition pharmaceutique comprend au moins un des antibiotiques d'amino-glycosides gentamicine B, gentamicine B.^ et gentamicine X répondant à la formule moléculaire globale (I)î ces antibiotiques étant appelés gentamicine B lorsque représente le radical hydroxy,^, un atome d'hydrogène et Sj, un groupe amino, gentamicine B^ lorsque R^ représente le radical hydroxy, R2, le groupe méthyle et Rj, un groupe amino, R2 un atome d'hydrogène et R^, le radical hydroxy, sous forme libre et/ou sous forme de leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, comme ingrédients actifs, éventuellement avec au moins de la gentamicine A sous forme libre et/ou sous forme de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, en mélange avec un support pharmaceutique approprié. 12. Procédé de préparation d'une composition pharmaceuti 71 22591 36 2104762 que, caractérisé en ce qu'on met, sous une forme appropriée pour l'administration thérapeutique, au moins.un'des antibiotiques d*amino-glycosides gentamicine B, gentamicine B^ et gentamicine X répondant à la formule moléculaire globale (I) : / V ) (I) NH2 ces antibiotiques étant appelés gentamicine B lorsque représente le radical hydroxy, R2, un atome d'hydrogène et Rj, un groupe amino, gentamicine B^ lorsque R^ représente le radical hydroxy, R2, le groupe méthyle et R^, un groupe amino, ainsi que -gentamicine X lorsque R^ représente un groupe amino, Rg, un atome d'hydrogène et. R^, le radical hydroxy, sous forme libre eV ou sous forme de leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables, éventuellement avec au moins de la gentamicine A sous forme libre et/ou sous forme de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, •comme ingrédients actifs. ' COPY