Brevet FR2068741A1 — publié le 19710903

i 2068741 La présente invention est relative à un procédé de préparation de "D-(-)- aC -aminobenzylpénicilline dénommée ci-dessous ampicilline. Suivant le procédé de l'invention on prépare efficacement 1'ampicilline en faisant réagir l'acide 6-amino-pénicillanique sur un dérivé fonctionnel de l'acide D-(-) -aminophénylacétique en présence d'une nouvelle bactérie appartenant au genre Flavobac-térium ou d'un enzyme préparé à partir de celle-ci, le préfixe "D- (-)-" étant omis ci-dessous par souci de simplification. La nouvelle bactérie utilisée dans le procédé suivant l'invention a été trouvée dans le sol d'une certaine zone de la région d'Osaka au Japon dont elle a été isolée. On connaît déjà plusieurs procédés dans la technicrue on la préparation par synthèse des pénicillines teiiesQue 1'ampicilline par réaction chimique pure de l'acide 6-amihopënicillanique et de l'anhydride, chlorure ou autre de l'acide oÇ-aminophénylacé-tique. On sait cependant que la préparation par synthèse par réaction chimique pure de pénicillines non-naturelles présente en général l'inconvénient de la racëmisation du radical acylede la pénicilline obtenue en fonction des conditions rëactionnelles à utiliser. Eji outre, ces procédés synthétiques peuvent s'accompagner de réactions secondaires indésirables telle que d'une décomposition, d'une hydrolyse et d'une polymérisation des réactifs et des produits de réaction au cours de la réaction. un autre procédé connu est le "procédé enzymatiaue" pour préparer des pénicillines semi-synthétiques dans lequel un micro-organisme ou un enzyme particullaire produit par celui-ci est utilisé comme catalyseur. C'est ainsi par exemple que le brevet des E.tJ.A. N° 3 079 306 décrit un procédé de préparation des acides 6-(de type phénoxy acyl)-aminopénicillaniques par condensation enzymatique de l'acide 6-aminopénicillanique et d'un dérivé fonctionnel d'un certain acide phénoxy-carboxylique tel crue l'ester, l'amide ou le sel de celui-ci en présence d'une suspension de cellules de Escherichia coli. En outre, la demande de brevet Sud-Africaine N° 3 870/62 mentionne un autre procédé de préparation de 1'ampicilline par condensation enzymatique de l'acide 6-amino-pénicillanicrue avec l'ester éthylique ou l'amide de l'acide«>C-amino-phénylacétique, en présence de bactéries telles que Escherichia coli, Alcaligénèse faecalia, Aerobacter aerogenèse, Proteus, Salmonella, Micrococus 69 45641 2 2068741 et Arthrobac fcep, Comme oif^erra dans les mémoires des brevets précités, toutes les bactéries ainsi que les enzymes formés à partir de celles-ci, appelés "pénicilline-amidases", tous deux utilisés dans 5 les procédés connus, sont choisis parmi ceux qui sont capables d"inactiver en 24 heures au moins 20% de l'activité de la pénicilline G pour former une solution due à la coupure partielle de la liaison amido entre les groupes phénylacétyles et amino en la position 6 de la pénicilline G servant de substrat, quand cette 10 dernière est mise en contact avec les amidases dans certaines conditions. L'activité perdue de la pénicilline G dans la solution obtenue peut être au moins partiellement restaurée en traitant la solution par le chlorure de phénylacêtyle. Les procédés de l'art antérieur reposent donc sur le 15 fait que les "pénicillines-amidasès" sont capables de faciliter la liaison d'un groupe acyle et du groupe amino de l'acide 6-amino-pencillanique en milieu acide, ces pénicillines-amidases ayant été connues à l'origine comme étant capables de couper la liaison 6-amido de la pénicilline G dans un milieu alcalin. 20 Dans ces cas, on notera que,bien que ces enzymes parti culiers présentent une activité catalytique remarquable pour engendrer de la pénicilline G naturelle, ils présentent une activité catalytique très médiocre pour préparer les-pénicillines semi-synthétiques. 25 ' Dans ces conditions, il est difficile d'obtenir les pé- nicilles semi-synthétiques désirées avec une productivité industriellement convenable même si l'on utilise le "teufestrat a une concentration élevée. En conséquence, l'invention vise un-procédé de prépara-30 tion sélective et efficace de 1'ampicilline par acvlation enzymatique de l'acide 6-aminopénicillanique ,servant de substrat et pris à une concentration élevée,sur un dérivé fonctionnel de l'acide o£-aminophénylacétique, sans que se produisent les réactions secondaires concurrentes et indésirables mettant en oeuvre une racé-35 misation et une décomposition qui., auraient lieu dans les procédés connus purement chimiques de préparation des pénicillines semi-synthétiques. Pour y parvenir la demanderesse a réussi à isoler une bactérie particulière appartenant au genre Flavobactérium auquel 40 elle a donné le nom de "Flavobactérium 44-102". Cette bactérie 69 45641 3 2068741 est caractérisée par le fait qu'elle produit une pénicilline-amidase qui se distingue totalement des enzymes ou des pénicillines-amidases connues jusqu'içi en raison de son activité catalytique excellente pour produire de 1'ampicilline plutôt que de la pénicilline G à par-5 tir de l'acide 6-aminopënicillanique. On a donc établi suivant l'invention un nouveau procédé enzymatique de préparation de 1'ampicilline en utilisant cette bactérie. Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche de la bactérie sont données ci-dessous A. Observations microscopiques sur gélose nutritive : 10(1) Apparence : Cellulesen forme de bâtonnet droit à boutsrondspresque toujours seul, parfois par paire mais jamais en chaînes longues ou en masses irrégulières (2) Dimensions : de 0.5-0.8 a 2.0-2.5 microns 15(3) Mobilité : néant (4) Flagella : nêan± (5) Formation de spore : néant (6) Ne prend pas le gramme B. Caractéristiques morphologiques : -—r~~" 20 1. Bouillon nutritif à 27"Cependant 96 heures : Trouble avec unlégër sédiment blanc et avec un anneau sur la surface 2. Gélose nutritive : (1) Culture en pente à 27°C pendant 48 heures : 25 Croissance abondante, muqueuse, jaune et brillante ; ne croît pas à une température de 37°C environ ; pigment insoluble dans l'eau (2) Culture en plaque à 27°C pendant 48 heures : Colonies muqueuses, jaunes et brillantes 3. Dans un bouillon nutritif à base de glucose à 27°C pendant 96 30 heures : Trouble uniforme avec un anneau en surface 4. Gélose nutritive à 27°C pendant 96 heures : Croissance un peu lente, colonies muqueuses, jaunes et brillantes avec pigment insoluble dans l'eau 35 5. Culture sur bloc de gélatine à 27°C pendant 96 heures : Croissance seulement en surface, colonies jaunes, pas de croissance dans le bloc, pas de liquéfaction ou liquéfaction très faible 6. Lait de tournesol : 40 27°C au bout de 158 heures, blanc pâle, pas de changement de va- 69 45641 4 2068741 leur du du pH ni de coagulation 7. Pente de gélose glucose-sel inorganique : A 27°C pendant 7 jours, très lent développement de cellules jaunes 5 C. Propriétés physiologiques : 1. Bonne croissance entre 24°et 29°C, pas de croissance à 37°C 2. Besoin d'oxygène : Aérobic 3. Réduction du nitrate en nitrite : négative 4. Production d'indole : négative 10 5. Production de sulfure d'hydrogène : négative 6. Liquéfaction de la gélose : négative 7. Liquéfaction de la gélatine : négative ou très faible 8. Besoin en sel pour la croissance : négatif 9. Sur tampon de pomme de terre : marque jaune 15 10. Activité de catalase : positive 11. Hydrolyse de l'amidon : négative 12. Coloration rapide pour un acide : négative 13. Utilité ou assimilation de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétigue comme source de carbone : négative 20 D. Essai de fermentation sur les carbohvdrates : Il ne se forme ni acides ni gaz en contact avec : le ribose, le xylose, le glucose, le fructose, le galactose, le sorbose, l'arabinose, le raffinose, le lactose, le sacharo-se, le rhamnose, le mannose, le maltose, le melibiose, le melézitose, 25 le tréhalose, la dextrine, .l'amidon, le glycéroi, le xvlitol, l'éry-thritol, le sorbitol, l'adnitol, 1îinositol, le mannitol, l'esculine, la salicine et l'inuline. En vérifiant les données ci-dessus, suivant les enseignements du "Manual of Determinative Bacteriology", de Bergey, 7ëme 30 édition, il est certain qu'il y a une certaine similitude entre les caractéristiques de la bactérie spécifiée et le pérégrinum Flavobactérium connu. Il y a cependant une distinction nette entre les deux, parce que la première bactérie présente. des caractéristiques telle une liquéfaction de la gélatine très faible, une décolo-35 ration;*du lait de tournesol très forte et pas d'utilisation d'assimilation de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique. Il est donc clair que Flavobactérium EF 44-102 est une bactérie nouvelle qui se distingue de celles connues. Les échantillons de cette nouvelle bactérie ont été déposés au"FERMENTATION 40 RESEARCH INSTITUTE"au Japon sous le N° FERM-P 343 et également au "AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION" sous le N° ATCC 21429. 69 45641 5 2068741 Comme on le sait, diverses pénicillines-amidases ont été préparées à l'aide de divers micro-organismes. Elles sont général-lement classées en 2 groupes suivant leur comportement enzymatique individuel vis-à-vis des substrats de pénicilline. Le premier groupe 5 dérive des bactéries et est capable d'hydroliser facilement la pénicilline G, le second groupe est très répandu parmi les Actinomyces et les Filamentous fungi et est capable de décomposer facilement la pénicilline V et la pénicilline K. C'est ainsi, par exemple, crue suivant l'article de C.A. Claridge dans "Proceedings of the Society 10 for Expérimental Biology and Medicine", 113, 1008 (1963), les péni-cillines-amidases provenant de Alcaligenes faecalis et Escherichia coli attaquent la pénicilline G, la pénicilline G, 1'ampicilline et d'autres produits similaires, pour donner de l'acide 6-aminopenicil-lanique. Cet article indique en outre, que les rendements en acide 15 6 -aminopénicillanique ainsi obtenus dépendent du type de substrat de pénicilline à traiter. En tout cas, il s'est révélé que c'est la pénicilline G qui est la plus facilement décomposée par ces pénicillines-amidases. Ceci est en complet accord avec ce qui se produit dans les procédés enzymatiques connus. 20 Au contraire de ce qui vient d'être indiqué ci-dessus, on a observé d'une manière surprenante que la pénicilline-amidase particulière produite par Flavobactérium EF 44-102 ne présente pas d'activité appréciable vis-à-vis de la pénicilline G ; elle catalyse la formation de seulement une faible quantité d'acide 6-aminopéni-25 cillanique à partir de la pénicilline V. Il faut en outre remarquer que la pénicilline-amidase provenant de la bactérie selon l'invention présente une activité enzymatique particulière vis-à-vis de l'ampicilline et coupe presque quantitativement la liaison 6-am.ido de 1'ampicilline, conduisant à l'acide 6-aminopênicillanique et 30 que cette pénicilline-amidase joue le rôle de catalyseur pour préparer presque quantitativement de 1'ampicilline à partir de l'acide 6-aminopënicillanique et d'un dérivé fonctionnel de 1'acideoC-amino-phénylacétique. L'existence d'une telle pénicilline-amidase nouvelle par-35 ticulière était inattendue pour tout homme de l'art. On a ainsi réussi à mettre au point un nouveau de préparation d'ampicilline à l'échelle industrielle par utilisation de cette pénicilline-amidase. On peut cultiver Flavobactérium EF 44-102 dans un milieu nutritif qui contient des quantités convenables de sources d'azote 40 organique et/ou inorganique telle qu'une peptone, de l'extrait de 69 45641 6 2068741 viande, une.liqueur de macération de maïs, un ferment sec, un hy- (3.6 ■v" drolysat /protéine de soja, un extrait de soja et des sels d'amno- nium inorganiquesainsi que des sources de carbone telles que des molasses, du glucose, un hydrolysat d'amidon et des sels inorgani- 5 ques. On effectue la culture par tout procédé classique tel que par culture en secouant, submergé et stationnaire à une température de 10° à 35°C pendant 12 à 48 heures. Pour effectuer la réaction enzymatique suivant l'invention on peut utiliser le micro-organisme indiqué sous la forme d*un bouil-2q Ion de culture tel quel, de cellules bactériennes récoltées du bouillon de culture ou d'une suspension de cellules. Il va de soi cependant que les produits cellulaires traités par processus mécanique et/ou chimique peuvent également être utilisés sous la forme de cellules sèches lysées ou rompues ou sous la forme d'une préparation 25 enzymatique partiellement purifiée aux fins de l'invention, dans la mesure où leur activité enzymatique est maintenue. On effectue habituellement la réaction enzymatique suivant l'invention en introduisant n'importe lequel des produits cellulaires telles que ceux _ précités dans de l'eau,avec ou sans solution 2o tampon, qui contient de l'acide 6-aminopénicillanique ou un sel de celui-ci et un dérivé fonctionnel de l'acide «(-aminophénylacétique. On peut utiliser l'acide 6-aminopénicillanique sous forme d'acide libre ou sous forme d'un sel de celui-ci à une"concentration allant de 0,1 à 20 mg/ml calculée en acide libre, et il s'est révélé qu'une 2^ concentration comprise entre 2-5 mg/ml est particulièrement avantageuse. D'autre part, on doit employer 1 'acide «^"-aminophénylacétique comme agent d'acylation sous la forme de"ses dérivés fonctionnels réactifs tels que ester et amide, parce que sous la forme d'a-cide libre, ce composé ne réagit presque pas avec l'acide 6-amino-pénicillanique dans les conditions de la réaction enzymatique. On peut utiliser de 2 à 20 moles d'agents d'acylation par mole d'acide 6-aminopénicillanique. Les proportions molaires de l'agent acylant et de l'acide 6-aminopénicillanique peuvent cepen-dans varier de manière convenable suivant la concentration de ce dernier dans le mélange réactionnel. Dans un mode de réalisation, on a obtenu d'excellents résultats avec un rapport de 15 mg/ml de chlorhydrate de l'ester méthylique de l'acide «C-aminophënylacétique pour 4 mg/ml d'acide 6-aminopénicillanique. La concentration du 40 chlorhydrate d'ester méthylique correspond à un excès molaire de 69 45641 7 2068741 4 fois par rapport à celle de l'acide 6-aminopénicillanique. On effectue la réaction enzymatique par voie stationnaire, par secou-age du mélange réactionnel entre 25° et 50°C pendant 0.5 à 24 heures , et en maintenant le pH à une valeur prise entre 4 et 8 envi- 5 ron. Il s'est révélé qu'une valeur pH comprise entre 5,5 et 6,5 environ est préférable. On donne ci-dessous quelques expériences démontrant le comportement enzymatique particulier vis-à-vis des pénicillines de la pénicilline-amidase particulière produite à partir de Flavo-1° bactérium EF 44-102, en comparaison avec les comportements des pënicillines-amidases bactériennes connues jusqu'içi. Expérience 1 : On inocule par Flavobactérium EF 44-102 100 ml d'un milieu de culture à une valeur de pH de 7,1 qui contient 5% d'extrait de 15 soja, 0,1% d'extrait de levure, 0,1% d'extrait de viande, 0,5% de liqueur de macération de maïs, 2% de glucose, 0,4% de KC1, 0,5% de (NH4)2S04 et 0,02% de K2 HP04. On cultive le tout à 27°C pendant 24 heures sur un agitateur alternatif. La culture terminée, on récolte les cellules bactériennes cultivées par centrifugation. On 20 remet en suspension les cellules vivantes récoltées dans 40 ml d'une solution tampon de phosphate dêcimolaire (pH = 7,0). On dilue 5 ml de la suspension de cellule ainsi obtenue avec un volume égal de la solution tampon de phosphate dêcimolaire. On ajoute ensuite 5 000 unités internationales de pénicilline G 25 et on soumet la liqueur à une réaction enzymatique à 32°C pendant 5 heures. On essaie l'activité antibiotique de la licrueur ainsi obtenue par un procédé à la plaque vis-à-vis de Staphvlococcus aureus F.D.A. 209 P. On n'observe aucune diminution d'activité de 30 la pénicilline G après l'expérience. On rend ensuite la liqueur a-cide et on extrait à l'ëther pour enlever la pénicilline G inaltérée, et on traite le reste de la phase aqueuse par du chlorure de phénylacétyle. On n'observe aucune apparition d'une activité antibiotique accrue dans la phase. 35 Expérience 2 : On reprend la réaction enzymatique de l'Expérience 1 en utilisant de 1'ampicilline au lieu de la pénicilline G. On trouve que l'activité antibiotique particulière de 1'ampicilline disparaît complètement. La solution aqueuse traitée telle qu'elle est 40 ou après l'avoir versée sur un disque de papier vendu par la Socié 69 45641 8 2068741 té Toyo Roshi K.K. Japon est soumise à éne phënylacétylatiôn par le processus classique. On note une restauration important de l'activité de la pénicilline. Des expériences ci-dessus on peut conclure que Flavobacté-5 rium EF 44-102 ne présente pas d'activité d'amidase vis-à-vis de la pénicilline G alors qu'il présente une activité d'amidase potentiel vis-à-vis de 1'ampicilline qui provoque la formation de l'acide 6-aminopénicillanique. Les exemples suivants illustrent l'invention. 10 Exemple 1 : On inocule avec Flavobactérium EF 44—102 100 ml d'un milieu de culture (pH = 7,0) contenant 1% d'extrait de viande, 1% de polypeptone et 0,5% de NaCl. On maintient ensuite le tout à 27?C pendant 48 heures tout en agitant. On ajuste la solution de culture 15 au pH = 7,5 par addition d'une solution normale de NaOH. On ajoute à la solution 100 ml d'un tampon de phosphate dêcimolaire (pH = 7,5) contenant 4 mg/ml d'acide 6-aminopenicilla-nique et 30 mg/ml de chlorhydrate de l'ester méthylique de l'acide -aminophénylacétique. On fait incuber le tout à 37°C pendant 20 4 heures. Lorsque la réaction est terminée, on estime l'ac-tivité antibiotique du mélange réactionnel vis-à-vis de Staphylococcus aureus F.D.A. 209 P. On trouve une activité correspondant à 3,1 mg/ ml d'ampicilline. On fait tomber une faible quantité du mélange 25 sur une feuille de papier filtre N° 50 vendue par la Société Toyo Roshi K.K. Japon et on soumet à une chromatographie sur papier en utilisant un système solvant butanol : éthanol : eau pris à raison de 5 : 1 : 4 (comme couche supérieure) et un système solvamt pyridine : isopropanol : eau pris à raison de 5 : 65 : 30. On trou-30 ve que la substance active présente des valeurs de Rf de 0,3 et 0,6 respectivement. Ces valeurs sont en accord avec celles, d'un échantillon authentique d'ampicilline. Exemple 2 : On reprend la réaction enzymatique de l'Exemple 1 en uti-35 lisant une quantité ëquimolaire de chlorhydrate d'ester ëthylique de l'acide o(-aminophénylacétique au lieu du chlorhydrate d'ester méthylique. On obtient ainsi un mélange réactionnel ayant une activité antibiotique correspondant à 2,8 mg/ml d'ampicilline. 69 45641 9 2068741 Exemple 3 : On inocule par Flavobactérium EF 44-102 un milieu de culture (pH =7,1) contenant 5% d'extrait d'huile de soja, 0,1% d'extrait de levure, 0,1% d'extrait de viande, 0,5% de licrueur de macé-5 ration de maïs, 2% de-.glucose, 0,4% de KC1, 0,5% de (NH^) 2S04 et 0,02% de I^HPO^. On cultive ensuite le tout à 27°C pendant 45 heures tout en agitant. On met la masse de cellules obtenue en centrifugeant 1 litre du bouillon de culture, ce qui correspond à 3,5 grammes de cellules sèches, en suspension dans 1 litre d'eau distillée. On 10 verse la suspension aqueuse obtenue dans 1 litre d'une solution a-queuse contenant 8 grammes d'acide 6-aminopénicillanique et 30 grammes du chlorhydrate d'ester méthylique de l'acide oC-aminophénylacétique et on ajuste la valeur du pH du mélange obtenu à 7,5. On effectue une réaction enzymatique du mélange à 37°C pendant 2 heures. 15 L'activité antibiotique du mélange obtenu est essayée suivant le procédé mentionné à l'exemple 1. On trouve que le substrat, l'acide 6-aminopénicillanique, est presque complètement acylë en ampicilline. On centrifuge le mélange réactionnel pour enlever les cellules bactériennes, et on traite la couche aqueuse ainsi obtenue 2o sur une résine échangeuse d'ions, Dowex -1x2 (0,149 mm-0,074 mm) suivant une technique classique. On lyophilise la solution ainsi obtenue pour obtenir 10,6 grammes de poudre blanche. L'essai de l'activité antibiotique vis-à-vis de E. coli NIHJ de la poudre montre que c'est de 1'ampicilline à 82% de pureté. 25 Exemple 4 : On met les cellules de culture obtenues par un procédé similaire à celui mentionné dans l'Exemple 3 en suspension dans une solution tampon dêcimolaire de phosphate (pH = 7,5) , et on fait subir un traitement par le son à la suspension obtenue pendant 5 minu-30 tes à température de la glace pour rompre les cellules bactériennes. On centrifuge la solution traitée pour obtenir une solution d'enzymes limpide. On effectue la réaction enzymatique suivant l'exemple 1 en utilisant cette solution d'enzymes. On obtient ainsi une solution ayant une activité enzymatique correspondant à 1,8 mg/ml d'am-35 picilline. Exemple 5 : On inocule Flavobactérium EF 44-102 à un milieu de culture ayant la même composition que celui de l'Exemple 3. On cultive le tout à 27°C pendant 20 heures tout en agitant. 40 on ajoute 150 ml du fluide cultivé à 15 litres du même 69 45641 10 2068741 milieu de culture que celui précité, que 1"on maintient dans un fer-menteur, on effectue la culture à 27PC pendant 24 heures tout en agitant à 350 tôur.s par minute et en envoyant de l'air dans le milieu au débit de 30 litres par minute. 5 On centrifuge le fluide cultivé pour recueillir les cellules bactériennes. On met cellesfci en suspension dans 1,5 litre d'eau distillée, centrifuge et remet en suspension dans 750 ml d'eau distillée. On sèche par lyophilisation la suspension de cellules pour obtenir 32 grammes de cellules sèches. 10 On ajoute 3 grammes de ces cellules sèches à 1 litre d'une solution aqueuse qui contient 5 grammes d'acide_6-aminopénicillani-que et 8 grammes du chlorhydrate de l'ester méthylique de l'acide o£ -aminophénylacétique, le pH de cette solution étant ajusté à 6;2. On agite le mélange rëactionnal ainsi obtenu à 37°C. Au bout de 15 30 minutes, on ajoute encore 6 grammes de chlorhydrate d'ester méthylique de l'acide «^-aminophénylacétique. Par la suite, les additions respectives de 4, 2, 2, et 2 grammes de chlorhydrate d'ester méthylique de l'acide -aminophénylacétique s'effectuent à 30 minutes d'intervalle. La réaction enzymatique est terminée au bout de 20 3 heures. On détermine la teneur en ampicilline du mélange réactionnel suivant la méthode indiquée par J. W. G. Smith et al. (coup. ; Analyst, 92_, pp 247-252 -1967-) . On constate la formation de 5,45 mg/ml d'ampicilline ce qui correspond à une conversion de 7-9,5% de 25 l'acide 6-aminopénicillanique. On centrifuge le mélange réactionnel en refroidissant pour enlever les cellules. On traite la liqueur séparée par la résine et on sèche par lyophilisation suivant les techniques données à l'Exemple 3. 30 On obtient 6,2 grammes d'ampicilline sous forme de poudre blanche. L'essai d'activité antibiotique de la poudre vis-à-vis de E. coli NIHJ montre que cette poudre est de 1'ampicilline à 80,7% de pureté. 69 45641 2068741 REVENDICATIONS 1. Un procédé de préparation de D-(-)-«(-aminobenzylpéni-cilline caractérisé en ce qu'on fait réagir l'acide 6-aminopénicil-liqee ou un sel de celui-ci sur un dérivé fonctionnel de l'-âcide D-(-)—«£-aminophénylacétique en présence d'un micro-organisme, 5 Flavobactérium EF 44-102, (ATCC N° 21429). 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise le micro-organisme sous la forme de cellules bactéri®-43es de celui-ci. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en 10 ce qu'on utilise le micro-organisme sous la forme d'un bouillon de culture, 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise le micro-organisme sous la forme d'une préparation enzymatique de celui-ci. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé fonctionnel de l'acide D-(-)-«^-aminophénylacëthique est un ester ou un amide de cet acide.ou un de&ses sels d'addition avec un acide. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce 2o que l'ester de l'acide D-(-)-aminophénylacétique est l'ester méthylique de cet acide ou d'un de ses sels d'addition avec un acide. 7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'ester de l'acide D-(-)-«^-aminophénylacétique est l'ester ë-thylique de cet acide ou d'un de ses sels d'addition avec un acide. 22 8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise 2 à 20 moles du dérivé fonctionnel de l'acide D-(-) - e("-aminpphénylacétique par mole d'acide 6-aminopénicillanique ou de sels de celui-ci. 9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce 3qqu'on effectue la réaction enzymatique de l'acide 6-aminopénicillanique ou d'un sel de celui-ci et du dérivé fonctionnel de l'acide D-(-)-o(-aminophénylacétique dans un milieu aqueux ayant un pH compri s entre 4.et 8. 3.0. Le micro-organisme Flavobactérium ATCC N° 21429.