Brevet FR2102088A1 — publié le 19720407

La présente invention concerne un nouvel antibiotique dénommé"Tumimycine"et ses sels et son procédé de préparation. La tuntimycine est utile comme agent antimicrobien. C'est une poudre rouge orangée ayant l'analyse élémentaire moyenne suivante : carbone 66,83 hydrogène 6,85 %, 5 azote 3,42 %, un spectre d'absorption infrarouge tel que représenté à la figure 1 et un spectre de RMN tel que représenté à la figure 2. La tumimycine se forme par culture en conditions contrôlées d'un micro-organisme, non découvert jusqu'à présent, qui est une espèce du genre Streptomyces. Ce streptomyces a été obtenu à partir de déblais de 10 charbon à Pékin, Illinois et des échantillons du micro-organisme vivant ont été déposés à 1'American Type Culture Collection à Rockville, Maryland sous le n° ATCC 21501. Le Streptomyces sp ATCC 21501 se développe abondamment dans des milieux de culture habituellement utilisés pour la culture d'autres 15 organismes du même genre. Il peut pousser à des températures d'environ 20 à 35°C de préférence à une température d'environ 25°C, sur un milieu de gélose incliné, préparé par mélange de 20 g de pâte de tomate, 20 g de farine d'avoine et 500 ml d'eau bouillante, et on refroidit ce mélange jusqu'à un .gruau fin, en filtrant, en ajoutant le filtrat à 15 g de gélose 20 dans 500 ml d'eau et en stérilisant le mélange résultant à 121°C sous 2 1 kg/cm de vapeur pendant 20 mn. Sur ce milieu, le mycélium aérien produit des conidies de couleur brun clair et il y a production d'un pigment soluble brun clair. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée à l'utili-25 sation du micrp-organiâme particulier décrit ci-dessus, et comprend notamment toutes les variations et les mutants obtenus par sélection naturelle ou par traitement des micro-organismes, par exemple, par les rayons ultraviolets, les rayons x, le chlorure de manganèse, le camphre, les moutardes azotées et les analogues,ainsi que les polyploïdes des divers 30 mutants. Le milieu, et les besoins nutritionnels pour la fermentation de Streptomyces sp ATCC 21501 sont semblables à ceux nécessaires pour la production d'antibiotiques par d'autres micro-organismes aérobies. Ainsi, on peut entretenir l'aérobiose dans un milieu nutritif liquide inoculé avec 35 une culture stérile incubée dans des flacons placés sur des secoueuses. Pour la production à l'échelle industrielle, on peut remplacer ces dispositifs par des cuves métalliques à aération interne et agitation au moyen " COPY 71 28956 2 2102088 de palettes. La tumimycine peut également être produite par culture de surface. Le micro-organisme a besoin comme élément nutritif d'une ou plusieurs sources d'énergie et de carbone, de substances azotées organiques et de sels inorganiques. La culture s'effectue au mieux lorsque le pH 5 initial du milieu de culture est compris 6,5 et 7,5, le pH optimal étant d'environ 7,0. Les sources de carbone utilisables pour la production de l'antibiotique sont très diverses et comprennent notamment les sucres tels que glucose, lactose, maltose, saccharose, la dextrine, les amidons de 10 différents types d'origine, le glycérol et d'autres polyalcools, l'inositol et les graisses animales et végétales ainsi que leurs esters. Les sources d'azote organiques qui stimulent activement la croissance et favorisent la production de tumimycine sont des substances telles que la farine de soja, la farine de laine de coton et d'autres farines végétales (complètes ou 15 partiellement ou totalement dégraissées), les farines de viande ou les viscères d'animaux,diverses peptones, des hydrolysats de caséine, de soja, de levure, la lactabumine, les glutènes de blé, les substances solubles de distillateurs, les liqueurs de trempage de maïs, l'urée et les antino acides. 20 On doit incorporer en concentrations appropriées des sels inorganiques tels que les chlorures, nitrates, sulfates, carbonates et phosphates de sodium, de potassium, d'ammonium et de calcium. Le milieu nutritif doit contenir un certain nombre d'oligo- éléments tels que magnésium, fer, cuivre, manganèse, zinc et cobalt. 25 Dans les conditions décrites ci-dessus et .à"une - température d'environ 25°C on obtient la production maximale de tumimycine d'environ 2 à environ 5 jours dans les cuves. L'inoculum pour la fermentation peut être fourni par des suspensions de spores ou par du mycéliunt lyophilisé, séché par congélation 30 avec un substrat inerte. On le transvase ordinairement par un ou plusieurs passages dans des milieux liquide avant la fermentation finale. La tumimycine est utile comme agent antibactérien et antifongique. contre les micro-organismes indiqués ci-après. Elle est utile telle que comme agent de conservation 35 (par exemple pour le cuir, la papier et les peintures) et en particulier dans les matières plastiques et les étoffes pour les rendre résistants à l'attaque du mildiou et d'autres moisissures. Pour la protection des étoffes, par exemple, Ql)py bad orig/mal 71 28956 3 2102088 on peut imprégner l'étoffe avec la tumimycine ou un de ses sels par trempage ou pulvérisation. On peut également utiliser la tumimycine comme agpit de protection des plantes : à cet effet, on peut la pulvériser sur les plantes à traiter. On peut préparer un mélange convenable à pulvériser 5 en broyant à l'état humide la tumimycine ou un de ses sels avec de l'eau et de préférence un agent mouillant,tel qu'un ester d'acide gras supérieur d'un polyoxyalkylènesorbitaxme (par exemple le monolaurate de polyoxy-éthylènesorbitanne vendu sous le nom de "Tween 20"). On peut également utiliser la tumimycine comme désinfectant 10 de surface, A cet effet, on la dissout dans de l'eau" contenant aussi de préférence un détergent ou un autre agent de nettoyage, à une concentration d'environ 0,1 à environ 10,0 %, de préférence environ 0,5 à environ 1,0 % en poids. On peut utiliser ces solutions comme lessives pour désinfecter les sols, les parois, les tables et analogues,ainsi que dans les nettoyages 15 des appareillages de l'industrie laitière ou alimentaire. Après la fermentation, on filtre le bouillon complet. On jette le filtrat et on extrait le gâteau de filtration avec un solvant non polaire. On purifie ensuite par précipitation et chromatographie l'antibiotique présent dans le solvant non polaire. Une purification finale 20 a lieu par recristallisations successives dans différents solvants. La tumimycine a les caractéristiques suivantes : 1) Lorsqu'on la soumet à une nouvelle chromatographie sur chromatogramme "Eastman Si-gel" en utilisant un système solvant méthanol-CHClg 10:90, on obtient une tache contenant 90 % de la substance à Rf=0,65 25 et une tache contenant 10 % de la substance à Rf=0,55. 2) Aspect : poudre rouge orangée. 3) Point de fusion^ 300°C. 4) Solubilité : soluble dans l'eau acide le méthanol, l'acétate d'éthyle, le chloroforme et l'éther ; insoluble dans l'eau 30 et l'hexène. 5)Spectre d'absorption ultraviolet (dans l'éthanol) Absorption à 243 mp. Eî = 623 Epaulement à 270 xyi ?» — 408 Epaulement à 315 H = 115 Epaulement à 395 m^i H — 95 Epaulement à 415 mji » = 103 Absorption à 432 njp H — 107 Absorption à 445 tjj Il — 89 COPY 71 28956 4 2102088 6) Analyse élémentaire : G 66s90 - 66392 - 66,67 % H 7302 - 6,72 - 6,80 % N 3,36 - 3342 - 3,48 % pas de cendre, de soufre ou 3 d'halogène. 7) Spectre d'absorption infrarouge : voir la figure 1. 8) Spectre de résonance magnétique nucléaire : voir la figure 2. 9) Titrage non aqueux de l'équivalent de base : poids 10 équivalent 470. 10) Détermination de N-CH^ : 4,8 % ; pas de C-CH^. 11) Analyse du chlorhydrate du composé ci-dessus,préparé par dissolution dans l'éther, introduction de gaz chlorhydrique anhydre dans la solution éthérée, centrifugation3 lavage à l'éther et séchage : 15 point de fusion ^ 300°C analyse élémentaire : C 57,86 % - H 6,22 % N 3,34 % - Cl 7,1 7o chromatographie sur "Eastman Cellulose ITLC" solvant méthanol - benzène 3:97 20 Rf = 0,9. 12) La tumimycine forme des sels par réaction avec des acides de matière connue. A titre d'exemples de ces acides, on peut citer HCl, H^SO^, HgPO^ et les analogues , ainsi que les acides citrique, oxalique et acétique. 25 13) Analyse de l'acétate du composé ci-dessus préparé par acétylation dans la pyridine avec l'anhydride acétique à la température ambiante pendant 16 h, on verse dans l'eau glacée, on extrait par l'éther, on sèche la solution éthéré et on recristallise dans le mélange éther-hexène point de fusion 145-146°C 30 analyse élémentaire : C 64,85 % - H 6,47 % - N 2,71 % titrage non aqueux de la base : 0 spectre d'absorption infrarouge : voir la figure 3 chromatographie sur "Eastman Si-gel ITLC", solvant méthanol—CHCl^ 10:90 Rf = 0,68. 35 La tumimycine possède in vitro un large spectre indiqué dans le tableau I ci-après : 71 28956 5 2102088 TABLEAU I Micro-organisme C.M. I. (ot ,ml) Staph. aureux SC 1276 0,6 Escherichia coli SC 2975 9,4 5 Candida albicans SC 5314 1,2 Aspergillus niger SC 2828 6,3 Salmonella schottmuelleri SC 3850 18,7 Pasteurella multocida SC 8739 6,3 Pseudomonas aeruginosa SC 3840 12,5 10 Proteus vulgaris SC 8504 Trichophyton mentagrophytes SC 2637 25,0 La tumimycine diffère des autres antibiotiques connus. Le seul antibiotique qui lui est semblable est l'iyomycine B^ (Y. Sano3 15 N. Kanda et T. Hata : J. Antibiotics, Tokyo 17, n° 3, p. 117, 1964). L'iyomycine B^ et la tumimycine sont semblables par l'analyse élémentaire, les spectres U.V. et I.R. et le point de fusion. Elles présentent cependant les différences suivantes : a) La tumimycine a un pic d'absorption caractéristique 20 dans le spectre infrarouge à 9,10 mp qui n'est pas présent dans le spectre I.R. de l'iyomycine B^. De même, l'iyomycine B^ a un pic d'absorption dans le spectre I.R. à 8,95 ji qui est absent dans le spectre I.R. de l'antibiotique selon l'invention. b) Les valeurs E''" des absorptions correspondantes dans 25 les spectres U.V. sont différentes. Tumimycine Iyomycine B^ 1 1 30 Absorption à 243 mju 623 500 Absorption à 270 mp 480 330 Absorption à 430-2 n^i 96 107 c) La DL^q pour la tumimycine est de 40 mg/kg par voie 35 intraveineuse chez la souris; pour l'iyomycine la DL^ est de 5 mg/kg par voie intraveineuse chez la souris. 71 28956 6 2102088 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée, EXEMPLE 1. Fermentation. 5 On fait pousser pendant 8 jours la culture de streptomyces sp. ATCC 21501 produisant la tumimycine sur un milieu de gélose contenant de la farine d'avoine "Heinz Baby Oatmeal" et de la pâte de tomate "Contadina Tomato Paste". On met ensuite la culture en suspension dans une solution à 0,01 % de Dupanol et on transfère dans 50 ml d'un milieu 10 liquide contenu dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml. Ce milieu contient 2,5 % de liqueur de trempage de maïs, 3,0 % de farine de soja extraite au solvant, 5,5 % de cérélose, 0,7 % de carbonate de calcium et on ajuste le pH à 7,0 avant stérilisation par la soude caustique. Après croissance pendant 48 h à 25°C sur secoueuse rotative, on transfère quantitativement 15 le bouillon dans une fiole d'Erlenmeyer de 4000 ml contenant le milieu ci-dessus auquel on a ajouté 0,025 "L de "Ucon Lubricant L625" comme antimousaes. Après encore 48 h de croissance à 25°C sur secoueuse rotative, on utilise le contenu de cette fiole pour inoculer 30 1 du milieu identique dans une cuve de germination en acier inoxydable de 38 1 de capacité 20 fonctionnant à 25°C avec un débit d'air par unité de surface de 0,6 m/mn avec une pression de 0,7 kg/cm et une agitation équivalant à 36 W/100 1. Après 48 h, on transfère 1500 ml de bouillon résultant dans un fermenteur en acier inoxydable de 38 1 contenant 30 1 du milieu utilisé à la fois dans la cuve de germination et dans la cuve secondaire. Pour la production 25 de l'antibiotique, on utilise une température de 25°C conjointement avec un débit d'air par unité de surface de '1,2 m/mn et une agitation équivalant à 76 W/100 1. Pour le contrôle de la mousse, on ajoute lorsque cela est nécessaire du "Ucon Lubricant L625". La récupération de l'antibiotique commence après 96 ou 120 h de croissance. 30 EXEMPLE 2. Isolement. Après 120 h de fermentation, on filtre le bouillon complet avec addition de 5 % de Hyflo. Comme la majeure partie de l'antibiotique 35 est dans le gâteau de fiîtration, on jette le filtrat. On extrait le gâteau riche en antibiotiques 8 fois par le benzène en agitant pendant au moins 1 h à chaque extraction. On jette le gâteau extrait après filtration. 71 28956 7 2102088 On combine les extraits benzéniques riches en antibiotique et on évapore à siccité. Le rendement est alors de 6-7 g d'une substance huileuse rouge pour 10 1 de bouillon complet. On triture te-résidu huileux rouge avec 1 1 de n-hexène et on maintient à 5°C pendant 16 h. Il se forme un précipité rouge que l'on recueille par filtration et que l'on sèche. Le rendement est d'environ 200-300 mg d'antibiotiques bruts d'un degré de pureté de 10 à 20 X pour 10 1 de bouillon complet. On dissout le produit brut dans un minimum d'acétate d'éthyle et on chromatographie sur des feuilles de chromatogramme "Eastman Si-gel" en utilisant comme solvant le système méthanol-chloroforme 10:90. On peut déceler au moins 6 taches différentes sur le chromatogramme après développement. On enlève par grattage de chromatogramme la tache visible jaune et également fluorescente en rouge à Rf 0,65 et on élue du gel par l'acétate d'éthyle. L'antibiotique brut traité de cette manière donne environ 40-50 mg d'antibiotique pur. On le recristallise 2 fois dans le mélange acétate d'éthyle-hexène. 71 28956 8 2102088 REVENDICATIONS 1. Nouvel antibiotique dénommé tumimycine, caractérisé en ce qu'il consiste en une poudre rouge orangé ayant l'analyse élémentaire moyenne suivante : C 66,83 %, H 6,85 %, N 3,42 7» et un point de fusion supérieur à 300°C. 2. Procédé pour la préparation de l'antibiotique selon la reven-5 dication 1, caractérisé en ce que l'on cultive Streptomyces sp. ATCC 21501 en conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrate de carbone fermentable assimilable et une source d'azote assimilable jusqu'à ce qu'une quantité notable de l'antibiotique s'accumule dans le milieu. 3. Compositions thérapeutiques contenant comme ingrédient actif 10 l'antibiotique selon la revendication 1 ou un de ses sels. 4. Formes pharmaceutiques appropriées par l'administration des compositions selon la revendication 3. 5. Utilisations de l'antibiotique selon la revendication 1, comme agent antibactérien et antifongique, caractérisées en ce que l'on dissout 15 ou suspend la tumimycine ou un de ses sels dans un liquide pour rinçage ou pulvérisation ou une lessive, contenant aussi de préférence un détergent. 6. Bain ou liquide à pulvériser pour la protection de substrats, notamment cuir, papiers, peintures, matières plastiques et étoffes , caractérisé en ce qu'il consiste en une suspension aqueuse de tumimycine ou d'un de ses sels. 20 7. Liquide à pulvériser pour la protection des plantes, caracté risé en ce qu'il consiste en une suspension aqueuse de tumimycine ou d'un de ses sels. 8. Liquide à pulvériser selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient aussi un agent mouiMant. . 25 9. Lessive pour désinfecter les sols, murs, tables et nettoyer les appareillages dans l'industrie laitière ou alimentaire, caractérisée en ce qu'elle consiste en une solution aqueuse acide de tumimycine ou d'un de ses sels, à une concentration d'environ 0,1 à 10,0%, de préférence de 0,5 à 1,0% en poids. 10. Lessive selon la revendication 9,'^caractériséeen ce qu'elle 30 contient aussi un détergent ou agent de nettoyage.