Brevet FR2068543A1 — publié le 19710827

La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un produit qui permet de gouverner la flore bactérienne dans les intestins d'hommes et d'animaux. Les phases propres à ce procédé sont la culture, dans 5 un milieu nutritif aqueux qui contient des hydrates de carbone, une source d'azote organique et une source de substances de développement, dans des conditions d'immersion anaérobies, d'une souche de Streptococcus faecium dénommée ici "St-reptococcus faecium Cernelle 68", dont les propriétés seront décrites par la 10 suite (cette souche a été déposée à la national Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station» Aberdeen, enregistrement en Ecosse N° NCIB 10.415), la séparation de l'amas résultant de bactéries d'avec son liquide de culture ainsi obtenu et, éventuellement, le séchage par congélation de l'amas isolé 15 de bactéries. Le microorganisme utilisé dans le procédé conforme à l'invention est une subculture classifiée à l'origine sous l'espèce Lactobacillus acidophilus. On élimine l'hypothèse d'identification initiale en 9e fondant sur les caractéristiques 20 microscopiques du microorganisme et aussi sur la grande tolérance thermique qu'il montre. Cependant, son image morphologique prête un peu à confusion, car les cellules en sont plutôt ârrégu-lières et montrent donc une analogie plus grande avec un Micro-bactérium qu'avec un streptocoque. Les résultats négatifs de 25 l'essai à la benzidine excluent toutefois la première hypothèse et l'aptitude de la source étudiée à se développer à 10°C donne une autre indication négative, Par conséquent, on conclut qu'en dépit de son irrégularité morphologique, le microorganisme est un streptocoque, qui 30 appartient plus particulièrement au groupe des entérocoques (haute tolérance thermique, développement à 10°C et à 45°c). D'autres essais confirment cette conclusion,. On peut ainsi démontrer que ce microorganisme est apte à se développer sur ure gélose de Slanetz et de Bartley. Pour ces raisons et bien d'autres, le 35 microorganisme doit être considéré comme étant un entérocoque. On peut aussi en démontrer les propriétés suivantes : développement pour un pH de 9,6, développement dans un milieu à concentration sn MaCl de 6,5$ et développement dans unegélose de bile à 40/&. Toutes ces propriétés sont considérées d3habitude 40 comme des critères spécifiques d'identification des entérocoques» BAD ORIGINAL 70 08466 2 2068543 Pour qu'on dispose d'une information de comparaison, tous les essais comprennent une souche de Streptococcus durans (ATCC 6056) qui appartient au groupe des enfcérocoques et aussi certaines souches d'entéroeoques spécialement isolées dans ce but à partir de 5 fumier. On trouve qu'il existe une vaste concordance entre la souche de Streptococcus durans et la souche étudiée et l'on admet donc au départ que les deux souches sont identiques. Cependant, des recherches poursuivies dans la littérature sur ce 10 sujet, ainsi que des études comparatives, mettent en évidence qu'il est plus probable que le microorganisme envisagé est un Streptococcus faecium (d'après Deibel, Bact. Reviews 28, 330-366, 1964, le Streptococcus durans peut etre considéré plus particulièrement comme une variante du Streptococcus faecium). Cette 15 conclusion se fonde principalement sur le fait que la souche étudiée se développe à 50°C et fermente l'arabinose, alors qu'elle ne fermente pas le sorbitol et n'utilise pas le citrate comme source de carbone0 Les quatre caractéristiques indiquées concordent avec celles du Streptococcus faecium, non avec le 20 Streptococcus faecalis «, Comme déjà mentionné, il est peu important de savoir si le microorganisme est classifié comme Streptococcus durans ou faecium. Par comparaison à la souche de référence de Streptococcus durans qui est fortement (i -hémolytique, la souche étudiée 25 doit être considérée comme pratiquement non hémolytique. Par conséquent, de ce point de vue également, sa classification en Streptococcus faecium doit être considérée comme correcte. -En outre, la souche étudiée ne coagule pas le lait. La formation d'acide dans le lait est faible, par exemple si on la compare 30 à la souche de référence de Streptococcus durans. Le pH final du lait vaut respectivement 5,5 et 4,4. Il faut remarquer que le Streptococcus faecium n'a pas été reconnu comme espèce individuelle dans la dernière édition du "Manual of Determina,tive Bacterioiogy" de Bergey (7ème 35 édition, 1957)* De nombreuses études réalisées dans les quelques années qui viennent de s'écouler ont pourtant indiqué nettement qu'il est besoin de réviser le groupe entérocoque du manuel de Bergey et que ce groupe devrait se composer de deux espèces différentes, à savoir le Streptococcus faecalis et le Streptococcus 40 faecium. Celui-ci se différencie très aisément de celui-là, qui BAD ORIGINAL 70 08466 3 2068543 exige l'acide folique. Une recherche des propriétés de morphologie et culture du 'fetreptococcus faecium Cérnelle 68" donne les résultats reportés dans le tableau suivant : Milieu, etc.., Propriétés Morphologie gélose de Xemco, gélose de sang et bouillon 10 15 20 Développement température de culture î>iage de températures atmosphère d'hydrogène, gélose au sang gélose au sang , 24 h à 25°C oses ou holosides dans eau et peptones (7 jours à 30°C) 25 30 35 40 glucose, Hugh et Leifson (7 jours à 25°C) gélose MRS lait de tournesol urée citrate ( de Koser) indole V oge s-Proskauer rouge de méthyle mlcroc-oques Gram positifs, souvent lancéolés. Seuls, en paires et chaînes de longueur variable. Pas de motilité. 30-45°C 15-45°C (pas d'examen au-dessus de 45°C) bon développement, 7 jours à 30°C. colonies punctiformes circulaires, moux, humides, un peu convexes; marge complète; opaques et incolores. butyreux, (V-hémolyse; acide, mais pas de gaz avec les glucose, sucrose, lactose, maltose, mannitol et tréha-lose. Ni acide ni gaz avec l'amidon, le glycérol et le dulcitol. acide en tubes ouverts et fermés bon développement. Pas de bulles gazeuses avec fil chaud. Homofermentation. acide, pas de coagulation ni de séparation. - (faible développement) + BAD ORIGINAL 70 08466 4 2068543 nitrate à nitrite NH^ provenant de tryptone plaque de gélose - gélatine plaque de gélose d'amidon 5 plaque de gélose de lait clarification, mais précipité avec HgClg catalase cytochrorne-oxydase oxydase (de Kovac) - (30 secondes). 10 Des essais de culture exécutés avec le "Strepto coccus faecium Cernelle 68" révèlent que les dix acides aminés suivants sont des facteurs de développement nécessaires pour cette souche: l'arginine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, 1'isoleucine, la leucine, la méthionine, la 15 " thréonine, le tryptophane et la valine. Quatre v-itamines B en sont des facteurs de développement importants : la riboflavine, la niacine, l'acide fJantothénique et l'acide folique. On détermine la résistance du microorganisme in vitro vis-à-vis de certains corps antibiotiques et â,- chimi-20 othérapiques et on obtient les résultats suivants : Antibiotiques et chimiothérapiques Groupe 1. Sulfaisodimidine XV" 2. Pénicilline III 3. Ampicilline III 25 4. Streptomycine IV". 5. Chlorotétracycline (Auréomycine) II 6. Oxytétracycline (Terramycine) I 7. Chloramphénicol II 8. Polymyxine IV 30 Dans le tableau qui précède, les différents groupes ont les significations suivantes : Groupe I : "sensible" (infection générale, dosage habituel) Groupe II : "assez sensible" (infection générale, fort dosa- 35 Groupe III ge) "peu sensible" (infection localisée, concentration d agent chimiothérapique sur l'endroit de l'in- d agent chimiothérapique fection, par exemple en infection des voies uri-naires ) Groupe IV : "résistant" (probablement non accessible à la 40 chimiothérapie). BAD ORIGINAL 70 08466 5 2068543 La présente invention a plus précisément pour objet la .culture d'une nouvelle souche de Streptococcus faecium, appelé ici "Streptococcus faecium Cernelle 68", dans des conditions d'immersion anaérobies, à 30-4-5 °C et de préf*iàes-34-40°C, avec agitation, dans un milieu contenant des oses ou/1 comme le dextrose, une source d'azote organique, comme une peptone, et une source de substances de développement* par exemple des extraits de levures. La culture s'effectue de préférence à pH de 5,8 à 7*2 et l'on utilise de préférence l'hydro-ïîyde-d*ammonium comme régulateur de pH. La durée de culture est de 10 à 30 heures. Les conditions optimales sont de 37°C pendant 16 heures. Quand le développement est achevé, on sépare l'amas de bactéries, de préférence à l'aide d'un séparateur, et on le met de préférence en suspension dans l'eau, on le sèche par congélation et on l'emballe. La bactérie produite conformément à l'invention est propre à se multiplier dans les intestins d'hommes et d'animaux et peut donc s'utiliser en médecine humaine et comme addition aux aliments d'animaux, en particulier pour prévenir l'entérite. Lbpganisme considéré forme de l'acide lactique, ést naturel aux intestins et a une viabilité si grande qu'il supprime d'autres bactéries intestinales et normalise ainsi la flore intestinale. Quand le produit envisagé selon l'invention est mélangé aux aliments d'animaux, il produit biologiquement un effet physiologique qui donne les mêmes résultatss ou bien de meilleurs résultats, que les antibiotiques alimentaires souvent mélangés aux aliments d'animaux. Il réduit les infections intestinales et augmente la croissance des animaux par unité de poids d'aliment» En même temps, on réduit le nombre de journées d'alimentation nécessaires pour atteindre un certain poids. On trouve que le produit est très intéressant pour les cochons de lait et les veaux. En admixtion avec des aliments, à la place d'antibiotiques, il conduit les cochons de lait à atteindre leur poids de vente beaucoup plus tôt qu'ils ne l'auraient fait sans cette admixtion. On peut donc se servir du produit envisagé comme substituant d'agents antibiotiques et chiïûiothérapiques dans les aliments. Ceci est très important puisqu'on ©Epêche ainsi 70 08466 6 2068543 les souches de bactéries qui résistent aux antibiotiques de se développer, ce qui arrive souvent quand on mélange lesdits antibiotiques aux aliments. Les souches résistant aux antibiotiques qui se développent ainsi constituent un problème dont l'ampleur 5 augmente en médecine humaine. Il va à présente être donné un exemple pour illustrer la façon d©nt on cultive le "Streptococcus faecium Cernelle 68" et dont on en recueille le produit. Dans cet exemple, on maintient de préférence la 10 culture de "Streptococcus faecium Cernelle 68" comme culture de piquage dans une gélose de Jus de tomate refroidie à 5°C. Les tubes sont repiqués une fois par mois sur de nouveaux tubes stérileso Après apparition d'un développement,: on contrôle l'un des essais par coloration gram et étalement sur une pla-15 que de gélose de jus de tomate et une plaque de gélose nutritive. On prépare une préculture en pesant : NaCl 5g peptone 10 g 20 extrait de viande • Jg dextrose 5 g eau 1000 ml qu'on partage sur quatre flacons Erlenmeyer de 250 ml et qu'on stérilise pendant 20 minutes à 121°C. Sous conditions stériles, 25 on transporte une boucle de platine de la culture au bouillon. Il y a incubation à 37°C pendant 24 heures. Après développement, on effectue un contrôle par coloration Gram, également sur une plaque de gélose de jus de tomate.' et dans un microscope à contraste de phase. 30 On prépare une solution^gut^alisante à 6% de NH^OH- qu'on stérilise par un filtre/Seïtz de type EKS I» Un tube en verre à manche devant être raccordé à une pompe à manche est relié au flacon contenant Mî^OH, de façon stérile. On prépare 17 litres de substrat pour une culture 35 partagée en pesant : peptone 510 g dextrose 765 g extrait de levure 119 g eau 1700 ml 70 08466 7 2068543 Les constituants solides sont bien dissous dans l'eau et l'on transfère la solution à des récipients stérilisants en acier ineoxydable, dotés d'une connexion qui permet de refouler" le liquide de manière stérile vers le récipient de culture. 5 Le substrat est stérilisé pendant 50 minutes à 121°C (10 lià très) et pendant 40 minutes à 121°C (7 litres). Le récipient de culture est stérilisé à 180°C pendant 4 heures. Le substrat est refoulé par de l'air stérilé sous pression (0,5 atm) des récipients de stérilisation vers le 10 récipient de culture. On ajoute ' l'inoculation. L1élimination" de l'air du récipient se réalise de façon stérile. On relie l'électrode de pH, qui est connectée à un régulateur de pH, lequel pH est maintenu dans l'intervalle de 5,8 à 7,2. Le régulateur envoie des impulsions à la pompe à manche qui fait 15 venir la solution de NH^OH par la connexion stérile au récipient. Un thermomètre à contact est raccordé au récipient et la température est ajustée à 37°C. On fait démarrer le moteur de l'agitateur et la culture commence. On laisse le développement se poursuivre pendant 20 environ 16 heures, à pH constant et avec agitation. Initialement, le.substrat est de couleur foncée et il prend finalement une teinte jaune brillante. On dépense environ 3000 mil de : NH^OH à 6$. La culture achevée est transférée à un séparateur, où 25 elle est*séparée à 10.000 tr/mn. L'amas de bactéries ainsi séparé est mis en suspension dans des conditions aseptiques. La suspension est séchée sous congélation à 0,01 mm Hg pendant 20 heures, La poudre sèche est emballée dans des boutèilles de verre stériles. 30 On vérifie la culture achevée au microscope par coloration Gram et après développement sur une gélose de jus de tomate, une gélose nutritive et une gélose "VRA. L'amas séché sous congélation est aussi contrôlé par des expériences de culture. 70 08466 8 2068543 - REVENDICATIONS - 1. Produit permettant de gouverner la flore bactérienne dans les intestins d'hommes et d'animaux, caractérisé par le fait qu'il est constitué par le résultat de la culture 5 dans un milieu nutritif aqueux contenant des hydrates de car bone, une source d'azote organique et une source de substances de développement, dans des conditions d'immersion anaérobies, d'une souche de Streptococcus faecium, ici dénommée "Streptococcus faecium Cernelle 68", de la séparation de l'amas de 10 bactéries qui en résulte d'avec le liquide de culture ainsi obtenu et du séchage éventuel par congélation de l'amas isolé de bactéries. 2. Procédé de préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé par les phases de culture,dans un milieu 15 nutritif aqueux contenant des hydrates de carbone, une source d'azote organique et une source de substances de développement, dans des conditions d'immersion anaérobies, d^'une souche de Streptococcus faecium ici dénommée "Streptococcus faecium Cernelle 68", de séparation de l'amas de îiâctéries qui en ré- 20 suite d'avec le liquide de culture ainsi obtenu et de séchage éventuel par congélation de l'amas isolé de bactéries. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on raâLise la culture vers 34 à 40°C, pour un pH " de 5,8 à 7,2 et pendant une durée de 10 à 30 heures. 25 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on réalise la culture à environ 37°C pendant environ 16 heures. 5. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 3 et 4, caractérisé par un ajustement du pH par admixtion 30 d'hydroxyde d'ammonium. 6. Procédé d'accélération de la croissance des animaux domestiques et en particulier des cochons de lait et des veaux, caractérisé par leur alimentation avec le produit selon la revendication 1.