Brevet FR2104768A1 — publié le 19720421

La présente invention concerne un nouveau procédé pour l'obtention et la purification d'un bouillon de fermentation d'un nouveau mélange d'antibiotiques contenant les deux produits suivants : . acide 7 £-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(e>C-métIioxy-p. sulfoxy-cinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxy-lique (la), et . acide 7 f>-(D-5-amino-5-earboxyvaléra!nido)-3-( Ces produits répondent à la formule plane suivante : I dans laquelle E eBt un radical hydroxy ou sulfoxy (c'est-à-dire -OSOjH. Ce mélange d'antibiotiques est appelé ci-dessous "mélange I". Tant le mélange I que les produits la et Ib isolés dudit mélange constituent des agents à large spectre d'efficacité, présentant un effet ffraa positif/ffram négatif sensiblement équilibré. Ceci englobe l'activité in vivo contre les organismes (Jram-négatifs suivants : Proteus vulgaris, Proteus mirabilis. Salmonella schottmuelleri. Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum. Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. ainsi que l'activité in vivo contre les organismes G-ram-posi-tifs suivants : Staphylococcus aureus. Streptococcus pyrogenes 71 23968 2 2104768 et Diplococcus pneumoniae. Un autre objet de la présente invention est la séparation desdits produits individuels du mélange I et de l'un avec l'autre. 5 Des deux produits entrant dans le mélange (I), l'acide 7 ft -(D-5-aaiino-5-carboxyvaiéra!n.ido)-3-(° la 10 et ce produit est appelé par la suite, "produit la" dans la présente description. Le produit la est plus résistant aux céphalosporinases que la céphalosporine C et la céphalotine, et se distingue par un faible degré de toxicité chez la souris. En outre, il est plus résistant que la céphalosporine C à la 15 dégradation enzymatique, et il est bactéricide. Administré par voie buccale, il protège contre les infections causées par le Proteus vulgaris et, administré par voie sous-cutanée, il est efficace contre toute une gamme d'infections Gram-négatives et G-ra m-p o s i t i ve s. 20 Le produit constitué par l'acide 7 -(D-5-amino-5- carboxyvaléramido)-3-(o 71 23968 3 2104768 développée suivante : 0 HH, Q OCH, II, I /s\ HOC-CH- ( CH2 ) 3-C-NH-fe -C 1 \ 0 GH OG-G=GH- -OH ' OCH„ r COOH Ib et ce composé est appelé par la suite, "produit Ib" dans la présente description. Purification du mélange d'antibiotiques I. 5 Selon la présente invention, le mélange d'antibiotique I est purifié par adsorption d'un bouillon de fermentation ou d'une solution impure contenant ledit mélange sur une résine échangeuse d'ions telle que, par exemple, une résine échangeuse d'anions synthétique dérivant du d-glucose, ou d'un copolymère 10 acrylique, ou d'un polymère rétifié non ionique, ou encore par mise en contact avec une résine échangeuse de cations appropriée. L'antibiotique adsorbé est élué de l'adsorbat sur résine ou polymère, au moyen de tout solvant approprié, cornue, par exemple, avec une solution aqueuse ou une solution alcoolique 15 d'un sel approprié, ou encore avec une solution aqueuse d'un acide minéral. Si on le désire, on peut ensuite purifier davantage l'éluat obtenu dans ce procédé, par un deuxième et un troisième cycles d'adsorption et élution. On prépare ensuite des concentrats des divers éluats, et on les réunit de façon à 20 obtenir le mélange I purifié. En pratique, le stade d'élution s'effectue le plus avantageusement avec de l'eau, avec de l'alcool aqueux, ou avec une solution hydro-alcoolique d'un ou plusieurs sels appropriés, 71 23968 4 2104768 tels que chlorure d'ammonium, de sodium ou de potassium et analogues, ou au moyen d'une solution aqueuse d'une alcoyl-cétone inférieure ou une solution aqueuse d'un acide minéral tel que J.es acides chlorhydrique, sulfurique ou phosphorique 5 et analo^ut-s. Si on le désire, les éluats obtenus selon ce procédé peuvent être purifiés davantage par un deuxième et éventuellement un troisième cycle adsorption-élution. On prépare ensuite des concentrats de 1'ensemble des éluats, de manière à obtenir le mélange d'antibiotiques I purifié. Des 10 éluants typiques pouvant être employés sont, par exemple, les suivants : (1) solution à 5 60 ?£ et 90 °/o de méthanol dans l'eau ; (2) solution diluée d'acide chlorhydrique telle que, par exemple, de l'acide chlorhydrique de pH 0,95 î 15 (3) solution à 20 ou 25 c!° d'acétone dans l'eau ; (4) mélange de pH 7,5 de solutions de nitrate de sodium 1 M et d'acétate de sodium 0,1 M ; (5) solution de bromure d'ammonium 0,5 M et d'acide acétique 0,5 M ; 20 (6) solution aqueuse d'acide formique à 1 Des exemples illustratifs des résines et polymères échangeurs d'ions pouvant être employés dans le procédé selon la présente invention sont, entre autres, les suivants : DEAE ( * ^ Sephadex A-25 , qui est une résine échangeuse d'anions syn-25 thétique dérivée du dextrane (un polysaccharide), sous sa ( ** I forme chlorure ; Amberlite IRA-68V 'qui est une résine échangeuse d'anions synthétique constituée par un copolymère acrylique rétifié contenant une amide tertiaire faiblement basique; (**) Amberlite XAD-2^ ', qui est un adsorbant non ionique constitue 30 par un polymère styrénique rétifié. les résines échangeuses de (*) Pharmacia Fine .Chemicals, Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Market, New Jersey 08854 (Etats-Unis). (**) Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania 19 105 (Etats-Unis). 71 23968 5 2104768 cations appropriées pouvant être employées comprennent, par exemple, les résines du type sulfonate ayant un squelette styrène-divinylbenzène, par exemple la résine à base d'acide ( polystyrène-sulfonique nucléaire Dowex 50 x 2V 'k son stade 5 hydrogène. Le pH du bouillon de fermentation contenant le mélange antibiotique I n'est pas crucial, et, en général, le bouillon brut peut être utilisé directement dans le processus d'extraction et de purification. Toutefois, il est généralement avan-10 tageux d'ajuster l'acidité du bouillon à un pH situé dans l'intervalle d'environ 2 à 7,. et, en pratique, il est particulièrement avantageux de réaliser un pH d'environ 3 à 4. Essais biologiques. - Le processus d'essais biologiques utilisé en ce qui concerne tant le mélange d'antibiotiques 15 I que lès produits individuels la et Ib s'effectue selon une méthode sur plaques-disques, en utilisant le Proteus vulgaris (MB-838) comme micro-organisme d'essai ; celui-ci est maintenu sous forme de culture en plan incliné (talus) sur de l'agar-agar alimentaire (Difco) additionné d'extrait de levure à 0,2 5É 20 (Difco). Les talus inoculés sont soumis à une incubation de 18-à 24 heures à 37 °C, puis conservés à la température d'un réfrigérateur pendant une semaine, des talus frais étant préparés chaque semaine. Le produit d'inoculation pour les plaques d'essai est 25 préparé quotidiennement en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250 ca^ contenant 50 car* de bouillon nutritif (Difco) additionné d'extrait de levure à 0,2 i> (Difco) avec un frottis prélevé sur un talus. On laisse incuber la fiole à 27°C sur un agitateur berceau pendant 18 à 24 heures. On ajuste alors le bouil-30 Ion de culture à une transmittance de 40 $ pour une longueur d'onde de 660 ayj, au moyen d'un appareil Spectronic 20 de Bausch & Lomb, par addition à la culture d'une solution d'extrait de levure à 0,2 j(. On utilise comme produit "à blanc", (***) Dow Chemical Co., 2040 Abbott Road Center, Midland, 35 Michigan 48 640 (Etats-Unis). 71 23968 g 8 «- 2104768 pour cette détermination, du bouillon non inoculé. le bouillon •7. ainsi ajusté (30 car ) est utilisé pour inoculer 1 litre du Milieu d'essai. . On utilise eo'sse milieu d'essais de X'agar-agar ali- 5 mentaire (Difco) additionné d'extrait de levure à 0,2 Ce milieu est préparé, stérilisé à l'autoclave et abandonné au refroidissement jusqu'à 50°C. Après inoculation du milieu, on "5 en ajoute 10 cm à chacune d'une série de boîtes de Pétri, et on laisse le milieu se solidifier. On conduit les essais sur 10 ces plaques selon le procédé plaques-disques, en utilisant des disques de papier de 13 mm. Les plaques en essai sont soumises à l'incubation à 37°0 pendant 20 à 24 heures. Dans les exemples suivants, les résultats d'essais sont exprimés en millimètres de diamètre de la zone d'inhibition ; on les utilise pour dé-15 terminer les puissances relatives, ou, par comparaison avec un échantillon standard purifié de référence, la puissance en Mg/cv?. Lorsqu'un tel essai est réalisé de manière quantitative, on peut détecter de 2 à 4 jUg/cm^ d'antibiotique. On détermine la bio-activité des éluats obtenus confor-20 mément à ce procédé de purification en les essayant contre le Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21 100 et NRRL B-3361) et le Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461). Séparation et purification des composants. - Le mélange purifié (I) obtenu en suivant la méthode précédente peut 25 être scindé en ses deux composants, les acides 7 P-(D-5-amino- 5-carboxyvaléramido)-3-( -méthoxy-p.sulfoxycinnaiùoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique (la) et 7 -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( -méthoxy-p.hydroxycinnamoyloxyméthy1)-7-*méthoxy-3-céphème-4-carboxylique (ib), par des procédés chro-30 matographiques ; ces procédés comprennent les suivants : (1) Chromatographie sur une résine échangeuse d'ions fortement hydrophile dérivée de polysaccharides, avec développement par un système bromure d'ammonium-acide formique. On peut employer des concentrations variées de ce système, mais, 35 en pratique, une solution de bromure d'ammonium 0,5 M et acide formique 0,1 M est préférable. Des exemples typiques des résines pouvant être employées sont celles dérivées du d-glucose 71 23968 7 2104768 soue leur forme chlorure, c'est-à-dire avec du chlore comme ion partenaire, représentées par exemple par la résine DEAE Sephadex A 25 décrite plus haut. (2) Chromatographie sur une résine échangeuse d'anions faiblement basique. Ceci constitue une séparation globale dans laquelle le produit à l'état brut est introduit à un pH d'environ 3 à 3»5 et élué tout d'abord avec un acide à un pH d'environ 2 et ensuite avec un mélange de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique à un pH d'environ 1. Parmi les résines appropriées figurent les résines de copolymères acryliques rétifiées contenant une amide tertiaire faiblement basique. L'Amberlite IRA-68 en est un exemple typique, et convient particulièrement bien pour cette méthode. (3) Chromatographie sur un polymère styrénique rétifié non ionique, tel que l'Amberlite XAD-2. L'élution s'effectue avec un système aqueux approprié, mais, en général, le plus avantageux est d'utiliser un mélange d'eau et d'une cétone aliphatique inférieure telle que l'acétone. Des exemples typiques des éluants pouvant être utilisés sont, entre autres, un mélange à 10 $ de méthanol dans l'eau suivi d'un mélange à 50 $ de méthanol dans l'eau. En variante, un mélange à 20 # d'acétone dans l'eau peut remplacer la solution à 50 $ de uéthanol dans l'eau. Les produits individuels la et Ib obtenus en suivant la méthode ci-dessus peuvent être purifiés par une chromatographie complémentaire. Ainsi, par exemple, l'acide 7f)-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(-méthoxy-p.sulfoxycinnamoyloxy-méthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-earboxylique (la) peut être purifié à nouveau en le soumettant à un traitement selon la méthode de purification (1) décrite ci-dessus, suivi d'un dessalage sur l'adsorbant Amberlite XAD-2, et l'acide 7 (^-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(c 71 23968 8 2104768 En pratique, on amène la solution d'antibiotique I à une colonne contenant l'adsorbant, et on poupe un éluat approprié à travers le lit. De même que dans le cas de la purification du mélange d'antibiotiques I décrite plus haut, 1'élution 5 est conduite de façon telle qu'on obtienne des fractions ou "coupes" qui sont soumises à des essais biologiques vis-à-vis de micro-organismes d'essai standard tels que le Proteus vulgaris (MB-838), de façon à isoler les fractions contenant la plus forte concentration d'antibiotique. En général, les plus 10 hautes concentrations en acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléra-mido ) -3- ( Préparation du mélange d'antibiotiques (I). - Le mélange d'antibiotiques (i), comprenant les produits la et Ib, s'obtient en cultivant, dans des conditions contrôlées, une 20 souche de micro-organisme inconnue jusqu'alors. 0e procédé consiste en une fermentation aérobie d'un milieu nutritif aqueux approprié par inoculation avec une culture de Strepto-myces griseus. Ce micro-organisme, qui a été isolé d'un échantillon de sol, est un nouvel actinomycète, et a été désigné 25 sous la référence MA-2837 dans la collection de cultures de la Société ï'erck & C0, Inc., Rahway, New-Jersey (Etats-Unis). Cette culture a été placée sous dépôt permanent dans la collection de culture de la Northern Utilization Research and Development Branch du Department of Agriculture des Etats-Unis, 30 à Peoria, Illinois, et il lui a été assigné le numéro de culture NRRL 3851. Les milieux aqueux pouvant être employés dans la fermentation sont ceux classiquement utilisés pour la production d'autres antibiotiques. De tels milieux contiennent des sources 35 de carbone et d'azote assimilables par le micro-organisme, ainsi que des sels minéraux. La composition exacte et la quantité de la source 71 23968 9 2104768 d'hydrates de carbone utilisée dépend en partie des autres constituants du milieu, mais, en général, la quantité d'hydrates de carbone varie habituellement entre envirori 1 jé et 6 JÉ en poids. Des types caractéristiques des sources d'hydrates de 5 carbone pouvant être employées dans la fermentation sont, par exemple les sucres tels que glucose, arabinose, maltose, xylo-se, mannite et analogues, ou les amidons et fécules tels que les céréales, par exemple avoine, seigle, amidon de maïs, farine dç maïs et analogues qui, selon les cas, peuvent être 10 utilisés soit seuls soit en association comme source de carbone assimilable dans le milieu nutritif. En général, toute matière protéique peut être utilisée comme source d'azote dans l'opération de fermentation, les sources d'azote appropriées comprennent, par exemple, les hydrolysats de levure, les autolysats 15 de levure, la farine de soja, les hydrolysats de caséine, les liqueurB de macération de maïs, les résidus solubles de distillerie, les concentrés de tomate et analogue, les sources d'azote, soit seules soit en association, sont utilisées en quantité allant d'environ 0,2 à 6 ^ en poids du milieu aqueux. 20 la fermentation est réalisée à des températures situées dans l'intervalle d'environ 20°C à 37°C ; toutefois, pour obtenir les résultats optimum, il est préférable d'effectuer la fermentation à des températures d'environ 22°C à 3Q°C. le pH des milieux nutritifs convenant au développement de la 25 culture de Streptomyces grlseus (MA-2837) et à la production du mélange d'antibiotiques I doit être dans l'intervalle d'environ 5,5 à 8,0. le mélange d'antibiotiques I et les produits la et Ib inhibent efficacement la croissance de nombreuses espèces de 30 Salmonella et peuvent, en conséquence, être utilisés comme désinfectants. Ainsi, par exemple, l'acide 7 P>-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(ot-méthoxy-p.hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique (Ib) et l'acide 7 (?> — (D—5— amino-5-carboxyvaléramido)-3-( 71 23968 10 J -» • 2104768 comme agents d'assainissement dans les applications domestiques et industrielles. Les produits la et Ib» constituant le mélange d'antibiotiques I ont été décrits comme ayant la partie 5-amino-5-5 carboxyvaléramido en position P par rapport au noyau cépiième. Cette désignation est basée sur les indications que l'on trouve couramment dans la littérature, mais la Demanderesse n'entend pas être liée par cette désignation de configuration spatiale, au cas où des indications ultérieures prouveraient qu'elle est 10 incorrecte. Les Exemples qui suivent illustrent le procédé conforme à la présente invention. Toutefois, le procédé revendiqué est susceptible de larges variantes et modifications, et, en conséquence, tout écart d'importance secondaire d'avec ledit 15 procédé et toute extension doivent être considérés comme étant du domaine du professionnel et donc entrant dans le cadre de la présente invention. EXEMPLE 1 Purification du mélange d'antibiotiques et séparation en ses 20 constituants. Stade A : Fermentation Etape 1 : On met le contenu d'un tube lyophilisé de Streptomyces griseus (MA-2837) en suspension dans 2 oïïP du milieu I (décrit dans l'exemple 1) et on utilise l'inoculum 25 obtenu pour inoculer des "talus" (couches inclinées) du même milieu. On fait incuber ces talus à 28°C pendant cinq jours, ou jusqu'à forte sporulation, et on ajoute ensuite aux talus 10 cm du milieu VIII ci-dessous : Milieu VIII 30 Extrait de viande 0,3 i° Chlorure de sodium 0,5 $> * . Aminé NZ 1 56 D-glucose 1 56 pH 7,0 35 * Une préparation de caséine soumise à une digestion enzymatique. 71 23968 n 2104768 Le produit de croissance de chaque talus est gratté et nis en suspension, et cette suspension est utilisée comme inocolum dans.l'Etape 2 ci-dessous. Etape 2 : On utilise la suspension obtenue dans * 5 l'Etape 1 pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer de 250 car, 'Z munie d'un capuchon, contenant 50 ca du milieu VIII (décrit dans l'Etape 1) stérilisé. On place ensuite la fiole d'Erlen-meyer sur un agitateur rotatif tournant à 220 tours/mn et on la soumet à l'incubation pendant 48 heures à 28°C. 10 Etape 3 : On utilise le contenu d'une fiole d'inoculum provenant de l'Etape 2 pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer de deux litres, munie d'un capuchon, contenant 500 cm du milieu désigné comme milieu 7III dans l'Etape î. On place ensuite la fiole incubée sur un agitateur rotatif tournant à 22C tours/mn 15 et on la fait incuber pendant 48 heures à 28°C. 3 Etape 4 : On utilise un inoculum de 5C~ cm de la culture obtenue dans l'Etape 3 pour inoculer un appareil à fermentation de 900 litres, en acier inoxydable, contenant 467 litres de milieu VIII (décrit dans l'Etape 1) stérile. On laisse 20 la fermentation s'effectuer à une température de 28°C, sous agitation (130 tours/mn), en maintenant un courant d'air de 280 1/mn, pendant 65 heures. Au cours de la fermentation, on ajoute de petites quantités d'un agent anti-mousse, le Polyglycol 2000, pour éviter un moussage excessif. 25 Etape 5 : On utilise un inoculum de 453 litres de la culture obtenue dans l'Etape 4 pour inoculer un appareil à fermentation de 6750 litres, en acier inoxydable, contenant 5 400 litres du milieu IX ci-dessous : Milieu IX : 30 Liqueur de macération de maïs 4 D-glucose 2 pH ajusté à 7,2 au moyen de soude caustique. 35 On laisse la fermentation s'effectuer à une température de 28°C, sous agitation (120 tours/mn), en maintenant un courant d'air de 1 540 l/mn, pendant 30 à 36 heures. Pendant la 71 23968 12 2104768 fermentation, on ajoute dtt Polyglycol 2 000 en petites quantités, pour éviter un moussage excessif. On effectue la récolte de la cuvée, et on détermine l.'activité par des essais sur plaques-disques. En utilisant des disques de 12,7 mm, ce bouillon 5 donne une zone d'inhibition de 32,5 mm vis-à-vis du Proteus vulgaris MB-838 lorsqu'il est récolté à 31 heures d'âge. Stade B : Isolement du mélange d'antibiotiques. Le bouillon filtré (4850 litres) provenant du Stade A, Etape 5, est récolté au bout de 36 heures, et on ajuste le pH 10 dans l'appareil de fermentation, dans l'intervalle de 7-8 à 3,0 par addition d'acide phosphorique. Les mycéliums sont éliminés par passage à travers un filtre-presse du type à plateaux-tamis, et rejetés. On fait ensuite passer le bouillon filtré à travers un lit de 450 litres de résine adsorbante Amberlite XAD-2, à un 15 débit de 45 litres par minute. Le bouillon résiduaire est essayé et rejeté, et le lit de résine est lavé avec deux fois son volume d'eau. L'antibiotique est élué du lit de résine au moyen d'une solution de 60 # de méthanol dans l'eau, à un débit de 22,5 li* très par minute. On recueille 40 fractions, de 22,5 litres cha-20 cune, et on les essaye. On réunit les fractions 2 à 40 et on chasse le méthanol par évaporation dans le vide. Le concentrât final (188 litres) est ajusté à pH 3,5 par addition d'hydroxyde d'ammonium, et conservé à l'état congelé. Des échantillons du mélange antibiotique ainsi obtenu 25 sont soumis à des essais biologiques par la méthode plaque-disque, vis-à-vis du Proteus vulgaris. Bouillon filtré : Des essais effectués sur 4 800 litres de bouillon filtré ont donné les diamètres de zone suivants : Bouillon filtré Dilution Diamètre de zone 1:2 26,8 mm. . 1:4 23,8 m®. 1:8 21,1 mm. 71 23968 13 2104768 Bouillon résiduaire et eaux de lavage : Dix fractions de 450 litres chacune, non diluées, donnent un résultat nul aux essais. ,11 en est de sème des eaux de lavage.' Fractions d1élution : Des essais sont effectués sur toutes les fractions. Les diamètres des zones d'infiltration sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Fractions d'élution Fraction Dimension des zoneç Fraction Dimension des zones 1 0 21 33 mm. 2 28 mm. 22 33 3 35 23 34 4 34 24 34 5 36 25 33 6 36 26 34 7 36 27 32 8 38 28 33 9 38 29 32 10 36 30 32 11 36 31 32 12 38 32 30 13 40 33 30 14 37 34 30 "15 36 35 28 16 37 36 27 17 38 37 28 18 36 38 26 19 36 39 26 20 35 40 26 Mélange d'éluats et concentrés d'éluats : Des essais sont effectués également sur 875 litres de mélange d'éluats et 187 litres de concentré d'éluats. 71 23968 14 2104768 Mélange c Dilution i'éluats Biaœëtre ii-è Concentré c Dilution 1 *éluats Diamètre de zone 1 % 5 | 1 ! 16 27,25 mm. 1 Î10 27,0 ma. 1:32 24,5 s®. 1:20 23,8 as» 1:40 21,0 mai. I l'otal des solides dans les essais : Bouillon filtré 119 kg 875 litres de mélange d'éluats 7,23 kg 187 litres d'éluats concentrés 7,20 kg 5 Stade 0 : Purification sur une résine échangeuse d'anions. Le concentré provenant du stade B (94 litres) est dilué à 140 litres avec de l'eau et adsorbé sur un lit de 22,5 litres d'une restas échangeuse. d'anions faiblement basique 10 (résine Amberlite Ira-68, au cycle "chlorure") à pH 4,0 et avec un débit de 9 litres/mn. Cette opération est suivie d'un lavage avec 45 litres â'eau, après quoi on élue le lit de résine, avec une solution de pH 7 de nitrate de sodium 1 M et acétate de sodium 0,1 avec un débit de 1,5 litre/mn. On 15 recueille ainsi 10 fractions d'éluats de 22,5 litres et on en ajuste le pH à 4 avec de l'acide chlorhydrique, dès que collectées. Toutes les fractions sont soumises à un essai biologique, par la méthode plaque-disque sur le Proteus vulgaris, 20 ce qui donne les résultats suivants : Solution d'alimentation Fractions d'éluats : Dilution 1:10 Dilution Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 1:10 1:20 1:40 28,5 mm. 26,5 mm. 24 mm. 1 2 3 4 5 27 mm. 30 mm. 28,5 mm. 26 mm. 26 mm. 6 7 8 9 10 25 mm. 23 mm. 22 mm. 21 mm. 17.5 mm. 71 23968 15 2104768 L'effluent résiduaire donne aux essais 25 mm, sans dilution, et l'eau de lavage 22 mm, sans dilution. Stade D : Purification complémentaire du mélange d'antibiotiques. On réunit les fractions 1 à 10 du stade C et on les enroie à un lit de 45 litres d'adsorbant Amberlite XAD-2 à un pH de 3,0 et arec un débit de 5 litres/mn. On lave le lit de résine arec 90 litres d'eau, au même débit. On élue ensuite l'antibiotique de la résine au moyen d'une solution à 25 d'acétone dans l'eau, avec un débit de 5 litres/mn. On recueille ainsi 16 fractions de 22,g litres. Joutes ces fractions sont essayées, par la méthode plaque-disque, sur le Protaus vulgaris. comme indiqué ci-dessous, lie courant d'alimentation (190 litres) donne les diamètres de zone suivants ; Solution d'alimentation Dilution Diamètre de zone 1:5 30 mm. 1 r 10 27,5 mm. 1:20 24,2 ma. Les diamètres de zone correspondant aux fractions d'éluats sont indiqués dans le Tableau suivant : Fract ions d'éluat Fractions d * éluat Fraction Dilution Diamètre de zone Fraction Dilution Diamètre de zone 1 2 3 1:10 1:10 1:10 20,5 mm. 29 mm. 29 mm. 4 5 6 1:10 1:10 1:10 29 mm. 28 mm. 27 mm. 71 23968 2104768 Fractions d'éluat Fractions d'éluat Fraction Dilution Diamètre de zone Fraction Dilution Diamètre de zone 7 8 9 10 11 1:10 1:10 1:10 1:10 1:5 26 mm. 26 mm. 25 mm. 26,5 mm. 26 mm. 12 13 14 15 16 1:5 1:5 1:5 1:5 1:5 28 mm. 27,5 mm. 25 mm. 25 mm. 24,5 mm. On réunit les fractions 2 à 16 ci-dessus et on chasse l'acétone par évaporation dans le vide jusqu'à un volume final de 17,4 litres. Ce concentrât de 17 >4 litres est ajusté à pH 4 au moyen d'hydroxyde d'ammonium puis lyophilisé, ce qui donne 620 g d'un mélange purifié d'acide 7 ft-(D-5-amino-5-carboxyva-léramido)-3-( 0( -méthoxy-p.suifoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique et d'acide 7 ^-(D-S-amino-S-carboxyva-léramido)-3-(-méthoxy-p.hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique. Ce produit sec présente, à l'essai biologique, un pouvoir de 320 mcg/cm^ pour une zone de 25 mm. Stade E : Séparation de l'acide 7 ft-(D-5-amino-5- carboxyvaléramido)-3-(-méthoxy-p.hydroxy- einnamoyloxyméth.yl)-7-méthoxy-3-céphème-4- carboxylique. On garnit une colonne pour chromatographie, de 25>5 mm de diamètre, jusqu'à une hauteur de lit de 100 cm, avec une résine échangeuse d'anions DEAE Sephadex A25 dans un système contenant du bromure d'ammonium 0,5 M et de l'acide acétique 0,05 M. On fait dissoudre le mélange d'acide 7 P>-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(c 3 D, dans 18 cm d'une solution de bromure d'ammonium 0,5 M et acide acétique 0,05 M, et on envoie cette solution dans la 71 23968 17 2104768 colonne. On pompe la solution d*élution.à travers le lit à un débit de 80 cm?/heure, et on recueille des fractions d'éluat 3 de 10 cm au moyen d'une machine. Le courant d'éluat est contrôlé au moyen d'un réfractomètre différentiel. Le diagramme 5 réfractométrique montre des maximums correspondant aux tubes 19, 36, 109 et 206. On effectue des essais plaqu-deisque, vis-à-vis du Proteus vulgaris (MB-838) toutes les trois fractions, en employant des disques de 6,5 mm de diamètre, tamponnés à pH 7,0. Lee diamètres de zone sont indiqués dans le Tableau sui-10 vant (les fractions 1 à 66 donnent zéro aux essais) : 1 Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 69 18 mm. 122 29 204 40 + 72 24 125 28 207 40 + 75 26 128 27 210 40 + 78 31 131 26 213 40 + 81 — 134 24 216 40 + 83 35 137 21 219 40 86 37 140 20 222 38 89 38 150 18 225 35 92 38 160 20 228 32 95 40 + • 170 29 231 31 98 40 + 180 35 234 27 101 40 + 183 38 237 24 104 40 + 186 40 + 240 23 107 40 + 189 40 + 243 19 110 40 + 192 40 + 246 17 113 40 195 40 + 249 0 116 38 198 40 + 252 0 119 33 201 40 On réunit d'une part les fractions 80 à 133 et d'autre part, les fractions 170 à 230. On répète l'opération précédente, et on réunit les 71 23968 13 2104768 fractions 82 à 130 et 180 à 234. Les fractions contenant le premier constituant actif5 provenant des opérations précédentes, sont réunies et adsorbées sur un lit de 100 eu" de résine Amberlite XAB-2. On lave ce lit 5 avec son volume d'eau et en l'élue ensuite avec 3 volumes d'une solution à 90 fo de méthanol dans l'eau. Le méthanol est chassé par évaporation sous vide., et le concentrât aqueux est séché par lyophilisation, donnant 810 mg d'un produit identifié comme 7 (b - (D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( eC-méthoxy-p .hydroxycin-10 namoyloxyaiéthyl)-7-!aéthoxy-3œcéphèaie-4-carboxylique. Le pouvoir biologique de ce produit, déterminé par des essais plaque-dis- • * * que vis-à-vis du Proteus vulgaris. est de 18Mg/ctir , donnant un diamètre de zone de 25 mm. L'analyse par absorption ultraviolette donne les caractéristiques suivantes : 15 Absorption ultraviolette dans l'acide chlorhydrique 0,1 BT î A max. 305 524 Absorption ultraviolette dans la soude caustique 0,1 N : A max. 328 564 Stade F : Séparation de l'acide 7ft -/D-5-amino-5-20 carboxyvâléramido)-3-(d-méthoxy-p.suifoxy- cinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphèaie-4-carboxylique. Les fractions provenant des deux passages sur Sephadex A-25» contenant le second composant actif, sont réunies ets 25 adsorbées sur un lit de 100 car' de résine Amberlite XAD-2. On lave le lit avec une fois son volume d'eau et on l'élue ensuite avec 3 volumes de méthanol aqueux à 90 On réunit les éluats riches, et on chasse le méthanol par évaporation sous vide. Les concentrats aqueux séchés par lyophilisation, donnant 720 mg 30 d'acide 7 P3-(D-5-aaiino-5-carboxyvaléramido)-3-( -méthoxy-p. sulfoxycinnamoyloxyaaéthyle)-7-méthoxy-3-céphèaie-4-carboxylique (la). L'analyse par absorption dans l'ultraviolet donne les caractéristiques suivantes : Absorption -ultraviolette dans l'acide chlorhydrique 0,1 N : 35 A max. 287 mm E^m 432 i w m Absorption ultraviolette dans la soude caustique 0,1 N : A max. 280 mm E{? 432 i coi 71 23968 19 2104768 EXEMPLE 2 Séparation de l'acide 7 fi?-(D-5-amino-5-earboxyvaléramido)-3-( et -méthoxy-'P.sulfoxycinnaffloyloxyaéthyl)-7-méthoxy-5-céphème-4-carboxylique du mélange d'antibiotiques. On fait dissoudre dans 200 cm^ d'eau le mélange d'acide 7 $-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(o et on ajuste à 3,5 le pH de la solution. On fait passer cette solution à travers un lit de 200 cv? de résine échangeuse d'anions Amberlite IBA.-68 au stade chlorure, puis on ajoute 300 cm^ d'eau de lavage. On élue alors le lit avec une solution à 1 $> (en volume) d'acide formique dans l'eau. Ceci est suivi de l'addition de deux portions d'acide chlorhydrique dilué de pH 0,95, La solution d'alimentation, les liqueurs résiduaires et de lavage, ainsi que les éluats 1, 2 et 3 sont analysés par électrophorèse sur papier à pH 4 effectuée pendant une heure sous 1000 volts en courant continu. L'enregistrement sur papier est séché, exposé à la vapeur d'ammoniac pour neutraliser l'acide, et incubé sur une plaque d'agar-agar nutritif ensemencée avec le ProteuB vulgaris (MB-838). l'examen effectué après 17 heures d'incubation à 3e?°C montre deux zones d'inhibition pour la solution d'alimentation (dans la direction de l'anode), un seul composant (le plus lent des deux) dans la liqueur résidu-aire et les éluats à l'acide formique et un seul composant dans le second éluat à l'acide chlorhydrique, correspondant au composant le plus rapide de la solution d'alimentation. Le Tableau suivant indique le poids de solides total est les résultats des essais biologiques : 71 23968 20 2104768 Poids Volume Unités biologiques totales Produits Solution d'alimentation 20 g 200 cm3 60000 unités la et Ib Liqueurs résiduaires et de lavage 11,15 g 500 cm3 7500 unités Ib Eluatà l'acide formique 4,52 g 1000 cm5 20000 unités Ib Premier éluat à l'acide chlorhydrique 500 car' 1000 unités Second éluat. à l'acide chlorhydrique 2,10 g 500 cm3 10000 unités la Ces fractions sont récupérées par adsorption sur résine Amberlite XAD-2, afin d'en extraire l'acide 7 £-(D-5-amino-5-carboxyyaléramido ) -3- ( o 5 élué avec une solution à 50 $ de méthanol dans l'eau, donnant le produit (la) pratiquement pur. EXEMPLE 3 Séparation de l'acide 7 -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-5-( -méthoxy-p.suifoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-5-oéphème-10 4-carboxylique du mélange d'antibiotiques. On fait dissoudre 5,0 g du mélange d'acide 7 $-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(c 71 23968 21 2104768 selon l'exemple 1, Stade D, dans 20 cm' d'une solution à 20 fi d'acétone dans l'eau et on ajuste le pH à 4,0. On amène cette solution à un lit d'adsorbant Amberlite XAD-2 de "50 mm de diamètre sur 100 cm de hauteur, dans une solution à 20 fi d'acé-5 tone dans l'eau. On pompe à travers ce lit une solution à. 20 fi d'acétone dans l'eau, avec un débit de 880 cm3/heure, et des fractions de 20 cm sont recueillies automatiquement. On effectue des essais plaque-disque vis-à-vis du Proteus vulgaris sur toutes les trois fractions, en utilisant 10 des disques de 6 mm. Les diamètres de zone sont indiqués dans le Tableau ci-dessous : Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 1-41 0 104 14 167 17 44 12 mm 107 13 170 18 47 22 110 13 173 20 50 25 113 11 176 21 53 29 116 10 179 21 56 31 119 9 182 21 59 35 122 8 185 21 62 30 125 8 188 22 65 28 " 128 8 191 23 68 27 131 0 194 23 71 25 134 0 197 23 74 24 137 0 200 22 77 21 140 8 203 24 80 20 143 11 206 24 83 19 146 13 209 24 86 16 149 13 212 24 89 14 152 15 215 24 93 13 155 15 218 19 95 13 158 16 221 18 98 13 161 17 224 18 101 13 164 18 227 18 71 23968 22 2104768 Fraction j Diamètre | Diamètre âe zone 230 ! i 1*7 ' I 269 12 233 l L 17 272 11 236 15 275 11 239 15 278 10 242 15 281 10 245 15 234 9 248 14 287 8 251 14 290 0- 254 14 293 0 257 13 296 0 260 - 299 0 263 19 302 0 266 12 330 zéro On réunit les fractions 44 à 90, on élimine par évaporation dans le vide, et on sèche les concentrats aqueux par lyophilisation, ce qui donne 3,3 g d'acide 7 (^-(D-amino-5-car-boxyvaléraraido-œéthoxy-p.suifoxycinnamoyloxyméthyl) -7-5 méthoxy-3-céphème-4-carboxylique (la) brut. Les fractions 150 à 225 réunies donnent, par le même traitement, 700 ag d'acide 7 jî>-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido) -3-(oC-méthoxy-p.hydroxyeinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème 4-carboxylique (Ib). 10 Une répétition de l'opération précédente donne 3,1 g d'acide 7 £)-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( On réunit les deux quantités d'acide 7 ^-(D-S-aaiino-S-carboxyvaléramido)-3-( -méthoxy-p.sûlfoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphèm"e-4-earboxylique (la) obtenues conformément à la méthode précédente, et les 6,4 g de produit sont amenés à 71 23968 23 2104768 un lit d'absorbant Amberlite XAD-2 de 50 mm de diamètre sur 100 cb de hauteur, dans une solution à 5 fi de méthanol dans l'eau. On pompe à travers le lit une solution à 5' fi de méthanol dans l'eau, à un débit de 880 cm3/heure, et des fractions 3 5 de 20 cm sont recueillies automatiquement. Deux cent quatre . vingt sept fractions sont ainsi recueillies, et chaque quatrième fraction est essayée par la méthode plaque-disque contre le Proteus vulgaris (MB-838) en employant des disques de 6 mm. Les résultats de ces essais sont indiqués dans le Tableau ci-10 dessous. Les fractions 1 à 50 ne sont pas examinées. Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 51 23 mm 115 20 55 26 119 20 59 23 123 19 63 18 127 18 67 12 131 19 71 0 155 16 75 0 139 17 79 0 143 15 83 7 147 16 87 ' 9 151 15 91 13 155 13 95 19 159 11 99 21 163 9 103 22 167 0 107 22 171 0 111 21 287 zéro On réunit les fractions 95 à 159» on évapore le méthanol sous vide, et on sèche les concentrats aqueux par lyophilisation, ce qui donne 700 mg d'acide 7 -(D-5-amino-5-carboxy-valéramido}-3-(o 71 23968 24 2104768 l'acide 7 f$-(33-5-anïino-5-carboxyvaléramido)-3-( ^-méthoxy-p. sulfoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique (la) présente les caractéristiques d'absorption suivantes : Absorption U.V. dans l'acide chlorhydrique 0,1 îï : max. 285 E- m 160 1 cm Absorption ÏÏ.V. dans la soude caustique 0,1 ïï : max. 277 Eicm Essayé avec des disques de 13 mm de diamètre par la méthode plaque-disque, contre le Proteus vulgaris. l'échantillon d'acide 7 £ -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(c EXEMPLE 4 Mélange purifié d'acide 7 ft-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3--(cx1 -méthoxy-p. suif oxycinnamoyloxyméthyl) -7-méthoxy-3-céphèaie-4-carboxylique et d'acide 7 fi-(D^5-amino-5-carboxyvaléramido)- 3-(oC-méthoxy-p.hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème- 4-carboxyIique. Le concentrât de 1'Exemple 1, Stade B, contenant l'acide 7 0 -(L-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( oC-méthoxy-p. sulfoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique " et l'acide 7 £-(L-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(°(-méthoxy-p.hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique est adsorbé sur 1500 g de résine échangeuse d'anions DEAE Sephadex.A-25, par agitation discontinue pendant 16 heures, entre 0 et 5°C. On recueille la résine par filtration, on la lave avec trois portions de 20 litres d'eau froide et on la transfère ensuite dans la colonne. Le mélange d'antibiotiques est récupéré par élution avec du chlorure d'ammonium à 3 fi dans le méthanol aqueux à 70 fi, et on recueille des fractions de 3,8 litres. On réunit les fractions actives 3 à 7 et on les concentre dans le vide de façon à obtenir une portion de 3,8 litres contenant 625 g de solides* On charge cette portion (3,8 litres) 7î 23968 25 2104768 dans une colonne de résine Dowex 50 x 2 de 20 litres au stade hydrogène, On élue la colonne avec de l'eau au débit de 50 ce'/ mn, on recueille des fractions de 2 litres et on -les essaye. On réunit les fractions actives 6 à 33» on les concentre à 4 litres par évaporation sous vide et on les sèche par lyophilisation, ce qui donne 41 g d'un mélange purifié d'acide 7 &-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(© On effectue des essais sur plaques-disques vis-à-vis du Proteus vulgaris (MB-838) sur le concentrât de départ et sur le mélange purifié. Avec le concentrât de départ, une zone de 25 ma est obtenue pour 0,30 mcg/cm3. le mélange purifié donne une zone de 25 mm pour 0,033 mcg/cm . Les composés (l) conformes à la présente invention sont décrits ici comme ayant la partie 5-amino-5-carboxyvaléra-mido en position bêta par rapport au noyau céphème. Cette désignation est basée sur les informations dont on dispose couramment, mais la Demanderesse n'entend pas être liée par cette désignation de configuration spatiale au cas où des informations ultérieures prouveraient qu'elle est incorrecte. 71 23968 26 2104768 lETCfflDIOAHOSrS 1. Procédé d'obtention et de purification d'an mélange d'antibiotiques comprenant d© l'aeide 7 ^-(D-5™E.siino-5-carboxy-valéramiâa)-3"( 5 méthoxy-3-céphème-4-carboxylique et de l'acide 7 Ç>-(D-5- atnîno~5-carbosyvaléraaiid.o)-3-(c ques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions dérive-du dextrane, et est sous sa forme chlorure, ou dériva d'un copolymère acrylique. 20 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions dérive d'un copolymère acrylique rétifié contenant une aminé tertiaire faiblement basique. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 25 le polymère non-ionique est un adsorbant à base de polymère polystyrénique rétifié. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse de cations se compose de groupes acide sulfonique nucléaires attachés à un squelette styrène divi-30 nylbenzène. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant d'élution est l'eau, une solution alcoolique aqueuse, une solution alcoolique" aqueuse de un ou plusieurs sels, ou une solution aqueuse d'un acide minéral. 23968 27 2104768 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le solvant d*élution est une solution de nitrate de sodium 1 H et d'acétate de sodium 0,1 M. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution impure d'antibiotiques est un bouillon de fermentation ayant un pH d'environ 2 à 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange purifié ainsi obtenu est séparé en ses constituants, l'acide 7 £-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oi -méthoxy-p.suifoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphèr me-4-earboxylique et l'açiâe 7 ft-(D-5-amino-5-carboxyvalé-ramido)-3-(®( -méthoxy-p.hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy -3-céph.èae-4—carboxylique, par mise en contact du mélange avec une résine échangeuse d'anions, ou avec une résine échangeuse d'anions faiblement basique dans des conditions acides, ou mise en contact avec un adsorbant à base de polymère styrénique rétifié, non ionique suivie de 1'élution de l'adsorbant résultant et de la collecte de deux fractions d'éluat contenant les deux plus fortes concentrations en antibiotique. Procédé selon la revendication 9» caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions est fortement hydrophile ou est une résine échangeuse -d-'anions faiblement basique employée dans des -conditions acides. Procédé selon la revendication 9» caractérisé en ce que la première fraction d'éluat, contenant la première concentration en antibiotique, est mise en contact avec un adsorbant à base de polymère styrénique rétifié non ionique et est éluée avec une solution alcoolique aqueuse pour donner l'acide 7$ -(D-5-amino-5-carboxyvaléraaido)-3-0?(-méthoxy-p; hydroxyeinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-car-boxylique. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la seconde fraction d'éluat, contenant la seconde concentration en antibiotique, est mise en contact avec un adsorbant à base de polymère styrénique rétifié non ionique et est éluée avec une solution alcoolique aqueuse pour donner 71 23968 28 2104768 lracide f P -(D-5-âmino-5-carboxyvaléramido)-3-( "^-méthoxy- p.sulfoxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carbo- xylique. 13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que 5 le mélange est mis en contact avec une résine échangeuse d'anions dérivée du dextrane, sous sa forme chlorure. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la première fraction d'éluat est mise en contact avec un adsorbant à base de polymère styrénique rétifié non ioni- 1O que. . 15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la seconde fraction d'éluat est mise en contact avec un polymère styrénique rétifié non ionique. 16. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que 15 l'éluant est une solution de méthanol et d'eau. 17. Procédé selon la revendication 1, pour la séparation et la purification de l'acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvalé-ramido)-3-(o 20 d'antibiotiques, caractérisé en ce qu'il comporte la mise en contact d'un mélange comprenant de l'acide 7 @-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( o(-méthoxy-p.suifoxycinnamoyloxyméthyl) -7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique et de l'acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(c 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions est un copolymère acrylique rétifié contenant une. aminé tertiaire faiblement basique. 35 19. Procédé pour l'obtention et la'purification d'un mélange d'antibiotiques comprenant de l'acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(P( -méthoxy-p.suifoxycinnamoyloxy- 71 23968 29 2104768 échangeuse d'anions ou avec un polymère non ionique, 1'élution de l'adsorbat avec un solvant, le recueillement des éluats et la réunion des fractions actives. 20. Procédé de séparation de l'acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxy-10 valéramido)-3-(c méthoxy-3-céphème-carboxylique et de l'acide 7f)-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oC-méthoxy-p.hydroxycinna-moyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphème-4-carboxylique d'un mélange en contenant, caractérisé en ce qu'il comporte la 15 mise en contact du mélange avec une résine échangeuse d'anions ou avec un adsorbant à base de polymère styrénique rétifié non ionique, 1'élution de l'adsorbat avec un solvant, le recueillement des fractions contenant les deux plus fortes concentrations en antibiotique, la mise 20 en contact avec un adsorbant à base de polymère styrénique rétifié non ionique et 1'élution des adsorbats avec un solvant pour donner les produits désirés. COPY