Brevet FR2088229A1 — publié le 19720107

L'invention concerne un nouveau produit inducteur d'in terféron, d'origine naturelle, ainsi que son obtention. Elle a essentiellement pour objet l'application dudit produit à titre de médicament. Un bref rappel de la technique antérieure montrera le grand intérêt de la présente invention. En 1957, Isaacs et Lindenmann mettaient en évidence une substance produite dans des cellules infectées par un virus, et capable de conférer à autres cellules une défense contre l'invasion virale. Ils nommèrent cette substance INTERPERON (Proc. Royal Soc. B. 147 : 258, 1957). On sait, actuellement, que l'interféron est une protéine de faible poids moléculaire (environ 30.000), spécifique de l'espèce, et qu'il induit dans des cellules encore saines, la formation d'une seconde protéine, dite T.I.P. (protéine inhibant la traduction, en anglais : Translation Inhibitory Protein); c'est la T.I.P. qui, en modifiant probablement les ribosomes, les rend inaptes à la réplication virale. La découverte de l'interféron a soulevé de.grands- espoirs en thérapeutique des maladies virales, et ceci pour deux raisons principales : d'une part, l'interféron est actif contre tous les virus; d'autre part, il agit préventivement dans la cellule. encore indemne, et par la chaîne de modifications qu'il entraine, permet à cette cellule d'inhiber les stades précoses de la réplication virale. Dans un organisme, l'interféron représente la première ligne de défense contre 1 invasion virale. Les anticorps n'apparaissent que plus tardivement, et leur rôle semble être de limiter la. libération extra-cellulaire du virus et d'empêcher la réinfection. Toutefois, les espoirs d'utilisation d'interféron exogène, en thérapeutique, ne sont pas encore réalisables. On se heurte à de nombreuses difficultés, notamment à des problèmes de purification de sources d'interféron humain et de faible rendement. Vu les faibles possibilités d'emploi prophylactique ou thérapeutique de l'interféron exogène, on a recherché des produits inducteurs d'interféron qui stimuleraient les cellules à produire leur propre interféron. Durant ces dernières années, on a mis en évidence des substances d'une grande diversité chimique et biologique capables de provoquer la production d'interféron.Parmi ces substances, on trouve, outre les virus, des bactéries, des endotoxines bactériennes, divers polyaniôns synthétiques et des acides ribonucléi ques à double chaîne, parmi lesquels il faut citer les polynucléo- tides synthétiques, tels que l'acide polyinosinique-polycytidylique (en abréviation poly I:C) dont l'action inductrice d'interféron a étè rapportée par Hilleman et coll. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 58: 1004, 1967). Le poly I:C a déjà fait l'objet d'expérimentation clinique aux Etats Unis, chez des volontaires à qui l'on a inoculé, notamment, des rhinovirus et du virus de la grippe; les premiers résultats sont encourageants. L'action du poly I:C est également étudiée dans certains cas de tumeurs et de leucémies.Cependant l'utilisation de ce polynucléotide synthétique se heurte à de graves problèmes de toxicité t d'antigénicité. On constate aussi des effets secondaires indésirables. I1 était donc très intéressant de trouver d'autres produits inducteurs d'interféron exempts des inconvénients qui affectent les produits dont on dispose jusqu'à présent. Une publication récente ontagnier, OR. Acad. Sc. Paris t. 267 p. 1417-1420 (21 Octobre 1968)0 a décrit la présence d'un acide ribonucléique en double chaîne dans des cellules animales. Dans cette publication, certaines hypothèses sont avancées sur la nature exacte de cet acide ribonucléique (ARN) et sur son origine cellulaire, mais on ne trouve aucune mention de la possibilité d'utiliser cet ARN comme inducteur d'interféron ou de toute autre manière à titre de médicament. La présente invention a essentiellement pour objet le médicament inducteur d'interféron comprenant, à titre d'agent actif, 1'ARN d'origine cellulaire isole et caractérise après l'étude antérieure qui vient d'entre décrite. Il Ktait imprévisible de trouver que, dans une telle application, 1'ARN selon l'invention procurerait des résultats de loin supérieurs aux ARN d'origine virale ayant une structure hélicale bicaténaire. L'application thérapeutique de ces derniers produits est en effet limitée du fait de leur toxicité aux doses actives. En revanche, l'invention a pour objet un agent qui, extrait de cellules non infectées par un virus, est inducteur d'interféron à des concentrations 10 à 100 fois plus faibles que les autres agents connus et ne présente aucun effet toxique décelable dans l'état actuel des recherches. L'agent actif du nouveau médicament proposé par l'invention est un ARN d'origine cellulaire qui ara défini dans la des cription ci-après d'une part à l'aida de son mode d'obtention et d'autre part à l'aide de ses caractéristiques de structure et de ses propriétés biologiques. Les matériels de départ pour l'obtention du nouvel ARN peuvent être variés et provenir de diverses sources animales et hu- maines. On peut utiliser ds systèmes cellulaires in vitro et in vivo. Certaine matériels animaux sont dcrits dans la publication citée supra. L'obtention de 1'ARN sera illustrée plus loin de fagon détaillée à partir de foie de rat. I1 est r important de noter que des matériels cellulaires d'origine humaine peuvent être également utilisés.Ainsi, par un procédé analogue à celui utilisé pour les cellules de foie de rat, on e obtenu l'ARN cellulaire selon l'invention en traitant des lignées établies de lymphocytes humains, telles que celles disponibles sous la dénomination de souche "MICH" et fournies par les Laboratoires Searle. A titre illustratif, on donnera maintenant en détails le procédé d'extraction de l'ARN bicaténaire à partir de foie de rat. Extraction d'ARN bicaténaire du foie de rat. Les animaux donneurs sont mis à jeun 48 heures avant le prélèvement. Après anesthésie de l'animal à l'éther, le foie est prélevé, rapidement lavé dans un tampon phosphate salin (PBS), préa- lablement refroidi à OOC, et congelé à -70 C jusqu'au moment de l'extraction. Les volumes indiqués ci-après sont valables pour deux foies de rat, soit en moyenne 8 à 10 g de tissu frais. Solutions mères - Dodécylsulfate de sodium (en abréviation SDS) à 20 % poids/volume dans l'eau. - Desoxycholate de sodium à 10 i poids/volume dans l'eau --Chlorure de magnésium 1 M. - Acide éthylène diamine-tétraacétique (EnT;), sel disodique, neutralisé avec NaOH pH 7,0 0,1 M. - Tris-HCl (tampon) pH 7,8 0,1 M. - Tampon TV : Tris-HCl pH 7,8 0,G05 M. EDTA pH 7,0 0,02 M. -Bentonite en suspension à 1 % en tampon acétate 0,01 M pH 6,0. - Phénol fraîchement distillé et saturé avec une solution aqueuse d'EDTA 0,05 i. - Pronase 10 mg/cc en TV. Extraction : Le mélange suivant est préparé -EDTA 0,05 M 42cc. - Dodécylsulfate de sodium en solution à 20 : 2,5 cc (soit un concentration finale de 1 %). - Desoxycholate de sodium, solution à 10 O/c : 0,5 cc. - Bentonite à 1 Y : 5 cc. - Phénol : 50 ce. Ce mélange est placé dans le bol d'un capacité de 500 cc d'un homogénéiseur de type Virtis. Les foies sont rapidement décongelés en surface par immersion du bécher qui les contient, dans de l'eau à 370Ç, puis versés, alors que leur centre n'est pas encore décongelé, dans le mélange d'extraction. On effectue une pré-homogénéisation d'un minute à basse vitesse de rotation, puis l'homo généisation proprement dite par rotation à grande vitesse aux environs de 20.000 t/mn pendant 5 à 8 mn jusqu'à ce qu aucun fragment apparent du tissu ne subsiste dans le bol.La suspension ainsi homogénéisée est ensuite egil-ée pendant 10 mn à la température du la- boratoire dans un agitateur à mouvement alternatif, puis centrifugée à 3500 g pendant 15 mn, à + 10 C. La phase aqueuse est prélevée et réagitée avec un gal volume de phénol pendant 15 mn à la tempé- rature du laboratoire, centrifugée à nouveau et la phase aqueuse résultante réextreite une nouvelle fois par le phénol. On ajoute à la phase aqueuse résultant de cette 3ème extraction du NaCl jusqu'à une concentration finale de 0,1 M, puis on précipite par deux volt- mes d'éthanol.On centrifuge à 3500 g pendant 15 mn à 40C, le surnageant est enlevé et le culot redlssous dans 40 cc de tampon Tris HCl pH 7,8 10-2 M. La solution est à nouveau précipiée par deux volumes d'éthanol, centrifugée et le culot à nouveau redissous dans 20 cc de Tris-HCl. Traitement par la désoxyribonucléase On ajoute à la solution du chlorure de magnésium jusqu'à une concentration finale de 10-3 3 M, puis 10 Y/cc de désoxyribonu- cléase (Worthington, purifiée électrophorétiquement, sans ribonucléase). La digestion DNAsique est effectuée à 37 C pendant 18 h, la solution étant agitée par un barreau magnétique. Elle est erre- tés par addition de 2cc de solution d'EDTA 0,1 t et 20cc de phénol. On agite 15 mn à la température du laboratoire, ct on centrifuge à 3500 g pendant 15 mn à la température de 100C; 1 phase aqueuse est prélevée, précipitée par deux volumes d'éthanol, le précipité est centrifugé et le culot redissous dans 10 cc de Tris 10-2 M tl pH 7,8 et reprécipité à nouveau par deux volumes d'éthanol, centrifugé et redissous alors dans 5 cc de tampon TV. La solution est conservée à ce stade à 4 C jusqu'à son mélange avec la phase résultant de l'extraction par la pronase. Extraction de l'interface par la pronase L'interface blanchâtre résultent de la centrifugation consécutive à la première extraction par le phénol, est débarrassée de la plus grande partie de la phase phénolique sous-jacente par aspiration de cette dernière à la pipette, puis est reprise dans 10 cc de TV et précipité par deux volumes d'éthanol.On centrifuge 15 mn à 3500 g à 4 , le surnageant est éliminé et on lave le culot avec 20 cc d'un mélange de EDTA 0,05 M 1 volume, et d'éthanol, 2 volumes, refroidi à 40; on centrifuge la- suspension-5 mn à 3500 g et le culot est finalement remis en suspension dans 45 cc de solution d'EDTA 0,05 Mauxquele on ajoute 5 cc de pronase à 10 mg/cc en TV, 2,5 cc de SDS 20 S et 0,05 cc de désoxycholate de sodium à 10 ,c. L'incubation est effectuée à 370 pendant 48 h avec agitation magnétique. Elle est arrêtée par addition d'un égal volume de phénol et agitation du mélange pendant 15 mn à la température du laboratoire.On centrifuge, et la phase aqueuse est prélevée et précipitée par deux volumes d'éthanol. Après centrifugation, le culot est redissous dans 10 cc de Tris 10-2M k! pH 7,8. Après un nouveau cycle de précipitations par 2 volumes d'éthanol, et centrifugation le culot final est redissous dans 10 cc de Tris 10-2 2 M et traité par la DNAse comme la première phase d'extraction. Les deux solutions finales résultantes sont mélangées, soit en tout 10 cc en TV; elles reçoivent 5 #/cc d'&alpha;-amylase (Worthington).L'incubation par l'amylase (destinée à hydrolyser le glycogène, qui rend 1 solution opalescente) est effectuée à 37 pendant 45 mn puis on effectue l'hydrolyse ménagée par la ribonucléase pancréatique Wor- thington) 10 Y/cc )0 mn à la température du laboratoire.La digestion par la ribonucléase est arrentée par addition d'un égal volume de phénol; on agite 15 mn, on centrifuge, la phase gueuse est pre- levée, précipitée par deux volumes d'éthanol et redissoute dans 1 cc de TV; la solution, qui doit être claire est placée sur une colonne de 50 cm x 2 cm de résine "Séphadex G-200", préalablement équilibrée avec 1 tampon TV. Si la solution reste op -ls-scente on recommence la digestion par l'&alpha;-amylase jusqu'à ce que 1 solution finale soit claire. L'élution est effectuée également par le même tampon, des fractions de 3 à 3,5 cc sont collectées, leur densité optique, éventuellement leur radioactivité s'il y avait eu utilisation de précurseurs radioactifs, mesurée. Les fractions du pic exclus sont mélangées, concentrées par pervaporation à la température du laboratoire, dialysées 24 h contre 500 cc de solution de chlorure de sodium 10-2 M. Le spectre d'absorption entre 230 et 300 nm est mesuré; le spuct--e d'ebsorption du RNA bicaténaire est modifié à ce stade ppr une majorité d'une impureté absorbant fortement entre 230 et 280 nanom tres, non identifiée. Les principales valeurs de ce spectre peuvent servir à caractériser dc façon utile 1'ARN extrait et à déterminer sa concentration. Les chiffres de concentration obtenus représentent alors plutôt des limites supérieures que des valeurs exactes, en raison de la présence d'impuretés non identifiées. L'ARN est susceptible d'entre identifié plus convenablement par ses-propriétés biochimiques et biologiques. ise en évidence de l'origine cellulaire de l'ARN double chaîne de foie de rat. L'expérience qui suit a pour but de démontrer que 1'ARN double chaîne possède, en grand nombre, des séquences complémentaires de l'ADN cellulaire. Mis en présence de l'AN de foie de rat dénaturé il s'hybride c'est-à-dire qu'il se lie spécifiquement par des ponts hydrogènes aux séquences d'ADN cellulaire complémentares. Dans les mêmes conditions expérimentales il ne s'hybride pas avec un ADN de bactérie. L'ADN du foie de rat est préparé selon 1 méthode de ARMUR J., J. Mol. Biol., 3, 208 (1961). I1 est trait par la ribonucléase et pronase selon GILLEPSIE, D., and SPIEGELMAN, S.A. J. Kol. Biol., 12, 829 (1965) et réextrait par le phénol. L'ADN purifié est dissous à 0,2 mg/ml dans 0,1 SSC (1 SSC = 0,15 M NaCl; 0,015 X citrate d sodium) et denturé par l'hydroxyde de sodium à pH 12,8. l'ARN double chaîne est fondu par chauffage pendant 1C mn à 9500 dans 0,1 SSC, puis la solution d'ARN est plonge dans la glace. nans un tube, on incube pendant 1 heure à 660C, dans un volume de 0,5 ml de tampon 2xSSC 50 g d'ADN dénaturé et de l'ARN double chaîne marqué par 3H et fondu comme indiqué précédemment. près l'incubation, les tubes sont refroidis et le contenu est filtré sous vide sur membrane de nitrocellulose (Sichleicher et Schull), préalablement gonflée dans une solution de 2xSSC. L'ADN reste fixé sur 1 membrane et avec lui 1'ARN qui est hybridé ainsi qu'une fraction d'ARN non spécifiquement lié. On se débarrasse de cette dernière en lavant le filtre avec du tampon 2xSSC puis en le plongeant à 370 pendant 30 mn dans une solution de ribonucléase (20 g/ml) dans 2xSSC. Les filtres sont ensuite lavés à nouveau avec 2xSSC et comptés au spectromètre à scintillation liquide (coups/minute). Les résultats sont consignés dans la tableau I ci-dessous. Dans certaines expériences, 1'ADU de foie de rat a été remplacé par de 1'ADN d'Escherichia Coli pour vérifier la spécificité de l'hybridation. Cette spécificité est également montrée par le fait que dans le cas o l'ARN an double chaîne n'est pas fondu par chauffage, l'hybridation n'est plus possible (Tableau I). Les pourcentages d'hybridation (en moyenne 25 ) indiquent clairement que I'ARN double chaîne de l'invention est d'origine cellulaire.Un ARN d'origine virale hybriderait avec des taux beaucoup moindres ou pas du tout, comme l'ont montré en particulier les travaux de HAREL, L., HAREL, J., et HUPPERT, J., B.B.R.C., 28 n0 1, 44 (1967). TABLEAU I. Radioactivité : Hybridation : ARN hybridé cmp cmp en pourcent (coups/minute) :ADN rat :ADN E. coli: ADN rat :ADN E. coli I ARN chauffé : 1020: 250 : 30 : 25 : 3 ARN non chauffé : : 1020: 30 : --- 33 : - II ARN chauffé : 1358: 420 : -- : 30 : ARN non chauffé : : 1358: 26 : -- . 2 : - III ARN chauffé : 1400: 175 : 10 : 12,5 : 0,7 IV ARN chauffé : 2580: 384 : 22 : 15 : 0,8 V ARN chauffé : 1420: 280 : 16 : 19,5: 1,1 VI ARN chauffé : 1400: 290 : -- : 20,7 : - ARN non chauffé : 1400: 40 : -- : 3 : Activité de l'ARN double chalne de foie de rat comme inducteur d'interféron. 10 - Induction d'interféron en culture de tissu. L'induction d'interféron par l'ARN bicaténairo de foie de rat a été testée dans des fibroblastes embryonnaires primaires et secondaires de souris, d rat et de poulet, ainsi que dans diverses lignées continues, soit a) une lignées de cellules de rat : cellules WIRA b) un, lignée de cellules Ce souris : c c--lrjles L c) une lignée de cellules de primates : cellules MA 104. Dans toutes ces conditions, l'ARN a induit e l'interféron. La méthode utilisée était la suivante : les cellules sont ensemencées dans des boîtes de Pétri en plastique. quand les cellules sont confluantes, on enlève le milieu Ce culture (Eagle et Berle MEM, Gibco, Long Island, New York, enrichi de 8 % de sérum de veau) et on incube les cellules dans du milieu sans sérum contenant diverses dilutions de la préparation d'ARN bicaténaire et 10 g par ml de DEAE dextran (Pharmacia, Uppsals, Suède). Deux temps d'incubation de l'ARN ont été étudiés a) une période d'incubation de 24 h b) une période d'incubation de 4 h, au bout de laquelle on aspire le milieu contenant l'ARN pour le remplacer par le milieu de culture ordinaire que l'on laisse encore 18 h en contact avec les cellules. A la fin de la priode d'incubation (milieu contenant l'ARN dans le cas a), milieu sans ARN dans le cas b , les surnageants sont récoltés pour dosage d'interféron et conserv-s à -200C. On procède ensuite à l'évaluation de l'état antiviral dans les cellules qui viennent d'être incubées avec 1'ARN. Les cultures sont lavé os puis inoculées avec une dilution appropriée de virus révélateur, calculée pour donner, chez les témoins, une moyenne de cnt plages de lésions virales. Le virus est aspiré après une heur d'incubation à 37C t 1:-s cultures sont recouvertes d'un milieu nutritif solidifié avec de l'amidon. Quarente-huit heures plus tard, l s cultures sont colorées en rouge neutre pour Qnuméra- tion des plages. Dans les cultures où l'ARN bicaténaire a conféré un tat anti-viral eux cellules, le nombre de plages dues eu virus indicateur est diminué. On détermine le degré d'inhibition des pis- ges selon la dilution d'ARN utilisée. TABLEAU II. Nombra de plages VSV* dans les cultures témoins et les cultures traitées pendant 24 heures avec 1 préparation NA 86. Témoins NA 86 1/15 NA 86 1/15 Moyenne des plages 43 o 0 (moyenne de (moyenne de (moyenne de 8 cultures) 5 cultures) 5 cultures) Unités d'interferon induit 0 90 35 VSV* : lésions virales causées par le virus d 1- stomatite vési- culaire. Pour proceder eux titrages d'interféron dns les surne- geants de cultures incubées avec l'ARN bicanténaire, on utilise des cultures confluantes de cellules, en botes de Pétri, que l'on met en présence, pendant 18 h, avec des dilutions appropriées de surngeant, dans du milieu de culture enrichi de 3 % de sérum de veau. A le fin de l'incubation, on aspire le milieu, et on joute du virus révélateur puis de l'amidon selon 1 méthode décrite ci-dessus. On détermine les taux d'interféron selon le degré d'inhibition des plages du virus révélateur. Une unité d'interféron correspond à une inhibition de 50 % des plages; ainsi, par exemple, si dans les con trôles, on a 100 plages de virus, et, à la dilution 1/30 du milieu dosé, on a 5C plages de virus, le titre d'interféron est de 30 unités. La substance mesurée après incubation des cellules avec l'ARN bicaténaire de foie de rat n été considérée comme interféron pour les raisons suivantes : elle est résistante à pH 2, elle est détruite par le trypsine, elle manifeste une action anti-virale contre plusieurs catégories de virus (virus de le stomatite vésicu laire, arbovirus; virus de la vaccine), mis n'est active que dans les cellules de l'espèce qui l'ont produite (spécificit d'espèce), elle e un poids moléculaire de 18.000, 36.000 et 72.000, chiffres comparables è ceux décrits dans la littérature pour l'interféron de rt. II - Induction d'interféren circulant chez la souris. Des souris de la lignée C57PL reçoivent, par voie intrapéritonéale, 0,3 ml d'une préparation d'ARN bicaténaire de foie de rat normal. Deux heures t six heures plus tard, on fait un prélèvement de sang au niveau du sinus péri-orbityire. Le sang est gardé quelques heures eu réfrigérateur pour formation du caillot et après centrifugation, on prélève les sérums qui sont gardés à -20 C pour titrages d'interféron. Cs derniers ont été effectués de la manière décrits pour les titrPges d'interféron obtenus in vitro. Les résultets sont consignés dans le tableau III. TABLEAU III. Temps après inoculation de l'ARN à double chaîne. 2 heures 6 heures Unités d'interféron par 2,5 ml 13 4 Les résultats qui précèdent montrent l'activité élevée de 1'ARN cellulaire selon l'invention comme inducteur d'interféron. L'ART possède une structure en doubla chaîne qui est responseble de cette activité, comme l'indiquent les expériences faites sur la courbe de fusion, entre autres. Caractérisation du nouveau produit. Le produit est caractérisé par son activité biologique inductrice d'interféron, et les variations de celle-ci selon les conditions définis ci-dessous. La capacité inductrice d'interféron (a) est rêsistente à une incubation d'une durée de 30 minutes à 200C avec 5 g/cc de ribonucléase pancréatique dans une solution aqueuse de 0,15 M NaCl et 0,015 M Na citrate (b) est sensible à la même concentration de ribonucléase 7 sous les mêmes conditions de temps et de durée, mais dans une so- lution de faiblc force ionique (0,015 M NaCl + 0,0015 X Na citrate). (c) disparait après un chauffage de la préparation à 1000C pendant 10 minutes, suivi d'un refroidissement rapide à 0 C. La perte de l'activité inductrice en fonction de le tem pérature de chauffage entre 20 et 1000C, suit une courbe sigmoïde. La température à laquelle on doit chauffer la préparation (dans ;i.a solution définie au paragraphe b), pour qu'elle perde 50 jo de son inactivité, initiale est d'environ 750C. L'ensemble de ces caractéristiques montre que le produit actif est un acid ribonucléique bicaténaire. Le produit de l'in vention est donc ainsi défini à l'aide de ses propriétés biologiques. En résumé, la présente invention montre que l'acide ribonucléique à double chaîne présent dans la cellule normale, est également capable d'induire la production d'interféron en culture tis- sulaire et chez l'animal. In vitro, l'ARN à double chaîne de la cellule normale de foie de rat, est capable de stimuler la production d'interféron dans des cellulars de rat, de souris, de poulet et de primates.In vivo, injecté pr voie intra-péritonéale à des souris, cet ARN induit également l'apparition d'interféron, dont on trouve la présence, au niveau du sérum, deux à quatre heures après le traitement. I1 est important de noter que 1'ARN à double chan de la cellule de foie. de rat est actif à doses bicn plus faibles que le poly I:C. En outre on obtien des résultats équiva- lents en partant de lymphocytes humains, qui peuvent ainsi constituer une source homogène t abondante de ce composé. L'action élevée du nouveau médicament semble donc beaucoup plus physiologique et spécifique que les inducteurs d'interféren précédemment connus Le nouveau médicament inducteur d'interféron peut trouver des applications importantes et immédiates, dans la lutte contre les maladies virales bénignes, mais coûteuses pour la Société, telles que les rhumes de cerveau, les rhino-pharyngites et la grippe. Enfin, il est permis de penser qu'un tel inducteur d'interfé ren puisse Ctre utilisé d-ns le traitement des tumeurs et des leucémies d'origine virale Dans toutes les application en cause, le nouveau médicament peut être utilisé d'une façon conventionnelle par voie intraveineuse ou pr voie locale. REVENDICATIONS. 1. A titre dé médicament contre les affections virales, un acide ribonucléique (ARN) bicaténaire d'origine cellulaire caractérisé par sa capacité inductrice d'interféron qui: (a) est résistante à une incubation d'une durée de 30 minutes à 20 C avec 5 g/cc de ribonucléase pancréatique dans une solution aqueuse de 0,15 M NaCL et 0,015 M Na citrate. (b) est sensible à la même concentration de ribonucléase, sous les memos conditions de temps t d: durée, mai dans une solution de faible force ionique (0,015 M NaCl + 0,0015 M Na citratre). (c) disparît après un chauffage de la préparation à 100 C pendant 10 minutes, suivi d'un refroidissement rapide à C C, et en ce que perte de l'activité inductrice en fonction de la température de chauffage, entre 20 et 100 C, suit une courbe sigmoïde et que la température à laquelle on doit chauffer la préparation (dans 1 solution à 20 C) pour qu'elle perde 50 ? do son inactivité initiale, est d'environ 75 C. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ARN est extrait de systèmes cellulaires animaux ou humains, in vive et in vitre. 3. Médicament selon l'un des revendications 1 ou 2, ca- ractérisé en c qu l'ARN est extrait du foie de rat, de fibroplastes d'embryon de poulet ou autres sources cellulaires animales. 4. Médicament selon l'une des revendications 1 ou 2, ca- ractérisé en ce que l'ARN est extrait de lymphocytes ou autres sources cellulaires humaines. 5. Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, adminstrable par voie intraveineuse ou par voie locale.