Brevet FR2068504A1 — publié le 19710827

On sait qu'on peut synthétiser de l'acide ribonucléique à activité informatrice (AEN-messager) par stimulation de cellules immunologiquement compétentes avec un antigène. L'AEN peut être transféré sur d'autres cellules immuriologiquement com-5 pêtentes et y déclencher-la-synthèse d'anticorps contre l'antigène qui a provoqué la synthèse de l'AEN-messager dans les cellules immunologiquement compétentes citées en premier lieu. On peut ainsi préparer des vaccins qui, bien qu'étant libres d'antigènes, développent quand même une immunité dans l'organisme. 10 Les avantages de ces vaccins vis-à-vis des vaccins habituels sont évidents (cf. brevet belge 7^6 806). L'inconvénient jusqu'à présent résidait dans le fait qu'il fallait toujours former de nouveau in vitro l'AEN-messager requis pour la préparation des vaccins par une stimulation renouvelée de 15 cellules immunologiquement compétentes avec l'antigène correspondant. Or, le Demandeur a trouvé une enzyme, ci-après appelée "réplicase", qui est capable de reproduire l'AEN-messager. L'objet de la présente invention est donc l'obtention de 20 réplicase ainsi que la reproduction d'AEN-messager à l'aide de réplicase. Le procédé est caractérisé en ce qu'on fractionne un système acellulaire obtenu à partir de cellules immunologiquement compétentes, porté à pH 5» on isole la fraction contenant de la réplicase, on fait incuber cette fraction avec 25 l'AEN-messager qui doit être reproduit et avec un système acellulaire obtenu à partir de cellules immunologiquement compétentes, exempt de réplicase et porté à pH 5» et on isole, de manière connue, l'AEN-messager nouvellement formé. Le procédé de l'invention permet la reproduction 30 d'AEN-messager sans qu'il faille constamment introduire de l'antigène. Pour la duplication de l'AEN-messager formatrice, la réplicase a besoin d'une matrice correspondante de l'AEN. Cette matrice est également un AEN-messager qui, à l'origine, a été obtenu à partir de cellules immunologiquement compé-35 tentes ou à partir de systèmes acellulaires obtenus à partir de telles cellules par stimulation avec un antigène (brevet belge 716 806). Pour la stimulation de la matière cellulaire immunologiquement compétente, on utilise des antigènes et des toxines provenant de bactéries, de virus, 40 de leurs sous-unités, de venins de serpents etc... 70 30142 2 2068504 ' Des cellules immunologiquemeirâ compétentes servant de matière de départ, d'où l'on isole la réplicase? se trouvent surtout dans les leucocytes périphériques. dans la rate» dans les ganglions lymphatiques, dans le ductus 5 t'ioracicus et parmi les macrophages péritonéales. Par "cellules immunologiquement compétentes" on entend, selon le brevet belge cité, des cellules qui sont aptes à réagir, sur un stimulus primaire par un antigène, avec formation d'ABN-messager. 10 Pour isoler la réplicase, on peut utiliser des procédés de séparation connus, tels que 11électrophorèse, la filtration sur gel, la centrifugation, etc... Avantageu-Tement, on procède comme suit : On met en suspension les cellules immunologiquement 15 compétentes, desquelles la réplicase doit être isolée, dans 5 fois le volume d'un taiçon faiblement alcalin, par exemple d'un tampon Tris/acide chlorhydrique ayant une molarité de 0,1 et un pH de 8,0, on les refroidit à 0°C et les congèle rapidement par immersion dans un mélange réfrigérant d'acide 20 carbonique et d'acétone. On concasse finement la glace contenant les cellules par voie mécanique jusqu'au dégel, et ensuite on la congèle de nouveau. On répète cette opération au moins dix fois. Cependant on ne doit pas dépasser une température de 2°C. On centrifuge les cellules homogé-25 néisées ainsi obtenues pendant 30 à 60 minutes, de préférence pendant 45 minutes, à 30000 g environ et une température de 0°C. Après cette centrifugation à 30000 g, on centrifuge le surnageant pendant plusieurs heures à 100000 g. Après cette centrifu-gation à 100000 g, on porte le pH du surnageant à un pE compris 30 entre 5,0 et 4,5, en ajoutant de l'acide, de préférence de l'acide chlorhydrique 0,2 N. Un précipité se forme qu'on sépare par centrif ugation à 2000 g environ (ci-après appelé "fraction à pH 5")» On lave le sédiment, par exemple avec un iampon au Tris ayant une molarité de 0,1 et un pH de 5*0, et on le dissout, par exemple 35 dans un tampon au Tris/acide chlorhydrique ayant une molarité de 0,1 et un pH de 8,0. On sépare de petites quantités restées insolubles par centrif ugation. On fractionne alors le surnageant clair- par f iltration sur gel, de préférence en utilisant une colonne de Sephadex-G-200. La fraction ayant le 40 coefficient de distribution Kd = 0,38 à 0,40 est la fraction BAD ORIGINAL 70 30142 3 2068504 active en réplicase. le coefficient de distribution est une constante de la matière et indique la distribution des molécules à fractionner dans la colonne. La reproduction de l'AEN-messager est effectuée 5 comme suit ï On réunit dans une masse réactionnelle les composantes réactives suivantes : 1)1 partie environ de la fraction contenant de la réplicase, 2) 2 parties environ d'une solution d'AEN-messager contenant 10 0,1 /ag/ml d'AEN, qui sert de matrice pour la synthèse de nouvel AEN-messager à l'aide de réplicase, 3) 2 parties environ d'une fraction à pH 5 qu'on a fait bouillir pendant 10 minutes (ce qui est nécessaire pour dénaturer la réplicase présente) qui sert, de la manière 15 la plus simple, de fournisseur d'éléments pour la synthèse de nouvel AEN-messager. On fait incuber cette masse à 3?°C environ, et on isole l'AEN-messager nouvellement synthétisé après un temps convenable, de préférence après 5 minutes, de manière connue, 20 par exemple en utilisant du phénol selon le procédé de Eirby. Ensuite, on peut préparer, de manière connue, avec l'AEN-messager, obtenu dans le procédé selon l'invention, un vaccin, par exemple en y ajoutant de l'hydroxyde ou du phosphate d'aluminium. 25 D'après le procédé selon l'invention, suivant l'antigène utilisé à l'origine pour la formation de l'AEN-messager, on peut préparer des vaccins pour l'immunisation contre de nombreuses maladies et toxiques, par exemple contre le tétanos, la diphtérie, la pertussis, la tuberculose, des 30 infections de Salmonellae, de Shigellae, de Brucellae et de Streptocoques, la grippe, la rougeole, la rage, la fièvre aphteuse, la variole, la peste porcine, la morve, l'Hepatitis contagiosa canis, l'encéphalite et les morsures de serpents. L'efficacité de ces vaccins est déjà grande à de très petites 35 doses ; en général, 10 /Ug de vaccin par kg de poids de corps sont suffisants. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 : ' Isolation de la réplicase. 40 On met en suspension 1 ml d'un sédiment de leucocytes 70 3014?. 4 , 206.8504 humains dans 5 ml d'un tampon au Tris/acide chlorhydrique ayant une molarité de 0,1 et un pH de 8,0, on le refroidit à 0°G et le congèle rapidement dans un mélange réfrigérant d'acide carbonique et d'acétone.. On concasse finement la 5 glace contenant les cellules par voie mécanique Jusqu'au dégel et la congèle de .nouveau. On répète cette opération dix fois sans qu'on dépasse une température de +2°C. On centrifuge les cellules homogénéisées ainsi obtenues pendant 45 minutes à 30000 g et une température de 0°C. On rejette le sédiment 10 et on centrifuge la solution surnageante pendant 4 heures à 100000 g. Après cette centrifugation à 100000 g, on porte le pH du surnageant à 5»0 (mesuré à l'aide d'une électrode en verre) en ajoutant de l'acide chlorhydrique 0,2 N. Il se forme alors un dépôt contenant la réplicase, qui est 15 séparé par centrifugation à 2000 g. On lave le sédiment ave» un tampon au Tris/acide chlorhydrique ayant une molarité de 0,1 et un pH de 5»0, et on l'ajoute à 5 ml d'un tampon Tris/acide chlorhydrique ayant une molarité de 0,1 et un pH de 8,0, ce qui provoque la dissolution de la plus grande partie 20 du sédiment. Une faible partie insoluble est séparée par centrifugation à 2000 g. On introduit le surnageant clair sur une colonne de Séphadex-G-200. On isole la fraction ayant le coefficient de distribution Kd = 0,4, au total 2 ml, et on la congèle, 25 EXEMPLE 2 Î Reproduction de l'AEN-messager à l'aide de réplicase. On dilue, dans tin rapport de 1:100, une solution d*AEN-messager, obtenue selon le procédé décrit dans le 30 brevet belge 7^6 806, et contenant 10 ^ug/ml d'AEN, avec un tampon au Tris/acide chlorhydrique ayant une molarité de 0,1 et un pH de 8. On mélange alors 0,2 ml de ce produit avec 0,2 ml d'une fraction à pH 5? qu'on a fait bouillir pendant 10 minutes, et 0,1 ml d'une fraction contenant de la 35 réplicase, on fait incuber le tout pendant 5 minutes à 37°C, et on isole l'AEN-messager nouvellement synthétisé avec du phénol selon Eirby. On détermine alors la teneur en AEN dans la solution obtenue, qui est de 45 /ig/ml d'AEN, ce qui correspond à line reproduction de 2250 fois. Cette quantité d'AEN 40 contient environ 100000 à 500000 doses de vaccination pour des cobayes ayant un poids moyen de 250 g. BAD ORIGINAL 70 3014? 5 2068504 REVENDICATIONS 1.- Procédé de reproduction d'acide rxbonucléique à activité informatrice(ABN-message$, caractérisé en ce qu'on fractionne un système acellulaire obtenu à partir de cellules 5 immunologiquement compétentes, porté à pH 5i on isole la fraction contenant de la réplicase, on fait incuber cette fraction avec l'AEN-messager qui doit être reproduit et avec un système acellulaire obtenu à partir de cellules immunologiquement compétentes, exempt de réplicase et porté à pH 5» et 10 on isole, de manière connue, l'AEN-messager nouvellement formé» 2.- Utilisation de l'AEN-messager , obtenu selon le procédé décrit à la revendication 1, pour la préparation de vaccins.