Brevet FR2081446A1 — publié le 19711203

018^1 20814^6 1 La présente invention concerne la préparation d'antisérums xénogéniques capables de reconnaître un donneur particulier. Il est connu que les anticorps, apparaissent chez des individus d'une espèce, par immunisation à l'aide de cellules pro-5 venant d'un autre individu de la même espèce, peuvent servir à reconnaître les spécificités antigéniques qui définissent le caractère unique d'un individu. De nombreux travaux ont été effectués dans ce domaine, qui sont relatifs à la préparation d'antisérums pour la détermination des groupes tissulaires chez 10 l'homme, par exemple pour la transplantation d'organes et ces antisérums sont couramment obtenus à partir de malades ayant subi des transfusions multiples, de femmes multipares et, plus récemment par immunisation délibérée de volontaires humains à 1'-aide de cellules humaines d'un type de tissu sélectionné. 15 Les sérums obtenus sont faibles et les spécificités requises sont difficiles à déceler. L'immunisatien de volontaires humains à l'aide de cellules est un procédé qui n'est pas exempt de danger. Les travaux relatifs à la préparation d'antisérums xénogé-20 niques chez différentes espèces, par exemple le sérum anti-souris du lapin et le sérum anti-humain du rat (antisérums xénogéniques) n'ont pas permis de reconnaître les individus de l'espèce donneur, les cellules servant à l'immunisation étant marquées de façon prédominante par les caractéristiques de l'espèce. 25 D'une façon résumée, la technique antérieure d'immunisation hétérologue avec des cellules entières en vue de la production des anticorps spécifiques n'a pas donné de résultats satisfaisants. En effet, les anticorps ainsi produits reconnaissent les antigènes d'espèce, mais ils ne peuvent pas reconnaître les spé-30 cificités individuelles à l'intérieur de l'espèce. Il n'a donc été possible de préparer les sérums pour le groupage tissulaire chez l'homme ou chez la souris que par isoimmunisation. Cela présente des inconvénients bien connus en ce qui concerne l'immunisation humaine : difficulté de choix des volontaires, risques 35 de l'immunisation par des leucocytes chez l'homme, résultats aléatoires etc. On a maintenant trouvé qu'il est possible, en utilisant: un produit de cellules purifié provenant d'un animal donneur, d'immuniser un animal d'une espèce différente et de susciter des antisérums capables de reconnaître le donneur par-40 ticulier. On a notamment trouvé quetL'on peut utiliser des anti- 71 01841 2081446 2 gènes de mammifère suffisamment purifiés, obtenus à partir de membranes cellulaires de différents tissus, pour immuniser d'au-très espèces en vue de la préparation d'antisérums reconnaissant le type de cellule ou l'individu utilisé comme donneur. 5 Un autre objet de l'invention est de fournir des sérums hétérospécifiques reconnaissant les spécificités individuelles humaines en utilisant des antigènes d'histocompatibilité humains purifiés et solubilisés. Un intérêt particulier de la présente invention réside dans la préparation d'antisérums produits chez 10 un mammifère non humain par immunisation de l'animal receveur à l'aide d'un antigène humain suffisamment purifié. De tels antisérums sont capables de reconnaître les cellules du donneur humain particulier. 15 paration d'antisérums qui consiste à immuniser un mammifère receveur à l'aide d'un allo-antigène de transplantation purifié provenant d'un mammifère ou d'un antigène tumoral spécifique provenant d'un donneur d'espèce mammifère différente et à recueillir à partir du receveur l'antisérum produit. 20 Les. substances antigéniques purifiée s mentionnées dans la pré sente description sont des substances qu'on a solubilisées ( en laissant un résidu insoluble avec un volume important d'impuretés) et ensuite fait passer à travers des colonnes .de filtration sur gel ("Sephadex G200") pour éliminer la fraction à poids molécu-25 laire plus élevé afin d'obtenir un.prod.uit soluble ayant un poids moléculaire situé dans la gamme de 30.000 à 70.000. Cette fraction à haut poids moléculaire est immunogène pour divers allo-antigènes qui peuvent être considérés comme des impuretés dont la présence rendrait la substance sans intérêt pour le procédé 30 de l'invention. La substance antigénique purifiée utilisée dans le procédé de la présente invention peut être préparée par une variante quelconque des procédés fondamentaux de purification connus qui prévient la préparation d'un extrait de membrane brut, la solubili-35 sation de l'extrait, la purification de l'extrait et la séparation des spécificités. Des exemples de telles techniques de préparation sont décrits dans la littérature, en particulier dans les articles suivants s La présente invention a donc pour objet un procédé de pré- 40 1. Davies, D.A.L. 1966, Immunology, 11,115 î 2» Nathanson S .G. et Davies D.A.L. 1966 71 01841 2081446 ? Proc. Nat.Acad.Sci. Washington ^6 476. 3. Davies, D.A.L. , Manstone, A.J., Viza D.C., Colombani, J., Dausset, J. 1968. Transplantation, 6, 571* 5 4. Davies, D.A.L. 1967, Transplantation, 5*31; 5. Davies, D.A.L., Colombani, J., Viza, D.C., Dausset, J. (1968), Biochem, Bicphys. Res. Commun. 22., 88, et 6. Davies, D.A.L. 1969, Transplantation, 8, 51-10 7. Colombani, J., Colombani, N., Viza, D.C., Degani-Bernard, Dausset, J., Davies D.A.L. 1970,Transplantation, 9*228. D'une façon succincte, un syztème de séparation spécifique d'HL-A, de ses homologues provenant d'autres espèces animales 15 ou d'antigènes définissant des types de cellules spéciales (y compris les cellules tumorales) peut être décrit comme suit : Des lymphocytes spléniques, des cellules leucémiques (provenant de la rate ou du sang périphérique) ou d'autres types convenables de cellules, sont élues avec du NaCl hypotonique (l) 20 et la lipoprotéine brute est centrifugée à partir de ces eaux de lavage de cellule. Ce produit est solubilisé par autolyse (avec utilisation de cathépsines lysozymatiques présentes dans la substance de départ brute (2) ou par utilisation d'autres enzymes protéolyticues (par exemple ficine, broméline ou papalne) 25 (3 et 4). La substance soluble est fractionnée par filtration sur gel (4) et la fraction active provenant de cette étape est déjà suffisamment purifiée pour pouvoir être utilisée comme immu-nogène pour les besoins de l'invention. Une purification ultérieure peut être effectuée par chromâtographie sur colonne échan-30 geuse d'ions (5), par électroph«rèse et par électrofocalisation. La chromatographie su? colonne échangeuse d'ions assure une séparation des spécificités, de sorte qu'un individu peut fournir ,par exemple, différents antigènes HL-A (6 et J) qui pourront être utilisés séparément pour l'immunisation. 35 La description générale ci-dessus et les références biblio graphiques y afférentes concernait des procédés de préparation d'un antigène purifié provenant de tissus de souris. Les étapes opératoires mises en jev s'appliquent intégralement à la préparation d'une substance similaire provenant de tissus humains ( 3, 5 et 40 7). 71 01841 2081446 4 Une forme de réalisation spécifique de la technique de purification décrite ci-dessus est la suivante : 100 rates de souris ( ou l'équivalent de cellules,spléni-ques humaines ou de cellules leucémiques, poids humide = 20g) 5 ont été désagrégées en une suspensoin de cellules par passage du tissu à travers un tamis. Les cellules ont été lavées à fond pendant trente minutes environ dans 200 ml de NaCl, 0,8$ (4°C) et centrifugées pendant 10 minutes à 1.500 t/mn. La couche surnageante a été conservée et le sédiment a été remis en suspen-10 sion dans 200 ml supplémentaires de NaCl à 0,8$. Cette suspension a été centrifugée pendant 10 minutes.à 1.500 t/mn., le sédiment a été éliminé et la couche surnageante a été ajoutée à la première couche. Ces 400 ml d'eau de lavage ce cellules ont été centrifugés pendant 60 minutes à 30.000 t/mn. et la couche surna-15 geante a été rejetée. Le sédiment a été remis en suspension dans rïf? l'eau à raison d'environ 20 à 30 mg/ml (soit 15 ml). Cette suspension peut être conservée à 4°C avec du thymol comme .agent de conservation et elle est désignée sous le nom. d'éluat brut. On a procédé à la solubilisation en ajoutant un tampon "Tris" 20 (phosphate trisodique) pH 8 pour obtenir une concentration finale de 0,05 M et la solution a été mise .à incuber pendant 2,5 heures à 37°C, centrifugée à 50 000 t/mn pendant 2 heures et la couche surnageante a été mise de coté. Le sédiment a été remis en suspension dans 15 ml de "Tris" pH 8 à 0,05 M et on a ajouté de la 25 papaine à raison d'environ 1/1506 - ou davantage si nécessaire -du poids, de la substance à solubiliser (soit 2,5 mg) _ Cette suspension a été mise à l'incubation pendant 1 heure à 37°C et la réaction a été stoppée par addition d'iodo-acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,05 M. La solution a été 30 ensuite centrifugée pendant 2 heures à 50.000 t/mn, le sédiment a "été éliminé et la couche surnageante a été réunie à la couche surnageante précédente centrifugée à haute vitesse. Cette couche surnageante réunie a été concentrée dans un évaporateur rotatif jusqu'à environ 6 ml et ensuite introduite dans une colonne de 35 "Sephadex G 200" (50 x 3 cm); on a recueilli 55 fractions de 10 ml. La mise en commun des fractions a été effectuée en tenant compte des allures de la densité «ptique et des résultats obtenus en contrôlant la spécificité antégénique c'est-à-dire en examinant les fractions pour reconnaître la présence d'antigène spécifique 40 par utilisation d'antisérums appropriés. Dans les conditions dé ; ■ 2081446 ./ finies, ce sont généralement les tubes 18 à 30 qui contiennent l'activité c'est-à-dite les antigènes H-2 et HL-A. Les contenus de ces tubes ont été réunis, concentrés sous pression réduite, dialysés et lyophilisés. Tout le traitement s'effectue à froid. 5 Le rendement d'une telle préparation était d'environ 5 L'analyse des produits a permis d'identifier des glycopro-téines mais, en l'absence d'une preuve d'homogénéité due au rendement très faible, il n'a pas été possible do fournir une analyse précise. L'évaluation du poids moléculaire, calculé d'après 10 les méthodes de vitesse de sédimentation et d'ultracentrifugation à l'équilibre, a fourni un chiffre de 54.000 (Summerell & Davis 1969. Trans. Proc. 1 , 479 et Summerel & Davis 1970. Biochem. Biophys. Acta. 207 92 ) pour trois spécificités H-2 de souris qui ont été étudiées. Les résultats de filtration sur gel montrent 15 que les antigènes humains HL-A possèdent un poids moléculaire très voisin. Les molécules sont solubles dans l'eau de purification et de solubilisation. Ce type de procédé a été utilisé pour les antigènes de transplantation humains HL-A, pour les antigènes de transplantation 20 de souris H-2, pour leurs homologues de chien et de porc et pour les antigènes spécifiques de leucémie humaine et de souris. Des modifications de cette technique de purification de base peuvent être appliquées à d'autres antigènes liés aux membranes cellulaires. Divers procédés ont été utilisés pour la pré-25 paration d'alloantigènes non HL-A ou non H-2 qui peuvent également servir à l'élaboration d'antisérums xénogéniques. Le mode d'immunisation de l'animal receveur n'est en aucun cas critique. La substance purifiée est habituellement administrée à l'animal receveur sous la forme d'une solution ou d'une 30 suspension dans un véhicule liquide non toxique physiologiquemerit acceptable. Il s'est révélé avantageux de préparer une solution ou une dispersion de la substance purifiée sur la base de 1 mg de substance purifiée pour 3 ml de liquide. Dans de nombreux cas, il est avantageux d'utiliser en supplément un adjuvant, par exem-35 pie l'adjuvant de Freund. La dose administrée lors de l'immunisation n'est pas critique. Le prélèvement du sérum à partir de l'animal immunisé s'opère par les techniques habituelles do séparation du sang, de coagulation, de centrifugation et de récupération du sérum. 40 Le produit de l'invention revêt une importance particulière 71 01841 2081446 6 dans le domaine de l'identification des tissus pour la transplantation. L'identification des tissus est une méthode d'évaluation des incompatibilités (dans le cadre d'une transplantation d'organes) entre les donneurs éventuels et les receveurs. Les réac-5 tifs utilisés sont des alloantisérums humains qui "reconnaissent" différents alloantigènes de leucocytes, essentiellement ceux de la' série "HL-A". Les antigènes HL-A sont les facteurs les plus importants intervenant dans le rejet des greffes et un couple donneur receveur bien assorti devra préspnter des différences 10 minimales dans sa composition HL-A. Lorsque des différences apparaissent entre deux individus, c'est-à-dire lorsque la réaction des antisérums révèle des "incompatibilités, les individus ne seront pas admis de préférence pour l'échange d'organes. Le produit de 1'invention peut aussi être utilisé pour i-15 dentifier et classer les antigènes leucémiques et d'autres antigènes tumoraux. Il peut également être appliqué dans la thérapeutique des tumeurs. On considère que l'invention permet également de caractériser les spécificités des cellules tumorales. A l'heure actuelle, 20 on estime que toutes les cellules tumorales possèdent un antigène qui les différencie de leurs cellules-hôtes et, de ce point de vue, les cellules de leucémie ont été le plus étudiées. Une grande partie des.travaux expérimentaux effectués se rapportent à l'utilisation de substance HL-A purifiée ou partiel-25 . lement purifiée. L'invention est illustrée dans être limitée par les exemples d'utilisation d'une telle substance pour la production d'un antisérum xénogénique. 1. Sérum Anti- KL-A de rat 30 Une préparation soiuble a été obtenue à partir de rate hu maine (HS 15) par désagrégation à travers un tamis métallique et les cellules ont été. mises en' suspension dans une solution de NaCl à 0,8% et traitées comme décrit ci-dessus en fournissant une substance purifiée qui a été identifiée par inhibition de la 35 cytotoxicitéo Cette substance a servi à immuniser deux rats (2 injections de 2,5 nig d'antigène à 1 semaine d'intervalle dans la patte avec l'adjuvant complet de Freund). Le sérum prélevé 8 jours après la deuxième immunisation a été testé en cytotoxicité sur les lymphocytes de 13 individus groupés. 40 Cette technique implique l'estimation du pourcentage de des 71 01841 2081446 7 truction de cellules-cibles lymphocytaires d'un groupe HL-A connu avec divers antisérums lymphocytotoxiques de tissu par des méthodes décrites dans "Histocompatibility Testing" 19ÔJ (Eds. Curtoni E.S. et al (Munksgaard). L'adaptation de cette 5 technique à une mesure d'activité de l'antigène par des méthodes d'inhibition est décrite dans la référence bibliographique (3) citée plus haut. Le sérum a été utilisé sous sa forme originelle et également après absorption. L'absorption a été effectuée pgr incubation, 10 pendant 1 heure à 37°C, de 1 ml de sérum .avec 10 lymphocytes provenant de sang périphérique de donneurs groupés. Le sérum a été recueilli par centrifugation à 500 G pendant 10 minutes. Le sérum non absorbé a donné lieu à 10 réactions négatives -et 3 réactions positives. Après absorption avec les lymphocytes 15 de l'un des trois individus ayant réagi, le sérum était inactif vis-à-vis des lymphocytes utilisés pour l'absorption mais réagissait encore avec les deux autres individus. Le sérum présentait un pouvoir d'agglutination très important des leucocytes, ce qui montre que le test d'agglutination 20 peut aussi être utilisé avec succès pour le groupage tissulaire à l'aide d'antisérums xénogéniques. 2. Sérum anti-HL-A de lapin Un lapin a été immunisé avec la préparation HS 15 (voir exemple 1)..Le processus d'immunisation était pratiquement le 25 même que celui adopté pour les rats. On a pratiqué trois injections de 3 mg d'antigène chaque fois à 10 jours d'intervalle. Le sérum a été contrôlé avant et après l'absorption par des globules rouges humains du groupe A (HL-A 2 négatif). Le sérum a réagi avec leEjfleucocytes de différents donneurs 30 avant et après l'absorption. Son titre était cependant légèrement réduit après l'absorption. On a constaté une nouvelle fois que le sérum de lapin fournit des taux d'agglutination très élevés. Contrôlé par cytotoxicité sur des lymphocytes de 5 individus différents, le sérum a fourni 4 résultats positifs et un résul-35 tat faiblement positif. Après absorption avec les lymphocytes d'un donneur, le sérum ne réagit pas avec les lymphocytes du donneur utilisés pour l'absorption mais réagit encore avec les lymphocytes d'autres donneurs. 71 01841 2081446 8 3. Sérum anti-HL-A de' lapin On a immunisé 3 lapins à l'aide d'une préparation provenant d'un tissu de rate humaine identifiée (préparation HSI, obtenue comme il est décrit à propos de HS 15). 5 Le sérum a été évalué par cytotoxicité. a) avant immunisation, il a danné des résultats négatifs, b) après la première immunisation, il a montré une réaction totalement négative et 2 réactions très faiblement positives, c) après la deuxième immunisation, on a observé 7 réactions 10 négatives ou très faibles (+ ou -), 3 réactions légèrement positives (+) et 3 réactions fortement positives (++), sur 13 individus testés qui avaient été préalablement groupés. • Les résultats sont indiqués dans le tableau. TABLEAU 15 ■ 2ème immunisation 501 502 503 20 MB - - - - - - KH - - - + + + DB - - - - - vw + + + ++ ++ ++ 25 ■ LB - - - + + + HW - - - + + + GT - - - - - - LK - - ■ - + + + 30 GK - - - - - - HW - - - - - - VH - - + + + JT _ _ _ ++ ++ ++ 35 AJ "" ++ ++ ++ Le sérum de lapin présente par conséquent différentes réactions vis-à-vis d'individus de type HL-A humain différent. Liste des Lapins 1ère immunisation individus ^Q1 ^Q2 ^ groupes ^ ^ ^ 1413/70-1418-142//71 71 01841 2081446 9 Absorption Après absorption du sérum par la préparation d'origine ayant servi à l'immunisation, celui-ci était devenu totalement inactif. Après absorption par deux préparations de type HL-A connu diffé-5 rentes qui n'avaient en commun que quelques uns des antigènes de la préparation primitive, la fréquence de réactivité du sérum a-vec les différents donneurs avait diminué. 4. Sérum anti-leucémique de lapin obtenu par immunisation à l'aide d'extraits de cellules leucémiques humaines. 10 Des lapins immunisés avec des préparations réalisées comme décrit ci-dessus mais obtenues à partir de cellules leucémiques humaines ont réagi avec des extraits de nombreuses ratesihumaines normales ainsi qu'il a été déterminé par double diffusion dans l'agar. Après absorption en vue de la suppression de toute réac-15 tivité avec des constituants de sérum normal, avec des réactifs utilisés pour la préparation de l'extrait soluble, par exemple la papaîne, des produits solubles extraits de cellules non leucémiques ,présentaient une réactivité croisée, pour la spécificité avec 1 extrait; leucémique HL-A/ Il ne restait que deux lignes de diffusion avec des ex- 20 traits de cellules provenant du donneur leucémique primitif, lignes témoignant de l'existence d'antigènes leucémiques spécifiques. Selon les propositions antérieures décrivant les antigènes spécifiques de la leucémie utilisant des sérums xénogéniques 25 provenant de cellules entières ou de produits homogénéisés bruts, ceux-ci présentent l'inconvénient de contenir une grande variété d'anticorps inappropriés. Le nombre de ceux-ci peut être fortement diminué en utilisant une substance purifiée. Les résultats rapportés ci-dessus démontrent la spécificité 30 des anticorps présents dans les sérums obtenus selon l'invention. Les essais dans lesquels des sérums cytot»xiques sur les lymphocytes d'un donneur ont été absorbés avec ces mêmes lymphocytes, montrent que cette absorption rend les sérums négatifs sur les lymphocytes qui ont servi pour l'absorption, mais qu'elle ne 35 diminue pas leur activité vis-à-vis d'autres lymphocytes appartenant à d'autres individus. Egalement des sérums lymphocytoto-xiques, obtenus après immunisation avec un extrait soluble ont été neutralisés soit par le même extrait soit par d'autres extraits. Seuls les sérums neutralisés avec l'extrait «riginal ont 40 perdu totalement leur activité, Les autres extraits n'ont fait que 71 01841 2081446 10 réduire la fréquence.de la réactivité des sérums avec les différents individus du groupe étudié. L'invention montre donc que les antigènes d'histocompatibili-té, lorsqu'ils sont suffisamment purifiés et rendus solubles,peu-5 vent être utilisés pour donner naissance à des antisérums spécifiques au delà des barrières de l'espèce. On peut apporter à l'invention de multiples variantes sans pour autant sortir de son cadre. Ainsi qu'on l'a décrit ci-dessus, une application particu-10 lièrement intéressante est la production d'antisérums pour les groupages tissulaires fchez l'homme ou chez l'animal (la souris en particulier) par l'immunisation d'autres espèces animales, avec un meilleur rendement et en évitant toutes les difficultés inhérentes aux immunisations humaines. Il est évident que l'obtention 15 d'antisérums spécifiques peut être réalisée chez diverses espèces animales (lapin, rat, cobaye, cheval, etc.) et l'antigène servant à l'immunisation peut appartenir aussi à n'importe quelle espèce animale (homme, souris, etc...) Il convient de noter aussi que, dans la description qui pré-20 cède, on* a caractérisé les sérums par leur activité cytotoxique Cette technique n'est évidemment pas limitative. On peut .utiliser d'autres techniques permettant d'évaluer l'activité des sérums telles que celles connues de fixation du couplement, d'agglutination, d'immuïio-adhérence entre autres. 25 Par ailleurs, une autre' application importante de l'invention est la production d'antisérum^pécifiques contre les antigènes leucémiques et tumoraux par hétéroimmunisation. De récents tra--vaux, prouvent que les cellules leucémiques humaines possèdent des néoantigènes non reconnus comme "self" par l'organisme. Plusieurs 30 travaux permettent de penser qu'il existe une situation analogue en ce qui concerne les tumeurs solides. L'invention est ainsi avantageusement applicable aux antigènes leucémiques ou des tumeurs solides chez * l'homme, une f»is qu'ils sont isolés et purifiés. Elle permet d'obtenir des anti-35 sérums spécifiques antileucémiques ainsi que des antisérums antitumoraux spécifiques par ummunisation animale. Le domaine d'application de l'invention est donc très étendu. 71 01841 2081446 11 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'antisérums caractérisé on ce qu'on immunise un receveur mammifère avec un alloantigène de transplante.tion mammifère ou un antigène spécifique tumoral qui 5 a été solubilisé, séparé des impuretés de haut poids moléculaire et qui possède un poids moléculaire compris entre JO.OOO et 70.000 et qu'on recueille l'antisérum ainsi formé. 2. Frocédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les allonntigènes de transplantation mammifères ou les antigènes 10 spécifiques tumoraux sont obtenus à partir d'un tissu humain riche en lymphocytes ou en cellules de type convenant comme source de l'antigène désiré, qui a été solubilisé et soumis à une filtration sur gel en vue de l'obtention d'un produit purifié ayant un poids moléculaire de l'ordre de 54.000 + 5.000. 15 3* Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracté risé en ce que l'alloantigène de transplantation mammifère purifié ou l'antigène spécifique tumoral est obtenu par désagrégation du tissu donneur riche en cellules lymphocytaires, par mise en suspension du produit cellulaire dans un véhicule liquide ap-20 proprié, par séparation du liquide surnageant du solide en suspension au moyen d'une ou plusieurs opérations de centrifugation, par séparation ultérieure de la substance solide et du liquide surnageant par ultracentrifugation, par solubilisation de la substance solide et, au besoin, par concentration de la solution 25 obtenue et par séparation des impuretés de haut poids moléculaire par fractionnement dans un appareil de filtration sur gel. 4. Procédé selon la revendication J, caractérisé en ce que la solubilisation s'effectue par incubation, avec de la papaïne ou autre enzyme efficace, du sédiment résultant de 1'ultracentri-30 fugation. 5- Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'on obtient l'antigène à partir des lymphocytes du sang périphérique ou de cellules on culture de tissus. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 35 caractérisé en ce que la substance purifiée est administrée à l'animal receveur sous forme d'une solution «u d'une suspension dans un véhicule liquide non toxique, physi«logiauement acceptable contenant également, le cas échéant, un adjuvant. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 71 01841 2081446 12 caractérisé en ce que le sérum de l'animal immunisé est recueilli par séparation du sang, coagulation du sang, centrifugation et récupération du sérum liquide. 8. Antisérums produits par le procédé revendiqué dans 5 l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Applications des antisérums selon la revendication 8, tels qu'ils sont obtenus chez une espèce animale quelconque à partir d'un antigène solubilisé et purifié appartenant à une autre espèce animale quelconque, y compris, à l'homme, à titre de 10 produits pour les groupages tissulaires chez l'homme ou chez 1'animal. 10. Produits selon la revendication 9> appliqués à la technique des transplantations d'organes en vue de déterminer la compatibilité des donneurs éventuels et d'un receveur. 15 11. Applications des antisérums selon la revendication 8, à titre d'agents spécifiques contre les antigènes leucémiques et tumoraux, administrables à l'homme par la technique d'immunothérapie passive. 12..Applications des antisérums selon la revendication 8, 20 à titre d'agents spécifiques pour la détection d'antigènes leucémiques et cancéreux -, lesdits antisérums étant utilisables pour le diagnostic..