Brevet FR2085734A1 — publié le 19711231

i. 2085734 La présente invention se rapporie k ,ae aouveaiui oeuâoéca.-peptides ayant un reste de 3-alanine à la position terminale azotée et un reste de L-ornithine à la position 15, respectivement à la place du reste de serine et du reste de lysine dans la corticotro-5 pine naturelle, à leurs dérivés, à leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et à leurs complexes. Les [1-0-alanine, 15-ornithine]-octadécapeptides (ci-après désignés sous le nom de [0-Ala1, Orn"5"^]-octadécapeptides) préparés par la présente invention sont utiles comme médicaments parce qu'ils présentent des activités 10 marquées de la corticotropine, telles que l'activité de stimulation surrénale, l'activité lipotrope ou l'activité de stimulation de mê-lanocytes, et que ces activités sont particulièrement à longue durée d'action. En 1965, la demanderesse a indiqué qu'elle était parvenue 15 à la synthèse d'octadécapeptides, ACTH(l-l8)-0H et ACTH(l-l8)-*H2, correspondant aux dix-huit premiers restes d'aminoacides de la corticotropine (ACTH) [Biochem. (Tokyo) 58 512 (1965)]. Ultérieurement, la synthèse de l'analogue de 1-glycine,c'est-à-dire Gly1-ACTH(1-18)-NHg, a été indiquée dans Bull. Chem. Soc. Japan 4^ 196 (1970). D'a-20 près ces études de synthèses et ces études biologiques sur les pep-tides de corticotropine, la demanderesse a appris que les dix-huit restes à position terminale aminée satisfont aux exigences ainima pour obtenir une activité élevée de stimulation surrénale. Cependant, on a trouvé que ACTH(l-l8)-NH2 et Gly1-ACTH{1-18)-NHg étaient 25 beaucoup moins actifs que l'hormone naturelle, spécialement lorsque ces produits étaient administrés pour des évaluations par voie sous-cutanée ou intraveineuse. Récemment, la demanderesse a indiqué un excellent peptide de corticotropine, c'est-à-dire P-Ala^"-AC3H(l-l8)-NH2 [Bull. Chem. Soc. Japan U63 (1970)]. Ce peptide possède 30 des propriétés biologiques remarquablement améliorées au point de vue du renforcement de la puissance, pai* suite de la diminution de sensibilité vis-à-vis de l'action d'aminopeptidase intracellulaire. La substitution en position terminale aminé© par la {3-Alanine a a-inéiioi'é ia. âuabxiiué ûU pëpulûs; uctilâ j_£E> '{ÛS.XB iion ^>c " 35 stabilité dans le sang. En fait, l'action cla l'analogue de ~ -fs-i-lanine dans le sang est moins durable que celle de la corticotre-pine naturelle, indiquant que le premier composé est désactivé plus rapidement que le dernier par l'action de 1'endopeptidase dans le sang, lorsqu'on l'administre par voie intraveineuse. Ainsi, or-, a 40 recherché fortement une autre amélioration au pvint de rue ao la BA0 ORIQmL 71 10181 2- "2085734 production industrielle et ae ±:utilisation pratique, pwui- pei-meo-tre au peptide à courte chaîne de ressembler davantage à la corticotropine naturelle. Par suite des études sur les peptides de corticotropine, 5 la demanderesse a découvert que les [p-Ala1, Om1^]-octadécapepti-des présentent des propriétés biologiques améliorées au point de vue de la durée de l'action et qu'ils possèdent le même niveau d' activité de stimulation surrénale que la corticotropine naturelle. La demanderesse a également découvert que ces propriétés amélio-10 rées sont dues à une diminution de sensibilité des [0-Ala1, Orn1^]-oetadécapeptides vis-à-vis de l'action de l1endopeptidase dans le sang et de l'aminopeptidase dans les tissus. La présente invention est basée sur ces découvertes. 1 Selon la présente invention, les [0-Ala , Orn -^-octadéca-15 peptides peuvent être préparés en condensant les aminoacides ensemble un par un ou en condensant les petits fragments de peptides ensemble, d'une manière classique en soi. Plus particulièrement, ils peuvent être préparés (a) en faisant réagir un ester d'aminoacide ou un ester de peptide ayant un groupe aminé libre avec un autre 20 aminoacide ou un autre ester de peptide, ayant un ou plusieurs groupes aminés protégés, en présence d'un agent de condensation, ou (b) en faisant réagir un aminoacide ou un peptide ayant un groupe aminé libre et un ou plusieurs groupes carboxyles protégés ou non protégés avec un autre aminoacide ou un autre peptide ayant un 25 groupe carboxyle activé et un ou plusieurs groupes aminés protégés, (c) en faisant réagir un aminoacide ou un peptide ayant un grou-k oarboxyle libre et vin ou plusieurs groupes aminés protégés avec Wi vatre aminoacide ou un autre peptide ayant un groupe aminé activé et un ou plusieurs groupes carboxyles protégés, et en reti-30 }«. nt les groupes de protection du peptide protégé résultant par ïiyarogénolyse, acidolyse, saponification par un alcali, hydrazino-lyse ou réduction par le sodium dans l'ammoniac liquide. La condensation pour la formation de liaisons de peptide pcui» X"€?â.j.i»oèc par icS pl'OCoClxzo CÏ'Cixîicxj.V'&âaV wCëîïipô.ô*3 uw 35 ces procédés sont le procédé à l'azothydrure, le procédé à la di-cyelohexylcarbodiimide, le procédé au carbonyldiimidazole, le procédé à l'anhydride mixte, le procédé à l'ester activé (par exemple le procédé à l'ester p-nitrophénylique, le procédé à l'ester de N-hydroxysuccinimide, le procédé à l'ester pentachlorophénylique, le 40 pi'o?.édé à l'ester eyanométhylique, le procédé au thiolester p-nitro- BAD ORK3ÎNAL 71 10181 3 2085734 phénylique), le procédé à 1'isoxazolium, le procédé au N-carboxy-anhydride, le procédé au pyrophosphite de tétraéthyle, le procédé au chlorophosphite d'éthyle, un procédé utilisant une combinaison des procédés précédents, ainsi que d'autres procédés couramment u-5 tilisés dans la technique. Les octadécapeptides désirés sont également préparés par la synthèse des peptides dite en phase solide. Bien que les procédés mentionnés ci-dessus puissent être employés pour la formation de n'importe quelle liaison de peptides dans la préparation des présents octadécapeptides, les procédés les plus 10 couramment mis en pratique sont le procédé à l'ester activé, le procédé à la dlcyclohexylcarbodiimide, le procédé à l'azothydrure et le procédé à l'anhydride mixte. Dans la production des [P-Ala1, Orn1^]-octadécapeptides, n'importe quel groupe fonctionnel libre ne participant pas à la ré-15 action est avantageusement protégé, spécialement par des groupes tels qu'ils puissent être facilement retirés par hydrogénolyse, a-cidolyse, saponification par un alcali, hydrazinolyse ou réduction par le sodium dans l'ammoniac liquide. Le groupe carboxyle est a-vantageusement protégé par estérification, par exemple par un al-20 canol inférieur (par exemple le méthanol, l'éthanol, le propanol, 1'isopropanol, le t-butanol) ou un aralcanol (par exemple l'alcool benzyliaue, 18alcool p-nitrobenzylique, l'alcool p-méthoxybenzyli-qv.e) eu par formation d'amides. Ces groupes de protection du groupe carboxyle sont introduits par les procédés ordinaires. 25 Le groupe aminé est protégé, de préférence, en introdui sant un groupe tel que le groupe t-butyloxyearbonyle, le groupe t-amyloxycarbonyle, le groupe o-nitrophénylsulfényle, le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle, le groupe benzyloxycarbonyle, le groupe p-ni trobenzyloxyc arbonyle, le groupe tosyle, le groupe 30 formyle ou le groupe trityle, d'une manière classique. Pour la protection du groupe guanldyle de l'arginine, on emploie de préférence le groupe nitro, le groupe tosyle, ou le groupe adamantyloxy-carbonyle, mais la protection du groupe guanidyle n'est pas toujours nécessaire. Le groupe îf-carboxyle de l'acide glutamique est 35 de préférence protégé par des groupes de protection du groupe carboxyle, tels que ceux mentionnés ci-dessus, et le groupeW-amino de la lysine ou de l'omithine est avantageusement protégé par des groupes de protection du groupe aminé tels que ceux mentionnés ci-dessus. Le groupe imidazole de l'histidine peut être protégé par 4.Q le groupe tosyle, le groupe benzyloxycarbonyle ou le groupe benzyle. 71 10181 4. 2085734 En outre, le groupe hy&roxyle de la sérine ou de la tyrosine peut être protégé par le groupe acétyle, le groupe benzyle ou le groupe t-butyle, mais cette protection n'est pas toujours nécessaire. En plus des restes d'aminoacides à la position terminale 5 aminée et à la position 15, certains autres restes de la séquence d'aminoacides du peptide de corticotropine peuvent être encore rem placés par d'autres aminoacides différents, sans dégrader sensible ment l'activité corticotrope. Par exemple, le quatrième aminoacide la méthionine, peut être remplacée par la norvaline, la norleucine 10 la leucine ou l'acide a-aminobutyrique et/ou le cinquième aminoaci de, l'acide glutamique, peut être remplacé par la glutamine. En conséquence, les présents octadécapeptides sont représentés par la formule (I) ï P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-X-Y-L-histi dyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-15 L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z dans laquelle X est le reste de L-méthionine, le reste de L-norvaline, le reste de L-norleucine, le reste de L-leucine, ou le reste d'acide a-aminobutyrique j Y est le reste de L-acide glutamique ou le reste de L-glutamine et Z est le reste de L-arginine, le reste d'ester de L-20 arginine ou le reste d'amide de L-arginine. La réaction de couplage final pour la production du peptide (I) est réalisée, par exemple, en condensant un décapeptide protégé ayant la formule : R^-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-X-y-Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyci-25 ne dans laquelle est un groupe de protection du groupe aminé j X est le reste de L-méthionine, le reste de L-norvaline, le reste de L-norleucine, le reste de L-leucine ou le reste d'acide a-aminobutyrique, et Rg est un groupe de protection du groupe carboxyle avec un oetapeptide protégé ayant la formule s HÊ-R^-L-lysyl-L-30 prolyl-L-valyl-glycyl-N^-R^-L-oraithyl-NS-R(--L-lysyl-L-arginyl-Z dans laquelle R^, R^ et R^ représentent chacun un groupe de protection du groupe aminé et Z est le reste de L-arginine, le reste d'ester de L-arginine ou le reste d'amide de L-arginine, par le procédé à l'ester activé, le procédé à la dicyclohexylcarbodiimide 35 le procédé à l'azothydrure, le procédé à l'anhydride mixte ou un procédé utilisant une combinaison de ces divers procédés, dans un solvant inerte, à une température de -20°C à 60°C, pendant environ 2 heures à 7 jours, et en retirant les groupes de protection de 1' octadécapeptide protégé résultant ayant la formule : R^-P-alanyl-40 L-tyrosyl-L-séryl-X-y-Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L- 71 10181 5. 2085734 arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N^-R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl--R^-L-ornithy1-NÊ-R^-L-lysyl-L-arginy1-Z dans laquelle R^, X, R2, V ^5 et z sont chacun tels que définis ci-dessus, par hydro-génolyse, acidolyse, saponification par un alcali, hydrazinolyse 5 ou réduction par le sodium dans l'ammoniac liquide, à une température d'environ -20°C à 60°C pendant j?0 minutes â 24 heures. Les solvants inertes sont la diméthylformamide, le diméthylsulf oxyde, le dioxane, l'hexaméthylphosphorotriamide, une solution aqueuse de ces solvants et un mélange de ces divers produits. 10 Les modes opératoires préférés pour la préparation des [p-Ala1, Orn^l-octadécapeptides sont présentés dans les graphiques I, II, III et IV. GRAPHIQUE I 3bo-(5--Ala~Ofî 4- H-Tyr-OMe DCC Cbo-(B -Ala.Tyr-GMo |NH HH„ i, d Cbo-(3 -Ala. Tyr-NHJÎÏÏg hno2 Cbo-0-Ala.Tyr-N^ + H-Ser-OMe i' Cbo-p -Ala. Tyr. Se:: -OMe iKB2,ta2 Cbo-p-Ala.Tyr. Ser-NHNHg ' HNO_ OBzl \ BOC-Glu-ONP + K-Hia.Phe.Arg.Trp.Gly-OH I OBzl BOC-Glu.His.Phe.Arg.Trp•Gly-OH OBzl \ CT-COOH 5 BOC-Met-ONP + H-Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH OBzl l BOC-Me t.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH Cbo-{3 -Ala. Tyr. Se :: -N^ OBzl CF-COOH 3 BOC BOC BOC I Cbo-Lys.Pro.Val.Gly.Orn-N^ + H-Ly s.Arg.Arg-R(R=OH,NHg,OdH^) OBzl H-Me t.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH BOC I BOC BOC Cbo-S-Ala.Tyr.Se::.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH Cbo-Lys.Pro.Val,Gly.Orn.lys.Arg.Arg-R OBzl HOSu, DCC BOC I H~/Pd BOC BOC Cbo-|3 -Ala. Tyr. Se::. Met. Glu. His. Phe. Arg. Trp. Gly-OSu + H-Ly a. Pro. Val. Gly. Orn. Lys. Arg. Arg-R OBzl \ BOC . I BOC BOC J , I Cbo-p - Ala. Tyr. Se::. Me t. Glu. His. Phe. Arg. Trp. Gly. Ly s. Pro. Val. Gly. Om. Ly s. Arg. Arg-R HJ? H-p-Ala.Tyr. Se . Me t.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Orn.Lys.Arg.Arg-R i\r : h-* ; o ; t ! |—^ • -| ON ro o CD U1 Usl GRAPHIQUE II BOC-p-Ala-OH + H-Tyr-OMe BOC-Ser-OH + H-Met-OMe DCC BOC-p-Ala.Tyr-OMe |îih2nh2 BOC-p-Ala.ïyr-NHNHg |hn°2 BOC-p-Ala.Tyr-Nj + vi BOC-p-Ala.Tyr.Ser.Met-OMe j®yiH2 BOC-p-Ala.Tyr.Ser.Met-NHNHg HN0„ DCC BOC-Ser.Met-OMe HCl H-Ser.Met-OMe OBu BOC-p-Ala.Tyr.Ser.Het-N^ + H-Glu.His.Phe,Arg.Trp.Gly-OH OBu1 BOC-p-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH OBu HOSu, DCC BOC BOC BOC BOC-p-Ala.Tyr.Ser.Ket.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OSu + H-lys.Pro."Val.Gly.Orn.lys.Arg-R (R=OH, Nïïg, OCH^) OBu _\ BOC BOC BOC ,1 ,1 BOC-p-Ala.Tyr,Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Orn.lys.Arg.Arg-R CT-COOH 3 H-p-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.lys.Pro.Val.Gly.Orn.lys.Arg.Arg-R h—^ O I-* 00 ro o OO : Ul VI Us] t GRAPHIQUE III î VI " h-5» Cbo-p-Ala.TyrrNHNH2 ■HNO, Cbo-g-Ala.Tyr-N^ + H-Ser.Met-OMe Cbo-p-Ala.Tyr.Ser.Met-OMe NH2NH2 Cbo-p-Ala.Tyr.Ser.Met-NHNHg HîfO« OBzl Cbo-p-Ala.Tyr.Ser.Met-Bj + B-fflu. His'.Phe. Arg. Trp. Gly-OH OBzl. Cbo-|3-Ala. Tyr. Ser. Met. Glu.His. Phe. Arg. Trp. Gly-OH HOSu, DCC OBzl BOC \ ! t t Cbo.-{3-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp,Gly-OSu + H-lys.Pro.Val.Gly.Orn.lys.Arg.Arg-R (Hs:OH, NHg, OCKj) BOC BOC ,) T I OBzl BOC BOC BOC Cb o-(3 -Ala. Tyr. Se r. Me t. Glu. His. Phe. Arg. Trp. Gly. ly s. Pr o. Val. Gly. Orn. lys .Arg. Arg-R HP H-p-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.His,Phe.Arg.Trp.Gly.lys.Pro.Val.Gly.Orn.lys.Arg.Arg-R O I—* CD ! ! 03 • |\J i o f co I UT • Vf f GRAPHIQUE IV flOC-s-AL: .îîyr. Ser-ÎÎHÏÏiï,, H&T0„ à OBzl BOC-p-Ali.Tyr.Ser-N^ + H-Met.Glu.His.Phe.Arg.ïrp.Gly-OH V03zl BOC-p-Al«» Tyr,Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH HOSu, DCC ÛB:;1 BOC BOC BOC BOC-p -A li . Ty r. Ser. île t. Glu. Hia. Phe. Arg. ïrp. Gly-OSu + H-lys. Pro. Val. Gly. Orn. Lys. Arg. Arg-R (K=0H5 HHg, OOEj) OB:;l BOC BOC! BOC ... A _ I. BOC-o-Al uTyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.lys.Pro.Val.Gly.Orxi.Lya.Arg.Arg-R HP 11 ji -A ls■...'Hyr,Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.ïrp.Gly.lys.Pro.Val.Gly.Om,Lys.Arg.Arg-R VI l-A O I-* co ! I vo IV) , O ! 00 VJ1 VI ,■ Ul 71 10181 10. 2085734 Dans les graphiques, les abréviations suivantes sont utilisées : {3-Ala = reste de {3-alanine, Tyr = reste de L-tyrosine, Ser s» reste de L-sérine, Met = reste de L-méthionine» Glu = reste d'acide glutamique, His = reste de L-nistidine, Phe = reste de L-5 phénylaianine, Arg = reste de L-arginine, ïrp = reste de L-trypto-phane, Gly = reste de glycine, Lys = reste de L-lysine, Pro - reste de L-proline, Val = reste de L-valine, Grn = reste de L-omi-thine, Cbo = benzyloxycarbonyle, BOC « t-butyloxycarfaonyle, Bzl = benzyle, OBu" = t-butoxy, DCC = N,N'-dieyclohexylearbodiimide, 10 HOSu = H-hydroxysuccinimide, ONP = p-ni trophénoxy. Tel qu'indiqué dans les graphiques, le procédé préféré implique le couplage du tripeptide contenant les trois premiers aminoacides, e?est-à-dire P-alanyl-L-tyrosyl-L-sériae, ou au fcétra-peptide, c'est-à-dire B-alanyl-L-tyrosyi-L-séryi-L-méthionine avec 15 l'heptapeptide ou l'hexapeptide correspondant à la position 4-10 ou 5-10, respectivement, de préférence par le procédé de l?azochy-ûrure, et là-dessus le décapeptide résultant est condensé avec le peptide correspondant au reste de la molécule (positions 11-18), de préférence par le procédé à l'ester activé. Bien que le mode opératoire mentionné ci-dessus soit le procédé préféré pour la production des présents peptides de corticotropine, il est possible de substituer aux groupes de protection, aux procédés de couplage ou aux procédés d'enlèvement de la protection, employée ci-dessus, des équivalents ou des procédés équiva-,:3 lentf et de modifier la sélection des fragments de peptides et de J ■' o;. xre de couplage d'une manière appropriée. Les groupes de protection employés dans la présente ln- î : a wc -vdrazinolyse, réduction par le sodium dans l'ammoniac i-,;; ..:, c-v par traitement avec un acide, tel que l'acide trifluo-ûique,. l'acide formique, un acide iiaiogénhydrique gaztux (par exemple 11 acide fluorhydriqùe gazeux, .l'acide hromhydrique gaaeux. 1! ac.1 l'.1 cliloï'hydrique gazeux), un acide halogénhydrique (par exem- * ** * » -î.^ ^ f ^ .. -t ! î a ^ i i . .? r - ^ - *~- — v-U J. Uv z , -• ui " ,?5 dririue) ca un mélange de ces produits, d'une manière classique, sel-.jn Z.% nature du groupe, 1 1^ Les [b-Ala% Orn -*]-octadéeaneptiùes, préparés par la j.-r-s&ÈBte invention, peuvent être purifiés par des procédés ..oi.uu.: yii sci t sl,ï que la chromatographie sur colonne avee une résine é , d'ions, une cellulose éehangeuse d'ions ou le proàui'c • BAD OHIQÎMÂL 71 10181 ii. 2085734 dit Sephadex, ou un procédé de distribution à contre-courant. Les [p-Ala1, Orn^J-octadécapeptides de la présente invention sont produits sous forme de bases ou de sels d'addition avec les acides non toxiques et pharaaceutiquement acceptables, selon 5 les conditions réactionnelles utilisées. Egalement, ces sels peuvent être préparés en traitant les octadécapeptldes avec des acides minéraux tels qu'un acide halogénhydrique gazeux (par exemple l'acide fluorhydrique gazeux, l'acide bromhydrique gazeux, l'acide chlorhydrique gazeux), un acide halogénhydrique (par exemple 10 l'acide fluorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide chlorhydrique), l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique, ou avec des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide formique, l'acide pro-pionique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide succinique, l'acide 15 maléique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide benzolque, l'acide méthanesulfonique, l'acide benzènesul-fonique, ou l'acide toluènesulfonique, d'une manière classique, line quantité équimolaire ou en excès de l'acide peut être utilisée dans cette formation de sel. 1 Te 20 Les [(3-Ala , Orn -octadécapeptldes ainsi obtenus ont une activité corticotrope élevée et présentent une excellente prolongation de l'action corticotrope. La période (demi-vie) dans le plasma est plus longue que celle de la corticotropine naturelle. Des études détaillées des propriétés biologiques de [P-Ala^,0rn^^]-25 octadécapeptldes seront indiquées ci-après, en utilisant [P-Ala^, Orn1^]-ACTH(1-18)-NH2 comme peptide expérimental. La période (demi-vie) biologique de [0-Ala1, Orn^j-ACTH (l-l8)-NH2 a été déterminée par l'activité lipotrope in vitro [A. Tanaka, B.T. Pickering et C.H. Li., Arch. Biochem. Biophys. £2 294 30 (1962)] en tant que paramètre. Les résultats sont résumés dans le tableau 1, par comparaison avec la corticotropine naturelle (corticotropine de mouton j as-ACTH), P-Ala1-ACTH(l-l8)-NH2 et Gly1- acth(i-i8)-nh2. 35 40 71 10181 12. 2085734 10 TABLEAU 1 Période (demi-vie) de la corticotropine et de peptides synthétiques apparentés, en tant qu'agent lipotropes in vitro Peptide In vivoa^ ïïï vitro**) (injection soumis à 1* intravei- incubation neuse) avec du plasma p-Ala1, Orn15]-ACTE 1-18)-NH2 4,5 mn 76,1 mn. a -ACTH ............ 4,4 nu 59*2 mn 5 ï P-Ala1-ACTH(1-18)-HH2 3,1 mn 35,4 mn Gly1-ACTH(l-l8)-HH2 2,0 mn 30,0 mn HOTE : a) Un échantillon de peptide a été injecté par voie intraveineuse dans la veine cave inférieure de rats, et on a évalué, l'activité lipotrope in vitro sur des échantil-15 Ions de sang, qui ont été rassemblés à partir de l'aorte abdominale à des Intervalles de temps appropriés et ont été acidifiés. b) Un échantillon a été dissous dans du plasma frais provenant de rat anesthésié et le mélange a été alors soumis PO à l'incubation à 37°C. Des parties prises dans le mélange, à des intervalles de temps appropriés, ont été soumises à l'évaluation de l'activité lipotrope in vitro. Les résultats indiqués ci-dessus montrent clairement que la période (demi-vie) de [0-Ala1, Orn15]-ACTH(l-l8)-NH2 de la pré-25 sente invention est presque la même que celle de la corticotropine naturelle et est plus longue que celle de peptides apparentés, lorsqu'on les administre par injection intraveineuse. De plus, la période de [P-Ala1, Orn15]-AC3H(1-18)-HH^ est beaucoup plus longue que celle de la corticotropine naturelle et des octadéca-peptides apparentés, par incubation avec du plasma in vitro. La prolongation de la durée d'activité des présents octadécapeptldes est due à l'augmentation de la résistance du peptide vis-à-vis de l'action de 1'endopeptidase dans le sang. X XR Les activités de stimulation suirénale des [{3-Ala , Orn J]-^5 octadécapeptldes ont été évaluées selon quatre procédés différents et elles ont été comparées à celles de la corticotropine naturelle de mouton (a-ACTH). L'activité stéréoldogène in vivo par l'admi-nistration intraveineuse à un rat ayant subi une hypophysosectomie a été évaluée par le procédé de Lipscomb et Nelson [Endocrinol. £1 13 (1962)] avec une modification peu importante [A. Tanaka et C.H. 40 71 10181 13. 2085734 Li, Endocrinol. Japoni'ca 13• 180 (1966) ]. L'activité stéréoïdogène ■in. vivo- a été également évaluée dans'la souris "amorcée" au dexa-saethasone-pentobarbital [A. ïanaka et N, Nakamura "ïntegrative me-chanism-o£ neuroendocrine syswffl3, Hokkaid'a univers!ty Médical Li-3 brary Séries 1 49 {1968)]. En outre, l'activité stéréoïdogène par 1!administration intramusculaire à un rat ayant subi une hypophy-sosectomie a été déterminée, et, dans ce test, une préparation de peptide a été injectée dans le muscle de la cuisse et on a rassemblé, â partir de l'aorte abdominale, un échantillon de sang 30 nsi-10 nu ces après l'injection» Sa outre, l'activité stéréoïdogène par i! administration intraveineuse à un rat ayant subi une hypophysosec-coiîiie a été déterminée de manière telle qu'on a injecté une préparation de peptide dans la veine fésaorale et vss échantlllasi de sang a été rassemblé à partir de 1 'aorte abdominale 30 minutes après 1' 15 injection. Durant toutes les expériences, on a utilisé comme norme la troisième norme de référence USP de la corticotropine et on a déterminé la production de 11-hydroxycorticostéroïdes (11-OHCS) par- le procédé f luoropho tome trique de Pet ers on [J. Biol» Chem. *25 25 {1 957)]. Pour chaque procédé d'évaluation, on a réalisé d'ordi-20 naire plusieurs déterminations et les résultats obtenus indépendamment ont été soumis au traitement statistique par le mode opératoire ae Sheps et Moore [J, Pnarmaeol„ Exti. T'herap„ 128 99 (1960)1, Les résultats de ces évaluations sur [p-Ala"1", Orn"1"5 j -ACTH ( 1-18} -NH -sont donnés dans le tableau 2, par comparaison avec ceux de la eor-25 siectropine naturelle (a -ACTH). TABLEAU 2 Activité de stimulation surrénale d}octadécapeptids et de cortiec- Psptj.de 30 Procédé Voie d'ad- [p-Ala^, Cri.v-'j- a -mCTH ministra- ACTH(l-l3)-=MK, tion *2 Stsroïàogênsse in vivo dans ; curre'n&ie Intraveineuxe -3 35 Souris bloquée par le 5:e;£S.ri2etlias-":-ne-nsîdfcutal Xntravsineus e 1-iS r^ipaéricue Intraveineuse 16C " I:;ti-avelnsusë ' : : ! _-s~ nativités sont -s&pri-sèss an vrAtr ??£?/•, ~ u:?P • ::■• 1s 71- 10181 u. 2085734 Les activités de stimulation surrénale de [6-Ala"~, Orn"'-'!j-ACTH(1-i8)-NH0 sont presque les mêmes que celles de la corvicocro-pine naturelle. I/octadécapeptide de la présente invention présente une 5 activité lipotrope élevée, qui est résumée aans le tableau $ et comparée à celle de la corticotropine naturelle (a„-Auiïïj. TABLEAU 3 Activité lipotrope de iJoctadécapepciue et de la corticotropine naturelle 10 Dose efficace miitima 6 AMasl expérimenté 1 fS-Ala~, Orn""- A ACTIÎÎ1- l'ù) Tissu fdipeux de rat ,....* 0,35 6,0 15 Tissu adipeux de lapin .... 0,10 7,i HOTli : L'activité lipotrope a été déterminée selon le procédé décrit par Tanaka et collaborateurs [Arch. Bioehem. Biophys. 99 294 (1962)], avec l'épididyme de rat et le tissu adipeux périrénal de lapin. L'augmentation de la concentration en r ) acides gras non estérifiés dans le milieu et le tissu est le paramètre. L'activité est exprimée sous forme de la dose efficace minima pour 50 mg de tissu. L'évaluation pour déterminer 1*activité de stimulation de aélanocytes in vitro de [S-Ala", 0rn~>]-ACTJ-l(l-l8)-NHrv a été réa-C>:- ".isè* selon le procédé de E. Shizume, A.B. Lerner et T.B. Fitzpa-j■ Endocrinol, ^4 533 (1954)] en utilisant des fragments âe isolés de grenouilles dites Rana pipiens, L'activité de sti--'•'•t-ition de mélanocytes du présent octadécapeptide a été trouvée 1 O \ use v.. de 0,7 x 10"w U/g. On a utilisé comme norme une pré-paraticr pure d'hormone a naturelle stimulant les mélanocytes. Les fB-Ala"1", Om^l-octatiëcapeptides de la présente invention peuvent être transformés en complexes correspondants avec xa. .p -'.'il lourd formant des complexes (par exemple, le zinc, le cuivre, .« l'iris le nickel, le cobalt),- un polyamincacidc formant des complexes i par- exenple l'acide pclyelutarcique, l'acide poly? sparv-iof- i, e. ■ ccpclyçl-utaiByltyrosine, le cepcîya:. 'par ty iaci de glutamic-x; eu -■%cv i-: mélange de ces produits. Le-romt? ex.e présente une -xeei-lerts î-roprléte de longue durée d'action. p*r rapport an pept-jde •tinr-lc t Le ecrpiexe de métal lourd peut ntre préparé en 1*1 ci.i tar. - ^cc-.p-rrtae avec un compose ïrétalv Icird-.--tel qu'un n^lcge- 71 10181 15- 2085734 nure de métal lourd (par exemple le chlorure de zinc, le chlorure de cuivre, le chlorure de fer, le chlorure de cobalt, le chlorure de nickel), un acétate (par exemple l'acétate de zinc), un sulfate (par exemple le sulfate de zinc) ou un hydroxyde (par exemple 1' 5 hydroxyde de zinc) suivant une proportion approximative de 1:0,1-100 en poids, dans des conditions faiblement acides, de préférence à un pH de 6,5 à 7,0, d'une manière classique. Parmi les métaux lourds, le zinc est celui qu'on préfère. Le complexe de polyaminoacide peut être préparé en traitant le présent octadécapeptide a-10 vec un polyaminoacide suivant une proportion approximative de 1: 0,1-100 en poids, dans des conditions faiblement acides, de préférence à un pH de 6,5 à 7,0, d'une manière classique. Les poly-aminoacides utilisés sont des homopolymères ou des copolymères d' aminoacides et ils peuvent avoir la configuration L, D ou DL. Des 15 exemples des polyaminoacides préférés sont le poly-L-acide glutamique, le poly-D-acide glutamique, le poly-DL-acide glutamique, le poly-L-acide aspartique, le poly-D-acide aspartique, le poly-DL-acide aspartique, la copoly-L-glutamyl-L-tyrosine et le copoly-L-aspartyl-L-acide glutamique. Le poids moléculaire préféré du poly-20 aminoacide est approximativement de 1.000 à 100.000, en particulier de 2.000 à 6.000. On préfère utiliser le polyaminoacide qui a été au préalable neutralisé avec un alcali (par exemple la soude). D' autres additifs convenables tel qu'un produit de conservation (par exemple l'alcool benzylique, le phénol, le thimerosal), un tampon 25 (par exemple un phosphate, un carbonate, un citrate) ou un agent de transformation en produit isotonique (par exemple le chlorure de sodium) peuvent être ajoutés pour la préparation du complexe. On doit noter que les résultats expérimentaux décrits ci-dessus ne sont présentés qu'à titre d'exemples. Puisque les autres 350 [0-Ala1, Orn15]-octadécapeptldes ont presque les mêmes caractéristiques et les mêmes avantages en tant que médicaments que [p-Ala1, Orn15]-ACTH(l-l8)-NH2 décrits ci-dessus, les [p-Ala1, 0rn15]-octa-décapeptides de la présente invention sont très utiles et avantageux dans des buts thérapeutiques, par exemple pour le traitement 35 de rhumatismes articulaires aigus ou chroniques, pour les maladies dues à l'allergie ou les affections surrénales des êtres humains et des animaux domestiques, et pour l'expérimentation de la fonction surrénocorticale. Ainsi, les [p-Ala1, Orn15]-octadécapeptldes, leurs sels 40 d'addition avec les acides et leurs complexes peuvent être adminis- 71 10181 lê- 2085734 très par voie orale ou par voie parentérale, sous les formes classiques en soi, par exemple des injections, des liquides, des suspensions, des émulsions ou des aérosols, de manière facultative a-vec des supports, des produits de stabilisation, des émulsionnants, 5 des produits de conservation , des tampons, des agents de transformation en produit isotonique et/ou des agents de mouillage, tous ces produits étant convenables, lorsqu'une quantité, efficace au point de vue thérapeutique, de l'ingrédient actif est contenue. La dose efficace peut être facilement déterminée par les 10 médecins sur la base des résultats décrits ici. Par exemple, une gamme de doses cliniques typiques pour les présents octadécapeptldes est approximativement 0,2 U/kg à 0,8 XJ/kg pour un adulte normal. L'octadécapeptide est avantageusement administré sous la forme de dose d'une injection, et l'administration est répétée aussi souvent 15 qu'on l'exige selon l'indication du médecin. Les exemples suivants ne sont donnés qu'à titre d'illustration et non pas de limitation. EXEMPLE 1 (a) Ester méthylique de benzyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosine 20 Dans une solution de benzyloxycarbonyl-0-alanine (8,9 g) et d'ester méthylique de L-tyrosine (7,8 g) dans l'acétonitrile, on ajoute une solution de H,H'-dicyelohexylcarbodiimide (8,3 g) dans le dichlorométhane à 0°C. On laisse le mélange reposer toute la nuit à 0°C, et la dicyclohexylurée précipitée est retirée par 25 filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu, qui est dissous dans l'acétate d'éthyle. La solution est lavée avec de l'acide chlorhydrique H et une solution à 5 % de bicarbonate de sodium, séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite pour donner un résidu sirupeux 30 qui est cristallisé dans l'acétate d'éthyle. La recristallisation dans le même solvant donne le produit désiré (13,2 g) fondant à Il4-ll6°c'; [a]^ + 6,2 ± 0,4° (c - 1,040, méthanol). Analyse calculée pour C2iI*24^2°6 : C' ^*99 î H, 6,04 j N, 6,93. Trouvé : C, 62,94 ; H, 6,06 ; H, 6,85. 35 (b) Hydrazide de benzyloxycarbonyl-3-alanyl-L-tyrosine L'ester méthylique de benzyloxycarbony1-P-alany1-L-tyrosi-ne (4,8l g) est dissous dans l'éthanol (50 ml), et on ajoute de l'hydrazine (2,9 ml). On laisse le mélange reposer à la température ambiante pendant 2 à 3 heures et à 4°C toute la nuit. L'hydrazide 40 cristallin séparé est rassemblé par filtration, lavé avec de l'é- 71 10181 17. 2085734 thanol froid "et- séehé sous pression .réduite pour donner le produit désiré (4572 g), qui est traité avec de l'éthanol chaud. Son point de fasisa est 225-22â°e j fe]|6 + 3,9 - O,*!-0 (o = 1,032, acide a-sêticme à 50 £>).' • . 5 Analyse ealewlée pots3 ^2o^4%°5 * c* 59*99 I H, 6,04 j N, 13,S9* Trouvé % G, 60,09 S H, 6,16 j N, 13,97* • {e 5 aiéthylique de bensylosycarbonyl-g-alanyl-L-tyrosyl-L-aé- rias • L'îiyds'asise de benzylo3qrcarbonyl-{3-alanyl-L-tyrosine (2,40 3.0 g) 3Sfc dissous dans de la dinséthy lf ormainide (7 Ml), et, dans la scliviion., ©~i ajoute de l'acide chlorhydrique N (15 al). La solution as'g refrsddie &?ec de la glace et on lui ajoute du ni tri te de scdit-^ 213 refroidi par de la glace (3,6 ml). Le mélange est main» t-3Lïu à 0*C pendant 4 Eimites, et l'azothydrure précipité est ex-15 trait £Tàc. de l'acétate- d'éthyle refroidi par de la glace (25 «ci s 2}s 1-3;? extraits scsit- oorçfeinés, lavés avec une solution à 5 £ de foieart-fîn^-t-s de sodiu® refroidi par de la glaee et séohés sur du siîlfat-s d® .ï-c-diuK»e La solution résultante est ajoutée à une solution ekls-rhydrafce de l'ester méthylique de L-séri»e (0,93 g) et 20 de triétfeylaaine (0,84 si) dans du tétrahydrofuraae à 90 $ (20 al), et le r.:élaî?£s est agité à 4*0 pendant 48 heures. Les précipités •vss. sont. rassec&lés par filtration, la^és à l'eau, et se-ohér. pressiez réduite pour dernier 1® produit déliré {1,5? £V;-qui -set fe'u:L?-t© CLy'GC C3 \? '3t^ll3,310X OilS,Iï.ci 3 pOXHfc ôiS --33T- £5 195 - 1Ç6°C 3 [œ]|6 - 2,1 i 0,4° (c « 1,091, méthasoi). A»&l?s« calculée pour CgjjHg^Og s c» 59,13 I H, 5,00 3 S, 8,52. Trouvé s C, 59#29 1 H, 6*08 1 N- 3,63 = (d) Hyd?»a*ids de benzyloxycarbonyl-g-alanyl-L-tyrosyl-L-séri&e "Dans une solution d'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-30 »3«alsrîyl«»L s addition d'éthaDol, les cristauz sont rassemblés par filtra» tJ-"* • lavés avec • de l'éthanol et séché s sous pression rédui te pour 35 der-nor le produit désiré {1,40 g), qui est traité avec de l'étisa-nol sLaud pour derner 18hydrazide pur (1,32 g)-., •. fondant à 223-224" •• ( dé C1- -sposition) i ïaiîp + 15,7 - 0,5° .(c « l,v&5, acide acéta vu 3al^ulée poiar i C, 36,66 s H, 6.00 ; .*, 14, V. trouvé ? C, 56,35 * lî, 5,r.ij ; . 1*.. BA0 °R'Q/na(. 71 10181 2085734 (e) t-butyloxycarbonyl-tf-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylala-nyl-L-arginy1-L-tryptophy1-glycine Dans une solution d'acétate de L-histidyl-L-pfrénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-giycine (1,20 g) (préparé selon le procédé 5 décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan i96 (1970)) dans de la dimé-thylformamide à 50 % (10 ml), on ajoute i'escer p-nitrophényiique de l'acide t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-glutamique (1,03 g) et de la diméthylformamide (25 nil), et on laisse le mélange reposer a 4'C pendant 3 jours. Le mélange réactionnel est ajouté goutte â goutte 10 à un mélange de solvants formé d'acétate d'éthyle et d'éthes1 (1:1 en volume, 200 ml), et les précipités séparés sont rassemblés par filtration. Les précipités sont lavés à 1'acétate d'éthyle et a 1! éther et séchés sous pression réduite (rendement 1,86 g), Le produit est à nouveau dissous dans de l'acide acétique à 50 % (envi-15 ron 10 ml), et on ajoute de l'éthanol (environ 100 mi). La masse précipitée est rassemblée et lyophilisée à partir d'acide acétique •■".f pour donner le produit désiré (1,37 g) î - 23»9 - 0*6" K c = 1,020, acide acétique à ^0 %). \naxyse calculée pour C^H^N^Oj j ,CH^C00H.3Ho0 : C, 56,07 * H, .20 6,5? î H, 14,81 î CEjCO^ 3,79Î Trouvé : C, 56,40 ; H, 6,22 ; N, 15,40 ; CH^CO, 3,25. ( f ) t - but y 1 oxy c arbony1-L-mé thionyi-jf -benzyi-L-glutamyl-I.-mstidyl- * . «JKw»; „■>. i m ik'i.» ii ■■ un i Tin H ir —■» iniïïirn i ni' i ir r ir n i II ■— mm ■ 11 i » n n rUTi ■— miimn ■ ÎT iii^nin I mt mil iim—iiihi ■ i n m m "mm in L-phénylalanyi-L-arglnyl-L-tryptophyi-glycine 25 La t-butyloxycarbonyl-jf-benzyi-L-giutarayi-L-histiayl-L- nét'ylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyi-giycine (1,26 g) eut dissoute l'acide trifluoroacétique (6 ail), et la solution esc mam-' *r>ue à la température ambiante pendant 30 minutes. La solution ast r& jp ■ *■ ^ il» e dans un bain de glace, ec on ajoute de i'étner. L! 30 hexapeptide insultant, partiellement débloqué, sous forme de précipité (1,34 g) est dissous dans de la aiméthylformamide ^10 ml;, et dans la solution on ajoute ae la diéthylamine (0,46 ml et de l'ester p-nitrophénylique de t-butyloxycarbonyi-L-ffièthj.oninfc ^0,f4 g). Le arélange est maintenu à h°C pendant BAD ORIGINAL 71 10161 19. 2085734 op eétate d'éthyle pour donner le produit désiré (1,16 g) ; [aljj - 18,5 - °»5° (c = 1,072, diméthylformamide). Analyse calculée pour C^gH^^N^O^S.CH^COOH.SHgO : C, 54,23 ; H, 6,67 ; N, 14,18. Trouvé : C, 54,51 î H, 5 6,16 ; N, 13,94. (g) benzyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosyl-L-Béryl-L-méthionyl-X'-benzyl-L-glutamyl-L-hlstidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryp-tophyl-glycine La t-butyloxycarbonyl-L-méthionyl-ïf-benzyl-L-glutamyl-L-10 histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (1,09 g) est dissoute dans 1'acide trifluoroacétique (6 ml) contenant une goutte d?oau, en refroidissant avec de la glace. On laisse le mélange réactionnel reposer à la température ambiante pendant 30 minutes, et le trifluoroacétate d'heptapeptide résultant est préci-15 pité par addition d'éther. Les précipités sont rassemblés par filtration, bien lavés à l'éther, et séchés sous pression réduite (rendement 1,21 g). Un mélange d'hydrazide de benzyloxycarbonyl-0-alanyl-L-tyrosyl-L-sérine (0,86 g), d'acide chlorhydrique N (4 ml) et de di-20 méthylformamide (5 ml) est refroidi dans un bain de glace, et on ajoute goutte à goutte du nitrite de sodium 2M refroidi par de la glace (0,96 ml). Le mélange est agité à 0°C pendant 4 minutes, et on ajoute de la diméthylformamide refroidie par de la glace (10 ml) pour dissoudre 1'azothydrure précipité. Après addition de triéthyl-25 aminé (0,56 ml), la solution résultante est ajoutée à me solution de trifluoroacétate d'heptapeptide obtenu ci-dessus et de triéthyl-amine (0,49 ml) dans de la diméthylformamide refroidie par de la glace "(20 ml). On laisse le mélange réactionnel reposer à 0°C pendant 24 heures, et on ajoute de l'acide acétique (1 ml). Le sol-30 vant est retiré par évaporation sous pression réduite à une température de bain de 45°C pour donner un résidu sirupeux, qui est additionné d'éthanol (20 ml). La masse gélatineuse précipitée est rassemblée par filtration, totalement lavée avec de l'éthanol, de l'acétate d'éthyle et de l'ester et séchée sous pression réduite 35 (rendement 0,88 g). Le filtrat et les lavages sont combinés et concentrés sous pression réduite pour donner un résidu. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle, et les précipités insolubles sont rassemblés par filtration. Les précipités sont chauffés dans l'éthanol jusqu'au point d'ébullition, refroidis et séparés par 40 filtration (0,27 g). Le rendement total s'élève à 1,15 g. Les pré 71 10181 20. 2085734 cipités combinés sont purifiés par traitement avec de l'éthanol chaud j [°0p2 - 18,5 - 0,5° (c = 1,067, diméthylformamide), Rf = 0,75 (chromatographie sur couche mince avec du gel de silice dans un système.de solvants n-butanol-acide acétique-pyridine-eau = 30: 5 6:20:24), Rf = 0,80 (chromatographie sur papier dans un système de solvants n-butanol-acide acétique-eau = 4:1:2). Analyse calculée pour C^H^QN^gO^S.2CH^C00H.3H20 : C, 55,70 j H, 6,23 î N, 13,33. Trouvé : C, 55,71 j H, 10 6,06 ; N, 13,34. (h) Ester méthylique de Na-benzyloxycarbonyl-N£-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-orni-thine L'ester méthylique de Na-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxy- pO 15 carbonyl-L-ornithine [1,20 g, point de fusion 60-70°C, [oc]D -10,6 ±0,5° (c « 1,092, méthanol)] est hydrogéné sur un catalyseur en noir de palladium dans du méthanol contenant de l'acide acétique à 10 %, pendant 2 heures. L'évaporation du solvant sous pression réduite donne l'acétate d'ester méthylique de N^-t-butyloxycarbo-20 nyl-L-ornithine sous forme d'un résidu sirupeux, qui est traité a-vec une solution aqueuse à 50 % de carbonate de potassium dans du dichlorométhane à 0°C. La couche organique est séchée sur du sulfate de sodium et évaporée sous pression réduite à une température de bain de 20°C. Le résidu résultant est dissous dans du dichloro-25 méthane (10 ml), et, à la solution, on ajoute de la Na-benzyloxy-carbonyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycine (1,83 g) préparée selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan j5Z 1471 (1964). Dans la solution, on ajoute une solution de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0,60 g) dans du dichlorométhane à 30 0°C. On laisse le mélange reposer à 4°C pendant 2 jours. Après enlèvement de la dicyclohexylurée par filtration, le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu sirupeux. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle, lavé avec de l'acide chlorhydrique N et du bicarbonate de sodium M refroidis par de la 35 glace, séché sur du sulfate de sodium et concentré sous pression réduite. Le résidu résultant est à nouveau dissous dans l'acétate d'éthyle (30 ml) et additionné d'éther (30 ml) pour donner l'ester méthylique du pentapeptide désiré sous forme pure. Le rendement est 2,24 g j [a]^6 - 55,9 - 0,9° (c - 1,062, méthanol). 40 Analyse calculée pour c42®67^7®12 ! c' 7,83 ; N, 11,37. 71 10181 21. 2085734 Trouvé : C, 58,52 i H, 8,08 ; N, 11,33. (i) Hydrazide de Ng-benzyloxycarbonyl-N£-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-K^-t-butyloxycarbonyl-L-ornitMne L'ester méthylique du pentapeptide (2,2 g) obtenu ci-des-5 sus est dissous dans du méthanol (30 ml), et on ajoute de l'hydra-sine (0,26 ml). On laisse le mélange réactionnel reposer à la température ambiante pendant 3 jours, et 1'hydrazide est précipité par l'addition d'eau. Les précipités sont rassemblés par filtration et cristallisés dans le mélange méthanol-eau pour donner l'hy-10 drazide désiré (2,1 g), fondant à 175-l80°C ; [a]|5 - 35,8 ± 0,7° (c = 1,040, diméthylformamide). Analyse calculée pour g41H67N9°11 ; c' 57,13 ; H, 7,83 ; N, 14,62. Trouvé s C, 57,01 I H, 7*87 s N, 14,41. („j) Placétate d'amide de ag-be5.zyloxyearbonyl-Nc-fc-butyloxycarbo- 15 nyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'^-t-butyloxycarbonyl-L- ornlthyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine Dans une solution, refroidie par de la glace, de l'hydra- zide de pentapeptide (0,95 g) obtenue ci-dessus, dans du tétrahy- drofurane à 90 % (10 ml), on ajoute de l'acide chlorhydrique N 20 (2,75 ml) et du nitrite de sodium 2M (0,61 ml) refroidis par de la glace. On laisse le mélange reposer à 0°C pendant 5 minutes et on le règle à un pH de 7,4-7,6 par l'addition de triéthylamine (0,38 ml). Dans la solution, on ajoute une solution, refroidie par de la glace, de triacétate d'amide de N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L- 25 arginyl-L-arginine (obtenu à partir de 0,92 mmole d'amide de NŒ- benzyloxycarbonyr-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NG-nitro-L-arginyl-r1 N -nitro-L-arginine par hydrogénation catalytique selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 22 882 (1966)) et de la triéthyl-amine (0,42 ml) dans du tétrahydrofurane à 80 $ (7,5 ml). On laisse 30 le mélange reposer à 4°C pendant 3 jours et on le concentre sous pression réduite. Dans le résidu résultant, on ajoute de l'acétate d'éthyle (10 ml) et de l'acide acétique N (10 ml), et le mélange est bien agité. La phase aqueuse est extraite trois fois avec de l'acétate d'éthyle, et les extraits combines sont concentrés sous 35 pression réduite jusqu'à approximativement 10 ml. Le concentré est complètement extrait avec du n-butanol saturé d'eau. L'extrait est séché sur du sulfate de sodium et concentré sous pression réduite. Le résidu résultant est lyophilisé à partir d'acide acétique pour donner le produit désiré (0,85 g) ; t«]^2 - 43,1 - 1,5° (c = 0,540, 40 acide acétique à 50 71 10181 22- ■ 2085734 Analyse calculée pour CfillH11n01(rN-,Q.2CH,C00H.4Ho0 : C, 51,70 ; H, 8,04 , N, 15,96 : CH^CO? 5,11. 3 Trouvé : C, 51,60 ; H, 7,72 j N, 15,62 j CH^CO, 4,30. 5 (k) Amide de g-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-Rlycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arglnyl-L-arginlne Dans une solution de benzyloxycarbonyl-fî-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-3Cbenzyl-L-glutamyl-L-hlstidyl-L-phénylalanyl-10 L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (0,405 g) dans l'acide acétique (5 ml), on ajoute de l'acide chlorhydrique N dans l'acide acétique (0,5 ml), et le mélange est immédiatement lyophilisé, suivi d'un séchage sur des pastilles de soude. Le chlorhydrate de décapeptide ainsi obtenu est dissous dans la diméthylformamide (4 ml) avec de 15 la N-hydroxysuccinimide (0,104 g), et, dans cette solution, on a-joute une solution de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0,186 g) dans la diméthylformamide (2 ml). Le mélange est maintenu à 4°C toute la nuit. La dicyclohexylurée précipitée est retirée par filtration, et le filtrat est déversé dans un mélange de solvants refroidi par r.'V de la glace, formé d'acétate d'éthyle (50 ml) et d'éther (50 ml). Les précipités résultants sont séparés par filtration, lavés à 1' acétate d'éthyle et à l'éther, et séchés sous pression réduite pour donner l'ester actif de décapeptide (0,435 g). L'amide de Na-benzyloxycarbonyl-N^~t-butyloxycarbonyl-L- C 25 lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N -t-butyloxycarbonyl-L-ornithyl-N -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine (0,230 g) est hy-dr<>gènée sur du palladium, en tant que catalyseur, dans du méthanol ( > % contenant de l'acide acétique (0,1 ml) pendant 3 heures. A-. " - ement du catalyseur, le filtrat est concentré sous presse -n réduite pour donner un résidu sirupeux, qui est lyophilisé à d'acide acétique pour donner 0,262 g de poudre. Ce produit est dissous dans la diméthylformamide (2 ml), et on ajoute de la tri-éthylamine (0,2 ml). Dans la solution, on ajoute une solution de 35 l'ester actif de décapeptide (0,435 g) obtenu ci-dessus dans la diméthylformamide (1,5 ml), et on laisse reposer le mélange à 4°C pendant 45 heures. Ensuite, le mélange réactionnel est déversé dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (100 ml), et les précipités formés sont rassemblés par filtration. Les précipités sont lavés à l'acétate d'éthyle et à l'éther, lyophilisés à partir 40 de l'acétate d'éthyle et séchés sur des pastilles de soude sous 71 10181 2085734 pression réduite pour donner l'octadécapeptide protégé brut (0,662 g)« L'octadécapeptide protégé (0,646 g) est traité avec de 1' acide fluorhydrique gazeux (environ 10 ml) à 0°C pendant 60 minutes, 5 en présence d'anisol (0,6 ml) et de L-méthionine (0,12 g). Après enlèvement d'acide fluorhydrique gazeux par évaporation, le résidu est dissous dans de l'eau refroidie par de la glace, et la solution est lavée avec de l'acétate d'éthyle. On fait passer la solution à travers une colonne (1,7 x 15 cm) du produit dit Amberlite 10 CG-400 (forme acétate). La colonne est bien lavée avec de l'eau, et les solutions aqueuses sont rassemblées. La solution est concentrée à un faible volume et lyophilisée. Le peptide brut débloqué (0,704 g) est soumis à une chromatographie sur une colonne (2,7 x 32 cm) de carboxyméthylcellulose (dite Serva, 0,56 meq/g) en uti-15 lisant un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,5, 2.000 ml) avec un gradient de concentration linéaire de 0,025 à 0,6 M. Des fractions de 10 ml sont rassemblées, et on enregistre l'absorption à 280 my. Les fractions correspondant à un pie principal (tubes n° 153-180) et à sa saillie (tubes n° 181-200) sont séparément rassemblées, et 20 la masse du solvant est retirée par évaporation sous pression réduite à une température de bain de 50-55°C. Les résidus sont lyophilisés jusqu'à poids constant pour donner 228 mg (P-l) et 62 mg (F-II) de poudre incolore duveteuse, provenant des premières fractions et de la dernière, respectivement. P-I (228 mg) est chroma-25 tographié à nouveau sur une colonne de carboxyméthylcellulose (2,2 x 27 cm) de la même manière que celle indiquée ci-dessus, et le peptide purifié (195 mg, F-I-l) est obtenu à partir d'un seul pic. Une petite saillie du pic donne F-I-2 (20 mg). F-II (62 mg) et F-1-2 (20 mg) sont combinés et la purification chromatographique est 30 répétée deux fois pour donner une quantité supplémentaire du peptide pur (46 mg). Le rendement total en octadécapeptide ainsi obtenu s'élève à 241 mg. [œ]|2 - 55,4° (c - 0,5, acide acétique 0,1 N), UvAJJ^ °'m = 279 >«ii ^ oii )t ^ \ HCl 0,1N oRO m/i $ T7 \ NaOH 0,1N ofti J (Elcm 24'4)' A saillie = 288 f (Elcm 1?'8)' ^max = 281 y 9>> 288 y 25'0)- Le rapport d'aminoacides dans un hydrolysat par un acide est le suivant : sérine 0,83, acide glutamique 0,96, proline 1,04, glycine 2,09, valine 1,00, méthionine 1,03, tyrosine 1,03, phényl- 40 alanine 0,98, 0-alanine 0,93, ornithine 1,11, lysine 1,95, hystidi- 71 10181 24. 2085734 ne 0,97* arginine 3*07. Le rapport tryptophane/tyrosine dans le peptide intact a été déterminé par voie spectrophotométrique à une valeur de 1,15. EXEMPLE 2 5 (a) t-butyloxycarbonyl-g-alanine De la P-alanine (8,91 g) est dissoute dans de la soude N (100 ml) et, dans cette solution, on ajoute du bicarbonate de sodium (21,0 g) et du dioxane (70 ml). La solution est agitée à 50°C, et on ajoute goutte à goutte une solution d'azidoformiate de t-bu-10 tyle (17,2 g) dans le dioxane (30 ml). Le mélange a été agité pendant 41 heures et demie à 50°C et concentré sous pression réduite jusqu'à environ 100 ml. Le concentré est refroidi avec de la glace et réglé à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 4N (180 ml). La solution est extraite avec de l'acétate d'éthyle refroidi par de , 15 la glace (environ 100 ml), séchéesur du sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite pour donner un résidu sirupeux. Le résidu est recristallisé dans le mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole pour donner 12,66 g du produit désiré, fondant entre 77 et 78°C. 20 Analyse calculée pour CgH^NO^ : C, 50,78 j H, 7,99 ; N, 7,40. Trouvé î C, 50,99 ; H, 8,06 j N, 7»^7. (b) Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-L-tyrosine Le chlorhydrate d'ester méthylique de L-tyrosine (3,48 g) est dissous dans l'eau (15 ml). Dans la solution, on ajoute une so-25 lution à 50 % de carbonate de potassium (5 ml) en refroidissant par de la glace, et on laisse le mélange reposer dans un endroit froid pendant 40 minutes. Les cristaux séparés sont rassemblés par filtration, totalement lavés à l'eau froide, et séchés sous pres-30 sion réduite pour donner 2,55 g d'ester méthylique de L-tyrosine. D'autre part, de la t-butyloxycarbonyl-p-alanine (1,89 g) est dissoute dans du tétrahydrofurane anhydre, et la solution est refroidie'jusqu'à -10°C. Dans la solution, on ajoute lentement successivement de la tri-n-butylamine (2,04 g) et du chloroformiate d'éthyle (1,19 g) en agitant. Après 10 minutes, on ajoute une sus-35 pension d'ester «éthylique de L-tyrosine (1,95 g) obtenu ci-dessus dans du tétrahydrofurane anhydre (20 ml). Le mélange est agité à -10°C pendant 30 minutes et à la température ambiante pendant 2 heures 1/2, et le solvant est retiré par évaporation sous pression réduite. Le résidu résultant est dissous dans l'acétate d'éthyle, 40 lavé successivement avec de l'acide chlorhydrique N, de l'eau, du 71 10181 25. 2085734 bicarbonate de sodium à 5 % et de l'eau, et séché sur du sulfate de sodium. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est additionné d'éther pour précipiter des cristaux. Les cristaux séparés sont rassemblés par fil-5 tration et séchés sous pression réduite pour donner 2,99 g du produit désiré. La recristallisation dans le mélange méthanol-éther donne des cristaux fondant entre 141 et 142°C ; + 8,2 - 0,5° (c = 1,020, méthanol). Analyse calculée pour ci8H26N2°6 : C' 59*00 j H, 7*15 * N, 7*65. 10 Trouvé : C, 59*03 j H, 7*12 ; N, 7*63. (c) Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-g-alanyl-L-tyrosine L'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-(3-alanyl-L-tyrosine (2,56 g) est dissous dans de l'éthanol anhydre (26 ml). On ajoute à la solution de l'hydrate d'hydrazine (1,7 ml)» et le mé-15 lange est maintenu à la température ambiante pendant 5 heures et dans un endroit froid toute la nuit. Les cristaux formés sont rassemblés par filtration, lavés à l'éthanol et à l'éther, et séchés pour donner 2,54 g du produit désiré. La recristallisation dans 1' eau chaude donne des cristaux, fondant entre 213,5 et 215°C ; [a]jjp 20 + 3*6 - 0,6° (c = 0,978, acide acétique à 50 %). Analyse calculée pour C17H16N405 . 0) . H> ?^ . N> 15>29_ Trouvé : C, 55,71 S H, 7,11 ; H, 15,30. (d) Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-g-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-mé thionine 25 L'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-L-tyrosine (1,10 g) est dissous dans de l'acide chlorhydrique N froid (7,5 ml). La solution est maintenue à environ -10°C, et on y ajoute du nitrite de sodium 2M froid (3,6 ml). Après qu'on ait laissé le mélange reposer pendant 4 minutes, 1'azothydrure formé est l'extrait à 1' 30 éther, lavé avec du bicarbonate de sodium M froid et séché sur du sulfate de sodium anhydre. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite à une température de bain d'environ 10°C, le résidu résultant est dissous dans l'acétonitrile froid. Dans la solution, on ajoute l'ester méthylique de L-séryl-L-méthio-35 nine (0,756 g) (préparé selon le procédé décrit dans Bull. Ohem. Soc. Japan 1171 (1966)), et on laisse le mélange reposer pendant 48 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu est dissous par l'addition d'acétate d'éthyle et d'une faible quantité d'eau. La solution est lavée suc-40 cessivement avec de l'acide chlorhydrique N froid, de l'eau, une 71 10181 26. 2085734 solution à 5 £ de bicarbonate de sodium et de l'eau, et séché sur du sulfate de sodium. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, la masse gélatineuse résultant est refroidie par filtration, lavée avec de l'acétate d'éthyle froid et de 5 l'éther, et séchée pour donner le produit désiré avec un rendement de 1,204 g. Le produit est purifié par la précipitation dans l'acétate d'éthyle ; son point de fusion est 121,5 à. 123°C ; - 13,0 t 0,6° (c « 0,997, aéthanol). Rf «= 0,53 (chromatographie sur couche mince avec du gel de silice 10 dans un système de solvants aéthanol-acide acétique = 15:85 en volume ). Analyse calculée pour C26H40K4°9S ** c* 52,41 j H, 6,90 î H, 9,58 j S, 5,48. Trouvé : C, 52,94 ; H, 6,85 ï H, 9,65 î 15 S, 5,48. (e) Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionine L'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-0-alanyl-L-tyro-syl-L-séryl-L-aéthionine (0,969 g) est dissous dans de la diméthyl-20 formamide (6 ml). Dans la solution, on ajoute de l'hydrate d'hydra-zine (0,5 ml), et on laisse le mélange reposer dans un endroit froid pendant environ 43 heures. La solution est additionnée d'acétate d'éthyle pour donner une substance gélatineuse qui est rassemblée par filtration, lavée à l'acétate d'éthyle froid et séchée 25 pour donner 1,01 g du produit désiré. La recristallisation dans l'eau donne des cristaux fondant entre 186,5 et l88°C. -20,1 - 0,5° (c = 1,346, méthanol à 50 %). Analyse calculée pour e^H^QOgNgS.HgO : C, 49,82 ; H, 7,02 ; N, 13,94 , 3, 5,32. 30 Trouvé : C, 49,72 ; H, 7,05 : N, 14,50 i s, 5,15. (f) t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-y^ t-butyl^L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryp-tophyl-glycine 35 L'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosyl-L- séryl-L-méthionine (0,452 g) est dissous dans de la diméthylformamide à 90 % (4,5 ml), et la solution est refroidie dans un bain de sel-glace. Dans la solution, on ajoute de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace (2,0 ml) et du nitrite de sodium M (0,825 40 ml), tout en agitant. Après environ 4 minutes, une solution refroi 71 10181 27. 2085734 die par de la glace (20 ml) saturée de chlorure de sodium est ajoutée et l'azothydrure de t-butyloxycarbonyltétrapeptide est extrait avec de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace. L'extrait est lavé avec du bicarbonate de sodium à 5 % refroidi par de la glace 5 et séché sur du sulfate de sodium anhydre. L'acétate de ^-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylala-nyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (0,496 g) (préparé selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 28 1148 (1965)) et de la triéthylamine (0,21 ml) sont dissous dans la diméthylformamide (15 10 ml). Dans cette solution, on ajoute une solution de l'azothydrure obtenu ci-dessus dans l'acétate d'éthyle, et l'acétate d'éthyle est retiré par évaporation sous pression réduite à une température de bain de 10-15°C pour donner une solution claire, qu'on laisse reposer toute la nuit dans un endroit froid. Une quantité supplé-15 mentaire de l'azothydrure préparé à partir de l'hydrazide de tétra-peptide (0,226 g), tel que mentionné ci-dessus, est ajoutée à la solution, et on laisse le mélange reposer toute la nuit dans un endroit froid. Ultérieurement, le mélange est ajouté goutte à goutte à 20 de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (200 ml), tout en agitant. Les précipités formés sont rassemblés par filtration pour donner 0,691 g du dérivé de décapeptide brut, qui est reprécipité dans le mélange diméthylformamide-méthanol (2:5 en volume) et lyophilisé à partir d'acide acétique pour donner une poudre avec un 25 rendement de 0,454 g. La chromatographie sur couche mince du produit arec du gel de silice donne une seule tache ayant une valeur de Rf de 0,54 à 0,57. Le produit a un pouvoir rotatoire optique spécifique de [a-19,4 i 0,7° (c = 0,882, diméthylformamide). 30 Analyse calculée pour CggH^N^O^S.SHgO : C, 51,57 » H, 7,°0 ; N, 14,15 5 S, 2,02. Trouvé : C, 51,62 j H, 6,66 ; N, 14,06 ; S, 2,64. D'une manière semblable à celle décrite dans l'exemple 1 35 (k), la t-butyloxyearbonyl-0-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-iCt-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-trypto-phyl-glycine est condensée avec 1'amide de N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-ornithyl-N -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine et 1'octadéca-40 peptide protégé résultant est traité avec de l'acide fluorhydrique 71 10181 28. 2085734 pour donner 1'octadécapeptide débloqué". Après purification chro-«atographique du produit, on obtient sous forme pure l'amide de f3-alanyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyeyl-L-or-5 nithyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine. Ce produit était identique à 1*octadécapeptide obtenu dans l'exemple l(k) au point de vue du pouvoir rotatoire optique [«]D, du spectre dans l'ultraviolet, des rapports d'aminoacides et des propriétés biologiques. EXEMPLE 3 10 L'acétate de [p-Ala1, Orn15]-ACTH(1-18)-NH2 (0,5 mg) est dissous dans du chlorure de zinc 40 mM (0,25 ml) à la température ambiante, et, dans cette solution, on ajoute une solution (0,25 ml) de phosphate acide disodique 40 mM contenant du chlorure de sodium (4,5 mg). Ainsi, on obtient une suspension du complexe désiré, et 15 elle est réglée à un pH de 7,0 par addition de soude 0,1 N. EXEMPLE 4 L'acétate de [p-Ala1, 0rn15]-ACrEH(l-l8)-NH2 (0,5 ag) est dissous dans de l'eau distillée (0,15 ml). Dans la solution, on a-joute une solution (0,1 ml) de poly-L-acide glutamique (0,5 mg ; 20 poids moléculaire environ 1.500-2.000) qui a été neutralisée au préalable avec de la soude 0,1 N. Le mélange est agité pendant plusieurs minutes, et on y ajoute une solution (0,25 ml) de tampon phosphaté M/30 contenant du chlorure de sodium (4,5 mg). La préparation de complexe résultante est réglée à un pH de 7,0 avec de la 25 soude 0,1 N. EXEMPLE 5 De l'acétate de [0-Ala1, Orn15]-ACTH(1-18)-NH2 (1,0 mg) est dissous dans de l'eau distillée (0,2 ml). Dans la solution, on ajoute en agitant une solution de poly-L-acide aspartique (2 mg j 30 poids moléculaire environ 3•000) qui a été neutralisée avec de la soude 0,1 N (0,3 al) avant utilisation, et ainsi on forme line suspension dë précipités blancs. La suspension désirée du complexe est préparée en ajoutant à la suspension une solution (0,5 ml ; pH 6,8) de phosphate acide disodique/phosphate diacide de potassium 35 M/15 contenant du chlorure de sodium (9,0 mg) et en réglant la suspension à un pH de 7,0 avec de la soude 0,1 N. EXEMPLE 6 De l'acétate de [p-Ala1, Orn15]-ACTH(l-l8)-NH2 (0,5 mg) est dissous dans du chlorure de zinc 100 mM (0,15 ml). D'autre 40 part, du poly-L-acide glutamique (0,5 mg ; poids moléculaire envi 71 10181 29. 2085734 ron 2.000 - 3.000) est neutralisé avec de la soude 0,1 N (0,1 ml) et, dans la solution, on ajoute du chlorure de sodium (4,5 mg) et du phosphate acide disodique 40 mM (0,25 ml). Les solutions ainsi obtenues sont combinées et agitées à la température ambiante pour 5 constituer une suspension du complexe désiré et neutralisées avec une quantité appropriée de soude 0,1 N. EXEMPLE 7 De l'acétate de [0-Ala1, Orn15]-ACTH(l-l8)-HH2 (0,5 mg) est dissous dans l'eau (0,1 ml) à la température ambiante, et on 10 y ajoute une solution M/15 de phosphate diacide de potassium/phosphate acide disodique (0,25 ml) contenant 4,5 mg de chlorure de sodium. La copoly-L-glutamyl-L-tyrosine (2,0 mg) (poids moléculaire 21.850) est neutralisée par l'addition de soude 0,1 N (0,15 ml). La solution neutralisée est ajoutée à la solution de peptide obte-15 nue ci-dessus et le mélange est agité pour constituer une suspension du complexe désiré, qui est réglée à ion pH de 7,0 avec de la soude 0,1 N. EXEMPLE 8 De l'acétate de [0-Ala1, Orn15]-ACTH(l-l8)-NH2 (0,5 mg) 20 est dissous dans l'eau (0,1 ml), et on y ajoute une solution M/15 de tampon phosphaté (0,25 ml) contenant 4,5 mg de chlorure de sodium. De la copoly-L-glutamyl-L-tyrosine (7 mg ; poids moléculaire environ 21.850) est neutralisée avec de la soude 0,1 N. La solution neutralisée (0,1 ml) est ajoutée à la solution de peptide obtenue 25 ci-dessus pour donner une suspension qui devient immédiatement claire. Dans la solution, on ajoute du thimerosal (0,1 mg) dans l'eau (0,05 ml), et la solution claire résultante est réglée à un pH de 7,0 par l'addition de soude 0,1 N. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de 30 réalisation qui viennent d'être décrits, elle est contraîre susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. 71 10181 30. 2085734 REVENDICATIONS 1 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant d1octadécapeptides représentés par la formule : p-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-X-Y-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-5 L-tryptophyl-glyeyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyi-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-Z dans laquelle X est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-méthionine, de reste de L-norva-line, de reste de L-norleucine, de reste de L-leucine et de reste d'acide a-aminobutyrique ; Y est un membre choisi dans le groupe 10 se composant de reste d'acide L-glutamique et de reste de L-gluta-mine et Z est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste d'ester de L-arginine et de reste d'amide de L-arginine j de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 15 2 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant d'octadécapeptides représentés par la formule ï 0-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phé-nylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-g?Lycyl-L-ornlthyl-L-lysyl-L-arginyl-Z dans laquelle Z est un mem-20 bre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste d'ester de L-arginine et de reste d'amide de L-arginine5 de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 3 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le 25 groupe se composant d'un octadécapeptide représenté par la formule suivante : amide de P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glu-tamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argi-ses sels non toxiques d'addition avec les acides et de ses 30 complexes.