Brevet FR2065659A1 — publié le 19710806

La présente invention concerne des compositions pour déterminer l'enzime tranearinase glutamique oxalacétique dans des humeurs corporelles, et, jj--lus particulièrement, une composition sèche d'un ri actif qui est • st-ûile pi.i?.cL\-nt des durées prolongées, 5 nêiie à des tempéracures élevées» L'enzime transaminase glutanir-ue oxalacétique catalyse la réaction réversible de l'acide L-aspartique et de l'acide al-pha-cétoglutarique en acide L-glutamique .et acide oxalacétique« Cette réaction particulière est devenue importante en médecine 10 clinique avec le rapport .de LaDue, 7/roblewski et Karmen en "1954-, disant que la transaminase glutamique oxalacétique est élevée dans le sérum sanguin après une occlusion- coronaire. De façon conventionnelle, les méthodes pour déterminer la concentration de transaminase glutamique oxalacétique présente dans le prélève-15 ment échantillon utilisent comme substrats les acides aspartique et alpha-cét^oglutarique, ou leurs sels correspondants, et déterminent la vitesse de formation de l'acide glutamique ou de l'acide oxalacétique, ou de leurs sels correspondants, par un système de réactions couplées» La technique la plus marquante et la plus 20 acceptable est basée sur la réaction de l'acide oxalacétique et de la disphosphopyridine nucléotide réduite (DPMI) qui, en présence de déshydrogénase malique, forme de l'acide malique et de la diphosphopyridine nucléotide (DHT) o Dans la mesure où le DH-TH a un pic d'absorption maximal à 34-0 millimicrons alors que■le DP1T 25 ne l'a pas, la vitesse de décroissance de-l'absorption à 34-0 millimicrons est une mesure de la vitesse de trarsamination et donc de la concentration de transaminase glutamique oxalacétique dans l'échantillon,, * Des progrès récents en chimie clinique et dans les sys-50 tèmes cliniques automatisés ont clairement suggérés que de nombreux systèmes analytiques futurs seront basés sur des produits chimiques pré-emballés, dans lesquels les produits chimiques seront .pré-stockés, sous forme stable,, dans un paquet d'essai disponible» Les avantages d'un tel système sont, entre autres, que 35 le technicien ne doit pas préparer les • ri, a et if s au moment de 1' analyse, évitant ainsi des erreurs produires" par une mauvaise préparation du réactif, eû que le récipient d'essai peut être 3été sprè;: usrre, évitant ainsi 1b possibilité de contaminations croisées par us^-re répété lu ::êiïe récipient d' ecsai._.videnrient, lovz rj : 1-jz .. ,'u. -.;i"cs cr.i.xi -nés son-; pré-onb-'ll s er. u_: pn-:uc t 70 15814 2» 2065659 d'essai disponible, ceci implique des périodes de stockage longues entre le moment où la composition réactive est préparée et l'analyse» II.est donc souhaitable-et nécessaire de posséder des compositions réactives stables pendant de longues périodes, à 1* 5 ambiance ou à températures élevées, de telle sorte que la composition ne sera pas dégradée lorsqu'elle ne sera pas utilisée immédiatement ni dans un laps de'temps raisonnable après préparation® Avec de telles compositions stables, l'utilisation finale d'analyseurs automatiques "basés sur la conception du pré-emballa- . 10 ge disponible peut donner un grand degré de fiabilité aux données obtenues qui, dans le cas présent, réfléchiront de façon e-xacte la concentration de la transaminase glutamique oxalacétique dans l'échantillon» Dans le passé, les problèmes de stabilité avec la déshy-15 drogénase malique ont été si importants et/ou le coût de la production de déshydrogénase malique stabilisée si élevé:que l'enzime devait être fraîchement préparée ou être stockée dans des installations frigorifiques. Ces problèmes ont récemment -poussé à l'utilisation de méthodes chimiques.sans enzimes, non spécifi-20 ques, pour déterminer la transaminase glutamique oxalacétique, méthodes moins souhaitables parce que non spécifiques» En accord avec cela, il serait souhaitable de posséder une préparation thermiquement stable de déshydrogénase malique pouvant être stockée pendant de longues périodes à la température ambiante ou à 25 des températures peu élevées, sans perte nuisible d'activité» C'est donc un objet de l'invention de fournir une déshydrogénase malique sous une forme thermiquement stable» G'est un objet de l'invention de fournir un extrait contenant'de la déshydrogénase malique qui.est suffisamment .stable 30 pour ne pas nécessiter de stabilisants externes pour attei&dre une longue durée de vie en magasin» C'est un objet de l'invention de fournir une méthode pour l'extraction de déshydrogénase malique sous une forme stable o 35 - C'est un objet de l'invention de fournir uné prépara tion stable de déshydrogénase malique pour la détermination de la transaminase glutamique oxalacétique dans des humeurs corporelles. C'est un objet de 15 invention de fournir une nouvelle 40 préparation de déshydrogénase malique pour déterminer la tr:-.nss— » - ^ BAD ORIGINAL ) 1 70 15814 3o 2065659 minas© glutamique oxalacéticue dan,: le sérum sanguine C'est un autre objet de l'invention de fournir une nouvelle préparation de déshydrogénase nalique pour du terminer la transaminase glutamique onal-acéti ue du sérum, préparation sta-5 oie pendant de longues périodes à températures élevées,, - C est encore un autre ci. jet do l'invention du fournir une méthode pour déterminer la transaminase glutamiras oxalacétique dans des humeurs corporelles en utilisant une nouvelle composition réactive décrite ici. 10 D'autres objets, caractéristiques et h vanta*;eu de' 1' invention apparaîtront de la description détaillée, donnée ci-dessous, de modes de réalisation exenplatifs» les objets de l'invention sont atteints selon ces modes de réalisation de l'invention en isolant de la déshydrogéna-15 30 malique de graines ae plantes et en utilisant l'enzime extraite en préparations, de préférence sèches, pour déterminer la transaminase glutamique oxalacétique dans des humeurs corporelles» Des graines de plantes oonven-blés comprennent celles du type monocotymédonc et dicotylédone» I.!'ne famille particulièrement 20 importante" de '-raines de niantes rentrant dans la grande famille des dicotyléJones est la famille des légunineuses ou des pois, dont les représentants comprennent des pois et des fèves de tous types, iiont particulièrement appropriées pour la présente invention comme source pour l'extrait d'enzime, les- graines de pois 25 jaunes et de pois à oeil noir, etc. D'autres -'raines dicotylédones comprennent : haricots blancs, haricots verts, etc» Dans la famill dicotylédone, désliydr ogénase malique obtenue de graines de la famille des graminées ou de l'herbe se sont montrées thermiquement stables» L'enzime de dashydrogén--->se malique 30 extraite selon le mode opératoire décrit plus bas a été trouvée plus staola qu--- les préparations commerciales de d,3_;y...rogénr-ce malique obtenues de sources animales, par exe mol.; de coeurs de porcs ou de poulets, et qui utilisent des aditifs stabilisants» De plus, des études de lyophilisation e-t de mise en tablettes 55 ont montré que la dé shydroaamva.se mali ue iuol'e de vrainen dico-tyléicnes est bien plue- aé-oée en préparations sèches ou en tablettes que las arép; a riions séchas correspondantes utilisant la déshydror:ônase malique obtenue de sources animalaso L'enzime de 1.: présente invention, sous sa forme extraite, est donc mieux ap-40 propriée pour un usaqa la as des préparations sèches de réactifs 70 15814 2065659 formulées pour unus-ge dans des sytèmes automatiques d'analyse "basés sur la conception du pré-emballage décrite plus kaut» L'enzime est isolée suivant le mode opératoire suivant: 5 Les graines sont pulvérisées en poudre fine, par exem ple jusqi-'à passer à travers un crible de 200 mailles, soit à la main avec un mortier et un pilonsoit avec un pulvériseur automatique tel que le micro-broyeur de la Chemical iîubber Company® De façon typique, les graines peuvent être pulvérisées en la pou-10 dre fine désirée avec le micro-broyeur en environ 2 à environ 5 minutes. La poudre pulvérisée .est mélangée avec un liquide aqueux ou'une solution froids, et. est agitée doucement, pendant environ 15 à environ 60 minutes, généralement de, l'ordre d'environ 20-30 minutes,dans un bain de glace» Un liquide d'extraction convenable 15 est l'eau distillée» Une solution exempl-ative est une solution saturée de chlorure de potassium qui peut être aélangôe à la poudre pulvériség danj le rapport d'environ 5 nOL -le- solution saturée pour environ 1 gratine 'de poudre » Jes. solutions der sels à con-centr -:-f.b-^fe3;. sel inférieure peuvent être utilisées* i;ais leur 20 rendement n'a pas été trouvé aussi grsi-d qu'avec la solution saturée» Oonne l'eau distillée donne un rendement environ 1%b supérieur à la solution saturée, elle est à présent le matériau d' extraction préféré» La suspension est ensuite centrifugée dans une centri-25 fumeuse réfrigérée jusqu'à ce que l'on obtienne un liquide surnageant clair, de façon typique pendant environ 15 minutes à 35000 G-» Le liquide cloir surnageant est recueilli et lyophilisé en une poudre sèclie qui contient la déshydrogénase malique stable de la présente invention» Le procédé d'isolaient, de, courte 30 durée en ce que le liquide extracteur est de façon typique en contact avec la fine poudre pendant moins d'une heure, isole apparemment la déshydrogénase malique en même temps que différentes autres matières, qui se trouvent naturellement dans la matière de départ ou matière première, qui peuvent agir comme stabi-35 lisants naturels» A ce propos, il faudrait notex^ l'absence d'une longue opération d'imbibition, dans laquelle la matière première est maintenue en contact avec une solution extractrice pendant line période prolongée» I)e telles opérations d'imbibition extraient même d'autres matières naturélles, généralement colorées, qui 40 forment des solutions troubles qui, à leur tour', interfèrent avec v" fcAD ORIGINAL i_, , . . * 70 15814 5° 2065659 la vérification de la transaminase glutamique oxalacétique et, de ce fait, rendent ces extraits inappropriés pour un usage dans des préparations analytiques» Donc, le procédé d1extraction,dans lequel la matière première est finement pulvérisée et est soumi-5 se à une courte opération d'extraction, comme dit plus haut, est extrêmement important parce qu'il permet l'isolement de l'enzime sous une forme stable sans nécessiter l'addition de stabilisants externes pour obtenir l'a stabilité thermique, comme c'est normalement requis lorsque des préparations de déshydrogénase mali-10 que sont obtenues de sources animales et/ou ne sont pas fraîchement préparées» Les exemples suivants sont donnés pour permettre à ceux qui s'y connaissent en la matière de mieux comprendre la mise en oeuvre de l'invention» Ces exemples ne doivent pas être considé— 15 ^és comme des limitations de l'invention, mais simplement comme des illustrations. Exemple 1 Des graines de pois jaune, sous forme de pois cassés, sont réduites en une fine poudre avec un micro-broyeur Chemical 20 Subber Company» La poudre de graines est mise en suspension dans une solution saturée de chlorure de potassium dans le rapport de 1 gramme de poudre pour 5 ml de la solution saturée de chlorure de potassium, et lron agite doucement pendant 30 minutes dans un bain de glace» La suspension est centrifugée, dans une centri-25 fugeuse Sorvall (Modèle 3C2-B) réfrigérée, pendant 15 minutes à 3000 G. Le liquide clair surnageant est recueilli et est lyophilisé, la poudre sèche obtenue contenant la déshydrogénase malique thermiquement stable de la présente invention» • La déshydrogénase malique isolée était formulée avec 30 les matières suivantes en tablettes convenant pour déterminer la transaminase glutamique oxalacétique dans le sérum sangiiin» déshydrogénase malique 1,000 milligramme phosphate acide bisodique 5,576 milligrammes phosphate acide monosodique 0,68h milligramme 35 - L-aspartate, sel de potassium 19,360 milligrammes polyvinylpyrollidone (FVP K-15) 0,>15 milligrammes ■ PiiG—40C0 (Polyéthylène glycol) 1,836 milligrammes Dana la formulation ci-dessus, 1'activité de la déshydro^onase malique est équivalente à 450 unités par milligramme, une unité 40 d'activité étant; definie corne le changement du pouvoir d'absorp 70 15814 5' 2065659 tion, à 340 millimicrons, de 0,001 unité de densité optique par minute (x 1000) à 32°C= ' Le tableau- suivant illustre la stabilité thermique de la déshydrogénase malique isolée à partir de graines de pois jau-5 nés, selon le -procédé d'extraction de la' présente invention, en tablettes de la formulation donnée plus haut» TABLEAU 1 Essai Unités/tablette 2 jours, -4° C 480 10 (Contrôle) 2 jours, W G 500 2 jours, 50° C 450 10 jours, 40° C ; 480 10 jours, 50° C . 450 15 Les résultats des études de stabilité* donnés au Ta bleau 1, montrent la stabilité thermique des formulations en tablettes à des températures élevées,- bien supérieures à la température ambiante,. Les données suggèrent clairement-que- les formulations seront stables pendant de bien,plus longues périodes, de 20 l'ordre d'au moins 3 à 4 mois, à la température ambiante, cette stabilité étant obtenue en l'absence de stabilisants externes.Il faudrait remarquer que la variation de moins de 10?& des tablettes après 10 jours à 50°C rentre bien dans les limites souhaitables pour des enzymes maintenues à la température donnée pendant 25 la période donnée. Une étude similaire de stabilité thermique portant sur une préparation commerciale de déshydrogénase malique obtenue de sources animales et stabilisée par des stabilisants externes donnait une perte dlactivité de 25% après 2 jours à 50°C et une, perte d'activité de 50% après 10 jours à 50°C» 30 Six essais sériques pour la transaminase glutamique o— xalacétique, 3 normaux et 3 anormaux (faiblement, moyennement et très fortement anormaux) étaient effectués en utilisant des tablettes des formulations ci-dessus et étaient comparés à des valeurs de contrôle obtenues par une technique de vérification con— 35 ventionnelle par voie humide utilisant la déshydrogénase malique ïype 410-9 de °igraa Chemical Company, préparation de déshydrogénase qui, selon le fabricant, a très peu d'activité transaminase» Les valeurs de contrôle étaient date nainees selon le aode opératoire de Henry et al, An» J. Clin» Pathol. 34, 381 (196^)» une u~ 40 nité d'activité de trarsfalinase glutamique or-ralacétique du s-^rum. 70 15814 2065659 étant définie couine un changement de pouvoir d'absorption, à 340 millimicrons, de 0,C01 unité de densité optique/minute par ml de sérum, à 5LL°C, Dans la vérification par voie humide avec la déshydrogénase malique iiiî-jns de contrôle, 1000 unités de 5 déshydrorrén-se malique furent utilisées, tondis que $'00 unités («- tablettes) de la dési:yoro-téne. se ïaalijue stabilisée ds 1" présente invention furent ui- Usées dans le mode opératoire analytique correspondant o .tUi"! élen nr 1-» -toc'.o ot!Aratoire de contrôle Ud a r_s le code op rcoi'e avec t .blô-utes, la BHïii était 10 ajoutée en solution à la cuvette contenant l'échantillon, et le volune réactiomiel total était de 3,0 ml» Le volume de sérum a-jouté devait être ajusté selon son activité de transaninase glutamique oxalacétique mais, pour chaque contrôle et la mode opératoire avec tablettes correspondant, des prélèvements échaii-15 tilôns identiques furent utilises» Chaque résultat d'essai est comparé à un essai témoin contenant les sels phosphates.et le sel de potassium"de l'acide L-aspartique susmentionnés. L'analyse sérique est réalisée en double et ses résultats sont donnés au tableau suivant : 20 ffriBL^q 2 Contrôle (procédé Henry) ïablettes Valeurs de (Utilisant de la L2)H com- IJnités/Véri- -^iereûce merciale en solution) fication Uni té s /Vé r i _ i c a t i on 23 1 190 130 157 2 30 54 35 3 520 350 4 20 20 27 5 110 115 • 118 30 6 30 30 27 Les valeurs de référence provenaient d'un laboratoire extérieur. La valeur pour l'échantillon de sérum n° 3, qui était gardé comme témoin, est contestable du fait qu'il y a un .cart important, aussi bien par rapport à la valeur obtenue avec la vérification 35 de contrôle que par rapport à la valeur obtenue avec la vérification utilisant lo déshydrogénase malisue stabilisée préparée selon la présente invention, qui, comme on peut le constater, sont substantiellement en accord. La corrélation entre les données obtenues avec les pré-40 parations de contrôle et les préparations de déshydror.éiiase ma- bad oftrôïNXL ] 70 15814 s. 2065659 lique en tablettes correspondantes démontre l'opportunité de 1' utilisation de la déshydrogénase malicrue stable produite selon 1s présente invention dans des vérifications pour li détermination de la transaminase^ glutamique oxalacétique dans le sérum 5 Exemple 2 Le mode opératoire d'extraction de l'Exemple 1 est .répété en utilisant des graines de pois à oeil noir comme source de déshydrogénase malique» le liquide surnagenant est lyophili-10 sé, l'extrait sec étant formulé en tablettes de réactif comme .à l'Exemple 1» ■ Le tableau suivant illustre la stabilité thermique de la déhydrogénase malique, isolée à partir de pois à oeil noir selon le procédé d'extraction de la présente invention, en ta-15 blettes des formulations susdites» TABLEAU 3 Essai . Activité de la I£DH/'Tablette (Unités/Vérification) 2 jours, 4° C 160 20 (Contrôle -2. jours, 40 CT G 150 2 jours, 50° C 160 , 10 jours, 4° G 150 10 jours, 40° G 130 25 10 jours, 50° G - 130 Exemple 3 Le mode opératoire d'extraction de l'Exemple 1 est répété en utilisant des haricots roses comme source de déshydrogénase maliqueo Le liquide surnageant est lyophilisé, l'extrait /* 30 sec ayant une activité de 5^5 unités/milligramme de poudre lyophilisée» Il n'y a aucun changement d'activité après stockage de deux jours à 60° G» Exemple 4 Le mode opératoire d'extraction de l'Exemple 1 est ré-35 pété en utilisant des haricots pinto comme source de déshydrogénase malique» Le liquide surnsgeent est lyophilisé, l'extrait sec ayant une activité de 55^ unités/milligramme» Après stockage pendont 2 jours à 60° 0, l'extrait a une activité de 575 unités/milligramme « 40 Exemple 5 ^ y»"-- » m""» h— tAD ORIGINAL j 70 15814 9. 2065659 Le mode opératoire d'extraction de l'Exemple 1 est répété en utilisant du blé comme source de déshydrogénase malique» Le liquide surnageant est lyophilisé, l'extrait sec ayant une activité de 230 unités/milligramme» Après stockage pendant -2 jours 5 a 60°C, l'activité est de 250 unités/milligramme. La stabilité thermique des Exemples 2-5 suggère clairement que les extraits de déshydrogénase malique seront stables pendant des périodes beaucoup plus longues, de l'ordre d'au moins 3 à.4- mois, à la température ambiante, cette stabilité étant ob-10 tenue en l'absence de stabilisants externes» Les variations mineures d'activité identifiées dans les Exemples, aussi bien au dessus qu'au dessous de la valeur de contrôle, sont en partie dues aux erreurs expérimentales normales associées à de telles mesures» L'absence de variations importan-15 tes indique cependant que les différents matériaux sont thermiquement stables, sans stabilisants externes, pendant les périodes de stockage que l'on s'attend à rencontrer avec les systèmes analytiques automatisés susmentionnés» Exemple 6 20 Des graines de pois à oeil noir sont pulvérisées en une fine poudre avec un micro-broyeur Chemical Bubber Company» Une partie de la poudre de graines est mise en suspension dans une solution saturée de chlorure de potassium, dans les proportions de 1 gramme de poudre pour 5 ni de solution saturée de chlo-25 rure de potassium, et l'on agite doucement pendant 30 minutes dans un bain de glace» une autre partie, égale en poids à la première, est mise en suspension dans 10 ml d'eau distillée et est également agitée doucement pendant 30 minutes dans un bain ^Le glace» Chaque suspension est centrifugée dans une centrifugeuse 30 Sorvall (iiC2-3) pendant 15 minutes à 3000 G» Le liquide clair surnageant est recueilli et lyophilisé» Le procédé d'extraction à l'eau distillée est trouvé donner un rendement supérieur de 25/- à celui du mode opératoire d'extraction correspondant avec la solution saturée de chlorure de potassium, lequel rendement 35 est défini par le poids de l'extrait multiplié par son activité de déshydrogénase malique, comme défini plus août. Bien entendu, l'invention n'est pr-:s limitée aux moaes de réalisations préférés décrits, qui n'ont été choisis qu'à titre d'exemple » BAD ORIGINAL j 70 15814 2065659 BSVEI'UICÀ'IIûiTS 1. Procédé pour préparer un extrait de déshydrogénase malique stabilisée, comprenant ï mélanger une quantité de graines de plantes finement divisées à 5 un liquide aqueux, en laissant le mélange au repos pendant un laps de temps suffisant pour extraire la déhydrogénase malique des graines finement divisées, mais insuffisant pour extraire des quantités substantielles d'autres matières naturelles qui af séparer le liquide clair surnageant du reste de la matière solide finement divisée, e.t lyophiliser le liquide clair surnageant pour obtenir l'extrait 15 de déshydrogénase malique thermiquement stable» 2. Le procédé de la revendication 1, dans lequel les graines de plantes sont choisies dans la famille des graines mo-nocotylédoneso , ' 3. Le procédé de la revendication 1, dans lequel les 20 graines de plantes sont choisies dans la famille des graines mo- nocotylédones de graminées.» __ 4-. Le procédé de la revendication 1, dans lequel les graines de plantes sont des grains de blé. >«, Le procédé de la revendication 1, dans lequel les 25 graines de plantes sont choisies dans la famille des graines dicotylédones. 6„ Le procédé de la revendication 1, dans lequel les graines de plantes sont choisies dans la famille des graines dicotylédones de légumineuses. 30 7» Le procédé de la revendication 1, dans lequel les graines de plantes sont choisies dans le groupe des graines de pois et des -haricots., S. Le procédé de la revendication 7; dans lequel les graines de plantes sont choisies dans le groupe des graines de 35 pois .j^mes, des graines de pois à oeil noir, des haricots roses et des haricots pinto. 9° Le procédé de l'une des revendications 1 à 8,dans lequel le liquide aqueux se compose d'eau distillôe. 10„ Le procédé de l'une des revendications 1 à 8,dans 40 lequel le liquide aqueux se compose d'une solution de sel sub 70 15814 11. 2065659 stantiellement saturée. 11. Le procédé de la revendication 10, dans lequel le liquide aqueux comprend mie solution saturée de chlorure de po-tassiun. IL. Le proc éd i de i 'uno des r e veiKiic t ions 1 à 11,dans leqqel le li-uiae et les rr--.?.n?-s do ni-ait os sont r:'..l -n~2s ûais le proportion d'environ 5 l. environ -.1 de li -aide aap-n:-: pour "1 ^*r>r:T v - r- ~0'L'l-riG Q.-3 O"*" ' ' w" ». 15. Le proo'd' de 1 'une des revendic-1Ions 1 v. 1.: lequel 1 -.• pnin38 . - iv ' cées resi-3.:t e*1- cvnt---ct ••.voc lo liquide pe;;d nt e:: 15 à 60 minutes. 14. Le procédé de l'une des revenaicétions 1 à i2,dans lequel les grvines finenen:; divisées restent en contact avec le liquide aqueux pendant environ 20 à environ p(j minutes» 15» Le procédé de l'une des revendieztions 1 -i 14-,dans lequel le liquide clair surnageant est enlevé du reste de la matière solide par centrifugation. 16o Le procédé de l'une des revendications 1 à 14,dans lequel le liquide clair surnageant est enlevé au reste de la matière solide par filtration. 17« dn procédé selon la revendication 1-, comprenant s mélanger une quantité de çraines de plante fineiaent divisées à un liquide aqueux, les graines étant choisies dans la famille des crainss dicotylédones de 1 jguiiinouses, laisser le mélange au repos pendant environ 15 à- environ 60 minutes, séparer le liquide clair surnageant du reste de la matière solide finenen g divisée, et lyophiliser le linuide cl^ir surnageant pour fournir l'extrait de déshyiropénase malicue thermiquement stable. 1S„ Le procédé de 1s revendication 17» dans lequel les graines de plantes sont choisies dans le groupe des graines de pois et des haricots» 19» Le procédé de 1-° revendication 17» dans lequel les graines de plantes sont choisies dans le -roupe des graines de nois .jaunes, des graines de pois à oeil noir, des haricots roses et des haricots pinto. 20o Le procédé de la revendication 17» dans lequel les graines fineiaent divisées restent en contact avec le liquide a-queux pendant environ 20 à environ JO minutes BAD original 70 15814 12. 2065659 21 . L'extrait de déshydrogénase malique thermiquement stable obtenu selon le procédé de n*importe laquelle des revendications 1 à 20„ 22. L1 extrait de doshydrogériase malique thermique-5 -iiiit stable obtenu selon le procédé de n'importe laquelle des revendications 1 à 20, cet extrait étant, en 1'absence d'autres stabilisants, therniquement stable pendant des périodes prolongées à des températures allant jusqu'à au moins 60°G„ 2J0 Une préparation convenant pour un usage dans des 10 déterminations de transaminase glutamique oxalacétique,comprenant l'extrait de dé sïrydr ogéna s e malique thermiquement stable selon la revendication 21 ou 22 et un sel de métal alcalin d'acide L-aspartique« 24. La préparation de la revendication 23 en combi-15 liaison avec de la dipliospopyridine nucléotide réduite (DPMI) „ 25» Une préparation sèche* convenant pour un usage dans des déterminations de transaminase glutamique oxalacétique,comprenant le. préparation' selon la revendication 23 et un tampon prévu pour maintenir le pli entre environ 7 et environ 7»5« 20 2bo La méthode pour déterminer la transaminase glu tamique oxalacétique dans des huïaeurs corporelles,comprenant î mettre en contact un prélèvement échantillon de l'humeur avec la préparation de la revendication 25, de la diphosphopyridine nucléotide réduite (DP2TH) et un sel de métal alcalin d'acide alpha-25 cétoglutsrique, et mesurer la vitesse de décroissance du pouvoir d'aborption de la solution résultante. 27» La méthode de la revendication 25, dans laquelle la vitesse de décroissance du pouvoir d'absorption est i^esxirêe 30 à environ 3^-0 millimicrons » 28. La méthode de la revendication 26 ou 27, dans laquelle les mesures d'absorption sont comparées au pouvoir d'absorption d'une solution tampon d'un sel de métal alcalin d'acide L-aspartique.