Brevet FR2073251A1 — publié le 19711001

La présente invention concerne des composés de flavanols monomères, leur procédé de préparation ainsi que leurs applications à titre de produits industriels nouveaux et à titre d'agents thé rapeuti que s. On sait que l'on trouve dans les végétaux des flavanols appartenant soit à la série des catéchols (une seule fonction alcool secondaire en position 3), soit à la série des leucocyanidols (deux fonctions alcool secondaire en positions 3 et 4). Ils sont tous hydroxylés en positions 5 et 7 et mono- ou polyhydroxylés sur le phényl latéral. Les oxhydryles peuvent etre substitués en totalité ou en partie. La présence d'atomes de carbone en positions 2 et 3 entrain l'existence de plusieurs isomères : ainsi avec la catéchine ( ou 2' - 3' - 5 - 7 flavanpentol), de formule développée : on obtient par exemple la d (ou +) catéchine, la 1 (ou -) catéchine, la d (ou +) épicatéchine, la 1 (ou -) épicatéchine. Les flavanols sont très instables : ils se polymérisent rapidement, soit par polymérisation oxydative lorsqu'ils sont en presence d'oxygène, soit meme par polymérisation non oxydative en l'ab- sence d'oxygène. Tous les flavanols se comportent comme des provitamines C2, ctest-à-dire comme deuxième facteur antiscorbutique (le premier étant l'acide ascorbique). Tout comme pour la vitamine K, la dimérisation ou les polymérisations plus poussées et également l'oxydation de ces composés, donnent des produits qui exercent des propriétés physiologiques inverses de celles du monomère, ctest-à-dire qu'ils sont scorbutigènes. Les matières premières permettant d'obtenir des flavanols sont très répandues dans le monde végétal. On citera principalement le gambir extrait de ltuncaria gambir (rubiacées); les cachous extraits de diverses légumineuses (acacia, catéchu et suma) et les kinos sucs de différents ptérocarpus et butea; les écorces de différentes rosacées telies que merisier, ronces, prunus; les écorces de différents conifères : pînus maritima et pinus pinaster entre autres; les feuilles-de thé vert; les raisins (épicarpe et pépins); secondairement dans des plantes très diverses : maures, pelargonium, eucalyptus, rhizophora, combretum, écorce de chênes, sommites fleuries de salicaire, mûres, cuticules d'arachides, azalées etc L'invention vise à éviter la transformation des flavanols monomères en leurs polymères, et donc à les stabiliser en vue de leur utilisation comme agents thérapeutiques. L'invention vise par ailleurs à séparer un flavanol choisi d'autres flavanols afin d'obtenir un composé aussi pur que possible. Suivant l'invention, le composé de flavanol est caractérisé en ce-qu'il est constitué par un complexe d'un flavanol monomère et d'un polyacide choisi parmi les polyacides-alcools organiques, l'acide phosphorique et l'acide borique-. Ce complexe est un composé st a ble dans lequel la cohésion des deux molécules de flavanol monomère et de polyacide est assu tée-par transfert partiel de charges opposées résiduelles. Parmi les polyacides-alcools organiques, l'acide citrique et l'acide tartrique sont préférés. Les complexes visés par l'invention sont obtenus aussi bien avec les flavanols monomères qu'avec les flavanols polymères; mais, alors qutun flavanol monomère et ses polymères ont des solubilités voisines, les complexes sont plus les mêmes solubilités, de sor te que les complexes du flavanol monomère et de ses polymères peuvent Btre séparés. Il en est de même pour un mélange de flavanols, que l'on peut séparer par formation de leurs complexes. Par exemple, la solubilité de la (-) épicatéchine monomère dans l'acétate d'éthyle est presque aussi grande que celle de ses po mères. le complexe acide citrique-(-) épicatéchine monomère est peu soluble dans l'acétate d'éthyle et-très soluble dans lteau, alors que les complexes acide citrique - (-) épicatéchine polymères sont très solubles dans l'acétate d'éthyle et très peu-solubles dans l'eau. Le leucoanthocyanidol et la (-) épicatéchine ont des solubilités très voisines dans-l'acétat-e d'éthyle et dans-lteåu, tandis que le complexe acide citrique - (-) épicatéchine est peu soluble dans l'acétate d'éthyle et très soluble dans l'eau et le complexe acide citrique - leucoanthocyanidol très soluble dans l'acétate d'éthyle et peu soluble dans l'eau. Ltanalyse chromatographique sur papier des complexes de flavanols montre un léger déplacement du paramètre i par rapport aux flavanols purs. On sait que le paramètre W est défini en chromatographie de partage par le rapport de la distance parcourue par la zone formée par la solution à la distance parcourue par le front du solvant. Le procédé suivant l'invention de préparation du complexe de flavanol monomère est caractérisé en ce que l'on provoque la formation in situ des complexes de flavanols monomère et polymères ou des différents flavanols en mélange dans une solution, et en ce que l'on isole le complexe de flavanol monomère ou dut flavanol recherché au moyen d'un solvant sélectif. Dans le cas de flavanols monomère et polymères en mélange, on sépare le complexe de flavanol monomère dissous dans le solvant sélectif par une extraction liquide-liquide et on retire le complexe de son solvant par évaporation de ce dernier. Dans le cas de flavanols différents en mélange, obtenus à partir d'un extrait végétal, on ajoute à l'extrait un solvant spécifique des flavanols additionné du polyacide choisi, on traite la solution obtenue contenant les complexes de flavanols de manière à former un résidu sec, et après avoir isolé le complexe de flavanol recherché en ajoutant à ce résidu le solvant sélectif, on précipite le complexe qui est ensuite purifié et séché. On décrira tout d'abord deux exemples de préparation de complexes de flavanols monomères par purification de flavanols monomères en mélange avec leurs polymères. 10) purification du leucoanthocoanidol. Le leucoanthocyanidol (monomère + polymères) est dissous dans de l'acétate d'éthyle (une partie pour 10 de solvant), La solution est versée dans une ampoule à décantation dans laquelle on ajoute une solution d'acide citrique 0,2 g dans l'eau (10 parties); on agit et on laisse reposer. la couche aqueuse inférieure est soutirée et le lavage répété 2 à 5 fois par l'acétate d'éthyle (5 parties chaque fois); l'acétate retient 3,5 ò d'eau. La phase aqueuse contient les polymères tandis que le leucoanthocyanidol monomère est dissous dans l'acétate éthyle sous forme de complexe acide citrique-leucoanthocyanidol. 20) purification des catéchines : La catéchine est dissoute dans une solution 0,2 M d'acide citrique dans l'eau (une partie pour 100). La solution obtenue est versée dans une ampoule d décantation et traitée par de l'acétate d'éthyle (10 parties). Après agitation, la couche aqueuse est soutirée, puis reprise deux fois dans les mimes conditions par de l'acétate d'éthyle (5 parties chaque fois). Les polymères ont été retenus dans l'acétate d'éthyle, alors que le complexe acide citrique-catéchine monomère se trouve dans la couche aqueuse. On citera comme exemple de préparation d'un complexe de flavanol à partir d'un végétal: L'extraction de la (-) épicatéchine du ambir. Les cubes de gambir (1.000 g) sont finement pulvérisés puis lixiviés pendant six heures par de l'acétone dans laquelle on a dissous 1 % d'acide citrique (10.000 ml). La lixiviation terminée, la solution acétonique est filtrée et traitée par du phosphate monosodique anhydre (2.000 g) pour déshydrater et par du sable (1.000 g) pour diviser la masse. L'on évapore à siccité sous vide à basse température avec un évaporateur rotatif (400C sous 70 cm de mercure). Le résidu est repris plusieurs fois par de l'éther anhydre exempt de dérivés oxydés (fractions de 1.000 ml) et filtré sous azote. Il est concentré à un faible volume (1.000 ml) sous vide et- à basse température. Par addition au résidu de 20 fois son volume de chloroforme, il se produit un précipité qui est recueilli sous atmosphère d'azote sur un filtre, puis lave toujours sous atmosphère d'azote, successivement avec du chloroforme (2e000 mi), du benzène (2.000ml) et de l'éther de pétrole (2,000 ml), puis séché sous un courant d'azote sec à 35 C. L9on obtient ainsi un complexe acide citrique- (-) épicatéchine pur SOU.S forme de poudre de couleur chamois. L'acide citrique a joué ici un double rôle par formation d'un complexe avec la (-) épicatéchine (rôle de protection) et par so lubilisation dans l'éther (la solubilité de la (-) épicatéchine se trouve augmentée) alors que tous les autres complexes formés avec les autres catéchines et les leucoanthocyanidols diminuent la solubilité. Le rendement atteint 5 à 15 %, suivant les échantillons de gambir traités. Pour caractériser le composé obtenu, on utilise de préférence l'analyse chromatographique sur papier. An prépare une solution å lOmg par ml-du composé à analyser et on effectue des prélèvements de 1 lambda au moyen d'une micropipette. On opère sur deux dimensions avec des feuilles de cellulose et des solutions de liquide migrateur constituées, pour la première dimension, par de l'acide acétique à 2 %, et pour la deuxième dimension par un melange isobutanol (4 parties) - acide acétique (1 partie) - eau à saturation. Le révélateur utilisé constitué de vanilline (2 g), acide paratoluène subsonique ( g),éthanol 1Q.S.P. 100 ml). Sur deux côtés perpendiculaires de la feuille de cellulose, on trace deux lignes droites distantes de 2 cm du bord de la feuille. Ces deux lignes constitueront la ligne de base de la première et de la deuxième dimensions. On dépose un prélèvement de 7 lambda de la solution à analy- ser à l'intersection des deux lignes. La feuille est disposée dans une chambre constituée par deux plaques de verre, la ligne correspondant à la première dimension étant située à la partie inférieure. L'ensemble est placé dans une cuve contenant le premier solvant (acide acétique à 2 ' ). Lorsque le front du solvant a atteint 6 cm de hauteur au-dessus de la ligne de base, on arrête l'opération et on sèche la feuille. On procède de la mEme manière avec le deuxième solvant dans le cas de la deuxième ligne de base. La feuille séchée est ensuite trempée dans le révélateur pendant une dizaine de secondes; elle est à nouveau séchée, puis portée dans une étuve à 90 C + 5 C, durant 5 minutes + 1 minute. On obtint ainsi une tache plus ou moins rouge pour chaque composé avec un RF bien défini. Pour le complexe (-) épicatéchine-acide citrique'on observe une tache unique rouge vif-dont le + est de 0,35 avec l'acide acétique et de 0,50 avec le mélange isobutanol-acide acétique-eau. Avec ces mimes solvants dans l'ordre précédent, on a obtenu les résultats suivants pour d'autres complexes leucoanthocyanidol-acide -citrique : 0,45 et 0,43 (+) catéchine - acide citrique 0,53 et (-) épitatéchine acide phosphorique : 0,37 et O,5O (+) catéchine -acide tartrique ; 0,52 et 0,41. L'évaporation de l'acétate d'éthyle contenant le complexe de leucoanthocyanidol en solution est effectuée sous une pression de 70 cm de mercure et a une température assez basse, voisine de 40 C. Le rendement; dans le cas de la séparation du complexe de leucoanthocyanidol comme dans celui du complexe de catéchine, dépend essentiellement du degré de pureté du produit initial traité. La perte de produit pur est d'environ 20 %. Application thérapeutique des complexes de flavanols à la prévention et à la guérison du scorbut expérimental. Des jeunes cobayes tricolores mâles, d'un poids compris entre 300 et 400 g sont soumis à un régime de base constitué par caséine : c,5 parties amidon :34 parties cellulose : 6,25 parties mélange salin (chlorure-de sodium, sulfate de magnésium, phos phates de sodium, potassium et calcium, citrate de fer et lac tate de calcium) : 1,75 parties mélange de vitamines (B1, B2, B6, PP, PAB) : 0,50 partie huiles vitaminées (foie de morue et germes de maîs) : 2,25 part. eau q.sep. 100 parties eu bout de75 jours, les animaux sont atteints dtun scorbut sévère qui est complet'au 21ème jour. Feu animaux, d'ailleurs, sont capables de dépasser ce 21ème jour et même de l'atteindre, la mortalité débutant après le 15ème jour; mortalité due en général à des hémorragies. Si lon ajoute à ce régime de base 1 mg d'acide ascorbique par 100 g de poids corporel et par jour (dose antiscorbutique théoriquement suffisante) rien n'est changé. En effet, on observe : une importante perte de poids (de 30 à 40 %); un effondrement de la résistance des capillaires (de 30 cm de mercure elle chute à moins de 15 et souvent 10); des microhémorragies souvent importantes par leur multiplicité; une activation des surrénales et de la thyroI!de;; une perturbation profonde de l'ossification éndochondralee Mais l'addition supplémentaire de 1 mg par 100 g et par jour de complexe d'épicatéchine empoche le scorbut Les animaux ainsi traités par voie orale à la dose de 1 mg/ 100 g/jour ou par une dose 10 fois moindre par voie intrapéritonéale avec une solution de (-) épicatéchine dissoute dans une solution isotonique de citrate de sodium, c'est-à-dire de (-) épicaté chine sous forme de complexe avec l'acide citrique, ne perdent que peu de poids (10 p,au maximum 15 %), maintiennent ou même augmentent (à 35 cm de mercure) leur résistance capillaire, ne présentent pas dthémorragies, ont une image de thyroSde et de surrénale de repos physiologique, ont une ossification'endochondrale parfaitement normale. Si l'addition est effectuée dès le ler jour, il y a prévention; si elle est effectuée à partir du 15ème jour, il y a guérison du scorbut déjà installé. Toutefois, en l'absence d'acide ascorbique le complexe d'épicatéchine est inactif. ApPlication thérapeutique des complexes de flavanols à l'augmen- tation de la résistance capillaire. Des cobayes tricolores mâles d'un poids moyen compris entre 300 et 400 g sont soumis à un régime journalier-constant bien défini, tel que son, avoine, orge ou à un régime dagglomérés que l'on trouve dans le commerce (dit n provende pour cobayes). Leur résistance capillaire moyenne se stabilise à une valeur qui se situe entre 20 et 25 cm de mercure. Les animaux reçoivent alors une seule injection (en général d'une forte dose du composé à essayer). Avec certaines substances on a précédemment obtenu une augmentation précoce de la résistance capillaire (au bout de 6 heures environ après l'injection), d'intensité modérée (augmentation de 10 à 20 cm de mercure) et de brève durée (24 heures environ). Cet te courbe monophasique caractérise les capteurs de catéchol-ortho- méthyl-transférases (COMT), c'est-à-dire que ces composés se présentent comme des protecteurs des catécholamines (adrénaline en particulier) Dans le cas du complexe de (-) épicatéchine, avec une injection intrapéritonéale de lï% mg/100 g de poids corporels la résistance capillaire, après avoir effectué une augmentation suivant la cour. be précédente, effectue une deuxième remontée (courbe biphasique) tardive (elle ne débute que 4@ heures environ après l'injection). de forte intensité (l'élévation atteint ou dépasse 30 cm de mercure) et de longue durée (150 heures et plus). Economie de l'acide ascorbique n in vivo n L'essai consiste à mettre en expérience deux lots identiques de cobayes soumis au même régime scorbutigène, cependant additionné d'acide ascorbique. Un lot reçoit un complexe d'épicatéchine, à raison de 1 mg/ 100 g/jour, tandis que le lot témoin ne reçoit rien. Au bout de 21 jours, les animaux sont sacrifiés. L'on prélève différents viscères de ces animaux (foie, rate, reins, surrénales) et l'on dose la quantité d'acide ascorbique qu'ils contiennent. Cette quantité est supérieure chez les animaux traités : de 5 fois environ dans le foie, de 3 fois environ dans la rate, de 10 fois environ dans les reins, de 7 fois environ dans les surrénales, Le complexe d'épicatéchine se montre un facteur d'économie de l'acide ascorbique, en ce sens qu'il provoque une rétention d'acide ascorbique dans ces différents viscères par rapport aux témoins. Economie de l'acide ascorbique " in vitro " Si l'on met en quantités stoechiométriques dans un tube à es sais de l'acide déhydroascorbique et du glutathion, l'acide déhydroascorbique est réduit à l'état d'acide ascorbique. La cinétique de cette réaction se traduit par la courbe asymptotique classique des vitesses de réaction. Mais, si lton ajoute toujours en quantités stoechiométriques un complexe d'épicatéchine, la vitesse de réaction est considérablement accrue; ainsi donc la régénération de acide ascorbique à partir de l'acide déhydroascorbique se trouve accélérée. L'importance de ce phénomène n in vitro ", est qutil est identique à celui que l'on a pu mettre en évidence dans ltorganisme (foie en particulier) où l'acide ascorbique est catabolisé en acide déhydroascorbique puis en acide dicétogulonique et enfin en acide oxalique et thréoniqueO Le mécanisme d'économie est réalisé par le glutathion et accéléré par le facteur C2. Dans l'épreuve " in vitro ", les tangentes à l'origine donnent la mesure de l'accélération initiale. Formes pharmaceutiques Le conditionnement des complexes de flavanols en vue de leur application à titre d médicaments est avantageusement réalisé en gélules ou comprimés vernis ou sous feuilles métalliques, ou bien dragéifiés et pouvant être conservés en flacons munis d'un déhy dratant. On peut aussi les présenter sous forme de poudre en flacons scellés pour dissolution extmporanée dans un solvant isotonique, ou encore sous forme de suppositoires, de crimes et pommades. Les comprimés et gélules sont dosés à 10 à 100 mg, de préférence à 25 mg; les flacons pour injections à 1 à 20 mg, de préférence à 10 mg; les suppositoires à 20 b 150 mg, de préférence à 50 mg; les pommades à 1 0. Les complexes de flavahols, et en particulier de (-) épicatéchine, peuvent Btre associés pour ces différentes formes à un ou plusieurs des composés suivants : acide ascorbique, glutathion, hypotenseurs, vasodilatateurs, diurétiques, antiinflammatoires, modificateurs de la crase sanguine (et en particulier anticoagulants). Posologie Le médicament est prescrit à raison de 2 à 3 comprimés par jour, ou de 1 à 2 injections par jour, ou de 1 à 2 suppositoires par jour. Toutes les maladies diminuant la résistance capillaire ou dont les effets exigent que cellecci soit augmentée peuvent être traitées. On citera plus particulièrement : les purpuras, les rétinopathies (en particulier rétinite diabétique), l'hypertension, tous les troubles veineux, les oedèmes, les hépatites, les glomérulonéphrites. Exemple d'essai clinique. I1 s 'agît d'un éthylique de 61 ans présentant un purpura qui s'accentue malgré le traitement institué qui consiste, outre le sevrage : en un régime hyperprotidique; en l'administration de facteurs lipotropes : choline principalement; en injections d'extraits hépatiques; en l'administration de corticoides; en vitaminothérapie du groupe B, vitamine K, acide ascorbique. Ltadministration par voie intramusculaire de complexe de (-) épicatéchine (10 mg matin et soir), amène un arrêt de l'évolu- tion du purpura dès la première injection. Au bout d'une semaine le purpura a pratiquement complètement régressé et il n'est apparu aucune nouvelle pétéchie. Par ailleurs, la résistance capillaire du malade qui, avant le traitement, était inférieure à 10 cm de mercure, donc pratiquement imprehable, est remontée dès la première injection à 17,5 cm de mercure et a atteint au bout d'une semaine 30 cm de mercure ce qui peut Btre considéré comme normal REVENDICATIONS 1 - Composé de flavanol, caractérisé en ce qutil est constitué par un complexe d'un flavanol monomère et d'un polyacide choisi parmi les polyacides-alcools organiques, l'acide phosphorique et l'acide borique. 2 - Composé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le polyacide eSt l'acide citrique. 3 - Composé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le polyacide est l'acide tartrique. 4 - Composé conforme à l'une des revendications 1 & 3, caractérisé en ce que le flavanol monomère est le leucoanthocyanidol. 5 - Composé conforme à l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le flavanol monomère est la (-) épitatéchine. 6 - Procédé de préparation du complexe de flavanol monomère conforme à l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on provoque la formation in situ des complexes de flavanols monomère et polymères ou des différents flavanols en mélange dans une solution, et en ce que lton isole le complexe de flavanol monomère ou du flavanol recherché au moyen d'un solvant sélectif. 7 - Procédé conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que dans le cas de flavanols monomère et polymèreven mélange, on sépare le complexe de flavanol monomère dissous dans le solvant sélectif par une extraction liquide-liquide et on retire le complexe de son solvant par évaporation de ce dernier. 8 - Procédé conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que dans le cas-de flavanols différents en mélange, obtenus à partir d'un extrait végétal, on ajoute à l'extrait un solvant spécifique des flavanols additionné du polyacide choisi, on traite la solution obtenue contenant les complexes de flavanols de manière à former un résidu sec, et après avoir isolé le complexe de flavanol recherché en ajoutant à ce résidu le solvant sélectif, on précipite le complexe qui est ensuite purifié et séché. 9 - Procédé conforme à la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise l'acétone comme solvant spécifique des flavanols. 10 - Procédé-conforme à la revendication 8 ou 9 appliqué à l'extraction d'un complexe de (-) épicatéchine, caractérisé en ce que le solvant sélectif utilisé pour isoler le complexe de (-) épicatéchine est l'éther anhydre. 11 - Procédé conforme à l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le précipité est formé par addition de chloroforme et recueilli sous atmosphère d'azote. 12 - Application thérapeutique d'un composé de flavanol confor- me à l'une des revendications I à 5 en qualité de deuxième facteur antiscorbutique. 13 - Application thérapeutique d'un composé de flavanol conforme à l'une des revendications 1 à 5 en qualité de facteur élevant la résistance capillaire. 14 - Application thérapeutique d'un composé de flavanol conforme à l'une des revendications 1 à 5 en qualité de facteur d'économie de l'acide ascorbique.