Brevet FR2081599A1 — publié le 19711210

la présente invention concerne un appareil de séparation par électrophorèse, qui comprend une colonne qui reçoit les substances à séparer, des électrodes placées aux extrémités supérieure et inférieure de la colonne et un orifice de sortie destiné aux 5 substances séparées à l'extrémité inférieure de la colonne. Plus précisément, l'invention concerne un appareil permettant l'élution par l'orifice de sortie des substances séparées à l'aide d'un champ électrique appliqué dans la colonne. Dans un appareil de séparation par électrophorèse du type 10 décrit ci-dessus, les substances séparées atteignent le fond de la colonne zone par zone. Il est important que l'élution des substances séparées s'effectue de manière que les zones séparées ne se mélangent pas les unes avec les autres. Il s'avère cependant qu'une telle élution est très difficile avec les dispositifs 15 connus, surtout lorsque la colonne contient un gel dans lequel le débit de liquide est faible ou nul. Dans de telles colonnes, on élue en général les substances séparées en utilisant un liquide spécial d'élution ou 1'électrolyte de la chambre d'électrode inférieure. Pour obtenir une élution totale, il est cependant 20 important que le liquide d'élution balaie la totalité de la section de la colonne. Dans ce but, on a déjà réparti le liquide d'élution dans un certain nombre d'orifices d'entrée placés autour de la colonne, ce liquide s'écoulant radialement vers l'intérieur dans une chambre dite d'élution comportant un orifice .se 25 de sortie au centre de la colonne. Les résultats ne/sont cependant pas révélés tout à fait satisfaisants,surtout à la périphérie de la colonne où l'élution est incomplète. L'utilisation d'un écoulement radial crée aussi le risque que les substances séparées s'accumulent au fond de la chambre d'élution. Dans 30 plusieurs applications, par exemple lors de la séparation de protéines, une telle accumulation peut provoquer la décomposition des substances. L'invention concerne donc un appareil de séparation par électrophorèse dans lequel l'élution des substances séparées 35 s'effectue d'une nouvelle manière qui permet une élution parfaite sur toute la section de la colonne. On peut le modifier facilement pour l'utiliser dans la mise en oeuvre de diverses méthodes 71 01199 2 2081599 de séparation par électrophorèse qu'on décrira plus loin. Selon une caractéristique de l'invention, l'appareil comprend une chambre d'électrode placée à la partie inférieure de la colonne, comportant l'électrode inférieure et munie d'un orifice d'entrée 5 et d'un orifice de sortie pour l'électrolyte, une chambre d'élution placée au-dessus de la chambre d'électrode et séparée de celle-ci par une membrane, le centre de cette chambre d'élution étant relié à un orifice de sortie d'élution destiné aux substances séparées, le diamètre de l'extrémité supérieure de la chambre d'élution 10 étant sensiblement égal au diamètre de la colonne, le diamètre de l'extrémité inférieure de la chambre d'élution, délimité par la membrane, étant supérieur au diamètre de l'extrémité supérieure de la chambre d'élution. Bans l'appareil selon l'invention, on utilise l'électrolyte 15 comme liquide d'élution. le liquide s'écoule vers le haut à travers la chambre d'électrode et.la surface totale de la membrane poreuse, puis dans la chambre dsélution vers l'orifice de sortie placé au centre de celle-ci, la vitesse d'écoulement radial croissant de la périphérie vers l'orifice, l'écoulement dans la chambre 20 d'élution est donc dirigé radialement vers 1'intérieur et axialement vers le haut, ce qui empêche l'accumulation des substances séparées dans la membrane poreuse qui constitue le fond de la chambre d'élution. Comme l'extrémité inférieure de cette chambre a un diamètre supérieur à celui de son extrémité supé-25 rieure, le liquide balaie toute la section de la colonne, y compris la périphérie. De préférence, le diamètre de l'extrémité inférieure dépasse celui de l'extrémité supérieure de 5 à 20 $>. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ress-xrtiront mieux de la description qui va suivre, doanée en 30 référence aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 est une coupe d'un appareil selon l'invention, comprenant une chambre d'élution destinée à être utilisée lorsque la colonns contient un gel ; la figure 2 est usa vue partielle agrandie de l1appareil 35 de la figure 1 ; la figure 3 est une coupe d'une variante de l'appareil de la figure î» et comprend une chambre d'élution destinée à être 71 01199 3 2081599 utilisée lorsque la colonne contient une poudre ; la figure 4 est une vue partielle agrandie du dispositif de la figure 3 ; la figure 5 est une coupe d'une seconde variante de l'appareil 5 de la figure 1, et comprend une chambre d'élution destinée à être utilisée dans une colonne contenant un liquide dans lequel existe un gradient de densité ; et la figure 6 est une vue partielle agrandie de l'appareil de la figure 5. 10 Sur la figure 1, la référence 1 désigne une colonne dont l'extrémité inférieure comporte trois organes 2a, 2b et 2c associés par des vis 3. Une chambre 4 d'électrode se trouve dans l'organe 2b. Cette chambre comporte une électrode circulaire 7 reliée à une source de courant par un conducteur 8. Un électrolyte peut 15 pénétrer dans la chambre par une entrée 6 et en sortir par une sortie 5. La chambre 4 comprend, de plus, une séparation verticale 27 au-dessus du bord supérieur de laquelle passe l'électrolyte. Grâce à cette séparation, on obtient une bonne circulation dans la chambre. 20 Une collerette 9 de l'organe 2c forme un siège pour la face d'extrémité inférieure de la colonne 1 qui coopère avec la collerette lorsqu'elle est mise en place dans cet organe. Le diamètre interne de la collerette 9 est sensiblement égal à celui de la colonne 1, et inférieur au diamètre de la chambre 4. 25 La collerette 9 comprend un canal 10 relié à un tube 11. L'extrémité supérieure d'un tube 12 traverse le fond de l'organe 2b et porte une tête 13 qui se loge à l'intérieur de la chambre d'électrode. Un écrou 14 maintient la tête en position. On peut insérer un tube 15 par l'extrémité supérieure du tube 12, 30 le tube 15 ayant un diamètre plus petit que le tube 12 et comportant une collerette 16 qui coopère avec la face supérieure de la tête 13. Un manchon non représenté sur les figures fixe le tube 15. Le fonctionnement du dispositif des figures 1 et 2 est 35 le suivant. L'organe 2b comporte un anneau 17 dont le diamètre interne est égal au diamètre d^La chambre 4. Cet anneau 17 porte une membrane poreuse 18, par exemple en acétate de cellulose. 71 01199 4 2081599 On insère alors le tube 15 par le trou central de la membrane poreuse et on le fixe en serrant la partie centrale de cette membrane entre la collerette 16 et la tête 13. On monte alors l'organe 2c sur l'organe 2b et on place une membrane poreuse 19, 5 par exemple en acétate de cellulose, sur la collerette 9, On fixe alors la colonne 1 qui contient un gel à l'organe 2a par le filetage 1a. La membrane 19 supporte alors la colonne de gel. Un joint torique 26 serre la colonne 11 contre l'organe 2c. On remplit alors la chambre 4 d'un électrolyte par le canal 6. 10 L'électrolyte s'écoule vers le haut à travers la membrane poreuse 18 et remplit la chambre d'élution 20 comprise entre les membranes 18 et 19. L'air de la chambre 20 part par le canal 10 et on ferme alors le tube 11 de raccordement à l'aide d'un robinet non représenté sur la figure. On applique alors une tension électrique 15 entre l'électrode inférieure 7 et l'électrode supérieure (non représentée sur la figure) en commençant la séparation. Il règne dans la chambre d'électrode 4 une pression supérieure à celle qui règne dans la chambre d'élution 20, soit qu'on exerce une pression sur l'électrolyte qui circule dans la chambre 20 4, soit qu'on relie l'extrémité inférieure du tube 15 à une pompe à vide qui exerce un-certain vide dans la chambre 20. Etant donné la différence de pression, l'électrolyte s'écoule de la chambre 4 à la chambre 20 en passant à travers la membrane 18, comme indiqué par les flèches, c'est-à-dire vers le haut et 25 radialement vers 1'intérieur dans la chambre 20, vers l'extrémité supérieure du canal 15, et le liquide d'élution sort de l'appareil par le tube 15. L'écoulement radial du liquide dans la chambre d'élution assure une élution èfficace sur toute la surface de la membrane 19, et les substances séparées qui atteignent la chambre 30 20 zone par zone en provenance de la colonne 1 se trouvent ainsi efficacement éluées par le canal 15. Les figures 3 et 4 représentent une variante de l'appareil des figures 1 et 2. Cet appareil est prévu pour être utilisé . avec une colonne contenant une poudre. Les parties analogues à 35 celles des figures 1 et 2 ont des références identiques. Un anneau 22 qui a une partie interne 22a remplace l'anneau 17 des figures 1 et 2 et coopère par sa face supérieure avec la face 71 01199 5 2081599 inférieure de la collerette 9» la face interne ayant Te même diamètre que la collerette. L'anneau 22a serre l'orifice du canal 10. L'anneau 22a comporte une membrane semi-perméable 21, de préférence une membrane de dialyse, dont la partie centrale est fixée 5 à la tête 13 de façon analogue à la fixation de la figure 1. Comme l'anneau 22 a une hauteur supérieure à celle de l'anneau 17 des figures 1 et 2, la hauteur de la chambre 20 est plus faible que celle des figures 1 et 2. La tête 13 est surélevée de la quantité correspondante par un anneau 23 d'entretoise placé sous la tête 10 13. Au cours de la séparation par électrophorèse, il ne passe pas d'électrolyte de la chambre 4 à la chambre 20 à travers la membrane 21, mais l'élution des différentes zones de substances séparées se produit grâce au liquide qui passe de la colonne 1 au canal 15 par 1'intermédiaire de la membrane 19 et de la chambre 20. 15 Les figures 5 et 6 représentent une autre variante de l'ap pareil, destinée à être utilisée avec une colonne contenant un liquide dans lequel existe un gradient de densité. Les parties analogues à celles des précédentes/po§ïenf des références identiques. L'appareil des figures 5 et 6 comporte le même anneau 17 que 20 l'appareil de la figure 1. Une membrane semi-perméable 24 de dialyse est fixée à cet anneau et a une partie centrale fixée à la tête 13 comme décrit précédemment. Le canal de sortie est prolongé vers le haut par mise en place d'un tube 25 ayant de 1 à 2 cm de longueur, dans la partie supérieure du tube 15. La membrane 19 des 25 figures 1 à 4 n'existe plus dans cet appareil. Au cours de la séparation par électrophorèse, on remplit la colonne 1 d'une solution dans laquelle existe un gradient de densité, la dènsité croissant vers le bas de la colonne. On introduit dans le fond de la colonne, par le tube 11 et le canal 10, une solution ayant 30 une densité supérieure à la solution la plus concentrée de la colonne. L'extrémité inférieure du tube 15 est reliée à une pompe qui aspire du liquide avec une vitesse qui est de 5 à 10 fois supérieure à la vitesse avec laquelle le liquide pénètre par le canal 10. En conséquence, il se forme une couche liquide horizontale à 35 l'extrémité supérieure du tube 25, le liquide de la colonne venant au contact du liquide plus lourd arrivant dans cette couche par en dessous. Dans la couche stable, le liquide s'écoule radialement 71 01199 6 20&1599 vers 1*intérieur■et sort de l'appareil par les tubes 25 et 15, entraînant les différentes zones séparées des diverses substances. Le dispositif des figures 5 et 6 est destiné à être utilisé lorsque l'élution s'effectue dans un champ électrique. On peut 5 aussi effectuer l'élution de liquides dans lesquels existe un gradient de densité sans champ électrique, en retirant l'électrolyte de la chambre d1électrode. Il est bien entendu que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra 10 apporter toute équivalence technique dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir du cadre de ladite invention, qui est défini dans les revendications annexées. 71 01199 7 2081599 REVENDICATIONS 1. Appareil destiné à la séparation par électrophorèse, comprenant une colonne destinée à recevoir les substances à séparer, des électrodes aux extrémités supérieure et inférieure de la 5 colonne et un orifice de sortie destiné aux substances séparées et placé à l'extrémité inférieure de la colonne, caractérisé en ce que l'extrémité inférieure de la colonne comprend une chambre d'électrode contenant l'électrode inférieure et comprenant un orifice de sortie et un orifice d'entrée pour un électrolyte, l'appa-10 reil comprenant de plus une chambre d'élution placée au-dessus de la chambre d'électrode et séparée de celle-ci par une membrane, cette chambre étant reliée par son centre à l'orifice de sortie d'élution et ayant une extrémité supérieure dont le diamètre est sensiblement égal à celui de la colonne au-dessus de cette chambre, 15 et dont l'extrémité inférieure est délimitée par la membrane poreuse et a un diamètre supérieur à celui de l'extrémité supérieure de cette chambre. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une tête tubulaire au centre de la chambre d'électrode 20 et un tube muni d'une collerette/destiné à passer dans un trou central de la membrane et dans la tête tubulaire, la partie centrale de la membrane étant serrée entre la collerette et la tête et le tube constituant l'orifice de sortie d'élution de la chambre. 3. Appareil selon la revendication 2, caractérisé en ce que 25 l'électrode inférieure forme un anneau autour de la tête. 4. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que la paroi de la partie supérieure de la chambre d'élution comporte une collerette radiale tournée vers l'intérieur dont la face supérieure forme un siège destiné à l'extrémité inférieure de la colon- 30 ne. 5. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un canal d'évacuation placé dans la paroi de la chambre d'élution. 6. Appareil selon la revendication 4, caractérisé en ce que 35 la partie supérieure de la paroi de la chambre d'électrode comporte un anneau amovible susceptible d'être remplacé par un anneau coopérant avec la face inférieure de la collerette et ayant le même diamètre interne que celle-ci.