Brevet FR2081359A1 — publié le 19711203

@e présente invention concerne ces extraits allergènes nouveaux sous forme précipitée ainsi qu'un procédé nouveau de préparation ae ces extraits. I1 est maintenant prouvé que beaucoup de manifestations allerçènes chez l'homme, telles que @@ume des @oins, @@inite, conjonctivite, asthme, etc,... sont provoquées par l'inhalation de divers corps végétaux et animaux er suspension dans I 'air. Ce divers corps comportent de nombreux constituants dont quelques uns seulement ou peut-être même un seul ont des propriétés allergenes.Comme il suffit de quantités infinitésimales d'allergéne pour provoquer des réactions chez l'individu, et comme le même corps provoque des @éactions différentes d'un individu à l'autre, il a été jusqu'ici difficile, et même en lait i..possiLle, en dépit de nombreuses recherches, d'isoler ou d'i@entifie les composants actifs des allergènes. Le pollen de certaines plantes de la famille des composacées a été l'objet des reenerches les plus poussées au courus ae ces dernières années. la graine en est constituée par une paroi cellulaire externe, une paroi cellulaire interne, et par la cellule contenant deux noyaux et un cytoplasme. la paroi cellulaire contient une grande quantité d'nuile de pollen, mais il semble que le cytoplasme des composacées et d'autres pollens contient la plus grande partie, sinon la totalité du, ou des composants allergènes. Beaucoup de composants du cytoplasme peuvent être facilement extraits avec de l'eau, des sels pnysiologiques ou des réducteurs. C'est ainsi qu'on produit maintenant des extraits bruts de pollen en dégraissant un pollen, un produit inhalant, ou un pénicillium, par exemple par extraction à l'éther, et en faisant une extraction aqueuse, glycérosaline ou par réducteur du pollen résiduel. Le processus de dégraissage n'est pas absolument nécessaire avant les extractions aqueuses mais l'effet de ces dernières en est multiplié par l'immiscibilité de l'eau et de la graisse contenues dans la paroi cellulaire. Cet extrait aqueux peut être utilisé tel quel mais, dans ce cas, les doses administrées doivent être très faibles au début et croître régulièrement et par petites quantités. Ceci exige un traitement prolongé, souvent jusqu'à vint ou trente injections, pour atteindre la ose maxima supportée par le patient. üe autre solution conaiste à précipiter l'extrait aqueux au moyen de divers ingrédients. La présentation des fractions antigènes en suspension insoluble a éliminé ces problemes ou an a diminué l'acuité. Le complexe antigene devant être césagrége dans le corps, le dégage ment lent de l'antigène diminue le nombre des réactions systémiques provoques pat ne dose trop forte. I1 est également posai ble d'atteindre la dose maxima supportée en beaucoup moins d'injections qu'avec les extraits usuels. On a en outre constaté que les malaues extrêmement sensibles chez lesquels un niveau adéquat d'hypersensibilisation est inaccessible avec les extraits usuels, pouvaient tolérer ces suspensions. Un procédé connu pour la préparation d'une suspension insoluble d'extrait innalant allergène consiste à extraire toute la matière innalante avec un liquide d'extraction contenant une base organique faible, et plus précisément une amine tertiaire hétérocyclique telle que la pyridine, la lutidine, la quinoline, et un milieu aqueux. On peut utiliser de l'eau distillée pure, mais aussi une solution saline contenant par exemple environ 0,3 % de bicarbonate de soude, ou 0,9 % de chlorure de sodium, ou 5 % de dextrose, ou une solution N/10 de soude caustique, ou un réducteur à base de phosphate donnant le pH 7. L'extrait est alors traité avec une solution d'alun pour précipiter la totalité du complexe inhalant insoluble à l'eau, et le précipité est récupéré. Un inconvénient notoire de ce procédé est qu'avant l'injection le produit doit être libéré de sa pyridine par rinçage. Le procédé est long et on a pensé que des traces de pyridine pouvaient rester dans le complexe insoLu- ble. Les Fractions antigènes extraites par la pyridine ne sont pas nécessairement les mêmes que celles extraites-pendant un laps de temps glus long par les solvants utilisés dans les extraits aqueux ou glycérinés usuels. L'invention a pour but de préparer des suspensions allergènes à action retardée à partir d'un extrait usuel contenant par conséquent les mêmes fractions allergènes. L'invention réalise donc un extrait allergène sous forme précipitée dérivée d'extraits usuels, exempt de complexes résultant ae l'usage ae solvants organiques et par conséquent totalement exempt de tels complexes. Le procédé selon la présente invention consiste à précipiter un extrait dialysé dégraissé d'un inhalant avec un volume égal d'un agent floculant, choisi parmi les sels métalliques alcalins ou alcalino-terreux du sulfate d'aluminium en maintenant le pH entre 7,4 et 7,o de façon à précipiter les facteurs allergènes, à séparer les précipités ainsi obtenus, à extraire les électrolytes qui y sont contenues en rinçant à l'eau distillée, à maintenir le précipité i-incê à une température d'au moins 0 C et, après avoir amené le précipité froid à la température ambiante, à éliminer ce qui surnage et à remettre le précipité en suspension dans de l'eau stérile, de préférence avec une sonde ultrasonique. Si on désire atteindre des rendements plus élevés, le procédé ci-dessus sera complété par un traitement du reliquat de la matière qui surnage sur le précipité initial. La matière qui surnage sera traitée une seconde fois avec l'agent floculant pour obtenir un second précipité qui sera ensuite combiné avec le premier et traité. La matière résiduelle qui surnage pourra alors etre encore traitée avec l'agent floculant et le précipité formé séparé et combiné avec le précipité obtenu précédemment. Selon une autre méthode, le produit surnageant obtenu dans la première précipitation pourra être centrifugé de façon à permettre de recueillir une autre quantité d'extrait allergène précipité qui sera ajouté au précipité initial. La matière flottante obtenue par la centrifugation pourra être encore précipitée par addition d'un agent floculant choisi parmi les sels métalliques alcalins ou alcalino-terreux du sulfate d'aluminium, le pH étant réglé à 7,5, élimination de la matière surnageante et addition du précipité obtenu aux deux premiers précipités. Les précipités recueillis sont alors rincés à l'eau distillée pour en éliminer les électrolytes qui pourraient s'y trouver. On obtient un extrait allergène très satisfaisant en congelant et en dégelant le précipité rincé et en en éliminant la matière qui surnage; un tel extrait mélangé à l'eau dans des proportions volumétriques adéquates peut donner une suspension susceptible d'adoucir des conditions allergènes. La matière première dont on part est un extrait aqueux d'un inhalant dégraissé par des méthodes connues. Par exemple un inhalant tel que le pollen peut être extrait au moyen d'un fluide extracteur glycérosalin. Lorsque le fluide extracteur a été en contact avec le pollen pendant environ 10 à 12 jours le mélange est filtré et le filtrat est dialysé, ce qui donne un extrait dialysé dégraissé d'un inhalant convenant aux traitements selon la présente invention. La phase de précipitation comprend l'utilisation arun agent floculant choisi parmi les sels métalliques alcalins ou alcalino-terreux du sulfate d'aluminium concentré à environ 2 %. Après addition de l'agent floculant, le pII du mélange est ajusté à une valeur comprise entre 7,4 et 7,6 (de préférence 7,5) par addition d'une solution de soude caustique concentrée à 50 %. L'extrait allergène d'un inhalant selon la présente invention est caractérisé par son insolubilité marquée dans l'eau; il contient tous les facteurs allergènes solubles dans la glycérine, est exempt de complexes organiques et reste très stable pendant les périodes de stockage. Le procédé de la présente invention est applicable à tous les inhalant et en particulier à ceux qui ont une action excitante sur les organes respiratoires et se trouvent en suspension dans l'air en quantité suffisante pour agir, sinon en abondance. Parmi les matières que le procédé de la présente invention a traitées avec succès et a réussi à transformer en complexe inhalant total insoluble à l'eau et allergéniquement actif, effectif pour la prophylaxie et la thérapeutique des asthmes et du rhume des foins, on peut citer les poussières telles que les poussières communes recueillies par les aspirateurs de poussières domestiques, et les poussières industrielles telles que les poussières de bois des menuiseries, les poussières des ateliers de fourrures et des boulangeries, les particules épithéliales y compris celles provenant des animaux à poils ou à plumes, les pollens des végétaux et en particulier ceuxdes composacées et d'arbres tels que frêne, hêtre, bouleau, orme, chêne, noyer, peuplier, érable, etc,... La matière inhalant peut être extraite par le procédé de la présente invention dans une gamme étendue de concentrations. L'invention va maintenant être expliquée à l'aide des exemples non limitatifs suivants, qui pourront être étudiés en se référant au diagramme opérationnel annexé. EXEMPLE 1 A - Préparation d'un extrait glycériné. On prépare quatre litres de fluide extracteur glycérosalin en mélangeant 50 % de glycérine, 0,6 % de chlorure de sodium, 0,5 @ de phénol, et de l'eau, auxquels on ajoute 150 g. d'un mélange de pollens d'une composacée telle que l'ambroisie (on mélange en partles égales @u pollen de l'espace géante et du pollen de l'espece or@@@olfe,. On @@@te le mel@nge pen@ant 24 neures au moyen @'un @@ tateur mag@@ique et on le laisse repose pendant @@ @@@@s en l'@@@@ant occasionnellement @@@@ o@ trois fois par @our. On fil@@@ le m@iange au moyen @ papier-@@ltre whatman n 41 de façon à obtenir un rit@a@@@ 3. @@@ mil@@l@tres contenant 34.424 unités par ml. @@ volune @@@@lt@@@t es : poité à 4.140 ml en lui ajoutant de @@ solution @@ycé@osaline, ce qui porte la teneur à 30.000 unités protéine-azote par ml. B - Préparation de l'ext@ait de pollen en suspension. Un volume de 32,5 ml ayant une teneur de 30.000 unités protéine-azote par ml est dialysé à l'eau courante pendant 18 deures pour en extraire la glycérine et donner 49 ml de solution de facteurs allergènes solubles à l'eau d'une teneur de 19.000 unités protéine-azote par ril. Cette solution est traitée avec 49 mi de sulfate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 %), le pJ étant maintenu à 7,5 par l'addition de soude caustique concentrée à 50 %. Il se forme un précIpité floculant aune qui se dépose lentement au repos. On laisse reposer la mélange cans le compartiment de congélation d'un réfrigérateur pendant environ 12 neures. On laisse revenir le mélange congelé à la température ambiante et on le décante.Le précipité, représentant un volume de Il ml, est mis de côté pour traitement ultérieur tandis que la matière qui surnage est centrifugée et conne un autre précipité qu'on ajoute au premier pour la suite du traitement. On traite la matière surnageante provenant de la phase de centrifugation avec 32,5 mi de sulfate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 ,) en maintenant le pH à 7,5 par addition de 50 % de concentration de soude caustique et ie précipité ainsi obtenu est combiné avec les deux premiers et la matière surnageante éliminée.Les précipitas combinés sont rinçés trois fois à l'eau distillée, placés cans le compartiment ae congélation d'un réfrigérateur pencant. 48 heures, et on les laisse revenir à la température ambiante pour donner un volume total de précipité de 28 ml ayant une teneur de 20.617 unités protéine-azote par ml. La matière surnageante est éliminée, le volume ramené à 28 ml au moyen d'eau distillée stérile, et le mélange est remis en suspension su moyen d'une sonde ultrasonique avec addition simulta née de phénol concentré à 0,5 @ à titre de préservatif. Le préparation ainsi obtenue convient aux injections aux doses voulues. La préparation peut être également a@ministrés aux sujets sensibles au pollen qui reculent le début du traitement jusqu'à ce qu'il soit trop tare pour peuvoir atteindre une dose @ypos@@sibilisante au moyen d'extraits @@ueux avant l'approcne @@ @@ @@ison des pollens. @@ préparation peut également être a@@@i@trée aux sujeté hypersensibles ne pouv une dise suffisants avec ces extraits aeux. EXEMPLE 2 Mélange de Végétaux Divers A - Préparation d'extrait glycériné. On prépare quatre litres de fluide extracteur glycérosalin en mélangeant 50 % en poids du volume total de glycérine, 0,6 du volume total de chlorure de sodium, C,5 % du volume total de phénol, et de l'eau distillée, auxquels on ajoute 200 g. d'un mélange de pollens divers (tels que les @erbes à fourrage, par exemple). Or; agite le mélange pendant 24 neures au moyen d'un agitateur magnétique et on le laisse reposer pendant 10 jour-s en agitant occasionnellement 2 ou 3 fois par jour. ON filtre le mélange au moyen de papier-filtre Whatman n 41 de façon obtenir un flltrat de 3.480 ml contenant 29.520 unités protéineazote par ml. B - Préparation d'extraits de pollen sous forme de suspension. Un volume de 110 ml de l'extrait glycériné ayant une teneur de 29.520 unités protéine-azote par ml est dialysé à l'eau courante pendant 24 heures pour en extraire la glycérine et donner 210 ml d'une solution des facteurs allergènes solubles à l'eau. Le pH de la solution est 7,0. Cette solution est traitée avec 210 ml de sulfate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 %) et le pH est maintenu à 7.50 en ajoutant goutte à goutte 1,70 ml de soude caustique à 50 % de concentration. Il se forme un précipité floculant Jaune qui se dépose quand on laisse reposer 12 neures. Le précipité représente un volume de 125 ml et est mis de côté cour la suite s traitement. Le liquide surna- geant (volume 280 ml) est transvasé dans des tubes creux en cellophane et concentré, par évaporation, à 120 1. On ajoute aux 120 ml du liquide concentré surnageant 120 1 de surate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 @). Le mélange a un pH de 3,60 qu'on amène à 7,50 en ajoutant goutte à goutte 1 ml de soude caustique concentrée à 50 Io. I1 se forme un précipité floculant jaune plus clair occupant un volume de 87 ml après avoir reposé pendant 12 heures; ce précipité est extrait et ajouté au premier précipité Le liquide qui surnage est concentré de 150 ml à 80 ml par évaporation. On ajoute un mélange de sulfate d'aluminium et de potassium concentré à 2 , à ces do ml.Le mélange a un pEt de 3,80 qui est amené à 7,50 en lui ajoutant goutte à goutte 0,50 ml ae soude caustique à 50 P. I1 se forme encore un précipité jaune clair qu'on extrait après l'avoir laissé reposer pendant 12 heures et qu'on ajoute aux deux premiers précipités. Le mélange de précipités est rincé trois fois à l'eau distillée stérile. Après un séjour de 48 heures dans un réErigé- rateur, on laisse le tout revenir à la température ambiante et on remet en suspension au moyen d'une sonde ultrasonique. Le volume final du précipité est amené à 216 ml. On constate que le taux d'unités protéine-azote est 14.432 par ml. On amène le volume à 155 ml et son taux à 20.000 unités par ml, et on ajoute du phénol concentré à 0,5 %. La préparation obtenue convient aux injections aux doses voulues. EXEMPLE 3 Poussières Ménagères A - Préparation d'un extrait. On prépare 10 litres ae fluide extracteur salin tamponné en mélangeant 0,5 % du volume total de chlorure de sodium, 0,143 % du volume de phosphate d'hydrogène bisodique, 0,036 % du volume de phosphate de potassium bihydrogéné, 0,55 % du volume de phénol, et de l'eau distillée, et on y ajoute 3,5 kg de poussières ménagères variées. On agite fortement le mélange et on le laisse reposer pendant 10 jours en l'agitant 2 à 3 fois par jour. On retire alors le liquide et on le dialyse dans des tubes clos en cellophane avec de l'eau courante pendant 48 heures. On concentre la solution par évaporation et son contenu de réduction est amené au taux des.concentrations originales.L'extrait de poussières est filtré à travers un papier-filtre Whatman nO 41 pour donner un filtrat contenant 13.120 unités protéine-azote par ml. B - Préparation d'extrait de poussières ménagères sous forme de suspension. On mélange un volume de 100 ml de l'extrait de poussières ayant un pH de 6,30 avec 100 ml de sulfate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 ). Le pH du mélange est 3,20. On l'amène à 7,50 en lui ajoutant goutte à goutte 0,95 ml de soude caustique à 50 % ae concentration. On obtient un précipité floculant brun foncé qui se dépose au cours d'un repos de 12 heures. Le précipité dont le volume est 100 ml est mis ae côté pour la suite du traitement. Le liquide qui surnage a un volume ae 100 ml. On lui ajoute 100 ml de sulfate- d'aluminium et de potassium (concentré à 2 %) et le pH du mélange, qui était de 3,80, est amené à 7,50 en lui ajoutant goutte à goutte 0,60 ml de soude caustique à 50 % de concentration. On obtient encore un précipité floculant brun foncé mulon laisse se déposer pendant 12 heures. Le précipité, dont le volume est de 76 ml, est ajouté au premier précipité pour la suite du traitement. Le volume du liquide qui surnage est de 110 ml; on y ajoute 110 ml de sulfate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 %). Le pH du mélange, qui était de 3,80, est amené à 7,50 en lui ajoutant goutte à goutte 0,065 ml de soude caustique à 50 % de concentration. On obtient un autre précipité brun clair qu'on extrait après avoir laissé le mélange reposer pendant 12 heures et qu'on ajoute aux deux précipités précédents. Les précipités combinés sont rincés trois fois à l'eau distillée stérile. Après un séjour de 48 heures dans un réfrigérateur, on laisse revenir le mélange à la-température ambiante et on le remet en suspension au moyen d'une sonde ultrasonique.Le volume final du précipité est 155 ml et son taux d'unités protéine-azote est de 9.020 unités par ml. On amène ce volume à 135 ml et à 10.000 unités par ml, et on ajoute du phénol concentré à 0,5 %. La préparation ainsi obtenue convient aux injections aux doses voulues. EXEMPLE 4 Germes divers A - Préparation de l'extrait glycériné. On prépare 2 litres de fluide extracteur glycériné en mélangeant, dans de l'eau distillée, 50 % en poids du volume total de glycérine, 0,6 % en poids du volume de chlorure de sodium, et 0,5 5 en poids du volume de phénol, et on y ajoute 200 grammes @e germes divers (tels que alte@na@ia, aspe@gillus, normodendrum et pénicillium).On a@ite le melange au moyen d'un agitateur mag@@ti@@ pen@@nt 24 neures et o@ le l@@sse @poser pendant 10 jours @n le @emuant 2 ou 3 lois par @o@@. Ch@@@ @ltre alo@s le melang@ @@ moyen @'un @@@@@@ -filt@e @@@@@@@@@ n 41 et o@ o@tient un f@@@@@ @@ @o@t le volume @st @e 1. @@@ @l et @@ @aux @'unit@s protéine-@@@@@ @@.@00 @@@@@@. a@ ml. @ - P@@p@@@tion @@ @'@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ so@@ @@@@@@@e suspensi@n. On @@@lyse @ l'eau cour a@te pen@ant 24 @e@@es un volume de 400 ml de l'ext@@it glycérine à 14.500 @@ités/ml p@@r @@ @liminer la gl@cé ine. @@ co@c@rt@@ e@svi@e cet ext@ alt par @vapora- tion dans des tubes de cellopnane @los pour @amener @e volume de 400 ml à 220 ml. @@ y ajoute 220 ml de sulfate d'alumi@ium et de potassium (concentré à 2 @@ et on amene le p@ d@ mélange de 3,75 à 7,50 en ajoutant goutte à goutte 1,80 ml de soude caustique à 50 % de concentration. Il se forme un précipité floculant brun clair qu'on laisse reposer 12 neures pour se déposer. Le précipité représente un volume de 165 ml et est mis de côté pour la suite du traitement. Le liquide qui surnage représente un volume de 270 ml et est concentré par évaporation dans des tubes de cellophane @ermé- tiques jusqu'à un volume de 135 ml. On ajoute à @e dernier 135 ml de sulfate d'aluminium et de potassium (concentré à 2 %) et le pH du mélange, qui était de 3,75, est amené à 7,50 en lui ajoutant goutte à goutte 1,50 ml de soude caustique à 50 % de concentration. Il se forme un précipité floculant brun clair qu'on laisse se déposer pendant 12 neures. Le précipité represente un volune @e 125 ml et est ajouté au premier précipité pour la suite du traitement. Le liquide qui su@nage est ramené d'un volume de 145 ml à 95 ml par évaporation dans un tube de cellop@ane hermétique. Aux 95 ml de liquide concent@é surnageant on ajoute 95 ml de sulfat@ @'aluminium et de potassium (concentré à 2 %) et le pH de 3,90 est amené à 7,50 en @joutant goutte goutte 0,80 ml de souce caustique à 50 % de concentr@@ion. On obtient à houveau @n precipite @@oculant @run @lair qu'on extrait après avoir laissé repose@ per@ant 12 neures et qu'on ajoute aux deux précipités précédents. @e melange de précipités est rincé trois fois à l'eau distillée stérile. Apres un séjour de 48 neures dans un réfrigérate@u on laisse le mélange revenir à la température amhiante et on le remet en suspension au moyen d'une sonde ultrasonique. Le volume final du précipité est 310 ml et son taux d'unités protéine-azote 9.020 unités/ml. Le volume est ramené à 280 ml avec @n taux de 10.000 unités/ml et on ajoute on @@@énol concentré à 0,5 @. La préparation obtenue convient aux injections aux oses voulues. EXEMPLE 5 On répète la procédure de l'exemple 2 mais en employant du plantain au lieu d'un mélange de pollens divers. Le produit obtenu est semblable à celui obtenu dans l'exemple 2 et aussi utile. REVENdICATIONS 1. Procédé de préparation d'un extrait allergène d'un inhalant caractérisé en ce qu'on traite un extrait aqueux dégraissé et dialysé d'un innalant avec un volume égal d'un agent Zlocu- lant choisi parmi les sels alcalino-métalliques ou alcalino- terreux su sulfate d'aluminium en ajustant le p entre 7,4 et 7,6 ae façon à précipiter les facteurs alle.genes, on sépare le précipité, on élimine les électfolytes dudit précipité, et on maintien ledit précipité rince à une température d'au moins 0 C. puis, après avoir laissé le précipité congelé revenir a la température ambiante, on remet le précipité ainsi obtenu en suspension dans de l'eau stérile. 2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'ajustement du pH est effectué au moyen de soude caustique. 3. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'agent floculant est constitué par du sulfate d'aluminium et de potassium concentré à 2 . 4. Procédé selon une des Revendications 1, 2 ou 3, prises séparément, caractérisé en ce que l'inhalant est constitué par un mélange de divers pollens végétaux. 5. Procédé selon une des Revendications 1, 2 ou 3, prises séparément, caractérisé en ce que l'inhalant est constitué par un mélange de pollens de diverses composacées. 6. Procédé selon une des Revendications 1, 2 ou 3, prises séparément, caractérisé en ce que l'inhalant est de la poussière domestique. 7. Procédé selon une des Revendications 1, 2 ou 3, prises séparément, caractérisé en ce que l'inhalant est un mélange de germes divers tels que des pénicilliums. 8. Extrait allergène d'inhalant caractérisé par son insolubilité essentielle dans liteau, par la présence ae tous les facteurs allergènes solubles dans la glycérine, l'absence de complexes organiques et de fractions grasses, et sa stabilité en cours de stockage.