Brevet FR2100638A1 — publié le 19720324

21Q06â8 La présente invention concerne des N-oxydes d'un polynuclée-tide synthétique, un procédé pour la fabrication de ces N-oxydes et des compositions pharmaceutiques les renfermant. L'acide polyriboinosinique se combine avec l'acide poly-5 ribocytidylique avec formation d'un complexe à deux chaînes dans lequel une seule chaîne de l'acide polyriboinosinique (Poly I) est associée par liaison hydrogène avec une seule chaîne d'acide polyribocytidylique (Poly C), ce qui donne lieu à la formation d'une substance à deux chaînes. On appelle communément la subs-10 tance à deux chaînes ainsi obtenue Poly I i Poly C et on sait qu'elle est capable de provoquer la production d'interféron à la fois dans les cultures de cellules et chez les animaux. Plus récemment, on a démontré que Poly X : Poly C était un agent antiviral actif chez l'homme, permettant d'obtenir une protec-15 tion contre plusieurs types d'infection par les virus. Cependant, le Poly I î Poly C manifeste certains effets secondaires toxiques qui semblent s'intensifier sous l'effet de doses croissantes. La présente invention est basée sur la découverte que certains dérivés du Poly X : Poly C sont moins 20 toxiques que la substance mère, ceux-ci conservant en même temps une bonne activité productrice d'interféron. L'invention concerne des N-oxydes du Poly I : Poly C et des sels de ceux-ci, lesdits oxydes étant eux-mêmes à deux chaîneso Les sels suivant l'invention peuvent être constitués par 25 des sels d'ammonium ou des sels de métaux alcalins (par exemple des sels sodiques ou potassiques) ; des sels avec des bases organiques telles que les aminés ; des sels avec des substances organiques polybasiques telles que la polylysine et le D.E.A.E. destraneo 30 On peut représenter les radicaux comportant la base cyto- sine, qui se trouvent dans une molécule d'acide polyribocytidylique, par la formule (I) page suivante, et en théorie on peut oxyder ces radicaux de bases en N-oxydes de formule (II):- On peut représenter les radicaux constitués par la base 35 hypoxanthine qui se trouve dans une molécule d'acide polyriboinosinique par la formule (III) page suivante, mais il est probable que les bases hypoxanthine ne sont pas transformées en N-oxydes (au moins à un degré notable) Ainsi, dans les N-oxydes suivant l'invention, au moins 40 certains des sites ou sièges basiques de la chaîne acide 71 16530 2 2100638 NH O 5 0 I 0 (I) (II) 10 15 N (III) H 20 polyribocytidylique sont oxydés, tandis que les bases hypoxanthine se trouvant sur la chaine polyriboinosinique ne sont pas oxydées. Il est évident qu'il est possible de réaliser divers degrés d'oxydation du Poly I : Poly C, avec obtention de produits allant de ceux dans lesquels une très faible proportion 25 seulement de la totalité des sièges basiques oxydables sont oxydés, à ceux dans lesquels la majorité des sièges basiques oxydables sont oxydés. On a constaté qu'à mesure que le degré d'oxydation augmente, c'est-à-dire, à mesure que le nombre de sièges comportant la base cytosine oxydés croît, la molécule à 30 deux chaînes a de plus en plus tendance à se séparer en une substance à chaîne unique. Etant donné que la présente invention ne concerne que les N-oxydes eux-mêmes constitués par deux chaînes, il s'ensuit que les .-oxydes suivant l'invention contiennent au moins certains sièges comportant une base non oxydée le 35 long de la molécule. On peut mesurer le degré d'oxydation des N-oxydes à deux chaînes suivant l'invention par une méthode empirique. Le spectre aux ultra-violets du Poly I : Poly C présente des absorptions à 258 mu et à 230 mu. A mesure que de plus en plus 40 de bases de la molécule à deux chaînes sont oxydées, l'absorp— 71 1653Û 3 2100638 tion à 230 myi augmente par rapport à l'absorption à 258 mji. Ainsi, le rapport des absorptions aux deux longueurs d'onde constitue une mesure du degré de N-oxydation du Poly X : Poly C, c'est-à-dire que le rapport :~ 5 Absorption à 230 mp augmente à mesure que le degré d'oxydation Absorption à 258 mji augmente. (NB. On écrira ultérieurement ici ledit rapport comme suit . 230 mu) A 258 mji) * Les autres paramètres que l'on utilise pour mesurer le 10 degré d'oxydation des substances suivant l'invention comprennent 1'hyperchromicité de la substance et sa valeur, Tm. On obtient ces paramètres en enregistrant l'aborption U.V. de la substance à une fréquence particulière, tout en augmentant graduellement la température de cette substance. L'absorption U.V. d'un 15 A.R.N. à deux chaînes, à 258 mp est toujours inférieure à l'absorption à la même fréquence de la même substance sous la forme comportant une seule chaîne. En outre, à mesure que l'on augmente la température de la substance à deux chaînes, la liaison hydrogène entre les chaînes s'affaiblit jusqu'à ce que fina-20 lement, les chaînes se séparent. Il s'ensuit, par conséquent, que la valeur de l'absorption U.V. d'une substance à deux chaînes augmente avec la température. On appelle la différence entre les deux extrêmes d'absorption exprimée en pourcentage de l'absorption de la substance à deux chaînes, 1'"hyperchromicité" 25 de cette substance. Lorsqu'on représente graphiquement l'aborption U.V. à 258 mp des N-oxydes suivant l'invention en fonction de la température, on constate que l'absorption est plus forte aux températures élevées qu'aux basses températures. L'accroissement de 30 l'absorption est graduelle, et il est possible de situer la température à laquelle l'absorption est à mi-chemin entre l'absorption de la substance à deux chaînes et celle de la substance à une seule chaîne. On appelle cette température la Tm du N-oxyde, laquelle est fonction du degré d'oxydation, et on constate que 35 la Tm diminue pour un degré d'oxydation croissant. Suivant d'autres modes de mise en oeuvre, l'invention concerne un procédé de préparation de N-oxydes à deux chaînes du Poly I . Poly C et les sels de ces derniers, comprenant soit (a) la réaction du Poly I : Poly C, ou d'un sel de celui-ci, 40 avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracide pendant un laps de 71 16530 4 2100638 temps et à une température suffisants pour provoquer l'oxydation d'au moins certaines des bases cytosine, mais insuffisants pour provoquer la séparation de la substance à deux chaînes en une substance à une seule chaîne, soit (b) la réaction du Poly C, 5 ou d'un sel de celui-ci, avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracide pendant un laps de temps et à une température suffisants pour provoquer l'oxydation d'au moins certaines, mais pas de plus de 26%, des bases cytosine, et ultérieurement la mise en contact du N-oxyde de Poly C ou du sel de celui-ci ainsi 10 obtenu avec le Poly I ou un sel de celui-ci, ce qui donne lieu à la formation du N-oxyde ou du sel de celui-ci à deux chaînes recherché. Lorsqu'on utilise le Poly I : Poly C comme substance de départ, et si l'on oxyde la substance à deux chaînes, il n'est 15 malheureusement pas possible de fixer une limite supérieure universellement applicable au degré d'oxydation au delà duquel on obtient des substances à une seule chaîne. Une telle limite supérieure est principalement fonction de la température et, dans une moindre mesure, de la durée de l'oxydation, mais on 20 peut déterminer d'une façon tout à fait classique les conditions de réaction les plus convenables permettant d'obtenir un degré d'oxydation exigé quelconque. Cependantlorsqu*on oxyde le Poly C et qu*on le traite ensuite avec du Poly X, ce qui donne lieu à la formation du N-oxyde à deux chaînes, on constate qu'il 25 ne se forme que peu ou pas du tout de substance à deux chaînes lorsqu'on oxyde plus de 26% environ des bases cytosine. Les peracides convenables pouvant être utilisés pour les besoins du procédé de l'invention comprennent l'acide peracé— tique, perbenzoîque, monoperphtalique ou m-chloroperbenzoïque. 30 Parmi ces peracides, on préfère utiliser l'acide m-chloroperbenzoïque en raison du fait que la réaction, lorsqu'on utilise ce produit, s'effectue d'une façon régulière et contrôlable. On effectue habituellement la réaction dans un solvant convenable pour le Poly I : Poly C ou le Poly C lui-même. Les 35 solvants convenables sont habituellement alcalins, afin de faciliter la solution; par exemple l'acétate de potassium dans l'eau et l'éthanol, à un pH d'environ 8, constitue habituellement un milieu de réaction convenable. Dans ce cas, on obtient le produit sous forme de son sel potassique. 40 La température à laquelle s'effectue la réaction n'est pas 71 16530 5 2100638 critique en ce qui concerne 1e inventiono On préfère éviter les très basses températures, auxquelles la réaction évolue avec une extrême lenteur, et les températures extrêmement élevées, auxquelles il existe un risque grave de destruction de la nature 5 à deux chaînes du produit. En général, on constate que les températures ambiantes (environ 20 - 25°C) sont judicieuses, bien qu'une température comprise entre 5°C et 50°C soit convenable. Le temps de réaction varie suivant le degré d'oxydation exigé et la température.du mélange réactionnelo Lorsqu* on uti-10 lise une température de réaction d'environ 20*C avec de 1*acide m-chlôroperbenzoïque en tant qu'oxydant, le degré d'oxydation du produit augmente graduellement en un laps de temps de quelques heures. On peut récupérer les N-oxydes suivant 1'invention à partir 15 du milieu réactionnel par précipitation par un anti-solvant. Un anti-solvant convenable pour les N-oxydes est l'éthanol. On recueille judicieusement le précipité lui-même par centrifuga-tion. On peut appliquer n'importe lesquels des procédés de purification pour les acides nucléiques au produit de l'inven-20 tion, par exemple, la chromatographie et l'électrophorèse. Ainsi qu'on l'a indiqué précédemment, les N-oxydes à deux chaînes suivant l'invention sont susceptibles de provoquer la production d'interféron chez les' animaux et l'homme, et ils manifestent en général une plus faible toxicité que le Poly X s 25 Poly C générateur, comme le démontrent les études de toxicité effectuées sur des animaux tels que la souris, tout en conservant une activité antivirale satisfaisante0 Etant donné que l'interféron est un agent antiviral non spécifique, il s'ensuit que les N-oxydes suivant l'invention 30 sont intéressants pour la prophylaxie et le traitement d'une large gamme d'infections virales telles que celles du virus Coxsackie, du virus Seraliki Forest, du virus de la variole vac-cinique, du virus de la fièvre aphteuse, du virus de la stomatite versicolor, du virus de la rage et du virus de la grippe. 35 Par conséquent, selon un autre mode de mise en oeuvre, l'invention fournit une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs des N-oxydes à deux chaînes du Poly I : Poly C, ou les sels non toxiques de ce dernier, sôus forme de mélange avec un ou plusieurs véhicules ou excipients pharmaceutiquement ac-40 ceptableso 71 16530 6 2100638 On peut formuler la composition suivant 1*invention sous forme d'un aérosol, par exemple, en vue d'une administration intranasale, sous forma injectable en vue d'une injection intra-péritonéale ou sous une forme convenable en vue d'une applica-5 tion locale, le fait étant bien évident que la formule ou présentation utilisée sera adaptée à la nature de l'infection. En général, les présentes compositions manifestent le plus d'efficacité dans la prophylaxie d'infections virales, bien qu'elles soient également efficaces pour le traitement de telles infec-10 tions. Bien que les N-oxydes et compositions suivant l'invention manifestent le plus d'utilité en tant qu'agents antiviraux, ils sont également utiles en tant qu'adjuvants favorisant la réaction immunologiqueo 15 Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, per mettront de mieux comprendre l'invention. EXEMPLE N" 1 On dissout de l'acide polyribocytidylique (10,0 mg sous forme du sel potassique) et de l'acide polyriboinosinique (10,0 20 mg sous forme du sel potassique) dans de l'acétate de potassium aqueux 0,4 M, à un pH de 8,2 (10 ml), et on ajoute une solution d'acide m-chloroperbenzoïque (500 mg) dans l'éthanol (10 ml). On abandonne la solution à 20" C pendant une heure et on ajoute de l'éthanol (60 ml). On sépare le précipité par centrifugation 25 et on lave avec de l'éthanol (2 x ÎOO ml). On dissout un échantillon du produit N-oxydé ainsi obtenu dans du chlorure de sodium aqueux 0,3 M renfermant 1% d'éthylè- ne glycol et on mesure le rapport A 230 ro)1. on mesure ensuite 258 mp le rapport A 230 mp pour le Poly I : Poly C non oxydé et on 258 m 30 compare les deux résultats* A 25g ^ Po^ poly I : Poly C = 0,88 A 2 30 mp pour le produit N-oxydé = 1,56 258 mji On soumet ensuite un second échantillon du produit N-oxydé à une séparation chromatographique sur une colonne de Sépharose 35 2B (filtration sur gel). On effectue cette opération à l'aide d'une colonne d'une longueur de 90 cm, d'un diamètre intérieur de 2,5 cm, et d'un volume d'environ 500 mlo On élue la colonne en direction ascendante à l'aide d'une solution renfermant du chlorure de sodium (0,15 M), un tampon tris (0,05 N) et du 71 16530 7 2100638 chlorure de magnésium (0,005 N) à un pH de 7,5 et avec un débit de 0,4 ml par minute. On recueille des fractions de 7,2 ml et on dose la teneur de chacune de celles-ci en produit N-oxydé (estimée selon l'intensité de l'absorption U.V. à 258 mu). On 5 constate que le produit s'élue de la colonne de Sépharose 2B de la même façon que la substance de départ Poly "X : Poly C, ce qui indique que le produit N—oxyde se caractérise à peu près par le même poids moléculaire et la même forme globale que le produit de départ et présente entièrement par conséquent, la 10 forme à deux chaînes. On examine un troisième échantillon du produit N-oxydé en vue d'obtenir son hyperchromicité et sa valeur Tm0 On effectue les. mesures dans des cellules de 1 cm à l'aide d'un spectromètre Unicam SP 800 B et en utilisant une solution de l'échantillon 15 dans du chlorure de sodium aqueux 0,03 N renfermant 1% d'éthylè-ne-glycol. On augmente la température de la solution de 1/2° C par minute, et on représente graphiquement l'absorption U.V» en fonction de la température. On note que le produit N-oxydé présente une Tm de 45° C et une hyperchromicité de 52,9%o 20 Le produit N-oxydé confère une protection à des souris lorsqu'on l'administre par voie intraperitonéale à des concentrations de 10 et 100 par souris, en provoquant 24 heures plus tard une attaque par le virus de 1'encéphalomyocardite administré par la même voie, les résultats étant les suivants : 25 TABLEAU 1 Dose de Dose du Mortalité après Mortalité après 12 N-oxyde Virus 12 jours chez les jours chez les té animaux ayant re moins n'ayant pas çu le N-oxyde reçu de N-oxyde 10 r 10"4 4/10 10/10 . 100 r io-4 4/10 10/10 On étudie l'effet du produit N-oxydé sur la réaction immu-nologique de la souris comme suit : On immunise des souris par injection intraveineuse d'une suspension à 10% de globules rouges du sang de mouton. On injec-40 te le composé à éprouver simultanément par la même voieo 71 16S30 8 2100638 On détermine l'effet du composé au troisième jour au moyen de la "technique d'hémolyse localisée en gel". Ce procédé est une version modifiée du "Jerne Plaque Àssay" décrit à l'origine par Jerne Norden et Henry. ("Cell Bound Antibodies" Wistar Insto 5 Press, Philadelphie 1963, p. 109 - Ed. Amos et Koprowski). On tue les souris et on extrait les rates. On dilacère celles-ci de façon à libérer les cellules lymphoïdes. On réunit les rates de cinq souris pour chaque composé éprouvé. Après une dilution convenable dans un milieu de culture, on mélange 0,1 ml 10 de la suspension de cellules de rates avec de l'agar-agar liquide et avec les globules rouges du sang de mouton et on verse l'ensemble dans une boîte de Pétri de façon à former une couche mince» Après deux heures d'incubation à 37° C, des anticorps se diffusent dans la gélose environnante depuis certaines des cel-15 Iules. On ajoute un complément de sérum (sérum du cobaye) pour effectuer la lyse des globules rouges du sang de mouton dans les zones où se trouvent des anticorps® Après une incubation supplémentaire pour permettre la lyse des globules rouges, on dispose les plaques sous un compteur de colonies (grossissement 20 avec une source de lumière indirecte) et on compte les zones de lyse ("plaques"). Celles-ci se présentent sous forme de zones claires par contraste avec le fond opaque rouge de globules rouges n'ayant pas subi de lyse. On exécute un comptage des cellules sur un échantillon de 25 la suspension de cellules après dépôt sur une lame. Les résultats sont exprimés en cellules formant une plaque (PFC) par million de cellules de rate ou par rate. On exprime l'effet du composé ("indice immunologique") par le rapport de PFC/10^ chez les animaux traités : celles du grou-30 pe témoin (dosées à l'eau physiologique). Ainsi, un rapport de 1,0 ne représente aucun effet. Une valeur inférieure à 1,0 représente une irnmunosuppression et une valeur supérieure à 1,0 représente un effet adjuvant. Résultats : 35 Indice immunologique ï à 10 T = 1,39 à 100 T « 1,38 Le produit N-oxydé manifeste, par conséquent, un effet adjuvant favorisant la réaction ou réponse immunologique. EXEMPLE N° 2 40 N-oxydation du Poly C 71 16530 9 2100636 (a) On dissout de l'acide polyribocytidylique (20,0 mg sous forme du sel potassique) dans de l'acétate de potassium aqueux 0,4 N, pH 8,2 (20 ml) et on ajoute une solution d'acide m-chloro-perbenzoïque (500 mg) dans de l'éthanol (10 ml)o On abandonne 5 la solution à 20° C pendant 5 minutes et on ajoute ensuite de l'éthanol (60 ml). On sépare le précipité par centrifugation et on lave avec de l'éthanol (2 x 100 ml). On dissout un échantillon du produit N-oxydé ainsi obtenu dans du chlorure de sodium aqueux 0,15 M et on détermine le 10 rapport À ^ . On mesure ensuite le rapport a 230 "ty1 pour ^/U 270 mji le Poly C non oxydé et on compare les résultats ï A 230 mF pour le Poly C = 0,93 270 mji 230 mji pour le produit N-oxydé = 1,09 A 27Ô mp Pour le cytidine-N-oxyde, les crêtes d'absorption U.V. 15 correspondantes se trouvent à 225 et 272 rtip, et le rapport A mB est égal à 3,36. 272 mu En' se basant sur ces valeurs, il est possible de calculer une valeur approximative du % des bases oxydées dans le Poly CD % bases oxydées = 1,09-0,93 = 6% 3,36-0,93 20 (b) On traite l'acide polyribocytidylique par de l'acide m-chloroperbenzoïque exactement'de la même manière que dans l'exemple N° 1, à la seule exception que l'on augmente le temps de réaction à 20 minutes. A 270 m)i Pour le produit N-oxydé = 1,36 25 * * % de bases oxydées » 1,36-0,93 _ ^7% 3,36-0,93 (c) On traite l'acide polyribocytidylique par de l'acide m-chloroperbenzoïque exactement de la même manière que dans l'exemple N° 1, à la seule exception que l'on augmente le temps de réaction à 60 minutes. 30 A 270 mjj Pour le produit oxydé = 1,56 * % * * de bases oxydées _ 1,56-0,93 = of,°l 3,36-0,93 (d) On ajoute de l'eau (10 ml) à une solution d'acide monoper— phtalique (500 mg) dans de l'éther (6,3 ml) et on sépare l'éther sous pression réduite. On amène la solution aqueuse au pH 7 à 35 l'aide d'hydroxyde de sodium N et on ajoute une solution d'acide polyribocytidylique (20,0 mg sous forme du sel potassique) 71 16530 10 2100638 dans l'eau (20 ml), au pH 7. On abandonne la solution à 37° C pendant 60 minutes et on ajoute ensuite de l'éthanol (70 ml). On sépare le précipité par centrifugation et on lave avec de l'éthanol (2 x 100 ml.). 5 Comme dans l'Exemple N® 1, on détermine le rapport A g^o mjS pour le produit N-oxydé dans du NaCl 0,15 Mo A §|2 , ! 59 270 mji ' * * % de bases oxydées = 1.59-0,93 _ oncL 3,36-0,93 " * (e) Traitement du Poly C N-oxydé par le Poly I 10 On dissout chacun des produits N-oxydés obtenus aux stades (a) — (d) à partir d'acide polyribocytidylique (10,0 mg sous forme du sel potassique) dans du NaCl 0,15 M (10 ml) et on ajoute une solution d'acide polyriboinosinique (10,0 mg sous forme du sel potassique). 15 On détermine le rapport entre l'absorption U.V. à 230 mji et celle obtenue à 258 rap (A 258 mp^ Pour chaque solution. On procède de la même manière pour une solution de Poly I i Poly C préparée à partir de Poly I et Poly C de manière analogue. On examine également les solutions en vue d'obtenir les 20 valeurs des hyperchromicités et de la Tm, et par conséquent une mesure du degré de liaison qui s'est produit entre les chaînes complémentaires du polyribonucléotide. On effectue les mesures dans des cellules de 1 cm à l'aide d'un spectromètre Unicam SP800B. On élève la température de la 25 solution de 1/2 degré par minute et on représente l'absorption U.V. à 250 mji en fonction de la température. Les résultats de ces expériences sont consignés dans le tableau ci-après (voir page suivante) Il est évident, lorsqu'on considère ces résultats, que 30 lorsqu'on oxyde plus de 26% des bases dans le Poly C, celui-ci ne forme plus de complexe à un degré appréciable avec le Poly I dans le NaCl 0,15 M à 20° C. EXEMPLE N ° 3 N-oxydation du Poly I : Poly C 35 On dissout de l'acide polyribocytidylique (10,0 mg sous ■forme du sel potassique) et de l'acide polyriboinosinique (10,0 mg sous forme du sel potassique) dans de l'acétate de potassium aqueux 0,4M, pH 8,2 (20 ml) et on ajoute une solution d'acide 71 16530 ii 2100638 TABLEAU I Duplex A §|2SSL 258m»i Hyperchromicité Tm° C : 5 /© (250 mp) Poly I : Poly C 0,84 75,0 63 5 Poly I : Poly C N-oxyde 6% 0,92 66,1 57 10 Poly I : Poly G N-oxyde 17% 1,05 25,6 Point de : fusion trop étendu et : mal défini pour la Tm * Poly I : Poly C N-oxyde CM 1,18 ■ 0 _ » Poly I : Poly C N-oxyde 27% 1,59 0 — 15 m-chloroperbenzoïque (500 mg) dans de l'éthanol (10 ml). On abandonne la solution à 20° C pendant 60 minutes et on ajoute ensuite de l'éthanol (60 ml)0 On sépare le précipité par cen-20 trifugation et on lave avec de l'éthanol (2 x 100 ml). On dissout un échantillon du produit N-oxydé ainsi obtenu dans du chlorure de sodium aqueux 0,3M renfermant 1% d'éthylène-glycol et on mesure le rapport A 258mp* 0n mesure ensuite le rapport A 258mp Pour le p°lY 1 : Poly C non oxydé, et on compare 25 les deux résultats : A §§§2E pour le Poly I : Poly C = 0,84 A 258mp P°ur produit N-oxydé = 1,56 On peut déterminer le rythme de variation du rapport A 258mja se^-on une N-oxydation croissante de la chaîne de Poly C 30 dans le Poly I : Poly C à partir des résultats (présentés dans le tableau I)o Etant donné que, dans des conditions de réaction identiques, le Poly X ne subit aucune N-oxydation décelable, on peut conclure .que, lors de la N-oxydation du Poly I : Poly C, seuls des résidus cytidine sont oxydés, et en conséquence, on 35 peut calculer le % approximatif des résidus cytidine oxydés dans le Poly I s Poly C. % de bases oxydées « 26(1,56-0,84) = 58% 1,18-0,84 71 16530 12 2100638 On soumet ensuite un second échantillon du produit N-oxydé à une séparation chromatographique sur une colonne de Sépharose 2B (filtration sur gel). On effectue cette opération à l'aide d'une colonne d'une longueur de 90 cm, d'un diamètre intérieur 5 de 2,5 cm, et d'un volume approximatif de 500 ml. On élue la colonne dans une direction ascendante à l'aide d'une solution renfermant du chlorure de sodium (0,15M), du tampon tris (0,05M) et du chlorure de magnésium (0,005M), au pH 7,5 et avec un débit de 0,4 ml par minute. On recueille des fractions de 7,2 ml, et 10 on dose la teneur de chacune d'elles en produit N-oxydé (estimée par absorption U.V. à 258mji). On constate que le produit s'élue de la colonne de Sépharose 2B en donnant lieu aux mêmes fractions que la substance de départ à base de Poly I : Poly C - ce qui indique que le produit N-oxydé se caractérise par le même 15 poids moléculaire et la même forme globale que la substance de départ et que, par conséquent, il comporte deux chaînes. On examine un troisième échantillon du produit N-oxydé en vue d'évaluer son hyperchromicité et la Tm. On effectue les mesures dans des cellules de 1 cm à l'aide d'un spectromètre 20 Unicam SP800B et en utilisant une solution de l'échantillon dans du chlorure de sodium aqueux 0,03M renfermant 1% d'éthylène-glycol. On élève la température de la solution de 1/2° C par minute et on représente l'absorption U.V. à 250mji en fonction de la température. On constate que le produit N-oxydé présente 2 5 une hyperchromicité de 52,9% et une Tm de 45°. EXEMPLE N° 4 On dissout une solution d'acide polyriboinosinique : acide polyribocytidylique (20 mg) dans de l'acétate de potassium aqueux 0,4M, pH 8,2 (20 ml) et on maintient la solution à 37° C 30 pendant 3 heures. On refroidit ensuite la solution à 20° C et on ajoute une solution d'acide m-chloroperbenzoïque (500 mg) dans de l'éthanol (10 ml). On abandonne la solution à 20° C pendant 20 minutes et on ajoute ensuite de l'éthanol (60 ml). On sépare le précipité par centrifugation et on lave avec de 35 l'éthanol (2 x 100 ml). On dissout un échantillon du produit N-oxydé ainsi obtenu dans du chlorure de sodium aqueux 0,15M et on détermine le rapport A §|§|E A oco -E « 0,93 71 16530 13 2100638 • * % de bases cytosine oxydées = 26(0,93-0,84) = 7% 1,18-0,84 On détermine 19hyperchromicité et la Tm de la substance N-oxydée dans du NaCl 0,15M comme dans l'Exemple N°le On constate que le produit N-oxydé présente une hyperchromicité de 71,1% 5 à 250 mji, avec une Tm de 60°. EXEMPLE N° 5 On traite une quantité supplémentaire de 20 mg de Poly I : Poly C exactement de la même manière que dans l'exemple N° 4, à la seule exception que l'on augmente le temps d'exposition à 10 l'acide m-chloroperbenzoïque à 60 minutes. La valeur du rapport A 258 mji * pour ce produit » * % de bases cytosine oxydées * 26(0,98-0,84)= 11% 1,18-0,84 On détermine 1'hyperchromicité et la Tm de la substance N-oxydée dans du NaCl 0,15M comme dans l'Exemple N° 4. On cons-15 tate que le produit N—oxydé présente une hyperchromicité de 65,9% à 250 mja avec une Tm de 60°o Une comparaison des degrés d'oxydation obtenus aux Exemples N° 4 et 5 avec celui de l'Exemple N° 3 indique que les zones à une seule chaîne du duplex sont préférentiellement oxydées. On 20 sait que le maintien d'une solution de Poly I : Poly C à 37° C augmente le degré de liaison entre les bases complémentaires. EXEMPLE N° 6 Données Biologiques Supplémentaires Tous les produits N-oxydés à deux chaînes des Exemples 25 N° 5, 7, 8 et 10 confèrent une protection à des souris de souche CD1 d'un poids compris entre 15 et 20 g lorsqu'on les administre par voie intrapéritonéale, à une concentration de 10 par souris, et lorsque celles-ci sont soumises, 24 heures plus tard, à une attaque par le virus de 1'encéphalomyocardite admi— 30 nistré par la même voie, les résultats étant indiqués dans le tableau ci-après:- (Tableau page suivante) Il est intéressant de noter que les caractéristiques de double chaîne et l'activité antivirale sont retenues à des taux 35 d'oxydation bien supérieurs lorsque le duplex Poly I : Poly C est oxydé (par exemple comme dans l'Exemple N° 3) que lorsque le Poly C est oxydé et ensuite traité par liaison avec le Poly I (par exemple comme dans l'Exemple N° 2). On répète le mode opératoire de l'Exemple N° 5 et on ob- 71 16530 14 2100638 TABLEAU II N-oxyde Dose yug Dose de Mortalité Mortalité ; par souris Virus (DL50 en 12 jours en 12 joursî 5 du virus) d'animaux d'animaux ï ayant reçu témoins ï le N-oxyde n'ayant pas* reçu de * N-oxyde î 10 : Poly I : Poly C 10 20 5/10 19/ 20 : 6% de N-oxyde : (exemple 2) 100 20 4/10 1 19/20 î * 15 Poly I : Poly C 10 20 9/10 19/20 î 17% de N-oxyde (exemple 2) 100 20 5/10 19/20 s Poly I : Poly C 10 20 4/10 19/20 : 20 58% de N-oxyde (exemple 3) 100 20 4/10 19/20 ï Poly I : Poly C 10 32 5/10 s 19/20 ï 11% de N-oxyde 25 (exemple 5) 10 320 8/10 19/20 : tient un N-oxyde à deux chaînes de Poly I : Poly C, oxydé à 16%. (Le N-oxyde original obtenu dans l'Exemple N° 5 n'est oxydé qu'à 11%, mais la différence provient probablement du fait 30 qu'un lot différent de substance de départ a été utilisé). Afin d'éprouver la toxicité aiguëjdu Poly I s Poly C N-oxydé à 16%, on administre, par voie intrapéritonéale, diverses quantités du N-oxyde r'ans une solution physiologique tamponnée au phosphate pH 7,0 à des groupes de souris de souche CD1. 35 On observe les souris pendant une période de 7 jours et on enregistre le nombre total de morts dans chaque groupe0 Les résultats sont consignés dans le Tableau III ci-après. (Tableau page suivante) Ces résultats indiquent que la toxicité aiguë du N-oxyde 40 à 16% est inférieure à celle de la substance de départ. 71 16530 15 2100638 TABLEAU XIX Dose(mg/kg): Mortalité/nombre de souris par : groupe 5 Poly I : Poly C: 10 0/10 0/10 0/10 6/10 20 40 80 10 15 Poly I : Poly C 16% N-oxyde 120 160 80 10 40 20 0/10 0/10 0/10 2/10 2/10 1/8 On note également une réduction de la toxicité aiguë pour les N-oxydes du Poly I : Poly C dont le degré d'oxydation est 20 compris entre 10% et 58% des résidus cytosine. Des modifications peuvent être apportées aux modes de mise en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de l'inventiono 71 16530 16 2100638 REVENDICATIONS lo- N-oxydes de Poly 1 : Poly C et sels de ces derniers, ces N-oxydes et leurs sels étant eux-mêmes à deux chaînes» 2.- Procédé de préparation de N-oxydes à deux chaînes de Poly I : Poly C et sels de ceux—ci, caractérisé soit (a) par la réaction du Pcly I : Poly C ou d'un sel de celui-ci avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracide pendant un laps de temps et à une température suffisants pour provoquer l'oxydation d'au moins certaines des bases cytosine, mais insuffisants pour provoquer la séparation de la substance à deux chaînes en une substance à une seule chaîne, soit (b) par la réaction de Poly C ou d'un sel de celui-ci avec du peroxyde d'hydrogène ou un peracide pendant un laps de temps et à une température suffisants pour provoquer l'oxydation d'au moins certaines, mais pas plus de 26%, des bases cytosine et ultérieurement la mise en contact du N-oxyde de Poly C ou du sel de celui-ci avec le Poly I ou un sel de celui-ci, de façon à former le N—oxyde à deux chaînes ou le sel de celui-ci désiré. 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le peracide est l'acide m-chloroperbenzoïque. 4.— N—oxydes de Poly I î Poly C et sels de ceux—ci, caractérisés en ce qu'ils sont préparés par le procédé suivant la revendication 2 ou 3.