Brevet FR2104735A1 — publié le 19720421

La présente invention concerne un procédé de prépa- B1 ration de la dés-phénylalanine -insuline. Selon ce procédé on fait réagir l'insuline, dans un mélange constitué d'un N.N-dialkyl-carboxamide ayant, au 5 total, de ^ à 6 atomes de carbone et d'une solution tampon aqueuse dont le pH se situe entre 8,0 et 9,0, avec un excès de tertio-butyloxycarbonyl-azide, à la température ambiante ou des températures légèrement élevées, puis on la fait réagir avec de 2 à 4 équivalents d'un isothiocyanate de phényle non 10 substitué ou portant un substituant négatif et on traite le produit réactionnel avec un acide fort, par exemple l'acide trifluoro-aeétique. B1 Jusqu'à présent on préparait la dés-phénylalanine insuline à partir de la fluorescéine- ou de la phényl-thio- T5«| 15 carbamoyl -insuline par la méthode de dégradation d'Edman. Mais, lorsqu'on fait réagir l'insuline avec les isothiocyanates correspondants en vue de créer les composés thiocarbamoyllques, il se forme toujours des mélanges car trois groupes amino présents peuvent réagir à des degrés différents. Jusqu'à pré-20 sent on devait séparer ces mélanges, laborieusement, par chromatographle sur colonne avec de l'urée 8M ou par électro-phorèse sur gel, avant d'obtenir, par la dégradation d'Edman, des composés purs. De telles séparations, cependant, ne sont possibles qu'à une petite échelle et servaient surtout, jus-25 qu'à présent, à des fins analytiques. En revanche, on peut facilement transposer le procédé selon l'invention à une échelle plus grande, ce qui fait l'avantage particulier de ce procédé. Il est surprenant de voir que dans la réaction du 30 teBtiobutyloxycarbonyl-azide avec l'insuline il se forme essentiellement, dans les conditions mentionnées du procédé la Na(A1 )^ jj£(B29)_kiS_tertiobuty 1 oxycarbony 1 -insuline dont le B1 groupe amino libre de 1'amino-acide ** (phénylalanine) peut alors réagir sélectivement avec un isothiocyanate de phényle. 35 Lorsqu'on traite ensuite le produit réactionnel par un acide fort, qui est de préférence l' acide trifluoro-acétique, les B1 deux groupes tertiobutyloxycarbonyles et la phénylalanine (à 1'état de thiazolinone) sont coupés simultanément. Le corps de départ mis en oeuvre est l'insuline d'une espèce animale ou d'une autre ; on utilise de préférence 71 03898 2 2104735 5 l'insuline bovine ou porcine ou un mélange de ces deux insulines dans lin rapport quelconque. Pour exécuter le procédé de l'invention on opère par exemple de la façon suivante. 5 Tout d'abord on met en suspension ou on dissout 1 millimole d'insuline dans 30 à 70 fois son poids d'un N.N-dialkyl-carboxamide . Ce dernier sera par exemple le diméthylformamide, le diméthylacétamide, le diéthylformaraide ou ]a N-méthylpyrrolidone. Ensuite on ajoute de 20 à 75 milli-10 moles de tertiobutyloxycarbonyl-azide et un volune d'une solution tampon représentant de 2,5 à 4 fois le poids de l'insuline employée, après quoi on agite pendant une durée de 3 à 6 heures à environ 35-40°C. Comme solution tan-pon on peut utiliser par exemple une solution normale d'un 15 bicarbonate alcalin ou un tampon aux phosphates alcalins de pH 8,0 - 9*0. On peut également augmenter la température de réaction à environ 50°C, de préférence à environ 35-40°C . La réaction se fait déjà à la température ambiante,mais il faut alcrs de 4 à 6 fois plus de temps. Pour séparer intermé-20 diairement la bis-tertiobutyloxycarbonyl-insuline,on peut soit précipiter directement avec de l'éther soit évaporer d'abord la solution à siccité sous vide à une température maximale du bain de 50°C, puis triturer le résidu avec de l'éther. Afin d'éliminer les sels tampons, on fait macérer le produit avec 25 de 5 à 10 fois son poids d'acide acétique à 1 - 2 % et avec de l'eau, et on le sèche sous vide sur P2®5* Afin de préparer le composé phényl-thiocarbamoy-lique, on dissout le produit avantageusement dans environ 20 à 50 fois sa quantité de pyridine aqueuse à environ 60 - 95 30 de préférence à 80 - 95 $, et on ajoute de 1,5 à 4 millimoles. d'un isothiocyanate de phényle éventuellement porteur de substituants. Au lieu de la pyridine on peut également utiliser comme solvant le diméthylformamide. Les substituants de 1'isothiocyanate de phényle peuvent être des substituants négatifs 35 tels que le chlore, le groupe nitro ou le groupe trifluoro-méthyle. On agite pendant une durée de 3 à 20 heures de préférence de 3 à 6 heures - à la température ambiante , et il est indiqué d'arrêter la réaction lorsqu'un trouble apparaît (indice de la dénaturation débutante du produit réactionnel). On 40 peut également opérer à environ 40°C ou à 0-10°C, respectivement 7t 03898 3 2104735 en diminuant ou en allongeant le temps de réaction. La réaction terminée, on précipite le produit réactionnel par de l'éther, on le conserve pendant 1 à 2 heures dans 10 fois son poids d'acide trifluoro-acétique, on le précipite de nouveau avec de l'éther et on le fait cristalliser de manière connue à un pH de 5,0 - 5,5. La détermination des amino-acides du composé montre la composition attendue. Une analyse typique, avec l'acide glutamique comme substance de référence, donne par exemple les résultats suivants pour les amino-acides corres-10 pondants : Glu Calculé: 7 Trouvé: 7,00 Gly " : 4 Trouvé: 3*98 Phe " s 2 " : 2,06 Lys " : 1 " : 1,01. 15 La dés-phénalalanine -insuline préparée selon l'invention possède les propriétés déjà connues pour ce composé. L'intérêt particulier de son application en tant que médicament (pour le traitement du diabète) réside dans le fait que certaines de ses propriétés physiques, par exemple la 20 solubilité, diffèrent de celles de l'insuline. Les exemples suivants illustrent l'invention. Afin de caractériser les insulines acylées, on s'est servi de l'électrophorèse sur papier (6. heures, 200 volts; dans acide acétique/acide formique pH 2 ; coloration avec du bleu 25 de bromonphénol); afin de vérifier la coupure de la phénylalanine, on aeu recours à l'électrophorèse et à la détermination des amino-acides. EXEMPLE 1 : a) On dissout 1 g (0,167 millimole) d'insuline porcine dans 30 70 ml de diméthyl-acétamide à 80 On y ajoute 1,45 g (10 millimoles) de tertiobutyloxy-carbonyl-azide et 3,3 ml (3,3 millimoles) de bicarbonate de sodium normal et on agite pendant 5 heures à 35°C. On concentre ensuite la solution sous vide à une température du bain de 35 50°C au plus. On triture le résidu avec de l'éther et on obtient 1,275 g d'un produit contenant du sel. Ce produit, après avoir macéré, avec 20 ml d'acide acétique à 2 donne 9^5 mg de N N ^^^-bis-tertiobutyloxy- carbonyl-insuline (porcine). 71 03898 4 2104735 On dissout ce composé dans 4 ml de pyridine à 95 %, on y ajoute 0,0365 roi d'isothiocyanate de phényle et on agite pendant 4 heures à la température ambiante. On concentre à un petit volume sous vide à une température du bain de 50°C au plus et on précipite le composé au moyen d'éther. Rendement : 820 mg de N £ ^^^-bis-tertiobutyloxy- carbonyl-N ^-phényl-thiocarbamoyl-insu- line (porcine). On conserve, à la température ambiante, 820 mg du composé préparé suivant b) pendant 1 heure dans 8,5 ml d'acide trifluoro-acétique. Après addition de .100 ml "Ri d'éther, 720 mg de dés-phénylalanine -insuline (porcine) précipitent et peuvent être cristallisés de manière connue à un pH de 5,0 - 5,5. Le traitement avec 1' acide trifluoro-acétique peut être effectué aussi pendant 10 minutes à 50°C ou pendant 5 minutes à reflux. Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,06 EXEMPLE 2 : On fait réagir 1 g d'insuline bovine suivant PO T5«J l'exemple 1 et on obtient 710 mg de dés-phénylalanine -insuline (bovine). Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,05. EXEMPLE 3 : On fait réagir 1 g d'insuline bovine suivant pc l'exemple 1 mais on réalise la réaction b) pendant 50 heures à + 5°C dans la pyridine à 85 B1 Rendement : 695 mg de dés-phénylalanine -insuline (bovine). Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,06. EXEMPLE 4 : 30 On fait réagir 1 g d'insuline porcine suivant l'exemple 1 mais on réalise la réaction b) pendant 1 heure à 40°C. B1 Rendement : 725 mg de dés-phénylalanine -insuline (porcine). Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,03. 35 EXEMPLE 5 Ï On fait réagir 1 g d'insuline mixte (bovine et porcine) suivant l'exemple 1 mais on prépare, suivant la réaction b), pendant 2 heures à la température ambiante au moyen de 0,3 millimole d'isocyanate de 4-nitro-phényle, le composé b) 10 c) 15 71 03898 5 2104735 ' 4-nitrophényl-thiocarbainoylique correspondant. Rendement : J80 mg de dés-phénylalanine -insuline. Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,02 EXEMPLE 6 : 5 On fait réagir 1 g d'insuline bovine suivant l'exemple 1 mais on prépare, suivant la réaction b), pendant 3 heures à la température ambiante au moyen de 0,4 millimole d'isothiocyanate de 4-chlorophényle, le composé 4-chloro-phé-nyl-thiocarbamoylique correspondant. B1 10 Rendement : 765 mg de dés-phénylalanine -insuline (bovine). Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,05. EXEMPLE 7 s On fait réagir 1 g d'insuline porcine suivant l'exemple 1 mais on prépare, suivant la réacticn b), pendant 15 2 heures à la température ambiante au moyen de 0,3 millimole d'isothiocyanate de 3-trifluorométhyl-phényle, le composé 3-trifluorométhyl-thlocarbamoylique correspondant. Rendement : 770 mg de dés-phénylalanine -insuline (porcine). Phe Cale. 2,00 Trouvé 2,04. 71 03898 6 2104735 REVENDICATIONS t.- Procédé de préparation de la dés-phényl- g«j. alanine -insuline, caractérisé en ce qu'on fait réagir l'insuline, dans un mélange constitué d'un N.N-dialkyl-carbo-5 xamide ayant au total de 3 à 6 atomes de carbone et d'une solution tampon aqueuse ayant un pH allant de 8,0 à 9*0 avec un excès de tertiobutyloxy-carbony1-azide, à la température ambiante ou à des températures légèrement élevées, puis on la fait réagir avec de 2 à 4 équivalents d'un isothiocyanate 10 de phényle non substitué ou portant un substituant négatif et on traite le produit réactionnel par un acide fort, par exemple par l'acide trifluoracétique. 2.- Procédé de préparation de compositions pharmaceutiques à action antidiabétique, caractérisé en ce •D4 15 qu'on présente la dés-phénylalanine -insuline préparée selon la revendication 1,associée ou non avec l'insuline ou ses dérivés, sous une forme de présentation appropriée pour l'emploi en thérapeutique. 3'.- Compositions pharmaceutiques utilisables 20 pour le traitement du diabète, caractérisées en ce qu'elles renferment la dés-phénylalanine -insuline préparée selon la revendication 1.