Brevet FR2081382A1 — publié le 19711203

La réaction de protéines avec des dérivés diazotés d'aniline, est une réaction connue depuis longtemps [K. LANDSTEINER, "The Specifity of Serologiéal Rections, 2ème édition, Harvard University Press, Cambridge/Mass., 1946]. Cette réaction donne des azoprotéines dont les propriétés biologiques, de préférence immunobiologiques, sont modifiées. Pour autant que l'a fait connattre la littérature technique, les enzymes n'ont pas encore été transformés en composés azoSques doués d'activité enzymatique.En raison de la forte spécifité des enzymes et de leur tendance fréquente à se dénaturer en perdant leur activité dès quels participent légèrement à des réactions chimiques, l'adaptation des procédés proposés par LANDSTEINER à des enzymes ne peut pas être généralisée. La Demanderesse vient de découvrir qu'on obtient des azo-Lasparaginases de grande activité enzymatique en faisant réagir des L-asparaginases avec des composés aromatiques de diazotation. La matière première, à savoir la L-asparaginase, a acquis depuis peu une importance en tant qu'agent chimiothérapique ["Biochemistry" (1967) 6, 721]. L'application de la L-asparaginase s'effectue principalement par injection intraveineuse. L'enzyme se répartit dans le sérum sanguin et est éliminé au bout d'un certain temps. La période biologique est une mesure de la durée de séjour dans le sérum. Cette période est nettement plus élevée dans le cas des azo-asparaginases que dans le cas des L-asparaginases non modifiées. On peut utiliser pour le procédé des L-asparaginases obtenues de façon quelconque, par exemple des L-asparaginases dérivées des micro-organismes E. coli ou Serratia marcescens. On considère toute une série de souches de E. coli comme organismes engendrant la L-asparaginase ; ce sont par exemple E. coli ATCC 9637, 4157, 8677, 8739, 9723, 10536, 10586, 11105, 11126, 12142, 120408, 12911, 13676, 13706, 13762, 14984, 11303. On considère comme composés de départ pour les sels de diazonium, des dérivés d'aniline ou des composés analogues. Par leur choix systématique, il est possible de faire varier,à dessein et par paliers,les concentrations et les solubilités des azoasparaginases. L'acide sulfanilique et l'acide p-aminobenzolque et leurs dérivés, de même que les dérivés à substituants basiques de l'aniline, se sont montrés particulièrement appropriés pour la réaction. La réaction de la L-asparaginase avec les dérivés diazotés des acides de l'aniline est conduite en solution aqueuse, et aussi, le cas échéant,dans des solvants aqueux tels que l'acétone, le méthanol, le dioxanne, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, etc. Lors de la réaction, le pH doit être neutre ou faiblement al- calin. Il est apparu particulièrement avantageux de faire réagir une mole de L-asparaginase avec 1 à 10 moles de sel de diazonium. Le produit de réaction, à savoir l'azo-asparaginase, peut entre isolé au moyen des procédés de la chimie des protéines, c'est-à-dire, par exemple,par élimination du sel par dialyse, précipitation avec des solvants organiques, déshydratation par congélation, ou conformément à une proposition ancienne, par précipitation au polyéthylèneglycol. Les nouveaux composés se distinguent des L-asparaginases utilisées comme matières premières par une modification de la vitesse de migration vers l'anode dans l'électrophorèse. Les azo-asparaginases décrites dans les exemples sont obtenues d'après le procédé général suivant, pour autant qu'elles dérivent de l'acide sulfanilique ou de l'acide p-aminobenzolque on ajoute 1,38 g de nitrite de sodium dans 20 ml d'eau à une solution refroidie de 20 millimoles du dérivé d'aniline dans 10 ml de lessive de soude 2N. Le mélange refroidi à la glace est versé dans 10 ml d'acide chlorhydrique 2N, ce qui abaisse la valeur de pH de la solution au-dessous de 3,5. On fait réagir une fraction aliquote de la solution fratchement préparée de sel de diazonium avec 1,05 g de L-asparaginase (50 moles) à un pH égal à 8,5 (tampon de borate).Le traitement est effectué au bout de 2 à 3 heures. Tout d'abord, on procède à la dialyse par échange avec de l'ammoniaque 0,01 M, puis le résidu non dialysable est déshydraté par congélation. L'azo-enzyme ainsi obtenu peut être purifié dans quelques cas par fractionnement avec le polyéthylène-glycol, à un degré tel qu'une cristallisation spontanée se produit. Exemple 1 On fait réagir 50 immoles d'acide sulfanilique diazoté avec 50 moles de L-asparaginase. On obtient une azo-asparaginase de légère couleur jaune orangé, ayant une activité de 158 U/mg de substance. Exemple 2 On fait réagir 250 moles d'acide sulfanilique diazoté avec 50 moles de L-asparaginase. On obtient une azo-asparaginase de légère couleur rouge orangé, ayant une activité de 105 U/mg de substance. Exemple 3 On fait réagir 250 moles d'acide p-aminobenzoSque diazoté avec 50 moles de L-asparaginase. On obtient une azo-asparaginase de couleur jaune orangé ayant une activité de 170 U/mg de substance. Exemple 4 On fait réagir 500 moles d'acide p-aminobenzoSque diazoté avec 50 moles de L-asparaginase. On obtient une azo-asparaginase de couleur jaune orangé ayant une activité de 130 U/mg de substance. Exemple 5 On fait réagir 250 moles d'acide 4-aminodiphénylamino diazote sulfonique-(2)/avec 50 moles de L-asparaginase. On obtient une azoasparaginase légèrement jaunâtre ayant une activité de 248 U/mg de substance. Exemple 6 On fait réagir 500 moles d'acide 4-aminodiphénylaminosulfonique-(2) diazoté comme dans l'exemple 5. On obtient une azoasparaginase jaunâtre ayant une activité de 228 U/mg de substance. L'azo-asparaginase cristallise lors de la précipitation fractionnée avec une solution aqueuse à 50 % de polyéthylène-glycol (de poids moléculaire égal à 6000) en petites aiguilles paraissant homogènes à l'examen microscopique. L'activité enzymatique ne peut pas entre augmentée par la cristallisation. Exemple 7 On fait réagir 250 moles d'acide 5-aminoisophtalique diazoté avec 250 moles de L-asparaginase. On obtient une azoasparaginase de couleur jaune terne ayant une activité de 182 U/mg de substance. Exemple 8 On fait réagir 500 moles d'acide 5-aminoisophtalique diazoté avec 250 moles de L-asparaginase. On obtient une azoasparaginase jaune ayant une activité de 163 U/mg de substance. Exemple 9 On fait réagir 250 moles d'acide 5-aminonaphtalènesulfonique-(2) diazoté avec 50 moles de L-asparaginase. On obtient une azo-asparaginase de couleur brun-rouge ayant une activité de 288 U/mg de substance. La substance peut entre obtenue à l'état cristallisé comme dans l'exemple 6. Exemple 10 Parréaction de 250 moles d'acide 4-chloro-2-aminobenzènesulfonique diazoté avec 50 moles de L-asparaginase, on obtient une azo-asparaginase de couleur jaune clair ayant une activité de 210 U/mg de substance. Exemple 11 Par réaction de 50 yoles d'acide 4-aminophénylméthanesulfonique diazoté avec 50 yoles de L-asparaginase, on obtient une azo-asparaginase de couleur jaune clair ayant une activité de 210 U/mg de substance. Exemple 12 Par réaction de 250 moles d'acide 3-chloro-4-aminobenzènesulfonique diazoté avec 50 moles de L-asparaginase, on obtient une azo-asparaginase jaune ayant une activité de 228 U/mg de substance, qui peut entre cristallisée comme dans l'exemple 6. Exemple 13 Par réaction de 250 moles d'acide 4-amino-2-hydroxybenzorque diazoté avec 50 moles de L-asparaginase, on obtient une azo-asparaginase de couleur rouge-orangé ayant une activité de 188 U/mg de substance. Exemple 14 Par réaction de 500 Moles d'acide 4-amino-2-hydroxybenzoique diazoté avec 50 umoles de L-asparaginase, on obtient une azoasparaginase de couleur rouge-orangé ayant une activité de 175 U/mg de substance. Xes azo-asparaginases décrites dans les autres exemples s'obtiennent Far réaction de L-asparaginase avec aes dérivés diazotés d'aniline à substituants basiques, d'après e procédé général suivant : On met en suspension 20 millim@@es de base dans 40 ml d'eau et on effectue la dissolution avec 21 @@ d'acide chlorhydrique 2N. On ajoute, en refroidissant à a glace, ,38 6 de nitrite de sodium dans 20 ml d'eau et on complète à 100 ml avec de l'eau.La valeur de pH des solutions se situe entre 7 et 4: Une fraction aliqucte de la solution est amenée à réagir avX ,05 g de L-asparaginase, Le traItement est effectué comme dans les exemples 1 à 14. Exemple 15 Par réaction de 250 umoles de 4-amino-N,N-diéthylaniline diazotée avec 50 moles de L-asparaginase, on obtient une azoasparaginase do couleur brunâtre ayant une activité de 70 U/mg de substance. Exemple 16 Par réaction de 50 @moles de 4-amino-N.N-diéthylbenzylamine diazotée avec 50 umoles de L-asparaginase, Dn obtient une azoasparaginase de couleur @aune terne ayant une activité de 175 U/mg de substance. Exemple 17 Par réaction de 250 @moles de 4-amino-N,N-diéthylbenzylamine diazotée avec 50 umoles de L-asparaginase, on obtient une azoasparaginase jaune ayant une activité ae 152 U/mg de substance. Exemple 18 Par réaction de 500 umoles de 4-amino-N,N-diéthylbenzylamine diazotée avec 50 moles de L-asparaginase, on obtient une azoasparaginase de couleur jaune-orangé ayant une activité de 115 U/mg de substance. Exemple 10 Par réaction de 250 umoles de 4-amino-(N-éthyl-N-hydroxyéthyl)-aniluine diazotée avec 50 @moles de L-asparaginase, on obtient une aso-asparaginase de couleur brunâtre ayant une activité de 102 U/mg de substance. REVENDICATIONS 1 - Des azo-L-asparaginases cristallisées. 2 - Procédé de préparation d'azo-L-asparaginases, caracte- risé par le fait qu'on fait réagir des L-asparaginases avec des amires aromatiques diazotées. - Méd@cament, caractérisé par le fait qu'il présente une teneur en azo-L-asparaginases.