Brevet FR2051522A1 — publié le 19710409

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique répondant à la formule I CH^O-CH, 10 CI) et qui sera désigné par la suite 11-désacétoxy-wortmannine„ L'invention concerne également tin procédé de préparation de cet antibiotique ainsi que son application en thérapeutique, à titre de 15 principe actif d'un médicament. Selon le procédé de l'invention, pour préparer la 11-désacétoxy-wortmannine 9(11) a) 20 on isomérise la -8,9-dihydro-ll-désacétoxy-wortmannine répondant à la formule II, 0 .CHO-CK > 25 ou (II) b) 30 on cultive une nouvelle souche de Pénicillium funiculosum Thom ou d'Aspergillus janus Râper et Thom dans un milieu nutritif, on isole la 11-désacétoxy-wortmannine de la bouillie de fermentation, par exemple par extraction ou adsorption, et on la purifie selon les méthpdes habituelles. Selon le procédé indiqué sous a), on effectue l'isomé-risation dans line base organique anhydre. En principe, on peut employer toute base organique; cependant,on utilisera de préfé-35 rence des bases organiques azotées, telles que la pyridine ou la quinoléine. Pour accélérer 1'isomérisation, on opérera à une 70 17286 2051522 10 15 température élevée, par exemple à la température d'ébullition de la base organique. Selon un mode d'exécution du procédé de l'invention, on dissout ra&^^^-8,9-dihydro-lI-désacétoxy-wortmannine dans la pyridine et on porte la solution à ébullition au reflux, de préférence sous atmosphère d'azote. Après évaporation, on purifie la 11-désacétoxy-wortmannine ainsi obtenue, par exemple par recristallisatibn. Pour préparer la à^il^-8,9-dihydro-ll-désacétoxy-wprtmannine, utilisée- comme produit de départ, on traite dans un solvant organique la wortmannine de formule III OAe m â% (III) 20 ' par de la poudre de zinc en présence d'un acide et en milieu anhydre, par exemple à la température d'ébullition du solvant organique. On sépare la poudre de zinc par fiitration, on évapore le mélange réactionnel et on purifie la A^^11^-8,9-dihydro-ll~ 25 désacétoxy-wortmannine ainsi obtenue,par exemple par recristallisation et/ou chromatographie. Selon le procédé décrit sous b), pour préparer la 11-désaeétoxy-wortmannine on part, soit d'une nouvelle souche de ■ Pénicillium funiculosum Thom. soit d'une nouvelle souche 30 d'Aspergillus januis Râper et Thom. La nouvelle souche S 3196 de Pénicillium funiculosum Thons, utilisée dans le procédé conforme à l'invention, a été isolée d'un prélèvement de terre provenant de Clarksburg, Mar^land (USA). Un échantillon de cette souche a été déposé sous le 35 n° NRRL 3363 au "United States Department of Agriculture" (Nothern Utilisation Research and Development Division), Peorla, BAD ORIGJNAl 70 17286 3 2051522 Illinois (USA).La nouvelle souche de Pénicillium funiculosum Thom se développe à une température comprise entre 18 et 27° sur un milieu gélose contenant de l'extrait de malt et de levure, en produisant ion mycélium fertile 5 abondant constitué de conidiophores jaune vif portant des conidies vertes. Sur la face arrière de la colonie, le substrat est coloré en vert-jaune. Du point de vue morphologique et physiologique, la souche S 3196 de Pénicillium funiculosum Thom correspond à la 10 description donnée par C. Thom dans U.S.Dept.Agr.Bur.Anim.Ind.Bul. Il8, page 69, fig. 27 (1910); elle est illustrée et décrite en détail dans le livre de K.B.Râper et C. Thom "A Manual of the Penicillia" pages 616-620, The Williams and Wilkins Co. (1949)* Baltimore. 15. La nouvelle souche S 8033/F d'Aspergillus janus, utili sée dans le procédé conforme à l'invention, a été isolée d'un prélèvement de terre provenant de la République Centrafricaine. Un échantillon de cette souche a été déposé sous le n° NRRL 3807 au "United States Department of Agriculture" (Northern Utilization 20 Research and Development Division), Peoria, Illinois (USA). La nouvelle souche d'Aspergillus janus Râper et Thom se développe à une température comprise entre 18 et 33°* de préférence comprise entre 18 et 27°* sur -un milieu gélose contenant de la peptone, du glucose, de l'extrait de malt et de levure, en formant un 25 mycélium étendu et non compact. La face arrière de la colonie et le substrat nutritif sont jaunâtres. Du point de vue morphologique et physiologique, la nouvelle souche d'Aspergillus janus correspond à la description donnée par K.B. Râper et D.J. Fennell dans "The Genus Aspergillus", 30 pages 476-480 (1965)* The Williams & Wilkins Co., Baltimore. Pour réaliser le procédé de l'invention, on peut également utiliser des souches telles que celles obtenues à partir des nouvelles souches de Pénicillium funiculosum Thom.ou d'Aspergillus janus Râper et Thom, par exemple par sélection ou mutation sous 35 l'action de rayons ultraviolets ou des rayons X, ou par d'autres méthodes, par exemple en traitant des cultures de laboratoire 70 17286 4 2051522 par des agents chimiques appropriés. Les nouvelles souches de Pénicillium funiculosum Thom et d'Aspergillus janus Râper et Thom peuvent être cultivées sur des milieux nutritifs très variés qui contiennent les matières 5 nutritives usuelles. C'est ainsi que ces souches utilisent les matières nutritives couramment employées par les organismes hétérotrophes, par exemple le glucose, l'amidon,, les dextrines, le lactose, le saccharose etc., comme source de carbone, des composés azotés organiques ou minéraux, tels que les peptones, 10 les extraits de levure et de viande, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, les amino-acides etc., comme source d'azote, ainsi que les sels minéraux et les oligo-éléments usuels. Pour préparer la 11-désacétoxy-wortmarinine, on peut procéder comme suit: 15 On ensemence un milieu nutritif liquide soit directe ment avec une suspension de spores d'une nouvelle souche de Pénicillium funiculosum Thom ou d'Aspergillus janus Râper et Thom, soit avec une suspension de mycélium de ces souches. Lorsqu'on utilise la nouvelle souche de Pénicillium funiculosum Thom, 20 on incube la culture pendant 5 à 10 jours à 2J°; lorsqu'on utilise la nouvelle souche d'Aspergillus janus Râper et Thom, on incube la culture pendant 3 à 4 jours à 18°. La culture peut être effectuée sous des conditions d'aérobiose en culture superficielle ou en culture submergée et agitée ou dans des fermenteurs 25 avec passage d'un courant d'air ou d'oxygène et sous agitation. Aussitôt qu'une quantité maximale de 11-désacétoxy-wortmannine a été produite, on filtre et on recueille le produit selon les méthodes habituelles, par extraction ou par adsorption, à partir du filtrat. 30 Selon une méthode qui s'est révélée particulièrement appropriée,-on extrait le filtrat avec de l'acétate d'éthyle; on peut également utiliser d'autres solvants organiques, tels que le benzène, le chloroforme, l'acétate de butyle, le chlorure de méthylène ou le butanol. On libère ensuite les extraits du solvant, 35 par exemple par distillation. Afin d'isoler le produit désiré, on purifie le résidu de distillation par chromatographie sur des 70 17286 5 2051522 milieux adsorbants, tels que l'alumine, le gel de silice, le silicate de magnésium etc., ou par partage à contre-courant. sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont tou-5 tes exprimées en degrés centigrades, les points de fusion ont été déterminés sur lë banc chauffant Kofier. wortmannine dans 200 ml de pyridine et on maintient pendant 60 10 heures à la température d'ébullition au reflux et sous atmosphère d'azote. On évapore ensuite le mélange réactionnel et on recristallise à deux reprises le résidu d'évaporation dans du méthanol. On obtient ainsi,à l'état pur, la 11-désacétoxy-wortmannine fondant à 178-180°. 15 Pour préparer la A^^^-S^-dihydro-ll-désacétoxy- wortmannine, utilisée comme corps de départ, on procède de la façon suivante: on dissout 10 g de wortmannine dans 1 litre d'éthanol, on ajoute 10 g de poudre de zinc et 10 ml d'acide 'acétique glacial à la solution ainsi obtenue et on la porte à 20 ébullition au reflux pendant 15 minutes. Après refroidissement, on filtre le mélange réactionnel et on l'évaporé. On reprend le résidu par du chlorure de méthylène, on filtre et on évapore à nouveau. Après recristallisation dans le méthanol, on obtient la A 9(ll)_8,9-dihydr0-ll-désaCét0xy-w0rtmannine à l'état brut que 25 l'on chromatographie sur 260 g de gel de silice en utilisant un mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 49:1 comme éluant. On recueille des fractions de 500 ml. On réunit les fractions 3 à 8, on évapore 1'éluant et on recristallise le résidu dans du chlorure de méthylène en ajoutant du méthanol. La 30 8,9-dihydro-ll-désacétoxy-wortmannine ainsi obtenue fond à Les exemples suivants illustrent la présente invention 35 20 g de célérose 2g d'extrait de malt 70 17286 6 2051522 2g d'extrait de levure 2 g de KH2P04 2 g de MgSO^ . THgO et, pour le reste, de l'eau déminéralisée. 5 On ensemence cette solution nutritive avec une suspen sion de spores de la souche NRRL 33&3 de Pénicillium funiculosum Thom et on incube pendant 112 heures à 27°, tout en aérant (150 litres d'air/minute) et tout en agitant (100 tours/minute). On filtre la bouillie de fermentation et on extrait le filtrat à 10 deux reprises avec chaque fois 100 litres d'acétate d'éthyle. On lave la phase organique une fois avec 60 litres d'eau et on l'évaporé sous pression réduite jusqu'à un volume de 5 litres. On sèche le concentré ainsi obtenu sur sulfate de magnésium anhydre et on l'évaporé. On répartit le résidu d'évaporation à trois re-15 prises entre de l'éther de pétrole et un mélange de méthanol et d'eau dans le rapport 9:1- On concentre la phase méthanolique et on l'extrait ensuite à trois reprises avec de l'acétate d'éthyle. On lave les solutions d'acétate d'éthyle une fois à l'eau, on les sèche sur sulfate de magnésium anhydre et on les évapore. On 20 chromatographie l'extrait ainsi obtenu sur 50 fois sa quantité de gel de silice. On élue avec un mélange de chloroforme et de siéthanol dans le rapport 99»! et on recristallise le produit à deux reprises dans un mélange de chlorure de méthylène et d'éther, ee qui donne la 11-désacétoxy-wortmannine fondant à 178-25 Exemple 3 — Dans un fermenteur, on introduit 30 litres d'une solution nutritive ayant par litrs la même composition que celle spécifiée à l'exemple 2. On ensemence cette solution nutritive avec 3 litres d'une préculture décrite ci-après, de la souche 30 NRRL 3807 d'Aspergillus janus et on incube pendant 50 heures à 18°,-tout en aérant (6-24 litres d'air/minute) et tout en agitant (150 tours/minute). On filtre la bouillie de fermentation et on extrait le filtrat à deux reprisas avec chaque fois 20 litres d'acétate d'éthyleo On lave la phase organique une fois avec 12 35 litres d'eau et on l'évaporé sous pression réduite jusqu'à un volume de 1 litre. On sèche le concentré ainsi obtenu sur sulfate BAD ORIGINAL 70 17286 7 2051522 de magnésium anhydre et on l'évaporé. On répartit le résidu d'évaporation à trois reprises entre de l'éther de pétrole et un mélange de méthanol et d'eau dans le rapport 9:1. On concentre la phase méthanolique et on l'extrait ensuite à trois reprises 5 avec de l'acétate d'éthyle. On lave les solutions d'acétate d'éthyle une fois à l'eau, on les sèche sur sulfate de magnésium anhydre et on les évapore. On chromatographie l'extrait sur 50 fois sa quantité de gel de silice. On élue avec un mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 99:1 et on recristal-10 lise le produit à deux reprises dans un mélange de chlorure de méthylène et d'éther, ce qui donne la 11-désacétoxy-wortmannine fondant à 178-180°. Pour préparer la préculture mise en jeu dans le procédé décrit ci-dessus, on opère comme suit: 15 A3 litres du milieu nutritif spécifié à l'exemple 2, on ajoute 2 g de peptone par litre de solution nutritive; on ensemence cette dernière avec une suspension de spores de la souche NRRL J>80J et on incube pendant 7 jours à 27°, tout en agitant. 20 La 11-désacétoxy-wortmannine possède une action fongi- statique très puissante vis-à-vis de différents agents pathogènes responsables des mycoses chez l'homme ou des infections fongiques des plantes. Il y a lieu de signaler en particulier la bonne activité de la 11-désacétoxy-wortmannine qu'on a observée "in 25 vitro" contre les organismes suivants: Histoplasma capsulatum, Candida krusei, Trichophyton tonsurans, Epidermophyton floccosum et 30 Microsporum canis. La 11-désacétoxy-wortmannine exerce en outre une action inhibitrice sur les oedèmes et une action antiphlogistique comme il ressort de l'exposé suivant. On a déterminé l'inhibition exercée par la 11-désacétoxy-35 wortmannine vis-à-vis de l'oedème provoqué par la carragénine sur la patte du rat. On utilise des rats maintenus au' jeûne pendant 70 17286 8 2051522 18 heures et hydratés par voie orale avant l'essai avec 30 ml/kg d'une solution à 0,9$ de chlorure de sodium. 0,1 ml d'une suspension à 10$ de earragénine, injectée dans la région plantaire d'une patte postérieure, provoque un oedème qui se manifeste 5 après environ 2 heures et qui atteint un maximum après 3 à 5 heures. La substance à essayer est administrée par voie orale, une fois par jour, pendant 4 jours. La DÉ,--, c'est-à-dire la dose qui inhibe à 50$ l'augmentation moyenne du volume de la patte par rapport aux animaux témoins, est de 2 mg/kg. 10 L'action antiphlogistique de la 11-désacétoxy^wort mannine a été mise en évidence par l'action inhibitrice qu'elle exerce sur le granulome en forme de poche provoqué par la earragénine chez le rat. On opère selon une modification de la méthode décrite par H. Selye dans J.Amer.med.Assoc. 152, 1207 15 (1953)* On injecte par voie sous-cutanée 6 ml d'air dans la région dorsale de l'animal. Il se forme une poche dans laquelle on administre le phlogogène (4 ml d'une suspension à 2$ de earragénine dans une solution de chlorure de sodium.à 0,9$)• Un exsudât apparaît alors, ainsi que des tissus prolifératiques. La 20 substance à-essayer est administrée par voie orale une fois par jour. Au bout de 7 jours on sacrifie les animaux et on détermine la quantité d'exsudât et de tissus prolifératiques qui se sont • formés. La dose qui inhibe à 50$ la prolifération des tissus par rapport aux animaux témoins est d'environ 3 mg/kg. La dose qui 25 inhibe à 50$ l'exsudât par rapport aux animaux témoins est de 2 mg/kg. On a également déterminé l'inhibition exercée par la 11-désacétoxy-wortmannine sur le granulome en forme de poche provoqué par la carboxyméthylcellulose chez le rat. On injecte 30 par voie sous-cutanée 5 ml d'air dans la région dorsale de l'animal. 24 heures plus tard, on injecte dans la poche qui s'est formée 4 ml d'une suspension à 2$ de carboxyméthylcellulose. La substance à essayer est administrée à deux reprises par voie orale 30 minutes avant l'injection d'air et 30 minutes avant 35 l'injection du phlogogène. 6 heures après l'injection de carboxyméthylcellulose, on mesure le taux des leucocytes et la teneur 70 17286 9 2051522 en protéines. La dose qui abaisse de 50$ le taux des leucocytes par rapport aux animaux témoins est de 2 mg/kg. La dose qui abaisse de 50$ la teneur en protéines est supérieure à mg/kg. La 11-désacétoxy-wortmannine peut donc être utilisée 5 en thérapeutique comme agent fongistatique ou encore comme anti-phlogistique pour le traitement des oedèmes et des états inflammatoires d'origines diverses. La dose à administrer dépend de l'effet désiré ainsi que de-1'application envisagée. La posologie s'établit entre 1 et 50 mg de principe actif par jour. 10 Pour l'application par la voie orale, les formes d'ad ministration appropriées contiennent de 1 à 50 mg de principe actif, en mélange avec des supports solides ou liquides. Pour l'application topique, on peut utiliser des poudres-, des liquides pour pulvérisation,des pommades ou des•teintures contenant de 15 0,1 à 2$ de substance active. En tant que médicament, la 11-désacétoxy-wortmannine peut être utilisée soit seule, soit sous forme de préparations médicamenteuses appropriées pour l'administration orale ou pour l'application topique. On prépare les formes médicamenteuses 20 appropriées en mélangeant la substance active avec des excipients minéraux ou organiques, indifférents du point de vue pharmaceutique. Comme excipients, on utilisera par exemple: pour des comprimés et des dragées: le lactose, l'amidon, le talc, l'acide stéarique etc.; 25 pour des sirops -: le saccharose, le sucre inver ti, des solutions de glucose etc.; pour des pommades : l'eulénine, la glycérine, la vaseline, l'huile de paraffine 30 etc.. Outre la substance active, les préparations peuvent contenir des agents de conservation, des stabilisants, des mouillants, des auxiliaires de dissolution, des édulcorants, des colorants, des aromatisants etc., appropriés. 70 17286 10 2051522 REVENDICATIONS 1.- Nouvel antibiotique, caractérisé en ce qu'il répond à la formule I CH^O-CHg 10 (I) en l'espèce la 11-désacétoxy-wortmannine. 2.- Un procédé de préparation de la 11-désacétoxy-wortmannine spécifiée à la revendication I, caractérisé en ce 15 qu'on isomérise la A^^^-S^-dihydro-ll-désacétoxy-wortniannine répondant à la formule II 20 CH^0-CH (II) 25 3.- Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue 1'isomérisation dans une base organique anhydre. 4.- Un procédé selon la revendication 3* caractérisé en' ce qu'on utilise une base organique azotée. 30 5«- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise la pyridine. 6.- Un procédé selon les revendications 2, 3, 4 et 5, caractérisé en ce qu'on effectue 1'isomérisation à température élevée, par exemple à la température d'ébullition de la base 35 organique. _7Q 17286 2051522 *• q ,3 f ^ n ■ 7*- Un procédé de préparation de la 11-désacétoxy-wortmannine spécifiée à la revendication 1, caractérisé en ce "-i-qtt-1 on cultive une nouvelle souche de Pénicillium funiculosum Thom dans un milieu nutritif, on isole la 11-désacétoxy-wortman-5 nine de la bouillie de fermentation, par exemple par extraction ou adsorption, et on la purifie, selon les méthodes habituelles. 8.- Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise la souche NRRL 33^3 de l'espèce Pénicillium funiculosum Thom. 10 9j- Un procédé de préparation de la 11-désacétoxy- wortmannine spécifiée à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive une nouvelle souche d'Aspergillus janus Râper et Thom dans un milieu nutritif, on isole la 11-désacétoxy-. • wortmannine de la bouillie de fermentation, par exemple par ex- 15•• traction ou adsorption, et on la purifie, selon les méthodes - - '^habituelles ^ 10.- Un procédé selon la revendication 9> caractérisé en ce qu'on utilise la souche NRRL 3807 de l'espèce Aspergillus janus Râper et Thom. .20 11.- Un médicament exérçant, notamment, une action fongistatique et caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, la 11-désacétoxy-wortmannine spécifiée à la revendication 1. 12.- Un médicament exerçant, notamment, une action 25 inhibitrice vis-à-vis des oedèmes et une action antiphlogistique et caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, la"11-désacétoxy-wortmannine spécifiée à la revendication 1. 13.- Une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient la 11-désacétoxy-wortmannine en association 30 avec des excipients et supports acceptables du point de vue -pharmaceutique.