Brevet FR2034698A1 — publié le 19701211

La présente invention se rapporte à un nouvel octadécapep-tide ayant la formule f3-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-I-L-hi s t i dy1-L-phénylalany1-L-arginy1-L-t rypt ophy1-glycyl-i-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-Y où X est un 5 reste d'acide glutamique ou un reste de glutamine et Y est un reste d'arginine ou un reste d'amide d'arginine ; elle se rapporte également aux sels non toxiques d'addition avec les acides, aux complexes avec un métal lourd, un acide polyaminé ou leurs mélanges et à leurs intermédiaires, l'octadécapeptide, le sel d'ad-10 dition avec les acides et le complexe sont utiles comme médicaments car ils sont très puissants et ont une longue action en ce qui concerne l'activité de stimulation surrénale, l'activité lipotrope et l'activité de stimulation de mélanocytes. Tous les acides aminés seront décrits ci-après sous forme de leur configuration L, 15 sauf indication contraire. La désignation en abréviation des ami-noacides, des peptides et de leurs dérivés est en accord avec la nomenclature de la Commission IUPAC-ITJB. On a déjà indiqué les synthèses d'un grand nombre d'analogues de peptide de corticotropine (ACTH) dans divers laboratoires. Les 20 analogues de peptide sont ceux' dans lesquels les aminoaciêtes individuels de la séquence naturelle sont remplacés par d'autres ami-noacides ; par exemple, le premier aminoacide, la sérine, est remplacée par la glycine ou la D-sérine, ou le quatrième aminoacide, la méthionine, est remplacé par la valine ou la norleucine ou le 25 cinquième aminoacide, l'acide glutamique, est remplacé par la glutamine, ou le dix-septième et le dix-huitième aminoacide, l'ar-ginine,sont remplacés par la lysine ou l'ornithine, ou le vingt-cinquième aminoacide, l'acide aspartique, est remplacé par la va-line. Bien que de nombreux peptides corticotropes ayant une sé-30 quence légèrement modifiée d'aminoacides aient été synthétisés jusqu'à présent, aucun n'a présenté une activité supérieure à celle de la corticotropine naturelle, à quelques exceptions près. Parmi ces peptides, on doit noter comme étant spécialement intéressant le peptide D-Ser^—îîLe^-Tal^^-AC!PH( 1—25)—HH2» coll"~ 35 tient le.résidu de D-sérine à l'extrémité aminée, à la place de la L-sérine du produit naturel, le résidu d'amide de valine à son extrémité carboxylique substitué au résidu d'acide aspartique et nn reste de norleucine à la place du reste de méthionine en position 4 de la corticotropine, et qui est plus puissant, au point 40 de vue des activités biologiques, que la corticotropine naturelle, 70 07914 2 2034698 tel qu'indiqué dans la littérature : Experientia., 22 526 (1966). Il semble très probable que l'augmentation apparente d'activités observée avec le produit D-Ser^-Nle^-Val^-ACTHC 1-25 est une conséquence de la diminution de sensibilité du peptide vis-à-vis 5 de l'action de 1 *aminopeptidase et de la carboxypeptidase, par suite de la présence de D-aminoacide à l'extrémité aminée et de l'amide de valine à l'extrémité carboxylique et est due au fait que l'oxydation de la méthionine en position 4- en méthionine sul- foxyde entraînant une désactivation ne se produit pas durant la 10 réaction, par suite du remplacement du reste de méthionine par un U a oc reste de norleucine. Bien que le produit D-Ser -Nie -Yal -1GTH(1-25)-MH2 soit un excellent peptide corticotrope au point de vue des propriétés biologiques fortement actives, ce peptide n'est pas nécessairement idéal parce qu'il entraîne certains problèmes à ré-15 soudre en vue de son utilisation pratique pour le traitement des êtres humains et d'un point de vue industriel. Puisque le produit D-Ser'-NLe^-Yal^^-ACÏH(1-25J-HHg contient trois aminoacidea modifiés, c'est-à-dire des restes de D-sérine, de norleucine et de valine, on craint qu'une réaction anaphylactique puisse se pro-20 duire lorsqu'il est administré ches les êtres humains par suite de différence de séquence d'aminoacidea entre la corticotropine humaine et le peptide de synthèse. Il est bien connu que la réaction anaphylactique se produit souvent lorsque la corticotropine disponible dans le commerce, provenant de glandes d'animaux tels 25 que des porcs, des boeufs, des moutons ou analogues est administrée aux être humains. Ce phénomène indésirable peut être une conséquence de l'existence de partie d'espèces spécifique, c'est-à-dire les différences de structure aux positions 25 à 33 dans les séquences d*aminoacidea entre la corticotropine humaine et la cor-30 ticotropine d'animaux, et peut être dû. à certaines impuretés du genre protéiné qui ne peuveïit pas être retirées complètement de la corticotropine naturelle d'origine animale. En outre, dans la production des peptides contenant de la sérine, il est bien connu que la réactivité du groupe hydroxyle de la sérine ainsi que la 35 labilité ou la mobilité de la liaison séryle du peptide dans des conditions alcalines, la tendance aux réactions d'alimination en 0 formant un déhydropeptide et le déplacement H— ;>0 acyle rendent très difficile la préparation de peptides contenant de la sérine qui sont souvent accompagnés de racémisations par suite de la la-40 bilité vis-à-vis des conditions alcalinea. De plus, puisque de 70 07914 3 2034698 nombreux procédés de synthèse, de nombreuses heures de travail et une main d'oeuvre importante sont exigés pour obtenir un peptide à longue chaîne, il est très souhaitable de préparer un peptide à forte activité corticotrope, dans lequel les séquences d'a-5 minoacides soient aussi courtes que possible. Pour obtenir un peptide à forte activité corticotrope dont la séquence d'aminoacides soit aussi courte que possible, l'amide d1octadécapeptide correspondant aux restes des dix-huit premiers aminoacides de la corticotropine, sauf l'extrémité carboxylique 10 transformée en amide, a été synthétisée tel qu'indiqué dans la littérature ; J.Am. Chem.Soc., 87 2696 (1965) et J.Biochem. (Tokyo) £8 512 (1965). En outre, la demanderesse a préalablement réussi à synthétiser une amide d'octadécapeptide dans laquelle la sérine de la terminaison aminée de la corticotropine est remplacée par 15 un reste de glycine et l'extrémité carboxylique est transformée en amide [Bull.Chem.Soc. Japan., 43 196 (1970)], Les deux peptides sont fortement actifs au point de vue de l'activité corticotrope ; dans des activités de stéroïdogénèse in vivo par administration intraveineuse chez les rats, ils sont équivalents à l'ac-20 tivité de la corticotropine de mouton. Cependant, les activités de stéroïdogénèse in vitro sont quelque peu inférieures à celles de la corticotropine de mouton. Au cours d'investigations sur des peptides corticotropes pour résoudre les problèmes techniques tels que mentionnés précé-25 demment, la demanderesse a découvert qu'un octadécapeptide ayant la formule P-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionyl-X-histidyl-phénylala-nyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-lysyl-lysyl-arginyl-Y où. X est un reste d'acide glutamique ou un reste de glutamine et Y est un reste d'arginine ou un reste d'amide d'ar-30 ginine, son sel non toxique d'addition avec les acides, son complexe avec un métal lourd, un acide polyaminé ou un mélange de ces produits présentent des propriétés biologiques marquées, une activité de stimulation surrénale, une activité lipotrope et une activité de stimulation de mélanocytes qui sont toutes supérieures 35 à celle de la corticotropine naturelle et des peptides de corticotropine synthétiques connus jusqu'à présent., La demanderesse a également découvert que 1'octadécapeptide avait une activité corticotrope ralentie, probalement par suite de la résistance à l'action de l'aminopeptidase. On a également trouvé que le com-40 plexe présente une activité à longue durée. On a, en outre, dé- 70 07914 4 2034698 couvert que les produits réalisés par la présente invention é-taient utiles comme médicaments et comme intermédiaires pour la préparation du produit désiré» La présente invention a été réalisée sur les bases de ces découvertes» 5 C'est, en conséquence, un objet de la présente invention d'obtenir un octadécapeptide ayant la formule (3-alanyl-tyrosyl-. séryl-méthionyl-X-Mstidyl-ph.énylalanyl-arginyl-tryptoph.yl-glycyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-lysyl-lysyl-arginyl-Y où X est un reste d'acide glutamique. ou un reste de glutamine et Y est un reste d'ar- : 10 ginine ou un reste d'amide d'arginine, son sel non toxique d'addition avec les acides, son complexe avec un métal lourd, un acide polyaminé ou un mélange de ces produits, possédant une activité biologique bien marquée et d'excellentes caractéristiques au point de vue des aspects industriels et biologiques, par rapport à la 15 corticotropine naturelle et aux peptides connus apparentés ayant j une activité corticotrope»Un autre objet de la présente invention- ! j est de mettre en oeuvre un procédé de préparation de 1'octadécapep- j tide, de son sel d'addition avec les acides et de son complexe, à ; l'état pur et avec un rendement élevé sans désactivation, sans ré-20 action secondaire et sans racémisation» Un autre objet de la présente invention est de fournir les intermédiaires pour la production du présent octadécapeptide et de produire ces intermédiaires. Ces objets et d'autres encore et la manière par laquelle ils sont réalisés apparaîtront aux personnes expérimentées dans la techni-25 que, d'après la description suivante de la classe générale de composés et de certains exemples spécifiques de membres particuliers, ainsi que des procédés généraux et spécifiques pour leur production. En général, les polypeptides sont produits par divers procédés, c'est-à-dire que les restes d'aminoacides dans une séquence 30 indiquée sont liés ensemble un parunou sous forme de fragments de peptide préalablement synthétisés» Ainsi, l'unité de peptide ou l1aminoacide peut être lié à des aminoacides ou des fragments de peptide supplémentaires par un procédé connu en soi. Dans la production du présent octadécapeptide et de ses in-35 termédiaires, n'importe quel groupe fonctionnel libre ne participant pas à la réaction est avantageusement protégé, spécialement au moyen de radicaux qui sont faciles à éliminer par un procédé tel que l'acidolyse, l'hydrogénolyse -ou l'hydrolyse» Le groupe carboxylique est avantageusement protégé par estérification, par 40 exemple, avec un alcanol inférieur (par exemple, le méthanol, copy \ 70 07914 5 2034698 l'éthanol, le propanol, l1 isopropajiol, le butanol tertiaire) ou un aralcanol inférieur (par exemple, l'alcool benzylique, l'alcool p-nitrobenzylique, l'alcool p-méthoxybenzylique) ou par formation d'amide» le groupe aminé est protégé de préférence en introdui-5 sant un groupe tel que le groupe t-butyloxycarbonyle, le groupe t-amyloxycarbonyle, le groupe p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le groupe benzyloxycarbonyle, le groupe p-nitrobenzyloxycarbonyle, le groupe trityle, le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle, le groupe formyle ou analogues. Pour la protection du groupe gua-10 nido de l'arginine, on emploie de préférence le groupe nitro ou tosyle, mais il n'est pas toujours nécessaire de protéger le groupe guanido de l'arginine durant la réaction. Egalement, le groupe £,-amino de la lysine est avantageusement protégé avec le groupe t-butyloxycarbonyle, le groupet-amyloxycarbonyle, le groupe ben-15 zyloxycarbonyle ou le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle. En outre, le groupe r-carboxyle de l'acide glutamique est, de préférence, protégé sous forme d'ester alkylique inférieur (par exemple, méthylique, éthylique, propylique, t-butylique) ou d'ester aralkylique inférieur (par exemple, benzylique, p-nitrobenzylique, 20 p-méthoxybenzylique) ou par formation d'amide, et le groupe imino de l'histidine peut être protégé par un groupe benzyloxycarbonyle, un groupe benzyle ou analogues. Le procédé de condensation pour la formation de liaison de peptide comprend, par exemple, le procédé à la dicyclohexylcarbo-25 diimide, le procédé à 1'azothydrure, le procédé à l'ester actif (par exemple, ester cyanométhylique, thiolester p-nitrophénylique, ester p-nitrophénylique, ester de M"-hydroxysuccinimide, ester 8-quinolyl-ique, ester 1-pipéridylique) le procédé au mélange d'anhydrides, le procédé au N-carboxyanhydride, le procédé au pyrophos-30 phite de tétraét&yle, le procédé au chloropliospiiite d'éthyle et un procédé en combinaison et les procédés normalement utilisés dans le domaine de la chimie des peptides. Les peptides désirés sont également préparés par la synthèse dite en phase solide, dans" laquelle le peptide est synthétisé en commençant à l'extrémité car-35 boxylique qui est liée, à la manière d'un ester, à un polymère, et les aminoacides sont condensés les uns après les autres. Tous les procédés mentionnés ci-dessus peuvent être employés pour la formation de toutes les liaisons peptides dans la préparation du présent octadécapeptide et de ses intermédiaires. 40 Comme on l'a mentionné ci-dessus, il y. a un certain nombre de \ 70 07914 6 2034698 voies possibles pour préparer l1octadécapeptide à partir des ami- noacides ou des unités de peptides. Selon un procédé, par exemple, 1'octadécapeptide ayant la formule 0-alanyl-tyrosyl-séryl-méthio- nyl-X-histiâyl-phénylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-lysyl-pro- 5 lyl-valyl-glycyl-lysyl-lysyl-arginyl-Y où. X est un reste d'acide glutamique ou un reste de glutamine et Y est un reste d'arginine ou un reste d'amide d'arginine, peut être produit en condensant un décapeptide ayant la formule R^-p-alanyl-tyrosyl-séryl-méthio- nyl-tf-B^-glutamy1-histidy 1-phénylalany1-arginy1-1ryptophy1-glycine 10 dans laquelle R^ est un groupe de protection du groupe aminé et R^ est un groupe de protection du groupe carboxylique, avec un octapeptide ayant la formule ïï ^-R,-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-f ( N -R^-lysyl-N °-R^-lysyl-arginyl-Y dans laquelle Rj est un groupe de protection du groupe aminé et Y est tel que défini ci-des-15 sus, dans un solvant inerte tel que la diméthylformamide, le di-méthylsulfoxyde, la pyridine, le diméthoxyéthane, l'hexaméthyl-phophorotriamide, le dioxane ou un mélange de ces solvants, à une température comprise entre -2Q°C et 50°C, pendant 2 à 96 heures, par un procédé connu en soi, et en retirant les groupes 20 protecteurs de 1'octadécapeptide protégé résultant ayant la formule R1 -p-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionyl-JH^rgUtamyl-histidyl- £ phénylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-N -R^-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-N^-R^-lysyl-N^-R^-lysyl-arginyl-Y où Rp Rg, R^ et Y sont tels que définis ci-dessus, d'une manière classique en soi, 25 tel qu'une acidolyse, une hydrogénolyse ou une hydrolyse. Le procédé qu'on préfère pour la préparation de 1'octadécapeptide est présenté dans le schéma de synthèse suivant : Schéma de synthèse pour 1'octadécapeptide BOC-p-Ala.OH + H.Tyr.OMe (I> i B0C-|3-Ala. Tyr.OMe (II) , I nh2nh2.h2o B0C-f3-Ala-Tyr.NHNH0 + (IV) j 2 BOC-P-Ala-Tyr.S er„Me t.OMe (VI) , I KH2NH2oH20 BOC-p-Ala-l'yr. Ser. Met. NHNHp (VII) * B OC-Ser 0 OH + H. Me t. OMe BOC-Ser„Met»OMe (m) | + I H+ H»Ser.Met.OMe (V) NOo BOC-Arg.Trp.Gly.OMe (VIII) . N0 J HCOOH I ^ BOC-Phe„OH + H.Arg„Trp„Gly.OMe I (IX) y°2 \ BOC-Phe.Arg„Trp.Gly.OMe (X) , HCOOH z | N02 Z-His.ONP + H.Phe.Arg.TrpoGly.OMe (XI) ? 1 fa Z-His o Phe oArg.Trp.Gly.OMe (XII> i , s - i \ (i) OH , (ii) HP Z-Glu-ONP + H„His oPhe0Arg0Trp„Gly OBu^ Z-(j1u„His»Phe„Arg,Trp„Gly.OH OBu1 (XIV) OBu i Hg/Pd H„Glu o His.Phe.Arg„Trp.Gly.OH (XV) ■^1 O o -o K> O eu Js* O O œ VII 01a + XV t BOC-P-Ala. Tyr. Ser. Met. dlu.. His. Phe .Arg. Trp. Q-ly. OH (XVI) HHS, DCCI si O O si >o OBu t B^C BOC BOC BOO-p-Ala » Tyr .Ser.Met .GrliiuHia. Phe. Arg. Trp. Q-ly. ONÏÏS +• H. Ly •. Ps®. Y al. &ly . Ly a. Ly a. Arg. Arg. R ' (XVII) OBu" BOC 100 ÏOC | | | B 00-P-Ala. Tyr .Ser.Met.G-lu.HiB. Phe. Arg. Trp. G-ly. Ly a. Pr o. Val. ffly. Ly œ. Ly ». Arg. Arg. R1 (m) , , v I (i) Àeidolyae (il) Colonne ât OMC H-p-Ala. Tyr.Ser.Met. Glu. Hi s. Phe. Arg. Trp. GUy. Ly a. Pro. Val. Gly. Lya e Lya. Arg. Arg. R » (XX) CD O UJ J* O 00 70 07914 9 2034698 Sans le schéma indiqué ci-dessus, on utilise les abréviations suivantes : OMC » carboxyméthylcellulQse, DCCI * ï,*-dicyclohexyl~ carbodiimide, HHS « H-hydroxysuccinimide, BOC ■ tr-butyloxycarbony-t le, OBu * ester t-butylique, R* = HH^ ou OH, Z ■ reste de benstyl-5 oxycarbonyle, OHP « ester p-nitrophénylique. Cône en l'indique dans le schéma de synthèse, le décapeptide à terminaison azotée typique, la t-butyloxycarbonyl-0-aïanyl-ty-rosyl-séryl-méthionyl-*-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycine,qui est un nouveau composé et est utile 10 comme intermédiaire pour la préparation du présent octadécapeptide, peut ttre préparé en faisant réagir l'hydrazide de t-butyloxycar-bonyl-P-alanyl-tyrosul-séryl-méthionine avec la T-t-butyl-gluta-myl-histidyl-phénylalanyl-arginyl-tryptephyl-glycine par le procédé à l'asothydrure. l'hydraiide de tétrapeptide, c'est-à-dire 15 l'hydraxide de t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-tyrosyl-séryl-méthio-nine,est également cul nouveau composé utile comme intermédiaire dans la production de 1'octadécapeptide et peut être préparé en introduisant le groupe t-batyloxycarbonyls dans la 3-alanine avec an agent de t-butyloxycarbonylatioa,, tel a/a» le foraiate &• t-fea-20 tylasethydrure, le carbonate de t-feutyl-g-=nits®pfeényle ©a 1® ehle-roformiate de t-batyle ou analogues, ©a ©anâeasant 1& ti-lsutyloxy-aarbonyl-P-alanine résultante avec l'ester méthylique de la tyro-sine, en transformant l'ester méthylique du dipeptide résultant en hydraxide correspondant avec l'hydrate hydrasine, en faisant 25 réagir l'hydraaide de t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-tyrosine avec l'ester méthylique de séryl-méthionine par le procédé à l'azot-hydrure et en transformant l'ester de tétrapeptide en hydraside correspondant par l'hydrate hydrasine. la t-butyloxycarbonyl-0-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionine peut être obtenue d'une lumière 30 semblable à celle décrite ci-dessus. l'hexapeptide, la r-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycine, est un composé connu décrit dans la littérature : Bull.Chem.Soc.Japan., 38 1148 (1965), mais on a réussi à synthétiser l'hexapeptide par un'procédé amélioré, qui 35 contribue "beaucoup à la production de 1'octadécapeptide k l'état plus pur e* £Tee aa rendement supérieur"à ce gu'on cosmaissait précédemment, Se procédé perfectionné pour l'hexapeptide comprend l'utilisation d'acide formique pour retirer le groupe t-butyloxy-carbonyle des peptides de tryptophane protégés, sans décomposi-40 tion du reste de tryptophane, et l'utilisation d'acide fluorhy- BAD originai^ 70 07914 10 2034698 dri que pour retirer le groupe nitro du reste de nitroarginine', ■eue affecter le reste de tryptophane mobile via-à-via des acides. Il est bien connu que les peptides contenant du tryptophane traités par un milieu acide sont fréquemment obtenus arec un faible 3 rendement par suite de la formation de sous-produits [Helv.Chim. JLcta., £1 1867 (1958), J.Am.Chem.Boc., 82 2062 (1960)]. 11 est également connu tue la réduction d'un reste de nitroarginine dans une chaîne de peptide exige fréquemment un long temps d'hydrogénation [Can.J.Chem.. 38 1946 (i960)] et que la réduction eatalytique 10 s'arrête souvent au niveau de 1 'amineguanidine [HelT.Chim.Acta., 44 2042 (1961)], Sans la production du présent hexapeptide qui contient les restes d'aminoacide^ l'hexapeptide peut être obtenu arec un fort rendement et sans réactions secondaires, en utilisant le propédé perfectionné. La v-t-butyl-glutamyl-kistidyl-phénylala^* 15 nyl-arginyl-tryptophyl-glycine peut être obtenue en retirant le groupe t-butyloxycarbonyle de l'ester méthylique de M*-t-butylexy-carbenyl-Ift-nitre-argiayl-tryptophyl-glyoine aree de l'acide fer-mique, en faisant réagir le tripeptide résultant arec la t-butyl-oxycarbenylphénylalanine par le procédé à la : t&çlM&ohexylearb*-20 diimidaen retirant le groupe t-butyloxycarbonyle t» tétrapeptide résultant, qui est l'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-phé-nylalanyl-V^-nitro-arginyl-tryptophyl-glycine, arec de l'acide formique, en faisant réagir le tétrapeptide résultant arec l'ester p-nitrophénylique de l^I^-dibenayloxyc&rbonyl-hiBtidine pour 25 donner le pentapeptide correspondant, l'ester méthylique de I*, IIm-*iben«yloxycarbonyl-histidyl-phénylalanyl-ia-nitro-arginyl-tryptophyl-glycine, qui est hydrolysé, traité à l'acide fluorhy-drique et mis à réagir arec l'ester p-nitrophénylique de l'acide ïa-bensyloxycarbonyl-V-t-butylglutamique et en hydrogénant la 30 I*-bensylexycarbonyl-*-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylaianyl-arginyl-tryptophyl-glycine. Bans la réaction indiquée ci-dessus, la séparation du groupe t-butyloxycarbonyle avec de l'acide formique est réalisée à une température d'environ 20 à 60°C pendant environ 2 à 4 heures, en 35 utilisant approximativement 5 à 15 fois plus d*acide formique que de t-butyloxycarbonylpeptide (en psids). lie groupe aitro est retiré par dissolution du nitroarginylpeptide dans l'acide fluorhy-drique (environ 5 à 10 fois plus en poids que de peptide) et en laissant la solution reposer à une température d'environ 0 à, 25 *C 40 pendant environ 30 à 60 minutes. ORIGINAL^ 70 07914 h 2034698 l'octadécapeptide à terminaison carbonée typique ayant la formule -t-butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-glyeyl-ï^ -t-butyloxycarbonyl-lysyl-H^ -t-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y où Y est on reste d'arginine ou un reste d'amide d'arginine peut 5 être préparé selon le procédé décrit dans la littérature : Bull. Chem.Soc.Japan, 22 88^ (1966). Ainsi, 1*octadécapeptide désiré peut être produit en faisant réagir la t-butyloxycarbonyl-0-ala-nyl-tyrosyi-séryl-méthionyl-v-t-butyl-'glutaayl-liistidyl-phényla-lany1-arginy1-tryptophyl-glycin# arec le produit ayant la formule 10 -t-butyloxycarbonyl-lysyl-prp?jyl--valyl-glycyl-ï^ -t-butyloxy-carbonyl-lysyl-H ^ -t-butyloxycarbonyl-lysy 1-arginy 1-T où T est tel que défini ci-dessus, par le procédé à la dicyclohexylcarbo-iàiimide, le procédé à l'estsr àe i'î-]?.jdr^.iE^sweciaiiRid« ©a aae som-binaison de ces précédée, à sa&e tempérât as® alleat d© -20 à 509 O 15 pendant 2 à 96 heures, et en retirant tous les groupes protecteurs de 1'octadécapeptide résultant ayant la formule t-butyl-oxycarbonyl-P-alanyl-tyrosyl-séryl-aéthionyl-V-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylalany 1-arginy 1-tryptoph.yl-glycyl-ï ^ -t-butyloxy-carbonyl-lysyl-prolyl-Talyl-glycyl-K^ -t-butyloxycarbenyl-lysyl-20 ï ^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y où T est tel que défini précédemment, dans un milieu acide tel qa'un acide halogénhydrique, à l'état gaseux ou en solution, l'acide trifluoreacétique, l'acide formique, l'acide acétique ou un mélange de ces produits, à une température allant d'environ -10*C à 40*C, pendant 10 à 90 minutes. 25 Selon un autre procédé, 1'octadécapeptide peut être produit en condensant le tétrapeptide qui est la t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionine, avec un tétradécapeptide» ayant la formule v-t-butyl-glutamyl(oE^glutaminyl)-hi3tidyl-pîiénylala-nyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-H -t-butyloxycarbonyl-lysyl-proiyl-30 valyl-glycyl-S ^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-H ^ -t-butyloiycarbonyl-lysy1-arginy1-Y où Y est tel que défini ci-dessus, d'une manière connue en soi. 1'octadécapeptide est également obtenu en condensant la t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyrosyl-séryl-métMonyl-v-t-butyl-gltt-35 tamyl-histidyl-phénylalany1-arginy1-tryptophyl-glycyl-ï^ -t-butyl-oxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-glycine avec le produit ayant la formule -t-butyloxycarbonyl-lysyl-H^ -t-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y où Y est tel que défini ci-dessus, d'une manière classique en soi. 40 Sous les groupes de protection employés dans la présente in- BAD OFUGINAL 70 07914 12 2034698 vention peuvent être retirés par réduction catalytique, par réduction par du sodium dans l'ammoniac liquide, par hydrolyse ou par traitement avec un milieu acide tel que l'acide trifluoracé-tique, l'acide acétique, l'acide formique, un acide halogénhydri-5 que (par exemple, l'acide fluorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide eh.lorh.ydrique) qui peut être en solution ou à l'état gazeux ou un mélange de ces produits,, L'octadécapeptide préparé par la présente invention peut être purifié par des procédés connus en soi, tels que par chromatogra-10 phie sur colonne avec une résine échangeuse d'ions, de la cellulose échangeuse d'ions ou le produit dit Sephadex échangeurd'ions ou par un procédé de distribution à contre-courant. 1'octadécapeptide est produit sous forme de bases ou sous forme de sels d'addition avec des acides, non toxiques et acceptables 15 au point de vue pharmaceutique, selon les conditions réactionnel-les utilisées, les sels peuvent être préparés en traitant les peptides avec des acides minéraux tels que des acides halogénhyd»tçaes à l'état gazeux ou en solution (par exemple, l'acide fluorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide chlorhydrique), l'acide sulfurique 20 ou l'acide phosphorique, ou avec des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide formique, l'acide propionique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide benzoïque, 25 l'acide cinnamique, l'acide méthanesulfonique, l'acide benzène-suif onique ou l'acide toluènesulfonique, d'une manière connue en soi. 1'octadécapeptide ainsi produit présente des activités biologiques marquées compre.nant une activité de stimulation surrénale, 30 une activité lipotrope et une activité de stimulation de mélano-cytes supérieures à celles de la corticotropine naturelle et des peptides connus apparentés, et il est, en conséquence, utile comme médicaments particulièrement pour le traitement des rhumatismes articulaires aigus ou chroniques et de maladies» dues aux al-35 lergies, de différents organes d'animaux et d'être humains. les diverses propriétés pharmacologiques de 1'octadécapeptide seront présentées ci-après avec les données biologiques. Des essais de détermination d'activités corticotropes des présents octadécapeptides ont été réalisés selon cinq modes opé-40 ratoires différents, par comparaison avec celle de la corticotro- 70 07914 13 2034698 pine naturelle de mouton (ccs-ACTH), ACIH( 1-18)-HH2, et Gly1-ACTH (1-18î-NHgo L'activité surrénale d'épuisement d'acide ascorbique dans le rat ayant subi une hypophysoseetomie a été déterminée par le procédé de United Stades Pharmacopeia XVII, 147 (1965). 5 L'activité stéroïdogène in vitro a été déterminée par le procédé de Saffran et Schally [Endocrinol., 56 523 (1955)3. L'activité stéroïdogène in vivo, par l'administration intraveineuse à un rat ayant subi une hypophysoseetomie, a été déterminée par le procédé de Lipscomb et Nelson [Endierinol., 7J. (1962)] avec une modi-10 fication peu importante [A.Ianaka et C.H.Li. Endocrinol.Japonica,, 13 180 (1966)]. L'activité stéroïdogène in vivo a été également déterminée par le procédé utilisant une souris activée par du dexa-méthazone-pentobarbitol [A.Ianaka et N.Nakamura, "Integrative mechanism of neuroendocrine system", Hokkaido ïïniversity Médical 15 Library Sériés. Toi. 2 4-9 (1968)]. En outre, l'activité stéroïdogène par administration intramusculaire à un rat, ayant subi une hypophysoseetomie, a été déterminée et on a injecté une préparation (0,05 ml/rat) dans le muscle de la cuisse et un échantillon de sang a été rassemblé à l'aorte abdominale 30 minutes après 20 l'injection. Durant toute l'expérience, on a utilisé comme norme la troisième norme de référence de la corticotropine de ÏÏSP (United Stades Pharmacopeia) et la production de 11-hydroxycortieo-stéroïdes (11-0HCS) a été déterminée par le procédé fluorophoto-métrique de Peterson [J.Biol. Chem., 225 25 (1957)]. Pour chaque 25 procédé d'expérimentation, on a réalisé d'ordinaire plusieurs déterminations et les données obtenues indépendamment ont été soumises au traitement statistique par le mode opératoire de Sheps et Moor [J. Pharmacol.Extl.Therap., 128 99 (1960)]. Les résultats de ces déterminations sur le présent octadécapeptide sont données 30 dans le tableau suivant par la comparaison avec celles des peptides de corticotropine connus et de la corticotropine naturelle. 70 07914 H 2034698 TABLEAU I Activités surrénocorticotropes de la corticotropine de mouton et des octadécapeptides synthétiques apparentés Procédé Voie d'administration la Peptide Ib I Epuisement surrénal d'acide ascorbique Stéroïdogénèse in vitro 10 Stéroïdogénèse in vivo Stéroïdogénèse in vivo dans : souris traitée au dexaméthazone-Nem- butal 15 sang périphérique de rat ayant subi une hypophysoseetomie sous-cutanée in vitro intraveineuse intraveineuse intramusculaire 45,4 13,7 92,0 139 25,6 20,8 167 135 237 125 -285 70 259 -168 35,4 124 120 120 100 -180 Note : Les activités sont exprimées en unités TJSP/mg, par rapport à la troisième norme de référence de cortico-20 tropine ÏÏSPo Les abréviations sont les suivantes : - Ia»ACTH(1-18)-NH2, Ib=Gly 1-ACTH Gomme on l'indique dans le tableau 1, le peptide I préparé par la présente invention est fortement actif sous de nombreux aspects par rapport aux activités de stimulation surrénale, L'ac-25 tivité stéroïdogène in vivo du produit I est du même ordre de grandeur que celle de la, Ib et de l'a -ACTH, lorsqu'on l'admi-nistre par injection intraveineuse. Cependant, le peptide I présente une activité fortement supérieure à celle de la et de Ib lorsqu'on la détermine par la stéroïdogénèse in vitro et les pro-30 cédés d'épuisement surrénal d'acide ascorbique. En outre, il est remarquable que les rapports de puissance de l'administration sous-cutanée ou in vitro par rapport à l'administration intraveineuse soient 1/0,5 pour le peptide I, tandis que les rapports pour les peptides la et Ib sont 1/7 à 1/8. Le peptide I est, sous cet as-35 peet, beaucoup plus proche de l'hormone naturelle (a -ACTH) (qui donne un rapport unitaire) que de la. et de Ib. La figure 1, dans laquelle on porte en abscisses les heures après l'injection et en ordonnées la concentration de 11-0HCS du 1' plasma (lyg/100 ml), montre que le produit (p-Ala )-ACTH( 1-18)-NH2 70 07914 15 2034698 (I) peut rester actif pendant une plus longue période de temps que le produit G-ly^-ACTHC1-18J-NHg (X"b) et que l'ACTH naturelle, quand les peptides I et Ib (5^ g/rat) ( 1 mg de peptide /ml) et l'ACTH naturelle (125 niU) sont administrés dans le muscle de la 5 cuisse d'un rat ayant subi une hypophysoseetomie par injection intramusculaire, où l'activité stéroïdogène est exprimée en fonction du niveau de 11-hydroxyco.rticostéroïde ( 11-OHCS) dans le plasmao L'octadécapeptide, (P-Ala1)-ACTH(1-18)-NHg (I), présente une 10 activité lipotrope fortement marquée, qui est comparée dans le tableau suivant aux activités de peptides de synthèse ACTH(1-18)-NILjXla), Gly Î-ACTH( 1-18)-NHg (Ib) et à la corticotropine de mou- 20 ton (ag-ACTH). TABLEAU 2 15 Activité lipotrope in vitro de corticotropine naturelle et d'oc-tadécapeptides synthétiques apparentés Dose efficace minima (10" mg/50 mg de tissu) la Ib I as-ACTH Tissu adipeux de rat 3,0 6,3 0,62 6,0 Tissu adipeux de lapin 0,004 0,35 0,065 7,1 Rapportia1/lapm, approximativement 750 20 10 î Note : L'activité lipotrope a été déterminée selon le pro-25 cédé décrit par Tanaka et collaborateurs (Arch. Biochem.Biophys., 99 294 (1962)), avec les tissus adipeux périrénaux"~cTu lapin et les tissus adipeux d'épididyme du rat. L'augmentation de la concentration de l'acide gras non estérifié dans le milieu et dans le tissu est le paramètre. L'activité est exprimée en fonction de la dose efficace minima pour 50 mg de tissu. 30 Comme cela appaïraît clairement d'après le tableau, l'octadécapeptide I préparé par la présente invention est à peu près dix fois plus actif, au point de vue de l'activité lipotrope, que les produits la, Ib et l'a -ACTH, lorsqu'on l'expérimente chez le s ' 35 rat. Une quantité inférieure de produit I peut exercer une activité chez le lapin comparable à celle chez le rat. La même relation est observée avec les autres peptides la et Ib. Cependant, on doit noter que le rapport de la dose efficace minima dans la graisse de rat par rapport à celle dans la graisse de lapin est 40 inférieur pour I aux doses pour Ib et la. Ce fait signifie que 70 07914 16 *- 20.34698 le peptide I de la présente invention est beaucoup plus proche de l'hormone naturelle que les peptides la et Ib„ Les figures 2 et 3, dans lesquelles on porte en abscisses le temps d'incubation en heures et, en ordonnées, l'activité lipotrc— 5 pe en logarithme des pourcentages, montre les schémas de désacti-vation de I et de Ib, en tant qu'agents lipoi;ropes dans le plasma frais et dans un tampon contenant des fragments de muscle de rat, respectivement. II n'y a pas de différence importante entre I et Ib dans le cas du plasma, alors que la désactivation de I 10 était plus fortement retardée que celle de Ib dans le cas du tissu, La désactivation de l'activité lipotrope par le plasma et par le tissu a été réalisée à la manière suivante» Un échantillon de peptide est dissous dans le plasma frais d'un rat anesthésié dans un tampon au bicarbonate de Krebs-flinger contenant de l'al-15 bumine de sérum de bovin, des fragments de muscle de cuisse de rat et du glucose, Le mélange a été alors soumis à l'incubation à 37°C et des parties ont été prises dans les mélanges d'incubation et expérimentées pour déterminer l'activité lipotrope par le procédé indiqué ci-dessus pour un temps d'incubation de 0,5» 1, 2 et 4 20 heures. La période biologique de ((3-Ala1 )-ACTH( î-18)-NH2 (l)f lors d'une injection par voie intraveineuse dans le rat pesant 200-250 g et ayant subi une hypophysoseetomie, a été mesurée. L'échantillon de sang a été rassemblé à partir de l'aorte abdominale à divers 25 intervalles de temps après l'injection. Le plasma séparé a été réglé au pH de 4-5 avec de l'acide chlorhydrique N, et le paramètre de l'activité biologique demeurant dans le plasma était l'activité lipotrope in vitro, en utilisant la graisse d'épididyme de rat mentionnée précédemment. Les résultats sont présentés dans le ta-30 bleau suivant par comparaison avec .les activités lipotropes de la corticotropine naturelle (ACTH) et du produit Gly*-ACTH(1-18)-NH« (I*). 70 07914 17 2034698 TABLEAU 5 Activité lipotrope in vitro de (p-Ala1)-ACTH( 1-18)-ïïH2» Gly*-ACTH(1-18)-NH2 et de la corticotropine naturelle (injection intraveineuse). Temps après 1'injection (mn) ACTH naturel Production de NEFA * (pEq/lOOmg) Ib Production de NEF A * (^lEq/100 mg) I Production de NEEA * (^/Eq/10Omg ) 0 0,129+0,028 0,094+0,016 0,179+0,076 0,5 3.082+0.4/7 (100£) 3,004+0,236 (100^) * 2,148+0.228 l100%)h* t 2,587+0,556 1,217+0,139 î,140+0,099 (83 i) (39 i) (49 i) . 2 .2,409+0,337 1,622+0,239 0,751+0,053 (77 ï) (53 i) (29 S) 4 2,396+0,364 0,777+0,113 0,815+0,090 (77 £) (24 5) (32 5) 8 1,108+0,180 0,243+0,087 0,431+0,079 (33 ï) ( 5 h (13 i). 12 0,252+0,063 ( 5 i ) 0,487+0,180 ( 16~JÉ) 16 0,380+0,056 0,263+0,079 0,512+0,055 (9 f) (6 JÉ) (17 i) 32 0,212+0,028 (3 i) — — HO 15 20 25 NE]?! = acide gras non estérifié. 51 * les chiffres entre parenthèses sont des activités relatives par rapport à la valeur obtenue après 0,5 minute pour chaque hormone. 30 D'après les données indiquées ci-dessus, la période de l1 ACTH naturelle, du produit Ib et I par rapport à l'activité lipotrope in vitro a été calculée respectivement à des valeurs de 266 secondes, 117 secondes et 188 secondes, étalés modèles d'activité lipotrope de ces peptides sont donnés*sur la figure'4, où l'on 35 porte en abscisses le-temps après l'injection en minutes et, en ordonnées, l'activité lipotrope en logarithme des pourcentages. On peut dire que le produit (P-Ala1 )-ACTH( 1-18)-lïH2 (ï) e3"'' maintenu d'une manière importante dans le plasma pendant un temps plus long que le produit Gly^-ACTH(1-18J-NHg (I^)« . : 40 D'une manière semblable, la période biologique du produit I, COPV 70 07914 18 2034698 Injecté par voie intramusculaire dans le rat ayant subi une hypophysoseetomie , a été mesurée. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant et dans la figure 5 où les abscisses et les ordonnées sont comme sur la figure 4» 5 TABLEAU 4 Activité lipotrope de la corticotropine naturelle (ACTH), de G-ly^'-AC!EH(1-18)-îïH2 (Ib) et de (P-Ala1)-ACTH( 1-18)-NHg. (I) (injection intramus culaire). 10 Temps après l'injection? mn1 ACTH naturel Production de NEFA (WEq/100 mg) t Ib Production de NEFA (UEq/100 mg) f. Production de NEFA (jJEq/100 mg) 15 25 0 2 5 10 20 20 30 60 90 ,097+0,032 0,922+0,540 (48,5 *) 1,693+0,356 (93,9 t) 1,797+0,392 (100 (68^6 56) 1,061+0,396 (56,7 *) 0,474+0,302 (22,2 *) 0,209+0,056 (6,6 i>) ,033+0,033 1,772+0,322 (57,7 t) 3,047+0,229 (100 *) 1,568+0,235 (50,9 #) 1,727+0,429 (56,2 #) 1,977+0,098 (64,5 f) 1,390+0,121 (45,0 *) 0,193+0,060 3,630+0,63l (100 *) 2,080+0,285 (54,9 *) 3,558+0,407 (97,9 *) 3,382+0,542 (92,8 ?É) 1,876+0,337 (49,0 *) NOTE î Dans les colonnes ci-dessus, les chiffres entre parenthèses 30 représentent l'activité lipotrope relative aux valeurs obtenues dix minutes après l'injection pour chaque hormone. La période de l'ACTH, du produit Ib et du produit I a été calculée, respectivement, à 1.389 secondes, 4.516 secondes et 4.516 secondes. On doit noter que la période de I préparé par la pré-35 sente invention est à peu près trois fois plus longue que celle de la corticotropine naturelle, tel qu'indiqué clairement sur la figure 5. La sensibilité du produit (P-Ala^)ACTH(1-18)-NH2 (I) vis-à-vis de l'action de l'aminopeptidase de leucine de reins de porc (LAP) 40 a été comparée à celle du produit ACTH(1-18)-NH2 (la) et Gly1-ACTH(Î-18)-NH2 (ib)a La figure 6 sur laquelle on porte en abseis- 70 07914 19 2034698 ses le teaps en heures et, en ordonnées, la libération dsaminoacide (en mI4 de leucine) présente l'action de 1 'aminopeptidase traitée par le fluorophosphate de diisopropyle (X0?P) sur les peptides I, la et Ib. Il apparaît, d'après cette figure, que 1'octa-5 décapeptide préparé par la présente invention peut être maintenu pendant un temps plus long que les peptides connus la et Ib, sans désactivation rapide par une attaque d5aminopeptidase dans les tissu et, de ce fait, le peptide I est très utile dans des buts thérapeutiques o Les tests sur la sensibilité des peptides synthétiques 10 seront décrits ci-après en détail0 Avant les expériences, on avait trouvé qu'une préparation de LAP disponible dans le commerce (produit de la société dite Washington 3iochemical Go., Preeliold, lew Jersey, 10U,A«) hydrolysait le produit (0»Àla)- ACTH( 1 — 10}-Oli (préparé à partir âu décapeptide 15 protégé correspondant, qui est la t-butylo^yearbonyl-p-alanyl-ty-rosyl-séryl-méthioayl-'ï-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycine (XVI} par le traitement à l'acide formique) et le produit (P-Ala ' )-ACSBL( 1-18j-ïïHg (I), isais non pas l'hydrazide de p-alanyl-tyrosyl-séryl-msthionine (préparé à partir 20 d'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionine (VII) par le traitement à l'acide formique). Puisqu'il n'y avait pas de {3-alanine détectée dans les produits de digestion enzymati-que par un dispositif d'analyse d'amhoacides, l'hydrolyse observée doit être due à la présence d'une endopeptidase contaminant la 25 préparation de LAP. Cette sensibilité apparente des P-alanyl-pep-tides à la préparation de LAP était complètement perdue quand la préparation d'enzyme a été traitée par le fluorophosphate de dii- -t sopropyle (DFP). Par le LAP traité au Dl'P, le Ser -peptide (la) était hydrolysé plus rapidement que le Gly^-peptide (Ib) .et on 30 n'a pas observé d'hydrolyse avec le P-Ala1-peptide (I) dans la précision des mesures» Le LAP traité au LFP a été obtenu en dialysant une suspension d'enzyme dans du sulfate d'ammonium saturé à 75 i» à 4°C, avant l'utilisation, par rapport au chlorure de magnésium 0,005 M, en 35 diluant la suspension de LAP (5 mg d'enzyme) à une concentration de 1/5 avec le produit tampon dit Tris 0,0005 M, en ajoutant à la solution d'enzyme diluée 0,08 ml de fluorophosphate de diisopropyle M dans l'alcool isopropylique, en soumettant à l'incubation le mélange à 37°C pendant 45 minutes et puis en dialysant le mé-40 lange par rapport au tampon dit Tris 0,0005 M à 4°C. BÀD ORIGINAL1 70 07914 20 2034698 l'activité de LAP de la solution d'enzyme a été déterminée à un pH de 8,3 et à 25 °C selon Truppy et collaborateurs [Z.Phy-siolo Chenu » 329 278 (1962)] avec quelques modifications, en. utilisant le p-nitroanilide de L-leucine (LNA) comme substituant» 5 Une unité de LAP était temporairement définie comme étant la quantité d'enzyme qui produisait une augmentation d'absorption, à 400 mU , de 0,001 par minute au-dessus de l'échantillon témoin, en utilisant des cellules de 1 cm dans un spectomètre photoélectrique dit Hitachi» 10 Pour les mesures de la séparation de substrat synthétique par le LAP, on a soumis à l'incubation à 37sO un mélange comprenant une partie du substrat 0,1 jbM dans 1'eau. une partie de tampon dit Tris 0,05 M (pH 8,3) et une demi-partie d'enzyme (4,88 unités/ml, LNA en tant que substrat)» A partir du mélange incubé, on a retiré 15 des échantillons de 0,5 ml et on les a immédiatement mélangés avec 0,5 ml de réactif à la ninhydrine et le mélange a été chauffé dans un bain d'eau bouillante pendant 15 minutes. Après refroidissement et dilution appropriée avec de l'éthanol à 50 on a déterminé la capacité d'absorption à 570 mjj dans un spectrophotomètre 20 dit Hitachi. Pour chaque essai, des mélanges d'incubation de contrôle sans substrat ou sans enzyme ont été analysés. Dans la réaction à la ninhydrine, on a également vérifié une solution standard de L-leucine chaque fois en tant que référence» Les résultats de la séparation enzymatique des peptides I, la et Ib par le LAP trai-25 té au DFP sont présentés sur la figure 6, tel que mentionné ci-dessus, où. la libération d'aminoacidea est exprimée en fonction de la concentration, de leucine. Des essais pour la détermination de l'activité de stimulation de mélanocytes in vitro du produit (|3-Ala1')-ACTH( 1-18)-NH2 ont été 30 réalisés selon le procédé de K» Shizume, A»B» Lerner et T.B. Fitzpatrick (Endocrinol», 54 553, 1954) en utilisant la grenouille dite Rana pipiens comme animal expérimental, par comparaison avec l'activité du produit Gly1-ACTH( 1-18J-NHg et du produit ACTH(1-24) -0H (produit connu sous la marque déposée Synacthen de la société 35 dite Ciba Co.). De l'hormone naturelle pure sous forme a, stimulant les mélanocytes (oc-MSH) a été utilisée comme norme de référence» Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. 70 07914 21 2034698 TABLEAU 5 Activité de stimulation de mélanocytes in vitro des produits (|3-Âla1:)-ACTH(1-18)-HH2, Gly1-ACTH( 1-18 J-BHg et ACTH( 1-24 )-OH 5 Composé Activité de MSK ! (unités/g) (P-Ala )-ACTH(1-18)-NHg 9,6 x 10* Glyî-ACTH(1-18)-MH2 6,7 x 108 ACTH(1-24)-OH 2,1 x 108 10 L'activité de stimulation de mélanocytes du produit O-Ala1')- ACTH(1-18)-NH2 est fortement supérieure à celle du produit Gly - ACTH(1-18)-SH2 et du produit ACTH(1-24)-0H. En outre, puisque la corticotropine naturelle du porc présente une activité de stimula- 8 tion de mélanocytes de 1,7 x 10 unités/g, telle qu'indiquée par 15 R.G. Shepherd et collaborateurs,J.Am.Chem.Soc., 78 5051 (1956), l'activité de stimulation de mélanocytes du produit (p-Ala^)-ACTH (1-18)-NH2 Préparé par la présente invention est environ 50 fois plus forte que celle de la corticotropine naturelle de porc. L1octadécapeptide préparé par la présente invention peut être 20 transformé en complexe correspondant avec un composé de métal lourd (par exemple, le chlorure de zinc, l'hydroxide de zinc, l'acétate de zinc, le sulfate de zinc, le chlorure de cuivre, le chlorure de nickel, le chlorure de cobalt, le chlorure de fer), un polyaminoacide (par exemple l'acide poly-L-glutamique, l'acide 25 poly-D-glutamique, l'acide poly-DL-glutamique, l'acide poly-L- aspartique, l'acide poly-D-aspartique, l'acide poly-DL-aspartique, la copoly-L-glutamyltyrosine) ou un mélange de ces produits, les produits obtenus présentant d'excellentes caractéristiques se rapportant à l'activité dans le niveau sanguin qui dure plus long-30 temps que 1*octadécapeptide simple. Par exemple lorsqu'un complexe zincique de (p-Ala^-ÀCTHt 1-18)-NH2» clui comprend le peptide (0,5 mg), du chlorure de zinc à 40 mM (0,25 ml), du chlorure de sodium (4,5 mg) et du phosphate acide disodique 40 mM (0>25 ml), est administré à un rat par injection intramusculaire (5Ji 1/rat), on a 35 trouvé que la quantité de 11-hydroxyco,rticostéroîde dans le plasma (deux heures après l'injection) était égale à 80jug/ml, mais dans le cas d'une préparation sans chlorure de zinc, la quantité de corticostéroïde était 6Jjg/ml. En conséquence, il est avantageux d'utiliser les complexes dans des buts thérapeutiques. Les com-40 plexes peuvent être obtenus en traitant 1'octadécapeptide avec un 70 07914 22 2034698 composé de métal lourd, un polyaminoacide ou un mélange de ces produits, suivant une proportion d'environ 1 : 0,1 - 20 en poids, dans des conditions faiblement acides, en particulier, un pH de 6,5 à 7,0. En utilisant le polyaminoacide, le poids moléculaire 5 préféré de ce produit est environ 1.000 à 100.000, en particulier, 2.000 à 6.000. Dans la préparation du complexe, on peut y ajouter, si cela est nécessaire, d'autres supports, agents de conservation, tampons, stabilisants et agents de transformation en produits isotoniques convenables. 10 On doit noter que les données expérimentales décrites ci-des- sus ne sont indiquées qu'à titre d'exemples. Puisque les autres composés de la présente invention ont presque les mêmes caractéristiques et avantages que les médicaments avec lesquels on a présenté ci-dessus les données expérimentales, les produits de la 15 présente invention sont très utiles et avantageux dans des buts thérapeutiques, par exemple, pour le traitement des rhumatismes articulaires aigus ou chroniques et des maladies d'allergie de différents organes chez les êtres humains et les animaux domestiques. 20 Ainsi, le présent octadécapeptide, ses sels d'addition avec les acides et ses complexes peuvent être administrés par voie orale ou parentérale sous des formes classiques en soi, par exemple, des injections, des liquides, des suspensions, des émulsions, des aérosols, des tablettes ou des comprimés, mélangés avec des 25 supports, des stabilisants, des émulsionnants, des produits de conservation, des tampons, des agents de transformation en produits isotoniques et/ou des agents de mouillage convenables, où une quantité thérapeutiquement efficace de l'ingrédient actif est contenue, la dose efficace peut être facilement déterminée par les mé-30 decins sur la base des données décrites ici. Par exemple, une gamme de doses cliniques typiques des composés de la présente invention est approximativement 0,2 U/kg à 0,8 U/kg pour un adulte normal. L'octadécapeptide est avantageusement administré sous forme de dose d'injection et l'administration est répétée aussi souvent 35 que cela est exigé selon les indications du médecin. les exemples suivants ne sont donnés qu'à titre d'illustration et non pas de limitation, les parties en poids dans cet exemple ont les mêmes relations avec les parties en volume que les grammes avec les millilitres. 70 Ô7914 23 2034698 EXEMPLE 1. Production d'hydrazide de Ha-t-butylox.ycarbottyl-3-alanyl- tyrosyl-séryl-méthionine (VII) cc t) N -t-butyloxycarbonyl-|3-alanine (I) 5 Le la (3-alanine (8,91 parties en poids) est dissoute dans de la soude N (100 parties en volume) et, à cette solution, on ajoute du bicarbonate de sodium (21,0 parties en poids) et du dioxane (70 parties en volume). La solution est agitée à 50°G et on y ajoute goutte à goutte une solution de formiate de t-butyl-10 azothydrurë (17,2 parties en poids) dans du dioxane (30 parties en volume). Le mélange est agité pendant 41 heures et demie à la même température et concentré sous pression réduite jusqu'à environ 100 parties en volume. Le concentré est refroidi avec de la glace et réglé à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydri que 4N 15 (180 parties en volume). La solution est extraite à l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (environ 100 parties en volume), séchée sur du sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite pour donner un résidu sirupeux. Le résidu est cristallisé à partir du mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 20 pour donner le produit désiré (-12,6 parties en poids) fondant entre 77 et 78°C. Analyse calculée pour CgH^NO^ : C, 50,78 ; H, 7,99 ; N, 7,40. Trouvé : C, 50,99 ; H, 8,06 ; N, 7,47. cc 25 2) Ester méthylique de N -t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyro- sine (II) Le chlorhydrate de l'ester méthylique de tyrosine (3,48 parties en poids) est dissous dans l'eau (15 parties en volume). A la solution, on ajoute du carbonate de potassium à 50 $ (5 parties 30 en volume) en refroidissant par de la glace, et on laisse reposer le mélange à 4°C pendant 40 minutes. Les cristaux formés sont rassemblés par filtration, lavés à l'eau froide et séchés sous vide pour donner de l'ester méthylique de tyrosine (2r55 parties en poids). oc 35 L'autre part, de la N -t-butyloxycarbonyl-P-alanine (1,89 partie en poids) obtenue ci-dessus est dissoute dans du tétra-hydrofurane anhydre et la solution est refroidie à -10°C. A la solution, on ajoute lentement successivement de la t-butylamine (2,04 parties en poids) et du chloroformiate d'éthyle (1,19 par-40 tie en poids), en agitant. Après 10 minutes, on ajoute une suspen 70 07914 24 2034698 sion d'ester méthylique de tyrosine (1,95 partie en poids) obtenue ci-dessus dans du tétrahydrofurane anhydre (20 parties en volume). Le mélange est agité pendant 30 minutes à -10°C et pendant 2 heures et demie à la température ambiante et le solvant est retiré par 5 évaporation sous pression réduite. Le résidu résultant est dissous dans l'acétate d'éthyle, lavé successivement avec de l'acide chlorhydrique N, de l'eau, du bicarbonate de sodium à 5 ^ et de l'eau et séché sur du sulfate de sodium» Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant 10 est ajouté à de l'éther pour précipiter les cristaux. En laissant reposer toute la nuit, les cristaux formés sont rassemblés par filtrat ion et séchés sous vide pour donner l'ester de dipeptide désiré (2,99 parties en poids), La recristallisation à partir,du mélange méthanol/éther donne des cristaux qui fondent entre 141 et 15 142°C et ont un pouvoir rotatoire optique [a]^' +8,2+0,5° (c* 1,020, méthanol). Analyse calculée pour C 13-^26^2^6 ! 59,00 ; H, 7,15 ; H, 7,65 Trouvé : C, 59,03 ? H, 7,12 ; îï, 7,63. 20 3) Hydrazide de N^-t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyrosine (IV) L'ester méthylique de H^-t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyrosine (2,56 parties en poids) est dissous dans de l'éthanol anhydre (26 parties en volume). L'hydrate d'hydrazine (1,7 partie en volume) est ajouté à la solution et le mélange est maintenu à la 25 température ambiante pendant 5 heures et à 4°C toute la nuit. Les cristaux formés sont rassemblés par filtration, lavés à l'éthanol et à l'éther-et séchés pour donner l'hydrazide de dipeptide désiré (2,54- parties en poids), La recristallisation à partir de l'eau chaude donne des cristaux qui fondent entre 213,5 et 215°G et ont 30 un pouvoir optique + 3,6+0,6® (c=0,978,acide acétique à 50 56). Analyse calculée pour C^H^gN^O^ : C, 55,72 ; H, 7,15, N, 15,29 Trouvé : C, 55,74- ; H, 7,11 ; îï, 15,30, cc 4) Ester méthylique de N -t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyro-35 syl-séryl-méthionine (VI) L'hydrazide de Na-t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-tyrosine (1,10 partie en poids) est dissous dans de l'acide chlorhydrique îï froid (7,5 parties en volume). La solution est maintenue à environ -10®C et on ajoute du nitrite de sodium 2 M froid (3,6 parties en volu-40 me). Après qu'on ait laissé reposer le mélange pendant 4 minutes, 70 07914 25 2034698 11 azotliyd.ru.re produit est extrait à l'éther, lavé avec du bicarbonate de sodium M froid et séché sur du sulfate de sodium anhydre. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite à une température de bain d'environ 10°C, le résidu résul-5 tant est dissous dans de l'acétonitrile froid» A la solution, on ajoute de l'ester méthylique de séryl-méthionine (0,756 partie en poids)[préparé selon le procédé décrit dans la littérature : Bull. 1 Chern. Soc. Japan., 3jJ 1171 (1966)] et on laisse reposer le mélange pendant 48 heures. Le solvant est retiré par évaporation sous pres-10 sion réduite et le résidu est dissous par addition d'acétate d'éthyle et de parties d'eau. La solution est lavée successivement avec de l'acide chlorhydrique N froid, de l'eau, du bicarbonate de sodium à 5 fi et de l'eau et séchée sur du sulfate de sodium. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, 15 le produit gélatineux résultant est rassemblé par filtration, lavé à l'acétate d'éthyle froid et à l'éther et séché pour donner l'ester méthylique de tétrapeptide désiré (1,20 partie en poids). Le produit est purifié par reprécipitation à partir de l'acétate d'éthyle. 20 Point de fusion : 121,5 à- 123°C. [oc]Jp -13,0+0,6° (o=0,997, méthanol) Rf 0,53 (par chromâtographie sur couche mince dans le système de solvants formé de méthanol/acide acétique=15/85) Analyse calculée pour C2gH^0N^0gS : C, 52,41 ; H, 6,90 ; N, 25 9,58 ; S, 5,48. Trouvé : C, 52,94 ; H, 6,85 ; N, 9,65 ; S, 5,48. 5) Hydrazide de Na-t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-tyrosyl-sé-ryl-méthionine (VII) L'ester méthylique de Na-t-butyloxycarbonyl-|3-alanyl-tyrosyl-30 séryl-méthionine (0,97 partie en poids) est dissous dans la dimé-thylformamide (6 parties en volume). A la solution, on ajoute de l'hydrate d'hydrazine (0,5 partie en volume), et on laisse reposer le mélange à 4°C pendant environ 43 heures. La solution est additionnée d'acétate d'éthyle pour former une matière gélatineuse 35 qui est rassemblée par filtration, lavée avec de l'acétate d'éthyle froid et séchée pour donner l'hydrazide de tétrapeptide désiré (1,01 partie en poids). La recristallisation à partir de l'eau donne les cristaux qui fondent entre 186,5 et 188°C et ont un pouvoir rotatoire optique -20,1 +0,5° (c=1,346, méthanolà.3$) 40 Analyse calculée pour C2^H^Q0gîIgS.H20: C,49j82 ; H, 7,02 70 07914 26 2034698 H, 13,94 ; S, 5,32, Trouvé : C, 49,72 ; H, 7,05 ; N, 14,50 ; S, 5,15» Production de 'ff-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylalanyl-ar-ginyl-t ryp t o phyl-glyc ine (XV) 1) Formiate d'ester méthylique de nitroarginyl-tryptophyl-glycine (IX)0 G L'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycine (5,77 parties en poids) est dissous dans l'acide formique (98-100 #,50 parties en volume) et on laisse reposer la solution pendant 3 heures et demie. L'acide formique est retiré par évaporation à une température de bain de 40-45°C et le résidu est dissous dans l'eau» La solution est lavée à l'éther et lyophilisée pour donner le produit désiré (4,86 parties en poids') fondant entre 107 et 111°0 et ayant un pouvoir rotatoire-optique [a]23 + 13,0 + 0,5° (c = 2,062, méthanol). Analyse calculée pour CrjQHggîïgOg.HCOOH. 1/2^0 : C, 47,45 } H, 5,88 ; N, 21,08. Trouvé : C, 47,25 ; H, 6,03 ; H", 20,90. r% 2) Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-phénylalanyl-ïï -nitro-arginyl-tryptophyl-glycine (X) Ce composé est synthétisé exactement de la même manière que celle décrite dans la littérature : Bull.Chem.Soc.Japan., 38 1148 (1965), sauf qu'on utilise le formiate d'ester de tripeptide obtenu ci-dessus au lieu du trifluoroacétate. Le composé recherché est obtenu avec un rendement de 4,06 parties en poids en faisant G- réagir le formiate d'ester méthylique de N -nitro-arginyl-tryp-tophyl-glycine (4,81 parties en poids) avec le sel de dicyclohexyl-amine de la t-butyloxycarbonylphénylalanine (4,42 parties en poids) dans l'acétonitrile par le procédé à la dicyclohexylcarbodiimide. Le produit fond entre 176 et 177°C et a un pouvoir rotatoire optique -20,4 +2° (c = 2, méthanol). Analyse calculée pour C34^45^g^g : 0» 56,42 ; H, 6,27 ; N, 17,42 o Trouvé : C, 56,34 ; H, 6,22 ; N, 17,58. Gr 3) Formiate d'ester méthylique de phénylâlanyl-N -nitro-ar-g iny1-1rypt o phy1-gly c ine (XI) n L'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-phénylalanyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycine (1,81 partie en poids) est dissous dans de l'acide formique (18 parties en volume) et la solution est maintenue à la température ambiante pendant 3 heures et demie. Après enlèvement 70 07914 27 2034698 âe l'acide formique, le résidu est cristallisé à partir du n-butanol. le produit cristallin est séparé par filtration, lavé à l'éther et séché sous vide, le rendement est 1,71 partie en poids, le produit fond entre 124 et 125,5°C et a un pouvoir rotatoire 5 optique [ocj^p -9,0 + 0,5° (c=0,977, méthanol). Analyse calculée pour CggH^NgO^.HCOOH. 1/2H20 : C, 54,38 ; H, 6,28 ; N, 17,84. Trouvé : C, 53,00 ; H, 6,10 ; N, 17,79» 4) Ester méthylique de Na, N^-dibenzyloxycarbonyl-histidyl- n 10 phénylalanyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycine (XII) Ce peptide est obtenu d'une manière semblable au procédé décrit dans Bull.Chem.Soc.Japan., 38 1148 (1965)» sauf qu'on utilise le formiate d'ester de tétrapeptide obtenu ci-dessus au lieu du trifluoroacétate correspondant, l'ester de pentapeptide est prépa- f* 15 ré à partir du formiate d'ester méthylique de phénylalanyl-N -ni-tro-arginyl-tryptophyl-glycine (2,60 parties en poids) et de l'ester p-nitrophénylique de Na,N^m -dibenzyloxycarbonyl-histidine (1,91 partie en poids) ; le rendement est 2,70 parties en poids, le pouvoir rotatoire optique du produit est [ Analyse calculée pour C^^H^gN^O^HgO : C, 58,50 ; H, 5,58 ; N, 16,05. Trouvé : C, 58,63 ; H, 5,70 ; N, 15,89. 5) Monoacétate d'histidyl-phénylalany1-arginy1-tryptophyl-25 glycine (XIII) l'ester méthylique de Nœ,N"*"m-dibenzyloxycarbonyl-histidyl- phénylalanyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycine (1,44 partie en poids) est hydrolysé dans du dioxane à 90 fi et lyophilisé à partir de l'acide acétique pour /donner la benzyloxycarbonyl-histidyl-Gr 30 phénylalanyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycine (1,35 partie en poids), selon le procédé tel que décrit dans Bull.Chem.Soc.Japan., 38, 1148 (1965). le pentapeptide (0,72 partie en poids) obtenu ci-dessus et de l'anisol (0,72 partie en volume) sont dissous dans de l'acide 35 fluorhydrique anhydre (7 à 8 parties en volume) à une température de bain d'acétone/glace sèche et. le mélange est agité à 0°C pendant 30 minutes. Après enlèvement de l'acide fluorhydrique par évaporation, le résidu est séché sur des paillettes de soude toute la nuit sous vide. le résidu est dissous dans l'eau (20 parties en volume) 40 et la solution est totalement lavée avec de l'acétate d'éthyle et 70 07914 28 2034698 puis passée à travers une petite colonne de produit dit Amberlite CG—4-00 (forme acétate). La colonne est lavée avec des parties d'eau. Les effluents aqueux sont combinés et lyophilisés ; le rendement est 0,64 partie en poids» X N = 279 m^ (E 5 66,2), 288 y(E { 53,5) et X °'1 N = 280 y (E ] 65,0), 288 my (E^j 54,5)» La chromatographie sur papier (n-butanol: acide acétique:pyridine:eau = 30:6:20:24 en volume en tant que solvant)-montre la présence d'un composant principal (Rf = 0,47 10 à 0,53) et deux traces, toutes étant réactives à la ninhydrine et aux réactifs de Pauly et d'Ehrlich ; seul le produit principal réagit avec le réactif de Sakaguchi0 6 - Monoacétate de benzyloxycarbonyl-'ff-t-butyl-glutamyl-his-tidyl-phénylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycine (XIV) 15 Une solution de composé (XIII) (0,83 partie en poids) et de triéthylamine (0,28 parties en volume) dans la diméthylformamide à 90 % (10 parties en volume) est agitée à 0°C et on y ajoute de l'ester p-nitrophénylique d'acide benzyloxycarbonyl-ir-t-butyl-glutamique (0,46 partie en poids) et le mélange est agité à 4°0 20 toute la nuit» Une quantité supplémentaire (0,46 partie en poids) de l'ester actif est introduite et le mélange est maintenu à 4°C jusqu'à ce que le pentapeptide (XIII) ne puisse pas être détecté par chromatographie sur couche mince. Le mélange réactionnel est alors ajouté goutte à goutte dans de l'acétate d'éthyle re-25 froidi par de la glace (100 parties en volume) pour donner des précipités gélatineux qui sont séparés par filtration, lavés à l'acétate d'éthyle et séchés sous vide. Le produit est reprécipité à partir du mélange acide acétique-eau pour donner l'hexapeptide désiré ; le rendement est 0,84 partie en poids et le pouvoir ro-30 tatoire optique est - 26,6 + 0,5° (c=1,377, acide acétique à 50 *). Analyse calculée pour ^Hg^N^Oy 1 .CH^COOH^HgO : C, 52,86 ; H, 6,74 ; N, 13,98. Trouvé : C, 52,73 ; H, 6,85 ; N, 13,92. 35 7) Monoacétate de v-t-butyl-glutamyl-histidyl-phénylalanyl- arginyl-tryptophyl-glycine (XV) Le composé XIV (0,265 partie en poids) dans de l'acide acétique à 50 $> (10 parties en volume) est soumis à une hydrogénolyse en présence de noir de palladium pendant 2 heures et demie. Après 40 que le catalyseur ait été retiré par filtration, le filtrat est 70 07914 29 2034698 évaporé sous pression réduite à une température de bain de 45 à 50®0. le résidu est lyophilisé à partir de l'acide acétique et séché sur des paillettes de soude sous vide ; le rendement est 0,22 partie en poids. Le produit se comporte comme un seul composant 5 par chromatographie sur papier (n-butanol:acide acétique:eau = 4:1:2 en volume en tant que solvant). Analyse calculée pour C^H^gïï^gOg'CH^COOH.SH^O : C, 49,53 ; H, 7,2Î ; N, 15,40. Trouvé : C, 49,46 ; H, 6,77 ; H, 15,49. ÎO Production de la t-butyloxycarbonyl-"3-alanyl-tyrosyl-séryl- mé thlony1-?-t-buty1-glutamyl-his tidyl-phénylalany1-arginy1-1ryp-tophyl-glycine (XVI) A une solution de TII (0,45 partie en poids) dans de la di-méthylformamide à 90 i> (4,5 parties en volume), qui a été refroi-15 die dans un bain de glace-sel, on ajoute de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace (2,0 parties en volume) et du nitrite de sodium M refroidi par de la glace (0,83 partie en volume) et le mélange est agité pendant 4 minutes. Du chlorure de sodium saturé redroidi par de la glace (20 parties en volume) et de l'acétate 20 d'éthyle refroidi par de la glace sont alors introduits. La couche aqueuse qui est séparée est extraite deux fois à l'acétate d'éthyle. Les solutions organiques sont combinées, lavées au bicarbonate de sodium froid à 5 séchées sur du sulfaté de sodium et ajoutées à une solution du produit XV (0,50 partie en poids) et à de la 25 triéthylamine (0,21 partie en volume) dans la diméthylformamide (15 parties en volume), et le mélange est évaporé à une température de bain de 10 à 15°C sous pression réduite par retirer l'acétate d'éthyle. La solution claire résultante est maintenue à 4°C toute la nuit. Une quantité supplémentaire de l'azothydrure (pré-30 paré à partir de 0,23 partie en poids du produit VII tel que décrit ci-dessus) est introduite et le mélange réactionnel est maintenu à 4°0 pendant un jour de plus. Il est alors ajouté goutte à goutte dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (200 parties en volume) pour donner les précipités amorphes qui sont 35 alors séparés par filtration, lavés à l'acétate d'éthyle et séchés sous vide ; le rendement est 0,69 partie en poids. La reprécipitation à partir du mélange diméthylformamide-méthanol (2:5) donne le dérivé de décapeptide pur ayant un pouvoir rotatoire optique [cc]^3 -19,4+0,7° (e=0,882, diméthylformamide). Le produit se com-40 porte comme un seul composant (Rf = 0,54 à 0,57) dans la chromato- 70 07914 30 2034698 graphie sur couche mince (diméthylformamide:acétate d'éthyle:acide acétique = 15:10:2 en volume en tant que solvant). Analyse calculée pour C68H94H16017S«8H2° ! G» 51»57 ; H' 7,00 ; N, H,15 ; S, 2,02o 5 Trouvé : C, 51,62 ; H, 6,66 ; H, 14,06 ; S, 2,64, Production d'amide de P-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionyl-glutamyl-histidy1-phénylalany1-arginy1-tryptophy1-glycyl-lysyl-•prolyl-valyl-glycyl-lysyl-lysy1-arginy1-arginine (XX) A une solution du composé XVI (0,37 partie en poids) dans 1.0 la diméthylformamide (10 parties en volume), on ajoute de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace (0,25 partie en volume) à 0°C et la solution est immédiatement ajoutée à un mélange acétate d'éthyle-éther refroidi par de la glace (1:1, 200 parties en volume). Les précipités résultants sont filtrés, lavés à l'é-15 ther et séchés sous vide ; le rendement est 0,36 partie en poids. Ces précipités sont dissous dans la diméthylformamide (5 parties en volume) et on y ajoute successivement de la N-hydroxysuccini-mide (0,115 partie en poids) et de la ÎJjN'-dicyclohexylcarbodi-imide (0,21 partie en poids) et on laisse le mélange reposer à 20 4°C toute la nuit. Après enlèvement des urées qui se sont séparées, le filtrat est introduit dans un mélange acétate d'éthyle-éther refroidi par de la glace (1s 1, 200 partie® en toIium). £•■ précipités sont séparés par filtration, lavés à l'éther et séchés sous vide pour donner l'ester actif de décapeptide ; le rendement 25 est 0,39 partie en poids» £ Le triacétate d'amide de N -t-hutyloxycarbonyl-lysyl-propyl-valyl-glycyl-N^ -t-butyloxycarbonyl-lysyl-N ^ -t-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-arginine (0,23 partie en poids) est dissous dans la diméthylformamide (3 parties en volume) et on ajoute de la trié-30 thylamine (0,24 partie en volume)» A ce mélange, on ajoute alors une solution de l'ester actif de décapeptide obtenu ci-dessus (0,39 partie en poids) dans la diméthylformamide et on laisse reposer le mélange réactionnel (volume total}environ 5 parties en volume) à 4°0 pendant 60 heures. L'octadécapeptide protégé "brut est ob-35 tenu sous forme de solide amorphe quand le mélange réactionnel est introduit dans de l'acétate d'éthyle froid (100 parties en volume) ; le rendement est 0,55 partie en poids. Le peptide protégé obtenu ci-dessus (0,55 partie en poids) est dissous, pour supprimer la protection, dans de l'acide tri-40 fluoroacétique à 90 i» (6 parties en volume) et la solution est 70 07914 31 2034698 maintenue à la température ambiante pendant 60 minutes, après quoi le solvant est retiré par évaporation sous pression réduite„ Le résidu est dissous dans l'eau et la solution est passée à travers une colonne (2,2 x 7 cm) de produit dit Amberlite CG-400 5 (forme acétate) ; la colonne est lavée avec des parties d'eau. Les solutions aqueuses sont combinées et concentrées jusqu'à 10 à 15 parties en volume sous pression réduite. Au concentrât, on ajoute du mercaptoéthanol M (1 partie en volume) et le mélange est soumis à l'incubation à 37°0 toute la nuit et lyophilisé. Le peptide brut 10 débloqué (0,51 partie en poids) ainsi obténu est soumis, en vue d'une purification, à une chromatographie sur une colonne (2,7 x 12 cm) de earboxyméthylcellulose (CMC, Serva, 0,6 meq/g) en utilisant un tampon à l'acétate d'ammonium (pH 6,8, 4.000 parties en volume) avec un gradient linéaire de concentration de 0,05 à 0,4 M. 15 Les fractions (15 ml/tube) correspondant au pic principal (tubes 166-245) sont combinées et la masse des solvants est retirée sous pression réduite. Le résidu est lyophilisé à maintes reprises jusqu'à poids constant pour donner 1'octadécapeptide partiellement purifié ; le rendement est 0,22 partie en poids0 Le produit (0,2 20 partie en poids) est chromatographié, en vue d'une purification ultérieure, sur une colonne (2,2 x 18 cm) de carboxyméthylcellulose (Serva, 0,6 meq/g) en utilisant un tampon à l'acétate d'ammonium (pH 6,8, 2000 parties en volume) avec un gradient linéaire de concentration de 0,05 à 0,8 M. Les fractions (7,5 ml/tube) correspon-2,5 dant à un pic principal (tubes 125-160) sont combinées, concentrées et lyophilisées pour obtenir le peptide brut qui est 1'amide de P-alanyl-tyrosyl-séryl-méthionyl-glutamyl-histidy1-phénylalany1-arginy 1-tryptophy 1-glycyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-lysyl-lysyl-ar-ginyl-arginine (0,17 partie en poids), [oc]^-54,0 + 1,8° (c=0,515, 30 acide acétique 0,1 îï), X 0,1 11 = 280 mu (E^m 23,0), nictx y* r cm , HCl 0, 1 H _ ooo c ml, 17 04- \ NaOH 0,1 M 9ft1 R t À plateau = 288'5 f (E1cm 17>5) et À max = 281,5 (E 24,9), 288 mp (E 24,3). Le peptide se comporte comme un seul composant vis-à-vis de la ninhydrine, des réactifs de Pauly, 35 d'Ehrlich et Sakaguchi et de la méthionine (Ptlg) par chromatographie sur papier (n-butanol : acide acétique : pyridine : eau =' 30 : 6 : 20 : 24 en tant que solvant) et par éleetrophorèse sur papier (600 V/36 cm, dans l'acide acétique 2ÏT). Les rapports des amino-acides dans l'hydrolysat des acides sont les suivants : Ser 0,75, 40 Glu 0,90, Pro 0,91, Gly 1,89, Val 1,00, Met 0,96, Tyr 1,01, Phe $AD OHtG'NAÈ* 70 07914 32 2034698 0,97, P- Àla 1,00, lys 2,83, -His 0,92, Arg 2,82, Trp 0,55, NH5 1,420 le rapport Trp/Tyr dans 1'octadécapeptide intact est déterminé par voie spectrophotométrique à une valeur de 1,16. EXEMPLE 2 5 l'acétate de ({3-Ala* )-ACTH( l-ISj-NHg (5 parties en poids) est dissous dans du chlorure de zinc 40 mM (2,5 parties en volume), la solution est additionnée d'une solution (2,5 parties en volume) de phosphate acide disodique 40 mM contenant du chlorure de sodium (45 parties en poids) pour constituer une suspension du complexe dé-10 siréo la préparation est administrée dans un rat soumis à une hypophysoseetomie par injection intramusculaire (5yl/rat). Après deux heures, une quantité de 11-hydroxycorticostéroïde dans le plasma a été déterminée à une valeur de 80y/g/dï. Au contraire, 15 dans l'administration d'une préparation obtenue d'une manière semblable à l'exclusion du chlorure de zinc, la quantité de 11-hydroxycorticostéroïde était 6 g/ml„ la détermination- a été réalisée selon le procédé décrit dans Endocrinol. Japanica., V5 180 (1966). 20 En travaillant avec du chlorure de cobalt, du chlorure de cuivre, du chlorure de nickel ou du chlorure de fer au lieu de chlorure de zinc, on obtient des complexes correspondants. EXEMPLE 3 De l'acétate de (p-Ala1)-ACTH(1-18)-NH2 (10 parties en poids) 25 est dissous dans de l'eau distillée (2 parties en volume). À la solution, on ajoute en agitant une solution d'acide poly-l-aspartique (20 parties en poids ; poids moléculaire environ 3.000) qui a été neutralisée avec de la soude 0,1 N (3 parties en volume) avant utilisation et, ainsi,, il se forme une suspension de précipités 30 blancs. Oh obtient la suspension désirée du-complexe en ajoutant encore à la suspension obtenue ci-dessus une solution (5 parties en volume) (pH 6,8) de phosphate acide disodique/phosphate acide, dipotassique M/15 contenant du chlorure de sodium (90 parties en poids)» 35 la préparation est administrée à un rat soUmis à une hypo physoseetomie par injection intramusculaire (5^1/rat). Deux heures après l'injection, la quantité de 11-hydroxycorticostéroïde dans le plasma a été déterminée à une valeur de 45y/g/dl mais la quantité quand la préparation dépourvue d'acide'poly-l-aspartique 40 est préparée d'une manière semblable et administrée a été trouvée 70 07914 33 2034698 à une valeur de 6 JJ g/dl0 EXEMPLE 4 De l'acétate de (0-Ala ' )-ACTH(l-Bj-NH^ (5 parties en poids) est dissous dans de l'eau distillée (1,5 partie en volume). A la 5 solution, on ajoute une solution (1 partie en volume) d'acide poly-L-glutamique (5 parties en poids) (poids moléculaire environ 1500 à 2000) qui a été réglée avec de la soude 0,1 N ; ensuite, on donne une suspension du complexe précipité. En ajoutant une solution de tampon phosphaté M/30 (2,5 parties en volume) conte-10 nant du chlorure de sodium (90 parties en poids) à la suspension, on obtient la préparation désirée du complexe. EXEMPLE 5 De -l'acétate de (P-Àla )-ACTH(l-ISj-NHg (5 parties en poids) est dissous dans du chlorure de zinc 100 mM (15 parties en volume). 15 D'autre part, de l'acide poly-L-glutamique (5 parties en poids) (poids moléculaire environ 1500 à 2000) est neutralisé avec de la soude 0,1 N (une partie en volume) et, à la solution, on ajoute du chlorure de sodium (45 parties en poids) et du phosphate acide disodique 40 mM (25 parties en volume). La solution ainsi obtenue 20 de 1'octadécapeptide et une solution d'acide polyglutamique sont combinées pour former une suspension du complexe désiré. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à 25 l'homme de l'art. 70 07914 34 2034698 REVENDICATIONS 1 - Composé caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant 1'octadécapeptide ayant la formule P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-X-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-1-tryp- 5 tophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-Y où. X est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste d'acide L-glutamique et un reste de L-glutamine et Y est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de L-arginine et un reste d'amide de I-arginine, ses sels d'addition non toxiques avec les acides et ses complexes avec un membre choisi dans le groupe comprenant un métal lourd, un acide polyaminé et leurs mélangeso 2 - Composé caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant 1*octadécapeptide formé de 1'amide de fà-alanyl-L-s éryl-L-mé thi ony1-L-glutamyl-L-his t idyl-L-phénylalanyl-L-arginy1-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine, ses sels d'addition non toxiques avec les acides et ses complexes avec un membre choisi dans le groupe comprenant le nickel, le cobalt, le zinc, le cuivre, le fer, l'acide poly-L-glutamique, 1'acide-poly-D-glutamique, l'acide poly-DL-glutamique, l'acide poly-L-aspartique, l'acide poly-DL-aspar-tique, la copoly-L-glutamyl -tyrosine et leurs mélanges. 3 - Composé caractérisé en ce qu'il a la formule R-j-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-I-méthionyl-r-Rg-Ii-glutamyl-L-histidyl-L-phényl-alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N^ -R^-I-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-N^ -R^-L-lysyl-N^ -R^-L-lysyl-L-arginyl-Y où R^ est un groupe de protection du groupe amino, Rg est un groupe de protection du groupe carboxyle, R^ est un groupe de protection du groupe amino et Y est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de L-arginine, un reste d'amide de L-arginine, un reste d'ester de L-arginine et un reste d'hydrazide de L-arginine. 4 - Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce que R.j et R^ sont chacun un membre choisi dans le groupe comprenant le groupe t-butyloxycarbonyle, le groupe t-amyloxycarbonyle, le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle, le groupe benzoyloxy-carbonyle, le groupe p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le groupe p-nitro -benzyloxycarbonyle, le groupe formyle, le groupe tosyle, et le groupe éthyle et R^ est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste d'ester alkylique inférieur, un reste d'ester aralkylique inférieur et un reste d'amide. 70 07914 35 2034698 5 - Composé caractérisé en ce qu'il a la formule R.j-|3-alanyl-L-tyro sy1-L-s éry1-L-méthi onyl-tf-Rg-L-glutamyl-hi s t idyl-L-phényl-alanyl-I-arginyl-i-tryptophyl-Z où R| est un groupe de protection du groupe aminé, Rg est un groupe de protection du groupe carboxy- 5 le et Z est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de glycine, un reste d'ester de glycine et un reste d'hydrazide de glycine. 6 - Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que R^ est un membre choisi dans le groupe comprenant le groupe t- 10 butyloxycarbonyle, le groupe t-amyloxycarbonyle, le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle, le groupe benzyloxycarbonyle, le groupe p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le groupe p-nitrobenzyloxycar-bonyle, le groupe formyle, le groupe tosyle et le groupe trityle, et Rg est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste d'es- 15 ter alkylique inférieur, un reste d'ester aralkylique inférieur et un reste d'amide. 7 - Composé caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant- la t-butyloxycarbonyl-(3-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-l-mé-thi onyl-r-t-butyl-L-glutamyl-L-his t idyl-L-hi s tidyl-l-phénylalanyl~ 20 L-arginyl-L-tryptophyl-glycine, l'ester de t-butyloxycarbonyl-0-alanyl-I-tyr o syl-l-s éry 1-L-mé thi ony l-"5-t-butyl-glut amy 1-L-hi s t idy 1-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine et l'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-r-t-butyl-L-glut amy1-L-hi s t idyl-L-phény 1 alany 1-L-ar giny l-Ii-1 r y p t o phy 1-gly cine. 25 8 - Composé caractérisé en ce qu'il a la formule R^-0-alanyl- L-tyrosyl-l-séryl-W où R^ est un groupe de protection du groupe amino et W est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de 1-méthionine, unieste d'ester, de Inné thi onine et un reste d'hydrazide de L-méthionine. 30 9 - Composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R| est un membre choisi dans le groupe comprenant le groupe t-butyloxycarbonyle, le groupe t-amyloxycarbonyle, le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle, le groupe benzyloxycarbonyle, le groupe p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le groupe p-nitrobenzyloxycar- 35 bonyle, le groupe formyle, le groupe tosyle et le groupe trityle. 10 - Composé caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant la t-butyloxycarbonyl-(3-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-mé-thionine, l'ester de t-butyloxycarbonyl-p-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-1-méthionine et l'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyro- 40 syl-L-séryl-L-méthionine» 70 07914 36 2034698 11 - Procédé de préparation d'un composé choisi dans le groupe comprenant un octadécapeptide et ses divers dérivés tels qu'indiqués dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à lier les aminoacides, dans l'ordre indiqué,par un procédé choi-5 si dans le groupe comprenant un procédé d1 allongement étape par étape et un procédé de condensation d'unités de peptide, et à transformer, si cela est nécessaire, 1'octadécapeptide résultant en son sel correspondant non toxique d'addition avec les acides ou en son complexe d'une manière classique en soi» 10 12 - Procédé de préparation d'un composé formé d'un octadé capeptide et de divers dérivés tels qu'indiqués dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un déea-peptide ayant la formule R ^-P-alanyl-L-tyrosyl-l-séryl-l-méthio-nyl-V-Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-l-trypto-115 phyl-glycine où R^ est un groupe de protection du groupe aminé et Rg est un groupe de protection du groupe carboxyle, avec un octapeptide ayant la formule H ^-R^-L-lysyl-l-prolyl-L-valyl-gly-cyl-î^-Rj-L-lysyl-îï ^ -R^-L-lysyl-L-arginyl-Y où R^ est un groupe de protection du groupe aminé et Y est tel que défini dans la re-20 vendication 1, par un procédé choisi dans le groupe comprenant le procédé à la dicyclohexylcarbodiimide, le procédé au chlorure d'acide, le procédé à 1'azothydrure, le procédé à l'ester activé, le procédé au mélange d'anhydrides, le procédé à l'isocyanate, le procédé au chlorophosphite d'éthyle, le procédé au pyrophosphite 25 de tétraéthyle et des combinaisons de ces procédés, à retirer les groupes protecteurs de 1'octadécapeptide résultant ayant la formule R-j-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-'ff-Rg-Ir-glutamyl-Ii-histidyl-l-phénylalanyl-Ir-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N £ -Rj-L-lysyl-L-prolyl-L-vg.lyl-glycyl-N^ -R^-L-lysyl-N4* -R^-L-lysyl-L-30 arginyl-Y où R^, Rg, R^ et Y sont tels que définis ci-dessus,par un procédé choisi dans le groupe comprenant l'hydrogénolyse, l'hydrolyse et l'acidolyse et à convertir, si cela est nécessaire, 1'octadécapeptide ainsi obtenu en sel avec les acides ou en complexe non toxique correspondant d'une manière classique en soi. 35 13 - Procédé de préparation de 1*octadécapeptide formé par le composé indiqué dans la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un décapeptide formé par la t-butyl-oxycarbonyl-j3-alanyl-L-tyrosyl-L-séry1-L-méthionyl-v-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine 4-0 avec un octapeptide formé par l'amide de -t-butyloxycarbonyl- 70 07914 " 2034698 L-lysyl-L-pro lyl-L-valyl-glycyl-2f ^ -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N ^ -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine par un procédé choisi dans le groupe comprenant le procédé à la dicyclohe-xylcarbodiimide, le procédé au chlorure d'acide, le procédé à 5 1'azothydrure, le procédé à l'ester actif, le procédé aux mélanges d'anhydrides, le procédé à l'isocyanate, le procédé au chlo-rophosphite d'éthyle, le procédé au pyrophosphite de tétraéthyle et leurs combinaisons, dans un solvant inerte, à une température de -20°C à 50°C, pendant 2 à 96 heures, et à retirer les groupes 10 protecteurs de 1'octadécapeptide résultant protégé, 1'amide de t-butyloxycarbonyl-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-TJ'-t-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-gly- cyl-N ^ -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N Ê -1~- f b utyloxycarbonyl-L-lysyl-N -1-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-argi-15 nyl-Ii-arginine, dans un milieu acide, à une température comprise entre 10°C et 50°C pendant 10 à 90 minutes. 14 - Procédé de préparation du produit ayant la formule R.j-0-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-V-Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-Z, où R| est un groupe de 20 protection du groupe amino, R2 est un groupe de protection du groupe carboxyle et Z est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de glycine, un reste d'ester de glycine et un reste d'hydrazide de glycine, caractérisé en ce qu'il consiste à condenser un tétrapeptide ayant la formule R^-P-alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-1-25 méthionine, où R^ est tel que défini ci-dessus, avec un hexapep-tide ayant la formule ff-Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-Z où Rg et Z sont tels que définis ci-dessus, d'une manière classique en soi. 15 - Procédé de préparation du produit ayant la formule R^-P-30 alanyl-L-tyrosyl-L-séryl-W où R1 est un groupe de protection du groupe amino et W est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de L-méthionine, un reste d'ester de L-méthionine et un reste d'hydrazide de L-méthionine, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un dipeptide ayant la formule R^-(3-alanyl-P, où R^ 35 est un groupe de protection du groupe amino et P est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de L-tyrosine et un reste d'hydrazide de L-tyrosine, avec un dipeptide ayant la formule L-sé-ryl-W, où W est un membre choisi dans le groupe comprenant un reste de L-méthionine, un reste d'ester de L-méthionine et un reste d'hy- 70 07914 38 2034698 drazide de L-méthionine. 16 - Procédé de préparation d'hexapeptide formé par la v-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-gLycine, servant à la production de 1'octadécapeptide, caractérisé 5 en ce qu'il consiste à retirer le groupe t-butyloxycarbonyle de OC & l'ester méthylique de N -t-butyloxycarbonyl-N -nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine avec de l'acide formique, à condenser l'ester de tripeptide résultant avec la t-butyloxycarbonyl-l-phénylalanine, à retirer le groupe t-butyloxycarbonyle de l'ester méthylique de q. 10 t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanyl-N -nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine avec de l'acide formique, à condenser le pentapeptide résultant avec l'ester p-nitrophénylique de la Na,îïIm-dibenzyloxy-carbonyl-l-histidine pour donner l'ester méthylique correspondant de , ïï^m-dib enzyl oxy c arb ony 1-L-hi s t i dy1-L-phénylalanyl-L-N^-ni tro -15 L-arginyl-L-tryptophyl-glycine qui est hydrolysé, traité avec de l'acide fluorhydrique et mis à réagir avec la benzyloxycarbonyl-'C-t-butyl-L-glutamyl-Ii-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-trypto-phyl-glycine. 17 - Préparation pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle 20 comprend un membre choisi dans le groupe comprenant 1) le produit ayant la formule (3-alanyl-L-tyro syl-L-s éry 1-L-mé thi ony 1-X-L-his ti -dyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Ii-arginyl-Y, où X est un membre choisi dans le groupe se composant du reste d'acide L-glutamique 25 et du reste de L-glutamine et Y est un membre choisi dans le groupe se composant du reste d'amide de L-arginine et du reste de L-arginine, 2) un sel d'addition non toxique avec les acides, acceptable au point de vue pharmaceutique, et 3) un complexe avec un membre choisi dans le-groupe comprenant le zinc, le cuivre, le co-30 balt, le nickel, le fer, un acide polyaminé et leurs mélanges, mélangés avec un membre choisi dans le groupe comprenant un support, un stabilisant, un émulsionnant, un produit de conservation, un tampon, un agent de transformation en produit isotonique et un agent de mouillage.