Brevet FR2047886A1 — publié le 19710319

On utilise actuellement des vaccins anti-coquelucheux constitués par une suspension de Bordetella Pertussis tués, qui présentent l'inconvénient important de provoquer chez le patient des réactions secondaires dont la plupart sont bénignes, passagères mais fréquentes et dont les autres, heureusement très rares, sont graves et peuvent conduire jusqu'à des encéphalopathies ayant des suites parfois irréversibles et mye mortelles. Malgré ces- inconvénients connus des vaccins anti-coquelucheux conventionnels, il n'est cependant pas souhaitable de renoncer à une vaccination généralisée en raison du danger que la coqueluche fait encore peser sur les enfants et en particulier sur les nourrissons. La présente invention est relative à un nouveau procédé de fabrication d'un vaccin qui, tout en conservant une excellente activité protectrice, n'entraine pas de réactions secondaires chez le sujet vacciné. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de fabrication d'un vaccin anti-coquelucheux essentiellement caractérisé par le fait que l'on réalise une culture de Bordetella Pertussis en phase I,- que l'on procède à l'extraction de la suspension microbienne à l'aide d'un agent tensio-actif anionique en provoquant l'éclatement des membranes cellulaires, puis à une précipitation ou à une centrifugation et que l'on purifie le surnageant. On peut procéder à la culture du Bordetella Pertussis d'une manière conventionnelle, en opérant soit en milieu liquides soit en milieu solide. La culture s'effectue généralement pendant des temps inférieurs à 72 heures et de préférence voisins de 48 heures. Il convient toutefois de s'assurer qu'en fin de culture les germes sont encore en phase I. Conformément à l'invention, le tensio-actif anionique utilisé est de préférence un alcoyl-sulfate ou un alcoyl-sulfonate comprenant dans sa molécule environ 10 à 18 atomes de carbone et de préférence de 12 ou 14 atomes de carbone. L'utilisation, par exemple, du myristyl-sulfate et du dodecylsulfate s'est révélée partioulièrement intéressante. L'extraction est effectuée conformément à l'invention avec des concentrations en composé tensio-actif qui sont généralement comprises entre environ 0,1 et 10 micro-moles de tensio-actif pour 10 milliards de germes tre4tés Les proportions préférentielles de composé tensio-actif par rapport à la culture microbienne seront indiquées ci-après en fonction des deux manières différentes dont l'extraction peut être effectuée. Il est préférable, selon l'invention, d'utiliser des suspensions microbiennes présentent une concentration en germes aussi élevée que possible. Généralement, on peut avantageusement utiliser des suspensions microbiennes contenant au moins environ 50 milliards de germes par cm3. L'extraction peut tre effectuée à l'aide du tensio-actif anionique dans une large gamme de pH. A titre d'exemple on précisera, ci-après, les conditions d'extraction, d'une part à pH basique, et d'autre part à pH acide. Dans un premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'in invention, la phase d'extraction s'effectue à un pH basique compris entre environ 7,5 et 9 et de préférence compris entre 8,5 et 9, par exemple égal à 8,8 Pour maintenir la suspension microbienne additionnée du tensio-actif au pH convenable, on peut utiliser différents tampons conventionnels, tels que les tampons acide borique/potasse connus sous le nom de tampon/Gomori, les tampons acide chlorhydriaue/ trihydroxyméthyl-aminonéthane, les tampons acide acétique/tri phosphane, borate connu sous le nom de ou encore le tampon a base de citrate/ bora e connu sous le nom de tampon de Téorell et Stenhaguen. Conformément à l'invention, il est préférable d'utiliser un tampon communiquant à la suspens ion microbienne contenant le tensio-actif une force ionique aussi faible que possible et de préférence inférieure à 0,5. Dans ce mode de mise en oeuvre, on utilise avantageusement une concentration en composés tensio-actif d'environ 4 à 6 micromoles par 10 milliards de germes de lawspension microbienne. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on effectue l'extraction de la suspension microbienne contenant le tensio-actif à un pH acide compris entre environ 2 et 5 et, de préférence, voisin de 9. Ce pH peut etre facilement obtenu à ,l'aide de tampons conven tionnels tels que les tampons à base d'acide citrique connus sous le nom de tampons de 'Mac Ilvaine. Dans ce cas égarement, il est préférable d'utiliser un tampon qui ne communique à la suspension microbienne microbienne combe e pension actif qu'une force ionique aussi faible que possible et, de préférence, inférieure à 0,5. Dans ce mode de mise en oeuvre de l'invention, il est possible d'utiliser une plus faible concentration en composé tensioactif. Celle-ci peut entre, par exemple, voisine de 0,5 micromole de composé tensio-actif par 10 milliards de germes. Dans les deux modes de mise en oeuvre qui viennent d'être decrits ci-dessus, on laisse agir le tensio-actif sur la suspension microbienne pendant un temps minimum d'environ 15 minutes, mais ce temps peut toutefois etre notablement supérieur. Dans la plupart des cas, il peut avantageusemert entre choisi au voisinage de deux heures. Pendant cette période, la suspension microbienne qui est en phase liquide est maintenue de préférence à une température inférieure à 100C, par exemple comprise entre 40 et 60C, -la suspension microbienne étant soumise à une agitation constante et modérée. Dans le cas où ce traitement a été effectué à pH acide, on procède à une centrifugation dont on garde uniquement le culot qui est ensuite placé dans une solution d'un tampon alcalin tel que ceux qui ont été décrits ci-dessus, ce qui a pour effet de provoquer l'éclatement des membranes cellulaires des bactéries, alors que dans le cas où le traitement a été effectué dès le début en milieu alcalin, cet éclatement se produit progressivément dès le début de la phase d'extraction qui s'effectue en totalité-à pH basique. Lors de l'extraction à l'aide du tensio-actif anionique,- on peut également introduire un agent chélatant, tel par exemple que le sel-disodique de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique. (E.D.T.A.). La suspension microbienne qui a été ainsi obtenue par l'un ou par l'autre des différents modes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est alors soumise à une centrifugation qui permet de recueillir le liquide surnageant en le débarrassant des débris cellulaires. Conformément à l'inventnon, il est avantageux de procéder ensuite, par des moyens conventionnels, à une purification de l'extrait microbien obtenu comme il vient autre indiqué. Cette purification peut par exemple s'effectuer avantageusement par chromatographie en faisant jouer simultanément des phénomènes d'échanges d'ions et d'exclusion-diffusion. On peut également réaliser la purification de l'extrait microbien par précipitation de -l'extrait brut à l'aide de poly éthylène-glycol ayant par exemple un poids molêculair' de 6.000. Le procédé selon l'invention permet de réaliser des doses vaccinantes immunisant contre la coqueluche qui contiennent, par exemple, de 8 à 12 unités internationales. La présente invention a également pour objet, à titre de produit nouveau, un vaccin coqueluchéux caractérisé par le fait qu'il contient un extrait de suspension de Bordetella Pertussis obtenu à l'aide d'un tensio-actif anionique, selon le procédé qui a été défini ci-dessus. Des essais qui ont été effectués ont montré que le vaccin anti-coquelucheux obtenu selon le procédé conforme à l'invention permet d'assurer une bonne immunité et ne présente aucun effet secondaire de toxicité ou d'allergie. Dans le but de mieux faire comprendre l'invention, on va en donner maintenant à titre d'illustration un mode de mise en oeuvre décrit dans l'exemple ci-après. EXEMPLE On part d'un mélange de trois souches A, B et C de Bordetella Pertussis, en phase I, que l'on cultive pendant 48 heures en milieu liquide selon un procédé conventionnel. La culture ainsi obtenue est lavée en tampon phosphaté sans être soumise à l'action de la chaleur ou du merthiolathe. La culture ainsi obtenue est mise en suspension dans un tampon TRIS Hr'l 0,02 M contenant de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique (E.D.T.A.) à 0,003 M, le pH étant de 8,5. La conceLtration est ensuite ajustée à 140 unités d'opacité par mi Le milieu microbien ainsi obtenu est alors soumis a une extraction par adjonction de dodécyl-sulfate de sodium à la concentration de 3,5. 10 3 2'l. Cette extraction effectue à la température de 4 C et elle permet d'obtenir en deux heures une 1yse de 40 à 55 %. On procède à une centrifugation à 7000 g pendant 45 minutes à une température de 400. Le culot de centrifugation est rejeté et le surnageant constitue l'extrait brut selon l'invention. On détermine, par analyse, qu'il contient 160j4Jg d'azote protéique par ml. On le soumet à une dialyse, puis on le précipite par adjonction de polyéthylèneglycol ayant un poids moléculaire de 6.000, à une concentration de 20 Xo. Le précipité obtenu est ensuite centrifugé à 12.000 g pendant une heure à la température de 4 C. Le surnageant est éliminé et le culot de centrifugation est redissous dans un tampon phosphaté à 4-OC. Après une dernière dialyse, on obtient la fraction lipoprotéique qui-constitue le produit actif du vaccin selon l'in invention Dans une variante, on peut réaliser la purification de l'extrait brut en le faisant passer sur un gel de cations (par exemple sur le gel connu sous la marque C.I. SEPHADEX 0.50 équilibré au pH de 5,9). Il résulte des expériences qui ont été effectuées que l'ex- trait brut, ainsi que sa fraction lipoprotéique, assurent une bonne innocuité vis-à-vis du Bordetella Pertussis, l'activité spécifique de la fraction lipoprotéique étant toutefois environ trois fois supérieure à celle dru lysat brut. PEVENDICADIONS 1) Procédé de fabrication d'un vaccin anti-coquelucheux caractérisé par le fait que lton réalise une culture de Bordetella Pertussis en phase I, que l'on procède à l'extraction de la suspension microbienne ainsi obtenue à l'aide d'un agent tensio-actif anionique, que l'on procède à une centrifugation de la suspension bactérienne ainsi traitéede manière à en recueillir le surnageant et, qu'auprès l'avoir de préférence purifié, on conditionne l'extrait bactérien ainsi obtenu en unités vaccinantes. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise un agent tensio-actif anionique constitué par un alcoyl-sulfate ou un alcoyl-sulfonate comprenant de 10 à 18 atomes de carbone, et de préférence 12 ou 14 atomes de carbone. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait queon utilise comme agent tensio-actif le myristyl-sulfate ou le dodeJcyl-sulfate. 4) Procédé selon au moins une des revendicatI.ons précédentes caractérisé par le fait que l'on effectue l'extraction à un pH basique compris entre environ 7,5 et 9, et, de préférence, compris entre 8,5 et 9. 5) Procédé selon au moins une 'es revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu on effectue l'extraction à un pH acide compris entre 2 et 5 et, de préférence voisin de 3, puis que l'on centrifuge l'extrait bactérien ainsi traité et que l'on remet le culot de centrifugation dans une solution tamponnée à un pH basique. 6) Procédé selon au moins une des revendications précédentes caractérisé par le fait que l'on choisit une concentration en tensio-actif qui est comprise entre environ 0,1 et 10 micromoles de tensio-actif pour 10 milliards de germes microbiens. 7) Procédé selon les revendications 4 et 6 caractérisé par 1e fait qu'on choisit une concentration en tensio-actif comprise entre environ 4 et 6 micro-moles de tensio-actif par 10 milliards de germes. 8) Procédé selon les revendications 5 et 6 caractérisé par le fait qu'on choisit une concentration en tensio-actif voisine de 0,5 micro-mole de tensio-actif par 10 milliards de germes 9) Procédé selon au moins une des revendicatioe-'c précedentes caractérisé par le fait qu'on utilise une suspension bactérienne présentant une concentration en germes aussi élevée que possible, par exemple d'au moins environ 50 milliards de germes par cm3. 10) Procédé selon au moins une des revendications précédentes caractérisé par le fait qu'on effectue l'extraction de la suspension microbienne par l'agent tensio-actif pendant au moins 15 minutes, et de préférence pendant environ deux heures, à une température de préférence inférieure à 100C, par exemple de l'ordre de 4 à 60C. 11) Procédé selon au moins une des revendications précédentes caractérisé par le fait que l'on réalise la purification de l'extrait brut par chromatographie, en utilisant des phénomènes d'échanges d'ions et d'exclusion-diffusion. 12) Procédé selon au moins une des revendications 1 à 10 caractérisé par le fait que l'on réalise-la purification de l'extrait brut par précipitation à l'aide de polyéthylène-glycol ayant, par exemple, un poids moléculaire de ci000, 13) Vaccin anti-coquelucheux n'entraînant pas de réactions secondaires chez le sujet vacciné, caractérisé par le fait qu'il a été obtenu selon au moins une des revendications précédentes. 14) Vaccin anti-coquelucheux obtenu comme indiqué dans l'exemple.