Brevet FR2017251A1 — publié le 19700522

La pressente invention concerne un vaccin amélioré contre la fièvre q)rteuse dans lequel on émulsifie en phase aqueuse l'antigène tué, avec une huile en prJd isant une émulsion d'eau dans l'huile comportant au maximum 25% d'eau la limite inférieure étant établie par la concentration de l'antigène dans la phase aqueuse susceptible d'etre produite et qui peut dans certains cas s'abaisser jusqu'à environ 2% On a proposé antérieurement de préparer des vaccins par formation d'une émulsion d'eau dans l'huile, l'antigène étant bien entendu dans la phase aqueuse, et l'émulsion type comportant environ 50% de phase aqueuse et 50% d'huile.Divers types d'agents émulsifiants sont utiles, tels que le monooléate de mannide soluble dans les huiles. I1 est parfaitement possible de produire des émulsions qui ont une stabilité appropriée à l'emmagasinage par réfrigération mais un sérieux problème survient en raison du fait que ces émulsions ont @ne viscosité tés élevée et, par suite, une injection prend un temps relativement long Lorsqu'on tend d'utiliser ces émulsions aver des vaccins contre la fièvre aphteuse ils sint completement irutilisables. Par exemple, avec une aiguille de calibre n 20, il faut presque 40 secondes pour injecter une dose normale de 10 ml, et le bétail des grands domaines où les betes sont à demi-sauvages, ne peut pas supporter un traitement aussi long. On pourrait supposer que l'on ne rencontrerait pas de problème en utilisant une aiguille beaucoup plus grande, par exemple une aiguille de calibre n 18 avec laquelle la durée d'injection est de l'ordre d'environ 10 secondes. Cependant, cette façon d'opérer n'est pas d'avantage utilisable car une grande aiguille occasionne une plaie assez importante et celle-ci peut facilement s'infecter ou des oeufs des larves de la mouche Chrysomia macellaria peuvent sty déposer. Par suite l'utilisation de ces grandes aiguilles est également impossible.En conséquence, les vaccinations contre la fièvre aphteuse sont en général effectués avec un virus tué en milieu aqueux en dépit de la courte période d'immunité. Selon la présente invention, on propose un vaccin contre la fièvre aphteuse dans lequel le virus tue en suspension aqueuse est émulsifié avec une huile afin de produire des émulsions ayant au maximum environ 25% de phase aqueuse et de préférence au maximum 20% de phase aqueuse. On obtient des résultats optimaux avec des émulsions ayant environ 10% de phase aqueuse. La limite inférieure de la quantité de phase aqueuse selon la présente invention est déterminée par d'autres facteurs å savoir la concentration du virus tué dans la phase aqueuse qui peut etre produite. Il n'est pas possible de produire en pratique d'une manière économique des solutions aux concen trations élevées en raison du coût prohibitif. Si, cependant on utilise une co-centration utile, la limite inférieure peut approcher 2%. Le procédé pour préparer des émulsions d'eau dans l'huile utilisées dans les vaccins de la présente invention ne s'écarte pas d'une manière notable de la pratique satisfaisante d'une émulsification type, et en général, on peut utiliser tous les agents émulsifiants bien connus, par exemple, les oléates, palmitates, laurates, stéarates, et analogues des polyols, tels que ceux provenant de la déshydratation du sorbitol et du mannitol. Deux des meilleurs exemples sont le monooléate de mannide et le monooléate de sorbitan En général, les émulsifiants qui sont bien entendu des agents tensio-actifs non ioniques, ont des indices hydrophile-lyophile relativement faibles, par exemple à partir de 8 jusqu'a une valeur s'abaissant dans une certaine mesure jusqu'à 2.Il est avantageux d'utiliser selon l'invention les agents émulsifiants bien connus pour produire les émulsions d'eau dans l'huile. L'huile dans l'émulsion peut-btre toute huile non toxique d'origine végétale ou minérale mais elle doit bien entendu être compatible avec le virus de la fièvre aphteuse tué. Toutes les huiles végétales utilisées doivent être capables de former des émulsions stables. On a trouvé que les antigènes du virus de la fièvre aphteuse tué n'ont pas d'enzymes qui tendent a rompre une émulsion rapidement et, par suite, la stabilité des émulsions est pratiquement inaltérée par la présence de l'antigène, qui est bien entendu présent en une quantité extremement faible. I1 existe bien entendu une limite au volume de la dose d'injection, et en général on a trouvé que des doses de 5 ml à 10 ml sont satisfaisantes. On peut utiliser des doses dans une certaine mesure plus grandes mais lorsqu'on emploieun volume trop grand, la tendance à la formation des abcès augmente, et, bien entendu, on doit même éviter avec la faible viscosité des émulsions à faible teneur en eau de la présente invention, des doses d'injection excessivement grandes. I1 existe certains facteurs qui établissent les limites inférieures, dans la pratique, concernant la quantité d'eau dans l'émulsion, puisque les doses doivent titre considérablement accrues si l'on n'utilise pas des concentrations d'antigènes, prùhibitivement coûteuses, car, bien entendu, une quantité suffisante d'antigènes doit être libérée. pendant une période de plusieurs mois au cours desquels l'émulsion se casse graduellement et Libers l'antigène de telle manière que l'immunité soit produite et maintenue, car les anticorps produits parles émulsions de la présente invention sont également détruits de la mme manière que les anticorps produits par une seule injection de vaccin aqueux. Ce fait conduit à certaines limites quant au pourcentage de l'agent émulsifiant par rapport à I'émulsion entière qui, bien entendu, varie dans une certaine mesure d'ur agent émulsifiant à l'autre.Il est nécessaire que la quantlté d'agent émulsifiant soit suffisante pour que la stabilité à l'emmagasinage à 40C soit appropriée, c'est-à-dire que ladite stabilité soit conservée pendant plus d'un an et dans certains cas pendant deux ans sans que l'émulsion soit cassée h plus de 10%.Cette valeur représente la limite inférieure de la concentration en émulsifiant stable dans le cas d'un émulsifiant particulier quelconque. I1 est, cependant également important que la stabilité de l'émulsion ne soit pas trop élevée de sorte que la rupture de l'émulsion jusqu'au degré de 1070 ou davantage à la température du corps, à savoir 37"C, ne se déroule pas d'une manière satisfaisante, par suite, bien entendu, du fait que la matière antigénique qui est incorporée dans l'émulsion et n'est pas encore parvenue dans les tissus animaux ne produit pas des anticorps. Tandis que les limites de la concentration en agent émulsifiant ne sont en aucune manière critiques, la quantité de l'agent émulsifiant ne doit pas dépasser fortement ceIle avec laquelle, à 37 C, au moins une rupture de 10% de l'émulsion a lieu pendant deux à trois mois. Ces valeurs sont appropriées pour le maintien d'une concentration en anticorps assez élevée pour conférer une immunité raisonnable, -et bien entendu, permettre une libération graduelle de la matière antigénique pendant une durée beaucoup plus longue, qui peut, dans des circonstances favorables, s'élever à une année ou davantage. C'est précisément cette immunité de longue durée qui est l'avantage important de cette invention selon laquelle on produit lesdits vaccins sans viscosités excessives. D'une manière générale, on a trouvé selon l'invention que la stabilité des émulsions s'accroît dans une certaine mesure lorsque la proportion d'eau devient inférieure à 50% et elle atteint un pic avec la ppart des agents émulsifiants pour une teneur en eau comprise entre 25% et 10%. Pour les concentrations les plus basses en eau, il se produit une légère chute des propriétés de stabilité en dessous de celle d'une émulsion type normale à 50%, cette chute entraînant une impossibilité d'utilisation dans la pratique pour les vaccins contre la fièvre aphteuse dans les conditions présentes dans les parcs à bétail, tandis que même à uùe valeur extrême de la teneur en eau drenviron 2%, la stabilité est encore élevée d'une manière convenable. D'une manière générale, le mode opératoire réel pour préparer l'émulsion peut suivre ptus ou moins le schéma courant. Par exemple, les agents émulsifiamta qui sont d'une façon générale solubles dans les huiles peuvent être dissous dans huile et la phase aqueuse contenant la matière antigénique, à savoir le virus de la fièvre aphteuse tué, peut être émul sifiée avec une agitation convenable dans un appareillage courant Le fait qu'il ngy ait pas d'exigence particulière en ce qui concerne le procé de l'appareillage pour la présente invention est un avantage dans la pratique et permet la production de vaccins en émulsion selon l'invention d'une mani*re relativement non critique et simple Comme avec tous les autres vaccins, on doit prendre des préca tions pour éviter l'introduction d'autres constituants pathogenes indési- rables. Ces précautions n'entraînent nullement des mesures opératoires exceptionnelles selon l'invention, mas on peut réaliser l'invention avec le soin ordinaire utilisé dans la productfon des préparations biologiques sûres. Les exemples suivants illustrent l'invention sans nullement la limiter dans son cadre et son esprit. EXEMPLE 7 On prépare des émulsions en utilisant une huile minérale purifiée et une dispersion aqueuse de virus de la fièvre aphteuse de type 0-2, purifié et tué afin d'obtenir une quantité constante d'antigène par ml d'émulsion finale. La quantité choisie est de 3 microgrammes d'antigène par millilitre d'émulsion finale. On prépare trois émulsions et on les compare à un vaccin aqueux ordinaire. On injecte 10 ml de chaque préparati au bétail avec une aiguille de calibre n 20 convenable.Le tableau suivant indique les caractéristiques physiques, en montrant également les valeurs pour une aiguille de calibre n 18, bien qu'ordinairement une aiguille aussi grande ne soit pas sûre pour l'injection au bétail en raison du risque couru par d'autres infections ou infestations dans les plaies produites lors des injections avec une aiguille aussi grande. TABLEAU I ml de phase ml d'huile ml de monooleate Viscosité à l'aiguille, s/5m1,2, aqueuse minérale de mannide Aiguille de Aiguille de ~~~~~~~~~~~~~ calibre n 18 calibre n 20 O 0 O moins d'l s. moins d'l s. 50 45 5 4,5 19 20 78 2 2,0 7,0 10 89 1 1,7 5,5 'Mesurée avec un poids de 2 kg posé sur un piston de seringue de 5 ml. Le vaccir aqceux erdrea@e tien entend@, est injecté d'ane mamière parfa@@e par sure de sa très faible viscosité, mais comme il est bien connu, l'imm@ni @ produite n'est pas suifisante ear elle ne dépasse pas environ @@@@ mois et est sans valear partique.L'émulsion à 20% est entièrement satisfaisante pour une injection même avec une aiguille de calibre n 20 mais elle n'est pas toaut à fait auss avantageuse qu'une émulsion à 10%. tous les vacclas émulsifiés prolongent d'une manière importante l'immanitéà par comparaison avec les vaccins aqueux Bien entend@@ toutes les émulsions montrent une immunité pral@@gée par rapport aux vaccinatians aquauses Le *ableau II montre des essais de statilité pour les trois ^mulsions aux trois températures de 56 C, @@ C en 4 C.Le temps indiqué est relatif à la rupture d'une émulsion a 10% T A B L E A D II Phase aqueuse Statilité, nombre de jours % 56 C 37 4 C 50 25 80 > 730 20- 31 92 > 800 10 17 45 > 370 D'après les résultats précités on peut observer que la stabilité de l'émulsion à 20% est réellement supérieure à la stabilité de l'émulsion à 50% ou de celle à 10% mais cette dernière montre encore une stabilité convenable pour 1e cas d'un emmagasinage pendant plus d'un an et l'émulsion à 20% se casse à la température du corps. d'une manière suffisamment rapide pour que l'on obtienne comme mentionné ci-dessus une immunité prolongée. Lorsque l'indication dépasse un certain nemtre de jours, qu'à ce moment l'émulsion est cassée a moins de 10%. On peut observer que les émalsions présentent une stabilité à l'emmagasinage appropriée et que la rupture à 37 C se sitae dans l'intervalle de 1 mois 1/2 à trois mcs et elle est auffisamment rapide pour produire l'immvnité dans an temps raisonnable après l'injection. EXEMPLE 2 On répète le mode opératoire de l'exemple l en remplaçant le monooléate de mannide par le moncoléate de serbitan. On prodeit d'excellents vaccins avec 20 et 10% d'eau dans l'émals@@@ les visccés et les sta@@@ sont comparables A 37 C la vitesse à laquelle l'émilsion est rompné est encore appropriée poru @ne immanisation se@@@fa@sanve. R E V E @ L @ @ @ I I O @ @ 1 - Vaccin c@@@e@@@ @vre aph@@@@@ à base de @@@@ de @a @@@@@@ aphterse t@é, caractér@sé en ce @@'al est sons la forme d'une émuision d'eau dans @'buile, l'ém@@@ion totale ayant un por@@centage d'eau compris entre @% et @@%, la quantité d'agent émulsifiant du tyne émulsifiant pour les émulsions d'eau dans l'huile étant s@@@ffsante pe@@ conférer are stab@@@té po@@ une @up@are de l'émulsi@@ à @@@, supéri@@@@ a @@ an à @ C, et insuffisante pour prodan@e @@e stabiliré de l'ém@@@@@, @ @@ s@p@rieure à celle qui libère la matiè@@ @@@@génique au moment de l'injection à une vitesse inférie@re au maint@en de l'im@@@@té. 2 - Vaccin selon la revandication 1, caractérisé en ce que l'émulsion contient environ @@% de phase aqueuse 3 - Vaccin selon la revandication 1, caractérisé en ce que l'émulsion contient environ 10% de phase aqueuse 4 - Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent émulsifiant est choisi parmi les esters d'acides gras des polyols obtenus par déshydratation du sorbitol ou les esters d'a@ides gras des polyols obtenus par déshydratation du mannitol. 5 - Vaccin selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'huile est @ne huile minérale purifiée