Brevet FR2028475A1 — publié le 19701009

i 2028475 La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de produits conjugués bactériophage-protéine et aux nouveaux produits ainsi obtenus. La liaison covalente des protéines à un bactériophage en-5 traîne une préparation de phage modifiée qui peut être utilisée pour la détection et la détermination quantitative d'anticorps antiprotéines à de très faibles concentrations. Il est possible de lier les anticorps d'une manière covalente aux phages et les produits conjugués résultants anticorps-phage peuvent être utilisés 10 pour la détection et la détermination quantitative de protéines. Une détermination quantitative de protéines peut être effectuée par la désactivation du produit protéine-phage par une antiprotéine, et l'inhibition de cette désactivation du produit protéine-phage par la protéine utilisée. Des quantités de protéines aussi faibles que 15 0,3 nanogramme/ml peuvent être déterminées., La liaison chimique avec les phages est effectuée par une liaison intermédiaire. Comme tel, on utilise avantageusement une petite molécule bifonctionnelle chimiquement réactive adaptée pour former des liaisons de covalence avec les deux parties. Des exem-20 pies de ces composés utiles comme agents de liaison sont le 2,4-diisocyanate de tolylène (TDIC), la bis-diazobenzidine (BDB) et le glutaraldéhyde. On a fait croître un bactériophage (T-4, T-2), on l'a purifié et on l'a testé selon le procédé préalablement décrit [ Haimo-25 vich et collaborateurs, Immunology, 97. 338 (1966^ 7 . Le bactériophage et sa bactérie hôte, l'Escherichia coli 33, ont été soumis à une croissance selon le procédé de Adams - Bacteriophages, Interscience Pub., N.Y. 1959 et purifiés selon le procédé de Putnam et collaborateurs, J. Biol. Chem., 179 (1949)> 303. Le dosage a été 30 réalisé par le procédé de la double couche d'agar-agar décrit par Adams (voir ci-dessus). Les solutions de bactériophage ont été maintenues dans un tampon de phosphate de sodium 0,05 M, pH 6,8, qui contenait également 20 g (1 ml) de gélatine. Ce tampon a été utilisé comme diluant pour le bactériophage et les antisérums. Des 35 solutions de bactériophage T-4 à une concentration de 1011 PFU/ml avalent une densité optique de 1,0 unité à 260 mp pour une longueur de chemin de 1 cm. Les antigènes utilisés ont été préparés selon le mode opératoire de Levy et collaborateurs, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 103 40 (i960) 250, ou obtenus à partir de sources du commerce. 70 01597 2 2028475 Les antisérums et les préparations d'anticorps purifiées ont été préparés ou obtenus à partir de sources du commerce. Des lapins et des chèvres ont reçu deux fois me injection de 2-5 mg d'antigène incorporés dans un adjuvant complet de Freund (produit 5 dit Difeo, Détroit, Michigan). Le mélange antigène-adjuvant a été injecté par voie intradermique à de multiples sites sur tout le corps. Du sérum anti-insuline de cochons d'Inde a été obtenu à la Société dite Welcome Foundation Laboratories, Beckenham, Angleterre. LTanti-sérum de chèvre contre 1 'immunoglobuline G de cochons d'Inde 10 (igG) a été obtenu à la Société dite Miles-Yeda Ltd, Rehovoth, Israè'l. L'isolement immunospécifique d'anticorps a été réalisé a-vec des immunoadsorbants préparés par couplage des antigènes sur la bromoacétylcellulose selon Robbins et collaborateurs, Immunochemis-try, 4 (1967) 11. La concentration des anticorps dans le sérum a 15 été déterminée par une analyse quantitative de précipitine, tel qu'indiqué dans l'ouvrage de Kabat et Mayer, Expérimental Immuno-chemistry, 2ème édition, C.C. Thomas, 1961. La concentration de protéine dans la préparation d'anticorps isolée a été calculée à partir de la capacité d'absorption, en utilisant pour une solution 20 de 1 mg/ml un E28omju de 1,40. - Le 2,4-diisocyanate de tolylène utilisé comme agent de couplage a été obtenu à la Société dite Aldrich de Milwaukee, Wis., et la bis-diazobenzidine a été préparée et emmagasinée selon Gordon et collaborateurs, J. Exp. Med. 108 (1958) 37. Le glutaraldéhyde a 25 été obtenu à la Société dite Fluka> Suisse, sous forme d'une solution aqueuse à 25 Désactivation des produits conjugués protéine-phage par des sérums antiprotéines et par des préparations d'anticorps isolées sur les antiprotéines : 30 Des antisérums ou des préparations d'anticorps pures suivant diverses dilutions (0,05 ml) et des solutions de bactériophage modifiées (0,05 ml contenant 500-1.000 PFU) ont été mélangés et maintenus à 37°C pendant différentes périodes de temps. A la fin de la réaction de désactivation, on a ajouté aux éprouvettes 2,5 ml d'agar-35 agar mou contenant 3.10^ bactéries, et tout le mélange a été déversé sur des plaques d'agar-agar de la couche inférieure. Les plaques ont été comptées après les avoir laisséespendant IO-I8 heures à 37°C. Le mode opératoire décrit ci-dessus est connu sous le nom de "procédé de formation directe de plaques". La désactivation du phage 40 modifié par la "technique de décision" (Jerne et collaborateurs, 70 01597 3 2028475 J. Immunol. 76 (1956), 200) a été réalisée d'une manière semblable, sauf que les bactéries ont été ajoutées au mélange réactionnel à la fin de la réaction de désactivation et que les tubes ont été agités doucement pendant 10 minutes. Un sérum anti-T4 hyperimmuni-5 se (ou un sérum correspondant pour les autres phages) a été alors ajouté pendant 4 minutes de plus. La concentration finale du sérum anti-phage dans le mélange réactionnel a été choisie pour donner 99,9 % de désactivation du phage modifié dans un temps de réaction de 4 minutes. De l'agar-agar mou a été ajouté dans les tubes et 10 tout le mélange a été formé en plaques. Le procédé de désactivation de complexe /"Goodman et collaborateurs, Immunochem. 2 (1965) 351i Krummel et collaborateurs, J. Immunol. 102 (1969) 772J est semblable au procédé direct de formation de plaques, sauf qu'un sérum contre la fraction de globulines ou contre la totalité du sérum 15 est ajouté au mélange réactionnel 10 minutes avant la formation de plaques. Détection d'anticorps anti-insuline en utilisant de l'insuline radlo-active : La détection d'anticorps anti-insuline dans les sérums de 20 patients diabétiques en utilisant de l'insuline radio-active a été réalisée selon Welborn et collaborateurs, Brit. Med. J. 1 (1967) 719. Préparation de produits conjugués protéine-bactériophage T4 en utilisant le TDIC comme réactif bifonctionnel : 25 A 0,3 ml d'une solution de bactériophage T4 (^O^ôOmH = 0,3 ml de solution de protéine est ajouté dans le PBG à plusieurs concentrations (10-50 mg/ml) (sauf pour l'insuline qui a été dissoute dans un tampon de carbonate de sodium 0,3 H, pH 9,5). A ce mélange, on a lentement ajouté avec agitation 0,1 ml d'une solution 30 de TDIC dans le dioxane (0,3 % - 3,0 % v/y). On a laissé le mélange réactionnel reposer pendant une heure à 24°C. A la fin de la réaction, 5 ml de PBG ont été ajoutés et le mélange a été dialysé en présence de-6 litres de tampon formé de phosphate de sodium 0,05 M, pH 6,8. Tout précipité a été retiré par centrifugation à faible 35 vitesse. Le produit conjugué protéine-bactériophage a été séparé de la protéine plus légère n'ayant pas réagi par deux centrifuga-tions successives pendant 1 heure à 20.000 g, la boulette étant mise à nouveau en suspension dans le PBG. La concentration des particules de phage a été déterminée par la capacité d'absorption à 260 40 mp et la concentration de phage viable a été déterminée par forma 70 01597 4 2028475 10 15 25 tion de plaques avec des dilutions des préparations de 50 fois, en série. A partir des concentrations indiquées ci-dessus, on a calculé le pourcantage du bactériophage modifié ayant survécu au procédé de couplage. Les conditions optima pour le couplage des diverses protéines sont données dans le tableau I. Tableau I Exemple Protéine couplée Protéine mg/ml / TDIC v/v / Phage ayant survécu, % 0 Anticorps détecté, nanog./ml m 1 RNase 7 0,008 1,1 2 2 BSA 11 0,2 0,05 2 3 RSA 17 0,6 0,05 1 4 IgG de lapin 9 0,016 0,6 0,5 5 Lysozyme 21 0,0025 80,0 0,2 6 Insuline 17 0,2 0,1 non déter' 20 30 35 40 miné ( ■# ) / Concentration finale dans le mélange réactionnel. // Le pourcentage de phage ayant survécu au procédé de couplage a été calculé à partir du nombre d'unités formant des plaques et de la densité optique de la préparation de phage modifiée. /// C'est la concentration la plus faible d'anticorps détectée à partir de la dilution de sérum (ayant une teneur connue en anticorps) qui donne 50 % de désactivation du produit conjugué protéine-phage après réaction pendant 10 heures à 37°C. Un sérum anti-insuline de cochon d'Inde a désactivé 50 % du produit conjugué insuline-T4 après dix heures de réaction à 37°C pour une dilution finale de 1:10^. La concentration d'anticorps dans le sérum ne pouvait pas être évaluée puisque les anticorps ne sont pas précipités par l'antigène. EXEMPLE 7 Préparation de produit conjugué ribonucléase-bactériophage T4 avec la bis-diazobenzidine (BDB) en tant que réactif bi-fonctionnel : A 0,1 ml de solution de bactériophage T4 (DO^ôOm^ = on a ajouté 0,1 ml de solution de protéine dans le PBG (10-50 ml). A ce mélange, on a ajouté 0,03-0,1 ml de solution de BDB diluée à 1:15 dans le PBG; le mélange réactionnel a été laissé pendant 15 minutes à 24°C et puis dilué, dialysé, centrifugé et dosé d'une manière semblable à celle des exemples précédents. La meilleure pré 70 01597 5 2028475 10 15 20 25 30 35 paration, avec la plus forte sensibilité à la désactivation par le sérum anti-RNase, a été obtenue avec 10 mg/ml de RNase et 0,03 ml de solution de BDB. La concentration finale de protéine dans le mélange réactionnel était 4,3 mg/ml, et 5 % du phage ont survécu. On pourrait déterminer 12 nanogrammes par ml (anticorps). Préparation de produit conjugué protéine-bactériophage T4 en utilisant du glutaraldéhyde comme réactif bifonctionnel : A 0,1 ml de solution de bactériophage T4 (D0; lcm 260m H = 200), on a ajouté 0,1 ml de solution de protéine dans le PBG (10-50 mg/ ml). A ce mélange, on a ajouté 0,025 ml de glutaraldéhyde (0,05-0,2 % v/v), le mélange réactionnel a été laissé pendant une heure à 24°C et dilué, dialysé, centrifugé et dosé comme on l'a décrit dans les exemples précédents, le tableau II. Les conditions optima sont indiquées dans Exemple 9 10 Protéine couplée Tableau II Protéine mg/ml t Agent de couplage, $, v/v RNase Lysozyme 4,3 10,0 voir texte voir texte Phages ayant survécu // 7,4 36,0 Anticorps détecté, nanog./ml /// 2,0 0,2 40 Pour l'explication des références, voir tableau I. EXEMPLE 8 Préparation de produit conjugué albumine de sérum de bovin (BSA)-bactériophage T2 et désactivation par du sérum- anti-BSA : 0,3 ml d'une solution d'albumine de sérum de bovins (BSA) (Worthington) à 25 mg/ml a été mélangé avec 0,3 ml d'une solution de bactériophage T2, dans un tampon phosphaté 0,05 M, pH 7,0,contenant 20 pg/ml de gélatine. Le bactériophage T2 a été séparé comme le T4 dans les .exemples précédents. La solution de bactériophage avait une DO^g™^ = 200. A ce mélange, on a ajouté 0,1 ml de solution de TDIC, 15 mg/ml dans le dioxane, et le mélange réactionnel a été maintenu deux heures à 24°C. La réaction a été terminée par dialyse en présence du tampon indiqué ci-dessus (deux changements par rapport à 6 litres de tampon). La protéine n'ayant pas réagi a été retirée en faisant tourner le bactériophage modifié pendant 1 heure à 20.000 g, en enlevant la liqueur surnageante et en redis 70 01597 6 2028475 tribuant le bactériophage dans un tampon phosphaté 0,05 M-à pH 7,0. Parmi la population initiale de bactériophage, 0,05 % & survécu au mode opératoire de couplage. Le produit conjugué BSA-bactériophage a été spécifiquement 5 désactivé par du sérum anti-BSA préparé en injectant dans un lapin 2 mg de BSA émulsiônné dans un adjuvant complet de Freund (produit dit Difco, une partie de solution de BSA et deux parties d'adjuvant). Il n'y avait pas de désactivation du produit conjugué BSA-bactériophage par des sérums de lapins n'ayant pas reçu d'injection. Une 10 désactivation de 50 % a été obtenue par réaction pendant 10 heures à 37°C avec le sérum anti-BSA pour une dilution d'une concentration finale de 2 nanogrammes d'anticorps/ml. La teneur en anticorps du sérum a été déterminée par analyse quantitative de précipitine. Le sérum anti-BSA n'avait pas d'effet sur le bactériophage non modi-15 fié T2. EXEMPLE 11 . Désactivation du produit conjugué insuline-bactériophage T4 La désactivation du produit conjugué insuline-bactériophage T4 a été effectuée au moyen d'un sérum anti-insuline de cochon 20 d'Inde. La désactivation déterminée par le procédé de formation directe de plaques et le procédé de désactivation de complexe était identique. Avec les deux procédés, la courbe s'est aplanie, en laissant environ 5 % de phage ayant survécu, même pour des concentrations d'anticorps élevées. La désactivation a été aussi déter-25 minée avec du sérum provenant de patients diabétiques qui avaient reçu des injections d'insuline. Une désactivation de 50 % du produit conjugué insuline-T4 a été obtenue avec du sérum humain dilué 5.000 fois. Le même sérum se liait à 25 % d'insuline radio-active lorsqu'on l'a testé par le test de précipitation à l'éthanol (Wel-30 born et collaborateurs, Brit. Med. J. 1 (1967) 719). Le sérum d'un autre patient diabétique, qui ne donnait que 10 % de liaison de l'insuline radio-active, a provoqué 50 % de désactivation du produit conjugué insuline-T4 après incubation pendant 2 heures, pour une dilution de 1:200. Le produit conjugué insuline-T4 n'a pas été 35 désactivé du tout par des sérums provenant d'individus normaux, pour une dilution finale de 1:10. L'"agar-agar mou" mentionné contient 10 g de produit dit "tryptone Bacto", 6 g d'"agar-agar Bacto", 8 g de NaCl, 2 g de citrate de sodium et 3 g de glucose, dissous dans 1 litre d'eau. 40 L'"agar-agar de couche inférieure" contient les mêmes ingré 70 01597 7 2028475 dients que l'agar-agar mou, sauf que l'agar-agar est plus concentré (10 g/1). Les abréviations utilisées sont les suivantes : PBG = tampon à base de phosphate de sodium 0,05 M, pH 6,8, contenant 20 il g/ 5 ml de gélatine; IgG = immunoglobuline Qr ; RNase =? ribonucléase A pancréatique de bovin; BSA = albumine de sérum de bovin; RSA = albumine de sérum de lapin; PFU = unité de formation de plaques. D'après ce qui précède„ il est clair que les protéines peuvent être liées par covalence à des bactériophages et que la prépa-10 ration modifiée de bactériophage peut être utilisée pour détecter et déterminer une quantité aussi faible que 0,2 nanogramme d'anticorps anti-protéine par ml. La plupart des protéines étant fixées au bactériophage, la grande majorité de la population de phages a été désactivée durant 15 le procédé de couplage (voir tableaux I et II). Les phages ayant survécu étaient efficacement désactivés par l'antisérum anti-protéine. Un emmagasinage jusqu'à une année a diminué la concentration de phages viables dans certaines préparations tandis que d'autres (in-suline-T4; lysozyme-T4) n'ont pas diminué. Dans un seul cas seule-20 ment (BSA-T4), il y avait une diminution de sensibilité jusqu'à la désactivation. La désactivation de produits conjugués protéine-bactério-phage par des anticorps de protéine peut être inhibée par l'addition de la protéine libre. Ceci est décrit comme suit. 25 L'inhibition de la désactivation de produitsconjuguéspro téine -bactériophage a été réalisée par le procédé de désactivation de complexe décrit ci-dessus, sauf que 0,075 ml de 1'anti-sérum (à une dilution exigée pour une désactivation de 90-95 % du phage après deux heures d'incubation à 37°C) a été mélangé avec 0,025 ml de la 30 protéine d'inhibition et on a laissé le mélange pendant 24-48 heures à 4°C, avant d'ajouter 0,05 ml du produit conjugué protéine-bac tériophage. La concentration d'insuline dans les sérums humains a été déterminée par radio-immunodosage selon Haies et Randle. La concentration d'insuline est exprimée en poids par unité de volume 55 ou en imité internationale. On considère que la corrélation entre ces deux mesures est 25 unités internationales pour 1 mg d'insuline. Dans le cas d'insuline, 0,025 ml de sérum humain a été ajouté au lieu de la solution d'insuline (l'insuline humaine a été également dissoute dans le sérum). Le sérum humain utilisé comme diluant pour 40 l'insuline et comme contrôle avait une très faible teneur en insu 70 01597 8 2028475 line, telle que déterminée par radio-immunodosage (inférieure à 0,2 nanogramme/ml). Il ne désactivait pas le produit conjugué insuline -bactériophage T4. Durant les expériences d'inhibition, lorsque la protéine d'inhibition a été ajoutée avant l'addition du 5 phage, l'importance de la désactivation des produits conjugués pro-téine-phage a été réduite, correspondant à la désactivation par des concentrations d'anticorps inférieures à celles présentes à l'origine dans le tube de l'expérience d'inhibition. L'importance de l'inhibition a été calculée d'après l'im-10 portance de la désactivation en présence et en l'absence de la protéine d'inhibition. Par exemple, le sérum anti-lysozyme, à une dilution finale de 3.10"*^, lorsqu'on le fait réagir avec le produit conjugué lyso-zyme-t4 h une concentration initiale de 6.000 PFU/ml, a provoqué la 15 diminution de la concentration des phages ayant survécu à 490 PFU/ ml après deux heures à 37°C- En présence du lysozyme libre, à une concentration finale de 5,6.10" mg/ml et dans les mêmes conditions de concentration initiale d'anticorps et de phage, la concentration de phage ayant survécu a diminué jusqu'à 1.700 PFU/ml. Cette im-20 portance de la désactivation était égale à celle obtenue seulement avec 20 $ de la concentration initiale d'anticorps et est, en conséquence, considérée comme étant due au blocage de 80 % des anticorps présents dans le tube, correspondant à une inhibition de Q0%. Les résultats de l'inhibition de la désactivation des produits con-25 jugués protéine-bactériophage par les protéines libres correspondantes, à différentes concentrations, sont résumés dans le tableau III suivant. Tableau III 30 35 DETECTION ET DETERMINATION QUANTITATIVE DE PROTEINES PAR INHIBITION DE DESACTIVATION DES PRODUITS CONJUGUES PROTEINE-BACTERIOPHAGE protéine-bactériophage: ml exigée 25 % pour l'inhibition de : 50 % 75 % 90 % RSA-t4 2,0 8,0 40 800 RNase-t4 0,4 3,0 60 200 Lysozyme-t4 0,4 1,0 4,0 10 IgG-t4 0,05 0,3 1,5 5,0 Insuline-t4 0,05 0,15 0,4 0,7 40 70 01597 9 2028475 D'après ce tableau, il est clair qu'on peut détecter et déterminer d'une manière importante (inhibition de 25 %) une quantité aussi faible que 0,05 ng/ml d'insuline ou de IgG de lapin. La concentration d'insuline dans une série de sérums humains 5 a été déterminée par l'inhibition de la désactivation du produit conjugué insuline-t4 et par radio-immunodosage. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau IV. TABLEAU IV DETERMINATION DE LA CONCENTRATION D'INSULINE DANS n DES SERUMS HUMAINS PAR INHIBITION DE LA DESACTIVA TION DE PRODUITS CONJUGUES INSULINE-BACTERIOPHAGE ET PAR RADIO-IMMUNODOSAGES Sérum N° : Concentration d'insuline en pu/ml : Phage Radio-immunodosage 1 34 40 15 2 150 187 3 250 >200 4 13 24 5 126 138 6 15 5 20 7 170 66 8 350 >200 9 42 35 10 33 26 25 Avec la plupart des sérums testés, la corrélation était bonne. Pour la détermination de l'insuline par l'inhibition de la désactivation du produit conjugué insuline-T4 dans des sérums ayant une teneur élevée en hormone (100-300 Jju/ml), les sérums ont été dilués 3 fois et 10 fois dans des sérums normaux et testés comme 30 d'ordinaire. Les sérums testés pour la détermination de la-concentration d'insuline ont été également vérifiés pour trouver leur capacité à désactiver le produit conjugué insuline-T4. On n'a pas observé de désactivation. Les expériences ont été répétées avec d'autres types de bac-35 tériophage, tels que T2, etc... et on a obtenu des résultats semblables. Un autre essai a été réalisé avec l'immunoglobuline G de lapin (RGG). La désactivation du produit conjugué RGG-phage au moyen d'un produit anti-RGG a été inhibée au moyen du RGG. Une quantité de 40 0,2 ml de RGG (1 ng/ml) a été mélangée avec 0,2 ml de sérum dilué 70 01597 io 2028475 anti-RGG (2 ng d'anticorps/ml) et laissée pendant 3 heures à 37°C. Le produit conjugué RGG-phage (0,2 ml contenant 500 PFU) a été ajou té et le mélange a été maintenu 20 heures de plus à 37°C. Parallèlement, on a réalisé un essai dans lequel un tampon seul a été ajou 5 té au lieu d'une solution de RGG. Le phage modifié a été désactivé jusqu'à 70 % en l'absence de RGG, tandis que seulement 40 % des phages étaient désactivés en présence de cette concentration de RGG. Des concentrations supérieures de RGG dans le mélange réactionnel inhibaient la désactivation du produit conjugué RGG-phage jusqu'à 10 des valeurs supérieures. L'inhibition totale a été atteinte avec 30 nanogrammes de RGG par ml. Il est clair que la description n'est donnée qu'à titre d'illustration et que l'on peut avoir recours, sans s'écarter de la présente invention, à diverses modifications de la nature des pha-15 ges, de l'agent de liaison et de la nature des protéines (ce terme comprenant les anti-protéines liées). Comme cela sera évident aux personnes expérimentées dans la technique, ces préparations et ces tests peuvent être étendus pour détecter et déterminer des protéines telles que des hormones protéiniques, des toxines, des enzy-20 mes, etc. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de 1'art. 70 01597 ii 2028475 REVENDICATIONS 1 - Produit conjugué bactériophage-protéine, caractérisé en ce que la protéine est liée chimiquement au bactériophage. 2 - Produit conjugué baetériophage-protéine, caractérisé 5 en ce que la protéine est liée par covalence au bactériophage par l'intermédiaire d'une molécule bifonctionnelle intermédiaire. 3 - Produit conjugué baetériophage-protéine selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les molécules de protéine sont liées au bactériophage par l'intermédiaire de 2,4-diisocyanate 10 de tolylène, de bis-diazobenzidine ou de glutaraldéhyde. 4 - Produit conjugué baetériophage-protéine selon 1'une des revendications 1 à J>, caractérisé en ce que le bactériophage est T4 ou T2. 5 - Produit conjugué baetériophage-protéine selon l'une des 15 revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine est l'immu- noglobuline, la ribonucléase pancréatique de bovins, l'albumine de sérum de bovins, l'albumine de sérum de lapins, le lysozyme, l'insuline, n'importe lequel des anticorps antiprotéines correspondants, une hormone protéinique, une toxine ou tin enzyme. 20 6 - Procédé de préparation de produits conjugués baetério phage-protéine, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir le bactériophage avec la protéine désirée en présence d'une quantité prédéterminée d'une molécule bifonctionnelle. 7 - Procédé de détection et de détermination quantitative 25 de protéine, caractérisé en ce qu'il consiste à lier par covalence des molécules de protéine aux particules de phage (le terme protéine comprenant également des anticorps antiprotéines) et à déterminer la désactivation du produit conjugué de phage au moyen de la protéine-antigène correspondante ou, dans le cas du produit conju-30 gué phage-antigène, au moyen de la protéine, 8 - Procédé de détection et de détermination quantitative de protéine, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer l'inhibition de la désactivation des produits conjugués baetériophage-protéine au moyen d'un antigène antiprotéine, par suite de l'addi- 35 tion de quantités prédéterminées de la protéine.