Brevet FR2028016A1 — publié le 19701002

Les mélanges de phosphatides qui sont des sous-produits de la production des huiles végétales, et qui sont appelés généralement lécithines végétales ou phosphatides végétaux, comprennent environ 65 $ d'un mélange, insoluble dans l'acétone de phosphatides, 5 de sucres et de glycolipides, et environ 35 $ de substances\ solu— bles dans l'acétone, principalement de l'huile neutre, des acides gras libres et des constituants non saponifiables. Par exemple, ils peuvent être isolés des huiles extraites par un solvant, après élimination du solvant, par hydratation avec de l'eau à 95 - 100°C, 10 par exemple par injection de vapeur humide. Les boues gonflées ainsi obtenues sont débarrassées de la majeure partie de l'huile par centrifugation et sont soumises à une évaporation sous vide. Les lécithines végétales ainsi obtenues sont utilisées comme émulsionnants dans les émulsions eau-dans-huile, comme la margarine, 15 de même que dans les émulsions huile-dans-eau, comme les mayonnaises et les huiles comestibles (pour salades). Leur pouvoir émul-sionnant n'est pas très grand parce que les radicaux phosphatides qu'elles contiennent en quantités environ égales, à savoir sous forme de lécithines à base de choline, de céphalines et de phospha-20 tides d'inositol, ont un effet mutuel antagoniste. On a cependant déjà essayé d'améliorer le pouvoir émulsion-nant des phosphatides végétaux en traitant des émulsions aqueuses de phosphatides végétaux contenant de l'huile au moyen de lipase, à des températures de 50 à 80°C pendant plusieurs heures (brevet 25 danois N° 101.649). Sous l'action de la lipase ,, qui est un enzyme décomposant les graisses, le triglycéride s'hydrolyse en mono- et/ou diglycé-rides avec dégagement d'acides gras libres. Dans ce brevet danois, une amélioration du pouvoir émulsionnant des produits ainsi trai-30 tés est revendiquée, mais ces produits présentent l'inconvénient que leur saveur est moins agréable que celle des phosphatides végétaux normaux non traités, peut-être à cause de la formation précitée des acides gras libres et/ou d'autres sous-produits. D'autre part, la littérature indique que l'extrait de pan-35 créas et la licithinase A (appelée parfois aussi phospholipase A) qui existe dans l'extrait de pancréas ou pancréatine en même temps que d'autres enzymes, et qui peut être préparée par inactivation thermique de ces autres enzymes, par exemple par chauffage d'une suspension aqueuse de pancréatine à 80 - 90°C pendant 30 minutes, 40 puis par extraction du résidu insoluble dans l'eau au moyen 70 00786 2 2028016 d'alcool à 45°C pendant 4 heures, déterminent la conversion de la lécithine en lysolécithine (voir H. Wittcoff, "The Phosphatides", 1951, pages 99 à 108). On a découvert à présent qu'il est possible de préparer des 5 émulsionnants d'application universelle convenant pour les émulsions huile-dans-eau aussi bien que pour les émulsions eau-dans-huile et ayant une saveur totalement neutre et une couleur claire, en hydrolysant partiellement des phosphatides végétaux ou leurs mélanges, y compris les phosphatides bruts, au moyen de préparations 10 enzymatiques techniques d'origine animale ou végétale, qui contiennent de la lipase de même que de la phospholipase A, à des températures de 30 à 70°G et de préférence de 40 à 50°C, jusqu'à une teneur en lysophosphatides d'au moins 2 fo et de moins de 15 f>t mais de préférence de 4 à 12 /s du poids de l'ensemble des phosphatides, 15 puis en traitant le produit avec des solvants organiques, ou des mélanges de tels solvants de manière qu'il se forme, au cours du traitement au moins deux phases, l'une de ces phases contenant le mélange de lysophosphatides et de phosphatides purifiés et activés et au moins l'une des autres phases contenant la majeure partie 20 des impuretés, après quoi on débarrasse la phase contenant les phosphatides et lysophosphatides des résidus de solvants, par exemple par évaporation sous vide, si nécessaire après addition d'huile raffinée ou d'autres excipients. Gomme matière de départ pour le procédé selon la présente 25 invention, on peut prendre les phosphatides végétaux bruts qui sont les sous-produits de l'isolement des huiles végétales, par exemple les phosphatides de soya, d'arachide, de tournesol et de colza. On peut donc utiliser comme matière première, par exemple, les boues d^hosphatides qui peuvent être obtenues dans la produc-30 tion des huiles végétales par extraction par des solvants, par boues qu'on peut récuper dans les huiles débarrassées des solvants par un traitement par la vapeur d'eau ou l'eau, à des températures de 95 à 100°C ou bien les phosphatides bruts contenant environ 65 fo en poids d^phosphatides et 35 fo en poids d'huile, qu'on 35 obtient en éliminant la majeure partie de l'huile contenue dans ces phosphatides par centrifugation, suivie d'une évaporation du résidu sous vide. En outre, on peut partir également d'un mélange de phosphatides bruts qui a été débarrassé de l'huile au préalable au moyen 40 de solvants gras, comme l'acétone, mais une telle élimination préa 70 00786 3 2028016 lable de l'huile du mélange des phosphatides bruts n'est, pas essentielle. . Gomme matière de départ, on peut également utiliser, conformément à l'invention des fractions de phosphatides obtenues par 5 fractionnement à l'aide d'un solvant ou par d'autres procédés, à partir du mélange des phosjihatides bruts, par exemple les fractions solubles dans l'alcool et les fractions insolubles dans l'alcool de phosphatides bruts, et spécialement les fractions solubles dans l'alcool présentant un rapport pondéral phosphatidylcholine (léci-10 thine) : phosphatidyléthanolamine (céphaline) d'au moins 4 : 1. Le procédé de l'invention est applicable aussi à des phosphatides végétaux ayant déjà subi un traitement par tin acide comme décrit dans le brevet français N° 1.488,086. 15 Suivant l'invention, l'hydrolyse partielle des phosphatides est exécutée au moyen de préparations enzymatiques contenant simultanément de la lipase et de la phospholipase A. Il convient d'envisager à cette fin les préparations enzymatiques convenables de qualité technique d'origine végétale ou animale, et en particulier 20 les extraits techniques dgfcancréas, connus aussi sous le nom de pancréatine. Avantageusement, ce dernier produit est pris à raison de 0,05 à 0,2 fo et de préférence de 0,05 à 0,1 fo, du poids des phosphatides. L'hydrolyse partielle est exécutée en présence d'au moins 25 25 fo et de préférence d'au moins 50 fo d'eau sur la base du poids des produits à hydrolyser, à une température de 30 à 70°C et de préférence de 40 à 50°C. L'hydrolyse à la température précitée est d'autant plus poussée, que la quantité de préparation enzymatique, rapportée à la 30 quantité des phosphatides à hydrolyser, est importante. Un apport de quantités plus importantes de préparation enzymatique permet aussi d'abréger le temps de réaction pour un degré d'hydrolyse déterminé. Le temps de réaction peut être de 3 à 60 heures. L'hydrolyse est exécutée avantageusement jusqu'à formation 35 de 5 à 20 fo en poids d'acides gras libres. Sur la base d'un indice d'acide initial d'environ 20, l'accroissement de l'indice d'acide au cours du traitement enzymatique peut être d'environ 50 à 300-fo. - Les hydrolysats obtenus ainsi sont purifiés suivant 1'inven-40 tion par un traitement ultérieur avec des solvants organiques, qui 70 00786 peuvent contenir de l'eau si nécessaire, et ils sont traités, avec des solvants organiques, ou leurs mélanges, de manière telle qu'on obtienne au moins deux phases, dont l'une contient le mélange de phosphatides et de lysophosphatides purifiés et activés et dont une 5 autre au moins contient la majeure partie des impuretés. Ce fractionnement des hydrolysats par les solvants peut s'exécuter de différentes manières. Dans la plupart de ces procédés, il est avantageux que l'eau résultant de l'hydrolyse ne soit pas séparée, ce qui économise une opération supplémentaire. La possibilité d'exécu-10 ter le raffinage par 'les solvants en présence d'aussi grandes quantités d'eau offre l'avantage supplémentaire^'on sépare ainsi en même temps les substances amères contenues dans pratiquement tous les mélanges de phosphatides. En outre, on sépare également avec l'eau une fraction importante des sucres contenus dans le mélange 15 brut, ce qui empêche la foi-mation de substances à saveur amère par réaction des sucres aldéhydiques sur les radicaux amino des cépha— lines. Diverses techniques permettent dçfcurifier les phosphatides végétaux partiellement hydrolysés, par fractionnement au moyen de 20 solvants. Dans un premier procédé, l'hydrolysat obtenu comme décrit ci-dessus est dissous dans un solvant organique dans lequel l'hydrolysat total (à l'exception de l'eau éventuellement encore présente) est soluble, après quoi les phosphatides et les lysophosphatides. 25 sont précipités daûs cette solution par addition d'un second solvant organique, éventuellement mélangé à de l'eau, dans lequel les phosphatides et les lysophosphatides.ne sont pas solubles. Suivant la nature du système de solvants il se forme deux ou trois couches. Des solvants appropriés pour former la. solution de l'hydro-30 lysat sont, de manière générale, des hydrocarbures aliphatiques, cycloaliphatiques ou aromatiques ayant 5 à 7 atomes de carbone, comme le pentane, l'hexane, l'heptane, le cyclohexane, le méthyl-cyclohexane et le benzène, de même que des hydrocarbures chlorés ayant 1 ou 2 atomes de carbone, comme le dichlorométhane,.le di-35 cliloroéthane, le trichloroéthylène et le tétrachlorure de carbone. Normalement,- on prend environ 0,5 à 1,5 litre de.ces solvants par kg d'hydrolysat, sur une base anhydre. Une première classe de solvants convenant pour la. précipitation du mélange de phosphatides et de lysophosphatides.dans la 40 solution de l'hydrolysat comprend les cétones à bad poids.malécu- 2028016 70 00786 5 2028016 laire et en particulier l'acétone, et les esters inférieurs des acides gras inférieur lesquels esters comptent au total 2 à 4 atomes de carbone, comme par exemple le formiate de méthyle, le formiate d'éthyle, l'acétate de méthyle et l'acétate d'éthyle. Les 5 solvants de ce dernier groupe peuvent comprendre jusqu'à 20 fo en volume d'eau, laquelle peut aussi provenir de l'hydrolysat. Au cours de ce traitement par les solvants, on obtient deux phases liquides, dont l'une contient l'huile, les acides gras et les impuretés restantes et dont l'autre contient les phosphatides et les lysophos-10 phatides. Après séparation des deux phases, on peut débarrasser le mélange des phosphatides et des lysophosphatides du solvant, par exemple par évaporation sous vide. Une seconde classe de solvants convenant pour la précipitation du mélange des phosphatides et des lysophosphatides dans la solution 15 de l'hydrolysat comprend l'acétone et les alcools de bas poids moléculaire comptant 1 à 3 atomes de carbone, en mélange avec de l'eau dans un rapport de 0,5 à 1,5 partie d'eau par partie d'acétone ou d'alcool inférieur, en volume. Lorsqu'on utilise ces systèmes de solvants, on obtient trois couches liquides dont l'une contient 20 l'huile et les acides gras, la seconde contient les substances amères et les sucres et la troisième contient essentiellement les phosphatides et les lysophosphatides, de même que du solvant. Après séparation.des couches, on débarrasse le mélange des phosphatides et des lysophosphatides du solvant, par exemple par évaporation 25 sous vide. Dans un second procédé de purification de l'hydrolysat, on soumet ce dernier à une extraction par un solvant choisi parmi l'acétone et les alcools inférieurs ayant 1 à 3 atomes de carbone, en mélange avec de l'eau dans un rapport en volume de 0,5 à 1,5 partie 30 et de préférence d'environ 1 partie d'eau pour 1 partie d'acétone ou d'alcool inférieur, respectivement. En général, on utilise environ 1 à 10 parties et de préférence environ 3 à 6 parties en volume de solvant contenant de l'eau pour 1 partie en volume d'hy-drolysat, sur une base anhydre. Dans ces cas, normalement, le mé-35 lange des phosphatides partiellement hydrolysés est tout d'abord intimement agité avec un peu d'acétone ou d'alcool, puis l'acétone contenant de l'eau ou l'alcool contenant de l'eau est ajouté jusqu'à formation de trois couches, dont la couche supérieure est formée par de l'huile neutre de couleur foncée et des acides gras, la 40 couche intermédiaire consiste en une solution des substances amères 70 00786 6 2028016 et des sucres dans un solvant aqueux et la couche inférieure comprend essentiellement des phosphatides et des lysophosphatides ainsi que du solvant. Une centrifugation est le plus souvent nécessaire pour la séparation des trois couches. Le mélange de phospha-5 tides et de lysophosphatides résultant est débarrassé du solvant d'une manière classique, par exemple par évaporation sous vide. Lorsque l'hydrolysat contient déjà suffisamment d'eau, l'acétone et les alcools peuvent être ajoutés à l'état exempt d'eau. Dans un troisième procédé de purification, étroitement appa-10 renté au second procédé décrit ci-dessus, l'hydrolysat est extrait par de l'acétone contenant un peu moins d'eau, à savoir environ 5 à 30 fo en volume. Dans ce cas, on obtient deux couches, dont la couche inférieure contient essentiellement les phosphatides et lysophosphatides et dont l'autre contient essentiellement l'huile 15 et les acides gras. Enfin, dans un quatrième procédé, on peut purifier efficacement l'hydrolysat, par extraction de ce dernier au moyen d'un hydrocarbure chloré ayant 1 ou 2 atomes de carbone, comme le chlorure de méthylène, le dichloroéthane, le trichloroéthylène ou le tétra-20 chlorure de carbone, en présence d'un égal volume d'eau, laquelle peut également provenir de l'hydrolysat, l'opération étant de préférence suivie d'une séparation des couches par centrifugation. Dans ce cas, le mélange de phosphatides et del lysophosphatides purifiés se retrouve dans la couche supérieure. 25 Lorsque la phase purifiée contenant les phosphatides et les lysophosphatides a été séparée, elle est débarrassée du solvant résiduel, par exemple par évaporation sous vide. Du fait que l'hydrolysat des phosphatides purifiés, tout comme les phosphatides purs, est susceptible d'une dégradation rapide 30 sous l'effet de l'oxydation par l'air, on y ajoute de préférence d'une manière appropriée quelconque, avant 1'évaporation finale, des excipients comme des huiles neutres, des monoglycérides et des diglycérides, dt^lycérol, du sorbitol, du 1,3-propanediol et du lactate d'éthyle. 35 Les produits obtenus finalement par le procédé sont des émul- sionnants d'application universelle qui donnent des résultats également bons dans la préparation d'aliments, comme la margarine, les mayonnaises et les huiles de table, des aliments pour'bétail, comme le lait synthétique pour les veaux, les compositions cosmétiques, 40 comme les lotions et pommades et les compositions pharmaceutiques. 70 00786 7 2028016 L'invention est illustrée par les exemples suivants, dans lesquels les pourcentages s'entendent en poids, sauf indication contraire, et les données analytiques sont obtenues par des procédés classiques. 5 EXEMPLE 1 On agite 1000 g de lécithine de soya brute avec 1000 g d'eau pour former une émulsion. Après l'addition de 1 g de pancréatine de qualité technique, on chauffe l1émulsion pendant 16 heures à 50°C. Après évaporation sous vide, on obtient environ 1000 g d'une 10 lécithine partiellement hydrolysée ayant un indice d'acide de 33, un indice de coloration par l'iode de 40 et une teneur de 64 fo en constituants insolubles dans l'acétone, de 15,6 fo en lécithine de choline, de 8,5 f> en céphaline et de 3 fo en lysolécithine (ce qui correspond à 4,7 fo du poids de la totalité des phosphatides). On 15 dissout 500 g de ce produit dans 500 ml d'hexane en vue de la purification et on extrait cette solution avec 1100 mi d'acétone contenant 2,5 fo en volume d'eau. Après décantation des couches, on sépare la couche supérieure et on extrait la couche inférieure deux fois encore avec 550 ml d'hexane et 1100 ml d'acétone aqueuse. 20 Après séparation finale de la couche supérieure, on évapore le résidu contenant les phosphatides, après y avoir ajouté une huile de soya ra,ffinée prise en tin poids égal à celui de l'huile extraite. Le produit a alors la même teneur en phosphatide, un indice d'acide de 19,7 et une coloration par l'iode de 25. Pour déterminer le pou-25 voir émulsionnant, on introduit, dans un verre cylindrique mélangeur de 100 ml, 50 ml d'eau à 50°C et une solution de 1 g du phosphatide à étudier dans 9 g de graisse d'arachide fondant à 32°C, et on forme une émulsion grossière en faisant tourner le cylindre sur 180°, à vingt reprises. On place ensuite le cylindre dans un 30 bain-marie maintenu à 50°C et on détermine le temps en heures -(demi-vie) nécessaire pour la séparation de 25 ml d'eau. Demi-vie en heures à 50°C | Eau distillée :Eau d'une dureté ) :de 13° ) Hydrolysat brut 2,8 ; 3,0 ) Hydrolysat purifié 4,25 ; 4,0 | 70 00786 8 2028016 EXEMPLE 2 On mélange 2000 g de boue de soya, résultant de l'hydratation de l'huile de soya après extraction et contenant 56,6 fo d'extrait sec, avec 500 mg de pancréatine de qualité technique, puis on laisse 5 reposer la mélange pendant 51 heures à 6l°C. L'indice d'acide de l'extrait sec passe de 20 à 38 pendant ce temps. On mélange 400 g de l'hydrolysat résultant, ayant une teneur en eau de 50 fo, avec 1000 ml d'acétone à la température ambiante. Après un long repos, on sépare par transvasement la couche trouble 10 supérieure du sédiment et on soumet celui-ci à nouveau à une extraction par 1000 ml d'acétone. Lors de 1'évaporation des extraits acé-toniques combinés, on obtient 70 g d'une huile foncée riche en acide gras. On dilue alors la fraction de l'hydrolysat qui est insoluble dans l'acétone avec 70 g d'huile de soya raffinée et on 15 évapore le tout sous vide pour obtenir 200 g d'un mélange contenant les phosphatides végétaux purifiés et partiellement hydrolysés. EXEMPLE 3 On agite une nouvelle portion de 400 g de l'hydrolysat aqueux obtenu dans l'exemple 2 avec 200 ml d'alcool isopropylique pendant 20 15 minutes à la température ambiante. On centrifuge le mélange. Par évaporation de la couche supérieure et de la couche moyenne combinées on obtient 44 g d'huile. Par concentration de la phase inférieure, après addition d'une quantité d'huile de soya raffinée égale à la quantité des impuretés extraites (44 g), on obtient 25 201 g d'un mélange de phosphatides purifiés. EXEMPLE 4 On agite vivement 400 g de l'hydrolysat aqueux obtenu dans l'exemple 2 à 20°G pendant 30 minutes avec 1200 ml de 1,2-dichloro-éthane. Après dépôt du mélange pulvérulent des phosphatides, on 30 sépare la couche de dichloroéthane contenant l'huile d'abord par décantation, puis par centrifugation. Par évaporation de l'extrait, on obtient 71 g d'huile. Après addition d'une quantité d'huile de soya raffinée égale à la quantité des impuretés éliminées, on évapore le résidu conte-35 nant les phosphatides. On obtient ainsi 201,0 g du mélange des phosphatides purifiés. On élimine l'eau de 400 g de l'hydrolysat aqueux formé comme dans l'exemple 2, à 70°C, dans un évaporateur rotatif sous vide. On obtient ainsi 201 g d'un mélange des phosphatides. 40 La supériorité de l'hydrolysat purifié suivant les exemples 70 00-786 9 2028016 2 à 4 sur l'hydrolysat non purifié ressort de la comparaison ci-après. Toutes les données sont rapportées au produit final anhydre, Hydrolysat non purifié de l'exemple 2 Hydrolysat purifié des exemples : 2 3 4 Données analytiques Coloration par l'iode 32 18 28 20 1 ï 10 Indice d'acide 38 20 35 26 Lécithine de choline, fo 13,8 13,5 13,7 13,5 Céphaline, fo 8,0 5,0^ 7,8 7,6 7,4 Lysolécithine, fo 4,9 4,8 5,0 Saveur Seuilfo 0,5 1,0 1,0 H ** O Pouvoir antiéclaboussant (3) dans la margarinex , Après addition de 0,25 g/kg de phase grasse 1 1- 1 2 0,4 " " " " I 2 2 4 1,0 " " " " 1 3 5 6 2,0 " " " " 3 5 6 8 4,0 " " " " 5 5 7 8 10 15 20 (. 25 30 (1) valeur correspondant à 7,7 fo du poids de l'ensemble des phosphatides. (2) c'est-à-dire -la concentration en phosphatides dans l'huile d'arachide qui peut encore être décelée par 50 fo des examinateurs. (3) 1 = très mauvais, 10 = excellent. 70 00786 to 2028016 REVENDICATIONS 1- Procédé de préparation de phosphatides végétaux ayant un pouvoir éniulsionnant amélioré, caractérisé par le fait qu'on hydrolyse partiellement des phosphatides végétaux essentiellement non 5 hydrolysés tout d'abord en chauffant une émulsion aqueuse de ces phosphatides en présence d'une préparation enzymatique technique d'origine animale ou végétale contenant de la lipase et de la phospholipase A, à une température de 30 à 70 °C, pour former un hydrolysat ayant une teneur en lysophosphatides de 2 à 15 $ du poids de 10 l'ensemble des phosphatides, après quoi on traite l'hydrolysat au moyen, d'un solvant organique ou d'un mélange de solvants organiques de manière à obtenir au moins deux phases, dont l'une contient le mélange des phosphatides et des lysophosphatides purifiés et activés et dont au moins une autre contient la majeure 15 partie des impuretés, puis on sépare les phases et on débarrasse la phase contenant les phosphatides et lisophosphatides du solvant restant, si nécessaire après addition d'un excipient» 2- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la préparation enzymatique est la pancréatine» 20 3- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on utilise la pancréatine à raison de 0,05 à 0,2 fa du poids des phosphatides. 4- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la matière de départ est la 2^. boue de phosphatides provenant de l'extraction des huiles végétales. 5— Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on dissout l'hydrolysat dans un premier solvant organique dans lequel l'hydrolysat total est soluble, puis on ajoute à la solution un second solvant organique 30 dans lequel les phosphatides et les lisophosphatides sont sensiblement insolubles, si nécessaire en présence d'eau. 6- Procédé suivant la revendication 5» caractérisé par le fait que le premier solvant organique est un solvant choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques, cycloaliphatiques et aromatiques 35 ayant 5 à 7 atomes de carbone et que le second solvant organique est un solvant choisi parmi l'acétone et les esters d'alcools inférieurs et d'acides gras inférieurs comptant au total 2 à k atomes de carbone, ce second solvant organique contenant 0 à 20 fa en poids d'eau. 70 00786 n 2028016 7- Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que le premier solvant organique est un solvant choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques, cycloaliphatiques et aromatiques ayant 5 à 7 atomes de carbone et que le second solvant organique 5 est un solvant choisi parmi l'acétone et les alcools aliphatiques inférieurs ayant 1 à 3 atomes de carbone en mélange avec de l'eau dans un rapport en volume de 0,5 à 1,5 partie d'eau par partie d'acétone ou d'alcool aliphatique inférieur, respectivement. 8- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 10 à 4, caractérisé par le fait que l'hydrolysat est soumis à une extraction par un solvant organique choisi parmi l'acétone et les alcools aliphatiques inférieurs ayant 1 à 3 atomes de carbone en mélange avec de l'eau dans un rapport en volume de 0,5 à 1,5 partie d'eau par partie d'acétone ou d'alcool aliphatique inférieur, res-15 pectivement. 9- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'hydrolysat est soumis à une extraction au moyen d'acétone contenant de l'eau à raison de 3 à 30 $ du volume de l'acétone. 2o 10- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'hydrolysat est soumis à une extraction au moyen d'un solvant choisi parmi les hydrocarbures chlorés ayant 1 ou 2 atomes de carbone en présence d'une quantité d'eau pouvant atteindre le même volumeo 11- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé par le fait que l'eau utilisée provient en tout ou partie de 1*émulsion qui a été soumise à l'action de la préparation enzymatique.