Brevet FR2020160A1 — publié le 19700710

La présente invention concerne de nouveaux polysac-charides actifs contre les tumeurs et leur procédé de préparation. On sait que l'on peut obtenir des substances agissant contre les tumeurs par extraction, à partir de diverses 5 sources naturelles» On peut obtenir par exemple des polysaccharides agissant contre les tumeurs en extrayant le fruit des Bacidio-mycètes, telles que Grifola frondosa, Grifola gigantea ou Fistulina hepatica de, la famille polyporaceae, des feuilles de bambou, des pousses de bambou, des pousses de Graminaceae ou des cellules 10 de levure. Cependant, elles ne sont pas satisfaisantes car elles n'agissent pas que sur les cellules cancéreuses mais causent aussi des dégâts aux tissus normaux. La demanderesse a découvert selon l'invention que les polysaccharides, extraits du fruit de divers champignons 15 comestibles, manifestent une action contre les tumeurs, et consistent en un mélange de glucanes actifs contre les tumeurs, de glucanes inactifs et d'hétéroglycanes inactifs, et que lfon peut isoler facilement les glucannes actifs contre les tumeurs des polysaccharides par dissolution et/ou précipitation fractionnée. 20 Selon l'invention, on produit de nouveaux poly saccharides agissant contre les tumeurs qui sont des glucanes actifs contre les tumeurs, et un procédé de fabrication des polysaccharides agissant contre les tumeurs, caractérisé en ce que l'on extrait le fruit d'un champignon comestible appartenant au 25 sous-ordre des Agarica2es tandis que l'on chauffe et que l'on récupère des extraits le polysaccharide actif contre les tumeurs, Les glucanes actifs contre les tumeurs que l'on obtient selon l'invention sont des composés inconnus et sont différents, du point de vue des effets biologiques et des pro-30 priétés chimiques et physiologiques, de tous les produits connus agissant contre les tumeurs en particulier par leur non-toxicité. Les glucanes selon l'invention sont illustrés par les figures du dessin annexé, dans lesquelles la figure 1 représente un spectre d'absorption infra-rouge du fâ~(1 —>3)glucane de 35 l'invention; et La figure 2 représente un spectre d'absorption infrarouge du p-( 1—>4)(1—>6)glucane de 18invention» 6934404 2 2020160 On peut utiliser comme matières premières selon l'invention des champignons comestibles du sous-ordre des Agaricalef, tels que Lentinus edodes (Berkl Sing, Flâmmulina vèltipes (Curt. ex Fr. ) Sing# , Tricholoma matsutake (Ito et Imai) Sing, 5 Lyophyllum agretatum (Schaff ex Secr.) Kuhner, Pleurotus ostreatus (Jacq ex Fr.) Quel, Pleurotus spodoleupus (Ft<>) Q»pl et Pholiota nameko (T. Ito et Imai). Le fruit du champignon peut être sauvage ou cultivé. En vue d'extraire le polysaccharide actif contre les 10 tumeurs, selon l'invention, on lave à l'eau le fruit d'un champignon comestible et on homogénéise la suspension aqueuse à l'aide d'un mélangeur ou d'un malaxeur Waring. On filtre alors la suspension obtenue ou on la centrifuge pour enlever les substances insolubles. On concentre la couche aqueuse sous pression réduite 15 et on ajoute un ou plusieurs solvants organiques à la solution concentrée pour précipiter les polysaccharides. Selon l'invention, on effectue de préférence, en deux étapes, la précipitation des polysaccharides à partir de la solution extraite : on ajoute un volume égal de solvant organique à la solution concentrée peur 20 précipiter une substance grise, fibreuse, que l'on peut enlever avec une épuisette, et on ajoute ensuite de 2 à 5 fois le même volume de solvant organique pour avoir une précipitation plus poussée et on sépare les précipités par filtration ou'centrifu-gation. Les solvants organiques que l'on peut utiliser selon 25 la présente invention sont des solvants organiques solubles dans l'eau tels que le méthanol, l'éthanol, le propanol ou l'acétone. On dissout les précipités de polysaccharides obtenus en solution aqueuse basique, et on récupère la protéine qui fait partie du précipité, par la méthode de Sevag. On peut ensuite 30 purifier les polysaccharides par des méthodes classiques telles que le relargage, la dialyse, la précipitation ou au moyen de résines échangeuses d'ionso On peut utiliser les polysaccharides actifs contre les tumeurs, obtenus comme ci-dessus, bien qu'ils consistent 35 généralement en un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs. 6934404 3 2020160 Lfinvention a aussi pour objet un procédé pour isoler les glucanes agissant contre les tumeurs, à partir d'un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs, caractérisé en ce que l'on dissout dans l'eau un mélange de 5 polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs, on ajoute un composé fortement basique pour précipiter les sels d'homo-glycane du composé fortement basique, on traite les sels avec des solutions acides de diverses concentrations pour résoudre par chromatographie les homoglycanes en leurs composants, et on 10 récupère les glucanes actifs contre les tumeurs. En vue d'isoler chaque glucane actif contre les tumeurs selon l'invention, on dissout dans une grande quantité d'eau un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs obtenues par extraction à partir de champignons 15 comestibles, et on ajoute une solution aqueuse d'un composé fortement basique pour précipiter les sels de tous les homoglycanes avec le composé basique. On recueille les précipités par filtra-tion ou centrifugation. Parmi les composés fortement basique que l'on peut utiliser selon l'invention, on peut citer les composés 20 dfammonium quaternaire, tels que hydroxyde de cétyltriméthylammo-nium, halogénures de cétyltriméthylammonium, halogénures de cétylpyridinium ou des résines échangeuses d'ions fortement basiques. Seul l'homoglycane réagit avec les composés fortement basiques pour former des précipités; les hétéroglycanes qui ne mani-25 festent aucune activité contre les tumeurs et les autres impuretés restent dans la couche aqueuse. On peut fractionner les précipités isolés en les traitant par des solutions acides de différentes concentrations. Par exemple, on ajoute les précipités à une solution acide 30 faiblement concentrée, on agite le mélange et on isole de la couche aqueuse le glucane soluble dans la solution acide en ajoutant des solvants organiques. On recueille par filtration les glucanes insolubles qui demeurent dans la solution acide, on les ajoute à une solution acide plus concentrée que dans la première.étape et 35 on isole le glucane soluble dans la solution acide en opérant comme précédemment. On effectue des opérations semblables pour les glucanes insolubles dans les solutions acides précédentes tandis que l'on augmente la concentration de l'acide, et on récupère généralement le glucane insoluble dans n'importe quelle 6934404 4 2020160 solution acide au dernier traitement. Les acides utilisés dans l'invention sont des acides organiques de concentration inférieure à 50$, tels que l'acide acétique ou propionique, et des acides minéraux de concentration inférieure à 0,3$. On purifie 5 chaque glucane fractionné par les procédés de l'invention selon la méthode de Sevag et/ou par précipitation, et on détermine leurs activités contre les tumeurs. L'invention vise également Un procédé qui permet d'isoler les glucanes actifs contre les tumeurs à partir d'un 10 mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs caractérisé en ce que l'on dissout dans l'eau un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs, on ajoute un composé fortement basique pour précipiter chromatographi-quement les sels de glucane et du composé basique, on traite 15 chaque fraction des précipités formés par une solution acide pour produire des glucanes et on récupère les glucanes actifs contre les tumeurs. En vue d'isoler chaque glucane actif contre les tumeurs à partir des polysaccharides actifs contre les tumeurs 20 selon l'invention, on dissout dans une grande quantité d'eau un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs que l'on a obtenu par extraction à partir des champignons comestibles; chaque précipité se forme chromatographiquement lorsque l'on ajoute une solution d'un composé fortement basique jusqu'à 25 ce que l'on n'observe plus de précipitation sans élévation brusque de pH, on traite les précipités par les acides et on détermine l'activité de chaque glucane contre les tumeurso EXEMPLE 1 On lave 500 g de fruit frais de Lentinus edodes, 30 . on homogénéise dans 4 ou 5 volumes d'eau avec un mélangeur, et on fait bouillir pendant 16 heures en agitant. On enlève les substances insolubles par centrifugation et on concentre 1 1 de liquide surnageant jusqu'à réduction au tiers de son volume initial sous pression réduite, et on lyophilise la solution ^ concentrée. On détermine comme suit l'activité de la poudre obtenue contre les tumeurs. 6934404 5 2020160 On utilise pour ces essais des souris albinos suisses pesant environ 20 g„ On injecte par voie sous-cutanée, dans l'aine droite des souris des ascites de Sarcome 1ÔO vieux de 7 jours à des doses de 0,05 ml. On injecte chaque fraction de 5 200 mg/kg de poudre en suspension dans de l'eau distillée par voie intrapéritonéale chaque jour pendant 10 jours en commençant 24 heures après 1*implantation de la tumeur. On suit graphiquement la croissance de la tumeur chaque semaine pendant 5 semaines, par comparaison avec celle des souris de référence. A la fin de la 10 5ème semaine, on tue les souris, on dissèque les tumeurs et on détermine les taux d'inhibition à partir du poids des tumeurs. -Le taux d'inhibition de croissance est calculé par la formule suivante : Taux d'inhibition ($) = ^ J - x 100 15 dans laquelle A est le poids moyen de la tumeur de référence et B celui du groupe traité. On détermine la régression complète (nombre de souris complètement guéries sur 10 souris traitées). Les résultats obtenus sont les suivants : 20 25 30 Dose Taux d'inhibition Régression complète (mg/kg/jour) {%) 6/10 200 00,7 EXEMPLE 2 On homogénéise des fractions de 50 kg chacune de fruits de Pleurotus ostreatus, Flammulina veltipes, Pleurôtus' spodoleucus,, Tricholoma matsutake et Pholiota. nameko respectivement dans 240 1 d'eau au moyen d'un mélangeur, on les fait bouillir 20 heures jusqu'à ce qu'il reste 120 1 de liquide et on filtre sous pression en chauffant» On filtre 80 1 de la solution extraite en présence de célite, on lyophilise le filtrat. Les résultats des tests d'activité contre les tumeurs sont les suivants ï 6934404 6 2020160 Echantillonsextraits Dose Taux d'inhi- Régression de : (mg/kg/jour) bition ($) complète Pleurotus ostreatus 200 75,3 5/10 Flammulina veltipes 200 81,1 3/10 5 Pleurotus spodoleucus 200 72,3 0/10 Tricholoma matsutake 200 91,8 5/9 Pholiota. nameko 200 86,5 0/10 EXEMPLE 3 .jq On verse dans 1,2 fois son volume d'éthanol l'extrait concentré obtenu comme dans l'exemple 1 ; on enlève avec une épuisette les précipités fibreux et gris (A) obtenus et on les lave à l'éthanol. On homogénéise-50 g de précipité dans 2 1„ d'eau avec un agitateur pendant 5 mn. On ajoute 201&*6au A. laoàoMtian ^ homogénéisée et on agite la solution jusqu'à ce qu'elle soit claire On ajoute goutte à goutte une solution aqueuse d'hydroxyde de cétyltriméthylammonium 0,2 M et on obtient un précipité incolore,. On s'arrête quand il ne se forme plus de précipité.. On recueille le précipité par centrifugation, on le lave à l'éthanol et on 2Q l'ajoute à 1,2 1 d'acide acétique à 20$. On agite à la température ambiante le mélange pendant 5 mn, on le centrifuge et on le fractionne en précipité (fraction I ) et liquide surnageant ( fraction II). On ajoute le liquide surnageant à 4 fois,son volume d'éthanol, on recueille les précipités formés par centrifugation, 25 on les lave deux fois à l'éthanol et ensuite à l'éther. On sèche les précipités sous vide, on les traite 5 fois par la méthode de Sevag pour enlever la protéine, et on les dissout dans 600 ml d'eau. On ajoute goutte à goutte 75 ml de solution d'hydroxyde de cétyltriméthylammonium 0,2 M à la solution aqueuse (pH 11,0) et on récupère par centrifugation les précipités incolores formés» On agite les précipités dans 300 ml d'acide acétique à 10$, on ajoute 600 ml d'éthanol à la solution et on recueille par centrifugation les précipités formés. On lave les précipités dans 100 ml d'éthanol, puis ■jjj 2 fois à l'éther; on obtient 2,2 g de p>-( 1 —> 4) ( 1—=>■ 6)glucane pur, actif contre les tumeurs (fraction ÏC-a). Après avoir séparé par centrifugation les précipités incolores, on ajoute au liquide surnageant 25 ml de solution 6934404 7 2020160 d'hydroxyde de c étyltriméthylammonium 0,2 M (pH 12,5) puis une petite quantité de chlorure de sodium et on traite les précipités formés (fraction H-b) de la même manière que dans le cas de la fraction Il-a et on obtient 4,5 g de (3-( 1 —> 6 )glucane pur inactif 5 contre les tumeurs ( fraction Il-b). Au liquide surnageant duquel on a séparé les précipités de la fraction H-b, on ajoute jusqu'à pH 12,Ô de l'hydroxyde de cétyltriméthylammonium, et ensuite 5 fois le volume d'éthanol; on recueille les précipités obtenus et on les traite comme ci-10 dessus. On obtient 2,0 g de (3-(1—6)glucane pur inactif contre les tumeurs (fraction IX-c). On ajoute à 1 1 d'acide acétique à 50% le précipité de la fraction I. On agite pendant 10 mn dans un bain glacé et on élimine le corps solide par centrifugation. Le liquide surna- • 15 géant ne contient plus de glucanes. On lave le solide avec 500 ml d'éthânol, on le dissout dans 2 1 de solution de ïïaOH à 6% et on enlève les impuretés par centrifugation. On ajoute 4 1 d'éthanol à la solution, on recueille les précipités formés, on les lave à lféthanol et à l'éther. On recueille la protéine incluse dans 20 les précipités par la méthode de Sevag, et on obtient 12,3 g de p-(1—> 3)glucane pur actif contre les tumeurs. Les propriétés des glucanes actifs contre ies tumeurs sont les suivantes : Fraction I ( (3- ( 1 —s* 3 ) glucane ) 25 (1) Z~a_7 1d = +19,5 - 21,5° (C=1, NaOH N) (2) On chauffe la fraction I dans une solution d'un mélange d'acide acétique, d'anhydride acétique et d'acide sulfurique et on détecte par chromatographie sur papier, chromatographie en couche mince 2o et chromatographie en phase vapeur les p-(1—> 3 )oligosaccharides consistant en laminaribiose, laminaritriose et laminaritétrose. (3) On obtient le f3-(1 —>3 )oligosaccharide consistant en laminaribiose, par hydrolyse partielle à l'acide sulfurique dilué et le glucose par hydrolyse complète. 35 (4) On obtient quantitativement le glucose par hydrolyse de l'exo-1,3-p-glucanase du Screlotium. (5) On ne peut pas déceler de mobilité par une électrophorèse avec une solution de borate de sodium tamponnée à pH 9,3, et on ne détecte qu'une tache avec les solutions alcalines. 6934404 8 2020160 (6) La fraction I est légèrement soluble dans l'eau, soluble dans les solutions alcalines, dans les solutions chaudes d'acide formique, dans l'eau et pratiquement insoluble dans les solvants organiques tels que l'éthanol, l'acétone et le chloroforme. 5 (7) La fraction est facilement décomposée à 70°G dans une solution de NaOH à 10$ et est relativement stable en milieu acide. (8) La proportion d'eau déterminée par analyse thermique différentielle est de 15 $• (9) .La fraction gonfle en un gel lorsque l'on la plonge dans 10 l'eau. (10) Analyse élémentaire i C ($) 40,54 H {%) 7,02 Cendres 0$ on ne décèle aucun autre élément. (11 ) Poids moléculaire de 950.000 à 1J350.000, déterminé par diffu- 15 sion de la lumière. i Fraction II-a (f3-(l-^* 4) (1—^6)glucane) (1) -16,3° (C = 1, H20) (2) Le glucose est le seul produit d'hydrolyse complète par un ^ acide dilué. (3) On ne décèle qu'une tache en électrophorèse avec une solution de borate de sodium de pH 9,3 et avec une solution de NaOH 1 N. (4) I# fraction est soluble dans l'eau, les bases et les solutions d*acid4 formique. 25 (5) Par acétolyse partielle, oh obtient de la cellobiose et de la gentiobiose. (6) Par la dégradation de Smith, on obtient de l'érythritol, du glycérol et du glycéraldéhyde. (7) Analyse élémentaire : 30 C ($) 40,49 H ($) 6,72 On lie détecte aucun autre élément. Il résulte des résultats précédents que la fraction II-b est le (3-(1-^4)(1-^6)glucane. 35 Le tableau I groupe les résultats des tests d'activité contre les tumeurs en ce qui concerne les exemples et le produit de départ. 6934404 9 2020160 TABLEAU I Echantillon Dose Taux d'inhibition Régression complète (mg/kg x {%) nombre de "jours 5 Produit initial 20 5 X X 10 10 69,5 78,1 2/10 5/9 Fraction I 5 1 0,5 X X X 10 10 10 97,6 100 100 7/10 10/10 8/.10 10 Fraction Il-a 25 5 1 X X X 10 10 10 91,0 94,0 55,0 7/1° 6/10 1/9 Fraction Il-b 25 5 1 X X X 10 10 10 -37 -18 0 0/1.0 0/10 0/10 15 Fraction II-c 25 5 X X 10 10 6,4 -19,1 0/10 0/10 6934404 10 2020160 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de polysaccharides actifs contre les tumeurs caractérisé en ce que l'on extrait le fruit d'un champignon comestible, et que l'on récupère les polysaccharides actifs 5 contre les tumeurs à partir des extraits. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le champignon comestible appartient au sous-groupe des Agaricales® 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5* caractérisé en ce que le champignon est Lentimus edodes. 10 4. Procédé pour isoler le glucane actif contre les tumeurs à partir d'un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs caractérisé en ce que l'on dissout dans l'eau un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs, on ajoute une solution aqueuse d'un composé fortement basique pour 15 préciter les sels de tous les homoglycanes avec le composé fortement basique, en ce que l'on traite les sels avec des concentrations variables d'acide pour résoudre chromatographiquement les homoglycanes, on isole un homoglycane de la solution acide en ajoutant un solvant organique si nécessaire, et on détermine l'activité contre 20 les tumeurs. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le composé fortement basique est un composé d'ammonium quaternaire. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce 25 que ledit composé fortement basique est l'hydroxyde de cétyltriméthylammonium. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on agite ledit sel dans une solution d'a'cide acétique à 20$, ai ce q-ue ibn agi-te : ensuite le constituant isoluble dans une solution d'a-30 cide acétique à 50$ et en ce que l'on récupère le 0-(1 3)glucane insoluble. 8. Procédé pour isoler le glucane actif contre les tumeurs d'un mélange de polysaccharides actifs et inactifs contre les tumeurs caractérisé en ce que l'on dissout dans l'eau un mélange de polysaccha- 35 rides actifs et inactifs contre les tumeurs, en ce que l'on isole chaque précipité formé par addition d'une solution aqueuse d'un composé fortement basique, addition poursuivie jusqu'à ce qu'iltfyaifc plus de précipitation sans élévation de pH, on traite le précipité par l'acide, et on détermine L'activité contre les tumeurs ;de glucane pur ainsi isolé. 6934404 n 2020160 9. Nouveau polysaccharide utile notamment comme médicament actif contre les tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste en glucane isolé d'extraits de champignons comestibles par le procédé selon l'une qiéLconque des revendications1 à 8. 5 10. Composé selon la revendication 9, qui est le 0-(13) glucane. 11. Composé selon la revendication 9» Qui est le P-(B (1-* 6) glucane. 12. Compositions thérapeutiques contenant comme ingré-10 dient actif l'un au moins des composés selon les revendications 9, 10 et 11, associé à un support pharmaceutique. 13. Formes d'administration des compositions selon la revendication 12.