Brevet FR2052945A1 — publié le 19710416

i 2052945 La présente invention est relative à la préparation de nouveaux peptides à effet ACTH. Il est connu que différents amino-acides des séquences naturelles de l'ACTH, en particulier ceux des positions 1 à 5» 5 17» 18, 19 et 25, peuvent être échangés contre différents autres a-amino-acides sans que 11 activité ACTH du peptide soit notablement influencée. C'est ainsi, par exemple, que le premier amino-acide de l'extrémité azotée peut être remplacé par de la glycine ou par un acide aminé présentant la configuration D, 10 comme la D-thréonine, la D-alanine, la D-proline ou surtout la D-sérine, que le second amino-acide peut être remplacé par de la phénylalanine, que le troisième peut être remplacé par de la glycine ou de l'alanine, que le quatrième peut être remplacé par un reste a-alcoyl(inférieur)-a-amino-acétyle comme la nor-15 valine, la nor-leucine, la leucine, la valine, l'isoleucine ou l'acide a-aminobutyrique, que le cinquième peut être remplacé par de la glutamine, que le dix-septième et le dix-huitième peuvent être remplacés par de 1'ornithine ou de la lysine et que les dix-neuvième et vingt-cinquième peuvent être remplacés 20 par de la valine. Il peut y avoir dans le peptide Tin ou plusieurs des amino-acides "échangés". D'une façon surprenante, on a maintenant trouvé qu'on obtient des peptides avec un effet fortement accru et/ou prolongé, en comparaison de la corticotropine naturelle, lorsqu'on 25 remplace le premier amino-acide (de l'extrémité azotée) par de la D-sérine et qu'on remplace l'acide aminé en position 11 et/ou, si on le désire, en outre les acides aminés en position 15 et 16 ou en position 15 à 18, par de la L-ornithine. La présente invention a en conséquence pour objet des 30 peptides se différenciant des peptides à effet ACTH (tout lévo-gyre) comportant de 18 à 39 acides aminés, par le fait qu'ils présentent, comme premier acide aminé, de la D-sérine et qu'ils présentent dans les positions 11 ou 11 et 15 à 16 ou 11 et 15 à 187 de l'ornithine, et dans lesquels le cas échéant d'autres 35 acides aminés échangés sont présents dans les positions 2 à 5» 17, 18, 19 et/ou 25. De préférence, les nouveaux peptides et amides pepti-diques comportent de 18 à 25 acides aminés. Il y a lieu de faire ressortir, en particulier, les amides D-sér^-octadéca- 21115 2 205*2945 peptidiques avec de la L-ornithine dans les positions mentionnées. Les nouveaux peptides comportant de la L-ornithine en position 11 ou 11 et 15 à 16 peuvent aussi présenter de la L-lysine en position 17 .et 18 ; "il y a lieu de faire ressortir 5 l'amide de la D-Sér"''-Orn^^-Lys''"'':',^®-P"''~"'"®-corticotropine-Lys^®. Comme sels d'addition avec des acides, il y a lieu d'indiquer, en particulier, des sels d'acides thérapeutiquement utilisables comme l'acide, chlorhydrique, l'acide acétique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, des acides gras à 10 longue chaîne. Par complexes, il y a lieu d'entendre des composés du genre des complexes dont la structure n'est pas encore éclaircie et qui prennent naissance lorsqu'on ajoute certaines substances minérales ou organiques à des peptides à effet adréno-15 corticotrope et surtout ceux qui leurs confèrent un effet prolongé. De telles substances minérales sont des composés dérivant de métaux comme le calcium, le magnésium, l'aluminium, le cobalt et, en particulier, le zinc, mais surtout des sels de métaux lourds tels que des phosphates, des pyrophosphates 20 et des polyphosphates, ainsi que des hydroxydes de ces métaux, de même que des polyphosphates de métaux alcalins. Les substances organiques qui provoquent la prolongation de l'effet sont, par exemple, des gélatines non antigènes, par exemple des hydroxy-polygélatines, la polyvinyl-pyrrolidone et la carboxyméthyl-25 cellulose, ainsi que des esters sulfoniques ou phosphoriques de l'acide alginique_, du dextrane, des polyphénols et des poly-alcools, surtout le phosphate de "polyphlorétine et l'acide phytique, ainsi que des produits de polymérisation et de copo-lymérisation d'amino-acides, par exemple la protamine et, en 30 particuliers d'acides aminés présentant une fraction prépondérante d'acides a-aminés acides comme l'acide glutamique ou l'acide aspartique. Le procédé conforme à l'invention pour la préparation des nouveaux peptides, de leurs amides et des sels d'addition 35 avec des acides et des complexes de ces composés est caractérisé par le fait qu'à partir de peptides à effet ACTH présentant line séquence de 18 à 39 amino-acides et de la D-sérine en tant que premier acide aminé et des restes ornithine dans les positions 11 ou 11 et 15 à 16, ou 11 et 15 à 18, peptides dans lesquels 70 21115 5 2052945 au moins le groupe a-aminogène et les groupes aminogènes des chaînes latérales, ainsi que les groupes carboxyle des chaînes latérales et le groupe carboxyle terminal, sont protégés, ou de leurs amides C-terminaux, on élimine les groupes de protection 5 et, si on le désire, qu'on transforme les composés obtenus en leurs sels d'addition avec des acides ou en des complexes. Les substances de départ sont préparées suivant les méthodes décrites pour la préparation des peptides à longue chaîne, en particulier des peptides à effet ACTH. 10 Comme groupe de protection pour les substances de départ et pour les produits intermédiaires nécessaires lors de la synthèse des substances de départ, on utilise les groupes connus pour la synthèse des peptides, en particulier ceux qui sont connus pour la synthèse de la séquence ACTH, ainsi que le 15 cas échéant, les groupes nouvellement proposés, par exemple les groupes décrits dans le brevet français 1.554-.051. Comme groupes de protection du groupe aminogène, il y a lieu de citer, par exemple, des groupes aralcoyle éventuellement substitués, tels que des groupes diphénylméthyle ou triphénylméthyle, ou 20 des groupes acyle tels que des groupes formyle, trifluoracétyle, phtaloyle, p-toluène-sulfonyle, b.enzyl-suif onyle, benzène-suifé-nyle, o-nitr.ophényl-sulfényle ou surtout des groupes dérivant de 1*acide carbonique ou de l'acide thio-carboniqùe tels que des groupes carbobenzoxy éventuellement substitués dans le reste 25 aromatique par des atomes d'halogène, par des groupes NOg, par des groupes alcoyle ou alcoxy inférieur ou par des groupes carbalcoxy inférieur, par exemple des groupes carbobenzoxy, p-bromo- ou p-chloro-carbobenzoxy, p-nitro-carbobenzoxy, p-méthoxy-carbobenzoxy, des groupes benzyloxy-carbonyle colorés, 30 comme le groupe p-phénylazo-benzyloxycarbonyle et le groupe p-(p'-méthoxy-phénylazo)-benzyloxycarbonyle, tolyloxycarbonyle, 2-phénylisopropyloxy-carbonyle, 2-tolyl-isopropyloxycarbonyle et surtout 2-para-diphényl-isopropyloxycarbonyle (voir le brevet français n° 1 554- 051), ainsi que des groupes hydroxy-35 carbonyle aliphatiques tels que, par exemple, des groupes al1yloxy-carbonyle^ cyclo-pentyloxy-carbonyle, tertio-amyloxy-carbonyle, adamantyloxy-carbonyle et, en premier lieu, tertio-but yl oxy-c arb onyle, de même que, par exemple, des groupes carbamoyle , thiocarbamoyle, N-phénylcarbamoy 1 e et ÎT-phényl-40 thiocarbamoyle. 21115 4 2052945 Les groupes carboxyle sont par exemple protégés par formation d'amide ou d'hydrazide ou par estérification. Conviennent par exemple, pour 1'estérification, des alcanols inférieurs éventuellement substitués comme le méthanol, l'étha-5 nol, l'alcool cyanométhylique ou, en particulier, le tertio-butanol, ainsi que des "aralcanols tels que des aryl-alcanols inférieurs, par exemple des alcools benzyliques éventuellement substités comme l'alcool p-nitrobenzylique ou l'alcool p-méthoxy-benzylique, des phénols et thiophénols comme le para-nitro-10 thiophénol, le 2,4-,5-trichlorophénol, le p-cyano-phénol ou le p-méthane-sulfonyl-phénol, ainsi que par exemple le N-hydroxy-succinimide et le' N-hydroxy-phtalimide. Les groupes hydroxy des châînes latérales, par exemple des restes de la sérine et/ou de la tyrosine, peuvent être 15 protégés, par exemple par éthérification par exemple avec l'alcool benzylique ou, de préférence, avec le tertio-butanol, mais ils n'ont toutefois pas besoin absolument d'être protégés. Pour protéger le groupe aminogène dans le groupe guanidino de 11arginine, on utilise surtout le groupe NOg, le groupe tosyle, 20 bien que le groupe guanidino n'ait pas besoin d'être protégé. De même, le groupe aminogène de l'hystidine n'a pas besoin d'être protégé, mais il peut être avantageux de le protéger, par exemple par xui reste benzyle, trityle, adamantyloxycarbonyle, ou par les groupes 2,2,2-trifluoro-l-tertio-butyloxycarbonylamino-éthyle ou 25 1-benzyloxy-carbonylamino-éthyle. 1/ élimination des groupes de protection a Heu d'une manière connue, par exemple par hydrogé-nolyse ou par hydrolyse, surtout par hydrolyse acide, en un seul stade ou le cas échéant en plusieurs stades. On utilise, de préférence, un peptide de départ dans 30 lequel les groupes aminogènes des chaînes latérales sont protégés par le groupe tertio-butyloxycarbonyle et dans lequel les groupes carboxyle de la chaîne latérale et de l'acide C-terminal, dans la mesure où ils ne sont pas amidifiés, sont protégés par le groupe estertertio-butylique. Ces groupes de protection sont 35 avantageusement scindés à l'aide d'acide trifluoracétique. En vue de préparer les peptides de départ," on lie les amino-acides dans l'ordre désiré, individuellement ou après formation préalable d'unités peptidiques assez petites. La liaison des unités d'acide aminé et/ou de peptide a lieu en faisant agir 70 21115 -5 2052945 lin amino-acide ou un peptide comportant un groupe a-aminogène protégé et un groupe carboxyle terminal activé sur un amino-acide ou sur un. peptide comportant un groupe a-aminogène libre et un groupe carboxyle terminal libre ou protégé, par exemple 5 estérifié ou amidifié, ou en faisant réagir un acide aminé ou un peptide comportant un groupe a-aminogène activé et un groupe carboxyle terminal protégé sur un amino-acide ou sur un peptide comportant un groupe carboxyle^ terminal libre et un groupe a-aminogène protégé. Le groupe carboxyle peut, par exemple,. 10 être activé par transformation en un azothydrure, anhydride, imidazolide, isoxazolide ou en ester activé comme l'ester cyanométhylique, l'ester carboxyméthylique, l'ester p-nitrophénylique, 1'ester 2,4,5-trichlorophénylique, 11 ester pentachlorophénylique, l'ester du IT-hydroxy-succinimide, l'ester du H-hydroxy-phtalimide 15 l'ester de la 8-hydroxy-quinoléine, l'ester de la N-hydroxy-pipéridine ou par réaction à l'aide d'un carbodiimide (le cas échéant avec addition de H-hydroxy-succinimide) ou d'un N,N'-carbonyl-diimidazole, et le groupe aminogène peut être activé, par exemple, par réaction sur un phosphitamide. Comme méthodes 20 les plus usuelles, il y a lieu de citer la méthode au carbodiimide, la méthode à l'azide, la méthode des esters activés et la méthode à l'anhydride, ainsi que la méthode de Merrifield. Les groupes fonctionnels libres ne participant pas à la réaction sont avantageusement protégés, en particulier par 25 hydrolyse ou par réduction de restes facilement éliminables, comme mentionné ci-dessus. Suivant le mode opératoire choisi, on obtient les nouveaux composés sous la forme de bases ou sous la forme de leurs sels. A partir des sels, on peut d'une manière connue en 30 soi obtenir les bases. A partir de ces dernières, on peut à nouveau, par réaction sur des acides convenant à la formation de sels thérapeutiquement utilisables, obtenir des sels tels que, par exemple, ceux avec des acides minéraux comme les hydracides halogénés, par exemple l'acide chlorhydrique ou 35 l'acide bromhydrique, avec les acides perchlorique, nitrique, ou thiocyanique, sulfurique ou phosphorique, ou avec des acides organiques tels que les acides formique, acétique, propionique, glycolique, lactique, pyruvique, oxalique, malonique, succinique, maléique, fumarique, malique, tartrique, citrique, ascorbique, 21115 6 2052945 . hydroxy-maléique, dihydroxy-maléique, benzoïque, phénylacétique, 4-amino-benzoïque, 4-hydroxy-benzoïque, anthranilique, cinnamique, mandélique, salicylique, pamique, 4-amino-salicylique, 2-phénoxy-benzoïque, 2-acétoxy-benzoïque, méthane-sulfonique, éthane-5 sulfonique, hydroxy-éthane-sulfonique, benzène-suifonique, p-toluène-sulfonique, naphtalène-sulfonique ou sulfanilique. Les peptides obtenus conformément au procédé peuvent être utilisés sous la forme de préparations pharmaceutiques. Ces dernières "renferment les peptides en mélange avec une 10 matière de support pharmaceutique, organique ou minérale, convenant par exemple pour l'application intra-veineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intra-nasale. Pour la formation de cette matière de support, on envisage des substances ne réagissant pas sur les polypeptides, comme par exemple la gélatine, 15 le lactose,, le glucose, l'amidon, la cellulose, par exemple "Avicel" (cellulose micro-cristalline) et des dérivés de la cellulose, comme la carboxyméthyl-cellulose, la méthyl-cellulose pu 11éthyi-cellulose, le talc, le stéarate de magnésium, des gommes, des poly-alcoylène-glycols, l'eau, des mono-alcools ou 20 des poly-alcools comme l'éthanol, 1'isopropanol, le glycérol, l'hexitol, des huiles végétales et d'autres esters d'acides gras comme l'huile d'arachides, l'huile de graines de coton, l'huile d'amandes, l'huile d'olives, l'huile de ricin, l'oléate d'éthyle, le myristate d'isopropyle, le.palmitate d'isopropyle, le pro-25 duit dénommé "Cetiol V" (ester oléique d'alcools gras liquides), le produit dénommé "Miglyol" de chez Labrafac (mélange de triglycérides d'acides gras comportant de 8 à 12 atomes de carbone), le produit dénommé "Labrafil M 2735" ou le produit dénommé "Labrafac WL 1219" (mélanges de glycérol et d'ester d'acides 30 gras poly-oxy-éthyléniques, le produit dénommé "Arlacel" (ester d'acides gras du sorbitan), le produit dénommé "Tween" (mono-oléate de poly-oxy-éthylène-sorbitan) ou d'autres excipients connus. Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées ou de capsules, » 35 ou sous forme liquide, à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émul-sionnants. Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres COPY 70 21115 7 2052945 .. substances thérapeutiquement précieùses. Poux des buts thérapeutiques, on utilise de 0,01 à 3 mg du peptide en solution ou en suspension, de préférence sous forme d'un complexe à effet prolongé, par exemple à l'état 5 d'une suspension, d'un complexe de zinc ou à l'état d'une solution de gélatine ou à l'état d'une solution de phosphate de polyphlorétine. On administre de 0,1 à 5 ml des solutions ou suspensions, par exemple par voie intra-veineuse, intra-muscu-laire, sous-cutanée ou intra-nasale. L'application peut avoir 10 lieu, par exemple, une à trois fois par jour ou bien une ou plusieurs fois par semaine. Le peptide libre est administré, de préférence, par voie intra-veineuse ou intra-musculaire, et les complexes, par exemple les complexes zinciques, de préférence par voie intra-musculaire ou sous-cutanée. 15 L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés Celsius. On utilise les abréviations suivantes : . B0C = tertio-butyloxy-carbonyle 20 Z = carbobenzoxy tBu = tertio-butyle Me = méthyle Dans la chromatographie en couche mince, oh utilise les systèmes suivants : 25 Système 1 = mélange (1 : 1) de benzène et d'acétone Système 2 = mélange (4 : 1) de chloroforme et de méthanol Système 101 A = mélange (42 : 24 : 4 : 30) de n-butanol, de pyridine, d'acide acétique glacial et d'eau Système 101 B = mélange (40 : 24 : 6 : 30) de n-butanol, de pyridine, d'acide acétique glacial et d'eau. CORY 70 21115 8 EXEMPLE 1 2052945 10 H-D-Sér-Tyr-Sér-Mét-Glu-His-Phé-Arg-Try-Gly-Orn-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Orn-NH^ (D-Sér-Orn'''"'', "^"~"^-p^~"'"®-corticotropine- ■JQ Orn -amide) Dans 2 ml d'un mélange d'acide trifluoracétique et d'eau (10 ï 1), on dissout 100 mg d'acétate de BOQ-D-Sér-Tyr-Sér- Mét-Glu(OtBu) -His-Phé-Arg-Tr.y-Gly-Orn(BOC ) -Pro-V a 1 -Gly-Orn (BOG)-Orn(BOC )-Orn(BOG )-Orn(BOG )-KH^. Au "bout de 90 minutes à là température ambiante, on élimine partiellement l'acide par évaporation, reprend le résidu dans de l'eau et concentre à nouveau. On répète ce processus à deux reprises et lyophilise le résidu. On dissout alors le produit dans 10 ml d'eau et fait ^ passer la solution sur un échangeur d'ions faiblement basique (Merck II, forme acétate). On lave la colonne avec de l'eau, bi-distillée et recueille le filtrat jusqu'à ce que la réaction de Giocalteux à la foline soit positive. En lyophilisant le filtrat et en séchant sur du péntoxyde de phosphore, on obtient dû 80 mg de D-sér^-Orn^,^~"^-p^~~'"®-corticotropine-Orn'^-amideo Dans un chromatogramme en couche mince sur de l'oxyde d1 aluminium, la valeur de est de 0,10 dans le système 52A, de 0,21 dans le système 101B et de 0,19 dans le système 101„ Dans un électrophorèse en couche mince sur des plaques de cellu-25 lose (.280 volts, pH 1,9 /tampon à l'acide formique et à l'acide acétique/, le composé migre en 30•minutes de 3 cm vers la cathode. La matière de départ peut être préparée comme suit : 1) Z-0rn(B0C)-0Me 30 A une solution éthérée de diazométhane, on ajoute 9,15 g de Z-Orn(BOG)-OH« Lorsque le dégagement d'azote a cessé, on maintient la solution pendant deux heures encore à la température ambiante et détruit alors le diazométhane en excès en ajoutant goutte-à-goutte de l'acide acétique glacial» On concentre alors 35 la solution à sec. On cristallise l'ester méthylique obtenu, dans une mélange d'éther et d'éther de, pétrole (1 : 1) ou dans de l'éther di-isopropylique. Il fond à 71° et présente un pouvoir rotatoire spécifique ~ 14,4° (c = 1,08 dans l'acide acétique à 90%), 70 21115 9 2Ù52945 Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, la valeur de est de 0,69 dans le système 1 et de 0,83 dans le système 2» 2) H-Orn(B00)-OMe 5 Dans 50 ml de méthanol renfermant un millilitre d'acide acétique glacial, on hydrogène, en présence d'un charbon à 10 % de palladium, 5»0 g (13,2 m.moles) de Z-0rn(B0C)-0Me» Après évaporation du solvant, on obtient une huile foncée que l'on sèche pendant peu de temps à une température de bain de 40°, sous une 10 pression de 10""^ mm de mercure» On soumet directément le produit à la suite du traitement» 3) Z-Orn(BOG)-Orn(BOG)-OMe On dissout, dans 10 ml de diméthylformamide, le résidu obtenu sous 2), et ajoute au tout 6,57 g (13,9 m.moles) d'ester 15 p-nitrophénylique de Z-Orn(BOC). On laisse réagir pendant 16 heures .à la température ambiante et dilue ensuite avec 250 ml d'eau» On sépare l'ester dipeptidique sous forme cristalline» On recristallise dans 30 ml de méthanol bouillant et 25 ml d'eau à 60°» En refroidissant lentement à 0°, on obtient le produit pur qui 20 fond à 125° et présente un pouvoir rotatoire spécifique /~a_7^ = - 15,1° - 1° (c = 1,34 dans l'acide acétique à 90 % )» Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, la 25 valeur de R^ est de 0,71 dans le système 1 et de 0,85 dans le système 2» 4) Z-Orn(BOG)-Orn(BOG)-0H Dans 68,2 ml de dioxanne, on dissout 8,1 . g (13,65 m. moles) de Z-Orn(BOC)-Orn(BOG)-OMe et ajoute goutte-à-goutte, tout 30 en agitant, 68,2 ml d'une solution 0,2-normale d'hydroxyde de sodium» On concentre ensuite le mélange jusqu'au quart environ de son volume. A la solution jaune limpide, on ajoute 15»1 g d'acide citrique, puis de l'acétate d'éthyle jusqu'à dissolution du précipité blanc. On remplace la couche inférieure par de l'acide 35 citrique frais à 1 %» Après avoir extrait la phase organique avec cette solution,on la lave à l'eau jusqu'à avoir une réaction neutre, la sèche et la concentre» On sèche le résidu sous un vide poussé, Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de 21115 10 2052945 .silice, la valeur de Rf est de 0,03 dans le système 1 et de 0,22 dans le système 20 /faJl° = 3»1Q -l°(c= 1 dans le méthanol) « 5 5) H-OrnÇBOG)-Orn(B00)-OME Dans 64 ml de méthanol, et en présence de 600 mg d'un charbon à 10 % de palladium, on hydrogène 6,4 g (10,8 m0 moles) de.Z-0rn(B0G)-0rn(B0C)-0Meo Au bout de 5 minutes, l'absorption 10 d'hydrogène est terminée. On filtre la solution et l'utilise aussitôt pour la réaction 6). 6) Z-Orn(BOC)-Orn(BOG)-Orn(BOC)-Orn(BOG)-OMe Au filtrat obtenu sous 5), on ajoute 6,3 g (10,8 m»moles) de Z-Orn(BOG)-Orn(BOG)-OHo On concentre alors à sec et dissout 15 le résidu dans 25 ml de diméthylformamide» On élimine le reste de méthanol sous vide, ajoute 2,48 g de U-hydroxy-succinimide, puis refroidit à -20° et, tout en maintenant cette température, ajoute 2,45 g (21,6 m»moles) de dicyclohexyl-carbodilmideo On laisse reposer pendant 6 heures à - 20° et ensuite pendant 18 20 heures à 0°. On sépare ensuite, la dicyclohexylurée par filtra-tion, concentre le solvant sous une pression de 0,01 mm de mercure, dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle, filtre et extrait le filtrat avec 3 fois 50 ml d'eau, avec 3 fois 50 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium, avec 3 fois 60ml 25 d'acide citrique à 1 % et finalement avec de l'eau jusqu'à avoir une réaction neutre» On sèche la solution organique et la concentre sous vide. On cristallise^le résidu dans un mélange de méthanol et d'eau. Il fond à 152°. Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, la valeur de R^ est de 0,36 30 dans le système 1 et de 0,91 dans le système 2. . ZT\7d° ~ ~ 17,8 ± 1° (c = 1 dans le méthanol). 7) H-Orn(BOG)-Orn(BOG)-Orn(BOG)-0rn(B0G)-0Me Dans 5° ml de méthanol, et en présence de 400 mg d'un » 35 charbon à 10 % de palladium, on hydrogène 4,1 g de l'ester obtenu sous 6)0 Au bout de 30 minutes, la réaction est terminée» La valeur de R^ est de 0,13 dans le système 1 et de 0,60 dans le système 2» On soumet directement à la suite du traitement la solu-tionméthanolique (cf» 10)» 70 21115 ii 2052945 8) Z-Orn(BOOVPro-Val-Sly-OC^Hn Dans 130 ml de méthanol renfermant 4,7 ml d'acide acétique glacial, on hydrogène 6,5 g (15 numoles) de Z-Pro-Val-Gly-OCgH^. On dissout l'acétate obtenu de l'ester tripeptidique 5 dans 40 ml de diméthylformamide et ajoute une solution de 8,78 g (18 m»moles) d'ester p-nitrophénylique de Z-Orn(BOC) dans-25 ml de diméthylformamide». On laisse le mélange reposer pendant 16 heures à la température ambiante» On sépare ensuite par filtra-tion la matière non dissoute, dilue le filtrat avec un volume 10 d'eau quadruple et extrait le mélange trouble à l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait avec du carbonate de sodium à 5 jusqu'à ce que la phase aqueuse ne renferme plus de p-nitrophénol, avec une solution d'acide citrique, avec de l'eau et finalement avec une solution de chlorure de sodium, sèche sur du sulfate de magné-15 sium,.. concentre jusqu'à 40 ml environ et dilue avec de l'éther di-isopropylique jusqu'à avoir 250 ml» On sépare le précipité par filtration, lave avec de l'éther di-isopropylique et cristallise dans xm..mélange d'éthanol et d'éther di-isopropylique., Le composé fond à 125° et présente ion pouvoir rotatoire spéci-20 fique " = - 79,4° î 1,0° (c = 1 dans le méthanol)» Dans.un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice,-la valeur de est de 0,41 dans le système 1 et de 0,84 dans le 25 système 20 9) Z-Orn(BOG)-Pro-Val-Gly-OH On dissout 3,14 g (5 m.moles) de l'ester tétrapeptidi-que protégé ci-dessus dans 80 ml de dioxanne et ajoute au tout 30 80 ml d'une solution 0,0625-normale d'hydroxyde de sodium (5 m0moles). On concentre la solution jaune limpide jusqu'à apparition d'un louche0 On ajoute alors au tout 10 m.moles environ d'acide citrique et extrait l'émulsion à deux reprises avec chaque fois 100 ml d'acétate d'éthyle» Après avoir réuni les 35 extraits, on les lave avec une solution d'acide citrique et finalement avec de l'eau, et après séchage et évaporation du solvant, puis addition d'éther di-isopropylique, on obtient 70 21115 12 2052945 une poudre facilement filtrableo La substance fond de façon peu nette à 95° et présente un pouvoir rotatoire spécifique £~ 5 Dans tin chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, la valeur de R^ est de 0,0 dans le système 1 et de 0,13 dans le système 2. . 10 10) Z-0rn(B00)-Pro-V"al-Gly-Orn(BOG)-0rn(BOG)-0rn(BOG)-0rn(BOG)-0Me On évaporé à sec la solution méthanolique de H-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Orn(.BOC)-Orn(BOC)-OMe obtenue sous 7), reprend le résidu dans 10 ml de diméthylformamide, ajoute à la solution 0,92 g 15 (8 m.moles) de N-hydroxy-.succinimide et 2,54- g de Z-Orn(BOG)-Pro-Val-Gly-OH, puis agite le mé-lange jusqu'à ce que tout soit passé en solution. On refroidit alors à - 20° et ajoute 1,0 g de dicyclohexyl-carbodiimide. On maintient le mélange pendant quelques heures à - 20° et ensuite pendant quelques jours à 0°. 20 On sépare alors le précipité paï1 filtration et concentre le.filtrat sous un vide poussé. On ajoute à l'huile épaisse un volume décuple d'éther. On obtient alors le dérivé octapeptidique sous forme de poudre. Cette poudre fond à 145 - 155° et présente un pouvoir rotatoire spécifique • 25 = - 41,0° i 1,0° (c = 1 dans le méthanol)-> Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, la valeur de R^ est de 0,10 dans le système 1 et de 0,88 dans 30 le système 2„ 11) Z-Orn(BOC)-Pro-Val-Gly-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Orn(BOC)- m Dans du méthanol sec, on met en suspension 1,5 g de l'ester octapeptidique protégé et fait passer*en solution èn 35 ajoutant une solution saturée d'ammoniac sec dans du méthanolo On laisse la solution reposer pendant trois jours à la température ambiante. On concentre alors à sec et reprend le résidu 21115 15 2052945 dans de l'éther ou de l'éther di-isopropylique» On sépare le précipité par filtration et le soumet à un partage à contre-courant dans un système constitué par un mélange (8 ; 16 : 9 : 6) d'éther de pétrole, d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau» 5 Au "bout de 150 stades, l'amide octapeptidique protégé est isolé à partir des éléments 38 à 56 (rmax = 4-2, K = 0,39). XI fond à 198° et présente un pouvoir rotatoire spécifique CaJj^ ~ " 33,0 i 1° (c = 1 dans le méthanol)» 10 Dans tui chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, la valeur de est de 0,0 et elle est de 0,90 dans le système 2» 12) Chlorhydrate de Orn(BOC)-Pro-Va 1-Gly-Orn(BOC)-Orn(BOC)-0rn(B0C)-0rn(B0C)-NH2 Dans 45 ml de méthanol, on dissout 443 g (0,3 m.mole) de l'amide octapeptidique protégé, ajoute au tout 5 ml d'acide chlorhydrique (0^3 m»mole) et hydrogène pendant trois heures en présence de 100 mg d'un charbon au palladium» Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, le chlorhydrate ci-dessus de l'amide octapeptidique présente une valeur de R^. de 20 0,76 dans le système 2» La solution méthanolique est directement soumise à la suite du traitement» 13) Acétate de BOC-D-Sér-Tyr-Sér-Mét-Glu(OtBu')-His-Phé-Arg-G}ry-Gly-0rn(B0C)-Pro-Val-Gly-Orn(BOC)-0rn(B0C)-Orn(BOC)-Orn(BOC)- 25 ^2 On neutralise la solution méthanolique obtenue sous 12) en y ajoutant 0,025 ml (0,3 m.mole) de pyridine, élimine le solvant et reprend le résidu dans 10 ml de diméthylformamide» On ajoute à cette solution 524 mg (0,36 m.mole) de BOC-D-Sér-Tyr-30 Sér-Mét-Glu(OtBu)-His-Phé-Arg-Try-Gly-OH (voir brevet français 1»512»342) et 41,4 mg de N-hydroxy-succinimide.On agite le mélange pendant deux heures et ajoute ensuite 75 mg de dicyclohexyl-carbodiimide, puis agite encore pendant trois jours. On filtre alors, concentre le filtrat à sec sous un vide poussé, malaxe le 35 résidu dvec de l'éther et purifie l'amide octadécapeptidique brut par un partage à contre-courant dans un système constitué par un mélange (8 % 3 : 6 : 2) de méthanol, d'un tampon, de chloroforme et de tétrachlorure de carbone, le tampon étant constitué par un 70 21115 14 2052945 mélange de 28,5 g d'acide acétique glacial, de 19,25 g d'acétate d'ammonium et d'eau jusqu'à avoir un volume d'un litre. Au "bout de 275 stades, on isole le produit <> ' 5 rmax = *5 s K = 0,20 /"oj?1 = 25,3° - 1° (c = 0,5 dans l'acide acétique ~ glacial). Dans un chromâtogramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange' (3 : 1) de chloroforme et de méthanol, la valeur de Sf est de 0,62o EXEMPLE 2 • Sous atmosphère d'azote,on dissout 93 mg de toluène-sulfonate 2^ de BOC-D-Sér-Tyr-Sér-Mét-Glu(OtBu)-His-Phé-Arg-Trp-Gly-Orn(BOG)-Pro-Val-Gly-Lys'(B0C)-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Lys(B0C)-:PÏH2 dans 1,4 ml d'acide trifluoracétique glacé à 90 % et laisse la solution reposer pendant 30 minutes à 0°. On précipite alors avec de l'éther exempt de peroxyde, laisse reposer pendant trois heures à 0°, sépare la fine poudre par essorage et la lave à trois reprises 20 avec de l'éther et la sèche sous vide dans un exsiccateur, sur de la soude cautisquë. On dissout alors à nouveau sous atmosphère d'azote dans 1,5 ml d'acide trifluoracétique à 90 % et laisse reposer pendant une heure à 22% On procède alors comme ci-dessus pour la précipitation avec de l'éther» On dissout la poudre 25 sèche dans de l'acide acétique à 5 % et la filtre sur une colonne d'un échangeur d'ions Merck n° II "(faiblement basique, forme acétate) pour éliminer les ions toluène-sulfonate et tri-fluoracétate. On lave ensuite avec de l'acide acétique à 5 °/° et lyophilise l'éluat® On obtient alors 71 mg d'hexa-acétate de 30 D-Sér-Œyr-Sér-Mét-Glu-His-Phé~Arg-Q?rp-Gly-Orn-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NHg o Dans une chromatographie en couche mince sur une plaque de cellulose, le produit présente une valeur de R^ de 0,37 dans la système 101 A et de 0,22 dans le système 101 B. La matière de départ peut être préparée comme suit î 70 21115 15 2052945 1„ H-Lys(BOC)-Lys(BOG)-Lys(BOG)-Lys(BOG)-NH2 Dans 40 ml de diméthylformamide, on dissout 3,8 g de Z-Lys(BOG)-Lys(BOC)-NH-NHg et refroidit à - 30°0 On-ajoute ensuite au tout 6,1 ml d'une solution aqueuse pentanormale d'acide 5 chlorhydrique et ensuite 6,1 ml d'une solution aqueuse normale de nitrite de sodium,. On agite pendant 15 minutes à - 10° et ajoute au tout 3,1 g de H-Lys (BOG) -Lys (BOC eri solution dans 15 ml de diméthylformamide. On ajoute alors goutte-à-goutte, à - 10°, encore 2,24 g de di-isopropyl-éthylamine et laisse repo-10 ser à 0° pendant 18 heures. On concentre ensuite à 40°, sous une pression de 0,01 mm de mercure, jusqu'à avoir un volume de l'ordre de 10 à 15 ml, précipite le dérivé tétrapeptidiqué en ajoutant beaucoup d'eau glacée, le malaxe "bien, le sépare par essorage et le lave ensuite avec de l'eau glacéeo On sèche la poudre 15 et purifie le produit brut par chromatographie sur du gel de silice (colonne préparée dans du chloroforme), en éluant le dérivé tétrapeptidique par addition de méthanol (30 %)„ On réunit les fractions qui, d'après la chromatographie.en couche mince sur du gel de silice /système constitué par un mélange 20 (4 j 1) de chloroforme et de méthanol7, renferment le produit pur, puis concentre à sec. On dissout alors le dérivé tétrapeptidique dans du méthanol et hydrogène le groupe carbobenzoxy en présence d'un charbon au palladium. 2. Z-Orn(BOC)-Pro-Yal-Gly-OH 25 Dans 80 ml de diméthylformamide, on dissout 8 g de H-Bro-Val-G-ly-OCgH^ et 14,7 g d'ester p-nitrophénylique de Z-Orn-BOC), laisse reposer pendant 18 heures à 28°, filtre le mélange réactionnel, le dilue avec un volume d'eau quadruple et l'extrait à l'acétate d'éthyle» Pour éliminer le p-nitrophénol, 30 on lave la solution obtenue à l'acétate d'éthyle, en refroidissant à la glace, avec une solution de carbonate de sodium, jusqu'à ce qu'elle ne soit plus que faiblement teintée.en jaune. On lave alors avec de l'eau, avec une solution diluée d'acide citrique et à nouveau avec de l'eau, sèche avec du sulfate de sodium, 35 filtre, concentre le filtrat jusqu'à un volume de 120 ml environ et ajoute au tout 750 ml d'éther di-isopropylique, ce qui fait que le dérivé tétrapeptidique cristallise. On obtient 13 g de 3-0rn(B0C)-Pro-Val-Gly-0C2H^ fondant à 125° et présentant un pouvoir rotatoire spécifique 70 21115 iG 2052945 /""*a_7^p = - 79,4° (c = 1 dans le méthanol). On dissout 10 g de ce produit dans 250 ml de dioxanne et ajoute au tout 250 ml d'une solution aqueuse 0,06-normale d'hydroxyde de sodium» Au bout de trois heures à la température ambiante, 5 on concentre sous pression de 11 mm de mercure, à une température de bain de 35°t jusqu'au tiers environ du volume, acidifie par addition d'une solution à 20 % d'acide citrique et reprend dans de l'acétate d'éthyle l'huile qui s'est séparée. On lave la solution d'acétate d'éthyle avec une solution d'acide citrique, avec 10 de l'eau, sèche et concentre» On malaxe le résidu avec de l'éther di-isopropylique, ce qui fait qu'on obtient le composé de formule Z-0rn(B0C)-Pro-Val-Gly-OH , sous la forme d'une poudre compacte fondant à 95° et présentant un pouvoir rotatoire spécifique PO £~aJn ~ ~ 66,5° (c = 1 dans le méthanol)» 3. H-OrnCB00)-Pr o-Va 1-C-ly-Ly s(B00)-Lys(B00)-Lys(BOC)-Lys(BOC)- - m2 ; Dans 40 ml de diméthylformamide, on dissout 7,7 g de Z-0rn(B0C)-Pro-Val-Gly-OH et 2,8 g de F-hydroxy-succinimide, ajoute au tout 10,5 g de H-lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)~Lys(BOC)-NH2 et 3,3 g de dicylohexyl-carbodiimide, puis laisse réagir pendant 18 heures à 25°» On filtre alors et concentre le filtrat à une température de bain de 40°, sous un vide poussé, jusqu'à consistance huileuse, malaxe avec de l'é.ther pour obtenir une poudre, sépare par essorage, lave ensuite à l'éther, sèche et malaxe avec de l'eau. On essore à nouveau, lave ensuite à l'eau et sèche le produit brut dans un exsiccateur, sur du chlorure de calcium. Pour purifier, on reprécipite la poudre à deux reprises dans un mélange de diméthylformamide et d'éther et à deux reprises dans un mélange de diméthylformamide et d'eau. D'après une chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice, le produit est suffisamment pur pour la suite du traitement ; il présente une valeur de de 0,9 dans un mélange (4 s 1) de chloroforme et de méthanol 0 ' 20 25 30 35 70 21115 17 2052945 10 15 20 Pour éliminer le groupe carbobenzoxy, on dissout le produit dans du méthanol,et hydrogène en présence d'un charbon à 10 % de palladium. 4-o BOG-D-Sér-Tyr-Sér-Ivîét-Glu(0tBu)-His-Phé-Arg-Trp-Gly-Orn(BOG)-Pr o -V al-Gly-Lys (BOG)-Lys (BOC)-Lys (BOG)-Lys (BOG)-Mo Dans 24 ml de diméthylformamide, on met en suspénsion un gramme de BOG-D-S ér-Tyr-Sér-Mé t-Glu(0tBu)-His-Pré-Arg-Trp-Gly-OH et ajoute ensuite, tout en agitant, 126 mg d'acide toluène sulfonique monohydrate et 110 mg de N-hydroxy-succinimide 0 Après avoir agité pendant une heure à la température ambiante, on ajoute au tout 910 mg de H-0rn(B0G)-Pro-Val-Gly-Lys(BOG)-Lys(BOG) Lys(BOG)-Lys(BOG)-Hïïg et 175 mg de dicyclohexyl-carboddimide, chauffe à 45° tout en agitant et agite pendant 6 heures à cette température. On refroidit alors à la température ambiante et précipite le produit brut par addition de beaucoup d'éther exempt de peroxyde, ce qui fait que la dicyclohexylurée se dissout dans l'éther» On sépare par essorage, sèche sous vide à 40°, lave la poudre à l'eau, essore à nouveau et sèche comme ci-dessus. Pour purifier le produit brut, on le soumet à un partage à contre-courant en 225 stades dans un système constitué par un mélange (8 : 3 : 6 : 2) de méthanol, d'un tampon, de chloroforme et de tétrachlorure de carbone, le tampon étant constitué par 28,5 g d'acide acétique, par 19,3 g d'acétate d'ammonium et par un litre d'eau)o Le maximum, de poids de l'octadécapeptide protégé se 25 trouve dans la fraction 47 (K =. 0,32)» Dans une chromatographie en couche mince sur une plaque de gel de silice, dans un système constitué par un mélange (3 : 1) de chloroforme et de méthanol, le dérivé peptidique présente une valeur de de 0,17o On réunit les fractions pures, concentre à sec à une température de bain 30 de 40°, sous une pression de 11 m de mercure, puis débarrasse le résidu de l'acétate d'ammonium en le séchant à 45° sous une pression de 0,01 mm de mercure» EXEMPLE 3 On prépare une suspension renfermant les constituants 35 suivants t Hexa-acétate de D-Sér"**-0rn"'"^,"^~"'"®-(3"''~*'"®-cortieotropine-Orn^-amide 0,10 mg ZnCl2 .5,25 mg Na2HP04»2H20 1,05 mg 70 21115 18 2052945 îîaCl 2,0 mg Alcool benzylique 10,0 mg Solution 0,6-normale de §oudô jusqu'à avoir un pH de 8,4 5 Eau distillée jusqu'à 1,0 mg 21115 19 2052945 REVENDICATIONS 1 . Les peptides à effet adrénocorticotrope qui se différencient des peptides à activité ACTH (totalement lévogyre) comportant une séquence de 18 à 39 amino-acides, par le fait qu'ils présentent comme premier amino-acide, compté depuis le 5 terminus azoté, de la D-sérine et comme amino-acide dans la position 11 ou dans les position 11 et 15 à 16 ou dans les positions 11 et 15 à 18, de la L-ornithine, leurs amides C-terminaux et les sels d'addition avec des acides et les complexes de ces composés. 10 2 „ Les peptides ou amides peptidiques comportant de 18 à 25 amino-acides de la séquence N-terminale des corticotro-pines naturelles, où toutefois le premier amino-acide est remplacé par de la D-sérine et où les acides aminés dans les positions 11, ou 11 et 15 et 16, ou 11 et 15 à 18, sont remplacés 15 par de la L-ornithine et où, le cas échéant, un ou plusieurs des acides aminés dans les positions 2 à 5, 19 et 25 sont en outre remplacés par d'autres a-amino-acides, leurs sels d'addition avec des acides et leurs complexes„ 3 o Les peptides ou amides peptidiques comportant 20 de 18 à 25 amino-acides de la séquence ïl-terminale des cor-ticotropines naturelles, où toutefois le premier amino-acide est remplacé par de la D-sérine et où le llème, ou les llème et 15ème à 18ème amino-acides sont remplacés par de la L-orni-thine et où, le cas échéant, le troisième amino-acide est rempla-25 cé par de la glycine et/ou le 4ème amino-acide est remplacé par de la L-nor-leucine et/ou le 5ème amino-acide est remplacé par de la L-glutamine et/ou le 19ème amino-acide et/ou le 25ème amino-acide sont remplacés par de la L-valine, leurs sels d'addition avec des acides et leurs complexes» 30 4. Les peptides ou amides peptidiques comportant de 18 à 25 amino-acides de la séquence N-terminale des corticotro-pines naturelles, où toutefois le premier amino-acide est remplacé de la D-sérine et où le llème, ou les llème et 15ème à 16ème amino-acides sont remplacés par de la L-ornithine et où, le cas 35 échéant, le troisième amino-acide est remplacé par de la glycine et/ou le 4ème amino-acide est remplacé par de la L-nor-leucine et/ou le 5ème amino-acide est remplacé par de la L-glutamine et/ou les 17ème et 18ème amino-acides sont remplacés par de la L-lysine et/ou les I9ème et/ou 25ème amino-acides sont remplacés 40 par de la L-valine. 21115 20 2052945 5» Les amides octadécapeptidiques comportant la séquence 1 à 18 de la (3-corticotropine, où toutefois le premier amino-acide est remplacé par- de la D-sérine et où le llème, ou le llème et les 15ème et lôème, ou le llème et les 15ème à 18ème 5 amino-acides sont remplacés par de la L-ornithine» 6. Le D-Sér"*'-0rn'^,^''"~'^-(3"''"~'^~corticotropine-0rn^-amide, ses sels d'addition avec des acides et ses complexes» 7. Le D-Sér"'"-Orn"'"''"-Lys'^, {3^" """^—c ortie otr opine—Lys amide, ses sels d'additions avec des acides et ses complexes» 10 8. Les complexes avec le phosphate de zinc, avec le pyrophosphate de zinc, avec le polyphosphate de zinc et/ou avec l'hydroxyde d'azote, des peptides ou amides peptidiques indiqués dans l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9» Les préparations pharmaceutiques renfermant les 15 composés qui sont indiqués dans l'une quelconque dès revendications 1 à 8. 10. Procédé de préparation de nouveaux peptides à effet ACTE, caractérisé par le fait que dans des peptides à effet ACTH ou leurs amides C-terminaux, comportant une séquence 20 de 18 à 39 amino-acides et présentant de la D-sérine comme premier amino-acide et des restes ornithine dans les positions 11 ou 11 et 15 à 16 ou 11 et 15 à 18, peptides dans lesquels au moins le groupe a-aminogène et les groupes aminogènes des chaînes latérales ainsi que les groupes carboxyle des chaînes latérales et le 25 groupe carboxyle terminal, sont protégés, on élimine les groupes de protection, puis, si on le désire, qu'on transforme les composés obtenus en leurs sels d'addition avec des acides ou en leurs complexes.