Brevet FR2043475A1 — publié le 19710219

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont contribué MM. HIRSCH Jean et BÏÏRET Jean, a pour objet de nouveaux composés d'origine "bactérienne. Elle a plus particulièrement pour objet des substances de 5 nature protidique, sécrétées par un germe microbien ou un mélange de germes microbiens et extraites des corps microbiens. Elle concerne spécifiquement une fraction constituée par des glycoprotéines extraites de cultures de souches microbiennes préalablement lysées. Ces glycoprotéines sont obtenues à partir de germes pathogènes tO ou saprophytes choisis dans le groupe constitué par les pneumocoques, streptocoques ITeisseria,Micrococci staphylocoques, KLebsellia pneumohiae et Hemophilus Influenzae, ou à partir d'un-mélange de ces germes, ou encore d'une association de différents types d'une même espèce microbienne. 15 Ces glycoprotéines ainsi obtenues possèdent des propriétés thérapeutiques très intéressantes. Elles sont douées de propriétés antiinflammatoires considérables et de propriétés immunisantes. rapides et non spécifiques. Elles possèdent en outre l'avantage considérable de n'être ni allergisantes, ni hyperthermisantes et de 20 ne pas provoquer de phénomènes d'intolérance au point d'injection. La littérature fournit déjà un grand nombre de préparations d'origine microbienne constituées par des corps microbiens lysés par un moyen chimique ou physique. C'est par exemple l'objet des brevets spéciaux de médicament 25 5488 M (Canadian Patents and Development Limited), 6495 M (Institut de Recherches Scientifiques) et 6513 M (institut de Recherches Scientifiques). Ces lysats microbiens, seuls ou associés à un antibiotique ou à xm solvant polaire, servent à déclencher une réaction d'immunisation 30 rapide ou à exalter les défenses de l'organisme vis-à-vis d'une agression microbienne. Ces lysats proviennent en général d'une espèce microbienne déterminée et amènent une immunisation plus spécifique que générale. Ils possèdent en outre l'inconvénient d'être généralement allergéniques. Leur emploi répété ne peut de ce fait être 35 conseillé. Enfin, ces lysats représentent des mélanges de fractions proti-diques très variées telles que lipoprotéines, mucopolysaccharides, 16297 2 2043475 nucléoprotéines ... dont les unes sont immuno-actives et les autres sont inactives. l'administration de tels mélanges peut entraîner des effets secondaires indésirables. Il était donc souhaitable de pouvoir disposer, en vue d'une 5 utilisation thérapeutique* non plus d'un lysat microbien doué néanmoins de propriétés antigéniques, mais d'une fraction purifiée d'un tel lysat qui représente la fraction réellement active» Cette fraction purifiée présenterait en outre l'avantage de conférer une immunité très large, rapide et suffisamment durable. 10 Un premier essai pour atteindre la solution de ce problème a été effectué par P. LHOHETTE (Revue d'Immunologie ^2 (1968) 105-150) à partir d1 un antigènesoiaatique extrait d'une souche de Bacillus Subtilis L. la fraction glycoprotéique obtenue par cet auteur possède une certaine activité antigénique non spécifique. Elle possède aussi 15 une action antiinflammatoire. la présente invention apporte une solution plus satisfaisante et plus générale à ce problème thérapeutique. En utilisant non plus un extrait d'une souche non pathogène bien particulière, mais un extrait d'une ou plusieurs souches sapro-20 phytes ou phatogènes, on a pu obtenir une fraction glycoprotéique possédant un pouvoir immunitaire beaucoup plus prononcé et beaucoup plus général. On a pu obtenir également une fraction possédant une action antiinflammatoire beaucoup plus intense. A partir de conditions expérimentales déterminées, on peut donc 25 isoler une ou plusieurs molécules de nature glycoprotéique apparemment responsables des propriétés antigéniques et antiinflammatoires des préparations microbiennes. Oette fraction est vraisemblablement très différente de celle obtenue par P. LiULOUETTE, en raison de l'origine distincte des cultures microbiennes. 30 La présente invention permet donc d'accéder à des fractions purifiées standardisables dont l'action immunitaire vis-à-vis d'agents phatogènes peut être reproduite et dont la teneur en glycoprotéines actives peut être déterminée avec précision par des tests chimiques, physiques, immunologiques ou bactériologiques. 35 Pour autant que les études effectuées aient pu le prouverr les glycoprotéines obtenues dans ces conditions bactériologiques sont un mélange de a et de -g-glycoprotéines lentes. Cette structure est 69 16297 3 2043475 montrée par le comportement électrophorétique par rapport à des glycoprotéines de référence et plus particulièrement par rapport aux glycoprotéines sériques. 5 des réactions chimiques telles que leur teneur oses et en pentosee, par l'identification"approximative du poids moléculaire, en utilisant des agents de ehromatographie sélectifs, tels que celluloses modifiés^ sephadex ou tamis moléculaires, par la teneur en fraction protidique de la molécule évaluée par le pouvoir biurétogène, calculé par 10 rapport à la sérumalbumine-étalon, par la teneur en hexosamines et en acide scialique. La fraction constituée par des glycoprotéines obtenues à partir d'une ou des souches pathogènes mentionnées ci-dessus, peut être définie comme constituée par des a et (3-glycoprotéines lentes, thermo-15 stables, acidosolubles et solubles dans les solutions de sulfate d'ammonium. Le poids moléculaire des a et p-glycoprotéines est apprécié par ehromatographie sur sephadex G 100. La ehromatographie de filtra-tion permet de définir un volume moléculaire ^ qui représente le 20 rapport entre le volume de solvant nécessaire à la désorption des glycoprotéines (Vo) et le volume de solvant nécessaire à l'élution d'une grosse molécule totalement exclue du gel de sephadex G 100 (Ve). Le volume moléculaire ^ pour de telles glycoprotéines est compris entre 2,5 et 3 par rapport à un tampon pH = 8 constitué par 25 le mélange suivant : - Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane 0,1 M - Chlorure de sodium 0,1 M Les glycoprotéines sont également définies par leur taux en hexoses combinés déterminé par une réaction spécifique comme par 30 exemple la réaction colorée à l'orcinol. Selon ces déterminations, les glycoprotéines, objet de l'invention, ont une teneur en hexoses combinés comprise entre 4 et 20 g pour 100. Cette teneur varie selon le degré de purification de la fraction considérée et de la quantité des sels minéraux contenue par la fraction glycoprotéinique. 35 Les. glycoprotéines sont encore définies par le rapport : La nature chimique de ces substances est ' ement indiquée par teneur en hexoses pouvoir biurétogène 16297 4 2043475 La teneur en substances biurétogènes, déterminée par rapport à la sérumalbumine étalon, est de l'ordre de 10 fo. Le rapport ,he*oses—î— varie entre 0,25 et 2 en fonction du degré de pouvoir biuretogene pureté. 5 Les glycoprotéines sont enfin définies par leurs critères de solubilités. Elles donnent, dans l'eau distillée, une solution légèrement opalescente qui ne se dénature pas par chauffage. Les glycoprotéines, objet de la présente invention, sont solubles dans les solutions d'acide perchlorique, d'acide trichlor-10 acétique et d'acide phytique. En particulier, on peut récupérer d'une solution d'acide phytique de pH = 2,10 les glycoprotéines sans dénaturation. Par ailleurs, les glycoprotéines, objet de la présente invention, sont définies par l'intensité de leur action antiinflammatoire 15 déterminée par des tests standard tels que l'oedème expérimental à la carrhagénine. L'activité antiinflammatoire est parallèle à la pureté de la fraction glycoprotéique. Enfin, il n'est pas impossible que les glycoprotéines, objet de la présente invention, renferment un méthylpentase spécifique et 20 notamment le fucose. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de ces glycoprotéines qui consiste essentiellement à cultiver sur milieu solide ou liquide une souche microbienne choisie dans le groupe constitué par des pneumocoques, des streptocoques, des 25 micrococci, des Neisseria, des staphylocoques, KLebsellia Pneumoniae, Hemophilus Influenzae ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches ou d'une association des différents types de ces souches, récolter après plein développement les corps microbiens de manière manuelle ou automatique, remettre les corps microbiens en 30 suspension dans un milieu aqueux, procéder à leur lyse par voie chimique, physique ou enzymatique, séparer les débris des corps microbiens, évaporer à sec la solution claire ainsi obtenue, soumettre le résidu sec à l'action d'un ou plusieurs solvants des lipides, reprendre par un solvant aqueux le résidu délipidé, le 35 débarrasser des protides par insolubilisation par des moyens physiques ou chimiques, éliminer le précipité de protides, puis précipiter sélectivement du liquide aqueux résiduel déprotide les Î6297 5 2043475 glycoprotéines lentes par addition drun solvant ou d'un mélange de solvants miscibles à l'eau et purifier si nécessaire les glycoprotéines lentes par ehromatographie sur xm support sélectif. Les glycoprotéines lentes ainsi obtenues proviennent de 5 cultures microbiennes sur milieu solide ou liquide, comme par exemple gélose nutritive enrichie ou non, en boîte de Pétri, ou cultivées en shakers ou en fermenteurs industriels dans un milieu liquide. Après complet développement de la souche ou des souches micro-10 biennes, on procède à la récolte de façon manuelle ou automatique. Les corps microbiens sont remis en suspension dans l'eau éventuellement en présence d'un tampon, comme par exemple une solution de phosphate disodique ou en présence d'un antiseptique comme le thimérosal. Les suspensions ainsi obtenues sont titrées par photo-15 métrie afin de déterminer la concentration en corps bactériens. On peut ajuster cette concentration à un titre voulu. La suspension des corps microbiens est ensuite lysée. La lyse des corps microbiens de cette suspension peut être effectuée de différentes façons, soit par voie chimique comme par 20 adjonction d'un agent tensio-actif, par exemple tin sorbate de poly-éthylèneglycol ou d'un antiseptique, soit par voie physique au moyen d'ultra-sons, ou par chauffage, ou par un rayonnement pénétrant? soit encore au moyen d'un enzyme, par addition d'enzymes protéoly-tiques ou polymucosaccharolytiques ou encore par tout autre moyen 25 permettant de recueillir le contenu cellulaire microbien sans altération et de la façon la plus complète possible. Le degré et la qualité de la lyse microbienne peuvent être suivis par photométrie. Lorsque cette lyse est jugée satisfaisante, on peut ajouter un 30 agent conservateur, ou stabilisant, ou tout autre adjuvant. Les lysats bactériens ainsi obtenus se présentent comme une préparation aqueuse éventuellement tamponnée, dans laquelle précipitent les débris des corps microbiens. Ces débris sont éliminés par les moyens usuels tels que filtration ou centrifugation. 35 A partir de ce lysat débarrassé des corps microbiens, on extrait les glycoprotéines5objet de la présente invention. Cette extraction est effectuée sur le résidu sec obtenu par évaporation ou lyophilisation du lysat. Le résidu sec est délipidé par un ou des solvants 69 16297 6 2043475 comme par exemple l'éther ou 1aacétone» Cette opération pourra éventuellement être renouvelée» la poudre clélipidée ainsi obtenue est ensuite remise en solution aqueuse. On procède alors à la déprotidation de cette solution par voie 5 physique ou chimique. la déprotidation peut être effectuée par chauffage après avoir amené le pH de la solution à une valeur voisine de 5 , plus particulièrement entre 5 et 6. la déprotidation peut également s'effectuer par simple chauffage, ou par le froid, ou par addition de 10 solvants, ou par défécation biochimique. On élimine le précipité de protides ou de nucléoprotéines par filtration ou cenirifugation. la solution claire est séparée. Elle est constituée essentiellement par le mélange de glycoprotéines et de sels minéraux. 15 On procède alors à une précipitation sélective des glyco protéines, en additionnant la solution d'un solvant ou d'un mélange de solvants miscibles à l'eau. On utilise de préférence, à cet effet, un mélange d'éthanol et d'acétone. le précipité de glycoprotéines qui apparaît dans ces conditions 20 est séparé, lavé par le même solvant ou mélange de solvants, pais séché. la fraction glycoprotéique est finalement purifiée par une des méthodes sélectives de la biochimie (dialyse, ehromatographie sur silice ou sur cellulose, électrophorèse, ultracentrifugation ...). 25 On peut ainsi obtenir une fraction glycoprotéique très enrichie et débarrassée des sels minéraux. Une dernière purification est assurée par filtration sur une colonne de cellulose chimiquement modifiée (éthylcellulose, diméthylaminoéthylcellulose), de maille et de poids moléculaire appropriés. 30 On obtient ainsi les glycoprotéines, objet de l'invention, à 18 état pratiquement pur. la purification finale est une opération souhaitable mais non obligatoire. Elle sera effectuée lorsque l'utilisation thérapeutique ou la forme pharmaceutique employée la rendront nécessaire. 35 l'invention a également pour objet l'emploi en thérapeutique des compositions contenant lès aet- ^-glycoprotéines lentes obtenues par le procédé''défini -ci^dessus. leurs propriétés immunisantes et 69 16297 7 2043475 antiinflammatoires les rendent utiles pour augmenter les capacités de défense de l'organisme et stimuler le système réticulo-endotbéliaL. Elles possèdent un pouvoir antigénique rapide et par là même, augmentent la résistance de l'organisme vis-à-vis des agressions 5 microbiennes. les propriétés antiinflammatoires de ces produits les rendent particulièrement utiles pour le traitement des affections ostéo-articulaires, des infections de l'appareil respiratoire, des affections chroniques des voies aériennes, des infections des voies 10 respiratoires supérieures, contre les némopathies et en phlébologie, pour le traitement des troubles résultant d'une infection de l'appareil génital ou urinaire. Ces propriétés trouvent également leur emploi en dermatologie. Les propriétés antigéniques trouvent leur emploi dans le 15 traitement des bronchites aiguës, des dermatites, des brûlures, des infections microbiennes de l'arbre génito-urinaire et en stomatologie. La combinaison des propriétés antiinflammatoires et antigéniques est en outre particulièrement bénéfique dans le traitement des 20 affections ostéo-articulaires où la phase d'inflammation est souvent accompagnée d'une phase d'autolyse engendrant des phénomènes d'auto-sensibilisation. . Les compositions pharmaceutiques contenant 1 es a efc |3-glycoprotéines lentes seront destinées aux injections par voie générale ou locale, 25 aux applications percutanées, aux applications locales, aux applications permuqueus es, pulmonaires ou encore sous forme de comprimés perlingaux ou à enrobage entérique. les formes pharmaceutiques telles que crèmes, gouttes nasales, gouttes auriculaires, solutions injectables, poudres lyophilisées 30 stériles pour injections, comprimés sublinguaux, aérosols, suppositoires ou ovules, sont préparées par les techniques usuelles de la pharmacotechnie. Elles consistent généralement en la mise en solution des a et p-glycoprotéines lentes dans un solvant aqueux et l'adjonction de produits de conservation ou d'agents épaississants, 35 ou d'agents d'adhésion, ou d'agents émulsionnants, de manière à réaliser la forme pharmaceutique désirée. Les produits peuvent en outre être associés à un agent assurant •une meilleure diffusion dans les tissus, comme par exemple un 69 16297 s 2043475 solvant polaire. La posologie est essentiellement fonction de la voie et de la forme d'administration. Dans un mode d'exécution actuellement préféré, le procédé peut 5 être défini de la manière suivante : - la ou les souches microbiennes utilisées sont choisies dans le groupe suivant : - pneumocoques siro types I, II, III, y. et VIIÎ - streptocoques groupes A, C, G 10 - ITeisseria catarrhalis - Staphylocoques dorés - ELebsellia Pneumoniae - Hemophilus Influenzae - la culture microbienne est effectuée sur milieu solide à base de 15 gélose nutritive -.la récolte des corps microbiens est faite manuellement - la lyse des corps microbiens est effectuée par addition d'un agent tensio-actif - la délipidation est effectuée par épuisement à l'éther 20 - la délipidation est effectuée par épuisement à l'acétone - la déprotidation est effectuée par chauffage à 1002 - la déprotidation est effectuée par acidification à l'aide d'acide trichloracétique - la précipitation sélective des aefc {3-glycoprotéines lentes est 25 effectuée par addition à la solution aqueuse d'un mélange d'alcool et d'acétone - le mélange d'alcool et d'acétone est ajouté dans des proportions qui peuvent varier entre 1 et 20 volumes de solvants pour 1 volume de solution aqueuse 30 - les a et {3-glycoprotéines lentes, objet de l'invention, sont purifiées par dialyse sur une membrane de cellulose, puis par ehromatographie sur Séphadex 200 suivie d'élution. L'exemple suivant sert à illustrer l'invention. Il ne la limite en aucune façon. 35 Exemple : Obtention de la fraction glycoprotéique à partir d'un lysat min-rrihign Le lysat obtenu à partir d'un litre d'un concentrât de cultures des souches suivantes : 16297 9 2043475 - Pneumocoques - Streptocoques - Micro coecu.s Gatarrhalis - Staphylocoques 5 - KLebsellia Pneumoniae - HemopMlus Influenzae 5x108/cm3 5x108/cm3 5x108/cm3 par addition de merthiolate sodique, est concentré sous -vide jusqu'à consistance sirupeuse, soit environ 160 cm3. 0e résidu est repris par environ 5 fois son volume d'acétone 10 glacéf.On recueille une fraction insoluble qui est introduite dans la cartouche d'un extracteur Sahxlèi.On épuise alors en continu cette fraction durant huit heures à l'acétone bouillante. Après épuisement à l'acétone, on procède à un nouvel épuisement à l'éther éthylique. La fraction solide ainsi dégraissée pèse de 15 20 à 30 g. Elle est sortie de la cartouche et séchée à 37e. On la met alors en solution dans l'eau distillée, de manière à réaliser une solution à 20 fo (poids - volume). Cette solution, maintenue à 4fiC pendant vingt-quatre heures, fournit un abondant précipité cristallin, constitué en majeure partie de phosphate et de sulfate de sodium. Le 20 liquide surnageant est recueilli par filtration. On procède alors à la déprotidation du filtrat, par chauffage à 1002C pendant trente minutes. Le précipité protéique est ensuite éliminé par centrifugation. Le liquide surnageant clair renferme essentiellement la fraction 25 glycoprotéique que l'on précipite par addition d'un mélange à parties égales d'alcool et d'acétone. Il apparaît un précipité floconneux qu'on laisse se développer pendant soixante-cinq minutes. 0e précipité est alors séparé par centrifugation et séché à 372C. On recueille ainsi 2 à 4 g de fraction glycoprotéique. 30 Cette fraction est purifiée par dissolution dans l'eau de manière à faire une solution à 20 et dialyse contre de l'eau. La solution ainsi obtenue est amenée à sec par lyophilisation. On obtient ainsi une fraction très purifiée pesant 1,4 g à 1,5 g. Par filtration d'une solution aqueuse de cette dernière 35 fraction sur cellulose Séphadex G- 200 et élution par une solution tampon à pH = 8 , on obtient 0,Î5 g environ de la fraction glycoprotéique purissime. Cette fraction, constituée d'à et de p-glycoprotéines lentes, renferme 20 fo d* hexoses combinés, Sa teneur en 16297 ,0 2043475 substances biurétagènes, évaluée par rapport à la sérum albumine prise comme substance de référence, est âe 10 Etude pharmacologciaue des composés de l'invention : 1/ Recherche du pouvoir allergisant ; 5 La recherche de l'action sensibilisatrice a été effectuée par la technique de Landsteiner. Trois lots de six cobayes ont reçu, par voie intradermique et pendant dix jours de suite : - Lot I : 0,05 ml d'une solution à 1 p.cent de fraction glycoprotéique pure 10 - Lot II s 0,05 ml d'une solution à 0,5 p.cent de fraction glycoprotéique pure. Les solutions ont été réalisées dans de l'eau bidistillée. - Lot III : 0,05 ml d'eau bidistillée. Après la dernière injection, les animaux ont été laissés au 15 repos pendant dix jours. Ensuite, ils ont reçu l'injection susceptible de déclencher la réaction allergique ou anaphylactique. Pour ce faire, la moitié des animaux de chaque lot a reçu, par voie intradermique, 0,1 ml d'une solution aqueuse de produit étudié à 1 p.cent, et, l'autre moitié, 20 pai* voie intraveineuse, 0,5 ml d'une solution de produit étudié à 0,5 p.cent. Chez les animaux traités par voie intradermique, on a examiné pendant les quarante-huit heures suivantes l'évolution du bouton dermique. Durant cette période, aucune réaction de type allergique 25 nea été observée qui, normalement, se manifeste par l'apparition de pétéehies ou de pustules. Aucune différence entre les animaux traités et les animaux témoins n'a été observée. Chez les cobayes traités par voie intraveineuse, on a examiné le comportement durant les trente minutes suivant l'injection et, 30 par la suite, jusqu'à la vingt-quatrième heure, on a recherché 18apparition éventuelle d'oedème de type anaphylactique. Aucun phénomène anormal n'a été observé, tant chez les témoins que chez les traités. On n'a observé ni oedème tant au niveau des pattes postérieures que de l'abdomen, ni inquiétude dans le comportement, ni 35 phénomène de dyspnée. Ces résultats permettent de conclure que, dans ces conditions expérimentales, le produit semble dénué de tout pouvoir allergisant. 69 16297 h 2043475 II/ Toxicité aiguë ï La toxicité aiguë a été déterminée sur trois espèces animales. Le produit étudié a été administré à des lots de souris, de rats et de lapins. Après huit jours d'observation et notation de la morta-5 lité éventuelle, on détermine graphiquement la DL ,-q : Animaux Toie d'administration DL50 Souris orale sous-cutanée supérieure à 1 g/kg supérieure à 500 mg/kg Bats intrapéritonéale supérieure à 200 mg/kg Lapins intraveineus e supérieure à 50 mg/kg III/ Toxicité subaiguë : Elle a été déterminée chez le rat et le lapin. A/ Chez le rat : 10 L'essai a été effectué pendant dix jours sur des rats femelles de souche Wistar, pesant entre 180 et 190 g» Le produit étudié a été administré en solution dans le sérum physiologique, à raison de 0,5 cm3 par 10Ô g de poids vif. Les animaux ont été divisés en quatre lots répartis de la manière suivante : 15 1er lot : animaux ayant reçu 100 mg/kg/24 heures du produit étudié par voie sous-cutanée 2ème lot : animaux ayant reçu 100 mg/kg/24 heures du produit étudié par voie intrapéritonéale 5ème lot : animaux témoins ayant reçu du sérum physiologique par 20 voie sous-cutanée 4ème lot : animaux témoins ayant reçu du sérum physiologique par voie intrapéritonéale. Les injections ont eu lieu tous les jours, six jours par semaine. 25 1 2) Observations -physiologiques : L'étude du comportement général des animaux n'a permis de mettre en évidence aucune symptomatologie particulière. On a noté un mort le dernier jour du traitements dans le lot témoin recevant par voie intrapéritonéale du sérum physiologique. 16297 12 2043475 22) Croissance pondérale : les animaux ont été pesés deux fois par semaine. On n'a noté aucune modification de la croissance pondérale des animaux. 3°) Examens hématologiques : 5 Avant et à la fin de 1'expérience, on a procédé à l'établisse ment de la numération globulaire et la détermination.de la formule leucocytaire ; on a noté seulement une augmentation des monocytes chez les animaux traités par voie intrapéritonéale. B/ Chez le lapin ; 10 L'essai a été effectué sur des lapins pesant de 1 800 à 2 400 g. Le produit étudié, utilisé en solution dans le sérum physiologique, a été administré par voie intraveineuse, à raison de 0,5 cm3 par kilogramme de poids vif et à la dose de 20 mg/kg. Les injections ont lieu tous les jours. 15 Pour chaque animal, la température rectale a été prise avant l'injection et une heure après. On note chez tous les animaux une augmentation de la température. Trois jours après l'arrêt du traitement, ces mêmes animaux ont reçu, par voie intraveineuse, une solution de sérum physiologique 20 dans les mêmes conditions. La température rectale, prise avant et une heure après l'injection, n'a pratiquement pas varié. La tolérance locale a été excellente. Les animaux, observés pendant plusieurs heures après les injections, n'ont révélé aucune symptomatologie particulière. 25 Les animaux ont été pesés tous les jours. On note une légère modification pondérale. IV/ Toxicité par voie pulmonaire : Les rats ont été traités quotidiennement par des séances d'aérosols de dix minutes, à l'aide d'une solution du produit étudié 30 à 1 °/oo dans le sérum physiologique et pendant quatre jours. Les animaux sont sacrifiés et on prélève les poumons et les bronches que l'on examine macroscopiquement et pèse à l'état frais et à l'état sec. Les animaux témoins ne reçoivent en aérosol que du sérum physio-35 logique. On n'a noté aucun signe d'altération d'oedème ou d'hémorragie, les pesées effectuées ont donné les résultats suivants s 69 16297 13 2043475 Lots Bronches Poumons Poids sec par 100 g Poids frais par 100 g Poids sec par 100 g Poids frais par 100 g Témoins 12 mg 45 mg 1 20 mg 560 mg Traités 11 mg 36 mg 110 mg 510 mg On constate, d'après ces résultats, que le produit étudié ne provoque pas, dans ces conditions expérimentales, l'apparition d'oedème ou de réaction d'intolérance locale ou générale. 5 V/ Tolérant 1 "fiai : On administre à des souris, par voie sous-cutanée, dans la région dorsale, le produit étudié à la dose de 50 mg/kg sous un volume de 0,2 cm3. Après quarante-huit heures d'observation, les animaux n'ont 10 présenté aucun signe d'intolérance locale ougénérale. A l'autopsie, on ne constate aucun signe d'inflammation dans le tissu sous-cutané et aucune différence avec des témoins n'ayant reçu que du sérum physiologique. La résorption est normale. VI/ Détermination de l'activité antiinflp-mmatoire : 15 1) Test_de 1 ' oedème_podal_à__la çarraghénine_; L'activité antiinflammatoire du produit a été étudiée par voies intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire et locale. On administre à des rats mâles pesant 130 à 150 g, 0,05 cm3 d'une suspension stérile à 1 de carraghénine dans l'articulation 20 tibio-tarsienne d'une patte postérieure. Le produit étudié a été administré quarante-huit heures, vingt-quatre heures, une heure avant, en même temps, et une heure après l'injection de l'agent phlobogène. Le volume de la patte est mesuré par pléfchy smographie, trois 25 heures, cinq heures ou vingt-quatre heures après le déclenchement de l'inflammation. La différence du volume des pattes des animaux traités et des témoins met en évidence l'action antiinflammatoire du médicament. Le tableau I suivant réunit les résultats obtenus. o* -o 1/ OEDEME PODAL A LA C A H E A 5 H E I II E VOIES ET POURCENTAGE DE REGRESSION PAR EAPPORT AUX TEMOINS DOSES ADMINISTREES Administration avant l'agent phlo'bogène Administration en même temps que Administrat ion 1 H. après 48 H 24 H 1 H l'agent phlo'bogène l'agent phlo'bogène VOIE INTRÀ~PERITQNEALE « 100 mg/kg » 50 mg/kg . 20 mg/kg 10 mg/kg. 52 * 43 % 32 $ 30 * 73 * 66 % 55 * 30 1> 41 t 72 "/» - 23 #** FOIS SOUS-OUTABEE | . 50 mg/kg 10 $> ** VOIE IJEDRA-MUSGUMIHE . 100 mg/kg . 50 mg/kg . 20 mg/kg » 10 mg/kg 41 ï - 18 #** 50 j> - 28 $** 40 % - 20 $>** 18 ^ - 10 #** 48 $> - 50 i> * VOIE LOCALE « 10 mg 70 # - 0 0 o K> -O -^1 K> O -t* OJ -fc» en , Mesures effectuées î * 5 H après le déclenchement de l'Inflammation — ~ "" ** 24 H " n " s„tous^Xss autres cas, mesures effectuées 3 H après le déclenchement de 69 16297 2043475 2) Test_dje 11 oedème_podal_au kaolin : L'oedème podal au kaolin a été réalisé dans les mêmes conditions que ci-dessus. Le produit a été administré par voie intrapéritonéale une heure avant et en même temps que l'agent phlo'bogène. 5 Le tableau II réunit les résultats obtenus .(voir page 16). 3) Test_du granulome au_coton : Ce test est effectué en utilisant une technique voisine de celle décrite par SINGER, Proceed. Soc. Exp. Biol. Med., 1956, %2, 23, et modifiée par ARTH, J. Jim. Chem. Soc., 1958, 80, 3161 . 10 Des rats femelles de 100 à 120 g reçoivent unç implantation sous-cutanée ventrale bilatérale de 4 pellets de coton de 5 mg environ. Le produit étudié est ensuite administré par voie intrapéritonéale, quotidiennement, à la dose de 100 mg/kg, pendant hait jours consécutifs, la première administration étant pratiquée immé-15 diatement après l'implantation. Le huitième jour, les rats sont sacrifiés, les pellets avec leur enveloppe de tissu de granulome sont excisés et pesés. Le poids du coton étant déduit, les poids des granulomes frais et secs, formés chez les rats traités, sont exprimés en pourcentage des poids des granulomes formés chez des rats témoins. 20 L'essai a été effectué en comparaison avec la deltacortisone administrée à la dose de 5 mg/kg, par voie intrapéritonéale. Les résultats obtenus sont groupés dans le tableau III suivant. III/ POIDS MOYEN DES GRANULOMES Lots Poids frais Poids sec Pourcentage de régression par rapport aux témoins Poids frais Poids sec Témoins 69 mg 16 mg Produit étudié 47,7 mg 12 mg 31 1o 25 % Deltacortisone 51,4 mg 12 mg 25 1° 25 % 25 4) Test_de 1 ' oedème_pulmonaire à l'acroléine î Des rats femelles, de souche Wistar, pesant de 180 à 200 g, sont soumis à des aérosols contrôlés d'acroléine. Les animaiy sont répartis en trois lots : 1er lot : animaux ne subissant aucun traitement 30 2ème lot : animaux ayant été soumis airs aérosols d'acrôléine o- vD o- . K? Il/ 0 E D E M E PODA-I AU KAOLIN «O — —; —,—,—* ' VOIE ET ; DOSES. ADMINISTREES POURCENTAGE.DE REGRESSION PAR RAPPORT AUX TEMOINS Administration 1 heure avant * 1* agent phlo'bogène Administration en même temps que l'agent phlobogène VOIE INTRA-PERITONEALE : ■65'# - 35#** 37 1» - 0#** ' 55 # - 28 ** 51 # 27 # ** i ' ■ 1 ' ; ■ . 100 mg/kg . 50 mg/kg Mesures à:3 H. > Messes À 24 B. i; g " - . w -Ci *-4 en '"5 16297 17 2043475 3ème lot : animaux ayant subi, durant quatre jours, une séance de dix minutes, d'aérosol par jour, d'une solution de produit étudié à 1 °/6o dans le sérum physiologique+ puis soumis à des aérosols d'acroléine. Vingt-quatre heures après le traitement, les animaux sont sacri-5 fiés, autopsiés. On prélève les poumons et les bronches que l'on pèse à l'état frais, puis à lrétat sea et on détermine le poids pour 100 g de poids vif. Les résultats obtenus ont été les suivants r Lots Poumons Bronches Poids frais en mg/100 g Poids sec en mg/tOO g Poids frais en mg/100 g Poids sec en mg/100 g 1er lot 528,6 m,4 38,8 11,9 2ème lot 797,7 I66,t 44,8 12,6 3ème lot 638,9 144,2 54,5 15,1 10 On constate, d'après ces résultats, que le produit étudié fait régresser de façon très importante lroedème pulmonaire à l'acroléine, étant administré préventivement sous forme d'aérosols, à de très faibles concentrations. On ne note pas d'action sur l'inflammation bronchique. 15 5) £est_de l'oedème "codai à 1*hémolysine a r On déclenche dans la patte d'un rat un oedème escarriforme, par injection de 0,1 cm3 d'une solution titrant 10 ÏÏ.I. d'hémolysine a de staphylocoçaé par cm3. Dans les premières heures suivant l'injection, on observe l'apparition d'un important oedème qui 20 s'aggrave ultérieurement et se complique,après vingt-quatre heures, d'hémorragies tarsiennes et d'escarres hémolytiques. Lesaet p-glyco-protéines lentes sont administrées avant ou après l'injection d'hémolysine a, par voies intrapéritonéale, intramusculaire ou locale. Les mesures de la patte sont effectuées trois heures, cinq heures, 25 vingt-quatre heures et quarante-huit heures après l'injection. Les résultats sont réunis dans le tableau V suivant. o> sO V/ OEDEME PODAIi A I' H E M 0 I ï S I N 1 cr- ro O ^4 POURCENTAGE DE REGRESSION PAR RAPPORT AUX TEMOINS VOIES ET DOSES ADMINISTREES Administration avant injection d'Hémolysine Administration après injection d'Hémolysine 7 jours 24 H 1 H 1 H 3 H VOIE INTRA-PERITQNEALB a-p-glycoprotéines lentes . 100 mg/kg 12 $É ** ¥01? INTIUL-MtJSCUIÀXHE oc-P-glycoprotélnes lentes . 50 mg/kg 15 * * 13 $ - 14^** VPDS LOCALE Ot-^-glycoprotéines lentes , 10 mg/kg 25 i - 31 # * 52 49 # » 84 # ** 85 # *** Mesures effectuées à s J heures * 5 heures **24 heures ***48 heuree O u> v 69 16297 2043475 6) Activité_antiirflammatoire_par_v'oie rectale : On, administre par voie rectale à des lots de rats maintenus /heures . . . vingt-quatre/à jeun, une solution de çt-{3-glycoprotéines lentes émulsionnées dans un mélange de triglycérides oléiques polyoxy-5 éthylénés (commercialisé sous le nom de Labrafil 1944/G). Chaque a nimal, reçoit 0,5 cm3 de la préparation correspondant à 100 mg/kg. Après le lavement, l'anus est obturé par une solution éthérée de collodion ; le produit étudié est administré, une heure avant l'injection podale d'une solution aqueuse à -1 -: î quatre heures après l'injection phlo'bogène. • -• * _ Le tableau suivant réunit les résultats- obtenus : Temps Pourcentage de régression par-rapport aux témoins 2 H 27,7 ' . 3 H 34,5 4 H 26 5 H 13,5 ; 24 H 15. • ; • On constate que l'administration du produit étudié, par voie 15. ï®0t«!Le,permet d'obtenir un net effet antiinflammatoire vis-à-vis de l'oedème podal à la carraghénine. 7) Acti^té_antiinfl^mato.ire_par_voie pulmonaire : Des rats ont subi pendant trois jours consécutifs, une séance d'aérosols de dix minutes, d'une solution du produit étudié à 20 1 9/oo dans le sérum physiologique. Après la dernière: séance, on provoque chez les animaux traités, un oedème podal à la carraghénine dont on suit 1'évolution par rapport à des animaux témoins. La mesure de la patte est effectuée deux, trois, quatre et cinq heures après l'injection phlobogè;ne. 25 -, Les résultats obtenus ont :été lés suivants 69 16297 20 2043475 - Temps Pourcentage de régression par rapport aux témoins 2 H • 40 3 H 35,5 4 H 30 5 H. 28 ' " ' " On constate que l'administration,par voie pulmonaire, de doses très faibles de produit étudié, provoque une régression importante de l'oedème podal à la carraghénine. 5 8) Conclusions : Le produit étudié possède un pouvoir antiinflammatoire considérable aussi bien à titre préventif que curatif. Oette action est aussi nette par voie intrapéritonéale que par voie intramusculaire ou locale. 10 On note également l'importante action vis-à-vis de l'oedème podal à l'hémolysine a, surtout à titre préventif. Cette action persiste plus de neuf jours après l'injection locale. On note, de même, l'activité antiinflammatoire par voie rectale et par voie pulmonaire vis-à-vis du test à l'acroléine. 15 9) Pouvoir immunitaire : Le pouvoir immunitaire a été recherché sur la souris inoculée, avec une suspension de streptocoques pyogènes A, souche 5-61 digonnet 7. La culture est faite en bouillon glucose tamponné en streptocoques. Les suspensions sont ajustées par néphélométrie, 20 suivant la technique classique. La préparation est administrée aux animaux, par voie intrapéritonéale, à la dose de 100 mg/kg, en solution aqueuse ajustée pour une injection de 0,5 cm3/20 g. Le produit étudié a été administré vingt-quatre et quatre-vingt-25 seize heures avant l1 inoculation. Les dilutions de streptocoques suivantes ont été utilisées : 10""^, 10~^, 10~8, 10"^ et 10~11. On a obtenu les résultats suivants : 16297 21 2043475 Pourcentage de mortalité à Lots 24 heures 96 heures 10"6 10"7 io-8 10~9 10"11 10~9 10 11 Témoins 100 100 9° 70 50 80 50 Traités 70 60 50 40 0 50 0 Les survies ont été observées durant les huit jours consécutifs de manière à vérifier que les résultats des quatre-vingt-seize heures étaient bien constants. 5 La préparation ne comporte pas de pouvoir antibactérien en elle- même. On note donc un pouvoir immunitaire important puisqu'une DL^q est ramenée à 0 et que les Eïj-jqq sont elles-mêmes ramenées aux environs de la DL^q. 16297 22 2043475 REVENDICATIONS 1 ) les ce et -p-glycoprot éines lestes extraites de corps microbiens de pneumocoques, micrococci streptocoques, Neisseria, staphylocoques, Klebsellia pneumoniae ou Hemophilus Influenzae, ou à partir d'un 5 mélange de deux ou plusieurs de ces germes ou d'une association de différents types d'une même espèce microbienne par lyse chimique, physique ou diastapique des corps microbiens et extraction du contenu cellulaire microbien. 2) Les a et -j3-glycoprotéines lentes définies selon 1) renfermant 10 entre 4 et 20 $ d'hexoses combinés et présentant un volume molé-V© culaxre sur séphadex G 100 compris entre 2,5 et 3 par rapport à un tampon de pH = 8. 3) Les a et ~0-glycoprotéines lentes définies selon 1) et 2) pré-sentant en outre un rapport 00"I,ris entr" 15 0,25 et 2. 4) L1application à la thérapeutique des composés selon les revendications t) et 3) et notamment en tant que médicament antiinflam-matoire et immunisant «. 5) Un procédé de préparation des composés selon 1) dans lequel on 20 cultive sur milieu solide ou liquide une souche microbienne choisie dans le groupe constitué par des pneumocoques, streptocoques, Neisseria, stap&ylocoques micrococci, Klebsellia pneumoniae et Hemophilus Influenzae ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches ou. d'une association des différents types d'une de ces 25 souches, récolte, après plein développement les corps microbiens de façon manuelle ou automatique, remet les corps microbiens en suspension dans un milieu aqueux, procède à la lyse du corps microbien par voie chimique, physique ou enzymatique, sépare les débris de corps microbiens par les moyens physiques usuels, amène à sec la 30 solution claire ainsi obtenue, soumet le résidu sec à l'action d'un o& plusieurs solvants des lipides, remet en solution dans un solvant aqueux le produit délipidé que l'on débarrasse des protides par des moyens physiques ou chimiques, sépare la précipité de protides ainsi foiraé,précipite sélectivement du résidu déprotide #s milieu 35 aqueux les glycoprotéines lentes par addition d'un solvant ou d'un mélange de solvants miscibles à 1 'eau at parifie si nécessaire par les techniques iisus 12.es de la biochi^îs 16297 23 2043475 6) Un procédé selon 5) dans lequel la lyse des corps microbiens est effectuée par un agent tensio-actif comme par exemple un sorbate de polyéthylèneglycol. 7) Un procédé selon 5) dans lequel la lyse des corps microbiens est 5 effectuée par un agent bactéricide comme par exemple un composé organo mercuriel. 8) Un procédé selon 5) dans lequel la lyse des corps microbiens est effectuée par un moyen physique tel qu'ultra-sons ou rayonnement pénétrant. 10 9) Un procédé selon 5) dans lequel la lyse des corps microbiens est effectuée par un enzyme protéolytique comme par exemple la papaïne, la bromélaïne ou l'a-chymotrypsine ou par un enzyme polymuco-saccharolytique comme par exemple le lysozyme ou la hyaluronidase. 10) Un procédé selon 5) dans lequel la délipidation du lysat micro-15 bien est effectuée par un ou des solvants oxygénés comme par exemple l'éther ou l'acétone. 11) Un procédé selon 5) dans lequel la déprotidation du résidu délipidé est effectuée en milieu aqueux par un moyen physique comme par exemple par chauffage. 20 12) Un procédé selon 5) dans lequel la déprotidation du résidu délipidé est effectuée par un acide minéral ou organique aqueux à un pH compris entre 5 et 6. 13) Un procédé selon 5) dans lequel la précipitation sélective des glycoprotéines lentes est effectuée en milieu aqueux par addition 25 d'un solvant ou d'un mélange de solvants miscibles à l'eau. 14) Un procédé selon 5) dans lequel la purification des glycoprotéines lentes est effectuée par dialyse, électrophôrëse ou ehromatographie. 15) les formes pharmaceutiques contenant comme principe actif les 30 composés selon 1) et un excipient adapté pour l'administration par voie percutanée, transcutanée, perlinguale, topique ou permuqueuse. 16) Les formes pharmaceutiques contenant comme principe actif les composés selon 1) et un agent assurant une meilleure diffusion dans les tissus. 35 17) Des modes d'exécution du procédé selon 5) caractérisés par les points suivants : a) la culture microbieme est effectuée sur milieu solide à base de gélose nutritive, • 16297 2043475 b) la récolte des corps microbiens est faite manuellement c) la lyse des corps microbiens est effectuée par addition d'un agent tensio-actif d) la délipidation est effectuée par épuisement à l'éther 5 e) la délipidation est effectuée par épuisement à l'acétone f) la déprotidation est effectuée par chauffage à 1002C g) la déprotidation est effectuée par acidification à l'acide trichloracétique h) la précipitation sélective des glycoprotéines lentes est effectuée 10 par addition à la solution aqueuse d'un mélange d'alcool et d'acétone. i) le mélange d'alcool et d'acétone est ajouté à la solution aqueuse dans des proportions qui peuvent varier entre 1 et 20 volumes de solvants pour 1 volume de solution aqueuse. 15 j) les glycoprotéines lentes sont purifiées par dialyse sur une membrane de cellulose.