Brevet FR2052968A1 — publié le 19710416

-1- 2Q52968 . 11enhygrofungine (U-29,479) est uzl composé chimique amphotère non-polyénique, qui peut être produit par culture d'un actinomycète engendrant 1*enhygrofungine dans un milieu nutritif aqueux. Il possède la propriété de contrarier la 5 croissance de bactéries Gram-positives,par exemple Staphylococ-cus aureus,Streptococcus hemolyticus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis.et Diplococcus,pneumoniae. De même, l'enhy-grofungine possède une bonne activité antifongique contre divers champignons, par exemple, Blastomyces dermatitidis. Gocci-10 diodes immitis, Phialophora verrueosa, Cryptococcus neoformans et Histoplasma capsulatum. Par conséquent, 1*enhygrofungine peut être utilisée seule ou en combinaison avec d'autres agents antibiotiques pour inhiber la croissance ou réduire le nombre de bactéries et de champignons, comme décrit ci-dessus, dans 15 divers milieux. Par_exemple, elle peut être utilisée comme agent antifongique dans les tiges de chaussures, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 130 505» L'enhygrofungine est considérée comme étant un composant de lsendomycine qui est un complexe antibiotique polyénique con-20 nu. Un procédé de préparation du complexe d!endomycine et la caractérisation de ee composé sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2 746 902. L*enhygrofungine, composé non-polyénique, n'est pas décrite dans le brevet nù 2 746 902 précité comme étant un composant du complexe d!endomycine. Par 25 conséquent, il n'existe pas de description des propriétés de 1'enhygrofungine ni de la manière dont on peut isoler ce composé du complexe d'endomycine. Bien qu'il soit connu dans le domaine des antibiotiques que le complexe d'endomycine possède une bonne activité antifongique, ce complexe n'a pas été utilisé en méde-30 cine du fait que sa préparation n'a pas pu être normalisée. La préparation du complexe drendomycine varie en fonction de la quantité de tout composant particulier du complexe qui est présent. La possibilité d'obtenir une normalisation de la préparation du complexe d'endomycine décrit dans le brevet n° 2 746 902 35 précité, qui puisse s'appliquer à des fins médicales, a donné lieu aux travaux qui ont abouti à la découverte du composé conforme à l'invention. Contrairement aux complexes polyéniques non bad original 70 2l733 2052968 cristallins de 1*endomycine, 1'enhygrofungine est une entité cristalline non-polyénique qui est très reproductible et qui, par conséquent,peut être normalisée à des fins médicales, les conditions de fermentation, y compris le microorganisme, décrites 5 ici, constituent un net -perfectionnement par rapport à ce qui a été décrit dans le brevet n° 2 746 902 précité, pour la production de plus grandesquantités de l1enhygrofungine dans le complexe d®endomycine. L1enhygrofungine cristalline possède les propriétés 10 chimiques et physiques suivantes : ' c ouleur : blanche analyse élémentaire : trouvé :C = 60,95 ; H = 9»00 ; N = 4.01 ; 0 = 26,46 résultats du titrage s dans l'acide acétique cristallisa-15 ble, avec l'acide perchlorique, poids équivalent = 1268 (titrage impossible dans le tertio-butanol avec la pyri-dine ) » rotation optique : [œî^ = -,-20° (c, 0,5 $ dans le diméthyl- & formamide). 20 solubilités : 1 'énhygrofungine est soluble à 'on taux infé rieur à 5 mg/ml dans" l'eau, l'acétone, l'aeetat- d'ethyle, la méthyléthyleéicrie, le chlorure de méthylènef le chloroforme, le "butanol et l'éther, Elle est soluble à une concentration supérieure à 10 mg/ml dans le méthanol, l'étha-25 nol5 le n-propanol, l'acide acétique cristallisable, le mélange acétone-eau (3*2), et le 1-butanol saturé d'eau. Point de fusion ; 119,3°C spectres d8 absorption ultraviolette : méthanol s inflexion à 227 mp, a =25,77 \ 30 maximum à 231 mp., a =27,22 légère inflexion à 240-mp, a = 17» 74 HC1 0,1 F dans le méthanol : 'inflexion à 226 mu, a = 25,96 maximum à 231 mp, a = 27,34 légère inflexion à 240 mp, a = 17»97 35 K0H 0,1 N dans le méthanol : inflection à 227 mp, a = 25,70 maximum à 231 mp, a = 27,17 légère inflexion à 240 mp,, a = 18,02 BAD ORIGINAL 70 21733 -3- 2052968 Spectre infra-rouge : le spectre d'absorption infra-rouge de l'enhygrof ungine en suspension épaisse dans une huile minérale est reproduit sur la figure 1 des dessins annexés. L*enhygrofungine montre des pics aux longueurs d'ondes 5 suivante s, exprimée s en centimètres réciproques (cm ^) : 3340 (S) 1375 (S) (huile) 982 (S) 2950 (S) (huile) 1295 (M) 940 (¥) 2845 (S) (huile) 1250 (M) 917 (w) 1720 (S) 1135 (S) 865 (W) 10 1660 (S) 1087 (S) 855 (¥) 1640 (S) 1063 (S) .840 (¥) 1590 (S) 1055 (S) 718 (W) (huile) 1460 (S) (huile) 1027 (M) Le spectre d'absorption d!infra-rouge de 1®enhygrofungine 15 dans le bromure de potassium, à partir de .chloroforme, montre des pics aux longueurs d'ondes suivantes, exprimées en centimètres réciproques : 3370 (S) • 1640 (S) 1135 (S) 3200 (S) 1595 (S) 1085 (S) 20 2980 (S) 1455 (S) 1060 (S) 2930 (S) 1415 (S) 1025 (Ep) (S) 2890 (S) 1380 (S) 985 (S) 1715 (S) 1275 (large).(S) 915 (M) 1660 (S) 1180 (M) 845 (M) 25 Les intensités des bandes d'absorption infra-rouge, dans toute la présente description, sont exprimées par les lettres "S", "M" et "W" respectivement, et elles sont exprimées par des valeurs approchées en fonction des fonds au voisinage des bandes. Une bande "S" est du même ordre d'intensité que la bande la plus 30 forte du spectre ; des bandes "M" se situent entre un tiers et deux tiers de l'intensité de la bande la plus forte et des bandes "V" ont une intensité inférieure au tiers de celle de la bande la plus forte. Gès estimations sont faites sur la base d'une échelle de pourcentage de transmission. De même, la dési-35 gnation "Ep" apparaissant derrière la valeur lue d'une bande caractérise une bande du type à "épaulement-". 70 21733 -4- 2052968 Chromâtogramme : le diagramme de chromâtographie sur papier de 1* enhygrof ungijie dans les systèmes suivants de solvants est illustré sur la figure 2 des dessins : 1. 1-butanol, eau "(84:16), 16 heures 5 2. 1-butanol, eau (84:16) + 0,25 % d'acide ^-toluène sulfonique, 16 heures 3. 1-butanol, acide acétique, eau (2:1:1), 16 heures 4. pipéridine h. 2 fa (volume/volume) dans le 1-butanol, eau, (84:16), 16 heures 10 5. 1-butanol, eau (4:96), 5 heures 6. 1-butanol, eau (4:96), + 0,25 f° d'acide ^-toluène sulfonique, 64 heures. Le microorganisme S. cerevisiae utilisé dans l'analyse chromâtographique sur papier a été cultivé dans un milieu à la 15 gélose contenant les substances nutritives suivantes : &tk dextrose 10,0 extrait de levure 2, 5 phosphate monopotassique 1,0 20 gélose 17,5 PH - 5,65 ± O,1 Résonance magnétique nucléaire (B.NM) : (également appelée résonance magaétique des protons) L'enhygrofungine a un spectre EMET caractéristique comme 25 le montre la figure 3 des dessins annexés. Le spectre EMU a été observé sur un spectromètre du type Yarian A-60 sur une solution (environ 0,5 ml, concentration d'environ 15 i°) de l'échantillon d'enhygrofungine dans du diméthylformami-de deutéré. Le spectre a été étalonné par rapport au té-30 traméthylsilane interne et la précision de Àv est supé rieure à plus ou moins 1 Hertz. Les fréquences sont enregistrées en Hertz dans un champ décroissant, en utilisant le tétraméthylsilane comme substance de référence. Propriétés antibactériennes de l1enhygrofungine 35 L'enhygrofungine est douée d'activité antibactérienne com me le montre le tableau suivant. L'essai est un essai de dilution double dans un bouillon d'infusion cerveau-coeur 70 21733 -5- 2052968 dans lequel on effectue une dilution finale d'une culture entièrement développée dans l'infusion cerveau-coeur de 1/40.000. les organismes qui nécessitent du sang sont cultivés dans ce milieu, mais l'essai antibiotique final 5 est effectué en l'absence de sang, car on a constaté que le développement convenable s'obtient sans lui. L'incubation est effectuée au repos à 37°C. Les lectures finales sont effectuées au bout de 20 heures. Le bouillon d'infusion cerveau-coeur (Difco) présente 10 la composition suivante : cervelles de veau, infusion de 200 g coeur de boeuf, infusion de 250 g peptone protéose, Difco 10 g dextrose Bacto 2 g 15 chlorure de sodium 5 g phosphate disodique 2,5 g eau 1 000 ml Concentration inhibitrice Organisme expérimental - minimale fug/ml) 20 O Staphylococcus aureus 8,0 *Streptoeoceus hemolytiens 31 ,0 Streptococcus faecalis 31,0 Bacillus subtilis 4,0 *Diplococcus pneumoniae 16,0 ^ * nécessite du sang pour son développement. L1enhygrofungine est douée d'activité contre la levure Saccharomyces pastorianus dans 1•essai mentionné ci-dessus, à une concentration inférieure à 0,5 p-g/ml. Spectre antifongique de 1'enhygrofungine : L'enhygrofungine a une activité antifongique correspondant au tableau suivant. Le spectre antifongique a été déter-miné au moyen de l'essai de dilution sur plaque de gélose décrit plus loin. BAD ORIGINAL 7U J-> -6- 2052968 Organisme d'essai 10 Concentration en enhygrofungine en ug/l 10 1 .0 + O cr y Nocardia asteroides Blastomyces dermatitidis Coccidiodes immitis G-eotrichum sp. Hormodendrum compactum - Phialophora verrueosa Cryptoeoeeus neof oriaans HiscoPlasma capsulatum :richum schenekii apiospermum Triehophyton rubrum Trichophyton interdigitale Candida albieans ABBOTT - Trichophyton violaceum "ton mentagrophytes " canis Trichophyton asteroides Remarque ; - = inhibition + = inhibition partielle -- = pas d'inhibition -Le composé expérimente est incorporé dans de la gélose contenue dans des boîtes de Pétri à des concentrations de 1000; 100, 10, 1 et 0,1 ug/al. Des suspensions des champignons ^ j-s. surface de la géloge^ Des témoins ont oralement ensemencés en stries avec + + ± + 0,1 + + + + + + + + + + + + + + + + son'c î.ppj.j-quees sa à "b? gexose 'OuVi 30 l'organisas cï3essai. Âpres 1 •'incubation (72 heures à 28°C), on examine les plaques et on note le degré d'inhibition de croissance des organismes d'essai.Les résultats sont exprimés par la quantité, en (ig/ml, capable d'inhiber la croissance des organismes d'essai » (^ ^La gélose utilisée présente la composition suivante : bador5gihau 70 21733 _7_ 2052968 Bacto-dextrose Difco 10 g Bacto-peptone Difco 5 g Extrait de levure Difco 1 g eau tri-distillée, quantité suffisante pour 1 litre 5 pH 6-8 gélose 15 g l'actinomycète utilisée conformément à l'invention pour la production de 1*enhygrofungine est Streptomyces hygroscopicus var. enhygrus. L'une de ses caractéristiques typiques est la 10 production d1enhygrofungine. Une sous-culture de l'organisme vivant a été déposée sans restriction dans la collection permanente (où elle est disponible) du Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, Etats-Unis d'Amé-15 rique. Elle s'y trouve sous le numéro matricule ïffiRl 3664. le microorganisme de l'invention a été étudié et caractérisé par Aima Dietz, laboratoires de recherches de la firme The Upjohn Company. Streptomyces hygroscopicus var. enhygrus est un microor-20 ganisme nouveau isolé du sol, appartenant au genre Streptomyces, qui diffère de l'espèce typique Streptomyces hygroscopicus CBS (Centraalbureau voor Schimmel) par certains caractères,notamment par le fait qu'il produit l'antibiotique appelé enhygrofungine, et de l'espèce typique Streptomyces endus HRRI 2339 par ses ca-25 ractéristiques de culturel On a trouvé que Streptomyces endus possède les caractères principaux du type hygroscopicus [H.D. Tresner et E.J. Backus, "Applied Microbiol." 4:243-250 (1956)], [A. Dietz et J. Mathews, "Applied Microbiol." 10:258-263 (1962)]. Des caractères distinctifs de moindre importance de la variété 30 nouvelle sont donnés sur les tableaux suivants. Streptomyces hygroscopicus var. enhygrUs est comparé à l'espèce typique Streptomyces hygroscopicus, (Jensen) Waksman, CBS, et à l'espèce typique Streptomyces endus ÏÏRR1 2339- Caractéristiques de couleur. Croissance aérienne allant 35 de blanc à blanc-grisâtre- ou de crème grisâtre à gris. Plaques humides hygroscopiques de couleur noire sur certains milieux. Réaction négative à la mélanine, l'aspect sur Ektachrome est 70 21733 -8- 2052968 donné sur le tableau I. Les caractéristiques de couleur de référence sont données sur le tableau II. Les cultures peuvent être placées dans la série de couleur du blanc (W) et du gris (G-Y) de Tresner et Backus [Applied Microbiol. .U_:335-338 (1962)]. 5 Caractéristiques microscopiques. Sporophores en spirales serrées. Spirales des sporophores au sens de Pridham et Collaborateurs ["Applied Microbiol." 6:52-79 (1958)]. Spores formant fréquemment des plaques hygroscopiques de couleur foncée. Spores lisses à surface irrégulière, parfois verruqueuse, à l'examen 10 direct au microscope électronique. Surface des spores en forme de morille à l'examen par la méthode de reproduction au carbone de Dietz et Mathews ["Applied Microbiol." J_0:258-263 (1962) ; "Applied Microbiol." J_6:935-941 (1968)]. Caractéristiques de culture : voir tableau III 15 Utilisation du carbone. L'aptitude de la culture à se dé velopper sur des composés du carbone a été déterminée dans le milieu synthétique de Pridham et Gottlieb ["J.Bacteriol." 56:107-114 (1948)], et dans leur milieu modifié [E.B.Shirling et D. Gottlieb, "International Journal of Systemic Bacteriology" 1_6:313-340 (1966)]. 20 Voir tableaux IV et V. Température. Toutes les cultures se développent d'assez bien à bien à des températures de 18 à 27°C sur le milieu de Bennett, le milieu au saccharose de Czapek et des géloses au maltose et à la tryptone. Des traces de légère croissance 25 végétatives apparaissent en 24 heures à 55°C. Les caractères de Streptomyces hygroseopicus var. enhygrus var. nova, ÏÏRRL 3664, sont donnés sur les tableaux suivants : Tableau I Aspect des cultures de S .-hygroscopicus sur Ektachrome Tableau II Caractéristiques de couleur de référence de cultures de S. hygroscopicus Tableau III Caractéristiques de culture de S. hygroscopicus Tableau IV Utilisation des composés du carbone dans le milieu synthétique de Pridham et Gottlieb Tableau V Utilisation des composés du carbone dans le milieu modifié de Pridham et Got-tlieb TABLEAU I VI O 03 > O O 33 O 2 É Aspect des cultures de S. Hygroscopicus sur Ektachrome* Milieu à la gélose S. hygroscopicus var. enhygrus P • hygroscopicus CBS S. endus NRRL 2339 Milieu de Bennett S Gris .blanc-gris gris D tan-jaune jaune tan Saccharose de Czapek' S gris gris blanc-gris D gris gris gris-jaune Maltose-tryptone S traces de traces de traces de blanc-gris blanc-gris blanc-gris D j aune jaune jaune Peptone-fer S ». traces de blanc-gris D jaune jaune jaune Tyrosine à 0,1 $ S traces de traces de traces de blanc-gris blanc-gris blanc-gris D rouge rouge crème-rose pâle Caséine-amidon S gris gris blanc D gris gris jaune pâle * A.Dietz, "Ektachrome Transparencies As Aids In Actinomycete Classification", "Annals of the New York Acad. of Sciences", 60:152-154* 1954. S = surface D = dessous ro M V,! O i vo I ro o vji N> VD ON co TABLEAU II Caractériel,! que s de couleur do référence do cultures de S. hygroscopicus !> D O 2 d z > Milieu à la gélose "Color Harmony Ma hy gr o r oopic u s nual"3ème édition r-"~~ hygroscopicus 19481 —-g^— endus KREL 2339 "NBS —ïïT-~ var. enhygrus Circular 553"» S. hygroscopicus 19552 S. endus j var. entevgrus CBS CBS - NRB.L 2339 •Milieu de Bennet S .D • P b*(m) 2gc (m) Ife (g) gçnc (g) 12®c(g) ! 3'»'® (m) 1 f e (m ) ' 25 g (m) . 2ge(g.) 21 «(g),. . c (g ) -c(g) 264g . 90gm " 112m, 122g 90gm 90gm 110g, 112m 94m, 109 gm 91 gm# & •Saccharose de 5 Czapeck d P 2fe(g) 2dc(g) 94g, I12gm 93 gm 63 gm 112m, 122g _4_ 2Ô4gm 264 gm •Maltose- -S tryptone D P b (m) lca(g) 2eb (m ) 2ec (g ji IsIT 263m, 264g 104g, 12im 92m, 93gm 90gm u 121m 92m, 93m Extrait de levu- S re, extrait de D malt (ISP-2) P 2fe(g) 2gc(g) icCm)" ldc (m) 2gc (m) 2gc (g) 3fe (m ) 21 e (m ) 2gc(f|) 94g, 112gm 90gm 121m, 122g i- 121m, 122g 90gm 90gm 1 ..j 63gm 91 gm, 94g, 105g 90gm Farine d'avoine S (ISP-3) D. P ûiil (m) 3fe(g) 2dc (g). 2fe (g) 2dc(g) ldc (m) ldc (m) lige(g) lca(g) T 63gm 93gm •* 94g, H2gm 93 gm 121m, 122g 121m, 122g 102g, 105gn1 104g, ; 121m i V'' c rv; K*- ■ v,'. U; U''- o l\D O U1 rv> vo os CD TABLEAU II (suite) Milieu à la gélose 1 "Color Harmony Manual','3ème édition 1948 "NBS Circular 553" 1955^ S. hygroscopicus S-. hygroscopicus entlus S. hygroscopicus S. hygroscopicus % endus 59 var. ennygrus CBS NRRL 2339 var. enhygrus CBS îffifil 23: Sels minéraux- S amidon (ISP-4) D P 3fe(g) 2cb im( lcb(m) 2fefg) 5fejg) 2dc(g) lcb(g) 2gc(m) lîec(m) ôjgm 92m, 93gm 121 gm 94g, 112gm 63 gm 93gm I21gm 90gm 90gm, 93m, ŒLycérol-aspara- S gine (ISP-5) D P 2fe (m) 2gc (g) m b(m) 2cb (m) ■ 2cb(m) lca(g) 94g, 112gm 90gm 263m, 264g. 92m, 93gm 92m, '93gm 104g, 121m VI O ro i-* vj V>1 UJ S = surface D = dessous P = pigment (m) = mat (g) = brillant 1 E.Jacobson, W.O. Granville et C.E. Foss, 1948, "Color harmony manual", 3ème édition , Container Corporation of America, Chicago, Illinois. 2 K.l.Kelly et D.B. Judd, 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors and dictionary of color names", Ministère du commerce des Etats-Unis d'Amérique, Circulaire 553° * les noms des couleurs sont donnés sur le tableau suivant. ro o ui ro vo o\ oo Code de couleurs relatif au Tableau II "Color Harmony Manual î^ème édition,1948 "NBS Circular -553", 1955 Echantillon de Nom dé la couleur Echantillon de Nom de la couleur couleur couleur b blanc nacré 263 m blanc • 264 g gris clair c gris clair 264 gm • gris clair 1 ca j aune pâle 104 g jaune verdâtre pâle 121 m vert-jaune pâle 1 cb parchemin 121 gm vert-jaune pâle .1 de mastic, grège 121 m vert-jaune pâle 122 g vert-jaune grisâtre 1 ec gris-jaune citron clair, 121 m vert-jaune pâle mastic 122 g vert-jaune grisâtre' 1 f e grège, gris-jaune citron 112 m gris-olive clair 122 g vert-jaune grisâtre 1l/2gc jaune poudreux 102 g jaune légèrement verdâtre ' 105 m jaune verdâtre grisâtre 1 !/2ec mastic 90 gm jaune grisâtre 93 m gris jaunâtre 2cb ivoire 92 m blanc jaunâtre 93 gm gris jaunâtre 2dc ficelle naturelle 93 gm gris jaunâtre 2ec / j biscuit, ecru, farine d'avoine, 90 gm jaune grisâtre sable 2fe gris caché 94 g brun-olive clair I 112 gm gris-olive clair Code de couleurs relatif r-u Tableau IX ( suite ) "Color Harmony ManualÏ3ème édition, 1948 "NBS Circular 553", 1955 Echantillon de couleur Nom de la couleur Echantillon couleur de Nom de la couleur 2gc bambou, chamois 90 gm jaune grisâtre 2ge tan caché, grège 94 109 m gm brun-olive clair olive grisâtre clair 2ie tan-moutarde clair 91 94 106 gm g g jaune grisâtre foncé brun-olive clair olive clair 2ig tan-ardoise 110 112 g m olive grisâtre gris-olive clair 2m1 (m) 3fe gris argenté 63 gm gris brunâtre clair VI G ro Vj*i VXi V>1 I en > o 0 33 1 I ro o vn ro vo os 00 l T A 13 L .S A U i 1 I Caractéristiques de culture de S* 1 soopicus CD > O O s o z £ | S- hygroscopicus var. S. hygroscopicus | S. endus Milieu à la gélose enhygrus CBS NRRL 2339 Peptone-fer S Traces de blanc Très légères traces de Blanc-gris pâle blanc. D Tan-jaune Tan-jaune Tan-jaune P Négatif &' 1m mélanine Négatif à la mélanine Négatif à la mélanine Malate de S Traces do nlanc Traces de blanc Traces de blanc calcium D Incol ore Incolore Incolore P Néant Néant Néant 0 Malate non solubilisé Malate non solubilisé Malate non solubilisé Glucose- S Blanc-gris Blanc-gris Blanc-gris pâle asparagine D Gris-crème Crème Rose-jaune P Néant Néant Néant Lait écrémé S Blanc-rose-gris Blanc-rose-gris Légèrement blanc-gris D Tan-rose-jaune Tan-rose-jaune Jaune P Rose-jaune Rose-jaune Jaune 0 Caséine solubilisée autour Caséine solubilisée autour Caséine solubilisée de la zone de croissance de la zone de croissance Tyrosine S Gris Gris Blanc-gris Ii Tan^rouge Tan-rouge Jaune P Tan-rouge Tan-rouge Jaune pâle 0 Tyrosine solubilisée Tyrosine solubilisée Tyrosine solubilisée Xanthine S Blanc-gris Traces de blanc-gris Blanc-gris D Jaune pâle Jaune pâle Jaune P Néant Néant Néant 0 Xanthine non solubilisée Xanthine non solubilisée Xanthine non solubilisée N , C K h-' v-, V -p*- i f=> VO Os TABLEAU 111 | suite) Milieu à la gélose S. hygroscopicus var. S. hygroscopicus S. endus enhygrus CBS NRRL 2339 Extrait de levure- S Blanc-gris-crème avec des Blanc-gris-crème avec des Blanc-gris-crème extrait de malt taches noires d'humidité taches noires d'humidité D Olive-jaune Olive-jaune Brun-gris P Néant Néant Néant Amidon-caséine S Gris Gris Gris D Gris Gris Gris P Néant Néant Néant 0 Amidon hydrolysé Amidon hydrolysé Amidon hydrolysé Amidon nutritif S Blanc Blanc Blanc D Crème Crème Crème P Jaune pâle Jaune pâle Jaune pâle 0 Amidon hydrolysé Amidon hydrolysé Amidon hydrolysé Dextrose de S Blanc Blanc Blanc Sabouraud D Orangé-1an-j aune Orangé-tan-jaune Jaune P Néant Néant Néant Milieu de Bennett S Blanc-gris intense Blanc-gris intense Blanc-gris léger D Jaune Jaune Jaune P Néant Néant Tan Saccharose de S Gris intense Gris intense Traces de gris Czapek D Gris Gris Gris P Néant Néant Néant Maltosë-tryptone S Blanc-gris Blanc-gris Gris léger D Jaune Jaune Crème P Néant Néant Néant O ro ■H1 V>l V>l ui i ro o ro VD ON 00 TABLEAU III (suite) VJ O Milieu à la gélose ! S. hygroscopicus var. enhygrus S. hygroscopicus CBS S. endus NRRL 2339 Peptone-extrait de levure-fer (ISP-6) S D P Pas de croissance aérienne Jaune Jaune pâle Pas de croissance aérienne Jaune Jaune pâle Blanc Jaune Jaune pâle Tyrosine (ISP-7) S D P Gris' Tan Rose pâle devenant tan-rose Gris Tan Rose pâle devenant tan-rose Blanc-gris-crème Olive Néant Milieux à la gélatine Gélatine pure P 0 Tan-liquéfaction à 1/4 Liquéfaction à 1/3 Tan-liquéfaction, à 1/4 Liquéfaction à 1/3 Tan-liquéfaction à 1/4 Liquéfaction à 1/3-3/4 Milieu nutritif P 0 Tan-liquéfaction à 1/4 Liquéfaction complète Tan-liquéfaction à 1/4 Liquéfaction à 1/2-complète Tan-liquéfaction à 1/4 Liquéfaction à 1/2-complète Bouillons ■ Nitrate synthétique S P 0 Pas de croissance en surface Jaune pâle Croissance allant de compacte à floconneuse à la base Croissance aérienne grise sur la pellicule superficielle Jaune pâle Croissance allant de compacte à floconneuse à la base Croissance aérienne blanche sur la pellicule superficielle Jaune-rose pâle Croissance allant de compacte à floconneuse à la base Nitrate réduit en nitrite Nitrate non réduit en nitrite Nitrate non réduit en nitrite TABLEAU III (suite) S. hygroscopicus var. S. hygroscopicus S. endus Milieu à la gélose enhverus CBS HSEL 2339 Nitrate nutritif S Pas de croissance en Pas de croissance en Traces de croissance surface surface aérienne blanche sur la pellicule superficielle P Néant Néant Néant 0 Croissance allant de Croissance allant de Croissance allant de compacte à floconneuse compacte à floconneuse compacte à floconneuse à la base à la base à la base Nitrate non réduit en Nitrate non réduit en Nitrate réduit en nitrite nitrite nitri te Lait au S Traces de croissance Anneau superficiel de Croissance aérienne tournesol aérienne grise sur couleur tan blanc-gris sur l'anneau 1*anneau su.perficiel superficiel bleu 0 Peptonisation complète, Peptonisation partielle, Peptonisation complète, pH 6,5 pH 6,6 pH 7,75 S = Surface D = Dessous P = Pigment 0 = Autres caractéristiques 00 > a o n o z » o K> l—^ KjI u.; —•3 I ro o VJl ro vo ON oo T k 3 L E A U 1 V Uti^ ieaticn des composes du carbone ■flans le milieu syntLécique de Pridham et Gottlieb* 1 S. hygroscopicus var. S. hygroscopicus S. endus _enhygrus i . - KRRI 2339 Témoin | (-) 1. D-xylose (+) 2. l-arabinose -i' 4" 3. rhamnose 4* + 4. D-fructose + + 5. D-galactose Jr -4- 4" 6.' D-glucose "î~ + + 7. D-mannose + 4- + 8. maltose H- 4* (-) 9. saccharose (+) (+) (-> 10. lactose + (+) 11. celloblitAe ' j, ' + + 12. raffinosfc + (-) 13- dextrine "f + + 14• inuline (~) (+> (-) ro i— Go ro o Uï ro vo Os CD Z P TABLEAU IV (suite) O S. hygroscopicus var. S. hygroscopicus S. endus enhygrus CBS NRRL 2339 Témoin - (-) (-) 15. amidon soluble + + + 16. glycérol + + + 17- dulcitol ( + ) (-) (+) 18. D-mannitol + + + 19. D-sorbitol ( + ) + (-) 20. D-inositol (+) ( + ) .(-) 21. salicine ( + ) ( + ) (-) 22. phénol - - ~ 23. crésol _ - - 24. formiate de Na (-) (-) (-) 25. oxalate de Na (-) ( + ) 26. tartrate de Na (-) ( + ) (-) 27. salicylate de Na - - - 28. acétate de Na '( + ) + ( + ) ro m VD I ro o ui ro vo o\ 00 TABLEAU IV (suite) S. hygroscopicus var. S. hygroscopicus S. endus enhygrus CBS NKRL 2339 Témoin (-) (-) 29. citrate de Na ( + ) + ( + ) 30. succinate de Na ( + ) + ( + ) + utilisation positive (+■) utilisation positive - légère croissance (-) légère croissance - pas d'utilisation pas de croissance * T. G. Pridham et D. Gottlieb, 1948 "The utilization of carbon compounds by some Actiriomycetales as an aid for species détermination","J. Bacteriol." £6 : 107-114. O ro h-* v>i i iv) 0 1 ro o ui ro vo o\ a> TABLEAU V VI O Utilisation des composés du carbone l , \ dans le milieu modifié de Pridham et Gottlieb* V>I V>1 o "3 O JJ Q S. hygroscopicus var. S. hygroscopicus S. endus enhygrus CBS NERL 2339 Témoin négatif (gélose de basé) (-) (-) (-) Témoin positif (gélose de base plus D-glucose) + + + L-arabinose + + 4" + Saccharose (-) 4" - D-xylose ++ ++ + Inositol - ± - D-mannitol ++ 4-4- ++ D-fructose H" ++ ++ i rv> N> O VJ1 N> VO ON 00 TABLEAU V (suite) VS O CD O 33 5 Z -> S. hygroscopicus var. enhygrus CBS S. endus HRRL 2339 Rhamnose -H- ++ ++ Raffinose ++ ++ - Cellulose "i* + - Croissance analogue ou inférieure è. la croissance obtenue sur le milieu de base, sans composé de carbone. ++ Croissance végétative égale ou supérieure à celle qui s"obtient avec le glucose. + Croissance végétative bien meilleure que sur le milieu de base, sans composé de carbone, mais légèrement meilleure qu'avec le glucose. + Cas douteux. La croissance n'est que légèrement meilleure que celle qui s'obtient sur le milieu de base sans composé de carbone et elle est notablement plus faible qu'en' présence de glucose. * B. B. Shirling et D. Gottlieb, 1966. "Methods for characterization of Streptomyces species". "International Journal of Systemic Bacteriology" 16:513-540. ro M1 V» Kjà ï iy> r\) 1 ro o ui ro vo ON co 70 21733 -23- 2052968 le nouveau composé de l'invention est produit lorsque l'organisme qui procède à son élaboration est cultivé dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en submersion. Il y a lieu de remarquer également que des cultures en surface et des 5 bouteilles peuvent être utilisées pour la préparation de quantités limitées. L'organisme est cultivé dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un glucide assimilable et une source d'azote, par exemple un composé azoté ou une matière protéi-nique assimilable. Les sources préférées de carbone comprennent le 10 glucose, la cassonade, le saccharose, le glycérol, l'amidon, l'amidon de maïs, le lactose, la dextrine, les mélasses, etc. Les sources préférées d'azote comprennent l'extrait soluble de maïs, la levure, la levure autolysée de brasserie contenant des matières solides du lait, la poudre de soja, la poudre de graines de coton, la 15 poudre de maïs, les matières sèches du lait, un produit de digestion pancréatique de la caséine, les produits solides de distillerie, les liqueurs peptonées d'origine animale, les déchets de viande et d'os, etc. On peut utiliser avec avantage des combinaisons de ces sources de carbone et d'azote. Des traces de métaux, par exemple 20 zinc, magnésium, manganèse, cobalt, fer, etc., ne nécessitent pas d'être ajoutées aux milieux de fermentation, car l'eau de ville et des ingrédients non purifiés sont utilisés comme composants des milieux. La production du composé de l'invention peut s'effectuer à 25 toutes températures conduisant à une croissance satisfaisante du microorganisme, par exemple entre environ 18 et 40°C et de préférence entre environ 20 et 32°0. Ordinairement, la production optimale du composé s'obtient- en 2 à 10 jours environ. Le milieu reste normalement basique pendant la fermentation. Le pH final dépend en 30 partie des tampons présents, s'il y en a, et en partie du pH initial du milieu de culture. Lorsque la culture est effectuée dans des récipients et des cuves de grandes dimensions, il est préférable d'utiliser la forme végétative,plutôt que la forme de spore, du microorganisme en vue 35 de l'inoculation, pour éviter un retard prononcé dans la production du nouveau composé et, par conséquent, l'exploitation inefficace de l'équipement. Par conséquent, il est désirable de préparer un ino-culum végétatif dans une culture en bouillon nutritif, par BAD ORIGINAL 70 21733 -24- 2052968 inoculation de cette culture en bouillon avec une partie aliquote d'un sol ou d'une culture inclinée, lorsqu'on s'est ainsi assuré l'obtention d'un inoculum végétatif jeune et actif, on transfère ce dernier dans des conditions aseptiques dans des récipients ou des 5 cuves de grandes dimensions. Le milieu dans lequel 1'inoculum végétatif est produit peut être le même que celui que l'on utilise pour la production du nouveau composé ou peut en être différent, pour autant qu'il est apte à donner un développement correct du microorganisme . 10 Le nouveau composé de l'invention est un composé chimique amphotère non polyénique. Il est soluble à une concentration inférieure à 5 mg/ml dans l'eau, l'acétone, l'acétate d'éthyle, la méthyléthylcétone5 le chlorure de méthylène, le chloroforme, le butanol et l'éther. Il est soluble à une concentration supérieure à 15 10 mg/ml dans le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l'acide acétique cristallisable, le mélange acétone-eau (3:2) et le 1-butanol saturé d'eau. Divers procédés peuvent être utilisés pour isoler et purifier 1'enhygrofungine, par exemple une extraction par solvant, 20 une chromâtographie de partage, une chromatographie sur gel de silice, une distribution liquide-liquide dans un appareil de Craig, et une cristallisation dans des solvants. On préfère les procédés d'extraction par un solvant pour l'isolement à l'échelle industrielle, car ces procédés prennent moins de temps et sont moins 25 coûteux. Un procédé préféré consiste à acidifier le mycélium contenant la liqueur de fermentation à un pH d'environ 4-6 avant la filtration. Lorsque cette opération a été effectuée, l'endomycine contenue dans le liquide de culture est'insolubilisée, de manière 30 que la partie de l'antibiotique qui apparaît dans le filtrat soit assez faible pour que ce dernier puisse être jeté sans perte appréciable d'endomycine. La filtration est de préférence conduite en présence d'une terre de diatomées utilisée comme auxiliaire de filtration, qui empêche l'obturation du filtre par le mycélium, ob-35 turation qui entraînerait une grande réduction de la vitesse de filtration. L'endomycine est extraite du résidu de filtration contenant le mycélium au moyen d'un alcool de bas poids moléculaire. On peut bad original 70 21733 -25- 2052968 utiliser le méthanol ou l'éthanol sous la forme anhydre, mais les alcools propylique et butylique dissolvent peu d'endomycine, à moins qu'ils n'aient été mélangés avec de l'eau. Les solvants d'extraction que l'on préfère sont des mélanges des alcools aliphatiques 5 de bas poids moléculaire et d'eau, contenant 30 à 90 $ d'alcool et 10 à 70 io d'eau, le mélange optimal dépendant de l'alcool particulier que l'on utilise en vue de l'extraction. L'enhygrofungine peut être séparée des autres composants du complexe d'endomycine par une chromatographie de partage, en utili-10 sant un système de solvants consistant en un mélange de méthyléthyl-cétone, d'acétate d'éthyle et d'eau dans la proportion de 10:5:1,5. Les fractions issues de la colonne peuvent être analysées par chromatographie en couche mince en utilisant des plaques de verre de 10 x 20 cm préparées avec du gel de silice (E. Merck, A.G.- 15 Darmstadt, Allemagne), en suspension dans une solution de sels tampons (pH 6,7) composée de volumes égaux de Ka^HPO^ 0,2 M et KH^PO^ 0,2 M. Les plaques sont séchées à l'air puis activées à 130°C pendant 2 heures avant leur utilisation. Des portions de deux ml de fractions sortant de la colonne de partage sont évaporées à sec 20 avec un courant d'azote gazeux et dissoutes dans 0,1 ml de méthanol (facteur de concentration égal à 20). On applique dix microlitres sur la plaque et on développe avec le système de solvants à base de méthyléthyleétone, d'acétone et d'eau dans la proportion de 150:50:34= Après le développement, les plaques sont séchées à l'air puis trai-25 tées par pulvérisation avec un mélange fraîchement préparé d'anis-aldéhyde, d'éthanol à 95 7°, d'acide sulfurique concentré et d "acide . acétique cristallisable dans la proportion de 055:990:0,5:0S1 (ml) puis chauffées à 90-100°C pendant 5 à 10 minutes. Lsenhygrofungine (Rf = environ 0,23) apparaît comme une tache d'un bleu foncé. 30 L!enhygrofungine peut être isolés des fractions de la colonne de partage ne contenant que 1'enhygrofungine, comme le montre la chromatographie en couche mince, en mélangeant les fractions avec du "Skellysolve B" (hexanes isomères) ; en séparant les phases et en mélangeant la phase supérieure avec de l'eau ; en séparant de 35 nouveau les phases ; en ajustant le pH de la phase aqueuse à environ 3,8 avec de l'acide chlorhydrique concentré, puis en mélangeant avec de l'eau, en filtrant et en refroidissant à environ 5°C pour provoquer la cristallisation de 1'enhygrofungine. Les cristaux bad original 70 21/33 -26- 2052968 obtenus peuvent être recristallisés dans un mélange d'acétone et d'eau (3:2) qui est ajusté à un pH acide, comme ci-dessus, puis les cristaux sont filtrés et le filtrat est conservé à environ 2°G pour provoquer la cristallisation de 11enhygrofungine. 5 Une variante du procédé de séparation de 1'enhygrofungine des autres composants du complexe d'endomycine consiste à soumettre une préparation de ce complexe à une chromatographie sur gel de silice et une cristallisation. La préparation de complexe d1endomycine peut être dissoirfce dans du méthanol, mélangée avec du gel de 10 silice, et le solvant peut être chassé par évaporation. Le mélange séché est ensuite versé dans une couche de "Skellysolve B" qui a été préalablement introduite dan-s une colonne de gel de silice. La colonne peut être développée avec un système de solvants consistant en méthyléthylcétone, acétone et eau dans la proportion de 150:50:28 ■5 et on peut isoler des fractions ne contenant que 1:enhygrofungine, connue déterminé par chromatographie en couche mince. Ces fractions peuvent être lyophilisées et la préparation lyophilisée sensiblement pure d'enhygrofungine peut être dissoute dans un mélange d'acétone et d'eau (3:1), qui est ensuite mélangé avec de l'eau et re-20 froidi pour provoquer la cristallisation de 1'enhygrofungine. L®enhygrofungine peut être purifiée par des passages successifs d8une forme protonée à Line forme non protonée et vice versa, en particulier avec d'autres types de traitements intermédiaires, par exemple des extractions par solvants et des lavages, 25 une chromatographie, et une extraction fractionnée liquide-liquide. De cette manière, on peut utiliser des sels d'enhygrofungine pour isoler eu concentrer l8antibi:tique. Par exemple, l'antibiotique ;eut être transformé en un sel insoluble tel que le picrate, qui peut être nouais à des opérations de purification,puis utilisé pour 30 régénérer 15antibiotique. Ou bien, l'antibiotique peut être trans-formé_ en un sel hydrosoluble tel que le chlorhydrate eu le sulfate, et la solution aqueuse du sel peut être extraite avec divers solvants non miscibles à l'eau avant la régénération de l'antibiotique. Etant donné que 1*enhygrofungine est une substance 35 amphotère, elle forme des sels avec des acides, des métaux alcalins, des métaux alcalino-terreux et des aminés. Des sels métalliques peuvent être préparés en dissolvant 1'enhygrofungine dans l'eau, en ajoutant une base métallique diluée jusqu'à ce que le pH de la BAD ORIGINAL 70 21733 -27- 2052968 solution soit égal à environ 7-8, et en lyophilisant la solution pour produire un résidu déshydraté consistant en sel métallique d'enhygrofungine. Les sels métalliques d'enhygrofungine comprennent les sels de sodium, de potassium et de calcixmiLes sels d1 aminé de 5 1'enhygrofungine, comprenant les sels formés avec des bases organiques telles que des monoamines, diamines et polyamines primaires, secondaires et tertiaires, peuvent aussi être formés en utilisant les procédés décrits ci-dessus ou d'autres procédés couramment utilisés. On obtient d'autres sels avec des bases douées d'activité thérapeu-10 tique, qui confèrent aux sels d'autres effets thérapeutiques. .Ces bases sont par exemple les bases puriques telles que la théophylline, la théobromine, la caféine ou des dérivés de ces bases puriques ; des bases antihistaminiques qui sont capables de former des sels avec des acides faibles ; des composés de pyridine tels que l'amide 15 d'acide nicotinique, l'hydrazide d'acide isonicotinique, etc»; des phénylalkylamines telles que l'adrénaline, l'éphédrine, etc.; la choline, et d'autres bases. Les sels d'acides de 1'enhygrofungine peuvent être préparés en neutralisant 11enhygrofungine avec l'acide approprié à un pH in-20 férieur à environ 7,0, et avantageusement à un pH compris entre environ 2 et 6. Les acides qu'il convient d'utiliser à cette fin comprennent les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, etc. On peut utiliser des sels d'acides et de bases de 1!enhygrofungine aux mêmes fins biologiques que le composé de départ. 25 L'enhygrofungine est active contre Bacillus subtilis et peut être utilisés pour minimiser ou prévenir l'odeur que cet organisme communique à des pcisscns et des caisses de poissons. Elle peut également être utilisée pour traiter les lieux d'éducation des vers, à soie afin de prévenir ou de minimiser les infections dues à 30 B. subtilis. De même, étant donné que 1'enhygrofungine est douée d'activité contre Cryptc-coccus neoformans. elle peut être utilisée pour traiter les perchoirs dans les pigeonniers,afin d'inhiber le développement de ce champignon dont on a mis en évidence la présence dans les déjections de pigeons. ("J. Am. Med. Assoc.", Volume 35 191, N° 4, 25 Janvier 1965, pages 269-274). De même, le nouvel antibiotique de l'invention peut être utilisé pour nettoyer les paillasses de travail et l'équipement d'un laboratoire mycologique. On donne ci-après des exemples non limitatifs illustrant le BAD ORIGINAL 70 21733 -28- 2052968 procédé et les produits de l'invention. Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont données en volume, sauf indications contraires. Exemple 1 5 A. Fermentation Une souche extraite du sol de Streptomyces hygroscopicus var. enhygrus NEEL 3664 est utilisée pour inoculer une série de fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant chacune 100 ml d'un milieu stérile d'ensemencement, à base des ingrédients suivants s 10 Glucose monohydraté 25 g/l "Pharmamedia"* 25 g/l Eau de ville le reste * Le produit "Pharmamedia" est une farine de graines de coton de qualité industrielle produite par la 15 firme Trader's Oil Mill Company, Port Worth, Texas. Le contenu des fioles est cultivé pendant 3 jours à 28°C sur une secoueuse mécanique rotative de Gump fonctionnant à une vitesse de 250 tr/mn. L'inoculum d'ensemencement décrit ci-dessus est utilisé 20 pour inoculer une série de fioles d'Erlenmeyer de 500 ail contenant chacune 100 ml de milieu stérile de fermentation. La vitesse d'inoculation est de 5 ml d'inoculum d'ensemencement par 100 ml de milieu de fermentation. Le milieu de fermentation contient les ingrédients suivants : 25 Glucose monohydraté 60 g/l Produit "Hi-starch"* 20 g/l Carbonate de calcium 4 g/l Nitrate de sodium 4 g/l "Pharmamedia" 20 g/l N 30 Eau de ville, quantité suffisante pour le reste * Le produit "Hi-starch"' est une farine de maïs produite par la firme Illinois Cereal Mills, Paris, Illinois. Le pH du milieu de fermentation est ajusté à 7,2 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium avant la stérilisation. 35 70 21733 2052968 Les fioles de fermentation, inoculées comme décrit ci-des-sus, sont mises à incuber pendant 6 jours à une température de 28°C sur une secoueuse mécanique rotative de &ump fonctionnant à 250 tr/mn. 5 Le titre en antibiotique des bouillons de fermentation est contrôlé au moyen d'un essai sur plaque circulaire utilisant le microorganisme Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae est inoculé dans la gélose d'essai ayant la composition suivante : dextrose 10,0 g/l 10 extrait de levure 2,5 g/l KH2P04 1,0 g/l gélose 17,5 g/l pH 5,65 t 0,1• On verse la gélose dans des boîtes de Pétri et on place 15 un disque de papier de 12,7 mm sur la gélose solidifiée. On applique un échantillon de 0,08 ml de la préparation d*enhygrofungine, et on détermine la zone d'inhibition de croissance après incubation pendant 18 heures à 28°C. L'activité antibiotique du bouillon de fermentation est ' 20 exprimée en mierogrammes. Un rendement réglé de fermentation, comme déterminé ci-dessus en utilisant S. cerevisiae, va de 4 à 5 mg d'antibiotique par ml. Il y a lieu de remarquer que ce titre repré-; sente la somme des composants actifs complexes d^endomycine qui sont présents.Les titres d'enhygrofungine ne sont pas spécifiques 25 tant que 1'enhygrofungine n'a pas été séparée des autres composants par chromatographie de partage, comme décrit ci-dessus et ci-après . B. Isolement. Le bouillon entier de fermentation engendrant 1'enhygrofun-30 gine, comme décrit ci-dessus, (2800 ml, titrant 1925 P-g/ml relativement à S. cerevisiae), est ajusté à un pH égal à 4,5 avec de l'acide chlorhydrique. Le bouillon acidifié est ensuite filtré en utilisant de la terre de diatomées comme auxiliaire de filtration. Le régidu mycélien est extrait trois fois avec à chaque fois 35 700 ml de 1-butanol saturé d'eau à 50°C. Le butanol est dilué avec deux volumes de "Skellysolve B". Le précipité huileux qui se forme est recueilli, dessous dans de l'éthanol à 80 $ et évaporé à sec BAD ORIGINAL 70 21733 „50_ 2052968 sous vide ; on obtient 1,73 g de produit titrant 525 j-ig/ml relativement à S. cerevisiae. C. Porifioation Une préparation impure contenant de 1'enhygrofungine ob-5 tenue comme décrit ci-dessus (75 g titrant 250 Hg/mg relativement à S. cerevisiae) est soumise à une chromatographie de partage. La colonne de partage est préparée de la façon suivante : on mélange 3000 g de "Bicalite 4200" (de la firme G-reat Lakes Carbon Corporation) avec environ 35 litres du solvant constituant la 0 phase supérieure et 1200 litres du solvant constituant la phase inférieure. Ces solvants constituant respectivement la phase supérieure et la phase inférieure sont préparés en mélangeant les solvants suivants et en séparant les phases : 1000 parties de métliyléthylcétone; 500 parties d'acétate d'éthyle, 150 par-15 ties d:eau. Le mélange est versé dans une colonne de verre de diamètre intérieur égal à 10 cm et la colonne est garnie de "Dicalite" à une hauteur constante de 137 cm, le solvant constituant la phase supérieure s'écoulant de Mut en bas. Le niveau du solvant est ajusté par écoulement à environ 2,5 cm au-dessus 20 de la souche garnissant la colonne = La préparation d'enhygrofungine décrite ci-dessus (75 g, 250 îAg/mg) est dissoute dans 120 ml dâ solvant constituant la phase inférieure » Cette solution est mélangée avec 240 g de "Dicalits 4200" et une quantité suffisante de solvant constituant 25 la phase supérieure pour rendre le mélange fluide. Ce mélange est versé à la partie- supérieure de la colonne préparée et le niveau de solvant est ajusté par écoulement au niveau du mélange de "Dicalite" qui vient d*être ajouté. On introduit du solvant irais constituant la phase supérieure, et la colonne e^st développée 30 à un débit de 16 litres/heure. On recueille des fractions de 4 litres après l'introduction de la charge. Les fractions de la colonne et les préparations sont analysées par chr0£_-v.:ographie en couche mince, les opérations préparatoires étant effectuées comme décrit ci-dessus. Des analyses des fractions de la colonne 35 par chromatographie en couche mince montrent que les fractions 9 à 23 contiennent la partie principale d'enhygrofungine purifiée. Ces fractions sont rassemblées (60 litres) et mélangées avec 30 BAD ORIGINAL 70 21733 -31- 2052968 litres de "Skellysolve B". Les phases sont séparées et la phase supérieure est mélangée avec 500 ml d'eau. Les phases sont de nouveau séparées et la phase supérieure lavée est jetée, mais les phases aqueuses sont rassemblées (4300 ml), ajustées à un 5 pH de 3,8 avec de l'acide chlorhydrique concentré (0,3 ml), mélangées avec de l'eau (1/2 volume, 2150 ml), filtrées, refroidies et maintenues à une température de 5°C jusqu'à ce que la cristallisation soit terminée. Les cristauz d'enhygrofungine sont isolés par filtration, lavés à l'eau et séchés sous vide 10 à poids constant ; on obtient 10,5 g de cristaux blancs d'enhygrofungine . On recristallise une partie des cristaux d!enhygrofungine obtenus comme ci-dessus (8,64 g) par dissolution dans 165 ml d'un mélange d'acétone et d'eau (3:2) et le pH de la solution est ajus-, . - ,1a solution est ■ 5 ne a 4,0 avec de l'acide chlorhydrique, puis/filtres®Le filtrat limpide est mélangé avec 1500 ml d'eau filtrée jusqu'à ce que la cristallisation de.1'enhygrofungine commence. Le mélange est ensuite conservé pendant environ 16 heures à 2°C. Les cristaux de 1'enhygrofungine sont isolés par filtration, lavés à l'eau (25 ml) 20 et séchés sous vide à poids constant ; on obtient 8,3 g de cristaux d' enhygrofungine de grande pureté. Exemple 2 On isole l'enhygrofungine d'une préparâtiosq^u complexe d'endomycine en utilisant le procédé de chromatographie sur gel 25 de silice décrit ci-après. On mélange 5 kg de gel de silice (Merck A.G., Darmstadt) avec du "Skellysolve 3% on verse le mélange dans un tube chromâtographique en verre de 10 cm de diamètre intérieur, et on garnit le tube à une hauteur constante de 122 cm en faisant couler du "Skellysolve B"'i' Une préparation ( 30 de 25 g de complexe d'endomycine (préparée comme décrit dans l'exemple 1, parties A et B) est dissoute dans 100 ml de méthanol et mélangée avec 200 g de gel de silice. On chasse le solvant par évaporation avec circulation d'air. Le mélange séché obtenu est versé dans une couche de "Skellysolve ^"restant à la 35 partie supérieure du lit de la colonne de gel de silice. Le niveau de "Skellysolve B" est abaissé au niveau de la chargé, et du solvant frgâs consistant en un mélange de méthyléthylcétone, 70 21733 2052968 d'acétone et d*eau (150:50:28) est introduit et utilisé pour développer la colonne à un débit de 12 litres/heure. On recueille des fractions de 4 litres. Les fractions sont analysées par chromât ographie en couche mince c omise décrit ci-dessus, à la 5 différence qu'on utilise le système de solvants consistant en méthyléthylcétone, acétone et eau (150:50:32). Les fractions 16 à 25 contiennent de 1'enhygrofungine sensiblement pure. Ces fractions sont rassemblées et concentrées sous vide en une solution aqueuse qui est lyophilisée; le rendement est de 12,5 g d'enhy-10 grofungine pratiquement pure. Une partie de cette préparation (50 mg)est dissoute dans 8 ml de mélange d'acétone et d'eau (3:1)» mélangée avec 58 ml d'eau et refroidie jusqu'à ce que la cristallisation soit totale. Les cristaux d*enhygrofungine sont isolés par filtration, lavés à l'eau et séchés sous vide à poids 15 constant. On obtient 39 mg d'enhygrofungine titrant 930 p.g/mg rélativement à S.cerevisiae. Exemple 5 Le bouillon obtenu par fermentation sous l'action de S. endus. comme décrit dans l'exemple 3 du brevet des Etats-Unis 20 d8Amérique n° 2 746 902 précité, peut être utilisé comme matière première pour, préparer 1'enhygrofungine au moyen du procédé de l'exemple 1, décrit ci-dessus» 70 21733 -33- 2052968 REVENDICATIONS 1. Nouvel antibiotique du type de 1'enhygrofungine, caractérisé par le fait qu'il est actif contre diverses bactéries G-ram-positives et divers champignons et qu'il présente, sous sa 5 forme cristallisée essentiellement pure, les particularités suivantes : - cristaux blancs, - analyse élémentaire : C = 60,95 ; H = 9,00 ; N = 4,01 ; 0 = 26,46, O C q - rotation optique [2]^ =+20 (e, 0,5 dans le diméthyl- formamide ), - point de fusion d'environ 119,3°C, - solubilités suivantes : soluble à un taux inférieur à 5 mg/ml dans l'eau, lsacétone, l'acétate d'éthyle, la 5 méthyléthylcétoile, le chlorure de méthylène, le chloro forme, le butanol et l'éther ; soluble à une concentration supéri-3'.ïre à 10 ag/'ml dans le méthanol, l'éthanol, le n-propanol5 l'acide acétique cristallisable, le mélange d4acétone et d'eau à 3:2 et le 1-butanol saturé 0 d'eau. - speetr-e d'absorption infra-rouge caractéristique comme sua* la figure 1 des dessins annexés et, - diagramme caractéristique de oliromatograpiiie sur papier s comme représenté sur la figure 2 des dessins annexés, 5 cet antibiotique étant sensiblement exempt d'autres com posants du complexe d'endomycine, 2. Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en enhygrofungine sous sa forme essentiellement pure. 0 3. Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en enhygrofungine sous sa forme cristallisée essentiellement pure. 4. Composé suivant la revendication 1,caractérisé par le fait qu'il consiste en enhygrofungine ou ses sels de métaux alca- 5 lins,de métaux alcalino-terreux et d'aminés. 5. Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en sels d'addition d'acides de 1'enhygrofungine. BAD ORIGINAL 70 21733 -34- 2052968 6. Procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver une souche de Streptomyces hygroscopicus var. enhygrus ou Streptomyces endus produisant de 1'enhygrofungine, dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies jusqu'à ce 5 qu'une activité notable contre Saccharomyces cerevisiae soit conférée à ce milieu par production de complexe d'endomycine. 7. Procédé suivant la revendication 6, caraotérisé par le fait qu'il consiste à cultiver une souche de Streptomyces hygroscopicus var. enhygrus produisant de 1'enhygrofungine dans ÎO un milieu nutritif squeuz contenant une source de glucide assi-milable et d3azote assimilable, dans des conditions aérobies, jusqu'à ce qu!une activité notable contre Saccharomyces cerevisiae ait été conférée à ce milieu par production du complexe d'endomycine, puis à isoler de I'enhygrofungine sensiblement exempte '• 5 d'autres composants d\|6omplexe d'endomycine. 8 c Procédé suivant la revendication 7» caractérisé parle fait que l'isolement consiste à filtrer le milieu, à extraire le complexe d'endomycine avec un solvant de 1'endomycine, à soumettre le complexe ds endomycine extrait à une chromâtogra-20 phie de partage et à isoler 1!enhygrofungine pure des fractions obtenues dans cette chromâtographie de partage. 9. Procédé'de séparation d'enhygrofungine de pi'éparations du complexe d3endomycine, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre le complexe d'endomycine à une chromatographie de 25 partsg© et à isoler de 1Jenhygrofungine sensiblement pure des fractions obtenues par cette chromâtographie de partage. 10. Procédé suivant la revendication 9» caractérisé par le fait qu'on utilise dans la chromât ographie de partage un système de solvants composé de méthyléthylcétone, d'acétate d'éthyle 30 et d'eau (10;5s1,5). 11. Procédé de séparation d'enhygrofungine de préparations du complexe d'endomycine, caractérisé par le fait qu:il consiste à soumettre le complexe d'endomycine à une chromatographie sur gel de silice et à isoler de 1'enhygrofungine sensiblement pure 35 de fractions obtenues par chromatographie sur gel de silice. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé par le fait qu'on utilise un système de solvants consistant en méthyléthyl- i cétone, acétone ét eau (150:50:28) dans la chromatographie sur gel de silice. BAD ORIGINAL