Brevet FR2037059A1 — publié le 19701231

70- 03496 ; "1_ ''-2037059 . la présente invention concerne tua procédé de production de -cellulase par culture de Basidiomycetes dans un milieu nutritif contenant suffisamment d'hydrates de carbone, de sources d'azote, de sels minéraux, d'initiateur de fermentation, etc.». 5 La cellulase est une substance "bien connue que l'on peut obte nir à partir d'animaux comme des escargots et des palourdes,ete«. et. de,certains microorganismes. Malgré de gros efforts,la cellulase provenant de ces sources n?a cependant pas trouvé de vastes applications pratiques» 10 Cela s'explique, en particulier par ;les faits que les microorga nisme s appartenant aui: genres _ Ûhaeiomrum et Myrothecium ne secrè-tent pas la cellulase à partir d8éléments microbiens, que l'on cul tive rarement des microorganismes de la décomposition du bois appartenant aux genres ïrametes et autres, en raison iis leur crois-15 sançe lente et que dans le cas des bactéries, il est difficile de séparer sur une échelle industrielle les éléments microbiens du bouillon de culture. De jplus, les microorganismes produisent généralement si peu de . cellulase qu'on ne peut les utiliser, pour des.buts industriels. 20 Pour la production industrielle,, on ne peut .actuellement utiliser que les microorganismes des espèces Aspergillus, Triehoderma,Trame tes,etc..La cellulase obtenue n'est pas constituée d'un seul enzyme, mais d'un èbmplexe d * enzymes varie s. Selon:-® « 'I. Reeds (dans Applied Microbiology, vol. 4, page 39, 1956} le processus peut 25 être représenté par les* formules suivantes i ^ Snzyme CL Cellulose naturelle ■ ■ ) n-glucane combiné en (î -1,4- / Cellobiasè" Enzyme C (CMC-ase) „ _ - •- - -x -4- = cellobiose .. P~^?P?s1Pt /.gfLucose L'enzyme 0^ est l'enzyme utile en pratique. 39 Par ailleurs, la cellulase de l'Aspergillus est de peu d'uti- v lité, car son activité enzymatique C^ y est faible -bien que son activité enzymatique CMC-ase soit forte. La cellulase des genres Trichoderma et Trametes présente une forte activité- enzymatique C^ et ces souches ont été beaucoup étudiées bien que l'activité 35 CMC-ase de cette cellulase soit inférieure à celle de la cellulase BAD ORIGINAL 03496 "2" ^ 2037059 provenant du genre Aspergillus» De plus,"le Triehoderma ne peut pas être cultivé par la technique"par immersion, pratique à l'échelle industrielle. Le brevet Japonais 1T° 45596/1968 déposé par la demanderesse dé-'5 erit une nouvelle méthode pour préparer dès protëasel^âe°^Ce^eS * Suivant cette'méthode, on a étudié les productivités en cellulase de divers microorganismes de la décomposition du bois . On a ainsi constate que, parmi les souches considérées comme '"inutilisables en pratique jusqu'ici, certaines ont de fortes acti-10' vités enzymatiques et CMC-ase et de plus, elles peuvent produire une' cellulase nouvelle ayant un faible pH optimum. la présente invention repose sur cette découverte. Suivant l'invention, on peut utiliser une souehe quelconque appartenant aux espèces lampteromyces et Fomitopsis . On peut citer 15 en particulier .les lampteromyces japonicus (ATCC 20195), Fomitop-^ sis "cytisina (ATCC 20196), Fomitopsis pinicola (ATCC 20036) et Fomitopsis ahiiosa (ATCC 20194), etc...,,ces microorganismes sont librement disponibles, sans limitation. "Ces souches sont décrites par Rokuya Imazeki et Tsuguo Hongo 20 G-enshbku Nippon Einrai Zukan (Coloured Illustrations of Fungi of 1 Japan), Hoiku-sha, Tokyo, (1957). Bien que les Basidiomycetes " portent parfois des noms différents selon les méthodes de cle^ssi-fication et de description utilisées, toute souche classé dans ce * g'enre" par Imazeki et ^eolï., peut être utilisée dans le procédé de 25 la présente invention. Sèlon cette invention, on cultive les Basidiomycetes dans un milieu liquide ou solide. Un milieu liquide est plus avantageux; la culture peut se faire en surface ou avec immersion. le milieu doit"renfermer des éléments nutritifs assimilables, 30 qui conviennent à la souche cultivée. La source de carbone peut .être du glucose, sucrose, maltose, lactose, amidon ,dextrine, mélasses, poudre de cellulose, coton absorbant, etc.. la source d!azote peut être fournie - par des matières minérales ou organiques contenant de l'azote, comme des sels d1 ammpnium^des, nitrat e s, pep-35 tone, extraits de viande, liqueur de macération âe Maïs, protéine de soja, farine de froment, cellules de ;ièy^"è, %e|idxis'"éolubles de distillerie, urée, etc... On peut également utiliser, si l'on le désire, des matières minérales et dés «elist'métalliques comme des phosphates, des sels de 'potass±om> âe'.'JKâgûéël^»-de fer, de BAD ORIGINAL 70 03496 -3- 2037059 zinc, etc... De plus, on peut incorporer des vitamines, des agents initiant la croissance, etc... Les conditions de culture des Basidiomycetes dépendent de la souche utilisée, de la composition du milieu, etc.. Il est avanta-5 geux que la température du milieu soit de 20° à 35*C environ, et • le pB de 4 à 7. La quantité de cellulase produite atteint son maximum après 5 à 10 jours de culture. On doit "bien sûr établir les conditions qui assurent un rendement maximum en cellulaseo La cellulase préparée par culture peut être précipitée ou con-10 centrée par addition de 50 à 65$ (V/Y) d'un solvant organique comme l'acétone, alcool, etc.. ou de 40 à 70fa ( P/V) d'un agent de précipitation comme du sulfate d'ammonium, du chlorure de calcium, etc.. à un extrait aqueux de la culture lorsqu'on utilise un milieu de culture solide ou à un bouillon de culture filtré dans le 15 cas d'une culture en milieu liquide. Le concentré peut facilement être purifié à l'aide de procédés classiques, comme par exemple, traitement sephadex, adsorption et élution sur une matière échan-geuse d'ion comme une résixte échangeuse d'ion, etc... La cellulase ainsi obtenue est soluble dans l'eau;' elle présente une forte ac-20 tivité , mais aussi une forte activité de GMC-ase, ainsi que le montrent les tableaux I et II donnés plus loin» De plus, le pH optimum est inférieur à celui d'une quelconque autre cellulase connue (Tableau III)» On nra trouvé aucuné de ces caractéristiques dans les types connus de cellulases «La cellulase obtenue selon 25 le procédé de l'invention peut être considérée comme étant un nouvel enzyme» L'activité de la cellulase est optimum entre 40 et 50°C. TABLEAU I Activité de décomposition du papier filtre de diverses 30 cellulases. Temps de décomposition du papier filtre (minute) 30 60 90 120 • 150 180 iii- ii i • i. ■. ^ i iii i i Enzyme de la présente invention + + -H- i t H 35 Enzyme produit par Trichoderma SP» + +++ -h h- Enzyme produit par Trametes(sanguinae) + i n i Enzyme produit par 40 Aspergillus SP - + + + ++ +-t 03496 ' "4~ 2037059 Ce tableau donne les résultats des essais effectués selon la méthode décrite par Kitamikado et îoyama î Journal of Fermentation Technology , Toi. 40, page 85 (1962) et les activités respectives sont exprimées de la façon définie par les auteurs. Chaque essai est effectué à 40°C avec une solution à Ifo de l'enzyme dans une solution tampon d1acide citrique. La solution est tamponnée à pH 3,0 dans le cas de l'enzyme de l'invention et à pH 4»5 dans le cas des autres» TABLEAU II Activité de décomposition de CMC de diverses cellulases Activité Enzyme selon l'invention 2.800 Enzyme produit par Tricoderma SP 4.600 Enzyme produit par Trametes (sanguinae) 2.500 Enzyme produit par Aspergillus SP 6.200 Ce tableau rassemble les résultats des essais effectués selon la «éthode décrite par'Matsuba et coll : Journal of Fermentation Technology « Toi. 41» page 47 (1963)• On fait réagir pendant 1 heure à 40°C , un substrat concentré à 0,625 %• Par définition, une unité d'enzyme produit 10,8 mg de sucre réducteur. On détermine la quantité de sucre selon la méthode de Nelson-Soffiogi• Chaque essai est effectué à 40°C avec une solution à 0,5 $ de l'enzyme dans une solution tampon d'acide citrique» La solution est tamponnée à pH 3,0 dans le cas de l'enzyme de l'invention et à pH 4,5 dans le cas des autres, enzymeso TABLEAU III pE optimum de diverses cellulases pour la décomposition de CMC. pH optimum Enzyme' selon l'invention 3,0 Enzyme produit par Tricoderma SP 4,5 Enzyme produit par Trametes (sanguinae) 4» 5 Enzyme produit par Aspergillus SP 5,0-7,0 Ce tableau rassemble les résultats êtes essais effectués selon la méthode décrite par Matsumura et coll» "Journal of Fermentation Technology, Toi 41, page 154 (19&3); Nara et coll ; Journal of Fermentation Technology, Vol., 42,-page 405 (1964) et Matsuba et coll : Record of the 2 and 3r 70 03496 -5- 2037059 L'invention sera mieux., comprise à la lecture Se l'a description , détaillée qui Ta. suivre , de plusieurs exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant 18invention. . "RXTÎMPLB 1 Dans une fiole de 250 ml ,.s on verse et stérilise S... 30 ml &8ua milieu renfermant. 2fo de sucrose, 1$ de poudre de cellulose, 3 fà. de résidus soiubles de distillerie, 0, 3 fc- d'extrait de levure, 0,5 % de EH^PO^ et 0,05 % de MgSO^ , 7 HgO , le mélange étant ajusté à pH 5,5 .On ensemence séparément des portions du milieu avec des -germes .de Lampteromyces japonicus, Fomitopsis 10 eytisi&a, Pcmitopsis gpaosa et Pomitopsis pinieola? on effectue la eultere à 30°0 pendant 7 jours, en secoïianta Les activités (par ail) âs-g 'botîillons de eelture filtrés sont les suivantes s TABLEAU -M- , : A . Lampteromyces japonicus Âï'GO 20195 105 min., 50 mm 15 Fomitopsis cytisina ATC0 20196 » 120 50 ïomitopsis pinicola ATCC 20036 180 - -'50 Fomitopsis annosa ATGG 20194 180 35 A î Activité de décomposition- du papier filtre (temps nécessaire (en-minutes) pour une décomposition complète.) 20 B : Activité pour liquéfier CMC - (longueur dsune couche liquéfiée d'tm gel, de CMC à 4$ » après 24 heures). EXEMPLE 2 On mélange du son; de froment, du son de riz, de . la farine de soja et des résidus solubles de distillerie, dans un = rapport de lO/l/l/l respectivement, puis on iïimeete "bien le mé-25 lange d'eau et le stérilise pour obtenir un.milieu de,culture solideo ' On ensemence'ce milieu dJune part, avec des mycellia de Laapteromyces japonicus et, d'autre part, de Fomitopsis cytisina, . .cultivés auparavant dans un milieu - liquide ; ensuite, on effectue 30 la culture à 25°0 pendant 10 jours0 La culture achevée, on divise finement chacun des milieux ensemencés et on-les extrait avec einq_ fois leur volume d'eau, pendant 2 heures à température ambiante0 Ses activités (par ml) des extraits sont les suivantes : TABLEAU "T . A .. B 35 ; Lampteromyces japonicus ATCC: 20195- , . 150 min . 2»600 Fomitopsis cytisina ATCC-20196 . *" 160 " : 2.100 A. Activité de décomposition du papier filtre (en minutes) B. Activité de décomposition de CM0o 70 03^96 2037059 EXEMPLE 5 On ajuste à pH 5,5 , 3 litres d'un milieu renfermant 2 % de sucrose, 1 ~fo de farine de soja, 3 # de résidus soiubles. de distillerie, 0,3 $ d'extrait.de levure, 0,5 $ de ESgPO^ et 0,05 f» de MgSO^ , 7H2Q. On ensemence le milieu avec des 5 ' Lampteromyces japonicus (ATCC 20195) et on le cultive dans des conditions aérobies à 30°C pendant 5 jours, sous, agitation, La culture terminée, l'élément microbien est séparé par filtra-tion» Le filtrat est refroidi à 0°C, puis additionné de 65% en volume d'acétone auparavant refroidie à -20?C« On lave le précipi-30 té résultant à 1* éther et on le sèche sous vide. On obtient 27 g • de poudre marron sombre» Un gramme de poudre décompose complètement du papier-g-filtre en 95 minutes» L1 activité de décomposition . de CMC est de 5000 CDl/g. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples 15 décrits ; elle-est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à.l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. 70 03496 2037059 -HEVENDIGATIOCTS- 1.- Procédé de préparation d'une cellulase, qui consiste à cultiver un microorganisme de la décomposition du bois, appartenant aux espèces choisies dans le groupe des Lampteromyces et des fomitopsis, dans un milieu nutritif ,puis à récupérer ladite cel- 5 lulase .dans ledit milieu» 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est le lampteromyces japonicus de référence "ATCC 20195". 3.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que 10 le microorganisme est le Fomitopsis cytisina de référence 11 ATCC 20196". 4<>- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est le Fomitopsis pinicola de référence 'ATCC 20036" . 15 5o- Procédé suivant la revendication lt caractérisé en ce que le microorganisme est le Fomitopsis annosa de référence "ATCC 20194 *. 6«- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 , caractérisé en ce qu'on maintient le milieu de culture à une tem-20 pérature de 20 à 35°C environ , et à un pH de 4 à 7» •7«- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6 , caractérisé en ce qu'on effectue la culture pendant 5 à 10 jours. 8.- Cellulase notamment préparée par le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 7? >