Brevet FR2035795A1 — publié le 19701224

La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un nouveau vaccin contre la brucellose et le nouveau vaccin obtenu par ce procédé. On sait que la brucellose qui est généralement ,connue sous le nom de " fièvre de Malte" est une maladie contagieuse commune aux animaux et à l'homme. Cette maladie est causée par des bactéries du genre Brucella. On sait également que la brucellose présente le double inconvénient d'entraîner des pertes économiques sensibles, en particulier du fait qu'elle provoque l'avortement des animaux atteints, et surtout du fait que les animaux atteints communiquent leur maladie aux personnes qui vivent à leur contact, de sorte que la brucellose constitue une maladie professionnelle, dont les conséquences ne peuvent être négligées. L'éradication de la brucellose animale peut se faire soit en abattant les animaux malades, ce qui est coûteux et difficile à mettre en oeuvre dans la pratique, soit encore en procédant à une vaccination systématique des troupeaux. On connait, en effet, actuellement, plusieurs sortes de vaccins contre la brucellose. Un premier type de vaccin est réalisé à base de bactéries vivantes atténuées, tel que le vaccin B 19 ou Rev.I. Un autre type de vaccin est à base de bactéries tuées agglutinogènes (souches H 38) soit encore à base de bactéries tuées non agglutinogènes (souche 45/20 de Mac ENJen). La présente invention est relative à un procédé de préparation de vaccin anti-brucellique à base d'extraits de parois de Brucella obtenues dans des conditions particulières. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un vaccin anti-brucellique caractérisé par le fait qu'on cultive une souche atténuée de Brucella abortus BUCK 19, que l'on procède à la désagrégation par broyage de ces bactéries, que l'on délipide les parois de Brucella ainsi obtenues, que l'on attaque ces parois à l'aide de papaine, et que l'on récolte la fraction solide qui constitue l'élément actif du vaccin. Dans un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, on procède au délipidage des parois de brucella, après leur broyage, en les épuisant par exemple avec du chloroforme. Les lipides éliminés correspondent généralement à environ 100/o du poids des membranes. Dans un mode de réalisation préferé de l'invention, les parois après avoir été soumises à l'action de la papaïne sont traitées à l'aide d'une solution de tensio-actif, telle par exemple qu'une solution de laurylsulfate de sodium ou de chélates. L'élimination du tensio-actif peut s'effectuer par dialise ou par une succession de lavages et de centrifugations. Il est avantageux de procéder à la lyophilisation des produits obtenus entre chaque étape du procédé. Comme produit de départ on utilise selon l'invention une sou- che de Brucella abortus BUCK 19 qui est entretenue par lyophili Sation. Au moment de l'utilisation on la cultive sur des tubes de gélose trypticase-soja B B B. Pour s'assurer de la pureté et de l'identité de la culture on procède aux vérifications suivantes est d'appartenance au genre Brucella espèce abortus: - gram négatif, - agglutinée par le sérum anti-Brucella abortus, puis par le sérum anti-Mélitensis, - dégagement de SH2, - lysée par le bactériophage Eb, - se cultive sur milieu additionné de fuchsine basique à 1/50.000. Test d'appartenance à la souche B 19: - Néase positive à pH 5, 7 - he se cultive pas en présence de 5 u/ml de pénicilline, - ne se cultive pas en présence de safranine 0 à 1/5.000, - ne se cultive pas en présence d'Erythnitol à 1mg/ml, - ne se cultive pas en présence de thionine bleue à 1/500.000. Dans le but de mieux faire comprendre l'invention, on va en décrire maintenant un-exemple de la mise en oeuvre du procédé de préparation d'un vaccin anti-brucellique. EXEEPLE On part d'une souche de Brucella abortus BUCK 19 dont la pureté et l'identité ont été vérifiées comme indiqué ci-dessus. On procède ensuite à la culture en masse de cette souche dans un milieu liquide semi-synthétique à base de peptone trypsique, d'oligo-éléments, de glucose et de vitamines du groupe B. La culture est effectuée dans un milieu aéré et sous agitation. La culture est poursuivie pendant 36 heures dans une étuve dont la température est maintenue à 370C, avec une aération intense pour éviter l'auto-échauffement des cultures. On sépare les germes vivants par sédimentation et on les lave dans un tampon-phosphate Sorensen pH 7,2. On tue ensuite les germes en les chauffant une heure à 600C. On obtient de cette manière environ 300 grammes de bactéries par litre soit environ 800 milliards de bactéries par ml. On procède alors à une lyophilisation en vrac (durée 24 heures, température de congélation -300C, température du condensateur -40 C, vide en fin d'opération 1/1.000 de mm de mercure). On réalise ensuite le broyage du lyophilisat obtenu. Ce broyage se fait en mélangeant une partie de lyophilisat à deux parties de microbilles de verre (ballotin glass de O,lmm de diamètre). Ce mélange est placé dans un broyeur de Mickle qui le soumet pendant 20 minutes à des vibrations à une fréquence de l'ordre de 6.000 à la minute. La température est maintenue à +100C. Après cette opération la désintégration des bactéries est totale, ce qui peut être vérifié par microscopie électronique et constatation de la libération des acides nucléiques dans le milieu. On traite 50 grammes de bactéries par opération et le contenu du broyeur est ensuite repris par 50 ml d'eau distillée, puis centrifugé à 1.000 G pendant 30 minutes en étant maintenu à une température de +4 C. On obtient ainsi quatre couches successives qui sont, à partir du fond : les billes de verre, quelques bactéries entières qui n'ont pas été broyées, les parois de bactéries et le surnageant. Les parois et le surnageant sont décantés et sont centrifugés à 10.000 G On rejète le surnageant. On vérifie la pureté des parois constituant le culot puis on lyophilise. On procède ensuite au délipidage en placant les parois lyophilisées dans un Soshlet et en épuisant avec du chloroforme pendant 24 heures. Il en résulte généralement une perte qui est de l'ordre de 10% du poids de départ des parois lyophilisées. 50 grammes de parois de Brucella ainsi obtenus sont ensuite mis en suspension dans 1000 ml d'eau distillée dont le pH est amené de 6,2 à 7 par adjonction de 50 ml-de NaOH N/1O. On introduit 1000 mg de papaïne (vendue sous la dénomination NBC par la firme Touzart et Matignon) dans 300 ml d'eau distillée dont le pH est amené de 4,8 à 7 par adjonction de quelques gouttes de NaOH N/10. On mélange la solution de papaïne à la suspension de parois de Brucella et on ajoute 100 gouttes de toluène. Le pH du mélange global est égal à 7. On place ensuite en incubation dans une étuve à 370C pendant 15 heures, et on agite doucement à l'aide d'un agitateur magnétique. Après 15 heures on mesure le pH qui est égal à 6,4. On centrifuge alors pendant une heure à 0 à 6.000 tours/minute. On élimine le surnageant et le culot repris avec 1300 ml d'eau distillée est centrifugé pendant une heure à 6.000 tours/ minute, à une température de OOC. Le surnageant est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions, puis le culot résultant de ces opérations est lyophilisé. On obtient ainsi 28 grammes de parois de bactéries lyophilisêes. On prélève 20 grammes du produit ainsi obtenu que l'on met en suspension dans 500 ml d'une solution à 1% de laurylsulfate de sodium dans l'eau et l'on ajuste le pH à 7. On agite pendant une heure à l'aide d'un agitateur magné- tique en plaçant dans un bain-marie à 18*C, puis on procède à une centrifugation pendant une heure à 6000 tours/minute en maintenant à une température de 0C. On lave ensuite trois fois avec 500 ml d'eau, le culot qui présente un aspect pâteux, en procédant à des centrifugations intermédiaires à 600 tours/minute pendant une heure, et à une température de 0 . te surnageant est chaque fois éliminé. La lyophilisation du culot permet d'obtenir 17,5 grammes de produit sec. Dans une variante de mise en oeuvre du procédé on peut éliminer le laurylsulfate de sodium par dialyse contre l'eau distillée. La fraction ainsi obtenue possède un pouvoir immunisant important contre la brucellose. Cette fraction peut être définie comme possédant les caractéristiques suivantes 10/ Réactions colorées - Réaction de Molish ou test au naphtol: réaction positive ce qui prouve la présence de sucres. - Réaction du biuret (spécifique de la liaison peptidique): réaction positive, - Réaction xanthoprotéSque (acides aminés contenant le cycle aromatique): réaction positive. - Recherche des lipides (méthode au noir de Soudan): réaction négative. 20/ Analyse élémentaire: - Carbone 47,40%. - Hydrogène 8,13 à 8,19%. - Azote (microkfeldahl) entre 9,55 et 10,9% (10,6% - 9,55%- 9,85% - 10,9h - 10,6% et 10,9%). -Phosphore (par colorimétrie) entre 0,75 et 0,95%. a) Après minéralisation par E2S04 et HNO3, méthode colorimétrique au réactif ferromolybdique: 0,75% et 0,85%. b) Après minéralisation en milieu sulfurique avec le mélange nitro-perchlorique, l'acide phosphomolybdique est réduit par l'hydroquinone (méthode de Macheboeuf et Delsal): entre 0,90 et 0?95% (0,895 - 0,915 - 0,935 - 0,955 - 0,900 - 0,020 -0,930). - H20 (après dessication à 800) : 8,5 % sous vide sur P2O5 : 6,5% - Solubilité dans l'eau : 10 mg/100 ml - Solubilité dans l'alcool : (50%) spectre d'absorp tion W : petite abaorption à 240 rien à 260 . 30/ Hydrolyse sulfurique (40 mg dans 2 ml de H2SO4N) chauffage 100 pendant une heure. Résidu repris par 1 ml d'eau. Chromatographie en couche mince Sur Kiesegel G tamponné par acide borique. - solvant : butanol - pyridine - eau (6-4-3) présence (glucose révélation nitrate d'argent ammor (glucosamine niacal. (phtalate d'aniline résorcinol en milieu ClH ou SO4H2 ninhydrine - solvant benzène - acide acétique glacial - méthanol (2-2-6) présence glucosamine confirmée (bien séparée du fructose) Chromatographie sur papier: Sur papier Whatman 1 - solvant : butanol - pyridine - eau (6-4-3) présence ribose révélation au réactif d'Elson Morgan (glucose bien déterminée gluco samine confirmée tpeut-etre N-acetyl gluco samine 4 / Hydrolyse chlorhydrique (100 mg dans 10 ml HEIN) chauffage 1000 pendant une heure. - dosage des sucres par la méthode de l'anthrone de Morris. - glucose : de 1 à 3% (1,2 - 1,1 - 2,3 - 1,35 - 2 - 2,2 2,5 - 3,1 - 3,2) - ribose : de 8 à 12% (7,8 - 9,9 - 9,6 - 9 - 10,8 - 12,6) - dosage des sucres aminés par la méthode d'Elson Morgan - glucosamine : de 0,6 à 0,7% (0,6 - 0,65 - 0,65 - 0,70) - dosage des protéines par la méthode de Lowry (étalon: ovalbumine) de 42 à 43,5% (42 - 42,75 - 42 - 43,5). Les tests suivants ont été effectués sur les parois de Bru- cella obtenues comme précédemment décrit Pouvoir agglutinogène Les tests ont été effectués sur cobayes dix jours après insection faite à chaque animal de 50 mg d'extrait de parois. D'après les études qui ont été faites c'est à cette période que se situe généralement le maximum du taux d' anticorps dans le sang des cobayes. On utilise au moins dix cobayes par série d'expériences en prenant des animaux de 350 grammes de lignée E albinos. Pour effectuer les tests, les animaux sont saignés, etla réaction d'agglutination est effectuée sur leurs sérums. A des dilutions croissantes de sérum (0,5 ml) on ajoute,dans chaque cas, une quantité fixe d'antigène (0,5 mi). Ces mélanges sont placés à 370C. L'agglutination est observée après 18 heures. Des tests comparatifs effectués dans les conditions précitées ont montré que le pouvoir agglutinogène de 50 mg de parois entières est de 1/9O, c'est-à-dire de 180 unités, alors que le pouvoir agglutinogène de 50 mg d'extrait de parois selon l'invention est seulement de 100 unités. il en résulte que le pouvoir agglutinogène des extraits de parois selon l'invention est notablement plus faible que le pouvoir agglutinogène de parois entières de bactéries. Pouvoir protecteur Pour tester le pouvoir protecteur, on utilise des souris blanches de lignée C P 1 femelles de 16 à 18 grammes qui sont vaccinées par injection d'extrait par voie sous-cutanée. Pour chaque dose d'extrait on a utilisé un groupe de 30 souris. Elles sont ensuite mises à ltépreuve un mois plus tard en même temps que des souris témoins, par injection par voie ultra péritonéale de 10.000 Brucella, de souche virulente n 544 par animal. Dix jours après l'épreuve on procède à l'autopsie de tous les animaux. On pèse leur rate que l'on broie ensuite dans dix fois leur propre poids d'eau. On procède alors à la numération des bactéries. Le nombre de bactéries trouvé est inversement proportionnel au degré d'immunité conféré à l'animal par i 'injection d'extrait bactérien. On a reporté dans le tableau ci-dessous le nombre de Brucella par gramme de rate de souris vaccinée, à l'aide de 0,10 mg de préparation par souris. Préparation vaccinante Nombre de Brucella par gramme de rate Parois de Brucella non traitées.....,.., 510 Parois de Brucella après délipidation... 2.500 Parois de Brucella après traitement à la papaSne ........................... 1.550 Parois de Brucella après traitement à la papaïne et au laurylsulfate ...... 940 Bactérie s entières formulées en excipient (vaccin du commerce) e 6.300 Aucune injection vaccinante e.... 1.900.000 Il convient de noter que les parois normales de Brucella ne peuvent être utilisées car elles sont toxiques. il résulte de ce tableau que les extraits de parois de BÙ- cella selon l'invention confèrent une très bonne immunité qui est de l'ordre de 4 à 6 fois supérieure à celle du vaccin du commerce qui était expérimenté à titre de référence. Ce résultat est d'autant plus remarquable que les extraits de parois selon l'invention ne provoquent que l'apparition d'un taux d'agglutinines assez faible. Pour réaliser un vaccin à l'aide des extraits de parois obtenus comme il vient d'etre décrit, il suffit de placer l'extrait dans un excipient convenable avec adjonction éventuelle d'un adjuvant. A titre d'exemple, 500 mg d'extrait de paroi obtenu comme décrit ci-dessus constituent une dose vaccinante pour un bovin. Comme excipient on peut, par exemple, utiliser des émulsions d'huile catelle que huile de paraffine ou produits vendus sous le nom de Span 80 ou de Tween 80) et d'eau, ou des mélanges connus d'hydrocarbures paraffiniques et de glycerides oléiques polyoxy- éthylènés tels que ceux vendus par la Société Gattefossé sous le nom W B. R E V E N D I 5 A T I o N S 1. Procédé de préparation d'un vaccin contre la brucellose, à base de parois de bactéries Brucella abortus, caractérisé en ce que successivement on cultive une souche atténuée de Brucella abortus Buch 19 > que l'on procède à la désagrégation par broyage de ces bactéries, qu'on délipide les parois obtenues, que l'on attaque ces parois à l'aide de papaine, à la suite de quoi llon récolte la fraction solide que l'on traite pour réaliser le vaccin. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'après avoir soumis les parois à l'action de la papale, on les traite à l'aide d'une solution d'un tensio-actif tel qu'un laurylsulfate ou un chélate. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on élimine le tensio-actif par dyalise contre l'eau distillée. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on élimine le tensio-actif par une succession de lavages et de centrifugations. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on lyophilise les produits obtenus à chaque étape du procédé. 6. Vaccin antibrucellique, caractérisé par le fait qu'il contient des parois de Brucella traitées selon l'une quelconque des revendications précédentes. 7. Vaccin selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'il contient un extrait de parois de Brucella possédant les caractéristiques de réaction colorée, d'analyse élémentaire, d'hydrolyse sulfurique et d'hydrolyse chlorydrique, stipulées dans l'exemple de la description. 8. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé par le fait qu'il contient 500 mg d'extrait de parois dans un excipient approprié pour constituer une dose immunisant les bovins. 9. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que extrait de parois de Brucella est mé- langé à un excipient constitué par une émulsion d'huile et d'eau ou un mélange d'hydrocarbures paraffiniques de glycéides oléiques polyoxyéthylénés. 10. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé par le fait qu'il contient également un adjuvant.