Brevet FR2047889A1 — publié le 19710319

La présente invention concerne un procédé pour isoler un enzyme fibrinolytique sous forme hautement purifiée. Elle concerne d'autre part l'enzyme ainsi obtenue et ses applications comme agent thrombolytique. En dehors de l'utilisation de la streptokinase, fondée sur une activation du plasminogène du corps en plasmine, on a effectué, d'une manière croissante des essais pour enrichir la thérapie thrombolytique par l'application d'enzymes protéolytiques à mode d'action fibrinolytique. De faibles quantités seulement d'une protéase de ce type permettent de résorber complètement les thromboses artérielles et veineuses. Une protéase de qualité désirée pour la thérapeutique doit cependant titre présente sous une forme hautement purifiée et elle doit être active du point de vue fibrinolytique dans les conditions physiologiques sans aucun effet secondaire toxique. I1 est connu que des mélanges de certains champignons, agents de moisissures, produisent des enzymes protéolytiques qui renferment également des protéases à activité fibrinolytique. I1 est déjà connu que l'on peut isoler, à partir d'Aspergillus oryzae, une protéase å activité iibrinolytique, désignée sous le nom d'AspergillineO J roc. Soc. exp. Biol., N.Y., qq, 504 (1958 * On enrichit la protéase par précipitation directe à partir des filtrats de culture avec des solvants organiques ou par précipitation avec des solvants organiques après une purification préliminaire sur un échangeur d rions en résine synthétique, mis dans le commerce sous le nom de IRA 400.Consécutivement, on met de nouveau en suspension le précipité obtenu, on le filtre et on précipite les substances inertes par addition d'une solution de sulfate de cuivre, de zinc ou de cadmium. Après une dialyse, on soumet le surnageant renfermant la substance active à une lyophilisation stance 2, 44.3 (1959)7. A.P. TRUÂNT et F.G. NORSTROM (brevet des Etats-Unis d'Amérique No. 3 256 157) ont obtenu une protéase à activité fibrinolytique à partir d'Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus ou Absidia coerulea, en ajoutant au filtrat de culture à 09C, soit le double du volume d'éthanol refroidi à -20QC et en filtrant à la trompe la sub- stance active précipitée, soit en ajoutant au filtrat de culture une solution de tanin et en traitant le précipité renfermant la substance active, après une durée de repos de 48 à +4 C, en agitant, avec de l'acétone en éliminant ainsi la substance active insoluble dans l'acétone.Consécutivement, on met en suspension dans l'eau la substance active séchée sous vide, on sépare par centrifugation la fraction insoluble, on dialyse la solution renfermant la substance active par rapport à l'eau et on la lyophilise. Par ailleurs, on décrit dans le brevet Canadien No. 671 648 un procédé pour la préparation d'agents fibrinolytiques à haute activité à partir d'Aspergillus oryzae, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on soumet la préparation brute, après sa dissolution dans l'eau et établissement du pH à 3,5 - 5,5 au moyen d'acide chlorhydrique, à la chromatographie sur une résine de dextrane réticulée, mise dans le commerce sous le nom de Sephadex G-50 et en ce qu'on lyophilise, consécutivement, après développement au moyen d'eau renfermant de l'acide chlorhydrique, les fractions renfermant les substances actives. B.A. LuDRJASCHOV g Ber. d. Akad. d. Wiss. der UdSSR 153, 4, 939 (1963 a trouvé également, en dehors des souches d'Aspergillus oryzae, une substance à activité fibrinolytique dans Aspergillus awamori, et il a isolé ladite substance active selon le procédé, décrit ci-dessus, de STEFÂNINI LProc. Soc. exp. Biol., N.Y., qq, 504 (1958)7. Â.Â. IMSCHENETSKI et coll. [Ber.d.Akad.d.Wiss. der UdSSR 163, 3, 737 (1965)] ont indiqué un procédé pour l'obtention d'une protéase à activité fibrinolytique à partir d'Aspergillus terricole. L solement est effectué en ajoutant du sulfate d'ammonium ou de l'acétone au filtrat de culture pour précipiter la substance active. après séparation par centrifugation, on dissout le précipité dans l'eau, on écarte par filtration les fractions insolubles et pn soumet à la filtration le filtrat ainsi obtenu, sur une colonne de résine connue dans le commerce sous le nom de Sephadex G-25, afin de séparer le sulfate d'ammonium et les pigments. On lyophilise l'éluat actif. Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No. 3 281 331, on décrit un procédé pour isoler des protéases à activité fibrinolytique, dans lequel on adsorbe la substance active à partir de la solution d'un mélange d'enzymes bruts d'Aspergillus oryzae, Âspergillus flavus ou Absidia coerulaa à pH 5,5, sur la carboxyméthylcellulose ou sur la résine connue dans le commerce Bouts le nom de carboxyméthyl Sephadex, on les élue avec un tampon à pH 7,0 et consécutivement, après la dialyse, on les lyophilise ou on les précipite avec le tanin, ou encore on les adsorbe à pH 6,0 sur la DELE-cellulose (dié thylaminoéthylcellulose) et on les élue avec un tampon par élévation graduelle de la concentration saline. Tous les procédés connus se rapportent à l'isolement d'une protéase à activité fibrinolytique à partir d'Aspergillus oryzae, Aspergillus terri cola, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori ou Âbsidia coerulea. Les procédés de traitement décrits ci-dessus ne sont applica bles, par suite de la structure moléculaire différente des protéases et des propriétés physico-chimiques spécifiques qui en résultent, qu'à l'isolement d'enzymes à activité fibrinolytique à partir de chacua des champignons, agents de moisissures, indiqués ci-dessus. Certains procédés de traitement ne conduisent, en outre, qu'à des préparations de protéases partiellement purifiées, ce qui limite leurs possibilités d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de l'invention, on se propose de développer un procédé pour l'isolement rationnel d'une protéase de haute pureté, ayant une activité fibrinolytique optimale dans les conditions physiologiques, à partir d'Aspergillus ochraceus, et qui puisse titre appliquée, sans effet secondaire toxique, dans la thérapie externe ou parentérale. Selon l'invention, on se propose d'isoler à partir de mélanges d 'enzymes bruts obtenus à partir d 'Âspergillus ochraceus, une protéase à activité fibrinolytique de haute pureté. Il était avant tout nécessaire de mettre au point un procédé au moyen duquel on puisse parvenir à éliminer par séparation, d'une manière rationnelle, les protéases inactives du point de vue fibrinolytique, les protéines inertes et les colorants gênants. On a ainsi déterminé selon l'invention que l'on peut préparer une protéase à activité fibrinolytique, utilisable en thérapeutique sans eifet secondaire tositue, lorsqu'on extrait avec une solutiontampon aqueuse un mélange d 'enzymes bruts isolé à partir de cultures dlAapergillus ochraceus, on filtre l'extrait renfermant la substance active sur un échangeur d 'anions constitué par la résine connue dans le commerce sous le nom defDEAE-Sephadew ou constitué par la D cellulose et, consécutivement, on précipite la substance active à partir du filtrat renfermant ladite substance active, au moyen d'un solvant organique miscible avec l'eau.Après séchage sous vide, on doit dissoudre dans l'eau le précipité séparé, renfermant la substance active, et le soumettre à une chromatographie sur gel, en utilisant à cet effet un gel de dextrane réticulé connu dans le commerce sous le nom de Sephadex G-75 ou Sephadex-10O. On effectue la cryodessiccation des fractions renfermant la protéase et on obtient ainsi la protéase à activité fibrinolytique de haute pureté L'extraction du mélange enzymatique brut est effectué de telle manière que l'on agite plusieurs fois, en le remuant à la température ambiante, cette préparation brute, ayant une activité protéolytique d'environ 1 unité caséinolytique/mg, avec un tampon de Tris-HCl 0,05-0,1 M, à pH 6,5-7,5, ou un tampon d'acétate d'ammonium 0,05-0,1 M, à pH 6,5-7,5, afin de dissoudre complètement la substance active. Par centrifugation à 15.000 g, on obtient une solution limpide, de couleur sombre, renfermant la substance active et on sépare la fraction inactive insoluble. On filtre ledit extrait renfermant la substance active, de préférence à 0-4sC, sur une colonne garnie de l'échangeur d'anions DEkE-Sephades Â-50 ou de l'échangeur d'anions DEkE-cellulose, de capacité 0,5-0,9 milliéquivalent/g, qui est équilibrée au moyen du tampon d'extraction. Consécutivement, on lave l'échangeur d'ions avec le tampon utilisé pour l'extraction. Par le traitement à l'échangeur d'anions indiqué ci-dessus, on libère de l'extrait renfermant la substance active aussi bien des substances protéiniques inertes que des protéases non appropriées pour une thérapie non fibrinolytique, de même que la plus grande partie des substances colorantes, tandis que la protéase ayant une activité fibrinolytique n'est, au contraire, pas adsorbée. A partir de la solution de la substance active obtenue de la manière précitée, on précipite la substance active en ajoutant trois fois la quantité d'un solvant organique miscible avec l'eau, préalablement refroidi à -20QC, de préférence avec l'éthanol, et on la sèche sous vide. On soumet la substance renfermant l'agent actif, redissoute dans la plus petite quantité d'eau possible, à une chromatographie sur gel de telle manière que l'on envoie la solution, de préférence à une température comprise entre O à +4QC, sur une colonne garnie d'un gel de Sephadex G-76 ou d'un gel de Sephadex G-100. Consécutivement, on élue avec de l'eau. On détermine l'activité protéolyti q des fractions obtenues par l'élution. On soumet les fractions actives à la cryodessiccation et elles fournissent une poudre sèche blanche d'une protéase à activité fibrinolytique, pure, ayant une activité protéolytique d'environ 15 unités caséinolytiques/mg. Par la mise en oeuvre du procédé de l'invention, il est possible d'isoler à partir d'un mélange enzymatique brut, obtenu à partir d'Aspergillus ochraceus, une protéase à activité fibrinolytique, de haute pureté, active dans les conditions physiologiques, en utilisant des moyens techniques simples. La protéase à activité fibrinolytique n'est entachée d'aucun effet toxique secondaire lors de son application par voie externe ou par voie parentérale dans des conditions thérapeutiques. L'activité protéolytique, exprimée en unités caséinolytiques, est déterminée selon un procédé modifié d'après la méthode d'essai indiquée par EUNITZ L3.Gen, Physiol. 30 (1947) 291 J . Les exemples suivants sont destinés à illustrer des modes de mise en oeuvre du procédé de l'invention sans nullement limiter celle-ci dans son cadre et son esprit. Exemple t On soumet 50 g d'un mélange enzymatique brut, isolé à partir de cultures d'Aspergillus ochraceus, ayant une activité protéolytique globale de 1,4 unité caséinolytique/mg, à une série de quatre extractions avec, dans chaque cas, 200 ml d'un tampon de Xris-Hal 0,05 M à pH 7,2, en agitant par voie mécanique pendant 1,5 minutes. On clarifie le mélange d'extraction par centrifugation à 15.000 g. On réunit les solutions renfermant la substance active, qui-sont limpides, de couleur sombre, et qui fournissent au total un volume de 750 ml. On filtre la solution globale entre O et 4QA sur une colonne garnie d'un échangeur d'anions DEAE-Sephades A-50 (10 cm de diamètre 18 cm de hauteur de remplissage). Ensuite, on lave avec un tampon de Tris-HCl 0,05 X à pH 7,2. Pour la préparation du lit d t échangeur, on équilibre 50 g de Drh2-sephadex A-50 avec un tampon de Tris-HCl 0,05 M à pH 7,2. A partir du filtrat renfermant la substance active, qui n'est plus que faiblement coloré (environ 3500 ml), on précipite la substance active avec trois fois le volume d'éthanol refroidi à -20OC. Pour la fluculation complète de la substance active, on laisse reposer le précipité pendant une nuit à -2QQC. On sépare le précipité par centrifugation, on le lave consécutivement avec de l'méthanol et de l'acétone et on le sèche sous vide. On obtient 4,43 g d'un produit enrichi en protéase à activité fibrinolytique, à 11,6 unités caséinolytiques/mg. On ajoute à 1,5 g de ce produit, 8 ml d'eau distillée, on agite en remuant et on le libère du résidu insoluble par centrifugation à 5.000 g. On filtre l'extrait limpide, brunttre, renfermant la substance active à 0-4 C sur une colonne garnie d'un gel de Sephadex-G-75 gonflé avec de l'eau (2,5 cm de diamètre, 95 cm de hauteur de remplissage) et on élue avec de l'eau distillé? . On recueille, à cet effet, l'élut qui sort de la colonne, par fractions de 20 ml. Après une fraction préliminaire inactive de 220 ml, la substance active se trouve dans les fractions 12 à 18, tandis que les colorants et les protéines à faibles poids moléculaires demeurent sur la colonne. On soumet la solution de la substance active (140 mi) à une cryodessiccation et elle fournit ainsi 616 mg d'une poudre sèche blanche, très soluble, ayant une activité protéolytique spécifique de 15,7 unités caséinolytiques/mg. Exemtie 2 On soumet 20 g d'un mélange enzymatique brut isolé à partir d'Asergillus ochraceus, ayant une activité protéolytique globale de 1,0 unité caséinolytique/mg, à une extraction selon le'mode opératoire de l'exemple 1. On filtre la solution limpide, de couleur sombre, renfermant la substance active obtenue (290 ml) sur une colonne garnie de l'échan- geur d'anions DEAE-cellulose (4,5 cm de diamètre, hauteur de remplissage 15 cm),-que l'on a équilibrée au moyen d'un tampon de Tris-HCl 0,05 X à pH 7,2. Consécutivement, on lave avec un tampon de Tris HCl 0,05 N à pH 7,2. A partir du filtrat renfermant la substance active (environ 400 ml), on précipite la dite substance active comme décrit à l'ssem- ple 1, en obtenant 3,19 g d'un produit enrichi en protéase à activité fibrinolytique de 4,5 unités caséinolytiques/mg, qui doit être soumis à une chromatographie sur gel selon l'exemple 1, pour récupérer la substance active de haute pureté. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour isoler un enzyme fibrinolytique à partir de cultures de champignons, agents de moisissures, caractérisé en ce qu'on extrait un mélange enzymatique brut obtenu à partir d'Aspergillus ochraceus, avec une solution-tampon aqueuse, on filtre 1 'ex- trait renfermant la substance active ainsi obtenue sur un échangeur d'anions, formé du produit connu dans le commerce sous le nom de DSkE-Sephadew ou de DEAE-cellulose (diéthylaminoéthylcellulose), on précipite la substance active, à partir du filtrat obtenu renfer mant la dite substance active, avec un solvant organique miscible avec l'eau, on redissout le précipité après séchage sous vide dans l'eau et on soumet la solution ainsi obtenue à une chromatographie sur gel en utilisant à cet effet des gels de dextrane réticulés formés de produits connus dans le commerce sous le nom de Sephadex G-75 ou Sephadex G-100 et, consécutivement, on soumet les fractions renfermant la protéase à une cryodessiccation. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on extrait le mélange enzymatique brut obtenu à partir d'Aspergillus ochraceus avec un tampon de Tris-HCl 0,05 M à 0,1 M ou un tampon d'acétate d'ammonium 0,05 M à 0,1 M à pH de 6,5 à 7,5, de préférence 7,0 à 7,2. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on filtre l'extrait renfermant la substance active sur une colonne garnie d'un échangeur d'anions formé du produit connu dans le commerce sous le nom de Dw42-ephadex Â-50 ou DEAE-cellulose, de capacité comprise entre 0,5 à 0,9 milliéquivalent/g, équilibré avec le tampon utilisé pour l'extraction, en effectuant la filtration de préférence entre 0 à 4 C, on lave consécutivement l'échangeur avec le tampon et on précipite la substance active à partir du filtrat au moyen d'un solvant organique miscible avec l'eau, de préférence l'éthanol, préalablement refroidi à -20tC, dans le rapport 1:3. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, áractdrisd en ce qu'on redissout la substance renfermant l'agent actif, obtenue après le traitement sur l'échangeur d'anions, dans la plus petite quantité possible d'eau, on soumet la solution obtenue à la chromatographie sur gel, de préférence entre O à 4 C, sur une colonne garnie d'un produit connu dans le commerce sous le nom de Sephadex G-75 ou de Sephadex G-100, on l'élue avec de l'eau et on rassemble l'éluat en fractions, puis on soumet les fractions renfermant la protéase à une cryodessiccation. 5 - A titre de produit industriel nouveau, la protéase de haute pureté obtenue à partir d'Aspergillus ochraceus, selon le procédé décrit à l'une des revendications 1 à 4.