Brevet FR2052923A1 — publié le 19710416

La présente invention traite d'un nouveau procédé pour cliver enzymatiquement la liaison amide de 11 antibiotique rovo-biocine, et d'un nouveau 'compose obtenu par un tel procédé. Plus particulièrement, la présente invention est relative au cliva.;,o 5 enzymatique de la liaison amide dans l'antibiotique novobiocinc afin d'obtenir de la 3-amino-4-hydroxy-7~0-/3-0-carbamoyl-4-0~ méthyl-5-désoxy-5, 5--diméthyl-p-L-lyxopyranosyl/méthyl coumari ne, à laquelle on a donné le nom de novénamine. La novénït- mine peut aussi être obtenue par le clivage enzymatique de la di-10 hydronovobiocine. La novobiocine est un antibiotique qui peut Être obtenu comme produit d'élaboration d'un streptomycète produisant de la novobiocine. Des procédés pour la production, la récupération et la purification de la novobiocine sont décrits dans le brevet USA 15.n° 3.049.534. La novobiocine est un antibiotique bien connu utilisé pour le traitement d'infections par staphylocoques et pour le traitement des infections des voies urinaires provoquées par cer-taine^souches de Proteus. Elle ne. montre aucune résistance réciproque à la pénicilline et est active vis-à-vis des souches de 20 Staphylococcus aureus résistant à la pénicilline. La dihydronovo-biocine est un antibiotique préparé par hydrogénation de la novobiocine suivant les processus décrits dans le brevet U.S.A. n° 3.175.944. Avant la présente invention, les spécialistes dans le domaine des antibiotiques n'ont pas été capables de cliver la mo-25 lécule de novobiocine afin d'obtenir le composé appelé novénamine. De la sorte, le procédé de la demanderesse pour le clivage enzymatique de la novobiocine afin d'obtenir de la novénamine est le premier procédé connu réalisant un tel résultat et est le premier procédé connu mettant la novénamine à la disposition des spécia-30 listes de la technique. La novénamine (U-33.918), un nouveau composé de la présente invention, est prép. rée par clivage enzymatique de la novobiocine ou de la dihydronovobiocine avec un nouveau micro-organisme qu'on a identifié comme étant un Arthrobacter sp. On a décou-35 vert que cette bactérie produit un enzyme qui clive la novobiocine en novénamine et en " 'acide 4-hyd.roxy--3- (3-métliyl-2-butényl) -benzoïque. Ce clivage "nydroly tique enzymatique est réalisé sous des conditions d'anaérobie et donne des rendements 'quantitatifs de BAD ORIGINAL 70 20018 2052923 produits de clivage. A. Le micro-organisme (1) Description La bactérie utilisée suivant la présente invention cour 5 le clivage enzymatique de l^hovobiocine a été identifiée comfao étant un Arthrobacter sp. , et dans la présente demande de brevet on l'appelle N-18. N-18 est une nouvelle bactérie» Une de ses caractéristiques de souche consiste en la propriété de produire un enzyme qui clive la novobiocine. Une sous-culture de l'organisme 10 vivant est déposée sans restriction et peut être obtenue à partir de la collection permanente de "Northern Utilization and Research Division", Agricultural Research , U.S. Department, of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. Son numéro d'accès dans cette collection est le NRRL B-3652. 15 La bactérie N-18 est une bactérie non douée de mouve ment , pléomorphique, Gram négatif, de longueur 'variable, quelque fois d'aspect coccoïdal . Elle croît très bién dans une série de milieux de laboratoire contenant différentes sources de carbone et d'azote , par exemple le peptone, les produits de digestion de 20 caféine, les produits de di->.gestion de lactalbumine, le tryptone, le tryptocase, etc. A l'exception de la méthionine et de la valine, la bactérie N-18 utilise tous les acides aminés ordinaires comme source de. carbone et d'azote pour la croissance, par exemple lJas-partate, le glutamate, la lysine, l'arginine, l'histidine, la pro-25 line, 1'hydropyroline, 1'asparagine, la glutamine, la glycine, l'alanine, la leucine, 18isoleucine, la sérine, la•thréonine, la tyrosine, la phénylalanine, et le tryptophane.Elle utilise aussi de la même manière la novobiocine. Les composés suivant peuvent aussi servir comme source de carbone pour la croissance : ribose, 30 xylose, glucose, fructose, galactose, 2-cétogluconate, p-hydroxv~ benzoate, citrate et glycérol, mais pas 11arabinose^ sorbose^ mal-tose, le sucrose, le lactose, la dextrine, l'amidon, le rhamnose, le raffinose, l£inositol, le sorbitol, le manriitol et le p-amino-benzoate. Les sels d'ammonium servent de sources dIazote adéquates 35 pour la croissance. La bactérie N-18 croît bien dans des conditions aérobies à 20, 28, 32 et 37°C , mais pas à 42 ou 5°C. Elle est positive à la catalase, mais les tests au cytochrome oxydase, à ltin~ dole, ainsi que les test Voges-Proskauer et à l'urease sont négatifs. BAD ORIGINAL 70 20018 2052923 Elle ne réduit pas les nitrates en nitrites, ne liquéfie pas la gélatine et ne produit pas de H S. Les tests quant aux arginine, lysine et ornithine décarboxylases sont négatifs. La bactérie pire— duit des acides à partir des sucres sans dégagement de gaz. 5 sur la base des résultats ci-dessus que cette bactérie a été désignée comme appax'tenant au genre Arthrobacter. (2) Conservation La bactérie est maintenue sur des cultures couchées ào milieu d'agar contenant 0,5 gr de tryptone, 1 gr de mélasse "Brer 10 Rabbit", 1 gr de glycérol, 0,25 gr d'extrait de levure et 1,5 gr d*agar (pH 6,8), conservée à 5°C et transférée à des intervalles de 2-4 semaines. La bactérie peut aussi être maintenue sur des milieux de composition comparativement simple , par exemple 0,2% d'agar Difeo Casitone ou 0,1% de glucose, 0,05% de NH^Cl et de sels 15 inorganiques ou 0,1% de glucose et 0,05% dlextrait de levure. Des milieux complexes, par exemple du bouillon d'infusion de coeur et cerveau, ne favorisent pas l'élaboration de l'enzyme clivant la novobiocine qui est appelé ici novobiocine acylase. (3) Conditions de croissance 20 Les cellules de la bactérie N-18 peuvent croître et pro duire de la novobiocine acylase dans une série de milieux se composant de diverses sources de carbone et d'azote aussi longtemps quxune bonne croissance de la bactérie est obtenue. Des sources convenables de carbone et d'azote sont de l'extrait de levure, la NZ-Amine B (produit de digestion enzymatique de caséine de 25 Sheffield; ), la Casitone (Difco) , le glucose, le NIï^Cl, etc. Les milieux peuvent être complétés avantageusement avec des sels inorganiques, par exemple KH^PO^, MgSO^, NaCl, FeCl^/ FeSO^, etc. Un milieu préféré se compose de 0,8% de NZ-Amine B, 0,5% de glucose, 0,05% de KH2P04, 0,05% de NaCl, 0,02% de MgS04.7H20 et 0,001% 30 de FeS04 (pH de 7,6). B. Le clivage enzymatique de la novobiocine Le clivage enzymatique de la novobiocine se fait de la façon suivante : BAD ORIGINAL 70 20018 4 2052923 10 15 H^N-C-O OH 2 |? 0 Novobiocine (fragment C et B) Novénamine (fragment A) Acide 4-hydroxy-3-(3-méthyl-2-butényl)-benzoîque 20 Le clivage ci-dessus est réalisé en mettant en contact la novobiocine ou la dihydronovobiocine, sous la forme de l'acide libre ou de son sel basique avec la bactérie N-18 décrite ci-dessus» Ce clivage est réalisé avantageusement sous des conditions anaéro-bies pour obtenir des rendements quantitatif des produits de cli-25 vage. Les cellules de la bactérie N-18 sont mises à croître pendant environ 1-3 jours à une température d'incubation d'environ 25-37°C. Le temps de croissance préféré est d'environ 1 jour à une température d'incubation d'environ 28°C. Avantageusement, les cel-30 Iules sont agitées et aérées dans le milieu au cours du cycle de croissance. Les cellules bactériennes sont recueillies du milieu de croissance avantageusement par centrifugation. Les cellules recueillies sont ensuite lavées à l'eau et remises en suspension avanta-35 geusement dans une quantité minimum d'eau. Cette matière peut ensuite être mise en suspension dans une solution aqueuse de novobiocine , par exemple de la novobiocine de sodium ,où le procédé de clivage se produit. Comme décrit ci-dessus, le procédé de clivage 70 20018 5 2052923 est réalisé avantageusement sous des conditions anaérobies. J-.:.: conditions anaérobies peuvent être réalisées dans le laboratoire- par différents moyens connus en pratique, par exemple en recouvrr: ; le mélange réactionnel avec une substance étanche à l£air comme pur 5 exemple le toluène ou en balayant le mélange réactionnel avec l'azote. Des conditions aérobies dans une installation de traitement plus grande qu'un laboratoire peuvent être réalisées par oit-férentes méthodes connues en pratique. D'une façon générale, le clivage de la novobiocine pni 10 l'enzyme formé par la bactérie N-18 est réalisé après une période d'environ 18-42 heures à la température ambiante. Des tempérât v>"es plus élevées par exemple de l'ordre de 34°C à environ 37°C raccourciront le temps réactionnel, tandis que des températures plus basses par exemple de 15°C à environ 24°C allongeront le temps réac-15 tionnel. Le clivage est de préférence réalisé à la température ambiante. Des concentrations très élevées des cellules contenant l'enzyme désiré raccourcissent aussi le temps de la réaction. Le clivage étant réalisé, les cellules bactériennes sont séparées du mélange réactionnel. Ces cellules de bactérie 20 N-18 sont tout à fait stables et elles ne sont pas facilement inactivées au cours du procé3é de clivage. De la sorte, les mêmes cellules peuvent être utilisées 4 à S fois plus dans des procédés de clivage tels que décrits ci-dessus. Les cellules peuvent aussi être lyophilisées et stockées pendant des périodes prolongées de 25 temps à de basses températures (de préférence en dessous de la congélation) sans perte mesurable de leur faculté d'activer la novobiocine. Les cellules sont séparées du mélange réactionnel par cen-" trifugation ou filtration. La centrifugation est préférée. La quantité de novénamine dans le surnageant exempt de cellules peut 30 être déterminée par la m; thode suivante: Une quantité (0,1-0,5 ml) de surnageant est diluée,ajustée à pH 1,8 avec du HCL 3N, extraite à Ieacétate de butyle, l'extrait est dilué avec 2 volumes d'éthanol acidifié (HC1 3N) (pH 2,0), et la quantité de novénamine est déterminée quantitativement par son absorption à 295 mp.. La quantité 35 de novénamine est calculée suivant la formule suivante : o:D295 m|X X dilution = mgr de novénamine/ml 35,4 x m 35,4 est égal à 0^2^^ mu de mgr de novénamine/ral (=a) OD = densité optique. BAD ORIGINAL 70 20018 6 2052923 Des concentrations de novobiocine d'environ 1-.2,so u; clivées en novénamine (et en fragment A) dans des rendements cio 91-100% en environ 1 jour par le procédé de clivage décrit: ci-dessus. 5 On peut substituer de la dihydronovobiocine à la ncc- biocine dans le procédé de clivage enzymatique décrit ci-dessus pour obtenir de la novénamine. La novénamine est relativement soluble dans l'eau et relativement insoluble dans les solvants dans lesquels la novo-10 biocine et la dihydronovobiocine sont extractibles à pH acide. Par exemple, la novénamine est relativement soluble dans les alkanas inférieurs chlorés, par .exemple le chlorure de méthylène, le chloroforme, le dichlorure d'éthylëne, etc; dans les esters non miscibles dans l'eau, par exemple l'acétatec?éthyle, l'acétate de 15 butyle, l'acétate d'amyle., etc; et dans les alcools supérieurs non miscibles dans l'eau. La novénamine est instable' en présence dEoxy-çpne en solution sous des conditions alcalines. La novénamine peut être récupérée à partir de la réaction da clivage enzymatique par une série de processus, par exempte 2o l'utilisation d'adsorbants, et la cristallisation dans des solvants. La première étape dcun tel procédé comprend avatageusement l'enlè-\etr.ent des cellules bactériennes; avantageusement, ceci est réalisé par centrifugation ou filtration d'une suspension acidifiée. Dans un procédé préférée, le surnageant de clivage ou filtrat con-25 tenant la novénamine ainsi que diverses impuretés telles qu'une certaine quantité de matière de départ non clivée , c'est-à-dire de la novobiocine ou de la dihydronovobiocine, est ajusté à un pH acide de l'ordre de 2 à 6, extrait ensuite avec un solvant dans lequel la novénamine n'est pas soluble. N'importe quel sol-30 vant décrit ci-dessus peut être utilisé ; l'acétate de butyle est le solvant préféré. L'extraction du surnageant de clivage acidifié enlève les impuretés, par exemple la novobiocine ou la dihydronovobiocine, en laissant ainsi un surnageant qui peut être séché par congélation en une préparation relativement pure de sel d'addition 35 d'acide de novénamine. Cette préparation de novénamine peut être utilisée dans des environnements ou des préparations de novénamine de très haute pureté ne sont pas essentielles. Aussi, cette préparation relativement pure de novénamine peut être acylée pour former BAD ORIGINAL 70 20018 7 2052923 des acylates de novénamine bactéricide actifs , tels que cêcrit ci-après. Des préparations de novénamine de très haute pureté peti-vent Strè obtenues en soumettant une préparation relativement pure 5 de novénamine , telle que décrite ci-dessus, à des procéssus de cristallisation dans un solvant. Far exemple, l'eau dans une préparation relativement pure de chlorhydrate de novénamine peut être enlevée par distillation azéotropique ,par exemple en utilisant de l'éthanol absolu , et on cristallise ensuite la novénamine dans de 10 l'éthanol absolu et dans de l'éther pour produire une préparation purifiée de novénamine. Des acides convenables pour ajuster le pH du surnageant de clivagé «tel., que décrit ci-dessus, sont des acides organiques ou minéraux forts, par exemple les acides chlorhydrique, bromhydri-15 que, phosphorique, sulfurique, formique, oxalique , etc. La novénamine séchée par congélation sera isolée sous la forme du sel de l'acide utilisé. Par exemple, si on utilise de l*acide chlorhydrique pour ajuster le pH du surnageant de clivage, la novénamine sera alors isolée sous la forme du sel chlorhydrate. Ce sel peut être 20 converti en la forme base libre de la novénamine en le mettant en suspension dans du tétrahydrofuranne et en ajoutant environ un équivalent de triéthylamine ou en le dissolvant dans de l'acétone légèrement humide, ou par séchage prolongé sous pression réduite. D"autres sels de novénamine peuvent être faits à partir de la base 25 libre . Les sais de novénamine peuvent être utilisés pour les mêmes besoins biologiques que la base libre. La novénamine peut aussi être récupérée à partir du surnageant de clivage décrit ci-dessus, en convertissant la novénamine en le N-acylate. Un exemple d'un tel procédé est le suivant : (1) 30 acidifier le surnageant de clivage à environ un pH de 2,5 avec un acide minéral, par exemple l'acide chlorhydrique, (2) extraire avec un solvant pour la novobiocine , par exemple l'acétate de butyle, (3) ajuster le pH à environ 8,0 avec une base, par exemple l'hydro-xyde de sodium 6N et (4) ajouter un halogénure ou un anhydride 35 d'une acide carboxylique choisi pour former le N-acylate de novénamine. Une atmosphère d'azote doit être maintenue dans le procédé décrit ci-dessus une fois que le mélange réactionnel est ajusté à un pH alcalin. 70 20018 8 2052923 Des acides" minéraux autres que l'acide chlorhydri.qu&. qui ont été décrits précédemment, peuvent être utilisés dans le pr.océdé ci-dessus. De même, d'autres solvants pour la novobioci..ic décrits précédemment, peuvent être utilisés à la place de l'acet^e 5 de butyle dans le procédé ci-dessus. Des bases qui peuvent être utilisées dans le procédé ci-dessus à la place de l'hydroxyde Ge sodium sont le bicarbonate de sodium ou lçfcarbonate de sodium, lehy-droxyde de lithium ou de potassium, les bicarbonates ou les bases aqueuse carbonatées ou les sels basiques de métaux. De plus, des 10 aminés tertiaires solubles "dans lseau, telles que les trialkyl- amines (triéthylamine ) ou la pyridine , la quinoline, etc, peuvent être utilisées. La novénamine peut aussi être récupérée à partir de solutions aqueusës, par exemple le surnageant de clivage décrit ci-15 dessus, par adsorption sur des résines d'échange de cations. Deux types d'acides peuvent être utilisés, les acides carboxyliques et les acides sulfoniques. Des résines d'acide carboxylique convenables sont les résines d'acide polyacrylique obtenues par la copoly-mérisation d'acide acrylique et de divinylbenzène par le procédé 20 donné page 87 de Kunin, "Ion Exchange Resins," seconde édition. (1958), John Wiley et Sons, Inc. Des résines d'acide carboxylique échangeuses de cations de ce type sont commercialisées sous les dénominations commerciales Amberlite IRC-50 et Zeokarb 226. Des résines d'acide sulfonique convenables sont des résines nucléaires 25 de polystyrène sulfoné réticulées avec du divinylbenzène , obtenues par le processus donné page 84 de Kunin, supra. Les résines échangeuses de cations suifonées de ce type sont commercialisées sous les dénomination commerciales Dowex 50, Amberlite IR-120, Nalcite HCR, Chempro C-20 , PermUtit Q et Zeokarb 225. 30 L'antibiotique protoné estélué de la résine avec de l'eau à un pH acide, avantageusement à un pH inférieur aupKa de la résine échangeuse de cations utilisée . Des résultats satisfaisants sont obtenus avec un pH de l'ordre de 2 à 6. L'excès d'acide dans l'éluat est neutralisé à environ un pH de 6-7 avec une base, 35 par exemple NaOH ou. une résine échangeuse d'anions fortement basique de manière à enlever l'excès d'acide par rapport à la que .tité nécessaire pour proto^-«er les groupes basiques. Les résines échangeuses d'anions convenables pour cette utilisation sont obtenues 70 20018 2052923 en chlorométhylant par le processus donné pages 88 et 97 de : supra, du polystyrène réticulé -, si désiré, avec du divinvlt préparé par le processus .donné page 84 de Kunin, supra, et on q'-.a-ternisant avec de la triméthylamine ou avec de la diméthylalkanoj-5 aminé par le processus donné page 97 de ICunin, supra. Des résines échangeuses d'anions de ce type sont commercialisées sous les dénominations commerciales Dowex 2, Dowex 70, Amberlite IR/i-400, Dualité A-102 et Permutit S-l. La novénamine peut aussi être récupérée à partir de solu-10 tions aqueuses par adsorption sur un absorbant tensio-actif, par exemple du carbone décolorant ou des résines décolorantes, et en éluant ,1a matière adsorbée avec une solution d'eau et d'acétone, La novénamine peut être acylée pour former de noueaux composés ayant une activité antimicrobienne. Ces composés peuvent 15 être représentés par la formule suivante : ch. ch3o ch 0 H \ ch. ,h M 20 1 /h h„n-c-0 2 II O oh '0 oh 0 !l ii NHCR II 25 9 dans laquelle RC- est l'acyle d'un l'acide benzo3!que substitué de la formule : Ha *Rl*4-n dans laquelle R2 est un alkanoyloxy de 2 à 18 atomes de carbone; n est un nombre entier delà 3; R^ est de l'hydrogène, de l'akyle 30 de 1 à 18 atomes de carbone inclusivement, de l'alkoxy de 1 à 6 atomes de carbone inclusivement ou de l'alkényle de 2 à 18 atomes de carbone inclusivement. Les alkanoyloxy de 2 à 18 atomes de carbone sont les acétoxy, propionoyloxy, butanoyloxy, pentanoyloxy, hexanoyloxyj 35 heptanoyloxy, octanoyloxy, nonanoyloxydécanoyloxy, undécanoyloxy, dodécanoyloxy, tridécanoyloxy, tôtradccanoyloxy, pentadécanoyloxy, hexadécanoyloxy, heptadécanoyloxy. et octadécanoyloxy et leurs formes isomères. BAD ORIGINAL 70 20018 10 2052923 Les alkyles cle 1 à 18 atomes de carbone sont les tue envie, éthyle, propyle, butyle, pyntyle, hexyle, heptyle, octyle, ronyle, décyle, undécyle, dodécyler tridécyle, tétradécyle, pentadécyle. hexadécyle, heptadécyle, octadécyle et leurs formes isomères. 5 Les alkoxy de 1 à 6 atomes de carbone sont les méthc: éthoxy, propyloxy, butyloxy, pentyloxy, hexyloxy et leurs forms s isomères. Les alkényles de 2 à 18 atomes de carlDone sont les vinyle, propényle, allyle, isopropényle, butényle, pentényle, hor.é-10 nyle, heptényle, octényle, nonényle, décênyle, dodécényle, tridé-cényle, tétradécényle pentadécényle hexadacényle, heptadécényle, octadécényle et leurs formes isomères. Le processus de préparation des produits d'acylation de la novénamine'dépend en grande partie de la proportion suivant la-15 quelle la matière de départ a elle-même été modifiée. Lorsque la novénamine est sous sa forme de .base libre relativement pure, une très petites quantité des réactifs dlacylation est requise. Au contraire, l'utilisation de préparations brutes de novénamine comme matière de départ requiert l'utilisation d'une plus grande quanti-20 té de réactif d'acylation. Dans un procédé préféré, les produits d'acylation de novénamine de formule II peuvent être préparés à partir de la novénamine par une N-acylation sélective de la base libre novénamine avec un halogénure d'acyle d'un acide carboxylique. L'acylation 25 est réalisée en présence d'eau. Par exemple, en faisant réagir de la novénamine dans une solution aqueuse maintenue à un pH d'environ 8,0 par l'addition contrôlée de base ou de tampon, avec du chlorure de benzoyle, on obtient la N-benzoyl-novénamine. L'halogénure d'hydrogène formé au cours de la réaction est neutralisé 30 par la base ou le tampon utilisé. L'acylation de la base libre novénamine suivant la manière décrite ci-dessus empêche les hydroxy-les disponibles d'être aussi acylés. Puisque la novénamine est une base faible, l'ajustement du pH d'une solution aqueuse de novénamine à environ un pH de 7,5-35 8,5 assure qu'une quantité suffisante de novénamine est en équilibre sous la forme de base libre pour N-acyler avec succès. Les produits d'acylation de novénamine de formule II • peuvent aussi être préparé—s en acylant la base libre novénamine BAD ORIGINAL 70 20018 " 2052923 dans des solutions neutres, par exemple le tétrahydrofuranno , en présence d'un agent de liaison d'acide, par exemple la pyridine. Le produit réactionnel est ensuite traité avec de l'ammoniac liquide pour enlever les groupes O-acyles sans agir sur le N-acyle. Il 5 est évident que ce processus n'est pas préféré à cause de l'étape supplémentaire qui consiste à enlever les groupes O-acyles. Cependant, cette acylation est nécessaire lorsqu'on utilise des agents d'acylation qui sont relativement solubles dans l'eau. Les halogénures d'acides utilisés comme agents d'acylation . 10 pour préparer les composés représentés sur la formule II peuvent être préparés par un procédé à deux étapes. D'abord, l'acide ben-zoïque substitué désiré est O-acylé avec 1'halogénure ou l'anhydride d'un acide carboxylique choisi en présence d'un agent de liaison d'acide, par exemple la pyridine. L'acide alkanoyloxy benzoïque ié-15 sultant est ensuite mis en réaction avec du chlorure de thionyle ou avec du chlorure d'oxylyle ,suivant une manière bien connue en pratique, pour produire 1'halogénure d'acide de l'acide benzoïque acy-lé. Par exemple, le chlorure de 4-acétoxy-4-(3-méthyl-2-butényl) benzoyle est préparé en acylant d'abord l'acide 4-hydroxy-3-(3-20 méthyl-2-butényl)benzoïque en présence de pyridine, pour former l'acide 4-acétoxy-3-(3-méthyl-2-butényl)benzoïque. On fait réagir ensuite ce dernier composé avec du chlorure de thionyle pour former le chlorure de 4-acétoxy-3-(3-méthyl-2-butényl)benzoyle. D'autres composés alkanoyloxy de formule Ha peuvent être préparés en acy-25 lant l'acide benzoïque substitué désiré avec un halogénure .d'acide ou anhydride de l'acide carboxylique désiré suivant la manière décrite ci-dessus. La novénamine peut être acylée pour former de la novobiocine ou de la dihydronovobiocine. De la sorte, lorsque la novénami-30 ne est dissoute dans de l'eau à un pH basique et traitée avec du chlorure de 4-O-acétyl 3-(3-méthyl-2-butényl)benzoyle, le produit d'acylation correspondant se forme. En traitant ceci avec une base, diluée , il se forme un mélange de novobiocine et d'isonovobiocine qui peut être séparé en ses composants par distribution à contre-35 courant. La novénamine empêche la croissance de diverses bactéries, comme par exemple Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Diplococcus pneumoniae, Sarcina lutea et Pseudomonas fluorescens . 70 20018 Par conséquent, la novénamine peut être utilisée pour trait-.:; les eidroits de reproduction des vers à soie afin d'empêcher où de minimiser les infections provoquées par B. subtilis. De même, on r=eut l'utiliser comme désinfectant sur divers appareillages dendaires 5 et médicaux souillés par S.Aureus. Les produits d'acylation de la novénamine, par exemple la N-benzoylnovénamine et la N/3-(3-méthyl-2-butényl)4-acétoxy-benzoyl/novénamine sont des produits bactéricides et ils peuve-.t être utilisés da.ns les mêmes emplacements, comme décrit ci-dessus 10 pour la novénamine. Les exemples suivants illustrent le procédé et les produits de la présente invention mais ils ne les limitent en aucun cas. Tous les pourcentages sont en poids et toutes les proportions concernant les" mélanges de - solvants sont en volumes sauf indica-15 tions contraires. EXEMPLE 1 - Clivage enzymatique de la novobiocine Une quantité de cellules provenant d'une culture couchée de bactéries N-18 ,NRRL B-3652,est inoculée dans des flacons d1 Erlenmeyerde 250 ml contenant ÎOO ml d'un milieu qui se compose 20 des ingrédients suivants : 0,8%de NZ-Amine B# 0,5% de glucose, 0,05% de KB2P04, 0,05% de NaCl, 0,02% de MgS04.7H20 et 0,01% de FeSO^, pH 6,8-7,8. Les flacons sont incubés à 28°C sur une secou-euse rotative. Après 18 heures d'incubation, au moment où la polu-lation bactérienne à presque atteint sa densité maximum, les cellu-25 les bactériennes sont recueillies par centrifugation, lavées une fois avec de l'eau distillée et remises en suspension dans de l'eau pour donner un volume final de 5 ml. Des fractions de 1 ml sont ensuite pipetées dans uife série de 5" tubes d'essais, on ajou te la novobiocine sous la forme du sel de sodium, et le volume 30 final dans chaque tube d'essai est ajusté à 3 ml. Les tubes sont balayés avec de l'azote, fermés hermétiquement et incubés sur une secc'.vse à mouvement de va-et-vient. Après 20 heures d'inculation à lr. apérature ambiante, les cellules sont enlevées par centrifu-gatii -, et le surnageant exempt de cellules est analysé pour la pré-35 sencc de novénamine par le processus décrit précédemment, ce qui donne les résultats suivants : 2052923 BAD ORIGINAL 70 20018 13 2052923 Novobiocine Novénamine formée, concentration initiale , mgr/ml Rendement en % 10 • 100 25 91,7 5 50 44,4 75 4,9 100 O EXEMPLE 2 - Isolement du chlorhydrate de novénamine Une portion de 4,5 litres de liquide exempt de cellules 10 provenant d'un procédé de clivage enzymatique à grande échelle, comme décrit dans l'exemple 1, contenant du produit de clivage à partir de 12 gr de novobiocine, est acidifiée avec 15 ml d'acide -chlorhydrique 6N et extrait une fois avec 1 litre de chlorure de méthylène et une fois avec 800 ml de chlorure de méthylène. 15 L'extrait par solvant est écarté et la matière aqueuse est séchêe par congélation; rendement : 10 gr de poudre de novénamine brute qui donne une couleur pourpre instantanée avec la ninhydrine dans de la pyridine. Une quantité de 800 mgr de la préparation ci-dessus de 20 novénamine est recristallisée dans l'éthanol absolu et l'éther après avoir enlevé l'eau par distillation de l'éthanol absolu; rendement : 400'mgr de cristaux de chlorhydrate de novénamine ayant un point de fusion supérieur à 300°C avec décomposition. Une préparation purifiée de novénamine a l'analyse élémentaire sui-25\ante : Analyse : Calculé pour ci9H25°9C"'" : C: 49,49; H: 5,47; N: 6,08; Cl: 7,69 Trouvé : C: 49,26; H: 6,61; N: 5,81 Le chlorhydrate de novénamine a les bandes IR intenses 30 suivantes dans une pâte d'huile minérale : (en cm "*") 3420 (ép = épaulement) 1645 1485 1340 1130 ép. 3350 2860 (huile).1606 1455 1265 1115 3190 2650 1575 1435 (huile) 1255 1083 2920 (huile) 1707 1540 1375 (huile) 1210 1000 35 - La cristallisation de la matière ci-dessus dans du mé- thanol légèrement humide donne la novénamine sous la forme de la base libre amphotè--re qui se décompose dans .1 ' intervalle de 220-240°C. 70 20018 14 2052923 EXEMPLE 3 - N~Benzoylnovénamine 5 O NHCO 10 N-benzoylnovénamine Une quantité de 1 litre de mélange de clivage enzymati que centrifugé , préparé suivant le processus décrit dans l'exemple 1, contenant environ 1,0 gr de novénamine , est acidifiée à pH de 0,5 avec de l*acide chlorhydrique. Ceci est extrait deux fois avec 15 350 ml d'acétate d'éthyle et deux fois avec 250 ml de chlorure de méthylène pour enlever la novobiocine n'ayant pas réagi: et l'acide 3-isopentényl~4-hydroxybenzoïque. La couche aqueuse est ensuite traitée avec 3 gr de bicarbonate de sodium et le pH est ajusté à 8,0 par l'addition d'hydroxyde de sodium 6N. Une atmosphère d'azote 20 est maintenue. Cette solution est ensuite vigoureusement agitée et on ajoute 5 ml de chlorure de benzoyle. On continue l'agitation pendant 1 heuie, temps au cours duquel le pH est maintenu èntre 7 et 9. Une. seconde quantité de 5 ml de chlorure de benzoyle est ajoutée et on continue l'agitation pendant encore 1 heure, tout en 25 maintenant à nouveau une atmosphère d'azote et un pH de 7 à 9. La solution est ensuite acidifiée avec de l'acide chlorhydrique à pH 2 et extraite avec de l'acétate d'éthyle (deux fois 200 ml). Après une évaporation partielle de l'extrait à 100 ml, deux volumes d'é-ther sont ajoutés et un précipité (450 gr) de N-benzoylnovénamine 30 est obtenu. Le filtrat est ensuite évaporé et le résidu est lixivié avec de l'éther pour enlever l'acide benzoïque, ce qui donne un résidu (300 mgr) de N-benzoylnovénamine additionnelle montrant une absorption UV à 323 mu, a = 34,0. La recristallisation de cette matière dans l'éthanol et l'eau donne des cristaux de N-benzoyl-35 novénamine fondant à 245°C avec décomposition. Analyse : Calculé pour C„^H„„N„0.,„ : A u 2o À. J.0 C: 59,08; H: 5,34; N: 5,30 Trouvé : C: 58,24; H: 5,49; N: 5,29 70 20018 15 2052923 EXEMPLE 4 - N/3- (3-rné thyl-2-butényl) 4-acétoxybenzoyl/novéna:r CH O 5 O OH 'NHCO\ butényl) 4-acétoxybenzoyl/nevé-namirîe 10 A une quantité de 2 gr de base libre de novénamine mise en suspension dans 20 ml d'eau contenant 1,1 gr d'acétate de sodium (p'T p-O), on ajoute par portions 2,4 gr de chlorure de 4-acétoxy-3- (3~r.;éthyi-2-butênyl)benzoyle. Une atmosphère d'azote est maintenue. Après 3 15 heures d'agitation, le pH est de 4,2. Un précipité (2 gr) est isolé. Ce précipité est mis en suspension dans du chloroforme , et la fraction soluble dans le chloroforme est isolée; rendement de 0,76 gr. Cette matière est soumise à une distribution à contre-courant dans le système acétate d'éthyle/cyclohexane/éthanol/eau (2/3/2,5/ 20 2,5). Les fractions des tubes 210-260 et des tubes 270-300 sont combinées et évaporées pour donner un résidu. On cristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle et le Skellysolve B (hexanes isomères); rendement de 70 mgr de cristaux de N/3-(3-méthyl-2~butényl)4-acé-toxybenzoyl/novénamine (acétoxy novobiocine) ayant un point de 25 fusion de 155-160°C Analyse : Calculé pour C„„H„„N„0., „ : o o 3 o À ±Z C: 59,09; H: 5,71; N: 4,18 Trouvé : . N: 4,21 EXEMPLE 5 30 Les halogénures d'acides des acides benzoîques substitués suivants peuvent être substitués au chlorure de 4-acétoxy-3- (3-méthyl-2-butényl)benzoyle de l'exemple 1 pour former les produits d'acylation de novénamine correspondants. Comme décrit ci-dessus, les acides benzoîques substitués sont d'abord O-acétylés pour for-35 mer le composé acétoxy et on fait ensuite réagir ce dernier composé avec du chlorure de thionyle ou du chlooire d'oxalyle pour former l'agent d'acylation constitué par 1'halogénure d'acide : 70 20018 10 2052923 acide o-hydroxybenzoxque acide p-hydroxybenzoïque acide m-hydroxybenzoïque acide 2-hydroxy-3-méthylbenzoïque 5 acide 2-hydroxy-3-propylbenzoïque acide 2-hydroxy-3-isopropylbenzoïque acide 2-hydroxy-4-methyIbenzoïque acide 2-hydroxy-4-isopropylbenzoïque acide 2-hydroxy~4-isohexylbenzoïque 10 acide 2-hydroxy-3,5-diméthylbenzoïque acide 2-hydroxy-3-allylbenzoïque acide 2-hydroxy-3-méthyl-5-éthylbenzoïque acide 2-hydroxy-3-méthyl-5-isopropylbenzoïque acide 2-hydroxy-6-méthyl-3-isopropylbenzoxque (acide O-thymotinique) 15 acide 2-"hydroxy-4,6-diméthoxybenzoïque acide 2-hydroxy-4-méthoxy-6-éthoxybenzoïque acide 2-hydroxy-6-pentadécadiénylbenzoïque (acide anacardique) acide 2-hydroxy-6-pentadécylbenzoïque acide 2-hydroxy-6-(8-pentadécényl)benzoïque (acide ginkgolique) 20 acide 2-hydroxy-6-heptadécadiénylbenzoxque (acide pe1andjanique) ac ide 3-hyd roxy-2-méthylbenzo ïque ac ide 3-hyd roxy-2-éthylbenzo ïque acide 3-hydroxy-4-isopropylbenzoïque acide 3-hydroxy-4-éthylbenzoïque 25 acide 3-hydroxy-2-méthyl-4-isopropylbenzoïque ac id e 3-hydroxy-2-mé thy1-4-tert-butyIbenzo ïque acide 3-hydroxy-4-méthoxybenzoïque acide 3-hydroxy-4-éthoxybenzoïque acide 3-hydroxy-4-butoxybenzoïque 30 acide 3-hydroxy-2x4-dimêthoxybenzoïque ac ide 4-hydroxy-2-méthylbenzo ïque acide 4-hyd roxy-3-méthylbenzo ïque acide 4-hydroxy-3-éthylbenzoïque ac ide 4-hydroxy-3-propylbenzo ïque 35 acide 4-hydroxy-3-isopentylbenzoïque acide 4-hydroxy-2(1-méthylbutyl)benzoïque acide 4-hydroxy-2-pentadécylbenzoïque acide 4-hydroxy-3,5-ditnéthylbenzoïque 70 20018 17 2052923 acide 4-hydroxy-3,5-dipropylbenzoïque acide 4-hydroxy-3,5-d iisopropylbenzoïque acide 4-hydroxy-3,5-di-tert~butylbenzoïque acide 4-hydroxy-3,5-di-sec-butylbenzoïque 5 acide 4-hydroxy-5-méthyl-2-isopropylbenzoïque acide 4—hydroxy-5-propyl-3-allylbenzoïque a c id e 4-hyd roxy-2-é thoxybenzo ïque acide 4-hydroxy-3-méthoxybenzo'£que acide 4-hydroxy-3-isopropoxybenzoïque 10 acide 4-hydroxy-3-butoxybenzoïque ac id e 4-hyd roxy-3-s e c-butoxybenzo ïque acide 4-:hydroxy-3-isobutoxybenzoïque acide 4-hydroxy-3-isopentoxybenzoïque acide 4-hydroxy-2,6-diméthoxybenzoïque 15 acide 4-hydroxy-3/5-diraéthoxybenzoïque acide 5-hydroxy-2-raéthylbenzoïque acide 5-hydroxy-3-méthylbenzoïque acide 5-hydroxy-2-êthylbenzoïque acide 5-hydroxy-2-isoaraylbenzoïque 20 acide 5-hydroxy-2,3-diméthylbenzoïque acide 5-hydroxy-2,4-diméthylbenzoïque acide 5-hydroxy-2-méthy1-4-isopropylbenzoïque acide 5-hydroxy-2-butoxybenzoïque acide 5-hydroxy-3,4-diméthoxybenzoïque 25 acide 6-hydroxy-2-méthylbenzoïque acide 6-hydroxy-3-méthylbenzoïque ac ide 6-hyd roxy-3-é thyIbenz o ïque acide 6-hydroxy-3-propylbenzoïque acide -6hvdroxy-3-isopropylbenzoïque 30 acide 6-hydroxy~3-tert-butylbenzoïque acide 6~hydroxy-2,3-diméthylbenzoïque acide 6~hydroxy~2,4-diméthylbenzoïque acide 6-hydroxy-2-méthyl-3-isopropylbenzoïque acide 6-hydroxy-4-méthyl-3-isopropylbenzoïque 35 acide 6-hydroxy-5-raéthyl-2-isopropylbenzoïque acide 6-hydroxy-3-méthyl-5-éthylbenzoïque acide 6~hydroxy-2-méthyl-5-isopropylbenzoïque acide 6-hydroxy-2,3,5-triméthylbenzoïque 70 20018 2052923 acide 6~hydroxy~2,4, 5-trimêthyIbenzoxque acide 2,4-dihydroxybenzoxque ((3-Résorcyclique) acide 2,5-dihydroxybenzoxque (Gentisique) 2,6-dihydroxybenzoxque (acide) (Y Résorcyclique) 5 acide 3,4-dihydroxybenzoïque (Protocatéchuique) acide 3,5-dihydroxybenzoxque (a-Résorcyclique) acide 2,3,4-trihydroxybenzoxque acide 2,3,6-trihydroxybenzoxque acide 2,4,6-trihydroxybenzoïque 10 acide 2, 3,5-trihydroxybenzoxque acide 3,4,5-trihydroxybenzoxque (acide gallique) acide 2,4,5-trihydroxy-3,6-diméthyIbenzoxque acide 3,4-dihydroxy-5-méthoxybenzoïque acide 3,5-dihydroxy-4-méthoxybenzoïque 15 acide 3,5-dihydroxy-2-méthylbenzoïque acide 3,5-dihydroxy-4-méthylbenzoïque acide 2,4-dihydroxy-3-méthyIbenzoxque acide 2,4-dihydroxy-3,6-diraéthoxybenzoïque (acide s'quamatique) acide 2,4-dihydroxy-5-mét.hylbenzoïque 20 acide 2,4-dihydroxy-6-raéthyIbenzoxque ac ide 2,4-d ihyd roxy-5-éthylbenzo ïque acide 2,4-dihydroxy-6-pentylbenzoïque acide 2 ,4—diï,. droxy-6-hepty lbenzo ïque acide 216-dihydroxy-3-isopentyl-4-raéthoxybenzoïque 25 acide 2,6-dihydroxy-4-cnéthoxybenzoïque acide 2,6-dihydroxy-4-méthoxy-3(3-méthyl-2-butényl)benzoïque acide 2,6-dihydroxy-4-méthyIbenzoxque acide 2,6-dihydroxy-3-raéthylbenzoïque acide 2,6-dihydroxy-4-pentadécylbenzoïque 30 acide 2,5-dihydroxy-3-méthoxybenzoïque acide 2,5-dihydroxy-4-méthoxybenzoïque acide 2,5-dihydroxy-4-mêthoxy-6-méthylbenzoïque acide 2, 5-di.hydroxy~3-méthyIbenzoxque acide 2,5-dihydroxy~4-méthylbenzoïque 35 acide 4,5-dihydroxy-2-méthyIbenzoxque acide 4,6-dihydroxy-2-méthylbenzoïque acide 5,6-dihydroxy-2-méthvlbenzoïque acide 5,6-dihydroxy-3-méthylbenzoïque 70 20018 19 2052923 acide 3,5-dihydroxy-2,4-diméthylbenzoïque acide 3,5-dihydroxy-2,6-diméthylbenzoïque acide 2,6-dihydroxy-3,5-dimêthyIbenzoxque acide 3,6-dihydroxy-2,4,5-triméthyIbenzoxque 5 acide 3-hydroxy~4-allyIbenzoxque acide 3-hydxo xy-2-allylbenzoxque acide 4-hydroxy~3-allyl-5-propyIbenzoxque acide 4-hydroxy-3,5-diallylbenzoïque acide 4-hydroxy-3(3-méthyl-2~butényl)benzoïque 10 Les acides benzoîques ci-dessus peuvent être convertis en d'autres O-acylates en acylant avec 1 ' halogénure d'acide approprié ou l'anhydridçêPun acide alkanoïque, comme par exemple les acides propionique, butyrique, pentanoïque, hexanoïque, heptanoïque, octànoïque nonanoïque, décanoxque, undécanoïque, dodécanoïque, 15 tridécanoïqueftétradécanoïque, pentadécanoïque, hexadécanoïgue. heptadécanoïque, octadécanoïque et leurs formes isomères. On peut ensuite faire réagir ces -produits d'acylation avec du chlorure de thionyle ou du chlorure d'oxalyle pour former 1'halogénure d'acide gai peut ensuite être substitué au chlorure de 4-acétoxy-3~ (3-20 méthyl-2-butényl)benzoyle dans l'exemple 4 pour former les produits d'acylation de novénamine correspondants. BAD ORIGINAL 70 20018 20 2052923 REVEND ICATIONS 1.L'antibiotique novénamine, est caractérisé en cc qu'il a une température de décomposition de l'ordre de 220~240°C et présente la formule: CH.O ÎO cette novénamine pouvant réagir avec du chlorure de 4--acétoxy 3- (3-méthyl-2-butéilyl) benzoyle pour produire de l'acétoxy novobiocine. 15 2. Sels d'addition d'acide, notamment le chlorhydrate, de la novénamine de la revendication 1. 3. Chlorhydrate de novénamine solide suivant la revendication 2, ayant la formule : CH„ 20 CH O A— o o ° /ch f. IV H 25 H-N-C-O 2 F O \ NH2'.HC1 et fondant au-dessus de 300°C (décomposition). 4. Un procédé pour la préparation de novénamine, composé cêfini dans la revendication 1, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on incube de la novobiocine ou de la dihydronovobiocine avec 30 des bactéries Arthrobacter sp., N-18,•sous des conditions anaérobies. 5. Un procédé pour la préparation de novénamine suivant la revendication 4, ce procédé étant caractérisé en ce que de la novobiocine est incubée avec des bactéries Arthrobacter sp., N-18, 35 sous des conditions anaérobies. 6. Un procédé pour la préparation de novénamine suivant la revendication 4, ce procédé étant caractérisé en ce que de la •novobiocine est incubée avec des bactéries N-18, NRRL B-3652 , sous 70 20018 23i 2052923 des conditions anaérobies. 7. Un composé , caractérisé en ce qulil a la formule : ?H3 ' CH3 5 NHCR H_N-C-0 OH OH 2 4 o 10 dans laquelle R&~ est le radical acyle d'un acide benzoïque substitué de la formule : 7=\ V/ c oh 15 dans laquelle R2 est un alkanoyloxy de 2 à 18 atomes de carbone ; n est un nombre entier de 1 à 3 ; R^ 'est de l'hydrogène, un alkyle de 1 à 18 atomes de carbone inclusivement; un alkoxy de 1 à 6 atomes de carbone inclusivement ou un alkényle de 2 à 18 atomes de carbone inclusivement. 20 8. La N/3-(3-méthyl-2-butényl)4-acétoxy benzoyl/novéna- mine, un composé de la revendication 7. mine te!fe que définis dans la revendication 7, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on fait réaçgir de la base libre novénamine avec 25 un halogénure d'acyle de l'acide carboxylique désiré sous une atmosphère d'azote et à un pH d'environ 7,5 à 8,5. mine suivant la revendication 9, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on fait réagir de la novénamine dans une solution aqueuse à 30 pH d'environ 8,0 sous une atmosphère d'azote avec du chlorure de benzoyle pour produire de la N-benzoylnovénamine. procédé étant caractérisé en ce qu'on fait réagir une solution a-35 queuse de base libre novénamine avec du chlorure de 4-acétoxy 3-(3-méthyl-2-butényl)benzoyle sous une atmosphère d'azote pour produire de la N/3-(3-méthyl-2-butényl)4-acétoxy benzoyl/novénamine. 9." Un procédé pour la préparation d'acylates de novéna- 10. Un procédé pour la préparation de N-benzoylnovéna- 11. Un procédé pour la préparation de N/3-(3-méthyl-2~ butényl)4-acétoxybenzoyl/novénamine suivant la revendication 9, ce