Brevet FR2027081A1 — publié le 19700925

La présence de L-asparaginase dans des cellules de E.coli est un fait connu. ["Biochem." 6 (1967), pages 721 à 730, cet ouvrage donnant d'autres références bibliographiques]. On sait de même que cet enzyme agit contre des cellules malignes 5 dont la croissance nécessite de la L~asparagine ["Proc.îf.A. S. " 56, 1516-19 (1966)]. La demande de "brevet français N° 6907898 déposée le 19 Mars 1969 par la sème Demanderesse a fait connaître un procédé améliorant le rendement de L-asparaginase à partir 10 ie cellules de E.coli,.La demande de ."brevet français 181248 déposée le 27 Décembre 1968 par la même Demanderesse fait connaître également l'enrichissement et la purification de la L-asparaginase jusqu'au stade de cristallisation. Le fractionnement de protéines avec des solvants miscibles 15 à l'eau est un procédé connu. Un enrichissement d'enzymes extraits des muscles de lapin par précipitation fractionnée à l'acétone, à froid, des extraits aqueux pauvres en ions, a été décrit dans là revue "Biochem.J." ^8 (1951)» page .42. La Demanderesse a déjà mentionné (Demande de brevet français lï? 181.248 précitée) 20 que le fractionnement à l'acétone convient pour un premier enrichissement de L-asparaginase. Dans ladite demande, elle a proposé de précipiter la L-asparaginaae de ses'solutions aqueuses avec le polyéthylène-glycol. La Demanderesse vient de découvrir que des diols conviennent 25 particulièrement bien pour un fractionnement de L-asparaginase. Le progrès réalisé par le procédé conforme à l'invention se traduit par le fait qu'il est à présent possible d'obtenir la L-asparaginase par reprécipitation avec des solvants de bas poids moléculaire, à la température ambiante et à peu de frais, 30 le produit obtenu ayant la grande pureté qui est nécessaire pour une application clinique. Les fractions de tête possèdent une grande activité spécifique ; il est possible de les faire cristalliser sans autre purification au moyen de procédés connus dans la chimie des enzymes. 35 ■ On considère comme diols intéressants, les diols hydro- solubles ayant 4 à 8 atomes de carbone, de même que ceux dans lesquels un groupe hydroxyle est alkylé, par exemple les isomères de butanediol, le pentanediol-(l,5), 11 hexanediol-(2,5), le 2-méthyl- BAD ORIGINAL 69 44994 2 2027081 pentanediol-(2,4) et le 3-méthoxybutanol. le fractionnement peut être conduit à des valeurs de pH pour lesquelles l'enzyme esfstable en solution aqueuse , c'est-à-dire à un pH de 4 à 9, les limites de fractionnement sont par-5 ticulièrement nettes au voisinage de la précipitation initiale, par exemple à un pH de 5,0. . Lorsqu'on effectue le fractionnement en partant de L— asparaginase brute ayant une activité de 2 à 4 H/mg, il peut être avantageux d'ajouter au préalable aux solutions aqueuses 10 des amides qui rompent les liaisons en pont d'hydrogène, par exemple l'urée, les sels de guanidine, l'acétamide, le formamide, etc. On entend ci-après par "unité" la quantité d'enzyme qui libère d'une solution d'asparagine une micromole d'ammoniac 15 en une minute à 37° C. On ignore encore à l'heure actuelle si les L-asparaginasea formées par différentes souches de E.coli sont totalement identiques ; là où l'on observe de faibles différences, on n'est pas encore renseigné sur la r..ature de ces différences. 20 Le procédé de"fractionnement convient pour des L-asparaginaaea dérivées de toutes les souches de E.coli, (E.coli ATCC 9637, 4157, 8677, 8739, 9723, 10536, 10586, 11105, 11126, 12142, 12408, 12911, 13676, 13706, 13762, 14948, 11303. Exemple -1 25 On dissout dans de l'eau bidistillée 5,0 g de L-asparaginase ayant une activité de 67 unités par milligramme de substance (obtenue par double fractionnement à l'acétone de L-asparaginase brute), on ajuste la valeur de pH à 5,0 "avec de l'acide chlorhy-drique 1ÏT, et on complète le volume à 100 ml. On ajoute lente-30 ment tout en agitant à la solution clarifiée, 20 ml de 2-méthyl-pentanediol-(2,4), en sorte quron obtient une précipitation. On appelle fraction A le sédiment séparé par centrifugation et -séché . . A partir de la solution surnageante, on obtient par addition supplémentaire de 20 ml de 2-méthylpentanediol-(2,4), 35 la fraction B et, d'une façon analogue par addition de chaque fois 10 ml de solvant, les fractions C à G. Le résultat du fractionnement ressort du tableau suivant : COPY , 69 44994 3 2027081 Fraction. Rendement ïï/mg U/précipitation $ d'unités de la en m g charge A 1070 13,7 14.700 4,4 B 645 26,0 16.800 5,0 C 330 13,3 " 4-390 - 1,-3 L 255 34,0- '8.700 3,1 E 270 81,7 22.000 ' 6,6 - F 775 158,0 122.500 36,5 & 570 2 2,-.6 11.680- 3,5 10 On dissout 100 mg de la fraction F dans 2,0 ml de tampon au citrate .à un pH de 5,0, on clarifie la solution par centrifugation et on ajoute 1,0 ml d'éthanol de qualité pour analyses. Après un séjour de 48 heures au réfrigérateur, l'échantillon. est totalement pris en une masse cristalline homogène. 15 Exemple 2 On dissout 2,8 g de L-asparaginase àyant une activité de 35 U/mg de substance dans 100 ml de tampon au tris-(hydroxy-méthylaminométhane) à un pH de 8,5» On ajoute tout d'abord 48 ml de 2-méthylpentanediol-(2,4), on sépare la phase liquide du 20 précipité, puis on ajoute encore 25 ml de 2-méthylpentanediol-(2,4)• La seconde fraction se compose de 601" mg de L-asparaginase ayant une activité de 92 unités par mg de substance. Par une autre précipitation, dans cet exemple et dans les exemples 3, 4, 6, 7, 8 et 9, on récupère la L-asparaginase résiduelle à peu près . 25 quantitativement, mais sous une forme plus impure. Exemple 3 En procédant comme dans.11 exemple 2, on dissout 2,8 g de L-asparaginase ayant une activité de 35 U/mg de substance, et on fractionne tout d'abord avec 48 ml, puis avec 17 ml 30 de 3-méthoxybutanol-(2). Là seconde fraction consiste en 425 mg de L-asparaginase ayant une activité de 87 U/mg. Exemple 4 En procédant comme dans l'exemple 2, on dissout 2,8 mg de L-asparaginase ayant une activité de 35 U/mg de substance, 35 et on fractionne tout d'abord avec 61,'puis avec 21 ml de 3-méthyl- «COP* 69 44994 4 2027081 pentanediol-(2,4)• La seconde fraction consiste en 320 mg de L-asparaginase ayant une activité de 91 ïï/mg dé substance. Exemple 5 On dissout 1 g de L-asparaginase préalablement fractionnée 5 à l'acétone5 ayant une activité de 110 ïï/mg de substance, dans 20 ml d'eau bidistillée à un pH de 5,0, puis on fractionne la solution après clarification à 1'heïanediol-(2,5). On obtient la fraction A par addition de 10 ml, les fraction E et C par addition de chaque fois 2,0 ml et la fraction D par addition 10 de 6,0 ml. La répartition des activités est représentée sur le tableau suivant : Fraction Rendement en m g ïï/mg ïï/précipitation # d'unités de la charge A 175 26,4 4.620 4,2 B. 125 104,0 13.000 11,8 C 140 178,0 24.800 22,6 D 90 77,3 6.930 6,3 La fraction C a pu être obtenue à l'état cristallisé à partir d'éthanol aqueux, comme dans l'exemple 1. Exemple 6 On dissout 50 g d'asparaginase brute dérivée de E.coli ATCC 9637 dans 1000 ml d'eau redistillée , à un pH de 5,0. 25 On fractionne tout d'abord avec 500 ml de 2-méthylpentanediol-(2,4) (Fraction A), puis avec 100 ml (Fraction B) et ensuite, avec à chaque fois 200 ml (Fractions C à E). La fraction D contient 4,3 g de L-asparaginase ayant une activité de 23 ïï/mg de .substance. Exemple 7 30 On soumet une solution à 5 $> de 4,0 g de L-asparaginase d'une activité de 23 ïï/mg de substance (obtenue suivant l'exemple 6) à un nouveau fractionnement à un pH de 5,0 avec du 2-méthylpèn-tanediol-(2,4). La fraction de tête diminue lorsqu'on porte l'addition de solvant de 64 ml à 72 ml. Elle contient 285 mg 35 de L-asparaginase ayant une activité de 85 ïï/mg de substance. Exemple 8 On dissout 50 g d'asparaginase brute dérivée de E.coli 11303 ayant une activité de 2,0 U/mg de substance dans 1Q00 ml d'eau B&0 ORIGINAL 69 44994 5 2027001 reâistip.ée à un pH de 5,2, et on fractionne la solution .décrit comme/dans l'exemple 6 avec du 2-E-,étïj.y.Ipentanediol-(2,4). la fraction de tête contient 1,6 g de L-asparaginase ayant une activité de 24 U/mg de substance. 5 Exemple 9 On dissout 5 g d'asparaginase brute dérivée de B.coli ATCC 9637 ayant une activité de 3sS U/mg de substance dans 100 ml de tampon au tris-(hydroxyméthylamincmétîiane ) s un pH de 8,5, qui contient 14,4 g d'urée.,-et on fractionne avec du 2-méthyl-10 pentanediol-(2,4). la fraction de tête contient 300: mg de L-asparaginase ayant une activité de 17*3 ïï/mg de substance. Exemple 10 On dissout 1000 g d'asparaginase brute ayant une activité de 3,6 TJ/mg de substance dans 20 1 d'eau redistillée, et on 15 fractionne à un pH de 5,0 , comme dans l'exemple 1, avec du 2-méthylpentanediol-(2,4)* la fraction de tête contient 20,3 U/mg de substance. En répétant cinq fois le fractionnement, on obtient une substance que l'on peut cristalliser dans l'éthanol aqueux. Analyse : Protéine 228,00 U/mg 20 Protéine (essai au biuret) 88,90 Eau 10,90 1« Résidu ■ 0,08 $ BAD ORIGINAL 69 44994 « 20270ÔÎ HEVEKDICATIQH Procédé d'enrichissement de L-asparaginase, caractérisé par le fait qu'on soumet une L-asparaginase à une précipitation fractionnée de ses solutions aqueuses par addition de diols 5 ayant 4 à 8 atomes de carbone. COPY