Brevet FR2034627A1 — publié le 19701211

L'invention concerne un nouveau procédé pour la préparation du pentitol à partir du pentose au moyen de bactéries ; elle visa en outre les produits ainsi obtenus. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver 5 une source de Corynebacterium 2f° 208, qui se trouve dans la nature, ou ses -variétés, ou les souches modifiées de l'espèce Corynebacterium, cette culture étant effectuée sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, telle que par exemple l'acide gluconique* ou d'autres substances à base de carbone, 10 une source d'azote, des sels inorganiques et de la thiamine ou une source contenant de la thiamine, cette culture étant effectuée sous aération, à ajouter du pentose à ce milieu de culture au moment désiré pendant la durée de la culture, en vue d'accumuler du pentitol dans le milieu de culture, et à séparer ledit pentitol 15 dudit milieu de culture. Conformément à la présente invention, on ajoute le pentose, tel que par exemple le D-xylose, le D-ribose ou le L-arabinose, au milieu de culture et l'on effectue la culture en vue de produire, respectivement; le xylitol, le ribitol ou le L-arabitol* 20 Parmi les pentitols, le xylitol a été soumis à des études poussées concernant ses actions physiologiques et ses applications et il a fait l'objet depuis peu d'une surveillance effectuée avec grand intérêt,- Le xylitol est connu cooae étant un intermédiaire métabolique normal du cycle de l'acide uronique qui 25 constitue l'une des filières métabolique du sucre produit le corps humain, dans des conditions telles que le xylitol fait montre d'une fonction importante dans le catabolisme du sucre et possède des propriétés-physiologique s intéressantes. Par exemple, il est connu que le xylitol est absorbé dans les cellules 30 sans nécessiter l'utilisation d'insuline et qu'il est aussi assimilé, tel qu'il est, dans les tissus de l'organisme sans subir de phosphorylation, de sorte qu'il peut être utilisé avec une grande efficacité. Il a également été prouvé que le xylitol peut être utilisé sans augmenter la glycémie et qu'il exerce une 35 action fortement antagoniste à celle des cétones. En raison de telles propriétés, le xylitol est utilisé pour le traitement médical des patients souffrant de diabète et il est en outre largement utilisé comme liqueur de transfusion de sucre lorsqu'on effectue une opération chirurgicale» De plus le xylitol s'est 40 révélé avoir effet tfeér-apstatiaue puisqa*!! goérit les 69 33406 2034627 jaunisses* Il faut encore signaler que le xylitol peut être utilisé comme substance adoucissante pour un patient diabétique puisqu'il peut être employé avec les aliments à accommoder en vue de l'obtention d'un goût sucré» Par conséquent, on s'attend à ce que le 5 xylitol ait un vaste champ d'application dans le futur. !'utilité du ribitol et de l'arabitol nra pas fait l'objet de compte rendus aussi fructueux, mais on s'attend à des développements ultérieurs en ce qui concerne ces composés. Jusqu'à présent, le xylitol a été préparé, à partir du xylose 10 comme matière première, par hydrogénation de celui-ci au moyen d'hydrogène en présence d'un catalyseur de réduction , sous haute pression. En parallèle avec la synthèse du xylitol par réaction chimique , Onishi. et Suzuki reportent (Agr. Biol. Chem., Vol. 30, page 1139, - 1966) que le pentitol peut être produit en 15 utilisant des microorganismes, par exemple des levures telles que Candida, Pichia, Hansenula, Torulopsis ou Monilia. D'autres compte rendus concernant la production et le métabolisme du pentitol sont relatifs à l'utilisation de levures, de moisissures et de champignons non classifiés. 20 il est essentiel de remarquer que la présente invention concerne un procédé pour la préparation du pentitol à partir du pentol en utilisant des bactéries appartenant à l'espèce Corynebacterium qui diffère, du point de vue bactériologique, des levures, moisissures et champignons non classifiés. On doit 25 aussi noter que la présente invention présente, par comparaison avec le procédé chimique de production du xylitol par hydrogénation du xyloae sous haute pression, l'avantage extrêmement important puisque le procédé de la présente invention n'exige pas l'emploi d'un catalyseur d'hydrogénation, ni la mise en 30 oeuvre d'une haute pression, et qu'il peut être effectué dans des conditions modérées, en utilisant un appareillage simple. la souehe de Corynebacterium N0 208 & été extraite du sol par les inventeurs et ses propriétés bactériologiques ont été décrites dans le brevet japonais publié N° 24.468/1968. De plus, 35 le Coiynebacterium N° 208 a été déposé sous le 5° FEBM-P N° 128 au service des dépôts de l'Institut de recherches sur la fermentation de l'Agence de technologie et science industrielles. les bactéries du genre Corynebacterium sont caractérisées par le fait qu'elles exigent de la thiamine et qu'elles doivent assi-j 40 miler de l'acide gluconiqu® pour leur croissance. î i 69 33406 2034627 Conformément à la présente invention, un milieu de culture utilisé pour la production et l'accumulation du pentitol contient des sels de l'acide glueonique, tels que le sel de potassium, le sel de sodium et le sel de calcium de l'acide glueonique, en tant 5 que source de carbone; ce milieu doit contenir aussi du pentose, des sels d femmoniun tels que le sulfate d'ammonite, le chlorure dfemmeemum, le nitrate d Ammonium et le lactate d'ammonium, comme source d'azote et des sels inorganiques tels que le phosphate monopotassique et le sulfate de magnésium, le milieu de culture jQ est mélangé avec de la thiamine ou une substance contenant de la thiamine telle qu'une liqueur de macération du maïs ou du blé, . un. extrait de viande ou un extrait de levure. lia thiamine ou la source contenant la thiamine doit être ajoutée dans le milieu de culture dans la proportion exigée pour favoriser au maximum la ] 5 culture de la souche de Corynebacterium afin que le pentiirol s'accumule dans le milieu de culture. Il est aussi possible de réaliser 1'accumulation du pentitol dans le milieu de culture, avec une haute efficacité, en contrôlant la quantité d'acide glueonique et de pentose (tel que par exemple xylose, ribose ou 20 L-arabinose) qui est ajoutée dans le milieu de culture, et aussi en réglant ou ajustant les proportions des substances d'addition, les processus de culture et le moment de l'adjonction desdites substances d'addition dans le milieu de culture. les processus suivants pour l'addition du pentose au milieu 25 de culture^'peuvent être mis en oeuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention : (1) L'acide glueonique et le pentose sont ajoutés à un milieu de culture au moment où l'on fait démarrer la culture, à la suite de quoi on effectue cette culture. 50 (2) On inocule une souche de bactéries à un milieu de culture contenant de l'acide glueonique comme source de carbone et on laisse se développer lesdites bactéries, à la suite de quoi on ajoute immédiatement ou par fractions successives le pentose audit milieu de culture et l'on poursuit la culture. 25 Lorsque la culture est terminée, le bouillon de culture résultant est soumis à la eentrifugation ou filtré afin de séparer les bactéries d'un filtrat. Le filtrat est ensuite traité pour enlever les substances protidiques et soumis à une évaporation sous pression réduite pour obtenir un concentré. Ce concentré 40 est soumis à une extraction au moyen d'éthanol très chaud de 69 33406 2034627 façon à obtenir un extrait. Cet extrait est traité avec une résine échangeuse d'anions type base forte constituée par un copolymère styrène-divinylbenzène, vendue par exemple par Rohm et Haas Co. sous la dénomination commerciale d'Amberlite IRA.-401 ou IRA-400 5 (du type hydroxy) en vue de séparer le pentose résiduel du pentitol obtenu. Le pentitol brut est purifié par recristallisation au sein d'une solution éthanolique de pentitol brut. On fait l'analyse élémentaire du pentitol et on détermine aussi son point de fusion ainsi que son pouvoir rotàtoire spécifique» Les 10 résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1 ci-après. Propriétés du pentitol 15 20 25 Pentitol Xylitol Point de J Observé 92,5 - 93 fusion (°C) Valeur indiquée (1) 92,5 - 93,5 Analyse élémentaire (°/B) C = 39,62 H = 7,88 (3) tt". Ribitol 101 - 102 101 - 102 C = 39,52 H = 8,08 L-arabitol 101 - 102 101 - 102 C « 39,52 H= 7,73 - 7,61 Remarques : (1) Le point de fusion reporté est celui indiqué dans Agr. Biol. Chem. Vol. 30, page 1139 par Onishi et Suzuki 30 (1966). (2) Les valeurs indiquées sont comparées aux valeurs théoriques correspondant à C^H^O^, ces valeurs théoriques étant égales à 39,4 i° pour le C et 7,89 $ pour H. •55 (3) Les valeurs indiquées sont celles du pouvoir rotàtoire spécifique mesuré dans le cas d'un échantillon dissous dans une solution saturée de borax, à la concentration de 7,1 i» en pentitol. Le pentitol ainsi obtenu en utilisant Corynebacterium N° 208 40 et le xylose, ribose ou L-arabinose,a été aussi soumis à une 69 33406 2034627 détermination du spectre d'absorption en lumière infrarouge. La figure 1 montre un spectre d'absorption infrarouge du xylitol obtenu par le procédé de la présente invention. La figure 2 montre un spectre d'absorption infrarouge du nMtaL obtenu par le procédé 5 de l'invention. La figure 3 montre un spectre d'absorption infrarouge du L-arabitol produit par le procédé de l'invention. On doit noter que dans chacune des figures» la courbe ï correspond au spectre d'absorption infrarouge de l'échantillon soumis aux essais, obtenu selon le procédé de 1®iKw®ati0as tandis que la 10" courbe II correspond au spsotr© d'absorption isfs©E:©rafg© d*un échantillon standard fabriqué par la, société ïakyo Xasei Eo©o Eabushiki Kaisha, qui eat disponible commercialement au Japon. On peut déduire des caractéristiques données dans le tableau 1 et des cotirbes représentées sur les figures 1 à 3 que le pentitol 15 obtenu en utilisant le Corynebacterium If0 208 et le xylose, ribose ou L-arabinose est, respectivement, un véritable xylitol, ribitol ou L-arabitol. L'invention est en outre illustrée par les exemples suivants. Quoique ces exemples concernent des modes de réalisation préférés 20 de l'invention mettant en oeuvre le Coiynebacterium N° 208, il est évident pour l'homme de l'art que l'invention peut être modifiée en utilisant lee différentes variétés morphologiques et physiologiques du Corynebacterium ïf° 208, les souches modifiées dérivant de ces variétés et les souches de bactéries Corynebaete-25 rium, toutes ces souches étant caractérisées par le fait qu'elles exigent de la thiamine et qu'elles assimilent de l'acide glueonique en vue de leur croissance. Il est par conséquent bien entendu que l'invention concerne tous les moyens constituant des équivalents ou, des variantes des 30 moyens précités, pourvu que lesdits moyens mettent @n oeuvre des bactéries pour la production et l'aecusrolation. du pentitol dans un milieu de culture ©oatsaant de la tSsiâEdne et de l'acide glueonique® D*ua© façon générale, on doit eomprendr© qa© le'Oerynefcae-35 terium M0 208.est susœptible d© costfsrtir X@s pentoses en psa-titôls puisque les ©sisaples iaoatr©at «pi© trois psntos'ss sont eoirrertis @a les pantitsls ©osœ®spœâaB,ts sans mcâifieation ô®s eonsSîimmats cc«f» dans 1© de ©ultras© et sans aeââfi- cation &oa esnMticas â® euXttas?Qo -:-0 13®S2sS-™1° 69 33406 2034627 On introduit dans chacun des éléments d'une série d'Erlen-meyers de 500 ml, 100 ml d'un milieu de culture contenant 4,8 % de gluconate de potassium, 4 $ de L-arabinose, 0,6 $ de sulfate d'ammoniaaPt 0,1 # de phosphate monopotassique, 0,05 $> de sulfate 5 de magnésium et 0,3 # de liqueur de macération de maïs, à la suite de quoi on ajuste le pH du milieu de culture à une valeur comprise entre 6,5 et 7. Chacun des milieux de culture ainsi ajustés est stérilisé et chaque milieu de culture stérilisé est soumis à 12a© incubation au moyen d'une certaine quantité d'une 10 liqueur conte ^ant en suspension des bactéries qui résultent de la croissance d'une souche de cultures de Corynebacterium N° 208 sur un milieu fa culture constitué par un bouillon d'agar et ce, pendant 48 heures. les bactéries ont été cultivées à 30°C pendant douze jours en agitant le milieu de culture stérilisé. Ensuite, 15 on a déterminé la quantité de L-arabitol contenue dans le milieu de culture en utilisant un papier charomatographique, ainsi que la méthode décrite par West et Hapoport, et l'on a ainsi trouvé que le milieu de culture contenait 10,0 mg de L-arabitol par millilitre de milieu de culture. Ainsi, le bouillon de culture 20 résultant contenu dans tous les flacons a été receuilli afin d'obtenir 1.000 ml de bouillon de culture, lequel bouillon de culture a été centrifugé pour enlever les bactéries de la solution surnageante. La solution surnageante a été traitée avec du sulfate de zinc pour enlever les substances protidiques et elle a 25 été ensuite neutralisée par addition d'hydroxyde de sodium, à la suite de quoi la solutions surnageante neutralisée a été centrifugée pour obtenir une nouvelle solution surnageante. Cette solution surnageante a été évaporée et concentrée sous pression réduite jusqu'à ce que substantiellement tout l'eau soit éli-30 minée. Le concentré résultant a été traité au moyen d'éthanol très chaud pour produire un extrait éthanolique. On a soumis le L-arabitol brut à un fractionnement, à partir de l'extrait éthanolique ? en le traitant au moyen d'une résine échangeuse d'anions constituée par un copolymère styrène-divinylbenzène ayant la 35 dénomination commerciale isberlite IEA-400 (type hydroxy 0H~). Osa a disaous le L-arabitol brut dans de l'éthanol et l'on a soumis la solution éthanolique à une recristallisation, ce qui a permis d'isoler 5,'' g de L-arabitol cristallisé. Exemple 2. 40 Oiiao^m des éléments d'un© série d'Brlenmeyers de 500 ml a 69 33406 2034627 reçu un chargement constitué par 100 ml d'un milieu de culture comprenant 2,4 i° de gluconate de potassium, 4 % de D~ribose, 0,6 $ de sulfate d'ammonium, 0,1 fo de phosphate monopotassique, 0,05 % de sulfate de magnésium et 0,3 $ de liqueur de macération 5 de maïs; le pH du milieu de culture a été ajusté à la valeur 6,5. Chacun des milieux de culture ainsi obtenu a été stérilisé et chaque milieu de culture stérilisé a été inoculé au moyen de la souche Corynebacterium H0 208, à 30°C, la culture ayant été effectuée pendant neuf jours, sous agitation du milieu de culture. 10 On a trouvé que ce milieu de culture contenait alors 9,2 mg de ribitol par ml. le bouillon de culture contenu dans les différents flacons a été alors rassemblé de façon à obtenir 1.000 ml de bouillon de culture, lequel a été traité de la même manière que flnrig l'exemple 1, ce qui a permis d'obtenir 4,6 g de ribitol 15 cristallisé. Bxemple 3. On remplit une série d'Erlenmeyers de 500 ml au moyen d'un milieu de culture, à raison de 100 ml pour chaque Brlenmeyer, ce milieu de culture comprenant 2,4 f° de gluconate de potassium, 7 $ 20 de D-xylose, 0,6 fo de sulfate d'ammonium, 0,1 ?£ de phosphate monopotassique, 0,055& de sulfate de magnésium et 0,3 i° de liqueur de macération de maïs; le milieu de culture est ajusté de façon à avoir un pH de 6,5. Les 100 ml du milieu de culture ainsi ajusté sont stérilisés et le milieu de culture stérilisé ainsi 25 obtenu est soumis à une inoculation au moyen de la souche de Corynebacterium H® 208, la culture étant effectuée pendant 30°C pendant quatorze jours, sous agitation du milieu de culture. On a trouvé que le milieu de culture contenait alors 28,4 mg de xylitol par ml. Le bouillon de culture contenu dans les différents 30 Erlenmeyers a été rassemblé en vuë d'obtenir un bouillon de culture de 1.000 ml qui a été traité de la même manière que dans l'exemple 1, de façon à obtenir 15,8 g de xylitol cristallisé. Exemple 4. On dissout dans 80 ml d'eau contenuedans un Erlenmeyer de 35 500 ml, 7,2 g de gluconate de potassium, 0,6 g de sulfate d'ammonium, 0,1 g de phosphate monopotassique, 0,05 g de sulfate de magnésium et 0,3 g de liqueur de macération de maïs, à la suite de quoi on a ajusté le pH du milieu de culture résultant à la valeur 6,5. Ce milieu de culture a été ensuite stérilisé et 40 soumis à une inoculation avec une souche de Corynebacterium N° 208. 69 33406 2034627 Après avoir effectué la culture à 30°C, pendant deux jours, sous agitation, on a ajouté au milieu de culture 20 g de D-xylose, puis l'on a ajusté le volume du milieu de culture à 100 ml, à la suite de quoi on a poursuivi la culture pendant encore.quatorze 5 jours. On a alors déterminé expérimentalement que le milieu de culture contenait 75,5 mg de xylitol par ml. Exemple 5. On dissout dans 80 ml d'eau contenue dans un Erlenmeyer de 500 ml, 7,2 g de gluconate de potassium, 0,6 g de sulfate d'am-10 monium, 0,1 g de phosphate monopotassique, 0,05 g de sulfate de magnésium et 0,3 g de liqueur de macération de maïs, à la suite de quoi on ajuste le pH du milieu de culture résultant à la valeur 6,5. Ce milieu de culture est alors stérilisé et soumis ensuite à une inoculation au moyen de la souche de Corynebacterium N° 208. 15 Après avoir effectué la culture à 30°C pendant deux jours sous agitation, on ajoute audit milieu de culture du D-xylose pendant une durée de quatre jours en augmentant la dose de 5 g tous les jours, à la suite de quoi on ajuste le volume du milieu de culture à 100 ml et l'on poursuit la culture pendant encore 20 quatorze jours. On trouve alors que le milieu de culture contient 53,6 mg de xylitol par ml de milieu de culture. Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux modes d'exécution décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. 25 En particulier elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. 69 33406 2034627 ISTEISHIIIOIS 1 - Procédé de préparation de pentitol à partir du pentose à l'aide de bactéries» caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des souches de Corynebacterium U° 208 ou ses variétés ou des souches modifiées d'une souche ou de souches appartenant au genre 5 Cor nebactérium, toutes ces souches nécessitant de la thiamine et assimilant l'acide glxieonique pour leur croissance, ladite culture étant effectuée sur un milieu de culture comprenant une source de carbone telle que l'acide glueonique par exemple, une source d'azote, des sels inorganiques et de la thiamine ou un* 10 substance contenant de la thiamine, en quantité appropriée, à ajouter du pentose à ce milieu de culture au moment approprié, au cours du processus de culture, de façon à provoquer l'accumulation de pentitol - dans le milieu de culture, et à séparer ledit pentitol dudit milieu de culture. 15 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pentose utilisé est le xylose et le pentitol obtenu le xylitol. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pentose utilisé est le ribose et le pentitol obtenu le ribitol. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 20 le pentose utilisé est le 1-arabinose et le pentitol obtenu le L-arabitol. 5 - Pentose et notamment xylose, ribose ou L-arabinose, obtenu selon le procédé des revendications 1 à 4.