Brevet FR2034669A1 — publié le 19701211

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un antibiotique colorant présentant une activité surprenante et nouvelle contre des agents pathogènes de certaines maladies dues à des protozoaires chez l'animal et chez l'homme. tant donnée l'absence ou l'insuffisance actuelle de médicament s contre les maladies provoquées par certaines espèces de trypanosomes, ledit procédé présente un grand intérêt pour la chimiothérapie de maladies dues à des protozoaires. Dans le service de documentation des antibiotiques de l'ins- titut de Microbiologie et de Thérapie expérimentale (Iéna) de l'Académie allemande des Sciences à Berlin il est enregistré plus de 120 antibiotiques formés par des streptomyces et agissant contre différentes espèces de protozoaires. Quatre de ces antibiotiques sont des colorants rouges présentant des caractéristiques d'indicateur. Pour aucune de ces substances naturelles on n'a cependant jusqu'ici pu constater une activité trypanocide. L'invention a pour objet la fabrication d'un antibiotique agissant contre certaines espèces de trypanosomes-. Elle crée un procédé de fabrication d'une substance naturelle trypanocide par culture d'une souche de streptomyces suivie de l'isolement de l'antibiotique à partir du bouillon de culture. il a été constaté que dans les dissolutions fermentatives de la souche IMET JA 10081 se forme avec un bon rendement un antibiotique approprié à la thérapie de maladies dues à des protozoaires et doué, en outre, d'un effet inhibiteur sur la croissance de cellules de tumeurs in vitro, sur des micro-organismes et sur la multiplication de virus bactériens et animaux et que cet antibiotique peut être isolé dans les conditions décrites ci-après. Le micro-organisme utilisé pour obtenir cette substance présente une analogie avec la source 207 (ATCC 12309) décrite par Waksman (1961) comme étant l'espèce type Streptomyces diastatochromogènes (lErainsky) Waksman et Henrici 1948 et figure sous le No JA 10081 dans la collection de souches de l'institut de Microbiologie et de Thérapie expérimentale (Iéna) de l'Académie allemande des Sciences à Berlin. ta souche IMET JA 10081 a été isolée d'un écnantillon de sol italien. L'échantillon provient d'un vignoble du village Anscapri situé dans l'ile de Capri et possède les propriétés morphologiques, macroscopiques, microscopiques et biochimiques décrites par Waksman (1961) pour le Streptomyces diastatochromogènes. lie procédé conforme à l'invention consiste à cultiver dans des conditions de culture aérobies, dans un milieu nutritif liquide comportant des sources de carbone et d'azote correspondantes ainsi que des sels minéraux, une source de streptomyces qui est la souche IMET JA 10081 décrite par Waksman (1961) comme étant analogue au Streptomyces diastatochromogènes ou correspond à des produits de mutation ou à des variantes de cette souche. lia culture est effectuée dans des milieux nutritifs appropriés, notamavec addition de sels de métaux lourds, à une température comprise entre 25 et 57 C pendant 2 à 6 jours, le milieu étant aéré et agité. L'antibiotique est obtenu, après séparation du mycélium, par extraction effectuée au moyen de solvants organiques tan-t sur le filtrat de culture que sur le mycélium, par transfert dans la phase aqueuse suivie d'une nouvelle extraction à partir des concentrés bruts aqueux dans la phase organique et par précicitation à partir des concentrés bruts au moyen d'une fraetion d'hydrocarbures à bas point d'ébullition. L'antibiotique ainsi isolé est désigné sos le nom de trypanoiycine. La culture de la souche IMET JA 10081 ainsi que de ses variantes et produits de mutation s'effectue dans des conditions aérobies. En partant de spores lyophilisés au contact de terre on procède à l'inoculation de sols nutritifs à gélose et, ensuite, de milieux nutritifs liquides sélectionnés. ta fabrication de l'antibiotique est effectuée par les méthodes habituelles connues et consiste essentiellement à cultiver la souche IMET JA 10081, dans un sol nutritif liquide préalablement stérilisé, dans des conditions aérobies à une température comprise entre 25 et 370C (de préférence à 280C) pendant 2 à 6 jours (de préférence 4 jours) avec une acidité correspondant au debut à un pH de 6,3 à 7,0 et à la fin du processus de fermentation à un pH de 7,5 à 8,3. Le sol nutritif est constitué d'une source de carbone et d'azote ainsi que de sels inorganiques. En tant que source de carbone, on peut utiliser amidon, glucose, glycérine, mannite, maltose, dextrine, huile de soja et farine de soja.En tant que source d'azote on peut, outre certaines des-substances azotées citées ci-dessus, utiliser également levure sèche, peptone obtenue à partir de viande et caséine. De bons résultats de fermentation peuvent être obtenus en utilisant les sels d'ammonium suivants: nitrate d'ammonium, sulfate d'ammonium, phosphate de diammonium. lie choix des sels minéraux à ajouter, qui favorisent le déroulement du processus de fermentation, peut varier en fonction du sol nutritif utilisé. Dans un sol nutritif contenant des substances complexes, telles que différentes farines, l'addition de carbonate de calcium, phosphate de sodium et phosphate de potassium s'est avérée favorable. Dans un sol nutritif contenant du glucose et de la levure ou des sels d'ammonium, l'addition de sels minéraux, tels que sels de potassium, de magnésium, de fer, de zinc, de manganèse et de cuivre, est nécessaire pour accroître le taux de conversion en antibiotique. L'addition de sels de fer au milieu de fermentation permet de stimuler particulièrement la biosynthèse de l'antibiotique.La fermentation du principe actif peut- être effectuée dans des bouteilles à paroi verticale et des ballons à fond rond de différentes capacités ainsi que dans un dispositif de fermentation en verre ou dans un réservoir V2A. te procédé conforme à l'invention, destiné à isoler l'antibiotique colorant trypanomycine de la souche IMET JA 10081 consiste à extraire l'antibiotique trypanomycine du filtrat de culture au moyen de solvants organiques non ou peu miscibles à l'eau et du mycélium au moyen de solvants miscibles à l'eau, à le transférer dans la phase aqueuse après concentration des extraits, à l'extraire à nouveau de la phase aqueuse sous un pH de 3,0 à 7,0 (de préférence 6,8) au moyen de solvants organiques- non miscibles à l'eau, à le précipiter des concentrés issus de le deuxième extraction par mélange, accompagné d'agitation, avec de l'éther de pétrole ou de l'essence, à le débarrasser du solvant par filtration et à le sécher. L'antibiotique trypanomycine est un complexe de substances amorphes rouge brun qui se dissout bien dans le chloroforme, l'acétone, le diméthyl-formamide, peu dans les alcools, les esters et le benzène, mais mal dans l'eau et qui possède des caractéristiques d' indicateur. Tant des bouillons de fermentation frais de la souche JA 10081 que l'antibiotique trypanomycine isolé de ceux-ci ont un effet inhibiteur sur la croissance de protozoaires pathogènes et non pathogènes in vitro et in vivo, de nocardies, d'actinomyces, de bactéries gram-positives et de forme t stables ainsi que de spéroplastes de bactéries gram-négatives. En ce qui concerne les levures, les cryptogames à filaments et les basidiomyces,lteffet inhibiteur de l'antibiotique est faible ou nul. L'antibiotique trypanomycine et ses dérivés, les produits de sa décomposition hydrolytique et les mélanges de ceux-ci peuvent être utilisés comme agents chimiothérapeutiques dans le traitement de maladies dues à des protozoaires. Etude de 1' action antiorotozoaire de l'antibiotique trypa- nomycine. li'étu'dede l'action antiprotozoaire de l'antibiotique trypanomycine a été effectuée in vitro et in vivo sur des souris en utilisant un "spectre" de protozoaires saprophytiques et pathogènes. 1. Sensibilité à la trypanomycine de différentes espèces de protozoaires in vitro. lie tableau I montre que des ciliates apathogènes, des entamoebes pathogènes et, en particulier, des espèces du type trypanosome sont très sensibles à la trypanomycine. Tableau I Organismes d'essai Concentration d'inhibition minimale q3 de trypanomy cine/ml (Destruton au bout de 6 h) apathogènes Euglena gracilis 100,00 Polytoma uvella 1,25 Paramaecum caudatum 1,25 Tétrahymene vorax 5,00 pathogènes Entamoeba invadens 50,00 Entamoeba histolytica 10,00 Trichomonas vaginalis 50,00 Leishmania brasiliensis t00,00 Trypanosoma equiperdum 0,05 Trypanosoma gambiense 0,05 Trypanosoma cruzi 25,00 2. Sensibilité à la trypanomycine de trypanosoma gambiense (agent pathogène de la maladie du sommeil) in vivo (souris). Des souris femelles de la famille AB-Kol furent infectées à ltage de 7 à 9 semaines avec du trypanosoma gambiense. A partir du deuxième jour d'essai on administra aux animaux d'essai journellement pendant 4 jours consécutifs de la trypanomycine à différentes concentrations, appliquée in vivo. lies résultats sont indiqués au tableau II. Il apparat que l'antibiotique étudié, utilisé à des doses comprises entre 1,0 et 2,0 mg/20 g de souris (doses individuelles journalières), a pour effet de prolonger d'une manière appréciable la durée de survie des animaux traités. Cette action d'antibiotiques colorants rouges à caractéristiques d'indicateur est surprenante et était usqu-'ici inconnue. Tableau -II Substance Dose indivi- Durée de Prolongement de Nombre duelle en mg survie la durée de d'animaux par 20 g de (jours) survie, % souris Témoins - 6,1 - 14 Trypanomycine 2,0 19,5 217,4 6 " 1 ,0 12,8 108,4 5 0,5 10,5 70,9 6 0,25 6,3 3,1 6 La dose mortelle critique (DM50) de la trypanomycine dépend, comme le montre le tableau III, du mode d'administration. Tableau III Mode d'administration DM50 (souris) (mg/kg) Injection: intraveineuse 60,0 intrapéritonale 31 ,0 Comparaison de la trypanomycine aux antibiotiques connus à action antiprotozoaire du type streptomyces. Les substances naturelles connues utilisées à titre comparatif sont également des colorants présentant des caractéristiques d'indicateur. Il s'agit des antibiotiques cinérubine, granaticine, danubomycine et hédamycîne. 1. lies agents de formation décrits pour la granaticine, la danubomycine et l'hédamycine, à savoir par exemple Streptomyces oli- vaceus (Xfàksman), Streptomyces griseus (ou analogue) et Streptomyces grisoeruber ne correspondent pas aux critères taxonomiques de l'agent de formation de la trypanomycine, à savoir Streptomyces diastatochromogènes, IMET JA 10081. lies synonymes à affecter (suivant une proposition de Htter) à cette dernière espèce sont indiqués dans un recueil publié par Hütter, Ralf sous le titre:: "Systématique des streptomyces établie en tenant compte en particulier des antibiotiques formés par eux" Bibliotheca Microbiologica, Fasc. 6 Basel-S. Karger New York 1967. Par contre, des agents de formation de cinérubine issus de souches de Streptomyces galilaeus sont considérés comme assimilables à l'espèce type Streptomyces diastatochromogènes, de sorte qu'il ne devrait pas y avoir de differences taxonomiques entre des agents de formation de cinérubine connus et l'agent de formation de trypanomycine caractérisé suivant la présente invention, à savoir IMET JA 10081. 2. La trypanomycine décrite dans le présent brevet se différencie dans son activité biologique de tous les 4-antibiotiques comparables. La cinérubine exerce, contrairement à la trypanomycine, un effet inhibiteur sur la croissance de levures et n'agit que faiblement contre ntamoeba histolytica (100,ug/ml). La granaticine n'agit elle aussi que faiblement sur Trichomonas vaginalis et Entamoeba histolytica (100, g/ml). La danubomycine exerce, contrairement à la trypanomycine, un effet inhibiteur sur les. cryptogames et le Trichomonas foetus. Lthédamycine exerce, comme la cinérubine, un effet inhibiteur sur des levures, qui ne se sont pas avérées sensibles à la trypanomycine. L'hédamycine a un effet inhibiteur sur Detrahyena pyriformis. Pour aux des antibiotiques colorants rouges à caractéristiques d'indicateur signalés jusqu'ici, on n'a fait état d'une action trypanocide. Il est donc surprenant que la trypanomycine décrite dans le présent brevet et issue de la souche IMET JA t0081 constitue un antibiotique présentant une forte action trypanocide in vitro et in vivo. Compte tenu de l'état actuel de la technique, cette action peut être qualifiée comme étant d'un type nouveau. 3. A l'exception des cinérubines les substances naturelles utilisées à titre comparatif, à savoir granaticine, danubomycine et hédamycine, peuvent être considérées comme ayant des propriétés physico-chimiques nettement différentes de celles de la trypanomycine. La trypanomycine appartient chimiquement à la même classe de substances que celle de la cinérubine (anthracyclines). Cependant, on n'a jusqu'ici pas pu constater qu'elle soit identique à la cinérubine. Aucune action trypanocide n'a été signalée pour la cinérubine. lies exemples suivants servent à élucider l'invention qui n'est pas pour autant limitée à ceux-ci. Exemple 1 Deux bouteilles à paroi verticale de 500 ml contiennent chacune 80 ml du milieu nutritif de culture suivant: glucose 1, 5 fio farine de soja 1, 5 % carbonate de calcium 0, 1 % chlorure de sodium 0, 5 % phosphate de potassium primaire O, 03 % eau de ville stérilisation fractionnée: 3 fois 30 mn à 1000C auprès la stérilisation, l'acidité correspond à un pH de 6,3. On introduit dans chaque bouteille à paroi verticale, à la dose d'un dixième de son contenu, une suspension de spores et de mycélium obtenue à l'aide d'une solution de sel de cuisine isotonique stérile à partir d'une culture de la souche IMET JA 10081 cultivée pendant 14 jours dans un verre a réaction sur le milieu nutritif suivant: saccharose 0,30 % dextrine 1,50 % urée 0,01 % extrait de levure 0,10 % peptone (bactérienne) 0,50 % chlorure de sodium 0,05 % sulfate de fer 0,001 % phosphate de potassium pri maire 0,05 % gélose (lavée) 2,0 % eau distillée stérilisation: 40 minutes à 1160 C. Après la stérilisation, l'acidité se situe entre un pH de 6,5 et un pH de 7,0. On fait couver les milieux de culture préalable ainsi inoculés pendant 48 heures à 280 C sur un secoueur fonctionnant à la vitesse de 180 t/mn. 8 ml d'un milieu de culture préalable ainsi couvé sont destinés à être introduits dans des bouteilles à paroi verticale de 500 ml contenant chacune 80 ml du milieu nutritif producteur suivant: glucose 3,0 % farine de soja 2,0 % carbonate de calcium 0,3 % chlorure de sodium 0,5 46 dans de l'eau de ville stérilisation: 35 minutes à 1100 C. Après la stérilisation, l'acidité correspond à un pH de 6,3. On fait couver à 280 C à une fréquence de secouage de 180 t/mn. Au bout de 96 heures de fermentation, la teneur maximale en trypanomycine est atteinte (150 > ug/ml). La détermination du degré d'activité s'effectue par une méthode d'essai microbiologique connue à diffusion de gélose dans laquelle l'intensité de l'action inhibitrice sur la multiplication de virus tempérants dans des bactéries sert de critère de l'activité de l'antibiotique (essai BTP; Fleck, W., 1968). Exemple 2 On procède comme dans l'exemple 1 à cette différence près que le milieu nutritif producteur a la composition suivante: glucose 3 % farine dé soja 3 % carbonate de calcium 0,3 % chlorure de sodium 0,3 % chlorure ferrique hydraté 0,025 % dans de l'eau de ville stérilisation: 35 minutes à 1100 C. Après la stérilisation, l'acidité correspond à un pH de 6,5. La teneur maximale en trypanomycine est atteinte au bout de 100 heures (170g/ml). Exemple 3 On procède comme dans l'exemple 2 à cette différence près que les milieux de culture préalable et de production ont les compositions suivantes: Milieu de culture préalable peptone 0,6 % levure sèche 0,3 % nitrate de calcium hydraté 0,05 % eau de ville stérilisation: 20 minutes à 1200 C, pH: 7,2. Milieu nutritif producteur glucose levure sèche 1,5 % chlorure de sodium O,3 % phosphate de potassium se con- daire 0,1 46 carbonate de calcium 0,15 % sulfate de magnésium 0,01 % sulfate de fer 0,002 5E sulfate de zinc 0,002 % sulfate de cuivre 0,001 % dans de l'eau de ville pH: 7,0 La stérilisation est effectuée de la manière habituelle. La teneur maximale en trypanomycine est obtenue au bout de 120 heures de fermentation (160 g/ol). Exemple 4 400 ml du milieu de culture liquide décrit dans l'exemple 1, contenus dans un ballon de 2000 mol, sont inoculés avec une culture de la souche IMET JA 10081 sur un sol nutritif solide conforme à l'exemple 1. Niait couver pendant 24 à 48 heures à 280 C sur un secoueur fonctionnant à une vitesse de 180 t/mn. Tes 400 ml de bouillon de culture ainsi obtenus servent à inoculer 20 l du milieu nutritif producteur décrit dans l'exemple 1 et qui est contenu dans un récipient de fermentation en verre de 32 l. lia fermentation s'accomplit à 280 C avec adduction de 20 l d'air à la minute et une vitesse d'agitation de 350 t/mn. lia formation de mousse se produisant lors de cette fermentation est réglée par addition de faibles quantités d'huile de soja. lie taux de production maximal de trypanomycine obtenu au bout de 96 heures de fermentation correspondait à une concentration de 100bgtml. Exemple 5 Le procédé se différencie de celui de l'exemple 4 par le fait que le milieu nutritif producteur a la composition indiquée dans ltexemple 2. A partir de 20 1 d'un bouillon de culture réalisé suivant ltesemple 4 on obtient, après séparation du mycélium, dans des conditions d'acidité inchangées, -18 1 de filtrat de culture que l'on soumet à une extraction effectuée avec 4,5 1 de butanol. le mycélium (1,8 kg de poids brut) est soumis -trois fois à une extraction effectuée avec 3,6 1 de méthanol. lies extraits sont concentrés jusqu'au quinzième du volume de départ, mis ensemble et débarrassés du solvant organique par distillation azéotropique. La suspension aqueuse (t,5 l) est soumise deux fois à une extraction au moyen d'une quantité de chloroforme correspondant à la moitié-du volume de la suspension, puis l'er- trait au chloroforme est concentré jusqu'au dixième de son volume et l'antibiotique est précipité par le même volume d'éther de pétrole. Le rendement est de 2 g de trypanomycine. Exemple 6 On procède comme indiqué dans l'exemple 4 à cette différence près que déjà au bout de 24 heures de fermentation dans le milieu nutritif producteur indiqué dans l'exemple 1 les 20 1 de bouillon de culture présents dans le ballon de 32 l sont utilisés pour inoculer 400 1 du md7ee milieu contenus dans un réservoir V2A de 700 l. La fermentation s'effectue à 280 C avec une adduction d'air de 450 1/mn et une vitesse d'agitation de 270 t/mn. Le rendement était de 50 g de trypanomycine. Exemple 7 Le procédé se différencie de celui décrit dans l'exemple 6 par le fait que le milieu nutritif producteur décrit dans l'exem- ple t est remplacé par le milieu décrit dans l'exemple 2. lie rendement était de 60 g de trypanomycine. REVENDICATIONS 1 - - Procédé d'obtention d'un antibiotique à action trypano- cide par culture d'une souche de streptomyces, caractérisé en ce que l'on utilise comme souche du streptomyces diastatochromogènes T1vE JA 10081 ses produits de mutation ou ses variantes. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est effectuée dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif contenant essentiellement des sources de carbone et d'azote. 3 - Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que des sels- de fer sont ajoutés au milieu nutritif. 4 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'antibiotique est obtenu en effectuant une extraction au moyen de solvants organiques, puis un transfert dans la phase aqueuse et une nouvelle extraction suivie d'une précipitation réalisée à l'aide d'hydrocarbures-à bas point d'ébullition.