Brevet FR2025061A1 — publié le 19700904

La présente invention concerne la production de lames à culture de tissus pour microbiologie et plus particulièrement, un procédé de production de lames d'essai comportant une culture de tissu cancéreux, les lames ainsi produites ayant une nature scientifique exacte et pouvant cependant être conservées facilement aux tempéra tures ambiantes, par exemple, pendant une importante période de temps. Jusqu'à présent,les lames de microbiologie portaient à leur surface un petit morceau de tissu ou de tissu implanté. Les lames de tissus biologiques ainsi conçues ne se sont pas avérées satisfaisantes : leurs constituants et leur nature diffèrent d'une lame à l'autre, elles ne sont pas de nature mono-couche et ne s'adaptent pas bien à une large application de stockage en laboratoire ou ailleurs au froid ou aux températures ambiantes. Les lames classiques ne conviennent que pour des applications assez limitées et, en tout cas, elles doivent dtre conservées et envoyées dans des conditions très strictes. On ne connais pas en pratique de lames qui comprennent des lames cibles ou lames témoins utilisant des cellules cancéreuses cibles ou cellules témoins cultivées sur la lame. Donc,un but principal de la présente invention est de fournir une nouvelle lame perfectionnée de culture de tissu cancéreux (CTC) à des fins de laboratoire de microbiologie et à d'autres fins. - Un autre but consiste fournir de nouvelles lames perfection- nées de culture de tissu, permettant de préparer à partir d'un seul spécimen d'innombrables lames sur lesquelles il y a des cultures de cellules, d'analyser aisément au cours d'examens d'immuno-fluorescence des mono-couches déposées sur les lames respectives et de transporter ces lames sans réfrigération. Un autre but de l'invention consiste à fournir une-lame perfectionnée de CTC pour des examens diagnostiques par des méthodes microbiologiques. Un autre but de l'invention consiste à fournir un procédé pour produire des lames de CTC pour examen microbiologique, permettant de désassocier mutuellement des cellules utilisables, de les séparer du tissu principal, de les cultiver ensuite et de les déposer eouB forme de structure à mono-couche de cellules sur la surface d'une lame ou d'une lamelle couvre-objet utilisée comme lame. Un autre but consiste à fournir un procédé de production de lames ou de lamelles de CTC pour microbiologie, ces lames ou lamelles pouvant autre aisément conservées aux températures ambiantes pendant de longues périodes de temps. Un autre but consiste à fournir pour des lames de CTC un nouveau type de culture de tissu où le maintien du métabolisme cellulaire est assuré durant le retrait des cellules de la solution et leur dép8t sur les lames pour y adhérer. Un autre but de l'invention consiste à fournir un procédé de production de lames où les lames comportent avantageusement sur elles des cellules cancéreuses cibles ou cellules témoins à utiliser pour la détection d'antigènes par immuno-fluorescence ou autrement. La présente invention, tant pour son organisation que pour sa mise en oeuvre, ainsi que d'autres buts et avantages, pourront mieux se comprendre par référence à la description qui suit,prise avec le dessin annexé, dont la figure unique est une vue en perspective d'une lame d'essai selon la présente invention. Bans la mise en pratique de la présente invention concernant la production de lames, on réalise les stades suivants Au début, on prévoit tqut d'abord la fourniture d'une lame, c'est-à-d(re tout objet translucide pouvant recevoir la culture de tissu cancéreux. Bien que de nombreux types de matériaux soient possibles pour la fabrication de la lame, par exemple-des matières plastiques limpides comme celles connues-sous la marque commerciale "Mylar", on pense souhaitable d'utiliser le matériau classique nécessaire pour la production de lames, à savoir le verre.La lame à utiliser est stérilisée au début, en appliquant des modes opératoires classiques de stérilisation, de sorte que la lame puisse être exempte d'impuretés, Le stade suivant consiste à fournir du tissu d'un organisme cancéreux choisi dont les cellules sont à disposer sur une surface de la lame. Cela stobtient àCpartir de n'importe quel organe ou tumeur cancéreux, etc., disponibles au laboratoire. Le tissus est tout d'abord identifié, bien entendu, selon les techniques générales de la pathologie, de façon que la nature du tissu concéreux soit prédéterminée et connue. Le tissu ainsi choisi et dont la nature a été prédéterminée est lavé, égoutté, puis soigneusement haché menu à l'aide d'un couteau ou de ciseaux.Si du sang cancéreux constitue le "tissu", les globules blancs cancéreux seront séparés par un processus de centrifugation classique. Le tissu haché menu est deposé dans un récipient approprié et l'on y introduit un agent d'hydrolyse des protéines à mélanger au tissu haché. le but de l'agent d'hydrolyse est de rompre ou décomposer la protéine servant de liant inter-cellulaire. Bien qu'il soit concevable d'utiliser ainsi de nombreux types différents d'agents d'hydrolyse, la Demanderesse a utilisé avec une satisfaction complète l'enzyme connu sous le nom de trypsine. Cet enzyme sert a rompre le tissu, c'est-à-dire la substance protéinique de liaison maintenant les cellules ensemble en étroite proximité, de sorte que les cellules ainsi séparées puissent servir ensuite. Les cellules du tissu sont alors séparées de la trypsine. Cela peut s'effectuer commodément dans une centrifugeuse classique.Il est souhaitable d'effectuer un ou plusieurs lavages à l'aide de solution saline physiologique stérilisée afin de garantir l'enlèvement de la quasi totalité de la trypsine, en laissant les cellules de tissu restant dans la centrifugeuse disponibles pour leur utilisation ultérieure. On peut, bien entendu, faire croître de telles cellules dans des flacons pour leur multiplication après quoi on'peut les faire rostre à nouveau sur l'es" lames. Le stade ci-dessus comprenant l'introduction et la séparation de l'agent d'hydrolyse est omis dans le cas où le "tissu" cancéreux est du sang. Les cellules du'tissu cancéreux, désignées simplement ci-après sous le nom de "cellules", sont alors mises en suspension dans un milieu de culture ou de croissance et placées sur unie ou plusieurs lames déposées dans une botte de Pétri, une cuvétte de laboratoire ou tout autre récipient approprié. le but du milieu de croissance est, bien entendu, de fournir assez d'agents nutritifs aux cellules pour permettre-la croissanc'e'de ces cellules. Le milieu de croissance utilisés compose de iT) du sérum sanguin, c'est-à-dire la phase liquide du sang, et (2) d'un milieu nutritif.Un milieu nutritif peut se définir de façon générique comme comprenant des tampons, par exemple des phosphates salins des produits chimiques des sels minéraux, par exemple chlorure de sodium chlorure de calcium chlorure de potassium des coraposés organiques, par exemple glucose dextrose hydrolysat d'albumine un indicateur au ro-uge de phénol des acides aminés des vitamines des antibiotiques, par exemple la pénicilline, la streptomycine, la néomycine, la mycostatine, l'actidione, etc. En ce qui concerne le sérum sanguin utilisé, il peut s' agir d'un sérum de boeuf, de veau, de foetus de veau ou même de sérum humain. Le sérum et le milieu nutritif ou d'entretien choisis sont tous deux prédissous dans de l'eau distillée et mélangés ensemble avant leur introduction, avec les cellules lavées en suspension dans cette solution, dans la botte de pétri ou autre récipient. On peut faire légèrement varier le milieu nutritif ci-dessus décrit selon les pratiques courantes en microbiologie pour la production de cultures de tissus. Des milieux nutritifs représentatifs sont la solution saline basique de Hank, le milieu de Fischer, le milieu 199, le milieu L-115 et le milieu essentiel minimum tel que la "solution de Bagle". Ces milieux sont décrits ci-après et aux pages suivantes SOLUTION de HANK Constituants mg/litre NaCl 8,000 KCl 400 CaCl2.2H2O 186 MgSO4.7SH2O 100 MgCl2.6H2O 100 NaH2PO4.H2O - Na2HPO4.7H2O 90 KH2PO4 60 Dextrose 1,000 Rouge de phénol 20 NaHCOD 350 MILIEU L-15 Constituants mg/litre Amino Acides DL-Alanine 450,0 L-Arginine (base libre) 500,0 L-Asparagine 250,0 L-Cystéine (base libre) 120,0 L-Glutamine 300,0* Glycine 200,0 L-Histidine (base libre) 250,0 DL-Isoleucine 250,0 L-Leucine 125,0 L-Lysine.HCl 82,0 DL-Méthionine 150,0 DL-Phénylalanine 250,0 L-Sérine 200,0 DL-Thréonine 600,0 L-Tryptophane 20,0 L-Tyrosine 300,0 DI-Valine 200,0 MILIEU L-15 (Suite) Constituants mg/litre Vitamines DL-Pantoténate de Ca 1,0 Chlorure de choline 1,1 Acide folique 1,0 i-Inositol 2,0 Nicotinamide 1,0 Pyrodoxine HCl 1,0 5-Phosphate de riboflavine, dérivé sodique 0,1 Pyruvate de sodium 550,0 Monophcsphate de thiamine 1,0 Autres constituants Amphotéricine B* 3,0 D-(+) Galactose 900,0 Rouge de phénol 10,0 Péniciline G-potassique* unités/ml 300,0 Sulfate de Streptomycine* 300,0 Sels minéraux CaCl2 .2H20 186, O Cl 400,0 KH2P04 60,0 MgCl2.6H2O 200,0 MgSo4.7H20 200,0 NaCl 8.000,0 Na2HPO4.7H2O 358,0 mis en ampoules à pH 7,6 (+ 0,1) *La formule de composition utilisée par la Demanderesse ne comprend ni la L-glutamine ni les antibiotiques. MILIEU 199 Constituants mg/litre Amino Acides L-Alanine 25,0 L-Arginine,HCl 70,0 Acide L-Aspartique 30,0 L-Cystéine, HCl 0,1 L-Cystine 20,0 Acide L-glutamique 67,0 L-Glutamine 100,0 L-Glycine 50,0 L-Histidine HCl,H2O 22,0 L-Hydroxyproline 10,0 L-Isoleucine 20,0 L-Leucine 60,0 L-Lysine HCl 70,0 L-Méthionine 15,0 L-Phénylalanine 25,0 L-Proline 40,0 L-Sérine 25,0 L-Thréonine 30,0 L-Tryptophane 10,0 L-Tyrosine 40,0 L-Valine 25,0 MILIEU 199 (Suite) Constituants mg/litre Vitamines Acide P-Aminobenzoïque 0,050 Acide Ascorbique 0,050 D-Biotine O,010 Calciférol 0,100 D-Pantoténate de Ca 0,010 Cholestérol 0,200 Chlorure de choline 0,500 Acide folique 0,010 i-Inositol 0,050 Ménadione 0,010 Nicotinamide 0,025 Acide nicotinique 0,025 Pyridoxal HCl 0,025 Pyridoxine HCl 0,025 Riboflavine 0,010 Thiamine HCl 0,010 Phosphate de DL-a-Tocophérol (Na2) Tween 80* 5,000 Vitamine A 0,100 Autres constituants Adénine HCl.2H20 12,10 Acide Adénosine-5'-monophosphorique, Dihydrate (-AMP) (Acide adén-ylique du muacle) 0,20 Adénosine-5'-triphosphate disodique, tétrahydrate (ATP) 1,00 Desoxyribose 0,50 Dextrose 1.000,00 L-Glutathione 0,05 *marque eommerciale de Atlas Powder Company MILIEU 199 (Suite) Constituants mg/litre Guanine HCl.H2O 0,33 Hypoxanthine 0,30 Rouge de phénol 20,00 Ribose 0,50 Acétate de sodium 3H20 83,00 Thymine 0,30 Uracile 0,30 Xanthine 0,30 Sels minéraux CaCl2.2H2O 186,0 Fe(NO3)3.9H2O 0,7 KCl 400,0 KH@PO4 60,0 MgCl2.6H2O 100,0 MgSO4.7H2O 100,0 NaCl 8.000,0 NaHCO3 1.250,0 Na2HPO4.7H2O 94,0 mis en ampoule à pH 7,2 (+ 0,1). NOTE NaHC03 doit être ajouté comme ingrédient final après dilution. MILIEU de FISCHER Constituants mg/litre Amino Acides L-Arginine HCl 15,0 L-Asparagine 10,0 L-Glutamine 200,0 L-Histidine 60,0 L-Isoleucine 75,0 L-Leucine 30,0 L-Lysine HCl 50,0 L-Méthionine 100,0 1-Phénylalanine 60,0 L-Sérine 15,0 L-Thréonine 40,0 1-Tryptophane 10,0 L-Valine 70,0 Cystine 20,0 L-Tyrosine 60,0 Vitamines D-Biotin 0,01 D-Panthoténate de Ca 0,50 Chlorure de choline 1,50 Acide folique 10,00 i-Inositol 1,50 Nicotinamide 0,50 Pyridoxal HCl 0,50 Riboflavine 0,50 Thiamine, HCl 1,00 Autres constituants Dextrose 1.000,0 Rouge de phénol 5,0 Pénicilline G-potassique unités/ml: 500,0 Sulfate de streptomycine @ 50,0 MILIEU de FISCHER (Suite) Constituants mg/litre Sels minéraux CaCl2 , 2H2O 91,0 KCl 400,0 MgCl2 , 6H20 100,0 NaCl 8.000,0 NaHCO3 1.125,0 NaH2PO4 , H20 69,0 Na2HPO4 , 7H2O 113,0 MILIEU ESSENTIEL MINIMUM (EAGLE) Constituants mg/litre Amino Acides L-Arginine HCl 126.4 L-Cystine 24,0 L-Glutamine 292,0* L-Histidine HCl.H2O 41,9 L-Isoleucine 52,5 L-Leucine 52,4 L-Lysine, HCl 73,1 L-Méthionine 14,9 L-Phénylalanine 33,0 L-Thréonine 47,6 L-Tryptophane 10,2 L-Tyrosine 36,2 aline 46,8 Vitamines D-panthoténate de Ca t,O Chlorure de choline 1,0 O.Acide folique 1,0 i-Inositol 2,0 O,Nicotinamide 1,0 O,Pyridoxal HCl 1,0 Riboflavine Oit Thiamine HCl 1,0 MILIEU ESSENTIEL MINIMUM (EAGLE) (Suite) Constituants mg/litre Sels minéraux et autres constituants Solution saline basique de Earle CaCl2.'2H2,O 265,0 KCl 400,0 MgSO4.7H2O 200,0 NaCl 6.800,0 NaHCO, 2.200,0 NaH2PO4.H2O 140,0 Dextrose 1.000,0 Rouge de phénol 10,0 Solution saline basique de Hank CaCl2.2H2O 186,0 KCl 400,0 EH2P04 60,0 MgC12.6H2O 1 00, O MgSO4.7H2O 100,0 NaCl 8.000,0 NaHCO3 350,0 Na2HPO4.7H2SO 90,0 Dextrose 1.000,0 Rouge de phénol 20,0 Pour des cultures en suspension XCl 400,0 NaCl 6,800,0 NaHCO3 2.200,0 NaH2PO4.H2O 1,500,0 MgCl2.6H2O 200,0 Dextrose 1.000,0 Rouge de phénol 10,0 * La L-glutamine n'est pas incluse dans la composition. Notes Il convient dtajouter la L-glutamine avant utilisation. Le pyruvate de sodium et/ou des amino-acides non essentiels constituent des suppléments facultatifs. Les similitudes étroites entre les divers milieux nutritifs apparaissent aisément. De légères variantes et des milieux nutritifs équivalents sont bien connus et établis en pratique. Ils com- prennent le "MB 752/1", le milieu 5a de McCoy, le milieu N-16 et le milieu 1-15, la solution nutritive de Scherer, etc. Tous ces milieux nutritifs sont couramment utilisé et bien connus en pratique microbiologique. Généralement mélangés aux milieux nutritifs ou considérés copte en faisant partie, il y a des tampons bien établis et servant cou:t-ent è des fins sérologiques. On indique oi-après la composition des tampons DGV, trie, au véronal et au phosphate TAMPONS Solution D.G.V. (Dextrose-gélatine-véronal) Constituants mg/litre CaCl2 20 Dextrose 10 000 Acide 5,5'-diéthylbarbiturique (barbital) 580 Gélatine (granulaire, pour bactériologie) 600 MgSO4 7H2O 120 NaCl 8.500 5,5'-diéthylbarbiturate de Na 380 (mise en ampoules ou flacons à pH 6,3 (+ 1,1)) TAMPON TRIS Constituants mg/litre Dextrose 2 000 Rouge de phénol 20 KCl 400 Cl 4.500 fris (hydroxyméthyl)aminométhane 2 430 (mis en ampoules ou flacons à pH 7,25 (+ 0,1)) VERONAL (5X) Constituants mg/litre CaC12, 2H20 100 Acide 5,5'-diéthylbarbiturique (barbital) 2 300 MgCl2, 6H2O 500 NaCl 41 900 NaHCOa 1 260 5,5'-diéthylbarbiturate de Na 1 500 (mis en ampoules ou en flacons à pH 7,4 (+ o,i)) SOLUTION SALINE TAMPONNEE AU PHOSPHATE Solution saline tamponnée par du phosphate 0,10 molaire. Le stade suivant consiste à prévoir un temps d'incubation pour le contenu de la botte de Pétri. Pendant cette incubation, les cellules en suspension dans le milieu de croissance se déposent progressivement sur les lames. Durant l'incubation, la botte ou le récipient reste, bien entendu, couvert. La période d'incubation peut durer de 3 à 15 jours. Durant cette période lee cellules vont en fait adhérer à la surface de la lame et crottre. Par croissance on entend au moins le maintien de l'état vivant et, en général, une multiplication des cellules. Il convient de maintenir la température ambiante durant la période d'incubation entre 320C et 420C (habituellement 370C). Un signe évident de la croissance des cellules s'obtient par l'observation de la couleur. Si après la période d'incubation le milieu devient jaune, cela indique la présence d'un métabolisme des cellules. La couleur jaunâtre est produite grSce à l'incorporation du colorant indicateur, d savoir le rouge de phénol dans le milieu de croissance. I1 est bien connu que le métaboliane des cellules aboutit à la production d'anhydride ~carbonique qui se combine aux atomes d'hydrogène de l'eau présente dans le milieu pour former -l'acide carbonique. Ainsi, le colorant indicateur va virer au jaune. Au contraire, si les cellules ne manifestent ni métabolisme ni croissance, le milieu garde unè couleur rouge rosé. Après le succès de la croissance, on retire les s lames des botesvde Pétri ou des. autres récipients, et on lave les lames avec une solution saline physiologique. On observera que les cellules ont en fait bien adhérer aux surfaces. des lamez de verre. On introduit ensuite ces lames dans un milieu fixateur comme celui formé par un mélange de 50 r d'éther et de 50 % d'alcool en volumes. On peut concevoir de n'utiliser que l'alcool seul comme fixateur, ou d'utiliser d'autres fixateurs. Il est cependant préfé- rable d'utiliser le mélange éther-alcool à 50-50 r (en volumes). Les lames contenant la culture de tissu peuvent Otre "fixées" dans les deux à cinq minutes qui suivent leur immersion initiale dans la solution de fixation. On retire ensuite les lames du fixateur et on les lave à nouveau dans une solution saline physiologique. Les lames sont alors protes pour être disposées dans des flacons d'expédition. La partie importante de l'invention est que ces flacons contiennent une solution ou un liquide d'immersion, un tampon conservateur, par exemple une substance connue sous la marque commerciale "Merthiolate" ou meme du glycérol qui inhibe l'évaporation de l'eau dans le flacon et évite également la contamination deslames. Un ingrédient idéal ainsi découvert pour éviter la contamination des flacons et des lames qui y sont immergés est le glycérol. Ainsi, lorsque le glycérol est mélangé à une solution tamponnée au phosphate et que le mélange est introduit dans la fiole, on peut en toute sécurité y déposer les lames et les y maintenir pendant de longues périodes de temps, peut Btre même aussi longtemps que 5 ans. On a observé qu'aucune réfrigération n'est nécessaire ; les flacons contenant les lames peuvent être emmagasinés au contraire aux températures ambiantes et maintenus en stockage avant usage. Certains chercheurs peuvent souhaiter réfrigérer le flacon et les lames, cette pratique est acceptable. I)ans la figure unique du dessin, on voit des cellules cancéreuses cibles ou témoins pré-séparées 10 déposées et que l'on a fait généralement croître sur la lame 11, comme indiqué dans le procédé ci-dessus décrit. Pour des essais ou examens par immuno-fluorescence impliquant des antigènes intra-cellulaires, les cellules seront fixées, comme expliqué ci-dessus. La lame 11. est au moins translucide de préférence transparente et peut autre fabriquée, en verre, en "Mylar" ou en d'autres matibres plastiques. La lame Il peut com prendre une lame classique pour microscope, une lamelle- couvre- objet, ou un autre article translucide approprié convenant pour supporter des cellules en vue d'une observation mictoscopique ou autre. La description ci-dessus des lames d'essai à culture de tissu cancéreux et du procédé pour leur fabrication sert entièrement à produire, pour un examen du sang des lames d'essai munies d'un type choisi de cellules cancéreuses connues, par exemple des cancers respectifs du foie, du poumon, du colon, du cerveau, des seins, du col de l'utérus, des ganglions lymphatiques, de la peau, etc. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Lame de microbiologie, à culture de tissu cancéreux, caractérisée par le fait qu'elle comprend une lame translucide et une couche de cellules cancéreuses cultivées et adhérant à celle lame. 2. Lame selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les cellules sont fixées. 3. Lame selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les cellules sont des cellules cibles ou témoins. 4. Lame selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la couche est une mono-couche. 5. Lame selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la lame est transparente, la couche n'adhérant qu'à une face de cette lame. 6. Lame de microbiologie à culture de tissu pour le diagnostic du cancer, caractérisée en ce qu'elle comprend une lame translucide et une couche de cellules cancéreuses témoins cultivées, capables de réagir à du sérum sanguin contenant des anticorps spécifiques à l'égard de ces cellules cancéreuses témoins, lesdites cellules cancéreuses adhérant à la lame. 7. Procédé de fabrication de lames cibles pour la diagnose du cancer, caractérisé par le fait que ce procédé comprend les stades de fourniture d'une lame translucide ayant une surface réceptrice pour des cellules, fourniture d'une certaine quantité d'un tissu cancéreux identifié, production à partir de ce tissu de cellules cancéreuses libres, culture de ces cellules dans un milieu de croissance comprenant un milieu nutritif et du sérum sanguin, introduction des cellules et du milieu de croissance sur la surface de la lame, et incubation de la lame pour permettre aux cellules de se déposer du milieu de croissance et d'adhérer à la surface de la lame. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, après le stade d'incubation, le procédé comprend encore les stades eupplémentaires de séparation de la lame d'avec le milieu de croissance, et de lavage de la lame. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la quantité de tissu comprend un morceau de tissu et, après avoir fourni le tissu, le procédé comporte les stades supplémentaires de hachage menu de ce tissu, de soumission du tissu à un agent d'hydrolyse pour fournir des cellules libérées' et séparées, et de épara- tion de ces cellules de l'agent d'hydrolyse. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la quantité de tissu comprend une portion de sang et le procédé comporte, après la fourniture du tissu, le stade consistant à séparer de la portion de sang les globules blancs cancéreux qui y sont présents. 11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, après le stade de lavage, le procédé comporte les stades supplémentaires de fixation de ces cellules et de conservation de la lame dans une solution d'emmagasinage contenant du glycérol. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, après le stade de lavage, le procédé comporte les stades supplémentaires de fixation des cellules et d'emmagasinage de la lame dans une solution saline tamponnée au phosphate et mélangée à du glycérol. 13. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que après le stade de lavage, le procédé comporte les stades supplémentaires de fixation de ces cellules et d'emmagasinage de la lame dans un conservateur liquide. 14. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, après le stade de lavage de la lame, le procédé comporte le stade supplémentaire de fixation de ces cellules.