Brevet FR2028289A1 — publié le 19701009

La présente invention concerne la production d' un antibiotique connu chimiquement comme étant l'acide (-) Çcis-t.2-époxy-propyl)phosphonique et ep. particulier un procédé perfectionnée pour la production'de l'antibiotique par fermentation de milieux 5 nutritifs avec des souches appropriées de microorganismes comme, par exemple, des Streptomyces. ; L'antibiotique est produit pendant la fermentation aérobie de milieux nutritifs aqueux dans des" conditions contrôlées. Des milieux aqueux comme ceux qu'on emploie pour la production 10 d'autres antibiotiques conviennent pour la production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. De tels milieux contiennent des sources de carbone et d'azote qui sont assimilables par le microorganisme, et des sels minéraux. En outre, les milieux de fermentation contiennent des traces de métaux nécessaires pour la 15 croissance du microorganisme qui sont apportées communément sous forme d'impuretés se trouvant dans les autres constituants du milieu. En général, des hydrates de carbone comme des sucres, par exemple le dextrane, le maltose, le galactose, le glucose et analogues et des amidons comme des grains* par exemple de l'avoine 20 et du seigle, de l'amidon de maïs, de la fariné de maïs et analogues, peuvent être utilisés soit seuls, soit en association comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quantité exacte de la source ou des sources d'hydrates de carbone dépend en partie des autres ingrédients du milieu. On a trouvé 25 toutefois qu'il suffit d'une quantité d'hydrate de carbone comprise entre 1 et 6% en poids du milieu. On peut utiliser une seule source de carbone ou bien on peut associer plusieurs sources de carbone dans le milieu. • Des sources d'azote satisfaisantes comprennent les 50 innombrables matériaux protéiques comme diverses formes drhydroly-sats de caséine, la farine de,soja, la liqueur de trempage de maïs les distillers solubles, les hydrolysats-de levure, la pâte de tomates et analogues. Les diverses sources d'azote peuvent être utilisées seules ou en association et sont utilisées en quantité 55 allant de 0,2 à 6fo en poids du milieu aqueux. On forme l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique en cultivant dans des conditions contrôlées des souches de microorganismes comme par exemple, les souches du genre Streptomyces 70 01015 2 2028289 qui produisent l'antibiotique. Un de ces microorganisme, qui a été isolé du sol, a reçu la désignation MA-2898 dans la collection de cultures de Kerck & Co«, Inc. à Sahway, Hew Jersey ; des sous-isolés de la culture parente ont reçu les désignations MA-2911, 5 MA-2912 et MA-291 3« Ces cultures ont été placées en dépôt permanent dans la collection de cultures de la Northern Utilization Research & Development Branch de 1'United States Department of Agriculture à Peoria, Illinois et ont reçu les numéros de culture HRRL B-3357» NRRL B-3358, .NRR1 B-3359 et NRHL. B-3360 respectivement. Ces micro-10 organismes ont été classées dans l'espèce Streptomyces frâdiae. L'antibiotique est également produit par.culture dans des conditions contrôlées., d'autres souches de Streptomyces également isolées du sol et identifiées dans,la collection de Merck & Co., Inc. comme étant des cultures-MA-2867, MÀ-2903, MÂ-2916, 15 MA-2917, MA-3270, MA-3272 et MA-3267. Ces cultures ont été classées comme membres de l'espèce Streptomyces viridochromogenes. Les cultures. MA-2903, MA-2867, MA-2917 et MA-3270 ont été placées en dépôt permament à Peoria et ont reçu les numéros de culture NRB1-3413, HRRL-3414, HEKL-3415, NRRL-3416 et NEEL-3427 respectivement. 20 La culture 3269 a été classée dans l'espèce Streptomyces wedmorensis et a reçu le numéro NBKL-3426« Outre les espèces ci-dessus de microorgahismes, on envisage aussi l'emploi d'autres microorganismes y compris des souches de Streptomyces soit isolées dans la nature soit obtenues par muta-25 tion de ces organismes, comme celles qu'on obtient par sélection naturelle ou celles qui'sont produites par des agents de mutation comme par exemple. 1'irradiation aux rayons X, l'irradiation ultraviolette, les moutardes à l'azote et analogues. En raison de la difficulté inhérente de séparation de 30 l'acide .(-) . ( cis-1.. 2-époxypropyl ) pho s phonique pur des grandës quantités,,d'impure tés dans le bouillon .de fermentation, il est . très important de trouver un moyen d'augmenter la concentration de .. lrantibiotique par rapport- aux solides totaux du bouillon. .., .a. La. demanderesse adéternd.néque:l'additxoiide citrate 35. à des. milieux de fermentation organiques-complexes''et chimiquement ... - définés; au^mente la, production de 1racide, :(-)- (cis-1.2-époxypropyl) phosphonique. Par "milieux, .organiques complexes" on ■.entend des . milieux dans lesquels certains, des; ingrédient srne -sont- pas définis 70 01015 3 2028289 chimiquement» Un exemple de tels milieux est un milieu consistant en avoine broyée, farine de soja, ascorbate de sodium et distillers solubles. Par "milieux chimiquement définis", on entend des milieux dont tous les ingrédients sont chimiquement définis. Un exemple 5 de tels milieux est un milieu consistant en amidon de maïs, phosphate acide de potassium, ascorbate de sodium, asparagine méthio-nine, glutamate monosodique, chlorure de calcium, sulfate de magnésium et sulfate ferreux» La quantité de citrate nécessaire pour stimuler la production de l'antibiotique varie selon le milieu 10 employé» La concentration réelle de citrate employée dans un milieu donné dépend du microorganisme particulier utilisé et des conditions de fermentation appliquées» Une production améliorée de l'antibiotique a été observée dans des milieux contenant environ 4 - 8 g par litre de la source de citrate quand on l'ajoute 15 sous la forme de citrate de sodium. D'une façon générale» on a trouvé que l'addition d'environ G,50 g/l à environ 8,0 g/l augmente la production de l'antibiotique. L'addition de citrate de sodium à un milieu constitué par des agents nutritifs complexes, par exemple, augmente la production d'acide (-) (çis-1,2-époxypro-20 pyl)phosphonique dans une proportion aussi grande que 95 i° quand le citrate de sodium est présent dans des concentrations d'environ 1,0 g/l à environ 8,0 g/l. De façon correspondante, dans un milieu chimiquement défini ou synthétique, on a trouvé que l'additon d'une source de citrate augmente de 6 à 7 fois la production d'a-25 cide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique quand la concentration de citrate de sodium est augmentée de 1 à environ 4 g/l de milieu. Ainsi, une concentration de citrate équivalant à une quantité allant d'environ 0,65 à environ 5,2 g/l augmente la production de 1'antibiotique• 30 On peut employer toute source de citrate qui donne une concentration adéquate en citrate dans le milieu de fermentation. Le citrate est ajouté de préférence sous la forme d'un sel minéral comme le citrate de sodium,/ potassium, ou calcium, bien qu'on puisse employer l'acide libre . Le citrate peut aussi être ajouté sous 35 la forme d'un sel ou complexe comme il peut s'en trouver dans des agents nutritifs microbiens qui sont riches en acide citrique. Les agents nutritifs habituels comprennent une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable, des sels minéraux et des 70 01015 4 2028289 facteurs de croissance, si nécessaire. On envisage aussi l'addition de citrate à des milieux de fermentation contenant d'autres microorganismes susceptibles de produire l'acide (-) (cis-1»2-époxypro-pyl)phosphonique. Une source de citrate peut aussi être utilisée 5 en même temps que d'autres stimulants pour la production de l'acide (-) (cis-t,2-époxypropyl)phosphonique, comme le cobalt, le glutamate monosodique, une source de phosphore, la méthionine et la 1-cystéine. Les adjuvants de production additionnels peuvent être présents dans le milieu de fermentation comme agents nutritifs ou 10 ils peuvent être présents comme additifs. L'emploi de citrate en même temps que d'autres stimulants pour la production de l'antibiotique entraine une augmentation supplémentaire de la production de l'antibiotique. Bien que le nouvel antibiotique selon l'invention puisse 15 être produit en culture en surface ou en culture submergée, on préfère actuellement effectuer la fermentation en culture submergée. Les fermentations à petite échelle sont conduites en plaçant des quantités appropriées de milieu nutritif dans des fioles, en stérilisant les fioles et leur contenu par chauffage à 120°0, en ino-20 culant les fioles soit avec des spores, soit avec une culture cellulaire végétative d'un microorganisme produisant de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique, par exemple une souche de Streptomyces. en bouchant les cols des fioles avec du coton et en laissant la fermentation se poursuivre à une température constante 25 d'environ 28°G pendant 3-5 jours. Pour le travail à plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des cuves appropriées équipées d'un agitateur et de moyens d'aération du milieu de fermentation. Dans ce procédé, le milieu nutritif est préparé dans la cuve et stérilisé par chauffage à 120°C. Après 30 refroidissement, le mélange stérilisé est inoculé avec une source convenable de culture cellulaire végétative du microorganisme et on laisse la fermentation se poursuivre pendant 2-4 jours tout en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à environ 28 &C. Oe procédé de production est particulière-35 ment approprié à la'préparation de grandes quantités du nouvel antibiotique. La fermentation utilisant le microorganisme producteur d'acide (-) (cis—1,2-époxypropyl)phosphonique peut être conduite 7.0 01015 5 ;20;28)289 à des températures allant d'environ 2.0°C à'40°G. Pour obtenir les meilleurs résultats, toutefois, il vaut mieux "conduire les fermentations à des températures situées entre 26-et 30°C« le pH ■du milieu nutritif : convenant à la croissance du microorganisme et 5 à la production de 1'antibiotique peut varier entre environ 5,0 et'9,0. l'intervalle de pïï préféré est toutefois'.compris entre 6,0 et 7,5. ■ ' • Pour mettre en oeuvre le procédé de fermentation, on prépare une suspension de cellules en ajoutant un milieu stérile 10 à une culture inclinée sur gélose d'un microorganisme producteur d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique*, Une culture de cette culture inclinée est alors utilisée pour inoculer une fiole d'ensemencement et cette dernière est agitée à 28°C- pendant 1-3 jours pour obtenir une bonne culture, la fiole d'ensemencement est uti-15 lisée pour inoculer les fioles de production, la culture d'ensemencement peut aussi être inoculée par une culture lyophilisée ou un inoculum congelé. On procède en général à l'inoculation en utilisant environ 1 ml par 30 ml de milieu de production contenant la concentra-20 tion désirée en citrate et on laisse la fermentation se poursuivre pendant .2 —4 jours en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 28°G environ. Toutes les fioles de production, c'est à dire celles qui contiennent le citrate ajouté et les fioles utilisées comme témoins, sont alors titrées, en 25 général après 3 — 4 jours, pour déterminer-la quantité d'antibiotique produite dans chaque fiole. l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique est titré de façon commode -par un procédé disque-plaque utilisant Proteus vulgaris MB-838 (ATGC 21100 et HEE1 B-3361 comme organisme d'essai. 30 la culture d'essai est maintenue sous forme d'une'culture inclinée sur gélose nutritive -(Difco) plus 0,2 d'extrait de levure (Difco). les cultures inclinées inoculées sont incubées à 37°G pendant 18 -24 heures et conservées aux températures du réfrigérateur pendant . une semaine, des cultures fraîches étant préparées chaque semaine. 35 On prépare 1"inoculum pour les plaques de titrage- chaque jour en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250-ml contenant 50 ml de bouillon nutritif (Difco) . plus: 0,2 $ d'eitrait de levure (Difco) . avec .un prélèvement de.:la eulture- inclinée._la fiole estincubée 70 01015 6 2028289 sur une machine à secousses à 37°C pendant 18 - 24 heures. La culture est ajustée à une trarismittahce de 40 i» à une longueur d'onde de 660 mju, en utilisant un appareil Spectronic 20 de Bausch & Lomb par addition de 0,2 fe d'extrait de levure à la culture. 5 Le "bouillon non inoculé sert de témoin pour cette détermination. On utilise 30 ml de "bouillon ajusté pour inoculer 1 litre de milieu Comme milieu de titrage, on utilise de la gélose nutritive (Difco) plus 0,2 io d'extrait de levure (Difco). On prépare ce milieu on le stérilise par autoclavage et on le laisse refroi-10 dir jusqu'à 50°C. Après que le milieu a été inoculé, on en ajoute 10 ml à des boîtes de Pétri stériles et on laisse le milieu se solidifier. L'activité est exprimée en unités, une unité étant définie comme étant la concentration de l'antibiotique par ml qui, sur 15 un disque de papier de 12,7 mm donne un diamètre de zone de 28 mm. On emploie quatre concentrations de l'antibiotique pour la préparation de la courbe standard, à savoir 0,3, 0,4, 0,6 et 0,8 unités par ml, chaque concentration étant obtenue par dilution dans le tampon tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,05 M ajusté à pH 8,0. 20 Quatre disques sont placés sur chacune des cinq plaques pour la préparation de la courbe standard, chaque plaque contenant un disque de chacune des quatre concentration indiquées ci-dessus. Les plaques sont incubées pendant 18 heures à 37°C et on mesure les diamètres en mm des zones d'inhibition, On calcule un diamètre 25 moyen de zone, à partir de quoi on prépare une courbe standard sur un papier semi-log. La pente de la ligne obtenue est comprise entre 4 et 5. Les fioles de production sont titrées en diluant l'échantillon dans le tampon 0,05 molaire à pH 8 à une concentration 30 appropriée. L'organisme d'essai est Proteus vulgaris MB-838 et le milieu de titrage est la gélose nutritive plus 0,2 fi d'extrait de levure. Qu'on emploie ïe titrage par plaque à disque ou par plaque à cylindre, on verse de 10 à, 15 ml de milieu par plaque. Quand on utilise le procédé par plaque h disque, les disques sont 35 plongés dans, une solution de l'antibiotique, à 0,4 unités par ml et sont placés sur ia plaque en position alterne avec, les échantillons. Les plaques sont alors incubées, à 37?C pendant 18 heures et on détermine les diamètres de la zone en millimètres. Quand on 70 01015 7 2028289 emploie le procédé par plaque à cylindre on utilise parplaque 6 cylindres, 3 de l'échantillon et 3 de la solution témoin en alternant les solutions à essayer et les solutions témoins. La solution témoin contient 1 f /ml d'acide libre, On emploie cinq plaque stan-5 dard contenant 6 valeurs du standard allant de 0,25T /ml à 3,0 y/ml Le titre est déterminé au moyen d'un Homographe et les résultats sont reportés en unités ou gamma par millilitre. Une unité d'acide libre est égale à 2,8 T • L'antibiotique peut être purifié et récupéré par un grand 10 nombre de procédés. Dans l'un de ces procédés on absorbe l'antibiotique sur de l'alumine ; l'alumine basique ou lavée à l'acide convient pour cette purification. L'antibiotique absorbé peut être élué de l'alumine le plus commodément par des solutions aqueuses ou hydroalcooliques d'hydroxyde d'ammonium ayant un pH d'environ 15 11,2 et en recueillant l'éluat par fractions. La purification des fractions solides impures contenant le sel d'ammonium de l'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique peut aussi être effectuée en dissolvant le produit dans le méthanol, en ajoutant un volume égal de n-butanol, en chassant le méthanol par évaporation, en filtrant 20 l'insoluble dans le méthanol et en obtenant une solution butanoli-que contenant le sel d'ammonium de l'antibiotique de pureté accrue. Le sel d'ammonium peut être obtenu sous forme solide en évaporant la solution butanolique à sec sous pression réduite. En variante le sel d'ammonium peut être extrait de la solution butanolique avec 25 de l'eau pour obtenir une solution aqueuse du sel d'ammonium de l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique. Le sel de calcium de l'antibiotique est produit en ajoutant de l'hydroxyde de calcium à la solution aqueuse du sel d'ammonium et en chauffant la solution résultante sous pression réduite. On peut aussi obtenir 30 le sel de calcium en faisant passer une solution d'un autre sel de l'antibiotique sur une résine échangeuse de cationg sur le cycle calcium. Le sel de calcium cristallise de' solutions aqueuses ayant une concentration de 10 mg/ml par repos ou avec agitation. Ces procédés de purification sont décrits plus en détails dans la de-35 mande de brevet de Louis Chaiet déposée le 22 Janvier 1968 aux Etats-Unis d'Amérique sous le N° 699 377. L'acide libre est un solide cristallin blanc qui se décompose à 170°C. 70 01015 8 2028289 L'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des agents antimicrobiens utiles qui sont actifs pour empêcher la croissance des bactéries pathogènes gram-positives et gram-négatives• Cet antibiotique et particulièrement ses sels 5 sont actifs contre les pathogènes Bacillus. Escherichia. Staphy-lococci. Raimonel1 a et Proteus et leurs souches résistàntes aux antibiotiques. Des exemples de ces pathogènes sont Escherichia coli. Salmonella schottmuelleri. Halmnwal1 a gallinarum. Proteus vulgaris. Proteus mirabilis. Proteus morganii et Staphylococcus ^ aureus. Ainsi l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique et ses sels peuvent être utilisés comme agents antiseptiques pour éliminer les organismes nuisibles des appareillages pharmaceutiques dentaires et médicaux et dans d'autres lieux sujets à l'infection par de tels organismes. De même ils peuvent être utilisés pour 15 séparer certains organismes de mélanges de microorganismes. Les sels de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont aussi utiles dans le traitement de maladies causées par les infections bactériennes chez l'homme et les animaux et ils ont une valeur particulière dans ce domaine car ils sont actifs contre des sou- 20 ches résistantes de pathogènes. Ces sels sont particulièrement précieux car ils sont efficaces par voie orale bien qu'ils puissent aussi être administrés par voie parentérale; Les exemples non limitatifs suivants sont destinés à illustrer l'invention. 25 Exemple 1 A une culture inclinée sur gélose de Streptomyces fra-diae HRRL B-3360, on ajoute 10 ml de lait écrémé stérile. La suspension de lait écrémé est lyophilisée dans des tubes stériles individuels contenant 0,1 - 0,2 ml de la suspension et la culture 30 séchée par congélation est utilisée pour inoculer une fiole d'Er-lenmeyer de 250 ml à chicanes contenant 40 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante* : Milieu d'ensemencement Quantité 35 — : Farine d'avoine hydrolysat de levure HgS047H20 - 10 grammes 10 grammes 50 mg. 70 01015 9 2028289 Tampon phosphate * 2. ml» Eau distillée 1000 ml. pH =6,6 5 * Tampon phosphate : KH2P04 = = 91 grammes Fa2HP04 = 95 grammes eau distillée = 1000 ml. 10 La fiole d'ensemencement est incubée à 28°C pendant un jour sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ. On prépare huit fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant 15 chacune 50 ml de milieu ayant la composition suivante : Milieu de Production complexe Quantité 20 Avoine broyée Farine de soya Distillers solubles ascorbate de sodium Eau distillée 30,0 grammes 25,0 grammes 10,0 grammes 0,-5 gramme 1000 ml. 25 ph = 6,5 On ajoute alors aux fioles une solution aqueuse de citrate de sodium pour obtenir une concentration finale en citrate de sodium comme indiqué dans le tableau qui suit. Ces fioles sont 30 stérilisées, refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme indiqué ci-dessus» Les fioles inoculées sont incubées à 28°C sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ. Une fiole est retirée après trois jours ; une autre fiole est retirée après incubation de 4 jours. 35 Les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8500 t/mn pendant 10 mn et le bouillon est séparé par décantation-des solides. Les bouillons, surnageants sont titrés en utilisant Prateus vulgaris MB-838 comme.organisme d'essai. Les titres des bouillons obtenus 70 01015 to •2028289 après incabation de 3 et 4 jours sont indiqués ci-après : 0. Milieu Citrate de sodium, 2H2Q g/l Antibiotique unités/al 3 jours 4 jours Base de production complexe 0 2,3 2,4 n 1,0 2,6 2,2 H 2,0 2,7 2,4 n 4,0 3,7 2,9 Augmentation totale 58 * 21 % 10 20 Exemple 2 la production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phos-15 phonique est conduite comme dans l'exemple 1 • On a obtenu, les résultats suivants : A. Milieu Citrate de sodium, 2H20 g/l Antibiotique unités/ml 3 jours 4 jours Base de production complexe 0 2,1 2,5 ft 1,0 2,7 2,3 19 2,0 3,0 2,9 « 4,0 3,6 3,6 n 8,0 4,1 4,1 Augmentation totale 95 % 64 * 25 Exemple 3 30 , Une cuillerée de cellules venant d'une culture inclinée sur gélose de Streptomyces fradiae NRRL B-3360 ayant la composition suivante : 35 Milieu de culture inclinée Quantité Amidon de maïs A'spaïagine E^P04 - 10,0. grammes t,0 gramme. t,0 gramme 70 0T0Î5 n 2028289 10 ïï20 1000 al. pH = 7,0 est utilisée pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer à chicanes de 250 ml contenant 40 ml de milieu d'ensemencement ayant la composition suivante : Milieu d'ensemencement Quantité 15 Amidon de maïs Asparagine KJBP0. h2O 10,0 grammes 1,0 gramme 1,0 gramme 1000 ml. pH = 7,0 20 25 30 35 La fiole inoculée est incubée à 28°C pendant 2 jours sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ. On prépare six fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant chacune 30 ml de milieu ayant la composition suivante : Ç. Milieu de production chimiquement défini Quantité Amidon de maïs K2hpo4 ascorbate de sodium citrate de sodium FeS04,7H20 micro éléments mélange N° 2 * NaCl MgS04,7H20 CaCl2,2H20 Bacto-asparagine D-L méthionine glutamate monosodique 20 grammes 0,5 gramme 0,5 gramme 1,0 gramme. 0,03 gramme 10 ml. 0,3 gramme 0,2 gramme 0,5 gramme 5,0 grammes 1,0 gramme 1,0 gramme 70 01015 12 2028289 Concentré de vitamines mélangées ** Eau distillée 5»0 ml. 1000 ml. pH = 6,8 - 7,0 Formule des micro éléments, mélange Mf° 2 : 20 10 î'eS04,7H20 MnS04,4H20 CuC12H20 CaCl2 15 H,B0, j 3 (NH4)6M07024,4H20 ZnS04,7H20 Eau distillée 1,0 gramme 1,0 gramme 25 mg. 100 mg. 56 mg. 19 mg. 200 mg. 1000 ml. ** Formule du concentré de vitamines mélangées Vitamine 25 pantothenate de calcium B2(Riboflavine) Bg(Pyridoxine) Bg(Pyridoxal) Kiacine 30 Acide p-aminobenzoïque Biotine B12 B.j (thiamine) Eau distillée 35 Poids 200 mg. 200 mg. 200 mg. 200 mg. 200 mg. 20 mg. 1*5 mg. 0,4 mg. 200 mg. 1000 ml. Une solution aqueuse de citrate de sodium est alors ajoutée aux fioles pour donner une concentration finale en citrate de sodium comme indiqué dans le tableau qui suit. Ces fioles sont stérilisées 70 01015 iï 2028289 refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme indiqué précédemment» les fioles inoculées sont incubées à 28°C sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ et une fiole est retirée après une 5 incubation de 3 jours et une autre après une incubation de quatre jours, les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8500 t/mn pendant 10 minutes et le bouillon est séparé par décantation des solides. les bouillons sont titrés en utilisant Proteus vulgaris comme organisme d'essai, les titres des bouillons après incubation 10 de 3 et 4 jours sont indiqués ci-après : D. Citrate de sodium Antibiotique Milieu 2H20 g/l unités/ml 3 jours 4 jours 15 Base de production chimiquement définie 1,0 2,0 4,0 0,59 0,56 2,46 2,99 3,97 4,11 II 19 20 Une unité équivaut à 2,8 jU g/ml d'acide libre l'addition de citrate de sodium multiplie l'activité par 6-7 quand la concentration passe de 1 à 4 g/l. 70 01015 14 2028289 REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl )phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux dans des 5 conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute du citrate au milieu nutritif sous la forme d'un composé de citrate pour augmenter la production dudit antibiotique. 2 - Procédé selon la revendication t caractérisé en ce 10 que le microorganisme est un Streptomyces. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du citrate en quantité équivalant à environ 0,65 à 5»2 grammes par litre de milieu. 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce 15 que le milieu nutritif contient du citrate en quantité équivalant à environ 1,0 à 8,0 grammes par litre de milieu quand il est ajouté sous la forme de citrate de sodium. 5 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1.2-épo-xypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme 20 producteur de cet acide dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé ,on ce qu'on ajuste la teneur en citrate du milieu de fermentation par addition d'un composé de citrate jusqu'à réaliser une concentration subs-25 tantiellement non toxique en citrate supérieure à 0,5 g/l. 6 - Procédé selon la revendication 5* caractérisé en ce que le microorganisme est un Streptomyces. 7 - Procédé de préparation de l'acide (-)(çis-1,2-époxy-propyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme pro- 30 ducteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute du citrate au milieu nutritif sous la forme d'un composé de citrate et on isole l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique du 35 bouillon de fermentation résultant. 8 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le microorganisme est un Streptomyces. 9 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce 70 01015 15 2028289 que le milieu nutritif contient du citrate en quantité équivalant à environ 0,65 à 5,2 grammes par litre de milieu. 10 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du citrate en quantité équivalant 5 à environ 1,0 à 8,0 grammes par litre de milieu quand il est ajouté sous forme de citrate de sodium. 11 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces fradiae. 12 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce 10 que le Streptomyces est une souche de Streptomyces wedmorensis» 13 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces viridochromo-genes. 14 - Procédé de préparation de l'acide (-) (çis-1,2-15 époxypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un Streptomyces producteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute du citrate au milieu nutritif sous la forme d'un composé 20 de citrate pour augmenter la production dudit antibiotique. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces fradiae. 16 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces wedmorensis. 25 17 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces viridochro-mogenes.