Brevet FR2027926A1 — publié le 19701002

La,présente invention concerne la production d'un antibiotique connu chimiquement comme étant l'acide (-) (cis-1,2- époxypropyi.) phosphonique et en particulier un procédé perfectionné pour la production de l'antibiotique par fermentation de milieux nutritifs avec des souches convenables de microorganismes comme, par exemple, des strentomsces. L'antibiotique est produit pendant la fermentation aérobie de milieux nutritifs aqueux appropriés dans des conditions contrôldes. Des milieux aqueux comme ceux qu'on utilise pour la production d'autres antibiotiques-contiennent pour la production de l'acide (-) (cis-i,2-époxypropgl)phosphonique. De tels milieux contiennent des sources de carbone et d'azote qui sont assimilables par le microorganisme, et des sels minéraux. En outre, les milieux de fermentation contiennent des traces de métaux qui sont communément apportées comme impuretés par les autres constituants du milieu.D'une façon générale des hydrates de carbone comme des sucres par exemple du dextrane, du maltose, du galactose, du glucose et autres et des amidons comme des céréales, par exemple de l'avoine et du seigle, de l'amidon de maIs, de la farine de malts et analogues, peuvent btre utilisés soit seuls, soit en association comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quantité exacte de la ou des sources d'hydrates de carbone utilisée dans le milieu dépend en partie des autres ingrédients du milieu. On a trouvé toutefois qu'une quantité d'hydrate de carbone comprise entre environ 1 et 6% en poids du milieu est suffisante. On peut employer une seule source de carbone ou bien on peut associer dans le milieu plusieurs sources de carbone. Des sources d'azote satisfaisantes comprennent les innombrables matériaux protéiques comme les différentes formes dthydrolysats de caséine, la farine de soja, la liqueur de trempage de mais, les "distillers'solubles", les hydrolysats de levure, la pâte de tomates et analogues. Les diverses-sources d'azote peuvent être utilisées seules ou en association et sont utilisées dans des proportions allant de 0,2 à 6% en poids du milieu aqueux. On forme l'acide (-) (cis-1,2-époxypropylyphosphonique en cultivant, dans des conditions contrôlées, des souches de microorganismes comme par exemple, les souches du genre Streptomsces qui produisent l'antibiotique. Un de ces microorganismes, isolé du sol, a reçu la désignation MA-2898 dans la collection de cultures de Nerok & Co.,lnc.,Rahway, New Jersey ; des sous-isolés de la culture parente ont reçu les désignations MA-2911, MA-2912 et M & 2913. Ces cultures ont été placées en dépôt permanent dans la collection de cultures de la Northern Utilization Research & Development Branch de l'United States Department of Agriculture à Peoria, Illinois et ont reçu les numéros de culture NRRL B-3357, NRRL-B-3358, NRRL B-3359 et NRRL B-3360 respectivement. Ces microorganismes ont été classés dans l'espèce Streptomyces fradiae. L'antibiotique est aussi produit en cultivant, dans des conditions contrôlées, d'autres souches de Streptomyces également isolées du sol et identifiées dans la collection de Merck & Co., Zinc. sous les références de cultures MA-2867, MA-2903, MA-2916, MA-2917, MB-3270, N & 3272 et MA-3267. Ces cultures ont été classées comme membres de l'espèce Strewtomyces viridochromogenes. Les cultures MA-2903, NA-2867, MB-2916, MA-2917 et MA-3270 ont été placées en dépôt permanent à la Northern Utilization Research & BR Development Division de l'United States Department of Agriculture et ont reçu les numéros de culture NRRL-3413, NRRL-3414,NRRL-3415, NRRL-3416 et NRRL-3427 respectivement. La culture M & 3269 a été assignée à l'espèce StrePtomyés wedmorensw et a reçu le numéro NRRL-3426. Outre les espèces ci-dessus de microorganismes, on envisage aussi l'emploi d'autres microorganismes y compris des souches de Streptomyces soit isolées de la nature, soit obtenues par mutation de ces organismes comme celles obtenues par sélection naturelle ou celles -obtenues par des agents de mutation comme, par exemple l'irradiation aux rayons X, l'irradiation ultraviolette, les moutardes à l'azote et analogues. En raison de la difficulté inhérente de séparation de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique pur de grandes quantités d'impuretés dans le bouillon de fermentation, il est très important de trouver un moyen d'augmenter la concentration de l'antibiotique par rapport aux solides totaux du bouillon. La demanderesse a déterminé que l'addition de phosphore à des milieux de fermentation organiques complexes et chimiquement définis augmente la production d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl) phosphonique. Par"milieux organiques complexes" on entend les milieux dans lesquels certains des ingrédients ne sont pas définis chimiquement. Un exemple de ces milieux est un milieu constitué par des produits d'avoine broyés, de la farine de soja, du citrate de sodium, du polyglycol et des distillers solubles. Par "milieux chimiquement définis" on entend des milieux dans lesquels tous les ingrédients sont chimiquement définis. Un exemple de ces milieux est un milieu consistant en-amidon-de maSs, phosphate acide de potassium, citrate de sodium, asparagine, méthionine, glutamate monosodique, sulfate de magnésium et sulfate ferrique.La quantité de phosphore nécessaire pour stimuler la production de l'antibiotique dépend du milieu employé. On a observé une certaine production de l'antibiotique dans des milieux contenant jusqu'à 10,0 gil de CaIlPO4 comme source de phosphore. On préfère toutefois utiliser l'équivalent d'environ 0,1 g/l à environ 1,0 g/l de phosphore pour obtenir une bonne production de l'antibiotique. L'addition de phosphore à un milieu composé d'agents nutritifs organiques complexes augmentera la production d'acide (-) (cis-1,2-époxypro- pyl)phosphonique de 30-60So quand le phosphore présent est fourni par addition de 0,2 à 0,4 g de phosphore par litre. En conséquence, dans un milieu chimiquement défini ou synthétique, l'addition d'une source de phosphore a augmenté la -production d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)-phosphonique de moins de 3jk g1ml à environ 41 * g/ml. Le phosphore peut être ajouté sous forme métallique, mais on préfère ajouter le phosphore sous forme d'un composé de phosphore, de préférence un sel minéral, comme le-phosphate acide de potassium, le phosphate acide de sodium ou le phosphate acide de calcium. Des composés organiques comme l'acide phosphoglycérique, l'acide 2-aminoéthylphosphonique, le glucose-l-phosphate, le glucose-6-phosphate et l'inosinate disodique peuvent aussi être employés comme source de phosphore. Le phosphore peut aussi être ajouté sous forme d'un sel ou complexe de phosphore rencontré dans la nature, comme il peut s'en trouver-dans des agents nutritifs microbiens qui sont riches en phosphore. Les agents nutritifs usuels comprennent une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable, des sels minéraux et des facteurs de croissance si nécessaire. L'addition de phosphore aux milieux de fermentation contenant d'autres microorganismes qui sont capables de produire l'acide (-) (cis-1 , 2-époxypropyl)phosphonique est aussi envisagée. Pour monter que l'activité accrue est due à la présence de phosphore, la fermentation a été aussi conduite en présence d'autres sels comme le chlorure de sodium ou de potassium. Dans chaque cas il n'y a eu augmentation d'activité qu'après addition d'une source de phosphore. Bien que le nouvel antibiotique selon l'invention soit produit aussi bien en culture en surface qu' en culture submergée, on préfère actuellement conduire la fermentation en culture submergée. Des fermentations à petite échelle sont réalisées de façon commode en plaçant des quantités convenables de milieu nutritif dans des fioles, en stérilisant les fioles et leur contenu par chauffage à 1 200C, en inoculant les fioles soit par des spores, soit par une culture végétative d'un microorganisme produisant l'acide (-) (ci3-1,2-époxypropyl) phosphonique, comme par exemple une souche de Strewtomvees, en bouchant les cols des fioles avec du coton et en laissant la-fermentation se produire alune température constante d'environ 280C sur un agitateur pendant 3 - 5 jours. Pour la fabrication à plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des cuves appropriées munies d'un agitateur et de dispositifs pour aérer le milieu de fermentation. Dans ce procédé, le milieu nitritif est préparé dans la cuve et est stérilisé par chauffage à 1200C. Après refroidissement, le milieu stérilisé est inoculé avec'une source convenable de culture cellulaire végétative du microorganisme et on laisse se poursuivre la fermentation pendant 2 - 4 jours en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 280C environ. Cette méthode de production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl) phosphonique convient particulièrement à la production de grandes quantités de l'antibiotique. La fermentation utilisant un microorganisme qui produit l'acide (-) (cis-1,2-épopypropyl)phosphonique peut être conduite à des températures situées entre environ 20 et 400 C. Pour obtenir les meilleurs résultats, toutefois, il est mieux de conduire les fermentations à des températures comprises entre 26 et 300C, Le pH des milieux nutritifs qui convient pour cultiver le microorganisme et produire l'antibiotique peut varier entre environ 5,0 et 9,0. Toutefois, l'intervalle de pH préféré est d'environ 6,0 à 7,5. Pour mettre en oeuvre le procédé de fermentation, on prépare une suspension de cellules par addition de milieu stérile à une culture inclinée sur gelose d'un organisme produisant de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. On utilise alors une culture de la culture inclinée pour inoculer une fiole d'ensemencement et la fiole d'ensemencement est agitée à 280C environ pendant 1 à 3 jours pour obtenir une bonne croissance. La fiole d'ensemencement est alors utilisée pour inoculer les fioles de production. La fiole d'ensemencement peut aussi être inoculée par une culture lyophilisde ou par un inoculum congelé. L'inoculation est en général réalisée en utilisant environ 1 ml par 30 ml de milieu de production contenant la concentration désirée en phosphore. On laisse la fermentation se poursuivre pendant 2 - 4 jours en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 280C environ. Toutes les fioles de production, c'est à dire celles qui contiennent le phosphore ajouté et les fioles utilisées comme témoins sont alors titrées, généralement après 3 - 4 jours, pour déterminer la quantité d'antibiotique contenue dans chaque fiole. L'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique est titré de façon commode par un procédé disque-plaque utilisant Proteus vulgaris MB-838 (BTCC 21100 et NRRL B-336t comme organisme d'essai. La culture d'essai est maintenue sous forme d'une culture inclinée sur gélose nutritive (Difeo) plus 0,2su d'extrait de levure (Difoo)O Les cultures inclinées inoculées sont incubées à 370C pendant 18 24 heures et conservées aux températures du réfrigérateur pendant une semaine, des cultures franches étant préparées chaque semaine. On prépare l'inoculum pour les plaques de titrage chaque jour en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de bouillon nutritif (Difco) plus 0,2% d'extrait de levure (Difco) avec un prélèvement de la culture inclinée. La fiole est incubée sur une machine à secousses à 370C pendant 18 - 24 heures. La culture est ajustée à une transmittanse de 400 à une longueur d'onde de 660 my' en utilisant un appareil Spectronic 20 de Bausch & Lomb par addition de 0,2% d'extrait de levure à la culture. Le bouillon non inoculé sert de témoin pour cette détermination. On utilise 30 ml de bouillon ajusté pour inoculer 1 litre de milieu. Comme milieu de titrage, on utilise de la gelose nutritive (Difco) plus 0,2% d'extrait de levure (Difco). On prépare ce milieu on le stérilise par autoclavage et on le laisse refroidir jusqu'à 5O0C. Après que le milieu a été inoculé, on en ajoute 10 ml à des boTtes de Petri stériles et on laisse le milieu se solidifier. L'activité est exprimée en unités, une unité étant définie comme étant la concentration de l'antibiotique par ml qui, sur un disque de papier de 12,7 mm, donne un diamètre de zone de 28 mm. On emploie quatre concentrations de l'antibiotique pour la préparation de la courbe standard, à savoir 0,3, 0,4, 0,6 et 0,8 unités par ml, chaque concentration étant obtenue par dilution dans le tampon tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,05 # X ajust à pH 8,0. Quatre disques sont placés sur chacune des cinq plaques pour la préparation de la courbe standard, chaque plaque contenant un disque de chacune des quatre concentrations indiquées ci-dessus. Les plaques sont incubées pendant 18 heures à 370C et on mesure les diamètres en mm des zones d'inhibition. On calcule un diamètre moyen de zone, à partir de quoi on prépare une courbe standard sur un papier semi-log. La pente de la ligne obtenue est comprise entre 4 et 5. Les fioles de production sont titrées en diluant l'échantillon dans le tampon 0,05 molaire à pH 8 à une concentration appropriée. L'organisme d'essai est Proteus vulgaris N2L838 et le milieu de titrage est la gélose nutritive plus 0,2% d'extrait de levure, Qu'on emploie le titrage par plaque à disque ou par plaque à cylindre, on verse de 10 à 15 ml de milieu par plaque. Quand on utilise le procédé par plaque à disque, les disques sont plongés dans une solution de l'antibiotique à 0,4 unités par ml et sont placés sur la plaque en position alterne avec les échantillons. Les plaques sont alors incubées à 370C pendant 18 heures et on détermine les diamètres de la zone en millimètres. Quand on emploie le procédé par plaque à cylindre on utilise par plaque 6 cylindres, 3 de l'échantillon et 3 de la solution témoin en alternant les solutions à essayer et les solutions témoins. La solution témoin contient 1 r /ml d'acide libre. On emploie cinq plaques standard contenant 6 valeurs du standard allant de 0,25 t /ml à 3,0 t /ml. Le titre est déterminé au moyen d'un Normographe et les résultats sont reportés en unités ou gamma par millilitre. Une unité d'acide libre est égale à 2,8 T L'antibiotique peut être purifié et récupéré par un-grand nombre de procédés. Dans l'un de ces procédés on absorbe l'antibiotique sur de l'alumine ; l'alumine basique ou lavée à l'acide convient pour cette purification.L'antibiotique absorbé peut etre élué de l'alumine le plus commodément par des solutions aqueuses ou hydroalcooliques d'hydroxyde d'ammonium ayant un pH d'environ 11,2 et en recueillant l'éluat par fractions0 La purification des fractions solides' impures contenant le sel d'ammonium de l'acide (-) (cis-1,2-épotypropyl)phosphonique peut aussi être effectuée en dissolvant le produit dans le méthanol, en ajoutant un volume égal de n-butanol, en chassant le méthanol par évaporation, en filtrant l'insoluble dans le méthanol et en obtenant une solution butanolique contenant le sel d'ammonium de l'antibiotique de pureté accrue. Le sel d'ammonium peut être obtenu sous forme solide en dvaporant la solution butanolique à sec sous pression réduite. En variante le sel d'ammonium peut être extrait de la solution butanolique avec de l'eau pour obtenir une solution aqueuse du sel d'ammonium de l'acide (-) (eis-1,2-époxypropyl)phosphonique. Le sel de calcium de l'antibiotique est produit en ajoutant de l'hydroxyde de calcium à la solution aqueuse du sel d'ammonium et en chauffant la solution résultante sous pression réduite. On peut aussi obtenir le sel de calcium en faisant passer une solution d'un autre sel de l'antibiotique sur une résine échangeuse de cations sur le cycle calcium. Le sel de calcium cristallise de solutions aqueuses ayant une concentration de 10 mg/ml par repos ou avec agitation. Ces procédés de purification sont décrits plus en détails dans la demande de brevet de Louis Chaiet déposée le 22 Janvier 1968 aux Etats-Unis d'Amérique sous le NO 699 377. L'acide libre est un solide cristallin blanc qui se décompose à 17O0C. L'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des agents antimicrobiens utiles qui sont actifs pour empêcher la croissance des bactéries pathogènes gram-positives et gramnégatives. Cet antibiotique et particulièrement ses sels sont actifs contre les pathogènes Bacillus, Escherichia, Staphylococci, Salmonella et Proteus et leurs souches résistantes aux antibiotiques.Des exemples de ces pathogènes sont Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Salmonella gallinsrum. Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganii et Staphvlococcus aureusO Ainsi l'acide (-) (ci3-1,2-6po2ypropyl)pho phonique et ses sels peuvent être utilisés comme agents antiseptiques pour éliminer les organismes nuisibles des appareillages pharmaceutiques, dentaires et médicaux et dans d'autres lieux sujets à l'infection par de tels organismes.De même il peuvent être utilisés pour séparer certains organismes de mélanges de microorganismes0 Les sels de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont aussi utiles dans le traitement dé maladies causées par les infections bactériennes chez l'homme et les animaux et ils ont une valeur particulière dans ce domaine car ils sont actifs contre des souches résistantes de pathogènes. Ces sels sont particulièrement précieux car ils sont efficaces par voie orale bien qu'ils puissent aussi être administrés par voie parentérale. Les exemples non limitatifs qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Exemple 1 Effet de l'addition de phosphore dans un milieu chimiquement défini Une culture inclinée sur gélose de StrePtOmyCeS fradiae NRRL B-3360 ayant la composition suivante Milieu de la culture inclinée Quantité Amidon de maSs 10,0 g Asparagine 1,0 g S2HP04 1,0 g Gélose 20,0 g H20 du robinet 1000 ml. pH = 7,0 est utilisée pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer à chicanes de 250 ml contenant 40 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante Milieu d'ensemencement Quantité Amidon de mals 20,0 g E2HP04 0,3 g Citrate de sodium 4,0 g Bacto-asparagine 5,0 g D L méthionine 1,0 g glutamate monosodique 1,0 g CaCl2, 2H2O 0,5 g MgSO4, 7H2O 0,2 g FeSO4, 7H2O 0,01 g micro éléments mélange N0 2 * 10 ml H20 distillée 1000 ml. pH = 7,1 Récipient et volume : 40 ml dans une fiole à chicanes de 250 ml. *Micro éléments mélange N02 Formule Concentration FeSO4, 7H20 1,0 g MnS04,4H20 1,0 g CuCl2,H2O 25 mg CaCl2 100 mg H3BO3 56 mg (NH4)6Mo7024,4H20 19 mg ZnSO4,7H20 200 mg H20 distillée 1000 mlO La fiole d'ensemencement est incubée à 280C pendant 2 jours sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ. On prépare douze fioles d'Erlenmeyer de 250 mi contenant chacune 30 ml de milieu ayant la composition suivante Milieu de Production Quantité Amidon de mais 20,0 g citrate de sodium 4,0 g Bacto-asparagine 5,0 g DL méthionine 1,0 g glutamate monosodique 1,0 g CaCl2,2H20 0,5 g MgSO4,7H20 0,2 g FeSO4 , 7H20 0,01 g CoC12,6H20 0,1 g H2O distillée 1000 ml. pH = 7,1 Récipient et volume : 30 ml./ fiole de 250 ml. On ajoute alors une solution aqueuse de K2HP04 à la fiole pour donner une concentration finale de K2HP04 dans chaque fiole comme indiqué dans le tableau qui suit. Les fioles sont alors stérilisées refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme indiqué plus haut. Les fioles inoculées sont incubées à 280C sur un agitateur rotatif avec une course de 50 mm environ tournant à 220 t/mn. Une fiole est retirée après trois jours ; une autre fiole est retirée après incubation de quatre jours. Les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8500 t/mn pendant dix minutes et le bouillon est séparé des solides par décantation. Les bouillons surnageants sont titrés en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essai. Les titres des bouillons obtenus après incubation de trois et quatre jours sont indiqués ci-après : G./l pH estimation libre Milieu de croissanoe 2H2 4 3jours 4 jours 3 jours 4 jours 3 jours 4Jous base de production 0 8,4 8,4 + 2 + 2 " 0,2 8,0 8,5 + 3 + 3 " 0,5 8,8 9,0 + 3 + 3 8,1 7,7 " 1,0 9,1 9,1 + 3 + 3 27,5 26,8 " 2,0 9,0 9,0 + 3 + 3 26,5 27,6 Exemple 2 La production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique est conduite comme indiqué dans l'exemple lo Une culture sur gélose est utilisée pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer à chicanes de 250 ml contenant 40 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante : Milieu d'ensemencement Quantité Amidon de mais 20,0 g K2HPO4 0,5 g citrate de sodium 4,0 g Bacto-asparagine 5,0 g D L méthionine 1,0 g glutamate monosodique 1,0 g CoC12,6H2O 0,1 g CaCl2,6H2O 0,5 g MgSO4,7H2O 0,2 g Micro éléments mélangé N 2 * 10 ml H2O distillée 1000 ml. * Comme dans l'exemple 1. la fiole d'ensemencement est incubée à 28 C pendant 2 jours sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mmO On prépare quatre fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant chacune 30 ml de milieu ayant la composition suivante Base de Production Quantité Amidon de maTs 20,0 g E2HP04 0,5 g citrate de sodium 4,0 g Bacto-asparagine 5,0 g D L méthionine 1,0 g glutamate monosodique 1,0 g CoCl2, 6H20 0,1 g CaCl2,6H20 0,5 g MgSO4,7H2O 0,2 g micro éléments mélangé N 2.* 10 ml. H2O distillée 1000 ml. * Comme dans l'exemple 1 A deux des fioles on ajoute une solution aqueuse de KCl à 0,45 g/l. A deux autres fioles on ajoute une solution aqueuse de K2HP04 à 0,5 g/l. À chacune des fioles, on ajoute une solution aqueuse de E2HP04 pour obtenir une concentration finale en E2HP04 comme indiqué dans le tableau ci-après. Ces fioles sont stérilisées, refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme décrit précédemment. Les fioles inoculées sont incubées à 280C sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm. Une fiole est retirée après trois jours une autre fiole est retirée après incubation de quatre jours. Les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8500 t/mn pendant dix minutes et le bouillon est séparé des solides par décantation. Les bouillons surnageants sont titrées en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essai. Les titres des bouillons obtenus après incubation de 3 et 4 jours sont indiqués ci-après g./l. addition g./l. g./l. pH estimation acide de croissan- libre en#/ml K2HPO4 ce milieu KCL K2HPO4 total 3 jours 3 jours 3 jours 4 jours base de production 0,45 0 0,5 9,0 + 3 5,6 6,7 " 0 0,5 1,0 9,1 + 3 26,0 28,0 KCl 0,45 g./l. # = 0,236 g./l. K K2HPO4 0,5 g./l. # = 0,224 g./l. K L'activité obtenue-en augmentant la concentration en E2HP04 de 0,5 à 1,0 g/l est due au phosphate ajouté plutôt qu'au potassium car la même teneur en potassium obtenue avec KCl ne donne pas le rendement maximum en antibiotique. Exemple 3 La culture, la culture inclinée, le milieu d'ensemencement et le mode opératoire utilisés pour la production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans l'exemple 1 sont employés dans l'exemple qui suit pour montrer l'effet de l'addition de phosphate à un milieu défini chimiquement0 L'effet de la présence soit du chlorure de sodium, soit du chlorure de potassium dans le milieu de production de l'antibiotique a été aussi déterminé. Les résultats de titrage du bouillon obtenu après incubation de 3 et 4 jours sont indiqués ci-après Autres sels Addition de Estimation acide libre Milieu phosphate de crois- ug./ml. 1,0 g./l Type g./l 3 jours 4 jours 3 jours 4 jours Base de production O E2HP04 1,0 + 3 + 3 24,2 23,9 n NaCl K2HPO4 0 + 2 + 2 3y 3 r n NaCl E2HP04 0,1 + 2 1/2 +3 3r 3r n NaCl E2HP04 0,5 + 3 + 3 10,1 10,6 n NaCl E2HP04 1,0 + 3 + 3 25,4 24,6 " NaCl E2HP04 2,0 + 3 + 3 26,8 24,7 " KCl K2HPO4 1,0 + 3 + 3 25,4 26,5 " KCl Na2HPO4 0 + 2 + 2 3# 3# " KCl Na2HPO4 0,1 +2 1/2 + 3 3# 3# base de Production KCl Na2HPO4 0,5 + 3 +3 21,3 20,2 " KCl Na2HPO4 1,0 + 3 + 3 24,2 27,4 " KCl Na2HPO4 2,0 + 3 + 3 23,5 - Exemple 4 La culture, la culture inclinée, les milieux d'ensemencement et le mode opératoire utilisés dans l'exemple 1 sont employés dans l'exemple qui suit pour démontrer l'effet de l'addition au milieu de production de CaHPO4 sur la production de l'a- cide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. Les titrages des bouillons obtenus après 3 et 4 jours d'incubation sont indiqués ci-après CaHP04 Autres sels Estimation Acide libre Milieu ajouté ajouté à la de la Milieu base de pro- croissance duction g./l g./l pH Fg/ml Base de KCl production 1,0 1,0 9,0 + 3 33,0 n EC.l 2,0 1,0 9,0 + 3 33,6 " KCl 5,0 1,0 9,0 + 4 40,9 n XCI 10,0 1,0 9,1 +4 41,4 Exemple 5 On opère encore dans les conditions de l'exemple 1 dans l'exemple qui suit pour démontrer l'effet de l'addition au milieu de production de diverses sources organiques de phosphore sur la production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. Les titrages des bouillons obtenus après incubation de 3 et 4 jours sont indiqués ci-après. Les sources de phosphore sont ajoutées à des concentrations équivalant au phosphore dans 1,0 et 2,0 g/l de E2HPO : Source de Autres sels Estimation phosphore Quantité ajoutés à de crois- Acide libre ajoutée la base de sance production g./l g./î. pH pg/ml. Fructose1,6-di phosphate 1,65 KCl 1,0 9,0 + 3 24,5 Fructose1,6-di- phosphate 3,3 KCl 1,0 8,9 + 3 22,5 Acide phosphoglycerique 1,85 KCl 1,0 9,1 + 3 14,3 Acide phosphoglycerique 3,7 KCl 1,0 9,1 + 3 19,6 Acide 2-aminoéthylphosphonique 0,65 ECl 1,0 8,9 + 3 17,0 Acide 2-amino éthyl- phosphonique 1,3 KCl 1,0 8,9 + 3 18,7 glucose-1 phosphate 2,1 KCl 1,0 9,0 + 3 19,9 glucose-1- phosphate 4,2 KCl 1,0 9,0 + 3 21,8 glucose-6phosphate 1,7 KCl 1,0 9,0 + 3 18,5 glucose-6phosphate 3,4 KCl 1,0 9,1 + 3 23,5 inosinate disodique 2,35 KCl 1,0 9,2 + 3 14,4 inosinate disodique 4,7 KOl 1,0 9,2 + 3 21,2 Exemple 6 A une culture inclinée sur gélose de StrePtomyces fradiae NRRL B-3360, on ajoute 10 ml de lait écrémé stérile. La suspension de lait écrémé est lyophilisée dans des tubes individuels stériles contenant 0,1 - 0,2 ml de la suspension et la culture séchée par congSlation est utilisée pour inoculer une fiole d'2rlenmeyer à chicanes de 250 ml contenant 40 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante : Milieu d'ensemencement Quantité Amidon de Maïs 10 g hydrolysat de levure 10 g MgS04,7H20 50 mg Tampon phosphate * 2 ml H2O distillée 1000 ml pH = 6,6 * Tampon phosphate :: KH2PO4 91 g Na2HP04 95 g Eau distillée 1000 ml La fiole d'ensemencement est incubée à 280C pendant 1 jour sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ. On prépare quatre fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant chacune 30 ml de milieu ayant la composition suivante Milieu de production Quantité Avoine broyée 20,0 g Farine de soya 15,0 g citrate de sodium 4,0 g CoCl2.6H2O 0,1 g H2O distillée 1000 ml Polyglycol 2000 (ajoute' directement aux fioles) 0,5% pH = ajusté à 6,5 On ajoute alors aux fioles une solution aqueuse de K2HPO4 pour avoir une concentration finale en K2HPO4 comme indiqué dans le tableau qui suit. Ces fioles sont stérilisées, refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme décrit précédemment. Les fioles inoculées sont incubées à 280C sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ.Une fiole est retirée après trois jours ; une autre fiole est retirée après une incubation de quatre jours. Les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8500 t/mn pendant dix minutes et on décante les solides du bouillon. Les liquides surnageants sont titrés en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essai. Les titrages des bouillons obtenus après incubation de 3 et 4 jours sont indiqués ci-après Milieu E2HP04 Acide libre - -r 3 3 jours 4 jours base de production 0 29,7 29,3 base de production 2,0 33,6 37,5 augmentation % 30% 28% Exemple 7 La production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phos- phonique est réalisée comme décrit dans l'exemple 6. On obtient les résultats suivants Milieu X2HPO4 Acide libre pg./ml g./l 3 jours 4 jours base de production 0 21,7 24,8 base de production 2,0 34,7 31,4 augmentation % + 62% 21% REVBEDICATIONS 1 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1,2époxypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute du phosphore au milieu nutritif sous la forme d'un composé du phosphore pour augmenter la production didit antibiotique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est un streDtoxYces. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du phosphore en quantité équivalant à environ 0,10 à 1,0 g par litre de milieu. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du phosphore en quantité équivalant à environ 0,50 à 5,0 g par litre de milieu quand il est ajouté sous forme de phosphate acide de potassium. 5 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1 '2- époxypropylphosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajuste la teneur en phosphore du milieu de fermentation jusqu' obtenir une quantité substantiellement non toxique de phosphore en excès de 0,04 g par litre de milieu. 6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le microorganisme est un Streptomsces, 7 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1,2 épopypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans le milieu, caractérisé en ce quton ajoute du phosphore au milieu nutritif sous la forme d'un composé du phosphore et on isole l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique du bouillon de fermentation résultant. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le microorganisme est un Strentomyces. 9 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du phosphore en quantité équivalant à environ 0,10 à 1,0 g par litre de milieu. 10 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du phosphore en quantité équivalant à environ 0,50 à 5,0 g par litre de milieu quand il est ajouté sous la forme de-phosphate acide de potassium. 11 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le StreptomYces est une souche de Stretomyces fradiae. 12 - Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le StrePtomyces est une souche de StrePtomYces wedmorensis. 13 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le Streptoxvees est une souche de Streptomyces viridochromogenes. 14 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1,2époxypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un strePtomvees producteur dudit acide dans un milieu nutritif aqueux jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute du phosphore au milieu nutritif sous la forme d'un compost de phosphore pour augmenter la production dudit antibiotique. 15 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Stretomvces est une souche de Strewtomvcess fradiae 16 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces wedmorensis. 17 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces viridochro mogenes.