Brevet FR2034465A1 — publié le 19701211

t -1- 2034465 La présente invention concerne des matières radio-actives et, plus particulièrement, des matières radio-actives et des compositions servant à des fins de diagnostic. L'inuline est un poly-saccharide dont le poids moléculai-5 re est approximativement égal à 5000, ë"t ce composé consiste en quelque 30 à 35 motifs d§£ructose reliés extrémité à extrémité pour former une chaîne droite, la principale utilisation médicale de ce composé est la mesure de la vitesse de filtration glomérulaire (Y.F.G.) qui peut servir d'indice du fonctionnement 10 des reins. On comprendra que l'inuline est injectée dans le courant sanguin et, étant physiologiquement inerte, elle est facilement filtrée par les reins pour passer sans changement dans l'urine. la quantité d'inuline contenue dans l'urine a normalement été estimée par un procédé colorimétrique, qui implique l'hydro-15 lyse de l'inuline en fructose. On se rendra aisément compte que ce mode opératoire d'estimation est laborieux et qu'il est également compliqué par la nécessité d'entreprendre des estimations à blanc, ou des estimations témoins, pour tenir compte de la présence éventuelle du glucose dans l'urine. 20 Afin d'éviter certaines des difficultés sus-mentionnées, il a été proposé de préparer et d'utiliser une matière radio-active fondée sur l'inuline, c'est-à-dire de l'inuline "marquée". Il est "bien connu que, à condition que la radio-activité soit "bien fixée, l'utilisation d'une,matière radio-active à des fins de diagnostic 25 est un mode opératoire simple et sûr, et l'estimation de la matière est relativement facile, puisqu'un comptage peut être effectué à l'aide de détecteurs classiques de la radio-activité et il peut s'avérer inutile d'entreprendre une séparation chimique quelconque. Le problème des estimations à blanc ou des estimations 30 témoins est également réduit à son minimum. IJn atome radio-actif commode pour le marquage est l'atome de carbone-14. L'inuline marquée, qui a été antérieurement proposée et préparée, a été produite par la réaction de l'inuline avec de l'acide cyanhydrique contenant du carbone-14, de façon à donner 35 un nitrile. On hydrolyse ensuite ce nitrile pour obtenir un groupe acide carboxylique contenant du carbone-14. Ce composé particulier a reçu diverses dénominations : "inuline à groupe carboxyle 70 00948 -2- 2034465 contenant un atome de C-14", "carboxy-inuline comportant un atome de C-14", ou "inuline (acide carboxylique comportant un atome de C-14)", et c'est cette dernière désignation qui va servir dans la suite du présent exposé. Du point de vue de l'estima-5 tion, l'inuline (à groupe acide carboxylique comportant un atome de C-14) s'est avérée être extrêmement satisfaisante. Cependant, on a exprimé certains doutes en déclarant qu'elle risquait de ne pas se comporter exactement de la même façon que l'inuline non modifiée, en raison de la présence du groupe carboxyle. Il est, 10 bien évidemment, extrêmement souhaitable qu'il n'y ait pas de différence de comportement physiologique dans le cas de l'inuline marquée par comparaison avec la matière non marquée, car cette différence rendrait inutile^Les connaissances précédemment accumulées . 15 les buts de la présente invention sont de fournir : - une inuline marquée nouvelle ou améliorée; ; - une composition pour le diagnostic comprenant une telle inuline marquée ; - un procédé pour la fabrication d'une telle inuline marquée, 20 Selon un aspect de la présente invention, le Demandeur- fournit une inuline marquée comprenant de l'inuline ayant un groupe hydroxyméthyle dont l'atome de carbone est un atome de carbone-14. Ci-après, ce composé sera appelé "inuline (à groupe hydroxyméthyle comportant un atome de carbone-14)". 25 Selon un autre aspect de la présente invention, le Demandeur fournit une composition pour le diagnostic comprenant une solution d'inuline (à groupe hydroxyméthyle comportant un atome de carbone-14) dans une solution saline physiologiquement inerte. On comprendra que la nouvelle inuline marquée ne. contient 30 pas de groupe acide carboxylique et que le groupe chimique qui a été introduit par le processus de marquage est un' groupe hydroxyméthyle qui est déjà présent dans les motifs de fructose, de sorte qu'il ne devrait pas y avoir de différence physiologique entre la nouvelle inuline marquée et l'inuline inactive ou non marquée. 35 On comprendra également que l'estimation de la nouvelle inuline marquée est essentiellement la même que l'estimation de l'inuline (comportant un groupe acide carboxylique ayant un "atome de carbone-14). 70 00948 -3- 2034465 On doit également indiquer que l'inuline étant physiologiquement inerte, l'inuline (comportant un groupe hydroxyméthyle ayant un atome de carbone-14) est inerte de façon similaire, la faible quantité de radio-activité due au carbone-14 5 émettant des rayons P mous étant totalement sans aucune importance aux doses et concentrations impliquées. Le procédé préféré de préparation de la matière est tel que ce produit présente une pureté radiochimique élevée, par exemple supérieure à 98 et une concentration commode de la composition destinée au diagnos-10 tic et appliquée par injection dans le courant sanguin est comprise entre 1,6 mg/ml et 5,0 mg/ml, ou plus spécialement, 2 mg/ml. On comprendra que 20 mg correspondent à 50 microcuries (fiCi). La quantité à injecter ou "dose" ne dépend pas tellement du poids du corps, mais seulement de l'obtention d'une concentration adéquate 15 d'activité dans le plasma. Dans le cas d'animaux d'expérience, comme les lapins, la dose est commodément de 1 (iCi/kg, alors que pour un être humain, elle pourrait être de 2 (îCi/kg. Ces doses sont à comparer avec la posologie classique de l'inuline qui est de 200 mg/kg et de 500 mg/kg, respectivement. 20 Selon un autre aspect de la présente invention, un procédé pour préparer l'inuline (comportant un groupe hydroxyméthyle à atome de carbone-14) consiste à prendre l'inuline (comportant un groupe acide carboxylique à atome de carbone-14), à méthyler-cette inuline pour obtenir l'ester méthylique, puis à réduire l'ester 25 pour obtenir l'alcool. En très bref, le procédé préféré de préparation consiste à méthyler l'acide à l'aide de diazométhane dans un mélange de mé-thanol et d'éther, et puis à réduire l'ester méthylique avec du borohydrure de sodium, pour obtenir l'alcool. On peut ensuite 30 fractionner le produit pour obtenir une gamme étroite des poids moléculaires au voisinage de 5000. Afin de permettre une compréhension plus aisée de la présente invention, on va maintenant décrire la préparation détaillée de l'inuline (comportant un groupe hydroxyméthyle ayant un atome 35 de carbone-14). Cette préparation utilise,, comme point de départ, l'inuline (ayant un groupe acide carboxylique à atome de carbone-14) qui est 70 00948 -4- 2034465 disponible au "Radiochemical Centre, Amersham" (Grande-Bretagne) et la préparation de cette matière à partir d'inuline non marquée ne sera pas décrite. On pulvérise 0,43 g d1inuline (comportant un groupe acide carboxylique ayant un atome de carbone-14) 5 présentant une activité spécifique de 1,4 p.Ci/mg et l'on mélange avec 1,5 ml de méthanol. On ajoute 2 ml d'une solution 0,14 molaire de diazométhane dans l'éther et l'on agite le mélange dans un ballon à la température ambiante durant 30 minutes. On retire ensuite du ballon les matières volatiles par pompage sous vide 10 poussé. On dissout le résidu non volatil à 40°C dans 15 ml d'eau contenant de l'hydroxyde d'ammonium (1 ml d'ammoniaque de densité 0,880 pour 150 ml d'eau). On ajoute une solution de 60 mg de boro-hydrure de sodium dans 3 ml d'eau et l'on agite le mélange à la température ambiante pendant 45 minutes, puis on l'évaporé à sic-15 oité sur un bain-marie, dont la température n'excède pas 35°C. On dissout le gel résultant dans 3 ml d'eau et l'on ajoute 10 ml de méthanol pour provoquer la précipitation du produit sous forme d'une poudre fine que l'on sépare par filtration et que l'on sèche. On répète sur le résidu les traitements effectués à l'aide 20 du diazométhane et du borohydrure de sodium. On mélange les poudres sèches obtenues comme produits de ces deux préparations et on dissout ce mélange dans 5 ml d'eau que l'on place sur une colonne de 200 ml de "Sephadex G-25" et l'on élue avec de l'eau utilisée en fractions de 5 ml chacune. 25 Les fractions numérotées 12 à 20 de l'éluat contiennent le composant majeur qui présente une gamme des poids moléculaires similaire de celle de l'inuline servant de matière de départ et ayant un groupe acide carboxylique à atome de carbone-14, et on groupe ces fractions et on les concentre à siccité sur un bain-30 marie dont la température n'excède pas 35°C. Ce mode opératoire donne 0,36 g de matière solide, ce qui représente un rendement de 84 i". Les essais effectués en utilisant la spectroscopie dans 1'infra-rouge ont indiqué qu'il n'y a pas de groupe carboxyle 35 présent dans la nouvelle inuline marquée. Afin de simuler une filtration par les glomérules, on a mélangé la nouvelle inuline marquée avec de l'inuline non marquée et l'on a essayé de séparer 70 00948 -5- 2034465 les deux par électrophorèse et filtration sur gel, mais ces tentatives ont été sans succès. Il convient de noter qu'il est possible de séparer l'inuline non marquée de l'inuline (ayant un groupe acide carboxylique à atome de carbone-14) par électro-5 phorèse. Pour une compréhension plus complète des essais, il convient de se référer aux dessins d'accompagnement où. : la figure 1 est un graphique montrant dans ses parties A et B l'excrétion totale (en pourcentage, ordonnées) en fonction 10 du temps (en minutes, abscisses), et la figure 2 présente un graphique, dans ses parties A et B, montrant l'activité spécifique de l'inuline excrétée (en ordonnées) en fonction du temps (en minutes, en abscisses). Dans les essais suivants, on a utilisé les compositions sui-15 vantes pour le diagnostic : TABLEAU I Abréviation* Ingrédient actif Dose In (o) Inuline non marquée 200 mg 20 InC^H (•) Inuline (ayant un groupe acide 4 mg, soit carboxylique à atome de C-14) 10 jiCi InCE^OH (x) Inuline (ayant un groupe hydro- 4 mg, soit xyméthyle à atome de C-14) 10 |i.Ci * Les signes placés entre parenthèses identifient les points re-25 présentés à la figure 1 du dessin annexé. On a injecté par voie intraveineuse, par l'intermédiaire d'une veine d'une oreille, une solution d'inuline naturelle et une solution d'un des dérivés marqués à des lapins. On a prélevé, à certains intervalles de temps après l'injection, des échantil-30 Ions d'urine et l'on en a déterminé la teneur en inuline et la radio-activité. On a pu comparer l'activité spécifique de l'inuline présente dans l'urine et l'activité spécifique de la matière de départ. Cette technique permettrait de révéler toute discrimination intra-rénale ou extra-rénale entre l'inuline marquée et 35 l'inuline non marquée. On a prélevé des échantillons d'urine (toutes les 10 minutes durant la première heure, puis environ toutes les 20 minutes pen 70 00948 -6- 2034465 dant les 2 heures suivantes), en lavant la vessie avec deux volumes de solution saline (20 ml dans chaque portion). On a noté le moment concernant chaque échantillon comme étant celui de l'enlèvement du second lavage de la vessie. 5 Le titrage de la radio-activité des échantillons a été effectué par un comptage de scintillations dans un liquide, en utilisant un appareil de comptage de scintillations dans un liquide, modèle I de "ÎTuclear Chicago". On a dilué les échantillons d'urine à 100 ml et on a ajouté des échantillons en double (1 ml 10 pour chaque échantillon ) à 10 ml de solution scintillante de "Triton X-100". On a refroidi tous les échantillons jusqu'à 4°C et on les a gardés à l'obscurité durant 30 minutes avant le comptage. On n'a pas observé de chimioluminescence. On a soustrait, pour chaque échantillon, des comptages effectués au préalable 15 pour tenir compte du fond et on a compté les échantillons jus-qu'à ce qu'un décompte, net pour un échantillon donne une différence courante de moins de 1 On a déterminé l'efficacité du comptage par le procédé du rapport des canaux et cette efficacité est habituellement de 60 à 80 %. 20 On a effectué la détermination colorimétrique de l'inuline par l'hydrolyse acide de l'inuline en fructose, ce dernier composé étant estimé par la modification faite par Nakamura au procédé de Roe et Epstein (voir "Agr. Biol. Chem.", (Tokyo), %2, 696 (1968)). Cette modification donne un rendement de couleur de 100:1 entre 25 le fructuse et le glucose-, ce qui réduit au minimum le fond de glucose dans les échantillons. Des échantillons pris en double se situent généralement à moins de 2,5 $ de la valeur moyenne. On a estimé des échantillons étalons de fructose, simultanément avec les échantillons expérimentaux ; cette technique a permis d'expri-30 mer directement en microgrammes la teneur en inuline dans les échantillons. Les étalons de fructose, qui couvraient la gamme des valeurs expérimentales, obéissaient à la loi de Lambert et Beer. Les totaux cumulatifs de l'inuline inactive et du dérivé 35 d1inuline marqué qui sont passés dans l'urine au moment de chaque prélèvement d'échantillon ont été calculés. Le tableau II montre ces totaux 1 heure, 2 heures et 3 heures après l'injection 70 00948 -7- 2034465 initiale de matière inactive et de matière active. Il est évident qu'une forte proportion (environ 50 à 60 fo) d'inuline a passé au cours de la première heure de l'expérience et qu'environ 80 % de cette matière a passé dans les 3 heures qui ont 5 suivi le début de l'expérience. v 70 00948 -8- TABLEAU II Totaux cumulatifs de passage de l'inuline, de l'inuline (ayant un groupe acide carboxylique comportant un atome de C-14), et de l'inuline (comportant un groupe hydroxyméthyle ayant un atome de C-14), exprimés sous la forme du pourcentage de matière injectée ayant passé dans l'urine à chaque moment de prélèvement Animal Matières injectées Temps (en minutes) après l'injection io de matière active ayant passé io de matière inactive ayant passé R3 InC02H 55 55,2 58,2 + In 120 71,9 75,8 180 81,7 87,3 R4 InC02H 53 51,0 54,4 + In 123 69,1 75,6 178 74,5 83,7 R5 InCOpH 55 68,4 78,7 + In 125 80,5 94,0 170 81,7 96,7 R6 InC02H 65 35,0 37,2 + In 13.5 48,3 52,0 180 63,0 68,9 R7 InCHpOH 60 50,6 49,2 + In 130 68,4 67,2 175 72,7 71,6 R8 InCH20H 65 37,1 31,9 + In 130 42,3 39,4 170 45,0 43,7 R9 InCH^OH + In 60 120 61.3 75.4 61,4 75,1 180 81,9 82,0 RIO InCB^OH + In 65 120 59,7 76,1 60,0 76,7 170 81,6 82,6 R11 InCHgOH + In 30 60 49,5 64,8 49,5 65,1 70 00946 -9- 2034465 On observera qu'il y a une discrimination évidente et continuellement croissante entre l'inuline (comportant un groupe acide carboxylique ayant un atome de carbone-14) et l'inule non marquée, le passage de l'inuline (ayant un groupe acide carboxy-5 lique comportant un atome de carbone-14) se situe nettement en dessous de la courbe du passage de l'inuline non marquée, ainsi qu'il ressort de la partie A de la figure 1, qui montre cette discrimination croissante entre la matière active et la matière inactive pour une expérience typique. Le passage de l'inuline 10 (comportant un groupe acide carboxylique ayant un atome de C-14) diminue tellement qu'il semble y avoir une rétention irréversible de matière active à l'intérieur de l'organisme. L'inuline (comportant un groupe hydroxyméthyle ayant un atome de C-14) qui constitue l'autre matière marquée présente une 15 bonne corrélation entre les totaux de matière active et de matière inactive excrétées à chaque moment (voir le tableau II et la partie B de la figure 1). Le rapport entre la matière marquée excrétée et l'inuline inactive excrétée a été calculé, pour chaque expérience, avec cha-20 que matière marquée pour les lectures finales que l'on trouve au tableau des proportions cumulatives ayant passé (tableau II). La valeur moyenne de ce rapport et son écart type ©nt été calculés pour les séries d'expériences effectuées à l'aide de chaque dérivé et ces valeurs sont indiquées ci-après : J R, rapport moyen entre le dérive marqué ayant passé et l'inuline Ecart Dérivé naturelle ayant passé, pour les type totaux finals Inuline (ayant un groupe ,n acide carboxylique comportant un atome de C-14) 0,899 0,017 Inuline (ayant un groupe hydroxyméthyle comportant un atome de C-14) 1,006 0,007 L'application de l'essai t de Student (n = 4) montre que 35 l'écart entre l'inuline (ayant un groupe acide carboxylique comportant un atome de C-14) et le comportement de l'inuline naturelle (R = 1,000) est nettement important (p ^ 0,QT). Par ail 70 00948 -10- 2034465 leurs, l'inuline (ayant un groupe hydroxyméthyle comportant un atome de G-14) montre un degré élevé de corrélation avec l'inuline naturelle. Activité spécifique de l'inuline dans l'urine 5 le critère des totaux cumulatifs de passage est utile pour établir l'existence d'une discrimination entre l'inuline et une inuline marquée, puisque la rétention de la matière marquée à l'intérieur de l'organisme se démontre aisément. Lee totaux cumulatifs peuvent être alourdis inutilement par une faible inexac-10 titude de l'estimation des échantillons prélevés tout au début de l'expérience, et qui contiennent de grandes quantités de matière marquée et d'inuline. Donc, un critère bien plus sensible, qui montrerait une discrimination entre le composé marqué et l'inuline naturelle, est l'activité spécifique de l'inuline dans chaque frac-15 tion émergente d'urine. Cela a été calculé à partir de la radio-activité et de là teneur en inuline de chaque fraction et cela a été exprimé comme étant l'activité spécifique de la fraction au point milieu de chaque moment de passage. L'activité spécifique a été comparée avec 20 celle de la matière injectée. Ces activies spécifiques montrent naturellement un éparpillement autour d'une ligne exprimant une tendance et la pente "b" de cette dernière ligne a été calculée pour la ligne ou courbe des moindres carrés, (y = a + bx), pour la régression de l'activité spécifique en fonction du temps. L'é-25 cart type de la courbe e^La valeur du point d'intersection ("a") ont également été calculés. La partie A de la figure 2 montre une ligne typique de tendance pour l'inuline (ayant un groupe acide carboxylique comportant un atome de carbone-14), alors que la partie B de la figure 30 2 montre une ligne similaire de tendance pour l'inuline (ayant un groupe hydroxyméthyle comportant un atome de C-14). Les données de . chaque expérience sont présentées au tableau III, qui donne la pente de la ligne de régression, exprimée comme un pourcentage de variation de l'activité spécifique initiale, l'écart type de 35 la pente, également exprimé en pourcentage, le point calculé d'intersection de la ligne, exprimé en pourcentage de 1*activité spécifique initiale, et le niveau de signification de l'écart de la 70 00948 -11- 2034465 10 15 pente par rapport à zéro. TABLEAU III * Variation de l'activité spécifique de l'urine (A.S.) en fonction du tenrps Le point d'intersection, "a", et la pente, ""b", de la ligne de régression des moindres carrés, y = a + bx, sont exprimés respectivement en des termes de pourcentage de l'activité spécifique initiale et de la variation de ce pourcentage par heure. Ecart type 20 Animal R3 R4 R5 R6 R7 R8 m R10 R11 * Matiere injectée InC02H Variation de A.S. A.S. initiale In.CHgOH "b" > par heure de "b" par heure "b" P* - 6,0 2,2 98,0 - 11,7 1,1 "99,3 0,001 - 12,7 2,7 95,6 c 0,001 - - 4,4 1,3 99,4 - 0,7 1,3 102,9 S.I.** - 4,2 2,4 108,4 11 + 2,2 2,0 100,1 II - 2,1 1,3 101,3 11 - 0,3 5,3 98,0 II 25 30 35 £ représente la probabilité que l'hypothèse selon laquelle b est nul est exacte. On l'obtient en utilisant l'essai P et l'essai t de Student (n = 10 à 12).** s.I = sans importance. Les résultats d'activité spécifique de l'inuline (comportant un groupe acide carboxylique ayant un atome de C-14) indiquent que ce composé ne peut être considéré comme une bonne molécule marquée pour indiquer le comportement de l'inuline naturelle dans ce système. Il y a une diminution continue de l'activité spécifique de l'urine émergente pendant toute l'expérience. Cette diminution montre une variation d'un animal à un autre et elle est très fortement importante dans deux expériences (p 0,001), très importante dans l'une (p 70 00948 -12- 2034465 par rapport à zéro. L'inuline (ayant un groupe hydroxyméthyle comportant un atome de C-14), au contraire, peut être considérée comme une bonne molécule marquée pour indiquer le comportement de l'inu-5 line non marquée. L'absence de valeur de la pente, "b", montre un écart important par rapport à zéro. Cela montre donc qu'il n'y a pas une variation importante de l'activité spécifique pendant la durée de l'expérience, même à la fin, quand le niveau de concentration de l'inuline dans le plasma est d'environ 6 mg fi. En 10 outre, l'écart type ou standard de la pente est faible, ce qui signifie que les limites de confiance à 95 fi pour l'amplitude de la pente couvrent une faible gamme (environ 4,5 fi de chaque côté de la valeur moyenne), (voir figure 2). La valeur moyenne de "b" pour l'inuline (comportant un grou-15 pe hydroxyméthyle ayant un atome de carbone-14) est égale à - 1,0 fi ( o* = 2,9 fi), ce qui indique à nouveau que ce dérivé marqué de l'inuline n'est pas séparé de l'inuline dangfce système. Toute petite différence éventuelle de traitement physiologique entre le dérivé marqué de l'inuline et l'inuline non marquée 20 serait réfléchie par une variation relativement grande de l'activité spécifique de l'inuline dans l'urine, en particulier vers la fin de l'expérience, lorsque les niveaux de concentration dans le plasma sont faibles pour l'inuline non marquée et le dérivé marqué. Par exemple, s'il y a une différence de l'ordre de 5 fi par heure, 25 du ïait que le dérivé marqué est excrété .plus lentement par un processus intra-rénal ou bien retiré de la circulation par un processus extra-rénal, l'activité spécifique de l'inuline présente dans l'urine au bout de 3 heures serait tombée à 75 fi de sa valeur d'origine. Même une différenciation de 2fi donnerait une activité spéci-30 fique de 88 fi de l'activité d'origine dans-l'urine au bout de 3 heures. 70 00948 -13- 2034465 - BHamiOAIIOHS - 1 - Dérivé marqué d'inuline, caractérisé par le fait qu'il s'agit d'une inuline comportant un groupe hydroxyméthyle dont l'atome de carbone est un atome de carbone-14. 5 2 - Une composition destinée à un diagnostic, caractérisée par le fait qu'il s'agit d'une solution de l'inuline (comprenant un groupe hydroxyméthyle dont l'atome de carbone est un atome de carbone-14) dans une solution saline physiologiquement inerte. 3 - Une composition destinée au diagnostic selon la revendi-10 cation 2, caractérisée par le fait que la concentration de l'inuline (comportant un groupe hydroxyméthyle dont le carbone est un carbone-14 )» est comprise entre 1,6 et 5 mg d'inuline marquée par millilitre. 4 - Procédé pour préparer de l'inuline (comportant un groupe 15 hydroxyméthyle ayant un atome de carbone-14)» caractérisé par le fait que l'on prend de 1'inuline(ayant un groupe acide carboxylique dont l'atome de carbone est un atome de 0-14),on méthyle cette inuline pour obtenir un ester méthylique et l'on réduit ensuite l'ester pour obtenir un alcool. 20 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on effectue la méthylation au moyen de diazométhane. 6 - Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par le fait que l'on effectue la réduction à l'aide de borohydrure de sodium.