Brevet FR2038106A1 — publié le 19710108

-1- 2038106 Pour éliminer l'acrinol (lactate monohydraté d1éthacridine} des protéines du sang, notamment de la gamma-giobuline, on procède en traitant des solutions aqueuses des protéines dans l'acrinol avec une matière siliceuse qui adsorbe préférentiellement l'acri-5 nol. Débarrassée de l'acrinol, la. gamma-globuline des sérums ou plasmas, notamment des sérums ou plasmas immuns, est intéressante pour combattre le rejet de tissus et organes transplantés, et pour remplacer la gamma-globuline. L'acrinol, autrement appelé lactate monohydraté de 6,9-dia-10 mino-2-éthoxyacridine, est vendu sur le marché par diverses firmes telles que Calbiochem, Box 54282, Los Angeles, Californie 90054, Pierce Chemical Co., Rockford Illinois et Winthrop Laboratories, 90 Park Avenue, ÎTew York, New York 10016. On l'utilise dans le fractionnement des protéines du sang,.notamment à cause de sa pro-15 priété caractéristique de laisser en solution pratiquement toutes les gamma-globulines (Voir Sagan, Z., "Clin. Chim. Acta" 21_, 225 (1968) ; Saifer A et Lipkin, L.E., "Proc. Soc. Expl. Biol. Med." 102, 220 (1959). Malgré la propriété avantageuse de l'acrinol de séparer utilement les protéines du sang, on s'est heurté à des 20 . difficultés considérables dans la technique antérieure pour l'éliminer notamment de la gamma-globuline. Par exemple, M. Matthaeus et D. Matheka, "Zentr. Bakteriol Parasitenk.", partie 1, 188, 6 (1963)» décrivent les difficultés et l'échec des tentatives qui ont été faites pour éliminer l'acrinol résiduel par précipitation 25 avec des sels. Sutton et Karp, dans la revue "Biochimica Biophysica Acta" 107. 154 (1965) mentionnent l'élimination de l'acrinol par adsorption sur du charbon. Ce dernier procédé a déjà été illustré par l'utilisation de charbon dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3.383.227. Toutefois, Sutton et Karp (l.c., paragraphe 30 2) décrivent la complexité de ce problème et montrent qu'il n'a pas été résolu dans la technique antérieure par le fait que l'utilisation de charbon dans l'élimination de l'acrinol s'accompagne d'une perte en produit désiré. Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique W° 3.449.316, on démontre que la purification par la bento-35 nite de gamma-globuline provenant d'un placenta remédie à la dégradation, mais il n'est pas fait mention de l'élimination de l'acrinol. 70 11475 -2- 2038106 La Demanderesse vient de découvrir, et ceci fait l'objet de la présente invention» que dans la purification de protéines du sang, comprenant la gamma-globuline sanguine et notamment la gammaglobuline anti-lymphoïde, dans laquelle on utilise l'acrinol pour 5 séparer diverses protéines du sang, l'acrinol peut être éliminé de solutions aqueuses des protéines désirées, comprenant la gammaglobuline, notamment la gamma-globuline anti-lymphoïde, par mise en contact de ces solutions avec une quantité efficace de gel de silice ou d'un silicate minéral utilisé comme matière adsorbante 10 pour éliminer l'acrinol. En raison de la couleur jaune caractéristique de solutions contenant de l'acrinol, l'efficacité avec laquelle la matière adsorbante élimine avantageusement l'acrinol est relativement facile à mettre en évidence par l'absence de cette couleur caractéristique de solutions de protéines et par le trans-15 fert de la coloration à la matière adsorbante. A titre facultatif, la présence d'acrinol dans un filtrat ou une liqueur surnageante après traitement avec la matière adsorbante peut être contrôlée par adsorption de rayons ultraviolets à environ 362 mp. et 268 mp. De même, dans le procédé de la présente invention, l'utilisation 20 de la matière adsorbante s'accompagne de l'élimination bénéfique des substances pyrogènes des solutions de protéines. Comme cela est connu en pratique, les substances pyrogènes sont des substances contaminantes dont la présence est très indésirable dans des produits pharmaceutiques, notamment ceux qui sont destinés à 25 l'administration parentérale, et leur élimination a parfois été difficile et incertaine et, dans certains cas, tout à fait irréalisable , comme le montre une publication de la firme Baxter Laboratories, Inc.,' Morton G-rove, 1-11., publication intitulée "Bacterial Pyrogens, Particularly Pyrogenic Polysaccharides of Bacterial 30 Origln, An Annotated Bibliography"- (1952). L'élimination de tout virus d'hépatite qui risque d'être présent est suggérée dans la technique antérieure par Bednarik et collaborateurs, "Zbl. f. Bakt. I. Orig." 200; 1, 1966. Comme mentionné ci-dessus, l'acrinol précipite efficacement 35 les protéines du sang de leurs solutions aqueuses en laissant non précipitées une certaine quantité de bêta-globuline et pratiquement toutes les gamma-globulines. En raison de cette propriété, 70 1 1475 . 2038106 ce composé est intéressant pour la purification des protéines du sang humain et du sang d'animaux tels que chevaux, moutons, chèvres, vaches et lapins. Comme cela est connu en pratique» lé sérum obtenu après coagulation et le plasma obtenu par élimination des élé-5 ments figurés sont des sources de gamma-globuline- purifiée . Comme cela est également connu en pratique, des fractions intéressantes de gamma-globuline sont préparées à partir de sang humain ou de sang d'animaux qui contient des anticorps désirables du point de vue clinique. Par exemple, le sérum ou le plasma d'êtres humains 10 qui ont été atteints de poliomyélite ou auxquels un virus non-virulent de la poliomyélite a été inoculé est avantageux pour la préparation de gamma-globuline humaine contenant des anticorps anti-poliomyélitique. De même, le sérum ou le plasma se prépare avantageusement à partir du sang d'animaux, notamment de chevaux, T5 auxquels on a préalablement inoculé un tissu lympho*Lde> par exemple un tissu lymphocytaire d'origine humaine comprenant des thy-mocytes et des lymphocytes de la rate. Pour préparer des lymphocytes, notamment des thymocytes destinés au traitement de chevaux, on procède à une centrifugation 20 par paliers pour séparer les lymphocytes et les plaquettes sanguines des granulocytes et des érythrocytes. On utilise ensuite une sédimentation par zones de même densité pour séparer les lymphocytes des plaquettes. On obtient de cette manière une population pratiquement pure de thymocytes que l'on peut injecter à des che-25 vaux d'une manière connue dans la préparation d'un sérum ou plasma thymocytaire anti-humain de cheval. :Des exemples particulièrement intéressants de sérums et plasmas de ce type comprennent le sérum et le plasma lymphoïdes antihumains de cheval, le sérum et le plasma lymphoïdes anti-humains 30 de mouton, et les sérums et plasmas analogues. Une gamma-globuline purifiée est isolée de ces sources et contient des anticorps anti-lymphoïdocytaires qu'il est avantageux d'utiliser comme substance supprimant l'immunité, par exemple en favorisant la tolérance de transplants homologues d'organes et de peaux, par exemple rein, 35 foie, coeur, poumon et peau chez des êtres humains et transplants analogues chez les animaux tels que les chimpanzés et les rats. 70 11475 2038106 Ordinairement, la solution à laquelle la substance adsorbante est appliquée pour éliminer les traces d'acrinol est une solution aqueuse de gamma-globuline purifiée, contenant par exemple du chlorure de sodium comme électrolyte, cette gamma-globuline provenant 5 des sources mentionnées ci-dessus, notamment de la gamma-globuline purifiée provenant de sérum ou plasma lymphoïde anti-humain de cheval. Comme on l'a mentionné ci-dessus, on peut contrôler visuellement l'élimination de l'acrinol d'une solution aqueuse par la disparition de la couleur jaune qui est caractéristique de l'acri-10 nol. En outre, la présence de ce composé dans des solutions aqueuses de gamma-globuline purifiée desquelles l'acrinol a été éliminé peut être contrôlée par des mesures d'absorption des rayons ultraviolets à 362 mp. (a = 38,4) et 268 mp (a = 138). On connaît en pratique des matières adsorbantes à base de gel de silice destinées 15 à être utilisées dans le procédé de l'invention et ces matières adsorbantes sont généralement celles qui sont vendues pour des traitements chromâtographiques et pour la chromatographie analytique. A titre d'exemple, un gel convenable est vendu par la firme E. Merck A.G-., Darmstadt, Allemagne. Ce type de gel consiste essen-20 tiellement en particules de 0,05 à 0,12 mm. D'autres matières adsorbantes comprennent le silicate de magnésium, le trisilicate de magnésium, le silicate de calcium et magnésium naturel, le talc et une aéolite telle que l'heulandite, la stilbite, la chabazite, l'analcite et la natrolite ['Infra-Inorganic Chemistry", Latimer-25 Hildebrand, MacMillan, 1940]. la quantité de matière adsorbante est celle qui est capable d'éliminer les traces d'acrinol qui restent dans des solutions aqueuses de gamma-globuline purifiée. Conformément au procédé de l'invention, on ajoute lentement une solution aqueuse d'acrinol contenant environ 0,1 à 5 i° en 30 poids d'acrinol, de préférence environ 0,4 f°t au sérum ou plasma tout en agitant pour précipiter les protéines sanguines autreg4ue la gamma-globuline, notamment les alpha- et bêta-globulines. Le plasma ou le sérum se trouve à son pH normal d'environ 7 à 8, bien qu'on puisse en régler le pH à environ 7»6 par addition d'un 35 réactif convenable tel que l'hydroxyde de sodium ou le carbonate acide de sodium. La précipitation s'effectue habituellement à environ 25°C, bien qu'on puisse utiliser des températures plus basses. 70 11475 -5- 2038106 On utilise 3,5 à 5 volumes, de préférence environ 4 volumes de la solution d'acrinol à 0,4 ^ pour chaque volume de plasma ou de sérum. On laisse la précipitation s'effectuer totalement, une sédimentation du précipité et une floculation s'effectuant au repos, 5 de préférence à une température d'environ 4°C, pendant une période de temps allant d'environ 15 minutes à 16 heures ou davantage. On sépare le précipité de la portion soluble, par exemple par filtra-tion ou centrifugation. La gamma-globuline partiellement purifiée est présente dans la partie soluble. Après que la valeur de pH a 10 été ajustée à environ 7» 2 avec un tampon d'acétate 0,8 M, en quantité nécessaire, on précipite la gamma-globuline en ajoutant à la fraction soluble de l'acétone ou un alcanol inférieur, par exemple 11isopropanol ou l'éthanol. Par exemple,.on ajoute de l'iso-propanol goutte à goutte tout en agitant à 0-6°C, jusqu'à ce qu'on 15 atteigne une concentration d'environ 25 en volume/volume d*isopropanol. Ceci provoque la précipitation de la gamma-globuline et, après une période convenable de sédimentation à environ 0°C, par exemple pendant plusieurs heures ou pendant une nuit, on isole la gamma-globuline par filtration ou centrifugation. Le précipité de 20 gamma-globuline partiellement purifiée contenant habituellement un peu d'acrinol, comme mis en évidence par une coloration jaune, et contenant parfois des substances pyrogènes, est dissous dans un volume minimal d'un solvant aqueux convenable, par exemple une solution de chlorure de sodium à 0,9 ou une solution de glycine à 25 2,25 . Une solution aqueuse de phosphate de sodium 0,01 M ou 0,02 M ayant un pH d'environ 6,7 donne une solution satisfaisante à des fins de chromatographie, comme décrit ci-après. Ensuite, la solution de gamma-globuline est appliquée à une petite colonne de matière adsorbante ou à une couche de matière adsorbante portée par 30 un support convenable, par exemple un entonnoir en verre fritté grossier. Un traitement supplémentaire avec la matière adsorbante peut éventuellement être requis. En ce qui concerne des rapports convenables de la matière adsorbante à la gamma-globuline purifiée, on a constaté qu'une gamme satisfaisante va de 1 g de matière 35 adsorbante à environ 0,5-5 g de gamma-globuline, des résultats tout à fait satisfaisants ayant été obtenus par exemple en utilisant environ 4 g de gel de silice sous la forme d'un lit de filtra- 70 11475 -6- 2038106 tion pour éliminer l'acrinol d'environ 2 g de gamma-globuline purifiée dans environ 50 ml d1 eau. On constate que la solution ainsi préparée de gamma-globuline purifiée est exempte d'acrinol ainsi que de substances pyrogènes. On la conserve à l'état congelé ou 5 partiellement concentré, de préférence en chassant le solvant d'une solution congelée, puis on la conserve jusqu'à son utilisation, soit comme solution froide, soit comme produit lyophilisé. Le traitement avec la matière adsorbante peut être combiné avec d'autres étapes ou successions d'étapes de purification, cette 10 combinaison portant par exemple sur de la globuline lymphoïde antihumaine de cheval destinée à être utilisée chez des êtres humains comme agent supprimant l'immunité, par exemple pour contrecarrer la tendance de l'hôte à rejeter des organes transplantés. A titre d'exemple, après l'immunisation d'animaux, par exemples des che-15 vaux, avec des thymocytes humains, des anticorps anti-érythrocytaires sont habituellement présents dans le sérum ou le plasma de l'animale Ces anticorps produits par des antigènes sont isolés par ad-sorption sur des érythrocytes humains mélangés (des types A, B, AB, 0 et Rh+). Ensuite, la solution riche en gamma-globuline qui reste 20 après le traitement à l'acrinol est traitée avec des érythrocytes ou stroma humains lavés entre environ un vingtième et un cinquième. du volume, de préférence à environ un dixième du volume, et la suspension obtenue est agitée modérément pendant 1 à 3 heures à 25°C ou à une température plus basse. Les érythrocytes ou le stroma sont 25 séparés par des moyens convenables, par exemple par filtration ou centrifugation. Comme on l'a mentionné, pour séparer des anticorps anti-érythrocytaires, on traite une solution riche en gamma-globuline avec un stroma d'érythrocytes humains. Par exemple, on prépare un stroma érythrocytaire humain qui est exempt de protéines du sé-30 rum en utilisant la digitonine. De la digitonine (0,5 ml d'une suspension 5 mg/ml dans du chlorure de sodium à 0,9 ?<>} est ajoutée à 10 ml d'une suspension refroidie à 10 f<> de globules rouges. Il se produit rapidement une lyse, suivie d'une agglomération du stroma. On effectue une sédimentation à environ 34.000.g pendant 30 35 minutes à une température d'environ 5°C. On procède à des lavages avec une solution de chlorure de sodium pour éliminer les traces d'hémoglobine et de digitonine et le stroma est utilisé comme dis- 70 11475 -7- 2038106 persion aqueuse, par exemple dans une solution aqueuse à 0,9 % âe chlorure de sodium, habituellement dans le rapport de 4 à 5 ml d'équivalent érythrocytaire par eeI de dispersion aqueuse finale dans le chlorure de sodium. Le titre anti-érythroeytaire d'une li-5 queur surnageante contenant la globuline se détermine par des techniques expérimentales courantes d1agglutination immunologique, et on effectue au besoin des absorptions supplémentaires. Ensuite, la solution ainsi traitée de globuline est précipitée à l'acétone ou avec 1*alcanol inférieur défini ci-dessus, et la globuline est tO reprise dans une solution aqueuse qui est traitée avec la matière adsorbante à base de silice pour éliminer l'acrinol et les pyro-gènes. Une étape supplémentaire de purification consiste dans le traitement de la solution de gamma-globuline avec un échangeur anionique, par exemple une colonne d'éther diéthylaminoéthylique 15 de cellulose, appelée en pratique diéthylaminoéthylcellulose (Cellulose DEAE). La colonne est tout d'abord équilibrée avec le solvant utilisé pour préparer la solution de gamma-globuline, et il s'agit de préférence d'une solution de phosphate de sodium 0,01 à 0,02 M, à un pH d'environ 6,7* Après application de la solution de gamma-20 globuline à la colonne, on effectue une élution avec le même solvant, et l'éluat est contrôlé par des déterminations de l'absorption des protéines à 280 mp,. On utilise une colonne de 5 à 10 cm de diamètre et de hauteur allant jusqu'à 80 cm, pour des débits d'environ t_2Q à^480 ml par heure. Les fractions qui montrent des absorptions 25 importantes sont soumises à une détermination de la teneur en gammaglobuline au moyen d'essais connus en immunologie ou en électro-phorèse. La gamma-globuline est normalement la première protéine qui traverse la colonne et la transférine tant à être retenue plus fortement. On isole la gamma-globuline, par exemple par précipita-30 tion à l'acétone ou avec un alcanol inférieur comme défini ci-dessus, et on sépare le précipité. Le traitement ultérieur implique un séchage sous vide ou une lyophilisation ou bien, à titre de variante, la gamma-globuline est dissoute dans un véhicule aqueux qui convient pour l'administration parentérale, par exemple de la glycine 35 0,3 M, stérilisée par filtration et conservée à 0-4°C. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent le procédé de la présente invention. 70 11475 -8- 2038106 Exemple 1 Gamma-globuline du sérum normal de cheval On ajoute goutte à goutte 400 ml d'acrinol aqueux à 0,4 ^ à 100 ml de sérum normal de cheval, tout en agitant en une période 5 de temps d'environ 30 minutes. Ensuite, on laisse le mélange se sédimenter à environ 4°C pendant environ 4 heures. On obtient par -filtration une portion insoluble que l'on jette et une portion soluble à laquelle on ajoute goutte à goutte 167 ml d'isopropanol (à -20°C), la température du mélange restant à environ 0°0. On 10 laisse le mélange se sédimenter à environ 0°C pendant 4 heures. Après cette période de sédimentation et de floculation, on centrifuge le mélange pendant 10 minutes à 2000 tours/minute. On verse la liqueur surnageante et on la jette. On utilise 30 ml de glycine aqueuse à 2,25 fi pour dissoudre la matière précipitée dans le mé-15 lange de précipitation à l'isopropanol à 25 fi. On filtre cette solution sous un lit de gel de silice versé dans l'eau (2 cm de diamètre sur 2,7 cm de hauteur). la matière insoluble est lavée sur le filtre avec 5 ml de solution de glycine et 10 ml d'eau. Le filtrat est congelé et déshydraté à partir de l'état congelé, le 20 rendement à sec étant de 2,53 g ; le calcul montre qu'il y a environ 788 mg de glycine, la quantité restante de 1,74 g étant la gamma-globuline. Cette gamma-globuline ne contient pas de substances pyrogènes, comme le montre l'essai de recherche des substances pyrogènes selon la norme " Food and Drug Administration 141A.3". 25 Exemple 2 Traitement au gel de silice On traite au gel de silice 4000 ml de solution aqueuse de gamma-globuline dans un tampon au phosphate 0,01 M, à un pH de 6,7. On verse 500 g de gel de silice sous forme d'une suspension 30 dans 1*eau ,pour préparer une colonne de 10 cm x 14 cm. On fait passer la solution aqueuse de gamma-globuline à travers la colonne, et on lave cette dernière avec la solution tampon. Le filtrat et les liqueurs de lavage, représentant un volume de 6600 ml, ne contiennent pas dtacrinol. La globuline provient de thymocytes anti-35 humains de cheval. 70 11475 -9- 2038106 Exemple 3 Traitement au gel de silice On traite 2000 ml de solution aqueuse de gamma-glo"buline dans un tampon au phosphate 0,01 M (pH 6,7) avec 500 g de gel de silice 5 versé sous la forme d'une suspension aqueuse, la colonne de gel de silice mesure 10 cm x 14 cm. le gel est lavé avec une quantité supplémentaire de tampon. Le filtrat et les liqueurs de lavage, représentant un volume total de 2800 ml, ne contiennent pas d'acrinol. La globuline provient de thymocytes anti-humains de cheval. 10 Exemple 4 Traitement au gel de silice Comme dans les exemples 2 et 3, on traite 3000 ml de solution aqueuse de gamma-globuline avec 600 g de gel de silice. Le filtrat et les liqueurs de lavage ne contiennent pas d'acrinol. 15 Exemple 5 Traitement à la diéthylaminoéthylcellulose On fait passer le filtrat et les liqueurs de lavage rassemblés (6600 ml)de l'exemple 2 sur une colonne de diéthylaminoéthylcellulose (le volume à l'état humide est de 10.550 ml). Le débit 20 est de 120 ml/heure. Apres avoir fait passer 3080 ml d'éluat à travers la colonne, on recueille la fraction suivante de 7870 ml pour isoler la gamma-globuline purifiée, par précipitation à une concentration en alcool éthylique de 25 fi en volume/volume. Exemple 6 25 Traitement à la diéthylaminoéthylcellulose On fait passer les filtrats et les liqueurs de lavage rassemblés des exemples 3 et 4 (6610 ml) sur une colonne de diéthylaminoéthylcellulose (volume humide de 14-970 ml), le débit horaire est de 120 ml. Après avoir fait passer 7770 ml d'éluat sur la colonne, 30 on recueille la fraction suivante de 9410 ml pour isoler la gammaglobuline purifiée par précipitation à une concentration ai alcool éthylique de 25 fi en volume/volume. Exemple 7 Isolement de la gamma-globuline purifiée de l'éluat 35 On précipite les éluats rassemblés contenant la gamma-globu line, des exemples 5 et 6, à une concentration à 25 fi en volume/ volume d'éthanol, par addition de 6516 ml d'éthanol à 95 fit la pré 70 11475 -10- 2038106 cipitation étant effectuée à une température d'environ 0°C. Après repos à -5° pendant une nuit* on centrifuge le mélange pour isoler la gamma-globuline purifiée insoluble, et on jette la liqueur surnageante. On obtient de cette façon 167,4 g de gamma-globuline pu-5 rifiée de plasma de thymocytes anti-humains de cheval. Exemple 8 Traitements à l'acrinol et au stroma On ajuste à 7»6 le pH de 5675 ml de plasma thymocytaire antihumain de cheval avec 350 ml de bicarbonate de sodium 0,9 M, le 10 bicarbonate étant ajouté lentement sous agitation. On ajoute lentement tout en agitant 24.100 ml de solution aqueuse d'acrinol à 0,4 f° au plasma dont le pH a été ajusté. On laisse le mélange de précipitation au repos pendant environ 16 heures au réfrigérateur à environ 4°G. Après cette période de repos, le précipité a convenable-15 ment floculé et le mélange se sépare aisément en une portion insoluble et une portion soluble. Le pH du filtrat est ajusté à 7,2 avec un tampon d'acétate 0,8 M. On ajoute 113>5 ml d'une suspension aqueuse de stroma dans une solution aqueuse à 0,9 f° de chlorure de sodium et on agite le tout pendant environ 3 heures à la tem-20 pérature ambiante. On laisse le mélange au repos pendant 16 heures à la température du réfrigérateur., puis on le filtre. On jette le résidu et on traite de nouveau le filtrat avec 113»5 ml de suspension aqueuse de stroma dans du chlorure de sodium à 0,9 %. On répète la filtration et à ce stade, le titre d'hémo-agglutination 25 est de 1 à 2. Exemple 9 En suivant le mode opératoire de l'exemple 8, on ajuste à 7»6 le pH de 1875 ml de plasma thymocytaire anti-humain de cheval avec 87 ml de'bicarbonate de sodium 0,9 M. Ensuite, on ajoute len-30 tement, tout en agitant, 7848 ml d'acrinol aqueux à 0,4 et on laisse reposer le mélange de précipitation. Après floculation complète, le mélange est filtré et le résidu est jeté. Le filtrat est ajusté à un pH de 7*2 avec un tampon d'acétate 0,8 M. On utilise 37,5 ml de la suspension de stroma pour la première adsorption 35 des anticorps indésirables et après filtration, on répète le traitement au stroma avec une autre portion de 37»5 ml de suspension de stroma. A ce stade, le titre d'hémo-agglutination est de 1 à 2. 70 11475 -îi- 2038106 Exemple 10 On rassemble les filtrats traités à l'acrinol et traités au stroma, de faible titre, que l'on obtient dans les exemples 8 et Sf- en vue de la précipitation de la gamma-globuline purifiée, au 5 moyen d'isopropanol. On ajoute aux filtrats rassemblés 12666 ml d1isopropanol préalablement refroidi, à une température d'environ -20°C. On abaisse progressivement à -5°C la température du mélange de précipitation. La concentration en isopropanol dans le mélange de précipitation est alors de 25 en volume/volume. Après repos 10 pendant environ 16 heures à -5°G, une centrifugation à 2000 tours/ gamma minuterpendant 10 minutes sépare le précipité, de/globuline de la liqueur surnageante que l'on jette. Le précipité est traité par lixiviation avec un volume minimal de tampon de phosphate 0,01 M à ùn pH égal à 6,7 et la solution est centrifugée à 2000 tours/ 15 minute pendant environ 10 minutes. Le résidu est jeté et le fil-; trat est utilisé en vue d'une expérience subséquente par passage sur dugel de silice pour éliminer les traces d'acrinol et de substance pyrogène. Exemple 11 20 Précipitation à l'acrinol et traitement au stroma On ajuste à 7»6 le pH de 4300 ml de plasma thymocytaire antihumain de cheval avec 128 ml de bicarbonate de sodium 0,9 M. Tout en agitant, on ajoute 17.712 ml d'acrinol aqueux à 0,4 et on laisse le mélange de précipitation au repos pendant 8 heures à en-25 viron 4°0. Après cette période de repos, une filtration sépare aisément le résidu que l'on jette. On ajuste à 7*2 le pH du filtrat avec un tampon d'acétate 0,8 M. On ajoute 86 ml de stroma d'érythro-cytes pour isoler les anticorps érythrocytaires. Après filtration, le traitement au stroma est répété avec 108 ml de suspension de 30 stroma. Après filtration, on trouve que le titre d'hémo-agglutination est égal à 0. On refroidit la solution à 0°C et on ajuste le pH à 7*2 avec un tampon d'acétate. On ajoute 7033 ml d'isopropanol comme dans les autres exemples pour obtenir un précipité de gammaglobuline purifiée que l'on dissout dans 2 litres de tampon de 35 phosphate 0,01 M, à un pH de 6,7, en vue d'un traitement ultérieur au gel de silice et à la diéthylaminoéthylcellulose. 70 11475 -12- 2038106 Exemple 12 G-amma-globuIine provenant du sérum anti-rat de la chèvre On ajoute goutte à goutte en 30 minutes environ, à 210 ml de sérum anti-rat de chèvre à un pH égal à 7,65, 840 ml d'acrinol 5 aqueux à 0,4 fi. On laisse ensuite le mélange sédimenter à environ 4°C pendant environ 4 heures. La centrifugation donne une portion insoluble que 1'on jette et une portion soluble à laquelle on ajoute goutte à goutte (après refroidissement à 0°C) 350 ml d'iso-propanol (-20°C), la température restant entre environ 0 et -5°C. 10 On laisse le mélange au repos à environ 0°0 pendant 16 heures. Après cette période de floculation, on centrifuge le mélange pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, à une température d'environ 5°C. La liqueur surnageante est versée et jetée. La portion insoluble est traitée par lixiviation avec une solution de chlorure 15 de sodium 0,15 M pour dissoudre la matière précipitée dans le mélange de précipitation à 1'isopropanol à 25 fi. On filtre cette solution sur un lit de 12 ml de gel de silice versé dans une solution de chlorure de sodium 0,15 M sur un entonnoir en verre fritté grossier, de 15 ml. Après filtration de la solution, on lave le 20 gel de silice sur l'entonnoir avec 5 ml de solution de chlorure de sodium 0,15 M. Le volume total de filtrat et de liqueurs de lavage représente 52,5 ml. La fraction de gamma-globuline contient 2,625 g de gamma-globuline, comme déterminé parviensité optique à 280 mp. Elle ne contient pas d'acrinol. 25 Exemple 13 Traitement au silicate de magnésium En suivant le mode opératoire de l'exemple 2, mais en remplaçant les 500 g de gel de silice par 500 g de silicate de magnésium, on réalise une élimination tout aussi convenable de l'acrinol. 30 Exemple 14 Traitement au trisilicate de magnésium En suivant le mode opératoire de l'exemple 3, mais en remplaçant les 500 g de gel de silice par 500 g de trisilicate de magnésium, on réalise une élimination tout aussi convenable de l'acri-35 nol. 70 11475 -13- 2038106 Exemple 15 Traitement au silicate de calcium et de magnésium. En suivant le mode opératoire de l'exemple 4r mais en remplaçant les 600 g de gel de silice par 600 g de silicate naturel de 5 calcium et cis magnésium. , on réalise une élimination tout aussi correcte de l'acrinol. Exemple 16 Traitement au silicate de magnésium En suivant le mode opératoire de l'exemple 12, mais en rempla-10 çant le gel de silice par du silicate de magnésium, on réalise une élimination tout aussi avantageuse de l'acrinol. Exemple 17 Traitements au gel de silice 2000 ml de plasma humain (exempt de facteur hémophile) à un 15 pH de 7,3, sont ajustés à un pH de 7,6 par addition de 33 ml de bicarbonate de sodium 0,8 M. On ajoute 8 litres de solution aqueuse d'acrinol à 0,4 tout en agitantet on refroidit le mélange pendant environ -16 heures. On verse la liqueur surnageante par décantation (volume de 9680 ml), la teneur totale en matières solides 20 du précipité étant de 307,8 g (poids humide). On divise la liqueur surnageante en parties aliquotes de 4840 ml chacune, à savoir les parties aliquotes I et II. Traitement de la partie aliquote I On verse lentement la partie aliquote sur un lit' d'environ 25 200 g de gel de silice porté par un entonnoir filtrant en verre fritté, et on lave à l'eau. On obtient un volume total de 5050 ml. Cette fraction ne contient pas d'acrinol. On refroidit à 0°C, à un pH égal à 6,9. On ajuste le pH à 7,2 avec .une solution de bicarbonate de sodium 0,8 M. On ajoute 1802,5 ntl d'éthanol à 95 fi et 30 on refroidit le mélange à -5°C pendant environ 16 heures. On verse la liqueur surnageante limpide et on la jette. On centrifuge à froid la suspension restante et on jette la liqueur surnageante. On reprend le précipité dans 100 ml de glycine 0,3 M. On ajuste le pH à 6,8 par addition d'acide acétique 0,1 M ; ■ le précipité se dis-35 sout complètement. Le volume total est de 161 ml.-On lyophilise la solution et on obtient 8,87 g de matières sèches consistant en 6,62 g de gamma-globuline humaine et 2,25 g de glycine. 70 11475 -14- 2038106 Traitement de la -partie aliquote II la partie aliquote de pH égal à 7,75> est ajustée à un pH de 7*2 avec de l'acide acétique 0,1 M. On ajoute lentement, tout en agitant, 17.27,5 ml d'éthanol froid à 95 ^ et on .refroidit le mé-5 lange à-5°0 pendant environ 16 heures. On verse la liqueur surnageante limpide par décantation et on la jette. On centrifuge la suspension restante et on jette la liqueur surnageante. On maintient le précipité sous vide pour chasser l'éthanol résiduel, puis on reprend le résidu dans 600 ml de tampon au phosphate de potassium 10 0,01 M, à un pE de 6,8. On fait passer la solution résultante à travers un lit contenant 450 ml de diéthylaminoéthylcellulose, puis à travers toi lit contenant environ 200 g de gel de silice, le volume total, y compris les eaux de lavage, est de 1500 ml. Il ne contient pas d'acrinol. la teneur en protéine (mesurée par la densité 15 optique à 278 mp) est de 6375 g. le pH est égal à 7,2. On refroidit à 0°C et on ajoute 535 ml d'éthanol à 95 fi 27 g de matières sèches consistant en.6,02 g. de gamma-globuline humaine et 2,25 g de glycine. Exemple 18 Traitement avec d'autres matières adsorbantes 25 On réalise une élimination tout aussi avantageuse de l'acri nol en utilisant, dans les exemples précédents, des quantités égales de talc ou d'une zéolite telle que l'heulandite, la stilbite, la chabazite, l'analcite ou la natrolite, qui sont des silicates minéraux dont une liste est donnée page 305 de l'ouvrage "Reference 30 Book of Inorganic Chemistry", W.M. lattimer et J.H. Hildébrand, édition révisée, The MacMillan Company, 1940. 70" 11475 -15- 2038106 KEVEHDICATIOHB 1. Procédé de purification de protéines de sérum ou plasma sanguin dans lequel on utilise l'acrinol pour séparer la gammaglobuline des autres protéines, caractérisé par le fait que pour 5 éliminer l'acrinol d'une solution aqueuse de gamma-globuline, on —place cette solution en contact avec une quantité capable d'adsor-ber l'acrinol, d'une substance choisie entre le gel de silice, / le silicate de magnésium, le trisilicate de magnésium, le silicate naturel de calcium et de magnésium, le talc, l'heulandite, la stil-10 bite, la chabazite, l'analcite et la natrolite, et on sépare cette substance de la solution. ----- 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le sérum ou plasma est celui d'un animal traité avec un tissu lymphoïde d'origine humaine. Î5 3. Procédé suivant la revendication î, caractérisé par le fait que le sérum ou plasma provient d'un cheval traité avec des thymocytes humains. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la matière adsorbante est le gel de silice. 20 5* Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le sérum ou plasma est d'origine humaine. 6. Procédé de purification de gamma-globuline d'un sérum ou d'un plasma, caractérisé par le fait qu'il consiste premièrement à séparer du plasma ou sérum à un pH de 7 à 8, une portion inso-25 lubie par addition au sérum ou plasma d'environ 3>5 à 5 volumes d'une solution aqueuse à 0,4 fi d'acrinol et à récupérer la portion soluble, deuxièmement à mélanger avec cette portion soluble à un pH d'environ 7 à 8 un stroma érythrocytaire humain ou des érythrocytes humains et à récupérer la portion soluble, troisièmement à 30 précipiter la gamma-globuline de la portion soluble à un pïï d'environ 7 à 8 par addition à cette portion d'une quantité suffisante d'acétone ou d'un alcanol inférieur pour que la concentration en acétone ou alcanol inférieur soit d'environ 20 à environ 30 fi en volume/volume et à récupérer le précipité, quatrièmement à dissou-35 dre la gamma-globuline précipitée dans un tampon au phosphate à un pH d'environ 6,5 à 7,5 et à traiter la solution obtenue avec du gel de silice, puis à récupérer la portion soluble, cinquièmement à 70 VI475 -16- 2038106 faire passer la portion soluble sur de la diéthylaminoéthylcellul^s équilibrée avec un tampon au phosphate à un pH d'environ 6,7 et à éluer la diéthylaminoéthylcellulose avec un tampon au phosphate à un pH d'environ 6,7» et sixièmement à isoler la gamma-globuline de 5 l'éluat conformément à des mesures d'absorption effectuées à 280 m|u. 7- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait que le sérum ou plasma est celui d'un animal traité avec un tissu lymphoïde d'origine humaine. 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le 10 fait que le sérum ou plasma provient d'un cheval traité avec des thymocytes humains. 9. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait que le sérum ou plasma est d'origine humaine.