Brevet FR2047884A1 — publié le 19710319

La présente invention concerne un nouvel. extrait biologique ayant une action thérapeutique déterminée, la préparation de la so- lution pour un emploi parentéral de cet extrait1 et des méthodes thérapeutiques d'emploi de cet extrait. L'obJet de l'invention consiste à préparer un extrait biolo gique ayant une action anti-leucopénique, utilisable en général et en particulier dans le traitement de la leucopénie et dans des traitements effectués avec des agents myélo-toxiques et autres agents ou méthodes analogues. Cet objectif ainsi que d'autres qui ressortiront mieux de la description suivante sont atteints par un extrait de thymus ayant une action anti-leucopénique, comprenant du thymus partiellement lysé et déprotéiné d'un.jeune mammifère et dilué dans une siution saline physiologique. On a trouvé qu'on obtient les meilleurs résultats avec un ex trait de thymus de veau. Le demandeur obtient cet entrait par une lyse partielle du thymus de veau, puis par une déprotéinisation de l'extrait. Le demandeur a trouvé que l'extrait ainsi obtenu a des caractéristi ques chimiques et biologiques bien définies. Une expérimentation médicale étendue a montré que l'extrait produit une action anti-leucopénique, et peut autre employé dans le traitement des leucopéniens primaires et secondaires avec des agents myélo-tosiques (par exemple rayonnements énergétiques, ra diothérapie, cobalto-thérapie, bétatron, agents thérapeutiques chimiques et cytostatiques). L'extrait de thymus de la présente invention peut autre obtenu par la méthode suivante: 20 kg de thymus de veaux récemment abattus sont réduits en fragments d'environ 2 m@ de diamètre, puis traités à la tempéra ture ordinaire (20 C environ) avec 1600 à 2400 g d'acide chlorhydrique de densité 1e092). La masse est soigneusement mélangée et abandonnée pendant 18 a 24 heures à une température de 20 C. A la fin de cette période, on place cette masse dans une cham- bre thermostatique et l'on maintient la température à 45-55 C pen dant 48 à 72 heures. On centrifuge ensuite, et le liquide séparé est placé dans un réfrigérateur à 0 C pendant 72 heures. On porteen suite la température à 2000 et l'on filtre le liquide. On traite le filtrant, tout en le brassant, avec une solution normale d'hydroxyde de sodium jusqu'à abstenir ut pH de. 4,4 à 4*8 et l'on chauffe pendant 60 minutes dans un bain d'eau dont la température est réglée à 80 C, On refroidit ensuite jusqu'à 20-25 C et l'on filtre. Le filtrat obtenu est de nouveau traité,tout en le brassant, avec une solution normale d'hydroxyde de sodium jusqu'à obtenir un pH de 9 à 9,5, puis on chauffe pendant 60 minutes dans un bain d'eau à température réglée à 80 C. On refroidit ensuite jusqu'à 20-250C et l'on filtre, Enauite, on ajuste le pH du filtrat à 6,5-6,7 avec une solution normale d'acide chlorhydrique. L'extrait obtenu est soumis à une température comprise entre -2 et 0 C, et est maintenu à cette temperature pendant 72 heures. A la fin de cette période, on porte la température de l'extrait à 20-250C et l'on filtre, L'extrait obtenu ainsi est rapidement congelé à -150C puis on le centrifuge On élimine ainsi la glace qui s'est formée. L'extrait est encore congelé à -200C, jusqu'à atteindre une concentration comprise entre 1/80 et 1/100 relativement à la glande initiale. L'extrait concentré est ensuite dilué avec du glycérol de façon donner un extrait de thymus de concentration 1/50 relativement à la glande. Cet extrait de thymus à 1/50 est ensuite dilué dans le rapport 1/4 avec une solution saline physiologique. Après filtration dans un filtre HAWP 142/50, fabriqué par Millipore Filter Corporation de Bedford, Massachussets 1 la solution est placée dans des ampoules de 2 cm3 qui sont stérilisées en autoclave à 1200C pendant 30 minutes. L'analyse chimique de divers échantillons d'extrait de thymus à 1/50 a donné des résultats suivants, en mg/Cm3 TABLEAU I échantil- éch. éch. éch. éch. éch. ion 1 2 3 4 5 6 Résidu sec 26,10 24,90 25,90 26,37 23,79 21,24 N total 2,29 1,67 . 2,16 2,11 2,01 1,71 P minéral 0,25 0,19 0,22 0,22 0,15 '0,19 P organique 0,30 0,21 0,30 0,33 0,20 0,2Q P total 0,55 0,40 0,52 0,55 0,35 0,39 Amine acides (exprimés en leucine) t,68 1,64 1,68 1,96. t,84 i,74 Adenosine 2,20 2,70 2,00 3,10 2,50 2,30 Guanosine 1,60 1,30 1,10 1,80 1,20 1,30 L'action anti-leucopénique de l'extrait de thymus de la présente invention a été déterminée à l'aide des essais charmacologiques suivants 1) Sur des lapins qui ont été irradiés aux rayons X et immunisés avec un antigène typique ciliaire et avec un antigène erytrocytique humain, l'administration de l'extrait de thymus produit une réaction nette poietique d'anticorps, et une réaction leucopoiétique très nette.Les résultats donnés par une série dressais sont indiqués dans le tableau II. 2) Sur des rats irradiés par des rayons X, l'extrait de thymus peut accélérer la guérison après le dommage leucocitaire produit par l'irradiation. On a effectuépar exemple une série d'expériences sur un groupe de 15 rats témoins et sur un groupe de 15 rats traités avec l'extrait de thymus (une ampoule de 0,5 cm3 par individu et par jour), tous les rats ayant été préalablement complètement irradiés en une seule séance, par administration de 250 r dans les conditions techniques suivantes : 180 kv, 15 mA, pénétration 60 cm, filtre 0,25 Cu + 1 Al. Les taux leucocitaires initiaux (9600 globules blancs) ont été réduits le cinquième jour à 5400 pour les rats témoins et à 6400 pour les rats traités. Le onzième jour, les rats traités avaient déjà atteint le taux initial tandis que les rats témoins avaient atteint seulement 7600. Le dix-huitième jour, les rats traités avaient atteint 109000 contre 8750 pour les rats témoins, qui étaient ainsi encore en dessous du niveau initial. 3)- L'extrait de thymus agit en stimulant l'activité phagocitaire du système réticuloendothélial. Dans une rechérche effectuée, on a divisé 30 souris albinos de 25 g en deux groupes de 15 animaux (premier groupe, groupe témoin traité avec une solution saline physiologique ; deuxième groupe, groupe traité avec l'extrait de thymus). Après 20 jours de traitement, on a inoculé les souris avec de l'encre de Chine, à raison de 16 mg pour 100 g de poids. Deux prélèvements de 0,020 cm3 chacun ont été faits, lun 4 minutes et l'autre 25 minutes après l'inoculation. Les prélèvements ont été placés dans des éprouvettes contenant 3 cm3 de carbonate de sodium à 1 zou et ont été observés au spectrophotomètre sur 625 my. On calculait l'indice phagocytaire E par la formule suivante K = (Log C1 - Log C2) / (T2 - T1) avec C = concentration de l'encre de Chine dt T = temps en minutes. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau suivant Groupe Nbre. de souris Jours de traitement K ( X 10-3 3 ) Souris témoins 15 20 8,59 Souris traitées 15 20 14,03 Ces résultats montrent une nette augmentation de l'indice phagocytaire du groupe d'animaux traités avec l'extrait de thymus. 4) L'action leucocytosique de l'extrait de thymus peut être encore évaluée au moyen d'un essai basé sur la protection, relativement à l'activité myélotoxique de l'amino-ptérine (acide (N-(p(( (2,4-diamine-6-ptéridyl)-méthyl)-amino)-benzyl)-glutamique) dans la souris, et du calcul de la diminution de l'indice de mortalité. Par exemple, pour faire une détermination d'activité, on a utilisé 90 souris d'un poids moyen de 30 g, qui furent divisées en deux groupes de 45 chacun de ceux-ci étant divisé en trois lots de 15 souris Le premier groupe était constitué par les animaux témoins, traités par voie intrapéritonéale, respectivement avec 3-2,5 et 2 mg/kg d'amino-ptérine pour les divers lots. Les lots du deuxième groupe étaient traités avec les mêmes doses dramino-ptérine que ceux du premier groupe, et avec l'extrait de thymus en ampoule à raison de 1 cm3 par souris pendant deux jours avant l'inoc u lation de l'amino-ptérine et jusqu'à la fin de lexpérience (sixième jour). Après inoculation damino-ptérine, on comptait dans chaque lot les animaux morts aux-quatrième, cinquième et sixième jours. On peut calculer l'activité A de l'extrait de thymus par la formule suivante A = 100 (T1 + T2 + T3) / C1 + C2 + C3 ) dans laquelle T1, T2 et T3 représentent respectivement les nombres d'animaux morts pendant les jours 4, 4 et 5, 4,5 et 6 après le traitement à lamino-ptérine et à l'extrait de thymus, et C1, C2 et C3 représentent respectivement les nombres des animaux morts aux jours 4, 4 et 5, 4, 5 et 6 après traitement avec 1 'amino- ptérine seule. L'indice d'activité A donné par la détermination éfait de 55,5, ce qui montre la forte activité de l'extraite L'activité clinique de l'extrait de thymus dans le traitement des leucopéniens primaire et secondaire a été notée de façon répétée lors de l'emploi des ampoules prépares comme indiqué ci-dessus. Par exemple on a conduit un essai clinique sur 40 malades dont les taux leucocytaires étaient fortement réduits à la suite d'une radiothéaple (traitement par rayons X pénétrants sous 200 kV, télécobaltothérapie, photons et électrons émis par un bétatron Siemens à 42 Mev). L'administration de l'extrait de thymus a été particulièrement efficace. L'action du remède n'est pas influencée par le genre de radiations employées. Sur 90,6 des malades traités, on a obtenu des résultats généralement satisfaisants En administras* l'extrait de thymus à raison de 2 ampoules par jour, on a pu terminer la radiothérapie sans interruption, bien qu'on ait initialement-noté une tendance à la leueooenie. L'extrait de thymus a donc montré qu'il est un bon moyen thérapeutique, capable de traiter presque tous les cas de leucopénie qui sont provoqués par irradiation et qui sont difficiles à mattri- ser autrement. On a également vérifié la non-toxicité absolue du remède. On a obtenu un autre exemple de l'activité de l'extrait de thymus sur un autre groupe de 40 malades atteints des maladies suivantes: 1) leucopénie primitive, 2) Leucopénie secondaire traitée par des méthodes myélo-toxi ques (thérapies cytostatiques et par rayonnements). 3) leucopénie immuno-allergique causée par î'aminopyrine. Les résultats obtenus permettent de conclure que ltextrait de thymus, administré par doses de 2 ampoules par jour, produit une action anti-leucopénique efficace, sans provoquer d'incidents connexes, locaux ou généraux. Un troisième essai clinique a été conduit sur un groupe de 22 patients atteints de leucopénie secondaire avec traitements nyelo- toxiques (thérapies par rayonnements et cytostatiques), et traités à l'aide de l'extrait de thymus en doses de 2 ampoules par jour. On a obtenu des résultats positifs dans presque tous les cas. en fait, le traitement à tomps o l'extgsit de thymus empoche chez des malades traités de façon myélo-toxique le début de la leucopé nie, qui atparaissait portant chez tous les malades d'un groupe de 10 traités par thérapie cytostatique mais non protégés par l'ex- trait de thymus. La comparaison des résultats obtenus sur les pa tients traités à l'extrait de thymus, avec les résultats obtenus sur un Froupe-de 29 patients traités par les méthodes tradition nelles anti-leucopéniques (extraits hépatiques, vitamine B 12 -,eme sous forme coenz#mique, vitamine B 6, acide folique, fortes doscs de testostorone, etc), ont montré que l'extrait de thymus a une activité beaucoup plus élvée. Alrs que, dans le groupe de patients traités par les methodes traditionnelles, les globules blancs subissaiant une diminution moyenne de 50%, la diminution était seulement de 16% chez les malades traités à l'extrait de thymus en ampoules dans des condi tions analogues T A B L E A U II IRRADIATION AUX RAYONS X SUIVIE D'UNE IMMUNISATION PAR DES ANTI-GENES TYPHIQUES CILIAIRES-MOYENNES avant irradiation avant immunisation après immunisation Variation % traitement par traitement par traite@ent par traitement par l'extrait de l'extrait de l'extrait de l'extrait de T@moins Thymus Témoins Thy@us Témoins Thymus Témo@s Thymus Globuline-gamma 1,04 1,03 0,91 0,86 1,05 1,26 + 15% + 46% Leucocytes, mm3 6.940 6.980 3.660 3.880 4.920 8.380 + 34% + 116% Neutrophiles 48 49 57 56 53 41 - 5% - 27% Lymphocytes 47 47 37 39 42 56 + 14% + 44% Titre d'anti-corps - - - - 1:4608 1::22524 - IRRADITION AUX RAYONS X SUIVIE D'U@E IMMUNISATION PAR DES ERYTHROCYTES HUMAINS - MOYENNES avant irradiation avant immunisation après immunisation Variation % traitement par trait@ment par traitement par traitement par l'extrait de l'extrait de l'extrait de l'extrait de Témd@@s Thymus Tém@@@ Thymus Témoins Thymus Témoins Thymus Globuline-gamma 1,05 1,04 0,83 0,84 0,97 1,10 + 17% + 31% Leucocytes, mm3 7.120 6.960 4.240 3.560 5.340 8.140 + 28% +128% Neutrophiles 49 51 58 58 50 37 + 14% - 31% Lymphocites 46 46 35 36 45 57 + 29% + 58% - - - - 1:26 1:409 - REVENDICATIONS 1. Extrait de thymus provenant d'un jeune mammifère et dilué dans une solution saline physiologique, caractérisé par ceci qu'il est partiellement lysé et déprotéiné lors de sa préparation, cet extrait produisant une action anti-leucopénique et poétique d'anti-corps. 2. Extrait de thymus conforme à la revendication 1, dans lequel le jeune animal est un jeune ruminant. 3. Extrait de thymus conforme à la revendication 1, dans lequel le jeune animal est un veau. 4o Procédé de préparation d'un extrait de thymus conforme à la revendication 1 et possédant une action antileucopénique et poétique d'anti-corps, ce procédé consistant à - réduire en fragments le thymus d'un mammifère, - traiter ces fragments avec une solution lysante, en mélangeant cette solution et ces fragments et en laissant reposer plusieurs fois le mélange à diverses températures pendant des périodes différentes, séparer le liquide du mélange ainsi traité et laisser reposer plusieurs fois ce liquide à diverses températures pendant des périodes différentes et filtrer plusieurs fois le liquide après et avant au moins lune de ces périodes de repos, ajuster le pH du liquide, congeler le liquide et séparer la glace formée, diluer l'extrait obtenu, et filtrer une dernière fois l'extrait dilué. 5. Procédé conforme à la revendication 4, dans lequel le jeune animal est un jeune ruminant. 6. Procédé conforme à la revendication 5, dans lequel le jeune animal est un veau. 7. Procédé conforme à la revendication 6 pour préparer un extrait de thymus ayant une action anti-leucopénique et politique d'anti-corps, ce procédé consistant à : réduire en fragments le thymus d'un veau, traiter ces fragments avec une solution lysante, en mélangeant cette solution et ces fragments et en laissant reposer plusieurs fois le mélange pendant plusieurs heures chaque fois, à des températures différentes et croissantes supérieures à OOC et inférieures à 650C, séparer mécaniquement le liquide de ce mélange, laisser ce liquide reposer plusieurs fois pendant plusieurs heures chaque fois, à des températures différentes et croissantes supé rieures à 0 C et inf-érieures à 350C, filtrer plusieurs.fois le liquide et laisser chaque fois le filtrat reposer pendant une période de l'ordre de plusieurs quarts-dtheure àplusieurs heures à des températures différentes, croissantes et décroissantes, supérieures à 0 C et inférieures à 850C env., ajuster chaque fois le pH du filtrat différemment, entre 4,4 env. et 6,7 envi, congeler plusieurs fois le filtrat à des températures de congélation différentes entre -100C env. et -250C env., séparer chaque fois la glace formée jusqu'à obtenir une concentration déterminée du filtrat relativement au thymus initial, diluer plusieurs fois ce filtrat concentré avec au moins un diluant physiologique, filter le filtrat ainsi dilué, et conserver le liquide obtenu0