Brevet FR2043476A1 — publié le 19710219

La présente invention est relative à un inhibiteur d'urokinase et à un procédé pour purifier un tel inhibiteur obtenu à partir des extraits du placenta humain recueilli après la délivrance. Dans le sang et les tissus humains, il existe un système qui coagule le fibrinogène, qui est une protéine coagulable (système de coagulation) et un système qui décompose ou dissout la protéine coagulée (système fibrinolytique), et la condition normale est maintenue grâce à un équilibre persistant entre les deux systèmes. Si cet équilibre est détruit et storiente dans un sens ou dans l'autre, un désordre se manifeste dans l'organisme. Si le système coagulant est prédominant, il peut se produire une thrombose et des troubles analogues et, au contraire, si le système fibrinolytique est prédominant, il est difficile de maintenir un état hémostatique et un état hémorragique survient. En ce qui concerne le système fibrinolytique, si le plasminogène présent dans le sang est activé en plasmine., cette dernière décompose le fibrine ou, éventuellement, le fibrinogène, et il se manifeste ainsi un phénomène fibrinolytique. L'urokinase qui, comme on le sait, est présente dans l'urine, est un activateur fibrinolytique qui stimule la conversion du plasminogène en plasmine et il a été confirmé qu'il est efficace par exemple dans les cas de thrombose, dans lesquels l'activité fibrinolytique est relativement diminuée. Un symptôme hémorragique résultant d'une élévation excessive de l'activité fibrinolytique est souvent constaté dans les cas de délivrance anormale et dans les opérations des poumons, de la prostate, etc,.. On a constaté qu'en plus de l'équilibre existant entre un tel système de coagulation et le système fibrinolytique, il se manifeste également une relation antagoniste entre un système d'activation et un système d'inhibition dans chacun des systèmes en question. I1 est bien connu que, par exemple, dans le système fibrinolytique, la plasmine activée et l'antiplasmine qui inhibe la plasmine ont une relation antagoniste. Un facteur qui inhibe spécifiquement l'urokinase, c'est-à-dire un facteur d'activation, est présent dans le sang, mais en faible quantité.Le facteur d'inhibition augmente fortement depuis les premiers stades de la grossesse jus- qu'à la délivrance dans le processus d'une grossesse normale et il atteint une valeur maximale immédiatement avant la délivrance, puis il revient à la valeur normale très rapidement après la délivrance. Ce fait montre qu'un facteur inhibant l'urokinase (inhibiteur d'urokinase) participe à l'inhibition d'un épanchement sanguin à partir de la surface desquamée du placenta, à la suite de la délivrance, dans le corps maternel. Par contre, il est admis comme possible qu'une hémorragie aiguë souvent rencontrée lors d'une desquamation précoce du placenta est due à une préparation incomplète du mécanisme de défense de l'organisme. La demanderesse a constaté qu'un inhibiteur d'urokinase est présent en une très grande quantité dans le placenta humain évacué après la délivrance. Toutefois, étant donné que l'extrait de placenta est contaminé par une grande diversité d'impuretés, il ne peut pas être utilisé tel quel dans des traitements cliniques. La demanderesse a réussi a purifier un inhibiteur d'urokinase pouvant être utilisé dans des traitements cliniques, à partir d'un extrait de placenta. Conformément à la présente invention, une fraction hydrosoluble est extraite du placenta humain par de l'eau ou une solution aqueuse d'un sel qui n'a pas d'effet sur la solubilité de la fraction, et on obtient un précipité en ajoutant à l'extrait du sulfate d'ammonium en une concentration finale correspondant à une saturation égale ou supérieure à 30%, une résine échangeuse de cations étant ajoutée à une solution précipitée dont le sulfate d'ammonium a été éliminé (par exemple par dialyse contre de l'eau en utilisant un tube de cellophane), dans un intervalle de pR de 5 à 7,5 (le pH de la solution précipitée étant ajusté à une valeur de 5 à 7,5 à l'aide de N-ECl ou de N-HaCh et une résine cationique traitée par une solution tampon au phosphate d'un pH de 5 à 7,5 étant ajoutée à la solution précipitée dont le pH a été réglé), après quoi on filtre sur un gel le filtrat laissé quand les impuretés ont été adsorbées sur la résine échangeuse d'ions; on peut encore soumettre au traitement ci-dessus la couche surnageante obtenue après élimination du précipité résultant du réglage du pH d'un extrait de placenta humain à une valeur comprise entre 3 et 4 et ensuite à un pH neutre. On obtient ainsi un inhibiteur d'urokinase purifié.Le placenta humain dont il est question dans la présente invention est un placenta congelé immédiatement après la délivrance et maintenu dans cet état jusqu'au moment même de l'extraction et de la purification. Entant donné qu'il est sensiblement impossible d'obtenir au même moment un grand nombre de placentas frais, les placentas utilisés comme matière de départ sont habituellement ceux qui ont été conservés à l'état congelé. Un inhibiteur d'urolinase purifié conformément à la présente invention a pour effet de prévenir les symptômes hémorragiques par administration parentérale préalable dans les cas où l'on prévoit une activation excessive du système fibrinolytique, par exemple dans le cas d'une délivrance anormale et dans les opéra- tions des poumons, de la prostate, etc... L'activité d'inhibition de l'urokinase est mesurée de la façon suivante. L'addition de thrombine au fibrinogène donne de la fibrine, sous forme d'une masse coagulée, et une coagulation en couche mince dans un récipient disposé horizontalement donne ce qu'on appelle une plaquette de fibrine. Si on place une goutte d'une solution d'urokinase sur la plaquette de fibrine et qu'on fait incuber dans un incubateur à 370C, recouvert d'une manière appropriée, la plaquette de fibrine se dissout en donnant une masse circulaire de dimensions diverses, qui dépendent de l'activité de l'inhibiteur d'urokinase.Si le produit des deux diamètres perpendiculaires du cercle résultant de la dissolution est défini comme étant la zone de lyse, il existe une relation nette entre l'activité d'urokinase de la solution et la zone de lyse, pour un volume déterminé de la solution d'urokinase et pour un temps d1in- cubation défini, à 370C. De ce fait, si la zone de lyse sur la plaquette de fibrine, obtenue en mélangeant des volumes égaux d'une solution d'urokinase ayant une activité définie et d'un échantillon, est inférieure à celle qu'on obtient avec un mélange de volumes égaux de ladite solution d'urokinase et d'une solution dans un solvant approprié, par exemple, une solution physiologique à 0,9, on estime que l'échantillon inhibe l'activité d'urokinase. Le degré d'inhibition est déterminé d'après la concentration connue d'un échantillon assurant une inhibition de 50f"o de l'activité d'urokinase, dans un mélange en volumes égaux d'une série de dilutions de l'échantillon et d'une solution d'urokinase. Dans le procédé utilisé par la demanderesse, une solution d'urokinase a une activité de 20 unités Ploug par ml. Une quantité inhibant 1 unité Ploug de l'activité d'urokinase est définie comme 1 unité d'inhibition, et on calcule une unité d'inhibition par ml de l'échantillon en multipliant par 10 le facteur de dilution de l'échantillon qui détermine une inhibition de 50%. EXENPIE On ajoute 50 litres de solution physiologique à 0,9%0 à 200 placentas humains conservés à l'état congelé, dès le moment de la délivrance, et on émince finement la masse en utilisant un hachoir à viande, ce qui favorise la décongélation. On y ajoute encore 150 litres de solution physiologique à 0,9 > 0 et on mélange parfaitement, tout en agitant. On centrifuge le mélange et on obtient une couche surnageante (extrait) après séparation des matières solides. L'extrait Per se peut être utilisé en vue d'un traitement ultérieur mais, étant donné qu'un extrait dilué de façon appropriée est plus facilement purifié, on le dilue à 5 fois son volume avec de l'tu. Tout en agitant l'extrait dilué, on l'ajuste au pH- 3,5 avec de l'acide chlorhydrique et on l'ajuste de nouveau au pH 7 avec de la soude caustique, après 30 minutes, ce qui donne un précipite. On sépare ce dernier par centrifugation. Le précipité comprend principalement un mucopolysaccharide. L'élimination de cette substance permet de conduire plus facilement la suite du procédé. Le pH de traitement du côté acide est compris de façon appropriée entre 3 et 4, étant donné que la réduction d'activité est importante à un pH de 3 ou moins et que l'élimination du mucopolysaccharide est insuffisante à un pH de 4 ou plus. On ajoute du sulfate d'ammonium à la couche surnageante jusqu'à un taux de saturation à 50% de ce sulfate et on recueille le précipité obtenu par filtration ou centrifugation. Si la concentration finale de ce précipité correspond à une saturation de 30% ou plus, on peut faire précipiter l'inhibiteur d'urokinase, mais un résultat optimal est obtenu avec une saturation de 50%. Pour éliminer le sulfate d'ammonium du précipité recueilli, on met ce précipité en suspension dans une petite quantité d'eau, on place la suspension dans un tube en cellophane et on la dialyse contre de l'eau. Lorsque le sulfate d'ammonium a été complètement éliminé, on sépare le résidu subsistant encore sous forme d'une matière insoluble et on recueille une couche surnageante. On y ajoute la résine "CM-Sephadex" (produit de Pharmacia, Suède) équilibré au pH 6,2 avec une solution tampon au phosphate 0,01 M, à raison de 200k en poids/volume (poids sec), après quoi on melange parfaitement et on filtre. On recueille un filtrat, en laissant la résine 'CM-Sephadex" sur le papier filtre.Le pH dans lequel le traitement par la résine CM-Sphadex est exécuté ne doit pas entre nécessairement limité à un intervalle particulièrement étroit et il est de préférence compris entre 5 et 7,5, étant donné qu'un inhibiteur d'urokinase est fortement adsorbe à un pH égal ou in férieur à 5 et que l'effet de purification n'est pas obtenu à un pH de 7,5 ou plus.On peut également utiliser une résine échan geuse de cations autre que la résine "CSS S e phadex", par exemple du phosphate de cellulose ou la résine "Amberlite IRO-SO" , mais l'effet de purification est plus net avec la résine "CM-SephadextO On concentre le filtrat de toute façon appropriée, par exemple par lyophllisation, et on le filtre en utilisant une colonne de résine "Sephadex G-i 50" (produit de Pharmacia, Suède).On élue tout d'abord une fraction comprenant la protéine et le constituant pigmenté, puis ensuite une fraction ayant une activité d' inhibi- tion de 1 'urokinase et une fraction ayant une grande activité d'inhibition de l'urokinaseO La filtration peut être effectuée en utilisant la résine "Sephadex G-100" ou "Sephadex G-200" ou encore le produit UBio Gel" (produit de Bio - Rad C, E.U.A.). A titre de solvant d'élution, on peut utiliser une solution tampon dont le pH est voisin de la neutralité, par exemple une solution tampon au phosphate 0,05 M, au pH 6,80 On stérilise la fraction obtenue par filtration sur colonne, on la filtre et on conserve le filtrat tel quel ou après lyophilisation. On l'administre dans le cas d'une délivrance anormale ou dans le cas dtopérations du poumon, de la prostate,etc.,o Le taux de récupération et l'effet de purification d'un inhibiteur d'urokinase dans le procédé, depuis l'extrait placentaire, qui est une matière brute, Jusqu'à la fraction recueillie après filtration sur colonne, sont généralement les suivants. La quantité d'inhibiteur dturokinase extraite de 200 placentas est de 3 à 4 x 108-unités et celle qui est récupérée après filtration sur colonne est comprise entre 4 et 6 x 106 unités, le taux de récupération étant ainsi de 10 à 15 Sto Pour connaltre l'indice de purification, on détermine l'activité d'inhibition pour chacune des absorptions aux longueurs d'ondes comprises entre 2800 et 4100 A . La première quantité exprime une activité spécifique uniquement d'après la quantité de protéine et la seconde exprime une activité spécifique d'après le degré de pigmentation.L'activité o spécifique d'après l'absorption à une longueur d'ondes de 2800 A est augmentée de 40 à 50 fois et celle qui est calculée d'après l'absorption à une longueur d'ondes de 4100 A est augmentée de 150 à 200 fois. L'injection intraveineuse de 400 unités d'un inhibiteur d'urolcinase purifié à 10 souris ayant un poids moyen de 20 g environ n'apporte pas d'anomalies. il a été constaté, d'après le calcul du poids vif, qu'environ un million d'unités peuvent dtre administrées aux adultes en toute sécurité, Etant donné que le résidu de la centrification du placenta dont un extrait a été prélevé par le procédé décrit dans l'exemple contient encore 5 à 10* d'inhibiteur d'urokinase, on peut soumettre l'inhibiteur à une extraction et une purification ultérieures par un procédé similaire. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un inhibiteur d'urokinase purifié à partir d'une fraction hydrosoluble extraite du placenta humain à l'aide d'eau ou d'une solution saline, caractérisé en ce qu'il consiste à former un précipité par addition à cette fraction hydrosoluble de sulfate d'ammonium en quantité telle que sa concentration finale soit égale à 30% ou plus de son taux de saturation, à ajouter une résine échangeuse de cations à la fraction précipitée remise en solution après élimination du sulfate d'ammonium, ce à un pH compris entre 5 et 7,5, et à effectuer enfin une filtration sur gel du filtrat obtenu, afin d'adsorber sur ce gel les impuretés contenues dans le mélange. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à l'addition de sulfate d'ammonium, on élimine de ladite fraction hydrosoluble le précipité obtenu par réglages successifs de son pH, d'abord à une valeur comprise entre pH 3 et pH 4, puis à pH neutre. 3. L'inhibiteur d'urokinase purifié obtenu selon le procédé qui fait l'objet de l'une quelconque des revendications 1 et 2.