Brevet FR2035036A1 — publié le 19701218

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique qui sera désigné par la suite SL J>¥40. L'invention concerne également un procédé de préparation de cet antibiotique ainsi que son application en thérapeutique, à titre de principe ' 5 actif d'un médicament. Le nouvel antibiotique SL 3^0 présente les caractéristiques suivantes: Il s'agit d'une huile visqueuse incolore présentant 20 un pouvoir roratoire spécifique [a]D égal à -247,5° (c = 0,3 10 dans le benfeène). L'analyse élémentaire donne la composition centésimale suivante: C - 64,3 H = 7,7 *î N = 10,3 £ . Spectre ultra-violet: absorption finale, épaulements à 235 nm (log £' = 0,8) et à 283 nm (log £' = 0,57) dans le méthanol. La 15 figure 1 du dessin annexé représente le spectre ultra-violet du nouvel antibiotique. Spectre infra-rouge: bandes, entre autres, â 1685 et 1635 cm"1 dans le chlorure de méthylène. La figure 2 du dessin annexé représente le spectre infra-rouge du nouvel antibiotique. 20 Selon le procédé de l'invention, pour préparer le nouvel antibiotique SL 3440 on cultive une nouvelle souche de Diheterospora chlamydosporia dans un milieu nutritif, on isole l'antibiotique de la bouillie de fermentation, par exemple par extraction ou adsorption, et on le purifie selon les méthodes 25 habituelles. La nouvelle souche de Diheterospora chlamydosporia, utilisée dans le procédé conforme à l'invention, a été isolée d'un prélèvement de terre provenant d'Italie. Un exemplaire de cette souche a été déposé, sous le n° NRRL 3472, au "United 30 States Department of Agriculture" (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Illinois/USA. La nouvelle souche de Diheterospora chlamydosporia se développe à une température de 18 à 27° dans un milieu gélosé contenant de la peptone, du glucose, de l'extrait de malt et de 35 l'extrait de levure, en formant un mycélium aérien court de teinte blanche. Sur la face arrière de la colonie, le substrat est coloré 7009485 2 2035036 en brun-jaune. Du point de vue morphologique et physiologique, la souche NRRL 3^72 correspond à la description donnée par G.L. Barron et A«H.S. Onions dans Canadian Journal of Botany, 44, 5 861-869 (1966). La nouvelle souche MRRL 3^72 de l'espèce Diheterospora chlamydosporia peut être cultivée sur des milieux nutritifs très variés qui contiennent les matières nutritives usuelles. C'est aîssi que cette souche utilise les matières nutritives couramment 10 employées par les organismes hétérotr-opîies, par exemple le glucose, 1'amidon, les dextrines, le lactose, le saccharose etc., comme source de carbonej des"composés azotés organiques ou minéraux, tels que les peptones, les extraits de levure ou de viande, le sulfate dc ammonium, le nitrate d'affiffloïiius, les amino-aci&es etc», 1? comme source d'azote, ainsi que les sels minéraux et les oligoéléments usuels. Pour préparer lé nouvel antibiotique, on peut procéder comme suits On ensemence un milieu nutritif liquide avec une sus-20 pension de spores de la nouvelle souche de Diheterospora chlamydosporia et on incube la culture pendant environ 8 jours à 18°. La culture peut être effectuée sous des conditions d'aérobiose, en culture superficielle ou en culture submergée et agitée ou dans un fermenteur avec passage d'un courant d'air ou d'oxygène et 25 sous agitation. Aussitôt qu'une quantité maximale d'antibiotique a été produite, on filtre et on récupère l'antibiotique selon les méthodes habituelles, par extraction et/ou par adsorption, à partir de la solution de culture débarrassée du mycélium. Selon une méthode qui s'est révélée particulièrement 30 appropriée, on extrait la solution de culture débarrassée du mycélium avec du chlorure d'éthylène; cependant, on peut également employer d'autres solvants organiques, tels que le benzène, le chloroforme, l'acétate de butyle, le chlorure de méthylène ou le butanol. A partir de 1'extrait brut, on peut isoler le nouvel 35 antibiotique par chromatographie. Le nouvel antibiotique possède une action fongistatlque 7009485 5 2035036 très puissante vis-à-vis de différents agents pathogènes responsables des mycoses. Il y a lieu de signaler en particulier la bonne activité du nouvel antibiotique qu'on a observée "in vitro" contre les' 5 organismes indiqués dans le tableau suivant: Organisme i Concentration inhibitrice minimale en )ig/ml 10 § Trichophyton mentagrophytes 10 Histoplasma capsulatum 10 Trichophyton tonsurans .10 Trichophyton rubrum 10 Epidermophyton floccosum 10 15 Microsporura canis 10 Microsporum audouinii 10 Histoplasma duboisii 10 Beastomyces brasiliensis 10 Beastomyces dermatitidis 1 20 Sporotrichum schenkii 100 Le nouvel antibiotique exerce en outre une forte action cytostatique. Cette action a été déterminée "in vitro", sur le mastoeytome P-S15 de la souris, par l'inhibition que le composé 25 exerce sur la multiplication des cellules tumorales. Dans une solution nutritive appropriée, ces cellules se multiplient en 40 heures jusqu'à atteindre quatre fois ou même cinq fois leur nombre primitif. La DE^q, c'est-à-dire la concentration pour laquelle la multiplication cellulaire est abaissée de 50$, est de 30 0,0004 yg/ml. L'activité du nouvel antibiotique contre les tumeurs expérimentales a été déterminée "in vivo" sur des tumeurs inoculées à des rats. Administré par voie intrapéritonéale à la dose quotidienne de 30 à 120 mg/kg, le nouvel antibiotique inhibe le 35 carcinosarcome de Walker. Le nouveau composé de l'invention peut donc être utilisé 7009485 4 2035036 en thérapeutique comme agent fongistatique ou cytostatique. La dose à administrer dépend de l'effet désiré ainsi que de l'application envisagée. Pour l'application par la voie orale, les formes d'administration appropriées contiennent de 20 à 1000 mg de -5 principe actif en mélange avec des supports solides ou liquides. Pour l'application topique, on peut utiliser des poudres, des liquides pour pulvérisation, des pommades ou des teintures contenant de 0,1 à 2% de substance active. En tant que médicament, l'antibiotique SL 3440 de 10 l'invention peut être utilisé sois seul, sous forme d'une huile ou de concentré brut, soit sous forme de préparations médicamenteuses appropriées pour l'administration orale ou l'application topique. On prépare les formes médicamenteuses appropriées en mélangeant l'antibiotique avec des excipients minéraux ou organi-15 ques indifférents du point de vue pharmaceutique. Comme excipients on utilisera par exemple: pour des comprimés et des dragées: le lactose, l'amidon, le talc, l'acide stéarique etc.; pour des sirops : le saccharose, le sucre inverti. 20 des solutions de glucose etc.; pour des pommades : l'eulénine, la glycérine, la vaseline, l'huile de paraffine etc.. Outre la substance active, les préparations peuvent 25 contenir des agents de conservation, des stabilisants, des mouillants, des auxiliaires de dissolution, des édulcorants, des colorants, des aromatisants etc., appropriés. L'exemple suivant illustre la présente invention, sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont toutes 30 exprimées en degrés centigrades. EXEMPLE: Dans un fermenteur, on introduit 10 litres d'une solution nutritive contenant par litre: 40 g de cérélose 35 5 g de tryptone 3 g de NaNO, mm 7009485 5 2035036 1 g de K2HP04 500 mg' de KC1 500 mg de MgSO^ . 7 H^O 10 mg de FeSO^ . 7 HgO 5 et pour le.reste de l'eau déminéralisée. On ensemence cette solution nutritive avec une suspension de spores de la souche NRRL 3^72 de Diheterospora chlamydosporia et on incube pendant 8 jours â 18°, -coût; en aérant (1,0 litre d'air/min./litre de solution nutritive) et tout en 10 agitant (30t) tours/min.)* On sépare le mycélium et on extrait le filtrat de culture avec du chlorure d'éthylène. On chromatogra-phie l'extrait brut sur gel de silice Merck (dimension des grains: 0,05 à 0,2 mm) et on élue la substance active avec un mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 99:1. 15 La suspension de spores utilisée pour l'ensemencement est préparée à partir d'une culture de la souche initialement isolée que l'on incube pendant. 8 jours à 27° sur un milieu de gélose dont la composition est la suivante; 20 g de cérélose 20 20 g de gélose filiforme 2 g d'extrait de malt (Schweiz. Ferment AG) 2 g d'extrait de levure 2 g de peptone 2 g de KH2P0^ 25 2 g de MsSOj, . 7 H„0 T d. et de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume de 1 litre. 7009485 6 2035036 REVENDICATIONS 1.- Le nouvel antibiotique SL 3440 qui présente les caractéristiques suivantes : - Huile visqueuse incolore. 5 - Analyse élémentaire: C = Sksjâ3 H = 7,7#, N = 10,3& o Q - Pouvoir rotatoire spécifique; [aîD - -247,5° (c = 0,3 dans le benzène), - Spectre ultra-violât: _ absorption finale, épauleraents à 235 niï (log £ J = 0,8 ) et le- à 283 tm (log £' = 0,57) (dans le méthanol), - Spectre infra-rouge: bandes- entre autress à 1685 et- 1635 cm"1 (dans le chlorure de méthylène). 1% 2 a« ïïn procédé de préparation du nouvel antibiotique SL 3^40 spécifié à la revendication 15 caractérisé en ce qu'on cultive la nouvalie souche NRRL 3472 de l'espèce IXiibaterospora chlamydospo-» ' ria dans un sailieu nutritif, oa isole 13antibiotique SL 3440 du. Edliei: aitri&if et on le purifie. 20 3»- Un médicament exerçant, notamment, une action fongistatique, caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, le nouvel antibiotique SL 3440 spécifié à la revendication 1. 4.- Un médicament exerçant, notamment, une action cytostatique, caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, le 25 nouvel antibiotique SL 3440 spécifié à la revendication 1. 5.- Une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient l'antibiotique SL 3440 spécifié à la revendication 1 en mélange avec des excipients et supports acceptables du point de vue pharmaceutique.