Brevet FR2018309A1 — publié le 19700529

Cette invention concerne des nouveaux stéroSdes physiologiquement actifs, des méthodes pour les préparer et des nouveaux intermédiaires intéressants dans ladite préparation. Plus particulèrement, cette invention concerne les stéroïdes de formule dans laquelle R et R' sont choisis dans le groupe constitué par l'hydrogène et le radical acyle. On connait les composés dans lesquels la position li est alpha-substitudecomme on peut le voir facilement dans une revue du brevet E.U.A. N 3.330.861. Cependant, la formation des composés orientés en ll-beta correspondants, si elle est possible, nécessiterait de nombreux stades de réaction chimiques. La présente in Invention a pour but la préparation, par une- méthode de fermetation simple et efficace, de composés qu'on ne peut obtenir autrement. Les radicaux acyle préférés sont ceux des acides carboxyliques hydrocarbonés à moins de douze atomes de carbone, comme par exemple les acides alcanoiques inférieurs (par exemple, les acides acétique, propionique, butyrique et tert-pentanoque), les acides alcénoiques inférieurs, les acides aryl carboxyliques monocycliques (par exemple, les acides benzoique et toluique), les acides alcanotques inférieurs arylés monocycliques (par exemple, les acides phénacétique et -phénylpropionique), les acides cycloalcane-carboxyliques et les acides cycloalcène-carboxyliques. Les nouveaux composés de cette invention sont des substances pharmacologiquement actives qui -possèdent une activité anti-androgène (c'est-à-dire qu'elles inhibent l'faction des androgènes), et qui peuvent être utilisées dans le traitement de cas tels que l'acné hyperandrogène. Les composés peuvent etre formulés pour entre ainsi administrés, la concentration et/ou le dosage étant basé sur l'activité du composé particulier et les besoins du patient. Généralement, on peut formuler les composés en utilisant de 0,01 à environ 1,0 mg/kg de poids du corps et on peut les appliquer dans des formulacions utilisables par vicie orale ou par voie topique chez l'homme ou chez les animaux (par exemple, vaches, chiens, chats, etc.). Les produits finals de la présente invention peuvent être préparés par la méthode de cette invention qui comporte un certain nombre de stades utilisant la 17t-hydroxy-A-norprogestérone comme substance de départ. Le procédé de la présente invention peut être représenté par les équations suivantes dans lesquel-les R et R' sont tels qu'ils ont été définis précédemment ici; CH CH j3 C=o c=O o Èoe[ÉOH HO OH o ÀÉ 1 -/ C. ~~ I CN A A CH O. c=O RO OR - OR' RO - OR' ~Y I s X I I ,/ . B C R=acyle, R'=acyle R=acyle, R'=hydrogène On a trouvé qu'un nouveau composé intermédiaire (composé A) de cette invention, à savoir la 11ss-17&alpha;-dihydroxy-A-norprogestérone peut être prépare à partir de la substance de départ en soumettant cette dernière à l'action d'un micro-organisme du genre Curvularia ou à l'action de ses enzymes dans des conditions oxydantes et de préference aérobies. Pour préparer les composés de cette invention, on peut soumettre le réactif de départ tout d'abord à l'action des enzymes d'un micro-organisme du genre Curvularia dans des conditions oxydantes. On peut effectuer, au mieux, cette oxydation soit en introduisant le réactif de départ dans une culture aérobie du micro-organisme, soit en mettant ensemble dans un milieu aciueuxr les composés, de l'air, et des enzymes de cellules non proliférantes du micro-organisme. En général, les conditions de culture du micro-organisme pour les besoins de cette invention sont (sauf en ce qui concerne l'introduction de la substance de départ à transformer) les mêmes que les conditions de culture de divers autres micro-organismes pour la production d'antibiotiques, et d'autres substances analogues. On cultive le micro-organisme en aérobiose au contact (dans ou sur) d'un milieu de fermentation convenable. Un milieu convenable comprend principalement une source de carbone et d'éner gie.Celle-ci peut être un glucide, par exemple, mélasses,glucose, n.Ltose, amidon ou dextrine, un acide gras, un corps gras et/ou le composé lui-même. De préférence, cependant, le milieu comprend une source assimilable de carbone et d'énergie en plus des stéroides.Parmi les corps gras utilisables pour le besoin de cette invention se trouvent l'huile de saindoux, l'huile de soja, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile d'arachide, l'huile de coprah, l'huile de mats, l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile de palme brute, le suif de mouton d'élevage, l'huile de baleine, l'huile d'olive, la tristéarine, la tripalmitine, la trioléine et la trilaurine. Panai les acides gras utilisables pour le besoin de cette invention se trouvent l'acide stéarique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide linoléique et l'acide myristique. La source de facteurs azotés utilisables pour les besoins de cette invention peut être organique (par exemple farine de soja, liqueur de cornsteep, extrait de levure, extrait de viande et/ou produits solubles de distillation) ou synthétique (c'est-àdire, constituée de composés organiquEsou inorganiques simples, synthétisables, tels que les sels d'ammonium, les nitrates alcalins, les acides aminés ou l'urée). Il faut maintenir un apport d'air stérile convenable pendant la fermentation, par exemple, par les méthodes conventionnelles consistant à exposer une large surface de milieu à l'air ou par l'utilisation de cultures aérées immergées. On peut ajouter le composé à la culture pendant la période d'incubation, ou l'introduire dans le milieu avant la stérilisation ou l'inoculation Le domaine de concentration préféré (mais non limitatif) du composé dans la culture est d'environ 0,01%. La durée de culture (ou plutôt le temps pendant lequel le composé ost soumis a l'action de l'enzyme peut varier considérablement, e domaine d'environ vingt quatre à quatre vingt seize heures étant réalisable, mais non limitatif. Ensuite on acyle le composé A pour former les nouveaux composes B tel qu'en traitant par un anhydride d'acide, par exemple, l'anhydride acétique en présence d'acide perchlorique pour obtenir les dérivés 11ss,17&alpha;-diacyloxy. On peut ensuite traiter ce dernier composé par une base faible, telle qu'un carbonate de métal alcalin, par exemple, le carbonate de potassium ou le carbonate de sodium pour obtenir les dérivés 11ss-acyloxy-17&alpha;-ol de la présente invention. L'invention peut être illustrée par les exemples suivants; toutes les températures sont en degrés centigrade sauf spécification contraire Exemple 1 11ss,17&alpha;-dihydroxy-norprogestérone (A) Fermentation - On met en suspension dans 5 ml d'une solution aqueuse de lauryleulfate de sodium à 0,01% la partie superficielle de chacune de 2 cultures de Curvularia lunata (NRRL -2380), âgées de deux semaines, sur tubes de gélose inclinés, les tubes inclinés contenant comme milieu nutritif (A) Grammes Glucose 10 Extrait de beurre 2,5 K2HP04 1 Gelose 20 Eau distillée pour un litre On utilise des portions de 1ml de cette suspension pour ensemencer huit flacons d'Erlenmeyer de 250 ml, chacun d'eux contenant 50 ml du milieu stérilisé suivant (B) Grammes Glucose 30 Farine de soja 20 Huile de soja 2,2 CaCO 2,5 Eau distillée pour un litre Aprés environ 48 heures d'incubation à 25 C, avec agitation rotative eontwnue (230 cycles/minute; oscillation de 5 cm), on transporte des fractions de 10% (vol./vol.) dans tre@te qua@re flacons d'@rlenmeyer @e 250 ml, chacun d'eux contanaut 50 ml du limieu sté@@lise suivent (C) :: Grammes Liqueur de cornsteep 6 3 Extrait de beurre 2,5 Dextrose 10 CaCO3 2,5 Eau distillée pour un litre On ajoute ensuite le stércide (300 microgrammes/ml) en introduisant dans chaque flacon 0,25 ml solution stérile (60 mg/ml) de 17@-hydroxy-A-norprogestérone dans N,N-diméthylformamide. Au total, 510 mg sont fermentés. u bout d'environ cinq jours d'incubation supplémentaire dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment, on rassemble le contenu des flacons et ensuite on filtre le bouillon de culture à travers un tampon filtrant Seitz. On lBve les flacons, le mycélium et 1e tampon avec des doses successives de 100 ml d'eau chaude. Le filtrat et le liquide de lavage réunis ont un volume de 1800 ml. (B) Isolement On extrait le filtrat ainsi obtenu, par le chloroforme (3 x 600 ml). On lave les extraits chloroformiques avec de l'eau t3 x 600 ml), on les sèche sur sulfate de sodium et o,n les évapore à s~: On chromatographi 1 r- résidu ur de l'alumine neutre (activité V) on utilisant du chloroforme contenant 3% de méthanol comme solvant de developpement. L'extraction de la substance dennant la principale bande U.V., par l#acétate d'éthyle donne un mélange de produits que lton purifie encore par chromatographi sur gel de silice en utilisant l'acétate d'éthyle comme solvant de développement.L'extraction de la substance correspondant à la principale hande U.V. par de l'acétate d'éthyle contenant 20% de méthanol, l'évaporation, et la cristallisation du résidu dans le mélange méthanol-éther isopropylique donne la 11ss,17&alpha;-dihydroxy-A- norprogestérone, p.f. 208-209 . La recristallisation dans le mélange méthanol-éther isopropylique donne l'échantillon pour an@@@@@, p.f. 210-211 , KBr 2,87, 5.88 5,99 et 6,20 @@@@ 5 @ @@-Me; 7,72 (s, 21-@@ @@ @@@@@ @ulée pour C20H28O@ : C @,@@; @ 8,4. @routé : C : 72,27. h: 8,49 Exemple 2 11ss,17&alpha;-Diacétoxy-A-norprogestérone On traite une solution de 400 mg de 11ss,17&alpha;-dihydroxy-A-nor- progestérone dans 3 ml d'anhydride acétique par une goutte de HClO4 à 70%, on agite à la température ambiante pendant 0,5 heure, on dilue avec de l'eau et on extrait par le chlooforme.On lave les extraite chloroformiques avec une solution de sel à 8%, on les séche et on les évapore sous vide pour obtanir la 11ss,17&alpha;- diacétoxy-A-norprogestérone. #TMS CDCl3 9,20 (s, 18-Me), 8,77 (@ @@-Me 8,01 @ 11ss-OA@), 7,99 (s, 21-Me), 7,93 (s, 17&alpha;-OAc), 4,65 (m, 11&alpha;-H) et 4,32 (s, 3-H). Exemple 3 11ss-acétoxy-17&alpha;-A-norprogestérone On agite, à la temptérature ambiante pendant 18 heures, une solution de 33 mg de 11ss,17&alpha;-diacétoxy-A-norprogestérone dans 20 ml de méthanol et 4 ml de solution de carbonate de potassium à 10%, on la neutralise par l'acide acétique et on la concentre. On dilue le résidu par l'eau et on l'extrait par le chloroforme. On lave les extraits chloroformiques avec une solution saline à 8%, on séche et on évapore. La chromatograhpie sur plaque du résidu, sur gel de silice, à l'aide du mélange chloroforme-acétate d'éthyle (1:1) comme solvant de développement et l'élution de la substance correspondant à la prinncipale bande U V. par l'acétate 'éthyle, sui@i@ de évaporation et de la cristallisation dans le mélange acétate d'éthyle-éther isopropylique donne 113 mg de 11ss-acétoxy 17&alpha;-hydroxy-A-norprogestérone p.f. 191-193 . La recristallisation dans le mflange acétate d'éthyle-éther isopropylique donne l'échartillon d'analyse, p.f. 194-196 : @ KBr 2,91, 2,97, 5,75, 5,78, 5,6@, 5,96, et 6,17 ; # EtOH 231 m (# =16.000); #CDCl3 TMS 9,13 (s, 18-Me), 8,79 (s, (19-Me), 8,00 (s, 11ss-OAc), 7,79 (s, 21-CH3), 4,68 (11&alpha;-H), 4,35 (s, 3-H). Analyse: calculée pour C22H30O5 : C : 70,56; H: 8,08 Trouvée : C : 70,57; H: 8,10 On peut réaliser l'invention de diverses autres maniéres dans les limi@@@ les evendications a@@@@@es. R E V E N D I C A T I O~M S 1. Un composé thérapeutiquement actif ayant le formule dans laquelle R et R' sont identiques ou différents et représentent l'hydrogène ou un radical acyle. 2. La 11ss, 17-dihydroxy-A-norprogestérone. 3. La 11ss, 17&alpha;-diacétoxy-A-norprogestérone. 4. La 11ss-acétoxy-17&alpha;-hydroxy-A-norprogestérone. 5.Procédé pour la préparation d'un composé thérapeutiquement actif ayant la formule dans laquelle R et R' sont identiques ou différents et représentent l'hydrogène ou un radical acyle, qui consiste à soumettre la 17 -hydroxy-A-norprogestérone à l'action d'un micro-organisme du genre Curvularia et, si nécessaire, à acyler la 11ss, 17&alpha;-dihydroxy- A-norprogestérone résultante et, si c'est encore nécessaire, à traiter la lla, 17a-diacyloxy-A-norprogastérone par une base faible. 6. Le procédé de la revendication 5,dans lequel le microorganisme est Curvularia lunata. 7. Le procédé de la revendication 5 ou 6, dans lequel on soumet la 17&alpha;-hydroxy-A-norprogestérone à l'action du micro-organisme Curvularia lunata et on recueille la lla, 17&alpha;-dihydroxy-A- norprogestérone. 8 Le procédé de la revend cation 5, ou 6, dans lequel on voum-t la 17&alpha;-hydroxy-A-norprogestérone a 1 action du micro-orga nisme Curvularia iunata et on traite 1a 11ss,17&alpha;-dihydroxy-A-nor- progestérone résultante par l'anhydride acétique pour obtenir la 11ss,17&alpha;-diacétoxy-A-norprogestérone. 9. Le procédé de la revendication 5, ou 6, dans lequel on soumet la l7-hydroxy-A-norprogestérone à l'action du micro-organisme Curvularia lunata, on traite la 11ss,17&alpha;-dihydroxy-A-norpro- gestérone résultante par l'anhydride acétique et on traite la Ilp,l7-diacétoxy--norprogestérone ainsi produite par une base faible pour former la 11ss-acétoxy-17&alpha;-hydroxy-A-norprogestérone. 10. Une composition anti-androgène contenant, comme ingrédient actif, un composé selon la revendication 1, ou 2, ou 3, ou 4.