Brevet FR2029462A1 — publié le 19701023

La présente invention a pour objet m procédé de pré- A 4- paration, par voie microbiologique * de 6-hydroxy-3-oxo- A -stéroïdes des séries du prégnane et de 1'androstane, procédé caractérisé en ce que l'on fait fermenter un 30-hydroxy ou 3(3-5 acyloxy-5 , 6-époxy-stéroïde à cycle A saturé, appartenant à la série du prégnane ou à celle de 11androstane, avec des bactéries du genre Flavobacterium ou du genre Pseudomonas, ou encore avec les enzymes produits par ces germes. Des micro-organismes particulièrement appropriés sont ceux appartenant à l'espèce 10 Flavobacterium dehydrogenans, ainsi qu'à l'espèce Pseudomonas fluorescens. Pour le procédé conforme à l'invention, le stéroïde de départ doit comporter un groupe 30-hydroxy ou 3(3-acyloxy, et, en outre, un cycle 5• 6-époxydique ayant 15 la configuration a ou p. Le stéroïde de départ peut également contenir d'autres substituants de nature quelconque, p^r example des groupes hydroxyles, libres ou transformés en dérivés fonctionnels, par exemple en positions 1a, 11a, 113, 14a, 15a» 16, 17 et/ou 21, de préférence des groupes alkyles infé-20 rieurs, par exemple en positions 1a, 2a, 7 Dans le produit obtenu par le procédé de l'invention le groupe hydroxylique introduit en 6 présente la configuration du cycle époxydique en 5»6 dans le stéroïde de départ. 30 On réalise la transformation par voie microbiologi que selon des procédés connus. C'est ainsi qu'on détermine d'abord analytiquement - en particulier par chromatographie en couches minces -, au cours d'essais préliminaires des types couramment utilisés, les conditions de fermentation les plus 35 favorables, par exemple le choix du milieu nutritif le plus avantageux, du solvant convenant pour le substrat, ,de la concentration du substrat, des conditions techniques telles température, aération, pH, agitation etc.», ainsi que des temps optimums pour la germination et l'addition du substrat.* et 40 aussi la durée du contact. 70 02614 2 2029462 Au stade de fabrication, on cultive le micro-organisme dans le milieu nutritif, en submersion et dans des conditions d'aérobiose, puis on le multiplie et on ajoute le substrat sous forme de suspension ou de solution, tout ceci en 5 tenant compte des résultat^ de l'essai préliminaire. On suit l'évolution de la fermentation par analyse au moyen de la chro-matographie en couches minces. Une fois la fermentation terminée, on extrait du bouillon de culture le produit obtenu, à l'aide d'un solvant organique approprié, puis on isole de 10 l'extrait le produit en question, par exemple par évaporation et par des procédés de purification connus, comme la recristallisation et/ou la chromatographie. L'invention permet de fabrication de manière simple des 6-hydroxy-3-oxo- A* -stéroïdes appartenant à la série du 15 prégnane ou à celle de 1'androstane, qui constituent des produits intermédiaires importants pour la préparation de stéroïdes doués d'activités hormonales, par exemple de 110-hydroxy-stéro-xdes présentant d'intéressantes propriétés pharmacologiques; certains de ces A^-stéroïdes peuvent même être utilisés direc-20 tement comme composés actifs dans des médicaments. Il était impossible de prévoir; même pour le spécialiste en la matière, que la réaction se ferait aisément et fournirait le composé cherché avec des rendements utilisables en pratique» 25 II résulte en effet des travaux de S.S Lee et ch. J. Sih [Biochem. 3, 1267 (1964)] que la fermentation de la 30-hydro3ty-5a.6a-époxy-androstane-l7-one avec des mycètes, par exemple avec Nocardia restrictus, ne convient pas pour l'introduction d'un groupe 6ot-hydroxyle, car la 6a-hydroxy- A* -andros-30 tène-3.17-dione, qui est le produit souhaité, ne se forme que dans une faible proportion (rendement maximum : 15%), et il apparaît de façon prédominante, par ouverture d'un cycle, des 9.10-seco-stéroïdes. Les 30-hydroxy- ou 30-acyloxy-5«6-époxy-stéroïdes 35 nécessaires pour la réalisation du proôédé de l'invention se préparent à partir des 3-hydroxy- ou 30-acyloxy- A^-stéroïdes correspondants dont on époxyde de manière connue la double liaison A5, par exemple au moyen de peracides. La préparation des stéroïdes de départ est a exposée 4-Q ci-dessous de façon plus détaillée, en prenant comme exemple 70 02614 3 2029462 la 33-hydroxy-21-acétoxy-16oc-méthyl- -^-prégnène-20-one * On dissout 60 g de 33-hydroxy-2l-acétoxy-16oc-méthyl-A ^-prégnène-20-one dans 1,8 litre de chlorure de méthylène anhydre, puis on ajoute 12 g d'acétate de sodium ( fondu) et 5 40 g de sulfate de sodium (anhydre). A. une température de 2°, on ajoute goutte à goutte, en une demi-heure, tout en agitant, 36 ml d'acide peroxyacétique, puis on ajoute encore 12 g d'acétate de sodium et 40 g de sulfate de sodium, après quoi on ajoute, goutte à goutte, également en une demi-heure,tout en •10 agitant, 36 ml d'acide peroxyacétique, puis on ajoute encore 12 g d'acétate de sodium et 40 g de sulfate de sodium, après quoi on ajoute, goutte à goutte, également en une demi-heure, un complément de 36 ml d'acide peroxyacétique. On continue l'agitation : au bout de 2 heures, la 15 solution réactionnelle s'est réchauffée jusqu'à la température ambiante. Après neutralisation au moyen de 1 litre d'une solution à 5% de? NaHCO^, sous agitation, on sépare la solution dans le chlorure de méthylène, on la lave à 1'eau, avec une solution de FeSO^ et de nouveau à l'eau, on la sèche sur Na2S0^ et on 20 la concentre à 40° sous pression réduite. On recristallise la fraction restante dans l'acétate d'éthyle. On obtient ainsi la 3P-hydroxy-21 -acé t oxy-5a • 6a-époxy-16a-mé thyl-pr é gxiane-20-one. Point de fusion ; 167—169°. Rendement : environ 85%. On obtient les acétates en 3 souhaités par époxyda-25 tion des A^-3-acétates analogues, ou par acétylation ultérieure des 30-hydroxy-5a.6oc-époxydes. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer la présente invention. Les températures y sont indiquées en degré Celsius. 50 EXEMPLE 1 ï 63-hydroxy-testololactone. On ensemence un erlenmeyer contenant 500 ml d'un milieu aqueux stérilisé, comportant 0,3% d'extrait de levure, 0,5% de liquide de macération de maïs et 0,2% d'amidon, dont le 35 pH a été ajusté à 7» avec une culture lyophilisée de Flavobac-terium dehydrogenans, après quoi on secoue pendant 48 heures, à une température de 30°, à raison de 145 tours par minutes On inocule 250 ml de la suspension bactérienne dans un fermenteur d'une capacité de 20 litres, contenant 14,75 litres d'une solu-40 tion nutritive stérilisée présentant la même composition, après 70 02614 2029462 quoi on agite pendant 24 heures, à 29% en faisant passer de l'air à raison de 1650 litres/heure, avec une vitesse de rotation égale à 220 tours par minute. On transvase 0,9 litre de ce produit de fermentation préliminaire dans un fermenteur d'une 5 capacité de 20 litres, contenant 15 litres d'un milieu stéri-lisé ayant la composition indiquée plus haut. Pour la fermenta-tien principale, les conditions techniques sont les mêmes que celles de la fermentation préliminaire. Pendant cette fermentation principale, on maintient le pH entre 6 et 7» Après une 10 phase de croissance d'une durée de 6 heures, on ajoute 5,75 g de 3 P-hydroxy-5j3. 60-époxy-testololactone dans 80 ml de diméthyl-formamide, puis on fait fermenter. On suit, l'évolution de la réaction en analysant par chromatographie en couches minces des extraits par la méthyl-isobutyl-cétone de plusieurs prélève-15 ments faits sur la culture. Au bout de 28 heures, la matière de départ a réagi en totalité. On extrait ensuite, par agitation, le bouillon de culture par la méthyl-isobutyl-cétone, puis évapore l'extrait à siccité sous pression réduite., à une température du bain au plus égale à 40°. On lave la fraction restan-20 te avea un peu d'hexane froid; on obtientaprès séchage, 3,2 g de produit brut. Après recristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol, puis dans un mélange d'acétate d'éthylè et d'éther isopropylique, on obtient 2,1 g (soit 58% de la quantité prévue par la théorie) de 6P-hydroxy-testololac-25 tone. Point de fusion : 222-224°; EXEMPLE 2 Ï • . ' 6a. 21 -dihydroxy—16a-méthyl- ^^-prégnène-3.20-dione. Dans les conditions décrites à l'exemple 1, à cette exception près que. le milieu utilisé pour la fermentation prin-30 cipale contient 1% d'extrait de levure et 0,77% dé- KE^PO^,. on. -fait fermenter,dans 15 litres d'un bouillon de culture de ' Plavobacterium dehydrogenans, 7*5 g de 3|3-hydroxy-2l -acétoxy— 5a.6a—époxy—16a-méthyl-prégnane—20-one dans 100 ml de diméthyl— formamide, Après un temps de contact de 33 heures, la matière 35 de départ est transformée. Le traitement complémentaire permet d'obtenir 3»2 g du produit brut, que l'on recristallise dans -l'acétate d'éthyle. Point de fusion : -177/179-181°; £ 239^*890 EXEMPLE 3 : * 6a-hydroxy-testolçlactone. 40 De la manière décrite à l'exemple 1, on fait fermen— 70 02614 5 2029462 ter, dans 15 litres d'un "bouillon de culture de Plavobacterium dehydrogenans, 3,75 S de 3P-hydroxy-5a.6a-époxy-testololactone dans 80 ml de diméthylformamide. Au bout de 25 heures, la matière de départ est transformée. Le traitement complémen-5 taire habituel permet d'obtenir un produit brut que l'on re— cristallise dans l'acétate d'éthyle, puis dans un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol. On obtient ainsi 2 g de 6a-hydroxy-testololactone. Point de fusion ï 264/269-272°; 6 238 = 15 700. 10 EXEMPLE 4 : 6(3-hydroxy- A ^-androstène-3 • 17-dione. On introduit une culture lyophilisée de Pseudomanas fluorescens (Biologische Bundesanstalt, Berlin) dans 20 ml d'un milieu aqueux stérile contenant 0,5% de glucose, 0,5% d'ex-15 trait de levure et 0,2% de liquide de macération de maïs (le pïï étant ajusté à 7), puis on secoue pendant 48 heures à 30°. On transfère 2 ml de la suspension bactérienne dans un erlen-meyer contenant 20 ml du même milieu. Au bout de 24 heures, on transfère 2 ml du bouillon de culture dans un erlenmeyer d'une-20 capacité de 100 ml, contenant 20 ml du même milieu. Après avoir secoué pendant 6 heures, on ajoute 4 mg de 33-hydroxy-5a.6a-époxy-androstane-17-one dans 0,2 ml de diméthyl—formamide puis on secoue pendant encore 42 heures à 30°. On extrait alors le bouillon de fermentation par la méthyi-isobutyl-cétone, 25 avec agitation, on examine un échantillon de l'extrait par chro matographie en couches minces, et on l'évalue en prenant comme élément de référence la 6a—hydroxy- -androstène-3 « 17-dione. . Le Rf est égal à 0,43 dans un mélange à 1:4 de benzène et d'acétate d'éthyle, sur plaques de gel de silice» selon 30 la méthode de Stahl. On obtient environ 60$ de produit transformé. - ' COPY 6 70 02614 2029462 REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de 6-hydroxy-3-oxo-stéroides appartenant à la série du prégnane ou à celle de 11androstane, caractérisé en ce que l'on fait fermenter un 5 30-bydroxy- ou 3(3-acyloxy-5»6-époxy—stéroïde à cycle A saturé, appartenant à la série du prégnane ou à celle de 1'androstane, avec des bactéries du genre Flavobacterium ou du genre Eteeudomonas, ou encore ies enzymes produits par ces germes. 2.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé 10 en. ce que l'on utilise des bactéries appartenant à l'espèce Fïavobacterium dehydrogenans. 3.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise des bactéries appartenant à l'espèce Bseudomonas fluoréscens. 15 4.- La 6a-hydroxy-testololactone. 5»- La 6a.21-dihydroxy-16a-méthyl- A^-prégnène- 3.20-dione. GOPY