Brevet FR2019434A1 — publié le 19700703

a présente invention concerne une méthode pour la production d'une protease alcaline par culture du Bacillus Licheniformis sur un milieu de culture approprié pour la production de ladite protease alcaline dans un bouillon de culture, et la récupération de cette même protease à partir du bouillon de culture précité. Jusqu'ici, l'emploi de bactériesappatenant au Bacillus subtilis est bien connu pour la production dune protease alcaline ayant une activité à la valeur optimum du pll dans la zone de haute alcalinité comme il est décrit dans le livre intitulé "Nature"", 170, 802 (1952) par M.Ottessen ou le "Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan", 33, 9 (1959) par Fukumoto ou le "Agr. Biol. Chem.", 30 , 1261 (1966) par Rumumoto ou "J. Biochem", 45 251 (1958) par Hagihara. Une telle protease alcaline est largement utilisée dans l'alimentation et pour d'autres Enjets industriels mais on doit noter -en outre, que la protease alcaline est produite par l'utilisation des souches-du Bacillus subtilis. a demanderesse a étudié l'activité de ltenzyme de différentes sortes de bactéries séparées du sol, et trouvèrent que certaines bactéries avaient une puissance considérable pour la production de proteasea Les bactéries furent tétées pour leurs propriétes' morphologiques, physiologiques et bactériologiques, d'après les procédés décrits dans le livre intitulé "Bergey's manual Qf Determinative Bacteriology, 7 the ad.'i et les inventeurs ont alors trouvé qu'elles se classifiaient et stidentifiaient aux bactéries appartenant au Bacillus lichenniformis. Jusqu'ici, une protease élaborée à partir du Bacillus licheniformis était décrite dans le livre intitulé "J. Biol. Chem.", 239, 538 (1964) par R. W. Bernlohr, et on y trouve que la pro teasen'.est pas génée par ltethylene diamine tetra-acétate (E.D.T.A.), et était analogue à la protease produite par le Bacillus subtilis quant à sa stabilité thermique, et son activité se situait dans le large domaine de pH allant des valeurs de 6,0 à 10,0 mais la valeur de pH optimum ne pouvait être citée précisément. Egalement, une enzyme dérivée du Bacillus licheniformis fut décrite dans le livre intitulé "3iochem. Acta", ffî, 99 (1955) par M. Damodaran, et on trouva dans cet ouvrage que l'enzyme consistait en une protease posEédant une valeur de pH optimum de 7, 4 et en une peptidase. En outre, une enzyme dérivée du Bacillus licheniformis fut traitée dans le livre intitulé "Arch. Biochem. Biophys.", 114, 145 (1966) par F. F. Hall, et on y trouva que l'enzyme consistàit en deux sortes de protease et une sorte de peptidase et que la protease en milieu de culture à base de caséine son activité au pH optimum établi dans le domaine de valeurs allant de 7 à 8. La protease dérivée du Bacillus licheniformis qui fût découverte et identifiée par la demanderesse se distingue de la protease décrite dans les références susmentionnées de par sa propriété et particulièrement de par sa valeur de pH optimum, qui représente un important facteur pour démontrer les actions et les effets de la protease lorsqu'elle est utilisée dans la pratique. La protease dérivée du Bafillus licheniformis qui fût découverte par la demanderesse dénote d'une activité à une valeur de pH optimum se situant dans la zone de haute alcalinité s'étendant de 10 à 10,5 meme si on a utilisé comme substrat de la caséine de l'hemoglobine ou de I'albuming et par conséquent il est évident que la protease est une protease alcaline.Ainsi, l'invention livre une nouvelle protease alcaline qui est produite par culture de souches appartenant au Bacillus licheniformis. La nouvelle protease alcaline peut être utilisée dans de larges domaines y compris la fabrication de denrées 91imenlalEy é cuars le perfectionnement de produils marins, l'industrie textile, et la fabrication de produits de blanchissage et égalementdags de nombreux domaines industriels. Selon la présente invention, la protease alcaline peut être produite par culture de souches de Bacillus licheniformis qui fût découvert et identifié par les inventeur sur le milieu de culture liquide conventionnel sous aération, puis par purification de la protease bruite résultante,de lameme manière que dans les procédés conventionnels. tes constituants à utiliser dans le milieu de culture comprennent le glucose et l'amidon comme souce de carbone ; la peptone et la caserne comme source d'azote des éléments nutritifs naturels tels q'un extrait de levure , un extrait de viande et des sels minéraux. Egalement, un extrait de gateau de soja sans graisse, de l'écorce de riz et de l'écorce de blé peuvaitetre employés comne milieu de culture naturel Il est préférable d'utiliser une température de culture allant de 30 à 350 C à un pH d'environ 7,0 sous aération pendant 40 à 72 heures pour obtenir l'activité maximum de la protéase, et l'activité maximum peut être obtenue à 350C pendant une période de temps de 40 heures. La protease alcaline accumulée dans le bouillon de culture est soumise à la purification par des opérations successives de débactérisation de concentration, diextraction, de dialyse, de décoloration, de. colonne chromatographique, en se servant de cellulose comme échangeur d'ions et un échangeur d'ion du type Sephadex, etd'unefiltration sur gel pour retrouver une proease alcaline purifiée. L'invention sera mieux comprise et d'autres-buts, caracté ristiques et avantages de celle-ci apparaîtront au cours de la description explicative qui va suivre, en se reportant aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d' exemple illustrant deux modes de réalisation de l'invention et dans lesquels, - la figure 1 montre le chromatogramme obtenu en soumettan le bouillon de culture à la débactérisation, ltestraction, la dialyse et la décoloration pour l'obtention d'une protease alcaline purifiée puis en soumettant la protease alcaline purifiée -à une colonne chromatographique au moyen de carbo xymethyl-cellulose. La figure 1 illustre la courbe 1 qui indique la concentration de protéine, le courbe de l'activité de protease et la ligne droite 3 la concentration de chlorure de sodium. Comme nous le montre la figure 1, l'activité de la protease est concentrée au pic de fraction C et également llac- tivité d'une petite quantité de protease peut être observée dans la fraction D. La protease concentrée dans la fraction C est la protease alcaline dérivée du Bacillus licheniformis qui fût découverte par lamandaresoe et on ne trouve pas de fraction démontrant l'activité de la protease comme sur la figure 1.Ces facteurs indiquent que la purification de la protease brute peut facilement être effectuée, et les effets avantageux de la présente invention peuvent être réalisés dans la production de la protéase alcaline. tes caractéristiques de la protease alcaline produite: : selon la présente invention sont illustrées sur les figures 2 à 5. La figure 2 montre la relation qui existe entre l'activité de la protease alcaline et la valeur du pH. Comme le montre la figure 2, la valeur de pH optimum se trouve dans le domaine de valeurs allant de 10 à 10,5 lorsqu'on emploie de la caseine comme substrat, et cette valeur de pH optimum n'est pas altérée même si l'on utilise de hemoglobine ou de 11 albumine comme substrat. -ta figure 3 montre la relation qui existe entre l'activité de la protease alcaline et la températun. Comme le montre la figure 3, la courbe 1 indique l'activité de la protease alcaline lorsque le substrat contient de l'acétate de calcium en quantité de 5 x 10 3 mol.La courbe 2 indique l'activité de la protease alcaline- lorsque le milieu de culture ne contient pas d'acétate de calcium. La figure 3 montre que la température de culture optimum est de 600C et la protease est activée à 800C. L'activité de la protease est remarquablement accrue lorsque'l'acétate de calcium est présent dans le: mélange de réaction comme l'indique la figure 1, mais la température de culture optimum n'est substantiellement pas altérée-. Ainsi, la protease alcaline fût analysée pour son activité, en se reportant à la méthode décrite dans le livre intitulé "Method for the Investagation of Enzyme", volume 2, page 240 par Ilagihara (imprimé chez Asakura Bookshop). La protease fût mélangée à une solution contenant de la caseine à la valeur de pH de 10,0 et la température de 300C, la caseine fût hydrolysée en tyrosine et de la caseine non hydrolisée furent précipitées en utilisant un agent de précipitation B qui est un mélange de 0,11 mol de CCl3COOH, 0,22 mol de CH3COONa et 0,33 mol de CH3COOH et le filtrar fût testé par l'absorption de la lumière à 257 m. 'activité de la protease est indiquée par "unité" qui mesure la quantité de - tyrosine ( t ) qui est produite - en une minute. La figure 4 montre la stabilité thermique de la protease alcaline. Gomme l'indique la figure 4, la courbe 1 nous montre que la protease est stable à une température au-delà de 550C lorsque le milieu de réaction contient de l'acétate de calcium en quantité de 5 x 10 -3 mole et qu'on l'utilise à un pH = 10,0 par 15 minutes. La courbe 2 nous montre que la protease est stable à une température au-delà de. 500 et que l'activité de la protease est rapidement réduite à une température supérieure à 50 C lorsque le milieu de culture ne contient pas d'acétate de calcium et qu'on l'utilise dans les mêmes conditions que dans la courbe 1. La figure 5 montre'la relation qui existe entre l'activité de la protease alcaline et la valeur de pH lorsque le mélange réactionnel est maintenu à 300C pendant 22 heures. La courbe 1 montre l'activité de la protease lorsque le mileiu réactionnel contient de l'acétate de calcium en quantité de 5x10- mole et la courbe 2 montre l'activité de la protease lorsque le mélange réactionnel ne contient pas d'acétate de calcium. Il est évident à partir de courbes 1 et 2 que la protease est -stable à une valeur de pH allant de 5,0 à 11,0. L'activité de la protease alcaline de cette invention est génée par les ions métalliques lourds tels que les ions Hg et Cu, et particulièrement les os;ydants tels que - l'iode ou le diisoprophylfluorophosphate (DEP) et le pLacduit appeléinhilmier de pommes de terre mais l'activité de la protease alcaline n'est pas génée par des agents réducteur; tels que la cysteine, les agents chelatés tels que le E.D.T.A., l'acide mono-iodo-acetique et des réactifs qui contiennat des radicaux SH. ta présente invention est illustrée par les exemples suivants. Exemple 1. te Bacillus licheliformis fut incubé dans un litre dlun milieu de culture liquide (pH=7,2) contenant 1 % de g lycose, 1%-de peptone, 0,10 % d'extrait de levure, 0,2 % de chlorure de sodium, 0,2 % de chlorure de calcium, 0,05 % de phosphate de potassium, 0,001 % de sulfate de magnésium, et 0,000-1 %de sulfate ferreux et de sulfate de manganèse, et le Bacillus licheniformis fût cultivé sous agitation à 300a pendant 72 heures. te bouillon de culture résultant contenait la protease alcaline possédant une activité de 1,930 unité par (ml). te bouillon de culture fût débactérisé par une centrifugeuse ou un filtre puis le filtrat fu: mélangé à une solution de sulfate d'ammonium de saturation 0,S et le mélange fût soumis au procédé de relargage et de dialyse. La solution dialysée traversa une colonne remplie de résine Duolite A-2 (ou une résine échangeuse d'un ion) pour extraire les matières colorantes. La solution décolorée fût soumise à la colonne chromatographique par emploi de carboxymeth rl-cellulose et de D.EA.E. Sephadex, puis la protease brute fût séparée par le procédé de filtration sur gel par emploi de Sephadex - 75 et la protease brute fût traitée par un procédé de précipitation à l'acétone pour obtenir la protease purifiée.La protease purifiée fût sêchée et mesurée, son poids était de 47(ml) de protease séchée possédant activité de -4,110 unités par (ml). Exemple 2. te Bacillus licheniformis fût incubé dans un litre d'un milieu de culture liquide (pH = 7,2 contenant un extrait qui fût produit par extraction dgun gâteau de soja déipidé avec 4 % de solution alcaline et 1 % d'amidon soluble, et le Bacillus licheniformis fût cultivé dans un récipient de fermentation à 3500 pendant 40 heures sous aération et sous agitation. Le bouillon de culture résultant contenait la protéase alcaline possédant une activité 4,400 unités par (ml). Ce bouillon de culture fût traité de la même façon que dans l'exemple 1, pour produire 1,07gramme de protease purifiée et séchée possédant une activité de 4,110 unies par mi. Bien entendu, llinvention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés quià titre d'exemple. En particuloer, elle comprend tous les moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1. Méthode de production d'une protease alcaline caractérisée en ce qu'elle est basée sur la culture de bactéries appartenant au Baci@us Licheniformis possédant une aptitude particulière pour la production de ladite protease valine sur les milieux de culture conventionnels, afin d'accumuler la protease alcaline précitée dans le bouillon de culture résultant et, procéder à la realpératDn dela prctease alcalis précitée à partir dudit bouillon de culture de la même façon que dans les procédés conventionnels.