Brevet FR2035037A1 — publié le 19701218

x 2035037 La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique qui sera désigné par la suite SL 3364. L'invention concerne également un procédé de préparation de cet antibiotique ainsi • * r que son application en thérapeutique, à titre de principe actif 5 d'un médicament. Le nouvel antibiotique SL 3364 présente les caractéristiques suivantes : Il s'agit de cristaux brun-rouge fondant à 169-171°î 20 [aj^ = -388° (c = 0,06 dans le chloroforme). L'analyse élémen- V • 10 taire donne la composition centésimale suivante: c = 69,6#; H = 5,7#; 0 « 24,2# Spectre ultra-violet: maximums à 243 nm (log£.'= 1,48). 308,5 nm (log f- l,6l) 380 nm (log£/= 2,10) 15 dans le chlorure de méthylène. La figure 1 du dessin annexé re~ . présente le spectre ultra-violet du nouvel antibiotique. Spectre infra-rouge: bandes, entre autres, à 1740, 1717* 1630 et — i 1603 cm dans le chlorure de méthylène. La figure 2 du dessin annexé représente le spectre infra-rouge du 20 nouvel antibiotique. Selon le procédé de 1'invention5 pour préparer le nouvel antibiotique SL 3364., on cultive une nouvelle souche de Sepedoniuni chrysospermum dans un Milieu nutritifs on isole l'antibiotique de la bouillie de fermentation et du mycélium, par 25 exemple par extraction ou adsorption, et on le purifie selon les méthodes habituelles. La nouvelle souche de Sepedonium chrysospermum, utilisée dans le procédé conforme à l'invention a été isolée d'un prélèvement de terre provenant d'Angleterre. Un échantillon de cette 30 souche a été déposé, sous le n° NRRL 3489, au "United States Department of Agriculture" (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Illinois/USA. La nouvelle souche de Sepedonium chrysospermum se développe sur un milieu gélose contenant du glucose, de l'extrait de 35 malt, de l'extrait de Is'rure et de la peptone, à une' température comprise entre 18 et 27° s en formant vin mycélium aérien feutré 7009486 2 2035037 de teinte blanche à beige. Sur la face arrière de la colonie, le substrat est coloré en brun-rouge. Les colonies plus anciennes forment un exsudât clair et limpide. Les hyphes aériens»d'un diamètre de 3,0 à 5,5 p,sont, ramifiés irrégulièrement et septés; 5 ils présentent une teinte orange pâle et sont étendus en couche fine sur la surfacè du milieu gélosé. Les conidiophores ne sont pas nettement distincts des hyphes végétatifs; ils sont simples ou divisés et hyalins. Pour la plupart, ils sont septés et épaissis sous le septum; leur"diamètre'est de 4,0 à 4,5 ju. Il se 10 forme deux types de sporesî (l) des conidies à paroi mince, ellipsoïdes ou piriformes, hyalines, en groupements non compacts aux extrémités de longs filaments? 9*0 - 11,0 x 4,5 - 6,0 jx. (ii) des conidies à membrane épaisse, semblables à des chlamydo-1? spores, sphériques, nettement verruqueuses, avec de grosses gouttes d'huile, d'un diamètre de 11,5 à 16,0 p, de teinte cadreium clair, isolément aux filaments latéraux. Du point de vue morphologique et physiologique, la nouvelle souche NRRL 3i-l89 de l'espèce Sepedonium chrysospermum 20 correspond aux descriptions données par J.C. Gilman dans "A Manual of Soil Fungi", The lowa State University Press (1957)> Ames, Iowa/USA, page 301, et par G.L. Barron dans "The Généra of Hypomycetes from Soil", The Williams and Wilkins Co. (1968), Baltimoré,USA, pages 278 à 279* 25 La nouvelle souche de Sepedonium chrysospermum.peut être cultivée sur des milieux nutritifs très variés qui contiennent les matières nutritives usuelles. C'est ainsi que cette souche utilise les matières nutritives couramment employées par les organismes hétérotrophes,par exemple le glucose, l'amidon, 30 les dextrines, le lactose, le saccharose etc., comme source de carbone;des composés azotés organiques ou minéraux, tels que la tryptone, les extraits de levure ou de viande, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, les amino-acides etc., comme source d'azote, ainsi que les sels minéraux et les oligo-éléments 35 usuels» Pour préparer lo nouvel antibiotique on peut procéder 7009486 3 2035037 de la manière exposée ci-dessous: On ensemence un milieu nutritif liquide avec une suspension de mycélium de la nouvelle souche de Sepedonium chrysospermum et on incube la culture à 18°. La culture peut être 5 réalisée sous des conditions d1aérobiose, en culture superficielle ou en culture submergée et agitée ou dans un fermenteur avec passage d'un courant d'air ou d'oxygène et sous agitation. Aussitôt qu'une quantité maximale d'antibiotique a été produite au bout d'environ 8 jours, on filtre et oh recueille l'antibiotique 10 selon les méthodes habituelles, par extraction ou adsorption, à partir de la solution de culture débarrassée du mycélium et à partir du mycélium qu'on a broyé au préalable mécaniquement. Selon une méthode qui s'est révélée particulièrement appropriée, on broie mécaniquement-le mycélium qu'on a séparé de 15 la bouillie de culture, on extrait avec du chloroforme une solution aqueuse de l'antibiotique obtenue à partir du mycélium, et on extrait avec de l'acétate d'éthyle la solution de culture débarrassée du mycélium; cependant, on peut également employer d'autres solvants organiques, tels que le benzène, le chloroforme, 20 l'acétate de butyle ou le chlorure de méthylène. A partir des extraits, on peut isoler h.e nouvel antibiotique par chromatogra-phie. Le nouvel antibiotique possède une action fongistatique très puissante vis-à-vis de différents agents pathogènes respon-25 sables des mycoses. Il y a lieu de signaler en particulier la bonne activité du nouvel antibiotique qu'bn a observée "in vitro" contre les organismes indiqués dans le tableau suivant: Organisme Concentration inhibitrice minimale en ^ig/ml Trichophyton mentagrophytes 10 Trichophyton tonsurans 10 Trichophyton rubrum 10 Epidermophyton floccosum 3 Microsporum canis 10 Microsporum audouinii 3 7009486 4 2035037 Le nouvel antibiotique exerce également une forte action cytostatique. Cette action est déterminée "in vitro", sur le mastocytome P-815 de la souris, par l'inhibition que le composé exerce sur la multiplication des cellules tumorales* Dans une 5 solution nutritive appropriée, ces cellules se multiplient en 40 heures jusqu'à atteindre quatre fois ou même cinq fois leur nombre primitif. La c'est-à-dire la concentration pour la quelle la multiplication cellulaire est abaissée de 50#, est de 1*5 mg/litre. , . ^ Le nouveau compose de 1 invention peut etre utilise en 10 thérapeutique comme agent fongistatique ou cytostatique. La dose à administrer dépend de l'effet désiré ainsi que de l'application envisagée; on administrera des doses quotidiennes comprises entre 50 et 1000 mg. Pour l'application par la voie orale, les formes d'administration appropriées contiennent de 50 à 1000 mg de prin-15 cipe actif en mélange avec des supports liquides ou solides. Pour l'application topique, on peut utiliser des poudres, des liquides pour pulvérisation, des pommades ou des teintures contenant de 0,1 à 2# de substance active. En tant que médicament, l'antibiotique SL 3364 de 20 l'invention peut être utilisé soit seul, soit sous forme de préparations médicamenteuses appropriées pour l'administration orale ou l'application topique. On prépare les formes médicamenteuses appropriées en mélangeant l'antibiotique avec des excipients minéraux ou organiques indifférents du point de vue pharmaceutique. 25 Comme excipients on utilisera.par exemple: pour des comprimés et des dragées: le lactose, l'amidon, le talc, l'acide stéarique etc.; pour des sirops : le saccharose, le sucre inverti, des solutions de glucose etc.; 30 pour des pommades : l'eulénine, la glycérine, la vaseline, l'huile de paraffine etc.. Outre la substance active, les préparations peuvent contenir des agents de conservation, des stabilisants, des 35 mouillants, des auxiliaires de dissolution, des édulcorants, des 7009486 5 2035037 colorants, des aromatisants etc., appropriés. L'exemple suivant illustre la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont toutes exprimées en degrés centigrades, les points de fusion ont été 5 mesurés sur le bloc Kofier. EXEMPLE: Dans un fermenteur, on introduit 10 litres d'une solution nutritive contenant par litre 40 g de cérélose 10 5 g de tryptone 3 g de NaKO^ 1 g de K2HP04 500 mg de KC1 500 mg de MgSO^* 15 10 mg de FeSO^ JHgO et pour le reste de l'eau déminéralisée. - On ensemence cette solution nutritive avec une suspension de mycélium de la souche NRRL 3^89 de Sepedonium chrysospermum et on l'incubé pendant 8 jours à 18°, tout en aérant (1 litre 20 d'air/min./litre de solution nutritive) et tout en agitant (150 tours/mih.). On filtre la bouillie de culture à travers une couche de eélite et on extrait l'antibiotique du filtrat avec de l'acétate d'éthyle. On désagrège le mycélium avec du méthanol dans un appareil "Ultra-Turrax", on le sépare par filtration et 25 on le lave avec un mélange de méthanol et d'eau dans le rapport 9:1. On chasse le méthanol par distillation et on extrait la phase aqueuse avec du chloroforme. On obtient ainsi des extraits bruts qu'on chromâtographie sur gel de silice Merck qu'on a au préalable lavé avec de l'acide chlorhydrique et ensuite séché 30 (dimension des grains: 0,05 à 0,2 mm). On élue l'antibiotique SL 3364 avec un mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 99:1 et on le recristallise à plusieurs reprises dans le méthanol. On obtient ainsi le nouvel antibiotique sous forme de cristaux orange fondant à 169-I710• 35 La suspension de mycélium utilisée pour l'ensemencement est préparée en deux étapes. Dans la première étape, on incube 7009486 6 2035037 . pendant 8 jours à 27° une culture de la souche initialement isolée, sur un milieu gélose dont la composition est la suivante: 20 g de cérélose 20 g de gélose filiforme 5 2g d'extrait de malt 2 g d'extrait de levure 2 g de peptone 2 g de KH2P04 2 g de MgSOv THgO 10 et de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume de 1 litre. Dans la seconde étape, on incube la culture ainsi obtenue dans le milieu de fermentation spécifié ci-dessus pendant 7 jours à 27°, tout en agitant. A partir de cette culture, on prépare ensuite une suspension de mycélium que l'on utilise de la 13 manière décrite à l'exemple. 7009486 7 2035037 REVENDICATIONS 1.- Le nouvel antibiotique SL 3364 qui présente les caractéristiques suivantes: Analyse élémentaire: C = 69,6#; H = 5*7#; 0 = 24,2# 5 Point de fusion: 169-171° on Pouvoir rotatoire spécifique: [a]^ = -388° (c = 0,06 dans le chloroforme) Spectre ultra-violet: maximums à 243 nm (log£'= 1,48) , 308,5 nm (l.og£'= 1,61) 10 380 nm (log£'= 2,10) (dans le chlorure de méthylène) Spectre infra-rouge: bandes, entre autres, à 1740, 1717, 1630, 1603 cm"1 (dans le chlorure de méthylène). 15 2.- Un procédé de préparation du nouvel antibiotique SL 3364 spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif la nouvelle souche NRRL 3489 de l'espèce Sepedonium chrysospermum, on isole l'antibiotique SL 3364 du milieu nutritif et du mycélium et on le purifie. 20 3.- Un médicament exerçant, en particulier, une action fongista-tique, caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, le nouvel antibiotique SL 3364 spécifié à la revendication 1. 4.- Un médicament exerçant, en particulier, une action cytosta-25 tique, caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, le nouvel antibiotique SL 3364 spécifié à la revendication 1. 5«- Une composition pharmaceutique caractérisée en ce . qu'elle contient l'antibiotique SL 3364 spécifié à la revendica-30 tion 1, en mélange avec des excipients et supports acceptables du point de vue pharmaceutique.