Brevet FR2020758A1 — publié le 19700717

On sait que les vaccins qui sont actuellement utilisés permettent d'immuniser l'homme cortre certaines maladies pendant une période de temps plus ou moins longue. Toutefois, avec les vaccins actuellement connus, on obtient seulement une immunité vis-à-vis d'une maladie ou d'un groupe restreint de maladies. La présente invention est relative à un nouveau médicament qui présente l'avantage d'immuniser ou tout au moins d'accroitre notablement la défense de l'organisme humain contre de nombreuses maladies ou infections causées par des germes à Gram négatif, tels que Salmonella ou Méningocoques, ou par des germes à Gram positif, tels que Staphylocoques, Streptocoques ou Pneumocoques. te médicament selon l'invention diffère, en conséquence, des vaccins antérieurement connus par le fait qu'il permet de protéger l'organisme humain non point contre une maladie particulière ou un groupe limité de maladies, mais contre un nombre important de maladies ou infections différentes. La présente invention a pour objet un nouveau médicament permettant de stimuler chez l'homme l'immunité non spécifique contre les maladies et les infections causées par les germes à Gram négatif ou à Gram positif caractérisé par le fait qu'il comporte dans un véhicule approprié des mycobactéries ayant subi une extraction à l'aide d'au moins un solvant organiQue des corps gras. Parmi les souches de mycobactéries que l'on peut utiliser conformément à l'invention, on peut citer les souches de Mycobacterium Phlei, Mycobacterium Smegmatis, Mycobacterium Butyricum, Mycobacterium Lacticola ou de B.C.G., sans que cette énumération soit limitative. te médicament peut comprendre des mycobactéries appartenant à une ou à plusieurs souches. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un médicament permettant de stimuler chez l'homme l'immunité non spécifique contre les infections et les maladies causées par les germes à Gram négatif ou à Gram positif, caractérisé par le fait que l'on cultive des mycobactéries, que l'on soumet ces mycobactéries à une extraction à l'aide d'au moins un solvant organique de corps gras, et qu'on incorpore les mycobactéries ayant subi cette extraction dans un véhicule approprié. tes germes peuvent, par exemple, être cultivés dans un milieu de culture synthétique liquide, à une température de 37 , pendant deux à trois semaines. Le milieu de culture peut être,par exemple, du type Sauton ou Weybridge. En fin de culture, les germes sont essorés et lavés. L'extraction est réalisée selon l'invention, de préférence à chaud, à l'aide d'un solvant ou successivement à l'ai- de de plusieurs solvants des corps gras. Parmi les solvants qui peuvent être utilisés, on peut citer sans que cela constitue une limitation : le méthanol, l'éthanol, l'éther, le chloroforme, l'acétone et le benzène. Il est avantageux de poursuivre l'extraction, ou les extractions, à l'aide de différents solvants jusqu a l'obtention d'une perte en poids maximum des bactéries. Cette perte en poids est généralement comprise entre 20 et 50% du poids initial. tes extractions sont avantageusement effectuées à la température d'ébullition du solvant. Il est également possible, selon l'invention, de réaliser l'extraction avec un mélange de solvants, par exemple un mélange d'éthanol et d'éther, ou encore de procéder à plusieurs extractions successives avec un même solvant. L'extraction peut être effectuée, par exemple, à l'aide d'un appareil du type Soxhlet ou Kumagawa. L'extraction a une durée qui dépend du type de solvant utilisé. Dans la pratique, on arrête l'extraction lorsque la perte en poids des bactéries devient nulle ou négligeable. Dans le cas de bactéries pigmentées, on peut arreter l'extraction dès que le liquide d'extraction reste incolore. Dans le cas où l'on effectue des extractions sucesSiw ves à l'aide de solvants différents, on peut, par exemple, ut- liser successivement l'alcool, l'éther, le benzène et le chlore forme, sans que cet ordre soit impératif. La caractéristique essentielle de l'extraction à l'aide des solvants organiques des corps gras est de faire per- dre un maximum de poids aux mycobactéries. tes germes qui ont subi l'extraction se présentent sous la forme d'un produit pulvérulent qui peut être mis en suspension dans de l'eau physiologique pour être ensuite stérilisé. Le véhicule dans lequel les germes ayant subi l'extraction sont introduits est avantageusement constitué par une solution aqueuse telle que de l'eau physiologique ou un tampon phosphate pH 7. Un autre véhicule pourrait toutefois être utilisé. En fin de fabrication, on vérifie par des tests conventionnels l'absence de vitalité des germes utilisés pour la fabrication du médicament, ainsi que la stérilité de ce dernier. Le médicament selon l'invention peut s'administrer à raison d'une injection sous-cutanée tous les 4 à 6 jours, de 1 ml de véhicule liquide contenant en suspension 4 mg de mycobactéries ayant subi l'extraction selon l'invention. Le médicament selon l'invention permet d'accroître l'immunité de l'organisme vis-à-vis de nombreuses maladies ou infections aiguës ou chroniques, telles que les infections à Entérobactéries, à Pseudomonas, à Pneumocoques, à Streptocoques, àtStaphylocoques ou à Listeria. L'administration du médicament selon la posologie indiquée ci-dessus a également permis de constater une prolongation des rémissions au cours des-leucémies. Dans le but de mieux faire comprendre l'invention, on va en décrire maintenant, à titre d'illustration, et sans aucun caractère limitatif, plusieurs modes de mise en oeuvre donnés ci-après à titre d'exemple. EXEMPLE 1 En partant d'une ampoule de Mycobacterium Phlei lyophilisé, on réalise une culture sur milieu pomme de terre/Sauton qui permet d'obtenir un premier voile. On repique ensuite le voile ainsi obtenu sur un milieu synthétique liquide de type Sauton disposé en Erlenmeyer, qui a la composition suivante . Glycérine 60 g . Acide citrique 2 g . P04 2H &commat; e 0 5 0,5 g Sulfate magnésium 0 e OX 5 0,5 g nitrate de fer ammoniacal 0,05 g . Asparagine Lévogyre 4 g . Eau bi-distillée 1000 ml pH final : 6,8 - 6,9 Le produit de cette culture est utilisé comme semence pour la culture industrielle qui s'effectue en voile sur un milieu synthétique liquide de type Weybridge ayant la composition suivante . Glycérine pure ....................... 100 g .Asparagine ........................... 12 g . PO4 K H2 ----H---- 1,08 g . Sulfate Magnésium .................... 1,00 g . Citrate trisodique ................... 1,10 g Citrate fer ammoniacal ............... 0,30 g . Ca 012 ...................... 0,087 g . Sulfate de zinc ...................... 0,026 g Sulfate de cuivre ................... 0,0026g . Nitrate de cobalt pur................. pur 0,0013g . Eau distillée q.s.p. ................. 1.000 ol pH final : 6,8 Après stérilisation, on ajoute stérilement 10% de glucose (concentration finale). La culture industrielle peut se faire, par exemple, dans des fioles de Roux de 2 litres de capacité avec une incubation en atmosphère ordinaire à 37 C, i & récolte se pratiquant durant la troisième semaine. Les cultures sont ensuite essorées par le vide sur filtre Büchner muni d'un disque de papier Joseph. Les germes sont lavés à l'eau physiologique tamponnée 0,1 M à pH 7,00. Les germes subissent ensuite dans un appareil de type Soxhlet des extractions successives à l'aide d'éther.Les températures d'extraction sont celles d'ébullition du solvant. L'extraction se poursuit jusqu'à l'obtention de la stabilisation de la perte de poids. En fin d'extraction, les germes ont perdu 19% de leur poids. Le produit obtenu est pulvérulent et de -couleur chamois . A laide d'un broyeur on le met en suspension dans de l'eau physiologique à raison de 4 mg par ml. Le produit ainsi obtenu est enfin stérilisé en autoclave L 1200C pendant 20 minutes. On vérifie l'absence de vitalité de la mycobactérie par ensemencement -dans des milieux favorables et incubation à diverses températures, et l'on vérifie la stérilité du produit obtenu à l'aide de tests conventionnels. Pour mettre en évidence l'activité du médicament selon l'invention, on a effectué des tests sur des souris blanches mâles d'un poids de 24 à 25 g, chaque souris recevant par voie intrapéritonéale 0,2 à 0,5 ml de la suspension obtenue pure ou diluée comme il vient d'etre indiqué. De 24 heures à 4 jours plus tard, on injecte aux souris par la même voie 0,5 ml de suspension contenant 20 millions de Salmonella typhi Ty2 dans l'eau physiologique. Les souris témoins non immunisées reçoivent de la même manière une dose de 10 millions de Salmonella Typhi Ty2. On relève ensuite le nombre de décès toutes les deux heures pendant 24 heures puis deux fois par jour pendant les deux jours suivants. On a constaté une survie de 70 à 100% des animaux traités en fonction de la dose reçue du médicament selon l'invention alors que la mortalité des souris non traitées est de 100%. Des résultats analogues ont été obtenus en injectant aux animaux les germes suivants : Pseudomonas aeruginosa, D.Pneumoniae, Pasteurella multocida, Staphylococcus aureus. EXEIIPIE 2 La souche utilisée est le Mycobacterium Smegmatis. On cultive la souche comme il a été indiqué précédemment. La récolte des germes a été effectuée après huit jours d'incubation à 360C. Les cultures essorées sont lavées à l'eau distillée stérile. tes germes subissent ensuite 2 extractions à l'alcool méthylique et une extraction à l'éther. En fin 2'Mextraction, les germes ont perdu 27% de leur poids. te produit obtenu est mis en suspension dans de l'eau physiologique à raison de 4 mg par ml. Le produit ainsi obtenu est stérilisé à l'autoclave à 1150C pendant 30 minutes. EXEMPLE 3 La souche utilisée est le Mycobacterlun Butyrium. On cultive la souche comme il a été indiqué précédemment. La récolte des germes a été effectuée après 30 jours d'incubation à 3600. Les germes essorés sont lavés abondamment à l'eau distillée stérile et essorés à nouveau. Une partie des germes a été lyophilisée en vue des futures extractions. L'autre partie a subi ensuite 5 extractions à l'acétone. EXEMPLE 4 La souche utilisée est le Mycobacterium Phlei. La récolte de germes a été effectuée après 15 jours d'incubation à 36 C en milieu de Sauton. Les germes ont été extraits à l'aide du mélange à parties égales éther éthylique/alcool éthylique et ont subi de cette façon 8 extractions. Le traitement a -été effectué avec l'appareil is type Eumagawa. La perte de poids en fin d'extraction a été d'nvi- ron 60 %. EXEMPLE 5 On utilise une souche de B.C.G. que l'on cultive 14 jours à 360C dans un milieu liquide de type Sauton. On fait subir aux germes lavés t desséchés trois extractions successives à l'éther. EXEMPLE 6 On opère comme indiqué à l'Exemple 5, mais en effectuant deux extractions successives à l'alcool méthylique. R E V E g D I C A X I O N S 1. Médicament pour stimuler l'immunisa vis-à-vis des maladies ou infections causées par les germes à Gram négatif ou à Gram positif, caractérisé par le fait qu'il comporte dans un véhicule approprié des mycobactéries ayant subi au moins une extraction à l'aide d'un solvant organique des corps gras. 2. Médicanent selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les mycobactéries proviennent d'une souche choisie dans le groupe composé par Mycobacterium Phlei, mycobacterîun Smegmatis, Mycobacterium Butyricum, Mycobacterium Lacticola et B.C.G. 3. Médicament selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les mycobactéries ont subi une extraction à l'aide d'au moins un solvant choisi dans le groupe constitué par le méthanol, l'éthanol, l'éther, le chloroforme, l'acétone et le benzène. 4. Médicament selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé par le fait que les mycobactéries ont subi lors de leur extraction une perte de poids comprise entre 20 et 50%. 5. Médicament selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le véhicule est de l'eau physiologique dans laquelle les mycobactéries ayant subi l'extraction sont mises en suspens à raison par exemple de 1 mg par ml. 6. Procédé de fabrication du médicament selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on cultive les mycobactéries, qu on les sépare de leur milieu de culture, qu'on les soumet à une extraction à l'aide d'au moins un solvant organique des corps gras et qu'on les place dans un véhicule approprié. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on procède à l'extraction à la température d'ébullition du solvant. 8. Procédé selon une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé par le fait que l'on poursuit l'extraction jus qu'à ce que la perte en poids de mycobactéries devienne nulle ou négligeable. 9. Procédé selon une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait qu'on réalise plusieurs extractions successives avec le même solvant. 10. Procédé selon une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que l'on réalise plusieurs extractions successives avec différents solvants. 11. Médicament caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon un quelconque des exemples 1 à 6