Brevet FR2016589A1 — publié le 19700508

L'invention concerne un procédé et un appareil pour la mesure quantitative de la bilirubine dans le sérum sanguin. On sait que la présence d'un excès de bilirubine dans le sérum sanguin peut être le signe précurseur de diverses maladies graves, comme le cancer, l'ictère par rétention , l'érythroblastosis featalis, et l'hépatite. I1 est donc désirable, pour faciliter le diagnostic du médecin, de disposer de moyens rapides'eut précis de mesure de la concentration de la bilirubine dans le sérum sanguin. De plus, pour les analyses de ce composé, couramment effectuées chez le nouveau né qui ne peut tolérer que de faibles prélèvements de sang, il est désirable de connaître des méthodes de mesure de bilirubine ne nécessitant que de petits échantillons de sang. La bilirubine est présente dans le sérum sanguin sous forme de bilirubine reliée aux protéines (bilirubine '1indirecte") et de bilirubine théoriquement non reliée aux protéines (bilirubine "directe"), dont la somme est désignée par le terme bilirubine "to tale". Les mesures de la concentration de laTbilirubine totale, ont jusqu'à présent été effectuées selon la méthode de Nalloy et Evelyn, J. Biol. Chem. 119, 481 (1937), ou selon de légères modifications de cette méthode.Malloy et Evelyn ont trouvé que le sérum sanguin contenant l'une ou l'autre des formes précitées de bilirubine, réagissent en solution dans le mélange méthanol-eau-acide chlorhydrique, avec le chlorure de p-sulfobenzène diazonium, pour former une solution colorée d"'azobilirubine", dont la densité optique est à peu près proportionnelle à celle de la solution c à 5400 A . On sait aussi que des mesures un peu plus rapides peuvent être effectuées selon la méthode de Malloy-Evelyn, en ajoutant des composés comme l'urée, l'acétate de sodium et l'antipyrène à la solution originale de Malloy-Evelyn. Cependant cette méthode présente certains inconvénients, comme par exemple la nécessité d'utiliser la solution de chlorure de psulfobenzènediazonium fratchement préparée au moment de l'emploi, par mélange de quantités soigneusement mesurées de nitrite de sodium et d'acide sulfanilique, dans l'acide chlorhydrique dilué. Une quantité déterminée de cette solution fratchement préparée est mélangée avec une quantité déterminée du sérum sanguin, dans une solution aqueuse- d'essai contenant 50 % en volume de méthanol (ou d'autres composés, comme mentionné ci-dessus). Après 1/2 heure (QU moins si possible), on compare la densité optique de la solution avec celle d'une solution de référence ne contenant pas de nitrate de sodium, et on établit la relation entre la différence des densités optiques et la-concentration de la bilirubine totale dans l'échantillon du sang0 Il est évident qu'un tel processus est lent-, compliqué et nécessite beaucoup d'appareillages de laboratoire et-un grand nombre de manipulations.En conséquence les mesures ainsi obtenues sont cot- teuses et entachées d'erreurs humaines En En particulier la durée de l'attente pour la fin de la réaction colorée fait -perdre un temps précieux, et étant donné leurs difficultés de réalisation, les mesures de bilirubine selon la méthode Malloy-Evelyn sont, à l'heure actuelle, presqu'uniquement effectuées dans les laboratoiren mé- dicaux hospitaliers. Le procédé de la présente invention permet d'obtenir des solutions d'azobilirubine colorées avec un nombre minimum de manipulations, à l'aide de certains sels solides -et stables-de diazonium, susceptibles de réagir dans des solvants déterminés, et en présence d'une quantité catalytique d'acide, avec la bilirubine dans le sérum sanguin. La concentration de la bilirubine est alors déterminée par la mesure de la densité optique de la solution colorée. Le procédé due l'invention est caractérisé par les opérations sui vantes 1) On fait réagir, dans un suivant organique miscible à l'eau, qui ne précipite pas la bilirubine dans le serum sanguin, et en présence d'une quantité catalytique~d'acide soluble dans ledit solvant, a) un échantillon de sérum sanguin contenant la bilirubine ; et b) un sel solide de diazonium, capable de réagir dans le dit solvant, avec la-bilirubine totale, en présence dudit acide, pour former une--solution colorée, visuellement limpide, d'azobilirubine, dont le coefficient d'extinction est d'au moins 7,50 10# 1/ mole-cm , pour les longueurs d'onde de 5 000 à 8 000 ; et 2) on mesure la densité optique de la solution colorée. On ajoute de préférence, d'abord l'échantillon de sérum sanguin au mélange de solvant et d'acide, puis on ajoute le sel de diazonium pour former l'azobilirubine colorée L'appareillage permettant d'exécuter le procédé décrit ci-dessus, fait également l'objet de l'invention et sera mieux compris à la lecture de la description détaillée qui suit et à l'examen des dessins annexés, qui représentent, à titre d'exemples non limitatifs, plusieurs modes de réalisation suivant l'invention. Sur ces dessins : La fig. l est une vue en coupe transversale d'un mode de réalisation préféré de l'appareil de l'invention la fig. 2 est une vue en perspective éclate de l'appareil de la figure 1 , où les réactifs ne sont pas représentés; la fig. 3 est une vue en coupe transversale d'un second mode de réalisation de l'appareil de l'invention; la fig. 4 est une vue en perspective éclatée d'une portion de l'appareil de la figure 3; la fig. 5 est une vue de dessus d'un élément de l'appareil de la figure 3; la fig. 6 est une vue en coupe transversale d'un troisième mode de réalisation de l'appareil de l'invention. Un grand nombre de sels solides de diazonium conviennent au procédé de l'invention. Les conditions requises pour ces sels sont la stabilité dans des conditions normales de stockage et de manipulation, et le pouvoir de former une azobilirubine colorée lorsqu'on les fait réagir avec la bilirubine dans un solvant sélectionné,con- tenant une quantité catalytique d'acide, pour obtenir une solution colorée d'azobilirubine, visuellement limpide et dont le coefficient d'extinction est supérieur à 7,5.lO3l/mole-cme Il est préférable, mais non nécessaire, que les sels de diazonium soient facilement solubles dans le solvant choisi.Il suffit qu'ils soient mdme faiblement solubles, pourvu qu'ils puissent former l'azobilirubine en solution et répondre aux conditions pré citées concernant les solutions obtenues dtazobilirubineO Sans con- naître le mécanisme exact de la réaction, on suppose que les fractions solubles des sels peu solubles de diazonium, par leur combinaison avec la bilirubine pour former l'azobilirubine, ne participent pas à l'équilibre des solubilités; ceci permet la dissolution de nouvelles quantités du sel solide, jusqu'à ce que la totalité de la bilirubine présente soit épuisée, Etant donné que la réaction colorée ne consomme que de très petites quantités du sel solide de diazonium, la quantité non dissoute de celui-ci qui peut subsister après la fin de la réaction ne peut être une cause substancielle de turbidité de la solution. Les sels de diazonium sont préférablement fournis, dans le procédé de l'invention, sous forme de granules ou de comprimés qui peuvent, en outre, contenir une quantité catalytique d'acide solide; dans ce cas l'acide peut, si on le désire, 8tre omis dans le solvant. La solution dtazobilirubine colorée formée selon l'invention ne doit présenter aucune turbidité décelable à l'oeil; pour cela,un échantillon de solution colorée d'l cm d'épaisseur (c'est-à-dire contenu dans un récipient de verre de 1 cm de diamètre intérieur) doit être parfaitement limpide ou clair à l'oeil. Une turbidité de la solution peut être due, par exemple, à la précipitation des protéines du sérum sanguin, ou à une forme insoluble d'azobilirubine formée à partir de certains sels de diazonium. Toute turbidité de la solution colorée nuirait à l'exactitude des mesures de densité optique et doit en conséquence entre évitée.Comme déjà mentionné, les solutions d'azobilirubine de lfinvention doivent, pour convenir au procédé et à l'appareillage décrits, présenter un coefficient d'extinction d'au moins 7,5.105 l/mole-cm aux lono gueurs d'onde de 5.000 à 8oOOO A Les sels de diazonium de l'invention peuvent être représentés par la formule : RN2+ X- ;ou RN2+ est un cation et X- est un anion. Les caractéristiques de couleur et de solubilité de l'azobilirubine dépendent, dans une large mesure, de la nature du radical R dans ces sels. Parmi les radicaux R associés à l'azobilirubine rouge, on peut citer les radicaux : 4-carboxyphényle, 4-nitrophényle, 3-carboxyphényle, 3, 5-dicarboxyphényle, 2-anthraquinonyle D-sulfo-4-chlorophényle, 3-sulfo-4-méthylphényle, 4-benzonitrile, 4-aminophényle et 2-sulfo-4-nitrophényle . Parmi les radicaux R associés à l'azobilirubine jaune, on peut citer les radicaux s 4diméthylamino-phényle, 2-hydroxy-Senitrophényle, 2-hydroxy-4-sulfol-naphtyle, 2-hydroxy-5-chlorophényle, 4-diéthylaminophényle,4 éthylpropylaminophényle, 4-morpholinophényle0Parmi les anions convenant aux sels de diazonium préférables de l'invention, on peut citer G o o- ZnCl4 , Cl , BF4 , Br ,PF6 (anion phosphotungstate Les sels de diazonium préférables selon l'invention sont ceux qui donnent ltazobilirubine rouge, par réaction avec la bilirubine neO Les sels de diazonium convenant particulièrement à l'invention sont Les sels de diazonium contenant un cation p-nitrobenzènediazonium donnent une réaction colorée particulièrement rapide, et l'a- zobilirubine obtenue présente un coefficient d'extinction particulièrement élevée Cependant la solubilité dans les solvants séiectionnés de l'azobilirubine ainsi obtenue est limitée, ce qui dimi- nue assez notablement la concentration mesurable de la bilirubine dans un échantillon de sérum sanguine Nais l'addition d'un groupe solubilisant, tel qu'un groupe sulfo- ou carboxyle, dans le noyau aromatique du cation, augmente sensiblement la solubilité de 1'aso- bilirubine, et permet l'analyse précise d'échantillons de sérum sanguin, dont la concentration en bilirubine varie dans de larges limites L'emploi du cation p-nitrobenzènediazonium peut avoir pour effet de provoquer un fond d'une couleur jaune indésirable dans la solution formée. Cette coloration jaune du fond peut être fortement réduite par l'emploi de ce cation en association avec, par exemple, l'anion Le brevet américain NO 2 854 317 décrit l'emploi conjoint de sels solides de diazonium avec des acides solides, comme l'acide sulfosalicylique, et de sels basiques, comme le bicarbonate de sodium, pour la détection qualitative de la bilirubine dans l'urine. Les ingrédients sont mélangés sous forme de tablettes ou comprimés, que l'on place sur un tampon absorbant, préalablement humecté avec l'urine. On ajoute de l'eau, pour répandre les constituants du comprimé sur le tampon, et y former une couleur en présence de bilirubine. Cependant l'eau et l'acide sulfosalicylique précipitent respectivement la bilirubine et les protéines dans le sérum sanguin, ce qui limite une telle méthode à la détection seulement qualitative de la bilirubine. Les solvants convenant à l'invention doivent être miscibles à l'eau, doivent contenir un constituant organique et ne doivent pas précipiter la bilirubine dans le sérum sanguin0 Un critère de miscibilité du solvant avec 11 eau, pour convenir à l'invention, est donné par la possibilité du mélange, à raison d'une partie d'eau, en volume, avec 1000 parties du solvant, en volume, en une phase unique de solution. L'vessai suivant permet de déterminer si un solvant est susceptible de précipiter la bilirubine dans le sérum sanguin, On introduit 3,8 ml du solvant essayé, dans un tube de verre, d'un diamètre interne de 1 cm, contenant une goutte d'acide chlorhydrique concen tré, à température ambiante On ajoute un sérum sanguin standard, vendu sous la dénomination commerciale de t'Versatol Pediatric par la Société dite General Diagnostic Division, Warner - Chilcott Laboratories ,puis on agite vigoureusement le tube, pendant environ 1 minute, et on l'examine à l'oeil. La présence d'un précipité, ou même d'une légère turbidi- té, est indicatrice de la précipitation de la bilirubine par le solvant essayé. Les solvants convenant à l'invention sont de préférence composés de mélanges de constituants liquides, mais ils peuvent aussi contenir des constituants solides. Parmi les solvants ou mélanges solvants, convenant à l'invention, on peut citer les suivants, où les proportions sont données en volumes dans le cas des mélanges nT e U 4 de diméthylsulfoxide pyridineXeau (2,5/l) acétone/eau (1/1) 1, 4-dioxane triméthylamine diméthylamine N,N-diméthylacétamide N-butyrolacétone cyclohexanone diéthylcétone propionitrile N-méthylformamide acide formique à 88 % formiate de méthyle nitrométhane nitro éthane N-éthylformamide acide formique à 88% /formaldéhyde (l/l) acide formique à 88% /N,N-diméthylformamide/eau (1/2/2) méthanol/eau (1/1) Parmi ces solvants, les diméthylsulfoxide, diméthylformamide, diméthylacétamide et le mélange acide formique-formaldéhyde constituent les solvants préférables pour le procédé de l'invention. La présence d'une quantité catalytique d'acide dans la solution réactionnelle est nécessaire pour la formation d'azobilirubine colorée, la quantité de l'acide dépendant du choix des réactifs et de la nature de l'acide, qui doit etre soluble dans le solvant choisi. Des acides solides, comme les acides maléique, citrique,tartrique, oxalique, p-toluène sulfonique, borique peuvent Qtre mélangés avec le sel de diazonium solide, comme décrit ci-dessus, ou dissous dans le solvant choisi. Parmi les acides liquides, l'acide chlorhydrique est préférable, et parmi les acides solides, l'acide oxali- que est préférable pour le procédé de l'invention. Les figures 1 et 2 représentent des formes de réalisation préférables des récipients de l'invention. Un récipient ou flacon de verre 10, comporte un fond scellé 12 et une extrémité supérieure 14 munie d'un filetage externe 16 ; un bouchon fileté 18 comporte un couvercle circulaire 20, muni d'une surface interne 22, contenant une ouverture coaxiale 24. Un manchon cylindrique , creux 26, comporte une portion supérieure 28, dont le diamètre externe permet le passage à travers l'ou- verture 24, et une portion inférieure 30 dont l'extrémité 32 est évasée à un diamètre égal au diamètre externe du filetage 16. Le manchon 26 est placé à l'intérieur du bouchon 18 de façon que l'ex- trémité 32 du manchon 26 recouvre la surface interne 22 du couvercle 20, la portion supérieure 28 dépassant vers l'extérieur de l'ouverture 24. Sur l'extrémité évasée 32 est montée étanche une membrane 34, déchirable (mais encore intacte) ,en matière plastique ou métallique. La surface 36 de la membrane 34 recouvre l'extrémité supérieure 14 du flacon 10, en le fermant de façon étanche aux liquides. Dans le manchon 26 coulisse une tige 38, dont la partie inférieure 42 a une extrémité 44 munie d'une pointe 46, capable de percer la membrane 34 lorsque la tige 38 est forcée vers le flacon 10. L'extrémité inférieure 44 de la tige 38, étant espacée de la mem brane 54, forme une cavité 48 avec celle-ciO La partie supérieure 40 de la tige 38 comporte une extrémité supérieure' 50 dont le diamètre est assez grand pour empecher son passage dans le manchon 26, ce qui limite le coulissage de la tige 38 vers le flacon 10. Un solvant 52 est placé dans le flacon 10 et un sel solide de diazonium 54 est placé dans la cavité 48. Une quantité catalytique d'acide, soluble dans le solvant 52, est mélangé soit au sel solide 54, soit au solvant 52, soit aux deux. Le flacon de verre 10 peut dtre remplacé par un compartiment de toute matière transparente à la lumière de longueur d'onde -5 000 o à 8 000 A . La cavité 48 peut aussi être constituée d'un second compartiment, qui communique avec le compartiment transparent lorsque le second compartiment est brisé, ou lorsque la membrane de séparation entre les compartiments est perforée, Par exemple, un second compartiment cassable peut être placé à l'intérieur d'un premier compartiment transparent et souple, de façon que le serrage du premier provoque l'écrasement du second, ce qui permet le mélange de leurs contenus respectifs. Le procédé préférable de l'invention peut entre effectué dans l'appareil décrit ci-dessus, de la manière suivante : on ajoute 0,2 ml d'un échantillon de sérum sanguin dans le flacon de verre contenant 3,8 ml du solvant 52, et une quantité catalytique d'acide. Le bouchon est assemblé au flacon, comme représenté sur la figure 1, et on agite pour dissoudre le sérum sanguin. On mesure la o densité optique DOl de la solution, à la longueur d'onde de 5250A dans un spectrophotomètre ordinaire.On abaisse ensuite la tige 38 pour rompre la membrane 34, et permettre le transfert dans le flacon 10 du sel de diazonium 54 en quantité suffisante pour réagir avec toute la bilirubine dans l'échantillon de sérum, et on agite à nouveau le flacon 10 pour dissoudre le sel de diazonium. Après un temps court (généralement 1 à 5 minutes), la réaction colorée est complète, et on mesure la densité optique D02 de la 50- lution colorée dans le flacon 10 à 5250 A . Pour obtenir la variation A DO de densité optique, attribuée à la formation dsazobiliru- bine, on soustrait DOl de DO2. La variation A DO est une fonction approximativement linéaire de la concentration de la bilirubine dans l'échantillon de sérum, qui est donc calculable en multipliant, par exemple, A DO par une constante de proportionnalité, ou par lecture d'un graphique de A DO en fonction de la concentration de bilirubine0 On peut avantageusement modifier le mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, décrit ci-dessus, en incorporant au sel de diazonium un acide solide comme l'acide maléique ou nitrique.On peut alors omettre, si on le désire, l'acide du solvant. Selon ce mode de réalisation préférable, il est désirable que le flacon de verre 10 soit adaptable aux spectrophotomètres standard, afin de permettre des mesures in situ de densité optique et d'éliminer l'emploi de cuvettes spéciales de spectrophotomètres. Les figs. 3 à 5 représentent un second appareil convenant à l'invention. Un tube 60, contenant un solvant 61 comporte une extrémité supé- rieure ouverte 62 munie , à l'intérieur, d'un bouchon tubulaire 64, dont la projection tubulaire 66, fermée hermétiquement en son extrémité 68, peut étre coupée pour permettre l'introduction de l'échantillon de sérum dans le solvant 61 dans le tube 60. La portion inférieure 70 du tube 60, de diamètre réduit, se termine par une face 72 ayant une ouverture conique 75 dans l'arc du tube 60. Un raccord 74, ouvert à sa partie supérieure 76, s'adapte de fa- çon étanche sur la portion 70 de moindre diamètre du tube 60.LZe2- trémité inférieure 78 du raccord 74 de diamètre réduit, s'adapte de façon étanche à l'extrémité ouverte suieura 80 d'un tube de verre 82, contenant le sel Zfdz 8? de diazonium, t d..oift l'extré- mité inférieure 86 est fermée0 Fixée à la paroi interne 87 du raccord 74, une aiguille 90, actionnée par centrifugation, est placée dans l'axe de l'ouverture 73 et la bouche au repos, de façon étanche. A l'aiguille 90 est suspendue une cage creuse 92 contenant un poids 94, tel qu'une sphère de plomb. Des bandes élastiques 88 peuvent légèrement s'allonger lorsque la cage 92 contenant le poids 94 est soumis à une fprce axiale,dans le sens de la flèche, d'une intensité supérieure à la force normale de pesanteur, comme par exemple celle résultant d'une centrifugation de l'appareil. Sous l'effet d'une telle force, la cage 92 chargée du poids 94 détache l'aiguille 90 de l'ouverture 73, à L'rencontre de l'action des bandes 88, en permettant l'écoulement du solvant 61 à travers le raccord 74, dans le flacon, et son mélange avec le sel 84. Une quantité catalytique d'acide est contenue soit dans le tube 60, soit dans le flacon 82, soit dans les deux0 Le procédé de l'invention peut être effectué dans l'appareil des figs0 3 à 5 , de la manière suivante : Après avoir coupé le tube 66, on introduit un échantillon de 0,2 ml de sérum sanguin dans le tube 60 contenant 3,8 ml du solvant 61 et, on dissout le sérum par agitation douce.L'appareil est placé dans une centrifugeuse, son bouchon 64 étant le plus rapproché de l'axe de la centrifugeuse et on centrifuge à une vitesse convenable pour que la cage 92 et son poids 94 soient soumis à une force environ six cent quatre vingt dix fois supérieure à la force normale de pesanteur L'aiguille 90 es-t ainsi dégagée de l'ouverture 73 et le contenu du tube 60 se mélange au sel 84, dans le flacon 82, pour y former la solution colorée d'azobilirubine. Après un temps court (généralement de 1 à 3 minutes) on mesure la densité optique de cette solution colorée, dans le flacon de verre 82, et on en déduit la concentration de la bilirubine dans le sérum, selon les méthodes précédemment indiquées. Il est désirable de mesurer simultanément la densité optique d'une solution de contrôle (c'est-à-dire dgune solution de sérum sanguin, d'acide et de solvant seul), pour permettre la correction de la mesure de densité optique de la solution colorée d'azobilirubine. La figure 6 représente une autre variante de l'appareil de l'invention. Un flacon de verre 96, contenant le solvant 98, est muni à son e Une quantité catalytique d'acide est contenue dans le sel 110, ou le solvant 98, ou les deux. Le procédé de l'invention peut etre effectué dans l'appareil de la figure 6 , de la manière suivante On retire le bouchon 102 du flacon 96, qui contient 3,8 ml de solvant 98 et une quantité catalytique d'acide, et on ajoute 0,2ml d'un échantillon de sérum sanguin dans le flacon 96 On remet le bouchon 102 sur le flacon 96 qu'on agite doucement pour dissoudre le sérum, puis on le place dans un spectrophotomètre standard,et on mesure la densité optique DOl de la solution. On détache ensuite la membrane 112 du bouchon 102 pour exposer le le sel solide 110. On enlève le bouchon 102, on le retourne et on l'adapte à nouveau sur le flacon 96, le sel 110 étant ainsi introduit dans la solution pour y former l'azobilirubine colorée.On agite doucement le flacon 96 pour dissoudre le sel et après un temps court, (généralement 1 à 3 minutes) on place le flacon 96 dans un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique D02 de la solution colorée, La concentration de la bilirubine dans l'échantillon de sang est déduite de ces mesures, comme précédemment indiqué. Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif EXEMPLE 1 :- Dans l'appareil des figs. 1 et 2, dont le tube de verre est adapté pour l'emploi comme cuvette dans un colorimètre Coleman "Junior II" ,on utilise 3,8 ml de diméthylsulfoxyde comme solvant, contenant 20 g/1 d'acide oxalique et 0,2 mg du sel de diazonium On établit la relation de la densité optique de la solution d'azobilirubine avec des concentrations connues de bilirubine dans un échantillon de sérum sanguin standard, de la façon suivante: dans chaque essai, on ajoute au solvant 0,2 ml du "Versatol Control Serum" vendu par la Société dite : General Diagnostic Division, Warner-Chilcott Laboratories, contenant une concentration connue de bilirubine.Après mesure de la densité optique DO à 5250 A , on ajoute le sel de diazonium en abaissant la tige 38 de l'appareil et on agite doucement pour dissoudre le sel. On laisse reposer pendant 5 minutes, au cours desquelles se forme une coloration rouge. On mesure ensuite la densité optique D02 de la solution colorée à 5250 , et on calcule # DO , dû à l'azobilirubi- ne, colorée, en soustrayant DO1 de D02 . Les résultats obtenus sont les suivants : (Voir tableau, page suivante). En portant la concentration de la bilirubine en fonction de FADO, on obtient une relation essentiellement linéaire, sauf pour le point correspondant à la concentration la plus élevée en bilirubine ne ,qui s'écarte légèrement de la droite. Concentration connue de DO1 DO2 A DO bilirubine mg/lOO ml de sérum 20,3 0,063 l,360 1,297 10,0 0,046 0,754 0,708 s 10,0 0,046 0,744 0,698 5,0 0,023 0,386 0,363 x 5,0 0,024 0,388 0,364 2,6 0,012 0,215 0,203 s 2,6 0,015 0,215 0,200 s Mesure faite en double. On répète le même processus pour l'analyse de quantités inconnues de bilirubine dans quatorze échantillons de sérum sanguin, et on établit la relation entre # DO et la concentration en bilirubine à l'aide du graphique préalablement établi, comme décrit cidessus, A titre comparatif, on effectue des mesures parallèles de bilirubine selon la méthode Nalloy-Evelyn J. BiolO Chem. 119, 481 (1937) où la densité optique de la solution d'azobilirubine est mesurée 10 minutes après le mélange des ingrédients. Les résultats obtenus, indiqués ci-dessous,montrent la fiabilité excellente du procédé de l'invention. Concentration en bilirubine, mg/100 ml Echantillon N Méthode de Malloy-Evelyn Mallo-Evelyn l'exemple 1 ##1 ## 2 1 0,3 0,4 0,6 2 1,6 1,7 1,9 3 0,7 0,7 1,1 4 0,2 0,3 0,3 5 0,3 0,3 0,4 6 0,3 0,6 1,2 7 0,7 0,8 1,0 8 12,5 15,4 13,4 9 5,3 5,8 5,6 lO 0,6 0,7 0,9 11 16,0 16,0 16,0 12 9,S 10,0 8,5 13 9,8 10,0 10,2 14 4,2 4,1 4,4 EXEMPLE 2 :- On utilise les ingrédients suivants : 0,2 mg de sel de diazonium, 3,8 ml de diméthylsulfoxyde, 0,076 g d'acide oxalique et 0,2 ml d'échantillon du sérum "Versatol Control" contenant 2,6 et 5,0 mg/100 ml de sérum. A0- On ajoute successivement, dans une cuvette de spectrophotomètre, les ingrédients précités, que l'on mélange entre eux après chaque addition 1.- Solvant (diméthylsulfoxyde); 2.- Sérum sanguin; 3.- Acide oxalique; 4.- Sel de diazonium On mesure DO1 avant l'addition du sel de diazonium, puis D02, 5 minutes après l'addition de ce sel. B.- On mélange, simultanément, tous les ingrédients précités dans une cuvette de spectrophotomètre, on laisse reposer le mélange pendant 5 minutes, puis on mesure D02. On répète le processus dans une seconde cuvette, sauf que le sel de diazonium est omis et on mesure DO1. Les résultats obtenus sont donnés ci-dessous ,comparativement avec ceux de l'exemple 1. Bien que les résultats-obtenus selon A semblent anormalement élevés, on obvient des mesures exactes de bilirubine en les rapportant à une courbe d'étalonnage de A DO en fonction de la concentration, établie comme dans exemple 1, avec des échantillons de sérum contenant des concentrations con nues de bilirubine. Concentration connue A DO A DO A DO en bilirubine mg/lOO ml exemple 1 exemple 2 (A) exemple 2 (B) 2,6 0,200 0,221 0,198 5,0 0,363 0,596 0,350 Bien entendu, l'invention n1 est nullement limitée aux exemples décrits et représentés, elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées, et sans quton s'écarte pour cela du cadre de l'inven- tion. -REVENDICATIONS lot Procédé pour la mesure quantitative de la bilirubine dans le sérum sanguin, selon lequel on fait réagir la bilirubine avec un sel de diazonlum en solution, pour obtenir une solution colorée dont la densité optique dépend de la concentration de la bilirubine dans le sérum sanguin, ledit procédé étant caractérisé par les opérations suivantes :: 1) on fait réagir, dans un solvant miscible à l'eau, qui ne pré cipite pas la bilirubine dans le sérum sanguin et qui comprend un constituant organique, en presence d'une quantité catalytique d'acide dans ledit solvant, a) un écantillon du sérum sanguin contenant la bilirubine, et b) un sel de diazonium solide capable de réagir dans ledit solvant avec la totalité de la bilirubine dans l'échantillon de sang, en présence dudit acide, pour former une so- lution colorée, limpide à l'oeil, d'azobilirubine, dont le coeffi cient deatinction est d'au moins 7,5o 183 l/mole-cm, dans la gam- me des longueurs d'onde de 5 QOO à 8 000 A 9 et 2) on mesure la densité optique de ladite solution colorée0 2 t Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant comprend le diméthylsulfoxyde, diméthylformamide, diméthyl- acétamide, -ou un mélange d'acide formique et de formaldéhyde. 3- Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le sel de diazonium comprend un cation e t Un anion, le ce tion étant un radical benzène diazonium, contenant au moins un substituant qui est un groupe -S03H, -NO2 , -COOH, ou NH2 O 40- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on dissout l'échantillon de sérum sanguin contenant la bilirubine dans le solvant, on mélange cette solution avec une quantité catalytique d'acide solide soluble dans le solvant et avec le sel de diazonium solide, et on mesure la densité optique de la solution colorée ainsi obtenue, 5)- Appareil pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, comprenntun récipient à deux compartiments, l'un desdits compartiments étant sensiblement transparent à la lu o o mière de longueur d'onde de 5000 A à 8000 A , le premier desdits compartiments contenant un solvant miscible à l'eau qui ne précipite pas la bilirubine du sérum sanguin et qui contient un composé organique, un moyen de séparation au repos desdits compartiments, des moyens permettant l'accès audit premier compartiment pour y placer un échantillon de sérum sanguin, le second desdits compartiments contenant un sel de diazonium solide capable de réagir dans ledit solvant avec toute ladite bilirubine dudit échantillon en présence d'une quantité catalytique d'acide pour former une solution claire d'azobilirubine ayant un coefficient d'extinction au moins égal à 7,5 x 105 litres/mole-cm pour une longueur d'onde de 5000 À à 8000 À , ledit récipient contenant en outre une quantité catalytique d'acide, des moyens permettant de faire communiquer entre eux lesdits compartiments pour mélanger les ingrédients et former une solution colorée d'azobilirubine dont la densité optique est mesurable dans ledit récipient transparent. 6.- Appareil suivant la revendication 5, dans lequel le premier compartiment est un flacon transparent à la lumière, le second compartiment comprenant un capuchon fermant ledit flacon de façon amovible. 7.- Appareil suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le premier compartiment est transparent à une lumière ayant une o o longueur d'onde de 5000 À à 8000 À et comporte à l'une de ses extrémités un élément de fermeture pouvant être rompu;le second compartiment est adjacent à ladite extrémité dudit premier compartiment; un élément de fermeture susceptible d'être rompu sépare les dits premier et second compartiments; un organe de rupture adjacent audit élément de fermeture permet au sel de diazonium de pénétrer dans ledit premier compartiment contenant l'échantillon sanguin afin de former une solution colorée d'azobilirubine ayant une densité optique mesurable dans ledit premier compartiment transparent. 8.- Appareil suivant l'une des revendications 5, 6 ou 7 caractérisé en ce que le premier compartiment est un tube de verre transparent à l'extrémité inférieure fermée hermétiquement et à l'extrémité supérieure à diamètre externe fileté; en ce qu'un capuchon tubulaire, vissé sur ladite extrémité supérieure dudit tube, a sa face supérieure circulaire percée dtune ouverture coaxiale audit tube; en ce qu'un manchon creux, cylindrique a une partie supérieure capable de passer à travers ladite ouverture et une partie inférieure évasée jusqu'à un diamètre sensiblement égal au diamètre externe dudit tube fileté, ladite extrémité évasée reposant dans ledit capuchon en contact avec sa face supérieure circulaire, ladite partie supérieure dudit manchon s'étendant à l'extérieur de ladite ouverture, coaxialement avec ledit tube; en. ce qutune membrane, non brisée mais susceptible d'être rompue, ferme hermétiquement ledit manchon et forme avec ltextrémité supérieure dudit tube un joint étanche aux liquides; en ce que la quantité catalytique d'acide est contenue dans ladite partie inférieure dudit manchon; en ce que le sel de diazonium est contenu dans ladite partie inférieure dudit manchon, séparé de façon étanche dudit tube par ladite membrane; en ce qu'une tige placée dans le dit manchon comprend une partie supérieure limitant le trajet de ladite tige dans ledit manchon et une partie inférieure, coulissable dans ledit manchon, se terminant en un point de rupture de la dite membrane lorsque ladite tige est forcée à travers ledit manchon en direction dudit tube pour déposer ledit sel de diazonium dans ledit tube ayant reçu l'échantillon sanguin. 90- Appareil suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'acide est en solution dans le solvant, dans le tube de verre,