Brevet FR2039274A1 — publié le 19710115

L'invention concerne un procédé pour la préparation d'enzymes, ainsi que les enzymes ainsi obtenus, le procédé en question étant basé sur l'utilisation de certains mutants du genre Bacil-lus pour préparer lesdits enzymes. 5 II est possible de produire plusieurs enzymes industrielle ment importants en cultivant des bactéries appartenant au genre Bacillus dans des milieux nutritifs adéquats. D'intéressants exemples de tels enzymes sont des protéases utilisables comme constituants d'agents nettoyants, tels par exemple que des dé-10 tergents, des compositions pour laver la vaisselle, etc., et des amylases utilisables pour réaliser l'hydrolyse de l'amidon. Normalement, les enzymes de ce type contiennent en grand nombre des bactéries vivantes provenant de l'opération même de production de ce» enzymes, ce qui se traduit par un résultat indé-15 sirablement élevé du dénombrement effectué par les méthodes habituelles de dénombrement sur plaques. Il convient d'éviter le plus possible ce type de contamination car des enzymes du type sus-spécifié, bien qu'ils puissent par ailleurs être satisfaisants (par exemple, en ce qui concerne l'activité enzymatique 20 et les rendements avec lesquels on obtient ces enzymes), ne sont pas facilement acceptables par les utilisateurs ni, dans certains cas, par les autorités officielles compétentes, à moins que le dénombrement des bactéries qu'ils contiennent se traduise par un nombre peu élevé. 25 Un nombre peu élevé de bactéries dans une préparation d'en zymes du type sus-spécifié peut par exemple être obtenu- en prévoyant une opération de filtration bactériologique au cours de la purification du produit contenant lesdits enzymes. Une filtration bactériologique est toutefois difficile et coûteuse 30 quand elle s'applique aux grandes quantités de liquide à traiter. . Un tel nombre peu élevé de bactéries peut, à titre de variante, s'obtenir par irradiation de la préparation impure d'enzymes avec des rayons Y ou des faisceaux d'électrons. Toutefois, ces méthodes sont elles aussi coûteuses et, en outre, provoquent une perte 35 d'activité enzymatique. De plus, dans de nombreux pays, des produits irradiés sont considérés comme non-conformes aux normes de sécurité quand ils sont utilisés en vue des buts sus-mention-nés. Conformément à l'invention, on a découvert que des produits 40 du type enzyme hautement avantageux des types sus-spécifiés peu 70 14056 2 2039274 vent être obtenus quand certains mutants, à sporulation déficiente, d'espèces appartenant au genre Bacillus sont cultivés dans des milieux adéquats, après quoi on peut élaborer des préparations enzymatiques liquides ou solides par mise en oeuvre des 5 méthodes usuelles. Par conséquent, l'utilisation de mutants asporogènes (ou à peu près asporogènes) telle que comprise dans la portée de l'invention conduit à l'obtention de produits enzymatiques qui non seulement sont pratiquement exempts d'impuretés se présentant 10 sous la forme de spores, mais aussi donnent des chiffres très bas de dénombrement de bactéries. Un avantage supplémentaire réside dans le fait que la culture des souches asporogènes donne fréquemment de meilleurs rendements en enzymes. 15 L'accroissement du rendement en enzymes par rapport au ren dement obtenu avec la souche sporogène apparentée s'est révélé le plus prononcé au cours de la production de protéases alcalines. Sous son aspect le plus large, la portée de l'invention en-20 globe un procédé pour la préparation d'un produit enzymatique contenant un faible nombre de bactéries par culture d'une bactérie du genre Bacillus dans un milieu nutritif, lequel procédé consiste essentiellement à réaliser la culture à partir d'un mutant asporogène producteur d'enzyme, et à isoler le produit en-25 zymatique directement à partir du bouillon de fermentation. Des mutants à sporulation déficiente d'espèces appartenant au genre Bacillus et qui conviennent en vue de la mise en oeuvre de 11 invention peuvent être obtenus par mise en oeuvre de modes opératoires de mutation généralement bien connus des spécialis- 30 tes et tels par exemple qu'irradiation mutagène par des rayons UV, des faisceaux d'électrons, des rayons X ou des rayonnements gamma ; par chauffage des spores dans le vide ; par utilisation de mutagènes chimiques tels qu'acide nitreux, nitrosoguanidine, éthylèneimine, sulfate de diéthyle, gaz moutarde, orange d'acridi-35 ne, acrif lavineou par tous autres moyens connus permettant d' d'accroître la fréquence des mutations. Des mutants à sporulation déficiente peuvent aussi être formés à partir de souches sporogènes par mutation spontanée. Les agents mutagènes préférés sont la lumière UV, des fais-40 ceaux d'électrons, des rayons X et 1'acriflavine. Un mode de réalisation particulier de l'invention consiste à COPY 70 14056 3 2039274 utiliser un mutant asporogène de Bacillus subtilis, de Bacillus licheniformis, de Bacillus cereus ou d'une espèce de Bacillus alcalophile lors de la mise en oeuvre du procédé sus-spécifié. D'autres modes de réalisation particuliers de l'invention 5 consistent essentiellement à utiliser les nouveaux mutants du genre Bacillus à sporulation déficiente suivants : B. subtilis souches NCIB nos 10448 et 10449, J3. cereus souche NCXB n° 10447 et J3. licheniformis souche NCIB n° 10402, et un Bacillus alcalophile sp. NCIB n°s 10398, 10399, 10400 et 10401 lors de la mise 10 en oeuvre du procédé sus-spécifié. Ces mutants ont été déposés et enregistrés, sous les numéros indiqués ci-dessus, à la National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Scotland (NCIB). En vue de la production d'enzymes, les mutants à sporulation 15 déficiente en question peuvent être cultivés sur des milieux rigoureusement ou pratiquement identiques à ceux servant à cultiver les souches sporogènes dont ils sont issus. On effectue donc la culture dans un milieu nutritif contenant du carbone et dé l'azote assimilables ainsi que d'autres agents nutritifs essen-2o tiels, le milieu de culture étant composé selon les principes bien connus des spécialistes. Des sources de carbone adéquates sont des hydrates de carbone tels que saccharose, glucose et amidon, ou des matières contenant des hydrates de carbone telles que grains de céréales, malt, riz et sorgho. La concentration 25 d'hydrates de carbone -incorporés au milieu nutritif peut varier largement : elle peut par exemple s'élever jusqu'à 25 % et s'abaisser jusqu'à 1 à 5 %, mais habituellement une concentration de 8 à 10 % est convenable ; ces pourcentages sont calculés en dextrose. 30 La source d'azote dans le milieu nutritif peut être de natu re minérale et/ou organique. Des sources d'azote minérales adéquates sont quelquefois des nitrates et des sels d'ammonium. Parmi les sources d'azote organiques, il en existe un grand nombre qui sont réqulièrement utilisées dans les opérations de fer-35 mentation mettant en jeu la culture de bactéries ; comme exemples non limitatifs, on peut citer la farine de soja, la farine de graines de coton, la farine d'arachide, la caséine, la liqueur de macération de mais, l'extrait de levure, l'urée, l'albumine. En outre, il convient que le milieu nutritif contienne aussi les 40 oligo-éléments usuels, substances présentes à l'état de traces. COPY 70 14056 ^ 2039274 A La température à laquelle on effectue habituellement la culture est comprise dans l'intervalle normalement utilisé pour la culture d'espèces du genre Bacillus. On peut habituellement opérer à une température comprise entre 25 et 55°C. La température 5 est de préférence de 30 à 40°C. Etant donné que la culture doit être effectuée dans des conditions aérobies» il est nécessaire de prévoir une aération artificielle quand on fait croître les bactéries dans des cuves de fermentation. La proportion d'air est du même ordre que celle utilisée au cours d'opérations de 10 culture classiques. En général, des rendements maximum en enzymes se trouvent obtenus après un temps de culture de 1 à 5 jours. Comme exemples de compositions convenables des milieux nutritifs, on peut mentionner les trois compositions suivantes ; les 15 concentrations sont données en grammes par litre d'eau du robinet . 1) RM 4 : amidon de pomme de terre 40 farine de soja 30 orge moulue 100 20 CaC03 5 huile de soja 0,5 2) BPFA : amidon de pomme de terre 50 saccharose 50 orge moulue 50 25 farine de soja 20 caséinate de sodium 10 Na2HP04, 12H20 9 agent anti-mousse (polyglycol) 0,1 3) BPX i même composition que BPFA, à l'exception du fait que 30 l'on ajoute au total 100 grammes d'amidon de pomme de terre par litre, et l'on n'utilise pas de saccharose. Dans tous ces milieux, l'amidon est liquéfié avec de 1'a-.amylase avant stérilisation. Les milieux BPFA et BPX sont aseptiquement ajustés à pH 9,7 35 avec du sesquicarbonate de sodium après stérilisation, sauf spécification contraire expressément mentionnée. Des préparations dfenzymes dans lesquelles on peut dénombrer peu de bactéries peuvent être obtenues, à partir des bouillons de fermentation élaborés ci-dessus, par mise en oeuvre de métho-40 des connues en soi. Bien que cela ne soit pas impératif, le pre— 70 14056 5 2039274 mier stade de l'opération de purification est habituellement une centrifugation permettant d'éliminer des particules grossières à partir du bouillon. XI en résulte la précipitation de quel- ques-unes des bactéries présentes dans le bouillon ; typiquement, 10 5 un bouillon peut contenir approximativement 10 organismes par 9 gramme avant la centrifugation et approximativement 10 organismes par gramme après la centrifugation. Une préparation d'enzyme liquide,stable,ne contenant que peu de bactéries, peut être obtenue en ajoutant un antiseptique au 10 bouillon centrifugé, si on le désire après une concentration par évaporation à basse température ou par osmose inverse. Comme antiseptique pour des préparations d'enzymes de ce type, on utilise souvent du chlorure de sodium à des concentrations de 15 à 20%. 15 Des préparations d'enzymes solides ne contenant que peu de bactéries peuvent être obtenues, à partir du bouillon centrifugé décrit ci-dessus, par précipitation au moyen d'agents habituellement utilisés en vue de l'isolement d'enzymes et tels que des sels minéraux ou des solvants organiques miscibles avec l'eau. 20 Des sels convenables sont par exemple le sulfate de sodium et le sulfate d'ammonium. Des solvants adéquats sont par exemple l'alcool, l'acétone, 1'isopropanol et le dioxanne. Afin de minimiser des pertes d'activité enzymatique, de telles précipitations sont souvent effectuées à de basses températures , par exemple com-25 prises entre 0 et 4°C. La proportion de précipitant nécessaire varie d'un enzyme à un autre et doit pour chaque enzyme être déterminée expérimentalement. Après la précipitation, l'enzyme est séparé par tous moyens adéquats, par exemple par filtration suivie d'un séchage, 30 à basse température, du précipité. Si on le désire, la préparation peut finalement être broyée et ajustée à une activité enzymatique spécifique par addition d'une substance inerte telle, par exemple, que du sulfate de sodium. 35 D'après ce qui précède, il est facile de comprendre qu'un mo de de réalisation particulier du procédé selon l'invention consiste essentiellement à isoler l'enzyme par concentration du bouillon de fermentation, de préférence par évaporation sous pression réduite ou par osmose inverse, suivie d'une addition 40 d'agents antiseptiques , de préférence du chlorure de sodium. 70 14056 6 2039274 Un autre mode de réalisation du procédé en question consiste essentiellement à isoler l'enzyme par relargage dô l'enzyme à partir du bouillon de fermentation, de préférence en se servant de Na2SO^ ou de (NH^^SO^ , et séchage du précipité à basse tem-5 pérature après séparation à partir du bouillon par filtration. Encore un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention consiste essentiellement à isoler l'enzyme par précipitation avec un solvant organique miscible avec l'eau, de préférence de l'éthanol ou de l'acétone, et séchage du précipité à 10 basse température après séparation à partir du bouillon par filtration. Le procédé faisant l'objet de l'invention est encore illustré ci-après par différents exemples particuliers» bien entendu non limitatifs. 15 L'activité protéolytique dont il est question ci-après est déterminée selon les indications de Anson (J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939)} en utilisant de l'hémoglobine dénaturée par de l'urée comme substrat. L'activité ct-amylase est déterminée par la méthode de Sands- 20 tedt, Kneen et Klish (Cereal Chem., 16, 712 (1939)). Exemple 1 .- Bacillus licheniformis mutant NCIB n° 10402 est cultivé à 30°C sur une table secouante rotative (220 tours/minute) dans des fioles d'Erlenmeyer de 500 ml cloisonnées et contenant 100 ml de milieu RM 4. 25 Après 5 jours de culture, le rendement en protéase alcaline est de 130 unités Anson par kg. On obtient une préparation d'enzyme par centrifugation, suivie d'une saturation du fluide surnageant avec du sulfate de sodium, et enfin par séchage du précipité sous vide à 30®C après 30 séparation par filtration. Le dénombrement des bactéries, sur •>. 2 4 une plaque a l'agar, donne 10 -10 organismes par gramme de la préparation sèche. Une expérience similaire conduite avec la souche parente spo-rogène donne un rendement de protéase alcaline de 120 unités An- Q 35 son/kg, et on dénombre dans la préparation finale environ 10 — 9 10 organismes/g . Exemple 2 .- Un Bacillus alcalophile, mutant NCIB n* 10401, est cultivé à 30°C sur une table secouante rotative (220 tours/ minute) dans des-fioles d'Erlenmeyer de 500 ml cloisonnées et 40 contenant 100 ml de milieu BPFA. Après'5 jours de culture, le 70 14056 7 2039274 rendement de protéase alcaline est de 120 unités Anson. On élabore une préparation d'enzyme en opérant de la manière décrite dans l'exemple 1. Le nombre de bactéries compté par gramme de préparation, sur 5 une plaque à l'agar ajustée à pH 9,7 avec du sesquicarbonate de 2 A sodium, est de ÎO -10 . Une expérience similaire conduite avec la souche parente sporogène donne un rendement de protéase alcaline de 30 unités Anson/kg et un nombre de bactéries dans la préparation finale com- 8 9 10 pris entre environ ÎO et 10 organismes par gramme. Exemple 3 .- On cultive un Bacillus alcalophile, mutant NCIB n° 10401, en opérant de la manière décrite dans l'exemple 2. Le bouillon de fermentation est centrifugé à 4500 G pendant 15 minutes pour en éliminer les matières en particules grossiè- 9 15 res ; le liquide centrifugé contient 10 organismes par gramme. On précipite l'enzyme par addition de 2 volumes d'éthanol à 96 % à 0°C ; on isole le précipité par filtration, on le lave sur filtre avec de l'éthanol, et on le sèche à l'air à la température ambiante ordinaire. Le rendement en enzyme dans la pré-20 paration sèche représente 50 % de l'activité que contenait le bouillon de fermentation. Le nombre de bactéries dans la préparation, déterminé de la x 2 manière décrite dans l'exemple 2, est inférieur à 10 par gramme. Une expérience similaire conduite avec la souche parente 25 sporogène donne un nombre de bactéries, dans la préparation £i- 9 nale, d'environ 10 organismes par gramme. Exemple 4 .- On répète l'expérience de l'exemple 3, mais en utilisant de l'acétone à la place de l'éthanol. Le rendement en enzyme dans la préparation sèche est de 50 % 30 de l'activité se trouvant dans le bouillon de fermentation ; le dénombrement des bactéries dans la préparation permet de trouver, ^ 2 en opérant de la manière décrite dans l'exemple 2, moins de 10 organismes par gramme. Une expérience similaire conduite avec la souche parente 35 sporogène permet de compter dans la préparation finale environ 9 10 bactéries/g. Exemple 5 .- On cultive un Bacillus alcalophile, mutant NCIB N° 10401, en opérant de la manière décrite dans l'exemple 2. On centrifuge le bouillon de fermentation à 45OO. G pendant 40 15 minutes pour en éliminer des matières en- particules grossiè- 70 14056 s 2039274 res ; le liquide centrifugé contient ÎO organismes par gramme. On précipite l'enzyme par addition de 40 g de sulfate d'ammonium pour 100 ml ; on sépare le précipité par centrifugation à 4500 G pendant 30 minutes, puis on le sèche sous vide sur 5 On recueille ainsi, dans la préparation sèche, 45 % de l'activité enzymatique contenue dans le bouillon de fermentation. Le nombre de bactéries dans la préparation, déterminé de la 2 manière décrite dans l'exemple 2, est inférieur à 10 par gramme. 10 Une expérience similaire, conduite abec la souche parente sporogène, donne dans la préparation finale un dénombrement cor- 9 respondant à environ 10 organismes par gramme. Exemple 6 .- On cultive un Bacillus alcalophile, mutant NCIB n° 10400, à 30°C sur une table secouante rotative (220 tours/ 15 minute) dans des fioles d*Erlenmeyer de 500 ml cloisonnées, contenant 100 ml de milieu nutritif BPX. Après 5 jours de culture, le rendement en protéase alcaline est de 125 unités Anson/kg. On produit une préparation d'enzyme en opérant de la manière décrite dans l'exemple 1. 20 Le dénombrement de bactéries par gramme, déterminé sur la préparation en opérant de la manière décrite dans l'exemple 2, 2 4 donne environ 10 -ÎO . Une expérience similaire, conduite avec la souche parente sporogène, donne un rendement en protéase alcaline de 50 unités 9 25 Anson/kg ; on dénombre dans la préparation finale environ 10 -10 10 bactéries par gramme. Exemple 7 .- On répète le mode opératoire de 1'exemple 2, mais en utilisant un Bacillus alcalophile, mutant NCIB n° 10399., Le rendement en protéase alcaline est- de 100 unités Anson/kg. 30 On élabore une préparation d'enzyme en opérant de la manière décrite dans l'exemple 1. En opérant de la manière décrite dans l'exemple 2, on dénom- 2 4 bre dans la préparation finale environ 10 -10 bactéries par gramme. 35 Une expérience similaire, conduite en utilisant la souche parente sporogène, donne un rendement en protéase alcaline de 60 unités Anson/kg et on dénombre dans la préparation finale 8 9 environ 10 -10 bactéries par gramme. Exemple 8 .- On répète le mode opératoire de l'exemple 3, 40 mais en utilisant un Bacillus alcalophile, mutant NCIB n° 10398. 70 14056 9 2039274 rendement en protéase alcaline est de 110 unités Anson/kg. Le dénombrement des bactéries par gramme, déterminé sur la préparation en opérant de la manière décrite dans l'exemple 2, est de 10^-10^. 5 Une expérience similaire, conduite en utilisant la souche parente sporogène, donne un rendement en protéase alcaline de 20 unités Anson/kg ; le dénombrement des bactéries dans la * 9 10 préparation finale donne environ 10 -10 organismes par gramme. Exemple 9 .- On cultive un Bacillus subtilis, mutant NCIB 10 n* 10449, à 30°C, sur une table secouante rotative (220 tours/ minute) dans des fioles d1Erlenmeyer de 500 ml cloisonnées, contenant 100 ml de milieu nutritif BPX à pH 5,8. Après 3 jours de culture on mesure l'activité protéolytique dans CaClg 0,01 M ; elle est de 62 unités Anson par kg. Le ren-15 dement en protéase alcaline déterminé dans EDTA 0,01 M (sel de sodium de l'acide éthylènediaminetétraacétique) est de 35 unités Anson/kg. L'activité amylolytique est de 250 unités SKB par gram-me • On élabore une préparation d'enzyme en opérant de la maniè- 20 re décrite dans l'exemple 1. Par dénombrement des bactéries en opérant de la manière décrite dans l'exemple 1 on en trouve en-. -.2 viron 10 par gramme. Une expérience similaire conduite sur la souche parente sporogène donne un rendement en protéase de 56 unités Anson/kg 25 (mesure effectuée dans CaC^ 0,01 M), un rendement en protéase alcaline mesuré comme ci-dessus de 2 7 unités Anson/kg, un rendement en a-amylase de 210 unités SKB par gramme, et le dénombrement des bactéries dans la préparation finale donne pour ré-9 10 sultat 10 -10 bactéries par gramme. 30 Exemple 10 .- On cultive Bacillus subtilis mutant NCIB n° 10448 sur agar nutritif à 30°C pendant 48 heures ; on se sert ensuite de cette culture comme inoculum pour une cuve de fermentation d'ensemencement en acier inoxydable contenant 80 litres de milieu nutritif RM 4 stérilisé à la vapeur. Après 18 heures 35 de croissance à 32°C, un taux d'aération de 1 volume par volume à la minute et une vitesse d'agitateur de 400 tours/minute, le contenu de la cuve de fermentation d'ensemencement est transféré à un appareil de fermentation principal contenant 200 litres de milieu, nutritif RM 4 ; on poursuit la fermentation pendant 72 40 heures dans.les conditions sus-spécifiées. Le rendement final en 70 14056 10 2039274 amylase est de 550 unités SKB par gramme et le rendement en protéase est de 50 unités Anson/kg. On refroidit le bouillon de fermentation jusqu'à 4 °C ; on en sépare les matières en suspension par centrifugation. Un dé-5 nombrement des bactéries dans le bouillon centrifugé en indique 10 par gramme. Une préparation solide, ayant une activité oc-amylase de 8100 unités SKB par gramme et une activité protéase de 0,7 unités Anson/g , est obtenue en saturant une moitié du bouillon avec 10 Na2S04 et en séchant le précipité sous vide à 40°C après séparation par filtration. On dénombre dans cette préparation environ 2 10 bactéries viables par gramme ; on compte par gramme moins de 10 organismes générateurs d'enzyme. Le reste du bouillon de fermentation centrifugé est concen-15 tré sous vide à 30°C jusqu'au cinquième de son volume initial. On ajoute NaCl jusqu'à une concentration finale de 18 %. On obtient ainsi une préparation d'enzyme dans laquelle on compte au 4 total 10 bactéries viables par gramme ; la présence de l'organisme générateur d'enzyme n'y est pas décelable. 20 On effectue une fermentation similaire avec la souche paren te sporogène. Le rendement en enzyme dans le bouillon de fermentation est de 470 unités SKB par gramme d'amylase et de 50 unités Anson par kg de protéase. On élabore des préparations solide et liquide d'enzyme à 25 partir dû bouillon en opérant de la manière décrite ci-dessus. 7 Dans la préparation solide, on compte au total 5 x 10 bactéries viables par gramme ; dans la préparation liquide , on en 7 compte 1 x 10 par gramme. Le résultat est principalement dû à la présence de la souche génératrice d'enzyme. 30 Exemple 11 .- On cultive Bacillus cereus mutant NCIB n° 10447 sur agar nutritif à 30°C pendant 24 heures ; on utilise ensuite cette culture comme inoculum dans une cuve de fermentation d'ensemencement en acier inoxydable contenant 80 litres de milieu nutritif BPX stérilisé à la vapeur et ajusté à pH 6,1 35 après stérilisation ; après 11 heures de croissance à 34®C à un taux d'aération de 1 volume par volume à la minute et à une vitesse d'agitateur de 400 tours /minute, on transfère le contenu de la cuve de fermentation d'ensemencement dans l'appareil de fermentation principal contenant 200 litres de milieu nutritif 40 BPX à pH 6,1, et on poursuit la fermentation dans les mêmes con 70 14056 ii 2039274 ditions que celles spécifiées ci-'déssus. Le rendement final en enzyme est de 150 unités Anson/kg. On refroidit le bouillon de fermentation jusqu'à 4°C, et on en élimine les particules en suspension par centrifugation. On 9 5 compte dans le bouillon centrifugé 10 bactéries par gramme. On obtient une préparation d'enzyme par l'addition de sulfate de sodium jusqu'à saturation, et séchage du précipité sous vide à 30&C après séparation par filtration. L'activité protéase de cette préparation d'enzyme est de 2 unités Anson/g. 10 On compte dans cette préparation 10 bactéries par gramme ; on compte moins de 10 organismes de l'espèce Bacillus cereus par gramme. Une expérience similaire effectuée avec la souche parente sporogène donne un rendement en protéase de 120 unités Anson par 15 kilogramme de bouillon de fermentation. Une préparation solide élaborée à partir de ce bouillon en 9 opérant de la manière décrite ci-dessus contient au total 10 bactéries viables par gramme. Ce résultat est principalement dû à la présence de l'organisme générateur d'enzyme. 20 Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement indiqués ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. 70 14056 12 2039274 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'une préparation d'enzyme contenant un faible nombre de bactéries par culture d'une bactérie du genre Bacillus dans un milieu nutritif, lequel procédé est 5 caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à effectuer la culture en se servant d'un mutant asporogène producteur d'enzyme, et à isoler l'enzyme, ainsi produit, directement à partir du bouillon de fermentation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 l'on isole l'enzyme produit par concentration du bouillon de fermentation, de préférence par évaporation sous pression réduite ou par osmose inverse suivie de l'addition d'agents antiseptiques, de préférence NaCl. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 15 l'on isole l'enzyme produit par relargage de cet enzyme à partir du bouillon de fermentation, de préférence en utilisant Na2SO^ ou (NH^^SO^, puis séchage du précipité à une basse température après séparation à partir du bouillon par filtration . 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce- que 20 l'on isole l'enzyme produit par précipitation avec un solvant organique miscible avec l'eau, de préférence de l'éthanol ou de l'acétone, puis on sèche le précipité à basse température après séparation à partir du bouillon par filtration. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 25 caractérisé en ce que l'on utilise un motant asporogène de Bacillus subtilis. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on utilise la souche de Bacillus subtilis NCIB n° 10448 ou 10449L 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 , 30 caractérisé en ce que l'on utilise un mutant asporogène de Bacillus licheniformis. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on utilise la souche de Bacillus licheniformis NCIB n° 10402. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 35 caractérisé en ce que l'on utilise un mutant asporogène de Bacillus cereus. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on utilise la souche de Bacillus cereus NCIB n° 10447 . 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 40 caractérisé en ce que l'on utilise un mutant asporogène d'une 70 14056 13 2039274 espèce de Bacillus alcalophile. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on utilise la souche de l'espèce de Bacillus alcalophile NCIB n* 10401, 10400, 10399 ou 10398 » 5 13. Préparation d'enzyme, caractérisée en ce qu'elle est préparée par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Procédé caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à utiliser des mutants asporogènes du genre Bacillus pour la 10 préparation de produits enzymatiques ne contenant qu'un petit nonbre de bactéries. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on utilise lesdits mutants asporogènes pour produire des préparations de protéinase alcaline et/ou neutre ne contenant 15 qu'un, petit nombre de bactéries* 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on utilise lesdits mutants asporogènes pour produire des préparations d'amylase ne contenant qu'un petit nombre de bactéries. 20 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'on utilise des mutants choisis parmi les souches de Bacillus NCIB nOS 10398, 10399, 10400, 10401, 10402 et 10447. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'on utilise des mutants choisis parmi les couches de Bacil- 25 lus subtilis NCIB nOS 10448 et 10449 .