Brevet FR2034488A1 — publié le 19701211

Il est reconnu depuis longtemps que divers individus, par contact avec certaines particules ou substances organiques naturelles et synthétiques, notamment par inhalation de ces particules ou substances, manifestent des réactions allergiques 5 caractéristiques, par exemple des éternuements,. une activât ion des glandes muqueuses, un oedème local, des éruptions épider-miques et une dilatation des vaisseaux. Ces réactions sont communément appelées "rhume des foins" et même si la réaction en elle-même n'est habituellement pas sévère, elle peut mener à -10 des complications, tant du point de vue physiologique que psychologique. Chez un nourrisson, l'existence permanente d'un état allergique provoque souvent des difformités .définitives du corps et en particulier de la structure faciale, sans compter les effets psychologiques d'une gêne toujours présente. Des 15 états asthmatiques sont aussi intimement liés à des réactions allergiques et peuvent aussi provoquer des complications plus sévères, la science médicale a maintenant reconnu que la maladie appelée rhume des foins est une maladie grave qui exige un traitement prudent et consciencieux. 20 Sous ce rapport, il est même connu depuis un certain temps que l'injection sous-cutanée d'extraits des substances précitées se comportant comme des allergènes ou des antigènes calme. ces réactions allergiques, le mécanisme physiologique exact de ce traitement, appelé en pratique hyposensibilisation, 25 n'a pas encore reçu d'explication complète et satisfaisante. Toutefois, on a avancé diverses théories qui tentent de donner une explication, l'une de ces théories suppose la formation d'anticorps dits de blocage ou de neutralisation provoquée par injection de l'extrait, tandis qu'une-autre théorie suppose 30 que ce traitement favorise la formation d'une union entre l'antigène (ou l'allergène) et l'anticorps dans la circulation libre, plutôt que dans le tissu atteint. Dans la préparation de ces extraits contenant des aller-gènes, la pratique courante a consisté dans le passé à extraire 35 simplement la substance organique responsable de la réaction allergique avec un liquide aqueux d'extraction acceptable du point 70 02551 2 2034488 de vue physiologique, tel qu'une solution de chlorure de sodium ou une solution de chlorure de sodium légèrement alcaline. Après que le liquide d'extraction a été séparé du résidu, la solution contenant les principes actifs est stérilisée et 5 simplement utilisée telle quelle, après en avoir effectué, bien entendu, la dilution convenable en série. Dans un tel procédé d'extraction, le liquide d'extraction acceptable du point de vue physiologique est choisi et conçu de manière à maintenir l'intégrité structurale de la molécule d'antigène. 10 Cependant, on a récemment mis au point un procédé qui donne un extrait d'allergènes plus complet et plus efficace. Ce procédé est décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3.148.121 et IT0 3.148.122 et consiste, dans son ensemble, à traiter une substance "allergénique" entière, non dégraissée, 15 avec un liquide d'extraction consistant en une aminé tertiaire hétérocyclique en milieu aqueux, à séparer du résidu la phase liquide contenant les principes actifs, à jeter le résidu et, en vue d'éliminer 1'aminé tertiaire hétérocyclique des principes actifs, à ajouter de l'eau et une solution d'alun à l'extrait 20 pour précipiter les principes actifs dans la solution, le précipité est ensuite lavé plusieurs fois avec de l'eau pour éliminer la totalité de 1'aminé tertiaire hétérocyclique et l'alun en excès, et, finalement, il est remis en suspension dans un véhicule acceptable du point de vue physiologique tel que, par 25 exemple, une solution tampon à base d'un, phosphate. On a supposé initialement que l'introduction de l'amine tertiaire hétérocyclique dans le procédé a simplement pour résultat de donner un extrait allergéniquë plus complet, car les constituants solubles dans l'amine sont inclus dans l'extrait, 30 de même que les fractions protéiniques et glucidiques hydroso-lubles. Cependant, on suppose à présent que la nature chimique réactive de l'amine tertiaire hétérocyclique peut provoquer une modification structurale de la molécule antigénique, ce qui donne pour un traitement allergénique un extrait qui 35 est efficace et relativement exempt de réactions secondaires dues à la constitution. 70 02551 3 2034488 Pour aussi efficaces et avantageux; que ces extraits allergéniques obtenus par extraction avec une aminé tertiaire hétérocyclique et précipités à l'alun se soient montrés (on les appelle ci-après extraits PEAP, car la pyridine constitue 5 l'amine tertiaire hétérocyclique que l'on préfère .utiliser dans' un tel procédé), plusieurs limitations sont apparues au cours des années. A ce propos, on a constaté que ce type d'extraits ne peut pas être utilisé à des fins de cuti-réactions, ce que les spécialistes en allergologie désirent habituellement éviter, 10 car ils préfèrent utiliser le même extrait tant pour le diagnostic que pour le traitement. Un tel mode opératoire utilisant le même extrait donne la garantie que le traitement implique précisément l'antigène qui a été trouvé responsable de la réaction allergique de l'épiderme. La limitation mentionnée ci-dessus des extraits 15 PEAP est supposée être due à l'insolubilité du précipité et/ou à la formation d'un complexe entre 1'antigène extrait à l'amine tertiaire hétérocyclique et l'alun utilisé dans la précipitation de l'antigène du liquide d'extraction. En outre, les paramètres du procédé de préparation des 20 antigènes PEAP, dans l'application des procédés antérieurs, sont de caractère plutôt long et le rendement laisse beaucoup à désirer, c'est-à-dire qu'il est de l'ordre d'environ 50 des unités d'azote protéinique initialement extraites. En plus des inconvénients mentionnés ci-dessus, on a 25 également mentionné certains cas dans lesquels un extrait de type aqueux a été efficace là où. l'extrait PEAP ne l'a été que relativement peu, et viee-versa. l'invention concerne, par conséquent, un extrait allergé- rdque plus souple et plus efficace que celui qui a été produit au 30 moyen des procédés antérieurs opérant en milieu aqueux, et par extraction à la pyridine et précipitation à l'alun. l'invention concerne également un 'procédé perfectionné , , .des de préparation d'extraits destines a/tests allergeniques et d'extraits pour traitement de longue durée en utilisant un processus 35 d'extraction antigénique commun. l'invention concerne en outre un procédé d'extraction 70 02551 2034488 par combinaison d'un solvant aqueux et d'un solvant organique, dans lequel le traitement de la matière antigénique permet sa récupération pratiquement totale. D'autres caractéristiques et avantages de la présente 5 invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. Le procédé de l'invention consiste (1) à extraire la substance douée d'activité allergénique au moyen d'un liquide aqueux d'extraction, (2) à séparer le liquide aqueux d'extraction contenant les principes actifs hydrosolubles de la matière inso-10 lubie qui s'y trouve, (3) à extraire la matière insoluble avec un liquide d'extraction du type d'un solvant organique, (4) à séparer le solvant organique d'extraction de la matière insoluble qu'il contient, (5) à séparer les principes actifs contenus dans le solvant organique de ce solvant, et de préférence (6) à rassem-15 bler les principes actifs hydrosolubles et les principes actifs solubles dans le solvant organique. Le procédé conforme à l'invention peut être appliqué à toutegfeubstances douées d'activité allergénique, tant d'origine naturelle que préparéee/par voie de synthèse. Ces substances com-20 prennent des poussières, par exemple la poussière ordinaire que l'on rencontre dans des habitations et qui est recueillie dans des aspirateurs, et la poussière que l'on rencontre dans des locaux industriels, par exemple la sciure de bois;des cellules épithéliales, par exemple de chat, chien, cheval et lapin ; 25 des plumes, par exemple des plumes d'oies et de poulets;des graines, par exemple les graines de coton et de kapok ; des insectes et des matières provenant d'insectes, par exemple d'abeilles, de frelons et de moustiques ; des pollens d'arbres, de graminées et de mauvaises herbes, par exemple l'Ambrosia, le 30 dactyle, les érables, les peupliers ; des moisissures telles que Aspergillus niger et Alternaria ; des agents chimiques synthétiques complexes tels que les antibiotiques, etc. Initialement, la substance douée d'activité allergénique est extraite au moyen d'un liquide d'extraction strictement aqueux. 35 Ce processus initial d'extraction est le même que celui qu'on utilise dans la préparation des extraits allergéniques aqueux antérieurs et implique simplement la mise en contact de la substance 70 Û2551 5 2034488 douée d'activité allergénique avec de l'eau ou un liquide aqueux d'extraction tamponné ou isotonique. Ces liquides aqueux d'extraction comprennent une solution tamponnée de chlorure de sodium ou solution d'Evan ; une solution de Coca contenant du bicarbonate 5 de sodium, du chlorure de sodium et du phénol ; une solution glycérosaline ou solution de Stier ; une solution de dextrose ou solution d'Ungar; des solutions tamponnées de phosphates ; le sérum physiologique ; une solution 0,1 N d'hydroxyde de sodium ; une solution alcoolique de chlorure de sodium ; une solution de dex-10 trose et de chlorure de sodium ; etc. Ces solutions sont bien connues des spécialistes dans le domaine du traitement des malades atteints d'allergie et une formulation plus complète indiquant la concentration des ingrédients peut être trouvée dans tout ouvrage élémentaire traitant de l'allergie. Ces solu-15 tions permettent toutes des opérations d'extraction dans des conditions douces et sont destinées à protéger l'intégrité structurale de la molécule douée d'activité allergénique ou antigénique. Ces solutions aqueuses d'extraction ont habituellement un pH ajusté dans la gamme d'environ 6,5 à 8,0. 20 Dans la préparation de cet extrait aqueux initial de. l'allergène, la substance naturelle, après l'élimination des substances physiques contaminantes et, éventuellement, après une pulvérisation ou une subdivision convenable, est mise en contact avec le liquide d'extraction pendant une période de 25 temps allant d'environ 1 heure à 3 jours ou davantage, en agitant occasionnellement. De préférence, l'extraction est effectuée sous agitation continue pendant une période de temps de 4 heures. L'allergène peut aussi être dégraissé avant sa mise en contact avec le liquide aqueux-d'extraction; toutefois, 30 dans certains cas, ceci est inutile ou risque d'éliminer une partie de la matière antigénique intéressante. Après l'extraction initiale avec le liquide aqueux, la matière insoluble ou résidu contenu dans le liquide d'extraction est séparéejcLu liquide aqueux au moyen d'un procédé tel qu'une 35 centrifugation ou une filtration, et il est lavé plusieurs fois avec de l'eau ou un volume supplémentaire de liquide d'extraction. La matière insoluble ou résidu laissé par l'extraction 70 02551 2034488 initiale au moyen du liquide aqueux est ensuite extrait et traité avec un solvant organique pour en éliminer les principes actifs insolubles dans l'eau. Bien qu'on puisse utiliser un solvant organique non aqueux, le liquide que l'on préfère utiliser dans 5 cette extraction consiste en un mélange d'une phase aqueuse et d'une phase solvant organique miscible. Ce dernier composant du liquide d'extraction peut consister en l'un quelconque de nombreux solvants organiques tels que'le dioxanne, le 2-propanol, le diméthylsulfoxyde, l'éthylène-diamine, l'hydrazine, le ÏT-10 méthylacétamide, la pipéridine, le formamide, le lT,K-diméthyl-formamide, le ÎJ,N-diméthylacétamide, et d'autres substances organiques analogues connues comme étant des solvants des substances protéiniques. Le solvant organique est de préférence une substance contenant de l'azote basique telle qu'une aminé, et 15 notamment une aminé tertiaire hétérocyclique telle que, par exemple, la pyridine, des dérivés de pyridine tels que lalutidine, la quinoléine, la collidine, la picoline, etc. Le système de solvant organique peut aussi consister en un mélange de solvants, de même qu'il peut contenir une phase aqueuse. 20 Bien que l'effet chimique exact de certains des solvants organiques,tels que la pyridine,sur la molécule d'antigène ou sur sa structure ne soit pas connu avec un degré bien défini de certitude, on suppose que la nature fortement polaire ou basique de ces solvants les fait réagir avec-les antigènes insolubles 25 dans l'eau pour former avec, eux un composé, ou modifie d'une certaine façon la structure moléculaire complexe de la protéine, du glucide, de la lipoprotéine ou du polypeptide qui constitue la base de la nature allergénique de la substance perturbatrice. Le second constituant, facultatif, de ce liquide d'ex-30 traction, c'est-à-dire la phase aqueuse, peut contenir de l'eau distillée ordinaire, ou bien, de préférence, une solution aqueuse de chlorure de sodium et/ou d'une base alcaline. Sous ce rapport, on peut utiliser le bicarbonate de sodium, le chlorure de sodium, l'hydroxyde de sodium, des. tampons de phosphate, etc. Lorsqu'on 35 utilise dans le liquide d'extraction des substances de nature alcaline telles qu'une aminé hétérocyclique tertiaire, ce second 70 02551 7 2034488 constituant aqueux peut aussi consister en un tampon qui ajuste le pH à une valeur plus neutre. Le pH résultant du liquide final d'extraction préparé en mélangeant la phase solvant organique (aminé) et la phase aqueuse, peut être compris entre 5 environ 7,5 et 12,0, et il est réglé de préférence dans une gamme plus étroite de pH allant d'environ 9,0 à 12,0. Etant donné qu'une grande variété de substances allergéniques se sont montrées capables d'être adaptées au procédé de l'invention, le pH du liquide d'extraction et la composition de ce liquide 10 peuvent varier considérablement. Par exemple, on sait que le pollen de l'Ambrosia contient une forte teneur en graisse ou lipide toxique, dont on a montré la forte contribution à la nature allergénique de cette substance. Dans l'extraction de ce pollen d'herbe, on peut désirer accroître le rapport de la 15 phase solvant organique à la phase aqueuse pour assurer la solubilité de la totalité du lipide. Toutefois, on a constaté que des parties à peu près égales de phase solvant organique et de phase aqueuse donnent un liquide d'extraction ayant une large gamme d'application. 20 Cette seconde étape d'extraction consiste habituellement à mélanger la matière insoluble avec le liquide d'extraction et à faire séjourner le mélange à une température d'environ 20 à 25°C pendant une période de temps allant jusqu'à environ 11 jours, soit en agitant, soit sans agiter. Le résidu est 25 ensuite séparé de la phase liquide qui, à ce stade, contient les principes allergéniques actifs insolubles dans l'eau ou solubles dans le solvant organique, traités et solubilisés, en laissant le résidu insoluble se sédimenter, en centrifugeant le mélange ou en appliquant un procédé de filtration, par 30 exemple une filtration sous vide. Le second résidu est ensuite jeté. A ce stade du procédé de l'invention, les principes actifs insolubles dans d'eau et solubles dans le solvant organiquQ&oi-vent être séparés de ce dernier ou du second liquide d'extraction 35 lui est habituellement inacceptable du point de vue physiologique. Ce processus de séparation peut comporter l'addition d'un agent précipitant tel qu'un sulfate de potassium et d'aluminium, par 70 Ô2551 8 2034488 lequel les principes actifs sont insolubilisés, ou bien caa élimine le solvant par un procédé physique. Le premier procédé est connu en pratique et a été décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique U° 3-148.121 et 3.148.122 précités. 5 Toutefois, le procédé que l'on préfère consiste à éliminer physiquement le solvant organique des principes actifs qu'il contient. On peut y parvenir en utilisant l'un quelconque des procédés connus de séparation d'un système de solvants d'une substance qui y est dissoute. Ces procédés comprennent, entre 10 autres, une lyophilisation, un séchage par pulvérisation, un séchage sous vide, l'utilisation d'un appareil rotatif de séchage sous vide, etc. Les températures utilisées dans l'étape de séchage peuvent aller d'un minimum nécessaire pour la volatilisation du liquide d'extraction à la pression utilisée, jus-15 qu'à environ 85°C. Cette dernière température est celle que l'on utilise dans un processus de séchage par pulvérisation, dans lequel l'antigène thermolabile n'est que momentanément soumis à cette température extrême. La pression utilisée dans le système de volatilisation dépend de même du mode opératoire spécifique 20 que l'on utilise et peut aller de la pression atmosphérique ou d'une pression légèrement supérieure à la pression atmosphérique, jusqu'à une pression d'environ 30 mm de mercure, c'est-à-dire la pression que l'on utiliserait dans une technique de lyophilisation. 25 On a également constaté que pour éliminer les dernières traces du liquide d'extraction composé d'un solvant organique en milieu aqueux, il est préférable de faire séjourner l'ant.igène en particules pratiquement anhydres résultant de l'étape de volatilisation dans un dessiccateur à vide pendant environ 30 24 heures. Cette opération peut être conduite à la température SL ambiante ou à une température s'élevant/environ 45°C. Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir une substance douée d'activité allergénique ou antigénique en particules anhydres, qui a été traitée avec le liquide d'extraction fortement 35 réactif, qui contient la presque totalité des principes actifs insolubles dans l'eau provenant de la substance perturbatrice initiale et, comme on le verra par la suite, qui est un extrait antigénique extrêmement souple du point de vue de l'application finale. 70 02551 9 203448ô Un autre moyen de séparer les principes actifs.insolubles dans l'eau du système de solvant organique consiste à effectuer une dialyse, lorsqu'on utilise un liquide d'extraction consistant en pyridine en milieu aqueux, on constate que l'opération d'éli-5 mination de la pyridine de l'extrait est une opération relativement aisée lorsqu'on utilise ce mode opératoire. A ce stade, on donne une récapitulation du procédé de l'invention : deux extraits ont été préparés séparément : (1) le premier extrait consistant en un système dissolvant aqueux con-10 tenant les principes actifs solubles dans l'eau, et (2) les principes actifs traités, solubles dans le solvant organique, sous l'une quelconque de diverses formes , c'est-à-dire un allergène en particules insolubles obtenu par précipitation à l'alun, une solution aqueuse de l'allergène obtenue par dialyse ou une poudre 15 sèche obtenue par volatilisation du solvant organique. Bien que les deux extraits séparés puissent être utilisés individuellement, il est préférable et plus pratique, de les réunir après leur séparation'. Ceci donne un extrait unique présentant plusieurs avantages importants, qui seront décrits en détail 20 dans ce qui suit, la réunion varie en fonction de la forme phy-siquQ&e l'antigène soluble dans le solvant organique après que le solvant organique en a été éliminé, lorsque le solvant a été éliminé par dialyse, il est facile d'analyser la solution restante pour déterminer son activité et de mélanger simplement 25 les parties convenables du premier extrait et du second. Dans la description qui suit, l'extrait aqueux sera appelé premier extrait et les principes actifs extraits par le solvant organique seront appelés second extrait. lorsque le solvant organique a été éliminé par volati-30 lisation, et que les principes actifs du second extrait se présentent sous la forme d'une poudre sèche, le procédé le plus simple pour réunir le premier et le second extrait consiste à reconstituer simplement la poudre sèche avec le premier extrait, l'extrait aqueux limpide que l'on obtient peut ensuite être 35 stérilisé et normalisé, comme décrit ci-après. Une autre variante du procédé de l'invention consiste à réunir le premier extrait et le précipité insolubilisé à 1'aluminium 70 02551 10 2034488 du second extrait, préparé comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique ÎT° 3.148.121 et N0 3*148.122 précités. On obtient une combinaison d'un premier extrait aqueux et d'un second extrait précipité à l'alun, dont l'action est 5 de longue durée. Il y a lieu de remarquer que la réunion des premier et second extraits peut être effectuée dans une large gamme de rapports en fonction de l'allergène particulier en cours d'extraction, ainsi que de la sensibilité de l'individu aux 10 divers antigènes de la substance perturbatrice. A ce stade, il y a lieu d'observer que l'extrait combiné peut encore être traité pour donner un extrait allergénique qui revêt une forme choisie parmi diverses formes connues dans la pratique d'utilisation des extraits allergéniques. Ainsi, 15 les extraits réunis peuvent être simplement dilués avec un solvant aqueux acceptable du point de v.ue physiologique et utilisés tant comme extrait destiné à l'expérimentation sur la peau pour le diagnostic, que comme extrait de traitement d'hyposensibilisation. Ces liquides acceptables du point de 20 vue physiologique comprennent une solution tamponnée de chlorure de sodium ou solution d'Evan, une solution de Coca contenant du bicarbonate de sodium, du chlorure de sodium et du phénol, une solution glycérosaline ou solution de Stier, une solution de dextrose ou solution d'Ungar, des solutions 25 tamponnées au phosphate, etc. Un second procédé de traitement ultérieur des extraits réunis, sous une forme entièrement soluble, peut consister en une addition d'un composé d'aluminium tel que l'alun de potassium ou l'hydroxyde d'aluminium pour insolubiliser l'antigène, 30 et préparer une forme posologique thérapeutique douée de propriétés permettant une lente mise en liberté. A ce propos, on a constaté de façon surprenante que le précipité insolubilisé ou produit d'adsorption utilisant la combinaison d'un extrait aqueux et d'un extrait traité au solvant -organique selon la 35 présente invention, e^t très supérieur aux antigènes antérieurs précipités à l'alun à partir de leurs solutions dégraissées ayant/un^extractioc strictement aqueuse. Tandis que ces pré- 70 02551 n 2034488 parations antérieures sont de nature gélatineuse et sont inacceptables du point de vue pharmaceutique, les préparations conformes à l'invention sont des suspensions homogènes en particules et ont un aspect acceptable du point de vue pharmaceutique. 5 On doit mentionner ici qu'on a également constaté,de façon inattendue, que le rendement en précipité qui provient de l'extrait reconstitué lorsqu'on utilise un composé d'aluminium pour insolubiliser l'antigène, est bien plus fort que celui qu'on obtient en utilisant le procédé antérieur d'extraction à la pyridine et de 10 précipitation à l'alun. Par exemple, on obtient des rendements d'environ 40 à 50 $ en utilisant le procédé PEAP antérieur, tandis que dans le procédé de l'invention, on obtient un rendement d'environ 70 à 90 %. Ce rendement est calculé sur la base de l'azote protéinique contenue dans le liquide d'ex-15 traction, comparativement à l'azote protéinique du précipité insolubilisé ou du produit d'adsorption. Dans ce procédé d'insolubilisation, on peut ajouter une quantité stoechiométrique d'aluminium et diluer simplement la suspension jusqu'à ce. qu'elle ait atteint la force correcte, 20 au moyen d'une quantité supplémentaire de liquide aqueux; on peut aussi ajouter un excès de composé d'aluminium et séparer de la liqueur surnageante le précipité ou le produit d'adsorption qu'on lave ensuite et qu'on remet en suspension dans un liquide aqueux acceptable du point de vue physiologique. 25 Pour s'assurer de la stérilité de l'extrait allergénique, la pratique courante consiste à faire passer une solution contenant l'extrait thermolabile d'antigène à travers un filtre bactérien, plus couramment appelé filtre de Seitz, filtre microporeux, filtre "millipore® " ou filtre à membrane. De 30 tels procédés sont bien connus en pratique et sont décrits dans divers textes relatifs à ce domaine de la technique. Conformément à la présente invention, la stérilisation peut être effectuée dans une phase liquide quelconque, pour autant que l'antigène se trouve en solution. Par exemple, on peut stériliser le 35 premier et le second extrait, ou bien l'extrait combiné final peut être stérilisé par filtration. Naturellement, il y a lieu de remarquer qu'une technique de séchage par pulvérisation peut effectuer une stérilisation du produit sec obtenu, lorsque 70 02551 12 2034488 cette technique est utilisée pour la préparation du second extrait, et rend inutile cette étape de filtration bactérienne. En ce qui concerne à présent le mode d'utilisation de la préparation selon l'invention, ces techniques sont également 5 bien connues en pratique et peuvent être divisées en deux catégories, c'est-à-dire (1) la catégorie comportant les extraits destinés à l'expérimentation sur la peau ou au diagnostic et (2) les extraits destinés au traitement ou extraits thérapeutiques. Les extraits destinés à l'expérimentation ou au 10 diagnostic sont de nature principalement aqueuse, et on les utilise en plaçant une goutte de l'extrait spécifique sur la peau de l'individu - ou de l'animal soumis à l'essai, et en excisant la surface de la peau en dessous de l'extrait. Si une éruption ou une papule apparaît au bout d'une assez courte 15 période de temps, ceci indique nettement que l'individu est allergique à l'antigène particulier utilisé dans l'essai. Une autre méthode d'essai consiste à effectuer l'injection intra-cutanée de l'extrait et à observer ensuite la formation d'une papule. 20 La seconde catégorie d'extraits, c'est-à-dire les extraits destinés au traitement ou extraits thérapeutiques, peut comprendre des extraits aqueux précipités à l'aluminium, de longue durée d'action et de type analogue. L'utilisation de ces extraits destinés au traitement comprend l'injection sous-cutanée d'une 25 solution extrêmement diluée de 1'antigène, suivie d'autres injections quotidiennes ou hebdomadaires de concentration progressivement croissante. Du fait de la gamme extrêmement large de sensibilités de divers individus et des différentes caractéristiques de mise en liberté des diverses formes thérapeu-30 tiques de l'antigène, le médecin établit un régime de traitement adapté à chaque individu. En ce qui concerne la dose ou la force de l'extrait, les produits de la présente invention peuvent être concentrés ou dilués conformément à la force de base de l'extrait initial 35 et à l'activité désirée de l'extrait final. Le moyen le plus courant, bien.que ne donnant pas entière satisfaction, pour normaliser l'extrait, consiste à doser les unités d'azote 70 02551 13 20344Ô8 protéinique de la solution, naturellement, le défaut de cette méthode réside dans le fait que toutes les fractions antigéniques de l'extrait ne sont pas nécessairement protéiniques, mais peuvent être des molécules de glucides, de lipides ou d'autres 5 molécules non azotées. En ce qui concerne l'activité de l'extrait-, la pratique usuelle consiste à normaliser les extraits destinés à un traitement entre environ 10 et environ 5000 unités d'azote protéinique, en fonction de la corrélation qui existe entre le caractère antigénique et l'azote protéinique. les extraits 10 destinés au traitement sont habituellement ajustés entre environ 10 et environ 20.000 unités d'azote protéinique, les extraits de plus faible activité étant utilisés dans les phases initiales du traitement d'hyposensibilisation, et les extraits de plus forte activité étant utilisés comme dose d'entretien à de plus 15 grands intervalle§â.e temps. l'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Exemple 1 On dégraisse 50 g d'Ambrosia à feuilles d'armoise (Ambrosia 20 artemisifolia) 5 fois avec des portions de 250 ml d'éther éthylique. Dans chaque opération de dégraissage, l'éther est éliminé par décantation après sédimentation du résidu de pollen, l'éther contenant la fraction de lipides du pollen est jeté et le pollen dégraissé est séché sous pression réduite, le pollen dégraissé 25 et séché est ensuite extrait avec 350 ml d'eau distillée à 25°C pendant 5 heures , sous agitation constante, le liquide d'extraction est ensuite filtré sur un entonnoir de Buchner et la matière pollinique insoluble dans l'eau qui reste sur le filtre est lavée plusieurs fois avec un volume d'eau supplémentaire. 30 Ensuite, on rassemble le filtrat et les eaux de lavage, et on y dose les unités d'azote protéinique. On trouve qu'environ 25 i° du poids initial du pollen, soit 122.800 unités d'azote protéinique, sont extraits par le liquide aqueux. Une extraction ultérieure avec de l'eau ne permet pas d'extraire du résidu de 35 pollen une fraction supplémentaire de principes actifs. le résidu pollinique insoluble dans l'eau provenant de la première extraction aqueuse est ensuite soumis à une nouvelle 70 02551 14 2034488 extraction avec 350 ml d'une solution à 1:1 (volume/volume)/le pyridine et une solution d'hydroxyde de sodium 0,1ET pendant 3 jours à la température ambiante, le récipient d'extraction est agité occasionnellement par secousses pendant cet intervalle de trois 5 jours. Ce second liquide d'extraction est ensuite filtré sur un entonnoir de Buchner, dialysé vis-à-vis d'eau distillée en utilisant une membrane cellulosique pour, éliminer la pyridine, et centrifugé pendant 15 minutes à 37.000 RCF. la liqueur surnageante limpide, appelée second extrait, contient 312.000 10 unités d'azote protéinique, et on la soumet à un dosage de l'antigène E ou d'une matière analogue à l'antigène E, au moyen de la technique d ' Ouchterlony en utilisant l'anti-sérum de lapin pour l'antigène E. On observe des lignes de précipitine qui indiquent la présence d'une matière semblable 15 à l'antigène E. Ce constituant spécifique du pollen d'Ambrosia est considéré comme étant la cause principale des réactions allergiques chez des individus sensibles au pollen d'Ambrosia. les premier et second extraits sont ensuite réunis dans un rapport de 1:1 . l'extrait combiné est intéressant pour le 20 diagnostic et le traitement (hyposensibilisation) d'individus allergiques au pollen d'Ambrosia. Exemple 2 On traite 2 volumes des premier et second extraits, préparés comme décrit dans l'exemple 1, et réunis dans un 25 rapport de 1:1, avec 1,1 volume de sulfate de potassium et d'aluminium a 2 % dans de l'acide sulfurique 0,25$T. le- précipité qui se forme (rendement 73 °) est lavé avec de l'eau distillée et remis en suspension dans un tampon au phosphate. Cette suspension est intéressante comme extrait allergénique 30 lentement libéré dans le traitement d'individus sensibles au pollen de l'Ambrosia. Exemples, 3 à, 7 On répète l'exemple 1, à la différence qu'on remplace le pollen d'Ambrosia par de la poussière ménagère, du pollen de 35 fléole, des plumes de poulet et du pollen de bouleau, les extraits réunis sont intéressants pour le diagnostic des réactions allergiques par cuti-réaction ou pour le traitement d'hyposensibilisation. 70 02551 15 2034488 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un extrait d'une substance active capable de provoquer une réaction allergique et contenant des principes actifs du point de vue physiologique, procédé carac- 5 térisé par le fait qu'il consiste à extraire la substance active-avec un liquide aqueux d'extraction, à séparer le liquide aqueux d'extraction contenant les principes actifs hydrosolubles de la matière insoluble», à extraire,.la matière.insoluble avec un liquide d'extraction contenant un solvant organique,à séparer le solvant ■|0 organique d'extraction contenant les principes actifs solubles dans ce solvant de la matière qui y est insoluble, et à séparer du solvant organique les principes actifs qui y sont contenus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les principes actifs solubles dans l'eau sont réunis 15 avec les principes actifs solubles dans le solvant organique. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le solvant organique est une aminé tertiaire hétérocyclique . 4. Procédé suivant la revendication 3, ?earactérisé par le 20 fait que l'amine tertiaire hétérocyclique est choisie parmi la pyridine, la quinoléine, la ~lutidine, la collidine et la picoline. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que l'amine tertiaire hétérocyclique est la pyridine. 25 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le solvant organique est une combinaison d'eau et d'une aminé tertiaire organique. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le solvant organique est une combinaison d'une solution 30 diluée d'hydroxyde de sodium et de pyridine. 8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la séparation des principes actifs du/solvant organique est effectuée par dialyse. 9. Procédé suivant la revendication -1, caractérisé-par le 35 fait que la substance capable de provoquer une réaction allergique est une substance absorbée par inhalation. 70 02551 16 2034488 10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que la substance absorbée par inhalation est choisie parmi des allergènes comprenant des pollens, la poussière ménagère, un épithélium, des moisissures, des matières provenant d'insectes, des graines et des plumes. 11. Procédé suivant les revendications 1 et 2,. caractérisé par le fait qu'on ajoute un composé d'aluminium aux principes actifs en solution, de manière à insolubiliser ces principes actifs. 0 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé par le fait que le composé d'aluminium est le sulfate de potassium et d'aluminium. 13. Produit obtenu au moyen du procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes.