Brevet FR2039239A1 — publié le 19710115

La présente invention a pour ob,iet une conmosition de diagnostic qui permet la différenciation rapide et positive des staphylocoques. En outre, l'invention a pour objet un procédé pour la mise en oeuvre de la composition. 5 Lorsqu'on opère selon l'invention, On traite une substance spon— . gieuse à action capillaire (c'est-à-dire capable de retenir un liquide par action capillaire) par (1) un agent de diagnostic qui est capable de déceler la fermentation du mannitol et (2) un agent de diagnostic qui est capable de déceler la production de coagulase. La 10 composition qui est utilisée pour déceler la fermentation du mannitol comprend (1) un élément nutritif du type classiquement utilisé pour le développement des microorganisrnes ou une association de tels éléments nutritifs, (2) du P-mannitol, (3) un indicateur chimique qui,par un virage dB eouifetr indiqua la fermentation du D-mannitol en 15 produits de dégradation acides et, éventuellement, (4) du chlorure de sodium et/ou un agent épaississant approprié. On utilise ce dernier, le cas échéant, pour obtenir une composition dont la viscosité convient le mieux pour 1'applica.tion sur la substance spongieuse à action capillaire. La composition qui, lors de la mise en oeuvre de 20 la présente invention, est utilisée pour déceler la production de coagulase est une substance coagulable appropriée qui est exempte, ou à peu près exempte, de glucose. La différenciation entre staphylocoques est une responsabilité importante , en microbiologie clinique. Deux des essais les plus 25 utilisés pour identifier les staphylocoques sont l'essai de production de coagulase et l'essai de fermentation dp. mannitol. La plupart des souches isolées des lésions humaines sont coagulase-positives et mannitol-positives, comme par exemple S. aureus. Ce dernier est pathogène. Les staphylocooues coagulase-négatifs et mannitol-négatifs, 30 cowe par exemple S.- epidermidis. sont la plupart du temps considéré comme étant parasites plutôt que pathogènes. Le fait d'obtenir des réactions positives à la fois à l'essai de production de coagulase et a l'essai de fermentation du mannitol indique la nature pathogène des staphyloconues. Des réactions négatives à ces deux essais indiquent 35 que la souche isolée a moins d'importance, cliniquemcnt parlant. Toutefois, comme il existe aussi certaines formes intermédiaires qui neuvent avoir une imnortance clininue, il est important que les laboratoires de clinique effectuent les deux essais de production de BAD ORIGINAL ' 70 13740 2 2039239 coapulase et de fermentation du mannitol. Le pouvoir qu'ont les staphylocoques pathogènes de produire de la coagulase, une enzyme ca.pable de faire coaguler le plasma., a été rapporté dans la. littérature. 5 De nombreux chercheurs ont tenté d'utiliser cette découverte comme poyen permettant d'établir le caractère pathogène d'organismes inconnus. Des essais classiques concernant la production de coagulase sont effectués couramment par le procédé dit en "tube" qui mesure la production de coagulase libre, ou par le procédé dit "sur 10 lamelle" oui mesure la coagulase fixée sur ou dans la paroi cellulaire de l'organisme. Lâ3 procédés "en tube" et "sur lamelle" sont décrits respectivement dans les publications J.Bact.41_:431-440 (1 941 ) et Médical Microbiology, R. Cruickshank,. pages 137-138, publié par Williams and Wilkins Company, 11ème édition, 1965. Dans ces essais, on a utilisé 15 comme substrat du plasma, de lanin et du plasma humain. On utilise la gélose au sel et au mannitol comme milieu sélectif pour isoler les staphylocoques pathogènes. Ce milieu est décrit dans J. Ract. 5,0:201—203 (1945). Du fait de la présence de 7,5?° de chlorure de sodium dans ce milieu, la croissance de la plupart des 20 bactéries autres que les staphvlocooues est inhibée. Lorsqu'on inocule au milieu une substance contenant des staphylocoques et qu'on fait incuber pendant 36 heures à une température de 37°C, les staphylocoques faisant fermenter le mannitol croissent en abondance,entourés de zones jaunes. Au contraire, les staphylocoques ne faisant 25 pas fermenter le mannitol produisent de petites colonies, entourées de zones routes ou pourpres. L'identification positive, comme étant pathogène, d'un échantillon inconnu peut prendre jusqu'à cino jours lorsqu'on fait appel à des essais classiques de production de coagulase et de fermentation du mannitol. 30 Un nilieu de croissance solide, utilisable pour l'identifica tion visuelle de staphylocoaues pathogènes provenant de cultures initiales est décrit dans la pxiblication Am. J. Clin. Path. 32; 102-194 (Août 1959). Ce milieu a permis d'obtenir quelques succès. Cependant, on a découvert que d'autres bactéries productrices decoa-3 5 «misse, prt exemple Escherichia. coli, poussent sur ce milieu» En conséquence, bien que certains progrès aient été faits dans le domaine de l'élaboration de réactifs et de modes de différenciation de? staphvloconues, il n'existe pas actuellement, dans le com- BÂD original 70 13740 3 2039239 merce, de réactif de diagnostic stable au stockage, facilement transportable, permettant de déceler simultanément la, production de coagulase et la fermentation du mannitol et ne nécessitant pas la préparation de réactifs d'essais par le personnel des laboratoires 5 de cliniaue. La composition de diagnostic selon l'invention comprend une substance spongieuse à action capillaire appropriée, sur laquelle on a appliqué un agent de diagnostic qui décèle la fermentation du mannitol et un agent de diagnostic qui décèle la production de coa-10 gulase. D'une façon générale, on peut, pour la mise en oeuvre de 1' invention, utiliser toute substance spongieuse à action capillaire classiquement utilisée pour préparer des compositions de diagnostic. Parmi les substances spongieuses à action capillaire utilisables selon l'invention on citera, à titre d'exemples non limitatifs, le 15 papier filtre, le feutre, des bandes de céramique poreuse, les fibres de verre en tissu ou en tapis, etc.. Il va de soi qu'on peut utiliser d'autres substances similaires. Selon le mode de réalisation préféré de l'invention, on utilise du papier filtre, en particulier la qualité accessible dans le commerce sous le nom de papier 2D filtre Eaton Dikeman No. 623 (31,75 kg). Comme indiqué ci-dessus, l'agent de diagnostic utilisé selon 1' invention pour déceler la fermentation du mannitol contient (1) un élément nutritif capable d'entretenir la croissance de microorganismes ou une association de tels éléments nutritifs, (2) du D—mànni-25 toi, (3) un indicateur chimique dont la coloration vire lorsque (et si) le mannitol est transformé par fermentation en produits de dégradation acides et, facultativement, (4) du chlorure de sodium et/ ou un agent épaississante D'une façon générale, pour préparer cet agent de"diagnostic, 30 on peut utiliser tout élément nutritif ou toute association d'éléments nutritifs classiquement utilisés pour faire croître les microorganismes. Ces éléments nutritifs comprennent, par exemple, l'extrait de levure, 1a. trvptone, les peptones aux protéoses, le trypto-se, etc.. Selon le mode de réalisation préféré de l'invention, on 35 utilise une association d'extrait de boeuf et de peptone aux protéoses Ko.3 comme source d'élément nutritif. Une telle association est décrite dans l'ouvrage DIFCO ï-iANUAL, 9ème édition (1953), Difco Laboratories, Inc., Détroit, Michigan, E.U.A. BAO ORIGINAL ' 70 13740 4 2039239 Tout au long de la présente description, on décrit le D-manni-tol comme constituant de la composition pour déceler la fermentation du mannitol. Il est bien entendu, toutefois, qu'on peut éventuellement utiliser le D,L-mannitol au lieu du D-mannitol. C'est pourquoi 5 par "D-mannitol" on veut désigner également de D,L-mannitol. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, on utilise le D-mannitol plutôt que le D,L-mannitol. D'une façon générale, tout indicateur chimique qui, par un vi-rageâëcouleur approprié^» indique la conversion du mannitol en produits 10 de dégradation acides, peut être utilisé. C'est ainsi, par exemple, qu'on peut utiliser le rouge de phénol,le bleu de bromothymol, le pourpre de bromocrésol, etc.. Toutefois, suivant le mode de réalisation préféré de l'invention,l'indicateur utilisé est le raigje cfe phéioï.; Bien que le chlorure de sodium soit un ingrédient facultatif 15 de la composition servant à déceler la fermentation du mannitol, on l'utilise pour préparer le produit préféré selon l'invention. L'agent de diagnostic pour déceler la fermentation du mannitol contient, comme ingrédient facultatif, un agent épaississant. L* agent épaississant est utilisé, lorsque cela est nécessaire, pour 20 obtenir un agent ayant la viscosité la plus appropriée pour son application sur' la substance spongieuse à action capillaire. De nombreux agents épaississants conviennent tout-à-fait. D'une façon générale, on peut utiliser tout agent épaississant qui n'exerce pas d'action néfaste sur la classe d'enzyme (c'est-à-dire la staphylo-25 coagulase) dont dépend la réaction de fixation de la coagulase et qui n'exerce pas d'action néfaste sur les enzymes dont dépend la fermentation du mannitol. Toutefois, sont particulièrement utilisables dans ce but, par exemple, un dextrane ayant un poids moléculaire d* environ 60.000 à 90.000, des polyéthylène glycols de poids moléculai-30 re supérieur, la carboxyméthyl cellulose, etc.. Dans le mode de réalisation préféré 'de l'invention, on utilise un dextrane. Pour préparer la composition décrite ci-dessus, on dissout 1' élément nutritif, ou l'association d'éléments nutritifs, le D-mannitol, l'indicateur chimique et le chlorure de sodium (utilisé le cas 35 échéant) dans l'eau distillée. Puis on ajoute l'agent épaississant à la solution, suivant les besoins, pour amener à la viscosité désirée, On peut ensuite ajouter une ouantité supplémentaire d'eau distillée pour obtenir une solution dans laquelle .les constituants sont à la BAD ORIGINAL 70 13740 5 2039239 concentration désirée et qui a une viscosité comprise dans des limites acceptables. Bien que les quantités des divers constituants utilisés pour préparer le réactif de diagnostic oui permet de déceler la fermenta— 5 tion du mannitol soient, dans une certaine mesure, critiques, elles sont variables dans certaines limites précises. C'est ain?i, par exemple, que, pour 100 ml de solution, les ingrédients seront présents da.ns les gammes de proportions suivantes! Substance(s) nutritive(s) : d'environ 5,5 à 17 g. 10 D-mannitol ou D,L-ma.nnitol : d'environ 5,0 à 30,0 g. Chlorure de sodium: d'environ 0 à 10,0 g. Indicateur chimique: d'environ 0,035 à 0,075 g. La quantité d'agent épaississant utilisé est, de même, variable. D1 une façon générale, on utilise une quantité d'agent épaississant suf-15 fisante pour obtenir une solution ayant une viscosité de 6 à 14 cps, telle que mesurée à 26°C à l'aide d'un viscosimètre Brookfield. Lorsqu'on utilise du dextrane, on atteint ce but en utilisant jusqu' à 6,0 g de dextrane pour 100 ml de produit. En outre, bien qu'on puisse l'omettre de la composition, on peut utiliser jusqu'à 10,0 g 20 de chlorure de sodium pour 100 ml de solution. Les produits préférés contiennent environ 3,0 à 10,0 g de chlorure de sodium pour 100 ml de solution. Une composition préférée contient, dans 100 ml solution dans l'eau distillée, les ingrédients suivants, en les quantités indiquées: 25 Elément ou mélange d'élément nutritif(s) environ 11 g D-mannitol . environ 15g Chlorure de sodium environ 5 g Indicateur chimique environ 0,55 g Agent épaississant environ 3,4 g 30 Dans cette dernière composition, l'élément nutritif préféré est constitué par une association de 1 " d'extrait de boeuf et 10 g de peptone aux protéoses Ko.3. En outre, dnns la composition préférée, l'indicateur chimique est le rouge de jhénol et l'agent épaississant est un dextrane ayant un poids moléculaire de 60.000 ?> 90.000, environ. 35 L'?if?en+ de diagnostic utilisé lors de la mise en oeuvre de la présente invention pour déceler la production de coagulase est une substance coagulable appropriée dont tout, ou à peu près tout, le flucose a été éliminé. Une telle substance comprend, par exemple, BAD ORIGINAL 70 13740 6 2039239 du plasma humain dialyse lyophilisé, du plasma de lapin dialysé lyophilisé et du fibrinofîène. Il est préférable d'utiliser un plasma dialvsé lyophilisé. La manière suivant laquelle le glucose est éliminé du plasma lyophilisé n'a pas une importance critique. Le gluco-5 se peut être éliminé par tout mode opératoire qui ne détruit pas le plasma et qui ne nuit pas à son fonctionnement efficace, dans le procédé de diagnostic. Selon un procédé, on élimine le glucose par dialyse d'un plasma lyophilisé approprié, contre un tampon ayant un pH de 7,0 à 7,8 environ. Après lyophilisation, le plasma est conservé 10 à une température d'environ 4°C, dans un récipient scellé étanche à l'air, jusqu'à son utilisation. Pour la dialyse, on reconstitue une proportion d'environ 20 g de plasma lyophilisé jusqu'à 100 ml, dans l'eau distillée. On maintient le plasma reconstitué à une température de 4°C, pour empêcher la croissance des bactéries. On dia-15 lvse chaque portion de 100 ml de plasma reconstitué contre 10 litres de tampon ayant un pH de 7,0 à 7,8. D'une façon générale, on peut utiliser tout système tampon approprié. Selon le mode de réalisation préféré de l'invention, on prépare le tampon utilisé en dissolvant environ 2,67 g de phosphate monopotassique, environ 11,34 g de phos— 20 phate disodioue anhydre et environ 8,75 g de chlorure de sodium dans environ 9,5 litres d'eau distillée. Puis on amène la solution à un volume d'environ 10 litres, en ajoutant une quantité supplémentaire d'eau distillée. La solution tampon ainsi obtenue est maintenue à une température d'environ 4°C, et la dialyse est effectuée à cette 25 température en a.citant constamment la solution tampon, en utilisant un tube de dialyse ayant la dimension appropriée. D'ordinaire, la dialyse totale prend environ 48 heures et, pendant ce temps, il faut changer deux fois la solution tampon, en attendant au moins deux heures entre deux changements successifs." C'est ainsi que, pour le 30 processus tout entier, on utilise au total environ 30 litres de solution tampon par-100 ml de plasma reconstitué utilisés. Le Plasma dialysé, lyophilisé, qui est ainsi obtenu est exempt, ou à peu près exempt, dé plucose. On lvophilise encore une fois la substance dia-lysée, et on conserve le produit, jusqu'à utilisation, à une tempé-35 rature d'environ 4°C. Immédiatement avant utilisation, on introduit environ 12,5 g du produit dialysé, lyophilisé, dans environ 50 ml d'eau distillée stérile. Comne indiqué précédemment, la composition de diagnostic selon BAD ORIGINAL1 70 13740 7 2039239 l'invention comnrend. une substance spongieuse à action capillaire qui a été traitée par un agent de diagnostic qui décèle la fermentation du mannitol et par un a.cent de diagnostic qui décèle la production de coagulase. Selon un mode de réalisation, les compositions 5 selon l'invention se présentent sous forme de bandes étroites de substance spongieuse à action capillaire, chaque bande présentant six zones, comme suit: 1 2 3 4 5 6 la zone marquée 1 étant la zone décelant la production de coagulase contenant le constituant exempt de glucose, au plasma lyophilisé ou 10 au fibrinogène; la zone marquée 2 étant une barrière hydrophobe; la zone marquée 3 étant la zone décelant la fermentation du mannitol et contenant du mannitol et d'autres substrats; la zone marquée 4 étant une seconde barrière hydrophobe; la zone marquée 5 n'étant pas traitée et la zone marquée 6 étant une bande d'identification» Il va de 15 soi que les zones 5 et 6 peuvent éventuellement être omises. Pour préparer ce produit, on traite d'abord la zone 1 par une solution aqueuse de dextrane et on sèche, formant ainsi un revêtement de dextrane sur celle-ci. On applique la substance coagulable, exempte de glucose, sur la zone 1, par dessus le revêtement de dex-20 trane. Il s'est avéré qu'on obtient les meilleurs résultats en utilisant une solution de dextrane ayant une viscosité d'environ 13 à 29 cps telle que mesurée à 26°C à l'aide d'un viscosimètre BrookfieB On peut obtenir une telle solution en dissolvant environ 16 à 25?à,en poids, de dextrane dans de l'eau distillée. 25 Les barrières hydrophobes servent à empêcher la migration d'un agent de diagnostic vers l'autre au cours de la période d'incubation. L'identité de la composition qui est utilisée comme barrière hydrophobe pour la réalisation de l'invention n'est pas particulièrement critique. D'une façon générale, on peut utiliser toute substance qui 30 est microbiologiquement inerte dans le système et dans les conditicns décrites ici et qui est capable d'empêcher le déplacement par lessivage ou la migration des constituants au cours de l'incubation. C* ^e-st ainsi, par exemple, qu'on peut utiliser des cires, des vernis, des substances hydrophobes naturelles telles que l'éthvl cellulose 35 ainsi que certains polymères. Selon le mode de réalisation préféré 70 13740 8 203923"? de l'invention, on utilise une composition de revêtement incolore à base d'acrylate de méthyle polymérisé, accessible dans le commerce sous la marque ERYLON 150 CIVYSTAL CLEAE, fournie par la Société Kry— Ion, Inc., Norristown, Pennsylvanie, E.U.A. Le produit précité est 5 vendu dans un véhicule toluénique et, si on le désire ou si c'est nécessaire, pour faciliter son application sur la substance spçngi-euse à action capillaire, on peut le diluer avec un supplément de toluène ou d'autres solvants hydrocarbonés, par exemple l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, l'alcool propylique, etc.. Bien que 10 des variantes soient possibles sans s'écarter du cadre de l'invention, il s'est avéré qu'une solution comprenant environ 75 à 100$ vol/vol de Krylon et environ 0 à 25$ vol/vol de diluant ajouté fournit une solution formant barrière et convenant bien. Une association particulièrement préférée est constituée par un mélange de 85$ vol/vol 15 de Krylon 150 Crystal Clear et 15^ vol/vol d'alcool éthylique F.S.P. Il va de soi que la zone non traitée marquée 5 ainsi que la zone d' identification marquée 6 peuvent éventuellement être omises. On vient de décrire ci-dessus un produit préféré selon l'invention, c'est-à-dire des bandes de papier à base de substance spon— 20 gieuse à action capillaire imprégnée avec les agents de diagnostic sous forme de zones séparées, les zones étant séparées par une barrière hydrophobe. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'agent de diagnostic qui décèle la fermentation du mannitol peut être appliqué sur la substance spongieuse à action capillaire et 1' 25 agent de diagnostic qui décèle la production de coagulase peut lui être superposée de manière à obtenir une bande contenant les deux agents de diagnostic dans une même première zone. Dans ce mode de réalisation de l'invention, une composition formant barrière hydrophobe est appliquée en position immédiatement adjacente à la. zone 30 des réactifs, sous forme de deuxième zone. Une troisième zone, immédiatement adjacente à la deuxième, est laissée non traitée et une quatrième zone, constituant une bande d'identification, est immédiatement adjacente à la troisième zone non traitée. Il va de soi qu'on peut éventuellement omettre la troisième zone ainsi que la zone d* 35 identification. La préparation d'un produit contenant les réactifs de diagnostic dans des' zones séparées ainsi que la préparation d'un produit contenant les réactifs de diagnostic clans une zone unique seront décrites de manière détaillée dans les exemples ci-après. 70 13740 9 2039239 Les compositions de diagnostic selon l'invention se sont révélées stables pendant un laps de temps d'au moins six mois, environ, lorsqu'elles sont maintenues h une température de 37aC environ» Pour faciliter son conditionnement et son utilisation, la substance spou-5 giexise p action capilla.ire traitée, obtenue comme décrit ici, est d' ordinaire découpée en bandes étroites gu*on petit, de manière appropriée, insérer dans un flacon ou un tube à essais approprié . Il va de soi que chaque bande découpée contient les réactifs nécessaires pour déceler la fermentation du mannitol et la production de coagu-10 lase. Les bandes ainsi conditionnées, peuvent facilement être expédiées ou stockées sans risque de contamination. Selon le type de bande d'essai utilisé, c'est-à-dire une bande contenant une zone unique pour les réactifs ou une bande contenant les réactifs dans des zones séparées, et selon les milieux utilisés, 15 il y a des différences dans la manière d'utiliser les produits pour différencier les staphylocoques. C'est ainsi, par exemple, que lorsqu'on utilise une bande à zone unique et des milieux non sélectifs, c'est-à-dire des matériels à inoculer provenant de milieux neutres tels que la gélose au sangr la gélose au soja et à la trypticase, 20 etc.., le mode opératoire est le suivant: On met le contenu d'une boucle de 3,0 mm pleine d'organismes,provenant d'une culture sur gélose de 18 à 24 heures, en suspension dans 0,3 ml de séruflr physiologique, dans un tube approprié. Le matériel à inoculer doit être soigneusement mélangé, de manière que la suspension soit uniforme. 25 Puis on place la bande d'essai dans le tube de telle façon que la zone des réactifs soit plongée dans le sérum physiologique. On fait ensuite incuber le tube sur un bain-marie, à une température d'environ 35 à 37°C et, au bout de 45 à 60 minutes d'incubation, environ, on examine le tube pour voir s'il présente des signes de réaction de 30 production de coagulase. L'essai est positif lorsqu'il y a agglutination de la suspension bactérienne, le degré d'agglutination étant compris entre un fin précipité et de gros agr*lptinats, suivant l'organisme sotimis aux essais. L'essai de production de coagulase est négatif lorsqu'il y a absence d'agglutination. Après aue le tube a 35 été examiné pour voir le résultat de la réaction de production de coagulase, on le place à nouveau sur le bain-marie et on le fait incuber une température de 35 h 37°C, pendant encore 3 à 5 heures. Lorsqu'on utilise le rouge de phénol comno indicateur chimique dans 1' BAD ORIGINAL " 70 13740 10 2039239 agent de détection de la fermentation du mannitol, l'essai de fermentation du mannitol est positif lorsqu'il y a apparition d'une coloration jaune sur la bande des réactifs ainsi que dans la suspension dans le sérum physiologique. Un résultat négatif est indiqué par 1' 5 apparition d'une coloration rose à rouge-cerise sur la zone des réactifs et dans la suspension dans le sérum physiologique. Lorsque la bande d'essai utilisée contient l'agent pour déceler la fermentation du mannitol et l'agent pour déceler la production de coagulase en des zones séparées et distinctes, et lorsqu'on utilise 10 un milieu non sélectif, on effectue la différenciation entre staphylocoques de la manière suivante: on met le contenu d'une boucle de 3,0 mm, pleine d'organismes, provenant d'une culture de 18 à 24 heures, uniformément en suspension dans 0,3 ml de sérum physiologique, dans un tube approprié. On place la bande d'essai dans le tube 15 de manière telle que la zone du réactif décelant la production de coagulase, c'est-à-dire la zone contenant le plasma ou fibrinogène spécialement préparé et normalisé, plonge dans la suspension. Immédiatement ensuite, on fait basculer le tube de manière à mouiller la zone du réactif décelant la fermentation du mannitol. On fait ensui-20 te incuber le tube à une température d'environ 37°C, dans une étuve. On peut enregistrer le résultat de la réaction de production de coagulase une heure après le début de l'incubation, ou à n'importe quel moment après ce temps. L'essai de production de coagulase est positif lorsqu'il y a formation d'agglutinats allant d'un fin précipité 25 à de gros agglutinats. L'essai de production de coagulase est négatif lorsqu'il y a absence d'agglutination. Une fois qu'on a examiné le tube pour voir le résultat de la réaction de formation de coagulase, on le place à nouveau dans 1'étuve dans lequel on le maintient à une température d'environ 37°C, pendant encore 3 à 5 heures. Lors-30 ou'on utilise]êrcuge dephàx>l comme indicateur chimique dans l'agent de détection de l'a fermentation du mannitol, l'essai de fermentation est positif lorsqu'il y a apparition d'une coloration jaune aur la zone du réactif décelant la fermentation du mannitol. L'essai est néga.tif lorsqu'une coloration rose à rouge-cerise apparaît sur cette 35 zone. On procède de la manière suivante lorsque la bande d'essai utilisée contient le réactif pour déceler la production de coagulase et le réactif pour déceler la fermentation du mannitol sous forme de BAQ ORlGINAtJ 70 13740 " 2039239 zones séparées et distinctes et lorsqu'on utilise un milieu sélectif, c'est-à-dire un matériel à inoculer provenant de milieu d'isolement des staphylocoques comn*e,par exemple, la gélose au sel et au mannitol, la gélose de type "Chapman Stone", etc..: On met le contenu d* 5 une boucle de 3,0 mm, pleine d'organismes provenant d'une culture de 18 à 24 heures, en suspension dans 0,3 ml de sérum physiologique, dans un tube approprié. On applique une boucle d'organismes, en frottant, dans la zone du réactif décelant la fermentation du mannitol, après quoi on humidifie la zone à l'aide d'une goutte de sérum 10 physiologique. On introduit ensuite la bande d'essai dans le tube, de telle manière que la zone du réactif de détection de la production de coagulase plonge dans la suspension. Puis on fait incuber le tube à une température d'environ 37°C, en relevant les résultats de la réaction de production de coagulase une heure après le début 15 de l'incubation, ou à n'importe quel moment après ce laps de temps. L'essai de production de coagulase est positif lorsqu'il y a apparition d'qggltrfciiatB dont les dimensions vont de celles d'un fin précipité à celles de gros agglutinats.L'essai de production de coagulase est négatif lorsqu'il y a absence d'agglutination. Après qu'on a 20 examiné le tube pour voir s'il y a production de coagulase, on le place à nouveau dans une étuve dans laquelle on le maintient à une température d'environ 37°C, pendant encore 3 à 5 heures. Lorsqu'on utilise le rouge phénol dans l'agent de détection de la fermentation du mannitol, comme indicateur chimique, l'essai de fermentation du 25 mannitol est positif lorsqu'il y a apparition d'une couleur jaune sur la zone du réactif, tandis que l'essai est.négatif lorsqu'il y a apparition d'une coloration rose à rouge-cerise sur la zone du réactif décelant la fermentation du mannitol. La valeur principale des compositions de diagnostic selon l'in-30 vention, dans un laboratoire de clinique, est la différenciation entre S.aureus pathogène et S.epidermidis qu'on pense souvent être parasite plutôt que pathogène. Le premier produit de la coagulase et fait fermenter le mannitol,tandis que le second ne produit pas de coagulase et ne fait pas fermenter le mannitol. La présente in-35 vention fournit un procédé ra.pide, sensible et reproductible pour effectuer une telle différerciation. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. ^Original 70 13740 12 2039239 Exemple 1 À. Préparation du réactif décelant la fermentation du mannitol Dans un récipient contenant 80 ml d'eau distillée on introduit, successivement, 1,0 g d'extrait de boeuf "Bacto", 10,0 g de peptone 5 aux protéoses No.3, 15 g de D-mannitol, 5 g de chlorure de sodium et 0» 55g de rouge de phénol . Puis on introduit 3,4 g de dextrane ayant un poids moléculaire d'environ 60.000 à 90.000 et on chauffe le mélange .jusqu'à une température de 100°C, afin d'obtenir une solution. On laisse ensuite la solution refroidir à température ambiante, 10 après quoi on l'amène à un volume de 100 ml par addition d'eau distillée. B. Préparation du réactif décelant la production de coagulase (a) 12,5 g d'un mélange de plasma humain lyophilisé et dialysé, débarrassé de toutes traces décelables de glucose, sont intro- 15 duite et dissous dans 50 ml d'eau distillée stérile. (b) Le mélange de plasma humain lyophilisé et dialysé,utilisé pour préparer la solution décrite au paragraphe précédent est préparé de la manière suivante: on dissout 20,0 g de plasma humain lyophilisé dans 80 mid'éau distillée puis on amène la solution à un 20 volume de 100 ml en y ajoutant de l'eau distillée. Chaque portion de 100 ml de plasma reconstitué ainsi obtenu est dialysée contre 10 litres d'un tampon. On prépare le tampon utilisé en dissolvant, successivement, 8,0 g de phosphate monopotassique, 34,0 g de phosphate disodique anhydre, 26,5 g de chlorure de sodium dans 9,5 litres d'eau 25 distillée. On amène la solution à un volume de 10 litres, en ajoutant de l'eau distillée. On maintient le tampon à une température de 4°C et on dialyse le plasma dans un tube de dialyse de 2,54 cm. On effectue la dialyse à une température de 4°C, en agitant constamment le tampon. Pendant le temps de dialyse total, d'environ 48 heures,on 30 renouvelle deux fois la solution tampon, avec un laps de temps d'au moins 8 heures entre les renouvellements. Comme, à tout moment, on dialyse 100 ml de plasma reconstitué contre 10 litres de tampon, on utilise au total 30 litres de tampon dans le processus. On obtient ainsi un plasma lyophilisé et dialysé qui est com-35 plètement exempt de glucose. C. Préparation de la composition formant barrière hydrophobe On prépare cette composition en diluant 85 ml de KRYLON 150 CRYSTÂL CLEAR avec 15 ml d'alcool éthylinue, U.S.P. BA0 ORIGINAL 70 13740 " 2039239 D. Application des réactifs de diagnostic sur une substance spongieuse à action capillaire On utilise une feuille continue de panier filtre Eaton-Dikeman Ko. 623 (31,75 kg), mesurant 82 mm sur 630 mm, comme substance spon-5 gieuse à action capillaire pour préparer 100 bandes de papier de diar-gnostic mesurant 82 mm sur 6,3 mm. Quatre zones sont inscrites sur la feuille, comme suit: 1 2 3 4 15 mm 15 mm 48. mm 4 mm On applique la composition formant barrière hydrophobe, dont la préparation est décrite dans la section C de cet exemple, sur la zo-10 ne 2, en une quantité suffisante pour saturër la zone. Puis on laisse la feuille reposer à température ambiante, pour permettre au solvant de s'évaporer. Lorsque la zone 2 est tout-à-fait sèche, on applique sur la zone 1 le réactif permettant de déceler la fermentation du mannitol, c' 15 est-à-dire le produit de la section A de cet exemple, en prenant soin d1empêcher que la zone 1 touche ou chevauche la zone 2. Puis on laisse sécher la zone 1 . On applique le réactif permettant dé déceler la production de coagulase (c'est-à-dire la composition décrite à la section B de cet 20 exemple) sur la zone 1, par-dessus le réactif séché permettant de déceler la fermentation du mannitol. Puis on sèche à nouveau la zone 1, après quoi on réapplique une quantité supplémentaire de la composition de la section B. La zone 3 est non traitée et la zone 4 est une bande d'identification. Après séchage, on découpe le papier en 25 100 bandes mesurant chacune 82 mm sur 6,3 mm, chaque bande contenant les quatre zones décrites ci-dessus. E. Utilisation de la composition de diagnostic Lorsqu'on utilise la-composition de diagnostic préparée comme décrit dons la section Dde cet exemple, on met une pleine boucle,de 30 3 mm, d'organismes provenant d'une plaque- de gélose au bouillon de soja et à la trypticase ou de gélose au sang, en suspension dans 0r3 ml de sérum physiologique, dans un tube de 13 x 100 mm. On introduit dans le tube une bande d'essai obtenue comme décrit à la section D de cet exemple, de façon que la zone comportant les milieux plonge bad original" 70 13740 U 2039239 dans la suspension. Puis on fait incuber le tube sur un bain-marie, à une température de 37°C. Au bout d'une période d'incubation d'une heure, on examine le tube pour voir s'il présente des signes de réaction de production de coagulase. L'essai de production de coagula-5 se est positif lorsqu'il y a agglutination de la suspension bactérienne ! se présentant sous forme d'un fin précipité jusqu'à de gros agglu-tinats. Lorsque l'essai est négatif, la suspension reste homogène. On continue à faire incuber le tube et, au bout d*un temps d'incubation total de six heures, on examine à nouveau le tube, cette fois-10 ci pour voir s'il présente des signes de fermentation du mannitol.L* essai de fermentation du mannitol est positif lorsqu'il y s, apparition d'une coloration jaune sur la zone d'application du réactif, c' cst-à-dire la zone 1, et dans la suspension. L'essai est négatif lorsqu'il y a apparition d'une coloration rose à rouge cerise sur la 15 zone d'application du réactif et dans la suspension. P. Variante de mode de réalisation de l'invention On opère entièrement comme décrit dans l'exemple ci-dessus, à cette exception près qu'on remplace le mélange de plasma humain lvo-•nhilisé et dialysé par 12,5 g de mélange de plasma cle lapin lyophi-20 lisé et dialysé.. Le produit ainsi obtenu, c'est-à-dire la bande d'essai, se révèle entièrement satisfaisant à utiliser pour la détection rapide et sure de production de coagulase et de fermentation du mannitol dans les staphylocoques. 25 Exemple 2 Cet exemple décrit la prénaration de bandes d'essai spongieuses à action capillaire sur lesquelles on a appliqué le réactif pour déceler la production de coagula.se et le réactif pour déceler la fermentation du mannitol sous forme de zones séparées. 30 A. Préparation du réactif décelant la fermentation du mannitol B. Prénaration du réactif décelant la production de coagulase C. Préparation de la composition formant barrière hvdrophobe On prépare les réactifs (A) et (B) ainsi que la composition (C) en utilisant les mêmes constituants et les mêmes quantités de ceux-35 ci, par les procédés décrits respectivement aux sections (a), (B) et (C) de l'exemple 1. D. Applications des réactifs de diagnostic sur la substance spongieuse à action capillaire ORIGINAL 70 13740 " 2039239 On utilise, pour préparer les bandes, une feuille continue de papier filtre Eaton Dikeman No. 623 (de 31,75 kg), de 82 mm de largeur. On divise le papier en 6 zones séparées, comme suit: 1 2 3 4 5 6 15 mm 16 mm 15 mm 16 mm 16 mm 4 mm On applique, sur les zones 2 et 4, la composition formant bar-5 rière hydrophobe, préparée comme décrite à la section C de l'exemple 1 . On laisse sécher ces zones et, une fois sèches, on traite la zone 1 par une solution de dextrane (ayant un poids moléculaire de 60.000 à 90.000) dans l'eau distillée, la solution utilisée contenant 18,3 g de dextrane pour 100 ml de solution. On prend soin d'empêcher que 10 les zones 1 et 2 se touchent ou se chevauchent. Lorsque la zone test sèche, on y applique, par-dessus le revêtement de dextrane, la composition au plasma lyophilisé et dialysé préparée comme décrit à la section B de l'exemple 1. On empêche les zones 1 et 2 de se chevaucher. Lorsque la zone 1 est sèche, on applique sur la zone 3 la com-15 position permettant de déceler la fermentation du mannitol, après quoi on sèche la zone. On traite la zone 6, uniquement aux fins d' identification, à l'aide d'une solution dans l'eau distillée dont chaque portion de 100 ml contient 0,1 g de bleu F.D. & C. Blue No.1 et 0,4 g de jaune F.D. & C. Tellov No.6. Le papier ainsi traité est 20 découpé en bandes de 6,35 mm de largeur, chacune de ces bandes contenant les six zones décrites ici. E. Utilisation de la composition de diagnostic Les bandes d'essai,dont on décrit la préparation dans cet exemple, présentent certains avantages par rapport aux bandes d'essai 25 préparées comme décrit à l'exemple 1. Comm« le réactif de détection de la production- de coagulase et le réactif de détection de la fermentation du mannitol sont appliqués en deux zones séparées, il est possible d'effectuer l'essai en utilisant soit un matériel à inoculer provenant de milieux neutres comme, par exemple, la gélose au 30 sang, la gélose au soja et à la trypticase, etc.. soit un matériel à inoculer provenant de milieux d'isolement staphylococciques comme par exemple la gélose au sel et au mannitol, la gélose de type "Chap-man Stone", etc.. En conséquence, on décrira ci-dessous le processus suivi en utilisant les deux types de milieux. 70 13740 " 203»259 Lorsqu'on procède en utilisant un matériel à inoculer provenant de milieux neutres, on met une boucle de 3,0 mm, pleine d'organismes, en suspension dans 0,3 ml de sérun physiologique, dans un tube à essais. On plonge la bande d'essai (dont on a décrit la prépa.ra-5 tion à la section D de cet exemple) dans la suspension de telle manière que la zone 1 se trouve en contact avec la suspension. Immédiatement après, on incline le tube suivant un certain angle, afin que la suspension vienne en contact avec la zone 3 et la mouille. Puis on fait incuber le tube à une température de 37°C. On enregis-10 tre le résultat de la réaction de production de coagulase au bout" d'une heure, ou plus. L'essai est positif lorsqu'il y a agglutination de la suspension bactérienne dans le tube. L'agglutination se présente sous une forme variant d'un fin précipité à de gros agglu-tinats. La réaction est négative lorsqu'il n'y a pas agglutination. 15 On poursuit l'incubation au-delà de la période nécessaire à la détermination de la production de coagulase, pendant un laps de temps supplémentaire de cinq heures, c'est-à-dire que le temps d'incubation total est de six heures. Pour la mise en évidence de la fermentation du mannitol, la réaction peut être rapide ou retardée, sui— 20 vant les caractéristiques biochimiques d'un produit iâolé donné. L'essai de fermentation du mannitol est positif lorsqu'il y a apparition d'une coloration jaune sur la zone 3 de la bande. La réaction est négative lorsqu'il y a apparition d'une coloration rose à rouge cerise sur la zone 3 de la bande. Il ne faut pas conclure au 25 caractère négatif de la réaction de fermentation du mannitol avant échéance des six heures d'incubation. Lorsqu'on utilise un matériel à inoculer provenant de milieu^ d'isolement etaphylococciques , par exepple la gélose au sel et au mannitol, la gélose de type "Chapman Stone", etc.., on met une plei— 30 ne boucle de 3,0 mm d'organismes en suspension dans 0,3 ml de sérum physiologique,dans un tube à essais. On incorpore une plèine boucle d'organismes dans la zone de fermentation de la bande d'essài, c'est-à-dire la zone 3, en frottant, puis on humidifie la zone à l'aide d' une goutte de sérum physiologique. On introduit ensuite la bande d' 35 essai dans la suspension de manière que la zone 1 plonge dedans. Puis on fait incuber le tube à une température de 37°C et on peut enregistrer le résultat de la réaction de production de coagulase une heure, ou plus, après le début de l'incubation. L'essai de production de BAD ORIGINAL" 7013740 17 2039239 coagulasê est positif lorsqu'il y a apparition d'agglutinants, tandis qu'il est négatif lorsqu'il y a, absence d'agglutination. On continue à faire incuber pendant encore cinq heures, de manière à amener le temps d'incubation total a six heures. La réaction de fermentation 5 du mannitol est positive lorsqu'il v a apparition d'une coloration jaune sur la zone 3 de la ban^e d'essai; l'essai est négatif lorsqu'il y a apparition d'une coloration rose à rouge cerise sur la zone 3 de la bande d'essai. F. Autre mode de réalisation selon l'invention 10 On opère entièrement comme décrit à l'exemple ci-dessus, h cela près qu'on utilise 1,0 g de fibrinogène au lieu de 13,5 g de mélange de plasma humain lyophilisé et dialysé, à titre de réactif permettant de déceler la production de coagulase. Le produit ainsi obtenu, c'est-à-dire-la bande d'essai, se ré-15 vêle entièrement satisfaisant pour la détection rapide et sûre de la production de coagulase et de la fermentation du mannitol chez les staphylocoques. SAD original- 70 13740 18. 2039239 REVENDICATIONS 1 - Un réaetif de diagnostic pour l'identification rapide et positive des staphylocoques, caractérisé en ce qu'il comprend une substance spongieuse à action capillaire contenant (l) une compo- 5 sition comprenant (a) un élément nutritif capable d'entretenir la croissance de microorganismes, (b) du D-mannitol et (c) un indicateur chimique qui produit un changement de coloration en présence des produits de dégradation acides qui sont formés par la fermentation du mannitol et (2) une substance coagulable dont pratique- 10 ment tout le glucose a été éliminé. 2 - Un réactif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la composition (2) recouvrent la composition 1. 3 - Un réactif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les compositions (l) et (2) sont appliquées séparément sur la 15 substance spongieuse à action capillaire de manière à former deux zones réactives, la zone réactive (l) étant séparée de la zone réactive (2) par une zone formant barrière hydrophobe. ^ - Un réactif suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3* caractérisé en ce que la composition (l) contient également 20 du chlorure de sodium. 5 - Un réactif suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la composition (l) contient également un agent épaississant, en particulier le dextrane. 6 - Un réactif suivant l'une quelconque des revendications 25 là 3i caractérisé en ce que, dans la composition (l), l'ingrédient (a) est un mélange d'extrait de boeuf et de peptone aux protéoses et l'ingrédient (c) est le rouge de phénol. 7 - Un réactif suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la composition (2) est appliquée sur une zone de la substance 30 spongieuse à action capillaire qui est revêtue de dextrane. 8 - Un réactif suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la zone formant barrière hydrophobe comprend.une composition de revêtement à i'acrylate de méthyle polymérisé. 9 - Une composition pour déceler la production de coagulase 35 chez les staphylocoques, caractérisée en ce qu'elle comprend une substance coagulable constituée par du plasma humain lyophilisé, du plasma de lapin lyophilisé ou du fibrinogène, cette substance étant pratiquement exempte de glucose. 10 - Un réactif de diagnostic pour déceler la production de 40 coagulase chez les staphylocoques, caractérisé en ce qu'il comprend 70 13740 19. une substance spongieuse à action capillaire sur laquelle on a appliqué la composition suivant la revendication 9. 11 - Un procédé pour la différenciation des staphylocoques, caractérisé en ce qu'on plonge un réactif de diagnostic suivant 5 la revendication 2 dans une suspension, dans du sérum physiologique, d'un matériel à inoculer provenant de milieux neutres, on fait incuber la suspension pendant environ une heure, à une température d'environ 35 à 37 °C, on examine la suspension pour voir s'il y a apparition d'agglutinats, on fait encore incuber la suspension 10 pendant un laps de temps supplémentaire d'environ trois à cinq heures, à une température de 37°C, et on examine la zone des réactifs ainsi que la suspension pour voir s'il y a eu changement de couleur. 12 - Un procédé pour la différenciation des staphylocoques, 15 caractérisé en ce qu'on introduit un réactif de diagnostic suivant la revendication 3 dans une suspension dans le sérum physiologique d'un matériel à inoculer provenant de milieux neutres, de manière telle que seule la zone réactive contenant la composition (2) plonge dans la suspension, on humidifie ensuite, à l'aide de cette 20 suspension, la zone réactive contenant la composition (l), on fait incuber la suspension pendant environ une heure, à une température d'environ 37°C, on examine la suspension pour voir s.'il y a eu formation d'agglutinats, puis on fait encore incuber la suspension pendant un laps de temps supplémentaire d'environ trois à cinq 25 heures, à une température d'environ 37°C, et on examine la zone réactive contenant la composition (l), pour voir s'il y a eu changement de couleur. 13 - Un procédé pour la différenciation des staphylocoques, caractérisé en ce qu'on applique un matériel à inoculer, provenant 30 de milieux d'isolement staphylococciques, sur la zone réactive d'un réactif de diagnostic suivant la revendication 3 contenant la composition (l), on humidifie ensuite cette zone réactive à l'aide de sérum physiologique, puis on introduit le réactif de diagnostic dans une suspension, dans le sérum physiologique, d'un matériel à 35 inoculer provenant de milieux d'isolement staphylococciques, de telle façon que la zone réactive contenant la composition (2) plonge dans la suspension, on fait incuber la suspension pendant environ une heure à 37°C ënviron, on examine le réactif pour voir s'il y a formation d'agglutinats, on fait ensuite incuber la suspension pen- 40 dant encore trois à cinq heures environ, à 37°C environ, et on examine la zone réactive contenant la composition (l) pour voir s'il y a eu chan- . "gement de couleur.