Brevet FR2027498A1 — publié le 19701002

La présente invention concerne un nouveau colorant pour l'analyse microscopique de frottis cytologiques secs permettant de colorer en un seul temps les principaux constituants cellulaires. On connatt actuellement divers colorants du type hOiV2WNOWSKY permettant l'examen microscopique de frottis cytologiques tels que colorant dit "de Wright" à base d'éosine et de bleu de méthylène qui colore spécifiquement les globules blancs du sang. L'invention a pour but un colorant-amélioré constitué au moins en partie par une solution-alcoolique à pH 6,5 environ, d'éosine, de bleu de m-ëthilène et de glycérine. On peut utiliser avantageusement un mélange d'éosine/bleu de méthylène dans le rapport 1/3 à 1/2 ou un colorant "de Wright" que l'on traite suivant le procédé de l'invention. Le colorant, suivant l'invention, peut avantageusement être utilisé en solution dans du méthanol absolu contenant éventuellement une faible proportion de phénol. Un tel colorant peut être avantageusement constitué par une solution à pH 6,5 dans le méthanol absolu renfermant environ par litre : 4 à 6 g de colorant constitué par un mélange dans la proportion pondérale d'environ 1/3 à 1/2 d'éosine bleu de méthylène, 75 à 125 ml de glycérine et 10 ml de méthanol absolu phéniqué à 10 46. Des proportions particulièrement avantageuses pour les ingrédients du colorant de l'invention sont de 5 g de colorant "de Wright", 100 ml de glycérine et 10 ml de méthanol absolu phéniqué à 10 , par litre de solution dans le méthanol absolu. La présence de glycérine dans le colorant confère à ce dernier une grande onctuosité, stabilise les ingrédients tinctoriaux et améliore leur répartition sur les frottis à analyser. Le colorant de l'invention permet de colorer en un seul temps les principaux constituants cellulaires. On peut l'utiliser pour tout examen microscopique de frottis sanguins, frottis cytologiques inflammatoires, tumoraux ou parasitaires, de la peau, des muqueuses et des parenchymes. Il permet une coloration spécifique des globules du sang. Les caractéristiques tinctoriales du colorant, suivant l'invention, sont plus fines et plus accentuées que celles des colorants cytologiques classiques, ce qui permet une meilleure reconnaissance des globules blancs du sang. On peut utiliser le colorant de l'invention pour déterminer la formule leucocytaire de frottis hématologiques. On constate que les caractéristiques tinctoriales des éléments sont sensiblement analogues à celles classiques que donne la coloration dite :" de May-OrUnwald-Giemsa"s les polynucléaires neutrophiles ont des granulations plus fines, les éosinophiles et les basophiles des granulations plus accentuées. Les petits lymphocytes sont semblables. les grands lymphocytes ont un cytoplasme moins bleuté, les monocytes ont un noyau plus clair, Le colorant de l'invention permet l'établissement du pourcentage des éosinophiles sur les frottis d'expectoration ou de mucus nasal des allergiques. Il permet en outre le dépistage du trichomonas dans les sécrétions vaginales ou uréthrales. On individualise aisément le parasite par son noyau petit coniforme rouge clair, souvent périphérique et son cytoplasme gris violet, Pour le dépistage des cellules néoplasiques, le colorant,suivant l'invention, met en évidence les principales caractéristiques pathologiques : gigantisme cellulaire, rapport nucléo-cytoplasmique augmenté, hyperchromatisme et irrégularités nucléaires, polynucléolose avec anisonucléolose. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de plusieurs exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. EXEMPS;E 1 On prépare un colorant , suivant l'invention, en malaxant au mortier dans une étuve à 400C ,100 ml de glycérine tiède , et 5 g de colorant éosine-bleu de méthylène en poudre (telcelui vendu sous la dénomination de "colorant de Wright" en Angleterre par les Etablissements GUIIR , Londres, pour lequel le mélange éosine-bleu de méthylène est dans le rapport l/2t On peut préparer le "colorant de Wright" de la façon classique suivant : Dans une solution à 0,5 % de carbonate de soude, on ajoute de la poudre dé bleu de méthylène ( à raison dsl g pour 100 ml de solution) que l'on écrase au pilon dans un mortier jusqu'à dissolution.Le mélange obtenu est mis dans un Erlenmeyer que l'on chauffe au bain-marie à 1000C pendant 60 minutes. Après refroidissement, on filtre la solution sur papier Whatman N 1 et on récupère le filtrat. A ce dernier, on ajoute par frac tion et en agitant une solution d'éosine åaunatreà O,1% ( à raison de cinq volumes de ce dernier, pour 1 volume du filtrat). Le mélan ge devient rouge pourpre et un fin précipité noirâtre apparattOOn récupère ce dernier par filtration sur papier Whatmann NO So Ce précipité est séché à I'étuve à 370 puis transféré dans un flacon en verre colore. Après homogénéisation du "colorant de Wright" et de la glycérine, on ajoute lentement, en mélangeant , 10 ml de méthanol absolu phéniqué à 10% . On ajuste ensuite le volume à l litre avec du méthanol absolu, On place la solution obtenue dans une étuve à 400C pendant 3 Jours, en l'agitant, matin et soir pendant quelques minutes. On filtre ensuite la solution et on ajuste le pH du filtrat à 6,5 avec une solution de soude ou d'acide acétique, Le colorant obtenu a d'excellentes caractéristiques tinctoriales, wsRMpLE 2 On opère de la façon suivante pour colorer des frottis cytologiques. On recouvre un frottis séché, avantageusement dans les heures qui suivent le prélèvement, avec 15 à 25 gouttes du colorant préparé suivant l'exemple 1. On laisse séjourner pendant 3 minutes. Le frottis est -ainei fixé et partiellement coloré. On ajoute ensuite 15 à 25 gouttes d'eau distillée neutre et on homogénéise le mélange de colorant et d'eau par une agitation douce. On abandonne le frottis ainsi pendant 3 minutes environ, période qui correspond au stade de la coloration proprement dite On lave le frottis à l'eau courante et on place la lame inclinée sur un portoir jusqu'à ce que le frottis soit sec, Le séchage à l'air ambiant favorise une meilleure différenciation des éléments (fin de la coloration) et donne de meilleurs résultats que le séchage sur papier filtre ou plaque chauffante. Bien entendu, l'invention ntest nullement limitée aux exemples décrits ; elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à lthomme de l'art, suivant les applications envisagées, et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 .- Colorant cytologique pour analyses microscopiques caractérisé en ce qu'il est constitué au moins en partie par une solution alcoolique à pH 6,5 environ, contenant par litre : environ 4 à 6g dpun mélange pondéral environ 1 partie d'éosine pour environ P à 3 parties de bleu de méthylène et environ 75 à 125 ml de glycérine. 2 .- Colorant suivant 10, caractérisé en ce que le mélange éosine-bleu de méthylène est un colorant de "Wright". 50.- Colorant suivant 10 ou 20 ,caractérisé en ce que le solvant alcoolique est du méthanol0 40.- Colorant suivant 10, 20 ou 30 caractérisé en ce que la solution contient une faible proportion de phénol0 50o Colorant suivant 40, caractérisé en ce que la proportion de phénol est d'environ 0,1 %. 60, Colorant telsque décrit en l'un quelconque des paragraphes précédents caractérisé en ce qu'il est constitué par une solution dans le méthanol absolu renfermant, par litre, 5 g de colorant de "Wright" dans lequel la proportion éosine-bleu de méthylène est 1/2 , 100 ml de glycérine, 10 ml de méthanol absolu phéniqué à 10%. 700- Procédé de préparation d'un colorant suivant l'un quelconque des paragraphes 10 à 60 caractérisé en ce que l'on chauffe de la glycérine à environ 400 C, on ajoute un colorant de "Wright" et on malaxe avec la glycérine, on ajoute lentement du méthanol phéniqué puis du méthanol absolu, on chauffe le mélange ainsi formé à environ 400C et on le maintient à cette température pendant trois jours environ, on recueille la solution par filtration et on ajuB- te le pH du filtrat à environ 6,5, 80.- Application des colorants décrits en l'un quelconque des paragraphes précédents pour la coloration de frottis cytologiques séchés caractérisée en ce qu'on recouvre chaque frottis pendant environ 3 minutes avec environ 15 à 25 gouttes du colorant suivant 60, on ajoute environ 15 à 25 gouttes d'eau distillée neutre, on homogénéise le mélange de colorant et d'eau, on lave à l'eau les dits frottis puis on les sèche.