Brevet FR2051547A1 — publié le 19710409

La présente invention concerne, comme antibiotique s, l'alpha- méthyldéthiobiotine, 1' alpha-méthylbiotine et leurs esters» L1 alpha-methyIdéthiofciotine et ses esters répondent à la formule : 10 CH0 HSC RO—C—IH—(CHg ) $ 8 o où R est de l'hydrogène ou un radical _t-butyle, phtalimidométhyle ou phénacyle. L'alpha-méthylbiotine et ses esters répondent à la formule : îl où E a la signification ci-dessus» L'alpha-méthyldéthiobiotine, où R ©st de lfhydrogène dans la 21- formule I, et l1 alpha-méthylbiotine où R est de l'hydrogène dans la formule II sont des bactéricides actifs® L'alpha-méthyldéthiobiotine (U-=28 559) est le nom commun pour désigner l'acide alpha, 5-diiaéthyl ~2-oxo-4-imidazolidinehexa-noïque. L'alpha-méthylbiotine est le nom commun pour désigner l'a-cide cis-tétrahydro-alpha-méthyl-2-osothiéno^~3j4-d 7imidazoline-4-valérique. Ge sont des composés acides. 1!alpha-méthyldéthiobio-tine est active contre différents microorganismes G-ram-positif et Gram-négatif, par exemple Escherichia coli. Mycobac ter juin . avium et Bacillus subtilis. L'alpha-méthyldéthiobiotine est également ac-^ tive contre les fongi, par exemple elle est active contre Kocardia asteroïdes. Blastomyces dermititidis et Phialophora verrue osa 3 L'alpha-méthylbiotine est active contre différents microorganismes Gram-positif, par exemple Bacillus subtilis. Bacillus cereus. Mycobacte-rium avium et Mycobacterium phlei. BAD ORIGINAL 70 18127 '2 20515^7 L'alpha-méthyldéthiobiotine et 1® alpha-méthylbiotine sont obtenues dans un procédé de fermentation productrice de lydimycine tel eue décrit au brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 395 220. La présence de ces composés n'était jusqu'à présent pas décelée 5 dans une telle fermentation. La production de 1!alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine dans une fermentation productrice de lydimycine telle que décrite dans' le brevet des Etats-Unis d'Amérique rappelé ci-dessus utilise le micr oorganisme Streptomyces lydicus, NHSL 2433. 10 Ce microorganisme est- disponible sans restriction en s*adressant à "Northern Utilization Research and Development Division, Agricul-tural Research Service, U.S, Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A.". L!alpha-méthyldéthiobiotine et 1'alpha-méthylbiotine peuvent également être obtenues à partir d'autres souches 15 de S. lydicus se présentant sous la référence NRRL 3432„ Une sous-culturs de cette souche est également disponible sans restriction en sEadressant à l'organisme mentionné ci-dessus. L!alpha-méthyldéthiobiotine et 1'alpha-méthylbiotine sont décelées dans la liqueur de fermentation productrice de lydimycine 20 par un nouveau procédé qui implique la chromâtographie sur papier de cette liqueur de .fermentation dans un système Sarma 1. Le chro-matogramme développé est soumis à une estimation biologique directe vis-à-vis d'une culture de Bacillus subtilis sur un milieu synthétique de gélose. Le système Sarma 1 consiste en un chromatogramme 25 développé avec la phase supérieure d'un mélange solvant consistant en 1-butanol, méthanol, bensène et eau (2:1:1:1). Le milieu synthétique sur lequel Bacillus subtilis est cultivé consiste en : Ia2HP04.7H20 1,7 g 30 IÎH2P04 2,0 g (IH^SO^ 1,0 g MgS04 0,1 g Glucose 2,0 g Gélose "Bacto"*' 15,0 g 35 Eau distillée 1 litre Solution-mère d'ions métalliques** 1 ml ^Gélose "Bacto" vendue par "Difeo Laboratories, Détroit » Michigan" **La solution-mère d'ions métalliques consiste en : bad original 70 18127 3 2051547 !TaMo04.2H20 200 (ag/ml ' 0oCl2 100 tig/ffil CuSO^ 100 pg/âl MnSO^ 2 mg/ml 5 CaCl^ 25 mg/ml FeCl^ 4H20 5 mg/ml ZnCl2* 5 mg/ml *ZnCl2 est à dissoudre séparément en utilisant une goutte de HC1 0,1 H pour 10 ml d'eau. La solution-10 mère est chauffée pour amener tous les composés en solution ; on la laisse reposer pendant 24 heures et la filtre dans des conditions stériles^ Le procédé décrit ci-dessus pour déceler l1alpha-méthyldéthiobiotine et 1'alpha-méthylbiotine dans un milieu de fermentais tion de prod^Qtion de lydimycine dit ci-après fermentation de lydimycine a/ trouvé postérieurement à la découverte de la lydimycine. Ainsi, 1'alpha-méthyldéthiobiotine et 1'alpha-méthylbiotine présentes dans les liqueurs.de fermentation de lydimycine n'étaient jusqu'à présent pas décelées et par conséquent n'étaient ni récu-20 pérées ni utilisées. L'alpha-méthyldéthiobiotine et 1'alpha-méthylbiotine peuvent être récupérées d'un milieu de fermentation de lydimycine par application d'absorbants surfactifs comme, par exemple, des résines décolorantes et du charbon actif (de préférence). Avantageusement, 25 tout le milieu de fermentation de lydimycine est d'abord filtré à pH 4, ou centrifugé pour séparer les substances myceliales et les solides non dissous du bouillon de culture. Le bouillon de culture limpide est ensuite envoyé sur un adsorbant comme, par exemple, du charbon actif. On lave la colonne au moyen d'un volume d'eau dé-30 sionisée correspondant au volume du bouillon puis au moyen de trois volumes chacun consistant en 25 % de méthanol dans l'eau, 50 fo de méthanol et méthanol. L'alpha-méthyldéthiobiotine, 1'alpha-méthylbiotine et la lydimycine sont éluées de la colonne au moyen de 20 volumes de triéthylamine à 1-5 i° dans le méthanol. On analyse les 35 fractions par chromatographie sur papier avec le système chromato- BAD ORIGINAL 70 18127 4 2051547 gramme Sarma 1 décrit ci-dessus. I1évaporation du solvant des élu-ats, la dissolution des résidus dans l'eau et l'acidification jusqu'à un pH d'environ 2,0, donnent un mélange cristallin d'alpha-méthyldéthiobiotine, d8alpha-méthylbiotine et de lydimycine. La 5 récupération de chacun des antibiotiques de es mélange est facilement réalisée par conversion du mélange des antibiotiques en esters, de préférence sous forme d5esters de phiracyle» D'autres esters appropriés sont les esters de t-butyle le phtaliiaidoffiéth^-le. Le mélange des esters antibiotiques est snrraite recristalliss 10 à plusieurs reprises dans un solvant appropria comme, par exemple; 1!éthanol, un mélange d'acétone et d'éthanol, jl mélange d'éthanol et de chlorure de méthylène, ou un mélange ds- chlorure de méthylène et de toluène pour séparer les esters de la lydimycine sensiblement exempts des esters de 1'alpha-méthyldéthiobiotine et de l'al-15 pha-méthylbiotine qui restent dans les liqueurs-mères» Ces liqueurs-mères contenant surtout les esters de l'alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine et une certaine quantité de l'ester ds lydimycine, sont réunies et évaporées jusqu'à l'obtention d'un résidu. Ce résidu est extrait au toluène saturé de propylène-glycol 20 et on soumet l'extrait à une chromatographie de partage dans une colonne. Les fractions ne contenant que les esters de 1 ' alpha-rmé- autre thyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine sont soumises à uns/ purification sur une colonne de chromatographie au gel de silice éluée au moyen de 3 f° d'éthanol dans du chloroforme, ce qui donne 25 des fractions contenant l'ester d'alpha-méthyldéthiobiotine sensiblement exempt d'ester d'alpha-méthylbiotine et l'ester d'alpha-méthylbiotine sensiblement exempt d'ester d'alpha-méthyldéthiobiotine . Les fractions actives provenant de la chromatographôe de 30 partage et de la chromatographie sur gel de silice sont détermines-3 par chromatographie sur papier en utilisant une culture de B. su-:— tilis dans un milieu synthétique comme décrit précédemment ou par chromatographie sur couche mince„ Ce dernier essai est préféré. Il est réalisé par un essai par touches sur une plaque de verre endui-35 te de gel de silice que l'on développa au moyen de 5 i° de méthanol et de chloroforme. Les zones actives sont décelées par lumière ultra-violette. la lydimycine est la plus polaire,et 1'alpha-méthyldéthiobiotine est la moins polaire, 1'alpha-méthylbiotine ayant use polarité intermédiaire. BAD ORIGINAL 70 18127 5 2051547 Le groupe ester provenant des esters de 11alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine peut être éliminé avantageusement au moyen d'une base, par exemple, le thiophénolate de sodium, le phénolate de sodium., l'ammoniac- et l'hydroxyde de sodium, 5 ce qui donne de 1'alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine cristallinesy respectivement» Ces cristaux peuvent être ultérieurement purifiés par recristallisation dans l'acétone» Le procédé ci-dessus de purification de 1'alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine convient particulièrement bien 10 pour séparer ces antibiotiques de la substance contenant 1'alpha-méthyldéthiobiotine y 1 ' alpha-méthylbiotiïie et la lydirqycine étant donné que les esters de 1'alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine sont facilement isolés par chromatographie sur une colonne de gel de silice» 15 L'alpha-méthyldéthiobiotine peut également être récupérée d'un milieu de fermentation de lydimycine par filtration de ce milieu à pH 4, passage du filtrat sur charbon actif, élution du charbon actif au moyen de 3 fois le volume de la colonne chacun de 25 fo de méthanol dans l'eau, 50 $ de méthanol et de méthanol sensiblement 20 anhydre. Cette élution est ensuite suivie d'une élution de la colonne au moyen d'environ 20 fois le volume de la colonne de méthanol à 5 % de triéthylamine. Les fractions d'éluat contenant 1'alpha-méthyldéthiobiotine sensiblement exempte de lydimycine peuvent être concentrées jusqu'à l'obtention d'un solide et purifiées par 25 chromatographie sur gel de silice0 Suivant une variante, la substance solide contenant 1'alpha-méthyldéthiobiotine pratiquement exempte de lydimycine peut être purifiée en dissolvant d'abord la matière solide dans l'hydroxyde d'ammonium, en filtrant la solution puis en acidifiant celle-ci 30 jusqu'à pH d'environ 2,0, ce qui donne des cristaux d1alpha-méthyldéthiobiotine essentiellement purs,, La recristallisation dans l'acétone conduit à une nouvelle purification des cristaux d'alpha-méthyldéthiobiotine . Les sels de l1alpha-méthyldéthiobiotine et de 11alpha-méthyl-35 biotine sont formés en utilisant l'acide libre de ces composés et une base minérale ou organique. Ces sels peuvent être préparés par exemple par dissolution de l'alpha-méthyldéthiobiotine ou de l'glpha-méthylbiotin© sous la forme acide libre dans un aleool, par exemple,, le méthanol et I*éthanols addition d'une base dilatée 'jusqu'à ce 40 çr&~ le pH de la solution att-eigae environ 10,0-11,0, BAD ORIGINAL 70 18127 6 2051547 et concentration et séchage de la solution pour obtenir im résicte sec consistant en sel basique. Les sels,que l'on peut former comprennent les sels de sodium, ds potassium et de calciumu D'autres: sels, y compris ceux avec des bases organiques comme les monoas:!-5 nés primaires secondaires et tertiaires, ainsi que les polyamines peuvent également être formés en utilisant les procédés décrits ei-dessus ou d'autres procédés couramment utilisés» D'autres sels intéressants sont obtenus avec des bases thérapeutiqueœent aotlïo qui confèrent des propriétés thérapeutiques supplémentaire s 0 D? 10 telles bases sont, par exemple, les bases de purine oorame la tiréc. phylline, la théo'oromine, la caféin® ou dérivés de ces bases c!-b purine % les bases antiliistaminiques qui sont susceptibles de for mer des sels avec des acides faibles ; des composés de la pyridin comité l'amide de l'acide nieotinique, 1 'hydrazide de l'acide iso-15 nieotinique, etc. ; les phénylalkyl aminés comme 1'adrénalines 1* phédriïia , etc. % la choline, etc. Les sels de l'alpha-methyldé-thiobiotine et de l'alpîm-iaéthylbiotine peuvent être utilisés pou les mêmes besoins biologiques que l'acide libre. L' alpha-méthyldéthiobiotine et l'alpha-méthylbiotine or»t us 20 spectre antibactérien tel que donné par les tableaux ei-apr-%so L® spectre antibactérien est déterminé par un essai normalisé de éif fusion dans la gélose au disque de papier de 13 mm de dimension. Les mieroorganismes sont cultivés dans les milieux suivante 25 B. subtilis i Streptomycine gélose (BEL) 3. lutea % Gélose d1ensemencement (BBL) E, coli : Gélose nutritive (BBL) H® aureus i Gélose nutritive (BBL) H® avium ; Infusion gélose cervelle-coeur (Difco) 30 Les milieux synthétiques ont la composition suivante ÎIa2HP04.7H20 kh2p°4 (ke4)2so4 MgS04 Glucose Gélose subtilis Se coli 1,5 g 2,2 g 4,3 g 1,0 g 1,0 g 1,0 g 0,1 g 0,1 g 2,0 g 2,0 g 15,0 g 15,0 g BAD ORIGINAt 70 18127 7 2051547 Eau distillée _ 1 litre 1 litre Solution-mère d'ions métalliques 1 ml pH final 6,2 6,7 5 (a) Solution-mère d'ions métalliques Composé Concentration HaMoO^^H^O 200 p.g/ml 0cCl2 100 M-g/ml CuS04 100 M-g/ml 10 MnSO^ 2 mg/ml CaCl2 25 mg/ml 5!eCl2.4H20 5 mg/ml ZnCl2* 5 mg/ml 15 *ZnCl2 doit être dissous séparément en utilisant une goutte de HC1 0,1 îl pour 10 ml d'eau. La solution-mère est chauffée pour amener tous les composés en solution ; elle est maintenue pendant 24 heures et filtrée dans des conditions stériles» 20 Activité antibactérienne de -1*alpha-méthyldéthiobiotine Dimension de la zone (en mm) à Organisme d'essai une concentration de 1 mg/ml. Bacillus subtilis 0 Bacillus subtilis (milieu synthétique) 67 Sarcina lutea 0 Escherichia coli 18 (contour flou) Escherichia coli (milieu synthétique) 22 Staphyloc occus aureus 0 Mycobacterium avium 33 30 L'alpha-méthyldéthiobiotine ne présente pas une zone d'inhibition vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus dans l'essai ci-dessus à une concentration de 1 mg/ml. A une concentration de 5 mg/ml, dans 35 l'essai ci-dessus, 11alpha-méthyldéthiobiotine donne une zone de 25mm d'inhibition vis-à-vis de S. pastorianus. A titre de comparaison, la lydimycine antibiotique présente une zone d'inhibition vis-à-vis de S. pastorianus à une concentration d'environ 5 à 10 pg/ml» BAD CRiGiNAL 70 18127 8 2051547 Activité bactéricide de --l'alpha-méthylbiotine Organisme d'essai Dimension de la zone (en mm) à une concentration de 686 {ig/ml Bacillus cereus 24 ïx —-— Bacillus subtilis (cultivé dans de la gelose nutritive) 17 Bacillus subtilis (cultivé dans de la gélose synthétique) 70 Mycobacterium avium 46 10 Myc obacterium phlei . 35 l'alpha-méthylbiotine ne présente pas de sone d1 inhibition vis-à-vis de Sac char omyce s pastorianus dans l'essai ci-dessus à une concentration de 686 pg/ml* . 15 L'alpha-méthyldéthiobiotine présente une activité antifongique comme le montre le tableau ci-après, le spectre antifongique est déterminé par un essai de dilution sur plaque avec de la gélose. 20 25 Activité antifongique de l'alpha-méthyldéthiobiotine Organisme d'essai Concentration inhibitrice minimale en ng/ml Hocardia asteroides 500 Blastomyces dermatitidis 500 Phialophora verrueosa 500 les nouveaux composés de l'invention, à savoir 1'alpha-méthyl-déthiobiotine et 1'alpha-méthylbiotine, peuvent être utilisés dans le cas des volailles et des lapins pour lutter contre le microorganisme Mycobacterium avium qui est connu pour provoquer la tubercu • 30 lose généralisée chez ces animaux. Ils peuvent également être utilisés pour le stockage des produits du pétrole pour lutter contre le microorganisme Bacillus subtilis qui est^producteur connu de boue et la cause de la corrosion dans le stockage des produits pétroliers. 1'alpha-méthyldéthiobiotine peut également être utilisés 35 pour inhiber le microorganisme Escherichia coli qui est un producteur connu d'odeurs et une source possible de gêne dans les piles de pâte à papier. BAD ORIGINAL 70 18127 9 2051547 Les esters nouveaux de phénylacyle de 1'alpha-méthyldéthiobiotine et de 1' alpha-méthylbiotine sont actifs contre Mycobacterium avium. et Bacillus subtilis. Ainsi, ces composés peuvent être utilisés pour inhiber ces microorganismes. En outre, les esters de 5 1'alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine conviennent dans un procédé de purification, tel que décrit ici, pour séparer 1'alpha-méthyldéthiobiotine et l1alpha-méthylbiotine de la lydimycine. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif du pro-10 cédé et.des produits de l'invention sans pour cela qu'ils soient limitatifs. Tous les pourcentages sont donnés en poids et toutes les proportions des mélanges solvants sont données en volume sauf indication contraire. Exemple 1 - alpha-méthyldéthiobiotine 15 Partie A. Fermentation On utilise un lot de Streptomyces lydicus. KREL 3432, pour inoculer une série de ballons Erlenmeyer de 1 litre contenant chacun 250 ml d'un milieu stérile comprenant les ingrédients suivants : 20 Monohydrate de glucose 25 g/litre "Pharmamedia,, * . 25 g/litre Eau du robinet q.s. 1 litre *"Pharmamedia"est une qualité industrielle de farine de graines de coton vendue par Traders Oil Mill 25 Company, Fort Worth, Texas. On cultive cet inoculum pendant 45 à 50 heures à 28°C sur un agitateur animé d'un mouvement alternatif. L'inoculum décrit ci-dessus est utilisé pour inoculer un bac 30 de 3 800 litres contenant 1 250 litres du milieu stérile suivant : Monohydrate de glucose 25 g/litre "Pharmamedia" 25 g/litre Eau du robinet q.s. 1 litre 35 "Ucon"LB-625* 0,4 ml/litre Le pH est ajusté à 7,2 au moyen d'hydroxyde d'ammonium à 50 % avant la stérilisation. *"Ucon" LB-625 est un agent anti-mousse vendu par la Société Union Carbide Corporation. 70 18127 10 2051547 On maintient le bac à une température de 28°C pendant 45 à 50 heures avec un taux d'aération de 1400 litres par minute et agitation à la vitesse de 150 tours/minute. L'inoculum décrit ci-dessus est utilisé pour inoculer un mi-5 lieu de fermentation de 56 700 litres contenant 50 000 litres du milieu de fermentation stérile suivant : Monohydrate•de glucose 10 g/litre Dextrine 50 g/litre Levure de Pabst* 10 g/litre 10 Farine de graines de coton 10 g/litre "UconHLB-625 0,2 ml/litre Eau du robinet q.s. 1 litre *Levure de bière de la Pabst Brewing Company. On ajuste le pH du milieu à 7,2 au moyen d'hydroxyde de so-15 dium à 50 % avant stérilisât ion J 20 Partie B. Récupération (1) La totalité du bouillon (46 200 litres) provenant d'une fermentation telle que décrite ci-dessus, est filtrée à pH 4 en se servant de terre de diatomée. On fait adsorber le bouillon limpide sur 545 kg de charbon dégazé (Pittsburgh Chemicals CAL Carbon) et 25 on élue au moyen de 9 000 litres d'acétone à 80 ?£ ; on recueille des fractions de 600 litres. Par des-touches, les fractions sont estimées vis-à-vis de microorganismes Saccharomyces pastorianus pour déterminer les fractions actives. Les fractions actives (7 800 litres) sont débarrassés de l'acétone et adsorbées sur 90 kg 30 de charbon dégasé "CAL". On lave le charbon à l'eau puis on l'élue graduellement au moyen de 3 200 litres d'acétone de 50 % à 100 Les premiers 420 litres sont concentrés jusqu'à 100 litres et ad-sorbés sur 10 kg de charbon dégazé "CAL" puis ils sont graduellement élués au moyen de 260 litres d'acétone de 50 fo a 100 fo, Les 7Q 18127 n 2Ô51547 premiers 40 litres sont concentrés jusqu'à 4?5 litres d'une solution visqueuse contenant 3 104 grammes de solides titrant 1 bio-unité/mg vis-à-vis de S» pastorianus. (Une bio>-unité est définie comme étant la concentration de l'antibiotique donnant une zone 5 de 20 mm d'inhibition sous les conditions normalisées de 1'essaie Ainsi, si par exemple un milieu de fermentation doit être dilué à 1/100 pour donner la zone de 20 mm d'inhibition,, l'activité de ce bouillon est de 100 BU par ml). les 20 litres suivants sont concentrés jusqu'à 4 litres de solution contenant 548 grammes de so-10 lides titrant3 bio-unités/mg vis-à-vis de S„ pastorianus. Ces deux concentrés sont stockés au réfrigérateur après quoi un solide se sépare de. chaque concentré, le premier concentré le plus visqueux est dilué au moyen de 3 volumes d'eau, refroidi pendant 16 heures et filtré. Le solide recueilli est lavé à l'eau et séché ; le ren-15 dement, à savoir 10,96 grammes de solide- brut, est riche en alpha-méthyldéthiobiotine, La présence de 1'alpha-méthyldéthiobiotine est révélée par chromatographie sur papier avec le système Sarma n° 1 décrit ci-dessus. Le second concentré décrit ci-dessus représente 15,25 grammes d'un'solide riche en alpha-méthyldéthiobiotine. 20 (2) On peut également récupérer 1'alpha-méthyldéthiobiotine du bouillon de fermentation décrit dans la Partie A, par le procédé de récupération suivant : la totalité du bouillon de fermentation est filtrée à un pH d'environ 4,0 avec l'aide d'une terre de diatomée. Le bouillon limpide est adsorbé sur un volume de charbon 25 dégazé "CAL" représentant 20 % du volume du bouillon, dans une colonne de chromatographie. On lave la colonne au moyen d'un volume d'eau déionisée égal au volume du bouillon puis au moyen de 3 volumes chacun de méthanol à 25 $ dans l'eau, 50 fo de méthanol et de méthanol. On élue 11alpha-méthyldéthiobiotine de la colonne, avec 30 la lydimycine qui peut être présentes au moyen de 20 fois le volume as la colomie de triéthylamine à 5 f° dans le méthanol. On analyse les fractions de l'éluat par chromatographie sur papier en utilisant le système Sarma n° 1. Partie C. Purification 35 On dissout dans 50 ml de la phase supérieure obtenue par mélange de butanol, de méthanol, de benzène et d'eau (2:1:1:1), une portion des solides bruts contenant 1'alpha-méthyldéthiobiotine" (6,3 g) obtenue comme décrit dans la Partie B ci-dessus et on fait adsorber sur une colonne préparée par mise en'suspension de BAD CRÎGINAL 70 18127 12 2051547 600 grammes de gel de silice (n° 7734 E. Merck'AS. I)armstadt), dans le même milieu solvant. On élue 'la colonne au moyen du même mélange solvant et on recueille des fractions de 20 ml. les fractions contenant 1?alpha-méthyldéthiobiotine sont décelées en plongeant 5 des disques de papier dans chaque fraction, en séchant les disques dans une hotte"pendant 2 heures, et en les appliquant sur une plaças de Bacillus subtilis (milieu synthétique); L'activité contre Bacillus subtilis indique la présence d'alpha-méthyIdéthiobiotine a Les fractions contenant 1'alpha-méthyldéthiobiotine, telles que 10 déterminées par lfessai au Bacillus subtilis ei-dessus, sont évaporées sous pression réduite, Le rendement est de 5,71 grammes de résidu. On triture ce résidu avec de l'eau à pH 2,5 ; le rendement est de 4,54 grammes d®alpha-méthyldéthiobiotine cristalline présentant un point de fusion de 160-161°C. On dissout les cristaux 15 d'alpha-méthyldéthiobiotine dans de l'acétone au reflux et on clarifie la solution avec une terre de diatomée. On concentre le filtrat ; le rendement est de 3,37 grammes d1 alpha-méthyldéthiobiotine sous forme cristalline fondant entre 161 et 162°G. Après recristallisation de ces cristaux dans l'acétone, on obtient 3,17 gram-20 mes d! alpha-méthyldéthiobiotine cristalline présentant un point de-fusion de 161,5-162,5°C. Suivant une variante du procédé de purification de 1'alpha-méthyldéthiobiotine à partir des solides obtenus dans la Partie B ei-dessus, on procède de la façon suivante : on prépare le solide 25 brut tel que décrit dans la Partie B (10,96 grammes) et on le dissout dans 50 ml de NH^OH 1 N puis on filtre avec une terre de diatomée. On acidifie le filtrat avec de l'acide chlorhydrique jusqu'à un pH d'environ 2,0 et il se forme des cristaux d'alpha-méthyldéthiobiotine ; le rendement est de 9,34 grammes d'alpha-méthyldé-30 thiobiotine cristalline présentant un point de fusion de 160,5- 161,5°C. On fait recristalliser ces cristaux d'alpha-méthyldéthiobiotine dans l'acétone puis dans 1"isopropanol ; le rendement est de 7,30 grammes d'alpha-méthyldéthiobiotine .cristalline ayant ua point de fusion de 161-162°00 35 Exemple 2» Les fractions d'éluat contenant 1'aJLpha-méthyldéthiobiotin© obtenues comme décrit à la Partie B (2) sont évaporées jusqu'à sic= cité et dissoutes dans un volume minimum d'eau, nécessaire pour la mise en dissolution. On ajuste le pH de la solution à 2,0 avec de BAD ORIGINAL 70 18127 13 2051547 l'acide sulfurique et on refroidit pendant environ 4 jours. On recueille le solide résultant, on le lave à l'eau froide et on le sèche. On dissout ce solide dans le diméthylformamide (19 ml/g) et la triéthylamine (1,2 ml/g), et on traite avec un poids égal de 5 bromure de phénacyle à la température ambiante pendant environ 1 plus a 2 heures. (Cette réaction peut être effectuée à 0°C pendant/longtemps ou à des températures supérieures allant jusqu'à 60°C pendant une durée plus courte. Au moins un équivalent ou un léger excès de bromure de phénacyle peut être utilisé. Un équivalent de triéthyl-10 aminé ou un excès peut être également utilisé). On verse la solution résultante dans 20 volumes d'eau refroidie à la glace et on recueille le solide résultant, on le lave à l'eau et le sèche. On dissout ce solide dans du chloroforme et on chromatographie sur gel de silice (100 g/g j E. Merck Ag. Darmstadt n° 7734). L'élu-15 tion de la colonne de gel de silice avec- du méthanol à 5 i° dans le chloroforme donne l'ester de phénacyle de 1'alpha-méthyldéthiobiotine d'abord puis l'ester de phénacyle de la lydimycine. Après recristallisation dans l'acétone, l'ester de phénacyle de l'a3pha— méthyldéthiobiotine fondant entre 128 et 129°C est hydrolysé de la 20 manière suivante : on ajoute 10 ml de UaOH 11 à une solution de 1,26 gramme d'ester de phénacyle d'alpha-méthyldéthiobiotine dans 200 ml d1isopropanol au reflux. Au bout de 10 minutes de reflux, on verse la solution et on l'évaporé jusqu'à l'obtention d'un résidu. On dissout celui-ci dans l'eau, on clarifie à la terre de 25 diatomée puis on acidifie jusqu'à un pH d'environ 2,0.avec de l'acide chlorhydrique. On recueille le solide formé, on le lave à l'eau froide, on le sèche et oh le- fait recristalliser dans l'acétone ; le rendement est de 0,63 gramme de cristaux d'alpha-méthyldéthiobiotine ayant un point de fusion de 160,5-162°C. (L'hydroly-30 se du groupe ester peut également être effectuée à la température ambiante par agitation d'une solution d'ester de phénacyle de 1'alpha-méthyldéthiobiotine dans le tétrahydrofuranne avec ÎfaOH 1 ÎT pendant environ 4 jours). Exemple 3. 35 En substituant le N-chlorométhylphtalimide au bromure de phénacyle dans l'exemple 2, on obtient l'ester de phtalimidométhy-le de 1'alpha-méthyldéthiobiotine. Cet ester est facilement scindé à la température ambiante avec de l'acide chlorhydrique anhydre dans l'acétate d'éthyle ou le dioxane, avec l'acidë bromhydrique 70 18127 H 2051547 dans lraeide acétique ou avec l'hydrate d'hydrazine dans 1 ' étha:aols pour donner 1'alpha-méthyldéthiobiotine. Suivant une variante, l'ester butylique tertiaire de 1'alpha-méthyldéthiobiotine peut être préparé par réaction de son chlorure 5 d'acide avec de l'alcool butylique tertiaire et de la triéthylamine à O0C. l'ester butylique tertiaire peut être facilement scindé à la température ambiante par de l'acide chlorhydrique dans le di-oxane ou avec de l'acide sulfurique, pour donner 1'alpha-méthyldéthiobiotine. 10 Exemple 4 - Lydimycine„ alpha-méthylbiotine et alpha-méthyldéthiobiotine. : La totalité du bouillon (46 200 litres) provenant d'une fermentation comme décrit à l'exemple 1, Partie A, est ajustée à pH 4,0 avec de l'acide sulfurique et on filtre sur terre de diatomse. 15 On lave le gâteau du filtre au moyen d'une quantité d'eau représentant 0,1 volume "de bouillon et on jette le gâteau. On fait a&-sor'ber le bouillon limpide sur 545 kg de carbone dégazé (Pittsburgh Chemical CAL Carbon) et on élue au moyen de 9 000 litres d'acétone à 80 fo ; on recueille des fractions de 600 litres. Les fractions 20 sont estimées à la touche vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus pour déterminer les fractions actives. Les fractions actives (7 800 litres) sont débarrassées de l'acétone et adsorbées sur 90 kg de charbon dégazé CAL. On lave le charbon à l'eau puis on l'élue graduellement au moyen de 3 200 ii-25 très d'acétone de 50 % à 100 fo. Les premiers 420 litres sont traités pour 1'alpha-méthyldéthiobiotine comme décrit à l'exemple 1, Partie B. Les éluats suivants sont réunis et concentrés jusqu'à une solution aqueuse que l'on sèche par congélation pour donner 8 712 grammes de résidu (3,3 Bu/mg vis-à-vis de S. pastorianus). On dis-30 sout ce résidu dans 5 litres de la phase inférieure d'un mélange d'acétate d'éthyle, de cyclohexane, d'un tampon pH 3 (Handbook of Chemistry and Physics, 22ème Edition, Chemical Rubber Publishing CO., p. 960) dans les proportions de 16:4:1 et on homogénéise avec 10 kg de "Dicalite 4 200" (une terre de diatomée vendue par la So~ 35 ciété ffreat Lakes Carbon Corp. New York, N.Y.) et la phase supérieure. On met le mélange à la partie supérieure d'une colonne contenant 52 kg de"Dicalite 4200"que l'on a mis en suspension dans la phase supérieure avec 20,8 litres de phase inférieure et on élue la colonne avec 1600 litres de phase supérieure. La concentration 70.18127 15 2051547 10 des fractions actives (essai au S. pastorianus) jusqu'à l'obtention d'une solution aqueuse et le refroidissement donnent 15,9 grammes de lydimycine impure titrant 2000-2260 Bu/mg vis-à-vis de S. •pastorianus. et 8,3 grammes de lydimycine moins pure titrant 555 Bu/mg. La rechromatographie de la liqueur-mère résiduelle avec le même système solvant donne une quantité supplémentaire de 7,3 grammes de lydimycine titrant 2000 Bu/mg vis-à-vis de S. pastorianus. L'analyse sur bande de papier (système Sarma 1) de ces solides montre deux zones principales de dimensions sensiblement égales. Ces solides sont extraits au moyen d'un excès de ÏÏH^OH 1 îf. Après clarification à la terre de diatomée, on acidifie l'extrait à un pH d'environ 2,0 avec de l'acide chlorhydrique. Le rendement est de 24,3 grammes de lydimycine qui présente deux zones principales d'activité sur le Système Sarma 1. Ces 24,3 grammes de lydimy-15 cine brute sont dissous dans une solution de 490 ml de diméthylfor-mamide et de 29,2 ml de triéthylamine. Après addition de 22,08 grammes de bromure de phénacyle, on agite la solution à la température ambiante pendant 1,5 heure. On verse alors le mélange réactionnel dans 9,8 litres d'eau glacée. On recueille le solide résultant, on 20 le lave à l'eau puis au Skellysolve B (hexanes isomères) et on sèche ; le rendement est de 25,53 grammes d'ester brut de phénacyle de lydimycine» L'analyse sur bande de papier de cette substance en utilisant une feuille saturée de mélange 1:1 méthanol:propylène-glycol et séchée à 37°C pendant 10-minutes puis développée au to-25 luène saturé de propylène-glycol, montre deux zones d'activité vis-à-vis de B. subtilis cultivé sur gélose synthétique. Ces zones montrent la présence de l'ester phénaeyle de lydimycine et de l'ester de phénacyle d'alpha-méthylbiotine« L'ester brut de phénacyle de lydimycine est recristallisé à 30 trois reprises dans 1'éthanol et à trois reprises dans un mélange de chlorure de méthylène et de toluène (cette substance est dissoute dans du chlorure de méthylène au reflux et on déplace le chlorure de méthylène par du toluène), ce qui donne 19,54 grammes de cristaux purs d'ester de -phénacyle de lydimycine. L'ester de phénacyle 35 est séparé de l'ester de phénacyle de lydimycine insoluble dans le toluène par le procédé suivant : Une solution de 1800 grammes de l'ester de phénacyle dans 1 litre de tétrahydrofuranne est agitée sous atmosphère d'azote avec 10 ml d'hydroxyde de sodium 1 N pendant 24 heures à la température ambiante. On recueille le solide 70 18127 16 20515kl qui se sépare, on le lave à l'acétone et le dissout dans lfeau (environ 100 ml). On filtre la solution aqueuse et l'acidifie, ce qui donne î029 grammes (85 %) de lydimycine (16 000 Bu/mg vis-à-vis de S„ pastorianus. fondant entre 251,5 et 252°C)„ 5 les résidus de la liqueur-mère provenant des recristallisa tions décrites ci-dessus, sont extraits au toluène saturé de prc-pylène-glycol et l'extrait (1,41 gramme) est soumis à la chromatographie de partage préparée de la façon suivante s on agite du toluène (5 litres) et du propylène-glyc ol (600 al) et on sépare les 10 couches. On met en suspension de la terre de diatomée (1200 grammes) dans la phase supérieure^ on agite pendant 30 minutes avec 400 ml de la phase inférieure puis on verse sur une colonne de chromatographie. l'extrait décrit ci-deasus est admis dans la colonne que 1'on élue ensuite avec 15 litres de phase supérieure tout en recueil=> 15 lant des fractions de 50 ml. les fractions actives sont déterminées en utilisant des disques de papier saturés de la fraction à essayer vis-à-vis de B. subtilis (culture sur gélose synthétique) puis analysées par chromatographie sur papier comme décrit ei-dessus et pare chromatograbhie sur couche mince (5 f> méthanol dans chloroforme sur détection aux 20 gel de silice et/U.Y.}» la fraction 210 montre une zone de B. subtilis se déplaçant avec 1'alpha-méthylbiotine plus large que la zone se déplaçant avec 1'alpha-méthyldéthiobiotine mais l'analyse U.V. montre que 1*alpha-méthyldéthiobiotine est le constituant principal (l!alpha-méthyldéthiobiotine est moins polaire que 1'alpha-Ec-2 5 thylb iot ine). 1'évaporation des fractions 210 à 258 laissent 70 mg de résidu que l'on chromatographie sur-30 grammes de gel de silice (Merck -Darmstadt n° 7734). On élue la colonne avec de 1'éthanol à 3 f> dans le chloroforme et on recueille des fractions de 20 ml que 30 l'on estime vis-à-vis de B. subtilis cultivé sur gélose synthétique comme décrit ci-dessus, là encore, on analyse les fractions actives par chromatographie sur bande de papier en utilisant le microorganisme B. subtilis (milieu synthétique) et la chromatographie en couche mince comme décrit ci-dessus, les fractions 24 à 32 consis-35 tent en ester de phénacyle d!alpha-rnéthylbiotine essentiellement pur c On traite une solution d'ester de phénacyle d'alpha-méthyl~ biotine (3 ffig ) dans le méthanol (3 ml) avec 0,02 ml de JTaOH 1 3Ï sous une atmosphère d'asote. On maintient la solution à la te m» BÀD ORIGINAL 70 18127 17 2051547 pérature ambiante pendant 30 minutes puis on la chauffe à 50°C pendant 40 minutes. On évapore le. méthanol et on dissout le résidu dans 3 ml d'eau et un chromatogramme sur papier du filtrat (Système Sarma 1) montre la présence d'alpha-méthylbiotine. 5 Oaractérisation de 1'alpha-méthyldéthiobiotine Cristaux : blancs Titration : pEa' 4,65 ; pds.éq. 233 Analyse élémentaire : Calculé pour C^ : 10 C, 57,87 ; H, 8,83 ; H, 12,27 Trouvé : C, 58,02 ; H, 8,70 ; N, 12,41 c, 57,99 ; H, 8,78 ; N, 12,18 Poids moléculaire : Calculé : 228,1474 15 Déterminé : 228,1472 (spectromètre de masse de haut pouvoir de résolution) Pouvoir rotatoire optique : = -2° (c, 0,98 dans 95 % EtOH) Solubilité : l'alpha-méthyldéthiobiotine èst très soluble dans le méthanol, l'éthanol, IfH^OH aqueux et les bases aqueu-20 ses ; elle, est soluble dans 1'isopropanol et l'acé tone ; elle est relativement insoluble dans le Skelly-solve B (hexanes isomères), le cyclohexane, l'acétate d'éthyle, le chlorure de méthylène, et le benzène. 25 L'alpha-méthylbiotine est caractérisée avantageusement sous la forme de son ester de phénacyle . la spectroscopie de masse de l'ester de phénacyle de 1'alpha-méfhylbiotine montre une masse mesurée de 376,1456. La théorie donne 376s1456 pour C.|gH^^O^S. La spectroscopie de masse de l'ester de phénacyle de 1'alpha-méthyl-30 biotine montre également un pic à 257,0949. Ceci correspond à la théorie qui est 257,0959 pour 1 ' alpha-méthylbiotine (C^H^^O^S). La dispersion optique rotatoire (OED) et le spectre de résonance magnétique du noyau montre que le groupe méthyle dans 1'alpha-méthylbiotine est en alpha par rapport au groupe carboxylique. 35 70 18127 18 2051547 10 KBVEHDICATIONS 1. Composé nouveau,caractérisé par le fait que c'est l'alpha-méthylbiotine et ses sels avec des métaux alcalins, des métaux alcalino-terreux et des aminés, qu'il est essentiellement exempt de lydimycine et qu'il répond à la formule suivante ; Hf N> . ;!« S HO—C CH—(CHa)4— «H X1 il 0 2„ Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est sous une forme cristalline essentiellement pure. 15 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il, est sous la forme de ses esters de t-butyle, de phta-limido-méthyle et de phénacyle. 4. Procédé de fabrication d'un nouveau composé, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver Streptomyces lydicus dans un 20 milieu nutritif aqueux sous des conditions aérobies jusqu'à ce que l'on obtienne, dans ce milieu, une activité appréciable contre Sac char omyc e s -pastorianus et à isoler 1'alpha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine provenant du milieu. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait 25 qu'il consiste à cultiver- Streptongrces lydicus NERL 3432 dans un milieu nutritif aqueux renfermant une source d'hydrate de carbone assimilable et une source d'azote assimilable sous des conditions aérobies jusqu'à ce que l'on obtienne, dans ce milieu, une activité appréciable contre Saccharomyces pastorianus et à isoler l'al- 30 pha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine provenant du milieu. 6. Procédé pour isoler 1'alpha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine, selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on convertit 1'alpha-méthylbiotine, présente dans une 35 substance brute, en un ester tel que l'ester de t-butyle, de phta- limido méthyle ou de phénacyle, que l'on soumet J.'ester d ' alpha - qu'on elue 1'adsorbant methylbiotine a une adsorption sur un adsorBant surf actif ,/et qu'on recueille des fractions ne contenant que l'ester de l'alpha-méthyl— 70 18127 2051547 biotine et qu'enfin on hydrolyse cet ester pour obtenir l1 alpha-méthylbiotine elle-même. 7. Procédé pour isoler 1'alpha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine selon la revendication 65 caractérisé par le 5 fait que l'on soumet l'ester d!alpha-méthylbiotine à une adsorption sur une colonne de chromatographie au. gel de silice, qu'on élue la colonne au moyen d'un système solvant consistant en un solvant dans lequel est soluble 1'al pha-méthyIbiotine et en un alcool ou alca-nol inférieur, qu'on récupère des fractions ne contenant que l'es-10 ter d'alpha-méthylbiotine et qu'on hydrolyse ce dernier pour obtenir 1'alpha-méthylbiotine elle-même. 8. Procédé pour isoler 1'alpha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine, selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'on soumet l'ester de phénacyle de 1'alpha-méthylbiotine 15 à une adsorption sur une colonne de chromatographie au gel de silice,- qu'on élue la colonne au moyen d'un système solvant consistant en 5 % de méthanol et en chloroforme, qu'on récupère des fractions ne contenant que l'ester de phénacyle de 1'alpha-méthylbiotine et qu'on hydrolyse ce dernier pour obtenir 1'alpha-méthylbiotine 20 elle-même. 9. Procédé pour isoler 1'alpha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine, selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on filtre le bouillon de fermentation contenant l'ai-pha-méthylbiotine pour obtenir un bouillon limpide contenant l'al- 25 pha-méthylbiotine, qu'on fait adsorber ce bouillon limpide sur du charbon actif, qu'on élue ce dernier au moyen d'acétone pour obtenir des éluats acétoniques, qu'on récupère une substance brute contenant 1'alpha-méthylbiotine et provenant de ces éluats acétoniques, qu' on soumet cette substance brute à une chromatographie sur gel de 30 silice en utilisant un système solvant butanol: méthanol:benzène :eau (2:1:1:1) pour obtenir des éluats de cette colonne de gel de silice et qu'on récupère de ces éluats 1'alpha-méthylbiotine sensiblement exempte de lydimycine» 10. Procédé de résolution d'un mélange contenant de la lydi-35 mycine, de 1!alpha-méthyldéthiobiotine et de 1'alpha-méthylbiotine, caractérisé par le fait qu'il consiste : - à convertir ce mélange sous forme d'esters de t-butyle, de phtalimidomathy^-e - ou-de phénacyle, pour former un ester du mélange ; 70 18127 20 2051547 - à recristalliser ce mélange d'esters dans un solvant choisi parmi 1'éthanol, un mélange acétone-éthanol, un mélange chlorure de méthylène-éthanol et uç., mélange chlorure de méthylène s ensîblement exempt et toluène pour séparer l'ester de lydimycine/des esters d'alpha- 5 méthyldéthiobiotine et d'alpha-méthylbiotine qui restent dans la liqueur-mère, - à concentrer cette liqueur-mère jusqu'à l'obtention d'un résidu, - à extraire ce résidu au toluène saturé de propylène-glycol 10 pour obtenir un extrait contenant l'ester d'alpha-méthyldéthiobio- tine et l'ester d'alpha-méthylbiotine, - à soumettre cet extrait à une chromatographie de partage pour obtenir des fractions ne contenant que les esters d'alpha-méthyldéthiobiotine et d'alpha-méthylbiotine, 15 - a soumettre ces fractions à une chromatographie sur gel de silice pour obtenir des fractions contenant l'ester d'alpha-méthyl-déthiobiotine sensiblement exempt d'ester d'alpha-méthylbiotine et l'ester d'alpha-méthylbiotine sensiblement exempt d'ester d'alpha-méthyldéthiobiotine, et 20 - à hydrolyser l'ester d'alpha-méthylbiotine et l'ester d'al pha-méthyldéthiobiotine pour obtenir respectivement, distinctes l'une de l'autre, 1'alpha-méthylbiotine et 1'alpha-méthyldéthiobiotine . 25