Brevet FR2030350A1 — publié le 19701113

La présente invention concerne un procédé pour introduire une fonction oxygénée dans la position 3 de 3-désoxy-C19-stéroïdes, en particulier de ceux dont le noyau A n'est pas saturé. La synthèse totale des hormones et médicaments stéroïdes a pris de plus en plus d'importance au cours des dernières arnées. Au début ou à la fin de cette synthèse, il est généralement nécessaire d'introduire dans la position 3 du stéroïde un groupe hydroxy ou un groupe oxo. Cette fonction oxygénée en position 3, que possèdent également le plupart des hormones stéroïdes existant naturellement et de nombreux médicaments stéroïdes, tels que des anabolisants, assure entre autres l'efficacité et la diffusion de ces composés dans l'organisme. On sait déjà introduire cette fonction oxygénée par voie microbienne dans le noyau saturé A de 3-désoxystéroïdes. C'est ainsi qu'au moyen de Calonectria decara, on a transformé la #5- androstène-7-one en #5-androstène-3ss, 12ss-diol-7-one (1). Un autre composé à noyau A saturé, le #8,24-lapostadiène, a été hydrolysé en position 3 par de l'extrait de levure exempt de parois cellulaires et a été ainsi transformé en lanostérol. Toutefois, on n'est pas encore parvenu à effectuer l'oxydation de composés non saturés dans le noyau A. De ce fait, la préparation par voie microbienne des composés biologiquement importants que sont les #4-3-cétostéroïdes était jusqu'à présent impossible. La problème posé par l'invention consiste à découvrir des micro-organismes appropriés pour l'introduction d'une fonction oxygénée dans le position 3 de 3-désoxy-C19-stéroïdes, en particulier de K-désoxystéroïdes non saturés dans la noyau A, et d'élaborer des conditions optimales pour la mise en oeuvre de ce procédé. On a constaté, suivant l'invention, que les cultures aérobies de souches de bactéries cultivées dans des conditions de croissance définies, de préférence des souches de Corybacterium spec. sont en mesure, dans des conditions appropriées, d'oxygéner en position 3 des 3-désoxy-C19-stéroïdes, en particulier ceux non saturés dans le noyau A. Ce résultat est obtenu suivant l'invention en dissolvant le stéroïde dans un solvant organique miscible à l'eau, par exemple dans de l'acétone, et en le traitement par ces cultures de bactéries. La fermentation est interrompue après 10 à 100 heures et, de préférence, ares 30 à 60 heures, le composé formé étant lors séparé et isolé de manière connue en soi. Dans le cas des # -3-désoxy-C19-stéroïdes, l'introduction d'une fonction oxygénée en position 3 est obtenue au moyen de Corynebacterium spec., cependant qu'intervient simultarément une isomérisation de la double liaison, de # en #4. On a par exemple, de cette manière, transformé la # -androsténe-17-one en #4 androstène-3,17-dione et la #3,5-androstadiène-17-one en #4,6- androstadiène-3,17-dione. Si l'on a affaire à une double liaison #4, on réalise l'introduction d'une fonction oxygénée en position 3 au moyen de Streptomyces spec. Par exemple, la transformation, suivant l'invention, de la #4-androstène-17-one conduit à le formation, dans la solution nutritive, de #4-androstène-3,17-dione. Le nrocédé suivant l'invention offre un nouveau moyen pour la préparation de 3-hydroxy ou de 3-oxo-C19-stéroïdes, en particulier de composés porteurs du groupe #4-3-céto, composés biologiquement importants. Le processus se déroule sans difficultés par ticulières en une seule etane et il est bien renroductible. L'ap- plication de ce procédé est particulièrement importante lorsque our la synthèse d'hormones ou de médicaments stéroïdes, l'introduction du groupe #4-3-céto par voie chimique se heurte à des difficultés ou n'est pas d'un assez bon rendement. L'invention est représentée, à titre non limitatif, aux exemples suivants: Exemple 1 Dans vingt ballons à fond plat de 300 cm , et garnis chacun de 50 cm d'une solution nutritive composée de 10 g de dextrose, de 10 g de pentone pour bouillons de culture, de 10 cm d'hydro lysat de caséine, de 2 g d'extrait de levure, de 6 g de NaC1 et du complément en eau potable pour un volume total de 1000 cm3, on inocule chaque fois le contenu d'un inoculateur en une suspension de spores d'une culture âgée de Il à 13 jours de Streptomzees spec. IMET 109 ensemencée à 280C sur gélose à la farine d'avoine. La poursuite de la culture est effectuée à 280C sur une table à secousses à excentrique. Après 48 heures, on ajoute au total, à cette culture, 100 mg de A4-androstène-17-one dissous dans 10 cm3 d'acétone et on continue d'agiter pendant encore 48 heures.On extrait ensuite plusieurs fois à éther toute la culture, on lave la solution éthérée avec NaOH In et avec de l'eau distillée, on sèche et on élimine ensuite l'éther par distillation. le résidu cristallin est purifié par chromatographie en couche mince sur gel de silice, tel que le produit vendu sous l'appellation commerciale "Kieselgel D" par Greiz à Dolau en R.D.A., avec addition d'un indicateur par fluorescence, dans un mélange 2:3 de benzène et d'éther comme liquide de garnissage. La zone réagissant positivement à l'irradiation UV est ensuite éluée avec un mélange 1:1 d'éther et de chloroforme. Après concentration de ltéluat, la h4-androstène-3,17- dione précipite à l'état cristallin. Exemple 2 Dans vingt ballons à fond plat de 500 cm3 - et garnis chacun de 50 cm3 d'une solution nutritive composée de 10 g de dextrose, de 10 g de peptone pour bouillons de culture, de 10 cm3 d'hydrolysat de caséine, de 2 g d'extrait de levure, de 6 g de NaCl et du complément en eau potable pour un volume total de 1000 cm3, on inocule chaque fois le contenu d'un inoculateur en une suspension de spores d'une culture âgée de 48 heures de Corynebacterium spec. SG 985 ayant été développée à 37 C sur gélose au bouillon de viande. La poursuite de la culture est effectuée à 37 C sur une table à secousses. Après 48 heures, on ajoute au total, à cette culture, 100 mg de 50 Exemple 3 Dans vingt ballons à fond plat de 500 cm et garnis chacun de 50 cm3 d'une solution nutritive composée de 10 g de dextrose, de 10 g de peptone pour bouillons de culture, de 10 cm3 d'hydro- lysat de caséine, de 2 g d'extrait de levure, d. 6 g de NaCl et du complément en eau potable pour un volume total de 1000 cm3, on inocule chaque fois le contenu d'un inoculateur en une suspension de spores d'une culture tgSe de 48 heures de Corynebacterium avec. SG 1093 ayant été développée à 280C sur gélose au bouillon de viande. La poursuite de la culture est effectuée à 28 C sur une table à secousses. Après 48 heures, on ajoute au total à cette culture 100 mg de a3'5-androstadiène-17-one dissous dans, au total, 10 cm3 d'un mélange 1 : 3 de chloroforme et d'acétone et on continue d'agiter pendant encore 144 à 192 heures. On extrait ensuite à plusieurs reprises l'ensemble de la culture avec de l'éther, on lave la solution éthérée avec NaOH n/10 et de l'eau distillée, on sèche et on concentre par évaporation. La purification de l'extrait brut est effectuée d'une manière analogue à celle de l'exemple 1, le produit isolé d'après sa réaction positive aux radiations UV étant la #4,6-androstadiène-3,17-dione. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour introduire par voie microbienne une fonction oxygénée dans la position 3 de 3-désoxy-C19-stéroïdes, de préférence de ceux dont le noyau A n'est pas saturé, caractérisé en ce qu'on dissout le stéroïde dans un solvant orqanique miscible à l'eau, par exemple sans ne ltPctone, er ce qu'on traite nr des culture aérobies de souches de bactéries cultivées dans des conditions de croissance définies, souches constituées de préférence nor Corynebacterium snec. et Streptomyces spec., en ce qu'on interrompt la fermentation après 10 à 100 heures et, de préférence, 30 à 60 heures, et en ce qu'on sépare et isole de manière connue en soi le composé ainsi formé. 9 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite des # -3-désoxy-C19-stéroïdes avec des cultures de Corynebacterium spec. 3 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite des #4-3-désoxy-C19-stéroïdes avec des cultures de Streptomyces spec. 4 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite des #3,5-3-désoxy-C19-stéroïdes avec des cultures de Corynebacterium spec.