Brevet FR2038108A1 — publié le 19710108

La présente invention concerne un nouveau procédé destiné à empêcher les troubles de la digestion au niveau de la panse et l'intoxication alimentaire associée à ces troubles. L'invention a trait en particulier à un procédé destiné à prévenir 5 les syndromes associés à l'acidose chez des ruminants, en administrant à un ruminant une composition capable d'éliminer l'excès d'acide lactique produit par le bouleversement métabolique de la fonction digestive en vue de maintenir le ruminant dans un état normal. 10 Le changement brusque du régime d'un ruminant, par rempla cement du foin et des autres aliments consommés au pacage par une nourriture concentrée fortement énergétique distribuée lorsque les animaux sont transférés du pacage dans des parcs, provoque souvent des troubles aigus de la digestion, qui ont 15 pour conséquence des degrés variables d'inappétence prolongée, et parfois la mort. Lorsque le passage à l'absorption d'un concentré fortement énergétique s'effectue progressivement, 1'"adaptation" s'accomplit habituellement sans provoquer de maladie chez l'animal. Toutefois, 1'"adaptation" nécessite 3 à 4 semaines dans 20 le parc, et 6 à 10 semaines après le vêlage chez une vache dont la production laitière est élevée. La vache laitière a un besoin critique d'énergie pour satisfaire à la brusque demande de sécrétion de lait au moment du vêlage et pendant la période initiale de lactation, et une "adaptation" complète apparaît 25 bien après la période maximale de besoins en énergie. Lorsque les animaux sont parqués, la période d'"adaptation" est improductive et coûteuse. L'un des buts de la présente invention est donc d'éliminer cette période d'"adaptation". La physiologie de la digestion provoque des bouleversements 30 gastro-intestinaux sévères chez les ruminants, animaux dont l'estomac est à poches multiples, lorsqu'ils absorbent de grandes quantités de rations à forte teneur en grains ou en glucides. L'hydrolyse des polysaccharides se produit dans le rumen ou panse, et la digestion bactérienne ultérieure des monosaccharides 35 produit des acides gras volatils à chaîne courte . Les acides gras ( principalement l'acide propionique) doivent ensuite être transformés par métabolisme en glucose (gluconéogénèse) 70 11505 2 2038108 par le foie du ruminant. Chez les ruminants dont l'alimentation est normale, le métabolisme des acides .gras volatils s'effectue très rapidement, principalement dans le foie, mais à un certain degré dans les reins et dans les parois du rumen. Toutefois, chez 5 le ruminant qui peut absorber brusquement de grandes quantités de grain ou une ration à forte teneur en glucides, il se produit des modifications profondes de l'organisme qui, si elles ne sont pas contrôlées, peuvent provoquer des syndromes sérieux et avoir une issue mortelle. Parmi les réactions qu'un ruminant peut 10 manifester lorsqu'il absorbe des quantités excessives de grain , on mentionne une accumulation rapide d'acide lactique dans le rumen, une baisse du pH du contenu du rumen, une brusque élévation du taux de lactate dans la circulation sanguine et un abaissement du volume et du pH du sang, accompagnés d'une hémo-15 concentration . L'ingestion excessive de grain ou de glucose peut avoir une issue fatale chez des ruminants, en provoquant un abaissement du pH du contenu du rumen entre. 4 jet 5» ' en quelques heures, une destruction des protozoaires, des bactéries cellulo-lytiques et des organismes utilisant les lactates, et une proli-20 fération relativement importante d'organismes Gram-positife, notamment Streptococcus bovis , producteurs d'acide lactique. Un faible pH du contenu du rumen provoque une stase de cet organe, qui persiste pendant des heures,même après que le.pH a été ramené à une valeur normale. Des variations de pH du contenu 25 du rumen et des altérations de la microflore et de la microfaune, entraînant l'inconstance des produits qui résultent de ces variations, s'accompagnent d'une migration des tensions osmo-tiques dans l'organisme de l'animal, migration qui se produit lorsque de trop grandes quantités de grain se trouvent dans le 30 rumen. La formation excessive d'acide lactique et de son sel augmente fortement la quantité de corps dissous dans le liquide du rumen, ce qui provoque une élévation notable de la pression osmotique qui attire du fluide dans le rumen, ce qui entraîne une déshydratation. L'acide lactique est absorbé rapidement 35 et passivement dans le rumen, tandis que le lactate est absorbé lentement et à un faible degré seulement. Le pH acide du rumen favorise l'absorption de l'acide lactique libre . Les symptômes 70 11505 3 2038108 de la toxicité aiguë due à 1'acide lactique comprennent une ataxie, une hyperventilation, le coma et finalement la mort. Cet état indésirable d'acidose est dû en particulier a un excès d'acide D-lactique dans la circulation sanguine de l'animal, 5 bien que les deux formes D et L contribuent au syndrome, les isomères 1 et D de l'acide lactique sont tous deux produits dans le rumen. L'acide L-lactique est métabolisé plus rapidement que l'acide D-lactique ; l'absorption de l'isomère B conduit à une acidose plus sévère et de plus longue durée qu'une absorption 10 équivalente d'acide L-lactique. L'invention concerne principalement un procédé destiné à empêcher le bouleversement gastro-intestinal chez des ruminants dont le régime alimentaire est fortement énergétique. L'invention concerne également une composition à base d'une bacté-15 rie utilisant l'acide lactique, qui, lorsqu'elle est administrée à des ruminants,prévient ou soulage l'état d'acidose extrême du système digestif de l'animal. L'invention concerne aussi une espèce nouvelle de Butyri-bacterium, appelée Butyribacterium ruminantium. Elle concerne 20 de même une forme déshydratée de la nouvelle espèce de bactérie , qui est capable d'utiliser l'acide lactique. L'invention a également trait à une composition contenant Butyribacterium ruminantium sous une forme qui permet sa posologie orale, pour en faciliter l'administration et en réduire le 25 prix. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. La Demanderesse vient de découvrir, et ceci fait l'objet de la présente invention, que l'administration à un ruminant 30 d'une souche de Butyribacterium ruminantium utilisant l'acide lactique,soulage ou prévient le bouleversement gastro-intestinal et 1'acidose qui se rencontrent normalement lorsque l'animal passe d'un régime normal de pacage à un régime fortement énergétique . 35 Les bactéries qui offrent un intérêt aux fins de la pré sente invention consistent en une espèce nouvelle du genre Butyribacterium à laquelle on a donné le nom de Butyribacterium ruminantium KRBL B 3581 . 70 11505 4 2038108 La bactérie utilisant l'acide lactique, qui a été nommée Butyribacterium ruminantium , a été isolée du fluide obtenu à partir d'un concentré artificiel de rumen (système fermentatif "adapté" décrit ci-après). On fait passer l'échantillon de 5 fluide du rumen à travers une étamine et on le dilue en série. r —8 On distribue une quantité de 0,1 ml de la dilution à t x 10 , —Q —10 ' 1x10, 1x10 ., dans un volume de 5 ml de gelose additionnée de fluide de rumen et on prépare des tubes de fermentation. Après incubation pendant 6 jours à 39°C, on sélectionne des colo-10 nies individuelles et on les soumet à une croissance anaérobie dans le milieu additionné de fluide de rumen (décrit ci-après). L'organisme Butyribacterium ruminantium NRKL B 3581 représente l'une de ces colonies isolées. La culture est maintenue par transfert en série dans du bouillon au fluide de rumen une fois 15 par semaine, ou bien par lyophilisation. Le rumen artificiel utilisé pour isoler l'organisme utilisant l'acide lactique est un récipient de fermentation anaérobie continue (d'une capacité de 5 litres dans ce cas) équipé d'un agitateur et d'un trop-plein servant à maintenir un volume cons-20 tant. La charge initiale de fluide est un fluide de rumen provenant d'ovins ou de bovins. Elle est additionnée d'un courant continu de salive liquide artificielle et maintenue sur une substance alimentaire pour animaux , préparée industriellement (var exemple une ration fortement énergétique pour agneaux). On 25 soumet la substance alimentaire à la fermentation en procédant à des additions à des intervalles fréquents. La salive est fournie à un débit permettant de rétablir le volume du contenu de l'appareil de fermentation une fois par 24 heures. Le trop-plein du liquide et les gaz produits sont recueillis à des fins de me-30 sure et d'analyse. Le système entier est conçu pour assurer des conditions entièrement anaérobie s . Le pH du système peut être réglé par des additions d'acide ou de base alcaline. Lorsque les conditions physiques sont maintenues dans d'étroites limites, la fermentation reste stable pendant une période indéfinie. 35 Les produits de cette fermentation sont semblables et, dans de nombreux cas, identiques à ceux que l'on obtient in vivo au cours de la fermentation dans le rumen. Ce processus est appelé 70 11505 5 2038108 système fermentât if "adapté'-'. La salive artificielle est un mélange minéral qui équivaut .au mélange que l'on rencontre naturellement chez des ruminants domestiques. Sa composition est la suivante : 5 - NaHCOj- 11 g KC1 0,64 g NaCl 0,53 g CaClg.213^0 0,05 g MgS04.7H20 0,13 g 10 (EH4)2HK)4 3,92 g Ces sels sont dissous.dans de l'eau distillée , en ajustant le vo lvuae final à 1 litre. Le milieu utilisé pour la culture de B. ruminantium NEEL B 3581 est un milieu au fluide de rumen modifié pour créer des conditions favorables à un organisme utilisant l'acide lactique. Le milieu au fluide de -rumen présente la composition suivante Lactate de sodium 1 ,2 Trypticase 1,0$ Extrait de levure 0,2 fo 20 Substances minérales (concen- . . tration finale) E3Î2P°4 NaCl ... (NH4).2SO4' 25 • *2^4 . , CaCl2 ,MgS04.7H20 . Acides gras volatils (concentration finale) 15 1, 3 X 10"% 7, 6 X Ï0~% 3, 4 X 10~% 1, 7 X 10"% 4, 1 X 10"% 3, 8 X 10"% 30 35 Acide isobutyrique 0,01 io Acide DL-Y -méthylbutyrique "o,oi io ' Acide valérique 0,01 1o Acide isovalérique 0,01 f Bésazurine ■ 0,0001 Gystéine (base libre) 0,019 # Na2S.9H20 0,025 1° NàHCO, 0,02 % fluide clarifié de rumen * 40 % eau pour ajuster le volume final * Fluide naturel de rumen filtré sur étaurine et centrifugé pendant 15 minutes à 16.500 x g. 70 11505 6 2038108 La phase gazeuse consiste en 8$ % d'azote, 10 $ d'anhydride carbonique , 1 f° d'hydrogène et elle eçt débarrassée de l'oxygène par passage dans un. appareil de purification catalytique à l'hydrogène. 5 L'organisme Butyribacterium ruminantium NRRL B 3581 est ion bâtonnet ovoïde G-ram-positif à extrémités acuminées, existant en éléments isolés mais le plus souvent attachés paor paires et formant éventuellement de courtes chaînes de quatre cellules. Dans un milieu au fluide de rumen contenant de l'acide lactique 10 comme source de carbone, les dimensions qui prédominent sont de 0,9 x 1,2 micron. Ce microorganisme nouveau a été appelé • Butyribacterium ruminantium dans la collection de cultures des laboratoires Merck, Sharp & Dohme Research de Rahway, New Jersey. Une culture de ce microorganisme a été déposée dans 15 le service "ARS Culture Collection Investigations", ""Northern Utilization Research and Development Division", du Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, 61604, et ajoutée à sa collection de cultures permanentes sous la dénomination NRR1 B 3581 . 20 Conformément à 1'ouvrage"Bergey1s Manual of Determinative Bacteriology", 7ème édition, B. ruminantium est une espèce appartenant à la famille des Prou ionibact eriac eae , du genre Butyribacterium. Comme l'indique la"clé de détermination des genres de la famille des Pro'pionibacteriaceae" du "Bergey1 s 25 Manual1', B.ruminantium produit de l'acide butyrique à partir d'acide lactique. Par conséquent, la bactérie NRRL B 3581 n'est pas classée dans le genre Erouionibacterium". puisqu'elle ne produit pas d'acide propionique. la seule espèce appartenant au genre Butyribacterium dans le "Bergey's Manual", à savoir 30 B. rettgeri, est comparée à B.: ruminantium sur le tableau suivant ! 70 11505 7 2038108 Milieu de rumen A (Yoir exemple 2) Butyribacterium rettgeri, AÏCC.10825, diagnose donnée dans ,rIntem Bull. Bacteriol. Nomenclature Taxonomy"15r 69-80,1965 Butyribact erium ruminantium NRRL B 3581 5 Glucose Aesculine Arabinose Cellobiose Cellulose 10 Bextrine Fructose Galactose Inuline Lactose Maltose 15 Mannose Mélézitose Pectine 20 Raffinose Ehamnose Ribose Salieine Sorbose 25 Saccharose Amidon !Eréhalose Xylose 30 Dulcitol Glycérol Mannitol Sorbitol Production d'acide pas de croissance Production d'acide pas de croissance d° production d'acide d° d° pas de croissance d° production d'acide pas de croissance d° production d'acide pas de croissance d° production d'acide d° pas de croissance d° d° d° production d'acide pas de croissance production d'acide pas de croissance légère croissance pas de croissance d° d° d° dQ production d'acide et de gaz pas de croissance pas de croissance d° production d'acide et de gaz légère croissance légère croissance pas de croissance d° d° d° d° d° production d'acide et de gaz pas de croissance d° d° d° àa d° d° En outre, le Batyribacteri'um ruminantium montre une 55 légère motilité, ce qui n'est pas le cas de B.rettgeri. Ce dernier liquéfie complètement la gélatine, tandis que B.ruminantium 70 11505 8 2038108 n'affecte pas le milieu. Aucune de ces deux espèces ne produit d'indole, ne coagule le lait, ne réduit l'ion nitrate, ne forme de l'hydrogène sulfuré ou n'exerce une réaction positive à la catalase. B.ruminantium ne forme pas de spores. 5 Les exemples 1 à 7 suivants sont donnés afin d'illustrer les conditions nécessaires à la croissance et l'entretien de la culture de B. ruminantium. Ces exemples montrent en particulier les caractéristiques de croissance, les "besoins nutritifs et les réactions vis-à-vis d'essais spéciaux. 10 EXEMPLE 1 Utilisation de l'acide D.L-lactique par Butyribacterium ruminantium Cinq tubes rotatifs,munis de bouchons en caoutchouc, contenant chacun 5 ml de milieu au fluide de rumen, sont inoculés avec une culture de B. ruminantium MRBLB 3581 . Chacun des cinq tubes 15 contient une concentration différente d'acide D-,L-lactique avant l'inoculation. Au bout de 24 heures d'incubation à 39°C, on dose l'acide lactique total dans le bouillon de fermentation, au moyen d'un auto-analyseur du type "Technichon". Les résultats sont reproduits sur le tableau I. 20 TABLEAU I Acide D.L-lactique,mg/ml Tube concentration initiale c onc entrât ion résiduelle A 0 O ^ B 0,5 0,2 25 C 1 ,0 0,2 D 2,5 0,6 E 5,0 2,2 EXEMPLE 2 Utilisation des acides D.L-lactique. D-Iactique et L-lactique 30 par B.ruminantium On utilise^ dans cet exemple, un milieu au fluide modifié de rumen (milieu de rumen A). Ce milieu contient les ingrédients suivants : 70 11505 9 2038108 Milieu de rumen A Lactate de sodium 0,1 % Trypticase 1,0 % Extrait de levure 0,2 % 5 Substances minérales (concentration finale) B^H>4 1 x 10"5M HaOl 7,6 x 10"4M (NH4)2S04 3,4 x 10"5M E2HK)4 1,Tx10"5M 10 CaCl2 4,1 x 10"^ MgS04.7H20 3,8 x 10_4M Acides gras volatils Acétate de sodium (anhydre) 1,0 fo Acide isobutyrique 0,01 $ 15 Acide DL- T -méthylbutyrique 0,01 % Acide valérique 0,01 $ Acide isovalérique 0,01 fo Résazurine 0,0001 % Cystéine (base libre) 0,019 # 20 Na2S.9H20 0,025 # NaHCO^ 0,02 $ Hémine 0,001 % Eau en quantité suffisante pour ajuster le volume final Le processus général d'inoculation dans 5 ml de milieu 25 de rumen A est le même que dans l'exemple 1. On prépare des doubles de 8 tubes séparés» Les tubes F et G- contiennent 1 mg/ml d'acide D,L-lactique ; les tubes H et J contiennent 1 mg/ml d'acide D-lactique ; les tubes K et L contiennent 1 mg/ml d'acide If lactique et les tubes M et ÏT contiennent une quantité égale 30 d'eau pure. On ajuste avec une base un pH égal à 1,0. Au bout de 24 et 42 heures d'incubation à 39°C, on mesure la densité optique dans un colorimètre du type "Photovolt Lumetron" en utilisant un filtre de 660 mja. On utilise la densité optique comme mesure de la croissance. Les résultats sont donnés sur le tableau II 35 ci-après. 70 11505 to 2038108 TABLEAU II Tube Croissance (densité optique) 24 h 42 h F 0,20 0,28 5 G 0,19 0,22 H 0,20 0,27 J 0,24 0,32 K 0,17 0,27 L 0,19 0,24 10 M 0,09 0,11 N 0,06 0,10 Les résultats montrent que l'acide D, 1-lactique, l'acide B-lactique et l'acide L-lactique sont utilisés à un degré égal par B. ruminantium MREL B.3.581.. 15 EXEMPLE 3 Besoins en acides gras volatils de B. ruminantium On cultive la souche de NBKL B 3581 sur 5 ml du milieu, de rumen A , comme dans les exemples précédents. En plus du milieu de base, on ajoute aussi certains acides gras volatils,jusqu'à la 20 concentration finale indiquée : Acide acétique 0,17 en volume/volume Acide isobutyrique . 0,01 % " " Acide isovalérique 0,01 $ » " Acide valérique 0,01 % nu 25 Acide DL-a-méthylbutyrique 0,01 $ " 11 On mesure la croissance par densité optique en utilisant l'eau comme témoin. Le fructose et le lactate de sodium sont tous deux utilisés comme source de carbone;. Les résultats sont récapitulés sur le tableau III ci-après. **4 O TABLEAU III Nombre Source d'heu- de res carbone Acides gras volatils totaux Croissance (densité optique^ moins l'a- moins l'a- moins l'a- moins l'acide moins l'acide çide acé- cide iso- cide iso- a-méthylbuty- n-valérique tiq,ue butyrique valérique rique pas d'acides gras volatils en o en 18 h20 0,06 0,03 0,06 0,08 0,06 0,07 0,05 18 fructose 0,29 0,31 0,27 0,28 0,26 0,29 0,27 18 lactate de sodium 0,14 0,04 0,15 0,13 0,15 0,16 0,07 H h2o 0,06 0,08 0,06 0,07 0,06 0,06 0,08 24 fructose 0,22 0,23 0,20 0,20 0,20 0,22 0,23 24 lactate 0,12 0,16 0,14 0,13 0,13 0,13 0,17 de sodium hO O OJ 00 •■4 O 00 70 11505 12 2038108 Il ressort de ces résultats que l'acétate stimule la croissance de B. ruminantium lorsque le lactate de sodium constitue la source de carbone. Au bout de 18 heures, il n'y a pas de développement (au-delà de ce que l'on obtient dans 5 l'eau utilisée comme témoin lorsque l'acétate est omis). On obtient une croissance totale dans tous les tubes au bout de 24 heures.. Lorsqu'on utilise le fructose comme source de carbone, aucun des acides gras volatils n'exerce d'effet sur la croissance. EXEMPLE 4 10 -Concentration nptimatg d'acétate et de lactate pour la croissance de B. ruminantium En utilisant le milieu de rumen A déjà décrit, on inocule des cultures avec une souche de B. ruminantium HREL B 3581 dans 5 ml de milieu contenus dans des tubes rotatifs de. 15 1.6 x 150 mm. Chaque tube contient des quantités différentes d'acétate et de lactate, comme indiqué sur le tableau IV. On mesure la croissance par la densité optique après 24 heures d'incubation. TABLEAU I¥ 20 Acétate O mg/ml 1 mg/ml 2 ma/ml 4 m10 mg/ml Lactate O mg/ml . 0,08 0,11 0,08 0,20 0,07 1,2 mg/ml 0,24 0,36 0,29 0,37 0,25 2,4 mg/ml 0,21 0,43 0,52 0,54 0,45 6 mg/ml 0,35 0*47 0,53 0,75 0,87 12 mg/ml 0*51 0,47 0,57 0,69 0,75 Il existe entre la concentration d'acétate et la concentration de lactate, un rapport optimal pour la croissance. 30 Comme le montrent les résultats obtenus au bout de 24 heures, ainsi que les mesures faites au bout de 18 et 40 heures, une quantité égale d'acétate et de lactate offre les conditions optimales de croissance. exemple 5 35 Sources d'amino-acides de B .ruminantium On utilise le milieu A au rumen comme milieu de culture. L'extrait de levure n'est pas omis du milieu et sa présence 70 11505 15 2038108 apporte certains aminoacides, comme le montre le développement qui se produit dans l'eau utilisée comme témoin. Toutefois» en plus du milieu au rumen A, on ajoute certaines sources d'aminoacides en quantités de 10 mg/ml. La croissance, indiquée 5 par la densité optique, est mesurée au "bout de la période d'incubation de 18 heures à 39 °C, et les résultats sont donnés sur le Tableau Y. TABLEAU Y Source d'amino-acide Croissance (densité optique) 10 Trypticase 0,49 Acides aminés de la caséine 0,27 Bydrolysat de caséine 0,37 Bacto-peptone 0,41 Bacto-casitone 0,36 15 Peptone de soja, type T 1,52 Lait peptoné 0,62 Edamine 0,51 F-Zamine, type AS 0,40 ïï-Zéase 0,57 20 Aminé concentrée de caséïne 0,25 Eau (témoin) 0,42 Seule la peptone de soja favorise notablement la croissance. EXEMPLE 6 25 Besoins en vitamines de B. ruminantium En utilisant le milieu de rumen A comme milieu de culture, on a constaté par des expériences que l'extrait de levure peut être remplacé par un mélange de vitamines pures. Dans cet exemple, l'extrait de levure a été omis. Chacune de 30 13 vitamines a été omise(à raison d'une à la fois)en vue de déterminer les vitamines qui sont nécessaires à la croissance de B. ruminantium. La croissance, indiquée par la densité optique,a été mesurée âu bout d'une période d'incubation de 18 heures à 39°C, et les résultats ont montré que la biotine 35 est indispensable. 70 11505 14 2038108 EXEMPLE 7 Besoins en amino-acicl.es de B. rumiwan-Hum En utilisant le milieu de rumen A comme milieu de culture , on ajoute des solutions de 17 L-amino-aeides. purs , à peu près 5 à la concentration qui est offerte par un produit d'hydrolyse acide de farine de soja. Chacun de ces acides est omis à raison d'un à la fois, afin de déterminer quels sont les acides qui sont nécessaires à la croissance de B. ruminantium. Toutefois, la cystéine est toujours présente à une concentration de 10 1,9 mg/ml , car elle est utilisée(avec le sulfure de sodium) pour établir les conditions qui conviennent pour une anaérobiose. La croissance est indiquée par la densité optique au bout de 18 et 40 heures d'incubation à 39 °C. Les résultats montrent que la L-méthionine et la L-tyrosine 15 exercent un effet stimulant. L'exemple suivant est donné pour illustrer le procédé de production du micro organisme B. ruminantium. EXEMPLE 8 Production de B. ruminantium 20 On prépare une culture-mère qu'on maintient sous la forme lyophilisée. L'inoculum destiné à la production est déve--loppé par mise en suspension , dans des conditions aseptiques , de la culture lyophilisée dans un milieu stérile au fluide de rumen et par incubation à 39-40°C dans.des conditions anaérobies 25 pendant 18 heures. Ensuite, on utilise un volume de 1 à 10 $ pour inoculer un plus grand volume de milieu que l'on fait . incuber dans les mêmes conditions. On poursuit ces transferts en série jusqu'à ce qu'on obtienne un volume suffisant -d^'ino-culum primaire" . 30 L'opération de production peut porter sur un volume quel conque, en fonction des conditions requises par les cellules. On introduit des volumes de deux litres dans des fioles d'Erlenmeyer qu'on bouche et qu'on équipe de soupapes de Bunsen pour permettre aux gaz de s'échapper. Les volumes plus importants, 35 de 200 à 600 litres , sont produits dans des appareils métalliques de fermentation qui sont équipés de manière à maintenir une atmosphère anaérobie au-dessus du liquide. 70 11505 15 2038108 Le milieu est examiné à chaque étape et il est stérilisé au moyen de procédés classiques à 120°C pendant 15 minutes. Après la stérilisation, le milieu est maintenu dans des conditions anaérobies pour la durée de la fermentation. On y parvient 5. au moyen de gaz tels que l'hélium, l'azote ou l'anhydride carbonique. Chaque étape de la fermentation industrielle est déclenchée par l'introduction d'une quantité convenable d'inoculum. Après"l'inoculation, le milieu de fermentation est maintenu 10 à une température de 39 à 40°C dans des conditions anaérobies, jusqu'à ce qu'on obtienne le développement maximal, généralement en 10 à 24 heures. On contrôle le processus fermentatif en mesurant la croissance, le pH, la consommation de lactate et l'activité. A la 15 fin de la fermentation, on récolte les cellules par centrifugation dans des conditions anaérobies. L'inoculum primaire est transféré à la seringue dans un tube à essai de 20 ml, muni d'un bouchon et contenant le milieu au fluide de rumen. Après incubation à 39°C pendant 24 heures, 20 sous atmosphère d'azote, on inocule 10 ml de ce stade "A" dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 ml équipé d'un bouchon de caoutchouc et d'une soupape Bunsen, ce flacon contenant 200 ml de milieu au fluide de rumen. Ce stade "B" est ensuite mis à incuber pendant 24 heures à 39°C sous atmosphère d'azote. 25 Après cette période de temps, on inocule 200 ml du stade "B" dans un flacon d'Erlenmeyer de 2 litres équipé comme dans l'opération "B" et contenant 1500 ml de milieu au fluide de rumen. Après incubation à 39°C pendant 12 heures sous atmosphère d'azote, ce stade "C" est prêt à être inoculé dans le stade "D". 30 Le stade wD,r est inoculé dans un appareil de fermentation en acier inoxydable de 190 litres de capacité, contenant 160 litres d'un milieu de culture de composition suivante ï 35 bad original 70 11505 16 2038108 Peptone de soja 2 % Lactate de sodium _ 1,2$ Acétate de sodium 1,0 $ Extrait de levure 0,2 $ 5 Chlorure de sodium 44 mg/l (HH4)2S04 1 82 mg/l EH2P04 177 mg/l CaClg^HgO 46,5 mg/l MgSQ4.7H20 94 mg/l 10 K2HP04 300 mg/l Bleu de méthylène 0,5 mg/l On ajuste à 7,0 le pH du milieu, au moyen d'hydroxyde de sodium. Le contenu de l'appareil de fermentation est inoculé 15 avec 4 litres de stade "C" (obtenu après 2 incubations séparées du stade "C") et on le fait incuber à 39°C sous atmosphère d'azote pendant 12 heures. On inocule ensuite environ 10 à 15 $ du stade "D" dans un appareil de fermentation en acier inoxydable d'une capacité 20 de 760 litres, contenant 600 litres du milieu du stade "D". Après incubation à 39°C pendant 14 heures sous atmosphère d'azote, on considère que la production est terminée. Lorsque la fermentation est terminée, le produit final appelé "bouillon entier" est recueilli sous pression d*azote 25 dans des bidons purgés à l'azote. Le bouillon entier est traité dans une centrifugeuse du type "Titan" sous atmosphère d'azote et on obtient 11,4 litres d'un concentré à 50x, Ce concentré peut être utilisé comme composition destinée au traitement des ruminants. 30 En outre, ce concentré peut être traité ultérieurement par déshydratation en appliquant des moyens de lyophilisation, de séchage par pulvérisation, ou d'autres moyens analogues. On procède à la lyophilisation en plaçant le concentré dans des coupelles, des bouteilles ou d'autres récipients d'évaporation, 35 et en le soumettant à une température inférieure à la température de congélation. Après congélation, le mélange congelé est placé dans un appareil dans lequel on peut faire le vide,et 70 11505 17 2038108 il est soumis à une "basse pression qu'on maintient jusqu'à ce que le mélange soit déshydraté. On peut aussi incorporer tin véhicule inerte ou un ingrédient de revêtement dans le concentré avant la déshydratation ; on obtient ainsi une composition 5 contenant les cellules sèches. Ces dernières sont conservées dans des récipients hermétiques à l'abri de la lumière du jour et elles sont maintenues au repos à la température ambiante normale. En général, un litre de bouillon entier donne environ 1 g de cellules sèches lorsque ce bouillon est produit en utilisant 10 le processus fermentatif décrit ci-dessus. Les exemples suivants illustrent l'utilisation de B. ruminantium in vitro. On utilise la culture pure, des échantillons de bouillon entier et la culture lyophylisée. EXEMPLE q 15 Cet exemple illustre l'effet in vitro de B. ruminantium sur un milieu artificiel de rumen produit par acidose. On déclenche une fermentation anaérobie continue par action du rumen sur de la luzerne, dans des récipients de fermentation continue équipés de moyëns d'agitation sur un dispositif à trop-plein 20 ayant une capacité de 3.000 litres. On procède à un retournement de volume toutes les 24 heures. On ajouté de la salive artificielle à un débit constant de 2 ml/mn. On maintient la température du système à 39°C, et on contrôle le rumen artificiel pendant une période de temps de 5 jours pour s'assurer qu'il 25 reste sous régime constant. Le contrôle consiste en l'analyse des produits de fermentation, qui"montrent la composition suivante après la période de cinq Acides gras volatils jours : 1 er .iour 2èmé .iour 3ème riour 4ème iour 5ème-nour Acétate, (Jmoles % 74 73 74 73 74 Propionate pmoles fo 1(5 16 15 16 16 Butyrate jJmoles $ 9 10 10 10 10 Isovalérate pmoles 0,5 0,5 0,5- 0,5 0,5 Valérate [Jmoles % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Nbnfare total de jtooles/ml d'acides gras volatils. 160 160 .164 160 166 Ph 6,5 6,5 6,5. 6,5 6,5 i 70 11505 18 2038108 Dégagement de gaz (l -par 24 heures) 1 er .jour 2ème .jour 3ème .jour 4ème .iour 5ème r1otar C02 $> 78 78 76 75 74 ir2 1° 3 3 3 • 3 5 5 CH4 £ 19 21 22 21 .20 Gaz total 125 125 125 125 125 Après cette période de contrôle, et lorsque l'existence d'un système sous régime constant a été établie, on ajoute 10 300 g de ration alimentaire du commerce (pour agneaux) au rumen artificiel, puis on ajoute des portions de 25 g toutes les trois heures. On ajoute également aux divers rumens artificiels des quantités variables d'une culture de bouillon entier , âgée de 24 heures,de B. ruminantium , produite dans l'exemple 7, 1 5 et des matières sèches lyophilisées équivalant à 200 ml du bouillon entier de B. ruminantium produit dans l'exemple 7, et on mesure l'accumulation d'acide D,L-lactique . Les résultats sont donnés sur le tableau VIII. TABLEAU VIII 20 Acide D.L-lactique accumulé en umoles/ml Nombre d'heure après millilitres de bouillon entier ajouté l'addition 1 3 2.5 6 9 12 15 18 30 21 0 30 100 300 matières 1 .5 16 0 2 3 12 10 0 , 7 2 15 1 0 13 7 34 0 0 9 96 80 .0 0 14 118 84 0 0 4 140 84 0 . 0 2 120 100 0 0 0 35 Il ressort de l'exemple précédent que l'accumulation d'acide lactique est efficacement réglée par l'addition d'au moins 100 ml de bouillon entier. La teneur en bactéries de 100 ml de bouillon entier est définie comme unité individuelle d'activité (a=1). Lorsqu'on utilise des matières sèches lyophilisées ou concentrées, cette même activité normale sert 70 11505 19 2038108 de référence. Par exemple,lorsqu'on utilise des matières sèches lyophilisées équivalant à 200 ml de bouillon entier, l'unité d'activité est égale à 2 (a=2) ; si l'on utilise 1 litre de bouillon entier (1.000 ml-), a est égal à 10. -5 Les exemples suivants montrent l'application in vivo de l'invention, tant à des ovins qu'à des bovins. EXEMPLE 10 On provoque une acidose chez six moutons nourris à la luzerne en utilisant le mode opératoire suivant : les animaux 10 utilisés sont des agneaux âgés d'environ sept semaines. Pendant quatre semaines ("période de pré-traitement") , les agneaux sont placés à deux dans un enclos et reçoivent à volonté une ration de boulettes de luzerne. On mesure la consommation de nourriture et les gains de poids. L'alimentation à la luzerne 15 assure une fermentation du type ayant son siège dans des détritus. On soumet ensuite les animaux à des étapes successives d'alimentation forcée,au moyen d'une sonde stomacale sous atmosphère d'azote, en leur faisant absorber ■une ration broyée fortement énergétique (boulettes pour agneaux du type " Agway 20 Early Market Lamb Pellets), en suspension dans un litre de salive artificielle. Chacune des rations contient également l'un de trois "produits de traitement", chaque produit étant absorbé par deux animaux. L'activité des produits de traitement 1 et 2 est égale à un litre de bouillon entier (a = 10). 25 Produits de traitement 1 inoculum déshydraté de culture pure remis en suspension 2 inoculum fraîchement préparé de bouillon entier 3 milieu au fluide de rumen (témoin) Cette alimentation forcée est poursuivie pendant 3 jours, 30 à raison de 400 g de ration additionnée de produit de traitement le premier jour, et 600 g chacun des deux jours suivants. La ration pour engraissement rapide d'agneaux est également distribuée à volonté et on note la consommation de nourriture dans chaque parc. 35 On recueille des échantillons de fluide du rumen trois fois par jour pendant le traitement d'une durée de 3 jours, 70 11505 20 2038108 et -une fois par jour pendant les 3 jours suivants. On détermine le pH de chaque échantillon, de même que la teneur en acide lactique et les taux dracides gras volatils. On analyse également un échantillon de sang veineux pour d'oser l'acide lac-5 tique total, le troisième jour du traitement. Les résultats de cet essai montrent que l'un des moutons témoins se trouve dans un état d'"acidose" prolongée qui se traduit par une chute du pH du rumen de 7,8 à 4,9 et par une grande accumulation d'acide lactique pendant la période de trai-10 tement. À titre comparatif, bien qu'on constate l'existence de plusieurs pics de grande netteté en ce qui concerne la teneur en acide lactique chez l'un des moutons ayant reçu 1'inoculum déshydraté, les pics en question étant temporaires, les moutons traités avec 1'inoculum ne montrent pas de symptômes 15 d'acidose,ni d'accumulation notable de l'acide lactique. EXEMPLE 11 Six jeunes boeufs de la race Hereford (157 à 180 kg) reçoivent une alimentation forcée d'environ 5,0 kg d'un concentré fortement énergétique, introduit directement dans le rumen 20 par une sonde stomacale sous pression d'azote pour provoquer un état d1"acidose" . Trois jeunes boeufs reçoivent la nourriture seule. Trois autres reçoivent le concentré fortement énergétique auquel on a ajouté un concentré liquide équivalant à 20 litres de bouillon entier de B. ruminantium produit comme 25 décrit dans l'exemple 7. L'activité est égale à 200 (a = 200). Une "acidose" sévère se produit chez 2 à 3 boeufs témoins, qui présentent des taux très élevés d'acide lactique dans le rumen, un abaissement du pH du rumen et des quantités d'acides gras volatils,une inappétence sévère, une forte diarrhée et 30 un état léthargique. Au contraire, les boeufs inoculés montrent des taux d'acide lactique du rumen qui sont normaux ou seulement un peu élevés, des taux importants d'acides gras volatils du rumen, des taux élevés de butyrate prouvant l'utilisation de l'acide lactique, une inappétence modérée et.une légère 35 diarrhée. Comme le montrent les exemples précédents, les symptômes d'acidose peuvent être soulagés ou prévenus chez les ruminants 70 11505 21 2038108 recevant une nourriture fortement énergétique par administra-- tion d'une quantité faible, mais efficace de B'. ruminantium. En vue du traitement ou de la prophylaxie de la maladie, on utilise des compositions dans lesquelles les cellules sèches 5 de B. ruminantium sont incorporées dans des véhicules ou diluants convenables ou mélangées intimement avec ces véhicules ou diluants. La quantité de cellules sèches de" B. mmi nanti iim que l'on utilise en vue d'obtenir les meilleurs résultats dépend naturellement de l'espèce animale,du procédé de trai-10 tement, de la quantité consommée de nourriture et de ce que l'on désire faire un usage thérapeutique (aux premiers stades de l'acidose) ou prophylactique dés compositions. Un moyen préféré d'administrer les cellules sèches de B. ruminantium à des ruminants consiste à les incorporer à 15 la nourriture des animaux. Ceci est particulièrement satisfaisant, car B. ruminantium. doit être administré en continu,pendant une période de plusieurs jours,lorsque les animaux commencent à absorber des rations fortement énergétiques. A.de telles fins, il convient de préparer initialement des suppléments nutritifs 20 ou des mélanges préalables dans lesquels les cellules sèches de B. Tiimi nanti nm sont intimement dispersées dans un véhicule pouvant être ingéré , qui est inerte, c'est-à-dire non réactif vis-à-vis de B. ruminantium. Les exemples de diluants qu'il convient d'utiliser pour des compositions de suppléments com-25 prennent des véhicules solides pouvant être ingérés tels que dés grains séchés dé distillerie , la luzerne , la farine de maïs, la farine d'agrumes, des résidus-de fermentation, des coquilles d'huîtres broyées , l'attapulgite, des brisures de r blé , des extraits solubles de-mélasses, de la- poudre d'épis 30 de maïs, des substances végétales Gomestibles, de la' farine décortiquée et grillée de soja, des résidus-de broyage des graines de soja, des mycéliums antibiotiques, la vermiculite, du gruau de soja, du calcaire broyé, etc. Pour préparer des compositions solides, les cellules sèches sont, dispersées intimement ou 35 incorporées dans la masse du véhicule au moyen de techniques telles qu'un broyage, une agitation, une mouture ou une agitation au tambour . En choisissant les diluants appropriés et 11505 22 2038108 en jouant sur le rapport du véhicule aux cellules sèches, on peut préparer des compositions de toute concentration désirée. Lorsque les cellules sèches de B. ruminantium sont incorporées à la nourriture' des animaux, on obtient de bons résultats, 5 dans le cas du gros bétail , lorsque 2,2 à 4,5 kg de nourriture contiennent 100 à 10.000 unités d'activité. Au contraire, les ovins nécessitent 10 à 1.000 unités d'activité de B. ruminantium par 2,2 à 4,5 kg de nourriture . Ces compositions nutritives peuvent être préparées soit en vue de l'utilisation 10 directe en mélangeant directement les cellules sèches avec la nourriture, soit de préférence , sous la forme de suppléments nutritifs contenant de plus fortes concentrations en ingrédient actif uniformément dispersé dans un véhicule solide comestible. Les suppléments sont ensuite dispersés ou incorporés dans la 15 nourriture pour produire la concentration désirée d'ingrédient actif en plus de l'alimentation. Etant donné qu'il est pratique, pour le fabricant de produits nutritifs , d'utiliser environ 0,45 kg de supplément nutritif par tonne de nourriture prête à la consommation, la concentration désirée en ingrédient 20 actif dans le supplément nutritif est en"partie fonction de la quantité de cellules de B. ruminantium dont la présence est désirée dans la nourriture prête à la consommation. En général, on utilise des suppléments nutritifs contenant environ 1 à environ 50 $ en poids d'ingrédient actif pour régler la dose 25 à la valeur désirée dans la nourriture prête à être consommée. Ces suppléments nutritifs peuvent ."'aussi contenir de petites quantités de déshydratants non-toxiques pouvant être ingérés, par exemple du gel de silice ou des antioxydants . 30 Les cellules sèches de B. muni nantinm peuvent aussi être enduites d'une matière inerte convenable pour prolonger la longévité des microorganismes. Un tel revêtement ne doit pas être hygroscopique , tout en se décomposant rapidement dans la panse de l'animal. Des revêtements convenables peuvent être -35 appliqués soit lorsque le concentré de bouillon entier est en cours de séchage , c'est-à-dire en y incorporant le concentré par mélange avant le séchage , soit après que les cellules de 70 11505 23 2038108 B. ruminantium ont été séchées. Des revêtements convenables comprennent la gélatine, la cire hydrocarbonée ou carbowax, des cires ou paraffines , des polymères synthétiques, etc. les microorganismes de l'espèce B« ruminantium peuvent 5 aussi être administrés à des- ruminants par voie orale, sous la forme de bols. On peut normalement utiliser des doses quotidiennes de 100 à 10.000 unités d'activit^ar 225 kg de poids corporel, dans le. cas du gros bétail. l'administration des cellules de B. ruminantium à de 10 telles doses , pendant un seul jour, constitue normalement une thérapeutique satisfaisante , mais d'autres traitements peuvent être appliqués sans donner de résultats contraires, les bols utilisés pour ce type d'administration contiennent la concentration désirée en cellules de B. ruminantium,en dispersion 15 intime ou en solution dans des diluants ou véhicules acceptables, du point de vue physiologique. Les cellules actives sont mélangées avec des diluants , des charges , des liants, des lubrifiants et autres excipients pouvant être ingérés, au moyen de techniques classiques de formulation . Les bols et les comprimés 20 sont normalement préparés de manière à contenir environ 5 à 70 ^ en poids de B. ruminantium. car de telles compositions peuvent être utilisées de façon satisfaisante pour apporter à l'animal la dose requise. Ces compositions sont en général préparées directement sous la forme posologique unitaire. 25 Le bouillon entier de B. ruminantium. ou le concentré de ce bouillon entier, peut aussi être utilisé comme breuvage destiné à l'administration pour un simple traitement. 70 11505 24 2038108 REVENDICATIONS 1. Culture 'bactérierme de Butyribac t er ium ruminanti"um. 2. Culture bactérienne suivant la revendication 1t dont le microorganisme est Butyribacterium ruminantium îffiEl B358i.« 3. Concentré déshydraté de Butyribacterium ruminantium. 5 4. Concentré déshydraté de Butyribacterium ruminantium NEEL B. 358t. 5. Composition destinée à 1*administration à des ruminants pour soulager les symptômes de l'acidose, caractérisée par le fait qu'elle consiste en une culture bactérienne,apte à uti- tO liser l'acide lactique, en mélange avec un support. 6. Composition suivant la revendication 5, caractérisée par le fait que le support est un additif pour les aliments des animaux, pouvant être ingéré par voie orale. ?. Composition suivant la revendication 5, caractérisée 15 par le fait que la culture bactérienne apte à utiliser l'acide lactique est sous la foime posologique unitaire. 8» Composition suivant la revendication 5, caractérisée par le fait que la culture bactérienne est Butyribacterium ruminantium. 20 9. Composition suivant la revendication 8, caractérisée par le fait que la culture bactérienne est Butyribacterium ruminantium NEEL B 3581 .