Brevet FR2039250A1 — publié le 19710115

î 2039250 L'invention concerne une méthode pour améliorer la stabilité des enzymes et les produits ainsi stabilisés Les enzymes sont généralement instables lorsqu'elles restent dans un milieu aqueux liquide, que ce soit leur véhicule 5 naturel (après les avoir extraites des cellules vivantes qui les cnt produites) ou que ce soit dans un milieu aqueux préparé dans lequel on les a remisas en suspension ou redissoutes (reconstitution) - après les avoir isolées de leur véhicule naturel Ainsi/ les enzymes commerciales, c'est-à-dire les enzymes préparées et 10 commercialisées pour des applications industrielles, y compris des applications médicales, sont normalement séchées, quoique dans certains cas on puisse commercialiser certaires préparations d'enzymes sous forme de siroje concentrés. Une certaine détérioration des enzymes peut se produire lorsque le séchage complet 15ou la concentration est obtenue. Pour les applications finales, les enzymes déshydratées ou concentrées sont souvent reconstituées en les mettant en suspension ou en les issolvant dans un milieu aqueux. Cette reconstitution fournit l'occasion d'erreur.; particulièrement dans le cas où la substance reconstituée doit 20avoir une activité définie par poids ou par volume unitaire. En outre, l'enzyme reconstituée est soumise à la détérioration, dont la vitesse et le degré dépendent de différents facteurs tels que, température, concentration, temps et nature du milieu reconstituant (pH par exemple)» 25 par exemple, dans les processus de diagnostic .électronique automatique pour l'étude du diagnostic des fluides de l'organisme tels que le sang, le plasma sanguin, le sérum' sanguin et l'urine, il faut un sérum sanguin témoin qui doit être aussi proche que possible du sérum sanguin normal, frais et naturel. 3°Le sérum sanguin contient naturellement de nombreuses enzymes. Autrefois, il était nécessaire de lyophiliser le sérum sanguin commercialisé pour cette application. Le technicien devait alors reconstituer la substance lyophilisée grâce à l'eau pour pouvoir l*utiliser dans eëb processus. Ceci présentait des inconvénients 35et des limitations. La lyophilisation elle-même peut détruire l'équilibre délicat des constituants du sérum.La reconstitution des substances lyophilisées est souvent source d'erreurs importantes. On devait souvent.préparer plusieurs produits à base de sérum sanguin lyophilisé différents parmi lesquels le 40technicien devait en choisir un ou plusieurs selon le diagnostic 70 14063 2 2039250 particulier qu'il devait effectuer» En outre, la matière reconstituée avait une durée de vie limitée si bien qu'on devait normalement reconstituer et utiliser chaque jour une substance lyophilisée fraîche. 5 Ce qui précède donne un exemple des problèmes rencontrés par suite de l'instabilité des préparations d'enzymes, et on les a longtemps étudié» • oar le sérum sanguin représente une substance particulièrement délicate et instable contenant des enzymes, substance à laquelle la présente invention s'applique particuliè-10 rement. Toutefois, comme on le verra plus loin, la présente invention s'applique aux enzymes en général, qu'elles se trouvent dans leur véhicule naturel (après extraction des cellules vivantes naturelles qui lésait produites ou de leur milieu) ou qu'elles se trouvent dans un milieu reconstitué. 15 Selon la présente invention, il est fourni une méthode pour améliorer la stabilité d'une enzyme qui consiste à refroidir l'enzyme en milieu aqueux à une température inférieure à 10° C, et puis, rapidement et successivement, (a) à soumettre l'enzyme - dans une zone de traitement, alors qu'elle est maintenue dans 20 un récipient fermé, perméable aux aici?o 70 14063 •3 2039250 vitesse pour lui faire faire au moins un tour complet de 360° au cours de ladite exposition, et de préférence plusieurs tours de 360°, afin d'exposer toutes les parois principales du récipient à 1*énergie de micro-ondes durant l'exposition mentionnée. 5 L'invention fournit également un sérum sanguin qui possède une stabilité améliorée à la détérioration, par rapport à celle du sérum sanguin similaire non traité de cette façon. On a constaté que le traitement précédent permet d'accroître sensiblement la stabilité des enzymes traitées à la 10 détérioration, c'est-à-dire à leur perte permanente d'activité. On sait que les enzymes • peuvent être -.cfci'vées / même de façon permanente, par des traitements thermiques plus poussés, y compris l'exposition à l'énergie de micro-ondes. Le traitement de la présente invention grfice aux effets d'un refroidissement 15 préalable et d'un rapide refroidissement ultérieur, effets combinés aux effets du gaz réfrigérant au cours de l'exposition aux radiations des micro-ondes et au degré limité de cette dernière, empêche la désactivation de l'enzyme tout en augmentant en même temps la stabilité de l'enzyme. Cephénomène est illustré 20 dans les exemples donnés ci-après, et spécialement dans l'exemple traitant du sérum sanguin. La stabilisation selon la présente invention s'effectue rapidement (en quelques secondes) et égaiement simplement et économiquement. Les conditions peuvent être normalisées pour 25 toute enzyme particulière ou mélange d'enzymes pour assurer des résultats reproductibles d'une fois à l'autre. Aussi, on peut essayer chaque lot pat des techniques spécifiques à une enzyme donnée. Autant qu'on sache actuellement, toute enzyme doit être 30 susceptible d'une amélioration de sa stabilité selon la présente invention. Les enzymes sont des protéines, y compris des métallo-protéines et des protéines conjuguées, et sont produites par des cellules vivantes. Il existe diverses classifications des enzymes : une classification reconnue est la suivante selon Webb, 35 Biochemical Engineering, D. Van Nostrand Co., Inc., Princeton, N.J., 1964 ( voir aussi Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmar, Seconde ^lition, Volume S) : (1) des hydrolases : protéases et peptidases, telles que pepsine, rénine, etc.; osidases, telles que amylase; estérases, telles quo lipases, 40 phosphatases, etc.; uréase ; désaminase; etc.; 70 14063 4 2039250 (2) des enzymes catalysant les transferts ï déshydrogénases, telles que lactico-déshydrogénase; oxydases; transaminases telles que glutamophérases; kinases, telles que créâtinephosphokinase; (3) les enzymes de fixation et de libération telles que 5 aconitase, énolase, carboxylase et aldolase; (4) les isomérases telles que l*alanine-racémase; (5) les synthétases telles que glutamine-synthétase; et (6) les nucléases telles désoxyribo-nucléase. Comme mentionné, la présente invention s'applique particulièrement au traitement des enzymes contenues 10 dans le sérum sanguin qui comprennent les phosphatases, les transaminases, les déshydrogénases et la phosphokinase. Toutes ces enzymes ou une quelconque d'entre elles peuvent être isolées du sérum sanguin et traitées séparément, après reconstitution, si nécessaire, ou alors on peut traiter le sérum sanguin tel 15 quel. Le sérum sanguin, qui est le liquide clair restant après avoir retiré les éléments cellulaires (globules rouges, globules blancset plaquettes) et le mécanisme de coagulation (fibrinogène) du sang total, est l'un des éléments préférés traités selon la présente invention. 20 L'enzyme traitée selon la présente invention se trouve dans un milieu aqueux, c'est-à-dire qu'elle n'est pas séchée. Elle peut se trouver dans son véhicule naturel concentré ou non ou elle . peut être reconstituée en la mettant en suspension ou en la dissolvant dans un milieu aqueux préparé après l'avoir isoléede 25 son véhicule naturel ou après l'avoir concentrée. La quantité de milieu aqueux associé» à l'enzyme n'est pas cruciale, du moment qu'une quantité suffisante est présente pour humidifier l'enzyme, et dépend de l'application finale du produit ou de considérations de traitement . Il est par exemple souvent très commode de faire 30 des recherches sur une suspension ou une solution. Comme on le sait bien, les micro-ondes sont des ondes électromagnétiques dont la longueur d'ondes est comprise entre 1 mm et 1 m dans le spectre électromagnétique*. La United States of America Fédéral Communications Commission a actuellement fixé, 35 pour les traitements à haute fréquence, des bandes de microondes de l'ordre d'environ 4Q0 à environ 20.000 mégahertz, avec des longueurs d'ondes dans les gammes d'environ 330 mm pour les plus basses fréquences et environ 18 mm pour les plus hautes fréquences; en particulier des fréquence d'environ 890 — 940 40mégahertz avec une longueur d'ondes d'environ 330 mm; 70 14063 5 2039250 des fréquences d'environ 2400-2500 mégahertz avec une longueur . d'ondes d'environ 100-130 mm, et des fréquences de 17.850-18.000 mégahertz avec une longueur d'ondes d*environ 18 mm. Toutefois, les micro-ondes actuellement préféréas pour être utilisés selon 5 la présente invention ont une fréquence comprise entre environ 1000 et environ 5000 mégahertz, et de préférence entre environ 2000 et environ 3000 mégahertz. Les micro-ondes sont produites par une source à haute fréquence appropriée telle qu'un magnétron. Une caractéristique de la présente invention est le 10 prérefroidissement de la substance contenant l'enzyme. Ainsi, la substance,lorsqu'elle est pour la première fois exposée aux microondes ,doit être à une température bien inférieure à la température ambiante c'est-à-dire au-dessous d'environ 10° C. Alors qu'on peut en .fait la g«lai, étant donné qu'elle fondra lors de 15 l'exposition aux micro-ondes, ceci n'est pas nécessaire et, pour faciliter la manipulation, il est préférable que la température soit supérieure à la température de congélation. Une température comprise entre environ 2° C et environ 7° G est particulièrement satisfaisante. On peut pré-refroidir la substance contenant 20 l'enzyme en dehors de l'enceinte ou de la zone de traitement ou alors on peut la pré-refroidir dans la zone même de traitement par un écoulement préalable de gaz réfrigérant avant que l'on produise les micro-ondes. Une autre caractéristique de la présente invention 25 consiste à maintenir la substance contenant l'enzyme traitée dans un récipient hermétiquement étanche durant le traitement. Les parois du récipient peuvent être classiques, c'est-à-dire fabriquées à partir de matériaux pratiquement imperméables auxgaz tels que le verre, le polyméthylméthacrylate, le polystyrène et le 30 polyéthylène, les récipients se présentant sous forme de bouteilles, de flacons et de sacs. Le récipient est pratiquement étanche au2c gaz. Le récipient dans lequel se trouve la substance contenant l'enzyme durant l'exposition est placé dans une enceinte ou zone 35 de traitement plus grande sur laquelle on dirige les micro-ondes pour qu'elles traversent les parois perméables aux micro-ondes du récipient et qu'elles filtrent à travers lJenzyme. Une autre caractéristique de l'invention est-la circulation d'un gszréfrigérant à travers l'enceinte ou zone de traitement et 40 autour des parois du récipient où se trouve la substance 70 14063 6 2039250 contenant l'enzyme. Le gaz réfrigérant employé peut être tout gaz pratiquement inerte (c'est-à-dire ne réagissant pas avec le milieu, en présence des micro-ondes), existant à l'état de gaz aux températures employées," en particulier l'air, l'azote ou 5 l'anhydride carbonique. Alors que des gaz tels que l'argon, l'hélium, le néon, le krypton, le xénon, l'oxyde d'éthylène, et des mélanges de ceux-ci, etc., sont équivalents, ils sont moins intéressants à l'heure actuelle par suite de leur prix de revient. 10 La température du gaz réfrigérant pénétrant dans.la zone de traitement doit être inférieure à environ 16° C, et est de préférence inférieure à environ 13° C. Alors que sa température peut descendre aussi bas que moins 18°C, cela n'offre aucun intérêt de descendre au-dessous d'environ 7° C, et à cas 15 températuresbasses il peut y avoir des'problèmes de congélation, si on laisse une substance contenant l'enzyme dans la zone de traitement contenant le gaz froid pendant das périodes prolongées , après avoir coupé la source de micro-ondes. On a constaté qu'une température du gaz d'entrée compriseentre environ -1° C et 20 environ 10° C est particulièrement appropriée» Le gaz réfrigérant se réchauffera au cours de sa propagation dans la zone de tcaifcofflent en particulier par contact avec les parois du récipient où . se trouve la substance contenant l'enzyme, et l'on retire le gaz réchauffé de la zone de traitement pour faire place au gaz réfri-25 gérant entrait. Lorsqu'on fait recirculer le gaz qui a déjà servi, sa température doit être ramenée â la température voulue pour son admission dans la zone de traitement* Etant donné que la principale fonction du gaz réfrigérant est de maintenir les parois du récipient à un© température bien 30 inférieure à celle de la substance contenant l'enzyme traitée, on fait pénétrer le gaz réfrigérant dans l'enceinte do traitement jusqu'aux parois du récipient sous une pression tout au moins légèrement positive (c'est-à-dire tout au moins légèrement supérieure à la pression atmosphérique), ce qui assure un refroidisse-35 ment d'ensemble plus efficace, sans que certaines zones des parois risquent d'être insuffisamment refroidies. On a utilisé des pressions aussi basses que 0,0019 atmosphère. , mais il peut être désirable d'utiliser des pressions aussi élevées que 3,38 atmosphères. L'air est particulièrement satisfaisant à des pressions 40 légèrement positives, alors qu'un gaz ne contenant pratiquement 70 14063 7 2039250 pas d'oxygène, en particulier l'azote, est préférable à des pressions plus élevées. La durée précise de traitement par les micro-ondes selon la présente invention peut dépendre quelque peu de l'enzyme 5 particulière qu'on traite, du volume de la substance contenant l'enzyme, de la concentration de l'enzyme dans la substance traitée et de la puissance du générateur de micro-ondes. En général, le temps nécessaire est directement proportionnel au volume de la substance contenant l'enzyme et de la concentration 10 d'enzyme en son seins ot est inversement proportionnel à la puissance du générateur de micro-ondes.On a constaté que le temps d'exposition, en tout; cas, est d'au moins environ une seconde. On a également constaté que la surexposition entraîne une inacti-vation complète de l'enzyme. Etant donné que celle-ci est indési-15 rable selon la présente invention, le temps d'exposition total n'atteint pas celui qui produit cette inactivation complète. Etant donné que ce temps diffère, pour les raisons mentionnées ci-dessus, il peut être nécessaire d'effectuer un essai ou des essais préliminaires pour connaître le degré auquel on peut soumettre 20 l'enzyme particulière subissant le traitement aux micro-ondes sans qu'elle subisse une inactivation complète. Chaque enzyme a une fiche de détermination propre si bien qu'on peut facilement déterminer si un échantillon traité de celle-ci a ou non subi une inactivation complète. En tout cas, la durée d'exposition 25 n'atteint pas celle qui provoquerait une élévation de température de la substance contenant l'enzyme jusqu'à la température d'inac-vation permanente de l'enzyme; en général, la durée n'est pas supérieure à celle qui provoque une élévation de température de la substance contenant l'enzyme au-dessus d'environ 52-55° C, 30 et dans la plupart des cas la température s'élève à environ 38° C-49° C. La substance contenant l'enzyme peut être soumise, selon la présente invention,à une seule exposition ou à plusieurs expositions successives aux micro-ondes. Une caractéristique du procédé préféré de la présente 35 invention est l'exposition de toutes les parois principales du récipient où se trouve la substance contenant l'enzyme aux micro-ondes au cours de l'exposition mentionnée. Il est très commode de réaliser cette exposition en utilisant une bouteille droite comme récipient, en faisant tourner la bouteille autour 40 de son axe longitudinal (vertical) d'au-moins 3&>° , et de 70 14063 0 2039250 préférences! i&faisant faire plusieurs tours de 360°, au cours de l'exposition de la bouteille aux micro-ondes dirigées vers la bouteille dans un plan généralement horizontal, c'est-à-dire perpendiculaire aux parois principales du récipient. Cette 5 méthode expose toutes les parois latérales principales du récipient, que sa section transversale soit circulaire, carrée, rectangulaire ou polygonale, directement aux radiations des micro-ondes. Après exposition à l'énergie de micro-ondes pendant leïaps 10 de temps requis, on arrête l'exposition à l'énergie de micro-ondes et on refroidit rapidement la substance contenant l'enzyme. On préfère, sous ce rapport, prolonger le traitement de refroidissement par le gaz réfrigérant après avoir arrêté l'exposition aux micro-ondes afin de refroidir ou congeler la substance contenant 15 l'enzyme, de façon à atteindre de préférence une température d'au moins environ 30° C. On peut réaliser ceci en laissant le récipient où se trouve la substance contenant l'enzyme dans la zone de traitement - dans laquelle on fait circuler le gaz réfri gérant après avoir coupé la source d'énergie de micro-ondes - ou, 20 dans le cas d'une chaîne de récipients - où se trouve la substance contenant l'enzyme-qui se déplace de façon continue, en prolongeant le mouvement au-delà du champ d'exposition directe aux microondes, alors que le gaz réfrigérant continue à s'écouler et à entrer en contact avec les récipients. Par ailleurs, on peut 25 refroidir la substance contenait l'enzyme par d'autres moyens, additionnels ou différents des moyens précédents, par exemple, par la mise en contact Il est plus facile de comprendre la présente invention en examinant les exemples spécifiques suivants qui sont donnés à titre d'illustration seulement et ne doivent pas être considérés comme limitant le cadre de l'invention de quelque façon que ce 35 soit. EXEMPLE 1 On a dissous la lactico-déshydrogénase ("IDH") dans une base aqueuse qui n'est pas du sérum tamponnée par du phosphate (pH environ 7,2) pour donner 627 unités/ml, et on a filtré la 40 solution dans un ultra-filtre. On a rempli des petites bouteilles 70 14063 9 2039250 de verre stériles (capacité nominale 7 ml) avec la solution, on les a fermées par un bouchon et on les a refroidies à. 5° C. OU a alors placé 48 des bouteilles dans une enceinte sous pression équipée d'un magnétron de 2 kilowatts relié à une source 5 de courant alternatif de 220 volts et capable de produire des micro-ondes dans l'enceinte à une fréquence d'environ 2450 mégahertz. On a réparti les bouteilles par groupes de 3 et l'on a monté chaque groupe sur un petit plateau circulaire individuel, on a monté tous les petits plateaux individuels sur un plateau 10 plus grand de façon à ce que, alors que le grand plateau tournait à la vitesse de 24 tours/mn, les petits plateaux individuels tournaient à 60 tours/mn; c'est-à-dire, les petits plateaux individuels tournaient 2,5 fois tandis que le grand plateau ne faisait qu'un seul tour. L'ensemble de plateaux était 15 constitué de polyméthylméthacrylate„ On faisait pénétrer dans l'enceinte de l'azote gazeux froid, puis on le faisait sortir de l'enceinte après l'avoir fait traverser sous une pression de 0,23 atmosphère , sa température d'entrée étant d'environ 2°G. On faisait alors fonctionner le magnétron pendant 62 secondes, 20 le magnétron et le guide d'ondes associé étant placés de façon à diriger les micro-ondes dans une direction horizontale vers les parois latérales des bouteilles0 La température maximum atteinte par la sçlufeiçn était d'environ 49? Après avoir arrêté 3e magnétron (après l'exposition de 62 secondes) on continuait 25 à faire circuler l'azote gazeux froid pendant une courte période jusqu'à ce que la solution soit portée à environ 27°C. On arrêtait la rotation de l'ensemble des plateaux circulaires, on ouvrait l'enceinte et on retirait les bouteilles de 111 enceinte, puis on les refroidissait immédiatement à 5° C dans un bain d"eau glacée. 30 On entreposait les échantillons traités, en même temps que les témoins non traités à différentes températures et l'on pratiquait une série d'essais avec les résultats suivants : Substance traitée : 5°C : après 13 jours, 583 unités/ml; après 20 jours, 375 unités 35 par ml. 2I°C : après 13 jours, 497 unités/ml; après 20 jours , 375 unités par ml. 38°C : après 13 jours, 520 unités/ml; après 20 jours, 400 unités par ml. 70 14063 10 2039250 témoin : 5° C : après une semaine, 315 unités/ml; après13 jours, O. 21°C ; après une semaine, 0. 38°C : après 48 "heures, 0. 5 EXEMPLE 2 On dissolvait la transaminase glutamique-oxalacétique du sérum (T.G.O.S.) dans une base aqueuse qui n'était pas du sérum tamponnée par du phosphate (pH approximatif 7,2) pour donner 37 unités/ml, et on filtrait dans un ultra-filtre. On 10 mettait la solution en bouteilles, on la traitait, on la stockait et 1'on pratiquait des essais comme dans l'exemple 1 avec les résultats suivants : Substance traitée : ;1°C s après 13 jours, 26,7 unités/ml? après 20 jours, 20 unités/ml 22®cs après 13 jours, 13 unités/tel; après 20 jours, 10 unités/ml 38aCî après 13 jours, 16 unités/ml7 après 2(j jours, 3 unités/ml, témoin s HCC s après une semaine, 0 s après 4 jours, O 20 3g°c s après 48 heures, 0 EXBMP&E 3 On a reconstitué QinQ -.-ni 11 igrammes de désoxyribonucléase, provenant sm pancréas de bovin , s?ec 1 ml d'eau distillée, puis on l'a dilué à 800 rai par l8ese distillée. On a filtré la solu-tion â travers un ultra-filtre», Après filtration, 1*activité de départ était de 786 imités par mg. On a rempli des petites bouteilles en verre stériles (capacité nominale 7 ml) avec la solution, on a posé un bouchon et l'on a refroidi à 5°C . On a alors traité différants échantillons (24 bouteilles par lot) comme dans l'exemple. 1, mais avec différentes durées d'exposition qui sont les suivantes : Echantillon Durée d'exposition Tempèreture maximum de l'échantillon A 60 environ 44° C 35 S 68 environ 46° C c 74 environ 50° C Après les avoir retirés de l'enceinte à environ 27" C et les avoir refroidis à 5° C dans un bain d'eau glacée, on a entreposé les échantillons traités de même que les témoins non 40 traités à la température de 25® C pendant 21 jours. 70 14063 ii 2039250 On a alors effectué des essais sur tous les échantillons grâce au spectrophotomètre Beckman DU dans la gamme de longueurs d'ondes des rayons ultra-violets permettant de déterminer la densité optique en utilisant la méthode dTessai selon Kunitz, M-. J-fflfegk. 5 Phvsiolog y33, 349 (1950). Les résultats étaient les suivants : Echantillon Essai 4- (unités/mg) A 475 B 520 10 C 450 Témoin 200 ♦ Moyennes de 2 bouteilles provenant de chaque traitement, trois échantillons séparés provenant de chaque bouteille. EXEMPLE 4 15 On a dissous la lactico-déshydrogénase, qui est 1'isoen zyme de la fraction du foie, extraite d'un coeur de bovin, dans de l'eau distillée stérile à une unité/ml, et l'on a filtré la solution à travers un ultra-filtre. On a rempli des petites bouteille^ en verre stérile (capacité nominale 7 ml) avec la 20 solution, on les a fermées avec un bouchon et on les a refroidies à 5° C. On a alors exposé 48 des bouteilles aux micro-ondes en présence d'azote froid gazeux, comme dans l'exemple 1, sauf que le temps d'exposition était de 56 secondes. Après les avoir retirées de l'enceinte à une température d'environ 27° C et les 25 avoir refroidies à 5° C, on a stocké les échantillons traités ainsi que les témoins non traités à la température ambiante. Les témoins devenaient complètement inactifs au bout d'une nuit, alors que la substance traitée était aussi active que la substance initiale après un vieillissement de trois semaines. Au bout de 30 trois mois, la perte d'activité était inférieure à 10 % dans la substance traitée. EXEMPLE 5 La lactico-déshydrogénase qui est 1'isoenzyme de la fraction du coeur, extraite du muscle du lapin, était dissoute dans 35 de l'eau distillée stérile (une unité/ml), et l'on filtrait la solution à travers un ultra-filtre. Après mise en bouteille et fermeture par un bouchon, on traitait la substance puis on la stockait comme dans l'exemple 4. Les témoins devenaient complètement inactifs au bout d'une nuit, alors que la substance 40 traitée était aussi active que la substance initiale après 70 14063 12 2039250 vieillissement pendant trois semaines. Au bout de trois mois, la perte d'activité était inférieure à 10 % pour les substances traitées. EXEMPLE 6 5 On préparait une solution aqueuse d'amylase (1000 unités par ml) et l'on filtrait à travers un ultra-filtre et l'on plaçait 10 ml de cette solution dans six petites bouteilles en verre stériles (capacité nominale 10 ml) qu'on encapuchonnait, On refroidissait alors les six bouteilles à 5° C, et l'on 10 plaçait trois d'entre elles dans une enceinte sous pression,équipée d'un magnétron de 2 Kw connecté à une source de courant alternatif de 220 volts et pouvant produire des micro-ondes dans l'enceinte à une fréquence d'environ 2450 mégahertz. On montait chaque bouteille sur un plateau circulaire individuel, chacun de 15 ces plateaux étant monté sur un plateau plus grand, si bien que le grand plateau entraînait les petits plateaux individuels et les bouteilles qui s'y trouvaient placées tournaient également. L*ensemble de plateaux circulaires était constitué de polyméthyl-méthacrylate. Le grand plateau circulaire ainsi que les petits 20 plateaux circulaires individuels tournaient à 30 tours/mn. L'azote froid gazeux pénétrait dans l'enceinte, la traversait et en sortait sous une pression de 0,23 atmosphères, sa température d'entrée étant d'environ 2° C. On faisait fonctionner alors"le magnétron pendant 7 secondes, le magnétron et le guide d'ondes 25 associé permettant de diriger les micro-ondes dans un plan horizontal en direction des parois latérales des bouteilles. Après avoir arrêté le magnétron (après l'exposition de 7 secondes)on prolongeait la circulation d'azote froid pendant une courte période jusqu'à ce que la solution d'amylase dans les bouteilles exposées 30 soit revenue à environ à 27° C. On arrêtait les plateaux circulaires et l'on retirait des bouteilles de l'enceinte, on les refroidissait immédiatement à 5° C dans un bain d'eau glacée et, en même temps que les trois bouteilles témoin non traitées, on les maintenait à 5° C pendant 48 heures. On essayait alors tous 35 les échantillons pour déterminer l'activité de l'amylase et l'on obtenait les résultats suivants (les chiffres sont des moyennes) : substance traitée 800 unités/ml Témoin 200 unités/ml 40 70 14063 13 2039250 EXEMPLE 7 On filtrait du sérum sanguin humain frais à travers un ultra-filtre et on le plaçait dans des bouteilles stériles en verre, dans les proportions de 30 ml par bouteille, on fermait 5 les bouteilles avec des bouchons et on les refroidissait à 5° C. On exposait alors trois des bouteilles aux micro-ondes en présence d'un écoulement d'azote gazeux sous une pression identique à celle de l'exemple 6 mais pendant seulement 15 secondes» Après les avoir retirées de l'enceinte à environ 22 - 24° C, 10 on refroidissait immédiatement les bouteilles à 5° C dans un bain d'eau glacée. On stockait alors les bouteilles en même temps que les témoins non traités à 5° C, et l'on pratiquait périodiquement des essais. Au bout de deux semaines, le résultat des essais biochimiques des témoins avait changé si bien qu'il ne 15 répondait plus aux gammes normales des enzymes. On analysait périodiquement la substance traitée, après un stockage continu à 5° C, pendant une période de 9 mois et l'on obtenait les résultats suivants : \ \ \ \ \ 70 14063 14 203925U TABLEAU 1 Constituant Jours 30 90 150 230 270 Limite supé Sodium rieure 145 143 142 142,5 142 Moyenne 141,8 140,8 140,9 141 141,5 Limite infé rieure 140 139 139/5 139,7 139 Limite supé rieure 4,3 4,4 4,3 4,4 4,4 Potassium Moyenne 4,0 4/0 4/0 4,3 4,3 Limite infé rieure 3,9 3,8 3,92 3,94 3,8 Limite supé rieure 101 100,4 102 100 100 Glucose Moyenne 98/ 8 99,0 98/8 97,5 97,5 Limite infé rieure 90,5 93, 6 93,5 93/2 91/4 Phosphatar Limite supé- 34,1 34,5 35,0 se Alcaliœ rieure 34,0 34,1 Moyenne 32, 9 33,2 33,4 33, o 33,0 . Limite infé rieure 30,0 30,2 31/0 30, 9 30/5 Limite supé rieure 20 25,7 25,0 24/0 23,-5 ïgos * Moyenne 25,1 24/5 24,0 23,8 22,8 Limite infé rieure 22*5 21(? 8 21/0 20,0 20,0 4- TGPS Limite supé rieure 21, o 20,7 20,g 20/0 19,0 Moyenne 20,2 19,0 19,2 19,0 18,7 Limite infé rieure 19,5 18,4 18,3 18/0 17/8 Limite supé LDH rieure 210 204 204 201 198 (total) Moyenne 200 196 196 196 190 Limite infé rieure 190 192,2 192 190 188 Isoenzy Limite supé me s LDH rieure 23,4 22,6 22,8 22,1 22/5 (fraction Moyenne 22, 5 21,5 21,3 21,4 21,2 du foie s Limite infé IDH-^ ) rieure 21,2 20/4 20,0 19,4 -19,0 Fraction Limite supé Su coeur rieure - 46; 5 45,8 44,0 43, 6 43,1 (idh5) Moyenne 44, 6 44/0 43,2 42, 9 42/6 Limite infé rieure 40,8 41,8 41,0 40/2 40,3 lo 15 20 25 30 35 40 70 14063 15 2039250 Valeurs au bout d'un temps exprimé en jours restantes (I£H0 o 10 Amylase Créatine phospho-kinase (C.P.K.) 15 Protéine •totale 20 Albumine 25 b Jours 30 90 150 210 270 Limite supé 134 134 134 132 132 rieure Moyenne 132,5 132,4 132 131,4 130,2 Limite infé rieure 130, 6 130,2 129,5 129,2 128 Limite supé 68 67 65 66,5 65 rieure Moyenne 65 64 63, 6 63,7 62,6 Limite infé rieure 62,5 61,8 61,3 61,6 61,4 Limite supé rieure 6,1 5,8 5,7 + * * + Moyenne 5,3 5,4 5,0 Limite infé rieure 4,8 4,5 4,2 Limite supé rieure 7,5 7,5 7,5 7,5 7,4 Moyenne 7,2 7,4 7,3 7,3 7,3 Limite infé rieure 6,9 7,0 7,1 7,0 7,0 Limite supé rieure 4,00 4,25 4,12 4,19 4,11 Moyenne 3,82 3,87 3, 90 3,87 3,92 Limite infé rieure 3,42 3,44 3, 56 3,51 3,70 Limite supé rieure 3,00 3,02 3,00 2,94 2,98 Moyenne 2,80 2, 90 2,88 2, 91 2,90 Limite infé rieure 2,55 2,66 2,61. 2, 60 2,70 30 TGOS est la transaminase glutamique-oxalacétique du sérum ■f TGPS est la transaminase glutamique_ pyruvique de sérum 4- IDH est la lactico-déshydrogénase 4- *■ Pas d'autres essais pratiqués. La substance traitée présentait une électrophorèse nortriale tout au cours de la période d'essai. Les valeurs normales pour ces constituants sont les suivantes : 35 40 70 14063 16 2039250 TABLEAU 2 10 Valeurs normales 135 - 145 méq./l. 3/5 - 5,0 méq./l, 65 - 1LO mg % 5-35 unités (International) 5-40 unités (International) 5-35 unités (International) 150 - 500 unités (International) 10 - 20 % du total 20 - 40 % du total 35 - 55 % du total 50 - 160 unités (Diastase) jusqu'à 35 unités (International) 6,8 - 8,0 mg. % 3,25 - 5,70. gm % 1,5 - 3,0 gm % 20 Des modifications considérables sont possibles tant dans les substances contenant les enzymes traitées que dans les techniques particulières employées,sans s'éloigner du cadre de l'invention. 15 Constituant Sodium Potassium Glucose Phosphatase alcaline T.G 0 S TGPS L D H (Total) LDH (fraction foie) LDH (fraction coeur) IDH (fractions restantes) Amylase Créât inephospholcinase Protéine totale Albumine Globuline 70 14063 17 2039250 REVENDICATIONS 1.- Une méthode pour améliorer la stabilité d'une enzyme, caractérisée par • le fait qu'on refroidit l'enzyme en milieu aqueux à une température inférieure à 10° C et puis que, rapidement 5 et successivement (a) on soumet l'enzyme - dans une zone de traitement, alors qu'elle est maintenue dans un récipient fermé, perméable aucmicro-ondes, placé dans ladite zone de traitement -à l'énergie de micro-ondes se propageant dans une atmosphère mouvante de gaz réfrigérant, pendant une courte période d'inacti-10 vation de l'enzyme, ladite atmosphère mouvante étant en contact direct avec les parois perméables aux micro-ondes dudit récipient* mais non en contact direct avec ladite enzyme, et étant à une température inférieure à 16° C lors de son admission dans ladite zone de traitement; (b) on arrête l'exposition de ladite enzyme 15 à ladite énergie de micro-ondes à la fin de ladite période et (c) on refroidit ladite enzyme. 2.- La méthode selon la revendication 1, caractérisée par le fait que lesdites micro-ondes ont une fréquence comprise entre environ 1000 et environ 5000 mégahertz. 20 3»- Une méthode selon la revendication 2, caractérisée par le fait que les dites micro-ondes ont une fréquence comprise entre environ 2000 et environ 3000 mégahertz. 4.- La méthode selon la revendication 3, caractérisée par le fait que lesdites micro-ondes ont une fréquence comprise entre 25 environ 2400 et environ 2500 mégahertz. 5.- Une méthode selon la revendication 1, 2, 3 ou 4, caractérisée par le fait que, après exposition à l'énergie des micro-ondes, on continue à soumettre l'enzyme traitée qui se trouve dans le récipient, à 1*fiction dudit gaz réfrigérant, 30 6.- Une méthode selon la revendication 1, 2, 3, 4 ou 5, caractérisée par le- fait que ladite enzyme en milieu aqueux est au moins une de celles qu'on trouve dans le sérum sanguin. 7.- Une méthode selon la revendication 1, 2, 3, 4 ou 5, caractérisée par le fait que l'enzyme en milieu aqueux est cons- 35 titué par le sérum sanguin. 8.- Une méthode selon la revendication 7, caractérisée par le fait qu'on refroidit le sérum sanguin à une température d'environ 2° C à' environ 7° C avant de l'exposer à ladite énergie de micro-ondes. 40 9.- Une méthode selon la revendication 7 ou 8, caractérisée 70 14063 18 2039250 par le fait que la température du sérum sanguin ne dépasse pas environ 52° C durant ladite exposition à ladite énergie de micro-ondes. 10.- Une méthode selon la revendication 7, 8 ou 9, caractérisée 5par le fait que, après avoir cessé d'exposer ledit sérum sanguin à ladite énergie de micro-ondes, on refroidit ledit sérum sanguin à une température inférieure à environ 10° C. 11.- Une méthode selon la revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caractérisée par le fait que la quasirtotalité des parois principales dudit récipient perméables aux micro-ondes sont exposées directement à ladite énergie de micro-ondes durant la- 10 dite exposition. 12.- Le sérum sanguin traité selon la méthode de la revendication 7, 8, 9, 10 ou 11, dans lequel les enzymes en son sein possèdent une stabilité améliorée à la détérioration, par rapport à celle du sérum sanguin similaire non traité de cette façon.