Brevet FR2051519A1 — publié le 19710409

-1- 2051519 La présente invention concerne un nouveau'vaccin,. dans leq.uel du diéthylaminoéthyldextrane est ajouté directement comme adjuvant à une solution d'antigènea A côté d'une augmentation importante de la formation, d'anticorps et d'une plus grande persistance du 5 titre des anticorps, ce nouveau vaccin provoque également chez les sujets vaccinés un renforcement considérable de 1*immunité, comparativement à l'application de.l'antigène seul. La nécessité d'associer des antigènes avec des adjuvants pour atteindre un meilleur pouvoir immunogène est un fait connu. Il 10 existe toute une série d'adjuvants qui sont utilisés à cette fin ; parmi ces adjuvants> les plus courants sont des émulsions du type eau—dans-îiuile et 1 ' hydro xyde d1 aluminium. Selon l'antigène qui est utilisé avec eux, ou suivant l'espèce animale, à laquelle les vaccins sont administrés, ces adjuvants 15 donnent des résultats différemment favorables ou des résultats moins favorables. Tous les adjuvants mentionnés ci-dessus ont pour trait commun de représenter une grande proportion du vaccin, à savoir 25 à 50 En outre, des effets secondaires prononcés peuvent se manifester au point de vaccination, en particulier dans le 20 cas d'adjuvants contenant une huile minérale» Pour cette raison, il a été indispensable de trouver un adjuvant qui : a) augmente considérablement l'activité immunogène d'antigènes, c'est-à-dire la formation d'anticorps et lîiaimuxiité, à savoir en ce 25 qui concerne tant leur déclenchement que leur durée i b) présente line toxicité relativement faible, de manière qu'il n'apparaisse que de légères réactions d'immunisation qui ne conduisent pas. à des déformations permanentes aux points de vaccination, ce qui a une importance particulière dans le cas d'animaux 30 de boucherie ; c) qui déploie une activité totale chez tous les animaux et aussi, éventuellement,chez les êtres humains ; d) qui occupe une faible fraction du volume du vaccin, de manière que la presque totalité de ce dernier se compose seulement 35 d'antigène. Ceci a pour conséquence que la dose de vaccin peut être fortement réduite ou que, dans le cas d'antigènes faibles, une dose de vaccin peut apporter une bien plus grande quantité d'antigène BAD ORIGINAL 70 17449 -s- 2051519 que cela nra été possible jusqu'à présent et s) ne nécessite pas de manipulations coûteuses et peu pratiques pour la préparation du Taccin. La Demanderesse vient de découvrir que le diéthylaminoéthy1-5 dextrane satisfait dans une large mesure à ces conditions. La proportion d'adjuvant conforme à l'invention dans un vaccin doit représenter 5 à 250 mg dé diéthylaminoéthyldextrane par ml de vaccin, et on a constaté que la quantité optimale est de 50 mg. 10 Le diéthylaminoéthyldextrane est ajouté tel quel à l'antigène Il est alors recommandable de procéder de la façon suivante : en introduit une quantité correspondante de diéthylaminoéthyldextrane dans un récipient approprié . Ëans le cas d'antigènes sensibles aux acides, on compense la valeur acide de pH du diéthylaminoéthyldex-15 trane par addition d'un tampon correspondant« On a constaté que le moyen le plus pratique est d'utiliser à cet effet une solution saturée de t:ns—{jbydroxyméthyl-amino-méthane}. Lorsque le pH initial de la solution d'antigène est de 7,8-8,0, il est nécessaire d'ajouter environ 2,25 ml de solution saturée de tris-(hydroxyméthyl-20 smino-méthans) par 10 g de diéthylaminoéthyldextrane, pour obtenir dans le vaccin final une valeur de pH de 7,4 à 7,6. Si l'on désirs des valeurs de pH plus hautes ou plus basses, on doit ajouter en conséquence une quantité plus grande ou plus faible de tampon au tris-(hydroxyméthyl-amino~méthane)„ Le diéthylaminoéthyldextrane 25 additionné du tampon est stérilisé par chauffage à l'autoclave à 110-120°C pendant 20 à 30 minutes. Après refroidissement total, on ajoute la solution d'antigène au diéthylaminoéthyldextrane solidifié et on maintient le mélange pendant au moins 48 heures à une température convenable, en agitant éventuellement par secousses. 30 Cette période de temps suffit habituellement pour dissoudre le diéthylaminoéthyldextrane* Après cette dissolution, en agite le vaccin par secousses pendant une heures, puis on le laisse encore reposer pendant au moins 24 heures fe une température convenable, jusqu'à son utilisation. 35 • On" peut utiliser cotisas àatigèzi© toutes les substances' âcuées d'activité immïmogène" , à' l'état purifié, partiellement purifié ou - non purx-fié. Les propriétés toatiûues ou virulèntes tes antigèness BAD ORIGINAL 70 I7kk9 -3- 2051519 qui existent éventuellement, sont réduites ou détruites avant l'addition du diéthylaminoéthyldextrane, à un point tel que les antigènes ne présentent aucun danger pour le sujet que l'on vaccine. Les antigènes peuvent être ajoutés individuellement, ou bien on 5 peut en ajouter plusieurs. Le diéthylaminoéthyldextrane peut aussi être ajouté .en association avec d'autres adjuvants, par exemple l'hydroxyde d'aluminium, la saponine, des adjuvants à base d'huile, etc. A titre d'exemple d'application de vaccins contenant du 10 diéthylaminoéthyldéxtrane, on indique un essai d'immunisation chez le porc avec un vaccin constitué par le virus inactivé de la fièvre . aphteuse et le diéthylaminoéthyldextrane utilisé comme adjuvant . Le système expérimental choisi convient particulièrement bien pour déceler l'activité de vaccins contenant du diéthylaminoéthyldextra-.15 . ne, car il est généralement connu que des- porcs peuvent difficilement être-immunisés avec les vaccins usuels déjà connus et utilisés contre la fièvre aphteuse. La protection par le vaccin ne s'étend -généralement que sur quatre semaines et,pendant cette: période de temps, les titres des anticorps à effet neutralisant sont faibles 20 et n'atteignent que dans quelques cas des valeurs de 1:50. On a inoculé à 15 porcs des vaccins comprenant le virus du type 0 de la fièvre aphteuse, inactivé par 1'éthyléthylènimine, et 50, 100 et 200 mg de diéthylaminoéthyldextrane.par ml. L'inoculation a été effectuée par voie sous-cutanée avec des doses de 25 10 ml. Des échantillons de sérum de .ces animaux ont été prélevés à des époques•différentes et on a recherché leur teneur en anticorps à effet neutralisant. Douze semaines après la vaccination, l'infec-.tion expérimentaledes sujets vaccinés est effectuée par mise en 30 cohabitation avec des porcs témoins infectés par le virus de la fièvre aphteuse et non protégés par le vaccin. Les résultats de cet essai sont reproduits sur- le tableau I. Le Tableau II donne les résultats d'un essai d'immunisation sur le cobaye. Pour la préparation des vaccins, on utilise une 35 suspension de virus de la fièvre aphteuse du type 0, inactivée à 37°C. On ajoute du diéthylaminoéthyldextrane en diverses quantités. On injecte par voie intramusculaire à chaque cobaye 0,5 ml du même 70 17449 -4- 2051519 vaccin, en quatre endroits différents. On effectue un autre essai avec le -virus inactivé de la rhinotrachéite "bovine infectieuse. Ce virus appartient au groupe des virus.contenant de l'acide désoxyribonucléique, tandis que le 5 virus de la fièvre aphteuse fait partie du groupe des' virus contenant de l'acide ribonucléique. L'activité en tant qu'adjuvant du diéthylaminoéthyldextrane est confirmée dans cet: essai également. Il ressort des résultats indiqués que'le diéthylaminoéthyldextrane, en liaison avec un antigène, satisfait entièrement aux 10 conditions imposées à un antigène, comme défini ci-dessus. a) Ce. composé augmente considérablement l'activité immunogène d'antigènes, comme le montrent la formation rapide d'anticorps chez le porc (quatrième jour après la vaccination), les titres élevés en anticorps chez le porc et le cobaye et la longue persistance des 15 anticorps, de même que l'immunité atteignant pratiquement 100 fo chez les porcs vaccinés, douze semaines après la vaccination. b) Il est peu toxique, car quatorze à seize.semaines après la vaccination, on ne peut plus constater de déformations notables aux points de vaccination chez les porcs vaccinés. 20 c) Il agit tout aussi bien sur diverses espèces animales, com me l'ont montré des essais effectués sur le porc, le cobaye, le lapin et la souris. Il- ressort en outre du Eiode de préparation indiqué ci-dessus, que le diéthylaminoéthyldextrane satisfait également aux conditions 25 mentionnées précédemment en d) et e), c'est-à-dire qu'il représente une faible fraction du volume total du vaccin et que des manipulations peu pratiques ne sont pas nécessaires pour la préparation du vaccin. TABLEAU I Vaccination du porc avec un vaccin préparé à partir du virus de la fièvre aphteuse et contenant du A-î p-HViyl «p-i noéthvldextranç Evolution dçx'infection 0^) Aphtes \1 O J—A \i 4> -P-kO Nombre de porcs Nature du vaccin Titre de neutralisation dos sérums après inoculation^ 0 2 4 8 2 4 6 8 10 12 Tour Jours Jours Jours Semai- Semai- Semai- Semai- Semai- Semaines nés nés nés nés nés T, Réaction au point d'inoculation 14—16 semaines après la vaccination 97 98 101 103 107 virus inactivé de la fièvre aphteuse + 50 mg de DEAE-D* par mli Dose inoculée 10 ml» voie sous-ffUlifflléfl - 595. 243 5450 1690 345 186 1400 705 700 122 21 166 113 21 „ 2000 7200 3600 5950 2700 Ju5) 1255 2350 1850 »*♦ 53 (■ 25 102 300 '81 785 2100 150 195 195 113 39»1 39,9 néant 39,4 39,7 néant 39,8 40,2 néant 39,1 39,1 néant \trèg légère induration du tissu adipeux néant néant i ui i 99 102 104 105 m virus motivé de la fièvre aphteuse + 100 mg de DEAE-D* par ml. Dose inoculée 10 ml. Voie .sous-outanée 96 130 5450 1600 405 '195 77 73 170 390 195 49 58 10 ' . 13 545 405 4700 4150 345 49 130 64 112 510 3900 4150 995 113 365 130 195 995 1 010 450 280 195 85 79 39.2 39,5 néant 39,0 39,9 néant • 39,5 41,0 39,0 39,5 néant 39.3 39,6 néant néant' néant néant néant néant l\D O. LTl l_> kO o TABLEAU I (Suite) . h—^ Vaccination du. porc avec un vaccin préparé à partir du virus de la "Vl fièvre aphteuse et contenant du diéthylaminoéthyldextrane -P^ Nombre de porcs Nature du vaccin 1 ) Titre de neutralisation des sérums après inoculation 0 2 4 8 2 4 6 8 10 12 Jour Jours Jours Jours Semai- Semai- Semai- Semai-* Semai- Semaines nés ' nés nés nés ' nés '■ ' ' ■ ' ' 2) Evolution de l'infection T^ T±4^ Aphtes Réaction au point d'inocui-lation 14-16 semaines après la vaccination 100 106 108 109 110 virus irac-tivé de la fièvre aphteuse + 200 mg de DEAE-D* par ml.Dose inoculée 10 ml. Voie sous-cutanée 2 12 235 300 40 21 7 4 1 1 12 595 6200 4150 595 510 680 260 37 545 504 4350 6) - 5 9 129 235 130 55 42 13 7 16 4900 2000 1220 345 73 86 39,1 39,6 néant 38,9 40,6 néant 39,3 39,7 néant 39,1 39,9 néant ■néant ...néant . légère indura-fcion du tissu adipeux 127 128 virus actif de la fièvre aphteuse (témoin) - 39.1 41,6 39.2 41,3 G39) IV) O UT I-* UT h-* VO 70. 17449 -7- 2051519 Remarques : 1) Valeur réciproque des titres dans le sérum après les nombres indiqués de jours ou de semaines. 2) Infection expérimentale des sujets vaccinés par cohabitation avec les témoins ET0 127 et 128. 3) Température corporelle avant l'infection expérimentale. 4) Température corporelle maximale enregistrée dans l'intervalle de 1 à 7 jours après l'infection expérimentale. 5) Mort .consécutive à une défaillance circulatoire. 6) Sujet abattu en raison d'un fort amaigrissement. 7) Formation d'aphtes sur un doigt. 8) Formation d'aphtes sur les quatre doigts. 9) Formation d'aphtes sur trois doigts, l'ahimal meurt à la suite d'une myocardite provoquée par la fièvre aphteuse. * diéthylaminoéthyldextrane Formation d'anticorps à effet neutralisant chez le cobaye après inoculation de vaccins de la fièvre aphteuse contenant différentes TABLEAU II quantités de diéthylaminoéthyldextrane Quantité de DEAE-D par ml de vaccin Valeurs de BIL» des sérums pu 4 semaines après la vaccination 5 mg 15 mg 1-:64 - 1:280 1:151 1:195 - 1:1080 . 1:451 1:235 - 1:1500 1:937 1:30.0 - 1 r 1500 1:674 négatif - 1:21 1:10 30 mg 45 mg 60 mg témoin ^ 70 17449 -s- 2051519 Remarques : 1) Valeurs extrêmes 2) Valeur moyenne des titres individuels de 6 cobayes. 3) Virus. inactivé sans adjuvant. 70 17449 -9- 2051519 atmiiroinATioitR 1. Vaccin destiné à l'immunisation active comprenant comme adjuvant le diéthylaminoéthyldextrane. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient comme antigène le virus inactivé de la fièvre aphteuse.