Brevet FR2027068A1 — publié le 19700925

-1- 2027068 la L-asparaginase est un enzyme connu ; on peut l'obtenir par extraction de cellules de E. coli. [H.A. Campbell, L.T. Mashburn, E.A. Boyse, L.J. Old, "Biochemistry" 6 (1967), pages 721 à 730, cet ouvrage fournissant d'autres références biblio-5 graphiques]. La L-asparaginase a pris récemment de l'importance comme médicament contre des tumeurs dont la croissance nécessite de la L-asparagine. Toutefois, on se heurte à des difficultés pour débarrasser 10 la L-asparaginase du pyrogène qui lui est associé. Le brevet français n° 69.07.391 du 14 mars 1969, déposé par la même Demanderesse, ou brevet belge n° 729.495, a déjà fait connaître un procédé qui se base sur la découverte selon laquelle la L-asparaginase montre une étonnante stabilité thermique en présen-15 ce de glycine, et peut donc être séparée des protéines sensibles à la chaleur. Le brevet français n° 181.248 du 27 décembre 1968, déposé par la même Demanderesse, ou brevet belge n° 726.113» décrit la précipitation fractionnée de l'enzyme L-asparaginase avec le poly-20 éthylène-glyçol. Les deux procédés, séparément ou ensemble, conduisent à un enrichissement de la L-asparaginase, mais il reste encore des quantités plus ou moins faibles de protéines étrangères. La Demanderesse vient de découvrir que le fractionnement 25 par précipitation, effectué à 40-60°, de préférence à 52°C, conduit à un enrichissement sélectif de la L-asparaginase. Ce procédé conforme à l'invention offre l'avantage d'un raccourcissement considérable du processus de purification, car on obtient directement de la L-asparaginase très purifiée et pauvre en pyrogène. 30 Pour la conduite du procédé conforme à l'invention, on fait passer en solution aqueuse à 0,5-15 des L-asparaginases qui présentent un degré de pureté d'environ 0,5 à 20 unités/mgo' On ajoute environ 3 $ en poids de glycine. On règle le pH à une valeur de 7 à 9. On chauffe la solution à 52°C. La matière inerte 35 qui précipite alors au bout de 2 heures est séparée par centrifu— gation et la solution limpide est soumise à une précipitation fractionnée avec une solution de polyéthylène-glycol chauffée à 52°C. 69 44910 -2- 2027068 EXEMPLE 1 On dissout dans 10 litres d'eau 1 kg de L-asparaginase ayant une activité spécifique de 3,0 unités/mg de substance. On ajoute 300 g de glycine et on ajuste le pH de la solution à 8,3. 5 On chauffe la solution à +52°C et on la maintient ainsi pendant 3 heures. La protéine qui précipite après cette opération est isolée par centrifugation (6000tours/minute, pendant plus de 20 minutes). La liqueur limpide de centrifugation est additionnée de 20 volumes fo d'une solution de polyéthylène-glycol, puis cen-10 trifugée. Ensuite, on ajoute encore 50 $ &e solution de polyéthylène-glycol, et on centrifuge de nouveau. La fraction précipitée après addition de la seconde portion de polyéthylène-glycol est centrifugée, reprise de nouveau dans l'eau à environ 10 %, encore additionnée de 3 $ de glycine, chauffée à 52°C et de nouveau pré-15 cipitée avec 60 $ de solution de polyéthylène-glycol à 52°C, centrifugée, lavée à l'acétone et séchée. Le rendement est de 10 g de substance ayant une activité de 225 unités/mg. EXEMPLE 2 20 On procède comme dans l'exemple 1, mais on ne chauffe qu'à +50°C et on ajuste la valeur de pH à 8,9. Le rendement à partir d'un kilo d'asparaginase brute ayant une activité de 3,2 unités/mg de substance est de 12,0 g, avec une activité de 185 unités/mg de substance. 25 EXEMPLE 3 On procède comme décrit dans l'exemple 1, mais on chauffe à 55°C et on ajuste la valeur de pH à 7,5. Le rendement à partir d'un kg d'asparaginase brute ayant une activité de- 2,8 unités/mg de substance est de 9,5 g, avec une 30 activité de 193 unités/mg de substance. 69 44910 2027068 -3- - REVENDICATION -Procédé de préparation de L-asparaginases pauvres en pyrogène, caractérisé par le fait qu'on fait subir une précipitation fractionnée à des solutions aqueuses de L-asparaginase en présen-5§ ce de glycine, à 40-60°C, de préférence à 52°C, avec du polyéthylène-glycol .