Brevet FR2019085A1 — publié le 19700626

La présente invention est relative à des produits de polymère-asparaginase, dans lesquels l'asparaginase est liée par covalence. Elle se rapporte également au traitement de matières contenant de l'asparagine avec de tels produits de polymère-asparaginase. Ces produits, qu'ils soient solubles ou insolubles dans l'eau ou en solution aqueuse, sont stables et d'une longue durée d'action, et on a trouvé en outre que1 de façon inattendue, ils ne contiennent pas de toxines ou de pyrogènes ou ne sont pas sujets à une souillure par ces toxines et pyrogènes qui sont normalement associés aux extraits enzymatiques natifs de départ,et qu en outre ils sont remarquablement résistants aux détériorations dues à des attaques par d'autres enzymes, en particulier ceux qui sont normalement présents dans les fluides du corps, comme le sang, et aux détériorations d'une nature autogène. De plus, ces produits sont récupérables et réutilisables ,et ils pénètrent aisément les tissus lorsqu'ils sont sous une forme soluble, forme dans laquelle ils sont en outre les plus actifs, de sorte qu'ils conviennent remarquablement bien pour la séparation de l'asparagine à partir de matières en contenant, notammént des cultures de tissus, des tissus et des fluides du corps, comme le sang, soit par application directe de lrun à l'autre sous forme solide ou liquide, soit en faisant passer la matière traitée sur ou à travers le produit de polymère-asparaginase, par exemple dans une colonne ou un lit filtrant, ou lors d'un maintien en place dans un conduit par une plaque filtrante.En tout cas, les nouveaux produits de l'invention sont extrêmement efficaces et apportent une solution à de nombreux problèmes découlant de l'utilisa- tion de l'asparaginase elle-meme. La présente invention se rapporte donc à de nouveaux produits de polymère-asparaginase, solubles ou non dans l'eau, dans lesquels l'asparaginase est liée par covalence , l'invention se rapportant également à un procédé de préparation de ces produits. Suivant l'invention, ces produits peuvent en outre etre employés de manière très avantageuse et avec des résultats très intéressants dans la séparation de l'asparagine à partir de matières en contenant. Les avantacJes d'un tel traitement nouveau ont déjà été signalés et ils sont particulièrement remarquables lors d'une application à des tissus et fluides du corps1 par exemple le sang ou le plasma sanguin. Dans l'utilisation des produit~de l'invention, il est uniquement nécessaire que le produit de polymère-asparaginase (désigné ci-après par "PPAS") soit amené et maintenu en contact pendant une période de temps suffisante pour que ce PPAS agisse par voie enzymatique ou exerce son activité enzymatique sur le substrat contenant de l'asparagine traité . Le procédé exact employé est quelconque pour autant que ce principe de base soit observé. Le procédé utilisé pour l'utilisation de l'asparaginase elle-meme convient d'une manière générale. Un simple passage de fluides sur.une colonne de PPAS ou à travers des lits filtrants de cette matière, ou encore à travers un conduit dans lequel le PPAS est maintenu, ceci impliquant qu'il n'y a qu'un bref contact, suffit fréquemment.L'emploi de plus longues durées de contact peut être avantageux dans certains cas. L'amenée du PPAS solide, de préférence sous la forme de particules, avec ou sans liant pour le maintenir en place, en contact avec la matière à traiter est fréquemment le modus operandi le plus intéressant. L'introduction de polymère-asparaginase solide sous forme d'une colonne, d'une plaque ou de particules dans une solution ou autre matière fluide, et ensuite sa récupération en vue d'un recyclage dans le procédé présentent des avantages évidents pour de nombreuses applications. A titre de variante, lorsqu'il s'agit du traitement de tissus, de cellules ou d'une autre matière à pénétration difficile, il convient de recourir au PPAS soluble, sta ble;pur, auquel cas celui-ci peut être appliqué ou employé d'une autre manière sous forme d2un solide avec ou sans liant ou vé hicule pour le maintenir en place, ou encore sous forme d'une solution ou suspension aqueuse, par exemple par pulvérisation, traitement avec une éponge, étalement, ou encore en trempant la matière a tralter dans une solution ou suspension du PPAS.De plus, on peut avoir reccurs à des pulvérisations à aérosol ou à bouteille compressible pour l'application sous forme solide ou liquide, bien que l'on réalise évidemment les économies les plus grandes lorsque le PPAS est utilisé sous une forme solide réutilisable ou récupérable D'autre part, lorsque l'efficacité maximum est le critère important, comme lorsqu'une pénétration avec une activité prolongée et très élevée est critique, l'application de la forme soluble s'indique, en dépit de la possihilité de per tìnale de PPAS dans le procédé. Dans la description suivante, l'abréviation "EAM" désigne un polymère d'éthylène et d'anhydride maléique. Les poly- mères de ce type sont d'un grand intéret suivant la présente invention. Un polymère "type EAM * est défini ci-après. Les expressions "EAM-asparaginase" ou "EAi1/asparaginase" désignent un copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique, auquel de l'asparaginase est liée par covalence. Le produit est le mme que l'asparaginase soit mise en réaction directement avec un groupe anhydride du copolymère d'éthylène-anhydride maléique ou avec un groupe carboxyle de ce copolymère, et que l'on utilise ou non un mécanis- me activant intermédiaire pour les groupes carboxyles du polymère. Les groupes anhydrides ne participant pas à la réaction par laquelle on obtient le produit dans un milieu aqueux sont présents dans le produit sous forme de groupes carboxyles ou carboxylates. De tels groupes non participants peuvent cependant etre convertis en groupes amides, imides, esters, etc, comme ils peuvent être présents dans les polymères du type EAM, tels que définis ciaprès. L'asparaginase est liée au polymère en tout cas par une liaison d'amide ou d'ester ,effectuée par exemple par la réaction ou la combinaison de groupes carboxyles ou anhydrides du polymère avec des groupes amines ou hydroxyles de l'enzyme, non essentiels pour son activité enzymatique et qui y sont présents sous une forme libre ou non liée, par exemple dans la position epsilon d'un fragment de lysine ou dans une portion de thréonine ou de sérine de la molécule d'enzyme, théoriquement de manière habituelle dans l'amino-acide terminal de la channe protéique enzymatique. L'expression 11insoluble dans l'eau" signifie que le produit en cause ne se dissout pas dans 13eau ou dans des solutions aqueuses, bien qu'il puisse avoir des caracLéristiques telles qu'un degré élevez de gonflement du à une solvatation dans lue u, même au point d'exister sous forme de gel. IJ'expression 11soluble dans l'eau" signifie évidemment que le produit n'est pas insoluble dans l eau et est citrine plus complètement par la suite. On peut préparer des dérivés de polvmère-asparaginase en faisant réagir l'asparaginase cristalline ou brute avec le po-lymère en solution, avec pour résultat la formation d'un produit polymère dans lequel l'aspàraginase est liée par covalence. Comme un anhydiecarboxyle est présent dans le polymère, par exemple un polymère du type EAM, une liaison covalente de l'asparaginase au polymère peut etre réalisée directement par réaction ou combinaison avec un groupe anhydride ou avec un groupe carboxyle en utilisant un agent d'activation de carboxyle.Une telle activation peut être réalisée en utilisant divers carbodiimides, carbodimidazoles, réactifs de Woodward ou Sheehan, etc, pour former des intermédiaires très actifs capables de réagir avec des groupes -ode l'enzyme sous des conditions modérées, ces dernières favorisant la conservation de l'activité enzymatique. Le produit est le meme dans les deux cas. La gamme de pH pour la réaction est habituellement de 5 à 9,5, de préférence d'environ 6 à 8. L'isolement et la purification sont généralement réalisés suivant lesprocédés biochimiques normaux et par le procédé général des exemples suivants. Comme une liaison par covalence de l'asparaginase au polymère est désirée, la réaction est ordinairement réalisée à de basses températures et à des pH relativement neutres, dans de l'eau ou un tampon aqueux dilué comme solvant. Lors d'une mise en oeuvre de cette manière, il en ré sulte une production du dérivé actif désiré de polymère-asparaginase, mais le degré d'activité imparti au produit polymère est parfois inférieur au degré désiré, peut-8tre du fait d'une inactivation partielle de l'asparaginase durant le procédé. On peut avantageusement avoir recours à l'utilisation d'un système solvant mixte en utilisant un solvant dans lequel l'asparaginase est au moins partiellement soluble, habituellement une quantité allant jusqu a environ 50% en volumes. Le sulfoxyde de diméthyle convient spécialement bien comme solvant, en meme temps que de l'eau ou une solution aqueuse de tampon dans un système solvant mixte.En utilisant un tel système solvant mixte, le produit ac Lif désiré d'asprraginase-polymère est ordinairement obtenu en des rendements élevés et en de hautes conversions en un produit avantageusement actif, et l'introduction de sommes avantageusement élevées d'activité d'asparaginase dans la molécule de polymère est yénéralement moins difficile. Comme on l'a signalé, le polymère dans cette réaction contient des liaisons de carboxyle ou d'anhydride Le polymère est de préférence le EAM ou un polymère du type EAM, mais il peut s'agir de l'un quelconque des polymères décrits comme se combinant ou réagissant avec un enzyme, et en tout cas, il doit autre adapté à réaliser une liaison covalente avec l'asparaginase pour donner un produit d'asparaginase-polymère, soit directement, soit indirectement en utilisant un agent d'activation.Pour autant que l'on désire conserver l'activité d'asparaginase de l'asparaginase de départ dans le produit final, il est évidemment d'abord nécessaire que la liaison de l'asparaginase au polymère se fasse par un groupe qui ne soit pas essentiel à l'activité enzymatique,qu' il soit d'une nature catalytique ou prévu pour la liaison au substrat, de manière à ne pas provoquer une inactivation d'un site actif dans la molécule d'enzyme. Par conséquent, comme on l'a déjà signalé; la liaison à la molécule de polymère se fait par réaction de ce---poly.mère avec un groupe amino ou hydroxyle de manière à éviter l'inactivation de l'asparaginase durant la liaison à la molécule de polymère. Dans son contexte le plus large, le polymère auquel l'enzyme doit autre combinée suivant un pu plusieurs aspects de 1'invention comporte des liaisons carboxyles ou anhydrides. Comme on désire une liaison covalente, il doit autre entendu que le polymère porteur est prévu de manière à contenir , pour chaque molécule de polymère, au moins un site réactif avec lequel l'enzyme peut réagir, directement ou indirectement, pour produire une liaison covalente. Suivant la présente invention, ce ou ces sites réactifs sont de préférence constitués par un ou des groupes de carboxyle ou d'anhydride carboxylique. Parmi les polymères convenant pour la mise en oeuvre de la présente invention, on préfère des polyélectrolytes polymères comportant des unités de la formule dans laquelle : RAet Rgreprésentent de l'hydrogène, un halogène (de préférence du chlore), un alkyle de 1 à 4 atomes de carbone (de préférence le méthyle), le radical cyano, le phényle, ou leurs mélanges, pourvu que l'un des RA et R B au plus soit du phényle; Z est un radical bivalent (de préférence un alkylène, un phénylalkylène, un alkoxy inférieur alkylène ou un acyloxy aliphatique inférieur alkylène) de 1 à 18 atomes de carbone inclusivement; q est égal à zéro ou un; X et Y sont choisis parmi : hydroxy, -0 métal alcalin, OR, -OH-NH3, -OH-R3N, -OH-R2NH, -OH-RNH2, -NRR', -(Q) -W-(ER'R') , et -(Q) -W-(-OH) , où x a une valeur de p p 1 à 4 et p est égal à zéro ou un, R représente un alkyle, un phé nylalkyle ou un phényle, dans chaque cas de 1 à 18 atomes de carbone , R' représente H ou R, Q représente de l'oxygène ou -NR'-, et W est un radical bivalent de préférence constitué par un alkylène inférieur, un phényle, un phénylalkyle, un phénylalkylphényle ou un alkylphénylalkyle ayant jusqu'à 20 atomes de carbone; X et Y pris ensemble peuvent autre un atome d'oxygène, ou au moins l'un de X et Y est le radical hydroxyle.De nombreux parmi ces polymères sont disponibles sur le marché et d'autres sont de simples dérivés de produits- du commerce, qui peuvent facilement être préparés avant ou simultanément à la réaction de combinaison avec l'enzyme, ou bien que l'on peut produire par une petite modification du polymère de base après la combinaison.De tels polymères contenanttes unités décrites ci-dessus du type EAM sont désignés ci-après par "polymères du type EAM", Comme les molécules d'enzyme ont un poids moléculaire extrêmement élevé, même si les unités polym;resexemplifiéés- comme étant utilisables pour la liaison de l'enzyme ne se présentent qu'une seule fois dans une chaste de polymère ,par exemple une seule fois pour chaque groupe de plusieurs centaines d'unités, une réaction de l'enzyme avec cette unité aura pour résultat un produit d'enzyme-polymère ayant une activité enzymatique importante et dans lequel le fragment enzyme constitue une proportion importante du poids moléculaire du produit de polymère-enzyme. S'il y a plus d'une des unités exemplifiées, on peut arriver à des liaisons multiples avec une activité enzymatique accrue du produit. Comme on le signale par la suite, les unités de la formule donnée sont de préférence répétitives, n étant au moins égal à 8. Lorsque les unités sont répétitives, les symboles dans ces diver ses unités ne désignent pas nécessairement la même chose dans toutes les unités répétitives. De plus, lorsque ces unités sont répétitives, certains des groupes X et Y peuvent avoir des significations autres que hydroxy ou oxygène. A titre d'exemple, certains d'entre eux, mais pas tous, peuvent être présents sous la forme de groupes d'imide, c'est-à-dire des groupes dans lesquels X et Y considérés ensemble représentent -NR- ou -N-W-(NR'R') , où R, x W et R' ont la signification donnée précédemment. Un type préféré de matière polymère utile dans la mise en oeuvre de l'invention est constitué par le polymère d'un acide polycarboxylique oléfiniquement non saturé ou d'un dérivé de celui-ci avec lui-même ou,-en des proportions approximativement équimolaires, avec au moins un autre monomère copolymérisable avec lui.Le dérivé d'acide polycarboxylique peut être du type non vicinal ,notamment acide acrylique, l'anhydride acrylique, l'acide méthacrylique, l'acide crotonique ou-leurs dérivés respectifs, y compris les sels partiels, les amides et les esters, ou du type vicinal , notamment les acides maléique,itaconique, citraconique, a,a-dimaléique, a-butylmaléique, a-phénylmaléiquew fumarique, aconitique, a-chloromaléique, a-bromomaléique et acyanomaléique, y compris leurs sels ,-amies? et esters partiels.. On utilise avantageusement des anhydrides de l'un quelconque des acides précédents. Des comonomères convenant pour l'utilisation avec les monomères fonctionnels précités sont les a-oléfines, comme ltéthy- lène, le propylène, l'isobutylène, les 1- ou 2-butènes, le 1hexène, le l-octène, le l-décène, le l-dodécène, le l-octadécène et d'autres monomères vinyliques, tels que le styrène, le a-méthylstyrène, le vinyltoluène, le propionate de vinyle, la vinylamine, le chlorure de vinyle, le formiate de vinyle, l'acétate de vinyle, les éthers vinylalkyliques, par exemple l'éther méthylvinylique, lesAácrylates d'alkyle, les méthacrylates d'alkyle, les acrylamides et les alkylacrylamides, ou des mélanges de ces monomères.La réactivité de certains groupes fonctionnels dans les copolymères résultant de certains de ces monomères permet la formation d'autres groupes fonctionnels utiles dans le copolymère formé, notamment des groupes hydroxy, lactone, amine et lactame. L'un quelconque cie ces dérivés d'acide polybasique peut être copolymérisé avec l'un quelconque des autres monomères décrits, et avec n:importe quel autre monoMère formant un copolymère avec des dérivés d'acide dibasique. Les dérivés d'acide polybasique peuvent être des copolymères avec une série de comonomères, auquel cas la quantité totale de comonomères sera de préférence à peu près équimolaire par rapport aux dérivés d'acide polybasique. Bien que l'on puisse préparer ces copolymères par une polymérisation directe des divers monomères, fréquemment ils sont préparés plus facilement par une modification post-réactive d'un copolymère existant. On peut convertir des copolymères d'anhydrides et d'un autre monomère en copolymères contenant du arboxyle pairéaction avec de l'eau, et en leurs sels d'ammonium, de métaux alcalins et alcalino-terreux et d'alkylamine par réaction avec-des composés de métaux alcalins, des composés. de métaux alcalino-terreux, des amines ou de l'ammoniac, et ce avant, durant ou après la liaison d'enzyme, etc.D'autres dérivés convenables des polymères précédents sont les esters alkyliques partiels ou d'autres esters, ainsi que les amides partiels, les alkylamides, les dialkylamides, les phénylalkylamides ou les phénylamides , préparés par réaction de groupes carboxyles sur la chatne polymère avec les amines ou alcools alkyliques ou phénylalkyliques choisis ,de même que des aminoesters, des aminoamides, des hydroxyamides et des hydroxyesters, dans lesquels les groupes fonctionnels sont séparés par un alkylène inférieur, un phényle, un phénylalkyle, un phénylalkylphényle ou alkylphénylalkyle, que l'on prépare de la même manière dans chaque cas en tenant bien compte de la conservation des sites de liaison d'enzyme, comme prévu antérieurement. Il peut y avoir d'autres groupes aryliques au lieu des groupes phényliques. Des dérivés particulièrement intéressants sont ceux dans lesquels des groupes carboxyles chargés négativement sont remplacés partiellement par des groupes d'amines ou de sels aminés. Ceux-ci sont formés par réaction de ces carboxyles avec des polyamines, par exemple la diméthylaminopropylamine ou des dialkylaminoalcools , comme le diméthylaminoéth nol, les premières formant une liaison d'amide avec le polymère, tandis que les derniers forment une liaison d'ester . Un choix convenable des dérivés précédents permet d'influencer plusieurs paramètres de comportement du produit d'enzyme-polymère de l'invention. On connatt des polymères d'acide ou anhydride dibasique et d'oléfine, en particulier des polymères d'acide ou anhydride maléique et d'oléfine, du type précite , à savoir le type EAM Le copolymère contient de préférence des quantités pratiquement équimolaires du résidu d'oléfine et du résidu d'anhydride. Généralement, il aura un degré de polymérisation de 8 à 10.000, de préférence d'environ 100 à 5000, et un poids moléculaire d'environ 1000 à 1.000.000, de préférence d'environ 10.000 à 500000. De nombreux parmi ces polymères sont disponibles sur le marché. Des polymères particulièrement intéressants sont ceux qui dérivent d'éthylène et d-'anhydride maléique en des proportions approximativement équimolaires. Ces produits sont disponibles sur le marché. Les copolymères d'anhydride maléique ainsi obtenus comportent des liaisons d'anhydride répétitives dans la molécule, qui sont'facilement hydrolysées par de l'eau pour donner la forme-acide du copolymère, la vitesse d'hydrolyse étant proportionnelle à la température.Du fait que les réactions de combinaison de la présente invention sont réalisées dans des solutions ou suspensions aqueuses, ou en utilisant des mélanges d'eau-solvant, le produit de la liaison covalente (combinaison) de l'enzyme au EAM comporte des groupes carboxyles ou carboxylates qui sont attachés à ses channes au voisinage de l'enzyme combiné , au lieu de groupes anhydrides, du fait de l'hydrolyse des- groupes anhydrides qui ne réagissent pas avec les enzymes, durant la réaction de combinaison. Cela est vrai aussi des groupes d'anhydride ne réagissant pas, qui sont présents dans d'autres polymères, par exemple les polymères du type EAM, qui s'hydrolysent en groupes de carboxyles ou de carboxylate durant la réaction de combinaison. L'expression " insoluble dans l'eau" ,comme on l'a déjà signalé, signifie que le produit concerné ne se dissout pas dans l'eau ou des solutions aqueuses, même sil peut avoir des caractéristiques telles qutun degré élevé de gonflement du à une solvatation par l'eau, même au point d'exister sous la forme de gel. Des produits "insolubles dans l'eau " peuventtre séparés par des procédés tels qu'une filtration, une centrifugation ou une sédimentation. Des caractéristiques de ce genre sont imparties par réticulation. L'expression "soluble dans l'eau11 signifie que le produit en cause se dissout dans l'eau ou les solutions aqueuses. Comme d'habitude, cependant, cela ne signifie pas que le produit se dissout totalement à toutes les concentrations ou à tous les pH. D'autre part, ces produits solubles dans l'eau sont caractérisés en ce qu'ils sont solubles à toute une série de concentrations et de pH, et ils sont généralement solubles à des pH d 7 ou plus. Sous leur forme soluble, les produits de polymère-enzyme de l'invention sont caractérisés par la même activité enzymatique que l'enzyme natif de départ, mais ils ont tous les avantages qui accompagnent la possibilité d'application en suspension ou solution, ainsi qu'une stabilité accrue et une activité prolongée.En outre, du fait de leur forme polymère, même stils sont solubles, le produits d polymère-enzyme de l'invention sont séparables de l'enzyme natif ou des substrats, ainsi que des impuretés et des matières colorantes d'une nature indésirable, par des procédés normaux de séparation, comme une centrifugation, une électrophorèse ou une chromatographie. C'est ainsi que des produits insolubles dans l'eau, suivant l'invention, sont produiispar réactipn de l'enzyme avec un polymère insoluble dans l'eau ou en amenant le produit de réaction de l'enzyme et du polymère à devenir insoluble , par réaction avec un agent de réticulation polyfonctionnel, tel qu'une polyamine ou un polyol (notamment un glycol), lorsque ceci est nécessaire. Le produit d'enzyme-polymère est f-réquemment au moins partiellement insoluble en soi cause de l'interréaction entre le fragment d'enzyme et les channes additionnelles du polymère. Si le polymère est pré-réticulé de manière à avoir une structure à trois dimensions ou si, dans certains cas, il a une longueur de chaîne linéaire suffisamment étendue, le polymère de départ est déjà insoluble dans l'eau. D'autres procédés de réticulation existent et sont bien connus en pratique. Lorsqu'on a en vue des produits nettement insolubles, il est souvent avantageux d'utiliser des copolymères qui contiennent déjà une certaine réticulation. De tels copolymères réticulés sont connus et peuvent être obtenus en-menant la polymérisa tion , par exemple la copolymrisation d'anhydride maléique et d'un hydrocarbure oléfinique, en présence dun agent de réticulation, par exemple un composé comportant deux doubles liaisons oléfiniques, comme le divinylbenzène ou le crotonate de vinyle, le potFl,2-butadiène ou les alpha, oéga-dioléfines. La quantité de l'agent de réticulation variera avec le degré d'insolubilité désiré mais elle sera généralement de 15ordure de 0,1 à 10% en poids du mélange total des monomères. A titre d'exemple de procédé de préparation du réseau de polymère à trois dimensions, lorsque celui-ci est-nécessaire ou desirable, on peut utiliser un composé difonctionnel pour la réticulation d'un compolymère préformé d'acide dibasique/monooléfine C2-C 18. Ceci peut être réalisé par réaction entre le copolymère et une polyamine, par exemple avec de 0,1 à 10 moles% d'éthylène diamine. De ce fait, on peut régler la somme de réticulation du polymère global. I1 doit être entendu que l'éthylène diamine est un exemple de réactif de iticulation mais que l'on peut utiliser à cet effet de nombreux autres composés, par exemple le groupe des alkylène; polyamines et d'autres polyamines similaires. D'autre part1 on peut avantageusement préparer des produits solubles dans l'eau par un procédé opératoire quelque peu différent. Pour obtenir des rendements élevés de produits d'enzyme me-polymère solubles dans l'eau, il est désirable d'éviter une réticulation qui provoque une insolubilisation. Pour préparer des dérivés d'enzyme-polymère solubles dans l'eau, la réaction est par conséquent réalisée de préférence sous des conditions n'assurant pratiquement pas de réticulation. La réticulation indésirable peut être réduite en réalisant la réaction de liaison en dilution élevée de. telle sorte que moins de réactions se produisent entre diverses mplécules de polymère et une seule molécule d'enzyme. A titre de variante, des proportions élevées de enzyme par rapport au polymère favorisent une réaction de plusieurs molécules d'enzyme avec une seule molécule de polymère. Ceci a par conséquent pour résultat un système d'enzyme me-polyrnère aggloméré qui conserve les propriétés désirées de solubilité des molécules d'enzyme individuelles.Bien que de tels procédé soient souvent avantageux, il nS est pas toujours nécessaire d'utiliser des solutions diluées ou des rapports enzyme/ polymère élevés pour provoquer la formation de dérivés solubles d'enzyme. Le procédé général utilisé consiste à permettre à des solutions froides d'enzymes dans des tampons appropriés de réagir pendant la nuit à 40C avec des suspensions homogénéisées froides de polymère, par exemple de EAM On préfère utiliser le EAM-21, qui a un poids moléculaire d'environ 20-30.000 On peut également utiliser des polymères ayant d'autres poids moléculaires. A titre d'exemple, le EA -11 qui a un poids moléculaire d'environ 23000 ,et le EAM-31 ;qui a un poids moléculaire d'environ 60.000, peuvent également être utilisés. On arrive à une séparation des produits d'addition solubles et insolubles , après la réaction, par centrifugation à froid (centrifugeuse Sorval SS-3-TM, environ 10.000 tours par minute, et durée de centrifugation de 10 minutes).Les produits d'addition solubles sont dialysés jusqu'à épuisement par rapport à de l'eau à froid et ensuite lyophilisés, Les produits d'addition insolubles sont lavés (et centrifugés), habituellement 10 fois avec un tampon froid et 5 fois avec de l'eau distillée froide, puis ils sont lyophilisés. L'asparagnasCtilisée comme matière de départ peut être de la L-asparaginase ou de la D-asparaginase ou leurs mélangesr mais elle est de préférence sous la forme L. Cette matière peut aussi être désignée par L-asparagine amidohydrolase (communément aussi EC 3.5.1.1.). La L-asparaginase EC 2 peut être obtenue d'une fermentation de E. coli B. L'asparaginase sous diverses formes et puretés est disponible sur le marché. EXEMPLE 1 Asparaqinase/EAM On dissout de l'asparaginase (Worthington, 20 unités/ mgr au minimum) (13,55 mgr) dans 10 ml d'un tampon de phosphate O,2M froid, à un pH de 7,5 On homogénéise du EAM-21(50,28 mgr) pendant 45 secondes avec 50 ml d'un tampon de phosphate, on l'ajoute (avec 15 ml supplémentaires de tampon froid ) à 0,5 ml d 'hexaméthylènediamine à 1% et on agite pendant 45 secondes, puis on ajoute la solution d'asparaginase froide et on agite le mélange pendant la nuit à 40C. Un traitement de centrifugation, dialyse et lyophilisation de la manière habituelle donne les systèmes soluble et insoluble. Poids d'asparaginase/EAM soluble 25,29 mgr; poids d'asparaginase/EAM insoluble : 57,55 mgr. Procédé de titrage de l'asparaginase : On utilise le procédé de la Worthington Biochemical Corporation. Lss concentrations d'enzyme et de EAM soluble et insoluble sont de 1 mgr/l ml de solution saline physiologique. Le substrat de L-asparagine est à 0,01M dans un tampon 0,05M de tris-HCl/chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl aminométhane)7, pH de 8,6. On incube à 370C une solution consistant en 1,7 ml du substrat et 0,2 ml du tampon de tris-HCl Au temps zéro, on ajoute 0,1 ml d'enzyme ou d'enzyme/EAM et on incube le mélange à 370C pendant 10 minutes.A la fin de cette période, on ajoute 0,1 ml d'acide trichloroacétique l,5M, on centrifuge le mélange et on ajoute 0,5 ml de la matière surnageante à 0,7 ml d'eau, puis on ajoute 1,0 ml de réactif de Nessler. Après 10 minutes, on lit le pouvoir d'absorption à 480 m . Un témoin est un échantillon dans lequel on a ajouté l'acide trichloroacé- tique au substrat avant l'addition d'enzyme. Les "standard" sont des solutions de sulfated'ammonium contenant 0,5 à 0,1 timole d'azote par 0,5 ml. Titrage au pH de 8,6 Asparaginase : 71 unités/mgr de protéine Asparaginase/EAM insoluble : 1,5 unité/mgr de poids total Asparaginase/EAMsoluble : 27 unités/mgr de poids total Comme d'habitude, la forme soluble est plus active. Analyse : L'asparaginase/E4 soluble contient 5,48% de N en poids sec. EXEMPLE 2 Asparaginase-copolvmères de stvrène/anhydride maléigue La combinaison d'asparaginase cristalline à un copolymère alterné de styrène-anhydride maléique (1/1) dans un milieu tampon aqueux enutilisant les procédés de exemple 1 avec des rapports véhicule/enzyme de 1/3 à 2/1, donne à la fois des dérivés solubles et insolubles de polymère-asparaginase comportant jusqu'à environ 20% de l'activité enzymatique initiale. EXEMPLE 3 Asparaginase-copolymères d'éther vinylméthylique/anhydride maléique La combinaison d'asparaginase cristallineà un copo lymère alterné d'éther vinylméthylique-anhydride maléique (1/1) dans un milieu tampon aqueux en utilisant bes procédés de l'exem- ple 1 avec des rapports véhicule/enzyme de 1/3 à 2/1 donne à la fois des dérivés solubles et insolubles de polymère-asparaginase comportant jusqu'à environ 35% de l'activité enzymatique initiale. EXEMPLE 4 Asparaginase-copolymères acétate de vinyle/anhydride maléique La combinaison d'asparaginase cristalline à un copolymère alterné d'acétate de vinyle-anhydride maléique (1/1), dans un milieu tampon aqueux, en utilisant les procédés de l'exemple 1 à des rapports véhicule/enzyme de 1/3 à 2/1 donne à la fois des dérivés solubles et insolubles de polymère-asparaginase, comportant jusqu à environ 27% de l'activité enzymatique initiale. EXEMPLE 5 Asparag inase-cyclo- copolymèrg d'éther d vinylique/anhydride maléique ique La combinaison d'asparaginase cristalline à un cylocopolymère alterné a'éther divinylique-anhydride maléique (com- portant des mailles consistant en segments adjacents d'éthylène- anhydride maléique, qu sont en outre liés l'un à l'autre par une liaison d'éther), dans un milieu tampon aqueux, en utilisant les procédés de l'exemple 1 à des rapports véhicule/enzyme de 1/3 à 2/1, donne à la fois des dérivés solubles et insolubles de poly mèxe-asparaginase, comportant jusqu'à environ 22% de l'activité enzymatique initiale. EXEMPLE 6 Asparaqinase-polymères d 'anhydride polymaléique La combinaison d'asparaginase cristalline à un polymère d'anhydr"de polymaléique dans un milieu tampon aqueux en utilisant les procédés de exemple à des rapports véhicule/enzyme de 1/3 à 2/1 donne à la fois des dérivés solubles et insolubles de polymèrewasparaginase, comportant jusqu'à environ 17% de l'activité enzymatique initiale. EXEMPLE 7 Asparaqinase-polymères d'anhydride polyacrylique La combinaison d'asparaginase cristalline à un polymère d'anhydride polyacrylique, dans un milieu tampon aqueux en utilisant les procédés de l'exemple 1 à des rapports véhicule/ enzyme de 1/3 à 2/1, donne à.îa fois des dérivés solubles et insolubles de polymère-asparaginase, comportant jusqu'à environ 37% de l'activité enzymatique initiale. De la même manière, on obtient le produit enzyme-polymère en partant d'un acide polyacrylique en utilisant un réactif de Woodward, le N-éthyl-5-phényl isooxazolium-3'-sulfonate, comme activant pour.les groupes carbo,sylesde l'acide polyacrylique. On obtient des résultats similaires en utilisant de l'acide polyglutamique et de l'acide polyamique comme polymère de départ contenant du carboxyle. EXEMPLE 8 Asparaqinase/diméthylaminoproPylamineimide-EAM Le diméthylaminopropylamineimide partiel de EAM est préparé en soumettant à reflux un mélange de EAM et d'une quantité limite (50% en poids) de N,N-diméthylaminopropylamine dans du xylène pendant 5 heures. Durant cette période, on sépare l'eau en utilisant un piège de Dean-Stark. Après que le développement d'eau a cessé, ce qui indique l'achèvement de la réaction, on isole le produit par précipitation avec de l'hexane et dessiccation sous vide à 1050C. Le produit imide contient 8,90in de N, ce qui indique une teneur d'imide de 54%. On dissout 34 mgr dgasparaginase dans 30 ml de tampon de phosphate 0,Dl- froid, pH de 7,5, et on ajoute à cette solution un mélange du diméthylaminopropylamineimide-EAM (45 mgr) que l'on a homogénéisé pendant une minute avec 30 ml de tampon de phosphate O,lM froid, pH de 7,5. On agite le mélange combiné,pendant la nuit à froid (40C) et on sépare le produit polymère-enzyme insoluble de la solution surnageante par centrifugation. Après lavage huit fois avec du NaCl O,lM et 5 fois à l'eau, on obtient le produit polymère-enzyme insoluble par lyophilisation, ce produit possédant 11% de l'activité initiale d'asparaginase. On dialyse la solution surnageante par rapport à de l'eau et on lyophilise pour obtenir un produit polymère-enzyme soluble qui possède 36% de l'activité initiale d'asparaginase On utilise d'autres N,N-dialkyl inférieur-amino-alkyl inférieur-amines pour obtenir des produits correspondants dlaspa- raginase/dialkyl inférieur-amino-alkyl inférieur imide/EAM. EXEMPLE 9 Réaction d'asparainase-EAM avec de l'asparaqine On prépare des, produits soluble. et insoluble d'asparaginase-EAM en faisant réagir de l'asparaginase et du EAM-21 (copolymère 1/1 d'éthylène/anhydride maléique1 d'un poids moléculaire d'environ 20-30.000) dans une solution de phosphate O,lM froide1 pH de 7,5, qn les sépare par centrifugation et on isole les deux par dialyse et lyophilisation. Dans un appareil Diaplex (TM) auquel est attachée une membrane UM-2(TM), on charge une solution de phosphate 0,001 M (350 ml), pH 7,5, contenant 150 mgr du produit soluble d'asparaginase-EAM. A cette solution, on ajoute 500 mgr de L-asparagine et on agite le mélange à la température ambiante pendant 24 heures. On applique une pression (3,5 kg/cm2) au mélange et on récolte la solution qui traverse la membrane, puis on l'analyse pour déterminer le taux d'acide aspartique. L'acide aspartique ainsi produit peut être isolé par les techniques habituelles, par exemple par extraction L'asparaginase-EAM qui reste dans l'appareil Diaplex (TM) est lavé à l'eau et on recharge la chambre en tampon dilué et en asparagine. On agite le mélange et l'acide aspartique ainsi formé est à nouveau isolé comme décrit ci-dessus. De la même manière, on utilise de la façon décrite cidessus l'asparaginase-EAM insoluble . La production d'acide aspartique formé pendant des périodes de temps et sous des conditions comparables se comparent à celle obtenue lorsqu'on utilise 1' asparaginase-EAM soluble. De la sorte, on peut utiliser les produits soluble et insoluble d'asparaginase-EAM pour la conversion de L-aspara gine en acide L-aspartique. On peut les employer de la même manière pour la conversion de DL-asparagine en acide L-aspartique, tandis que la D-asparagine est laissée pratiquement à l'état n'ayant pas réagi. Outre l'activité anti-asparagine, telle qu'illustrée dans le procédé deXitrage susdit, les produits des exemples précédents, qu'ils soient solubles ou insolubles, montrent une activité anti-asparagine dans d'autres essais, notamment une activité contre les carcinomesdinsbi etudes-~decultures de cellules et dans la séparation de l'asparagine à partir du sang et du plasma sanguin, à titre d'agents supérieurs de remplacement de l'asparaginase, et on peut les récupérer et réutiliser dans le procédé avec facilité. Ces produits sont remarquablement exempts de toxines et de pyrogènes associés aux extraits natifs d'enzymes et les souillant ; la forme soluble est la plus active. En outre1 comme on l'a déjà mentionné, pour la préparation de produits de polymère-asparaginase cationiques on utilise se des polymères ayant de tels groupes présents dans la molécule. Des imides partiels d'un polymère de départ contenant du carboxyle ou un anhydride d'acide carboxylique; des amino-alkyl inférieur-amidessecondaires et tertiaires partiels du polymère de départ contenant du carboxyle ou un anhydride d'acide carboxylique et des produits d'aminoester partiel-polymère- sont mis en réaction avec de l'asparaginase suivant le procédé de 1' exemple précédent pour donner le produit de polymère-asparaginase cationique actif désiré. Pour des produits de polymère-asparaginase non ioniques, on peut attacher des groupes neutres à la molécule de polymère après la liaison d'enzyme, par exemple des alkylamines, des amino-alcools et des alcools que l'on peut attacher via une réaction avec des groupes résiduaires carboxyliques ou d'anhydride d'acide carboxylique du polymère, et ce de la façon habituelle. De ce fait, de la manière précitée, on. prépare les produits solubles et insolubles dans l'eau supplémentaires suivants, le polymère ayant dans chaque cas des substituants cationiques : asparaginase-esters de dialkyl inférieur-amino-alkanol inférieur de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, asparaginase-esters d'alkyl inférieur-aminoalkanol inférieur de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, et asparaginase-esters d'amino-alkanol inférieur de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, par exemple l'asparaginase-ester de diméthylamino- propanol de EAM, l'asparaginase-ester d'éthylaminobutanol de EAM, l'asparaginase-ester d'aminoéthanol d'anhydride ou acide polymaléique ou polyacrylique; asparaginase-dialkyl inférieur-amino-alkyl inférieur-imides de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, asparaginase-alkyl inférieur-amino-alkyl inférieur-imides de l'un quelconque des polymère employés dans les exemples précédents, et asparaginase-açino-alkytinférieur- imides de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, par exemple l'asparaginase-diéthylaminopropylimide de EAM, l'asparaginase-méthylaminobutylimide de EAM, et 1' asparaginase-aminopentylimide d'anhydride ou acide polymaléique ou polyacrylique;; asparaginase-d ialkyl inférieur-amino-alkyl in-férieur-amides de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, asparaginase-alkyl inférieur-amino-alkyl inférieur-amides de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, et asparaginase-amino-alkyl inférieur-amides de l'un quelconque des polymères employés dans les exemples précédents, par exemple l'asparaginase-diméthylamino-propylamide de EAM, llasparaginase-éthylaminohexylamide de EAM, et l'-asparagina- se-aminopropylamide d'anhydride ou acide-polymaléique ou polyacrylique. I1 est ainsi évident de ce qui précède que les produits de polymère-asparaginase préférés de l'invention sont ceux dans lesquels le polymère est choisi dans le groupe comprenant: copolymère d'éthylène/anhydride maléique copolymère de styrène/anhydride maléique copolymère d'éther vinylméthylique/anhydride maléique copolymère d'acétate de vinyle/anhydride maléique cyalo-copolymère d'éther divinylique/anhydride maléique anhydride polymaléique anhydride polyacryliquew et leurs dérivés cationiques. REVENDICATIONS 1. Un produit de polymère-asparaginase actif par voie enzimatique, dans lequel l'asparaginase est liée par covalence à la structure polymère par l'intermédiaire d'un groupe de cette asparaginase qui n'est pas essentiel pour son activité enzymatique. 2. le produit de la revendication 1, dans lequel le polymère est apte à réaliser la liaison par covalence avec l'asparaginase à l'aide d'un groupe carboxyle ou d'anhydride carboxylique de ce polymère. 3. Le produit des revendications 1 ou 2, qui est un produit actif par voie enzymatique, soluble ou insoluble dans l'eau, d'asparaginase-polymère du type EAM, d'asparaginase-styrène/anhydride maléique, d' asparaginase-éther vinylméthyliquelanhydride maléique, d'asparaginase-acétate de vinyle/anhydride maléique, d'asparaginaseéther divinylique/anhydride maléique, d'asparaginase-anhydride polymaléique, d'asparaginase-anhydride polyacrylique, ou de leurs dérivés cationiques. 4. Procédé de préparation d'un produit de polymère-asparaginase suivant l'une quelconque des revendications précédentes, plus particulièrement d'un produit asparaginase-polymère du type SEMA, ce procédé comprenant la réaction d'asparaginase et d'un polymère qui est apte à réagir ou à se combiner avec cette asparaginase par l'intermédiaire de groupes non essentiels, de manière à réaliser une liaison par covalence avec cette asparaginase, sous des conditions qui ne provoquent pas de destruction de l'activité enzymatique afin d'obtenir le produit de polymère-asparaginase désiré; actif par voie enzymatique. 5. Procédé de la revendication 4, dans lequel la réaction est menée sous des conditions ne provoquant pratiquement pas de réticulation, et dans lequel le produit est un produit polymère-asparaginase soluble dans l'eau, actif par voie enzymatique. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le polymère est du type EMA. 7. Procédé de séparation d'asparagine à partir d'une matière en contenant, comprenant la mise en contact de cette matière avec un produit de polymère-asparaginase suivant 1' une quelconque des revendications 1 à 3, produit actif par voie enzymatique et dans lequel l'asparaginase est liée par covalence à l'aide d'un groupe de cette asparaginase qui n'est pas essentiel pour son activité enzymatique. 8. Procédé suivant la revendication 7, dans lequel le produit d'asparaginase-polymère utilisé est du type soluble ou insoluble dans l'eau. 9 Procédé suivant l'lLne queloon ).o des revendications 4 à 8, dans lequel la produit d'asparaginase-polymère est récupéré et ra cyclé â procédé