Brevet FR2014141A1 — publié le 19700417

L'invention concerne un procédé de préparation d'hydroxy-4- ss-D-ribofuranosyl-1-pyrazolo-pyrimidine [3,4-d] par contact d'un dérivé avec un microorganisme déphosphorylant. On trouve l'hydroxy-4-ss-D-ribofuranosyl-1-pyrazolo-pyrimidine [3,4-d] (appelé plus loin ribosyl-1-allopurinol) dans l'urine de patients auxquels on a administré de l'hydroxy-4-pyrazolo- pyrimidine [3,4-d] (appelé allopurinol). L'allopurinol sert à i'ruhiber la xanthinéoxiaase et est utile commue médicament pour le traitement de la goutte. Le dérivé ribosyle de l'allopurinol est le ribosyl-1-allopurinol; il présente des propriétés curatives similaires à celles de l'allopurinol. Le ribosyl-1-allo prinol est soluble dans l'eau et l'on pense qu'il est moins to trique que l'allopurinol.Le ribosyl-1-allopurinol peut entre préparé à partir de la purine nucléosidephosphorylase ("J. of Bio. Chem. 242, 2675-2682 (1967)"). Cependant cette méthode de préparation n'est pas intéressante industriellement. L'hydroxy-4- pyrazolo-pyrimidine [3,4-d]-ss-D-ribofuranoside-1-pyrophosphate -5', (ctest-à-dire l'allopurinol-p-D-ribofuranoside-1-pyrophos- phate-5', appelé allopurinolribotide) peut Qtre préparé par fermentation (brevet japonais n 58.638/66). On sait également quequelques microorganismes sont capables de former des nucléosides par déphosphorylation de divers purineet pyrimidine-nucléotides et les phosph6tase et nucléotidase qui catalysent ces réactions sont aussi connues. Cependant, on n'a jamais mentionné que le ribosyl-1-allopurinol pouvait être préparé par déphosphorylation microbienne d'allopurinolribotide. L'invention a pour objet un procédé de préparation au ribosyl- 1-allopurinol, qui est plus simple et meilleur marché que les méthodes antérieures. Selon cette invention, on prépare le ribosyl-1-allopurinol par déphosphorylation d'allopurinolribôtide. Ce dernier composé et de préférence préparé pour cette invention, par le procédé de fermentation décrit dans le brevet déjà mentionné; mais on peut se servir de toutes autres méthodes classiques. On effectue la déphosphorylation de l'allopyrinolribotide en plaçant ce corps en contact avec un microorganisme convenable dans un milieu aqueux. Le procédé de cette invention implique l'utilisation de microorganisme capable de déphosphoryler l'allopurinolribotide en ribosyl-1-allopurinol. De tels microorganismes comprennent des bactéries, streptomyces, champignons et levure et ils appartiennent à des genres très variés, si bien qu'il est- difficile de les classer en genres et espèces typiques. Il est avantageux d'utiliser un milieu aqueux d'allopuri@@l- ribotide contenant divers éléments nutritifs nécessaires à la croissance du microorganisme mis en oeuvre; il n'est pas néces- saire d'utiliser de tels éléments nutritifs pour atteindre les buts de la présente invention. Il est également possible d'utiliser des bouillons de fermentation contenant l'allopurinolribo- tide et obtenus de façons classiques. L'allopurinolribotide peut être mis en oeuvre soit sons forme libre soit sous forme de sel (par exemple, de sodium, d'ammonium, etc3. La culture est effectuée à un pli compris entre environ 4 et 9, et de préférence entre 20 et 40 C environ. La durée de culture peut varier en fonction de la quantité de cellules microbiennes ajoutée au milieu aqueux contenant l'allopurinolribotide et de l'activité du microorganisme mis en jeu. Il est avantageux cependant, de déterminer périodiquement la quantité de ribosyl-l- allopurinol accumulé, afin de poursuivre la déphosphorylation jusqu'à ce qu'on obtienne une quantité suffisante du produit souhaité. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. Exemple 1 On-prépare un milieu de culture contenant du glucose (2-g/dl), de l'èxtrait de levure (1 g/dl), de la peptone (1 g/dl) et du chlorure de sodium (0,25-g/dl) Le pH du milieu est ajusté & à 7,2. Des doses de 20 ml du milieu sont placées séparément dans des erlenmeyers. Chacune des doses est e-nsemencée avec l'un des microorganismes indiqués dans le tableau suivant. La-culture s'ef- -fectue sous agitation, à 30 C, pendant 24 heures. On ajoute ensuite 14,4 millimoles d'allopurinolribotide à chacun des milieux renfermés dans les erlenmeyers.On indique dans le -tableau le nombre de millimoles de rib-osyi-1-allopurinol produites après 48 heures de culture -On filtre le bouillon de- culture pour éliminer les éléments de cellules microbiennes et traite le résidu au charbon actif@ Le ribosyl-1-allopurinol est -absorbé sur le charbon actif et élué par de l'éthanol à 50 ,- contenant 2 % d'ammoniaque. Le produit élué est concentré sous pression-réduite et son pH est ajusté à 8,5.Le produit élué traverse une colonne garnie de "Dowex 1x8" (une résine échangeuse d'anion, fortement basique, du type styrène et disponible chez "Dow Chemical Company U.S.A.") sous sa forme acide pour absorber le ribosyl-1-allopurinol. Après élution avec de l'acide formique 0,1N, on concentre à sec le produit élué contenant le ribosyl-1-allopurinol. Le résidu est recristallisé dans un mélange eau-éthanol pour extraire le ribosyl1-allopurinol. TABLEAU Quantité de 1-ribosyl Microorganisme allopurinol produit (millimoles) Esoherchia coli ATCC 10798 7,7 Micrococcus sodonensis ATCC 11880 1,2 Bacillus subtillus ATCC 15244 12,5 Bacillus megaterium ATCC 15177 -5,5 Aerobacter aerogenes ATCC 8308 5,8 Brevibacterium helvolum ATCC 11822 1,2 Brevibacterium vitarumen ATCC 10234 9,1 Arthrobacter simplex ATCC 15799 13,5 Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 8,4 Candida utilis ATCC 16321 2,7 Hansenula anomala ATaC 580 9,2 Mucor Savanicus ATCC 15242 1,6 Rhizopus oryzae ATCC 11910 1,8 Saccharomyces cerevisiae -RRL 337 14,4 Penicillium chrysogenum ATCC 15241 9,2 Streptomyces coelicolor ATCC 3355 3,8 Chacun de ces microorganismes identifiés par leur référence "ATCC" (American Type Culture Collection) et "NRRL" (Ministère ae l'Agriculture des Etats-Unis, "Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory"), ont été déposés sous la référence numérique indiquée et sont accessibles au public. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant lés applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela au cadre de l'invention. - REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation d'hydroxy-4-P-D-ribofuranosyl-l- pyrazolo-pyrimidine [3,4-d] consistant-à placer l'hydroxy-4pyrazolo-pyrimidine [3,4-d]-ss-D-ribofuranoside-1-pyrophosphate5' en milieu aqueux, en contact avec un microorganisme capable de convertir ce dernier produit en produit désiré. 2 - Procédé suivant 1 où la température du milieu aqueux est comprise entre 20 et 40 C environ. 3 - Procédé suivant 1 et 2, où le pH du milieu aqueux est ajusté à une valeur comprise entre 4 et 9. 4 - Procédé suivant 1 à 3, où l'hydroxy-4-pyrazolo pyrimidine [3,4-d]-ss-D-ribofuranoside-1-pyrophosphate 5' est mis en oeuvre sous forme de son sel de sodium. 5 - Procédé suivant 1 à 3, où l'hydroxy4-pyrazolo pyrimidine 3,4-d]-ss-D-ribofuranoside-1-pyrophosphate 5' est mis en oeuvre sous forme de son sel d'ammonium. 6 - Procédé suivant 1 à 5, dans lequel le microorganisme est Micrococcus sodomensis de référence"ACC 11880", Bacillus subtils lus de référence "ATCC 15244", Bacillus mégaterium de référence "A2CC 15177", Escherchia coli de référence "ATCC 10798", Aero- bacter aerogenes de référence "ATCC 8308", Brevibacterium Helvolum de référence "ATCC 11822", Brevibacterium vitarumen de référence "AgCC 10234", Arthrobacter simplex de référence "ATCC 15799", Arthrobacter uréafaciem de référence "ATCC 7562", Candida utilis de référence "ATCC 16321", Hansenula anomala de référence "ATCC 580", Mucor javanicus de référence "ATCC 15242", Rhizopus oryzae de référence "ATCC 11910", Saccharomyces cerevisiae de référence "NRRL 337", Penicillium chrysogenum de référence "ATCC 15241", Streptomyces coelicolor de référence "AGCC 3355".