Brevet FR2029463A1 — publié le 19701023

La présente invention, a pour objet vin procédé permettant d'obtenir, par voie microbiologique, des 6-hydroxy-3-oxo-ti * -stéroxdes des séries du prégnane et de l1androstane. Selon ce procédé on fait fermenter un 30-hydroxy-5 ou 30-acyloxy-5.6-époxy-stéroïde à noyau A saturé, appartenant à la série du prégnane ou à celle de 1*androstane, avec des micro-organismes des genres Bacillus, Mycobacterium ou Arthrobacter, ou bien avec des enzymes produits par ces germes. Il est particulièrement avantageux d'utiliser des micro-10 organismes appartenant aux espèces Bacillus lentus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium amegmatis et Arthrobacter simplex. Pour la réalisation du procédé de l'invention, le stéroxde de départ doit présenter un groupement 3P-hydroxy ou 15 30-acyloxy, et en outre un noyau 5« 6-époxydique ayant l'une des configurations a et p. Par ailleurs, le stéroxde de départ peut contenir d'autres substituants de nature quelconque, entre autres des groupes hydroxyliques libres ou convertis en dérivés fonctionnels, se trouvant par exemple en positions 20 11a, "11(3, 14a, 15a et 16.17 et/ou 21, qui sont de préférence des groupes alkyles inférieurs se trouvant par exemple en positions 7«, 16 et/ou 18, des groupes oxo libres ou convertis en dérivés fonctionnels, se trouvant par exemple en positions 11 et/ou 17 ou 20, ainsi que des atomes d'halogènes, de 25 préférence le chlore et le fluor, par exemple en position 16. Le stéroxde de départ peut également contenir des doubles liaisons supplémentaires, par exemple en positions 7, 9(11), 14(15) et/ou 16.Dans le produit obtenu par le procédé de l'invention le groupe 6-hydroxylique introduit présente la 30 configuration a ou p, en fonction de la configuration du noyau 5•6-époxydique dans le stéroxde de départ. On effectue la transformation microbiologique suivant des procédés connus. C'est ainsi que des essais préliminaires couramment utilisés permettent de déterminer les conditions les 35 plus favorables pour la fermentation, par exemple de choisir le milieu nutritif le plus convenable, le. solvant approprié du substrat, la concentration du substrat, les conditions techniques telles que température, aération, pH et agitation, et les temps optimum pour la germination et l'addition du 40 substrat, ainsi que la durée du contact, ceci par analyse, 70 02615 2 2029463 en particulier par chromatographie en couches minces. Au stade de la fabrication, on cultive ensuite le micro-organisme, dans les conditions réactionnelies qui ont été déterminées par les essais préliminaires, dans la solution 5 nutritive, en submersion, dans des conditions d'aérobiose, on réalise la multiplication, puis on ajoute le substrat sous forme de solution ou de suspension. On.suit l'évolution de la fermentation par analyse, en utilisant la chromatographie en couches minces. Une fois la fermentation terminée, on 10 extrait du bouillon de culture le produit conforme à l'invention, à l'aide d'un solvant organique approprié, après quoi on isole ledit produit de l'extrait, par exemple par évaporation et par des procédés de purification connus, entre autres la recristallisation et/ou la chromatographie. 15 Le procédé conforme à la présente invention permet de préparer, de manière simple, des 6-hydroxyy^-oxg-stéroxdes appartenant aux séries du prégnane/ou de 1'androstane, qui constituent des produits intermédiaires pour la préparation de stéroxdes ayant une action hormonale et qui, pour certains 20 du moins, peuvent même être utilisés tels quels comme substances actives de médicaments. On ne pouvait guère prévoir que la réaction se déroulerait aisément et fournirait les produits cherchés avec des rendements intéressants du point de vue pratique, car on était en droit de s'attendre, en se 25 fondant sur les résultats des recherches de S.S. Lee et de Oh. J. Shi [Biochem. 3, 1267 (1964)3, à ce que l'action des micro-organismes sur des substrats contenant un groupement 3|3-hydroxy-5• 6-époxy donne, de façon prépondérante, des produits ayant une structure seco en 9»10. 30 On prépare les 30-hydroxy- ou 3 P-acétoxy-5•6— époxy-stéroxdes, nécessaires pour le procédé de l'invention, à partir des 30-hydroxy- ou 3P-acétoxy-A^-stéroxdes, en époxydant la double liaison selon des procédés connus, par exemple à l'aide de peracides. La préparation du stéroïde 35 de départ est décrite ci-dessous de façon plus précise en prenant comme exemple la 3P-hydroxy-21-acétoxy-16a-méthyl-£p-prégnène-20-one. On dissout 60 g de 3P-hydroxy-21-acétoxy-16a-40 méthyl-A prégnène-20-one dans 1,8 litre de chlorure de 70 02615 5 2029463 méthylène anhydre et on ajoute 12 g d'acétate de sodium (fondu) et 40 g de sulfate de sodium anhydre. A une température de +2°, on introduit goutte à goutte en une demi-heure, tout en agitant, 36 ml d'acide peroxyacétique, on ajoute encore 5 une fois 12 g d'acétate de sodium et 40 g de sulfate de sodium, puis, goutte à goutte et dans le laps de temps indiqué plus haut, encore 36 ml d'acide peroxyacétique. On agite encore pendant quelque temps ; au bout de 2 heures le mélange réactionnel s'est réchauffé jusqu'à la température ambiante. 10 On neutralise par addition, sous agitation, d'un litre d'une solution à 5 % de NaHCO^, on sépare la solution dans le chlorure de méthylène, on lave celle-ci à l'eau, avec une solution de PeSO^, puis encore à l'eau, on la sèche sur NagSO^, puis on la concentre à 40° sous pression réduite. On recristal-15 lise la fraction restante dans l'acétate d'éthyle. On obtient ainsi la 3 P-hydroxy-21 -acétoxy-5ou6a-époxy-16a-méthyl-prégnane-20-one, qui fond à 187-169° (rendement : environ 85 %). On obtient les acétates en 3 souhaités par époxydation des A^-3-acétates correspondants, ou encore par 20 acétylation ultérieure des 3P-hydroxy-5a«6a-époxydes. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer la présente invention. Les températures y sont exprimées en degrés Celsius. EXEMPLE 1 ; 25 On ensemence avec une culture lyophilisée d'Arthro- bacter simplex dans un erlenmeyer où. l'on a introduit 500 ml d'un milieu aqueux stérilisé contenant 0,1 % d'extrait de levure, 0,5 % de liquide de macération du maïs et 0,05 % de sucre d'amidon, dont le pH a été réglé à"7,0, après quoi 30 on agite pendant 48 heures à 30°, à raison de 145 t.p.m. On ensemence ensuite avec 250 ml de la suspension bactérienne un fermenteur d'une capacité de 20 litres, contenant 14,75 litres d'une solution nutritive stérilisée ayant la même composition, puis on agite pendant 24 heures à 29°, en aérant à raison de 35 1650 litres par heure, à une vitesse de rotation égale à 220 t.p.m. On transfère 0,9 litre de ce produit de préfermentation dans un fermenteur d'une capacité de 20 litres, contenant 14,1 litres d'un milieu stérilisé présentant la même composition. Pour la fermentation principale, on utilise les ^ mêmes conditions techniques que pour la préfermentation. Pendant 70 02615 4 2029463 cette fermentation principale, on maintient le pH entre 6 et 7» Après uneihase de croissance d'une durée de 6 heures, on ajoute 3,75 g de 3P-hydroxy-5oc.6a-époxy-testololactone dans 80 ml de diméthylf ormamide, puis on fait fermenter. On suit 5 l'évolution de la réaction en analysant, par chromatographie en couches minces, des extraits dans la méthyl-isobutyl-cétone de différents prélèvements de culture. Au "bout d'environ 34 heures, la matière de départ est entièrement transformée. On extrait, sous agitation, le bouillon de culture par la méthyl-10 isobutyl-cétone, puis on concentre l'extrait à siccité, sous pression réduite, à une température maximum du bain égale à 40°. On lave la fraction restante avec un peu d'hexane froid. On obtient, après séchage, 3,2 g de 6a-hydroxy-1-déshydro-testololactone qui, après recristallisation dans le ^5 méthanol, fond à 297-299° ; fJ oha= 15 820. HCEMELS 2 : Cet exemple diffère de l'exemple 1 uniquement par le fait qu'on met en jeu pour la primo-culture une culture lyophilisée de Bacillus lentus (au lieu d1Arthrobacter simplex) 20 et qu'on utilise un milieu nutritif aqueux, dont le pH a été ajusté à 7, contenant 1,5 % de peptone, 1,2 % de liquide de macération du maïs et 0,2 % de MgSO^ (au lieu du milieu à l'extrait de levure, au liquide de macération du maïs et au sucre d'amidon). Pour la fermentation préliminaire et la fermentation. 25 principale, on utilise le milieu indiqué à l'exemple 1. La transformation est terminée après un contact d'une durée de 28 heures. On obtient 3,1 g de produit brut et, après recristallisation dans le méthanol, 2,2 g de la 6o-hydroxy-l-déshydro-testololactone? Qui fond à 293-295°• 30 La comparaison des spectres et le point de fusion à l'épreuve de mélange montrent que ce composé est identique au produit réactionnel obtenu selon l'exemple 1. EXEMPLE 3 : De la manière décrite à l'exemple 2, on fait 35 fermenter avec Bacillus lentus 3,75 g de 33-hydroxy-5oc.6a-époxyandrostane-17-one en solution dans 80 ml de diméthyl-formamide. Au bout de 28 heures, la matière de départ est entièrement transformée. On recristallise dans le méthanol le produit brut obtenu (3,4 g) . On obtient ainsi 2,4 g ^ de 6a-hydroxy-A'' * ^-androstadiène-3 « 17-dione. Point de 70 02615 5 2029463 fusion ! 255-256» ^ 15 100. EXEMPLE 4 t Dans les conditions indiquées à l'exemple 2, on fait fermenter avec Bacillus lentus 2,7 g de 3P•15P-dihydroxy-5 6a-époxy-16a-méthyl-prégnane-11.20-dione, en solution dans 30 ml de diméthylformamide. Après un contact d'une durée de 27 heures, la matière de départ est transformée. Après traitement complémentaire, on obtient 2,2 g de la 6a.15P-dihydroxy-16a-méthyl-A'''^-prégnadiène-^.H .20-trione, qui après recristal-10 lisation dans l'acétate d'éthylène, fond à 263-267° >£, 239=^/i" 100. On acétyle un échantillon du produit dans un mélange de pyridine et d1anhydride acétique, à la température ambiante ; il se forme le diacétate en 6a.153 correspondant ; point de fusion : 202-204° j £,235- 1^ 800. 15 EXEMPLE 5 : Dans les conditions décrites à l'exemple 2, on fait fermenter pendant 27 heures avec Bacillus lentus 3,75 g de 3P-hydroxy-21-acétoxy-5a.6a-époxy-16a-méthyl-prégnane-20-one, puis on effectue le traitement complémentaire. Par chromato-20 graphie sur colonne et recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther isopropylique, on obtient la 6ai21-dihydroxy-16a-méthyl-Z5 *^-prégnadiène-3.20-dione ; point de fusion : 207-209° ;£,241= 15 400 ' EXEMPLE 6 : 25 Dans les conditions décrites à l'exemple 2, on fait fermenter pendant 30 heures, dans 12 litres d'une culture de Bacillus lentus, 3,0 g de 3P-hydroxy-21-acétoxy-5a.6a-époxy-prégnane-20-one ; puis on effectue le traitement complémentaire. Par chromatographie sur colonne et recristal-30 lisation dans un mélange d'acétone et d'éther isopropylique, on obtient la 6a.21-dihydroxy-A^*^-prégnadiène-3.20-dione ; point de fusion : 187-189° = 15 700. EXEMPLE 7 Ï 245 Dans les conditions décrites à l'exemple 2, on 35 fait fermenter pendant 28 heures avec Bacillus lentus 3,75 g de 3P-bydroxy-5a.6a-époxy-16a-méthyl-prégnane-20-one, puis on effectue le traitement complémentaire. Après chromatographie sur colonne et recristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane, on obtient la 6a-hydroxy-16a-méthyl-A ^ ^ prégnadiène-3.20-dione ; point de fusion : 178-180°;£,241^^ 1®®* 70 02615 2029463 Dans les conditions décrites à 1'exemple 2 on fait fermenter avec Bacillus lentus 125 mg de 30.17a-dihydroxy-5a.6a-époxy-prégnane-20-one, dans plusieurs ballons 5 à secousses d'une capacité de 2 litres, qui, chargés chacun de 500 ml de milieu nutritif , servent de récipients de fermentation. La transformation est terminée au bout de 30 heures. Après le traitement complémentaire habituel et une recristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane, on obtient 10 la 6a. 17a-dihydroxy-A '^-prégnadiène-3.20-dione = 14 000. 241 EXEMPLE 9 : Dans les conditions indiquées à l'exemple 1, on fait fermenter 1,87 g de 30.110.21-trihydroxy~5a.6a-époxy-15 prégnane-20-one, pendant 20 heures, dans 15 litres d'un bouillon de culture d'Arthrobacter simplex puis on effectue le traitement complémentaire. Par chromatographie sur colonne du produit brut et recristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther isopropylique, on obtient la 6a. 110.21 -trihydrcayA'* 20 prégnadiène-3.20-dione ; point de fusion;210/211-212° =14200. EXEMPLE 10 s Dans les conditions indiquées à l'exemple 1, on fait fermenter pendant 27 heures, dans 15 litres d'un bouillon de culture contenant Arthrobacter simplex, 1,87 g de 30.110» 21-25 trihydroxy-5a.6a-époxy-16a-méthyl-prégnane-20-one, puis on effectue le traitement complémentaire. On sépare et on purifie le produit brut par chromatographie sur colonne. Après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther isopropylique, on obtient la 6a.11P.21-trihydroxy-16a-méthyl-A ^ *4-prégnadiène-30 3.20-dione ; point de fusion : 211-212° v^242~ ^ ®00. EXEMPLE 11 Ï Dans les conditions décrites à 1'exemple 1, on fait fermenter, pendant 56 heures, dans 8 litres d'un bouillon de culture contenant Arthrobacter simplex, 2 g de 3P~hydroxy-35 5P-6P-époxy-testololactone dans 50 ml de diméthylformamide. Le produit brut huileux obtenu par le traitement complémentaire habituel (1,5 g), est séparé par une chromatographie sur colonne de gel de silice. Après recristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther isopropylique, on 40 obtient la 6p-hydroxy-1-déshydro-testololaGtone ; point de 70 EXEMPLE 12 : Dans les conditions décrites à l'exemple 2, on fait fermenter 3,75 g de 3p-hydroxy-5a. 6a.16a.17a-diépoxy-5 prégnane-20-one dans 15 litres d'ua bouillon de culture.contenant Bacillus lentus. Au bout de 29 heures, la substance de départ est entièrement transformée. Le produit brut (2,93 g) obtenu par le traitement complémentaire habituel est recristallisé dans l'acétate d'éthyle. On obtient ainsi la 10 6a-hydroxy-16a. 17a-époxy-A''*4-prégnadiène-3.20-dione ; point de fusion ï 227-230° ^ 500. EXEMPLE 13 : Dans les conditions décrites à l'exemple 2, on fait fermenter avec Bacillus lentus 3,75 g «le 3P-hydroxy-21 -^ acétoxy-5a.6a.16a.17a-diépoxy-prégnane-20-one. Au bout de 26 heures, l.a matière de départ est totalement transformée. Le produit brut (3,3 g) obtenu grâce au traitement complémentaire habituel est recristallisé dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther isopropylique. On obtient la 6a.21-dihydraxy-^ 16a.17a-époxy-A ^*^-prégnadiène-3«20-dione ; point de fusion : 55-60° ;£241~ ^ 900. EXEMPLE 14 : On introduit une culture lyophilisée de Bacillus sphaericus, souche ATCC 7055, dans 500 ml d'un milieu aqueux ^ stérile, dont le pH a été ajusté à 7, contenant 0,1 % de peptone, 0,2% de liquide de macération du maï^ 0,5% de glucose et0^5% d1exta?ait de levure, puis on secoue pendant 48 heures à 30°. On transvase alors 50 ml de la suspension bactérienne dans un erlenmeyer d'une capacité de 2 litres, contenant 500 ml 30 du même milieu. Au bout de 24 heures, on introduit 50 ml du bouillon de culture dans chacun de 4 erlenmeyers contenant 500 ml du même milieu. Après avoir secoué pendant 6 heures, on ajoute, dans chaque flacon, 100 mg de 33-hydroxy- 5a.6a-époxy-androstane-17-one dans 5 ml de diméthylformamide, après 35 quoi on secoue pendant encore 42 heures à 30°. On effectue ensuite l'extraction dû bouillon de fermentation en le secouant avec la méthyl-isobutyl-cétone. On examine une prise d*essai de l'extrait, en regard d'un échantillon standard 40 de 6a-hydroxy-A1•4-androstadiène-3•17-dione, par chromatographie 02615 7 2029463 fusion : 254—258° :f =16 000. 243 7° 02615 8 2029463 en couch.es minces sur des plaques de gel de silice ; le facteur Rf est de 0,37 (dans un mélange à 1 î 4 de benzène et d'acétate d'éthyle). On traite ensuite l'extrait , qui contient d'environ 70 à 80 % du produit de la transformation, 5 par chromatographie sur colonne de la manière habituelle, puis on recristallise le produit brut isolé dans un mélange d'acétone et d'éther isopropylique. On obtient ainsi 275 mg de 6a-hydroxy-^\ ^*^-androstadiène-3«17-dione, fondant à 257-259° • EXEMPLE 15 : 10 De la manière décrité à l'exemple 14, on cultive et on fait fermenter une culture lyophilisée de Mycobacterium phlei. On met de nouveau en jeu comme substrat 400 mg de 30-hydroxy-5a.6oc-époxy-androstane-17-one.On fait fermenter pendant 42 heures. D1 après 11 analyse par chromatographie en 15 couches minces, il s'est formé, là encore, un produit contenant de 70 à 80 % de 6a-hydroxy-A^"^-androstadiène-3.17-dione ; le Ef est de 0,37, dans un mélange à 1 : 4 de benzène et d'acétate d'éthyle. Après avoir soumis le mélange réactionnel au traitement complémentaire habituel, on obtient 260 mg de 20 6oc-hydroxy-A^*^-androstadiène-3«17-dione, fondant à 255-259°• EXEMPLE 16 : De la manière décrite à l'exemple 14, on fait incuber "une culture lyophilisée de Mycobacterium smegmatis, souche ATCC 14 468. On utilise ici encore comme substrat 400 mg de 25 3P-hydroxy-5oc. 6ot-époxy-androstane-17-one. La durée de la fermentation est de 64 heures. D'après l'analyse par chromatographie en couches minces, il s'est formé un produit contenant environ 50 % de 6a-hydroxy-A1 *Z|'-androstadiène-3.17-dione. Après un traitement complémentaire effectué de la manière 3° habituelle, on obtient 180 mg de ôa-hydroxy-A''"^-androstadiène-3 « 17-dione, fondant à 254-257°• 70 02615 2029463 REVENDICATIONS 1.— Un procédé de préparation de 6-hydroxy-3-oxo- LS * -stéroxdes appartenant aux séries du prégnane et de ^ 1'androstane, caractérisé en ce que l'on fait fermenter un 30-hydroxy- ou 3P-acyloxy-5.6-époxy-stéroïde de la série du prégnane ou de l1androstane, dont le noyau A est saturé, avec des "bactéries des genres Bacillus, Mycobacterium ou Arthrobacter, ou avec les enzymes produits par ces germes. 10 2.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'çn fait fermenter avec des bactéries appartenant aux espèces Bacillus lentus, Bacillus sphaericus, Mycobaatérium phlei, Mycobacterium smegmatis ou Arthrobacter simplex. 3— la 6a-hydroxy-1-déshydro-testololactone. 15 4-.- La 6a.15P-dihydroxy-16a-jnéthyl-A'' '^"-prégnadiène- 3.11.20-trione. 5. — La 6a. 21 -dihydroxy-1 Scx-métbyl-ùP1 ° égaadièas== 3.20-dione. 6. - La 6a. 21-dihydroxy-A ^ * ^--or égnadiène-3 • 20-dione • ".'I â 20 ?•- La 6a~hydroxy-16a-méthyl-A ° -prégnadiène- 3.20-dione. 8.- La 6a. 17oc-dihydroxy-*^"-prégnadiène-3.20-dione. 9.- La 6a.113.21-trihydroxy-A^'^-prégnadiène—3«20- dione. 25 10.- La 6a. 110.21 -trihydroxy-16a-méthyl-A - prégnadiène-3»20-dione. ^ ^ 11.— La 6a-hydroxy-16a. 17°c-époxy-A -prégnadiène-3.20-dione. ^ ^ 12.— La 6a.21-dihydroxy-16a.17a—époxy—A -30 pré gnadiène-3.20-dione.