Brevet FR2036801A1 — publié le 19701231

Bbicoccidiose, en particulier la coccidiose de la volaille, est un problème essentiel dans l'industrie de la volaille, et si l'on ne combat pas la mortalité et la morbidité, on endure des pertes économiques sérieuses dans l'élevage de la volaille. La coccidiose est une maladie causée par un parasite protozoaire de grandeur microscopique et appelé coccidia, apparte nant au groupe eimeria. Son hôte spécifique est l'animal. Le fait qu'an agent coccidiostatique est approprié à l'utilisation contre une espèce d1eimeria dans un hôte d'une espèce spécifique n'implique pas forcément qu'il est également efficace contre d'autres espèces d'eimeria dans la mdme espèce ou dans une espèce différente d'hôte. Beaucoup dtagents coccidiostatiques, qui sont efficaces contre une certaine espèce d'eimeria dans un hôte animal, ne présentent pas cette efficacité envers d'autres espèces d'eimeria dans le mdme hôte animal. La coccidiose affecte essentiellement des animaux élevés commercialement et destinés à l'alimentation, en particulier la volaille, telle que les dindons, les canards, les poulets, etc..; les moutons, les bovins, les porcs, etc... sont également affectés. Par exemple, dans l'industrie de la volaille, il 09 a pas de problèmes plus importants et plus communs que les problèmes résultant des maladies parasitaires, telles que la coccidiose0 Le problème est particulièrement important dans l'industrie depuis que les nouvelles techniques d'élevage de la volaille requièrent que les animaux soient proches les uns des autres et vivent ainsi dans des conditions de surpeuplement. Cette étroite proximité des animaux provoque la coccidiose et une progagation rapide de cette infection. L'infection est due à l'invasion des animaux par le parasite protozoaire coccidia. L'infection dans les hôtes animaux est initiée par l'ingestion, en général par les aliments ou par l'eau, d'organismes eimeria se trouvant au stade d'oocystes sporulés. Lorsque les oocystes ingérés entrent dans l'intestin, l'eimeria entre immédiatement dans le stade infectieux et provoque des dommages importants à la paroi intérieure de l'intestin et au caecum. La coccidiose chez les poulets apparat à la fois sous forme chronique et sous forme aiguë. L'un des types, appelé coccidiose caecale, est causé primairement par l'organisme E.tene3la et provoque la destruction de la muqueuse intestinale chez l'hôte. La coccidiose intestinale de la volaille est provoquée primaire ment par pardau-tres espèces d'eimeria et elle est aussi importante du point de vue économique. Comme exemples de telles espèces d'eimeria, on peut citer E. necatrix, E. aceruulina, E. maxima, E. brunetti, E. hagani, E. praecox, E. mitis, etc..0 D'autres organismes, tels que E.- gallopavonis, E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. meleagridis, E. dispersa, E.-innocua, E. subrotunda, etc... provoquent la coccidiose chez les dindons La coccidiose est provoquée chez les canards et les oies par E. truncata, E. anseris, etc..; chez les bovins par E. bovis, E. zurnii, E. alabamensis, E. auburnensis, etc..; chez les moutons par E. ahsata, E. parva, E. faurei, E. arloingi, etc..; chez les porcs par E. debliecki, E. spinosa, etc... I. ressort de- cela que les différentes espèces d'eimeria provoquent- une infection dans divers types spécifiques d'hôtes animaux, Lorsque la coccidiose apparais chez la volaille, par exemple chez les poulets ou. chez les les dindons, l'infection des animaux devient importante sans avertissement préalable ou pratiquement sans avertissement, et il peut. en résulter une mortalité très élevée si les animaux ne sont pas. traités promptement.Les animaux qui survivent à de telles infections ont généralement une valeur économique amoindrie, étant donné qu2ils sont incapables de convertir la nourriture en poids vif; ils grandissent beaucoup plus lentement que des animaux normaux et fréquemment ils sont apatiques. Comme vu ci-dessus, la coccidiose est aussi un problème chez les animaux plus volumineux, par exemple chez les agneaux, les moutons, les veaux, les génisses et les porcs-, bien qu'elle ne soit pas si importante que dans l'élevage de la volaille. Cependant, on commence, aujourd'hui, à se rendre compte de l'effet de la coccidiose sur l'élevage de ces animaux d'un point de vue économique, et dans l'agriculture on commence à reconnaître que les problèmes résultant de la coccidiose ne doivent pas être négligés. Lorsqu'une telle maladie se déclare chez les bovins, un troupeau entier peut être sérieusement infecté sans avertissement préalable ou presque. Il est évident que mdme un taux de mortalité peu élevé animaux volumineux atteints de coccidiose a des conséquences économiques importantes vu que la perte par unité d'animal est importante0 hi Un certain nombre d'agents coccidiostatiques sont aujourd'hui accessibles pour la thérapie ou pour la prévention de la coccidiose, et certains de ces agents sont propres à empe- cher une mortalité élevée chez les animaux infectés.Cependant, la coccidiose se déclare tout de même, et elle est due, dans certains cas, au développement d'une résistance de 1' eimeria envers les agents coccidiostatiques connus. D'autre part, les animaux traités avec certains agents coccidiostatiques connus présentent souvent un mauvais coefficient de fourrage et des graine de poids moins rapides que les animaux sains. En outre, on a trouve que beaucoup d'agents coccidiostatiques connus ntaglssent qu'envers une catégorie limitée d'espèces coccidiales, et ils sont souvent trop coûteux pour une utilisation importante, telle qu elle est nécessaire dans l'élevage de la volaille, en particulier vu les concentrations importantes d'agents coccidiostatiques qui doivent etre utilisés avec succès.Ainsi, le besoin est ressenti d'avoir une composition antiparasitaire qui soit efficace dans le traitement et dans le contrôle de la coccidiose provoquée par un large spectre d'organismes eimeria et qui n'ait pas le désavaitage d'amoindrir l'efficacité de la nourriture et de freiner la croissan- ce. Dtautre part, les éleveurs désirent un agent coccidiostatique très efficace qui soit bien toléré par l'hôte. La présente invention a ainsi trait à une méthode de traitement de la coccidiose chez les animaux, avantageusement chez la volaille, en particulier chez les dindons et chez les poulets, caractérisOeen ce qu'on introduit dans le tracte gastro-intestinal de l'animal infecté par l'agent pathogène une quantité thérapeutique dtun antibiotique cristallisé désigné au laboratoire par 1-537 Â ou un sel correspondant pharmaceutiquement acceptable, par exemple un sel de sodium, de potassium, de baryum, etc... Dtautre part, la présente invention a trait à une méthode empechnnt le développement de la coccidiose chez les animaux, en particulier chez la volaille, caractérisée en ce qu'on introduit des compositions contenant l'antibiotique 1-537 Â cristallisé ou un sel correspondant pharmaceutiquement acceptable dans le tracte gastrointestinal de l'animal avant l'infection. Finalement, cette invention a trait à des compositions coccidiostatiques contenant l'antibiotique 1-537 Â cristallisé. a a découvert que l'antibiotique 1-537 Â cristallisé, ou un sel correspondant pharmaceutiquement acceptable, est utile à la fois pour la prophylaxie et pour la thérapie de la coccidiose. Il est particulièrement utile du fait de sa grande activité envers Eimeria tenella ou envers de multiples infections, par exemple les infections dues aux autres organismes provoquant la coccidiose, tels que E. necatrix, E. acervuline, E. brunetti, E0 maximat E. mivati etc.., particulièrement chez la volaille, par exemple chez les poulets ou chez les dindons. L'organisme produisant l'antibiotique utile dans cette invention a été isolé d'un échantillon de terre recueilli à Hyde Park (Massachusetts) et est un membre du groupe de Streptomyces. Des tubes lyophilisés de la culture, munis de la désignation de laboratoire X-537, ont été déposés dans la collection de microorganismes de l'U.S. Department of Àgriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria (Illinois), sous la désignation N9RT 3382. Cette culture a été rendue accessible au public. L'antibiotique 1-537 b, l'ingrédient actif dans les compositions de cette invention, est obtenu sous la forme de son sel de sodium lorsque la culture se développe sur une variété de milieux en culture submergée. La préparation de cet antibiotique à partir de NRRL 3382 est expliquée par Berger et Collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, Vol. l2, (1951) pages 5295-5298. L'antibiotique qui est obtenu sous forme de sels de sodium par extraction des cellules avec de l'acétate de butyle est soluble dans le benzène et dans l'éther de pétrole chaud, et pratiquement insoluble dans l'eau. La formule empirique de l'anti- biotique est C34H5+08. 'acide libre dans l'alcool isopropylique a un spectre d'absorption ultra-violet caractéristique avec un maximum à 317 mK 3700) et à 249 m (# 6400), et présente des pics principaux dans l'infrarouge (3 ffi dass CHCl3) à 3410, 3030, 2960, 2860, 1705, 1650, 1460 cm 1. il fournit une. réaction positive avec le chlorure ferrique; il est actif in vitro envers les bactéries gram positives et les mycobactéries, mais il est inactif envers les bactéries gram négatives. Le tableau suivant fournit le spectre antimicrobien de l'antibiotique 1-537 À cristallisé. Tableau Spectre antimicrobien de 11 antibiotique 1-537 À Organisme employé dans le test Unités par mg Bacillus E 800 Sarcina lutea 500 Staphylococcus aureus 20 Mycobacterium phlei 20 Corynebacterium simplex 20 Bacillus cereus 120 Bacillus simplex 20 Bacillus nesentericus 50 Saecharomyce cerevisiae 0 Scopulariopsis brevicaulis O Bactéries gram négatives * O * Il s'agit là de Pseudomonas aeruginosa, Âerobacillus polymyxa et Escherichia coli. L'antibiotique n'est pas toxique et ne provoque pas d'effet secondaire non désiré lorsqu'il est utilisé aux dosages nécessaires à un contrôle efficace de la coccidiose. Le dosage toxique de l'antibiotique, tel qu'il a été testé sur les souris et désigné par dose létale, est le suivant : Tableau Mode d'administration Dose létale Dose tolérée mg/kg (LD 100) mg/kg (LD 0) Orale 125 62,5 Sous-cwianée 125 62,5 Intrapéritonéale 62,5 50 On peut préparer l'antibiotique en cultivant les organismes Btreptomyces en une culture aérée submergée. Ceci peut dtre effectué, soit dans une bouteille secouée ou dans des réservoirs de fermentation en acier inoxydable et fer ayant un volume de 200 à 4000 litres.Les bouillies sont ajustées à un pH qui est quasineutre; c'est-à-dire de 6,5-7,5, avant la stérilisation, et elles sont alors incubées à des températures légèrement élevées, par exemple à environ 27o30o, après avoir été inoculées avec des suspensions de spores ou des cultures végétatives. La bouillie est alor filtrée et la substance active est extraite avec un solvant approprié, préférence avec le méthanol, le n-batanol ou l'acétate de butyle.L'activité antibiotique est observée par la méthode de la diffusion en gélose dans des bottes de pétri, où on emploie Bacillus . comme organisme de test. 3n général, la concentration d'antibiotique nécessaire pour produire une zone d'inhibition de 20-22 mm de diamètre avec l'organisme test est considérée comme étant une unité par nil. Pour le titrage, les bouillies. sont diluées entièremeLt dans une solution-tampon de phosphate à 1 % (pH 6,0)0 La culture de l'organisme Streptomyces peut Cotre effectuée sur un milieu qui produit des antibiotiques.Comme exemples de milieux appropriés, on peut citer ceux qui contiennent des sources d'azote complexe, telles que la farine de soja, la farine de poissons, des résidus de distillation et de la farine de graine de coton. Ces milieux permettent la production djantibiotique avec 30-400 unités d'activité. Les milieux thétiques ne sont en général pas satisfaisants, étant donné qu'ils fournissent des rendements bas. Les sels pharmaceutiquement acceptables de l'antibiotique 1-537 À peuvent titre préparés par des moyens conventionnels. Parmi de tels sels, on peut citer les sels de métal alcalin les sels de métal alcalino-terreux et les sels organiques. On préfère les sels de sodium, de potassium, de calcium et de baryum. le sel de sodium est préparé par réaction de 11 antibiotique avec le carbonate de sodium; le sel de potassium est préparé par réaction de l'antibiotique avec le carbonate de potassium et le sel de baryum est préparé par réaction de l'antibiotique avec l'hydroxyde de baryum. Les compositions coccidiOstatiqUcs de cette invention contenant comme ingrédient actif l'antibiotique 1-537 À cristalli- sé, ou un sel correspondant pharmaceutiquement acceptable, sont préparées par mélange de l'ingrédient actif avec un ingrédient inerte. L'ingrédient actif peut comprendre un aliment, des substances de ballast, etc... Par le terme "ingrédient inerte", on entend une substance qui ne fonctionne pas comme agent antiparasitaire, qui est inactif envers l'ingrédient actif et qui peut etre ingéré sans danger par les animaux devant titre traités; une telle substance inerte est donc inactive quant au but de la présente invention. htantibiotique cristallisé ou ses sels sont efficaces pour la prophylaxie ou pour la thérapie de l'infection lorsqu'ils sont administrés oralement, comme une composante de la nourriture, à la volaille domestique exposée à la coccidiose, en particulier aux dindons et aux poulets. D'autre part, la volaille traitée maintient son poids ou gagne en poids relativement aux animaux témoins Ainsi, les compositions de cette invention non seulement luttent contre la coccidiose, mais encore elles favorisent la transformation de nourriture en poids vif. La concentration de l'ingrédient actif dans la nourriture animale peut naturellement etre ajustée aux besoins individuels et peut varier entre de larges limites. Les limites sont fixées par les impératifs suivants i la concentration minimum est telle qu'une quantité suffisante d'ingrédient actif est présente pour effectuer le contrôle désiré de la coccidiose et la concentration minimum est telle que la quantité de composition ingérée ne provoque pas d'effet secondaire indésirable0 ffinsi, par exemple, un prémélange de nourriture animale, ou l'aliment complet, contient suffisamment de substance active pour assurer environ 0,001 % à environ 0,0125 % en poids de la consommation de nourriture journalière.De préférence, on utilise environ 0,00312 % à 0,00625 % en poids0 Généralement, 0,005 % de la substance active est suffisant pJr contrôler et pour combattre la coccidiose. Des quantités supérieures à 0,0125 %, tout en étant efficaces, ne fournissent généralement pas de meilleur résultat que 0,0125 %. M & e si des quantités supérieures à 0,00625 % sont efficaces dans la lutte contre la coccidiose, cette quantité est la limite supérieure préférée pour des raisons économiques, étant dohné que le codt est le plus bas à ce niveau. Les quantités inférieures à 0,001 % ne sont pas efficaces dans la lutte contre la coccidiose. On préfère une limite inférieure à 0,00312-%, étant donné que celle-ci assure le plus grand effet. La quantité la plus avantageuse, c'est-à-dire 0,005 % en poids de la consommation journalière de nourriture pour volaille, est particulièrement efficace, étant donné qu'elle produit un effet maximum avec une dose minimum.La dose optimum varie évidemment avec la taille de l'arr al. Lorsqu'on utilise les composés de cette invention pour la thérapieSSou pour la prophylaxie de la coccidiose, l'agent coccidiostatique peut d'abord être composé ou mélangé avec un ingrédient alimentaire ou un support de manière à fournir un prémélange adjuvant de nourriture, un concentrat de nourriture ou un supplément d'adjuvant de nourriture. Un adjuvant de nourriture, un concentrat ou un prémélange est un article destiné à titre dilué de manière à fournir un aliment complet, c'est-à-dire un article destiné à dtre administré en une seule ration.Un supplément d'adjuvant de nourriture est un article destiné à la consommati on directe par un animal ou qui peut être dilué davantage de manière à fournir un aliment complet ou qui peut être ingéré et utilisé comme supplément pour d'autres rations. Les suppléments d'adjuvant de nourriture, les concentrats et les prémélanges contiennent un pourcentage relativement important d'agents coccidiostatiques, c'est-à-dire d'ingrédient actif, et on les prépare habituellement en ajoutant l'ingrédient actif à un support approprié et en mélangeant de manière à obtenir une dispersion uniforme de l'agent-coccidiostatique dans le support. Comme supports appropriés, on peut citer des solides qui sont inertes vis-à-vis de l'ingrédient actif et qui peuvent etre ingérés sans danger par les animaux.Comme tels supports on peut citer la nourriture de volaille commerciale, des grains de céréales moulus, des produits secondaires de grains, des concentrats de protéine végétale (soja, cacahuète, etc..), des produits secondaires de fermentation, du sel, du calcaire, des composés inorganiques, etc... et des mélanges de ceux-ci.On peut préparer des dispersions liquides en utilisant de l'eau ou de l'huile végétale contenant de préférence un agent tensio-actif, un agent émulsifiant, etc... dans la dispersion li= quide, telle que l'acide éthylènediaminetétracétique, etc... et des agents olubilisantso Tout support approprié ou toute substance de ballast peut servir d'ingrédient inerte dans la forme solide de l'agent antiparasitaire, pourvu qu'il soit inerte vis-à-vis de la substance active et qu'il soit non toxique vis-à-vis de l'animal auquel il est administré. L'ingrédient actif peut, par toute technique convenable, être mélange en une pate, des boulettes ou toute configuration désirée avec le support inerte ou la substance de ballast solide. Par exemple, on peut préparer ces compositions en moulant finement ou en pulvérisant l'ingrédient actif et l'ingrédient inerte avec un moulin habituel ou un appareil de pulvérisation, avec ou sans nourriture. Si l'on moud ou pulvérise sans la nourriture, la substance résultante peut titre répartie conformément à la présente invention dans tout aliment.Les aliments de volaille typiques auxquels on peut ajouter l'ingrédient actif de cette invention peuvent contenir plusieurs ingrédients, par exemple ils peuvent contenir de la graine de haute énergie, telle que le mais, le blé, la farine d'avoine, etc..; de la graine à énergie moyenne ou basse, telle que de l'avoine, l'orge, la farine de blé, les remoulages, les remoulages standard, etc..; les graisses stabilisées; les protéines végétales, telles que la farine de soja, la farine de gluten de mLTs, la farine de cacahuètes, etc..; des protéines animales, telles que la farine de poissons, des résidus. de pressage de poissons, des particules de viande, etc.; des sources UGF (unidentified growth factor) et d'autres supports de vitamine B, tels que les produits desséchés du lait, des levures de bière desséchées, des produits solubles de distillateur secs, des produits solubles secs de fermentation, etc..; de la farine d'alfalfa deshydratée; et des adjuvants spéciaux variés, tels que la lactoflavine, la vitamine 312 le pantothénate de calcium, la niacine, la choline, la vitamine E et la vitamine E, etc.., de meme que de la vitamine Â stabilisée, la vitamine D) (stérols animaux D active vés); des suppléments de calcium et de phosphore, tels que le phosphate dicalcique, la farine d'os, le phosphate défluoruré, le calcaire, etc..; du sel iodé, du sulfate de manganèse, du carbonate de zinc, un supplément de nourriture antibiotique; la méthionine ou- son analogue hydroxylé et un agent anti-oxydant. Les compositions coccidiostatiques sont destinées à l'administration orale. Elles peuvent titre ajoutées à la nourriture normale de l'animal traité ou elles peuvent être administrées par d'autres procédés, tels que l'incorporation de celles-ci dans un comprimé, des pilules, etcs.. L'administration de l'ingrédient actif dépendra de l'animal spécifique et des conditions d'élevage rencontrées. Exemple 1 PréParation d'antibiotique 1-537 Â cristallisé Les organismes Streptomyces sont cultivés en culture submergée aerée dans des bouteilles agitées. Le pH de la bouillie est ajusté à 6,5-7,5 par addition d'une solution de EOH, ensuite la bouillie est stérilisée0 On utilise un réservoir de fermentation dans lequel on introduit un inoculun de 5 à 10 r consistant en une culture submergée vieille de 3 jours provenant des bouteilles aérées, Le milieu contient 2 % de farine de graine de soja, 2 % de sucre brun, 0,5 ffi de Hop04. La fermentation est effectuée à 280 sous une pression d'air positive avec des courants d'air de 150-300 litres par minute pour 150-300 litres de charge liquide. La bouillie est récoltée après 4 à 6 jours de fermentation, filtrée et l'antibiotique est recueilli par extraction. L'extraction est effectuée de la manière suivante : 204 litres de bouillie sont filtrés et le gâteau humide du filtre est mis en suspension dans 100 litres d'acétate de butyle et le mélange est agité jusqu'au lendemain à la température ambiante. Le mélange est alors filtré et la couche d'eau est séparée et jetée. La solution d'acétate de butyle, contenant d'après le titrage 30 maillions d'unité de Bacillus E, est concentrée sous vide à 3 litres, lavée avec une solution de carbonate de sodium à 10 % et desséchée avec du sulfate de sodium anhydre. après concentration ultérieure à 300 ml et dilution avec 350 ml d'éther de pétrole (point d'ébullition 50-60 ), 41 g de substance solide, contenant 25 millions d'unité de Bacillus E, se séparent. Cette substance solide est alors extraite dans un appareil Soihlet avec 4 litres d'éther de pétrole (point d'ébullition 50-60 ) pendant 40 heures. L'extrait est desséché sous vide, le résidu cristallisé est mis en suspension dans l'éther de pétrole et filtré; on obtient 24,49 g contenant 500 unités E par mg : total de 12,25 millions d'unités E. La liqueur-mère du solide fournit encore 5s73 g de l'antibiotique cristallisé. Après cristallisation dans le mélange éther-éther de pétrole, cette substance qui contient le sodium est dissoute dans l'éther et lavée dans l'éther sulfurique dilué pour le transformer en acide libre, Par élimination de l'éther on obtient un résidu huileux qui cristallise dans l'éthanolO Plusieurs recristallisations dans l'méthanol ne changent pas le point de fusion qui reste imprécis à 100-1090; [&alpha;]266 (D -7,2 ) (méthanol, c. i); le titrage fournit 800 unités-E par mg. Le spectre d'absorption ultraviolet de l'acide libre présente des maxima à 317 mf ( & 3700) et 249 mF ( g 6400) dans l'alcool isopropylique.L'acide est soluble dans les solvants organiques et insoluble dans l'eau, mais il ne peut être obtenu sous forme cristallisée qurà partir des alcools, à partir desquels il semble cristalliser avec une ou plusieurs molécules de solvant. Avec le chlorure ferrique alcoolique on obtient une coloration vert-bleuâtre, Le test à l'anthrone pour le carbohydrate est négatif L'antibiotique réagit avec le diazométhane éthéré, mais on ne peut pas isoler de produits cristallisés. il ne contient pas d'azote et pas d'halogène, de phosphore ou de soufre, et après combustion il ne reste pas de cendre, L'analyse du composé donne les résultats suivants : Analyse : calculé pour C34H5408 : C = 69,12 ; H = 9,21 ; O = 21,67 trouvé : C = 68,88 ; H = 9,48 ; 0 = 21,73. Un échantillon recristallisé deux fois à partir d'alcool isopropylique fond à 100-1090; son analyse fournit les résultats suivants : analyse : calculé pour C34H5408 : C = 69,12 ; H = 9,21 pour C3H7OH : C = 68,27 ; H = 9,60 ; pour C34H54O8.2C3H7OH : C = 67,57 ; H = 9,93. Trouvé (desséché à 500) : C = 67,60 ; H = 9,32 ; Trouvé (desséché à 600) : C = 68,24 ; H = 9,35-9,26. Exemple 2 Sel de sodium de l'antibiotique X-537 A cristallisé On prépare le sel de sodium en secouant une solution d'éther de l'acide libre avec du carbonate de sodium aqueux. Le sel qui reste dans l'éther est recristallisé deux fois dans le mélange benzène/ligrolne et desséché. Le point de fusion mesuré dans un tube capillaire ouvert se situe à 1961970 (déc.). Après stockage au froid, le point de fusion se situe à 191-192 (déc.). On titre alors par voie électrométriquee 0,6204 g de sel de sodium utilise 10,1 ml d'acide chlorhydrique O,iN, L'analyse du sel donne les résultats suivants Calculé pour C34H5308Na : C = 66,65 ; H = 8,70 Trouvé (desséché à 780) : C = 66,65 ; H = 8,89 Par analyse, on trouve un poids équivalent de 604 pour un poids équivalent calculé de 610,7. Le spectre d'absorption ultraviolet du sel de sodium dans l'alcool isopropylique présente un maximum à 308 mt ( & 4100) et une inflection à environ 245 m . Le spectre infrarouge du sel de sodium présente les pics principaux suivants : (3 i6 dans le chloroforme) 3500-3100 (large), 3000, 2960, 2940, 2875, 1710, 1600, 1580, 1460, 1440, 1390, 1380 cm"l Exemple 3 Sel de potassium de l'antibiotique X-537 Â crlstallisé On prépare le sel de potassium en secouant une solution éthérée de acide libre avec du carbonate de potassium aqueux en desséchant et en éliminant l'éther sous vide.Le résidu cristal- lisé est recristallisé deux fois dans l'éther de pétrole et desséché sous vide à 1000. Le composé a un point de fusion de 177-1780, Après analyse, on obtient les résultats suivants : Calculé pour C34H5308K : C = 64,94 ; H = 8,48 ; E = 6,22 Trouvé : C = 65,23 ; H = 9,17-8,94 ; K = 6,17-6,24. Exemple 4 PréParation d'une bouillie desséchée d'antibiotiqueX-537 Â On prépare des plaques de gélose inclinée présentant la composition suivante (en grammes par litre) : pâte de tomate en conserve, 20 ; farine de soja dégraissée (Soyalose 103), 10 ; glucose technique, 10 ; carbonate de calcium, 2 ; peptone bactériologique (Wilson Medo peptone), 1 ; phosphate dipotassique, 1 ; gélose granulée, 20. Le milieu est ajusté au pH 7,0 avant la stérilisation. Un certain nombre de plaques de gélose inclinée sont inoculées avec des spores et du mycélium de Streptomyces et mises à incuber à 280 pendant environ 7 jours. Après cette période de temps, les plaques de gélose inclinées présentent une forte sporulation0 A l'aide d'une anse, des spores sont transférés de manière à inoculer des portions de 400 ml de milieu nutritif contenues dans des flacons coniques de 2000 ml munis d'un orifice inférieur. Le milieu contient, en grammes par litre : du sucre brun, 20 ; de la farine de soja dégraissée (Soyalose 103), 20 de la liqueur de macération de mats, 5 ; de l'huile de saindoux, 2; du phosphate dipotassique, 1,0. Le milieu est ajusté au pH 7,0 avant la stérilisation.Après l'inoculation, les flacons sont mis à incuber à 280 sur une secoueuse rotative agitant à 240 tours par minute suivant une orbite circulaire horizontale de 2,50 orne Après 5 jours d'incubation, des quantités de 200 ml de la culture très développée sont transférées de manière aseptique sur des quantités de 8,5 litres de milieu contenu dans des récipients de fermentation Nev Brunswick de 14 litres. Le milieu de fermentation contient, en grammes par litre : de la farine de grains de coton, 5 ; de l'amidon de maIs, 5 ; de l'huile de soja, 10 ; du phosphate disodique, 1. Le milieu est ajusté au pH 7,0 avant la stérilisation, puis mis à l'autoclave à 1200 pendant 45 minutes. Après inoculation, on incube quatre autres récipients de fermentation agités à 280 tout en y faisant passer 4 litres d'air par minute et en les agitant à 500 tours par minute. On ajoute de l'huile de soja stérilisée pour empêcher la formation d'écume. Après incubation pendant 212 heures, le milieu nutritif a atteint la concentration maxima et les flacons de fermentation sont vidés. Les bouillies sont mises en commun et bien mélangées pour les rendre homogènes. 2 portions de 2,5 litres de la bouillie non filtrée sont placées sur des plateaux d'acier inoxydable à fond plat et congelées dans un congélateur0 Lorsque la bouillie est entièrement congelée, les plateaux sont placés dans un appareil à lyophiliser et deshydratés à l'état congelé0 La bouillie contient alors environ 10,8mg d'antibiotique 1-537 A par gramme. Exemple 5 Cet exemple illustre l'utilisation de l'antibiotique coccidiostatique cristallisé dans la nourriture animale. On prépare une nourriture médicinale pour volaille, plus particulièrement une nourriture donnée aux poulets au début de la croissance, en mélangeant 0,005 ffi en poids de l'antibiotique 1-537 A cristnllisé avec une ration de base consistant en :: Ingrédient kg par tonne Farine de mais jaune 510 Graisse stabilisée ou huile végétale 27 Farine de soja avec une petite teneur en fibres et 50 ffi de protéine 220 Farine de gluten de malus 23 Farine de poissons traitée par un anti-oxydant contenant 60 % de protéines 14 Résidu de pressage de poissons séché .5 Particules de viande et d'os, 50 ffi de protéines 64 Produits solubles secs de distillation de malus 23 Farine d'alfalfa, 17 % de protéines, 100 000 'A/kg 14 Sel iodé 2,5 Sulfate de manganèse, qualité alimentaire 0,35 Carbonate de zinc ou oxyde 0,11 Lactoflavine, g 3 Vitamine 312 mg 6 Pantothénate de calcium, g 5 Niacine, g 30 Vitamine A stabilisée, unités USP 6 000 000 Vitamine D3 unités IC 650 000 Acétate de vitamine E, unités internationales -5 000 Vitamine K, (sodio-bisulfite de ménadione), g 2 DL-méthionine ou analogue hydroxylé, 0,5 Anti-oxydant (éthoxyquine ou hydroxytoluène butylé) Ot1 On peut préparer des nourritures semblables contenant l'antibiotique à d'autres concentrations, par exemple, contenant environ 0,001 % à 0,0125 % en poids du composé précité. Les tests suivants sont effectués pour déterminer l'activité de l'antibiotique X-537 A cristallisé. A. Infection par Binaeria tenella avec des wousssns de laboratoire Méthode de test Dans ce test, on utilise 10 poussins par groupe de drogue. On utilise 10 poussins comme groupe témoin du poids et 10 poussins comme groupe témoin infecté. Le médicament est administré 24 heures avant l'infection. Un gramme de la drogue de test est mélangé dans un mélangeur mécanique avec une quantité suffisante de nourriture de poussins de manière à obtenir le dosage désiré. L'infection est provoquée par environ 300 000 oocystes administrés oralement à l'aide d'une pipette. Le test dure 8 jours, ensuite les animaux survivants sont soumis à l'autopsie et on observe les lésions importantes au caecum. Les animaux testés sont classés suivant le nombre de survivants et le nombre de lésions caecales. Les résultats sont exprimés en degré moyen d'infection (D.M.I.). Un degré moyen d'infection inférieur à 2,5 est considéré comme important. Résultats du test Degré moyen % Mor- Gain en de l'in- talité poids % Dosage fection Composé dans la nourri- Traité Non- Trai- Non- Trai- Non ture. % ~~~~~~ traité té traité té traité Contrôle non-infecté et non-traité aucun 0,0 0 100 Contrôle infecté et non-traité aucun 3,0 25 68 Antibiotique 1-537 A cristallisé 0,00625 0,4 O 92 0,00312 2,2 O 85 Le tableau fait apparaître que l'utilisation d'antibiotique cristallisé comme agent coccidiostatique n'amoindrit pas substantiellement la conversion de nourriture en poids vif. B. Infection multiple d'Eimeria chez les poussins Méthode de test La méthode du test est la même que pour Eimeria tenella. 11infection multiple d'Eimeria testée est provoquée par des mélanges de E. tenella, E. necatrix, E. acervulina, Eo brunetti, E. maxima, E. mivati. Résultats du test Degré moyen % Morta- Gain en Composé Dosage de l'in- lité poids % dans la fection nourri- Traité Non- Traité Non- Traité Non ture, % traité ~~~~~~ traité traité Contrôle noninfecté et non-traité aucun 0,0 0 100 Contrôle infecté et non-traité aucun 3 50 62 Antibiotique 1-537 A cris- 0,00625 0,0 0 108 tallisé 0,00312 0,9 0 105 Be tableau montre que l'antibiotique cristallisé est efficace pour le traitement de coccidiose multiple et qulil est d'autre part intéressant du fait qu'il entre une efficacité de la conversion de nourriture en poids vif supérieure à l'efficacité à laquelle on sgest attendus, prouvant ainsi la présence d'un certain effet synergique. Rt;v;NDICATIONS gent coccidiostatique, en particulier aliment pour animaux, caractérisé en ce qu'il contient, pour 100 parties en poids, environ 0,001 à environ 0,0125 partie en poids de l'anti- biotique 1-537 A ou-d'un sel correspondant. 20- Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient pour 100 parties en poids environ 0,00312 à environ 0,00625 partie en poids de la substance active, 3.- Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient, pour 100 parties en poids, environ 0,005 partie en poids de la substance active. 4.- Agent selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance active est présente sous forme cris tallisée. 5.- Concentré pour la préparation d'un agent selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient l'antibiotique 1-537 A ou un sel correspondant et un support solide ou liquide. 6.- Procédé de préparation d'agents coccidiostatiques, en particulier dtaliments pour animaux, ou de concentrés pour la préparation de tels agents, caractérisé en ce qu'on mélange ltantibiotique 1-537 A ou un de ses sels avec un support inerte. 7.- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le support inerte consiste en aliment pour animaux et/ou en substance de ballast. 8.- Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on ajoute à 100 parties en poids de support inerte environ 0,001 à environ 0,012 partie en poids de l'antibiotique La537 A cristallisé ou d'un-sel correspondant. 9e- Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on ajoute à 100 parties en poids de support inerte environ 0,00312 à environ 0,00625 partie en poids d'antibiotique 1-537 A cristallisé ou d'un sel correspondant0 10.- Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on ajoute à 100 parties en poids de support inerte, environ 0,005 partie en poids de l'antibiotique X-537 A cristallisé ou d'un-sel correspondant. 11.- Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'on ajoute la substance active sous forme cristallisée. 120- Agent favorisant la croissance, en particulier aliment pour animaux, caractérisé en ce qu'il contient, pour 100 parties en poids, environ 0,001 à environ 0,0125 partie en poids de l'antibiotique X-537 A ou d'un sel correspondant. 13.- Agent selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient pour 100 parties en poids environ, 0,00312 à environ 0,00625 partie en poids de substance active. 14.- Agent selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient pour 100 parties en poids environ, 0,005 partie en poids de la substance active. 15.- Agent selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que la substance active est présente sous forme cristallisée.