Brevet FR2040195A1 — publié le 19710122

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une solution stable des protéines du plasma : albumine et globulines alpha et bêta, qui trouve des applications en médecine. On connait déjà des procédés de préparation de solutions de protéines à partir du plasma ou du sérum sanguin exempt d'hémopigments, notamment un procédé de préparation d'une solution stable de protéines à partir du plasma par fractionnement à froid avec de l'ethanol, procédé dans lequel on ajoute de l'éthanol au plasma jusqu'à une concentration finale de 8 0,6, ce qui provoque la précipitation du fibrinogène. Le précipité est séparé par centrifugation. Le produit centrifugé est additionné d'éthanol jusqu'à une concentration de 25 %. . Il y a alors précipitation de la fraction des globulines gamma.On sépare les précipités et ajoute au produit centrifugé ajusté au pH 4,8 de l'éthanol jusqu une concentration de 40 S'o. Il y a précipitation de l'albumine et des globulines alpha et bêta. On soumet le précipité à un séchage par lyophilisation, puis on dilue, en vue de l'obtention du produit final, avec de l'eau distillée apyrogène avec addition de stabilisants. L'inconvénient de ce procédé réside dans la nécessité de faire appel à des matières premières exemptes d'hémopigments. On connaît des procédés d'obtention de l'albumine à partir des solutions contenant des hémopigments par précipitation de ceuxci avec des ions de métaux lourds, notamment des ions zinc. L'inconvénient des procédés indiqués est la difficulté de la purification du produit visé d'ions de métaux lourds, ce qui limite l'industrialisation de ces procédés. L'invention se propose de remédier aux inconvénients précités, par un choix judicieux des conditions pour la dénaturation des globulines thermolabiles et pour la dégradation des hémopigments, de manière à obtenir une solution stable de protéines du plasma, exempte de globulines thermolabiles et d'hémopigments, à partir de solutions contenant des hémopigments. L'invention a pour objet un procédé de préparation d'une solution stable des protéines du plasma : albumine et globulines alpha et bêta, par fractionnement des protéines du plasma et du sérum sanguin avec isolement ultérieur de la fraction contenant l'albumine et les globulines alpha et bêta, caractérisé en ce qu'on utilise comme matière de départ du plasma et du sérum contenant des hémopigments, et on ajoute à la fraction isolée, de liteau oxygénée jusqu'à ce que sa concentration finale dans la solution re présente de 0,01 à 0,1 /;, en opérant à une température ne dépassant pas 700C et en maintenant à cette même température pendant deux à dix heures, avec séparation ultérieure des globulines thermolabiles dénaturées et des hémopigments à partir de ladite solution. On peut mettre en oeuvre le procédé suivant l'invention de la manière suivante La matière de départ, telle que le sérum rétroplacentaire et celui provenant des avortements, le plasma hémolysé du sang provenant des donneurs et des cadavres, ou d'autres genres des matières premières, est fractionnée par n'importe quel procédé connu jus qu'à obtention d'une fraction contenant l'albumine, les globulines alpha et bêta et- les hémopigments. La fraction isolée est débarrassée d'agents de fractionnement (en cas d'utilisation de sels) et diluée avec de l'eau distillée, de préférence jusqu'à une concentration de 6 % de protéines dans la solution. On ajoute à la solution de l'eau oxygénée jusqu'à une concentration finale de celle-ci dans la solution de 0,01 à 0,1 %, en opérant à une température ne dépassant pas 700C et en maintenant la solution à cette meme température pendant deux à dix heures. Le chauffage dans les conditions indiquées exerce un effet dénaturant sur les globulines thermolabiles et la partie protidique des hémopigments, ce qui conduit à la dégradation du complexe globine-hématine. La présence d'eau oxygénée assure la décomposition de l'hématine, la libération du fer et l'oxydation de celui-ci sous la forme trivalente. Pendant le chauffage, il y a formation d'un précipité de globulines dénaturées et d'hémopigments, que 1'on sépare par centrifugation. La solution obtenue contient au moins 70 fo d'albumine et au plus 30 do de globulines alpha et bêta stables, rapportées à la quantité totale de protéines, et ne contient pas d'hémopigments. La solution en question contient 4,3 à 4,8' de protéines totales et moins de 1 % dtéthanol. Pour obtenir une solution à teneur plus forte en protéines, on modifie le rapport-entre la quantité de la fraction initiale d'albumine et de globulines alpha et bêta, et celle du solvant, ou bien on augmente la concentration du produit final par n'importe quel procédé connu. Le procédé suivant l'invention permet d'isoler l'albumine pure à partir de la solution-de protéines du plasma obtenue. A cet effet, on ajuste la solution débarrassée d'hémopigments à un pli de 4,7 à 4,8 et on y ajoute de l'alcool éthylique en portant sa concentration dans la solution à 18 ',0. On sépare par centrifugation le précipité formé, on porte le pH de la solution obtenue à 5,2 et on ajoute de l'alcool éthylique jusqu'à ce que sa concentration dans la solution soit de 40. On assiste à la formation d'un précipité d'albumine pure que l'on porte à l'état final par des procédés communément utilisés. Le procédé suivant l'invention permet d'obtenir une Solution stable de protéines du plasma, exempte d'hémopigments et de globulines thermolabiles, à partir de solutions de protéines à n'importe quelle teneur en hémopigments. La teneur de la solution stable de protéines du plasma obtenue en chlorure de sodium représente un quart de celle du plasma des donneurs. La pression isooncotique de la solution, dans les cas nécessitant l'utilisation d'une solution à basse teneur en chlorure de sodium (pour le traitement des maladies rénales), est obtenue en ajoutant du glucose à la solution. Lors du traitement thérapeutique des maladies ne nécessitant pas la limitation de l'introduction de chlorures dans l'organisme, l'isooncoticité de la solution est obtenue en lui incorporant la quantité correspondante de chlorure de sodium ou d'autres sels. Les exemples suivants illustrent le procédé de préparation d'une solution stable de protéines du plasma à partir de solutions contenant des hémopigments, suivant l'invention. EXEMPLE 1. On utilise un sérum rétroplacentaire à une teneur accrue en hémopigments. On refroidit le sérum à OOC et ajoute sous agitation continue de l'méthanol à 53 ,o refroidi à la température de -150C, à raison de 180 ml pour chaque litre du plasma de départ. On crée ainsi dans le mélange une concentration d'alcool égale à 8;. Il y a d'ailleurs une baisse de température de -30C. Dans ces conditions, les caillots et la mucosité se séparent. On soumet le mélange à une centrifugation, sépare le culot et ajoute au produit centrifugé de l'éthanol à 53 ',0 refroidi à -150C, à raison de 720 ml pour chaque litre du plasma de départ. La concentration d'alcool dans la solution atteint 25 %, la température du mélange baisse à 80c. Dans ces conditions, il y a précipitation de la fraction contenant la globuline gamma que l'on sépare par centrifugation. On ajoute au produit centrifugé obtenu de l'acide chlo rhydrique 1 N jusquà obtention d'un pH de 6,0, le précipite formé étant ensuite séparé par centrifugation. On ajoute au produitn cen- trifugé, à raison de 200 ml pour chaque litre de celui-ci, de l'éthanol à 96 i refroidi à -15 C, en quantité telle que concentra-. tion finale dans la solution atteigne 40 dp. On baiss 4 e pH à 4,8 par addition de HCl 1 N. Le précipité qui en résulte est séparé par centrifugation et dissous dans 4 volumes d'eau distillée apyrogène contenant 0,3 d de caprylate de sodium et 3 % de glucose. La dissolution est opérée sous malaxage poussé pendant trente à quarante minutes. On soumet le mélange obtenu à une centrifugation, on sépare le culot et ajoute au produit centrifugé de la soude caustique 1 N jusqu'à un pH de 7,2. La solution obtenue est portée à 650C puis additionnée d'une solution à 10 % d'eau oxygénée de façon à obtenir une concentration finale de celle-ci de 0,05 % dans la solution, après quoi la solution est maintenue à la température de 650C pendant dix heures, la teneur résiduelle en alcool ne dépassant pas 1 %. Après avoir refroidi la solution, on y ajoute de l'acide chlorhydrique 1 N jusqu'à un pH de 5,1. Il y a formation d'un précipité que l'on sépare par filtration. On ajoute à la solution de la soude caustique 1 N jusqu'à un pH allant de 7,0 à 7,4. La solution obtenue, contenant des hémopigments et des globulines instables et exempte de virus d'hépatite, est clarifiée et stérilisée par filtration puis mise dans des flacons. EXEMPLE 2. On utilise comme matière de départ le plasma d'origine des donneurs a une teneur augmentée en hémopigments. Le fractionnement s'opère comme dans l'exemple 1. On dissout la fraction obtenue, contenant l'albumine, les globulines alpha et bêta, des hémopigments, dans 4 volumes d'eau distillée apyrogène contenant 0,3 ,' de caprylate de sodium et 3 ?,6 de glucose. La dissolution se fait pendant trente à quarante minutes sous malaxage poussé. On soumet le mélange obtenu à une centrifugation et ajoute au produit centrifugé de la soude caustique 1 N de façon à l'ajuster à un pH de 7,2. On porte la solution obtenue à la température de 600C, puis ajoute une solution à 10 ss d'eau ocygénée de façon à en obtenir une concentration finale dans la solution égale à 0,03 , et on maintient la solution pendant deux heures à la température de 60 Oc. Après le refroidissement de la solution, on y ajoute de l'acide chlorhydrique 1 N de manière à porter le pH à 5,1. Il y a formation d'un précipité que l'on sépare par filtration. On ajoute à la solution de la soude caustique 1 N de façon à porter le pH à 7,0 à 7,4. On obtient une solution contenant 4,3 à 4,8 Xp de protéines. La solution obtenue, exempte d'hémopigments et de globulines instables, est clarifiée et stérilisée par filtration, mise dans des flacons et soumise à la pasteurisation pendant dix heures à la température de 600C,-en vue de l'inactivation du virus d'hépatite infectieuse -épidémique. - REVENDICATION. Procédé de préparation d'une solution stable des protéines du plasma : albumine et globulines alpha et bêta, par fractionnement des protéines du plasma et du sérum sanguin, avec isolement ultérieur de la fraction contenant l'albumine et les globulines alpha et bêta, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on utilise, titre de matière de départ, du plasma et du sérum contenant des hémopigments, on ajoute à la fraction isolée de l'eau oxygénée jusqu'à ce que sa concentration finale dans la solution atteigne 0,01 à 0,1 74, en opérant à une température ne dépassant pas 700C, et on maintient la solution à cette même température pendant deux à dix heures, avec séparation ultérieure des globulines thermola- biles dénaturées et des hémopigments dégradés à partir de la solution finalement obtenue.