Brevet FR2025455A1 — publié le 19700911

la présente invention concerne la fabrication d'un antibiotique connu chimiquement sous le nom d'acide (-)(cis-1,2-époxy- propyl)phosphonique et en particulier un procédé perfectioené pour produire l'antibiotique par fermentation de milieux nutritifs avec des souches appropriées de micro-organismes, comme par exemple, Streptomyces. L'antibiotique est produit pendant la fermentation aérobie de milieux nutritifs aqueux convenables dans des conditions contrôlées. Des milieux aqueux comme ceux quion emploie pour la production d'autres antibiotiques conviennent pour la production de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. De tels milieux contiennent des sources de carbone et dtazote qui sont assimilables par les mîcroorganismes, et des sels minéraux. En outre, les milieux de fermentation contiennent des traces de métaux nénesZ saires pour la croissance du micro organisme qui sont en général apportées comme impuretés avec les autres constituants du milieu. En général, des hydrates de carbone corme les sueresp par esemple le sucrose, le maltose, le fructose, le lactose et analogues et des amidons comme les amidons de grain, par exemple d avoine et de seigle, l'amidon de maïs, la farine de mas et analogues peuvent être utilisés soit seuls, soit en mélanges comme sources de car- bone assimilable dans le milieu nutritif. La quantité exacte de source ou sources d'hydrates de carbone utilisée dans le milieu dépend en partie des autres ingrédients du milieu. Ona trouvé toutefois qu'unie quantité d'hydrate de carbone comprise entre environ 1 et 6 % en poids du milieu est suffisante.On peut utiliser une seule source ou plusieurs sources de carbone dans le milieu. Des sources d'azote satisfaisantes comprennent les très nombreuses matières protéiniques comme les diverses formes d'hydrolysats de protéines, de farine de soja, de liqueur de trempage de mars, de distillers solubles, d'hydrolysats de levure, de pâtes de tomates et analogues. les diverses sources d'azote peuvent être utilisées soit seules, soit en association et sont utilisées en concentrations allant de 0,2 à 6 % en poids du milieu aqueux. L'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)-phosphonique est formé par la croissance, dans des conditions contralées, de souches de microorganismes comme, par exemple, des souches du genre Strep- tomyces qui produisent l'antibiotique. Un de ces microorganismes, qui a été isolé dans le sol, a été appelé MA-2898 dans la collec- tion de cultures de Merck & Co., Inc., à Rahway, New-Jersey ; des produits isolés de la culture parente ont été appelés MA-2911, MA-2912 et MA-2913.Ces cultures ont été déposées dans la collee- tion de cultures de la Northern Utilization Research & Development Branch de l'United States Department of Agriculture à Peoria, Illinois et ont reçu les numéros de cul-sure NRRL D B-3357, NRRL B-3358, NRRL B-3559 et NRRL B-3360 respectivement. Ces microorganismes ont été classés dans l'espèce Streptomyces fradiae. Liantibiotique est également produit par culture, dans des conditions contrôlées, d'autres souches de Streptomyces également isolées du sol et identifiées dans la collection de cultures de Merck & Co., Inc., comme cultures MA-2867, MA-290, MA-2916, MA-2917, MA-3270, MA-3272 et MA-3267. Ces cultures ont été classées comme membres de l'espèce Streptomyces viridochromogenes. Les cultures MA-2903, MA-2867, MA-2916, MA-2917 et MA-3270 ont été déposées de façon permanente dans la collection de cultures de la Northern Utilization Research & Development Division de l'United States Department of Agriculture et ont reçu les numéros de cultures NRRl-3413, NRRL-3414, NRRL-3415, NRRL-3416 et NRRL-3426 respectivement. la culture MA-3269 a été classée dans l'espèce Streptomyces wedmorensis et a reçu le numéro NRRL 5426.- Bien qu'on n'ait décrit que trois espèces de microorganismes, on envisage aussi l'emploi d'autres microorganismes y compris des souches de Streptomyces soit isolées dans la nature, soit obtenues par mutation de ces organismes, comme celles qu'on obtient par sélection naturelle ou celles qu'on produit par des agents de mutation, comme par exemple irradiation aux rayons X, irradiation ultraviolette, moutardes à l'azote et analogues. En raison des difficultés inhérentes qu'on rencontre dans la séparation d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique de grandes quantités d'impuretés dans le bouillon de fermentation, il est de grande importance de trouver un moyen d'augmenter la concen tration de l'antibiotique par rapport à 1'ensemble des substances solides du bouillon. La demanderesse a déterminé que l'addition de cobalt à des milieux de fermentation organiques complexes et à des milieux de fermentation chimiquement définis augmente la production d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. Par "milieux organiques complexes" on entend des milieux dans lesquels certains. des ingrédients ne sont pas définis chimiquement. Un exemple de tels milieux est celui qui consiste en avoine (crescent brand), farine de soja, citrate de sodium, polyglycol et distillers solubles. Par t'milieux chimiquement définis", on entend les milieux dans lesquels tous leB ingrédients sont chimiquement définis.Un exemple de tels milieux est celui qui consiste en amidon de maIs, phosphate acide de potassium, citrate de sodium, asparagine, méthionine, glutamate monoso- dique, chlorure de calcium, sulfate de magnésium et sulfate ferrique. La quantité de cobalt nécessaire pour stimuler la production de l'antibiotique varie selon le milieu utilisé. On a observé une certaine production de l'antibiotique dans des milieux contenant Jus- qu'à 0,125 gramme de cobalt par litre. On préfère toutefois uti- liser dienviron 0,0010 g/l à 0,075 g/l de cobalt pour obtenir 7;e bonne production d'antiuotique. l'addition de cobalt à un milieu composé d'agents nutritifs organiques complexes augmente la produit tion d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique d'une quantité aussi grande que 36 quand le cobalt est présent dans des concen- trations allant d'environ 0,0025 g/l à environ 0,075 g/l. Des concentrations plus élevées en cobalt tendent à diminuer la production de l'antibiotique dans de tels milieux. De faon corres- pondante, dans un milieu chimiquement défini ou synthétique, l'ai- dition de cobalt augmente la production d'acide (-)(cis-1,2-époxy- propyl)phosphonique de moins de 2 g/ml à 27 g/ml. le cobalt peut être ajouté sous forme métallique mais il est préférable d'ajouter le cobalt sous forme d'un composé de cobalt, de préférence un sel de cobalt, comme le nitrate de cobalt, le chlorure de cobalt ou le sulfate de cobalt. Le cobalt peut aussi être ajouté sous forme d'un sel ou d'un complexe de cobalt se trouvant dans la nature comme on peut en trouver dans des agents nutri tifs de microbes riches en cobalt. Les agents nutritifs usuels contiennent une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable, des sels minéraux et des facteurs de croissance si nécessaire. Bien que le nouvel antibiotique selon l'invention soit produit par culture en surface et par culture submergée, on préfère, en fait, effectuer la fermentation à l'état submergé. Des fermentations à petite échelle sont conduites de façon commode en plaçant des quantités appropriées de milieu nutritif dans des fioles, en stérilisant les fioles et leur contenu par chauffage à 12000, en inoculant les fioles soit avec des spores, soit avec des cultures cellulaires végétatives d'une souche de StrePtomyces produisant de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique, en bouchant les cols des fioles avec du coton et en laissant la fermentation se produire à une température constante d'environ 289C sur un agitateur pendant 3-5 jours.Pour une préparation à plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des cuves convenables équipées d'un agitateur et d'un moyen d'aération du milieu de fermentation. Dans cette méthode, le milieu nutritif est préparé dans la cuve et stérilisé par chauffage à 120OC. Après refroidissement, le milieu stérilisé est inoculé avec une source convenable de culture cellulaire végétative du Streptomyces et on laisse la fermentation se poursuivre pendant 2-4 jours tandis qu'on agite et/ou aère le milieu nutritif et qu'on maintient la température à environ 28OC. Cette méthode de production de l'acide (-) (cis-1 , 2-époxypropyl) phosphonique convient particulièrement à la préparation de grandes quantités du nouvel antibiotique. La fermentation utilisant un microorganisme producteur d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique peut être effectuée à des températures allant d'environ 20 à 40OC. Toutefois, pour obtenir les meilleurs résultats, il est plus commode de conduire la fermentation à des températures comprises entre 26 et 30OC. le pH des milieux nutritifs qui convient pour cultiver le Streptomyces et produire l'antibiotique peut varier d'environ 5 à 9,0. l'in- tervalle de pH préféré est, toutefois 6,0-7,5. Dans la mise en oeuvre de l'invention, on prépare une suspension de cellules en ajoutant un milieu stérile à une culture inclinée sur gélose d'un microorganisme producteur d'acide (-)(cis1,2-époxypropyl)phosphonique.La culture venant de la culture inclinée est alors utilisée pour inoculer une fiole d'ensemencement et la fiole d'ensemencement est agitée à 28oC environ pendant 1-3 jours de façon à obtenir une bonne croissance. La fiole dtensemen- cement est alors utilisée pour inoculer les fioles de production. La fiole d'ensemencement peut aussi être inoculée à partir d'une culture lyophilisée ou d'un inoculé congelé. L'inoculation est en général effectuée en utilisant environ 1 ml par 30 ml de milieu de production. la concentration désirée en cobalt est alors ajoutée aux fioles de production et la fermentation est continuée pendant 2-4 jours tandis qu'on agite et /ou aère le milieu nutritif et qu'on maintient la température à 28 oC environ. Toutes les fioles de production, c'est-à-dire celles contenant du cobalt ajouté, et les fioles utilisées comme témoins, sont alors examinées, en général après 3-4 jours, pour déterminer la quantité d'antibiotique produite dans chaque fiole. L'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique est examiné de façon appropriée par un procédé disque-plaque en utilisant Proteus vulgaris StB-838 (BTCC 21100 et NRRL B-3361) comme organisme d'essai. La culture d'essai est maintenue sous forme de culture inclinée sur gélose nutritive (Difco) plus 0,2 % d'extrait de levure (Difco). les cultures inclinées inoculées sont incubées à 37OC pendant 18-24 heures et stockées aux températures du réfrigérateur pendant une semaine, des cultures inclinées fraîches étant préparées chaque semaine. On prépare chaque jour l'inoculum pour les plaques d'essai en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml contenant un bouillon nutritif (Difco) plus 0,2 ffi d'extrait de levure (Difco) avec un prélèvement de la culture inclinée. La fiole est incubée sur une machine agitée à 37"C pendant 18-24 heures. La culture du bouillon est ajustée à une transmittance de 40 % à une longueur d'onde de 660 rm, en utilisant un appareil Spectronic 20 de Bausch & Plomb par addition à la culture d'une solution d'extrait de levure à 0,2 . le bouillon non inoculé est utilisé comme témoin pour cette détermination.On emploie 30 ml du bouillon ajusté pour inoculer 1 litre du milieu0 De la gélose nutritive (Difco) plus 0,2 ffi d'extrait de levure (Difco) sont utilisés comme milieu de titrage. Ce milieu est préparé, stérilisé par autoclavage et abandonné au refroidissement à 50oC. Une fois que le milieu est inoculé, on en ajoute 10 ml à des boîtes de Petri stériles et on laisse le milieu se solidifier. L'activité est exprimée en unités, une unité étant définie comme étant la concentration de l'antibiotique par ml qui sur un disque de papier de 12,7 mm produit une zone de 28 mm de diamètre. On emploie quatre concentrations de l'antibiotique pour la prépa ration de la courbe standard, à savoir 0,3, 0,4, 0,6 et 0,8 unité par ml, chaque concentration étant obtenue par la dilution dans un tampon 0,05 M de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane ajusté à pH 8,0. On place quatre disques sur chacune des cinq plaques pour la pré paration de la courbe standard, chaque plaque contenant un disque de chacune des conentrations de l'antibiotique indiquées ci-dessus. les plaques sont incubées pendant 18 heures à 37sC et on mesure les diamètres en millimètres des zones d'inhibition. On calcule un diamètre moyen pour chaque concentration, d'après quoi on prépare une courbe standard sur un papier semi-logarithmique. L'inclinaison de la ligne obtenue est entre 4 et 5. On titre les fioles de production en diluant l'échantillon dans un tampon 0,05 molaire à pH 8 à une concentration appropriée. L'organisme d'essai est Proteus vulgaris MB-838 et le milieu d'es sai est la gélose nutritive plus 0,2 % d'extrait de levure. Qu'on ,effectue le titrage sur plaque à disque ou sur plaque à cylindre, on verse par plaque 10-15 ml du milieu. Si on emploie le procédé sur plaque à disque, les disques sont plongés dans 0,4 unité par ml de la solution d'antibiotique et sont placés sur la plaque en position alternée avec l'échantillon. Les plaques sont incubées à 37OC pendant 18 heures et on détermine les diamètres des zones en millimètres. Si l'on utilise le procédé sur plaque à cylindre, on emploie par plaque 6 cylindres, 3 de l'échantillon et 3 de la solu tion témoin.La solution témoin contient 1 /ml de l'acide libre. On emploie cinq plaques standard contenant 6 degrés de référence allant de 0,25 /ml à 3,0 /mol. le titre est calculé au moyen d'un Nomograph et les résultats sont reportés en unités ou gamma par millilitre. Une unité d'acide libre est égale à ?,8 w. L'antibiotique peut être purifié et récupéré sous forme plus pure par un certain nombre de procédés. Un de ces procédés consiste à adsorber l'antibiotique sur de l'alumine ; on peut utiliser pour cette purification de l'alumine basique ou de l'alumine lavée à l'acide. L'antibiotique adsorbé peut être élué de l'alumine le plus convenablement par des solutions aqueuses ou hydroalcooliques d'hydroxyde d'ammonium ayant un pH de 11,2 environ et en recueillant l'éluat par fractions.La purification des fractions solides impures contenant le sel d'ammonium de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique peut aussi être effectuée en dissolvant ce produit dans le méthanol, en ajoutant un volume égal de n-butanol, en évaporant le méthanol, en filtrant tout produit insoluble dans le butanol et en récupérant une solution butanolique contenant le sel d'ammonium de l'antibiotique de pureté améliorée. le sel d'ammonium peut alors être obtenu sous forme so- lide en évaporant la solution butanolique à sec sous pression réduite. le sel d'ammonium peut aussi être extrait de la solution butanolique avec de l'eau pour obtenir une solution aqueuse du sel d'ammonium de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. On obtient le sel de calcium de l'antibiotique en ajoutant de l'hy- droxyde de calcium à la solution aqueuse du sel d'ammonium et en chauffant la solution résultante sous pression réduite. En variante, on obtient aussi le sel de calcium en faisant passer une solution d'un autre sel de l'antibotique sur une résine échangeuse de cation sur le cycle calcium. le sel de calcium cristallise de solutions aqueuses ayant une concentration de 10 mg/ml, par repos ou par agitation. Ces procédés de purification sont décrits avec plus de détails dans la demande de brevet français déposée par la demanderesse le 13 septembre 1968, sous le PV. No. 166,199. L'acide libre est un solide cristallin qui se décompose à 170oC. L'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des agents antimicrobiens utiles qui sont actifs pour empêcher la croissance de bactéries pathogènes aussi bien gram-positives que gram-négatives. Cet antibiotique et particulièrement ses sels sont actifs contre les pathogènes Bacillus, Escherichia, Staphv- locoques, Salmonella et Proteus et leurs souches résistant aux antibiotiques. Des représentants de tels pathogènes sont Escherichia colt, Salmonella Schottmuelleri, Salmonella gallinarum, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.Proteus morganii et Staphylococcus aureus. Ainsi,l'acide (-) (cis-1 ,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels peuvent être utilisés pour éliminer les organismes nuisibles des matériels pharmaceutiques , médicaux et dentaires et dans d'autres endroits susceptibles d'être infestés par ces organismes. De même, ils peuvent être utilisés pour séparer certains microorganismes de mélanges de microorganismes. Les sels de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont aussi utiles dans le traitement de certaines maladies causées par des infections bactériennes chez l'homme et chez l'animal et sont particulièrement précieux à cet égard car ils sont actifs contre des souches résistantes de pathogènes. Ces sels sont particulièrement précieux car ils sont efficaces par voie orale bien qu'ils puissent être administrés aussi par voie parentérale. les exemples qui suivent illustrent l'invention sans la limiter. Exemple t Â une culture inclinée sur gélose de Streptomyces fradiae NRRL B-3360, on ajoute 10 ml de lait crémé stérile, La suspension de lait écrémé est lyophilisée dans des tubes stériles individuels contenant 0,1-0,2 ml de la suspension et la culture séchée par congélation est utilisée pour inoculer une file d'Erlenmeyer de 250 ml à chicanes contenant 50 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante A. Milieu d'ensemencement Quantité Amidon de maïs 10 grammes Hydrolysat de levure 10 grammes MgSO4, 7H2O 50 mg. Tampon phosphate (*) 2 ml H2O distillée 1000 ml pH = 6,6 (*) Tampon phosphate -- KH2PO4 = 91 grammes Na2HPO4 = 95 grammes H2O distillée = 1000 ml La fiole d'ensemencement est incubée à 280C pendant un jour sur un secoueur rotatif tournant à 22Q t/mn avec une course de 50 mm. A chacune de six fioles d'Erlenmeyer de 250 ml conte5 nant 30 ml de milieu stérile ayant la composition suivante B. Milieu de Production Quantité Avoine (crescent brand) 20,0 grammes Farine de soja à 4 S 15,0 grammes Distillers solubles 5,0 grammes Citrate de sodium 4,0 grammes H20 distillée 1000 mi Polyglycol 2000 (ajouté directement aux 0,5 % fioles) pH = 6,5 on ajoute 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme décrit ci-dessus. À deux des fioles, on ajoute une solution aqueuse contenant suffisamment de CoCl2, 6H2O pour avoir une concentration finale en cobalt de 0,0025 g/l et à deux autres fioles on ajoute suffiamment de CoCl2, 6H2O pour avoir une concentration finale en cobalt de 0t025 g/l. Les fioles inoculées sont incubées à 280C sur un secoueur rotatif tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm. Une fiole est enlevée après trois jours ; une autre fiole est enlevée après une incubation de quatre jours. Le contenu de chaque fiole est centrifugé à 8500 t/mn pendant dix minutes et le bouillon est décanté du solide. On titre les bouillons surnageants en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essai. les résultats des titrages des bouillons obtenus après 3 et 4 jours d'incubation sont donnés ci-après: c. 3 jours 4 jours Milieu CoCl2, 6H2O g/ml g/ml Acide libre acide libre Base de produc- 0 29,4 28,6 tion Base de produc- 0,01 g/l 34,6 29,6 tion Base de produc- 0,10 g/l 37,1 36,4 tion s d'augmentation 26 % 27 s Exemple 2 On produit de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phos- phonique comme décrit dans l'exemple 1.On obtient les résultats de titrages suivants Milieu CoCl2, 6H2O 3 jours 4 jours g/ml g/ml Acide libre Acide libre Base de produc- O 19,3 20,0 tion Base de produc- 0,1 g/l 26,2 24,2 tion % d'augmentation 36 % 21 % Exemple 3 On produit de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl) phosphonique comme décrit dans l'exemple 1. On obtient les ré- sultats de titrages suivants: A. MILIEU DE CULTURE QUANTITE Amidon de maïs 10,0 grammes Asparagine 1,0 gramme K2HPO4 1,0 gramme Agar 20,0 grammes H2O 1000 ml pH = 7,0 est utilisée pour inoculer un milieu de culture ayant la composition suivante B. Milieu d'ensemencement Quantité Amidon de maïs 20,0 grammes K2HPO3 0,3 grammes Citrate de sodium 4,0 grammes Bacto-asparagine 5,0 grammes D L méthionine 1,0 gramme Glutamate monosodique 1,0 gramme CaCl2-2H2O 0,5 gramme MgSO4, 7H2O 0,2 gramme FeSO4, 7H2O 0,01 gramme Traces d'éléments &num; 2* 10 ml H2O distillée 1000 ml pH 7,1 Formule, Trace d'éléments Concentré &num; 2: FeSO4, 7H2O 1,0 gramme MnSO4, 4H2O 1,0 gramme CuCl2, 2H2O 25 mg CaCl2 100 mg H3PO3 56 mg (NH4)6Mo7O24, 4H2O 19 mg ZnSO4, 7H2O 200 mg H2O distillée 1000 ml La fiole inoculée est incubée à 2800 pendant 2 jours sur un secoueur rotatif à 220 t/mn avec une course de 50 mm. A chacune des fioles Erlenmeyer à chicanes de 250 ml drune série de 6 fioles, contenant 30 ml de milieu stérile ayant la composition suivante C. Base de production Quantité K2HPO4 1,0 gramme Amidon de maïs 20,0 grammes Citrate de sodium 4,0 grammes Bacto-asparagine 5,0 grammes D L méthionine 1,0 gramme Glutamate monosodique 1,0 gramme CaCl2.2H2O 0,5 gramme MgSO4.7H2O 0,2 gramme FeSO4.7H2O 0,01 gramme H2O distillée. 1000 ml pH = 7,1 On ajoute 1s0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme décrit ci-dessus.A 2 fioles, on ajoute une solution aqueuse contenant suffisamment de CoCl2, 6H2O pour donner une concentration finale en cobalt de 0,0025 g/l, et à deux autres fioles on ajoute une quantité suffisante d'une solution de CoCl2, 6H2O pour avoir une concentration finale en cobalt de 0,025 g/l. Les fioles inoculées sont incubées à 280C sur un secoueur tournant fonctionnant à 220 t/minute avec une course de 50 mmo et une fiole est retirée après trois jours et une autre fiole est retirée après quatre jour d'incubation. Les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8500 t/mn pendant 10 minutes et le bouillon est décanté des solides.Les bouillons surnageants sont titrés en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essaie Les résultats des bouillons après 3 et 4 jours d'incubation sont donnés ciaprès D. Titrages (pg/ml acide libre) Milieu CoCl2,6H2O g/l 3 jours 4 jours Base de pro- O 2,0 duction Base de pro- 0,01 22,5 20,7 duction Base de pro- 0,10 25,8 27t0 duction Exemple 4 On produit de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl) phosphonique comme décrit dans l'exemple 3. On obtient les résultats suivants Milieu CoCl2, 6H2O g/l 3 jours 4 jours Base de pro- 0,025 30,0 24,1 duction Base de pro- 0,05 27,44 22,4 duction Base de pro- 0,1 18,76 20,44 duction Revendications 10 Procédé de préparation de l'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl) phosphonique dans lequel on cultive une souche de Streptomy- ces productrice acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce que ledit milieu ait une activité antibiotique substantielle, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu nu tritif du cobalt sous la forme dtun sel de cobalt, pour aco crotte la production de 1'antibiotiqueO 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces fradiae. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces wedmorensis. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces viridochromogenes. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du cobalt en proportion de 0,0025 à 0,075 gramme par litre de milieu, quand il est ajouté sous forme de chlorure de cobalt. 6. Procédé de préparation d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)pho phonique dans lequel on cultive un StrePtomyces producteur d'acide (-)(cis 1,2-époxypropyl)phosphonique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce que ledit milieu ait une activité antibiotique substantielle, caractérisé en ce qu'on ajuste la teneur en cobalt du milieu de fermentation par addition de cobalt jusqutà ce qu'une quan tité de cobalt substantiellement non toxique soit présente en excédent de 0,0010 g par litre de milieu0 7.Procédé de préparation d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phos phonique dans lequel on cultive un Streptomyces producteur d'acide (-)(cis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce que ledit milieu ait une activité antibiotique substantielle9 caractérisé en ce qu'on ajoute du cobalt au milieu nutritif sous la forme d'un sel de cobalt pour accroire la production de l'acide et on récupère l'acide (-)(cis-I,2-époxypropyl) phosphonique du bouillon de fermentation résultant0 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient du cobalt en proportion d'environ 0,0025.à 0,075 gramme par litre de milieu quand il est ajou té sous forme de chlorure de cobalt. 9e Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomycse fradiae. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le Strestomyces est une souche de Streptomyces wedmorensisO 11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces viridochromo genes.