Brevet FR2052927A1 — publié le 19710416

L'invention concerne un procédé de préparation du lactogène placentaire (hormone du placenta), utilisable pour toutes appui cations thérapeutiques connues en soi. Dans l'essentiel, selon le procédé de preparation du lactogène placentaire qui fait l'objet de l'invention, on traite le placenta humain congelé pour en extraire les protéines et les hormones placentaires ; extrait est--adsorbé sur un échangeur d'anions et la fraction éluée pour augmenter sa force ionique est ensuite précipitée par (NH4)2S04 et mise--en suspension dans NH4HC03 et ensuite traitée dans une colonne de Sephadex G25 et une colonne de Sephadex Gloo dans une solution tampon de NH4HC03 en vue de l'élimination-du sulfate d'ammonium et des impuretés et pour l'équilibrage de la protéine ; on élimine par recyclage les-impuretés de~poids moléculaire supérieur pour obte- nir le lactogène placentaire, précipité par (NH4)2S04, mis en suspension. dans NH4HCO3, dialysé contre H20 et lyophilisé. De façon plus détaillée, on procède de la manière suivante. Le placenta humain congelé est pulvérisé dans un appareil approprié et la poudre est mise en suspension dans une solution de NaCl à 1%, afin d'extraire les protéines et lthormone placentaire du tissu, puis on procède à une centrifugation. L'extrait est additionné d'éthanol (EtOH) refroidi à -200C, jusqu'à l'obtention d'une concentration de EtOH de 25% en volume, par une technique connue en soi, par exemple pour l'extraction de gammaglobuline à partir de sang placentaire. Le précipité recueilli par centrifugation à froid est extrait au bicarbonate-d',ammonium (NH4HC03) à 0,1 M, pH = 7,6.L'extrait est agité avec un échangeur d'ions tel que la diéthyl-amino -éthyl-ce-llulose, équilibré avec une solution tampon de NH4HC03 à 0,1 M, afin d'obtenir l'absorption de l'hormone par l'échangeur d'ions. La cellulose est lavée avec la même solution tampon et la fraction retenue est éluée avec NH4HC03 à- 0,4 M, dé façon à obtenir une augmentation de la force ionique de la solution. La fraction active est précipitée par (NH4)2S04 solide qui est ajouté jusqu'à 50% de la saturation ; puis le précipité est mis en suspension dans NH4HC03 à 0,15 M, pH = 7,6, et introduit dans une courte colonne de Sephadex G25 dont l'effluent est envoyé dans une autre colonne semblable, mais de plus grandes dimensions, contenant du Sephadex G100, tous deux dans une solution tampon de NH4HC03 à 0,15 M, pH = 7,6. Ce traitement est destiné à extrair.e le sulfate d'ammoniuml à retenir les impuretés et à atteindre l'équilibre de la protéine avec l-'éluant de la colonne de Sephadex G100. Un lactogène placentaire de pureté élevée est obtenu-- aw se- cond cycle de la chromatographie à recyclage sur cette dernière colonne, après avoir éliminé lors du-premier cycle une. fraction inactive constituée par les deux premiers pics chromatographiques. Le lactogène placentaire est précipité par (NH4)2S04 solide ajouté jusqu'à 50% de la solubilité de ce sel dans l'eau, mis en suspension dans NH4HC03 à 0,15 Mf pH = 7,6 et dialysé contre H20 pour extraire les sels, et enfin lyophilisé pour.son conditionnement. r On trouvera ci-après un exemple non limitatif de réalisation pratique possible du procédé de l'invention.- A 30 litres d'extrait en suspension dans NaCl à 1%, correspondant à 10 kg environ de placenta, on ajoute 10,5 litres d'é thanol à 95% et le tout est refroidi à -200C. Toute l'opération est menée à froid et la température finale ne dépasse pas -5"C. Le précipité recueilli par centrifugation est mis en suspension dans 8 litres d'une solution de NH4HC03 à 0,1 M. On agite à froid pendant une nuit et le sédiment est séparé par centrifugation. A l'extrait, on ajoute 1 kg de diéthyl-amino-éthyl-cellulose humide, équilibrée avec NH4HCO3 à 0,1 M, à froid. La diéthyl-amino-éthyl-cellulose est séparée par centrifugation et lavée avec la même solution tampon jusqu'à ce que l'on obtienne une densité optique inférieure à 0,3 à la longueur d'onde 280 mp. On élue la fraction active avec NH4HCO3 à 0,4 M, en répétant le lavage jusqu'à ce que l'on obtienne une densité optique inférieure à 0,3 à 280 mp. La fraction active est précipitée en ajoutant, aux produits réunis des lavages, du (NH4)2S04 solide jusqu'à 50% de la saturation. Le précipité séparé par sédimentation ou centrifugation est dissous dans NH4HC03 à 0,15 M, pH = 7,6. Des fractions de cette solution sont introduites dans une colonne (2,5 x 40 cm) de Sephadex G25, équilibrée avec une solution tampon de NH4HC03 à 0,15 M, pH = 7,6 ; le produit d'élution est introduit directement dans une colonne (10 x 90 cm) de Sephadex G100 dans la même solution tampon. On élimine une première fraction inactive, c'est-à-dire celle qui correspond aux premiers pics du contrôle chromatographique, de façon à exclure les parties dont le poids moléculaire est supérieur ; la fraction active retardée-est recyciée dans la colonne de Sephadex G100. Le pic contenant le lactogène placentaire est élué, puis précipité en ajoutant du (NH4)2S04 solide jusqu'à 50% de la saturation. Le précipité, séparé par centrifugation, est dissous -dans Nd4HCO3 à 0,15 M à-pH = 7,6 et cette solution est dialysée contre H20 et lyophiiisée. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention-ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés elle en embrasse, au contrainre, toutes les variantés. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation de lactogène placentaire, ca ractérisé par le fait que le placenta humain congelé est traité pour en extraire les protéines et les hormones placentaires ;a partir de la solution d'élution de l'échangeur d'ions pour -accroitre la force ionique, l'hormone est précipitée par (NH4)2S04 et mise en suspension dans NH4HC03, puis traitée dans une -colonne de Sephadex G25 et dans une colonne de Sephadex G100 dans une solution tampon de NH4HC03 pour l'élimination du sulfate d'ammonium et des impuretés et pour l'équilibrage des protéines ; les impu retés de poids moléculaire supérieur sont éliminées par recyclage pour obtenir le lactogène placentaire qui est précipité avec (NH4)2S04, mis en suspension dans NH4HCO3, dialysé contre H20 et lyophilisé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le placenta congelé et pulvérisé est mis en suspension dans une solution de NaCI et centrifugé pour obtenir un extrait de protéine, additionné d'éthanol à basse température, et par le fait que le précipité recueilli par centrifugation à froid est extrait au bicarbonate d'ammonium à 0,1 M, pH = 7,6, et traité par un échangeur d'ions à base de diéthyl-amino-éthyl-cellulose, équilibré avec une solution tampon de NH4HCO3, la fraction retenue étant éluée avec NH4HC03 à 0,4 M. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la fraction active du produit d'élution est précipitée par (NH4)2S04 solide ajouté jns;qn!à..50% de la saturation, puis mise en suspension dans NH4HC03 à 0,15 M, pH = 7,6 pour son traitement ultérieur dans les colonnes de Sephadex. 4. Procédé selon les revendications 1 et 3, caractérisé par le fait que le traitement dans la colonne de Sephadex G25 et de Sephadex GloO est effectué dans une solution tampon de NH4HC03 à 0,15 M, pH = 7,6 ; et qu'une fraction inactive, correspondant aux deux premiers pics de l'examen chromatographique, est éliminée lors du premier cycle, et le lactogène est prélevé lors du second cycle de la chromatographie à recyclage. 5. Procédé selon les revendications 1, 3 et 4, caractérisé par le fait que le lactogène obtenu à partir des colonnes de Sephadex est -précipité par addition de (NH4)2S04 jusqu'à une concentration égale à 50% de la solubilité de ce sel dans l'eau, mis en suspension dans NH4HCO3 à 0,15 M, pH = 7,6, puis dialysé et lyophilisé. 6. Lactogène placentaire, caractérisé par le fait qu'il est préparé par mise en oeuvre du procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 5.