Brevet FR2034555A1 — publié le 19701211

I 2034555 La présente invention se rapporte à un nouvel antibiotique utile, désigné sous le nom de "largomycine", et, plus particulièrement, elle se rapporte à sa production par fermentation, à des procédés pour sa récupération et sa concentration à partir de 5 solutions brutes, telles que des bouillons de fermentation, et à des procédés pour sa purification. La présente invention comprend, dans son domaine de protection, l'antibiotique sous des formes diluées, ainsi que sous forme de concentrés bruts et sous des formes pures. Ces nouveaux produits sont spécialement utiles pour com-10 battre des microorganismes pathogènes et pour contrôler des cellules à tumeur maligne. lu cours de la recherche de nouveaux antibiotiques, on a trouvé qu'une espèce de Streptomyces indexée sous la désignation MCRL 0367 dans la collection du Laboratoire de recherche de chimie mi-15 crobienne de la société dite Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Osaka, Japon, et déposée à la Collection de culture des services de recherche d'agriculture du département d'agriculture des Etats-Unis, Illinois, Etats-Unis d'Amérique, sous le numéro de classification IRRL 3679, produisait au moins un antibiotique. 20 On a trouvé que le Streptomyces HRRL 3679 présentait les caractéristiques microbiologiques suivantes. Caractéristiques morphologiques Sur des milieux naturels et synthétiques, la souche présente une bonne croissance en formant un mycélium de substrat. Les my-25 célioms aériens ramifiés en touffe sont formés sur le milieu synthétique. Il ne se forme pas de spirales ou de groupements "en tourbillon". Les spores cylindriques de 0,4 à 0,6 px 0,9 à 1,4p de dimension sont formées à la partie terminale des mycéliums aériens. Par observation au microscope électronique, la surface 30 des spores est plate et lisse. Caractéristiquesde culture Les nombres entre parenthèses représentent le ton de couleur indiqué dans le "Color Index" publié par le Japan Color Research Laboratory. 35 (1) Plaque d'agar-agar-nitrate-sucrose de Czapek (à 27®C) : croissance incolore ; formation de mycéliums aériens poudreux de couleur olive pâle (8-18-2) à gris jaunâtre (7-19-1) ; production de pigment soluble de couleur violet pâle (20-17-3). (2) Plaque d'agar-agar-nitrate-glycérol (à 27°C) : croissan-40 ce de couleur marron rouge grisâtre (2-14-3) avec partie à l'en 70 05796 2 2034555 vers de couleur violet brunâtr# (24-12-3) î formation de mycéliums aériens poudreux, de couleur rose pâle (2-18-2) ; production de pigment soluble de couleur marron rougeâtre (3-14-4). (3) Plaque d'agar-agar-nitrate-glucose (à 27*0) :j croissance 5 de couleur orangée jaunâtre claire (5-18-5) avec partie à l'envers de couleur marron clair (4—15—4) ; formation de .mycéliums aériens de couleur blanc brunâtre (6-19-1) ; produetioii aie pigment soluble de couleur orangée jaunâtre (-6-18-6) . (4) Plaque d'agar-agar-glucose-asparagine de Krainsky (à 27#C) 10 : croissance de couleur marron jaune pâle (7-18-3) avec partie à l'envers de couleur marron jaunâtre pâle (6-18-3) ; formation de mycéliums aériens poudreux de couleur blanc brunâtre (6-19-1) ; production de pigment soluble jaune pâle (8—19—2). (5) Plaque d'agar-agar-malate de calcium (à 27#C) : croissan-15 ce de coloration noire rougeâtre (2-11-1) avec partie à l'envers de coloration violet marron sombre (1—11—4) ; formation de mycéliums aériens poudreux de couleur jaune pâle (8-19-2) à orange pâle (5-19-2) ; production de pigment soluble marron (4-14-5). (6) Plaque d'agar-agar-amidon (à 21*0) ; croissance jaune 20 rougeâtre elair (7-19-5) avec partie à l'envers jaune rougeâtre (7-18-6) ; formation de mycéliums aériens poudreux de couleur blanc brunâtre (6-19-1) ; production de pigment soluble orange jaune (5-17-6). (7) Plaque d1agar-agar-tyrosine (à 27°C) 1 croissance de co-25 loration marron jaunâtre (6-16-3) avec partie à l'envers de coloration orange jaunâtre pâle (6-19-3) ; formation de mycéliums a-ériens de couleur orange pâle (5-19-2) ; production de pigment soluble marron jaunâtre pâle (7-17-3). (8) Solution de nitrate-glucose de Czapek (à 27®C) : crois-30 sanee en pellicule de coloration marron jaunâtre (6-16-3) ne formant pas de mycélium aérien ; production de pigment soluble jaune pâle (7-19-4). (9) Milieu de cellulose (à 27°Ç) : mauvaise croissance ; pas de formation de mycélium aérien ; pas de production de pigment so- 35 lubie. (10) Partie inclinée en agar-agar de Bennett (à 27°C) : croissance incolore avec partie à l'envers marron (4-13-5) ; formation de mycéliums aériens poudreux de coloration orange pâle (5-19-2) ; production de pigment soluble de coloration marron rougeâtre (3- 40 12-5). 70 05796 3 2034555 (11) Partie inclinée en agar-agar nutritif (à 37°C) : coloration incolore à crème (7-19-3) avec partie à l'envers jaune pâle (7-19-4) ; pas de formation de mycélium aérien ; pas de production de pigment soluble. 5 (12) Partie inclinée en agar-agar nutritif-glucose (à 37°G) : croissance de coloration orange terne (5-17-4) avec partie à l'envers jaune rougeâtre (7-18-6) ; pas de formation de mycélium aérien ; pas de production de pigment soluble. (13) Plaque d'agar-agar-glucose-peptone (à 37°G) : croissance 10 de coloration orange terne (5-17-4) avec partie à l'envers jaune rougeâtre (7-18-6) ; formation de mycéliums aériens de coloration légèrement blanche ; pas de production de pigment soluble. (14) Plaque en agar-agar-sang (à 37°C) : croissance de coloration crème à jaune (8-15-5) ; pas de formation de mycélium aérien; 15 pas de production de pigment soluble. (15) Milieu d'oeuf (à 37®C) ; croissance de coloration jaune terne (7-18-4) ; pas de formation de mycélium aérien ; pas de production de pigment soluble. (16) Bâton de gélatine (à 18°C) : croissance de coloration 20 crème à marron (4-14-3) î pas de formation, de mycélium aérien ; production de pigment soluble de coloration marron rougeâtre (3-14-4). (17) Teinture de tournesol (à 37°C) : croissance en anneau de coloration marron jaunâtre pâle (7-17-3) ; pas de formation de my- 25 célium aérien ; changement de coloration au rose pâle (3-19-2) ; présentant un pH acide. (18) Sérum coagulé de Loeffler (à 37*C) : croissance ondulée incolore à crème (7-19-3) ; pas de formation de mycélium aérien ; pas de production de pigment soluble. 30 (19) Morceau de pomme de terre (à 37°C) ï croissance incolore à crème (7-19-3) î pas de formation de mycélium aérien ; pas de changement de la coloration du morceau. Utilisation de sources de carbone Sur le milieu de base de Pridham-Gottlieb, la souche présente 35 l'utilisation suivante de sources carbonées ! Bonne utilisation - arabinose, glucose, glycérol, maltol, man-nitol, mannose, rhamnose, xylose et amidon. Utilisation - fructose, lactose et sucrose. Utilisation douteuse -salicine. 40 Pas d'utilisation - inositol et raffinose. 70 05796 4 2034555 Caractéristiques physiologiques La souche est positive au point de vue solubilité dans le malate de calcium, réduction des nitrates, hydrolyse de l'amidon, propriétés hémolytiques, liquéfaction de la gélatine, liquéfaction 5 du sérum, coagulation du lait et peptonisation du lait,et négative au point de vue réaction de la cellulase, réaction de la tyrosinase et formation de mélanine. Température et pH pour la croissance La souche présente une "bonne croissance à 27°C dans une gam-10 me de pH de 6 à 9. A 10 et à 30°C, elle peut croître à un pH de 7,0 et 8,0 mais non pas à un pH de 4,0 et 5,0. Indépendamment du pH, on ne peut pas voir de croissance à 60*0. La souehe est aérobie. D'après les propriétés mentionnées ci-dessus, la souche HRRL 15 3679 est définitivement un Streptomyces d'un type non chromogène, de la série rouge et de la section dite Rectus flexibilis. Selon le système de classification proposé par Waksman [J. Bact., 56, 107 à 114 (1948)], la souche HRRL 3679 peut être classée dans la section A-1-6 à laquelle appartient un Streptomyces ne formant pas 20 de spirale, ne formant pas de pigment de mélanoïde et produisant des pigments solubles de coloration marron jaunâtre à marron rougeâtre. Parmi les Streptomyces dans cette section, le Streptomyces pluricolorescens d'Okami et Umezawa [Waksman î "The Actinomycetes", Vol. 2, p. 259 (1961) ; J. Antibiotics, Ser. A, 9, 75 à 81 (1956)] 25 présente une ressemblance de propriétés avec la souche HRRL 3679. Cependant, la première souche diffère de la souche HRRL 3679 par les propriétés suivantes. Sur un bâton de gélatine, le Streptomyces pluricolorescens fait croître des mycéliums aériens incolores à beiges et produit un pigment soluble marron légèrement jaunâtre. 30 Malgré les différences peu importantes décrites ci-dessus, le Streptomyces pluricolorescens et le Streptomyces sp. HRRL 3679 sont très semblables au point de vue d'autres propriétés, comprenant les propriétés morphologiques et physiologiques et le modèle d'utilisation des sources de carbone. En conséquence, la souche 35 HRRL 3679 produisant la largomycine est ainsi identifiée comme étant une souche de "Streptomyces pluricolorescens". On doit comprendre que, pour la production de largomycine, la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation de Streptomyces pluricolorescens HRRL 3679. On désire spécialement inclure 40 l'utilisation d'espèces mutantes naturelles ou artificielles ou 70 05796 5 2034555 d'espèces variantes produites à partir de cette souche. La production artificielle d'espèces mutantes ou d'espèces variantes peut être réalisée par une opération classique telle que des rayons X, un rayonnement ultraviolet et des moutardes azotées. On désire, 5 en outre, inclure l'utilisation de souches produisant de la largomycine, qui se conforment à la même espèce que la souche indiquée ci-dessus. Selon un aspect de la présente invention, le nouvel antibiotique, la largomycine, est produit durant la culture du microorga-10 nisme, c'est-à-dire une souche de Streptomyces pluricolorescens produisant la largomycine, dans un milieu nutritif aqueux, à une température allant d'environ 25 à environ 30°C, de préférence entre 27 et 28°C, dans des conditions aérobies. La composition de ce milieu nutritif peut être modifiée dans une gamme très large. Es-15 sentiellement, ce qu'on exige est une source de carbone, une source d'azote et des éléments minéraux à l'état de traces. Ses exemples de sources de carbone convenables sont le glucose, le lactose, le maltose, l'amidon et le glycérol. Ses sources convenables d'azote pour le procédé de fermentation comprennent la peptone, des 20 extraits de viande, la levure, la liqueur de mais macéré, la farine de soja, la farine d'arachide, l'hydrolysat de protéines, des nitrates minéraux et du sulfate d'ammonium. Ses exemples de sources convenables d'éléments minéraux sont le chlorure de sodium, le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, le carbonate de cal-25 cium, les phosphates et des sels de métaux lourds tels que le fer, le zinc, le cuivre et le manganèse. Le milieu nutritif peut être réglé ou non à un pH d'environ 6 à 8 avant l'inoculation du microorganisme. Le pH tend à rester plutôt constant durant la fermentation mais, si on rencontre des variations, on peut ajouter au 30 milieu un agent de tampon tel que le carbonate de calcium. Si on rencontre une formation excessive de mousse, on peut ajouter au milieu de fermentation, avant ou au cours de la fermentation, des agents anti-mousse tels que des huiles végétales, l'huile de saindoux et une huile aux silicones. Le rendement maximum en antibio-35 tique dit largomycine peut être obtenu dans l'intervalle d'environ 70 à environ 100 heures de fermentation dans des conditions opti-ma de température et d'aération. Après la croissance du microorganisme, le mycélium est retiré du bouillon de fermentation en utilisant des équipements standards 40 tels que des presses et des centrifugeuses à filtre, et puis l'an 70 05796 6 2034555 tibiotique dit largomycine est récupéré à partir du filtrat par un grand nombre de modes opératoires classiques de séparation tels qu'un mode opératoire de précipitation et un mode opératoire d'ad-sorption» Parmi ces modes opératoires, on préfère particulièrement 5 les modes opératoires suivants : addition d'une quantité convenable de aulfate d'ammonium ou de sulfate de sodium au filtrat du bouillon de fermentation, avec ou sans concentration préalable, afin de précipiter l'antibiotique, réglage du filtrat à un pH approprié (par exemple pH 3,5 à 5,0) afin de précipiter l'antibio-10 tique, addition d'un solvant organique miscible à l'eau (par exemple le méthanol, l'éthanol, l'acétone) au filtrat afin de précipiter l'antibiotique, etc... L'antibiotique ainsi obtenu à l'état brut comprend diverses matières protéinées parmi lesquelles la présence de trois compo-15 sants actifs, présentant des activités antimicrobiennes et antitumeurs, est particulièrement remarquable. Par exemple, la filtra-tion sur gel de l'antibiotique brut sur un gel de dextrane dont le nouveau gain d'eau est à peu près 10,0 g/g, fabriqué par la société dite Pharmacia, Uppsala, Suède, sous la marque déposée "Se-20 phadex G-100", donne le modèle d'élution tel que présenté sur la figure 8 des dessins ci-joints, dans laquelle on a porté en abscisses le volume en ml et en ordonnées la densité optique [ce modèle étant obtenu par les modes opératoires suivants : dissolution de l'antibiotique (500 mg) dans un tampon phosphaté 0,0t M à pH 7,0, 25 déversement de la solution sur une colonne remplie de produit dit Sephadex G-100 (1 litre à l'état humide), élution de la colonne avec un tampon phosphaté 0,01 M à pH 7,0, rassemblement sur un collecteur de fractionsde l'éluat dans chaque fraction de 10 à 15 ml, mesure de la quantité de protéine dans chaque fraction en 30 fonction de la densité optique à 280 m{J et tracé graphique de la relation entre le volume de l'éluat et la quantité de protéine éluée], d'où le rapport entre les composants actifs désignés respectivement par "PI", "PII" et "FUI* est calculé à une valeur d'approximativement 1,2 : 1I40 35 La séparation d'un ou de plusieurs composants actifs à par tir de l'antibiotique à l'état brut peut être réalisée par fractionnement au sulfate d'ammonium et/ou fractionnement suivant le pH. L'antibiotique brut est soumis au fractionnement par extraction avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium ayant une 40 saturation non inférieure à 0,5 (saturation de Hofmeister) et, de 70 05746 7 2034555 ce fait, la fraction du composant actif PI, qui est insoluble dans la solution, et la fraction des composants actifs PII et FIII, qui sont solubles dans la solution, sont séparées. De préférence, le fractionnement indiqué ci-dessus est réalisé en deux étapes. 5 Par exemple, l'antibiotique brut est traité par une solution a-queuse de sulfate d'ammonium d'une saturation de 0,7 pour extraire les impuretés protéinées contaminantes, et puis le résidu est traité par une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de saturation égale à 0,5 à 0,6, pour séparer en partie insoluble du composant 10 actif FI et en partie soluble des composants actifs F II et P III, les deux parties n'étant contaminées qu'avec une faible quantité d'impuretés protéinées. L'utilisation d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium, d'une saturation de 0,53 à 0,56, est particulièrement préférée pour l'extraction efficace des composants ac-15 tifs F II et F III. Les composants actifs F II et F III présents dans la partie du composant actif F I sous forme d'impuretés peuvent n'être que partiellement récupérés par traitement de cette partie avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de saturation allant de 0,3 à 0,4. L'addition de sulfate d'ammonium en ex-20 cès à l'extrait contenant les composants actifs F II et P III produit des précipités dans lesquels la quantité du composant actif P III est estimée à environ 2,5 fois celle du composant actif F II et la quantité du composant actif F I n'est pas supérieure an dixième de celle du composant actif F II. La plupart des impure-25 tés protéinées présentes dans l'antibiotique à l'état brut sont retirées dans le produit obtenu ci-déssus. Pour la séparation du produit contenant les composants actifs F II et F III en chaque composant, on le soumet au fractionnement suivant le pH, Ainsi, le produit est lavé avec une solution saline 30 aqueuse, de pH de 3 à 5, favorablement à un pH de 3,5 à 4,3 et, de ce fait, la partie soluble du composant actif F III et la partie insoluble du composant actif FII sont séparées l'une de l'autre. L'addition de sulfate d'ammonium à la partie soluble donne des précipités qui sont rassemblés par un mode opératoire classique, 35 tel qu'une filtration ou uns centrifugation pour obtenir le composant actif P III avec une pure-té élevée. 0e produit contient molnB de 5 i» en poids du composant actif F I et on ne détecte pas de quantité du composant actif P II. La partie insoluble séparée ci-dessus contenant le composant actif P II peut être con-40 taminée avec une faible quantité d'impuretés protéinées et, en conséquence, soumise à un traitement avec une solution aqueuse 70 05796 8 2034555 d'un sel, à un pH d'environ 6,0, pour retirer les impuretés insolubles. La solution résultante est alors saturée de sulfate d'ammonium pour former des précipités. Dans les précipités, le composant actif F II est présent suivant une teneur supérieure à 70 ^ 5 en poids, qui est extrêmement supérieure à une teneur de 16 56 en poids dans l'antibiotique d'abord obtenu à l'état brut. La solution saline convenable pour ce fractionnement suivant le pH peut être, par exemple, un tampon acide acétique-acétate de sodium. Pour augmenter l'effet, on incorpore favorablement du sul-10 fate d'ammonium dans le tampon pour contrôler la saturation à une valeur d'environ 0,5. Bien que le fractionnement avec du sulfate d'ammonium soit d'abord réalisé et le fractionnement suivant le pH soit ensuite effectué dans l'illustration indiquée ci-dessus, ces opérations 15 peuvent être réalisées en sens inverse. Chacun des composants actifs obtenus ci-dessus P I,'ï II. et F III, peut être en outre purifié par des opérations convenables telles que le relargage, l'extraction par gradient, la précipitation au point isoélectrique, la filtration sur gel, la chromato-20 graphie sur colonne, 1'électrophorèse, la dialyse sur membrane semi-perméable et analogues. Par exemple, une solution contenant le composant actif F II est filtréesur gel, en utilisant le produit dit Sephadex G-100, et des éluats contenant le composant actif F II sont rassemblés. Les fractions rassemblées sont dialysées et 25 la solution intérieure, après dialyse, est lyophilisée pour obtenir une poudre. La poudre se compose du composant actif F II de haute pureté mais la présence d'impureté à l'état de trace peut être quelquefois détectée par électrophorèse sur disque sur un gel d'acrylamide. Dans ce cas, la poudre est soumise à une chro-30 matographie sur un échangeur d'ions, tel que de la cellulose, ou à une électrophorèse sur disque de préparation sur un gel d'acrylamide, suivi d'une filtration sur gel et d'une dialyse par membrane semi-perméable pour donner le composant actif F II, sur lequel on confirme qu'il n'a pas de contamination par des impu-35 retés grâce à une ultracentrifugation, une électrophorèse au point isoélectrique, une électrophorèse sur disque et une électrophorèse de Tiselius. L'antibiotique dit largomycine F 3, tel qu'isolé ci-dessus, est une poudre amorphe, acide, jaune pâle, ne présentant pas de 40 point de fusion ou de décomposition défini. Il est précipité par 70 05796 9 2034555 une solution de sulfate d'ammonium à 50 ^, une solution de sulfate âe magnésium à 50 une solution de chlorure de zinc à 50 + et de l'acide trichloracétique à 20 Le point isoélectrique est à un pH de 4,2. Les râleurs analytiques moyennes de 1*antibiotique 5 sont les suivantes î C, 47,93 ?£, H, 7,46 ï, 6,50 56, S, 0,82 ft, cendre,12,30 56. Le poids moléculaire de l'antibiotique est estimé à une valeur supérieure à 50.000 par le procédé de filtration sur gel. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet, dans l'acide chlorhydrique 0,1 V, est caractérisé par un maximum à 270 m|i 10 (ï| qM * 110) (présenté sur la figure 1 des dessins ci-joints sur laquelle on. porte en abscisses la longueur d'onde en a|4 et en ordonnées la capacité d'absorption e| qM). spectre d'absorption dans l'infrarouge, réalisé sur une tablette de bromure de potassium, présente les fréquences suivantes : 3400-3330 (large), 15 2920, 1660, 1550 et 1085-1040 (large) cm"1 (présenté sur la figure 4 des dessins où l'on porte en abscisses le nombre d'onde en cm"*1 et en ordonnées le pourcentage de transmission). Il donne des réactions positives à la ninhydrine, au biuret, à la xanthopreté-ine, à la réaction de Sakaguchi, de Molish, à l'anthrone, à la réac 20 tion du phénol-acide sulfurique et à la réaction de Folin. Il devient de couleur violette en solution alcaline. Il est négatif dans la réaction d'Elson-Morgan. Par analyse des aminoacides, on détecte les aminoacides suivants : la lysine, l'arginine, l'his-tidine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la thréonine, la 25 sérine, la proline, la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine et la méthionine. La cystéine n'est pas détectée. La teneur en sucre déterminée par le procédé au phénol-acide sulfurique [Anal. Chem., 28, 350 à 356 (1956)] est 56 + 1 j£f.-et la ehromatographie sur pa-30 pier sur l'hydrolysat, avec de l'acide chlorhydrique 0,24 H à 100°C pendant 18 heures, indique la présence de glucose„ L'antibiotique dit largomycine F II est une poudre amorphe, acide, jaune pâle, ne présentant pas de point de fusion ou de décomposition défini. Il est précipité avec une solution de sulfate 35 d'ammonium à 50 une solution de sulfate de magnésium à 50 une solution de chlorure de zinc à 50 56 et de l'acide trichloracé-tique à 20 3*. Le point isoélectrique est pH 4,2. Les valeurs analytiques moyennes de l'antibiotique sont les suivantes : C, 47,83 1» H, 8,30 JÉ, ï, 13,63 S, 0,25 cendre, aucune. Le poids molécu-40 laire de l'antibiotique F II est de 25.000 par le procédé d'Archi- 70 05796 10 2034555 bald. Les spectres d'absorption de l'ultraviolet dans l'acide chlorhydrique 0,1 H et dans une solution de soude 0,1 M sont caractérisés respectivement par on maximuai à 278 nu (ïî| £ * 19,4) et un 1 maximum à 540 mp (E^ ^ = 4,0) (présenté sur la figure 2 des des-5 sins ci-joints où les abscisses et les ordonnées sont corne sur la figure 1). Le spectre d'absorption dans l'infrarouge, réalisé sur une tablette de bromure de potassium, présente les fréquences suivantes : 3400, 2940, 1660, 1530, 1460, 1400, 1230 et 1070 brune, ne présentant pas de point de fusion ou de décomposition défini. Il est précipité par une solution de sulfate d'ammonium à 50 56., une solution de sulfate de magnésium à 50 une solution de chlorure de zinc à 50 $ et de l'acide trichloracétique à 20 5C. 30 Les valeurs analytiques moyennes de l'antibiotique sont les suivantes : C, 46,79 H, 6,57 N, 8,64 S, 1,08 cendre, 13,40 Le poids moléculaire de l'antibiotique est estimé à une valeur de 10.000 à 20.000 par le procédé de filtration sur gel. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet, dans l'acide chlorhy-35 drique 0,1 H et dans la soude 0,1 N, est caractérisé par deux ma-xima à 275 (e| ^ » 30,0) et 425 (présenté sur la figure 3 des dessins ci-joints où les abscisses et les ordonnées sont comme sur la figure 1). Le spectre d'absorption dans l'infrarouge, réalisé sur une tablette de bromure de potassium, 40 présente les fréquences suivantes ; 3400, 2980, 1660, 1540 (pla 70 05796 n 2034555 teau), 14-70, 1+00 et 1090 (large) (présenté sur la figure 7 des dessins ci-joints où les abscisses et les ordonnées sont comme sur la figure 4). les réactions colorées de F III sont tout à fait les mômes que celles de F I. Par analyse des aminoacides, 5 on détecte les mômes aminoacides que ceux de F I. La teneur en sucre déterminée par le procédé au phénol-acide sulfurique est 22+1 et la chromâtographie sur papier sur l'hydrolysat avec de l'acide chlorhydrique 0,24 lï à 100*0 pendant 18 heures indique la présence de glucose. 10 Les largomycines FI, F II et F III présentent une activité contre un grand nombre de microorganismes„ Les activités antimi-erobiennes in vitro des antibiotiques déterminées par le procédé des bandes d'agar-agar sont présentées dans le tableau suivant : TABLEAU 15 Organismes testée Milieu 1) Concentration d'inhibition minima (fg/ml) F I F II F III Staphylococcus aureus FDA-209P I 100 100 100 Staphylococcus aureus Terashima I 100 100 100 Streptococcus faecalis No. 3 I 100 100 100 20 Sarcina lutea PCI-1001 I 50 12,5 12,5 Bacillus subtilis PCI-219 I 100 100 100 Bacillua aycoides I 50 12,5 12,5 Eschérichia coli HIHJ I 100 100 100 Shigella flexneri 2b I 100 100 100 25 SaHmone lia typhi I 100 100 100 Proteus vulgaris I 100 100 100 Pseudeaanas aeruginosa I 100 100 100 Corynebacterium xerosis I 50 6,25 12,5 Lactobacdllus brevis II 100 100 100 30 Mycobacterium ATCC 607 III 100 100 100 Xanthomonas oryzae IY 100 12,5 100 Candida albicans 92 IY 100 100 100 Aspergillus niger NIH IV 100 100 100 Mycoplasma pneumoniae Mac ' Y 12,5 0,7 1,5 35 Mycoplasma pulmonis mA V 25 0,7 1.5 Myeoplasma gallisepticum PG-31 V 25 0,25 12,5 Vote : 1) Milieu : I, agar-agar nutritif ; II, agar-agar-jus de tomate ; III, agar-agar nùtritif-glycérol à 1 56 5 IV, agar-agar de Sabouraud ; V, PPL0 40 agar-agar de Difco. 70 05796 12 2034555 2) L'activité antimycoplasma a été déterminée par le procédé d'expérimentation de diffusion de plaques d'agar-agar [Arai et Collaborateurs : J. Antibiotics, Ser. A, 19, 118 à 120 (1960)]. ~ D'après le tableau précédent, on note que les antibiotiques 5 sont, d'une manière caractéristique, actifs contre un nombre limité de microorganismes tels que le Sarcina lutea, le Bacillus mycoides et le Corynebacterium xerosis. On note également qu'ils sont actifs d'une manière très importante contre le Mycoplasma. La toxicité aiguë (valeur de DL^0) de la largomycine P II, 10 lorsqu'on l'administre par voie intrapéritonéale à des souris, est 35,5 mg/kg. Les résultats du test de cytotoxicité sur des cultures de cellules de mammifères sont présentés dans le tableau suivant s TABLEAU 15 Cellules Dose de dégénération minima (Hg/ml) P I p II 1 III HeLa S—3 5,0 0,1 1,25 L 1,0 0,25 0,5 20 Rein d'embryon humain 100 20 100 Rein de veau 100 10 20 Dans le tableau précédent, on voit que les doses cytotoxi-ques minima des antibiotiques contre des cellules normales culti-25 vées, telles que des cellules d'embryons humains et des cellules de reins de veaux, sont bien supérieures à celles contre les cellules dites HeLa S-3 et L. Ainsi, ces antibiotiques ont une toxicité sélective pour les cellules cancéreuses. L'injection intrapéritonéale des antibiotiques, en particu-30 lier le composant actif P II, à des doses quotidiennes de 0,4 à 3,2 mg/kg pendant 7 jours consécutifs, inhibe d'une manière remarquable l'augmentation de fluide ascitique et prolonge la période de survie de souris portant la forme ascitique du carcinome par ascite d'Ehrlich,Sarcoma-180 et SN-36, quand le traitement commence 24 35 heures après la transplantation de cellules à tumeur. Le nombre de cellules de carcinome par ascite d'Ehrlich dans le fluide d'ascite diminue immédiatement après le traitement avec les antibiotiques. Le nombre de cellules mitotiques est remarquablement réduit. A ce moment, les perturbations mitotiques et les anormalités des chro-40 mosones , telles que la dispersion, l'adhérence, ou 1' agrégation, sont observées d'une manière marquée, spécialement sur les cellu 70 05796 13 2034555 le* dans la prophase et la métaphase. D'autre part, l'effet contre la forme solide du carcinome par ascite d'Ehrlich n'est pas remarquable. Ainsi, l'activité de l'antibiotique est plus forte contre la forme ascite que contre la forme solide de la môme tu-5 meur. Comme on le comprend d'après les descriptions précédentes, les antibiotiques dits largomycine PI, P II et P III sont utiles comme agents pour inhiber la croissance de microorganismes pathogènes et de cellules à tumeur. Ils sont également utiles pour ob-10 tenir des cultures de microorganismes individuels et, de ce fait, on peut séparer un microorganisme sensible, tel que le Bacillus mycoides, d'un microorganisme résistant tel que le Bacillus sub-tilis. Un exemple de réalisation pratique et actuellement préféré 15 de la présente invention est présenté à titre d'illustration dans l'exemple suivant où les parties sont en poids. Le terme "dose efficace minima" utilisé ci-après est destiné à signifier une dose minima du composé expérimental entraînant la disparition complète de la rétention de fluide ascitique lors-2o qu'une certaine quantité du composé expérimental est administrée par voie intrapéritonéale à un carcinome par ascite d'Ehrlich transplanté sur des souris pendant 5 jours consécutifs, à partir de 24 heures après la transplantation, et que l'observation est réalisée le troisième jour après l'interruption de l'administra-25 tion. "BTRM~P~IYR Dans une cuve de fermentation d'un volume de 2.000 litres, on introduit un milieu nutritif (1.200 l) à pH 7,0 contenant les matières suivantes s 30 Matière £ (poids/volume) Glyeérol 2 Amidon 2 Peptone 0,5 Extrait de viande 0,5 35 Chlorure de sodium 0,5 Carbonate de calcium 0,5 Après stérilisation à 120°C pendant 30 minutes, on inocule au milieu une culture d'ensemencement (150 1) de Streptomyces pluricolorescens HRRL 3679, obtenue par culture dans un milieu nu-40 tritif ayant la même composition que ci-dessus, pendant 4-8 heu- 70 05796 H 2034555 res. la culture est réalisée à 27°C soua *aa@ aération de 6.000 litres par minutes, en agitant entre 140 at 180 tours par minute et, durant ce temps, la pression intérieure est maintenue à 0,5 kg/cm ® lorsqu'il se produit une formation remarquable de mousse, 5 on ajoute au milieu une quantité appropriée d'un agent anti-mousse 0 Après 90 heures, la culture est interrompue. Le bouillon de fermentation, qui inhibe la croissance de carcinome par ascite d'Ehrlich chez les souris, même par dilution jusqu'à peu près 300 fois, est filtré à l'aide d'une terre de diatomées. Le gâteau de 10 mycélium est lavé à l'eau et le lavage est combiné au filtrat. A la solution résultante (1.000 1), on ajoute par parties de la terre de diatomées (9 kg) et puis du sulfate d'ammonium (750 kg) en agitant. Après avoir laissé reposer à 10*0 toute la nuit, le précipité est rassemblé par filtration pour obtenir la matière aux 15 tibiotique (47,5 kg) sous forme d'un produit humide. ÏÏne partie de la matière antibiotique est extraite à l'eau. L'extrait est dialysé sur un film de produit dit cellophane et le liquide à l'intérieur du film est lyophilisé. La poudre ainsi obtenue présente une dose efficace minima de 1,6 mg/kg/jour con-20 tre le carcinome par ascite d'Ehrlich chez les souris. La poudre lyophilisée (500 mg) ainsi obtenue peut être fractionnée sur le produit dit Sephadex G—100 pour donner les fractions PI, PII et FUI suivant un rapport de 1,2 : 1,0 s 4,0 (voir le modèle d'élu-tion présenté sur la figure 8 des dessins ci-joints). Par électro 25 phorèse sur disque de gel d'acrylamide à un pH de 8,5, la présence de nombreuses substances du genre protéine dans la poudre lyophilisée est confirmée. La matière antibiotique humide obtenue ci-dessus (1 kg) est lavée avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium (4 1) à 30 une saturation de 0,7 et le résidu insoluble est extrait avec 4 1 d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium ayant une saturation de 0,5 et, de ce fait, le composant FI demeure dans la matière insoluble, alors que les composants FII et FUI sont reti rés dans l'extrait. A l'extrait, on ajoute tour à tour de la ter-35 re de diatomées (50 g) et du sulfate d'ammonium (1 kg), et on laisse reposer toute la nuit le mélange résultant dans un réfrigérateur. Le précipité est rassemblé par filtration pour obtenir les composants PII et FUI. Le mélange est lavé avec 3 1 d'une so lution aqueuse de sulfate d'ammonium d'une concentration de 0,7 40 pour éliminer les matières solubles. Le résidu, dont on confirme 70 05796 15 2034555 qu'il ne contient qu'une faible quantité de matières du genre protéine, comme on peut le voir dans la matière antibiotique par électrophorèse sur disque, est extrait avec 2 1 d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium d'une saturation de 0,5. A l'extrait, 5 on ajoute de la terre de diatomées (50 g) et du sulfate d'ammonium (500 g) et on laisse reposer toute la nuit dans un réfrigérateur le mélange résultant. Le précipité est rassemblé par filtration pour obtenir un produit contenant en abondance les composants PII et FUI. Une partie du produit est extraite à l'eau et dialysée 10 sur un film de produit dit cellophane. Le liquide maintenu dans le film est.lyophilisé pour donner une poudre dont la dose efficace minima contre la carcinome par ascite d'Ehrlich sur les souris est 0,4 mg/kg/jour. Comme on le présente sur la figure 9 des dessins ci-joints (où les abscisses et les ordonnées sont telles que 15 sur la figure 8), la filtration sur gel de la poudre avec le produit dit Sephadex G-100 montre que le rapport des composants FI, FII et FUI dans la poudre est 0,1 î 1,0 : 2,5. La matière insoluble contenant le composant FI, obtenue au cours de l'opération indiquée ci-dessus, est soumise à une élimination de sel de la 20 même manière que ci-dessus, pour donner une poudre dont la dose efficace minima contre le carcinome par ascite d'Ehrlich sur les souris est 10,0 mg/kg/jour. Le produit contenant les composants FII et FUI, tel qu'obtenu ci-dessus à l'état humide, est extrait avec 2 1 d'une solu-25 tion tampon acide acétique-acétate de sodium 0,05 M (pH 4,0) contenant du sulfate d'ammonium à une saturation de 0,5. Le sulfate d'ammonium (500 g) est ajouté à l'extrait (2 l), et on laisse reposer le mélange résultant toute la nuit dans un réfrigérateur. Le précipité est rassemblé par centrifugation, dissous dans une 30 faible quantité d'eau distillée et dialysé à travers une membrane semi-perméable. Le liquide maintenu dans la membrane est lyophilisé pour donner une poudre brune (1 g) contenant le composant F III dont la dose efficace minima contre le earcinome par ascite d'Ehrlich chea les souris est 0,8 mg/kg/jour. Lorsque la poudre 35 (500 mg) est soumise à la filtration sur gel avec le produit dit Sephadex G-100, on obtient un modèle d'élution tel que présenté sur la figure 10 des dessins ci-joints, où les abscisses et les ordonnées sont telles que sur la figure 8» D'après le modèle, on confirme que la quantité de composant FI contaminant la poudre 40 n'est que d'environ 5 $> de celle du composant principal F III. 1 70 05796 16 2034555 La matière insoluble non extraite arec un tampon acide acétique-acétate de sodium 0,05 M dans l'opération indiquée ci-dessus est extraite avec 3 1 d'une solution tampon acide acétique-acéta-te de sodium 0,05 M(pH 6,0) contenant du sulfaté d'ammonium de 5 saturation égale à 0,5 et ayant un pH de 6,0» Le sulfate d'ammonium (750 g) est dissous dans l'extrait, et on laisse reposer la solution résultante dans un réfrigérateur toute la nuit. Le précipité est rassemblé par centrifugation, dissous dans une faible quantité d'eau distillée et dialysé à travers une membrane semi-10 perméable toute la nuit. Le liquide intérieur est lyophilisé pour donner une poudre marron elair (1,5 g) contenant le composant F II, dont la dose efficace minima contre le carcinome par ascite d'Ehrlich sur les souris est 0,2 à 0,4 mg/kg/jour. Le modèle d'élution par filtration sur gel de la poudre (500 mg) avec le produit dit 15 Sephadex G-100 est présenté sur la figure 11 des dessins ci-joints (où. les abscisses et les ordonnées sont telles qu'indiquées sur la figure 8), d'où l'on confirme que le rapport des composants PI, PII et FIII est 0,1 : 1,0 : 0,3. La poudre obtenue ci-dessus (500 mg) est soumise à la filtra-20 tion sur gel avec le produit dit Sephadex G-100. L'éluat est rassemblé sur un dispositif de rassemblement de fraction tous les 10 ml. La quantité de protéine dans chaque fraction est déterminée par la capacité d'absorption à une longueur d'onde de 280 ap . Les fractions contenant le composant F II sont combinées et dialysées 25 à travers un film en produit dit cellophane par rapport à l'eau. Le liquide intérieur, après la dialyse, est lyophilisé pour donner une poudre jaune (150 mg), dont la dose efficace minima contre le carcinome par ascite d'Ehrlich chez les souris est 0,2 mg/kg/ jour. Par filtration sur gel de la poudre (50 mg) avec le produit 30 dit Sephadex G-100, on obtient un modèle d'élution tel que présenté sur la figure 12 des dessins ci-joints, où les abscisses et les ordonnées sont telles que sur la figure 8. D'après ce modèle, le produit semble être sensiblement pur. Cependant, la présence d'une quantité d'impuretés à l'état de trace est révélée par élec-35 trophorèse sur disque. La poudre obtenue ci-dessus (100 mg) est dissoute dans un tampon formé de tris-glycine à un pH de 8,5 et soumise à 1'électrophorèse de préparation, en utilisant une colonne de gel de polyacryla-mide de 20 ml, une tension électrique de 600 V et un courant élec-40 trique de 10 mA pendant 6 heures. La couche de polyacrylamide por 70 05796 17 2034555 tant le composant F II est coupée, broyée et extraite à l'eau, l'extrait est soumis à la filtration sur gel avec le produit dit Sephadex G-100 (200 ml à l'état humide). L'éluat est rassemblé sur un dispositif de rassemblement de fractions tous les 5 ml. 5 Les fractions contenant le composant F II sont combinées ensemble et dialysées avec une membrane semi-perméable. Le liquide maintenu à l'intérieur de la membrane est lyophilisé pour donner une poudre jaune pâle (10 mg) dont divers modes opératoires physiques oonfirment qu'elle est formée par le composant F II de haute pu-10 reté. A la place du mode opératoire de 1'électrophorèse sur disque de préparation indiquée ci-dessus, la poudre, dont on a confirmé qu'elle comprenait seulement le composant F II par la filtration sur gel, peut être également obtenue par chromatographie 15 sur colonne avec de l'AE cellulose. La poudre (20 mg) est dissoute dans l'eau distillée (2 ml), et la solution est déversée sur une colonne de AS cellulose (0,9 cm x 22 cm) traitée par un tampon phosphaté 0,01 M à pH 7,0. Après un bon lavage avec le tampon, la colonne est éluée sucessivement avec des tampons phospha-20 tés ayant des concentrations molaires en série variant de 0,01 à 0,2 M (pH de 7,0). Les éluats avec les tampons phosphatés ayant une concentration molaire de 0,05 à 0,09, qui peuvent effectivement diluer le composant F II, sont combinés ensemble et dialysés avec une membrane semi-perméable. Le liquide maintenu dans la mem-25 brane est lyophilisé et dissous dans une faible quantité d'eau. La solution aqueuse est déversée sur une colonne de produit dît Sephadex G-100 (25 ml) et soumise à la filtration sur gel en utilisant de l'eau distillée comme solvant de développement. Les é-luats contenant le composant F II sont combinés et lyophilisés 30 pour donner le composant F II (3,5 mg). La présente invention n'est pas limitée à l'exemple de réalisation qui vient d'être décrit, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. 70 05796 18 2034555 REVENDICATIONS 1 - Procédé de production d'un antibiotique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche de Streptomyces pluricolorescens produisant le produit dit largomycine, dans un milieu 5 nutritif aqueux, dans des conditions aérobies, et à récupérer l'antibiotique accumulé à partir du bouillon de fermentation. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est réalisée dans des conditions aérobies immergées. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 la culture est réalisée à une température allant d'environ 25 à environ 30#C„ 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est réalisée pendant une période allant d'environ 70 à environ 100 heures» 15 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est réalisée dans des conditions aérobies immergées, à une température allant d'environ 25 à environ 30°C, pendant une période d'environ 70 à environ 100 heures. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 20 la récupération de l'antibiotique à partir du bouillon de fermentation est réalisée par filtration du bouillon de fermentation, saturation du filtrat avec du sulfate d'aumonium et rassemblement du précipitéo 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il 25 est suivi du traitement de l'amtibiotique récupéré par un fractionnement avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium, à une saturation inférieure à 0,5, pour le séparer en composant actif insoluble et en composant actif soluble. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ee qu'il 30 est suivi du traitement du composant actif soluble.par fractionnement avec une solution aqueuse de sel, à pH allant de 3 à 5, pour réaliser une séparation en composant actif insoluble et en compossint actif soluble. 9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 35 la souche produisant la largomycine est le Streptomyces pluricolorescens HRRL 3679. 10 - Antibiotique dit largomycine P II, caractérisé en ce qu'il est efficace pour inhiber la croissance de microorganismes et de tumeurs, cet antibiotique étant une poudre amorphe jaune pâle a-40 cide, ne présentait pas de point de fusion ou de décomposition dé 70 05796 19 2034555 fini, étant précipité avec une solution de sulfate d'ammonium à 50 une solution de sulfate de magnésium à 50 une solution de chlorure de zinc à 50 1» et de l'acide trichloracétique à 20 56, présentant le point isoélectrique à un pH de 4,2, contenant les 5 éléments carbone, hydrogène, azote et soufre sensiblement selon les proportions suivantes en poids: présentant le spectre d'absorption dans l'ultraviolet et le spectre d'absorption dans l'infrarouge respectivement indiqués sur les figures 2 et 5, prenant une couleur violette en solution alcaline, 15 donnant des réactions positives à la ninhydrinè, au biuret, à la xanthoprotéine, à la réaction de Sakaguchi, de Molish, à l'anthrone, au phénol-acide sulfurique et à la réaction de Folin,et négative au point de vue de la réaction d'Elson-Morgan, contenant comme constituants d'aminoacide la lysine, l'arginine, l'histidine, l'acide 20 aspartique, l'acide glutamique, la thréonine, la sérine, la pro--line, la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, 1*isoleucine, le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine et la méthionine. 10 Carbone -Hydrogène Azote Soufre — * 47,8 8,3 13,6 0,25