Brevet FR2032476A1 — publié le 19701127

-1- 2032476 La conservation d'organes et de tissus, principalement de ceux qui sont destinés à des transplantations, s'accompagne souvent de difficultés dues au fait que ces organes et tissus sont plus ou moins détruits par autolyse post-mortem et deviennent 5 ainsi impropres aux buts mentionnés. Des champignons et des bactéries qui renferment des protéa'ses peuvent aussi produire le même effet défavorable. Il en est de même dans le cas de substances alimentaires qui peuvent également être rendues inutilisables par I action de protéases. » 10 Des agents connus de conservation parviennent bien à contre carrer plus ou moins les effets indésirables mentionnés, mais de tels procédés présentent toutefois l'inconvénient que de nombreux agents usuels de conservation ne sont pas bien tolérés par l'organisme . . 15 La Demanderesse vient de découvrir qu'il est possible de con server des organes, des tissus et des substances alimentaires au moyen d'inhibiteurs biologiques de protéases. Ces inhibiteurs biologiques de protéases ont le grand avantage d'être tolérés pratiquement sans complications par l'organisme. Mais 20 ils montrent avant tout à un haut degré l'effet désiré de conservation. On entend ici par inhibiteurs biologiques de protéases, des inhibiteurs extraits d'organes animaux, notamment l'inhibiteur connu dçfcallikréine et de trypsine, et en outre, des inhibiteurs de pro-25 téases d'origine végétale, dérivés principalement de pommes de terre, ainsi que de légumineuses. Les organes et tissus, qui peuvent être conservés selon l'invention, sont principalement le foie, les reins, le coeur, le pancréas, les poumons, la peau et la moelle osseuse. 30 Les inhibiteurs mentionnés sont utilisés, de préférence, en solutions aqueuses. On peut placer, dans ces solutions aqueuses, les organes, tissus et substances alimentaires à conserver, mais on peut aussi injecter les solutions aqueuses dans ces organes, etc., ou. bien on peut y faire passer un courant ininterrompu de ces aolations, 35 Toutefois, il est également possible de placer les inhibiteurs sous la forme solide, éventuellement avec des substances de support, en contact avec les organes, etc., à conserver. 70 07284 -2- 2032476 SI l'on utilise des solutions aqueuses pour la mise en oeuvre de la conservation selon lrinvention, de faibles concentrations sont déjà suffisantes pour atteindre l'effet désiré. Toutefois, il peut également être avantageux d'utiliser de plus fortes concentra-5 tions, suivant le cas particulier. EXEMPLE 1 On prélève des reins frais de rats en bonne santé et on les divise en deux parties par une incision médiane. Un groupe de demi-reins est placé dans une solution physiologique de chlorure de so-10 dium, et l'autre groupe est placé dans une solution de chlorure de sodium, qui est additionnée de 1' inhibiteur de kallikréine et tryp-sine à une concentration de 8 mg/ml. Les demi-reins sont conservés à la température ambiante dans ces solutions, dans des conditions stériles, ils sont prélevés-, toujours dans des conditions stériles, 15 après différentes périodes de temps comptées à partir du début de l'essai, et on contrôle leur intégrité au moyen de méthodes histo-logiques pratiques, ainsi que par des méthodes de l'histo-chimie des ferments. Les morceaux de tissu sont ou bien découpés au cryostat, pour l'histo-chimie spéciale des ferments, ou bien ils sont fixés 20 avec une solution neutre tamponnée de formol, ou fixés selon la méthode Wolman. La matière fixée selon la méthode Wolman est enrobée dans la paraffine, après passage dans le benzoate de méthyle, et utilisée en histologie classique. La matière fixée ■ au formol est découpée à l'état congelé et sert à la préparation des hydrolases. 25 On prépare les ferments suivants : EAD-cytochrome-c-réductase (ETABH-C-R) » lactate-déhydrogénase (LDH), glucose-6-phosphate-déhydro-génase (G6PDH), succino-déhydrogénase (SDH), cytochrome-oxydase (CO), estérases non spécifiques (ENS), phosphatases basiques (PB) et phos-phatases acides (PA). La caractérisation histo-chimique des hydrola-30 ses est effectuée d'après la méthode de A.G-.E. Pearse ["Histochemis-try ; Theoritical and Applied", 3ème édition ; J. a. A. Churchill Ltd. (Londres 1968)] et celle des autres enzymes est effectuée d'après la méthode de T. Barka et P.J. Anderson ["Histochemistry ; Theory, Practice and Bibliography" ; Harper and Row, Publishers, 35 Inc. ; New York (1963)]. En fait de colorations histologiques, on effectue la coloration à l'hématoxyline et l'éosine et la coloration selon la méthode de Goldner. 70 07284 -3- 2032476 Après 6 heures d'incubation dans une solution physiologique de chlorure de sodium, le plasma est très faiblement coloré par l'hématoxyline-éosine ; les cellules des tubes sont déformées par turgescence. On constate un relâchement prononcé de tout le tissu. 5 L'activité de la LDH, de la KADH-C-R et de la SDH n'a pas encore nettement diminué, mais on constate déjà des irrégularités de forme et de densité des granulations. Dans le cas de l'enzyme G6PDH, on observe des modifications analogues, notamment dans la zone juxta-médullaire. La caractérisation de la cytochrome-oxydase donne une 10 coloration tachetée. Dans le cas des estérases non spécifiques, on constate dans l'appareil tubulaire une répartition et une floculation irrégulières du colorant ; dans la moelle osseuse, l'activité a diminué. La coloration des phosphatases acides montre une réduction de l'activité et une granulation plus grossière. Après conser-15 vation pendant 6 heures dans la solution d'inhibiteur de kallikréine et de trypsine, il ne s'est produit qu'une faible perte de l'aptitude à la coloration par l'hématoxyline et l'éosine, mais la préparation est toujours nette ; on n'observe pratiquement pas de gonflement. Les orifices des tubules sont nettement délimités. La colora-20 tion, pour les enzymes mentionnés, ne donne généralement pas d'écart notable, par rapport à l'image normale. L'activité est forte et uniformément répartie. Les granulations de colorant sont généralement bien différenciées. Au bout de 24 heures, en l'absence d'inhibiteur de kalli-25 kréine et de trypsine, on constate un nouveau progrès de l'autolyse. Les noyaux s'estompent et la plupart ne peuvent plus être colorés, notamment dans les parties internes des morceaux de tissu. Les tubules ne montrent plus que de faibles parois. L'orifice n'apparaît plus obturé. Le tissu montre, dans toute son étendue, un début de 30 relâchement ; le tissu conjonctif interstitiel est lui aussi très relâché. Après coloration pour caractériser les enzymes LDH, ÎTADH-C-R, SDH et CO, les particules de colorant sont concentrées en des masses homogènes, et les noyaux n'ont plus de délimitation nette dans la zone colorée. L'activité de l'enzyme G6PDH est fortement 35 réduite. Les estérases non spécifiques ont totalement disparu. On note bien encore la présence partielle de phosphatases basiques de forte activité, mais elles n'apparaissent plus que sous la forme 70 07284 -4- 2032476 y » d'amas grumeleux, les phosphatases acides montrent une coloration homogène, accompagnée d'une forte réduction de l'activité. Sous l'action de l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine, les structures des noyaux sont encore presque toutes bien différenciées au 5 bout de 24 heures. On observe bien un premier indice d'autolyse commençante, mais le tissu semble fermé, et le tissu conjonctif est encore intact, la répartition du colorant entre les enzymes colorés est généralement plus régulière, l'activité est bien mieux conservée. En effet, en ce qui concerne l'enzyme G-6PDH, on observe 10 déjà une tendance à la décroissance, et les estérases non spécifiques ne peuvent plus être décelées. La différence, par rapport au témoin ne contenant pas d'inhibiteur de kallikréine et de trypsine, est particulièrement nette dans le cas des phosphatases acides, qui subsistent encore correctement du point de vue de l'activité et de 15 la structure. Au bout de 5 jours, en l'absence d'inhibiteur de kallikréine et de trypsine, on est parvenu à une rupture totale des structures. La préparation ne donne pratiquement pas de coloration avec l'hématoxyline et l'éosine, quelques noyaux seulement étant encore appa-20 rents. Les contours ne peuvent plus, être distingués. Quant aux enzymes LDH et MA.DH-C-R, la coloration ne donne plus que des masses homogènes. Les enzymes CO et PB ne peuvent plus être décelés. Les enzymes PA montrent encore une activité, mais leur structure n'apparaît plus. Après conservation pendant 5 jours en présence d'inhi-25 biteur de kallikréine et de trypsine, on ne voit plus apparaître nettement que la structure du tissu cortical ; la plupart des tu-bules ont encore conservé leur forme intacte. La mise en évidence par coloration des enzymes LDH et MDH-C-R ne montre plus qu'une granulation distincte. En ce qui concerne la coloration destinée 30 à l'enzyme LDH, les glomérules ne sont plus délimités que par leur négativité. L'enzyme CO ne peut plus être nettement caractérisé. L'activité des phosphatases acides est plus forte et mieux répartie que dans le cas des témoins. EXEMPLE 2 35 Des tissus de foie de rats en bonne santé sont découpés en cubes de 5 mm d'arête, et les cubes sont conservés, comme dans l'exemple 1, dans des solutions de chlorure de sodium, en l'absence 70 07284 -5- 2032476 et en présence d'inhibiteur de kallikréine et de trypsine. Le traitement et les examens sont ensuite effectués comme décrit dans l'exemple 1. Au bout de 6 heures, on constate, dans le cas des enzymes 5 LDH, MADH-C-R et SDH, des diminutions par places de l'activité. Dans la plupart des cellules, l'activité de l'enzyme G-6PDH a considérablement diminué ; toutefois, la structure et la négativité des noyaux sont bien conservées. En ce qui concerne les estérases non spécifiques, on constate des lacunes par places. Dans * 10 le cas des phosphatases acides, la délimitation des capillaires n'est pas nette et l'activité semble irrégulièrement répartie. Après conservation pendant 6 jours dans une solution contenant l'inhibiteur de kallikréine et de trypsine, les enzymes LDH, ÏTADH-C-R, SDH et G-6PDH ne montrent encore aucune modification. 15 Les estérases non spécifiques montrent d'assez faibles pertes. Les phosphatases acides sont plus nettement délimitées et plus régulièrement réparties que dans le cas des témoins. Au "bout de 24 heures, on constate une lyse de la structure, en l'absence d'inhibiteur de kallikréine et de trypsine. Les lobu-20 les ne sont plus nettement délimités ; la délimitation des sinus est irrégulière et ces derniers montrent de profondes excavations. L'activité des enzymes LDH, ÏTADH-C-R, SDH et, notamment, G6PDH a diminué. Dans le cas de la recherche par coloration des phosphatases acidesj il apparaît, à côté d'une forte baisse -d'activité, un 25 début de destruction des systèmes canaliculaires. Après conservation pendant 24 heures dans une solution d'inhibiteur de kallikréine et trypsine, la délimitation des lobules et des sinus est plus régulière. L'activité des enzymes LDH, NADH-C-R, SDH et G6PDH est encore, en général, moyennement forte. Même après la coloration des 30 phosphatases acides, l'activité est encore bien plus forte, et lâs systèmes canaliculaires semblent mieux conservés. Au bout de 5 jours, en l'absence d'inhibiteur de kallikr?éîjae et de trypsine, on ne constate plus qu'une activité minimal© homogène ou disséminée en ce qui concerne les enzymes LDH, EAJJH-^C—R et 35 SDH. Seules les phosphatases acides montrent encore une fixation moyenne du colorant. Même en cas de conservation dans mie solution d'inhibiteur de kallikréine et trypsine, une certaine lyse de la 70 07284 -6- 2032476 structure s'est à présent amorcée. Toutefois, les enzymes LDH, NADH-C-R et SDH montrent encore une nette activité. L'activité des phosphatases acides est bien plus forte que celle des témoins. EXEMPLE 3 5 On prélève par ponction sternale sur un être humain 2 à 4 œl de moelle osseuse. On met cette moelle en suspension dans deux fois son volume de solution de "Tyrode", à laquelle on ajoute, par ml, 15 mg d'inhibiteur de kallikréine et de trypsine. On conserve la suspension à environ -20°C. Si l'on compare, au bout d'un an, 10 cette suspension avec une suspension correspondante de cellules de moelle osseuse, qui a été préparée sans addition d'inhibiteur, mais par ailleurs dans les mêmes conditions, on constate dans cette dernière suspension, après coloration au bleu Trypan ou à l'éosine, un plus grand nombre de cellules mortes que dans la suspension confor-15 me à l'invention. EXEMPLE 4 On traite un foie humain destiné à la transplantation, par perfusion à travers la veine porte et l'artère hépatique avec une solution de "Tyrode", qui contient, par ml, 10 mg d'inhibiteur ex-20 trait de pommes de terre. Le tissu du foie garde mieux son intégrité que celui d'un autre foie qui nra pas été traité. Les variations autolytiques visibles à 1'examen histologique sont nettement inhibées . 70 07284 -7- 2032476 - BEVEM)ICATIOHS -1 - Application d'inhibiteurs biologiques de protéases à la conservation d'organes, de tissus et de substances alimentaires. 5 2 - Application de l'inhibiteur de kallikréine et trypsine à la conservation d'organes, de tissus et substances alimentaires. 3 - Application d'inhibiteurs de protéases d'origine végétale à la conservation d'organes, de tissus et de substances alimentaires . 10 4 - Application de l'inhibiteur dérivé de pommes de terre à la conservation d'organes, de tissus et de substances alimentaires.