Brevet FR2006843A1 — publié le 19700102

i 2006843 L'électrophorèse d'un, gel consiste à séparer des mélanges complexes de matièresfeed&éiguas telles que des protéines d'un sérum, des extraits de tissus, des hormones, des enzymes, des polypeptides, etc... au moyen d'une migration différentielle 5 des composants du mélange à travers un milieu sous la forme d'un gel dans un champ électrique. Bien que les techniques d'électro— phorèse des gels constituent un outil analytique "bien connu, l'utilisation largement répandue de 1'électrophorèse d'un gel comme travail préparatoire en "biologie et dans des sciences cor~ 10 respondantes a été gênée par' le manque d'appareils appropriés et relativement peu coftteux destinés à cette application. En conséquence, la présente invention a pour "but de fournir un appareil pour l'électrophorèse d'un gel de préparation : - présentant une capacité relativement élevée et capable 15 d'obtenir une résolution poussée des composants,, - d'un modèle relativement peu coûteux et cependant durable, qui soit facile à utiliser et qui puisse être démonté facilement pour le nettoyer et/ou l'emmagasiner. - comportant un système tampon discontinu et assurant une 20 élution continue des composants de sorte que le recueil des fractions du composant pendant l'électrophorèse est considérablement facilité. Ces résultats sont obtenus par un appareil d8électrophorè-se d'un gel qui comprend une colonne sensiblement verticale d'un 25 gel électrophorétique comportant une partie supérieure et une partie inférieure, un moyen servant à établir un potentiel unidirectionnel sensiblement uniforme longitudinalement à travers de la colonne, une chambre collectrice disposée en dessous de la colonne de gel et communiquant avec sa partie inférieure, et 30 un moyen de récupération qui est destiné à balayer la matière protéique qui pénètre' dans la chambre collectrice depuis la colonne, à peu près radialement vers un moyen de sortie disposé au centre, et vers le bas à travers celui-ci. D'autres avantages et caractéristiques-de la présente in-35 vention ressortiront au cours de la description détaillée qui va suivre, faite en regard du dessin annexé dont la figure unique représente une coupe de l'appareil d*électrophorèse d'un gel selon l'invention. En se reportant à la figure, un cylindre 10, ouvert à ses 40 deux extrémités, est suspendu verticalement dans un vase ou 69 12889 2 2006843 • bêcher 11 à embouchure ouverte à lsaide dïun élément de support 12 ou d'un moyen semblable» Le vase 11 est destiné à contenir tine première solution tampon 19, et le cylindre 10 est destiné à contenir un gel électrôphorétique 16 et une seconde solution 5 tampon 20 au-dessus du gel. Le gel 16 peut se supporter de lui-même ou bien en variante il peut être semi-rigide et être maintenu en place par une cloison 15 qui doit être perméable aux ions et également perméable aux matières ppotéiques qui effectuent une migration à travers le gel. Un matériau de construc-10 tion approprié dans ce but est un. polyéthylène poreux dont les dimensions de pores sont comprises entre 10 et 50 microns environ. De préférence, les dimensions des pores sont comprises entre environ 30 et environ 40 microns. Une plaque d'élution 13 qui est un disque perméable aux 15 ions réalisé d'une manière appropriée en po^yëthylène poreux ou en une matière semblable est disposée à une position relative espacée en dessous de la cloison 15® La plaque dcélution 13 et la cloison 15 forment ensemble tsss chambre collectrice 29 -en des= sous de la colonne de gel 16. De préférence, la perméabilité aïs 20 ions de la plaque dsélution 13 est telle qu'un potentiel sensi-* blement uniforme peut être maintenu longitudinalement à travers de la colonne 16, comme décrit plus complètement plus loin. La plaque d'élution 15 est également pourvue d'une ouvei>* ture centrale 30 qui communique avec la chambre collectrice 29 25 et qui permet à la matière protéique qui est collectée dans cette chambre 29 d'en être enlevée d'une manière continue par un canal d'écoulement ou conduit fermé 14-, La plaque d'élution 13 s'ajuste étroitement contre la paroi voisine du cylindre 10 de telle sorte que la solution tampon 19 contenue dans le vase 11 30 peut passer librement entre elles et pénétrer dans la chambre-23» Lorsqu'on applique une aspiration aux matières fluides qui se trouvent dans la chambre 29 par le conduit 14 au moyen d'une pompe ou d'un agencement de siphon approprié une solution tampon franche pénètre dans la chambre 29 autour de la périphé-35 rie de la plaque d'élution 13 et, en se déplaçant radialement vers l'ouverture centrale 30, balaye les matières protéiques éluées de la colonne de gel 16 vers le bas et à traders l'ouvert ture. On peut également faire varier la configuration dsécoule-ment radial particulière de la solution tampon 19 dans la cham-40 bre 29 en méhagèant des ouvertures minuscules espacées d'une 69 12889 3 2006843 manière appropriée dans la plaque d* élution 13 ou par un choix approprié de la porosité de la plaque, à -volonté. Le taux de débit de laf solution tampon à travers la chambre collectrice 29 peut être modulé en réglant le taux de soutirage du fluide par 5 le conduit 14. La plaque 13 peut être maintenue en place par ure bague de retenue 17 ou par tout autre moyen commode. Facultativement , un moyen d*espacement 18 peut être disposé entre la plaque 13 et la cloison 15 pour assurer à la chambre 29 un volume constant. Un tamis en "Nylon", ou un dispositif semblable peut 10 être utilisé dans, ce but. De plus, pour éviter qu'une certaine quantité de matière protéique ne traverse la plaque d'élution 13» une membrane de dialyse, ou un élément semblable, peut être interposée entre le moyen d'espacement 18 et la plaque 13 en cas de besoin. . ... 15 La force d'entraînement assurant la migration différentiel le des divers composants du mélange protéique est la force élec-tromotriee appliquée de part et d'autre de la colonne de gel. Pour assurer une séparation relativement nette des composants, il est souhaitable d'obtenir un potentiel unidirectionnel sensi-20 blement uniforme longitudinalement à travers la colonne de gel. Dans ce but, l'appareil selon l'invention envisage d'utiliser . une électrode 21 mise en contact électrique avec la solution tampon 20 et connectée par un conducteur 23 à im premier pôle d'une source de courant continu 28, et une autre électrode 22 25 mise en contact électrique avec la solution tampon 19 et connec~ tée par un conducteur 24 au pôle opposé de la source de courant continu 28. Les électrodes 21 et 22 peuvent être en carbone, en un métal noble tel que du platine, etc.. Du fait $ue les solutions tampons.19 et 20 sont conduc-30 trices et de nature aqueuse, pendant le fonctionnement de l'appareil il peut se produire une certaine électrolyse des solutions avec production correspondante de bulles de gaz. Dans ce but, il est préférable de disposer l'électrode inférieure 22 de telle sorte que toutes les bulles de gaz produites à cet endroit et 35 Qui en sont dégagées ne se trouvent pas emprisonnées à l'intérieur de la partie inférieure du cylindre 10 mais s'élèvent jusqu'à la surface de la solution tampon 19 pour être dissipées dans l'atmosphère ambiante. Les solutions tampons 19 et 20 servent également à dissi-40 per la chaleur produite pendant que l'appareil d'électrophorèse 69 12889 4- 2006843 du gel est en service. Dans le cas où cette dissipation de chaleur s'avère insuffisante pendant une application particulière, on peut utiliser un moyen d'échange de chaleur approprié tel que des serpentins de refroidissement, ce qu'on appelle des 5 doigts froids", une chemise de transmission de chaleur autour du cylindre 10 ou du vase 11, etc... De-plus, un couvercle-25 muni d'un évent 26 pour le sommet du cylindre 10 peut- être utilisé, à volonté. L'appareil selon la présente invention peut être utilisé 10 avec une grande diversité de gels électrophorétiques tels que des gels d'amidon, des gels de silice, des gels d'agar, etc.#. Les gels peuvent être rigides ou semi»-rigides. Un gel d'un polymère d*acrylamide convient particulièrement pour être utilisé avec le présent appareil, ce gel étant semi-rigide et insoluble 15 dans l'eau et étant obtenu en copolymérisant un acrylamide avec un méthylène bisacrylamn.de. Ce gel est pratiquement transparent et peut être formé avec un minimum d'environ 2,5 # du mélange monomère, la concentration maximale du polymère dans le gel n'étant limitée que par la solubilité de 1*acrylamide et du méthy-20 lène bisacrylamide. L'agent de rétification est le méthylène bisacrylamide et on peut faire varier sa concentration depuis un minimum d'environ 1 % de la teneur totale en monomère jusqu'à un maximum correspondant à sa limite de solubilité dans l'eau. Avec une plus forte concentration du polymère, le gel devient-25 plus résistant et plus rigide. Un mélange solide d'environ 95 % ' d'acrylamide et de 5 % de méthylène bisacrylamide peut être trouvé dans le commerce. L'appareil est préparé pour l'utiliser en coulant un gel voulu, tel que le gel polymère d*acrylamide précité, dans le cy— 50 lindre 10, à peu près comme représenté sur la fig. 1. La coulée peut s'effectuer d'une manière commode en commençant par obturer l'extrémité inférieure du cylindre 10j en le remplissant avec de l'eau jusqu'à un niveau suffisamment élevé pour recouvrir la plaque d'élution 13 et la cloison 15 lorsqu'elles sont en place 35 et en- plaçant ensuite ces deux derniers éléments à leur position normale. Toute l'eau en excès au-dessus de la cloison 15 est décantée et la .solution de gel voulue est coulée en place. Le volume d'air qui se trouve au-dessus de la solution de gel coulé est balayé à l'aide d'azote et on laisse prendre la solution. 40 La durée de la prise peut être raccourcie si la solution de gel 69 12889 - ï 5 2006843 est désoxygénée. Une fois que le gel a pris, on débouche la partie inférieure du cylindre "ÎO et on en évacue l'eau, on relie le conduit 14 à l'ouverture 30 de la plaque d'élution et on suspend. 5 le cylindre 10 dans le vase 11. Ensuite, on verse les solutions tampon 19 et 20 en place, on réalise les connexions électriques nécessaires, et on dispose en couah.es le mélange protéique à séparer au sommet de la surface supérieure 27 du gel 16 au moyen d'une pipette ou d'un dispositif semblable. La source de 10 courant continu est alors connectée et le courant qui traverse le gjiÇ. est réglé de façon à permettre au mélange protéique de pénétrer dans le gel/sans déformation exagérée. Lorsque la pénétration a été effectuée, on augmente l'intensité du courant jusqu'au miveau de fonctionnement normal et effectue la sépara-15 tion. Le balayage de la chambre collectrice 29 est commencé juste avant que le premier composant séparé du mélange ne traverse la cloison 15 et il se poufsuit jusqu'à ce que tous les composants voulus aient été récupérés. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et 20 représentée qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et . qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. R E Y E I D I G A T I. 0 IfS 1D Appareil- pour la séparation, ppr électropliorèse de matières prQtéiquess caractérisé en ce qu'il comprend 5 une colonne de gel électrophorétique comportant- une partie supérieure 5 et une partie . inférieure ; un. moyen servant à établir un poten«> tiel unidirectionnel sensiblement uniforme longitudinalement en travers de la colonne-^, une chambre collectrice- disposée en dessous de la colonne eb communiquant avec sa partie inférieure| et un moyen de récupération destiné à balayer .une matière prà— 10 téique pénétrant dans la chambre collectrice depuis la colonne, à peu près radialemert vers un moyen de sortie disposé au centie et vers le bas à travers ce moyen„ 20 Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la colonne de gel électrophorétique -est supportée par une 15 cloison poreuse, perméable aux protéiness Jc Appareil suivant la revendication 13 caractérisé en ce que le moyen de récupération eospreM wi disque poreux perméable aux ions juxtaposé et disposé en dessous de- la colonie de gel électrophorétique à une position relative espacée de celle— 20 ci et qui est pourvue d'u&e ouverture centrale communiquant avec la chambre collectricea 43 Appareil suivant la revendication 1a caractérisé en ce que le moyen servant à établir un potentiel unidirectionnel uniforme longitudinalement en travers de la colonne est constitué 25 par deux électrodes destinées à être baignées dans des solutions tampon séparées, lesquelles sont en contact électrique avec le sommet et le bas de la colonne, respectivement, et qui sont connectées à une source de courant continu. 5. Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en se 30 que le gel électrophorétique est un gel d'un polymère d8acrylamide» 6„ Appareil pour 11 électropliorèse d8un gel de préparation^ caractérisé en ce qu'il comprend. 5 ur: vase pourvu d'une extrémité supérieure ouverte et d'un fond et qui est destiné à conte-35 nir une solution tampon ; un récipient cylindrique, ouvert à ses deux extrémitésj_ suspendu à peru près verticalement dans le vase et qui est destiné à contenir une colonne d'un gel électrophoré»» tique surmontée d'une solution tampon; une cloison perméable aux protéines destinée à supporter le gel électrophorétique, dis-40 posée près de l'extrémité inférieure de la colonne et s!étendant 69 12889 7 2006843 en travers suivant une direction à peu près perpendiculaire à son axe longitudinal ; un disque perméable aux ions juxtaposé et disposé en dessous de la cloison perméable aux protéines et à une position relative espacée de celle-ci, pour former avec 5 elle une chambre collectrice, ce disque étant pourvu d'une ouverture centrale qui communique avec la chambre collectricB et étant destiné à régler le débit de la solution tampon dans la chambre collectrice ; un conduit communiquant avec la chambre collectrice à travers l'ouverture centrale du disque une pre-10 mière électrode disposée à l'intérieur du vase à extrémité ouverte près de sa partie inférieure et destinée à être connectée à un premier pôle d'une source de courant continu ; et une seconde électrode disposée à l'intérieur du récipient cylindrique près de son extrémité supérieure et qui est destinée à être con— 15 nectée â l'autre pôle d'une source de courant continu.