Brevet FR2001108A1 — publié le 19690926

La présente invention est relative à un procédé de produc- ! tion de D-ribose. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production de D-ribose, qui consiste à inoculer Tin microorganisme producteur de D-ribose et du genre Bacillus. micro-5 organisme qui exige de la L-tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylalanine pour sa croissance, dans un milieu de culture contenant de la L-tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylana-nine, en des quantités respectives supérieures à environ 100 Hg/ml, en plus de sources assimilables de carbone et d'azote, 10 à faire incuber le milieu de culture jusqu'à ce que le D-ribose y soit accumulé et à récupérer le D-ribose ainsi accumulé dans le milieu de culture# Le D-ribose est un composé important, par exemple comme matière de départ dans la synthèse de composés de la riboflavine et 15 comme matière première dans la production de condiments à base de nucléotides qui ont été récemment créés. Dans la technique antérieure, on connaissait plusieurs procédés de production de D-ribose utilisant des micro-organismes, mais leur mise en oeuvre industrielle est difficile parce qu'ils 20 ne donnent que de petites quantités de D-ribose. Conformément à la présente invention, l'incubation de certains micro-organismes du genre Bacillus détermine l'accumulation de D-ribose en une quantité remarquablement importante dans le milieu de culture, et le D-ribose accumulé de cette façon peut être 25 facilement récupéré dans ce milieu de culture. La présente invention a pour objet un procédé de production de D-ribose, qui peut être mis en oeuvre à l'échelle industrielle avec un bon rendement. On atteint le but précité en inoculant un micro-organisme 30 producteur de D-ribose du genre Bacillus « qui exige de la L-tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylalanine pour sa croissance , dans un milieu de culture contenant de la L-tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylalanine, et en faisant incuber ensuite le milieu de culture. 35 (Dans la suite de l'exposé, les micro-organismes qu'on vient de mentionner sont simplement appelés des "Micro-organismes")* Les Micro-organismes sont dérivés de souches non cultivées au moyen d'une technique de mutation classique per se ou bien ils sont isolés de souches non cultivées. 40 En d'autres termes, on peut effectuer la mutation en sou 69 01867 2 2001108 mettant des souches non cultivées appartenant au genre Bacillus à un traitement par exemple par des rayons ultraviolets, par des rayons X, par des rayons gamma, par un mutagène tel que la nitro-soguanidine, etc. , 5 Les Micro-organismes sont par exemple les mutants de Bacillus pumilus tels que le Bacillus pumilus n° 503 (IFO 12600), le Bacillus pumilus n° 537 (IFO 12601), le Bacillus pumilus n° 558 (IFO 12602), etc., et les mutants de Bacillus subtilis tels que le Bacillus subtilis n° 429 (IFO 12603), le Bacillus 10 subtilis n° 483 (IFO 12604), etc. Les caractéristiques micro-biologiques représentatives de ces Micro-organismes sont telles qu'ils ne peuvent pas utiliser pour leur croissance l'acide D-gluG'onique, le L-arabinose ou le D-ribose comme source de carbone, et qu'ils exigent pour leur 15 croissance la L-tyrosine, le L-tryptophane et la L-phénylalanine» A d'autres égards au point de vue microbiologique, leurs propriétés sont identiques à celles qui sont exposées dans le manuel de Bergey "Determinative Bacteriology", 620-622 (1957)» En vue de produire le D-ribose à l'échelle industrielle, on 20 cultive de préférence les Micro-organismes dans un milieu de culture liquide. On procède généralement à une incubation submergée, en aérant et en agitant, en utilisant un milieu de culture contenant nécessairement de la L-tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylalanine• 25 Bien que la L-tyrosine, le L-tryptophane et la L-phény1ana— nine puissent être ajoutés au milieu de culture sous leur forme isolée respective, on peut également utiliser une substance naturelle contenant ces composés, comme par exemple la levure séchée, la peptone, un extrait de viande, un acide aminé de la caséine, 30 la liqueur de macération du maïs, etc., ainsi que des mélanges de telles substances « v On doit ajouter la L-tyrosine, le L-tryptophane et la L-phénylalanine au milieu de culture en une quantité suffisante pour permettre la croissance des Micro-organismes. En. général, 35 on les ajoute au milieu de culture dé manière que leur concentration respective soit supérieure à 100 Hg/ml., et de préférence inférieure à 5»000 Hg/ml» Comme source de carbone assimilable, on peut utiliser un ou plusieurs composés tels que les monosaccharides, comme par 40 exemple le D-glucose, le D-fructose, le D-mannose, le sorbitol, 69 01867 3 2001108 "le D-mannitol, etc., les disaccharides, comme par exemple le saccharose, le maltose, etc., divers polysacharides, comme par exemple la dextrine, l'amidon soluble, etc., les mélasses résiduaires, et des produits analogues. 5 La source i*azote assimilable peut être constituée par exem ple par des composés azotés minéraux tels que le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, etc. ainsi que par des matières azotées organiques telles que l'urée. De plus, on peut utiliser une petite quantité de sels minéraux tels que le sulfate de magnésium, 10 le phosphate de calcium, le carbonate de calcium, etc. On doit régler la température d'incubation de manière que la substance désirée s'accumule en une quantité maximale. En général, on règle la température entre 25 et 45°C. On poursuit l'incubation jusqu'à ce que la quantité maxima— 15 le de D-ribose soit accumulée dans le milieu de cul titre. Bien que la période requise pour 1'accumulation maximale de D-ribose soit fonction de divers facteurs, elle est habituellement comprise entre 24 et 120 heures depuis le début de l'incubation. Le bouillon de culture contient une grande quantité de D-20 ribose lorsque la culture est terminée. Etant donné que la partie principale du D-ribose ainsi obtenu est accumulée dans la phase liquide du bouillon, il est recommandé, pour commencer, de séparer les cellules par filtration et de récupérer ensuite le D-ribose dans le filtrat. Par exemple, on peut récupérer le D-ribose en 25 éliminant les sels du filtrat à l'aide d'une résine échangeuse d'ions et en le décolorant par passage à travers une colonne de charbon en poudre. Quand le bouillon de culture contient des hydrates de carbone brute en plus du D-ribose désiré, à la fin de la culture, on 30 peut éliminer de tels hydrates de carbone par n'importe quel procédé connu per se. par exemple en traitant le bouillon avec un oxidase du glucose dans le cas où le glucose constitue l'hydrate de carbone de départ ou avec une levure de boulanger qui n'utilise pas le D-ribose mais qui utilise uniquement d'autres hydrates 35 de carbone. Les exemples qui suivent sont donnés uniquement à titre il-lustratif et non limitatif de la portée de la présente invention dont ils décrivent des modes ûe réalisation actuellement préférés. Dans le présent exposé ainsi que dans les exemples, l'abré-. 40 ▼iation IFO signifie "Institute for Fermentation Osaka" et les 69 01867 2001108 pourcentages s'entendent en poids/volume sauf mention contraire. TmaipLE 1 Le mutant Bacillus pumilus n° 503 (IFO 12600), qui provient du Bacillus pumilus (ATCC n° 7061) par irradiation avec des 5 rayons ultraviolets, suivie"d'une sélection par la pénicilline [voir "Experientia", 66, 41 (1960)] et d'un repiquage sur plaque [voir "Journal of Bacteriology", 63, 399 (1952)], est inoculé dans 500 ml d'un milieu contenant 2 % d'amidon soluble, 2 %de liqueur de macération du maïs, 0,3 % de phosphate dipotassique 10 et 0,1 % de phosphate monopotassique. On fait incuber le milieu à 28°C pendant 24 heures pour préparer une culture d'ensemencement . On inocule ladite culture dans 30 litres d'un milieu (qu'on appellera par la suite A) qui contient 12,5 % de glucose, 2,5 % de levure sèche, 1,5 % de sulfate d'ammonium, 0,5 % de phosphate 15 bicalcique, 0,5 % de phosphate tricalcique et 1 % de carbonate de calcium» On fait incuber le milieu à 32°C pendant 66 heures, tout en aérant et en agitant constamment. Ce procédé donne 28,5 mg/ml de D-ribose dans le bouillon de culture. On fait passer le bouillon de culture ci-dessus, contenant 20 du D-ribose, à travers une colonne de charbon aetivé (15 x 100 ca on concentre l'effluent jusqu'à un volume d'environ 5 litres sous pression réduite et on le fait incuber après addition de 10 % de levure de boulanger, à 37°C et pendant 1 heure. Après avoir séparé les cellules de levure par filtration, on fait encore passer 25 le produit cohcentré, en vue d'éliminer-les sels, à travers des couches de résines échangeuses de- cations (disponibles dans le commerce sous le nom "Amberlite IR-120") et de résines échangeuses d'anions (connues dans le commerce sous le nom "Amberlite IR-A-400"), puis on concentre l'effluent jusqu'à un volume de 1 30 litre. On ajoute 1 litre d'alcool éthylique à ce produit concentré, ce qui donne 620 g de cristaux de D-ribose brut. •RTRMPLE 2 Le mutant Bacillus pumilus n° 537 (IFO 12601), préparé de la même manière que dans l'exemple"1, est inoculé dans 500 ml 35 d'un milieu contenant 2 % de sorbitol, 2 % de liqueur de macération du maïs, 0,3 % de phosphate dipotassique et 0,1 % de phosphate monopotassique. On fait incuber le milieu à 32°C pendant 24 heures, pour préparer une culture d'ensemencement". On inocule ensuite la culture d'ensemencement dans 30 litres d'un milieu 40 comprenant le milieu A et 150 H-g/ml de L-phénylalanine. On fait 69 01867 5 2001108 ensuite incuber ce milieu à 37°C pendant 55 heures, tout en aérant et en agitant. Le procédé'ci-dessus donne 30,5 mg/ml de D-ribose dans le bouillon de culture. Ce bouillon contenant du D-ribose, après traitement de la manière décrite dans l'exemple 5 1, donne 693 g de cristaux bruts de D-riboseo EXEMPLE 3 Le mutant Bacillus pumilus n° 558 (IFO 12602), préparé de la même manière que dans 1 * exemple'1, est inoculé dans 500 ml d'un milieu ayant la même composition que celui qu'on a utilisé 10 pour préparer la culture d'ensemencement de l'exemple 2. On fait incuber le milieu à 37°C pendant 24 heures, tout en secouant, pour préparer une culture d'ensemencement. On inocule cette culture d'ensemencement dans 30 litres du milieu A auquel on a ajouté 50 Fg/ml de L-tyrosine. On fait incuber le milieu à 37°C pen-15 dant 80 heures tout en aérant et en agitant. Ce procédé donne 29,3 ag/ml de D-ribose dans le bouillon de culture. On traite ce bouillon de culture de la même manière que dans 1* exemple 1, ce qui donne 620 grammes de cristaux bruts de D-riboseo TrawPT/E a 20 Le mutant Bacillus subtilis n° 429 (IFO 12603), qu'on ob tient par irradiation de Bacillus subtilis (ATCC n° 6051) avec des rayons ultraviolets, suivie d'une sélection par la pénicilline (comme décrit ci-dessus) et d'un repiquage sur plaque (comme décrit ci-dessus), est inoculé dans 500 ml d'un milieu contenant 25 2 % d'amidon soluble, 2 % de liqueur de macération du maïs, 0,3 % de phosphate dipotassique et 0,1 % de phosphate mohopotassique. On fait incuber le milieu à 32°C pendant 24 heures. On inocule ensuite cette culture d'ensemencement dans 30 litres d'un milieu contenant 10 % d'amidon soluble, 1,5 % de levure sèche, 1,5 % de 30 sulfate d'ammonium, 0,5 % de phosphate tricalcique, 0,5 % de phosphate bicalcique et 1 % de carbonate de calcium. On fait incuber ce milieu à 32^ pendant 72 heures, tout en aérant et en agitant. Un tel procédé donne 26,5 mg/ml de D-ribose dans le milieu de culture. 35 On filtre ce bouillon de culture avec un auxiliaire de filtration pour en séparer les cellules, et on fait passer le filtrat à travers une colonne (20 x 100 cm) de charbon en poudre traité au préalable par un acide. On concentre l'effluent jusqu'à un volume d'environ 4,5 litres sous pression réduite, puis on le 40 fait incuber après avoir ajouté 10 % de levure de boulanger, à 69 01867 6 2001108 37°C pendant 1 heure. Après avoir séparé les cellules de levure 1 par filtration, on fait passer le produit concentré, en vue d'en éliminer les sels, à travers des couches de résines échangeuses de cations (disponibles dans le commerce sous le nom "Amberlite 5 IR-120") et de résines échangeuses d'anions (disponibles dans le commerce sous le nom "Amberlite IR-A-400"), puis on concentre encore l'effluent jusqu'à un volume de 1 litre sous pression réduite. On ajoute au produit concentré 1,5 litre d'alcool éthy-lique, ce qui permet d'obtenir 558 g de cristaux bruts de D-10 ribose. h:X KKTPTÏR 5 On irradie le Bacillus subtilis avec des rayons ultraviolets, ce qui donne le mutant de Bacillus subtilis n° 483 (IFO 12604), On inocule ce mutant dans 500 ml du milieu A, à 30°C pen-15 dant 20 heures. On inocule la culture d'ensemencement résultante dans 30 litres d'un milieu contenant 10 % de D-glucose, 2 % de levure sèche, 1,8 % de sulfate d'ammonium, 0,5 % de phosphate de calcium, 1 % de carbonate de calcium et 100 Kg/ml de l-phénylalanine. On fait incuber ce milieu à 32°C en 68 heures, le procédé 20 ci-dessus donne 29,5 mg/ml de D-ribose dans le bouillon de culture. On traite le bouillon de la même manière que dans l'exemple 1, ce qui donne 615 g de cristaux bruts de D-ribose. 69 01867 7 2001108 REVENDICATIONS 1. [Procédé de production de D-ribose, caractérisé par le fait qu'il consiste à inoculer un Micro-organisme producteur de D-ribose, du genre Bacillus. Micro-organisme qui exige de la L- 5 tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylalanine pour sa croissance, dans un milieu de culture contenant de la L-tyrosine, du L-tryptophane et de la L-phénylalanine, en des quantités respectives supérieures à 100 Hg/ml, en plus des sources de carbone et d'azote assimilables, à faire incuber le milieu de 10 culture jusqu'à ce que le D-ribose s'y accumule, et à récupérer le D-ribose dans le milieu de culture. 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité précitée est inférieure à 5000 Fg/ml. 3« Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 15 le fait que le Micro-organisme est incubé dans le milieu de culture à line température d'environ 25 à 45°C, en aérobie • 4. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le Micro-organisme est le Bacillus pumilus. 5» Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé par 20 le fait que le Micro-organisme est le Bacillus pumilus n° 503 (IFO 12600). 6. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé par le fait que le Micro-organisme est le Bacillus pumilus n° 537 (IFO 12601). 25 7» Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé par le fait que le Micro-organisme est le Bacillus pumilus n° 558 (IFO 12602). ' 8. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le Micro-organisme choisi est le Bacillus subtilis. 30 9. Procédé conforme à la revendication 8, caractérisé par le fait que le Micro-organisme est le Bacillus subtilis n° 429 (IFO 12603). 10. Procédé conforme à la revendication 8, dans lequel le Micro-organisme est le Bacillus subtilis n° 483 (IFO 12604).