Brevet FR2007901A1 — publié le 19700116

i 2007901 lia présente invention concerne un procédé nouveau pour la préparation d'un antibiotique désigné par W847-A et de dérivés pharmaceutiquement acceptables de cet antibiotique® Le brevet belge N° 715*638 décrit un complexe antibioti-5 que identifié comme étant le complexe ¥847, sa préparation par incubation d'une espèce alors nouvelle de microorganismes de la désignation Hicromonospora sp« ¥847 et les propriétés thérapeutiques intéressantes de ce complexe antibiotique sous sa foime libre et sous la forme de ses dérivés fonctionnels» Ce brevet belge 10 décrit aussi diverses fractions possédant une activité antibiotique qui ont été isolées du Complexe ¥847# et qui ont été appelées Fraction A, Fraction B, Fraction et Fraction Cg» les mélanges des Fractions 0^ et Cg sont appelés Complexe ¥847-C. Selon le brevet belge N° 715«638, l'antibiotique Complexe 15 W847 peut être formé par culture du microorganisme Hicromonospora bp. ¥847 dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies immergées. Ces microorganismes sont du genre Micromonospora et de 1*ordre Actinomycetaies. Des cultures d'organismes vivants de deux souches de ce genre ont été déposées et font partie de la 20 collection de cultures du United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, où elles ont reçu les désignations HEEL 3274 et NEBL 3275* Ces souches peuvent être obtenues sur demande adressée au bureau de la collection. 25 Ainsi qu'il sera évident pour l'homme de l'art, il est très souhaitable qu'on ait à sa disposition des fractions antibiotiques simples, au lieu d'un complexe, car on peut administrer une fraction simple avec une bien plus grande assurance d'uniformité concernant la puissance, les effets, la concentration, l'ab-30 sorption, etc... De même, il est souhaitable qu'on ait l'antibiotique disponible sous la forme d'un composé cristallin pur unique pour fournir des normes uniformes de pureté et de dosage. De plus, les études faites par la demanderesse ont montré que l'antibiotique ¥847-A présente plusieurs avantages nets 35 par rapport au constituant principal ¥847-0^, à savoir une meilleure tolérance, une toxicité subaiguë plus faible, une meilleure activité contre les organismes Grram-négatifs, des taux sanguins maximaux plus élevés et une activité protectrice légèrement 69 14299 2 2007901 supérieure chez les souris. Par le procédé décrit dans le brevet belge H° 715.638, les diverses fractions du Complexe W847, et la fraction A en particulier, sont séparées et isolées par des techniques chromato-5 graphiques longues. De plus, la fraction A (c'est-à-dire l'Antibiotique W847-A) est présente dans le Complexe W847 produit dans le bouillon de fermentation du procédé décrit par ce brevet belge à raison d'une quantité relativement petite seulement, c'est-à-dire moins de 10 56, le constituant principal étant ¥847-C^ • Ainsi, 10 même en utilisant cette technique ennuyeuse d'isolement, ¥847-A est obtenu à de faibles rendements seulement. Il est donc apparu souhaitable de rechercher un procédé permettant d'obtenir ¥847-A avec de meilleurs rendements, en utilisant des techniques plus simples. 15 On a maintenant découvert que ¥847-®, ¥847-C,j et ¥847-02 contiennent chacun au moins un groupement hydrolysable par élimination duquel on obtient ¥847-A. Ainsi, selon la présente invention, on obtient ¥847-A avec de bons rendements par un procédé simple comprenant l'hydro-20 lyse sélective d'un substrat contenant ¥847-B, ¥847-C^ et/ou ¥847-Cg de façon à transformer ces matières en ¥847-A, et l'isolement de ¥847-A ou d'une fraction enrichie en ¥847-A sous la forme libre ou sous la forme d'un dérivé fonctionnel. De préférence, l'hydrolyse sélective est effectuée dans des conditions non-acides, 25 en particulier sous la formé d'une hydrolyse alcaline contrôlée dans un milieu ayant un pH compris entre 9 environ et 12 environ. Avantageusement, on continue l'hydrolyse jusqu'à ce que la transformation soit à peu près complète. Il est particulièrement commode d'appliquer le procédé 30 de l'invention au bouillon de fermentation du procédé du brevet belge N° 715.638 sans isoler l'une quelconque des fractions ou même le Complexe ¥847 de ce bouillon. Toutefois, il est également possible d'appliquer le procédé de l'invention au Complexe ¥847 isolé (obtenu en général par extraction du bouillon par un solvant 35 non miscible avec 1'eau et concentration), ou. au Complexe ¥847-C isolé ensuite, ou à l'un quelconque des Antibiotiques ¥847-B, ¥847-C,| et ¥847-Cg individuellement, ou à un mélange contenant deux fractions ou plus du Complexe ¥847. De plus, la présente invention 14299 3 2007961 ne doit pas être considérée comme limitée à la transformation de 1'antibiotique Complexe ¥847, du W847-B, du ¥847-0^ ou du ¥847-Cg seulement quand ils sont produits par utilisation de la souche Micromonoapora sp. ¥847 var. NEHL 3274 ou var» HRHL 3275» Tout 5 d'abord, on peut utiliser aussi d'autres variétés de Micromonospora bp. ¥847 ou des mutants produite à partir de cet organisme par des agents de mutation comme par exemple un rayonnement à haute fréquence, y compris les rayons X et ultra-violets, les actinophages et l'ypérite azotée. En deuxième lieu, d'autres microorganismea 10 peuvent produire une ou plusieurs fractions d'antibiotique ¥847» En troisième lieu, des fractions d'antibiotique ¥847 produites synthétiquement peuvent être hydrolysées d'une manière similaire en ¥847-A. En d'autrer termes, le procédé de la présente invention est applicable et efficace pour transformer les substances anti-15 biotiques ¥847-B, ¥847-C^ ou ¥847-Cg ou leurs mélanges en l'antibiotique ¥847-A, quelle que soit la méthode par laquelle les premières substances sont elles-mêmes produites. les matières de départ de la présente invention peuvent être identifiées chacune de façon certaine sans référence à leur 20 méthode de production, l'antibiotique Complexe ¥847 possède un spectre antibactérien essentiellement tel qu'indiqué dans le Tableau 1 avec à peu près pas de diminution de puissance après contact pendant 24 heures à 37®C avec l'un quelconque des ensymes suivants : tiypsine, chymotrypsine, pepsine, ec-amylase et péni- Les constituants ¥847-A, ¥847-B, ¥847-^ et ¥847-C2 . peuvent être identifiés d'une façon certaine par leurs propriétés chimiques et physiques comme indiqué dans le Tableau 2 ; par leurs spectres infra-rouges, comme représenté sur les figures 1, 2, 3 et 30 4» respectivement, du brevet belge N° 715.638; par leurs-spectres de résonance magnétique nucléaire (EMN), comme représenté sur les figures 5» 6, 7 et 8, respectivement, du brevet belge N° 715*638j et par leurs speetres antibactériens comme indiqué dans le Tableau 1• les spectres infra-rouges sont déterminés dans une 35 huile minérale (Nujol) et les pics d'absorption les plus significatifs sont indiqués dans le Tableau 3 avec les désignations suivantes : S = prononcé, M = modéré, ¥ = faible, VS = très prononcé, M-S = modéré à prononcé, brd. = large, shp. = aigu, 14299 4 2007901 shd» = épaulement, et s»b„ = bande latérale o vO Tableau 1 Spectre antibactérien de l'antibiotique Complexe W847 et des fractions A, B, , Qg et Complexe C Microorganisme Concentration minimale d'inhibition (mcg/cm3) Antibiotique W847 .fc» KJ> ■4D O ComplexeComplexe Fraction Fraction Fraction Fraction Comple-Base HC1 A B C1 C2 xe C Bacillus megatherium DA 7064 Baoillus subtilis ATCC 6633 Diplococcus pneumoniae DA 700 M n ATCC 10015 " M DA 15Q Enterococcus sp. M 800 " M 801 " M 802 Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus aureus ATCC 12715 " " ATCC 6538P « « ATCC 11631 " " (G-ray) " " DA 2001 » » DA 2003 « » DA 2010 " " DA 2014 " M DA 2018 " M DA 2032 " " DA 2033** Streptococcus faecalis DA 20 n pyogenes DA 21 » » DA 11 w " DA 1.2 0,3 0,03 0,3 0,3 6,0 6,0 0,3 0,75 0,3 0,75 0,3 >1,0 0,0075 0,0075 : 0,3 0,75 ' 0,3 0,03 * 0,3 0,075 0,3 0,3. 0,03 0,3 0,03 0,03 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,075 0,3 >16 . . >16 .0,3 .0,3 0,75 >1,0 0,3. 0,6 0,005 A»2 Q,5 > 2,7 0,6 0,6 0,2 0,005 0,08 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 >2,7 0,03 5,0 0,6 0,2 1,2 0,05" A»2 P,5 >2,7 0,6 0,6 0,2 0,005 0,2 0,2 0,6 0,6 0,2 0,6 0,6 0,6 0',6 0,6 >2,7 0,1 5,0 S'2 0,2 0,3 0,03 12,0 .0,3 0,3 0,3 0,0075 0,3 0,03 0,3 0,3 0,03 0,075 0,3 . 0,03 0,075 0,075 >32,0, . 0,3 0,3 0,3 0,6 0,005 0,6 0,05 >2,7 .0,08 0,6 0,03 0,0005 0,005 0,005 0,6 0,6 0,03 0,6 0,2 0,6 0,1 0,08 >2,1 0,005 0,6 . 0,03 0,03 0,3 0,005 >2,7 0,3 0,3 0,3 0,00075 0,03 0,03 0,3 0,5 0,03 0,3 0,25 0,03 2'1 0,08 >2,7 0,075 0,3 0,3 vi O O O o *0 Mycobacterium smegmatis ATCC 10143 0,75 Eacherichia coli ATCC 10536 . 6,0. KLebsiella pneumoniae ATCC 10Ô31 12,0 ïroteus vulgaris DA 121 .6,0 Pseudomonas aeruginosa.ATCC 8689 6,0 Salmonella schottmueïleri DA 10 6,0 Tableau 1 (suite) 0,3 >16 >16 >1 1 6 2,0 2,0 5,0 6,0 6,0 12,0 6,0 '6,0 5,0 12,0 24,0 24,0 12,0 12,0 0,3 12,0 12,0 24,0 6,0 12,0 0,05 12,0 24,0 24,0 6,0 12,0 0,3 12,0 12*0 24,0 6,0 12,0 -O NO «sO nO Milieu g bouillon de boeuf aux levures (pH 8,0) Complexe = Mélange de constituants A, B, C^ et Cg« '* Souche résistant à la pénicilline ** Souche résistant à l^rythromycine. tv> O o o sO Tableau 2 ^ Propriété p-VHmicmea et physiques des fraotions de l'antibiotique V847 sO Fraction A Fraction B Fraction Fraction C2 Rotation optique £ -90° -92® 1 -104° -102° Point de fusion 255-259°C déc. 125-135°C déc.1 243-246°C déc. 146-150°C déc. PKa 9,1 ' 8, à 8,8' 8,6' Equivalent de neutralisation 442 490 488 492 Analyse élémentaire Trouvé Cale» Trouvé Cale. Trouvé Cale. Trouvé Cale. Carbone Hydrogène azote Oxygène (par différence) 60,23 60,25 9,28 9,19 3,30 3,1.9 27,19 27,36 58,90 58,95 .8,94 .9,03 2,88 2,99 29,18 29,03 60,23 59,98 8.93 8,81 2.94 2,92 27,90 28,30 60,54 60,35 8,60 8,89 2,87 2,87 27,99 27,89 Formule empirique G44H80N2°15 C46H82N2°16 °48H84ir2017 W2°17 Poids moléculaire 877,10 919,14 961,17 975,20 •j Monohydrate. tv» O O *o l o vO Tableau 3 Spectres infra-rouges des fractions de l'antibiotique W847 Fraction A Fraction B Fraction Fraction Cg longueur Intensité d'onde ( |A ) du pic Longueur d1 onde Intensité du pic longueur d'onde Intensité du pic longueur d'onde Intensité du pic 45* hO vO nO 2,82-2,90 M-S, brd. 3,35-3,50 Nujol 5,77 S 5,82 (Parasite dû à l'instrument) 5,88 M-S 6,82 Nujol 7,24 Nujol 7,36 s.b. 7i82 M-S, shp. 8,45 VS, brd. 8,92 VS 9,02 VS 9,12 VS 9p32 M-S 9p53 VS 9,63 VS 9,98 VS 10,27 S 11,02 M-S 11,17 M-S 2,87 2,97 3,35-3,50 5,72 5,83 6,82 7,25 8,05 8,45 8,59 8,94 9,30 9,62 9,91. 10,02 1.0,29 10,84 '1,08 1,20 M shd. Nujol S S Nujol Nujol S S, brd, S S S S M-S M-S M W-M W-M W-M 2,82 3,87 3,35-3,50 5,72 5,87 6,82 7,25 7,45 7,57 7,82 8,03 8,13 8,60 , 8,94 9,05 9,56 9,70 10,13 10,48 11,02 h M s ob • w Nujol S W-M Nujol Nujol M M M S VS S M-S S S S M-S M W-M V-M 2,83 3,33-3,48 5,70 5,80 5,88 6,80 7,23 8,00 8,53 8,93 9,08 9,27 9,65 10,00 10,38 10,97 1,15 1,52 1,92 1 W-M Nujol S (Parasite dû à l'instrument) shd. Nujol Nujol S S,brd. S shd. M-S S M-S, brd. M M M W W-M 09 K> O O "Ni sO 69 14299 9 2007901 Comme on le voit d'après le Tableau 1, l'antibiotique W847-A présente un large éventail d'activité antimicrobienne contre des microorganismes tant Gram-positifs que Grain-négatifs 0 Dans le groupe des microorganismes Gram-positifs, sont compris des 5 microorganismes pathogènes comprenant des espèces dès Genres Streptococcus. Staphylococcus et Diplococcus qui sont connus comme provoquant de nombreuses manifestations de maladies. Diverses espèces de Staphvlococcus et Streptococcus sont les organismes responsables de la mammite de la vache. Ces espèces sont facilement 10 maîtrisées et traitées au moyen de l'antibiotique W847-A après un régime d'administration relativement court. L'antibiotique W847-A est actif aussi contre des organismes Gram-négatifs comprenant des espèces des genres Bscherichia. Salmonella, Proteus et Pseudomonas. Ces organismes sont responsables de nombreux syndromes de maladies 15 graves comprenant des infections des voies urinaires et des diarrhées* Ces syndromes sont très courants chez les humains ainsi que chez des animaux domestiques comme les bestiaux, les chevaux, les moutons, les porcs, les chiens et les chats et ils peuvent être efficacement maîtrisés et traités au moyen de l'antibiotique 20 W847-A. L'antibiotique W847-A en suspension dans une solution aqueuse à 0,5 de carboxyméthylcellulose et dispersé par. ultrasons est actif par administration sous-cutanée chez les souris contre le S. aureus Gray avec une PDj-q (dose protectrice pour 50 $> 25 de la population d'expérimentation) de 20 mg/kg et contre le P, aeruginosa avec une PD^q de 161 mg/kg» La dose LD^q chez les souris par la voie sous-cutanée est de 7 000 mg/kg. L'antibiotique W847-A peut être utilisé aussi pour nettoyer et stériliser la verrerie de laboratoire, les instruments 30 chirurgicaux, etc... Il peut être utilisé aussi en combinaison avec des savons et des détergents pour nettoyer et assainir des zones utilisées pour la préparation d'aliments comme des cuisines, des salles à manger, etc... Bien que la présente.demande ne doive pas être limitée 35 par la théorie suivante de la chimie intervenant dans le processus de transformation de la présente invention, il semble qu'il se produit des réactions de saponification étonnamment sélectives. Plus précisément, l'antibiotique ¥847 semble contenir un noyau de 69 14299 10 200790t lactone et au moins 4 groupements hydroxyles estérifiables. Dans l'antibiotique W847-A, ces quatre groupements hydroxyles ne sont apparemment pas estérifiés. Les fractions antibiotiques W847-B, ¥847-C^ et W847-Cg semblent être les esters monoacétate, diacétate 5 et monoacétate-monopropionate de l'antibiotique W847-A» Dans les conditions d'hydrolyse sélective du procédé de la présente invention, les esters sont apparemment saponifiés pour donner des groupements hydroxyles libres sans qu'il se produise une ouverture du noyau de lactone ou une autre dégradation ou transposition quelcon-10 que de la macrostructure de l'antibiotique. Ceci est surprenant en ce que dans ces conditions on aurait pu s'attendre à une ouverture du noyau de lactone. Il se produit une décomposition notable et ainsi un rendement médiocre concernant le produit désiré si l'hydrolyse 15 est conduite dans des conditions de pH acide ou à un pH au-dessus de 12 environ. L'hydrolyse à un pH d'au moins 7, mais inférieur à 9 environ, est trop lente pour être pratique. Ce dernier point est mis en évidence par le. fait que le mélange de fermentation dans le procédé du brevet belge N° 715.638 a un pH compris entre ces 20 limites, et que pourtant après les quelques jours nécessaires pour la fermentation, seulement une quantité assez petite de V847-JL est présente (moins de 10$). Comme indiqué ci-dessus, l'hydrolyse directe du bouillon de fermentation du procédé du brevet belge N° 715.638 est préférée.. 25 Parmi d'autres avantages, cette méthode permet de séparer l'antibiotique ¥847-A du bouillon par extraction à l'aide d'un volume de chlorure de méthylène ou d'un solvant équivalent de l'ordre d'un cinquième du volume du bouillon. Au contraire, quand l'antibiotique Complexe ¥847 est d'abord isolé du bouillon, il faut un volume de 30 solvant à peu près double du volume du bouillon. Le bouillon peut être filtré avant ou après l'exécution de l'hydrolyse de la présente invention. En général, on ajoute avant la filtration un adjuvant de filtration comme la Celite ou le Supercel. Après l'hydrolyse directe du bouillon de fermentation selon le mode de mise en 35 oeuvre préféré décrit ci-dessus de la présente invention, le bouillon filtré est avantageusement traité pair extraction par un solvant organique polaire non miscible avec l'eau comme le chlorure de méthylène et l'extrait est concentré. 69 14299 n 2007901 Quand la réaction d'hydrolyse sélective n'est pas effectuée sur le bouillon entier, le système de solvants doit de préférence contenir un constituant organique polaire miscible avec l'eau afin d'augmenter la solubilité des constituants de 5 l'antibiotique ¥847 et d'augmenter ainsi la vitesse d'hydrolyse. Le méthanol représente un tel constituant commode. D'autres tels solvants organiques miscibles avec l'eau sont l'éthanol, l'isopro-panol, l'acétone et le diméthylacétamide. Evidemment, ce constituant polaire doit être un composé qui n'est pas lui-même saponi-10 fié dans les conditions de réaction® Après l'hydrolyse, le milieu d'hydrolyse est avantageusement concentré et/ou traité par extraction, et le ¥847-A est ensuite isolé à partir des concentrés par cristallisation. Dans l'un ou l'autre dea modes de mise en oeuvre décrits 15 ci-dessus, la cristallisation peut être favorisée par l'addition d'un solvant dans lequel l'antibiotique ¥847-A a une solubilité limitée comme par exemple l'acétone.• Des matières utilisables pour rendre basique le milieu d'hydrolyse comprennent l'hydroxyde d'ammonium, l'hydroxyde de 20 sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, le carbonate de sodium, le bicarbonate de sodium et les composés du même genre. Ici encore, la quantité ajoutée est de préférence telle qu'elle donne un pH compris entre 9 environ et 12 environ. On peut augmenter la vitesse d'hydrolyse en opérant à 25 des températures élevées. L'utilisation de telles températures élevées n'est pas pratique, toutefois, quand on utilise l'hydroxyde d'ammonium pour rendre basique le milieu. Le caractère complet désiré de l'hydrolyse peut être contrôlé de diverses façons. Une technique commode utilise la 30 chromatographie sur couche mince et consiste à séparer une portion de 10 cm du mélange de réaction et, si nécessaire, à ajouter assez d'acide sulfurique pour abaisser le pH à un niveau compris entre 9,0 et 9,5 environ. La portion est ensuite traitée par extraction par 15 cnr d'acétate d'éthyle et l'extrait est 35 concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est ensuite dissous dans 0,2 car d'éthanol à 95 # et on répartit en gouttes 20 ^.1 (20 À ) de cette solution sur des plaques de gel de silice G-F en couches minces (Analtech, Inc) en utilisant un système de 69 14299 12 2007901 solvants consistant en 40 # de méthanol et 60 # de chloroforme. Une quantité égale d'un échantillon authentique d'antibiotique W847-A est répartie en gouttes d'une manière similaire» Après 15 à 30 minutes, les plaques sont soumises à une pulvérisation d'un 5 mélange acide sulfurique concentré-méthanol (1:1 en volumes) et développées par chauffage à 105°C pendant plusieurs minutes. On compare la position et la couleur des deux taches. L'exemple 1 illustre la préparation de l'antibiotique Complexe W847 par fermentation et les exemples 2 et 3 illustrent 10 des méthodes pour extraire le Complexe du bouillon de fermentation. Ces procédés sont décrits dans le brevet belge 11° 715.638 précité. Les exemples suivants illustrent le procédé de transformation de l'invention appliqué au bouillon de fermentation du brevet belge N° 715.638 (exemple 4), au Complexe ¥847 isolé 15 (exemple 5) et au Complexe ¥847-C isolé (exemple 6). Sauf spécification contraire, toutes les parties sont en poids. Exemple 1 - Production de l'antibiotique Complexe ¥847 - •x On ajoute 0,5 car d'une culture lyophilisée de Micromonospora sp« ¥847 dans un ballon de 2 litres contenant *5 20 500 car du milieu suivant qui a été réglé au pi 7,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium dilué avant stérilisation : Extrait de boeuf Bacto (Difco) 3,0 g Tryptose Bacto (Difco) 5»0 g Dextrose 1,0 g 25 Amidon (pomme de terre) 24»0 g Extrait de levures Bacto (Difco) 5,0 g Carbonate de calcium 2,0 g Eau ordinaire 1000,0 cm^ On met en incubation le ballon et son contenu pendant 30 72 heures à 28°C sur un appareil rotatif à secousses £~280 tours par minute ; course 5 cm__7 • On introduit dans un fermenteur 10 litres du milieu de production stérile suivant réglé à un pH de 7,15 à 7,25 avant la stérilisation : 35 Trypticase 170,0 g Chlorure de sodium 50,0 g Phosphate dipotassique 25,0 g Dextrose 25»0 g 69 14299 13 2007901 Bouillon Czapek-Dox 350,0 g Antimousse G.E.-60 (General Electric Company) suivant le besoin Eau ordinaire complément à 10,0 litres * 5 On inocule à ce fermenteur 500 cm de la culture de germes préparée ci-dessus, vieille de 72 heures. On porte la température du milieu de fermentation à 31°C et on l'agite à 500 tours par minute tandis qu'on introduit un courant d'air dans le milieu à raison de 0,5 litre d'air par litre de bouillon 10 et par minute. On porte la vitesse d'agitation à 600 tours par minute après 24 heures et à 700 tours par minute après 48 heures. On arrête la feimentation après 69 heures. À la fin de cette période, la puissance de l'antibiotique produit atteint un maximum qui reste à peu près constant. 15 Pendant toute la feimentation, le pH du mélange de ferpentation reste essentiellement dans l'intervalle de 7,2 à 8,2. Le volume des cellules tassées atteint une valeur constante de 3,5 à 4,5 canr l'ensemble du bouillon donne un diamètre de zone de 15 à 25 mm quand on l'essaie sur disque contre le S. aureus ou le P„ aerugi-20 nosa. Exemple 2 - Extraction de l'antibiotique Complexe ¥847 (technique chromâtographique) On règle 60 litres du bouillon entier préparé selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1 à un pE de 9,5 à l'aide 25 d'hydroiyde de sodium aqueux dilué» On effectue une extraction par 2 volumes d'acétate d'éthyle pour chaque volume de bouillon. On sépare la phase de solvant et le concentré sous vide pour obtenir un résidu huileux (environ 30,0 g)« Ce résidu huileux à une dilution de 1/20 donne une zone d'inhibition d'un diamètre de 20 à 30 30 mm environ contre le S. aureus et d'environ 15 à. 25 mm contre le P. aeruginosa. On purifie le résidu huileux par chromatographie sur colonne selon les techniques suivantes : On prépare une colonne en utilisant 1000 g de Sephadex 1H20 (Pharmacia Fine Chemical, Inc.) en suspension dans l'éthanol 35 aqueux à 95 5^. On transfère le résidu huileux à la colonne et on effectue l'élution avec de l'éthanol à 95 $> à. raison de 200 mg 3 par heure. On recueille des fractions de 50 cm . On combine les fractions selon leur activité antibactérienne (déterminée par des 69 14299 H 2007901 essais sur disqu.es de gélose contre le S. aureus ATCC 6538P). On concentre à sec les fractions ayant le maximum d'activité. On dissout le résidu solide dans une petite quantité d'acétone et on verse la solution dans un excès volumétrique d'éther de pétrole 5 (intervalle d'ébullition : 30-60°C). On transfère le mélange dans un bain carboglace-acétone (environ -50°C) et on l'abandonne à lui-même pendant 20 minutes. On laisse revenir le mélange à la température ambiante et on sépare la liqueur-mère du résidu huileux par décantation» On concentre à sec la liqueur-mère pour 10 obtenir l'antibiotique Complexe ¥847 purifié. Exemple 5 - Extraction de l'antibiotique Complexe ¥847 (tenhniq-qe d'extraction à l'acide) On règle 37 litres du bouillon obtenu comme décrit à l'exemple 1 au pH 9,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium aqueux à 50 15 On effectue une extraction par 2 volumes d'acétate d'éthyle pour chaque volume de bouillon et on évapore l'extrait à un volume d© 3 3 2150 cm » Une portion de 500 cm du concentré à l'acétate d'éthyle est traitée par extraction par deux portions de 250 cm d'acide chlorhydrique à 0,5 5^ (0,14N) ou d'acide sulfurique 0,1 IT« Les 20 extraits acides combinés sont rendus légèrement alcalins par l'addition d'hydroxyde de sodium aqueux à 5 # (pH 8,5 à 9,0 environ) et on traite deux fois par extraction par des portions de 3 250 cm d'acétate d'éthyle. On combine les extraits à l'acétate d'éthyle et on les concentre à sec sous pression réduite. 25 Exemple 4 - Production de l'antibiotique ¥847-1. par hydrolyse directe du bottillon de fermentation On ajoute de l'hydroxyde d'ammonium concentré au bouillm de fermentation total décrit à l'exemple 1 de façon à obtenir ua mélange 1N en ammoniac, pH 10,8 environ (71,3 cm de solution 30 aqueuse concentrée d'ammoniac par litre de bouillon). Le mélange est abandonné à lui-même à la température ambiante pendant 3 à. 4 jours. On ajoute du Supercel au bouillon et on filtre le mélangée On soumet le bouillon filtré à une extraction par un cinquième de son volume de chlorure de méthylène. L'extrait au chlorure de 35 méthylène est lavé en retour une fois à l'eau. On concentre à un petit volume la solution au chlorure de méthylène, on ajoute de l'acétone et on cristallise. On recueille le ¥847-A cristallin par filtration et on le lave à 1!acétone glacée. On combine les liquidas 69 14299 15 2007901 de lavage avec la liqueur-mère et on concentre pour obtenir des récoltes supplémentaires. On sèche le produit pendant toute une nuit à 50°C dans une étuve à vide, point de fusion 250°C environ (décomposition). 5 Exemple 5 - Préparation de W847-A par hydrolyse du Complexe ¥847 -On dissout 1 partie de Complexe ¥847 (obtenu comme décrit à l'exemple 3) dans 7 parties de méthanol et on ajoute 3 parties d'eau contenant 0,67 partie d'hydroxyde d'ammonium concentré, pour obtenir une solution aqueuse à 70 fo de méthanol qui 10 est 1N en ammoniac. Cette solution est abandonnée à elle-même à la température ambiante pendant 14 jours. On ajoute 15 $> de Darco (par rapport au poids de matière de départ), on agite à la température ambiante pendant 30 minutes, on filtre et on concentre à environ 1/3 du volume sous pression réduite. On traite deux fois 15 par extraction avec des demi-volumes de chlorure de méthylène. On concentre à un petit volume les extraits au chlorure de méthylène combinés, on ajoute de l'acétone et on cristallise. On recueille le produit cristallin par filtration et on le lave à l'acétone glacée. On combine les liqueurs de lavage avec la liqueur-mère et 20 on concentre pour obtenir une deuxième récolte. On sèche le produit pendant toute une nuit à 50°C dans une étuve à vide, point de fusion 250°C environ (décomposition). Exemple 6 - Préparation de ¥847-A par hydrolyse du Complexe ¥847-C A. Préparation du_Complexe ¥847^C_-25 On dissout 542 g de Complexe ¥847 (obtenu comme décrit dans l'exemple 3) dans 5»4 litres d'acétone et on traite la solution résultante par 81 g de carbone décolorant pendant 30 minutes environ à la température ambiante environ. On élimine le carbone décolorant par filtration et on concentre le filtrat sous vide à 30 2,0 litres environ. On prépare une bouillie d'environ 80 litres de glace et d'eau et, en agitant énergiquement, on ajoute la solution acétonique. On permet à la température de la suspension résultante de monter à 25°C environ en agitant et on recueille le produit par filtration. On lave les matières solides à l'aide 35 d'une petite quantité d'eau et on les sèche à 50°C environ sous vide pour obtenir environ 212 g d'antibiotique Complexe W847-C. On peut obtenir du produit supplémentaire (85 g environ) par concentration de la liqueur-mère. 69 14299 16 2007901 B. Hydrolyse de_la Fraction_¥847-Ç - A une solution de 250 g de cette fraction W847-C dans « 1900 cnr de méthanol, on ajoute 25 g de Darco et on agite le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes, puis on le ■5 5 filtre. On ajoute au filtrat 166,5 cm de solution aqueuse concentrée d'ammoniac (15N) et on porte le volume total à 2500 as? à l'aide de méthanol» La solution, qui est alors 1N en ammoniac, est maintenue à la température ambiante pendant 14 jours, puis on la traite par 25 g de Darco comme ci-dessus. On concentre la solu-10 tion filtrée sous pression réduite et on ajoute de l'acétone pour obtenir un produit cristalline On chauffe l'acétone au bain-marie bouillant pendant un court laps de temps pour permettre une dissolution complète des impuretés et une cristallisation optimale du produit désiré, puis on refroidit et on filtre le produit» La 15 concentration de la liqueur-mère donne des récoltes supplémentaires. On lave à l'acétone froide le produit ¥847-A cristallin et on le sèche à 50°C dans une étuve à vide» La production totale d'antibiotique ¥847-A est de 149,6 g (60 # en poids), point de fusion 250°0 environ (décomposi-20 tion). Le W847-A peut être recristallisé à partir d'acétone pour donner une matière pure pour analyse, point de fusion 255-259°C (décomposition); /~œ_7D = -90° (éthanol); masse moléculaire trouvée t 868 (dans le benzène)} titrage : équivalent de neutralisation = 435» pK = 9»0; analyse : trouvé : C 60,23 H 9,28 U 3,30 3* 25 (moyenne de deux déterminations). Comme indiqué ci-dessus, l'antibiotique ¥847-A peut lui-même être utilisé directement. Il est envisagé aussi, toutefois, qu'on peut former des dérivés du ¥847-A ainsi produit par estérification, formation de sel, etc.., pour optimaliser les 30 propriétés physiques et/ou pharmacologiques désirées. Des exemples de dérivés fonctionnels utilisables sont donnés dans le brevet belge N° 715»638» De nombreuses autres variantes dans l'esprit de l'invention seront évidentes pour l'homme de l'art» 69 14299 17 2007901 BEVEHDICATIONS 1 - Un procédé pour la préparation d'un antibiotique appelé ¥847-A et de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, qui comprend l'hydrolyse sélective d'un substrat 5 contenant au moins l'un des antibiotiques appelés ¥847—B, ¥847-0^ et ¥847-Cg de façon à transformer ces derniers en ¥847-A, et l'isolement du ¥847-A ou d'une fraction enrichie en ¥847-A sous la forme libre ou sous la forme d'un dérivé fonctionnel» 2 - Un procédé selon la revendication 1, dans lequel 10 l'hydrolyse est effectuée dans des conditions non-acides. 3 - Un procédé selon la revendication 2, dans lequel l'hydrolyse est conduite à tin pH compris entre 9 environ et 12 environ* 4 - Un procédé selon la revendication 3* dans lequel le 15 pH est réglé entre 9 environ et 12 environ par l'addition, avant l'hydrolyse, de composés inorganiques basiques, de préférence l'ammoniac, l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, le carbonate de sodium ou le bicarbonate de sodium. 20 5 - Un procédé selon la revendication 4, dans lequel le milieu d'hydrolyse est IN en ammoniac. 6 - Un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5» dans lequel l'hydrolyse est appliquée à un bouillon de fermentation contenant plus d'une fraction du Complexe ¥847, de 25 préférence après filtration de ce bouillon. 7 - Un procédé selon la revendication 6, dans lequel Tin adjuvant de filtration a été ajouté avant la filtration du bouillon de feimentation. 8 - Un procédé selon l'une quelconque des revendications 30 1 à 5» dans lequel l'hydrolyse est appliquée à une substance ou un mélange de substances isolées à partir d'un bouillon de fermentation contenant le Complexe ¥847. 9 - Un procédé selon la revendication 8, dans lequel l'hydrolyse est effectuée à température élevée, dans un milieu qui 35 ne contient pas d'ammoniac. 10 - Un procédé selon la revendication 8 ou 9» dans lequel la solution contient un solvant organique polaire inerte, miscible avec l'eau, de préférence le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone ou le diméthylacétamide. 69 14299 18 2007901 t1 - Un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la matière de départ est soumise à une hydrolyse jusqu'à ce que cette hydrolyse soit à peu près complète. 12 - Un procédé selon l'une quelconque des revendica-5 tions 1 à 11, comprenant l'extraction du milieu d'hydrolyse après l'hydrolyse par un solvant organique, de préférence le chlorure de méthylène, la concentration de l'extrait et la cristallisation de 1'antibiotique W847-A à partir de l'extrait concentré» 13 - Un procédé selon la revendication 12, dans lequel la 10 cristallisation est favorisée par l'addition d'un solvant dans lequel le W847-A est faiblement soluble, de préférence l'acétone. 14 - L'antibiotique ¥847-A, sous la forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, obtenu par le procédé de l'une quelconque des revendications 15 1 à 13.