Brevet FR2000245A1 — publié le 19690905

Il est extrêmement important que les endohydrolases capables de couper des polysaccharides, puissent être déterminées d'une façon simple et sûre. Un exemple important dans ce domaine réside dans la détermination de l'oc-amylase (enzyme) . qui hy-5 drolyse les amidons et les sucres. Les déterminations de l'oc-amylase sont effectuées dans de nombreux cas, à savoir : dans • le domaine médicinal pour les dosages de l'urine et du sang à des fins de diagnostics. Les procédés habituels sont jusqu'à présent accompagnés de 10 désavantages sérieux et ne donnent pas entièrement satisfaction. La détermination de l'a-amylase est également importante dais Industrie. D'une façon analogue, il est également important depcuvcâr déterminer simplement et de façon sûre d'autres endohydrolases qui hydrolysent d'autres polysaccharides tels que le dextrane. 15 La présente invention concerne un procédé simple et sûr pour la détermination d'endohydrolases qui coupent des polysaccharides dans des échantillons aqueux et des réactifs pour la mise en oeuvre des déterminations. Par "polysaccharides", on entend tant des polysaccharides 20 naturels que des polysaccharides synthétiques qui présentent les caractéristiques structurelles de polysaccharides naturels, ces caractéristiques les rendant susceptibles d'une dégradation par 1'endohydrolase en question. Des exemples de ces polysaccharides sont constitués, par exemple, par les amidons tels que l'amylose 25 ou l'amylopectine ou leurs dextrines c'est-à-dire le dextrane, le lévulose, la mannite, la galactane ou leurs dérivés, etc. Dans le procédé d'hydrolyse, 1'endohydrolase rompt les liaisons glucosidiques dans le polysaccharide ou ses dérivés susceptibles d'une dégradation. 30 Le procédé de détermination est principalement caractérisé en ce que l'échantillon est mis en contact avec un réactif insoluble dans l'eau mais hydrophile, gonflable, à réseau trimen-sionnel hydrolysable du point de vue enzymatique des molécules du polysaccharide ou de ses dérivés hydrolysables enzymatique-35 ment, ces molécules étant réticulées par des ponts avec des liaisons de nature covalente, dans le réseau il existe également des groupements d'indication ou des atomes liés au moyen de liaisons du type à covalence, une réaction ayant lieu entre l'enzyme et le réactif pour libérer des fragments hydrosolubles 69 00458 2 , 2000245 du réactif contenant les groupes ou atomes susceptibles de fournir une indications, tandis qu'ensuite, après que l'enzyme a réagi sur le réactif pendant une période de temps déterminée, la substance du réactif non dissoute est séparée du liquide avec 5 les fragments hydrosolubles du réactif qui y sont dissous, après quoi les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication dans le liquide ou dans la matière du réactif non dissoute sont déterminés comme une mesure de l'activité enzyma-tique. 10- Un réactif pour la mise en oeuvre de la détermination se lon l'invention est principalement caractérisé en ce qu'il est insoluble dans l'eau mais hydrophile, gonflable, qu'il comporte un réseau tridimensionnel hydrolysable du point de vue enzyma-tique des molécules du polysaccharide ou de ses dérivés hydro-15 lysables enzymatiquement, ees molécules étant réticulées par des ponts présentant des liaisons de type covalent, un tel réseau comportant également des groupements ou atomes susceptibles de fournir une indication, qui sont reliés par des liaisons à nature covalente. 20 On entend, par "groupements ou atomes susceptibles de fournir une indication", des groupements produisant des couleurs, des groupements fluorescents, des isotopes radioactifs ou des groupements munis d'isotopes radioactifs. Toutefois, de préférence, on choisit, pour des raisons de commodité, des groupe-2 5 ments produisant des couleurs car il est relativement simple d'effectuer des mesures de colorimétrie même dans les laboratoires habituels. Néanmoins, lorsqu'un degré de sensibilité particulièrement élevé est nécessaire, on peut avoir recours à des groupements fluorescents, en particulier des isotopes radio-30 actifs ou des groupements munis d'isotopes radiactifs. le réactif utilisé pour effectuer la détermination peut être préparé suivant de nombreuses façons différentes. Par exemple, il est possible avec des agents de formation de pont bi-fonctionnels de réticuler des molécules du polysaccharide ou de 35 ses dérivés qui peuvent être hydrolysées par 1'endohydrolase en question au moyen de liaisons à caractère covalent d'un réseau tridimensionnel, après quoi les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication sont, reliés au réseau par des liaisons à nature covalente. Il est également possible de 69 00458 3 2000245 relier tout d'abord les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication par des liaisons de nature covalente avec les molécules du polysaccharide ou ses dérivés hydrolysa-bles du point de vue enzymatique, et d'effectuer ensuite la ré-5 ticulation avec des agents de formation de pont bifonotionnels. Il est également possible d'effectuer une réticulation et une ' introduction des groupements susceptibles de fournir une indication dans la même opération, par exemple en utilisant des agents de formation de pont bifonotionnels qui contiennent aussi 10 les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication, par exemple des substances à réactions bifonctionnelles produisant des couleurs. Il existe de nombreux types de substances bifonctionnelles qui peuvent jouer le rôle d'agents de formation de pont bifonc-15 tionnels. Des exemples de ces agents de formation de pont bifonotionnels comprennent les diépoxydes, les halohydrines correspondantes, les diisocyanates (par exemple 1'hezaméthylène-diisocyanate) et les dithioisocyanates. Ces agents de formation de pont peuvent, par exemple, réagir avec des radicaux hydroxyle 20 ou amino du polysaccharide ou de ses dérivés qui peuvent être hydrolyses par 1'endohydrolase, ses molécules étant réticulées ensemble par les ponts présentant des liaisons de nature covalente. Des exemples d'époxydes et d'halohydrines bifonotionnels 25 comprennent la dichlorohydrine, 1'épichlorohydrine, 1'épibromo-hydrine, l'éther 1,2-éthanedioldiglycidique, l'éther 1,4-butanedioldiglycidique, l'éther de glycérol-diglycidique, l'éther bis Z~2,3-époxypropylique_7 et le 1,2-3,4-diépoxybutane. Ces composés sont capables de réagir, par exemple, avec des radicaux 30 hydroxyle et amino en présence d'une substance alcaline. Par exemple, lorsque la réaction a lieu avec les radicaux hydroxyle dans le polysaccharide, le pont est du type - 0 - A - 0 - , formule dans laquelle A est un radical hydroxyle contenant un pont d'alcoylène qui peut être facultativement interrompu par un 35 ou plusieurs atomes d'oxygène. Le polymère réticulé est insoluble mais gonflable dans l'eau. Des exemples de radicaux A dans le pont mentionné ci-dessus comprennent s -GHg .CH(OH) .CHg- ou -oh2.ch(oh).oi^.o.oh2.ch(oh).ch2- ou ô9 00458 2000245 -GHg .CH(OH).CH^ • 0.CEk, .CH^ .O.CI^ .CH(OH) .CHg- ou -CI^ .CÏÏ(OH) .0^ .O.CCHg^.O.CI^ .OHCOHJ.C^- ou -CHg .OH(OH) .Cft, .0.Cfr) .CHg • 0.OE^ .CHg .O.CI^ .CH(OH) .CHg- ou -CE^ .CH(OH) . CE^ .O.OHg .CH(OH) .CE2 .O.Ci^ .GH(OH) .CHg- ou 5 -CHg.CHCOHÎ.CHCOH).^- ou -CH^ .GH(OH) .CHg .O.CBg .CH(OH) .CI^ .O.CGE^ )2 ,0.CH2 .OH(OH).CH2.O.CH2. .Cïï(OH)-GHg- ou -CHg .CH(OH)..0.CËU, .CH(OH) .CI^ .0. (CI^ ^.O.CI^ .CH(OH) .C^. O-CE^-.ch(oh).ch2-. 10 Comme il ressort de ce qui précède, on peut choisir de nom breux types de ponts différents entre les molécules du polysaccharide dans le réactif. Dans une forme de réalisation appropriée, les molécules du polysaccharide sont réticulées par des ponts aliphatiques ayant des liaisons de nature covalente, le 15 nombre d'atomes de carbone dans ces ponts allant de 2 à 20 (par exemple de 3 à 20), de préférence de 3 à 15, et plus particulièrement de 3 à 10. Il convient notamment de choisir des ponts qui contiennent des radicaux hydroxyle présentant des groupements alcoylènes ayant de 3 à 20 atomes de carbone, en 20 particulier de 3 à 15 atomes de carbone, tel que de 3 à 10 atomes de carbone, ces groupements étant interrompus à titre facultatif par un ou plusieurs atomes d'oxygène. Ces groupements hydroxyle contenant des ponts rendent le réseau plus hydrophile et gonflable dans l'eau et améliorent ses propriétés. 25 Des groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication peuvent être introduits de nombreuses façons différentes. Par exemple, lorsque l'on désire introduire des groupements colorés, il est relativement simple de les faire réagir avec des substances réactionnelles produisant des couleurs ea-30 pables d'avoir une action par exemple avec des radicaux hydroxyle ou amino dans le polysaccharide ou les dérivés de celui-ci, par exemple, on choisit des substances produisant des couleurs réagissant avec de la laine de coton ou de la laine, ces substances étant fixées au polysaccharide ou à ses dérivés par des 35 liaisons de nature covalente. Suivant la catégorie d'utilisation, les couleurs qui conviennent le mieux sont, par exemple, le bleu ou le rouge. Des exemples de substances réactives produisant une coloration sont représentés par î l'écarlate "Gibacron" 2 G (écarlate "îrocion" H3&S), le bleu "Cibacron" 3ff (bleu 69 00458 5 2000245 "Procion" HBS). Les formules de base de ces composés sont illustrées dans un article de J. Panchartek et autres dans "Coll. Czech. Chem. Commun. Vol. 25 (1960), pages 2785 à 2799". L'introduction de groupements fluorescents peut être effectuée, par 5 exemple, avec des dérivés fluorescents tels que l'isothiocyanate de fluorescéine. Il existe également de nombreuses manières d'i&-troduction de groupements radioactifs ou de groupements contenant des isotopes radioactifs. ïïn exemple réside dans l'introduction d'un groupement contenant un isotope radioactif de l'io- 12 5 10 de, par exemple I .On peut aussi introduire en premier un groupement ne comportant pas d'isotopes puis ensuite un isotope radioactif dans le groupement. Ceci peut, par exemple, être réalisé en introduisant tout d'abord tan radical allyle» tel que du bromure d'allyle et en ajoutant par la suite un iodoisotope ra-15 dioactif à la double liaison. Le degré de substitution par rapport aux groupements ou aux atomes susceptibles de fournir une indication et aux ponts réticulés des molécules du polysaccharide est choisi pour que la quantité des groupements et atomes présents, susceptible de four-20 nir une indication soit suffisante pour le procédé de détermination et pour que le réseau à trois dimensions soit maintenu ensemble d'une façon suffisante. Toutefois, le degré de substitution n'est pas choisi à un niveau qui empêche les molécules de polysaccharide dans le réseau d'être interrompues par l'endohy-25 drolase en question à ce stade. ïïn degré convenable de substitution par rapport aux groupements susceptibles de fournir une indication et aux ponts réticulés pour le polysaccharide approprié et les endohydrolases en question, peut être établi par l'expérience par des spécialistes d'une façon relativement aisée. 30 Si l'on désire que lê réactif soit sous la forme de parti cules, le produit gélifié obtenu dans la synthèse décrite ci-dessus du réactif peut être broyé à la grosseur de grains appropriée. La synthèse du réactif affectant la forme d'un gel peut aussi être réalisée par un procédé de .polymérisation en perles, 35 par émulsification du mélange réactionnel dans un liquide inerte avec lequel le milieu réactionnel n'est pas miscible, de petites particules sphériques étant obtenues directement. La matière granulaire obtenue peut être criblée d'une manière appropriée et on peut, récupérer les fractions présentant une grosseur des 69 00458 6 2000245 grains qui convient. Une condition essentielle de l'invention réside en ce que les molécules du polysaccharide avec les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication reliés par des liai-5 sons covalentes (par exemple des groupements produisant une couleur) sont fixées ensemble par des ponts ayant des liaisons du type à covalence. De cette façon, il est possible aux groupements ou atomes susceptibles de fournir une indication d'être dissous autrement que par hydrolyse des liaisons des molécules 10 du polysaccharide dans le réseau par les endohydrolases. Il est également important que, bien que le réactif soit insoluble dans l'eau, il puisse être facilement attaqué par 1*endohydrolase en question, cette nécessité est accomplie car le réactif est constitué par un réseau lâche à trois dimensions, hydrophile, gon-15 fable dans l'eau, relié avec des ponts ayant des liaisons de nature covalente. Les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication tels que les groupements produisant une couleur que l'on peut facilement mesurer, permettent d'effectuer des déterminations comparatives faciles. De plus, la combinaison 20 des caractéristiques décrites ci-dessus permet un procédé de détermination particulièrement sensible et sûr qui peut être exécuté simplement et qui convient particulièrement bien pour les travaux de contrôle. Lorsque 1'endohydrolase réagit sur le réactif, les enehaî-25 nements du polysaccharide sont interrompus et les fragments hy-drosolubles du réactif avec les groupements ou atomes susceptibles de fournir une indication attachée sont libérés. Ces fragments sont dissous et peuvent facilement être isolés du réactif non dissous, par exemple par de simples procédés de filtration 30 ou de centrifugation. La détermination est convenablement effectué e par la mise en contact de l'échantillon aqueux contenant 1'endohydrolase en question avec une quantité appropriée du réactif et en permettant à cet échantillon de réagir sur le réactif lors d'une agitation pendant une période de temps prédéterminée 35 et à une température qui convient pour l'enzyme en question. Naturellement, l'hydrolyse par l'enzyme est accomplie à un pH approprié pour l'enzyme en question et dans un milieu de sels "convenables. Lorsque l'enzyme a réagi sur le réactif pendant la période de temps déterminée, le procédé d'hydrolyse de l'enzyme 69 00458 7 2000245 ultérieur est arrêté d'une manière classique dans ce domaine. Par exemple, il est possible d'empêcher une autre hydrolyse du réactif en chauffant ou en refroidissant le système, en changeant le pH ou en ajoutant des inhibiteurs appropriés. On peut 5 également séparer simplement le réactif de la solution d'échantillon si le temps nécessaire est court par rapport à la durée de la réaction. Après la séparation du réactif de la solution de l'échantillon, les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication dans le liquide ou dans le réactif non 10 dissous permettent une mesure de l'activité de l'enzyme. Le plus simple, sous ce rapport, est que les groupements, susceptibles de fournir une indication sont des groupements produisant une couleur et que la couleur est déterminée dans le liquide comme une mesure de l'activité de l'enzyme. 15 Le réactif affecte, de préférence la forme de particules, de petites particules étant choisies pour qu'on obtienne une surface de contact la plus grande possible, bien que les particules ne doivent pas être trop petites pour rendre la séparation de la substance non dissoute et du liquide difficile. 20 Par une suspension des particules dans un liquide approprié sous agitation, il est possible de remplir des tubes à essais au même volume de la suspension obtenue, de telle sorte que le réactif est introduit dans chaque tube à réactif suivant des quantités analogues au degré de précision nécessaire. Les erreurs pro-2 5 voquées par les variations de la quantité de substance introduite dans les tubes à essai peuvent également être réduites en utilisant une quantité en excès du substrat de l'enzyme. Le réactif, par exemple sous la forme de particules, peut être mélangé avec une matière inerte telle qu'une substance sous 30 la forme d'un support. On peut ainsi mélanger de la pulpe de papier pour former un papier en mélange avec le réactif, ce papier pouvant être découpé en petits morceaux qui conviennent pour l'analyse. Le procédé de l'invention a une importants particulièrement 35 grande pour la détermination d'endohydrolases qui rompent les amidons et les sucres, par exemple oïl peut effectuer de nombreuses déterminations d'oc-amylase comme essais de contrôle à des fins médicinales et dans l'industrie. Les procédés de contrôle existants jusqu'à présent pour déterminer l'a-amylase ne peuvent 69 00458 2000245 être considérés comme étant totalement satisfaisants et, par conséquent, le procédé de l'invention satisfait un besoin particulièrement prononcé. Le procédé peut également être utilisé pour la détermination d'autres endohydrolases tels que celles 5 qui rompent le dextrane. La quantité de groupements ou d'atomes susceptibles de fournir une indication dans les fragments hydrosolubles qui sont libérés et dissous dépend de l'activité de l'enzyme dans l'échantillon et de la durée pendant laquelle l'enzyme réagit sur le 10 réactif, de même, qu'avec d'autres facteurs importants concernant les procédés enzymatiques tels que la température, le pH et, dans certains cas, en particulier dans le cas d'cc-amylases, la teneur en sel de l'échantillon. Conformément à une forme de réalisation préférée de l'invention, la détermination est effectuée 15 à une température et à un pH convenables pour l'enzyme en ques-tions on applique également un milieu salin approprié- On peut déterminer un temps réactionnel qui convient pour que la quantité des groupements ou atomes susceptibles de1 fournir une indication dans la solution ne soit seulement qu'une fonction 20 de l'activité de l'enzyme dans l'échantillon. Naturellement, il est possible de mesurer la quantité de groupements ou d'atomes susceptibles de fournir une indication dans la solution à des. intervalles de temps différents, par exemple, lorsqu'une certaine quantité de substance a été obtenue dans la solution. Au besoin, 2 5 on peut utiliser des tableaux et/ou des graphiques comparatifs pour transformer les valeurs obtenues en d'autres unités pour l'activité de l'enzyme en question. L'invention est représentée, à titre d'exemples non limitatifs, par les exemples suivants. 30 Exemple 1 On dissout dans 200 ml d'eau 50 g d'amidon (soluble, pour analyse). On ajoute à 2 0°C, 10 ml d'une solution de soude 10 M, puis lentement goutte à goutte tout en agitant 4 ml d'é-ther 1,4-butanediol-diglycidique. Le mélange réactionnel est 35 ensuite laissé au repos sans agitation, pendant deux jours à 2 0°C. Le gel obtenu est broyé en petites particules et lavé à 1'eau. On dissout dans 200 ml d'eau, 10 g de bleu "Cibaeron 3 Gr-A" et les particules de gel sont mises en suspension dans 69 00458 9 2000245 line solution colorante. 15 g de chlorure de sodium sont également ajoutés. On introduit à 20°G, tout en agitant, après deux heures 10 ml d'une solution de soude 10 M. Le mélange réactionnel est ensuite laissé au repos sans agitation pendant 20 5 heures à 20°C. Les particules sont alors lavées à fond avec de l'eau. On les sèche dans une opération subséquente et on les broyé dans un broyeur à billes pour obtenir une grosseur moyenne des particules d'environ 40 microns. Les particules sont insolubles mais gonflables dans l'eau. 10 Exemple 2 On réalise le même mode opératoire qu'à l'exemple 1 sauf que l'on utilise 3 ml d'éther 1,4-butanediol-diglycidique. Exemple 3 On emploie le même mode opératoire qu'à l'exemple 1, mais 15 avec 5 ml d'éther 1,4-butanediol-diglycidique. Exemple 4 On procède de la même façon qu'à l'exemple 1 mais avec 8 g de bleu "Cibaoron 3 G-A". Exemple 5 20 On conduit le même mode opératoire que celui de l'exemple 1 mais avec 10 g d1écarlate "Cibracron 2 G" au lieu du bleu "Cibacron 3 G-A". Exemple 6 On dissout dans 200 ml d'eau, 50 g d'amidon (soluble, 25 pour analyse). On ajoute à 20°C, 10 g de bleu "Cibacron" 3 G-A et 15 g de chlorure de sodium. Lorsque la matière colorante est dissoute, 10 ml de soude normale sont agités dans le mélange. Le milieu réactionnel est ensuite laissé au repos pendant 20 heures à 20°G, après quoi on ajoute goutte à goutte 30 tout en agitant 5 ml d'éther 1,4-butanediol-diglycidique. Le gel obtenu est ensuite broyé et lavé à fond avec de l'eau. Les particules sont séchées et broyées encore dans un broyeur à billes pour obtenir une grosseur moyenne des particules de 40 microns. 35 Exemple 7 On adopte le même procédé qu'à l'exemple 6 mais en utilisant 8g' de bleu "Cibacron 3 G-A" et 4 ml d'éther 1,4-butanediol-diglycidique. 69 00456 10 2000245 Exemple 8 On met en oeuvre le même procédé qu'à l'exemple 6 mais avec 10 g d'écarlate "Cibacron 2 G-" au. lieu du bleu "Cibacron 5 G—A". 5 Exemple 9 On réalise le même mode opératoire qu'à l'exemple 1 mais en utilisant cette fois du dextrane de poids moléculaire égal à 460.000 au lieu de l'amidon. Exemple 10 10 On utilise le même mode opératoire qu'à l'exemple 6 sauf que cette fois, l'amidon est remplacé par du dextrane de poids moléculaire égal à 460.000. Exemple 11 Les réactifs des exemples 1 à 8 sont éprouvés avec l'a-15 amylase du pancréas, du plasma sanguin, de l'urine, de la salive, du malt et du Bacillus subtilis. Dans ce cas, le dégagement de la couleur peut être mesuré convenablement à 620 manomètres pour le bleu et 510 manomètres pour le rouge. Un tampon approprié qui convient dans les déterminations de l'invention est un 2 0 tampon à base de phosphate de sodium 0,02 M ayant un pH égal à 7,0, celui-ci peut également contenir du chlorure de sodium (par'exemple, 0,01 M). On peut également ajouter au tampon 0,02 °fo de îîaHj pour empêcher la croissance de micro-organismes. La détermination est, de préférence, effectuée de telle sorte 25 que la quantité désirée du réactif soit ajoutée avec un volume approprié de la solution tampon dans le tube du réactif, après quoi on ajoute l'échantillon aqueux qui contient l'a-amylase. Le tube du réactif et ses contenus sont agités dans un thermostat, à une température convenable pendant la période de temps 30 désirée puis on empêche une autre hydrolyse de l'enzyme, par exemple, en chauffant ou en refroidissant le système ou en changeant la valeur de pH, ou en ajoutant des inhibiteurs de l'enzyme appropriés d'une manière connue, ou en séparant les particules du liquide. Le procédé de mesure colorimétrique est avan-35 tageusement effectué sur le liquide qui est séparé des particules par c entrifugation ou filtration. La libération de la coloration des réactifs des exemples 1 à 8 sous l'influence des a-amylases mentionnés ci-dessus est étudiée à différentes températures, par exemple de 2 0°C à 69 00458 11 2000245 60°C, avec différentes valeurs de pH et concentration de chlorure de sodium comme une fonction du temps et de la quantité de l'enzyme. On effectue également des essais en faisant varier les quantités de réactif. 5 On a trouvé que les déterminations sont bien conduites avec le tampon mentionné plus haut à un pH de 7,0, par exemple à 37°0 (bien que l'on puisse choisir des températures plus élevées allant jusqu'à 47°C dans certains cas). Toutefois, si on le désire, les déterminations peuvent aussi être réalisées 10 à la température ambiante (2 0°C) ou à une température inférieure bien qu'un temps de réaction plus long soit nécessaire naturellement. D'un point de vue pratique pour la mise en oeuvre, on a trouvé que dans le cas de déterminations pour le contrôle classique de 1 'oc-amylase, les conditions doivent être choisies 15 pour que la quantité du réactif soit de l'ordre de 5 à 10 mg et que le volume du tampon défini plus haut soit de 1 à 2 ml, bien que le volume de l'échantillon de l'enzyme puisse être de 0,01 à 0,1 ml, naturellement d'autres quantités peuvent être choisies. 20 On a trouvé, lors des essais, que la libération de la cou leur dans les phases initiales est essentiellement une fonction linéaire du temps. On a également trouvé que la libération de la couleur est une fonction de l'activité de l'enzyme dans l'échantillon, un 25 degré élevé de libération de la couleur après une certaine période de temps correspond par conséquent à un degré élevé d'activité de l'enzyme dans l'échantillon et les courbes ou les tableaux de cette fonction entre la couleur libérée et l'activité de l'enzyme peuvent facilement être tracés pour le réactif en 30 question. Il y a lieu de remarquer pour illustrer la sensibilité du procédé que 0,04- microgramme d'oc-amylase cristalline du Bacillus subtilis libère depuis 1 mg du réactif de l'exemple 6 après 10 minutes à 47°0, une quantité de couleur entièrement suffi-35 santé pour effectuer le procédé de mesure. (ODggQ ^ à environ 1 pour les conditions d'essais en question). Une j3-amylase pure, qui est une exoenzyme, ne libère pas de couleur de ce réactif; lorsque l'on fait des essais avec une jâ-amylase pure du Bacillus subtilis, il n^y a pas de libé 69 00458 12 2000245 ration de couleur. Des essais conduits avec le réactif mentionné ci-dessus et un grand nombre d'autres réactifs préparés avec des quantités variables de substances réactionnelles produisant une couleur 5 et l'éther 1,4-butanediol-diglycidique et d'autres agents de formation de pont, tels que l'éther 1,2-éthanediol-diglycidique et 1'épichlorohydrine, sous des conditions qui varient, montrent l'utilité de ces réactifs dans la détermination d'a-amylase. A titre d'exemple, les réactifs illustrés aux exemples 1 et 2 se 10 sont montrés très favorables vis-à-vis du degré de substitution des groupements produisant une couleur et des ponts réticulés et ont montré qu'il était particulièrement bien approprié pour les déterminations d'a-amylase. Exemple 12 15 Pour illustrer encore la libération de fragments hydrosolu- bles présentant des groupements produisant une couleur qui y sont fixés, comme fonction du temps réactionnel, on a représenté au Tableau 1 suivant les temps de réaction utilisés et les valeuis ODfiPOnm correspondantes. Dans cet essai, on utilise d'a-amylase 2 0 du Bacillus subtilis (0,08 microgramme par ml) et le réactif de l'exemple 6 (5 mg/ml). La température est de 60°C. La solution tampon est celle décrite à l'exemple 11 avec un pH égal à 7,0. Tableau 1 2 5 Temps de réaction ^620 nm en minutes 2 1,16 5 2,82 7 4,22 30 10 6,22 Gomme on peut le constater, la quantité de la coloration dans la solution augmente avec la durée de la réaction. Exemple 13 On donne, au Tableau 2 suivant, les valeurs ODggQ ^ 35 pour un essai avec 1'a-amylase du Bacillus subtilis, la quantité de l'enzyme variant de 0,04 à 0,40 mg/ml. La quantité du réactif de l'exemple 6 est de 7 mg/ml. La température est de 47°C et le temps de réaction de 10 minutes. La solution tampon 69 00458 13 2000245 est celle décrite en référence à l'exemple 11 et à un pH de 7,0. Tableau 2 Enzyme 0I)620 nm 5 y g/ml 0,04 2,27 0,16 6,80 0.40 10,00 Gomme on peut le constater, la quantité de la coloration 10 dans la solution augmente avec un temps de réaction constant avec accroissement des quantités d'enzymes. Exemple 14 On éprouve avec des endodextranases de différents microorganismes d'une manière analogue à celle utilisée pour l'oc-15 amylase des exemples 11a 12 et 13 les réactifs des exemples 9 et 10 et d'autres réactifs préparés avec des quantités variables d'agents de formation de pont et de substances réaction-nelles produisant une couleur par rapport au polymère de dextrane. On obtient également, dans ce cas, une libération de 20 fragment coloré d'une manière correspondant à celle où l'oc-amylaBe réagit sur le réactif d'cc-amylase décrit ci-dessus. 69 00458 14 2000245 REVENDICATIONS 1- - Procédé de détermination d ' endohydrolases capables d'hydrolyser des polysaccharides dans des échantillons aqueux, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'échantillon en con-5 tact avec un réactif insoluble dans l'eau mais hydrophile, gonflable, à réseau tridimensionnel hydrolysable du point de vue enzymatique des molécules du polysaccharide ou de ses dérivés hydrolysables enzymatiquement, ces molécules étant réticulées par des ponts avec des liaisons de nature covalente, dans le 10 réseau il existe également des groupements d'indication ou des atomes liés au moyen de liaisons du type à covalence, une réaction ayant lieu entre l'enzyme et le réactif pour libérer des fragments hydrosolubles du réactif contenant les groupes ou atomes susceptibles de fournir une indication, tandis qu'en-15 suite, après que l'enzyme a réagi sur le réactif pendant une période de temps déterminée, la substance du réactif non dissoute est séparée du liquide avec les fragments hydrosolubles du réactif qui y sont dissous, après quoi les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication dans le li-2.0 quide ou dans la matière du réactif non dissoute sont déterminés comme une mesure de l'activité enzymatique. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif est sous la forme de particules. 3 - Procédé suivant les revendications 1 ou 2 ou les 2 5 deux, caractérisé en ce que le polysaccharide est l'amidon ou ses dextrines ou ses dérivés hydrolysables du point de vue enzymatique. 4 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les groupements susceptibles 30 de fournir une indication sont des groupements produisant des couleurs. 5 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les groupements susceptibles de fournir une indication sont des groupements fluorescents. 35 6 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication sont des isotopes radioactifs ou des groupements munis.d'isotopes radioactifs. 69 00458 15 2000245 7 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détermination est effectuée en présence d'un tampon ayant un pH approprié pour l'enzyme en question. 5 8 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules du polysaccharide sont réticulées dans le réactif par des ponts alipha-tiques ayant des liaisons de nature covalente, le nombre d'atomes de carbone des ponts étant compris entre 2 et 20, de 10 préférence entre 3 et 15. 9 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules de polysaccharides sont réticulées dans le réactif par des radicaux hydroxyle contenant des ponts d'alcoylène ayant de 3 à 20 atomes 15 de carbone, notamment de 3 à 15 atomes de carbone, ces ponts étant à titre facultatif interrompus par un ou plusieurs atomes d'oxygène. 10 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réactif est mélangé avec 20 de la pulpe de papier sous la forme de papier pour réactif. 11 - Procédé suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détermination est effectuée par voie quantitative. 12 - Réactif pour la détermination d'endohydrolases ca- 25 pables d'hydrolyser des polysaccharides destinés à être utilisés dans le procédé conforme aux revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est insoluble dans l'eau mais hydrophile, gonflable, à réseau tridimensionnel hydrolysable du point de vue enzymatique des molécules de polysaccharide ou de ses dé- 30 rivés hydrolysables enzymatiquement, ces molécules étant réticulées par des ponts ayant des liaisons à nature covalente, le réseau présente également des groupements ou des atomes susceptibles de fournir une indication et reliés par des liaisons de type covalent. 35 13 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est sous la forme de particules . . 14 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est l'ami 69 00458 16 2000245 don tel que l'amylose ou le 1'amylopectine ou ses dextrines. 15 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les groupements susceptibles de fournir une indication sont des groupements produisant une 5 couleur. 16 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les groupements susceptibles de fournir une indication sont des groupements fluorescents. 17 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications 10 précédentes, caractérisé en ce que les groupements ou les atomes susceptibles de fournir une indication sont des isotopes radioactifs ou des groupements présentant des isotopes radioactifs. 18 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules du polysaccha- 15 ride dans le réactif sont réticulées par des ponts aliphatiques ayant des liaisons de nature covalente, le nombre d'atomes de carbone de ces ponts est compris entre 2 et 2 0, notamment entre 3 et 15. 19 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications 20 précédentes, caractérisé en ce. que les molécules du polysaccharide dans le réactif sont réticulées par des radicaux hydroxyle contenant des ponts d'alcoylène ayant de 3 à 20 atomes de carbone, en particulier, de 3 à 15 atomes de carbone, ces ponts étant interrompus à titre facultatif par un ou plusieurs atomes 2 5 d'oxygène. 20 - Réactif suivant une ou plusieurs des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance du réactif est mélangée avec de la pulpe de papier sous la forme de papier pour réactif.