Brevet FR2003583A1 — publié le 19691107

La présente invention est relative à un procédé de production de L-thréonine et de L-valine par fermentation à l'échelle industrielle. Elle concerne plus particulièrement la production simultanée de L-thréonine et de L-valine avec un rendement élevé en presence de divers genres de substances servant de source de carbone principale, en utilisant des mutants exigeant de l'iso- leucine, de 1'acide CX-cétobutyrique ou de 1' acide &alpha;-aminobutyri- que et qui sont obtenus à partir des souches Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus et Brevibacterium ketoglu tamicum. Actuellement, on connut des procédés de production par fermentation d'un type classique dans lesquels on obtient une accumulation de chacun des produits désirés en utilisant divers mutants ayant des exigences nutritives diverses et provenant de microorganismes divers et en contrôlant le processus métabolique des microorganismes. Dans la technique antérieure, on pouvait obtenir l'accumulation de la L-valine en utilisant un mutant, exigeant de l'acide pantothénique, de la souche Escherichia coli, un mutant exigeant de l'isoleucine de la souche Nicrococcus glutamicus, etc. De façon similaire, il est connu qu'on peut obtenir une accumulation de L-thréonine en utilisant un mutant, exigeant de la méthionine et de I1 acide diaminopimélique, de la souche Eacherichia coli un mutant, exigeant de la méthionine et de la lysine, de la souche Xicrococcus glutamicus, un mutant exigeant de l'isoleucine de la souche Protes rettgeri, etc. En outre, en ce qui concerne l'accumulation de L-thréonine, un procédé courant consiste à laisser s'accumuler la L-thréonine dans un milieu en ajoutant à ce dernier une quantité notable de L-homosérine qui est un précurseur de la L-thréonine.Toutefois, on ignorait que la L-thréonine et la L-valine pouvaient staccumuler simultanément en grandes quantités dans un milieu identique, mais ne contenant pas les précurseurs de ces composés. La présente invention a pour objet : - un procédé perfectionné de production simultanée de L-thréonine et de L-valine à l'échelle industrielle; - un procédé de production simultanée de L-thréonine et de L-valine avec des rendements élevés en présence d'hydrocarbures, en particulier en présence de composés dérivés de la saccharine, qui constituent la source de carbone principale, ce procédé pouvant entre mis en oeuvre d'une manière efficace et simple; - un procédé de préparation simultanée de L-thréonine et de L-valine avec des rendements élevés, dans lequel on utilise des mutants exigeant divers éléments nutritifs et obtenus à partir de microorganismes spécifiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparattront au cours de la description détaillée qui va suivre; toutefois, il est bien entendu que cette description détaillée et les exemples particuliers qui sont donnés, bien qu'ils illustrent des modes de réalisation préférés de la présente invention, n'ont aucun caractère limitatif et qu'on peut y apporter de nombreuses modifications sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. Conformément & la présente invention, on a constaté qu'on peut supprimer les inconvénients susmentionnés et obtenir un procédé permettant de produire simultanément la L-thréonine et la L-valine en cultivant des mutants exigeant divers éléments nutritifs, qui sont obtenus à partir de microorganismes appartenant aux genres Arthrobacter paraffineus, Corriiebacterjua hydrocarboclastus et Brevibacterium ketoglutamicum. Comme exemples de mutants exigeant divers éléments nutritifs et pouvant entre utilisés dans le procédé de fermentation de la présente invention, on citera le mutant KY 4303-H821, qui exige de l1isoleucine, de l'acide -cétobutyrique ou de 11 acide &alpha;-aminobutyrique pour sa croissance et qu'on obtient par irradiation aux rayons ultraviolets du microorganisme Arthrobacter paraffineus KY 4303 (ATCC 15591), le mutant KY4309-H1213, qui exige de l'isoleucine, de l'acide -cétobutyrique ou de l'acide &alpha;;-aminobutyrique pour sa croissance et quton obtient par irradiation au cobalt 60 de la souche Oorvnebacterium hvdrocarboclastin KY4309 (ATCC 15592) et le mutant KY4305-H1223, qui exige de l'isoleucine de l'acide -cétobutyrique ou de l'acide &alpha;-amino- butyrique pour sa croissance et qu'on obtient par irradiation aux rayons ultraviolets de Brevibacterium Ketoglutamicum KY4305 (ATCC 15588), etc. En ce qui concerne la fermentation elle-mme, un milieu de culture synthétique convient aussi bien qutun milieu nutritif naturel, à condition qutils contiennent tous deux les éléments nutritifs essentiels pour la croissance de la souche de microorganisme choisie. De tels éléments nutritifs sont bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azotes des composés minéraux, etc., qui sont utilisés par les microorganismes en des quantités appropriées. Bien que la fermentation soit exécutée conformément à la présente invention dans un milieu nutritif aqueux, qui peut contenir un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme source de carbone, le procédé de la présente invention est particulièrement satisfaisant quand la source de carbone principale comprend des hydrates de carbone, par exemple le glucose, le fructose, le mannose, le saccharose, le maltose, le mannitol, le sorbitol, le glycérol etc. Des matières de départ non traitées telles que les mélasses, un hydrolysat dtamidon, etc, conviennent également.Bien que les rendements en L-thréonine et en L-valine obtenus à partir de cétoses ou de cétoses contenant un saccharides tels que le fructose, le saccharose, etc, soient très bons, les rendements obtenus à partir d'alcools dérivés de sucres comme le mannitol, le sorbitol, le glycérol, etc. sont particulièrement élevés. Quand on utilise des hydrocarbures comme source de carbone, des substances particulièrement efficaces sont les n-paraffines (alcanes) ayant environ 9 à 30 atomes de carbone, comme par exemple le n-nonane, le n-décane, le n-undécane, le n-dodécane, le n-tridécane, le n-tétradécane, le n-pentadécanet le n-hexadécane, le n-octadécane, le n-docosane, le n-triacontane, etc.On peut utiliser une source de carbone unique ou un mélange de plusieurs sources de carbone. La source do azote peut être constituée par divers genres de sels ou de composés minéraux ou organiquest comme l'ammoniaque ou les sels d'ammonium tels que le chlorure dtammo- nium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etc, ou un ou plusieurs aminoacides mixtes combinés, ou/substances naturelles contenant de l'azote, comme la liqueur de macération du mats, l'extrait de levure, 11 extrait de viande, ltamine NZ, la chair de poisson, la peptone, le bouillon, les hydrolysats de caséine, les matières solubles du poisson, un extrait d'enveloppes de grains de riz, etc. Ces substances également peuvent être utilisées isolément ou sous forme d'un mélange comprenant plusieurs entre elles. Les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de culture en des quantités appropriées et comprennent le phosphate de sodium, le phosphate acide disodique, le phosphate diacide de potassium, le phosphate acide de potassium, les ions métalliques comme le sulfate de magnésium, le sulfate de manganèse, le sulfate de sinc, le sulfate de cuivre, le sulfate de fer ou d'autres sels du fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de nickel, le chlorure de cobalt, le carbonate de calcium, le borate de sodium, le molybdate de sodium etc. Les mutants qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont ceux dont la croissance exige des élé ment s nutritifs tels que l'isoleucine, l'acide &alpha;-cétobutyrique ou I1 acide -aminobutyrique. On utilise très souvent de la thiamine conjointement avec de l'isoleucine à titre d'éléments nutritifs nécessaires.Avantageusement l'un quelconque des éléments nutritifs, à savoir la thiamine l'isoleucine l'acide cétobutyrique ou l'acide o(-aminobutyrique, peut être ajouté au milieu de culture en des quantités comprises par exem- ple entre 1 et 5 mg/l pour la thiamine et 5-200 mg/l pour l'iso- leucine, c'est-à-dire en des concentrations qui ne sont pas tout à fait optimales. L'addition de quantités excessives des éléments nutritifs, par exemple dtisoleucine et de composés analogues. freine l'accumulation de thréonine et de valine dans le milieu de culture, spécialement l'accumulation de valine. Bien que la présente invention concerne particulièrement l'utilisation des éléments nutritifs mentionnés ci-dessus, on peut également utiliser l'extrait de viande, l'extrait de levure et la liqueur de macération du mats. On conduit la fermentation en aérobie, par exemple en secouant la culture en aérobie0 ou en agitant une culture submergée, à une température d'environ 20 à 4o.C. Le pH reste neutre pendant la culture et on l'empêche de diminuer en ajoutant du carbonate de calcium, du carbonate d'ammonium, une solution d'ammoniaque, de la soude caustique ou des produits analogues au milieu de culture. La durée de la culture est généralement comprise entre environ 2 et 5 jours. Lorsque la culture est achevée, on sépare les cellules et on récupère la L-thréonine et la L-valine dans la liqueur de culture grace à un traitement par une résine échangeuse dotions comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessous. En outre, on constate que de l'acide -cétogluta- rique, de l'acide glutamique, de l'acide aspartique, de la leucine, de la sérine, de l'alanine et des produits analogues existent simultanément dans la liqueur de culture. Les exemples suivants doivent être considérés comme étant donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif de la portée de l'intention. Sauf mention contraire, les pourcentages s'entendent en poids. EXEMPLE 1 Le licroorganisme choisi est Arthrobacter paraffineus KY4303-H821 (ATCC 21220). On cultive cette souche dans du bouillon en secouant la culture en aérobie, à 30 C et pendant 24 heures, ce qui donne une culture d'ensemencement. On verse un milieu de fermentation préparé au préalable dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml, qui comportent chacune une plaque déflectrice et qui sont stérilisées, à raison de 20 ml de milieu par fiole.On inocule la culture d'ensemencement dans le milieu de fermentation, dans une proportion de 5%, et on fait incuber en secouant à 28'C. La composition du milieu de fermentation est la suivante Composition du milieu de fermentation : 10 de mannitol; 2% de (NH4)2SO4; 0,1% de KH2PO4; 0,1% de Na2HPO4, 12 H2O; 0,01% de MgSO4, 7H2O; 0,002% de FeSO4, 7H2O; 0,002% de MnSO4, 4H2O; 1 mg/i de thiamine; 10 mg/l de L-isoleucine et 2% de CaCO3 (ajouté après stérilisation séparée). On maintient le milieu de fermentation au pH 7. Après le 4ème jour de culture, un titrage biochimique, montre une accumulation de 7 mg/ml de L-thréonine et de 10,8 mg/ml de L-valine dans la culture. Lorsque la culture est terminée, on filtre la liqueur de culture pour en séparer les cellules. On ajoute de l'acide chlorhydrique à 1 litre du filtrat ainsi obtenu (7 g/l de L-thréonine et 10,8 gjî de L-valine) pour ajuster son pH à 2 et on absorbe ce filtrat sur une résine wDiaion SK-1" (type H). On lave la colonne de résine, puis on l'élue avec une solution d'ammoniaque 1N. On recueille les fractions donnant une réaction positive avec la ninhydrine et on les concentre sous pression réduite à 50 C ou moins, puis on chasse l'ammoniaque.On ajoute du carbonate de cuivre à la solution concentrée et on.fait passer à travers une résine wDiaion SÂ-2IA" (type OH) une solution de sel de cuivre d'un amino-acide, après ébullition et dissolution . L'effluent est constitué par le sel de cuivre de L-valine. On lave à l'eau la partie adsorbée et. on l'élue avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N, ce qui donne une fraction qui donne une réaction à la ninhydrine positive, c'est-à- dire une solution de sel de cuivre de L-thréonine. On traite les deux amino-acides par l'hydrogène sulfuré pour en éliminer le cuivre, on les décolore avec du charbon actif et on les concentre sous pression réduite, puis on ajoute de l'alcool éthylique. On obtient ainsi 4,8 g de cristaux bruts de L-thréonine et 6,2 g de cristaux bruts de L-valine. EXEMPLE 2 On utilise l'un des microorganismes Arthrobacter parrafineus KY4303-H821 (ATCC 21220), Cerynebacterium hydrocarboclastus KY4309-H1213 (ATCC 21221) et Brevibacterium ketoglutamicum KY4305-H1223 (ATCC 21222). On utilise divers hydrocarbures et on cultive les microorganismes par le procédé de culture de l'exem- ple 1.Les quantités de-L-thréonine et de L-valine accumulées après le 4ème jour de culture apparaissent dans le tableau 10 TABLEAU 1 Arthrobacter Corynebacterium Brevibacte paraffineus hydrocarboclastus rium keto KY4303-HH821 KY4305-H1223 glutamicum Sources de carbone KY4305 (ATCC 21220) (ATCC 21221) H1223 (ATCC 21222) L- L- L- L- L- L thréonine valine thréonine valine thréonine valine (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) Glucose 10% 1,5 2,3 1,0 2,0 0,5 1,2 Fructose 10% 4,2 6,5 3,8 6,2 2,6 4,5 Mannose 10% 0,8 1,8 0,8 1,5 0,5 1,2 Saccharose 10% 2,4 4,0 2,2 3,5 1,8 3,2 Maltose 10% 1,0 1,5 1,6 2,2 0,8 2,0 Mannitol 10% 8,8 11,0 8,5 12,0 6,2 8,0 Sorbitol 10% 7,6 11,5 8,2 11,3 5,5 8,0 Glycérol 10% 6,4 9,0 5,6 8,8 4,8 7,2 Mélasse de sucre de canne 10% * 3,7 7,0 3,0 5,2 1,5 3,0 n-paraffines 10% 9,8 13,0 8,2 12,5 5,8 7,6 Mannitol 5% + n-paraffine 5% 7,3 11,5 8,0 10,8 6,0 8,0 Sorbitol 5% + n-paraffine 5% 6,8 11,0 7,2 11,0 5,0 6,8 Alcool éthylique 2% 2,5 3,0 2,4 3,1 2,2 2,8 * Calculé sous forme de glucose. EXRMPLE 3 Le microorganisme, le milieu de culture et le mode de culture sont les mimes que dans l'exemple le Après 48 heures de culture, on ajoute l'une des substances mentionnées ci-dessus, c'est-à-dire la L-homosérine, l'acide acétique, l'acide succinique, etc., à des portions respectives du milieu de culture, en une quantité de 5 mg/ml. On poursuit ensuite la culture, les quantités des deux aminoacides qui sont accumulées et récupérées dans le milieu de fermentation après 4 jours de culture sont données dans le tableau 2. TABLEAU 2 Substance ajoutée L-thréonine L-valine Néant 6,8 mg/ml 9t5 mg/ml L-homosérine 10*0 t 9,2 " Acétate de sodium 9,5 " 9,2 " Citrate de sodium 9,7 " 10,0 " Succinate de sodium 8,8 n 10,2 " Fumarate de sodium 9,0 " 9,5 " L-malate de sodium 9,8 " 10,5 " Pyruvate de sodium 9,5 " 11,0 n Comme on peut le voir dans le tableau 2, la présence de L-homosérine et des divers acides organiques améliore le rendement en L-thréonine et en L-valine. REVENDICATIONS 1. Procédé permettant de produire sionltanément de la L-thréonine et de la L-valine, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on cultive un mutant exigeant divers éléments nutritifs et obtenu à partir d'un microorganisme capable de produire de la L-thréonine et de la L-valine, en présence d'un élément nutritif pris dans le groupe comprenant l'isoleucine, l'acide &alpha;-cétobutyrique et acide &alpha;-aminobutyrique, en aérobie et au sein d'un milieu nutritif aqueux, en présence d'au moins une substance contenant du et carbone/qui sert de source de carbone principale, après quoi on récupère la L-thréonine et la L-valine accumulées simultanément dans la liqueur de culture. 2. Procédé conforme à la revendication I g dans lequel les mutants appartiennent au genre Arthrobacter paraffineus, Corynebaoterium hydrocarboclastus et Brevibacterium ketoglutamicum. 3. Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel le mutant KY4303-H821, est obtenu par irradiation aux rayons ultraviolets de la souche de Arthrobacter paraffineus KY4303 (ATCC 15591). 4. Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel le mutant KY4309-H1213 est obtenu par irradiation au cobalt 60 de la souche Corynebacterium hydrocarboclastus KY4309 (ATCC 13592). 5. Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel le mutant KY4305-H1223 est obtenu par irradiation aux rayons ultra violets de Brevibacterium ketoglutamicum KY4305 (ATCC 15588). 6. Procédé conforme à la revendication 1 dans lequel la source de carbone principale comprend au moins un hydrate de carbone e/ou une n-paraffine. 7. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on ajoute l'élément nutritif au milieu de culture en une quantité d'environ I à 50 mg/l 80 Procédé conforme à la revendication 1 dans lequel, lorsque l'isoleucine constitue l'élément nutritif particulier, on ajoute également de la thiamine ou l'un de ses dérivés au milieu de culture. 9. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on ajoute également de la L-homosérine ou un acide organique au milieu de culture. 10. Procédé de production simultanée de L-thréonine et de L-valine, qui consiste à cultiver un mutant d'un microorganisme appartenant au genre Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus et Brevibacterium ketoglutamicum, mutant qui exige divers éléments nutritifs pour sa croissance, en présence d'environ 1 à 30 m/1 2 d'un élément nutritif tel que l'isoleucine acide &alpha;-cétobutyrique et l'aide W;aminobutyrique, en aérobie et au sein d'un milieu nutritif aqueux, en présence d!'une source de carbone principale constituée par au moins un hydrate de carbonet la L-thréonine et la L-valine accumulées simultanément dans la liqueur de culture étant récupérées dans celle-ci. ilo Procédé conforme à la revendication 10, dans lequel le mutant est Arthrobacter paraffineus KY4303-H821(ATCC 212;* Corynebacterium hydrocarboclastus KY4309-H1213 (ATCC 21221) et Brevibacterium ketoglutamicum KY4305-H1223 (ATCC 21222). 12. Procédé conforme à la revendication 10, dans lequel l'hydrate de carbone est au moins un alcool dérivé du sucre et pris dans le groupe comprenant le mannitol, le sorbitol et le glycérol. 13. Procédé conforme à la revendication 10, dans lequel l'hydrate de carbone est constitué par au moins un saccharide tel que le glucose, le fructose, le mannose, le saccharose ou le maltose. 14. Procédé conforme à la revendication 10 dans lequel au moins un membre du groupe que forment la L-homosérine, l'acide acétique, l'acide succinique et acide malique est ajouté au milieu de culture. 15. Procédé conforme à la revendication 10, dans lequel la culture est effectuée en aérobie entre environ 20 et 400C et un pH d'environ 7. 16. Procédé conforme à la revendication 10, dans lequel l'élément nutritif est ajouté au milieu de culture en une quantité d'environ 1 à 5 mg/l.