Brevet FR2001246A1 — publié le 19690926

La présente invention concerne des perfection nements au procédé d'isolement de la L-asparaginase à partir de cellules dgEscherichia coli (E. coli); Plus particulièrement, liinvention concerne le traitement deun extrait obtenu par l'éclatement des cellules de E. coli avec une faible quantité de ribonucléase, de désoxyribonucléase ou de leur mélange Dans la preparation de la LXasparaginase selon le procédé de lsinvention, on peut utiliser ntimporte quelle cellule de E . coli, bien que l'on préfère sécher sabord les cellules par lyophilisation ou traitement par l'acétone.On préfère le séchage par lDacétone et on lveffectue de préférence en mettant en suspension une pâte humide de cellules de E col obtenue par centrifugation dans lveau distillée ou désionisee On ajoute de préférence la suspension à de lgacétone froide. Après mélange, on recueille par filtration les cellules précipitées par l'acétone et on les sèche On peut ensuite provoquer l'éclatement des cellules par n'importe quel moyen connu dans la technique pour obtenir un extrait débarrassé de cellules contenant l'enzyme On connais divers moyens dans la technique pour provoquer cet éclatement des cellules, par exemple par les ultrasons ou d'autres moyens mécaniques tels que broyage dans un moulin à colloïde.Dans le mode de mise en oeuvre préféré de lsinvention, on effectue la lyse des cellules en mélangeant les cellules de E coli avec du lysozyme en présence d'un tampon pour maintenir un pH d'environ 5 à environ 9, et on sépare les débris cellulaires par centrifugation ou- filtration pour obtenir l'extrait débarrassé de cellules Suivant un autre mode de mise en oeuvre, on peut mélanger une suspension aqueuse (ajustée à pH 7,5-8,0 par NaOH) des cellules de E coli avec le lysozyme pour effectuer la lyse des cellules Suivant un autre mode de mise en oeuvre, on peut obtenir des extraits sans cellules à partir de cellules de E. coli, bien qu'avec une pureté et un rendement très inférieurs, en soumettant simplement les cellules humides au broyage, à 1'diitement ultrasonique ou à l'action du lysozyme comme indiqué ci-dessus. Jusqua présent cependant, dans la production de ces extraits exempts de cellules ainsi que dans les étapes ultérieures de récupération de l'enzyme, qui implique une série de filtration et de centrifugation on a rencontré de grandes difficultés telles que la viscosité extreAmement élevée de l'extrait résultant de la lyse cellulaire L'invention a donc pour objet de surmonter les difficultés de la purification de ces extraits dues à la viscosité élevée ci-dessus mentionnée De façon surprenante, on atteint ce résultat par une mesure relativement simple consistant à ajouter à l'extrait après la lyse cellulaire de faibles quantités de ribonucléase, de désoxyribonucléase ou de leurs mélanges On a trouvé que l'addition de faibles quantités de ces enzymes à 19extrait immédiatement après la lyse transforme l'extrait fortement visqueux en une substance de viscosité relativement faible en quelques minutes, même à de basses températures Outre les avantages dans la filtration et la centrifugation obtenus par la faible viscosité de l'extrait traité comme ci dessus, on obtient des avantages supplémentaires dans les étapes ultérieures de purification, tels que chromatographie sur colonne et les analogues, en raison de leabsence d t interférence des acides nucléiques par suite de l'hydrolyse des acides nucléiques résultant de l'addition de la ribonucléase et/ou de la désoxyribonucldase à l'extrait Les quantités de ribonucléase et de désoxyribonucléase ajoutées peuvent- être comprises entre 0,1 et 10 /ml et de préférence entre 0,25 et 0,5 y/ml. Lorsque l'on a obtenu les extraits exempts de cellules selon le procédé ci-dessus, on précipite les protéines indésirées et on les sépare de l'extrait exempt de cellules par des procédés connus; par exemple, par traitement par le chlorure de manganèse et de sulfate d'ammonium. met élimination de la substance précipitée, par exemple par centrifugation, on fractionne la liqueur surnageante obtenue, de préférence par l'acétone et-on réeupere l'enzyme Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée EXEMPLE 1 On met en suspension 15 g de cellules de E. coli B (ATCC 9637) séchées à l'acétone dans un tampon au phosphate de sodium et on les lyse par le lysozyme.Après agitation pendant 65 mn à 25 C, on ajoute de la désoxyribonucléase (IX cristallisée) à deux portions de la suspension visqueuse dans le tampon au phosphate OsOOl 001 M à pH 890 pour obtenir une concentration finale de désoxyribonucléase dans la suspension visqueuse de cellules lysées de 0,10 et 0,25 ry/ml respectivement On prépare également un échantillon témoin ne contenant pas de désoxyribonucléase. Au bout de 8 mn après l'addition de la désoxyribonucléase, les suspensions visqueuses de lyses cellulaires sont totalement fluides tandis que la suspension de lysat de cellules ne contenant pas de désoxyribonucléase reste visqueuse. Après 15 mn d'incubation supplémentaire à la température ambiante, la suspension témoin de lysat cellulaire est encore aussi visqueuse qu'au début. On refroidit ensuite les suspensions cellulaires d 5-80C. On ajoute une solution de chlorure de manganèse et on centrifuge les suspensions dans une ultra centrifugeuse Sorvall Ultracentrifuge à 6 000 G pendant 20 mn. I1 apparat nettement que les débris cellulaires de la suspension sans désoxyribonucléase ne sont pas sédimentés aussi bien que ceux la suspension de lysat cellulaire traités à la désoxyribonucléase. La liqueur surnageante de cette dernière est beaucoup plus limpide et il est évident que l'on a réalisé une séparation beaucoup plus efficace. EXEMPLE 2 On répète le procédé de l'exemple 1 sauf que l'on ajoute de la désoxyribonucléase pour donner des concentrations de 5 et 10 /ml après une période de lyse cellulaire de 30 mn. Le degré de séparation obtenu ne ze ditingue ps de celui de l'exemple I. EXEMPLE 3 On suit le. procédé de l'exemple 1 sauf qu utilise de la désoxyribonucléase amorphe après une lyse cellulaire de 20 mn au lieu de 65 mn. Les résultats ne se dis tinguent pas de ceux de l'exemple 1. EXEMPLE 4 On suit le procédé de l'exemple 1 sauf qu'on remplace la désoxyribonucléase par un mélange à parties égales de ribonucléase et de désoxyribonucléase. On observe des résultats qui ne se distinguent pas de ceux de l'exemple 1. EXEMPLE 5 On lyse 50 g de cellules séchées à l'acétone par 0,05% de lysozyme de la manière indiquée à l'exemple 1. On ajoute ensuite de la désoxyribonucléase pour donner une concentration de 0,1 /ml et on mélange la bouillie pendant 15 mn et on la refroidit à 10 C. On ajuste le pH à 7,6 par la soudez On ajoute du chlorure de manganèse tout en maintenant le pH entre 7,5 et 8,0. On clarifie la suspension par centrifugation à froid. On ajuste la liqueur surnageante clarifiée à 2 M en sulfate d'ammonium et on sépare par centrifugation les protéines précipitées ne contenant pas de L-asparaginase. A la solution clarifiée 2 M en sulfate d'ammonium, on ajoute de lacdtone froide et on récupère la L-asparaginase précipitée. On récupère la L-asparaginase en mettant en suspension dans l'eau le précipité de sulfate d'ammonium 2 2 M dans l'acétone. Le degré de récupération de la L-asparaginase dans les cellules séchées à l'acétone est de 46%. L'activité spécifique est augmentée de 0,58 à 2,17 UI/mg de protéine. REVENDICATIONS î.Un procédé pour isoler la L-asparaginase des cellules d*Escherichia coli caractérise en ce que l'on soumet ces cellules à la lyse, on traite l'extrait obtenu de ladite lyse par une faible quantité de ribonucléase, de désoxyribonucléase ou de leurs mélanges et on récupère la L-asparagi nase dudit extrait0 2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit extrait dérive de cellules séchées. 3. Le procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche dtEschrichia coli est Escherichia coli B. 4. La L-asparaginase obtenue par le procédé selon les revendications 1 à 3.