Brevet FR2009245A1 — publié le 19700130

La présente invention est relative à un procédé de production de L-thréonine et, plus particulièrement, à un procédé de production de L-thréonine par fermentation. Encore plus particulièrementi la présente invention se rapporte à un procédé qui permet d'augmenter le rendement en L-thréonine grâce à l'addition de certains composés au milieu nutritif dans lequel on exécute la fermentation. Des procédés de production de L-thréonine par fermentation sont déjà connus dans la technique. s titre d'exemples, on peut citer un procédé utilisant le microorganisme Esoherichia coli Lvoir "Applied Microbiology", Vol. 9, pages 419-424 (1961)Jet un procédé utilisant de l'homosérine comme matière de départ Lvoir "Âmino acide Fermentation and Netabolism1, Vol. 1, pages 80-84 (1959); ibid., Vol. 11, pages 119-127 (1965); ibid., Vol. 10, pages 68-74 (1964)].Dans ces procédés de production de thriow nine par fermentation, la thréonine produite dans la liqueur de culture a tendance k se décomposer, ce qui diminue le rendement en thréonine. Par exemple, il a déjà té mentionné que, dans un procédé de fermentation utilisant Escherichia coli, la quantité de thréonine accumulée atteint un maximum après 28 heures de culture et que, lorsqu'on continue la culture, la quantité de thréo nine diminue sensiblement et il se forme simumtanément de la glycine Lvoir "Applied Microbiology", Vol. 99 pages 419-424 (1961)].En outre, on a constaté que lorsqu'on utilise une bactérie du genre Pseudomonas, comme exposé ci-dessus, la quantité de thréonine accumulée dans la liqueur de culture diminue, parce qu'il se produit de la glycine vraisemblablement on raison de la décomposition de la thréonine. On suppose que, si on réussit à esptcher une réduction de la production de thréonine par suite de sa décomposition, une condition adéquate pour la production et l'accumulation de thréonine peut entre maintenue pendant un long moment et que, de ce fait, le rendement en thréonine peut être augmenté. Après avoir étudié ce problème, la demanderesse a constaté que, lorsqu'on ajoute de l'hydroxylamine à une liqueur de culture, sensiblement au milieu de la période culture, à savoir quand lo microorganisme s'est développé jusqu'à un certain degré, le ren- dement en thréonine est sensiblement plus élevé que dans le cas où ce composé n'est pas ajouté au milieu de culture. La présente invention a donc pour objet : - un procédé perfectionné de production de L-thréonine qui pallie les inconvénients des procédés de la technique antérieure; - un procédé de production de L-thréonine par fermentation qui peut être mis en oeuvre d'une manière efficace et relativement simple, et qui peut/mis en oeuvre avantageusement à l'échelle industrielle, pour donner le produit recherché avec un rendemen élevé et à peu de frais; - l'obtention de L-thréonine. Ces caractéristiques et avantages de la présente invention ainsi que d'autres apparattront aux techniciens à la lecture d description et des revendications qui Tont suivre. En étudiant les problèmes exposés plus haut, la demanderesse a constaté, conformément à la présente invention que le rendement en thréonine est sensiblement augmenté quand on conduit la fermentation ou la culture dans un milieu de culture préparé auquel on a ajouté l'un des composés suivants, en une quantité appropriée, par comparaison avec le cas où l'on n'effectue pu une telle addition.Les composés ajoutés conformément à la pr- sente invention comprennent une hydroxylamine; l'hydrazine et iu dérivés, les cyanures, les ions de métaux lourds (ayant une des sité égale u supérieure à 4), l'ion lithium, la glycine, l'aci- de pyruvique, des alcools inférieurs tels que l'éthanol, l'acide acétique, l'acide &alpha;-aminobutyrique et l'acide &alpha;;-cétobutyrique, Plus particulièrement, les composés ajoutés au milieu de culture pour augmenter le rendement en thréonine, conformément à la présente invention, sont de substances choisies dans le group comprenant l'hydrazine et ses dérivés (comme les semicarbazides, les thio-semicarbazides, l'hydrate d'hydrazine, etc...), des cyanures, des ions de métaux lourds (par exemple des ions fer, cuivre, argent, mercure, plomb, nickel, cobalt, zinc, etc...) et l'ion lithium, ces substances étant utilisées en des concent tions comprises entre environ 10-1 M à environ 10-4 M, les subs tances prises dans le groupe comprenant la glycine, l'acide pyruvique, les alcools inférieurs (ayant 1 à 9 atomes de carbone comme le méthanol, ltéthanol, etc...), l'acide acétique, l'acide &alpha;-aminobutyrique et l'acide &alpha;-cétobutyrique, ces substances pouvant en une concentration comprise entre environ 1 et 20 mg; et l'hydroxylamine dont la concentration peut être comprise ent environ 0,1 et 10 mg/ml. On peut bien entendu utiliser les sel minéraux de tous ces composés. En ce qui concerne le moment d'addition de l'une des substances précitées au milieu de culture, on obtient nn effet su- parieur on introduisant cette substance dans le milieu à un xo- ment approprié après le début de la culture, plutôt qu'au début de la culture, comme on le verra à la lecture des exemples qui vont suivre. La présente invention permet d'augmenter la production de thréonine par fermentation, en général dans le cas de tous les microorganismes producteurs de thréonine, et spécialement dans le cas et la thréonine se décompose en donnant de la glycine. Toutefois, le mécanisme de l'effet des substances précitées n'est pas clairement élucidé. On sait que lors de la décomposition de thréonine on glycine, le pyridoxal phosphate se comporte à la manière d'un co-enzyme, et il est donc possible de suposser que l'effet qui est obtenu dépend de l'inhibition de cette réaction.Un autre facteur qui peut entrer on jeu réside dans le fait que le développanent des microorganismes est généralement quelque peu freiné dans l'intervalle des concentrations effectives utilisées conforme dément à l'invention. Toutefois, comme mentionné plus haut, le mécanisme exact de cette action est inconnu et la demanderesse ne désire pas se limiter à une explication théorique quelconque. Les souches productrices de L-thréonine utilisées dans la présente invention sont cultivées au sein d'un milieu de fermen- tation, et cette culture donne mme quantité potable de L-thréonine qui s'accumule dans la liqueurt-de culture résultante.En ce qui concerne la composition du milieu de fermentation et le mode de culture on utilise les procédés classiques convenant pour la fer- tentation des aminoacides. ainsi on peut utiliser aussi bien un milieu de culture synthétique qu'un milieu nutritif naturel pour cultiver les seuches utilisées dans la présente invention, à condition que de tels milieux contiennent les éléments nutritifs essentiels pour le développement de la souche choisie. De tels éléments nutritifs sont bien connus dans la technique et con- prennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des produits analogues qui sont utilisés par le microorganisme on des quantités appropriées. Ainsi, la source de carbone peut être constituée par exemple par des hydrates de carbone comme le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolyvat d'ami- don, la mélasse, etc... ou n'importe quelle autre source de car- bone appropriée, telle que des aoides organiques, par exemple l'acide acétiques l'acide lactique9 etc...On put utiliser une seule substance de ce genre ou des mélanges comprenant deux ou plus de deux d'entre elles. La source d'azote peut entre censtituée par divers genres de sels ou composés minéraux u organiques, comme l'urée, l'ammoniac liquide, des sels d'ammonium, comme le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, ou des substances naturelles contenant de l'azote comme la liqueur de macération du maïs, un extrait de levure, un extrait de viande, de la peptone, de la farine de poissons du bouillon, un hydrolyat de caséine, un acide aminé de la caséine, des matières solubles du poisson, un extrait do son de riz, etc...Ces substances ga- lement peuvent ttre utilisées seules ou sous forme de mélanges comprenant deux ou plus de deux d'entre elles. Les composés or- ganiques quton peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate bipotassique, le sulfate de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le ohlorure de sodium, le sulfate de zinc, etc...Dans le cas où l'on utilise des microorganismes assimilant des hydrocarbures, la source de carbone peut ttre constituée par des hydrocarbures tels que des n-paraffines, des huiles brutes, du kérosène et des produits analogues. On fait fermenter ou on cultive les microorganismes dans des conditions aérobies, par exemple en secouant la culture dans des conditions aérobies ou bien en agitant et on aérant une culture submergée, à une température comprise entre environ 20 et 40 C et à un pE compris entre environ 5 et 9,5. après environ 2 B-7 jours de culture dans de telles conditions on constate que de grandes quantités de L-thréonine se sont accumulées dans la liqueur de culture résultante. Lorsque la culture est terminée, en peut récupérer la Lthréonine dans la liqueur de culture résultante d'une façon classique, par exemple grace à un traitement par une résine échan- geuse d'ions, à une extraction par un solvant, une précipitation, une adsorption, une chromatographie ou des procédés d'extraction analogues. Les exemples qui suivent sont donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif de la portée de la présent. invention. Sauf mention contraire, les pourcentages s'entendent en poids par litre d'eaux EXEMPLE I On utilise le microorganisme Escherichia coli ATCC 13070 comme microorganisme d'ensemencement. On inocule ce microorganisme dans une fiole conique contenant 30 ml d'un milieu de culture d'ensemencement. comprenant 2 de glucose, 1% de peptone, 1% d'ex- trait de levure et 0,25% de Nazi. On cultive à 300C pendant 24 heures pour obtenir une culture d'ensemencement. On inocule ensuite la culture d'ensemencement ainsi obtenue en une proportion de 10% en volume, dans des fioles coniques de 250 ml contenant chacune 20 mi d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante. glycérine 5% (NH4)2SO4 1,4% KH2PO4 0,1% MgS04*7H20 0,03% acide méso-diami- nopimélique 50 sgll DL-méthionine 25 mg/l Ce milieu est au pH 7,2. On conduit ensuite la culture en secouant ce milieu en aé robiez pendant 48 heures. Ensuite, oa ajoute un hydraziile d'acide isonicotinique, jusqu'à obtention d'une concentration de 5 x 10-2M et on continue B cultiver pendant 48 heures. La liqueur de culture ainsi obtenue contient 4,3 mg/ml de l-thréonine accumulée. I1 ne se forme sensiblement pas de glycine. A titre de comparaison, on mentionnera que la quantité de L-thréonine accumulée dans une fiole témoin, i laquelle on n'a pas ajouté d'hydrazide d'acide isonicotinique, est de 2,5 mg/ml et qu'on a également obtenu 0,95 xg/ml de glycine. EXEMPLE 2 On utilise Pseudomonas fluorescens ATCC 21256 comme microorganisme d'ensemencement. On cultive cette souche en la secouant en aérobie au sein d'un milieu de culture contenant 2% de glucose, 1% de peptone, 1% d'extrait de levure et 0,3% de NaCl, à 300C, pendant 24 heures, ce qui donne une culture dtensemencement. On inocule la culture d'ensemencement précitée, en une proportion de 10% en volume, dans des fioles coniques de 250 ml contenant 10 mi d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante : Glucose 5% KN2PO4 0,05% K2HPO4 0,05% MgSO4.7H2O 0,025% FeSO4.7H2O 10 mg/l MnSO4.4H2O 10 mg/l (NH4)2SO4 2% CaCO3 2% L-méthionine 30 mg/l L-homosérine 5 g/l Le milieu est au pli 7,2. On cultive ensuite tout en secouant en aérobie à 30 C, pen dant 4 jours. Les concentrations et les moments d'addition des composés portés dans le tableau sont indiqués dans le même tableau. Les quantités de L-thréonine et de glycine obtenues dans es li queurs de fermentation résultantes sont également portées dans le tableau TABLEAU Composés ajoutés Concentration Temps Thréonine Glycine (heures) (mg/l) (mg/l) Pas d'addition Témoin 2 0,35 2,10 24 1,20 0,60 Semicarbazide 10-2 M 48 1,25 0,60 Hydrazide de 1'- 0-2 2 24 1,05 0,45 acide isonicoti- 5 x 10 M 48 1,70 1,70 nique Hydrate d'hydra- 5 x 10-2 M 24 0,70 0,40 zine 5 x 10 M 48 1,90 1,45 Cyanure de potas- 10-2 M 24 1,30 1,00 sium 10 M 48 0,95 1,55 Cyanure de so- 10 2 M 24 1,30 1,00 dium FeSO4 10-2 M 48 1,15 0,65 24 1,15 0,85 CuSO4 10-2 M 48 1,15 0,90 24 1,00 0,60 AgNO3 10-2 M 48 1,55 1,15 HgCl2 10-2 M 24 1,10 0,95 24 1,00 0,65 Pb(NO3)2 10-3 M 48 1,50 1,15 NiCl2 10-3 M 24 0,80 0,90 Co(NO3)2 10-2 M 48 1,20 1,20 ZnSO4 10-3 M 24 1,05 0,45 Li2SO4 10-3 M 24 0,55 1,15 5mg/ml 48 1,30 5,40 Glycine 1 mg/ml 48 1,40 2,55 Acide pyruvique 5 ni mi 48 1,10 0,90 Méthanol 5 mg/ml 24 0,90 1,40 Ethanol 10 mg/ml 24 0,90 1,50 Acétate de so- 5 mg/ml 24 1,10 0,90 dium 1 mg/ml 24 1,05 0,65 Acide D1-&alpha;-ami- 1 mg/ml 24 1,65 1,20 nobutyrique Acide &alpha; ;-cétobu- 1mg/ml 48 1,55 0,65 tyrique EXEMPLE 3 Le microorganisme d'ensemencement est Escherichia coli ATCC 13070. On inocule ce microorganisme dans une fiole conique contenant 30 mi d'un milieu de culture d'ensemencement comprenant 2% de glucose, 1% de pqtone, 1% d'extrait de levure, 0,25% de NaCl et 50 mg/I: d'acide méso-diaminopimélique. Après 24 heures de culture à 30 C, on obtient une culture d'ensemencement. On inocule ensuite la culture d'ensemencement résultante, dans une proportion de 10% en volume, dans des fioles coniques de 250 ml contenant 20 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante : Glycérine (NH4)2SO4 1,4% KH2PO4 0,1% MgSO4.7H2O 0,03% Acide méso-diaminopimélique 150 mg/l DL-méthionine 25mg/l Ce milieu est au pH 7,8 (avant stérilisation). On cultive ensuite ce milieu pendant 48 heures à 30 C. On y ajoute ensuite du chlorhydrate d'hydroxylamine jusqu' Wobten- tion d'une concentration de 1 mg/ml et on continue à cultiver pendant 48 heures. La quantité de L-thréonine accumulée dans la liqueur de culture résultante est de 4,2 mg/ml et la quantité de glycine est très faible ou même nulle. A titre de comparaison, la quantité de L-thréonine accumulée dans une fiole témoin, quand on ajoute de l'hydroxylamine est de 2,5 mg/ml et on obtient également 0,95 mg/ml de glycine. EXEMPLE 4 Le microorganisme d'ensemencement est Xanthomonas citri ATCC 15923. On inocule cette souche dans une fiole conique de 250 ml contenant 30 ml d'un milieu de culture d'ensemencement comprenant 2% de glucose, 1% de peptone, 1% d'extrait de levure et 0,25% de NaCl.On cultive tout en secouant, é 300C, pendant 24 heures0 On inocule la culture d'ensemencement résultante, dans une proportion de 10% en volume, dans des fioles coniques de 250 ml contenant 20 ml dtun milieu de fermentation ayant la composition suivante : Glucose (NH4)2SO4 2% K2HPO4 0,1% MgSO4.7H2O 0,03% CaCO3 2% Ce milieu est au pH 7,2 (avant stérilisation) On cultive ensuite à 300C pendant 6 heure s0 On ajoute ensuite de la L-homosérine jusqu'à une concentration de 10 mg/ml et, simultanément, on y ajoute du chlorhydrate d'hydroxylamine jusqu'à une concentration de 1 mg/mlO On continue à cultiver pendant 96 heures et il s'accumule 4,2 mg/ml de L thréonine dans la liqueur de culture résultante. A titre de comparaison, on répète le même mode de culture que ci-dessus, mais sans ajouter de chlorhydrate d'hydroxylamine. La quantité de L-thréonine accumulée es-t de 1,1 mg/ml. Les microorganismes capables de produire de la L-thréonine sont bien connus dans la technique et comprennent les microorganismes du genre Escherichia, Pseudomonas, Xanthomonas, Corynebacterium, Brevibacterium, Micrococcus, Proteus et Bacillus. Des exemples spécifiques comprennent Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Xanthomonas citri, Corynebacterium rathayi, Brevibacterium vitarumen, Micro- coccus varianss Proteus retigeri et Bacillus subtilisO I1 est évident qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour cela du cadre dé la présente invention0 REVENDICATIONS 10) Procédé perfectionné de production de L-thréonine par culture d'un microoganisme producteur de L-thréonine dans des conditions aérobies, au sein d'un milieu nutritif aqueux, la Lthréonine étant récupérée dans la liqueur de culture résultante, ce perfectionnement résidant dans le fait qu'on ajoute un composé tel qu'une hydroxylamine, une hydrazine ou l'un de ses dérivés, un cyanure, un ion de métal lourd, un ion lithium, de la glycine, de l'acide pyruvique, un alcanol inférieur, de l'acide acétique, de l'acide a-aminobutyrique ou de acide &alpha;;-cétobutyrique, au milieu de fermentation 20) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le composé en question est ajouté au milieu après le début de la culture0 30) Procédé de production de L-thréonine qui consiste à cultiver un microorganisme producteur de L-thréonine dans des con- ditions aérobies, au sein d'un milieu nutritif aqueux auquel on a ajouté un composé tel qu'une hydroxylamine, de l'hydrazine et l'un de ses dérivés, des cyanures, des ions de métaux lourds, l'ion lithium, la glycine, l'acide pyruvique, un alcanol inférieur, l'acide acétique, l'acide &alpha;-aminobutyrique et l'acide &alpha;;-cétobuty- rique, à laisser la L-thréonine s'acumuler dans la liqueur de culture résultante et à récupérer la L thréonine dans cette liqueur de culture0 40) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel on ajoute au milieu précité environ 10-1 à 10-4 mole par litre de l'hydrazine, d'un cyanure, d'un ion d'un métal lourd ou d'un ion lithiums 50) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel on ajoute au milieu environ 1 à 20 mg/ml de glycine, d'acide pyru- vique, d'un alcanol inférieur, d'acide acétique, d'acide &alpha;-amino- butyrique ou d'acide &alpha;-cétobutyrique. 60) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel la quantité d'hydroxylamine ajoutée au milieu est comprise entre environ 0,1 et 10 mg/mlO 70) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel le dérivé d'hyarazine est un semicarbazide, un thiosemicarbazide, de l'hydrate d'hydrazine ou un hydrazide d'acide isonicotiniqueo 80) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel les ions de métaux lourds sont des ions fer, cuivre, argent, mercure, plomb, nickel, cobalt et zinc, 90) Procédé conforme à la revendication 3 dans lequel les alcanols inférieurs contiennent 1 à 4 atomes de carbone0 100) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel on utilise le sel de sodium ou de potassium des composés ajoutés précités. 110) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel le composé est ajouté au milieu après le début de la culture. 120) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel le microorganisme est Escherichia coli ATCC 13070, 130) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel le microorganisme est Pseudomonas fluorescens ATCC 2l256o 140) Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel le microorganisme est Xanthomonas citri ATCC 15923. 150) Procédé de production de L'thréonine qui consiste à cultiver un microorganisme producteur de Thréonine dans des con ditions aérobies, au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant (1) environ 10 1 à 10 4 mole/l d'un composé pris dans le groupe que forment l?hydrazine, les semicarbazides, les thio-semicarba zides, l'hydrate d'hydrazine, l'hydrazide de l'acide isonicotini que, les cyanures, les ions de métaux lourds ayant une densité supérieure à 4 et l'ion lithium ou (2) environ 1 à 20 mg/ml d'un composé pris dans le groupe que forment la glycine, l'acide pyru vique, les alcanols inférieurs, l'acide acétique, ltacide z-amino- butyrique et l'acide a-cétobutyriques à laisser la L-thréonine s'accumuler dans la liqueur de culture résultante et à la récupérer dans cette liqueur. 160) Procédé conforme à la revendication 13, dans lequel le composé ajouté au milieu est introduit après le début de la cul ture. 17 ) Procédé conforme à la revendication 13, dans lequel le composé ajouté au milieu est introduit sensiblement au milieu du temps to tal de culture. 180) Procédé conforme à la revendication 15, dans lequel le microorganisme est Escherichia coli ATCC 13070. 190) Procédé conforme à la revendication 15, dans lequel le microorganisme est Pseudomonas fluorescens ATCC 21256. 200) Procédé conforme à la revendication 15, dans lequel le microorganisme est Xanthomonas citri ATCC 15923.