Brevet FR2011080A1 — publié le 19700227

Cette invention concerne un procédé de préparation de stéroîdes et,plus particulièrement,un procédé amélioré pour préparer des 11-hydroxy stéroîdes contenant des groupes hydroxyle additionnels en position 16a et 17a. 5 Avant cette invention on savait que des stéroîdes, non subs titués en position 11, pouvaient être hydroxylés en 11 par voie microbienne en incorporant le stéroîde dans une culture d'un microorganisme hydroxylant en 11 en cours de croissance ou en soumettant le stéroîde à l'action de cellules d'un microorganisme hydroxylant lO en 11 séparées du milieu de culture, ou à l'action d'enzymes hydroxylant en 11 séparées des cellules de tels microorganismes. De tels procédés sont désignés collectivement ici sous le nom de "hydroxy-lation enzymatique en 11". Cependant lorsque de tels procédés étaient appliqués à des stéroîdes ayant des groupes hydroxyle en 15 position 16a et 17a, on a trouvé que de tels procédés donnaient dans des conditions normales soit des vitesses de réaction et des rendement faibles soit rien du tout. C'est donc l'un des buts de cette invention de fournir un procédé amélioré d'hydroxylation enzymatique en 11 d'un stéroîde 20 de la série 16a, 17a-dihydroxy non substitué en 11, et plus particulièrement de la série du 16a, 17a-dihydroxy-prégnane non substitué en 11. Ce but est réalisé par le procédé de cette invention qui consiste à soumettre, dans des conditions aérobies, un 16, 17-cy-25 cloborate ester d'un stéroîde hydrosoluble de la série 16a, 17a-dihydroxy non substituée en 11, à l'hydroxylation enzymatique en 11. L'hydroxylation enzymatique en 11 peut être réalisée soit en incorporant le stéroîde à une culture, en cours de croissance ou à maturité, d'un microorganisme connà pour effectuer l'hydroxy-30 lation en 11 des stéroîdes, soit en traitant le stéroîde avec les cellules, les spores ou le mycélium d'une telle culture séparée du milieu de culture ou des enzymes hydroxylant en 11 séparés des cellules de tels microorganismes. Les microorganismes qui conviennent pour l'hydroxylation en lia 35 comprennent des représentants des genres : Aspergillus (par exemple, A. ochraceus), Rhizopus (par exemple, arrhizus), Syncephalstrum (par exemple, £3. racemosum). Thamnidium (par exemple, T. elegans), Streptomyces (par exemple, S. fradiae), Sporotrichum (par exemple, S.. epjgaeum), Absidia (par exemple, A. glauca) . Apsergillus (par 40 exemple, A. niger), Aspergillus (par exemple, A. nidulans). Dactylium 69 19978 2011080 (par exemple, D. dendioides), Neurospora (par exemple, N. sitophila). Sclerotina (par exemple, S. libertiana), Gleosporium (par exemple, G. kaki), Polysporous (par exemple, P. orientalis), Bacillus (par exemple, B. cereus), Mucor (par exemple, M. adriaticus), Pseudomonas 5 (par exemple, P, fluorenscens), Trichothecium (par exemple, T.roseum) Phycomyces (par exemple, P. nitens), Pénicillium (par exemple, P. expansum), Beauvaria (par exemple, B. bassiana), Blakeslea (par exemple, B. trispora), Cercospora (par exemple, C. melonis), Delà-croixia (par exemple, D. urenata), Fusarium (par exemple, F.discolor) 10 Glomerella (par exemple, G. cingulata) , et Calonectria (par exemple, Ç. décora). Les microorganismes capables d'effectuer l'hydroxylation en 110 comprennent des représentants des.genres: Curvularia (par exemple, Ç. lunata), Coniothyrium (par exemple, e. hellebori), Chaeto-15 mella (par exemple, Ç. oblonqa), Dothichiza (par exemple, D.ferrugi-nosa) , Spondylocladium (par exemple, S. australe?, Cunninghamella (par exemple, Ç. blakesleeana), Rhodoseptoria sp., Pycnosporium sp., Stachylidium (par exemple, Sr. bicolor), Botrytis (par exemple, B. cinerea), Colletotrichum (par exemple, C. phomoides) ou Corticium 20 (par exemple, C. sasaki). Si le microorganisme est utilisé per se, on le cultive en aéro-biose dans un milieu nutritif convenable, comme on en. connaît dans la technique; le stéroîde à déshydrogénar en 1 est ajouté soit au début soit parfois pendant la culture. 25 En général, les conditions de culture des microorganismes pour le but de cette invention sont les itrêmes que celles utilisées dans la culture.des microorganismes pour .".a production d'antibiotiques ou de vitamines. Ainsi, le microorg^nisme est cultivé au contact (dans ou sur) d'un milieu nutritif convenable ,'en présence fi:un 30 apport convenable d'oxygène (air). Un milieu nutritif convenable comprend une source de facteurs azotés, et une source assimilable de carbone et d'énergie. Ce peut être u.i hydrate de carbone tel que sucrose, mélasses, glucose, maltoser amidon ou dextrine. La source de facteurs azotés peut être organique (par exemple farine de soja, 35 liqueur de "corn steep", (macération de maïs)# extrait de viande., produits solubles de distillerie, peptones et/ou extrait de levure) ou synthétique (c'est-à-dire constituée de composés inorganiques et organiques simples synthétisables tels que sels d'ammonium, nitrates alcalins, amino-acides eu urée). 40 Comme substrat stéroîde on peut utiliser n'importe quel 69 19978 3 2011080 16,17-cycloborate ester hydrosoluble d'un stéroîde de la série 16a, 17a-dihydroxy non substituée en 11. On préfère cependant les stéroîdes de la série du prégnane et plus particulièrement ceux de la série du 3-céto- ZS ^-pregnène. De tels composés comprennent 5 les sels de métaux alcalins (par exemple, le sodium et le potassium) et d'ammonium des 16, 17-cycloborate esters. On préfère en particulier les stéroîdes de formule générale 10 15 O =1 B-O-R" où les positions 1, 2 et 6,7 sont saturées ou forment une double 20 liaison; X et X" représentent l'hydrogène, un halogène, ou un groupement hydroxyle, alcoxy inférieur ou alcoyle inférieur, un X au moins étant l'hydrogène; Y représente l'hydrogène ou un radical méthyle, un chlore ou un fluor; Z représente l'hydrogène, un halogène, ou un groupement hydroxyle ou acyloxy; et R" est un cation, 25 de préférence un métal alcalin ou l'ammonium. Les substrats stéroîdes convenables comprennent les sels de métaux alcalins et d'ammonium des 16,17-cycloborate esters de : 16a,17a-dihydroxyprogestérone, 16a,l7a-trihydroxyprogestérone, 6a-méthyl-16a,17a-dihydroxyprogestérone, 6a-chloro-16a,17a-dihydroxy-30 progestérone, 6a-fluoro-16a,17a-dihydroxyprogestérone, 16a,17a-dihy-âroxy-21-fluoroprogesterone, 16oc,17a-dihydroxy-21-chloroprogestérone, 16a,17a-dihydroxy-l-dehydroprogestérone, 16a,17a-dihydroxy-6-dehy-droprogestérone, 6-fluoro-6-dehydro-16a:,17a-dihydroxyprogestérone, 16a-hydrpxy-cortexolone, l-dehydro-16a-hydroxy-cortexolone, 6-déhy-3 5 dro-16a-hydroxy-cortexolone, 1,6-bis-dehydro-16u-hydroxy-corteï:o-lone, 6a-méthyl-16ûii-hydroxycortexolone, 6a-chloro-16a-hydroxycorte-xolone, 6a-fluoro-16a-hydroxycortexolone; et les esters de stéroîdes ayant un groupe hydroxyle en 21. On préfère en particulier les esters formés avec les acides carboxyliques hydrocarbonés à moins 40 de 12 atomes de carbone, dont l'exemple est donné par les acides 69 19978 . 4 2011080 alcanoîques à moins de 12 atomes de carbone, les acides alcenoîques à moins de 12 atomes de carbone, les acides arylcarboxyliques mono-cycliques, les arylacides alcanoîques inférieurs monocycliques, les acides cycloalcanecarboxyliques et les acides cycloalcènecarboxy-5 liques. Etant donné que les substrats stéroîdes de cette invention, à la différence des substances stéroîdiennes classiques, sont fortement hydrosolubles, on peut les ajouter au milieu d'hydroxylation en 11 sous forme de solutions aqueuses, ou sous forme de solides, 10 ou dans une solution non aqueuse, et dans tous les cas ils restent en solution dans ie milieu de fermentation. Cette différence constitue l'un des avantages du présent procédé sur ceux connus dans la technique puisqu'elle permet la présence d'une concentration de substrat sous forme soluble plus élevée qu'auparavant. Ainsi, 15 avant cette invention, on ajoutait le stéroîde de préférence en solution dans un solvant organique, telle qu'une solution de dimé-thylformamide. De tels solvants organiques sont des inhibiteurs de l'hydroxylation enzymatique en 11 et limitaient donc la concentration de stéroîde qui pouvait être ajoutée à un système d'hydroxyla-20 tion en 11. Sinon, on ajoutait le stéroîde sous forme solide, auquel cas la vitesse et le rendement de la réaction étaient limités par la vitesse de dissolution et la solubilité finale du stéroîde. Toutefois, en utilisant les substrats stéroîdes de cette invention on peut utiliser des concentrations de substrat stéroîde aussi 25 élevées que 0,0125 M dans les procédés où l'on ajoute le substrat à une culture diluée du microorganisme, et aussi élevées que 0,1 M dans les procédés où l'on ajoute le substrat à un système contenant des cellules séparées concentrées ou un enzyme d'hydroxylation en 11. De préférence,la concentration du substrat dans le premier 30 système est environ 0,0002 M à environ 0,002 M et dans le second environ 0,0002 M à environ 0,025 M. Le substrat stéroîde, en solution aqueuse ou alcoolique aqueuse, est ajouté soit avant soit pendant la culture du mieroorganisme si le mieroorganisme est utilisé per se, ou à un milieu aqueux conte-35 nant les cellules séparées, les spores ou l'enzyme d'hydroxylation en 11 exempt de cellules si on utilise ce procédé. Au bout d'environ 1 à environ 120 heures, suivant la concentration de ce stéroîde et de cet enzyme, la réaction est effectivement totale. On peut récupérer ie 16,17-cycloborate ester du dérivé hydroxylé en 11 40 résultant. Toutefois, de préférence, on acidifie le milieu (après 69 19978 5 2011080 élimination des cellules ou du mycélium si on utilise un mieroorganisme) jusqu'à un pH d'au moins 4,5 et de préférence d'environ 1,5 à environ 3,5, comme par traitement avec un acide minéral tel que l'acide sulfurique pour hydrolyser le groupement 16,17-cycloborate 5 ester qui conduit au dérivé 16a,l7a-dihydroxy libre» Le stéroîde désiré peut alors être récupéré de la manière classique, comme par filtration ou centrifugation (s'il est solide) ou par extraction .. à contre-courant. Les exemples suivants illustrent les procédés de cette inven-10 tion (toutes les températures sont en degrés centigrade^; Exemple 1 lia.16a-Dihydroxy-cirtexplone On cultive Aspergillus ochraceus (portant le numéro de culture 405 dans la collection du Northern Régional Research Laboratory) 15 7 jours à 25° sur gélose inclinée de composition suivante : Gélose 2C g Glucose 10 g Extrait de levure 2,5 g K2HP04 1 g 20 Eau distillée q.s.p. 1 litre Stérilisation à l'autoclave : 30 minutes à 121° On utilise des fractions de un ml d'une suspension obtenue en lavant la surface d'un tube de milieu incliné avec 5,0 ml d'eau stérile pour ensemencer 50 ml du milieu suivant contenu dans un Erlenmeyer 25 de 250 ml bouché par du coton : Liqueur de cornsteep 40 g Glucose 20 g Eau distillée q.s.p. 1 litre pH ajusté à 6,5 par NaOH 2N 30 Autoclavage 30 minutes à 121°C On met le flacon ensemencé sur un agitateur mécanique tournant à 280 tours/minute sur un cercle de 5,08 cm de diamètre. Au. bout de 24 heures à 25° on transporte 5% (vol./vol.) du contenu dans un autre flacon de 250 ml contenant 50 ml du milieu suivant : 35 Liqueur de cornsteep 10 g Glucose 5 g Eau distillée q.s.p. 1 litre pH ajusté à 6,5 par NaOH 2N Autoclavage 30 minutes à 121® 40 Le second flacon est mis à incuber comme le premier mais après addi 69 19978 6 2011080 tion de 16a-hydroxy-cortexolone solubilisée, préparée de la façon suivante : à 112,2 ntg de 16os-hydroxy-cortexolone on ajoute 0,23 ml de borax aqueux (62,5 mg/ml) et 0,30 ml de potasse éthanolique (14 mg/ml). On dissout en chauffant à environ 40-50°. On ajoute 5 de l'éthanol (95%) pour amener le volume à 1,12 ml. On ajoute 0,40 ml de la solution de stéroîde dans le flacon au moment de l'ensemencement. Quarante huit heures et soixante douze heures après l'ensemencement on ajoute au milieu de fermentation un supplément de sel de potassium du I6os-hydroxy-cortexolone-16,17-10 cycloborate. Le tableau suivant donne un résumé des quantités de stéroîde ajoutées : Tableau Stéroîde ajouté (sous forme de 16«-hvdroxy-cortexolone) Quantité de Quantité totale de 15 Age de la culture stéroîde ajoutée stéroîde ajoutée (heures) (/*-g/ml) ( A»g/ml) 0 800 800 48 1250 2050 72 1430 3480 20 On détermine la quantité de lia,16a-dihydroxy-cortexolone formée en acidifiant une aliquote du bouillon à pH 2,5 avec de l'acide sulfurique dilué, en diluant avec de l'eau distillée (1/3 pour les échantillons de 48 heures, 1/6 pour 72 heures et 1/10 pour 120 heures), en extrayant 5,0 ml de bouillon dilué avec 25 2,0 ml de méthyl isobutyl cétone et en soumettant les extraits à la méthyl isobutyl cétone à la chromatographie sur papier dans un système benzène-éthanol-eau (2îl:2). Les résultats de l'analyse sont donnés dans le tableau suivant : Tableau 30. Détermination de la 11«,16«-dihvdroxy-cortexolone Equivalents de 16«-hydroxy-Age de la cortexolone culture Ajouté Total ajouté Produit Transformation (heures) (y^tg/ml) . ( ^g/ml) (yj,g/ml) % 35 40 O 800 800 48 546 67 48 1250 2050 72 1152 56 72 1430 3480 120 2040 59 69 19978 7 2011080 Lorsque 1 ' analyse monts^ que tout le stéroîde du substrat a été transformé en produit, toute la culture est filtrée par aspiration à travers un lit de terre de diatonées sur un entonnoir de BUchner. Le gâteau de filtration est lavé in situ avec une solution aqueuse 5 (0,1%) de tétraborate de sodium. On utilise environ 10-20 ml de solution de lavage par 100 ml de bouillon. L'ensemble filtrat et eau de lavage est ajusté à pH 3,0 avec HCl à 10% (poids/vol.), la température étant maintenue à 5-10°. Le produit cristallise de la solution. On obtient environ 2,0 g de substance brute à partir de 10 3,48 g de substrat. Après recristallisation dans l'éthanol, on obtient 1,4 g de produit pur. Par voie de contraste, en suivant la méthode de l'Exemple 1, mais en remplaçant le cycloborate ester par La 16a-hydroxy-corte-xolone libre on a trouvé que l'on pouvait utiliser une charge ma-15 ximale de 500 p g/ml de 16os-hydroxy-cortexolone et que 11 on pouvait obtenir un rendement global maximal d'environ 40% au bout de 120 heures. Exemple 2- On utilise une culture d'Aspergillus ochraceus sur gélose incli-20 née de 7 jours, comme décrit dans l'Exemple 1, po«r ensemencer un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml contenant un milieu de la composition suivante : Maïs éclaté 15 g 2g Liqueur de cornsteep dilué (20 ml de liqueur de cornsteep, 50% de solides, sont amenés à 300 ml par dilution avec l'eau du robinet) 15 ml Autoclavage à 121° pendant 60 minutes, 2 fois, en 2 jours successifs. Le flacon ensemencé est incubé 5 jours à 25° dans une pièce bien aérée, humidifiée, sans aucune agitation. On récolte les spores O C (conidies) en ajoutant 50 ml de solution saline à 0,85% contenant 0,1% de laurylsulfate die sodium. On centrifuge les spores ainsi récoltées à l5.000Xg à 5° et on les lave en les* remettant 2 fois en suspension dans un tampon de phosphate 0,05 N, à pH 7,0. La pâte de spores obtenue en centrifugeant la troisième fois est conservée 40 à -20° jusqu'à utilisation. 69 19970 8 2011080 On utilise les spores pour transformer le stéroîde en remettant en suspension 0,2 g de pâte de cellules humide dans 100 ml de phosphate 0,05 N, pH 7,0, avec 3% de glucose, le tout contenu dans un Erlenmeyer de 500 ml. On prépare et on ajoute le cycloborate ester 5 comme décrit dans l'Exemple 1. Il n'est pas nécessaire d'observer des précautions d'asepsie. L'incubation de spores non-proliférantes conjointement avec le stéroîde est effectuée en aérobiose, sous agitation mécanique tournante à 25°, comme dans l'Exemple 1. Si le O nombre de spores dans le mélange réactionnel est d'environ 10 /ml,envi-10 ron 150 Mg de stéroîde/ml sont hydroxylés en lies en 24 heures. En O faisant passer le nombre de spores à 10 /ml, environ 1.000 ^Vg de stéroîde sont hydroxylés en lia en 24 heures. Les spores ne germent pas pendant la réaction. On peut récupérer le stéroîde hydroxylé dans le mélange réactionnel par le même procédé que décrit dans 15 l'Exemple 1. Exemple 3 Suivant le procédé de l'Exemple 1 mais en remplaçant A.ochraceus par Rhizopus arrhizus ATCC 11.145 le 16a-hydroxy-cartexolone 16,17-cycloborate ester est de même transformé en lla,16a-dihydroxy-corte-20 xolone. De même, les microorganismes suivants transformeront aussi le sel de potassium du 16,17-cycloborate ester de 16a-hydroxy-cortexo-lone en lia,16a-dihydroxycortexolone; Syncephalstrum racemosum, 25 Thamnidium elegans, Streptomyces fradiae, Sporotrichum epigaeum, Absidia glauca, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Dactylium dendioides, Heurospora sitophila, Sclerotina libertiana, Gleosporium kaki, Polysporous orientalis, Bacillus cereus, Mucor adriaticus, Pseudomonas fluoréscens, Trichothecium roseum, Phycomyces nitens, 30 Pénicillium expansum, Beauvaria bassiana, Blakeslea trispora, Cercospora melonis, Delacroixia urenata, Fusarium discolor, Glome-rella cinqulata et Calonectria décora. Exemple 4 lia,16a,17«-trihydroxyprogestérone En suivant le procédé de l'Exemple 1, mais en remplaçant le 35 sel de potassium du 16,17-cycloborate ester de 16a-hydroxy-cortexo-lone, par une quantité équivalente du sel de.sodium du 16,17-cycloborate ester de 16a,l7a-dihydroxyprogestérone, cri obtient la lia,16a, 17a-trihydroxyprogestérone. De même, en remplaçant dans l'Exemple 1 le stéroîde par le sel de potassium du 16,17-cycloborate ester du 40 substrat stéroîde indiqué et en suivant le procédé de l'Exemple, on 69 19978 9 2011080 obtient le produit stéroîde indiqué Exemple 5 10 15 20 25 30 35 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Substrat stéroîde 16a,17a-Trihydroxy-progestérone 6a-Méthyl-16a, l7ûs-dihydro-xyprogestérone 6a-Chloro-16a,17a-dihydro-xyprogestérone 6ci-Fluoro-l6a, l7a-dihydro-xyprogestérone 21-Fluoro-16a, l7a-dihydro-xyprogestérone 21-Chloro-16a,17a-dihydro-xyprogestérone 16a,17a-Dihydroxy-l-déhydroprogestérone 16a,17a-Dihydroxy-6-déhydroprogestérone 6-Fluoro-6-déhydro-16a,17a-dihydroxyprogestérone l-Déhydro-16a-hydroxy-cortexolone 6-Déhydro- 16ot-hy droxy-cortexolone 1,6-Bis-Déhydro-16ct-hydroxy-cortexolone 6a-Méthy1- 16os-hydroxy-cortexolone 6ot-Chloro-16a-hydroxy-cortexolone Produit stéroîde lia,16a,17a,21-Tétra-hydroxyprog estérone 6a-Méthyl-llcs, 16a, 17a-trihydroxyprogestérone 6«-Chloro-lla,16a,17a-trihydroxyprogestérone 6a-Fluoro-lla,16a,17a-trihydroxyproge stérone 21-Fluoro-ïla,16a,17a-trihydroxyprogestérone 21-Chloro-lla,16a,17a-trihydroxyprogestérone llafcl6a, l7a-Trihydroxy-1-déhydroprogestérone lia,16a,17a-Trihydroxy-6-déhydroprogestérone 6-Fluoro-6-déhydro-lla, 16a,17a-trihydroxypro-gestérone l-Déliydro-lla, 16a-dihy-droxy-cortexolone 6-Déhydro-lla,16a-dihy-droxy-cortexolone 1,6-Bis-déhydro-lla,16a-dihydroxy-cortexolone 6a--Méthyl-ll«, 16a-dihy-droxy-cortexolone 6c-Chloro-lla,16a-dihy-droxy-cortexolone 40 Ga-Flaoro- 16ot-hydroxy-cortexolone Exemple 20 16ofc"Hvdroxvhvdrocortisone 6«-riu.oro-lla, 16a-dihy-droxy-cortexolone 69 19978 10 2011080 On cultive Curvularia lunata (culture n° 1Î017 dans 1* American Type Culture Collection) 7 jours à 25° sur une gélose inclinée de composition suivante : Gélose 20 g 5 Glucose 10 g Extrait de levure 2,5 g K2HP04 1 g Eau distillée q.s.p.l litre Autoclavage 30 minutes à 121° 10 On utilise ce qui s'est développé à la surface de la gélose inclinée pour ensemencer 100 ml du milieu suivant s Liqueur de cornsteep 6 g NH4H2p°4 3 g Extrait de levure 2,5 g 15 Glucose 10 g CaCO^ 2,5 g Eau distillée q.s.p. 1 litre pH ajusté à 7,0 avec NaOH 2N Autoclavage 30 minutes à 121° 20 contenu dans un Erlenmeyer de 500 ml. Le flacon ensemencé est incubé 38 heures à 25° sous agitation tournante (diamètre de 5,08 cm 280 t/mn). On transporte une fraction de 5% (vol/vol) dans un deuxième flacon de 500 ml contenant 100 ml du même milieu et le deuxième flacon est incubé comme le premier. On ajoute une solution 25 du sel de potassium de 16,17-cycloborate de 16ot-hydroxy-cortexolone, préparé comme dans l'Exemple 1, pour avoir 1000pg/ml de l6«t-hydroxy-cortexolone au bout de 3 heures et on ajoute une autre fraction de solution de stéroîde au bout de 24 heures pour avoir en plus 1000 fig/ml de 16«-hydroxy-cortexolone, pour un total de 2000 -ug/ml de 30- 16a-hydroxy-cortexolone. On évalue la quantité de 16oi-hydroxy-hydrocortisone formée en ajustant une aliquote de bouillon à pH 2,5 avec de l'acide sulfuri-que dilué, en diluant au 1/6 avec de l'eau distillée, en extrayant 5,0 ml de bouillon dilué avec 2,0 ml de méthylisobutyl-cétone et en 35 soumettant l'extrait à la méthylisobutylcétone à la chromatographie sur papier. Au bout de 48 heures, la 16«-hydroxyhydrocortisone est le seul stéroîde décelable. On trouve une concentration d'environ 1500 fig de 16ct-hydroxyhydrocortisone/ml, soit environ 75% (poids/ poids) de transformation dans le milieu. 40 En suivant la méthode d1isolement dé l'Exemple 1, on obtient 69 19978 11 2011080 740 mg de 16 Par contraste, si l'on suit le procédé de l'Exemple 20, mais 5 en remplaçant le cycloborate ester par la lôas-hydroxycortexolone libre, on a trouvé que l'on pouvait utiliser une charge maximale de 300 pg/ml de 16a-hydroxy-cortèxolone et que l'on pouvait obtenir un rendement global maximal d'environ 20% après 144 heures. Exemple 21 10 En suivant le procédé de l'Exemple 20, mais en remplaçant C.lunata par Coniothvrium hellebori ATCC n° 12522 on transforme de même le 16,17-cycloborate ester de 16«~hydroxy-cortexolone en 16a-hydroxyhydrocortisone. De même, les microorganismes suivants transfermeront aussi 15 le sel de potassium du 16,17-cycloborate ester de la 16a-hydroxy-cortexolone en 16«-hydroxyhydrocortisone. Chaetomella oblonga. Dothichiza ferruginosa, Spondylochadium australe, Cunninghamella blakesleeana, Rhodoseptoria sp., Pycnospo-rium sp., Stachylidium bicolor, Botrytis cinerea. C.olletotrichum 20 phomoides. ou Corticium sasaki. 69 19978 12 2011080 REVENDICATIONS 1. Dans un procédé d'hydroxylation enzymatique en 11 d'un stéroîde de la série 16a,l7a-dihydroxy non substituée en 11 pour obtenir son dérivé 11-hydroxylé à action thérapeutique, l'amélio- 5 ration caractérisée par l'emploi comme substrat stéroîde d'un 16,17-cycloborate ester hydrosoluble d'un stéroîde de la série 16a,17a- dihydroxy non substituée en 11, 2. Le procédé de la revendication 1, caractérisé par le fait que le substrrt stéroîde est un 16,17-cycloborate ester hydroso- 10 lubie d'un stéroîde de la série 16a, 17wi-dihydroxy-prégnane non substituée en 11. 3. Le procédé de la revendication 1, caractérisé par le fait que le substrat stéroîde est un sel d'un métal alcalin d'un 16,17-cycloborate ester d'un stéroîde de la série 16a,17«-dihydroxy~3- 15 céto- A4 -prégnène non substituée en 11. 4. Le procédé de la revendication 3, caractérisé par le fait le substrat stéroîde est lljî-hydroxylé. 5. Le procédé de la revendication 4, caractérisé par le fait que la lljï-hydroxylation est effectuée en utilisant un microorga- 20 nisme de l'espèce Curvularia lunata. 6. Le procédé de la revendication 3, caractérisé par le fait que le substrat stéroîde est llcc-hydroxylé. 7. Le procédé de la revendication 6, caractérisé par le fait que la lla-hydroxylation est effectuée en utilisant un microorga- 25 nisme de l'espèce Aspergillus ochraceus. 8. Le procédé de la revendication 1, caractérisé par le fait que le substrat stéroîde est le sel de métal alcalin du 16,17-cycloborate de 16a-hydroxy-cortisone.