Brevet FR2003584A1 — publié le 19691107

La présente invention est relative à un procédé de production de L-thréonine et de L-valine et, en particulier, à un procédé de production simultanée de ces composés par fermentation. Encore plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de production simultanée de L-thréonine et de L-valine par fermentation, dans lequel on cultive des microorganismes utilisant des hydrocarbures. La L-thréonine et la L-valine sont des aminoacides importants, par exemple dans le domaine de la nutrition. On connatt déjà des procédés de production par fermentation dans lesquels on obtient l'accumulation de quantités importantes des substances recherchées en utilisant des mutants ayant des exigences nutritives diverses et en réglant le métabolisme de ces microorganismes. Récemment, on a mis au point des processus de fermentation dthydrocarbures donnant certains genres de produits par culture de microorganismes en utilisant du kérosène comme source de carbone. La production d'aminoacides à partir d'hydrocarbures par fermentation a fait ltobjet dtune étude.Toutefois, un procédé permettant d'obtenir l'accumulation simultanée de quantités notables de L-thréonine et de L-valine à partir d'hydrocarbures n'a jamais été décrit dans la technique antérieure. La présente invention a donc pour objet - un procédé de production de L-thréonine et de L-valine qui ne présente pas les inconvénients et les insuffisances des procédés de la technique antérieure; - un procédé de production simultanée de L-thréonine et de L-valine par fermentation, qui peut être mis en oeuvre d'une manière efficace et relativement simple, ce procédé pouvant être mis en oeuvre avantageusement à grande échelle, à peu de frais, tout en permettant d'obtenir les produits recherchés avec un rendement élevé; - l'obtention de L-thréonine et de L-valine. Ces caractéristiques et avantages de la présente invention ainsi que d'autres apparaitront aux techniciens à la lecture de la description et des revendications qui vont suivre. Conformément à la présente invention, on a constaté que des quantités notables de L-thréonine et de L-valine peuvent etre produites simultanément à partir d'hydrocarbures, par fermentation de mutants ayant certaines exigences nutritives et obtenus à par tir de microorganismes utilisant des hydrocarbures.On a constaté que des mutants exigeant de l'isoleucine, de l'acide &alpha;-cétobuty- rique ou de acide &alpha; -aminobutyrique, et qui sont dérivés des souches Àrthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclas- tus et Brevibacterium ketoglutamicum sont spécialement avantageux dans la présente invention.Les mutants particulièrement préférés pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention comprennent le mutant Ârthrobacter paraffineus KY4303-H821 (ATCC 21220) (qui exige de l'isoleucine, de l'acide &alpha;-cétobutyrique ou de l'acide c(-aminobutyrique), obtenu par irradiation aux rayons ultra-violets du microorganisme Ârthrobacter paraffineus KY4308 (ATCC 15591), le mutant Corynebacterium hydrocarboclastus KY4309-H1213 (ATCC 21221) (qui exige de l'isoleucine, de l'acide &alpha;-cétobutyrique ou de l'acide &alpha; -amino-butyrique), obtenu par irradiation au Cobalt 60 de Corynebacterium hydrocarboclastus KY4309 (ATCC 15592) et le mutant Brevibacterium ketoglutamicum KY4305-H1223 (ATCC 21222) (qui exige de l'isoleucine, de l'acide &alpha;-cétobutyrique ou de l'acide o(-aminobutyrique), obtenu par irradiation aux rayons ultra-violets de Brevibacterium ketogluta- micum KY4305 (ATCC 15588).- Les souches utilisées dans la présente invention peuvent être cultivées dans un milieu de culture synthétique aussi bien que dans un milieu nutritif naturel, à condition que le milieu choisi contienne les éléments nutritifs essentiels pour le développement de la souche utilisée.De tels éléments nutritifs sont bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'urne source de carbone, une source dtazote, des composés minéraux etc... qui sont utilisés par le microorganisme choisi en des quantités appropriées. Conformément à la présente invention, on utilise un hydrocarbure comme source de carbonate principale, Un tel hydrocarbure comprend les paraffines à chatne droite et à channe ramifiée (alcanes) ayant 10 à 20 atomes de carbone, comme le n-décane, le n-dodécane, le n-hexa- décante, le n-éicosane, e-tc., ainsi que leu-rs mélanges et des hydrocarbures mixtes tels que le kérosène, les huiles légères, les huiles lourdes, les huiles paraffiniques, etc. Le rendement en L-thréonine et en L-valine est spécialement élevé quand on utilise des n-paraffines ayant 13 à 18 atomes de carbone. Le milieu de fermentation peut contenir, en plus de l'hydro- carbure, de petites quantités d'autres sources de carbone telles que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le mannose, le galactose, l'amidon, un hydrolysat d'amidon, des mélasses, etc.., ou toute autre source de carbone appropriée comme des acides organiques, par exemple l'acide acétique, l'acide lactique, etc. La source de carbone peut Btre constituée par une substance unique ou par un mélange d'un nombre quelconque de substances. La source d'azote peut dtre choisie parmi de nombreux sels ou composés minéraux ou organiques, comme une solution d'ammoniaque ou les sels d'ammonium tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate dJammonium, le nitrate dtammonium, l'acétate d'ammonium, le phos- phate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, etc., ou parmi des substances naturelles contenant de l'azote comme la liqueur de macération du mais, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, un hydrolysat de caséine, un acide aminé de la caséine, des matières solubles du poisson, un extrait d'enveloppes de grains de riz, etc. Là encore, on peut utiliser une seule de ces substances, ou un mélange comprenant un nombre quelconque d'entre elles. Les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate acide disodique, le phosphate monopotassique, le sulfate ferreux, le chlorure de manganèse, le sulfate de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, etc. Les souches qu'on peut utiliser dans la présente invention exigent de la thiamine et de l'isoleucine, de l'acide g-cétobuty- rique ou de l'acide $-aminobutyrique pour leur croissance. Par conséquent, des quantités appropriées de telles substances doivent être ajoutées au milieu. Des quantités appropriées sont comprises entre 1 et 5 mg/litre pour la thiamine et habituellenent entre 5 et 50 milligrammes/litre pour l'isoleucine, l'acide ct-cétobutyrique ou l'acide -aminobutyrique. L'addition d'un excès d'un élément nutritif tel que l'isoleucine et un composé analogue inhibe la production de thréonine et de valine.Etant donné que des substance telles qu'un extrait de viande, un extrait de levure, la liqueur de macération du mats et des produits analogues contiennent de tels éléments nutritifs, ces substances peuvent constituer la totalité ou une partie de la source des éléments nutritifs requis. Les microorganismes sont soumis à la fermentation ou à la culture en aérobie, par exemple par secousse aérobie de la culture ou par agitation et aération d'une culture submergée, à une température comprise par exemple entre environ 20 et 400C et à un pH compris par exemple entre environ 5 et 9. Il est désirable de maintenir un pH sensiblement neutre (pH 7) pendant la culture et, Si le pH diminue au cours de cette culture, on peut ltajuster en ajoutant au milieu des substances telles que le carbonate de calcium, une aolu- tion d'ammoniaque, du carbonate d'ammonium, de la soude caustique, etc. Après environ 2 à 5 jours de culture dans de telles conditions, on constate que de grandes quantités de L-thréonine et de L-valine sont accumulées dans la liqueur de culture résultante. Lorsque la culture est terminée, on sépare les cellules de microorganismes et on récupère ensuite la L-thréonine et la L-valine dans la liqueur de culture par un procédé classique tel qu'un traitement par une résine échangeuse d'ions, une extraction par un solvant, une précipitation, l'absorption, la chromatographie ou un procédé analogue. On préfère un traitement par une résine échangeuse d'ions et un tel procédé est décrit dans l'exemple 1 ciaprès. On constate également que la fermentation détermine l'accumu lation d'acide M -cétoglutarique, d'ac-ide glutamique, diacide as- partique, de leucine, de sérine, d'alanine, etc.., dans la liqueur cultivée. Toutefois, ces substances ntont pas d'effet notable sur le rendement des produits désirés conformément à la présente invention. Les exemples qui suivent sont donnés uniquement à titre indicatif et non limitatif de la portée de la présente invention. Sauf mention contraire, les pourcentages seentendent en poids par litre d'eau. Exemple 1 Le microorganisme est la souche Arthrobacter Daraffineus KY4303-H821 (ATCC 21220). On le cultive en aérobie, tout en secouant, dans un milieu constitué par un bouillon, à 300C, et pendant 24 heures. On inocule la culture d'ensemencement résultante, dans une proportion de 5% en volume, dans 20 ml d'un milieu de fermentation stérilisé au préalable qui est placé dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml pourvue d'une plaque déflectrice pour empêcher les projections.La composition du milieu de fermentation est la suivante Mélange de n-paraffines (C11 -Cl8) (NH4) 2S04 2% KH2PO4 0,1% Na2HP04, 1 2H2 MgS04,7H20 0,01% Fe8O4, 7H20 0,002% MnSO4, 4H2O 0,002% Thiamine 1 mg/litre L-isoleucine 10 mg/litre CaCO3 (ajouté après avoir 2% été stérilisé à sec séparément) Le milieu de fermentation est au pH 7. On procède ensuite à la culture en aérobie avec secousses, à 28 0C. Après 4 jours de culture, les quantités de L-thréonine et de L-valine accumulées dans la liqueur de culture, déterminées par un procédé de titrage biochimique, sont respectivement de 7,5 mg/ml et de 12,6 mg/ml. Lorsque la culture est achevée, on filtre la liqueur résultante en vue d'en séparer les cellules de microorganismes. On ajuste 1 litre du filtrat ainsi obtenu (7,5 g/l de L-thréonine et 12,6 g/l de L-valine) au pH 2 en ajoutant de l'acide chlorhydrique, et on le fait passer à travers une colonne de résine échangeuse d'ions Diaion SK-1" (type H). On lave la colonne de résine avec de l'eau etXon ltélue ensuite avec une solution d'ammoniaque 1N. On recueille les fractions donnant une réaction positive à la ninhydrine et on les concentre sous pression réduite au-dessous de 50 C, en vue d'éliminer l'ammoniaque.On ajoute du carbonate de cuivre à la solution concentrée et on fait passer la solution de sels de cuivre d'aminoacides résultante après ébullition et dissolution à travers une colonne de résine échangeuse d'ions "Diaion SA-21Aw (type OH). Le produit effluent est le sel de cuivre de la L-valine. Après avoir lavé à l'eau la substance adsorbée, on l'élue avec de acide chlorhydrique 0t5N, ce qui donne des fractions ayant une réaction positive à la ninhydrine, à savoir une solution de sel de cuivre de la L-thréonine. On élimine le cuivre des deux solutions de sels de cuivre des amino-acides et on décolore les solutions avec du charbon0 On concentre la solution résultante sous pression réduite et on y ajoute de l'alcool éthylique. On obtient ainsi 5 g de cristaux bruts de L-thréonine et 7,1 g de cristaux bruts de L-valine. EXEMPLE 2 Les microorganismes utilisés sont les souches Arthrobacter naraffineus KY4303-H821 (ATCC 21220), Corynebacterium hydrocarboolastus KY 4309-H1213 (ATCC 21221) et Brevibacterium ketoglutamicum Ki 4305-H1223 (ATCC 21222). La culture est conduite de la même manière que dans l'exemple 1, à cette exception que la source de carbone est constituée par 10% de divers hydrocarbures (donnés dans le tableau 1). Les quantités de L-thréonine et de L-valine accumules dans la liqueur de culture après 4 Jours de culture sont données dans le tableau 1, en mg par ml de liqueur de culture. TABLEAU 1 Source de Sthrobacter Corynebacterium Brevibacte- carbone naraffineus hydrocarboclastus rium keto glutamicuni KY4303-H821 KY4309-H1213 KY4305-H1223 ATCC 21220 ATCC 21221 ATCC 21222 Thr. Val. Thr. Val. Thr. Val. n-undécane 1,0 2,1 1,8 3,0 1,5 2,8 n-dodécane 4,8 6,5 4,5 6,2 8,5 6,2 n-tridécane 6,2 10,2 6,8 9,5 5,6 7,6 n-tétradécane 8,0 12,6 7,5 10,6 7,2 9,8 n-pentadécane 7,2 12,8 7,2 10,0 n-hexadécane 8,0 11,8 7,0 10,2 7,0 8,8 n-heptadécane 7,5 12t3 7,5 11,0 7,0 9,6 n-octadécane -7,0 12,5 7t0 9,8 6,5 8,8 Mélange de n-paraffines 7,8 12,6 7,2 10,5 7,0 10,2 (Cll-C18) kérosène 2,5 3,8 2,6 4,0 2,4 4,0 huile légère 1,2 2,0 1,0 1,5 1,2 2,0 Thr s L-thréonine Val t L-valine. EXEMPLE 3 Le microorganisme (Arthrobacter naraffîneus ATCC 21220) le milieu de culture et le mode de culture sont les mêmes que dans exemple 1. Après 48 heures de culture, on ajoute 5 ng/ml de L-homosérine ou d'acides organiques tels que l'acide acétique, ltaci- de succinique, l'acide malique, etc. (comme on le voit dans le tableau 2) et on continue ensuite la culture. Les quantités des deux amino-acides accumulées dans les liqueurs de culture résultantes, après 4 Jours, sont données dans le tableau 2. TABLEAU 2 Composés ajoutés L-thréonine L-valine (mg/ml) (mg/ml) Néant 7,1 10,5 '-homosérine 10,3 10,0 Acétate de sodium 10,0 10,0 Citrate de sodium 9,8 10,7 Succinate de sodium 9,1 11,3 Fumarate de sodium 9,5 11,3 L-nalate de sodium 10,5 11,3 Il ressort du tableau 2 que ltaddition de L-homosérine, diacides organiques tricarboxyliques (ou de sels sodiques de ces acides) augmente le rendement en L-thréonine et en L-valine dans la plupart des cas. Ainsi, dans un autre mode de mise en oeuvre de linvention, l'addition au milieu de composés tels que la L-homosérine, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide succinique, l'acide fumarique ou l'acide malique permet d'augmenter le rendement on amino-acides désirés. fl est bien évident quton peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de L-thréonine et de L-valine, caractérisé par le fait qu'un microorganisme utilisant un hydrocarbure et exigeant de l'isoleucine, de l'acide &alpha;-cétobutyrique, ou de l'acide -aminobutyrique pour sa croissance, est cultivé en aérobiet au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme source de carbone principale, la L-thréonine et la L-valine s'accumulant dans la liqueur de culture résultante. 20 Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la culture est effectuée entre environ 20 et 40.c et à un pH d'environ 5 à 9. 3. Procédé conforme à la revendication 1 dans lequel le microorganisme est Arthrobacter Saraffineus (ATCC 21220). 4. Procéda conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 2122t > 0 5. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Brevibacterium ketoglutamicum (ATCC 21222) 6. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel l'hydrocarbure précité est un hydrocarbure aliphatique ayant 10 à 20 atomes de carbone. 7e Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel lthydrocarbure est une n-paraffine ayant 13 à 18 atomes de carbone. 8. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on ajoute au milieu environ 5 à 50 mg/l des éléments nutritifs nécessaires à la croissance du microorganisme. 9. Procédé conforme à la revendication 8, dans lequel on ajoute en outre environ 1 à 5 mg/l de thiamine au milieu0 100 Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le pH est maintenu à environ 7 pendant la culture. 11. Procédé conforme à la revendication i, dans lequel on ajoute au milieu de la L-homosérine ou un acide organique tricarboxylique ou encore un sel sodique d'un tel acide. 12. Procédé conforme à la revendication 1 dans lequel l'acide organique précité est l'un des acides acétique, citrique, succinique, fumarique et malique 13. Procédé de production simultanée de L-thréonine et de L-valine, qui cansiste à cultiver Arthrobacter paraffineus ATCC 21220, Corvnebaoterium hydrocarboclastus ATCC 21221 ou Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222, en aérobie entre 20 et 4oc et à un pH d'environ 6 à 9, au sein dtun milieu nutritif aqueux contenant un ou plusieurs hydrocarbures comme source de carbone principale, à laisser la L-thréonine et la L-valine stac- cumuler dans la liqueur de culture de résultante etw enfin, à récupérer la L-thréonine et la L-valine dans cette culture. 14. Procédé conforme à la revendication 13, dans lequel l'hydrocarbure précité est une n-paraffine ayant 13 à 18 atomes de carbone. 15. Procédé conforme à la revendic-ation 13, dans lequel l'hydrocarbure est le kérosène. 16. Procédé conforme à la revendication 14, dans lequel on ajoute au milieu environ 5 à 50 mg/litre d'isoleuoine, diacide &alpha;-cétobutyrique ou d' acide ds-aminobutyrique; 17. Procédé conforme à la revendication 16, dans lequel on ajoute également au milieu 1 à 3 mg/litre de thiamine. 18. Procédé conforme à la revendication 14, dans lequel on ajoute au milieu de la L-homosérine ou un acide organique tricarboxylique ou encore un sel sodique d'un tel acide. 19. Procédé conforme à la revendication 15, dans lequel acide organique tricarboxylique est l'un des acides acétique, citrique, succinique, fumarique ou-malique.