Brevet FR2012409A1 — publié le 19700320

-i- 2012409 La présente invention concerne des réactifs de la cyanméthé-moglobine contenant du ferricyanure et du cyanure, utilisés dans la détermination photométrique de l'hémoglobine du sang, et plus particulièrement un réactif formulé à sec utilisant un desséchant 5 macromoléculaire soluble dans l'eau, comme la polyvinylpyrrolidone, afin d'améliorer sa résistance à la lumière, à la chaleur et au froid, et au vieillissement. le sang des êtres humains et des animaux fournit un dérivé stable d'hémoglobine, la cyanméthémoglobine, dans une solution al-10 câline aqueuse contenant du ferricyanure et du cyanure. Le ferri-cyanure oxyde le fer d'hémoglobine de l'état ferreux à l'état fer-rique pour former la méthémoglobine, qui réagit ensuite avec le cyanure pour former la cyanméthémoglobine. Lorsqu'on le mesure spectrophotométriquement à 54-0 millimicrons, le pigment rouge du 15 produit réactionnel est proportionnel à la concentration d'hémoglobine de l'échantillon en cours d'analyse. Cette détermination, de processus classique de Drabkin, est largement utilisée dans les laboratoires de diagnostics médicaux et les équipements d'essais biologiques. 20 Les réactifs habituels de la cyanméthémoglobine sont sensibles à la lumière et à la fois à la chaleur et à la congélation. En outre, ils ont tendance à se détériorer spontanément avec le vieillissement. Pour ces raisons, il est nécessaire de les préparer, de les transporter et de les emmagasiner avec de grandes précautions. 25 Même lorsqu'ils sont traités à sec dans des conditions de lumière réglées, empaquetés dans des récipients opaques ou colorés, et emmagasinés en chambre froide, ils présentent une vie de magasinage inférieure à quatre mois. Normalement, en raison des conditions exactes du processus photométrique, la possibilité d'une détériora-50 tion les rend non sûrs pour une application clinique après deux ou trois mois seulement. Lorsqu'ils sont exposés à la lumière ou qu8on les laisse reposer à la température ambiante, ils se dégradent au delà d'une limite d'utilité en 24 heures. L'explication de l'instabilité et de la sensibilité observées 55 de ces réactifs n'est pas évidente; cependant, on sait qu'ils présentent une nature hygroscopique marquée; et on suppose que leur absorption d'humidité ou bien provoque ou bien accélère le processus de dégradation. Les techniques bourantes de dessiccation, comme le chauffage 69 22854 -2- 2012409 des réactifs eux-mêmes, la déshumidification de la zone d'jsiumaga-sinage, et l'utilisation de matières déliquescentes dans le récipient de réactif se sont révélées être peu pratiques et inefficaces sous forme de solutions à ce problème embarrassant et coûteux. 5 On a constaté qu'on peut obtenir un degré élevé de stabilité et de résistanc.e à l'influence de la lumière, aux températures élevées et basses et au vieillissement en formulant et traitant le réactif de la cyanméthémoglobine classique avec certains desséchants solubles dans l'eau ayant une structure macromoléculaire et 10 un poids moléculaire moyen d'environ 10.000. Le polyacrylamide, la gélatine, la dextrine, les sels cellulosiques de métaux alcalins solubles, et les dérivés d'alcools polyvinyliqu.es hydrolysés sont des exemples de ces matières; cependant, on a obtenu les résultats peut-être les plus remarquables avec la polyvinylpyrrolidone, qui 15 présente un poids moléculaire moyen d'environ 60.000. On a peu de renseignements au sujet du mécanisme par lequel ces matières stabilisent le réactif. Une mise en évidence expérimentale indique que dans le procédé de traitement, leurs molécules relativement énormes permettent d'envelopper et d'enfermer le fer-20 ricyanure et le cyanure granulaires. Quel que soit le mécanisme impliqué, le but de la présente invention est de fournir un réactif de la cyanméthémoglobine formulé à sec qui résiste à la lumière, à la chaleur et au froid, et au vieillissement. 25 Les Exemples suivants sont donnés à titre illustratif, mais non limitatif, de l'invention. EXEMPLE 1 On prépare un réactif anhydre ayant la composition suivante : 50,0 g de polyvinylpyrrolidone 30 50,0 g de NaHCO^ 9,9 g de K^fPeC 2,6 g de KCN On broie la polyvinylpyrrolidone sous forme de poudre, et on en mélange intimement environ 4-5 g avec le bicarbonate de potas™ 35 sium en poudre. On mélange séparément le reste de la polyvinylpyrrolidone avec le cyanure de potassium sous forme finement granulaire. A la fin de ce mélange, on remarque lors d'un examen approfondi que les granules de cyanure normalement légèrement humides sont sensiblement recouverts d'une mince couche relativement uni 69 22854 -3- 2012409 forme de polyvinylpyrrolidone et présentent un caractère tassé notablement réduit. Le ferricyanure de potassium est ensuite combiné et mélangé avec le mélange de polyvinylpyrrolidone et de bicarbonate de potassium préalablement mixtionné, et la charge résul-5 tante est mélangée avec le cyanure revêtu pour former un produit sensiblement homogène. Ce réactif est transféré dans un récipient en verre de couleur ambre et emmagasiné à la température ambiante. Pendant une période de presque quatre années, on prélève au hasard des échan-10 tillons dans le récipient pour former des solutions aqueuses et les utilise dans la détermination de cyanméthémoglobine photométrique habituelle de l'hémoglobine dans des étalons témoins de sang humain lyophylisé. Dans toutes ces déterminations, les résultats se situent dans des limites acceptables, et le réactif ne ré-15 vêle pas de perte de son pouvoir. Il n'existe pas non plus de trace de noircissement du réactif anhydre qui est associé à une détérioration. EXEMPLE 2 On prépare un réactif anhydre ayant la composition suivante : 20 22,4 g de polyvinylpyrrolidone 50,4 g de NaHCO 10,0 g de K^PeCCN)^ 2,6 g de KCN On suit le processus de l'Exemple 1 dans la préparation de 25 cette matière, excepté qu'on combine environ 20 g de la polyvinylpyrrolidone initialement avec le bicarbonate, et les 2,4 g restants sont utilisés pour revêtir les granules de cyanure avant le mélange final de la masse entière. •RTRMPT/E ? 30 On prépare un réactif anhydre ayant la composition suivante s 50,0 g de polyvinylpyrrolidone 50,0 g de NaHCO^ 10,0 g de K5/-Fe(010^7 2,6 g de KCN 35 On suit également le processus de l'Exemple 1 pour la prépa ration de cette matière. On emmagasine les réactifs des Exemples 2 et 3 dans des bouteilles en verre de couleur ambre sur des étagères de laboratoires à l'air à la température ambiante pendant des durées dépassant 18 69 22854 2012409 mois, sans qu'il se produise de signe d'altération de couleur ou de dégradation. On irradie des échantillons prélevés à partir de ces deux bouteilles pendant deux semaines sous une exposition directe à 5 une lampe électrique émettant une lumière ultraviolette dans la gamme de 2800 à 3200 unités Angstrom. Simultanément, on irradie sous la même lampe un- échantillon témoin d'une charge fraîchement préparée de réactif ordinaire de Drabkin sensiblement identique à la matière des Exemples 2 et 3, excepté qu'on n'utilise pas la 10 polyvinylpyrrolidone. Les deux premiers échantillons restent inchangés en ce qui concerne leur couleur, alors que le troisième est noirci fortement. Le traitement d'échantillons de cette manière est à peu près équivalent à l'exposition normale à la lumière des mêmes ma-15 tières lorsqu'elles sont soumises en laboratoire dans des conditions normales en six mois à un an. Des échantillons supplémentaires prélevés à partir de matières traitées par la polyvinylpyrrolidone des Exemples 2 et 3 et un échantillon témoin de réactif de Drabkin ordinaire sans poly-20 vinylpyrrolidone sont placés dans un incubateur et maintenus à 37°C pendant deux semaines. L'échantillon non traité noircit rapidement, alors que les échantillons traités restent inchangés du point de vue de la couleur» 25 Les échantillons de réactif traité qui ont été irradiés par la lumière ultraviolette et ceux qui ont été incubés sont préparés en solutions et utilisés dans des essais de détermination de l'hémoglobine sur des étalons d'hémoglobine témoins. Dans tous les cas, les résultats se situent dans des limites acceptables. 30 Des échantillons prélevés à partir des réactifs traités des Exemples 2 et 3 sont préparés en solutions et emmagasinés pendant deux semaines à 4°C, à la température ambiante et à 37°C. On effectue ensuite des mesures de la densité optique sur chacun de ces échantillons entre 220 millimicrons et 450 millimicrons sur 35 un spectrophotomètre d'enregistrement. Tous les échantillons présentent une stabilité remarquable et se révèlent tout à fait utiles pour déterminer la teneur en hémoglobine du sang. Il est bien connu que le réactif ordinaire de la cyanméthémoglobine en solution ne peut pas êtr-e maintenu à la température 69 22854 -5- 2012409 ambiante, très inférieure à 37°C, pendant des périodes atteignant même 24 heures sans déplacement spectral du pouvoir absorbant. Finalement, les solutions de réserve du réactif de Drabkin contenant des quantités de polyvinylpyrrolidone comprises entre 5 1,25 et 22,5 % en poids de matières solides sont préparées dans des fioles de polyvinyle, sont congelées et maintenues à -20°C pendant 12 heures. Au bout de ce temps, on les retire de la chambre froide et les laisse atteindre l'équilibre naturellement jusqu'à 25°C. Les pouvoirs absorbants de ces échantillons congelés 10 et des échantillons de référence non congelés sont alors enregistrés à 4-20 millimicrons. Il est bien établi que le réactif de la cyanméthémoglobine ordinaire non traité subit un déplacement important dans le pouvoir absorbant lors de la congélation et du dégel. Les résultats 15 de cet essai démontrent clairement, dans des conditions simulant une application réelle, que le même réactif traité avec une proportion aussi faible que 6 % en poids de polyvinylpyrrolidone est cryostable et conserve son utilité même après la congélation et le dégel. 20 En résumé, il a été démontré que l'addition d'une proportion aussi élevée que 50 % en poids d'un desséchant macromoléculaire soluble dans l'eau au réactif courant de cyanméthémoglobine de Drabkin a peu ou pas d'effet sur ses caractéristiques d'absorption ou son utilité pour la détermination phatométrique de l'hémo-25 globine du sang. Le traitement de ce réactif avec les matières de cette classe, comme la polyvinylpyrrolidone, augmente nettement sa stabilité et sa résistance à la lumière, à la chaleur et au froid, et au vieillissement sous sa forme anhydre et en solution». En outre, la présence d'une proportion aussi faible que 6•% de 30 ces matières fournit efficacement une protection pour le réactif autrement très instable dans des conditions de congélation. 69 22854 -6- 2012409 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un réactif formulé à sec, stable contenant du bicarbonate, du ferricyanure et du cyanure, à utiliser pour la détermination photométrique de 1'héméglobine du sang, 5 caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger le cyanure avec une quantité suffisante d'un desséchant macromoléculaire soluble dans l'eau pour recouvrir sensiblement les granules de cyanure d'un revêtement mince relativement uniforme du desséchant; à mélanger le bicarbonate avec 50 à 100 % environ de son poids du même dessé 10 chant; à combiner et mélanger le ferricyanure avec le mélange préalablement préparé de bicarbonate et de desséchant; et à combi ner et mélanger le mélange préalablement préparé de ferricyanure," de bicarbonate et de desséchant avec le cyanure revêtu de desséchant préalablement préparé pour former un produit sensiblement 15 homogène. 2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le bicarbonate est le bicarbonate de sodium, le ferricyanure est le ferricyanure de potassium, le cyanure est le cyanure de potassium, et le desséchant macromoléculaire est choisi parmi la poly- 20 vinylpyrrolidone, les polyacrylamides, la gélatine, la dextrine, les sels de métaux alcalins de la cellulose, et les dérivés d'alcools polyvinyliques hydrolysés. 3. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le desséchant macromoléculaire soluble dans l'eau est la poly- 25 vinylpyrrolidone. 4. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que les constituants comprennent environ : 50 g de bicarbonate. 5. Réactif de la cyanméthémoglobine, stabilisé à l'égard des effets nuisibles de la lumière, de la chaleur et du froid, et du vieillissement, caractérisé en ce qu'il comprend : un cyanure ; et : un desséchant macromoléculaire "soluble dans l'eau. 6. Réactif selon la Revendication 5» caractérisé en ce que le desséchant est choisi parmi la polyvinylpyrrolidone', les poly- 30 10 g de ferricyanure ; 2,5 g de cyanure ; 25 à 50 g de desséchant macromoléculaire ; et : 35 un ferricyanure ; 69 22854 -7- 2012409 acrylamides, la gélatine, la dextrine, les sels de métaux alcalins de la cellulose, et les dérivés d'alcools polyvinyliques hydroly-sés. 7. Réactif selon la Revendication 5> caractérisé en ce que le 5 desséchant est la polyvinylpyrrolidone. 8. Réactif selon l'une quelconque des Revendications 5S 6 et 7, caractérisé en ce que le ferricyanure est le ferricyanure de potassium ou le ferricyanure de sodium; le cyanure est le cyanure de potassium; et le réactif comprend également du bicarbonate de 10 potassium ou du bicarbonate de sodium. 9. Réactif selon la Revendication 8, caractérisé en ce que les constituants sont présents dans les proportions approximatives suivantes : 10. Réactif selon la Revendication 8, caractérisé en ce que les constituants comprennent approximativement : 15 8,9 % - 11,4 % de ferricyanure ; 2,1 % - 2,4 % de cyanure ; 28,6 % - 44,5 % de desséchant macromoléculaire ; et ; 44,5 % - 57>6 % de bicarbonate» 20 10 g de ferricyanure ; 2,5 g de cyanure ; 50 g de desséchant macromoléculaire ; et 50 g de bicarbonate.