Brevet FR2005168A1 — publié le 19691205

i 2005168 L'invention se rapporte à de nouveaux dérivés de synthèse de l'agarose en vue de l'application en chromatographie d'échange ionique. Les dérivés synthétisés peuvent être utilisés, entre autres, pour l'étude et la séparation des protéines de diverses origines, des enzymes et en chromatographie des cations minéraux etc .. On connaît des produits semblables, mais qui ont été obtenus en partant de cellulose et qui sont destinés aux mêmes buts. En réalisant de nouveaux échangeurs ioniques acides de force moyenne, la présente invention étend la gamme des produits utilisables dans l'analyse chromatographique. Le procédé d'obtention des dérivés, conformément à l'invention, consiste dans l'introduction du groupement phosphate (P) soit dans la molécule d'aga-rose comme telle, soit dans la molécule d'agarose liée transversalement par des ponts glycériques. Deux modes de mise en oeuvre de l'invention sont donnés ci-après pour illustrer l'invention. EXEMPLE 1 - On introduit 10 g d'agarose dans 35 ml de solution d'hydroxyde de sodium 10 N refroidie à environ 0°C. On homogénéise avec une baguette pendant 60 minutes, ajoute en homogénéisant toujours 5 ml d'eau et porte la masse obtenue et le récipient au bain d'eau à 25-30°C. On ajoute ensuite goutte-à-goutte, pendant 40-60 minutes, 8 ml d'oxychlorure de phosphore dissous dans 16 ml d'éther éthylique, en mélangeant la masse réactionnelle avec une baguette de verre. Si la réaction est trop violente, on interrompt l'introduction d'oxychlorure de phosphore pendant un certain temps, en surveillant la température qui ne doit pas dépasser 30-35°C. A la fin de la réaction, on met le produit obtenu en suspension dans 200 ml d'eau refroidie autour de 3-4°C. La suspension ainsi obtenue est soumise à la centrifugation, on lave encore une fois avec 200 ml d'eau refroidie, puis deux fois avec de l'étha-nol à 60% toujours par centrifugation, on déshydrate par l'éthanol et/ou acétone et lfon sèche. On obtient 1Q g de phosphate-agarose (P-agarose) sous forme d'une poudre blanche avec un contenu en phosphore avois-inant 0,6 milliequivalent/g. EXEMPLE 2 - On répète le premier exemple en utilisant l'agarose liée transversalement par des ponts glycériques (agarose X - 7.5 de granulométrie 50-100 mesh). Après la fin de la réaction, on lave par décantation avec beaucoup d'eau distillée jusqu'à réaction neutre et l'on procède à la déshydratation avec l'éthanol et/ou l'acétone sur l'entonnoir. On obtient 10 g phosphate-agarose liée croisé (P-agarose X) d'un blanc parfait, renfermant environ 0,3 milli- BAD 69 09231 2 2005168 equivalent/g de phosphore. Dans les exemples mentionnés, on peut faire varier les quantités d'oxychlorure de phosphore ajoutées au mélange réactionnel en obtenant ainsi des produits qui diffèrent entre eux par leurs propriétés physico-chimiques et 5 mécaniques. On doit rappeler cependant que l'on ne peut ajouter 1'oxychlorure de phosphore en plus grande quantité qu'à l'agarose liée transversalement car l'agarose simple donnerait des produits de plus en plus solubles dans 1'eau. Les dérivés obtenus en partant de l'agarose simple selon la présente 10 invention, sont solubles à chaud et donnent par refroidissement des gels qui peuvent être transformés en granules (perles) d'après des méthodes connues dans la littérature. Les dérivés obtenus selon la présente invention, en partant de l'agarose liée transversalement sont insolubles dans des solutions aqueuses même à 15 chaud. Pour obtenir des particules d'une certaine dimension, leurs gels sont d'abord broyés mécaniquement, puis déshydratés et tamisés sélectivement pour l'isolation des fractions avec la granulométrie désirée. La présente invention offre l'avantage de fournir, par l'introduction du groupement phosphate dans la molécule simple ou liée transversalement de 20 l'agarose, de nouveaux échangeurs d'ions acides de force moyenne qui, grâce à la bibasicité de leur groupement actif, se prêtent surtout à l'analyse chromatographique des protéines basiques et à la chromatographie des cations minéraux. BAD origine 69 09231 3 2005168 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation des dérivés d'agarose en vue de l'application en chromatographie d'échange ionique, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire le groupement phosphate soit dans la molécule d'agarose comme 5 telle, les dérivés obtenus mis en solutions préparées à chaud donnant par refroidissement des gels échangeurs d'ions, soit dans la molécule d'agarose liée transversalement par des ponts glycériques, les produits formés étant insolubles dans les solutions aqueuses et pourvus de propriétés d'échange ionique. 10 2. Procédé de préparation des dérivés d'agarose selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter l'agarose en milieu alcalin par l'oxychlorure du phosphore dissous dans l'éther éthylique à une température de 30°C environ. 3. Procédé de préparation des dérivés de l'agarose selon la revendica-15 tion 1, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter en milieu alcalin l'agarose liée transversalement par l'oxychlorure du phosphore dans l'éther éthylique à une température de 30°C environ. 1 BAD ORIGINAL