Brevet FR2007270A1 — publié le 19700102

La présente invention a pour objet des procédés de préparation de seco-stéroTdes optiquement actifs. Les stéroïdes produits par synthèse totale à partir de composés chimiques relativement simples, comme décrit, par exemple, par Smith et ses, / dans otaR y Synthetic Steroid Hormones" hart II, J. Chem. Soc. (1964), pages 4472-4492, formentldes racémates, si pendant la synthèse on ne procède à aucun dédoublement. En utilisant une conversion approuvée par Fieser & Fieser, "SteroIds" page 336 (1959) > les composés appelés formes d ou destrogyres sont des énantiomères dont la configuration en C-13 correspond à celle de l'hormone oestrone naturell Les énantiomorphes correspondants sont par conséquent appelés formes 1, et les racémates formes d1. Etant donné que des effets hormonaux supposés intéressants ont été attribués eseentiellement à la série dextrogzre, les techniques dirigées vers la formation de ces composés présentent un grand intérêt. Comme cela est bien connu, la forme dextrogyre d'un stéroïde hormonal complet peut autre préparée en partant de la forme dextrogyre d'un intermédiaire approprié dans la svnthèse à plusieurs stades. ,'ollaborateurs Gibian et seaZ ontdécrit la formation de seco-stéroïdes optiquement actifs par un processus microbiologique utilisant une levure du genre Saccharomyces dans "Tetrahedron Letters" n 21. pages 2321 - 2330 (1966) Le même genre de micro-organisme collaborateurs est également mentionné et dans le même but par Rufer et ses/ dans "Liebigs Ann. Chem." 722, pages 141 - 148 (1967). La demanderesse a maintenant trouvé qu'on peut réaliser des réductions semblables à l'aide d'autres micro-organismes. Selon la présente invention, un procédé pour préparer une d-17bêta-hydroxy-8,14-secogona-tétraen-14-one, comprend une ré réduction asymétrique d'une 8,1 4-secogona-tétraène-1 4, 17-dione, en soumettant le composé à l'activité réductrice d'un micro-organisme du genre Cryptococcus, Rhodotorula, ou Torulopsis. Le procédé consiste én gros à réduire par fermentation des seco-stéroïdes choisis en utilisant des micro-organismes spécifiques du genre Cryptococcus, Rhodotorula, et Torulopsis ou les enzymes produits à partir de ces micro-organismes. Les organismes utilisés de préférence sont cryptococcus laurentil, Rhodotorula glutinis et Torulopsis utilis, tels que les souches appelées Cryptococcus laurentii QM-8412 (classée auparavant sous le nom de Rhodotorula aurea), Rhodotorula glutinis, ATCC 10 788 et Torulopsîs utilis NRRL Y-900, ou leurs préparations enzymatiques. Les 8,14-secogona-tétraène-14,17-diones agissant comme substrat ont de préférence la formule suivante dans laquelle R et R1 représentent chacun des groupes alkyle tels que des groupes alkyle inférieur contenant jusqulà 6 atomes de carbone. Ces composés sont décrits , par exemple , dans le brevet britannique n 1041.273. Les composés résultant du stade de réduction de l'invention sont des intermédiaires très intéressants pour préparer des stéroïdes optiquement actifs comme ceux décrits par ced58MoSadSrs les ublications. mentionnées ci-dessus de Gibian et ses/. et de collaborateurs Rufer et ces Certains stérordes ayant un cycle A aromatique produit à partir de ces intermédiaires sont des oestrogènes à activité hormonale et sont intéressants, par exemple pour réduire l'typer lipémie chez les animaux à sang chaud. Le procédé de l'invention peut être réalisé en cultivant d'abord le micro-organisme choisi dans un milieu de croissance typique comprenant du carbone assimilable, de préférence un hydrate de carbone tel que le dextrose, une source d'azote, de préférence d'azote organique Ocras, des substances protéiniques, par exemple, de la liqueur de macération de maïs et de la peptone des traces de sels minéraux et de l'eau. Après l'incubation du micro-organisme au degré voulu on ajoute le substrat' de seco-stéroïde choisi, de préférence dans un solvant, dans des conditions stériles et aérobies. Un agent anti-mousse approprié est utile et peut également être présent. On agite le mélarige en maintenant la température entre 250 et 57 C pendant une période de temps suffisante pour effectuer la trains formation ou la conversion biochimique désirée du seco-stéroïdes en composé optiquement actif. La réduction microbiologique terminée on extrait le bouillon de fermentation avec un solvant approprié, par exemple, l'acétate d'éthyle ou la méthyl-isobutyl-cétone, et l'on concentre les extraits ainsi obtenus en vue d'éliminer le solvant , la température étant maintenue en dessous de 500C. Le produit désiré qui est la forme dextrogyre de la 17 ss -hydroxy-8,14-secogona-tétra ène-14-one est énsuite isolé du résidu au moyen de techniques habituelles. Les exemples suivants décrivent et illustrent avec plus de détails divers aspects du procédé de l'invention. EXEMPLE 1 Préparation de la d-3-mé;choxy-8,14-secoestra-1, ,3,5(10),9(11)-té- traène-17 -ol-1 4-one On lave une culture inclinée de Rhodotorula glutinis ATCC 10 788 sur agar-agar avec 5 ml d'eau distillée, et l'on transvase 1 ml de la suspension cellulaire dans un flacon de 250 ml contenant 50 ml du milieu ayant la composition suivante Liqueur de macération de maSs 5 > 0 g Dextrose 20,0 g Peptone 20,0 g Eau distillée jusqu'à 1 litre On fait incuber le flacon à 280C sur un agitateur rotatif, tournant à 250 minute , et ayant un diamètre de rotation de 50 mm. Après avoir laissé la croissance s'effectuer pendant 24 heures on ajoute dans le flacon 10 mg de 3-méthoxy-8,14-secoestra- 1,3,5(10),9(11)-tétraène-14,17-dione dans 0,5 ml d'éthanol, puis on remet le flacon sur l'agitateur. Après encore 23 heures d'incubation, on prélève du flacon un échantillon de 5 ml. On ajoute 1 ml de méthyl-iso-butyl-cétone à l'échantillon et on équilibre le mélange. On place en points une partie aliquote de l'extrait en solution dans le solvant sur une plaque de gel de silice F-254 (Brinkmann); on fait passer la plaque dans une mélange de CH Acétone (9/1). Après séchage, on examine la plaque sous l a lumière ultraviolette 254 mXu. On note deux produits polaires, l'un ayant le Rf du dérivé 1 Z,ss -hydroxy(d-3-méthoxy-8,14-secoestra-1,3,5 (10),9(11)-tétraène-17ss-ol-14-one) et l'autre ayant le Rf du composé 14&alpha;, 17ss-dihydroxy (d-3-méthoxy-8,14-seccestra-1,3,5 (10),9(11)-tétraène-14&alpha;,17ss -diol). Après chauffage à 1000C pendant 30 secondes on asperge la plaque avec une solution d'acide phosphomolybdique (PMA) dans de l'éthanol (10g/100ml).Les réactions eolorées obtenues avec les deux produits correspondent à celles obtenues avec les témoins respectifs. L'exemple suivant décrit une opération à échelle plus grande, utilisant un appareil de fermentation de 14 litres. EXEMPLE 2 On lave quatre cultures inclinées de Rhodotorula glutinis ATCC 10 788, sur agar-agar, chacune avec 5m1 d'enu distillée et l'on transvase les suspensions dans quatre flacons de 1 litre avec 200 ml du milieu décrit dans l'exemple 1 ci-dessus. On fait incuber les flacons pendant 24 heures comme décrit dans l'exemple 1. On transvase le contenu des quatre flacons (800 ml) dans un appareil de fermentation de 14 litres contenant 8 litres du milieu d'inoculation. On agite à 200 t/mn, on aère avec 8 litres d'air/ minute > la température est de 280C. On utilise comme agent antimousse de l'huile de porc. Après 17 heures d'incubation, on ajoute dans l'appareil de fermentation 1,6 g de 3-méthoxy-8,14-secoestra-1,3,5(10),9(11)- tetrabne-14,17-dione dans 80 mi d'éthanol. On augmente l'agitation en portant la vitesse à 250 t/mn. On prélève des échantillons dans la cuve au bout d'une heure, et de deux heures, et on traite les échantillons eomnne dans l'exemple précédent. Au bout de deux heures et demie, on recueillis le produit de fermentation. On extrait le bouillon avec 6 litres d'acétate d'éthyle et lton élimine complètement le solvant sous pression réduite, en ne laissant jamais la température du bain excéder 50 C. On dissout le résidu dans du benzène, on le filtre à travers un tampon de gel de silice afin d'éliminer la matière cellulaire, et l'on évapore le filtrat jusqu'à siccité. On soumet le résidu dans le benzène à une chromatographie sur du gel de silice (80g) et on l'élue avec un mélange de 12% d'acétate d' éthyle et de 88% de benzène, on obtient la d-3-méthoxy-17ss-hydroxy-8,14-secoestra 1,3,5(10),9(t1-)-tétraène-14-one qui, après recristallisation dans l'éther isopropylique fond entre 1120 et 114 C,[&alpha;] = -35 (C = 1, dans le dioxane). Les données de la littérature pour ce composé sont : point de fusion: 112 à 113 C, [&alpha;]D25 = = -37.5 (C = 1 dans le dioxane). On n'observe aucune diminution du point de fusion du produit de fermentation isolé ci-dessus à l'épreuve du mélange avec un composé témoin. On sépare également de la colonne chromatographique, par élution avec 50% d'acétate d'éthyle, et 50k de benzène, du 3 méthoxy-8,14-secoestra-1,3,5(10),9(11)-tétraène-14&alpha;,17ss-diol qui après recristallisation dans de l'éther fond à 1340 - 1360C [&alpha;]D25 = + 29 (C = 2, dans le dioxane). Le seco-stéroïde témoin fond entre 1350 - 1360C [&alpha;]D25 = +27 (C=2 dans le dioxane) On ne note aucune diminution du point de fusion /1 épreuve du mélange. EXEMPLE 3 Préparation de la di-13ss-éthyl-17ss -hydroxy-3-méthoxy-8,14-secogona-1,3,5(10)9(11)-tétraène-14-one. On procède comme décrit dans l'exemple 1, en utilisant également le micro-organise Rhodotnrula glutinis.ATCC 10 788 pour réduire asymétriquement la 13 ss -éthyl-3-méthoxy-8,14-secogona-1,3, 5(10)9(11) -tétraène-1 4, 17-dione. L'analyse chromatographique par couches minces de l'extrait dans le solvant, obtenue dans le cas d'un échantillon prélevé au bout de 23 heures, montre la présence d'un produit polaire important ayant le Rf du dérivé 17j3-hydroxy. La réaction colorée du produit au PMA est semblable à celle de l'échantillon témoin. EXEMPLE 4 On procède à échelle plus grande de la façon décrite dans l'exemple 2. Après addition de 1,6 g du substrat seco-stéroIde mentionné dans l'exemple 3, dans 80 ml d'éthanol, on augmente l'agitation en portant la vitesse de rotation à 400 t/mn. On extrait des échantillons du produit de fermentation toutes les heures pendant 6 heures, et on note le cours de la transformation par une chromatographie en couches minces. La fermentation est complète au bout de 7 heures, et lton extrait le bouillon avec un total de 6 litres d'acétate d t éthyle. On regroupe les extraits dans le solvant, on les lave avec de l'eau et NaHC03, puis on les déshydrate sur Na2SO4. On élimine le solvant dans un évaporateur rotatif à charge continue à des températures inférieures à 550C et l'on filtre le résidu dans le benzène sur de l'alumine neutre de qualité 1 (6,0g). Après élimination du solvant, on recristallise le réside dans l'éther isopropylique en vue de produire la d-13J3-éthyl-17fi hydroxy-3-méthoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tétraène-14-one, point de fusion : 87 - 89 C, [&alpha;]D24 = +10 ( C=2, dans le dioxane) Le composé témoin fond entre 85 - D86 C, [&alpha;]D20 @@@ dans le dioxane). On ne note aucune diminution du point de fusion à l'épreuve du mélange. EXEMPLE 5 Préparation de la d-3-méthoxy-8,14-secoestra-1,3,5(10),9(11)-tétraène-17ss-ol-14-one On lave quatre cultures inclinées de Torulopsis utilis NRRL Y-900 sur agar-agar, chacune avec 5 ml d'eau distillée et l'on verse les suspensions cellulaires dans quatre flacons d'un litre chacun avec 200 ml du milieu utilisé dans exemple 1. Après incubation pendant 24 heures à 280C sur un agitateur rotatif (250 t/mn), on transvase le contenu des quatre flacons dans un appareil de fermentation de 14 litres contenant 8 litres du milieu ci-dessus. La température d'incubation est de 28 C, l'agitation est de 268 t/mn, l'aération de 1 litre d'air/litre de milieu/minute, et on utilise comme agent anti-mousse de l'huile de porc. Après 18 heures de croissance, on ajoute dans l'appareil de fermentation, le substrat, la 3-méthoxy-8,1 4-secoestra-1,3,5 (10),9(11)-tétraène-14,17-dione (1,6g) dissous dans de l'éthanol (80 ml). On augmente l'agitation en portant la vitesse à 300 t/mn On suit le cours de la conversion par une analyse chromatographique par couches minces comme décrit dans l'exemple 1, et l'on recueille le produit de fermentation au bout de 48 heures On extrait 1 bouillon complet avec 4 litres de méthyl-isobutyl- cétone, et l'on concentre les extraits jusqu'à siccité. On reprend le résidu dans une faible quantité d'éther diisopropylique et on abandonne la solution à -10 C pendant deux jours. On filtre le solide précipité puis on le recristallise dans de l'éther diisopropylique, on obtient le composé énoncé ci-dessus en titre; point de fusion : 112 - 1140C, [&alpha;]25 = -37 (C=2, dioxane). EXEMPLE 6 Préparation de la d-13ss-éthyl-3-méthoxy-8,14-secogona-1,3,5(10), 9(i1)-tétraène-17J3 -o'-14-one On lave trois cultures inclinées de Torulopsis utilis NRRL Y-900 sur agar-agar, chacune avec 5 ml d'eau distillée. On transvase les suspensions cellulaires provenant de deux cultures dans deux flacons de 1 litre chacun avec 200 ml du milieu, tel que décrit dans exemple 5. On transvase la moitié de la suspension cellulaire provenant de la troisième culture dans un flacon de 500 ml avec 100 ml de milieu. Après 18 heures dtincubation dans des conditions semblables à celtes de l'exemple 5, on utilise les contenus des trois flacons pour inoculer un appareil de fermentation de 14 litres avec' 5 litres du milieu de croissance. On aère avec 0,5 litre d'air/litre de milieu/minute, on agite à 250 t/mn, la température est de 280C, on utilise comme agent anti-mousse de l'huile de porc. On ajoute le substrat, la 13-éthyl-3-méthoxy-8,14-secogona 1,3,5(10),9(11 )-tétraène-l 4,17-dione (1 g, dans 50 ml d'éthano) 6 heures après dans l'appareil de fermentation et on réduit l'agitation en abaissant la vitesse à 20 t/mn. On prélève des échantillons pendant l'essai, on les traite et on les analyse en les soumettant à une chromatographie par couches minces.On recueille la solution de fermentation au bout de 138 heures, et on extrait avec 2,8 litres de méthyl-isobutyl-cétone. On réduit de volume les extraits jusqu a siccité et l'cn soumet le résidu brut à une chromatographie sur du gel de silice (60 g). On élue le composé énoncé ci-dessus en titre avec du benzène contenant 15% d'acétate d'éthyle et on le recristallise dans de l'éther diisopropylique, point de fusion : 84 - 87 C, [&alpha;]25 c = + 120 (C = 1, dioxane). La chromatographie gaz liquide indique une pureté de 100%. EXEMPLE 7 Préparation de la d-3-méthoxy-8,14-secoestra-1,3,5(10),9(11 )tétraène-17ss-ol-14-one On lave trois cultures inclinées de Cryptococcus laurentti (Rhodotorula aurea) QM 8412 sur agar-agar, chacune avec 5 ml du milieu utilisé pour la croissance. g/l Liqueur de macération de maïs 20 Peptone 20 Dextrose 50 Eau distillée 1 000 ml On ajuste le pH à 7,0 avec NaOH 5 N avant de traiter à l'autoclave. On transvase les suspensions cellulaires dans trois flacon de 1 litre, chaque flacon contenant '500 ml du milieu décrit ci dessus. Or fait incuber les flacons sur un agitateur rotatif à 28 C pendant 24 heures, puis on transvase les contenus des trois flacons dans un appareil de fermentation de 14 litres contenants 6 litres du milieu de croissance . La température de l'incubation est de 28 C, l'aération est de 1 litre d'air/litre de milieu/mn, et l'agitation est de 250 t/mn. On utilise comme agent anti-mouses le produit "Antifoam B" de Dow Corning. Après 24 heures de croissance, on ajoute 6 g de 3-méthoxy8,14-secoestra-1,3,5(10),9(11)-tétraène-14,17-dione dissous dans 45 ml d'éthanol. On élève la température à 320C, et l'on augment l'agitation à 300 t/mn. Cinq heures et demie après l'addition du composé, on ajoute encore 6 g comme ci-dessus. On recueille le produit de fermentation au bout de 49 heures7 et on l'extrait avec 4 litres de méthyl-isobutyl-cétone. On rec duit de volume les extraits combinés jusqu'à siccité et l'on re- cristallise deux fois le résidu dans de l'éther diisopropylique; on obtient le composé énoncé ci-dessus en titre9 point de fusion 111 - 114 C, [&alpha;]D25 = -37,6 (C=2,dioxane). L'analyse chromato graphique par couches minces montre que le produit est homogène. EXEMPLE 8 Préparation de la d-13ss-éthyl-3-méthoxy-8,14-secogona-1,3,5(10), 9(11) -tétraène-17-ol-1 4-one On prépare des suspension cellulaires de Cryptococcus lauren tii comme décrit dans l'exemple 7, excepté qu'on utilise le milieu composé de g/l Produit de digestion de soja (Difco) 10 Peptone 20 Dextrose 20 Eau distillée 1 000 ml On inocule trois flacons d'un litre contenant 200 ml du milieu décrit ci-dessus avec les suspensions cellulaires.On les fait incuber à .280C sur un agitateur rotatif pendant 24 heures puis on transvase le contenu des trois flacons dans un appare de fermentation de 14 litres avec 6 litres du milieu decroi---' On élève la température dtincubation à 320C, l'aération est de 1 litre d'air/litre de milieu/minute, et l'agitation est de 250 t/mn, et l'on utilise comme agent anti-mousse le produit "Antifoam B" fabriqué par Dow Corning. Après 18 heures de croissanee, on ajoute 3,6 g de la i3J3- éthyl-3-méthoxy-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tétraène-14,17-ss dione dissous dans 30 ml d'éthanol. On augmente la vitesse d'agitation à 300 t/mr.. 24 heures plus tard on ajoute encore 3,0 g du composé . Au bout de 43 heures , on recueille le produit de fermentation et on extrait avec 4 litres d'isobutyl-cétone. On réduit de volume les extraits combinés jusqu'à siccité. On reprend le résidu dans de l'éther diisopropylique, on le filtre et on le réduit de volume. Après une deuxième filtration pour éliminer la matière cellulaire, on abandonne la solution au repos à -100C pendant 16 heures. On recristallise le solide précipité dans le même solvant en vue de produire le composé énoncé cidessus en titre; point de fusion: 89 - 91 C, [&alpha;]25 = + 130 (c = 2, dioxane) D Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son caere. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé de préparation d'une d-17ss-hydroxy-8,14-secogona tétraène-1 4-one, caractérisé par le fait qu'on réduit asymétriquement une 8,14-secogona-tétraène-14,17-dione en soumettant le composé à l'activité réductrice d'un micro-organisme du genre Cryptococcus, @ Rhodotorula ou Torulopis 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la 8,14-secogonga-tétraène-14,17-dione a la structure dans laquelle R et R1 sont chacun des groupes alkyle, 3 - Procédé selon laerevendication 2, caractérisé par le fait que R1 est un groupe alkyie inférieur contenant jusqu'à 6 atomes de carbone 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que R1 est le groupe méthyle. 5 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que R1 contient au moins deux atomes de carbone. 6 - Procédé selon la revendication .5, caractérisé par le fait que R est le groupe éthyle. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 caractérisé par le fait que R est un groupe alkyle inférieur contenant jusqu'à 6 atomes de carbone. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que R est le groupe méthyle. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé par le fait que le micro-organisme est le Rhodotorula glutinis 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 caractérisé par le fait que le micro-organisme est le c;; us laurentii 11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 caractérisé par le fait que le micro-organisme est le Torulopsis utilis.