Brevet FR2000479A1 — publié le 19690905

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un acide ribonucléique immunisant spécifique et un procédé pour développer l'immunité chez les humains et les animaux. Une étude systématique du développement de l'immunité a 5 permis de constater que si l'on injecte à des êtes humains ou à des animaux hétérologues de l'acide ribonucléique immunisant préparé avec des animaux immunisés par injection d'antigène, cet acide peut développer une immunité et produire un anticorps spécifique de l'antigène utilisé pour l'immunisation. 10 Par exemple,si l'acide ribonucléique est extrait de macrophages d'animaux tels que le lapin, le cheval,, le boeuf, le porc, le mouton ou autres similaires, ayant reçu une injection d'antigène (par exemple, une bactérie ou un virus sous forme de vaccin un toxoïde,etc..) et injecté à des êtres humains ou à des 15 animaux, une immunité contre cet antigène peut êtrg6btenue. En outre, lorsque des cellules sont traitées avec de l'acide ribonucléique immunisant, elles produisent un anticorps qui s'oppose à l'antigène employé pour la préparation de l'acide ribonucléique mais, après celà, même lorsqu'elles sont 20 traitées avec un autre acide ribonucléique immunisant, elles ne produisent pratiquement pas d'anticorps spécifique de l'antigène employé pour la préparation de ce dernier acide ribonucléique. Ce fait indique la possibilité qu'une introduction, préalablement à une opération chirurgicale pour une transplan-25 tation d'organe, d'un acide ribonucléique immunisant différent de celui responsable de l'immunité de la transplantation, empêche le rejet de l'organe transplanté. Comme il ressort clairement des faits ci-dessus, l'acide ribonucléique immunisant spécifique de l'invention peut créer jffi une immunité spécifique,par exemple, contre une bactérie ou un virus sans effet secondaire tel qu'une allergie,et l'on pensô qu'il est utilisable pour empêcher le rejet d'organe dans les transplantations. La présente invention est basée sur la découverte ci-35 dessus et elle fournit un procédé de préparation d'un acâde ribonucléique immunisant spécifique, qui est caractérisé en ce qu'il consiste à injecter un antigène à un animal, à tuer le dit animal après développement complet de l'immunité,à extraire l'acide ribonucléique de macrophages existant dans la rate, les 40 ganglions lymphatiques et/ou l'exudat du péritoine de l'animal 69 00808 2000479 et à purifier l'acide ribonucléique extrait. En outre, l'invention se rapporte aussi à un procédé pour développer l'immunité contre les antigènes chez un être humain ou un animal,qui consiste à injecter à ces receveurs de 5 l'acide ribonucléiquçlmmunisant préparé à partir de macrophages existant dans la rate, les ganglions lymphatiques et/ou l'exudat du péritoine d'un animal qui est hétérologue aux animaux receveurs et qui a été immunisé par injection dudit antigène. Conformément à la présente invention, on peut utiliser, pour la préparation d'un acide ribonucléique immunisant spécifique, n'importe quel antigène connu,par exemple, des bactéries pathogènes comme la typhoïde, la coqueluche , des virus pathogènes, tels que la grippe, l'encéphalite virale , la variole, 15 la rage, des microorganismes pathogènes comme les champignons, les protozoaires ou les organismes affaiblis ou tués par eux, des toxines comme le tétanos, la diphtérie, le venin de serpent, les protéines hétérologues, des organes d'êtres humains ou d'animaux ou leurs, extraits. En ce qui concerne les animaux 20 recevant l'injection d'antigènes, on peut utiliser n'importe quel type d'animal. Les animaux les plus facilement utilisables sont le cheval, le boeuf, le porc et le mouton. Le sérum de la toxine antidiphtérique, de la toxine antitétanique, et le sérum antivenimeux sont préparés habituellement avec les ani— 25 maux précités, auxquels on a injecté les toxines ci-dessus. La rate, l'exudat du péritoine, les ganglions lymphatiques des animaux ainsi immunisés constituent des matières appropriées à la préparation de l'acide ribonucléique qui développe l'immunité contrefces antigène. L'injection d'antigène aux animaux 30 s'effectue en une ou plusieurs fois, jusqu'à ce qu'une immunité suffisante ait été obtenue.Après s'être assuré que l'injection d'antigène aux animaux a créé en eux une immunité suffisante, on prélève la rate, l'exudat du péritoine et les ganglions lymphatiques des dits animaux,dans lesquels il se trouve 35 grande quantité de macrophages, et l'on extrait l'acide ribonucléique de ces matières. L'acide ribonucléique peut être extrait par des procédés d'extraction connus, par exemple, le procédé Eidson ou Kirby (J.Mol.Biol. 7i 312 à 345, 1966), dans lequel les organes 40 ou les cellules prélevés sont broyés dans un liquide contenant o9 00808 2000479 un inhibiteur de l'enzyme décomposant l'acide ribonucléique, et extraits à plusieurs reprises à l'aide de phénol. L'acide ribonucléique immunisant ainsi extrait peut être purifié davantage en le soumettant à l'action d'une enzyme protéoly-5 tique,comme la trypsine, la pronase et autres similaires, pour enlever la protéine, puis à la chromâtographie sur colonne ou à une supercentrifugation. L'acide ribonucléique immunisant spécifique ainsi purifié peut être injecté à un être humain ou à un animal, par exemple, 10 de la manière suivante . On fait dissoudre l'acide ribonucléique purifié dans une solution physiologique de chlorure de sodium. En général, cette solution peut être injectée par piqûres sous-cutanées ou intracutanées, en une ou plusieurs fois à des intervalles 15 de 5 jours, la quantité d'acide ihjectée étant comprise entre 1 et 10 mg pour les adultes, avec une quantité deux fois plus faible pour les enfants. Cette injection s'tffectue de la même manière, quel que soit le type de maladie contre lequel le sujet doit être immunisé. L'inventeur a constaté tout d'abord 20 que l'acide ribonucléique préparé à partir de macrophages d'animaux immunisés peut développer l'immunité, même s'il est injecté à des êtres humains ou à des animaux hétérologues. De toute façon, l'invention sera bien comprise, à l'aide de la description qui suit et en référence aux exemples non 25 limitatifs ci-dessous : Exemple 1 On injecte à des rats un vaccin vivant de Salmonella enteritidis. L'acide ribonucléique immunisant est extrait, au moyen du phénol, de rates de rats suffisamment immunisés, 30 en appliquant le procédé suivant . On coupe finement, à l'aide d'un rasoir, deux grammes de rates prélevées sur des souris immunisées ..Après addition de 10 ml d'une solution à 0,5% de sodium-naphtalène 1,5 disul-fonate (NDS) préalablement refroidi, le tissu est homogénéisé 35 à l'aide d'un homogénéiseur de verre sur un bain de glace. Le produit homogénéisé est mélangé à un volume égal de phénol à 90% (en volume) contenant 0,1 % (poids/volume) de 8-hydro-xiquinoline (Ph-HQ), à froid. A la phase aqueuse (habituellement 9 al) séparée par centrifugation, on ajoute un volume 40 égal de p-aminosalicylate de sodium à 10 % (poids/volume), 69 00808 2000479 contenant 2 % (poids/volume) de dodécylsulfate de sodium (PAS-SDS) et le mélange est extrait de nouveau par addition de Ph-HQ, c'est-à-dire la moitié du volume de la phase aqueuse. Le lavage au Ph-HQ est effectué plus de 4 fois (habituellement 5 5 fois) jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de matière visible entre la phase eau et la phase phénol. Au stade, on obtient environ 7,5 ni de phase aqueuse. On ajoute à la phase aqueuse finale deux volumes d*éthanol froid. Le précipité qui se forme est dissous dans une petite quantité de NaCl à 0,1 M contenant 10 2>«-g/ml de potassium-polyvinylsulfate (PVS),puis il est précipité de nouveau et lavé à plusieurs reprises avec de 1'éthanol. Toutes ces opérations ont lieu à une température de 4°C. L*éthanol est éliminé par évaporation et centrifugation, puis le précipité sec est dissous dans 3 ml de solution tampon de 15 Tris-HCl à 0,01 M, pH 7,5» contenant 10""^ M de MgClg. On ajoute à cette solution trois dixièmes de ml de dioxyribonu-cléase titrant 50 g par ml, et on laisse reposer pendant 30 minutes à 4°C. Après addition de 1,5 ml de SDS-PAS et de 1,5 ml de ÏTDS à 1 %, on extrait de nouveau l'acide ribonucléique 20 avec Ph-HQ de la manière décrite ci-dessus et on le précipite avec de l'éthanol.Après cinq lavages à l'éthanol, la suspension du précipité final dans 1'éthanol absolu est stockée à -20°C avant utilisation. L*acide ribonucléique immunisant est administré à des rats, à des cobayes et à des souris par 25 injection intrapéritonéale. L'immunité se développe -sans parler des rats- dans les cobayes et les souris, qui sont des animaux hétérologues. Récepteurs d'acide ribonucléique immunisant Quantité injectée d'acide ribonucléique immunisant /x-g/tête Développement de l'immunité souris 100 + cobayes 1000 + . rats 1000 + L'extrait ci-dessus est purifié davantage par le procédé mentionné ci-après. L'extrait purifié est essayé de la manière indiquée ci-dessus. Un développement similaire de l'immunité est alors prouvé. 40 Centrifugation d'un gradient de densité de saccharose. 69 00808 5 2000479 On place deux d'acide riboniicléique iamunisant dans 1 Al de solution tampoa d'acétate à 0,01 M, pH 5,0 contenant 0,"i M de NaCl, 10~^ M de MgC^ et 2 jl g/ml de FVS sur 30 al d'un gradient linéaire de saccharose de 5 % à 20 %, préparé dans la 5 même solution tampon» Les tubes sont centrifugés dans un rotor à cuve oscillante Hitachi RPS-25 (type 55~ï,A, Hitachi Ltd, Tokyo,Japon), pendant 16 heures à 24.000 t/m. Des quantités de 1 Ml chacune sont recueillies après mesure automatique du pouvoir absorbant à 254 vi/jl au moyen de l'appareil à 10 fractionner pour gradient de densité ISC0 (Modèle 180, Instrumentation Specialties Company Inc. , Nebraska,U.S.A). Les quantités ainsi recueillies sont condensées par dialyse à pression négative à travers la cellophane (tube cellulose, 6,077 »*, Visking Co. Chicago, U.S.A) contre une solution 15 de NaCl à 0,15 M, contenant 2yug/ml de FVS et précipitées avec 1'éthanol. Exemple 2 On injecte un toxolde de diphtérie à un cheval, pour obtenir un antisérum. L'acide ribonucléique immunisant est 20 extrait de la rate du cheval, qui a un titre plus élevé d'anticorps, de la même manière qu'à l'exemple 1. L'acide ribonucléique immunisant est administré à des cobayes, des souris et des lapins et l'on observe la formation d'anticorps. 25 30 Receveur âe Quantité l'adide ribo- injectée nucléique d'acide immunisant ribonucléique immunisant M- g/tête Cellules formant des anticorps contre le toxolde de la diphtérie Cellules formant des anticorps contre le toxoïde du tétanos Cellules Cellules'Cellules de l'exu- de la *de l'exudat du rate *date du péritoine péritoine Cellules de la rate 35 cobayes souris rats 50 500 5000 1224 404 920 10 750 1 500 17 400 0 0 0 0 0 0 BAD ORIGINAL o9 00808 2000479 - EEVEHDICATIOHS - 1o- Procédé pour développer 1' immunité contre des antigènes chez les humains ou les animaux, consistant à injecter aux receveurs précités de l'acide ribonucléique immunisant préparé à partir de macrophages existant dams la rate5 dans les ganglions 5 lymphatiques et (ou) dans l'exudat péritonéal d'un animal qui est hétérologue aux animaux receveurs et qui est immunisé par injection de l'antigène à combattre0 20~ Procédé selon la revendication 1, dans lequel les antigènes sont des bactéries pathogènes, des virus pathogènes 10 les organismes qu'ils tuent ou affaiblissent ou les toxoïdes qu'ils produisent® 3®» Procédé selon la .r e vsaclication 2a dans lequel le toxoïde est le toxoïde de la diphtérie® 4-,,- Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'acide 15 ribonucléique est administré par injection sous-cutanée ou intracutanée, dans une quantité comprise entre 1 et 10 mg pour les adultes, cette quantité étant réduite de moitié pour les enfantso 5o- Procédé pour la préparation d'acide ribonucléique 23 immunisant, consistant à injecter un antigène à des aanVwatrr pour y développer une immunité suffisante, à abattre ces animaux , à extraire l'acide ribonucléique de macrophases existant dans la rate, les ganglions lymphatiques et (ou) l'exudat du péritoine des dits animaux, puis à purifier l'acide ribonu-25 cléique en le soumettant à l'action d'un enzyme protéolytique, puis à une chromâtographie sur colonne ou à une supercentri-fugation» BAD ORIGINAL