Brevet FR2004604A1 — publié le 19691128

la présente invention se rapporte a un procédé de «répara-» 15 • - •*' „ tion de l'acide N-L-glutamiquee Elle concerne plus particuliè-- 1 ^ rement un procédé de préparation de l'acide N-L-glutamique à 15 partir de l'acide li-L-aspertique „ 15 5 L'acide N-L~aspartique a été antérieurement préparé par synthèse chimique. Dans ce procédé, on obtient un DL-racémate duquel or- obtient le L-isomère intéressant par résolution chimique ou enzymatique. Les rendements globaux de la synthèse chimique 1 S sont faibles et, ainsi, la teneur isotopique en 2Iî est générale— 10 ment inférieure à 20 fo. Un autre procédé de préparation de 1 ' acide ^ ^N-L-aspartique comprend la synthèse ensy matique /.^Sonne des rendements variables0 On pense que l'échec de ce procédé est dû à la complexité du système rencontré dans l'utilisation des suspensions entières de cellules au repos. 15 La possibilité d'effectuer la synthèse des L-amino-aeides par transfert catalysé par un enzyme du groupe amino d'un amino-acide facile à se procurer à un acide cétonique approprié est connue depuis longtemps. Akabori et Oshio (1956)9 Japons 3763, ont fait la zynthèse de l'acide L-glutamique par trans-amixiation 20 au moyen de phénylalanine en utilisant des suspensions entières de cellules de Pseudomonas sarinamia. Un. autre procédé de synthèse de l'acide L-glutamique (Sakurai et Akabori, 1956) utilise l'acide L-aspartique comme source aminique et catalyse la trans-amination à l'aide d'un extrait de muscle cardiaque d'animaux, 25 Ce second procédé utilisant un extrait de muscle cardiaque d'animal n'est pas considéré comme une bonne préparation*, Le premier procédé, bien qu'il ait recours à un organisme facile à cultiver, 1 5 exigerait comme substratum la N-L-phénylalaaine dont on ne . dispose pas encore. 15 30 L'acide lï-L-glutamique a été préparé par réaction enzy- 15 matique d'échange entre le chlorure de K-ammonium. et l'acide 15 L-glutamique, Ce procédé donne de l'acide N-L-glutamique contenant environ 50 /£ de et doit être répété plusieurs fois pour 1 S élever la teneur isotopique à 90 % de N. Malheureusement, si 35 le procédé est répété plusieurs fois, 15échange isotopique perd BAD ORIGINAL 69 08420 2 2004604 son avarccage le plus important sur la synthese chimique « à savoir- 15 la faible pert;e d'utilisation de l'isotope -\tT, La présente invention se propose de fournir un procédé de 15- préparation de l'acide N-li-glutamique avec une teneur en iso-1 r 5 tope "'H supérieure a 90 Elle se propose également de fournir un procédé nouveau 15 d'isolement de l'aspartase et de synthèse de l'acide I>T=i~aspar-~ tique, qui est particulièrement utile dans la préparation de 1 5 1!acide N-L-glutamique. 10 Une des caractéristiques de l'invention consiste à prépa- 15- rer l'acide ÎM-L-aspartique par réaction de fumarate de sodium 1 5 et de chlorure de N-ammonium dissous dans un tampon neutr®, pas? exemple du phosphate de sodium neutre, en présence d'une préparation enzymatique d'aspartase« On soumet le mélange à 1!ineuba-15 tion à J7°0 pendant une période de temps d'environ dix-aa.it à trente heures ; on obtient alors la synthèse maximale dsacide aspartique, ce que confirme la chromâtographique en couche mince. La réaction peut être représentée de la manière suiya±e s 15 20 ^2 H00C CH = CH COOH + ^NH^Cl" >HOOC OHg GH GOOH La préparation enzymatique d1aspartase s'obtient en cultivant une bactérie, par exemple Bscherichia coll. sur un milieu 25 nutritif jusqu'à développement maximal. Les cellules sont mises en suspension dans un tampon neutre de phosphate de sodium, lavées à l'aide d'un tampon et recueillies par centrifugeâge. Les cellules lavées sont brisées par broyage avec de l'alumine dana une suspension tamponnée, puis diluées à l'aide de tampon et 30 centrifugées pour enlever l'alumine. Les acides nucléiques sont précipités de la liqueur surnageante par addition d'une solution de sulfate de streptomycine et on enlève par dialyse à 1® aidé d'eau de ville froide une matière de bas poids moléculaire. Le dialysat est alors acidifié et conservé pendant une nuit à basse 35 température et les granules d'aspartase s«nt recueillies par cen- BAD ORIGINAL 69 08420 3 2004604 trifugeage. Elles peuvent être dissoutes dans une solution tampon et conservées à 4°C en vue de leur utilisation ultérieure. 15 L'acide ÏT-L-aspartique désiré est isolé par le procédé suivant : On arrête la réaction en faisant "bouillir pendant quel-5 ques minutes et on enlève par filtration les protéines précipitées. On soumet alors le filtrat à l'adsorption sur une résine d'échange cationique fortement acide, on lave à l'eau et on retire l'acide aspartique de la résine par élution à l'aide d'un solvant volatil. La fraction d'acide aspartique est alors adsor-10 bée sur une résine d'échange d'ions faiblement basique et recueillie par élution à l'aide d'un acide faible. La fraction d'acide aspartique est ensuite séchée, puis dissoute dans de l'eau 15 chaude. On obtient l'acide W-L-aspartique cristallisé par addition d'alcool éthylique à la solution. 15 Conformément à l'invention, on obtient également l'acide 15 15 N-L-glutamique on mettant en suspension de l'acide M-L-as- partique et de l'acide alpha-cétoglutarique dans de l'eau distillée et en neutralisant le mélange réactionnel à un pli de 7,0 à 8,0. On ajoute au mélange du phosphate de pyridoxal, une ré-20 -sine d'échange d'ions faiblement basique et 1'aminotransférase aspartique en tant qu'enzyme. On soumet le mélange réactionnel à l'incubation à la température ambiante et on laisse diminuer le pH pour décarboxyler l'acide oxalacétique. La réaction est terminée quand on ne peut plus déceler d'acide aspartique par 25 chromâtographie en couche mince. Le schéma réactionnel est le suivant : 15fa 30 H00C CH2CH2C0 C00H + H00C CH2CH C00H- 35 H00C CH2CH2CH COOH + HOOC CHgCO C00H Résine basique d'échange d'ions 0Co + CH,C0 COOH 2 3 69 08420 4 2004604 15 L*acide Jï-L-glutamique ainsi obtenu est séparé de la manière suivante : On acidifie le mélange réactionnel, on l'agite avec du charbon de bois, puis on filtre la suspension. On absorbe le filtrat -sur une résine d'échange de cations forte, on lave 5 à l'eau et on effectue 1'élution des aaino-acides de la résine à l'aide d'un solvant volatil, la fraction d1amino-acide est ad— sorbée sur une résine d'échange d'ions faiblement basique et l'acide glutamique est obtenu par élution à l'aide d'un acide faible, amené à siccité et redissous dans l'eau chaude. L'acide 1 5 10 H-L-glutamique est ensuite obtenu à l'état cristallisé par addition d'éthanol à la solution. Les exemples suivants, qui sont illustratifs mais ne sont pas limitatifs, permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1. - Préparation d'enzyme 15 On cultive sur gélose selon Wu et Rittenberg des cellules de E. coli (NïC 9001). On isole 1'aspartase par un procédé impliquant une opération de précipitation par un acide selon Virtanen et Ellfolk. La purification subséquoirte est effectuée sur des cellules provenant de 19 fioles de Roux. 20 A chacune des fioles de Roux, on ajoute environ 10 ml de tampon de phosphate de sodium 0,001 M à pH 7,4 et on met les cellules en suspension en secouant doucement. On rassemble les suspensions de cellules et on centrifuge à 10.000 g pendant dix minutes. On remet en suspension la masse cellulaire dans 20 ml 25 de tampon, on ajoute deux volume s d'alumine et on broie la pâte ainsi obtenue au mortier pendant vingt minutes. On dilue la pâte à l'ai.de de 100 ml de tampon et on centrifuge comme précédemment. On ajoute au liquide surnageant une solution du sulfate de streptomycine à 5 f<> jusqu'à ce que la couche surnageante contienne 30 1 i" de sulfate de streptomycine. Au bout de trente minutes, on enlève les acides nucléiques précipités par centrifugeage à 10.000 g pendant dix minutes. On dialyse la couche surnageante pendant dix-huit heures contre 3 litres de tampon de phosphate de sodium 0,001 M à pH 7,4 à 4°0. On acidifie le dialysat au moyen 35 d'acide acétique à 10 70 jusqu'à un pH de 4,4 et on conserve à 4°C 69 08420 5 2004604 pendant une nuit; On centrifuge la suspension comme ci-dessus, on rejette la couche surnageante, on dissout le culot formé d1aspartase dans 45 ml de tampon de phosphate de sodium 0,001 M à pH 7»4 et on agite lentement pendant quarante-cinq, minutes» Il 5 est nécessaire de réajuster le pH do la solution à 7>4 par addition de solution d'hydroxyde de sodium 0,01 l\i. Il reste une certaine quantité de matière insoluble qu'oïl enlève par centrifugea-ge, La couche surnageante constitue la préparation enzymatique et reste stable pendant au moins un mois quand on la conserve à 10 4°C. Exemple 2. A 9,0 ml de tampon de phosphate de sodium 0^005 M à pH 7,4. on ajoute 1,5 g de fumarate de sodium et 0P4 g de chlorure d'ammonium. On vérifie le pH, puis on ajoute 3? 5 aû. de préparation 15 d1aspartase et on fait incuber le mélange à 37°0 pendant le temps voulu, usuellement environ soixante-douze heures. On suit la réaction en prélevant des échantillons et en les examinant à la tache sur feuilles de cliromatographie en couche mince (Eastman Chromogram K301R). On développa les chromo-20 grammes au moyen de butanol/acide acétique/eau (80/20/20 en volume), puis on asperge à l'aide d'une solution butsnolique à 0,2 % de ninhydrine. Dans certains cas, on fait des estimations semi-quantitatives d'acide aspartique en essayant à la taehe des échantillons à diverses dilutions et en comparant ces taches en même 25 temps à un témoin. Le témoin est une solution à !■ mg/ml d'acide aspartique dans de l'acide acétique 0,15 M. Exemple 5. On fait bouillir doucement le mélange réactionnel pendant une minute avec 250 mg de Dareo X® (charbon de h ois ) „ puis on 30 filtre sur papier au verre sur un entonnoir de Buchner. On étend le filtrat avec de l'eau distillée à trois fois son volume initial. On procède à l'adsorption sur une colonne de "Bowex 50 W®" (3,8 x 28,5 cm) (0,297-0?149 mm) sous la forme H+. On lave la colonne au moyen de 300 ml d'eau distillée et on déplace l'acide 15 35 ïï-L-as partique au moyen d'une solution d'hydroxyde d'ammonium gAB ORIGINAL 69 08420 6 2004604 15 0,75 J5« On soumet la fraction contenant l'acide W-L-asparfc±çpie à une évaporation instantanée à siccité pour chasser l'excès dfammoniac , on dissout dans 300 ml d'eau et on fait adsorber sur colonne de CG—45 ® type II (4,5 x 38,0 cm) sous la forme acé=- 5 tate. Après avoir fait passer 300 ml d'acide acétique 0,05 M sur 15 la colonne, on élue l'acide N-L-aspartique au moyen d'acide acétique 0,25 M. On évapore à siccité la solution d'acide aspartique (40CC), on dissout dans un volume minimal, d'eau chaude et 15 on fait cristalliser l'acide îi-L-aspartique au sein de la solu-10 tion par.addition de 0,5 volume d5éthanol absolu» On recueille le produit sur papier filtre, on sèche sur ^2^5 dans un exeisca-teur et on pèse. Exemple 4. 15 A 75 ml d'eau distillée, on ajoute 1,5 g d'acide K-L»» 1 *5 15 aspartique (96,5 de "H) et 2,1 g d'acide alpha-cétoglutariepe. On agite lentement la suspension et on dissout les réactifs en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium 4 N jusqu5à pH 7,6© On ajoute quelques mg de phosphate de pyridoxal et 50 œg de CH3— 45® (sous la forae acétate). On ajoute environ 2 mg d• amino— 20 transférase d'aspartate, on soumet le mélange à 1'incubation à 25°C en mesurant le pH toutes les heures et en le réglant h 1,6 au moyen d'une solution d'acide ehlorhydrique 1 H. Au bout de six heures, on amène le pH à 6,5 au moyen d'une solution d'acide acétique à 10 yà et on agite lentement le mélange réactionnel pen-25 dant une nuit. Au bout de dix-huit heures, on rétablit le pH à 7,6 au moyen d'hydroxyde de sodium 4 M et on le maintient à cette valeur pendant six heures. La chromatographie en couche aince montre qu'il ne reste que très peu d'acide aspartique. On ajuste le pH à 5,0 au moyen d'une solution d'acide acétique à 10 $ et Gn 30 agite le mélange réactionnel pendant trente minutes avec 206 n$g de charbon de bois Darco X® . On filtre la suspension sur papier 15 au verre, on purifie l'acide N-L-aspartique et on le sépare par chromatographie d'échange d'ions sur résines Dowex 50 et C&=> 45® , comme il est décrit dans l'exemple 3. 35 - La suscription(Ë) indique qu'il s'agit d'un produit de marque déposée » BAD original 69 08420 7 2004604 REVENDICATIONS 1 *5 1. Procédé de préparation d'acide -^-L-glutamique, ca- 15 ractérisé par le fait qu'on fait réagir de l'acide j>T-L-asparti-que et de l'acide alpha-cétoglutarique en milieu neutre en pré-5 sence de phosphate de pyridoxal et d1aminotransférase aspartique en tant qu'enzyme. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on ajoute une résine faiblement basique d'échange d'ions au mélange réactionnel. 10 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le pH du mélange réactionnel est amené du côté acide pour provoquer la décarboxylation de l'acide oxalacétique formé. 15 4. Procédé de préparation d'acide H-L-glutamique, caractérisé par le fait qu'il consiste à amener en contact de 15 15 l'acide M-L-aspartique avec de l'acide alpha-cétoglutarique en milieu aqueux réglé à tin pH compris entre 7 et 8, à ajouter du phosphate de pyridoxal et une résine d'échange d'ions faiblement basique au mélange, à ajouter une base d1aminotransférase aspartique et à soumettre le mélange à l'incubation, puis à régler le 20 pH du côté légèrement acide de manière à provoquer la décarboxylation de l'acide oxalacétique formé dans le mélange réactionnel.