Brevet FR2000654A1 — publié le 19690912

x 2000654 La présente invention concerne un procédé pour identifier des cellules néoplasiques et pour différencier ces cellules de cellules saines. Les cellules néoplasiques sonu celles qui sont responsables d'excroissance nouvelles et anormales. Une telle excroissance est habituellement caractérisée corme un néoplasme malin ou une tumeur maligne, les tumeurs malignes et les néoplasmes malins étant ce que l'on caractérise p-.r le nom de cancer, l'expression "cancer" s'applique à diverses maladies qui ont toutes pour trait commun la transformation de cellules corporelles saines en cellules parasites croissant d'une façon anormale. Ces cellules anormales ou néoplasiques sont à la base commune à tous les types de cancer et représentent un test d'identification significative. Le cancer, à l'heure actuelle, est la deuxième cause de mortalité aux Etats-Unis d'Amérique. Conformément à la Commission Présidentielle sur les Maladies Cardiaques, Cancérigènes et d'Apoplexie, on a démontré , en 1963, que le cancer représentait une quantité de mortalité de 285 362 ou 15,7 ch de mortalités globales et qu'actuellement i?n américain sur quatre présente les symptômes du cancer. Ces morts sont provoquées par le cancer qui affecte de nombreux endroits du corps humain. Parmi les-différents types de cancer qui sont couramment Connus, on mentionne : le cancer des poumons, le cancer de la prostate, le cancer du colon, le cancer de l'estomac, le cancer du pancréas, le cancer du système lymphatique appelé "lymphome" qui est un désordre néoplasique du tissu lymphoïde et qui ëftglobe le lymphome clâsmocytique, le lymphome folliculaire, le lymphome lymphoplasique et le lymphome lymphocytique , la leucémie, le cancer du rectum, de la vessie, de l'urètre , de la cavité buccale, du pharynx, du sein, de l'utérus, des ovaires, du foie et des conduits biliaires. En plus des cancers par lesquels les organes peuvent être affectés, le maladie peut, en outre, être caractérisée par un tissu spécifique qui est .attaqué. En particulier, il existe lin carcinome qui est une excroissance des cellules épithéliales tendant à s'infiltrer dans les tissus avoisinant et à provoquer des métastases. De plus, on connaît, le carcinome acineux qui est un carcinome à structure en forme de grappe de raisin, l'adénome qui est un cancer qui forme une structure granulaire en forme 69 01254 2 2000654 de sac, le carcinome alvéolaire dans lequel les cellules néoplasiques apparaissent sous la forme de groupements enfermés dans le tissu conjonctif, le carcinome chorionique, le carcinome des colloïdes dans lequel les cellules ont subi une dégé-5 nération des colloïdes, le carcinome des cellules cylindriques où les cellules ont une forme cylindrique , le carcinome des voies dans lequel les cellules affectent la conduite mammaire, le carcinome encéphaloïde qui concerne une structure molle comme celle du cerveau, le carcinome épibullaire qui 10 commence au niveau de la cornée et qui se développe sur la cornée et la conjonctive de l'oeil, le carcinome épithélial, le carcinome des glandes où les cellules sont glandulaires ou du type à sécrétion, le carcinome lenticulaire qui est un carcinome squirreux de la peauj le carcinome lipomateux qui est 15 un carcinome caractérisé par le fait qu'il contient beaucoup de graiose, la mastite carcinomateuse qui est un type de cancer des seins se développant rapidement, le carcinome médullaire qui est un cancer de la moelle médullaire, le carcinome du système périportal dans lequel le cancer affecte le foie 20 et s'étend tout autour de la veine porte et de ses affluents, le carcinome schneiderien qui concerne le nez et les sinus paranasaux, le carcinome squirreux qui est un carcinome caractérisé par une structure dure qui se développe à partir de tissus conjonctifs alvéolaires, le tubérosumcarcinome qui est 25 le carcinome de la peau. i£n plus des carcinomes, il existe les sarcomes qui sont des tumeurs présentant une constitution qui ressemble au tissu conjonctif embryonnaire. Les sarcomes les plus courants sont représentés par le sarcome adipeux qui contient une quan-30 tité importante de graisse, le sarcome alvéolaire qui est un stroma fibreux réticulé renfermant des groupements de cellules à sarcomes, le sarcome utérin qui affecte le vagin, le sarcome chloromateux qui affecte le péoste de la boîte crânienne, le sarcome facial qui se développe dans les fascies autour des 35 articulations, le sarcome d'Hodgkin, le sarcome de la leuco- cythémie qui est une leucémie, le sarcome du sytème lymphatique qui est un lymphosarcome, le sarcome ostéoblaste qui produit des tissus ayant l'aspect d'os ou de cartilage, le sarcome oestéogénique qui réside en des tumeurs se produisant dans les 69 DÎ254 3 2000654 os et provenant de cellules osseuses, le sarcome polymorphe gui contient plusieurs cellules différentes, sarcome, de cellules provenant du réticulum qui est un lymphone malin et le sarcome des cellules en fuseau dans lequel lés cellules ont la 5 forme de fuseaux. Tous les types ,de cancer mentionnés ci-dessus ont un point commun,. c'est-à-dire que la cellule néoplasique, comme le rapport de la Commission Présidentielle, cité plus haut, le mentionne, subit une modification biologique fondamentale qui 10 la rend différente de cellules saines. On a supposé que la modification qui se produit était une altération permanente des acides nucléiques contenus dans la cellule. Notamment, on a pensé que la modification affecte l'acide désoxyribonucléique et l'acide ribonucléique, le premier étant associé à des gênes 15 de cellules et le deuxième agissant pour produire des enzymes et des substances à base de protéines. On a également trouvé qu'une certaine modification se produisait dans la morphologie de la membrane cellulaire qui entoure toutes les cellules. La aioâifieation biochimique de la structure cellulaire de cellules 20 néoplasiques doit être responsable de la perte de l'inhibition par contact que les cellules néoplasiques montrent, ce qui les distingue de cellules saines et qui rentrent dans une certaine mesure dans les différences qui existent dans le processus de division cellulaire entre les cellules néoplasiques et les 25 cellules saines. On a tenté, dans le passé, d'effectuer un essai relativement simple, qui permettait de reconnaître et de distinguer des cellules néoplasiques et des cellules saines à l'aide d'un processus chirurgical ou de laboratoire rapide. Ces efforts 30 ont abouti à des essais qui comprennent l'injection du sang à des embryons de poussins. Dans l'essai d'embryon de poussin, si le sang provenait d'une personne ayant le cancer, soit l'embryon de peussin était tué, soit il en résultait des déformations frappantes du poussin. D'autre part, si le sang provenait 35 d'un patient sain, l'embryon de poussin se développait normalement. Un autre procédé d'essai implique l'utilisation d'une bactérie dont la croissance était arrêtée par des cellules cancérigènes et ne l'était pas par des cellules non cancérigènes D'autres procédés d'essais concernant l'essai cytologique du 69 01254 4 2000654 VS.giîl Papanicolaou, couramment appelé "essai Pap", l'examen aux rayons X et cela sans utilisation de matières opaques, l'utilisation d'une matière colorante spécifique d'une tumeur, l'emploi de matières radio-actives, l'analyse du sang pour les enzymes, les antigènes, les anti-corps, les polysaccharides, les glycoprotéides, les restes de tissu sain et de tissu présentant des tu~eurs, les protéines, les albumines, les globulines, les vitamines, les métaux à l'état de trace, les amino-acides, les ^raisses, les lipides, les cellules toxiques, etc..., l'examen microscopique des tissus, les analyses d'urines, tous ces essais servant à décrire certaines caractéristiques différentes entre c^-s patients sains et des patients atteints de cancer. Sien que certains de ces essais n'aient pas été sûrs dans le passé, ils présentent tous un facteur commun en ce qu'ils sont spécifiques pour un type particulier de tumeur, cancer ou analogue. Ceci signifie qu'il n'y a pas un seul test spécifique auquel un médecin pourrait se référer pour déterminer d'une façon uniforme la présence de tout type de cancer qui touche un organisme vivant. L'invention crée : - Un procédé de détermination de cellules néoplasiaueso - Un procédé de détection de cellules cancérigènes uniques en présence de plusieurs cellules saines par la fixation spécifique de toutes ces cellules cancérigènes avec une agglutuline marquée# -Une agglutuline :.e glycoprotéide utilisée pour la détection de cellule néoplasique, le glycoprotéide pouvant être marqué ou non avec une substance fluorescente, un colorant visible ou une matière radio-active. - Un moyen permettant de différencier des cellules néoplasiques c.e cellules saines par l'addition d'un glycoprotéide. - Un essai pour éprouver des cellules cancérigènes en y ajoutant une substance qui réagit spécifiquement avec la cellule néoplasique et qui ne réagit pas avec une cellule saine » - Un procédé pour effectuer une différence er.tre des cellules néoplasiques et des cellules saines par'1'addition d'une substance chimiqus fluorescente qui peut être détectée par 1' émission de fluorescence lorsqu'elle est en contact avec des cellules néoplasiques. - Un procédé de différenciation entre des cellules néoplasiques BAD ORIGINAL 69 01254 5 2000654 et des cellules saines en "mettant les cellules au contact d'un composé chimique radioactif, qui peut être détecté par l'émission de radiations lorsqu'il se trouve avec des cellules néoplasiques. 5 - Un procédé permettant de différencier des cellules néoplasiques de cellules saines par la mise en contact avec un composé chimique qui produit une couleur qui peut être vue par un procédé optique, en cas de présence de cellules néoplasiques. - Un procédé pour "effectuer une différence entre une substance 10 cellulaire néoplasique et une substance cellulaire saine en mettant en contact la matière cellulaire avec un glycoprotéide fluorescent qui lorsqu'il se trouve en présence de cellules néoplasiques permet de rendre ces cellules fluorescentes mais pa« les cellules saines. 15 - Un procédé de différenciation entre une cellule néoplasique et une cellule saine par mise en contact de la matière cellulaire avec un glycoprotéide qui émet des radiations lorsqu'il est en présence d'une matière cellulaire néoplasique. - Un procédé permettant de différencier des cellules néopla-20 siques de cellules saines par introduction d'un glycoprotéide qui entraîne une couleur pouvant être décelée par toute technique permettant de Voir et mesurer des radiations visibles, soit à l'oeil nu soit au moyen de microscopes ou des spec-troïhotomètres lorsque des cellules néoplasiques sont présentes. 25 - Un procédé de différenciation entre une matière cellulaire néoplasique et une matière cellulaire saine par mise en contact de la matière avec un glycoprotéide qui agglutine la matière cellulaire néoplasique et qui n'agglutine pas. une matière cellulaire saine. 30 Diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent d'ailleurs de la description suivante. l'invention concerne la différenciation d'une matière cellulaire néoplasique à partir d'une matière cellulaire saine en faisant réagir une matière, cellulaire avec une substance néopla-35 sique spécifique de manière à obtenir une réponse visible ou .mesurable lorsque des cellules néoplasiques sont présentes. La substance néoplasique spécifique employée dans l'invention est un glycoprotéide qui est isolé à partir de germes de blé ou d'une préparation brute d'une lipase de germes ,de blé. 69 01254 e 2000654 On entend dans la présente description par "digloprotéide" une agglutinine qui est extraite de germes de blé ou de ses dérivés et qui réagit spécifiquement avec les substances néoplasiques* le glycoprotéide est préparé en prenant des germes de 5 blé ou une préparation brute d'une lipase de germes de blé et en-introduisant pour former une suspension dans un solvant tel que l'eau, un alcool, des solvants organiques ou leurs mélanges ou tout milieu solvant approprié et en broyant ensuite la suspension pour y homogénéiser la matière• La suspension est alors 10 chauffée jusqu'à environ 75®C puis est centrifugée aifée élimination du précipité résultant. La suspension peut être chauffée à toute température à laquelle l'activité biologique du glycoprotéide n'est pas réduite ou a subi une désactivation. Lu sulfate d'ammonium, du sulfate de clacium, du chlorure d'am-15 monium, du chloruré de calcium'ou tout autre sei approprié à des fins de relargage est alors ajouté au liquide surnageant en une quantité suffisante pour obtenir le relargage du glycoprotéide qui entraîne un précipité qui est' centrifugé. La vitesse de eentrifugation utilisée n'est pas critiqué et 20 toute vitesse qui est suffisante pour séparer le' filtrât cr\-vient. Le précipité provenant de ce traitement avéo le sel est alors dissous dans l'eau puis dialysé contre de l'eau au froid, conformément au processus de dialyse classique, concentré et redissous dans l'eau, un alcool, des solvants 25 organiques, leurs mélanges ou d'autres systèmes à solvants" analogues et est introduit dans un milieu d'échange.' Les températures employées dans ce processus de dialyse classique sont comprises entre environ 0°C' et environ 4°0 mais la dialyse peut aussi être exécutée à d'autres tempé-30 ratures appropriées. Les milieux de séparation utiles comprennent les milieux qui permettent la séparation de molécules suivant' une diff érence par rapport à leurs grosseurs ou charges relatives. Parmi ces milieux, on mentionne les milieux dé filtration sur 35 gel "Biogel" et "Sephadex" de même que les résines à base de diéthylamino-éthyl cellulose et de earboxyméthyl cellulose. Les procédés de purification du glycoprotéide utile conformément à l'invention comprennent les processus connus de' purification de protéine tels que 1'ëlectrophorèse sur l'un 69 01254 7 2000654 quelconque de plusieurs supports tels que l'amidon, le caoutchouc alvéolaire et le polyacrylamide. Les procédés chroma-t©graphiques oui permettent une absorption sélective du composé désiré sont également utiles, les substances fréquemment utilisées dans les procédés de chronr^tographie sont représentées par un gel au phosphate de calcium, un gel à'alumine, la terre diatomées, l'amidon, 1'hydroxy-apatite0 îin plus du procédé de purification mentionné ci-dessus, le glycoprotéide utile peut être préparé par un mode opératoire classique de précipitation et de purification employant les milieux ce purification donnés ci-dessus avec d'autres matières de différenciation des grosseurs classiques. 3n outre, le glycoprotéide peut être obtenu par d'autres procédés de précipitation couranment employés en liaison avec les substances protéinicues c'est-à-dire par précipitation de sels, précipitation isoélectrique et précipitation avec des solvants organiques. D'autres part, le glycoprotéide peut être obtenu sous une forme pure en utilisant un procédé d'élution d'haptènes c'est-à-dire en fixant-un h&ptène à un support en absorbant une préparation contenant de 1'agglutinine impure avec un support contenant de l'haptène et en éluant 11agglutinine spécifique avec un haptène solubie. •le produit qui résulte de cette extraction et de cette purification est un glycoprotéide pur qui a une densité optique maximale à 278 millimicrons et une de:-.sité optique minimale à 252 millimicrons. On n'observe pas d'absorption au-dessus de 300 millimicrons. la fig. 1 annexée est :..n diagramme dans lequel on a représenté en abscisse la densité optique en millimicrons, tandis qu'en ordonnée on a représenté la concentration du glycoprotéide. le coefx"icient d'extinction à 280 millimicrons est de 15,0, le rap ort des densités optiques de 280 à 260 millimicrons étant de 1,34. On a trouvé, -le plus, qu'une excitation de la fluorescence maximale se produit à 280 millimicrons et qu'une émission maximale a lieu troc environs de 340 millimicrons. le glycoprotéide a un coefficient de sédimentation de 2,74 dans l'eau à 20°U, un coefficient de diffusion dans l'eau —7 à cette même température de 9,2 x 10 cm2/seconde, un volume BAD ORIGINAL 69 01254 8 2000654 spécifique partiel (obtenu avec un pycnomètre) de 0,71 nl/g et une densité partielle (tirée de la composition en amino-acide) de 0,72 ml/g. La viscosité intrinsèque est de 8 à 10 ml/cm-"'" par seconde Ce glycoprotéide a un poids moléculaire 5 d'environ 26.000, un rapport de friction de 1,2 et un rapport axial de 4 à 5. La viscosité intrinsèque du glycoprotéide est d'environ S à 25°C. On obtient le glycoprotéide à partir de tous les amino-acides usuels et il contient de grandes quantités d'acides glutaniques et aspartique, c'est-à-dire respectivement 10 ae 19 et 15 résidus/molécules. La partie d'hydrate de carbone (3 à 5 /») du glycoprotéide en question consiste essentiellement en groupements de glucose» Au tableau I ci-après,on donne différentes compositions d'amino-acides pouvant être utilisées pour obtenir le glu— 15 coproteide désiré» Voir Tableau 1 page 2 6 Conformément à l'invention, le glycoprotéide pur peut être marqué avec un composé fluorescent, un composé susceptible d'émeitre de la lumière sous un éclairage ultraviolet et infra-20 rouge, un isotope radio-actif, ou peut être utilisé comme substance chimique pure dans le présent essai» Le marquage radio-actif peut être celui qui est utilisé avec le glycoprotéide suivant la manière dont l'essai est mis en oeuvre. Notamment, le glycoprotéide peut être marqué avec 25 un isotope léger, une substance opaque aux rayons £ ou un isotope lourd, le choix étant déterminé par les conditions spécifiques sous lesquelles l'essai est effectué. Le glycoprotéide peut être marque avec un isotope lourd d'éléments tel eue l'iode, le cérium, le xénon, le césium, le baryum, etc ... 30 au moyen d'un mélange de glycoprotéide avec une solution alcaline telle que le carbonate de sodium, conformément au procédé décrit dans "Proceedingsof the Society of Expérimental Biology and Kedicine 80: 741 (1952)"» On prépare line matière à base d'isotope lourd tel que l'iode en ajoutât de l'iode 35 à une solution d'ioiure de sodium et de nitrite de sodium, goutte à goutte, à la solution du glycoprotéide et on agite» Le produit obtenu est alors introduit dans une colonne d'échange ionique dont l'effluent est une solution isotonique avec 69 0} 254 s 2000654 du chlorure de sodium. Cette solution isotonique est filtrée, il en.résulte un glycoprotéide iodé radiô-actif. D'autres procédés bien connus peur marquer dés protéines telles que celles de l'invention sont décrits-par "Lutwack, L., 5 Proceedings of the Society of Expérimental Biolôgy and Medicine, 80, 741 (1952), Gilmore Jr., U.C., et autres Kucleonics 12, No.2, 65 (1954), McParlane, Biochemical Journal, 62, 135 (1956). A titre de variante, le glycoprotéide peut être marqué avec 14 un isotope léger tel que le tritium ou carbone en faisant réa-10 gir le glycoprotéide avec l'anhydride acétique ainsi marqué.Ceci peut être réalisé en ajoutant l'anhydride acétique marqué à une solution alcaline du glycoprotéide et en faisant une extraction du produit par chromatographie• Le marquage peut également être obtenu par les procédés de "Coleman, H.jj1. et autres, Journal of 15 Biological Chemistry, 241 3652 (1966) ou Colowick, S.P., et autres, Methode d ' enzymology, Vol.IV, P.251, ^cademic Press,New Ïcrfc19î7. Une autre variante pour marquer avec une substance radioactive le glycoprotéide consiste à utiliser, une substance opaque aux rayons X telle que l'iode 125 qui peut être utili-20 sée pour le marquage du glycoprotéide d'une façon analogue à celle mentionnée pour marquer l'iode 131. En dehors du marquage des composés avec une substance radio-active, le glycoprotéide employé dans l'invention peut réagir avec un composé fluorescent. Les agents fluorescents 2 5 utiles comprennent des composés tels que des isothiocyanates de fluorescéine, le chlorure de 5-diméthylamino-1-naphtalène-sulfonyle ou le chlorure de bis-amine-rhodamine [3-2 00 ou d'autres composés réactifs analogues qui sont fluorescents. Ces composés peuvent être utilisés soit sous une forme libre, soit 30 sous une forme fixée à une célite. La célite est une terre si-licieuse ou une terre de diatomées dont les exemples les plus courants sont mentionnés par la terre d'infusoire, le kiesel-guhr, etc. En général, le marquage fluorescent peut être fixé au gly-35 coprotéide en faisant réagir une solution alcaline et du glycoprotéide avec la metière fluorescente fixée sur la célite. Lorsque la réaction est terminée, la matière n'ayant pas réagi est retirée par centrifugation et le glycoprotéide marqué est purifié par tout procédé de purification classique.. Le marquage 69 01254 10 2000654 r>ar fluorescence conformément à ce procédé et d'autres procédés utiles (3ans ce domaine, sont décrits dans "Hinderkn.echt, H„, ultra-J^apid fluoréscer.t Labeling o_\ Proteins, mature, 193, 167 (1962), et S::perientia, Vol fragment de tissu qui a été obtenu à partir d'un patient ou sujet par biopsie et observer l'échantillon à des fins d'indications de fluorescence, de radio-activité ou d'une coloration visible suivant la façon spécifique dont le-glycoprotéide employé est 30 marqué* En outre, l'essai peut être réalisé avec une suspension de matière cellulaire qui peut être obtenue par un procédé chirurgical, après quoi le chirurgien doit laver le tissu analysé exempt des liquides qui l'entourent» Le glycoprotéide peut ensuite être ajouté au tissu tandis que.le chirurgien observe 3.5 l'agglutination, 3 a fluorescence, 1 a radio-activité ou la coloration visible suivant le, runière dont, on a marqué; le glycoprotéide eLp_oyé o Le plus, le procédé - d '.essai de 1 'invention comprend 1' administration d'un glycoprotéide marqué à. un patient ai ' on c-v;,;co se atteint d'un cancer. La substance spécifique néo- 69 01254 «■ 2000654 plasique doit être concentrée dans la zone.de toute excroissance néoplasique et peut être observée au moyen d1 émission radioactives. £n particulier, une préparation telle que celle donnée à l'exemple 2 peut être rendue isotonique avec une solution 5 de chlorure de sodium et filtrée k travers un filtre stérile de Seitz-Manteufel pour préparer une solution isotonique stérile en vue d'injection* On peut injecter au sujet environ 5 ml de cette préparation pour ..bserver une éventuelle réaction possible. Le corps du sujet peut être exploré avec un comp-10 teur Geiger et on peut observer l'endroit du tissu cancérigène présentant un degré de radio-activité supérieur L celui du reste du corps humain» Ceci signifie que le glycoprotéide ra-dio-actif est isole dans la zone de la substance néoplasique et ceci est une détermination spécifique d'une matière néopla-15 sique. Bien que certaines radiations puissent être observées sur le sujet en entier, ceci est attribué à l'agglutination d'une autre matière cellulaire qui contient la substance caractéristique à une tumeur et l'acétyl-glucosamine. Toutefois, en vue d'obtenir une différence plus grande de la réponse, on 20 suppose que cette substance est utile pour un essai in vivo de la matière néoplasique.. Le procédé d'essai peut également être .appliqué à une suspension d'une matière cellulaire qui a été obtenue à partir d'un patient qu'on suppose atteint de cancer et dans ce procédé particulier, la suspension doit être 25 traitée avec le glycoprotéide et observée pour là réaction caractéristique si la substance néoplasique est présente» L'invention peut également être utilisée en administrant à une personne un glycoprotéide opaque aux rayons X. le glycoprotéide marqué peut ensuite être détecté dans une zone 30 isolée, si le patient a le cancer, au moyen d'un fluoroscope ou d'un procédé utilisant les rayons X» notamment, on peut injecter à lin patient qu'on suppose atteint de cancer une solution isotonique stérile du glycoprotéide préparé selon le procédé de 1'exemple 60 Une visualisation aux rayons X peut avoir 35 lieu dans la zone corporelle supposée être cancéreuse et on peut observer avec la matière opaque aux rayons X l'endroit précis du tissu cancérigène. £n outre, un examen à 1 aide d'un compteur G-eiger montre qu'une grande partie de la matière raaio-active a été isolée dans l'aire du tissu cancérigène. 69 01254 12 2000654 Conformément au procédé de l'invention, le glycoprotéide, lorsqu'il est mis en contact avec la matière cellulaire néoplasique agit pour agglutiner cette matière et provoque sa combinaison en grumauxo Cette réaction distingue la matière néoplasique 5 d'une matière cellulaire saine dont les cellules restent isolées et qui ne s'agglutinent pas dans une mesure appréciable. Bien que le processus exact de ceci ne soit pas connu, on suppose dans la théorie que le glycoprotéide réagit avec une certaine substance qui est spécifique vis-à-vis de la membrane cellu-10 laire de la matière néoplasique qui n'est pas présente dans les membranes de cellules saines» On pense qu'une partie de cette substance est la U-acétyl glucosamine qui forme une partie entière d'une molécule plus grande et qui peut réagir spécifiquement avec le glycoprotéide de l'invention, ce qui entraîne 15 l'agglutination observée. Cette réaction, toutefois, ne se produit pas lorsque le glycoprotéide est placé au contact d'une matière cellulaire saine. En outre, si le glycoprotéide employé est marqué avec une substance fluorescente, radio-active ou un colorant visible, la fluorescence, la radiation ou la colo-20 ration correspondante peuvent être observées uniquement sur des cellules cancérigènes. Cependant ce phénomène ne peut pas se détecter d'une façon significative si seulement une matière cellulaire saine est présente dans la substance dressai. L'invention est représentée, à titre non limitatif aux 25 exemples suivants » Exemple 1 Le glycoprotéide est extrait à partir de lipase de germes de blé conformément au procédé décrit dans un articule intitulé "Identification of a ïumor Spécifié Déterminant on leoplas-30 tic Cell Surfaces", Buger, M.K. Goldberg, À.R., Proceeding of the National Academy of Sciences 57:2 pages 359-366, Eebruaxy 1967. 10 g de lipase de germes de blé sont mis en suspension dans 500 ml d'eau distillée broyés dans un mortier au pilon puis homogénéisés. Des lots de 100 ml de la suspension mention-35 née plus haut sont immergés dans un bain-marie à 60°C pendant 15 mn. Ces suspensions sent alors centrifugées et le filtrat est retiré par décantation bien que 1'.n puisse employer d'autres techniques de séparation. Les parties de liquide surnageantes qui en résultent sont combinées et clarifiées par passage à 69 01254 « 2000654 travers un filtre en laine 'de verre et, 425 ml de ce liquide clarifié sont refroidis à 0°G. Cette température est utilisée pour maintenir la solution de sulfate d'ammonium dans un état de saturation, la température peut varier suivant le sel particulier employé dans le procédé de relargage de manière à maintenir ce sel dans un état de saturation. On ajoute 113 g de sulfate d'ammonium au liquide clarifié refroidi et la solution formée est centrifugée pendant 20 mn. le précipité est recueilli et redissous dans 14 ml d'eau puis est dialyse au froid. Tout précipité formé pendant cette dialyse est éliminé par centrifugation. la fraction dialysée est ensuite condensée dans un évaporateur rotatif bien que d'autres processus de condensation puissent être avantageusement employés à 4°C et est amenée à traverser une colonne de gel de pblysaccharide (Sephaa.ex G-75) qui est aussi refroidie à 4°C et diluée avec de l'eau, le glycoprotéide est obtenu dans l'effluent, lorsque 300 à 375 ml de ce dernier se sont écoulés. la pureté de ce produit est éprouvée dans une ultra centrifugeuse de type Spinco model E. Le glycoprotéide donne un seul pic avec un coefficient de sédimentation égal à 2,74 dans l'eau à 20°C. De plus, on soumet le produit à une électrophorèse sur du caoutchouc alvéolaire supportant une bande comme cela est décrit dans le procédé de Messieurs Burger et L. fflaser comme cela est publié dans le journal de biochimie aux pages 239, 3. 168 (1964). On trouve que le glycoprotéide est dans un étant de pureté et que les réstiltats de l'extraction peuvent être reproduits. Exemple 2 Le glycoprotéide purifié de 1' exemple 1 est marqué avec de l'iode 131 conformément au procède suivant» On mélange 25 mg du glycoprotéide avec de l'eau et 1,25 mg de carbonate de sodium est alors ajouté au mélange obtenu un mélange iodé est préparé en malaxant 1,2 ml d'une solution de iodure de sodium 0,002 M, 1,2 ml d'une solution de nitrite de sodium G,lc2 3£ et 1,0 ml d'iode 131 dans le disulfite de sodium, cet iode 131 ayant une activité de 1 me/ml» Le pH du mélange iodé est réglé à une valeur inférieure à 4 par l'addition d'acide chlo-rydrique 0,5 H et la solution est ensuite neutralisée avec 0,25 îï d'hydroxyde de sodium» Le mélange iodé neutralisé est 69 01254 w 2000654 dilué avec 16,5 ml d'eau et est ajouté à la solution du glycoprotéide alcaline, le mélange que l'on obtient, est introduit sur une colonne d'Amberlite Iît-4-B et l'effluent qui en sort qui contient la majeure partie de la matière mar-^ quée radio-active, comme cela est déterminé par les techniques d'analyses infra-rouges classiques, est amenée à traverser une autre colonne d'échange d'Amberlite IR-lOOH. Le produit obtenu de cette deuxième colonne est un glycoprotéide iodé radio-actif. Exemple 3 10 Le glycoprotéide de l'invention est marqué avec isotope léger par le procédé suivant, à savoir : on fait réagir 100 ml d'une solution du glycoprotéide contenant 5 $ de cette substance avec 100 ml d'une solution d'acétate de sodium saturée» Le glycoprotéide et le mélange d'acétate de sodium sont alors 15 refroidis dans un bain de glace» On ajoute de. l'anhydride acétique marqué au tritium (à 5 % dans l'acétone), avec cinq parties égales de 2 mg chacune pendant une durée de 2 heures, tandis que la température du milieu réactionnel est maintenue à 0°C. Le produit obtenu (un glycoprotéide acétylé) est ensuite 20 séparé de l'anhydride acétique marqué au tritium n'ayant pas réagi et de l'acétate par dialyse contre de l'eau. Exemple 4 Le glycoprotéide de l'invention est marqué avec un isotope léger par le procédé suivant s on tamponne 50 ml d'une solution 25 du glycoprotéide contenant 2 $ de cette substance dans l'eau à un pH de 8,5 avec du bicarbonate de sodium , se pH de 8,5 étant préféré. Un pH spécifique et un milieu tampon caractéristique ne sont pas cependant critiques dans le procédé de l'invention. On ajoute à la solution du glycoprotéide tamponnée 30 5 ml d'anhydride acétique marqué au carbone 14 à 1 # dans l'acétone. La solution est maintenue à la température ambiante pendant environ 10 heures jusqu'à ce eue la réaction soit terminée» Le glycoprotéide marqué au carbone 14 est ensuite séparé de l'acide acétique et de l'anhydride acétiqué n'ayant pas réa-35 gi par séparation à travers une colonne Sephadex jusqu'à ce que la majorité de la matière active par voie biologique ait été éluée comme cela est déterminé par le procédé de l'exemple 2. Exemple 5 Le glycoprotéide marqué par fluorescence est préparé en 69 01254 i5 2000654 faisant réagir 10 ml de glycoprotéide à 5. /" dans l'eau avec 10 ml d'un tampon ae "bicarbonate 0,05 II à pH égal à 3,5» Ce mélange est traité avec 10 ml d'une solution 0,5 mil de 17-acétyl-glucosaminé. la suspension est ensuite mélangée avec de l'iso-5 thiocyanate de fluorescéine fixé sur de la célite (vendu par -Calbiochem Cat. LTo. 34523"); on laisse le mélange réagir pendant 2 heures. Le glycoprotéide à 1'isotiocyanate de fluorescéine est alors séparé dti colorant n'ayant pas réagi fixé sur la célite par centrifugation. le produit marqué est purifié par 10 parties à travers une colonne de filtration sur gel (Sephadex) avec de l'eau conformément au procédé dé l'exemple 2. Exemple 6 le glycoprotéide de l'invention est marqué avec de l'iode 125 opaque à la radiographie par le procédé suivant : on fait 15 réagir 500 mg du glycoprotéide dans 10 ml d'un tampon salin avec 12 me d'iode 125 exempt de support, en ajoutant l'iode gcutte à goutte® Ceci est suivi par l'addition de 3 ml d'eau. On laisse terminer la réaction du mélange réactionnel à la température ambiante et on dialyse enstiite contre de l'eau au 20 froid à 4°C, le glycoprotéide iodé opaque à la radiographie est récupéré par des techniques de filtration sur gel classique. Exemple 7 Le glycoprotéide de l'invention est marqué avec un colorant visible par le procédé qui suit : on mélange 500 mg du 25 glycoprotéide avec un 1 mg d'une solution de bicarbonate de sodium et le volume total est ajusté à 20 ml avec de l'eau. 1 mg de l-fluoro-2,5-dinitrobenzène est ajouté dans 20 ml d'éthanol et le mélange obtinu est agité pendant environ 2 heures à la température ambiante. Le mélange est alors concen-30 tré par l'emploi de chaleur pour dégager 1' éthanol et l'eau et évaporé jusqu'à dessication, le résidu obtenu est dissous dans l'eau et extrait avec de l'alcool. Le glycoprotéide visible est ensuite là encore dissous dans l'eau» Exemple 8 35 Le glycoprotéide est éprouvé pour déterminer son aptitude à différencier des cellules néoplasiques de cellules saines. On choisit à des fins de comparaison avec des cellules tumorales de lymphome, des thymus de scui-is et de rats sains» Les thymus de souris saines sent préparés par cultures>dans une 69 01254 is 2000654 solution saline tamponnée (PBS) au phosphate et sont isolés conformément au procédé décrit dans "Cancer Research 2Q, 1426 (i960)"des thymus de souris suisses âgées de cinq, semaines? les thymus de rats sains sont également cultivés de la 5 même façon à partir du thymus de rats wistar âgés de cinq semaines» Ces cellules saines sont utilisées pour effectuer une comparaison vis-à-vis de thymus malins . Les thymus nwHnn (cellules de lymphome L I2i0) sont transplantés par voie intrapéritonéale dans des souris suisses blanches âgées de six 10 semaines et au bout de. sept jours le liquide du péritoine est recueilli dans du sulfure de plomb» Les cellules sont alors isolées de la substance cellulaire externe et mises en suspension dans du sulfure de plomb et centrifugées pendant cinq minutes» Le liquide surnageant est éliminé et les 15 cellules sont remises en suspension dans le sulfure de plomb, lavées dans le sulfure de plomb et le procédé est répété» Les cellules sont ensuite remises en suspension avec du sulfure de plomb et diluées jusqu'à une concentration de -5 x 10 cellules par ml avec le sulfure de plomb» Ces 20 suspensions cellulaires diluées sont combinées avec 0,02 ml du glycoprotéide dans l'eau (lO mg par ml) et mises au repos pendant l0 mn à 3a température ambiante» Une goutte de 0,05 ml de cette solution est enfermée dans une chambre cellulaire de Sykes-Moore et la goutte suspendue est observée» Les thymus 25 malins s'agglutinent suivant un nombre d'au moins 3 à 4 de l'échelle suivante et les cellules saines ne le font pas ou le font suivant un degré négligeable comme résultat de cet essai» L«échelle utilisée pour mesurer le degré d'agglutination est la suivante : 0 signifie pas d'agglutination, 30 1 indique la présence de seulement quelques cellules agglutinées, la majorité des cellules restant isolées 2 montre la présence d'un nombre plus grand de petits agglu-tinats, 3 signifie que toutes les cellules sont agglutinées en petits groupes, 4 indique une agglutinatiqn importante 35 de toutes les cellules. Le degré d'agglutination élevé qui apparaît avec les cellules néoplasiques est facilement observable et on peut le distinguer de la réaction qui se produit avec des cellules saines» 69 01254 i7 2000654 Exemple 9 On développe des tissus de cultures fibreuses dans un milieu de cultures en "fuseaux" dans un milieu supplémentaire* Ils sont ensuite transférés dans du sulfure de plomb 5 et dilués à une concentration de 1 x 1Û cellules par ml avec le sulfure de plomb» A des fins de comparaison avec ces cellules saines on transplante à des souris suisses âgées de six semaines une préparation de substances fibreuses de souris malignes hyperdiploides ascites d'Ehrlich» Ces 10 cellules sont cultivées dans du liquide.du péritoine et mises en suspension dans du sulfure de plomb et diluées jusqu'à une concentration de 1 x lO cellules par ml avec le sulfure de plomb* On effectue une suspension qui comprend chaque type de cellules conformément au procédé de 15 l'exemple 8. Gomme résultat d'une comparaison au microscope, on observe un agglutinement des cellules néoplasiques égal à 3 et 4 par rapport à l'échelle de l'exemple 8, les cellules saines ne s'agglutinant pas ou s'agglutinant selon un degré négligeable apte à permettre une différenciation 2D entre les deux types de cellules» Exemple 10 Un échantillon sanguin obtenu à partir d'une personne dont on sait qu'elle présente la leucémie, est préparé conformément à une variante du. procédé Amos publié dans "the proceeding of the 9th Congress of the EUropean Society of 25 Hematology 1963" page 1132. L'échantillon sanguin est traité avec une solution à 5 $ d'un sel disodique de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique (Ua2 EDTA) et 5 ^ de polyvinyle-pyrrolidine ce qui entraine la sédimentation des globules rouges du sang» La suspension est centrifugée et le liquide 30 surnageant est éliminé et dilué avec un tampon salin au c r\ 6 phosphate à une concentration de 5 x 10 cellules par ml» Un échantillon de sang sain est traité de la même façon pour obtenir une suspension de globules blancs. Les deux échantillons des cellules du sang; l'un contenant des leucocytes 35 sains, l'autre contenant des leucocytes d'un sang leucémique, sont traités comme décrit ci—après ï un échantillon de 0,3 ml 69 01254 îs 2000654 de chaque suspension de cellules est traité avec le glycoprotéide jusqu'à une concentration finale de 20 microgrammes par ml* Une goutte de chacune des suspensions obtenues est alors placée sur une plaque de verre et enfermée dans une 5 chambre cellulaire de Sykes-Moore et est observée en ce qui concerne l'agglutination. Comme résultat de cet essai, les échantillons du sang leucémique montrent un degré élevé d'agglutination comme on peut le voir sur le tableau Z suivant, tandis que la suspension qui provient d'un sang 10 sain"ne montre qu'une agglutination relativement peut importante» Par conséquent, cet essai distingue nettement les cellules néoplasiques des cellules saines* Tableau U Préparation des leucocytes Quantité relative d'agglutination 15 sains + leucémiques +++ ^ans ce tableau, 0 signifie une agglutination négligeable, + mentionne la détection de quelques cellules agglutinées, la majorité des cellules restant isolée, ++ représentent la présence de quelques petits agglutinats de cellules, +++ indiquent que toutes les cellules présentes se sont agglutinées et ++++ représentent une situation dans laquelle il existe un agglutinement très important de toutes les cellules• 25 Exemple 11 Une préparation cellulaire est réalisée à partir de lymphome L2 de lymphome 6C3HED et d'adénocarcinome TA3. Le lymphome L2 est préparé par irradiation conformément au procédé de Shelton E, comme publié dans "the journal of the 20 National Cancer Institute 12j1203, (l952)h„ Le lymphome 6C3HED est préparé en faisant réagir des cellules avec du benzoate d'estradiol conformément au procédé de G-ardner W.Y. et autres comme cela est publié dans "Cancer Research 4:75 (1944). 1'adénocarcinome TA3 est prélevé d'une tumeur 35 mammaire se produisant naturellement dans une souris femelle 20 69 01254 îs 2000654 de lignée A. I»es suspensions, cellulaires sont préparées pour être utilisées en injectant les cellules dans la cavité péritonéale d'une souris saine et les substances ascites sont retirées et mises en suspension dans un tampon 5 de ïyrodes, introduites dans le bas et remises ensuite en suspension dans un tampon de ïyrodes et d'acide d'éthylène-diamine-tétraacétique à 5 $» On prépare une suspension de cellules saines à partir du thymus, des poumons et de la rate de souris en séparant la matière cellulaire du tissu lO conjonctif associé par pressage des fragments à travers un tamis fin» La matière cellulaire obtenue est alors centrifugée et remise en suspension en utilisant le même procédé que celui employé avec les cellules néoplasiques» On prépare de la même façon des cellules saines de foie et on effectue l5 ensuite le lavage du tissu du foie in situ dans une solution d'acide éthylène-diamine-tétraacétique• On obtient ainsi de petites suspensions d'épidermes et d'os conformément au procédé décrit dans "Transplantation of ïfssue and Cells édité par H»2. Bmingham (Philadelphia : Wistar Institute 20 Press, l96i) pages 12 et 9l". Du fait que les cellule s saines sont en général plus petites que les cellules présentant une tumeur, on règle les concentrations cellulaires pour que des quantités analogues de la surface des cellules soient exposées* ^n compare environ 5 x 10 cellules/ml de la 25 rate dans le tampon avec 2 x 10 L ^ 2 cellules/ml du tampon» Un échantillon de 0,3 ml de chacune des préparations cellulaires définies ci-dessus est ensuite traité avec une suspension (10 mg/ml) d'un glycoprotéide marqué au fluorodi-nitrobenzène obtenu par le procédé de l'exemple 1 jusqu'à 30 une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre» Oomme il ressort du Tableau III suivant, dans chaque cas, la préparation contenant des cellules néoplasiques agglutinées et des agglutinats visibles est observée» En contraste, ces préparations contenant des cellules saines ne montrent 35 pas de souillures de fluorodinitrobenzène ni de degré d'agglutination notable avec les matières néoplasiques. 69 01254 ao 2000654 TABLEAU III Matières cellulaires Réaction observée Lymphome L / 2 +++ (]_) Lymphone 6.C3HEIÏ +++ (i) 5 Adénocarcinome TA3 ++++ (1)- Cellules saines de la rate + Cellules saines du thymus 0 Cellules saines des poumons 0 Cellules saines de l'épiderme 0 lO Cellules saines de la moelle d'os 0 Cellules saines du foie + (1) Une agglutination visible et une réponse par coloration concomitante sont observées- Les symboles utilisés dans ce Tableau ont les 15 mêmes significations que celles données à l'exemple lO» On a, par conséquent, conclu que le glycoprotéide marqué employé dans cet essai est utile pour différencier des matières saines de matières néoplasiques» Les cellules utilisées dans l'invention peuvent être mises en suspension 20 dans tout milieu-tampon classique tel que le tampon de Tyrodes, le versène, le sulfure de plomb, etc.»» Le glycoprotéide de l'invention peut -être employé soit par un procédé d'essai in vivo, soit par un procédé d'essai in vitro pour effectuer une différenciation entre 25 des matières cellulaires néoplasiques et des matières cellulaires saines» La concentration du glycoprotéide employé n'est pas critique et peut aller dans une gamme comprise jusqu'à environ 20 $ ou plus selon les conditions- Exemple 12 30 On prépare et on met en suspension dans du sulfure de plomb comme mentionné préalablement, des cellules de lymphome L-i2i0<> a chacune de ces suspensions cellulaires ayant une concentration de 5 x lO cellules par millilitre, on ajoute de nombreux solvants pour déterminer leurs effets 35 par rapport à la réaction d'agglutination» On ajoute ainsi 69 01254 2l 2000654 0,3 ml de^suspension cellulaire ayant une concentration de 5 x 10 cellules par millilitre à une quantité suffisante du glycoprotéide (10 mg/ml dans l'eauj jusqu'à une concentration de 40 microgramiaes par millilitre. Comme il ressort 5 du Tableau 4 suivant, l'addition du glycoprotéide entraîne 1'agglutination de cellules cancérigènes tandis que lorsqu'on n'emploie pas le glycoprotéide, il n'y a pas d'agglutination. TABLEAU IY Agglutination lO Lymphome L-1210 + 6 $ d'acide acétique et 95 % d'alcool méthylique 3 à 4+ Lymphome L-l2i0 + sulfure de plomb 0 Lymphome L~l2i0 + le glycoprotéide +4 Lymphome L-l2i0 + sulfure de plomb 0 Lymphome L-1210 avec de 1' éthanol à 10 ?» 15 + le glycoprotéide + 4 Lymphome L-1210 avec de 1'éthanol à lO ^ 0 Lymphome L-l2l0 + de 1'éthanol à 50 $ et le glycoprotéide + 3 Lymphome L-1210 + de 1'éthanol à 50 $ 0 à 1 20 Exemple 13 On prélève, à partir de patients ayant un cancer, une matière cellulaire cancétigène provenant du vagin et des conduits urinaires» Ces cellules sont de la même façon mises en suspension et diluées jusqu'à une concentration 25 d'environ 5 x 10 cellules par millilitre et on traite un échantillon de 0,3 ml avec le glycoprotéide jusqu'à une concentration de 50 microgrammes par millilitre de manière à déterminer leurs effets d'agglutination» C0mme il ressort du Tableau Y suivant, dans chaque cas où. 30 le glycoprotéide est ajouté, on note une agglutination significative des cellules comparativement à la matière cellulaire qui est vise en suspension et qui n'est pas traitée avec le glycoprotéide» i 69 01254 22 2000654 TABLEAU V Agglutination Substance prélevée de cellules du vagin Q Substance prélevée de cellules du vagin + le glycoprotéide + 2 5 Substance prélevée du conduit urinaire 0 Substance prélevée du conduit urinaire + le glycoprotéide . + 2 à 3 Exemple 14 Des cellules de reins d'embryons d'hamsters cancérigènes qui sont maintenues dans un milieu de Hahk:s-Eagle, sont 10 chauffées à 37°G et traitées avec 0,2 ml de trypsine à 2,5 On laisse au repos pendant 2 à 3 minutes les suspensions cellulaires, après quoi les cellules sont séparées» Les suspensions sont ensuite aspirées, condensées, centrifugées, lavées avec du sulfure de plomb, tamgonnées et diluées 15 jusqu'à une concentration de 5 x lO cellules par millilitre» Un échantillon de 0,3 ml de la suspension cellulaire est alors traité avec le glucoproteide jusqu'à une concentration finale de 20 microgramm.es par millilitre* La suspension cellulaire montre un degré d'agglutination de 4- par rapport à 20 l'échelle mentionnée préalablement dans les exemples antérieure* L'échantillon non traité ne montre pas d'agglutination* Exemple 15 On isole et on dilue de la même façon qu'à l'exemple 14 des cellules de HeLa maintenues dans une solution de Hanks 25 Eagle* Un échantillon de 0,3 ml de la suspension cellulaire est traité avec le glucoprotéide jusqu'à une concentration finale de 20 mi crogr animes par millilitre* La suspension cellulaire montre un degré d'agglutination de 4 par rapport à l'échelle mentionnée dans les exemples précédents» L'échan-30 tillon non traité ne montre pas d'agglutination® Comme on l'a mentionné ci-dessus, le glycoprotéide de l'invention peut être utilisé soit par un procédé d'essai in 69 01254 23 2000654 vivo, soit par un procédé.d'essai in vitro pour différencier des cellules néoplasiques et des cellules saines» la concentration du glycoprotéide utilisé n'est pas critique et peut se situer dans une gamme allant jusqu'à 20 fo ou plus suivant les 5 conditions d'emploi. En outre, si on emploie un procédé in vivo, le glycoprotéide peut être administré par tout procédé classique tel que par voie topique comme par les voies parentérale, orale, rectale et vaginale» l'invention peut être appliquée pour la détection de substances néoplasiques 1Û de sujets tels que des souris, des rats, des chiens, des chats ou tout autre mammifère, y compris l'homme, dans lesquelles il est nécessaire d'effectuer une détection soit à des fins de diagnostic expérimental, soit à des fins cliniques» Sous ce rapport, le glycoprotéide marqué ou non 15 marqué peut être inclus avec des supports pharmaceutiques classiques tels qu'un milieu isotonique tamponné stérile, une suspension aqueuse, des sirops, un milieu solide comme des comprimés et des gélules, comme on l'a déjà décrit» L'invention n'est pas limitée à la forme de réalisation 20 représentée et décrite en détail car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre» 69 01254 24 2000654 EE7EIDICAII PUS 1 - Un procédé pour la détection d'une substance cellulaire néoplasique qui consiste à placer en contact la matière cellulaire avec un glycoprotéide qui conduit à une liaison spécifi- 5 que du glycoprotéide vis-à-vis des cellules néoplasiques, ce glycoprotéide ayant été, au préalable, marqué de façon à permettre la détection d'une réponse. 2 - Un procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact la matière cellulaire avec 10 une quantité d'agglutination efficace du glycoprotéide qui a été extrait de germes de blé et en ce qu'on observe la matière cellulaire et la réaction qui peut être décelée lorsqu'il y a des matières néoplasiques. 3 - Un procédé suivant la revendication 1 ou 2, caracté- 15 risé en ce que la réaction que l'on peut déceler est une réaction avec fluorescence qui est visible et qui peut être mesurée. 4 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dans la réaction observée, on décèle la présence d'un colorant visible sur la substance néoplasique. 20 5 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce nue la détection de la substance néoplasique implique l'émission de radiations. 6 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on administre à un sujet une quantité effi- 25 cace du glycoprotéide et en ce qu'on observe le sujet en vue d'une réponse prédéterminée. 7 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la réponse prédéterminée réside en une émission localisée de radiations. 30 8 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la réponse prédéterminée consiste en la détection d'une substance opaque à la radiographie au moyen de rayons X ou d'un fluoroseope. 9 - Un glycoprotéide utilisé pour la détection de cellules 35 néoplasiques comprenant un glycoprotéide essentiellement pur caractérisé par les propriétés suivantes : une densité optique maximale de 278 millimicrons, une densité optique minimale de 252 millimicrons, un coefficient de sédimentation dans l'eau de 69 01254 2,74 à 20°C, un coefficient de diffusion de 9,2 x 10"^ cm^/s, un volume spécifique partiel (obtenu à l'aide d'un pycnomètre) de 0,71 ml/g, une densité partielle de la composition en amino- acide de 0,72 ml/g, une viscosité intrinsèque de 8 à 10 ml/ — 1 — 1 5 cm" /s" , un poids moléculaire d'environ 26 000, un rapport de friction de 1,2, un rapport axial de 4,5, une viscosité intrinsèque d'environ 9 à 25°C, une composition d'amino-acide décrite au tableau, et une partie d'hydrate de carbone (de 3 à 5 $) qui consiste presque exclusivement en unités de glucose, 10 le glycoprotéide étant marqué au préalable de manière à permettre la détection d'une réponse lorsque les cellules néoplasiques sont en contact avec lui. 10 - Le glycoprotéide suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est marqué avec un composé, ce qui entraîne 15 une fluorescence. 11 - Le glycoprotéide suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est marqué avec un colorant visible. 12 - Le glycoprotéide suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est marqué avec une substance radio-active„ 69 01254 26 2000654 TABLEAU I Compositions des ami no-acidea d*agglutinines de germes de blé 5 Nombre de résidus par molécule calculé (poids moléculaire = 26.000) nombre de résidus supposé Ami no—acides Durée de l'h 24 heures ydrolyse ** 72 heures Lysine T»90 6,91 8 à 9 10 Histidine 2,86 2,23 3 Amide NH^ 25,99 26 Arginine 9,75 9,65 10 Acide aspartique . . 14,28 14,17 15 Thréonine 7,82 7,54 8 à 9 15 Sérine 12,44 11,05 13 à 14 Acide glutami que . . 19,0 19,0 19 Proline 14,70 14,39 15 Glycine 24,10 24,05 24 à 25 19,41 18,94 19 à 20 20 Demi-cystine .... 13,60 13,20 13 à 14 yaline . 11.71 12,98 13 à 14 Méthionine ..... 3,67 3,81 4 Isoleucine 4,54 4,80 5 Leucine 12,25 12,13 12 à 13 25 Tyrosine 6,46 6,95 T Phénylalanine . . . 4,81 4,88 5 Tryptophane * ... 3, 92 4 * trouvé par voie spectrophotométrique ** hydrolyse acide exécutée à une température du bain d'huile 30 constante entre 105 et 106° C pendant 24 et 72 heures, conformément au procédé classique, application à un analyseur d1amino-acides de Beckman pour une détermination d'amino-acidës. les résidus de demi-cystines sont estimés en effectuant une oxydation acide conformément à Hirs et autres. 35 J. Biol. Chem. 212, 611 (1956).