Brevet FR2004659A1 — publié le 19691128

La présente invention concerne des composés chimiques nouveaux» Plus particulièrement, elle concerne une substance chimique appelée ambutyrosine, ses constituants individuels appelés ambutyrosine A et ambutyrosine B, les sels d'addition 5 d*acides correspondants, et des procédés pour la production des composés précédents» Le produit principal de l'invention, tel qu'il est normalement produit sous la forme de la base libre, a reçu le nom d*ambutyrosine, comme indiqué ci-dessus. 1*ambutyrosine peut être 10 isolée, identifiée, caractérisée et utilisée telle quelle. En variante, l1ambutyrosine peut être séparée en constituants individuels appelés ambutyrosine À et ambutyrosine B et chacun de ces constituants peut être isolé, identifié, caractérise et utilisé séparément. De plus, 1*ambutyrosine, 11ambutyrosine A et l'ambuty-15 rosine B peuvent être isolées, identifiées, caractérisées et utilisées soit sous la forme de la base libre, soit sous la forme de sels d'addition d'acides. Quand ce n'est pas précisé autrement, le terme ambutyrosine, tel qu'il est utilisé ici, désigne un mélange d*ambutyrosine A et d'ambutyrosine B, ou l'un ou l'autre 20 des constituants quand la distinction entre eux n'a pas d'importance. L'ambutyrosine, telle qu'elle est normalement obtenue à partir de bouillons de fermentation selon l'invention, contient une proportion majeure d'ambutyrosine A et une proportion plus faible (allant jusqu'à 10-15 f°) d'ambutyrosine B. 25 L'ambutyrosine A, 1* ambutyrosine B et leurs mélanges sont des bases solides blanches stables qui sont très solubles dans l'eau, modérément solubles dans le méthanol et légèrement solubles dans l'éthanol. Les bases libres forment des sels d'addition d'acides avec divers acides organiques et inorganiques comme les 30 acides acétique, propionique, maléique, malique, citrique, gluconique, chlorhydrique, bromhydrique, phosphorique, sulfurique et les acides du même genre. Chacune des bases libres a quatre groupements amino primaires et ces quatre groupements peuvent former des sels d'addition d'acides. Avec des quantités moindres 35 d'acide, certains des groupements amino restent sous la forme de la base libre. L'ambutyrosine A fond avec décomposition sur un large intervalle commençant à 149°G environ dans un tube capillaire scellé. Elle a des valeurs de pE'a de 5,6, 7,3, 8,7, et 9,8. 40 Elle a un spectre caractéristique d'absorption infra-rouge dans le 69 08570 2 2004659 bromure de potassium avec des maxima d'absorption à 700, 1028, 1090, 1340, 1390, 1457, 1498, 1550 à 1610, 1652, 2938, 3040 et 3410 cm"^0 Elle ne présente pas de maxima d'absorption dans l,ultra-violet entre 220 et 360 millimicrons. la rotation spéci-5 fique £~a_J^5 _ + ggo (1,46 fo dans l'eau)» 1 'ambutyrosine B peut être obtenue sous la forme d'une substance ayant la composition d'un dihydrate et fondant avec décomposition sur un large intervalle commençant à 146°C environ dans un tube capillaire scellé. Elle a des valeurs de pK'a de 5,3, 10 7,1, 8,6, et 9,8» Elle a un spectre caractéristique d,absorption infra-rouge dans le bromure de potassium avec des maxima d'absorption à 700, 1026, 1100, 1345, 1390, 1458, 1497, 1549, 1580, 1650, 2938, 3040, 3315 et 3370 cm~^. Elle présente des maxima d'absorp-tion dans l'ultra-violet entre 220 et 360 millimicrons. La 15 rotation spécifique C°-Jf = +33° (1,5 "f" dans l'eau)» Du fait de leurs groupements fonctionnels, 1*ambutyrosine A et 1 * ambutyrosine B forment chacune un grand nombre de dérivés chimiques importants et caractéristiques comme les dérivés tétra-H-acétyle et les dérivés tétra-M-méthanesulfonate . La tétra-ÎT-20 acétyl-ambutyrosine A a une rotation spécifique = +25° (2,11 dans l'eau). La tétra-N-acétyl-ambutyrosine B a une rotation spécifique = +33° (1,34 $ dans l'eau). L'hydrolyse acide de l'ambutyrosine A dans des conditions relativement modérées, par exemple dans l'acide chlorhydrique 25 0,4 N à 65°C, donne le D-xylose» L'hydrolyse acide de l1ambutyrosine B dans les mêmes conditions modérées donne le D-ribose, mais pas de D-xylose. Une hydrolyse acide plus énergique de 1*ambutyrosine A ou de 1*ambutyrosine B, par exemple avec 1*acide chlorhydrique 6N 30 à la température de reflux pendant 6 heures, donne la néamine, la désoxystreptamine, la néosamine C et l'acide a-hydroxy- Y -amino-butyrique. L'acide a-hydroxy- X -aminobutyri que est caractérisé comme une substance cristalline ayant un point de fusion de 212,5-214,5°0 et une rotation spécifique = -28,2° (1,22 fo dans 35 l'eau). Des déterminations plus poussées concernant la structure ont été effectuées sur 1*ambutyrosine A et l'ambutyrosine B. Sous la forme de la base libre anhydre, chacune a la formule empirique C21H41N5°12' 40 .La structure de l'ambutyrosine A a été déterminée comme 69 08570 3 2004659 étant la ïï"'-(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-0-D-xylofuranosyl-2-désoxystreptaiaine de la formule développée 10 15 20 25 0=0 ! OHOH ÇH CH_ H-C-OH i d. i 0E^m2 HO-C-H H-C CH^OH La structure de 11ambutyrosine B a été déterminée comme étant la U^-(4-amino-2-liydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-0-D-ribofuranosyl-2-désoxy-streptaxaine de la formule développée : 30 35 69 08570 4 ✓ 2004659 10 15 20 CE2m2 >?- o, CHgOH Ainsi, l*ambutyrosine A et 1*ambutyrosine B sont des isomères dont les configurations diffèrent à tin atome de carbone dans la portion pentose. 25 L*ambutyrosine et ses constituants, 1' ambutyrosine A et ' 1*ambutyrosine B, ont des spectres similaires d'activité anti-bactérienne, qui peuvent être illustrés par le spectre antibactérien du sel sulfate d*ambutyrosine, comme indiqué dans le Tableau I suivant• Dans ce tableau, le spectre antibactérien du sulfate d'am-30 butyrosine est exprimé sous la forme de la concentration minimale d'inhibition, mesurée en microgrammes d'équivalent de base libre par em^ de milieu, contre diverses espèces de bactéries pathogènes pour les humains. Les résultats donnés dans le Tableau I ont été obtenus en utilisant des souches couramment rencontrées des organis-35 mes désignés. Quand on indique plus d'une souche pour un organisme, la plage de concentrations minimales d'inhibition est donnée pour illustrer la variabilité observée pour des souches différentes de l'espèce unique. 69 08570 5 2004659 TABLEAU I Spectre antibactérien in vitro du sulfate d1ambutyrosine ÏTombre Concentration minimale Microorganisme de souches d'inhibition, Microgrammes 3 5 de base par cm Aerobacter aerogenes 3 0,8-6,3 Diplococcus pneumoniae 6 3,1 ->100 Escherichia coli 11 1,6-50,0 Klebsiella pneumoniae 1 1,6 . Mycobacterium tuberculosis 1 1,6 Proteus vulgaris 1 6,3 * Pseudomonas aeruginosa 25 4,5-35,5 Salmonella enteritidis 3 12,5-50,0 Salmonella typhimurium 2 12,5-50,0 Shigella flexneri 5 12,5 Shigella sonnei 5 3,1-12,5 Staphylococcus aureus 14 1,6-100 Streptococcus faecalis 1 >100 Streptococcus pyogenes 3 6,3-12,5 20 L'activité antibactérienne du sulfate d*ambutyrosine a été démontrée aussi dans des infections aiguës expérimentales chez la souris. Des doses sous-cutanées uniques d'environ 2 à 10 mg d'équivalent de base par kg de poids du corps sont efficaces contre des infections par les Esche ri chia çoli, Elebsiella pneumoniae, 25 Proteus vulgaris et Staphylococcus aureus. La dose unique moyenne d'ambutyrosine, administrée sous la forme du sulfate, qui est mortelle pour la moitié des souris d'un groupe (LD^q aiguë) a été déterminée comme étant de 3050 mg de base par kg de poids du corps par la voie sous-cutanée; de 30 2188 mg/kg par la voie intra-péritonéale; et de 487 mg/kg par la voie intra-veineuse. L*ambutyrosine et ses sels d'addition d'acides peuvent être produits selon l'invention par culture d'une souche productrice d1ambutyrosine de l'organisme Bacillus cirmilnns dans des 35 conditions artificielles. L'expression "souche productrice d'ambutyrosine de Bacillus circulans". telle qu'elle est utilisée ici, désigne une souche de Bacillus circulans qui, quand elle est reproduite dans les conditions artificielles décrites ici, donne un bouillon 40 fermenté à partir duquel on peut obtenir l'ambutyrosine ou un sel 69 08570 6 2004659 d1addition d'acide correspondant par les méthodes spécifiées. Une souche de Bacillus circulans utilisable pour les buts de l'invention a été obtenue à partir d'un échantillon de terre recueilli près de Melspruit, Transvaal Oriental, Afrique du Sud. 5 Des sous-cultures de cette souche ont été déposées au United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, et sont entretenues dans la collection de cultures permanentes de cet organisme sous les numéros d'identification NRRL B-3312 et UBB1 B-3313. le 10 numéro ERRL B-3312 correspond au germe isolé initial et le numéro HRBIi B-3313 correspond à un choix de colonie unique. Les deux sous-cultures déposées sont à peu près équivalentes comme caractéristiques morphologiques et physiologiques. Telles qu'elles sont utilisées ici, les désignations Bacillus circulans NERL B-3312 et 15 Bacillus circulans KBEL B-3313 se rapportent à une souche de Bacillus circulans ayant les caractéristiques décrites ci-après et ne sont pas limitées à une culture particulière de l'organisme comme celles qu'on peut trouver dans une collection particulière de cultures. 20 Les études critiques d*identification ont été effectuées sur la souche ÏÏEBL B-3313 conformément au "Manual of Determinative Bacteriology" de Bergey, 7ème édition (1957). Les milieux et les méthodes utilisés pour l'identification de l'organisme sont ceux de Smith, Gordon et Clark, Aérobic Sporeforming Bacteria, 25 Agricultural Monograph 16, U.S. Department of Agriculture (1952) et de la Society of American Bacteriologists, Manual of Micro-bioligal Methods (1957). L'organisme est un bâtonnet aérobie Gram-variable, doué de mouvement (0,3 à 0,9 sur 1,1 à 4»7 microns); il se développe 30 sur de l'extrait de viande ou d'autres milieux organiques complexes, et forme des endospores. Il appartient donc au genre Bacillus. Ses sporanges sont nettement gonflés. Ses spores ont des formes d'ellipsoïdes, rarement de cylindres, sont centrales à terminales, et la paroi des spores est épaisse et facile à colorer. Il est 35 Gram-variable. Dans la classification des espèces du genre Bacillus (Manuel de Bergey, pages 613-615), l'organisme appartient donc aux espèces de II (page 615). Il ne produit pas de gaz à partir des hydrates de carbone, est saprophyte, se développe sur les milieux ordinaires, hydrolyse l'amidon, ne produit pas d'indole ou 40 d'acétylméthylcarbinol et ne se développe pas à 65°C. Il appartient 69 08570 7 2004659 10 15 20 25 donc à B., 1», a., bb.» cc« Une seule espèce, l'espèce B. circulans, occupe cette place dans la classification. Dans les essais effectués et indiqués dans le Tableau 2 suivant, l'organisme ne diffère pas notablement du B, circulans. Jordan, 1890, Emend» Ford, 1916 comme décrit dans le Manuel de Bergey, pages 628 et 629. 1?organisme est donc considéré comme une souche de l'espèce B. circulans « Dans des études comparatives, le B. circulans ÏÏEEL B-3313 diffère à plusieurs points de vue de la souche 4513 cLe l'American Type Culture Collection (ATCC) (néo-type proposé, ÎT.E, Smith et autres "Type cultures and proposed neotype cultures of some species in the genus Bacillus". J. Sen. Microbiol. 34: 269-272, 1964)» Les différences comprennent la grosseur des cellules végétatives et des spores, l'épaisseur de paroi des spores, le développement à 45°0# les caractéristiques de développement sur la gélose nutritive, l'hydrolyse de la gélatine et de la caséine, l'utilisation du citrate, la réoxydation du bleu de méthylène et la fermentation du 1-arabinose, de l'inuline, du lactose et du D-xylose. Les caractéristiques du ÏÏEEL B-3313 et la comparaison avec l'ATCC 4513 sont données dans le Tableau II. TABLEAU II Caractéristiques du Bacillus circulans ÏÏEBL B-3313 et•comparaison avec l'ATCC 4513 Caractéristiques sur le milieu indique Aspect Bacto-ïïutrient Agar ÏÏEBL B-3313 ATCC 4513 Bâtonnets Gram- varia-(Difco-),développement bles, habituellement 24 heures à 28° C; simples, à extrémités 30 modification de Hacker arrondies ou pointues, de la coloration de Gram 0,3 à 0,9 sur 1,1 4,7 microns Bâtonnets Gram-variable s, habituellement simples, à extrémités arrondies, 0,3 à 1,0 sur 2,0 à 6,5 microns Bacto-Peptone Iron 35 Agar (Difco) plus 0,1$ de Bacto-Yeast Extract (Difco),développement à 28°C, coloration des spores 40 de Conklin Bonne sporulation à 2 jours; sporanges bombés et clavés; spores ellipsoïdaux, parfois réniformes, terminaux -et subterminaux;paroi des spores épaisse; Bonne sporulation à 5 j ours ; sporanges bombés et clavés;spores ellipsoïdaux,parfois sphériques, habituellement terminaux ; paroi des spores mince; 69 5 10 15 20 25 30 35 40 08570 2004659 Mobilité Bacto-Nutrient Broth (Difco),développement 24 heures à 28°G Température de développement Baeto-Nutrient Agar (Difco) 28°C 37°G 45°C 65°C Caractéristiques de développement dans le bouillon Surface sous la surface Quantité Sédiment Caractéristiques des colonies Bacto-ïïutrient Agar (Difco) Forme Elévation Bord Surface Densité Consistance Couleur Hydrolyse de la gélatine Bacto-ïïutrient Agar (Difco) plus 0,4$ de Bacto-ffelatin (Difco) Bacto-Gelatin (Difco) Stab spores de 0,6 à 1,3 sur 1,1 à 2,3 microns Mobile Positif Positif Négatif Négatif Néant Trouble Modérée Floconneux blanc Circulaire, parfois punctiforme convexe Entier Lisse Translucide Yisqueuse à butyreuse Incolore à blanchâtre Zone de 35 à 37 mm à 7 jours Liquéfaction à 5 jours spores de 0,4 à 1,1 sur 0,8 à 1,5 micron Mobile Positif Positif Positif Négatif Néant Trouble Modérée Floconneux blanc Irrégulière,parfois circulaire Plate Ondulé ou érodé Lisse Translucide Butyreuse Incolore à blanchâtre, légèrement irisée Zone de 1 à 2 mm à 7 jours Pas de liquéfaction à 5 et 13 jours 69 08570 8 2004659 Hydrolyse de la caséine Production d'indole 5 Réduction du nitrate en nitrite Production d'acétyl-méthylearbinol 10 Hydrolyse de l'amidon Utilisation du citrate 15 20 25 Réduction du "bleu de méthylène Fermentation (28°0) Gélose aux; sels ' d'ammonium Négative à 6 jours Positive à 13 jours Négative à 5 et 13 jours Négative à 5 et 13 jours Négative à 2,6 et 13 jours; pH du bouillon à 6 jours, 5,8 Positive à 6 jours, zone de 1 à 2 mm Négative à 6 jours Positive à 13 jours Positive à 2, 5 et 13 jours Acide Gaz 30 35 1-arabinose Deztrine D-fructose D-galactose D-glucose Glycérol Inuline lactose Maltose B-mannitol D-mannose Raffinose Saliciline Sucrose D-xylose Bacto-phenol Red Broth (Djfco) 1-arabinose - D-glucose * + D-mannitol + Sucrose + + + + + Négative à 6 et 13 jours Négative à 5 et 13 jours Négative à 5 et 13 jours Négative à 2, 6 et 13 jours; pH du bouillon à 6 jours, 5,8 Positive à 6 jours, zone de 4 à 5 mm Négative à 6 et 13 j ours Positive à 2 jours, réoxydé à 5 jours Acide + + + + + + + + + + + + + + + + + Gaz * pH après 6 jours 5,5 5,3 69 08570 9 2004659 Certains milieux mentionnés dans le Tableau 2 ont les compositions indiquées ci-après. Il est satisfaisant aussi d'utiliser des milieux de compositions similaires. Le milieu Bacto-ïïutrient Agar (Difco) contient 3 g 5 d'extrait de boeuf, 5 g de peptone et 15 g de gélose, en solution dans 1000 cm d'eau distillée. Le milieu Bacto-Peptone Iron Agar (Difco) contient 15g de peptone, 5 g de protéose-peptone, 0,5 g de citrate ferrique et d'ammonium, 1 g de phosphate dipotassique, 0,08 g de thiosul-10 fate de sodium et 15 g de gélose, en solution dans 1000 cm^ d'eau distillée. Le milieu Bacto-Yeast Extract (Difco) est la portion soluble dans l'eau d'un autolysat de levures, contenant les vitamines complexes B naturelles. 15 Le milieu Baeto-Nutrient Broth (Difco) contient 3 g d'extrait de boeuf et 5 g de peptone, en solution dans 1000 g d'eau distillée. Le milieu Bacto-G-elatin (Difco) est une gélatine de qualité supérieure sous la forme granulaire. 20 Le milieu Bacto-Phenol Red Broth Base (Difco) contient 1 g d'extrait de boeuf, 10 g de protéose-peptone, 5 g de chlorure de sodium et 0,018 g de Phénol Red, en solution dans 1000 cm^ d'eau distillée. Selon l'invention, on produit 1'ambutyrosine et ses sels 25 d'addition d'acides en inoculant à un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables,une souche productrice d'ambutyrosine de l'organisme Bacillus circulans et en mettant en incubation le milieu inoculé à une température comprise entre 20 et 40°C environ dans des conditions aérobies. Selon le 30 mode opératoire usuel, le milieu nutritif aqueux est stérilisé avant l'inoculation et l'incubation du milieu inoculé est effectuée dans des conditions aérobies aseptiques jusqu'à ce que le milieu de fermentation ait une activité aatibactérienne notable, après quoi 1'ambutyrosine est isolée sous la forme de la base 35 libre ou d'un sel d'addition d'acide par traitement ultérieur du mélange de fermentation. Les conditions préférées pour la conduite de la fermentation sont une température comprise entre 28 et 32°C et lin pïï compris entre 6,0 et 8,0, spécialement de 7,5 environ.' L'inoculum pour la production d'ambutyrosine par la 40 culture d'une souche appropriée de Bacillus circulons peut être 69 08570 10 2004659 obtenu en utilisant le développement de surface de cultures inclinées sur un milieu de gélose nutritive. Quand on le met en incubation à une température comprise entre 25 et 32°C environ, l'organisme se développe ët produit un développement confluent en un à 5 deux jours, l'incubation pendant 2 jours ou plus est nécessaire pour produire une culture complètement sporulée, ce qui est souhaitable, mais pas essentiel pour les buts de l'invention. En général, des cultures sporulées sont utilisées pour inoculer un milieu nutritif liquide aéré et agité contenu dans un récipient approprié 10 comme un ballon secoué ou un fermenteur agité et aéré. On laisse le microorganisme fermer et se développer pendant 24 à 48 heures à une température de 20 à 40°0, de préférence de 26 à 32°G» Ce germe en croissance est utilisé alors pour inoculation de fermen-teurs de production ou d'autres fermenteurs de germes» 15 Comme indiqué ci-dessus, des milieux nutritifs aqueux appropriés sont ceux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables. Des sources de carbone qui sont assimilables et satisfaisantes à utiliser comprennent des hydrates de carbone purs et des alcools polyhydriques qui peuvent être utilisés par l'orga-20 nisme, ainsi que des mélanges d'hydrates de carbone disponibles dans le commerce. Des exemples de matières utilisables à cet effet sont des amidons, la farine de maïs, des sucres et le glycérol. la quantité de l'hydrate de carbone ou de l'alcool polyhydrique présente dans le milieu nutritif n'est pas particulièrement criti-25 que et varie communément d'environ 0,5 à 5 % du poids du milieu. Des quantités un peu à l'extérieur de ces limites peuvent être utilisées aussi. Les sources d'azote dans le milieu nutritif peuvent être de nature organique, inorganique ou mixte organique-inorganique. 30 Des exemples des nombreuses substances azotées qui peuvent être utilisées sont la caséine, la farine de soja, la farine d'arachide, la farine de graines de coton, le gluten de blé, les déchets d'orge ou d'avoine, la lactalbumine, le produit de digestion enzymatique de la caséine, la tryptone, la peptone de viande, le chlorure 35 d'ammonium et le sulfate d'ammonium. En raison de la nature brute de beaucoup des sources d'azote facilement disponibles, la quantité à ajouter au milieu varie suivant la pureté et il n'est pas facilement possible de spécifier une quantité déterminée de matière à ajouter comme source azotée au milieu. Toutefois, les matières 40 utilisées comme sources azotées ne dépassent généralement pas 5 à 69 08570 n 2004659 6 io du poids du milieu de fermentation total, et dans la plupart des cas elles sont présentes en quantité moindre. La présence de petites quantités de facteurs auxiliaires de croissance dans le milieu de fermentation est avantageuse aussi. 5 Certains de ces facteurs sont déjà présents dans les sources "brutes ordinaires d'azote organique et n'ont pas besoin d'être ajoutés séparément. En variante, on peut ajouter au mélange de fermentation de petites quantités de matières comme des résidus solubles de distillation, une levure, un autolysat de levures, un extrait de 10 levures et des résidus de fermentation de mélasse; des sels inorganiques comme le chlorure de sodium, le phosphate de potassium et le sulfate de magnésium; et des sels de traces de métaux comme le zinc, le cuivre, le manganèse, le fer et le cobalt. Le milieu nutritif aqueux préparé comme indiqué ci-dessus 15 est, si nécessaire, réglé à un pi compris entre 6,0 et 8,0 environ, de préférence à 7,5 environ. Un agent tampon, comme le carbonate de calcium, peut aussi être ajouté pour maintenir le pH entre les limites désirées au cours de la fermentation. Un agent antimousse peut être ajouté aussi suivant le besoin. 20 La culture de la souche productrice d*ambutyrosine de Bacillus circulans dans le milieu nutritif aqueux peut être effectuée d'un certain nombre de façons différentes. Par exemple, l1organisme peut être cultivé dans des conditions aérobies sur la surface du milieu; ou il peut être cultivé sous la surface du 25 milieu, c'est-à-dire à l'état immergé, pourvu que l'on fournisse une quantité suffisante d'oxygène. La méthode préférée pour produire 1* ambutyrosine et ses sels d'addition diacides selon l'invention consiste à opérer par fermentation d'une souche productride d'ambutyrosine de Bacillus 30 circulans dans une culture immergée ou profonde, en utilisant comme inoculum un bouillon de l'organisme en croissance, ayant de 24 à 48 heures, aéré et agité. Selon cette méthode, on inocule l'organisme à un milieu nutritif aqueux stérile et on le met en incubation avec agitation et aération à une température comprise entre 20 35 et 40°C environ, de préférence au voisinage de 28 à 32°C, jusqu'à ce qu'une haute concentration d' ambutyrosine soit présente dans le liquide de culture. Le laps de temps nécessaire pour le rendement maximal varie avec les dimensions et le type de l'équipement utilisé, les vitesses d'agitation et débits d'aération, et d'autres 40 facteurs. Dans les fermentations effectuées sur une grande échelle 69 08570 12 2004659 dans des fermenteurs du type réservoir, la production maximale est habituellement obtenue en 3 à 6 jours environ. La quantité d1ambutyrosine présente dans le bouillon après la période de fermentation ou à un instant quelconque durant 5 la période de fermentation peut être déterminée par essai biologique. ^'activité antibactériemie (représentant la teneur en ambutyrosine) du bouillon est déterminée par mesure de l'inhibition du développement du microorganisme Eschérichia coli (ou un autre organisme sensible) sur un plateau d'essai, et comparaison du 10 résultat avec l'inhibition provoquée par une dilution appropriée d'un échantillon de référence d*ambutyrosine purifiée, obtenue comme décrit ci-après. A la fin de la période de fermentation, 1'ambutyrosine ou un sel d'addition d'acide de ce composé peuvent être obtenus à 15 partir du bouillon par les méthodes décrites ci-après, et le produit peut être soumis au degré désiré de purification supplémentaire, y compris la séparation en constituants ambutyrosine A et ambutyrosine B. L'ambutyrosine peut être obtenue à partir du bouillon 20 d'un certain nombre de façons. Par exemple, on traite le bouillon par une résine d'acide carboxylique dans la forme ammonium pour adsorber 1*ambutyrosine sur la résine. On recueille la résine et 1'ambutyrosine est enlevée par élution par une base comme l'hydro-xyde d'ammonium 1M. Pour purification, on peut répéter une ou 25 plusieurs fois l'adsorption sur la résine et l'élution par une base. L'ambutyrosine peut être séparée en constituants ambutyrosine A et ambutyrosine B par un certain nombre de méthodes différentes. Une méthode préférée fait intervenir l'adsorption sur 30 une résine échangeuse d'anions forte dans la forme borate, suivie d'une élution sélective des constituants. La séparation par élution sélective se produit probablement parce que l'ambutyrosine B a des groupements cis-hydroxyle adjacents dans la portion ribose et forme un complexe borate; tandis que 1'ambutyrosine A n'a pas de 35 groupements cis-hydroxyle adjacents dans la portion xylose et ne forme pas un complexe borate. Quand 1'ambutyrosine est adsorbée sur la résine échangeuse d'anions forte dans la forme borate, le constituant ambutyrosine A est enlevé d'abord par élution par l'eau et le constituant ambutyrosine B est enlevé ensuite par 40 élution par une solution à 5 $ d'acide borique. Chaque constituant 69 08570 13 2004659 peut être purifié encore par adsorption sur une résine d*acide carboxylique, forme ammonium, et élution par l'hydroxyde d*ammonium 1M0 Les quantités résiduelles de bore dans le produit peuvent être enlevées par une résine échangeuse d'anions spécifique pour 5 le bore . Selon une autre méthode de séparation de 1*ambutyrosine en ses constituants, le mélange d'ambutyrosine est transformé en dérivés tétra-N-acétyle et ces dérivés sont soumis à une chroma-tographie de partage sur la terre d'infusoires en utilisant des 10 systèmes tels que les suivants : 1-butanol/eau/pyridine (10:10:3) ou ou 1-butanol/acide borique à 5 $/pyridine (10:10:3). ^es mélanges des deux constituants peuvent être séparés et les constituants facilement distingués l'un de l'autre par chromâtographie sur papier des dérivés tétra-N-acétyle en utilisant le 1-butanol, la 15 pyridine et l'acide borique à 5 $ (6:4:3) ; Rf tétra-N-acétyl ambutyrosine A, 0,30-0,38; R^ tétra-N-acétyl ambutyrosine B, 0,16-0,20. Les dérivés tétra-N-acétyle peuvent être détectés sur papier en utilisant une variante de la méthode générale de Pan et Dutcher, Analytical Ghemistry. 28. 836 (1956), le chlore gazeux 20 étant utilisé au lieu de l'hypochlorite de sodium. Pour obtenir les dérivés tétra-N-acétyle pour utilisation dans les techniques 3 . ci-dessus, on dissout 7,50 g d'ambutyrosine dans 150 cm d»anhydri-de acétique et 430 cm de méthanol. La solution est maintenue à 25°C pendant 48 heures et le mélange de réaction est ensuite ajouté 25 à 3 litres d'oxyde d'éthyle. Le précipité résultant des dérivés tétra-N-acétyle est recueilli sur un filtre et desséché. Le dérivé tétra-N-acétyle de chaque constituant peut être obtenu d'une manière similaire. L1 ambutyrosine et ses constituants peuvent être transfor-30 mes en sels d'addition d'acides pharmaceutiquement acceptables par réaction avec l'un quelconque d'un grand nombre d'acides comme les acides acétique, propionique, maléique, malique, citrique, gluco-nique, chlorhydrique, bromhydrique, phosphorique, sulfurique et les acides du même genre. 35 L'ambutyrosine, ses constituants individuels et leurs sels d'addition d'acides sont des agents antibactériens ayant un large éventail d'activité antibactérienne. Une propriété remarquable de ces substances est leur activité relativement grande contre les Pseudomonas aeruginosa tant in vitro qu'in vivo. Les composés 40 peuvent être administrés oralement ou par voie parentérale ou 69 08570 14 2004659 topique. Chez les humains, des doses intramusculaires uniques de sel sulfate d'ambutyrosine correspondant à 4 mg de base ambutyrosine par kg de poids du corps sont bien tolérées et donnent des concentrations bactériostatiques du médicament dans le plasma 5 sanguin et dans l'urine. En raison de leur large éventail antibactérien et de leur activité bactéricide en même temps que bactériostatique, les composés de l'invention sont utiles aussi comme agents antibacté-riens dans des applications in vitro comme la stérilisation d'ins-10 truments de laboratoire et de surfaces, la stérilisation de produits pharmaceutiques et le maintien de conditions stériles durant des opérations de fabrication dans l'industrie pharmaceutique. Pour stériliser les instruments de laboratoire et les surfaces et pour des applications in vitro similaires, les composés peuvent être 15 utilisés sous la forme d'une solution aqueuse de 0,1 à 1,0$. Les exemples non limitatifs suivants montreront bien comment l'invention peut être mise en oeuvre. Exemple 1 - Stade I : Quatre cultures inclinées de Bacillus circulans 20 HRRL B—3313 sont préparées sur un milieu gélose stérile ayant la composition suivante : Peptone dérivée de caséine par digestion pancréatique 15g Produit de digestion papaïque de farine de soja 5g Chlorure de sodium 5 g 25 Gélose 15 g Eau distillée 1 litre Les cultures inclinées sont mises en incubation à 28°C pendant 2 jours et la production de chaque culture est mise en suspension dans 10 cm^ de solution stérile à 0,1 $ d'heptadécyl-30 sulfate de sodium. Stade II : On prépare un milieu nutritif ayant la composition suivante (poids/volume) : Farine de soja, 44 $ de protéine 1 ,0 $ (extraction au solvant) 35 Peptone animale 1,75 $ Chlorure d'ammonium 0,4 $ Eau, complément à 100 Le pH du milieu est réglé à 7,5. à l'aide d'hydroxyde de sodium 10ÏT et ensuite on ajoute 0,5 $ (poids/volume) de carbonate 40 de calcium. 69 08570 15 2004659 On place 12 litres de ce milieu dans un fermenteur de 30 litres» On stérilise le milieu par chauffage à 121°C pendant 3 90 minutes, on le laisse refroidir et on y inocule 40 cm de la suspension de spores de Bacillus circulans ÏÏEEL B-3313 dans 5 l'heptadécyl-sulfate de sodium, préparée comme décrit pour le Stade I. le milieu inoculé est mis en incubation à 26-27°C pendant 32 heures tandis qu'il est agité à 200 tours par minute et aéré à l,aide d'air stérile introduit à raison de 6 litres par minute. Pendant ce temps, on ajoute par portions environ 36 g d*un mélange 10 d'huile de lard et d'huile minérale avec des mono- et diglycérides pour empêcher une formation excessive de mousse. Stade III : Dans un fermenteur de 189,25 litres, on place 113,55 litres d'un milieu nutritif ayant la même composition que celui utilisé dans le Stadë II« le milieu est stérilisé à 121°C 15 pendant 60 minutes, on le laisse refroidir et on lui inocule ' 3 400 cm de la culture du Stade II ayant 32 heures d'incubation. On laisse se poursuivre la fermentation pendant 32 heures à 25-27°C avec aération à raison de 269 litres par minute et addition d*un agent antimousses suivant le besoin. 20 Stade IV : On prépare un milieu nutritif ayant une composi tion telle que décrite au stade II, mais contenant en plus 4,0 $ (en poids/volume) de glycérol. Dans deux fermenteurs de 757 litres, on place des portions de 567,75 litres de ce milieu nutritif, et le milieu est stérilisé par chauffage et refroidi. On inocule à chaque 25 fermenteur 56,775 litres de la culture en croissance du stade III vieille de 32 heures, puis on fait incuber avec agitation et aération à raison de 481 litres par minute pendant 122 heures à une température de 29,5 à 30,5°0. On ajoute environ 15 litres d'agent antimousses à chaque fermenteur, par portions suivant le besoin. 30 Isolement et purification du produit : Les bouillons provenant du stade IV sont combinés et le bouillon combiné (1154,5 litres j pH 6,8) est agité pendant 1 heure avec 48 litres de résine d'acide carboxylique dans la forme ammonium. On peut utiliser une résine comme l'Amberlite IEO-50. La résine avec la matière adsorbée est 35 laissée à déposer et débarrassée par lavage à l'eau des matières solides en suspension. La résine lavée est introduite dans une colonne en verre de 15,24 cm de diamètre contenant déjà 10,5 litres de résine d'acide carboxylique fraîche, dans la forme ammonium, comme couche de fond. lia colonne garnie est lavée à l'aide de 40 3709 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des 69 08570 16 2004659 impuretés et le produit ambutyrosine est enlevé par élution à l'aide de 378,5 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M. L'éluat à l'hydroxyde d'ammonium 1M est concentré à 22 litres, réglé au pH 7 à l'aide d'acide sulfurique dilué et passé à travers une colonne de 5 275 cm de la même résine d'acide carboxylique, dans la forme •Z "X ammonium, à raison de 0,03 cnr/cm de résine/minute. la résine avec la matière adsorbée est enlevée de cette colonae et placée sur le dessus de 825 cm^ de résine fraîche dans une colonne en verre de 5,08 cm de diamètre. On lave la colonne à l'aide de 10 49 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des impuretés et le produit ambutyrosine est élué à l'aide de 4 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M. L'éluat ambutyrosine est concentré sous vide à un petit volume, filtré et lyophilisé pour donner un résidu d'ambutyrosine; rotation spécifique £a_7^ = +2^° ^ ^ $ dans 15 l'eau). Par micro-analyse, le produit contient 45,41 $ de carbone, 7,26 io d'hydrogène, 12,83 d'azote. On prépare des sels avec l'acide chlorhydrique et avec l'acide sulfurique en ajoutant un excès d'acide chlorhydrique ou d'acide sulfurique à une solution aqueuse de la base libre. Le sel 20 est précipité par addition d'acétone. Le sulfate obtenu par cette méthode a une rotation spécifique Ca_7|5 = +29° (2 io dans l'eau). Par micro-analyse, il contient 32,32 $ de carbone, 6,20 $ d'hydrogène et 8,64 d'azote. Dans l'eau, il a des valeurs de pK'a de 6,5, 8,1 et 9,5. 25 Des cultures de Bacillus circulans URBL B-3312 peuvent être substituées au Bacillus circulans NRBL B-3313 dans les modes opératoires du présent exemple avec des résultats équivalents. Exemple 2 - Stade I : Une suspension de spores de Bacillus circulans 30 IffifîL B-3313 dans une solution stérile à 0,1 $ d'heptadécyl-sulfate de sodium est préparée comme à l'exemple 1, stade I. Stade II : Une fermentation est conduite comme décrit à l'exemple 1, Stade II, à ceci près qu'aux 12 litres de milieu ■5 nutritif, on inocule seulement 10 cm de la suspension à l'hepta-35 décyl-sulfate de sodium de Bacillus circulans EREL B-3313. Stade III : On prépare un milieu nutritif ayant la composition décrite à l'exemple 1, stade II. Le pH du milieu est réglé à 7,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium 10N et ensuite on ajoute 0,5 $ (en poids/volume) de carbonate de calcium et 0,1 $ (en poids/volume) 40 d'un agent antimousses polypropylène-glycol. On peut utiliser un 69 08570 17 2004659 polypropylène-glycol comme le Polyglycol P2000. Des portions de 113,55 litres de ce mélange sont placées dans deux fermenteurs de 189,25 litres, stérilisées à 121°C pendant 60 minutes, refroidies, et on leur inocule 200 cm du milieu de culture en croissance du 5 Stade II vieux de 32 heures» Chaque mélange de fermentation est mis en incubation pendant 32 heures à 29-31°C avec aération à raison de 269 litres par minute. Stade IV" : On prépare un milieu nutritif ayant la composition décrite au stade III, mais contenant en plus 4,0 $ (en poids/ 10 volume) de glycérolo On ajoute un agent antimousses polypropylène-glycol. Des portions de 567,75 litres de ce mélange sont placées dans 4 fermenteurs de 757 litres, stérilisées par la chaleur, refroidies, et on leur inocule 56,775 litres de la culture en croissance au stade III vieille de 32 heures. Chaque mélange de 15 fermentation est mis en incubation pendant 128 heures à une température de 29 à 31°C avec aération à raison de 481 à 963 litres par minute. Un agent antimousses polypropylène-glycol est ajouté par portions suivant le besoin. Isolement et purification du produit : Les bouillons provenant des 20 4 feimenteurs sont combinés et le bouillon combiné (2309 litres, pïï 6,9) est agité pendant une heure avec 127 litres de résine d'acide carboxylique dans la forme ammonium„ On laisse déposer la résine avec la matière adsorbée, et les impuretés solides en suspension sont séparées par lavage à l'eau de la résine. La résine 25 lavée est ensuite introduite dans une colonne de 30,48 cm de diamètre contenant déjà 113 litres de résine d'acide carboxylique fraîche, dans la forme ammonium, comme couche de fond. La colonne garnie est lavée à l'aide de 16.465 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des impuretés et le produit ambutyrosine est 30 recueilli par élution de la colonae à l'aide de 1892,5 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M. Cet éluat est concentré sous vide à 119,8 litres, réglé au pH 7 à l'aide d'acide sulfurique dilué et passé à travers une colonne de 3,5 litres de résine d'acide carboxylique, dans la forme ammonium, à raison de 0,03 cm /cm de résine/minute. 35 La résine est lavée à l'aide de 2 litres d'eau et ensuite placée sur le dessus de 10,5 litres de résine fraîche tassée dans une colonne en verre de 10,16 cm de diamètre. La colonne est lavée à l'aide de 1033 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des impuretés et ensuite éluée à l'aide d'un total de 170,325 li-40 très d'hydroxyde d'ammonium 1M en 3 portions égales. La première 69 08570 18 2004659 fraction de 56,775 litres contient la majeure partie du produit ambutyrosine et est concentrée sous vide à un volume de 4.litres, réglée au pH 6,2 à l'aide d'acide sulfurique dilué et agitée pendant une heure avec 813 g de charbon activé lavé à l'eau et 400 g 5 de terre d'infusoires lavée à l'acide. On peut utiliser des matières comme celles dites Darco G—60 et Celite 545» On filtre le mélange, et le gâteau de filtration est lavé à l'aide de 80 litres d'eau. Le filtrat et l'eau de lavage sont combinés, concentrés sous vide à un volume de 4 litres, filtrés et lyophilisés. 10 Le produit est un sel sulfate d'ambutyrosine, rotation spécifique r d'azote, 8,01 $ de soufre, 24,01 $ de sulfate. Dans l'eau, il a des valeurs de pK'a de 6,5, 8,1 et 9,5. 15 Exemple 3 - Stade I : Une suspension de spores de Bacillus circulans MEBL B-3313 dans une solution s térile à 0,1 $ d'heptadécyl-sulfate de sodium est préparée comme décrit à l'exemple 1, Stade I. Stade II : On prépare un milieu nutritif ayant la composition 20 suivante (en poids/volume) : Farine de soja, 44 $ de protéine 1,0 $ (extraction au solvant) Peptone animale 0,75 $ Sulfate d'ammonium 0,4 $ 25 Eau, complément à 100 $ Le pH du milieu est réglé à 7,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium 10N et ensuite on ajoute 0,5 $ (en poids/volume) de carbonate de calcium. On place 12 litres de ce milieu dans un fermenteur de 30 30 litres. Le milieu est stérilisé par chauffage à 121°C pendant 3 90 minutes, on le laisse refroidir et on lui inocule 10 cm d'une suspension à 11heptadécyl-sulfate de sodium du Bacillus circulans HREL B-3313 du stade I. Ce mélange est mis en incubation pendant 33 heures à 28-30°C, avec agitation et aération à raison de 35 6 litres d'air par minute. Pendant cette période, on ajoute 400 cm d'un agent antimousses polypropylène-glycol, par portions, suivant le besoin pour empêcher la formation de mousse. Stade III : Dans un fermenteur de 113,55 litres, 56,775 litres d'un milieu nutritif ayant la même composition que décrit au stade 40 II (pH 7,5), sont stérilisés par la chaleur, refroidis, et on 69 08570 is 2004659 3 inocule 400 cm de la culture en croissance du stade H vieille de 33 heures. Le milieu inoculé est mis en incubation pendant 32 heures à 28-30°C avec aération à raison de 177 litres d'air par minute. Un agent antimousses polypropylène-glycol est ajouté 5 suivant le besoin. Stade 17 : 1135»5 litres d'un milieu nutritif ayant la même composition que celui utilisé au stade II (pH 7,5) sont stérilisés par la chaleur, refroidis, et on inocule 56,775 litres de la culture en croissance du stade II vieille de 32 heures. Le mélange est 10 mis en incubation pendant 24 heures à une température de 29- 31,5°C avec aération à raison de 1.274 litres d'air par minute. Un agent antimousses polypropylène-glycol est ajouté suivant le besoin. Stade Y : On prépare un milieu nutritif ayant la composition 15 décrite au stade II, mais contenant en plus 4#0 $ (en poids/volume) de glycérol. Le milieu, pH 7,5» contient aussi l'agent antimousse polypropylèneglycol. Dans deux fermenteurs de 7.570 litres, on place des portions de 4.542 litres de ce milieu, qu'on stérilise par la chaleur, on refroidit, et on leur inocule 567,75 litres de 20 la culture en croissance du stade IY vieille de 24 heures. La fermentation est conduite pendant 120 heures à 28-31°0 avec aéra-. tion à raison de 1.699 litres d'air par minute et addition d'agent antimousses supplémentaire suivant le besoin. Isolement et purification du produit : Les bouillons sont combinés 25 et le bouillon combiné (11.052 litres) est agité pendant 1 heure \ avec 508 litres de résine d'acide carboxylique dans la forme ammonium. On laisse déposer la résine avec la matière adsorbée et elle est recueillie et. débarrassée par lavage à l'eau des matières solides en suspension. La résine lavée est introduite dans une 30 colonne contenant déjà 46 litres de résine d'acide carboxylique fraîche, dans la forme ammonium, comme couche de fond. La colonne de résine est lavée à l'aide de 11.355 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des impuretés et le produit ambutyrosine est enlevé par élution par 3.785 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M. 35 Cet éluat est concentré sous vide à un volume de 121,1 litre, réglé au pH 7 à l'aide d'acide sulfurique dilué, et filtré.- Les opérations décrites dans les stades I, II, III, IY et Y et la méthode d'isolement décrite ci-dessus sont répétées pour donner un deuxième éluat concentré d'ambutyrosine de 215»75 litres. 40 L'éluat est réglé au pH 7 à l'aide d'acide sulfurique dilué et 69 08570 20 2004659 filtré. Pour traitement ultérieur, on combine les deux éluats de façon à former une solution ayant un volume de 336,85 litres. La solution combinée est diluée à 1135,5 litres à l'aide 5 d'eau et passée à travers une colonne de 30 litres de résine d'acide carboxylique, dans la forme ammonium, à raison de 900 cm par minute# La résine est lavée à l'aide de 56,775 litres d'eau et placée ensuite sur le dessus de 91 litres de résine fraîche dans une colonne en verre de 30,48 cm de diamètre. La colonne garnie 10 est lavée à l'aide de 7.381 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des impuretés et le produit ambutyrosine est enlevé par élution par 1514 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M et recueilli par portions. La première portion de 673,7 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M contient la majeure partie de l'ambuty-15 rosine. Elle est concentrée sous vide pour élimination de l'ammoniac. Pour purification supplémentaire, le produit est adsorbé sur 35 litres de résine d'acide carboxylique fraîche, dans la forme ammonium, et cette résine est placée sur le dessus de 105 litres de résine fraîche dans line colonne de 30,48 cm de diamètre. La 20 colonne garnie est lavée à l'aide de 7.570 litres d'hydroxyde d'ammonium 0,1M pour élimination des impuretés et le produit ambutyrosine est enlevé par élution par 757 litres d'hydroxyde d'ammonium 1M. Cet éluat est concentré sous vide à un volume de 88,95 litres, réglé au pH 6,0 à l'aide d'acide sulfurique dilué, agité 25 pendant une heure avec 12 kg de charbon activé et 12 kg de terre d'infusoires et filtré. Le gâteau de filtration est lavé à l'eau jusqu'à ce que le volume combiné du filtrat initial avec les eaux de lavage soit de 832,7 litres. Cette solution est concentrée sous vide à un volume de 30,28 litres et elle est ensuite filtrée et 30 lyophilisée. Le produit, le sel sulfate d'ambutyrosine, a une rotation spécifique £"ctjjp ~ +29,3° (2 $ dans l'eau). Par microanalyse, le produit contient 32,08 $ de carbone, 6,36 $ d'hydrogène, 9,08 fo d'azote, 8,14 $ de soufre. Les valeurs micro-analytiques calculées pour Cg^H^lI^O^g'^^SO^^HgO sont les suivantes : 32,08 fo 35 de carbone, 6,27 $ d'hydrogène, 8,89 i» d'azote, 8,14 # de soufre. Les sels d'addition d'acides d'ambutyrosine sont transformés en la base libre par traitement modéré à froid par une base comme l'hydroxyde de sodium, le carbonate de potassium ou le bicarbonate de potassium; ou par des techniques d'échange d'ions. Par 40 exemple, une solution aqueuse du sel sulfate est passée sur une 69 08S70 21 2004659 résine échangeuse d'anions forte dans la forme hydroxyde. On peut utiliser une résine hautement réticulée comme celle dite Dowex 1 X 16 ou une résine similaire. On recueille le produit sous la forme de la base libre en faisant passer la solution à travers la 5 résine et en lavant la résine à l'eau» En variante, une solution aqueuse du sel sulfate est placée dans une colonne contenant une résine d'acide carboxylique dans la forme ammonium,, la résine avec la matière adsorbée est lavée à l'eau et à l'aide de petites quantités d'hydroxyde d'ammonium 0,1M et ensuite la base libre ambuty-10 rosine est éluée de la colonae à l'aide d'hydroxyde d'ammonium 1M. Une solution de 6,169 g d*ambutyrosine et 5,911 g de formaldéhyde-bisulfite de sodium dans 20 cm d'eau est abandonnée à elle-même pendant 2 jours. On ajoute ensuite du méthanol, 3 210 cm, en agitant. Le produit gommeux est trituré jusqu'à ce 15 qu'il devienne solide. Ce produit solide est recueilli sur un filtre et lavé au méthanol. C'est le sel de sodium de l'ambutyro-sine-tétra(acide U-méthanesulfonique). Pour purification, il est redissous dans l'eau et reprécipité par l'addition de méthanol. Le sel de potassium correspondant de l'ambutyrosine-tétra(acide 20 ff-méthanesuifonique) est formé d'une manière similaire à partir du formaldéhyde-bisulfite de potassium. Ces sels de métaux alcalins de l'ambutyrosine-tétra(acide N-méthanesulfonique) sont des dérivés pharmaceutiquement acceptables ayant les propriétés antibactériennes de 1'ambutyrosine elle-même. 25 Exemple 4 - L'ambutyrosine, telle qu'elle est obtenue par l'un quelconque des exemples précédents, peut être séparée en ses constituants ambutyrosine A et ambutyrosine B par la méthode suivante. Une résine échangeuse d'ions dans la forme borate est préparée 30 comme suit. Dans une colonne en verre de 5f08 cm de diamètre, on tasse trois litres de résine échangeuse d'anions forte dans la forme chlorure. On peut utiliser une résine comme celle dite Dowex 1 X 2, en particules de 0,149 à 0,297 mm. On transforme la résine à la forme hydroxyde par passage de 16 litres d'hydroxyde de 35 sodium 2M. Elle est ensuite lavée à l'eau (environ 9,5 litres) jusqu'à ce que le pH de l'effluent soit 9,2, traitée par 17,5 litres de solution à 5 d'acide borique, et finalement lavée à l'eau, jusqu'à ce que le pH de l'effluent soit de 5,5 environ. Un échantillon de 6,01 g d'ambutyrosine contenant l'am- 3 40 butyrosine A et l'ambutyrosine 1 est dissous dans 15 cm d'eau et 69 08570 22 2004659 ajouté à la colonne. La colonae est éluée à l'aide; de 6,42 litres d'eau, et on recueille des fractions à environ 7 cm par minute. Les fractions contenant le produit sont identifiées et comMnées. Par exemple, dans une séparation typique, on trouve le produit 5 dans l'éluat après élution par 2,25 litres d'eau et en continuant jusqu'à ce que la colonne ait été éluée par un total de 4,95 litres d'eau. Le produit obtenu par élution à l'eau de cette manière contient 1'ambutyrosine A sans ambutyrosine B. La colonne est ensuite éluée successivement par 4 litres 10 d'acide borique à 1 2 litres d'acide borique à 2 et finalement par une solution à 5 $ d'acide borique. L'éluat est recueilli, en fractions et les fractions contenant le produit sont identifiées et combinées. Dans une séparation typique, on trouve le produit principalement dans les fractions correspondant à un volume 15 d'effluent de 2,64 à 4»00 litres après l'utilisation d'acide borique à 5 i<>» Ce produit consiste en ambutyrosine B à peu près exempte d'ambutyrosine A. L'ambutyrosine A peut être encore purifiée comme suit. Les fractions provenant de la colonne de résine mentionnée ci-20 dessus, correspondant à un volume d'effluent de 3,0 à 3,6 litres (en utilisant l'eau comme éluant), sont passées à travers une 3 colonne contenant 11 cm de résine d'acide carboxylique, dans la forme ammonium, en 20 heures environ. On peut utiliser une résine comme l'Amberlite IRC-50. Cette colonne est lavée à l'eau, puis 3 25 à l'aide de 40 cm d'hydroxyde de sodium 0,1M pour éliminer les impuretés. L'ambutyrosine A est ensuite éluée par deux portions de 80 cm^ d'hydroxyd'e d'ammonium 1M. La première portion est évaporée sous vide et lyophilisée pour donner 584 mg d'ambutyrosine A contenant une trace de bore. 3 30 Pour éliminer le bore, on dissout ce produit dans 5 cm d'eau et on fait passer la solution à travers 4 cm d'une résine -échangeuse d'anions spécifique pour le bore. On peut utiliser une résine comme l'Amberlite XE 243, sous la forme de la base libre. La colonne est éluée à l'aide d'une quantité supplémentaire de 35 8 cm"* d'eau et la solution qui sort est lyophilisée pour donner l'ambutyrosine A (base libre) ne contenant pas d'acide borique. Une solution de cette ambutyrosine A exempte de bore 3 3 dans 8 cm d'eau est passée à travers 6 cm d'une résine échangeuse d'anions forte dans la forme hydroxyde. On peut utiliser une résine 40 comme celle dite Dowex 1 X 16. La colonne est éluée à l'aide d'une 08570 23 2004659 quantité supplémentaire de 15 cm^ d'eau et la solution qui sort est lyophilisée pour donner 1'ambutyrosine A purifiée sous la forme d'une base libre ayant les propriétés suivantes. Les rotations spécifiques (1,46 ft> dans l'eau) à diverses lon-5 gueurs d'ondes sont les suivantes : +26,0° à 589 millimicrons, +27,2° à 578 millimicrons, +30,4° à 546 millimicrons, +49»5° à 436 millimicrons, +74,40 à 365 millimicrons» Après séchage sous vide à 100°C pendant 24 heures, la micro-analyse indiqué 44,94$ de carbone, 7,05 $ d'hydrogène et 12,23 i» d'azote. Dans le bromure 0 de potassium, le produit a des maxima d'absorption infra-rouge à 700, 1028, 1090, 1340, 1390, 1457, 1498, 1550 à 1610, 1652, 2938, 3040 et 3410 cm"1. Exemple 5 - Un autre exemple de séparation de 1'ambutyrosine en ses 5 constituants ambutyrosine A et ambutyrosine B est donné ci-après. Une résine échangeuse d'anions forte dans la forme borate est préparée comme suit» Une résine échangeuse d'anions forte dans la forme chlorure, 3,4 litres, est tassée dans une colonne de 5#4 cm de diamètre. On peut utiliser une résine comme eelle dite Dowex !0 1 Z 1, en particules de 0,149 à 0,297 mm. Cette résine est transformée à la forme hydroxyde à l'aide d'hydroxyde de sodium 2M, lavée à l'eau jusqu'à ce que le pïï de l'effluent soit 10,5» puis traitée par 12 litres d'acide borique à 5 $» et finalement lavée à l'eau jusqu'à ce que le pH de l'effluent soit 6,9» •5 25 Une solution de 4.03 g d*ambutyrosine dans 7,5 cm d'eau est ajoutée à la colonne. La colonne est éluée par 11 litres d'eau à raison de 14 cm par minute et on recueille des fractions de l'éluat. Les fractions commençant à un volume d'effluent de 3,96 litres et se terminant à un volume d'effluent de 6,97 litres 30 contiennent un produit qui consiste en ambutyrosine A à peu près exempte d'ambutyrosine B. Ces fractions sont combinées et l'ambutyrosine A est isolée par adsorption sur une résine d'acide carboxylique, dans la forme ammonium, et ensuite élution par l'hydroxyde d'ammonium 1M comme décrit ci-dessus. La colonne 35 contenant la résine échangeuse d'anions forte dans la forme borate est ensuite éluée par 7,1 litres d'acide borique à 2,5 et finalement par 5 litres d'acide borique à 5 Un produit est recueilli de la colonne par élution par l'acide borique à 5 La majeure partie de ce produit se trouve dans les fractions corres-40 pondant à un volume d'effluent de 0,5 à 3,2 litres d'acide borique 69 08570 24 2004659 à 5 io. Il consiste en ambutyrosine B à peu près exempte d1 ambutyrosine A. Pour purification supplémentaire, la solution d1ambutyrosine B dans l'acide borique à 5 i° est passée très lentement à 3 5 travers une colonne de 0,6 cm de diamètre contenant 5 cm de résine d'acide carboxylique, dans la forme ammonium. La colonne est lavée à l'eau et ensuite éluée à l'aide de 90 cm d'hydroxyde d'ammonium 1M. L'éluat à l'hydroxyde d'ammonium est évaporé sous vide et lyophilisé pour donner 614 mg d'ambutyrosine B (base libre) 10 contenant une petite quantité d'acide borique comme impureté. Une solution aqueuse de ce produit est passée lentement à travers 3 4 cm de résine échangeuse d'anions spécifique pour le bore, sous la forme de la base libre, pendant 3 heures, et la colonne est éluée à l'aide d'une quantité supplémentaire de 10 cm d'eau. La 15 solution qui sort est lyophilisée pour donner 609 mg d'ambutyrosine B contenant seulement 0,02 $ de bore et ayant les propriétés suivantes. Les rotations spécifiques (1,5$ dans l'eau) à diverses longueurs d'ondes sont les suivantes : +33,0° à 589 millimicrons, +34,0° à 578 millimicrons, +38,5° à 546 millimicrons, 20 +64,0° à 436 millimicrons. Après séchage sous vide à 100°C pendant 24 heures, la micro-analyse indique 42,79 $ de carbone, 7»53 $ d'hydrogène et 11,45 $ d'azote (correspondant à un dihydrate). Dans le bromure de potassium, le produit a des maxima d'absorption infra-rouge à 700, 1026, 1100, 1345, 1390, 1458, 1497, 1549, 1580, 25 1650, 2938, 3040, 3315 et 3370 cm"1. 08570 25 2004659 REVENDICATIONS 1 o- La N1 -(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6 -didé s oxy-D-glucopyrano syl ) -5-0-D-xylofur anosyl-2-désoxy-streptamine. 2.- Des sels d'addition d'acides de la N1-(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glycopyranosyl)-5-0-D-xylofuranosyl~2-désoxystreptamine« 3.- La N1 -(4-amino-2-hydroxy'butyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-0-D-ribofuranosyl-2-désoxy-streptaminé. 4a- Des sels d'addition d'acides de la N1-(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-0-D-ribofuranosyl-2-désoxystreptamine. 5.- Un produit contenant une proportion majeure de N1-(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl )-5-0-D-xylofuranosyl-2-désoxystreptamine et une proportion plus faible de N1-(4-amino-2-hydroxybatyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-0-D-ribofaranosyl-2-désoxystreptamine. 6.- Un produit selon la revendication 5 sous la forme d'un sel d'addition d'acide. 7.- Un produit selon la revendication 5 sous la forme d'un sel sulfate. 8.- A titre de médicament nouveau, l'une quelconque des matières suivantes : a) N1-(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-0-D-xylofuranosyl-2-désoxy-streptamine ; b) N1-(4-amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6~diamino-2,6-didésoxy-D-glucopyranosyl)-5-O-D-ribof uranosyl-2-désoxy-streptamine, ou c) un sel d'addition d'acide de l'un des composés ci-dessus.