Brevet FR2011676A1 — publié le 19700306

i 2011676 Il est bien connu que certains microorganismes métabolisent les composés hydrocarburéso Récemment, on s'est considérablement intéressé à développer un procédé de production dTaliments contenant des protéines destinés à la arisom-5 mation animale et humaine, par 1*intermédiaire de la conversion microbiologique d'hydrocarbures. Nombre de procédés de conversion micro-biologique de composés hydrocarburés en aliments contenant des protéines ont été décrits„ 10 Des levures de la famille des cryptococ- caceoe et particulièrement de la sous famille des cryptococcaideoe sont préférées ,mais des levures ascosporogènea delà famille des saccharomyoideoe peuvent être utilisées» De l'ensemble de la sous famille des cryptococcoideoe, on préfère le torulopsis et le can-15 dida. La candida lipolytica, candida pulchenin-ca, condida utilis et candida tropicalis sont connues comme étant des levures utilisables pour produire un aliment contenant des protéines à partir de substrats hydrocarburéso D'autres microorganis-20 mes utilisés dans des procédés similaires comprennent des bactéries de la famille des Bacellocoe et des Pseudomonadoceoe ainsi que des moisissures de la famille des Aspergilloceoe0 La vitesse de croissance et de production de protéine dans la levure Candida Intermedia a été étudiée 25 à propos d'un produit ressemblant de manière étroite à Candida Intermédia. La taxonomie des levures incluant candida intermedia a été également décrite ainsi que l'isolement de Candida Intermedia. La vitesse de croissance et la production de protéines avec Candida Intermédia sur les alcanes normaux 3.0 a été étudiée en utilisant une solution, nutritives contenant Zn 30^.7^0 à raison de 800 microgrammes par litre (3-83 microgrammes de Zinc par litre)» L'invention a pour objet un procédé de fabrication de protéines alimentaires de croissance de Candida In-35 teimêdia sur des alcanes normaux en présence de solutions nutritives, procédé caractérisé parce qu'on effectue la croissance de la levure en présence d'environ 8oQ00 à environ 10»000 microgrammes de Zinc par litre de milieu nutritif, ce Zinc se présentant sous forme d'un sel soluble dans l'eau et non toxique, procédé 40 assurant une croissance plus rapide dé la levure et une teneur 69 18748 2 2011676 plus élevée en protéines0 Par le procédé de l'invention» on peut accroître à la fois le vitesse de croissance de Candida Intermedia sur des alcanes normaux et la teneur en protéine des cellules de 5 levure, en cultivant la levure Candida Intermedia sur des alcanes normaux en présence d'un milieu nutritif contenant environ 9«000 microgrammes de Zinc par litre„ Le procédé de cette invention est appliqué généralement en utilisant l'organisme Candida Intermedia0 10 "Le procédé est appliqué dans un bac de fermentation à une température comprise entre 25°C et kO°Gs de préférence environ 30°C» On utilise de l'oxygène, ou un gaz contenant de l'oxygène, par exemple de l'air, afin de maintenir des conditions aérobies dans le réacteur de fermentation Ce procédé 15 peut être appliqué en opération continue ou discontinue» Le pHs dans chaque cas, est maintenu entre .4,5 et 6,6 et de préférence à environ 5,5, par addition contrôlée d'ammoniac, de préférence sous forme d'une solution aqueuse à 5 -30 fo d'hydroxyde d'ammonium» 20 Le substrat d'hydrocarbure est ajouté au système, de préférence automatiquement, en quantités proportionnelles à la teneur en hydroxyde d'ammonium» Cependant, il peut être ajouté par doses progressives en apportant des quantités prédéterminées à certaines périodes au cours de la fermentationp lors-25 que le substrat se trouvant dans la réaction est consommé» La réaction de fermentation est conduite en présence d'un milieu nutritif contenant une source d'azote,, une source de phosphate et des traces de divers métaux incluant le zinc, se présentant de préférence sous forme de sulfate de Zinc» 30 Le zinc, cependant, peut se présenter sous la forme d'un sel quelconque non toxique, comme l'acétate de Zinc, 1'acétylcarbonate de Zinc, le chlorure de Zinc, le citrate de Zincs le tartrate de Zinc etc..»- De manière similaire, les traces de métaux se présentent de préférence sous forme de .sulfate ou de chlorure et peuvent se pré-35 senter sous une quelconque de leurs formes solubies et non toxiques pour l'organisme, présent dans le système» Dans ces conditions, les temps de fermentation ont approché ou dépassé 30 heures» Les temps de fermentation optimaux sont déterminés en suivant la vitesse de croissan-40 ce. Initialement, la vitesse de croissance est comparativement BAD ORIGINAL 69 18748 3 2011676 lente. Par la suite, la vitesse de croissance augmentera jusqu®à une valeur plus grande, comme sous le nom du "phase de croissance exponentielle", puis la densité cellulaire dans le système deviendra constante alors que la vitesse de croissance diminuera» Xes 5 cellules de levure sont usuellement récoltées à ou près de la fin de la phase de vitesse de croissance exponentielle0 Dans de telles conditions de croissance, les rendements bruts en protéine ont été approximativement de' 30% en utilisant les procédés de la technique antérieure, particuliè= 10 rement dans le procédé décrit par Millet et Coll» On a maintenant constaté, cependant, qu*en accroissant la concentration du Zinc dans le milieu nutritif d'environ cinquante fois par rapport à la teneur en Zinc de la solution nutritive, le temps de fermentation peut être diminué avec 15 un accroissement substantiel du rendement brut en protéineo Par exemple, on avait constaté antérieurement qufune croissance èt une production de protéine satisfaisantes adviennent lorsque le milieu nutritif contenait 800 microgrammes de Zn S0^, 7H20, ce qui correspond approximativement à 183 microgrammes de Zinc par litreo 20 Comparativement, cependant, avec le procédé de 1Tinvention, on constate qu'une augmentation de 50 fois de la teneur en Zinc dans le milieu nutritif, 4»10^ microgrammes de Zn S0^<>7H20 par litre (9,120 microgrammes de Zinc), augmente la vitesse de croissance et de plus augmente la teneur en protéine de la levure produite,, 25 Ce résultat surprenant est bien illustré par les exemples qui suivent o On a préparé deux milieux nutritifs de composition suivante i KH2P04 30 NH^Cl CaCLj »2H/j 0 MgS04o7H20 CuSO^o 5H2O KI 35 FeCl3.6H20 MnS0^oH20 NA2Mo0^.H20 : ZnS04«7H20 ' iï20 distillée 40 Après ajustage du pH des milieux èù 5,5» Milieu I "Milieu II 7o5 g •' 7o5 g 7o0 g 7o0 g 0o5 g ' 0o5 g 3 <>8 g 00 o C\ 80 g ' 80 ^0 g 200 /^g 20 0 y* g 400 Ja, g 400 g 800 y-t/g 800^*, g 400 JÀ g - 400 J** g 800>t,g 40,000^ g 1,000 ml' ' • 1,000 ml 69 18748 4 2011676 les solutions furent stérilisées à 82°C sous une pression de 1,05 kg/cra2 pendant 55 minutes» Après refroidissements 011 intro» duisit un litre du milieu I dans un fermenteur stérile de 5 litres On ensemença alors le système avec un litre d!une culture de 48 h„ 5 de Candida Intermedia poussée dans le milieu ci-dessus, puis on introduisit 2,8 cm3 d'un mélange de n-alcanes contenant des alcanes normaux dont la longueur de chaine variait de C-^ à fournit de l'oxygène en système à la vitesse de 0,1 v/minute et la phase liquide fut agitée par un agitateur du type à hélice ro-10 tative à 750 t/mn<> On .maintint Ie pH entre 5»5 et 5,7 par des additions horaires de NH^OH en quantités variant de 1,1 à 3S5 cm3 par heure jusqu'à un total de 63,1 cm3o le substrat hydrocarbure a été ajouté simultanément avec le NH^OH en quantités variant de 0,7 a 2,3 cm3 par heure jusqu'à un total de 44,6 cm3 o 15 On laissa la fermentation se poursuivre jusqu'à disposition de la nécessité d'addition de NH^0Ho On récolta alors les cellules et on les soumit à un dosage d'azote totale On conduisit la fermentation, utilisant le milieu II, de ma même manière, les données obtenues à partir des deux expériences et les 20 résultats des dosages d'azote sont répertoriés au tableau Ie TABLEAU I N° de la Concentra- Temps de Rendement Azote Rendement réaction tion fermenta- en cel- total. en protéine Zn30^ g/l tion Iules 25 1 800 27 82,3 $ 6,00$ 30,8 2 4xl04 2 0 81,3 1° 7 s, 5 &f° 38,5 1o Il apparaitra des données du tableau I qu'en plus d'une diminution substantielle du temps de fermentation 30 il y a un accroissement significatif du rendement brut en protéine Par emploi du milieu II, à haute teneur en Zinc, comparé au milieu I qui correspond pour l'essentiel au milieu décrit dans la littérature par Miller et Coll, le temps de fermentation a été diminué de 26% alors que le rendement brut en protéine a été augmenté de 35 26 %a Alors que ces données montrent clairement, pour les n-alcanes de C^ à C^, l'accroissement inattendu du rendement en protéine, même avec des temps de fermentation courts, il est clair que des résultats similaires auraient été 40 obtenus en utilisant les n-alcanes décrits par Miller et Colle 69 18748 5 2011676 C'est pourquoi, il est entendu que les n-alcanes généralement et les n-alcanes ayant une longueur de chaine d'environ G^z ^ environ G22 en Particulier sont comprises dans le domaine de la présente invention» 5 les données expérimentales que l'on peut obtenir montrent que la teneur en zinc la meilleure dans le milieu nutritif est de l'ordre de 9«000 microgrammes par litre^mais on peut obtenir des résultats satisfaisants en utilisant des teneurs en Zinc comprises entre environ 80OOO et environ lOoQQO micro-10 grammes par litre de milieu nutritifo Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés On pourra, au besoin, recourir à d'autres modes et à d'autres formes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'inven^ 15 tion. 69 18748 6 2011676 REVENDICATIONS 1°) Procédé de fabrication de protéines alimentaires de croissance de Candida Intermédia sur des alcanes normaux en présence de solutions nutritives» procédé caractérisé -5 par ce qu*on effectue la croissance de la levure en présence dfen-viron 8.000 à environ 10o000 microgrammes de Zinc par litre de milieu nutritif, ce Zinc se présentant sous forme d*un sel soluble dans l'eau et non toxique, procédé assurant une croissance plus rapide de la levure et une teneur plus élevée en protéines» 10 2°) Procédé de la revendication I, carac térisé parce que le processus de croissance est conduit à une température comprise entre 25 °C et 40°GÎ) le pH du milieu nutritif se trouvant compris entre environ 4,5 e-tenviron 6,50 3°) Procédé des revendications I et IIt 15 caractérisé par ce que la croissance de la levure est conduite en présente de ZnSO^^HgO» 4°) ^rocédé de la revendication 3, caractérisé par ce qu*on utilise 4O0OOO microgrammes de ZnSO^oT^O par litre du milieu nutritif0