Brevet FR2001545A1 — publié le 19690926

La présente invention concerne l'hydroxylation microbiolff-gique d'acides benzoïques, de leurs sels ou de leurs esters, substitués ou non-substitués, possédant au moins 2 atomes de carbone voisins non substitués sur le noyau. 5 Le brevet américain 3 382 289 décrit un procédé d'oxyda tion microbiologique d'hydrocarbures benzéniques méthyl-substitués, par différentes espèces de Nocardia, pour former, entre autres, un mélange des acides benzoïques correspondants dihydroxylés et de leurs analogues non-hydroxylés. De ces deux produits élaborés, le 10 dérivé dihydroxylé est commercialement le plus intéressant. Néanmoins, chaque fois qu'il y a formation de dérivé dihydroxylé, on récupère également des quantités importantës du produit analogue non-hydroxylé. Tous les essais, faits jusqu'ici pour convertir ces produits secondaires non-hydroxylés en acides dihydroxylés plus in-15 teressants, par des moyens microbiologiques, se sont révélés entièrement infructueux parce que, de façon surprenante, les espèces de Nocardia, capables de produire un mélange de ces deux produits à partir de méthyl-benzènes, sont incapables d'effectuer la transformation souhaitée en partant de l'acide benzoxque correspondant. 20 De façon inattendue, cette dihydroxylation est réalisée par la présente invention. Le nouveau procédé permet en effet la préparation d'acides dihydroxybenzoxques, de leurs sels ou de leurs esters, à partir d'acides benzoïques correspondants, substitués par O à 3 groupes méthyle et/ou halogénés, et possédant au moins sur le 25 noyau 2 atomes de carbone voisins non substitués. Ce procédé, suivant l'invention, réalise la transformation des acides benzoïques en analogues dihydroxylés correspondants, par l'action de différentes espèces de Nocardia normalement incapables d'effectuer une telle transformation. 30 On soumet, selon l'invention, ces acides benzoïques, leurs sels alcalins ou leurs esters d'alcoyle inférieurs, dans des conditions de fermentation, à l'action microbiologique d'une espèce de Nocardia, normalement incapable d'effectuer cette transformation, mais qui a été antérieurement mise en contact avec un "inducteur" 35 aromatique ou halogéno-aromatique, défini plus loin, pendant une durée suffisante pour orienter le système enzymatique dudit microorganisme vers cette dihydroxylation. Le procédé selon l'invention peut être avantageusement mis en oeuvre par la culture préalable de cellules de Nocardia en 40 milieu nutritif ï ces cellules sont normalement incapables d'hydro- OVÛ2778 2 2001545 xyler un acide benzoïque, mais leur système enzymatique est susceptible d'être induit, dans ce but ; on ajoute ensuite à ces cellules, à l'état de dispersion, une quantité adéquate d'un promoteur d'hy-droxylation, tel que défini ci-dessous, dans des conditions de cul-= ture et pendant un laps de temps suffisant pour amener le système enzymatique de la cellule à dihydroxyler le dérivé d'acide benzoïque choisi ; on soumet ensuite ce dérivé benzoïque à l'action des cellules ainsi induites, ou activées, en présence d'un milieu nutritif, dans des conditions de fermentation aérobie ; puis on récu-10 père à partir du bouillon de fermentation un dérivé dihydroxylé de l'acide benzoïque. On peut aussi introduire le substratum acide benzoïque dans le milieu de fermentation au moment où l'on y ajoute le promoteur. Dans ces conditions, toutefois, il s'écoule une période d'induction de plusieurs heures avant que l'on observe la formation 15 de produit dihydroxylé. Pour préparer une espèce de Nocardia, utilisable dans le procédé selon l'invention, on transporte de préférence un échantillon de culture sur gélose inclinée, dans un flacon secoueur contenant un milieu nutritif adéquat, comprenant une source carbonée, sur 20 laquelle l'organisme puisse se développer. Dans certains cas, il peut être également souhaitable d'avoir une substance supplémentaire, stimulant la croissance, telle que peptone, extrait de boeuf ou de levure, etc., bien que l'addition de telles substances ne soit pas essentielle. Puis le mélange est soumis à incubation à 30°C en-25 viron. Le promoteur ou inducteur est ajouté à la culture immédiatement ou après une période d'incubation allant jusqu'à 24 heures em~ viron, selon la concentration des cellules. Le milieu nutritif dans lequel est ensemencé l'organisme choisi doit contenir, ainsi qu'il est indiqué ci-dessus, outre des 30 substances minérales nutritives et une source d'azote, une source de carbone qui fournit également son énergie à l'organisme. Bien qœ l'on puisse utiliser en général toute substance organique renfer» mant du carbone et de l'hydrogène comme par exemple les hydrates de carbone ou les acides gras, il est préférable d'employer des hydro~ 35 carbures, en particulier des n-paraffines à 1 à 30 atomes de carbone, comme n-butane, n-dodécane, ou n-hexadécane et plus spécialement ce dernier. On peut aussi utiliser, à la plaoe de ces paraffines et selon la souche d'organisme choisie, certains hydrocarbures aromatiques comme le benzène. La source carbonée, par exemple n-hexadécane 40 peu"t être ajoutée en une seule opération, juste avant l'ensemencement 6902778 3 2001545 du milieu. Cependant, on l'ajoute de préférence par petites quantités à intervalles réguliers, répartis sur toute la durée de la fermentation, afin d'éviter dans le milieu des concentrations élevées de cette substance, qui seraient toxiques pour l'organisme. Bien 5 ) que la quantité à ajouter chaque fois puisse varier selon l'organisme, il est généralement souhaitable de ne pas avoir à tout moment plus de 3 ml environ de n-hexadécane par litre, dans le récipient, pour une quantité totale de 10 g environ de cette source carbonée par litre, pour chaque opération donnée de fermentation en disconti- 10 nu- La source d'azote, à incorporer dans le milieu nutritif, peut être tout composé minéral ou organique contenant de l'azote et capable de le fournir sous forme utilisable pour le métabolisme du microorganisme, tel que protéines, acides aminés, sulfate et 15 phosphate d'ammonium, urée, etc. Les substances minérales nutritives doivent être solubles dans l'eau et fournir une source convenable de minéraux, de préférence sous forme de leurs sels, tels que ceux du fer, sodium et phosphore. A titre d'exemple, la composition ci-dessous, complétée 20 ' par une source carbone-énergie, constitue un milieu nutritif adéquat A. grammes par litre d'eau urée 2,0 extrait de levure (Difco) ...... 0,5 25 Mg S04.7H20 0,2. Na2C03 0,1 CaCl2.2H20 0,01 MnS04.H20 0,02 FeS04.7H20 0,005 30 KH2P04 0,8 Na2HP04 1,2 L'oxygène peut être introduit dans le milieu de fermentation sous toute forme facilement assimilable par l'organisme. On l'introduit de préférence sous forme de gaz, soit en faisant bar-35 boter de l'oxygène ou de l'air dans le milieu liquide, soit par agi tation vigoureuse du bouillon. ' La température, à laquelle s'effectue la fermentation, tant avant qu'après addition du substrat, peut varier aux alentours de 20° à 45°C ; elle est de préférence comprise entre 25° et 35°C 40 ce qui assure à l'organisme une croissance convenable. Le pH dumi- 6902778 4 2001545 lieu doit être maintenu entre 5,5 et 9,5 et de préférence entre 7 et 8,5. Des ajustements sont souvent nécessaires au cours de la fermentation afin de conserver le pH dans les limites favorables. Cela se réalise généralement par addition périodique de quantités suffi-5 santés d'un hydroxyle de métal alcalin. La période de fermentation, qui suit l'introduction initiale du substrat dans le milieu de fermentation préparé et constitue le deuxième stade du procédé, doit durer de 24 à 84 heures-environ et de préférence de 36 à 60 heures. Les composés capables d'induire ou activer les s^tèmes 10 enzymatiques de Nocardia, en vue de la conversion des dérivés d'acide benzoïque en leurs dérivés dihydroxylés correspondants, sont des hydrocarbures aromatiques ou halogèno-aromatiques possédant au moins un noyau aromatique avec pas plus d'un substituant halogéné. Ces promoteurs contiennent de préférence, bien que ce ne soit pas essen-15 tiel, au moins 2 atomes de carbone voisins sur le noyau, non substitués. Ils doivent être également, de préférence, non volatils et non métabolisables par l'organisme de Nocardia, bien que cela ne soit pas non plus indispensable. Parmi ces composés qui entraînent de façon satisfaisante 20 les cellules de Nocardia à hydroxyler les dérivés d'acide benzoïque, on peut citer des hydrocarbures tels que p-, m-, et o-xylène, toluène, benzène, diphényle, naphtalène, méthyl-2- naphtalène et tétraline ; et des hydrocarbures halogénés tels que p-chloro-toluè-ne ou chlorobenzène. On ajoute de préférence ces composés à la cul-25 ture de cellules de Nocardia avant l'addition du substrat acide benzoïque, en quantités capables d'amorcer 1'hydroxylation sans risques d'empoisonner le microorganisme. Ces quantités varient selon le promoteur et l'organisme utilisés, mais de préférence doivent être, dans le milieu de fermentation, supérieures à 5 parties pour 30 mille et de préférence voisines de 20 à 200 parties pour mille. Le promoteur ou inducteur est ajouté de préférence en quantités suffisantes pour maintenir ces concentrations dans le milieu pendant la période s'écoulant avant que l'induction ne soit achevée, habituellement pendant 1 à 12 heures, selon la vitesse de croissance 35 de l'organisme. Les substrats d'acide benzoïque, destinés à l'nydroxyla-tion, sont, ainsi qu'il a été dit plus haut, des composés possédant de O à 3 substituants méthyle et/ou halogène sur le noyau aromatique et qui de plus, présentent au moins 2 atomes de carbone voisins non 40 substitués sur ce noyau. A titre d'exemples de ces substrats selon .902778 5 .2001545 l'invention, on peut citer les acides benzoïques, o-, m-, et p-toluique, diméthyl-2,5 et diméthyl-2,3-benzoïque, triméthyl-2,3,4-benzoïque, méthyl-3-chloro-4-benzoIque, p-chloro-benzoïque, etc., ainsi que leurs sels de métaux alcalins et leurs esters d'alcoyle 5 inférieur, dans lesquels ledit groupement alcoyle contient 1 à 6 atomes de carbone. Bien entendu, étant donné que le milieu doit être maintenu de préférence à un pH neutre ou supérieur à 7, lorsque 1' on utilise l'acide libre lui-même, il se retrouve généralement dans le milieu réactionnel sous la forme de son sel. Les esters d'alcoy-10 les inférieures, qui ne sont pratiquement pas hydrolysables dans ces conditions de fermentation, peuvent être aussi utilisés. Lorsque les composés décrits ci-dessus sont soumis à 1' action des cellules de Nocardia activées, on obtient les acides benzoïques dihydroxylés correspondants, tels que l'acide dihydroxy-15 benzoïque, dihydroxy-2,3-p-toluique, dihydroxy-2,3-diméthyl-4,6-benzoïque, dihydroxy-2,3-diméthyl-5,6-benzoïque, dihydroxy-2,3-chloro-4-méthyl-5-benzoïque, dihydroxy-2,3-p-chlorobenzoïque, dihydroxy-2 ,3-o.chlorobenzoïque et d ihydroxy-2,3-triméthy1-4,5,6-benzoïque, généralement sous forme de leurs sels ou de leurs esters. 20 Le substrat d'acide benzoïque est ajouté de préférence au milieu de fermentation à intervalles de temps réguliers, par petites quantités principalement sous forme de sel hydrosoluble, tout au long de la période de fermentation suivant la période d'induction. Il faut ajouter, en même temps que ce substrat, de petites quantités 25 de la source carbonée décrite précédemment, telle que n-hexadécane. La quantité de chaque portion de substrat, ajoutée au milieu, est généralement comprise entre 0,2 et 0,5 g/litre ; elle est de préférence inférieure à 1 g/litre. Les produits dihydroxylés sont facilement récupérés à par-30 tir du milieu de fermentation par des moyens classiques. Ainsi, par exemple, les cellules peuvent être séparées du bouillon par centri-fugation ou filtration, et ce bouillon clair peut être acidifié et traité par extraction à l'aide d'un solvant approprié tel que éther, dioxane, ou acétate d'amyle. 35 Les espèces de Nocardia, utilisables avec profit dans le procédé selon l'invention, sont celles qui normalement se révèlent incapables de convertir un acide benzoïque en dérive dihydroxylé, mais dont néanmoins les systèmes enzymatiques sont susceptibles d* être activés en ce sens, comme décrit ci-dessus. L'un des organismes 40 préférés selon l'invention est Nocardia Salmoni-color9 ATCC n° 19149. 6902778 6 .7001545 D'autres espèces de Nocardia, également utilisablessont énumérées, dans le brevet américain 3 383 289 cité ci-dessus, qui décrit plusieurs espèces de Nocardia capables d'oxyder des dérivés de méthylbenzène. Ainsi, peuvent être utilisées avec profit les es-5 pèces supplémentaires suivantes de Nocardia, qui toutes ont été classées d'après le manuel de BERGEY, et ont été en outre déposées à 1' American Type Culture à Washington. (1) Souche de type sauvage, obtenue à partir de sol de l'Alabama, possédant approximativement les caractéristiques décrites 10 par le manuel précité pour Nocardia corallina, et cataloguéçfen conséquence comme telle. Une culture de cette souche a été déposée a l'ATCC sous le n° 19 070. Les colonies de ce microorganisme ont une coloration orange. (2) Mutant rougeâtre, obtenu par irradiation à l'ultra- 15 violet de ATCC n° 19 070. Ce mutant a également été déposé à l'ATCC sous le n° 19 071. *(3) Souche isolée à partir de sol de Pennsylvanie et cataloguée de même comme Nocardia corallina. Ce microorganisme est coloré en orange comme le spécimen de type sauvage mentionné en (l), 20 mais il présente des différences dans les caractéristiques d'oxydation enzymatique. Une culture de cette souche a été déposée à 1* ATCC sous le n° 19 148. (4) Autre souche isolée du sol, cataloguée d'après le manuel de Bergey comme Nocardia minima, et désignée sous le n° 19 150 25 à l'ATCC. Il est bien entendu qu'en plus des espèces précitées, la présente invention comprend l'utilisation d'autres espèces de Nocardia pouvant être couramment identifiées par l'homme de l'art, selon les techniques décrites ici, pour déterminer leur possibilité d'ap-30 plication au présent procédé original. Parmi ces espèces il faut inclure les mutants constitutifs des Nocardia définis ci-dessus» Par le terme "mutant constitutif", on entend les organismes choisis, ayant subi une mutation par des moyens classiques en vue de leur transformation d'une espèce n'effectuant pas normalement la 35 conversion désirée en l'absence d'un promoteur, en une espèce qui ensuite accomplira cette conversion hors la présence d'un tel promoteur. Des exemples d'autres types de mutants constitutifs et de procédés pour les obtenir sont déjà connus et décrits par exemple dans Biochim. Biophys. Acta, 90 (1954) 609-610. BAD ORIGINAL 6902778 7 2001545 Les exemples non limitatifs suivants illustrent des formes d'exécution de l'invention. EXEMPLE 1 32 litres du milieu stérilisé A, de composition indiquée 5 plus haut, dépourvu de carbone, sont préparés dans une cuve de fermentation stérile d'une capacité nominale de 60 litres, par passage séparé à l'autoclave de 3 groupes de constituants; une solution d'urée à 50% (poids/volume), une solution de phosphates mélangés, et une solution des sels restants. 10 La cuve de fermentation en acier inoxydable,de 305 mm de diamètre interne, est munie de chicanes et équipée d'un rotor de turbine à ailettes de 152,4 mm. Cette cuve est utilisée à 30°C, avec de l'air stérile arri-vant à raison de 0,33 volume/volume/minute et une vitesse d'agitation de 500 tours/minute. On l'ensemence avec 3 litres 15 d'une culture de 48 heures de Nocardia Salmonicolor, ATCC n°19 149 qui s'est développée dans un milieu identique et dans un récipient similaire, dans lequel on ajoutait de façon continue du n-hexadécane à raison de 5 ml/heure/récipient pendant les premières 8 heures et 10 ml/heure/récipient pendant les 40 heures suivantes. On a-20 limentela cuve de fermentation de façon continue avec du n-hexadécane à raison de 5 ml/heure/récipient depuis le début jusqu'à la 6ème heure et de 10 ml/heure/récipient de la 6ème à la 17ème heure. A ce moment, une croissance modérée étant atteinte, on ajuste le pH de la culture à 8 avec de la soude aqueuse à 8%. On commence égale-25 ment à ajouter, de façon intermittente, du benzène, de telle maniè-que le taux apparent de ce dernier, dans la culture, déterminé par l'analyse quantitative à l'ultra-violet d'extraits à l'iso-octane de cette culture, se maintienne entre 75 et 125 mg/litre. On ajoute également à la culture, à la 17ème heure, 20 grammes d'acide p-^tolui-30 que (plus une quantité suffisante de NaOH pour neutraliser cet acide et le dissoudre dans l'eau sous forme de son sel de sodium). Des additions similaires sont effectuées à la 42ème, 53ème, et 62ème heure, pour maintenir la concentration en acide p-toluique entre 0,3 et 0,5 grammes/litre. Le dosage colorimétrique révèle la présence de 35 0,89 g/litre d'acide dihydroxy-2,3-p.toluique (DHPT) à la 62ème heure, et de 1 g/litre à la 70ème heure. La présenée de DHPT est également confirmée par le spectre ultraviolet, la . mobilité et la réaction typique sur les chromatogrammes sur papier. Sur ces derniers on observe une disparition progressive de l'acide p-toluique à me-40 sure que DHPT s'accumule. Pour des essais de fermentation conduits 6902778 8 2001545 de manière similaire, mais en l'absence de benzène, on n'observe ni disparition de l'acide ptoluique, ni formation de DHPT. EXEMPLE 2 Une cuve de fermentation,contenant 32 litres de milieu sté-5 rile, est préparée et ensemencée comme décrit dans l'exemple 1. On opère à 30°C, avec une vitesse d'agitation de 500 tours/minute et une arrivée d'air stérile de 0,2 volume/volume/minute. On ajoute de manière continue du n-hexadécane à raison de 10 ml/heure/récipient pendant les 9 premières heures suivant l'ensemencement. Entre la 19ème et la 10 22ème heure on ajoute de manière continue 10 g de diphényle dissous dans 40 ml de n-hexadécane ; une addition similaire est effectuée entre la 57ème et la 59ème heure. A la 20ème heure, le pH de la culture est ajusté à 8 au moyen d'une solution aqueuse à 8% de NaOH, et maintenu à cette valeur durant toute l'opération par de nouvelles ad-15 ditions de NaOH si besoin est. Entre la 22ème et la 45ème heure, on ajoute à raison de 26 ml/heure/récipient, une solution aqueuse à 200, (poids/volume) d'acide p-toluique, plus une quantité suffisante de NaOH pour neutraliser cet acide et le dissoudre dans l'eau sous la forme de son sel de sodium. Les liquides surnageants du bouillon, d* ^0 après l'analyse quantitative à l'ultra-violet, contiennent 1,25 g/ litre de DHPT après 45 heures et 2 g/litre après 66 heures. La présence de DHPT est confirmée par la mobilité typique sur papier chromato-graphique et les réactions colorées. Lors d'opérations témoins de même nature, mais ne comportant pas de diphényle, on n'observe ni uti-25 lisation de l'acide p-toluique, ni formation de DHPT. EXEMPLE 3 Une culture de Nocardia est préparée en vue de l'ensemencement comme dans l'exemple 1. On transvase une portion de 35 al dans un flacon de culture de 300 ml, dans lequel on ajoute 4,5 ml d'eau, 30 0,5 ml d'une solution aqueuse de p-toluate de sodium (8% poids/volume d'acide libre) et 0,05 ml d'une solution à 3056 (volume/volume) de tétraline dans du n-hexadécane» Le flacon de culture est secoué à 30°C pendant 9 heures, et au bout de ce temps le bouillon contient 0,05 g/litre de DHPT. Des flacons parallèles, dans lesquels on a omit 35 soit le p-toluate de sodium, soit la tétraline, ne présentent pas de trace de DHPT. EXEMPLE 4 ~ ~ On effectue dans une cuve à fermentation une culture de Nocardia de la manière indiquée dans l'exemple 1, mais en remplaçant 40 le benzène par du p-xylène et sans ajouter de ptoluate. Au bout de "902778 9 2001545 7 heures, on prélève dans la cuve un échantillon de 240 ml, on sépare les cellules du bouillon par centrifugation, on lave ces cellules une fois par remise en suspension dans 240 ml du milieu de sels minéraux dépourvu de carbone, onvttentrifuge et finalement les remet 5 en suspension dans 240 ml du mêpe milieu. On place 35 ml de cette suspension de cellules dans un flacon de culture, auquel on ajoute 0,5 ml d'une solution aqueuse de p-toluate de sodium (8% poids/volume d'acide libre)-. Après secouage du flacon à 30°C pendant 1 heure, on observe la formation de 0,15 g/litre de DHPT. Un flacon si-10 milaire, non additionné de p-toluate de sodium ne présente pas de trace de DHPT. De plus, des cellules préparées de manière semblable, mais sans addition de xylène au stade de croissance fermentative, se révèlent incapables de convertir le p-toluate de sodium en DHPT lors d'expériences en flacons avec des cellules lavées, conduites 15 de même manière que ci-dessus pour des cellules en présence de p-xylène. EXEMPLE 5 On répète le mode opératoire de l'exemple 3 avec remplacement de la tétraline par du m-xylène et fermeture immédiate du 20 flacon avec un bouchon de liège. Au bout de 22 heures, on observe dans le bouillon la formation de 0,02 g/litre de DHPT. Le flacon témoin ne contenant pas de m-xylène ne produit pas du tout de DHPT. EXEMPLE 6 Le mode opératoire de l'exemple 3 est répété, mais la té-25 traline est remplacée par de l'o-xylène et le flacon est fermé immédiatement avec un bouchon de liège. L'organisme utilisé est Nocardia corallina ATCC n° 19 148. Au bout de 22 heures on observe la formation de 0,04 g/litre de DHPT. On n'en trouve pas trace dans le flacon témoin. 30 EXEMPLE 7 On répète le mode opératoire de l'exemple 3, en remplaçant la tétraline par du méthyl-2-naphtalène. Au bout de 22 heures, on observe la formation de 0,11 g/litre de DHPT dans le bouillon tandis qu'on n'en trouve pas trace dans le flacon témoin. 35 EXEMPLE 8 Le mode opératoire de l'exemple 3 est çépété avec remplacement de la tétraline par du naphtalène. Au bout de 22 heures on constate la formation dans le bouillon de 0,11 g/litre de DHPT, alors qu'on n'en trouve pas dans le flacon témoin. 40 EXEMPLE 9 Dans le mode opératoire de l'exemple 4, du p-c'nlorotoluène 6902778 10 2001545 remplace le p-xylène dans le récipient de croissance fermentative. L'organisme utilisé est Nocardia minima, ATCC n° 19 150. Au bout d'une heure de secouage à 30°C, on observe dans le flacon contenant la suspension de cellules lavées et le p-toluate, la formation de 5 0,11 g/litre de DHPT. EXEMPLE 10 Le mode opératoire de l'exemple 4 est répété avec de l'acide p-chlorobenzoxque à la place de l'acide p-toluique, au cours d,e l'expérimentation en flacon sur les cellules lavées. L'organisme 10 utilisé est Nocardia sp., ATCC n° 19 070. Après une heure de secousses à 30°C, on observe la formation de 0,08 g/litre d'acide dihydroxy-2 ,3-chloro-4-benzoïque. EXEMPLE 11 On reprend le mode opératoire de l'exemple 4 en substi-12 tuant le toluène au p-xylène dans le récipient de croissance fermen-tative. L'organisme utilisé est Nocardia sp., ATCC n® 19 071. Au bout de 22 heures, on constate la formation de 0,04 g/litre de DHPT. EXEMPLE 12 Le mode opératoire de l'exemple 3 est reprjs avec substi-20 tution de n\ésitylène à la tétraline. Les résultats sont négatifs et l'on n'observe pas de formation de DHPT. EXEMPLE 13 On répète le mode opératoire de l'exemple 3 en substituant le durène à la tétraline. Les résultats sont négatifs et il n'y a 25 pas formation de DHPT. EXEMPLE 14 On répète le mode opératoire de l'exemple 3 en remplaçant la tétraline par du p-dichlorobenzène. Les résultats sont négatifs et il n'y a pas formation de DHPT. 30 Les exemples précédents illustrent spécifiquement la pré= paration de l'acide dihydroxy-2,3-p-toluique à partir d'acide p-toluique. Cependant, des fermentations effectuées avec les autres dérivés d'acide benzoïque énumérés ci-dessus donnent des résultats analogues. Ceci est vrai quel que soit le promoteur utilisé. 35 Les dérivés dihydroxylés des acides benzoïques, préparés selon l'invention, sont desproduits intéressants ayant de nombreuses applications, en particulier comme agents de chélation, de dé-sactivation de métaux et comme intermédiaires dans la fabrication des colorants. n 2001545 6902778 REVENDICATIONS lt. Procédé pour la dihydroxylation microbiologique d'acides benzoïques ou de leurs sels ou esters, par action de microorganismes susceptibles de provoquer l'oxydation d'un alcoyl-benzène, mais 5 incapables de produire la dihydroxylation d'un acide benzoïque, caractérisé en ce que la culture du microorganisme en est rendue capable par une activation au moyen d'un promoteur ou inducteur constitué par un composé organique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mi-10 croorganisme est une espèce Nocardia, plus particulièrement du type corallina, salmonicolor ou minima, et notamment d'une des souches ATCC n° 19 970, 19 071, 19 148, 19 149 ou 19 150. 3. Procédé suivant'la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit promoteur est un hydrocarbure aromatique, éventuellement halogéné, contenant au moins un noyau benzénique ne portant pas plus de 2 halogènes. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que ledit promoteur est un xylène, toluène, benzène, diphényle, naphtalène, méthyl-2-naphtalène, tétraline ou chloro-toluène. 20 5. Procédé suivant une des revendications 114, caractérisé en ce que la culture du microorganisme, en milieu njutritif, est additionnée d'une faible proportion de promoteur et laissé au repos dans les conditions aérobiques pendant le temps nécessaire à 1' acquisition de la propriété d'opérer la dihydroxylation des a-25 cides benzoïques. 6. Procédé suivant une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'acide benzoïque ou son dérivé, à dihydroxyler, est introduit dans la culture du microorganisme activé par ledit promoteur, et que la fermentation aérobique est conduite à une tempé-30 rature de 20° à 45°C. 7'. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le pH du milieu en fermentation est de 5,5 à 9,5. 8. Procédé suivant une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'acide benzoïque, ou son dérivé, traité, porte sur son noyau 35 0 à 3 substituants constitués par des méthyles ou/et halogènes. 9. Procédé suivant une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les acides benzoïques, leurs sels ou esters, soumis à la fermentation sunt les acides : benzoïque ; o-, m- ou p-toluiques; diméthyl-2,5-benzoïque ; diméthyl-2,3-benzoïquej triméthyl-2,3, 40 4-benzoïque'; méthyl-3-chloro-4-benzoïque ; p-chlorobenzoïque, et similaires.