Brevet FR2008361A1 — publié le 19700123

L'orgotéine est une dénomination non déposée attribuée par le "United States Adopted Name Council" à une protéine pure, très compacte, hydrosuluble et d'un assez faible poids moléculaire, ayant une configuration principalement alpha-hélicoïdale, 5 chélatée avec deux à quatre atomes de métaux bivalents, par exemple Mg, Fe, Gu. Elle est un chélate métallique de protéine isolée non enzymatique, physiologiquement active et utile dans les maladies dans lesquelles le système immunisé de l'hôte est un facteur déterminant, par exemple dans les états inflammatoires. 10 Voir Huber et al., "Abstracts Seventh Annual Meeting of the Society of Toxicology", Washington, D.C., mars i960, Numéro 59; Brevet français N® 1.516.026 du 7 octobre 1966, correspondant à la demande de Brevet Américain N° 576.454» déposée le 31 août 1967. Dans le Brevet Français N°*1.516.026 du 7 octobre 1966, on 15 décrit les détails de "son procédé désolation du foie de boeuf. Dans la demande de brevet Américain N° 657.066, déposée le 2 août 1967, on revendique un perfectionnement de ce procédé, donnant des rendements plus élevés. Le procédé de la présente invention est un procédé plus simple et moins coûteux dans lequel on emploie 20 une matière première moins coûteuse. lforgotéine est une protéine hélicoïdale, c'est-à-dire qu,elle semble avoir une configuration alpha-hélicoïdale dfau moins 00%, cette conformation étant apparemment due"à la faible proportion (c*est-à-dire moins de 15 $ et, probablement, environ 25 13$) de résidus d'amino-acides "interrompant la chaîne", c*est-à-dire la sérine, la thréonine, la proline, l'isoleucine et la cys-téine, dans ses résidus d'amino-acides. Une analyse élémentaire moyenne du chélate protéinique est la suivante : C, 50,02; H,' 7 >93 0, 25,55; N, 15,26; S, 0,43; néxant; cendres î 4-1%.~ Des tests 30 avec des réactifs de sucres typiques après hydrolyse acide indiquent la présence dTenviron 3 à 4 % de carbohydrate, calculés en glucose, ce carbohydrate•étant probablement lié dfune manière covalente à la protéine. Il contient moins de 0,01 $ de phosphore lipide, moins de 0,1 fo de cholestérol, moins de 0,05 % de 35 galactolipide et aucun glycolipide hydrosoluble détectable. En se basant sur des calculs récents, l'orgotéine a un poids moléculaire protéinique d'environ 32.600 (i 10$) et un poids moléculaire total (y compris le carbohydrate) d'environ 34*000. En se basant sur ce poids moléculaire et sur une teneur en cen-40 dres de 0,3 le chélate protéinique contient un total moyen de 235 résidus d'amino-acides et environ 2-4atomes-grammes de bad original 14931 2008361 1 métaux par molécule. Une analyse d'anino-acides indique que la protéine est formée entièrement d'amino-acides essentiels. Elle est pratiquement exempte de cystine et a une faible teneur en autres- frac-5 tions contenant du soufre, c'est-à-dire qu'elle ne contient qu'un résidu de cystéine et quatre résidus de méthionine par mole et aucune autre fraction contenant, du soufre. Elle a une teneur exceptionnellement faible en sérine et en thréonine, c'est-à-dire environ 2 et 5 résidus respectivement par molécule. Elle contient 10 une quantité prépondérante de groupes, basiques libres (55, soit 11 d'arginine, 26 de lysine et 10 d'histidine) vis-à-vis des groupes acides libres (31, fournis par l'acide aspartique et l'acide glutamique; 17 des groupes d'acides aspartique,.et glutamique étant présents sous forme d'amides), ce qui donne un rapport 15 exceptionnellement faible de 0,564 groupe acide libre vis-à-vis des groupes basiques libres* Le tableau I donne un profil typique d'amino-acides d'orgotéine, calculé sur un poids moléculaire de 32*600. Ce tableau donne des valeurs moyennes pesées basées sur plusieurs 20 essais et différentes durées de digestion en utilisant le procédé de 3* Moore et al., "Anal. Chenu" £0, 1190 (195#) et en prenant la norleucine comme nome interne* TABLEAU I* PROFIL D'AMINO-ACIDES. 25 Amino-acides Résidus par mole (à un nombre entier près)* Alanine 25 Arginine 11 Acide aspartique 25 30 Cystine - l/2 "1 Acide glutamique 25 Glycine 24 Histidine 10 Isoleucine 13 35 Leucine 17 Lysine . 27 Méthioniïie 4 Phénylalanine 9 Proline 10 40 Sérine 4 69 14931 2008361 Thréonine 5 Tryptophane 1 Tyrosine 1-2 Valine 24 5 Amide-NH, (15) 1 1 Gendres (atomes de Me ) 2-4 * Valeurs réglées et basées sur une digestion avec HCC - 18, 24 et 72 heures, en se basant sur un poids moléculaire protéinique de 32.600. 10 Le chélate métallique de protéine a tin point isoélectri que à un pH d*environ 5,5 i 0,2 et un point isoionique à 7,92 + 0,02. On a déterminé lé point isoélectrique par électrophorèse sur de l'acétate de cellulose à différents pH en utilisant un tampon de citrate-phosphate. On a déterminé le point isoionique 15 suivant Riddiford et al., nJ. Biochem." 239. 1079, (1964). On a dialysé complètement la protéine pour la libérer entièrement de tous les électrolytes, puis on l*a soumise à une lyophilisation. A un pH de 7, l*orgotéine a, au spectre des rayons infrarouges, uns courbe typique pour les protéines. Le tableau II re-20 prend des données obtenues d'après ses spectres d*absorption des rayons ultraviolets à un pH de 1,5 dans du HC1 0,05 N et du HC1 0,05 N plus KG1 0,10 M; à un pH dé 7 dans l*eau; à un pH de 7 dans un tampon de phosphate 0,05 M et à un pH de 13 dans du KC1 0,15 M, réglé à un pH de 13 avec du K0H 1 N. 25 69 14931 4* 2008361 TABLEAU II. SPECTRES D'ABSORPTION DES RATONS ULTRAVIOLETS DU NOUVEAU CHELATE DE PROTEINE. DENSITE OPTIQUE 5 pH 1,5 pH 7 pH 7 pH 13 Y = 0,05 Y = 0,05 EpO Tampon KC1-K0H m -jol 0,560 mg/ml 0,434 1,00 mg/ml 0,492 0,492 mg/ml mg/ml mg/ml 310 0,066 0,005 0,035 0,00 0,12b 10 300 0,102 0,030 0,090 0,03 0,280 295 0,145 0,066 0,104 0,13 0,353 290 0,236 0,129 0,372 0,18 0,430 285 0,320 0,190 0,510 0,25 0,429 2Ô4 0,342 0,204 0,540 0,22 0,430 15 2Ô3 0,355 - 0,560 ■ - " - 20 2 0,369 0,219 0,570 0,29 0,438 2Ô1 - - 0,580 - - 2ë0 0,377 0,224 0,585 0,30 0,430 279 - Q s226 0;590 - - 20 27$ 0,3^4 0,227 0,592 0,30 0,420 277 - 0,220 0,590 - - 276 0,3^5 0,226 0,588 0,30 0,411 275 0,305 0,225 0,580 - 0,410 270 0,364 0,206 0,538 0,27 0,422 25 26 5 0,330 0,179 0,475 0,23 0,471 260 0,204 0,144 0,400 0,19 0,592 255 0,2kl 0,117 • 0,337 0,15 0,845 250 0,226 0,104 0,315 0,13 1,150 245 0,263 0,134 0,402 0,18 1,45 30 240 230 0,432 0,272 0,190 0,37 1,80 1,70 A un pH de 13*0, tous les groupes tyrosyles de la protéine ^semblent être librement disponibles pour le solvant et, par conséquent, pour l'ionisation instantanée tandis que, à un 35 pH de 1,5, même à une concentration ionique de 0,05, les résidus de tyrosine restent partiellement protégés contre l'attaque par les solvants. Dès lors, la molécule de protéine semble ®tre^j^lQp{|Q|{vj^ 69 14931 2008361 déployée à un pH alcalin. A un pH acide, la protéine est largement insoluble dans la zone se situant en dessous d'un pH de 5,5, mais elle commence à se redissoudre à un pH de 2. A un pH de 1,5, elle 5 est complètement redissoute. Au spectre de différence acide, des crêtes dans la zone de 292-294 m yu sont dues au tryptophane et à la tyrosine dans la zone 'de 285-287 myu., avec une faible contribution par le tryptophane, tandis que la phénylalanine provoque des changements dans la fine structure à partir de 250-10 265 m yu. Il y a une surprenante différence entre le spectre de différence acide à des concentrations ioniques de 0,05 M et 0,15 M. A une concentration ionique de 0,05 M, il n'y a aucune crête définie à partir de 200-296 myu, mais il y a un palier à 294-296 nyu et xine large saillie à partir de 285-290 m yu, précédée d'un palier 15 inférieur à 200-202 m yu. A une concentration ionique de 0,15 M, il n'y a aucune crête ni aucun palier à 294-296 myu, tandis qu'un large palier ondulé couvre la zone de 278-285 m yu avec une saillie à 206-290 myu. Il semble qu'à un pH de 1,5» le palier à 292-296 myu 20 est dû aux changements de milieu ambiant dans les résidus de tryptophane dans la molécule de protéine. La saillie à 287-290 m yu est probablement due, en partie, aux résidus de tyrosine de la molécule. Contrairement à la concentration ionique de 0,05.à 0,15 M, les résidus de tryptophane semblent être presque complè-25 temént protégés. Les spectres aux deux concentrations ioniques sont plutôt anormaux vis-à-vis des crêtes de tyrosine. La crête habituelle que l'on a à environ 285 m yu pour d'autres protéines, fait défaut à 0,15 M et ilaya qu'une faible saillie à 0,05 M. Tout le diagramme dans la zone de 204-288 myu indique que les 30 rési-dJ» de tyrosine de la protéine "sont enfouis à l'intérieur de la molécule et qu'ils sont ainsi protégés contre l'attaque des solvants. Lors de l'électrophorèse par gel en disques sur le polyacrylamide et lors de l'électrophorèse d'agarose en mince 35 pellicule, le nouveau chélate métallique protéinique donne un diagramme typique présentant trois bandes étroites rapprochées disposées d'une manière anodique à partir de l'origine. Ge diagramme peut être reproduit d'une manière aisée et sûre et il représente une zone caractéristique d' "empreintes fonctionnelles" 40 pour la nouvelle protéine. La technique d'agarose en mince gel 69 14931 2008361 est une modification des travaux décrits par R.E. Phillips et F.R. Elevitch, "Progress in Clinical Pathology", 1966, pages 62-153* La technique au polyacrylamide est basée sur les travaux de Ornstein et Davis, "Ann. N.X* Acad* Sci.n, 121, 321 et 404 5 (1964) et par Williams et Reisfield, "Nature", 195. 2Ô1 (1962). L'orgotéine isolée du sang de boeuf semblé être virtuellement, sinon complètement identique à l'orgotéine isolée du foie de boeuf. Son poids moléculaire semble être le même et il a la même teneur en métal. Il exerce la même activité dans le 10 test d'agglutination du facteur rhumatoïde et il exerce la même activité anti-inflammatoire au biotitrage d'Ungar. Il a été surprenant de découvrir que l'orgotéine pouvait être isolée du sang en un état pratiquement exempt d'enzymes, puisqu'aussi bien le sang est une réserve d'enzymes, au moins 15 62 enzymes ayant été trouvés dans les globules rouges humains. Toutefois, leur présence avec la .chromoprotéine qu'est l'hémoglobine, les phospholipides et le cholestérol, ainsi que les ions inorganiques ne pose aucune difficulté particulière de purification lorsqu'on suit le procédé décrit. j 20 Un objet de la présents invention est de prévoir un nouveau procédé d'isolatiori d'orgotéine avec un rendement global supérieur à celui pouvant être obtenu jusqu'à présent. Un autre objet est de prévoir un procédé plus simple, moins long et moins coûteux. L'homme de métier reconnaîtra d'autres objets de la 25 présente invention. Suivant la présente invention, on obtient l'orgotéine en un état exempt d'enzymes .à partir d'érythrocytes exempts de plasma hémolysé, en séparant l'hémoglobine de lliâaolysat, en chauffant l'hémolysat exempt d'hémoglobine en présence d'un tam-30 pon et d'un ion de métal bivalent, de préférence un ion de métal bivalent ayant un rayon atomique de 0,69 à 0,00 £, jusqu'à ce que l'anhydrase carbonique soit rendue inactive, après quoi on sépare l'orgotéine de la solution obtenue. Par ce procédé, on obtient des rendements globaux en orgotéine comparables à ceux obtenus à par-35 tir de foie de boeuf avec cette matière première plus économique, moyennant des techniques plus simples, moins longues et moins coûteuses. L'orgotéine, qui est une protéine, est labile à la chaleur. C'est pourquoi, à l'exception de l'étape de chauffage 69 14931 7. 2008361 décrite ci-après, toutes les étapes d'isolation sont effectuées, de préférence, en dessous de la température ambiante, mieux encore en dessous de 5eC. On sait que l'orgotéine est beaucoup plus stable en présence d'une solution tampon contenant des ions de mé-5 taux bivalents, en particulier ceux ayant un rayon atomique de O 0,69 à 0,00 A. C'est pourquoi, après avoir libéré l'orgotéine des globules rouges par hémolyse, toutes les étapes suivantes, à l'exception de l'isolation de l'orgotéine à l'état sec, sont effectuées, de préférence, en présence de ce tampon (voir Brevet 10 français 1.516.026 du 7 octobre 1966). On emploie des érythrocytes, c'est-à-dire des globules rouges, provenant, de préférence, des mammifères. Les globules rouges de boeuf sont particulièrement préférés, étant donné que le sang de boeuf est peu coûteux, qu'il peut être obtenu aisément 15 dans les abattoirs et qu'il constitue une source riche en orgo-téine. Le sang de boeuf frais ou le sang stabilisé, par exemple avec de l'acide tétraacétique d'éthylène-diaminé, peu après l'abattage, est préféré, étant donné que le rendement en orgotéine pouvant être isolée du sang diminue au fur et à mesure que le sang 20 vieillit à l'état non congelé et/ou non préservé. Des congénères d'orgotéine peuvent être obtenus à partir de globules rouges d'espèces de mammifères et d'animaux autres que les bovidés, par exemple les chevaux, les chèvres, les moutons, etc. Il semble que certains congénères puissent être plus 25 efficaces que d'autres en tant que produits pharmacologiques. On sait que l'orgotéine obtenue à partir de sang de bovidés est très active et c'est la raison pour laquelle également les globules rouges de bovidés constituent la matière première préférée. Isolation des globules rouges. 30 Les globules rouges qui, en moyenne, constituent 35 à 45fo en volume et environ 39-50% en poids du sang complet, sont séparés du plasma sanguin par centrifugation, encore que la gravité seule puisse suffire. En lavant les globules séparés et en les soumettant à une nouvelle centrifugation, on élimine le plaana 35 résiduel adhérant aux globules qui sont devenus compacts. On peut employer de l'eau, du sérum physiologique ou un tampon, ce dernier étant préféré pour éviter le risque d'hémolyse prématurée. Hémolyse. L'hémoglobine, qui est une chromoprotéine, est libérée 4C des globules rouges exempts de plasma par hémolyse. On peut uti bad original 69 14931 2Ô08361 liser des procédés classiques (voir M. Moskowitz et M. Calvin, s,Exp. Cell Res.!l, 33 (1952); S.S. Bernstein et al., "J. Biol. Chem.122, 50? (193^)» Une simple hémolyse avec de l'eau déminéralisée à 0-5°C est préférée. Des détergents et/ou des agents 5 tensio-actifs peuvent éventuellement être présents dans l'eau. S'ils sont présents dans l'eau, le tampon et d'autres ions doivent l'être en faibles concentrations, afin de ne pas gêner l'hémolyse; par exemple, il peut y avoir un ou plusieurs des ions | | i » Mg à une concentration d'environ 10"^ M, Cu à une concentra-10 tion d'environ 10~^ M et Zn++ à.une concentration d'environ 10""'' M, seuls ou en mélange avec un tampon de tris- ou de borate à une _o concentration inférieure à 5 x 10 J M. Elimination de l'hémoglobine. Dans la technique, on connaît de nombreux procédés en 15 vue d'éliminer l'hémoglobine libérée des globules rouges par hémolyse (voir E.R. Waygood, "Methods in Enzymology", volume 2, Ô36 (1955), Âcademic Press). Certains des procédés connus à cet effet, par exemple la filtration à travers de la diéthyl-amino-cellulose, exercent un effet néfaste sur l'orgotéine. C'est pour-20 quoi, la précipitation par solvant est préférée. Toutefois, on peut également employer des solutions aqueuses de sulfate d'ammonium et d'autres sels inorganiques. L'hémoglobine ne précipite pas convenablement de l'hémolysat. Toutefois, les solvants organiques non miscibles à 25 l'eau ayant des densités supérieures à celle de l'eau, de préférence les solvants aliphatiques halogénés, par exemple le chlorure de méthylène, le chlorure d'éthylène, le chloroforme et le tétrachlorure de carbone, facilitent sa précipitation, apparemment par la formation d'un complexe avec l'hémoglobine. Afin de 30 former efficacement ce complexe, le solvant organique doit être en contact intime avec l'hémoglobine. Etant donné que le solvant organique utilisé est non miscible à l'eau, on utilise habituellement un solvant organique miscible à l'eau avec le solvant non miscible pour mettre une faible proportion du solvant non misci-35 ble en phase aqueuse. A cet effet, on peut employer des alcanols inférieurs, par exemple le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l?i-propanol, le t-butanol, ainsi que d'autres solvants miscibles à l'eau, par exemple le dioxanne, le tétrahydrofurane, l'acétone, la méthyl-ëthyl-cétone, etc. bad original 69 14931 9" 2008361 Il importe que 1*élimination de 1*hémoglobine soit complète. C'est pourquoi, le traitement avec un solvant de précipitation doit être poursuivi jusqu'à ce que le liquide surnageant ne présente plus la coloration de lfhémoglobine. 5 Afin d'augmenter le rendaient en orgotéine isolée, il est souhaitable de soumettre l'hémoglobine précipitée à un ou plusieurs lavages supplémentaires. Par exemple, à partir de 425 ml de globules rouges, 640 mg d'une fraction de protéine contenant de l*ormétéine étaient présents dans le liquide surnageant séparé 10 de 1*hémoglobine précipitée. En lavant une fois l'hémoglobine séparée avec de l'eau déminéralisée, on a éliminé 325 mg supplémentaires occlus dans 1*hémoglobine précipitée. La précipitation à des températures inférieures est préférée pour éviter la dénaturation de l'ormétéine. C'est pour-15 quoi, cette étape est effectuée, de préférence, en dessous de 5°C, mieux encore en dessous de 0°C et, avantageusement, à environ -10*0. A ce stade, il est parfois souhaitable de soumettre le produit surnageant à une dialyse et une lyophilisation afin de 20 vérifier la teneur et/ou la pureté de l'orgotéine, ou également d'accumuler des lots avant de procéder à une purification complémentaire. A cet effet, on peut adopter des procédés classiques. Le produit de lyophilisation est très stable mais, pour la conservation, il est souhaitable de procéder à une réfrigération, de 25 préférence en dessous de 5°C. Destruction des enzymes. Bien que le sang complet de départ contienne une large variété d'enzymes, les enzymes restants sont constitués principalement d,anhydrase carbonique. Cet enzyme et les autres enzymes 30 présents en quantités beaucoup plus faibles sont éliminés par dénaturation thermique. En ce qui concerne la sensibilité de ltanhydrase carbonique à la chaleur, on se référera à R.P. Davis, "The Enzymes",'volume 5, 545 (1961), Académie Press, New York City. L'anhydrase carbonique est rendue complètement inactive 35 en chauffant le produit surnageant exempt d'hémoglobine. Lorsque l'anhydrase carbonique est rendue complètement inactive, tous les autres enzymes labiles à la chaleur du produit surnageant sont également rendus inactifs. Un chauffage à 60° pendant plus de 10 minutes est habituellement nécessaire pour rendre inactifs toute £ad original 14931 10. 2008361 l'anhydrase carbonique et les autres enzymes. A 65°, une durée de 10 à 15 minutes est suffisante. Un chauffage pendant 20 minutes ou même davantage n'altère pas sensiblement le rendement final en orgotéine pure. Toutefois, un chauffage à 70°C pendant une heure 5 détruit au moins la moitié de l'orgotéine. Si'l'on effectue le chauffage pendant 10 à 20 minutes à 65°C, l'orgotéine nfest pratiquement pas altérée par ce traitement si elle est protégée par une solution tampon contenant des ions de métaux bivalents ayant un rayon atomique de 0,69 à 0,00 X. Par exemple, une solution 10 tampon dforgotéine ne devient pas trouble (la formation d'un trouble étant l'indice d'une destruction par dénaturation) lorsqu'elle est chauffée pendant 20 minutes à 65°0. A ê0°G, la formation d'un trouble commence dans les dix minutés et dans'les deux minutes, à 100°C. A 37°C» il faut plusieurs heures avant que la formation 15 d'un trouble'ne commence. Après avoir rendu toute l'anhydrase carbonique inactive par chauffage, on refroidit immédiatement le mélange bien en dessous de la température ambiante. Les protéines précipitées sont éliminées par filtration ou centrifugation* Le produit sur-20 nageant, subsistant après élimination des protéines précipitées, contient l'orgotéine comme protéine-prédominante. On peut en isoler l'orgotéine par dialyse pour éliminer les ions tampons et les ions métalliques éventuellement non chélatés, après quoi on soumet la solution protéinique à une lyophilisation pour obtenir me 25 poudre d*orgotéine 2*pure» Après avoir éliminé le précipité formé lors de l'étape de chauffage, l'orgotéine contenue dans la solution formée ou. isolée de celle-ci par dialyse et lyophilisation peut être purifiée très aisément par filtration au moyen d'une résine à lit mixte, 30 électrophorèse et/ou filtration par gel à travers un polymère agissant à la manière d'un tamis moléculaire^ ^r c^x^^Le|^gime décrit dans le Brevet Français N° 1.516.026/ L'impureté organique principale a un poids moléculairè sensiblement inférieur à celui de l'orgotéine et son élimination peut être effectuée simplement 35 et rapidement par filtration au moyen d'un gel. •Ces exemples suivants illustrent le procédé de la présente invention. Exemple 1 - Isolation d'orgotéine de sang de boeuf. On a centrifugé du sang de boeuf frais à 2.600 x G pen-40 dant 10 minutes à 0°C et on a laissé décanter le plasma. On a 69 14931" u- 2008361 ensuite lavé deux fois les globules rouges avec 2 à 3 volumes d'une solution de sérum physiologique à 0,9 %. On a hémolyse les globules rouges lavés en les mélangeant avec 1,1 volume d'eau froide déminéralisée contenant 0,02 $ dfun détergent (saponine). 5 Après une durée minimum de 30 minutes à 4°C, tout en agitant, on a ajouté lentement 0,25 volume (par volume d'hémolysat) d'alcool éthylique à -15°C, puis 0,31 volume (par volume d'hémolysat) de chloroforme, également à -15°C. On a poursuivi l'agitation pendant environ 15 minutes à -5°C ou moins et, à ce moment, le mélange 10 était une pâte épaisse.'On a effectué la précipitation de l'hémoglobine dans un bain froid maintenu en dessous de -1Q°C. Après avoir laissé reposer la pâte pendant 15 minutes supplémentaires à 4°C, on a ajouté 0,2 volume d'une solution froide de NaCl 0,15 M pour obtenir une suspension que l'on a pu verser aisément. On a' 15 éliminé le précipité et l'excès de chloroforme par centrifugation à 20.000 x G à environ -10°G pendant 10 minutes. On a filtré le liquide surnageant et on l'a soumis à une dialyse avec de l'eau froide déminéralisée. La solution dialysée a ensuite été soumise à une lyophilisation. 20 On a à nouveau extrait le précipité d'alcool et de chloroforme avec une quantité minimum d'eau déminéralisée en mélangeant le précipité et de l'eau dans un mélangeur et en procédant à une centrifugation. Il faut habituellement un volume d'eau égal à celui des globules rouges du sang de départ. La solution 25 de réextraction a été soumise à une dialyse et . une lyophilisation. La réextraction de l'hémoglobine précipitée a donné 40 -50-# de mélange protéinique présent dans le liquide surnageant initial. Une réextraction supplémentaire donne un supplément de 10 - 15 fo. 30 La matière lyophilisée a été redissoute dans un tampon de triglycine 0,025 M contenant du Mn"*"* 0,001 M à un pH de 7,5 (habituellement à une concentration de 20 mg/ml). On a chauffé la solution à Ô5°G pendant 15 minutes. Par cette étape, on a éliminé, de la solution, toute l'anhydrase carbonique et les autres enzy-35 mes labiles à la chaleur. Après chauffage, on a immédiatement refroidi la solution dans un bain de glace à 5°C. On a ensuite soumis la solution à une centrifugation à 20.000 x G à 0°C pendant 10 minutes pour éliminer le précipité. On a soumis le liquide surnageant à une dialyse avec de l''eau déminéralisée pour éli-40 miner 1-^ tampon et les icns métalliques en excès, puis on l'a {3ad original 69 14931 l£' 2008361 lyophilisé. Le solide obtenu était constitué principalement d'orgotéine. Filtration par gel. On ajoute lentement du "Sephadex G-75" à de l'eau 5 chaude déminéralisée (environ 60°C) tout en agitant continuellement. Ensuite, on place le bêcher contenant le mélange dans un bain-marie à 60°G pendant 5 heures et 45 minutes, puis on le retire et le laisse reposer pendant une heure à la température ambiante. Par aspiration, on décante le liquide surnageant et les 10 fins produits. On ajoute le tampon au "gel gonflé de "Sephadex" à raison de 4 à 5 fois son volume. On agite le gel de "Sephadex", on le laisse décanter puis, par aspiration, on élimine les fins • produits et le liquide surnageant. On ajoute à nouveau un tampon frais au gel gonflé et l'on répète quatre fois, le procédé 15 ci-dessus. On refroidit la suspension finale à 4°C puis, avant l'utilisation, on en élimine l,air sous pression'réduite. On utilise une colonne de recyclage constituée de polyméthacrylate. Cette colonne a 1050 mm de long et un diamètre intérieur de 32 mm. Lorsqu,on remplit la colonne au moyen de tam-20 pon dont on a éliminé les gaz, il convient de prendre des précautions spéciales pour qu'aucune bulle d'air ne soit enfermée près du filtre et sur les côtés de la colonne. La colonne chargée de tampon est ensuite déplacée dans une chambre froide et elle est fixée dans une position verticale à lfaide d'un niveau de char-25 pentier. Après avoir établi 1*équilibre dans la chambre froide, on verse la bouillie de gel dans un entonnoir adapté au sommet de la colonne, tout en agitant- mécaniquement et continuellement. Lorsqu'il s'est formé une couche de "Sephadex" de quelques centimètres d'épaisseur au fond de la colonne, on ouvre la sortie pré-30 vue au fond de cette dernière pour permettre un écoulement régulier. Au cours du garnissage, une surface horizontale de gel montant dans le tube indique l'uniformité appropriée du garnissage. Après décantation d'environ 95 cm de gel, on élimine le tampon et le gel en excès. Lorsque la surface supérieure du gel a complètement 35 décanté, on ferme le sommet de la colonne au moyen d'un plongeur muni d'un disque filtrant. On fait ensuite circuler le tampon à travers la colonne pendant deux jours afin de stabiliser le lit. On maintient le débit à 10 ml par heure. Volume final du lit, 7 r2h = (3,14) (1,6 cm)2 (96,5 cm) = 775,7 cm3. 8ad original 69 14931 2008361 Dans le tampon (20 mg/ml), on dissout le produit de lyophilisation provenant de l'étape de chauffage. Les produits insolubles éventuellement présents sont éliminés par centrifugation. On charge la solution limpide dans la colonne en utilisant 5 une soupape sélectrice LKB (modèle N° 49HB). Toutes les opérations en colonne sont effectuées à 4°C. Le tampon utilisé est du tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, 0,15 M dàns SGI et 0j005 M dans la glycine, contenant 10"^ M Mg"*-1", 1G~4 Cu** et 10"5 Zn*** 10 La solution de protéine est chargée par la fond. Le courant ascendant de tampon est maintenu à 10 ml par heure. On détermine la teneur en protéine des fractions par la capacité d'absorption à 2Ô0 m yu. On détermine le volume d'élution pour chaque protéine 15 à la fois par voie voiumétrique et gravimétrique. La première crête sortant de la colonne est l^orgotéine. Gelle-ci sort généralement dans l'intervalle de 300 à 400 ml de l'éluat total. On combine ces fractions en vue d'un traitement complémentaire. Après la crête principale bien définie, suit une 20 saillie que l'on suppose être un congénère de ibrgotéine et qui ne doit pas être séparé. Toutefois, on peut le séparer en recueillant séparément les fractions d'éluat lorsque leur teneur en protéine diminue précipitamment par rapport à la concentration maximum. Une impureté protéinique d'un plus faible poids moléculaire 25 sort sensiblement plus tard de la colonne, lors de l'élution complémentaire. On l'élimine également pour libérer la colonne en vue d'une opération ultérieure. Elimination du tampon et des ions métalliques en excès. La solution d'orgotéine obtenue par filtration au moyen 30 d'un gel est filtrée à travers une colonne d'une résine échangeuse d'ions du type à lit mixte de résine "Amberlite MB-1" et à un lit de gel (Rohm & Haas), c'est-à-dire un copolymère mixte de : styrène et de divinyl-benzène contenant des groupes fortement acides rL -t. | (-S0^~H ) et des groupes fortement basiques (—N'(CH^)*GH20H0H ), 35 ce copolymère réduisant le tampon, ainsi que les concentrations en > t | | t | ions Mg , Gu et Zn non liés à moins de 10"' M. A titre de variante, cette élimination peut être effectuée par dialyse. On remplit, à moitié, une colonne de 36,$ x 1143 nim avec de l'eau déminéralisée dont on a éliminé toutes les bulles bad original 69 14931 U' 20QÔ361 d'air. Dans la colonne, on verse doucement une bouillie de la résine dans de lTeau déminéralisée exempte d*air et on laisse décanter. Ensuite, on lave plusieurs fois la colonne avec de l'eau déminéralisée, lTeffluent étant à un pH (environ 7,0) et 5 une concentration ionique (conductance : environ 1,0 mho) constants. La hauteur finale du lit est de &3&,2 ce qui donne un volume de lit de 957- ml et une capacité totale d'échange de 440 milliéquivalents, calculés sur un facteur de 0,46 donné par le fabricant de cette résine» 10 On concentre éventuellement "l'éluat provenant de l'étape de filtration par gel à une teneur en protéine de ê-10 On charge prudemment cette solution par le sommet de la colonne de résine échangeuse d'ions, puis on la développe avec de l'eau déminéralisée. On règle le débit à environ 20 ml par minute et 15 on suit l'apparition de là protéine dans l'éluat par absorption des rayons ultraviolets (A0£q). On recueille l'éluat en fractions de 25 à 50 ml. La protéine désirée apparaît généralement dans les l l fractions 4 à 12. La concentration en tampon-Me tombe bien «n -7 dessous de 10 ' M, comme l'indiqué line perte de conductivité de 20 4*000 à 5»000 mho avant la filtration en colonne à 1,5 - 2,5 mho après filtration. Pour la préparation dfune solution protéinique stérile pour injection, on ajoute, à la solution obtenue, du fructose, du sucrose ou tin autre saccharide en une concentration d'au moins 25 2 parties par partie de protéine. Ensuite, on stérilise la solution par ultra-filtration et on la filtre, dans des conditions stériles,, dans des ampoules .ou des fioles préalablement stérili*-sées. Le produit obtenu peut être ensuite lyophilisé pour donner un produit plus stable. 30 Une ou plusieurs des variations ci-après peuvent être apportées aux conditions employées à l'exemple 1 en obtenant pratiquement les mânes résultats î (a) la lyophilisation avant l'étape de chauffage peut être éliminée: 35 (b) la matière dialysée avant l'étape de chauffage peut être chauffée dans une solution tampon, par exemple un tampon de triglycine 0,025 M, pH : 7,0, contenant 10"^ M Mg"1"1", 10-4 M Cu4"4" et 10~5 M Zn44". bad original 69 14931 15' 2008361 10 15 (c) la filtration par gel peut être effectuée dans la solution tampon de (b) ci-dessus ou dans un autre tampon à un pH de 7,ô, par exemple un borate; (d) l'impureté à bas poids moléculaire peut être éliminée en filtrant le produit surnageant à travers un milieu filtrant nfayant aucune capacité d'absorption pour des composés ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000 et (e) on peut utiliser une solution de sulfate drammonium (1$) pour libérer l'hémolysat d'hémoglobine. (f) en suivant le procédé de l'exemple 1, on isole l'orgotéine et ses congénères des globules rouges du sang des lapins, des poulets, des êtres humains et des autres animaux ci-après dans les rendements suivants : Rendement1»2 1% Réextraction du Espèces a précipité d'éthanol- .200 p chloroforme 20 25 30 35 Jeune boeuf 0,005 2,1 1 0,23 Deux fois Veau 0,0053 2,1 Néant Cheval, pur-sang 0,0067 2,1 Une fois Mouton 0,0020 3,1 Néant Rat OjOOÔÔ4 2,g Néant Cobaye 0,0034 3,5 Néant Basé sur le poids du sang complet; la teneur en globules rouges diffère avec l'espèce et l'âge. 2 Après filtration à travers du "Sephadex G-75"» -"^Moyenne de cinq préparations. 4Avant purification complète. Exemple 2 - Isolation d'orgotéine de sang de boeuf. Pendant 20 minutes, on a centrifugé, à 4-000 x G à 0°C, 1050 g de sang bovin obtenu dans les abattoirs locaux et préservé dans une solution d' "Alsevers" ou avec de l'acide tétraacétique d'éthylène-diamine, afin de séparer le plasma des globules rouget. On a éliminé le plasma. On a préparé la solution d'Alsevers en dissolvant 24,6 g de glucose, 9,6 g de citrate de scdiurr, à deux dans 12uC ml :lécules d ' : = u et 5*04 0 de chlcru.- d'eau froide distillée, en réglant le pH à 6,1 avec de l'acide citrique, puis en stérilisant par filtration au "Millipore". On a lavé trois fois les globules rouges séparés en les mélangeant pad original 69 14931 2008361 avec un à deux volumes de solution froide de chlorure de sodium à 0,9 fo et en centrifugeant à 4» 000 x G à 0°C pendant 20 minutes. On a hémolysé un volume de globules rouges lavés par mélange avec 1*1 volume dfeau froide déminéralisée. On a laissé 5 reposer le mélange à 4°C pendant une heure. Tout en agitant, on a ajouté lentement 0,25 volume (par volume d'hémolysat) d'alcool à -15°C, puis on a ajouté 0,31 volume (par volume d'hémolysat) de chloroforme à -15°C pour précipiter l'hémoglobine. On a poursuivi l'agitation pendant environ 10 15 minutes à -15aC et, à ce moment, le mélange était une pâte épaisse. On a laissé reposer le mélange à 4°C pendant 15 minutes. On a ajouté 0,2 volume d'eau froide déminérâlisée pour obtenir une suspension que l'on a pu verser aisément.- Par centrifugation à 20.000 x G à 0°C pendant 20 minutes, on a éliminé le précipité 15 et le chloroformé en excès. On a filtré le liquide surnageant à travers un filtre époxy "Versapor." (0,9), pour obtenir un filtrat clair. On a réextrait le précipité par mélange avec de l'eau froide déminéralisée dans un mélangeur "Qsterizer". On a utilisé 20 au moins 0,5 volume (par volume d'hémolysat de départ) d'eau froide déminéralisée, pour obtenir une suspension pouvant être versée aisément. On ^'centrifugé la suspension à 20.000 x G à 0°G pendant 20 minutes. On a filtré le liquide surnageant à travers du "Versapor". On a combiné le filtrat clair avec la fraction 25 principale (réextraction I). On a à nouveau réextrait et centrifugé le précipité comme décrit ci-dessus et on l'a filtré à travers du "Versapor". le filtrat clair s'est combiné avec la fraction principale (réextraction II). On a lyophilisé les filtrats combinés sans dialyse. Le 30 rendement à ce stade était de 2,1 g (0,2 %, calculé sur le sang complet). On a redissous la matière lyophilisée dans de la tri- O -j j glycine 0,025 M, 10 M Mn , tampon,îpH : 7>5, à une concentration d'environ 20 mg/ml. On a chauffé la solution à 65°C au bain-marie pendant 15 minutes tout en agitant de temps à autre. Le 35 précipité provenant du chauffage a été élimir.é par filtralirr. à trav°r: "Versapor". On a dialysé le filtrat clair v l'eau déminéralisée, on l'a filtré à travers du "Versapor" et on l'a lyophilisé. Le rendement à ce stade était de 300 mg (0,029 calcul' .r 2e .rang complet). Il é+v;.t constitué principalement bad original 69 14931 2008361 d1orgotéine. On a redissous le produit lyophilisé à une concentration dfenviron 50 mg/ml dans un tampon 0,03 M tris, 5 x 10""^ M glycine contenant 10"^ M Mg"*"*", 10~*4 M Cu4-1", 10"^ M Zn4-1", pH :7,1« On a chargé l'échantillon dans une colonne de "Sephadex G-75" de 5 3,2 cm x 95 cm, équilibrée avec le même tampon. Le débit était de 10 ml par heure et lTon a recueilli des fractions chaque fois après 100 gouttes (environ 3,2 ml). On a divisé l'éluat en fractions A (tubes 01-100), B (tubes 101-107), C (tubes 10Ô-122), D (tubes 123-135), E (tubes 10 136-150), F (tubes 159-lSO) et G (tubes 101-235). La fraction C contenait l'orgotéine. La coupe pour la fraction G a été prise très nettement afin que tout le produit récupéré de la fraction G soit bien de l'orgotéine pure. Les fractions B et D, qui contenaient moins d'orgotéine pure, ont été rassemblées pour être re-15 traitées. Les fractions ont été dialysées chacune avec de l'eau déminéralisée, filtrées à travers du "Millipore1* et lyophilisées. La quantité de matière dé chaque fraction et leur capacité d'absorption maximum des rayons ultraviolets à 2&0 m ^1 sont reprises ci-après : 20 Fraction Rendement Max A2Ô0 A 2,0 mg 0,175 B 1,0 mg 0,1 C 55,0 mg 0,35 25 D 5,0 mg 0,11 E Traces 0,075 F Traces 0,19 G 7,0 mg " 0,495 Le rendement global en orgotéine, y compris les 3 .mg récupérés 30 des fractions B et D, était de 5# mg (0,005# fo, calculé sur le sang complet). Exemple 3. On a suivi le procédé de l'exemple 2, avec cette exception que l'hémoglobine a été éliminée de l'hémolysat en 35 réglant le pH de ce dernier à 6,0 - 7,0 par addition de (NH^^SO^ solide à 25°C, jusqu'à ce que la solution ait line saturation de 47-50$, puis en centrifugeant à S.000 tours/minute pendant 20-30 minutes. 69 14931 18. 2008361 liTillIClIIOIS . 1. Procédé d'isolation d'orgotéine sous forme pratiquement pure à partir d'érythrocytes,caractérisé en ce qu'il consiste à : 5 (a) séparer toute l'hémoglobine des érythrocytes exempts de plasma hémolysé; (d) chauffer l?hémolysat exempt d'hémoglobine dans une solution tampon contenant dss ions de métaux bivalents jusqu'à ce que l'anhydrase carbonique soit rendue inactive; 30 (c) interrompre le chauffage et éliminer le précipité, puis (d) séparér l'orgotéine du liquide surnageant. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les érythrocytes sont des érythrocytes de bovidés» 15 3» Procédé suivant la r©v^S.cation 1, caractérisé en ce que le tampon contient dss ions de métaux bivalents ayant un S A. ° rayon atomique de Q,o9 a 0,80 À» ' 4. Procédé suivant la revendication 3» caractérisé en | | ce que les ions de métaux bivalents sont un mélange d'ions Mg , 20 Cu*"*" et Zn++. 5. Procédé suivant la revendication 4» caractérisé en ce que les érythrocytes sont des érythrocytes de bovidés. bad original