Brevet FR2010640A1 — publié le 19700220

i 2010640 L'invention concerne ion complexe antibiotique et son procédé de préparation. Plus particulièrement, on décrit le nouveau complexe antibiotique axénomycine, aussi appelé F0I„ 2604, qui est constituée par 11axénomycine A aussi appelée F„I. 2604A 5 et l1axénomycine B aussi appelée F.I. 2604b, ainsi que leurs sels, et leur procédé de préparation par culture du Streptomyces lisandri n„sp.. Les nouvelles substances antibiotiques axénomycine A et axénomycine B présentent une grande activité pharmaco-logique et sont particulièrement utiles comme antihelminthiques, 10 antiprotozoaires et antifongiques. La nouvelle souche Streptomyces lisandri n„sp., aussi appelée Streptomyces F.I. 2604 (numéro de la collection de souches de la demanderesse) qui produit le nouveau complexe antibiotique, a été isolé d'un échantillon de sel prélevé à Lisandro 15 Olmos (Argentine). Elle est déposée à l'Institut de Pathologie Végétale de l'Université de Milan sous le n° I.P.V. 1951.» à l'Université de Rutgers (Etats-Unis) sous le n° I.M.R.U. 3935 et au Commonwealth Msycological Institute, Ferry Lane, Kew (Surrey) Angleterre, sous le n° I.N.I. 137 178. Elle présente les 20 caractéristiques suivantes : Propriétés microscopiques Sur les milieux de culture usuels, le mycélium végétatif estformé d'hyphes plus ou moins minces, de 0,5 "à 0,9 p-d'épaisseur, longs et abondamment ramifiés qui forment des 25 conidiophores longs et droits de 1,1 à 1,3 y- d'épaisseur. De ceux-ci partent, par ramification monopodiale,des hypes qui produisent des spores et qui sont de longueur normale et spiralés de façon serrée dans leur portion distale. Ces hyphes peuvent être insérés de façon opposée ou 30 alternée sur des conidiophores et à la maturation, ils se changent en chaînes de spores ou conidies. Ces dernières ont une surface lisse et une forme ovale et mesurent 0,9 à 1,2 y- sur 1 à 1,4 y- . Propriétés macroscopiques 35 Au tableau 1, on indique les propriétés culturales - obtenues sur différents milieux lorsqu'on cultive le microorganisme à 28*C, les obeervations étant faites les 3ème, 8ème, 15ème, 20ème et 30ème jour après inoculation. Le microorganisme présente essentiellement une croissance rapide et abondante avec 40 formation d'un mycélium végétatif compact, consistant, en patine 69 18667 2 2010640 lisse sur les milieux synthétiques et légèrement plissées sur les milieux organiques„ Sur les premiers, le mycélium végétatif est incolore, tandis que son envers peut prendre des tonalités de couleur variable selon le milieu de culture, autrement dit 5 du jaune paille au jaune foncé, jusqu'au marron ou au gris avec des nuances violettes, rose vineux, vert foncé0 Sur les milieux organiques, le mycélium végétatif a une couleur miel et son envers est moins variable et présente une couleur jaune citron ou jaune ocre qui, au vieillissement, vire au marron plus ou 10 moins clair . Le mycélium aérien est abondant sur les milieux synthétiques et. il est plutôt rare sur les milieux organiques. Sur les premiers, la couleur prédominante est le blanc qui peut prendre sur certains milieux des tonalités rose vineux ou ivoire-beige, ou encore brun-gris clair. Sur les milieux orga-15 niques, il est blanc pur ou blanc sale, parfois avec des nuances brun-gris clair. L'aspect est cotonneaux à poudreux selon le milieu de culture» o- vO Milieu Agar-agar Bennett (1) Agar-agar Czapeck (1) Agar-agar asparagine glucose (1) Agar-agar glycérol glycine (l) Agar-agar Emerson (1) Agar-agar amidon et sels (2) Agar-agar pomme de terre (4) Agar-agar avoine (3) TABLEAU 1 - Propriétés oulturales du Streptomyces lisandri Croissance Mycélium aérien Mty-oélium végétatif Pigement soluble abondante, en patine légèrement plissée rare 00 o o abondante, en patine lisse discrète, en patine lisse abondante, en patine légèrement plissée discrète, en patine lisse abondant, en patine légèrement plissée très rare et lente, en patine lisse abondant, légèrement cotonneaux, blano avec nuances beige-rosé abondant, plutôt cotonneux, blano discret, plutôt ras, blanchâtre avec nuances roses très abondant ; cotonneux, blano avec des tonalités belges rarë, blanchâtre, ras très abondant, ras, brun-gris clair disçrêt, plutôt ras, blanchâtre avec tona. lités beige brunâtre abondant, ras, blanc à brun-gris clair miel, l'envers a une couleur ocre clair à brun clair incolore, l'envers est d'abord jaune paille, puis présente des tonalités gris-violet plus ou moins foncées incolore ; l'envers est d'abord jaune citron, puis rose vineux incolore ; l'envers est jaune paille à ocre brun miel i envers ocre foncé couleur thé clair violet clair avec nuances brunâtres vineux clair Absent Couleur thé clair w incolore } l'envers pas- jaune clair se du jaune clair au brun, puis au gris jaune paille à citron ; l'envers prend ensuite une couleur marron incolore ; l'envers est d'abord jaune citron, puis brun clair couleur thé absent K> O O O O o- xO (suite) Milieu Agar-agar rçlrToérol aspareaginQ (1) ,^.^-igar -ax'tamifcs de levure glucose TABLEAU 1 - Propriétés oulturales du Stroptorayces lisandri OO Croissance Mycélium aérien Mycélium végétatif Pigeant solu- O Agar-agar peatone amidon (1) Agar-agar. •oenborxe EKQ-* (1) ■' ^ rare, en patine lisse abondante, en patine légèrement plissée abondant, en patine lisse discrète, en patine lisse très abondant, ras, jaune paille ; l'envers blanc avec des tona- passe de l'ocre orangé lités beiges au brun abondant, plutôt ras, blanc abondant, plutôt ras, blanc jaune paille ; l'envers est ocre clair miel à jeune citron j l'envers est ocre brun avec tonalités roses abondant, légèrement incolore, envers jaune cotonneux, blanc paille jaune-brun clair absent thé clair absent (1) Tr'akom&n SeA0 i "The Actinomycetes", volume II, The William and Wilkins Co.1961, pages 328-33^» (2j Pridnam.TeC0, Anderson P., Foley C„ Lidenfelser L.A0, Hesseltine GoM. et Benediot R„B. : "Antibiotics Annuel", 1956-1957, pages 947-953. (3) Baldaeoi E., Giollitti G., Ktlster E, et Scotti T. : Journal of Microbiology, page 39 (1961)/ (4) Grein Ae, Spalla C. et Cotta'E. : Journal of Microbiology, 13; 299 (1965) O ^4 NO O CD 69 18667 5 2010640 Propriétés biochimiques gélatine protéolyse totale nitrate ne sont pas réduits en nitrites * amidon hydrolyse totale 5 lait n'est pas coagulé, mais complètement peptonisé pigments mélanoïdes aucune production tyrosine " décomposée . . HgS aucune production 10 Sur milieu d'agar-agar, le microorganisme produit vin pigment soluble qui est rose vineux clair ou jaune brun clair sur les milieux synthétiques, tandis que sur les milieux organiques il est de couleur thé clair. Le microorganisme utilise pour sa croissance les sources 15 de carbone suivantes : glucose, 1-arabinose, saccharose, d-xylose, méso-inositol, d-mannitol, d-fructose, maltose et raffinose. Il n'utilise pas le rhamnose. Le microorganisme ne se développe pas à 50°C et ne forme pas de sclérotes. En culture immergée dans un liquide agité, il 20 produit les antibiotiques qui forment le complexe axénoirçycine. Identification du microorganisme Les propriétés présentées par le microorganisme à l'examen et décrites ci-dessus le rangent dans le genre Streptomyces, Waksman et Henrici (Bergey's Manual of Determinative 25 Bacteriology, 7ème édition, 1957, pages 744-745). La souche appartient à la Section "Spira", série "blanc"'de Pridham et al., (Appl. Microbiol. 6, 1958, page 52), à la section II, série "Albidoflavus" de Baldacci (Journ. Microbiol. 6, 1958, page 10), à la série "Albus" de Waksman (The Actinomycetes, volume II, page 30 117, 1961), et au groupe de streptomycetes présentant le mycélium aérien "niveus" de Htîtter (Systematik der Streptomyceten, Bibl. Microbiol. Faso. 6, S. Karger, Bâle 1967, P* 256). La comparaison entre les propriétés du microorganisme à l'examen et celles des espèces appartenant aux groupe systé-35 matiques subgénériques (Taxa) cités montre qu'aucune de celles-ci ne présente toutes les propriétés correspondant à celles du microorganisme à l'examen. Pour les raisons ci-dessus et étant donné que le microorganisme produit, spécialement sur des milieux synthétiques, un 40 pigment soluble variable du rose au rougeâtre, au violet vineux, 69 18667 6 2010640 au jaune citron, qu'on ne trouve dans la description d'aucune des espèces de microorganismes appartenant aux taxa subgénériques cités, et étant donné qu'il produit le nouveau complexe antibiotique axénomycine, on le considère comme une espèce 5 nouvelle et on l'a dénommé Streptomyces lisandri n.sp.. Le microorganisme Streptomyces lisandri n.sp. peut être conservé par des transferts successifs sur mileiu solide et par lyophilisation d'une suspension de ces spores dans un véhicule approprié. 10 Le procédé microbiologique de préparation du complexe antibiotique axénomycine consiste à cultiver le nouveau microorganisme Streptomyces lisandri n.sp. dans un milieu de culture contenant des sources de carbone, d'azote et des sels minéraux, à extraire l'antibiotique et ensuite à séparer et à caractériser 15 les substances qui le constituent. Plus particulièrement, on développe le microorganisme sur un milieu liquide dans des conditions aérobies, à une température de 23-37*C, de préférence de 28*C, pendant 60 à 160 heures. Le pH peut varier de 6 à 9 selon les milieux de fer-20 mentation utilisés. Comme source de carbone, on peut utiliser le glucose, l'amidon, la dextrine, différentes farines (de soja, de mais, de froment etc.), la liqueur de macération de mais et d'autres substances d'usage courant. La source d'azote peut être constituée, entre les 25 substances complexes ci-dessus qui contiennent de l'azote, par la caséine, les hydrolysats de caséine, la farine de graines de coton et des sels d'ammonium tels que les sulfates, phosphates, chlorures et autres substances d'usage courant. Les sels minéraux utiles à la fabrication de l'anti-30 biotique peuvent varier selon le milieu utilisé. Le carbonate de calcium .est presque toujours présent et, en outre, on peut ajouter des chlorures, sulfates, phosphates etc. de sodium, de potassium, de magnésium, de fer, de cuivre, de zinc, de manganèse et de cobalt. On peut effectuer la fermentation dans des 35 flacons Erlenmeyer et dans des fermentateurs de laboratoire et industriels de diverse capacité. Quand la fermentation est terminée, on extrait le complexe antibiotique du bouillon de culture en utilisant des solvants appropriés, dans des conditions appropriées, et on le 40 sépare par adsorption sur une colonne chromatographique pour obtenir les substances antibiotiques qui le constituent. 69 18667 7 2010640 Pour déterminer la concentration du complexe antibiotique dans le milieu de culture, on essaie, pendant la période de croissance du microorganisme, des échantillons que lfon a obtenus en extrayant le mycélium humide par l'alcool éthylique. Après 5 évaporation du solvant sous vide, on reprend le résidu par le plus petit volume d'un solvant approprié (alcool éthylique, alcool méthylique, diméthylformamide), puis on le dilue par l'eau. On essaie ces échantillons sur des organismes sensibles au complexe antibiotique, par exemple le Rhabditis macrocerca et 10 le Saccharomyces carlsbergensis, en préparant une série de dilutions des échantillons à 1*examen et en les comparant à des solutions du complexe antibiotique qui ont un titre connu. De façon analogue, on peut titrer les échantillons provenant de purifications successives. 15 Propriétés ch-îmico-physiaues Le complexe antibiotique axénomycine est formé de deux substances ayant des caractéristiques chimico-physiques similaires. On les a appelées axénomycine A et axénomycine B et elles existent sous la forme de produits amorphes blanc jaunâtre, insolubles dans 20 le benzène et l'éther de pétrole, peu solubles dans l'eau, l'acétate d'éthyle, l'acétone et le Chloroforme. Elles sont solubles dans les alcools méthylique, éthylique et propylique, réduisent la liqueur de Fehling, le nitrate d'argent ammoniacal et donnent une réaction positive avec le bleu tétrazole. La réaction de 25 Molish est faiblement positive. Sur papier, les réactions du phtalate d'aniline pour les aldoses et celles du naphtorésorcinol pour les cétoses sont négatives. La réaction sur le chlorure de fer est négative. L*axénomycine A donne à l'analyse élémentaire les chiffres suivants : C 61,74#, H 8,52$>, 0 28,07$. Le poids mo-30 léculaire est de 1451,3» I»e composé fond entre 127° et 142'C en formant un gel transparent rouge-brique, / _/D = +10,5" (à 0,9$ dans le méthanol). Bf = 0,49 sur gel de silice tamponné à pH 7 (butanol-n ï acide acétique î eau 4 : 0,5 î 1)• Le spectre ultra-violet dans le méthanol donne des 35 maximums d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 249, 254 et 330 mp- et un palier à 265-268 mp-. Dans le spectre infra-rouge, dans KBr, on note des bandes aux longueurs d8onde suivantes (en p-)î 2,94 - 3,44 - 5,78 - 6,00 - 6,16 - 6,24 - 6,88 - 7,25 - 7,41 -8,61 - 8,85 - 9,35 - 10,00 - 10,40 - 10,95 - 11,0 - 12j5. 69 18667 8 201.0640 L'axénomycine B donne â l'analyse élémentaire les données suivantes : C 62,$$, H 8,58$, O 27,$$. Le poids moléculaire est de 1330,2. Le composé fond entre 122° et 140*0, JT= +5° (à 0,9$ dans le méthanol). Rf « 0,61 sur gel de silice tamponné à 5 pH 7 (butanol-n : acide acétique ï eau 4 t 0,5 : 1). Les spectres ultra-violets dans le méthanol donnent des maximums d'absorption aux longueurs d'onde de 249, 254 et 330 iap-et un palier à 265 -268 mjt. Dans le spectre infra-rouge dans KBr, on trouve des bandes aux longueurs d'onde suivantes (en y-) ï 10 2,94 - 3,40 - 5,82 - 6,00 - 6,16 - 6,24 - 6,86 - 7,25 - 7,41 -8,60 - 8,85 - 9,35 - 10,00 - 10,40 - 10,98 - 11, 8 - 12,5. Activité antihelmirithitme On a vérifié 1*activité antihelminthique in vitro sur différents helminthes, suivant différentes modalités. 15 On a cultivé le Rhabditis macrocerca, en laboratoire sur culture, sur de 1'agar-agar avec extrait de levure traité par l'antibiotique à diverses concentrations. Après une incubation appropriée, on a déterminé la DIM ou dose minimale de l'antibiotique qui inhibe totalement le développement de l'organisme essayé. 20 On plonge le Syphacia obvelata et l'Hymenolepis nana, prélevés sur des souris infectées expérimentalement, dans des solutions salines tamponnées à pH 7,5 et on y ajoute l'anbitioti-que à différentes concentrations. On vérifie la survie des deux helminthes après différents 25 temps de contact et on détermine la DImM oû dose minimale d'immobilisation qui représente la quantité minimale de la substance qui est capable d'immobiliser in vitro les mouvements de l'organisme essayé. Le tableau 2 indique les données concernant la dose 30 inhibitrice minimale et la dose minimale d'immobilisation, déterminées après.4 heures de contact. 69 18667 9 2010640 TABLEAU 2 5 Espèce essayée Axénomycine A Axénomycine B DIM DImM DIM DImM pg/ml pg/ml p-g/ml f>-g/ml Bhabdltis macrocerca 10 10 Syphacia obvelata 1000 1000 Hymenelepis nana 0,5 0,5 On a essayé l'activité antihelminthique in vivo sur des souris albinos de 25 g infectées expérimentalement par l'Hymenole 10 pis nana* Les essais se font sur des groupes de 10 souris chacun* Les résultats montrent que 100$ des animaux parasités sont guéris par administration de 1*axénomycine A ou B à une seule dose par voie buccal** Cette dose, ou dose thérapeutique, correspond à 10 mg/kg et elle est nettement inférieure à celle qui est permise 15 par les données de toxicité. Le tableau 3 indique les données de toxicité algue chez la souris* TABLEAU 3 DL50» mg/kg Y®$ e d ' ni on Axénomycine A Axénomycine B buccale 200 300 intrapéritonéale 3,7 10 Activité antiprotozoaire 25 On a essayé l'activité antiprotozoaire in vitro sur l'Entamoeba histolytica souche F 22 dans un milieu monophasé de Pavlova et sur le Trichomonas foetus dans un milieu biphasé avec oeuf coagulé - solution saline de Locke, sérum de cheval. Après k6 heures d'incubation à 37*0, on a déterminé la dose inhibitrice 30 minimale en dénombrant au microscope les protozoaires existants. Le tableau k indique l'activité antiprotozoaire obtenue expérimentalement in vitro* 69 18667 10 2010640 TABLEAU L DIM, pg/ml Axénomycine A Axénomycine B Trichomonas foetus 0,1 0,1 5 Entamoeba histolytica 1,5 3 Activité antifongique On a essayé l'activité antifongique in vitro sur le Saccharorayces carlsbergensis et le Candida albicans, sur milieu de Sabouraud. 10 Après incubation de 48 heures à 30°C, on a déterminé la dose inhibitrice maximale (DIM). Les données obtenues sont indiquées au tableau 5 « TABLEAU 5 15 DIM, f Axénomycine A *g/ml Axénomycine B Saccharomyces carlsbergensis Candida albicans 0,04 1,25 0,04 1,25 Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans la limiter. 20 EXEMPLE 1 On prépare deux flacons Erlenmeyer contenant chacun 60 ml du milieu suivant : dextrine - 3 # caséine 0,5# 25 carbonate de calcium 0,4# sulfate d'ammonium 0,1# liqueur de macération de maïs 1 # eau du robinet, pour faire 100 Pour effectuer la stérilisation, on chauffe à 1'autoclave 30 à 120#C pendant 20 minutes. Le pH du milieu après stérilisation varie de 6,8 à ?• 69 18667 n 2010640 On inocule chaque flacon arec 0,5 ml d'une suspension de spores que l'on a obtenue en lavant avec 4 ml d'eau distillée stérile la patine d'une culture inclinée de Streptomyces lisandri de 15 jours, sur agar-agar avec glucose et pomme de terre, 5 On fait incuber les flacons à 28 *C pendant 48 heures sur une secoueuse rotative à 225 tr/mn avec unè course de 3 cm. On utilise 2 ml d'une telle culture pour inoculer d'autres flacons de 300 ml contenant chacun 60 ml du milieu productif suivant : amidon 4,5# 10 farine de soja 2,2# liqueur de macération de mais 2,3# carbonate de calcium 0,4# chlorure de calcium 0,5# eau du robinet, pour faire 100 15 On effectue la stérilisation en chauffant à 120°C pendant 20 minutes. On fait incuber à 28°C de la façon décrite plus haut pour la culture végétative. Après 120 heures d'incubation, on obtient une production de complexe antibiotique de 50 pg/ml de bouillon de culture. 20 2 On effectue la phase végétative comme dans l'exemple 1. On cultive la phase productrice sur le milieu suivant amidon soluble 8 # farine de graines de coton 4 # liqueur de macération de mais 2,5 # huile de saindoux 1,5 # , carbonate de calcium 1 # sulfate d'ammonium 1 # sulfate manganeux 0,01 # sulfate de cobalt 0,0007# eau du robinet, pour faire 100 On ajuste le pH â 6,2 avec une solution de soude 4n. On effectue la stérilisation par chauffage à 120°C pendant 20 minutes. On fait incuber à 28°G dans les conditions d'agi-35 tation déjà décrites à l'exemple 1. Après 120 heures d'incubation, on atteint une production de complexe de 70 pg/ml de bouillon de culture. EXEMPLE 3 On prépare deux flacons Erlenmeyer de 300 ml contenant 40 chacun 60 ml du milieu suivant : 69 18667 12 2010640 dextrine ' 5 f° carbonate de calcium 0,5 # liqueur de macération de mais 1 # caséine 1 /" 5 sulfate d'ammonium 0,2 fo phosphate dipotassique 0,01% eau du robinet, pour faire 100 On stérilise en chauffant à 120°C pendant 20 minutes. Le pH du milieu après stérilisation varie de 6,7 à 7. 10 On inocule chaque flacon avec 1 ml d'une suspension de spores qu'on a obtenue en lavant avec 5 ml d'eau distillée stérile la patine d'une culture inclinée de Streptomyces lisandri de 15 jours, sur agar-agar avec pomme de terre de glucose. On fait incuber les flacons à 2&°C pendant 1*8 heures 15 dans les mêmes conditions d'agitation qui sont indiquées aux exemples 1 et 2. On utilise 2 ml d'une culture ainsi obtenue pour inoculer d'autres flacons de 300 ml contenant chacun 60 ml d'un milieu productif ayant la composition suivante : glucose 6 fo 20 farine de soja 3 % liqueur de macération de maïs 2 fo carbonate de calcium 1 fo chlorure de sodium 0,3 # huile de soja 0,05# 25 eau du robinet, pour faire 100 On effectue la stérilisation à 120°G pendant 20 minutes. Le pH après stérilisation varie de 6,2 à 6,8. On fait incuber les flacons à 28°C dans les mêmes conditions d'agitation que dans les exemples 1 et 2. Après 120 heures d'incubation, on obtient une 30 production de complexe de 120 |xg/ml. EXEMPLE 4 On prend un ballon de 2000 ml de trois dispositifs déflecteurs et d'une tubulure latérale d'inoculation et contenant 500 ml du milieu décrit à l'exemple 3 pour la phase végétative et 35 on le stérilise par chauffage à 120°C pendant 20 minutes* Après refroidissement;, on inocule le ballon avec toute la suspension de spores que Ieon obtient en lavant à l'eau distillée la patine de quatre cultures inclinées de 15 jours sur agar-agars glucose et pomme de terreo On fait alors incuber le ballon à 2$®C sur une I- 0 secoueuse vs â 120 tr/am avee une course de 4s5 cm pendant 48 heurse- 69 18667 13 2010640 On utilise 50 ml de la culture végétative obtenue pour inoculer, dans un fermentateur en verre de 5 litres, 3 litres d'un milieu préalablement stérilisé à 120°C pendant 30 minutes et présentant la composition suivante : 5 dextrine 4 # caséine 1 # liqueur de macération de maïs 1 # carbonate de calcium 0,50# sulfate d'ammonium 0,1 fo 10 phosphate monopotassique 0,01# eau du robinet, pour faire 100 On agite le bouillon à 400 tr/mn et on l'aère avec environ 1 volume d'air par volume de milieu par minute et on fait incuber à 27-2Ô°G pendant environ 24 heures. Au bout de ce temps, 15 on utilise 3 litres de la suspension mycélienne obtenue pour inoculer 50 litres du milieu de fermentation. Le milieu de fermentation présente la composition suivante : glucose $ # farine de soja 3 # 20 liqueur de macération de maïs 2 # carbonate de calcium 1 # chlorure de sodium 0,25# huile de soja 0,5 # eau du robinet, pour faire 100 25 Après stérilisation à 121°G pendant 30 minutes et après inoculation, on agite le milieu à 200 tr/mn au moyen d'un agitateur à turbine à disque muni de quatre pales planes et on aère avec 0,7 litre d'air par litre de milieu par minute, à 27-2Ô*C pendant 120 heures. 30 On prend le mycélium recueilli par filtration de 5 litres de bouillon de culture et on l'extrait à quatre reprises avec 3 litres de méthanol chaque fois. On réunit les extraits et on les concentre sous pression réduite et on lave le résidu aqueux à l'éther de pétrole, puis on l'extrait à quatre reprises avec un 35 volume égal d'alcool butylique normal. On recueille les extraits, on les évapore jusqu'à siccité sous vide et il reste un résidu que l'on reprend par 100 ml d'alcool méthylique. On jette la partie insoluble et on évapore la solution. On met le résidu en suspension dans 200 ml de chloro-40 forme puis on le filtre. On concentre la solution de chloroforme, 69 18667 14 2010640 on la précipite par l'éther dé pétrole et elle donne 2,0 g d'un produit brut qui contient les antibiotiques axénomycine A et B. On purifie le produit brut par distribution à contre-courant avec un système biphasé chloroforme - tétrachlorure de carbone -5 - méthanol - eau (3 î 2 î 4 : 1). En fractionnant sur 50 tubes, on obtient le maximum de l'activité dans les lOème à 20ème tubes. En évaporant jusqu'à siccité le contenu de ces tubes, on obtient 0,20 g du complexe d'axénomycine pur. Par chromatographie sur plaque, on démontre que le 10 complexe obtenu contient les deux constituants, axénomycine A et B ayant un Rf respectif de 0,49 et 0,61. On effectue la séparation des deux substances actives par chromatographie sur des colonnes de gel de silice tamponné à pH 7 avec un tampon phosphate 0,05M et avec addition de 33% de 15 poudre de cellulose. Pour 1 g du complexe antibiotique, il faut une colonne de 2,4 cm de diamètre et 30 cm de hauteur. En éluant avec le mélange alcool butylique normal : acide acétique : eau (4 î 0,5 : 1 en volume), on obtient des fractions contenant 0,60 g du composé B et ensuite 0,25 g du composé A. 20 On reprend par le méthanol chaque antibiotique après évaporation des produits élués, on le récupère par élimination du solvant et on le sèche sur PgO^ à 0,2 mm de Hg et à la température ambiante jusqu'à poids constant. 69 18667 15 2010640 REYENDIC AH ONS 1) Procédé microbiologique pour la préparation du nouveau complexe antibiotique axénomycine comprenant les axénomycines A et B et de ses sels d'acide non toxique, caractérisé par le fait que 5 l'on cultive le nouveau microorganisme Streptomyces lisandri n.sp. dans des conditions aérobies, dans un milieu liquide contenant une source de carbone et d'azote et des sels minéraux, à une température de 23-37°G, en un temps de 60 à 160 heures, à un pH de 6-9 et que l'on isole le complexe du milieu de fermentation et qu'on le 10 sépare en ses deux constituants antibiotiques. 2) Complexe antibiotique axénomycine et ses sels d'acide non toxique. 3) Antibiotique axénomycine A et ses sels d'acide non toxique. 15 4) Antibiotique axénomycine B et ses sels d'acide non toxique. 5) Composition pharmaceutique douée d'activité anti-helminthique, antiprotozoaire et antifongique et caractérisée par le fait qu'elle contient une ou plusieurs substances antibiotiques 20 selon 2 à 4, mélangées à un véhicule approprié.