Brevet FR2011689A1 — publié le 19700306

i 2011689 La présente invention est relative à une composition hémostatique ainsi qu'à son procédé de préparation à partir du venin d'un serpent venimeux du genre Trlmeresurus en taxinomie . Le serpent appelé "Habu" est un serpent venimeux-qui appar-5 tient au genre Trlmeresurus de la famille des Crotalidés et on peut citer, par exemple , Trimeresurtis flavoy-lriS-âs.Trlmeresurus oklnavensls, Trlmeresurus elegans, Trlmeresurus tokarensls, TrImeresurus tlnkami, Trlmeresurus mucrosquamatus et Trlmeresurus ste.jnegeri. Sauf autre indication, le nom "Habu" désigne ces 10 serpents dans la présente description . On sait que le serpent "Habu" est un serpent très venimeux qui vit dans les Iles Tokara et au sud de celles-ci et on craint son venin car c'est une substance qui tue les hommes et les autres animaux par son activité hémorragique et son activité de nécrose 15 tissulaire . La Demanderesse a découvert , au cours de recherches effectuées sur les toxoïdes du veçiin du serpent "Habu", ©e fait inattendu que la substance qui est obtenue par un certain traitement du venin a une forte activité hémostatique et la Demanderesse a 20 été convaincue que la substance hémostatique peut être utilisée cliniquement de façon satisfaisante grâce à la présente invention. La présente invention est donc relative à une composition hémostatique et à son procédé de préparation . On prépare la composition selon l'invention en extrayant 25 une solution aqueuse du-venin du serpent "Habu" à l'aide d'un solvant orgaçiique afin d'éliminer les lipides , en dîalysant la couche aqueuse, en faisant adsorber la substance active contenue dans la solution interne sur un gel de dextranne réticulé (Cephadex marque déposée) , en éluant la substance active à l'ai-50 de d'une solution de tampon au phosphate afin de recueillir une fraction ayant une puissante activité de coagulation du sang et en effectuant une chromât ographle sur eolontîe de résine échangeu-se d'ions basique de manière à recueillir une fraction ayant une activité très élevée de coagulation du sang . 35 Le procédé selon l'invention est représenté- schématiquement au Tableau ci-dessous, que l'on décrira ensuite de manière plus -détaillée . bad original. 69 20680 2011689 TABLEAU I 5 F-I-AT F-l-I 10 15 20 25 P-II ++++ +-f+ -h- + + activité de coagulation du sang valeur hémorragique ehromatographle . sus? eclonns de CEAE-eellulose D-I D-H D-XV 0-V •f+ - ■. +++ ++ I ~¥ï' activité de coagulation dû sang valeur hémorragique Le venin-brut est d'abord dissous dans de 1'eau distillée dont le pH a d'abord été ajusté à 7?0 à l'aide d'alcali, et la solution est soumise à.plusieurs extractions avec un volume équivalent d'un solvant organique, par exemple le chloroforme, 1'éther 30 l'acétate, d'éthyle, suivies de centrifugation Comme les lipides du venin-passent dans la couche de solvant . organique au, cours, rte .ce. .stade-d 'extraction, seule la couche aqueuse (F-I-A) est séparée et âlalysée contre de 1'eau distillée, de manière à obtenir la solution interne dialysée (F-I-B) .A ce sta-55 de, on peut efficacement ejnpêcher la. pe-rte dç substance actise si on effectue la dialyse avec la couche .aqueuse précitée à laquelle on BAD ORIGINAL 69 20680 3 2011689 ajoute un liquide surnageant ( indiqué comme couche aqueuse au Tableau I), le liquide surnageant étant obtenu en ajoutant un petit volume d'eau à la couche de solvant organique (F-III) ,en séparant le précipité intermédiaire (F-IX) et en centrifugeant 5 le mélange . Lorsqu'on étudie l'adsorption du venin brut, de F-I-A et de F-l-B à 280 m , la solution aqueuse de venin brut ainsi que la couche aqueuse dont les lipides ont été séparés donnent presque la même valeur et ce fait montre que la majeure partie 10 des protéines sont passées dans la couche-aqueuse .Comme l'ad-sorption de la solution interne dialysée donne une valeur un peu plus faible , on en déduit que la substance à bas poids moléculaire est séparée par dialyse .• Lorsqu'on étudie le temps de coagulation du sang provoqué 15 par le venin brut, J?-I-A, F-I-B ,F-II et F-IlX par la méthode du temps de recalcification, à llaide de plasma de lapin, les activités de coagulation du sang du venin brut, de F^I-A et de F-I-B sont élevées presqu'au même degré, et l'activité est à peine remarquée chez F-II et F^III .Ces résultats montrent que 20 la majeure partie-de la substance active est contenue dans la solution interne dialysée-. La solution interne dialysée ainsi obtenue contient encore divers constituants nuisibles comprenant le facteur hémorragique; en conséquence, on fait passer la solution sur une colonee 25 de Cephadex et on obtient les fractions P--X à P-IV à l'aide d'une solution de tampon au phosphate .La Fraction P-I comportant les molécules les plus grosses contient une quantité importante de substance coagulant le sang, mais cette fraction contient également encore une quantité importante de facteur hé-30 morragique .En conséquence, on effectue une chromatographie sur colonne afin de séparer le facteur hémorragique, en utilisant une résine échangeuse d'ions basique, par exemple la diéthylamino-éthyl-cellulose (DEAE-cellulose), la triéthylaminoéthyl-cellulose (TSAE~ -cellulose) et la diéthylaminoéthyl-cellulose-Cephadex 35 (DEAE-Cephadex) obtenant ainsi les fractions D-X à. D-VI parmi lesquelles la fraction O-IXI présente une activité élevée de coagulation du sang avec peu de facteur hémorragique La substance active ainsi obtenue par extraction d'une fraction ayant une puissante activité hémostatique est une excellente 2|_0 substance hémostatique ayant une activité semblable à celle de 69 20680 4 2011689 la thrombine, et son activité de coagulation du sang est de plusieurs fois à dix fois environ supérieure à celle des agents hémostatiques du commerce connus . L'Exemple suivant illustre l'invention . 5 Exemple On dissout 500 mg du venin brut lyophilisé de Trlmeresurus oklnavensls dans 10 ml d-'eau distillée dont on a préalablement ajusté le pH à 7,0 à l'aide d'alcali, et on soumet la solution à une extraction à-l'aide de 10 ml de chloroforme tout en secouant, 10 extraction suivie de centrifugation .On répète cette opération 5 fois et on recueille la couche aqueuse . On-extrait-ensuite la couche-chloroformique et le précipité intermédiaire, deux fois, à l'aide d'eau distillée et on centrifuge afin de recueillir la couche aqueuse . On lyophilise la solution interne . 15 - On dissout 170 mg du produit dans 1 ml de solution l/70 M de tampon en phosphate (-pH 7,4) et on fait passer la solution sur une colonne de Cephadex G-75 ( 2 x 46 cm) pour y-faire adsor-ber la substance hémostatique et on l'élue à .l'aide d'une-solution l/70 M-de tampon au phosphate ayant une température de 21°C, 20 la vitesse d'élution ëtant de 6 ml/heure . A l'aide de plasma de lapin, on recueille une fraction ayant une puissante activité de coagulation du sang-et on-lyophilise cette fraction . On dissout 55 mg du produit dans 1 ml de solution 0,095 M de tampon à l'acétate de sodium ayant un pH de 7,1 et on fait 25 passer la solution sur une colonne (0,9 x 35 cm) de DEAE-cellulose afin que la substance hémostatique soit adsorbée sur celle-ci ; on effectue la chromatographie sur colonne tout en élevant progressivement la concentration molaire de la solution de tampon- à l'acétate de sodium de 0,005 M jusqu'à 0,5 M (élution par 30 gradients) . On recueille et on lyophilise une fraction ayant l'activité de coagulation du sang la plus élevée » - Le produit final ne contient pas de facteur hémorragique et pas d'autre constituant nuisible et constitue un agent hémorra-35 gique qui peut être utilisé de manière pratique . 69 20680 5 2011689 REVENDICATIONS - 1-Un procédé de préparation d'une composition hémostatique caractérisé en ce qu'on extrait une solution aqueuse du-venin du serpent "Habu" à 1'aide d'un solvant organique afin de sé- 5 parer les lipides , on dialyse la couche aqueuse, on fait ad- sorber la substance active contenue dans la solution Interne sur un gel de dextranne réticulé tel que le Cephadex, on élue la substance active à l'aide d'une solution de tampon au phosphate de manière à recueillir une fraction ayant une puissante actl- 10 vlté de coagulation du sang et on- effectue une chrornatographle sur colonne de résine échangeuse d'ions basique' afin de recueillir une fraction ayant l'activité hémostatique la plus élevée. 2-Un procédé suivant-la revendication 1, caractérisé en ce que le venin provient de Trlmeresurus flavovlrldls , 15 Trlmeresurus oklnayens'Is, Trlmeresurus elegans » TrImeresurus tokarensls, Trlmeresurus tlnkaal,, Trlmeresurus mucrosquamatus et Trlmeresurus- stejnegeri . 3-Un procédé suivant la revendication 1 ou 2,caractérisé en ce qu'on utilise du chloroforme pour séparer les lipides 20 de la solution aqueuse du venin du serpent "Habu" . 4-Un procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on effectue la dialyse contre de l'eau distillée . 5-Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en 25 ce qu'on extrait la solution.aqueuse du venin du serpent-"Habu" à l'aide d'un soldant organique afin de séparer les lipides et on dialyse la couche aqueuse, à laquelle on a ajouté de l'eau constituée par la solution de lavage-de la couche de solvant organique et du précipité provenant de l'extraction précitée . 30 6-Une composition hémostatique utilisable en thérapeutique humaine telle qu'obtenue par un procédé suivant les revendications 1 à 5. 7-Une composition hémostatique suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une poudre lyophi-35 Usée . BAD ORfQWAt