Brevet FR2011313A1 — publié le 19700227

La présente Invention concerne un procédé de préparation par fermentation de dérivés de la purine et plus particulièrement un procédé de préparation de dérivés de la purine k partir d'acide acétique par l'utilisation de bactéries. Les dérivés de la purine obtenus selon le procédé de 1,'invention sont des composés de formule : A f 26 MHg Y est un atome d'hydrogène ou un groupe 0 - p(oh)2 . Les dérivés de la purine sont utiles pour la préparation 25 d'assaisonnements. Ona préparé des dérivés de la purine à partir de glucides, tels que le glucose, les mélasses, ou le produit d'hydrolyse de l'amidon à l'échelle industrielle par fermentation (brevets des E.U.A. n# 3 249 511, 3 152 966, 3 385 761,321549 30 -3 '&>% (brevets britanniques n° 983 213, 980 753, 1 080 427, 855 690, 987 269). La'demanderesse a découvert selon l'invention que l'on peut préparer des dérivés de la purine & partir d'acide acétique comme seule ou principale source de carbone, avec de 35 très bons rendements, en utilisant des bactéries du genre Corynebacterium et du genre Brevibacterium lorsque l'on cultive ces bactéries dans un milieu nutritif contenant d® 1'acide acétique, une source d'azote, des sels minéraux et des aatiôres 69 20556 2 2011313 organiques nutritives. Les bactéries utilisables dans le procédé de l'invention sont caractérisées par leur possibilité d'assimiler l'acide acétique comme source de carbone et d'obtenir un ou 5 plusieurs dérivés de la purine à partir de l'acide acétique. Comme exemples de ces bactéries, on peut citer Corynebacterium acétoacidophilum AJ-3141 (FERM-P-185) et AJ-J142 (FERM-P-186), Brevibacterium flavum AJ-3143 (FERM-P-187) et AJ-2m(FERM-P-188). Les numéros qui sont à côté de "FERM-P" sont les numéros 10 d'ordre du "Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry, Japan " qui constitue la seule collection de cultures publiques autorisées par l'Office de Brevets japonais. Les souches nécessitent de l'adénine pour 15 leur croissance. Le milieu nutritif ut ildsé pourla prépà rafcim dss dérivés de la purine par le procédé de l'invention comprend de l'acide acétique comme source de carbone, source de carbone assimilable, das sels minéraux et des matières organiques nutritives. L'acide 20 acétique peut être un produit pétrochimique purifié ou un produit de fermentation ou de l'acide acétique déjà utilisé obtenu par divers procédés pétrochimiques. L'acide acétique peut être présent dans le milieu de culture dès le début de la fermentation ou peut être partiellement ajouté au milieu pendant la 25 fermentation. Des sels d'ammonium tels que le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium ou le carbonate d'ammonium, ou l'urée, sont des sources d'azote qui conviennent à l'invention. On peut aussi utiliser des composés organiques azotés telsqiBles acides aminés, les peptides ou les protéines, Les ions phosphate sous forme de phosphate monopotassique, de phosphate bipotassique, de phosphate biammonique ou de phosphate de sodium, et les ions magnésium et ferreux constituent les sels minéraux présents 35 dans le milieu de culture. Des substances organiques nutritives, l telles que la liqueur de macération du maïs^ la peptone, les extraits de malt, les extraits de levure ou les produits d'hydrolyse des protéines de plantes vertes contenant des k 69 20556 3 2011313 vitamines et des acides aminés sont de préférence présents dans le milieu de culture. Le milieu de culture de l'invention doit contenir toutes les substances nutritives dont la bactérie a besoin 5 pour sa croissance; par exemple une petite quantité d'adénine doit être présente dans le milieu de culture sous forme d'adénine» d'adénosine, d'acide adénylique, d'acide ribonucléiqjae ou d'extrait de levure lorsque la bactérie utilisée exige de l'adénine pour sa croissance. 10 On maintient des conditions aérobies en secouant, en agitant et/ou en aérant le milieu de culture. On peut réaliser la fermentation selon l'invention dans un intervalle de pH dans lequel la bactérie utilisée se développe et de préférence dans un intervalle allant de pH 15 légèrement acide à pH neutre. Dans fce but on ajoute au milieu un acide minéral tel que l'acide suifurique, l'acide chlor-hydrique ou l'acide acétique pendant la fermentation. La température doit être comprise entre 25 et 40°C et de préférence entre 27 et 3**C. 20 On peut récupérer du mélange réactionnel les dérivés de la purine obtenus, tels que l'inosine, la guanosine, la xanthosine, l'acide xanthylique-5', l'acide guanylique-5' ou l'acide inosinique-51 en opérant selon des procédés classiques itels que l'extraction par solvant, 1'évaporation ou l'utilisa-25 tion de résines échangeuses d'ions. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée . Exemple 1 On prépare un milieu de culture contenant 10g/l de 30 (NH^SO^, 5g/l de (NH^HPO^, J&/1 de KHgPO^, 4g/l de MgSO^THgO, 2 ppm de FeSO^, 15 ml/1 de produit d'hydrolyse de protéine-végétale (24g/l au total d'azote contenu), un mélange de vitamines (100 ml de milieu de culture comprend 4 y de biotine, 100 y d'acide nicotinique et 0,5 -f d'inositol) et 5 mg/1 35 d'adénine, ajusté à un pH de 6,5 et on place chaque fraction de 20 ml du bouillon dans un ballon à agitation de 500 ml. Après stérilisation à 110°C pendant 5 mn dans un autoclave, on réajuste le pH du bouillon à 6,5 aras de l'ammoniaque et on ajoute au milieu COPY 6 4 2011313 15 s/1 d'acide acétique stérile (sous forae d'acide acétique libre). On inocule à chaque bouillon une cuillerée de Coryne-bacterium acetoacidophilum AJ-3141 (FERM-P-185) que l'on a 5 primitivement cultivé sur un milieu nutritif constitué par 10g/l d'extrait de levure, 10g/l de peptone, 5g/l de NaCl et 20 g/1 de gélose àp.H7*0 à 31»5#C pendant 24 h et on le cultive à 31»5°C avec àgitation (120 va-et-vient par mn, 7 c® d'oscillation) 24 h et 45 h après le début de l'opération; on 10 nourrit le milieu de culture avec 5g/l ®t 10g/l d'acide acétique et l'incubation est terminée 72 h après l'inoculation. Le bouillon de culture contient 4,5 g/1 d'inosine et 1g/l d'acide inosinique-51. On traite 200 ml du bouillon de culture pardi charbon actif et s^r résine échangeuse d'ions» 15 et on isole 0,60g d'inosine cristallisée et 0,11g d'acide inosinique-5'. Exemple 2 On cultive de la même façon que dans l'exemple 1 Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3142 (FERM-P-186) et on 20 constate que le.bouillon de culture contient 3> Og/1 de guanosine, 0.8g/l d'acide guanylique-5', 1,3g/l d'inosine et 0,6g/l d'acide inosinique-5'. * On traite de manière classique 200 ml du bouillon de culture récupéré et on obtient 0r11g d'inosine, 0,05g d'acide 2$ inosinique-5', 0,55g de guanosine et 0,0$ g d'acide guanylique-5'. Exemple 3 On prépare un bouillon de culture comme dans l'exemple 1, mais on remplace les vitamines par 40 y/I de biotine et 30 1 000 y/1 de chlorhydrate de thiamlne, et on ajoute 0,5 g/1 d'extrait de levure; on inocule au bouillon une cuillerée de Breyibacterium flavum AJ-3143 (FERM-P-187), et on cultive le bouillon pendant 72 h comme dans 1'exemple 1. Le bouillon cultivé contient 2,5 g/1 d'inosine et 35 1»1fi/l d'acide inosinique-51 et on obtient 0,28g d'inosine et 0,12g d'acide inosinique-5' à partir de 200 oïl de bouillon cultivé. 69 20556 5 2011313 Exemple 4 ' On cultive Brevibacterium flavum AJ-3144 pendant 72 h dans le même milieu que dans l'exemple 3 en opérant de la àrâme manière que dans l'exemple 1. On trouve que le bouillon de 5 culture contient 2,3 g/1 de guanosine, 0,9 g/1 d'acide guanylique-51, 1,1g/1 d'inosine et 0,6g/l d'acide inosinique-5'. On obtient 0,29 S de guanosine cristallisée et 0,1 g d'aeide guanylique-5' cristallisé dans 200 ml de bouillon de culture. Exemple 5 10 On prépare un bouillon de culture comme dans l'exemplel mais en remplaçant les quantités de KHgPO^ et de MgSO^,ÎHgO par 20g/l et I0g/1 respectivement; on inocule le milieu avec une cuillerée de Corynebacterium acétoacidopfailum AJ-3141 (F^RM-P-185), et on cultive le bouillon pendant 72 h comme dans 15 11 «icemple 1. On trouve que le bouillon de culture contient 5»1 g/1 d'acide inosinique-51 et 1g/l d'inosine. On cultive Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3142 (FERM-P-186) de la même manière que ci-dessus pendant 72 h 20 «t on constate que le bouillon de culture contient 3t1g/l d'acide guanyllque-51 » 1»8g/l d'acide inosinique-5', G,6g/l de guanosine et 0,9 g/1 d'inosine. Exemple 6 On cultive Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3141 25 (FERM-P-1 £|5)dans le même milieu que dans l'exemple 5 en présence de 2,5g/l d'hypoxanthine en opérant de la même manière que dans l'exemple 1, et on trouve que 9»5fi/l d'acide inosinique 5' sont obtenus dans le bouillon de culture. On effectue une culture semblable à la culture ci-30 dessus en utilisant Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3142 (FERM-P-186) et on obtient 5,8g/l d'acide guanylique-5' et' 4,3g/l d'acide inosinique-5' à partir du bouillon de culture. 69 20556 « 2011313 revendications 1. Procédé de préparation des dérivés de la purine de formule s 15 dans laquelle X est un atome d'hydrogène, un groupe OH ou NHg et Y un atome d'hydrogène ou un groupement ; 0 -Moh)2 20 caractérisé en ce que l~*on cultive unebactérie capable d'assimiler l'acide acétique pour obtenir le dérivé de la purine dans un milieu contenant de l'acide acétique comme source principale de carbone, une source d'azote, des sels minéraux et des substances organiques nutritives dans des conditions aérobies, et l'on 25 récupère les dérivés d£ la purine. W 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce ,que ladite bactérie est une souche appartenant aux genres Corynebacterium ou Brevibacterium. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé 30 en ce que ladite bactérie est une souche appartenant aux espèces Brevibacterium flavum ou Corynebacterium acétoacido~ philum. 69 20556 7 2011313 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite bactérie est Corynebacterium acétoacidophilum FERM-P-185, Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P-186» Brevibacterium Havum FERM-P-187 ou Brevibacterium flavum . 8 FERM-P-188.