Brevet FR2010751A1 — publié le 19700220

1- 20107S.1 La présente invention se rapporte h un nouvel antibiotique et à son procédé de production.' Plus particulièrement, elle se rapporte au nouvel antibiotique et à un procédé pour sa production par fermentation, ainsi qu'à des procédés de récupération et de purifi-5 cation. La présente invention comprend, dans son domaine de protection, l'antibiotique sous des formes diluées, sous forme de concentrés bruts et sous des formes cristallines pures. L'antibiotique selon des caractéristiques de la présente invention possède des activités lo anti-bactériennes contre un grand nombre de micro organismes. L'organisme produisant le nouvel antibiotique, selon des carac-téristiaues de la présente invention, au'on a désigné par th iopep-tine, a été isolé à partir d'un échantillon de sol rassemblé à Tateyama, préfecture Toyama, Japon, et est identifié comme nou-15 velle espèce du genre Streptomyces, désignée par Streptomyces tateyamensis. Une culture de l'organisme vivant a été déposée dans la Collection Américaine de Cultures Types, Maryland, U.S.A. et ajoutée à sa collection permanente de microorganismes sous le nom de A.T.C.C. 21.389. 20 La morphologie de la culture a été observée par voie micros copique sur de l'agar-agar de Bennett. Les hyphes de cette culture sont épais, rectilignes et forment des touffes. Les conidies à surface lisse étaient plutôt de grande dimension et de forme elliptique allongée, mais certaines conidies rectangulaires ont été 25 observées. Le Streptomyces tateyamensis nov. sp. ATCC 2138g avait les caractéristiques de culture suivantes lorsqu'on l'a fait croître sur les milieux indiqués, pendant 10 à 14 jours, à 30° C, à une exception près lorsqu'on l'a fait croître sur une culture formée 30 de plaques de gélatine. La culture sur plaques de gélatine a été observée après incubation à la température ambiante pendant 20 jours. Agar-agar de Czapeck : faible croissance, incolore ; pas de mycélium aérien; pas de pigments solubles. Agar-agar- ammonium - amidon : croissance abondante, colora-35 tion brune jaunâtre à la périphérie, blanche au centre; mycélium aérien, épais, blanc brunâtre, poudreux ; pas de pigment soluble. Remarque : l'amidon est vigoureusement I^drolysé, Agar-agar- asparagine -glucose : croissance sous forme plate, couleur brun sombre; mycélium aérien, à extension, blanc, poudreux ; 40 pas de pigment soluble. bad obie^ 69 19383 2 2010751 Agar-agar - malate de calcium : croissance plate, couleur brun faible ; mycélium aérien blanc, poudreux ; pas de pigment soluble. Agar-agar - tyrosine : croissance de couleur faiblement brune mycélium aérien, à extension, couleur blanche, faiblement brunâtre, 5 poudreux ; pas de pigment soluble. Bouillon d'agar-agar : mauvaise croissance, incolore, pas de mycélium aérien ; pas de pigment soluble. Agar-agar de Bennett : croissance de couleur faiblement brune, mycélium aérien, de couleur blanche, faiblement grisâtre, poudreux, 10 à extension ; pas de pigment soluble. Remarque : croissance plutôt mauvaise à 37° C. Plaque de gélatine : faible croissance ; pas de mycélium aérien, pas de pigment soluble. Remarque : faible liquéfaction. Glucose - solution de Czapek : petites colonies blanches pré-15 cipitées ; pas de mycélium aérien : pas de pigment soluble. Remarque : aucun nitrite produit. Glucose-bouillon : colonies de couleur faiblement grise, qui se sont développées en surface ; pas de mycélium aérien : pas de pigment soluble. Remarque : la valeur du pH a changé légèrement 20 pour passer à une gamme acide. Lait : colonies faiblement grises qui se sont développées en surface. Pas de mycélium aérien ; pas de pigment soluble. Remarque : peptonisation et coagulation négatives. Morceaux de pommes de terre : croissance de couleur faible-25 ment brune, à ondulation ; pas de mycélium aérien ; pas de pigment soluble. Cellulose : pas de croissance. L'utilisation de carbone par le Streptomyces tateyamensis a été déterminée selon le procédé décrit par Pridham et Gottlieb. 30 Dans le tableau suivant, on présente les résultats des tests d'utilisation de carbone et les symboles employés pour indiquer la réponse de croissance ont les significations suivantes : ( +) = utilisation probable ( -) = utilisation douteuse. 35- TABLEAU 1 Type d'utilisation du carbone pour le Streptomyces tateyamensis : Arabinose ( + ) Fructose ( -) Glucose ( + ) ^0 Inositol ( _ ) BAD ORIGINAL 69 19383 Lactose .. Mannitol , Mannose Raffinose Rhamnose Salicine Sucrose Tréhalose Xylose 10 Pour la production de thiopeptine, on doit comprendre que la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation de l'organisme particulier décrit ici, mais comprend, entre autres, des espèces mutantes produites, à partir de l'organisme décrit, par des agents de mutation tels que les rayons X, les rayonnements ultra-violets, 15 l'exposition de phagédénisme et des moutardes azotées. Lathiopeptine peut être produite par la culture du Streptomyces tateyamensis dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies immergées. Le milieu nutritif utile pour la culture du Streptomyces tateyamensis produisant la thiopeptine comprend une 20 source de carbone, par exemple un hydrate de carbone assimilable et une source d'azote, par exemple un composé azoté assimilable ou une matière protéinée. Des exemples de sources de carbone sont l'amidon, le glucose, le sucrose, le glycérol et analogues. Des exemples de sources d'azote sont des extraits de viande, la peptone, 25 la farine de gluten, la farine de soja, la farine de coton, la liqueur de maïs macérée, la levure sèche, l'extrait de levure, le sulfate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'acide dit casamino, l'urée et analogues. La combinaison de ces sources de carbone et d'azote peut être utilisée de manière avantageuse. Des sels miné-30 raux, pouvant donner des ions tels que le potassium, le sodium, le calcium, le phosphate, le sulfate et analogues, peuvent être incor-porés dans le milieu. Des éléments à l'état de traces, telsque le magnésium, le manganèse, le zinc, le fer et analogues, peuvent être aussi compris dans.le milieu de culture. Ces métaux à l'état de 35 traces peuvent être fournis sous, forme d'impuretés, suite à l'addition des constituants du milieu. En conséquence, on doit comprendre que l'addition de ces métaux à l'état de traces, ainsi que de sels minéraux, est réalisée efficacement lorsque l'organisme produisant l'antibiotique les exige comme composants du milieu. Des vitamines 40 telles que l'inositol, la vitamine B]_2.> l'-afiide is oascorbique,~ là bio- 69 19383 4 2010751 tine et analogues peuvent être ajoutées au milieu utilisé dans le procédé de fermentation selon des caractéristiques de la présente invention, Pour obtenir un rendement maximum en thiopeptine sur le milieu 5 tel que décrit ci-dessus, on préfère l'utilisation de composés de soufre, qu'ils soient organiques ou minéraux. Des exemples de ces composés de soufre sont la N-acétyl-DL-méthionine, la méthionine, l'acide 2-naphtol-6,8-disulfonique, le sulfosalicylate de sodium, le cétylsulfate de sodium, la taurine, la thionine, le produit dit 10 ^méthyle orange, le sulfate de sodium et analogues, Les composés soufrés préférés sont la N-acétyl-DL-méthionine et le sulfate de sodium. Cependant, pour des questions d'aspect économique des milieux, le sulfate de sodium peut être employé avantageusement. Des rendements optima en thiopeptine sont obtenus lorsque la 15 culture est réalisée à une température conduisant à une croissance satisfaisante du microorganisme entre environ 24°C et environ 37°C et, de préférence, entre 27°C et environ 32°C, pendant une période d'environ 2 jours et environ 6 jours. Lorsque la fermentation a été réalisée, on peut utiliser un 20 grand nombre de modes opératoires pour l'isolement et la purification de la thiopeptine, par exemple l'extraction par solvant, la chromatographie et la recristallisation à partir de solvants. Dans un procédé de récupération préféré, la thiopeptine est récupérée à partir de tout le bouillon en soumettant le gâteau de 25~- mycélium séparé par des moyens classiques, tels que la filtration ou la centrifugation, à l'extraction au moyen d'un solvant organique convenable tel que l'acétone, le méthanol et analogues. L'acétone est le solvant d'extraction préféré. L'extrait résultant peut être concentré par des procédés classiques pour former un résidu 30 Qui est à nouveau soumis à l'extraction avec un solvant organique convenable, tel que l'acétate d'éthyle, le chloroforme et analogues. La préparation cristalline impure de thiopeptine peut être obtenue en concentrant l'extrait résultant pour former un résidu qui est alors refroidi jusqu'à la température ambiante. La préparation 35 cristalline impure de thiopeptine peut être également obtenue en concentrant l'extrait résultant en un résidu qui est à nouveau dissous dans un solvant organique convenable, tel que le n-hexane, l'éther de pétrole et analogues, pour induire la précipitation. On doit comprendre que la thiopeptine est un complexe formé 1[0 d'un facteur principal et de trois facteurs secondaires.- Cette -- T 69 19383 5 2010751 détermination a été réalisée dans l'analyse de chromatographie sur-couche mince de la préparation de thiopeptine cristalline impure, en utilisant comme agent de développement un.système de solvants formé de méthanol et de chloroforme (10 : 1 en volume1!. Les cuatre compo-5 sants ont été arbitrairement désignés par thiopeptine kj_, thiopeptine Ag et thiopeptine A^ , pour les trois composants secondaires, et par thiopeptine B pour le composant principal. D'après des analyses de chromatogramme sur couche mince telles que présentées sur la figure 1, dans laquelle on désigne par C le complexe de 10 thiopeptine, par A-^ la thiopeptine Ai , par Ag la thiopeptine A2, par A j la thiopeptine A ^ et par B la thiopeptine B, les valeurs de Rf pour les 4 facteurs ont été déterminées comme suit ; TABLEAU 2 Valeurs de Rf pour les composants de thiopeptine 15 Composants : Valeurs de Rf Thiopeptine A]_ 0,78 Thiopeptine A2 0,68 Thiopeptine A-^ 0,60 Thiopeptine B 0,19 20 Ces composants constituant le complexe de thiopeptine peuvent être séparés en dissolvant la préparation cristalline impure ainsi obtenue dans un solvant organique convenable, tel que le chloroforme et analogues, et puis en soumettant la solution à une chromatographie sur colonne avec un système convenable de solvants 25 organiques, un système formé de chloroforme et de méthanol étant préféré. Les qudae composants peuvent être identifiés par la division des quatre bandes adsorbées apparaissant sur le gel de silice dans la colonne. L'isolement des trois composants de thiopeptine A peut être réalisé par l'utilisation du chloroforme et du métha-30 nol, suivant un rapport en volume allant d'environ 20 : 1 à environ 50 : 1. Pour séparer les trois composants de thiopeptine A, il n'est pas nécessaire de changer le système de solvants et ainsi ces composants peuvent être séparés sous forme de chaque composant de thiopeptine en développant en continu les bandes apparaissant, 35 par utilisation du même système de solvants. Après que l'élution des composants de thiopeptine A ait été achevée, le changement du rapport de volume du système de solvants peut conduire à l'élution du composant de thiopeptine B. Le rapport préféré des solvants en volume est d'environ 4 : 1 à environ 9 • 1* Comme on l'a décrit 40 ci-dessus, bien que la première élution du complexe des trois SAD ORlGiHAL 69 19383 2010751 composants de thiopeptine A soit avantageusement utilisée, l'inversion de l'ordre d'élution est également possible. Les trois composants de thiopeptine A peuvent être chacun séparés en divisant 1'éluat en fraction et puis en déterminant les 5 valeurs de Rf de ces fractions. Tous les composants de thiopeptineA peuvent être cristallisés par concentration des fractions séparées, suivie de dissolution du concentré dans l'acétone. Contrairement aux trois composants, l'autre composant ne forme pas de matière cristalline dans les mêmes modes opératoires que ceux décrits ci-10 dessus. Cette fraction est à nouveau chromatographiée dans une colonne sur de l'acide silicique (vendu sous la marque déposée "Mallinckrodt" par la société dite Mallinckrodt Chemical Works), avec un système de solvants formé de chloroforme et de méthanol (de préférence 50 : 1 à 20 : 1 en volume), La cristallisation de 15 la thiopeptine B peut être obtenue en concentrant 1'éluat résultant pour former un résidu qui est alors dissous dans l'acétone chaude. La cristallisation peut être réalisée en refroidissant la solution jusqu'en dessous de 10°C. Les exemples suivants illustrent la production de culture d'en-20 semencement, la production de thiopeptine et l'isolement des composants de thiopeptine, mais ne sont pas donnés à titre de limitation. EXEMPLE 1 Production de la culture d'ensemencement Le produit d'inoculation à utiliser pour produire la culture 25 d'ensemencement a été obtenu en faisant croître du Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 sur une plaque d'agar-agar pendant 4 jours, à 30°C. La culture d'ensemencement peut être produite en ensemençant le produit d'inoculation ainsi obtenu sur un dispositif incliné rempli d'agar-agar de Bennett, et puis en soumettant 1'agar-agar 30 à l'incubation pendant 7 jours à 30°C. Cette culture d'ensemencement a été utilisée pour des procédés de fermentation tels que décrits ci-dessous. EXEMPLE 2 Production de thiopeptine 55 A - Fermentation, 1. Une culture d'ensemencement de Streptomyces tateyamensis ATCC 21389* obtenue dans l'exemple 1, a été inoculée sur un milieu stérile contenant, dans 100 ml d'eau, les ingrédients suivants : Composants du milieu % 40 Amidon de pomme de terre .... 2,0 bad original 69 19383 7 2010751 Farine de graines de coton* 2,0 Liqueur de maïs macéré 1,0 Carbonate de calcium 0,3 Phosphate diacide de potassium 2,18 5 Phosphate acide disodique, 12 H^O .... 1,43 *) Cette farine utilisée ci-dessus et ci-dessous est vendue sous la marque déposée "Pharmame-dia" par la Société dite Traders Protein Division of Traders Oil Mill Company. Le bouillon ensemencé a été soumis à l'incubation pendant deux 10 jours à 30°C. Cette culture a été transférée dans un dispositif de fermentation inoxydable de 30 litres, contenant 20 litres du milieu. Le dispositif de fermentation stérile a été soumis à l'incubation à 30°C pendant 48 heures par passage de 20 litres d'air stérile par minute sur un dispositif d'agitation rotatif, 15 fonctionnant à 300 tours par minute. 2. La fermentation a été conduite dans les mêmes conditions et avec les mêmes modes opératoires que ceux décrits ci-dessus dans l'exemple 2-1, en utilisant un milieu stérile contenant, dans 100 ml d'eau, les composants suivants : 20 Composants du milieu % Amidon de pomme de terre 4,0 Farine de graines de coton*.... 2,0 Liqueur de maïs macéré 1,0 Levure sèche 1,0 25 Carbonate de calcium 0,3 Phosphate diacide de potassium 2,l8 Phosphate acide disodique, 12 H20 .... 1,43 N-acétyl-DL-méthionine 0,17 3. La fermentation a été également conduite dans les mêmes condi-30 tions et par les mêmes modes opératoires que ceux décrits ci-dessus dans l'exemple 2-1, en utilisant un milieu contenant, dans 100 ml d'eau, les composants suivants : Composants du milieu $ Amidon de pomme de terre 2,0 35 Farine de graines de coton*.. 2,0 Liqueur de maïs macéré 1,0 Levure sèche 1,0 Carbonate de calcium 0,3 Phosphate diacide de potassium ....... 2,l8 Phosphate acide disodique, 12 H2O .... 1,43 40 Sulfate de sodium 0,5 BAD ORIGINAL 69 19383 8 2010751 B - Récupération 1. La récupération de la thiopeptine a été conduite en filtrant le bouillon de culture et en extrayant 1,8 kilogramme de gâteau de mycélium obtenu avec 7 litres d'un mélange de chloroforme et de ^ méthanol (2 : 1 en volume), tout en chauffant le mélange à 50°C. Ce mode opératoire d'extraction a été répété 3 fois et l'extrait combiné a été filtré. La concentration du filtrat a été amenée à sec et le résidu a été dissous dans 200 ml de chloroforme. L'addition de 200 ml de benzène a formé un précipité qui a été 10 retiré par filtration de la solution de mélange. Le résidu, obtenu par concentration du filtrat résultant, a été dissous à peu près dans 10 fois la quantité de n-hexane pour former une matière cristalline composée des quatre composants de thiopeptine. 2. La thiopeptine a été obtenue en filtrant le bouillon de culture 15 et en extrayant le gâteau de mycélium ainsi obtenu'avec de l'acétone. L'extrait acétoniaue a été concentré pour former un résidu qui a été à nouveau extrait à l'acétate d'éthyle. La thiopeptine cristalline brute a été produite en concentrant l'extrait résultant et en refroidissant le produit. 20 EXEMPLE 3 Isolement du complexe de thiopeptine A La thiopeptine brute a été chromatographiée dans une colonne sur du gel de silice en utilisant un système de chloroforme et de méthanol ( 50 : 1 en volume). L'éluat a été concentré à sec, et le 25 complexe de thiopeptine A, sous forme de poudre brune, a été produit en dissolvant le concentré dans de l'acétone et en refroidissant le mélange en dessous de la température ambiante. EXEMPLE 4 Isolement de la thiopeptine Ai 30 Les poudres impures obtenues dans l'exemple ont été adsorbées sur du gel de silice dans un chromatogramme sur colonne. Après lavage au chloroforme, l'élution avec un système de solvants formé de chloroforme et de méthanol suivant un rapport en volume de 50 i 1 a été réalisée, et l'éluat a été concentré jusqu'à former un rési-35du qui a été dissous dans l'acétone. Alors qu'on a laissé reposer la solution tout en refroidissant, la thiopeptine Ai a été cristallisée. On l'a alors rassemblée par filtration. EXEMPLE 5 Isolement de la thiopeptine A2 et de la thiopeptine A^ f ^ 40 La thiopeptine A? et la thiopeptine A^ ont été cristallisées bad original 69 19383 9 2 u *i 0 7 51 par le même mode opératoire que celui utilisé dans l'exemple 4. EXEMPLE 6 Isolement de la thiopeptine B Après avoir élué le complexe de thiopeptine A avec un système 5 de solvants 50 : 1, le changement du rapport en volume du même système de solvants a été effectué pour développer la bande aàsorbée de thiopeptine B. On a employé le rapport en volume de 9 î"1. La thiopeptine B a été récupérée en concentrant l'éluat résultant pour former un résidu qui a été dissous dans le chloroforme et à nouveau 10 chromatographié sur colonne sur de l'acide silicique (vendu sous la marque déposée "Mallinckrodt" par la Société dite Mallinckrodt Chemical Works), avec un système de chloroforme et de méthanol (50 : 1 en volume). La thiopeptine cristalline B a été obtenue en concentrant l'éluat jusqu'à former un résidu qui a été dissous 15 dans l'acétone. La solution a été refroidie jusqu'à une température inférieure à 10°C pour induire la précipitation. La thiopeptine formée B a été rassemblée par filtration. o* Les composants de thiopeptine ainsi obtenus ont tous des propriétés physiques et chimiques sensiblement communes. Ces compo-20 sants de thiopeptine sont chacun solubles dans le dioxane, le dimé-thylsuifoxyde, la diméthylformamide, la pyridine, le chloroforme et l'acide chlorhydrique 3 N; légèrement solubles dans le méthanol, l'acétone et l'acétate d'éthyle ; insolubles dans l'éther, le benzène, le n-hexane, l'éther de pétrole et l'eau. Cet antibiotique 25. présente une réaction positive dans le test au permanganate et une réaction négative dans les tests à la ninhydrine, au biuret, de Fehling, au chlorure ferrique, d'Erlich et de Dragendorff. Les composants de thiopeptine sont tous stables à 60°C pendant une heure, dans une gamme de pH d'environ 2,0 à environ 8,0. 30 En outre, on indique'dans ce qui suit les propriétés physiques ; et chimiques de la thiopeptine Ai, de la thiopeptine A2, de la thiopeptine A3 et de la thiopeptine B. Thiopeptine Ai La thiopeptine Ai est une matière cristalline jaune.paie, ayant 35 des points de fusion ou de décomposition compris entre environ 223°C et environ 226 °C. Le pouvoir rotatoire optique de cette fraction est : | Le produit a un poids moléculaire de 1637, tel que déterminé par 40 le procédé de tension de vapeur et présente l'analyse élémentaire gAD ORIGINAL 69 19383 201075! suivante * C = 49,38 1 H = 4,93 ; N = 14,22 ; S = 11,72. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la thiopeptine A 1 dans, le méthanol présente des épau.ie;nents ou plateaux entre 5 230 et 250 m»!., à 295 mjjt et à 305 mpt, comme on le représente sur la figure 2 dans laquelle on porte en abscisses la longueur d'onde en millimicrons et en ordonnées E • Sur la figure 5, dans la- 1cm quelle on porte en abscisses inférieures le nombre d'ondes en cm. et en abscisses supérieures la longueur- d'ondes en microns, le 10 pourcentage de transmission étant porté en ordonnées, le spectre dans 1'infra-rouge dans une pâte de Nujol présente des bandes d'absorption aux fréquences suivantes : 3400, 3530, 3150, 1718, 1655, 1585, 1508, 1492, 1338, 1305, 1275, 1245, 1205, 1160, 1135, 1123, 1113, 1092, 1065, 1028, 1002 / 973 , 950 , 923, 893, 850, 820, 15 805, 765, 723 cm . On détermine que la thiopeptine A^ hydrolysée avec l'acide chlorhydrique 6N à 100°C, comprend, en tant que composants d'aminoacide, par exemple, la valine, la cystine, la thréo-nine et la proline, par le test à la ninhydrine. Thiopeptine A2 20 La thiopeptine A2 est une matière cristalline jaune pâle. Thiopeptine a3 La thiopeptine A5 est une matière cristalline jaune pâle, ayant des points de fusion ou de décomposition compris entre environ 232°C et environ 23ô°C ; elle présente un pouvoir rotatoire 25 optique comme suit : {jjQ f = -10,8 (c=l dans.le chloroforme). Le poids moléculaire de ce composant est 1972, tel que déterminé par le procédé de tension de vapeur et le produit présente l'analyse élémentaire suivante : 30 C = 48,45 ; H = 5,11 ; N =14,46 ; s ^ 12,09. La figure 3, sur laquelle on porte en abscisses la longueur d'ondes en millimicrons et en ordonnées E . est le spectre d'absorption lcm' dans l'ultra-violet de cette fraction dans le méthanol, présentant des épaulements ou plateaux entre 235 et 255 ray,,- entre 285 rry. et 35 300 myu et entre302 et 310 myi. La figure 6, sur laquelle on porte en abscisses inférieures le nombre d'ondes en cm-1, en abscisses supérieures la longueur d'ondes en microns et en ordonnées le pourcentage de transmission, est le spectre d'absorption"dans l'infra-40 rouge dans une pâte de Nujol, présentant des bandes à : .3386, 3320, BAD ORIGINAL 69 19383 ii 201075î 1725, 1655, 1583, 1518, 1490, 1305, 1210, 1160, 1130, 1115, 1090, 1070, 1028, 1000, 945, 920, 890, 860, 765, 720, 710 cm"1. Thiopeptine B La thiopeptine B est un composant principal de la matière cristalline jaune pâle, ayant des points de fusion ou de décomposition à environ 219°C et à environ222°C ; elle présente un pouvoir rota-toire optique comme suit : Kl 23 = -800 (c = 1 dans le chloroforme) D Le poids moléculaire de ce composant est 1942, tel que déterminé par 10 le procédé de tension de vapeur et il présente l'analyse élémentaire suivante : C = 49,26; H = 5,16 î N = 14,35 ; S = 10,68. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la thiopeptine B dans le méthanol, tel que représenté sur la figure 4 sur laquelle on porte I/O 15 en abscisses la longueur d'ondes en millimicrons et en ordonnées E icra» présente des épaulements ou plateaux entre 230 m^fc et 250 my., à 295 et à 305 raji. La figure 7 est le spectre d 'absorption dans l'infra-rouge de cette fraction dans une pâte de Nujol et le spectre présente des bandes d'absorption maxima aux fréquences suivantes : 20 3400, 3300, 3160, 1735, 1685, 1660, 1650, 1640, 1585, 1510, 1485, 1335, 1305, 1270, 1250, 1240, 1205, 1165, 1130, 1120, 1110, 1095, 1070, 1025, 1005, 975, 950, 930, 895, 820, 765, 725, 705 cm"1. L'activité antimicrobienne de la thiopeptine A^ , de la thiopeptine A3 et de la thiopeptine B a été testée . Dans ces tests, dont 25 les résultats sont donnés dans le tableau 2, l'activité de ces composés est exprimée sous forme de leur concentration d'inhibition minima. La concentration d'inhibition minima a été déterminée par le procédé ordinaire de dilution d'agar-agar contre un grand nombre de microorganismes. Les concentrations d'inhibition minima sont 30 exprimées par la concentration de composés en j*g/ml qui a inhibé la croissance de l'organisme. TABLEAU 2 Concentration d'inhibition minima des composants de thiopeptine. 35 Organismes : Thiopeptine Thiopeptine Thiopeptine A 1 ■ A .3 b Staphylococcus ~ aureus 209P 0,10 0,25 0,1Ç) 40 Bacillus subtilis 0,10 ~ 0,25 0,05 69 19383 12 2010751 Bacillus megaterium Sarclna lutea Corynebacterium 0,10 0,05 0,05 o , 25 0,06 0,25 0,05 0,025 0,01-, xerosis 5 Escherlchia coll Proteus vulgaris Pseudomonas >100,0 >100,0 >100,0 >100,0 >100.0 >100,0 >100,0 >100,0' >100,0 aeruginosa Mycobacterium > 100,0 8,0 50,0 10 SP-607 Mycobacterium phlel 50,0 32,0 50,0 Pour déterminer la toxicité aiguë des composants de thiopeptine chez les souris, une suspension à 5 % de l'antibiotique dans la carboxyméthylcellulose sodique a été diluée avec de l'eau distillée 15 et administrée par voie intrapéritonéale dans les souris. Les DL^q de la thiopeptine Ai, de la thiopeptine A3 et de la thiopeptine B ont été trouvées respectivement supérieures à 500, 250 et 250 mg/kg. La thiopeptine ayant les propriétés indiquées ci-dessus peut être avantageusement utilisée comme additif renforçant la crois-20 sance dans des produits alimentaires pour animaux, tels que les porcs et la volaille. Pour cette utilisation, les composants de thiopeptine utilisés comme compositions alimentaires pour animaux peuvent être de préférence utilisés sous des formes moins pures de ces composants, telles que le gâteau de mycélium séché brut, conte-25 nant les thiopeptines obtenues après filtration du mycélium à partir de l'effluent du dispositif de fermentation. Le gâteau de mycélium contenant les thiopeptines peut être maintenu aussi sec que possible pour conserver sa puissance et, lorsqu'on le mélange avec des rations adéquates au point de vue nutrition, la ration doit 30 avoir une faible teneur en eau. On peut également utiliser quatre composants de thiopeptine, seuls ou en combinaison, sous forme de suppléments d'aliments pour animaux. Les composants des thiopep- . tines, seuls ou en combinaison ou sous forme àe gâteVu de mycélium, peuvent être mélangés avec des rations ordinairement*utilisées dans 35 l'alimentation pour animaux. La proportion de cet antibiotique, qui peut être incorporée dans des compositions alimentaires pour animaux, peut être modifiée dans une gamme très large selon, entre " autres choses utiles dans les animaux en cours de croissance, les propriétés de l'antibiotique et les propriétés désirées dans les 40 compositions résultantes. Lorsque des poulets 13 u iy/3il 69 19383 / ou des porcs ont été alimentés par cet antibiotique, à des niveaux compris entre environ 0,1 p-.p.m.,et environ 100 p.p.râ. ou entre environ 10 p.p L'exemple suivant illustre l'effet des composants de thiopep-20 tine A et de la thiopeptine B seule sur la croissance et l'efficacité alimentaire dans la volaille. EXEMPLE 7 On a réparti des poulets, en cinq groupes de 40 poulets., chacun sur une base, égale en poids.. Les poids individuels et les consomma-25 tions alimentaires des groupes ont été enregistrés toutes les deux semaines. Les six groupes soumis au traitement étaient formés de deux groupes de contrôle et de quatre groupes expérimentaux. Le. groupe de contrôle a été alimenté par la ration de base. Les quatre groupes expérimentaux ont été alimentés par la ration de base mélan-30 gée avec un mélange à 50 g "et 200 g par tonne, respectivement, des ^composants de thiopeptine A et de la thiopeptine B. Les composants de thiopeptine A utilisés étaient les produits obtenus dans l'exemple 3. La thiopeptine B était celle obtenue dans l'exemple 6. Les composants de thiopeptine A et la thiopeptine B seule 35 étaient efficaces pour renforcer la croissance et ont'produit une amélioration de gain et d'efficacité alimentaire. Les résultats expérimentaux sont résumés dans les tableaux 3 et 4. L'exemple suivant illustre l'effet de la thiopeptine en combinaison avec les composants des thiopeptines A et de la thiopep-40 tine B et sous forme de gâteau de mycélium pour traiter la volai-Lie. 1A0 QRfC" 69 193b3 14 2010/s Des poulets ont été répartis en cinq groupes.de. -traitements de 36 poulets, chacun sur une base égale en poids. Des poids individuels et des consommations alimentaires par groupe - ont été enre-5 3j.3tré>3 toutes les dsux semaines. Les cinq groupes de traitement ont été alimentés par la ration de hase seule comme contrôle, le complexe de thiopeptine en quantité égale à 25 g et 100 g par tonne de la ration de base, respectivement, et la ration de base mélangée avec 25 g et 100 g par tonne, respectivement, du gâteau 10de mycélium. _ L'addition de thiopeptine, en combinaison et sous forme de gâteau de mycélium à la ration, a entraîné une augmentation de gain quotidien moyen et une amélioration d'efficacité alimentaire durant la période expérimentale telles que résumées dans le tableau 5« 15 L'exemple suivant illustre l'effet de la thiopeptine, sous forme de combinaison des composants de la thiopeptine, chez les porcs. EXEMPLE 9 Des porcs ont été répartis en trois groupes expérimentaux de 20 6 porcs, chacun sur une base égale en poids. Les poids individuels et les consommations alimentaires par groupe ont été enregistrés toutes les deux semaines. Les groupes de traitements comprenaient un mélange de tous les composants de thiopeptine pour un rapport en poids de 200 g et de 1000 g par tonne. La période expérimentale était de six semaines. L'addition des composants de thiopeptine produit une amélioration du gain quotidien et de l'efficacité alimentaire pendant la période de six semaines. Les résultats expérimentaux sont présentés dans le tableau 6. TABLEAU 3 ■ - Ration Thiopeptine A de base (5.PPm) (20 ppm) Poids initial moyen . (grammes) 36,80 36,80 36,80 Poids final moyen (grammes) 627.08 666,66 659,57 Gain moyen bi-hebdomadaire (grammes) 0-2 semaines 201,05 237,85 213,40 2-4 semaines 389,23 398,37 409,37 bad original 69 19383 15 2010751 Grammes d'alimentation/ Gramme de gain 0-4 semaines 1,82 1,80 1,78 TABLEAU 4 Ration de base Poids initial moyen (grammes) 10 Poids final moyen (grammes) Gain moyen bi-hebdomadaire (grammes) 0-2 semaines 15 2-4 semaines Grammes d'alimentation/ Gramme de gain 0-4 semaines 20 25 Poids initial moyen (grammes) Poids final moyen (grammes) Gain moyen bi-hebdoma-30 daire (grammes) 0-2 semaines 2-4 semaines 55 Grammes d'alimentation/ Gramme de gain 0-4 semaines 37,00 614,63 200,85 376,78 1,80 TABLEAU 5 . Thiopeptine B (5 ppm) (20 ppm) 37,00 37,00 629,16 637,50 215,29 217,79 376,87 382,71 1,74 1,79 Ration Thiopeptines Gâteau de de A + B Mycélium Ba se (2,5PPP)(1Oppm) (2,5ppm)(lOppm) 57,7 37,7 37,7 37,7 ,37,7 549,3 583,4 580,7 577,1 579,6 193>9 195,9 199,0 204,4 199,0 307,7 349,8 344,0 334,7 342,9 1,97 1,89 1,89 1,88 1,87 69 193Ô3 16 2010751 10 15 Poids moyen, initial (kg) Poids final moyen (kg) . Gain moyen (kg) 0-4 semaines 4-6 semaines Kg d'alimentation/ Kg de gain 0-6 semaines TABLEAU 6 Ration de base 19,75 44,42 15,72 8,92 2,91 Thiopeptines A + B (20 ppm) (100 ppm) 19,75 45,70 15,65 9,60 2,83 19,75 47,27 17,67 9,85 2,61 La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme 20 de 11 art. 69 19383 17 REVENDICATIONS 1. Une composition de produits dits thiopeptine, caractérisée en ce qu'elle comprend un premier composé, la thiopeptine A^ , qui a) est une substance cristalline jaune pâle ayant des points de fusioi 5 ou de décomposition compris entre environ 223°C et environ 226°C ;• b) est stable à 60° C pendant une heure dans une gamme de pH d'environ 2,0 à environ 8,0 ; c) est soluble dans le dioxane, le diméthylsuifoxyde, la diméthyl-formamide, la pyridine, le chloroforme et l'acide chlorhydrique 3N, 10 légèrement soluble dans le méthanol, l'acétone et l'acétate d'éthyle et insoluble dans l'éther, le benzène, le n-hexane, l'éther de. pétrole et l'eau ; d) a un pouvoir rotatoire optique = -71° (c =ï dans le chloroforme). B D 15 e) a une valeur de Rf de 0,78 dans un système de solvants formé de chloroforme et de méthanol suivant un rapport en volume de 10 : 1; f) a un poids moléculaire de 1637, tel que déterminé par le procédé de tension de vapeur ; g) présente l'analyse élémentaire suivante : 20 c; 49,38 ; H. 4,93 ; N. 14,22 ; S. 11,72 ; h) a un cliché de chromatogramme sur couche mince caractéristique, tel que présenté dans la figure 1 ; i) a un spectre d'absorption dans l'ultra-violet caractéristique, tel que présenté dans la figure 2 ; 25 j) a un spectre d'absorption dans 1'infra-rouge caractéristique, tel que présenté dans la figure 5 ; un second composé, la thiopeptine A 2 , qui : a) est une substance cristalline jaune pâle ; b) est soluble dans le dioxane, le diméthylsulfoxyde; la diméthyl-30 formamide, la pyridine, le chloroforme et l'acide chlorhydrique 3N, légèrement soluble dans le méthanol, l'acétone et l'acétate d'éthyle et est insoluble dans l'éther, le benzène, le n-hexane, l'éther de pétrole et l'eau, et c) a un valeur de Rf de 0,68 dans un système de solvants formé de chloroforme et de méthanol, suivant un rapport 35 en volume de 10 : 1 ; lin troisième composé, la thiopeptine A-j, qui : a) est une substance cristalline jaune pâle ayant des points de fusion ou de décomposition compris entre environ 232° C et environ 236° Cj 40 b) est stable à 60° C pendant une heure dans une gamme de pH em> opk^ 69 19383 ±8 201075e d'environ :?,0 à environ 8,0 ; g) esc soluble dans le dioxans, le diméthylsuifoxyde, la diméthyl-for-isamide, la pyr-idine, le chloroforme et l'acide chlorhydrique 3N, légèrement soluble dans le méthanol, l'acétone, - l'acétate d'éthyle et iiisolable dans l'éther, le benzène, le n-hexane, i'éther de pétrels ec l'eau ; d) a un pouvoir rotatcire optiqueJeÊl '' ~ -10,8° (c =1 dans le chloroforme ) i - • e) a une valeur deRfée G.cD f) a un poids moléculaire de 1972, tel que déterminé par le procédé de tension de vapeur ; g) présente l'analyse élémentaire suivante : C. 48,45 ; H. 5,11 ; N. 14,46 ; s. 12,09 ; 15 h) a un cliché de chromatogramme sur couche mince caractéristique, tel que présenté sur la figure 1 ; i) a un spectre d'absorption dans l'ultra-violet caractéristique tel que présent é sur la figure 3 î j) a un spectre d'absorption dans 1'infra-rouge caractéristique ,tel 20 que présenté sur la figure 6 ; et un quatrième composé, la thiopeptine B," qui : a) est une matière cristalline jaune pâle ayant des points de fusion ou de décomposition compris entre environ 219°C et environ 222°C ; b) est stable à 6o°C pendant une heure dans une gamme de pH d'envi-25 ron 2,0 à environ 8,0 ; c) est soluble dans le dioxane, le diméthylsulfoxyde, la diméth'yl-formamide, la pyridine, le chloroforme et l'acide chlorhydrique 3N, légèrement soluble dans lé méthanol, l'acétone et l'acétate d'éthyle et insoluble dans l'éther, le benzène, le n'-hexane, l'éther de pé- 30 trole et l'eau ; . .. d) a 'un pouvoir rotatoire optique [*{ |^ = -80° (c =1 dans le chloroforme) ; l- e) a une valeur de Rf de 0,19 dans un système de solvants formé de -chloroforme et de méthanol suivant un rapport en volume de "10 ï 1 ; 35 f) a un poids moléculaire de 1942, par un procédé de tension de vapeur g) présente l'analyse élémentaire suivante : C. 48,73 î H. 4,87 ; N. 14,30 ?" S. 11,04'j h) a un cliché de chromatogramme sur couche mince caractéristique 40^ tel que présenté sur là figure 1 ; BAD ORIGINAL 69 19383 19 2010751 i) a un spectre d'absorption dans l'ultra-violet caractéristique tel que présenté sur la figure 4 ; j) a un spectre d'absorption dans 11 infra-rouge caractéristique tel que présenté sur la figure 7. 5 2. Thiopeptine , thiopeptine Ag , thiopeptine A-j et thiopeptine B ayant les caractéristiques présentées dans la revendication 1, obtenues à titre de produits industriels nouveaux. 3. Composition de thiopeptine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sous des formes diluées ou sous forme 10 essentiellement pure. 4. Procédé de production d'une composition de thiopeptine, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche de Streptomyces tateyamensis ATCC 21389, dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies immergées jusqu'à ce que sensiblement toute 15 l'activité antibiotique soit transmise au milieu par la production de la thiopeptine. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver le Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone et une 20 source d'azote, jusqu'à ce que l'activité antibiotique substantielle soit transmise au milieu par la production de thiopeptine, et à récupérer la thiopeptine à partir du milieu. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en.ce qu'un composé de soufre est ajouté au milieu nutritif aqueux. 25 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé de soufre est la N-acétyl-DL-méthionine. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé de soufre est le sulfate de sodium. 9» Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que 30 la fermentation est réalisée à une température comprise entre environ 20aC et environ 37°C, pendant une période d'environ 2 jours à environ 6 jours. 10. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce*que la souche produisant la thiopeptine est le Streptomyces tateyamensis 35 ATCC 21389. 11. Composition à utiliser comme supplément alimentaire pour animaux, caractérisée en ce qu'elle comprend de la thiopeptine et une ration de base pouvant être utilisée comme aliment pour ani- 40 maux. 69 19383 20 2QT-Q751 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que la thiopeptine, telle qu'indiquée dans la revendication 1, est administrée aux animaux à des niveaux compris entre 0,1 ppm et 500 ppm. 5 13. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que le supplément alimentaire pour animaux est la thiopeptine ou la thiopeptine A2 ou la thiopeptine A-^ ou la thiopeptine B. 14. Procédé d'amélioration du taux de croissance des animaux, caractérisé en ce que les animaux sont alimentés par une certaine 10 quantité de la composition indiquée dans la revendication 11, efficace pour améliorer le taux de croissance. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les animaux sont alimentés par le gâteau de mycélium. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il 15 consiste à administrer une certaine quantité de la composition indiquée dans la revendication 13.