Brevet FR2003809A1 — publié le 19691114

La L-iso-leucine est un amino-acide essentiel et est précieuse comme aliment pour llhomme et les animaux. Il est possible, par exemple, d'augmenter la valeur alimentaire des protéines par addition de L-iso-leucine. 5 Les premiers chercheurs ont signalé que la L-iso- leucine peut être préparée par fermentation en utilisant un miliei de culture constitué principalement par des saccharides. En outre on a signalé le remplacement des saccharides par des hydrocarbure.' moins coûteux (brevet EUA 3 222 25Ô) mais on a signalé qu'il se 10 formait seulement des quantités très faibles de L-iso-leucine dans le milieu de culture (environ 2,2 mg/l selon les exemples du brevet sus-mentionné). Les procédés en question ne conviennent donc pas pour la production industrielle de la L-iso-leucine. La demanderesse a découvert que la L-iso-leucine 15 peut être préparée avec un bon rendement en cultivant un microorganisme assimilant les hydrocarbures dans un milieu de culture contenant un hydrocarbure comme source principale de carbone et, en plus, de l'acids a-aminobutyrique, de l'acide hydroxybutyriquej de la thréonine ou des mélanges ou des sels non toxiques de ces 20 produits. On peut utiliser tout micro-organisme assimilant un hydrocarbure susceptible de produire de la L-iso-leucine pour atteindre les objectifs de la présente invention. Les microorganismes susceptibles de produire de la L-iso-leucine selon le 25 procédé de l'invention font partie de divers genres, mais des micro-organismes particulièrement appropriés font partie des genres ci-après : Corynebacterium. Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus. Pseudomonas. Candida. Nooardia, Streptomyces, etc. L'action et le rôle de l'acide a-aminobutyrique, ^ l'acide a-hydroxybutyrique, la thréonine ou des mélanges de celle-ci ne sont pas suffisamment connus pour établir s'ils agissent comme support pour la préparation de la L-iso-leucine. Même s'ils agissent comme support, la présente invention envisage l'utilisation de sources d'hydrocarbures, moins coûteuses que celle 35 utilisés classiquement dans le même but et conduit ainsi à un procédé plus facilement utilisable industriellement. 69 07103 2 2003809 L'effet de l'addition d'acide a-aminobutyrique â un milieu de culture contenant des hydrocarbures pour la préparation de la L-iso-leucine par fermentation a été établi en utilisant une souche productrice de L-iso-leucine appartenant 5 au genre Corynebacterium hydrocarboclastus. On ajoute de l'acide a-aminobutyrique dans la proportion indiqués au tableau X à chaque fois à 10 ml d'un milieu de culture contenant un mélange de n-alcanes .(C^-C.^) (2 g/dl), NH^Cl (0,34 g/dl), KH^O^ (0,16 g/dl), MgS04,7H20 (0,05 g/dl), NaCl (0,2 g/dl), de 10 chlorhydrate de thiamine (50 mg/l) et ayant un pH de 7,2. Après avoir introduit de l'acide a-aminobutyrique dans les milieux de culture, chacun de ces milieux a été placé dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml. Ces milieux ont été stérilisés à 115°C pendant 10 mn. Chaque milieu a été ensuite 15 inoculé par la souche sus-mentionnée et cultivé pendant 96 h à 30°C en agitant (230 tr/mn) avec un agitateur classique pour obtenir la quantité de L-iso-leucine figurant sur le tableau I. Il est manifeste d'après ce tableau que la production de L-iso-leucine est considérablement accrue par addition d'acide 20 a-aminobutyrique. TABLEAU I Addition d'acide a- Quantité de L-iso-leucine aminobutyrique formée en mg/l mg/ml 25 0 1 200 10 4600 30 4700 30 La quantité d'acide a-aminobutyrique ajoutée à un milieu de culture donné variera suivant le type de micro-organismei utilisé, la composition du milieu et sa concentration etc. mais 32 il est recommandé d'utiliser 0,5 à 50 g/l. On a également observé des phénomènes semblables à ceux indiqués sur le tableau I quand on ajoute de l'acide a—hydroxybutyrique, de la thréonine ou des mélanges de ceux—ci au milieu de culture. 69 07103 3 2003809 Tout milieu synthétique ou naturel contenant de l'acide a-aminobutyrique, de l'acide a-hydroxybutyrique, de la thréonine ou des mélanges ou bien des sels non toxiques de ces produits et des quantités appropriées d'hydrocarbures assimilables 5 comme source de carbone principale, une source d'azote, des matières minérales et d'autres aliments nécessaires pour la croissance des micro-organismes employés peut être utilisé pour atteindre l'objectif de l'invention® On peut employer comme hydrocarbures dans le milieu 10 de culture divers hydrocarbures assimilables tels que le kérosène, l'essence, l'huile lourde, le butane, l'essence lourde, la ligroïne, le gaz naturel, le propane, l'éthane, le méthane etc. On peut employer comme source d'azote des composés de l'azote,organiques ou minéraux tels que l'urée, les nitrates, 15 l'ammoniaque et les sels d'ammonium par exemple le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etc. On peut également employer diverses autres substances contenant de l'azote, par exemple des peptones, de l'extrait de viande, de l'extrait de levure, une 20 liqueur obtenue par macération de graines, un hydrolysat de caséine, de la farine de poisson ou de soya etc» Ces substances peuvent être utilisées isolément ou en mélange avec d'autres» On peut citer parmi les substances minérales qui peuvent être introduites dans le milieu de culture : KgHPO^, 25 Kî^PO^, le sulfate de magnésium, le sulfate de zinc, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium etc. De plus on peut ajouter des vitamines, des amino-acides et des bases etc. au milieu de culture suivant les caractéristiques des micro-organismes utilisés. 30 La fermentation doit être exécutée en présence d'air, par exemple par aération, agitation etc. La température de culture est de préférence comprise entre 20 et 40 °C. Le pH du milieu peut varier mais il est recommandé d'ajuster ce pH aux environ de 7 avec un"acide ou une base. 35 Les exemples ci-après sont uniquement explicatifs mais non limitatifs de l'invention : 69 07103 4 2003809 EXEMPLE 1 On exécute une fermentation en utilisant un milieu de culture contenant un mélange de n-alcanes, (C^-C^) (1 g/dl), (NH4)2S°4 (2 g/dl), KH2P04 (0,02 g/dl), NaHPO^ (0,2 g/dl), 5 MgSO^ , 7H20 (0,1 g/dl), FeS04 , 7H20 (0,001 g/dl), MnSO^ , 4H£0 (0,001 g/dl), ZnSO^ , 2H20 (0,001 g/dl), thiamine (1 mg/l) de l'extrait de levure (0,3 g/dl); CaCO-j (2 g/dl) et 10 mg/ml d'acide DL - a -arainobutyrique avec un pH de 7,4* Dix fractions de 10 ml de ce milieu ont été placées séparément dans de grands tubes à 10 essai et inoculés chacun avec des micro-organismes figurant au tableau 2. La fermentation a été exécutée à 30°C pendant 96 h en agitant afin d'obtenir la quantité de L-iso-leucine figurant au tableau H. Dans des conditions de culture semblables, mais en l'absence d'acide DL-a-aminobutyrique, on n'obtient pas de gran-15 des quantités de L-iso-leucine, sauf avec le Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592) (50 mg/l). La L-iso-leucine obtenue est récupérée en utilisant de manière connue une résine échan-geuse d'ions. 20 25 TABLEAU II Micro-organisme Quantité de L-iso-leucine produite (g/l) Arthrobacter hydrocarboglutamicus 1,00 (ATCC.15503) Micrococcus paraffinoliticus (ATCC 15582) 1,55 Corynebacterium hydrocarboclastus 1,50 (ATCC 15592) 30 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 7700) 0,10 Pseudomonas Vendoreli (IF0 3899) ' 0,05 Candida tropicalis (IAM 4924) "0,40 Candida lipolytica (IFO 0746) 0,10 35 Necardia globerula (ATCC 21022) 0,20 Streptomyces antibioticus (ATCC 10382) 0,30 69 07103 5 2003809 10 25 30 35 EXEMPLE 2 Les micro-organismes figurant sur le tableau 3 sont cultivés d,une manière semblable à celle décrite dans 1?exemple 1, sauf quTon utilise 5 mg/ml dfacide DL-a-hydroxy-butyrique à la place de lfacide a-aminobutyrique. Les résultats obtenus figurent sur le tableau III. TABLEAU III Micro-organisme Quantité de L-iso-leucine produite en g/l Micrococcus paraffinoliticus (ATCC 15582) 0,50 Micrococcus paraffineus (ATCC 15589) 0,25 Corynebacterium hydro carb o cla stus (ATCC 15592) 0,75 ^ Nocardia globerula (ATCC 21022) 0,30 20 Une culture semblable à celle décrite ci-dessus est réalisée sans ajouter au milieu de l'acide a-hydroxybutyrique. On n,observe pas la formation d*une quantité importante de L-iso-leucine, sauf avec le Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592) (50 mg/l). EXEMPLE 3 Une culture semblable à celle décrite dans 1iexemple 1 est réalisée avec les micro-organismes figurant au tableau IV, sauf que 1*acide BL-a-aminobutyrique est remplacé par 5 mg/ml de D-thréonine. Une culture semblable à celle décrite ci-dessus est réalisée sans ajouter au milieu de la D-thréonine. Il ne se forme pas de quantité appréciable de L-iso-leucine, sauf avec le Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592) (50 mg/l). T A B L B A U IV Micro-organisme Quantité de L—iso— leucine produite en g/l Arthrobacter hydrocarboglutamicus (ATCC 15583) 0,15 Micrococcus paraffinoliticus (ATCC 15582) 0,25 Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592) 0,25 Fseudomonas vendoreli (IF0 3899) 0,10 69 07103 2003809 10 RYKMPT.K lh Les micro-organismes figurant au tableau V sont cultivés dTune manière semblable à celle décrite dans lTexemple 1 sauf que la L-thréonine (10 mg/l) est substituée à 1*acide a-aminobutyrique pour obtenir les résultats figurant sur le tableau 5. Une culture semblable à celle décrite ci-dessus est réalisée sans addition de L-thréonine aux divers milieux. Il ne se forme une quantité importante de L-iso-leucine qu'avec le Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592) (50mg/l). TABLEAU Y Micro-organisme Quantité de L-iso- leucine produite en g/l Arthrobacter hydrocarboglutamicus (ATCC 15583) 0,25 Micrococcus paraffinoliticus (ATCC 15582) 0,25 Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592) 0,30 Pseudomonas vendoreli (IFO 3899) 0,10 20 Nocardia globerula (ATCC 21022) 0,10 Bretibacterium Retoglutamicum (ATCC15587) 0,20 15 Une culture de chaque micro-organisme identifié 2^ par son numéro de 1,ATCC (American Type Culture Collection) et de l'IAM (Institute of Applied Microbiology, Université de Tokyo) a été déposée à l'organisme ci-dessus pour être sans restriction à la disposition du public. 69 07103 7 2003809 REVENDICATIONS 1„ Procédé de préparation de la L-iso-leucine par fermentation, caractérisé en ce qu'on cultive en présence d'air un micro-organisme assimilant les hydrocarbures dans un milieu de culture contenant un hydrocarbure comme source de carbone 5 principale et de l'acide a-aminobutyrique, de l'acide a-hydroxy-butyrique, de la thréonine ou des mélanges ou des sels non toxiques de ces produits et en ce qu'on récupère la L-iso-leucine formée à partir dudit milieu de culture# 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en 10 ce que ledit micro-organisme est choisi dans le groupe suivant : Corynebacterium, Brevibacterium. Arthrobacter, Micrococcus. Pseudomonas, Candida. Nocardia et Streptomyces. 3. . Procédé se-lon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Arthrobacter hydrocarboglutamicus 15 ATCC 15583. 4. Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Micrococcus paraffinoliticus ATCC 15582. 5. Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est C o ryneba et e r ium hydro carbo clastus 20 ATCC 15592. 60 Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Pseudomonas aeruginosa ATCC 7700. 7« Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Pseudomonas vendoreli ATCC 7700 25 8o Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Candida tropicalis IAM 4924» 9. Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Candidalipolytica IF0 0746. 10. Procédé selon la revendication 2 dans lequel 30 ledit micro-organisme est Nocardia globerula ATCC 21022. 11. Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Strept-omvces antibioticus ATCC 1038£ 69 07103 8 2003809 12» Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est Micrococcus paraffineus ATCC 15589 13 » Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la température dudit milieu de culture est maintenue entre 5 20 et 40°C. 14. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le pH dudit bouillon de culture est maintenu à 7 environ. 15. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit milieu de culture contient une source d,azote, une matière miné- 10 raie et des substances nutritives. 16» Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit micro-organisme est le Brevibacterium Retoglutamicum ATCC 15587.