Brevet FR2011807A1 — publié le 19700313

La présente invention concerne un composé stérolique doté d'activités anti-inflammatoires et un procédé de préparation de ce dernier. Selon un premier mode de mise en oeuvre du procédé suivant l'invention, on obtient le composé stérolique doté d'activités anti-inflammatoires au moyen d'un procédé d'oxydation de l'estrone à partir duquel on obtient un groupe de composés qui,.pris séparément ou en combinaisons, sont dotés d'activités pharmacologique anti-inflammatoire; selon un deuxième mode de mise en oeuvre, on l'obtient par voie d'extraction à partir du gas de citron et d'un complexe flavonoïde; et selon un troisième mode de mise en oeuvre, on l'obtient par voie enzymatique à partir de la testostérone. Par conséquent, on décrira d'abord la technique: de préparation du compos ou des composés dotés d'activité anti-inflammatoire à partir de l'estrone au moyen d'un traitement oxydant et ensuite la technique d'extraction ê partir de produits que l'on trouve à l'état naturel et finalement, la méthode d'obtention par action enzymatique. Exemple d'un procédé de préparation de composés st éroliques & BR On dissout 1 g d'estrone dans 100 ml d dtOthanol chaud; et on ajoute & cette solution 150 ml de H202 à 120 vol. et 2 ml d'anhydride acétique. On introduit le tout dans un ballon muni d'un agitateur mécanique à une température de 50 -60 C (122.0 -140.0 F). Dons le cas où, après l'addition de H202 une partie de l'estrone précipite, on ajoute de l'éthanol jusqu'à solubilisation complète. Le temps de séjour optimum du mélange dans de telles conditions est d'environ 4 heures. On a prévu, par conséquent, d'ajouter à l'échantillon soumis à la réaction d'oxydation, une base en une quantité permettant de maintenir le pH du mélange réactionnel aux environs de 5,5. En tant que base, l'utilisation de Ca(OH)2 à 0,017 M s'est avérée convenable. flans ces conditions, lorsque le temps de réaction s 'est écoulé, on épuise au moins trois fois par des quantités de benzine égales en volume0 On a constaté que l'on augmente la quantité de produit utile en effectuant des extractions supplié mentaires à partir des liqueurs mères. On réunit les diverses solutions benzèniques qu'on lave avec un volume égal d'eau distillée afin de séparer le H202 résiduel après quoi on les filtre sur du sulfate de sodium anhydre et les évapore sous pression réduite à une température d'environ 40 C (104.0 F). On dissout ensuite le résidu sec dans de éther éthylique dé- pourvu de peroxydes en une proportion de 35Q ml/10 g. d'estrone de départ0 On sépare la partie du résidu sec qui ne se solubilise pas en vue de la recycler0 On- évapore ensuite la solution d'éther éthylique sous vide et on dissout à nouveau le résidu solide dans da benzène en une proportion de 250 ml/10 g de l'estrone de départ. On sépare la partie insoluble et la recycle. On évapore ensuite le benzène et on reprend le résidu solide, provenant de l'évaporation du benzène, par de l'éther de pétrole (dont le point d'ébullition est compris entre 40 et 60 C) (104.0 - 140 F), (200 ml/10 g d'estrone de départ). On fait recycler la partie insoluble et le produit dissous, amené à siccité par évaporation du solvant sous vide, constitue la substance stérolique partiellement purifiée et fortement con centrée conforme à l'invention. En faisant recycler les résidus insolubles dans l'éther éthyli- que et le benzène, le rendement final du procédé réactionnel est de 10-15 % par rapport à l'estrone de départ. L'analyse chromatographique sur gel de silice en couche mince du produit recueilli, à l'aide d'une solution de chloroforme-ben- zène-acétate d'éthyle en des proportions de 2 : 5 : 5 en tant qu'éluant, indique que le nombre de composés dans " l'association est plutôt élevé, du fait que l'on note une pluralité de taches aux différents Rf, en utilisant comme révélateur de la couleur, la SbCl3 dans l'acide acétique, ou du H2SO4 à 50 %. Exemple d'un procédé de séparation de " l'association " sur colonne chromatographique. On utilise une colonne chromatographique d'un diamètre de 10 mm et d'une hauteur de 300 mm munie d'un diaphragme poreux Gz et d'un robinet compte-gouttes. On utilise comme absorbant un gel de silice Merck pour chromatographie, d'une dimension granulométrique inférieure ou égale à 0,08 mm. En tant qu'éluants on utilise : a) le benzène b) un mélange benzène méthanol dans les proportions respectives de 99,5-0,5 c) un mélange benzène méthanol dans les proportions respectives de 90-10. La vitesse d'élution est de 0,25 ml par minute. Le volume des fractions est de 3 ml. On effectue le lavage et l'activation du gel de silice de la manière suivante : on met en suspension 100 g de gel de silice dans 2000 mS d'acide acétique à 20 % et on maintient sous agita- tion pendant 24 heures. A la fin de cet intervalle de temps, on laisse l'adsorbant se déposer après quoi on le décante et lave à l'eau distillée jusqu'à obtention d'un pH de 6e On filtre ensuite le tout sous vide et active le gel de silice ainsi traité en le conservant dans l'étuve à une température de 110 C (230,0 F) pendant 24 heures. ta utilise le procédé suivant pour la préparation de la colonne chromatographique. On remplit la colonne chromatographique avec du benzène jusqu'à une hautour de 200 mm (hauteur totale 300 mm), et on y verse ensuite l'adsorbant activé de la manière décrite ci-dessus jusqu'à ce que l'on atteigne la hauteur prédéterminée de la colonne, égale à 300 mm. On laisse filtrer l'excès de benzène et on charge la colonne avec 20 mg du mélange de stéroïdes obtenu suivant le procédé décrit et dissous au préalable dans du chloroforme . Lorsque le ménisque inférieur de la solution chlorofbrmique se trouve au niveau du disque de papier-filtre, on verse soigneuse- ment le premier élément par le haut de la colonne et on attend la sortie du chloroforme situé au-dessus. Il est possible de suivre une telle étape en raison du fait que le chloroforme adsorbé ne se mélange pas avec le benzène à l'intérieur de la colonne mais y migre sous forme d'un anneau diaphane a A Ce stade, on commence à réunir les fractions séparées de la manière suivante : de 1 à 100 avec du benzine (éluant a) de 100 à 200 avec l'éluant (b), et de 200 à 225 avec l'éluant (c). On examine chaque fraction individuelle au spectophotomètre à une longueur d'onde de 280 m , en se basant sur l'éluant utilisé. On a tracé dans le graphique de la figure 1, les densités optiques observées ce qui donne le graphique d'élution. Pour chaque sommet significatif, on a effectué une chromatographie sur couche mince et on a procédé à l'examen du spectre ultraviolet - voir figures 2,3,4. L'efficacité d'extraction de la colonne chromatographique est de 95,4 % Essais biologiques et pharmaceutiques On a utilisé les produits obtenus pour mener les travaux de recherches biologiques suivants A) Essais d'activité anti-inflammatoire : Oedème de la patte du rat provoqué par la formaline. On effectue deux séries d'essais en utilisant des rats mâles pesant chacun 150 g. Dans la première série on utilise 20 rats divisés en deux sousgroupes de 10 chacun. On administre au premier sous-groupe, en injection sous-cutanée, 0,1 ml d'une solution de formaldéhyde, à 2 % dans a patte droite postérieure et dans la gauche 0,1 mi de sérum physiologique. On injecte au deuxième sous-groupe, une solution de l'association dans l'huile (alcool benzylique - huile d'arachide en un rapport de 1 : 9 > o En utilisant une dose de 4 mglkg de poids corporel et après une heure, on soumet le groupe entier au même traitement que celui décrit ci-dessus pour le premier sous-groupe.Chez les rats du premier sous-groupe, il se développe un oedème dans la patte traitée par le formaldéhyde, tandis que chez les rats du deuxième sous-groupe traités au préalable par le stérol on note une inhibition de l'oedème de 60 ç après deux heures, de 65 % et 60 % à partir de la cinquième à la vingt-quatrième heure. B) Oedème par la streptolysine - antistreptolysine dans l'articulation de la patte du cobaye. On effectue une série d'espérien- ces en utilisant des cobayes d'un poids de 500 g environ, suivant la méthode modifiée préconisée par Ungar modifiée. Cette modification consiste à remplacer le système antigène-anticorps (albumine d'oeuf - antialbumine -d'oeuf) par le système suivant : strep tolysine - antistreptolysine, afin de reproduire le syndrome du rhumatisme articulaire aigu ou maladie de Bouillaud. On prépare l'antistreptolysine par injection de streptolysine très pure dans du sérum physiologique, fournie par Bohringwerke, à la dose d'un mg un jour sur deux, par voie intramusculaire.Après trois injections, on administre trois autres injections intraveineuses respec tivement de 0,1 : 0,5; 1 mg @n jour sur deux. Quatre jours après la dernière injection, on prélève un échantillon de sang et on détermine sur le sérum la valeur de l'antistreptolysine, laquelle est égale à 1380 unités.On prélève ensuite du sang par saignée de la catotide et on sépare du plasma de l'antistreptolysine pure par électrophorèse, laquelle antistreptolysine, dissoute en solution saline et diluée jusqu'au volume de sang prélevé, provoque l'hémolyse à la même valeur, L'inflammation de l'articulation tibiofémorale dans la patte droite postérieure du cobaye est provoquée par l'injection par voie intracardiaque, de 1 ml de la solution d'antistreptolysine et par l'injection, dans l'articulation de 0,1 mi d'une solution de streptolysine à la concentzation de 1 mg/ml.On divise les cobayes en deux groupes : on traite le pre sieur groupe au préalable par une injection huileuse de stérol dans un liquide composé d'alcool benzylique et d'huile d'arachide apyrogénétique dans le rapport de 1 : 9, à la dose de 4 mg par kg; on traite le deuxième groupe uniquement par le système anti gbne-anticorps. Les résultats démontrent que pour les cobayes du premier groupe, l'inhibition de l'oedème est égale à 99,99 %, tandis que ceux du deuxième groupe présentent des signes d'un état inflammatoire a0 la outre, on mesure la température de la peau des pattes postérieures de chaque animal. Les animaux du premier groupe traités par la substance stérolique ne présentent aucune différence de température entre les deux pattes tandis que ceux du deuxième groupe présentent une différence de température de 3-4 C. La réaction i la douleur, provenant de la simple manipulation de l'ani- mal, en vue de mesurer le volume de la patte et la température, est très accusée chez les cobayes faisant partie du deuxième groupe tandis que celle-ci est pratiquement absente chez les cobayes faisant partie du premier groupe. C) Oedème provenant du blanc d'oeuf. Cet essai est effectué sur des rats figés de 120 jours. On divise les rats en quatre groupes de 15 animaux. On n'injecte au premier groupe que 0,1 mi de blanc d'oeuf par 100 g de poids, à titre de témoin, on traite le second au préalable par 6 mg de la substance à éprouver par kg de poids corporel et on traite le troisième et quatrième groupe par deux produite, disponibles dans le commerce, renfermant de la bétamétasone à la dose de 6 mg par kg de poids corporel. Les résultats démontrent que l'inhibition, dans le deuxième groupe pendant les premières 24 heures, est plus forte que celle provoquée par les produits connus à base de cortisone du type bétamétasone. 3 - 4 Oedème provenant du carragaheen On provoque chez 60 rats supplémentaires l'oedéme de la patte par injection de carragaheen à la concentration de 1 % et en une quantité correspondant à 0,1 ml par 100 g de poids corporel. On divise les rats en quatre groupes comme dans le cas précédent et on traite les groupes individuels par les mêmes doses des composés cités ci-dessus. Dans ce cas, le volume de l'oedème est r*- duit d'un même ordre de grandeur par les deux types de composés. Extraction à partir de produites naturels Selon un autre procédé compris dans l'invention, on peut éga- lement obtenir les produits dotés d'activité pharmacologique, analogue à celle des produits obtenus par synthèse à partir de l'es- trone, par extraction à partir de produits naturels, tels que les jus de citron concentrés ou à partir de complexes flavonofdes. Le procédé d'extraction comporte la filtration sur de la gaze du jus de citron, ayant un pH fortement acide (en général un pH de 3,5) suivie de l'addition de celui-ci à des bases fortes jus- qu'à obtention d'un pH fortement basique (pH de fl - 11,5). Q soumet ensuite la solution ainsi obtenue à des extractions subsé- quentes par un volume égal d'éther de pétrole d'un point d'ébul- iition compris entre 40 et 600C jusqu'à ce que la nouvelle solution éthérée ne donne plus de résultat positif à la réaction de Solkowsky. On réunit les diverses fractions d'éther de pétrole et les lave avec un volume égal d'eau distillée, Oh laisse s'évaporer l'éther de pétrole et lave le résidu solide, constitué par une poudre jaune amorphe, avec un faible volume d'un mélange à parties égales d'alcool et d'acétone. On constate que le résidu insoluble est actif en tant que substance anti-inflammatoire selon les mimes essais effectués sur animaux que ceux décrits précédemment. La modification du procédé d'extraction à partir du complexe flavonotde se caractérise comme suit On ttaite le complexe flavonoïde par du méthanol en une proportion de 1 g par 10 mI, et lave et centrifuge le résidu insoluble trois fois avec du méthanol. On concentre les extraits méthanoliquesréunis à O % du volume initial et on y ajoute un mélange de 4 parties d'acide acétique 4 parties d'acétate d'éthyle et 1 partie d'eau. On ajoute ce mélange jusqu'à ce que l'on obtienne une concentration à 10 % du complexe biolavonofde, calculée par rapport au poids initial. On ajoute 6 volumes d'acétone à la solution ainsi obtenue présentant un aspect entièrement limpide, et on agite pendant une heure. Ch obtient à nouveau un précipité que lton sépare, ainsi qu'une solution à laquelle on ajoute un volume égal d'éther éthylique, et on agite pendant une heure. On obtient à nouveau un précipité que l'on sépare et un liquide de couleur jaune-paille. On évapore le liquide de couleur jaune-paille à sec. On reprend le résidu par une solution aqueuse d'acide acétique 6 X et par de l'éther éthylique à parties égales en volume. n en résulte un partage entre les phases d'acide acétique et d'éther éthylique. On sépare la fraction soluble dans 1 'acide acétique tandis que l'on distille la solution d'éther éthylique sous pression réduite i une température de 320C jusqu'à élimination complète de éther. A la fin de cette opération, on obtient un Liquide épais et trouble dans lequel l'acide acétique (incomplètement séparé dans l'étape précédente) constitue la phase dispersante. on traite ledit résidu conformément à la description concernant le jus de citron. Les produits obtenus à la fois du Jus de citron et du complexe de flavonoide se présentent, à la suite de l'examen chromatographique sur une couche mince de gel de silice, comme étant compo sés d'une pluralité de substances, dont certaines présentent le mEme Rf et la même couleur que les composés obtenus par synthèse. Comme pour les combinaisons précédentes, ces dernières présentent une activité pharmacologique conforme à la description cidessus. Extraction par voie enzymatique Selon un autre procédé de l'invention, des produits dotés d'activité pharmacologique analogue à celle des produits obtenus par synthèse à partir de l'estrone, de produits naturels tels que les jus concentrés de citron et d'un complexe flavonoide peuvent aussi être préparés, par voie enzymatique, à partir de la testostérone, l'enzyme nécessaire étant obtenue par le traitement du placenta humain. Prémparation de l'enzyme On récupère l'enzyme du placenta humain, prélevé, immédiatement après la naissance, on le lave avec du sérum physiologique et le conserve à une basse température égale à environ 0 C. On prélève des fragments de tissus en prenant soin de séparer le tissu de liaison et les vaisseaux; on triture ensuite finement le tissu et le rend homogène à l'aide d'un tampon au phosphate de pH 7,2 à la concentration de 1 g par ml après quoi on filtre le produit d'homogénéisation sur de la gaze. Afin d'obtenir la rupture complète des membranes cellulaires des divers restes intra-cellulaires, on préfère la méthode de congélation et de décongélation qui comporte la congélation du filtrat à -30 C et sa décongélation à la température ambiante six fois dans l'espace de trois jours Finalement, on rend l'ensemble homogène à nouveau et centri- fuge à 18.000 tours pendant une heure dans une centrifugeuse ré- frigérée; on sépare les lipides flottants et recueille la partie limpide surnageante qu'on lyophilise. On soumet 500 mg de cette dernière substance, sous forme d'une poudre sèche, à l'électrophorèse sur un bloc d'acétate ou de chlorure (Pévikon) de polyvinyle, dans les conditions suivantes 1) tampon à l'acétate de sodium véronal au pH 8,64. 2) bloc Pévikon, longueur 70 cm, largeur 4 cm, hauteur 2 cm. 3) on prépare le lit de Pévikon sur un support en plexiglas à double fond où circule de l'eau refroidie à une température supé- rieure à 3 C. 4) V = 700 volts; I = 40 mA; temps de migration 14 heures. 5) Zone de dépit des protéines placentaires lyophilisées à 25 cm de la cathode A la fin de la migration, on divise le bloc Pévikon en de pe tits blocs d'une longueur de 1 cm, ce qui permet ainsi d'obtenir soixante-dix petits blocs, que l'on élue individuellement à l'aide d'un tampon au phosphate à 0,0015 M (10 ml) au pH 7,2, après quoi on filtre sur papier et lyophilise. On soumet les soixante-dix fractions ainsi obtenues à l'épreu- ve d'activité enzymatique en présence de co-facteurs, à savoir 1) substrat-(testostérone @200) 2) protéines 1 mg 3) nucléotide triphosphopyridique 0,5 M 4) glucose 6 - phosphate déhydrogénase 0,5 unités 5) tampon au phosphate pH 7,2 - 50 ml 6) solution aqueuse de Kcl 0,154 , 660 jul 7) température 37 C 8) temps 30 minutes Après les 30 minutes d'induction, qui a lieu dans le solvant propylène glycol, dans des fioles Erlenmeyer ou dans un bainmaris oscillant Dubnoff, on arrête la réaction par addition d'alcool éthylique absolu (10 ml) et on refroidit l'ensemble rapide- ment. On évapore l'alcool éthylique dans un évaporateur rotatif; on amène la portion aqueuse résiduelle au pH 8,2 par addition de Ca(OH2)0,017 M et on l'épuise trois fois dans une ampoule à décantation par un volume égaled'un mélange éther éthylique-chloroforme (3 : 1). On réunit les diverses fractions du mélange éther éthylique chloroforme et évapore dans un évaporateur rotatif. On reprend le résidu solide dans du benzène-méthanol (70 : 30) ot lave la phase benzène-méthanol avec un volume égal d'eau. On évapore la phase benzène-méthanol et passe le résidu sec à la chromatographie. On sait que certains enzymes placentaires présente dans les microsomes sont capables de provoquer l'aromatisation et l'oxydation de certaines hormones stéroides et en particulier la tes- tostérone est déméthylée et oxydée en estrone dans les conditions spécifiées ci-dessus. Dans l@ cas en question, la fraction susceptible d'effectuer la conversion de la testostérone de la manière citée ci-dessus est celle qui correspond au bloc n 39 en prenant pour bloc n 1, celui se trouvant le plus proche de l'anode. Les autres fractions se sont avérées inactives aux fins de cette conversion. Les fractions correspondant aux blocs 61, 62, 63, 64, 65, à savoir, ceux qui présentent une migration nettement cathodique, effectuent la conversion de la testostérone en un composé qui, par chromatographie sur une couche mince de gel de silice Merk 254F, en utilisant comme système éluant le mélange chloroforme : benzène : acétate d'éthyle (2 : 5 9 5), présente un Rf = 0,92. On développe les plaques avec du trichlorure d'antimonine et on chauffe à 120 C pendant 10 minutes. Il se développe dans la zone comportant le Rf susmentionné, une tache de couleur bleue-marron, accompagnée d'autres taches d'un Rf inférieur, ctest-à-dire, les taches correspondant à la testostérone non convertie et à d'au- tres composés stéroides qui représentent manifestement des termes intermédiaires. En conséquence, on effectue la séparation des constituants par chromatographie préparative sur des plaques de gel de silice ou sur une colonne de gel de silice. Dans le premier cas, on enlève toutes les zones relatives aux diverses taches chromatographiques et dans le deuxième cas, on prélève les divers éluats au moyen d'un collecteur de fractions. Après examen chromatographique, on réunit tous les échantillons présentant le même aspect chromatographique. En particulier, on lave le composé dont le Rt = 0,92, après évaporation du mélange éluant, à l'aide d'un mélange critique à parties égale en volume d'alcool-acétone, ce qui permet d'obte- nir ainsi un précipité blanc que l'on sépare par centrifugation. On enlève le produit surnageant qui acquiert une couleur jaune pâle et on recueille le résidu solide représentant le composé cherché que l'on reprécipite dans l'acétate d'étyle. Le précipité présente la même activité pharmacologique que les produits obtenus de la manière précédemment décrite. RFVENDI CATIONS 1 - Procédé de préparation d'une association de produits à caractère stérolique prédominant, à partir de ltestrone, qui comporte la dissolution d'estrone pure dans un solvant à la température d'ébullition de ce dernier, l'addition de peroxydes à ladite solution après refroidissement, le maintien de la totalité de la solution sous agitation à des températures comprises entre 400 et 609F,le réglage du pH à environ 5 - 5,5 à l'aide d'une base et Itextraction par solvant de l'association active conjointement avec les autres constituants. 2 - Procédé selon la revendication 1 suivant lequel ledit solvant comporte de l'alcool éthylique. 3 - Procédé selon la revendication 1, suivant lequel ledit agent oxydant est de préférence le H202. 4 - Procédé selon la revendication 1 suivant lequel on ajoute de l'anhydride acétique avant d'amorcer la réaction. 5 - Procédé selon la revendication 1 suivant lequel on règle le pH à l'aide d'une base à des valeurs comprises entre 5 et 5,5. 6 - Procédé selon la revendication 5, suivant lequel ladite base comporte de la Ca(OH)2. 7 - Procédé selon la revendication 1 suivant lequel on effectue l'extraction du produit actif, à partir du liquide réaction neï, par du benzène. 8 - Procédé selon l'une au moins des revendications 1 à 7 suivant lequel on lave le produit actif extrait avec de l'eau distillée et filtre sur du sulfate de sodium anhydre, après quoi on évapore à sec sous pression réduite. 9 - Procédé selon la revendication 8 suivant lequel on dissout le résidu sec dans de l'éther éthylique dans la proportion de 350 m1/10 g d'estrone de départ, et on fait recycler la partie qui ne se dissout pas. 10 - Procédé selon la revendication 9 suivant lequel on évapore la solution d'éther éthylique et on dissout le résidu solide dans du benzène dans la proportion de 250 mu/10 g d'estrone de départ et on fait recycler la partie qui ne se dissout pas. 11 - Procédé selon la revendication 10, suivant lequel on évapore la phase benzénique et on épuise le produit insoluble par de l'éther de pétrole, (100 ml/iO g d'estrone de départ) et on fait recycler la partie insoluble, le produit obtenu par évaporation de l'éther de pétrole représentant l'association de produits actifs parmi lesquels se trouvent les produits stéroliques. 12 - Procédé de récupération du stérol à partir de produits naturels tel que le jus de citron suivant lequel on ajoute des bases fortes audit jus de façon à l'amener à un pH basique (11 11,5 pH) et on soumet la solution obtenue à des extractions sub séquentes par de lut ex de pétrole (dont le point d'ébullition est compris entre 400 et 600C). 13 - Procédé selon la revendication 12, suivant lequel on purifie les solutions d'extraction par l'éther de pétrole avec de l'eau distillée. 14 - Procédé selon la revendication 13 suivant lequel on éta- pore l'éther de pétrole et on lave le résidu sec avec un mélange d'alcool-acétone 50 : 50 et recueille le résidu insoluble constitué par des produits utiles. 15 - Procédé de récupération du stérol à partir d'un complexe flavonoïde suivant lequel on mélange ledit complexe flavonofde avec du méthanol et centrifuge et lave ledit résidu insoluble & BR 16 - Procédé selon la revendication 15 suivant lequel on concentre et traite les extraits méthanoliques par de l'acide acétique, de l'acétate d'éthyle et de l'eau. 17 - Procédé selon la revendication 16, suivant lequel on ajoute de l'acétone, ce qui permet d'obtenir un précipité qie l'on sépare et une solution à laquelle on ajoute de l'éther éthylique après quoi on agite le mélange, ladite opération étant répétée plusieurs fois sur la solution, ce qui donne une solution que l'on évapore à siccité. 18 - Procédé selon la revendication 17 suivant lequel on dissout ledit résidu sec dans de l'acide acétique et de l'éther éther lique, la phase soluble dans l'acide acétique étant rejetée après quoi on distille la phase d'éther éthylique-sous pression réduite de façon à séparer l'éther, ce qui donne un liquide épais. 19 - Procédé selon la revendication 18 suivant lequel on ajoute des bases fortes audit liquide épais de façon à l'amener à un pH basique et on soumet la solution obtenue à des extractions sub séquences par de l'éther de pétrole (dont le point d'ébullition est compris entre 400 et 60 C). 20 - Procédé selon la revendication 19, suivant lequel on purifie lesdites solutions d'extraction avec de l'eau distillée. 21 - Procédé selon la revendication 20 suivant lequel on évapore l'éther de pétrole et lave le résidu sec avec un mélange d'alcoolacétone après quoi on recueille le résidu insoluble constitué par les produits utiles. 22 - Procédé de préparation par voie enzymatique d'une associa tion de produits stéroliques qui comporte les étapes suivantes, d'obtention de tissu placentaire avec enlèvement des vaisseaux et de tissu de liaison; trituration et homogénéisation du tissu placentaire à l'aide d'un tampon au phosphate à un pH pratiquement neutre; congélation et décongélation répétées du tissu placentaire afin de rompre les membranes cellulaires; centrifugation et homogénéisation du tissu placentaire ainsi traité avec élimination des lipides flottants et récupération et lyophilisation de la substance limpide surnageante; électrophorèse du lyophilisat sur un bloc d'azotate ou de chlorure de polyvinyle à l'aide d'un tampon d'acétate de sodium véronal à un pH légèrement basique; prélèvement de la fraction à migration cathodique; soumission de ladite fraction à migration cathodique à une induction e présence de testostérone; séparation chromatographique des constituants; lavage du constituant à l'aide d'un mélange d'al- cool-acAtone, élimination de la substance surnageante et récup6- ration du résidu solide stérolique (après précipitation dans l'acétate d'éthyle). 23 - Produits obtenus selon une ou plusieurs des revendications 12-à 15. 24 - Produits obtenus selon une ou plusieurs des revendications 15 à 21. 25 - Produits obtenus selon la revendication 22.