Brevet FR2003958A1 — publié le 19691114

La présente invention concerne un procédé de fabrication de la l-isoleucine par culture d'un micro-organisme, plus particulièrement de l'espèce de Corynebacterium. La l-isoleucine est un amino-acide qui constitue un additif intéressant dans la nutrition des hommes et des animaux. Selon des procédés connus, la l-isoleucine peut être obtenue par fermentation, en employant l'acide a-aminobutyrique (voir brevets Japonais nO 18.511/1961 et 5.167/1962) ou l'acide a-hydroxybutyrique (voir brevet japonais nO 11.918/1965) ou la thréonine (voir brevets japonais nO 1.990/1965 et 2.880/1965), dans un milieu de culture. Il est également connu que les microorganismes de l'espèce Bacillus et Pseudomonas dans un milieu de culture additionné d1 acide a-hydrorybutyrique sont préférables pour la production de la l-isoleucine. Selon le procédé de la présente invention on obtient la l-isoleucine avec un rendement élevé par culture d'un microorganisme de l'espèce Corynebacterium dans un milieu contenant de l'acide a-hydroxybutyrique, Les micro-organismes convenant au procédé de l'invention appartiennent à l'espèce de Corgmebacterium glutamicum (syn. kicrococcus glutamicus (voir brevet français nO 1.234.732). Une culture de ce micro-organisme, identifié sous le numéro B'PCC 21.193 a été déposée et mise à la disposition du public dans la collection dite Anierican 2Jrpe Culture Collection. D'autres souches semblables, de l'espèce Gornebacterium Rlutamicum, sont connues et conviennent également à l'invention. Le milieu de culture utilisé dans le procédé de l'invention doit contenir de l'acide a-hydrozybutyrique, ainsi que des quantités convenables des ingrédients usuels, tels que des sources de carbone et d'azote, des substances minérales et autres additifs nutritifs. On peut employer des acides a-hydroxybutyriques d'activités optiques diverses, ou leurs sels non toxiques. Parmi les sources de carbone convenant aux milieux de culture de l'invention, on peut citer les glycides, comme les glucose, fructose, maltose, sucrose, l'amidon hydrolysé, les mélasses, la glycérine etc. D'autres substances nutritives, comme divers acides organiques, tels que les acides lactique, acétique, pyruvique, peuvent aussi être employés. Comme sources d'azote convenant aux milieux de culture de l'invention, on peut citer les dérivés organiques et minéraux de l'azote, comme l'ammoniac, l'urée et les sels d'ammonium, tels que le sulfate, le chlorure, l'acétate, le phosphate, le carbonate d'ammonium, etc. Comme sources organiques d'azote naturel convenant également à l'invention, on peut citer les extraits de levure, de mais, de viande, la peptone, la caséine hydrolysée, la pulpe hydrolysée, les compositions de poisson, hydrolysées ou non, les graines de soJa, hydrolysées ou non, les compositions de soJa, hydrolysées ou non, etc. On peut aJouter aux milieux de culture des substances minérales comme le phosphate mono- ou di-potassique, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le carbonate de calcium, etc. D'autres additifs nutritifs peuvent encore être ajoutées, selon les besoins. La fermentation est effectuée dans des conditions aérobies, comme par exemple celles de culture aérobie submergée, à une température de 20 à 40 C. Le pH du milieu peut varier dans de larges limites, mais il est avantageusement ajusté à la neutralité. La durée de la culture est de préférence de 2 à 5 Jours, pour obtenir des rendements élevés en 1-isoleucine. Après la fin de la culture, on sépare les cellules microbiennes par filtration, et le filtrat est traité selon tous moyens convenables, comme par exemple par une résine échangeuse de cations, pour absorber la l-isoleucine, qui est ensuite éluée, concentrée et refroidie, de façon usuelle, pour donner des cristaux bruts de 1-isoleucine. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui ve suivre d'un exemple non limitatif de mode de réalisation suivant l'invention. Exemple La fermentation est effectuée sur un milieu de culture de base, de composition suivante : glucose (5 g/dl), sulfate d'ammonium (2 g/dl), KH2P04 (0,05 g/dl), E2HP04 (0,05 g/dl), Mgt304.7H20 (0,025 g/dl), CaCO3 (2 g/dl), biotine (30 W/l et L-lysine (20 mg/l). On prépare deux milieux modifiés par addition de 10 mg/ml et 5 mg/ml, respectivement, d'acide DL-a- hydroxybutyrique, au milieu de base et on ajuste leur pH à 7,4. On place séparément 10 ml de chacun de ces trois milieux dans de grands tubes à essai, qu'on inocule avec une culture d'ense mencemenW de Corynebacterium glutamicum M-14 (A'l'CC 21.193). La fermentation est dans chaque cas effectuée à 300 C, pendant 96 heures, pour obtenir les quantités de l-isoleucine indiquées au Tableau suivant. TABLEAU Quantité d'acide DL-a-hydroxy- Quantité de l-isoleucine butyrique employé dans le milieu accumulée de base (mg/ml) (mg/ml) 10 7,1 5 3,8 O 1,2 On ajoute 10 mg/ml d'acide DL--hydroxybutyrique au milieu de base, coite précédemment décrit, et on place 20 ml de ce milieu modifié dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 ml; on ino culte et cultive, comme décrit ci-dessus, pour obtenir 7,8 mg/ml de l-isoleucine. On réunit les bouillons des quatre cultures, on aJuste leur pH à faible acidité, puis on les chauffe et on filtre toutes cellules microbiennes et autres précipités. On fait passer le filtrat sur une colonne de la résine échangeuse de cation, vendue sous la dénomination commerciale de Diaion SK NO 1, par la Société dite MITSUBISHI EAShI KOGYO X.K., sous sa forme H+. La l-isoleucine absorbée est ensuite éluée par une solution aqueuse diluée d'ammoniaque. Les éluats réunis, concentrés et refroidis, fournissent 7,9 g de cristaux de l-isoleucine. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée à l'exemple décrit, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. - REVENDICATIONS 1 -- Procédé de fabrication de la l-isoleucine selon lequol on cultive, dans des conditions aérobies, un micro-organisme de l'espèce Corynebacterium, dans un milieu de culture conte3zant de l'acide a-hydroxybutyrique, et on recueille la l-isoleucinc- accumulée dans ledit milieu de culture. 2 - Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Cornebaeterium glutamicum. 3 - Procédé suivant les revendications 1 ou 2, dans lequel le micro-organisme est Corynebacterium glutamicum ÂTCC 21.193. 4 - Procédé suivant les revendications 1, 2 ou 3, dans lequel le milieu de culture est maintenu à une température de l'ordre de 20 à 40 C. 5 - Un procédé suivant les revendications 1 à 4, dans lequel le pH du milieu de culture est maintenu à environ 7. 6 - Procédé suivant les revendications 1 à 5, d ns lequel on effectue la culture pendant une durée de ltordre de 2 à 5 jours. 7 - Procédé suivant les revendications 1 à 6, dans lequel la milieu de culture contient une source de carbone, une sotrrce d'azote, des matières minérales et des substances nutritives.