Brevet FR2005072A1 — publié le 19691205

-1- 2005072 La présente invention concerne un procédé de préparation de L-phénylalanine par culture d'un microorganisme nécessitant de la tyrosine et assimilable par les hydrocarbures, dans un milieu qui contient des sources d'hydrocarbure et d'azote. 5 La L-phénylalanine est un amino-acide essentiel. Parmi les procédés connus pour préparer la L-phénylalanine par fermentation, on peut citer par exemple le procédé' utilisant une souche d'Escherichia coli nécessitant de la tyrosine /"Experientia, Vol. 6. 41 (195G_7; Ie procédé utilisant une souche de Micro-10 coccus glutamious nécessitant de la tyrosine /~J. Agr. Chem. Soc. Japan, Vol. 35j ^2 (1$61)_7 etc. Toutefois, ces procédés connus utilisent des saccharides comme produits bruts. Or ces saccharides sont des produits coûteux. Certaines espèces mutantes qui nécessitent de la tyrosine 15 pour leur croissance, sont capables d'accumuler une quantité notable de L-phénylalanine dans un milieu de culture contenant des hydrocarbures relativement bon marché comme source de carbone. Les souches de mutants qu'on peut utiliser pour la fermenta-20 tion, suivant l'invention, sont des souches assimilables par les hydrocarbures et nécessitant de la tyrosine. On peut obtenir ces souches de mutant par irradiation ultra-violette des souches correspondantes et déjà isolées, assimilables par les hydrocarbures. Des espèces mutantes particulièrement avantageuses, 25 suivant l'invention, sont, par exemple, une souche de mutant nécessitant un agent nutritif, de référence (2438-U-12) (ATCC 21226) de Cor.ynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 15592), la souche de mutant (2411-U-25) d'Arthrobacter paraffineus (ATCC 15591)» celle (2473-U-54) On peut obtenir les espèces mutantes à partir des souches correspondantes par un procédé mutagène classique. Des sels minéraux utilisables, suivant l'invention, compren-35 nent, par exemple, le phosphate acide de potassium, le phosphate diacide ue sodiuu, le sulfate de magnésium, le sulfate ferreux, le sulfate de zinc, le carbonate de calcium. On effectue la culture dans des conditions aérobies, par exemple sous agitation ou à l'état submergé, à une température 40 de 1C à 75°C mais avantageusement de 25 à. ^0°C. Il est avanta- BAD ORIGINAL 69 09276 -2- 2005072 geux de maintenir le pH de la liqueur de fermentation à une valeur approximativement neutre; pour cela, on utilise un agent neutralisant approprié tel que de l'ammoniaque aqueux, de l'hy-droxyde de sodium, du carbonate d'ammonium, du carbonate de cal-5 cium, etc. Une culture pendant environ 2 à 8 jours, avantageusement 2 à 4 jours, est suffisante pour qu'une quantité notable de L-phénylalanine s'accumule dans le milieu. Cette durée peut évidemment varier selon les rendements requis. Des rendements normaux sont 10 de 3 à 5 mg/ml. A la fin de la culture, on élimine les cellules microbiennes par filtration et on traite le filtrat, par exemple avec une résine échangeuse d'ions ou par d'autres procédés classiques de récupération. 15 L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. Exemple 1 On cultive du Cor.ynebacterium hydrocarboclastus U0 2438-U-12 20 (ATCC 21226) (espèce mutante nécessitant de la tyrosine) sous agitation dans un bouillon de levure pendant 24- heures et on - l'utilise comme culture d'ensemencement. La composition du milieu de fermentation est la suivante, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids : KEpPO^ 0,2 %, 25 Fa2HP04 0,2 %, MgSO^HgO 0,1 %, MnS04,4H20 0,005 %, PeS04,7H20 0,001 %, ZnS04,7H20 0,001 %, ÏÏH^NO^ 1 %, Thiamine • 1 mg/1,. UZ-amine 0,5 % (hydrolysat enzymatique de caséine), mélange de n-paraffine (d|2 à C^) 5 % (pH 7,0). Après stérilisation on ajoute 1 % en poids de carbonate de 30 calcium, stérilisé à part. On inocule la culture d'ensemencement précitée au milieu de fermentation dans un rapport pondéral de 5 %. On effectue la culture à 30°C pendant 4 jours en agitant. On ajuste le pH du milieu à environ 7 ajoutant du carbonate d'ammonium. 4,5 35 mg/ml de L-phénylalanine s'accumule dans le milieu. A la fin de la fermentation, on filtre 1 litre de bouillon pour éliminer les cellules microbiennes et on ajuste le pH du filtrat à 2. On fait ensuite passer le filtrat à travers une colonne contenant une résine échangeuse de cations fortement acide, 40 vendue sous la dénomination commerciale de "Diaion SK N° 1" par BAD ORIGINAL 69 09276 -3- 2005072 "Mitsubishi Kasei Kogyo K.K.", Japon). Après lavage avec de l'eau, on élue la résine-avec de l'ammoniaque aqueux 1ÏT. On recueille des fractions d'éluat ayant une réaction positive à la ninhidrine et on les concentre à 40°C sous vide. Après décolora-5 tion avec du charbon actif, on ajoute de l'alcool au concentré pour obtenir 3,6 g de cristaux bruts de L-phénylalanine. Exemple 2 On utilise du Oorynebacterium hydrocarboclastus ÏT° 2438-U-12 (ATCC 21226) (espèce mutant nécessitant de la tyrosine). On rem-10 place l'amine-îTZ du milieu de fermentation de l'exemple 1 par 500 "if/ml de L-tyrosine et on utilise ce milieu synthétique pour la fermentation. Les conditions de fermentation sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1. 4,1 mg/ml de L-phénylalanine s'accumule dans le milieu. On recueille le produit par le procé-15 dé de 11 exemple 1. Exemple 3 On utilise comme germe un bouillon de culture de Arthrobacter paraffineus 0° 2411-U-25 (mutant nécessitant de la tyrosine). Une culture sous agitation pendant 4 jours donne 2,4 mg/ml de 20 L-phénylalanine. Exemple 4 On opère ainsi que décrit dans l'exemple 1 si ce n'est qu'on utilise du Brevibacterium ketoglutamicum Iî° 2473-U-54 (souche nécessitant de la tyrosine) pour former 1,4 mg/ml de -L-phényl-25 alanine. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de 1'invention. 69 09276 -4- 2005072 " HEVEMDICATIONà - 1 - Procédé de préparation de L-phénylalanine par fermentation, qui consiste à cultiver un microorganisme assimilable par les hydrocarbures et nécessitant de la tyrosine, dans un milieu 5 de culture contenant une source d'azote et un hydrocarbure comme source principale de carbone, à laisser s'accumuler la L-phényl-alanine dans le milieu, puis à récupérer la L-phénylalanine formée . 2 - Procédé suivant 1 dans lequel le microorganisme est obte-10 nu par irradiation ultra-violette d'un élément du groupe formé par le Corynebacterium hydrocarboclastus, Arthrobacter paraffi-neus, Brevibacterium ketoglutamicum et Arthrobacter roseoparaf-fineus. 3 - Procédé suivant 1 dans lequel le milieu de culture con-15 tient un élément du groupe constitué par le kérosène, les hydrocarbures aliphatiques ayant 10 à 25 atomes de carbone, l'essence et les mélanges desdits éléments comme source de -carbone. 4 - Procédé suivant 1 dans lequel on effectue la culture à une température de 10 à 75°C dans des conditions de pH sensible- 20 ment neutre jusqu'à obtention d'une quantité notable de L-phénylalanine . 5 - Procédé suivant 1 dans lequel le microorganisme est Corynebacterium hydrocarboclastus (ATCC 21226), Arthrobacter paraffineus 11° 2411-U-25} Brevibacterium-ketoglutamicum 0° 25 2437-U-54.