Brevet FR2007917A1 — publié le 19700116

La présente invention est relative à une composition utile pour la détection de maladies periodontales ainsi qu'un procédé pour la détection de ces maladies. Au cours des récentes années, on a reconnu que des changements intervenant dans la physiologie normale du sillon gingival sont liés à certaines modifications pathologiques sous-jacentes. Voir, par exemple, la revue "Periodontics, 2, 147, 164. En bref, on a trouvé que lorsque le sillon gingival environnant subit certaines modifications pathologiques, on constate la présence d'un fluide gingival qui ne se trouve pas normalement dans un tissu sain.Dans de nombreux cas, bien qu'il puisse y avoir présence de fluide gingival, il n'y a pas d'autre signe clinique indiquant que les tissus gingivaux sont dans des états pathologiques sous-jacents0 Généralement, la détection repose sur des signes cliniques et des symptômes comme l'inflammation, que l'on constate sous la forme de rougeur, oedème, perte de taches, douleur et formation de poches. Quand ces états sont laissés sans traitement, le résultat en est la destruction des tissus de soutien avec perte d'os, qui aboutit finalement à la perte de la dent. Evidemment, si le clinicien doit attendre l'apparition des symptômes cliniques, il peut être trop tard pour traiter l'état pathologique profond. En conséquence, une détection dans les premiers stades et faite avec certitude est d'une importance primord ale. En conséquence, l'invention vise principalement à fournir un substrat permettant de détecter avec précision la présence dlu- ne maladie périodontale, et particulièrement la gingivite. Elle vise également une composition détectant la présence d'une maladie périodontale avant toute manifestation clinique. Elle vise encore une composition permettant de détecter la présence d'une maladie périodontale en employant des techniques simples. Par ailleurs, la composition visée est stable pour la détection des maladies périodontales et gingivales. L'invention a en outre pour but de fournir une composition permettant de détecter et de différencier la source d'origine de l'enzyme p -D-galactosidase. D'autres buts et avantages de l'invention apparaitront dans la description détaillée qui va suivre, en se référant à la Fig. unique du dessin annexé. On a maintenant découvert que la présence de p -D-galacto sidase dans le sillon gingival est ordinairement associée à des modifications pathologiques sous-jacentes survenant dans le tissu environnant. D'une manière courante, le diagnostic dépend de la connaissance clinique et de la capacité du clinicien de reconnaître à vue des altérations des structures gingivales. La découverte de cette association de la p -D-galactosidase avec une modification pathologique même légère est, en vérité, surprenante puisque normalement le fluide gingival contient de nombreux enzymes, comme par exemple la phosphatase acide, la phosphatase alcaline, la deshydrogénase lactique, etc. En conséquence, une détection précoce et exacte de la présence de p -D-galactosidase permet un diagnostic dès les premiers stades.Conformément à l'invention, on fournit un substrat capable de détecter la présence de H -D-galacto- sidase ainsi que de distinguer si l'enzyme est d'origine bactériens ne ou provient d'un tissu de mammifère. D'une manière générale, le substrat de l'invention contieG, comme ingrédient actif, de 1 à 900 mg, de préférence 15 mg % un 6-halo-2-naphtyl- p -D-galactopyranoside, de préférence le dém rivé 6-bromo, que l'on peut trouver facilement dans le commerce (par exemple fourni par Sigma Chemicals), cet ingrédient étant dissous dans un milieu alcoolique aqueux. La solution de galactopyranoside est tamponnée avec un tampon convenable, comme un tam pon à l'acétate, ou un tampon au barbiturate, tel qu'un tampons au Véronal, pour obtenir le pH désiré. Ces tampons sont bien connus et se préparent par des procedés classiques. La solution est complétée à 100 so avec de l'eau distillée.Quand cette solution est tamponnée avec un tampon à l'acétate, elle a un pH de l'ordre de 5,0, alors qu'avec un tampon au Véronal, elle a un pH de l'ordre de 7,5 A l'usage, on fait incuber le substrat ainsi préparé avec-une petite quantité de fluide gingival. Après incubation à 370C, on traite le substrat avec un sel de diazonium, tel qu'un sel diazo bleu fourni dans le commerce par la firme DAJAC.Quand l'échantilK lon contient de la É -D-galactosidase, cette dernière réagit sur le substrat en libérant du 6-halo- naphtol qui, à son tour, ré- agit avec le sel de diazonium pour donner une coloration visible Il a été également découvert que la g -D-galactosidase d'origine bactérienne a une activité enzymatique optimale à pH 7,5 tandis que celle qui provient d'un tissu de mammifère est actif pH 5,0; en conséquence, en utilisant le substrat ayant deux pH différents, on peut facilement distinguer l'origine de l'enzyme. Une autre caractéristique de l'invention réside dans le fait que le substrat est disposé sur un support tel qu'une feuille absorbante et/ou un produit à base d'acétate ou de Nylon. En se référant à la Fig. unique du dessin annexé, on y voit un matériau absorbant, tel qu'un feutre, un papier filtre, mais de préférence un tissu de Nylon ayant des pores de 1 à 10/u, mais de préférence de 1/u découpé en bandes de 2 à 3 cm de largeur environ. La bande est séparée en zones différentes, comme indiqué sur le dessin. La barrière ou zone d'arrêt est réalisée généralement en appliquant un produit hydrophobe quelconque, comme par exemple une résine acrylique, du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique Nb 3 359 180, dont le rôle est d'empêcher la migration des ions.Le substrat est appliqué en saturant la zone destinée au substrat avec la solution de substrat, préparée comme il a été indiqué précédemment, puis en laissant sécher, l'ingrédient actif restant ainsi fixé dans la bande absorbante. On applique également le sel de diazonium sur le produit absorbant, d'une manière analogue, dans l'espace réservé à cet effet, indiqué sur le dessin. Il est parfois souhaitable, bien que non nécessaire, d'ajouter une zone pour un inhibiteur d'enzyme. Les inhibiteurs d'enzyme qui peuvent convenir sont, par exemple, des acides, comme l'acide trichloracétique ou l'acide phosphotungstique, ou tout agent de précipitation des protéines. La présence de l'inhibiteur d'enzyme fournit un moyen commode d'arrêter la réaction, si on le désire. Une variante consiste à appliquer le substrat au bout de la bande de diagnostic. On peut le faire en appliquant par exemple une solution alcoolique aqueuse du substrat à une concentration de 15 à 100 mg %. On doit appliquer le substrat en saturant le produit absorbant ou en le faisant absorber par capillarité par le support poreux d'acétate ou de Nylon. On peut ensuite sécher les bandes à l'air, en laissant ainsi sur celles-ci le substrat avec les sels ajoutés, chlorure de sodium ou chlorure de potassium. Dans ce cas, on ne fait ou ne place sur la bande aucun tampon. On peut alors effectuer le test en faisant incuber la bande avec le prélèvement gingival dans les tampons à pH 5,0 ou 7,5 selon le cas. Après l'incubation, on peut effectuer séparément la copulation diazoique. En application, la substance absorbante est insérée dans le sillon gingival et, par attraction capillaire, le fluide gingival vient au contact soit du substrat tamponné soit d'une zone non traitée de la bande. La réaction peut alors se poursuivre comme récrit ci-dessus. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d > il- lustration de l'invention. EXEMPLE 1. On prépare comme suit un substrat ou composition en vue de la détermination de la p -D-galactosidase : 1 - 15 mg de 6-bromo2.-naphtyl- p -D-galactopyranoside, 2 --10 ml dialcool méthylique. On dissout 1 et 2 ensemble en l'espace d'environ une heure. 3 - On ajoute à cette solution 15 ml d'eau distillée en agitant. 4 - 20 ml ou une quantité suffisante de tampon à l'acétate 0,1 M pour obtenir un pH de 5,0 ou 20 ml, ou une quantité suffisante de tampon au Véronal 0,1 M pour obtenir un pH de 7,5. On peut aussi bien utiliser tous autres tampons convenables assurant ces gammes de pH. 5 - 5,8 g de NaCl ou KCl. 6 - Etendre à 100 ml avec de l'eau distillée. Le sel de diazonium convenant à la réaction de copulation est préparé par dissolution de 10 mg de sel diazo bleu dans 10 ml d'eau distillée et d'environ 20 à 30 mg de NaHCO3 ou d'un autre produit convenable pour obtenir un pH d'environ 7,5-8. EXEMPLE 2. La technique de prélèvement du fluide du sillon gingival emploie une petite bande poreuse d'acétate ou de Nylon de diamètre de pores compris entre 1 et 10/u. Les dimensions de la bande sont de 2 mm en largeur et 10 mm en longueur, avec une extrémité coupée en pointe. La zone de prélèvement est isolée avec des rouleaux de coton et les mucus gingivaux sont essuyés complètement avec une gaze. On saisit une bande pour échantillon avec une paire de forceps aplatis et on insère doucement l'extrémité pointue de la bande sèche dans le sillon gingival ou la poche gingivale; on la laisse en place cinq secondes, puis on la retire. On insère de la même façon une seconde bande. On place ensuite ces bandes dans un récipient de substrat tamponné (une bande à pH 5,0 et la seconde bande à pH 7,5), et on incube à 370C pendant deux heures pour développer les activités enzymatiques optimales.On rince alors les bandes à l'eau distillée et on termine par la copulation avec le sel diazo bleu. On laisse les bandes dans la solution de copulation de trente secondes à une minute, en agitant doucement de temps en temps. On les rince à l'eau distillée et on les fait sécher. EXEMPLE 3. Quand on emploie un support absorbant, on prépare les bandes de papier comme suit. Une solution alcoolique aqueuse du substrat, à la concentration de 15 à 100 mg % est appliquée au rouleau sur la matière absorbante vierge qui est ensuite séchée à l'air. Au-dessus du niveau du substrat, on applique ensuite un produit hydrophobe pour empocher la migration des ions. Ce produit est appliqué au rouleau d'une manière analogue à celle employée pour appliquer le substrat. Après cette barrière hydrophobe, on applique également et de la même manière le sel de diazonium. On découpe ensuite le papier en bande de 2 mm sur 10 mm, une des extrémités étant coupée en pointe. EXEMPLE 4. Quand on emploie un support poreux en acétate ou en Nylon pour la bande de diagnostic, on procède comme suit. On applique au rouleau sur le support poreux une solution alcoolique aqueuse du substrat, à une concentration de 15 à 100 mg %, avec une addition de 5,8 g ffi de NaCl et KCl; ou encore9 on trempe le support dans la solution et, par action capillaire, la solution est absorbée dans le support. On laisse sécher la solution de substrat et on découpe des bandes de dimensions approximatives 2 x 10 mm en ccupant l'une des extrémités suivant un angle pour former une pointe. Les solutions tampons servant à réaliser un pH de 5,0 ou 7,5 sont préparées ensuite sous forme de pastilles que l'on peut dissoudre dans l'eau au moment de l'incubation. Après l'incubation, on traite la bande avec le sel de diazonium pour réaliser la copulation ultérieure. EXEMPLE 5. Si on utilise pour le test la matière absorbante, le mode opératoire est analogue à celui qui est décrit dans l'exemple 2 précédent. La différence réside en ce que tous les réactifs nécessaires sont contenus dans la bande. L'opérateur n'a qu'à mouiller succes sivement chacune des zones pour effectuer les réactions désirées Si c'est le matériau poreux qui est utilisé9 l'opérateul simplement à faire incuber la bande au pH désiré et à terminer par la réaction finale de copulation. L'avantage de ces deux techniques est que le substrat est contenu dans la bande de prélèvement. - REVENDICATIONS. 1 - Une composition servant à détecter la présence de galactosidase caractérisée en ce qu'elle contient approximativement 1 à 100 mg % d'un 6-halo-2-naphtyl- -D-galactopyranoside dans un tampon alcoolique aqueux donnant soit un pH de 5,0, soit un -pH de 7s5. 2 - Une composition suivant la revendication 1 caractérisée en ce que le t3 -D-galactopyranoside est le 6-bromo-2-naphtyl /≈-D-galact Q pyranoside. 3 - Un procédé pour détecter la présence de p -D-galactosidase caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une composition suivant la revendication 1 ou 2, avec un échantillon et à traiter le mélange résultant avec un sel de diazonium. 4 - Une préparation unitaire sèche pour le diagnostic en vue de détecter la présence de p -D-galactosidase caractérisée en ce qu'elle comprend une bande d'un matériau support imprégné avec une zone de substrat comprenant un 6-halo-2-naphtyl- / -D-galactopy- ranoside, une zone contenant un sel de diazonium, et une zone formant barrière séparant la zone du substrat et la zone du sel de diazonium. 5 - Une préparation suivant la revendication 4, caractérisée en ce que le p -D-galactopyranoside est le 6-bromo-2-naphtyl p -D-galactopyranoside. 6 - Une préparation suivant la revendication 4 ou 5 caractérisée en ce que la zone de substrat est tamponnée à un pH voisin de 7,5. 7 - Une préparation suivant la revendication 4 ou 5 caractérise en ce que la zone de substrat est tamponnée à un pH voisin de 5,0. 8 - Un procédé pour détecter la présence de p -D-galactosidase caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact la zone de substrat d'une préparation telle que dés nie à la revendication 4 avec un échantillon, puis à mettre en contact le mélange résultant avec la zone de sel de diazonium et à observer la coloration formée. 9 - Un procédé pour détecter la présence de /c -D-galactosidase caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants : (a) on met en contact un support renfermant de 1 à 100 mg % d'un 6-halo-2-naphtyl- 4 -D-galactopyranoside avec un échantillon; (b) on fait incuber le support et l'échantillon ensemble, à une température voisine de 370C pendant environ deux heures, dans un milieu tamponné ayant un pH de l'ordre de 5,0 ou 7,5; (c) on rince le support avec un solvant aqueux et on met en contact le produit rincé ainsi obtenu avec un sel de diazonium; et (d) on observe la coloration ainsi développée.