Brevet FR2005167A1 — publié le 19691205

La présente invention se rapporte à de nouveaux dérivés de synthèse de l'agarose en vue de leur application en chromatographie d'échange ionique. Les dérivés synthétisés peuvent être utilisés surtout dans l'étude, l'isolement et la purification des substances macromoléculaires comme les protéines 5 d'origine animale ou végétale, enzymes etc .. On connaît des produits semblables, mais qui ont été obtenus en partant de cellulose ou dextrane et qui sont destinés dans des buts similaires. En réalisant de nouveaux échangeurs dfions fortement acides, la présente invention étend la gamme des produits utilisables dans l'analyse chromatogra-10 phique. Le procédé d'obtention des dérivés selon l'invention, consiste en l'introduction du groupement sulfoéthyle (SE), soit dans la molécule d'agarose simple, soit dans la molécule d'agarose liée transversalement par des ponts glycériques, avec l'aide de 1'êpichlorhydrine. 15 Deux modes de mise en oeuvre de l'invention sont décrits ci-après pour illustrer l'invention. EXEMPLE 1 - On introduit 10 g d'agarose dans 35 ml de solution d'hydroxyde de sodium 10 N refroidie à environ 0°C et on l'homogénéise. Après une heure, on 20 ajoute en 2-3 portions, 3 g de bromoéthylsulfonate de sodium dissous dans 5 ml d'eau en homogénéisant le mélange réactionnel , à froid, pendant 30 minutes. On chauffe ensuite le mélange sous atmosphère d'azote au bain de paraffine à 115-120°C, en mélangeant de temps en temps au début de lropération. Après 3 heures de chauffage, on reprend à chaud le mélange réactionnel jaune-brun 25 par 30 ml d'eau distillée et on le reprécipite avec 300-400 ml d'éthanol en agitant foitEment à 50-55°C. On reprécipite deux fois en lavant chaque fois avec de l'éthanol à 75% jusqu'à décoloration complète et élimination des.dernières traces de l'hydroxyde de sodium. On broie mécaniquement les flocons et l'on filtre sur un entonnoir G^. On met ensuite la masse isolée en suspen-30 sion dans 200 ml de solution alcoolique d'acide sulfurique 0.5 N à 757», on filtre sous vide, lave à l'éthanol à 75% jusqu'à disparition des traces d'acide sulfurique, déshydrate avec de l'éthanol et puis avec de l'acétone et l'on sèche. On obtient 7 g de sulfoéthyle-agarose (SE-agarose) sous forme d'un produit pulvérulent renfermant environ 0.35 milliequivalent de groupements 35 acides par gramme. EXEMPLE 2 - On répète le premier exemple mais en utilisant lo g d'agarose liée transversalement par des ponts glycériques (agarose X- 7.5 granulométrie de 50-100 mesh) au lieu d'agarose simple. Après trois heures de chauffage du mélanger 40 réactionnel à 115-120°C sous atmosphère d'azote, on lave les granules de gel V BAD ORIGINAL. 09223 2 2005167 sur un entonnoir G^ à l'eau distillée jusqu'à décoloration et élimination complète des tracés d'hydroxyde de sodium. Le produit isolé est mis'en suspension dans 200 ml d'acide sulfurique 0.5 N, on filtre, lave à l'eau distillée jusqu'à élimination de l'acide sulfurique, déshydrate avec de l'éthanol et/ou acétone et sèche. On obtient 8 g de sulfoéthyle-agarose liée transversalement (SE-agarose X) renfermant 0,3 milliequivalents de groupements acides par gramme. Dans les exemples mentionnés ci-dessus, on peut faire varier les quantités de bromoéthylsulfonate de sodium par rapport à celles indiquées, en obtenant des produits qui diffèrent entre eux par leurs constantes et propriétés physico-chimiques. On doit cependant souligner que le réactif mentionné ne peut être ajouté en plus grande quantité qu'à l'agarose liée transversalement, les produits obtenus avec l'agarose simple étant trop so-lubles. Les dérivés obtenus, conformément à la présente invention, en partant de l'agarose simple, sont solubles à chaud en solutions aqueuses. Par refroidissement de leurs solutions, on obtient des gels qui peuvent être transformés en granules de dimension voulue d'après la littérature, forme sous laquelle ces produits sont utilisés dans l'analyse chromatographique. Les dérivés obtenus en partant de l'agarose liée transversalement selon la présente invention, sont insolubles en solution aqueuse même à chaud. Leurs gels sont d'abord broyés mécaniquement puis déshydratés, séchés et tamisés sélectivement pour isoler les fractions de granulométrie désirée. La présente invention offre l'avantage de fournir, par l'introduction des groupements sulfoéthyle dans la molécule d'agarose simple ou liée transversalement par des ponts glycériques de nouveaux échangeurs d'ions fortement acides, qui permettent surtout l'analyse des sérums normaux et pathologiques , des phosphoprotéines, des protéines végétales, de quelques enzymes etc . . bad original 69 09228 3 2005167 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation des dérivés de l'agarose en vue de l'application en chromatographie d'échange ionique, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire des groupements sulfoéthyle soit dans la molécule d'agarose 5 simple, les dérivés obtenus mis en solution préparée à chaud formant par refroidissement des gels échangeurs d'ions , soit dans la molécule de l'agarose liée transversalement par des ponts glycériques, les produits résultant étant insolubles et doués de propriétés d'échange ionique. 2. Procédé de préparation des dérivés de l'agarose selon la revendi- 10 cation 1, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter l'agarose en-milieu alcalin par le bromoéthylsulfonate de sodium et sous chauffage en atmosphère d'azote aux températures comprises entre 115-120°C pendant trois heures. 3. Procédé de préparation des dérivés de l'agarose selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter l'agarose liée transver- 15 salement par le bromoéthylsulfonate de sodium en milieu alcalin et sous chauffage pendant trois heures en atmosphère d'azote aux températures comprises entre 115-120°C. i BAD ORIGINAL