Brevet FR2005071A1 — publié le 19691205

-i 2005071 La présente invention concerne un procédé de préparation de L-tyrosine par culture d'un micro-organisme dans un milieu contenant des quantités appropriées de source de carbone, de source d'asote, de sels minéraux et de divers autres agents nutritifs 5 lorsqu'ils sont nécessaires, pour la croissance. On peut préparer la L-tyrosine par fermentation en utilisant un mutant d1 Esch.erich.ia Coli nécessitant de la phénylalanine [Experientia. 6, 41 (1950)3 , un mutant de Bacillus subtulis r&Bino Açids, 1,1 (1959)3 ou un -autant âe Micrococcus glutaEieus .i- nécessitant de-la piiézsylalaaiae M. Agricuitnral Oheia. Soe. Japaji, 22, 146 ',1961 toutefois ces procédés antérieurs utilisent des earbohydrates oomie produits "bruts a L'invention a pour but un procédé de préparation de L-tyrosine par culture d'un microorganisme produisant un amino-acide, assi-1.5 milable par les hydrocarbures et nécessitant de la phény lalanine pour sa croissance dans un milieu de culture. Les microorganismes capables de produire la L-tyrosine suivant le procédé de l'invention peuvent appartenir à diverses espèces et notamment Oorynebaeterium, Brevibacterium, Arthrobacter, etc. 20 des souches de mutants particulièrement avantageuses, suivant l'invention, sont Oorynebaeterium hydrocarboclastus, Brevibac-terium Ketoglutamicum, Arthrobacter paraffineus et Arthrobacter roseoparaffinus. Toutes ces souches de mutants nécessitent de la phénylalanine pour leur croissance. On les obtient par irradia-25 tion ultra-violette de bactéries assimilables par les hydrocarbures . Les cultures de mutants sont déposées au Centre" American Type Culture Collection". Le mutant (2438-U-8) de Oorynebaeterium hydrocarboclastus porte ainsi la référence "ÂTCG 21227" 30 et le mutant 2411-0-30 d'Arthrobacter paraffineus la référence Aï'Cû 21377. Comme source de carbone dans le milieu de culture, on peut utiliser des hydrocarbures aliphatiques ayant 10 à 25 atomes de carbone ou des mélanges de ces hydrocarbures, des hydrocarbures 35 gazeux ou des produits hydrocarbonés bruts comme le kérosène, l'essence, etc... On obtient des résultats exceptionnellement bons avec des n-paraffines ayant 11 à 18 atomes de carbone. bad original 69' 0927.5 -2- 2005071 Comme source d'azote, on peut utiliser du nitrate d'ammonium, du chlorure d'ammonium, du sulfate d'ammonium, du carbonate d'an monium, du phosphate d'ammonium, de l'urée, etc... Il est avantageux d'ajouter des agents nutritifs organiques et 5 des sels minéraux au milieu de culture. Comme agents nutritifs organiques, on peut utiliser la peptone, une amine-NZ, de l'extrait de viande, de l'extrait de levure, de la liqueur de macération de blé, de l'hydrolysat de caséine, de la farine de poisson ou de l'hydrolysat de farine de poisson, de l'hydrolysat de 10 farine de soga. lorsqu'on utilise un milieu uniquement synthétique5 on peut remplacer ces produits par de la tM aminé et de la phényManine. Gomme substances minéraless on peut utiliser NagEPO^, du sulfate de magnésium, de manganèse, ou de zinc, du sulfate 15 ferreux, du carbonate de calcium. On effectue la culture dans des conditions aérobies, par exemple dans des conditions submergées ousous agitation. La température de culture est avantageusement de 25 à 50° Ce Le pH du milieu peut varier mais il est avantageux que ce pH soit approximativement neutre ; pour cela, on 20 peut ajouter un agent neutralisant comme de l'ammoniaque aqueux, de l'hydroxyde de sodium, du carbonate d'ammonium ou de calcium. La durée de culture est avantageusement de 2 à 4 jours ce qui donne une quantité suffisante de L-tyrosine. A la fin de la culture, on enlève les cellules microbiennes 25 du bouillon et on traite le filtrat par un procédé approprié, par exemple sur une résine échangeuse d'ions, afin de donner la L-tyrosine. Bans la suite de la description, les pourcentages indiquent des poids par volume (poids/volume), sauf en ce qui concerne les 30 sources de carbone (volume/volume)» L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de plusieurs exemples non limitatifs, de modes de réalisation suivant l'invention. Exemple 1.- On effectue la fermentation en utilisant un milieu 35 de culture contenant les ingrédients suivants : KHgPO^ 0,2 % lîagHPO^ 0,2 % MgSO^ ,7H20 0,1 % MnSQ,, , 4-H-0 0,005 % BAD ORIGINAL 69 09275 -3- 2005071 FeSO^ , 7H20 0,001 % ZnSO^ , 7H20 0,001 % HH^ITOj 1 % TM aminé 1 mg/1 5 Amine-ÏTZ 0,5 % Mélange de n-paraffine ^12 ~ ®14-^ ~ 5 % (v/v) On stérilise le milieu puis on ajoute du carbonate de calcium (1 fo) qui a été séparément stérilisé et séché, afin d'ajuster le pH du milieu à 7» On inocule le milieu avec des germes de 10 Arthrobacter paraffineus 2411-ÏÏ-30 (ATCC 21377) (10 % en v/v) préparé par culture de la souche dans un bouillon de levure, sous agitation, pendant 24 heures. On effectue la fermentation à 30° C pendant 4 jours en agitant. Durant la culture, on ajuste le pH à une valeur approximativement neutre en aj'outant du car-15 bonate d'ammonium. On recueille 352 mg/ml de L-tyrosine. On filtre le bouillon pour éliminer les cellules microbiennes. On aj'uste le pH du filtrat à 2 et on l'absorbe sur une résine échangeuse de cations, fortement acide, dite "DIANTON SK ïf°1n, vendue par Mitsubishi Kasei Xogyo K.K Japan. Après lavage avec 20 de l'eau, on élue la résine avec de l'ammoniaque aqueux.IN. On recueille des fractions d'éluat positives à la ninhydrine ; on - les combine et on les concentre à 40° C sous pression réduite. On décolore ensuite la solution concentrée avec du carbone actif. On ajoute de l'alcool et on obtient 2,6 g de cristaux bruts de 25 L-tyrosine. Exemple 2.- On utilise des germes de Arthrobacter Paraffineus 2411-ÏÏ-30 (ATCC 21377) et on effectue la fermentation ainsi que décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise un milieu synthétique contenant 500 //ml de L-phénylalanine au lieu d'aminé 30 NZ (0,5 %). A la fin de la fermentation on obtient 2,8 mg/ml de L-tyrosine. Exemple 3.- On utilise un bouillon de culture de Oorynebaeterium hydrocarboclastus 2438-U-8 (ATCC 21227) comme germe. Le milieu de culture est analogue à celui décrit dans l'exemple 1 35 si ce n'est qu'on remplace le mélange de paraffine (5 % v/v) par du kérosène (5 % v/v).-On effectue la fermentation en agitant pendant 4 jours ; On obtient 1,2 mg/ml de L-tyrosine. Exemple 4.- On opère ainsi que décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise des germes de Brevibacterium ketogluta-40 aicum 24.73-0-21 pour produire 3,1 mg/ml de L-tyrosine# 69 09275 -4- 2005071 Bien entendu, l'invention n'ést nullement limitée aux exemples décrits ; elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. 69 09275 -5- 2005071 - REVENDICATIONS - 1.- Procédé de préparation de L-tyrosine qui consiste à cultiver, dans des conditions aérobies, un microorganisme assimilable par les hydrocarbures qui nécessite de la phénylalanine 5 pour sa croissance, dans un milieu de culture contenant au moins un hydrocarbure comne source principale de carbone, puis à récupérer la L-tyrosine accumulée dans ledit milieu de culture. 2.- Procédé suivant 1 dans lequel le microorganisme est choisi dans le groupe du Ccrynebacterium, le Brevibacterium et du Ar- 10 throbacter. 3.- Pr-ccédé suivant 2 dans lequel le micro organisme est le Oorynebaeterium hydrocarboclastus portant la référence "ATCC 21227", Arthrobacter paraffineus de référence "ATCC 21377"» 4.- Procédé suivant l'une des revendications précédentes carac-15 térisé en ce que la température du milieu de culture est maintenue entx'e 25 et 50° C. 5«- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4 dans lequel le pH du milieu de culture est maintenu à environ 7. 6.- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5 caractérisé 20 en ce qu'on effectue la culture pendant une période de 2 à 4-jours. 7«- Procédé suivant 1, dans lequel la source principale de carbone est un hydrocarbure aliphatique ayant 10 à 25 atomes de carbone ou un mélange desdits hydrocarbures, du kérosène ou de 25 l'essence. 8.- Procédé suivant 75 dans lequel la source principale de carbone est une n-paraffine de 11 à 18 atomes de carbone. 9.- Procédé suivant l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le milieu de culture contient une source d'a- 30 zote, des substances minérales et des agents nutritifs.