Brevet FR2000632A1 — publié le 19690912

La présente invention est relative à un procédé de production de cellules de levures. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production de cellules de levures contenant du L-tryptophane. 8elon la technique antérieure, on obtient du L-tryptophane dans une liqueur de culture en ajoutant de l'acide anthranilique au milieu nutritif, dans lequel on cultive les levures en présence de saccharines à titre de source de carbone. Toutefois, on ignorait que le L-tryptophane peut être produit et accumulé dans les cellules de levures quand on cultive des levures capables d'utiliser on d'assimiler des hydrocarbures qui ont été ajoutés au milieu de culture à titre de source de carbone. La présente invention a donc pour objet - un procédé de production de cellules de levures qui contiennent de grandes quantités de L-tryptophane ; - un procédé de production de cellules de levures contenant du L-tryptophane, à peu de frais et à l'échelle industrielle avec un rendement élevé de produit ; - l'obtention de L-tryptophane ; - loobtention de cellules de levures contenant du L-trypto- phase, qui peuvent titre avantageusement utilisées conne matières alimentaires, conne suppléments pour des matières alimentaires, etc. Ces caractéristiques et avantages de la présente invention ainsi que d'autres apparattront aux techniciens à la lecture de l'exposé qui va suivre. En étudiant des procédés de production de cellules de micro-organismes contenant de grandes quantités de L-tryptophene, à peu de frais, la deianderesse a constaté qu'on peut obtenir des cellules de levures contenant du L-tryptophane avec un rende- lent élevé, en cultivait des levures dans un milieu contenant des hydrocarbures conne source de carbone et en ajoutant de l'acide anthranilique au milieu, à un moment quelconque pendant le proches sus de culture. De cette manière, on atteint les buts précités en cultivant des levures assimilant les hydrocarbures dans un milieu nutritif contenant au moins un hydrocarbure comme source prince pale de carbone. Les souches de levures utilisées dans la présente invention sont celles qui sont capables d'utiliser on d'assimiler des h- drocarbures. Par eremple. on peut utiliser des levures apparte nant aux genres Candida, Torulopsis, Brettanomyces, atc. Des souches de levures appropriées appartenant à ces genres et-pouvant entre utilisées comprennent par exemple les souches Torulosis famata, Torulopsis intermedia, Candida tropicalis, Candide lipolytica, Candida mycoderme, Candida zeylanoides, etc. On peut utiliser aussi bien un milieu de culture synthétique qu'un milieu nutritif naturel pour cultiver les souches utilisées dans la présente invention, à condition que le milieu de culture choisi contienne les él6ments nutritifs essentiels pour le développement dje la souche choisie. De tels éléments nutritifs sont bien connus dans la technique-et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'asote, les composés min6raux et des produits analogues, qui sont utilisés en des quantités appropriées pai le micro-crganisme choisi. Etant donné qu'on utilizo dans la présente invention des souches assimilant les hydrocarbures, le milieu contient des hydrocarbures comme source de carbone principale. Les hydrocarbures qui conviennent dans ce cas comprennent, par exemple, les paraffines à chaîne droite et à chaîne ramifiée (alcanes) telles que le n-pentane, le n-octane, le n-dé cane, le n-dodécane, le n-heradécane, l'isopentane, l'isooctane, etc., des cycloparaffines telles que le cyclohexane et le cyclooctane, des oléfines à chaînes droites et ramifiées, telles que le pentène-2, l'exène-1, l'octène-2, etc., des syclcoléfines telles que le cyclohaxene, des hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, l'oxylème, le p-xylène, etc., et leurs mélanges, einsi que des hydrocarbures mixtes comme le h6rosène, lon huiles l6gères, les huiles lourdes, les huiles paraffiniques, les bruts de pétrole, etc. De petites quantités d'autres sources de carbone peuvent également êtreincorporées an milieu. On cite, à titre d'exemple, des hydrates de carbone tels que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, un hydrolysat d'anidon, la mélasse, etc., ou n'importe quelle autre source de carbone appropri6e telle que des acides organiques, conne par exemple l'acide acétique, l'acide lactique, ets. On peut utilisor ces substances isolément ou sous forme de mélangos comprenant deur ou plus de deux de ces substances. La source d'azote peut être courtitrse par divers genres de u semposés minéroex ou organiquen, tola que l'urée, une so lution d'^mmoniaque ou des sels d1ammonium tels que le chlorure d'swsonium, le sulfate d'sonium, le nitrate d'ammonium, 1' acé- tate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, etc0, ou encore des substances naturelles contenant de l'azote, comme une liqueur de macération du maTs, un extrait de levure, un extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, du bouillon, les hydrolysats de caséine, un acide aminé de la caséine, les matières solubles du poisson, un extrait de déchets de grains de riz, etc.Ces substances également peuvent entre utilisées isolément ou sous forme de mélanges comprenant deux ou plus de deux de ces substances. Les composés minéraux qui peuvent entre ajoutés au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate ferreux, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, etc. En outre, des éléments nutritifs essentiels pour la crois sance de la souche particulière utilisée seront ajoutés au milieu et comprennent, par exemple, des vitamines telles que la biotine, la thiamine et divers genres d'amino-acides tels que l'acide glutamique, etc. Conformément à la présente invention, de l'acide anthranilique est ajouté au milieu, à un moment quelconque du processus de culture. En d'autres termes, l'acide anthranilique peut être ajouté au début de la culture ou bien au milieu de celle-ci, après une prolifération considérable des souches. De plus, l'acide anthranilique peut entre ajouté en une seule fois ou par intermittence, le mode d'introduction choisi étant celui qui donne des résultats optimaux. La quantité d'acide anthranilique devant être ajoutée au milieu-peut varier en fonction de la souche particulière et des conditions de culture particulières qu'on a choisies.Toutefois, on ajoute l'acide anthranilique au milieu de préférence en une concentration comprise en général entre environ 20 mg/litre et 5 g/litre. On exécute la fermentation ou la culture des micro-organismes dans des conditions aérobies, par exemple en secouant la culture dans des conditions aérobies ou bien en agitant et en aérant une culture submergée, à une température comprise par exemple entre environ 10 et 500C et à un pH compris par exemple entre environ 2 et 9. Après environ 2 à 10 jours de culture dans de telles conditions, aes cellules de levures contenant de gran des quantités de L-tryptophane sont obtenues.On peut ensuite récupérer le L-tryptophane dans les cellules par des procédés classiques, tels qu'une extraction ou un procédé analogue On comprendra mieux la présente invention à la lecture de l'exemple qui va suivre, étant bien entendu que celui-ci est donné uniquement à titre indicatif et non limitatif de la portée de l'invention0 Sauf mention contraire, les pourcentages donnés dans cet exemple et dans la totalité de l'exposé s'entendent en poids par litre d'eau. EXEMPLE On cultive chacun des micro-organismes Candida tropicalis KY5014 (ATCC 20175), Candida arborea KY5015 (ATCC 20176) et Candida lipolytica KY5034 (ATCC 8661), dans un milieu d'ensemencement contenant 2 % de sorbitol, 1 % d'extrait de viande, 0,5 % d'extrait de levure, 1 % de peptone et 0,3 % de chlorure de 80- dium, tout en secouant en aérobie à 300C, pendant 24 heures, en vue de préparer une culture d'ensemencement.Les cultures d'ensemencement ainsi obtenues sont inoculées respectivement dans des fioles coniques contenant chacune 20 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition suiivante : Mélange de n-alcanes (c12-C14) 5 % (NH4)2SO4 2 % KH2Po4 0,2 % Na2HPO4 0,2 % MgSO4, 7H2O 0,1 % FeSO4, 7H2O 0,001 % MnSO4, 4H20 0,001 % ZnSO4, 7H2O 0,001 % Extrait de levure 0,5 % Liqueur de macération du ma$s 1 CaCO3 1 % Acide anthranilique 1 g/l Le pH du milieu de fermentation est de 6,5. On exécute la fermentation en secouant les cultures en aé- robie à 300C, pendant 72 heures, on centrifuge les cellules résultantes pour les séparer de la liqueur de culture et on ex- trait le L-tryptophane libre contenu dans les cellules au moyen d'eau chaude. On mesure la teneur en L-tryptophane de la solution extrait te par titrage biologique et on calcule la teneur en tryptophane libre par rapport au poids des cellules sèches. Des résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous. Ce tableau donne également, à des fins de comparaison, le rendement en cellules et les résultats obtenus dans le cas où l'on cultive les mimes lesures dans les mêmes conditions, mais en utilisant un milieu de fermentation qui ne contient pas d'acide anthranilique. TABLEAU Addition Rendement L-tryptophaue Levure d'aciden en cellules libre dans 1 g utilisée anthranilique (mg/ml) de cellules (poids sec) (mg/g) Candida tropicalis 1 31,0 2,50 KI5014 ATCC 20175 néant 33,8 0,95 CamdidA arborea 1 39,4 1,27 KI5015 AtCC 20176 néant 45,0 0,30 Camdida lipolytica 1 28,2 0,64 KI5034 ATCC 8661 néant 33,8 0,15 I1 est évident qu'on peut apporter de nombreuses modifi- cations & la description qui préméde sans sortir pour cela du cadre de l'invention. 1. Procédé de production-de cellules de levures contenant du L-tryptophane, caractérisé par le fait qu'on cultive une levure assimilant des hydrocarbures, dans des conditions aérobies, au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme source de carbone principale, et de l'acide anthranilique. 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise un micro-crganisme appartenant à un geure choisi dans le groups comprenent les scoches des levures Candida, Tourlopsis et Brettanomyces. 3. Procédé conforme à la revendication 1, caract6risé par le fiat qu'on cultive la lovere à une @empératue d'environ 10 à 50 C, à un pH d'environ 2 à 9. 4. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu nutritik contient caviron 20 mg/litre à 5 g/litre d'acide anthranicique. 5. Procédé conforme @ la revendication 1, caract6risé par le fiat que l'acide anthrantlique est ajonté au milieu nutritif au début de la culture 6. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fiat qu'on ajoute de l'seide anthraullique au milieu nutritif après le début de la culgure. 7. Procédé sonf@@@ la revendication 1, carant6risé par le fait qu'il comprend en uttre les op6rations d'élimination des cellules de levures génuitantes contennen dans la liqueur de culture et le'xtraction de lmtryptophus contenu daNs ces cellules. 8. Procédé confosmin à la retendieution 2, coractéris6 pur le fait que le aricre-cargantsme est la scnche Candida fropiclis ATCC 20175. 9. Procédé confenme à la revendicAstion 2, caractérisé pr le fait que ledit rderz-orgraine est la souche Candida arborea ATCC 20176. 10. procédé conforme à la revendication 2, caractérisé par le fait que le micro-orgu@Ane est l souche Candida lipolytica ATCc 8661. 11. Procédé conforme à la rev@@@@ 1, dase lequel l'ayércemrbure précité @@@ @@@ le@@@@ @@@@. 12. Procédé conforge à la revendication 1, dans loquel l'lydrouarbure est le k6resére.