Brevet FR2012406A1 — publié le 19700320

La présente invention concerne la préparation d'un vaccin, avec lequel on peut procéder à l'immunisation préventive de porcs d'âge quelconque, mais au plus t8t une semaine après la naissance, ainsi que des truies gravides, à l'exception des premières et des dernières semaines de la grossesse, contre la peste porcine classique et les infections dues à des bactéries pathogènes. Il est connu qu'à la suite d'une infection de porcs avec le virus de la peste porcine, des maladies secondaires dues à des germes des genres Salmonella et Pasteurella apparaissent très fréquemment. De même, on rencontre souvent-une maladie due à l'un de ces germes seulement, par exemple le paratyphus du porcelet ou la septicémie hémorragique. Ces infections engendrent des symptômes très sévères, qui conduisent rapidement, dans de nombreux cas, à la mort des animaux qui en sont affectés. Ces maladies se manifestent de façon particulièrement aiguë chez de jeunes animaux, lesquels sont d'ailleurs atteints relativement plus souvent. C'est la raison pour laquelle il est très courant d'immuniser des porcelets quelques semaines après la naissance avec des vaccins contre ces agents pathogènes.Toutefois, la pratique jusqu'à présent courante présente, à côté des frais élevés, l'inconvénient qu'un intervalle de temps de plusieurs semaines doit exister entre les inoculations individuelles, afin que les vaccinations puissent conduire à une protection. Dans le cas des nombreux vaccins antibactériens d'usage courant jusqu'à présent (vaccins contre des bactéries pathogènes), il n'y a pas de concentration des bactéries, de sorte que la vaccination. doit généralement être répétée au bout de quelques semaines. Des réactions allergiques sont parfois provoquées par la teneur en protéines du bouillon nutritif qui est nécessaire pour la culture des bactéries. L'expédition de ces vaccins et leur utilisation doivent s'effectuer en tenant compte de l'instabilité des solutions aux températures élevées, dans des gammes de température de + 4 à + 80. L'invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin associé, qui exclut ces inconvénients. Le vaccin se présente sous une forme lyophilisée, de sorte que l'aptitudeXau stockage atteint au moins un an et demi, des températures de stockage inférieures à + 180 étant suffisantes. Un dépassement occasionnel de courte durée de ces conditions, jusqu'à 350, ne nuit en rien. Après dissolution de la matière lyophilisée dans le solvant qui lui est ajouté et qui contient un adjuvant destiné à renforcer l'action immunisante du composant bactériel, les antigènes sont administrés dans une seule oonr;re injection, de sorte que l'animal vacciné est protégé/les divers agents pathogènes en même temps.Au moyen du procédé particulier de préparation, on peut régler la concentration de l'antigène bactériel d'une façon quelconque à la valeur optimale, de sorte qu'on obtient en combinaison avec l'adjuvant ajouté, un très bon effet de protection par une seule et unique injection. L'acétone utilisée pour inactiver les bactéries est totalement éliminée avant la lyophilisation. Ceci supprime les effets secondaires de l'agent d'inactivation, qui provoquent une réduction progressive des propriétés d'immunisation. La préparation des vaccins conformes à l'invention steffectue en trois étapes : 1) > préparation des antigènes, 2) mélange des an- tigènes et lyophilisation avec addition d'une solution d'agent stabilisant, et 3) préparation du solvant additionné d'adjuvant. 1) A titre d'antigène pour combattre la peste porcine clae- sique, on utilise une souche spécialement atténuée du virus suipestique, dont la production en vue de l'application comme vaccin vivant est protégée par les brevets espagnols NO 347 294 et NO 347 295. Les souches de bactéries sont des germes particulièrement pathogènes, isolés en cas d'apparition de la maladie, ces germes étant multipliés dans un bouillon nutritif usuel et étant précipités à l'acétone à 40C, lorsque la concentration optimale des bactéries a été atteinte. Les bactéries sont agitées à 40C dans la suspension d'acétone jusqu'à l'inactivation totale, puis elles sont séchées. 2) Des solutions du virus suipestique, qui ont été obtenues dans des cultures cellulaires, sont essayées sur des porcs pour déterminer leur teneur en virus par titration de l'effet de protection, et sont-diluées par mélange avec une solution d'agent de stabilisation, qui contient des hydrates de carbone et des protéines, de sorte que chaque charge de production contienttpar dose d'inoculation du vaccin prit à l'emploi, la m8me teneur en virus de 800 UMP. L'unité UMP désigne la plus petite quantité de virus qui, par inoculation à des porcs, protège encore tous les animaux contre une infection provoquée expérimentalement par un virus suipestique virulent. On répartit uniformément dans cette solution autant de poudre sèche de bactéries que le vaccin prêt à l'emploi doit contenir de bactéries par dose d'inoculation, par exemple 20 x 109 bactéries par dose d'inoculation. La proportion des espèces de bactéries peut être réglée à des valeurs quelconques, par exemple 60 % de Salmonella choleraesuis et 40 % de Pasteurella multocida. Le mélange est versé dans des flacons classiques de lyophilisation, puis lyophilisé. 3) On dissout à 3% dans de l'eau distillée, en mQme temps que 0,4 ffi de gluconate de calcium, de l'alginate de sodium dont le poids moléculaire a été choisi de manière qu'une solution à 3 % de ce composé dans l'eau distillée puisse être aspirée sans difficulté dans une seringue hypodermique à aiguille N018, on règle le pH & 7,6 par addition d'une solution tampon et on stérilise par chauffage à l'autoclave. Le vaccin prdt à l'emploi est préparé en ajoutant la quantité correspondante de solvant à la matière lyophilisée à l'aide d'une seringue hypodermique d'adaptation. En agitant par secousses, on obtient un mélange homogène des substances. On injecte 2 ml par porc de cette suspension, par voie sous-cutanée ou intramusculaire. L'invention est illustrée en détail par l'exemple- suivant La souche atténuée du virus de la peste porcine classique est multipliée suivant le procédé décrit dans le brevet espagnol N0 347 294 précité. On détermine par titration chez le porc la teneur en virus de la solution ainsi obtenue. A la dilution de 1:10 000, les 4 porcs qui ont été vaccinés avec cette dilution sont tous encore protégés. En raison de ce résultat, on dilue le virus avec deux parties de solution d'agent de stabilisation. On ajoute 1,0 g de poudre sèche de bactéries à 5 litres de cette suspension. Ce produit se compose de 0,6 g de Salmonella choleraesuis et 0,4 g de Pasteurella multocida. Les bactériès sont mélangées en même temps avec la solution de virus, le mélange est réparti entre des flacons de lyophilisation et il est déshydraté sous vide après congélation à -400. On dissout 1 200 g d'alginate de sodium et 200 g de gluconate de calcium dans 40 litres d'eau distillée et on-regle le pH à 7,6 par addition d'un tampon de phosphate 0,5 M. On chauffe le mélange à l'autoclave pendant 15 minutes à,1150. Après refroidissement de la solution, le précipité est séparé par centrifugation, on verse la liqueur surnageante dans des flacons, par portions de chacune 10 ml, conformément au solvant poar"cinq doses de vaccin, et on stérilise après fermeture des flacons. Le contenu d'un flacon de vaccin lyophilisé, correspondant à cinq doses, est mélangé avec 10 ml de solvant. On injecte par voie intramusculaire à des groupes de 4 porcs, 2 ml de ce vaccin à l'état non dilué, dilué à 1 : 100 et dilué à 1 : 400 avec une solution physiologique de chlorure de sodium. Trois semaines plus tard, on traite les porcs par injection de 2 ml de sang de porcs qui ont été saignés 5 jours après l'infection par une souche très pathogène de virus suipestique. Les animaux vaccinés à l'aide du vaccin non dilué et du vaccin dilué à 1 : 100 sont restés tout-à- fait sains.Les animaux vaccinés au moyen du vaccin dilué à 1 : 400 ont montré, du quatrième au septième jour après l'injection, une élévation de température à 40,9o, sans autre réaction. Une autre partie du vaccin est injectéarvoie intrapéritonéale à raison de 0,2 ml à chacune des souris de deux groupes de 10. 21 jours plus tard, 10 des souris reçoivent une injection intrapéritonéale de 5 x 108 Salmonelles, les dix autres souris recevant une injection de 5 x 108 Pasteurelles. Avec le même nombre de bactéries, on traite en même temps par injection, pour chaque souche de bactéries, 10 souris qui n'ont pas été vaccinées. Tous les ani- maux non vaccinés meurent dans 1! espace de 3 jours en présentant les signes typiques d'une salmonellose et respectivement d'une pasteurellose, et parmi les animaux vaccinés, au bout de 7 jours, 9 animaux sur 10 survivent à l'infection avec Salmonella et 8 sur 10 survivent à l'infection avec Pasteurella. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation, d'un vaccin associé contre la peste porcine et des maladies bactériennes du porc, caractérisé par le fait qu'on mélange une solution du virus suipestique qui a été adapté par atténuation à la vaccination de porcs avec une solution d'agents de stabilisation et une poudre sèche de bactéries inactévées, de sorte qutil existe par dose d'inpculation de vaccin prêt à l'emploi, au moins 800 UMP de virus suipestique et 20 x 109 bactéries, on stabilise le mélange par lyophilisation et on le dissout, avant l'inoculation, dans un solvant qui contient un adjuvant des tiné à renforcer l'action immunisante. 2. Procédé de préparation d'un vaccin associé contre la peste porcine et des'maladies bactériennes du porc, suivant-la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise en tant que bactéries Salmonella choleraesuis et Pasteurella multocida, de préférence dans le rapport de 60 % de S. choleraesuis et 40 % de P. multocida. 3. Procédé de préparation d'un vaccin associé contre la peste porcine et des maladies bactériennes du porc, suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on précipite les bactéries à 40C dans le bouillon nutritif par addition d'acétone, on fait digérer avec l'acétone, jusqu'à ce que le caractère infectieux des bactéries pour les animaux et leur aptitude à se multiplier dans des milieux de culture aient disparu, et on déshydrate après élimination de l'acétone. 4. Procédé de préparation d'un vaccin associé contre la peste porcine et des maladies bactériennes du porc, caractérisé par le fait qu'on utilise en tant qu'adjuvant un alginate de sodium dont le poids moléculaire est assez haut pour qu'une solution à 3 %de cet alginate dans une solution à 0,4 % de gluconate de calcium puisse être facilement aspirée par une aiguille d'injection N 18. 5. Vaccin associé contre la peste porcine et les maladies bactériennes du porc, obtenu au moyen du procédé suivant l'une des revendications 1 à 4e