Brevet FR2010678A1 — publié le 19700220

On sait que la nats canine est sujetts à un cartain nombre de maladies qui penvent avtir des conséquences graves, il s'agit notamment de la maladie de Carré, de la maladie de Rubarth on hépatite canine contagieuse, et des leptospiroses. On a déjà cherché à réaliser des vaccins polyvalants contre ces maladies, mais l'on s'est heurte à des difficultés importan- tes en raison de la grande fragilité du vaccin contre la maladie de Carré, en particulier vis-à-vis du formol et autres agents d"- nactivation des virus de l'hépatite et des leptospires La présente invention est relative àun procédé de prépara- tion d'un vaccin.polyvalent qui permet à l'aide d'une seule et même inoculation d'immuniser un chien contre la maladie de Carré, la maladie de Rubarth et les leptospiroses canines heures, sous réserve des rappels habituels. Conformément à l'invention, on prépare un vaccin vivant contre la maladie te Carré en cultivant sur culture de cellules d'em- bryon de poulet une souche de virus de Carré avienisé. On obtient ainsi an vaccin ne contenant pas de protéines de l'oeuf, que l'on stabilise ansuite par lyophilisation. Conformément à l'invention, le vaccin contre la maladie de Rubarth et les leptospires est préparé sous forme de liquide de maniére à pouvoir serivr de solvant au vaccin contre la maladie de Carré qui a été lyophilisé isolément, le mélange s'effectuant au moment de l'injection. Conformément à l'invention, on prepare le vins inactivé de l'hépatite en ensemençant à l'aide d'une squché de virue de l'hépatite une culture cellulaire provenant de reins de chiot dans un milieu sans sérum, et l'on procède à la récolte lorsque l'effet cytopathogène est nettement visible. La suspension de virus est ensuite soumise à me filtration puis elle est inactivée par action conjuguée du formol et de la chaleur. Enfin le formel est neutralisé. Selon l'invention, on produit isolément les leptospires à partir de souches telles que la Leptospira canisola nu la Leptospira icterohemorragiae dans un milieu de culture tel que le milieu de Korthoff additionné de 10 % de sérum de lapin et de 1 % d'hémoglobine de lapin après un temps d'incubation de 8 à 15 jours à 28 C. On contrôle la pureté de la culture par examen an microscope sur fond noir. Pour évaluer la richesse de la culture on vérifie par centrifugation que l'on obtient un culot cellulaire de 0,02 à 0,04 % en volume. On mélange alors les cultures des différents sérotypes uti lisés et l'on entrifuge cet ensemble. Le culot est alors repris à l'aide ou vaccin inactisé contre l'hépatite qui a été préparé comme indiqué ci-dessus. Après agitation ce mélange est rapide mant congelé puis nécongelé. Au moment de l'emploi, ce vaccin qui est à l'état liquide est utilisé comme solvant du vaccin contre la maladie de Carré qui a été préparé comme indique ci-dessus. On voit que conformément à l'invention, il est possible de préparer un vaccin polyvalent contre la maladie de Carré, lthe- patite et les leptospiroses qui est obtenu au moment de l'emploi en dissolvant un vaccin lyophilisé contre la maladie de Carré dans un solvant constitué par le vaccin inactivé contre l'hépa tite qui contient également les leptospires inactivés. Dans une variante du procédé selon l'invention, il est pos sible de réaliser un vaccin bivalent en dissolvant au moment de l'emploi le vaccin lyophilisé contre la maladie de Carré dans le seul vaccin inactivé contre l1hepatite dont l'obtention a té décrite ci-dessus. Selon une autre variante du procédé selon l'invention, on peut obtenir un vaccin polyvalent en dissolvant au moment de l'emploi le vaccin lyophilisé contre la maladie de Carré dans un vaccin contenant à l'état liquide les leptospires inactivés. À cet effet, le vaccin à l'état liquide peut être obtenu en reprenant le culot de la culture des leptospires dans par exemple du milieu 199 de Parker sans sérum au lieu de le reprendre à ltssi- de du vaccin inactivé contre l'hépatite. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le vac cin contre les leptospiroses est réalisé à partir de cultures de Leptospira canicola "Houd Utrecht IV" et de Leptospire ictero hemorragiae "Kantarowitz" prises par exemple en parties égales. Bans le but de mieux faire comprendre l'invention on va en décrire maintenant à titre d'illustration et sans aucun carat tère limitatif plusieurs modes de réalisation donnés comme exemples. EXEMPLE 1 Préparation de la valance Carré On part de la souche Pitman-Moore (Dow Chamical C ) qui est sous forme de virus avianisé. Ce vivus a été adapté à la multipli cation avec effet cytopathogène spécifique sur culture cellules d'embryon de poulet. A la suite de cette adaptation, on a obtenu une amélioration simultanée des titres du virus sur oeuf qui est en moyenne de l'ordre de 100 fois par rapport au virus d'origine. Après homogénéisation de la suspension virale et addition d'un support de lyophilisation, le vaccin est stabilisé par ce procédé. La purification résultant de la multiplication sur culture cellulaire permet d'obtenir une meilleure tolérance locale du vaccin chez le chien et une meilleure réponse immunitaire qui peut être établie par titrage des anticorps neutralisants. EXEMPLE 2 Préparation de la valence hépatite. Pour réaliser la culture cellulaire on part de reins de chiots de 2 à 4 mois qui sont soumis à une digestion enzymatique dans une solution de Haïks contenant 0,25 % de trypsine. On ensemence des flacons de 500 ml contenant un milieu de culture Earle-lactalbumine + sérum de veau, à raison de 200 000 cellules par ml. On place la culture à l'étuve à une température de 37 C. Le tapis cellulaire se forme en 3 à 4 jours. On élimine ce milieu.de mise en culture et on le remplace par un milieu 199 de Parker sans sérum. On inocule le virus dans la proportion de 1 partie de virus non dilué d'une récolte précédente pour 100 parties de milieu 199. On ensemence à l'aide de virus contre l'hépatite provenant d'une souche IFFA (voir la publication TERRE J., LANG R., VAN. HAVERBECKE G., SOULEBOT J.P., Rev. Méd. Vét., 1966, 117 , 991.) Au bout de 3 à 5 jours, l'effet cytopathogène est nettement visible et l'on procède à la récolte du virus qui est stocké au congélateur à -70 C. La suspension de virus est alors rapidement décongelée puis soumise à une filtration clarifiante et à une filtration finale sur filtre connu sous la marque "Millipore" de .0,22 Pour procéder à l'inactivation du virus, on ajoute une solution de formol à 40 % jusqu'à une c.oncentration finale de formol de 0,036 % dans la suspension de virus et l'on laisse incuber pendant 96 heures à la température de 37 C. On ajoute ensuite une solution de métabisulfite de sodium à 350 Bé pour avoir une condentration de 0,027%par rapport à la suspension de virus, On contre l'inactivation du virus sur des cultures de cellules rénales de chiens. Cette culture ne doit permettre de ne réisoler aucun virus de l'hépatite. EXEMPLE 3 Production des valences hénatite + leptospiroses tes leptospires sont produits séparément à partir des deux souches Leptospira canicola de "Houd Utrecht IV" et Leptospira icterchemorragiae "Kantarowitz". Pour effectuer la culture on inocule chaque souche de leptospires dans un milieu de "Korthoff additionné de 10 % de sérum de lapin et I % Le temps d'incubation est généralement de 8 à 15 jours à la température de 28 C. La culture présente une bonne vitalité et donne lieu aprbs centrifugation en tubes.de Hophius à la p.roduc- tion d'un culot de 0,02 à 0,04 %. Dans le mode de mise en oeuvre décrit, on produit séparément des mêmes quantités des deux sérotypes précités. On mélange les cultures des deux sérotypes par parties égales puis on les centrifuge avec une accélération de 1 600 g pendant 2 heures à la température de + 4 C. Le culot des cultures des deux sérotypes est ensuite repris à l'aide du vaccin inactivé contre l'hépatite dont l'obtention a été décrite à l'exemple 2. Après 30 minutes d'agitation, le mélange est à nouveau rapidement congelé à la température de - 20 C pendant 24 heures ou plus. Après décongélation, le vaccin qui se trouve à l'état liquide est prêt à être utilisé comme solvant du vaccin Carré. En opérant comme il vient d'être décrit, les leptospires se trouvent être complètement inactivés. Aucun leptospire n'est réisolable en milieu de Korthoff. EXEMPLE 4 PréParation d'un vaccin inactivé contre les leptospires. On procède à la culture des leptospires comme indiqué à l'exemple 3. Toutefois, le culot de culture des leptospires est repris dans du milieu 199 de Parker sans sérum 'puis congelé dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 3, ce qui permet d'obtenir un vaccin inactivé liquide contre les leptospiroses. EXEMPLE 5 Préparation d'un vaccin quadrivalent maladie de Carré, hépatite, leptospiroses. Pour préparer un tel vaccin on procède, au mondent de ploi, à la dissolution du vaccin lyophilisé contre la maladie de Carré, obtenu selon l'exemple 1, dans un vaccin liquide contre l'hépatitte et les leptospiroses obtenu selon l'exemple 2 et l!on procède à l'inoculation immediate de ce vaccin au sujet considéré, En respectant les normes d'un calendrier de vaccination on obtient une immunisation contre ces quatre maladies On voit que le procédé sel-on l'invention permet de réalise un vaccin permettant à l'aide d'une seule inoculation, compte te nu du rappel, de conferer à un chien l'immunité contre la mala- die de Carré, l'hépatite à virus et les leptospiroses majeures. Ce procédé présente également l'avantage de permettre sans aucune modification du processus industriel d'obtenir les vaccins suivants 1 ) Un vaccin contre la seule maladie de Carré par simple dissolution du vaccin lyophilisé dans un solvant conventionnel. 2 ) Un vaccin contre l'hépatite à virus en inoculant ce seul vaccin qui a été préparé à l'état liquide et sans l'avoir utilisé pour reprendre le culot de culture des leptospires 30) Un vaccin contre les leptospiroses qui est réalisé à par tir de cultures de leptospires. 4 ) Un vaccin bivalent contre la maladie de Carré et l'hé- patite en mélangeant les deux vaccins monovalents correspondants. 5 ) En vaccin polyvalent contre la maladie de Carré et les leptospiroses en mélangeant les vaccins correspondants. 6 ) Un vaccin polyvalent contre l'hépatite et les leptospiroses én mélangeant les vaccins correspondants. R E V E N D I C A T I ON S 1) Procédé de préparation d'un vaccin vivant contre la maludie de Carré, utilisable pour réaliser un vaccin polyvalent pour chiens, caractérisé par le fait que l'on cultive sur une culture de cellules une souche de virus de Carré apathogène et que l'on stabilise ensuite par lyophilisatîon la culture ainsi obtenue. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que l'on cultive une souche de virus de Carré avianisé sur cel- lules d'embryon de poulet. 3) Procédé de préparation d'un vaccin contre l'hépatite à virus utilisable pour réaliser un vaccin polyvalent pour chiens, caractérisé par le fait qu'on cultive une souche de virus de l'hépatite sur une culture de reins de chiots, qu on inactive la solution virale par l'action conjuguée du formol et de la chaleur et que l'on neutyalise le formol par exemple à l'aide de métebisulfite de sodine. 4) Procédé selon la revandication 3, caractérisé par le fait que l'onj réalise la culture da virus de l'hépatite dans un milieu de culture sans sérum. 5) Procédé de préparation d'un vaccin pour chiens contre les leptospiroses et contre l'hépatite à virus, caractérisé par le fait que l'on cultive des souches de leptospires telles que la Leptospira canicola ou la Leptospire icterchemorragiae et qu'on reprend les culots de ces cultures à l'aide du vaccin contre l'hépatite obtenu selon les revendications 3 ou 4. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on congèle la solution obtenue par exemple à - 20-C pendant an moins 24 h. puis qu'on décongèle cette solution. 7) Procédé de préparation d'un vaccin pour chiens contre la maladie de Carré, lthépatite à virus et lés leptospiroses, caractérisé par le fait que l'on dissout le vaccin contre la maladie de Carré obtenu selon la revendication I ou 2 dans le vaccin contre l'hépatite et les leptospiroses obtenu selon la revendication 5 ou 6. 8) Procédé de préparation d'un vaccin contre- la maladie de Carré et l'hépatite à virus, caractérisé par le fait qu'on dissout le vaccin obtenu selon la revendication I ou 2 dans le vaccin liquide obtenu selon la revendication 3 ou 4, 9) Procédé de préparation d'un vaccin contre les leptospi- roses, caractérisé par le fait qu'on cultive des leptospires de souches telles que la Leptospira canicola et la Leptospira icterohemorragiae dans un milieu tel que du milieu de Eorthoff additionné de 10% de sérum de lapin et de 1% d'hémoglobine de lapin, que l'on centrifuge et que l'on reprend les culots des cultures dans un milieur 199 de Parker sans sérum, que l'on congèle à - 200C pendant au moins 24 h. puis que l'on décongèle. 10) Procédé de préparation d'un vaccin pour chiens contre la maladie de Carré et les leptospiroses, caractérisé par le fait que l'on dissout le vaccin lyophilisé obtenu selon la revendication 1 ou 2 dans le vaccin liquide obtenu selon la revendication 9. 11) Vaccins monovalents et polyvalents obtenus selon au mbins une des revendications précédentes. 12) Procédés de préparation et vaccins obtenus comme décrits aux exemples 1 à 5.