Brevet FR2005304A1 — publié le 19691212

098Tt 2005304 L'invention concerne des enzymes capables d'hydrolyser sélectivement les liaisons «-1,8-glucosides du glucos® : *: connues depuis longtemps par quelques articles. Au cours des dernières années, elles ont éveillé de l'intérêt en connection avec l'iden-5 tification des structures de l'amidon, et ont fait 1-'objet d'études intenses. Il est connu que ces enzymes ont des activités sp®lque peu différentes et peuvent itre classées, de ce point de vue, en trois types, cornue dans la table I. Chacun de ces trois types d'activités différentess coona 10 résiné dans la table, démontrent une spécificité marquée aux différents types de liaisons *-1,6-glucosides. Par exemple,, les iso-mérases de levures n'agiront pas sur les liaisons ,6-glucosides de pullulanes, des pullulanases, de bactéries seront inactifs à l'égard des liaisons 1,6-glucosides de dextranes, et les R-enzymes 15 d'origine végétale n'agiront pas sur les liaisons 1,6-glucosides de glycogènes mais agiront sur celles des amidons « Ainsi, ©lies diffèrent dans les comportements des activités enzymatiques, bien qv» de nembreux éléments doivent encore ttre éclaireis. m. TABLE 1 - Types de *-1,6-glucosidases et leur spécificité de substrat. 25 Qtiyiwi de Levvres Bactéries Riz, gros haricots, 1'enzyme pommes de terre et orge. Isomerases Pullulanases R-enzymes 1 enzyme Spécificité aux substrats : Amidons ♦ + + P-limite dextrines-* + + 30 glyMfèmes + ♦ - dextranes - Pullulanes - + + Les présents inventeurs ont étudié ces enzymes connues 35 du point de vue industriel parce qu'elles pouvaient avoir une signification importante pour l'utilisation des amidons et des produits de décomposition similaires tels que des glycogènes, des dextrines, et des pullulanes. Quant au résultat, il a été trouvé que les isoamylases et les R-enzymes obtenues à partir de levures 40 et de plantes, respectivement, ont de très faibles activités et BAD ORIGINAL' 69 09811 2 2005304 de très faibles tsœpératMres optimales de 20 à 40®Gp tandis que les pullulanases d© bactéries ont d®s activités relativement élevées et sont le plus actives à des températures légèrement plus élevées„ 45°C. Par suit®, avec l'objectif de trouver des enzymes de *pécifi~ 5 cités aux substrats différentes pour des applications demandant une plus grande spécificité; ou des enzymes ayant une résistance à la chaleur^ améliorée^ les présents inventeurs ont recherché parmi 169 familles de cultures de type bactériel des bactéries produisant des *-1,6-glucosidases. 10 Le fil conducteur utilisé dans la recherche était le phé nomène suivant 3 lorsqu® tusse famille produit une «azyme ayant une activité de «*r1,6-glucosidase, 1* amidon et la solution d'iode-iodure de potassium ajoutée virent au bleu. Ceci conduisit à la découverte que les enzymes ci-dessus pouvaient être produites par 40 15 familles de 16 genres, nommément Bacillus, laetobacillusf Necardia, Agrobacteriura, Azotobacter, Leuconostoc, Pediococcus, Mycebaeteritmi Pseudomcnas; Saricina, Staphylecoccus, Serratia, Aerobacter, Exwinia Streptococcus et Micrococcus. De ces bactéries, celles du genre Aerebacter ont été sifna-20 lées par de nombreux étudiants et l'utilisation des bactéries dm genre Pseudomones fait l'objet de la demande de farevet ffrmmqmlm n* 3PY 155 570, dép®sé« 1* « mam ém 1* fin — deresse. Par suite, à l'exception des deux genres mentionnés ci-dessus, 25 toutes les familles des 14 genres disponibles ont été élevées dams des milieux de cultures pour bactéries aérobies et d'acide lactique, dont les compositions seront décrites plus loin, chacune de 100 ml et maintenue à 30*C. Les familles aérobies ont été élevées par la méthode de 30 vibration rotationnelle ®t les familles d'acide lactique par la méthode stationnaire. L'activité enzyœatique était déterminée de la manière suivante en utilisant un fluide surnageant obtenu en centrifugeant chaque fluide de culture produit et aussi en utilisant un fluide surnageant obtenu par l'autolyse des corps crypto-35 gamiques (fongus) précipités dans une solution tampon et en centrifugeant ensuite la solution. Chaque composition consistant en 5,0 mi d'amidon de riz glutinique liquéfié à 1%, 1,0 ml de solution tampon d'acide acétique à 0,5M, et 1,0 ml d'une solution d'enzyme, était maintenue en réaction à 40°C pendant trente minutes..De la 40 solution réagissante, on échantillonnait des portions de 1,0 ml BAD ORIGINAL1 69 09811 2005304 . après des périodes de réaction de zéro heure et trente minutes. Chaque partie échantillonnée était versée dans un mélange de 30 ml d'une solution d'acide sulfurique 0,01 N et d'iode-iodure de potassium 0,01 N. Le mélange1 virait au pourpre, et le coefficient d*ex-5 tinction à 620 m^ était déterminé 15 minutes après. L'accroissement du coefficient d'extinction de la solution réagissante pendant une période de 30 minutes- à partir du début de la réaction était considéré comme l'activité enzymatique. Dans ces conditions, un accroissement de 0,01 E du coefficient correspond à 1 unité d*ac-10 tivité. * Des familles examinées pour leur activité de la manière décrite, des familles typiques du genre qui produit plus d'enzymes & l'extérieur de leurs corps cryptogamiques qu'à l'intérieur peuvent être mentionnées, une pour chaque genre, comme l'Azotobacter 15 indicus,N le Bacillus cereus, l'Erwinia areideae, et le Nocardia corallina. Les familles qui'produisent plus d'enzymes à l'intérieur de leurs corps cryptogamiques représentent dix genres, nommément î Agrobacteriua tumefaciens, Mycobacterium lysçéeikticus, Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, Serratia plymuthica, Staphylococcus 20 aurcus, Làctobacillus plantarum, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacitici et Streptococcus faecalis. Parmi les familles choisies'ci-dessus, étaient particulièrement actives celles du genre Lactobacillus, Nocardia et Mi-crococcus. Elles furent cultivées en pots et purifiées pour la 25 recherche de leurs comportements enzymatiques et leur spécificité aux substrats. Les milieux de culture utilisés avaient les deux compositions suivantes : Milieu de culture 30 Pour bactéries Pour baetéries aérobies d'acide lactique Peptone 1 % 1 % Extrait de levure 0,5 0,5 K2HPO4 0,1 0,1 35 NaCl 0,05 0,05 MgS04,7H20 0,05 0,05 FeS04,7H20 0,001 0,001 MnS04,4H20 - 0,0002 Amidon liquéfié 1,4 0,7 40 Maltose - 0,5 69 09811 V 2005304 La croissance des corps cryptogamiques était représentée par le coefficient d'extinction à 660 myUde chaque fluide de culture dilué 10 fois, et le pH était déterminé en utilisant des électrodes de verre. 5 Comme pour les familles aérobies des trois genres men tionnés ci-dessus, elles furent cultivées dans des pots sous aération, ët les familles des genres Nocardia et Lactobacillus furent cultivées à 30°C pendant 3 jours et les familles de Micrococcus furent cultivées à 30°C pendant 1,5 jour. Les deux premières furent 10 purifiées par autolyse des fluides de culture et en éliminant les sels avec du sulfate d'ammonium et par dialyse du fluide surnageant, chaque opération étant effectuée deux fois. Le fluide de culture de chaque famille Micrococcus était traité après la fin de la culture en collectant les bactéries, les 15 lavant avec de l'eau pure, effectuant 1*autolyse pendant 48 heures avec l'addition d'une solution tampon S.D.S, centrifugeant, et soumettant le fluide surnageant à l'élimination des sels avec du sulfate d'ammonium, et extrayant ainsi une enzyme soluble. 20 (Voir tableau page suivante) COMPORTEMENT ENZYMATIQUE ET SPECIFICITE AU SUBSTRAT Propriété Isoamvlase Pullulanases enzvmatfgue de levures d'Aerobacter pH optimum temp. optimum Stabilité au pH 6-6,2 20°C pH 6-9 5,5-6 47 °C pH 5-8 Stabilité à la chaleur Rapidem-ent Rapidement déactivée à déactivée à en-dessous en-dessous de pH 5 de pH 5 Rapidement Rapidement déactivée à/déactivé« dessus de au-dessus 25 °C de 45°C Spécificité au substrat î Amidon de pomme de terre Amidon de riz glutineux Dextrine limite Dextrane Pullulane Glycogène + + + + Enzyme» dt S>seudomonas 2,5 45 °C ENZYME R-enzymes d'origine végétale 5f5,5 40®C Enzymes de Nocardia 6-7 40-45°C Enzymes de Lactobdcil- lus 5,6 au dessus de 50#C Enzymes de Micrococcus 5,5—6 45 °C pH 5,5-7,5 pH 5-6,5 Rapidement Rapidement déactivée déactivée à en-des- à en-dessous de sous de pH 5 pH 5 Rapidement Rapidement déactivée déactivée au-dessus au-dessus de 45°C de 45°C + + + + Rapidement déactivée à en dessous de pH 4,5 Rapidement déactivée au-dessus de 57°C + + pH 5-8 Rapidement déactivée à en dessous de pH 5 Rapidement déactivée au-dessus de 40-45 °C a» o >o oo Ui NJ O O en UJ o ■te. 69 0981\ 6 2005304 Les solutions d'enzymes furent essayées pour leurs propriétés enzymatiques et donnèrent les résultats reportés dans le tableau. A titre de référence, les résultats comparables des iso-amylases de levures, des pullulanases du genre Aerobacter, et des 5 enzymes du genre Pseudomonas sont aussi indiqués. En considérant ces résultats, il apparait que les enzymes de Lactobacillus ont des températures optimales et une résistance à la chaleur plus élevée, c'est-à-dire une température optimale supérieure à 50°C, en contraste avec les valeurs de 40 à 45°C pour les autres enzymes, et 10 sont par suite mieux adaptées aux applications commerciales que le reste. En ce qui concerne le pH optimum et la stabilité au pH, les enzymes du genre Nocardia démontrent des valeurs optimales de 6 à 7, légèrement supérieures à celles des enzymes de Lactobacillus «t de Micrococcus qui se situent au voisinage de 5,5. En ce qui con-15 cerne la stabilité au pH, toutes les enzymes perdent rapidement leur activité au pH 5 ou inférieur, à l'exception des enzymes de Lactobacillus qui demeurent actives à des pH relativement bas. La spécificité au substrat a été mesurée en soumettant un substrat à l'action de la p-amylase ainsi qu'à une «-1,6-gluco-20 sidase particulière et en déterminant ensuite la vitesse de décomposition. Des substrats utilisés dans ce but furent de l'amidon de pomme de terre, de l'amidon de riz glutineux, de la dextrine P-ldmite, du glycogène, de la dextrane et de la pullulane. La vitesse de décomposition de la pullulane fut comparée en termes de vitesse 25 de production de malttriose et les vitesses de décomposition des autres en termes de vitesses de production de maltose. Les résultats , comme indiqués dans les tableaux ci-inclus, ont montré que Jcs trois types d enzymes sonj^ii^^ri^b^em^gt ^Sac^fves1^1^' dex- sons 1,6 du système amidon ;/et, seules les enzymes du genre micro-Vfcra- Vies 30 coccus ne montrent pas d'activité a l'égard des glycogènes. En ce sens, les enzymes de Micrococcus peuvent être comparées aux R-enzymes d'origine végétale, pour autant que le type d'activité contre des «t—1,6-glucosides est concerné. Les autres enzymes du genre Lactobacillus et Nocardia sont considérées proches des pullu-35 lanases du genre Aerobacter. L'invention sera maintenant décrite plus complètement en liaison avec les exemples ci-après. La présente invention sera maintenant décrite plus complètement avec ses éléments constitutifs, en liaison avec les dessins ci-joints, sur lesquels sont représentées graphiquement 40 les conditions des solutions d'enzymes à utiliser dans l'application 7 69 098ÎV 2005304. de la présente invention : la figure 1 est une courbe indiquant les valeurs de pH optimales ; et la figure 2 est une courbe indiquant les températures optimales. 5 EXEMPLE 1 - Production de a-1,6-glucosidases par des bactéries. recherche a été faite pour des familles qui pourraient développer une coloration dans cet essai. Comme résultat, ces familles ont été trouvées dans les bactéries des genres Aerobacter, Bacillus, 10 Lactobacillus, Nocardia, Agrobacterium, Azotobacter, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Micrococcus, Microbacterium, Pseudomo-nas, Saricina, Serratia et Staphylococcus. Par suite, les familles disponibles qui appartiennent à ces familles furent cultivées dans des flacons et essayées pour leur activité. 15 Cent ml d'un milieu de culture ayant d'une des deux compositions ci-après ont été injectés d'une cuillerée (du platine) de chaque famille à essayer, et la culture a été conduite pendant 4 jours. La' température était maintenue à 30°C. Des bactéries aérobics furent cultivées avec rotation et vibration, tandis que 20 des bactéries d'acide lactique furent cultivées au repos. En utilisant la réaction de l'iode sur l'amidon, une MILIEU DE CULTURE Pour bactéries aérobies" Pour bactéries d'acide lactique 25 Peptone Extrait de levure 1,0* 0,5 0,1 0,05 0,05 0,001 1,4 1,0% 0,5 0,1 0,05 0,05 0,001 0,7 0,5 K2HP04 NaCl 30 MgS04,7H20 FeS04,7H20 Amidon liquéfié Maltose 35 Les résultats des cultures sont indiqués sur le tableau ci-dessous, dans lequel seules les familles ayant une activité relativement grande ont été mentionnées : 69 09811 Famille essayée 5 Agrobacterium fumefaciens IFO 3085 Azotobocter indicus IFO 3744 Bacillus C«reus IFO 3001 10 Bacillus firmus IFO 3330 Enninia aroideae IFO 3057 Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 15 Mycobacterium phlei IFO 3158 Nocardia corallina IFO 3338 Sarcina albida IAM 1012 20 Sarcina lutea, IFO 3232 Sarcina variabilis IFO 3067 Serratia indica IFO 3759 25 Staphylococcus aureus IFO 3061 Staphylococcus aureus IFO 3332 M H •IFO 3761 30 w " IFO 3340 Lactobacillus breris IFO 3345 w it IFO 3960 35 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus gayonii ATCC 8289 Lactobacillus Plantarum ATCC 8008 L«uconostoc citrovorum 40 ATCC 8081 2005304 Activité A l'extérieur A l'intédeur Activité du corps du corps total» cryptogamique cryptogamiaue 9,3 0 2,3 2,3 7,1 1,1 0 1,1 8,9 5,7 4,0 9,7 8,7 4,9 5,0 9,9 7,3 6,7 1,5 8,2 8,7 6,6 0,8 7,4 8,5 0 1,8 1,8 7,6 24,6 1,6 26,2 9,3 0 5,0 5,0 9,2 0 4,7 . 4,7 8,8 0 4,6 4,6 8,9 3,1 0,6 3,7 9,0 0 5,4 5,4 9,2 0 4,5 4,5 8,7 0 3,0 3,0 9,2 0 5,0 • 5,0 4,7 . 2,1 1,5 3,6 4,8 0,3 2,7 3,0 3,9 1,3 3,6 4,9 6,5 0 2,0 2,0 3,8 3,5 3,9 ' 7,4 4,0 0,8 . 2,0 . : ...,x . .2,8;. ■r~~ —, COPY 69 09811 2005304 Leuconostoc mesenteroides IFO 3426 Pediococcus acidilactici IFO 3884 Streptococcus faecalis 5 IFO 3128 n h IFO 3181 4,4 0,3 3,1. 3,4 4,0 0,1 2,3 2,4 4,1 1,8 2,4 4,1 1,8 1,9 . 3,7 EXEMPLE II - Production d'enzymes à partir de Lactobacillus plan--jq tarum et Nocardia corallina et étude de leurs propriétés. Des milieux de culture identiques à ceux de l'exemple 1 ont été utilisés, et la culture conduite pendant trois jours à 30°C dans un litre de milieu avec agitation. Les "résultats sont les 15 suivants ï Croissance pH 20 Lactobacillus plantarum ATCC 8008 Nocardia corallina IFO 3338 0,95 1,28 4,0 7,4 à l'extérieur du corps cryptoga— mi que 16 34 Activité à l'inté- Activité tota- rieur du corps cryptoqa- mique 17 16 le 33 50 La solution d'essai d'enzyme des bactéries Lactobacillus 25 était préparée en saturant le fluide surnageant de la solution de culture avec du sulfate d'ammonium jusqu'à une solution saturée à 0,8, en recueillant par centrifugation le précipité obtenu, en dissolvant le précipité recueilli, et en dialysant ce précipité avec de l'eau pendant un jour. Le fluide de culture des bactéries 30 Nocardia était traité de la même manière. Le fluide surnageant était saturé avec une solution d'ammonium pour donner une solution saturée à 0,8, et le précipité était centrifugé, dissous dans l'eau; les matières insolubles éliminées, dialysées, étaient ensuite saturées à 0,8 avec une solution de sulfate d'ammo-35 nium,les sels éliminés, et dialysé. La solution d'enzyme ainsi obtenue était éprouvée. Lorsque les-valeurs optimales du pH étaient déterminées, comme indiqué sur la figure 1, les solutions d'enzyme de Nocardia montraient des valeurs de pH entre 6 et 7, tandis que les solutions de Lactobacillus donnaient des valeurs entre 5 et. 40 6,5. Alors que les températures optimales pour les solutions de 10 69 09811 2005304 Nocardia s'établissaient de 42 à 45°C, comme indiqué sur la figure 2, celles pour les solutions de Lactobacillus s'établissaient au-dessus de 55°C, indiquant ainsi une plus grande résistance à la chaleur de ces enzymes que celle des autres enzymes. Au contraire, 5 les enzymes de Nocardia perdaient rapidement leur activité à 50°C. Pour la détermination de la spécificité au substrat des étaient enzyme-s, des substrats/préparés dans le laboratoire de l'inventeur, et . la pureté était confirmée par chromatographie sur papier î nommément, de l'amidon de pomme de terre, de l'amidon de riz glu--10 tineux, de la dextrine p-limite, de la dextrane, du glycogènc et de la pullulane furent utilisés. Ces substrats furent soumis aux actions simultanées de chaque enzyme à essayer et de la p-amylase, et les résultats furent exprimés en texxM de vitesses de production de maltose ou de malttriose, comme indiqué dans la table 2. 15 Ainsi qu'on peut le voir dans cette table 2, les enzymes de Nocardia ne décomposent pas la dextrane, et les enzymes de Lactobacillus sont aussi incapables de la décomposer. TABLE 2 - Activités à 1'encontre des substrats - 20 30 35 Mélange réactionnel î Substrat Tampon acétate P-amylase 40 Pullulanase ( 156) 50 ml (0,5 MPH 6,0) 1,0 ml (5 unités) 1,0 ml (4 unités) 1,0 ml (p-amylolys e) Enzyme . Substrat sans enzyme p-amylase P-amylase et enzyme de Lactobacillus P-amylase enzyme de Nocardia Amidon de pomme de terre 11.5 67,8 (56,3) - 92,5 (81,0) Amidon de riz glutineux Glycogène 5,7 6,3 58,8 (53.0) 43,4 (37.1) 95,1 (89,4) 96,6 (90,9) 54,5 (48,2) Dextrine limite ! 7,9 13,7 (7,4) - 83,9 (76,0) Dextrane 10,8 11,2 (0,4) 10.0 ' (0) 10,8 (oi Pullulane 32,4 32,6 (0,2) 120,0 (87,6) 99,6 (67,2) 69 09811 11 2005304 Les valeurs dans la table représentent les pourcentages de sucres réduits (maltose et malttriose) dans le sucre total. Le sucre total était estimé par la méthode à l'anthrone et les sucres réducteurs par la méthode de Somogyi-Nelson. Des 5 témoins d'essai des dextrine p-limite, p-amylase, maltose, pullulane, et malttriose utilisées étaient préparés au laboratoire de l'inventeur et d'une pureté confirmée par chromatographie au papier. 10 EXEMPLE III - Production d'enzyme à partir de micrococcus lysodi- klicus et étude de leurs comportements enzymatiques. Un exemple de culture dans un récipient de 20 litres est cité ici. Le milieu de culture constitué de 1# de maltose, 0,5# de peptone, 0,25# d'extrait de levure, 0,2# d'urée, 0,2$ d'extrait de 15 viande, 0,1# de K2HP04, 0,05# de KCl, et 0,05# MgS04,7H20 était inoculé avec 2# de bactéries à 30°C, et la culture conduite avec aération et agitation à 200 rpm. Le pH initial était 7,0. Trois jours après, la culture était terminée avec un pH de 8,2. Alors qu'il y avait encore une 20 grand* proportion d'enzyme bactérielle, les bactéries étaient recueillies par centrifugation et lavées une fois avec de l'eau pure. Une solution S.D.S. à 0,1# contenant une solution tampon de pH 7,0 était mise en suspension dans un dixième en volume, du milieu de culture, et 1'autolyse effectuée dans un agitateur rotatif 25 à 30°C pendant 48 heures. Après séparation" par centrifugation, le fluide surnageant était déba*assé des sels en saturant à 0,8 avec du sulfate d'ammonium. Une quantité d'eau convenable était extraite du produit résultant avec l'enzyme, et ensuite le résidu était dialysé. A la fin de la culture, l'activité de 1*endo-enzyme était 30 de 39,2 unités/ml et l'activité de l'exo-enzyme de 12 unités/ml. Les comportements ont été étudiés avec la solution d'enzyme ainsi purifiée. Le pH optimum et la température optimum ont été trouvés égaux à environ 5,5 et 42°C, respectivement, comme indiqué sur les figures 1 et 2. Aux températures supérieures à 50°C, l'enzyme . 35 perdait nettement son activité. Egalement, elle était rapidement déactivée aux valeurs du pH inférieures à 5,0. Eh ce qui concerne la spécificité au substrat, l'enzyme fut essayée de la même manière que dans l'exemple -II. Comme indiqué . n* dans la table 3, les résultats montraient qu'elle/était pas active 40 sur la dextrane et le glycogène. Pour confirmer le comportement j 05 g S . : . .. •. ' Hicité au substrat - Les activités spéeifLmuoc des enzymes du genre Micrococcus, Aerobacter, et Pseudomonas à l'eneorr^ u i. /er.3 substrats furent comparés, les valeurs numériques étant donn .-es t-n termes de vitesses, décomposition en pourcent. 3ubs trat Enzyme p-amylase (3-amylase et enzyme-MI P-amylase et enzyme d'Aerobacter p-amylase et enzyme de Pseudomonas À'il. non i. ■ t an e o'B 84 91 Amidon de riz glur tineux 57 78 86 83 Dextrine p-limite (amidon de mais paraf-fineux) 8 84 84 59 Dextrane Glycogène Pullulane 0,7 1,5 0 0,4 37 35 55 81 O 115 99 0 MI Abréviation pour l'enzyne de Micrococcus. (Dv M (+ «# c £U a O H- (Os H- CD • F* «+ f (î>v (D tn a H rt>> M U) «. C CD h-1 3 r+ N 0) r+ 1 tn rc> tn o» o 3 i—1 «+ - fD a D o O 3 o D 3 (Ds r+ tn H (D a (U a 3 c tn IQ H i—• eu - O & tr (t>' M 3 e m » c «+ a « T3 M C en O vO o sO 00 to O O CJn U> O -£> o sO TABLE 4 - Résultats de l'étude complémentaire des activités enzvmatiques à l1encontre du glycogène. O O 00 Enzymes p-amylase p-amylase et enzyme MI Remarquas ■■■■■■■■anattaoaa! 36,8 31,7 31,7 31,7 33,3 35,4 33,2 34,5 (39,0 v36,0 33,4 P-amylase et enzyme d1Aerobacter 54,7 43,4 se Agit simultanément avec la p-amylas® (enzyme MI 100 u/g de substrat) Agit simultanément avec la p-amylase (enzyme MI 100 u/g de substrat) Agit simultanément avec la p-amyla (enzyme MI 250 u/g de substrat) Agit simultanément avec la p-amylase et est déactivée 24 heures plus tard (enzyme MI 250 u/g de substrat) et agit ensuit© simultanément avec la p-amylase dans les mimes conditions qu'avant la déaetivation Agit simultanémont avec la p-amylase (enzyme MI 100 u/g do substrat). «à u K3 O O Un u> o -te» MI = Micrococcus lyssdeikticus 69 0981V 2005304 R e WWtif &®TiQtib ~~! o Procédé pour produire «la» «—1luc®sidas«s qui ccaajprend l'inoculation d°une ou plusiaurs souches de bactéries du genre Agro-basteriuiiî, Azoiobacter, Lactobacillus» Leuconostoc» Microbacte-rium, Nocardia, Pediococcus, Saricina, Serratia, Staphylococcus, S Streptococcus, Bacillus, Micrococcus, et Erwinia, dans un milieu de culture composé d'une source azotée et d'une source carbonée appropriées avec des sels minéraux nécessaires, et cultivant en-etaiie les bactéries pour produire «ne «-»1 ^â-glucosidase. 2. Procédé, suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les • 50 souches de bactéries appartiennent aux genres Agrobacteriun, Azo- tobacter, Lactobacillus, Leuconostoe, Microbacteriu», Nocardia, Pediococcus, Saricina, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Micrococcus, et Erwinia. 3. Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en c* 'S" que la source azotée est de la peptone, un extrait de levure et de l'urée s'il y a lieu. 4. Procédé suivant les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source carbonée est de l'amidon liquéfié, et/ou du maltose* 5. Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ■30 les bactéries se développent à 30°C environ pendant plusieurs jours. 6. Comme produit enzymatique nouveau, l'a-1,6-glucosidase obtenue à partir de Lactobacillus qui résiste à des températures supérieures à 50°C. $ 7. Enzymes préparés selon Jks revendications 1 à 5, à partir des genres Lactobacillus, Nocardia et Micrococcus qui sont spécialement actifs contre les liaisons cc-1 ,6-glucosides des amidons en particulier. 8. Enzymes préparés selon les revendications 1 à 5, à partir des 30 genres Lactobacillus et Micrococcus, qui sont spécialement actifs contre le pullulane en particulier.