Brevet FR2002593A1 — publié le 19691031

044S8 1 2002593 l'invention concerne un procédé de fermentation pour la préparation d'ergocornine et d'ergosine» Plus particulièrement, elle concerne un nouveau procédé microbiologique pour l'obtention d'ergosine et d*ergocornine qui utilise la nouvelle souche de 5 Glaviceps purpurea F.I. 43/14 (numéro de la collection microbiolo-£ique de la demanderesse), le microorganisme a aussi reçu le numéro ATCC 20 106 de 1* American Type Culture Collection, Rockville (Mg.ryland) 20 852, Etats-Unis, et le numéro IPV F-297 de l'Institut de Phytopathologie de l'Université de Milan. 10 Par le procédé de l'invention, on obtient un mélange prati quement à parties égales dtergocornine et d'ergosine avec de bons rendements et une pureté élevée. l'ergocornine et l'ergosine appartiennent au groupe des alcaloïdes de l'ergot j dans la littérature, on connaît leur 15 structure chimique et, particulièrement pour l'ergocornine, l'activité pharmacologique et l'utilisation de ce corps comme hypotensif et dans le traitement des troubles vasculaires périphériques. la nouvelle souche de Claviceps purpurea F0I. 43/14 qui produit ces alcaloïdes a été isolée d'un sclérote d'ergot recueilli 20 sur un épi de seigle à Usseglio (Val di lanzo Torinese). Elle présente les propriétés morphologiques suivantes : Caractères, microscopiaues Sur les milieux de culture à l'agar-agar, les colonies sont formées d*hyphes plus ou moins sineuses et entortillées de 3-4 p 25 d'épaisseur, les hyphes sont peu ramifiées ; certaines ramifications s'élèvent au contact direct de l'air (hyphes aériennes). Ces dernières peuvent former des conidies ; toutefois, sur la majorité des terrains celles-ci sont absentes. le mycélium des cultures immergées (7-10 jours d'âge : 30 phase productive) présente l'apparence de touffes d'hyphes formées de cellules très irrégulières dont l'épaisseur varie de 3 à 10 |x# Parfois, les cellules sont gonflées et arrondies et les hyphes ont l'aspect d'un collier 69 04458 2 2ôû25f3 •f Milieu Gz4 : développement discret à reliefs irréguliers, incolore à rose-chair ; envers de la colonie : incolore* Pigments solubles : absents ; conidies : absentes- — Milieu : bon développement en patine étendue, on-5 dulée irrégulièrement, incolore à rose pâle ; envers : incolore- Pigments solubles : absents ; conidies : absentes» Milieu pomme de terre - glucose : développement discret avec petits reliefs, blanchâtre avec taches violettes ou entièrement violet-rose ; envers de la colonie : taches violettes ou violet 10 clair. Pigments solubles : absents ; conidies : généralement absentes, seulement présentes dans certains transferts- Milieu S : bon développement à reliefs irréguliers ; couleur rose ; envers de la colonie incolore à rose. Pigments solubles : absents ; conidies : absentes-15 — Milieu saccharose - peptone : bon développement, plis larges plutôt plats ; incolore à rose violet ou violet foncé ; envers incolore à violet plus ou mSsins foncé. Pigments solubles; absents ou violet-rose ; conidies : absentes. — Milieu Tg : très bon développement, Barges plis en relief; 20 rose-violet à violet foncé ; envers violet clair à violet foncé* Pigments solubles : absents ; conidies : présentes en petite quantité* 04458 3 2002593 TABLEAU Constituants : Milieux 4 z l C 4M f • . Pommes s • o : ^p- : T 0 o • l de ter-: : re-glu-: : cose : • • : tone- : : saccha~: : rose : • • a • • • • • o • Glucose 40 g 40 g 20 g 40 g - - Saccharose - m* - - 300 g 100 g Peptone - - - 8 g 10 g ** Extrait végétal p o ur bo uillon ~ Extrait de levure — 1 g - - - mm 0,1 g Asparagine - - - - 10 g (EH4)2HPO4 5 g 5 g - - « K2HP04 1 g 1 g - - - - KH2PO4 - - - 0,5 g 0,25 g MgS04o7H 0 2,5 g 2,5 g: - - 0,5 g 0,25 g KC1 0,5 g 0,5 g - - - 0,125g FeS04 10 mg 10 mg - pm 7 mg 20 mg ZnS04.7H2Q 10 mg 10 mg - 6 mg 15 mg Ca(N0_)2„4H20 - - —m - - 1 g Chlorhydrate de cystéine "" Agar-agar : 18 g 4M 18 g 18 g 18 g 18 g 10 mg 18 g Extrait aqueux de pomme de s — terre (1) ï eau distillée: pour :1000ml mm pour 1000 ml i 500 ml pour 1000 ml pour 1000 ml pour 1000 ml pour 1000 ml pH : 6,7 6,7 7,2 6,4 6,2 5,2 stérilisation: 20 mn îà110°C 20 mn à 110°C 20 mn 120°C 20 mn à 110°C 20 mn à 110°C 20 mn à 110°C (1) Préparation de l'extrait aqueux de pomme de terre : on coupe en petits morceaux 200 g de pommes de terre épluchées, puis on les fait bouillir pendant 45 minutes dans 500 ml d'eau du robinet; on filtre sur une gaze et on porte au volume voulu.. 69 04458 4 2002593 l'invention a pour objet un procédé microbiologique pour la préparation d'un mélange pratiquement à parties égales des alcaloïdes ergocornine et ergosine qui consiste à cultiver le nouveau microorganisme Claviceps purpurea Fol. 43/14 dans un milieu conte-5 nant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux, à extraire puis à séparer les alcaloïdes. Plus particulièrement, suivant le procédé de l'invention, on cultive le microorganisme dans un milieu de culture liquide, dans-des conditions aérobies, en culture immergée, à une tempéra-10 ture de 20~30°0, et de préférence de 24°0, pendant 10-16 jours, le pH peut varier de 3>5 à 6 selon les milieux de fermentation utilisés. On peut utiliser comme sources de carbone le glucose, le saccharose, le mannitol, le sorbitol, le glycérol, l'acide citrique, l'acide succinique» la source d'azote peut être formée 15 d'ammoniac, d'asparagine, de peptone, d'hydrolysats de caséine et de sels d'ammonium comme le sulfate et le chlorure et d'autres substances d'usage courant. les sels minéraux utiles à la formation des alcaloïdes contiennent des chlorures, phosphates et sulfates de magnésium, 20 de fer, de zinc, de manganèse et de potassium.» On peut conserver la souche de Olaviceps purpurea Fol»43/14 par lyophilisation ou par transferts successifs sur milieu 0 4 ou sur milieu peptone-saccharose. Pour effectuer la lyophilisation, on prend le mycélium 25 d'une culture inclinée et on le triture avec une poudre de quartz très fine. Puis on met le mycélium en suspension dans 4 ml d'un mélange comprenant 2 parties d'une solution aqueuse stérile de saccharose à 60 fa pour 1 partie de lait stérile» On distribue dans des flacons et on lyophilise. 30 On peut effectuer la fermentation dans des flacons Brlen- meyer et dans des fermentateurs de laboratoire et industriels de diverse capacité. On sépare les alcaloïdes obtenus et on les purifie par des techniques d'extraction connues au moyen de solvants et par chromâtographieo les "exemples suivants servent à illustrer 35 l'invention, sans la limiter. 69 04458 5 2002593 EXEMPLE 1.- D'un stock de cultures inclinées sur milieu 0 4M décrit au tableau ci—dessus, on effectue un transfert sur un milieu incliné semblable ; on fait incuber pendant 10 jours à 28°0 et on 5 utilise la culture obtenue pour inoculer deux bocaux de 300 ml dont chacun contient 50 ml du milieu TS suivant : 1-asparagine 10 g KHgPO^ 0,5 g MgSO^.THgO 0,3 g 10 extrait de levure 0,1 g PeS04o7H20. 7 mg ZnS04.7H20 6 mg saccharose 100 g eau distillée pour 1000 ml 15 On ajuste le pH à 5,2 au moyen de soude avant stérilisa tion ; on stérilise à 110°C pendant 20 minutes. On fait incuber les flacons pendant 5 jours à 24°C sur une secoueuse rotative à 220 tr/mn avec une excentricité de 3»5 cm. On utilise les cultures ainsi obtenues à raison de 10 i<> 20 pour inoculer des bocaux de 300 ml contenant 50 ml du milieu 668 suivant : saccharose 60 g glycérol 60 ml glucose 80 g 25 extrait de levure 0,1 g acide citrique 15 g EC1 0,125 g kh2po4 0,5 g MgS04.7H20 0,5 g 30 FeS04.7H20 7 mg ZnS04.7H20 6 mg eau distillée pour 1000 ml On ajuste le pH à 5»2 avec de 1' ammoniac. On stérilise à 100°C pendant 20 minutes. 35 Après 12-14 jours d'incubation dans les conditions décrites pour les cultures végétatives, les cultures contiennent 950 jig/ml d'un mélange d'alcaloïdes qui comprend 45 d'ergosine et 55 °fa d'ergocornine. On recueille le contenu de cent-vingt bocaux qui a un titre de 950-1100 iig/ml et on filtre. 69 04458 6 2002593 On extrait séparément le filtrat et le mycélium» Le filtrat représente 5 litres ; on ajuste son pH à 9 au moyen de carbonate de sodium et on extrait à deux reprises, chaque fois avec 3 litres de chloroforme. 5 On agite le mycélium avec une solution aqueuse d'acétone à 50 fa contenant 2$ d'acide tartrique et on filtre. On ajuste le pH du filtrat à 9 au moyen de carbonate de sodium et on extrait à trois reprises par le chloroforme. On réunit les extraits au chloroforme du filtrat et du mycélium, on les évapore sous vide 10 à 20-30°0 jusqu'à environ 1/5 du volume primitif et on extrait par une solution d'acide tartrique à 2^. On alcalinise la solution d'acide tartrique jusqu'à un pH de 9 et on extrait par le chloroforme. On évapore l'extrait jusqu'à un petit volume et on précipite le produit brut par l'hexane» 15 Le produit brut obtenu après séchage sous vide pèse 6,2 g. On le dissout dans un petit volume de chloroforme et on le fait passer à travers une colonne de 400 g de gel de silice dans du chloroforme» On élue par le chloroforme et on obtient une fraction contenant de l'ergocornine que l'on sèche dans les 20 conditions usuelles. On dissout le résidu à 1î20 dans du benzène, puis on concentre jusqu'à un quart du volume initial» Après une nuit à 5°0, on obtient 2,5 g d'ergocornine base que l'on recristallise par l'alcool méthylique et qui a un point de fusion de 182°0. 25 Formule empirique : dans le chloroforme); les réactions de Keller et de Van ïïrk sont positives et le spectre ultra-violet présente un maximum de J10 mu dans le méthanol» Par hydrolyse acide, ce produit donne de la valine et de 30 la proline ; par hydrolyse alcaline, il donne de 1'acide lysergi-que et de l'acide diméthylpyruvique. En poursuivant l'élution de la colonne de silice par le chloroforme et le méthanol à 4f°, on obtient une deuxième fraction qui contient 2,1 g d'ergosine» Elle répond à la formule empirique 35 C^qH^O^ ; /~cc_7§0°= -183 (à \fa dans le chloroforme), le spectre ultra-violet dans le méthanol présente un maximum à 310 mji et les réactions de Keller et de Van Urk sont positives. Le chlorhydrate, après cristallisation par l'acétone, présente un point de fusion de 235°0 ; par hydrolyse acide, il donne 40 de la leucine et de la proline et par hydrolyse alcaline il donne 69 04453 7 2002593 de l'acide lysergique et de l'acide pyruvique. EXEMPLE 2« On opère comme dans l'exemple 1 si ce n'est que l'on utilise des cultures inclinées sur milieu 0^4 et que l'on effectue 5 la production sur le milieu T25 suivant : saccharose 300 g acide citrique 15 g extrait de levure 0,1 g 10 E01 0,125 g EHgPO^ 0,5 g MgS04.7H20 0,5 g FeS04o7H20 7 mg . ZnS04«7H20 6 mg 15 eau distillée pour 1000 ml On ajuste le pH à 5,2 avec de l'ammoniac et on stérilise à 120°0 pendant 20 minutes» Après 12-14 jours d'incubation, les cultures contiennent 1100 ng/ml d'un mélange d'alcaloïdes comprenant 60 fo d'ergocornine et 40 $ d'ergosine. 20 EXEMPLE 3. On opère comme dans l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise des cultures inclinées sur milieu C ,4 et que l'on effec- z tue la production sur le milieu TSM suivant : saccharose 250 g 25 asparagine 10 g KH2P04 0,5 g MgS04.ÎH20 0,3 g extrait de levure 0,1 g FeS04.7H20 7 mg 30 ZnS04.7H20 6- mg eau distillée pour 1000 ml On ajuste le pH à 5,2 avec de la soude et on stérilise à 120°0 pendant 20 minutes- Après 12-14 jours d'incubation, les cultures contiennent 35 960 ng/ml d'un mélange d'alcaloïdes comprenant 55 î° d'ergocor-nine et 45 # d'ergosine. 04458 8 2002593 ES7H1DI0ATI0U L'invention a pour objet un procédé microbiologique pour préparer un mélange d'alcaloïdes d'ergot qui comprend de l'ergo-cornine et de l'ergosine, procédé caractérisé en ce qu'on cultive le microorganisme Olaviceps purpurea F0I, 43/14 dans des conditions aérobies en culture immergée dans un milieu nutritif liquide contenant une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux, à une température de 20-30°G, pendant 10-16 jours à un pH de 3#5-6 et on extrait et on sépare les alcaloïdes ainsi formés.