Brevet FR2011810A1 — publié le 19700313

i 2011810 La présente invention concerne la préparation d'extraits de foie injectable pour l'utilisation en thérapie humaine. Un procédé qui peut être considéré comme à l'avant-garde de la technique de préparation des extraits de foie pour 5 l'utilisation en thérapie humaine et décrit dans le brevet des E.U.A. n* 2 125 844. Le développement ultérieur de la préparation de ces extraits est illustré par le brevet des E.U.A. n° 2 901 396, le brevet anglais n* 882 588 et le brevet allemand n° 1 089 509. 10 Les solutions proposées dans ces brevets sont, sans aucun doute, valables sous certains aspects, mais, ce qui est beaucoup plus important du point de vue pratique, elles n'ont pas réussi à concilier de manière acceptable deux exigences fondamentales: a) qualité supérieure du produit et 15 b) facilité de mise en oeuvre industrielle du procédé. Ainsi, actuellement, les extraits de foie utiles en thérapeutique sont encore préparés maintenant de manière convenable par le procédé déorit dans le brevet des E.U*A. n* 2 125 844 ci-dessus mentionné, qui donne à la fois un extrait injectable et une 20 fraction protéique pour l'administration orale, ce procédé étant cependant modifié sensiblement de la manière suivante. On broie finement des foies de bovins et on les disperse dans l'eau, on amène la suspension résultante à un pH de 5,5 par addition"de l'acide sulfurique, ensuite on chauffe pro-25 gressivement à 75-80*C pour coaguler une fraction protéique indésirable. On filtre la suspension chaude et on concentre le filtrat limpide jusqu'à une pfite ayant une teneur en matières ■èohes d'environ 60-J0 % en poids. On disperse cette pâte dans l'alcool éthylique pour obtenir une dispersion à 70 % en poids 30 d'éthanol et on sépare ainsi une fraction protéique convenable pour l'administration orale, la matière injectable restant dans la phase hydro-alcoolique. On sépare cette phase par filtration et on concentre sous vide jusqu'à élimination totale de l'éthanol 35 «t obtention d'une pftte ayant une teneur en matières sèches d'environ 70# . On dissout cette pite dans l'eau distillée jusqu'à une solution à environ 20# de matière sèche, on traite la solution résultante si nécessaire par une résine échangeasa d'ions pour éliminer l'excès d'histamine. On réajuste ensuite le pH si 69 05630 2 2011810 nécessaire à environ 5,5 et on dilue la solution par l'eau distillée jusqu'à une teneur en matière sèche d'environ 10 fi en poids. On mélange la solution diluée avec 0,5 fi de phénol (ou d'un autre agent de conservation) et on la soumet au contrôle 5 analytique, puis on prépare des doses injectables. La solution a une couleur brun rougeâtre à brun-noir très foncée. En ce qui concerne les extraits de foie injectables préparés comme ci-dessus mentionné, on peut soulever au moins . les objections suivantes. Tout d'abord, il est bien connu, 10 non seulement de l'homme de l'art,"mais aussi des patients, que les extraits de foie en fioles présentent, après un temps de stockage plus ou moins long, une floculation ou un précipité dont la présence est rarement tolérée par le patient et même interdite par les règlements dans certains pays. Pour 15 pallier cet inconvénient, on laisse jnûrir les extraits de foie en solution'par décantation dans des récipients convenables au fond desquels on recueille un précipité plus ou moins consistant. Ce mûrissage est même accéléré dans certains cas par des traitements alternés de chaud efc froid. 20 D'autre part, ce qui concerne plus particulièrement l'homme de l'art est le fait (qui est vérifié) que les extraits de foie préparés comme décrit ci-dessus ne contiennent en réalité qu'une fraction relativement faible de la quantité globale disponible de principes actifs (vitamines du groupe B, 25 aminoacides, nucléotides, etc.) qui sont présents dans le foie au départ et peuvent être extraits sous forme injectable ; en même temps, bien que l'on utilise des foies absolument sains d'animaux fraîchement sacrifiés, l'opérateur rencontre fréquemment des teneurs relativement élevées en histamine dans 30 l'extrait, ce qui nécessite un traitement de déshistamination au moyen de résines échangeuses d'ions. L'invention concerne un procédé pour préparer des extraits de foie injectables en évitant les inconvénients ci-dessus mentionnés. 35 Plus particulièrement, par rapport à l'art antérieur, l1invention concerne un procédé de préparation d'extraits de foie injectables dans lequel on disperse un foie broyé et on le fait digérer dans de l'eau acidifiée par l'acide sulfurique, puis on concentre la phase liquide et on la débarrasse de sa fraction 69 05630 3 2011810 protéique pour l'administration orale par traitement par un solvant organique et on récupère la matière dissoute pour la préparation d'une solution aqueuse injectable, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape de digestion s'effectue 5 à une température de 45 à 50 °C (de préférence 45°C), puis on concentre la phase liquide à une température de dépassant pas 35°C jusqu'à une teneur en matière sèche de 13 à 18 % en poids (de préférence 15 % en poids) et on la soumet en agitant à une déprotéination au moyen d'acétone à une température de 10 15 à 25°C, de manière à séparer ladite fraction pour l'utilisation par voie orale et on débarrasse la solution hydro-acétonique de l'acétone par concentration à une température ne dépassant pas 32°C. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention 15 apparaîtront à la lecture de la description qui suit : Dans un premier stade du procédé selon l'invention, on broie un foie de bovin et on le disperse dans de l'eau déminéralisée additionnée d'acide sulfurique en proportion telle que le pH de la dispersion soit de 5,3 à 5*8 (de préfé-20 rence 5,5). On agite la dispersion et on chauffe à 45°C-50°C pendant une pérîod* d® 5 à 8 heures (généralement 7 hèures) jusqu'à ce que la digestion ait lieu à m degré notable. On décèle la fin di> cette étape par un aspect uniforme fortement fluide de la masse. 25 Lorsque la digestion est terminée, on refroidit la dispersion à une température de 2-10°C, de préférence environ 5°C, et on filtre, le filtrat étant une solution opalescente. Oh pourrait même effectuer la filtration à température plus élevée sans refroidissement j cependant, le refroidissement de 30 la solution, plus particulièrement lorsqu'on effectue en un temps d'environ 12 heures, facilite la séparation de l'extrait liquide cfiavec-la masse protéique. On concentre la solution opalescente résultante sous vide à une température de dépassant pas 35°C (de préférence 35 ne dépassant pas 30°C) jusqu'à une teneur en matière sèche de 13 à 18 % en poids, avant la déprotéination par l'acétone. On effectue la déprotéination par l'acétone en maintenant la solution à 15-25°C (de préférence à l8°C) et en ajoutant de l'acétone 69 05630 4 2011810 (à la même température) dans la proportion de 100 parties en volume d'acétone à 50-70 parties en volume, notamment 66 parties, de solution aqueuse, en agitant. Au-delà de ces limites, le rendement s'abaisse notablement. On continue à agiter pen-5 dant environ 2 heures, en veillant à maintenir une température ne dépassant pas l8°Ç, puis on refroidit jusqu'à -8°C à -12°C, par exemple -10°G, pendant une période de 12 heures au moins. A la fin de cette période, on peut considérer que la précipi-, 10 tation de la fraction protéique pour l'administration orale ■ est pratiquement complète. On peut séparer le précipité par filtration. Notamment, le filtrat doit consister en une solution hydro-acétonique limpide; si la solution n'est pas~limpide, on peut répéter la filtration en utilisant de faibles 15 quantités de terres filtrantes perlitiques comme auxiliaires de filtration, telle que la Dicalite 478. _ Comme-on l'a mentionné précédemment, on sépare l'acétone de la solution à ce stade, par concentration à une température ne dépassant pas 32°C, de préférence ne dépassant 20 pas 30°C. Après élimination de l'acétone, la solution aqueuse concentrée résultante est à nouveau opalescente et contient des teneurs inhabituellement élevées en constituants de valeurs tels que les aminoacides, nucléotides et vitamines du groupe B 25 (principalement et B^) comme l'illustrent clairement les exemples ci-après. Cependant, en raison justement des teneurs élevées de ces constituants de valeurs, il serait pratiquement impossible d'éviter la floculation ou la précipitation de cette solution pendant le stockage (ou du produit dérivé par exemple 30 par dilution jusqu'à 10 % de matière sèche). En conséquence, selon un autre aspect de l'invention, on traite ultérieurement la solution pour obtenir comme produit final un extrait lyophilisé facilement soluble dans l'eau bidistillée au moment de l'emploi. En conséquence, on amène d'abord par de l'eau la solu 35 tion concentrée ci-dessus mentionnée à une dilution convenable pour sa stérilisation et sa filtration dépyrogénante et principalement pour lyophilisation que l'on peut effectuer ultérieurement sur le volume total de la solution ou sur la solution subdivisée en doses (comme déterminé par les résultats de l'ana 40 lyse finale). La dilution la plus appropriée correspond à 8-12 69 05630 5 2011810 en poids de matière sèche, de préférence 10 % en poids.. On additionne avantageusement la solution diluée d'un agent de conservation. Les agents de conservation volatils tels que phénols, crésols et alcool benzylique ne sont pas appropriés 5 car ils se vciafc 1,11 seraient au cours de la lyophilisation et provoqueraient des dérangements dans l'appareil. Les agents de conservation employés sont de faible volatilité, par exemple éthylmercurithiosalicylate de sodium et p-hydroxybenzoates. Ainsi, par exemple, on peut utiliser le p-hydroxy-10 benzoate de méthyle disponible dans le commerce sous le nom de Paramétil. Un agent de préservation très avantageux consiste en un mélange synergique connu sous le nom de marque de Paracombin et consistant en : 35 % en poids de p-hydroxybenzoate de méthyle 15 35 % en poids de p-hydroxybenzoate d'éthyle 10 % en poids de p-hydroxybenzoate de propyle 10 % en poids de p-hydroxybenzoate de n-butyle 10 % en poids de p-hydroxybenzoate de benzyle Avant d'ajouter l'agent de conservation, on peut 20 filtrer, si nécessaire, la solution ; après avoir ajouté l'agent de conservation, on filtre sur un filtre abactérique (par exemple "Membranfilter" ou "Millipore") pour la stériliser et éliminer les substances pyrogènes. A ce stade, si nécessaire, on peut conserver la solution (de couleur jaune doré) dans 25 un réfrigérateur à environ 5°C, plus particulièrement jusqu'à son analyse. Lorsque l'analyàe est terminée, on lyophilise la solution telle que ou en doses déterminées par l'analyse. Une température de précongélation de -20°G seulement avec une température dans le condenseur d'environ -60°C est suffisante 30 pour la lyophilisation. L'extrait lyophilisé est stable au stockage pendant une durée pratiquement indéfinie. Le rendement du procédé décrit ci-dessus est en moyenne 9 à 10 kg d'extrait sec par 100 kg de foie et il est donc supérieur de plus de 50 % à celui du procédé antérieur. 35 A titre d'illustration, une analyse de l'extrait donne les résultats suivants i 69 05630 2011810 ANALYSE Extrait de foie 10 20 Azote total Azote-amino Acide cytidylique Acide uridylique Acide guanilique Acide folique Acide pantothénique (exprimé en panto-thénate de Ca) Choline (exprimée en choline, HCl) Vitamine B12 Vitamine PP 9,8 % 4 % 1 % 0,15# 0,18# 1 Y/g 400 y/g Extrait de foie injectable obtenu par le procédé antérieur 12 # 4 # moins que la limite mesurable id. id. traces 100 Y/g Vitamine B-j Histaminé 10 mg/g 2 mg/g 0>7 y/g traces 15 Vitamine PP 150 y/g 30 y/g 20 y/g 5 y/s 10 y/g 100 y/g Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 : Matière première : foie de bovin prélevé lors de l'abattage sur un jeune taureau Simmenthal de 14 mois, d'un poids total de 600 kg. On broie 1 965 g de foie dans un hachoir (perforations 25 extérieures de 5 mm de diamètre) et on le suspend dans 3 930 ml d'eau déminéralisée acidifiée par 6,5 ml d'acide sulfurique à 95 #. On agite la suspension, on chauffe à 45°C et on maintient ces conditions pendant 5 heures. La valeur du'pH est de 4,5 à 4,6. On refroidit la masse à +5°C et on filtre sous vide, on 30 obtient un filtrat jaune opalescent. On place le filtrat à part, on reprend le résidu sur filtre par 3 000 ml d'eau déminéralisée, on le fait à nouveau digérer pendant 1 heure comme ci-dessus et on filtre. On réunit les deux filtrats et on obtient un total de 6 500 ml de filtrat à pH 4,6. On effectue la concentration sous 35 vide dans un évaporateur à cyclone à une température marimadu liquide de 34-35°0 p 69 05630 7 2011810 de 16 % en poids j on ajoute 2 660 ml d'acétone en agitant et il se forme un précipité boueux brun. On continue à agiter pendant environ 2 heures à une température de l8°C. On refroidit à -8°C, puis on filtre sous vide sur une plaque de Dicalite 478 5 (auxiliaire de filtration fabriqué par Dicalite Europe Sud). On obtient une solution jaune doré limpide. On sépare l'acétone dans un évaporateur à cyclone, la température maximale du liquide à la fin de la concentration étant de JO°C. On congèle la solution concentrée à -20°C et on la lyophilise, on obtient 10 186 g (rendement 9,48 % par rapport au foie de départ) d'extrait sec soluble dans l'eau. L'extrait résultant donne l'analyse suivante : Azote total 10 % Azote-aminc k0l fj 15 Acide cytidylique 0S$ fo Acide uridylique Q.,15 # Acide guanilique 0,18 % Acide folique 1 y/g Acide pantothénique 20 (exprimé en pantothénate de Ca) 400 y/g Choline (exprimée en choline,HC1) 10 y/g Vitamine B12 1 Y/g 25 Vitamine PP. 150 y/g Vitamine B.^ 20 y/g Histamine (base) 8 y/g Exemple Ibis (exemple de comparaison) : Produit de départ : foie de bovin prélevé à l'abattage 30 sur le même animal qu'à l'exemple 1 et conservé à l'état congelé à une température de -25°C jusqu'au moment de l'utilisation. On broie,(après l'avoir fait dégeler) 1 662 g de foie dans un hachoir (orifices de sortie de 5mm de diamètre) et on met en suspension dans 3 324 ml d'eau de source. On agite la 35 suspension et on la mélangé avec 2 ml d'acide sulfurique à 95 Le pH de la suspension est de 5,3-5,4. On élève la température à 85°C pendant environ 60 mn. Lorsque l'on atteint cette température, on filtre la solution et on obtient 3 460 ml d'un filtrat jaune rougeâtre limpide. Le 69 05630 8 2011810 pH du filtrat est de 5,7» On concentre le filtrat sous vide jusqu'à une pâte ayant "me teneur en matière sèche jusqu'à environ JO % en poids | pendant la concentration sous vide, la pâté âfïtôint 5 use température finale de 75°C. On refroidit la pâte à une température ambiante et on la mélange en agitant avec de l'éthanol à 95 % pour obtenir une solution hydro-alcoolique contenant JO % d'étha-nol. Une addition supplémentaire d'alcool donne un précipité -0 abondant. On décante le précipité et on filtre la liqueur surnageante. On concentre sous vide le filtrat hydro-alcoo-lique limpide jusqu'à une pâte à environ JO % de matière sèche. Cette pâte est la fraction injectable de l'extrait de foie.. On la sèche dans un four sous vide sur des étagères 15 chauffées à 70°C, au moyen d'eau chaude ; on obtient 50 g d'un produit sec brun rougeâtre. Le rendement est donc d'environ 3 % par rapport au poids de foie initial. L'extrait obtenu donne l'analyse suivante : Azote total 11 £ ÇO Azôte-amino 4,1 % Acide cytidylique moins qûa= la llaite mesurable Acide uridylique id. Acide guanilique id. Acide folique traces 25 Acide pantothénique (exprimé en pantothénate de Ca) " 105 Y/g Choline (exprimée en choline, HC1) 2,1 Y/g 30 Vitamine B12 traces Vitamine PP 35 Y/g Vitamine B1 5,7 Y/g Histamine (base) 95 Y/g Exemple 2 : 35 Matière première : foie de bovin prélevé lors de l'abattage sur un jeune taureau Simmenthal de 17 mois, de poids total 680 kg. On disperse 2 676 g de foie broyé comme à l'exemple 1 dans 7 350 ml d'eau déminéralisée additionnée de 8,85 ml d'acide 69 05630 9 2011810 suIHirique à 95 %* On effectue la digestion comme dans l'exemple 1, cependant, on chauffe la masse à 50°C, son pH étant de 4,9-5» On obtient 6 600 ml de filtrat brun-jaune opalescent. On reprend la masse restant sur le filtra st on la digère encore 2 fois 5 avec 3 000 ml d'eau déminéralisé© à chaque fois, comme'dans l'exemple 1, On obtient un total 3g 12 710 ml de filtrat et on concentre sous vide sans dépasser lia® température d® Z>5°0S jusqu'à ce que l'on obtienne 2 8f2 g &*vxi@ solution à 13,6'$ de matière sèche. On ajouts ^ '140 'isl 10 on procède ensuite eomise eVJardt'à l'exeaple 1» On obtient 265 g d'un produit lyophilisé, le rendement étant de 9,9 % par rapport au poids inîtal« L'extrait résultant donne 13analyse suivante % Azote total 9*8 % 15 Azote-amino 4 % Acide cytidylique Ôs7- $ Acide uridylique 051S$ Acide guanilique 0,13% Acide folique 0-9 l'/s 20 Acide pantothénique (exprimé en pantothénate de Ca) 350 y/g Choline (exprimée en choline, HCl) 9 Y/g 25 Vitamine B12 1*2 Y/g Vitamine PP 155 ' y/s Vitamine 18 y/s Histamine (base) 6,5 Y/g Exemple 3 : 30 Matière première : foie de bovin prélevé lors de l'abattage sur un jeune taureau de race Alpine âgé de 23 mois, de poids total 710 kg. On disperse 2 425 g de foie broyé comme dans l'exemple 1 dans 4 850 ml d'eau déminéralisée additionnée de 8 ml d'acide 35 sulfurique à 95 On agite la suspension et on élève progressivement sa température à 45°C en maintenant ces conditions pendant 8 heures, avec pH de 4,5. On place ensuite la suspension pendant une nuit dans un réfrigérateur à 5*C. BAD ORIGINAL 69 05630 10 2011810 On ramène la suspension à la température ambiante, on ajoute 2 000 ml d'eau déminéralisée et on chauffe la suspension pendant 1 heure à 45°G en agitant et on filtre à chaud sous vide sur une plaque de Dicalite 478 ; on obtient un fil-5 trat ehaud presque limpide. On reprend la.masse restant sur le filtre par Ë 000 al d'eau déminéralisée et on le fait à iîoirveea digéré pendant 1 heure dans les conditions décrite.s-ei-dessus s on réunit les filtrats et on obtient un total de S 670 ral de filtrat à pH 4,5. On concentre le filtrat sous vids? 10 clans un évaporateur à 'cyclone à 35°C jusqu'à ce que l'on obtienne 2 840 g d'une solution à 12,2 % de matière sèche. On ajoute 4 135 d'acétone en agitant, le traitement ultérieur étant comme décrit à l'exemple 1. On obtient 202 g de produit injectable; représentant 15 un rendement de 8,35 % par rapport au poids de départ. L'extrait résultant donne l'analyse suivante ï 9,3 $ 3,8 $ 0,7 $ 0,11 * 0,14$ 0,7 Y/g 360 Y/S 8,8 y/S 0,9 Y/S 140 Y/g 17 Y/g 7,2 y/g Matière première : foie de bovin prélevé lors de l'abattage sur le même animal que l'exemple 3 et conservé par congéla-55 tion à -25°C Jusqu'au moment de l'utilisation. On broie 2 000 g de foie dégelé dans un hachoir (orifices de sortie de 3 nim de diamètre) et on le met en suspension dans 9000 ml d'eau déminéralisée acidifiée par 6,6 ml d'acide sulfuriqu® h 95 %s ®a élevant progrsssivemsnt la température Azote total Azote-amino Acide cytidylique 20 Acide uridylique Acide guanidique Acide folique Acide pantothénique (exprimé en pantothênate 25 de Ca) Choline (exprimée en eholine, HCl) Vitamine B12 Vitamine PP 30 Vitamine Histamine (base) !ÎY0»nl a il . BAD ORIGINAL 69 05630 ii 2011810 à 45°C et on agite. On effectue la digestion dans un courant de gaz inerte (azote) pendant 10 heures, puis on filtre comme décrit à l'exemple 3 ; on obtient 3 600 ml d5un filtrat jaune presque limpide de pH 4,4. 5 On lave le gâteau de filtration par de faibles quan tités d'eau déminéralisée à 45°C, en utilisant -un total de • 1 000 ml ; on concentre sous vide dans un évaporateur à cyclone à 30°C jusqu'à ce que l'on obtienne 2 010 g d'une solution à 12,9 # de matière sèche. On ajoute 2 950 ml d'acétone 10 en agitant, le traitement ultérieur étant tel que décrit dans l'exemple 1. On obtient 200 g d'extrait lyophilisé, représentant' un rendement total de 10 % par rapport au poids de foie initial. Dextralt résultant donne l'analyse suivante i 15 Azote total 10,2 # „ Azote-amino 4,5 % Acide cytidylique "1,1 # Acide uridylique 0,16# Acide guanilique 0,19# 20 Acide folique 1,1 y/g Acide pantothénique (exprimé en pantothénate de Ca) 405 y/g Choline (exprimée en choline, 25 HC1) 10,2 y/g Vitamine B12 0,7 y/g Vitamine PP 155 y/g Vitamine 22 y/g Histamine (base) 7,5 y/g 3G , Les données analytiques indiquant dans les exemples ci-dessus sont obtenus par des procédés décrit dans la littérature, à savoir : 1 - Azote-amino M. Caleffi, F. Dal Brollo, E. Mecarelli, E. Rossi 35 "Metodo di determinazione dell'azoto amminieo negli estratti epatici". Parmaco, 14> 233 (1959). 69 05630 12 2011810 2 - Azote total Farmacopea Ufficiale Italiana ; Je édition, appendix n° J>6, page 1006. 3 - Aoides cytidylique, uridylique, guanilique 5 J. Am. Chem. Soe. J2, 1471 et 2811 (1950), nature 167» 483 (1951). 4 - Choline N F XI page 4l6. 5 - Vitamine "B-^ 10 Procédé microbiologique sur plaque utilisant comme souche d'essai E. Coli 113/3 (Salvini Bolzoni - Boll. Ist. Sier. Milanese pages 97-1952). On effectue l'extraction et' les dilutions conformément aux normes américaines U.S.P. XVI appliquées aux préparations de foie. " 15 6 - Vitamine PP (aoide nicotinique) Procédé microbiologique sur plaque, la souche sensiblé étant Aspergillus nidulans. Princivalle, Caradonna - Rendiconti Istituto Superiore Sanità 26, 75 (1963). 20 7 - Acide folique Procédé microbiologique utilisant comme souche sensible Streptococcus lactis R. A.T.C.C. 8043.' Le procédé des titrages est* décrit dans Farmacopea Ufficiale, Vile édition, page 1870. 25 8 - Acide pantothénlque Procédé microbiologique utilisant comme souche sensible Lactobacillus arabinosus 17-5. Le procédé de titrages est décrit dans "Methods of Vitamin Assay" - Interscience Publ. Inc., New York, 3e édition, 30 page 197 (1966). 9 - Vitamine B^ Procédé microbiologique utilisant comme souche d'essai Lactobacillus fermenti 36. Procédé indiqué dans Difco Manual, 55 9e édition, pages 214 et 217 (1953). 10 - Histamine Détermination biologique selon D„ Glick, "Methods of Biochemical Analysis", Vol. III, Interscience Publishers, Inc., N.Y„ - Londres, pages 62-71, 1966. 69 05630 2011810 Exemple 6 : On dissout 200 g d'extrait de foie lyophilisé,obtenu par le procédé décrit à l'exemple 4, dans 1 000 ml d'eau bidis-tillée apyrogène. 5 On dissout séparément 2 g de Paracombin dans 200 ml d'eau bidjflbillée apyrogène en chauffant à environ 80°C. On ajoute la solution résultante à la solution contenant l'extrait de foie. On agite et on filtre sous vide sur une capsule clarifiante du type Seitz K7. On lave le gâteau de filtration avec 10 environ 150 ml d'eau bidistillée apyrogène. On place le filtrat résultant dans une pièce stérile et on filtre en utilisant de la verrerie stérile et apyrogène sur un filtre stérilisant et dépyrogénant ( Membranfilter, Gruppe MF JO). Par lavage du fil€re, encore avec de lfeau bidistillée 15 apyrogène, on amène le volume du filtrat à un total de 2 000 ml contenant 10 # de matière sèche. La solution résultante est placée au moyen d'une machine à pipette automatique dans des fioles de 8 ml de capacité à raison de 2,5 œlJ dans chaque fiole. Les fioles sont i 20 du type à fond plat pour lyophilisation de verre neutre du typ« Una. On plaee les fioles (toujours dans la chambre stérile) dans un réfrigérateur à -20*C pour effectuer une congélation rapide de la solution. Après un séjour d'environ 12 heures ( une nuit) dans le réfrigérateur, on place les fioles congelées dans 25 un appareil de lyophilisation, dont les étagères ont été préalablement refroidies à -25°C. On branche ensuite l'appareil de lyophilisation sur le vide jusqu'à obtenir dans la chambre de sublimation une pression résiduelle d'environ 0,1 hg. On commence* à chauffer les étagères, de. «anière & 30 atteindre une température finale de 45 °C après 24 heures. Lorsque la lyorphil±*utiion- est terminée (la pression résiduelle atteignant environ 0,001 mm Hg), on retire les fioles et les ferme toujpurs en chambre stérile. On obtient environ 800 fioles. On soumet un échan-35 tillon de ce lot à l'analyse chimique, microbiologique et toxicologique avant l'utilisation en thérapeuthie. La durée de conservation des fioles est pratiquement indéfinie. 69 05630 i» 2011810 Pour l'utilisation pratique, on utilise en outre des "fioles à solvant" contenant 2,5 ffll d'eau bidistillée stérile -■ 5. Contrairement à la pratique en usage avec les extraits de foie obtenus par le procédé classique, la lyophilisation des extraits de foie selon l'invention ne nécessite pas l'utilisation de glycocole comme support Inerte pour le produit lyophi- t lisé. Cela a un autre avantage, surtout du point de vue théra- -10 peutique, dans la mesure où la solution- injectable obtenue par dissolution du produit lyophilisé dans le contenu de la fiole à solvant est exempte des inconvénients particuliers des solutions hypertoniques. COPY 69 05630 15 2011810 REVENDICATIONS 1 - Un procédé de préparation d'un extrait de foie injectable dans lequel on disperse du foie broyé et on le fait digérer dans de l'eau acidifiée par l'acide sulfurique, puis on concentre la phase liquide et on la débarrasse de sa frac- 5 tion protéique pour l'administration orale par traitement par un solvant organique et on récupère la matière dissoute pour préparer une solution aqueuse injectable, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape de digestion s'effectue à une température de 4-5 à 50°C (de. préférence à 45°C), après quoi 10 on concentre la, phase liquide à une température ne dépassant pas 35°C jusqu'à une teneur en matière sèche de à 18 % (de préférence 15 %) en poids et on la soumet à la déprotéination au moyen d'acétone à une température de 15 à 25°C, de manière à séparer ainsi ladite fraction protéique pour l'admi-15 nistration par voie orale, et on débarrasse la solution hydro-acétonique résultant de l'acétone par concentration à une température ne dépassant pas j52°C. 2 - Un procédé selon la revendication 1, dans lequel on dilue par l'eau la solution débarrassée d'acétone jusqu'à 20 une teneur en matière sèche de 8 à 12 %, de préférence à 10 %, en poids, on mélange avec un agent de conservation et on lyophilise . 3 - Un procédé selon la revendication 2, dans lequel l'agent de conservation est 1'éthylmercurythiosalicylate de 25 sodium, un p-hydroxybenzoate ou un mélange synergique de p~ hydroxybenzoates„ i