Brevet FR2008463A1 — publié le 19700123

l'invention concerne des substances antibiotiques, leurs dérivés et leur procédé de préparation. Plus particulièrement, on décrit les nouvelles substances antibiotiques du type indicateur dénommées diliydrodaunomycine, 5 daunosaninyldaunomycine, leurs sels, l'aglycone dihydrodaunomy-cinone, ainsi que leur préparation à partir de cultures de Streptomyces peucetius var<> carneus. Il est démontré que les nouvelles substances antibiotiques, dihydrodaunomycine, daunosaminyldaunomycine et dihydrodau-10 nomycinone, que l'on désignera respectivement par les abréviations B—111» B-107 et B-112, possèdent des activités pharmaceutiques intéressantes, particulièrement comme agents antitumoraux, antibactériens, antiviraux et antiprotozoaires. La nouvelle souche de Streptomyces peucetius var. carneus 15 qui produit les nouveaux antibiotiques et qui est aussi appelée Streptomyces 1?»I. 65 (numéro de la collection de souches de la Demanderesse), est déposée à l'Institut de Pathologie Végétale de l'Université de Milan sous le n° I.P0Y0 1950, à "1'American Type Culture Collection" de Rockville (Haryland 20 852, Etats-20 Unis) sous le 11° A.I.C«C0 21 354 et au Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew (Surrey, Angleterre), sous le 11° I.M.I. 136 533» elle présente les caractéristiques suivantes : Caractéristiques microscopiques Le mycélium végétatif, sur les milieux de culture usuels, 25 est formé d'hyphes minces (épaisseur 0,5 - 0,9 mji) plus ou moins longs et ramifiés. Ces ramifications donnent naissance à des hyphes plus gros (épaisseur 1,1 - 1,6 m^x) qui sont appelés conidio-phores ; ils sont souvent sphériques et terminés par des crochets. Les conidies ont une forme sphérique et un diamètre. de. 1,8 - 3»3mt|i:. 30 Elles sont d'abord disposées en petites chaînes et ensuite libres» Au microscope électronique, les conidies présentent une forme presque sphérique à contours irréguliers et à surface ver-ruaueuse. 14947 2 2008463 Caractéristiques macroscopiques. Le Tableau 1 indique les caractéristiques macroscopiques observées sur les milieu:: indiqués lorsqu'on cultive le micro-organisme à 28°C, les observations étant faites 3, 8, 15, 5 21 et 30 jours après l'inoculation. Caractéristiques biochimiques♦ Gélatine : ~ hydrolyse totale. âmidon : hydrolyse totale» iîitrates ; .pas de réduction en nitrites. 10 HgS : légère formation. Pigments mélanoïdes % pas de formation» Lait s ni coagulation, ni peptonisation. Le micro-organisme utilise : la tyrosine, 1© d~xylosep 1© malto6er 1© mannose, le mamitolp le gLycérol, le glucose, le 15 saccharoses le thréaloss, le raffinose, le fructose et le manni-tol ; il n'utilise pas le lactose, 1®adonitol, le rhamnose, le sorbitol, le 1-arabinose» le mésoinositol, ni 1'esculine. En culture liquide submergée et aérée, la souche produit des substances antibiotiques. o >o Tableau 1 ~ Caractéristiques culturelles du Streptomyces peucetius var. carneus. Milieu Croissance Mycélium aérien Agar-agar, extrait de malt, levure (selon Hesssltine et al.) (°) Petites colonies confluentes avec plis ridés, durs, en relief, abondante. Très faible, lisse, couleur vert-gris. Absence de spirales et de verticilles. nO Agar-agar Bennet Agar-agar Emerson Agar-agar pomme de terre (selon Hesseltine et al.)(°) Agar-agar peptonç + KNO^ Agar-agar Qzapeck Agar-agar, asparagine, glucose Agar-agar, glycérol, glycine Agar-agar amidon Gélatine Lait Faible avec petites colonies isolées jaunâtres Moyenne avec petites colonies confluentes en patine lichénoï-de, non durs Abondant en patine douce uniforme . Abondant en petites colonies confluentes. Abondant en petites colonies confluentes. Faible, en petites colonies isolées Abondants, en patine lisse dure Faible en petites colonies isolées Modérés en surface Faible Absent Absent Abondant, bleu-vert-gris, hyphes terminés en crochet, puis en boucle Absent Faible, blanc sale, légèrement cotonneux. Hyphes terminés en crochet et en boucle. Faible, blanchâtre, rosé, Mycélium très divisé, court, sans crochets terminaux Absent Moyen, bleu-vert à gris-vert Absent Absent va O O CD 45» O Uf o NO IABLEAU 1 (suite) Milieu Agar-agar* extrait de malt, levure (selon Hesseltine et al«) Agar-agar Bennet Agar-agar Emerson Agar-agar pomme de terre (selon Hesseltine et al„) (°) Agar-agar peptone + KNQ^ Agar-agar Gzapeck Agar-agar » asparagine, glucose Agar-agart glycérol» glycine Agar-agar'amidon. Gélatine I»ait (0) Mycélium végétatif Abondant^ jaunâtre, puis jaune-rouge Moyen, rose vineux Moyen» incolore Abondant» couleur chair. Patine lisse dure. Abondant» incolore. Abondant, rose-chair vif* Faible, incolore Abondant» jaune à orange clair• ' Faible Incolore puis jatmâtra rosé. O -C* t Pigments solubles Intense, d'abord jaune-rouge, puis rouge-brun Absent Rougeâtre-brun pâle Intense, d'abord jaune rou-geâtre, puis orange foncé. Absent Absent Absent Absent Absent Modéré, incolore à jaunâtre Abondant, brun foncé-noir Faible, annulaire en surface, rose-saumon Faible, rose- Ni O O cx> o OU • w 69 14947 5 2008463 (°) Hesseltine et al., 1954, ânn. N.Y. Acad. Soi» 60, pages 136-151. Identification de la souche. La description du micro-organisme à l'examen permet de 5 le ranger dans le système de classification de Pridham et al. (Appl. Microbiol., 6, page 52, 1958), dans la section Retinacu-lum apertum. Dans le système de classification de Baldacci (Giorn. di Hicrobiol., 6 , page 10, 1958), le micro-organisme appartient à la série Albosporeus ; dans le système de Waksman 10 ( The Actinomycetes, vol. II, page 129, 1961), il appartient à la série Ruber» La comparaison entre les caractéristiques du micro-or-ganisme et celles d'espèces appartenant aux groupes systématiques cités montre qu'aucune d'elles ne présente des caractéris-15 tiques correspondant à celles du micro-organisme à l'examen. Le Tableau 2 indique les données de cette comparaison pour les espèces produisant des substances similaires à celles que les inventeurs ont étudié. Le tableau indique les données concernant le Streptomyces cinereoruber, le Streptomyces cinereo-20 ruber var. fructo fermentans, le Streptomyces caespitosus et le Streptomyces antibioticus, bien qu'ils n'appartiennent pas aux groupes cités. On cite également ci-après les différences relativement aux espèces qui ne produisent pas les substances du type examiné. 25 Le micro-organisme de l'invention diffère de l'espèce Streptomyces alborporeus (Waksman : The Actinomycetes, vol. II, 1961, page 171) parce que ce dernier ne produit pas de pigments solubles, qu'il réduit les nitrates et ne forme pas d'hydrogène sulfuré ; du Streptomyces cinnamonensis (Waksman : The Actinomy-30 cetes, vol. II, 1961, pages 195-196). et du Streptomyces fradiae (Waksman : The Actinomycetes, vol. II, 1961, pages 21t-212 à cause de la couleur du mycélium végétatif et aérien ; de l'es-, pèce Streptomyces ruber (Waksman The Actinomycetes, vol. II, 1961, page 27t) parce que ce dernier coagule le lait, ne forme 35 pas de pigments solubles ni d'hydrogène sulfuré. .-Il 'diffère du Streptomyces rubescens (Waksman, The Actinomycetes, vol. II, 1961, page 271) à cause de la couleur du mycélium aébien et parce que le Streptomyces rubescens ne forme pas de pigments solubles ni d'hydrogène sulfuré ; du Streptomyces oidiosporus 69 14947 6 2008463 (Waksman : The Actinomycetes, vol. II,. 1961, page 251) parce qu'il ne réduit pas les nitrates et ne peptonise pas le lait. En outre, le Streptomyces oidiôsporus né forme pas de pigments solubles. TABLEAU 2. Comparaison entre le Streptomyces peucetius var. carneus et des espèces produisant des substances similaires à l'antibiotique à l'examen. 10 AS ■2 o Streptomyces Streptomyces peucetius var. purpurascens carneus iporophores Spores droits ou crochus spiralés arrondis, ver- ovales, épi-ruqueux, neuxs 1,8-3,3 P 0,8-1 ji sur 0,4- 0,5 p. Mycélium végétatif Mycélium aérien Séduction des nitrates incolore à jaune-rouge, parfois li-chénoïde bleu-vert à gris-vert Lait (pep0coag.) 1-ogrXose 1 —arabinose■ L-rhamnose Fructose Saccharose Lactose Raffinose D-mannitol D-sorbitol + + ■f .Streptomyces ' bobiliae spiralés / rouge blanc rosé rouge--corail blanc / + + + + + + + + Antibiotiques Dihydrodauno- Rhodomycine formés mycine ;dauno-s aminyl-dauno-mycine et dihy-drodaunomycine Streptomyces c±-nereoruber droits ou crochus ovales, lisses, 0,7-1 ii sur 0,9-2 }i jaune- rouge brun gris-cendre / + + + + + + + Oinéru- Rhodomy-bines cines 14947 7 2008463 TABLEAU 2 (suite) Streptomyces Streptomyces cineréoruber, caespitosus var. frueto fermentons Streptomyces Streptomy-niveoruber ces gali-laeus Sporo-pbores Spores Droits ou crochus ovales lisses, 0,7-1 H sur 0,9-2 |i Mycélium végétatif Mycélium aérien gris-cendre gris-cendre Réduction des nitrates lait (pep.coag.) L-xylose L-arabinose yio L-rhamnose Fructose Saccharose Lactose Raffinose - ^ D-mannitol D-sorbitol Antibioti ques formés / + + + + + + + + + verticillés spiralés ovales, lisses, 0,5-1,3p. sur 0,3-0,5|i spiralés crème à brun à ^aune-rou-geâtre blanc jaunâtre gris + + / rouge carminé blanchâtre Cinéru-bines Mitomycines / / / / / / / / / / Oinéru-bines rouge carminé blanc à gris cendre / + / / / / / / / / / Oinérubines - V- 69 14947 8 2008463 lABIEAU 2 (suite) Streptomyces anti-Moticus Streptomyces A 1165 (Asheshov et al. : Antibo and Chemoth. 4, 380f 1954) Streptomyces A 220 (Acheshov et al. : Antib° and Ghemoth. â, 380, 1954). Streptomyces DOA 1205 (Brockmans Ohem. Ber. 21, 1880, 1959) Sporophores droits non décrits non décrits spiralés Spores lisses, sphériqueS non décrits non décrits non décrits Mycélium végétatif jaune-crème non décrit non décrit rouge-brique, rouge vineux Mycélium aérien blanc à gris-souris - non décrit non décrit rouge-gris Réduction des nitrates / / / / Lait (pep. coag.) + / / + L-xylose / / / / L-arabinose / / / / L-rhamnose / / / / Fructose / / / / Saccharose / / / / Lactose / / / / lafflnose / / / / -LS D- .msunitol / / / / D-sorbitol / / / / Antibiotiques Oinéru- Aklavine Rutiiantine Fyrro- formés bines mycin® + = réaction positive «- = réaction négative •£o / = absence de données. 69 14947 9 2008463 On peut donc conclure que le micro-organisme à l'examen est différent de toutes les espèces produisant des substances similaires et que plus généralement il diffère de toutes les espèces appartenant aux groupes systématiques subgénériques 5 dont fait partie cette souche» Le Streptomyces peucetius var, carneus diffère du Streptomyces peucetius (G-iornale di Microbiologia, vol. 11, 1963, page 109), parce que : a) il forme un mycélium aérien abondant gris-vert sur 10 le milieu d'extrait de levure et de tyrosine, tandis que le mycélium végétatif et l'envers de la culture sont incolores ; b) sur les milieux Bennet et Ozapeck, le mycélium végétatif présente des couleurs vives de tonalités vineuses sur le premier et de tonalités rose-chair sur le second ; 15 c) sur le milieu Emerson, le mycélium végétatif prend une consistance et un aspect lichénoïdes et l'envers de la culture est incolore ; - d) sur le milieu d'amidon et de sels, il se forme un mycélium aérien abondant bleu-vert qui a de nettes tonalités 20 gris-vert ; e) sur le milieu de pommes de terre et glucose, on n'observe aucune formation de mycélium aérien ; f) il produit les antibiotiques dihydrodaunomycine (B—111), daunosaminyl-daunomycine (B-107) et dihydrodaunomycinone 25 (B-112) en culture liquide submergée- On conclut que le micro-organisme à l'examen doit être considéré comme une variété de Streptomyces peucetius, pour laquelle on propose le nom de Streptomyces peucetius var. carneus. Ge micro-organisme peut être conservé par transplantations suc-30 cessives sur le milieu B (composition décrite à l'exemple 1) ou par lyophilisation d'une suspension de mycélium d'une culture sur milieu B. En faisant fermenter le nouveau micro-organisme Streptomyces peucetius var. carneus dans un milieu de culture 35 contenant des sources de carbone, d'azote et de sels minéraux, on obtient des substances antibiotiques nouvelles qui possèdent une activité antitumorale, antibactérienne, antivirale et anti--protozoaire. 69 14947 10 2008463 Plus particulièrement, pour fabriquer la dihydrodauno-mycine, la daunosaminyl-daunomycine et la dihydrod aunomycinone, on cultive le Streptomyces peucetius var. carneus dans un milieu liquide préalablement;stérilisé» en mi lieu aérobie, à une tempé-5 rature de 25-35°C, pendant 4-7 jours, à un pH de 6, 5-8. le milieu de culture comprend une source de carbone, une source d1azote et des sels minéraux. La source de carbone peut être constituée par l'amidon, la dextrine, le glucose, le glycérol, le mannitol, le maltose, 10 la liqueur de macération de mais, les produits solubles de distillerie, l'huile de soja et la farine .de soja. La source d'azote peut être constituée, outre les substances complexes azotées mentionnées plus haut, par la levure sèche, la peptone de viande et la caséine. On obtient aussi de 15 bons résultats en utilisant des sels d'ammonium tels que le nitrate, le sulfate et le diphosphate. Les sels minéraux utiles à la fabrication d'antibiotiques peuvent varier selon le milieu utilisé. Le carbonate de calcium est presque toujours présent et, en outre, on peut ajouter des chlorures, sulfates, phospha-20 tes etc... de sodium, de potassium, de magnésium, de manganèse, de fer, de cuivre, de zinc et de cobalt. On effectue la fermentation dans des flacons Erlen*eyer et dans des fermentateurs de laboratoire et industriels de capacité diverse» 25 Quand la fermentation est achevée, on extrait du bouil lon de culture les substances antibiotiques dihydrodaunomycine, daunosaminyl-daunomycine et dihydrodaunomycinone au moyen de solvants appropriés, dans des conditions appropriées et on les sépare par chromatographie, puis on les purifie. On détermine 30 par lecture spectrophotométrique la quantité d'antibiotiques présente dans les bouillons de culture, puis on la compare à des échantillons d'antibiotiques de titre connu. Propriétés chimico-physiques Les substances antibiotiques dihydrodaunomycine, dauno-35 saminyl-daunomycine "et dihydrodaunomycinone présentent la structure : 14947 n 2008463 10 15 20 25 30 35 OGH dans lao.ua lie 3 ^OH R représente H et R^ le radical daunosaminyle H > m2 oh - CES - CH0 - G - G - G - CH, l 2 , t » 3 I. H H lorsqu'il s'agit de la dihydrodaunomycine ; R représente = 0, R^ le radical daunosaminyle et un deuxième radical daunosaminyle est en liaison glycoside avec l'un des groupes hydroxyle libres de la molécule lorsqu'il s'agit de la daunosaminyl-daunomycine 0H "H et R,| un atome d'hydrogène lors- R représente qu'il s'agit de la dihydrodaunomycinone. L'analyse élémentaire du chlorhydrate de dihydrodaunomycine donne les valeurs suivantes : formule empirique : G 27^3 ^ 0 ^ qF.HG1 trouvé, 56 : C 57,16 ; H 6,01 ; JT 2,68 5 01 5,86 ; calculé, 56 î C 57,29 ; H 5,71 ï N 2,47 ï 01 6,26. Le spectre d'absorption dans l'ultra-violet et le visi-bledonne, dans le méthanol, des maximums d'absorption aux lon-gœurs d'onde suivantes : à 470 mfi sfoffl = à 496 mfi = 220 223 à 233 mil v\f°om = 590 à 252 mji E^cm =430 à 286 mp, E|/aom = 140 Dans le spectre infra-rouge dans KBr, on note des baâes importantes aux longueurs d'onde suivantes (en p.) : 2.94 ; 3,44 ; 6,19 ; 6,32 Î 6,95 ; 7,11 ; 7,25 ; 7,80 Î 8,28 8.95 î 9,40 î 9,95 î 10,10 ; 11,5 î 12,30 ; 12,65 13, 18. à 528 mp, = 130 cm. 69 14947 12 2008463 L'analyse élémentaire du chlorhydrate de daunosaminyl--daunomycine donne les valeurs suivantes î formule empirique : 0^jH^qO ^ gN2•2HC1 ; trouvé, % 0 54,42 ; H 6,17 ; N 5,64 ; 01 9,43 ; 5 calculé, io i G 54,32 ; H 5,80 ; K 3,84 ; Cl 9,72. Le spectre d'absorption dans l'ultra-violet et le visible donne, dans le méthanol, des maximums airs longueurs d'onde suivantes ï à 233,5 mu -sfQm =515 à 477 m,i = 168 10 à 251 mil s]^cni = 364 à 497 mp e]^ = 171 à 290 mp, E^cm = 121 à 531 mu e]^ = 95. Dans le spectre infra-rouge, on observe des bandes aux longueurs d'onde suivantes (en fi) ï 2,93 (large) ; 3,44 (large)î 15 5,80 ï 6,18 ; 6,30 ; 7,10 ? 7,78 ; 8,24 ; 8,95 ; 10,05 ; 12,20 ? 12,50 j 13,10. On peut obtenir la dihydrodaunomycinone non seulement à partir des bouillons de culture du Streptomyces peucetius var. carneus mais aussi par hydrolyse aoide de la dihydrodaunomycine; 20 son analyse élémentaire donne les valéurs suivantes : formule empirique : °21H20°8 trouvé, S& î 0 62,83 ; H 5,16 ; OCH^ 7,75 5 calculé§ % I 0 62,90 ? H 5,02 ; QGHj 7,75. Le spectre d'absorption dans 1'ultra-violet et le visible 25 donne, dans le méthanol, des maximums aux longueurs d'onde suivantes s à 233 mp jsf0>1 = 780 à 479 m = 295 à 252 mil E1^cm = 610 à 496 mu E1^ =310 30 à 2$5 mp =185 à 527 m E1^ = 180 Dans le spectre infra-rouge, on observe des bandes . remarquables aux longueurs d'onde suivantes (en |i) : 2,94 ; 3,44 ; 6,19 ; 6,35 ; 6,92 ; 7,08 ; 7 ,30 ; 7,84 ; 8,05 ; 8,31 ; 9,38 ; 9,80 ? 10,20 ; 11,38 ? 12,50 ; 13,18. 55 les exemples suivants illustrent.l'invention sans la limiter. 14947 13 2008463 EXEMPLE 1 «, On utilise la suspension de la souche Streptomyces peucetius var. carneus tirée d'un flacon lyophilisé pour inoculer 5-7 milieux inclinés ayant la composition suivante : 5 saccharose 2 5» phosphate bipotassique 0,2 °/o nitrate de sodium 0,2 sulfate de magnésium heptahydraté 0,2 c/ô levure sèche 0P5 fo 10 eau du robinet, pour faire 100 Le pH du milieu, non corrigé, est de 7 environ. On ajoute de l'agar-agar Difco au milieu à raison de 2% en poids sur le volume du milieu. On stérilise le milieu à l'autoclave à t10°0 pendant 20 minutes. On fait incuber les 15 cultures inoculées à 28°C pendant" 7 jours, puis on les utilise pour inoculer les flacons de phase végétative contenant chacun 60 ml du milieu A qui présente la composition suivante : peptone "Bacto " 0,5 levure sèehe 0,3 ?« 20 nitrate de calcium 0,05 eau du robinet, pour faire 100 Le pH du milieu, non corrigé, est d'environ 7. On stérilise les flacons à l'autoclave à 110°0 pendant 20 minutes. L'inoculum de chaque flacon est constitué par une portion de 25 la couche superficielle du mycélium, correspondant à environ 1/4 de la surface de la culture inclinée, homogénéisée dans des bocaux avec 2 ml d'eau distillée» On fait incuber les flacons à 28°0 sur une secoueuse rotative à 240 tr/mn avec une excentricité de 35 mm. Au bout 30 de 48 heures d'incubation, on utilise ces flacons pour inoculer les flacons de la phase de production, contenant chacun 40 ml du milieu B qui a la composition suivante : glucose 6 fi levure sèche 2,5 35 chlorure de sodium 0,2 c/° carbona.te de calcium 0,2 ^ phosphate bipotassique 0,1 ?ô sulfate anhydre de magnésium , 0,01 c/° sulfate de fer heptahydraté - 0,001 °/o 40 sulfate de zinc heptahydraté 0,001 $ 69 14947 14 2008463 chlorure de cuivre 0,001 $ acide éthylènediaminotétra- acétique neutralisé par la soude 0,012 5 eau du robinet, pouç faire 100 le pH. du milieu, non corrigé, est de 7- On le stérilise à l'autoclave à 110°C pendant 20 minutes ; on stérilise le glucose à part à 110°C pendant 20 minutes» L'inoculum des flacons de production est constitué 10 par 2 ml des cultures de la phase végétative. Les conditions de fermentation sont les mêmes que pour les cultures végétatives. Au bout de 120 heures d'incubation, les cultures contiennent 114 pg/ml de pigments totaux (calculés en dihydrodaunomycine sur la base de l'absorption à 496 mp de l'extrait éthanolique 15 d'une portion de la culture, qui comprennent 21 pg/ml de dihydrodaunomycine, 4 pg/ml de daunosaminyl-daunomycine et 10 pg/ml de dihydrodaunomycinone. EXEMPLE 2. On opère comme dans l'exemple 1, avec cette différence 20 que pour les phases végétative et productive, on utilise respectivement les milieux L et D qui ont la composition suivante : Milieu végétatif L : glucose 1 % extrait végétal pour bouillon 1,5 i" hydrolysat enzymatique de ca-25 séine 0,3 # eau du robinet, pour faire 100 Le pH n'est pas corrigé. On effectue la stérilisation 30 35 à 120°G pendant 20 minutes. Milieu de production D : glucose 6 fo produits solubles de distil lerie 2,5 * chlorure de sodium 0,2 fo carbonate de calcium 0,2 * phosphate bipotassique 0,1 sulfate anhydre de magnésium 0,01 fo sulfate de fer heptahydraté 0,001 JÊ sulfate de zinc heptahydraté" 0,001 i» eau du robinet, pour faire 100 69 14947 15 2008463 Le pH est corrigé à 7 au moyen de lïaOH dilué. On effec-tuela stérilisation à 1îO°C pendant 20 minutes. La concentration maximale de dihydrodaunomycine, de dannosaminyldaunomycine et de dihydrodaunomycinone est atteinte 5 -au 6ème jour de fermentation et elle est de 66 pg/ml de pigments totaux comprenant 21 pg/ml de dihydrodaunomycine, 3 pg/ml de daunosaminyl-daunomycine et 8 pg/ml de dihydrodaunomycinone. EXEMPLE 3. On opère comme dans l'exemple 1 avec cette différence 10 que pour la phase productive on utilise un milieu ayant la composition suivante : glucose 7 fo farine de pois chiches 6,6 carbonate de caocium 0,2 # 15 chlorure de sodium 0,2 $ phosphate bipotassique 0,1 $ sulfate de magnésium heptahydraté 0,02$ sulfate de fer heptahydraté 0,001 fe sulfate de zinc heptahydraté 0,001 % 20 eau du robinet, pour faire 100 On effectue la stérilisation à 120°C pendant 20 minutes. Au 5ème jour, on atteint une concentration totale de 72 pg/ml de pigments comprenant 22 pg/ml de dihydrodaunomycine, 4 pg/ml de daunosaminyl-daunomycine et 9 pg/ml de dihydrodaunomycinone. 25 EXEMPLE 4.- Avec une culture de Streptomyces peucetius var. carneus, sur le milieu solide décrit à l'exemple 1, on inocule 500 ml du milieu liquide de phase végétative décrit à l'exemple 1, contenu dans un flacon de 2000 ml en verre "Pyrex" gravé. 30 On homogénéise le mycélium de la culture inclinée dans un bocal avant' l'inoculation. On fait incuber le flacon à 28°G sur une secoueuse rotative à 120 tr/mn avec une excentricité de 35 naa pendant 48 heures. On utilise 500 ml de la culture végétative obtenue pour 35 inoculer, dans un fermentateur -en acier inoxydable de' 80 litres, 50 litres d'un milieu comprenant : . 14947 16 2008463 peptone 0,5 fo levure sèche 0,3 $ nitrate de calcium tétra- hydraté 0,09 i° eau du robinet, pour faire 100 5 On agite le fermentateur au moyen d'hélices à disque de turbine à 250 tr/mn et on aère avec environQÇ litre d'air par litre de milieu par minute, à 27°C. Au bout de 48 heures d'incubation, on utilise 25 litres de la suspension de mycélium obtenue pour inoculer 500 10 litres d'un milieu de fermentation dans un récipient de 800 litres. le milieu présente la composition suivante : glucose 6 % chlorure de sodium 0,2 f» levure sèche 2,5 carbonate de calcium 0,2 % phosphate bipotassique 0,1 $ sulfate de magnésium 0,01 % sulfate de fer heptahydraté 0,001 fo chlorure de cuivre 0,001 % eau du robinet, pour faire 100 On stérilise préalablement le milieu à 120°0 et après inoculation, on l'agite avec deux hélices à disque de turbine à 220 tr/mn, on aère avec 0,7 litre d'air par litre de milieu 25 par minute. La température est de 27°0 . Au bout de 130-140 heures d'incubation, on atteint un pouvoir égal à 69 pg/ml de pigments totaux. On ajuste au pH 2, au moyen d'acide chlorhydrique 6n, 50 litres d'un bouillon de fermentation filtré contenant 69 pg/ml 30 de pigments totaux, soit un total de 3,45 g, et on ajoute 5 litres de chloroforme. Au bout de 20 minutes d'agitation et après séparation des phases, on recueille l'extrait et on l'évaporé jusqu'à sic-cité. Le résidu, lavé à l'éther de pétrole, est constitué par 35 874 mg d'un produit rouge-brun qui, après deux cristallisations par l'acide acétique glacial, donne 240 mg de dihydrodaunomycinone ayant un point de fusion de 230-232°C. = +75°0 (à 0,05 i° dans le dioxane). 14947 17 2008463 A la phase aqueuse acide, correspondant à 52 jig/rol de pigments totaux et dont on a ajusté le pH à 7,5 au moyen d'ammoniaque à 32 on ajoute un mélange de 20 ml de salicylaldéhyde et 200 ml d'alcool méthylique. 5 Après 30 minutes d'agitation, on ajuste" le pH à 8,6 et on extrait au moyen de 10 litres de chloroforme en agitant pendant 1 heure. Après avoir séparé la phase organique, on répète l'extraction à deux reprises avec une quantité totale de 8 litres du solvant. On concentre sous pression réduite les extraits réu-10 nis jusqu'à environ 1,5 litre, ils contiennent 2,58 g de pigments totaux déterminés par spectrophotométrie. ' - On évapore alors cette solution, on reprend lé résidu par un peu de chlorure de méthylène et on l-'adsorbe sur une colonne de 75 g d'acide silicique. On élue alors la colonne avec 15 le système solvant chlorure de méthylène/éther de'pétrole/mé-tbanol (100 : 50 : 10). Il se forme deux bandes colorées. De la bande colorée qui descend le plus lentement, on tire 1,65 g du dérivé salicylidène amorphe de la dihydrodaunomycine. On cristallise ce produit par le méthanol et on obtient 20 1,23 g de cristaux fondant à 165-168°C' J' analyse effôètive : 0 64,24 ; H 5,61 ; H 2,13 ; 00H^ 4,86. Analyse calculée pour O^O^H : 0 64,44 î H 5,58 ; ÏT 2,21 ; OCH^ 4,90. Pour obtenir le chlorhydrate de dihydrodaunomycine, on dissout 1 g de dérivé salicylidène dans 50 ml de chloro-25 forme et on extrait à trois reprises chaque fois par 15 ml de H01 0,1 n. la couleur se transfère totalement dans-la-phase aqueuse que l'on alcalinise à un pH de 8*6, au moyen de soude 0,1n et que l'on extrait par le chloroforme jusqu'à ce que les extraits ne soient que légèrement colorés. 30 On recueille les extraits au chloroforme, on les sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide jus-qu'à environ 10 ml. On y ajoute 2,9 ml de HG1 0,6 n dans du méthanol et 10 volumes d'éther éthylique anhydre. On cristallise le précipité obtenu par un mélange de méthanol et de dio-35 xane. On obtient 0,52 g de chlorhydrate de dihydrodaunomycine fondant à 204-206°0 (avec décomposition), ® = +188° (à 0,13 CÂ dans le méthanol). 14947 18 200846.3, En éluant la première bande colorée de la colonne d'acide silicique ci-dessus, on obtient 800 mg d'un produit amorphe formé d'un mélange de pigments. On dissout le produit dans 40 ml de chloroforme et on l'extrait à trois reprises, chaque fois 5 par 10 ml de H01 .0,1 n„ De cette manière, tous les pigments se . transfèrent dans.la phase aqueuse ; on alcalinise celle-ci à un pH de 8,6 au moyen .de ITaOH 0,.1n et on extrait par le chloroforme; on effectue trois extractions avec 100. ml de solvant au total. On recueille les extraits et on, les sèche sur du sulfate de so-10 dium anhydre, on les concentre sous vide jusqu'à 5 ml, puis on ajoute 1,5 ml de HC1 0,6 n dans du, méthanol et 1.0 volumes d'éther éthylique anhydre. On obtient 400 mg d'un précipité qui est constitué par un chlorhydrate brut ; on le purifie sur une colonne de 100 g de 15 poudre de cellulose tamponnée à un pH de 5,4 au moyen d'un tampon phosphate M/15 et on élue"au moyen d'alcool butylique saturé de tampon phosphate M/15 à un pH de 5,4. On recueille des fractions de 25 ml chacune. Des fractions 21-50, on tire 85 mg d'un produit partiel-20 lement formé de daunosaminyl-daunomycine. les fractions 51-78 contiennent de la daunosaminyl-daunomycine pure. On réunit ces fractions, on y ajoute 350 ml d'éthër éthylique et 300 ml d'éther de pétrole, puis on extrait à trois reprises en utilisant au total 450 ml d'eau. On extrait par le chloroforme la phase aqueuse 25 qui a un pH de 5,4 et qui contient maintenant tous les pigments, et on jette l'extrait. On ajuste le pH de la phase aqueuse à 8,6 au moyen de ïTaOH 0,1n puis on extrait par le chloroforme j on effectue trois extractions pour un total de ,600 ml. On réunit les extraits et 30 on les sèche sur du sulfate de sodium anhydre, puis on les évapore sous vide, jusqu'à environ 20 ml. Au concentré, on ajoute 1,5 ml de HC1 0,6n dans du méthanol. et 10 volumes d'éther éthylique anhydre. On obtient 200 mg de chlorhydrate de daunosaminyl--daunomycine amorphe, le précipité,.recristallisé par un mélange 35 de méthanol et d'isopropanol,. donne 150 mg de cristaux de chlorhydrate de daunosaminyl-daunomycine fondant à 200°G. (avec dé-. — «-20 on composition) ; ^ocj ^ = +142°0 (à 0,1 dans le méthanol). 14947 19 2008463 10 15 20 25 30 35 HEVmDIQAJIOMS 1°) - Procédé microbiologique pour la préparation des antibiotiques dihydrodaunomycine, daunosaminyl-daunomycine et dihydrodaunomycinone et de leurs sels d'acides non toxiques pharmaceutiquement acceptables, caractérisé par le fait que l'on cultive le nouveau micro-organisme Streptomyces peucetius var. carneus dans des conditions aérobies, dans un milieu liquide de culture contenant une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux, à une température de 25-35°0, pendant 4-7 jours, à un pH variant de 6,5 à 8, que l'on isole du bouillon de fermentation les antibiotiques formés et qu'on les sépare. 2°) - Les nouvelles substances antibiotiques caractérisées par la formule structurale : dans laquelle : a) si E représente radical daunosaminyle ï , R' représente le H HH 0H H j 2 * « -0H - CH2- C - C - C - GH3 H H 0 ou un atome d'hydrogène, b) quand R représente = 0, R' est le radical daunosaminyle et un deuxième radical daunosaminyle estérifie l'un des groupes hydroxyle libres de la molécule. 3°) - Les antibiotiques répondant à la formule structurale de la revendication 2 et notamment la dihydrodaunomycine, la daunosaminyldaunomycine et la dihydrodaunomycinone. 4°) - Les sels formés par les composés suivant la revendication 2 avec des acides non toxiques, pharmaceutiquement acceptables et notamment le chlorhydrate de dihydrodaunomycine et le chlorhydrate de daunosaminyldaunomycine. 14947 20 2008463 5°) - Des compositions pliarmaceutiques douées d'activité antitumorale, antivirale, antibactérienne et antiprotozoaire et caractérisées par le fait qu'elles contiennent une ou plusieurs des substances antibiotiques selon les revendi-5" cations 2 à 4, mélangées à un véhicule approprié.