Brevet FR2012069A1 — publié le 19700313

i 2012069 Cette invention concerne des composés gui ont une activité semblable à celle des vitamines D. Plus précisément, cette invention concerne un composé du calciférol choisi entre le 25-hydroxyergocalciférol et le 25-hydro-5 xycfcDlécalciférol. L'activité antirachitique des vitamines D, plus précisément des vitamines Dj et Dj, est bien connue et grandement pourvue d'informations. L'emploi de ces vitamines comme complément nutritif est également: bien établi. 10 Les dérivés des vitamines Dj 3** D3 présentent une activité biologique plus grande que les vitamines Dj et D^» et ces dérivés sont identifiés comme le 25-hydroxyergocalcif érol et le 25-hydroxy-cholécalciférol respectivement. On prépare le 25-hydroxyergocalciférol et le 25-hydroxycholé-15 calciférol en les isolant du plasma sanguin de porcs qui ont été maintenus à des niveaux quotidiens élevés de vitamines Dj et respectivement, pendant des périodes prolongées. On prépare aussi le 25-hydroxycholécalciférol par une méthode synthétique, et plus précisément par irradiation ultraviolette d'un composé intermédiaire 20 inconnu jusqu'ici, le cholest-5,7-diène-3/3,25-diol qui fait aussi partie de la présente invention. Une manière de préparer le cholest-5,7-diène-3£,25-diol est la suivante : 69 22028 2 2012069 10 15 ?=° —O-C-R' 1)N,N' -dibroraodi-méthylhydantoine 2)Triméthyle phos- phite yv/v > c=o o O-C-R' I R LiAlH. 20 25 R=groupe alcoyle contenant de 1 à 16 atomes de carbone ou groupe phényle R"«groupe alcoyle contenant de 1 à 6 atomes de carbone ou groupe phényle OH HO On notera que la conversion du diester en diol dans le procédé ci-dessus peut être effectuée par d'autres moyens que par la réac-30 tion avec l'hydrure d'aluminium et de lithium. Par exemple, la soude ou la potasse alcoolique peuvent être utilisées à la place du composé du lithium avec des résultats équivalents. Une autre manière de préparer le cholest-5,7-diène-3/S, 25-diol est la suivante ï 35 69 22028 3 2012069 10 1 ) N, N ' - dib romodiméth^.-hydantoine c=o vv 15 2)Triméthyle Phosphite R= groupe alcoyle contenant de 1 à 16 atomes de carbone ou groupe phényle 20 25 t MeMgl OH Il est entendu que les méthodes précédentes ne se limitent pas aux valeurs et excipients spécifiques énumérés et que l'on peut utiliser des variantes comme il apparaîtra facilement à l'homme de l'arfc. De même, on peut utiliser d'autres méthodes pour séparer les divers constituants voulus. Dans les dessins : 35 La Figure 1 est le profil de radioactivité sur colonne chroma- tographique d" acide silicique de plasma de porcs jnarqué au tritium lequel plasma provient du sang de porcs qui ont reçus une nourriture contenant de grandes quantités de vitamines ^. La Figure 2 est le profil de radioactivité sur colonne 69 22028 4 2012069 chromatographique d* acide silicique des fractions du pic IV représentées sur la Figure 1. La Figure 3 est le profil de radioactivité sur colonne de Celite pour chromatographie de partage des fractions du pic IV 5 représentées sur la Figure 2. La Figure 4 est une représentation du squelette du 25-hydro-xyergocalciférol. Les descriptions suivantes des méthodes de cette invention ne sont que des exemples et il est évident qu'on peut utiliser des 10 substances et réactifs de départ autres que ceux spécifiquement indiqués dans les exemples. Exemple 1 On a dissous 100 mg de diacétate de 3,25-cholestéryle dans un mélange de 1,5 ml de benzène sec et de 1,5 ml de Skelly B sec 15 (Skellysolve B, naphtes de première distillation (hexane normal principalement) dérivés de kérosène, de point d'ébullition compris entre environ 60° et 68cC; commercialisé par Skelly Oil Company). On a ajouté la solution résultante à 32 mg de N,H1-dibromodiméthyl-hydantolne dans un tube à essai que l'on a ensuite immergé dans un 20 bain-marie maintenu à une température allant d'environ 72° à 74°C. Après dissolution complète de la N,N'- dLbromodiméthylhydantoîne on a refroidi la solution dans de la glace et on a séparé par filtration le précipité cristallin de diméthylhydantotne tout en le rinçant avec deux doses de un ml de Skelly B froid que l'on a 25 introduite dans le filtrat. On a évaporé le filtrat à sec à moins de 40°C sous vide et on a repris le résidu résultant par 0,4 ml de xylène sec. On a ajouté goutte à goutte cette solution en même temps que deux doses de xylène de 0,1 ml chacune pour rincer, à une solution de 0,1 ml de triméthylphosphite dans 0,3 ml de xylène 30 maintenu à environ 130°-135°C. On a laissé réagir le mélange résultant pendant 90 minutes environ tout en le maintenant dans les limites de température indiquées et on l'a ensuite évaporé à sec à environ 65°C sous vide. On a dissous le résidu obtenu dans du Skelly B et on a passé 35 sur une colonne de chromatographie de 25 g d'alumine neutre, rualité I, (Bio-Rad, de la California Corp. for Biochemical Research, Los Angeles, Californie). On a élué de la colonne avec un mélange 1:3 de diéthyl éther et de Skelly B suivi d'un mélange 1:1 des mêmes solvants et on a recueilli des fractions de 12 ml. Les fractions 40 contenant le diacétate de cholest-5,7-diène-3/S, 25-diol, mis en BAD ORIGINAL 69 22028 5 2012069 évidence par le spectre U.V. des fractions avec maxima à 272, 282 et 294 mp ont été mélangées entre elles et on a évaporé à sec pour récupérer le composé diacétate. On a dissous le composé diacétate récupéré dans 3 ml d'éthyl 5 éther sec et on l'a fait réagir avec une petite quantité (10 mg) d'hydrure de lithium et d'aluminium (LiAlH^) pendant 5 minutes environ. On lave la solution réactiormelle avec plusieurs parties aliquotes d'eau pour éliminer les substances inorganiques, on sépare la couche éthérée, on sèche et on élimine 1'éther par évapo-10 ration sous vide. On a identifié les 18 mg de résidu résultant comme étant le cholest-5,7-diène-3/ï,25-diol à partir des données suivantes : P.169°-171°C (MeOH aqueux) A Max. 272, 282 et 294 (£ 2Q2 11.000) 15 rmn = ci8~H3' £ 0,65 ppm C19"H3' ^ 0,98 ppm C21 -H^, S 0,89 ppm (doublet, J =6,5 a/s) C26,27"H3' d'1'20 PPHI Cg ?-H, &5,4 ppm (multiplet) 20 Exemple 2 On a dissous 142ng d'acétate de 26- norcholest-5-ène-25-one-3/S-yle dans un mélange de 2,2 ml de benzène sec et de 2,2 ml de Skelly B sec et on l'a ajouté à 50 mg de N, N-' -dibromodiméthylhydan-toîne. On a effectué la réaction selon la méthode du procédé A 25 précèdent. On a repris le résidu obtenu par ledit procédé par 0,5 ml de xylène. On a ajouté goutte à goutte cette solution en même temps que 0,3 ml de xylène pour rinçage à 0,15 ml de triméthyl-phosphite dans 0,5 ml de xylène maintenu à environ 130°-135°C. On a laissé réagir le mélange pendant 90 minutes environ tout en le 30 maintenant dans les limites de température indiquées puis on a évaporé le solvant sous vide à une température d'environ 65°C. On a dissous le résidu résultant dans le chloroforme et on l'a adsorbé sur une colonne chromatographique contenant 20 g d'alumine neutre, qualité X. On a élué de la colonne avec du 35 chloroforme et on a recueilli des fractions sucessives de 5,5 ml. On a récupéré l'acétate de 26-norcholest-5,7-diène-25-one-3/3-yle à partir des fractions 10-14 par évaporation du solvant. On a identifié le composé diènique du produit par les spectres ultraviolet , infrarouge et rmn suivants : 69 22028 6 2012069 U.V. A(£282 11.000) Max. 272, 282, 294 IR fi Max. 1730, 1712 dm"''' - correspondant à l'absorption du carbonyle de l'acétate et aux groupes méthylcétone respectivement 5 rmn C^-Hg-6 0,63 ppm C19~H3~ ^°'95 PP® C27-H3-^2,12 ppm OAc - cf 2,02 ppm La chromatographie gaz-liquide a indiqué la présence du produit 10 de départ (acétate de 26-norcholest-5-ène-25-one-3p-yle) comme seule impureté. On a dissous 245 mg. du résidu ci-dessus contenant environ 180 mg du composé 5,7-diène dans 3,5 ml de benzène sec et on a ajouté au réactif de Grignard préparé par addition de 0,24 mg 15 d'iodure de méthyle dans 2,5 ml d'éther sec à 72 mg de tournure de magnésium. On a mis le mélange au reflux pendant 2 heures 1/2, on l'a laissé reposer pendant 17 heures et on l'a alors ajouté à une solution froide de chlorure d'anmonium, de façon qu'une couche aqueuse et une couche de solvant (éther) se séparenfc.On a éliminé 20 la couche éthérée, on l'a séchée et on a évaporé 1'éther. Le résidu trituré avec du Skelly B a donné par filtration 212 mg d'une poudre amorphe que la spectrophotométrie ultraviolette et la chromatographie gaz-liquide ont montré consister en 140 mg de cholest-5,7-diène-3p,25-diol, le reste étant le 25-hydroxy-25 cholestérol. Exemple 3 On a dissous dans 400 ml d'éther 106 mg du mélange préparé selon l'Exemple 2/contenant 70 mg du composé 5,7-dièna et on 1'a exposé pendant 3,5 minutes au rayonnement d'une lampe Hanovia 30 à vapeur de mercure en quartz haute pression (Modèle 654A) .L'irradiation a été effectuée dans un manchon autour d'un réservoir à immersion en quartz à double paroi, refroidi par l'eau, et pendant l'irradiation la solution d'éther était rigoureusement agitée et traversée en continu par de 1'azote. 35 Les produits irradiés mis dans une solution 1:1 d'éther/âkelly B ont été passés sur une colonne pour chromatographie (Fisher, G.A. et Kabara, J.J.(1966) Anal.Biochem., jï, 303) remplie de 14 g d'acide silicique activé par la chaleur (acide silicique Bio-Rad, HA, -325 mesh, California Corp. for Biochemical Research, Los 40 Angeles, Californie). L'élution a été effectuée avec un gradient 69 22028 7 2012069 d*éther/Skelly B obtenu en faisant couler de 1'éther dans une chambre de mélange de 250 ml initialement remplie d'une solution 1:1 d1éther/Skelly B. On a recueilli des fractions consécutives de 2,8 ml. 5 On a déterminé par spectrophotométrie U.V. et par chromato graphie gaz-liquide que seules les fractions 33-38 contenaient le 25-hydroxyprécholécalciférol (identifé par U.V. f\ max. = 261 mji ^ 261 -9000). On a combiné ces fractions et on les a laissé reposer sous atmosphère d'azote à la température ambiante pendant 7 jours, 10 temps au bout duquel le produit se trouvait sous la forme de 25-hydroxycholécalciférol comme indiqué par les données suivantess U.V. max. 265 mp ( £l8.000) rmn C2^-H3^0,90 ppm (doublet, J = 8 c/s) C18~H3^0,54 ppm 15 C26 27-H3cfl,22 ppm C19"H2 ^4'80 ppm 5,00 ppm Cg 7-H 6,25 ppm (doublet, J = 12 c/s) 20 PM 400,3340 (calc. 400r3341) Les fractions recueillies après la fraction n° 38 contenaient le 25-hydroxytachystérol3, le 25-hydroxycholestérol et une petite quantité de 5,7-diène non transformée. Les fractions contenant le 25-hydroxytachystérolg et le 5,7-diène inchangé ont été combinées 25 à des fractions analogues provenant de l'irradiation d'un second lot de substances comme décrit précédemment, et ont été de nouveau irradiées, également comme décrit, pendant 3,5 minutes de plus. La chromatographie des produits sur une colonne d'acide silicique activé a donné une quantité supplémentaire (8 mg) de 25-hydroxy-30 cholécalciférol. L'irradiation de 15 mg du 5,7-diène préparé dans l'Exemple 1 ci-dessus pendant 2 minutes 1/2 selon le procédé exposé ci*-dessus a donné 2,4 mg de 25-hydroxyprécholécalciférol qui a été transformé en 25-hydroxycholécalciférol comme décrit précédemment ici. 35 La conversion du 5,7-diène en 25-hydroxycholécalciférol et 25'-hydroxycholécalciférol est illustrée par l'équation suivante : 69 22028 8 2012069 10 HO /X -fOH 15 20 HO /\ Exemple 4 Quatre porcs (95-110 kilos) ont été maintenus à un régime normal complété quotidiennement pendant 26 jours par 250.000 Unités ^5 internationales(Ul) de vitamine (marque Delstérol, Vita Plus Corporation, Madison, Wisconsin). On a ensuite recueilli le sang de ces porcs et on l'a traité avec 1,6 litre d'oxalate de sodium 0,1 M pour récupérer 6,8 litres de plasma. On a séparé les protéines du sérum en ajoutant assez de sulfate d* ammonium au sérum ?0 pour réaliser une saturation de 65-70%, on a alors laissé se former le précipité résultant de cette addition pendant 3 jours à 4°C, on l'a recueilli par centrifugation pendant 25 minutes à 15.000 tpm et on l'a extrait par 9 litres d'un mélange méthanol-chloroforme (rapport 2 à 1) par la méthode de Bligh et Dyer, Canadian j. Biochem. 35 Physiol., 37, 911 (1959). On a amené l'extrait total obtenu par ce procédé à un volume de 50 ml avec du Skelly B /Skellysolve B, naphtes aliphatiques de première distillation (hexane normal principalement) provenant, de kérosène commercialisé par Skelly Oil Company, et ayant un domaine d'ébullition allant d'environ 60° à 68°Ç/ et on y a dosé un total de 100.000 UI d'activité de vitamine D par l'essai 40 du "test de la ligne" chez le rat (U.S. Pharmacopeia 1955). 69 22028 s 2012069 On a passé 20 ml de l'extrait au Skelly B obtenu dans la méthode précédente sur une colonne d'adaaption d!acide silicique pour chromatographie (58 x 1,5 cm et contenant 25 g d'acide silicique). On a fait l'élution de la colonne avec un gradient d'éther-5 Skelly B obtenu en faisant couler 400 ml du mélange de 85% d*éther et de Skelly B de la chambre de retenue dans une chambre de mélang© contenant initialement 250 ml de Skelly B. Après avoir recueilli 36 fractions de 11 ml, on a mis de 11éther à 100% dans la chambre de retenue et on a recueilli 30 autres fractions de 11 ml. On a 10 mélangé les fractions 51-60 et on les a passées sur une colonne de partage construite de la manière suivante : on a mélange 20 g de Celite (produit à base de silice de diatomées commercialiséepar Johns-Hanville Company) avec 15 ml d'une phase statiormaire (80% de méthanol - 20% d'eau, équilibrée avec un volume égal de Skelly 15 B); c*i a tassé environ deux tiers de cette substance dans une colonne de verre de 1 cm de diamètre et on a passé les échantillons (fractions 51-60) sur la colonne dans une petite quantité de la phase mobile (Skelly B équilibré avec un mélange métfoanol-eau) et o» a fait l'élution avec la phase mobile et on a recueilli des frac-20 tions de 5 ml. On a gardé, les fractions 17-21. On a soumis de la même manière le reste des 50 ml d'extrait au Skelly 3 à la chro- Cl ^ matographie et on/partage selon la méthode précédente et on a garde les mêmes fractions de partage. Dans tous les cas, et pour des raisons de reproductibilité, 25 les fractions à retenir et à garder sont celles qui présentent un maximum d'absorption ultraviolefcbedans le diéthyl éther à 264 min. On a utilisé un coefficient d'extinction de 18.200 pour le maxium d'adsorption ultraviolette. Les spectres de masse de haute résolution obtenus avec un 30 spectromètre de masse Modèle MS-9 de Associated Electrical Industries couplé avec un calculateur modèle Sigma-7 de Scientific Data Systems ont fourni des informations sur les différences entre la vitamine D^ et les produits isolés obtenus dans le procédé ci-dessus» Le poids moléculaire du produit isolé avait été trouvé égal 35 à 400 (formule moléculaire C27H44°2' c"est-à-dire un cholécalcifer-didL). Dans les spectres de masse du produit isolé et de la vitamine Dg, la présence d'un pic à m/e 271 (C^^yO) indiquait la place du second groupe hydroxyle du produit isolé sur la chaîne latérale puisque le fragment m/e 271 se produit par perte de la chaîne laté-40 raie par clivage de la liaison C1?_2q. De plus, un pic à m/e 59 BAD ORIGINAL 69 22028 2012069 (CgH^O) dans le spectre du produit isolé mais non dans le spectre de la vitamine pouvait se produire par clivage de la liaison C24-25 avec 9rouPe hydroxyle attaché au C2g. La localisation du groupe hydroxyle en C25 a été vérifiée à l'aide du spectre r.m.n. 5 à 100 Mc/sec. (établi dans une solution de CDCl^ avec un spectro-nhotomètre modèle IîA-100 de Varian Associated utilisant le tétra-méthylsilane comme étalon interne) gui présentait un pic de singlet marqué à él,20 ppm (comme dans le 25-hydroxycholestérolî, l'absence de doublet à S0,87 ppm due au groupes 27-méthyle secondaires 10 somme dans le cholécalciférol. D'autres caractéristiques d'identification r.m.n., comme les suivantes sont identiques pour la vitamine Dg et le produit isolé : 15 6o ,54 ppm - résonance du groupe C^g-H^ ^0,93 ppin - doublet du au groupe c22~®3 (J — 5 c/sec) £4,81, 5,03 ppm - pics dus au groupe ôâ,02 ppm (J -• 11,5 c/sec), 6,24 ppm (J - 10,5 c/sec) -doublets dus aux protons aux positions 20 6 et 7. Exemple 5 h quatre porcs de race mixte pesant de 75 à 90 kilos oh a donné des rations alimentaires de réserve auxquelles on avait ajouté suffisamment de vitamine d2 hydro-dispersible pour avoir 70.000 Uni-25 tés lnternationalss(Ul) de vitamine D2 par quantité de 450 g de nourriture. Cette ration complémentaire apportait à chaque porc 500.000 UI de vitamine D2 par jour. Après 26 jours de ce régime comportant un complément de vitamine D2 on a recueilli le sang des porcs et on l'a immédiatement mélangé avec un dixième de son 30 volume d'oxalate de sodium 0,1 M pour empêcher la coagulation. On a séparé les cellules du sang par centrifugation, on a traité le plasma obtenu (4,1 litres) avec assez de sulfate d'ammonium pour avoir une saturation de 70% et on a laissé reposer le plasma traité à 4°C pendant 7 jours pour précipiter les protéines du 35 sérum. On a recueilli le précipité par une centrifugation équivalent à centrifuger à 25.000 tpm pendant 25 minutes dans une centrifugeuse AS—16—P de Sharples Company. On a extrait le précipité avec 6,6 litres d'un mélange 2:1 de méthanol et de chloroforme et on a laissé reposer pendant 24 heures après quoi on a ajouté 40 encore 2,2 litres de chloroforme en agitant. On a éliminé les 69 22028 2012069 protéines dénaturées par filtration à travers de la laine de verre et on a réextrait avec 4,4 litres du mélange méthanol-chloroforme après quoi on a laissé les filtrats combinés se séparer en une phase aqueuse (méthanol) et une phase au chloroforme. On a soutiré la 5 phase aqueuse et on l'a réextraite avec deux litres de chloroforme et l'on a laissé de nouveau décanter. On a mélangé toutes les couches au chloroforme, on a lavé avec 10 litres d'eau, laissé reposer pendant 24 heures et on a concentré sur un évaporateur éclair tournant jusqu'à obtention de 50 ml d'un résidu noir huileux. 10 On a lavé ce résidu avec du chlorure de sodium saturé et on l'a séché sur du sulfate de magnésium anhydre. On l'a évaporé à sec sur un évaporateur éclair tournant et ensuite on l'a dissous dans ÎOO ml de Skelly B (Skellysolve B, naphtes aliphatiques de première distillation (principalement hexane normal) provenant de kérosène et 15 commercialisé par Skelly Oil Company,ayant un point d'ébullition d'environ 65-67°C). La séparation des fractions de plasma désirées par chromatographie a nécessité initialement l'établissement d'ua profil de radioactivité du plasma. On l'a réalisé de la manière suivante : 3 20 On a préparé de la vitamine D^- H radiochimiquement pure en exposant un gramme de vitamine D2 à 3,0 Ci d'acide acétique marqué au tritium pendant 2 semaines après lesquelles on 1'a chro-matographié trois fois sur une colonne d'acide silicique et une fois sur une colonne à chromatographie en phase inversée jusqu'à 3 activité spécifique constante. La vitamine D2- H avait une activité 25 spécifique de 1200 DPM/UI ou 8,6 mc/m mole. (Voir Neville, P. et DeLuca, H.F. (1966) , Biochemistrv. 5_, 2201, pour la description des colonnes et pour la méthode d'établissement de la pureté radioactive). A dix rats pesant chacun environ 400 g et nourris avec une faible ration de réserve de vitamine D (comme décrit par Steenbock 30 H. (1923), Science, 58. 449) on a administré par voie intrapérito- 3 néale 10.000 UI de vitamine D2~ H dans 0,1 ml d1éthanol. Vingt-quatre heures plus tard on a prélevé le sang par ponction cardiaque et on l'a centrifugé pour obtenir 40 ml de plasma. On a extrait le phsma par un mélange 2:1 de méthanol-chloroforme comme décrit par Blunt 35 et al dans Biochemistrv, 1_, 3317 (1968) , on a séché l'extrait au chloroforme sur du sulfate de sodium anhydre et on a évaporé à sec sur un évaporateur éclair. On a dissous le résidu résultant dans du Skelly B et on l'a combiné à l'extrait obtenu à partir du sang de porc précédent. 69 22028 12 2012069 On a divisé l'extrait combiné en cinq portions égales et on a chromatographié chaque portion sur une colonne d'acide silicique comme décrit dans l'article précédent de Blunt et al. Le profil de radioactivité de l'extrait dans cette colonne est représenté sur 5 la Figure 1 où le pic identifié en III représente la vitamine D2 inchangée. On a combiné les fractions (10 ml chacune) indiquées sous chacun des pics et on a testé leur activité biologique (anti-rachitique) par le "test, de la ligne" ou test de traitement du ra-chitime chez les rats (U.S. Pharmacopoeia 1955). Les fractions 10 du pic IV étaient 1,5 fois plus actives que celles du pic III tandis que les fractions des pics I, II, iVa et V présentaient une activité biologique faible sinon nulle. Les fractions du pic IV provenant des cinq parties aliquotes ont été recueillies, évaporées à sec dans un évaporateur éclair et 15 rechromatographiées sur une colonne d'acide silicique comme décrite dans la référence précédente de Neville et DeLuca sauf que la chambre de mélange contenait 250 rai de Skelly 3 et la chambre de retenue contenait 400 ml de diéthyl éther à 85% dans du Skelly B. Dès que la chambre de retenue se vidait on la remplissait avec 300 ml de 20 diéthyl étherà lOOft.Le profil d'élution de ces fractions combinées, sur la base de fractions de 5 ml, est représenté sur la Figure 2 où le pic IVa est toujours visible. On a combiné les fractions 63-98, évaporé sur évaporateur éclair, et chromatographié sur une colonne de partage de célite 25 (produit à base de silice à diatomées commercialisé par Johns-Manville Company) de la manière suivante : On a fait un mélange équilibré de 200 ml de Skelly B avec un volume égal de 80% de méthanol et 20% d'eau. On a mélangé 20 g de célite avec 15 ml de la phase 30 méthanolique et l'on a entassé à sec dans une colonne de 60 x 1 cm par portion de 2 cm. On a utilisé comme phase mobile la première phase. On a fait passer les fractions combinées sur la colonne dans 1-3 ml de la phase mobile et on a développé avec la phase mobile. 35 On a recueilli des fractions de 5 ml. On a recombiné les fractions 11-17, on les a évaporées à sec et rechromatographiées sur une autre colonne de partage identique. Le profil de radioactivité de cette colonne est représenté sur la Figure 3. 40 Toutes les déterminations de radioactivité ont été effectuées 69 22028 2012069 à l'aide d*un compteur à scintillation liquide Modèle 3003 Packard Tri-Carb équipé d'un système d'étalonnage externe automatique. Les échantillons à soumettre au comptage ont été évaporés à sec dans un courant d'air, dissout dans une solution de comptage au toluène 5 (2 g de 2,5-diphényloxazole et 100 mg de 1,4-bis-^i-(4-méthyl-5-phényloxazolyl)benzène/ par litre de toluène} et soumis au comptage. Identification Pour faire l'identification il a été nécessaire de préparer le dérivé tétraméthylsilyl éther de la substance du pic IV. On a 10 séché sous un courant d'azote sec 30 yag de la substance isolée. On a ajouté quelques gouttes d'un réactif (14 ml de pjridine sèche, 4 ml d'hexaméthyl disilazane et 2 ml de chlorure de triméthylsilyle), on y a fait passer de l'azote et on a laissé le mélange reposer à l'obscurité à la température ambiante pendant 3 heures. On a ajouté 15 3 ml de Skelly B puis 2 ml de HjSO^ à 10%. On a vigoureusement remué le mélange et on a laissé la séparation se faire. On a séché la phase au Skelly B sur une petite quantité de Na2S0^ anhydre. On a ensuite chromatographié sur colonne d'acide silicique comme décrit par Lund et al dams Arch. Biochem. Biophvsics, 120, 513 (1967). 20 On a localisé le dérivé disilyl éther (15 pgî dans les tubes 19-27 et la chromatographie gaz-liquide a monté qu'il était pratiquement pur. On l'a alors utilisé pour la détermination des spectres de masse. Les spectres ultraviolets et les données de la chromatographie 25 gaz-liquide suggèrent nettement que la structure triène de la vitamine D2 existe dans la substance du pic IV. Le spectre de masse de la substance du pic IV montre des pics intenses à m/e 136 (CgH^O) et 118 (CgH^g) dérivant du noyau A de la molécule comprenant C-6 et 7 et qui sont présents aussi dans le spectre de la 30 vitamine D2« Le spectre de masse de la substance du pic IV indiquait un ion moléculaire de m/e 412, l'augmentation de 16 unités de masse par rapport au poids moléculaire de la vitamine d2 suggérant l'incorporation d'un atome d'oxygène supplémentaire. La confirmation 35 en a été donnée par le spectre de masse à résolution élevée, puisque la masse exacte de l'ion moléculaire — 412;3341 -=>- correspondait à la composition de c2qH44°2 ^ca;1Lc* 412,3341) . La localisation de l'oxygène supplémentaire dans la chaîne latérale ressort de la comparaison des spectres de la vitamine D2 et de la substance du 40 pic IV. Tous deux présentent des pics à m/e 271 (C H..0 — 69 22028 M 2012069 271,2065, par spectrométrie de masse à résolution élevée) résultant de la perte de la chaîne latérale entière par clivage de la liaison C!7~C2o* De plus,1e spectre à résolution élevée de la substance du pic IV contient des pics secondaires qui sont probablement dus à 5 la chaîne latérale elle-même : m/e 141,1255 (CgH1?0) et 123,1181 ÎCgHig)• Un fragment de masse 59 (C^H^O, déterminé par spectrométrie de masse de résolution élevée) et l'élimination de 58 unités de masse à partir de 1'ion moléculaire pour donner un pic à m/e 354 10 (354,2900 — CjçjHggO), tous deux présents dans le spectre de masse de la substance du pic IV mais absenta dans celui de la vitamine D2/ apportait une preuve de la présence d'une fonction hydroxyle en €-25. Le premier pic se produisait par simple clivage de la liaison €24/25 pour donner l'ion (CH^) 2C= On a obtenu la preuve de la position du groupement hydroxyle à partir du spectre de masse du dérivé silyl éther de la substance du pic IV qui présentait un ion moléculaire pour m/e 556, comme 20 c'est le cas pour un di-triméthylsilyl éther, et ihe pic intense attendu en m/e 131 (pic de base), qu'on a montré par spectrométrie de masse à résolution élevée correspondre à C_H._SiO, x Q (CH )2C»=0-Si(CRj )j » Ce pic, qui se produit aussi dans les spectres des3dérivés triméthylsilyl éther du 25-hydroxycholestérol et du 25 25-hydroxycholécalciférol mais non dans les spectres des silyl éthers des vitamines D2 ou Dj, veut donc que la position de la fonction hydroxyle supplémentaire soit en C-25. Les spectres rmn de la substance du pic IV ont été établis dans une solution de CDC13 à l'aide d'un spectromètre modèle HA-100 de 30 Varian Associates associé à un calculateur faisant la moyenne des temps à cause de la petite quantité de substance du pic IV isolée, et avec le tétraméthylsilane comme étalon interne; ces spectres ont confirmé totalement les déductions précédentes et ont apporté une preuve indépendante sur la structure. Les résultats sont prê-35 sentés sous forme de £ en parties par million relativement au tétraméthylsilane ( 69 22028 2012069 25-hydroxycholécalciférol présentent un singlet pour les groupes méthyle en C-26 et 27 fondamentalement à la même position ( ^1,20 ppm). Il faut noter que deux doublets à So.Ql (J = 7,0 cps) et Les spectres de masse de résolution élevée ont été obtenus avec un spectromètre modèle MS-9 de Associated Electrical Industries associé à un calculateur modèle Sigma-7 de Scientific Data Systems. 15 On peut obtenir plus de détails sur l'identification dans "The Isolation and Identification of 25-Hydroxy3rgocalcifërol" de T.Suda, H.F. DeLuca, H.K.Schnoes et J.W. Blunt (paru). Activité biologique Essai du "test de la ligne11 ou test de traitement du rachitisme. 20 On a mis de tout jeunes rats au régime rachitigène de Steeribock et de Black, J. Biol. Chem. 64, 263 (1925) pendant 21 jours. On a modifié le régime en ajoutant les vitamines hydrosolu-bles décrites par DeLuca et al, J.Nutr., 75, 175 (1961). Après la période d'épuisement de 21 jours on a administré une seule dose de 25 0,25yug de vitamine Dj ou standard, de substance du pic IV ou de 25-hydroxycholécalciférol des Exemples 3 et 4. Sept jours plus tard on a sacrifié les rats et l'on a effectué le test de la ligne sur les radius et les cubitus sectionnés de chacun des rats. On a déterminé l'activité biologique de la façon décrite dans 30 U.S. Pharmacopeia, 14th revision /Mack Publishing Co ., Easton, Pa. (195517 Le 25-hydroxyergocalciférol substance du pic IV a donné une valeur d'environ 60 UI par jxg; le 25-hydroxycholécalciférol des Exemples 3 et 4 a donné dans les deux cas une valeur %de 56-60 UI 35 tandis que chacune des vitamines D, et D a de nié une valeur d'en- £ 3 viron 40 UI seulement par yug. Transport du calcium par les sacs intestinaux renversés On a maintenu des tout jeunes rats mâles dans des cages en grillage suspendues et on les a soumis ad libitum à. un régime 40 carencé en vitamine D purifiée comme décrit par DeLuca et al, 69 22028 2012069 J.Nutr., 75 dans la référence ci-dessus. Ce régime ne produit pas de rachitisme chez les rats mais produit une sévère carence en vitamine D au bout de 3-4 semaines caractérisée par un taux faible de calcium dans le sérum et une croissance réduite, Steenbock, H.et 5 Herting D.C., J. Nutr.. 57, 449 (1955). Après avoir soumis les rats au régime ci-dessus on leur a administré par voie intrajugulaire une dose, dans 0,02 ml d*éthanol, de 0,25 yug de vitamine D2 ou de vitamine D3 ou de 25-hydroxycholécalciférol de lrExemple 3 ou 4 ou de la substance du pic IV de 10 l'Exemple 5. Les rats témoins ont reçu une injection intraveineuse de 0,02 ml d'alcool éthylique à 95%. Au bout des temps indiqués dans le tableau suivant on a sacrifie les rats et on a fait l'expérience de transport du calcium par les sacs intestinaux retournés selon les procédés de Zull, J.E. et al. Science, 149, 182 (1965). 15 On a obtenu les résultats indiqués dans le Tableau ci-après en exprimant le transport du calcium sous la forme du rapport de *^Ca (côté séreuse)/^^Ca (côté muqueus^. / o «O TABLEAU I Taux de Transport Heures après | n Administration | Vltamine P2 Vitamine D. Exemple 3 Exemple 4 Exemple 5 K> KO O ho 00 Témoin 1,50 î 0,14 (25)! 3 1,40 - 0,39(5) 1,74 - 0,12(4) 1,94 - 0,41(5) 4 1,54 i 0,36(5) 1,01 - 0,12(4) 2,31 ± 0,50(5) 1,66 ± 0,13(4) 2,09 - 0,65(5) 6 1,88 î 0,30(4) 1,32 ± 0,10(4) 2,33 i 0,31(4) 2,6 ~ 0,4(4) 2,74 i 0,49(5) 8 2,06 - 0,12(5) 3,51 î 0,23(5) 10 2,0 - 0,3(3) 2,3 i 0,6(4) 1 12 r ■ 3,35 - 0,70(5) ■ - 3,58 - 0„ 59(5) £ Le nombre entre parenthèses représente le nombre de rats du groupe K> O tO O O sO 69 22028 la 2012069 Il est évident d'après les données précédentes que la présente invention initie le démarrage du transport du calcium dans 1*intestin beaucoup plus rapidement que le fait la vitamine D2 ou D^. Réponse du calcium du sérum (mobilisation par les os) 5 De tout jeunes rats mâles ont reçu le régime carencé en vitamine D décrit dans la référence précédente de DeLuca et al, J. Nutr., 75 pendant 3-4 semaines sauf que l'on a éliminé le calcium du régime. Ensuite on a injecté aux rats par voie intrajugulaire une dose de 2,5^g de vitamine D2 ou de 25-hydroxyergocalciférol de l'Exemple 4 10 dans 0,02 cc d'éthanol. Les rats témoins n'ont reçu que de l'éthanol. On a recueilli le sérum des animaux à des temps indiqués dans le Tableau ci-dessous et on en a dosé le calcium par la méthode de Webster, Am. J. Clin. Pathol., 131. 330 (1960). Cn a effectué tous les dosages en double et obtenu les résultats donnés dans le Tableau. 15 TABLEAU II Heures après Ca du sérum (mg %) Administrât ion D„ 25-OH-D, '2 Témoin . 3,7'£ 0,2(6)* . 4 3,7-0,5(4) 4,3-0,3(4) 20 8 3,7 - 0,3(4) 4,6^0,3(5) 12 3,6 - 0,3(4) 4,8 i 0,3(5) 16 4,2 -0,1(3) 5,1 t 0,2(4) 24 5,7 - 0,3(6) 6,0 - 0,4(6) * Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre 25 de rats du groupé. Il est évident d'après ce qui précède que le 25-hydroxyergocalciférol induit la mobilisâtionpr l'os (augmentation du calcium du sérum) beaucoup plus vite que la vitamine D2. Réponae du calcium du sérum (mobilisation par l*os) 30 De tout jeunes rats mâles ont reçu le régime carencé en vitamine D décrit dans la référence antérieure de DeLuca et al, J. Nutr., 75, pendant 11-15 jours sauf que l'on a éliminé le calcium du régime. Ensuite on a administré aux rats par voie intrajugulaire une dose de 2,5/fg de 25-HCC synthétique ou de vitamine dans 0,02 cc 35 d'éthanol. On a recueilli le sérum des animaux à des temps indiqués dans le tableau ci-après et on en a titré le calcium par la méthode de Webster, Am. J. Clin, pathol., 131. 330 (1960). On a effectué tous les dosages en double et obtenu les résultats donnés dans le tableau ci-après. 69 22028 1-9 2012069 TABLEAU III Ca du sérum mcr/100 ml Heures après Vitamine D3 25-HCC 25-HCC Administration Exemple 4 Exemple 3 5 O Témoin 3,75 ±0,23 8 3,9 ± 0,1(3)** 5,7 ±0,2(4) 6,4 ±0,5(7) 12 5,0 ± 0,4(3) 7,1 ± 0,4(4) 7,36± 0,21(6) Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre de rats du groupe 10 II est évident d*après les données ci-dessus que le 25-hydroxycholécalciférol (25-HCC) de la présente invention est capable de stimuler la résorption par l'os beaucoup plus vite que la vitamine D^, comme l'indique l'augmentation de la concentration du calcium du sérum. 15 Complément à l'alimentation de la volaille On a fait une étude sur l'alimentation des poulets selon la méthode esquissée dans "Vitamin D in Poultry Feed Supplément - First Action, Methods of Analysis", A.O.A.C. 784 (1965), Tenth Edition. On a dispersé le produit isolé dans l'Exemple 4 dans de l'huile 20 de mais pour l'utiliser dans l'étude (125juq de produit, isolé dans 25 g.d'huile). On a rassemblé par groupes les os de chacun des poulets et on a déterminé le pourcentage de cendres restant dans les os humides et dégraissés pour seule réponse à chaque dosage. On a estimé le pouvoirde la préparation dressai (le produit isolé) à 25 partir de la courèe6/ avec les produits étalons.Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau ci-après 69 22028 20 2012069 TABLEAU IV par Poids du corps Unités P.I. par gramme 5 Groupe de référence : O Groupes de référence ÎO ration de 100 g Huile inerte O pendant l'étude initial/final seulement 35 116 % de cendres d'os (tibia) 28/ 3 Vitamine D ajoutée comme étalon de référence U .S.P. 400 0/113 35 142 32,4 400 0,158 35 145 33,4 400 0,225 35 151 35,3 400 0,319 35 166 38,7 400 0, 450 35 152 41,8 Groupes à l'étude : Produit isolé de l'Exemple 4 dans l'huile de maïs 15 0,158 35 140 32,2 0,225 35 151 36,3 0,319 35 162 41,2 *Unités-poulet internationales équivalentes à 0,025^q de cholécalciférol 20 Sur la base des données précédentes on a estimé que chaque gratuite du produit isolé dilué dans l'huile contenait au moins 206 UPI d'activité de vitamine D_. 69 22028 21 2012069 REVENDICATIONS 1. Un composé du calciférol choisi entre le 2 5-hydroxyergocalci-= férol et le 25-hydroxychlolécalciférol. 2. Le 25-hydroxycholécalciférol. 3. Un procédé pour préparer le 25-hydroxycholécalciférol, qui 5 comprend l'irradiation d'une solution de cholest - 5,7 - diène - 3/5, 25 - diol par les rayons ultraviolets et la récupération par chromatographie du 25-hydroxycholécalciférol à partir du produit irradié. 4. Un procédé pour préparer le cholest - 5,7 - diène - 3/5 , 10 25-diol, qui consiste à : dissoudre un composé ayant la formule où R est un groupe alcoyle ayant de 1 à 16 atomes de carbone ou un groupe phényle et R' est un groupe alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupe phényle, dans un solvant approprié, et faire réagir le composé avec la N, N' - dibromodiméthylhydantoïne jusqu'à 25 dissolution complète de la N, N' - dibromodimêthylhydantoïne ; refroidir la solution résultante pour en précipiter la diméthylhy-dantoîne et éliminer le précipité par filtration ; évaporer à sec le filtrat résultant ; redissoudre le filtrat séché dans un solvant approprié, le faire réagir avec une solution de triméthylphosphite 30 et en évaporer ensuite le solvant ; dissoudre le résidu résultant dans un solvant approprié, adsorber la solution résultante sur une colonne chromatographique d'alumine et récupérer le diester de cholest - 5,7 diène - 3/5 , 25 - diol par élut ion de la colonne % dissoudre ledit composé diester récupéré dans un solvant approprié, 35 le faire réagir avec de l'hydrure d'aluminium et de lithium (LiAl et extraire le cholest -5,7 diène - 3/5 - 25 - diol des produits ds la réaction. le diacétate de 3,25 - cholestêryie ou l'acétate de 25-benzoyloxy-40 cholestêryie. 15 20 5. Le procédé de la revendication 4 dans lequel le composé est 69 22028 22 2012069 6. Un pr. cédé pour préparer le cholest - 5,7 - diène - 3/3, 25 -diol qui consiste à : faire réagir un composé ayant la formule où R est un groupe phényle ou un groupe alcoyle contenant de 1 à 16 atomes de carbone, dans un solvant approprié, avec la N, N* - dibrc-modiméthylhydantoïne, et laisser la réaction se faire jusqu'à dissolution complète de la N, N* - dibroraodiméthylhydantoïne 7 refroidir 15 la solution résultante pour en précipiter la diméthylhydantoïne et éliminer la diméthylhydantoïne précipitée par filtration ; évaporer à sec le filtrat résultant ? redissoudre le filtrat sec dans un solvant approprié, le faire réagir avec une solution de triméthyl-phcsphite et en évaporer ensuite le solvant y dissoudre le résidu 20 résultant dans un solvant approprié, adsorber la solution résultante sur une colonne chromatographique d'alumine et récupérer l'ester de 26-norcholest -5,7 diène - 25 - one - 3/3 yle par élution de la colonne ; dissoudre ledit composant diène récupéré dans un solvant approprié et le faire réagir avec un réactif de Grignard à groupe 25 méthyle ; ajouter le mélange résultant à une solution aqueuse, froide de chlorure d'ammonium, de façon qu'une couche aqueuse et une couche de solvant se séparent ; séparer la couche de solvant, en éliminer le solvant et récupérer le cholest -5,7 diène - 3/3, 25-diol du résidu. 30 7. Le procédé de la revendication éit dans lequel le composé est l'acétate de 26- norcholest - 5 - ène - 25 - one 3/3 - yle.