Brevet FR2002028A1 — publié le 19691003

Û3561 i 2002028 La présente iEventioÉ '©st relative à de nouveaux dérivés de la thionine ayant an effet inhibiteur vis-à-vis des tumeurs? aissi qu'à des compositions ph.arffiac@atiqu.es contenant d@ tels dérivés et à leur préparation 5 On connaît déjà guelgues composés cytostatiques et oellulisidesj. qui sont applicables dans le traitement des affections tamoralsso Toutefois^ ces composés connus agissent non seulement sur la fonction "biologique des cellules des tumeurs^ mais aussi sur celle des autres cellules des voies métaboliques® XQ Cette toxicité des composés connus a limité énormément leur application* Un groupa spécial de composés doués d°uae activité acti-mitotique a été mis au pelât ®a asseoient des composés cytostatiques et des antimétabolites à de l8héparine rendu® iaae-3L5 tive» qui n* inhibe pas la thrombefeisèse ^vois "brevet hongrois - c° 149.746 et l'ouvrage KS©oplasma% 219 '157» 545 (196417e Os a" utilisé d® tels composée en se "basant sur 1® fait9 confirmé par des expériences9 que la quantité dfihéparin© accumulé® dans les voies métaboliques diminue lors d°un@ affection tumorales 20 tandis que les cellules dcEhrlieh contenant de l8héparine s8ac-cumule Est aux alentours des tumeurs et des tissus en cours d® prolifération» De ce faits les cellules des tumeurs exigent é-galement de 1°héparine pour leur prolifératione Il a été également constaté que des tumeurs expérimen-25 talesp qui ont été transplantéess se développent très rapidement après administration de constituants de 1 "héparine (acide gluouronique» glucamine) £voir ^Brito Jo Cancer13 14S 562 (l96Q]7 alors que leur développement peut être sélectivement retardé à un degré suffisant par la fixation chimique de 1"héparine in 30 vitre et in vivo avec du "bleu de toluidine ou du sulfate de protamine £ voir KBrito J© Cancer53 14c 367 (1960)_7o la présente invention est basée sur l'hypothèse que des substances fixant l'héparine s'accumulent au aim© endroit que lchéparinej c'est-à-dire dans les tumeurs ou dans les tis-55 sus environnants® De ce faitg si une substance fixant lch'épari-ne (c6est-à-dire un composé contenant un atome d'azote quaternaire dans une structure quinoïdej, comme par exemple la thionine, le bleu de méthylèneg le bleu de toluidine ou les alfcylène protéines) est complétée par une substance cytostatique, cette 40 substance sera présente en bien plus grandes quantités dans les 69 03561 2002028 tumeurs et aux alentours d©s tumeurs qae dans une autre partie des voies métaboliqueso Sa fait qae v mSme la fixation de ^héparine inhibe la mitose des cellules dea tumeursp des composés cytostatiques efficaces ayant deux points d'attaque p@uv@Bt tfre probablement préparés en introduisant an constituant cytestati-que dans des substances fixant l'héparinee Ses composés anti-mitotiquee conformes à l'investi®® sont caractérisés par la formule g 10 15 25 35 X-OH, '2 2 X=CH2~CIi2 ^ -0h2-x ch2-ch2-x CD 20 dans laquelle X représent® un atome d°halogène ou us groupe hy-droxys Y représente iw groupe hydroxy ou bien un reste d°UB aoi-de organique ou minéral (par exemple un chlorure^ an bromarej, ma sulfate acide2 un perchloratSj, un acétate9 un fumarate d°aeide9 un maléinate) et les symboles R et R"®" représentent ehacus an atome d'hydrogènes un atome d'halogène ou un radical alcoxj inférieurs les nouveaux composés de formule I peuvent être prépa-rés8 conformément à la présente invention^ en oxydant un dérivé de phénylène-diamine de formule g x-ch2-ca S 30 X-GH2-GH2 m2 (il) (dans laquelle X a la même signification que ci-dessus)„ ou un mélange comprenant des composés de formule II et une dihydroxy-éthyl~ ou E-haloéthylanilinej, en présence d'un composé capable de céder du soufre dans un milieu acideo l'oxydation peut Itre mise en oeuvre avec du chlorure ferrique en présence d'hydrogène sulfuré (voir brevet de la République Séfiéself d'Allemagne n® 1886 et 24=125) Un mélange comprenant un composé de formule-II et un dérivé d8anilin@ peut être oxydé de préférence avec des bichromates en présence de 69 03561 3 2002028 thiosulfate d'aluminium ou d'acide thiosulfurique naissant, libéré par le thiosulfate de sodium dans les conditions de la réaction. La réaction peut être avantageusement mise en oeuvre également en présence de chlorure de zinc0 5 Le groupe sulfo est éliminé sous forme d'acide sulfu- rique ou d'acide sulfureux, qu'on peut transformer en dithiona-te par traitement avec du bioxyde de manganèse ou du sulfate cuivrique /""Annalen 230" , p« 73 (1885), 251, p. 1 (1889), Fierz-David : Farbenchemie, 2ème édition, p. 186 (I922)_7e Dans un procédé préféré conforme à l'invention, on oxyde un composé de phénothiazine, répondant à la formule ci-dessous : H ^ t (m) 20 Ci^ns laquelle R et R"*" ont les significations données ci-dessus), ën présence d'une aminé secondaire de formule : x-ch2-ch2-n-ch2-ch2-x (iv) b 25 (dans laquelle X a la signification donnée plus haut et B représente un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène» Le processas d'oxydation est mis en oeuvre d'une façon classique. Dans un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, on fait réagir un com-50 posé dis phénothiazine de formule III avec un halogène, ce qui donne le dérivé dihalogéné correspondant £~Ber0 £8, p. 318 (1935) p. 53 (1916)_7 qu'on oxyde ultérieurement, de préférence saffi l'isoler, avec une quantité supplémentaire d'un halogène en présence d'une aminé secondaire de formule IV. La réaction est de 55 préférence exécutée au sein de solvants organiques inertes, comme par exemple le dioxane, ou d'un mélange de dioxanâ et de méthanol. Conformément à un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, on fait réagir les 40 composés de formule III avec des dérivés halogénés de formule IV 69 03561 4 2002028 à environ 0°0. Dans certains cas, les composés de formule I, dans laquelle Y représente du chlore, sont formés directement. On peut encore préparer les composés de formule I en traitant un composé de formule ci-dessous : 5 h 10 x-ch2-ch2 x-ch2-ch2 / ch2-ch2-X ch2-ch2-x (V) (dans laquelle X, R et R1 ont les mômes significations que ci- dessus) avec un agent oxydant, dans des conditions acides, l'a- un groupe hydroxy peuvent être convertis en dérivés halogénés correspondants, dans lesquels X représenta un atome d'halogène, par réaction avec des agents d'halogénation. Si l'agent d'halo-20 génation est le chlorure de thionyle, les composés peuvent subir une réduction au cours de ce procédé, mais les composés formés, répondant à la formule Y, peuvent être facilement réoxydés pour donner les composés désirés de formule I. 25 vertis en n'importe quel autre composé de formule I par des techniques classiques. Ainsi, par exemple, le symbole Y (s?il représente un reste d'acide) peut être remplacé par un autre reste d'à-* cide, en faisant réagir le composé de formule I avec un acide plus fort que celui qui correspond au radical Y (par exemple le 30 groupe chlorure peut être remplacé par un radical perchlorate). Dans une variante, le dérivé de thionine de formule I peut ttre converti en bases libres correspondantes par réaction avec des hydroxydes ou des carbonates de métaux alcalins, suivie d'une réaction des substances ainsi obtenues avec l'acide organique ou 35 minéral désiré. En outre, on peut faire réagir un dérivé de thionine de formule I avec le sel de métal alcalin, de métal al-calino-terreux, de métal terreux ou d'ammonium d'un acide quelconque, plus faible que l'acide représenté par le symbole y,pour obtenir un autre dérivé de thionine désiré, répondant à la for-40 mule I. gent oxydant est de préférence un halogène, du peroxyde d'hy-15 drogène, de l'acide chromique ou du bioxyde de plomb. les composés de formule I dans laquelle X représente les composés de formule I peuvent en outre être con- 69 03561 5 2002028 Il est intéressant de noter que les substances de formule I, dans laquelle X représente un groupe hydroxy, sont (comme prévu) parfaitement solubles dans l'eau ; il est donc assez compliqué de préparer les composés purs. L'absorption sa— 5 tisfaisante sur du charbon activé est démontrée par l'aptitude à la décoloration de la solution bleu foncé quand on la traite avec environ deux fois son poids de charbon activé. On peut é-luer les sels et les solvants de l'adsorbat granulaire ainsi obtenu, qui est facile à filtrer, par lavage à l'eau. Les déri-10 vés de thionine de formule I, dans laquelle X représente un atome de chlore ou de brome, sont moins solubles. Leur solubilité est d'environ 0,4 à 1 g/100 ml dans l'eau, d'environ 0,3 à * 1,5 g/100 ml dans l'éthanol et d'environ 15 à 30 g/100 ml dans le diméthylsulfoxyde ou le diméthylformamide, selon l'anion re-15 présenté par Y. Les composés de formule I peuvent être transformés en compositions pharmaceutiques par addition des excipients et substances auxiliaires classiques. On a étudié l'accouplement spécifique des nouveaux com-20 posés à l'héparine ou des cellules d'Ehrlich contenant de l'héparine, respectivement, en utilisant des préparations de membranes obtenues à partir de tissus conjonctifs sous-cutanés prélevés chez des rats, après coloration préalable avec les nouveaux composés. Les grains des cellules. d'Ehrlich sont teints d'une ma-25 nière orthochromatique totalement sélective, alors que d'autres cellules ou éléments oellulaires ne montrent aucune affinité pour le colorant. L'activité anti-mitotique de certains des nouveaux composés a été comparée en étudiant une tumeur ascitique d'Ehrlich 30 Des souris albinos mâles, réunies par groupes comprenant chacun sept animaux, ont été infectées par voie intrapéritonéale avec une dose de 2,5 x 10^ cellules. Les composés à étudier ont été introduits à des doses journalières de 100 mg/kg, le traitement débutant 24 heures après l'infection. Les composés, à étudier ont 35 été dissous dans le diméthylformamide, et la solution a été diluée avec de l'eau avant l'administration aux animaux. Le trai-> tement a été poursuivi pendant 14 jours» Le 15ème jour, on a pesé la tumeur ascitique, on a compté les cellules et on a pesé la rate des animaux. Les résultats sont donnés dans le tableau sui-40 vant : 69 03561 e 2002028 Composé de formule i Nombre moyen de cellules Poids de la rate ïaux d'inhibition $ (Groupe témoin) NoTo 2192 x 106 87 mg mm r » r^h ; X=C1 ; Y=C1 629 II 105 mg 68,5 5 r = rx=h ; X=C1 ,• Y=C104 651 II 96 mg 67,3 r=r1=h ; X*C1 ; Y=HS04 727 II 160 mg 66,6 r=r1«H ; X=C1 ; Y = acide tartrate 509 II 125 mg 76,7 r=r1=H ; X=C1 ; Y=Br 511 !t 103 mg 76,7 10 R=»H ; R-'-Cl ; X=C1 Y=Br 581 n 118 mg 73,4 R=H ; R^l ; X=01 Y=C1 608 H 92 mg 72,4 R=C1 ; R^H ; X=C1 Y=Br 747 ii 111 mg 65,8 R=C1 ; RX=H ; X=C1 Y=C1 409 n 99 mg 81,4 R=CH^O; R-W; X=C1 Y=Br 752 n 148 mg 65,8 15 RsbCH^O; R^H; X=C1 Y=C1 chaque animal meurt en 72 heures U.To = non traité Chacun des composés essayés inhibe le développement de tumeurs dans une grande mesure, ce qui est mis en évidence 20 par l'augmentation du poids de la rate, par comparaison aveo celui qui est observé chez les animaux témoins. Oes composés n'ont pas d'effets secondaires toxiques, à l'exception du dernier composé, qui s'est avéré toxique. En ce qui concerne les valeurs de toxicité et d'au-25 très caractéristiques, le dérivé de thionine de formule I, dans laquelle les symboles R et R représentent de l'hydrogène et les symboles X et Y représentent du chlore, semble surtout convenir pour des expériences cliniques. Ce composé a été étudié avec des animaux atteints de 30 tumeurs pouvant être transplantées. Les résultats sont donnés dans les tableaux suivants® On notera que le nouveau composé précité montre un effet d'inhibition considérable eontre la tumeur C^H de la sou-ris. Une tumeur mammaire C^H spontanée a été injectée à une 35 souris femelle C^H, et des doses journalières du composé de 150 mg/kg ont été injectées par voie intramusculaire sous la forme d'une solution dans le diméthylsulfoxyde, pendant 26 jours en commençant 24 heures après l'infection, 15 jours après le 69 03561 7 2002028 traitement, les tumeurs des animaux témoins pesaient en moyenne 4,2 g, tandis que celles des animaux traités pesaient en moyenne 0,82 g. Le taux d'inhibition est donc de 80,5 i°° Les résultats des essais montrent que la plupart des 5 nouveaux composés de formule I possèdent une activité à spectre large, spécifique et très intense, d1inhibition des tumeurs, pratiquement sans effets secondaires toxiques» La caractéristique prédominante des nouveaux composés est leur activité de fixation de l'héparine, et la présence de groupes cytostatiques 10 augmente leur efficacité* Les composés peuvent tout aussi bien être administrés oralement sans perdre leur efficacité» v Nbre Nature d* de animaux la témoins/ tumeur Nbre d' animaux traités 5/5 5/10 9/7 9/5 9/5 9/9 9/6 9/8 8/8 * Examen de tumeurs asoitiques chez les souris O sO Ehrlich tt n ii o J oBoK, ii Durée du traitement et méthode de traitement i*ia « 9 jours ; iom<> 7 " 10 » 3,6,9 j« 1 jour 10 « 3,6,9 jours " 1 jour NK/ly 14 " = intramusculaire Dose mg/ kg Nombre de cellules : Animaux témoins/animaux traités Taux . inhibition t ■ Modification du 0 sans tumeur poids de la rate poids du corps . 1° u> Ln O 60 1090/400 x 106 63,0 0/5 — - 60 504/144 x 106 71,5 4/10 +44 +20 80 550/0 x 106 100,0 7/7 +59 + 0 240 550/0 x 106 100,0 5/5 t 0 + 0 240 550/18 x 106 67,8 2/5 + 3,5 + 0 80 349/123 x 106 77,5 2/6 + 29 + 0 240 349/80 x 106 77,5 2/6 + .27 + 0 00 240 349/237 x 106 32,0 0/8 + 4,2 + «M 0 60 820/308 x 106 62,5 2/8 -43 11 Il n'y a pas d'animaux exempts de tumeurs dans le groupe témoin,, 49 $ des animaux traités sont exempts de tumeurs, même parmi ceux qui n'ont reçu qu'une injection. La dose administrée est pratiquement non toxique0 K> O O K> O K> OO Nbre d* animaux témoins/ Nbre d1 animaux traités 6/10 8/9 8/14 " 10/16 Guérin Examen des tumeurs solides ehez les rats Nature de la tumeur Yoshida Durée du traitement ; mode de traitement Dose mg/ kg 60 Benevo-lenskaja 60 7 jours à partir du 4ème jour suivant l'infection; i.m. * 10 jours à partir du 7e jour suivant l'infection } i.m0 10 jours à partir.du 7e jour suivant 100 l'infection ; i.m. 22 jours à partir du 2e jour suivant l'infection ; i.m. Poids des tumeurs Animaux témoins/animaux traités 11,5/0 Taux Sans d' tumeur inhibition Modification du poids de la rate poids du oorps * 100,0 10/10 60 23,0/12,6 45,0 0/9 + 12,5 23,0/9.4 59,0 3/14 +8,0 23,0/ 9.3 60,5 10/16 + 7,2 -10 + 3,1 + 7,0 * i.m. =* intramusculaire Il n'y a pas d'animaux dépourvus de tumeurs dans le groupe témoin. 47 $ des animaux traités sont exempts de tumeurs et, dans le cas de la tumeur de Yoshida, on a obtenu une inhibition totale. Parmi les animaux sans tumeurs, des tumeurs ont fait leur apparition seulement dans le cas d'un animal, deux mois après le traitement, les autres restant dépourvus de tumeurs0 le composé est non toxique à la dose administrée» O O o Oui Cn O vo N> O O O K> OO 69 03561 2002028 10 la présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs qui vont suivre. Exemple 1 On dissout 39,8 g (0,2 mole) de phénothiazine dans 5 200' ml de dioxane» On ajoute à la solution 147 g (1,4 mole) de diéthanolamine dissoute dans 600 ml de méthanol, puis on introduit goutte à goutte 31 ml (0,6 mole) de brome dans le. mélange ainsi obtenu, tout en agitant et en refroidissant dans la glace. On verse le mélange de réaction de couleur bleu fon-cé dans 1,7 1 d'eau, on filtre pour séparer le sous-produit solide (environ 10 à 15 g), et on le lave avec 300 ml d'eau, puis on fait évaporer le filtrat et les eaux de lavage sous pression réduite, le résidu contient une grande quantité de bromhydrate de diéthanolamine comme impureté. On dissout ce 15 résidu dans 100 ml d'une solution aqueuse à 85 $ d'acide acétique, à 50 - 60°C, on ajoute 100 ml de tétrahydrofurane à la solution, et on laisse le mélange au réfrigérateur pendant quelques jours. On le filtre ensuite pour séparer les aiguilles brillantes verdâtres qu'on lave avec un mélange 2:1 d'acide 20 acétique glacial et de tétrahydrofurane. On obtient 21 g de bromure de ÎT,23",3ï* ,îî,-tétra-(p-hyâroxyéthyl)thionine. le composé se dissout parfaitement bien dans l'eau en formant une solution blBUe» On purifie la substance brute par recristallisation dans l'acide acétique glacial ou par précipitation de la 25 substance dans une solution d'acide acétique glacial avec un volume égal de dioxanec Analyse pour C20H2gBrN^0^S Calculé : C = 49,59 $ ; H = 5,41 f° ; N = 8,68 30 Trouvé ; C = 49,44 1" ï H = 5,74 $ ; N = 8,88 $> ; S = 6,48 $ ; Br = 16,33 1°. Exemple 2 On utilise les mêmes matières de départ que dans l'exemple 1, mais on remplace le mélange de dioxane et de mé-55 thanol servant de solvant par 500 ml de dioxane. Après addition de brome, le bromure de phénothiazonium ainsi formé se sépare de la phase verdâtre foncé formée par le dioxane sous forme d'une huile épaisse bleu foncé. On laisse décanter cette dernière phase et on ajoute 1,7 litre d'eau à l'huile, après quoi 69 03561 n 2002028 on filtre pour éliminer les sous-produits insolubles dans l'eau. On ajoute du charbon activé au mélange de réaction,jusqu'à ce que la solution devienne incolore ou d!une couleur ver-dâtre pâle. On filtre l'adsorbat, on élimine le solvant et la 5 diéthanolamine par lavage avec de grandes quantités d'eau, on sèche l'adsorbat granulaire à l'air ou dans un exsiccateur, au-dessous d'une température de 35°C<> On obtient 92 g d'adsor-bat, qui comprend 62 g de charbon activé et 30 g de bromure de ,U'-tétra-(p-hydroxyéthyl)thionineo On peut donc séparer 10 la substance quantitativement de la solution aqueuse par traitement avec une quantité de charbon activé égale sensiblement au double de son poids. Exemple 3 On introduit par portions, en 15 minutes, 12 g de bro-15 mure de ,N*-tétra-(p-hydroxyéthyl)thionine(préparé comme dans l'exemple 1) dans 50 ml de bromure de thionyle, Le produit se dissout immédiatement en formant une solution bleu foncé,qui est soumise à un barbotage modéré du fait du dégagement de S02 et HBr. La température du mélange s'élève jusqu'à environ 35°C. 20 On soumet ensuite le méiange de réaction au reflux pendant 3 heures, à 50°C. Pendant ce processus, des cristaux rouges commencent à se'séparer. Le produit final est partiellement réduit en dérivé leuco par S02 qui subsiste encore dans la solution. On refroidit le mélange, on filtre pour récupérer le produit, 25 on lave ce produit avec deux portions de 20 ml chacune de benzène anhydre et on le sèche dans un exsiccateur à vide garni de potasse caustique. On transforme le produit en poudre tout en le séchant» On obtient 11,9 g de bromure de U,U,U',N'-tétra-(p-bromoéthyl) thionine (formule globale : G20H22Br^If^S). Ce 30 produit se dissout difficilement dans l'eau. Exemple 4 On utilise le même procédé que dans l'exemple 3» à cette exception qu'on remplace le bromure de thionyle par du chlorure de thionyle. Le groupe hydroxy en position 4 est rem-35 placé par du chlore mais, en raison de la présence de l'acide t chlorhydrique dégagé, les anions bromure sont également remplacés en majorité par des anions chlorure. En utilisant au départ 11,9 g de bromure de N,H",ET* ,îf'-tétra-(|3-hydroxyéthyl)thionine, on obtient 9 g d'aiguilles brillantes de couleur rouge bronze, 40 On peut préparer du chlorure de H, 1T,13"* jH1—'tétra-((3-chloréthyl) 69 03561 12 200202Ô thionine pur en dissolvant le bromure dans 35 ml d'acide acétique glacial et en introduisant de l'acide chlorhydrique gazeux -anhydre dans la solution, pendant 1 heure, tout en refroidissant dans un "bain d'eau» On obtient une solution qu'on fait évaporer 5 sous pression réduite jusqu'aux 2/3 de son volume initial, puis on précipite le produit en utilisant 120 ml de toluène, le rendement est de 8,3 g. Analyse pour G2qH22C1^Iî^S Calculé : N » 8,18 # ; S » 6,24 $ ; Cl = 34,51 # 10 Trouvé : U = 8,10 £ ; S = 6,75 % ; Cl ■ 34,96 # Exemple 5 On dissout 1,81 g (0,01 mole) de l,N»bis(p-hydro-xyéthyl)aniline dans 20 ml d'acide chlorhydrique concentré et, tout en agitant le mélange, 'on y introduit goutte à goutte une 15 solution de 0,7 g de nitrite de sodium dans 2 ml d'eau, à -5°C. On laisse le mélange reposer pendant une demi-heure, puis on y ajoute 4 g de zinc en poudre, tout en refroidissant, pour réduire le composé nitroso. On filtre le mélange et on dilue le filtrat avec de l'eau jusqu'à un volume de 100 ml. On dissout 20 1,2 g (0,005 mole) de Na2S, 9H20 dans 50 ml d'eau, on ajoute le filtrat ci-dessus à la solution et on introduit immédiatement 300 ml d'une solution aqueuse à 2 $> de chlorure ferrique. On traite la solution bleue résultante avec du charbon activé, comme décrit dans l'exemple 2. On obtieht 4,2 g d'un adsorbat con-25 tenant du chlorure de ,N»-tétra-(p-hyâroxyéthyJL)thionine, à partir de laquelle on peut isoler 1,2 g du produit désiré. Exemple 6 En appliquant le procédé décrit dans l'exemple 5, à cette exception qu'on remplace la N,N-bis-(p-hydroxyéthyl) ani-30 line par 2,18 g (0,01 mole) de N,N-bis-(p-chloroéthyl)aniline, on obtient 5 g d'un adsorbat contenant du chlorure de U,H,Uf,¥* tétra-(p-chloréthyl)thionine et à partir duquel on peut isoler 1,45 g du produit désiré. Exemple 7 On dissout 19,9 g (0,1 mole)-de phénothiazine dans 100 ml de dioxane, on ajoute 500 ml de méthanol et 99,4 g (0,7 mole) de bis-((3-ohloréthyl)aminé et, en 15 minutes environ, 10 litres de chlore gazeux, tout en agitant vigoureusement et en refroidissant dans la glace. Il se forme une solution bleu 69 03561 13 2002028 foncé. On verse immédiatement le mélange.dans 4 litres d'une solution aqueuse à 10 ^ de chlorure de sodium» Un précipité "brillant, de couleur rouge bronze, se sépare et la solution devient bleu verdâtre clair. 5 On laisse le mélange reposer pendant 1/2 heure, on dé cante la phase liquide et on triture le résidu avec deux portions de 100 ml d'eau. le produit se solidifie après quelques heures de séchage. On obtient 30 g de chlorure de NjUjEf* ,U,-té-tra-((3-ohloréthyl) thionine. On peut purifier la substance brute 10 par recristallisation, par précipitation ou par conversion, par exemple par conversion en perchlorate, et en libérant la base, lia solubilité de la substance est de 0,5 g/100 ml d'eau, de 0,35 g/100 al d'éthanol et de 25 g/100 ml de diméthylsulfoxyde ou de diméthylformamide. Son spectre d'absorption dans l'ultravio-15 let montre un maximum à 645 » qui caractérise le bleu de méthylène et les composés apparentés (600 à 660 mji). Bans le procédé ci-dessus, la bis-((3-chloréthyl)aminé peut être remplacée par une quantité équivalente de son chlorhydrate mais, dans ce cas, on ajoute à la solution 28 g (0,7 mole) 20 de soude caustique dissoute dans 40 ml d'eau, la formation de la base libre est accompagnée de la précipitation de grandes quantités de chlorure de sodium. Exemple 8 En appliquant le procédé de Bernthsen et Ulrich 25 (Fierz-David : larbenchemie, 2ème édit.ion , 1922), mais en remplaçant la diméthylaniline par une quantité équivalente de N,ïï-bis-(p-chloréthyl)aniline, on peut obtenir du chlorure de H,H, H"1, H,-tétra((3-chloréthyl)thionine avec un rendement de 25 $> • le produit brut ainsi obtenu contient une grande quantité d'im-30 puretés. On peut purifier la substance brute par formation d'un sel avec du chlorure de zinc et par élimination du composé du zinc à l'aide de carbonate de sodium, comme décrit dans l'ouvrage qu'on vient de mentionner. Exemple 9 35 les adsorbats sur charbon activé, contenant les com posés tétrahydroxylés de formule I, préparés par un procédé v quelconque, par exemple conformément aux exemples 2 et 5, peuvent Stre convertis en dérivés tétrachlorés purs en introduisant l'adsorbat dans un grand excès de chlorure de thionyle, 40 le composé tétrachloré étant élué par le chlorure de thionyle 8A0 original 69 03561 14- 2002028 pendant la réaction, la réaction peut être mise en oeuvre par .exemple de la manière suivante : On ajoute 3 g d'un adsorbat contenant 0,9 g de composé tétrahydroxylé' à 10 ml de chlorure de thionyle, tout en refroi-5 dissant, puis on chauffe le mélange graduellement jusqu'à 70°C, en 1 heure. On laisse le mélange refroidir à 35 - 40°C, on le filtre pour éliminer le charbon séparé en faisant appel à une légère aspiration et en utilisant un filtre en verre fritté G4, après quoi on lave avec 3 portions de 2 ml de chlorure de thiony Exemple 10 On répète le procédé déerit dans l'exemple 9, mais au. 20 lieu de faire évaporer la solution bleu foncé de chlorure de thionyle, on la verse sur de la glace pilée. le dérivé de thionyle est réduit par SOg (formé lors de la décomposition du chlorure de thionyle) en un dérivé de phénothiazine de couleur verte, répondant à la formule Y et qui est insoluble môme dans l'a-25 cide chlorhydrique aqueux» l'analyse élémentaire du produit correspond à la formule globale CgQlI^Cl^S. le composé de phénothia zine ainsi obtenu, qui répond à la formule V, peut être oxydé de nouveau èn un dérivé de thionine correspondant de formule I, par réaction avec une quantité équivalente de bioxyde de manga-jO nèse, de bioxyde de plomb , de bichromates ou de persulfates dans un milieu constitué par un acide minéral dilué. De plus, le composé leuco peut être oxydé avec du chlore ou du brome, par exemple en solution dans le dioxane, ou par passage de bulles d'air à travers une solution dans le dioxane en présence d'un 35 acide. Exemple 11 On peut préparer les perchlorates de formule I qui ont une pureté maximale, et c'est pourquoi les substances brutes obtenues par les procédés décrits par exemple dans les exemples 40 3, 4, 6, 7, 8, 9 et 10 peuvent être purifiées de préférence par 69 03561 15 2002028 l'intermédiaire de leurs perchlorates. On dissout 2,5 g de chlorure ou de bromure de -tétra(p-chloréthyl)thionine dans un mélange de 30 ml d'éthanol absolu et de 10 ml de dioxane, à 50 - 60°C, et on ajoute 0,45 ml 5 d'une solution aqueuse à 75 fo d'acide perchlorique au mélange, tout en agitant et en refroidissant ce dernier. Une substance cristalline se sépare immédiatement. On conserve ce mélange au réfrigérateur, puis on recueille les cristaux par filtration et on les lave avec trois portions de 2 ml d'éthanol absolu» On obtient 1,4 à 2,5 g de cristaux brillants de couleur brun ver-dâtre, le rendement étant fonction de la pureté du composé ha-logéné de départ, l'analyse élémentaire correspond à la foîaole globale G20H22015N504S. Exemple 12 ^5 On dissout 2,5 g de chlorure ou de bromure de HjNjïï', N'-tétra-(p-bromoéthyl)thionine à l'état pur dans le mélange comprenant 30 ml d'éthanol absolu et 10 ml de dioxane, à 50-60BC, puis on ajoute 0,3 ml d'acide sulfurique concentré, tout en a-' gitant et en refroidissant la solution. On verse le mélange ain-2q si obtenu, tout en agitant, dans 30 ml d'une solution aqueuse à 20 i» de sulfate de sodium, qui a été chauffée au préalable à 50 *• 60°C, et le sulfate de sodium cristallin (contenant de l'eau de cristallisation) commence à se séparer après décantation de la phase liquide chaude. On traite le résidu à deux re-25 prises ayeo de petites quantités d'eau, puis on sèche les matières solides. On obtient 2 g de sulfate acide de IÏjSjU1 tétra-(p-bromoéthyl)thionine sous forme d'un produit résineux de couleur bleu foncé, l'analyse élémentaire correspond aux valeurs calculées d'après la formule globale C^Hg^Cl^ïî^O^Sg. 30 Exemple 13 Tout en chauffant, on dissout 0,01 mole de chlorure de N,N,B',,N,-tétra-(p-chloroéthyl)thionine analytiquement pur (ou bien du bromure, du sulfate acide ou du perchlorate correspondants) dans 100 ml d'éthanol. On refroidit la solution et on • 55 y ajoute 0,01 mole de potasse caustique ou de soude caustique en dissolution dans 2 ml d'eau, la solution de couleur bleu fon-V oé devient brun grisâtre pendant l'addition. l'hydroxyde pratiquement insoluble dans l'eau, de formule I, est isolé de préférence de la manière suivante. On fait évaporer la solution 40 alcoolique à siccité sous vide, on traite le résidu avec 10 ml 69 03561 16 2002028 d'eau, on filtre pour séparer les matières solides et on élimine les sels par lavage aveo une petite quantité d'eau. On obtient l'hydroxyde de H,N,îr' ,IJ*~tétra-(|3-ch.loroéthyl)thionine avec un rendement d'environ 80 à 90 5 les sels de thionine bruts de formule I peuvent égale ment être utilisés comme matière de départ mais, dans ce cas, on doit filtrer la solution alcoolique avant d'ajouter la solution alcaline» Conformément à un autre procédé, les sels de thionine purs en poudre fine, répondant à la formule I, sont traités avec 10 un hydroxyde alcalin au sein d'un milieu aqueux. Exemple 14 l'hydroxyde pur de 33",jIT'-tétra-Cp-chloroéthyl) thionine, préparé conformément à l'exemple 13, forme des sels a-vec les acides organiques et minéraux. On forme de préférence 15 ces sels au sein d'un milieu alcoolique ou aqueux. Si les réactifs sont introduits en des quantités équimoléculaires, on peut obtenir une substance sensiblement pure simplement en faisant évaporer la solution ou la suspension# Si le sel de thionine obtenu est médiocrement soluble dans l'eau, une solution alcoo-20 lique d'hydroxyde de 1T,S",ST* ,IÎ!-tétra-((3-Ghlorsthyl)thionine cb= tenueconformément à l'exemple 13 peut alors être utilisée comme matière de départ, et les sels alcalins minéraux sont éliminés après évaporation, par exemple par lavage à l'eau du résidu. De cette manière on peut obtenir le chlorure, le bromure, l'iodure, 25 le sulfate, le phosphate, l'acétate, le benzoate, les tartrates, les fumarates, les maléates, les citrates, etc.. de ]J,N,lît,ïï',-tétra-(p-chloréthyl)thionine. Exemple 15 les sels de thionine médiocrement solubles dans l'eau, 30 répondant à la formule I dans laquelle l'anion Y est dérivé d'un acide carboxylique, peuvent être préparés de préférence de la manière qu'on va décrire. On fait réagir le chlorure, le bromure ou le perchlo-rate de thionine correspondant avec le sel de sodium, de potas-35 sium ou d'ammonium de l'acide carboxylique désiré, de préférence au sein d'un milieu aqueux, on recueille les matières solides par filtration et on élimine les sels minéraux par lavage du précipité avec de l'eau. Un tel procédé permet d'obtenir l'acétate, le benzoate, les tartrates, les fumarates, les maléates, les citra-40 tes, etec de 13",33",ÎST' jU'-tétra-Cp-chloréthylJthionine. 69 03561 17 2002028 Exemple 16 En mettant en oeuvre les procédés décrits dans les exemples 1 à 15, on peut préparer des dérivés de thionine de formule I, dans laquelle les symboles R et R"*" représentent un 5 groupe méthoxy ou un atome de chlore» On a pu synthétiser les dérivés suivants : - le chlorure de NjNjN'1 ,H,-tétra«-((3-chloréthyl)-l-chlorothionine, de formule (C^Hg-jClgU^S) - le bromure de ,ET,-tétra-(p-chloréthyl)-l-chlorothionine, 10 de formule (C20H2^BrCl^HjS) - le chlorure de ïï',ï^,3!^,jH'-tétra-Cp-chloréthylJ-^-chlorothionine, de formule (C^Hg-^ClgN^S) - le bromure de NjEjN1 jïf'-tétra-Cp-chloréthylJ-S-chlorothionine, de formule (C2QH2-^BrGl^îr^S) 15 - le chlorure de îï,!!,]?* ,U,-tétra-(p-chloréthy])-3-méthoxy-thionine, de formule (Cg-jH^Cl^H^OS) - le bromure de jtf'-tétra— (p-chloréthyl)-3-méthoxythionine, de formule (Gg^Hg^EcQl^lî^OS). 69 03561 18 2002028 re7eibicai ions 1» Dérivés de thionine doués d'activité anti-raitotique et répondant à la formule î x-gh2-gh2 X-ch2-CH2/^ gh2-gh2-x ch2-ch2-x (I) 10 dans laquelle les symboles R et RX représentent de l'hydrogèae, un halogène ou un radical alooxy inférieur, X représente un groupe hydroxy ou un halogène et Y représente un groupe hydroxy ou un reste d'un acide organique ou minéral. 15 2o Procédé de préparation de dérivés de thionine de formule : 20 x-oh2-ch2 x-ch2-ch2/ $ ch2-ch2-x 1 ^ ch2-ch2-x (I) © dans laquelle r et r représentent de l'hydrogène, un halogène ou 25 un radical alcoxy inférieur, X représente un groupe hydroxy ou un halogène et Y représente un groupe hydroxy ou un reste d'un acide organique ou minéral, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'un dérivé de phénylène diamine, de formule : 30 x-ch2-ch2 x-ch2-ch2 îih, (ii) (dans laquelle x a la signification donnée ci-dessus) est oxydé 35 dans un milieu acide, en présence d'une substance capable de donner du soufre. 3o Procédé de préparation de dérivés de thionine de formule I ci-dessus, dans laquelle r et rx représentent de l'hy-40 drogène, un halogène ou un radical alcoxy inférieur, X représente 69 03561 19 2002028 10 20 *3 30 un groupe hydroxy ou un halogène et Y représente un groupe hydroxy ou un reste d'acide organique ou minéral, procédé dans lequel un mélange comprenant un dérivé de phénylène diamine de formule II ci-dessus et une ÏT-dihydroxyéthyl- ou E-dihaloéthyla-niline est oxydée au sein d'un milieu acide en présence d'une substance capable de donner du soufre,, 4» Procédé de préparation de dérivés de thionine de formule I ci-dessus, dans laquelle R et R"1" représentent de l'hydrogène, un halogène ou un radical alcoxy inférieur, X représente un groupe hydroxy ou un halogène et Y représente un groupe hydroxy ou un reste d'un acide organique ou minéral, procédé dans lequel on dérivé de phénothiazine de formule : 15 (iii) (dans laquelle R et-R^ ont les mêmes significations que ci-dessus) est oxydé en présence d'une aminé secondaire de formule s x-ch2-ch2-n-ch2-ch2-x b (iv) (dans laquelle X a la même signification que ci-dessus et B représente un atome d'hydrogène ou d'un halogène) 5. Procédé'de préparation de dérivés de thionine de formule I ci-dessus dans laquelle R et R"*" représentent de l'hydrogène, un halogène ou un radical alcoxy inférieur, X représente un groupe hydroxy ou un halogène et Y représente un groupe hydroxy ou un résidu d'un acide organique ou minéral, qui consiste à faire réagir un composé de formule î 35 4-0 R x-ch2-ch2 x-ch2-ch2 / h I (V) ï CHO-0HQ-X / 2 2 X ch2-ch2-x 69 03561 20 2002028 dans laquelle X, R et Rl ont les mêmes significations que ci-dessus, avec un agent oxydant, au sein d'un milieu acide. 6. Procédé de préparation de dérivés de thionine de formule I ci-dessus dans laquelle R et RX représentent de l'hy-5 drogène, un halogène ou un radical alcoxy inférieur, X est un halogène et Y est un reste d'un acide organique ou minéral, dans lequel, les groupes hydroxyle d'un composé de formule I, dans laquelle X représente des groupes hydroxyle qui sont remplacés par des atomes d'halogène0 10 7« Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel le composé capable de céder du soufre est l'hydrogène sulfuré, et l'oxydation est mise en oeuvre avec du chlorure ferrique en présence d'un acide minéral» 80 Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel 15 un mélange équimolaire d'un composé de formule II et de ÏT-dihy-droxyéthyl ou H-dihaloéthyl aniline est oxydé avec un bichromate en présence d'acide thiosulfurique naissant ou d'un mélange d'acide thiosulfurique et de chlorure de zinc. 9. Procédé conforme à la revendication 4, dans lequel 20 la réaction est mise en oeuvre dans un mélange de dioxane et de méthanol, à environ 0°Co 10. Procédé conforme à la revendication 4, dans lequel l'agent oxydant est un halogène, et l'oxydation du composé de formule III est mise en oeuvre en deux stades, à savoir en for- 25 mant d'abord un dérivé bichloré et en oxydant ensuite ce dérivé en présence d'une aminé secondaire de formule IY.