Brevet FR2009529A1 — publié le 19700206

-1- La présente invention concerne un procédé ppjur la stabilisation de la L-asparaginase. * . . ' \ L1 enzyme L- a sp ar aginas e ( L- aspar agine-amidohydro1ase E.C. 3.5*1«1«)sst connu.On peut l'obtenir par extraction à partir 5 de cellules de E.coli (H.A. CiUiPBSLL, L..T. x..ii3iïBIIEM,E.À.B0YSE, L.J.OLD, "Biochemistry",6 (1967),pages 721 à 730 qui renvoie à d'autres documents de la littérature) .La L-asparaginase a. pris depuis quelque temps une certaine importance comme médicament contre celles des tumeurs qui ont besoin de l'asparagine pour 10 leur croissance. On peut enrichir la L-asparaginase selon les procédés habituels de la chimie des enzymes,par exemple par la chromatogra-phie sur colonnes,la précipitation fractionnée avec du sulfate d'ammonium ou par précipitation fractionnée par des solvants "15 inertes.On se heurte toutefois à des difficultés pour purifier l'enzyme L-asparaginase Jusqu'au point où l'on peut la faire passer sous la forme cristalline.Ces difficultés reposent sur le fait que la L-asparaginase se présente à l'état naturel avec des quantités considérables de protéines d'accompagnement,qui n'en sont 20 que difficilement séparables. Conformément à une prescription antérieure (voir la demande de brevet français PV 181,248 du 27 Décembre 1968 déposée par la Demanderesse), il existe un procédé qui repose sur la constatation selon laquelle on peut libérer dans une mesure déterminée la L-asparaginase de ces protéines 25 d'accompagnement inactives en chauffant les solutions brutes de L-asparaginase pendant 15 minutes à 59?5°C.I1 se produit alors une dénaturation partielle des protéines d'accompagnement tandis que l'enzyme demeure sous forme active en solution.Ce procédé est compliqué et n'est pas bien approprié aux travaux' a l'échelle-30'des préparations industrielles,par le fait que la durée et la température doivent être conservées avec précision pour parvenir au résultat désiré. Une ancienne proposition pour la purification de l'enzyme s'est avérée particulièrement conforme au but (voir la 3 5 demande de brevet français 181.248 précitée).Cette proposition ancienne repose sur le fait que l'on fractionne la L-a,sparaginase avec le polyéthylène glycol,de sorte qu'une addition d'urée et le réglage au point isoélectrique de l'enzyme conduit à des produits particulièrement purs. bad original 69 07391 -2- 2009529 Il est connu dans la chimie des protéines que lorsqu'on .travaille avec des enzymes, on doit compter sur diverses sortes de dénaturation ; par exemple la dénaturation thermique, la dénaturation aux valeurs extrêmes du pH et la dénaturation 5 superficielle ("J. Eiol. Chera." 118 (.1937) pages, 16-3 à 175). La dénaturation thermique se produit en général lorsqu'on chauffe " des protéines à des températures qui sDnt supérieures à. 40°C. Pour les diverses protéines, il y a, psr suite des différences de résistance de la structure , des différences de température 10 limite à partir de laquelle commence à se produire la dénaturation. Ceci vaut également pour la dénaturation à des valeurs de pH trop élevées ou trop faibles. La dénaturation superfi- ' cielle s'établit lorsque,- par effet d'échange avec une surface ou par extension à une surface de séparation de phases les 15 ponts ou liaisons hydrogène de la protéine se trouvent brisés. Le dernier"cas peut par exemple se produire très facilement lorsque de 1?écume se forme par agitation ou par barbotage d'un gaz.inerte. Déjà .le simple fait de verser une solution d'enzyme provenant d'un récipient dans un autre peut provoquer un 20 affaiblissement de l'activité. La dénaturation superficielle apparaît très particulièrement nette au point isoélectrique, comme on le sait par la littérature. On sait en outre que la sensibilité des protéines enrichies croît avec l'augmentation du degré de pureté et que des préparations de grande pureté sont 25 particulièrement sensibles aux phénomènes de dénaturation. La Demai2d.eres.9e a maintenant découvert un procédé pour la stabilisation de L-asparaginase, qui consiste à ajouter aux solutions de L-asparaginase deux substances différentes, dont chacune a déjà un net effet stabilisant, mais dont la com- • 30 binaison est particulièrement favorable. Le procédé selon la présente invention réside dans le ■ fait qu'on ajoute à des solutions de L-asparaginase, des acides aminés, de préférence du glycocolle et/ou du polyathylène gly-col. 35 Déjà l'addition des acides aminés, de préférence du glycocolle, présente *'•■..• glle seule les avantages suivants ; l) la totalité de l'activité enzymatiaue est conservée lors du chauffage jusqu'à 60°C..; la durée du.chauffage n'a pas BAD ORIGINAL 69 07391 _3_ 2009529 "besoin d'être conservée avec précision. 2) Amélioration de la solubilité de l'enzyme déshydraté ou lyophilisé. Ceci provient du fait qu'une dénaturation partielle de la L-asparaginase est totalement eapêchée. 5 Lors de la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on ajoute aux solutions de L-asparaginase, l'acide aminé en des quantités de 0,01 à 5,00 à des températures comprises entre -10° et +65°C. Dans le cas où les protéines d'accompagnement doivent être dénaturées à 60°C. environ, 10 la durée du chauffage peut atteindre de 10 minutes à 4 heures. La solution surnageante d'une charge qui a été soumise à la dénaturation, contient la L-asparaginase active. Cette solution est assez pure pour servir de matière première à la purification ultérieure de la L-asparaginase. 15 II est surprenant que, par le procédé de purification selon la présente invention, seules les protéines d'accompagnement et non pas la L-asparaginase, se trouvent dénaturées, par le fait que l'on sait que la plupart des enzymes sont therrno-labiles. 20 Une combinaison de ce procédé de stabilisation et les pro cédés antérieurs précités de purification a conduit à la L-asparaginase pure et cristallisée. Toutefois encore, l'addition de polyéthylène glycol seul stabilise la L-asparaginase contre diverses sortes de dénatura-25 tion. Ce résultat est surprenant par le fait que le polyéthylène glycol ne présente aucune efficacité tensio-active remarquable, qui pourrait empêcher par exemple la dénaturation superficielle en réduisant la formation d'écume, lu contraire de la glycine proposée antérieurement comme stabilisant, le polyéthylèn^ly-30col possède deux paires d'électrons libres sur les atomes d'oxygène de la fonction éther, mais pratiquement aucun atome d'hydrogène disponible pour un pont ou liaison hydrogène. Cet.effet stabilisant se produit pour des asparaginases ayant divers degrés de pureté. La concentration du polyéthylène glycol à 35 ajouter peut varier dans de larges limites. L'effet de stabilisation est déjà nettement décelable pour une addition de 10 f--calculée sur la L-asparaginase introduite. On peut ajouter le polyéthylène glycol aussi bien en BAD ORIGINAL 69 07391 -4- 2009529 solution, (de préférence en solution aqueuse, mais aussi alcoolique), que sous forme solide à la solution de L-asparaginasë « la stabilisation de l'enzyme avec la glycine ■ se renforce d'une façon particulièrement favorable par 1'addition 5 de polyéthylène glycol. La L-asp.3.rr~cinase stabilisée possède sensiblement les mêmes propriétés pharmacologiques et trouve les cernes applications thérapeutiques que les fermes antérieurement connues de 1'enzyme0 10 EXEMPLES : Stabilisation avec des acides aminés. Exemple 1 i On dissout 50 g d'asparaginase brute, avec une activité I© 37 U/rag df=ns un tampon de glycocolle à pH 8,5» et chauffe pendant 1 heure à 60°C. La composition qui contient alors beau-*! 5 coup de protéine inactive et dénaturée est centrifugée à 6000 tours/minute et on fractionne à l'acétone. La portion qui précipite par addition de 40 à 45 ?° d'acétone atteint 3,9 g« Elle contient 950 U/mg. On rassemble 18,6 g de l-asparaginase'enrichie? prove-. 20 eaat d© plusieurs compositions de dénaturation,, et les dissout dans 380 ml d'une solution 3-molaire d'urée, on règle la valeur du pH à 8,5 avec une lessive de seude 1 2T et fractionne avec une solution de polyéthylène glycol à 50 f. La portion précipitée après addition de 45 à 60 ml est centrifugée et lavés à 25 1'acétone, et séchée. Rendement 4,2 g ; 313 0 U/sg.- On règle à pH 5,2 '.me solution de 4,0 g de cet échantillon dans 80 n:l cl'eau bi—distillée, avec de 15 acide chlorhy— •irique 1 S et l'on fractionne avec une solution de polyéthylène giyeol. la portion qui précipite après addition de 25 à 30 ml 30 est après un repos de 20 minutes à la température ambiante centrifugée et, après 2 heures de repos sous acétone, elle est lavée avec une autre quantité d'acétone. Rendement 1,2 g 6110 TJ/mg. Cet échantillon s'avère être une matière cristallisée homogène. On peut recristalliser : l) par précipitation d'une 35 solution des cristaux dans-l'eau, par une solution de polyéthylène glycol à pH 4,9 ; 2). par précipitation de cette même solution aqueuse avec de l'acétone. Prismes plats, décomposition à partir de 289°G., décom BÂOQfWGfNAt 69 07391 -5- 2009529 position totale à 292°C. Exemple 2 On dissout 5 g d1 asparaginase "brute, contenant 97 U/mg dans 100 ml d'une solution d'alanine à 1 $ (g/ml) que l'on a réglée à pH 8,5 avec de la lessive de soude, et l'on chauffe 5 pendant 15 minutes à 60°C. la composition qui contient beaucoup de protéine dénaturée est clarifiée par centrifugation à 6000 tours/minute. Elle contient la totalité de l'activité d'asparaginase. Par la poursuite du traitement d'élaboration selon 10 l'exemple 1, il est possible d'obtenir, à partir de cette composition de dénaturation, la l-asparaginase cristallisée. Exemple 3 On dissout 5 g de 1-aspariginase ayant une activité spécifique d'environ 170 U/mg, dans un litre d'eau à la tempé-15 rature ambiante, et on sépare par centrifugation la portion qui reste insoluble. Dans la solution ainsi obtenue, on introduit en agitant lentement à la température ambiante 10 g de glycocolle. On continue l'agitation jusqu'à dissolution totale, on congèle la solution et ensuite on lyophilise. Après l'addition du • 20 glycocolle la valeur du pH atteint 5,2. On explicitera l'effet de stabilisation du polyéthylène glycol à l'aide des exemples suivants : Exemple 4 On effectue le fractionnement d'une préparation de 1-25 asparaginase dans une colonne contenant du gel de dextrane, et on dialyse la fraction contenant la l-asparaginase. la solution contient 12 400 U ayant une activité spécifique de 251 U/mg de protéine. On sèche par congélation la première moitié de cette 30 solution. On obtient une préparation ayant une activité de 5050 U (= 81 i° de l'activité introduite) et une activité spécifique de 202 U/mg de protéine. le seconde moitié de la solution ci-dessus est mélangée à 0,1 ml d'une solution à 50 L7° de polyéthylène glycol puis 35 séchée par congélation, le rendement atteint 6100 U (= 98 f° de l'activité introduite) avec une activité spécifique de 244 U/mg de protéine. : BAD ORIGINAL 69 07391 2009529 Exemple 5 * On soumet à expérience comme suit,à chaque fois -5 ml d'une solution à 0,1%(g/ml)de L-asparaginase ayant une teneur de 146 U/mg dans un tampon d'acétate de 0,2 IT,pH 5»0 : 5 a)On" fait "barboter pendant 90 raiiiutes de l'argon pur de sorte qu'il se forme une écume abondante. b) On procède comme sous a),mais on ajoute toutefois au préat-lable 100 mg de polyéthylène glycol de poids laoléculaire 1500. c) On secoue la solution pendant 3 heures en récipient clos 10 d) On procède comme sous c)mais toutefois on ajoute au préa lable à la solution 100 mg de polyéthylène glycol. e) On conserve en chambre froide pendant 3 heures la solution (expérience-témoin). À la déterraination des teneurs des solutions a) à e), on 1 5 obtient les valeurs suivantes s- a) U/ml = b) U/ml = 140 c) U/nl 35 d) U/ml = 138 2 0 e) U/ml = 146 Exemple 6 - On traite, de façon analogue celle de l'exemple 5»selon le mode opératoire a) et b),chaque fois 5 elL d'une solution à 0,1^ de L-asparaginase,ayant mie teneur de 146 U/mg dans un 2 5 tampon au phosphate m/15, pH = On trouve à la détermination des" teneurs : a) U/ml = 76 b) U/nl =145 Exemple 7 3 0 On dissout une préparation de L-asparaginase ayant un poids à sec de 100 U/mg dans un tris-tampon ou bien "tham-tampon" (trihyclroxyaninornéthane) (pH 8,0) en concentration de 1 mg/ml. On dilue 6,0 ml de cette solution avec 0,5 ml d'eau, et chauffe dans un dispositif à thermostat à 55°C. Simultanément, 35 on mélange 6,0 ml de la meme solution de L-asparaginase avec 0,3 ml d'eau et 0,2 ml d'une solution à 50 °/o de polyéthylène glycol dans 11 eau et porte à la nême température . Après des délais déterminés , on prélève BAD ORIGINAL 69 07391 _7_ 2009529 des échantillons et examine leurs activités.Les résultats sont donnés au tableau I. Une recherclie analogue est entreprise sur la même préparation de L-asparaginase à S0°C. Les résultats sont également 5 contenus au Tableau I. Exemple 8 On cL'-ssout une- préparation de L—asparaginase contenant environ 100 U/mg à la concentration de 1 mg/ml, dans un tris-taiapon 0,1 ÏT (pH 8,0). A des échantillons de 6,0 b1! de cette 0 solution, on ajoute soit 0,5 ml d'eau, soit 0,5 ml de solutions aqueuses qui contiennent 50, 100 ou 200 mg de polyéthylène glycol. On chauffe la solution pendant 80 minutes à 55°0 « L?s résultats en sont donnés au Tableau II. Exemple 9 5 On dissout une préparation de L-asparaginase à 100 U/mg à la concentration de 1 mg/mls dans un tris-tampon 0,1 H" (pH S,0). On ajoute à des volumes de 6 ml chaque de cette solution s a) 0,3 ml d'eau "b) 0,2 ml d'eau et 0,1 ml de polyéthylène gl/rcol (à 50?= 0 dans 1'eau), c) 0,2 ml d'une solution de glycine (100 mg/ml) d) 0,1 ml de polyéthylène glycol (à 50/a dans 1® eau)et 0,2 ml de solution de glycine (100 mg/nl). On chauffe les solutions pendant 80 minutes à S0°Coet 5 l'on vérifie leur teneur en iF-asparaginaseoLes résultats sont donnés au Tableau III. BAD ORIGINAL TABLEAU I Chauffage c'e L-asparaginase on présence de polyéthylène glycol Durée du chauffage Température (°C.) Activité de la L-asparaginase (U/ml) (minutes) S, ns addition Avec le poly.'ithj lèregi ycol 0 55 86 104 20 55 74 103 40 55 62 101 60 55 61 94 80 55 43 94 0 60 91 96 20 60 49 ' 69 40 60 33 48 60 60 26 40 80 60 16 32 tris- 100 U/rag de L-asparaginase dissoute dans un/tampon 0,1 N (pH 8,0) j coacfcatration de 0,92 mg/ml. L'addition de polyéthylène glycol atteint 15,1 mg/ral. TABLEAU II O* «Q O Stabilité de la L-asparaginase en fonction de diverses quantités do rol.véthylène-glycol ' ' UJ Concentration en Proportion polyéthylène Activité avant Activité aprôs Activité on °/<> "~* polyéthylèneglycol glycol-enzyme chauffage 80 minutes u.e la valeur mg/ml mg/ml U/ml à 55°C. initiale U/ml 0 0 92 43 47 7,5 8,2 98 86 88 15,0 16,3 98 94 96 30,0 32,6 98 91 93 La préparation de L-asparaginase a une activité spécifique de 100 U/mg ep poids sec. La concentration dans la solution atteint 0,92 mg/ml. Par addition de "PclywcJî" on observe une augmentation de l'activité de 92 à 98 U/ml- (=106 %). O sO en ho «vO TABLEAU III "Stabilité de la L-asparaginase en présence de divers stabilisants' Activité de L-asparc^inas^ aprt • chauffage de 80 minutes a 60 U/ml a/o ae ] a \ aleur initiale O -O O -4 UJ -O L--asporcgir;ase seule L--asparagir ase avec le polyéthylène glycol L-asprragirase avec la glycine L-asparaginase avec le polyéthylène glycol et la glycine 14 44 52 83 15 48 57 90 i H 0 1 NJ O O vO en SJ vO 69 07391 -u- 2009529 BEVEI'ÎDI GA TI QHS 1 - Procédé pour la stabilisation de l-asparaginase, carsc- . térisé en ce que l'on ajoute à ses solutions des acides aminés, de préférence du glycocolle et/ou du polyéthylène glycol. 5 2 - Procéd.e selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute seuls des acides aminés, de préférence du glycocolle . 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajoute les acides aminés en des quantités de 10 0,01 à 5,00 % (g/ml). 4 •- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'addition des acides aminés s'effectue à une température comprise entre -10° et + 65°C. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on 15 ajoute du polyéthylène glycol. 6 - La L-asparaginase stabilisée. BAD ORIGINAL ! i