Brevet FR2000716A1 — publié le 19690912

La présente invention concerne un procédé de transformation d'un stéroïde qui est saturé en position 1,2 dans le noyau A et comporte des atomes d'hydrogène remplaçables en position 11,16,17 ou 21, par traitement simultané par un micro-5 organisme du genre Arthrobacter et un ou plusieurs microorganismes capables d'introduire un groupe hydroxy, par fermentation d'une culture mixte, de manière qu'il y ait dans la même opération, introduction d'une double liaison en position 1,2 et d'un groupe hydroxy dans une ou plusieurs des positions 10 11,16,17 et 21. La demanderesse a constaté que.la culture mixte permet d'obtenir des résultats améliorés dans une fermentation effectuée par un micro-organisme de déshydrogénatlon du genre Arthrobacter. On effectue souvent la transformation des stéroïdes par 15 l'action de micro-organismes dans un milieu de fermentation, avec introduction de groupëments fonctionnels dans le noyau stéroïde ou avec d'autres transformations. Lorsque l'on utilise plusieurs transformations microbiologiques dans la synthèse des stéroïdes, en particulier celles dans lesquelles 20 interviennent des genres ou espèces de différents micro-organiames et impliquant divers changements de la structure du stéroïde, on propose ordinairement d'effectuer ces transformations successivement plutôt que simultanément, car on pensât que les réactions compétitives rendraient moins spécifique 25 l'action du micro-organisme et réduiraient le rendement. La demanderesse a découvert selon 1'invention que lorsque l'on effectue une déshydrogénatlon bactérienne par un microorganisme (ou par les enzymes actifs) du genre Arthrobacter et une hydroxylation par une ou plusieurs moisissures, la 30 déshydrogénatlon et 1'hydroxylation ont lieu de manière efficace dans une réaction simultanée lorsque l'on met en contact le stéroïde à déshydrogéner et hydroxyler dans un milieu contenant à la fois les organismes déshydrogénants et hydroxylants. Dans le procédé selon l'invention, on choisit des combinaisons de micro-organismes et du substrat de manière que le résultat global, exprimé par l'efficacité globale de transformation d'un stéroïde pn un autre plus intéressant, soit plus effi* cace qu'avec les procédés comparables dans lesquels les i 69 01221 69 01221 2 2000716 cultures sont utilisées séparément ou successivement. Parmi les stéroïdes connus intéressants que l'on peut préparer par le procédé de l'invention» on peut citer la prednisolone, la triamcinolone, la dexaméthasone, leurs 5 analogues 6a-fluoro, ainsi que la 6a-méthylprednisolone et les analogues. Ainsi, par exemple, lorsque l'on inocule un milieu au soja contenant de la 9a-fluorohydrocortisone simultanément par le micro-organisme 1-déshydrogénant A^ simplex et le 16a-10 hydroxylant S. roseochromogenes dans les conditions ,-d1 incubation normalement utilisées pour la 1|5-hydroxylation, cette substance est transformée totalement en triamcinolone dans 72 heures. Dans ce milieu, S. roseochromogenes dans une culture pure transforme normalement environ 200 ^ug/ml de 15 9®-fluorohydrocortisone en 9a-fluoro-l6a-hydroxyhydrocortisone en environ 96 heures. A. simplex utilisé seul dans ces conditions effectue la 1-déshydrogénatlon, mais réduit également le groupe 20-cétone. Dans le procédé de fermentation combinée simultanée, on ne met pas en évidence les produits 20-dihydro, 2 0 ni la 9a-fluoro-l6a-hydroxyhydrocortisone libre. Ainsi, non seulement les réactions avantageuses sont facilitées par interaction physiologique des micro-organismes, mais les réactions indésirables sont supprimées. Plus exactement, il s,emble que les actinomycètes limitent ou évitent l'induction de la 20-25 céto-réductase de A. simplex et simultanément, l'activité de l6a-hydroxylation de S. roseochromogenes est facilitée. On observe un type d'interaction différent mais également avantageux, lorsque l'on inocule un milieu à la liqueur de trempage de mais contenant un 16a-hydroxycortexolone-30 16,17-acétonide avec un champignon tel que Curvularia lunaia ou Absidia coerulea et une bactérie de l'espèce A. simplex. Dans le milieu de trempage de mais, l'induction de la 1i-déshydrogénase de A. simplex qui a poussé d'abord sur un milieu à la farine de soja , est limitée dans une culture 35 pure.. Cependant» lorsque A. coerulea ou C. lunata est également présente pendant toute la durée de fermentation, il y a induction de la 1-déshydrogénâse de A. simplex, c'est-à-dire que ,sa limitation est supprimée ou compensée par l'activité 69 01221 3 2000716 métabolique du champignon. Outre A. simplex , les espèces du genre Arthrobacter qui effectuent l'introduction d'une double liaison en position ti2 du noyau A d'un stéroïde (1-déshydrogénants) comprennent 5 les espèces globiformis, pascens, oxydans, aurescens, ureafaclens, tumegcens, citreus et terregens. Les micro-organismes qui effectuent l'introduction d'un groupe hydroxy dans une position du noyau stéroïde ayant un atome d'hydrogène remplaçable comprennent les espèces 16a-10 hydroxylantes du genre Streptomyces, en particulier S. roseqchromogenes, Didymella ou Pestalotia; les espèces 11(3-hydroxylantes du genre Curvularia, en particulier C. lunata, Conlothyrium, en particulier hellebori, Botrytls, Çolletotrichum, en particulier C. phomoides, Cunninghamella, 15 en particulier C. blakesleeana, Rhodoseptoria, Pseudoinonas ou Pyonosporiumj les espèces 11a et 11 (3-hydroxylantes du genre Absidia, en particulier A. coerulea, Blakeslea, Ghoanephora, Clrcinella, Stachylidium» Thamnldium, en parti-culiei' elegans-, ou Tieghemella; les espèces Hœ-hydroxy-20 lantes du genre Aspergillus, en particulier A. ochraceus, Baclllus, en particulier B. cereus, Beauveria, Dactyllum, Fusarium, Hormodendrum, Mucor, Rhlzopus, en particulier R. nlgrioans, Neurospora, Nlgrospora ou Pénicillium; les espèces 17ci-hydroxylantes du genre Tricothecium, en particulier 25 Tricothecium roseum, Cladosporium, Leptosphaerla ou Trichodema; les espèces 21-hydroxylantes du genre Wojnowicla, en particulier W. graminis, Ophlobolus, en particulier 0. herpotrichus ou tiendersonia. La combinaison des micro-organismes peut être constituée par l'ure quelconque des espèces 1-déshydrogénantes du genre Arthrobacter ci-dessus mentionnées et une ou plusieurs du groupe des espèces hydroxylantes. L'avantage particulier de l'invention découle du fait que les micro-organismes choisis de manière convenable agissent mieux ensemble que séparément. Cet avantage est démontré de manière" très frappante par la combinaison d'Arthrobacter simplex et Streptomyces roseochromogenes . 30 35 69 01221 4 2000716 On peut préparer l'inoculum pour le milieu de fermentation mixte en cultivant le micro-organisme donné sur le milieu le mieux approprié pour la croissance de ce micro-organisme particulier. On peut utiliser une culture 5 sur tranche de gélose pour fournir une culture de surface pour-- inoculer un flacon secoueur en vue de la propagation ultérieure du micro-organisme selon les techniques classiques. On peut ensuite utiliser la culture obtenue à partir du premier flacon secoueur ou des flacons suivants d'une série dans 10 la culture de fermentation mixte. Par exemple, un milieu à la gélose approprié pour la culture telle que A. simplex peut avoir la composition suivante : Milieu A 15 Extrait de viande de boeuf (Difco) 1,5 g Extrait de levure (Difco) 3,0 g Peptone (Difco) 6,0 g Dextrose 1,0 g Eau distillée q.s.p. 1,0 litre 20 Passage à l'autoclave pendant 20 minutes à 121°C. Un autre milieu à la gélose particulièrement approprié pour la croissance des actinomycètes telles que 3. roseochromogenes, est le suivant ; Milieu B 25 Gélose (Difco) 20,0 g Glucose 10,0 g Extrait de levure (Difço) 2,5 g Phosphate de potassium (dibasique) 1,0 g Eau distillée q.s.p. 1,0 litre 30 Passage à l'autoclave pendant 20 minutes à 121°C. Un milieu que l'on peut utiliser dans les stades initiaux en flacon secoueur pour la croissance de culture de bactéries et d'actynomycètes peut avoir la composition suivante : 69 01221 5 2000716 Milieu c Farine de soja extraite (Archer-Daniels-Midland) 15,0 g Huile de soja 2,2 g 5 Mohohydrate de glucose 11,0 g Carbonate de calcium (technique) 2,5 g Bau de ville q.s.p. 1,0 litre La fermentation par culture mixte selon l'invention s'effectue dans un milieu de culture liquide contenant 10 des sources classiques d'hydrates de carbone, des substances azotées, des sels minéraux et des agents de croissance. Les sources d'hydrates de carbone comprennent par exemple, les farines de soja, de glucose, saccharose, des mélasses et des analogues. Les substances azotées comprennent par.exemple, £> les aminoacides, les hydrolysats de caséine, les farines de céréales, les peptones, les extraits de viande, la liqueur de trempage de mais et les analogues. A titre d'exemple de sels minéraux, on peut citer le sulfate de magnésium, le phosphate acide de sodium et les phosphates de potassium, mono- et diba-20 siques. On peut ajouter les facteurs de croissance sous forme pure ou les obtenir à partir d'extrait de levure ou d'impuretés à l'état de traces dans les substances azotées brutes. On peut ajouter le substrat stéroïde transformé dans le milieu de fermentation sous forme de solution ou de 25 suspension dans l'eau. La solution ou la suspension comprend de préférence Une faible quantité d'un agent tensloactlf tel que Tween 80. On peut faire varier entre de larges limites, la quantité de substrat stéroïde Introduite dans le milieu de fermentation, mais elle est de préférence d'environ 0,2 à 30 2 g/litre. A titre d'exemple de milieu de fermentation mixte préféré pour les fermentations avec les bactéries et les actinomycètes, on peut citer le milieu de composition suivante : 69 01221 6 2000716 Milieu D Farine de soja extraite 20,0 g Monohydrate de glucose 33»0 g Carbonate de calcium (technique) 7,5 g 5 ■ Huile de soja 2,2 g Phosphate de potassium (dibasique) 1,0 g Phosphate de potassium (monobasique) 1,0 g Eau de ville q.s.p. 1,0 litre Passage à 1'autoclave 30 minutes à 121°C. 10 Un milieu approprié pour la culture de champignons tels que C. lunata ou A. coerulea, ainsi que pçur A. simplex, pour leurs cultures mixtes, est le suivant : Milieu E Glucosè 30,0 g 15 Farine de soja 20,0 g Huile de soja 2,2 g CaCO-j 2,5 g Eau distillée q.s.p. 1 litre Passage à l'autoclave pendant 30 minutes à 121°C. 20 Un milieu préféré pour le stade final de culture mixte de champignons et de bactéries est le suivant : Milieu F Solides de liquèur de trempage de mais 3,0 g 25 (nh4)h2po4 3,0 g Extrait de levure (Difco) 2,5 g Glucose 10,0 g Ajusté à pH à 1,0 Eau distillée q.s.p. 1 litre 30 Passage à l'autoclave pendant 30..minutes à 121 °C. On utilise environ 1 à 20%, de préférence environ 5# (en volume) d'inoculum de chacune des espèces 1-déshydrq-génantes pour inoculer le milieu de fermentation. On effectue l'inoculation au mieux, autant que possible simul-35 tanément, bien qu'ufi certain intervalle entre l'Inoculation 69 01221 7 2000716 avec les micro-organismes ne soit pas nuisible dans certains cas pour autant qu'il y ait Interaction entre eux. Pour les meilleurs résultats, on doit aussi ajouter le stéroïde à peu près simultanément. Il est possible également d'introduire 5, une portion de stéroïde en môme temps que les micro-organismes et ensuite des quantités supplémentaires du stéroïde à mesure que la réaction se poursuit. Après avoir ajouté au milieu les deux cultures et le stéroïde, on effectue l'incubation en conditions aérobies 10 (par exemple à environ 0,6-1,0 volume/volume/minute), de préférence avec agitation (par exemple environ 400-600 tr/mn). On peut effectuer la fermentation à une température comprise entre environ 15 et 45°C, de préférence d'environ 25°C. La déshydrogénatlon et l'hydrox^latiok -sont en général 15 complètes dans un intervalle d'environ 20-200 heures. Il suffit ordinairement ta'environ 72 heures. On sépare le produit du milieu de fermentation par les moyens classiques en séparant les solides par filtration et en récupérant le produit du filtrat par extraction au 20 solvant, précipitation sélective ou les analogues. Si on le désire, on peut mettre en contact la totalité du bouillon avec un solvant miscible ou non miscible avant la séparation des solides par filtration ou centrlfugation. Avant ou après contact avec le solvanjc, on peut extraire à nouveau les solides '25 obtenus par centrlfugation ou filtration, au moyen d'acétone de méthylisobutylcétone ou les analogues. On peut utiliser ce procédé pour produire, par exemple les corticostéroïdes tels que prednisolone, triamcinolone dexaméthasone, 6a-fluorodexaméthasone, 6ct-fluorotriamcinolone, 30 6a-fluorotriamcinolone-acétonlde, 6a-méthylprednisolone, et les analogues, ainsi que des intermédiaires tels que 16a-hydroxyprednisolone, l6a-hydroxyprédrï£solone-l6,17-acétonide, 1-déhydro-llayl6a-dihydroxycor*texolone, l6a-hydroxypredni-solone, l-déhydro-l6-déhydro-lla-hydroxycortexone, 1-déhydro-55 Ha,l6a-dihydroxycortexolone-l6,17-acétonlde, l6a-hydroxy- prednisolone-16,17-acétonide, 6a-fluoro-l6a-méthylprednlsolone-16,17-acétonide, qui peuvent être enfin transformés en ces composés. 69 01221 8 20007 T 6 i A titre d'exemples des stéroïdes qui sont saturés en position 1, 2 et possèdent un atome d'hydrogène rempla-çable en position 11,16»17 ou 21 et que l'on peut soumettre à la déshydrogénatlon et à 1'hydroxylation par le procédé 5 de l'invention, on peut citer les composés suivants : 9a-fluorohydrocortisone et ses 21-esters tels que É1-acétate, 21-hémisucclnate et les analogues, cortexolone, l6a-hydroXy-cortexolone, 16a-hydroxycortexolone- 16,17-acétonide et ses 21-esters tels que l'acétate, hydrocortisone et ses 21-esters 10 tels que 21-acétate, 6a-fluoro-lôa-hydroxycortexolone-16,17-acétonide, 6a-fluoro-l6a-méthylcortexolone, 6a-méthylcorte-xolone, 16-déhydrocortexone, et ses 21-esters tels que l'acétate. ; La fermentation en culture mixte du procédé selon 15 l'invention, comprenant 1'utilisation d'une espèce 1-déshydro-génante du genre" Arthrobacten et au moins un organisme hydroxylant simultanément aveq interaction des cultures et de leurs enzymes pendant la croissance et la formation de l'enzyme en présence du stéroïde» se déroule de telle manière que les 20 transformations indésirables sont évitées et les activités enzymatiques avantageuses accentuées. La transformation résultante en une étape offre sur les procédés en plusieurs étapes, de nombreux avantages, non seulement du pôint de vue économique des substances et du temps, mais également par la 25 réduction des pertes qui se produisent dans les récupérations successives. , Les exemples suivants illustrent l'invention sans ■J toutefois en limiter la portée. Exemple 1 30 On utilise une culture de surface d'Arthrobacter simplex ATCC n° 6946 sur tranche de gélose, âgée d.e 5 à 7 joutfs, ayant poussé sur le milieu A ci-dessus, pour inoculer 50 ml du milieu C ci-dessus dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml. On place la fiole inoculée à 25°G pour l'incubation » 35 et on 1 "agite sur une secoueuse à 280 tr/mn^aur un cercle de 5,08" c* de diamètre. Après 48 heures, on effectue un 69 01221 9 2000716 contenant 50 ml du milieu C. Après inoculation, on incube la seconde fiole dans les mêmes conditions que la première. En procédant suivant le même mode opératoire qu'avec la première culture, on transfère une culture de surface-5 sur tranche de gélose de Streptomyces roseochromogenes ATCC n® 13 "400, ayant poussé sur le milieu B ci-dessus, dans 50 ml de milieu C dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml. Le milieu contenu dans la fiole est le même que celui utilisé pour la propagation de A. simplex dans les deux premiers stades en 10 fiole . Après inoculation de la première culture en fiole secoueuse de S. roseochromogepeaf comme il a été indiqué plus haut, on incube pendant 48 heures dans des conditions identiques à celles utilisées pour la propagation de A. simplex. 15 On inocule un second stade en fiole par un transfert de 10% en volume et on incube la seconde fiole comme la première pendant 48 heures. L'inoculum des deux cultures est ainsi prêt simultanément pour son utilisation. On utilise les deux cultures pour inoculer des portions 20 de 50 ml du milieu D ci-dessus. On utilise 5% en volume d'inoculum de chaque espèce et l'inoculation est autant que possible simultanée. En même temps aussi, on ajoute une suspension de 9cfr*fluorohydrocortisone en suspension aqueuse pour atteindre une concentration de 300yU de stéroïde par ml du 25 bouillon de culture mixte. On prépare la suspension de stéroïde en ajoutant le stéroïde finement pulvérisé à une solution aqueuse à 0,01% de Tween 80 pour obtenir une concentration de 30 mg/ral et on passe à l'autoclavé-, pendant 15 minutes à 121 °C. Après avoir ajouté les deux cultures et la suspension 30 de stéroïde au milieu de fermentation, on effectue l'incubation dans les mêmes conditions que décrites pour la préparation de l'inoculum. On prélève à intervalles réguliers des échantillons que l'on extrait par la méthylisobutylcétone et on soumet les extraits à la chromatographie sur papier avec du papier 35 Whatman n° 1 et un système solvant benzène-éthanbl-eau. On décèle les stéroïdes contenant une fonction cétonique a, (3-insaturée par un dispositif dç diffraction de rayons ultraviolets et la chaîne latérale dihydroxyâcétone par un réactif 69 01221 10 2000716 de tétrazolium bleu . La tranformation de la 9a-fluorohydro-cortisone en triamcinolone est complète en 71 heures. On ne constate pas de réduction du groupe 20-céto. On isole le stéroïde du bouillon en séparant le mycélium par filtration, 5 en extrayant le filtrat par l'acétate d'isobutyle et en concentrant le solvant à siccité, puis en recristallisant le résidu dans un système solvant acétone-hexane. Exemple 2 On prépare un inoculum végétatif des deux espèces 10 A. simplex et S. roseochromogenes comme décrit dans l'exemple 1, sauf que dans le second stade en fiole , on utilise une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de- milieu C. On utilise les inoculum ainsi préparés pour inoculer 4 litres de milieu D préparés et stérilisés dans une cuve de fermentation 15 en verre de 7*5 litres. Au bouillon de fermentation inoculé, on ajoute aussi rapidement que possible après l'inoculation, 2,0 g de 9a-fluorohydrocortisone en suspension dans 80 ml d'une solution aqueuse à 0,01% de Tween 80. On maintient la température d'incubation (15°) en plongeant partiellement la cuve à 2 0 fermentation dans un bain d'eau tiède. On agite à 400-600 tr/innjle débit d'aération est de 4 litres/minute à la température ambiante. Après 89 heures, la transformation de l'o-fluoro-hydrocortisone en triamcinôlone est complète. L'analyse 25 quantitative des chromatogrammes sur papier montre que le taux de conversion est égal ou supérieur à 90%. On isole la triamcinolone comme dans l'exemple 1. Exemple 3 On fait pousser les deux cultures de A. simplex et jJD S. roseochromogenes comme dans 11 exemple 1, sauf que dans le second stade en fiole secoueuse, on utilise 1 000 ml du milieu C dans un ballon de 4 litres muni d'une tubulure latérale de transfert et d'une cloche d'inoculation. Pourrie stade de fermentation, on prépare et on stérilise 30 litres du 35 milieu D dans une cuve à fermentation de 40 litres en acier inoxydable, munie d'une enveloppe pour ;le contrôle de la ' température au moyen d'eau tiède, d'un système d'agitation ou d'un système d'aération. Immédiatement après l'inoculation des \ 69 01221 h 2000716 deux cultures (5% en volume de chacune) dans la cuve de fermentation, on ajoute 9»37 S de 9®-fluorohydrocortisone en suspension dans 300 ml d'une solution aqueuse à 0,01% de Tween 80. On effectue la fermentation à 25°C avec agitation § à 220-350 tr/mn et aération à 0,5-1,0 volume/volume/mn. L'analyse périodique par chromatographie sur papier montre que la transformation en triamcinolone est complète en 81 h . On filtre le bouillon avec 5 kg de Hyflo comme auxiliaire de filtration à travers un entonnoir de Lapp . On 10 lave le gâteau de mycélium sur l'entonnoir avec environ 5 litres d'eau. On combine le filtrat et l'eau de lavage, voume j total 41,7 litres et on extrait avec un total de 134 litres de méthylisobutylcétone en 4 parties égales en extractions successives. La concentration de l'extrait pratiquement 15 jusqu'à siccité donne 6,02 g de stéroïde brut contenant 77,8% de triamcinolone. On obtient ,1a triamcinolone pure par recristallisation dans l'éthanol. Exemple 4 On suivant le procédé de l'exemple 1, on obtient la 20 triamcinolone à partir du 21-acétate de 9a-fluorohydroeortisone en utilisant S. roseochromogenes et A.aimplex . Exemple 5 On prépare la triamcinolone à partir du 21-hémisuccinate de "9a-fluorohydrocortisone en suivant le procédé de l'exemple 1 25 et en utilisant le S. roseochromogenes et A. simplex . Exemple 6 On prépare la l6a-hydroxyprednisolone à partir de 1'hydrocortisone en suivant le procédé de l'exemple 1 et en utilisant S. roseochromogenes et A. simplex . 30 Exemple 7 • On prépare le 16a-hydroxyprednisolone-16,17-acétonide à partir du l6c&-hydroxycortexolone-16,17-acétonide en suivant procédé de l'qxeraple 1 avec Curvularla lunata ATCC n° 12017 et A. simplex. 35 On utilise 1 ml d'une suspension aqueuse de C. lunata ayant poussé pendant 2 semaines à 25°C sur le milieu E pour inoculer 50 ml du milieu C dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml. On effectue 1-incubation à 25°C sur une secoueuse 69 01221 rotative à 280 tr/mn sur un cercle de 2,54 cm de rayon pendant 48 heures. En même temps et dans les mêmes conditions, mais séparément, on fait pousser A. simplex comme dans l'exemple 1. On utilise un second stade en fiôle dans 5 lequel on utilise le milieu E (100 ml dans une fiole de 500 ml) pour faire pousser les organismes séparément pendant 48 heures dans les conditions ci-dessus. On prépare dans le second stade 3 fioles de chaque culture. Dans le troisième stade en fiole, on utilise 29 fioles de 500 ml contenant 10 chacune 100 ml du milieu F et on ajoute à chacune 1 OPJ mg de l6a-hydroxycortexolone-16,17-acétonide en suspension dans 60 ml d'une solution aqueuse de Tween 80 (2,0 ml par fiole). On effectue l'incubation pendant 129 heures dans les conditions décrites ci-dessus. 15 On réunit le contenu des flacons et on filtre à la trompe à travers un tampon de Seitz. On utilise environ 870 ml d'eau distillée pour rincer les flacons et laver le gâteau de mycélium. Le volume total du filtrat combiné avec les eaux de lavage est de 3 570 m. 20 On extrait ce mélange trois fois avec des portions de 1 200 ml d'eau et on évapore sous pression réduite. On recristallise le résidu (1,4 g) dans un mélange d'acétone-hexane pour obtenir 424 mg de l6a-hydroxyprednisolone-l6,17 acétonide. Par chromatographie en couche mince de la liqueur-mère en 25 utilisant un gel de silice HFg^ comme adsorbant et un mélange d'acétate d'éthyle-chloroforme (1:1 en volume) comme solvant de développement, on décèle deux bandes en lumière ultraviolette avec des de- 0,2 et 0,5 respectivement. Par élution de la bande la plus polaire et recristallisation 30 et encore 64 mg de l6a-hydroxyprednisolone 16,17-acétonlde . A partir de la bande la moins polaire on obtient par élution et recristallisation 147 mg de l6ct-hydroxy-1 -déhydrocortexolone-16,17-acétonide, Exemple 8 35 On prépare la 1-déhydro-11a, lôc^dihydroxycortexolone à partir de la 16a-hydroxycortexolone par le procédé de l'exemple 7 en utilisant Aspergillus ochraceus ATCC n° 12337 et A. globiformis ATCC n° 8010. Le produit est un intermédiaire dans la préparation de la triamcinolone. 2000716 69 01221 15 2000716 Exemple 9 On prépare un intermédiaire de la production de la triamcinolone, la l6a-hydroxyprednisolone, à partir de la I6o&-hydroxycortexolone par le procédé de l'exemple 8 en 5 utilisant Curvularia luaata ATCC n° 12017 et A. oxydans ATCC n° 143^9. Exemple 10 On prépare la 1-déhydro-l6-déhydro-11o&-hydroxy-cortexone, qui est un intermédiaire dans la créaction de la 10 triamcinolone, à partir du 21-acétate de 16-déhydro-cortexone par le procédé de l'exemple 8 en utilisant Aspergillus ochraceus et A. ureafaciens ATCC n° 7562. Exemple 11 On prépare un mélange de 1-déhydro-11 a, l6a-dihydroxy-15 cortexolone-16,17-acétonide et de I6a-hydroxyprednisolone-16,17-acétonide, intermédiaires dans la production de la triamcinolone, à partir du 21-acétate de 16ctr-hydroxy-cortexolone-16,17-acétonide par le procédé de l'exemple 9 en utilisant Absidlà coerulea ATCC n° 14076 et A, simplex. 20 On utilïse 1 ml d'une suspension d'une croissance de surface obtenue à partir d'une culture de 2 semaines sur tranche de gélose de A. coerulea sur milieu B pour inoculer 50 ml du milieu C dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml. On incube la fiole inoculée sur une secoueuse rotative, à 280 25 cycles par minute sur un cercle de 2,54 cm de rayon, pendant 48 heures à 25°C. Simultanément mais séparément, on cultive A. simplex comme dans l'exemple 1. On Inocule 6 fioles de 500 ml contenant 100 ml du milieu E (3 fioles avec chaque culture) dans le second stade de croissance de culture pure, 30 on incube comme dans le premier stade. Le troisième stade en fiole, dans lequel on mélange les cultures, s'effectue avec 30 fioles de 500 ml contenant chacune 1,00-ml du milieu P et environ 35 nig de l6a-hydroxycortexolone-16,17-acétonide. On ajoute le stéroïde en suspension dans une solution aqueuse 35 de Tween 80, environ 2,0 ml par fiole, avant d'inoculer les fioles. On ajoute un total de 1059 mg de stéroïde . On effectue la fermentation en culture mixte pendant 95 heures, on réunit le contenu des fioles, on lave à l'eau, 69 01221 rt 2000716 on filtre à la trompe sur un tampon de clarification Seitz et on recueille un total de 3 520 ml de filtrat et d'eau de lavage. On lave le gâteau de mycélium résiduel avec 900 ml 5 d'acétone que l'on recueille séparément du filtrat et des eaux de lavage. On extrait le filtrat aqueux et les eaux de lavage trois fois avec dés portions de 1 200 ml de chloroforme. On combine les extraits chloroformiques, on lave deux fois avec 10 2 000 ml d'eau et on concentre sous pression réduite . On recristallise le résidu (1 » 01g) dans un mélange acétone-hexane \ pour obtenir 430 mg de l6a-hydroxy prednisolone-16,17-acétonidé. Par chromatographie en couche mince d'es liqueurs-mères sur gel de silice HF2^ en utilisant un système acétate 15 d'éthyle-chloroforme (1:1 én volume) comme solvant de développement, ori décèle deux bandes en lumière ultraviolette avec des Ef de 0,2 et 0,3 respectivement. L'élution de la bande la plus polaire et la recristallisation du résidu dans un mélange acétone-hexane, donne 25 mg de 11 a, l6a-dihydroxy-1-déhydrocorte-20 xolone-16,17-acétonide. Par élution de la bande la moins polaire et recristallisation, on obtient encore 89 mg de 16a-hydroxyprednisolone-16,17-acétonide. Par concentration des liqueurs de lavage acétoniques du gâteau de mycélium, puis distribution entre le chloroforme et 25 l'eau et évaporatlon de l'extrait chloroformique, on obtient 161 mg de résidu qui, par recristallisation dans un mélange acétone-hexane, donne 50,8 mg de l6c&-hydroxycortexolone-16,17-acétonide . Exemple 12 3 0 On prépare le 6ot-fluoro-16a-hydroxyprednisolone-16,17- acétonide, intermédiaire dans la préparation du 6a-fluoro-triamcinolone-16,17-acétonide, à partir du 6a-fluorotriam-cinolone-16,17-acétonide à partir du 6a-fluoro-l6a-hydroxy-cortexolone-16,17-acétonide par le procédé de l'exemple 8 en 35 utilisant Cunninghamella blakesleeana ATCC n° 8688a et A. tûmescens ATCC n° 6947 . Exemple 13 On prépare la 6a-fluoro-l6a-méthylprednisolone, 69 01221 2000716 intermédiaire dans la préparation de la 6otpfluorodexaméthasone, à partir de la 6a-fluoro-l6a-méthylcortexolone par le procédé de l'exemple 8 en utilisant Cunninghamella blakesleeana et A. terregens ATCC n° 13345 . 5 Exemple 14 On prépare la 1-déhydro-17a-hydroxyprogestérone à partir de la progestérone par le procédé de l'exemple 7 en utilisant A. simplex et Tricothecium roseum. Exemple 15 10 On prépare la 1-déhydrodésoxycorticostérone à partir de la progestérone par le procédé de l'exemple 7 en utilisant A. simplex et Wojnowicla gramlnis . 69 01221 16 2000716 REVENDICATIONS 1. Un procédé pour déshydrogéner et hydroxyler un stéroïde saturé en position 1,2 et possédant un atome 5 d'hydrogène remplaçable en position 11,16,17 ou 21, caractérisé en ce que l'on soumet ledit stéroïde simultanément aux enzymes d'une bactérie 1-déshydrogénante du genre Arthrobacter et d'un ou plusieurs micro-organismes hydroxylants dans une fermentation en culture mixte contenant une source 10 assimilable d'hydrate de carbone, des substances azotées, des sels minéraux et les facteurs de oroissance et on récupère le 1-déhydrostéroïde hydroxylé. 2. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme hydroxylant est une espèce du genre Streptomyces, Curvularia, Aspergillus, Absidia ou Cunnlnghamella. 3. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme 1-déshydrogênant est Arthrobacter aimplex et le micro-organisme hydroxylant est Streptomyces roseochromogenes. 4. Un procédé selon la revendication 3» dans lequel le stéroïde de départ est la 9a-fluorohydrocortisone. 5. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme 1 -déshydrogénant est A. simplex et le micro- ... organisme hydroxylant est Absidia coerulea. 6. Un procédé selon la revendication 5, dans lequel le stéroïde de départ est le l6a-hydroxycortexolone-l6,17-acénonide. 30 7. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme 1-déshydrogénant est A. simplex et le micro-organisme hydroxylant est Curvularia lunata . 8. Un procédé selon la revendication 7 dans lequel le stéroïde de départ est le I6a-hydroxycortexolone-l6,17- 35 acétonide . 9. Les stéroïdes comportant une double liaison en 1,2 et un groupe hydroxy en une pu plusieurs des positions 11, 16, 17 et 21, préparés par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8.