Brevet FR2007637A1 — publié le 19700109

Dans les laboratoires cliniques, on doit fréquemment déterminer la concentration d'aldoses dans les liquides du corps. La détermination quantitative de galactose ou de xylose et, en particulier de glucose, de préférence dans le sang, est extrême-5 ment importante. Les déterminations de glucose servent principalement à poser un diagnostic plussûr et à mieux contrôler la thérapeutique du Diabetes mellitus. En outre, la teneur en sucre du sang donne une indication de toute une série d'autres perturbations du métabolisme /"voir H. Hallmann, "Klinische Chemie und Mikros-10 kopie", page 437, G-eorg-Thieme-Verlag, Stuttgart (1950) _J. On connaît déjà un grand nombre de procédés de détermination d'aldoses, en particulier des procédés de détermination de la teneur en sucre du sang. Une série de procédés connus, par exemple ceux décrits dans 15 "Biochem. Zeitschrift", 135. 46 (1923) ; "Biochem. Zeitschrift", 320, 359 (1950) et"Miinch. med. Wochenschrift" 1301 (1928), reposent sur la mise en évidence de l'activité réductrice du glucose. Etant donné que, dans ces procédés dits de réduction, toutes les matières réductrices sont reprises, ces déterminations ne sont 20 toutefois pas spécifiques. Dans un autre procédé de détermination, on fait réagir le glucose avec des enzymes correspondants, par exemple l'oxydase de glucose, puis on mesure les produits formés par réaction enzyma-tique. La réaction enzymatique est spécifique, mais la réaction 25 à l'indicateur est susceptible d'être perturbée, par exemple, vis-à-vis d'agents réducteurs tels que l'acide ascorbique. C'est pourquoi, la teneur en glucose ne peut être déterminée exactement par le procédé à l'oxydase de glucose, par exemple, dans l'urine. En outre, tout comme les autres procédés enzymatiques, ce procédé 30 présente un inconvénient du fait que les enzymes ne sont stables que dans des conditions limitées. De plus, on connaît également la détermination du glucose par réaction avec de l'aniline, de l'acide p-amino-salicyligue, de la p-bromoaniline ou de la diphénylamine dans de l'acide acétique 35 glacial ou également d'autres acides. Cette réaction a été adoptée pour faire apparaître différents sucres séparés sur des chromato-grammes sur papier ou à mince couche / voir, par exemple "J.Chromî 13137 2 2007637 24, 117 (1966) et "Scand. J. Clin. Lab. Invest.", 20, 216 ( 1967) /• Toutefois, ce procédé est peu approprié pour déterminer des mélanges d'aldose non séparés, car la réaction n'est pas spécifique. Dans les conditions de cette détermination, aussi "bien les aldo-5 iiexoses, par exemple le glucose ou le galactose, que les aldopen-toses, par exemple le' xylose, de même que les cétoses, par exemple le fructose, absorbent dans le proche ultraviolet, de sorte que, par exemple, les pentoses ne peuvent être mesurés séparément des hexoses. 10 Actuellement, dans les laboratoires cliniques, on adopte généralement le procédé décrit, par exemple, dans "Nature" 185. 108 (1959) pour déterminer la teneur en sucre du sang. Suivant ce procédé, on emploie, comme réactif coloré de l'otoluidine dans de l'acide acétique glacial. Ce réactif peut être stabilisé par une 15 addition de thiourée assurant une protection contre l'auto-oxydation, de sorte qu'il possède une bonne stabilité ("Clin. Chim. Acta 2, 140 -1962-). Dans le procédé à 1'o-toluidine, le colorant se formant avec le glucose est mesuré à 620 nm, tandis que, par le procédé à 11 aniline/acide acétique glacial, il doit être mesuré 20 dans le proche ultraviolet. Le procédé à l1o-toluidine présente l'avantage d'être spécifique pour les aldohexoses lorsqu'on pratique une mesure à 620 nm, tandis qu'il est très spécifique pour les aldo-pentoses, lorsqu'on pratique une mesure à 480 nm. Par suite de sa bonne spécificité, le procédé-à l'o-tolui-25 dine appartient actuellement aux méthodes standards des laboratoires cliniques. Toutefois, il présente un grand inconvénient car on rencontre d'énormes difficultés par l'effet irritant de l'acide acétique glacial employé comme solvant. Dans presque toute la réalisation de l'analyse, c'est-à-dire lors du pipetage du.réactif, 30 lors de la réaction du glucose à 1002C dans le tube à essai, lors de la mesure au photomère et lors du nettoyage dps récipients, on est fortement incommodé par les odeurs. Lorsqu'on effectue quelques centaines d'analyses par jour, comme c'est habituellement le cas dans les grandes cliniques, les vapeurs d'acide acétique posent un 35 sérieux problème pour le personnel. On a déjà proposé d'èmployer de l'acide acétique à 50 $ au lieu d'acide acétique glacial ("Arztl. Labor." 177-180 -1967- ) pour réduire au moins partiellement 13137 3 2007637 les odeurs gênantes. Toutefois, ce solvant donne lieu à des durées réactionnelles plus longues et à des rendements de coloration beaucoup plus faibles, de sorte que ce procédé n'a pu être adopté dans la pratique. 5 A présent, on a trouvé que l'on pouvait éviter les inconvé nients précités pour déceler des aldoses avec de 1'o-toluidine lorsque le réactif contient des acides mono-, di- et/ou tricarboxy-liques comportant des groupes hydroxyles, éventuellement avec addition d'acide acétique glacial et/ou un unisseur supplémentaire. 10 En conséquence, la présente invention a pour objet un agent en vue de déterminer les aldoses, en particulier le glucose ou le galactose ou encore le xylose dans les liquides du corps, en employant des aminés aromatiques substituées en position o et non substituées en position oj., en particulier l1o-toluidine, en présence d'acides 15 et éventuellement d'eau et/ou de thiourée, cet agent étant caractérisé en ce qu'il contient des acides mono-, di- et/ou tricarboxy-liques comportant des groupes hydroxyles, éventuellement avec addition d'acide acétique glacial et/ou un unisseur supplémentaire. De plus, la présente invention concerne également un pro-20 cédé en vue de déterminer les aldoses, en particulier le glucose ou le galactose ou encore le xylose, dans les liquides du corps, en chauffant l'échantillon à examiner avec un réactif coloré, puis ' en procédant à une détermination par extinction du composé coloré formé, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on emploie l'agent 25 défini ci-dessus et décrit ci-après d'une manière détaillée. Un avantage majeur de ce nouvel agent réside dans le fait que l'acide acétique glacial employé jusqu'à présent est superflu ou n'est employé qu'en faibles concentrations et, lorsqu'on emploie le réactif, il ne se dégage aucune odeur gênante ou il ne se dégage 30 qu'une odeur gênante réduite tandis que, avec ce nouvel agent, on obtient une vitesse réactionnelle favorable et de bons rendements de coloration. En modifiant la concentration de ses différents constituants, le nouvel agent permet d'adapter les vitesses de coloration et la sensibilité dans de larges limites à chaque condition 35 requise. On peut rendre la réaction beaucoup plus sensible ou la stabilité du colorant formé beaucoup plus grande que dans les procédés connus jusqu'à présent. 13137 4 2007637 La formation aisée du colorant spécifique avec l'agent de la présente invention est étonnante car, par exemple, les acides gras halogénés, les thioacides, les acides dicarboxyliques non hy-droxylés ou également les acides inorganiques ne peuvent remplacer 5 les acides carboxyliques comportant des groupes hydroxyles, ayant une bonne activité et contenus dans l'agent de la présente invention. En outre, pour cette réaction, on ne peut recourir avec succès à des solvants organiques ou inorganiques sans addition d'acide car, avec ces solvants, on ne peut obtenir aucun rendement de colo-10 ration mesurable. Par contre, de façon étonnante, l'agent de la présente invention, dans lequel on emploie un groupe spécifique d'acides, éventuellement en combinaison avec un -unisseur, donne des résultats de mesure remarquables dans un procédé aisé. Parmi les aminés aromatiques substituées dans une position 15 o et que l'on emploie suivant l'invention, il y a celles qui sont aisément distillables. En outre, les aminés peuvent également être éventuellement substituées en position 2. et/ou 4 et/ou jj, en particulier par des radicaux alcoyles comportant jusqu'à 4 atomes de carbone, par exemple les radicaux méthyle, éthyle ou également n-20 propyle, isopropyle ou butyle. De même, la position o est, de préférence, substituée par un des radicaux alcoyles mentionnés ci-dessus. Sont particulièrement préférées, les aminés aromatiques qui ne sont substituées qu'en position o, par exemple 1'o-toluidine, 25 la 2-éthylaniline, la 2-n-propylaniline, la 2-isopropylaniline, la 2-n-butylaniline, la 2-isobutylaniline ou la 2-tert-butylaniline ou également une aniline substituée en position 2, J5, 2, 4 ou 2, 2 Par un radical alcoyle inférieur, en particulier un radical méthyle, éthyle, par exemple la 2,3-diméthylaniline, la 2,4-diméthyl-30 aniline, la 2,5-diméthylaniline, la 2,3-diéthylaniline, la 2,4- diéthylaniline et la 2,5-diéthylaniline. Ces aminés aromatiques employées de préférence, peuvent être aisément putifiées, par distillation, des produits d'auto-oxydation gênants et toujours contenus en quantités plus ou moins importantes. L'o-toluidine est particu-35 lièrement préférée. La concentration de 1'aminé influence les rendements de coloration et la stabilité du colorant formé, de sorte qu'en modifiant la concentration, on peut préparer un réactif 13137 5 2007637 adapté aux conditions requises. Les aminés substituées en position jo et non substituées en position o^, que l'on emploie dans l'agent suivant la présente invention, en particulier 1'o-toluidine, ne donnent avantageusement 5 des colorations qu'avec les aldoses. Dans ce cas, les aldohexoses forment un maximum à 620 nm (coloration verte) et ils peuvent être mesurés spécifiquement à cette longueur d'onde, tandis que les aldopentoses forment un maximum à 480 nm (coloration rouge brun). 10 Parmi les acides carboxyliques comportant des groupes hydro xyles et contenus dans l'agent de la présente invention, on emploie, de préférence, les acides à courte chaîne, principalement ceux: de 2 à 6 atomes de carbone. Soit appropriés, par exemple, les acides hydroxycarboxyliques 15 que l'on peut obtenir aisément à partir de matières naturelles, par exemple les acides hydroxycarboxyliques dérivant des sucres, en particulier des hexoses et des pentoses. A cet effet, il y a, par exemple l'acide gluconique et l'acide mannonique. Par ailleurs, parmi les acides monocarboxyliques hydroxylés, on emploie princi-20 paiement et, de préférence, les acides mono-hydroxymonocarboxy-liques, en particulier ceux de 2 à 4 atomes de carbone tels que l'acide glycolique et/ou l'acide lactique. Les acides dicarboxyliques employés dans le réactif suivant l'invention,contiennent, de préférence, 3-6, en particulier 4-6 25 atomes de carbone et 1-4 groupes hydroxy. Dans ce cas, l'acide ma-lique et/ou l'acide tartrique sont particulièrement appropriés. On peut employer les différents stéréoisomères de ces acides, par exemple l'acide d-malique, l'acide 1-malique, l'acide d-tartrique, l'acide 1-tartrique et/ou l'acide mésotartrique.. 30 De plus, des acides tricarboxyliques contenant des groupes hydroxyles tels que l'acide citrique peuvent également être contenus dans l'agent suivant l'invention. En tout cas, les acides hydroxy-tricarboxyliques augmentent sensiblement la viscosité de la solution du réactif, de sorte que, dans l'agent de la présente inven-35 tion, on emploie, de préférence, des acides mono- ou dicarboxyliques contenant des groupes hydroxyles. En employant différents acides carboxyliques contenant BAD ORIGINAL 2007637 des groupes hydroxyles dans l'agent de la. présente invention, on peut obtenir des vitesses réactionnelles différentes. De même, en modifiant les concentrations des acides carboxyliques employés contenant des groupes hydroxyles, on peut faire varier la vitesse 5 de formation de colorants et la sensibilité du réactif dans de larges limites et les adapter à chaque condition requise. En outre, les mélanges d'acides avec lesquels on peut empêcher la cristallisation du réactif, même à basses températures, se sont avérés particulièrement appropriés. En outre, il est recommandé d'employer 10 des acides pouvant être préparés ou purifiés aussi aisément que possible, en particulier des mélanges d'acides cristallisant convenablement tels que l'acide malique et l'acide tartrique ou également des mélanges de ces acides cristallisant convenablement avec des acides cristallisant moins bien tels que l'acide lactique ou 15 l'acide glycolique. Par exemple, on peut employer les mélanges suivants : acide malique/acide tartrique ; acide malique et/ou acide tartrique avec de l'acide lactique et/ou de l'acide glycolique ou également le mélange d'acide glycolique/acide lactique. La concentration dans laquelle les acides sont ajoutés, dépend notamment de 20 la solubilité des acides. Des acides d'une bonne solubilité, par exemple l'acide lactique, peuvent être contenus dans l'agent de l'invention en une concentration allant jusqu'à 90 tfo. Outre les acides mono-, di- ou tri-carboxyliques contenant des groupes hydroxyles, l'agent de l'invention peut encore contenir 25 de l'acide acétique glacial comme acide. Toutefois, en règle générale, afin d'éviter des odeurs gênantes, dans l'agent de la présente invention, l'acide acétique glacial n'est généralement pas employé ou n'est employé qu'en faibles concentrations, par exemple 10 fa ou éventuellement jusqu'à 20 ,-30 En outre, l'agent de la présente invention peut contenir un unisseur, en particulier sous forme de solvants organiques conte- « •y. nant des groupes hydroxyles et miscibles à l'eau. Dans ce cas, il est particulièrement préférable d'employer des alcools ou des po-lyols d'un point d'ébullition supérieur à 902, en particulier des 35 diols, par exemple des alcools inférieurs et, en particulier, des diols inférieurs ayant jusqu'à 4 atomes de carbone et un point d'ébullition de 902 0u plus. C'est ainsi que les diols de 2 à 3 13137 13137 7 2007637 atomes de carbone tels que 1'éthylène-glycol, le 1,2-propylène-glycol ou le 1,3-propylène-glycol ou encore des alcools de 3 à 4 atomes de carbone tels que le n-propanol, l'isopropanol ou le bu-tanol se sont avérés particulièrement appropriés. 5 D'autres unisseurs préférés sont les éthers monoalcoyl- glycoliques, en particulier les glycols inférieurs éthérifiés chaque fois avec un radical alcoyle inférieur tel que l'éther mé-thyl-, éthyl- ou également butyl-glycolique. Les éthers glycoliques particulièrement préférés dérivent de l'éthylène- ou du 1,2-propy-10 lèneglycol ou encore du 1,3-propylène-glycol, par exemple l'éther monométhylique (ou éthylique ou butylique) d'éthylène-glycol, l'éther monométhylique (ou éthylique ou butylique) de 1,2-propylène-glycol ou encore l'éther monométhylique (ou éthylique ou butylique) de 1,3-propylène-glycol. 15 De même,comme unisseur, on peut éventuellement employer également des mélanges des composés précités. Lorsqu'on emploie de l'éther monométhylique d'éthylène-glycol, le colorant se forme avantageusement d'une manière extraordinairement rapide. L'éthylène-glycol offre un avantage du fait que le colorant est extraor-20 dinairement stable en solution. Outre 1'unisseur qui est généralement constitué de solvants organiques contenant des groupes hydroxyles ou, dans quelques cas, par exemple, lorsqu'on emploie de l'acide lactique également au lieu de cet unisseur, de l'eau peut également être contenue dans l'agent 25 suivant la présente invention. En modifiant la teneur en eau dans le réactif, on peut adapter la vitesse de formation de colorant et la sensibilité du réactif à chaque condition requise.- L'emploi d'eau est particulièrement recommandable lorsqu'on doit empêcher la formation d'esters internes à partir des acides hydroxycarboxyliques 30 ou plutôt la formation d'esters à partir de ces acides avec les solvants organiques contenant des groupes hydroxyles. En outre, le composé coloré formé à partir de 1'aminé et de l'aldose est un peu plus stable en présence d'eau. En choisissant une concentration appropriée pour 1'unisseur, 35 l'eau, les acides carboxyliques contenant des groupes hydroxyles et/ou l'acide acétique glacial ou 1'aminé, on peut obtenir une formation optimum rapide d'un colorant stable pendant une plus longue 13137 8 2007637 période. le réactif peut encore éventuellement contenir d'autres solvants organiques ne gênant pas la formation de colorants et la mesure par extinction. L'addition d'une faible quantité de méthanol 5 (par exemple jusqu'à 15 en poids, de préférence environ 5 i» en poids) à l'agent suivant l'invention s'est avérée particulièrement appropriée pour réduire la viscosité. Parmi d'autres solvants appropriés que l'on peut ajouter en faibles quantités, il y a, par exemple, le dioxanne, le tétrahydrofuranne, les esters d'acide 10 glycolique, par exemple l'ester méthylique d'acide glycolique. Afin d'améliorer la stabilité, le réactif suivant l'invention peut encore contenir, en outre, de la thiourée. Les teneurs indiquées ci-après pour les différents conti-tuants mentionnés ci-dessus du nouvel agent se sont avérées parti-15 culièrement avantageuses (les indications ci-après sont des parties en poids pour 100 parties en poids de réactif). Mélange A Aminé aromatique substituée en position o et éventuellement en 20 position 2, et/ou 4 et/ou £ de préférence 1'o-toluidine 2-25,en particulier 4-15 parties Acides carboxyliques contenant des groupes hydroxyles, de préfé- 25 rence l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide malique et/ou l'acide tartrique 5-90, en particulier 15-50 parties 30 Unisseurs, de préférence solvants organiques contenant des groupes hydroxyles et ayant un point d'ébullition de 902 ou plus jusqu'à 85', en particulier 40-80 parties 35 Eau (éventuellement) jusqu'à 70, en particulier 0,2-10 parties Thiourée (éventuellement) jusqu'à 3, en particulier 0,02-0,5 partie 13137 9 2007637 Solvants organiques inertes supplémentaires (éventuellement) en particulier le méthanol jusqu'à 15» en particulier 5 parties 5 Solution B Dans la mesure où l'on emploie de l'acide acétique glacial comme acide supplémentaire, la teneur des différents composants varie de la manière suivante : Acide acétique glacial jusqu'à 30 parties 10 Acides mono-, di- ou tri-carboxyliques contenant des groupes hydroxyles jusqu'à 50, de préférence 10-30 parties Solvants organiques contenant 15 des groupes hydroxyles (de préférence d'un P.E. de 902 ou plus) comme unisseurs 30-80, de préférence 40-60 parties. 1'aminé aromatique substituée en position o, l'eau, la 20 thiourée et éventuellement Tin solvant organique inerte supplémentaire sont contenus dans la même concentration que dans le mélange A. Pour préparer l'agent suivant la présente invention, les composants peuvent être mélangés dans n'importe quel ordre. On 25 dissout avantageusement les acides carboxyliques contenant des groupes hydroxyles dans 1'unisseur employé, qui est généralement constitué d'un solvant organique contenant des groupes hydroxyles (de préférence, d'un P.E. de 902 ou plus), éventuellement avec de l'eau et/ou de la thiourée, puis on ajoute 1'aminé aromatique subs-30 tituée en position o. Les différents composants du réactif doivent être ajoutés sous forme pure afin de maintenir de faibles valeurs à blanc lors de la mesure. L'application de cet agent en vue de déterminer des aldoses, en particulier, du glucose, du galactose ou du xylose, dans les li-35 quides du corps, s'effectue de façon connue en soi. Comme liquides du corps, on peut examiner, en particulier, le sang,.le plasma, le sérum, le liquide céphalo-rachidien ou l'urine. Dans la plupart 13137 10 2007637 des cas, en particulièr lors de l'examen du sang, il convient d'éliminer tout.d'abord les protides de l'échantillon à analyser avec un agent habituellement employé à cet effet, en particulier l'acide trichloracétique, l'acide perchlorique ou l'acétate d'ura-5 nyle. Après élimination des protides, on sépare avantageusement le précipité d'albumine par filtration ou centrifugation avant d'effectuer la détermination d'aldoses. Lorsqu'on emploie du sérum, du plasma ou du liquide céphalo-rachidien et de l'urine, on peut éventuellement renoncer à l'élimination des protides. 10 Pour la détermination, on fait réagir une partie aliquote de la solution dont on a, de préférence éliminé les protides, avec une quantité mesurée d'une solution de l'agent suivant l'invention, puis on chauffe de la manière habituelle pendant une période déterminée à une température fixe, par exemple environ 1002. Pour 15 autant que la teneur en eau soit faible, les durées adoptées sont d'environ 4-10 minutes ou, pour autant que la teneur en eau soit plus élevée ou que la température soit plus basse, ces durées vont jusqu'à environ 60 minutes. La durée de chauffage exacte optimum -est déterminée chaque fois d'après la composition en cause du yéac-20 tif et la température de la réaction. On choisit la durée au cours de laquelle, à la température réactionnelle en cause, on atteint au moins 98 du rendement maximum de coloration. Toutefois, dans des cas d'urgence, on peut également travailler avec de plus courtes périodes, car les échantillons standard et analytiques sont tou-25 jours traités de la même manière, tandis que seul le rapport des extinctions intervient dans le résultat. Après le refroidissement du mélange, on mesure l'extinction de la solution vis-à-vis d'un échantillon à blanc à une longueur d'onde appropriée. Lorsqu'on emploie de 1'o-toluidine, on mesure, par exemple, et de préférence, 30 dans un intervalle de 540 à 700 nm, par exemple au maximum d'environ 620 nm. La teneur en aldose, par exemple eh glucose, est obtenue en comparant la valeur de mesure d'un échantillon standard d'une teneur connue. La réaction peut être effectuée de la manière habituelle, par exemple manuellement, dans des tubes à essai ou à 35 l'aide d'un dispositif automatique d'analyse, par exemple par ana- -logie au procédé indiqué dans "Clinica Chemica Acta" 11, 88 (1965). Pour la détermination du galactose, on oxyde préalablement 13137 n 2007637 et sélectivement le glucose éventuellement présent avec de l'oxydase de glucose. La mesure de la teneur en galactose a alors lieu à 620 nm tout comme lors de la détermination du glucose. Lors de la détermination du xylose, il est recommandé d'adopter préalable-5 ment l'oxydation à l'oxydase de glucose. La mesure de la teneur en xylose a lieu à 480 nm dans l'intervalle du maximum d'extinction du colorant rouge-brun. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention d'une manière plus détaillée. 10 Exemple 1 Réactif pour la détermination du glucose. a) Composition du réactif. 10 ml d'o-toluidine ou de 2-éthylaniline ou de 2-n- (ou iso-)-propylaniline ou de 2-n- (ou iso- ou tert-)-butylaniline 15 35 ml d'acide lactique (à 85 f°) ; 50 ml d'éther monométhylique d'éthylène-glycol ; 3 ml d'eau. b) Réalisation d'une détermination de glucose dans le sang. On mélange et centrifuge 0,05 ml de sang et 0,5 ml d'acide 20 trichloracétique à 3 Ensuite, on mélange 0,2 ml du résidu obtenu exempt de protide avec 2 ml du réactif décrit sub a) et l'on chauffe la solution pendant 10 minutes dans un bain-marie en ébul-lition. Après refroidissement, on mesure l'extinction de la solution à 578 nm vis-à-vis d'une valeur à blanc. Le calcul a lieu par 25 comparaison avec le résultat de mesure d'un échantillon standard. Exemple 2 Réactif pour la détermination de glucose. a) Composition du réactif 6 ml d'o-toluidine ou de 2,3-diméthylaniline ou de 2,3-diéthyl-30 aniline ; 30 ml d'acide lactique ; 60 ml de glycol ; 13 ml d'eau ; 0,1 g de thiourée. 35 b) Réalisation d'une détermination de glucose dans le sérum. On mélange 0,02 ml de sérum avec 2 ml du réactif décrit sub a) et l'on chauffe pendant 20 minutes à 9020. Après refroidisse 13137 12 2007637 ment, on mesure l'extinction à 623 nm vis-à-vis d'une valeur à blanc. On lit la teneur sur une courbe d'étalonnage que l'on a obtenue d'une manière correspondante avec des solutions d'une teneur connue en glucose. 5 Exemple 5 Réactif pour la détermination du xylose. a) Composition du réactif. 0,6 ml d'o-toluidine ou de 2,4-diméthyl-(ou diéthyl)-aniline, 1,2 g d'acide malique, 10 1,2 g d'acide glycolique, 6 ml d'éther monométhylique d'éthylène-glycol, 0,5ml de méthanol, 0,5ml d'eau 10 mg de thiourée. 15 b) Réalisation d'une détermination de xylose lors d'essais de charge de xylose. On fait réagir 0,1 ml d'urine avec 1 ml de tampon de phosphate (pli = 7,0 0,1 M) et, pour décomposer le glucose contenu dans l'échantillon, on fait réagir avec 0,5 mg d'oxydase de glucose^ODVAg) 20 On laisse reposer la solution pendant 30 minutes à la température ambiante et l'on mélange 0,2 ml de cette solution avec 2 ml du réactif d'o-toluidine décrit sub a) ci-dessus. On chauffe le mélange pendant 6 minutes dans un bain marie en ébullition ou pendant 30 minutes, à 8020. Après refroidissement, on mesure l'extinction à 25 480 nm dans une cuvette de 1 cm, vis-à-vis d'une valeur à blanc, la teneur est indiquée par comparaison avec la valeur de mesure d'un échantillon standard. Exemple 4 Réactif pour la détermination de galactose lors d'essais 30 de charge de galactose a) Composition du réactif Pour le réactif, on emploie les composants indiqués à l'exemple 3 a). b) Réalisation de la détermination de galactose lors d'essais de 35 charge de galactose. On fait réagir 0,1 ml de sang avec 1 ml d'une solution de 160 mg d'acétate d'uranyle et de 900 mg de chlorure de sodium 13137 13 2007637 dans 100 ml d'eau. On centrifuge et l'on mélange 0,5 ml du résidu obtenu exempt de protides avec 0,5 ml de tampon dé phosphate (pH =7,5 0,2 M) et, pour décomposer le glucose, on fait réagir avec 0,5 mg d'oxydase de glucose. On laisse reposer le mélange pendant une demi-heure. Ensuite, on chauffe 0,5 ml de cette solu-5 tion avec 5 ml de la solution du réactif pendant 8 minutes à 10020. Après refroidissement, on mesure l'extinction à 620 nm vis-à-vis d'une valeur à blanc (cuvette 2 cm), la teneur est indiquée par comparaison avec la valeur de mesure d'un échantillon standard. Exemple 5 10 Réactif pour la détermination de glucose. a) Composition du réactif. 0,60 ml d*o-toluidine ou de 2,5-diméthyl- (ou diéthyl)-aniline, 1 g d'acide malique, 1 g d'acide glycolique, 15 6,4 ml d'éther monométhylique d'éthylène-glycol, 0,5 ml de méthanol, 0,05 ml d'eau, 0,01 g de thiourée. b) Réalisation d'une détermination de glucose dans l'urine. 20 Pendant 5 minutes, on chauffe, à 1002C, 0,2 mi d'un échan tillon d'urine de diabétique diluée dans le rapport de 1:10, avec 2 ml du réactif décrit sub a). Après refroidissement, on mesure l'extinction à 632 nm vis-à-vis d'une valeur à blanc, puis, par comparaison avec un échantillon standard, on calcule la teneur en 25 glucose. D'une manière analogue, avec le réactif décrit sub a), on peut déterminer la teneur en glucose dans le plasma, le sérum ou le liquide céphalo-rachidien. Dans une forme de réalisation modifiée, dans le réactif 30 défini sub a), au lieu de 6,4 ml d'éther monométhylique d'éthylène-glycol, on emploie 3,2 ml de n-(ou iso)-propanol/3,2 ml d'éther monométhylique d'éthylène-glycol. la réalisation de la détermination de glucose avec le réactif modifié a lieu de la manière décrite sub b). 35 Exemple 6 Réactif pour la détermination de glucose.- 69 13137 2007637 a.) Composition du réactif 0,6 ml d'o-toluidine, 1 g d'acide malique, 1,5 g d'acide lactique (à 80 %), .5 6 ml d'éther monométhylique d1éthylène-glycol, 10 mg de thiourée. b) Détermination du glucose dans du sang complet. On fait réagir 0,1 ml de l'échantillon avec 1 ml d'une solution de 5 g d'acide trichloracétique dans 100 ml d'eau, ù» centri-10 fuge, on fait réagir 0,2 ml du résidu obtenu exempt de protides avec 2 ml du réactif décrit sub a) et l'on chauffe le mélange pendant 6-8 minutes dans un bain-marie en ébullition. Après refroidissement, on mesure l'extinction à 578 nm vis-à-vis d'une valeur à blanc. On effectue le calcul suivant une courbe d'étalonnage ou pas* 15 comparaison avec les valeurs de mesure d'un échantillon standard0 Exemple 7 Réactif pour la détermination de glucose, de galactose ou de xylose. Composition du réactif. 20 1 ml d'o-toluidine, 2 ml d'acide acétique glacial et 1 g d'acide malique, 5 ml d'éther monoéthylique d*éthylène-glycol, 1 ml d'eau. . 10 mg de thiourée. 25 La réalisation des déterminations avec le réactif a lieu d'une manière analogue à celle de l'exemple 4. Dans une variante de la composition indiquée ci-dessus, au lieu de 5 ml d'éther monoéthylique d'éthylène-glycol, on employa. a) un mélange de 4 ml d'éther monoéthylique d'éthylène-30 glycol et de 1 ml d'éther monométhylique (ou éthyliqns) de 1,2-propylène-glycol ou b) un mélange de 3 ml d'éther monométhylique d'éthylène-glycol et cLe 2 ml d'éther monométhylique (ou éthylique/ ûe 1,3-propylène-glycol ou 35 c) un mélange de 4,5 ml d'éther monométhylique d*éthylèn@= glycol et de 0,5 ml de butanol. On effectue également les déterminations d'aldoses avec ces réactifs d'une manière analogue à celle de l'exemple 4.- BAD ORIGINA 69 13137 15 2007637 Revendicat ions 1. Agent en vue de déterminer les aldoses, en particulier le glucose, le galactose ou le xylose, dans les liquides du corps en employant des aminés aromatiques substituées en position o 5 et non substituées en position oJ_, en particulier 1 • o-toluidine, en présence d'acides et éventuellement d'eau et/ou de thiourée, caractérisé en ce qu'il contient des acides mono-, di- et/ou tricarboxyliques contenant des groupes hydroxyles, en ajoutant éventuellement de l'acide acétique glacial et/ou un unisseur 10 supplémentaire. 2. Agent suivant la revendication 1., caractérisé en ce que, comme acides mono-, di- ou éventuellement également tri-carboxyliques contenant des groupes hydroxyles, il y a des acides hydroxy-monocarboxyliques inférieurs, de préférence des acides mono- 15 hydroxarboxyliques et/ou des acides mono- ou dihydroxycarboxy-liques inférieurs, en particulier l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide malique, l'acide tartrique et/ou l'acide citrique. 3. Agent suivant les revendications 1. et 2., caractérisé en ce 20 que l'acide malique et/ou l'acide tartrique sont contenus éventuellement en mélange avec de l'acide lactique et/ou de l'acide glycolique. 4. Agent suivant les revendications 1. à 3., caractérisé en ce que, comme unisseurs, on emploie des solvants organiques contenant 25 des groupes hydroxyles et ayant de préférence, un point d'ébullition de 902 ou plus, en ajoutant éventuellement une faible quantité de méthanol. 5. Agent suivant les revendications 1. à 4., caractérisé en ce que, comme unisseurs, on emploie des éthers monoalcoylglyco- 30 liques et/ou des glycols, en particulier des éthers monoalcoyl-glycoliques inférieurs et/ou des glycols inférieurs. 6. Agent suivant la revendication 5., caractérisé en ce que, comme unisseurs, on emploie les éthers monométhylique et/ou éthylique d'éthylène-glycol et/ou 1'éthylène-glycol et/ou le 35 propylène-glycol. 7. Agent suivant les revendications 1. à 6., caractérisé en ce que 69 13137 16 2007637 les composants suivants sont contenus dans les parties en poids approximatives indiquées ci-après par 100 parties* en poids de réactif : 2-25 parties d'une aminé aromatique substituée en position 5 o et non substituée en position oJ_, en particulier l'o- toluidine, 5-90 parties d'un ou plusieurs acides mono-, di- ou tri-carboxyliques contenant des groupes hydroxyles, éventuellement jusqu'à : 10 85 parties de solvants organiques contenant des groupes hydroxyles, en particulier ceux d'un point d'ébullition de 902 ou plus et éventuellement jusqu'à 70 parties d'eau 15 éventuellement jusqu'à 3 parties de thiourée, éventuellement un solvant organique supplémentaire : jusqu'à 15 parties. 20 8. Agent suivant la revendication 7,. caractérisé en ce qu'il contient chaque fois environ : 10 parties en poids d'o-toluidine, 30 parties en poids d'acide glycolique, 55 parties en poids d'éther monométhylique d'éthylène-gly-25 col, 5 parties en poids d'eau. 9. Agent suivant la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient chaque fois environ : 6 parties en poids d'o-toluidine, 30 40 parties en poids d'acide lactique, 60 parties en poids de glycol, i 13 parties en poids d'eau, 0,1 partie en poids de thiourée. 10. Agent suivant la revendication 7., caractérisé en ce qu'il 35 contient chaque fois environ : 0,6 partie en poids d'o-toluidine, 2,4 parties en poids d'acide malique/acide glycolique, 69 13137 17 2007637 de préférence dans le rapport 1:1, 5-7 parties, de préférence environ 6,4 parties en poids d'éther monométhylique d'éthylène-glycol, jusqu'à 1, de préférence 0,5 partie en poids de métha-5 nol, jusqu'à 1, dé préférence environ 0,5 partie en poids d'eau, jusqu'à 0,1 de préférence environ 0,01 partie en poids de thiourée. 11. Agent suivant les revendications 1 à 6., caractérisé en ce qu'il contient chaque fois environ : 10 2-25 parties en poids d'une aminé aromatique substituée en position o, en particulier 1'o-toluidine, jusqu'à 50, de préférence 10-30 parties en poids d'un ou plusieurs acides mono-, di- ou tricarboxyliques contenant des groupes hydroxyles, 15 jusqu'à 60, de préférence 40-50 parties en poids d'acide acétique glacial, 30-60 parties, de préférence 40-50 parties en poids d'un solvant organique contenant des groupes hydroxyleB et ayant un point d'ébullition de 902 ou plus, 20 éventuellement jusqu'à 30 parties en poids d'eau, éventuellement jusqu'à 3 parties en poids de thiourée. 12. Procédé de détermination d'aldoses, en particulier de glucose, 25 de galactose ou de xylose, dans les liquides du corps, par chauffage de l'échantillon avec la solution d'une aminé aromatique substituée en position o, puis par détermination par extinction du colorant formé, caractérisé en ce qu'on emploie l'agent suivant les revendications 1. à 11. 30 13« Procédé suivant la revendication 12 en vue de déterminer le glucose, le galactose ou le xylose dans des liquides du corps dont on a éventuellement éliminé les protides," en particulier le sang, le plasma, le sérum ou l'urine, caractérisé en ce qu'on emploie l'agent suivant les revendications 1. à 11.-35 14. Procédé suivant les revendications 12. et 13. caractérisé en ce que, comme aminé aromatique substituée en position o, on emploie 1'o-toluidine et l'on mesure l'extinction lors de la 69 13137 18 2007637 détermination d'aldohexoses dans l'intervalle de 560 à 680 nm et, lors de la détermination d'aldopentoses, dans l'intervalle de 440 à 520 nm.