Brevet FR2011233A1 — publié le 19700227

* 2011233 69 20472 La présente invention concerne un procédé de préparation de l'amylose et la réduction de ce corps en amylitol. Elle se rapporte plus particulièrement à un procédé de préparation d'amy-lose de grande pureté par prise en gelée et décomposition par la 5 chaleur d'une suspension d'amylopectine, soumise ensuite à l'action d'une cÇ-1,6-glucosidase. Elle a également pour but l'hydrogénation catalytique de l'amylose ainsi recueillie sous forme de précipité, en vue de l'obtention d'amylitol que l'on purifie ensuite par passage au travers d'une résine échangeuse d'ions pour 10 obtenir un produit de grande pureté. L'amylopectine, constituant principal de l'amidon, est obtenu à l'état relativement pur sous forme d'amidon glutineux de riz ou d'amidon cireux de maïs, alors que l'amylose, autre constituant important, ne se trouve pas à l'état libre dans la nature et 15 ne peut être séparé facilement de l'amidon. La séparation de l'amylose et l'amylopectine de lfamidon est réalisée de différentes manières, par exemple par prise en gelée de l'amidon, amidon de blé, de pomme de terre,etc. dans l'eau, suivie d'une précipitation fractionnée de cette gelée d'amidon par 20 refroidissement (brevet anglais 1 014 105), ou par précipitation fractionnée à l'aide de sels, tels que sulfate de magnésium CO) brevets américains 2 829 987, 2 829 988; 2 829 989 et 2 829 990 ; S. AUGUSTAT, Staerke 12, 145 (1960)3» où bien à l'aide de butanol ou similaire C (1) T.J. SCHOCH, Cereal Chem. 18, 121, (1941) et 25 J. Am. Chem. Soc. 64, 2957 (1942), (2) brevet américain 2 803 568 et (3) J. MJETGEERT, Adran. Carbohydrate Chem» 16, 299 (1961) 3» Toutefois, aucun de ces procédés ne donne de l'amylose de grande pureté. La longueur de chaîne de l'amylose ainsi obtenue est extrêmement irrégulière et le degré de polymérisation du glucose oscille 30 entre 300 et 700. C'est pourquoi cet amylose ne peut donner par réduction un polyol stable doté d'une longueur de chaîne uniforme, et même si l'amylose est réduit, on obtient un produit aux propriétés trop complexes pour des utilisations précises. En conséquence la présente invention permet de préparer 35 de l'amylose à bas poids moléculaire et longueur de chaîne uniforme, par hydrolyse enzymatique des liaisons glucosidiques oC-1,6, qui forment les ramifications de la structure ramifiée de l-'amylopectine. Elle permet également de préparer de 1'amylitol, polyol intéressant pour l'industrie, à bon marché, par réduction de l'amylose. 40 L'étude a d'abord porté sur la fabrication d'amylose a ®AD ORIGINAL 69 20472 2011233 bas poids moléculaire et ayant un degré de polymérisation du glucose voisin de 20, ce qui correspond à la longueur de la chaîne ramifiée, par hydrolyse sélective au moyen d'un enzyme, des liaisons oC-\,6-glucosidiques formant les ramifications de l'amylopectine. 5 Parmi les enzymes capables d'hydrolyser les/iiaisons eC-1 ,6-glucosidiques, on trouve les i/-1,6-glucosidases (pullulanase) (1) produits par des bactéries Ç^Hans BENDER, Kurt WALLEMFALS, Biochemische Zeitschrift, 334, 79-95 (1961), demande de brevet japonais n° 34468/67^, et des c(-1,6-glucosidases (2) produites par 10 une souche du genre Pseudomonas (Pseudomonas amylodelamosa A3CC 21262, demande de brevet n° PV 155 570), ainsi qu'une K-1,6-gluco-sidase obtenue à partir d'Escherichia intermedia (ATCC 21 073) ainsi que celles qui sont décrites dans la demande de brevet en France n° 69 - 09811 . 15 Quant a l'amidon, il est possible d'en utiliser différen tes variétés, amidon de maïs, de pomme de -ferre, etc. mais il est préférable, pour obtenir un amylose possédant un degré uniforme de polymérisation du glucose, d'utiliser un amidon ne contenant que de l'amylopectine, par exemple un amidon cireux de maïs, ou un amidon 20 glutineux de tiz. Le procédé d'hydrolyse de l'amidon en amylose a été décrit dans la demande de brevet français n° 69 - 09810. Il consiste a faire prendre en gelée aux environs de 100°C, de l'amidon à une concentration comprise entre 5 et 20%, et de préférence entre 5 et 25 10% ; le pH du gel obtenu est alors ajusté à la valeur optimale pour l'enzyme (p(-1,6-glucosidase) considéré, à savoia: entre 5 et 7 pour l'enzyme (1) et entre 4 et 6 pour l'enzyme (2) mentionnés ci-dessus. On ajoute à ce gel une solution aqueuse à 5 à 10%, ou de préférence à 5%, d' Of-1,6-glucosidases à raison de 20 à 50 unités par gramme 30 d'amidon. Le mélange est maintenu pendant 24 a 48 heures entre 40 et 50°C, de préférence 45°C, et l'amylose produite précipite. Si cette précipitation ne s'effectue pas bien, on concentre et garde au froid pendant 24 heures? et la précipitatioi^a lieu. Le produit précipité, après centrifugation, séparation et lavage à l'eau, donne 35 un amylose avec un degré de polymérisation du glucose voisin de 20. On réduit cet amylose de laAanière suivanteo On ajoute de l'eau pour obtenir une concentration en amylose comprise entre 7 et 15%, de préférence voisine de 10%. Cette solution aqueuse est alors chauffée entre 95° et 100°C afin de disperser l'amylose, puis pla-40 cée dans un autoclave avec addition d'un catalyseur au nickel, tel ®AD ORIGINAL 69 20472 3 2011233 que nickel de Raney, à l^proportion de 10% environ deAa charge. Il se produit alors, pendant .5 à 7 heures, une réaction d'hydrogénation avec agitation à une température égale ou inférieure à 100°C, et introduction d'hydrogène sous pression né dépassant pas 100 kg/ 2 2 5 cm , de préférence comprise entre 70 et 80 kg/cm . Lorsque l'absorption d'hydrogène est terminée, la charge a absorbé une quantité prévue de 1 mole d'hydrogène qui équivaut à 1 mole d'amylose chargé. Le catalyseur au nickel est éliminé par centrifugation, et le produit obtenu désionisé au moyen d'une résine échangeuse de 10 cations fortement acide, telle que ^IR-120, IRA-411 ou IRA-68 (produits commercialisés par ROHM'& HAAS), puis concentré. On obtient ainsi un polyol, ou amylitol. Les propriétés de cet amylitol, telles qu'indiquées par les examens, sont décrites en détail dans ce qui suit, en liaison 15 avec les dessins annexés sur lesquels : Fig. 1 est un graphique illustrant la solubilité de 1'amylitol préparé par le procédé selon l'invention ; » Fig. 2 est un graphique illustrant la viscosité ; Fig. 3 est un graphique illustrant la résistance à l'a- 20 cidité j et la Fig. 4 un graphique illustrant la résistance à l1 alcalinité. Pour l'examen de la solubilité, un échantillon est dissous à chaud à une concentration comprise entre 10 et 20%, et est 25 abandonné toute une nuit dans une enceinte thermostatique. Après précipitation la teneur totale en sucre du liquide surnageant est mesurée à l'aide d'un réactif à l'anthrone. Les résultats donnés dans la figure 1 (en abscisse la température en °C j en ordonnée la solubilité en mg/ml, la courbe A correspond à des amyloses de D#P. 30 (degré de polymérisation) 24, la courbe B à 1'amylitol de D.P 24 et la courbe C aux amyloses de D.P 21,8) montrent que la solubilité dans l'eau de l'amylitol est supérieure à celle de l'amylose dont il provient par réduction. En ce qui concerne l'étude de la viscosité, l'échantil-35 Ion à examiner est dissous à chaud en quantités respectives de 1,2 à 3g de produit sec, dans 20 ml d'eau chacun, pour préparer des solutions aqueuses à 5, 10 et 15%. Les viscosités de ces solutions sont déterminées, dans des enceintes réglées thermostatiquement à des températures différentes, avec un viscosimètre de type-B muni d* 40 une allonge B-1 et fonctionnant à 60 tours/minutes. On constate d* 69 20472 4 2011233 après la figure 2 (en abscisse la température en °C ; en ordonnée la viscosité en centipoise (C.P.) ; courbes A = solution à 15% d* amylose, B = solution à 10%, C * solution à 5% ; courbes D = solution a 15% d'amylitol, H = solution à 10%, F = solution à 5%) que 5 la viscosité de 1'amylitol est inférieure à celle de l'amylose. Pour étudier la résistance à l'acidité et à l'alcalinité on procède de la manière suivante : des portions de 2 ml' de solution à 0,1% du produit à essayer additionnées de 4 ml de solution acide ou alcaline à des valeurs de pH différentes, sont pla-10 cées dans des tubes à essai dans des enceintes thermostatiques à 55°C et à 100°C. Ces mélanges de solutions sont prélevés et neutralisés au bout de laps de temps de 1, 2, 3, 5, 7 et 24 heures. Les teneurs directes en sucre réducteur de l'amylose sont évaluées par la méthode de SOMOGYI-NELSON. Sur la figure 3, qui concerne 15 la résistance à l'acidité, Cenabscisse, durée en heure de l'hydrolyse ; en ordonnée sucre réducteur x 100 on opère sur amylose sucre total courbes A', B* et c' et amylitol courbes A, B et C de D.P = 24 j les courbes A et A* correspondent à l'hydrolyse menée à pH 1 et 20 100°C ; les courbes B et &' à pH 2 et 100°C ; les courbes C et C-* à pH3 et 100°C, et également à pH 1 à 4 à 55°C on constate que la réaction menée pendant 7 heures, à 100°C, provoque l'hydrolyse . de l'échantillon à pH 1, à 80% (courbe A), dé l'échantillon à pH 2, à.10 a 15% (courbe B;) et de/L'échantillon à pH3, à 2 à 5% (courbe C). 25 Ces résultats révèlent une tendance pratiquement identique à celle qui est observée avec l'amylose avant réduction. Par des moyens identiques à ceux qui ^.ont été utilisés pour la détermination de la résistance à l'acidité,on détermine la résistance à l'alcalinité des échantillons en fonction de leurs te-30 heurs totales en sucre. Il ressort de la figure 4 Cen abscisse le temps en heures ; en ordonnée le sucre total (r) ; on a opéré sur l'amylitol, courtes A, B et C, et l'amylose courbes A', B*, Û', D', A", Bn et C" ; les courbes A et A* correspondent à une décomposition à pH 12,8 et 100°C, B et B' à pH 11,75 et 100CC, la courbe C' 35 à pH 9,45 et 100°C, D* à pH 6,89 et une température de 100°C et de 55°C, C à la fois à une température de 100°C pour des pH de 6,89 à 9,45,. et a une température de 55°C pour des pH de 6,89 à 12,8, A" à pH 12,8 et 55°C, B" à pH 11,75 et 55°C, et C» à pH 9,45 et 55°C } que la comparaison des teneurs totales en sucre après une période 40 de 24 heures à des températures et des valeurs de pH différentes, 69 20472 5 2011233 montre que si l'échantillon réduit (amylitol) est grandement décomposé à 100°C pour 'des valeurs de pH comprises entre 11,75 et 12,8, l'échantillon non réduit correspondant l'est encore beaucoup plus. On constate également que si l'échantillon non réduit est 5 quelque peu décomposé à pH 9,45, pour le composé réduit correspondant il n'y a pratiquement pas de changement entre les pH £,89 et 9,45. A 55°C, l'échantillon réduit demeure inchangé jusqu'à pH 12,8, mais son correspondant non réduit est décomposé de façon appréciable à pH 11,75 et 12,8 et même à pH 9,45 quoique de façon 10 moins importante. Ceci témoigne du fait que la stabilité vis-à-vis de l'alcalinité est obtenue par la réduction. Ainsi qu'il a été dit précédemment, 1'amylitol préparé par le procédé selon l'invention est chimiquement stable et peut avoir une solubilité et une viscosité différentes de celles de 1' 15 amylose correspondant. De plus, les polysaccharides ainsi obtenus possèdent une longueur de chaîne uniforme, ou des propriétés uniformes et de la stabilité dans les qualités, ce que l'on n'avait jamais pu obtenir par les techniques antérieures. En raison de ces avantages, les produits seloh la présente invention ont- une grande 20 importance du fait qu'ils conviennent pour un grand nombre d'applications industrielles, ainsi que commevjfnatière première pour la synthèse de nombreux dérivés. En outre, ils peuvent être préparés avec des rendements sensiblement élevés présentant des avantages pratiques. 25 L'invention est illustrée noh limitativement par les exemples qui suivent. EXEMPLE 1 Préparation de l'amylose On fait prendre en gelée, à chaud et sous agitation, de 30 l'amidon cireux de mais (fourni par NIPPON SHOKUHIN KOGYO CO) sous forme de suspension à 5%. Cette solution prise en gel est totalement dispersée par chauffage à 125°C pendant 30 minutes, dans un four à pression. Le produit obtenu est refroidi à 45°C, son pH ajusté à 4,5, et l'on^ajoute, à raison de 50 unités/g d'amidon, une solution 35 dta-l ,6-glucosidase obtenue à partir d'une souche de Pseudomonas. La réaction s'effectue pendant 48 heures à 45°C, puis on laisse le mélange reposer au réfrigérateu^endant toute une nuit. L'amylose précipité pendant cette période. On la sépare par décantation. Le liquide surnageant est porté sous pression réduite à une concentra-40 tion de 10% pour avoir une nouvelle précipitation que l'on sépare 69 20472 6 2011233 également. Ces précipités d1amylose sont purifiés par lavage à 1' eau, puis sèches. Les degrés de- polymérisation de ces produits, déterminés par le procédé d'estimation des groupes terminaux par oxydation au periodate, sont de 25 pour le premier précipité, et 21 5 pour le second. L'étude du degré de ramification selon le^rocédé de décomposition de SMITH donne une valeur de 1,5 pour le premier précipité et 1,3 pour le second, indiquant ainsi que tous deux sont des molécules à chaîne linéaire pratiquement sans ramification. On obtient ainsi un amylose de faible poids moléculaire avec des 10 chaînes linéaires de longueur uniforme. EXEMPLE 2 Réduction de l'amylose On place 44 g d'amylose ainsi préparée (teneur en eau 9,3%) et dissoute à chaud dans 435 g d'eau, avec 5 g d'un cataly-15 seur au nickel de Raney (produit commercialisé par NIKKI KAGAKU sous le nom de "N 154"), dans un four à prêssion équipé d'un agitateur. La réaction a lieu avec de l'hydrogène gazeux à 95°—100°C, sous pression de 70-80 kg/cm2 avec une vitesse d'agitation à 800 tours/minute. Au bout de 5 à 7 heures, l'absorption d'hydrogène 20 atteint le point de saturation® La quantité d'hydrogène absorbé est égale à celle qui a été calculée. Le catalyseur au nickel est éliminé par supercentrifugation à 80°C, puis le produit obtenu est refroidi. Par précaution, on le désionisé par addition de résines é-changeuses de cations fortement acides IR—120 et de résines échan— 25geuses d'anions fortement basiques IRA-41V. Les résines sont éliminées et le résidu est concentré sous vide et séché. L'amylitol se présente sous forme de poudre incolore. 69 20472 7 2011233 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation à partir d'amidon d'amylose a bas poids moléculaire et longueur de chaîne uniforme, caractérisé en ce que l'on soumet l'amylopectine de l'amidon à l'action d'une z^-1,6-glucosidase qui hydrolyse sélectivement les liaisons ç(-1 ,6 -glucosidiques constituant les ramifications de l'amylopectine . 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sour ce d'amylopectine est constituée par de l'amidon cireux de maïs ou de l'amidon glutineux de riz. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que avant d'être soumise à l'action enzymatique, l'amylopectine est mise en suspension dans l'eau, prise en gelée par la chaleur et dispersée par chauffage à 125°C pendant 30 minutes environ. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1* 0(-1 ,6-glucosidase provient soit d'une souche d'Aerobacter, soit d'une souche de Pseudomonas. 5. Procédé de préparation d'amylitol par réduction de l'amylose obtenu par le procédé selon revendication 1 à 4, caractérisé en ce que l'on ajoute à l'amylose dissous à chaud dans l'eau, un catalyseur au nickel et l'on y introduit ensuite de l'hydrogène gazeux a une température comprise entre 95 et 100°C et une 2 pression comprise entre 70 et 80 kg/cm . 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le ca talyseur au nickel est un catalyseur au nickel de Raney. 7. Produitnouveau obtenu par le procédé selon revendications 5 et 6.