Brevet FR2003207A1 — publié le 19691107

formule : 5 10 dans laquelle R est un groupe hydroxy ou acyloxy, R1 est un groupe hydroxy et le présente l'une des structures suivantes : 0 OH OH OH " , ' H , ' ,-CH_ et ' ,-CH=CH_; le groupe acyle dérive d'un -C- -C- -C- 3 -C- 2 15 acide carboxylique, de préférence radical acyle d'un acide carboxylique contenant moins de 13 atomes de carbone, comme par exemple les acides alcanofques (corne les acides acétique, propionique, butyrique, oenanthique et laurique), les acides alcénolques, les acides arylcarboxyliques monocycliques (cooae les acides benzolque et m-toluique), les acides arylalca-20 tioïquee inférieurs monocycliques (comme les acides phénylacétique et /S -phénylpropionique), les acides cycloalcanecarboxyliques et les acides cycloalcènecarboxyliques. L'invention a pour objet de nouveaux composés utilisés comme produits intermédiaires dans la préparation de nouvelles hormones 25 oestrogènes. On réalise les objectifs de l'invention en soumettant les 19-norstéroïdes de formule : 35 âans laquelle le G~ ast défini comme ci-dessus, à l'action d'enzymes des microorganismes appelés Corynespora melonis et Corynespora cassiicola. On prépare ainsi le produit intermédiaire 8 6-hydroxylé de l'invention. On soumet ensuite ce produit inte :médiaire à des enzymes du microorganisme La présente invention concerne de nouveaux stéroldes de 69 05896 2 2003207 Corynebacterium simplex pour obtenir les produits finals aromatisés de 11 invention. Comme autres réactifs de départ de l'invention que l'on peut utiliser, on peut citer la 19-norandrostènedione, la 19-nor-17«-5 méthyltestostérone et la 19-nor-17«-éthynyltestostérone. On a découvert que l'on peut utiliser selon l'invention un microorganisme l-déshydrogénant pour l'aromatisation du noyau A, même si la position 10 n'est pas substituée. En plus du microorganisme que l'on peut utiliser comme ci-dessus, on peut citer d'autres organismes 1-déshy-10 drogénants, à savoir Nocardia restrictus (ATCC 14887), Pseudomonas testosteroni (ATCC 11996), Cylindrocarpon radicicola (ATCC 11011), Mycobacterium rhodochrous (ATCC 4277). En général, les conditions de culture des microorganismes de l'invention sont les mêmes que les conditions de culture de différentes 15 autres bactéries utilisées pour la préparation d'acides organiques ou de glycols, c'est-à-dire que le microorganisme est à croissance aérobie sur ou dans sm milieu dé fermentation que l'on choisit convenablement. Un milieu approprié consiste essentiellement en une source de facteurs azotés, ainsi qu'en une source de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate 20 de carbone (comme le saccharose, les mélasses, le glucose, le maltose, l'amidon ou la dextrine), un acide gras, une graisse et/ou le stéroîde lui-même. Cependant, le milieu comprend de préférence une source de carbone et d'énergie assimilable en plus du stéroîde. La source de facteursazotée peut être de nature organique (par exemple, farine de soja, liqueur de 25 trempage du mats, extrait de viande et/ou solubles de distillerie) ou de nature synthétique,(c'est-à-dire qu'elle peut être constituée par de simples composés organiques et minéraux synthétisables tels que des sels d'ammonium, des nitrates alcalins, des aminoacides ou de 1 'urée). On doit maintenir une alimentation en air stérile suffi-30 santé au cours de la fermentation, par exemple en opérant selon les procédés classiques d'exposition à l'air d'une grande surface du milieu ou en utilisant des cultures aérées submergées. On peut ajouter lè stéroîde à la culture au cours de la période d'incubation, ou on peut "1'incorporer dans le milieu avant stérilisation ou inoculation. 35 On peut utiliser les composés de l'invention comme agents oestrogènes inhibiteurs de gonadotrophine; on utilise ces composés en thérapeutique de remplacement dans la ménopause et également dans le contrôle de la fertilité chez les femmes et les animaux. Ces composés ont également une activité antioestrogène, et par conséquent on devrait les utiliser dans 69 05896 3 2003207 les tumeurs du sein ou de la mamelle et dans les tumeurs utérines. On peut préparer des comprimés avec ces composés en opérant selon des procédés connus,et on peut les administrer à raison de 0,10 à 10,0 mg/kg du poids du corps et par jour dans le cas de la femme et à raison de 0,05 à 5 mg/kg 5 du poids du corps et par jour dans le cas d'animaux (par exemple des vaches). On peut administrer les composés sous forme de comprimés conme cifdessus ou d'injectables Dans ce cas, on les dissout dans une huile végétale (par exemple, sésame) ou une solution saline,et l'adminis-tration se fait par voie parentérale. 10 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute fois en limiter la portée. Dans ces exemples, les températures s'entendent en degréBcentigrade. EXEMPLE 1 8 ^-hydroxy-19-nor-A^-androstène-3,17-dione 15 A. Fermentâtiôn. On réalise une croissance en surface avec chacune des quatre cultures en tranche sur gélose âgées de 10 jours de Corynespora melonis (CBS), Centraal Bureau voor Schimmel Cultures, Baârn, Pays-Bas; la tranche de gélose contient le milieu nutritif (A)suivant : Grammes 20 Farine d'avoine 20 Concentré de tomate 20 (ajouter 500 ml d'eau du robinet bouiÏLante) Gélose 15 Eau du robinet 500 ml 25 On met en suspension cette tranche dans 5 ml d'une solu tion aqueuse de laurylsulfate de sodium à 0,01%. On utilise des portions de 1 al de la suspension pour inoculer 12 flacons coniques de 250 ml, contenant chacun 50 ml du milieu stérilisé suivant (B) : Grammes 30 Glucose 30 Farine de soja 20 Huile de soja 2,2 CO^Ca 2,5 Eau distillée complément à 1 litre 35 Après 72 heures d'incubation à 25°C avec agitation rota tive en continu (280 tr/mn, course de 5,8 cm), on effectue des transferts de 5% en volume dans 80 fioles coniques de 250 ml contenant chacune 50 ml du milieu stérilisé suivant (C) : 69 05890 4 200320? Grammes Dextrose 10 Liqueur de trempage du maîs 6 P04H2Nh4 3 5 Extrait de levure 2,5 C03Ca 2,5 Eau distillée complément à 1 litre Après une incubation de 24 heures, en opérant dans les mêmes conditions que ci-dessus, on introduit le stéroîde (500 micro-10 grammes/ml); à cet effet, on ajoute en plus dans chaque flacon 0,25 ml d'une solution stérile (100 mg/ml) de 19-nor-^^-androstène-3,17-dione dans le N,N-diméthylformamide. On obtient par fermentation un total de 2,0 g. Après une nouvelle incubation de 6 heures, en opérant dans les mêmes conditions que ci-dessus, on recueille le produit de la fermentation. 15 On réunit le contenu des flacons pour obtenir unTOlume total de 4500 ml. B. Isolement et caractérisation. Oti procède à trois extractions successives du mélange de bouillon de fermentation avec à chaque fois une fraction de 900 ml de chloroforme. On lave à l'eau les mélanges d'extraits chlorofor-miquesque l'on sèche en les faisant passer sur du sulfate de sodium anhydre 20 et que l'on concentre à siccité sous vide; on obtient ainsi 900 mg de produit brut. On procède à la chromatographie de ce produit sur 24 plaques de verre de 40,64 x 20,32 mm, enduites d'une couche mince de Gel de Silice GF (Merck) d'épaisseur 1 mm, en opérant avec du chloroforme contenant 5% en volume de méthanol comme développateur du substrat, c'est-à-dirë la 19-25 norandrostènedione, et on procède à l'élution avec un mélange 1:1 en volume de méthanol et de chloroforme. Après évaporation du solvant, on répartit le résidu entre du chloroforme et un mélange 1:1 en volume d'eau et de méthanol. Après évaporation à siccité sous vide, la phase chloroformique donne le produit cristallisé 8 6 -hydroxy-19-nor- A^-androstène-3,17-dione. 30 On procède à une recristallisation dans un mélange d'acétonewhexane pour Acdci * 3 3605, 1731, 1 r. ^ rnpi max 1654, 1600 cm ; ;T jJJg 3 8,82, 4,17 ppm. EXEMPLE 2 En suivant le mode opératoire de l'exemple 1 mais en 35 remplaçant la 19-nor-^^-androstène-3,17-dione par une quantité équivalente de 19-nortestostérone, on obtient la 8 H> -hydroxy-19-nortestostérone. 69 05890 5 2003207 En suivant le mode opératoire de l'exemple 2 mais en utilisant le substrat indiqué au lieu de la 19-nor--^>^-androstène-3,17-dione, on obtient le produit indiqué. Substrat de stéroîde Produit 5 19-nor-17 méthyltestostérone 19-nor-17 éthynyltestostérone EXEMPLE 3 10 Préparation de 8 # -hydroxyoestrône par culture de Corynebacterium simplex A. Fermentation. On réalise une croissance en surface avec une tranche de gélose vieille de deux semaines de Corynebacterium simplex (ATCC 6946); la tranche contient comme milieu nutritif (A) : Grammes 15 Glucose 10 Extrait de levure 2,5 po4hk2 1 Gélose 20 Eau distillée complément à 1 litre 20 On met en suspension cette tranche dans 5 ml d'une solution aqueuse de laurylsulfate de sodium à 0,01%. On utilise des fractions de 1 ml de cette suspension pour inoculer deux Erlenmeyer de 250 ml contenant chacun 50 ml du milieu stérilisé suivant (B) : Grammes 25 Extrait de boeuf ls5 Extrait de levure 3 Peptone 6 Dextrose 1 Eau distillée complément à 1 litre 30 Après une incubation de 24 heures à 25°C avec agitation rotative en continu (280 tr/mn, course de 50,8 mm), on effectue des transferts de 5% en volume dans deux Erlenmeyer de 250 ml contenant chacun 50 ml de milieu fraîchement stérilisé (B). Après une nouvelle incubation de 24 heures. In opérant dans les mêmes conditions que ci-clessus, on introduit 35 le stéroîde (500 microgrammes/ml); à cet effet, on ajoute en plus dans chaque Erlenmeyer 0,25 ml d'une solution stérile (100 mg/ml) de 8^-hydroxy-a4 19-nor-^ -androstène-3,17-dione dans le N,N-diméthylformamide. On obtient par fermentation un total de 50 mg. Après une nouvelle incubation de 48 69 05890 6 2003207 heures en opérant dans les mêmes conditions que ci-dessus, on réunit le contenu des flacons, et on procède à trois extractions du bouillon avec à chaque fois une fraction de 50 ml de méthylisobutylcétone. Après évaporation à siccité sous vide du mélange d1 extrails,tm obtient la 8-hydroxy-5 oestrone cristallisée. On procède à deux recristallisations dans le mélange d'acétone-hexane pour donner 40 mg environ du produit pur, de point de fusion 260°C (décomposition),^ 3565, 3370, 1720, 1606, 1580 (pic aigu) 1504 cm~\ EXEMPLE 4 10 Préparation de 8^-hydroxy-oestrone avec des cellules lavées de Corynebacterium simplex En suivant le mode opératoire de l'exemple 3 sauf que l'on utilise la testostérone à la place de la 8/3-hydroxy-19-norandrostène- dione, on récolte par centrifugation au bout de 72 heures les cellules- de \ 15 la culture de Corynebacterium simplex. On lave trois fois les cellules tassées avec un tampon au phosphate contenant 0,005 mole par litre de chacun des produits PO^I^K et P20^H2Na23 et on ajuste le pH à 7,0. On met ensuite en suspension les cellules lavées dans le même tampon au phosphate jusqu'à un volume égal au quart du volume de la culture originale. On ajoute 20 le substrat 8^-hydroxy-19-norandrostènedione et l'accepteur d'hydrogène, par exemple la 2-méthylnaphtoquinone, sous forme de leurs solutions dans l'éthanol pour obtenir des concentrations finales respectives de 100 y/ml et de 0,4 mM, la quantité d'éthanol introduite étant au plus égale à 5% de la quantité totale. On laisse reposer le mélange réactionnel à la tempéra-25 ture de 30°C pendant 4 à 6 heures;on l'extrait ensuite deux fois avec 1/4 de son volume de méthylisobutylcétone. On traite l'extrait de méthyliso-" • butylcétone exactement de la même manière que dans l'exemple 3 pour obtenir la 8R-hydroxyoestrone pure de point de fusion 260°C(décomposition). EXEMPLE 5 30 Préparation de la 8 /$-hydroxyoestrone avec des cellules séchées à l'acétone de Corynebacterium simplex En suivant le mode opératoire de l'exemple 4, on dilue les cellules tassées avec un volume égal de tampon au phosphate à pH 7,0. On ajoute goutte à goutte la suspension de cellule,en agitant constamment, 35 dans 10 fois son volume d'acétone que l'on refroidit à une température de 5°C au plus. On filtre immédiatement sur Buchner le dépôt qui se trouve au fond en opérant avec la trompe à vide; on le lave avec un faible volume d'acétone, puis on le sèche à l'air. On prépare une suspension de 10 mg 69 05890 7 003207 des cellules séchées à l'acétone par ml du tampon â; pH 7,0 en mélangeant les cellules avec le tampon dans un mélangeur Waring; on utilise cette suspension à la place de la suspension des cellules lavées de l'exemple 4. On ajoute de la même manière qui vient d'être décrite le substrat et 5 l'accepteur d'hydrogène. En suivant le même mode opératoire d'incubation, d'extraction, etc..., on obtient également la 8 #-hydroxyoestrone sous forme cristalisée; le point de fusion de ce produit est de 260°C (décomposition) . " EXEMPLE 6 10 Préparation de 8 &-hydroxyoestrone par production d'enzymes exempts de cellules à partir de Corynebacterium simplex En suivant le mode opératoire de l'exemple 4, on place les cellules tassées dans un mortier avec une quantité égale en poids d'alumine (finement divisée.) , et on les traite pendant 20 minutes dans 15 un oscillateur à magnétostriction Raytheon. On centrifuge le mélange ainsi traité pendant 10 minutes (2000 g) pour éliminer les débris de cellules et 1'alumine. On place dans un tube à essai la 8 $-hydroxy-19-norandrostène-dione (1 mg), la 2-méthylnaphtoquinone (500 3r) et 2,0 ml de la préparation 20 de déshydrogénase à noyau A exemptede cellules ci-dessus, et on complète à un volume de 5,0 ml avec un tampon au phosphate de sodium 0,03 M. On laisse le mélange reposer pendant 1 heure à 30°C; on procède ensuite à deux extractions avec à chaque fois 1 ml de méthylisobutylcétone. On procède à une chromatographie sur papier du mélange d'extraits en uti-25 lisant 1'éthylèneglycol comme phase stationnaire et un mélange de volumes égaux de benzène et de chloroforme comme phase mobile. On observe une tache qui se déplace avec le même R^ (0,19) et qui présente les mêmes réactions de couleur caractéristiques que la 8$ -hydroxyoestrone obtenue dans l'exemple 3. 30 De la même manière, en suivant les modes opératoires des exemples 3, 4, 5 ou 6, mais en remplaçant la 8 fi -hydroxy- 19-nor- A1^-androstène-3,17-dione par la 8$-hydroxy-19-nor-17c 69 05890 8 2003207 1. formule REVENDICATIONS Procédé pour la 8 —hydroxylation d'un stéroîde de 10 15 20 25 30 dans laquelle le C 17 0 h 0H -C- 0H ' .-CH -C- présente 1'une des structures suivantes : 0H et CH=CH, -C- -C- -C- " -c- ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on soumet ledit stéroîde à l'action d'enzymesdes microorganismes Corynespora melonis et Corynespora cassiicola. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stéroîde est une 19-nor-androstènedione. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stéroîde est une 19-nor-17 -méthyltestostérone. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stéroîde est une lS-nor-l?^ -éthynyltestostérone. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet à l'action d'un microorganisme déshydrogénant le dérivé 8 -hydroxylé d'un composé de formule : ,17 35 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent, 1-déshydrogénant est le Nocardia restrictus, le Pseudomonas testosteroni, le Cy1indrocarpon radicicola ou le Mycobacterium rhodochrous. 69 05890 9 2003207 Un composé de formule ch„ H /N/ R1 R AlA ,17 10 dans laquelle R est un groupe hydroxy ou acyloxy, R' un groupe hydroxy et C17 présente l'une des structures suivantes : 0 OH OH OH " , 1 ,-H, ' CH , et ' ,-CH=CH . -C- -C- -C- -C- 8. 15 dione. 9. 10. oestrône. 11. 20 oestradiol. Un composé dénommé 8 fi-hydroxy-19-nor- û -androstène-3,17- Un composé dénommé 8£ -hydroxy-19-nortestostérone. Un composé selon la revendication 7 dénommé 8 â-hydroxy- Un composé selon la revendication 7 dénommé 8 fi -hydroxy-