Brevet FR2003204A1 — publié le 19691107

La présente invention concerne les anti-microbiens. Sous un aspect plus particulier, elle est relative à des anti-microbiens efficaces pour la protection vis-à-vis des infections bactériennes par cocci. 5 Les bactéries telles que les cocci représentent un groupe d'organismes unique comportant en eux-mêmes toute une série d'énigmes biologiques non résolues et aussi bien fondamentales qu'expérimentales. Leur répartition est ubiquitiste et ils ont atteint des degrés extêmes de diversification dans leurs caractéristiques bio-10 logiques et biochimiques. On admet que 1'importance des infections staphylococales n'est pas tellement liée à leur gravité, sauf dans quelques cas, qu'aux subtilités de l'infection dues aux caprices imprévisibles de ces organismes. Le traitement des affections bactériennes par cocci se trou-15 ve compliqué par l'aptitude de ces organismes à donner naissance à une résistance. L'ampleur du problème se trouve encore accrue par l'extrême difficulté d'obtenir un effacement total, et la réapparition fréquente de la même souche, même après une élimination ap-paramment satisfaisante. L'inaptitude à l'élimination du véhicule 20 par l'un quelconque des procédés classiques et l'apparition de nouvelles souches résistantes aux antibiotiques dans les hôpitaux ont ajouté une nouvelle dimension à cette situation désappointante. La pénicilline G (benzyl-pénicilline) est toujours le médicament de choix dans le traitement des infections causées par des 25 souches toxiques susceptibles. Cependant de nombreuses souches sont connues pour élaborer des enzymes telle que la pénicillinase en réponse à l'action des médicaments, et demeurer ainsi insensibles. Cela a conduit à la mise au point de pénicillines semi-synthétiques qui ne sont pas inactivées par la pénicillinase. Cependant on a si-30 gnalé récemment la résistance de staphylocqques, à ces nouvelles pénicillines. Par suite il semble qu'une demande sans fin existe pour des facteurs anti-cocciques et anti-bacilliques. On a déjà signalé une certaine quantité de substances qui modifient la résistance du sujet aux infections cocciques. Cepen-35 dant les médicaments provoquant un degré élevé de résistance aux 69 05874 2 2003204 infections cocciques, quand ils sont administrés à titre prophylactique, n'ont pas reçu une large audience. Il est important de noter que des médicaments conférant une immunité vis-à-vis des infections cocciques pendant plus d'une semaine après l'administration sont pra-5 tiquement inconnus. L'invention concerne un anti-microbien qui non seulement manifeste ses propriétés anti-cocciques dès une heure a-près l'administration mais encore confère une immunité vis-à-vis des infections staphylococales jusqu'à 4 semaines après l'administration. Ce qui est encore plus remarquable, une infection après traitement 10 confère une immunité complète vis-à-vis de la réinfection jusqu'à au moins 2 mois. L'invention vise donc un nouvel anti-microbien conférant u-ne résistance remarquable aux infections cocciques. Le traitement du problème est unique en ce que des compositions du type vaccin ont 15 été mises au point en tant que sa solution. Le travail d'approche est de nature prophylactique plus que thérapeutique. L'invention vise donc un anti-microbien effectif en ce qu'il donne naissance à une résistance aux infections bactériennes quand il est administré à titre prophylactique, tout en n'étant lui-même par vivant, cet anti-20 microbien étant du type sphingolipide. Ce sphingolipide est soit la phrénosine soit la sphingomiélyne. Les processus d'infection conduisant à la maladie sont considérés comme un problème de l'écologie du parasite. On admet de plus en plus que les facteurs déterminants chez la bactérie et chez le 25 sujet sont étroitement liés entre eux. La virulence staphylococale découle de l'action combinée de plusieurs facteurs bactériens dont l'efficacité est conditionnée par les réactions du sujet. La caractéristique peut être la plus frappante dans les relations sujet-parasite dans les infections staphylococales est la réponse immunolo-30 gique relativement atypique. Des études sur êtres humains ont apporté la preuve convaincante que la plupart des adultes possèdent tout un éventail d'anti-corps antistaphylococaux. Néanmoins la résistance aux staphylocoques semble être déterminée à un degré considérable par d'autres facteurs non liés aux précédents. Pour cette 35 raison les tentatives d'administration prophylactique n'ont pas été 69 05874 3 2003204 complètement satisfaisantes. Des expériences in vitro conduites pour étudier les effets sur les caractéristiques les mieux connues du staphylocoque doré sur les deux sphingolipides considérés ici ont conduit à la conclusion 5 que ces sphingolipides ne modifient pas les caractéristiques biochimiques de l'organisme. Cela est en fait très important. Cela signifie que ces composés ne sont pas des antibiotiques au sens vrai. Les antibiotiques sont en quelque sorte des des poisons, mais ils sont plus toxiques vis-à-vis de l'organisme que vis-à-vis du sujet. Les 10 essais in vitro ont démontré que ces composés ne tuent pas l'organisme. On a fait cependant la découverte tout à fait surprenante que dans le système du sujet ils créent un environnement dans lequel l'organisme ne peut apparaîtraient pas se développer. Ainsi ils restituent de façon surprenante l'immunité au sujet mais sans que l'or-15 ganisme lui-même soit présent comme c'est le cas dans les vaccins. Les compositions selon l'invention constituent donc une nouvelle classe importante d'anti-microbiens. On les administrera par voie orale périodiquement comme des vitamines ou par injection intra-mus-culaire, par exemple à raison de doses quotidiennes de 250 mg cal-20culées sur la base du produit chimique lui-même, en administration orale de préférence à raison de comprimés ou de pilules de 400 mg par jour. Un avantage de l'invention est que, avant les périodes ou l'on peut redouter un contact avec des staphylocoques ou des streptocoques, par exemple avant de pénétrer dans un hôpital, le médecin 25 peut utiliser une injection ou des comprimés. Le degré élevé de résistance aux infections staphylococales obtenu par l'administration prophylactique de ces sphingolipides apparaîtra mieux de leurs effets biologiques' lors d'études in vivo. Comme la phrénosine et la sphingomiélyne sont connues et se trouvent 30 dans le commerce, il n'est pas nécessaire d'.en décrire ici la préparation. Elles sont relativement insolubles dans l'eau mais elles sont émulsifiées par un léger chauffage et une agitation vigoureuse. Au coûrs de ces études on a utilisé des souris C3H et Swiss albinos mâles et femelles. Ces animaux avaient 10 à 30 semaines et 35 un poids moyen de 20 à 25 g. Ils étaient pour la plupart élevés et 69 05874 2003204 entretenus au régime Rockland. Les essais ont été conduits en utilisant une souche originale résistante à la pénicilline de staphylocoque doré, isolée d' abord depuis un cas de toncilite aiguë et conservée en laboratoire 5 depuis plusieurs années. Cette souche est conservée à l'état lyophilisé et à 0°C et les cultures sont préparées, sur des tubes obliques SA HO une fois tous les 6 mois. Pour l'essai on prépare l'i-noculum à partir de cultures de 24 heures sur tubes obliques SA 110 à 37°C. Les cellules sont lavées et mises en suspension dans une 10 solution physiologique (solution Tyrode TC, commercialisée par la firme Difco). Au contraire des processus classiques, on utilise dans ces recherches une DL 80-90 au lieu d'une DL-50. La raison fe&*est que dans les études faites en laboratoires avec les staphylocoques, des doses plus faibles ne donnent souvent pas un degré adéquat de 15 mortalité. On détermine la DL-80-90 en injectant par voie sous-cutanée à des groupes de souris des dilutions différentes de la suspension bactérienne et en notant la mortalité sur une période de 5 jours. En utilisant 6 groupes de souris femelles C3H/HeJ de 10 à 2o 11 semaines, on a réalisé un essai biologique de la sphingomirêl±ne^ Les animaux sont inoculés par voie sous-cutanée pendant 3 jours consécutifs par des quantités variables de sphingomyéline. Le 4e jour on les oppose avec une suspension de la souche originale donnant une transmission de 60 %. Les résultats sont réunis au tableau 1. 25 TABLEAU 1 Sphingomyéline-Prophylactique-sous-cùtanée Groupe Dose en mg Mortalité % en heures par animal après le choc M 48 T2 96 120 Témoins , 10 - 30 60 80 80 O 3° Sphingomyéline 10 OOO'O Sphingomyéline 5 O 0 0 0 0 Sphingomyéline 1 0 10 ÎO 10 10 La mise en opposition avec une suspension de la souche originale donnant 55 % de transmission, donne les résultats réunis .au tableau 2- TABLEAU 2 35 69 05874 5 2003204 Sphingomyéline-Prophylactique-Sous-cutanée Groupe Dose en mg Mortalité % en heures par animal après le choc M 48 II 96 120 5 Témoins 60 80 80 80 80 Sphingomyéline 8 0 0 0 0 0 Ces résultats démontrent que la sphingomyéline possède une activité considérable de compensation des effets mortels de l'infection staphylococale. Pour comparer la sphingomyéline avec la phré-10 nosine, on donne les résultats suivants obtenus sur des souris Swiss albinos. TABLEAU 3 Sphingomyéline et phrénosine-Prophylactique-Sous-cutanée Groupe Dose en mg Nombre Mortalité % en jours 15 par animal d ' animaux après le choc 1 2 3 4 5 Témoins 10 50 50 60 60 60 Sphingomyéline 5 10 20 30 40 40 50 Phrénosine 5 10 20 40 40 50 50 Témoins 10 50 70 80 80 90 Sphingomyéline 5 10 30 40 70 70 80 Phrénosine 5 10 10 30 40 40 40 Ces chiffres non seulement illustrent la valeur très nette de la phrénosine pour la protection des souris Swiss albinos vis-à-25 vis des infections staphylococales expérimentales mais encore montrent que la phrénosine est encore plus efficace que la sphingomyéline. Il a été décidé de soumettre ces composés à des essais sur différentes races de souris pour déterminer si des absences de con-30 cordance dans les résultats résulteraient de différence chez le sujet. Les essais ont été conduits sur dés souris femelles C3H en utilisant la sphingomyéline et la phrénosine dans une série d'essais prophylactiques de 3 jours. Le tableau 4 montre les résultats de ces essais. 35 TABLEAU 4 69 05874 6 2003204 10 Sphingomyéline et Phrénosine dans les souris C3H-Prophylactique Groupe Dose en mg Nombre Mortalité % en jours par animal d'animaux après le choc 1 2 3 4 5 Témoins 10 70 100 ÎOO 100 100 Sphingomyéline 5 10 20 40 40 40 40 Phrénosine 5 10 70 70 70 70 70 Ces études montrent que les différences de sujet ont une influence à un certain degré sur l'activité in vivo des composés essayés. En raison de la récurence relativement fréquente des infections par staphylocoques, on pense généralement que l'immunité vis-à-vis de cet organisme est courte dans le temps, ou seulement partielle. Il était donc intéressant de voir si les survivants de groupes soumis aux doses léthales sont encore immunisés après administration prophylactique pour recréer une opposition. Les survivants 15 ont été prélevés sur les groupes traités par la sphingomyéline et la phrénosine. Un traitement par l'extrait de cerveau a été également conduit conjointement pour obtenir un ensemble de résultats comparatifs. Les survivants de la première opposition dans les groupes respectifs ont été maintenus en conditions idéales et à des intervalles appropriés ils ont reçu à nouveau la dose mortelle de staphylocoque doré. Des groupes de témoins frais ont été employés à chaque fois. La mortalité dans chaque groupe a été prise comme indice de la résistance relative ou de la susceptibilité, selon le cas. 25 On a obtenu pratiquement les mêmes résultats dans plusieurs des essais. Les résultats de l'un de ces essais, réunis au tableau 5, sont représentatifs de ces essais. Dans ce cas particulier, les animaux ont été élevés à un régime expérimental et resoumis à l'opposition 59 jours après la première. TABLEAU 5 Groupe Nombre % Mortalité par jour après d1 animaux . le choc 1 2 3 4 1 Témoins 10 100 100 100 100 lOO 35 Survivants de 69 05874 7 2003204 l'extrait de cerveau 7 14.2 14.2 14.2 14.2 14.2 Survivants de la Sphingomyéline 5 OOOOO Survivants de la Phrénosine 5 0 0 0 0 0 5 Le tableau 6 représente les résultats d'essais semblables, sauf que les animaux étaient élevés avec un régime du commerce. Les animaux ayant survécu à la première opposition après le traitement à la phrénosine sont soumis à une nouvelle opposition 41 jours après la première, en même temps qu'un groupe témoin à titre comparatif. 10 TART.BftTT fi Survivants soumis à une nouvelle opposition 41 jours après le premier choc. Groupe Nombre Mortalité % en jours après d ' animaux le choc 113 4 5 15 Témoins 10 80 90 90 90 90 Survivants de la Phrénosine 5 0 0 0 0 0 Ces expériences de réopposition ont été conduites à divers intervalles jusqu'à un maximum de 59 jours après la première opposi-20 tion et on a observé de façon constante que quelque soit le traitement avant l'opposition, les survivants présentent une immunité près que complète au moins sur les périodes couvertes par ces expériences Les compositions selon l'invention constituent donc une nouvelle classe importante d'anti-microbiens. Elles pourront être admi-25 nistrées par voie orale- périodiquement comme les vitamines ou hebdomadairement ou mensuellement en comprimés dé 250 à 500 mg. Avant les périodes où l'on peut redouter un contact avec des staphylocoques ou des stretocoques, par exemple avant de rentrer dans un hôpital, le médecin pourra utiliser des injections de 150 à 500 mg. Le sphin-30 golipide peut être combiné avec un véhicule 'aqueux, une huile végétale, un monoglycéride ou un diglycéride en vue de l'injection, du chlorure de sodium étant utilisé au besoin pour rendre la solution isotonique. La suspension ou la solution contiendra 0,1 à 5 % et, de préférence 0,1 à 1,5 % en poids du sphingolipide. 35 Dans le cas de comprimés, si on le désire, on pourra incor- 69 05874 8 2003204 porer des agents convenables tels que colorants, adhésifs et lubrifiants en même temps qu'un diluant pharmaceutique solide par exemple un amidon, du lactose, du sucrose ou autre. Ces comprimés contiendront 20 à 50 % du sphingolipide. Des capsules peuvent également 5 être préparées. On dispose donc ainsi d'un procédé pour le traitement chez l'être humain et les autres mammifères des infections dues au cocci et aux bacilles, traitement consistant à administrer aux mammifères une quantité prophylactique du sphingolipide. On pourra modifier les diluants, les doses et autres variables, comme il appa-10 raitra aux techniciens. De telles variantes rentrent dans le cadre de 11 invention. 69 05874 9 2003204 REVENDICATIONS 1) Anti-microbien destiné à donner naissance à une résistance aux infections dues aux cocci et aux bacilles quand il est administré à titre prophylactique, constitué par un sphingolipide choisi entre la sphingomyéline et la phrénosine, en combinaison a-vec un véhicule pharmaceutique. 2) Anti-microbien selon 1 dans lequel la composition est un mélange de sphingomyéline avec un diluant pharmaceutique solide. 3) Anti-microbien selon 1 dans lequel la composition est une suspension aqueuse de sphingomyéline. 4) Anti-microbien selon 1 dans lequel la composition est un mélange de phrénosine avec un diluant pharmaceutique solide. 5) Anti-microbien selon 1 dans lequel la composition est une supension aqueuse de phrénosine. 6) Anti-microbien selon 2 dans lequel la sphingomyéline est présente à raison de 20 à 50 % par rapport à la composition. 7) Anti-microbien selon 3 dans lequel la composition est une suspension aqueuse contenant 0,1 à 5 % de sphingomyéline. 8) Anti-microbien selon 4 dans lequel la phrénosine est présente à raison de 20 à 50 % par rapport à la composition. 9) Anti-microbien selon 5 dans lequel la composition est une suspension aqueuse contenant 0,1 à 5 % de phrénosine.