Brevet FR2010200A1 — publié le 19700213

la présente invention est relative à une composition ayant pour effet d'améliorer et de prévenir les troubles des fonctions" cérébrales, particulièrement les troubles de la conscience et 1' oedème cérébral, par exemple par suite de blessure à la tête, de 5 troubles de la fonction des vaisseaux sanguins, etc.., ainsi qu'à son procédé de préparation. L1étude du gonflement de la cellule cérébrale a montré que les taux d'âdénosine triphosphatase des mitochondi-ies du cerveau baissent rapidement lorsque la cellule cérébrale subit une lésion 10 et, au contraire, qu'il se produit un gonflement des mitoclaondries du cerveau et du tissu cérébral. On a étudié la relation entre la fonction des mitochondries du cerveau et le gonflement des cellules cérébrales et cette étude a révélé qu'un extrait de mitochondries de cerveau animal frais inhibe spécifiquement la diminution 15 de l'activité de l'adénosine triphosphatase en rapport avec le dinitrophénol (appelée ci-après DKP-ATPase) ainsi que le gonflement des mitochondries, et on constate que par administration de la préparation à un animal dont le cerveau a été expérimentalement lésé (chat présentant des troubles de la conscience après 20 relâchement de la compression cérébrale), un électroencéphalogramme (EEG) lent, présentant un.voltage anormalement élevé, du fait de la blessure à la tête, revient à la normale, ce fait montrant qu'elle a un effet remarquable d'amélioration sur les troubles des fonctions cérébrales,-particulièrement pour guérir, les 25 troubles de la conscience. La présente invention résulte d'une vaste expérimentation reposant sur ces nouvelles découvertes. C'est-à-dire que la présente invention est relative à une composition ayant pour effet d'améliorer et de prévenir les troubles des fonctions cérébrales, ainsi qu'à un procédé pour sa pré-30 paration. On prépare la composition selon l'invention par un procédé comprenant les stades suivants : a) on centrifuge une suspension homogénéisée de cerveau frais d'animal pour séparer les mitochondries du liquide surn^ge^nt I, 35 ce dernier étant centrifugé à nouveau pour obtenir un liquide surnageant III, b) on met en suspension les mitochondries dans un milieu de mise en suspension, c) on congèle et décongèle la suspension de mitochondries 40 pour décomposer les mitochondries, 69 18482 2 2010200 d) on centrifuge la. suspension de mitochondries décomposées pour séparer les débris- de mitochondries d'un-liquide surnageant II, ■ • e) on réunit les liquides surnageants II et III, 5 f) on dialyse les liquides surnageants réunis auxquels on ajoute une petite quantité d'albumine, et • g) on recueille la solution externe ou dialysat après dialyse. Le mode opératoire le plus approprié pour la mise en oeuvre 10 de l'invention est décrit ci-dessous. Il est préférable que le cerveau soit rapidement prélevé sur un rat, un chat, un chien, un mouton, un boeuf, etc.. juste après que l'animal a été sacrifié. On obtient les mitochondries à partir du cerveau ainsi obte-15 nu, de manière connue. Par exemple, on place le cerveau dans un •mélange mannitol-acide éthylènediaminetétracétique (LDTA) en ajustant le pli à 7,4 à l'aide, d'hydroxyde de potassium (on se référera ci-dessous à cette solution sous le nom de solution manni-tol-EDTA) pendant 10 à 15 secondes, de préférence. On obtient de 20 mauvais- résultats, lorsque le temps est beaucoup plus long, car cela provoque non seulement la décomposition' du facteur actif, mais encore une formation importante d'acide gras qui inhibe 1' activité de la DNP-ATPase. On place le cerveau d'animal dans, par exemple, 5 à 10 fois 25; son volume de solution mannitol-EDTA, on homogénéise la suspension à i'homogénéisateur et on centrifuge pendant 10 minutes à 2000 x g. Après séparation du précipité, on centrifuge à nouveau le liquide surnageant à 20.000 x g et on obtient- un précipité de mitochondrieô et le liquide surnageant (I). 30; Les mitochondries ainsi obtenues sont mises en suspension dans un milieu approprié, sont congelés et décongelés, puis la suspension est centrifugée pendant une heure à 50.000 x g afin d'obte:nir. le liquide, surnageant (II)- On centrifuge séparément le--liquide -surnageant ■ (-1) pendant 35 2 heures, à 50.000 x.g afin^d'obtenir le liquide surnageant.(III). On mélange- les liquides" surnageants (II) .-et (III) ;e%-on -y- dissout ce l'albumine, par exemple de manière :à obtenir un© .eon-c-en-tration de 1 %, on place le liquide surnageant dans des tubes de dialyse pour dialyser contre une solution de 0,25 K de mannitol-40 5 iïïï,T de tampon au phosphate (pH 7,4) pendant 24 heures, à une 69 18482 3 2010200 température de 0 à 4°C. Le facteur actif se trouve dans la solution externe. Ces stades sont représentés schéma tique^nent dans le tableau ci-dessous. Cerveau t I Homogénéisât , centrifugation dans un milieu de mise en suspension 2.000 x g, 10 minutes Précipité liquide surnageant centrifugation 20.000 x g, 10 minutes Précipité (mitochondries congélation décongélation centrifugation dans un milieu de mise en suspension 50.000 x g, 1 heure Précipité liquide" surnageant (1)1 centrifugetion 50.000 x g, 2 heures Liquide surnageant (II} Précipité liquide sur-! nageant(III)i dialyse dialysat (fluide externe) L'activité croît lorsqu'on mélange les liquides surnageants (II) et (III) et, par addition d'albumine, on peut obtenir une meilleure composition car cela empêche qu'il y ait mélange d'acide gras dans la composition visée, ledit acide gras étant un inhibiteur de la DÎTP-AÎPase formée en petite quantité au cours du procédé. La solution externe ainsi obtenue contenant le facteur actif est lyophilisée afin d'obtenir un produit approprié pouvant être conservé longtemps, et on utilise la préparation lyophilisée sous forme de préparation injectable par dissolution jusqu'à la concentration désirée. . 69 18482 4 2010200 Essai 1 On anesthésie légèrement un chat au phénobarbiturate de-sodium et on fixe la tête afin de faire un trou de trépan dans la région pariétale droite. On place, dans l'espace épidural, un pe-5 tit ballon en caoutchouc sur lequel on a fixé un tube en polyéthylène, et on place des électrodes d'"'EG sur les deux zones pariétales. Pour les deux enregistrements corticaux, on utilise une électrode monopolaire et on place l'électrode indifférente sur le frontal. On fixe respectivement le tube er. polyéthylène et les 10 électrodes à l'aide de ciment dentaire. lorsque les caractéristiques anormales de l'EEG ont été éliminées après disparition de l1anesthésie, on gonfle le ballon en ajoutant des quantités successives de 0,2 ml de sérum physiologique. Sous l'effet de la compression, des ondes lentes à haut vol-15 tage et des ruptures en pointe apparaissent d'abord du côté comprimé. Lorsque l'onde lente apparaît de l'autre côté, on interrompt l'addition de sérum physiologique et on ferme le tube en polyéthylène. On maintient la compression cérébrale pendant 24 heures. Puis on retire respectivement le sérum physiologique et 20 le ballon en caoutchouc, et on poursuit les observations pendant environ 3 heures. Après avoir noté que l'état général est redevenu normal mais que le sujet n'est toujours pas conscient," on injecte par voie intraveineuse 2 ml de la composition selon l'invention contenant le constituant efficace correspondant à 3 à 7g 25 de cerveau, et on obtient 1'électroencéphalogramme figurant à la Fig. unique du dessin annexé. Exemple 1 Immédiatement après avoir décapité un rat, on prélève les hémisphères cérébraux qu'on place dars 5 volumes de solution man-30 nitol-EDTA froide (contenant 0,3M de mannitol et 0,01 ml d'acide éthylène diaminetétracétique, pH 7,4). L'opération dure environ 10 secondes. Puis on homogénéise modérément l'échantillon de cerveau à l'aide d'un homogénéiseur Potter-Elvehjem en verre, et on centrifuge le produit homogénéisé"pendant 10 minutes à 20.000 x g 35 afin d'obtenir un liquide surnageant^it un précipité de mitochondries. On met les mitochondries ainsi obtenues en suspension uniforme dans 10 ml de solution manritol-3PTA froide e*t on congèle la suspension dans un congélateur s. -20§C. Après décongélation à temrérature ambiante, on centrifuge la suspension pendant une 40 heure, en refroidissant, 50.00C x g afir d'obterir le liauide surnageant (II). 69 18482 5 2010200 On centrifuge séparément le liquide surnageant ( I)*, pendant 2 heures, à 50.000 x g afin d'obtenir le liquide surnageant (III). Au mélange de liquides surganeants (II) et (III) on ajoute de l'albumine ce manière à obtenir une concentration d'environ 5 1 yo. On dialyse le mélange contre une solution 0,25 E. de manni-tol-5 ml Exemple 2 10 Immédiatement après avoir - sacrifié un mouton, on prélève du tissu cérébral par un trou de trépan pratiqué dans la région pariétale, à l'aide d'une pompe à aspiration, et on met le tissu ainsi obtenu en suspension, de la même m^r^re qu'à l'exemple 1, afin d'obtenir une préparation injectable ayant pour effet d'amé-15 liorer et de prévenir les troubles des fonctions cérébrales. 69 18482 e 2010.200 • Rêvendications 1 - Un procédé 'de préparation d'une.composition ay?nt pour effet .d'améliorer et de prévenir les- troubles des fonctions cérébrales caractérisé en ce qu'il comprend les .stades suivants. : ; 5 a) on centrifuge une suspension homogénéisée'de cerveau frais-, d' nnimal oour séparer les mitochondries du- liquide surnageant' I.,- ;ce dernier étant centrifugé h rouveau pour obtenir un liquide, surnageant III, b) on met en suspension les mitochondries dans un milieu de mise 10 en suspension, c) on congèle et décongèle la suspension de mitochondries pour décomposer lec mitochondries, d) on centrifuge la suspension de mitochondries décomposées pour séparer les débris de mitochondries d'un liquide surnageant II, 15 e) on réunit les liquides surnageants II et III,. f) on dialyse les liquides surnageants réunis auxquels on ajoute une petite quantité d'albumine, et g) on recueille Ie* solution externe ou dialysat après dialyse. 2 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en 20 ce qu'on prélève le cerveau frais d'animal sur un rat, un chat,. un chien, un mouton ou un boeuf, en 10 à 15 secondes. 3 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on homogénéise le cerveau frais c"'animal dans 5 à 10 fois son volume de solution mannitol-acide éthylènediaminetétracéti- 25 que. 4 - Un procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la solution mannitol-acide éthylènediaminetétracétique contient 0,3M de mannitol et 0,01 mM d'acide éthylènediaminetétracétique, le pH étant de 7,4-. 30 5 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de mise en suspension des mitochondries est une solution mannitol-acide éthylènediaminetétracétique. 6 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on centrifuge 1- suspension "homogénéisée de cerveau frais 35 d'animal pendant 10 minutes à 2.000 x s de manière ? obtenir le liquide surnageant , or centri^u.-e le !j.ouide surnageant de manière à précipiter les mitochondries, or. met 1rs litochon-cries en suspension da.rr un milieu de mise er suspension, on congèle et décongèle 1? euspersior- de mitochondries ce manière à 4-0 décomposer les mitochondries, on centrifuge la suspension de 69 18482 7 2010200 mitochondries décomposées pendant une heure à 50.000 x g de manière à obtenir le liquide surnageant (II) et on recueille la solution externe de' dialyse ou liquide surnageant (II) auquel on ajoute un peu d'albumine et du liquide surnageant (III) obtenu 5 en centrifugeant le liquide qui surnage lors de l'opération destinée à obtenir les mitochondries. 7 - Une composition pour l'amélioration et la prévention des troubles des fonctions cérébrales, telle qu'obtenue par un procédé suivant les revendications 1 à 6