Brevet FR2002445A1 — publié le 19691017

x 2007445 Cette invention concerne un nouvel agent antibiotique comprenant le composé appelé ici du nom arbitraire de A204, et des sels, et un procédé pour leur préparation. L'antibiotique A204 est une molécule acide produite par cultu-5 re dans des conditions contrôlées d'une souche, non décrite jusqu'ici, de Streptomvces albus NRRL 3384. L'antibiotique A204 est un solide cristallin blanc dont le point de fusion est 96-98®C quand il est cristallisé dans l'éthyl éhher, il est soluble dans les esters, le benzène, les hydrocarbures 10 halogénés, le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'éther et les cétones, peu solubles dans les alcools, et très peu 25° solubles dans l'eau. Le pouvoir rotatoire spécifique, ( Le titrage electrométrique de l'antibiotique A204 dans une solution diméthyl formamide-eau à 66% révélait la présence d'un groupement titrable ayant un pK'a = 6,1. Le poids moléculaire précis de l'antibiotique A204 n'a pas 20 encore été déterminé. Le poids moléculaire de l'antibiotique A204, calculé d'après les résultats du titrage est égal à environ 900. L'analyse auxrayoïBX des sels cristallins d'argent et de sodium indiquait un poids moléculaire moyen de 937. Une moyenne de plusieurs analyses élémentaires de 1' A204 25 cristallin séché sous vide à environ 80°C sur du pentoxyde de phosphore donnait les valeurs suivantes : Elément Pourcentage Carbone 61,74 Hydrogène 9,37 30 Oxygène „ 28,38 Des analyses physiques et chimiques de l'A204 cristallin indiquaient la présence de groupements 4-5 méthoxy. Le spectre d'absorption infrarouge de l'acide libre cristallin dans le chloroforme est représenté dans la Figure 1 du dessin ci-35 joint. Les bandes que l'on pouvait distinguer dans le spectre infrarouge dans le domaine de 2,0 à 15,0 microns sont les suivantes : 2,95; 3,43 ; 5,95 ; 6,87 ;7,26 ; 7,80; 8,52 ; 6,95 r 9,17 ; 9,34 ; 9,59 ; 9,82 ; 10,07; 10,24 ; 10,51 ; 10,77 ; 11,40 ; et 11,80 microns. 40 Le nouvel antibiotique n'a pas de diagramme caractéristique 69 03.465 2 2002445 d'absorption ultraviolet La chromatographie sur papier de l'antibiotique A204 sur un papier Whatman N°1 donnait les valeurs de Rf suivantes : Rf = 0,14 dans un solvant composé d'eau, de méthanol, d'acétone et de benzène 5 dans un rapport en volume de 72/24,5/3/0,5 ; Rj = 0,87 dans un solvant composé de n-propanol aqueux à 10%; Rf = 0,33 dans un solvant contenant de l'eau, du méthanol et de l'acide acétique dans un rapport de 12/3/1 (la solution était ajustée à pH 10,5 par NH^OH et ensuite à pH 7,3 par H^PO^). Dans la détermination des 10 valeurs précédentes, l'antibiotique était appliqué sur du papier en solution méthanolique. On obtenait des bioautographes en plaçant le chromatograme de papier sur des plaques d'agar-agar ensemencées par du Bacillus subtilis comme organisme de test. Quand l'A204 est soumis à une chromatographie en couche mince 15 sur des plaques de gel de silice dans un solvant acétate d'éthyle, en utilisant une pulvérisation de vanilline ou d'acide sulfurique comme détecteur, il a une valeur de Rf égale à environ 0,8. Le sel de sodium de l'antibiotique A204 est un solide blanc cristallin, fondant à 144-145°C, et ayant un poids moléculaire 20 déterminé par analyse aijc rayons X égal à environ 960. Le sel de sodium est soluble dans les esters, le benzène, les hydrocarbures halogénés, le DMF, le DMSO, l'éther, et les cétones, et il est peu soluble dans les alcools. Le pouvoir rotatoire spécifique 25° (a Le spectre d'absorption infrarouge du sel de sodium de l'antibiotique A204 dans le chloroforme est représenté dans la Figure 2 du 30 dessin ci-joint. On distingue les bandes suivantes dans le spectre infrarouge dans le domaine de 2,0 à 15,0 microns : 3,1-3,2 (large) ; 3,44 ; 6,26 ; 6,87 ; 7,29 j 7,67 ; 7,79 ; 8,45 ; 8.96 ; 9.11 ; 9,18 ; 9,36 ; 9,56 ; 9,82 ; 10,05 ; 10,26 ; 10,54 ; 10,95 : et 11,77 microns. 35 Le poids moléculaire du sel d'argent cristallin hydraté dans l'antibiotique A204, déterminé d'après les résultats des rayons X est égal à environ 1099. Les cristaux du sel d'argent sont incolores mais sont sensibles à la lumière et aux rayons X, virant au brun foncé après irradiation de deux jours dans l'air. La masse 40 volumique observée pour le sel d'argent mesurée par flottation dans ô 1 L1 «2 4- w o 3 2002445 ZnCl2 aqueux est 1,293 g par cm"5. La seule règle d* extinction est hkl : h + k = Zn, ce qui indique un groupement spatial monoclinique non centré C^. Il y a quatre unités monocliniques asymétriques et une molécule par unité asymétrique dans la ïsaiil© unitaire qui 5 a les dimensions : a = 25,977 A, b = 14,517 A, C = 14,418 A, B = 91,94 A. L'antibiotique A204 et ses sels présentent une très bonne activité contre les infections coccidioses quand il est incorporé dans le régime des poulets. Une quantité de 9 à 45 grammes d'anti-10 biotique A204 ou bien d'un de ses sels par tonne d'aliments est efficace pour contrôler les infections simples de B. tenella, B. acervulina» et E. maxima. Les mêmes quantités sont efficaces pour contrôler une infection mixte de E. brunetti et E. tenella ainsi qu'une infection mixte des huit espèces de coccidies (Coccivac 15 type D). Les composés de cette invention présentent également une activité insecticide et acaricide. L'activité insecticide e+- acaricide de l'antibiotique A204 est résumée dans le Tableau X. On utilise l'échelle de classement suivante dans le 20 Tableau I. Mort % Classement 0-10 0 11-20 1 21-30 2 25 31-40 3 41-50 » 4 51-60 5 61-70 6 71-80 7 30 81-90 ^ 8 91-100 9 ■ J O*-i0 O 4 2002445 TABLEAU I Efficacité de l'Antibiotique A204 comme insecticide Classement (ppm.) 5 Insecte Voie 1000 500 250 100 50 25 Scarabée Mexicain du haricot (Epilachna variestis) Estomac 8 4 0 — Ver de l'Armée du Sud (Prodenis eri-dania) Estomac 8 9 8 8,5 3,5 3 10 Puceron du melon Contact 3,5 2 1 dans l'organisme 7 0 0 Tétranyque à deux taches Contact 9 7 7 8 7 6 15 Insecte du coton (oncopeltus fas-ciatus) Contact 9 9 4 3 12 L'antibiotique A204 présente également une action inhibitrice contre la croissance d'organismes microbiens comprenant les 2Q bactéries gram-positive et les champignons, qui sont pathogènes pour l'animal et les plantes. Donc, l'antibiotique A204 est également utile quand il est incorporé dans des solutions désinfectantes pour la stérilisation des surfaces autour des piscines, des établis sements de ferme abritant le bétail, etc... , et pour maintenir 22 ces surfaces exemptes de contaminants bactériens et champignons. Les doses inhibitrices étaient déterminées par le test de dilution à l'agar-agar. Dans le test de dilution à l'agar-agar, on faisait une culture étalée de l'organisme à tester sur une série de plaques d'agar-agar contenant diverses concentrations de l'antibiotique A204 pour déterminer la concentration minimale de l'antibiotique A204 en microgrammes par millilitre dans le substrat d'agar-agar, qui inhibait la croissance de l'organisme pendant une période de 24 heures. 69 03465 5 2002445 tableau II Concentration minimale inhibitrice Organisme testé (souche) en meg/ml 24 fteures 5 Staphvlococcus aureus (3055) 6,25 Bacillus subtilis (X12-1) 6,25 Mycobacterium avium (X-85) 1,56 Streptococcus faecalis 1, 56 Lactobacillus casei 1,5S 10 Leuconostoc citrovorum 0,39 Trichophvton mentagrophvtes 25,00 Xanthomonas phaseoli 100,00 Botrvtis cinerea 100,00 Colletotrichum pisi 100,00 15 Helminthosporum sativum 100,00 Pullularia sp. 100,00 N. crruberi (HB-1) dans une culture de tissus 100,00 20 Le sel de sodium de l'antibiotique acide libre A204 présente une activité comparable in vitro. Les composés de cette invention présentent égalëment une activité contre le virus du mildiou du haricot et le virus nain du mais à des concentrations allant de 16 à 400 ppm,, et ils sont 25 donc utiles pour contrôler ces virus et champigons des plantes. Comme dans le cas de nombreux antibiotiques, l'antibiotique A204 comprend parfois plusieurs composants étroitement reliés l'un à l'autre. On ne trouve pas le second composant dans toutes les fermentations et, quand il est présent, il est habituellement présent 30 en quantité allant jusqu'à 5% de la quantité totale. Ce second composant mineur, observé de temps en temps, a été appelé arbitrairement A204II. On l'a seulement obtenu sous forme du sel mixte de sodium-potassium. On a constaté que le sel mixte de sodium-potassium de l'A204lI avait une activité comparable à l'antibiotique A204. 35 Le sel mixte sodium-potassium de l'antibiotique A204II fond à 177-179°C quand il est cristallisé dans l'acétone, il est soluble dans les esters, le benzène, les hydrocarbures halogénés, le dimé-thylformamide, le dimêthylsulfoxyde, l'éther, et lés cétones, il est légèrement soluble dans les alcools et très peu soluble dans 40 l'eau. 69 03465 6 2002445 25° Le pouvoir rotatoire spécifique, , du sel mixte de sodium et de potassium de !'A204II séché à température ambiante sous vide ...sur du chlorure de calcium anhydre pendant environ 15 heures est égal à 42,3° (C = 1 pour cent en poids par volume 5 dans le méthanol). Le titrage électrométrique du sel mixte sodium-potassium de 11A204II dans une solution eau-diméthylformamide à 66% révélait la présence d'un groupement titrable ayant un pK'a = 6,3. Le poids moléculaire précis de l'A204H n'a pas encore été 10 déterminé. Une moyenne de plusieurs analyses élémentaires du sel mixte cristallin sodium-potassium de l'A204 sécha sous vide à environ 80°c sur du pentoxyde de phosphore donnait les valeurs suivantes : C 60,SS 15 H 8,76 0 27,09 Plusieurs analyses d'absorption atomique indiquaient que le composé était un sel mixte de sodium-potassium de diverses proportions, contenant une mole de cation mixte par mole de A204. 20 Le spectre d'absorption infrarouge du sel mixte sodium-potas sium de l'A204H dans le chloroforme présentait les bandes distinctes suivantes dans un domaine infrarouge allant de 2,0 à 15,0 microns : 3,20;3,45; 6,26; 6, 9Q 7,30 ; 7,80 ; 8,20 ; 8,50 ; 8,80 ; 9,22 ; 9,39 ; 9,59 ; 9,70 ; 9,82 ; 10,08 ; 10,26 ; 10,48 ; 10,83 ; 25 10,96 ; 11,30 ; 11,55 ; et 11,78 microns. Le sel mixte sodium-potassium de l'A204H n'a pas de diagramme caractéristique d'absorption ultraviolette. La chromatographie en couche mince du sel mixte sodium-potassium du gène II sur des plaques de gel de silice donnait une valeur 30 de R^ de 0,75 dans un système d'acétate d'éthyle utilisant une pulvérisation d'acide sulfurique pour la détection. Le sel mixte de sodium et potassium de 1*A204II présentait également une action inhibitrice entre la croissance de nombreux organismes microbiologiques, comprenant les bactéries Gram-positifs 35 et les champignons qui sont pathogènes pour les animaux et les végétaux. Les doses inhibitrices étaient déterminées comme on l'a décrit ci-dessus. 7 Concentration inhibitrice minimale Orcranisme testé mcg./ml. Staphylococcus aureus 12,50 5 Bacillus subtilis 3,12 Mycobacterium avium 12,50 Streptococcus faecalis 3,12 Lactobacillus casei 6,25 Leuconostoc citrovorum 6, 25 10 Alternaria solani- 100, 00 Botyrvtis cinerea 50, 00 Colletotrichum pisi 50,00 Helminthosporium sativium 50,00 L'antibiotique A204 peut être produit par culture d'une souche 15 inconnue jusqu'ici de Streptomvces albus, dans des conditions aérobies, dans un milieu de culture contenant une source assimilable de carbone, d'azote, et de sels minéraux. Les organismes étaient d'abord isolés d'échantillons du sol de PerrJ, Floride. Les organismes étaient isoléscfeséchantillons de sol ci-dessus 20 en mettant en suspension des parties d'échantillons de sol dans de l'eau distillée stérile, et en faisant des cultures étalées avec les suspensions sur des plaques nutritives d'agar-agar. Les plaques nutritives d'agar-agar ensemencées étaient incubées à environ 30°C pendant plusieurs jours. A la fin de la période d'incubation, 25 les colonies des organismes produisant l'A204 étaient transférées au moyen d'une spatule stérile sur des cultures inclinées d'agar-agar. Les cultures inclinées d'agar-agar étaient ensuite incubées pour fournir di/'grandes quantités d'inoculum pour la production de l'antibiotique A204. 30 Le nouvel organisme capable de produire l'antibiotique A204 a été placé sur un dépôt permanent, sans restriction, avec la collection de culture de la Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (Formerly Northern Régional Research Laboratories),. Peoria, 35 Illinois, et on peut le trouver dans le commerce sous le nom de culture N° NRRL 3384. A cause de l'incertitude des études taxonomiques avec le groupe d'organismes Streptomvces, il y a toujours un élément de doute associé à la classification d'un organisme nouvellenent 40 découvert. Cependant, l'organisme qui produit l'antibiotique A204 ' j j "t U J a ZUU^44D apparaît ressembler de façon la plus proche, dans ses caractéristiques les plus importantes, à la description publiée des organismes Streptomvces albus. Streptomyces albidoflavus, et Streptomvces flaveolus. Cependant, on considère la culture comme étant une souche 5 de S. albus, (Rossia Doria), Waksman et Henrici, d'après la description de la souche néotype de S. albus ATCC 3004 par Lvon et Pridham, _ _ de /J. Bacteriol 83 ; 370-380 (1962)_/, et/la souche S.albus de IMRU 3005 décrite par Waksman, /The Actinomvcetes, Vol. II "Classification, Identification, and Description of Généra and Species, 10 "Williams and Wilkins Co., Baltimore (196l)_7- Cependant, en dépit des similitudes, il existe des différences suffisantes pour distinguer le nouvel organisme employé dans cette invention des souches de S. albus décrites préalablement. Donc, on a classé les organismes NRRL 3384 comme étant une nouvelle 15 souche de Streptomvces albus. Les descriptions détaillées données ici sont faites avec référence particulière au nouvel organisme NRRL 3384. Cependant, on doit comprendre que la production de l'antibiotique A204 par log mutants de croissance de cet organisme produisant l'A204 rentre 20 dans le champ d'application de cette invention. On peut produire d'autres mutants par des -procédés connus, comme par exemple en soumettant la souche ci-dessus à l'action des rayons X, des radiations ultraviolettes, ou bien à l'action d'agents chimiques tels que les moutardes à l'azote. 25 Les méthodes employées pour les études taxonomiques de la souche S. albus produisant l'antibiotique A204 étaient celles recommandées pour le International Streptomyces Project décrit par Shirling et Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species, "Intern. Bull. Systematic Bacteriol : 16, 30 313-340 (1966), avec d'autres essais supplémentaires. On effectuait les tests d'utilisation du carbone selon la méthode décrite par Pridham et Gottlieb, J. Bac. 55, 107 (1948). Les résultats obtenus d'après les études taxonomiques sont représentées dans le tableau ci-dessous. Les noms des couleurs étaient donnés selon la méthode 35 ISCC-NBS (Kelly et Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names.° U.S. Dept. of Commerce Cire. 553. Washington, D.C.). Les références entre parenthèses se rapportent aux séries de couleur de Tresner et Backus (Tresner et Backus /Ï9667» "System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy," 40 Appld. Microbiol. 11: 335-338). Les couleurs de Maerz et Paul sont 69 03465 9 2002445 données entre parenthèses. (Maerz et Paul, 1950, Dictionarv of Color. McGraw-Hill, New York). TABLEAU IV Description de la Culture NRRL 3384 5 Propriété observée Caractéristiques Morphologie 10 CARACTERISTIQUES DE CULTURE SURs Malate de calcium 15 20 Farine d'avoine à la sauce tomate ICP N°2 25 (Agar de malt de levure) ICP N°3 30 (Agar de farine d'avoine) ICP N° 4 (Sels minéraux - Agar 35 Amidon) ICP N° 5 (Glycérol-Agar d'asparagine) 40 Sporophores en spirale produits, contenant 3 à 50 spores par chaine, habituellement 10 à 50, spores ovoidesà allongés, l,9/i x 1,3 /a-, surfaces des spores lisses, comme cela est observé dans des micrographiques électroniques. Croissance abondante ,envers vert-jaunâtre pâle ^10Bl7; sporulation et mycélium àlbir abondant, (7) jaune pâle, 2ba /TlCl7; pas de pigment soluble ; milieu légèrement éclairci. Croissance abondante, envers jaune-grisâtre /IlB27; sporulation et mycélium abondants à l'air (W), blanc ci ; pas de pigment soluble Croissance abondante, envers jaune-gris /Ï1B27; sporulation et mycélium abondant à l'air (Y), jaune-pâle, 2ba /llcl7; pas de pigment soluble. Belle croissance, envers blanc, sporulation et beau mycélium à l'air, (W), blanc a. ; pas de pigment soluble. Croissance abondante, envers jaune gris /Ï1B27; sporulation abondante et mycélium à l'air (Y), jaune-pâle 2ba /llCl/; pas de pigment soluble. Croissance abondante, envers vert- jaunâtre pâle /L0B17 ; sporulation abondante et mycélium à 11 air (W), blanc, ,a ;pas de pigment soluble. 69 03465 10 2002445 TABLEAU IV (SUITE) Description de la Culture NRRL 3384 Propriété observée Agar de Czapek 5 Agar de tyrosine 10 Asparacrine de glucose 15 Agar d'Emerson 20 Agar de Bennett Agar de Nutrient 25 Action sur le lait Réduction du nitrate Production de mélanine Agar fer-peptone 30 Extrait de levure de tryptone Liquéfaction de la gélatine Températures nécessaires 35 Caractéristiques Bonne croissance, envers blanc, bonne sporulation et mycélium à l' air (W), blanc a. ; pas de pigment soluble. Croissance très médiocre, pas de couleur. Belle croissance, envers jaune /Ï1C17; belle sporulation et mycélium à l'air (Y), jaune pâle, 2ba /TlClJ ; pas de pigment soluble. Croissance abondante, envers jaune gris /X2B37; sporulation abondante et mycélium à l'air (GY), gris jaunâtre, 2de /ÏQA27; pas de pigment soluble. Croissance très médiocre, pac de couleur. Belle croissance, envers jaune-grisâtre /Ï1B27; belle sporulation et mycélium à 1'air (W) blanc a ; pas de sigment soluble. Pas de changement après 14 jours. Positive Positive Négatif Négatif Nulle après 14 jours. Croissance et sporulation-belles à 26° ; bonnes à 30° ; croissance végétative à 37°C; trace de croissance, seulement végétative à 43-49°. Pas de croissance à 55°. ô l± f*\ ***, \J sj 11 2002445 TABLEAU IV (SUITE) •' Description de la Culture NRRL 3384 Propriété observée Caractéristiques - Tous les milieux sauf le milieu ICP N° 4 ne sont pas affectés. Changement sur le milieu ICP/N°4, du brun au blanc ou incolore quand il est traité soit par HCl 0,05N soit par NaOH O,05N. Pas de pigment soluble + (-) (+) (+) + + + + + 25 (+) = utilisation probable (-) = utilisation douteuse - = pas d'utilisation -Le milieu de culture pouvant être employé dans la production de l'antibiotique A204 par culture de l'organisme décrit ci-dessus 30 peut être un milieu quelconque choisi parmi plusieurs milieux, puisqu'il apparaît d'après les tests d'utilisation décrits ci-dessus que l'organisme est capable d'utiliser différentes sources d'énergie. Cependant, pour une économie dans la production,un rendement maximum de l'antibiotique, et une facilité d'isolement de l'antibiotique, 35 certaines sources nutritives relativement simples sont préférables. Par exemple, les milieux qui sont utiles dans la production de l'antibiotique comprennent une source assimilable de carbone telle que le glucose, le fructose, l'amidon, la glycérine, les mélasses, la dextrine, le sucre brun, etc... La source de carbone préférée est 40 le glucose. De plus, les milieux pouvant être employés comprennent Réponse du mycélium du substrat 5 à changement de pH 10 Réponse du pigment soluble à un changement de pH Utilisation du carbone L-arabinose Sucrose 15 D-Xylose D-Pructose Glucose Rhamnose Raffinose 20 I-Inositol D-Mannitol Carbone (témoin) Code d'utilisation + = positif 69 03465 12 2002445 une source assimilable d'azote telle que la farine de soja, les macération de solides à base de/céréales, la levure, la farine de graine de coton, de l'extrait de boeuf, des peptones (viande ou soja) la caséine, les mélanges d'amino acides, et les produits semblables. Les sources 5 d'azote préférées sont les peptones, la farine de soja, les mélanges d'amino acides, et les produits semblables. Parmi les sels minéraux nutritifs pouvant être incorporés dans les milieux de culture, on trouve les sels courants pouvant donner doc ions sodium, potassium, ammonium, calcium, phosphate, sufate, chlorure, carbonate, et 10 des ions semblables. Des éléments mineurs nécessaires pour la croissance et le développement optimum de l'organisme utilisé pour la production de l'antibiotique A204 doivent également être compris dans le milieu de culture. Ces éléments à l'état de trace se trouvent habituelfement 15 sous forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu en quantité suffisante pour satisfaire aux exigences de la croissance des actinomycetes employés dans cette invention. Le pH initial du milieu de culture peut varier. Cependant, on a constaté qu'il était souhaitable que le pH initial du milieu soit 20 compris entre 6,5 et 7,5. Comme cela a été observé avec d'autres actinomycetes, le pH du milieu augmente progressivement durant la période de croissance de l'organisme pendant que l'organisme est produit, et il peut atteindre une valeur de 7,0 à 7,6 ou bien davantage, le pH final dépendant au moins en partie du pH initial 25 du milieu, des tampons présents dans le milieu, et du laps de temps pendant lequel on laisse l'organisme croître. Des conditions de culture aérobie submergée sont les conditions de choix pour la production de l'antibiotique A204. Pour la préparation de quantités relativement petites, on peut employer des flacons 30 agités et des cultures en surface dans des bouteilles ; mais pour la préparation de grandes quantités, on préfère une culture aérobie submergée dans des réservoirs stériles. Le milieu dans le réservoir stérile peut être inoculé par une suspension sporulée, mais à cause du retard de croissance expérimenté quand une suspension sporulée 35 est utilisée comme inoculum, la forme végétative de la culture est préférée. En évitant ainsi le retard de croissance, on réalise une utilisation plus efficace de l'installation de fermentation. Donc, il est souhaitable de produire un inoculum végétatif de l'organisme en inoculant une quantité relativement petite de milieu de culture 40 par la forme de spore de l'organisme ; et quand on a obtenu un 69 03465 13 2002445 inoculum actif, végétatif, jeune, tranférer 1'inoculum végétatif de manière as eçfcique au grand réservoir. Le milieu dans lequel l1inoculum végétatif est produit peut être soit identique soit différent du milieu utilisé pour la produ tion à grande échelle 5 de l'antibiotique A204. L'organisme qui produit l'antibiotique A204 croît dans un grand intervalle de température compris entre 25 et 37°C. Il semble que la production optimale de l'A204 se produits à des températures de 26-'30°C. En général, la production maximale de l'antibiotique 10 se produit en 48-72 heures après inoculation du milieu de culture. Comme d'habitude dans les procédés de cultures aérobies submergées, de l'air stérile est insuflé dans le milieu de culture. Pour la croissance efficace de l'organisme et la production efficace de l'antibiotique A204, le volume d'air employé dans la production 15 avec un réservoir de l'A204 va de 0,2 à 0,4 volume d'air par minute par volume de culture. Le volume préféré est 0,35 volume d'air par minute par volume de milieu de culture. La concentration de l'activité antibiotique dans le milieu de culture peut être suivie facilement au cours de la période de fer-20 mentation en testant des échantillons de milieu de culture en ce qui concerne leur activité inhibitrice contre la croissance des organismes connus comme étant inhibés par la présence de 11 antibiotique A204. On a constaté que les organismes Straphvlococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, et Mycobacterium avium sont utiles 25 dans ce but. L'essai des échantillons peut être effectué par des méthodes bien connues de turbiâimétrie ou de"plaque-coupelle" (cup-plate). En général, la production maximale de l'A204 se produit dans les deux ou trois jours suivants l'inoculation du milieu de culture 30 dans des procédés de culture aérobie sulmergée ou de culture en flacon agité. L'activité antibiotique produite au cours de la fermentation de l'A204 peut se produire soit dans le bouillon antibiotique soit dans le mycélium soit dans ces deux endroits à la fois.- Donc, 35 les techniques d'isolement employées dans la production de l'A204 sont conçues de façon à permettre la récupération maximale de l'antibiotique à partir de l'une de ces sources ou bien les deux. Donc, par exemple, le bouillon de fermentation obtenu peut être filtré et le filtrat peut être extrait par un solvant convenable 40 pour récupérer l'activité antibiotique n'étant pas retenue par 69 03465 14 2002445 le cake mycelien. De plus, l'antibiotique présent dans le cake mycélien est récupéré par extraction complète par un solvant convenable. Dans l'un ou l'autre cas, l'antibiotique peut être récupéré du solvant d'extraction par des méthodes ordinaires habituellement 5 employées dans la technique. Afin d'illustrer plus en détail l'opération de cette invention, on donne les exemples suivants à titre d'illustration. Exemple 1 Production de l'antibiotique A204 en flacon agité 10 La production de l'antibiotique A204 dans des cultures en flacon agité est illustrée par l'exemple suivant : Des spores de Streptomvces albus NRRL 3384 étaient inoculés sur une pente d'agar-agar nutritive faite- de 10 g. de dextrine, de 2 g. de caséine digérée par une enzyme, de 1 g. d'extrait de 15 boeuf, de 1 g d'extrait de levure, de 20 g d'agar-agar et de suffisamment d'eau pour avoir un volume total de 1 litre. Les pentes étaient inoculées par des spores de Streptomvces albus NRKL 3384 et on les laissait incuber pendant quatre à cinq jours à 30°C. Les pentes étaient recouvertes d'eau distillée stérile et grattées 20 doucement pour enlever ""'.es organismes et pour en fournir une suspension dans un milieu aqueux. On utilisait un millilitre de la suspension de spores résultants pour inoculer chaque partie de 100 ml du milieu végétatif. Le milieu de culture végétatif était préparé en combinant 25 15 g de glucose, 15 g de farine de soja, 5 g de solides à base de liqueur de mais, 5 g de chlorure de sodium, 2 g de carbonate de calcium , et suffisamment d'eau du robinet pour faire un volume total de 1 litre. L'inoculum végétatif était agité pendant 48 heures à 30°C sur un agitateur alternatif ayant une course d'environ 30 5 cm à 108 tours minute. L'inoculum ainsi préparé est ensuite utilisé dans la production de l'antibiotique A204, de la manière suivante. On préparait un milieu de production ayant la composition suivante: Farine de soja 15 g/1. Caséine 1 g/1. 35 NaN03 3 g/1. Sirop de glucose 20 g/1. CaC03 2,5 g/1. Eau de robinet On plaçait des parties de 100 millilitres de milieu de produc-40 tion dans des Erlenmeyers, et on stérélisait ensuite à 120°C pendant 69 03465 15 2002445 30 minutes. Au cours du refroidissement, chaque flacon était inoculé par un inoculum végétatif à 5 pour cent préparé comme cela est écrit ci-dessus. Les flacons de production étaient agités pendant 48 heures 5 à 30°C sur un agitateur rotatif fonctionnant à 250 tours minutes. Le pH du milieu inoculé variait dans un domaine de pH de 6,5 à 7,5. Le pH de récolte à la fin du cycle de fermentation était compris entre 7,0 et 7,6 . On décelait une activité antibiotique à la fois dans le bouillon et dans le mycélium. Cette activité 10 était déterminée en testant le bouillon et le mycélium pour leur activité sur le Bacillus subtilis, en utilisant les méthodes connues du disque ou de la plaque-coupelle (cup-plate) « La totalité du bouillon (25 litres) obtenu par le procédé ci-dessus, était filtrée sous vide avec de la diatomite. Le 15 cake mycélien était extrait trois fois par un demi volume de méthanol aqueux à 50%. Les trois extraits myc=liens étaient combinés et concentrés sous vide pour éliminer le méthanol. Le bouillon filtré et le concentré aqueux des solutions d'extrait de mycélium étaient combinés, le pH du mélange était ajusté à 3 avec de l'acide 20 chlorhydrique, et la solution était extraite deux fois par un demi volume d'acétate d'éthyle. Des extraits d'acétate d'éthylé étaient combinés et concentrés à sec, redissous dans le chloroforme (10 ml par gramme de solides), et on faisait passer les solutions de chloroforme par une colonne de 30 cm x 100cm de carbone de Pittsburgh 25 contenant 2 g de carbone par gramme de solides. La colonne était ensuite éluée par un volume de chloroforme égal à 5 à 10 fois le volume initial. Les fractionsâ®€Luatde chloroforme étaient combinées, concentrées à sec sous vide, dissoutes dans une petite quantité de méthanol 30 chaud, refroidies, et les cristaux résultant étaient filtrés. La recristallisation donnait 8,9 g de cristaux d'antibiotique A204 ayant une puissance de 1200 à 1400 unités microbiologiques par milligramme. On identifiait les cristaux comme étant de l'antibiotique A204 par spectrographie RMN, IR, par chromatographie en 35 couche mince, et par chromatographie sur papier. Exemple 2 rroduction de l'antibiotique A204 On produisait l'antibiotique A204 selon le procédé de l'exemple 1, mais en utilisant un milieu ayant la composition suivante : 40 Glucose 15 g 69 03465 16 2002445 Farine de soja 15 g Solides de liqueur de maïs 5g NaCl 5 g 5 CaC03 2 g et de l'eau du robinet en quantité suffisante pour avoir un volume total de 1 litre. Exemple 3 On produisait l'antibiotique A204 dans le procédé de l'Exemple 10 1, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante : Glucose 20 g (MH4)2S04 5 g CaCOg 8 g 15 KC1 4 g KH2K>4 0,4 g farine de soja 5 g et suffisamment d'eau du robinet pour amener le volume total à 1 litre. 20 Exemple 4 On produisait l'antibiotique A204 selon le procédé de l'Exemple 1, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante : Glucose 10 g 25 Hélasses comestibles 20 g Peptone 5 g CaC03 2g et suffisamment d'eau du robinet pour amener le volume total à 1 litre. 30 Exemple 5 Production avec une installation pilote de l'anti- biotique A204 submergée La production de l'antibiotique A204 par une fermentation/avec une installation pilote est illustrée par le procédé suivant : 35 Un flacon de 250 ml contenant 50 ml d'un milieu végétatif comprenant 10 g par litre de dextrose, 25 g par litre d'amidon soluble, 15 g par litre de gruau d'avoine, 10 g par litre de liqueur de macération de maïs, et 2 g par litre de CaC03 dans de l'eau du robinet, ayant un pH ajusté à 6,5 (NaOH), était inoculé par une 40 suspension à 5% obtenue selon la méthode décrite dans l'Exemple 1 69 03465 17 2002445 à partir d'une culture inclinée sur de l'agar-agar nutritif comprenant 10 g de glucose, 10 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl, 0,01 g de FeSO., 7H 0, 0,25 g de MgSO., 7H_0, et 20 g d'agar-agar de Meer (lavé trois fois) dans un litre d'eau permutée. 5 Le milieu végétatif inoculé était incubé à environ 30° C pendant 48 heures sur un agitateur rotatif ayant une course de 5 cm, fonctionnant à 250 tours minute. Une partie de 1S ml de la culture végétative ainsi obtenue était employée pour inoculer un flacon de 1 litre contenant 200 ml de milieu végétatif. Le milieu végétatif 10 inoculé était incubé à environ 30°C pendant 30 heures sur un agitateur rotatif ayant une course de 5 cm et fonctionnant à 250 tours minute. Une partie de 200 ml de la culture végétative ainsi obtenue était employée pour inoculer un fermenteur de 40 litres contenant 25 litres d'un milieu de fermentation aqueux stérilisé comprenant 15 0,2 g par litre d'agent anti-moussant Dow Corning Antifoam, 25 g par litre dè dextrose, 15 g par litre de gruau d'avoine, 3 g par litre de mélasses "blackstrap", 1 g par litre de caséine et 2,5 g par litre de CaCO^ dans de l'eau du robinet. On maintenait la fermentation à une température de 30°C pendant 30 heures après l'ino-20 culation. On effectuait une agitation à la vitesse de 420 tours par minute au cours de la fermentation. L'aération au cours de la 3 3 fermentation était effectuée à une vitesse de 0,4 m d'air par m de milieu par minute. On isolait l'antibiotique de la manière décrite dans l'Exemple 1. 25 Exemple 6 Préparation de sels de l'antibiotique A204 à partir du bouillon et du mycélium Les sels de métaux alcalins, d'ammonium, et d'aminé de l'antibiotique A204 étaient préparés à partir du bouillon et du mycélium 30 selon la méthode de l'Exemple 7 en^ajustant le pH du bouillon filtré et du concentré aqueux combinés de l'extrait de mycélium à une valeur au moins égale à pH 8,5, avec l'hydroxyde de métal alcalin, d'ammonium, ou d'aminé approprié, en extrayant deux fois par un demi volume d'acétate d'éthyle, et en procédant ensuite de la manière 35 décrite ci-dessus. L'acide et ses sels peuvent également être cristallisés dans de nombreuses cétones, de nombreux esters, alcools, et mélanges benzène-hydrocarbure, ou bien ils peuvent être purifiés par d'autres méthodes connues dans la technique, par exemple par chromatographie 40 sur colonne et méthodes semblables. 69 03465 18 2002445 Exemple 7 Préparation du sel de sodium de l'Antibiotique A2 04 A 100 mg de l'antibiotique A204, obtenus dans l'Exemple 1 et 5 dissous dans un ml d'acétone, on ajoutait une goutte de NaOH 5N et un ml d'eau. On éclaircissait le mélange en chauffant doucement et on le laissait reposer à -15°C jusqu'à ce qu'il se produise la cristallisation. Les cristaux étaient filtrés et recristallisés dans l'alcool aqueux pour donner 72 mg de sel de sodium de l'anti-10 biotique A204. Exemple 8 Préparation du sel de Potassium de l'antibiotique A204 On obtient le sel de potassium en substituant à la goutte de NaOH 5N de la méthode ci-dessus une goutte de KOH 5N. 15 Exemple 9 Préparation du sel d'argent de l'antibiotique A204 Six cent soixante dix milligrammes du sel de sodium de l'antibiotique A204 étaient dissous dans 40 ml de méthanol, mélangés à une solution de 270 mg de nitrate d'argent dans 2 ml d'eau, et on 20 laissait reposer à température ambiante pendant 3 heures dans le noir. La solution était évaporée à sec et lavée par de l'eau pour éliminer l'excès de nitrate d'argent. Le résidu était dissous dans 10 ml de méthanol en chauffant, filtré à chaud dans un entonnoir de verre fritté, et on le laissait reposer pendant 16 heures 25 à 50°C. On obtenait de grands cristaux rectangulaires blancs de sel d'argent de l'antibiotique A204, et on le recristallisait dans l'acétone aqueux, on obtenait 450 mg de sel d'argent de l'antibiotique A204. Exemple 10 30 Isolement de l'antibiotique A204II Le sel mixte sodium-potassium de l'antibiotique A204 (100 g), obtenu comme cela est décrit dans l'Exemple 6, était dissous dans 500 ml d'un mélange benzène-acétate d'éthyle (7/3). La solution était chromatographiée sur une colonne contenant 2000 g de gel de 35 silice (Grace-Davison Chemical Co, Grade 62). L'élution était effectuée avec un mélange benzène-acétate d'éthyle (7/3), et l'élution des fractions était suivie par chromatographie en couche mince sur du gel de silice en utilisant de l'acétate d'éthyle comme solution de développement et une pulvérisation de H^SO pour la détection. 40 On éluait d'abord 1'A204. Après avoir recueilli approximativement 69 03465 19 2002445 32 litres de solvant, on changeait le solvant pour une solution benzène sur acétate d'éthyle (1/1). On continuait l'élution jusqu'à ce que l'on ne détecte plus de tache sur les plaques CCM-gel de silice. 5 Les fractions contenant des concentrations éle vées de A204II étaient combinées,concentrées à sec, et cristallisées dans une solution acétone-eau. Les cristaux résultants(3 g.) étaient de nouveau chromatographiés sur une colonne contenant 71 g de gel de silice dans un mélange benzène-acétate d'éthyle (7/3) et on sui-10 vait de nouveau l'élution par CCM. Les fractions contenant seulement l'A204II étaient combinées, concentrées à sec, et cristallisées dans une solution acétone-eau, on obtenait 788 mg de A204II cristallin (point de fusion 177-179°C., activité égale à 1550 unités de A204 par ml). 69 03465 20 2002445 REVENDICATIONS 1. L'antibiotique A204 et ses sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, et ses sels azotés basiques, ledit antibiotique étant caractérisé comme un solide cristallin blanc fondant 5 à 96-98°C quand il est cristallisé dans 11éthyl-éther ; il est soluble dans les esters, le benzène, les hydrocarbures halogénés, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, l'éther et les cétones, il est légèrement selubies dans les alcools, et il est très peu soluble dans l'eau ; il est acide, il a un groupement titrable 10 ayant un pK'a égal à 6,1 ; il a un poids moléculaire apparent égal à environ 900, déterminé d'après des résultats de titrage ; il a la composition approximative suivante : carbone : 61,74 pour cent, hydrogène : 9,37 pour cent, et oxygène : 28,38 pour cent ; il a . 25° un pouvoir rotatoire spécifique, (c*0D , égal à468,12° (C = 1 pour 15 cent en poids par volume dans le méthanol) -, dans une solution de chloroforme on peut distinguer les bandes suivantes dans le spectre d'absorption infrarouge de ce corps, dans le domaine de 2,0 à 15,0 microns ; 2,95 ; 3,43 ; 5,95 ; 6,87 ; 7,26 ; 7,80 ? 8,52 ; 8,95 ; 9,17 ; 9,34 ; 9,59 ; 9,82 ; 10,07 ; 10,24 ; 10,51 ; 10,77 ; 20 11,40 ; et 11,80 microns, et^'a pas de spectre d'absorption ultraviolet caractéristique. 2. Une substance antibiotique choisie dans la claaje composée de l'antibiotique A204II ou d'un de ses sels d'un métal alcalin, alcalino-terreux, d'ammonium ou d1aminé, le sel mixte sodium-potas- 25 sium de l'antibiotique A204II étant caractérisé comme un solide cristallin blanc soluble dans les esters, le benzène, les hydrocarbures halogénés,.le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, l'éther, et les cétones, il est légèrement soluble dans les alcools et très peu soluble dans l'eau ; il a un groupement titrable ayant' un 30 pK'a = 6,3 dans une solution eau-diméthylformamide à 66%, il a . 25° un pouvoir rotatoire spécifique (^)jj égal à+42,3° (C = 1 pour cent en poids par volume dans le méthanol) ; et, en solution dans le chloroforme, on distingue les bandes suivantes dans le spectre d'absorption infrarouge de ce produit, dans un domaine de 2,0 à 35 15,0 microns ; 3,20 ; 3,45 ; 6,26 ; 6,90 ; 7,30 ; 7,68 ; 7,80 ; 8,20 ; 8,50 ; 8,80 ; 9,22 ; 9,39 ; S, 59 ; 9,70 ; 9,82 ;10,08 ; 10,26 ; 10,48 ; 10,83 ; 10,96 ; 11,30 ; 11,55 ; et 11,78 microns. 3. Une méthode do production de l'antibiotique A204 comprenant la culture d'une souche produisant l'antibiotique A204 de Strepto- 40 mvees albus dans un milieu de culture contenant des sources assimi- 69 03465 21 2002445 labiés de carbone, d'azote, et des sels minéraux, dans des conditions aérobies submergées, jusqu'à ce qu'une quantité appréciable de l'A 204 soit produite par ledit organisme dans ledit milieu de culture. 4. Une méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit 5 organisme est le Streptomvces albus NRRL 3384. 5. Une méthode selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle le milieu de culture est maintenu à une température égale à environ 25-37°C, et dans laquelle la croissance de l'organisme est effectuée pendant une période égale à environ 24 à 72 heures. 10 6. Une méthode selon la revendication 3, 4 ou 5, comprenant do plus la récupération de l'A204 dudit milieu de culture. 7. Une méthode selon la revendication 3, 4 ou 5, comprenant de plus la récupération desdits sels de métaux alcalino terreux, alcalins,et azotés basiques de l'antibiotique A204 dudit milieu 15 de culture. 8. Une méthode selon la revendication 3, 4,- 5, ou 6, comprenant de plus la récupération de l'antibiotique A204 et de l'antibiotique A204II, comme substances séparées, en transformant l'antibiotique A204 en un sel de l'antibiotique A204, en absorbant l'antibiotique 20 A204 de la solution dudit sel sur une résine convenable et en élu-ant sélectivement l'antibiotique A204IX et l'antibiotique A204 exempt d'antibiotique A204II de ladite résine. 9. Une méthode de production de l'antibiotique A204, sensiblement telle qu'elle est décrite ici. 25 10.L'antibiotique A204 ou l'antibiotique A204II, sensiblement tels qu'ils sont décrits ici.