Brevet FR2001159A1 — publié le 19690926

i La présente invention concerne un nouveau procédé perfectionné pour la préparation de la L-asparaginase qui est un enzyme connu. Dans la technique antérieure, on libérait la L-asparaginase des cellules d'Escherichia coli ( E. coli) ayant pous-5 sé sur un mULai de composition suivante : 3,0% de produit de digestion pancréatique de caséine, 0,7% d'un produit de digestion pancréatique de farine de soja, 0,25% d'hydrate de glucose, 0,5% de chlorure de sodium, 0,25% de phosphate dipotassique, île reste étant constitué par de l'eau de ville. ^ i 10 Dans le procédé selon l'invention, on prépare un 4 inoculum en ajoutant 0,25 à. 1 ml d'une suspension de cellules de E.coli à 50 ml d'un milieu stérile dans des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml. On incube ensuite les flacons inoculés à 25-j57°C sur uœîsecoueuse rotative pendant 20 à. 24 heures. 15 * On transfère ensuite en conditions aseptiques 0,5% en volume de 1'inoculum ci-dessus dans un volume désiré quelconque d'un milieu stérile. On effectue la fermentation à 25-37°C pendant 18 à 24 heures avec agitation, après quoi on récupère les cellules et on y dose la L-asparaginase. 20 Pour récupérer la L-asparaginase produite par la fermentation ci-dessus on centrifuge la suspension de cellules à 3-8°C'pour obtenir une pâte de cellules que l'on met en suspension dans une solution tampon au phosphate 0,001 M à pH 8,0 ou dans l'eau de ville et on soumet les cellules à 25 l'action des ultrasons pendant 5 minutes à une température de -15 à -5°C. On centrifuge la suspension de cellules éclatées contenant l'enzyme désiré et on-dose à pH 5*0 la L-asparaginase active in vivo dans la liqueur surnagearte ainsi clarifiée en 30 suivant le procédé décrit par Campbell et col., dans BIOCHEtîISTRY, Volume 6, n° J>, Mars, 1967* pages 721-730. Bien que la fermentation utilisant le milieu ci-dessus aboutisse à la production de quantités utilisables de L-aspa-raginase, les rendements laissent encore à désirer. La demande» 35 resse a découvert de façon surprenante selon l'invention que l'on peut accroître notablement les rendements en L-asparaginase en remplaçant l'hydrate de glucose dans le milieu réactionnel ci-dessus par le glycérol. 69 02213 2 2001159 15 Les quantités de glycérol que l'on peut utiliser dans le milieu de^fermentation selon l'invention peuvent varier entre environ 0,01$ et environ 0,75$ en poids. On utilise de préférence des quantités de glycérol de 0,01 à 0,5$ en poids 5 par rapport au milieu de fermentation. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemgle_l 10 A. milieuxd'essai On prépare un milieu de composition suivante : Produit de digestion pancréatique de caséine „ 3*00$ Produit de digestion pancréatique de farine de soja 0,70$ Chlorure de sodium 0,50$ Phosphate dipotassique 0,25$ Eau de ville q.s.p. 1000 ml Pour préparer les milieux d'essai, on ajoute au milieu de base ci-dessus l'un des composants suivants: a) 0,25$ ^ d'hydrate de glucose, b) une combinaison de 0,25$ d'hydrate de glucose et 0,25$ de glycérol et c), 0,15, 0,25, 0,50 ou 1,0$ de glycérol. On stérilise ensuite les milieux pendant - 2 30 mn à une température de 12Ô°C sous 1/5 kg/cm de pression de vapeur. B. Fermentation On met en suspension la culture de E. coli B (ATCC. n° 9637) cultivée sur milieu à la gélose dans un tube à essai dans 10 ml d'une solution stérile à 0,01$ de Duponol* On utilise la suspension de cellules résultantes pour inoculer un flacon contenant 50 ml d'un milieu stérile de composition suivante : 3,0$ d'un produit de digestion pancréatique de caséine, 0,7$ d'un produit de digestion pancréatique de farine de soja, 0£5$ d'hydrate de glucose, 0,5$ de chlorure de sodium, 25 t 35 0,25$ de_phosphate dipotassique, le reste étant constitué par de Veau ''de ville» On incube ce mélange à 33°C sur une secoueuse rotative d'une course de 5»08 cm à une vitesse de 240 tr/mn pendant 18-heures-. On inocule 4 Erlenmeyer de 250 ml contenant chacun 50 ml de milieu d'essai stérile avec 0,25 ml d'inoculum-- 69 02213 3 2001159 âgé de 18 heures. On place ces fioles dans la secoueuse rotative ci-dessus à 37°C pendant 20 heures, on centrifuge à 0-5°C la suspension de cellules résultantes et on jette la liqueur surnageante.On met en suspension la pâte de cellules résultantes 5 dans 11 ml d'une solution tampon au phosphate 0,02 M à pH 8,0 et on traite par les ultrasons pendant 5 mn à une température de -15 à -5°C dans un Bronson Sonifier (Modèle S-110) fonctionnant avec une puissance de 110 W et produisant des ondes sonores de 20 kilooycles par seconde. On clarifie ensuite la suspension 10 de cellules éclatées ainsi obtenues par centrifugation à 0,5*0, on jette la pâte de cellules et on dose la L-asparaginase active in vivo dans la liqueur-surnageante à pH 5,0 conformément au procédé de Campbell et Col. mentionné ci-dessus. Pendant le procédé de fermentation il peut être 15 souhaitable d'ajouter des ageris antimousse tels que polypro-pylèneglycol, saindoux ou analogues. Ces agents peuvent être ajoutés de temps en temps en quantités nécessaires pour contrôler la formation de mousse. Le tableau I ci-dessous donne les résultats de la 20 fermentation ci-dessus dans les divers milieux d'essai, avec et" sans hydrate de glutose et avec des pourcentages variables de glycérol. TABLEAU I 25 30 Glycérol Hydrate de Dosage Variâtitoriede' glucose Ul/ml la synthèse 0 % 0,25% 0,90 Témoin 0,15% 0% 1,62 +73% 0,25% . 0% 1,51 +67% 0,5 0% 1,21 +33# 1,0% 0% 0,86 -5,3% 0,25% 0,25% 0,90 0 35 Exemgle_2 Dans une expérience parallèle, en suivant le même procédé que dans l'exemple 1, sauf pour les quantités de glycérol utilisées, on obtient les résultats indiqués dans le tableau II ci-dessous. 69 02213 4 2001159 TABLEAU_II Effet du glycérol sur la synthèse de la L-asparaginase Glycérol Glucose Dosage Variation/ Ul/ml témoin 0# 0,25# 1,01 témoin 0# 0# 0,73 -28# 0,01# 0# 1,4.5 +42# 0,05#' 0# 1,40 +40# 0,10# 0# 1,46 +44# 0,15# 0# 1,45 +42# 0,25# 0# 1,21 +20# 1,0# 0# 0,83 -14,7# 15 On peut voir d'après les tableaux ci-dessus que l'utilisation de faibleB quantités de glycérol à la place de l'hydrate de glucose dans le milieu de réaction aboutit à des augmentationsnotâibles de la quantité de L-asparaginase produite 20 par la fermentation. Le tableau I montre aussi que l'addition d'une faible quantité de glycérol à l'hydrate de glucose n!appoite pas d'avantages et le tableau II montre que l'absence de l'un et de l'autre aboutit à une forte baisse du rendement en L-asparaginase. 69 02213 2001159 5 revendications 1° - Procédé de préparation de la L-asparaginase par fermentation d'Escherichia-coli caractérisé en ce que l'on utilise un milieu de fermentation contenant une faible proportion, de préférence de 0,01 à 0,5 % en poids, de 5 glycérol. 2° - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la couche Escherlchia-coli est Escherichia-coll B. 3° - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le milieu de la fermentation comprend un 10 mélange d'un produit de digestion pancréatique de caséine, d'un produit de digestion pancréatique de farine de soja, de glycérol, de chlorure de sodium, de phosphate dipotassique et d'eau. 4° - Procédé selon la revendication 1 caractérisé 15 par le fait que l'on effectue la fermentation avec agitation à une température de 25 à 37°0. 5° - La L-asparaginase obtenue par le procédé selon les revendications 1 à 4.