Brevet FR2010927A1 — publié le 19700220

i 2010927 Cette invention concerne un procédé amélioré pour isoler un enzyme, la L-asparaginase, d'un extrait provenant de cellules d'Escherichia coli (E.coli), lequel procédé comprend le traitement d'une solution de l'extrait par un polyalcoylèneglycol. 5 Cette invention concerne un procédé amélioré pour"isoler un enzyme, la L-asparaginase, d'un extrait provenant de cellules d'Escherichia coli (E. coli). Plus particulièrement, cette invention concerne le traitement de cet extrait par un polyalcoylèneglycol pour en précipiter l'enzyme. 10 On connaît dans la technique d'autres méthodes de précipitation de l'enzyme à partir de tels extraits. Par exemple, l'une de ces méthodes met en jeu la précipitation de l'acide nucléique et un fractionnement en deux étapes par le sulfate d'ammonium pour éliminer les autres protéines. 15 On a maintenant découvert, cependant, que l'on peut isoler l'enzyme plus facilement qu'il n'a été possible jusqu'ici, en le faisant simplement précipiter de la solution en ajoutant à cette dernière un polyalcoylèneglycol. Ainsi,le glycol polymère agit comme un agent de précipitation sélectif. 20 Les matériaux de "gâteau" cellulaire de départ qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont indiqués plus en détail dans les demandes de brevets américains en instance, n° 626.383, déposée le 28 Mars 1967 et n° 662.868 déposée le 24 Août 1967. 25 On a découvert que lorsqu'on ajoute un polymère d'un poly alcoylèneglycol à une solution contenant de la L-asparaginase et ayant un pH d'environ 4 à environ 11, la L-asparaginase est facilement précipitée. On opère en ajustant tout d'abord une suspension aqueuse du 30 "gâteau" cellulaire à un pH compris entre environ 7 et 8 avec une solution de base diluée (par exemple, solution de soude ou de potasse), ou une solution de phosphate tampon. Cette solution est ensuite acidifiée à l'aide d'acide chlorhydrique dilué. Le pH de cette solution est maintenu entre 3 et 5,2, les meilleurs résultats 35 étant obtenus à un pH d'environ 4 à environ 5. On ajoute ensuite de l'éthanol ou de l'acétone à cette solution pour en éliminer tous débris de cellules présents dans la suspension., Cn a aussi trouvé que l'addition d'un polyalcoylèneglycol à la suspension jusqu'à obtention d'une concentration en glycol de 1 à 2 % peut être aussi 40 utilisée à ce stade du mode opératoire. Ceci élimine notamment, 69 19779 2 2010927 comme indiqué ci-dessus, les débris cellulaires insolubles qui peuvent ensuite être écartés ou élimines par des méthodes*classiques, telles que filtratiori, centrifugation ou ëlectrophorèse, ou même genre. 5 Le surnageant du "gâteau", récupéré, est alors réajusté, avec la solution de phosphate tampon, à un pH d'environ 6 â environ 8,5 (pH désiré environ 8) „ On ajoute ensuite de l'éthanol ou de l'acétone jusqu'à formation d'un précipité. Ce précipité est recueilli soit par centrifu-10 gation, soit par filtration ou électrophorèse, et le surnageant est éliminé. On ajoute ensuite une solution de phosphate tampon au précipité jusqu'à obtention d'un volume égal au 1/lOème ou l/60ème du volume initial. Cette solution est maintenue à un pH d'environ 6 à 8 et tout insoluble apparaissant dans cette solution est séparé 15 par des moyens commodes comme indiqué ci-dessus. On ajoute à la solution surnageante récupérée un polyalcoylèneglycol jusqu'à obtention d'une concentration comprise entre environ 5 et 30 % en poids/vol. Le précipité formé à cette concentration est la L-asparaginase et la plus grande partie de la précipitation 20 a lieu pour une concentration en polyalcoylèneglycol d'environ 15 à environ 20 %. On élimine ensuite le précipité par des méthodes conventionnelles comme indiqué ci-dessus et on ajoute ensuite une solution de phosphate tampon pour reconstituer le volume cellulaire, le pH de cette solution étant d'environ 8. 25 On ajuste ensuite cette solution à un pH d'environ 3 à environ 5,2 avec de l'acide chlorhydrique dilué et on ajoute ensuite un polyalcoylèneglycol jusqu'à obtention d'une concentration de 1 à 2 %. Ceci provoque la précipitation des impuretés autres que la L-asparaginase. Le liquide surnageant résultant peut alors être 30 soumis directement à la séparation par chromatographie ou être précipité par un complément de polyalcoylèneglycol comme indiqué ci-déssus. On peut répéter cette opération à volonté. Les opérations de cette invention sont généralement effectuées à une température allant d'environ -5 à la température ambiante, la 35 température la plus souhaitable étant de -5 à 15° C. Las polyaljoylèney'lycols polymères qui peuvent être- utilisés pour faire précipiter la L-asparaginase" de la solution sont des polymères dérivés d'alcools alipàatiques dihydroxylés tels qu'éthylèse glycol, - "propylèn® glycol et 1,4-dihydroxybutane. Ainsi 40 las polymères tel a que polypropylèse glyeol, polyêthyl-èae glycol et 69 19779 3 2010927 poly-1,4-dihydroxybutane peuvent être utilisés, le polyéthylène-glycol étant le polymère préféré qui donne les meilleurs résultats. Les exemples suivants illustrent l'invention, toutes les températures sont en degrés centigrad® sauf spécification contraire. 5 Les expériences exposées dans ces exemples sont réalisées conformément à l'article de H.A. Canibell et al. donné dans BIOCHEMISTRY, Volume 6 (1967) pages 721 à 730 : Exemple 1 50 grammes de poudre acétonique de E. coli B sont mis en 10 suspension dans 1 litre d'eau distillée à la température ambiante. On ajoute alors 25,0 mg de lysozyme dissous dans 2-3 ml d'eau distillée. On agite la suspension pendant 20 à 30 minutes et on refroidit à + 5° C et on maintient à + 5° C pendant les étapes suivantes. On ajuste ensuite le lysat à pH 8,0 avec de l'alcali 15 dilué (NaOH) puis on l'ajuste à pH 5,0 avec de l'acide chlorhydrique dilué. On centrifuge alors la suspension, on jette le précipité et l'on ajuste le surnageant (580 ml) à pH 8,0 avec de l'alcali dilué. L'activité spécifique de la L-asparaginase est de 5 unités^ig de protéine. On ajoute ensuite lentement de l'alcool à 95 % à 20 la solution claire pour avoir une concentration finale de 60 % (v/v). On recueille ensuite le précipité formé par centrifugation à + 5° C, et on l'extrait par 33 ml de tampon de phosphate de potassium 0,01 M, pH 8,0. On sépare ensuite 11 insoluble par centrifugation et on l'élimine. Le surnageant riche en L-asparaginase 25 a une activité spécifique de 18 unités/mg de protéine. On ajoute ensuite du polyéthylèneglycol -6000 à la solution claire pour avoir une concentration finale de 20 % (unités/v). Ensuite on abaisse la température de + 5° C à 0° C. On recueille ensuite le précipité formé par centrifugation à 0° C après incubation pendant 20 heures 30 à 0°. On extrait le précipité par le tampon de phosphate de potassium 0,01 M, pH 8,0 ce qui donne une solution contenant la L-aspa-raginase à une activité spécifique de 94 unités/mg. Exemple 2 Conformément au procédé de l'Exemple 1 mais en utilisant 35 le polypropylène glycol au lieu du polyéthylène glycol on obtient la L-asparaginase désirée. Exemple 3 Conformément au procédé de l'Exemple 1 mais en ajustant la solution surnageante claire à pH 4 avant d'ajouter du polyéthylène-40 glycol-6000 on obtient la L-asparaginase désirée. 19779 4 2010927 L'invention peut être mise en application autrement, de manières diverses, dans le champ des revendications jointes. 69 19779 5 2010927 REVENDICATIONS 1. Un procédé d'isolement de la L-asparaginase, à action thérapeutique, qui consiste à ajouter à une solution contenant de la L-asparaginase un polyalcoylèneglycol qui fait précipiter la L-asparaginase de la solution, et à éliminer de la solution la 5 L-asparaginase ainsi formée. 2.Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le polyalcoylèneglycol est le polyéthylène glycol, le polypropylène glycol ou le poly-1,4-dihydroxybutane glycol. 3. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le poly-10 alcoylèneglycol est ajouté à la solution jusqu'à ce que sa concentration en solution soit d'environ 5 I 30 %. 4. Un procédé selon la revendication 3, dans lequel le pH de la solution est d'environ 4,0 à environ 11,0. 5. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel le poly-15 alcoylèneglycol est le polyéthylène glycol, le polypropylène glycol ou le poly-1,4-dihydroxybutane glycol.