Brevet FR2001200A1 — publié le 19690926

La présente invention a pour objet un agent de diagnostic pour la mise en évidence, sans perturbation, de sucres dans les liquides corporels, dans l'urine par exemple, de préférence. La mise en évidence de sucres tels que le glucose et le galactose dans les liquides corporels à l'aide du système couplé d'enzymes et d'indicateur comprenant la glucose-oxydase/la péroxydase/un agent générateur d'une matière colorante, ou la galactoseoxydase/une péroxydase/un agent générateur d'une matière colorante, dans deS solutions ou sur des papiers d'épreuve,est déjà connue depuis longtemps. Comme l'urine contientfréquemment des substances qui gènent la réaction précitée, les papiers d'épreuve à base de la réaction enzymatique susmentionnée, ne réagissent qu'en présence de concentratiom en sucre relativement élevées et pathologiquement significatives.Les substances perturbatrices contenues dans l'urine sont principalement des agents de réduction déterminés tels que 1' acide urique et l'acide ascorbique qui est occasionnellement présent. En raison de l'utilisation prophylactique et thérapeutique très répandue de doses élevées d'acide ascorbique sous forme de fortifiants, de Jus de fruits et de comprimés, des concentrations relb tivement élevées d'acide ascorbique dans l'urine humaine, ne constituent plus une rareté. Les perturbations des réactions enzymatiques de mise en évidence de sucres sont de ce fait, d'une très grande importance, car, pour différentes raisons, la précision et a sûreté des tests doivent obligatoirement être très grandes: 1 - Le pronostic favorable du diabète sucré augmente en cas de caractérisation précoce de la maladie du métabolisme.C'est pourquoi il est extrêmement important de pouvoir déterminer avec exactitude et en temps voulu,même des glycosuries très faibles. 2 - L'on est en mesure de doser, à l'aide d'une bande d'épreuve très sensible, même la faible teneur physiologique en glucose de l'urine normale. L'on peut déduire d'une réaction négative de bandes d'épreuve extrêmement sensibles, que des germes pathogènes ont consommé le glucose et que l'on est en présence d'une infection significative des voies urinaires. 5 - La présence d'excrétions de galactose dans l'urine permet-de déduire l'existence de graves anomalies du métabolisme chez le nouveau-né et d'affections hépatiques chez l'adulte, dont on peut éviter les conséquences si on les découvre à temps. I1 ressort de la littérature médicale que des maladies latentes des voies urinaires, en particulier la pyélonéphrite, sur viennent beaucoup plus fréquemment que l'on ne le supposait jusqu' à présent. Ces-maladies étaient le plus souvent mises en évidence par voie bactériologique, c'est-à-dire en déterminant le nombre de germes. En raison de la perte de temps importante Bu'une telle voie de détermination implique, les examens systématiques ne peuvent pas être effectués par ces moyens. De même, les différentes mises en évidence qui sont basées sur la réduction du chlorure de triphényltétrazolium (TTC) par des germes pathogènes, sont trop compliquées pour pouvoir être mises en oeuvre dans des examens systématiques ; cf. à ce sujet Mittlg. Lebensmitt. Unters. Hyg. 47, pages 191-199 (1956), Mschft. Kinderh. 113, pages 569-572 (1965).Le dosage rapide de nitrite dans l'urine permet la mise en évidence des germes pathogènes qui réduisent le nitrate présent dans l'urine. Mais comme toutes les infections des voies urinaires ne sont pas provoquées par des germes qui réduisent le nitrate, l'on obtient dans certains cas des résultats faussement négatifs qui limitent les possibilités d'utilisation de ce test ; cf. à ce sujetDtsch. Med. J. 18 , pages 343-547 (1967). Pour améliorer la mise en évidence des sucres par voie enzymatique, il a déjà été recommandé d'éliminer les substances peF turbatrices réductrices présentes dans l'urine, en faisant tout d' abord passer l'échantillon à examiner à travers une colonne char- gée d'un échangeur d'anions, puis d'examiner ensuite sa teneur en sucre. L'on comprendra aisément que de telles méthodes d'examen ne conviennent pas dans le cas d'examens systématiques pratiqués sur une importante agglomération de personnes. L'on a obtenu une certaine amélioration de ce principe en combinant le papier d'épreuve usuel avec un papier échangeur d'ions, en sorte que le liquide contenant du sucre ne pouvait parvenir dans la zone de mise en évidence proprement dite qu'éprès avoir migré à travers le papier échangeur d'ions : cf. à ce sujet le brevet Belge 692.196 du 4 Janvier 1967 . Les zones ainsi disposées séparément requièrent une manipulation exacte par un personnel spécialisé ; elles sont difficilement utilisables pour un examen systématique très développé. Si l'on doitj par exemple, examiner la population totale d'une grande ville ou d'un pays, pour déterminer la présence de diabète sucré ou de bactériurie, il est nécéssaire que des profanes puissent également exécuter la mise en évidence avec exactitude.Celà signifie que, dans la pratique, la bande d'épreuve ne doit pas livrer de résultats érronés, même si elle est manipulée de façon malhabile (par exemple par immersion com plète dans l'urine). Les bandes d'épreuve conformes au brevet Belge 692.196 précité possèdent en outre l'inconvénient de devoir être fabriquées à l'aide de machines spéciales, selon un procédé très précis, ce qui entratne un prix de revient élevé par bande d'épreuve. La Demanderesse a trouvé à présent que l'on obtient des bandes d'épreuve pour la mise en évidence simple et sans perturbation, de sucres, en imprégnant un support absorbant, possédant des propriétés d'échange dtions, de glucose-oxydase ou de galactoseoxydase, de péroxydase et d'un agent générateur d'une matière colorante. Un tel résultat n'était pas prëvisible, et il est particulièrementsurprenant pour les raisons suivantes : selon la conception en cours jusqu'à présent, lton ne peut mettre en évidence de faibles concentrations de glucose ou de galactose à l'aide de papiers d'épreuve, que lorsque la totalité des substances perturbatrices a été préalablement éliminée.L'on supposait à cet égard, jusqu'à présent, que la purification et la mise en évidence devaient être effectuées en deux stades séparés, car l'on supposait que l'eau oxygénée libérée au cours du premier stade de la réaction de mise en évidence était immédiatement fixée par les substances fortement réductrices présentes, notamment par l'acide urique et l'acide as ascorbique, et qu'elle ne participait pas, de ce fait, à la formation d'une matière colorante. I1 s'est à présent avéré, contre toute attente, que stil est vrai que dans les bandes d'épreuve conformes à l'invention, la zone direCtement humectée lors de 1 immersion de l'échantillon d'urine, ne présente > le cas échéant, aucun changement de couleur, par contre, dans la zone voisine, dans laquelle le liquide pénètre ensuite, il apparatt une réaction colorée nette et extrêmement sensible. Les papiers d'épreuve conformes à l'invention présentent, d'une manière surprenante, indépendamment de leur sensibilité vis-à-vis des solutions aqueuses des sucres considérés, une sensibilité uniforme, pratiquement indépendante de la concentration des substances perturbatrices, vis-à-vis des mêmes sucres dans l'urine. Comme celà ne procure aucune difficulté de faire varier la sensibilité des papiers d'épreuve usuels par voie enzymatique, en choisissant les qualités de papiers, les concentrations en enzymes, les valeurs de pH, etc ..., de même, l'on peut également réaliser les nouveaux papiers d'épreuve conformes à la présente invention à partir de papiers échangeurs d'ions de façon à leur conférer des sensibilités différentes.L'on utilise, pour la mise en évidence exacte des glycosûries élevées chez les diabétiques, des papiers moyennement sensibles qui ne donnent des indications qu'au dessus de 20 à 30 mg ffi de glucose.-Par contre, pour mettre en évidence les infections des voies urinaires, il est nécessaire de disposer de compositions qui conduisent à des papiers très et ex trtmement sensibles, et permettent même la mise en évidence de quart tités physiologiques de glucose comprises entre 2 et 20 mg %. I1 faut considérer comme particulièrement surprenant le fait que les papiers d'épreuve conformes à l'invention permettent d'éliminer les perturbations dues à la présence de substances réductrices telles que l'acide urique et l'acide ascorbique, bien que les échangeurs d'ions ne soient pas présents, comme dans les papiers conformes au brevet Belge 692.196 déjà mentionné, sous la forme basique, mais soient présents, en partie ou en totalité, sous forme de sels, du fait de l'utilisation de mélanges tampons (de.préférence dans une zone de pH comprise entre 4 et 7,5-). L'on ne pouvait pas prévoir que des échangeurs d'ions pourraient encore permettre, dans cette zone de pH, la séparation des substances perturbatrices, et que, de plus, dans de telles conditions le stade de purification et la réaction de mise en évidence se laisseraient combiner entre eux. La combinaison des opérations de purification et de mise en évidence, dans un seul support absorbant, rendue possible conformément à l'invention, est particulièrement avantageuse et permet une utilisation extrêmement économique des réactifs, dont certains sont coûteux. C'est ainsi qu'il est possible, par exemple, de découper une bande de papier absorbant, imprégnée de glucoseoxydase, de péroxydase et d'un agent générateur d'une matière colorante, et possédant des propriétés d'échange d'ions, en bandes de 5 mm dezlarge, conformément au brevet Français nO 1.350.340 déposé le 8 mars 1963 au nom de la Demanderesse, d'enfermer ces bandes entre deux feuilles de matière plastique et de découper les feuilles en question en bandes d'épreuve de 5 mm, facilement maniables, de telle manière que chaque bande contienne une zone de mise en évidence dont les dimensions ne soient que de 5 x 5 mm. Ces zones ne doivent pas eAtre soudées avec les feuilles, mais il suffit de les gainer de façon lâche. I1 s'est avéré particulièrement avantageux, dans ce mode de réalisation, de rendre en outre la surface de la bande de réactif faiblement hydrophobe. L'on peut utiliser comme agent propre à rendre la surface hydrophobe,par par exemple la paraS- fine ou l'huile de silicone dans un solVant organique légèrement volatil . Ce mode de réalisation de l'agent de diagnostic conforme à l'invention est particulièrement intéressant et sûr,et et peut être aisément utilisé par chacun.Ce test peut être utilisé soit sous la forme moyennement sensible, pour la mise en évidence du diabète sucré, soit sous la forme extrêmement sensible, pour la mise en évidence des infections des voies urinaires. Une immersion d'une brève durée dans l'urine, ou une imprégnation par un jet d'urine, suffisent pour la mise en oeuvre du test. L'agent de diagnostic pour la mise en évidence, sans perturbation, de sucres dans les liquides corporels, de préférence dans l'urine, constitué par un support absorbant qui est imprégné de glucose-oxydase, ou de galactose-oxydase, de péroxydase et d'un agent générateur d'une matière colorante, est en conséquence carao térisé, en ce que la totalité-du support absorbant possède des pro priNtds d'échange d'ions. L'on peut utiliser comme supports absorbants possédant dws propriétés d'échange dotions, principalement des papiers disponibles dans le commerce, qui contiennent en outre, des résines é chanteuses d'ions finement pulvérisées, comportant des groupements amnanium quaternaire, ou des fonctions amine primaires ou secondaires, dans leur structure, comme c'est notamment le cas de 1' "Amberlite IRA 400 n (marque déposée) sous forme de chlorure (grade SB 2), par exemple ; ou des papiers échangeurs d'ions réalisés à partir de cellulose modifiée, tels > par exemple, le. papier Whatman "Chromédia ET 81" ou des papiers échangeursd'anions MN 827 SB 35, MN 520 SB, MN 440 SB et MN 818 SB 35 fabriqués par la société MACHEREY, NAGEL & CO, de DUREN. Drautres supports absorbants possédant des propriétés dPechange d'ions, peuvent être constitués par des mAeches, des petites tiges ou'des bandes.L'on scelle de préférence les supports absorbants sur des bandes de matière plastique ou bien on les enferme entre des feuilles de matière plastique. I1 est évidemment également possible-de combiner les bandes d'épreuve conformes à l'invention avec d'autres bandes d'épreuve (par exemple pour le dosage d'albumine et la détermination du pH) ou avec des bandes d'épreuve présentant des sensibilités différentes.L'on peut utiliser comme agents générateurs de matière colorante, toutes les substances usuelles telles que I'o-tolidine, la benzidine, l'o dianisidine, etc..., ainsi que les substances décrites dans la demande de brevet Français nO PV 159.916 déposée le 19 Juillet 1968 au nom de la Demanderesse poUr " Procédé et agent de diagnostic pour le dosage des hydropéroxydes et des substances présentant une activité péroxydasique", les substances décrites dans le brevet Français 1.535.921 du 31 Août 1967 au nom de la Demanderesse et les substances décrites dans la demande de brevet Français nO PV 169.573 déposée le 11 Octobre 1968 au nom de la Demanderessepour:: Procédé et agents de diagnostic pour le dosage d'hydropéroxydes et de substances à activité péroxydasique". Les agents de diagnostic conformes à la présente invention seront décrits de façon plus détaillée dans les exemples qui vont suivre, qui sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention et n'ont aucun caractère limitatif. EXEMPLE 1 L'on imprègne du papier d'Amberlite SB 2, fabriqué par la Société SERVA, successivement des solutions de réactifs suivantes 1 - Péroxydase 7,7 mg Glucose-oxydase 178,0 mg Tartrazine 100,0 mg Eau distillée jusqu'à 100,0 ml 2 - Laurylsulfate de Sodium 100,0 mg Eau distillée 5,0 ml O-tolidine 420,0 mg Acétone jusqu'à 100,0 ml Si l'on immerge un tel papier d'épreuve dans de l'urine normale, l'on n'obtient aucune réaction colorée. Si on l'immerge partiellement dans une urine qui contient 50 mg ffi de glucose et en même temps 50 mg ss d'acide ascorbique, une coloration verte nette dans la partie non-immergée du papier d'épreuve, indique la présence de glucose. Avec des papiers d'épreuve destinés au dosage du glucose, disponibles dans le commerce, l'on n'obtient aucune réaction colorée. EXEMPLE 2 L'on procède à une imprégnation ultérieure d'un papier d'épreuve réalisé conformément à l'exemple 1, à laide d'une solution à 0,25 ffi de paraffine dans de l'éther de pétrole, on le découpe et on l'enferme entre deux feuilles, conformément au brevet Français 1.350.340 déjà cité plus haut, de telle manière que le pa pier soit gainé de façon lache par ces deux feuilles. Si l'on immerge une telle bande d'épreuve dans de l'u- rine normale, l'on n'obtient aucune réaction colorée. Si on l'im-- marge dans une urine qui contient 50 mg ffi de glucose et en même temps 50 mg ffi d'acide ascorbique, l'apparition d'une coloration verte nette indique la présence de glucose. Avec les bandes d'é- preuve de mise en évidence du glucose, disponibles dans le commerce, l'on n'obtient aucune réaction colorée. EXEMPLE L'on imprégne du papier échangeur d'anions MN 827 SB 35 fabriqué par la Société MACHEREY, NAGEL & CO, successivement des solutions de réactifs suivantes 1 - Péroxydase 7,7 mg Glucose-oxydase 178,0 mg Tartrazine 100,0 mg Phosphate monopotassique 269,0 mg Phosphate disodique 4,0 mg Eau distillée jusqu'à 100,0 ml 2 - Laurylsulfate de Sodium 100,0 mg Eau distillée 5,0 ml O-tolidine 420,0 mg Acétone jusqu 'à 100,0 ml Si l'on immerge un tel papier d'épreuve dans de l'urine normale dont la teneur en glucose est comprise entre 2 et 20 mg %, l'on obtient en l'espace d'une minute une coloration verte nette. EXEMPLE 4 L'on procède à ltimprégnation ultérieure d'un papier d' épreuve réalisé conformément à l'exemple 3, à l'aide d'une solution à 0,25 fi de paraffine dans de l'éther de pétrole, on le découpe et on l'enferme entre deux feuilles, conformément au brevet Français 1.350.340 déjà cité plus haut, de façon à gainer le papier entre ces deux feuilles,de façon lâche. Si l'on immerge un-tel papier dans de l'urine normale dont la teneur en glucose est comprise entre 2 et 20 mg %, l'on obtient en l'espace d'une minute, une nette coloration verte. REVENDICATIONS 1 - Agent de diagnostic pour la mise en évidence sans perturbation, de sucres dans les liquides corporels, de préférence dans l'urine, constitué par un support absorbant qui est imprégné de glucose-oxydase ou de galactose-oxydase, de péroxydase et d'un agent générateur de matière colorante, lequel agent de diagnostic est caractérisé en ce que la totalité du support absorbant possède des propriétés d'échange d'ions. 2 - Agent de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce que lue support absorbant est constitué par un papier échangeur d'ions. 3 - Agent de diagnostic selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le support absorbant contient des additions qui lui confèntdes propriétés hydrophobes, et est enfermé entre deux feuil les de matière plastique.