Brevet FR2011732A1 — publié le 19700306

La présente invention concerne un nouvel antibiotique à large spectre d'activité Antibiotique 66-40, ayant un effet défavorable sur le développement de bactéries G-ram-positives et firam-négatives, un procédé microbiologique-pour sa production et des 5 compositions pharmaceutiques contenant cet antibiotique. L'antibiotique peut être préparé, isolé et utilisé sous sa forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceUtiquement acceptables. L'Antibiotique 66-40 est un produit d'élaboration biosyn-10 thétique obtenu par culture d'une souche de Micromonospora généra-' trice d'Antibiotique-66-40 dans un milieu nutritif,aqueux. Le microorganisme préféré utilisé selon la présente invention pour la production du nouvel antibiotique a été.appelé Micromono spora inyoensis (quelquefois ci-après M. inyoensis). Cette 15 espèce a été isolée d'un échantillon de terre prélevé dans la Inyo National Forest dans les ¥hite Mountains de Californie# L'une des caractéristiques de souche est sa capacité de produire l'Antibiotique 66-40. Une culture de l'organisme vivant a été déposée et fait partie de la collection permanente de The Northern Utilization 20 and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, où on lui a attribué le numéro NEKL 3292. Des sous-cultures de M. inyoensis NRRL 3292 peuvent être obtenues facilement par le public auprès de l'organisme précédent, sur demande. Le M. inyoensis est aérobie et se développe 25 bien sur la surface de divers milieux nutritifs solides .et liquides Il présente un développement et une production d'antibiotique spécialement bons dans des conditions aérobies immergées* Le M. inyoensis peut se distinguer des autres espèces de Mi cromono sp ora "par divers paramètres taxopomiques» Après 14 jours 30 d'incubation à 24-26°C sur un milieu de gélose comprenant 3 # de NZ Aminé Typé A (Sheffield Chemical Coapaïay, >Norwich, New York), 1 Jé de dextrose et 1,5 # de gélose, on observe que le développement est seulement assez bon à médiocre. Microscopiquement, il n'y a pas de mycélium aérien apparent. Parfois, quelques colonies bien 35 développées apparaissent tardivement dans la zone d'inoculation. Sur certaines plaques? on observe un pigment diffusible brun rou-geâtre pâle associé air colonies. /"Dans la description des formations de couleurs pou.-- cette observation et pour d'autres, on 69 21096 2 2011732 utilise le système et les références suivants : les désignations de couleurs comprennent deux parties. La première partie est un nom de couleur pris dans le "Descriptive Color Name Dictionary", par Taylor, Knoche et G-ranville, publié en 1950 par la Container 5. corporation of America, Etats-Unis, avec un "chip number" de couleur correspondant au nom de la couleur, le "chip number" étant pris dans ."The Color Harmony Manual", 4ème édition, publié en 1958 par The Container' Corporation of America. La deuxième partie; de la désignation consiste en vin nom de couleur et un numéro se rappor-10 tant au synonyme ou synonyme approché trouvé; dans la Circulaire 553 du 1er novembre 1955 du National Bureau of Standards (Etats-Unis )_7 La surface des colonies a une couleur variant du'Tile fied g5ne - Strong Brown 55 au Brown Mahogany m6pi. Microscopiquement, le mycélium est long, ramifié, régulier et non cloisonné, comme 15 observé par microscopie à contraste de phases. Le mycélium a un diamètre d'environ 0,5 micron. Les spores sont portées isolément sur des sporophores simples de 1,0 à 1,5 micron de diamètre. Les spores sont à paroi rugueuse et sont de formes ovoïdes à sphériques. Le M. inyoensis se développe bien à 28-37°C; aucun dévelop-20 pement ne se produit à 50°C. Sur un milieu asparagine-gélose glu-cosé, le développement est médiocre. Une colonie de M. inyoensis en cours de développement hydrolyse la gélatine, le lait, l'amidon et réduit le nitrate en nitrite quand on effectue de tels essais selon la méthode de Gordon et autres, J. Bacteriology 69, 147 25 (1956) et 73» 15 (1957). De plus, le sucrose est utilisable comme source de carbone. Des caractéristiques supplémentaires d'une1 culture de M. inyoensis sont indiquées dans le Tableau A : 69 21096 3 2011732 TlBT.iaiTT 1 Milieu Caractéristiques 5 Gélose de Bennett Développement modéré - Couleur : Rust Brown-g5pg ; Strong Brown-55 Gélose d'Emerson Développement assez bon - Couleur : Brick Red-g6ng ; Moderate Red-dish Brown-43 10 Grélose à la pâte de tomates et à la farine d'avoine Développement assez bon iap&ragine-gélose glucoeée Développement médiocre 15 Gélose glucosée à l'extrait de levures Bon développement - Couleur : Rose Browa-g7ai j Bark Greyish Red 20 (Pigment diffusible marron pâle produit par certaines colonies) Tranche de pomme de terre Développement médiocre, mais qui s'améliore quand on ajoute du carbonate de calcium de la qualité 8réactif" 20 Gélose de Gzapek Développement assez bon Gélose à la tyrosine Développement assez bon, pas de pigment diffusible 25 Gélose peptonée au fer Développement assez pas de pigment diffusible Le M, Inyoensis est capable d'utiliser diverses sources de carbone et d'azote. Dans le ïableau B, on donne des observations concernant l'utilisation des hydrates de carbone. Une esti-50 mation visuelle du degré de développement est effectuée dans un milieu consistant en 0,5 % d*extrait de levures, 1 % d'hydrate de carbone et 1,5 % de gélose, le tout dans l'eau distillée. 69 21096 4 2011732 TABTMO B Utilisation des hydrates de carbone Hydrate de carbone dane le milieu Développement Essai à blanc Médiocre L-arabinose Médiocre D-glucose Bon D-galactose Assez bon à médiocre Bêta-lactose Assez bon à médiocre D-lévulose Médiocre Raffinose Médiocre L-rhamnose Médiocre Amidon Bon Suerose Bon (fl-xylose Assez bon à médiocre ïaosital Médiocre D-mannitol Médiocre d-(-)-arabinose Médiocre Dulcitol Médiocre D-ribose Assez bon Alpha-aélibioas Médiocre s ( -i- ) -méliSi4'@ae Médiocre Gljrcé2.*ol Médiocre Dans le ïableaii 0, l'utilisation est indiquée comme déterminée par estimation visuelles du développement sur des plaques de gélose dans un milieu consistant en 1 fo de glucose, 1,5 % de gélose et uns source d'azote comme indiqué, le tout dans l'eau distillés» 69 21096 5 2011732 ttbt.mtt -n Source d'azote. Développement.: 5 1 i» de NZ Aminé Type A Assez bon à modéré 0,5 56 de levure Bon ' ' 1 56 d ' asparagine Médiocre 1 d'acide glutamique Médiocre • 1 jé de nitrate d'ammonium Médiocre 10 -• - l'Antibiotique 66-40, le composé nouveau de la présente invention, est produit quand le mieroorganisme d'élaboration, le M. inyoensis. se développe dans un milieu nutritif aqueux dans des 15 conditions aérobies de préférence immergées comme décrit ci-après. 11Antibiotique 66-40 est un pseudo-oligasaccharide basique qui ae distingue facilement des autres pseudo-oligosàccharides par 8*8 propriétés biologiques, physiques et chimiques comme spécifié ci-après. 69 21096 6 2011732 10 15 L'Antibiotique 66-40 a un spectre d'absorption infrarouge caractéristique dans l'Jxaile minérale (Eujol) comme--représenté sur la figure 1. Les bandes d'absorption les plus significatives sont indiquées dans le Tableau D avec les désignations suivantes : S = forte, M = moyenne, W = faible, brd = large, VS = très forte et ¥W = très faible. " ' , TABLEAU D ' ' • ■ Bandes significatives d'absorption dans l'infrarouge de l'Antibiotique 66-40 2,98 3,05 3,16 3,35 5,93 6,25 / rU (M-S) / rU (M-S) / u (M-S) / 'U-3,50 yu(nujol) / 'U (W-M) / rU (M) 6,82 yu (nujol) 7,25 yu (nujol) 8,77 yx (M-S) 9,00 yu (M-S) 9,47 yu (S) 9,72-10,07 yu(S,large) 10,46 yu (M-S) 115 97 yti (M) 12,75 /u (V¥,large) 13,45-13,90/u (¥,lar . ge ) L'Antibiotique 66-40 a aussi un spBctre de résonaB.0» ma- 20 gnétique nucléaire (spectre EHÊT) caractéristique, comme représenté sur la figure 2. Le spectre EMU a été obtenu en utilisant un spec- tomètre Varian A-60-A (Varian Associates, 611 Hànsen Way, Palo Alto Californie) sur une solution (environ 0,4 cm^; concentration envi ron 20 mg/cn?) de l'antibiotique dans l'oxyde de deutérium (DgO). 25 Le spectre est enregistré en parties par million (PPM) par rapport au sel de sodium de l'acide 3-(triméthyl-silo)-propanesuifonique, l'étalon interne* • Dans le Tableau. Ej> on donne des résultats supplémentaires concernant des essais qualitatifs sur l'Antibiotique 66-40 et des 30 constantes physiques de cet antibiotique (base libre). 69 21096 7 2011732 TABLEAU E a) Réactions de coloration Sakaguchi Négatif Amidon-iodure de potassium Positif lïinnydrine Positif Chlorure stanneux Négatif Molish Négatif Biuret Positif b) Constantes physiaues Z^iZ/60 (C=0,3 1o dans H20) + 188,9° Point de fusion {Monohydrate) 185-190°C Poids d'équivalent 92 Ka 8,0 Analyse élémentaire Trouvé Calculé pour un mono- hydrate C 49,80 49g02 H 8, 20 8,44 N H, 95 15,04 0 (par différence) 27, 05 27,50 • L'analyse élémentaire correspond à la formule C^H^^U^Oy.HgO Masse moléculaire déterminée par spectrométrie de masse 447,26 Absorption- dans l'ultra-violet : transparent dans la plage entre 220 et 400 nyu. c) Solubilité de 1'Antibiotiaue 66-40 dans divers solvants Solvant Solubilité* Méthanol Modérément soluble Acétone Insoluble Chloroforme Légèrement soluble Ether Insoluble Benzène Insoluble Eau Très soluble * Terminologie selon U.S. Pharmacopia XVIII, page 8« Dans le tableau F, on Indique le spectre de masse de l'Antibiotique 66-40 sou& la forme de la base libre. Bass 1s tableau, les colorais e intitulées ai/e indiquent le l'apport de la masse à la charge et les colonnes intitulées Int. rel» indiquent l'intensité relative, c'est-à-dire les intensités des pics pour les divers rapports de la masse à la charge (ti/e) par rapport à celle du pi& m/e ~ 118» -j-3--3 —3—3 ctiomr»0ïct>0%ululululululululul-£'.-fa>.-^--p»-f»'.pfc-î* •f^unv)-* ovoco—j crvuiovo œ-3 o\ui-f»-v*iv>-* o>ui-p*v>tJv>-»o v ro o\ onv>4 -»■ iuct\ —»■ —»4^- j CD C\ Ci OVO -*Ul fOVri-P-UJ O-J^UJ OOO OUMUlOOOOUOU o o O O OOUl OWOUlOoui o o O OUlUl OO o o o o • "iR a m tf ch H o _» ooo o oovovdvdvovovovovo 03 00 €0 cd 00 cd 00 00 00*4 •lo -»• ovooo-jro -» ovooo-3 avui-f^vd lu 00-3-oïuî.ê».aj*ivî -»oui b » VJ) —>■ ' —»c-fv —*ro -»■ —v ,-»■ AJ.U1 IUVJ1 -»AjJ -»■ IV) - AOVjl'O'-i-JU-J-^ —U1 O-J Vjl ON-J -* CD OO-1- -»■ CTiVJlVO-fVjJ - O o O-OUI OOOO OO OOOOOOOOO O OU1U1U1 OO v ri- 4 a H •4^4i~4^4^4*v^uiAjî\ji.v>i.ro.rororoiu iojo roiv*iv*-»•.** uv-^\>i io ocdwv>j -» ovo co-a ovuh^vjj tu hovdoo-j crtui-etv» o «ti -» —* -»-.vjî m (-1 uv c^vjj crv\ji,ro,iv).rorouvui ro ui o a\v>i.ro.ro.ro ro oo-*.-»• roro-£»--*■ p «*• I oovnooooouioooooooooooooouiuioo tri 4 p • n H 0 w ; —*c -x: —jk —k; —je —*c -a: —-* ■-«( -v -à; -a: —». -a; —v: —». -* ^ vbvo Gb oo oo oo—3—3—3—3—3 ct\ o\ (T\ o\ ui uiuiui ui u»ui ;fO -J- QD-J ^ui a>CTi-f»VjJ O vx> CD 4a".Vjt ro -»• O VOCD-3 OVUïlV)-*-3 Oi O V* -* -»• IV) VO -- vji.roro.--jioru--jvji uivoroA-riro roo rovaoov>i4vioruv>iiurovjJ-» • Ul-O VJI-O UlOOO O-OUI Ul O O OOVJlOAJIUI VJ1OOUIOUI o -* —■ ro rovuroro ■v04*ul:0v-»-l\j.of0..f* iv>cjv^ lo oytvj.—3 to m ivî » «• ». vji ooo •OUI OO O OOUlUlUl OOOOOOOO o ooo o 'd- 4 œ H .ro.ro.iu.ro.to,ro.iu.ro.ro.ro ro.ro.ro ro.ro ro ro ro.to ru roro to to ro 10—>• @ vo œ*oo-~3-j—3 vn vn uiu>4^4>- v>i v>i v>i ujro-* -»■ -»• oo o o OOvo uD.vo furo -»• o-ovut-p» vu mui vo cd -3 m o vd o> ui- o>ui.v* lo -»■ ovo • P cf- 4 © H 4».4». 4». 4* -p».4*- 4»-4* Vd V»l VJJ VJJ V» V»V>1 VU VJ4 VJI VJIVU 4». VjJ V>lIO->-->. 0\CT>U1V>JV>1VjIVjHV> -»0 OO G&-3 -» OVO-f^ (U -»V>J IU OVri-IO -*0 IU—3UI-f^O -«• ru 4* o o o ovauiui4»-u*rouivji co—3 ->-4* V»J O OU1VOU1 OWJl Ô O O O O OO OUI o OO B o !? c+ 4 a H zzlilol 8 960il 6 69 21096 9 2011732 Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne aussi des dérivés pharmaceutiquement acceptables de l'Antibiotique 66-40, comme par exemple ses produits de solvatation (par exemple les hydrates), ses sels et ses produits de condensation avec des 5 aldéhydes et/ou des cétones. Il y a lieu de noter que l'antibiotique peut être soumis à plusieurs traitements ultérieurs; par exemple, les produits de solvatation de sels de l'Antibiotique 66-40 sont compris aussi dans l'invention. Certains de ces dérivés sont décrits en détail ci-après. 10 l'Antibiotique 66-40 étant basique forme facilement des sels non toxiques avec des acides organiques et inorganiques, comme par exemple les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, stéarique, propionique, tartrique, maléique, benzoïque et les acides du même genre. On peut utiliser aussi des acides' 15 polybasiques partiellement neutralisés (par exemple neutralisés par une base inorganique comme ïîaOH ou par une base organique). En général, les sels d'acides minéraux, comme ceux formés avec l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et les acides du même genre, sont solubles dans l'eau et peuvent être 20 obtenus par concentration ou lyophilisation d'une solution aqueuse de ces composés ou par précipitation par un solvant organique miscible avec l'eau, de préférence un alcool aliphatique inférieur ou une cétone. Il y a lieu de noter, toutefois, que les chlorhydrates de l'Antibiotique 66-40 présentent une solubilité notable 25 dans le méthanol et sont donc atypiques, les chlorhydrates peuvent être précipités à partir d'une solution aqueuse par l'addition d'une alcoylcétone inférieure, comme l'acétone. En titrant une solution aqueuse d'Antibiotique 66-40 avec moins qu'une quantité stoechiométrique d'acide, il est possible de former des sels 30 partiels d'addition d'acides. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression "sel d'addition d'acide"englobe tous les composés de ce genre. les sels d'addition d'acides non toxiques décrits, ci-dessus présentent à peu près le même spectre antibiotique que la 35 base azotée libre, mais ils en différent par les caractéristiques de solubilité. le nouvel antibiotique et ses sels*d'addition d'acides forment des hydrates a?oc l'eau et d'autres produits de solvatation 69 21096 10 2011732 avec des solvants organiques. Il devient évident, par conséquent, que dans les techniques d'isolement décrites ici, l'antibiotique est normalement obtenu sous la forme d'un hydrate et ses sels d'addition d'acides sont normalement obtenus sous la forme de produits 5 de solvatation d'alcools aliphatiques inférieurs ou de cétones. Ces hydrates et produits de solvatation sont relativement stables, et par conséquent les produits isolés contiennent de l'eau ou un solvant, habituellement à raison d'environ une mole par mole d'antibiotique. 10 Des caractéristiques physiques de certains dérivés de ce genre sont rassemblées dans le Tableau G. tatuïpiàii a Constantes physiques de sels de l'Antibiotique 66-40 Chlorhydrate de l'Antibiotique 66-40 sous la forme du produit de 15 solvatation avec le méthanol. £*7d25 (C = 1 > dans H20) +112,2° Analyse élémentaire Trouvé Calculé C 37,70 36,29 H 7,45 7,00 20 N 10,61 10,58 Cl 25,60 26,78 L'analyse correspond à C^gHj^N^0Y.5HCl.CH^0H Absorption dans l'ultra-yiolet.: transparent dans la plage entre 220 et 400 nyu. 25 Sulfate de l'Antibiotique 66-40 sous la forme du produit de solva- tation avec ls méthanol. /- 7 25 ' ( C = 1 0 dans HgO) + 105,1® Analyse élémentaire Trouvé Calculé G 35,52 33,14 30 H 6,33 6,39 N 9,32 9,66 S04 33,90 33,13 l'analyse correspond à (C1 )2.2CH^0H Absorption dans l'ultra-violet : transparent dans la plage entre 35 220 et 400 myu. Comme mentionné ci-dessus, l'Antibiotique 66-40 forme des produits de condensation non toxiques avec des aldéhydes et/ou àer 69 11096 n 2011732 cétones par des techniques qui sont en elles-mêmes connues. Les produits préférés envisagés ici, probablement des bases de Schifft sont ceux préparés.par condensation de l'antibiotique avec des aldéhydes et/ou des cétones ayant jusqu'à 12 atomes de carbone. 5 Parmi des aldéhydes et ces cétones, sont compris des composés ali-phatiques, alicycliques, aromatiques et hétéroeycliques. De plus, il y a lieu de noter que les aldéhydes et cétones ayant une structure cyclique fermée peuvent porter des substituants tels que des substituants hydroxy, halogéno, nitro, alcoxy inférieurs, alcanoyl-10 oxy inférieurs, etc. A titre d'illustration, et sans aucune intention de limitation, les composés suivants sont compris parmi les aldéhydes et cétones envisagés ici : aeétaldéhyde, acétone, méthyl-éthylcétone, crotonaldéhyde, furfural, cyclopentylaeétaldéhyde, vanllline, vératraldéhyde, benzophénone, benzaldéhyde, acétophénone, 15 salicylaldéhyde, pyridoxal, etc. Il y a lieu de noter que ces produits de condensation ne sont pas stables en présence d'eau. 69 21096 12 2011732 Comme mentionné ci-dessus, l'Antibiotique 66-40 est produit quand le microorganisme d'élaboration, le KL inyoensis» se développe dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies, de préférence immergées. 5 Pour des quantités limitées d'antibiotique, une culture en surface dans des flacons ou des ballons secoués peut être utilisée au lieu des conditions immergées, l'organisme est cultivé dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un hydrate de carbone assimilable. Il faut aussi un composé de l'azote 10 ou une matière du type protéique assimilable, les sources préférées de carbone comprennent le glucose, le maltose, le mannose, le su-crose, l'amidon, l'amidon de maïs, etc. les sources préférées d'azote comprennent la liqueur de macération de maïs, les extraits de levures, la farine de soja, les peptonee de viande, les produits 15 d'hydrolyse de caséine, les extraits de boeuf, etc. Des combinaisons de ces sources de carbone et d'azote peuvent être utilisées avantageusement. Il n'est généralement pas nécessaire d'ajouter des traces d'éléments, car l'eau du robinet est utilisée comme milieu pour la préparation; toutefois, l'addition de sels de cobalt 20 s'est révélée avantageuse. la production de l'Antibiotique 66-40 peut être effectuée à une température quelconque conduisant à uh développement satisfaisant du microorganisme, par exemple entre 20 et 40°C, de préférence entre 25 et 35°C. 25 Habituellementj la production optimale est obtenue en 3 à 7 jours, le pH du milieu reste habituellement assez près de 7 durant la fermentation, le pH final dépend en partie des tampons présents, s'il y en'.âr et il est avantageusement réglé à 8,0 environ avant la stérilisation. Quand la culture est effectuée dans 30 des récipients et cuves de grandes dimensions, il est avantageux de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif en inoculant au bouillon de culture une culture en terre ou sur gélose inclinée ou une culture lyophilisée de l'organisme. Quand un inoculum actif a été ainsi obtenu, il est transféré aseptiquement 35 dans des réservoirs ou cuves de plus grandes dimensions, le milieu dans lequel 1'inoculum végétatif est produit peut être identique à celui utilisé pour la production de l'antibiotique dans des cuves ou différent de lui du moment que l'on obtient un bon développement 69 21096 13 2011732 du microorganisme. Après achèvement de la fermentation, le milieu peut être traité par exemple comme suit : le bouillon entier est réglé à un pH de 2 environ à l'aide d'un acide minéral, de préférence l'acide 5 sulfurique aqueux, de façon que l'antibiotique basique soluble dans l'eau soit séparé du mycélium et dissous dans le milieu aqueux de fermentation. On filtre le mélange entier de façon à éliminer le bouillon et on neutralise le filtrat, avec ensuite addition d'acide oxalique pour précipiter les ions de calcium. Après une filtration 10 supplémentaire et un réglage à la neutralité, de préférence à l'aide d'hydroxyde d'ammonium, le filtrat neutralisé clair est passé à travers une résine échangeuse d'ions, de préférence du type IRC-50 Amberlite à la forme ammonium. Des exemples des résines du type Amberlite utilisées ici, pour un échange tant anionique que 15 cationique, peuvent être trouvés dans le Handbook of Chemistry and Phyaics, 42ème édition, Chemical Rubber Publishing Compapy, Cleve-land, Ohio (1960). On se débarrasse du bouillon usé, et l'antibiotique est élué de la résine à l'aide d'hydroxyde d'ammonium. Ii1éluat est concentré et évaporé et on obtient un résidu consistant 20 en Antibiotique 66-40 brut ayant une activité d'environ 500yug/mg selon la méthode d'essai décrite ci-après. la purification de l'antibiotique brut peut être effectuée par utilisation d'une résine échangeuse anionique, de préférence la résine Dowex 1 X 2 ou une résine du type Amberlite IRA 401S. l'anti-25 biotique brut peut être adsorbé à partir d'une solution aqueuse sur la colonne et élué à l'aide d'eau distillée, la matière obtenue de cette manière titre environ 900 yug/mg. En variante, par exemple l'antibiotique brut est purifiable par chromatographie sur colonne sur la cellulose en utilisant un système de solvants consistant en 30 chloroforme : méthanol : hydroxyde d'ammonium à 17 $ (2s1:1) ; la phase supérieure du système de solvants est utilisée pour "mouiller" d'abord la colonne, et la phase inférieure est utilisée à des fins d'élution. l'antibiotique peut être placé sur la colonne par adsorp-tion à partir d'une solution concentrée dans la phase supérieure 35 du système de solvants mentionné ci-dessus. Pour déterminer l'activité des diverses préparations en microgrammes par milligramme de l'antibiotique, on utilise habituellement la méthode a1essai normalisée dite "cylinder cup" en 69 21096 14 2011732 utilisant le Staphylococcus aureus ATCC 6538P (ATCC = American Type Culture Collection) comme organisme d'essai. Cette méthode est complètement analogue à celle décrite par Oden et autres dans Antimicrobial Agents and Ch.emotherapy ( 1963) s Un microgramme 5 d'activité antibiotique.de l'antibiotique est la quantité de matière qui produit une réponse zonale de 16>3 - 0,9 mm dans les conditions de la méthode d'essai et on exprime l'activité en yug/mg, les exemples suivants illustrent des méthodes de fermentation et d3isolement donnant l'Antibiotique 66-40 : 10 Exemple 1 - Fermentation en cuve de Micromonospora inyoensis -Premier stade de germjnation j Dans des conditions aseptiques, on ajoute une culture lyophilisée (ou des cellules obtenues à partir d'une culture inclinée) de M- -friynona-iw dans un ballon à secousses de 300 em^ con-•x 15 tenant 100 enr du milieu stérile suivant : Extrait de boeuf 3 g Tryptone 5 g Extrait de levures 5 g Dextrose j g Amidon 24 g Carbonate de calcium 2g, 20 Eau du robinet 1000 ca? On met en incubateur le ballon et son contenu pendant cinq jours à 35°C sur un appareil rotatif à secousses (280 tours par minute, course de 50,8 mm). Deuxième stade de germination î 25 On. transfère aseptiquement 25 car du milieu de fermenta tion du premier stade de germination dans un ballon à secousses * d'une capacité de 2 litres contenant 500 cm du milieu de germination stérile décrit ci-dessus. On met en incubation.le ballon et son contenu pendant trois jours à, 28°C sur un appareil rotatif à 30 secousses (28Q tours par minuté, course de 50,8 mm). Stade de fermentation ; On transfère aseptiquesfênt 500 ern^ du milieu obtenu à partir- du deuxième stade de germination d'ans une cuve de fermentation de 14 litres contenant 9,5- litres^ du milieu stérile suivant : 35 Dextrine - • 50 g ■ Dextrose 5 g Farine de soja 35 g Carbonate de calcium Tgg Chlorure de cotait . 10- mole Eau du robinet * 1000 enr 10 cm 69 21096 " 2011732 Avant la stérilisation du milieu décrit ci-dessus, on règle le pH à 8. On laisse fermenter dans des conditions aérobies pendant 66 à 90 heures tout en agitant à 250 tours par minute avec introduction d'air à raison de 4,5 litres par litre et par minute 5 et sous 22,5 atmosphères. L'activité de l'antibiotique produit à • la fin de cette période atteint un maximum de 150 à 225 yig/mg et reste relativement constante. Le pH du milieu de fermentation change légèrement durant la production de l'antibiotique, variant entre 6,8 et 7,3« 10 Exemple 2 - Isolement de l'Antibiotique 66- 40 - ïout le bouillon de l'Exemple 1 est réglé au pH 2 à l'aide d'acide sulfurique 6N. (Pour cet exemple, les quantités sont données à propos de 170 litres de bouillon de fermentation obtenus en combinant les bouillons acidifiés de 17 lots obtenus selon le 15 mode opératoire de l'Exemple 1). le bouillon acidifié est agité pendant 15 minutes environ et-ensuite filtré. On lave à l'eau le mycélium-et on combine les eaux de lavage au filtrat. On règle le pH du filtrat à 7 & l'aide d'hydroxyde d'ammonium 6BT. Au filtrat neutralisé, on ajoute assez d'acide oxalique pour précipiter le 20 calcium et on filtre* On neutralise de nouveau le filtrat à l'aide d'hydroxyde d'ammonium. On introduit le filtrat sur une colonne d'adsorption à échange cationique contenant 1500 à 2000 g de IRC-50 Amberiite dans sa forme ammonium. On se débarrasse de l'éluat, on lave la résine à l'eau et on effectue l'élution à l'aide d'hy-25 droxyde d'ammonium 21. On recueille des fractions de 400 cm^ et contrôle par des essais sur disques avec le S. aureus•ATOQ 6538P. On combine les fractions actives et on évapore à sec sous vide -pour obtenir environ 28 g d'Antibiotique 66-40 brut ayant me activité d'environ 500 yug/mg. 30 ^"TT17 ^ - Purification de l'Antibiotique 66-40 - On dissout 28 g d'Antibiotique 66-40 brut obtenu à l'Exem-pie 2 dans 100 cm-' d'eau distillée et on introduit la solution dans-une colonne d'adsorption à échange d'an ions (Dovex 1X2) dans la forme hydroxyle. On forme une bouillie aqueuse de 2000 g de 35 la résine dans une colonne de 63,5 mm de diamètre et 914,4 mm de • hauteur. On élue la colonne à l'eau distillée à raison-d'environ 23 cm^/min. en recueillant des fractions de 100 cm^ et on contrôle à-l'aide d'un indicateur de conductivité et par des essais sur 69 21096 16 2011732 disques contre le Staphylococeus aureus. Les essais sur disques permettent une séparation grossière entre les fractions de l'éluat contenant l'antibiotique et celles qui. n'en contiennent pas. Pour être certain que les fractions sont combinées de façon appropriée, 5 on soumet une portion de chaque fraction à une chromatographie sur papier en utilisant la phase inférieure d'un système chloroforme : méthanol : hydroxyde d'ammonium à 17 $ (2:1:1). Chaque papier est soumis à une pulvérisation de ninhydrine et les éluats contenant une matière semblable sont combinés et lyophilisés, donnant envi-10 ron 5,7 g d'Antibiotique 66-40 d'une activité d'environ 900 yug/mg. Exemple 4 - Préparation du sulfate d'Antibiotique 66-40 - On dissout 3,9 g d'Antibiotique 66-40 à l'état de base préparé comme décrit à l'Exemple 3, dans 60 et? d'eau et on règle le pH à 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 6N. On agite la solution 15 avec du charbon de bois décolorant pendant environ \ heure et on filtre. On ajoute le filtrat à environ 1 litre de méthanol. On filtre et on sèche pour obtenir 4,8 g du sel sulfate; activité environ 640 yug/mg. Exemple 5 - Autre purification de l'Antibiotique 66-40 en passant 20 par son sulfate - On mélange 200 g de poudre de cellulose Whatman tf° 1 avec 20 cm^ de la phase supérieure d'un système de solvants composé de chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium à 17 fi (2:1:1) et on tasse le mélange en petits segments dans une colonne ayant uil 25 diamètre intérieur de 6,35 111121 et uae hauteur de 508 mm. La phase inférieure du système de solvants est passée à travers la colonne jusqu'à la sortie d'une bande jaune d'impuretés. Deux grammes de sulfate d'Antibiotique 66-40 préparé comme décrit à l'Exemple 4 *5 sont dissous dans environ 3 enr' de la phase supérieure de solvant, 30 mélangés avec un peu de poudre de cellulose, séchés sous vide et tassés au sommet de la colonne de cellulose. On laisse passer la phase inférieure à travers la colonne à raison de 1 car par minute ■3 en recueillant des fractions de 5 enr toutes les 15 minutes. Avec des portions de chaque fraction, on forme des taches 35 sur du papier-filtre et on effectue des essais avec le réactif ninhydrine pour déterminer la présence ou l'absence d'antibiotique. La chromatographie sur papier des fractions contenant l'antibiotique montre que la matière désirée est située entre l#â fractions -.121 et 190. 69 21096 17 2011732 Les fractions 121 et 190 sont combinées, évaporées à sec, redissoutes dans l'eau et passées à travers de l'IRA 401S (une résine échangeuse d'anions) dans le cycle ihydroxyle. L'éluat est réglé au pH 4,5 à l'aide d'acide sulfurique et traité au charbon 5 de bois, filtré et concentré à un plus petit volume. Le concentré est ajouté à un excès de méthanol et le précipité blanc qui se forme est séparé par filtration. Le précipité est dissous dans l'eau et passé à travers une colonne de résine IRA 401S dans la forme hydro-xyle. L'effluent est recueilli, concentré et lyophilisé, donnant 10 environ 300 mg d'Antibiotique 66-40 à l'état de base ayant une activité d'environ 1000yug/mg. Exemple 6 - Préparation de chlorhydrate de l'Antibiotique 66-40 -On dissout 104,7 mg d'Antibiotique 66-40 à l'état de base, préparé comme décrit à l'Exemple 2, dans 4 cm^-d'eau et on règle 15 le pH à 4,5 à l'aide d'acide chlorhydrique. On évapore à see la solution et on redissout le résidu dans du méthanol. On ajoute cette solution à un excès d'acétone et on filtre 1© précipité résultant pour obtenir 130 mg de chlorhydrate d'Antibiotique 66-40 ; activité 753 yug/mg. -20 Exemple 7 - Préparation de monohydrate cristallin d'Antibiotique 66-40 - On prépare une colonne chromatographique au gel de silice (26 x 2,5 cm) en utilisant la phase inférieure (organique) d'un mélange de solvants consistant en isopropanolsCHGl^îhydroxycLe d'am-25 monium dans les rapports en volumes de 1:2:1 comme agent de développement et éluant. On dissout 1,0 gramme d'Antibiotique 66-40 •7. à l'état de base dans 5,0 enr de mélange de solvants. On adsorbe la solution antibiotique sur le gel de silice et on chromatographie. •5 On recueille des fractions de 5,0 enr et on détermine la position 30 des fractions désirées par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice. On combine les fractions appropriées (44-78) et on les évapore sous vide pour obtenir im sirop jaune pâle qui par distillation aaéotropique avec l'éthanol cristallise sous la forme de rosettes jaune pâle. Le produit obtenu de cette 35 manière est le monohydrate d'Antibiotique 66-40 qui fond à 185-190°C environ. La production est de 650 mg environo "Phreityple 8 - Préparation du- produit de condensation avec le ben-zaldJehyde de l'Antibiotique 66-40 - saq original 69 21096 18 2011732 5,0 g d'Antibiotique 66-40 dans 60 cm^ d'éthanol absolu sont traités par 5,9 g de benzaldéhyde (légèrement plus de. 5 équivalents) et chauffés au reflux pendant 1 heure. La solution est ' reffoidie et filtrée, donnant 7,0 g d'une matière solide cristal-5 line blanche, point de fusion 123-126°C, + 43,2° C = 0,3 fa dans CHCl^) » L'analyse élémentaire indique cinq résidus de benzaldéhyde. D'une manière similaire, en remplaçant le réactif benzal- i déhyde dans l'exemple précédent par une quantité équivalente de 10 l'un quelconque des aldéhydes suivants : acétaldéhyde , furfural , c^clopentylacétaldéhyde , crotonaldéhyde , salieylaldéhyde , vanilline , 15 vératraldéhyde ou , pyridoxal et en suivant essentiellement le mode opératoire décrit dans 1 ' exeia™ pies on obtient les produits de condensation correspondants (probablement des bases de Schiff comme structure chimique). J 20 L'Antibiotique 66-40 et ses dérivés fonctionnels pharmaceit- j tiquement acceptables possèdent un large spectre antibactérien. L'Antibiotique a la propriété d'exercer une influence défavorable sur le développement de bactéries Gram-positives et G-ram-négativee et peut aissi être utilisé seul ou en combinaison avec d'autres 25 agents antibiotiques pour empêcher le développement de bactéries ou réduire le nombre de bactéries dans divers environnements. On 1 8 peut utiliser, par exemple, pour désinfecter la verrerie de laboratoire, le matériel dentaire et médical contaminé par le Staphy-lococcus aureus ou d'autres bactéries dont le développement est i 30 défavorablement influencé par l'Antibiotique 66-40. En raison de j son activité particulièrement efficace contre les bactéries ffram- | négatives, il est utile dans la lutte contre des infections provo- ! quées par ces organismes Gram-négatifs. ! L'activité in vitro de l'Antibiotique 66-40 contre diverses ' 35 bactéries G-ram-positives et G-ram-négative s est indiquée dans le Tableau H. la concentration minimale d'inhibition a été déterminée en utilisant un bouillon de boeuf aux levures comme milieu d'essai» On a utilisé une technique de dilution en-série, mise en oeuvre en bad original 69 21096 19 2011732 double, la concentration minimale d'inhibition est le point intermédiaire entre le dernier tube clair et le premier tube trouble, déterminé par-observation visuelle. Les déterminations sont effectuées en utilisant une dilution 10"^ d'un bouillon de culture de 24 heures de la bactérie d'essai* Tous les tubes sont mis à incuber pendant 18 heures à 37°C. Dans le Tableau, l'Antibiotique 66-40 ayant une activité de 1000 yug/mg est utilisé pour l'étude. TABLEAU H Activité in vitro de l'Antibiotique 66-40- 10 Microorganismes utilisés Bactéries G-ram-positives -Diplococcus pneumoniae DA 150"*" Enterococcus sp. DA 800 15 Enterococcus sp. DA 801 Enterococcus sp. DA 802 Staphylococcus aureus ATCC 6538P Staphylococcus aureus ATCC 11631 Staphylococcus aureus Gray • ■ 20 Staphylococcus aureus DA 2033 Streptococcus faecalis ATCC 10541 Streptococcus pyogenes DA 1 • Streptococcus pyogenes DA 21 Streptococcus pyogenes DA 15 25 Bactéries Gram-négatives Escherichia coli ATCC 10536 Escherichia coli DA 3 • Escherichia coli DA 4 Escherichia coli DA 1 30 KLebsiella pneumoniae DA 20 Klebsiella pBBumaniae ATCG 10031 Proteus vulgaris DA 121 Proteus vulgaris ATCG 9921 Proteus vulgaris DA 13 35 Proteus vulgaris DA 12 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8709 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689 Concentration minimale d'inhibition /ug/cm3 3,° 2,25 2,25 2,25 0,23 0,21 0,05 0,08 3,0 3,0 3,7 3,7 0,6 0,3 0,6 0,6 0,23 3,0 0,6 0,6 0,3 3,0 0,45 0,6 0,6 69 21096 20 2011732 Salmonella schottmuelleri DA 10 0,53 Salmonella sp. DA 101 0,3 Salmonella sp. DA 102 0,3 Aerobacter sp. DA 3a 0,3 i 5 DA désigne le numéro de collection de la Schering Corporation. La toxicité aiguë de l'Antibiotique 66-40 sous la forme de son sulfate a été déterminée de la manière normale par diverses méthodes sur des souris pesant 18-20 grammes. Les résultats de toxicité donnés dans le Tableau-J sont rapportés à la base libre. 10 . TABLEAU J Toxicité aiguë-de-l'Antibiotique 66-40 Mode d'administration —50 sous-cutanée 288-, intra-péritonéale 221 15 intra-veineuse -34 L'Antibiotique 66-40 présente une action antibactérienne contre les infections bactériennes pathogènes provoquées chez des animaux de laboratoire, en particulier chez la souris. Pour déter-20 miner l'activité protectrice in vivo de l'Antibiotique 66-40 contre des infections d'origine bactérienne pathogène chez les souris, on administre l'antibiotique deux fois à des souris, une fois juste avant une injection intra-péritonéale de la bactérie infectante et une fois 4 heures après cette injection. On détermine le nombre 25 de souris survivantes 48 heures après l'infection et on analyse les résultats par des méthodes normales de calculs de probabilités pour déterminer les valeurs PD^q avec un degré de certitude de 95 $ . Le Tableau K indique l'activité protectrice de l'Antibiotique-66-40 contre diverses bactéries pathogènes. 30 TABLEAU K Activité protectrice de l'Antibiotique 66-40 chez les souris Organisme 35 Staphylococcus aureus Grav DC 445 Streptococcus pyogenes C DC28 Klebsiella pneumoniae DC 801 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8709 Salmonella paratychi B DC 837. Voie d'administration PDgo(mg/kg) sous-cutanée 0,12 orale 25,0 sous-cutanée 0,87 sous-cutanée 0,70 orale 50,0 sous-cutanée 1,12 sous-cutanée 1,91 69 21096 21 2011732 Il est évident d'après le Tableau K que l'indice thérapeutique (LD^q/PDj-q) par la voie sous-cutanée est compris entre 330 et 2400 en ce qui concerne les organismes Gram-positifs et entre 150 et 410 en ce qui concerne les organismes Gram-négatifs. 5 De plus, des souris infectées par voie intra-péritonéale par huit doses I^q de Rickettsia akaria sont protégées à 100 # par l'administration sous-cutanée de 2 mg d'Antibiotique 66-40-administrés une fois par jour pendant quatre jours. Compte tenu des résultats in vivo précédents, et spéciale-10 ment de l'indice thérapeutique favorable présenté par l'Antibiotique 66-40, il est évident qu'on peut utilisér l'antibiotique pour maîtriser et traiter diverses infections chez des hôtes mammifères. Parmi ces infections, se trouvent celles provoquées par des genres . d'organisme comme les Streptococcus. Staphylococcus. Streptococcus. 15 Escherichia. Salmonella. Klebsiella. Proteus, Pseudomonas. etc. ■ les organismes précédents sont la cause ou on les soupçonne d'être la cause de la mammi.te de la vache, d'infections des voies uri-naires et de diarrhées. Des espèces des mêmes organismes sont soupçonnées de provoquer des maladies de la peau et des troubles 20 d« la partie supérieure de l'appareil respiratoire ou d'aggraver les manifestations préexistantes de ces maladies chez les mammifères. l'Antibiotique 66-40 et ses dérivés fournissent donc une arme puissante pour lutter contre ces organismes et les maladies qu'ils provoquent. 25 L'Antibiotique 66-40 et ses dérivés peuvent être adminis trés par la voie topique sous la forme d'onguents, tant hydrophiles qu'hydrophobes, sous la forme de lotions, qui peuvent être aqueuses ou non ou du type émulsion ou sous la forme de crèmes. Les véhicules pharmaceutiques utiles dans la préparation de ces 30 compositions comprendront, par exemple, dés substances comme l'eau, des huiles, des graisses, des polyesters, des polyols, etc. En général, les préparations topiques contiendront d8environ 0,1 à environ 3,0 g de l'antibiotique par 100 g d'onguent, crème ou lotion. Les préparations topiques sont habituellement appliquées 35 doucement sur les lésions à raison de 2 à 5 fois environ par jour. Les antibiotiques de la présente invention peuvent être utilisés à l'état liquide comme sous la forme de solutions, de . suspensions, etc; pour des applications otiques et ophtalmiques 69 21096 22 2011732 et ils peuvent être administrés aussi de façon parentérale par injection intramusculaire. La solution ou suspension injectable sera administrée habituellement à raison d'environ 1 mg à environ 5 mg d'antibiotique par kilogramme de poids du corps et par jour, 5 divisés en deux à quatre doses environ. La dose précise dépend du stade et de la sévérité de l'infection, de la sensibilité de l'organisme infectant à l'antibiotique et des caractéristiques individuelles de 18espèce d'animal que l'on traite. Exemple 9 ci-après indique les ingrédients et le mode 10 opératoire pour préparer une solution injectable. Exemple 9 - Solution injectable - Par fiole^de Pour 2.0 cnr 50 litres * * Sulfate d'Antibiotique 66-40 84,0 mg 2100,0 g 3,6 mg 90,0 g 0,4 mg 10,0 g 6,4 mg 160 g 0,2 mg 5,0 g 2,0 cm3 50,0 lit, * Comprend une surcharge de fabrication de 5 ?£. 25 X Pharmacopée des Etats-Unis. Mode opératoire : Pour tua lot de 50.0 litres - On introduit environ 35 litres d'eau pour injection dans un récipient chemisé en acier inoxydable approprié et on chauffe à 70°C environ. On introduit le méthylparaben et le propylparaben 30 dans-l'eau pour injection chauffée et on dissout en agitant. Quand les parabens sont complètement dissous, on refroidit le contenu du réservoir à 25-30cC en faisant circuler de l'eau froide dans la chemise du récipient. On fait barboter de l'azote gazeux à travers la solution pendant au moins 10 minutes et on maintient la solution 35 sous asote pendant la suite du traitement. On introduit et on dissout le dihydrate d5 éthylènediamlnetétracétate disodique et le bisulfite de sodium. On introduit et on dissout le sulfate d'Antibiotique 66-40. On porte le volume de l'ensemble à 50 ;0 litres à ^ Ester de méthyle de l'acide p-hydroxy-benzoïque, USP^ {= méthylparaben) Ester de propyle de l'acide p—hydroxy-benzûïoue, IISP (= propylparaben) Bisulfite de sodium, USP1 20 Dihydrate d8 étliylènediaminetétracétate disodique, E.G. Eau pour injection, ÏÏSP^, complément à BAD ORK3INAL 69 21096 23 20T1732 1 'aide d'eau pour injection et on agite jusqu'à ce que le mélange soit homogène. Dans des conditions stériles, on filtre la solution à travers un filtre approprié retenant les bactéries, en recueillant le 5 filtrat dans tin récipient de remplissage. On effectue aseptiquement le remplissage en produit de fioles à doses multiples stériles exemptes de pyrogène, on met en place le bouchon et on ferme hermétiquement. Exemple 10 - Ongnent antibiotique -10 Antibiotique 66-40 à l'état de base 10 g Vaseline 990 g Mode opératoire - (1) On fait fondre la vaseline; (2) On mélange l'Antibiotique 66-40 à l'état de base avec 15 environ 10 fi de la vaseline fondue ; (3) On fait passer le mélange antibiotique-vaseline à travers un aoulin colloïdal ; (4) On ajoute ce mélange dans le reste de la vaseline et on refroidit le mélange jusqu'à ce qu'il devienne semi-solide. A 20 ce stade, le produit peut être mis dans des récipients appropriés. 69 21096 24 2011732 REVENDICATIONS 1- Un produit ayant une activité antibiotique appelé Antibiotique 66-40, ou un produit ayant une activité antibiotique qui contient l'Antibiotique 66-40 ou qui s'y trouve contenu, sous sa 5 forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharma-ceutiquement acceptables. 2- Un produit selon la revendication .1, qui est une composition solide ayant un spectre d'absorption infrarouge dans l'huile minérale essentiellement tel que représenté sur la figure 1 et un 10 spectre de résonance magnétique nucléaire dans le deutériua essentiellement tel que représenté sur la figure 2, sous sa forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables. 3- Un produit selon l'une des revendications 1 et 2, ce 15 produit étant un produit de solvatation. 4- Un produit selon la revendication 3, dans lequel le produit de solvatation est un hydrate. 5- Un produit selon la revendication 4, ce produit étant • le monohydrate de l'Antibiotique 66-40 sous sa forme cristalline 20 à peu près pure. 6- Un produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ce produit étant tua sel, de préférence un sel d'addition d'acide. 7- Un produit selon la revendication 6, ce produit étant 25 un sel d'addition d'acide, qui, quand il est dérivé d'un acide po- lybasique, peut contenir des groupements d'acide libres et/ou des groupements d'acide neutralisés par d'autres bases. 8- Un produit selon la revendication 7, contenant des portions acides d'au moins l'un des acides suivants : acides chlorhy- 30 drique, sulfurique, phosphorique, acétique, stéarique, propionique, tartrique, maléique et benzoïque. 9- Un produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, ce produit étant un produit de condensation avec un aldéhyde ou une cétone ou avec un mélange d'aldéhydes et/ou de 35 cétones. 10- Un produit selon la revendication 9, dans lequel la portion aldéhyde ou cétone a jusqu'à 12 atomes de carbone. 11- Un produit selon la revendication 10, ce produit étant 69 21096 25 2011732 le pentabenzylidène-Antibiotique 66-40. 12- Un procédé pour la production d'un produit possédant une activité antibiotique appelé Antibiotique 66-40, ou d'un produit possédant une activité antibiotique qui contient l'Antibioti- 5 que 66-40 ou qui s'y trouve contenu, sous sa forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, selon lequel on met en incubation un microorganisme de l'espèce Micromonospora inyoensis dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne 10 notable soit donnée à ce milieu et on isole à partir de ce milieu au moins une fraction possédant une activité antibiotique sous sa forme libre ou sous la forme d'un dérivé fonctionnel pharmaceutiquement acceptable. 13- Un procédé selon la revendication 12, dans lequel on 15 effectue l'incubation dans des conditions immergées dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables au moins d'azote et de carbone. 14- Un procédé selon la revendication 12 ou 13, dans lequel le microorganisme mis en incubation est Micromonoapora inyoensis 20 BBBL 3292 ou un mutant ou variant correspondant, possédant à peu près la même activité biologique. 15- Un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, -dans lequel le microorganisme est mis en incubation à une température comprise entre 20 et 40°G environ, de préférence entre 25 25 et 35°C environ, et à jjH très voisin de 7 à 8 environ» 16- Un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15 i dans lequel des méthodes d'échange d'ions sont utilisées pour l'isolement, comprenant les étapes qui consistent à : séparer l'antibiotique du mycélium, adsorber l'antibiotique sur une résine 30 échangeuse d'ions, laver à l'eau la matière adsorfoée sur la résine, éluer l'antibiotique de la résine, concentrer l'éluat et séparer l'antibiotique du concentré. 17- Un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, dans lequel on utilise des méthodes chromât©graphiques 35 pour la purification de l'Antibiotique A ou de ses dérivés. 18- Un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, qui comprend la transformation de l'antibiotique ou de son dérivé en un dérivé fonctionnel pharmaceutiquement acceptable 69 21096 26 2011732 par au moins l'un des traitements ultérieurs suivants, à un stade quelconque après la formation de l'antibiotique : a) précipitation du produit de solvatation à partir de sa solution organique ou aqueuse par addition d'un solvant dans lequel le produit n'est pas 5 ou n'est que faiblement soluble; b) addition d'un acide ou d'un dérivé d'acide de façon que l'on obtienne vin sel d'addition d'acide qui, quand il dérive d'un acide polybasique peut contenir des groupements d'acides libres et/ou des groupements d'acide neutralisés par d'autres bases; c) condensation avec un aldéhyde et/ou une 10 cétone, de préférence .avec des aldéhydes ou des cétones ayant jusqu'à 12 atomes de carbone. 19- 15 antibiotique dit 66-40, ou un produit possédant une activité antibiotique qui contient cet antibiotique 66-40 ou qui s'y trouve contenu, sous sa forme libre ou sous la forme de ses 15 dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, quand ils sont obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18. 20- Ub produit possédant une activité antibiotique dont on. peut montrer que la structure chimique est identique à celle d'un 20 produit obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, ou à celle d'un composé ou d'une fraction possédant une activité antibiotique contenus dans un produit ainsi obtenu, ou contenant un produit possédant une activité antibiotique présentant cette identité de structure. 25 21- XJn procédé pour la préparation d'une composition thé rapeutique possédant une activité antibiotique, caractérisé en ce que le produit possédant une activité antibiotique dit Antibiotique 66-40, ou un produit possédant une activité antibiotique qui contient cet Antibiotique 66-40 ou qui s'y trouve contenu, sous sa 30 forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, comme ingrédient actif, est mis sous une fora© appropriée pour- administration thérapeutique. 22- Un procédé selon la revendication 21, dans lequel 1 '.ingrédient actif est mélangé avec uh véhicule pharmaceutique appro- 35 prié. 23- Une composition possédant une activité antibiotique, caractérisée en ce qu'elle contient le produit possédant une activité antibiotique dit Antibiotique 66-40 ou un produit possédant bad original 69 21096 27 2011732 line activité antibiotique qui contient cet Antibiotique 66-40 ou qui s'y trouve contenu, sous sa forme libre ou sous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, comme ingrédient actif. 5 24- Une composition selon la revendication 23, dans laquel le un véhicule pharmaceutique approprié est également présent. 25- Une composition de matière de forme déterminée, comme un comprimé ou une capsule, caractérisée en ce qu'elle contient le produit possédant une activité antibiotique dit Antibiotique 10 66-40, ou un produit possédant une activité antibiotique qui contient cet Antibiotique 66-40 ou qui s'y trouve contenu, sous sa forae libre ounsous la forme de ses dérivés fonctionnels pharmaceutiquement acceptables, comme ingrédient actif.