Brevet FR2007561A1 — publié le 19700109

La présente invention concerne un nouvel antibiotique et plus particulièrement la triénine sous ses diverses formes. On obtient la triénine en cultivant en conditions contrôlées un micro-organisma jusqu'à présent inconnu qui 5 est une espèce du genre S --reptonaroes. Ce Streptomyces a été obtenu à partir d'un échantillon de sol recueilli à Piscataway, dans le New Jersey , et des échantillons d'organismes vivants ont été déposéà 1* American Type Collection à Washington,- et à la collection de culture de H Northern Utilisation Research 10 Branch du Département de l'agriculture à Peoria , Illinois, d'où ils sont disponibles actuellement sous les n° ATCC 21229 et NRRL 3^24 respectivement. Le Streptomanes ATCC 21229 se développe abondamment dans des milieux de culture habituellement utilisés pour la cul-15 ture d'autres organismes du même genre. Il peut pousser à des températures comprises entre 20°C et 30°C de préférence à une température de 25°C sur un milieu de gélose que l'on prépare en mélangeant 20 g de pâte de tomate, 20 g de farine d'orge et 500 ml d'eau bouillante, en refroidissant ce mélange jus-20 qu'à un fin gruau, en filtrant en ajoutant le filtrat à 15 g de gélose à 500 ml d'eau et en stérilisant le mélange résul-tant à 121°C sous 1,05 kg/cm de vapeur pendant 20 mn.Sur ces milieux , le mycélium aérien est coloré en gris et l'organisme produit un pigment soluble brun clair. 25 II est entendu que l'invention n'est pas limitée à l'utilisation de l'organisme décrit ci-dessus, mais comprend notamment toutes les variantes et les mutants obtenus par traitement du micro-organisme, par exemple par les rayons ultraviolets les rayons X, le chlorure de manganèse, le camphre, les ypérites 30 et les analogues ainsi que les polyploïdes de divers mutants. Les besoins d'ambiance et d'éléments nutritifs pour la fermentation de streptomyces ATCC 21229 sont semblables à ceux nécessaires pour la production d'antibiotiques par d'autres microorganismes aérobies. Ainsi, on peut maintenir l'aérobiose dans 35 un milieu nutritif liquide inoculé avec une culture stérile incubée dans des fioles placées sur des secoueuses . Pour^la production à l'échelle inductrielle, on peut remplacer les fioles par des réservoirs métalliques avec aération et agitation internes 69 1368S 2 2007561 au moyen d'agitateur à palette. On peut aussi produire la triénine par culture de surface. Le micro-organisflie nécessite comme élément nutritif une ou plusieurs sources d'énergieefc ds carbone des substances organiques azotées et des sels minéraux. La cultu-5 re s'effectue au mieux lorsque le pH initial du milieu de ci culture est compris entre 5*5 et 8,5* le pH optimum étant voisin de 7,0. Les sources de carbone utilisables pour la production d'antibiotiques sont très diverses, et comprennent notamment les 10 sucres tels que glucose, lactose, maltose, saccharose, la dextrine, les amidons de différents types d'origine, le glycérol et d'autres polyalcools. , l'inositol et les graisses animales et végétales ainsi que leurs esters. Les sources d'azote organique qui stimulent activement la croissance et favorisent la production de la 15 triénine son# des substances telles que la farine de soja, la farine de graine de coton et d'autres farines végétales (complètes ou partiellement ou totalement dégraissées), les farines de viande ou les viscères d'animaux, diverses peptones, les hydrdjysats de caséine, hydrolysats de soja, hydrolysats de levure, lactal-20 bumine, gluten de blé, solubles de distilleries, liqueurs de trempage de maïs, urée et aminoacides. Le milieu nutritif doit contenir des sels minéraux tels que chlorures, nitrates, sulfates, carbonates et phosphate de sodium , d'ammonium et de calcium aux concentrationsappropriées. 25 Le milieu nutritif doit contenir des traces d'oligoéléments tels - que magnésium, fer, cuivre, manganèse, zinc et cobalt. Pour l'ajustement du pH pendant la fermentation, il est préférable d'ajouter des agents tampons tels que le carbonate de calcium. Si nécessaire, on peut ajouter un agent antimousse 30 au milieu de fermentation. , Dans les conditions décrites ci-dessus avec une température de culture de 25°C, on obtient la production maximale f de triénine au bout de 1 à 5 jours en cuve. L'inoculum pour la fermentation peut être obtenu à partir de suspension de spores 35 ou dé mycélium lyophilisé, séché par congélation avec un substrat inerte. On le transfert habituellement par un ou plusieurs passage dans des milieux liquides avant la fermentation finale. 69 13685 3 2007561 On peut récuper la triénine avec un bon rendement du bouillon de fermentation brut ou centrifugé à un pH compris entre 5 et 8, auquel la triénine présente sa stabilité la plus élevée. A un pH plus acide, il y a un peu de perte, la vitesse 5 de perte étant accélérée par la diminution du pH. Comme on obtient initialement le produit actif sous une forme insoluble finement dispersée dans le milieu de fermentation, presque toute l'activité retenue avec le mycélium aux valeurs de pH de la fermentation, de préférence à l'aide d'un 10 auxiliaire de filtration tel que Hyflo. On peut recueillir la triénine du gâteau de filtration résultant par extraction du gâteau humide avec un solvant polaire tel que l'isopropanol. On concentre ensuite l'extrait résultant et on remet en suspension le concentrât dans le solvant pendant plusieurs heures 15 à environ 5°C. Il se forme un précipité qui est ensuite filtré et séché. On peut réaliser une purification plus poussée en soumettant ce produit à une nouvelle étape d'extraction, une étape de distribution à contre courant et plusieurs étapes 20 de reprécipitation. La triénine est une poudre amorphe jaune clair, F 163-165°C, se décomposant à l80°C. Elle est soluble dans le méthanol, la pyriîLne, le diméthylformamide, mais insoluble dans la plupart des autres solvants organiques. 25 La triénine donne une réaction positive au réactif de Tollens et une réaction négative à la liqueur de Fehling. La réaction à la ninhydrine est positive, seulement après hydrolyse acide. Dans l'hydrolysat acide, on n'a pas pu déceler d'amino-acides par chromâtographie sur papier. L'analyse élémentaire , 30 donne les valeurs suivantes s C s 54,75 > H 7*99 J N 1,17 î 0 (par différence) 36,09. Calculé sur la base de la teneur en azote, le poids moléculaire minimum est d'environ 1400. Les titrages en milieu non aqueux du EN (équivalent de neutralisation) indiquent des équivalents d'acide et de 35 base aux environs des poids moléculaires suggérer ci-dessus. EN acide 1500, EN base 1580. 69 13685 4 2007561 Le spectre d'absorption IR de la triénin^ indiqué dans la figure 1 du dessin annexé présente des absorptions caractéristiques à 3,0 - 3,42 - 6,29 - 6,90 - 7,25 - 8,12 - 8,70 -10,07 et 11,80 microns. Sur la base du spectre II£ on peut conclu.; c 5 que la triénine contient des groupes carboxyle ionisés et des groupes hydroxyle. L'absorption à 10,07 /u est due à la formatiez d'un triène. L'absorption caractéristique du groupement lactone des antibiotiques polynéique vers 5,8yu est absente. Le «pec.tr.e IR et lé poids moléculaire élevé de la triénine conduisent à 10 la conclusion qu'elle n'est pas un antibiotique polyénique • \ . caractéristique. Le spectre d'absorption UV de la triénine en solution dans le méthanol, représenté à la figure 2 du dessin annexé, présente une courbe d'absorption-caractéristique d'un 15 triène. Les maxima d'absorption sont à 257, 267 et 278 myu avec 15g / des valeurs de.-E^ de 332,407 et 322 respectivement. La valeur molaire ^calculée sur le pic à 267 myU avec un poids jw&lée^-laire de 1400 est de 56 980 , ce qui est très voisin de la valea? de 53 000 donnée dans la littérature pour l'octatriène. Ainsi* 20 le poids moléculaire minimum calculé d'après les données UV sont en accord avec celui calculé à partir de l'analyse élémentaire. On effectue les mesures d'ultracentrifugation seiia le procédé de J. Kirschbaum et A. Aszalos ( J. Pharm. Soi., 56* 25 410-411 (1967) ) en utilisant l'approximation d'Archibald à ; l'optique d'équilibre de sédimentation à 42 000 tours/minute et un angle de phase de Schlieren de 75° à 20°C. Dans le tampon au phosphate, on trouve deux constituants avec des poids moléculaires de 1300 et 3200. Dans le méthanol on 30 ne trouve qu'un seul constituant avec un poids moléculaire de 1430. Le second constituant de poids moléculaire 3200 trouvé dans le tampon au phosphate est probablement dû à la formation d'un dimère. Les mesures d'ultracentrifugation appuient ainsi le poids moléculaire calculé d'après l'indice élémentaire 35 et les données du spectre UV. On a utilisé divers systèmes chromatographiques pendant 1'isolement de la triénine pour s'assurer de l'homogénéité . Dans la chromatographie sur papier en utilisant le sys» J 13685 - 200.7561 5 tème/en utilisant le système solvant BuOH s AcOH s HgO 4 s 1 î la triénin» a un Bf de 0,55. Sur chromatogramme Eastman ITLC en couche mince avec le méthanol comme solvant la triénine a un Rf de 0,0. 5 La triénine forme des sels de manière connue par réaction avec des bases. A titre d'exemples de ces sels on peut mentionner les sels de métaux tels que sodium, potassium, calcium et les analogues, les sels d'ammonium et les sels d'aminés, par exemple le sel de procalne. 10 La triénine possède in vitro le spectre indiqué dans le tableau I oi-dessous. TABLEAU_I Micro-organismes Concentration inhibitrice minimale (y/ml) S. aureus 0,37 S. pyogenes 0,44 E. coli >50 P. vulgaris >50 P. aeruginosa ^>50 20 schottmuelleri ^>50 15 25 Geotrichum candidum 9,4 S. cerevisiae 7,8 C. tropicalis 6,3 C. krusei 9,4 C. albicans 8,6 T. mentagrophytes >50 P. bulbigenum 6,3 A. niger 6,3 30 La triénine est utile comme agent antibactérien et antifongique contre des micro-organismes tels que ceux indiqués ci-dessus. On peut l'utiliser telle que comme agent de conservation par exemple pour le cuivre, le papier et les peintures et 35 en particulier dans les matières plastiques et les étoffes pour les rendre résistantes à l'attaque du mildiou et d'autres moisissures.. Dans la protection des étoffes par exemple, on peut imprégner l'étoffe par la triénine ou un de ses sels» par exemple 69 13685 6 2007561 par trempage ou pulvérisation. On peut aussi utiliser la triénine comme agent de protection des plantes, dans quel cas on peut la pulvériser sur les plantes à traiter. On peut préparer une composition à pulvériser convenable en broyant au broyeur à boulets 5 la triénine ou un de ses sels avec de l'eau et de préférence un agent mouillant tel qu'un ester d'acide gras supérieur du polyoxyalkylènesorbitàne (par exemple le monolaurate de polyoxy-éthylènesorbitanevendu sous le nom de Tween 20). On peut aussi utiliser la triénine comme désinfectant 10 de surface. A cet effet on la dissout, contenant de préférence un détergent ou un autre agent de nettoyage, à une concentration de 0,1 à 10,0# de préférence d'environ 0,5 à 1,0# en poids.On peut ensuite utiliser ces solutions comme lessives.pour désinfecter les sols, les murs, les tables et les analogue^ ainsi que dans 15 le nettoyage des appareils de traitement de produite laitiers et autres produits alimentaires. L'exemple suivant illustre l'invention sans, toutefois en limiter la portée. 20 Exemgle On isole le micro-organisme Streptomyces ATCC 21229 d'un échantillon de sol provenant de Piscataway, dans le New Jersey par des techniques classiques. On le maintient sur un milieu de gélose préparé à partir de 20 g de pâte de toamte, 25 20 g de farine d'orge 500 ml d'eau bouillante, que l'on fait refroidir jusqu'à un fin gruau, on filtre, ensuite onliajoute à 15 g de gélose dans 500 ml d'eau et stérilise à 121°C sous 1*05 cg/ûm de pression de vapeur pendant 20 minutes. Sur ce milieu, un mycélium aérien est coloré en gris et l'organisme 30 produit un pigment soluble brun clair. On utilise une portion de la culture à partir d'une tranche bien sporulée en suspension dans une solution à 0,01# de Dupanol pour inoculer 50 ml de bouillon stérilisé dans une fiole de 250 ml. Le bouillon a la composition centésimale 35 suivante s 69 13685 7 2007561 Farine de soja 1,5# Glucose 5,5# CaCO^ 0,7# kh2po4 0,1# 5 (nh4)2so4 0,5# KgHPOj^ 0,1# Liqueur de trempage de mais 0,25# Eau distillée. 1000 ml On passe à l'autoclave à 121°C sous 1 kg/cm2 de 10 pression de vapeur pendant 30 minutes. Après 48 heures d'incubation à 25°C sur secoueuse rotative, on verse le contenu de la fiole dans 1000 ml du milieu stérile ci-dessus dans une fiole de 4000 ml. Après 48 heures d'incubation à 25°C sur une secoueuse rotative on 15 utilise la totalité du contenu de la fiole pour inoculer un préfermenteur de 750 1 contenant 225 1 du milieu ci-dessus avec 0,01# d'antimousse (UCON Lubrieant). On poursuit la croissance pendant encore 48 h à 25°C, un débit d'air par unité de surface de 30,5 cm/Mn et une 20 agitation équivalant à 0,053 CV/100 1. A ce moment, on utilise environ 55 1 de l'inoculum du préfermenteur pour inoculer 500 1 du même milieu utilisé dans le stade de préfermentation contenus dans une cuve à fermentation de 945 1. On continue la fermentation pendant 120 h à 25°C. La 25 vitesse superficielle de l'air est de 30,5 cm/mn et l'agitation équivaut à 0,053 CV/100 1. Après 120 h de fermentation on filtre le bouillon total sur un filtre presse à l'aide d'un auxiliaire de filtration (Hyflo). Comme la majeure partie de l'antibiotique est 30 dans le gâteau de filtration, on jette le bouillon filtré. On extrait le gâteau de filtration deux fois avec deux litre d'iso-propanol par kg de gâteau et on combine les extrait que l'on concentre à l/60 - 1/70 du volume initial sous vide. A ce concentrât qui est une suspension aqueuse, on ajoute 3 volumes 35 d'isopropanol et on maintient la suspension pendant 4 à 6 heures à 5°C. Il se forme un précipité que l'on sépare par filtration et que l'on sèche à 30°C sous vide. 69 13685 8 2007561 On met en suspension 10 g du précipité dans un litre de phase supérieure et un litre de phase inférieure d'un mélange BuQH-HgO ajusté à pH 2,5 (HC1 dilué). Après agitation pendant 30 minutes, on filtre les deux phases et on place le filtrat 5 dans une ampoule à décanter. On sépare la phase inférieure et on ajoute la phase supérieure avec un litre de phase inférieure du système solvant décrit oi-dessus. On sépare à nouveau la phess inférieure et on répété encore 3 fois ce procédé d'extraction. On maintient le pH à 2,5 dans tout le procédé. Après exirainatlciï 10 de la dernière phase inférieure on neutralis« la phase supérieis?® restante par une solution de NaOH dilué et on évapore à siceitë A ce moment le rendement est d'environ 2 g. On dissout ces deux g de substance dans 125 ml de phase supérieure et 125 ml de phase inférieure du système BuOH î HgO ajusté à pH 10 par NaOH 15 dilué. On place le mélange dans une ampoule à décanter et on effectue une distribution de Craig en 5 stades à la tempérât*»# ambiante en 6 à 8 heures. On maintient le pH à 10 pendant ce. procédé dans chaque tube. A la fin du procédé de Craig on neutïâlie® le contenu des six tubes par HC1 dilué et on évapore à siccitë. 20 On dose ensuite chaque fraction par l'un des deux procédés suivante pour déterminer la présence dé triénine. Procédé_l_ On essaie chaque fraction dans le système de tumeur 5 WM comme décrit dans Cancer Chemotherapy Reports, Vol 25 p 12 25 (1962). On détermine par présence de la triénine par un titrage in vivo caractéristique dans le système 5 WM comme suit, dans lequel T/C représente le rapport exprimé en % du poids de la teneur chez l'animal traité au poids de la tumeur chez l'aminal . non traité (témoin). 30 Dose (mg/kg/jour) 50 25 12 6 T/C Toxique 9 22 41 Procédé 2 On essaie chaque fraction pour déterminer son activité contre S. aureus et son spectre d'absorption UV. La présence de 35 la triénine est révélée par une concentration inhlbitrlce minimale (y/ml) pour S. aureus d'environ 1,2 à 1,5 et des maxima d'absorption d'ultraviolet à 257» 267 et 278 myu avec une valeur de -E^ d1environ fO à 100 à 267 nyu. 69 13685 9 2007561 On extrait 2 g de la ou des fractions contenant la triénine deux fois par 60 ml de mélange pyridine-eau 5 s 1 dans une centrifugeuse. On concentre la liqueur surnageante jusq'uà environ 10 ml. On sépare par centrifugation les substances insolu-5 bles formées pendant la concentration et on ajoute au concentrât surnageant limpide 4 volumes d'isopropanol. On lave le précipité formé dans le tube de centrifugeuse par 11isopropanol et sèche à 35°C sous v fie. On jette la liqueur mère. On répète le procédé ci-dessus aveo les solides jusqu'à ce que l'on n'observe plus 10 de changement du coefficient d'extinction molaire dans le spectre UV. Ordinairement, deux ou trois de ces précipitations sont suffisantes. Le rendement dans ce procédé de précipitation est d'environ 15 à 20#. Le produit est une substance amorphe jaune clair. 69 13685 10 2007561 R_E_y_E_N_D_X_Ç_A_T_I_0_H_3 1°- A titre de produit industriel et de médicament nouveaux un antibiotique choisi parmi la triénine et 5 ses sels, caractérisé en ce que ladite triénine est une substance amorphe jaune clair ayant l'analyse élémentaire suivante C 5^,75, H 7,99 ; N 1,17, un poids moléculaire minimum d'environ 1400, et point de fusion de 163-165°C, et un point de décomposition de 180°C, çoluble dans le méthanol, la pyridine et le diméthyl-10 formamide et dont le spectre d'absorption IR comporte des maxima à 3,0, 3,42, 6,29, 6,90, 7,25, 8,12, 8,70, 1QQ7 et 11,80/U et le spectre d'absorption UV présente des maxima à 257, 267 et 278 m/U avec des valeurs de E1^ de 332, 407 et 3,22 respectivement. 1cm 15 2°- Les compositions thérapeutiques contenant comme ingrédient actif l'antibiotique selon la revendition 1 associé à un support pharmacologlquement acceptable. 3°- Les formes d'administration des compositions selon la revendication 2. 20 4°- Procédé pour la préparation de l'antibiotique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on cultive Streptomyces ATCC 21229 en conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrate de carbone fermentescible assimilable et une source d'azote assimilable, et on recueille 25 la triénine du milieu.