Brevet FR2009795A1 — publié le 19700206

La présente invention a pour objet un procédé de production de 1'acide l-gluta ique ainsi que le produit ainsi obtenu. Dans le procédé classique de préparation de l'acide l-glutamique par fermentation on a employé comme source principale de carbones, du glucose, des mélasses inutilisées, de acide alpha-cétoglutarique ou due l'acide citrique etc... ; il a également été indiqué que lton pouvait employer, pour produire de l'acide l-glutamique, une source de carbone contenant un plus petit nombre d'atomes de carbone que celles mentionnées ci-dessus en ltoccurence l'acide acétique qui constitue un produit secondaire de l'industrie pétrochimique. tes inventeurs ont fait différentes études en vue d'employer les composés suivants comme matières premières pour la fermentation produisant l'acide l-glutamique éthanol, n-propanol ou isopropanol, pour-lesquels on s'attend à une production a plus grande échelle et de meilleurs courts en raison des développements prévus pour la pétrochimie. A ce sujet, lesdits inventeurs ont trouvé que certains microorganismes pouvaient utiliser même l'éthanol, le n-propanol ou ltisopropanol. On connait déja certaines de celles des bactéries susceptibles d'accumuler Itacide l-glutanique à partir des sucres ou hydrates de carbone ; d'autres bactéries de ce type ont été isolées,dtune manière nouvelle, à partir de-sources naturelles. tes auteurs de la présente invention ont également découvert, comme résultat d'étùdescomplémentaires concernant le procédé de fermentation desdits alcools en utilisant ces micro organismes de façon à obtenir un haut rendement en acide 1-glutamique, que lton pouvait effectuer très avantageusement ladite fermentation par addition de pénicilline. La présente invention concerne donc un procédé pour la production d'acide 1-glutamique par fermentation avec un rrendement, élevé en utilisant de l'éthanol, du propanol normal (désigné ci-après par n-propanol) ou dtalcoolschoisisdans le groupe constitué par ltéthanol, le n-propanol et l'isopropanol ( utilisés comme source de carbone, en ajoutant de la pénicilline , au cours de la culture. te but de la présente invention est d'offrir un nouveau procédé de production de l'acide l-glutamique, d'une grande efficacité, et à partir de sources de carbone peu coûteuses. Un autre objet de l'invention consiste à offrir un nouveau procédé de production de l'acide l-glut-amique qui est avantageux sur le plan industriel. D'autres buts, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre. On donne ci-après des descriptions plus détaillées de microorganismes qui sont utilisés dans le cadre de la présente invention. Comme il résulte dXétudes extsnsives, effectuées par les présents inventeurs, sur les microorganismes, capables d'utiliser l'éthanol , le n-propanol ou les alcools choisis dans le groupe formé par l'éthanol, le n-propanol et l'isopropanol, 60 à 70 % des bactéries appartiennent aux espéces Corytebacterium, Brevibacterium ou Microbacterium qui sont capables de produire de l'acide -glutamique à partir de sucres ou de paraffines normales et qui sont capables d'utiliser les alcools. Parmi elles Brevibacterium vitalumen de la variété propanolophilum N 234 (ATCC N 21 390 ), Corynebactérium petrophilum de la variété propanolophilum N 4112S (AUCC N 21 391 ) et Corynebacterium melassecola de la variété alcoholophilum N0 313 tATCC N 29 39.2 ) sont les plus efficaces pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention.Ces trois bactéries ont été isolées, de manière nouvelle, à partir des sources naturelles et leurs caractéres bactériologiques ont été étudiés selon les méthodes expérimentales par les présents inventeurs, lesdites méthodes étant décrites dans le Manuel de méthodes microbiologiques" de l'Assocaiation bactériologique américaine ; les données numériques obtenues ont été analysées sur la base de la septième édition dudit manuel par BARGEY, ce qui a donné lieu aux conclusions suivantes Le premier type de bactéries ne produit pas d'acide à partir du maltose, mais donne de l'acide à partir du mannitol; de plus il possède une grande aptitude à utiliser l'méthanol et le n-propanol ; ces caractéres différent de ceux de Brevibacterium vitalumen, mais les autres caractéres sont tout à fait identiques à ceux de ce dernier type de sorte qu'on peut conclure qu'il s'agit dXuns nouvelle varieté de l'espéce. te second type de bactéries possède la plupart des caractéres bactériologiques communs à Corynebacterium petrophilum qui a été décrit dans la demande de brevet japonais publiée N0 510/1967, mais elle constitue une nouvelle variété , en raison de sa faible aptitude à utiliser le glucose, indépendamment de nombreux sucres, et elle peut utiliser le n-propanol. te troisième type précité de bactéries constitue une nouvelle variété, différent de Corynebacterium melassecola ATCC N 17965, uniquement en raison de sa forte capacité à utiliser l'alcool. Parmi ces microorganismes certains ergot de la biotine pour leur croissance, mais d'autres n'en requierent pas ét mêmepourles bactéries qui exigent de la biotine, lorsqu'elles utilisent de l'éthanol, et plus particulièrement du propanol, comme source de carbone, une petite quantité d'acide glutamique s'accumule lorsque l'on est dans un état biotinique suboptimal, ce qui doit être considéré comme l'une des conditions pour l'accumulation de grandes quantités d'acide glutamique à partir de sucre, de telle sorte que la biotine doit être donnee aux bactéries, dans le ordre du procédé de l'invention, en vue d'une reproduction maximale. t'éthanol, le n-propanol, ou les alcools choisis dans le groupe constitué par l'éthanol, le n-propanol et l'isoproânol, ou les mélanges de ceux-ci , peuvent etre introduits dans le milieu de culture de fermentation en grandes quantités dès le débuts, mais il semble préférable de les ajouter progressivement par exemple sous forme de petites quantités de façon à maintenir leur concentration dans le milieu de culture dans l'interxalle de 0,3 - 1,5 g/dl pendant 10 heures de culture et ensuite dans l'in tervalle 0,5 - 2,0 g/dl. L'addition de pénicilline, qui contitue l'élément le plus important du procédé, peut être répartie lors de chaque apport de la source de carbone, au bout de 8 heures de culture, ou s'effectuer en une seule fois, de façon à maintenir la concentration totale dans le milieu de culture dans l'intervalle de 1 à 20 unités/ml. En ce qui concerne la pénicilline à employer, tout type de pénicilline commercialement disponible est utilisable, de même que les types non raffinés. tes constituants dunilieu de culture, autres que la source de carbone, qui peuvent être utilisés sont ceux habituellement employés dans la fermentation de l'acide glutamique, c'est-à-dire, en tant que constituant inorganique: phosphate, magnésium , fer, manganèse-,et entant que source d'azote et agent régulateur du pH, l'urée ou l'ammoniac , qui peuvent être ajoutés de façon à maintenir le milieu de culture à un pH de 6,5 - 8,5. De plus, il est souhaitable d'ajouter une petite quantité d'un agent nutritif orga- nique, tel que la liqueur de maïs macéré pour favoriser la croissance. Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer la présente invention et endonner une plus claire compréhension. Exemple I TABLEAU 1 Milieu de culture des germes Glucose 2g/dl Extrait de viande 1 Peptones 1 " NaCl 0,2 " MgSO4, 7H2O 0,05 " KH2PO4 0,1 " pH après stérilisation 6,8 - 7,1 TABLEAU 2 Milieux de culture pour fermentation A B C n-Propanol (Total des 5 g/dl 5 g/dl 5 g/dl : additions successives ): 5 g/dl liqueur de maïs macéré 0,4 " 0,4 " 0,4 KH2PO4 0,2 " 0,2 " 0,2 r MgSO4,7H2O r 0,05 " : 0,05 " : 0,05 Fe++Mn++ à l'état de 0,001 " 0,001 " 0,001 " sulfate : Urée : 0,4 " : 0,4 " : 0,4 " : Biotine 100 g/l 1 00g/l 2 gYl : Péniciline G potassium .10 unités/ml .0 unité /ml . 0 unité/ml On verse 100 ml du milieu de culture de germes ayant la composition donnée dans le tableau 1, dans un Brlenmeyer de 500 ml et on stérilise à 1200C pendant 7 minutes, à la suite de quoi on y inocule une petite quantité de Brevibacterium vitalumen de la variété propanolophilun N 234 (ATCC NO 21 391 ) et l'on porte alors la culture dans un récipient soumis à une agitation par rotation, à 320C pendant 20 heures. 2 % du milieu de culture ainsi obtenus sont inocules à 50 mi du milieu de culture pour fermentation, qui a été préalablement préparé dans un récipient de Sakaguchi de 500ml (composition donnéedans le tableau 2) on effectue alors la culture, sous agitation à 320G pendant 96 heures. Pendant ce temps, on ajoute du n-propanol, soit 0,5 ffi au début et, au bout de 12 heures de culture, 4,5 g/dl, réparti toutes les 12 heures et ce, 5 fois, jusqu'à ce que la durée de culture soit égale à 60 heures de telle sorte que l'on ait ajouté en tout Sg/dl. On introduit de l'ammoniac de façon à maintenir le pH à 6,5 - 8,0.On ajoute alors au milieu de culture A, de la pénicilline en plusieurs fois au bout de 12, 24, 36 et 48 heures de culture , de façon à ce que la quantité totale ajoutée soit de 10 unités/ml. Le milieu de culture G est considéré comme constituant l'état biotinique suboptimal dont il a été question plus haut. La fermentation s'est terminée au bout de 96 heures de culture. Les quantités résiduelles de n-propanol dans les limieux de culture A, B et C ont été trouvées égales respectivement, à 0,23, 0,23 et 0,31 g/dl, par chromatographie en phase gazeuse. La densité optique des milieu de culture, dilués 30 fois atteignait finalement les valeurs respectives de 0,46, 0,62 et 0,42. La quantité totale d'acide l-glutamique qui a été produite et qui s'èst accumulée dans le milieu de culture a été déterminée en utilisant l'acide l-glutamique décarboxylase de B. Coli ce qui a donné Le résultat suivant : 2,31 g/dl dans le milieu de culture A (rendement par rapport à la source de carbone : 46,2 %) ; 0,32g/dl dans le milieu de culture B (rendement : 6,4 %) ; et 0,88g/dl dans le milieu de culture G (rendement : 17,6 Xo). Exemple 2 TABLEAU 3 Milieux de culture pour fermentation A A B n-Propanol 5,0 g/dl (Total des : 5,0 g/dl additions successives: :liqueur de maîs macéré: 0,4 " : 0,4 : Urée 0,4 " : 0,4 : KH2PO4 0,2 " : 0,2 MgSO4,7H20 : 0,05 " : 0,05 Fe++Mn++ 0,001 " 0,001 " Pénicilline G Potassium: 10 unités/ml : 0 unités/ml On a cultivé Corynebacterium petrophilum de la variété propanolophilum N 4112 S (ATCC N 21 390 ) dans le milieu de culture des germes, lequel a été inoculé, à raison de 2% avec le milieu de culture pour fermentation du tableau 3 On a ensuite effectué la culture pendant 96 heures de la même façon que dans l'exemple 1 en ajoutant du n-propanol et de la pénicilline. Comme résultat on a obtenu pour un milieu de culture dilué 30 fois, une densité optique de 0,47 pour le milieu A et de 0,60 pour le milieu B. ta quantité totale d'acide l-glutamique formée à la fin de la culture était de 1,63g/dl dans le milieu A et de 0,12g/dl dans le milieu B. Après ajustement du pH du produit surnageant sur le bouillon de culture, au moyen d'acide chlorhydrique, on a obtenu facilement par centrifugation. des cristaux b-ruts d'acide l-glutamique Exemple 3 TABT.RAU 4 Milieux de culture pour fermentation A B n-Propanol 3,0g/dl (Total des : 3,0 g/dl additions successives): : Isopropanol :2,5 " : 2,5 tiqueur de mais macéré :0,4 " : 0,4 Urée :0,2 " : 0,2 KH2PO4 :0,2 " : 0,2 :MgSO4,7H20 :0,05 " : 0,05 g 4 2 Fe++Mn++ 0,001 " 0,001 Biotine 100 /l 100 /l Penicilline G Potassium :5 unités (u. Fl : On a inoculé 2% du bouillon final de culture des germes de Brevibacterium vitalumen de la variété propanolpphilum N 234 (ATGG N 21391 ) aux milieux de culture pour fermentation (milieux de culture principaux) du tableau 4 et on a maintenu le pH à 6,5 - 8,0 par addition d'ammoniac ; on a effectué la culture pendant 96 heures.Pendant ce temps, on a ajouté une quantité totale de 5,5g d'un mélange de n-propanol et d'isopropanol (contenant 30 parties de n-propanol pour 25 parties d'isopropanol) pour 100 ml de chaque milieu, cette addition étant répartie en plusieurs fois, en ltoccurence, 0,5g au début de la culture et ensuite 5 fois 1g toutes les 12 heures. On a ajouté5 u./ml de pénicilline en plusieurs fois, soit au bout de 12, 24, 36, 48 et 60 heures de culture-. La densité optique desmilieuxde culture finaux dilués 30 fois, était de 0,39 pour le milieu A et de 0,44 pour le milieu B. tes quantités résiduelles de n-propanol et d'isopropand étaient respectivement de O,O9g/dl et 0,88g/dl dans le milieu A et de 0,05g/dl et 0,74g/dl dans le milieu B.De plus, la quantité total d'acide l-glutamique accumulée dans le milieu A était de 2,07g/dl et de 0,22g/dl dans le milieu B. Exemple 4 TABLEAU Milieu de culture pour fermentation n-Propanol 3,Og/dl Isopropanol 2,5 liqueur de mais macéré 0,4 Urée 0,2 KH2PO4 0,2 " MgSO4,7H2O 0,05 " Fe++Mn++ 0,01 " Péniciline G Potassium 20 unités/ml On a fait une pré-culture, pendant 48 heures, de Corynebacterium petrophilum N 234 (ATGC N 21 391 ) et on a inoculé 2% du milieu de culture desdits germes dans le milieu de culture pour fermentation du tableau 5 ; on a effectué la culture penfant 96 heures. La méthode d'adjonction de n-propanol et dtisopropanol a été la même que celle de l'exemple 3, tandis que l'adjonction de pénicilline se fait en une seule fois au bout de 12 heures de culture.La densité optique du mileu de culture e final , dilué 30 fois,était de 0,49, la quantité résiduelle de n-propanol était de O,O5g/dl et celle dtisopropanol de 0,92g/dl, tandis que la quantité accumulée d'acide l-glutamique était de 1,34 g/dl. Exemple 5 On a remplacé le n-propanol par de l'éthanol dans les formulations du milieu de culture A de l'exempeî et l'on a utilisé Corynebacterium melassecola de la variété alcoholophilum N0 313 (ATCC N 29 392 ) en effectuant, de la même façon que dans l'exemple 1,la culture pendant 72 heures. A la suite de celle-ci on a obtenu 2,61g/dl d'acide l-glutamique dans le bouillon de culture final, ce qui correspondait à une rendement de 52 % en poids par rapport à l'éthanol. Bien entendu l'invention n'est nullement limitée aux modes d'exécution décrits et représentés qui n'ont été donnes qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des equivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé de production de l'acide l-glutamique par fermentation caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer, à un milieu de culture contenant de l'étanol, du n-propanol ou des alcools choisi; dans le groupe constitue par l'éthanol, le n-propanol et l'isopropanol, comme source de carbone, une bactérie appartenant à l'espèce Corynebacterium ou Brevibacterium et possédant une ibrte tude à utiliser l'abool, à effectuer la culture de façon aérobie, en ajoutant de la pénicilline après le début de la culture, de façon à provoquer une accumulation d'acide l-glutamique dans ledit milieu de culture 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source de carbone est naintenue dans ledit milieu à une concentration de 0,3 - 1,5g/dl pendant lesdites premières heures et de 0,5- 2,Og/dl ensuite. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que on ajoute la pénicilline dans le milieu précité, à la concentration de 1 à 20 unités (u)/ml. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute ladite pénicilline au milieu précité au bout de 8 heures de culture. 5 - Acide l-glutamique caractérisé en ce qu'il est obtenu par le précédé de fermentation qui consiste à inoculer, à un milieu de culture contenant de l'éthanol, du n-propanol ou des alcools choisis dans le groupe constitué par l'éthanol, le n-propanol et l'isopropanol, comme source de carbone, une bactérie appartenant à l'espéce Corynebacterium ou Brevibacterium et possedant une forte aptitude à utiliser l'alcool, à effectuer la culture de façon aérobie, en ajoutant de la pénicilline après le bébut de la cul- turne, de façon à provoquer une accumulation d'acide l-glutamique dans ledit milieu de culture. 6 - Acide l-glutamique , caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4.