Brevet FR2007478A1 — publié le 19700109

La présente invention concerne un nouveau groupe utile de substances appelées leupeptines, dont les structures sont indiquées par les formules suivantes j Ep E* GHO urr i r i , , E5«C0wHH«0H-00-.HH-CH«G0-.NH-.CH«(Ca2)5-HH«G^ HHg Ej»0HJ—, OHj^Hg4» oh3 OH_ GH-» t /3 / ' Eyj jEg^OH^^ | «CHg^OH/ , «ï>GH—CHg—CH^ 10 0H3 GH3 oh5 Leupeptine JLc-LL: , E^, Eg «^GHg^-GH \h, OH, / 3 Leupeptine Pr—LL t E^-CHj—CHg—, E^ 15 ^GH3 Gomme montré par les formules, les leupeptines sont acétyl—L» 1 eucyl«-L-leucyl-DL~argininal, propionyl—L—leucyl-L-leucyl—DL*» argininal et leurs analogues dans lesquels un ou deux groupes de L-leucine sont substitués par de la L~isoleucine et/ou L~valine<> 20 La présente invention concerne les leupeptines et leur production* Plus spécialement, elle concerne des procédé pour leur production par fermentation et des méthodes de récupération et de purification. L'invention englobe les substances thérapeuti-quement utiles et leurs sels d'addition acides sous forme de 25 concentrés bruts, sous forme de solides purifiés et à l'état pur# Les leupeptines sont efficaces pour inhiber les réactions enzymatiques de la trypsine, papaine, kallikréine, plasmine et thrombokinase, et pour inhiber la fibrinolyse, la formation de kinine à partir de kininogène et la coagulation du sang# Les 30 leupeptines ont une faible toxicité et présentent en effet thérapeutique sur l'inflammation chez les rats provoquée par la carrageenine» Elles sont utiles pour le traitement de la pancréatite et des maladies inflammatoires, en particulier pour les maladies inflammatoires de la peau, par exemple les brûlures0 69 11374 * 2007478 Comme montré par les structures décrites ci-dessus, il y a deux groupes de leupeptines, selon le groupe acétyle ou le groupe propionyle. Dans la présente invention, une leupeptine avec groupe acétyle est désignée comme "leupeptine Ac", et une 5 autre avec groupe propionyle eomme "leupeptine Pr"« Acétyl-L-leucyl-L-leucyl-DL-argininal ou acétyl-L-leucyl-L-leucyl-DL-argininal sont abrégés comme "leupeptine Ac-LL" ou "leupeptine Pr-LL" respectivement» La figure 1 et la Figure 2 sont des courbes de spectres 10 d'absorption d'infra-rouge respectivement du chlorhydrate de leupeptine Pr-LL et du chlorhydrate de leupeptine Ac-LL les plus purifiés, pris sous forme de comprimés de bromure de potassium# Il est maintenant fourni, selon l'invention, des composés 15 i usage thérapeutique ou leurs mélanges, choisis à partir des leupeptines dont les structures ont été décrites plus haut» Il est en outre fourni selon la présente invention un procédé pour la production de leupeptines qui consiste à cultiver une souche de Streptomyces dans un milieu aquetuc contenant une 20 substance azotée dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité importante d'une leupeptine ou de leupeptines se soit accumulée dans la dite solution» Les leupeptines ont été découvertes, par les présents inventeurs, pat triage systématique d'un composé actif inhibant 25 la fibrinolyse par plasmine dans des filtrats de cultures d'Aetinemycetes. U a également été découvert par les présents inventeurs que des leupeptines sont produites par beaucoup de souches de diverses espèces de Streptomyces» Six souches qui ont été confirmées comme produisant des leupeptines ont été 30 classées comme suit t Streptomyces roseus (2 souches, dont les numéros de laboratoire à l'Institut de Chimie Microbienne étaient Ma839-A1, MB262-M1), Streptomyces roseoehromogenes (3 souches, MA943-M1, MB4-56-AE1, MB260-A2), Streptomyces ehartreu-sis (1 souche, MB58-MG1), Streptomyces albireticuli (1 souche, 35 MB26—A1), Streptomyces thioluteus (1 souche, MB 321—Ai), Streptomyces lavendulae (1 souche, MB 172-A2), Streptomyces nobori-toensis (1 souche, MB46—AG)» Les propriétés de ces espèces ont été décrites dans "Les Actinomycetes", Vol» II (par S»A« Waksman, ïhe Williams & Wilkins Company, 1961)» En outre, d'autres sou-40 ches qui doivent être clàssifiées en plus de 11 espèces ont été 11374 5 2Ô07478 confirmées comme produisant des leupeptines« L'aptitude à produire des leupeptines est largement répartie parmi les Streptomyces, et en employant des méthodes de test d'activité et de préparation décrites dans la présente invention, il est ^ facile de trouver des souches de Streptomyces convenant pour la production de leupeptines en cultures de souches et sources naturelles. Un bouillon de fermentation contenant des leupeptines est préparé en inoculant des spores ou mycéliums d'organismes 1 o producteurs de leupeptines dans un milieu convenable et en cultivant ensuite dans des conditions aérobies. On peut faire varier la température sur un large intervalle de 23-37°G dans lequel l'organisme peut se développer, mais la température 27-35°C est préférable. Sans la fermentation aérobie submergée 15 de l'organisme pour la production de leupeptines, le milieu contient comme source de carbone une huile de glycéride ou un hydrate de carbone qu'on trouve dans le commerce, par exemple amidon, glucose, glycérol, maltose, dexfcrine, sucrose, lactose, etc.. à l'état pur ou à l'état brut, et comme source d'azote 20 mie substance organique, telle que. peptone, hydrolysat de caséine, caséine, extrait de levure, extrait de viande, farine de soja, farine d'arachide, amino-acides ; etc.. et, quand on le veut, des sources inorganiques d'azote. Bien que les leupeptines soient produites dans un milieu contenant ces substances 25 azotées, le peptone et l'hydrolysat de caséine sont des exemples de sources d'azote convenant pour la production de leupeptines* Les études de biosynthèse* montrent que la leucine, l'isoleucine, la valine et la portion guanidine d'arginine sont utilisées pour la production de leupeptines. Par conséquent, un hydrolysat de 30 protéine tel que le peptone, la N-Z aminé (Sheffield Ohemical, Type A), l'hydrolysat de caséine, et l'hydrolysat de levure font partie des sources d'azote convenant pour la production de leupeptines. Les leupeptines sont stables aux états neutre et acide, 35 mais relativement instables à l'état alcalin : il est par conséquent désirable de maintenir le pH du liquide de culture à pas plus de 7,5 pendant la fermentation. Sans tin milieu contenant 1,0% de glucose, 1,0% d'amidon, 2,0% de peptone, 0,5% HaCl auquel un organisme producteur de leupeptines a été inoculé et 40 cultivé avec agitation à 27°G, le pH à 24, 48, 72 et 96 heures a 11374 4 2Ô07478 été 6,0 , 6,5 t 7»5 et 8,0 respectivement* Des leupeptines étaient déjà produites après 24 heures et le rendement maximum a été observé de 48 à 72 heures et a ensuite diminués Une chromâtographie des filtrats de culture sur mince couche d'acide ^ silicique a montré plusieurs taches positives de ninhydrine comprenant celles correspondant à la leucine, l'isoleucine et la valine. Ces taches ont été observées jusqu'à 48-72 heures et ont disparu ensuite» C'est là une indication utile de la période de production maximum de leupeptines pendant la fermentation* Dans un milieu contenant une substance organique telle que peptone, hydrolysat de caséine, etc ... en général diverses leupeptines sont produites simultanément* Toutefois, des mycéliums d'un organisme producteur de leupeptine, s'ils semt cultivés dans un milieu synthétique contenant de la leucine, pro-duisent des leupeptines Pr-LL et Ac-LL. Si au lieu de leucine on ajoute de la valime eu de l'isoleucine, alors des leupeptines contenant ces smine-aeides sont produites* La méthode de test de l'activité anti-plasmine a été la suivante : le mélange consistant en 0,5 cm3 de solution d'euglo-20 buline préparée à partir de sérum humain par la méthode décrite par Kline (J.Biol. Chem. 204, 949, 1953) et Norman (J.Expotl. Med. 106 . 4231 1957)« 0,4 cm3 de phosphate H 1/50 tampon (PBS) de pH 7«2 dans du sérum physiologique contenant une substance d'essai, et 0,1 cm3 de solution de streptokinase (200 unités/ 25 0,1 cm3 de PBS), a été mis en incubation à 37°C pendant 3 minutes et ensuite 2,0 cm3 de solution de fibrinogène.'(-2,0% dans du PBS) ont été ajoutés et mis en incubation à 37°C pendant 20 minutes ] après l'incubation 1,5 cm3 d'acide perchlorique 3»5M a été ajouté, maintenu à la température du laboratoire pendant une heure, 30 centrifugé, et la capacité d'absorption de la couche surnageante à 280 mç, a été déterminée. Le pourcentage d'inhibition a été calculé comme suit t (a—b)/b x 100, où a était la capacité d'absorption avec de la leupeptine et était la capacité d'absorption sans leupeptine* 35 Les leupeptines sont stables à l'état neutre et à l'état acide. Aucune décomposition ne se produit quand on chauffe dans du HC1 0,1H à 95-100°C pendant 30 minutes, mais une décomposition complète a-lieu quand on chauffe dans du NaOH 0,1N à 95-100°C pendant 30 minutes. Si les leupeptines sont maintenues 40 dans les solutions aqueuses de pH 9,0 à 60°C pendant 30 minutes, 69 11374 5 2007*78 une décomposition de plus de 50% se produite II est par conséquent désirable de traiter la substance à l'état neutre ou acide pendant l'extraction. Dans le bouillon de culture de souche productrice de leu-^ peptines, les leupeptines existent principalement dans la partie liquideo Les leupeptines sont assez stables pour une évap©ration du bouillon par distillation sous vide, et à partir de la solution ainsi concentrée les leupeptines peuvent §tre précipitées par addition d'un solvant dans lequel les leupeptines soient 10 pratiquement insolubles et qui soit miscible à l'eau, par exemple 1'acétone» Toutefois, un procédé d'adsorption est préférable pour extraire les leupeptines du bouillon de fermentation. Comme adsorbant on peut employer un carbone actif, une résine échangeuse d'ions, l'alumine, l'acide silicique, etc.. qui peu-vent adsorber les leupeptines et desquels les leupeptines peuvent Stre éluées» Far exemple, les leupeptines sont adsorbées par un carbone actif et éluées avec de l'eau acide, du méthanol acide,, du méthanol aqueux acide, ou de 1 *éthanol aqueux acide. Si on désire une élution rapide, le solvant acide est plus 20 désirable que le solvant neutre. Une résine échangeuse d'ions est un adsorbant convenant mieux pour l'extraction de leupeptines. Les leupeptines ont un groupe guanidine, et par conséquent on emploie une résine échangeuse de cations. Une résine poreuse faiblement acide, par exemple Lewatit CRP (Farbenfabriken Bayer 25 A.G.) est préférable. La résine échangeuse de cations peut ftre employée sous des formes de H, HH^, Na, Li et leur mélange. Si une résine échangeuse de cations est utilisée sous forme de H, la leupeptine adsorbée est éluée lentement avec de l'acide chlorhydrique dilué ou de l'acétone aqueux à 50%. Toutefois, un jO solvant organique acide tel que HC1 0,5N dans de l'acétone aqueux à 50%, ou HG1 0,5N daiis du méthanol aqueux à 50-80% convient mieux pour 1'élution. Une chromatographie au carbone, par exemple adsorption de leupeptines hors de la solution aqueuse et élution avec du 35 méthanol aqueux acide, est utile pour la purification ultérieure. La chromatographie à l'alumine peut également être employée pour la purification. La chromatographie à l'alumine se développe avec méthanol, éthanol, chloroforme-méthanol,. éthylacétate-méthanol, etc..» Si les leupeptines sont dissoutes dans du 40 méthanol, de l'éthanol ou leur mélange avec de. l.'e.au, les 11374 6 2007^78 leupeptines passent alors la colonne d'alumine. Ce procédé est utile pour la purification de leupeptines, par exemple une résine échangeuse de cations est employée dans la forme mixte de H et Na, et les leupeptines sont éluées avec du HC1 5 0,1H~0,2No Un chromât ographe à colonne d'acide silicique est également utile pour la purification de leupeptines. Par exemple, les leupeptines sont dissoutes dans un mélange chloroforme-méthanol (9/1) et le chromatogramme est développé avec du chloroforme-10 méthanol (8/2)« Une distribution à contre-courant peut également itre utilisée pour l'extraction ou la purification de leupeptineso Un extracteur centrifuge à plusieurs étages, par exemple l'extracteur centrifuge Podbielnak, peut ftre employé dans ce 15 but* Le coefficient de distribution des leupeptines entre le but» nol et le phosphate—tampon de pH 6,0 est d'environ 1* L'extraction de leupeptine au butanol est utile pour la purification des leupeptines. Les leupeptines ont un groupe guanidine et sont précipi-20 tées hors de la solution aqueuse sous la forme de leurs picrates, flavianates, reineckates, sels acide 5~méthyl-/3 —naphtalenesulfo-niques. Cette méthode de précipitation est également utile pour la préparation de leupeptines. Ces sels sont traités avec des solvants organiques contenant de l'acide chlorhydrique et sont 25 convertis en chlorhydrates de leupeptines. Ce qui suit est un procédé efficace d'extraction et de purification de leupeptines à partir du bouillon de culture j les leupeptines sont adsorbées par une méthode utilisant une résine poreuse échangeuse de cations ayant un groupe d'acide carboxylique, éluées avec de 30 l'acide chlorhydrique-méthanol, puis l'éluat est concentré sous vide et la solution aqueuse concentrée est "extraite plusieurs fois avec du butanol, et l'extrait au butanol est concentré jusqu'à siccité, le résidu en solution aqueuse est décoloré par passage à travers la colonne de résine échangeuse d'anions, et 35 l'écoulement de sortie est évaporé, donnant des mélanges purifiés de chlorhydrates de leupeptines» Le chlorhydrate de leupeptine Pr le plus purifié, que l'analyse d'amino-acide a montré contenir principalement de la leupeptine Pr—LL (leucine 1,qo, isoleucine 0,10 , valine 0) 40 présentait les propriétés suivantes ; poudre blanche fondant sur 69 11374 2007478 1« large iaterralle de 110-140*0,/y7 «*56° (o«1t néthaiiol). L B " pKa* supérieur à 12. Analyse calculée pour C21H40°4'IÎ6oHG1#H2C5 1 0 50,95 î H 8,76 | 0 16,16 j N 16,98 } 01 7,16. Trouvé * 0 51,13; H 8,77 ; 0 14,96 | S 17,10 : Cl 5,73. Elle n'a pas d*absorption 5 caractéristique des ultra-violets. Le spectre IR montre une absorption correspondant à un aldéhyde (1720»1730 cm ) et de fortes bandes d'aaides (1650, 1540 cm**'')« Le spectre (100 MHs) de SUT (résonance magnétique nucléaire) dans (CD^gSO montre l'existence d'un groupe ÏT-propioiiyle dans la molécule suivant 10 des maximums à/1,00 (triplet, 3h) et i / 2,12 (quadruplet, 2H). Le chlorhydrate de leupeptine Ac le plus purifié, que le résultat de l'analyse d'amino»acide a montré contenir principalement de la leupeptine Ac-IiL (leucine 1,00, isoleucine 0,04, valine 0,01), présentait les propriétés suivantes : poudre 15 blanche fondant sur le large intervalle 75-110*0, M 3 "52* (c«1, méthanol), pKa' supérieur à 12. Analyse calculée pour °20H3804H6*H01, fî2° * C 49,93 } H 8,59 ; 0 16,63 ; N 17,47 | 01 7,37» Trouvé : 0 50,34 j H 8,57 i 0 16,42 } N 16,03 : 01 5,27* Elle n'a pas d'absorption caractéristique des ultra-violets. 20 Le speetre IR est semblable à celui du chlorhydrate de leupeptine Pr* Sur le spectre HMN (100 MHz) dans ([CD^gSO, un maximum à S1,85 ( singulet, 3H) montre l'existence d'un groupe H—acétyle. Les chlorhydrates de leupeptines sont solubles dans l'eau, 25 le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acide acétique, la dimé-thylformamide et le diméthylsulfoxyde, et à peine solubles dans l'acétate d'éthyle, l'acétone, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, l'éther éthyle et le n-hexane» Les leupeptines donnent des réactions positives Rydon-30 Smith, tétrazolium rouge, 2,4-dinitrophénylhydrazine, Sakaguchi, diacétyle, et pentacyanoaquoferriate, et des réactions négatives ninhydrine, Jaffe, chlorure ferrique, anthrone, Molisch, benzidine. La chromatographie sur papier de leupeptines par méthode 35 ascendante a révélé une seule tache détectée par réaction Rydon-Smith, tétrazolium rouge, ou Sakaguchi à Rf 0,9 - 0,95 se développant avec une couche supérieure de butanol—acide acétique—eau (4/1/5 en volume), 0,9 - 0,95 avec n-propanol-eau (7/3) et 0,4 69 11374 2Ô07478. « 0,6 avec acétate d'éthyle-méthanol^eau (4/1/1). i. l'électro-phorèse sur papier à haute tension (3.500 V 15 min) en employant acide formique—acide ac è t i que—e au (25/75/900) leupeptines 5—6 es vers la cathode en partant du point de départ» A la chromato-^ graphie sur couche mince en employant du gel de silice & (E» Merck), les leupeptines donnent une seule tache à Ef 0,6 « 0,7 avec n-propanol-eau (7/3), 0,2 - 0,4 avec chloroforme-méthanol (7/3), 0,2 - 0,3 avec acétone-eau (1/1) , et 0,3-0,4 avec acétate d'éthyle-acide acétique-eau (60/17/17)* Les leupeptines /jq Pr et Ac ne peuvent pas ttre distinguées • par chromatographie sur papier et sur couche mince et par électrophorèse sur papier à haute tension dans les conditions décrites ci-dessus» A la chromatographie sur couche mince de gel de silice G- en employant comme solvant de développement butanol—hutylacétate- acide acètique-eau (4/2/1/1 en volume), les leupeptines Pr et Ac sont séparées. Chacune d'elles montre deux taches t Ef 0,45-0,50 et 0,35-0,45 pour la leupeptine Pr, et Ef 0,35^0,45 et 0,30-0,35 pour la leupeptine Ac. Les extraits de chaque tache sont détectés comme deux taches respectives sur la mSme chromatographie 20 couche minceo Le di-n-butyl-acétal-chlorhydrate de leupeptine Pr-LL est une poudre blanche fondant à 70«90°C «-46° (c-2,*éthanel), pKa' supérieur.à 12. Analyse calculée pour °29É5805VHG:UH20 * G 55*70 | H 9,83 ; 0 15,35 ; H 13,44 j 01 5*67. Trouvé : G 55,73| 25 H 9,68 | 0 14,43 ; lï 13,56 | Cl 5,86. La formule moléculaire est établie comme 029H58°5M6 P®1* le maxijjm11 (original) m/e ■ 57© dans le spectre de masse» Le di-n-butyl—acétal—picrate de leupeptine Pr-LL est une poudre cristalline jaune fondant à 60-90°C. Analyse calculée 50 pour o29h58o5iï6.c6h3o7n5 t C 52,55 | H 7^69 i 0 24,00 | N 15,76* Trouvé * C 52,32 j H 7,80 ; 0 24,80 } H 15,43. Le di-n-butyl-acétal-chlorhydrate de leupeptine Ac-LL est une poudre blanche fondant à 70-90°C,|[o{J^ —43° (c*2, méthanol), pKa' supérieur à 12. Analyse calculée pour ^gH^gO^Hg.HC1» 1 /2H2O1 35 0" 55,84 i H 9,71 » 0 14,61 j H 13,96 s Cl 5,89. Trouvé î C 56,03| H 9,67 | 0 14,77 ; N 13,68 : Cl 6,16. La formule moléculaire est dérivée du spectre de masse à grand pouvoir séparateur de son chlorhydrate. Poids moléculaire calculé pour °28H56°5N6' 556,431; 69 11374 9 2007478 trouvé, m/e 556,429 i 0,003» Le di-n-butyl—acétal—picrate de leupeptine Ac—LL est une poudre cristalline jaune fondant à 60-100oC„ Analyse calculée pour C28H5605N6.C6H307IÏ3 s C 51,96 } H 7,57 5 0, 24,43 f N 16,04. 5 Trouvé : 0 51,78 : H 7,51 ; 0 25,17 i N 15,67. Les di-n~butyl—acétal—chlorhydrates de leupeptines Pr et Ac n'ont pas d'absorption caractéristique des ultra—violets0Les ••i spectres IR montrent la forte absorption à 1070 cm attribué©à 1'acétal. A la chromatographie sur couche mince, en employant 10 du gel de silice G et butanol -aeétate butyle - aeide acétique»* eau (4/2/1/1), les leupeptines Pr di-n-butyl acétal et Ac di—a— butyl acétal donnent chacune une seule tache à Ef 0,65 et 0,60 respectivement. Les leupeptines les plus purifiées"montrant une activité 15 anti-plasmine, un inhibition de la trypsine, de la papaïne, de la kallikrèine, mais non de la chymotrypsine. Les concentrations d'inhibition à 50% de leupeptines sont obtenuées somme suit t hydrolyse protéolytique de fibrine par plasraine, easéine par trypsine et hémoglobine par papaïne à 6yW g/cm3, 2y#g/em3 et 20 0,15 ^g/cm3 de leupeptines et hydrolyse estérolytique d'ester méthyle de p-toluénesulfonyl—L—argi ni ne (TAME) et d'ester éthy— le d* -H-benzoylarginine (BAEE) par plasmine, trypsine ou kallikrèine à 65—8^/f g/cm3 de leupeptines.Le type d'inhibition des leupeptines a été confirmé comme étant compétitif contre 25 l'hydrolyse de TAME par trypsine et de l'hémoglobine par papaïne# Les leupeptines inhibent la coagulation des sangs humain, de lapin, de chat et de vache. L'inhibition de la coagulation de sangs de souris, rats et chiens est très faible. Ges activités des leupeptines ont été comparées avec le trasylol, l'inhibi-50 teur de trypsine, l'acide carboxylique de trans-4—aminomethylcy-clohexane (t-AMOHA) et l'acide £ «aminocaproïne (g-ACA). Les leupeptines, l'inhibiteur de trypsine et le trasylol ont été trouvés de puissants inhibiteurs de la plasmine et de la trypsine. L'effet inhibiteur des leupeptines a été 100 fois plus 55 puissant que celui de£«*ACA et 20 fois plus puissant que celui— de t-AMOHA sur un système de plasmine. Les leupeptines ont été de puissants inhibiteurs de la thrombokinase mais n'ont pas été reconnues contre 1'^-chymotrypsine. Le trasylol n'a pas inhibé la thrombokinase mais a été un inhibiteur puis-40 sant de 1' «C -chymotrypsine. Les leupeptines ont également fait 69 11374 10 2007478. 10 preuve d* inhibition contre 11 inflammation, par la carrageenine chez les rats, l'injection intrapéritonéale de plus de 6?25 mg/ kg de leupeptines ou l'administration buccale de plus de 12§5 ng/kg à des rats a inhibé l'inflammation des plantes des pieds provoquée par l'injection sous a été observé dans le sérum au bout de 1,5 heure, et 240CM?» g/cm3 ©nt été observés dans; l'urin® au-bout de 3-5 heures. Au total environ 40% des leupeptines administrées ont été récupérés dans l'urine® ED^q était oornse suit § souris, 118 mg/kg par l'injection intraveineuse, 1405 mg/kg par l'injection sous-cutanée, 1550 mg/kg par voie "buccal© 5 rats s 125 mg/kg per l'infection intraveineuse, ^ 4000 mg/kg par l'injection sous-cutanée, P* 4000 mg/kg par voie buccale j lapins , 35 mg/kg par 1'in» jeetion intraveineuse, 300 mg/kg pas l'injection sous-cutanée, ^ 1500 mg/kg par voie buccale. Des exemples vont être exposés ci-après. Toutefois, on 20 comprendra d'après ce qui précède que l'invention n'est pas limitée aux procédés donnés dans ces exemples. Comme les caractéristiques des leupeptines sont exposées ici, il est évident qu'il est possible d'adopter diverses variantes ou modifications qui ne sont pas concrètement décrites ici. 25 "F-TEMPT/E 1 Streptomyces roseus MA839-A1 a été cultivé à 27°C pendant 71 heures dans 85 flacons (volume réparti dans un flacon, 125cm3) par agitateur alternatif à secousses (130 coups/min), le milieu contenait 1% glucose, 1% amidon, 2% polypeptone (Daigo Eiyo Go.) 30 et 0,5 % chlorure de sodium, et a été ajusté à pH 7,0 avec de l'hydrate de sodium 2N. Un inoculum végétatif, 1% en volume, développé pendant 2 jours dans le même milieu, a été employé. Le bouillon de culture a été recueilli (10 litres, activité anti-plasmine : ID^q 0,015 cm3/Cm3) et centrifugé à 3000 t/mn 35 pendant 10 minutes» A la couche surnageante (9 litres, pH 7,3) on a ajouté 135 g de carbone (Wako Pure Chem0 )» Après agitation pendant 30 minutes, le carbone a été séparé par filtration et lavé avec 6 litres d'eau et élué avec 1500 cm3 et 1200 cm3 de méthanol acide à 80%'(pH 2 avec acide chlorhydrique 2N).L'éluat 40 actif a été neutralisé avec de l'Amberlite IR 45 (forme OH) et 11374 "" 2007478 concentré à sec en donnant 22 g. d'une poudre brunâtre (activité antiplasmine : ID^q 95^**g/cm3 rendement d'activité 38%) TgrraurPEE 2 Streptomyces roseus MÀ839—A1 a été cultivé dans un fermen-2o tateur de 2000 litres (volume réparti : 1500 litres)» le milieu contenait 2% de glucose, 1% d'amidon, 2% de peptone, 0,5% HaCl et 0,2% KHgPO^, et a été stérilisé à 110°C pendant 30 minutes» Un inoculum végétatif, 0,13% en volumej développé pendant 48 heures dans le mime milieu a été employé» La température a été 25 maintenue à 27°C, le débit d'air a été maintenu constant à 1500 litres par minute et l'agitation a été faite à 200 t/mn» Le bouillon de culture (1500 litres, pH 7,15s activité anti-plasmine t ID50 0,015 cm3/cm3) a été recueilli au bout de 53,5 heures et filtré en employant 45 kg de Dicalite comme acide de filtre» 50 On a fait passer le filtrat à travers une colonne de résine Lewatit CNP (Farbenfabriken Bayer A»G», pH 6,0 avec hydrate de sodiula ,180 litres), La colonne a été lavée avec de l'eau et éluée avec 300 'litres d'acide chlorhydrique 1N dans du méthanol à 80% et 200 litres d'acide chlorhydrique 0,2N dans du méthanol 35 à 80-%» L'éluat actif (565 litres) a été ajusté à pH 5»2 avec de l'hydrate de sodium 6N et concentré jusqu'à 90 litres. Le concentré a été extrait avec du butanol (80 litres) et l'extrait a été concentré à sec en donnant 979,1 g d'une poudre brunâtre (activité anti-plasmine : ID^q 13 ^ug/cm3, rendement d'activité 40 75%)» 69 11374 12 2007478. Cette poudre brunfttre (164- ag) dans 2 cm3 d'eau a été dé» colorée et purifiée par une chromatographie sur résine de Dowex 1x2 (maille 100—200, forme Cl, iO cm3) en développant avec de l'eau. L'éluat, qui donnait des réactions Rydon-Smith et 5 Sakaguchi positives, a été concentré à sec en donnant 126 mg d* une poudre blanche de chlorhydrates de leupeptines (activité antiplasmine t H>^0 H^tts/®a3, rendement d'activité , 91%)* Exemple 3 - ■ • Séparation des di-n-butyl acétals de leup^ptinés pj et Ac 10 Les chlorhydrates de leupeptines (19,2 g, ID^q 15^«.g/cm3) ont été chauffés au reflux dans 270 cm3 de butanol pendant 2 heu— res. La solution de butanol a été lavée avec 270 ca3 d'eau et concentrée à sec en donnant 23,4 g d'une poudre brute. Cette poudre brute (14,0 g) a été dissoute dans 20 em3 de Butanol*»Butyl 15 acétate—acide acétique—eau (4/8/1/1) et soumise à une chromatographie en colonne d'acide silicique (Hallinekrodtt900 g) en développant avec le aâae solvant. Le premier éluat (150 cm3), qui donnait des réactions Rydon—Smith et Sakaguchi., a été concentré à seo £n donnant 1,5 g de di-n«-butyl acétal-chlorhydrate 20 de leupeptine PR sous forme de poudre blanche. Le deuxième éluat (500 em3) a été concentré à seo en donnant 5$3 g d'un mélange contenant des di-n-butyl-acétals (chlorhydrates) de leupeptines Pr et Ac. Le troisième éluat (1400 cm3) & été concentré à seo en donnant 3,4 g de di—n-butyl acétal-chlorhydrate de leupeptine 25 Ao sous forme de poudre blanche. Exemple 4 Chlorhydrate de leupeptine Pr Du di-n-butyl-acétal-chlorhydrate de leupeptine Pr (93 ag) a été dissous dans 5 cm3 d'acide chlorhydrique 0,01N et chauffé 30 à 60*C pendant 3 heures. La solution a été neutralisée à pH 6,0 avec de l'Aaberlite IR 45 (forae OH) et concentrée à sec en donnant 72 mg de chlorhydrate de leupeptine Pr sous forae de poudre blanche (Id^0: 8y*g/cm3). EXEMPLE 5 35 Chlorhydrate de Leupeptine Ac Du di-n-butyl acétal-chlorhydrate de leupeptine Ac (1,0g) a été dissous dans 50 ca3 d'acide chlorhydrique 0,01N et traité par la même méthode que celle décrite dans l'Exemple 4. On a alors obtenu une poudre blanche de chlorhydrate de leupeptine Ac 69 11374 15 007478 Exemple 6 Di-n-butyl ac é t al~p1erate de leupeptine P:c A une solution de di-n—butyl aeétal-chlorhydrate de leu et on a obtenu un picrate c-ristallir* ^auas de di n Exemple 7 Di~n-"buti»'l ac é t al • -p icr at e leir^-sûtias A© L xms solution de âi^r.=butyl aoétal^slslQrhydrats âs l©u» ^ peptine Ac (100 mg) dans 2 aaj ds®au9 88 mg de prisrats de sodium dans 1 cse3 &'oa*£ &2it été à 40s=>5O°Co TJo. piorat© cristallin 3 aune d® âi-Ep^utyl aoét-al Isupoptia,® A© (109 ®g) a. été obtenu par la mâke tcç-fcaiq«/3 70® «elle âéerite. âsm~' 18Exsg« pie 6» 2q Exemple 8 Une souche productrice de leroeptlnes ÇSûgQia'e s goseas MA 839*"A!') a été cultivée avec secousses pendant 48 heures daas»-les conditions décrites dans l3Sxejaple 1o Le zsy®êl±m?. a été séparé du bouillon de culture (375 ca3) par e ea.tr ifagat ion s e» 2^ lavé avec 80 cm3 de sérum physiologique stérilisée Le iàj©éliŒ2. humide (7»0-7»8 g) obtenu a été mis sa suspension dans 26 emî? d'eau stérilisée» La suspension (2 ghl3) a été inoculés dans 30 cm3 d'un milieu synthétique contenant 0,2% 9 091fS lyEOPO^g 0,05% M S0.o7Hp0, 0,05% KC1, 0,001% EeSQ^HpO s 1,0# glucose. 1,0 % amidon et un mélange d* aminc~acides (3»05 Maolss de L» leucine, 0,61 mmole de L^isGleucine t 0,70 Bâcle d® It=>proline# Gt 0,23 mmole de L-arginine), et a été secouée à 27°0 pendant 24 heures» Le mélange réaotionnel a été filtré et adsorbé sur une colonne de résine Amberlite IRC 5>0 (5 8®3 de îosse E). La eoloz>« ne a été lavée avec 50 cm3 d4 acétone 8.queui: à 50$,- et éluée 3.V03 du HCL 0,5 N dans de l'acétone aqueux à 50%« L#éluat (15chi3) a été neutralisé avec de l'Amberlite IR 45 (forae OH) et concentré à sec.» Le résidu a été dissous dans 1 cia3 de méthanol à 80% ©t soumis à une colonne d'alumine acide (5g) en■ développant ave© 40 25 cm3 de méthanol. L'éluat actif (5 cm3) a été concentré et 11374 2007478. (réparti en gouttes) sur m® plaque à souche miac© de gol à® silice G© La plaque a été développée avec un mélange de chloroforme et de méthanol (4/1)s Ses leupeptines ont été extraites par méthanol du gel de silice recueilli do la zone en Rf Q915*~ 5 0,50» La solution de méthanol a été concentrés à sec ea donnant) uae poudre blanche (1,2 Eg) de leupeptines® Activité ant#»p,lasmi-ne i ÏD^q 10^g/emjô l'analyse pour amino-aoides de l'hydrolysat acide (en rapport molaire) a donné de la leucine (1 ,,13), de 11 isoleucine (0,12), de la prolise (0,09) ® de 11 arginine (tracs.; 10 et pas de valIns. Dans la mime expérience çmë cells décrite plus fcaut, en employant 209ô smoles de L-leucine9 0,57 mmoles de L-iselenoine et O065 s-mele de L-pïoline sous forme de mélange d1 amir o aeiâasj on a obtenu 0,6 mg de ^«peptine s* L'analyse pour aminc-acides 15 a doané s leueiae (1,16) } isoleuciae (0C10), proline (0,06)« Quand on a employé 3®05 aimoles de L—Leucine„ 0,7 mmole de ]j«proliae et 0^23 ™nole de L-argiaiae corae mélange d'amiao-acides,. on a obtenu 2 atg de leupaptiïiG^o L®analyse pour amiao-a@ides a donné î leueine (1,39)» isoleuciae (0-301)§ praline 20 (0,10). Grâce aux activités biologiques décrites ci-dessus, les léupeptines et leurs sels sont utiles pour le traitement de diverses maladies inflammatoires. Pour le traitement de la pan» oréatite, des leupeptines dans une formulation stérile sont 25 données par voie sous-cutasée, iatra—musculaire 3 istraveissuse ou buccale? Pour des maladies d® peau , les leupeptines peuvent Stre employées sous forme de pâte, crème, solution ou suspension? Sont compris dans le domaine de la présente invention les sels d'addition acides de leupeptines avec des acides organiques 5 0 et inorganiques, tels qu'acide chlorhydrique, acide sulfurique, acide brciahydrique, acide iodhydrique, acide phosphorique , acide nitrique, acide citrique, acide de malate, acide malique, aei&e tar trique, acide bensoïques acide einnamique, aoide ascorbique, acide acétique tl acide pierique s acide phytique, acide levopima~ 55 rique-6,8a-ois»endosu©cinique9 acide sulfamique, acide glycoli-« que et acide mandeliqu®. Pour des fins thérapeutiques on se sert de sels d'acides non-toxiques, mais des sels d'acides toxiques, par exemple l'aoide picriqu®s sont utiles dans les techniques d'isolation, par exemple comme préeipitants hors de 11374 15 2007478 solutions aqueuses, et aux fins de désinfection quant la toxicité n'est pas importante. Quand ils sont désirés pour des fins spécifiques et rendus pharmaceutiquement compatibles, on peut mélanger avec les compo-5 sés de la présente invention d'autres médicaments, tels que les an.tih.ist ami nés, les médicaments suif a (par exemple, suifadiazine, suifabenzamide, suifacetamide, suifanilamide, suifapyridine, suifathiazole, suifapyrazine, suifaguanidiae, suifathaliiine, suifasuxidine, sulfisoxazole, sulfamylon, phtalylsulfacetamide, 10 H*-3»4—diméthylbenzoylsulfanilamide, benzylsulfanilamide, et N*-2—( 2-quinomalyl) suif anilamide)t des agents liptropiques (en particulier méthionine, clioline, isositol et beta-sitosterol et des mélanges de ceux-ci) des stimulants du système nesveux central (par exemple, caféine, amphétamines), des anesthésiques 15 locaux, des analgésiques (par exemple, aspirine salieylamide, geatisate de sodium, p—acétyl-aainophéiiol, phénacétine, codéine), des laxatifs (par exemple, phénolphtaléine), des sédatifs (par exemple, barbitufcates, bromures), des antibiotiques (par exemple, pénicillines, kanamycine, streptomycine, dihydrostreptoaycine, 20 bacitracine, polymixine, tyrothricine, érythromycine, chlortétra( cycline, oxytetracycline, tétracycline, oléandomycine, cherampiie— nicol, magnamycine, novobiocine, cyclosérine, néoaycine,) des vitamines (par exemple, vitamines A, , Bg , Bg , des membres de cette famille, acide folique et des membres de 25 cette famille, Vitamines 0, I>2, D^, et E), des hormones (par exemple, cortisone, hydrocortisone, 9-«^—fluor©cortisone, 9-c( —fluorhydrocortisone, prednisone et prednisolone), des agents anaboliques (par exemple 11,17~dihydroxy—9 — °( ~fluoro— 17— «^téthyl—4-androsten—3—one y 17**éthyl—19-u.ortestosterone) 30 et des agents antifongaux (par exemple, mycostatine). 11374 16 2007478 ( « REVENDICATIONS 1.-» Composé thérapeutiquement utile, efficace dans l'inhibition de trypsine, papaïne, plasmine, kallikrèine, de la coagulation du sang, de la fibrinolyse et de l'inflammation, choisi dans le groupe de leupeptines dont les structures sont les suives, . m II. I / Ej-C O-HH-CH-C 0-NH~CH-C O-NH-CH-(CH2)j-HH-G^ hh2 fix««0Hz—, CHX—CH0«* * * * d GK 10 OH^ p OHj E^ ,22- -CH2^Cl/ , -CH-CH2-CH5 ,~CH/ oh3 oe3 CHj Leupeptine Ac-LL: E^« CH^-, E^ ,E2« -CHg^H^' OH, >3 15 Leupeptine Pr-LLi Ej« GH^-CHg-, E^,E2«-CH2-CH^ 2.« Sel d'addition acide d'une leupeptine, comme défini dans la Eevendication 1. 3.— Acétyl—L—leucyl—L—leueyl—DL-eurgininal, comme défini ; dans la Eevendication 1* Propienyl-L~leucyl-L-leucyl«DL-argininal, comme défini dans la revendication 1. 5«- Sel d'addition acide d'acétyl-L-leucyl-L-leucyl«»I)3> argininal, comme défini dans la Eevendication 1. 6.- Sel d'addition acide de propionyl-L-1 eucyl-L«-leucyl-DL-^ argininal, comme défini dans la revendication 1. 7.- Procédé de production d'un bouillon de fermentation contenant des leupeptines décrites dans la revendication 1,qui consiste à cultiver une souche de Streptomyces dans un milieu contenant des nutritifs azotés. 8.~ Procédé selon la revendication 7» dans lequel les leupeptines sont séparées du bouillon de fermentation par adsorp-tion sur une résine échangeuse de cations et élution subséquente hors de cette résine. 9.- Procédé selon la revendication 7» dans lequel les leu-peptines sont séparées du bouillon de fermentation par extraction au butanol. 30