Brevet FR2007713A1 — publié le 19700109

La présente invention concerne un procédé de production de cellules de microrganismes par culture desdits microrganismes dans un milieu contenant comme source principale de carbone des hydrocarbures inférieurs. Plus spécialement elle- concerne un procédé pour la production de cel-5 Iules de microrganismes dans lequel on cultive un microrganisme assimilant les hydrocarbures inférieurs en présence d'air dans un milieu de culture contenant des hydrocarbures inférieurs acycliques avec 2 à 5 atomes de carbone comme source principale de carbone. La présente invention a pour objet un procédé économique de production de cellules de microrganismes. 10 Au cours de ces dernières années, la demande pour les cellules de microrganismes comme source de protéines a augmenté dans les industries du fourrage et de l'alimentation et il y a eu en particulier une forte demande de matières premières pour la production de condiments tels que les produits en relation avec les acides nucléiques, par exemple l'acide 15 inosique, les amino-acides etc..., et la fourniture à bas prix de cellules de microrganismes. Jusqu'à présent on savait que les cellules de certains microrganismes tels que la levure et certaines bactéries pouvaient être produites avec des rendements élevés par culture desdits microrganismes dans un 20 milieu contenant des hydrocarbures paraffiniques à chaîne linéaire avec 12 à 18 atomes de carbone, comme source principale de carbone. Mais il est tout à fait nouveau de produire des cellules de microrganismes avec des rendements élevés en cultivant un microrganisme dans un milieu contenant comme source de carbone les hydrocarbures inférieurs. 25 Au cours de recherches antérieures, on obtenait seulement de faibles rendements par exemple 25 % au maximum, en cellules quand on utilisait du méthane comme hydrocarbure inférieur dans le milieu de culture. Au contraire, dans le cas où l'on utilisait comme source principale de carbone des hydrocarbures paraffiniques à chaîne linéaire avec 12 à 18 30 atomes de carbone, on obtenait des rendements élevés en cellules jusqu'à près de 100 %. La différence entre les rendements dans ces deux cas est importante. Selon la-présente invention les rendements en cellules dans un procédé où l'on utilise des hydrocarbures inférieurs comme source de carbone principale peuvent être considérablement accrus jusqu'à près de 100 % comme 35 indiqué ci-dessus bien qu'on admette en général qu'ai nbbtient par ce procédé que de faibles rendements en cellules de microrganismes. Actuellement, le propane et le butane produits au cours d'opérations de raffinage du pétrole sont utilisés sur une grande échelle comme 1.4098 2007713 2 combustibles pour l'usage domestique sous le nom de "gaz de pétrole liquéfié" mais ces hydrocarbures n'ont aucun autre usage important. De plus, dans l'industrie pétrochimique, une très forte proportion d'hydrocarbures avec 2 à 5 atomes de carbone sont produits à partir de l'essence lourde 5 et les hydrocarbures ainsi produits, à part l'éthylène et le propylène, sont utilisés presque exclusivement comme combustibles. Selon la présente invention, ces hydrocarbures inférieurs peuvent être utilisés comme source de carbone dans un milieu de culture. Des hydrocarbures inférieurs acycliques, tels que les hydrocarbures paraffiniques ou olé-10 finiques à chaîne linéaire ou ramifiée, avec 2 à 5 atomes de carbone, peuvent être utilisés de préférence, si on le. désire, sous forme de mélanges. Du fait de la volatilité élevée des hydrocarbures inférieurs, la séparation et la purification des cellules d'un microrganisme ainsi 15 préparées à partir d'un bouillon de culture contenant les hydrocarbures inférieurs comme source principale de carbone peuvent être réalisées facilement et on n'a pas à craindre d'inconvénients tels que l'apparition de cancers et analogues sur l'homme et les animaux, provoqués par les autres hydrocarbures. De plus, compte tenu des coefficients de solubilité 20 élevés des hydrocarbures inférieurs dans la culture, ils peuvent être assimilés facilement par les microrganismes. Dans la présente invention, on procède de la manière suivante pour séparer un microrganisme du milieu de culture. Dans le cas d'une culture liquide, on utilise des milieux de 25 culture ayant les compositions indiquées aux tableaux 1 ou 2. Dans une fiole à secousses de 500 ml, on verse 50 ml d'un milieu de culture. Après stérilisation de la fiole, avec son contenu, en autoclave à 110°C pendant 10 mn, on ajoute au contenu environ 0,5 g d'une matière naturelle à étudier et on introduit des hydrocarbures inférieurs et de l'air dans l'es-30 pace vide de la fiole. Ensuite, la fiole est bouchée hermétiquement et secouée à 30°C pendant 2 à 7 jours pour accumuler les microrganismes assimilant les hydrocarbures. On peut isoler un microrganisme désiré à partir du mélange cultivé de microrganismes, par culture sur plaque d'une manière classique. 35 Dans le cas d'une culture sur plaque, on utilise un milieu de culture contenant 20 g/1 de gélose et le milieu de culture utilisé ci-dessus. On verse le milieu de culture dans une boîte de Pétri. Après stérilisation de cette boîte avec son contenu à l'autoclave à 120°C pendant 14098 3 2007713 5 mn, on répand environ 0,1 g de la matière naturelle étudiée sur le milieu constituant la plaque et on la maintient à 30°C pendant 2 à 7 jours dans un récipient contenant des hydrocarbures inférieurs et de l'air pour former des colonies. A partir des colonies formées, on isole de manière 5 connue le microrganisme désiré. TABLEAU I COMPOSITION D'UN MILIEU POUR ISOLEMENT DE MICRORGANISMES 10 NH4N03 5 g K2HP04 2,5 g MgS04 7H20 1 g FeS04 7H20 0,05 g H20 1 litre 15 pH 7,0 - 7,4 TABLEAU II COMPOSITION D'UN MILIEU POUR ISOLEMENT DE MICRORGANISMES 20 (NH4)2S°4 10 g Na2HP04 12H20 2 g KH2P04 2 g MgS04 7H20 • 0,5 g 25 FeS04 7H20 30 mg Extrait de levure 100 mg H20 1 litre pH 4,5 - 5,5 30 On a isolé par culture en vue de l'isolement un microrganisme JTB-271 (Institut Japonais de recherche sur la fermentation, dépôt ATCC n° 1 385) qui est utilisé dans la présente invention et on a étudié les caractéristiques taxonomiques de ce microrganisme. La description taxo-nomique dudit microrganisme est la suivante : 35 A - Caractéristiques morphologiques Pendant la première phase (les premières 20 h) de croissance : bâtonnets de 0,4 à 0,6 x 5 à 20 microns, de forme allongée ou filamentaire et ramifiés. Sans motilité. Gram positif. Ne résiste pas aux acides. 14098 4 2007713 On observe des granules soudanophiles. Ensuite (après 48 ou 72 h) : cellules sous forme de bâtonnets courts, longueur 5 microns ou moins. B - Caractéristiques de culture 5 1°) Colonies sur gélose Colonies alimentées par de la gélose : forme circulaire à rosace, surface rugueuse à ondulée, avec saillies allant jusqu'à la convexité, droit à sinueux, opalescent, jaune orangé pâle, milieu inchangé. Colonies sur gélose - glutamate - glucose 10 circulaire, lisse, pulviné, sans saillie, opalescent, orangé pâle, milieu inchangé. 2°) Culture sur gélose inclinée Aliment : gélose inclinée : croissance modérée, filiforme, plat, lisse à rugueux, opalescent, brun jaunâtre pâle, milieu inchangé. 15 Gélose-glucose-glutamate incliné : croissance modérée, fili forme, plat ou avec saillies, lisse, luisant, orangé pâle, milieu inchangé. 3°) Bouillon de culture Aliment : bouillon de culture : membraneux à pelliculaire, clair à légèrement trouble, précipité granulaire. 20 Bouillon de culture glutamate-glucose : membraneux, clair à légèrement trouble, précipité granulaire. 4°) Aliment Barre de gélatine. Pas de liquéfaction, croissance superficielle. C - Caractéristiques physiologiques 25 1°) Action sur le lait Pas de changement, tournesol réduit, alcalin au pourpre de bromo- crésol. 2°) Action sur les nitrates Pas de production de nitrite à partir d'un bouillon au nitrate, 30 mais formation de nitrite dans un bouillon au succinate-nitrate. 3°) Respiration par les nitrates Négative. 4°) Production d'indol Négative. 35 5°) Décomposition du sucre Selon le procédé de Hugh et Leifson, on observe une production d'acide mais non de gaz, à partir du glucose en présence d'air. On n'obtient ni acide ni gaz à partir du glucose en l'absence d'air. Pas de for 14098 5 2007713 mation d'acide ni de gaz à partir du glycérol, du xylose, du sucrose, du lactose et de l'amidon. 6°) Hydrolyse de l'amidon Négative. 5 7°) Assimilation des hydrates de carbone Le glucose, les gluconates, les citrates, les succinates, le glycérol, le rhamnose, le fructose, le sucrose, le lactose, le raffinose, l'inositol et le manitol sont assimilés. Mais l'arabinose et le xylose ne sont pas utilisés. 0 8°) Catalase Positive. 9°) Température de croissance Température optimale 25 à 30°C, croissance ralentie à 37°C. 10°) Influence la teneur en chlorure de sodium 5 Croissance pour 5 %. Croissance ralentie pour 7 % et crois sance nulle pour 10 %. Les résultats obtenus d'après l'étude ci-dessus indiquent que le microrganisme selon l'invention est très semblable au"Corynebacterium hydrocarboclastus"qui a été signalé par Hiroshi Iizuka et Kazuo Komagata 0 dans le "Journal of General Microbiology", 10 (3) 207, (1964). Mais le microrganisme signalé par Iizuka et autres n'assimile que les hydrocarbures paraffiniques à chaîne linéaire comportant plus de 10 atomes de carbone et n'assimile pas les hydrocarbures inférieurs comportant moins de 10 atomes de carbone. Au contraire, le microrganisme selon la présente 5 invention peut assimiler des hydrocarbures supérieurs et des hydrocarbures inférieurs. En particulier, il peut assimiler l'éthane, le propane, le butane, le pentane, etc. et même l'hydrogène. A ce point de vue, le microrganisme de la présente invention n'est pas identique au microrganisme déjà signalé et dénommé"Corynebacterium hydrocarboclastus"JTB-271 peut être consU 0 déré comme un nouveau microrganisme. Les exemples ci-après expliquent plus complètement la présente invention. EXEMPLE 1 5 On introduit dans une fiole à secousses de 500 ml, 20 ml d'un milieu de culture décrit ci-après. Après stérilisation à l'autoclave à 110°C pendant 10 mn puis refroidissement, on inocule environ 1 mg du microrganisme "Corynebacterium hydrocarboclastus" JTB-271 isolé comme in 14098 6 2007713 diqué ci-dessus dans le milieu de culture et on verse sur lui 50 mg de n-pentane et on bouche hermétiquement la fiole. On vaporise le n-pentane dans la fiole et on remplit l'intérieur de ladite fiole avec la vapeur de n-pentane. On secoue le tout à 130°C pendant 40 h. Le milieu de cul-5 ture obtenu est centrifugé et on lave à l'eau les cellules obtenues du microrganisme. Après centrifugation, les cellules sont à nouveau lavées à l'eau distillée et centrifugées à nouveau, et desséchées sous pression réduite de façon à obtenir 42,5 mg dudit microrganisme. 10 COMPOSITION DU BOUILLON DE CULTURE NaN03 12 8 Na.HPO..12H-0 2 4 2 •4 g kh2po4 0,6 g MgS04-7H20 0,5 g FeSO..7H„0 4 2 30 mg CaCl2 60 mg CuS04>5H20 15 /Ug Na2B40?.10H20 O 00 MtiCl2. 4H20 60 ^ug ZnS04 150 ,ug Na2Mo04.2H20 U5 o ""e 0Q Extrait de levure ' 100 mg Eau distillée 1 litre 25 pH 7,0 La composition du microrganisme séché obtenu est la suivante : eau 7 %, protéine 41 %, hydrates de carbone 40,2 %, graisse 3 % et cendres 8,8 %. 30 EXEMPLE 2 Comme dans l'exemple 1 on utilise 150 ml du milieu de culture décrit ci-après. On inocule environ 1 mg de Corynebactérium hydrocarbo-clastus JTB-271 sur le milieu de culture et on bouche hermétiquement la fiole avec un bouchon équipé d'un robinet et on réduit ensuite la pres-35 sion dans la fiole jusqu'à environ 150 mm de mercure au-dessous de la pression atmosphérique. On introduit dans la fiole sous pression réduite un mélange d'hydrocarbures inférieurs (C_H 2 %, C„H '3 %, C H 45 %, L O J D HO C^H^q 5 %, 45 % en vol.) obtenus comme sous-produits dans la pro 14098 7 2007713 duction de l'éthylène par craquage de l'essence lourde jusqu'à ce que la pression dans la fiole devienne égale à celle de l'atmosphère. On a besoin d'environ 250 mg du mélange d'hydrocarbures inférieurs. Ensuite on cultive le tout par un procédé classique en secouant la cul-5 ture. Pendant la culture, on ouvre de temps à autre le robinet pour introduire de l'air et par conséquent de l'oxygène dans la fiole. On obtient ainsi 175 mg du microrganisme desséché. COMPOSITION DU MILIEU DE CULTURE 10 NaN03 k2hp°4 MgS04.7H20 12 g 2,5 g 1 g 15 PH 1 litre 7,0 - 7,4 14098 8 2007713 REVENDICATION Procédé de production de cellules d'un microrganisme carac-5 térisé en ce qu'on cultive en présence d'air un microrganisme assimilant les hydrocarbures à savon', le Corynebactérium hydrocarboclastué JTB-271, dans un milieu de culture contenant comme principale source de carbone des hydrocarbures inférieurs acycliques avec 2 à 5 atomes de carbone.