Brevet FR2000651A1 — publié le 19690912

."S 69 01219 1 2000651 La présente invention concerne un procédé par fermentation pour la préparation d'acide a-cétoglutarique, consistant à inoculer un milieu de culture contenant un hydrocarbure comme principale source de carbone avec une levure 5 du genre Candida ou Saccharomyces capable d'assimiler l'hydrocarbure et de produire de l'acide a-cétoglutarique à partir de l'hydrocarbure assimilé, et à cultiver par voie aérobie le milieu inoculé de manière à produire l'acide a-cétoglutarique. Un objet de l'invention est un procédé pour la production 10 d'acide a-cétoglutarique avec un rendement élevé, utilisant comme principale source de carbone un hydrocarbure disponible dans le commerce à un prix modique. On a déjà indiqué un procédé de fermentation pour la production d'acide L-glutamique et d'acide a-cétogluta-15 rique dans un milieu de culture contenant un hydrocarbure comme principale source de carbone avec une souche de bactéries (brevet français n° 1.447.541 ou brevet anglais n" I.O85.923). Mais la vitesse de fermentation et le rendement en acide a-cétoglutarique dans le milieu à base d'hydrocarbures des pro-20 cédés ci-dessus sont considérablement inférieurs à ceux obtenus dans un milieu à base de sucre. En raison de ce qui précède, la demanderesse a étudié un procédé de fermentation pour la production d'acide a-cétoglutarique en grandes quantités dans un milieu de culture 25 contenant un hydrocarbure comme principale source de carbone. La demanderesse a découvert selon l'invention que certaines levures appartenant aux genres Candida et Saccharomyces sont capables de produire de l'acide a-cétoglutarique dans un milieu de culture qui contient des hydrocarbures ou des mélanges bruts 30 d'hydrocarbures comme principale source de carbone assimilable. Les levures appropriées pour l'utilisation selon l'invention sont des souches du genre Candida ou Saccharomyces capbles d'assimiler l'hydrocarbure et de produire de l'acide a-cétoglutarique à partir de l'hydrocarbure 35 assimilé, par exemple : Candida lipolytica AJ4541 (ATCC I6617), AJ4548 (ATCC 16618), Candida cloacae AJ4719 (ATCC 20184), Candida tropicalis AJ4468 (IF0 0006) et Saccharomyces lactis AJ4070 (ATCC 20185). 69 01219 2 2000651 Les milieux appropriés pour le procédé de l'invention peuvent être des milieux synthétiques et des milieux naturels, comportant un hydrocarbure comme principale source de carbone et contenant également d'autres constituants classi-5 ques, par exemple une source d'azote, des substances minérales et de faibles quantités de substances organiques de croissance. On utilise comme principale source de carbone une seule n-paraffine ou un mélange de plusieurs de ces n-paraffines ou bien tous les hydrocarbures contenant des n-paraffines, avan-10 tageusement une n-paraffine ou un mélange de n-paraffines en C10"C20- A titre d'exemple de sources d'azote appropriées, on peut citer les sels d'ammonium tels que sulfate, nitrate, chlorure, phosphate et carbonate ou l'urée. On augmente la vitesse de fermentation et le 15 rendement en acide a-cétoglutarique en ajoutant au milieu de culture des traces d'ions métalliques, de vitamines, d'amino-acides et de produits naturels contenant ces substances tels que liqueur de trempage de maîs, peptone, extrait de malte et Aji-eki (hydrolysat de soja). En particulier, la présence de 20 0,5 à 100 y/1, de préférence de 1 à 10 y/1 de vitamine B-^ et de 0,0005 à 0,5& de préférence, de 0,001 à 0,02# d'ions Fe++ (sous forme de FeSO^,7Hg0) augmente de manière remarquable le rendement en acide a-cétoglutarique dans le procédé de fermentation. Et la présence de 1000 ppm ou moins, avantageusement 25 de 1 à 100 ppm d'ions Zn++ et/ou de 100 ppm ou moins, avantageusement de 0,01 à 10 ppm d'ions Cu++ augmente encore le rendement. Expérience n° 1 - On verse dans des flacons secoueurs de 500 ml 30 des échantillons de 20 ml du milieu à pH 5,5 contenant 8# d'un mélange équivalent de n-paraffines en C12~Cyj, 0,2# de KHpPO^, 0,1# de MgS0^,7H20, 0,02# de FeS04,7H20, 2# de NH^NO^, 2# de CaCO^ et les quantités de vitamine B-^ Indiquées dans le tableau I ci-après (NH^NO^, CaCO^ et les n-paraffines sont 35 stérilisées séparément) et on stérilise. On inocule chaque fiole avec Candida lipolytica AJ4548 (ATCC 16618) qui a été cultivée au préalable pendant 48 heures sur la même tranche de gélose qu'indiquée dans l'exemple 1 ci-après et on cultive par'voie aérobie avec agitation à 31°C pendant 3 jours. 69 01219 3 2000651 La vitesse de croissance des levures et le rendement en a-cétoglutarique dans le bouillon de culture sont indiqués dans le tableau I ci-dessous. 5 TABLEAU I Quantité de vitamine B1, y/1 0 1 *Z > 5 10 100 1000 Croissance,D îf 0,08 0,30 0,68 0,75 0,90 1,22 1,32 A a C G, g/dl - 2,33 4,05 3,28 2,16 0,83 0,42 s D : Densité optique,à 562 m/u,du milieu de culture 15 dilué 26 fois. ' Expérience n° 2 - On effectue la fermentation en suivant exactement le même procédé qu'indiqué dans l'exemple 1 ci-après sauf 20 que l'on remplace les 0,02# de FeS0]|,7H20 et les quantités de vitamine B1 indiquées dans le tableau I par les quantités de FeS0^,7H20 indiquées dans le tableau II ci-après et 3 y/1 de vitamine B^. Les résultats obtenus sont indiqués dans le 25 tableau II ci-dessous. TABLEAU II 30 Quantités de FeS0it,7H„0, # *r 0 0,0005 0,001 0,01 0,02 0,05 0,10 Croissance, D 0,10 0,51 0,63 0,65 0,63 0,63 0,68 k a C G, g/dl 0 1,22 3,12 4,05 3,92 2,35 2,28 35 En outre, on augmente le rendement"en acide a-cétoglutarique dans ce procédé de fermentation en ajoutant au milieu de culture des agents tensioactifs ou des acides gras. 69 01219 1 2000651 On maintient le milieu à un pH faiblement acide. Comme la concentration en ion hydrogène dans le bouillon de fermentation augmente pendant la fermentation à cause de l'accumulation d'acides organiques, on peut ajouter des agents 5 neutralisants tels que carbonate de calcium, ammoniaque et soude pour maintenir un pH optimum. De grandes quantités d'acide a-cétoglutarique et une faible quantité d'acide L-glutmique sont généralement accumulées dans le bouillon de fermentation. 10 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On verse des échantillons de 20 ml du milieu à pH 5,5 contenant 8# d'un mélange équivalent de n-paraffines 15 en C12-C17, 0,5# de KH2P0^, 0,1# de MgS0^,7H20, 0,02# de FeS0^,7H2O, 0,002# de MnS0^,4H20, 1,0# de (NH^SO^, 1,0# de NH^NO^, 0,3 ml/dl d'Aji-eki (nom de marque d'un hydrolysat de soja fabriqué par la demanderesse st 2# de CaCO^ (le sulfate et le nitrate d'ammonium, les n-paraffines et le 20 carbonate de calcium sont stérilisés séparément) dans des flacons secoueurs de 500 ml et on stérilise. On inocule chaque flacon avec chaque souche des micro-organismes indiqués dans le tableau III ci-dessous, qui ont été cultivés préalablement sur la tranche de gélose ci-dessous mentionnée pendant 48 25 heures et on cultive en conditions aérobies avec agitation pendant 3 jours à 31»5°C. Tranche de gélose : On prépare un milieu ajusté à pH 7,4 par la potasse et contenant 0,1# de NH^NOy 0,02# de MgS04,7H20, 0,15# de Ki^PO^, 0,35# de Na^PO^, 12H20, 30 0,001# de CaCl2, 0,0005# de FeS0^,7H20, 2,0# de gélose et de l'eau du robinet. On plonge ensuite dans le tube à essai contenant le milieu ci-dessus mentionné un disque de pâte qui a été plongé dans un mélange équivalent de n-paraffines en Cu-Ci6 comme source de carbone. 35 Les quantités d'acide a-cétoglutarique ou L- glutamique accumulées dans le Lcuillon de fermentation sont indiquées respectivement dans le tableau III ci-dessous. Après séparation des cellules microbiennes par centrifugation, on BAD ORIGINAL 69 01219 5 2000651 soumet le filtrat du bouillon de culture à un traitement d'adsorption et désorption avec une résine échangeuse d'ion de manière classique et on obtient ainsi les cristaux d'acide a-cétoglutarique comme indiqué au tableau III ci-dessous. 5 TABLEAU III 10 15 Micro-organisme""--^ Acide a-cétoglutarique Acide L-glutamique accumulé (g/dl) obtenu (g/dl) accumulé (g/dl) Candida lipolytica AJ4541 (ATCC16617) 4,50 3,00 0,15 Candida cloacae AJ4541 (ATCC 20184) 1*35 0,88 0,08 Candida tropicalis AJ4468 (IF0 0006) 4,10 2,80 0,18 Candida lipolytica AJ4548 (ATCC 16618) 4,82 3,18 0,05 Saccharomyces lactis AJ4070 (ATCC 20185) 1,20 0,80 0,02 20 Exemple 2 On met en oeuvre la fermentation exactement de .la même manière que dans l'exemple 1 sauf qu'on utilise 8% d'un mélange équivalent de n-paraffines en 2# de NH^NO^ et 0,02% de liqueur de trempage de maïs au lieu d'un mélange 25 équivalent de n-paraffines en comme source de carbone, du sulfate et du nitrate d'ammonium comme source d'azote et de l'Aji-eki dans le milieu de l'exemple 1. Les quantités d'acide a-cétoglutarique et L-glutamique accumulées dans le bouillon de fermentation de 30 Candida tropicalis AJ4468 (IFO 0006) ou Candida lipolytica AJ4548 (ATCC 16618) sont indiquées dans le tableau IV ci-dessous. TABLEAU IV Micro-organisme Acide a-cétoglutarique (g/dl) Acide L-glutamique (g/dl) Cand. tropicalis AJ4468 Cand. lipolytica AJ4548 3,05 5,13 0,13 0,16 [ 69 01219 6 2000651 Exemple 3 On verse dans des flacons seeoueurs de 500 ml et on stérilise des échantillons de 20 ml du milieu.de base à pH 6,0 contenant 8# d'un mélange de n-paraffines du commerce (Ci;L : trace, Cl2 : 7#, C^ : 24#, : 19$, : 39#, 5 Cl6 : 8#, : 1# et C^g-Cgo : trace), 2# de NH^NO^, 0,2# de KH2P0^, 0,1# de MgS0v7H20, 0,02# de FeS0^,7H20, 0,02# de liqueur de trempage de mais et 2# de CaCO^ (le mélange de n-paraffines, le nitrate d'ammonium et le carbonate de calcium sont stérilisés séparément) et du milieu enrichi à pH 6,0 10 obtenu par addition de 10 ppm de Zn++ au milieu de base. On inocule chaque flacon avec chaque souche de micro-organismes indiqués dans le tableau III ci-dessus, préalablement cultivés sur la même tranche de gélose qu'indiqué à l'exemple 1 pendant 48 heures et on cultive en milieu aérobie avec agitation pen-15 dant 3 jours à 31,5°C. Les résultats sont indiqués dans le tableau V ci-dessous. On récupère du bouillon de culture des cristaux d'acide a-cé-toglutarique par le même procédé que décrit à l'exemple 1. TABLEAU V 20 25 30 micro-organisme pas de Zn++ 10 ppm de Zn++ A a C G accumulé, g/dl L—G.A. accumul4 g/dl A a C G accumulé g/dl A a C G obtenu, S/dl L-G.A. accumulé, g/dl Cand. lipolytica AJ4541 4,20 0,12 5,25 3,53 0,15 Cand. cloacae AJ4719 1,12 0,08 2,20 1,50 0,13 Cand. tropicalis AJ4468 3,63 0,16 4,20 2,80 0,21 Cand. lipolytica AJ4548 4,66 0,05 5,52 3,85 0,09 Sacch. lactis AJ4070 1,20 0,02 1,82 1,32 0,05 69 01219 7 2000651 Exemple 4 On met en oeuvre la fermentation exactement par le même procédé que dans l'exemple 3 sauf que l'on utilise _L J 3 y/1 de vitamine B-j_ et 1 ppm de Cu au lieu de liqueur de trempage de mais et d'iorEZn++ dans le milieu de l'exemple 3-5 Les résultats sont indiqués dans le tableau VI ci-dessous. TABLEAU VI ^icro-org^ — A a C G accumulé,g/dl pas de Cu++ 1 ppm de Cu++ Cand. lipolytica AJ4541 3,82 5,15 Cand. cloacae AJ4J19 0,93 1,83 Cand. tropicalis AJ4468 2,35 3,02 Cand. lipolytica AJ4548 4,68 5,63 Sacch. lactis AJ4070 1,02 1,92 Exemple 5 On prépare un milieu de base C contenant 2# de NH^NO-j, 1# de (NH^gSO^/ 0,2# de KHgPO^, 0,1# de MgS0^,TH20, 0,005# de FeSO^jYHgO, 0,5 ml/dl d'une solution d'hydrolysat 20 de protéine végétale, 2# de CaCO^et 8# d'un mélange de n-paraffines en O^Q-CpQ et des milieux enrichis A et B par addition de * • +4" i -i-„L 5 ppm d ionsZn et 0,5 ppm d- ion Cu respectivement au milieu de base et on stérilise ces milieux. On inocule des échantillons de 20 ml de chaque 25 type de milieu avec Candida lipolytica AJ4548 (ATCC 16618) et on cultive en conditions aérobies par le même procédé que dans l'exemple 3. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau VII ci-dessous. 69 01219 s 2000651 TABLEAU VII n-paraffine Acide a-cétoglutarique accumulé g/dl pas de Cu++ ni Zn++ 5ppm de Zn++ 0,5ppm de Cu++ C 10 3,80 4,56 4,32 C 11 3,95 4,42 4,25 C 12 3,98 4,62 4,53 c 13 4,28 4,83 4,75 C 14 4,36 4,82 4,69 c 15 4,32 4,98 4,88 c 16 4,42 5,31 5,09 c 17 4,53 5,42 5,30 c 18 4,50 5,51 5,50 c 19 4,59 5,49 5,30 C 20 3,10 4,32 4,40 Exemple 6 On prépare dans des flacons seeoueurs et on stérilise des échantillons de 20 ml du milieu de hase contenant 20 8# d'un mélange équivalent de n-paraffines en C-^g-C-j^, 2# de NH^NO^, 0,2# de KHgPO^, 0,1# de MgS0^7H20, 0,02# de PeS0^,7H20, 0,02# de liqueur de trempage de mais et 2# de CaCO^ et du milieu enrichi par addition d'un mélange de 5 ppm i i i de Zn et 0,5 ppm de Cu au milieu de base. On inocule chaque 25 flacon avec Candida lipolytica AJ4541 (ATCC 16617) et on cultive suivant le même procédé qu'indiqué dans l'exemple 3. Les quantités d'acide a-cétoglutarique accumulées dans le bouillon de fermentation sont indiquées dans le tableau VIII ci-dessous. 30 TABLEAU VIII 35 Milieu A a C G, g/dl j e~7 ^ • /-1 pas de Zn ni Cu 4,43 5 ppm de Zn++ et 0,5 ppm de Cu++ 5,42 69 01219 9 2000651 r_E_Y_5_N_D_X_Ç_A_T_I_P_W_S 1 - Un procédé de fermentation pour la production d'acide a-cétoglutarique, consistant à inoculer un milieu de culture contenant un hydrocarbure comme principale source de carbone avec une souche du genre Candida ou Saccharomyces 5 capable d'assimiler l'hydrocarbure et de produire de l'acide a-cétoglutarique à partir de l'hydrocarbure assimilé, et à cultiver en conditions aérobies le milieu inoculé, de manière à produire l'acide a-cétoglutarique. 2 - Un procédé selon la revendication 1 dans lequel 10 l'hydrocarbure contient 1 ou plusieurs n-paraffines en C-^q-C^. 3 - Un procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute des traces de vitamine B-,, et d'ion Fe++, Zn++ ou Cu audit milieu pour augmenter le f-endement en acide a-cétoglutarique . 15 ^ - Un procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite souche est Candida lipolytica AJ4541 (ATCC 16617), AJ4548 (ATCC 16618), Candida cloacae AJ4719 (ATCC 20184), Candida tropicalis AJ4468 (IFO 0006) ou Saccharomyces lactis AJ4070 (ATCC 20185).