Brevet FR2007288A1 — publié le 19700102

" 13S0" 1 2007288 Les anticorps de la mononucléose infectieuse humaine sont hétérophiles, c'est-à-dire qu'ils réagissent avec des antigènes ne provoquant pas leur formation. Par exemple, on sait que les anticorps de la mononucléose infectieuse humaine agglutinent les 5 érythrocytes de mouton ou de cheval et ceux de boeuf qui ont subi un traitement spécial. Certains réactifs pour le diagnostic de la mononucléose infectieuse disponibles dans le commerce sont basés sur cette réaction. Toutefois^ l'agglutination des érythroeyfces de mouton et de cheval n'est pas spécifique des. anticorps à® la 10 mononucléose infectieuse et elle a lien également avec les enti~ corps de Fôrseraan et pour cette raison, 1'identification d Ce problème est à présent résolu gre.ee à l^absorption 15 différentielle du sérum à examinsro Par exemple,, on sait qu'après la mononucléose infectieuse, le sévim qui a ©té absorbé par uno suspension de cellules de rein â® sotejr@j agglutine ©aeor© les érythrocytes de cheval. D'autr© part, après absorption par âu s trama d'érythrocyte de boeuf., 1© sérum n'agglutin© les érytîaro- ' 20 sytQS de cheval que dans environ 30$ des eas après la MonoaueléosG - infectieuse. Environ 10# ssuies&eat des sérums aoïmas ou soatenaat des anticorps de Forseman pr&voquent l'agglutination d®s érjtlxr©^ eytos d« cheval après absorption par un® suspension d® eellulas de rein de cobaye ou de sfcroiaa d'érytliroeyt® û® boeuf, et 7 su? 25 10 'le ces sérums font preure -;Pagglutination plus précoce ©t/ou plus forte après absorption par du stroma d'érythroeyfc® d© boeuf qu'après absorption par un© suspension de cellules de rein »fi© cobaye» Las 3 sérums restants ne provoquent l'agglutination qu'après absorption par du stroma d'érythrocyt© de boeufQ 30 Ainsi, lors.de l'exécution des essais les plus courants qui sont actuellement disponibles, le sérum à examiner est combiner, sur une demi-lame porte-objet"de microscopie, à une. suspension de cellules de reins de cobaye et sur une autre demi-lame2 il est combiné à du stroma d'érythrocyte de boeuf. Des érythrocytes de 35 cheval sont ajoutés et si après 1 minute le sérum provoque l'agglutination plus vite et plus fort sur la lame portant la suspension de cellules de reins de cobaye que sur la lame contenant le stroma d^éiythrocyte de boeuf, l'essai est considéré comme positif. Cet essai est "l'essai à la touche" bien connu des docteurs Davidsohn 40 et Lee. BAD ORIGNAL 69 13509 ' 2007288 L'essai décrit ei-dessus est plias spécifique, et par conséquent plus précis, quand on utilise des érythrocytes d# cheval qui n'ont pas été formolés. Toutefois, ces érythrocytes non formolés ne sont stables que pendant un temps limité et par conséquent, la 5 durée de conservation du réactif n'est que de 3 mois. La Demanderesse a mis au point à présent, un.es^ai dsagglutina ti on direct pour la mononucléose infacUeuse, Etant donné que cet essai est direct, il ne recourt pas à--une.-multitude de réactifs et de procédés compliqués et longs. V-ssactitrasks de cet 10 essai est -équivalente à celle des essais déjà connus pour"la aono-2iricl!©se infectieuse et la durée de conservatian du réactif est illîzai tée» Comme les essais antérieurs ds c® type, lPessai suivant I5iiW@atioB est basé sur 1 *agglutinati«:-n à© !■'anticorps de la morm~ 1Ç> uusléose infectieuse humaine par un antigène hêtérophiles mais l5antigèn« est isolé d'une part des autres antigènes qui provoquât 19agglutination des anticorps dans le sérum humain et d'autre -•art des érythrocytes qui le transportai en te L'utilisation de l'an-tigène hétéropMle seul plutôt que des érythrocytes le contenant 80 permet d'éviter l'agglutination non spécifique possible des anti-c-'ï'ps de.Forsemaa avec d5autres antigènes hétérophiles présents &ans ces érythrocytes. Ceci à aon tour permet d9éviter un essai clr'absorption différentielle du sérum à l'aide d'une suspension de " cellules. de rein de cobaye et de stroma d9érythrocyte de boeuf» ;B En. outres puisque le réactif contient 1»antigène sous forme isolés du reste des érythrocytes, sa durée de conservation est illimitée. Le réactif de base de 1* essai est une suspension de stroma à l'état finement divisé du seul antigène hétér-ophilê actif préle-30 vê sur des érythrocytes de cheval ou de boeuf.. L;antigàn Sous sa forme préférée, le réactif comprend aussi environ 0j25 à 0,75# en volume d'une résine synthétique à l'état de latex 35 enrobée de sérum animal ou humain. La résine enrobée de sérum permet l'identification visuelle de l'agglutination sans l'accélérer ou la favoriser sensiblement. Ce réactif peut comprendre en outre environ 1 à 2% en volume d'albumine de sérum de boeuf, ou autre, pour augmenter sa constante diélectrique jusqu'à une valeur 4.0 à laquelle l'agglutination est plus rapide. BAD ORIGINAL 69 13509 3 2007288 Lors de l'exécution de l'essai, on dépose deux gouttes du réactif sur une lame porte-objet de microscopie avec une goutte de sérum du patient. Après mélange et étalement sur la lame, on relève la présence ou l'absence d'agglutination. Cet essai s'exécute en 5 environ 2 minutes. A. Préparation et isolement du stroma antigéniaue. 1. Préparation du milieu de mise en suspension et procédé de collecte des erythrocytes. Avant de procéder à la collecte des érythrocytes, on doit 10 préparer un milieu de mise en suspension approprié, constitué par exemple par : Dextrose anhydre, pharmacopée américaine 20,5 g Citrate trisodique 8,0 Chlorure de sodium 4,2 15 Acide citrique 0,55 Sulfate de néomycine 0,10 Chloromycétine 0,33 Eau distillée, pour faire 1 litre . On doit maintenir le pH de ce milieu à une valeur d'environ 6,1'à 20 6,2 par un tampon. Sa conductance spécifique doit être au minimum de de 6,39 x 10"^ mohs à voie température de 0 à 1°C. Si le milieu doit être stocké avant son utilisation, on doit le maintenir à une température de 4 à 6°C. Bien qu'on préfère utiliser des érythrocytes de cheval, et . 25 spécialement comme décrit ci-après, on peut aussi recourir à des érythrocytes de boeuf. Les procédés de collecte des érythrocytés sont bien connus des spécialistes. Suivant un procédé approprié à cette fin, on introduit dans un flacon, un volume du milieu de mise en suspension égal à celui qu'occuperont les érythrocytes. De 30 manière aseptique, on prélève du sang à un cheval en bonne santé par saignée au niveau de l'encolure dont la peau a été rasée, et on le recueille dans le flacon. On y introduit un volume égal d'agent anti-coagulant. On transfère le sang dans des tubes de cen-trifugation et on le centrifuge à 4°C pendant 25 minutes à une 35 vitesse de 1700 tours/minute. On sépare le plasma surnageant par siphonage et on le remplace par ion volume égal de milieu de mise en suspension. On centrifuge tout le mélange deux fois encore pour en isoler les érythrocytes. On introduit ceux-ci dans un flacon contenant le milieu de mise en suspension des érythrocytes de che-40 val de façon à obtenir une suspension d'une concentration de 20$ 69 13509 1 2007283 en volume et on mélange doucement le tout pendant 15 minutes. Le procédé de collecte et de traitement des érythrocytes de cheval décrit ci-dessus ne fait pas l'objet de la présente invention et ces techniques sont bien connues des spécialistes. L'in-5 vention n'est donc pas limitée par ce procédé de collecte et tout procédé acceptable connu peut convenir à cette fin. 2. Isolement de l'antigène hétérophile Le procédé d'isolement de l'antigène actif de l'invention comprend un traitement bien déterminé des érythrocytes au moyen 10 d'ultrasons dans un milieu de mise en suspension. Dans ce procédé, il n'y a pas de concentration critique en érythrocytes dans le milieu, mais on préfère une concentration de 17 à 23% en volume. La concentration en érythrocytes se détermine à l'aide d'un tube d'hé-matocritie de Wintrobe et de techniques bien connues. De préférence, 15 on soumet les érythrocytes en suspension à un traitement aux ultrasons avec une quantité d'énergie d'environ 6,0 à 15,0 watts.secondes/cm^ et à une fréquence 15 à 25 kilocycles. Il est important lors de l'exécution de l'essai décrit ci-après, que le stroma antigénique soit à l'état finement divi-20 sé. Si la quantité d'énergie appliquée est très supérieure à environ 15 watts, secondes/cm^, les fragments de stroma antigénique seront à l'état granulaire plutôt qu'à l'état finement divisé. Lors de l'exécution de l'essai, un stroma antigénique à l'état granulaire rend les résultats extrêmement difficiles à interpréter. En ou-25 tre, avec des quantités d'énergie plus élevées, d'autres antigènes, comme l'antigène de Forseman, peuvent se détacher de l'érythrocyte. Si la quantité d'énergie est excessivement élevée, l'érythrocyte lui-même se détruit. Si la quantité d'énergie est inférieure à environ 6,0 watts, secondes/cm^, la quantité d'antigène est, dans le 30 meilleur des cas, très faible et le procédé n'est pas rentable. Pour les mêmes raisons, le traitement aux ultrasons se fait de préférence à 15 à 25 kilocycles. De préférence, on utilise un appareil à ultrasons Bronson à large sonde avec des volumes de 300 ml de suspension d'érythrocy-35 tes de cheval. Sous une puissance de 125 watts, et à une fréquence de' 20 kilocycles, on voit qu'en 5 à 10 secondes, les fragments de stroma contenant l'antigène hétérophile actif ne se détachent pas de l'érythrocyte. Si on poursuit le traitement aux ultrasons pendant environ 15 secondes, les fragments commencent à se détacher, mais 40 la quantité obtenue reste très faible. On obtient la quantité opti- • . ~ COPV 69 13509 ' 5 2007288 . malé de fragments de stroma contenant l'antigène hétérophile actif quand on exécute le traitement aux ultrasons pendant environ 30 secondes. Si on poursuit le traitement pendant un temps plus long, par exemple environ 35 secondes, les fragments de stroma antigéni-5 ques continuent à se détacher, mais ils sont alors sous forme granulaire plus grande, ce qui conduit à une agglutination non'spécifique sur la lame lors de l'utilisation du réactif. Si le traitement dure jusqu'à 45 secondes, tous les fragments de stroma antigénique sont granulaires.. 10 On sépare ensuite l'antigène hétérophile du milieu de mise en suspension et du reste des érythrocytes. On peut exécuter cette opération par centrifugation du milieu qui a subi le traitement aux ulstrasons et ensuite par précipitation de l'antigène du liquide surnageant. On utilise de préférence du méthanol pour précipiter 15 l'antigène, bien que de nombreux autres produits convenant aussi bien soient connus des spécialistes et que le choix du précipitant n'entre pas dans le cadre de l'invention. Quand on utilise du méthanol, de l'antigène précipite quelle que soit la teneur en méthanol du milieu.Cependant, du point de vue strictement commercial, ii 20 est nécessaire de précipiter l'antigène en quantité maximum et on a ainsi trouvé que le méthanol doit être présent en une quantité d'au moins environ 5QJ6" en volume. Si la teneur en méthanol est très inférieure à environ 30% en volume, la précipitation de la fraction active n'est que partielle. Par exemple, on peut centri^ 25 fuger le milieu ayant subi le traitement aux ultrasons à une vitesse de 6500 "tours-/ minute pendant environ 1 heure à 5°C. On maintient le liquide .surnageant à une température de 4 à 6°C, on le refroidit ensuite à -5°C et on y ajoute alors ion volume égal de méthanol à 100^. Après agitation pendant 15 minutes, on centrifuge 30 le système à 6500 tours/minute à une température de -5°C pendant 1 heure encore. On sépare le liquide surnageant par siphonage et on remet le précipité, c'est-à-dire l'hémoglobine et l'antigène actif, en suspension dans 750 ml d'une solution physiologique. On repète ce procédé trois fois et on concentre alors la solution 35 physiologique contenant l'antigène jusqu'à 350 ml. On répèté"encore deux fois les opérations de centrifugation (à 6500 tours/minute pendant-30 minutes à une température de 5°C) et de siphonage. On me.t la fraction sédimentée de la dernière centrifugation en suspension 69 13509 6 2007288- d'ans 375 ml d'une solution physiologique et on chauffe le mélange à 56°C pendant 30 minutes. On centrifuge à nouveau et.on met le sédiment en suspension dans un tampon au borate à un pH de 8,6. Cette suspension finale de l'antigène, dans 375 ml du tampon au 5 borate à un pH de 8,6 est stockée à une température-de 4 à. 6°C jusqu'à utilisation. , B. Le Réactif 1. Antigène Comme on l'a signalé précédemment, le réactif consiste 10 en une suspension de fragments finement divisés du seul antigène hétérophile actif. Pour interpréter facilement l'essai faisant intervenir le réactif, il est nécessaire que la concentration de l'antigène hétérophile actif y soit relativement élevée. Ainsi, l'antigène actif doit être présent en une quantité d'au moins en-15 viron 1,0 à 1,5# en volume. Si il y a beaucoup moins d'antigène, l'essai "rate" dans le cas de sérum à mononucléose infectieuse légère. 2. Particules de résine Si l'essai est basé sur un réactif qui ne consiste qu'en 20 une suspension de l'antigène hétérophile actif isolé, les résul-' tats sont extrêmement difficiles à interpréter. Par conséquent, il est important d'incorporer au réactif un corps étranger quelconque qui n'accélère pas ou ne retarde pas significativement l'agglutination et qui n'est visible qu'après l'agglutination. On peut 25 utiliser toute substance appropriée ayant ces propriétés, mais on a découvert que des particules de résine à l'état de latex enrobées de sérum conviennent particulièrement bien. Ajoutées en faible quantité à la suspension, ces particules ne sont pas identifiables visuellement. Après l'agglutination qui provoqua l'ac cumul ta tioii 30 d'un nombre considérable de particules de résine en un certain point, celles-ci deviennent facilement identifiables et par conséquent l'essai peut s'interpréter facilement. Lorsqu'on utilise des particules de résine à l'état de latex celles-ci ont de préférence un diamètre .d'environ 0,20 à 0,80 micron et au mieux peu supérieur à 35 0,30 micron. Les particules de résine non enrobées ont tendance à adsorber des substances à leur surface et ainsi à provoquer parfois une réticulation ou une agglutination non spécifique, et 13509 7 2007288 c'est pour cette raison que l'on introduit dans le réactif du sérum humain ou animal afin d'enrober les particules de résine. Cependant, les particules de résine à l'état de latex enrobées de sérum rendent l'essai difficile à interpréter quand elles sont 5 présentes en une quantité beaucoup supérieure à environ 0,75# en volume. Par conséquent, si on tient compte de tous ces facteurs, on préfère que les particules de résine à l'état de latex soient présente en une quantité d'environ 0,25 à 0,75# en volume. 10 Comme on peut le voir d'après la discussion ci-dessus, la quantité de sérum humain utilisée est directement reliée à la quantité de résine présente et aussi à la granulométrie de ces particules de résine. Par conséquent, s'il est important de connaître la quantité de sérum à incorporer, il n'est pas possible d'en préciser 15 exactement la quantité requise, si ce n'est de façon indirecte, c'est-à-dire par l'estimation de la quantité suffisante de sérum pour enrober sensiblement la plupart des particules de résine. Par exemple lorsqu'on utilise des particules de résine à l'état de latex d'ùne granulométrie d'environ 0,22 micron en une quantité 20 d'environ 0,5# en volume, on doit incorporer le sérum en une quantité d'environ 10 à 15# en volume. On peut utiliser par exemple des particules d'un latex Dow ayant un diamètre de 0,22 micron. On centrifuge une suspension à 50# de particules pendant 1 heure à 16.000 tours/minute à-une 25 température de 5°C. On remet les particules en suspension dans un tampon au borate d'un pH de 8,6 et on centrifuge à nouveau la suspension, comme indiqué précédemment. On remet encore une fois les particules en suspension dans du tampon au borate, à raison de 4# en volume et on les stocke à une température de 4. à 6°C jusqu'à 30 ce qu'on les ajoute au réactif. Au moment de la préparation du réactif, on ajoute 125 ml de cette suspension de résine à 4# à 125 ml de sérum inactivé et on agite le mélange doucement pendant 1 heure. 3. Ajustement de la constante diélectrique 35 Si on se base sur un réactif ne consistant qu'en anti gène hétérophile actif et en particules de résine enrobées de sérum pour le diagnostic de la mononucléose infectieuse, l'agglutination est faible et/ou lente et l'essai est donc difficile à • interpréter. Ceci est dû.au fait que le réactif n'est pas favo-40 rable à l'agglutination à cause de sa constante diélectrique re 69 13509 s 2007288 lativement faible. On préfère donc augmenter la constante diélectrique du réactif par addition d'une substance protéique, comme un acide aminé ou une albumine de sérum humain ou bovin. L'addition d'une quantité excessive d'un tel agent provoque cepen-5 dant une agglutination non spécifique. Par exemple, l'albumine de sérum bovin doit être ajoutée au réactif en une quantité d'environ 1 à 2% en volume. Lors de la préparation du réactif, on ajoute d'une manière appropriée 250 ml d'une solution physiologique à 6% d'albumine de sérum bovin à 250 ml d'une suspension de parti-10 cules de résine enrobées de sérum dans un tampon au borate et on agite le mélange doucement pendant 1 heure. On ajoute ce mélange à 500 ml d'une suspension de l'antigène hétérophile dans un tampon au borate et on agite encore ce mélange final pendant 1 heure. C. Exécution de l'essai 15 Suivant un procédé d'exécution de l'essai, on dépose sur une lame noire une goutte de sérum à examiner et deux gouttes du réactif. On mélange convenablement le sérum au réactif et on étale la préparation sur la lame. Après environ 2 minutes, on relève l'absence ou la présence d'agglutination. L'agglutination 20 indique la présence des anticorps de la mononucléose infectieuse et son absence celle des anticorps. Cet essai répété sur du sérum contenant des anticorps de Forseman et sur du sérum normal ne doit pas donner d'agglutination avec le réactif de la présente invention et il en est effectivement ainsi. On relève une agglutina-25 tion de 4+ avec du sérum à haute teneur en anticorps de la mononucléose infectieuse. 69 13509 9 2007288 REVENDICATIONS. 1 - Procédé d'isolement de l'antigène hétérophile de la mononucléose infectieuse d'érythrocytes, caractérisé en ce qu'ai soumet aux ultrasons des érythrocytes dans un milieu de mise en suspension, on centrifuge ensuite ce milieu et on précipite l^an- 5 tlgène du liquide surnageant. 2 - Procédé d'isolement de l'antigène hétérophile de la mononucléose infectieuse d'érythrocytes de cheval et de boeuf, caractérisé en ce qu'on soumet ces érythrocytes dans un milieu de mise en suspension à un traitement aux ultrasons avec une quantité 10 d'énergie d'environ 6,0 à 15,0 watts:secondes/cm^ et à une fréquence d'environ 15 à 25 kilocycles, on centrifuge ensuite ce milieu et on précipite l'antigène hétérophile actif du liquide surnageant. 3 - Réactif pour essai de diagnostic de la mono- - 15 nucléose infectieuse, caractérisé en ce qu'il comprend l'antigène hétérophile actif d'érythrocytes de cheval ou de boeuf, cet antigène étant présent dans un milieu de mise en suspension en l'àbsen» ce d'autres antigènes hétérophiles à l'égard d'autres anticorps du sérum humain et en l'absence des érythrocytes ayant transporté 20 l'antigène hétérophile. 4 - Réactif suivant la revendication 3* caractérisé en ce què l'antigène a été isolé d'une suspension d'érythrocytes de cheval ou de boeuf par traitement aux ultrasons avec une quantité d'énergie d'environ 6,0 à 15 watts:secondes/cm^9 par centri» 25 fugation de ce milieu et par précipitation de l'antigène du liquide surnageant. 5 - Réactif pour essai de diagnostic de la mononucléose infectieuse, caractérisé en ce qu'il comprend une suspension de stroma à l'état finement divisé du seul antigène hété- 30 rophile actif d'érythrocytes de cheval ou de boeuf et environ 0,25 à 0,75% en volume d'une résine synthétique à l'état de latex enrobée de sérum humain ou animal, les particules de résine permettant l'identification physique de l'agglutination et étant enrobées du sérum pour qu'elles ne puissent favoriser sensiblement 35 l'agglutination. 6 - Réactif suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le sérum est présent en une quantité d'environ 10 à 15% en volume et l'antigène est présent en une quantité d'au moins environ 1,5# en volume. 40 7 - Réactif suivant la revendication 6, caractérisé 13509 10 2007288 en ce qu'il comprend aussi environ 1 à Zfj en volume d'albumine de boeuf. 8 - Diagnostic de la mononucléose infectieuse, caractérisé en ce qu'on mélange le réactif suivant la revendication 3 à du sérum humain et on relève la préesnco ou l'absence d'agglutination.