Brevet FR2005645A1 — publié le 19691212

La présente invention concerne la préparation d'un enzyme et plus spécialement la préparation d'un enzyme obtenu à partir d'enzymes déacylase que l'on sait dissocier la liaison amido dans les pénicillines. Un but de l'invention est de permettre l'obtention de préparations a base d'enzymes insolubles dans l'eau, pouvant être récupérées du milieu réactionnel en vue d'une réutilisation et qui soient sous une forme judicieuse pour permettre un stockage et un transport de l'enzymé. Par ailleurs, l'acide 6-aminopénicillanique résultant est plus pur que lorsqu'on utilise de l'amidase de pénicilline soluble, lors de sa préparation d partir de pénicillines, étant donne que des traces de l'enzyme lui-même ne sont pas présentes dans le produit. L'invention permet d'obtenir une préparation a base d'enzyme insoluble dans l'eau renfermant un enzyme déacylase que l'on sait dissocier la liaison amido dans les pénicillines, fixé sur une matière polymère inerte insoluble dans liteau. De préférence, l'enzyme déacylase est obtenu à partir de bactéries telles que les souches d'Escherichia coli, lors d'une utilisation pour la dissociation de la benzylpénicilline en acide 6-aminopénicillanique, ou par exemple à partir de champignons et d'actinonycètes, lors d'une utilisation pour la dissociation de la phénoxyméthylpénicilline. De préférence, les matières polymères comprennent la bromacétylcellulose et le dérivé azido de la carboxyméthylcellulose. Les dérivés insolubles dans l'eau peuvent être préparés par exemple par les processus décrits dans les brevets anglais n 916.931 et 1.062.596. On peut faire réagir par exemple enzyme avec de la bromacétylcellulose, ou bien on peut assurer son couplage avec un complexe Cn-Sephadex ("Séphadex" est une dénomination commercia leê, en présence d'un réactif convenable de formation d'une amide, comme la carbodiimide.Parmi les autres matières polymères convenables, on peut citer certaines résines échangeuses d'ions activées, telles que le chlorure d'acide du type 'tZeokarb 226" et les résines éthylène-anhydride maléique reticulees avec de l'hy- drazine. Les derivés insolubles dans l'eau conservent l'activité de l'enzyme père, mais lors d'une utilisation ils demeurent sous la forme insoluble dans l'eau et ils peuvent en conséquence être utilisés au cours du processus mis en oeuvre en continu, dans des colonnes ou dans un autre equipement. L'invention concerne également un procedé pour la préparation d'acide 6-aminopénicillanique, consistant à amener en contact une benzylpénicilline ou une phénoxyméthylpénicilline avec une préparation à base d'enzyme insoluble dans l'eau telle que définie ciavant, en présence d'eau, à séparer la solution résultante de la matière solide, et à récupérer l'acide 6-aminopénicillanique à partir de cette solution. Dans le cas de l'enzyme déacylase produit par E. coli, la préparation ins-oluble dans l'eau peut être obtenue en-isolant d'abord et en purifiant l'enzyme. libre, puis en assurant son couplage avec la matière polymère. L'isolement de l'enzyme peut être effectué en séparant les cellules d'E. coli d'un milieu fermenté, .en tuant les cellules avec du formaldéhyde en solution aqueuse et en les récoltant par filtration ou centrifugation. Les cellules sont ensuite soumises à un éclatement ou brisées et l'enzyme est séparé des débris de cellules par centrifugation, puis il est purifié par précipitation par du sulfate d'ammonium et chromatographie ultérieure. l'enzyme ainsi obtenu est pur comme le montre une électrophorèse, et il a une activité spécifique élevée en ce qui concerne la dissociation de la benzylpénicilline. Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif permettront de mieux comprendre comment l'invention peut entre mise en oeuvre. Dans ces exemples, une unité amidase est l'équivalent numérique de la quantité d'acide 6-aminopénicillanique (exprimée en microgrammes/ml) produite dans les conditions de l'essai, qui correspondent au traitement par l'enzyme de benzylpénicilline à 3,3 % pendant une heure et demie, à un pH égal à 7,9 et à 370C. EXEMPLE N 1 On agite l'enzyme obtenu à partir, d'E. coli en solution aqueuse avec de la bromacétylcellulose à la température ambiante pendant trente heures, à un pH égal à 5,8, pour obtenir des préparations ayant des activités allant de 30.000 à 250.000 unités déacylase/g. Onmaintient ensuite-ces matières à40C et à un pH égal à 8,9 pendant douze heures, pour obtenir des préparations ayant des activités allant de 13 000 à 100.000 unités déacylase/g. Les préparations.à base d'enzymes sont débarrassées'du brome inaltété par traitement--ayec de l'éthanolamine 0,05 M dans à 4 C pendant vingt.-quatre heures, puis elles-sont -îavées deux fois: l'eau ehlorure de sodium en solution aqueuse- 0,15 avec du M, et ensuite avec de l'eau. Dans le cas d'une préparation obtenue de cette manière, ayant une activité égale à 40.000 unités/g. de bromacétylcellulose sèche, on effectue quatre traitements successifs par l'enzyme de benzylpénicilline en solution aqueuse à 2 % dans des conditions classiques. Chaque fois, l'efficacité du traitement par l'enzyme est satisfaisante et la préparation finale, qui conserve son activité, donne satisfaction en vue d'une réutilisation. On isole des mélanges réactionnels. de l'acide 6-aminopénicillanique dont la pureté est supérieure à 98 %. EXEMPLE N 2 On prépare de la manière connue le dérivé azido de la carboxyméthylcellulose. Ensuite, on agite 30 g.-d'azido-c & boxyméthylcellulose dans 3000 ml d'un agent tampon à base de phosphate 0,05-M à un pH égal à 8,7 et on ajoute 5 x 106 unités d'enzyme amidase pur (obtenu à partir d'E. coli). On agite le mélange à 4 C pendant vingtquatre heures. On centrifuge la préparation active et on lave le solide successivement avec NaCl 1 M, NaHCO3 0,5 X, NaCl 1 M, et finalement avec de l'eau. On constate que le solide obtenu après la centrifugation finale a une activité égale à 100.000 unités/g d'azide-carboxyméthylcellulose sèche. Une autre préparation obtenue en utilisant le processus pré- cité et ayant une activité égale à 34.300 unités/g d'azido-carbe- xyméthylcellulose sèche est utilisée pour effectuer deux traite ments consécutifs par l'enzyme de benzylpénicilline à2 %, selon une quantité égale à 400 ml, à un pH égal à 7,8 et à 370C. On ré- cupère la préparation active après le premier traitement par l'enzyme, en vue d'une réutilisation pour le second traitement. On obtient des efficacités de traitement par l'enzyme comparables au cours des deux expériences.(67 et 70 % respectivement). EXEMPE N 3 On agite 2000 mg de résine polymère d'anhydride maléiqueéthylène (EMA 21) dans 25 ml d'agent tampon à base de phosphate à un pH-égal à 7,6 à 5 C On ajoute l'agent de réticulation, qui est formé par 2 ml d'une solution à l : d'hydrate d'hydrazine, cette addition-étant- suivie, après une- à deux minutes, de l'addi- tion de-10 flig d'enzyme amidase pur.(obtenu partir d'E. coli et ayant une activité égale à 5,7 x 107 unités/g) en solution dans une petite quantité d'agent -tampon- à-base de phosphate. qnagite. le mélange dans un bain de glace pendant deux heures et on mainvient pendant une nuit a 50C. On récupère la préparation active et on la lave comme décrit dans l'exemple n 2. On constate qu'elle a une activité égale à 360.000 unités/g de résine sèche. D'autres expériences effectuées en utilisant le même processus fournissent des activités comprises entre 100.000 et 600.000 unités/g de résine sèche. EXEMPLE N 4 On convertit du Zeokarb 226 en chlorure d'acide par chauffage au reflux avec du chlorure de thionyle et de la diméthylformamide dans le chloroforme. Le titrage du chlore donne un résultat égal à 14 t. On ajoute à 30 ml d'agent tampon à base de phosphate à un pH égal à 7,6, contenant 250 000 unités d'enzyme amidase pur (obtenu à partir d'E. coli), 1,0 g du chlorure d'acide de Zeokarb 226, et on agite le mélange réactionnel pendant cinq heures à 50C. On récupère la préparation active et on la lave conte décrit dans l'exemple n 2. On constate que l'activité est égale à 119.000 unités/g de chlorure d'aeide de Zeokarb 226 sec. EXEMPLE N 5 On convertit du Zeokarb 225 en chlorure de sulfonyle par chauffage au reflux avec de l'oxychlorure de phosphore. Le titrage du chlore donne un résultat égal à 12,5 %. On ajoute à 30 ml de l'agent tampon à base de phosphate, à un pH égal à 8,5, contenant 270.000 unités d'enzyme amidase pur (obtenu à partir d'E. eoli), 1,0 g de chlorure de sulfonyle de Zeokarb 225 et on agite le mé- lange réactionnel pendant cinq heures à 5 C. On récupère la préparation active et on la lave comme décrit dans l'exemple N0 2. On constate qu'elle a une activité égale à 4.800 unités/g de chlorure de sulfonyle de Zeokarb 225 sec. EXEMPLE N 6 On convertit de la carboxyméthylcellulese en chlorure d'acide par réaetion avec du chlorure de thionyle et de la diméthylforma- mide, dans de la pyridine. Le titrage du chlore donne 9,9 %. On ajoute à 30 ml d'agent tampon à base de phosphate, à un pH égal à 8,5, contenant 270.000 unités d'enzyme amidase pur (obtenu à partir d'E. coli), 1,0 g de chlorure d'acide de carboxyméthylcellulose, et on agite le mélange réactionnel pendant deux heures et demie à 5 C. On récupère la préparation active et on la lave comme décrit dans l'exemple N 2. On constate qu'elle a une sc activité égale à 11.900 unités/g de chlorure d-'acide de carboxy- méthylcellulose à l'état sec. Des modifications peuvent être appertées aux modes de mize en ceuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'acide 6-aminopéniellanique, caractérisé en ce qu'on amène de la benzylpénicilline.ou de la phénoxyméthylpénicilline, ou encore un sel non toxique de celleci en contact avec une préparation à base d'enzyme insoluble dans l'eau renfermant un enzyme déacylase que l'on sait dissocier la liaison amido dans les pénicillines, fixé sur une matière polymère inerte insoluble dans l'eau, en présence d'eau, on sépare le liquide résultant de la manière solide et on récupère l'acide 6-aninopénicillanique à partir dulliquide. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme déacylase est dérive de bactéries. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme dEacylase est obtenu à partir d'Escherichia coli. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme dEacylase est obtenu à partir de ehampignons ou d'actinomycètes. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la ratière polymère inerte insoluble dans l'eau est de la bromacétylcellulese, de l'azido-carboxyméthyl- cellulose, une résine polymère éthylène-anhydride malique réticulée avec de l'hydrazine ou du chlorure d'acide de carboxyméthylcellulose. 6. Acide é-aminopénicillanique,de formule connue, préparé par le procédé suivant l'une quelconque des revendications précéden- tes.