Brevet FR2003908A1 — publié le 19691114

La présente invention a pour obJet un procédé de fabrication de la t-isoleucine par fermentation. Elle concerne plus particulièrement un procédé de culture d'un micro-organisme dans un mi- lieu contenant de la leucine. La L-isoleucine est un amino-acide qui constitue un additif intéressant dans la nutrition des hommes et de l'espèce animale. Selon des procédés connus, la L-isoleucine peut être obtenue par fermentation, en employant l'acide i -minobutytique (voir brevets Japonais nO 18.511/1961 - 5.167/1962 - 7.091/1963 et 10.242/1964), l'acide o( -hydroxybutyrique (voir brevet Japonais nO 11.918/1965) ou la thréonine (voir brevets Japonais nO 1.990/ 1965 et 2.880/1965), dans un milieu de culture. Selon le procédé de la présente invention, on obtient la L-iso leucine avec un rendement élevé, par culture d'un micro-organisme spécifique dans un milieu contenant de la leucine. tes micro-organismes capables de produire la t-isoleucine selon le procédé de l'invention, appartiennent à différentes espèces, parmi lesquelles les micro-organismes convenant particulièrement à l'invention sont ceux du groupe de Corynebacterium, Brevibac terium, Achrombacter, Pseudomonas, Serratia, Micrococcus, Bacil lus, Streptomyces, Aerobacter, Escherichia, Eicrobacterium, etc. tes autres espèces de micro-organismes capables de produire la t-isoleucine selon le procédé de l'invention, peuvent se déduire de l'examen de ceux déåà employés dans les procédés antérieurs. tes souches des micro-organismes des espèces précitées convenant particulièrement à la présente invention sont celles dérivées de Corynebacteriui glutamicum (syn. Micrococcus glutamicus) (voir brevet français nO 1.234.732), et de Brevibacterium ammoniagenes, Escherichia coli, Pseudomonas ovalis, Achromobacter cycloclastes, Paracolobactrum coliforme, Streptomyces antibioticus et Bacillus megatherium. Bien qu'on ne connaisse pas quelles sont exactement l'action et la fonction exercée par la leucine dans le procédé de l'inven tion, il semble que celle-ci n'agisse pas comme un substrat. En effet la quantité de L-isoleucine formée est supérieure à la quan tité de leucine introduite dans le milieu de culture, et d'autre part, lwiaaeure partie de la leucine introduite dans le milieu de culture he se transforme pas lorsqu'on en a introduit plus de îmg /ml. On peut utiliser initialement de la leucine D ou L. On peut appliquer le procédé de l'invention à tout milieu synthétique ou naturel, contenant de la leucine, ainsi que des quantités convenables de sources de carbone assimilable et d'azote, des substances minérales et autres substances nutritives pour la croissance du micro-organisme. On peut employer diverses sources de carbone assimilable, comme le glucose, l'amidon hydrolysé, les mélasses et autres hydrocarbures. Comme source d'azote, on peut employer les dérivés organiques ou minéraux azotés, comme l'urée ou des sels d'ammonium, tels que le sulfate ou chlorure d'ammonium, etc, Parmi les substances minérales convenant à l'invention, on peut citer le phosphate de potassium, de magnésium ou de zine, le carbonate de calcium, etc. De plus on peut aJouter au milieu de culture des substances nutritives favorisant la croissance du micro-organisme comme les vitamines, les amino-acides, les bases etc., dont le choix dépend des caractéristiques du micro-organisme employé. On peut encore aJouter des substances connues pour augmenter le rendement en L-isoleucine, appelées précurseurs, tus que l'acide a-aminobutyrique, la thréonine ,l 'ide tL-hydroxybutyrique, etc. La culture des micro-organismes dans le procédé de l'invention, est effectuée dans des conditions analogues à celles de la fermentation usuelle des amino-acides, c'est-à-dire dans des conditions aérobies obtenues par aération, agitation, etc. La température de la culture est préférablement de 10 à 500C et le pH qui peut varier, est de préférence à peu près neutre. On effectue la culture pendant 30 à 150 heures, de préférence, pour obtenir une quantité suffisante de L-isoleucine. La leucine est ajoutée au milieu de culture en quantité variable avec la nature de la souche du micro-organisme employé, mais elle est préférablement de l'ordre de 50y à 20 mg de leucine par ml du milieu de culture. Après la fin de la culture, on sépare les cellules microbiennes du bouillon, par filtration, et le filtrat est traité selon tout moyen convenable, comme par exemple par une résine échangeuse de cations, pour absorber la L-isoleucine, qui est ensuite éluée, concentrée et refroidie, de manière usuelle, pour donner des cristaux bruts de L-isoleucine. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. Exemple 1 La fermentation est effectuée avec un milieu de culture de composition suivante : glucose (5. g/dl), sulfate d'ammonium (2 g/dl), EH2P04 (0,05 g/dl), E2HP04 (0,025 g/dl), MgS04.7E20 (0,05 g/dl), CaC03 (2 g/dl), biotine (30 &gamma;/1), t-lysine (10 mg/l), acide DL-&alpha;-aminobutyrique (10 g/l et L-Leucine (1 g/l).On place a0 ml de ce milieu dans un flacon Erlenmeyer, et on inocule avec-une culture d'ensemencement de Corynebacterium glutamicum M-14 (ATCC 21.193). près fermentation à 300C pendant 96 heures, on obtient 4,3 g/l de L-isoleucine dans le milieu de culture. Dans des conditions semblables, mais en l'absence de Leucine, on n'obtient que 1,9 g/l de t-isoleucine. On aJuste le pH du bouillon pour le rendre faiblement acide, puis on le chauffe et on filtre les cellules microbiennes et autres précipités. On fait passer le filtrat à travers une colonne remplie de la résine vendue sous la dénomination commerciale "Diaion SE- N 1" par la Société dite MITSUBISHI KASEL KOGYO K.K., qui est-une résine échangeuse d'ions de styrène, faiblement acide, sous sa forme H+. La L-isoleucine adsorbée est ensuite éluée par l'acide sulfurique dilué. Les fractions d'éluat sont réunies, concentrées sous pression réduite, puis la L-isoleucine y est précipitée par l'alcool. Le rendement est de 2,8 g/ par litre de bouillon. Exemple 2 La fermentation est effectuée avec un milieu de culture de composition suivante : glucose (5 g/dl), sulfate d'ammonium (2 g/dl), EH2P04 (0,05 g/dl), E2EP04 (0,05 g/dl), MgSO4.7H20 (0,025 g/dl), biotine (30 &gamma; /l), extrait de levure (0,5 g/dl) et acide DI-a-aminobutyrique (1 g/dl). On sépare le milieu de culture en plusieurs fractions qu'on inocule avec l'un des mieroorganismes indiqués au tableau suivant. La fermentation dans tous les cas est effectuée en secouant à 300C pendant 96 heures. Les quantités de L-isoleucine obtenues sont indiquées au tableau qui suit. TABLEAU Quantité de L-isoleucine produite (m/il) Absence de Présence de leucine dans leucine dans le milieu de le milieu de Microerganisme culture. culture (1 g/l du milieu). Brevibacterium ammoniagenes 1,5 3,7 (ATCC 6872) Escherichia coli 1,0 2,2 (A2CC 3655) Pseudomonas ovalis 1,0 3,8 fIAM -B-2-1) Achromobacter cycloclastes 2,5 5,1 IAM - 1013) Paracolebactrum coliforme 1,1 (ATCC 21186) 1,1 4,1 Bacillus megatheriuc 1,1 2,1 Une culture de chaque organisme identifié par un numéro ATCC (American Type Culture Collection) ou IÂM (Institute of Âpplied Microbiology-Tokyo University), a été déposée et mise à la disposition du public, sans aucune restriction. ExemDle 3. On procède ainsi que décrit dais l'exemple 1, Si ce n'est qu'on utilise de la DL-leucine au lieu de L-leucine. On obtient alors 4,1 g/l de L-isoleucine dans le milieu de culture. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. - REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication de la L-isoleucine, selon lequel on effectuée une culture aérobie d'un micro-organisme producteur delisceucine, dans un milieu de culture contenant de la leucine, et on sépare la L-isoleucine obtenue du milieu de culture dans lequel elle s'est accumulée. 2 - Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le microorganisme appartient au groupe de Corynebacterium, Brevibacterium, Achrombacter, Pseudomonas, Serratia, Micrococcus, Bacillus Streptomyces Aerobacter, Escherichia ou Microbacterium. 3 - Procédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Corynebacterium glutamicum AWOG 21.193. 4 - Procédé suivant la re-vendication 2, dans lequel le microorganisme est Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872. 5 - Procédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Escherichia coli ATCC 3655. 6 - Procédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Pseudomonas ovalis IAM - B-2-1. 7 - Procédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Achromobacter cycloclastes IAM - 1013. 8 - Procédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Paracolobactrum coliforme ATCC 21186. 9 - Procédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Streptomyces antibioticus ATCC 10382. 10 - recédé suivant la revendication 2, dans lequel le microorganisme est Bacillus megatherium ATGC 15450. 11 - Procédé suivant les ievendications 1 ou 2, dans lequel la tem; > érature du milieu de culture est maintenue entre 10 et 50 C. 12 - Procédé suivant les revendications 1, 2 ou 11, dans lequel le pH du milieu de culture est maintenu à environ 7. 13 - Procédé suivant les revendications 1, 2, Il ou 12, dans lequel la culture est effectuée pendant une durée de 30 à 150 heures. 14 - Procédé suivant les revendications 1, 2, 11, 12 ou 13, dans lequel le milieu de culture contient une source de carbone, une source d'azote, et des substances minérales et nutritives.