Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών

Η ηλεκτροφόρηση είναι το φαινόμενο της κίνησης χημικών ενώσεων (κυρίως πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων) μέσα σε ένα πήκτωμα (gel) με την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η κίνηση των ουσιών μέσα στο ηλεκτρικό πεδίο εξαρτάται από το ηλεκτρικό φορτίο και το μοριακό βάρος των ουσιών. Αποτελεί μέθοδο διαχωρισμού των πρωτεϊνών που απαρτίζουν το ολικό λεύκωμα του ορού, ολικού αίματος, πλάσματος, εγκεφαλονωτιαίου υγρού, ούρων ή όποιου άλλου βιολογικού υγρού.[1, 2, 3, 4]

 Η ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται στο κλινικό εργαστήριο για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών του ορού, των ισοενζύμων, των αιμοσφαιρινών, του DNA, του RNA και άλλων μακρομορίων. Ο διαχωρισμός σε κάθε περίπτωση είναι παρόμοιος αν και το ρυθμιστικό διάλυμα, το pH, η τάση του ηλεκτρικού ρεύματος και το μέσο στήριξης των ταινιών εξαρτώνται από τα συστατικά που θα μετρηθούν. Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί σήμερα πολύτιμο διαγνωστικό εργαλείο στην ιατρική. Π.χ. η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του ορού χρησιμεύει στη διάγνωση του νεφρωσικού συνδρόμου, της ηπατοκυτταρικής νόσου, της υπο – γαμμασφαιριναιμίας, της μονοκλωνικής παραπρωτεϊνικής νόσου (πολλαπλούν μυέλωμα), της μακροσφαιριναιμίας Waldenstrom κ.α. Δείγμα βιολογικού υγρού τοποθετείται σε ηλεκτρικό πεδίο που προκαλεί την κίνηση των φορτισμένων ουσιών του προς την άνοδο ή την κάθοδο ανάλογα με το ηλεκτρικό φορτίο τους. Η κατεύθυνση της κίνησης εξαρτάται από το ηλεκτρικό φορτίο της ένωσης και η ταχύτητα τους από το βάρος ή το μέγεθος κάθε ουσίας. Πριν τη τοποθέτηση του δείγματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης αραιώνεται σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (π.χ. pH = 8,6) το οποίο συνήθως προσδίδει σε όλες τις ενώσεις το ίδιο φορτίο έτσι ώστε η κίνηση των ουσιών μέσα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης να εξαρτάται αποκλειστικά από το μοριακό της βάρος. Π.χ. στην ηλεκτροφόρηση ορού όλες οι πρωτεΐνες του ορού φέρουν αρνητικό φορτίο και μεταναστεύουν προς την άνοδο. Μετά τη λήξη εφαρμογής του ηλεκτρικού πεδίου οι ενώσεις που προηγουμένως έτρεχαν σε αυτό σταματούν την κίνηση τους και συσσωρεύονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις σε ευδιάκριτες ζώνες (ή αλλιώς μπάντες). Η πυκνότητα των ζωνών αυτών μετριέται με ειδική συσκευή που ονομάζεται πυκνόμετρο και έτσι υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία τους και η συγκέντρωσή τους. Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης του ορού βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών του ορού υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σε πήκτωμα αγαρόζης. Όλες οι πρωτεΐνες κινούνται προς την άνοδο δηλαδή τον θετικό πόλο. Τα βασικά στάδια της διαδικασίας είναι τα παρακάτω: [5, 6] 1. Αρχικά γίνεται διάνοιξη μικρών οπών (πέντε στον αριθμό), επάνω στο gel αγαρόζης με ειδική συσκευή που ονομάζεται applicator. 2. Τοποθετείται μικρή ποσότητα δείγματος ορού (3 – 5 μl), σε κάθε οπή του πηκτώματος. 3.Το πήκτωμα τοποθετείται μέσα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ή «μπανάκι» στο οποίο υπάρχει ρυθμιστικό διάλυμα. Παραμονή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης για περίπου 25 λεπτά της ώρας στα 100 volts. 4. Αφαίρεση πηκτώματος και πλύσιμο αυτού με τη χρήση των ακόλουθων διαλυμάτων: Όξινη Αλκοόλη: 3 min Διάλυμα χρωστικής (π.χ. Ponceau-s): 2 min Οξικό Οξύ: 2 min Όξινη Αλκοόλη: 2 min Οξικό Οξύ: 2 min5. Μέτρηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών με τη χρήση πυκνόμετρου στα 600 nm. Το πυκνόμετρο (densitometer) είναι ένα ειδικό χρωματόμετρο σχεδιασμένο να σαρώνει και να ποσοτικοποιεί τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης. Συγκεκριμένα μετρά τη πυκνότητα του χρώματος των διαφόρων κλασμάτων της ηλεκτροφόρησης. Τα πυκνόμετρα «διαβάζουν» ποικίλες γέλες καθώς και μεμβράνες όξινες κυτταρίνης. Πριν την μέτρηση της πυκνότητας των πρωτεϊνών οι πρωτεΐνες έχουν διαχωριστεί με ηλεκτροφόρηση και έχουν καταστεί ορατές με κατάλληλη χρωστική. Μετά την απομάκρυνση και το στέγνωμα της επιπλέον χρωστικής από τη γέλη, η μεμβράνη καθίσταται διαυγής με προσεκτική βύθιση σε έναν παράγοντα αφυδάτωσης καθώς και σε ένα μίγμα από οργανικούς διαλύτες. Με θέρμανση της μεμβράνης εξατμίζονται οι διαλύτες και δημιουργείται ένα λεπτό διάφανο φιλμ με τις μπάντες των πρωτεϊνών βαμμένες με μία κόκκινη ή μπλε χρωστική.Η διαυγής μεμβράνη σαρώνεται με το πυκνόμετρο το οποίο ρίχνει στη διαφανή μεμβράνη μια δέσμη φωτός που διαπερνά αυτή καταλήγει σε ένα φωτοανιχνευτή. Η απορρόφηση της φωτεινής αυτής δέσμης από τη μπάντα των πρωτεϊνών είναι ανάλογη της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στη περιοχή αυτή. [1] Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών του ορού με ηλεκτροφόρηση χρησιμεύει στη διάγνωση διαφόρων κλινικών καταστάσεων. Τα πρωτεϊνικά προφίλ συνήθως παρουσιάζουν συγκεκριμένα πρότυπα στις ακόλουθες ασθένειες: νεφρωσικό σύνδρομο, ηπατοκυτταρική νόσος, υπο – γαμμασφαιριναιμία και μονοκλωνική παραπρωτεϊνική νόσος (πολλαπλούν μυέλωμα, μακροσφαιριναιμία Waldenstrom). Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε συγκεκριμένες θέσεις πάνω στο ηλεκτροφόρημα αποτελεί τις λεγόμενες μπάντες, ζώνες ή κλάσματα. [1] Η αλβουμίνη του ορού αποτελεί την πιο έντονη ζώνη σε ένα ηλεκτρογράφημα αφού αποτελεί το 60% περίπου της ολικής πρωτεΐνης του ορού. Συντίθεται αποκλειστικά στο ήπαρ και λειτουργεί ως ρυθμιστής της ωσμωτικής πίεσης του αίματος, ως μεταφορέας πολλών κατιόντων και ουσιών αδιάλυτων στο νερό και ως δεξαμενή αμινοξέων για ενεργειακούς και βιοσυνθετικούς σκοπούς. Η μείωση της αποδίδεται κυρίως σε ηπατοκυτταρική βλάβη αλλά η μεταβολή αυτή είναι σχετικά αργή. Το εύρος των τιμών αναφοράς κυμαίνεται μεταξύ 3,5 – 5,2 g/dL. Κατά τη διάρκεια των πρώτων 4 μηνών της ζωής η αλβουμίνη των περισσότερων νεογνών είναι κατά 10 – 12 % μειωμένη από αυτή του συνολικού ποσοστού των ενηλίκων. Η απόκλιση αυτή μπορεί να είναι λίγο μεγαλύτερη στα πρόωρα νεογνά. Αυξημένη συγκέντρωση αλβουμίνης. Καταστάσεις υπεραλβουμιναιμίας είναι σπάνιες, με την εξαίρεση των περιπτώσεων οξείας αφυδάτωσης ή καταπληξίας. Η αύξηση στη συγκέντρωση της αλβουμίνης είναι τότε παροδική, διότι οι αυξημένες οσμωτικές δυνάμεις προκαλούν τη διάχυση του διάμεσου υγρού μέσω των τοιχωμάτων των τριχοειδών. Ελαττωμένη συγκέντρωση αλβουμίνης. Καταστάσεις που προκαλούν ελάττωση στη συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης του ορού, προκαλούν ταυτόχρονα και μείωση στη συγκέντρωση της αλβουμίνης. Το δεύτερο κλάσμα η α1 – σφαιρίνη αυξάνεται συχνά όταν ελαττώνεται η συγκέντρωση της αλβουμίνης του ορού, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια λοιμώξεων και φλεγμονωδών καταστάσεων. Η συγκέντρωση της μειώνεται στην οξεία ηπατίτιδα και στην οικογενή έλλειψη α1 – αντιθρυψίνης η οποία προκαλεί εμφύσημα. Η συγκέντρωση του κλάσματος αυτού αυξάνεται πολύ στο νεφρωσικό σύνδρομο, λόγω της μεγάλης αύξησης της α2 – μικροσφαιρίνης, μιας πρωτεΐνης της οποίας το μεγάλο μέγεθος παρεμποδίζει τη μεταφορά της μέσα από τις αλλοιωμένες μεμβράνες του νεφρικού σπειράματος που οφείλονται σε αυτή τη νόσο. Το 3ο κλάσμα αυξάνεται συχνά σε φλεγμονώδεις καταστάσεις όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα και ο ερυθηματώδης λύκος ή έπειτα από έμφραγμα του μυοκαρδίου. Στις σπάνιες περιπτώσεις πολλαπλού μυελώματος η παραπρωτεΐνη μπορεί να μετακινηθεί στη ζώνη α2. Η συγκέντρωση του 3ου κλάσματος στον ορό μειώνεται κατά τη διάρκεια οξείας ηπατοκυτταρικής νόσου. Το κλάσμα της β – σφαιρίνης συνήθως αυξάνεται σε διάφορα είδη υπερλιπιδαιμιών. Αναιμία η οποία οφείλεται σε έλλειψη σιδήρου μπορεί επίσης να οδηγήσει σε αύξηση της β – περιοχής λόγω της αύξησης της τρανσφερρίνης. Άλλες φορές η παραπρωτεΐνη του πολλαπλού μυελώματος μετακινείται στο β – κλάσμα κι εμφανίζεται εκεί μια υψηλή κορυφή. Είναι γνωστό πως οι παραπρωτεΐνες των μονοκλωνικών νοσημάτων είναι μη φυσιολογικές γ – σφαιρίνες. Η κάθε μία από αυτές είναι μοναδική και η σύσταση των αμινοξέων της διαφέρει από αυτή των φυσιολογικών ανοσοσφαιρινών. Για το λόγο αυτό μπορούν να μετακινηθούν περισσότερο προς την άνοδο απ’ ό,τι συνήθως, εάν στο μόριο έχουν προκύψει αντικαταστάσεις με αμινοξέα που φέρουν μεγαλύτερο αρνητικό φορτίο. Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης δίνονται στον ασθενή ή στον κλινικό ιατρό με τις παρακάτω μορφές: [1, 2, 5, 6] Ως εικόνα ηλεκτροφορήματος όπου φαίνονται χρωματισμένες οι μπάντες των κλασμάτων της ηλεκτροφόρησης. Ως διάγραμμα όπου το εμβαδό κάθε μπάντας αντιστοιχεί στην εκατοστιαία αναλογία αυτής. Απαιτείται μέτρηση της πυκνότητας των κλασμάτων σε πυκνόμετρο. Ως εκατοστιαία αναλογία των κλασμάτων των πρωτεϊνών. Απαιτείται μέτρηση της πυκνότητας των κλασμάτων σε πυκνόμετρο ή σαρωτή. Ως συγκέντρωση των κλασμάτων των πρωτεϊνών. Απαιτείται μέτρηση της πυκνότητας των κλασμάτων σε πυκνόμετρο αλλά και μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης στον ορό σε φωτόμετρο ή βιοχημικό αναλυτή. Στα φυσιολογικά άτομα τα κλάσματα των πρωτεϊνών κυμαίνονται σε συγκεκριμένα εύρη εκατοστιαίας αναλογίας. Εκατοστιαία αναλογία πρωτεϊνικών κλασμάτων Υπολογίζεται επίσης ο λόγος A/G (αλβουμίνη/σφαιρίνες) δηλαδή το κλάσμα Alb/(a1 + a2 + β + γ). Ο λόγος A/G θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 1,39 – 2,23. Εάν το ολικό λεύκωμα του ασθενούς είναι γνωστό μπορούν να υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών του ορού σε mg/dL σύμφωνα με το παρακάτω τύπο:Εκατοστιαία αναλογία πρωτεΐνης x ολικό λεύκωμα = mg/dL Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μία μέθοδο με την οποία ηλεκτρικά φορτισμένα είδη διαχωρίζονται κατά τη μετακίνησή τους σε ηλεκτρολυτικό ρυθμιστικό διάλυμα, παρουσία και επίδρασης ηλεκτρικού φορτίου, συγκεκριμένης έντασης. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός γίνεται σε πηκτή (ge)l, το οποίο λειτουργεί επιπλέον ως μοριακός ηθμός βοηθώντας έτσι τους διαχωρισμούς των μορίων καθώς έχει επιπλέον την ιδιότητα να αναιρεί ρεύματα που δημιουργούνται λόγω επίδρασης της θερμοκρασίας, απαραίτητη προϋπόθεση για τον αποτελεσματικό διαχωρισμό των προς εξέταση μορίων.[2] Η ταχύτητα μετακίνησης (u), κάθε φορτισμένου μορίου σε ηλεκτρικό πεδίο, εξαρτάται από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Ε), το καθαρό φορτίο του (z), και το συντελεστή τριβής (f), ο οποίος δημιουργείται επάνω στην ηλεκτροφορητική γέλη κατά την άνοδο ή κάθοδο των μορίων. Η ταχύτητα μετακίνησης δίνεται από τον παρακάτω τύπο:u = Ez/f Η ηλεκτροστατική δύναμη Ez που κατευθύνει το φορτισμένο μόριο προς το αντίθετα φορτισμένο ηλεκτρόδιο είναι αντίθετη της τριβής που εμφανίζεται μεταξύ του μορίου που μετακινείται και του μέσου μετακίνησης. Η σταθερά τριβής f εξαρτάται από τη μάζα και το σχήμα του μορίου που μετακινείται, καθώς και από την πυκνότητα του μέσου μετακίνησης. Η βασική παραπάνω αρχή ηλεκτροφορητικής διαδικασίας αφορά τόσο σε πήκτωμα αγαρόζης όσο και σε πολυακριλαμιδίου.[2] Παραπάνω αναφέρθηκε η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Παρόλη, όμως, την ευκολία της χρήσης της αγαρόζης οι ερευνητές χρησιμοποιούν εξίσου και το πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Η χρήση του ακρυλαμιδίου βρίσκει ευρεία εφαρμογή, σε παγκόσμιο επίπεδο, μιας και παρέχει καλύτερα εικονικά αποτελέσματα εν συγκρίσει με την αγαρόζη.[2] Το πήκτωμα ακρυλαμιδίου αποτελεί ένα πολυμερές υλικό, με τελική μαλακή και εύπλαστη υφή, το οποίο συνήθως παρασκευάζεται από τον εκάστοτε ερευνητή ή προσωπικό ενός εργαστηρίου. Αποτελείται κατά 50 % από γλυκερόλη, 40 % από ακρυλαμίδη και υπόλοιπο 10 % από διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα όπως για παράδειγμα διάλυμα Tris, Sodium Acetate και EDTA. Το πήκτωμα ακρυλαμιδίου δεν χρησιμοποιείται σε επίπεδο ρουτίνας λόγω του μεγάλου κόστους καθώς και της πολύπλοκης διαδικασίας παρασκευής του. Καρκαλούσος Π. Αρχές Ηλεκτροφόρησης. Έκδοση Πρώτη, ΑΤΕΙ Αθήνας, Αθήνα 2012. Kaplan A, Jack R, Opheim K, Toivola B, Lyon A. Κλινική Χημεία – Δοκιμασίες και Τεχνικές, 4η έκδοση, εκδόσεις Πασχαλίδης, Αθήνα 2003, ISBΝ: 960-399-148-1. Gaw A, Murphy M, Cowan R, O’Reilly D, Stewart M, Shepherd J, Κλινική Βιοχημεία. Eκδόσεις Παρισιάνου 4η έκδοση, ISBN 978-960-394-707-3, Αθήνα 2010. Beckett G, Walker S, Rae P, Ashby P. Κλινική Βιοχημεία. Eκδόσεις Παρισιάνου 7η έκδοση, ISBN 978-960-394-688-5, Αθήνα 2010. Manual ηλεκτροφόρησης της εταιρείας Paragon. Manual ηλεκτροφόρησης της εταιρείας Sebia.