Μέθοδος FISH

H μέθοδος Φθορίζων in situ υβριδισμός (Fluorescence In Situ Hybridisation, FISH) είναι μία τεχνική που άρχισε να εφαρμόζεται στις αρχές της δεκαετίας του 1990 και αποτελεί μία από τις σημαντικότερες εξελίξεις στο χώρο της κυτταρογενετικής. Στηρίζεται στον υβριδισμό μιας αλληλουχίας «στόχου» στην προς μελέτη χρωμοσωμική περιοχή, στη φυσική της θέση (in situ) και ενός μοριακού συνθετικού ανιχνευτή σημασμένου με φθορίζουσα ουσία.

 Η μέθοδος στηρίζεται στον υβριδισμό γνωστών DNA ανιχνευτών (probes) σημασμένων με φθορίζουσα ουσίες με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες τους πάνω στο υπό μελέτη χρωμόσωμα και παρατήρηση σε φθορίζον μικροσκόπιο. Με αυτόν τον τρόπο μας δίνεται η δυνατότητα να αναγνωρίσουμε συγκεκριμένες περιοχές παρατηρώντας τα χρωμοσώματα στο μικροσκόπιο λόγω της φθορίζουσας ουσίας που είναι συνδεδεμένη με τον ανιχνευτή. Οι ανιχνευτές είναι δυνατόν να παρασκευασθούν είτε από βιβλιοθήκες χρωμοσωμάτων (paints) για την αναγνώριση ολικών ή μερικών ανευπλοειδιών, είτε από τις περιοχές των χρωμοσωμάτων που ενέχονται σε μικροελλείψεις και μικροδιπλασιασμούς (cosmid probes). Με τη χρήση περισσότερων του ενός φθοριζουσών ουσιών είναι δυνατόν να εντοπισθούν διαφορετικές χρωμοσωμικές περιοχές στο ίδιο παρασκεύασμα (multicolor FISH). Εφαρμόζεται στη διάγνωση ορισμένων de novo χρωμοσωμικών ανακατατάξεων και στην ταυτοποίηση χρωμοσωμάτων άγνωστης προέλευσης όταν αυτό δεν είναι δυνατό με τις συμβατικές τεχνικές της κυτταρογενετικής. Με την multiplex FISH είναι δυνατόν να "βαφτούν" όλα τα χρωμοσώματα με διαφορετικό χρώμα το καθένα. Με αυτήν την τεχνική είναι δυνατόν με ένα πείραμα να γίνει ταυτοποίηση μικρών υπεράριθμων χρωμοσωμάτων, μεταθέσεων και διπλασιασμών. Μία από τις σημαντικότερες εφαρμογές της FISH είναι η δυνατότητα ανίχνευσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε μεσοφασικούς πυρήνες. Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο γιατί σημαίνει ότι είναι δυνατόν να γίνει ταχεία διάγνωση (24h-48h) των συχνότερων ανευπλοειδιών (τρισωμιών ή της μονοσωμίας Χ) σε μη καλλιεργημένα κύτταρα αμνιακού υγρού. Κάνοντας χρήση ανιχνευτών για τα χρωμοσώματα 21, 18, 13, Χ και Υ είναι δυνατόν να αποκλεισθούν αυτές οι ανευπλοειδίες με αξιοπιστία μέχρι και 98%. Είναι ευρεία η εφαρμογή της FISH στην ανίχνευση συνδρόμων που οφείλονται σε μικροδιπλασιασμούς ή μικροελλείψεις με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών για γονίδια που εδράζονται σε αυτές τις περιοχές. Είναι δυνατή η προεμφυτευτική διάγνωση σε βλαστομερίδιο προκειμένου να μειωθεί η πιθανότητα εμφύτευσης εμβρύου με μία από τις συχνότερες χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Εφαρμόζοντας την ίδια τεχνική που χρησιμοποιούμε και στην ταχεία προγεννητική διάγνωση είναι δυνατόν να αποκλεισθεί με 85% πιθανότητα η εμφύτευση παθολογικού εμβρύου. Σημαντική είναι επίσης και η συνεισφορά της στη χαρτογράφηση των γονιδίων, υποδεικνύοντας την ακριβή θέση τους στα χρωμοσώματα.Η ραγδαία εξέλιξη της τεχνολογίας έχει διευρύνει τις εφαρμογές της τεχνικής οδηγώντας στη δημιουργία του 3D-FISH το οποίο αποτελεί σημαντικό εργαλείο για την αποτύπωση της χωρικής διάταξης στοχευμένων αλληλουχιών γενετικού υλικού. Ο συνδυασμός τρισδιάστατης μικροσκοπίας με τεχνικές ανακατασκευής εικόνας παρέχει τη δυνατότητα της αυτοματοποιημένης αξιολόγησης της εικόνας FISH. https://commons.wikimedia.org/ Παρέχει πολυμεσικό υλικό σχετικό με τη θέση των γονιδίων στα χρωμοσώματα