Αντίστροφη μεταγραφάση

Η αντίστροφη μεταγραφάση (RT) (αναφερόμενη και σαν ανάστροφη τρανσκριπτάση) είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA από ένα πρότυπο RNA, μια διαδικασία που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή. Οι αντίστροφες μεταγραφάσες χρησιμοποιούνται από ιούςόπως ο HIV και ο ιός της ηπατίτιδας Β για την αναπαραγωγή των γονιδιωμάτων τους, από ρετρομεταθετόνιο κινητών γενετικών στοιχείων για να πολλαπλασιαστούν εντός του γονιδιώματος του ξενιστή, και από ευκαρυωτικά κύτταρα για να επεκτείνουν τα τελομερή στα άκρα των γραμμικών χρωμοσωμάτων. Σε αντίθεση με μια ευρέως διαδεδομένη πεποίθηση, η διαδικασία δεν παραβιάζει τις ροές γενετικής πληροφορίας όπως περιγράφεται από το κλασικό κεντρικό δόγμα, καθώς οι μεταφορές πληροφοριών από το RNA στο DNA είναι ρητά πιθανές.Η ρετροϊική RT έχει τρεις διαδοχικές βιοχημικές δραστηριότητες: ενεργότητα DNA πολυμεράσης που εξαρτάται από το RNA, ριβονουκλεάση Η (RNase H) και εξαρτώμενη από DNA ενεργότητα πολυμεράσης DNA. Συνολικά, αυτές οι ενεργότητες επιτρέπουν στο ένζυμο να μετατρέπει μονόκλωνο RNA σε δίκλωνο cDNA. Σε ρετροϊούς και ρετρομεταθετόνια, αυτό το cDNA μπορεί στη συνέχεια να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή, από το οποίο μπορούν να δημιουργηθούν νέα αντίγραφα RNA με μεταγραφή μέσω του κυττάρου του ξενιστή. Η ίδια αλληλουχία αντιδράσεων χρησιμοποιείται ευρέως στο εργαστήριο για τη μετατροπή του RNA σε DNA για χρήση σε μοριακή κλωνοποίηση, αλληλούχιση RNA (RNA sequencing), αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), ή ανάλυση γονιδιώματος.

 Οι αντίστροφες μεταγραφάσες ανακαλύφθηκαν από τον Howard Temin στο Πανεπιστήμιο του Ουισκόνσιν στο Μάντισον σε ιοσωμάτια Rous sarcoma και απομονώθηκαν ανεξάρτητα από τον David Baltimore το 1970 στο Τεχνολογικό Ινστιτούτο Μασαχουσέτης από δύο ογκογόνους ιούς RNA: ιός λευχαιμίας ποντικού και πάλι ιός σαρκώματος Rous. . Για τα επιτεύγματά τους, μοιράστηκαν το 1975 το Βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής (με τον Renato Dulbecco). Οι καλά μελετημένες ανάστροφες μεταγραφάσες περιλαμβάνουν: Την αντίστροφη μεταγραφάση HIV-1 από ιό ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 1HMV έχει δύο υπομονάδες, οι οποίες έχουν αντίστοιχα μοριακές μάζες 66 και 51 kDas. Την αντίστροφη μεταγραφάση M-MLV από τον ιό λευχαιμίας ποντικού Moloney είναι ένα μοναδικό μονομερές 75 kDa. Την αντίστροφη μεταγραφάση AMV από τον ιό μυελοβλάστωσης πτηνών έχει επίσης δύο υπομονάδες, μια υπομονάδα 63 kDa και μια υπομονάδα 95 kDa. Την αντίστροφη μεταγραφάση της τελομεράσης που διατηρεί τα τελομερή των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων. Τα ένζυμα κωδικοποιούνται και χρησιμοποιούνται από ιούς που χρησιμοποιούν την αντίστροφη μεταγραφή ως βήμα στη διαδικασία της αντιγραφής. Οι ιοί RNA αντίστροφης μεταγραφής, όπως οι ρετροϊοί, χρησιμοποιούν το ένζυμο για να μεταγράψουν αντίστροφα το RNA των γονιδιωμάτων τους σε DNA, το οποίο στη συνέχεια ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή και αντιγράφεται μαζί του. Η αντίστροφη μεταγραφή ιών DNA, όπως της οικογένειας Hepadnaviridae, μπορεί να επιτρέψει στο RNA να χρησιμεύσει ως πρότυπο για τη συναρμολόγηση και τη δημιουργία κλώνων DNA. Ο HIV μολύνει τους ανθρώπους με τη χρήση αυτού του ενζύμου. Χωρίς την αντίστροφη μεταγραφάση, το γονιδίωμα του ιού δεν θα ήταν σε θέση να ενσωματωθεί στο κύτταρο ξενιστή, με αποτέλεσμα την αποτυχία αντιγραφής. Η αντίστροφη μεταγραφάση δημιουργεί δίκλωνο DNA από ένα πρότυπο RNA. Σε είδη ιού με αντίστροφη μεταγραφάση που στερούνται δραστικότητας πολυμεράσης DNA εξαρτώμενης από το DNA, η δημιουργία δίκλωνου DNA μπορεί πιθανώς να γίνει από την κωδικοποιημένη από τον ξενιστή πολυμεράση δ του DNA, παρερμηνεύοντας το ιικό DNA-RNA ως εκκινητή και συνθέτοντας μια διπλή έλικα DNA με παρόμοιο μηχανισμό όπως στην αφαίρεση εκκινητή, όπου το νεοσυντιθέμενο DNA εκτοπίζει το αρχικό πρότυπο RNA. Η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής, που ονομάζεται επίσης αναδρομική μεταγραφή ή ρετρότρα, είναι εξαιρετικά επιρρεπής σε σφάλματα και κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου μπορεί να εμφανιστούν μεταλλάξεις. Τέτοιες μεταλλάξεις μπορεί να προκαλέσουν αντοχή στα φάρμακα. Ρετροϊική αντίστροφη μεταγραφή Οι ρετροϊοί, που αναφέρονται επίσης ως ιοί κατηγορίας VI των ssRNA-RT, είναι ιοί αντίστροφης μεταγραφής RNA με ενδιάμεσο DNA. Το γονιδίωμά τους αποτελείται από δύο μόρια μονόκλωνου RNA με καπέλο στο 5’ άκρο και 3’ πολυαδενυλιωμένη ουρά. Παραδείγματα ρετροϊών περιλαμβάνουν τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) και τον ανθρώπινο Τ-λεμφοτροπικό ιό (HTLV). Η δημιουργία δίκλωνου DNA συμβαίνει στο κυτοσόλιο ως μια σειρά από αυτά τα βήματα: Το μεταφορικό RNA του λυσυλίου δρα ως εκκινητής και υβριδοποιείται σε ένα συμπληρωματικό τμήμα του γονιδιώματος RNA του ιού που ονομάζεται θέση δέσμευσης εκκινητών ή PBS. Η αντίστροφη μεταγραφάση προσθέτει στη συνέχεια νουκλεοτίδια DNA στο 3' άκρο του εκκινητή, συνθέτοντας συμπληρωματικό DNA στην περιοχή U5 (μη κωδικοποιητική περιοχή) και στην περιοχή R (μια άμεση επανάληψη που βρίσκεται και στα δύο άκρα του μορίου RNA) του ιικού RNA. Ένας τομέας στο ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης που ονομάζεται ριβονουκλεάση H αποικοδομεί τις περιοχές U5 και R στο 5' άκρο του RNA. Ο εκκινητής tRNA στη συνέχεια "πηδά" στο 3' άκρο του ιικού γονιδιώματος και οι νεοσυντιθέμενοι κλώνοι DNA υβριδοποιούνται στη συμπληρωματική περιοχή R στο RNA. Το συμπληρωματικό DNA (cDNA) που προστέθηκε στο (2) επεκτείνεται περαιτέρω. Η πλειονότητα του ιικού RNA αποικοδομείται από τη ριβονουκλεάση H, αφήνοντας μόνο την αλληλουχία PP. Η σύνθεση του δεύτερου κλώνου DNA ξεκινά, χρησιμοποιώντας το εναπομένον τμήμα PP του ιικού RNA ως εκκινητή. Ο εκκινητής tRNA φεύγει και συμβαίνει ένα «άλμα». Το PBS από τον δεύτερο κλώνο υβριδοποιείται με το συμπληρωματικό PBS στον πρώτο κλώνο. Και οι δύο κλώνοι επεκτείνονται για να σχηματίσουν ένα πλήρες δίκλωνο DNA, αντίγραφο του αρχικού γονιδιώματος του ιικού RNA, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή από το ένζυμο ενσωματάση (ιντεγκράση).Η δημιουργία δίκλωνου DNA περιλαμβάνει επίσης τη μεταφορά κλώνου, στην οποία υπάρχει μια μετατόπιση του προϊόντος του βραχέος DNA από την αρχική σύνθεση DNA που εξαρτάται από το RNA σε περιοχές μήτρας δέκτη στο άλλο άκρο του γονιδιώματος, οι οποίες αργότερα επιτυγχάνονται και επεξεργάζονται από την αντίστροφη μεταγραφάση για την εξαρτώμενη από το DNA δραστικότητα DNA της. Το RNA του ρετροϊού είναι διατεταγμένο από το άκρο 5' προς το άκρο 3'. Η θέση όπου ο εκκινητής επαναδιατάσσεται στο ιικό RNA ονομάζεται θέση σύνδεσης εκκινητή (PBS). Το 5' άκρο του RNA στη θέση PBS ονομάζεται U5 και το άκρο 3' του RNA στο PBS ονομάζεται οδηγός. Ο εκκινητής tRNA ξετυλίγεται μεταξύ 14 και 22 νουκλεοτιδίου και σχηματίζει ένα διπλό ζεύγος βάσεων με το ιικό RNA στο PBS. Το γεγονός ότι το PBS βρίσκεται κοντά στο 5' άκρο του ιικού RNA είναι ασυνήθιστο επειδή η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει DNA από το 3' άκρο του εκκινητή προς την κατεύθυνση 5' προς 3' (σε σχέση με τον νεοσυντιθέμενο κλώνο DNA). Επομένως, ο εκκινητής και η ανάστροφη μεταγραφάση πρέπει να επανατοποθετηθούν στο άκρο 3' του ιικού RNA. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτή η επανατοποθέτηση, χρειάζονται πολλαπλά στάδια και διάφορα ένζυμα συμπεριλαμβανομένης της DNA πολυμεράσης, της ριβονουκλεάσης Η και του ξετυλίγματος του πολυνουκλεοτιδίου. Η αντίστροφη μεταγραφάση του HIV έχει επίσης ενεργότητα ριβονουκλεάσης που αποικοδομεί το ιικό RNA κατά τη σύνθεση του cDNA, καθώς και ενεργότητα πολυμεράσης DNA που εξαρτάται από το DNA, που αντιγράφει τoν νοηματικό κλώνο cDNA σε ένα αντινοηματικό DNA για να σχηματίσει ένα δίκλωνο ενδιάμεσο ιικό DNA (vDNA). Αυτοαναπαραγόμενες εκτάσεις ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων που είναι γνωστά ως ρετρομεταθετόνια χρησιμοποιούν την αντίστροφη μεταγραφάση για να μετακινηθούν από τη μια θέση στο γονιδίωμα στην άλλη μέσω ενός ενδιάμεσου RNA. Βρίσκονται σε αφθονία στα γονιδιώματα των φυτών και των ζώων. Η τελομεράση είναι μια άλλη αντίστροφη μεταγραφάση που βρίσκεται σε πολλούς ευκαρυώτες, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, η οποία φέρει το δικό της πρότυπο RNA και αυτό το RNA χρησιμοποιείται ως πρότυπο για αντιγραφή του DNA.Οι αρχικές αναφορές για αντίστροφη μεταγραφάση σε προκαρυώτες ήρθαν ήδη από το 1971 στη Γαλλία (Mirko Beljanski|Beljanski et al., 1971a, 1972) και λίγα χρόνια αργότερα στην ΕΣΣΔ (Romashchenko 1977). Αυτά έχουν από τότε περιγραφεί ευρέως ως μέρος των βακτηριακών Retron, διακριτών αλληλουχιών που κωδικοποιούν την αντίστροφη μεταγραφάση και χρησιμοποιούνται στη σύνθεση του πολλαπλού αντίγραφου μονόκλωνου DNA (msDNA). Για να ξεκινήσει η σύνθεση του DNA, απαιτείται ένας εκκινητής. Στα βακτήρια, ο εκκινητής συντίθεται κατά την αντιγραφή. Ο Valerian Dolja από την Πολιτεία του Όρεγκον υποστηρίζει ότι οι ιοί, λόγω της ποικιλομορφίας τους, έχουν παίξει εξελικτικό ρόλο στην ανάπτυξη της κυτταρικής ζωής, με την αντίστροφη μεταγραφάση να παίζει κεντρικό ρόλο. Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιεί μια δομή "δεξιού χεριού" παρόμοια με αυτή που βρίσκεται σε άλλες ιικές πολυμεράσες νουκλεϊκών οξέων. Εκτός από τη λειτουργία μεταγραφής, οι αντίστροφες μεταγραφάσες ρετροϊών έχουν μια περιοχή που ανήκει στην οικογένεια ριβονουκλεασών H, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για την αντιγραφή τους. Η αποικοδόμηση του προτύπου RNA, επιτρέπει τη σύνθεση του άλλου κλώνου του DNA. Μερικά θραύσματα από την πέψη χρησιμεύουν επίσης ως εκκινητές για την DNA πολυμεράση (είτε το ίδιο ένζυμο είτε μια πρωτεΐνη-ξενιστής), που είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία του άλλου (συν) κλώνου. Υπάρχουν τρία διαφορετικά συστήματα αντιγραφής κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής ενός ρετροϊού. Η πρώτη διαδικασία είναι η σύνθεση αντίστροφης μεταγραφάσης ιικού DNA από ιικό RNA, το οποίο στη συνέχεια σχηματίζει πρόσφατους συμπληρωματικούς κλώνους DNA. Η δεύτερη διαδικασία αντιγραφής συμβαίνει όταν η πολυμεράση του κυτταρικού DNA του ξενιστή αντιγράφει το ενσωματωμένο ιικό DNA. Τέλος, η RNA πολυμεράση II μεταγράφει το προϊικό DNA σε RNA, το οποίο θα συσκευαστεί σε ιοσωμάτια. Η μετάλλαξη μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια ενός ή όλων αυτών των βημάτων αντιγραφής. Η αντίστροφη μεταγραφάση έχει υψηλό ποσοστό σφάλματος κατά τη μεταγραφή του RNA σε DNA, επειδή, σε αντίθεση με τις περισσότερες άλλες DNA πολυμεράσες, δεν έχει ικανότητα διόρθωσης. Αυτό το υψηλό ποσοστό σφάλματος επιτρέπει στις μεταλλάξεις να συσσωρεύονται με επιταχυνόμενο ρυθμό σε σχέση με τις διορθωμένες μορφές αντιγραφής. Οι εμπορικά διαθέσιμες αντίστροφες μεταγραφάσες που παράγονται από την Promega αναφέρονται στα εγχειρίδια τους ότι έχουν ποσοστά σφάλματος στην περιοχή 1 στις 17.000 βάσεις για το AMV και 1 στις 30.000 βάσεις για το M-MLV. Εκτός από τη δημιουργία πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου, οι αντίστροφες μεταγραφάσες έχουν επίσης αποδειχθεί ότι εμπλέκονται σε διαδικασίες όπως συντήξεις μεταγραφής, ανάμειξης εξωνίων και δημιουργία τεχνητών αντινοηματικών μεταγραφών. Εικάζεται ότι αυτή η δραστηριότητα εναλλαγής προτύπου της αντίστροφης μεταγραφάσης, η οποία μπορεί να αποδειχθεί πλήρως in vivo, μπορεί να ήταν μία από τις αιτίες για την εύρεση πολλών χιλιάδων μη σχολιασμένων μεταγραφών στα γονιδιώματα των μοντέλων οργανισμών. Δύο RNA γονιδιώματα είναι συσκευασμένα σε κάθε σωματίδιο ρετροϊού, αλλά, μετά από μια μόλυνση, κάθε ιός δημιουργεί μόνο έναν προϊό. Μετά τη μόλυνση, η αντίστροφη μεταγραφή συνοδεύεται από εναλλαγή προτύπου μεταξύ των δύο αντιγράφων γονιδιώματος (ανασυνδυασμός επιλογής αντιγράφου). Υπάρχουν δύο μοντέλα που προτείνουν γιατί η μεταγραφάση RNA αλλάζει πρότυπα. Το πρώτο, το μοντέλο εξαναγκασμένης επιλογής αντιγραφής, προτείνει ότι η αντίστροφη μεταγραφάση αλλάζει το πρότυπο RNA όταν συναντά μια εγκοπή, υπονοώντας ότι ο ανασυνδυασμός είναι υποχρεωτικός για τη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος του ιού. Το δεύτερο, το μοντέλο δυναμικής επιλογής, προτείνει ότι η αντίστροφη μεταγραφάση αλλάζει πρότυπα όταν η λειτουργία της ριβονουκλεάσης και η λειτουργία της πολυμεράσης δεν συγχρονίζονται ως προς το ρυθμό, υπονοώντας ότι ο ανασυνδυασμός συμβαίνει τυχαία και δεν είναι απόκριση σε γονιδιωματική βλάβη. Μια μελέτη από τους Rawson et al. υποστήριξε και τα δύο μοντέλα ανασυνδυασμού. Σε κάθε κύκλο αντιγραφής συμβαίνουν από 5 έως 14 συμβάντα ανασυνδυασμού ανά γονιδίωμα. Η εναλλαγή προτύπων (ανασυνδυασμός) φαίνεται να είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος και ως μηχανισμός επισκευής για τη διάσωση κατεστραμμένων γονιδιωμάτων. Επειδή ο Ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας χρησιμοποιεί την αντίστροφη μεταγραφάση για να αντιγράψει το γενετικό του υλικό και να δημιουργήσει νέους ιούς (μέρος ενός κύκλου πολλαπλασιασμού ρετροϊών), έχουν σχεδιαστεί ειδικά φάρμακα για να διακόπτουν τη διαδικασία και έτσι να καταστέλλουν την ανάπτυξή του. Συλλογικά, αυτά τα φάρμακα είναι γνωστά ως αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης]] και περιλαμβάνουν τα νουκλεοσίδια και ανάλογα νουκλεοτίδια ζιντοβουδίνης (εμπορική ονομασία Retrovir), λαμιβουδίνης (Epivir) και τενοφοβίρη (Viread), καθώς και μη νουκλεοσιδικούς αναστολείς, όπως νεβιραπίνη (Viramune). Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται συνήθως στην έρευνα για την εφαρμογή της τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στο RNA σε μια τεχνική που ονομάζεται αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (reverse transcription polymerase chain reaction) (RT-PCR). Η κλασική τεχνική PCR μπορεί να εφαρμοστεί μόνο σε DNA κλώνους, αλλά, με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης, το RNA μπορεί να μεταγραφεί σε DNA, καθιστώντας έτσι την ανάλυση των μορίων RNA με PCR δυνατή. Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται επίσης για τη δημιουργία βιβλιοθηκών cDNA από αγγελιαφόρο RNA. Η εμπορική διαθεσιμότητα της αντίστροφης μεταγραφάσης βελτίωσε σημαντικά τη γνώση στον τομέα της μοριακής βιολογίας, καθώς, μαζί με άλλα ένζυμα, επέτρεψε στους επιστήμονες να κλωνοποιήσουν, να αλληλουχήσουν και να χαρακτηρίσουν το RNA. animation of reverse transcriptase action and three reverse transcriptase inhibitors Molecule of the month Αρχειοθετήθηκε 2020-04-09 στο Wayback Machine. (September 2002) at the RCSB PDB HIV Replication 3D Medical Animation. (Nov 2008). Video by Boehringer Ingelheim. Goodsell DS. «Molecule of the Month: Reverse Transcriptase (Sep 2002)». Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB). Αρχειοθετήθηκε από το πρωτότυπο στις 19 Οκτωβρίου 2015. Ανακτήθηκε στις 13 Ιανουαρίου 2013.