Δοκιμές ανίχνευσης αντιγόνου ελονοσίας

Οι δοκιμασίες ανίχνευσης αντιγόνου ελονοσίας είναι μια ομάδα εμπορικά διαθέσιμων ταχέων διαγνωστικών δοκιμασιών τύπου ταχείας δοκιμασίας αντιγόνου, οι οποίες επιτρέπουν τη γρήγορη διάγνωση της ελονοσίας από άτομα που δεν είναι ειδικευμένα στις παραδοσιακές εργαστηριακές τεχνικές διάγνωσης της ελονοσίας ή σε καταστάσεις όπου δεν υπάρχει διαθέσιμος τέτοιος εξοπλισμός. Επί του παρόντος υπάρχουν πάνω από 20 τέτοιες δοκιμασίες στο εμπόριο (WHO product testing 2008). Το πρώτο αντιγόνο της ελονοσίας που ήταν κατάλληλο ως στόχος για ένα τέτοιο τεστ ήταν ένα διαλυτό γλυκολυτικό ένζυμο γλουταμινική αφυδρογονάση. Καμία από τις ταχείες δοκιμές δεν είναι επί του παρόντος τόσο ευαίσθητη όσο ένα παχύ φιλμ αίματος, ούτε τόσο φθηνή. Ένα σημαντικό μειονέκτημα στη χρήση όλων των σημερινών μεθόδων με δείγμα είναι ότι το αποτέλεσμα είναι ουσιαστικά ποιοτικό. Σε πολλές ενδηµικές περιοχές της τροπικής Αφρικής, ωστόσο, η ποσοτική εκτίµηση της παρασιταιµίας είναι σηµαντική, καθώς ένα µεγάλο ποσοστό του πληθυσµού θα είναι θετικό σε οποιαδήποτε ποιοτική δοκιµασία.

 Η ελονοσία είναι μια ιάσιμη ασθένεια εάν οι ασθενείς έχουν πρόσβαση σε έγκαιρη διάγνωση και άμεση θεραπεία. Οι ταχείες διαγνωστικές δοκιμασίες με βάση το αντιγόνο (RDTs) έχουν σημαντικό ρόλο στην περιφέρεια της ικανότητας των υπηρεσιών υγείας, επειδή πολλές αγροτικές κλινικές δεν έχουν τη δυνατότητα να διαγνώσουν την ελονοσία επί τόπου λόγω έλλειψης μικροσκοπίων και εκπαιδευμένων τεχνικών για την αξιολόγηση των φιλμ αίματος. Επιπλέον, σε περιοχές όπου η ασθένεια δεν ενδημεί, οι τεχνολόγοι εργαστηρίων έχουν πολύ περιορισμένη εμπειρία στην ανίχνευση και ταυτοποίηση παρασίτων της ελονοσίας. Ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός ταξιδιωτών από εύκρατες περιοχές κάθε χρόνο επισκέπτεται τροπικές χώρες και πολλοί από αυτούς επιστρέφουν με λοίμωξη από ελονοσία. Οι εξετάσεις RDT εξακολουθούν να θεωρούνται συμπλήρωμα της συμβατικής μικροσκοπίας, αλλά με κάποιες βελτιώσεις μπορεί κάλλιστα να αντικαταστήσει το μικροσκόπιο. Οι εξετάσεις είναι απλές και η διαδικασία μπορεί να εκτελεστεί επί τόπου σε συνθήκες πεδίου. Οι εξετάσεις αυτές χρησιμοποιούν αίμα από δάκτυλο ή φλέβα, η ολοκληρωμένη εξέταση διαρκεί συνολικά 15-20 λεπτά και δεν απαιτείται εργαστήριο. Το όριο ανίχνευσης με αυτές τις ταχείες διαγνωστικές δοκιμές είναι της τάξης των 100 παρασίτων/μl αίματος σε σύγκριση με 5 με τη μικροσκοπία παχιάς μεμβράνης. Γλουταμινική αφυδρογονάση του πλασμοντίου (pGluDH) κατακρημνισμένη από αντισώματα του ξενιστή Η ακριβής διάγνωση γίνεται όλο και πιο σημαντική, λόγω της αυξανόμενης ανθεκτικότητας του Plasmodium falciparum και της υψηλής τιμής των εναλλακτικών της χλωροκίνης. Το ένζυμο pGluDH δεν εμφανίζεται στα ερυθρά αιμοσφαίρια του ξενιστή και συστήθηκε ως ένζυμο-δείκτης για τα είδη Plasmodium από τους Picard-Maureau και συν. το 1975. Η εξέταση ενζύμου-δείκτη ελονοσίας είναι κατάλληλη για εργασίες ρουτίνας και αποτελεί πλέον τυποποιημένη εξέταση στα περισσότερα τμήματα που ασχολούνται με την ελονοσία. Η παρουσία της pGluDH είναι γνωστό ότι αντιπροσωπεύει τη βιωσιμότητα των παρασίτων και μια ταχεία διαγνωστική δοκιμασία που χρησιμοποιεί την pGluDH ως αντιγόνο θα έχει τη δυνατότητα να διακρίνει τους ζωντανούς από τους νεκρούς οργανισμούς. Μια πλήρης RDT με αντιγόνο την pGluDH έχει αναπτυχθεί στην Κίνα και υποβάλλεται τώρα σε κλινικές δοκιμές. Οι GluDHs είναι πανταχού παρόντα ένζυμα που καταλαμβάνουν ένα σημαντικό σημείο διακλάδωσης μεταξύ του μεταβολισμού του άνθρακα και του αζώτου. Τόσο τα ένζυμα GluDH [EC 1.4.1.2] που εξαρτώνται από το δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου αδενίνης (NAD) όσο και τα ένζυμα GluDH [EC 1.4.1.4] που εξαρτώνται από το φωσφορικό δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου (NADP) είναι παρόντα στα Plasmodia- η GluDH που εξαρτάται από το NAD είναι σχετικά ασταθής και μη χρήσιμη για διαγνωστικούς σκοπούς. Η αφυδρογονάση του γλουταμινικού παρέχει μια οξειδώσιμη πηγή άνθρακα που χρησιμοποιείται για την παραγωγή ενέργειας καθώς και έναν ανηγμένο φορέα ηλεκτρονίων, το NADH. Το γλουταμινικό είναι ένας κύριος αμινοδότης για άλλα αμινοξέα σε επακόλουθες αντιδράσεις μεταμόρφωσης. Οι πολλαπλοί ρόλοι του γλουταμινικού στην ισορροπία του αζώτου το καθιστούν πύλη μεταξύ της ελεύθερης αμμωνίας και των αμινομάδων των περισσότερων αμινοξέων. Η κρυσταλλική δομή του έχει δημοσιευθεί. Η δραστικότητα της GluDH στις P.vivax, P.ovale και P. malariae δεν έχει ελεγχθεί ποτέ, αλλά δεδομένης της σημασίας της GluDH ως ενζύμου σημείου διακλάδωσης, κάθε κύτταρο πρέπει να έχει υψηλή συγκέντρωση GluDH. Είναι γνωστό ότι τα ένζυμα με υψηλό μοριακό βάρος (όπως η GluDH) έχουν πολλά ισοένζυμα, γεγονός που επιτρέπει τη διαφοροποίηση των στελεχών (δεδομένου του κατάλληλου μονοκλωνικού αντισώματος). Ο ξενιστής παράγει αντισώματα έναντι του παρασιτικού ενζύμου που υποδεικνύουν χαμηλή ταυτότητα αλληλουχίας. Η πλούσια σε ιστιδίνη πρωτεΐνη II (HRP II) είναι μια πλούσια σε ιστιδίνη και αλανίνη, υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα, συμπεριλαμβανομένου του κυτταροπλάσματος του παρασίτου. Το αντιγόνο εκφράζεται μόνο από τους τροφοζωίτες του P. falciparum. Η HRP II από το P. falciparum έχει εμπλακεί στη βιοκρυστάλλωση της ημοζοΐνης, μιας αδρανούς, κρυσταλλικής μορφής της σιδηροπρωτοπορφυρίνης IX (Fe(3+)-PPIX) που παράγεται από το παράσιτο. Σημαντική ποσότητα της HRP II εκκρίνεται από το παράσιτο στην κυκλοφορία του αίματος του ξενιστή και το αντιγόνο μπορεί να ανιχνευθεί στα ερυθροκύτταρα, στον ορό, στο πλάσμα, στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ακόμη και στα ούρα ως εκκρινόμενη υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη. Τα αντιγόνα αυτά παραμένουν στο κυκλοφορούν αίμα μετά την εκκαθάριση ή τη μεγάλη μείωση της παρασιταιμίας. Χρειάζονται γενικά περίπου δύο εβδομάδες μετά την επιτυχή θεραπεία για να αποδειχθούν αρνητικές οι εξετάσεις με βάση την HRP2, αλλά μπορεί να χρειαστούν έως και ένα μήνα, γεγονός που μειώνει την αξία τους στην ανίχνευση ενεργού λοίμωξης. Αναφέρθηκαν ψευδώς θετικά αποτελέσματα δείγματος σε ασθενείς με θετικό ρευματοειδή παράγοντα ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Δεδομένου ότι η HRP-2 εκφράζεται μόνο από το P. falciparum, αυτές οι δοκιμασίες θα δώσουν αρνητικά αποτελέσματα με δείγματα που περιέχουν μόνο P. vivax, P. ovale ή P. malariae- πολλές περιπτώσεις ελονοσίας που δεν ανήκουν στο Falciparum μπορεί επομένως να διαγνωστούν λανθασμένα ως αρνητικές για ελονοσία (ορισμένα στελέχη του P. falciparum δεν διαθέτουν επίσης HRP II). Η μεταβλητότητα των αποτελεσμάτων των RDT με βάση την pHRP2 σχετίζεται με τη μεταβλητότητα του αντιγόνου-στόχου. Η γαλακτική αφυδρογονάση του P. falciparum (PfLDH) είναι μια οξειδοαναγωγάση 33 kDa [EC 1.1.1.1.27]. Είναι το τελευταίο ένζυμο της γλυκολυτικής οδού, απαραίτητο για την παραγωγή ΑΤΡ και ένα από τα πιο άφθονα ένζυμα που εκφράζονται από το P. falciparum. Η Plasmodium LDH (pLDH) από P. vivax, P. malariae και P. ovale) παρουσιάζει 90-92% ταυτότητα με την PfLDH από P. falciparum. Τα επίπεδα της pLDH έχει παρατηρηθεί ότι μειώνονται στο αίμα νωρίτερα μετά από θεραπεία από ό,τι η HRP2. Από την άποψη αυτή, η pLDH είναι παρόμοια με την pGluDH. Ωστόσο, οι κινητικές ιδιότητες και οι ευαισθησίες σε αναστολείς που στοχεύουν στη θέση πρόσδεσης του συμπαράγοντα διαφέρουν σημαντικά και μπορούν να προσδιοριστούν με τη μέτρηση των σταθερών διάστασης για αναστολείς οι οποίες, διαφέρουν έως και 21 φορές. Η αλδολάση της διφωσφορικής φρουκτόζης [EC 4.1.2.13] καταλύει μια αντίδραση-κλειδί στη γλυκόλυση και την παραγωγή ενέργειας και παράγεται και από τα τέσσερα είδη. Η αλδολάση του P.falciparum είναι μια πρωτεΐνη 41 kDa και έχει 61-68% ομοιότητα αλληλουχίας με τις γνωστές ευκαρυωτικές αλδολάσες. Η κρυσταλλική δομή της έχει δημοσιευθεί. Η παρουσία αντισωμάτων έναντι της p41 στους ορούς ανθρώπινων ενηλίκων με μερική ανοσία στην ελονοσία υποδηλώνει ότι η p41 εμπλέκεται στην προστατευτική ανοσολογική απόκριση έναντι του παρασίτου. Malaria Antibodies Roll back malaria WHO product testing 2008 WHO Rapid Diagnostic Tests (RDTs)