Γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα στην εξελικτική - αναπτυξιακή βιολογία

Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα (GRNs) αποτελούν σύνολα μοριακών ρυθμιστών, οι οποίοι αλληλεπιδρούν τόσο μεταξύ τους όσο και με άλλα συστατικά του κυττάρου, καθορίζοντας τα επίπεδα έκφρασης του mRNA, επομένως και των πρωτεϊνών. Τα δίκτυα αυτά θεωρείται ότι διαδραματίζουν εξέχοντα ρόλο στην μορφογένεση και στη δημιουργία των δομών του σώματος όπως τις γνωρίζουμε, τα οποία με τη σειρά τους φέρουν κεντρική σημασία για την εξελικτική αναπτυξιακή βιολογία (Evolutionary developmental biology, evo-devo). Η evo-devo αποτελεί πεδίο βιολογικής έρευνας και αναφέρεται στη μελέτη αναπτυξιακών προγραμμάτων και μοτίβων υπό μια εξελικτική προοπτική. Συγκρίνοντας τις αναπτυξιακές διαδικασίες διαφόρων οργανισμών και εντοπίζοντας τις προγονικές σχέσεις μεταξύ τους, επιδιώκεται η κατανόηση των διαφόρων επιρροών που διαμορφώνουν τη μορφή και τη φύση της ζωής στον πλανήτη.Οι οργανισμοί αποκτούν τη μορφή και τη λειτουργία τους μέσω ενός περίπλοκου δικτύου κανονιστικών σχέσεων μεταξύ DNA, RNA, πρωτεϊνών και μεταβολιτών. Συγκεκριμένα, μοριακές γενετικές μελέτες οργανισμών μοντέλων υποδεικνύουν ότι οι αναπτυξιακές διαδικασίες ελέγχονται συνήθως από τα προαναφερθέντα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα, τα συστατικά των οποίων συνδέονται μεταξύ τους με διάφορους τύπους ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων και τελικά υπαγορεύουν τα πρότυπα έκφρασης σε ένα κύτταρο. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι αλλαγές στα δίκτυα αυτά οδηγούν στην εμφάνιση φαινοτυπικών καινοτομιών αποτελεί σημαντική πρόκληση για την evo-devo.

 Ο τομέας της evo-devo ξεκίνησε να αναπτύσσεται στις αρχές του 19ου αιώνα. Η δημοσίευση της εργασίας «Η προέλευση των ειδών» από τον Κάρολο Δαρβίνο (1859) και η θεωρία του Ernst Haeckel η οποία συσχετίζει την οντογένεια με τη φυλογένεια (1866), ώθησε τους εξελικτικούς εμβρυολόγους και μορφολόγους της εποχής να μελετήσουν την evo-devo. Από τα τέλη της δεκαετίας του 1860 μέχρι τα μέσα της δεκαετίας του 1880, η εξελικτική εμβρυολογία κέντρισε το ενδιαφέρον των καλύτερων ζωολόγων της εποχής. Ωστόσο, μετά τη δεκαετία του 1880 αυξήθηκαν οι πειραματικές και φυσιολογικές προσεγγίσεις για την μελέτη της εμβρυικής εξέλιξης και παράλληλα ήρθαν στο προσκήνιο τα πειράματα του Γκρέγκορ Μέντελ και οι νόμοι της μεντελιανής κληρονομικότητας. Τα γεγονότα αυτά είχαν ως αποτέλεσμα πολύ μικρή πρόοδο της evo-devo για περίπου ένα αιώνα, μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1970. Το 1977, η τεχνολογία του ανασυνδιασμένου DNA στη γενετική, καθώς και το βιβλίο του Stephen J. Gould «Οντογένεια και Φυλογένεια», επανέφεραν το ενδιαφέρον για την μελέτη της evo-devo. Το 1978, ο Έντουαρντ Λούις (Edward B. Lewis) ανακάλυψε τα ομοιοτικά γονίδια, τα οποία είναι υπεύθυνα για την οριοθέτηση της πρόσθιας, οπίσθιας, ραχιαίας και κοιλιακής πλευράς στο έμβρυο του είδους Drosophila melanogaster. Γρήγορα διαπιστώθηκε πως όλα τα ζώα, καθώς και τα φυτά και οι μύκητες διαθέτουν ομοιοτικά γονίδια, γεγονός το οποίο έδωσε ακόμα μεγαλύτερη ώθηση στην μελέτη της evo-devo.Σήμερα, οι τεχνολογικές πρόοδοι στον τομέα των βιολογικών αναλύσεων και οι συνεχείς βελτιώσεις στην αποδοτικότητα, σε συνδυασμό με τη μείωση του κόστους της αλληλούχησης, συνεισφέρουν σε μεγάλο βαθμό στην κατανόηση της πολυπλοκότητας των μεταγραφημάτων διαφόρων οργανισμών και της γονιδιακής τους ρύθμισης. Αυτή η έκρηξη δεδομένων γονιδιακής κλίμακας προώθησε την ανάπτυξη υπολογιστικών μεθόδων, επιτρέποντας μια περισσότερο ολοκληρωμένη μελέτη για το πώς τα μόρια δημιουργούν διαφορετικούς φαινοτύπους. Συγκεκριμένα, η ανάλυση δικτύων, η οποία αποτελεί παρακλάδι της θεωρίας γράφων των μαθηματικών και της επιστήμης των υπολογιστών, κατέστησε δυνατή τη μοντελοποίηση των σχέσεων μεταξύ μονάδων βιολογικών δεδομένων. Το πεδίο της evo-devo αξιοποιεί τα δεδομένα αυτά με σκοπό την καλύτερη κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι οργανισμοί αναπτύσσονται, εξελίσσονται και ανταποκρίνονται στα βιοτικά και αβιοτικά ερεθίσματα. Τα πρώτα δίκτυα που σχετίζονταν με την evo-devo (όπως αυτό του Davidson et al. ) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας απευθείας πειραματικά δεδομένα για την αναπαράσταση ενός κατευθυνόμενου δικτύου. Παρ’ ότι αυτά τα δίκτυα ήταν μικρά σε μέγεθος (περίπου 40 γονίδια), αποτέλεσαν ένα μεγάλο βήμα στην κατανόηση των αναπτυξιακών διαδικασιών. Αυτά τα πρώτα μοντέλα δικτύων αποτελούνταν από ένα ή δύο τύπους μαθηματικών μοντέλων, το Λογικό ή Boolean μοντέλο (δυαδικά) και το δυναμικό μοντέλο συστημάτων. Ένα Boolean δίκτυο αποτελείται από γονίδια-κόμβους που μπορούν να έχουν δύο μόνο καταστάσεις και άρα να πάρουν δύο τιμές: Ενεργοποιημένη (1) ή απενεργοποιημένη (0) και η οποία μπορεί να ρυθμίζεται κατ’ επέκταση από άλλα γονίδια. Αυτή η μέθοδος μπορεί να ερμηνεύσει βρόχους ανάδρασης (feedback loops) καθώς και γονίδια που ρυθμίζουν τη δραστηριότητα άλλων γονιδίων (όπως μεταγραφικοί παράγοντες), αλλά αδυνατεί να ερμηνεύσει μεταβαλλόμενες καταστάσεις έκφρασης ενός γονιδίου καθώς αυτό, με βάση το συγκεκριμένο μοντέλο, μπορεί να βρίσκεται σε δύο μόνο καταστάσεις μέσα στο κύτταρο. Τα δυναμικά συστήματα αντιθέτως χρησιμοποιούν διαφορικές εξισώσεις οι οποίες επιτρέπουν την ερμηνεία μεταβαλλόμενων καταστάσεων έκφρασης γονιδίων και μη γραμμικών αλληλεπιδράσεων. Βέβαια τα μοντέλα αυτά είναι αρκετά περιορισμένα ως προς την υπολογιστική δύναμη.Μελέτες evo-devo έχουν υπογραμμίσει τη σημασία της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στην εξέλιξη και στην ανάπτυξη των οργανισμών, υποδηλώνοντας την σύνδεση των αναπτυξιακών γενετικών ρυθμιστικών δικτύων (GRNs) με την εξέλιξη . Για να κατανοηθεί όμως αυτή η σύνδεση και να γίνουν αντιληπτές οι πληροφορίες που παρέχουν τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα σχετικά με την εξέλιξη και την ανάπτυξη, χρειάζεται να αναφερθούν τα τμήματα που απαρτίζουν τέτοια δίκτυα. Ο εντοπισμός -μέσω της μελέτης των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων- γονιδίων και/ή συστατικών των δικτύων που συνεισφέρουν σημαντικά στην εξέλιξη των οργανισμών, αποτελεί σημαντικό στόχο με μεγάλο ενδιαφέρον για την evo-devo . Σε ένα γενετικό ρυθμιστικό δίκτυο οι κόμβοι αντιπροσωπεύουν τα γονίδια (ή τα συστατικά αυτών) και οι ακμές τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους (όπως η στόχευση γονιδίων για ενεργοποίηση ή καταστολή). Κόμβοι που φέρουν εξαιρετικά υψηλό βαθμό συνδεσιμότητας ονομάζονται υπερκόμβοι (hubs) και θεωρούνται απαραίτητοι για πολλές κυτταρικές λειτουργίες και για τη βιωσιμότητα των οργανισμών. Τα γονίδια υπερκόμβων αντιπροσωπεύουν ένα μικρό ποσοστό κόμβων με μέγιστη ανταλλαγή πληροφοριών με άλλους κόμβους και τείνουν να συνδέονται με ουσιαστικούς ρόλους στις βιολογικές διεργασίες. Θεωρείται ότι η εξέλιξη και η ανάπτυξη πιθανόν να ρυθμίζονται από τέτοια τμήματα των δικτύων όπου οι παράγοντες μεταγραφής λειτουργούν ως γονίδια υπερκόμβων. Αυτά τα γονίδια, εντοπίζονται κεντρικά του δικτύου αλληλεπιδράσεων και θεωρούνται ότι δρουν ως ρυθμιστές πολλών άλλων ρυθμιστικών γονιδίων. Επιπλέον, γονίδια που είναι πολύ διασυνδεδεμένα στο δίκτυο συνήθως εμπλέκονται στις ίδιες βιολογικές μονάδες του δικτύου ή στα ίδια μονοπάτια. Από την άλλη, τα μη ρυθμιστικά γονίδια εντοπίζονται στην περιφέρεια του δικτύου και συνδέονται με λίγα γονίδια, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με ακόμη λιγότερα ή μηδέν γονίδια. Αν και μερικά περιφερειακά γονίδια μπορεί να είναι ρυθμιστικά, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιούν παράγοντες μεταγραφής, ένα δίκτυο ρυθμιστικών γονιδιακών αλληλεπιδράσεων, τοποθετώντας τα στην περιφέρεια, φανερώνει γι' αυτά μικρή σχέση με το σύστημα ελέγχου. Ο τεράστιος όγκος των διαθέσιμων δεδομένων μεταγραφομικής για ολόκληρα γονιδιώματα, πλέον έχει καταστήσει την κατασκευή των δικτύων τους άμεσα διαθέσιμη για τους περισσότερους ερευνητές. Για την κατασκευή και ανάλυση ενός τέτοιου δικτύου, τα δεδομένα που παρέχονται από τεχνικές όπως RNA-seq ή μικροσυστοιχίες (microarray) αρχικά κανονικοποιούνται κατάλληλα. Στη συνέχεια τα γονίδια χρειάζεται να ομαδοποιηθούν σε υποσύνολα προκειμένου να διευκολυνθεί η απεικόνιση των δεδομένων. Αυτό το στάδιο περιλαμβάνει μεθόδους διαφορικής γονιδιακής έκφρασης (differential gene expression, DGE) και ομαδοποίησης (clustering) όπως η ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis, PCA), οι αυτό-οργανωμένοι χάρτες (self-organizing maps, SOM) και t-distributed stochastic neighbor embedding, t-SNE . Μέθοδοι Ομαδοποίησης γονιδίων (Grouping) Κάθε μία από τις μεθοδολογίες που αναφέρονται αποτελούν τεχνικές μείωσης διαστάσεων (Dimensionality Reduction – DR) που προσπαθούν να προβάλουν ένα σύνολο από διανύσματα υψηλής διάστασης σε ένα χώρο χαμηλότερης διάστασης. Με αυτόν τον τρόπο οι τεχνικές αυτές μειώνουν την πολυπλοκότητα των δικτύων μετατρέποντας τα σε δυσδιάστατες, εύκολα ερμηνεύσιμες και αντιπροσωπευτικές δομές. Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis – PCA) είναι μία στατιστική διαδικασία για τη μείωση των διαστάσεων η οποία μετατρέπει μία ομάδα τιμών (παρατηρήσεων), δυνητικά συσχετιζόμενων μεταβλητών, σε μία ομάδα νέων τιμών, μη γραμμικά συσχετιζόμενων μεταβλητών, οι οποίες καλούνται κύριες συνιστώσες. Βέβαια το αποτέλεσμα δεν αντιπροσωπεύει συχνά την πραγματική συσχέτιση των γονιδίων.Ο αλγόριθµος k-means (k-µέσων) είναι ένας αλγόριθµος που οµαδοποιεί τις τιμές βάσει των χαρακτηριστικών των k ομάδων (clusters). Αποτελεί μεταβλητή του αλγόριθμου μεγιστοποίησης αναµονής (expectation-maximization algorithm-EM). Η χρήση αυτού δίνει μία καλύτερη αναπαράσταση της σχέσης των αντικειμένων.Οι ιεραρχικοί αλγόριθμοι ομαδοποίησης δημιουργούν ένα ιεραρχικό δέντρο με κόμβους που αναπαριστούν τα clusters μέσω πολλαπλών διαφορετικών μεθόδων. Αν και η ιεραρχική ομαδοποίηση παρέχει πιο «ενημερωμένο» αποτέλεσμα, λάθη συγχώνευσης μπορεί να οδηγήσουν σε απώλεια σημαντικών ομάδων γονιδίων .Όλες oι παραπάνω μέθοδοι βασίζονται σε Ευκλείδειες αποστάσεις για μέτρα ομοιότητας/ ανομοιότητας μεταξύ γονιδίων εντός χώρων υψηλών διαστάσεων, οι οποίοι από τη φύση τους, δεν περιορίζονται εύκολα σε γραμμικές σχέσεις. Oι αυτό-οργανωμένοι χάρτες (self-organizing maps, SOM) και τα t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) χρησιμοποιούν μη γραμμικά μέτρα απόστασης για την προσέγγιση της σχέσης μεταξύ των γονιδίων στον χώρο υψηλών διαστάσεων και συνεπώς παρέχουν μια πιο ρεαλιστική αναπαράσταση της ομοιότητας γονιδίων στις δύο διαστάσεις.Αυτή η κατανομή των εκφραζόμενων γονιδίων διευκολύνει όχι μόνο την απεικόνιση των δεδομένων αλλά και την εστίαση της ανάλυσης σε εξειδικευμένα βιολογικά ερωτήματα. Μετά τον διαχωρισμό των γονιδίων σε ομάδες με παρόμοια πρότυπα έκφρασης πραγματοποιούνται δοκιμές για τον εντοπισμό της φύσης των γονιδίων (gene ontology κ.ά.) μέσα στις ομάδες . Στη συνέχεια πραγματοποιείται η κατασκευή των δικτύων. Κατασκευή δικτύων (Network construction) Υπάρχουν τρείς κύριοι τύποι δικτύου που χρησιμοποιούνται στην evo-devo: Τα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα, που είναι κατευθυνόμενα ως προς την αλληλεπίδραση μεταξύ των κόμβων/γονιδίων Τα δίκτυα σύνδεσης (association networks), τα οποία είναι μη κατευθυνόμενα και δείχνουν τις άμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ συσχετιζόμενων γονιδίων και Τα γενετικά δίκτυα συνέκφρασης (gene coexpression networks-GCN), τα οποία είναι μη κατευθυνόμενα και μπορούν να δείξουν άμεσες ή έμμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γονιδίων. Με τα σύνολα των μεταγραφικών δεδομένων που υπάρχουν διαθέσιμα, τα GCN αποτελούν το πιο ευέλικτο εργαλείο για την μελέτη αλληλεπίδρασης γονιδίων, χρησιμοποιώντας τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης για τον προσδιορισμό πιθανών συσχετίσεων . Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο με οργανισμούς μη μοντέλα στα οποία η λειτουργία των περισσότερων γονιδίων δεν έχει προσδιοριστεί και συνεπώς οι ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις παραμένουν άγνωστες.Τα δίκτυα συνέκφρασης γονιδίων (GCN) χρησιμοποιούν κατά κύριο λόγο δύο μεθόδους κατασκευής: (Α) Η πρώτη στηρίζεται στη συσχέτιση, και στις περισσότερες περιπτώσεις στoν συντελεστή συσχέτισης Pearson, για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονιδίων. Έτσι, η βαθμιαία συσχέτιση γονιδίου με ένα άλλο δημιουργεί την συνολική αρχιτεκτονική του δικτύου. Ο συντελεστής συσχέτισης του Pearson δίνει ένα μέτρο της γραμμικής συσχέτισης μεταξύ δύο μεταβλητών (γονιδίων), αλλά αδυνατεί να ερμηνεύσει ακραίες τιμές ή συσχετίσεις γονιδίων οι οποίες δεν είναι γραμμικές. Ο Συντελεστής συσχέτισης του Spearman αντιμετωπίζει αυτά τα προβλήματα ερμηνεύοντας ακραίες τιμές και συσχετίσεις γονιδίων οι οποίες δεν είναι γραμμικές. (Β) Η δεύτερη ανήκει στις εποπτικές μεθόδους (supervised methods), στις οποίες χρησιμοποιείται σύνολο γονιδίων σαν προβλέψεις για την σχέση αλληλεπίδρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Με αυτό τον τρόπο δημιουργείται ένα περισσότερο κατευθυνόμενο δίκτυο. Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να αντιμετωπίζει καλύτερα μεταβαλλόμενες εκφράσεις των γονιδίων, όμως είναι λιγότερο αξιόπιστη στην περίπτωση μελέτης των βρόχων ανάδρασης. Ο συνδυασμός διάφορων μαθηματικών τεχνικών είναι προτιμότερος για την επίτευξη μιας ακριβέστερης αναπαράστασης των συσχετίσεων των γονιδίων. Τα GCNs μπορούν να αναδείξουν τις αλληλεπιδράσεις και βιολογικές λειτουργίες και είναι χρήσιμες τόσο σε οργανισμούς μοντέλα, όσο και σε μη. Άλλες μέθοδοι περιλαμβάνουν πιθανολογικά μοντέλα (probabilistic graphical models-PGMs) στα οποία ανήκουν τα Bayesian και τα Markov μοντέλα.Τα Bayesian αποτελούν κατευθυνόμενα δίκτυα, παρέχοντας με αυτόν τον τρόπο κατεύθυνση στην σχέση των γονιδίων του δικτύου. Με την κατασκευή του GCN δικτύου, προσδιορίζεται στη συνέχεια η αλληλεπίδραση μεταξύ των γονιδίων καθώς και άλλες πληροφορίες, όπως λειτουργικότητα γονιδίων και οι βιολογικές διεργασίες που ρυθμίζονται. Η χρήση συγκριτικών GCN και ανάλυση των συγκεκριμένων δικτύων σε διαφορετικά είδη μπορεί να δώσει πιο ακριβείς λειτουργικότητες γονιδίων στα είδη καθώς συντηρημένα γονίδια μπορεί να σχετίζονται λειτουργικά. Μία από τις πιο ελκυστικές πτυχές των GCN είναι ότι ολόκληρα δεδομένα μεταγραφομικής μπορούν να συνδυαστούν με άλλα δίκτυα μεγάλης κλίμακας όπως τα μεταβολομικά ή τα δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, παρέχοντας μεγαλύτερη εικόνα για την πραγματική φύση των βιολογικών διαδικασιών στις οποίες ανήκουν οι ομάδες των γονιδίων. Βέβαια, πλέον τα διαθέσιμα μεταγραφομικά δεδομένα υπερβαίνουν κατά πολύ τις υπολογιστικές δυνατότητες, αποτελώντας τροχοπέδη για τους ερευνητές παρά βοήθεια. Η ανάλυση και σύγκριση γενετικών ρυθμιστικών δικτύων που βασίζεται σε αναπτυξιακές διεργασίες διαφόρων ειδών δύναται να εντοπίσει ομοιότητες και διαφορές μεταξύ των συνιστωσών τους και των αλληλεπιδράσεών τους. Ο παρουσία ομοιοτήτων στα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα μεταξύ δύο ειδών πιθανόν να υποδεικνύει τη συντήρηση μοτίβων κατά μήκος των γενεών και την παρουσία κοινής εξελικτικής προέλευσης. Ωστόσο, για να προσδιοριστεί εάν ένα δεδομένο συστατικό ενός γενετικού ρυθμιστικού δικτύου (λόγου χάρη μια ομάδα συνρυθμιζόμενων γονιδίων) αποτελεί προϊόν εξελικτικής συντήρησης ή σύγκλισης, είναι απαραίτητο να δείξουμε ότι τα υπό εξέταση στοιχεία του δικτύου αντιπροσωπεύουν πραγματικά πολύπλοκα μοτίβα. Συγκεκριμένα, εάν τα στοιχεία του δικτύου είναι ανεξάρτητα (δηλαδή εάν μπορούν να μεταβληθούν ) και οι συσχετίσεις μεταξύ δύο ή περισσοτέρων στοιχείων είναι πολύπλοκες, τότε μόνο μπορεί να ειπωθεί ότι το υπό μελέτη μοτίβο είναι πραγματικά πολύπλοκο κι έτσι τόσο πιο εύλογη θεωρείται η υπόθεση παρουσίας κοινής εξελικτικής προέλευσης. Όπως παρατηρείται, η μελέτη των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων παρέχει εξαιρετικά μεγάλες δυνατότητες άντλησης πληροφοριών σχετικών με την εξέλιξη και την ανάπτυξη της ζωής στη φύση. Ωστόσο, μέχρι το στάδιο της ουσιαστικής αξιοποίησης αυτών των πληροφοριών, μεσολαβούν ενδιάμεσα στάδια κατά τα οποία πραγματοποιείται συγκριτική ανάλυση δικτύων διαφόρων ταξινομικών κατηγοριών προκειμένου να συλλεχθούν δεδομένα προς αποσαφήνιση. Η μελέτη και ανάλυση των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων στηρίζεται σε μια συγκριτική προσέγγιση για τον εντοπισμό, αρχικά, ομόλογων χαρακτήρων μεταξύ δύο ή περισσοτέρων ταξινομικών ομάδων (όπως κλάσεις, τάξεις κλπ). Εν συνεχεία, επιλέγεται η περισσότερο σύντομη υπόθεση σχετικά με την προέλευσή τους και πραγματοποιείται διάκριση μεταξύ παλαιότερων και νεότερων εξελικτικών χαρακτήρων. Διαδικασία ανάλυσης Κύριο άρθρο: Evo–Devo in the Era of Gene Regulatory Networks Αρχικά, πραγματοποιείται μια εκτίμηση της ποσότητας των παρόμοιων γονιδίων ή των γονιδιακών προϊόντων που υπάρχουν μεταξύ των εν λόγω δικτύων. Ακολουθεί σύγκριση των αλληλεπιδράσεών τους, με σκοπό τον εντοπισμό εκείνων που εμφανίζονται επανειλημμένα ή είναι μοναδικές σε ορισμένα δίκτυα. Κατά κύριο λόγο αναμένεται ένα μεγάλο αλληλεπικαλυπτόμενο σύνολο γονιδίων μεταξύ όλων των συγκρινόμενων δικτύων με διαφορετικά μόνο ορισμένα γονίδια και αλληλεπιδράσεις. Εμπειρικά, 5 έως 10 γονίδια σε κάθε δίκτυο, θεωρούνται ο ελάχιστος ικανοποιητικός αριθμός για τέτοιες αναλυτικές συγκρίσεις.Επόμενο βήμα αποτελεί η επισήμανση εκείνων των γονιδίων που δεν περιλαμβάνονται σε κάθε συγκρινόμενο δίκτυο και η ανάλυση των αλληλεπιδράσεών τους, οι οποίες πολύ πιθανόν να διαφέρουν. Η μοναδικότητα αυτών των γονιδίων και των αλληλεπιδράσεων είναι σημαντική για την απόδειξη της ανεξαρτησίας των συγκρινόμενων στοιχείων του δικτύου (π.χ. ειδών οργανισμών).Μετά την αξιολόγηση και την επιβεβαίωση της ομολογίας, ακολουθεί η ανακατασκευή του γενετικού ρυθμιστικού δικτύου του τελευταίου κοινού προγόνου. Με αυτόν τον τρόπο, γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα άλλων ειδών μπορούν να συγκριθούν με αυτό, προκειμένου να ελεγχθεί εάν το υποθετικό προγονικό δίκτυο ισχύει ή πρέπει να επανατροποποιηθεί. Επιπλέον, παρέχεται η δυνατότητα ελέγχου για το ποια γονίδια ή αλληλεπιδράσεις αποτελούν τους πιο κοινούς παράγοντες που οδηγούν στην εμφάνιση διαφορών μεταξύ των ταξινομικών κατηγοριών.Συνοπτικά, παρότι η ανακατασκευή προγονικών δικτύων φέρει τεχνικές δυσκολίες - δεδομένου ότι απαιτεί πολυάριθμες τροποποιήσεις της γονιδιακής έκφρασης - ο έλεγχος ρυθμιστικών στοιχείων ή γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των ειδών δύναται να παρέχει εξαιρετικά σημαντικές πληροφορίες για την εξέλιξη και την ανάπτυξη της ζωής στη φύση. Αναλύσεις evo-devo κατά κανόνα ξεκινούν από ένα καλά εδραιωμένο, σε μελέτες, μοντέλο δικτύων μεταξύ τουλάχιστον δύο οργανισμών. Η κατανόηση των σχέσεων μεταξύ όλων των οργανισμών είναι, άλλωστε, ο βασικός στόχος των βιολογικών επιστημών. Ένα πρώτο βήμα στην evo-devo μελέτη είναι η σύγκριση μορφολογικών και αναπτυξιακών δεδομένων σε φυλογενετικά δέντρα με σκοπό την κατανόηση των μορφολογικών και αναπτυξιακών διεργασιών που έχουν λάβει μέρος. Πολυάριθμες μελέτες και συγκρίσεις γενετικών ρυθμιστικών δικτύων έχουν πραγματοποιηθεί τόσο σε οργανισμούς που αποτελούν μοντέλα στη βιολογία, όσο και σε οργανισμούς που δεν αποτελούν. Ένα μειονέκτημα, είναι ότι για μη οργανισμούς μοντέλα δεν έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες. Παρά τους πειραματικούς περιορισμούς, πολλές τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν για τη μελέτη των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων σε μη-οργανισμούς μοντέλα μέσω εύχρηστων και ευρέως χρησιμοποιούμενων τεχνικών, όπως η αλληλούγχιση του γονιδιώματος και η μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (protein-protein interactions, ppi) τους. Συγκρίνοντας τοπολογίες δικτύων διαφορετικών ειδών, μπορούμε να εξάγουμε συμπεράσματα για προγονικές καταστάσεις των δικτύων σε πολλά διαφορετικά επίπεδα, όσον αφορά τη φυσιολογία των οργανισμών. Σηματοδοτικό μονοπάτι SkeletogenicΠρόσφατες έρευνες στην ανάπτυξη του αχινού παρέχουν πληροφορίες για εξειδικευμένα γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα που οδηγούν σε κυτταρική διαφοροποίηση. Tα εμβρυικά κύτταρα του αχινού ανταγωνίζονται μεταξύ τους για την επαγωγή του σκελετογονικού ρυθμιστικού δικτύου (skeletogenic GRN) και τη δημιουργία του σκελετού. Αυτό σημαίνει ότι οποιοδήποτε κύτταρο του εμβρύου μπορεί να ενεργοποιήσει το συγκεκριμένο μονοπάτι. Τα πρώτα μεσεγχυματικά κύτταρα του εμβρύου είναι εκέινα που επάγουν το συγκεκριμένο δίκτυο. KNOX γονίδια στην τομάτα Αναλύσεις γενετικών δικτύων στην καλλιεργούμενη τομάτα και στα αγρίου τύπου συγγενικά είδη της, έχουν αποκαλύψει τη δομή των γενετικών ρυθμιστικών δικτύων τους, σχετικών με την ανάπτυξη των φύλλων τους. Συγκριτικές αναλύσεις των δικτύων μεταξύ των ειδών ταυτόχρονα με πειραματικές μελέτες , εντόπισαν την παρουσία ενός μικρότερου περιφερειακού υποδικτύου υπεύθυνου για τη ρύθμιση της φυλλικής πολυπλοκότητας, το οποίο φαίνεται να επηρεάζει το κύριο δίκτυο που απαρτίζεται από ρυθμιστές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των φύλλων. Τα γονίδια των μεταγραφικών παραγόντων KNOX1 (KNOTTED-LIKE HOMEOBOX) εμφανίστηκαν να δρουν ως συνδετικός κρίκος των δικτύων. Συγκρίσεις δικτύων στα οποία πραγματοποιήθηκαν αλλαγές συστατικών ικανές να μεταβάλλουν τη ρύθμιση των KNOX, οδήγησαν σε παραλλαγές της φυλλικής πολυπλοκότητας, συμφωνώντας με παλαιότερες μελέτες evo-devo κατά τις οποίες αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες επανειλημμένα επηρέαζαν την μεταβολή του φυλλικού σχήματος. Τα δεδομένα αυτά και η θέση εντοπισμού των μεταγραφικών παραγόντων μεταξύ των δικτύων, καθιστά τα KNOX πιθανά εξελικτικά hotspots. Σηματοδοτικό μονοπάτι Hedgehog Χαρακτηριστικό παράδειγμα κατά την εξέταση της παρουσίας κοινής εξελικτικής προέλευσης μεταξύ οργανισμών, αποτελεί η μελέτη των συστατικών του σηματοδοτικού μονοπατιού Hedgehog, το οποίο εμπλέκεται σε πολλές αναπτυξιακές διεργασίες του υποβασιλείου των Ευμεταζώων. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που συντονίζουν το μονοπάτι, όπως αυτές της οικογένειας Patched και Smoothened και οι μεταγραφικοί παράγοντες Ci και Gli, είναι υψηλά συντηρημένες. Επιπλέον, οι ίδιες οι πρωτεΐνες είναι λειτουργικά εξαρτημένες μεταξύ τους, καθώς δεν μπορούν να μεταβληθούν χωρίς να προκληθεί μεταβολή στα υπόλοιπα συστατικά του δικτύου. Ανθογένεση στα φυτά Arabidopsis thaliana και Cardamine hirsute Παράδειγμα οργανισμών, όσον αφορά τα φυτά που έχουν μελετηθεί, αποτελεί το ζευγάρι οργανισμών Arabidopsis thaliana και Cardamine hirsuta και αφορά την ανθογένεση. Τα δύο αυτά φυτά διαφέρουν στην μορφολογία του φύλλου και την δομή του άνθους. Βέβαια, ο δεύτερος οργανισμός δεν αποτελεί οργανισμό μοντέλο στην βιολογία. Ανάλυση evo-devo των μοριακών μηχανισμών που επάγουν την ανθογένεση έχουν γίνει μόνο στο Arabidopsis thaliana. Στη συνέχεια μπορούμε, μέσω των μεθόδων που αναφέρονται παραπάνω, να μελετήσουμε το ίδιο ρυθμιστικό δίκτυο και στο Cardamine hirsuta. Μέσω σύγκρισης των δύο δικτύων, είναι δυνατό να βγάλουμε συμπεράσματα για ένα αρχέγονο δίκτυο από το οποίο προέκυψαν. Είναι θεωρητικά δύσκολο να πούμε ποιο είναι το μέλλον της evo-devo καθώς και το τι θα προσφέρει στο μέλλον. Παρόλα αυτά, είναι σίγουρο ότι η επιστήμη αυτή θα προσφέρει πολλές πληροφορίες στο πως αλλαγές στην ανάπτυξη σχετίζονται με αλλαγές στην εξέλιξη των οργανισμών. Η μείωση του κόστους αλληλούχισης του DNA και άλλων μοριακών τεχνικών (RNA seq, rtPCR) οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των οργανισμών που δεν αποτελούν μοντέλα στη βιολογία και μελέτης τους σε μικρό χρόνο. Επίσης, ο χαρακτηρισμός νέων μορίων μαρτύρων, όπως για παράδειγμα της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (red fluorescent protein, RFP) και η βελτιστοποίηση νέων τεχνικών (CRISP/Cas9) έχει συμβάλει επίσης στην μελέτη της evo-devo. Με αυτόν τον τρόπο, σύντομα θα έχουμε στα χέρια μας πληροφορίες για γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα από τεράστιο αριθμό οργανισμών και θα είναι δυνατή η σύγκριση μεταξύ τους για την κατασκευή της εξελικτικής τους διαμόρφωσης. Γενετικά ρυθμιστικά δίκτυα Εξελικτική βιολογία Μοντελοποίηση-Ανακατασκευή Βιολογικών Δικτύων