Αντιπυρηνικά αντισώματα

Τα αντιπυρηνικά αντισώματα' (ANAs, γνωστά και ως αντιγονικός πυρηνικός παράγοντας ή ANF) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα αυτοαντισωμάτων που στρέφονται κατά διαφόρων αντιγονικών συστατικών του πυρήνα όπως του DNA, ιστονικών και μη πρωτεϊνών. Η δοκιμασία ΑΝΑ μετρά το ποσοστό των αυτοαντισωμάτων, τα οποία επιτίθενται στον ανθρώπινο ιστό σαν να ήταν ξένο υλικό. Παρουσιάζονται σε υψηλότερο από το φυσιολογικό ποσοστό σε αυτοάνοσες ασθένειες. Στο γενικό πληθυσμό, τα αυτοαντισώματα εμφανίζουν χαμηλούς τίτλους, αλλά σε ποσοστό περίπου 5% του πληθυσμού υπάρχει μια τάση προς αύξηση, από το οποίο περίπου το 2,5% έχει τελικά μια αυτοάνοση ασθένεια.

 Η μελέτη των αντιπυρηνικών αντισωμάτων άρχισε το 1948 όταν οι Hargraves et al ανακάλυψαν τα κύτταρα λύκου (LE κύτταρα) στο μυελό των οστών μιας άρρωστης με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ). Τα κύτταρα λύκου είναι λευκά αιμοσφαίρια που εμφανίζουν μία ομοιογενή μάζα στο κυτταρόπλασμα. Χρειάστηκε να γίνουν πολλά πειράματα για να εξακριβωθεί ότι η μάζα αυτή αποτελείται από συμπλέγματα αντιγόνου – αντισώματος (ανοσοσυμπλέγματα) στα οποία το αντιγόνο είναι δεοξυριβοζονουκλεοπρωτεΐνη. Με τη μέθοδο αυτή ο ορός που εξετάζεται επωάζεται με πυρήνες κυττάρων, σχηματίζονται τα ανοσοσυμπλέγματα και στη συνέχεια φαγοκυτταρώνονται από λευκοκύτταρα με τη βοήθεια του συμπληρώματος. Έτσι δημιουργείται η εικόνα των κυττάρων λύκου που χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη των φαγοκυτταρομένων πυρήνων σαν μια ομοιογενής μάζα, βασεόφιλης χρώσης, στο κυτταρόπλασμα. Η δοκιμασία των LE κυττάρων είναι δύσκολη στην εκτέλεση της, η εκτίμηση της είναι υποκειμενική, δεν είναι ποσοτική μέθοδος, ούτε αρκετά ευαίσθητη και ειδική. Για πολλά χρόνια τα κύτταρα λύκου βοήθησαν στη διάγνωση του ΣΕΛ, αποτελώντας ένα από τα 11 διαγνωστικά κριτήρια της Αμερικανικής Ρευματολογικής Εταιρίας, σήμερα όμως τείνουν να εγκαταλειφθούν` καθώς αντικαθίστανται από μια πιο ευαίσθητη μέθοδο, την ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωμάτων (ΑΝΑ, antinuclear antibodies) με τη χρήση του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Τη μέθοδο αυτή εισήγαγαν το 1957 συγχρόνως τρείς ερευνητές που δούλευαν ανεξάρτητα. Η εφαρμογή της έκανε εφικτή την ανίχνευση αντισωμάτων που αναγνωρίζουν ένα ευρύ φάσμα πυρηνικών αυτοαντιγόνων, συγχρόνως προσδιορίζοντας και τον τίτλο αυτών των αυτοαντισωμάτων. Τα αντιπυρηνικά αντισώματα είναι : Αντι – DNA αντισώματα. Διακρίνονται σε αντι – ss DNA (έναντι απλής έλικας DNA) και αντι – ds DNA (έναντι διπλής έλικας DNA). Τα αντι – ds DNA αντισώματα θεωρούνται ότι παίζουν ενεργό ρόλο στην παθογένεια του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου. Φαίνεται ότι τα αντι- ds-DNA δεσμεύονται από το DNA με επακόλουθο την εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων στους ιστούς. Αντίθετα τα αντι- ss DNA δεν θεωρούν τα ειδικά για κάποια νόσο αφού αυξάνονται εξίσου σε ρευματικές και μη ρευματικές παθήσεις. Σήμερα τα αντι- DNA έναντι διπλής έλικας ανιχνεύονται χωριστά από τα υπόλοιπα ΑΝΑ για την διάγνωση του συστηματικού ερυθυματώδους λύκου. Ο προσδιορισμός τους γίνεται με ELISA αλλά και με IFA πάνω σε υπόστρωμα του αιμοπαράσιτου Crithidia lucidiae. Το μαστίγιο του Crithidia lucidiae έχει εξ’ ολοκλήρου αντιγονική συμπεριφορά παρόμοια με τα αντι- ds DNA. Αντισώματα προς τις ιστόνες. Υπάρχουν πέντε τάξεις ιστονών Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4. βρίσκονται κυρίως στο φαρμακευτικό λύκο σε ποσοστό 95-100%. Έχει σημασία να γνωρίζουμε έναντι ποιών ακριβώς ιστονών έχουν αναπτυχθεί αντισώματα. Έτσι στον ιδιοπαθή ερυθηματώδη λύκο (35-80% των περιπτώσεων) αναπτύσσονται αντισώματα έναντι των ιστονών Η1 και Η2Β και του συμπλέγματος Η2Α - Η2Β. Αντίθετα στον φαρμακευτικό λύκο αναπτύσσονται αντισώματα έναντι των ιστονών Η2Α – Η2Β (αγωγή με προκαιναμίδη) ή έναντι των ιστονών Η2Α και Η3 (αγωγή με υδραλαζίνη). Αντισώματα έναντι του αντιγόνου Sm. Αποτελεί δείκτη του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (ανιχνεύεται στο 20-30% των περιπτώσεων). Στον ορό ανιχνεύονται συνήθως με τα nRNP. Αντισώματα έναντι των μη ιστονικών πυρηνικών πρωτεϊνών nRNP. Αντισώματα έναντι των nRNP αναπτύσσονται σε πολλά νοσήματα όπως ΣΕΛ, σκληρόδερμα, και σύνδρομο Sjögren. Τα αντισώματα nRNP σχετίζονται με ηπιότερο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Αντισώματα έναντι των SSA/Ro ή SSA και SSB/La ή SSB. Τα SSA/Ro και SSB/La αναπτύσσονται μαζί και συσχετίζονται με πολλές νόσους του συνδετικού ιστού όπως ο ΣΕΛ και το σύνδρομο Sjögren. Αντισώματα έναντι του Scl-70. Η Scl-70 είναι μια βασική μη –ιστονική πυρηνική πρωτεΐνη. Αντισώματα έναντι αυτού αναπτύσσονται στο διάχυτο σκληρόδερμα και στη νόσο Raynaud. Αντισώματα έναντι του κεντρομεριδίου – ACA. Τα αντικεντρομεριδιακά αντισώματα ACA είναι αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών του κινητοχώρου των κυττάρων. Τα αντιγόνα με τα οποία συνδέονται είναι τρία πολυπεπτίδια τα CENP-A, CENP-B και CENP-C. Τα αντισώματα έναντι του CENP-B είναι συχνότερα απαντώμενα. Τα ACA χρησιμοποιούνται στη διάγνωση του συνδρόμου CREST, μιας μορφής σκληροδέρματος. Προσδιορίζονται επίσης και χωριστά από τα υπόλοιπα ΑΝΑ με IFA και ELISA. Αντισώματα κατά του αντιγόνου Jo-1, εμφανίζονται στην νόσο της πολυμυοσίτιδας (30%). Γίνεται στον ορό του αίματος, το οποίο έχει παρθεί από φλέβα. Ο προσδιορισμός γίνεται των αυτοαντισωμάτων: Η τεχνική της εξέτασης είναι απλή. Ένα υπόστρωμα κυττάρων επωάζεται με αραιωμένο δείγμα ορού αίματος. Τα αντιπυρηνικά αντισώματα θα συνδεθούν με τα αντιγόνα που αναγνωρίζουν. Αφού ξεπλυθεί η περίσσεια του ορού, το υπόστρωμα επωάζεται με αντιανθρωπίνη ανοσοσφαιρίνη, συνδεδεμένη με φθοριόχρωμα (π.χ. ισοθειοκυανούχο φλουορεσκεϊνη ή ροδαμίνη) αυτή, θα αναγνωρίσει την ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη. Η περίσσεια της συζευγμένης ανοσοσφαιρίνης ξεπλένεται και το υπόστρωμα εξετάζεται στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η ύπαρξη φθορισμού θα αντανακλά έμμεσα την παρουσία αντιπυρηνικών αντισωμάτων. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος κατά την αρχική αραίωση γίνεται τιτλοδότηση (διαδοχικές υποδιπλάσιες αραιώσεις μέχρι την τελευταία θετική), ενώ παράλληλα καταγράφονται όλοι οι τύποι φθορισμού που παρατηρήθηκαν. Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των αντισωμάτων που υπάρχουν στο δείγμα του ορού με προπαρασκευασμένα αντιγόνα και την προσθήκη ενός αντισώματος που προσκολλάται σε αυτό το σύμπλοκο και προκαλεί μια αλλαγή χρώματος. Το αποτέλεσμα είναι μια τιμή οπτικής πυκνότητας (φωτομετρική κλίμακα) που διαβάζεται ως θετική, αρνητική ή διφορούμενη. Το εύρος τιμών αναφοράς για αντιπυρηνικά αντισώματα είναι αρνητικό με ELISA. Εάν η μέθοδος με την ELISA οδηγεί σε θετικό ή διφορούμενο εύρημα τότε το δείγμα τιτλοδοτείται χρησιμοποιώντας έμμεσο ανοσοφθορισμό ανιχνεύοντας επί των κυττάρων Hep-2 και οποιαδήποτε τιμή μικρότερη από ή ίση με αραίωση 1:40 (ή <1/0 IU) είναι αρνητική. Πρόκειται για μέθοδο ποσοτικής μέτρησης της συγκέντρωσης ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε κάποιο διάλυμα (ορό). Στην πρώτη περίπτωση, παρασκευάζεται πήκτωμα, στο οποίο ενσωματώνεται το αντίσωμα. Το υπό εξέταση διάλυμα του αντιγόνου τοποθετείται σε φρεάτιο που σχηματίζεται στο πήκτωμα. Έτσι, το αντιγόνο διαχέεται ακτινωτά γύρω από το φρεάτιο δημιουργώντας ομόκεντρους κύκλους βαθμιδωτής συγκέντρωσης. Στα σημεία που η συγκέντρωση του αντιγόνου θα βρεθεί σε σημείο ισορροπίας με την εντός του πηκτώματος σταθερή συγκέντρωση του αντισώματος, σχηματίζεται δακτύλιος καθίζησης, η διάμετρος του οποίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου στο διάλυμα. Η μέτρηση επιτυγχάνεται με τη σύγκριση της διαμέτρου του δακτυλίου με τις διαμέτρους των δακτυλίων προτύπων διαλυμάτων του αντιγόνου, που εξετάζονται παράλληλα. Για τη μέτρηση συγκέντρωσης αντισώματος, χρησιμοποιείται πήκτωμα, στο οποίο ενσωματώνεται το αντίστοιχο αντιγόνο. Πρόκειται για ποιοτική μέθοδο με περιορισμένη ευαισθησία, που χρησιμοποιείται κυρίως για την αναγνώριση της ταυτότητας των αντιδράσεων αντιγόνων διαφόρων λοιμωδών παραγόντων με αντίσωμα γνωστής ειδικότητας. Αν σε δύο φρεάτια, δίπλα στο φρεάτιο του αντιορού, τοποθετηθούν διαλύματα δύο αντιγόνων, οι γραμμές ιζηματίνης που θα σχηματισθούν είναι ενδεικτικές της αντίδρασης του αντιορού με τους επιτόπους του ενός ή του άλλου ή κανενός από αυτά. Η ραδιοαονοσοδοκιμασία είναι μία από τα χαρακτηριστικά παραδείγματα τεχνικής ραδιοανίχνευσης χρησιμοποιώντας ένα ραδιοϊσότοπο. Ο ανταγωνισμός ενός αναλύτη με τον ραδιενεργά επεξεργασμένο ανταγωνιστή του για ένα περιορισμένο ποσό αντισώματος, είναι η βασική αρχή αυτής της τεχνικής. Η αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη αναστέλλει τη σύνδεση του επεξεργασμένου με ραδιενέργεια αναλύτη στο αντίσωμα. Η συγκέντρωση του αγνώστου προκύπτει από τη σύγκριση της ανασταλτικής δράσης της σύνδεσης του ραδιενεργά επεξεργασμένου αναλύτη σε σχέση με εκείνο ενός γνωστού προτύπου (φθίνουσα καμπύλη). Εν συντομία, το αντιδραστήριο RIA περιέχει δοκιμαστικά σωληνάρια που έχουν επωαστεί με το αντίσωμα. Πρότυπα διαλύματα ή οροί προστίθεται (10-200μl όγκο) μαζί με τον ραδιενεργό ανιχνευτή. Το περιεχόμενο επωάζεται για 1- 5 ώρες και τα σωληνάρια εκκενώνονται με την απόχυση ή αναρρόφηση του περιεχομένου. Τα σωληνάρια πλένονται με το παρεχόμενο πλυστικό διάλυμα και μετριούνται σε ένα μετρητή γ-ακτινοβολίας. Οι κρούσεις που παράγονται από τα γνωστά πρότυπα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία παράγουν μία καμπύλη δόσης-απάντησης και η άγνωστη συγκέντρωση στα δείγματα των ορών εξάγεται από τα δεδομένα της καμπύλης. Φυσιολογικοί τίτλοι για τα αντιπυρηνικά αντισώματα θεωρούνται οι 1:40 ή και χαμηλότεροι. Υψηλοί τίτλοι είναι ενδεικτικοί για μια αυτοάνοση ασθένεια. Η παρουσία των ΑΝΑ στο αίμα μπορεί να οφείλεται σε: Χρόνια νόσο του ήπατος Μικτή νόσο του κολλαγόνου (95%) Συστηματικό ερυθηματώδη λύκο – ΣΕΛ (95%) Προκαλούμενη από φάρμακα ερυθηματώδη λύκο (100%) Μυοσίτιδα (φλεγμονώδης νόσος των μυών) (30%) Ρευματοειδής αρθρίτιδα (40-50%) Σύνδρομο Sjogren (70%) Σύνδρομο CREST (Calcinosis, Raynaud’s phenomena, Esophageal dysmobility, Sclerodaktyly, Telangiectasias) (60–90%)Αυξημένα επίπεδα ΑΝΑ μπορεί να παρατηθούν σε: Συστηματική σκλήρυνση (σκληροδερμία) (70-90%) Ασθένειες θυροειδούς (π.χ. Hashimoto’s) Ιδιοπαθή θρομβοπενική πορφύρα Αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία Σακχαρώδης διαβήτης τύπου Ι Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός είναι μια απλή, ευαίσθητη αλλά και μη ειδική εξέταση. Αποτελεί την αρχική εξέταση ρουτίνας (screening test) για κάθε άρρωστο με υπόνοια ρευματικού νοσήματος. Ένα θετικό αποτέλεσμα θα οδηγήσει σε μια πιο ειδική έρευνα, ενώ στην αντίθετη περίπτωση ο περαιτέρω ανοσολογικός έλεγχος κρίνεται περιττός, εκτός και αν υπάρχουν ιδιαίτεροι λόγοι, όπως στον υποξύ δερματικό λύκο και την πολυμυοσίτιδα. Αρνητικά ΑΝΑ αποκλείουν τη διάγνωση του ενεργού ΣΕΛ, σε >95% των περιπτώσεων. Ψευδώς θετικά ΑΝΑ παρατηρούνται σε 15% των υγιών ενηλίκων, συνήθως σε χαμηλό τίτλο και ομοιογενή φθορισμό. Η συχνότητα των ψευδών θετικών ΑΝΑ αυξάνει προϊούσης της ηλικίας. Τα θετικά ΑΝΑ δεν αποτελούν ειδικό εύρημα και μπορεί να παρατηρηθούν σε πολλά αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα, σε χρόνια φλεγμονώδη και λοιμώδη νοσήματα ή να οφείλονται σε φάρμακα. Τα αντι- ds DNA ανευρίσκονται, σχεδόν αποκλειστικά, στο ΣΕΛ και σπανίως στη βαριά ρευματώδη αρθρίτιδα. Τα αντι-Sm είναι ειδικά του ΣΕΛ. Υψηλός τίτλος αντι- RNP (>1:10.000) είναι χαρακτηριστικός ΜΝΚ, ιδιαίτερα όταν δεν συνοδεύονται από άλλα ΑΝΑ. Αντι- RNP παρατηρούνται συχνά στο ΣΕΛ, αλλά σε μέτριους τίτλους. Αντι-RNP μπορεί, επίσης, να ανευρεθούν και στη ΠΣΣ και, σπανιότερα, σε άλλα ΑΝΑ (+) ρευματικά νοσήματα, αλλά σε χαμηλούς έως μέτριους τίτλους. Τα αντι – Ro και τα αντι- La απαντώνται στο πρωτοπαθές Sjogren > ΣΕΛ > δευτεροπαθές Sjogren. Τα αντι- Ro συσχετίζονται ισχυρά με τον νεογνικό λύκο, τον υποξύ δερματικό ερυθηματώδη λύκο και την ομόζυγο ανεπάρκεια του C2 που συνοδεύεται με ανάλογο του ΣΕΛ σύνδρομο. Τα αντι- Ro συσχετίζονται ισχυρά με τον συγγενή πλήρη καρδιακό αποκλεισμό. Τα αντι- La ανιχνεύονται πάντοτε μαζί με τα αντι- Ro, χωρίς να ισχύει και το αντίθετο. Τα αντι- Scl-70 (έναντι της τοποϊσομεράσης 1) απαντώνται αποκλειστικά στην ΠΣΣ. Παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία της μεθόδου (έμμεσος ανοσοφθορισμός) Ανάμεσα στους πολλούς παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία της ανίχνευσης αντιπυρηνικών αντισωμάτων με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοθφορισμού συγκαταλέγονται: το είδος του υποστρώματος και η επεξεργασία του η ποιοτική και ποσοτική σύνθεση της συνεζευγμένης αντιανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης ο καθορισμός της αρχικής αραίωσης των ορών η επιλογή του μικροσκοπίου και τέλος, ο υποκειμενικός παράγοντας που συνοδεύει την εκτίμηση του φθορισμού στο μικροσκόπιο.