Μηχανική των ιστών

Η μηχανική των ιστών είναι ο συνδυασμός της χρήσης κυττάρων, μηχανικής, μεθόδων των υλικών και κατάλληλων βιοχημικών και φυσικοχημικών παραγόντων. Έχει σκοπό τη βελτίωση ή την αντικατάσταση βιολογικών λειτουργιών. Αν και κάποτε χαρακτηριζόταν ως κλάδος των βιοϋλικών, σήμερα έχει εξελιχθεί σε σημασία και σε πεδίο δράσης και θεωρείται ως αυτόνομο πεδίο.

 Οι περισσότεροι ορισμοί της μηχανικής των ιστών καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών. Στην πράξη όμως, ο όρος σχετίζεται στενά με εφαρμογές που διορθώνουν ή αντικαθιστούν ολόκληρους ιστούς, όπως οστά, χόνδρους, αιμοσφαίρια, κύστες, δέρμα και μύες. Συχνά οι ιστοί που εμπλέκονται χρειάζεται να έχουν συγκεκριμένες μηχανικές και δομικές ιδιότητες για να λειτουργήσουν σωστά. Ο όρος έχει χρησιμοποιηθεί επίσης στις προσπάθειες εκτέλεσης ειδικών βιοχημικών διαδικασιών που χρησιμοποιούν κύτταρα μέσα σε ένα τεχνητό σύστημα υποστήριξης. Για παράδειγμα, τεχνητό πάγκρεας και πνεύμονας. Ο όρος αναγεννητική ιατρική ή αλλιώς θεραπεία με βλαστοκύτταρα, χρησιμοποιείται συχνά ως συνώνυμο της μηχανικής των ιστών. Όμως ορισμένοι δίνουν περισσότερη έμφαση στη χρήση βλαστοκυττάρων για την παραγωγή ιστών. Ένας ευρύτατα εφαρμοσμένος ορισμός της μηχανικής των ιστών, όπως διατυπώθηκε από τον Langer και τον Vacanti είναι ότι : «…αποτελεί ένα διεπιστημονικό πεδίο που εφαρμόζει τις αρχές της μηχανικής των επιστημών της ζωής προς την κατεύθυνση της ανάπτυξης βιολογικών υποκατάστατων που επαναφέρουν, διατηρούν ή βελτιώνουν τη λειτουργία των ιστών ή ενός ολόκληρου οργάνου». Η μηχανική των ιστών έχει ορισθεί επίσης ως : «…η κατανόηση των αρχών της ανάπτυξης των ιστών και η εφαρμογή τους για την παραγωγή λειτουργικών υποκατάστατων ιστών για κλινική χρήση». Μια περαιτέρω περιγραφή λέει ότι : «..η υποκείμενη θεωρία της μηχανικής των ιστών είναι ότι η εφαρμογή της φυσικής βιολογίας του συστήματος θα επιτρέψει για μεγαλύτερες επιτυχίες στην ανάπτυξη θεραπευτικών μεθόδων που σκοπεύουν στην αντικατάσταση, επιδιόρθωση, διατήρηση και στη βελτίωση της λειτουργίας των ιστών». Δυναμικές εξελίξεις στο διεπιστημονικό πεδίο της μηχανικής των ιστών απέφεραν ένα νέο σύνολο εξαρτημάτων αντικατάστασης των ιστών και μεθόδους εφαρμογής τους. Έχουν γίνει επιστημονικές πρόοδοι στα βιο – υλικά, στα βλαστοκύτταρα, στους παράγοντες διαφοροποίησης και ανάπτυξης και στα βιομιμητικά περιβάλλοντα. Έτσι, δημιουργήθηκαν μοναδικές ευκαιρίες για την κατασκευή ιστών στο εργαστήριο από συνδυασμούς μηχανικών εξωκυτταρικών καλουπιών (ικριωμάτων), κυττάρων και βιολογικά ενεργών μορίων. Μεταξύ των κύριων προκλήσεων που αντιμετωπίζει σήμερα η μηχανική των ιστών, είναι η ανάγκη για πιο σύνθετη λειτουργικότητα. Επίσης και για λειτουργική και βιο – μηχανική σταθερότητα στους εργαστηριακούς ιστούς που προορίζονται για μεταμόσχευση. Η συνεχιζόμενη επιτυχία της μηχανικής των ιστών και η τελική ανάπτυξη αληθινών υποκατάστατων των ανθρώπινων μελών – οργάνων, θα προκύψει από την σύγκλιση των μηχανικής και των ερευνητικών προόδων στους ιστούς, στα ικριώματα, στους αυξητικούς παράγοντες, στα βλαστοκύτταρα, στην βιολογία της ανάπτυξης, στην επιστήμη των υλικών και στην βιο – πληροφορική. Το 2003 το εθνικό ίδρυμα επιστημών των Η.Π.Α. (NSF) δημοσίευσε μια έκθεση με τίτλο «Η εμφάνιση της Μηχανικής των Ιστών ως ερευνητικό πεδίο», η οποία δίνει μια λεπτομερή περιγραφή της ιστορίας αυτού του πεδίου. • Βιο – τεχνητή τραχεία: Η πρώτη εφαρμογή της αναγεννητικής ιατρικής στην μεταμόσχευση ενός βιο – τεχνητού οργάνου. • In vitro κρέας : Εδώδιμος τεχνητός ζωικός μυς καλλιεργημένος “in vitro”. • Βιο – τεχνητή συσκευή συκωτιού : Αρκετές ερευνητικές προσπάθειες παρήγαγαν συσκευές ηπατικής υποστήριξης, που χρησιμοποιούν ζωντανά ηπατικά κύτταρα. • Τεχνητό πάγκρεας : Η έρευνα περιλαμβάνει τη χρήση κυττάρων – νησίδων για να παραγάγει και να ρυθμίσει την ινσουλίνη, ειδικά σε περιπτώσεις διαβητικών ατόμων. • Τεχνητές κύστες : Ο Anthony Atala (Wake Forest University) μεταμόσχευσε με επιτυχία κύστες που αναπτύχθηκαν τεχνητά σε 7 από τους 20 εθελοντές που πήραν μέρος στο πείραμα. • Χόνδρος : Ιστός ανεπτυγμένος στο εργαστήριο χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για την επιδιόρθωση χόνδρου του γόνατου. • Χόνδρος χωρίς ικρίωμα : Χόνδρος που παράχθηκε χωρίς τη χρήση εξωγενούς ικριωματικού υλικού. Σε αυτή τη μεθοδολογία, όλο το υλικό κατασκευής είναι κυτταρικό ή παράγεται απευθείας από τα κύτταρα. • Καρδιά της Doris Taylor σε δοχείο • Αεραγωγός (αναπνευστική οδός) από κατασκευασμένο ιστό • Αγγείο από κατασκευασμένο ιστό • Τεχνητό δέρμα από κατασκευασμένα ανθρώπινα κύτταρα δέρματος ενσωματωμένα σε κολλαγόνο • Τεχνητός μυελός των οστών • Τεχνητό οστό • Τεχνητό πέος • Μηχανική ιστών της στοματικής βλεννογόνου • Ακροβυστία Η μηχανική ιστών χρησιμοποιεί ζωντανά κύτταρα ως μηχανικά εργαλεία. Για παράδειγμα χρησιμοποιούνται ινοβλάστες στης επιδιόρθωση και στην αντικατάσταση δέρματος. Ικριώματα επισκευάζονται με ζωντανά χονδροκύτταρα. Τα κύτταρα έγιναν διαθέσιμα ως μηχανικά υλικά όταν επιστήμονες της εταιρίας Geron ανακάλυψαν πώς να επεκτείνουν τελομερή το 1998. Παρήγαγαν «αθάνατες» αλυσίδες κυττάρων. Πριν από αυτό εργαστηριακές αποικίες από υγιή κύτταρα θηλαστικών μπορούσαν να διαιρούνται μόνο μέχρι έναν αριθμό φορών, μέχρι το όριο Hayflick. Από υγρούς ιστούς (όπως το αίμα) τα κύτταρα αποσπώνται με μεθόδους όγκου ή αφαίρεση. Από στέρεους ιστούς η εξαγωγή είναι πιο δύσκολη. Τα κύτταρα συνήθως κατηγοριοποιούνται από την προέλευσή τους : • Τα αυτόλογα κύτταρα προμηθεύονται από τον ίδιο οργανισμό στον οποίο εμφυτεύονται. Έχουν τα λιγότερα προβλήματα απόρριψης ή παθογενούς μετάδοσης. Σε μερικές περιπτώσεις όμως μπορεί να μην είναι διαθέσιμα. Για παράδειγμα σε γενετικές ασθένειες. Επίσης πολύ άρρωστα ή ηλικιωμένα άτομα και ασθενείς που υποφέρουν από σοβαρά εγκαύματα πιθανόν δεν διαθέτουν επαρκείς ποσότητες αυτόλογων κυττάρων για να δημιουργήσουν λειτουργικές αλυσίδες κυττάρων. Ακόμη, επειδή αυτά τα κύτταρα λαμβάνονται από τον ασθενή, υπάρχουν κίνδυνοι μόλυνσης του σημείου λήψης. Επιπλέον τα αυτόλογα κύτταρα πρέπει να καλλιεργηθούν από δείγματα πριν χρησιμοποιηθούν. Αυτό απαιτεί χρόνο, οπότε τέτοιες λύσεις δεν είναι πάντοτε μέσα στα χρονικά περιθώρια. Πρόσφατα εμφανίστηκε η τάση χρήσης μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από μυελό των οστών και από λίπος. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε μια ποικιλία τύπων ιστών, όπως οστό, χόνδρος, λίπος, και νεύρα. Ένα μεγάλος αριθμός κυττάρων μπορεί να απομονωθεί εύκολα και γρήγορα από το λίπος. • Τα αλλογενή κύτταρα προέρχονται από τον οργανισμό ενός δότη που ανήκει στο ίδιο είδος με το δέκτη. Υπάρχουν ορισμένοι εθνικοί περιορισμοί για τη χρήση ανθρώπινων κυττάρων σε μελέτες in vitro. Όμως η χρήση δερματικών ινοβλαστών από ανθρώπινη ακροβυστία έχει αποδειχθεί ότι είναι ανοσοποιητικά ασφαλής. Άρα είναι μια βιώσιμη λύση για μηχανική ιστών του δέρματος. • Ξενογενή κύτταρα είναι αυτά που λαμβάνονται από γενετικά παρόμοιους οργανισμούς με το δέκτη, όπως δίδυμοι, κλώνοι ή εργαστηριακά μοντέλα ζώων. • Τα βλαστικά κύτταρα είναι μη – διαφοροποιημένα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να ποικίλλουν και να σχηματίζουν διαφορετικές μορφές εξειδικευμένων κυττάρων. Ανάλογα με την προέλευσή τους, χωρίζονται σε «ενήλικα» και «εμβρυακά». Η πρώτη κατηγορία είναι πολυδύναμη και η δεύτερη πληθοδύναμη. Ορισμένα κύτταρα είναι ολοδύναμα, στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του εμβρύου. Υπάρχει μεγάλη διαμάχη για την ηθικότητα της χρήσης εμβρυικών βλαστικών κυττάρων. Θεωρείται ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επισκευή άρρωστων ή κατεστραμμένων ιστών και για την καλλιέργεια νέων οργάνων. Τα κύτταρα εμφυτεύονται ή «σπέρνονται» σε μια τεχνητή κατασκευή ικανή να υποστηρίξει την τρισδιάστατη ανάπτυξη των ιστών. Αυτές οι κατασκευές, που καλούνται συχνά ικριώματα είναι συνήθως σημαντικές τόσο ex vivo όσο και in vivo. Ανακεφαλαιώνουν το κυτταρικό περιβάλλον και επιτρέπουν στα κύτταρα να επηρεάζουν το μικρο – περιβάλλον τους. Τα ικριώματα εξυπηρετούν τους εξής σκοπούς : • Επιτρέπουν την προσκόλληση και την μετανάστευση των κυττάρων. • Απελευθερώνουν και διατηρούν τα κύτταρα και τους βιοχημικούς παράγοντες. • Κάνουν δυνατή τη διάχυση ζωτικών κυτταρικών θρεπτικών στοιχείων και των προϊόντων τους. • Ασκούν κάποια μηχανική και βιολογική επιρροή για να τροποποιήσουν τη συμπεριφορά της κυτταρικής φάσης. Για να επιτευχθεί ο σκοπός της ανακατασκευής των ιστών, τα ικριώματα πρέπει να πληρούν κάποιες προδιαγραφές. Η ύπαρξη πολυάριθμων και ευμεγεθών πόρων είναι απαραίτητη για τη διευκόλυνση της σποράς των κυττάρων και της διάχυσης μέσα στην κατασκευή κυττάρων και θρεπτικών στοιχείων. Η βιο – διασπασιμότητα είναι συχνά ένας σημαντικός παράγοντας επειδή τα ικριώματα προτιμάται να απορροφούνται από τους γειτονικούς ιστούς χωρίς την ανάγκη χειρουργικής αφαίρεσης. Ο ρυθμός απορρόφησης πρέπει να συμπίπτει όσο το δυνατόν περισσότερο με αυτόν της ανάπτυξης των ιστών. Αυτό σημαίνει ότι όσο τα κύτταρα κατασκευάζουν το δικό τους φυσικό καλούπι γύρω τους, το ικρίωμα είναι ικανό να παρέχει κατασκευαστική ακεραιότητα μέσα στο σώμα. Τελικά θα αποσυντεθεί, αφήνοντας το νέο ιστό να καταλάβει ολόκληρο το χώρο. Επιπλέον, η δυνατότητα ένεσης είναι σημαντική για κλινικές χρήσεις. Πρόσφατες έρευνες στην εκτύπωση οργάνων έδειξαν πόσο κρίσιμος είναι ο καλός έλεγχος του τρισδιάστατου περιβάλλοντος για την εξασφάλιση της δυνατότητας αναπαραγωγής των πειραμάτων και καλύτερων αποτελεσμάτων. Υλικά Πολλά διαφορετικά υλικά (φυσικά και συνθετικά, βιο – διασπώμενα και μόνιμα) έχουν μελετηθεί. Τα περισσότερα από αυτά ήταν γνωστά στην ιατρική πριν την εμφάνιση της μηχανικής των ιστών και χρησιμοποιούνταν ως βιο – απορροφήσιμα ράμματα. Παραδείγματα τέτοιων υλικών είναι το κολλαγόνο και ορισμένες πολυεστέρες. Νέα βιο – υλικά έχουν τροποποιηθεί για να έχουν επιθυμητές ιδιότητες και λειτουργική παραμετροποίηση. Τέτοιες είναι η δυνατότητα ένεσης, συνθετική παρασκευή, βιο – συμβατότητα, μη – ανοσογονικότητα, διαφάνεια, μικροσκοπικές ίνες, μικρή πυκνότητα, ρυθμός επαναρρόφησης. Το Pura Matrix που κατασκευάστηκε από τους ερευνητές εργαστηρίων του ΜΙΤ, τους Zang, Rich, Grodzinsky και Langer, είναι μια από τις οικογένειες ικριωμάτων που βγήκαν στο εμπόριο και επηρέασαν την κλινική χρήση της μηχανικής των ιστών. Ένα συνθετικό υλικό που χρησιμοποιείται συχνά είναι το πολυγαλακτικό οξύ (PLA). Αυτή η πολυεστέρα αποσυντίθεται μέσα στο ανθρώπινο σώμα σε γαλακτικό οξύ . Το γαλακτικό οξύ υπάρχει στη φύση και εύκολα αποβάλλεται από τον οργανισμό. Παρόμοια υλικά είναι το πολυγλυκολικό οξύ (PGA) και η πολυκαπρολακτόνη (PCL). Ο μηχανισμός αποσύνθεσής τους είναι παρόμοιος με αυτόν του πολυγαλακτικού οξέος. Όμως ο ρυθμός τους σε σύγκριση με αυτό, είναι γρηγορότερος και βραδύτερος αντίστοιχα. Τα ικριώματα μπορεί να κατασκευάζονται επίσης από φυσικά υλικά. Συγκεκριμένα, διαφορετικά παράγωγα της εξω – κυτταρικής μήτρας έχουν μελετηθεί για να εκτιμηθεί η ικανότητά τους να υποστηρίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Πρωτεϊνικά υλικά (όπως το κολλαγόνο ή η fibrin), πολυσακχαρικά υλικά (όπως η χιτοζάνη) και γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) έχουν όλα αποδειχθεί κατάλληλα όσον αφορά την συμβατότητά τους με τα κύτταρα. Υπάρχουν όμως ορισμένα προβλήματα με πιθανή ανοσογονικότητα. Μεταξύ των γλυκοζαμινογλυκάνων, το ουαλουρονικό οξύ – πιθανότατα σε συνδυασμό με παράγοντες διασύνδεσης (όπως γλουταραλδεΰδη και υδατοδιαλυτό καρβοδιϊμίδιο) – είναι μια εύλογη επιλογή ως υλικό ικριώματος. Λειτουργικές ομάδες ικριωμάτων ίσως είναι χρήσιμες στην παράδοση μικρών μορίων (φαρμάκων) σε συγκεκριμένους ιστούς. Μια άλλη μορφή ικριώματος υπό έρευνα είναι ο από – κυτταροποιημένα εκχυλίσματα ιστού, όπου τα απομείναντα κυτταρικά υπολείμματα και η εξω – κυτταρική μήτρα δρουν ως ικρίωμα. Μια μελέτη του 2009 από τον Ratmir στόχευε στη βελτίωση των vivo – συνθηκών για τρισδιάστατο ιστό. Χρησιμοποίησε στοιβαγμένα και απο – στοιβαγμένα στρώματα χαρτιού εμποτισμένα με εναιωρήματα κυττάρων σε εξω – κυτταρική μήτρα υδρογέλης. Έτσι κατέστησε δυνατό τον έλεγχο οξυγόνου και της κλίσης των θρεπτικών συστατικών σε 3 διαστάσεις και την ανάλυση μοριακών και γενετικών αντιδράσεων. Είναι δυνατός ο χειρισμός των κλίσεων διαλυτών μορίων και ο χαρακτηρισμός τους σε αυτές τις σύνθετες κλίσεις. Με αυτόν τον τρόπο γίνονται πιο αποτελεσματικά απ’ ότι σε συμβατικές τρισδιάστατες καλλιέργειες βασισμένες σε υδροπηκτές, κυτταρικά φαιρίδια ή τρισδιάστατους αντιδραστήρες αιμάτωσης. Ποικίλα πάχη χαρτιού και τύπων μέσων μπορούν να υποστηρίξουν διάφορα πειραματικά περιβάλλοντα. Κατά την αποδόμηση αυτά τα φύλλα μπορεί να είναι χρήσιμα σε εφαρμογές όπως η απεικόνιση υψηλής απόδοσης και η φαρμακευτική έρευνα. Σύνθεση Ένας αριθμός από μεθόδους έχει περιγραφεί σε διάφορα άρθρα για την προετοιμασία πορωδών κατασκευών, για να χρησιμοποιηθούν ως ικριώματα. Καθεμιά από αυτές τις τεχνικές έχει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Τεχνικές υφασμάτων Αυτές οι τεχνικές περιλαμβάνουν όλες τις προσεγγίσεις που έχουν επιτυχώς χρησιμοποιηθεί για την προετοιμασία των μη – υφασμένων πλεγμάτων από διαφορετικά πολυμερή. Συγκεκριμένα μη – υφασμένες κατασκευές από πολυγλυκολίδη έχουν δοκιμαστεί. Τέτοιες ινώδεις κατασκευές έχουν αποδειχθεί χρήσιμες στην καλλιέργεια διαφορετικών τύπων κυττάρων. Τα κυριότερα μειονεκτήματα σχετίζονται με τις δυσκολίες απόκτησης υψηλής πορώτητας και κανονικού μεγέθους των πόρων. 4.2.3. Διαλυτή χύτευση και σωματιδιακή έκπλυση (SCPL) Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει την προετοιμασία των πορωδών κατασκευών με κανονική πορώτητα, αλλά με περιορισμένο πάχος. Αρχικά, το πολυμερές διαλύεται σε ένα κατάλληλο οργανικό διαλύτη (το πολυγαλακτικό οξύ διαλύεται σε διχλωρομεθάνη). Έπειτα το διάλυμα ρίχνεται σε ένα εκμαγείο γεμάτο με πορογόνα υλικά. Ένα τέτοιο πορογόνο μπορεί να είναι ανόργανο άλας, όπως το χλωριούχο νάτριο (αλάτι), κρύσταλλοι σακχαρόζης, σφαίρες ζελατίνης ή παραφίνης. Το μέγεθος αυτών των υλικών επηρεάζει το μέγεθος των πόρων του ικριώματος. Η αναλογία των πολυμερών προς τα πορογόνα σχετίζεται άμεσα με την πορότητα της τελικής κατασκευής. Αφού το πολυμερές διάλυμα χυθεί, ο διαλύτης αφήνεται να εξατμιστεί πλήρως. Έπειτα η σύνθετη αυτή κατασκευή στο εκμαγείο βυθίζεται σε ένα υγρό κατάλληλο για την διάλυση του πορογόνου υλικού. 4.2.4. Αφρός αερίου Για να ξεπεραστεί η ανάγκη χρήσης οργανικών διαλυτών και στέρεων πορογόνων, έχει αναπτυχθεί μια τεχνική που χρησιμοποιεί αέριο ως πορογόνο. Πρώτα, κατασκευές σε σχήμα δίσκου, αποτελούμενες από το επιθυμητό πολυμερές, προετοιμάζονται με συμπίεση, με τη χρήση ενός θερμού καλουπιού. Έπειτα οι δίσκοι τοποθετούνται σε ένα θάλαμο όπου εκτίθενται σε υψηλή πίεση διοξειδίου του άνθρακα (CO2) για μερικές ημέρες. Η πίεση σταδιακά μειώνεται σε κανονικά επίπεδα. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, οι πόροι σχηματίζονται από τα μόρια του διοξειδίου του άνθρακα, τα οποία εγκαταλείπουν το πολυμερές και έτσι προκύπτει μια κατασκευή που έχει την όψη σφουγγαριού. Τα κυριότερα προβλήματα αυτής της τεχνικής προκαλούνται από την περίσσεια θερμότητας που χρησιμοποιείται κατά τη διάρκεια της συμπίεσης. Αυτή η θερμότητα εμποδίζει την ενσωμάτωση κάθε θερμοκρασιακά ασταθούς υλικού στη μήτρα του πολυμερούς. Επίσης οι πόροι δεν αποτελούν μια συνεκτική κατασκευή. 4.2.5. Γαλακτωματοποίηση – ξηρή ψύξη Αυτή η μέθοδος δεν απαιτεί ένα στέρεο πορογόνο σαν το SCPL. Αρχικά, ένα συνθετικό πολυμερές διαλύεται σε ένα κατάλληλο διαλύτη, όπως πολυγαλακτικό οξύ σε διχλωρομεθάνη. Έπειτα προστίθεται νερό στο πολυμερές διάλυμα και τα δυο υγρά ανακατεύονται για να παραχθεί γαλάκτωμα. Πριν οι δύο φάσεις μπορέσουν να διαχωριστούν το γαλάκτωμα χύνεται σε ένα καλούπι και ψύχεται γρήγορα μέσω βύθισης σε υγρό άζωτο. Το παγωμένο γαλάκτωμα έπειτα ξηραίνεται με ψύξη για να αφαιρεθεί το διασκορπισμένο νερό και ο διαλύτης. Έτσι απομένει μια στερεοποιημένη, πορώδης κατασκευή από πολυμερές. Η γαλακτωματοποίηση και η ξηρή ψύξη επιτρέπουν την γρηγορότερη προετοιμασία σε σχέση με το SCPL, επειδή δεν χρειάζεται το χρονοβόρο στάδιο της έκπλυσης. Όμως απαιτείται η χρήση διαλυτών. Ακόμη, το μέγεθος των πόρων είναι σχετικά μικρό και η πορώτητα είναι συχνά ακανόνιστη. Η ξηρή ψύξη είναι πολύ δημοφιλής τεχνική για ην κατασκευή ικριωμάτων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται για να προετοιμάσει σφουγγάρια από κολλαγόνο. Το κολλαγόνο διαλύεται σε όξινα διαλύματα από οξικό οξύ ή υδροχλωρικό οξύ, που χύνονται σε ένα καλούπι, παγωμένο με υγρό άζωτο. Μετά λυοφιλοποιούνται. Διαχωρισμός φάσεων με χρήση θερμότητας Παρόμοια με την προηγούμενη, αυτή η μέθοδος διαχωρισμού των φάσεων απαιτεί την χρήση διαλυτών με χαμηλό σημείο τήξης, το οποίο είναι εύκολο να επιτευχθεί. Για παράδειγμα το διοξάνιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διαλύσει το πολυγαλακτικό οξύ. Έπειτα ο διαχωρισμός των φάσεων προκαλείται από την πρόσθεση μικρής ποσότητας νερού. Μια φάση άφθονη και μια φτωχή σε πολυμερές σχηματίζονται. Μετά ο διαλύτης ψύχεται κάτω από το σημείο τήξης του. Αφού περάσουν μερικές ημέρες ξήρανσής του σε κενό για να αφαιρεθεί, απομένει ένα πορώδες ικρίωμα. Ο διαχωρισμός της υγρής – υγρής φάσης παρουσιάζει τα ίδια μειονεκτήματα με την γαλακτωματοποίηση – ξηρή ψύξη. Ηλεκτροστατική Μια πολύ ευέλικτη μέθοδος που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή συνεχών ινών, διαστάσεων 1nm – 1mm. Σε αυτή τη μέθοδο, ένα διάλυμα παρέχεται μέσα από ένα όργανο και υψηλή τάση εφαρμόζεται στο άκρο. Η συσσώρευση ηλεκτροστατικής άπωσης μέσα στο φορτισμένο διάλυμα, το προκαλεί να αποβάλλει ένα λεπτό ινώδες νήμα. Ένα τοποθετημένο δοχείο ή ράβδος συλλογής με αντίθετη τάση ή γειωμένο, προσελκύει τις συνεχείς ίνες. Αυτές συγκροτούν ένα ιδιαίτερα πορώδες δίκτυο. Τα βασικά πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι η απλότητά της και η ευκολία παραλλαγής της. Σε εργαστηριακό επίπεδο, αυτή η τεχνική απαιτεί μόνο μια πηγή υψηλής τάσης (μέχρι 30 KV), μια σύριγγα, μια βελόνα με πλατύ άκρο και έναν αγώγιμο συλλέκτη. Με την τροποποίηση των μεταβλητών, όπως η απόσταση από τον συλλέκτη, το μέγεθος της τάσης ή ο ρυθμός ροής του διαλύτη, οι ερευνητές μπορούν να αλλάξουν δραματικά την αρχιτεκτονική δομή του ικριώματος. Τεχνολογίες CAD – CAM Οι περισσότερες από τις παραπάνω τεχνικές έχουν περιορισμένο έλεγχο στην πορώτητα και στο μέγεθος των πόρων. Η σχεδίαση και η κατασκευή με χρήση υπολογιστή εισήχθη στην μηχανική των ιστών. Πρώτα, η τρισδιάστατη κατασκευή σχεδιάζεται με λογισμικό CAD. Η πορώτητα μπορεί να προσαρμοστεί με αλγορίθμους του λογισμικού. Το ικρίωμα έπειτα τυπώνεται από πολυμερές σε εκτυπωτές με ψεκασμού μελάνης ή μέσω αποθετικής μοντελοποίησης τήξης ενός πολυμερούς. Μια μελέτη του 2011 από τον El – Ayoubi ασχολήθηκε με την τρισδιάστατη τεχνική απεικόνισης για την παραγωγή (βιο – συμβατών και βιο – διασπώμενων) μακρόπορων ικριωμάτων από πολύ – L – λακτίδια με δύο διαφορετικά μεγέθη. Χρησιμοποίησε στερεή κατασκευή ελεύθερης μορφής (SSF) με τη χρήση λογισμικού CAD. Διερεύνησε θεραπείες αντικατάστασης αρθρικών χόνδρων ως εναλλακτική στην συμβατική επισκευή ιστών. Η μελέτη βρήκε ότι όσο μικρότερο είναι το μέγεθος του πόρου σε συνδυασμό με τη μηχανική καταπόνηση σε ένα βιο – αντιδραστήρα (για να προσομοιώσει συνθήκες in vino) , τόσο υψηλότερη είναι η βιωσιμότητα του κυττάρου. Αυτό οφείλεται στη δυνητική θεραπευτική λειτουργία λόγω του μειωμένου χρόνου ανάρρωσης και της αυξημένης αποτελεσματικότητας των μεταμοσχεύσεων. Βιο – εκτύπωση με χρήση λέιζερ (LaBP) Σε μια μελέτη του 2012 ο Koch ερεύνησε αν η βιο – εκτύπωση με χρήση λέιζερ μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην κατασκευή τρισδιάστατων προτύπων σε φυσική μήτρα. Επίσης ασχολήθηκε με το αν τα παράγωγα λειτουργούν σωστά και παράγουν ιστό. Αυτή η τεχνική διευθετεί μικρούς όγκους από εναιωρήματα ζωντανών κυττάρων σε πρότυπα υψηλής ανάλυσης. Η έρευνα ήταν επιτυχής και οι ερευνητές προέβλεψαν ότι : «Τα παράγωγα μπορεί να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμές in vivo, μέσω της εμφύτευσής τους σε πειραματόζωα». Σε αυτήν τη μελέτη μόνο ανθρώπινο δέρμα έχει συντεθεί, όμως οι ερευνητές προβλέπουν ότι : «Θα ενσωματώσουμε επιπλέον τύπους κυττάρων (όπως μελανοκύτταρα, κύτταρα του Schwann, κύτταρα των τριχοποιών αδένων), μέσα στην εκτυπωμένη κυτταρική κατασκευή. Έτσι η συμπεριφορά αυτών των κυττάρων σε ένα τρισδιάστατο in vitro μικρο – περιβάλλον παρόμοιο με το φυσικό τους, μπορεί να αναλυθεί». Αυτή η εξέλιξη θα είναι χρήσιμη για την έρευνα φαρμάκων και για τις τοξικολογικές μελέτες. Ένα από τα συνεχιζόμενα και επίμονα προβλήματα της μηχανικής των ιστών είναι οι περιορισμοί της μεταφοράς μάζας. Οι κατασκευασμένοι ιστοί γενικά στερούνται μια αρχική παροχή αίματος. Αυτό καθιστά δύσκολη για τα ενσωματωμένα κύτταρα την πρόσληψη αρκετού οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών για να επιβιώσουν και να λειτουργήσουν σωστά. 5.1. Αυτό – συναρμολόγηση Η αυτό – συναρμολόγηση ίσως παίξει ένα σημαντικό ρόλο από την άποψη της ενσωμάτωσης κυττάρων και πρωτεϊνών. Επίσης και στην κατασκευή ικριωμάτων στην κατάλληλη φυσική κλίμακα για μηχανικά παράγωγα ιστών και στην ανάπτυξη των κυττάρων. Η μικρο – οικοδομική είναι μια ακμάζουσα τεχνολογία για την ανάπτυξη των κυττάρων σε εργαστήριο και την συναρμολόγησή τους σε τρισδιάστατα σχήματα. Για να αποσυνθέσουν τον ιστό σε μοναχικά κύτταρα, οι ερευνητές πρέπει να διαλύσουν το εξω – κυτταρικό υλικό που φυσιολογικά τα κρατά μαζί. Μόλις αυτή η κόλλα αφαιρεθεί, είναι αρκετά δύσκολο να συναρμολογήσει κανείς τα κύτταρα πίσω στις σύνθετες δομές που αποτελούν τους φυσικούς ιστούς. Αν και τα κύτταρα δεν είναι εύκολο να στοιβαχτούν, οι δομικές μονάδες τους είναι. Άρα, η μικρο – οικοδομική ξεκινά με την ενσωμάτωση ζωντανών κυττάρων σε κύβους από πολυμερή. Έπειτα, οι δομικές μονάδες αυτό – συναρμολογούνται σε οποιοδήποτε σχήμα, με τη χρήση περιγραμμάτων. 5.2. Προσθετική κατασκευή Μπορεί να είναι εφικτό να εκτυπωθούν όργανα, ή ακόμα και ολόκληροι οργανισμοί με αυτή τη μέθοδο. Μια πρόσφατη καινοτόμα τεχνική κατασκευής, χρησιμοποιεί ένα μηχανισμό ψεκασμού μελάνης για να εκτυπώσει ακριβή στρώματα από κύτταρα σε μια μήτρα από θερμο – αναστρέψιμη γέλη. Ενδοθηλιακά κύτταρα (καλύπτουν εσωτερικά τα κύτταρα του αίματος) έχουν εκτυπωθεί σε ένα σύνολο από στοιβαγμένων δακτυλίων. Όταν επωαστούν, λιώνουν σε ένα σωλήνα. Το πεδίο των τρισδιάστατων μοντέλων υψηλής ακρίβειας σε βιολογικά συστήματα αναπτύχθηκε χάρη σε πολυάριθμα προγράμματα και τεχνολογίες. Αυτές περιλαμβάνουν μια ταχεία μέθοδο κατασκευής ιστών, ακόμα και ολόκληρων οργάνων και χρησιμοποιούν τρισδιάστατους εκτυπωτές που τυπώνουν ικριώματα και κύτταρα στρώμα – με – στρώμα, σε ένα λειτουργικό δείγμα ιστού ή οργάνου. Η συσκευή παρουσιάστηκε σε ένα συνέδριο της TED από τους δρ. Anthony Atala, M.D. και W.H. Boyce. Σε αυτό το συνέδριο μια ολόκληρη κύστη τυπώθηκε επί σκηνής κατά τη διάρκεια ενός σεμιναρίου και παρουσιάστηκε στο κοινό. Αυτή η τεχνολογία χρησιμοποιήθηκε για να εκτυπωθεί η κύστη ενός νέου άνδρα που θα πέθαινε χωρίς το μόσχευμα. Προσδοκάται ότι θα κάνει εφικτή την εκτύπωση νεφρών και ίσως συκωτιών στο μέλλον για μεταμόσχευση και θεωρητικά για τοξικολογικές και βιολογικές μελέτες. Το 2013με τη χρήση ενός τρισδιάστατου ικριώματος της εταιρίας Matrigel σε διάφορες συνθέσεις, ουσιώδη παγκρεατικά οργανίδια παράχθηκαν in vitro. Συστάδες από μικρό αριθμό κυττάρων πολλαπλασιάστηκαν σε 40 χιλιάδες κύτταρα μέσα σε μια εβδομάδα. Οι συστάδες μετασχηματίζονται σε κύτταρα που φτιάχνουν είτε πεπτικά ένζυμα, είτε ορμόνες (όπως η ινσουλίνη), που αυτό – οργανώνονται σε διακλαδισμένα παγκρεατικά οργανίδια που μοιάζουν με το πάγκρεας. Τα κύτταρα είναι ευαίσθητα στο περιβάλλον, π.χ. δυσκαμψία γέλης και επικοινωνούν με άλλα κύτταρα. Τα μοναχικά κύτταρα δεν ευημερούν. Τέσσερα γειτονικά κύτταρα απαιτούνται για μεταγενέστερη ανάπτυξη οργανιδίων. Παραλλαγές στην σύσταση του μέσου παρήγαγαν χαμηλές σφαίρες, που αποτελούνταν κυρίως από παγκρεατικούς προγόνους (προγεννήτορες). Επίσης παρήγαγαν σύνθετα οργανίδια που αυθόρμητα περνούσαν φάσεις παγκρεατικής μορφο – γέννεσης και διαφοροποίησης. Η διατήρηση και η επέκταση των παγκρεατικών προγεννητόρων απαιτεί ενεργά σήματα Notch και FGF. Αυτά τα σήματα ανακεφαλαιώνονται in vivo σε γωνίες και αλληλεπιδρούν. Τα οργανίδια θεωρούνται πως δυνητικά θα προσφέρουν μικρο – όργανα για δοκιμές φαρμάκων και για κύτταρα παραγωγής εφεδρικής ινσουλίνης. Σε πολλές περιπτώσεις η δημιουργία λειτουργικών ιστών και βιολογικών κατασκευών in vitro απαιτεί εκτεταμένη καλλιέργεια για να εξασφαλιστεί η επιβίωση, ανάπτυξη και η λειτουργικότητα. Γενικά, οι βασικές απαιτήσεις των κυττάρων που καλλιεργούνται, περιλαμβάνουν σταθερό οξυγόνο, πεχά (pH), υγρασία, θερμοκρασία, θρεπτικά στοιχεία και οσμωτική πίεση. Μηχανικές καλλιέργειες ιστών επίσης παρουσιάζουν προβλήματα στην διατήρηση σταθερών συνθηκών. Σε τυπικές καλλιέργειες, η διάχυση είναι ο μοναδικός τρόπος μεταφοράς θρεπτικών στοιχείων και μεταβολιτών. Όμως η καλλιέργεια γίνεται μεγαλύτερη και πιο σύνθετη, όπως συμβαίνει με τα μηχανικά όργανα και ιστούς. Τότε άλλοι μηχανισμοί πρέπει να χρησιμοποιηθούν για να την συντηρήσουν, όπως η δημιουργία τριχοειδών δικτύων εντός του ιστού. Ένα άλλο ζήτημα είναι η πρόκληση των κατάλληλων παραγόντων – ερεθισμάτων που απαιτούνται για την αύξηση της λειτουργικότητας. Σε πολλές περιπτώσεις, η απλή συντήρηση της καλλιέργειας δεν είναι αρκετή. Απαιτούνται αυξητικοί παράγοντες, ορμόνες, συγκεκριμένοι μεταβολίτες ή θρεπτικά στοιχεία, χημικά και φυσικά ερεθίσματα. Για παράδειγμα ορισμένα κύτταρα αντιδρούν σε αλλαγές την ένταση του οξυγόνου, ως τμήμα της φυσικής τους ανάπτυξης (όπως τα χονδροκύτταρα). Επομένως πρέπει να προσαρμοστούν σε συνθήκες χαμηλού οξυγόνου ή υποξίας κατά τη διάρκεια της σκελετικής τους ανάπτυξης. Άλλα (όπως τα επιθηλιακά κύτταρα), αντιδρούν στη διατμητική τάση λόγω της ροής υγρού, όπως συμβαίνει στις αρτηρίες. Μηχανικά ερεθίσματα (όπως παλμοί πίεσης), φαίνεται να είναι ωφέλιμοι σε όλα τα είδη καρδιαγγειακών ιστών, όπως καρδιακές βαλβίδες, αρτηρίες ή το περικάρδιο. Βιο – αντιδραστήρες Ένας βιο – αντιδραστήρας είναι μια συσκευή που προσπαθεί να προσομοιώσει ένα φυσιολογικό περιβάλλον με σκοπό να προωθήσει την ανάπτυξη κυττάρων ή ιστών in vivo. Ένα φυσιολογικό περιβάλλον μπορεί να αποτελείται από πολλές διαφορετικές παραμέτρους, όπως η θερμοκρασία και το οξυγόνο ή η συγκέντρωση διοξειδίου του άνθρακα. Όμως μπορεί να εκτείνεται σε όλα τα είδη βιολογικών, χημικών, ή μηχανικών ερεθισμάτων. Γι’ αυτό υπάρχουν συστήματα που μπορεί να συμπεριλαμβάνουν την εφαρμογή δυνάμεων ή τάσεων στους ιστούς, ή ακόμη και ηλεκτρικού ρεύματος σε μοντέλα 2 ή 3 διαστάσεων. Στις ερευνητικές μονάδες, είναι τυπικό για τους βιο – αντιδραστήρες να κατασκευάζονται για να αναπαριστούν το συγκεκριμένο φυσικό περιβάλλον του ιστού που καλλιεργούν (π.χ. διάτμηση καλωδίων ή υγρών στην καλλιέργεια καρδιακών ιστών). Αρκετοί βιο – αντιδραστήρες γενικής χρήσης και ειδικών εφαρμογών είναι εμπορικά διαθέσιμοι και μπορεί να παρέχουν στατικές χημικές προσομοιώσεις ή συνδυασμό χημικών και μηχανικών προσομοιώσεων. Οι βιο – αντιδραστήρες που χρησιμοποιούνται για τρισδιάστατες κυτταρικές καλλιέργειες, είναι μικροί πλαστικοί κυλινδρικοί θάλαμοι με ρυθμιζόμενη εσωτερική υγρασία. Ειδικά σχεδιασμένοι για το σκοπό της καλλιέργειας των κυττάρων σε 3 διαστάσεις. Ο βιο – αντιδραστήρας χρησιμοποιεί βιο – ενεργά συνθετικά υλικά, όπως μεμβράνες από τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο, για να περιβάλλουν τις σφαιρικά κύτταρα. Έτσι δημιουργούν ένα περιβάλλον που διατηρεί υψηλά επίπεδα θρεπτικών συστατικών. Είναι εύκολοι στο άνοιγμα και στο κλείσιμο, έτσι ώστε τα σφαιρίδια κυττάρων να μπορούν να αφαιρεθούν για εξέταση. Ο θάλαμος όμως μπορεί να διατηρήσει 100% υγρασία και μετά το άνοιγμα. Η υγρασία είναι σημαντική για την διατήρηση της μέγιστης ανάπτυξης και της λειτουργικότητας των κυττάρων. Παραγωγή μακρών ινών Το 2013, μια ομάδα από το πανεπιστήμιο του Τόκιο ανέπτυξε ίνες φορτωμένες με κύτταρα. Έφταναν σε μήκος το 1 μέτρο και είχαν μέγεθος 100μm. Αυτές οι ίνες κατασκευάστηκαν με τη βοήθεια μιας μικρο – υγροσκοπικής συσκευής. Αυτή η συσκευή σχηματίζει μια διπλή ομοαξονική ελασματώδη ροή. Σε κάθε «στρώμα» της συσκευής τα κύτταρα σπέρνονται σε ECM, υπάρχει μια θήκη υδρογέλης και τελικά ένα διάλυμα χλωριούχου νατρίου. Τα κύτταρα καλλιεργούνται εντός της θήκης υδρογέλης για αρκετές ημέρες και μετά η θήκη αφαιρείται με ίνες κυττάρων. Διάφοροι τύποι κυττάρων εισήχθησαν στον πυρήνα του ECM, συμπεριλαμβανομένων μυϊκών κυττάρων, επιθηλιακών κυττάρων και ινών από νευρικά και επιθηλιακά κύτταρα. Η ομάδα έπειτα έδειξε ότι αυτές οι ίνες μπορούν να υφανθούν μαζί για να σχηματίσουν ιστούς ή όργανα σε ένα μηχανισμό παρόμοιο με την ύφανση ρούχων. Οι ινώδεις μορφολογίες είναι ανώτερες στο ότι παρέχουν μια εναλλακτική στη συμβατική κατασκευή ικριωμάτων. Πολλά όργανα (όπως οι μύες) αποτελούνται από ινώδη κύτταρα. Βιο – τεχνητά όργανα Ένα άρθρο δημοσιεύτηκε στην εφημερίδα New York Times με τίτλο : «Μια πρωτοπορία : Όργανα κατά παραγγελία από τα ίδια τα κύτταρα του σώματος». Αναγνώριζε την πρώτη εγχείρηση της αναγεννητικής ιατρικής, που ήταν η μεταμόσχευση ενός βιο – τεχνητού οργάνου. Σε αυτή την περίπτωση ήταν μια τραχεία και πραγματοποιήθηκε στο ινστιτούτο Karolinska της Σουηδίας. Ο στόχος είναι να κατασκευαστούν πιο σύνθετα όργανα, όπως η καρδιά, το συκώτι και τα νεφρά. Το 2011 ένας ασθενής χρειαζόταν μια νέα τραχεία. Ο δρ. Macchiarini του το πρότεινε λέγοντάς του ότι αυτή η επέμβαση είχε πραγματοποιηθεί ως τότε μόνο σε γουρούνια. Στην εγχείρηση χρησιμοποιήθηκαν βλαστικά κύτταρα και ένα ικρίωμα, που μπορούσε να δημιουργήσει ένα ολόκληρο τεχνητό όργανο. Ο γιατρός πήρε κύτταρα από τον μυελό των οστών του ασθενούς. Με ένα συνθετικό ικρίωμα, το έσταξαν (σχεδόν ράντισαν), αναφέρει το άρθρο της εφημερίδας. Αυτό συνεχίζεται μέχρι τα ανθρώπινα κύτταρα να αναγεννηθούν από μόνα τους και να σχηματίσουν το όργανο. Αυτού του είδους η επέμβαση βοηθά στο να ξεπεραστούν ορισμένα από τα προβλήματα του οργάνου από δότη. Αυτό γιατί τα κύτταρα προέρχονται από τον ίδιο τον ασθενή και επομένως δεν υπάρχει φόβος απόρριψης του μοσχεύματος. Υπάρχει η φιλοδοξία να κατασκευάζονται όργανα χωρίς το συνθετικό ικρίωμα. Αυτός είναι ο στόχος της μηχανικής των ιστών σήμερα.