Μοριακό ρολόι

Το μοριακό ρολόι είναι ένας όρος για μια τεχνική που χρησιμοποιεί το ποσοστό μετάλλαξης των βιομορίων για να μειώσει τον χρόνο στην προϊστορία δύο ή περισσότερων μορφών ζωής που αποκλίνουν. Τα βιομοριακά δεδομένα που χρησιμοποιούνται για τέτοιους υπολογισμούς είναι συνήθως οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων για DNA, RNA ή οι αλληλουχίες αμινοξέων για πρωτεΐνες. Τα σημεία αναφοράς για τον προσδιορισμό του ρυθμού μετάλλαξης είναι συχνά απολιθωμένες ή αρχαιολογικές ημερομηνίες. Το μοριακό ρολόι δοκιμάστηκε για πρώτη φορά το 1962 στις παραλλαγές πρωτεΐνης αιμοσφαιρίνης διαφόρων ζώων και χρησιμοποιείται συνήθως στη μοριακή εξέλιξη για την εκτίμηση των χρόνων ειδογένεσης ή ακτινοβολίας. Μερικές φορές ονομάζεται ρολόι γονιδίων (gene clock) ή εξελικτικό ρολόι (evolutionary clock).

 Η έννοια της ύπαρξης ενός λεγόμενου μοριακού ρολογιού αποδόθηκε αρχικά στους Emile Zuckerkandl και Λάινους Πόλινγκ οι οποίοι, το 1962, παρατήρησαν ότι ο αριθμός των διαφορών των αμινοξέων στην αιμοσφαιρίνη μεταξύ διαφορετικών γενεών αλλάζουν περίπου με τον χρόνο, όπως εκτιμάται από απολιθωμένα στοιχεία. Γενίκευσαν αυτή την παρατήρηση για να υποστηρίξουν ότι ο ρυθμός εξελικτικής αλλαγής οποιασδήποτε καθορισμένης πρωτεΐνης ήταν περίπου σταθερός με την πάροδο του χρόνου και σε διαφορετικές γενεές (γνωστή ως υπόθεση μοριακού ρολογιού). Το φαινόμενο της γενετικής ισότητας σημείωσε για πρώτη φορά το 1963 ο Emanuel Margoliash, ο οποίος έγραψε: Φαίνεται ότι ο αριθμός των διαφορών των υπολειμμάτων μεταξύ του κυτοχρώματος c οποιωνδήποτε δύο ειδών εξαρτάται κυρίως από ο χρόνος πέρασε από τότε που οι γραμμές εξέλιξης που οδήγησαν σε αυτά τα δύο είδη απέκλιναν αρχικά. Εάν αυτό είναι σωστό, το κυτόχρωμα c όλων των θηλαστικών πρέπει να είναι εξίσου διαφορετικό από το κυτόχρωμα c όλων των πτηνών. Δεδομένου ότι τα ψάρια αποκλίνουν από το κύριο στέλεχος της εξέλιξης των σπονδυλωτών νωρίτερα από ό,τι τα πουλιά ή τα θηλαστικά, το κυτόχρωμα c τόσο των θηλαστικών όσο και των πουλιών θα πρέπει να είναι εξίσου διαφορετικό από το κυτόχρωμα c των ψαριών. Ομοίως, τα κυτοχρώματα c των σπονδυλωτών πρέπει να είναι εξίσου διαφορετικά από την πρωτεΐνη της ζύμης. Για παράδειγμα, η διαφορά μεταξύ του κυτοχρώματος c ενός κυπρίνου και ενός βατράχου, χελώνας, κοτόπουλου, κουνελιού και αλόγου είναι μια πολύ σταθερή 13% έως 14%. Ομοίως, η διαφορά μεταξύ του κυτοχρώματος c ενός βακτηρίου και της μαγιάς, του σίτου, του σκώρου, του τόνου, του περιστεριού και του αλόγου κυμαίνεται από 64% έως 69%. Μαζί με τη δουλειά των Emile Zuckerkandl και Λάινους Πόλινγκ, το αποτέλεσμα της γενετικής ίσης απόστασης οδήγησε άμεσα στην επίσημη διατύπωση της υπόθεσης του μοριακού ρολογιού στις αρχές της δεκαετίας του 1960.Ομοίως, οι Vincent Sarich και Allan Wilson το 1967 έδειξαν ότι οι μοριακές διαφορές μεταξύ των σύγχρονων πρωτευόντων στις πρωτεΐνες της λευκωματίνης έδειξαν ότι είχαν σημειωθεί περίπου σταθεροί ρυθμοί αλλαγής σε όλες τις γενεαλογίες που αξιολογήθηκαν. Η βασική λογική της ανάλυσής τους περιελάμβανε την αναγνώριση ότι εάν μια γενεαλογία ειδών είχε εξελιχθεί ταχύτερα από μια γενεαλογία αδελφών ειδών από τον κοινό πρόγονό τους, τότε οι μοριακές διαφορές μεταξύ ενός είδους εξωομάδας (πιο μακρινή συγγένεια) και των ταχύτερα εξελισσόμενων ειδών θα πρέπει να είναι μεγαλύτερες (καθώς περισσότερες μοριακές αλλαγές θα είχαν συσσωρευτεί σε αυτή τη γενεαλογία) από τις μοριακές διαφορές μεταξύ των ειδών της εξωομάδας και των πιο αργών εξελισσόμενων ειδών. Αυτή η μέθοδος είναι γνωστή ως δοκιμή σχετικού ρυθμού (relative rate test). Η εφημερίδα του Σάριχ και του Γουίλσον ανέφερε, για παράδειγμα, ότι οι ανοσολογικές διασταυρούμενες αντιδράσεις λευκωματίνης στον Homo sapiens και τον Pan troglodytes διέφεραν το ίδιο από το είδος Ceboidea (Χιμπαντής του Νέου Κόσμου) (μέσα στο πειραματικό σφάλμα). Αυτό σήμαινε ότι και οι δύο είχαν συσσωρεύσει περίπου ίσες αλλαγές στην λευκωματίνη από τον κοινό τους πρόγονο. Αυτό το μοτίβο βρέθηκε επίσης για όλες τις συγκρίσεις πρωτευόντων που εξέτασαν. Όταν βαθμονομήθηκε με τα λίγα καλά τεκμηριωμένα σημεία διακλάδωσης απολιθωμάτων (επειδή δεν βρέθηκαν απολιθώματα πρωτευόντων σύγχρονων όψεων πριν από το όριο Κρητιδικού-Παλαιόγονου), αυτό οδήγησε τον Σάριχ και τον Γουίλσον να υποστηρίξουν ότι η απόκλιση ανθρώπου-χιμπατζή εμφανίστηκε πιθανώς πριν από περίπου 4-6 εκατομμύρια χρόνια. Η παρατήρηση ενός μοριακού ρυθμού ρολογιού ήταν αρχικά καθαρά φαινομενολογική. Αργότερα, το έργο του Motoo Kimura ανέπτυξε την ουδέτερη θεωρία της μοριακής εξέλιξης, η οποία προέβλεπε ένα μοριακό ρολόι. Εάν υπάρχουν N άτομα και για να διατηρήσουμε αυτόν τον υπολογισμό απλό, αφήστε τα άτομα να είναι απλοειδή (δηλαδή να έχετε ένα αντίγραφο κάθε γονιδίου). Αφήστε το ρυθμό των ουδέτερων μεταλλάξεων (δηλαδή των μεταλλάξεων που δεν επηρεάζουν την αρμοστικότητα) σε ένα νέο άτομο να είναι μ {\displaystyle \mu } . Η πιθανότητα ότι αυτή η νέα μετάλλαξη θα γίνει σταθερή στον πληθυσμό είναι τότε 1/N, καθώς κάθε αντίγραφο του γονιδίου είναι τόσο καλό όσο οποιοδήποτε άλλο. Κάθε γενιά, κάθε άτομο μπορεί να έχει νέες μεταλλάξεις, οπότε υπάρχουν μ {\displaystyle \mu } N νέες ουδέτερες μεταλλάξεις στον πληθυσμό ως σύνολο. Αυτό σημαίνει ότι σε κάθε γενιά, μ {\displaystyle \mu } θα γίνουν σταθερές νέες ουδέτερες μεταλλάξεις. Εάν οι περισσότερες αλλαγές που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της μοριακής παρέκκλισης είναι ουδέτερες, τότε οι σταθεροποιήσεις σε έναν πληθυσμό θα συσσωρευτούν με ρυθμό ρολογιού που είναι ίσος με τον ρυθμό των ουδέτερων μεταλλάξεων σε ένα άτομο. Το μοριακό ρολόι μόνο του μπορεί να πει μόνο ότι μια χρονική περίοδος είναι διπλάσια από μια άλλη: δεν μπορεί να δώσει συγκεκριμένες ημερομηνίες. Για ιογενείς φυλογενετικές μελέτες και μελέτες αρχαίου DNA - δύο τομείς της εξελικτικής βιολογίας όπου είναι δυνατόν να γίνει δειγματοληψία αλληλουχιών σε μια εξελικτική χρονική κλίμακα - οι ημερομηνίες των ενδιάμεσων δειγμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ακριβέστερη βαθμονόμηση του μοριακού ρολογιού. Ωστόσο, οι περισσότερες φυλογενέσεις απαιτούν το μοριακό ρολόι να βαθμονομηθεί ως προς ανεξάρτητα στοιχεία για τις ημερομηνίες, όπως η καταχώριση του απολιθώματος. Υπάρχουν δύο γενικές μέθοδοι για τη βαθμονόμηση του μοριακού ρολογιού χρησιμοποιώντας δεδομένα απολιθωμάτων: βαθμονόμηση κόμβου και βαθμονόμηση άκρων. Η βαθμονόμηση κόμβων (χρονολόγηση κόμβων (node dating)) είναι μια μέθοδος βαθμονόμησης φυλογένεσης που γίνεται με την τοποθέτηση περιορισμών απολιθωμάτων στους κόμβους. Ένας απολιθωμένος κόμβος βαθμονόμησης είναι ο παλαιότερος εντοπισμένος αντιπρόσωπος αυτού του κλάδου, που χρησιμοποιείται για τον περιορισμό της ελάχιστης ηλικίας του. Λόγω της αποσπασματικής φύσης του απολιθώματος, ο πραγματικός πιο πρόσφατος κοινός πρόγονος ενός κλάδου πιθανότατα δεν θα βρεθεί ποτέ. Για να ληφθεί υπόψη αυτό στις αναλύσεις βαθμονόμησης κόμβου, πρέπει να εκτιμηθεί η μέγιστη ηλικία του κλάδου. Ο καθορισμός της μέγιστης ηλικίας του κλάδου είναι δύσκολος, επειδή βασίζεται σε αρνητικές ενδείξεις - την απουσία παλαιότερων απολιθωμάτων σε αυτόν τον κλάδο. Υπάρχουν αρκετές μέθοδοι για την απόκτηση της μέγιστης ηλικίας του κλάδου χρησιμοποιώντας πρότυπα γέννησης-θανάτου, αναλύσεις κατανομής στρωματογραφικών απολιθωμάτων ή ταφονικά στοιχεία. Εναλλακτικά, αντί για μέγιστο και ελάχιστο, μπορεί να καθοριστεί η προγενέστερη πιθανότητα του χρόνου παρέκκλισης και να χρησιμοποιηθεί για τη βαθμονόμηση του ρολογιού. Υπάρχουν αρκετές προηγούμενες κατανομές πιθανότητας, όπως η κανονική, η λογαριθμοκανονική, η εκθετική, η κατανομή γάμμα, η ομοιόμορφη, κ.λπ.) που μπορεί να χρησιμοποιηθούν για να εκφράσουν την πιθανότητα της πραγματικής ηλικίας της απόκλισης σε σχέση με την ηλικία του απολιθώματος. Ωστόσο, υπάρχουν πολύ λίγες μέθοδοι για την εμπειρική εκτίμηση του σχήματος και των παραμέτρων της κατανομής πιθανότητας. Η τοποθέτηση κόμβων βαθμονόμησης στο δέντρο ενημερώνει την τοποθέτηση των μη περιορισμένων κόμβων, δίνοντας εκτιμήσεις ημερομηνίας παρέκκλισης σε όλη τη φυλογένεση. Οι ιστορικές μέθοδοι βαθμονόμησης ρολογιού μπορούσαν να κάνουν χρήση μόνο ενός περιορισμού απολιθωμάτων (μη παραμετρική εξομάλυνση ρυθμού), ενώ οι σύγχρονες αναλύσεις (BEAST και r8s) επιτρέπουν τη χρήση πολλαπλών απολιθωμάτων για τη βαθμονόμηση του μοριακού ρολογιού. Μελέτες προσομοίωσης έχουν δείξει ότι η αύξηση του αριθμού των περιορισμών των απολιθωμάτων αυξάνει την ακρίβεια της εκτίμησης του χρόνου παρέκκλισης. Η βαθμονόμηση των άκρων (Μερικές φορές αναφέρεται και ως χρονολόγηση άκρων (tip dating)) είναι μια μέθοδος βαθμονόμησης μοριακού ρολογιού στην οποία τα απολιθώματα αντιμετωπίζονται ως ταξινομικές κατηγορίες και τοποθετούνται στις άκρες του δέντρου. Αυτό επιτυγχάνεται δημιουργώντας μια μήτρα που περιλαμβάνει ένα σύνολο μοριακών δεδομένων για την υφιστάμενη ταξινομική κατηγορία μαζί με ένα σύνολο μορφολογικών δεδομένων τόσο για τις εξαφανισμένες όσο και για τις υφιστάμενες ταξινομικές κατηγορίες. Σε αντίθεση με τη βαθμονόμηση κόμβων, αυτή η μέθοδος ανακατασκευάζει την τοπολογία του δέντρου και τοποθετεί τα απολιθώματα ταυτόχρονα. Τα μοριακά και μορφολογικά πρότυπα συνεργάζονται μαζί ταυτόχρονα, επιτρέποντας στη μορφολογία να ενημερώνει την τοποθέτηση των απολιθωμάτων. Η βαθμονόμηση άκρων χρησιμοποιεί όλες τις σχετικές ταξινομικές κατηγορίες απολιθωμάτων κατά τη βαθμονόμηση του ρολογιού, αντί να βασίζεται μόνο στα παλαιότερα απολιθώματα κάθε κλάδου. Αυτή η μέθοδος δεν βασίζεται στην ερμηνεία των αρνητικών ενδείξεων για να συναχθούν οι μέγιστες ηλικίες του κλάδου. Σύνολο στοιχείων που χρονολογούνται Αυτή η προσέγγιση για τη βαθμονόμηση των άκρων προχωρά ένα βήμα παραπέρα με ταυτόχρονη εκτίμηση της τοποθέτησης των απολιθωμάτων, της τοπολογίας και της εξελικτικής κλίμακας του χρόνου. Σε αυτήν τη μέθοδο, η ηλικία ενός απολιθώματος μπορεί να ενημερώσει τη φυλογενετική του θέση επιπροσθέτως της μορφολογίας. Επιτρέποντας ταυτόχρονα όλες τις πτυχές της ανακατασκευής δέντρων, μειώνεται ο κίνδυνος μεροληπτικών αποτελεσμάτων Αυτή η προσέγγιση έχει βελτιωθεί συνδυάζοντάς την με διαφορετικά πρότυπα. Μια τρέχουσα μέθοδος βαθμονόμησης μοριακού ρολογιού είναι τα συνολικά στοιχεία που χρονολογούνται σε συνδυασμό με το πρότυπο γέννησης-θανάτου απολιθωμάτων (fossilized birth-death ή FBD) και ένα πρότυπο μορφολογικής εξέλιξης. Το πρότυπο FBD είναι καινοτόμο στο ότι επιτρέπει προγόνους με δειγματοληψία, που είναι ταξινομικές κατηγορίες απολιθωμάτων οι οποίες είναι οι άμεσοι πρόγονοι μιας ζώσας ταξινομικής κατηγορίας ή γενεαλογίας. Αυτό επιτρέπει την τοποθέτηση απολιθωμάτων σε έναν κλάδο πάνω από έναν υπάρχοντα οργανισμό, αντί να περιορίζεται στις άκρες. Οι Μπεϊζιανές (Bayesian) μέθοδοι μπορούν να παρέχουν πιο κατάλληλες εκτιμήσεις των χρόνων απόκλισης, ειδικά εάν χρησιμοποιούνται μεγάλα σύνολα δεδομένων - όπως αυτά που παράγονται από την φυλογονιδιωματική. Μερικές φορές μόνο μια ημερομηνία απόκλισης μπορεί να εκτιμηθεί από τα απολιθώματα, με όλες τις άλλες ημερομηνίες να συνάγονται από αυτήν. Άλλα σύνολα ειδών διαθέτουν άφθονα απολιθώματα, επιτρέποντας τη δοκιμή της υπόθεσης των σταθερών ποσοστών απόκλισης. Οι αλληλουχίες DNA που παρουσιάζουν χαμηλά επίπεδα αρνητικής επιλογής έδειξαν ρυθμούς απόκλισης 0,7-0,8% ανά Myr (εκατομμύρια έτη) σε βακτήρια, θηλαστικά, ασπόνδυλα και φυτά. Στην ίδια μελέτη, οι γονιδιωματικές περιοχές που παρουσίασαν πολύ υψηλή αρνητική ή καθαριστική επιλογή (κωδικοποίηση rRNA) ήταν σημαντικά βραδύτερες (1% ανά 50 Myr). Εκτός από μια τέτοια διακύμανση του ρυθμού με τη γονιδιωματική θέση, από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 η διακύμανση μεταξύ των ταξινομικών κατηγοριών έχει αποδειχθεί εύφορο έδαφος για έρευνα, ακόμη και σε σχετικά σύντομες περιόδους εξελικτικής χρόνου (για παράδειγμα ατριχόρνιθες). Τα ρινοτρυπόμορφα (Procellariiformes) έχουν μοριακά ρολόγια που κατά μέσο όρο τρέχουν με μισή ταχύτητα πολλών άλλων πουλιών, πιθανώς λόγω μεγάλων χρόνων γενεών και πολλές χελώνες έχουν μοριακό ρολόι που τρέχουν με το ένα όγδοο της ταχύτητας που έχουν τα μικρά θηλαστικά, ή ακόμα και πιο αργά. Τα αποτελέσματα του μικρού μεγέθους πληθυσμού είναι επίσης πιθανό να συγχέουν τις αναλύσεις μοριακού ρολογιού. Ερευνητές όπως ο Francisco J. Ayala έχουν αμφισβητήσει ουσιαστικά την υπόθεση του μοριακού ρολογιού. Σύμφωνα με τη μελέτη του Ayala το 1999, πέντε παράγοντες συνδυάζονται για να περιορίσουν την εφαρμογή των προτύπων του μοριακού ρολογιού: Αλλαγή των χρόνων γενεών (Εάν ο ρυθμός των νέων μεταλλάξεων εξαρτάται τουλάχιστον εν μέρει από τον αριθμό των γενεών παρά τον αριθμό των ετών) Το μέγεθος του πληθυσμού (Η γενετική παρέκκλιση είναι ισχυρότερη σε μικρούς πληθυσμούς και έτσι περισσότερες μεταλλάξεις είναι ουσιαστικά ουδέτερες) Διαφορές για συγκεκριμένα είδη (λόγω διαφορετικού μεταβολισμού, οικολογίας, εξελικτικού ιστορικού, ...) Αλλαγή στη λειτουργία της πρωτεΐνης που μελετήθηκε (μπορεί να αποφευχθεί σε στενά συγγενικά είδη χρησιμοποιώντας αλληλουχίες μη κωδικοποιητικού DNA ή τονίζοντας σιωπηλές μεταλλάξεις) Αλλαγές στην ένταση της φυσικής επιλογής.. Οι χρήστες του μοριακού ρολογιού έχουν αναπτύξει λύσεις παράκαμψης χρησιμοποιώντας μια σειρά στατιστικών προσεγγίσεων, συμπεριλαμβανομένων των τεχνικών μέγιστης πιθανοφάνειας και αργότερα Μπεϊζιανής προτυποποίησης. Συγκεκριμένα, έχουν προταθεί πρότυπα που λαμβάνουν υπόψη τη διακύμανση του ρυθμού μεταξύ των γενεαλογικών γραμμών, προκειμένου να ληφθούν καλύτερες εκτιμήσεις των χρόνων απόκλισης. Αυτά τα πρότυπα ονομάζονται χαλαρά μοριακά ρολόγια (relaxed molecular clocks) επειδή αντιπροσωπεύουν μια ενδιάμεση θέση μεταξύ της 'αυστηρής' υπόθεσης μοριακού ρολογιού και του προτύπου πολλών ρυθμών (many-rates)του Joseph Felsenstein και καθίστανται δυνατές μέσω τεχνικών MCMC που διερευνούν ένα σταθμισμένο εύρος τοπολογιών δέντρων και ταυτόχρονα εκτιμούν τις παραμέτρους του επιλεγμένου προτύπου υποκατάστασης. Πρέπει να θυμόμαστε ότι οι ημερομηνίες απόκλισης που συνάγονται χρησιμοποιώντας ένα μοριακό ρολόι βασίζονται σε στατιστικά συμπεράσματα και όχι σε απευθείας απόδειξη. Το μοριακό ρολόι αντιμετωπίζει ιδιαίτερες προκλήσεις σε πολύ σύντομα και πολύ μεγάλα χρονικά διαστήματα. Σε μεγάλα χρονικά διαστήματα, το πρόβλημα είναι ο κορεσμός. Όταν έχει περάσει αρκετός χρόνος, πολλές θέσεις έχουν υποστεί περισσότερες από μία αλλαγές, αλλά είναι αδύνατο να εντοπιστούν περισσότερες από μία. Αυτό σημαίνει ότι ο παρατηρούμενος αριθμός αλλαγών δεν είναι πλέον γραμμικός με την πάροδο του χρόνου, αλλά αντίθετα εξομαλύνεται. Ακόμη και σε ενδιάμεσες γενετικές αποστάσεις, με φυλογενετικά δεδομένα ακόμα επαρκή για την εκτίμηση της τοπολογίας, το σήμα για τη συνολική κλίμακα του δέντρου μπορεί να είναι αδύναμο σε πολύπλοκα πρότυπα πιθανοφάνειας, οδηγώντας σε εξαιρετικά αβέβαιες εκτιμήσεις μοριακού ρολογιού.Σε πολύ μικρές χρονικές κλίμακες, πολλές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων δεν αντιπροσωπεύουν σταθεροποίηση διαφορετικών αλληλουχιών στους διαφορετικούς πληθυσμούς. Αντιθέτως, αντιπροσωπεύουν εναλλακτικά αλληλόμορφα που ήταν και τα δύο παρόντα ως μέρος ενός πολυμορφισμού στον κοινό πρόγονο. Η συμπερίληψη διαφορών που δεν έχουν ακόμη γίνει σταθερές οδηγεί σε δυνητικά δραματικό πληθωρισμό του φαινομένου ρυθμού του μοριακού ρολογιού σε πολύ σύντομα χρονικά διαστήματα. Η τεχνική μοριακού ρολογιού είναι ένα σημαντικό εργαλείο στην μοριακή συστηματική, τη χρήση πληροφοριών μοριακής γενετικής για τον προσδιορισμό της σωστής επιστημονικής ταξινόμησης οργανισμών ή για τη μελέτη της παραλλαγής στις επιλεκτικές δυνάμεις. Η γνώση του προσεγγιστικά σταθερού ρυθμού μοριακής εξέλιξης σε συγκεκριμένα σύνολα γενεαλογίας διευκολύνει επίσης την εκτίμηση των ημερομηνιών των φυλογενετικών γεγονότων, συμπεριλαμβανομένων αυτών που δεν τεκμηριώνονται από απολιθώματα, όπως οι αποκλίσεις μεταξύ των ζωντανών ταξινομικών κατηγοριών. Σε αυτές τις περιπτώσεις - ειδικά σε μεγάλα χρονικά διαστήματα - πρέπει να ληφθούν υπόψη οι περιορισμοί της υπόθεσης του μοριακού ρολογιού (παραπάνω). <! - Υπάρχει μια κριτική στο περιοδικό TREE που θέτει ένα καλό σημείο σε αυτό -> τέτοιες εκτιμήσεις μπορεί να αποκλίνουν κατά 50% ή περισσότερο. Ho, S.Y.W., επιμ. (2020). The Molecular Evolutionary Clock: Theory and Practice. Springer, Cham. doi:10.1007/978-3-030-60181-2. ISBN 978-3-030-60180-5. Kumar, S. (2005). «Molecular clocks: four decades of evolution». Nature Reviews Genetics 6 (8): 654–662. doi:10.1038/nrg1659. PMID 16136655. Morgan, G.J. (1998). «Emile Zuckerkandl, Linus Pauling, and the Molecular Evolutionary Clock, 1959–1965». Journal of the History of Biology 31 (2): 155–178. doi:10.1023/A:1004394418084. PMID 11620303. Zuckerkandl, E.· Pauling, L.B. (1965). «Evolutionary divergence and convergence in proteins». Στο: Bryson, V.· Vogel, H.J. Evolving Genes and Proteins. Academic Press, New York. σελίδες 97–166. Allan Wilson and the molecular clock Molecular clock explanation of the molecular equidistance phenomenon Date-a-Clade service for the molecular tree of life