高檸檬酸合酶

在生物化學領域 ， 高檸檬酸合酶 （ Homocitrate synthase ） 是一種可催化高檸檬酸 （ 2 - 羥基 -1,2,4-三羧酸 ） 合成的酶 。 催化如下化學反應 ： 乙酰CoA + H2O + α - 酮戊二酸 ( R ) -2-羥基-1,2,4-三羧酸 + CoA 在一些真菌和特定古生菌中 ， 高檸檬酸合酶摧化賴氨酸生物合成中的第一步 ， 也是關鍵的一步反應 。 高檸檬酸合酶是由兩個相同的亞基組成 ， 靠氮和碳末端的域交換穩定結構 ， 氮末端的催化域由TIM桶摺疊組成 ， 底物在二價金屬離子的協助下通過氫鍵與活性部位相連 。 碳末端結構域由α / β結構組成 ， 在高檸檬酸合酶與一個底物結合後 ， 一個由碳末端結構域組成的蓋子模序阻礙了底物與相鄰單體活性部位的結合 。 在酶結合兩個底物分子後 ， 這個蓋子模序就消失了 。 這說明酶可以通過改變表面的柔性來調節底物與活性部位的結合 。 無論在體內還是體外 ， 活性位點的變異導致底物與酶結合的減弱與酸鹼催化活性的減弱 。 一些物種通過不同的代謝途徑合成賴氨酸 。 在植物和大部分細菌中 ， 賴氨酸是通過二氨基庚二酸鹽途徑合成的 ， 酵母和其他真菌 ， 包括人類寄生蟲和一些特定的古生菌利用氨基己二酸途徑合成賴氨酸 。 因爲人不能合成賴氨酸 ， 所以抑制真菌氨基己二酸途徑的小分子可以作爲廣譜抗真菌藥物 ， 這在臨牀上有很大的應用潛力 。 特別對於免疫缺陷的患者 ， 比如艾滋病 、 癌症 、 器官移植患者 ， 他們感染真菌的概率很高 。 氨基己二酸途徑包括八步酶反應 ， 高檸檬酸合酶催化第一步反應 ， 也是關鍵的一步反應 。 它的功能是將乙酰輔酶A上的乙酰基轉移到酮戊二酸上 ， 同時形成輔酶A和高檸檬酸 。 動力學研究表明這個反應是有序雙雙反應 ， 酮戊二酸首先與酶結合 ， 再與乙酰輔酶A 結合 ， 完成反應後 ， 依次釋放產物輔酶A和高檸檬酸 。 推測它的反應機理和三羧酸循環中檸檬酸合酶的催化機理相似 ， 都是通過酶的酸鹼催化實現混合羥醛的克萊森縮合 。 通過分析結核分枝桿菌的異丙基蘋果酸合酶的晶體結構 ， 可以更好的理解高檸檬酸合酶的作用機理 。 兩種酶屬於同一家族 ， 催化的反應也類似 — — 異丙基蘋果酸合酶催化亮氨酸合成途徑中的一步反應 ， 即催化異戊酸和乙酰輔酶A生成異丙基蘋果酸和輔酶A 。 根據異丙基蘋果酸合酶的結構 ， 對高檸檬酸合酶的lys20進行了突變和動力學的研究 。 結果顯示穀氨酸 - 組氨酸催化二連體負責第一步催化反應中乙酰輔酶A乙酰基的去質子化 。 但是因爲缺少高檸檬酸合酶的晶體數據 ， 無法確定負責催化和結合的殘基 ， 也就無法獲知其催化和調節機制 。 Bulfer, S. L.獲得了從裂殖酵母中提取的高檸檬酸合酶的結晶以及兩個不同酶 - 底物複合物的結晶 。 一種酶 - 底物複合物的晶體結構中有一個蓋子模序 ， 它阻礙了底物靠近TIM桶中的活性位點 ， 調控底物與酶的結合 。 穩態動力學分析和活性位點突變顯示蓋子殘基對結合和催化的影響 。 擴增從裂殖酵母基因獲得的高檸檬酸合酶基因 ， 然後轉移到載體pHIS2上 ， 這個載體在氮末端有his6 標籤 ， 幷包含菸草花葉病毒蛋白酶裂解位點 。 突變體通過QuikChange直接位點突變工具包實現突變 ， 並由DNA測序予以確定 。 0.1 mM異丙基 - D -1-硫代半乳糖苷誘導 ， 高檸檬酸合酶在大腸桿菌Rosetta2中過量表達 ， 在18攝氏度條件下培養過夜 。 細胞用超聲波處理後加入5mg溶菌酶裂解 ， 裂解液用Co ( II ) 的固定化金屬親和層析柱 （ 用於結晶 ） 或Zn ( II ) 交換的固定化親和金屬層析純化 （ 用於動力學研究 ） ， 上樣之前 ， 首先用pH = 7,50 mM磷酸緩衝液 ， 包含500mM NaCl ， 5mM巰基乙醇的上樣緩衝液平衡 ， 用0 - 500mM的咪唑溶液線性洗脫 。 His6標籤在用pH = 8 ， 50mM磷酸鹽緩衝液包含150mMNaCl和5mM巰基乙醇透析過夜時被菸草花葉病毒蛋白酶除去 ， 菸草花葉病毒蛋白酶用5ml 親和層析柱作用一小時除去 。 高檸檬酸合酶用凝膠過濾層析 （ Superdex 200 ） 進一步純化 ， 用pH = 9 ， 25mM tris 包含50mM NaCl ， 1mM三 （ 2 - 羧乙基 ） 膦的溶液洗脫 。 純化後 ， 蛋白用SDS - PAGE檢測純度 。 在一些情況下 ， 高檸檬酸合酶在凝膠過濾前用10mMEDTA處理 ， 以除去金屬離子 。 突變型高檸檬酸合酶純化過程和野生型相同 。 硒甲硫高檸檬酸合酶用Doublie描述的方法制備 ， 純化方法同野生型 。 硒甲基原酶的結晶在100 mM HEPES ； pH 6.8 - 7.2 ； 200 mM 醋酸鎂 ； 16 - 25 % 聚乙二醇 400 ； 24攝氏度 ； 24mg / ml 硒甲基原酶的條件下進行 ， 得到了衍射數據並進行了優化 。 在優化過程中發現高檸檬酸合酶並不是一個完美的二聚體 ， 由於晶體學二重軸被強制地適應二聚體分子二重軸的準對稱性 ， 掩蓋了兩個單體之間的微小差異 。 高檸檬酸合酶與底物結合 ， 蓋子模序呈現關閉狀態 ， 晶體是通過20 mg / ml EDTA處理高檸檬酸合酶後在1mM Zn ( II ) 和 50 mM底物存在條件下獲得的 。 而高檸檬酸合酶與底物結合 ， 蓋子模序呈的關閉狀態的晶體是在24 mg / mL高檸檬酸合酶 和50 mM底物條件下生長的 。 高檸檬酸合酶包含418個殘基 ， 通過硒甲硫單波長異常衍射達到 2.7 埃的分辨率 ， 用分子置換達到優化晶體的目的 ， 達到了 2.24 埃的分辨率 。 有兩種不同的蓋子模序 （ 320 - 333 ） 覆蓋活性位點 ， 分別稱爲開和關構象 。 在關構象中 ， 蓋子模序在電子密度圖中清晰可見 ， 並阻塞了活性位點 ， 在開構象中 ， 這個蓋子模序消失了 ， 活性位點暴露在溶劑中 。 此外 ， 酶可與有兩種二價金屬離子結合 ， 硒甲硫固定相晶體的同步輻射X射線熒光掃描發現有鈷的存在 ， 這是在Co ( II ) 金屬親和層析純化步驟中引入的 。 和鋅結合的高檸檬酸合酶 - 底物複合物中關的蓋子模序是通過用EDTA螯合鈷離子 ， 然後在結晶過程中加入1 - 2mM的鋅離子實現的 。 在動力學研究中 ， 使用的酶是通過Zn ( II ) 金屬親和層析純化的 ， 這是因爲高分辨率電感耦合等離子體質譜的結果說明 ， 天然的酶含有87 % + - 5 % 的鋅 。 高檸檬酸合酶的晶體結構顯示該酶是由一個緊密相連的同型二聚體組成 ， 單體是由氮末端的催化域和碳末端的螺旋摺疊混合域組成 ， 氮末端域 （ 1 - 300殘基 ） 由一個標準的TIM桶 （ 35 - 300 ） 組成 ， 還包含一些二級結構單元的插入 。 酶和底物的複合物中 ， 氮末端 （ 1 - 34殘基 ） 形成一個短的β - 股 。 在TIM桶內 ， 一些短的α螺旋分佈 。 高檸檬酸合酶的碳末端有兩個不同的亞域構成 ， 由一個兩股的反平行β摺疊 ， 一個兩股平行的β摺疊和三個連續的310螺旋構成 。 催化是通過多醛克萊森縮合反應進行的 。 首先2 - 酮戊二酸和乙酰輔酶A與酶的有序結合在酶上 ， 形成三元複合物 ， 乙酰輔酶A的乙酰基團在鹼的催化下去質子化 ， 形成烯醇化物 。 這個烯醇化物作爲親核試劑攻擊2 - 酮戊二酸的二號碳原子 ， 在酸催化下生成醇鹽的中間化合物 。 隨後在水分子的作用下 ， 硫酯鍵被水解 ， 生成輔酶A和高檸檬酸 。