核桿菌还有一个特殊的双层脂质外膜。细胞壁富含脂质是分枝桿菌属特有的临床特征，使用一般的革兰氏染色鑑定，会出现不明显的阳性反应或无法被染上色的现象，原因就是其细胞壁中富含脂质以及（一种脂肪酸）。在自然界，结核桿菌只能生长于宿主个体的细胞中，但在实验室中可在试管内培养。医检师可利用组织染色法处理痰液检体，便可用显微镜鑑别出结核桿菌。因为结核桿菌染色后不会被酸性溶剂沖洗掉，分类上又被称为。目前最常用的耐酸染色法是及，两染色法在显微镜下所见的背景为蓝色，而结核桿菌则是呈现红色。另外也可使用，并在萤光显微镜下观察。