戊辰战争爆发，土方代替于墨染事件中负伤的局长近藤勇率领新选组参战，但在皇军新式枪炮前败北。土方觉悟到冷兵器的时代已经过去，而开始致力引进西洋军备 。鸟羽伏见之战战败的幕府军从大坂往江户撤退后，近藤化名大久保刚、土方化名内藤隼人避走甲斐，于3月6日甲州胜沼之战再度败退。4月3日时在皇军包围下，土方阻止了近藤的切腹谢罪，并前往江戸向胜海舟请求赦免近藤，但胜海舟未能成功说服皇军，庆应4年（1868年）4月25日、近藤勇在板桥（现在JR板桥站前）被斩首。是年4月11日，江户城无血开城。土方率流山残部与幕府军