基质或组织基质的酶可以以运输的方式穿过线粒体膜间隙。线粒体中的移位酶有的在线粒体外膜上（TOM）有的在线粒体内膜上（TIM，叶绿体中的移位酶有的在外膜上（TOC）有的在内膜上（TIC）。在电子传递期间，因为质子梯度的缘故，膜间隙倾向于低pH，当质子从线粒体基质被泵入膜间隙时就会产生质子梯度。负责形成质子梯度的相应细胞结构包括了：辅酶Q、NADH-辅酶Q氧化还原酶复合体（复合体I）、琥珀酸盐-辅酶Q氧化还原酶复合体（复合体II）与辅酶Q-细胞色素c氧化还原酶复合体（复合体III）。
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