fgang凯撒（Wolfgang Kaiser (physicist)）使用激光激发在CaF2：Eu2 +晶体中观察到。 艾萨克·阿贝拉（Isaac Abella）于1962年在铯蒸气中表明，双光子激发单个原子是可能的。双光子激发荧光显微镜与共聚焦激光扫描显微镜具有相似性。
开发.双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在康奈尔大学的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得专利。他们将双光子吸收的概念与使