1962年在铯蒸气中表明，双光子激发单个原子是可能的。双光子激发荧光显微镜与共聚焦激光扫描显微镜具有相似性。
开发.双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在康奈尔大学的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得专利。他们将双光子吸收的概念与使用激光扫描仪相结合。在双光子激发显微镜中，红外激光束通过物镜聚焦。 通常使用的钛-蓝宝石激发激光具有大约100飞秒的脉冲宽度和大约80MHz的重复率，允许两个光子吸收