尤翰三世等国王皆曾试图恢复该校的兴盛，但均徒劳无功。1593年的乌普萨拉会议上，重振校务获得各方一致同意，而关于校务革新的官方文件则在1595年成文化。进入17世纪后瑞典国力扶摇直上，乌普萨拉大学的第一个黄金时代也正式开启于1620年代；国王古斯塔夫二世·阿道夫借由慷慨的捐助为校务的发展奠定稳固的经济基础，学生总数也大幅上升，至1630年代全校已有一千多名学生。奥洛夫．鲁德贝克担任医学院教授，开启了该校自然科学领域的发展。1640年代，乌普萨拉大学的学生开始依据自家祖籍、地缘关系组织名为Nation