年6月、新选组全员被幕府拔擢为幕臣，这时源三郎作为副长助勤而被赐与七十俵三人扶持。但是幕末的政局却受到大政奉还、王政复古等巨大命令的影响，连带的使得属于佐幕派新选组的源三郎渐渐处于劣势之中。
淀千两松之战.庆应4年1月、鸟羽伏见之战爆发。新选组因为败战，于是把基地从伏见撤退移转到淀。1月5日，新选组在淀千两松与官军激战（淀千两松之战）。在这场战争的中期，井上因为受到枪击而战死。享年40岁。据说因此流传着一则小故事，身为井上侄子的井上泰助虽然打算把井上的首级给带回来，但因为被