段，共价键必须必须被打断以使酶再生。在如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶等的蛋白酶中发现了这一机制，在反应中形成了酰基酶中间产物。使用来自赖氨酸残基的自由胺形成施夫碱的过程则是另外一种机制，就像在糖酵解过程中的醛缩酶一样。一些酶利用如磷酸吡哆醛（PLP）或硫胺素焦磷酸（TPP）之类的非氨基酸辅因子与反应物分子间反应形成共价中间产物。这样为降低后面反应过渡态能量而形成的共价中间产物在功能上与反应物与活性位点中的氨基酸残基形成共价中间产物是一样的，都是为了达到稳定；而所不同的是辅因子有着允许带着产物离开酶之功能然而氨