个人土地所有权被确立，殖民者被分割为4个城镇（citties）。詹姆斯敦被划入詹姆斯城内。与殖民者们维持了数年的紧张关系后，奥普查纳坎奴和波瓦坦联盟决心彻底清除英国殖民地。1622年3月22日，原住民们袭击了外围的种植园和沿詹姆斯河的社区。史称詹姆斯敦大屠杀或1622年印第安人大屠杀。超过300名殖民者被杀，占到当时殖民地英语人口的三分之一左右。在袭击中，托马斯·戴尔爵士在亨利科斯的定居点和詹姆斯敦以南的沃尔斯顿霍尔姆镇完全被摧毁。由于一个土着人的通风报信，詹姆斯敦幸免于难，但外围的定居点则完全没有防备