负氧离子洞（）能够稳定去质子化的氧或醇盐上的过渡态负电荷，其通常由骨架酰胺或带正电荷的残基组成。稳定过渡态会降低反应所需的活化能，从而促进催化作用。例如，胰凝乳蛋白酶的蛋白酶含有负氧离子洞，以稳定蛋白质水解过程中形成的四面体中间阴离子，并保护底物的带负电的氧气不受水分子的影响。另外，它可以允许插入或定位基底，如果它不能占据洞（例如血红蛋白中的BPG），则会受到空间位阻的影响。催化多步反应的酶可以具有多个负氧离子洞，其稳定反应中的不同过渡态。