聚糖网不能阻挡复合体溶出，因此会被脱色而成为无色。为了对比，在此之后会加入番红（Safranin）进行复染，革兰氏阴性菌成红色，而革兰氏阳性菌仍保有原来的紫色。
定性.
KOH-试验.另外的一种方法是氢氧化钾-试验。将培养好的细菌取出一小部分，使其悬浮于一滴KOH溶液中。革兰氏阳性菌与之不发生反应，用细针穿过该溶液，溶液呈正常液体状。革兰氏阴性菌因细胞壁中主要成分为脂多醣，脂质含量较高，接触强硷KOH后与KOH发生皂化反应，以细针穿过会有明显黏稠状Se