六年（1846年）偕户部尚书赛尚阿查勘江南江防善后事宜，校阅江苏、安徽、江西营伍。咸丰元年（1851年）擢刑部尚书。咸丰三年（1853年）要犯刘秋贵死于狱，承审官未得实情，周祖培坐降三级调用，授左副都御史，历工部、吏部侍郎。咸丰四年（1854年）连擢左都御史、兵部尚书，兼管顺天府尹。咸丰六年（1856年）加太子太保，调吏部。咸丰八年（1858年）会办五城团防，以吏部尚书协办大学士，兼署户部。咸丰九年（1859年）调户部尚书，兼署吏部。咸丰十年（1860年）英法联军入侵，京师戒严，咸丰帝避走热河，命周祖培