抑制酶的活性，因此这种抑制不能逆转。不可逆抑制剂通常含有活性官能团，例如氮芥，醛，卤代烷，烯烃，迈克尔受体，苯磺酸盐，MAFP等。这些亲电体与氨基酸侧链反应形成共价加合物，修饰含亲核体（如羟基或巯基）侧链的残基，包括氨基酸丝氨酸(见右侧图)，半胱氨酸，苏氨酸，酪氨酸等。不可逆抑制不同于不可逆的酶失活(enzyme inactivation)。 不可逆抑制剂通常对一类酶具有特异性，不会使所有蛋白质失活; 它们不通过破坏蛋白质结构而是通过特异性改变其靶标的活性位点起作用。 例如，极端的pH或温度通常会导致所