相伯完成见习，发初愿，献身教会，后升入大修院，研习神学、哲学、数学及天文等。1869年（同治八年），马相伯获得神学博士，并晋升神父，随后被派往安徽宁国府（宣城）及江苏徐州一带传教。马相伯任神父期间，与耶稣会发生数次冲突。当时，马相伯的大哥马建勋成为李鸿章的淮军粮台，又是中外交往的纽带，不久马家成为上海的名门望族。马相伯在徐州传教期间，未经教会同意，用大哥马建勋的捐款救济灾民，违反耶稣会会规，被要求回到上海反省。马建勋率兵至耶稣会交涉，要求放人。1872年（同治十一年），马相伯任徐汇公学校长兼任耶稣会编撰