构域之间的“沟”结合到肽聚糖分子上；随后其底物在酶中形成过渡态的构象。根据Phillips机制，溶菌酶与葡聚六糖结合。然后溶菌酶将葡聚六糖上的第四个糖扭曲为半椅形构象。在这种扭曲状态（能量较高）中，糖苷键很容易就发生断裂。位于溶菌酶蛋白序列35位的谷氨酸（Glu35）和52位的天冬氨酸（Asp52）的侧链被发现对于溶菌酶的活性非常关键。Glu35作为糖苷键的质子供体，剪切底物的C-O键；而Asp52作为亲核试剂参与生成糖基酶中间体。随后，糖基酶中间体与水分子发生反应，水解生成产物，而酶保持不变。Se