校吸引了大批欧洲人才前来就学，这使得学校规模迅速扩张。1566年5月30日，让·斯图尔姆文理中学晋升为学术院，随后设立法学院（前身）、医学院、哲学院等学院。1621年8月14日，学校改建为大学，斯特拉斯堡大学正式成立。神圣罗马帝国三十年战争结束后，斯特拉斯堡市管辖权被交给法兰西王国。国王路易十四是坚定的反宗教改革派，他在斯特拉斯堡大学内设立皇家执政官，以促使大学向天主教派转变。不过学校的路德派教师和学生众多，新教传统深厚，学校的天主教化推进缓慢。法国大革命期间，伴随着君主独裁制度的废除和天主教在政治领域的