值日本侵犯朝鲜，爆发万历援朝之役，利玛窦作为外国人无法在北京久留，而且又遇到了财政上的困难，仅住一个多月便只好返回，次年（万历二十七年）2月6日再度到达南京。在南京居住期间，利玛窦通过瞿太素的帮助，结交了不少名士，如南京礼部侍郎叶向高、思想家李贽、徐光启等。当然这主要还是人们对于他的自然科学知识的倾慕。值得一提的是，在南京利玛窦还与一位三淮和尚（即大报恩寺僧雪浪）进行了一场辩论，在这次辩论中，利玛窦凭借其科学性的思辨明显占了上风。他还在正阳门（今光华门）内洪武岗西崇礼街（今尚书巷）建成中国第四座天主教堂