入中国同盟会（未知其加入与否）。1911年武昌起义爆发后，马叙伦在故乡组建民团，进行响应。后来，他任浙江都督府秘书。此后不久，他来到上海和章太炎同办《大共和日报》，他任总编辑。1913年，他到北京医学专门学校以及北京大学担任教授。1915年，为抗议袁世凯称帝，他辞职返回浙江。袁世凯称帝失败后，他应北京大学校长蔡元培邀请，重任北京大学教授。1919年五四运动中，马叙伦任北京大学教职员会和北京中等以上学校教职员联合会书记和主席。1920年，在北京大中小学教职员工向军政府进行索薪运动中，马叙伦被推举为运动领袖