13岁时在上海一家餐馆作服务生，学得一口熟练英语，后来升为餐馆领班。周祥生在餐馆工作时经常为顾客叫车雇车，因而熟悉运输业行情，并与很多汽车司机相熟。1919年，周祥生转入汽车行业，向英商购入旧篷车一辆，始作出租车生意。鼎盛时，周祥生的出租车行祥生汽车股份有限公司拥有出租车230辆，职工逾800人，是上海滩最大的出租车企业。周祥生也是上海出租车同业公会的会长。中共统治上海后，周祥生的企业遵循公私合营。周祥生自己退出出租车行业，并于1974年在上海逝世。周祥生身后有“中国出租车鼻祖”之称。