通常使用近红外激发光，其也可以激发。 然而，对于每次激发，两个光子的红外光被吸收。 使用红外线可最大限度地减少组织中的散射。 由于多光子吸收，背景信号被强烈抑制。 这两种效果都会导致这些显微镜的穿透深度增加。 由于其更深的组织穿透，有效的光检测和减少的光漂白，双光子激发可以是共聚焦显微镜的优越替代品。借助于强聚焦激光束，产生非线性光学效应，其基于同时到达一个分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所产生的信号的强度不会随着照射光子的数量而线性增加，而是与平方率（对于双光子效应）或立方率（对于三光子