詹姆斯四世登基。1513年詹姆斯四世借英格兰国王亨利八世离境之机起兵入侵，但在弗洛登遭受惨败，其本人、诸多贵族和数千士兵战死。其子詹姆斯五世尚年幼，由此苏格兰又一次进入摄政。詹姆斯五世于1542年再次入侵英格兰，但在同年过世，王位传予其六日大的女儿玛丽一世。苏格兰再次摄政。身为天主教徒的玛丽一世在其统治时期面对严重的宗教动乱，即苏格兰宗教改革。在约翰·诺克斯等改革者的推动下，新教逐渐崛起。1565年玛丽一世与其表弟天主教徒达恩利勋爵成婚，引发新教徒的警觉。1567年达恩利勋爵遇刺，玛丽一世同据传凶手