酮酸激酶（Pyruvate kinase）的催化，使原本接在氧原子上的磷酸根转移到ADP上，进而生成ATP以及丙酮酸。这个反应会放出大量的能量，是一个难逆的反应，其标准自由能变化是31.4 kJ/mol（在pH=7的纯水中）。此外，这个反应也需要钾离子与镁离子（或其他二价阳离子）的参与。
糖质新生.由于糖解作用的最后步骤是个难逆反应，因此在糖质新生的过程中，需要一个替代途径，才能将丙酮酸还原成磷酸烯醇丙酮酸。首先丙酮酸必需要先在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase