吉亚已获得另外一颗古代遗物「伊甸碎片」，并欲成为教宗以获得教宗十字（伊甸碎片「圣杖」（The Staff））以开启位于罗马西斯廷小堂圣座下之「地窖」（The Vault）。埃奇欧在伯父及刺客组织成员协助下夺得碎片，并于1499年前往罗马刺杀已成为教宗亚历山大六世之波吉亚。二人各以其「伊甸碎片」战斗，波吉亚夺回埃奇欧手上之碎片并逃至「地窖」但无法将之开启，埃奇欧追至后二人以徒手搏斗方式再次进行战斗，波吉亚于被击败倒地后发现自己从来没有资格进入「地窖」而求一死，但埃奇欧认为即使将之刺杀也无法使家人复生而拒绝