行政院的命令接替陈其迈担任代理高雄市市长一职，成为中华民国首位女性直辖市市长。在任内叶菊兰重整市政府团队并且提交高雄捷运外劳弊案的报告，并且提出将高雄市建设成为「海洋首都」的愿景。之后叶菊兰并未参加民主进步党第四届高雄市长初选，并且担任了高雄市市长候选人陈菊的竞选总部主任委员。而她也一度被视为可能参加2008年中华民国总统选举并且和作为总统候选人的谢长廷组成搭档之人选，对此叶菊兰也表示对于这一说法「当仁不让」。不过最后谢长廷选择了前行政院院长苏贞昌担任副总统候选人，之后叶菊兰则受邀担任竞选总干事。在这期间担