抗日战争爆发后，何长工任两延（延长、延川）河防司令员兼政委。1939年，任中国人民抗日军政大学第一分校校长，率三千部队东渡黄河，前往晋东南敌后办学。其后，调任抗大总校教育长。1943年，返回陕北，担任抗日军政大学副校长，重点培养军事干部，并进行整风和大生产运动。1944年7月，因校长徐向前突患重病，何长工开始主持总校工作。1945年10月，何长工率抗大总校前往东北，先后创办了东北军政大学及四个分校，任东北军政大学代校长。不久，兼任通化军区司令员。同时，相继建立了航空、工兵、坦克、医科等学校。1947年起