特伦托会议的召开宣告了欧洲天主教势力反对宗教改革的浪潮的开始。查理五世决心惩罚德意志的新教王公。1546年查理五世与施马尔卡尔登联盟开战。在施马尔卡尔登战争的第一阶段（1546年－1548年）他打败了萨克森选侯约翰·腓特烈，并将投降的黑森伯爵（慷慨的）腓力一世监禁起来（1547年－1552年）。然而，他先胜后败。新的战事于1552年爆发后，查理五世遭到一系列失利，遂与诸侯签订1555年奥格斯堡宗教和约。
查理五世与美洲.1523年，查理五世授权圣多明哥法官艾利翁探查今日美国卡罗来纳