道夫二世统治时期是布拉格的另一个光荣年代。布拉格再次成为神圣罗马帝国的文化中心。鲁道夫与雅盖隆王朝、卢森堡王朝和普热米斯尔王朝都有关联，但他也与西班牙的疯女胡安娜（卡斯蒂利亚女王伊莎贝拉一世和阿拉贡国王斐迪南二世的女儿）有血缘关系，胡安娜是鲁道夫祖父斐迪南一世的母亲。鲁道夫二世虽然非常有才华，却非常古怪，患有抑郁症。鲁道夫二世住在布拉格城堡，他在那里的宫廷充塞着占星家、魔法师和其他古怪人物。但这是该市的一个繁荣时期，居住在此的名人包括天文学家第谷·布拉赫和约翰·开普勒，画家朱塞佩·阿尔钦博托、B.斯普朗格、