图亚特家族仍被排除在英国王位继承的行列外。玛丽的麻烦由于法国结盟宗（胡格诺派）起义（称作1560年3月6日到17日的安波依斯阴谋）而增多，使得法国不能在苏格兰方面援助玛丽。继承问题由此产生。1560年12月5日，弗朗索瓦二世去世。玛丽的婆婆，凯瑟琳·德·美第奇开始在弗朗索瓦二世的弟弟查理九世执政时期摄政。1560年7月6日，玛丽的代表签署了爱丁堡条约，在其母玛丽·德·吉斯逝世后，按条约法国从苏格兰撤军，并承认伊丽莎白女王在英格兰的统治权。仍居法国，十八岁的玛丽拒绝批准这个条约。