1806年10月再度参加反法战争，随即在耶拿败于拿破仑，被迫逃往柯尼斯堡。1807年普鲁士和法国在涅曼河的提尔西特缔结和约，普鲁士割让16万平方公里土地，包括普属波兰的绝大部分领土（第二次、第三次瓜分波兰所得，以及第一次瓜分波兰所得领土的南半部），以及易北河以西的全部领土，并赔款1.3亿法郎。1806年惨败后，普鲁士首相卡尔·施泰因开始推行改革，其措施包括让公民参与政治以唤醒其民族主义情感；释放农奴；实行地方自治；改组中央政府机构等。1809年在柏林创办腓特烈·威廉大学（柏林大学），同时格哈德·冯·沙恩