日（1860年3月24日），这天是上巳之日，也是驻居在江户的大名固定要进城谒拜的日子，以水户藩浪士为主的暗杀集团决定于今日起事。天寒未明，路上积雪处处，一行人饱餐一顿由东海道品川宿（今东京都品川区）的旅店出发，经过大木户后在札之辻转向，途经网坂（今东京都港区的庆应义塾大学附近）、神明坂、中之桥，接着穿过樱田通，在爱宕山的爱宕神社与次会合，向樱田门进发。此时共计有水户浪士17人、萨摩浪士1人，后世合称「樱田十八士」。由于井伊直弼的宅邸在樱田门附近，樱田门为井伊直弼进城的必经之路，所以暗杀集团便埋伏在樱田门