而不复存在，因此，金羊毛骑士团的领主权也随之由勃艮第大公，转为对神圣罗马帝国皇帝效忠。查理五世亦进一步加强骑士团的规律，金羊毛骑士一旦犯罪，必需由其他成员联合审理；除非当中最少六名成员同意，否则不能逮捕该名被控的骑士。而在审讯期间，被控者不受羁押只需接受软禁。另外，查理五世还规定只有天主教徒才可以加入金羊毛骑士团。查理死后，金羊毛骑士团却没有按理落入其弟，神圣罗马帝国皇帝斐迪南一世手里；反而一直跟随查理之子，西班牙的费利佩二世及其子孙的西班牙哈布斯堡王朝。一直至到1700年卡洛斯二世去世绝嗣，西班牙波旁