发动反查理的，当弗朗索瓦一世撕毁与查理五世的马德里条约时，教宗以上帝的名义认可条约无效，给予弗朗索瓦一世神圣的加持。作为报复，查理五世1527年再度派军侵入意大利，包围罗马。因为主帅夏尔三世·德·波旁意外死亡，西班牙军队在暴乱中焚掠罗马并掠走教宗，是为罗马之劫。此后一百年内，教宗常常受到西班牙国王的压力和巨大影响（西班牙正式在义大利称霸），使其无法批准英格兰国王亨利八世离弃查理的姨母阿拉贡的凯瑟琳，逼使亨利八世在1533年发动宗教改革。1529年法国在兰德里亚诺战役被西班牙再次击败，正式放弃米兰予西班牙