双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
测序反应过程.早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应，每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型荧光（或放射性同位素）