寡居的玛丽一世回到苏格兰开始履行女王的权责。由于玛丽一世是虔诚的天主教徒，刚刚即位为英格兰女王的伊丽莎白一世视她为重大威胁。因为伊丽莎白一世的政权信奉新教，而英格兰国内有大量天主教的支持者。同时玛丽一世由于其祖母的关系，也是伊丽莎白一世的表侄女，有继承都铎王朝王位的资格。伊丽莎白一世多次想为玛丽一世指定一个合适的丈夫缓解这种危机，但是都被玛丽一世拒绝。1565年，玛丽一世与同属斯图亚特家族的远亲兼表弟达恩利勋爵结婚，并很快生下一子，即将来的詹姆斯六世。玛丽一世在不久后的内乱中被苏格兰贵族推翻，几次试图复