1521年，法国国王弗朗索瓦一世发觉其国被哈布斯堡领土包围，于是攻击西班牙在意大利的属地，再次引起两国的冲突。法国遭遇灾难性败绩，先后在比克卡会战（1522年）、帕维亚之战（1525年，弗朗索瓦本人被虏）受挫。结果，被查理俘虏的弗朗索瓦退出战争，再次放弃米兰予西班牙；弗朗索瓦一世为取得自由，不惜签订割让勃艮地（给查理）、布列塔尼（给英王亨利八世）等领土的屈辱条约。但弗朗索瓦一世一回到法国，就宣布撕毁条约，拒绝割让土地给查理和英国。1525年，查理五世在帕维亚之战中大败法国，使很多义大利及德意志人感到意外