过程十分复杂：前体蛋白在游离核糖体上释放后，在细胞质分子伴侣Hsp70辅助下解折叠，然后通过蛋白质N端的转运肽跟粒线体外膜上的受体蛋白识别，在受体上或受体附近的内外膜接触点处利用三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，缩写为“ATP”）水解产生的能量驱动前体蛋白进入转运蛋白的运输通道，然后由电化学梯度驱动穿过粒线体内膜、进入线粒体基质。在线粒体基质中，前体蛋白继续由mHsp70继续其解折叠状态，直至Hsp60对其进行正确折叠。在折叠后，转运肽酶切除蛋白末端的转运肽，线粒体基质蛋白质最终成熟