原有的几个公营京剧团华东戏曲研究院华东实验京剧团、上海市人民京剧团、新民京剧团组建而成，创院院长周信芳，一时汇集了周信芳、盖叫天、童芷苓、李玉茹、言慧珠、沈金波、童祥苓、黄桂秋、小王桂卿、黄正勤、王正屏、孙正阳、金素雯、赵晓岚、王燮元、赵济羹、张鑫海、郝德泉、查长生、黎秋觉、高明亮、王玉璞、蒋阿炳、马锦良等京剧表演艺术家。天蟾舞台改公营后，亦由剧院负责经营管理。1966年文化大革命爆发以前，剧院曾参加《武松》、《宋士杰》、《周信芳舞台艺术》、《尤三姐》等多部京剧电影的摄制，纪录保存了周信芳、盖叫