万古霉素对于革兰氏阴性菌几乎无效（除了一些非淋菌性的奈瑟菌属细菌）。特别的是，万古霉素阻止N-乙酰胞壁酰基（NAM-）和n-乙酰葡糖酰基（NAG-）参与肽聚糖骨架的形成，而肽聚糖骨架是革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分。万古霉素中大量的亲水基团可以形成氢键，与NAM-肽和NAG-肽中D-丙氨酰丙氨酸末端的部分相互作用。通常这是一种有5个作用点的反应。这样万古霉素分子就被氢键“捆绑”在了D-丙氨酰丙氨酸上，阻止了NAM-肽与NAG-肽参与肽聚糖骨架的形成。万古霉素存在阻转异构现象。由于氯酪氨酸残基旋转特