商业用途.乳糖酶最主要的商业用途是分解牛奶中的乳糖，以适合罹患乳糖不耐症的人群饮用。冰淇淋的生产中也要用到乳糖酶。这是因为葡萄糖和半乳糖的甜度比乳糖本身高，使用乳糖酶使得冰淇淋具有更好的口感；另一个原因是乳糖酶在冰淇淋的低温下会结晶，而其分解产物则可以保持液态，使得冰淇淋具有光滑的质地。乳糖酶还被用于将乳清转化为糖浆。
实验室用途.在分子生物学实验中，乳糖酶被用于对含有质粒的大肠杆菌或其他细菌进行蓝白斑筛选，以获得带有正确质粒的克隆。