人众视为眼中钉的第十三代幕府将军足利义辉被松永久秀和三好三人众所弒杀。
灭亡.永禄11年（1568年），当时实力雄厚的织田信长扶植长期流亡在外的足利义辉之弟足利义昭成为第十五代幕府将军，挟其为傀儡以号令天下。足利义昭并不甘心作织田信长手中的傀儡，后来暗中联络各地势力大名，意图挑战织田信长的权威，导致他于天正元年（1573年）被后者流放赶出京都。室町幕府至此灭亡。虽然足利义昭被织田信长流放，但他依旧保有“征夷大将军”的名义直至1588年他辞去此职位。故而也有人主张室町幕府的灭亡时期应