在地中海的另一处，医院骑士团已经于1530年重建为马耳他骑士团，他们针对穆斯林海军的反抗行动很快激怒了奥斯曼人。奥斯曼人调集另一支庞大的舰队开往马耳他岛，试图将骑士团赶出马耳他岛。奥斯曼人于1565年到达马耳他，围攻战从5月18日持续到9月8日，由意大利画家马泰奥·佩雷斯·德·阿莱奇奥 所绘于瓦莱塔大王宫圣米迦勒和圣乔治大厅的一组壁画生动地描绘了这场战役。战役开始时似乎是1522年罗得岛战役的翻版，马耳他岛上的大部分城市被毁，半数骑士团成员阵亡；但西班牙军队及时赶来增援骑士团，奥斯曼人损失三万人，最终失败