于真核生物胞质溶胶中的蛋白质生物合成，真核细胞的细胞溶质中只有核基因被翻译。它亦不被用于古菌中。在人体中，"N"-甲酰甲硫氨酸会被免疫系统识别为外源性物质并刺激机体对抗潜在感染。 
在蛋白质合成中的功能."N"-甲酰甲硫氨酸是原核生物蛋白质合成中的起始残基，因此它位于生长中多肽的N-端。"N"-甲酰甲硫氨酸被一种特殊的转移RNA（tRNA.fMet）递交到核糖体（30S）-信使RNA复合体上，这种特殊的tRNA具有3'-UAC-5'反密码子可以结合到位于信使RNA上的5'-AUG-