二世驱逐城里的犹太居民，将其遗留的房舍赠予大学，继任的统治者鲁普雷希特三世并捐赠资金，以纾解财务困难。圣灵教堂自创校初始即为大学教堂，直至19世纪，彼得教堂成为大学教堂。虽历任选帝侯均对大学倾注心力，然若必要时，亦干涉大学之自主权，却因此激发出大学人文主义之思潮，进而由Friedrich der Siegreiche主导重要的大学改革，争取学术自由。
宗教改革时期.尽管马丁·路德于1517年倡导宗教改革，海德堡大学最初未受此影响。不久，大学内路德的支持者将该校变成了德意志西南部