区别于氧化磷酸化的重要步骤）中，通过磷酸甘油酸激酶的作用，将1,3-二磷酸甘油酸分子上的高能磷酸基团转移到腺苷二磷酸上，生成3-磷酸甘油酸。因为腺苷三磷酸从无机磷酸基团中生成出来，此步骤导致了糖酵解过程中的能量收获。第二个底物水平磷酸化在之后发生：在丙酮酸激酶的作用下通过磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应而生成丙酮酸。此反应重新生成了在糖酵解准备阶段用于将葡萄糖活化为葡萄糖-6-磷酸以及将果糖-6-磷酸活化为果糖-1,6-二磷酸而耗去的腺苷三磷酸。一旦糖酵解的产物丙酮酸进入线粒体基质，丙酮酸就被转变为乙酸酯