底物羰基的亲核进攻，这两个过程是协同进行的（见(c)）。显然这种情形下，三联体中酸性基团和碱性集团采取有利的取向并形成氢键（见(d)），会加强碱性基团之碱性，促进羟基氢的脱去，进而加快酶的催化速率。第二步是四面体中间体（Ⅰ）分解产生一个产物和中间产物酯或硫酯的过程。这是一个亲核消除反应，故离去基团的离去性越好，消除越易进行。对两种蛋白酶而言，这步反应的离去基团是胺负离子（当然其他酶可依此类推），而后者碱性极强，不是好的离去基。因而四面体中间体在分解前（或分解同时），需要对其离去部分进行质子化，从而使离去