直至1623年（明朝天启三年），下一任澳督（马斯卡雷尼亚斯）正式到澳门到任就职。在清政府与大英帝国签订《南京条约》割让香港后，葡萄牙派代表与清朝钦差大臣耆英谈判，要求豁免地租银，并由葡萄牙军队驻防澳门半岛。为了与位于澳门对岸、1841年成为自由港的英属香港竞争，1845年，葡萄牙女王玛丽亚二世单方面宣佈澳门为自由港，容许外国商船停泊进行贸易活动。1849年澳门总督亚马留被刺杀斩首后清朝军队与葡萄牙军队交火，此战役最终使澳门正式全面成为葡萄牙帝国的殖民地。葡萄牙于1851年和1864年分别侵佔了凼仔和路环