水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上。在许多生物体中都普遍存在的一种磷酸酶是碱性磷酸酶。磷酸酶可以被分为两类：半胱氨酸依赖的磷酸酶和金属磷酸酶(其活性依赖位于活性位点上的金属离子)。
催化机制.半胱氨酸依赖的磷酸酶通过形成磷酸－半胱氨酸中间体来催化磷酸酯键的断裂，具体过程如下(以磷酸化的酪氨酸去磷酸化过程为例，参见右图)：首先，酶活性位点