罗马帝国于公元395年永久分裂后，十二群岛就成为了东部帝国的一部分。尽管拜占庭近千年的统治曾多次被外族入侵所打断，帝国仍为群岛留下了丰富的历史文化遗产。在十三世纪，意大利人随着第四次十字军东征入侵一部分当时仍由尼西亚帝国统治的十二群岛。威尼斯人和热那亚人都曾佔领过群岛的一部分。十四世纪，拜占庭帝国对群岛的统治终于来到终结。1309年，医院骑士团佔领了罗得岛，并在随后佔领了整座群岛。骑士团在十二群岛建立据点，并使其首都罗得市成为了一座宏伟的中世纪城市。骑士团大规模的防御工事有效击退了1444年埃及苏丹和