运用.EF53型电力机车投入运用初期，均配属于国津府机关区，主要担当东海道本线东京至国府津间的旅客列车牵引任务。1934年，随着复线电气化的丹那隧道建成通车，EF53型电力机车的运用区段亦延长至沼津，并主要用于牵引以“富士号”和“燕号”为代表的优等旅客列车。与EF52型电力机车相比，EF53型电力机车更适合牵引快速列车，而且其可靠性亦备受好评。因此，其中三台EF53型电力机车（EF53-16～EF53-18）于1934年被指定为日本皇室御召列车的专用牵引机车，直到1953年才被EF5