二世死后，她的同父异母兄长恩里克四世继承王位。1469年10月19日她和堂弟亚拉冈王储费尔南多联姻。1474年，恩里克四世去世，只有一个女儿胡安娜·拉·贝尔特兰尼哈，恩里克被指无法生育，而胡安娜是他亲信和王后的孩子。当时胡安娜已经嫁给了葡萄牙国王阿方索五世。伊莎贝尔迅速继承了王位。葡萄牙的阿方索五世发兵声称胡安娜应该继承王位，但1476年在托罗一役彻底失败。阿方索五世被迫签署阿尔卡索瓦什和约，放弃对卡斯提尔王位的一切要求。1478年伊莎贝尔在天主教教宗的批准下成立西班牙宗教裁判所，迫害非天主教人士并大力