周昌投奔刘邦，担任「职志」军官，负责掌管军旗。项羽灭秦，分封十八路诸侯，刘邦封为汉王，周昌为中尉。汉王四年（前203年），从兄御史大夫周苛坚守荥阳，被项羽烹杀。刘邦感念周苛，以周昌代职，拜为御史大夫。刘邦统一中国之后，依照功臣之功劳等第，封十八位列侯，周昌排行第十六，为汾阴侯，但居功第一的酂侯萧何，第二的平阳侯曹参乃至于文武百官，对周昌都非常恭敬。有一次周昌奏事，却没想到刘邦与正在戚夫人欢好，周昌掉头就走，刘邦却追上周昌，骑在他的脖子上，问周昌：“我是怎样的君主？”周昌大骂：“陛下是桀纣一样的暴