弟弟马蒂亚斯，马蒂亚斯在1606年艰难地分别同匈牙利叛乱者和土耳其人达成和平协定，鲁道夫对此非常生气，他认爲马蒂亚斯所作出巨大的让步只是爲了维持自己的权力，因此准备重新对土耳其开战。但马蒂亚斯争取到了匈牙利叛乱者的支援，迫使鲁道夫放弃了匈牙利、奥地利和摩拉维亚的王位给马蒂亚斯。与此同时，波希米亚新教派看准了神圣罗马帝国最微弱的时机，提出更多宗教自由的要求，鲁道夫在1609年签署文件（Majestätsbriefe）满足了他们的要求，赋予信奉新教的波希米亚和西里西亚贵族以宗教信仰自由和特权，这一举动成爲了