。天主教会拒绝承认信奉新教的伊莉莎白一世为合法的英国君权，而伊莉莎白也以出席英国国教会宗教仪式作为对天主教会的反击，并下令禁止进行弥撒或诵其经文。英国同时着手于扶持新教在荷兰的势力，此举更使西班牙政权对英的敌意日益高涨。于是，伊莉莎白的表侄女苏格兰女王玛丽一世因信仰天主教，而被腓力二世与天主教会认定是正统英国女王。1567年，玛丽因贵族叛变而遭到囚禁，并被迫将苏格兰王位让给她的幼子詹姆斯。惊险逃脱后，她迅速逃往英格兰，却又被伊莉莎白囚禁。此后直至玛丽过世的二十年间，伊莉莎白与詹姆斯的敌对者仍然不停地筹计