昭与织田信长一同参加野田福岛城之战，并在志贺之阵中与朝廷斡旋织田信长及朝仓义景的和谈。元龟3年（1572年）10月，信长向义昭送达了17条责问状，批评了义昭的一些举措。此时东方的武田信玄率兵进军京都，12月22日在三方原之战中击败了信长的盟友三河的德川家康，信长陷入窘境。足利义昭趁机任命宠臣山冈景友（六角义贤的重臣以及幕府的奉公众）为山城半国守护，正式和信长决裂。翌年正月，信长欲遣子入质于义昭以求和解，但遭义昭的拒绝。足利义昭在近江的今坚田城和石山城为幕府军的据点，举起反对信长的旗帜，但数日后两城皆被攻