该同位素在自然界的丰度只有0.7%。由于铀-235与常见的铀-238原子质量几乎相等，所产生的化学反应也完全相同，人们很难将这两种同位素相互分离。为此，曼哈顿计划设计出三种不同的铀浓缩法：电磁型同位素分离法、气体扩散法和热泳法。分离工作主要在田纳西州的橡树岭进行。与此同时，人们也在研究制钚的方法。曼哈顿计划在橡树岭和汉福德区制造了若干反应堆，对铀辐射照射并引发核嬗变转化为钚，再使用化学方法将钚从铀中分离出来。钚后来被证实不适合用在这种枪式的设计上，因此曼哈顿计划又耗费大量的精力在计划的主实验室洛斯阿拉莫斯实