至超过二百人，驻地从壬生村迁移到西本愿寺（京都市下京区）。庆应三年（1867年）三月，新选组的伊东甲子太郎一派受命成为孝明天皇的御陵卫士，脱离新选组，同年十一月被新选组肃清。
解散.庆应三年十一月，末代幕府将军德川庆喜实行大政奉还。不久新政府和幕府之间展开戊辰战争，新选组站在幕府一方参与1868年初的鸟羽伏见之战，被新政府军击败。新选组屡败屡战，甲州胜沼之战后，新选组返回江户，部份队员在这时离队。近藤勇被新政府军捕获处死，沖田总司也因肺结核而病逝。新选组其后参与宇都宫城之战和会