步骤中，甘油醛-3-磷酸会在甘油醛-3-磷酸去氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）的催化之下生成1,3-双磷酸甘油酸，此反应会消耗掉一个NAD，使其成为NADH（可直接利用的能量携带分子），并释出一个氢离子。由于一个葡萄糖分子可以形成了两分子的甘油醛-3-磷酸，所以对于一分子葡萄糖所进行的糖解作用来说，在此反应将会有两分子的NADH与两分子1,3-双磷酸甘油酸的诞生。接下来两分子的1,3-双磷酸甘油酸会经由磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycer