32年2月23日，在第二代教堂被摧毁后的仅仅数天，皇帝查士丁尼一世决定兴建第三代截然不同的大教堂，第三代教堂较前两所更为宏大雄伟。查士丁尼一世选用物理学家米利都的伊西多尔和数学家特拉勒斯的安提莫斯为建筑师，但安提莫斯在不足一年内逝世。拜占庭史学家普罗科匹厄斯在《建筑》一书里描述了建造圣索菲亚大教堂的状况。皇帝将帝国各地的物料运送到君士坦丁堡，如以弗所阿耳忒弥斯神庙的古希腊圆柱。大石都是来自远处的採石场，包括埃及的斑岩、色萨利的绿色大理石、博斯普鲁斯海崃地区的黑石及敍利亚的黄石。超过一万人参与建造工作，这