0-80 μm的穿透深度，取决于制剂，可以与多光子显微镜一起使用更深的区域，例如，200 μm，在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm（= 1 mm）。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。
概念.双光子激发采用双光子吸收，这一概念首先由玛丽亚·格佩特-梅耶（1906-1972年）在1931年的博士论文中描述，并且首次在1961年被Wolfgang凯撒（Wolfgang Kaiser (physicist)）使用激光激发在CaF2：Eu2 +晶体中观察到。 艾萨克·阿贝