十七年（1599年）叶向高结识了在南京传教的耶稣会士利玛窦。后来他进入内阁后，还曾拨冗两次会见利玛窦。万历三十八年（1610年）利玛窦去世后，叶向高十分悲痛，力主赐葬地给利玛窦神父，为此说道：“姑勿论其他，即其所译《几何原本》一书，即宜钦赐葬地矣”。万历三十二年（1604年）第二次妖书案发生，内阁大臣间的派系之争公开化。叶向高私下致信首辅沈一贯，希望他不要借妖术案兴大狱，株连无辜，引起沈一贯的不满，受沈抑制，未得升迁为南京礼部尚书。
独相七年.万历三十四年（1606年）首辅沈一