生化反应的酶类。其中，苹果酸脱氢酶是线粒体基质的标志酶。线粒体基质中的某些酶系组成网状结构，与线粒体内膜内侧有一定的连接，利于上述酶促反应所形成的NADH转移至内膜的电子传递链中。除各种可溶性酶外，线粒体基质还含有线粒体自身的DNA（即线粒体DNA）和核糖体（粒线体核糖体）。线粒体基质中每1μL的水溶解了约1.25mg的蛋白质，而细胞质基质中每1μL的水溶解了约0.26mg蛋白质，所以线粒体体基质较细胞质基质黏稠。虽然已知线粒体内膜含有可调节水分子转运的水通道蛋白，线粒体维持内膜两侧的渗透平衡的方式仍不