借助于强聚焦激光束，产生非线性光学效应，其基于同时到达一个分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所产生的信号的强度不会随着照射光子的数量而线性增加，而是与平方率（对于双光子效应）或立方率（对于三光子效应）一致。多光子显微镜的操作类似于共聚焦激光扫描显微镜的操作。 然而，虽然共聚焦激光扫描显微具有50-80 μm的穿透深度，取决于制剂，可以与多光子显微镜一起使用更深的区域，例如，200 μm，在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm（= 1 mm）。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。