查理五世将会继续扩张势力。很快地，教宗克莱孟七世倒戈支持法国及义大利一些重要城邦，以上帝的名义宣布，弗朗索瓦一世与查理五世所签订的割地条约无效；克莱孟七世还主动参与针对哈布斯堡帝国的（1526-1529年）。查理五世因此勃然大怒，加上查理渐渐厌倦克莱孟七世教宗干预他认为与宗教毫无关系的事务，波旁公爵夏尔三世率领军队攻打罗马，在1527年攻陷罗马，使教宗蒙羞。结果，以后克莱孟七世与继任的教宗在与世俗势力交往时，都显得加倍谨慎，不敢违背西班牙国王。1529年法国在兰德里亚诺战役被西班牙再次击败，正式放弃米兰