一説是1月22日），在土佐藩的坂本龙马、中冈慎太郎、的仲介下，晋作和桂小五郎、井上闻多、伊藤俊辅一起在京都和萨摩藩组成萨长同盟。5月时，与伊藤俊辅一起被命令前往萨摩，并且在长崎单独买下了。在6月的第二次长州征伐担任海军总督并击退幕府舰队，夺回了周防大岛。而在小仓方面，于序盘攻势时与肥后藩在小仓城的战斗势均力敌，使得长州藩的局势一度呈现好转的状态。由于幕府军总督胆小寡断而激怒了加入幕府军的诸藩们，他们威胁随时要撤兵。7月时则因为收到将军德川家茂死去的消息，使得小笠原决定撤退，此事因此决定了幕府的败