应的第一步是在合成酶作用下，ATP分子和对应的胺基酸（或其前体）结合形成胺酰-AMP（腺苷酸），并释放出无机焦磷酸（PP）。然后，酶与胺酰-AMP复合物再与正确的tRNA分子结合，催化胺基酸从胺酰-AMP转移到tRNA的3'端最后一个碱基的2'-或3'-羟基上。一些合成酶还具有校对功能以确保tRNA结合的正确性：如果tRNA被发现与错误的胺基酸相连接，那么所形成胺酰tRNA会通过水解重新被打开。
反应式.胺酰tRNA合成酶所催化反应的反应式如下：总反应式：胺基酸 + tRNA