为万历十七年（1589年）己丑科进士。累官国子监祭酒，万历三十六年（1608年），湖、苏大水，国祯致书巡抚，力请救荒。湖州知府陈幼学洞察民隐，大修荻塘，朱国祯撰《修东塘记》以志。天启三年（1623年）拜礼部尚书、文渊阁大学士。天启四年（1624年）春晋户部尚书，武英殿大学士，总裁《国史实录》，史称其“处逆境时，独能不阿，洁身引退。性直坦率，虽位至辅伯而家业肃然”。晚年遭李蕃弹劾，称病辞官，魏忠贤向阉党人士评论国桢：“此老亦邪人，但不作恶，可令善去。”加少师兼太子太师，晋吏部尚书兼建极殿大学士，託病归隐着书。