酸蛋白酶中，丝氨酸羟基pKa值较大，不容易电离。因此，丝氨酸蛋白酶在催化反应时，酸性基团-碱性基团从丝氨酸羟基上夺氢和产生的烷氧负离子对底物羰基的亲核进攻，这两个过程是协同进行的（见(c)）。显然这种情形下，三联体中酸性基团和碱性集团采取有利的取向并形成氢键（见(d)），会加强碱性基团之碱性，促进羟基氢的脱去，进而加快酶的催化速率。第二步是四面体中间体（Ⅰ）分解产生一个产物和中间产物酯或硫酯的过程。这是一个亲核消除反应，故离去基团的离去性越好，消除越易进行。对两种蛋白酶而言，这步反应的离去基团是胺负离子