成立时，重点针对以反战抗议者为主体的言论自由。在1920年代，美国公民自由联盟将其影响范围扩大到保护艺术家和罢工工人的言论自由，以及与美国全国有色人种协进会（NAACP）合作反对种族歧视。美国公民自由联盟在1930年代开始打击美国警察的不当执法，保护美国原住民的权利。大多数ACLU参与的案件来自美国共产党和耶和华见证人。1940年，美国公民自由联盟被卷入红色恐怖，成员投票解除了共产党员的领导职务。第二次世界大战期间，美国公民自由联盟保护被强行迁往收容所的日裔美国人。冷战期间，美国公民自由联盟总部被反共主义者