（庆长元年），当局下令处死长崎的26名天主教信徒。1612年（庆长17年）之后，德川家康更发布禁教令，长崎的教堂全部被毁。1622年（元和8年）更发生55名天主教徒被公开处死的事件。同一时期，长崎的人口持续增加，城市规模也从最初的6町增加到23町。江户时代初期，长崎虽然是幕府设有长崎奉行的直辖领地，但另一方面也是自治色彩较强的城市。然而在德川幕府开始实施锁国政策之后，长崎开始成为日本唯一的对外贸易据点。1616年，幕府下令外国（中国例外）船只只能在长崎和平户进行贸易。1634年（宽永11年），幕府开始修