A连接酶的功能便是在黏合断裂的DNA，而细胞内只有DNA复制与DNA修复的反应牵涉到DNA断裂的合成，因此DNA连接酶就是在上述的两个机制扮演重要的角色。除了细胞内的黏合反应，随着分子生物学的进展，几乎大多数的分子生物实验室都会利用DNA连接酶来进行重组DNA的实验，或许这也可以被规类为其另一着重要的功能。
黏合反应的进行.关于DNA连接酶的化学反应过程，首先是一条DNA的3'端要先修饰成羟基（OH），而另一条的5'端则是必须带有磷酸，借由DNA连接酶的作用促进磷酸双脂键的共价键，