。因而上述的正确取向对半胱氨酸蛋白酶显得尤为重要，只有两者精确配合，才能抗衡逆反应带来的不利因素。（见(e)）接着另一反应物（对蛋白酶而言为水，其余酶依此类推）参与反应，产生四面体中间体（Ⅱ）。此反应与第一步反应类似，不同的是，这里水代替了丝氨酸或半胱氨酸作为亲核试剂。当然这一步也是可逆的。最后中间体（Ⅱ）分解，得到另一个产物，酶复原。对半胱氨酸蛋白酶，可以直接产生巯基负离子。对丝氨酸蛋白酶，仍需使中间体（Ⅱ）在分解时夺走碱性基团上的一个质子。（见(f)）与氧相比，硫的原子半径较大，所成共价键较长，