线粒体内膜含有比外膜更多的蛋白质，所以承担着更复杂的生化反应。存在于线粒体内膜中的蛋白质主要可分为如下几类，它们分别负责不同的生理过程：
通透性.线粒体内膜不含有孔蛋白，所以通透性较线粒体外膜低。此外，线粒体内膜中的心磷脂与离子的不可渗透性有关。相对于外膜而言，内膜对于大多数的核苷、糖类以及较小的离子等都是不通透的，这些物质进出线粒体内膜需要利用各自对应的特异性载体。线粒体内膜对大多数离子的低渗透性为其建立质子梯度、驱动ATP合成并行驶其他正常功能提供了保证。