土着巴比伦人国王短暂地恢复了独立。可是这些叛乱相对很快地被镇压下去。巴比伦的城市和领土被波斯人稳固地统治了两个世纪，一直到公元前331年亚历山大大帝的到来。
希腊化时期.公元前331年，波斯帝国阿契美尼德王朝最后一任国王——大流士三世在高加米拉战役中被古马其顿希腊统治者亚历山大大帝击败。当年十月，巴比伦沦陷于年轻的征服者。这次侵略的当地记述指出亚历山大的统治不扰民。巴比伦在亚历山大的统治下恢复了作为学问与贸易中心的繁荣。但亚历山大在公元前323年死于尼布甲尼撒的宫殿，随后，他的将