电子传递期间，因为质子梯度的缘故，膜间隙倾向于低pH，当质子从线粒体基质被泵入膜间隙时就会产生质子梯度。负责形成质子梯度的相应细胞结构包括了：辅酶Q、NADH-辅酶Q氧化还原酶复合体（复合体I）、琥珀酸盐-辅酶Q氧化还原酶复合体（复合体II）与辅酶Q-细胞色素c氧化还原酶复合体（复合体III）。
线粒体膜间隙.因为线粒体外膜具有通道，膜间隙的内容物与胞浆的内容物很相似。
叶绿体膜间隙.叶绿体的膜间隙异常狭小，只有10-20 nm厚。