逐步进行的。脂肪酸首先变成Acyl-CoA的活化形式。接下来反应有4个步骤：β-碳原子分别在第2.4步骤反应中被氧化为羟基和再进一步成为酮基。脱下的氢离子和电子会被FADH 和 NADH + H带到电子传递链产生能量。每进行一次β-氧化，一个乙酰辅酶A就会断裂离开，脂肪酸分子脱下了两个碳原子。过程不断重复直到脂肪酸彻底分解。生成的乙酰辅酶A可以进一步到三羧酸循环中或者用于合成酮体。而到了这一步需要利用肉硷和膜蛋白来通过粒线体的膜。