爱丁堡的爱丁堡城堡出生，是苏格兰女王玛丽·斯图亚特与她的第二任丈夫达恩利勋爵亨利·斯图亚特所生的唯一儿子（不过现代的部份历史学家却对此存疑，认为可能是和第三任丈夫所生之子）。出生后5个月，其父死亡，其母遭苏格兰贵族驱逐，流亡英格兰。1567年，苏格兰贵族罢免玛丽·斯图亚特，詹姆士被立为国王，称詹姆斯六世，由几个大贵族摄政。他本人在喀尔文派的教育环境下，成为新教坚定的信徒。他即位后，在国内互相对立的阶层中挣扎茁壮：约翰·诺克斯（1572年过世）领导的喀尔文派苏格兰长老会、新教贵族（低地区较多）、天主教贵族