本人写了多部神学着作，领导了教会会议。为了推动基督教的普及，查士丁尼一世于529年下令关闭哲学上非常有影响的雅典的阿卡德米学园，因为在那里新柏拉图派的哲学思想占主流。在教会内部的派别斗争中查士丁尼一世未能达成一个折衷解决方法，最后他判提奥多拉也信奉的基督一性论为邪教，这样他加大了信奉基督一性论的叙利亚和埃及教会与不信奉基督一性论的罗马和君士坦丁堡教会之间的分歧。查士丁尼一世对异教徒进行迫害，尤其在埃及南部。他的宗教政策导致了529年巴勒斯坦信犹太教的撒玛利亚人的起义。查士丁尼一世血腥镇压了这次起义。53