爆发的西班牙内战，和1937年的爆发中日战争，本机被实战试验，并起初只由苏联航空志愿队驾驶，直到二战之初的苏日在诺门罕战役武装冲突中，都有很好的战果。在因为当时飞行员还是以一战的经验作战术指导思想下，而且同期轴心国空军主力还是双翼机，包括德国的He 51战斗机和义大利的CR.32战斗机还有日本的九五式战斗机，所以起初伊-16战绩辉煌并使苏联突然跻身航空先进国的地位，但客观反刺激了轴心国研究适应新时代空战的战术和飞机，例如：在西班牙内战当中，当I-16被He 51双翼战斗机咬尾，I-16的飞行员祇要开大