战争爆发后，驻华大使馆跟随蒋中正政府迁往重庆。原馆舍被日军接管。1946年4月，大使馆从重庆迁回到南京，改设在今西康路33号（原西康路18号），原上海路馆舍改为新闻处。1949年4月中国人民解放军进入南京后，美国驻华大使司徒雷登于8月离开。中华人民共和国成立后，1950年2月18日美国当时最后一名驻华外交官培根离开南京返美后，大使馆闭馆。1952年11月，江苏恢复省治，中共江苏省委成立，中共江苏省委办公厅入驻西康路33号大使馆旧址，直至1960年迁往新建省委办公楼。