基质中的蛋白质可统称为“粒线体基质蛋白质”，这些蛋白质除少数在粒线体基质中合成外，绝大多数由细胞质基质中的游离核糖体转译产生的，这些在线粒体外合成的蛋白转运过程十分复杂：前体蛋白在游离核糖体上释放后，在细胞质分子伴侣Hsp70辅助下解折叠，然后通过蛋白质N端的转运肽跟粒线体外膜上的受体蛋白识别，在受体上或受体附近的内外膜接触点处利用三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，缩写为“ATP”）水解产生的能量驱动前体蛋白进入转运蛋白的运输通道，然后由电化学梯度驱动穿过粒线体内膜、进入线粒体基质。