苏格兰女王玛丽；亨利二世最小的女儿玛格丽特·德·瓦卢瓦；和腓力二世的表妹奥地利的安娜，她未来将成为腓力二世的第四任妻子。但在此之前皇帝马克西米利安二世已在1564年同意将安娜许配给卡洛斯1560年，卡洛斯成为公认的卡斯蒂利亚王位继承人，三年后又取得亚拉冈王位的继承权。他也成为了金羊毛骑士团第218位骑士，时常出席国家委员会的会议(涉及外交事务的委员会)，并参与他姑姑玛格丽特以腓力二世之名统治的低地国会议。1562年卡洛斯从楼梯摔落，受到严重的头部损伤，靠着着名解剖学家安德雷亚斯·维萨里进行头部穿孔手