进城内，夺得古代遗物「伊甸碎片」并杀害埃奇欧伯父马力欧·奥狄托雷（Mario Auditore）。埃奇欧负伤带领居民及家人逃亡后独自前往义大利首都罗马，并发现波吉亚家族几乎控制整个城市，市内百业萧条，市民被剥削而生活困苦。埃奇欧其后以市内台伯河上的小岛台伯岛为基地，联结市内妓女、盗贼及佣兵势力，招揽反抗教廷的市民加入刺客兄弟会，解放教宗势力控制下的罗马。在盟友协助下，埃奇欧得知切萨雷的财政管理由其兄长胡安·波吉亚（Juan Borgia）负责，军事上借助法国瓦卢瓦公爵路易十二的力量以及发明家达文西之战争机器