六年（1856年）加太子太保，调吏部。咸丰八年（1858年）会办五城团防，以吏部尚书协办大学士，兼署户部。咸丰九年（1859年）调户部尚书，兼署吏部。咸丰十年（1860年）英法联军入侵，京师戒严，咸丰帝避走热河，命周祖培留京办事，拜体仁阁大学士，管理户部。咸丰十一年（1861年）帝驾崩，命总理丧仪，兼办定陵工程。及同治帝奉两宫回銮，疏言「祺祥」年号意义重复，请更正。周祖培加入了东太后慈安、西太后慈禧和奕䜣的祺祥之变，消灭肃顺的顾命八大臣集团，又与大学士贾桢、尚书沈兆霖、赵光等疏议，列举历代皇后协助幼帝的