道光二十年（1840年）进士，授翰林院编修，曾任贵州学政。咸丰初年，太平军事起，被派往江南大营襄办军务，辅佐琦善、托明阿、德兴阿，曾是两江总督曾国藩的部下。咸丰八年（1858年）任安徽巡抚，驻定远城。误抚江北绿林苗沛霖，坐视苗沛霖乱杀平民。苗暗与陈玉成勾结，翁同书又被太平军包围，七月，退守定远，“待援不至，待饷不来”，九年六月文武官绅殉难甚众，同书弃城逃跑。寿州邑绅孙家泰、徐立壮奏苗沛霖跋扈，苗沛霖大怒，咸丰十一年（1861年）五月，苗沛霖发兵攻寿州，清廷饬令同书配合袁甲三共同查办苗沛霖，反复无常的苗