线粒体基质是线粒体中由线粒体内膜包裹的内部空间，其中充满无定形液体，含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶类。其中，苹果酸脱氢酶是线粒体基质的标志酶。线粒体基质中的某些酶系组成网状结构，与线粒体内膜内侧有一定的连接，利于上述酶促反应所形成的NADH转移至内膜的电子传递链中。除各种可溶性酶外，线粒体基质还含有线粒体自身的DNA（即线粒体DNA）和核糖体（粒线体核糖体）。线粒体基质中每1μL的水溶解了约1.25mg的蛋白质，而细胞质基质中每1μL的水溶解了约0.26mg蛋白质，所以线粒体体