底物水平磷酸化的主要部分发生在细胞质中，为糖酵解的一部分；以及在有氧与无氧环境中的线粒体中，为三羧酸循环的一部分。
糖酵解.在糖酵解的放能阶段，底物水平磷酸化生成了四分子的腺苷三磷酸：其中两分子是在1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸的过程中被磷酸甘油酸激酶将磷酸基转到腺苷二磷酸上的；另外两分子是在磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸的过程中被丙酮酸激酶将磷酸基转到腺苷二磷酸上的。第一步是在3-磷酸甘油醛与一分子的无机磷酸被磷酸甘油醛脱氢酶转变为1,3-二磷酸甘油酸之后发生的。在接下来独