与此同时，波希米亚新教派看准了神圣罗马帝国最微弱的时机，提出更多宗教自由的要求，鲁道夫在1609年签署文件（Majestätsbriefe）满足了他们的要求，赋予信奉新教的波希米亚和西里西亚贵族以宗教信仰自由和特权，这一举动成为了后来1618年开始的三十年战争导火索。虽然波希米亚人的要求被满足了，但是他们却得寸进尺地施压要求更多自由，鲁道夫只得派兵镇压，波希米亚人转而向马蒂亚斯请求帮助，马蒂亚斯将鲁道夫囚禁在布拉格的城堡中，直到1611年鲁道夫将波希米亚的王位让与马蒂亚斯。被弟弟夺去所有实权的9个月后，