解散.庆应三年十一月，末代幕府将军德川庆喜实行大政奉还。不久新政府和幕府之间展开戊辰战争，新选组站在幕府一方参与1868年初的鸟羽伏见之战，被新政府军击败。新选组屡败屡战，甲州胜沼之战后，新选组返回江户，部份队员在这时离队。近藤勇被新政府军捕获处死，沖田总司也因肺结核而病逝。新选组其后参与宇都宫城之战和会津战争，斋藤一在会津战争期间离队。土方岁三与部份队员跟随其他拥护幕府的军队退到北海道，成立虾夷共和国及参与箱馆战争。明治二年（1869年）五月，土方与明治政府军作战时中弹身亡，相马主计接任，与余下的新选组