剪切肽键。胰凝乳蛋白酶的偏好受质包括酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸以及亮氨酸和甲硫氨酸。与其他蛋白酶相似，胰凝乳蛋白酶也可以在体外水解酯键；因此可以用一些受质类似物，如N-乙酰-L-酪氨酸对硝基苯酯，来作为酶反应试剂。胰凝乳蛋白酶上195位丝氨酸残基的羟基氧是一个强的亲核物，可以进攻肽键上的羰基碳，使酶与底物共价连接形成短暂的酶－底物中间体，随后不稳定的肽键发生断裂。这一催化机制的发现是基于对酶与底物类似物（N-乙酰-L-酪氨酸对硝基苯酯）反应动力学的研究；由于反应产物对硝基苯酚显黄色，就可以通过在405nm