34残基）形成一个短的β-股。在TIM桶内，一些短的α螺旋分布。高柠檬酸合酶的碳末端有两个不同的亚域构成，由一个两股的反平行β折叠，一个两股平行的β折叠和三个连续的310螺旋构成。催化是通过多醛克莱森缩合反应进行的。首先2-酮戊二酸和乙酰辅酶A与酶的有序结合在酶上，形成三元复合物，乙酰辅酶A的乙酰基团在碱的催化下去质子化，形成烯醇化物。这个烯醇化物作为亲核试剂攻击2-酮戊二酸的二号碳原子，在酸催化下生成醇盐的中间化合物。随后在水分子的作用下，硫酯键被水解，生成辅酶A和高柠檬酸。