尊氏与直义和好，但不久又因南北统一主张的不同再次反目。1353年2月，尊氏杀直义。1358年4月，尊氏殁，12月，足利义诠继任第二代将军。1367年11月，足利义满就任第三代将军，1392年，北朝统一南朝。南北朝时代结束。1467年，幕府三管领中的细川胜元与四职中的山名宗全等守护大名的争斗。其范围除九州等部分地方以外，战火遍及其他日本国土，史称「应仁之乱」。由于此一动乱，使日本进入将近一个世纪长的战国时代，室町幕府将军名存实亡。1573年，织田信长流放最后一任将军足利义昭，室町幕府正式灭亡，进入安土桃