在七月的禁门之变中，协助幕府击退长州藩的倒幕派进攻。这两次事件使新选组得到朝廷、幕府和会津藩赏赐二百多两黄金。同年九月，新选组进行第二次招募队员，队员增至超过二百人，驻地从壬生村迁移到西本愿寺（京都市下京区）。庆应三年（1867年）三月，新选组的伊东甲子太郎一派受命成为孝明天皇的御陵卫士，脱离新选组，同年十一月被新选组肃清。
解散.庆应三年十一月，末代幕府将军德川庆喜实行大政奉还。不久新政府和幕府之间展开戊辰战争，新选组站在幕府一方参与1868年初的鸟羽伏见之战，被新政府军击败