基质内。含碳数超过12的脂肪酸会需要辅助穿越细胞膜并进入粒线体。脂肪酸借由carnitine acyl transferases(如carnitine-palmitoyl transferase I，CPT-I)的协助穿越粒线体外膜，接着由carnitine协助穿越粒线体内膜。进入粒线体基质的fatty acyl-carnitine(由原本的脂肪酸与carnitine结合而来)，会与CoA反应得到乙醯辅酶A，最后乙醯辅酶A进入柠檬酸循环产生FADH以及NADH。其中，CPT-I的反应是脂肪酸氧化反应的