世前后共娶了三位妻子，第一任是托斯卡纳大公科西莫一世·德·美第奇的女儿，第二任是神圣罗马帝国皇帝马克西米利安二世的妹妹奥地利的芭芭拉，第三任是曼托瓦公爵的女儿，尽管前后共娶了三位妻子，阿方索二世于1597年去世时，并没有留下任何子嗣，在他死后神圣罗马帝国皇帝鲁道夫二世承认蒙泰基奥侯爵的儿子切萨雷·埃斯特是公国的合法继承人，阿方索·埃斯特是阿方索一世·埃斯特的私生子。由于这项继承权不被教宗接受，又因费拉拉公国本来就是教宗国的封地，教宗克莱门特八世遂下令威胁将切萨雷逐出教会并派兵进驻法恩扎，切萨雷最后放弃对费拉