式丙酮酸转变为丙酮酸的过程中被丙酮酸激酶将磷酸基转到腺苷二磷酸上的。第一步是在3-磷酸甘油醛与一分子的无机磷酸被磷酸甘油醛脱氢酶转变为1,3-二磷酸甘油酸之后发生的。在接下来独立的步骤（区别于氧化磷酸化的重要步骤）中，通过磷酸甘油酸激酶的作用，将1,3-二磷酸甘油酸分子上的高能磷酸基团转移到腺苷二磷酸上，生成3-磷酸甘油酸。因为腺苷三磷酸从无机磷酸基团中生成出来，此步骤导致了糖酵解过程中的能量收获。第二个底物水平磷酸化在之后发生：在丙酮酸激酶的作用下通过磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应而生成丙酮酸。此反应重新