由羟基(-OH)的反式加成以及一个氢原子1,4反式加成，为一个具有立体专一性的水合作用。由以上可以看出：由延胡索酸合成苹果酸为E脱去反应，HO提供的羟基加成是伴随着延胡索酸上碳阳离子的质子化而来的。但是，近来的研究指出延胡索酸酶的反应机制应为以碳阴离子为中间物的酸-硷催化脱去反应(如图二)。
生化反应途径.在柠檬酸循环中(位于粒线体内)为了促进能量来源NADH的合成，细胞利用延胡索酸酶催化其中一个步骤。而在细胞质中，延胡索酸酶被用来代谢尿素循环的副产物延胡索酸，并利用这个反应合