6年3月，哈夫金重新回到加尔各答，再次接种了超过3万人。 与此同时，第三次鼠疫大流行爆发，哈夫金受到印度孟买省省长邀请，前往协助控制当地的鼠疫疫情。他在当地一所医院内研发出了首支鼠疫疫苗。1897年1月10日，他在自己身上进行了人体试验（注射了10c.c.的疫苗剂量），在高烧后完全恢复。此后，他从当地一所已爆发鼠疫的监狱内招募了志愿者，并在进行了人体试验证明有效后，随即开始了大规模接种。哈夫金的疫苗此后被广为使用。1899年8月，孟买当地成立了“鼠疫研究实验室（Plague Research Labor