胞质核醣体合成后，运输到线粒体基质中。乙酰辅酶A + 草酰乙酸 + HO → 柠檬酸 + 辅酶A
机制.首先，柠檬酸合成酶的组氨酸残基作为亲核试剂使乙酰辅酶A中甲基去质子化而形成碳负离子，后者亲核攻击草酰乙酸的羰基碳，从而羟醛缩合生成柠檬酰辅酶A，将高能硫酯键水解后即得到柠檬酸。