过程中形成的。底物水平磷酸化充当腺苷三磷酸的快速来源，而不依赖额外的电子受体以及唿吸作用。这种情况例如人类红细胞，其中没有线粒体，或是缺氧状态下的肌肉细胞。底物水平磷酸化的主要部分发生在细胞质中，为糖酵解的一部分；以及在有氧与无氧环境中的线粒体中，为三羧酸循环的一部分。
糖酵解.在糖酵解的放能阶段，底物水平磷酸化生成了四分子的腺苷三磷酸：其中两分子是在1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸的过程中被磷酸甘油酸激酶将磷酸基转到腺苷二磷酸上的；另外两分子是在磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸