基端肽键。由于其广泛地的切割能力，在实验室中很常用。此蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶SB超家族中的S8家族（枯草杆菌蛋白酶也属于这个超家族）。蛋白酶K的分子量为28.9千道尔顿。
酶活性.酵素偏好的切位是在疏水性胺基酸后的位置。本酵素由钙活化，虽然钙并不会影响酵素的活性，但它可使酵素更稳定。在足量酵素浓度及作用时间的环境下，蛋白质会完全被水解。若移除钙离子，蛋白酶K的稳定性会大幅降低，但其水解活性仍然存在。蛋白酶K对于钙离子具有两个结合位，都在活性中心附近，但都与催化反应无直接关联。