二年（1499年）中进士，授常州府推官，善于决断案件，期间劝魏国公徐与退田于民，后因刘瑾接受徐与贿赂，巡抚艾朴等十四人悉数被逮捕，当时伍文定已经升至成都同知，也因此下诏狱，被贬斥为民。刘瑾伏诛，伍文定重新起用，并平定江西姚源、王浩八等民乱，此后升爲河南府知府，擒拿张勇、李文简叛乱。因政绩，调任吉安府知府，平定永丰及大茅山叛乱，此后辅佐巡抚王守仁平定桶冈、横水。宁王朱宸濠称兵造反，吉安府官民争相逃亡，是为宁王之乱，伍文定斩杀一个逃亡者后，众人纷纷安定，并迎接赣南巡抚王阳明入城抗敌。此后知府邢珣、徐琏、