次世界大战中，1940年4月投入挪威战役，皇家方舟号的俯冲轰炸机炸沉了德国轻巡洋舰柯尼斯堡号。1940年7月随英国舰队攻击阿尔及利亚米尔斯比尔泊地的法国舰队。战争期间皇家方舟号主要在地中海掩护运输船队。皇家方舟号参加最着名的战斗是1941年5月围歼德国海军俾斯麦号战舰，皇家方舟号的鱼雷轰炸机打坏其船舵，迫使俾斯麦号自沉以防英方俘虏。1941年11月13日皇家方舟号在运载飞机到马耳他岛后，返回直布罗陀50海里处被德国潜艇U-81发射一枚鱼雷命中，损管失利沉没。