62年开始用于医疗，被列为世界卫生组织基本药物。用于治疗肿瘤已超过50余年，可通过多种途径发挥作用，其中最主要的作用方式是作为胸苷酸合成酶抑制剂，阻断DNA复制的必需原料——胸腺嘧啶的合成。胸苷酸合成使单磷酸脱氧尿嘧啶（dUMP）发生甲基化从而变成单磷酸胸腺嘧啶（dTMP）。与其它抗肿瘤药类似，5-FU作用于全身各个系统，快速分裂的细胞（如肿瘤细胞，亦包括消化道上皮细胞以及生殖细胞）因其核酸合成活动活跃而受到的影响最大。5-FU主要用于结直肠癌以及前列腺癌的治疗，数十年前就已建立了标准的化疗方案。