麻、丝绸、纸张染色。生物学上也被用做细菌或细胞染色剂。
医药.亚甲蓝因为有还原性，其注射液被用来治疗正铁血红蛋白血症。也用于解救硝基苯、亚硝酸盐和氰化物中毒等。因为其杀菌消毒的作用，口服亚甲蓝或用其溶液冲洗可以治疗膀胱炎和尿道炎。另外，亚甲蓝在进入人体30分钟（注射）至几小时（口服）内会从尿中排出，导致尿液暂时呈蓝色，因此也用来作肾功能测定。观赏鱼养殖中，0.1-0.2ppm的亚甲蓝溶液也被用作消毒，或治疗白点病等疾病。0.3ppm的亚甲蓝溶液可以防止水霉菌的发生。