丰后国海部郡栂牟礼城城主。佐伯惟教的嫡孙。佐伯惟真之子。
继任家督.天正6年(1578年)祖父惟教与父亲惟直、叔父镇忠于耳川之战败死后继承第14代家督，之后丰萨合战中，抵抗北上的岛津军而不断努力。天正十四年（1586年）十月，岛津家久统率一万兵马挥军北上，从日向往丰后攻打，同时岛津义久也派出许多使者招降大友家臣，在周遭许多同僚响应臣服时，佐伯惟定却坚持不肯投降。期间，佐伯惟定请伊东旧臣山田匡得协助，扩充整备宇山城、 八幡山砦等各处支城积极防战，在岛津家久派遣僧人玄西堂来劝降时将