兴二十三年（335年）再次设置西域都护，治所在高昌（今新疆吐鲁番市东），历经前凉、前秦、后凉、北凉（段氏）、西凉、北凉（沮渠氏）沿置。
两次废置.西域都护的废置和匈奴的兴衰有一定关系；西域都护第一次废置是在公元10年，当时匈奴与新朝关系破裂，匈奴大击北边，而西域亦瓦解；焉耆国因离匈奴近，先反，杀西域都护。新朝西域都护被自己属国所杀后，匈奴遂重新占领西域，此后，匈奴在西域征收重税，而西域诸国“苦匈奴重敛”。第二次废置也是最后一次废置在公元107年，东汉虽成功镇压并保有龟兹国，但因西域