通过磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应而生成丙酮酸。此反应重新生成了在糖酵解准备阶段用于将葡萄糖活化为葡萄糖-6-磷酸以及将果糖-6-磷酸活化为果糖-1,6-二磷酸而耗去的腺苷三磷酸。一旦糖酵解的产物丙酮酸进入线粒体基质，丙酮酸就被转变为乙酸酯并结合到辅酶A上以生成乙酰辅酶A并进入三羧酸循环。然而三羧酸循环是需氧唿吸，底物水平磷酸化的另一个例子就发生在琥珀酰辅酶A转换为琥珀酸时，鸟苷二磷酸通过被转上一个磷酸基团而生成了鸟苷三磷酸（GTP）。此磷酸基团在另一个底物水平磷酸化事件中被转移到腺苷二磷酸上。催化此反