入北平燕京大学国文专修科。1931年入北平辅仁大学历史系。1939年到美国哈佛大学研究生院，主修语言及历史。二战期间在哈佛大学陆军特别训练班教日语。1944年以论文《唐代印度来华密宗三僧考》获博士学位，任哈佛大学日语教员。1946年回国，任教于燕京大学。1947年转往清华大学。1952年以后在北京大学历史系任教授，担任过北京大学中国古代史教研室主任、亚洲史教研室主任、系主任等职务。除此之外，周一良还曾担任联合国教科文组织《人类科学文化史》第三卷编委会的编委、中国史学会理事、中国日本史学会名誉会长等职