。放线菌是另一大类革兰氏阳性菌，根据DNA中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的含量，放线菌被称爲高G+C革兰氏阳性菌，而厚壁菌被称爲低G+C革兰氏阳性菌。如果细胞的第二层膜是衍生特征，这两类革兰氏阳性菌可能是细菌基部的分支，否则它们可能组成关系相对较近的单系群。它们被认爲可能是古细菌和真核生物的祖先，因爲它们都缺乏第二层膜，并且具有一些生化上的相似性，比如含有固醇类。此外，尽管恐球菌-栖热菌（Deinococcus-Thermus）类细菌结构上类似革兰氏阴性菌，但也可被染成革兰氏阳性。