5月任独立团参谋长，10月任代理团长，参与北伐战争，在汀泗桥、贺胜桥、武昌等战役中立有战功。1926年底，叶挺独立团该称国民革命军第四军第二十五师第七十三团，仍任团长。
第一次国共内战时期.1927年8月1日，周士第参与中共的南昌起义，任起义军第二十五师师长。后南昌起义军南下，一路遭受重大损失。第25师在三河坝浴血奋战，激战了三天三夜。10月，师长周士第前往香港、党代表李硕勋前往上海，分头寻找党组织。1927年年底，周士第到达香港，向李立三做了汇报。后周士第染上疟疾，但当时党组织的