其研究彻底推翻由传统经典理论米丘林、李森科的“无性杂交”学说，并推论水稻亦有杂交优势。通过培育雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系的三系法途径来培育杂交水稻，可以大幅度提高水稻产量。1966年，三系杂交水稻的发现以《水稻的雄性不孕性》发表在中国科学院的《科学通报》上，是他的第一篇重要论文，而这一刊《科学通报》却是文革前的最后一刊。文化大革命冲击了袁隆平的研究，其实验稻田育种甚至被人恶意破坏拔除，但其仍坚持试验。为了增加试验效果，每年冬天，其与助手还去海南三亚进行水稻育种，甚至在路上把种子绑在身上，