蛋白酶上195位丝氨酸残基的羟基氧是一个强的亲核物，可以进攻肽键上的羰基碳，使酶与底物共价连接形成短暂的酶－底物中间体，随后不稳定的肽键发生断裂。这一催化机制的发现是基于对酶与底物类似物（N-乙酰-L-酪氨酸对硝基苯酯）反应动力学的研究；由于反应产物对硝基苯酚显黄色，就可以通过在405nm下测量反应混合物的吸光值来计算产物浓度。胰凝乳蛋白酶的催化反应可以分为两个阶段：开始时的快速反应和随后遵从米氏方程的稳定反应，又被称为“乒乓”机制。这一反应模式可以用胰凝乳蛋白酶催化的两个步骤来解释，即先乙酰化底物形成