s-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。
应用.木瓜蛋白酶主要被用于将硬的肉纤维（蛋白质组成）切断，并且该用途已经被南美洲的土着居民使用了数千年。该酶是嫩肉粉（在大多数的超级市场都可以买到）的成分之一。由于可以降解生物毒液中的蛋白毒素，木瓜蛋白酶可以在家庭治疗被水母、蜜蜂、黄蜂等蛰伤或被魔鬼鱼刺伤的情况。它也是在澳大利亚流行的急救药“Sto