后升爲河南府知府，擒拿张勇、李文简叛乱。因政绩，调任吉安府知府，平定永丰及大茅山叛乱，此后辅佐巡抚王守仁平定桶冈、横水。宁王朱宸濠称兵造反，吉安府官民争相逃亡，是为宁王之乱，伍文定斩杀一个逃亡者后，众人纷纷安定，并迎接赣南巡抚王阳明入城抗敌。此后知府邢珣、徐琏、戴德孺等纷纷前来共同讨伐，伍文定担任大帅。在战场上，伍文定身中矢石，火烧其须而不动。平定叛乱后，因功最大，升江西按察使。太监张忠、许泰抵达南昌，意图冒功，但王阳明已经俘虏朱宸濠抵达浙江。至此张忠大恨，伍文定反被捆绑，伍文定怒骂张忠是想帮宁王报仇，