·美第奇开始将家族收藏存放至宫殿的顶层，并不断的扩充，是欧洲最古老的博物馆之一。至斐迪南二世·德·美第奇大公时期收藏达到顶峰，斐迪南二世的妻子是末代乌尔比诺公爵的唯一继承者，借着这段婚姻，他获得了蒙特费尔特罗家族及德拉·罗维雷家族部分的收藏，而大公的两位枢机弟弟以及也对扩充家族收藏不遗余力，尤其是列奥波尔多，美术馆的画作中有十分之一是由他收藏的。科西莫三世·德·美第奇大公以收藏古雕像及法兰德斯绘画闻名，而美第奇家族最后的统治者吉安·加斯托内·德·美第奇也持续妆点这座美术馆。
佛罗伦斯