酸时必须先将苹果酸水解为碳阳离子的中间产物，接着只要脱去H即可形成延胡索酸。反观其逆反应：将延胡索酸转化为苹果酸的机制就比较容易理解了。将延胡索酸转化为苹果酸的过程包含了借由羟基(-OH)的反式加成以及一个氢原子1,4反式加成，为一个具有立体专一性的水合作用。由以上可以看出：由延胡索酸合成苹果酸为E脱去反应，HO提供的羟基加成是伴随着延胡索酸上碳阳离子的质子化而来的。但是，近来的研究指出延胡索酸酶的反应机制应为以碳阴离子为中间物的酸-硷催化脱去反应(如图二)。
生化反应途径.