因此阻隔了结晶紫-碘复合体的外渗，仍然呈紫色只能留在细菌体内。革兰氏阴性菌细胞壁层薄，外膜类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，在遇脱色剂时，以类脂爲主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡复合体溶出，因此会被脱色而成为无色。为了对比，在此之后会加入番红（Safranin）进行复染，革兰氏阴性菌成红色，而革兰氏阳性菌仍保有原来的紫色。
定性.
KOH-试验.另外的一种方法是氢氧化钾-试验。将培养好的细菌取出一小部分，使其悬浮于一滴KOH溶液中。革兰氏阳性菌