当然这一步也是可逆的。最后中间体（Ⅱ）分解，得到另一个产物，酶复原。对半胱氨酸蛋白酶，可以直接产生巯基负离子。对丝氨酸蛋白酶，仍需使中间体（Ⅱ）在分解时夺走碱性基团上的一个质子。（见(f)）与氧相比，硫的原子半径较大，所成共价键较长，需要匹配更大的活性位点。故某个丝氨酸蛋白酶催化三联体中的丝氨酸变异成了半胱氨酸，或是半胱氨酸蛋白酶催化三联体中的半胱氨酸变异成了丝氨酸，均会失去活性。因为它们结合底物后，各基团的取向不对。例如，对硫代胰蛋白酶的晶体结构研究证实，其中的半胱氨酸不仅没有与底物接近，反而与氧阴离