特点是在使用载体作为模板时没有链置换活性。几轮PCR循环后，得到的产物是带有两个缺口的融合质粒（每条链一个）。然后使用这种新质粒转化大肠杆菌感受态细胞，转化后大肠杆菌细胞中的DNA修复酶可以封住缺口。
引入序列变异.如果设计特殊引物，重叠延伸PCR也能够用来在DNA序列中引入变异。引物可以有一个单点突变或在5' 端加入一段新的序列。如果需要删除片段，从删除位点两段设计两对引物，靠近删除片段两个引物的为5' 端，加入删除目标片段后的序列并保持互补性，3' 端不变，进行OE-PCR，即