射线并行跨越珠江前往大坦沙岛，自坦尾站后从高架进入地下，向东穿过南岸路与中山八路交叉口，再折向北经过和平新村，穿过一片建成区到达西村站。之后沿环市路走廊敷设。过动物园南门后折向南行到杨箕站。经五羊新城向东沿花城大道穿越珠江新城、员村地区之后向东北，折回黄埔大道，经黄埔大道-科韵路口、东圃、鱼珠、茅岗，折入黄埔区大沙地路，最终抵达文沖，全长约31.9公里。五号线的鱼珠车辆段，位于三溪站东北方，路线的控制中心亦设在其中。同时，鱼珠车辆段是广州地铁的直线电机列车架修、大修基地。五号线的地下路段也是国内盾构