蜘蛛侠和玛莉·珍·华生之外，麦尔斯·莫拉雷斯、梅婶、诺曼·奥斯朋、渡边悠里（）和黑猫等都会出现在游戏内。《蜘蛛侠》亦包含众多其他漫威宇宙中的客串角色，例如夜魔侠和复仇者。许多起源自蜘蛛侠系列和其他漫威漫画的反派也会出现，例如八爪博士、负极先生、金霸王、震动人、电光人、犀牛人、 蝎子人、秃鹰、银貂、、和模仿大师。DLC出现角色有黑猫和。
剧情.彼得·帕克是一位正于实验室实习并将从大学毕业的23岁青年，他八年前成为蜘蛛侠，并一直担任纽约的保护者。在故事初期，他打败了控制了整个纽