马力欧·奥迪托雷（Mario Auditore）保管之古代遗物「伊甸碎片」、将之枪杀及命士兵枪伤伊吉欧。伊吉欧负伤带领佣兵及家人逃走后独自前往义大利首都罗马，并发现波吉亚家族已几乎控制了整个城市，市区百业萧条，市民被剥削而生活困苦。以市内台伯河上的小岛台伯岛为基地，伊吉欧联结市内妓女、盗贼及佣兵势力，以及招揽反抗的市民加入其刺客兄弟会以解放在教宗势力控制下的罗马。于各方协助下，伊吉欧得知切萨雷的财政由其兄长胡安·波吉亚（Juan Borgia）负责，而切萨雷则欲借助法国瓦卢瓦公爵路易十二的军事力量以及发明家