制酶处理载体和外源DNA。由此产生的DNA片段含有平末端或粘性末端，然后通过分子连接将载体DNA和具有相容末端的外源DNA连接在一起。在将DNA片段克隆到克隆载体中后，可以将其进一步亚克隆到另一种用于更具体用途的载体中。构建基因文库常常使用的载体有λ噬菌体，cosmid载体，质粒和人工染色体（包括酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC、P1派生人工染色体PAC等）。载体最常在细菌细胞中繁殖，但如果使用YAC（酵母人工染色体）作为载体，则可以在酵母细胞中繁殖。载体也可以在病毒中繁殖，但这可能是耗时