细菌为原料制备。比如枯草芽孢桿菌、大肠桿菌都可以用来制备L型细菌。通过抑制肽的合成可以制备L型细菌，而前者通常是通过用抗生素或能够水解细菌细胞壁的溶菌酶对细菌进行处理达成的。为了防止菌体因过渡吸水而裂解，L型细菌通常会在与其细胞质基质具有相同的培养液（即等渗培养液）中培养。L型细菌在制成后可重新长出细胞壁，但可将之长期置于制备环境中避免。一些研究指出，L型细菌发生了突变，因为它们是由正常的细菌衍生而来的。该突变点为一种参与甲羟戊酸途径的酶。上述突变据信能够将生成L型细菌的可能性提高至原来的1000倍。这