维持其不分化的状态也十分困难。爲了阻止胚胎干细胞在培养过程中分化，培养基需加入如白血病抑制因子（LIF）等因子。最初，胚胎干细胞需要在含有餵养层细胞的培养基上培养。餵养层细胞能爲胚胎干细胞提供特定的微环境，以抑制胚胎干细胞的分化。餵养层细胞常常使用经过有丝分裂阻断剂（如丝裂霉素）处理过的胚胎成纤维细胞。目前已能在成份清楚、无异物、不含有血清以及餵养层细胞的培养基上培养胚胎干细胞。
胚胎干细胞的鑑定.胚胎干细胞可以通过细胞集落或细胞本身的形态初步鑑定；除此之外，还可以从分子标记和分化