硫原子还拥有空的3d轨道可充填电子。因而硫负离子是比氧负离子更弱的碱。（例如HS的Kb值比OH大七个数量级） 催化反应的第一步是亲核基团对底物羰基进攻，形成四面体中间体（Ⅰ）的过程。半胱氨酸巯基之pKa值是如此之低，以至于部分半胱氨酸蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）在基态下催化三联体中半胱氨酸巯基氢是电离的（见(a)）。一些甚至不需要酸性基团参与即能有效催化反应（见(b)）。催化过程中，已电离的烷硫负离子可以直接进攻底物羰基。然而，在丝氨酸蛋白酶中，丝氨酸羟基pKa值较大，不容易电离。因此，丝氨酸蛋白酶在催化反