关西，以丰臣秀赖的名义举兵。其后，昌幸收到长束正家和增田长盛等五奉行的联署书，书中指出若无忘秀吉的恩情，便向秀赖尽忠，一同讨伐家康，昌幸在与两名儿子真田信幸和幸村商议后，决定他跟幸村支持丰臣氏，信幸则支持德川氏，并且随即与幸村返回上田城。同年9月5日，德川秀忠派信幸和本多忠政劝降昌幸不果后，开始进攻上田城，尽管兵力差距超过十倍，但是真田氏仍然成功抵挡德川军的攻势，其后秀忠在9月11日撤军，最终未能赶及在9月15日参与关原之战。关原之战后，昌幸的旧领小县郡由信之接管，信之的领地原本是2万7千石和上田3万8千石