氢键本身，则会导致所定义的二级结构不准确。例如，蛋白质的螺旋中的残基都分布在拉氏图（以主链二面角为坐标）的特定区域，因此二面角位于这一区域的残基都会被认为参与形成「螺旋」，而不论它是否真正的存在对应氢键。其他稍微不准确的定义多是应用曲线微分几何的观念，如曲率及扭量。也有一些结构生物学家以肉眼观察通过软件显示的蛋白质结构来决定其二级结构。对生物大分子的二级结构含量可以以光谱来初步估计。对于蛋白质，最常用的方法是圆二色性(Circular dichroism), （利用长紫外线，波长范围170-250nm）