原酶 (NADH)（EC 1.5.1.42）在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）存在的条件下，将黄素单核苷酸（FMN）还原产生。细菌荧光素中的二氢黄素单核苷酸（FMNH）和长链脂肪醛（RCHO）可经荧光素酶在分子氧存在下分别氧化为黄素单核苷酸和长链脂肪酸，使得反应可持续进行。该过程的第二步可释放出λ约为490nm的蓝绿色光。