Williams mötte den olympiska kvaltid som vann IFAM-titeln i Belgien i maj men misslyckades med att vinna automatiskt urval vid British Championships.
Sebastian Rodger vann den brittiska titeln med Jack Green andra och därefter båda säkrade urval i Birmingham.
Williams, 32, sprang på OS 2012 och vann europeiskt guld samma år.
"Rhys var endast berättigad till urval i omgång fyra av urvalet, och för att vara framgångsrik i denna omgång juryn skulle behöva tro att han skulle vinna en medalj i Rio eller vid en framtida olympiska spel och / eller det fanns exceptionella omständigheter om hans potentiella urval / kvalificering," en brittisk Athletics uttalande läst innan överklagandet.
"Tyvärr ansåg man att Rhys inte passade in i någon av dessa kategorier och därför inte valdes ut."
Williams, som fick ett fyra månaders förbud för doping 2014, sprang precis under British Athletics Olympic A standard, vinna sitt Belgien möte i maj i en tid av 49.22 sekunder. Den brittiska OS kvaltid för 400m hinder var 49,40 sekunder.
Williams ansåg att han borde vara berättigad, men British Athletics har avvisat hans överklagande.
Seren Bundy-Davies, som hjälpte Storbritannien att vinna 4x400m europeiskt guld på helgen, är den enda walesiska banan och fältidrottare namngivna i Storbritanniens lag för Rio 2016 vilket innebär att Wales kommer att ha bara ett spår och fältidrottare på en olympiska spel för första gången sedan 1952 Helsingfors Games.
Welsh 400m hinderr Rhys Williams har misslyckats i sin överklagande mot hans utelämnande från Team GB: s atletisk trupp för Rio OS nästa månad.