Mallon sade affärskvinna Christine Bell och fullmäktigeledamot Len Junier hade kritiserat honom och hans kolleger för att sälja mark i Acklam Hall för utveckling.
De kallade det "dodgy" på Twitter och vid ett rådsmöte.
Borgmästare Mallon sa att de nu var tvungna att bevisa påståendena.
Den oberoende borgmästaren sade: " Ni har två personer här som hävdar att försäljningen av Acklam Hall var knasig.
"Vad dessa människor har att göra nu är att producera bevis på oegentligheter, korruption, eller kriminalitet, och jag kommer att ge dig en gjutjärn garanti att de inte kommer att kunna producera en enda strimla av bevis.
"Nu måste de faktiskt sätta upp eller hålla käften."
Junier (Oberoende), som har bett statssekreteraren att undersöka försäljningen av marken, sade: "Det handlade om att jag hade en skyldighet att ställa frågor och väcka oro var de än fanns.
"Allt jag vill veta är om skattebetalarna fick bästa möjliga affär för marken?"
Hallen värderades till cirka 1 miljon pund för några år sedan, men Middlesbrough Council har vägrat att säga hur mycket den såldes för.
Kritiker sa att marken var värd mer än 20 miljoner pund.
Bell berättade för BBC att hon hade tagit upp en fråga av oro som ännu inte hade lösts och nu väntar resultatet med intresse.
Middlesbrough Mayor Ray Mallon har hänvisat sig till sitt råd standard kommitté som svar på anklagelser en markförsäljning var "dodgy".