Den 21-tiden Grand Slam singlar mästare förlorade 6-7 (3-7) 6-1 6-2 till ryska 15: e frö Svetlana Kuznetsova.
Det var den 34-åriga amerikanska gemensamma tidigaste utgången från turneringen, som hon har vunnit åtta gånger.
"Spelarna kommer ut och spelar mig som de aldrig har spelat tidigare i sina liv," sade Williams, som inte hade förlorat i Miami sedan 2012.
Hon har nu inte vunnit en turnering sedan augusti, när hon hävdade 69: e titeln på sin karriär, i Cincinnati.
"Jag tycker inte det är lämpligt att kritisera min rörelse just nu", tillade hon, som svar på frågor från reportrar. "Jag gjorde mitt bästa. Jag kan inte vinna varje match."
Kuznetsova sa att hon var "riktigt glad" men bad om ursäkt till fans som hoppades se mer av Williams på denna turnering.
Hon tillade: " Jag försökte hålla mig på en bra nivå hela spelet. Jag tror att jag gjorde det ganska bra och jag är nöjd med hur jag tjänade."
Polens tredje frö Agnieszka Radwanska förlorade också, slog 2-6 6-4 6-2 av 19: e fröet Timea Bacsinszky av Schweiz.
Även på måndagen slog den brittiske nummer ett Johanna Konta 32:a fröet Monica Niculescu 6-2 6-2 för att nå kvartsfinalen, medan Heather Watson besegrades 6-3 6-4 av Rumäniens Simona Halep.
Världsmästare Serena Williams drabbades av ett chocknedslag i fjärde omgången av Miami Open.