Akvarellen, som tillskrivs drottning Victorias favoritkonstnär Sir Edwin Landseer, såldes av JP Humbert av Whittlebury i Northamptonshire.
Målningen har lockat både starka anhängare och de som tvivlar på att den avbildar Brontes.
Den såldes till en samlare som planerar att göra mer forskning och sälja den vidare.
Budding tog bara 15 minuter innan slutet av den "tidiga" online auktionen med målningen säljs för £ 40,550 hammare pris (50,038 inklusive köpare premie) till en privat investerare som tros vara baserad i Storbritannien.
Auktionsförrättaren Jonathan Humbert sade: "Vi är mycket nöjda med att vår teori har accepterats och fått stöd av etablissemanget.
"Beläggen var övertygande att detta är Brontes som målas av Landseer och dess framgångsrika försäljning har visat att forskning och fakta bevis kommer att övervinna apati och negativitet."
Humbert hade bestämt sig för att ta bilden, som han anser vara av "nationell betydelse", från en auktion 2012 så att mer forskning kunde göras.
Landseer var en populär viktoriansk målare mest känd för sina djurporträtt och designade bronslejonen på Trafalgartorget i London.
Familjen Bronte flyttade till Haworth i West Yorkshire år 1820 där pastor Patrick Bronte utsågs till Curate of Haworth.
De bodde på Haworth Parsonage från 1820 till 1861, som nu är Bronte Parsonage Museum.
En målning påstås vara ett tidigare okänt porträtt av de tre systrarna Bronte har sålt för mer än 40 000 pund på auktion.