Efter rapporterad lobbyverksamhet från Spanien är EU:s Brexit-förhandlingsstrategi att beslut som påverkar Gibraltar kommer att gå förbi den spanska regeringen.
Labour's Keir Starmer sa att Gibraltar inte skulle vara ett "bargaining chip".
Utrikesminister Boris Johnson har insisterat på att Storbritannien förblir "oförsonligt och rockliknande" i sitt stöd.
John Johnson höll i fredags samtal med Gibraltars chefsminister för att försäkra honom om den brittiska regeringens fortsatta stöd.
John Johnson träffade Fabian Picardo, som sade att området valdes ut för "onödig, omotiverad och oacceptabel" diskriminering från Spaniens sida.
En EU-källa berättade för BBC att införandet av Gibraltarfrågan i det dokument som utlöser artikel 50 hade kommit efter lobbyverksamhet från Spanien.
Men Theresa May hade inte nämnt Gibraltar en gång i sitt 2 200-ordsbrev, som inledde Brexitprocessen.
Lord Boswell, ordförande i Lord House of Lords EU-kommitté, sade att regeringen inte får ge intryck av att Gibraltar är ett "eftertänkt".
Sir Keir, skuggföredraganden Brexit sekreterare, har sagt till Brexit sekreterare David Davis att Gibraltars suveränitet och intressen måste skyddas.
Clare Moody, labour parlamentsledamot för Gibraltar och sydvästra England, berättade BBC Radio Four's Today program att det var regeringens uppgift att "representera folket i Gibraltar".
Hon sade: " Jag blev förvånad över att de inte gjorde det i det brev som de sände på onsdag.
"Det oroar mig att vi är på väg att inleda de mest detaljerade förhandlingar som vi har känt till i årtionden.
"Om regeringen har förbisett Gibraltars intressen, som är en avgörande del av den typ av konstitutionella arrangemang som vårt medlemskap i Europeiska unionen innebär, vad mer kommer de då att förbise?"
Christian Hernandez, ordförande för Gibraltars handelskammare, berättade för programmet att den brittiska regeringen behövde "stå fast inför den spanska mobbningen".
"Vi vill inte vara oberoende av Storbritannien.
"Vi har gjort det mycket tydligt under de senaste 100 åren, under de senaste 20 åren, under de senaste 15 åren, vi vill ha en konstitutionell relation med Storbritannien, där vi fortsätter att vara en del av Storbritannien och självständighet är inte något vi strävar efter", tillade han.
Spanien har länge bestritt Storbritanniens 300-årsregeln i Gibraltar.
Gibraltarborna, som uppgår till omkring 30 000, förkastade med 99 % till 1 % idén om att Storbritannien skulle dela suveränitet med Spanien i en omröstning 2002.
Spanien har dock fortsatt att hävda sitt territoriella anspråk.
Efter EU-omröstningen i juni förra året - där Gibraltar röstade med 96 % till 4 % för att stanna kvar i EU - föreslog Spaniens dåvarande utrikesminister att delad suveränitet skulle göra det möjligt för Gibraltars medborgare att behålla en del av fördelarna med EU-medlemskap och göra det möjligt för Spanien att "lägga sin flagga" där.
Men Alfonso Dastis, hans efterträdare, sade i januari att Spanien inte skulle sätta Gibraltar i centrum för förhandlingarna och att det skulle vara fritt att lämna EU om det så önskade.
Av Matthew Cole, BBC News reporter
Under månaderna sedan folkomröstningen, många högre spanska tjänstemän spelade ner förslag Brexit skulle användas för att trycka Spaniens påståenden till Gibraltar.
En källa nära den spanska premiärministern berättade även Mariano Rajoy är "inte en äventyrare" och skulle inte försöka utnyttja Brexit, eftersom det var "inte hans stil".
Så det kanske är sekvenseringen av de Brexit-samtal som tillkännagavs av EU:s ordförande Donald Tusk på fredag som har gett Spanien en möjlighet att inte missa.
Samtal om Brexit skilsmässan kommer först. Sedan samtal om Storbritanniens framtida handelsavtal med blocket.
När Storbritannien äntligen får förhandla om sitt framtida handelsavtal med EU skulle det kunna ha inflytande över Spanien, som kommer att vilja skydda affärsintressen och investeringar i Storbritannien - som i Santanderbanken.
Så det kan förklara varför spanjorerna tar upp frågan om Gibraltar nu, försöker få det avgjort som en del av Brexit skilsmässoavtalet.
För tillfället kommer Storbritannien att hoppas att andra EU-medlemmar beslutar sig för att stödja Spanien om detta är en låg prioritet - och kommer inte att insistera på att det är en del av den slutliga överenskommelsen.
I sitt utkast till förhandlingsriktlinjer från Brexit fastställde Europeiska rådet framtida arrangemang för Gibraltar som en av dess 26 huvudprinciper.
Den skrev: "När Storbritannien lämnar unionen får inget avtal mellan EU och Storbritannien tillämpas på Gibraltars territorium utan avtal mellan Spanien och Storbritannien."
Bryssels tjänstemän citerades av Väktaren och sade att EU stod upp för sina medlemmars intressen.
"Det betyder Spanien nu", berättade en högre EU-tjänsteman för tidningen.
"En eventuell förlängning av avtalet [efter utträdet] till Gibraltar... kommer att kräva Spaniens stöd. [I texten] erkänns att det finns två parter i denna tvist."
Gibraltar: centrala fakta
Men Picardo sade: "Detta förslag tyder på att Spanien försöker komma undan med att inteckna de framtida förbindelserna mellan EU och Gibraltar till sin vanliga besatthet av vårt hemland.
"Detta är ett skamligt försök av Spanien att manipulera Europeiska rådet för sina egna, smala, politiska intressen.
"Brexit är redan tillräckligt komplicerat utan att Spanien försöker komplicera det ytterligare."
Lopresti, ordförande för den brittiska parlamentsgruppen All-Party om Gibraltar, sade att det inte var fråga om några förhandlingar om Gibraltars framtid.
Han kommer att ta upp frågan med Natos generalsekreterare, där både Storbritannien och Spanien är medlemmar.
Han sade: "Det är skamligt att EU har försökt att ge Spanien ett effektivt veto över framtiden för brittiskt suveränt territorium, som flyger mot Gibraltars folks vilja."
Labour MP Mary Creagh, en anhängare av Open Britain kampanjgruppen, sade Gibraltarians riskera att behandlas som "pawns" i Brexit processen.
Gibraltars regering har uteslutit varje utspädning av suveräniteten i utbyte mot fortsatt tillträde till den europeiska inre marknaden eller andra förmåner som är knutna till EU-medlemskapet.
Viktiga frågor i förhandlingarna efter Brexit om Gibraltar kommer sannolikt att vara gränskontroller - tusentals arbetstagare pendlar in och ut ur territoriet från det spanska fastlandet varje dag - och flygplatslandningsrättigheter.
Förenade kungariket har sagt att det kommer att stå upp för Gibraltars intressen efter det territorium som anklagats Spanien för att använda Brexit för att främja sina territoriella mål.