Bossar - inklusive BT, Marks & Spencer och Vodafone - undertecknade ett brev som publicerades i Times och sade att ett EU-utträde skulle avskräcka från investeringar i Storbritannien.
Lämna kampanjdeltagarna påpekar två tredjedelar av FTSE 100 företag, inklusive Tesco och Sainsbury, stödde inte brevet.
En folkomröstning om huruvida Storbritannien ska stanna kvar i EU kommer att hållas den 23 juni.
David Cameron tog tidigare frågor från anställda på mobiltelefonjätten O2, en av undertecknarna av brevet, vid huvudkontoret i Slough, på den första av en serie turnéevenemang för att sälja sitt EU-vänliga budskap till väljarna. Flytten är utformad för att nå bortom Westminster och de framväxande divisionerna inom Torypartiet.
Londons borgmästare Boris Johnson, den mest uppmärksammade politikern för att stödja EU:s utträde, har uppmanat människor att fokusera på frågorna och spela ner prat om dålig känsla mellan honom och statsministern, säger "teamanda" inom partiet var bra.
I ett drag som beskrivs i nr 10 som "oförutsedda" undertecknade ordförande eller verkställande direktörer för 36 FTSE 100-företag skrivelsen, organiserad av Stronger i Europa och Downing Street, som stöder kampanjen för att stanna i EU, inklusive Burberry, BAE Systems och EasyJet.
FTSE:s chefer var bland totalt 198 undertecknare från affärsvärlden, däribland cheferna för Heathrow och Gatwicks flygplatser.
Nästan två tredjedelar av Storbritanniens största börsnoterade företag skrev dock inte under, inklusive RBS och Barclays.
Frågade om varför majoriteten av FTSE 100 företag inte skrev på skrivelsen, David Cameron sade att företag ofta var ovilliga att "göra någon form av politiska uttalanden".
Men han tillade: "Om permissionskampanjen kunde producera 35 företagsledare av denna typ av storlek skulle de vara över månen och jag tror inte att de har möjlighet att göra det med FTSE 100 ledare på något sätt."
När det gäller Boris Johnsons beslut att kämpa mot honom sade premiärministern att han hade "hungrig respekt" för Londons borgmästare och att han hade "stor framtid i brittisk politik" men tillade: "Han har fått det fel på den här."
Bank of England guvernör Mark Carney, har under tiden sagt att beslutsfattare "inte göra en bedömning" om resultatet eller konsekvenserna av folkomröstningen.
Carney berättade för parlamentsledamöterna i finansutskottet att banken behandlade juniomröstningen som "alla andra politiska händelser".
Analys av BBC:s affärsredaktör Kamal Ahmed
För politiker som stöder Storbritannien som stannar kvar i Europeiska unionen ses företagsledarnas välsignelse som ett positivt steg.
Och listan som undertecknar det proeuropeiska brevet - åtminstone delvis orkestrerat av nummer 10 - är verkligen ett tungt gäng. Men några hälsovarningar.
För det första har många av de personer som har undertecknat länge varit offentliga förespråkare för att Storbritannien ska stanna kvar i EU. Dessa inkluderar Sir Roger Carr från BAE, Iain Conn från Centrica, Dame Carolyn McCall från EasyJet och Bob Dudley från BP.
För det andra säger några av de företagsledare som nämns att även om Storbritannien skulle ha det bättre ekonomiskt i EU, så är Förenade kungariket fortfarande en betydande marknad.
Läs Kamals blogg
I brevet från företagsledare sade David Cameron att han hade säkrat ett åtagande från EU "att minska regleringsbördan, fördjupa den inre marknaden och underteckna viktiga internationella handelsavtal".
Undertecknarna skrev: "Företagen behöver ett obegränsat tillträde till den europeiska marknaden med 500 miljoner människor för att kunna fortsätta att växa, investera och skapa arbetstillfällen. Storbritannien kommer att vara starkt, säkrare och bättre på att förbli medlem i EU."
John Holland-Kaye, chef för Heathrow flygplats, förnekade att han hade pressats att underteckna brevet och sade att hans företag ville få ut budskapet om att EU hade "öppnat luftfartsmarknaden och minskat flygkostnaderna".
"Lågare kostnader för att flyga innebär att vi kan åka på semester lättare, vi kan gå på affärer lättare - så oavsett om du går på en svensexa eller exportera det finns en verklig fördel med att vara en del av EU," sade han BBC News Channel.
Richard Tice, medgrundare av Leave.EU, sade Downing Street hade medgett att använda skattebetalarnas pengar och "tillämpa påtryckningar" på FTSE-ordförande och verkställande direktörer att underteckna brevet.
"Sanningen är att trots mobbning av en premiärminister som inte har någon verklig affärserfarenhet, är det andra normala kommersiella faktorer som kommer att avgöra den fortsatta framgången för brittiska företag att investera och växa", sade han.
En annan grupp som förde en kampanj för EU:s utträde sade att det var "förtvivlat att se premiärministern så snabbt försöka skrämma folk till att rösta för sitt avtal".
En talesman för BT sade: "Alla förslag om att vårt företag har pressats att offentligt stödja fortsatt brittiskt medlemskap i ett reformerat EU är felaktiga" och man ville informera allmänheten om hur EU gynnar sin verksamhet.
Ta reda på var din MP står
Under tiden gör högt uppsatta personer från båda sidor av debatten sina röster hörda.
Boris Johnson uppmanade folk att ignorera dem som "spridde oro och oro" över de ekonomiska riskerna för EU:s utträde, och sade att många av de inblandade stödde Storbritanniens anslutning till euron under 1990-talet.
"Vi har nu en stor möjlighet att träffa nya avtal för Storbritannien att vara navet i nya handelsordningar runt om i världen", sade han.
Före detta inrikesminister Alan Johnson, som är chef för Labour's In-kampanjen, har varnat för att två tredjedelar av de brittiska jobben inom tillverkningsindustrin är beroende av efterfrågan från Europa och att lämna skulle kunna riskera upp till 50 000 lärlingsplatser.
"Det finns inget progressivt fall för Storbritannien att isolera sig", sade han i ett tal i Bristol. "Vi måste vara ledande i Europa, inte lämna."
Enligt BBC:s forskning kommer 142 parlamentsledamöter från Tory att arbeta för att stanna kvar i EU, 120 för att lämna landet, medan 68 fortfarande måste klargöra sina ståndpunkter.
Tidigare konservativ ledare Lord Hague har varnat för att splittringar över Europa i hans parti kan ta "generationer att läka".
Dessa meningsskiljaktigheter avslöjades under en debatt i parlamentet i måndags, då en rad parlamentsledamöter från Tory ifrågasatte innehållet i statsministerns överenskommelse med EU:s ledare - som tillkännagavs på fredag.
Den överväldigande majoriteten av Labourparlamentarikerna tillbaka fortsatte EU-medlemskapet liksom SNP, Plaid Cymru och liberaldemokraterna, men de demokratiska unionisterna och UKIP motsätter sig detta.
Att lämna Europeiska unionen skulle hota sysselsättningen och äventyra den brittiska ekonomin, sade några av Storbritanniens största företag.