Costa, 27, skickades iväg under klubbens 2-0 FA Cup kvartsfinal nederlag på Everton förra veckan, utesluter honom från lördagens match med West Ham.
Chelsea boss Guus Hiddink sade på fredag att Costa har ett problem med en sena i en höftmuskel.
Spanien är på väg till Italien i Udine den 24 mars innan landet möter Rumänien i Cluj tre dagar senare.
Athletic Bilbao framåt Aritz Aduriz, 35, har ersatt Costa som Vicente del Bosque s trupp bygga upp till sommarens EM i Frankrike.
Aduriz har gjort 17 mål i 28 La Liga spel den här säsongen.
Den spanska truppen har sex Premier League spelare.
Manchester United målvakt David de Gea och midfielder Juan Mata ingår tillsammans med tre Chelsea spelare - försvarare Cesar Azpilicueta, midfielder Cesc Fabregas och ytter Pedro.
Manchester City midfielder David Silva är också namngiven.
Målvakter: Iker Casillas (Porto), David de Gea (Manchester United), Sergio Rico (Sevilla).
Försvarare: Jordi Alba, Gerard Pique, Marc Bartra (alla Barcelona), Sergio Ramos, Nacho (båda Real Madrid), Cesar Azpilicueta (Chelsea), Juanfran (Atletico Madrid), Mario Gaspar (Villarreal).
Mellanfältare: Sergio Busquets, Sergi Roberto (båda Barcelona), David Silva (Manchester City), Mikel San Jose (Athletic Bilbao), Koke (Atletico Madrid), Cesc Fabregas (Chelsea), Thiago Alcantara (Bayern München), Isco (Real Madrid), Juan Mata (Manchester United).
Vidare: Pedro Rodriguez (Chelsea), Alvaro Morata (Juventus), Aritz Aduriz (Athletic Bilbao), Paco Alcacer (Valencia), Nolito (Celta Vigo).
Chelsea-strejkaren Diego Costa har lämnats utanför Spaniens trupp för vänner mot Italien och Rumänien.