Premiärminister Recep Tayyip Erdogan reste ombord på det första tåget i tjänsten från Ankara, stannar vid en stad på väg för att hålla ett kampanjtal.
Spåren gör det möjligt för tågen att nå hastigheter på upp till 250 kilometer i timmen.
Erdogan, kandidat i presidentvalet i augusti, har lovat att se över Turkiets transportnät.
"Vi gav ett löfte. Vi arbetade hårt. Vi korsade bergen, och passerade över floder, sade Eskisehir, vid en kampanj stopp i staden Eskisehir.
"Trots alla försök till sabotage, blockad och avmattning, avslutade vi linjen och öppnade den för tjänst idag."
Invigningen av tågförbindelsen har ansatts av släp och förseningar, senast när ett tåg kraschade in i ett underhållsfordon.
Den nya tjänsten kommer att avslutas i Istanbuls förort Pendik, på den asiatiska sidan av Bosporen.
Regeringen planerar att bygga ytterligare en järnvägsförbindelse, under Bosporen, till stadens centrum, men det är oklart när detta kommer att ske.
Turkiet har invigt en järnvägsförbindelse för höghastighetståg mellan Istanbul och Ankara, som skär ner med hälften av den sju timmar långa restiden mellan de två städerna.