Museet hoppas kunna höja £5m för att utveckla sin Maryfield spårvagnsdepå till en fullt renoverad nationell besöksattraktion.
Den har varit baserad vid sitt tillfälliga huvudkontor på Market Street sedan april 2014.
Bidraget kommer att finansiera en ny museichef och konsulttjänst under två år.
Museets ordförande Jimmy McDonell sade: " Vi är oerhört privilegierade över att ha erbjudits detta bidrag från Mathew Trust.
"Det kommer att göra det möjligt för oss att föra projektet framåt genom att föra in den expertis vi behöver för att göra det allra bästa av denna möjlighet som vi har."
Museet, som drivs av frivilliga, lockade mer än 10 000 besökare under sitt första år.
VisitScotland regionchef Jim Clarkson sade: "I Skottlands år för innovation, arkitektur och design, kommer bidraget att hjälpa Dundee Museum of Transport förbli en spännande del av stadens turism erbjudande, öka besökarens ekonomi i processen."
Dundee Museum of Transports insamlingskampanj har fått ett bidrag på 80.000 pund.