Brevet skrevs bara sex timmar före avrättningen den 8 februari 1587.
Det 430-åriga handskrivna brevet har inte visats upp i Edinburgh sedan 2009.
Av bevarandeskäl skulle brevet bara visas i sex timmar mellan 10:00 och 16:00. Det kommer nu att visas fram till 19:00. Inträde är gratis.
Köer har börjat bildas på National Library of Scotland där brevet visas.
Mary är en av de mest fascinerande figurerna i skotsk historia.
Hon blev drottning av Skottland när hon var sex dagar men tillbringade större delen av sin barndom i Frankrike.
När hon återvände ledde hennes korta regering till ödesdigra äktenskap, mord och krig.
Hon gav upp tronen vid 24 års ålder och var fånge i England under större delen av de kommande 20 åren tills hon avrättade på order av sin kusin, drottning Elizabeth I.
Hennes son Jakob blev kung över Skottland och England.
Marys sista brev skrevs klockan två på morgonen onsdagen den 8 februari 1587 när hon förberedde sig för att möta sin död på Fotheringhay Castle i Northamptonshire.
Hon skrev på franska till Henri III, Frankrikes kung - bror till hennes första man - och sade: "Jag ska avrättas som en brottsling klockan åtta på morgonen."
I brevet sade hon att hennes "brott" var hennes lojalitet mot hennes katolska tro som tillsammans med hennes anspråk på den engelska tronen gjorde henne till ett betydande hot mot hennes kusin Elizabeth.
Hon uttryckte också oro över de tjänare hon skulle lämna kvar som hade tjänat henne så lojalt under hennes 19-åriga fängelse i England.
Mot slutet av brevet bad hon kung Henri att "be till Gud för en drottning som har burit titeln Mest kristna, och som dör en katolik, berövade alla sina ägodelar".
Marys sista brev, Queen of Scots, kommer att visas upp i ytterligare tre timmar på grund av den stora efterfrågan från allmänheten.