Ikechi Anyas utbrytningsmål efter 10 minuter, som påminner om hans strejk i Dortmund mot Tyskland, visade sig vara det avgörande ögonblicket i Prag.
Skottland kunde ha haft en andra hade Alan Hutton tilldelats vad som såg ut som en klar andra hälften straff.
Men Gordon Strachans förberedelser för VM började med bara en andra-ever seger över tjeckerna.
De återvänder hem för att möta Danmark i en annan vänlig på Hampden Park på tisdag, med ytterligare matcher i juni mot Italien och Frankrike innan de börjar VM kval mot Malta i september.
Skottland manager Strachan talade innan matchen av att ha valt svåra vänliga motstånd för att hjälpa sina spelare att utvecklas inför mer meningsfulla fixturer.
Tjeckerna gjorde förvisso ett hårt test och stärkte sin ställning som vinnare av en tuff grupp i eurokvalificeringarna.
De bombarderade Allan McGregors mål i öppningen 20 minuter, bara för Hull målvakten att producera en rad räddningar för att förneka dem.
Han tog Tomas Sivoks huvud runt inlägget efter att Borek Dockal hade krossat en frispark från baren.
En dykning spara för att tipsa bort Martin Frydek s rasping skott var den andra höjdpunkten efter att Anya hade hånat hem supportrar genom att slotting Skottland framför.
Watford mannen tävlade på Ross McCormacks genom bollen ner för vänster flank och slutade starkt, första gången, med sin vänstra fot.
Skottarnas första-halva visning var full av slack pass och brist på koncentration.
Men de började få tjeckernas mått och blev mer sammansatta allteftersom matchen fortskred.
En mängd substitutioner på båda sidor hade också en störande effekt, men Skottland såg säkert ut under den andra perioden och kunde ha gått längre när Matt Phillips såg sitt huvud från en Robert Snodgrass kors räddas av Tomas Koubek.
Men McGregor uppmanades än en gång att göra en annan förstklassig intervention, vända en ansträngning av Lukas Marecek runt posten.
Även om Skottlands ledningsgrupp hade betonat att detta inte var en övning i experiment, tog Strachan tillfället i akt att ge Aberdeen mittfältaren Kenny McLean en debut.
McLean spelade precis bakom McCormack och fann det svårt att få tag i vad som var en tuff introduktion till internationell fotboll, som varade i 57 minuter.
McCormack, som fick en sällsynt chans i sin första mössa i två år, saknade också service men spelade en avgörande roll i Anya mål, visar stor styrka och vikt pass att spela yttern igenom.
Det var sena debuter också för strejker Tony Watt och försvarare Paul Caddis, som skulle ha berättat för chefen lite om deras förmåga att hantera denna nivå av fotboll, men erbjöd dem en stund att njuta av.
Matchen slutar, Tjeckien 0, Skottland 1.
Andra halvlek, Tjeckien 0, Skottland 1.
Hörnet, Skottland. Sammankallad av Pavel Kaderábek.
Försök missade. Matej Vydra (Tjeckien) höger fotade skott från höger sida av lådan är hög och bred till höger. Hjälpt av Lukás Marecek.
Foul av Daniel Pudil (Tjeckien).
Paul Caddis (Skottland) vinner en frispark på högerkanten.
Substitution, Skottland. Paul Caddis ersätter Ikechi Anya.
Substitution, Tjeckien. Jakub Rada ersätter Vladimir Darida.
Foul av Matej Vydra (Tjeckien).
Russell Martin (Skottland) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Försök missade. Matthew Phillips (Skottland) huvud från mitten av rutan missar till höger. Hjälpt av Ikechi Anya med ett kors.
Foul av Daniel Pudil (Tjeckien).
Tony Watt (Skottland) vinner en frispark på högerkanten.
Försök missade. Lukás Marecek (Tjeckien) vänster fotade skott utanför lådan är för hög efter ett hörn.
Hörnet, Tjeckien. Förföljd av Allan McGregor.
Försöket räddades. Daniel Kolár (Tjeckien) höger fotade skott från mitten av lådan sparas i nedre högra hörnet. Hjälpt av Vladimir Darida med ett kors.
Försök missade. Matthew Phillips (Skottland) höger fotade skott från utsidan lådan är hög och bred till höger.
Utanför Tjeckien. Pavel Kaderábek försöker en genom boll, men Matej Vydra fångas offside.
Substitution, Tjeckien. Daniel Pudil ersätter Josef Sural.
Substitution, Tjeckien. Lukás Marecek ersätter Kamil Vacek.
Substitution, Skottland. Tony Watt ersätter Ross McCormack.
Josef Sural (Tjeckien) vinner en frispark i defensiven.
Foul av Matthew Phillips (Skottlandet).
Foul av Kamil Vacek (Tjeckien).
Robert Snodgrass (Skottland) vinner en frispark i defensiva halvan.
Tomas Sivok (Tjeckien) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Foul av Robert Snodgrass (Skottland).
Jiri Skalak (Tjeckien) visas det gula kortet för en dålig foul.
Foul av Jiri Skalak (Tjeckien).
Charlie Mulgrew (Skottland) vinner en frispark på vänsterflygeln.
Foul av Daniel Kolár (Tjeckien).
Christophe Berra (Skottland) vinner en frispark i defensiva halvan.
David Limbersky (Tjeckien) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Foul av Robert Snodgrass (Skottland).
Försök missade. David Limbersky (Tjeckien) huvudet från mitten av lådan är högt och brett till höger. Hjälpt av Kamil Vacek med ett kors.
Försök missade. Robert Snodgrass (Skottland) huvud från vänster sida av rutan missar till höger. Hjälpt av Matthew Phillips med ett kors.
Foul av Daniel Kolár (Tjeckien).
Robert Snodgrass (Skottland) vinner en frispark i defensiva halvan.
Försök missade. Matej Vydra (Tjeckien) höger fotade skott från utsidan lådan är nära, men missar till vänster. Hjälpt av Josef Sural.
Substitution, Tjeckien. Matej Vydra ersätter Tomas Necid.
Skottland stod emot kraftiga tidiga påtryckningar för att spela in en imponerande vänlig seger över Euro 2016-bundna Tjeckien.