Flyget All Nippon Airlines (ANA) lyfter från Tokyo runt 1230 lokal tid, på väg till Hongkong.
Dreamliner hade ursprungligen planerats för leverans 2008, men Boeing har drabbats av en rad bakslag.
Boeing planerar att göra 10 av planen i månaden från 2013.
Onsdagens flyg är en speciell charter, med normal service för start i november.
På grund av de material som används i byggandet, Boeing säger Dreamliner är cirka 20% mer bränsleeffektiv än liknande storlek modeller som flyger idag.
Det skulle vara till stor hjälp för flygbolagen att klara av de höga kostnaderna för flygbränsle, som vanligtvis är deras största enskilda kostnad.
Japan, ett land där Boeing dominerar rivaliserande Airbus, är en stor marknad för Dreamliner.
ANA kommer att ta emot dussintals fler flygplan under de kommande åren.
Men Boeings förseningar har skadat dess affärer.
Förra veckan, China Eastern Airlines annullerade beställningar för 24 Dreamliners, snarare än att vänta på produktionen att plocka upp.
Efter tre år av förseningar, Boeings Dreamliner jet är inställd för sin jungfru kommersiella resa.