CBI Wales ordförande Chris Sutton sade den föreslagna omröstningen 2017 var att skapa "osäkerhet".
David Cameron lovade att omförhandla ett "bättre avtal" för Storbritannien och hålla en "in-out" folkomröstning i slutet av 2017.
Kansler George Osborne sade att Storbritannien skulle vara "konstruktivt men beslutsamt" i samtal med EU:s ledare.
Sutton sade: "Ur ett affärsperspektiv är EU inte perfekt, men jag tror att näringslivet ser det som ett verkligt positivt - det är en inre marknad med 500 miljoner människor och jag tror att det kommer att bli svårt för oss att ta oss ur det."
Han tillade att näringslivsorganisationen skulle driva en kampanj för att stanna kvar i ett reformerat EU och varnade för att företagen inte skulle tycka om det osäkra under de två år som ledde fram till folkomröstningen.
"Utgången från EU är inte en svängdörr; om vi gör fel kan vi inte bara komma tillbaka in igen. Det skulle bli en enorm omförhandling av ståndpunkter när det gäller bilaterala handelsavtal och en inverkan på vårt nationella välstånd för oss att komma ut ur det."
REAKTION AV FÖRETAG - JA ELLER NEJ TILL REFERENDUM?
Bethany Sawyer är chef för Biopharm UK - baserad i Hendy i Carmarthenshire - som har levererat blodiglar för medicinskt bruk sedan 1812.
Hon tror att de två åren före en folkomröstning kommer att ge Storbritannien tid att förhandla om ett bättre EU.
Men för Peter Lewis, vd för ingenjörsfirman IAC i Newport, skulle folkomröstningen skapa stabilitet och vara slöseri med pengar.
Han har 75 anställda och är orolig för att en röst för att dra sig ur EU skulle kunna bli ett bakslag när tillverkningsindustrin behöver ett uppsving.
Många multinationella företag, däribland Tata, Airbus, Toyota och Ford, är verksamma i Wales och stöder ett antal mindre leverantörer.
De är ansvariga för tiotusentals arbetstillfällen.
Airbus har dock sagt att Storbritannien som lämnar EU inte skulle leda till en omlokalisering.
Den brittiska bilindustrin och tillverkarnas organisation, EEF, har uttryckt oro över utsikterna att lämna EU.
West Wales och Valleys har fått över 4 miljarder pund i EU-finansiering med ytterligare 2 miljarder pund att komma under de kommande sju åren för att stödja ekonomisk tillväxt och skapa arbetstillfällen.
Men kritiker hävdar att detta inte är någonting jämfört med de pengar som Förenade kungariket skickar till EU och att det därför skulle finnas mer medel att tillgå i händelse av att de lämnar landet.
EU är en viktig handelspartner med Wales.
Elgan Morgan, från South Wales Chamber of Commerce, sade: " Att samarbeta med EU-länderna är det första steget för många företag när de vill exportera sina varor och tjänster.
"Att lämna EU skulle komplicera relationerna mellan walesiska företag och deras europeiska kunder och kan avskräcka företag från att utnyttja exportmöjligheter helt och hållet. Detta måste till varje pris undvikas."
Ny konservativ parlamentsledamot för Gower Byron Davies sade att folkomröstningen var något som de hade sökt igenom och folk kom överens om att hålla den.
Planer på att hålla en folkomröstning om EU-medlemskap är inte till någon hjälp för företag i Wales och skulle kunna leda till minskade investeringar, varnar ett industriorgan.