Matt Tubbs sjätte mål för säsongen kom från platsen på 70 minuter för Ryan Astles utmaning på Yemi Odubade.
Chester, som hade slagit Aldershot 8-2 i mitten av veckan, var helt invaderade av en Eastleigh sida som hade förlorat fem av sina tidigare sju liga matcher.
Besökare Tony Thompson nekade Luke Coulson, Josh Payne och Odubade innan Tubbs välförtjänta vinnare.
Kampen för att nå play-offs är fortfarande spänd, med Eastleigh nu bara två poäng bakom femte plats Braintree, medan Chester är bara åtta poäng fri från problem.
Chester manager Steve Burr berättade för BBC Radio Merseyside:
Mediauppspelning stöds inte på den här enheten
"Det var två saker vi kände oss hårt gjorda av. Vi hade ett mål otillåtet i första halvan när Ryan Higgins klippte bollen tillbaka till Ross Hannah.
"Och grabbarna är missnöjda med straffbeslutet. Det fanns minimal kontakt. Det var hårt, minst sagt.
"De har en mycket dyr ihopsatt sida med erfarenhet, som man kunde se är vana vid att spela på den planen och, i slutändan, det bestämdes av ett straff
"Det skulle alltid bli tufft efter det som har hänt denna vecka, sedan den långa resan ner. Vi gav oss av klockan sju i morse och man kunde se en eller två trötta ben där ute. Men jag vill inte komma med ursäkter. Vi skapade inte tillräckligt med chanser."
Eastleigh säkrade back-to-back-vinster för första gången sedan december när de snävt besegrade Chester.