Tycoon Sir Terry Matthews, JoJo Mamam Bebe grundare Laura Tenison och Cardiff flygplats ordförande Roger Lewis är bland 10 som har undertecknat ett brev som stöder argumentet för att förbli i EU.
Det belyser tillgången till den europeiska marknaden och EU:s investeringar i kompetens.
Kampanjen Leave hävdar att företagen fortfarande skulle kunna handla med EU efter Brexit.
Kommissionen anser också att finansieringen från EU till Wales skulle kunna ersättas av Westminster från besparingarna av att inte betala för EU-medlemskap.
Men i brevet hävdar företagsledarena: "Vårt medlemskap i EU är avgörande för den walesiska ekonomin - vilket ger Wales ett gynnsamt tillträde till en marknad med 500 miljoner människor, stöder konkurrenskraft och innovation och sprider investeringar i infrastruktur till alla delar av Wales."
För närvarande går 41 procent av exporten från Wales till Europeiska unionen.
Detta har ökat från 4,7 miljarder pund i varor och tjänster 1999 till 5 miljarder pund 2015.
De som stöder att man lämnar EU:s krav skulle göra det möjligt för exportörerna att fokusera mer på växande marknader längre bort.
Exporten från Wales till länder utanför EU har ökat från 1,7 miljarder pund 1999 till 7,2 miljarder pund 2015.
Om Brexit händer kommer försäljningen utomlands att vara beroende av vilka handelsavtal som kan förhandlas fram med andra länder.
Kompetens är ett av de viktigaste områdena för företagen och i brevet heter det vidare: "Att investera i kompetens är så viktigt för att höja inkomstnivåerna och uppmuntra till ytterligare tillväxt inom näringslivet, och under detta årtionde kommer vi att få se 1 miljard pund av EU-medel investeras i ungdomar, utbildning och kompetens."
Andra som undertecknade brevet är:
Förespråkare för att lämna EU hävdar att de pengar som sparats från medlemsavgifter skulle kunna återinvesteras på andra områden.
Reality Check: Skulle Brexit riskera 400 000 jobb?
Vad innebär EU:s folkomröstning för Wales?
Företag på Anglesey om folkomröstningen
Den oberoende tankesmedjan Institute for Fiscal Studies (IFS) har varnat för att besparingarna från medlemsavgifter inte tar någon hänsyn till den potentiella skadan för ekonomin att lämna EU.
De flesta företagsundersökningar tyder på att företagen i större eller mindre utsträckning är positiva till att stanna kvar i EU.
I april skrev flyg- och rymdföretaget Airbus till sina 6 000 arbetstagare i Flintshire en varning om riskerna med att rösta för att lämna Europeiska unionen.
Den walesiska ekonomin är "starkare, säkrare och bättre ut" i Europeiska unionen, säger en grupp toppföretag.