Mitroglou förvrängdes i det avgörande målet för de portugisiska mästarna från Luisaos huvud i andra halvlek.
Dortmund's Pierre-Emerick Aubameyang slog ett straff rakt på väktare Ederson efter Ljubomir Fejsa hanterade.
Den tyska sidan var de bästa målskyttarna i gruppscenen, men lyckades inte hitta en väg genom ett envist hemförsvar.
Dortmund kommer att vara värd för det andra benet den 8 mars, med en plats i kvartsfinalen som står på spel.
Återupplev Benficas seger mot Borussia Dortmund
PSG bedöva Barcelona för att lämna Luis Enriques sida på randen
Bundesliga sidan förväntades utgöra ett större hot mot Benfica efter poäng 21 mål i gruppstadiet.
Gabon internationella Aubameyang hade bidragit med fyra av dessa strejker men epitomiserade en out-of-sorts Dortmund, scooping en nära håll chans över baren och missar hans straff innan ersättas efter en timme.
Dortmunds form har vacklat sedan december, med den tyska sidan vinner bara två av sina senaste sju ligamatcher.
Thomas Tuchels sida drabbades av ett chocknedslag av Bundesligas bottenklubb Darmstadt på lördagen, och sjukdomskänslan fortsatte när de hölls i schack av en envis Benfica display.
Den portugisiska klubben har aldrig förlorat en sista 16 slips i Champions League - efter att ha nått den scenen tre gånger - och kommer att ha en ledning att försvara i Tyskland efter att ha gjort mål med sin enda skott på mål.
Benfica coach Rui Vitoria: "Vi kämpade, gav vårt bästa, och segrar är också gjorda av det.
"Grattis till Ederson också, en väktare som visade sin kvalitet igen, denna gång mot ett lag som gjorde så många mål i gruppstadiet."
Dortmund tränare Thomas Tuchel: "Aubameyang är inte helt passar efter Afrika Cup of Nations och hans kroppsspråk inte tyder på att han skulle göra bättre efter att ha missat straffet.
"Vi spelade ett enastående spel och medgav ett mål med deras första skott i andra halvan.
"Det är ett extremt komplicerat resultat, men jag är väldigt stolt över hur vi spelade ikväll. Även om jag är mycket besviken, är jag stolt över hur vi presenterade oss."
Matchändar, Benfica 1, Borussia Dortmund 0.
Andra halvlek, Benfica 1, Borussia Dortmund 0.
Foul av Marcel Schmelzer (Borussia Dortmund).
Ederson Moraes (Benfica) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Hörnet, Borussia Dortmund. Förföljd av Eduardo Salvio.
Marc Bartra (Borussia Dortmund) visas det gula kortet för en dålig foul.
Foul av Marc Bartra (Borussia Dortmund).
Raúl Jiménez (Benfica) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Försök missade. Christian Pulisic (Borussia Dortmund) höger fotade skott från utsidan av lådan är bara lite för hög efter ett hörn.
Hörnet, Borussia Dortmund. Sammankallad av Eliseu.
Julian Weigli (Borussia Dortmund) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Filipe Augusto (Benfica).
Försök missade. Marc Bartra (Borussia Dortmund) höger fotade skott från utsidan av lådan missar till vänster. Hjälpt av Julian Weigl.
Christian Pulisic (Borussia Dortmund) visas det gula kortet för en dålig foul.
Foul av Christian Pulisic (Borussia Dortmund).
Pizzi (Benfica) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Hörnet, Borussia Dortmund. Förföljd av Ederson Moraes.
Försöket räddades. Christian Pulisic (Borussia Dortmund) höger fotade skott från utsidan rutan sparas i nedre vänstra hörnet.
Christian Pulisic (Borussia Dortmund) vinner en frispark på högerkanten.
Foul av Eliseu (Benfica).
Ersättning, Borussia Dortmund. Gonzalo Castro ersätter Raphael Guerreiro.
Ersättning, Borussia Dortmund. Christian Pulisic ersätter Marco Reus.
André Schürrle (Borussia Dortmund) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Filipe Augusto (Benfica).
Substitution, Benfica. Raúl Jiménez ersätter Kostas Mitroglou.
Marcel Schmelzer (Borussia Dortmund) visas det gula kortet för en dålig foul.
Foul av Marcel Schmelzer (Borussia Dortmund).
Eduardo Salvio (Benfica) vinner en frispark på höger vinge.
Erik Durm (Borussia Dortmund) vinner en frispark på höger flygel.
Foul av Lubomir Fejsa (Benfica).
Handboll av Erik Durm (Borussia Dortmund).
Försök missade. Lukasz Piszczek (Borussia Dortmund) huvud från mitten av lådan missar till vänster. Hjälpt av Ousmane Dembélé med ett kors efter ett hörn.
Hörnet, Borussia Dortmund. Översatt av Franco Cervi.
Hörnet, Borussia Dortmund. Förföljd av Eduardo Salvio.
Substitution, Benfica. Franco Cervi ersätter Rafa.
Försök missade. Marco Reus (Borussia Dortmund) vänster fotade skott från mitten av lådan missar till höger. Hjälpt av Raphael Guerreiro med ett kors.
André Schürrle (Borussia Dortmund) vinner en frispark på högerkanten.
Foul av Victor Lindelöf (Benfica).
Lubomir Fejsa (Benfica) visas det gula kortet för en dålig foul.
Ousmane Dembélé (Borussia Dortmund) vinner en frispark på högerkanten.
Kostas Mitroglou gav Benfica en fördel i första etappen av Champions League förra 16 slipsen med Borussia Dortmund.