Mediauppspelning stöds inte på den här enheten
En dag före 43 års ålder slog den äldsta ryttaren i evenemanget ryska Olga Zabelinskaya, som återvände från ett dopingförbud förra året, med 5,55 sekunder.
Holländska ryttaren Anna van der Breggen, vinnare av road race, tog brons.
Storbritanniens Emma Pooley, som, liksom Armstrong, kom ut ur pensionen för att tävla i Rio, slutade 14th.
Ta reda på hur du kommer in i cykling med vår speciella guide.
Pooley, 33, berättade BBC Radio 5 live hon "kampade med blusterikorsvind" på den kuperade 29,7km banan.
"Vädret var lite annorlunda än vad vi förväntade oss", sade hon. "Jag var tvungen att dumpa mitt visir halvvägs eftersom det blev ångkokt.
"En del människor är bättre på att hålla sig i blöta, antar jag."
Armstrong blev den första personen att vinna samma vägcykling händelse vid tre OS.
Efter att ha vunnit tid rättegång i Peking 2008, gick hon i pension 2009 för att starta en familj innan hon återvänder för att vinna guld i London 2012 och pensionerar sig igen.
Mediauppspelning stöds inte på den här enheten
Prenumerera på BBC Sport nyhetsbrev för att få vårt tips på nyheter, funktioner och video skickas till din inkorg.
Amerikanska Kristin Armstrong vann den olympiska kvinnorättegången för tredje gången i rad med seger i Rio.