Den 26-årige hade planerats att spela Louisa Chirico i USA i omgång tre på onsdag, men drog ut under uppvärmningen.
Vitryska Azarenka sade att hon kommer att genomgå medicinska tester innan hon beslutar om hon ska spela i Rom före den franska öppna, som börjar den 22 maj.
Hennes avgång innebär att de fem bästa fröna är ute ur den spanska turneringen.
Agnieszka Radwanska, Angelique Kerber och Garbine Muguruza lämnade i tidigare omgångar medan femte frö Petra Kvitova förlorade 6-3 6-4 till Australiens Daria Gavrilova på onsdag.
Azarenka, som nyligen hade vunnit titlar i Indian Wells och Miami, sade hon "tweaked" tillbaka under sin öppning Madrid match mot Laura Robson och att smärtan kvarstod under hennes andra omgången seger över Alize Cornet.
Hon följer värld nummer 13 Lucie Safarova - som var tvungen att dra sig tillbaka tidigare i veckan med matförgiftning - och brittisk nummer ett Johanna Konta som gick i pension i den första omgången med en andningssjukdom.
Männens händelse förlorade också Roger Federer - världen nummer tre en annan spelare ut med en ryggskada.
Vill du aldrig missa de senaste tennisnyheterna? Du kan nu lägga till denna sport och alla andra sporter och lag du följer till din personliga My Sport hem.
Fjärde fröet Victoria Azarenka har anslutit sig till listan över Madrid Open-uttag med en ryggskada.