Han kommer nu att åka i fängelse omedelbart för att avtjäna den femårsperiod som han fick i mars 2014.
Det kommer att bli Anwars andra besvärjelse i fängelse på grund av anklagelser som han alltid har argumenterat för har varit politiskt motiverad.
Anwar ses allmänt som den enda man som kan bryta den styrande koalitionens dominans, säger korrespondenterna.
"Jag vidhåller min oskuld. Detta för mig är en fabricering som kommer från en politisk konspiration för att stoppa min politiska karriär," Mr Anwar berättade för domstolen.
Han berättade för domarna: "Du har blivit partner i brott i mordet på rättslig självständighet," uppmana dem att stiga upp och gå ut ur rummet, AP nyhetsbyrå rapporterade.
Anwar twittrade ett uttalande senare på dagen och sade att han inte skulle tystas.
Hans dotter Nurul Izzah Anwar, själv politiker, berättade för BBC att oppositionen skulle hålla ett möte på tisdag kväll för att diskutera "nästa handlingsväg".
Hon sade att hon hoppades att hennes fars fängelse skulle galvanisera både oppositionen och väljarna.
"Jag hoppas att malaysarna kommer att vakna upp... det enda sättet att säkerställa normala... rättvisa äger rum är genom valurnan", berättade hon BBC World Service's Newsday program.
I detta senaste fall anklagades Anwar för att ha haft sex med en manlig politisk assistent 2008. Sodomy är olagligt i Muselman-majoritet Malaysia, även om mycket få människor någonsin åtalas.
Han godkändes av en högsta domstol för anklagelserna 2012 på grund av brist på bevis. Regeringen vädjade då och hans frikännande omintetgjordes. Det är Anwars överklagande av detta beslut som nu har avslagits.
Den populära politikern satt tidigare fängslad i sex år för sodomi och korruption efter att ha blivit utkastad som vice premiärminister 1998.
Han frigavs 2004 och fortsatte att leda sin trepartiallians till aldrig tidigare skådade vinster i valet 2008 och 2013. I det senare fallet drabbades den regerande Barasan Nasional, som har suttit vid makten sedan 1957, av sitt värsta resultat någonsin.
När domare Arifin Zakat läste domen sade han att det fanns "överväldigande bevis" mot Anwar och försvarade domen.
Domstolen bekräftade därefter det femåriga fängelsestraffet, eftersom några hundra av Anwars anhängare protesterade utanför.
Inför domen, herr Anwar, 67, sades det att det inte fanns någon som helst anledning för dem att någonsin överväga att sätta mig i fängelse.
"Jag är oskyldig", sa han. "I händelse av ett politiskt beslut att sätta mig i fängelse, förstår jag systemet, jag har suttit i fängelse... Men då är detta ett pris som jag måste betala."
På plats: Jonathan Head, BBC News, Putrajaya
Det fanns tårar och kramar för den malaysiska oppositionsledaren från hans familj efter att hans övertygelse bekräftades av den federala domstolen. Han hade till hälften väntat sig denna dom, men vid 67 års ålder har han också fruktat den.
I 16 år har Anwar Ibrahim dominerat Malaysias oppositionspolitik, och nästan lika länge har han utkämpat samma rättsliga kamp mot anklagelser som han och de flesta människorättsgrupper alltid har sagt var politiskt motiverade.
Han är den första oppositionsledaren som utgör en allvarlig utmaning för regeringspartiets maktövertagande genom att använda sin egen karisma och förhandlingsförmåga för att föra in tre helt olika partier i en koalition som lyckades vinna folkomröstningen vid det senaste valet, men inte en majoritet av parlamentssätena.
Anwar måste nu avtjäna ett femårigt fängelsestraff och ett femårigt ämbetsförbud. Det kommer att bli svårt för honom att studsa tillbaka igen, och svårt för oppositionen Pakatan koalition att hålla ihop utan honom.
Men det kommer att bli lika svårt för regeringen att vända sin flagnande popularitet, efter en dom kommer många malayser att se som en cynisk manöver för att ta bort en man som den länge har sett som sitt främsta hot. Riven genom fraktionell kamp och besmittad av korruptionsanklagelser, är regeringens problem inte lösta genom att sätta Anwar Ibrahim bakom galler igen.
Human Rights Watch anklagade premiärminister Najib Razaks regering för att fortsätta med ett "politiskt motiverat åtal" av Anwar.
"Att tillåta denna rättskipning att stå upp kommer att ytterligare undergräva respekten för rättigheter och demokrati i Malaysia", sade gruppens Asienchef Phil Robertson.
I ett e-postmeddelande uttalande, en malaysisk regerings talesman sade "uttömmande och omfattande due process" hade följts.
"Domarna kommer att ha nått sin dom först efter att ha övervägt alla bevis på ett balanserat och objektivt sätt."
Malaysias högsta domstol har försvarat oppositionsledaren Anwar Ibrahims dom för sodomi efter att ha avvisat hans vädjan.