I sitt första tal sedan han kom tillbaka som parlamentsledamot sade John Johnson att han trodde att David Cameron skulle bli framgångsrik i sina EU-förhandlingar.
Men Londons borgmästare sade att Storbritannien måste vara villigt att "strike out" och skapa "en alternativ framtid" om det önskade resultatet inte kunde säkras.
Regeringen har lovat att hålla en in/ut folkomröstning om EU senast 2017.
John Johnsons kommentarer kommer efter det att kommissionens ordförande Jean-Claude Juncker föreslog att David Cameron ville använda EU:s röst för att "kasta" Storbritannien permanent in i 28-nationsblocket.
Jean-Claude Juncker berättade för en tysk tidning att frågan om en brittisk utträde ur EU "inte uppstår", eftersom detta inte var vad Förenade kungariket sökte.
BBC:s biträdande politiske redaktör James Landale sade att det visade vilka påtryckningar premiärministern kommer att utsättas för över Europa, både från Bryssel och hans egna bakbenscher.
David Cameron tillbringade den sista veckan i maj på en rundresa i Europa för att lobbyera ledarna över sina föreslagna EU-reformer, som innehåller hårdare regler för att förhindra att invandrare ansöker om förmåner.
I sitt tal till underhuset, John Johnson, den nya parlamentsledamoten för Uxbridge och Ruislip, gratulerade David Cameron till hans "schmoozathon" runt om i Europa.
Han sade att den allkonservativa regeringen hade "ett tydligt mandat" att åstadkomma förändringar i EU.
"Och vi kan - vi kan vinna detta argument genom att vara obevekligt positiva och genom att klargöra att det vi förespråkar inte bara ligger i Storbritanniens intresse, utan i hela EU:s intresse", sade John Johnson.
Men Johnson tillade: " Om du skall gå in i en svår internationell förhandling av detta slag, då måste du vara beredd att gå din väg om du inte får det resultat som du vill ha.
"Om vi inte får det avtal som ligger antingen i detta lands eller i Europas intresse bör vi vara beredda att slå ut och skapa en alternativ framtid som skulle kunna vara lika ärorik och lika framgångsrik med ett fritt handelssystem."
Samtidigt sade utrikesminister Philip Hammond vid en utrikesministerkonferens i London att regeringen före folkomröstningen skulle "sälja hårt" fördelarna med att stanna kvar i EU, om ett bra reformpaket hade säkrats.
"Premiärministern har inte gjort någon hemlighet av det faktum att det han vill göra i Europa är att förhandla om en reform av Europeiska unionen och sedan en gång för alla avgöra denna fråga att Storbritannien är en aktiv ledande medlem av EU i ett reformerat EU, framöver", sade han.
Regeringen har infört lagstiftning som banar väg för en omröstning om EU senast i slutet av 2017, även om det finns spekulationer som kan äga rum redan nästa höst.
Reglerna för valbarhet kommer i stort sett att vara desamma som för allmänna val, vilket innebär att medborgare från de flesta EU-länder som bor i Storbritannien inte kommer att få någon röst.
Irländska medborgare i Storbritannien kvalificerar sig, liksom invånare från Malta och Cypern tillsammans med andra från samväldet.
Regeringen har uteslutit att förlänga franchiseperioden till 16- och 17-åringar.
Förenade kungariket måste vara berett att lämna EU om tillräckliga reformer inte uppnås, sade Boris Johnson.