Organisationerna bakom klagomålet säger att det är det största författningsklagomålet i Tysklands historia.
De säger att det övergripande avtalet om ekonomi och handel (Ceta) bryter mot demokratiska principer och kommer att ge för mycket makt till multinationella företag.
Men den tyska ekonomiministern säger att ett utslag till förmån för framställarna skulle vara "en katastrof".
Konstitutionsdomstolen i Karlsruhes sydvästra stad ska döma i brådskande mål på torsdag.
Överenskommelsen har redan nåtts efter flera års förhandlingar - men om denna framställning är framgångsrik, säger korrespondenterna, är det ytterst osannolikt att den kommer att undertecknas enligt planerna i slutet av oktober.
Protester i Tyskland mot transatlantiska TTIP- och Ceta-handelsavtal
EU-kommissionen vägrar att se över Ceta-affären i Kanada
Belgiska provinsen kan sänka handelsavtalet mellan EU och Kanada
Tre aktivistgrupper samlade in mer än 125.000 underskrifter som de skickade till domstolen i 70 lådor med dokument i augusti.
De är Compact, Foodwatch och More Democracy.
Deras rättsliga invändning mot avtalet är att delar av det kan träda i kraft redan innan de nationella parlamenten har ratificerat det och därmed bryter mot den tyska konstitutionen.
– Inte ett enda parlament som valdes av mig - varken Bundestag eller Europaparlamentet - fick mandat att förhandla om Ceta, säger Roman Huber of More Democracy.
Dess mest synliga motståndare på tisdagen var Tysklands ekonomiminister och rektor Sigmar Gabriel.
Han har redan kämpat för att vinna sitt socialdemokratiska parti (SPD) runda till affären.
Han berättade för domstolen att en framgångsrik utmaning för Ceta skulle undergräva Tysklands trovärdighet, rapporterade Die Welt nyhetssajt. "Jag vill inte föreställa mig vad det kan betyda för Europa", sade han till domstolen.
Aktivister fruktar att avtalen skulle kunna urvattna de europeiska normerna på de viktigaste områdena för arbetstagarnas rättigheter, folkhälsa och miljö. De säger att det kommer att öppna nya områden för privatisering och ge företag nya befogenheter att göra vinster.
De säger att det skulle ge företagen möjlighet att stämma regeringar genom en särskild bolagsdomstol om de försöker genomföra politik eller regler som skulle kunna minska de vinster ett företag förväntar sig att göra - till exempel genom att höja minimilönen.
Motståndare pekar också på komplexiteten i affären - tyder på att många vicesheriffer inte kommer att ha läst 1.500-sidigt dokument i sin helhet.
Vissa hävdar att Ceta kommer att tillåta många av bestämmelserna i TTIP - det kontroversiella transatlantiska partnerskapet för handel och investeringar mellan USA och Europa - in genom bakdörren.
I augusti var Gabriel bland ledande europeiska politiker som erkände att oppositionen innebar att TTIP-avtalet faktiskt var dött i vattnet.
Rätten i Karlsruhe ska avgöras på torsdag.
Om EU avvisar klagomålen kommer EU:s ministrar att godkänna avtalet den 18 oktober, vilket banar väg för att det ska undertecknas vid ett toppmöte med den kanadensiske premiärministern Justin Trudeau den 27 oktober.
Men om det misslyckas skulle hela processen kunna förbättras, Gabriel och Ceta motståndare som den österrikiska förbundskanslern Christian Kern håller med.
Vissa, till exempel chefen för Tysklands vänsterparti Katja Kipping, hävdar att omfattningen av motståndet mot Ceta är sådan att en omprövning av affären är berättigad även om domstolen avvisar detta klagomål.
Skulle Ceta vara en bra modell för Storbritannien?
Europaparlamentets information om Ceta
Tysklands högsta domstol står inför en utmaning mot ett planerat frihandelsavtal mellan EU och Kanada från omkring 125 000 medborgare.