Genómica y transcriptómica comparativa de Trypanosoma Cruzi
Facultad: medicina

 El parásito Trypanosoma cruzi es conocido como el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, según reportes de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se encuentra dentro de las 17 enfermedades tropicales desatendidas y es la tercera infección parasitaria más común en todo el mundo después de la malaria y la esquistosomiasis. T. cruzi muestra una marcada diversidad genética que ha permitido clasificarlo al menos en seis unidades discretas de tipificación (DTUs). Así mismo, una alta variabilidad genética intra-DTU ha sido observada en TcI, la DTU más prevalente en Colombia y altamente distribuida a nivel mundial. Esta variabilidad ha llevado a algunos autores a clasificarla en genotipos, que en algunos casos son asociados a los ciclos eco-epidemiológicos de la transmisión de este parásito. De igual manera, una alta plasticidad genómica ha sido reportada en T. cruzi, reflejada en aneuploidías cromosómicas y re-arreglos estructurales entre los genes codificantes para las familias multigénicas. Sin embargo, y a pesar de los avances en los últimos años en el estudio del genoma de T. cruzi muy pocos estudios han evaluado la arquitectura genómica de este parásito. Por otro lado, este parásito posee un complejo ciclo de vida que transcurre entre humanos, mamíferos-reservorios e insectos triatominos de la subfamilia Reduviidae; presenta varios estadios morfológicos con características antigénicas distintas. Uno de los procesos más importantes durante su ciclo de vida es la metaciclogénesis, cuyo objetivo final es la transformación de epimastigotes replicativos a tripomastigotes metacíclicos infectivos. Durante este proceso se generan cambios morfológicos, metabólicos, transcriptómicos y proteómicos que permiten su progreso y confieren características infectivas al mismo; además de características virulentas de invasión de células y tropismo hacia diferentes tejidos. A pesar de los estudios realizados sobre la metaciclogénesis, el conjunto de cambios que ocurren en el transcriptoma durante este proceso biológico no se ha evaluado a profundidad en T. cruzi. Por otro lado, el ciclo de vida en el mamífero, donde se incluyen los estadios amastigotes y tripomastigotes derivados de células, cobra gran importancia ya que durante el desarrollo de este se pueden llegar a generar las manifestaciones clínicas relacionadas con la enfermedad de Chagas, producida por este parásito, principalmente por la invasión celular, replicación y lisis celular, que adicionalmente desencadena una fuerte respuesta inmune por parte del hospedero que no es efectiva en la eliminación de este, pero si afecta y daña los tejidos en el hospedero, lo que hace aún más interesante el estudio en la expresión génica de T. cruzi  en estos estadios. Por los motivos anteriormente expuestos, el objetivo general de este trabajo fue “Evaluar la arquitectura genómica y los perfiles de expresión génica durante el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi”, del cual se desencadenan tres objetivos específicos: 1. Describir la arquitectura genómica y diversidad genética de clones de Trypanosoma cruzi I (TcI). 2. Evaluar los perfiles de expresión génica de Trypanosoma cruzi I durante el proceso de metaciclogénesis in vitro. 3. Determinar la remodelación en la expresión génica durante el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi II. Siendo cada uno de los anteriores objetivos asociados a un capítulo dentro de este trabajo de tesis. En relación con el primer capítulo de este estudio, se exploró la diversidad genómica entre 18 clones colombianos de T. cruzi I y 15 clones de T. cruzi I de otros países de América. Los resultados obtenidos confirman la alta variabilidad genética descrita con anterioridad a un nivel filogenético, la presencia de una alta heterocigosidad entre los genomas, y la existencia de un clado compatible con el genotipo TcIdom, descrito previamente para cepas asiladas a partir de humanos en Colombia y Venezuela. Adicionalmente, se reportan diferentes procesos compatibles con una alta plasticidad en el genoma de TcI. Eventos de aneuploidía total y segmentaria (SA) presentes a lo largo de los cromosomas con características diferenciales entre cepas e incluso entre clones de la misma cepa fueron encontrados y corroborados por medio de cálculos de la profundidad y la frecuencia alélica. Así mismo, se encontró pérdida de heterocigosidad (LOH) en diferentes cromosomas, la ubicación de los fragmentos que presentaban LOH, al igual que la extensión a lo largo de cada cromosoma, no estuvo relacionada entre los distintos clones aislados de cada cepa. Por último, los genes presentes en los segmentos con SA y LOH fueron evaluados. Los genes relacionados con puntos calientes de retrotransposón (RHS) se encontraron flanqueando el inicio de las secuencias que presentaban SA. Los resultados observados sugieren que la compleja regulación del genoma involucrado en este parásito implica más procesos que otros eucariotas y podría estar involucrada en la respuesta para evitar diferentes tipos de estrés durante el complejo ciclo de vida de este parásito. Para responder el segundo y tercer capítulo de esta tesis, se determinó el momento exacto de obtención de los tripomastigotes metacíclicos realizando curvas de metaciclogénesis en medio LIT y se seleccionó el día donde se presentó una diferencia estadísticamente significativa en el aumento de la producción de estas formas respecto al día cero. Como resultados en general, se logró establecer el día de inicio de la metaciclogénesis para las DTUs TcI y TcII y se estandarizó un protocolo para la producción y purificación de tripomastigotes metacíclicos en cultivo LIT por medio del uso de una cromatografía en resina de sefarosa-DEAE, de igual manera, se comprobó que esta técnica no afecta la capacidad infectiva del parásito de manera in vivo e in vitro. Los resultados obtenidos para el segundo capítulo, relacionados con los perfiles de expresión de T. cruzi I, permitieron determinar que existía una diferencia entre la expresión génica de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos para la DTU TcI. Además, que una de las principales vías reguladas diferencialmente estaba relacionada con los ribosomas, de los cuales se infiere juegan un papel fundamental durante la regulación génica y mantenimiento del proteoma celular en el proceso de metaciclogénesis; otra vía diferencialmente expresada fue la autofagia, que se sabe participa durante todo el ciclo de vida de T. cruzi y es un estímulo fundamental en la metaciclogénesis, los perfiles energéticos relacionados con la glucosa, el metabolismo de los aminoácidos, y por último, los procesos celulares y de DNA. Para el capítulo 3, se logró determinar que existían diferencias estadísticamente significativas entre todos los estadios presentes en el ciclo de vida de T. cruzi II, siendo importante destacar una clara diferenciación en la expresión génica entre los tripomastigotes derivados de células y los tripomastigotes metacíclicos. Al igual que como se reportó para el capítulo 2, una gran cantidad de genes relacionados con los procesos energéticos de la glucosa, la autofagia y los perfiles de genes codificantes para proteínas ribosomales fue diferencialmente expresado a lo largo del ciclo de vida de TcII demostrando su importancia en el ciclo de vida de este parásito. Sin embargo, de manera interesante este estudio fue capaz de captar la expresión de genes específicos relacionados con meiosis y recombinación homologa SPO11 y RAD51. Los resultados obtenidos abren una ventana de conocimiento para el análisis de diferentes procesos fundamentales en el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi¸ e incluso algunos que no habían sido previamente descritos, que podrían aportar al entendimiento de la historia natural y biología de este parásito.