HUMARA assay
HUMARA Assay bir tümörün klonal kökenini bulmak için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Metod, X kromozomu inaktivasyonuna (bkz: X inaktivasyonu) dayanmaktadır ve X kromozomu üzerinde bulunan HUMARA (Human Androgen Receptor: İnsan Androjen Reseptörü) geni allellerinin farklı metillenme durumlarına sahip olmaları gerçeğini kullanmaktadır. Bir hücrede X kromozomlarından biri bir kez metillendikten sonra, bu hücreden bölünmeyle oluşacak tüm diğer hücreler aynı X kromozomunu metiller. Yani, aynı ata hücreye sahip (monoklonal) hücreler aynı X kromozomunu inaktive etmişlerdir. HUMARA geninin sahip olduğu üç özellik, onu klonal köken belirleme amacı için oldukça uygun hale getirmiştir:
1-) HUMARA geni X kromozomunda bulunmaktadır ve dişi memelinin embriyogenezinde metillenme yoluyla inaktifleştirilebilir. X kromozomundaki tüm genlerin inaktifleştirilmediği düşünüldüğünde (her ne kadar çoğu gen inaktifleştirilse de), bu önemli bir özellik haline gelmektedir.
2-) İnsan Androjen Reseptörü alelleri değişen sayılarda -CAG- tekrarları içerirler. Böylece, sağlıklı bir dişi dokusundan alınan DNA, genin belirli bir bölgesi için PCR ile çoğaltıldığında, jel üzerinde ayrılmış iki bant görülür.
3-) PCR ile çoğaltılan bölge, metillenmediğinde HpaII (ya da HhaI) gibi restriksiyon enzimleri ile parçalanabilme özelliği gösteren kısımlar içermektedir. Bu ayrıntı, araştırmacılara metillenmiş bir aleli metillenmemiş allelden ayırt edebilmek için bir fırsat sağlar.
Genin bu özellikleri deneysel süreçlerde kullanılarak incelenen bir tümör dokusunun (dişi bir bireyden edinilmiş) klonak kökeni belirlenebilir. İşlem, basitçe aşağıdaki basamaklar takip edilerek gerçekleştirilebilir:
1-) Elde edilmiş dokudan DNA izole edilmesi.
2-) İzole edilmiş DNA'nın uygun enzim (HpaII gibi) ile en uygun koşullarda, önerilen zaman boyunca muamele edilmesi.
3-) DNA'nın temizlenmesi ve ilgili gen bölgesinin uygun primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılması (kullanılan primerlere örnek için şu makaleye göz atabilirsiniz:).
4-) PCR ürünlerinin jelde yürütülmesinden sonra jelin görüntülenmesi ve sonuçların analiz edilmesi; eğer, tümör hücreleri enzim ile muameleden sonra iki bant vermişse, tümörün poliklonal olduğu söylenebilir. Eğer tek bir bant gözlenmişse, tümör büyük ihtimalle monoklonaldır-ancak her iki alelde aynı sayıda CAG tekrarı olabileceği ya da çoklu hücrelerden başlatılmış olsa da aynı X kromozomunun inaktivasyonu dolayısıyla, monoklonal gibi görünen bir doku olması olasılığı da değerlendirilmelidir.
Alınan deneysel sonuçların, tümörün klonal kökenine dair kesin sonucuna dair yorumu sağlayabilmesi için deneyde, (mümkünse) aynı bireyden alınmış normal doku hücreleri ve her iki tip hücrenin (normal ve tümör) enzim ile muamele edilmemiş DNA'ları da PCR ile çoğaltılmalıdır. Eğer, enzim ile muamele etmediğin normal dokuda dahi tek bir bant görülüyorsa, bu şöyle açıklanabilir; çalışılan kişi XO kromozomal düzenine sahip olabilir. Ancak, böyle bir durumda, var olan tek X kromozomu metillenmeyeceği için, enzim ile muameleden sonra bandın yok olması gerekmektedir. Eğer, enzimle muameleden sonra bant varlığını koruyorsa bu durumda, bu birey HUMARA geninin iki alellinde aynı sayıda -CAG- tekrarı bulunduruyor demektir. Eğer, çalışılan iki tür hücre için, hem enzimli hem enzimsiz iki bant gözleniyorsa, tümörün poliklonala sahip olduğunu kesin olarak söyleyebilirsiniz. Ancak, enzimle muamele ettiğiniz tümör örneğinde tek bant görürken diğerlerinde çift bant görüyorsanız, elinizdeki tümör büyük ihtimalle monoklonaldır. Kesin olarak söyleyememenizin nedeni; yukarıda değinildiği gibi, farklı hücrelerin aynı metillenme yapısı gösterebilme ihtimalinin hala var olmasıdır.