Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia

Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia eli NMR-spektroskopia (eng. Nuclear Magnetic Resonance) tai pelkkä NMR on lähinnä kemiassa käytetty ydinmagneettiseen resonanssiin perustuva yleinen tutkimusmenetelmä, jolla voidaan tutkia molekyylien ominaisuuksia ja tunnistaa tuntemattomia molekyylejä. Molekyylejä sisältävän näytteen mittaus suoritetaan NMR- spektrometrillä, jossa näyte altistetaan vahvalle ja jatkuvalle magneettikentälle, joka nykyisin saadaan aikaan suprajohtein. Molekyylejä voidaan tutkia NMR:ssä vain jos niissä olevilla mittauksen kohteena olevilla atomiytimillä on spin. Kaikkien alkuaineiden isotooppeilla ei ole spiniä. Vedyn isotoopilla 1 (1H) ja hiilen isotoopilla 13 (13C) on spin – nämä ovat NMR:ssä useimmin mitattuja ytimiä. NMR:ssä mitattavat molekyylit usein nestemäisiä tai liuotettu nesteeksi. Tekniikalla voidaan myös mitata kiinteitä aineita. Tosin kiinteiden mittaustekniikat ovat usein vaativampia ja saadut mittaustulokset vaikeatulkintaisempia kuin nesteiden NMR-tutkimuksessa. Kiinteiden NMR-tutkimus on siten nesteiden NMR-tutkimusta harvinaisempaa. Poikkeustapauksissa myös kaasuja voidaan tutkia. Nykyisten NMR-spektrometrien toimintaperiaate on seuraavanlainen. Molekyyleissä olevat tiettyjen isotooppien atomiytimet alkavat resonoida tai pikemminkin pyöriä (prekessoida) magneettikentässä niille ominaisilla Larmorin taajuuksilla, joka riippuu ydinten spineistä ja kemiallisesta ympäristöstä eli muiden läheisten ydinten ja niiden elektronien ominaisuuksista. Spektrometrin jatkuva magneettikenttä saa ydinten magneettikenttien suuntaa kuvaavat magneettiset momentit asettumaan keskimäärin paikalleen jatkuvan kentän myötäisesti. Mittauksessa nettomagneettimomentit ajetaan pyörintäliikkeeseen, joka ilmenee niiden Larmorin taajuuksilla. Muutos aiheutetaan lyhytkestoisin magneettikentin, joiden muuttuvilla taajuusalueilla on ydinten Larmorin taajuudet. Muuntuvien kenttien lakatessa, kestävät ydinten nettomagneettimomenttien pyörinnät hetken palaten lopulta jatkuvan kentän myötäisiksi. Pyörinnän aikana nettomagneettimomentit mitataan. Saadaan päällekkäisiä taajuuksia sisältävä signaali. Mittaus toistetaan kunnes signaali on kyllin vahva, josta ydinten taajuudet erotetaan Fourierin muunnoksella. Saadaan kuvaaja (NMR-spektri) ydinten ympäristöä kuvastavista Larmorin taajuuksista (ilmaistaan spektrissä ppm-arvoina) ja suhteellisiksi intensiteeteiksi muunnetuista amplitudeista, jotka tilanteesta riippuen kuvastavat ydinten lukumääriä. Spektristä voidaan ehkä päätellä jotakin molekyylin rakenteesta. Magneettikuvauksen periaatteet ovat samankaltaiset kuin NMR-spektroskopiassa. ==Johdanto teoriaan== ===Spin ja magneettinen momentti=== Useilla alkeishiukkasilla on spin, muun muassa elektroneilla, u- ja d-kvarkeilla. Spin on eräänlainen pyörimismäärä, joka kuvaa siis hiukkasen "pyörintää" akselinsa ympäri – hiukkaset eivät oikeasti pyöri, mutta ne käyttäytyvät lähes siten kuin ne pyörisivät.Levitt, s. 7-10 Atomiydinten protonit ja neutronit koostuvat gluonien yhdistämistä u- ja d-kvarkeista. Protonin kvarkkiyhdistelmä on uud ja neutronin udd. U- ja d-kvarkkien spinit ovat ½, mutta kvarkkien spinit ovat arvoiltaan vastakkaiset eli ne sulkevat toisensa osin pois. Protoniin ja neutroniin jää siten ½ kokonaisspin.Levitt, s. 10-14 Ytimen u- ja d-kvarkkien spinit voivat tosin olla samanarvoisetkin jos ytimellä on hyvin suuri energia. Siten vaikka protonin spin voi olla 3/2, jolloin se on Δ+-hiukkanen. Näitä on vain suurienergiaisissa olosuhteissa joten ne jätetään NMR:ssä huomiotta. Spinin omaavilla hiukkasilla ja joskus näistä koostuvilla atomiytimillä on myös ominainen magneettikenttä, jonka suuntaa kuvaa vektori, magneettinen momentti μ (J T-1). µ ja spin pyörimismäärävektori S (J s, vertaa ħ) vektorien välistä suhdetta kuvaa kerroin, gyromagneettinen suhde γ (tässä yhteydessä s−1 T−1)Levitt, s. 25-26 \mu=\gamma S Jos γ>0, µ- ja S-vektorit ovat hiukkaselle/ytimelle täysin samasuuntaiset. Jos γ<0, µ ja S ovat erisuuntaiset. ===Ydinspin=== Ytimessä voi olla monia neutroneita, joiden määrä on N, ja protoneita, joiden määrä on Z. Näiden ½ spinit voivat pariutua toistensa spinejä pois sulkien ja/tai lisäten. Ytimen kokonaisspin voi siis olla 0, ½ tai ½ monikerta: 1, 3/2 jne. Ydinspinin symboli on I. Eri yhdistelmillä on erilainen potentiaalienergia, joiden energiaeroja kuvataan energiadiagrammeissa energiatasoina. Tasoista pienienergiaisinta kutsutaan perustilaksi, jossa ydin normaalisti on. Muita kuin perustilan ytimiä ei kuitenkaan tarkastella NMR:ssä. Perustilan yksityiskohtaisia protonien ja neutronien spinyhdistelmiä ei voi ennustaa yksinkertaisin kaavoin, mutta perustilan ytimen kokonaisspin voidaan (kaavat alla). Jos N ja Z ovat parilliset, ydin ei näy NMR:ssä, ja sen ydinspin on I=0 Edeltävän esimerkkejä: 12C, 16O, 18O, 32S. Jos N ja Z ovat parittomat, ydin näkyy NMR:ssä. Ytimessä siis on 2 paritonta spin ½ hiukkasta eli ydinspin on I=2\tfrac{1}{2}X=X *X on yksikötön kerroin, jonka arvo on 1, 2, 3... Edeltävän esimerkkejä: 2H (I=1), 10B (I=3), 14N (I=1).Lambert, s. 19-21 Jos N tai Z on parillinen toisen näistä taas ollessa pariton tai nolla, ydin näkyy NMR:ssä. Ytimessä siis on 1 pariton spin ½ hiukkanen eli ydinspin on I=1\tfrac{1}{2}X=\tfrac{1}{2}X Edeltävän esimerkkejä: 1H (I=½), 13C (I=½), 35Cl (I=3/2). ===Nettomagneettimomentti=== NMR-spektrometreissä on vahva magneettikenttä B0, joka on ihannetilanteessa laitteeseen asetetun näytteen joka kohdassa likimain yhtä vahva ja samasuuntainen, jolloin kemiallisilta ympäristöltään ja muutenkin samanlaiset ytimet kokevat sen yhtä vahvana. Ilman B0-kenttää ydinten µ-vektorit eivät kohdistu mihinkään tiettyyn suuntaan – ne ovat sekaisin.Levitt, s. 26-28 Taas B0 vallitessa on energiallisesti suotuisaa että µ-vektorit kääntyvät B0 myötäisesti seuraavan yhtälön mukaisesti:Levitt, s. 24 E_{mag}=-\mu B_0\cos\theta *Emag: magneettinen energia (J) *µ: magneettinen momentti (J T−1) *B0: magneettikenttä (T) *θ: µ ja B0 välinen kulma Edeltävä on skalaarimuodossa. Varsinaisia µ- ja B0-vektoreita käytettäessä yhtälö on pistetulo E_{mag}=-\mu \cdot B_0 Tilanne on verrattavassa magneettien samamerkkisten napojen hyljintään – toisen magneetin pysyessä paikallaan (spektrometrin B0), pyrkii liikkuva magneetti kuten kompassi (ydinten µ) pyörähtämään paikallaan pysyvän magneetin kentän myötäisesti energiansa minimoidakseen. Yksittäiset ydinten µ-vektorit eivät oikeasti asetu täysin B0 myötäisesti ja voivat myös muuttaa myös suuntaansa NMR-kokeen aikana. Vaihtelut johtuvat ydinten ja elektronien keskinäisistä erityyppisistä vuorovaikutuksista, jotka muuttavat yksittäisten samanlaistenkin ydinten kokeman B0 voimakkuutta hieman hetkestä toiseen. NMR-näytteessä ytimiä on kuitenkin valtavia määriä, joten niiden kaikkien µ aikaansaama summa, nettomagneettimomenttivektori, on paikallaan ja on B0 kanssa täysin samasuuntainen.Macomber, s. 14-16 ===Prekessio ja Larmorin taajuus=== Koska NMR-aktiivisilla (I>0) ytimillä on niissä aina läsnä oleva pyörimismäärävektori eli spin S, alkavat niiden S-vektorit ja samalla µ-vektorit B0 vaikuttaessa pyöriä kartiomaisesti eli prekessoida B0-vektorin ympäri vaihtelevin kulmin. Tilanne on verrattavissa hyrrään, joka pyörii vakionopeudella. Jos hyrrä on kulmassa pyöriessään, se prekessoi (kuva).Levitt, s. 28-31 Yksittäisten ydinten S-vektorit voivat olla eri kulmissa prekession alkaessa ja hyvin pieni osa jopa täysin kentän myötäisesti tai vastaisesti, jolloin ne eivät prekessoi. Ytimet kuitenkin muuttavat prekessiokulmiaan NMR-kokeen aikana vaikuttaessaan mm. toistensa kokemiin magneettikenttiin omilla kentillään, joiden suuntia µ-vektorit kuvaavat. Prekessio tai sen kulmavaihtelu ei silti muuta µ-vektorien B0 myötäisen suuntautumisen suotuisuudesta johtuvan nettomagneettimomentin suuntaa. Yksittäiset ytimet nimittäin prekessoivat eri vaiheissa ja niitä on näytteessä valtavasti.Levitt, s. 27, 30-32 Ydinten prekessiota kutsutaan Larmorin prekessioksi ja se tapahtuu kulmataajuudella \omega=-\gamma B_0 *ω: Larmorin kulmataajuus (rad s−1) *γ: gyromagneettinen suhde (rad s−1 T−1) *B0: magneettikenttä (T) ω etumerkki kertoo prekessiosuunnan. Jos ytimen γ>0, ω on negatiivinen ja ytimen S-vektori prekessoi vastapäivään katsojasta, josta B0-vektori loittonee poispäin. γ<0 ytimen ω on positiivinen ja S-vektori prekessoi myötäpäivään. ===Varjostus=== Elektronien sanotaan varjostavan (eng. shield) ympäröimiään atomiytimiä sillä elektronien liike orbitaaleillaan B0-kentässä saa ne muodostamaan omia magneettikenttiään. Kenttien ollessa ytimen kohdalla B0 vastaisia, heikentävät ne ytimen kokemaa kenttää B0 paikallisesti. Siten ytimet prekessoivat hitaammin eli niiden Larmorin taajuus pienenee. Elektronikenttien ollessa B0 vastaisia ytimen kohdalla, puhutaan diamagneettisesta varjostuksesta, jota ilmenee erityisesti pallosymmetrisiä orbitaaleja (s-orbitaali) sisältävillä ytimillä kuten H.Macomber, s. 68-70 Elektronikenttien ollessa B0 myötäisiä ytimen kohdalla, puhutaan paramagneettisesta varjostuksesta, jota ilmenee erityisesti epäsymmetrisiä orbitaaleja sisältävillä raskailla ytimillä kuten C, F ja P. Paramagneettinen varjostus suurentaa ytimen prekessiotaajuutta. Ytimen varjostus on dia- ja paramagneettisen varjostuksen summa. Varjostukseen vaikuttaa myös ydinten läheinen kemiallinen ympäristö. Tämä siirtää erilaisten kemiallisten ryhmien prekessiotaajuuksia niille ominaisille taajuusalueille. Siksi 1H-ytimet prekessoivat vaikkapa CH2\- ja CH3-ryhmissä eri taajuuksilla. Ilmiötä kutsutaan kemialliseksi siirtymäksi.Levitt, s. 195 ===Signaalin saanti=== NMR- spektrometrissä on johdinkelat, joihin johdetaan tietyn taajuinen vaihtovirta. Yksinkertaisissa mittauksissa virta aiheuttaa näytteeseen vaihtovirran taajuudella muuntuvan magneettikentän B1 (katso Maxwellin yhtälöt-artikkeli), joka tuotetaan usein 90° kulmaan suhteessa kenttään B0. Vain ne ytimet, jotka prekessoivat samalla Larmorin taajuudella kuin kelojen aiheuttama kenttä muuntuu, kääntyvät nopeasti µ-vektoreiltaan samaan tasoon kuin B1 eli noin 90° kulmaan niiden alkuperäisestä B0 myötäisestä suunnasta. Yksittäisten ydinten µ ei välttämättä ole täysin samassa tasossa kuin B1, mutta niiden nettomagneettimomentti on. Nettomagneettimomentti alkaa siis pyöriä ympyrää samassa tasossa kuin B1 vaikuttaa sen sijaan, että se olisi liikkumatta B0 myötäisesti. Kelojen virransyöttö lopetetaan ja B1 lakkaa vaikuttamasta. Nettomagneettimomentti eli ydinten aiheuttama muuttuva magneettikenttä jää silti vaikuttamaan hetkeksi ja tuottaa siksi samoihin keloihin vaihtovirran. Muodostuneen vaihtovirran taajuus on verrannollinen ydinten Larmorin taajuuteen, joka on kemiallisille ympäristöille ominainen, ja amplitudi on usein verrannollinen ydinten lukumäärään. Tutkittava aine voidaan siten ehkä tunnistaa mittaamalla sen kaikkien tai osan NMR:ssä näkyvien ydinten intensiteetit ja taajuudet.Levitt, s. 33-36 Käytännössä B1 taajuutta muutetaan mikrosekuntien aikana laajan taajuusalueen läpi, sähkönsyöttö lopetetaan ja sitten kaikkien alueelle Larmorin taajuuksiltaan osuvien ydinten signaalit mitataan kerralla. Tämä nopeuttaa mittausta merkittävästi suhteessa tilanteeseen, jossa eri Larmorin taajuuksien ytimet mitattaisiin taajuus kerrallaan.Macomber, s. 32-33 Laajaa taajuusaluetta käytettäessä usealla eri Larmorin taajuudella prekessoivat ytimet reagoivat kenttään lähes yhtäaikaisesti, jolloin niiden nettomagneettimomentit siirtyvät pyörimään samaan tasoon kuin B1. Pyörintä kuitenkin ilmenee kunkin ytimen eriävillä Larmorin taajuuksilla. Siten mittauksessa saadussa raakasignaalissa (eng. free induction decay, FID) taajuuksiltaan erilaisten ydinten signaalit ovat päällekkäin toisiaan paikoitellen vahvistaen ja heikentäen. Ne voidaan kuitenkin tietokoneen avulla erottaa matemaattisesti Fourierin muunnoksella.Macomber, s. 34-36 ===NMR-spektri=== Raakasignaali, jossa ydinten nettomagneettimomenttien aiheuttamat jännitemuutokset (amplitudit) ovat ajan funktiona, muutetaan Fourierin muunnoksella NMR-spektriksi kutsuttuun kuvaajaan. Yksiulotteisessa spektrissä ydinten signaalien eli "piikkien" intensiteetit ovat niiden Larmorin taajuuden funktiona,Levitt, s. 48 mutta yksiulotteisen spektrin x-akselin yksikkönä käytetään ppm-arvoja taajuuden sijaan.Levitt, s. 53-54 On tosin olemassa mm. kaksi-, kolmi- ja neliulotteisia NMR-spektrejä tuottavia menetelmiä, joita kutsutaan vastaavasti 2D, 3D ja 4D NMR-spektroskopiaksi. Näissä ppm-akseleita on useita. ===Relaksaatio=== Vietäessä näytteen ytimet B0-kenttään, kestää hetki ennen kuin ne kehittävät B0 myötäisen nettomagnettimomentin maksimin. Nettomagneettimomentin M kehittyminen on logaritmista (käänteisen eksponentiaalista). Taas otettaessa näyte pois B0-kentästä, M katoaa näytteestä ajan kuluessa eksponentiaalisesti. Tämä johtuu mm. ydinten omien magneettikenttien vuorovaikutuksista toistensa µ-vektorien suuntautumiseen, jotka lopulta sekoittavat ydinten suuntautumisen aiemmin vaikuttaneen B0 myötäisesti. Ytimet siis rentoutuvat eli relaksoituvat. B0 myötäisen M muodostumiseen ja katoamiseen kuluu tietty aika, joka saadaan laskettua yhtälöllä, johon sijoitetaan T1-aikakerroin. M muodostumista/katoamista kutsutaan pitkittäisrelaksaatioksi ja joskus spin- hila-relaksaatioksi (eng. longitudinal/spin-lattice relaxation). Jälkimmäinen termi on harhaanjohtava erityisesti puhuttaessa kaasujen tai nesteiden T1-relaksaatiosta, joilla ei ole kidehilarakennetta. Termi tulee historiallisesta selityksestä relaksaatiolle, jonka teoretisoitiin pohjautuvan ydinspinien ja hilan vuorovaikutukseen. B1 kanssa samassa tasossa pyörivän M palatessa B0 myötäiseksi B1 lakatessa vaikuttamasta, kuvaa tähän kuluvaa aikaa yhtälö, johon sijoitetaan T2-aikakerroin. M muodostumista kutsutaan pitkittäisrelaksaatioksi ja joskus spin-spin-relaksaatioksi (eng. transverse/spin-spin relaxation). Jälkimmäinen termi on harhaanjohtava, sillä se vihjaa ydinspinien vuorovaikutusten johtavan T2-relaksaatioon. Relaksaatio aiheutuu siitä, että ytimet kokevat magneettikentän hieman eri tavoin riippumatta siitä, että vuorovaikuttavatko ytimet keskenään, vai eivät. Kaikille ytimille pätee T1≥T2.Levitt, s. 285 Mitä suurempi T1 tai T2 ytimelle on, sitä pidempi aika relaksaatioon kuluu. Tutkittaessa pieniä molekyylejä sisältäviä nestenäytteitä, T1 ja T2 ovat likimain samat. Suurien molekyylien nestenäytteiden kohdalla T2 on usein paljon pienempi kuin T1. T1-kerroin on usein muutamia millisekunteja, mutta harvinaissa tapauksissa se voi olla päiviä tai kuukausia. ==Ppm== Yksiulotteisessa NMR-spektrissä ydinten signaalien intensiteetit ovat niiden Larmorin taajuuden funktiona. NMR- spektrometrien magneettikentät B0 kuitenkin vaihtelevat ja siten myös niissä mitattujen ydinten Larmorin taajuudet. Eri laitteiden NMR-spektrit eivät ole siis suoraan vertailukelpoisia jos spektrin x-akselilla käytetään havaittuja taajuuksia.Macomber, s. 56-58 Yksiköiden yhtenäistämiseksi NMR-spektrin x-akselilla käytetään Larmorin taajuuden sijaan sovitusti miljoonasosia (ppm), jotka ovat yksiköttömiä eli 123 ppm = 123*10−6. Jos ytimen signaali on kohdassa 123 ppm, sanotaan 123 ppm olevan ytimen kemiallinen siirtymä. Ppm käyttämiseksi kutakin havaittua Larmorin taajuutta ν (Hz tai kulmataajuutta rad s−1) verrataan standardiksi kutsutun aineen Larmorin taajuuteen νsta (katso tarkemmat aineet kohdasta Standardit). Standardiaine tulee ilmoittaa samassa yhteydessä kuin spektrikin esitetään sillä spektrin ppm-arvot riippuvat standardista. Standardin oma kemiallinen siirtymä δ spektrissä on aina 0 ppm. δ muille ydinten signaaleille on \delta=\frac{ u- u_{sta}}{ u_{sta}} Kaava on kemiallisen siirtymän määritelmä. Kertomalla kaavan tulos luvulla 10−6 saadaan tulos ppm- arvona.Macomber, s. 59 Kun ytimen kokema varjostusLevitt, s. 53-56 *kasvaa, sen ppm ja Larmorin taajuus pienenevät suoraan verrannollisesti. Tällöin lähinnä vanhoissa tiedejulkaisuissa δ sanotaan siirtyvän spektrissä yläkenttään (eng. upfield). *vähenee, ppm ja Larmorin taajuus kasvavat suoraan verrannollisesti. δ siirtyy alakenttään (eng. downfield). ==Kemialliset siirtymät== Kemiallisen siirtymän δ määritelmä on kohdassa ppm. δ johtuvat lähinnä varjostuksesta, jota lisäävät erityisesti matalaenergiaisten energiatasojen elektronit. Näiden elektronien määrät kasvavat raskaissa ytimissä, jolloin myös ytimen mahdolliset siirtymät kasvavat. Esimerkiksi kevyen 1H δ ovat yleensä enimmillään 10 ppm. Hieman raskaamman 13C δ taas ovat 200 ppm. Hyvin raskaiden ydinten kuten 209Pb mahdolliset δ voivat olla jo usean tuhannen ppm:n alueella.Levitt, s. 202-203 Elektronegatiiviset atomit kuten O, Cl ja F vetävät elektroneja molekyylirakenteissa viereisistä ytimistä lisäten viereisten ydinten kokemaa magneettikenttää ppm-arvoja kasvattaen. Elektronivirtaukset vaikuttavat myös siirtymiin: aromaattiset renkaat toimivat magneettikentässä johdinsilmukoina ja elektronit alkavat kiertää niissä kehää (ns. rengasvirtaus) luoden renkaalle oman donitsimaisen kentän (katso Lenzin laki-artikkeli). Renkaan ulkopuolella ydinten kokema kenttä kasvaa (indusoitu kenttä on B0 myötäisesti) ja niiden ppm kasvaa. Renkaan sisällä koettu kenttä heikkenee (indusoitu kenttä on B0 vastaisesti). Isotrooppinen siirtymä on keskimääräinen δ, joka johtuu molekyylien nopeasta liikkeestä. Esimerkiksi kemiallisen ryhmän muuntuessa kyllin nopeasti muodosta A muotoon B tasapainoreaktiossa A⇌B, on havaittu δ näiden keskimääräinen δ, vaikkei minkään tasapainoon osallistuvan muodon δ oikeasti vastaisikaan havaittua keskimääräistä ppm-arvoa. Isotrooppiset siirtymät voivat olla erilaiset kiinteissä ja nesteissä. Viereiset isotoopit vaikuttavat ppm-arvoihin: 12CH312CH2OH ja 13CH312CH2OH siirtymät CH3-ryhmän 1H-ytimille ovat hieman erilaiset. Tämä on toissijainen isotooppisiirtymä – ensisijainen koskee esimerkiksi eroa 1H- ja 2H-ydinten (deuterium) δ välillä 1H-spektrissä.Levitt, s. 253 ===Korrelaatiotaulukot=== Kunkin NMR-aktiivisen ytimen δ ovat usein vain tietyillä ppm-arvojen alueilla.Macomber, s. 101-102 Siten siirtymien ppm- arvoja voidaan listata taulukoihin, joita kutsutaan usein kemiallisen siirtymän korrelaatiotaulukoiksi (eng. correlation tables). Kukin taulukko pätee vain tietylle standardille (katso Ppm-sarake) ja osin myös liuottimelle. Taulukoiden avulla voidaan siten tulkita jonkin molekyylin NMR-spektrissä havaittavat piikit jos molekyylin spektri on mitattu samoissa oloissa kuin taulukonkin arvot on esitetty. Tällaista taulukkoa käyttäen tuntemattoman molekyylin rakenne voidaan ehkä päätellä. 1H-spektreissä δ ovat tavanomaisilla kemiallisilla ryhmillä usein alueella 10–0 ppm.Levitt, s. 230 Esimerkiksi TMS standardia käytettäessä RC(O)H eli aldehydin vahvennetun vedyn signaali näkyy 1H-spektrissä usein alueella 9.5–1.5 ppm. Jos tällä alueella näkyy signaali tuntemattoman molekyylin 1H-spektrissä, voidaan aineen ehkä päätellä olevan aldehydi.Macomber, s. 81-85 13C-spektreissä δ siirtymät ovat usein 200–0 ppm. Esimerkiksi RC(O)H näkyy usein alueella 200–190 ppm.Macomber, s. 98-99 On myös kehitetty kokeellisesti määritettyjä kaavoja, kuten osin yleispätevä Shooleryn sääntö X–CH2–Y molekyyleille. X ja Y ovat ryhmiä, joilla on vastaavasti taulukoihin listatut vakiot ΔX ja ΔY kaavassaLambert, s. 71 0.23+\Delta_X+\Delta_Y=ppm ==Zeeman-tilat== Magneettikenttä B0 jakaa NMR- aktiivisen ytimen perustilan (katso Ydinspin-sarake) useampaan Zeeman-tilaan, joiden energiat ovat eri. Ilmiötä kutsutaan ydinten Zeeman-jakautumiseksi, johon liittyy läheisesti elektronien energiatasojen jakautumisesta johtuva Zeemanin ilmiö. Zeeman-tiloja ei tule sekoittaa ydinten energiatasoihin. Zeeman-tilojen lukumäärä on 2I+1=tilojen\ lkm. *I: ydinspin (½, 1, 3/2...) 1H, 13C ja muiden I=½ ydinten Zeeman-tilojen määrä on siten 2 (2*(½)+1). Nämä tilat ovat +½ eli α ja -½ eli β. Tiloja on yli 2 jos ytimen I>½. Näiden ydinten sanotaan olevan kvadrupolisia (eng. quadrupolar). Esimerkiksi 17Al I=5/2, joten sillä on 6 Zeeman-tilaa (2*(5/2)+1), jotka ovat -5/2, -3/2, -½, ½, 3/2, ja 5/2. 14N I=1, joten sillä on 3 Zeeman-tilaa, jotka ovat -1, 0 ja 1.Levitt, s. 160 Zeeman-tilojen välillä vallitsevat yhtä suuret energiaerot, jotka kasvavat lineaarisesti B0 voimistuessa. Eroja eri ole, jos ytimet eivät koe B0-kenttää. Tilojen energiaerot suhteessa perustilaan ovatMacomber, s. 9 \Delta E_m=-m\gamma \hbar B_0 *ΔEm: m potentiaalienergia suhteessa perustilaan (J) *m: Zeeman-tila (0 tai ½ monikerta kuten -½, +½, -1, 0, +1, -5/2 jne.) *γ: gyromagneettinen suhde (rad s−1 T−1) *ħ: redusoitu Planckin vakio (J s) *B0: magneettikenttä (T) Siten esimerkiksi +½ eli α Zeeman-tila on matalaenergiaisempi kuin -½ eli β. Tilat vaikuttavat heikosti ydinten varjostukseen, ja täten niiden prekessiotaajuuksiin ja NMR-spektrien ppm- arvoihin. Esimerkiksi 1H-ytimen ollessa +½- eli α-tilassa, sen ppm kasvaa suhteessa -½- eli β-tilaan.Levitt, s. 112 ==J-kytkeytyminen== ===Kytkeytymisvakiot=== Eri Zeeman-tiloissa olevat atomiytimet voivat vaikuttaa toisiinsa kovalenttisten sidoselektronien välityksellä jos ydinten välillä ei ole liian montaa sidosta. Tätä kutsutaan J-kytkeytymiseksi (eng. J-coupling) tai spin-spin-kytkeytymiseksi ja se aiheuttaa ydinten signaalien jakautumista spektrissä tietyin välimatkoin, joita kutsutaan kytkeytymisvakioiksi (symboli J). J on taajuuden yksiköinä – usein hertseinä (Hz). Arvo voi olla positiivinen tai negatiivinen. Taajuudet ovat vakioita, eikä magneettikentän vahvuus vaikuta niihin.Lambert, s. 13-14 J-kytkeytymisen aiheuttama signaalien jakautuminen voi kertoa tärkeää tietoa tutkitun molekyylin erilaisten ydinten läheisistä kemiallisista ympäristöistä. Tämä helpottaa tuntemattoman molekyylin tunnistusta.Macomber, s. 110 Kun ydin on kytkeytynyt n kemiallisen sidoksen päästä toiseen ytimeen, on kytkeytymisvakion symboli nJ. Ydinten kytkeytyminen voi tapahtuaMacomber, s. 135-139 *yhden sidoksen välityksellä. Kytkeytymisvakion J symboli on 1J. *kahden sidoksen välityksellä. Kytkeytyminen on geminaalista. J symboli on 2J. *kolmen sidoksen välityksellä. Kytkeytyminen on visinaalista. J ymboli on 3J. J taajuudet ovat usein 1J > 2J > 3J, eli yhden sidoksen välinen kytkeytyminen on voimakkainta.Balcı, s. 124 Visinaalista kauaskantoisempaa kytkeytymistä ei usein havaita esimerkiksi 1H NMR-spektreissä. Kaksois- ja kolmoissidokset kuitenkin usein helpottavat elektronivälitteisen kytkeytymisen siirtymistä pidemmälle elektronidelokalisaation kautta.Macomber, s. 143 Yhteenvetona siis kun 2 1H-ydintä on kytkeytynyt toisiinsa visinaalisesti, on kytkeytymisen symboli 3JHH. Jos isotoopit ovat samoja, kuten edeltävässä esimerkissä, kytkeytyminen on homonukleaarista. Jos ne ovat eri, kytkeytyminen on heteronukleaarista.Macomber, s. 112, 118 ===Kytkeytymismekanismi=== J-kytkeytymistä selittävistä mekanismeista yksi on Fermin kontaktimekanismi (eng. Fermi contact mechanism). Tämä on suurin selittävä tekijä kytkeytymisvakioiden positiivisille tai negatiivisille etumerkeille, joissa 1H-ytimet ovat osana. Mekanismin yksinkertaistus on alla.Balcı, s. 101 1JHC- kytkeytymisvakiot 1H ja 13C välillä ovat aina positiivisia. Nämä ytimet voivat olla vastakkaisissa Zeeman-tiloissa ±½. Sidoksessa H–C on 2 sidoselektronia, joista kullakin voi olla tila ±½. Oletetaan että 1H on magneettikentän B0 myötäisesti, eli +½ tilassa. 1H-ytimen spin "kääntää" eli polaroi molekyyliorbitaalissa läheisemmän sidoselektronin spinin vastakkaisesti tilaan -½ Paulin kieltosäännön mukaisesti. Siten spinit voivat olla samalla avaruusalueella. Ydin ja elektroni ovat "kontaktissa". Kieltosäännön mukaisesti toisen sidoselektronin σ-sidosorbitaalissa tulee polaroitua tilaan +½. Tilan +½ elektroni polaroi 13C spinin tilaan -½. Siten 1H ja 13C spinit ovat kytkeytyneet vastakkaisesti (kuva, rakenne 1).Lambert, s. 104 Kytkeytyneiden ydinten spinien ollessa vastakkaiset, ovat kytkeytymisvakiot positiivisia. Jos H–C sidoksessa 1H ja 13C spinit olisivat samasuuntaiset, olisi yhdistelmä suurienergiainen ja siten epäsuotuisa (kuva, rakenne 2). Kontaktimekanismista erillisenä on myös toinen vaikutus: ydinten magneettiset momentit ovat vastakkaiset, sillä molempien ydinten γ>0 (katso Spin ja magneettinen momentti-sarake). Ydinten magneettikentät ovat siis toistensa myötäiset ja myös tämä on energiallisesti suotuisa vuorovaikutus. 2JHH- kytkeytymisvakiot ovat usein negatiivisia sidoksessa HA–C–HB, jossa on ytimet 1H ja 13C tai 12C. +½ HA polaroi läheisen sidoselektronin tilaan -½, elektroni polaroi C läheisen elektronin tilaan +½. C-ytimen sidoksiin luovuttamat 2 elektronia ovat samanenergiaisilla sidosorbitaaleillaan Hundin säännön mukaisesti samasuuntaiset. Siten C–HB välinen C:n läheinen elektroni on myös tilassa +½. Tämä elektroni polaroi HB läheisen elektronin tilaan -½. HB polaroituu tilaan +½. Ydinten spinit ovat samasuuntaiset ja kytkeytymisvakiot ovat yleensä negatiiviset. Tilanne ei muutu vaikka H–C–H sidoksessa olisi 13C. Sen spin olisi polaroitunut tilaan -½. 2JHH metaanissa on -12.4 Hz, mutta (H3C)2C=CH2 kaksoissidoksen päässä se on +2.5 Hz. Kontaktimekanismi ei siis ole ainoa J-vakioihin vaikuttava tekijä, vaikka se on osin yleispätevä selitys 1H välisten kytkeytymisten kohdalla. 3JHH-kytkeytymisvakiot ovat usein positiivisia HA–CA–CB–HB sidoksissa. Edellä kuvattujen periaatteiden mukaisesti +½ HA polaroi HA-CA sidoselektronit tiloihin -½ ja +½ vastaavasti. CA–CB sidoselektronit ovat tiloissa +½ ja -½ vastaavasti. CB–HB sidoselektronit ovat tiloissa -½ ja +½ vastaavasti. HB polaroituu teoriassa tilaan -½, ja HA ja HB spinit ovat vastakkaiset (kuva, rakenne 3). γ<0 ydinten kohdalla edeltävät yleistykset voivat muuttua päinvastaisiksi. 1JCH-vakioiden suuruuteen vaikuttavat suoraan myös 13C-ydinten s- ja p-orbitaaliluonne. Vakiot muuttuvat positiivisemmiksi mitä enemmän kytkeytyneillä ytimillä s-luonnetta. S-orbitaalit välittävät kontaktimekanismin kautta ydinspin tiedon helpommin eteenpäin kuin p-orbitaalit. Yksöissidoksissa kuten etaanissa hiilten hybridiorbitaalien s-luonne on pieni (25%) ja positiivinen 1JCH on pienempi (125 Hz), kuin etyynissä, jossa s-luonne on 50% ja 1JCH on suuri (249 Hz). γ ja s lisäksi 3JHH-vakioihin vaikuttavat konformaatioiden kiertokulmat. Tätä vaikutusta kuvaa Karplus-yhtälö. ===Multipletit=== Yhden tai usean samanlaisen ytimen signaali voi jakautua NMR-spektrissä useiksi signaalien "piikeiksi", joita erottavat kytkeytymisvakiot. Jakautumatonta piikkiä tai jakautunutta piikkikokonaisuutta kutsutaan multipletiksi ja piikkien lukumäärää signaalissa sen multiplisiteetiksi. Multipletin täsmentävä nimi singletti, jos signaali ei ole jakautunut. Jos multipletissä on 2 piikkiä, jotka ovat yhtä intensiiviset eli niiden intensiteettisuhde on 1:1, on multipletti dupletti, ja sen multiplisiteetti 2. 1H ja muiden I=½ ytimien spektreissä nähtäviä multiplettejä on alla taulukossa. I=½ ydinten kuten 1H yksinkertaisia multiplettejäMacomber, s. 113-115 n Multiplisiteetti (n+1) Multipletti Intensiteettisuhde 0 1 Singletti 1 1 2 Dupletti 1:1 2 3 Tripletti 1:2:1 3 4 Kvartetti 1:3:3:1 4 5 Kvintetti 1:4:6:4:1 5 6 Sekstetti 1:5:10:10:5:1 1H ja muiden I=½ ydinten kytkeytymisessä yksittäisen multipletin intensiteettisuhteet voidaan muistaa Pascalin kolmion avulla. ====Multiplettien muodostuminen==== Multiplettien muodostuminen johtuu erilaisten Zeeman-tilojen J-kytkeytymisestä. Esimerkiksi etanolin CH3-ryhmän 1H-ytimiin kytkeytyvät visinaalisesti CH2-ryhmän 1H-ytimet. Kunkin 1H-ytimen Zeeman-tila voi olla +½ eli α tai -½ eli β. Etanolin CH3-ryhmän kohdalla kytkeytymisyhdistelmiä on 4: ββ, αβ, βα ja αα. Yhdistelmistä suurienergiaisin on ββ. Siten sen varjostus on suurin eli sen taajuus ja ppm on pienin. αα on pienienergiaisin. Sen varjostus on pienin eli sen taajuus ja ppm on suurin. αβ ja βα ovat samanenergiaiset. Siten niiden ppm-arvot ovat yhtä suuret. Yhdistelmät ovat likimain yhtä todennäköisiä ja signaaleja antavia ytimiä on näytteessä suuria määriä. Siksi CH3 1H-ytimet muodostavat 1:2:1 intensiteettisuhteisen tripletin 1H NMR-spektriin (kuva).Levitt, s. 56-59 1H-spektreissä ei usein nähdä J-kytkeytymistä hapen kautta, eli etanolissa OH- ryhmän 1H jää kytkeytymättä ja näkyy singlettinä. Normaalisti piikki on kuitenkin leventynyt jos etanoli ei ole hyvin puhdasta. Myös CH2 1H-ytimet jäävät kytkeytymättä OH 1H kanssa, mutta kytkeytyvät CH3 1H-ydinten kanssa muodostaen kvartetin. Kvartetin muodostuminen voidaan perustella kuten tripletti, eli Zeeman-tilayhdistelmien kautta. Kussakin yhdistelmässä on tällöin kytkeytyneenä 3 Zeeman-tilaa: (βββ), (αββ) jne. Etanolin multipleteissä olevien piikkien väliset ppm-erot ovat likimain samat koska ne muodostavien ydinten 3J-kytkeytymisvakiot ovat suunnilleen samat. Jos multipletin muodostavien ydinten J-kytkeytymisvakiot eivät olekaan likimain yhtä suuret, voi muodostua monimutkaisempia multiplettejä (kuva alla). Jos J-vakioiden välillä on vain pieni ero, signaali näyttää yksinkertaiselta. Kuitenkin ns. korkean resoluution NMR-spektrometrien erikoisvahvoissa magneettikentissä nämä pienetkin erot voivat näkyä, jolloin spektri on monimutkainen. Multipletin rakenne voidaan esittää kytkeytymisvakiopuuna (kuva alla). ==1H NMR-spektrit== 1H NMR-spektreissä eli protonispektreissä orgaanisten yhdisteiden 1H-ydinten visinaalista J-kytkeytymistä (H–C–C–H) havaitaan lähes aina. Taas 1H J-kytkeytymistä sitä sitovaan hiileen (H–C) ei tavallisesti nähdä spektreissä sillä hiilen isotoopeista luonnossa noin 99% on 12C-isotooppeja. 12C I=0, eli se ei näy NMR:ssä. Hiilen toisen vakaan isotoopin eli 13C:n I=½. Se siis näkyy NMR:ssä. 1H ja 13C välillä tapahtuu kytkeytymistä, mutta 13C yleisyys on noin 1%, eli se on harvinainen. Kytkeytyminen on siten niin heikkoa, ettei sitä yleensä nähdä.Lambert, s. 17-18 1H-ydinten välistä geminaalista kytkeytymistä (H–C–H) ei usein nähdä spektreissä koska niissä olevat hiilten väliset yksöissidokset yleensä kiertävät huoneenlämmössä nopeasti ympäri (katso konformaatio-artikkeli). Tällöin geminaaliset vedyt ovat kemiallisilta ympäristöiltään keskimäärin samanlaiset. Kiertymisen vähentyessä esimerkiksi näytettä viilentämällä tai kiertymisen muuten estyessä geminaalista kytkeytymistä saatetaan havaita spektrissä.Macomber, s. 52 Kiertyminen estyy esimerkiksi steerisistä syistä, kuten substituoidussa eteenissä (esim. kloorieteeni), jossa on kaksoissidoksen vuoksi E/Z-asemissa olevilla 1H-ytimillä eri siirtymät.Balcı, s. 65 Kaikki kemialliset ryhmät eivät aina tuota selkeitä piikkejä, vaan piikit ovat leventyneitä ja niiden intensiteetti on heikko. Leventymistä nähdään niiden 1H-ydinten kohdalla, jotka ovat sitoutuneet muun muassa happiin ja typpiin. Esimerkkejä: alkoholit, karboksyylihapot, fenolit, amiinit, amidit ja imidit. Näissä olevat 1H-ytimet voivat vaihtua molekyylin näistä kemiallisista ryhmistä toiseen ja vaihtua myös deuteroidun liuottimen deuteriumin kanssa, jollaisia käytetään yleisesti NMR:ssä. Tätä tapahtuu lähinnä poolisten liuottimien kuten D2O kohdalla. Näytteeseen epäpuhtauksina jääneet hapot tai emäkset katalysoivat 1H siirtymistä. Visinaalista kytkeytymistä ei myöskään yleensä havaita mm. typpien ja happien kautta, sillä nopea 1H siirtyminen estää Zeeman-tilojen tiedon välittymisen ytimeltä toiselle (katso Kytkeytymismekanismi-sarake).Lambert, s. 23-24 Puhdistamalla näyte 1H siirtymistä edesauttavista epäpuhtauksista ja/tai laskemalla lämpötilaa, voidaan piikkien leventymistä vähentää ja kytkeytymistä mm. happien kautta saatetaan havaita. Lisäksi näytteen viilentäminen hidastaa tai voi estää konformeerien muuttumisen toisiksi. Esimerkiksi viilentämällä sykloheksaania noin -89 °C:n lämpötilaan, estyy sen rengaskäännös, jolloin aksiaaliset ja ekvatoriaaliset 1H näkyvät spektrissä kahtena piikkinä yhden keskimääräisen piikin sijaan. ===n+1 -sääntö=== 1H visinaaliseen kytkeytymiseen pätee usein (muttei aina) n+1 -sääntö, jossa n on tarkastellusta vedystä kolmen sidoksen päässä olevien vetyjen lukumäärä. Esimerkiksi etanolin kohdalla *CH3-ryhmän viereisten vetyjen määrä on 2 (CH2): 2+1=3. NMR-spektrissä näkyy siis tripletti. *CH2-ryhmän viereisten vetyjen määrä on 3 (CH3, OH jätetään huomiotta): 2+1=4. Nähdään siis kvartetti. *OH-ryhmän viereisten vetyjen määrä on 0 (CH2 jätetään huomiotta): 0+1=1. Nähdään siis singletti. ==13C NMR- spektrit== Orgaanisten yhdisteiden 13C NMR-spektreissä näkyy J-kytkeytymistä toisiinsa suoraan sitoutuneiden 1H- ja 13C-ydinten välillä. 13C välistä suoraa, geminaalista tai muuta kytkeytymistä ei havaita 13C isotoopin harvinaisuuden takia. On siis tilastollisesti epätodennäköistä että signaalin antavan 13C-ytimen vieressä (tai muualla läheisyydessä) olisi toinen 13C, jonka kanssa ydin kytkeytyisi ja täten signaali jakautuisi multipletiksi. Ytimen vieressä on todennäköisemmin 12C, jonka I=0, eli ydin ei näy NMR:ssä eikä 13C voi myöskään kytkeytyä sen kanssa. 13C NMR-spektreissä 13C välistä kytkeytymistä tapahtuu, mutta se on niin vähäistä että signaaleita ei nähdä spektreissä. Kytkeytyminen tosin muuttuu havaittavaksi jos näytemolekyylit tarkoituksellisesti tehty pääosin 13C-ytimistä eli rikastettu niillä. ==Irrottaminen== Irrottaminen (eng. decoupling) tarkoittaa tiettyjen J-kytkeytymisten poistamista. 13C NMR-spektristä voidaan poistaa 1H kytkeytymiset, jolloin 13C-signaalit näkyvät orgaanisten yhdisteiden spektreissä singletteinä muiden multiplettien sijaan. 13C-spektriä, josta on irrotettu 1H-ytimet, kutsutaan 13C{1H} NMR-spektriksi. Nimeämiskäytäntö pätee muihinkin spektreihin: 13C{1H, 19F}, 31P{1H} jne.Macomber, s. 191 Irrottamisen pyrkimyksenä on usein yksinkertaistaa muuten monimutkaisia spektrejä. Tämä helpottaa spektrien tulkintaa.Levitt, s. 91 Signaalin saantiin käytetyn magneettikentän B1 lisäksi yksinkertaisimmissa kaksoisresonanssi- irrottamismenetelmissä näytteeseen kohdistetaan toinen magneettikenttä (B2) jonka avulla irrottaminen tapahtuu. ==Integraalit== Yleensä NMR-spektrissä kunkin multipletin pinta-alat lasketaan integroimalla tietokoneella ja ilmoitetaan spektrissä jollain tapaa. Usein pinta-alat ovat likimain verrannollisia multipletin antamien ydinten suhteelliseen lukumäärään ja spektrin voidaan sanoa olevan kvantitatiivinen. Määrät ovat suhteellisia ja siksi esimerkiksi dietyylieetterin 1H-spektrissä CH3-signaalin pinta-ala on noin 1.5 ja CH2:n ~1. Etanolin 1H-spektrissä CH3:n pinta-ala on noin 3, CH2:n ~2 ja OH:n ~1. Pinta-alat eivät silti aina kerro ydinten lukumääristä muun muassa ytimen Overhauser-ilmiön takia (eng. nuclear Overhauser effect, NOE). NOE voi voimistaa tai heikentää piikkien intensiteettejä suhteessa niiden odotettuun intensiteettiin.Macomber, s. 198 Ilmiötä havaitaan 13C-spektreissä, muttei juurikaan 1H spektreissä. Tämä johtuu eri 13C-ydinten hyvin eriävistä relaksaatioajoista suhteessa 1H-ytimiin.Macomber, s 62 Siten integrointia ei juuri käytetä 13C-spektrien käsittelyssä. ==NMR-spektrometri== ===Magneetti=== NMR-spektrometrit koostuvat useista kuorista. Laitteen keskellä on sen pystysuunnassa läpäisevä ontto putki.Levitt, s. 65-71 Putkea ympäröivässä sisimmässä kuoressa on noin -269 °C heliumnestettä, johon on upotettu sisäputken ympärille solenoidiksi kierretty suprajohde. Johteessa kiertävä tasavirta tekee siitä sähkömagneetin, joka aiheuttaa laitteen sisä- ja ulkopuolelle voimakkaan magneettikentän B0. Solenoidi menettää suprajohtavuuden jos helium ei jäähdytä sitä. Toimintavalmiissa NMR-laitteen käämissä kiertää siis sähkövirta lähes loputtomiin ilman ulkoista sähkönsyöttöä. Useimmissa laitteissa heliumia on 40–100 litraa. B0 vahvuus on usein 4–20 T, mutta voi olla jopa 32 T. Mitä vahvempi kenttä on, sitä nopeammin ydinsignaalit saadaan erottumaan kohinasta (katso Mittaus-sarake), sillä mitattujen signaalien intensiteetti on likimain verrannollinen B0 neliöön.Macomber, s. 24-26 Heliumkuori on eristetty sitä ulommasta kuoresta ja laitteen sisimmästä putkesta tyhjiöllä, jotta heliumiin ei pääse johtumalla lämpöä (vertaa termospulloon). Eristeittä helium kiehuisi pian pois. Tyhjiötä ympäröivässä kuoressa on noin -196 °C typpinestettä. Tämäkin kuori on eristetty ulkopuolelta tyhjiöin. Helium ja typpi haihtuvat hitaasti ja laitteen yllä on siksi varoventtiilit. Nämä päästävät ylimääräisen kaasun pois. Joskus laitteiden oheen on rakennettu niistä erillinen järjestelmä, jolla uusiutumaton helium kerätään ja kierrätetään taas nesteeksi. Yllä on myös täyttöaukot kylmänesteille. Haihtumisen takia säiliöihin lisätään kylmänesteitä säännöllisesti. Heliumia lisätään laitteesta riippuen esim. 1–2 viikon välein ja typpeä 5–6 kuukauden välein. ===Ilmaisin=== Sisimpään putkeen on asetettu laitteen pohjasta tutkittavalle ytimelle ja sen tutkimusmenetelmälle sopiva ilmaisin (eng. probe). Ilmaisin on usein vaihdettavissa ja siinä on ainakin yhdet vastakkaiset ja toisiinsa johtimin kytketyt käämiparit, joiden väliin näyte asetetaan spektrometrin yläosasta. Nestenäytteitä sisältäviä lasiputkia yleensä pyöritetään mittauksen aikana pystysuuntaisesti ilmaisimessa noin 10–100 Hz taajuudella. Magneettikenttä ei ole näytteen kohdalla täysin tasalaatuinen, joten pyöritys vähentää spektrin näytesignaalien levenemää eli ne erottuvat paremmin toisistaan. ===Näyte=== 1H-spektriä nesteestä mitattaessa jopa alle 1 µg näytettä voi uusissa laitteissa riittää nestenäytteen valmistukseen. 13C-spektrin kohdalla näytettä vaaditaan usein muutama milligramma. Erityisen hyvillä laitteilla vaaditut määrät voivat kuitenkin vastaavasti olla vain muutamia nano- ja mikrogrammoja. Näyte on liuotettuna sopivaan deuteroituun liuottimeen kuten CDCl3, CD3OD tai DMSO-d6. Näiden 2H-signaalit eivät häiritse 1H-mittausta.Lambert, s. 33-36 pienoiskuva|230px|Nestemäinen näyte NMR-näyteputkessa. Kiinteiden aineiden mittauksessa käytetään usein MAS NMR-spektroskopiaa (eng. magic angle spinning), jossa näyte asetetaan mittauksen ajaksi maagiseen kulmaan 54.74° (≈ arc cos √2) pyörimään jopa 70 kHz taajuudella. Kiinteissä ydinten ja elektronien vuorovaikutukset ovat vahvempia ja monimuotoisempia kuin nesteissä ja MAS:n käyttö vähentää niiden havaittua vaikutusta. Vuorovaikutukset mm. leventävät spektripiikkejä.Levitt, s. 527 Näyte mitataan usein huoneenlämmössä, mutta lämpötilaa voidaan myös muuttaa sopivin laittein. ====Standardit==== Muun muassa nestenäytteissä standardiainetta saatetaan lisätä mitattavan näytteen joukkoon pieni määrä eli se on sisäinen standardi. Standardeja on monia ja yksi 1H-ydinten mittauksissa usein käytetty standardi on tetrametyylisilaani (TMS). TMS:ää käytetään sisäisenä standardina myös 13C-mittauksissa. TMS ei ole vesiliukoinen, joten jos näyte on liuenneena usein käytetyn deuteroidun kloroformin sijaan vaikka deuteroituun veteen (D2O), käytetään standardina usein vesiliukoista DSS:ää eli 4,4-dimetyyli-4-silapentaani-1-sulfonihappoa. 31P-mittauksissa standardi on usein fosforihappo (H3PO4), joka voi kuitenkin reagoida näytteen kanssa. Siksi nestenäytteiden 31P-mittauksessa se lisätään esimerkiksi NMR-näyteputkiin sisälle pieneen kapillaariputkeen erilleen muusta näytteestä, eli se on ulkoinen standardi. CCl3F käytetään usein 19F-mittauksissa; (CH3)4NI (tetrametyyliammoniumjodidi), NH3 tai CH3NO2 käytetään usein 15N-mittauksissa. ===Lukitseminen=== NMR-spektrometrin magneettikentän B0 voimakkuus muuttuu aikaa myöten. Tätä ilmenee mittauksen aikana, jolloin spektrin signaalit levenevät. Signaalien erottumisen parantamiseksi B0 lukitaan (eng. locking). Nestenäytteiden kohdalla lukitseminen suoritetaan usein siten, että näytteen deuteroidun liuottimen 2H-signaalia mitataan jatkuvasti ja verrataan laitteessa olevassa oskillaattorissa tuotettuun vakiotaajuuteen. Näiden taajuudet muutetaan ennen mittausta puoliautomaattisesti samoiksi eli lukitaan. Kun B0 muuttuu mittausten aikana, muuttaa laitteisto automaattisesti takaisinkytkennän avulla näytteeseen kohdistuvaa kokonaiskenttää toisen magneettikentän tuottavin keloin siten, että kokonaiskenttä B0 pysyy samana. Lukkosysteemi on tietyssä mielessä jatkuva NMR-mittaus, joka suoritetaan samanaikaisesti varsinaisen mittauksen ohella. Lukkosignaalin ydin ei voi olla sama kuin mitattava ydin. Deuteriumsignaalia käytetään 1H sijaan koska 1H-signaaleita muutetaan mittauksen aikana. Kiinteiden näytteiden mittauksessa lukkosignaalin antava signaali on usein ulkoinen eli se ei ole kiinteän näytteen joukossa. ===Shimmaus=== Magneettikenttä B0 ei ole kaikissa näytteen kohdissa täysin tasalaatuinen eli kemiallisilta ympäristöiltään samanlaiset ytimet kokevat sen eri vahvuisina. Siten niiden Larmorin taajuudet ja ppm- arvot ovat eri. Pienetkin eriävyydet kentässä leventävät spektripiikkejä ja aiheuttavat sivupiikkejä (eng. spinning sidebands).Lambert, s. 37-39 Kentän eriävyydet johtuvat monista seikoista kuten NMR-spektrometrin valmistuksessa siihen jääneistä epätasalaatuisuuksista ja mitattavasta näytteestä. Täysin tasalaatuista kenttää ei ole mahdollista tuottaa teknisistä syistä, mutta sitä voidaan pyrkiä tasalaatuistamaan.Levitt, s. 298 Ilmaisinta ympäröivät useat erilliset shimmauskelat. Kelojen ympärille luodaan magneettikenttiä johtamalla niihin tasavirtoja, joiden jännitesäätöä sanotaan shimmaukseksi (eng. shimming). Shimmauksessa heikennetään tai vahvistetaan B0-kenttää paikoitellen tarpeen mukaan, jotta se saadaan kyllin tasalaatuiseksi näytteen kohdalta. Shimmauskelat ovat usein magneetissa ja ne ovat resistiivisiä. Suprajohtavia shimmauskeloja voi olla myös sisäänrakennettu nesteheliumsäiliöön. Shimmaus tehdään puoliautomaattisesti toistuvasti kokeilemalla, kunnes on saatu kyllin tasalaatuinen kenttä. Shimmaus tehdään joka näytteen kohdalla erikseen ennen varsinaista mittausta, sillä näytteiden ja näyteputkien eriävät magneettiset ominaisuudet muuttavat B0-kenttää näytteen kohdalta. Shimmaus tulee englanninkielen sanasta shim. Sanalla tarkoitettiin diamagneettisia metallipaloja, joita siirtelemällä tasalaatuistettiin varhaisten NMR- spektrometrien magneettikenttiä, joissa ei ollut sähkösäätöisiä keloja. ===Virittäminen ja sovittaminen=== Ilmaisimen käämeihin tulee duplekserin kautta lyhytkestoinen ja taajuudeltaan ja muuttuva vaihtovirtapulssi. Tämä aiheuttaa NMR-signaalin muodostumiseen johtavan muuttuvan B1 magneettikentän. Käämiparin välissä on niiden virittämiseen (eng. tuning) käytetty kondensaattori, jolla on kapasitanssi CT (faradi). Käämeillä on induktanssi L (henry). Käämit on rakennettu siten, että ne toimivat LC-värähtelypiirinä kulmataajuudella ωLC (rad s−1)Levitt, s. 70-72 \omega_{LC}=(LC_T)^{-1/2} CT säädetään puoliautomaattisesti siten, että värähtelypiiri vastaa likimain duplekserilta tulevan sähkösignaalin kulmataajuutta ωdup eli ωLC ≈ ωdup. Tätä kutsutaan virittämiseksi ja se tehdään aina mitattavaa näytettä vaihdettaessa. Värähtelypiiri vahvistaa duplekserilta tulevan taajuuden amplitudia ja voimistaa siten käämien tuottamaa ytimiin kohdistuvaa B1-kenttää. Virransyötön loppuessa B1 lakkaa ja käämeihin ytimiltä tuleva niiden Larmorin kulmataajuuksista koostuva signaali vastavuoroisesti voimistuu piirissä, jonka taajuus vastaa likimain myös ydinsignaalien taajuuksia. Täten näytteestä tuleva heikko signaali vahvistuu. Värähtelypiiriin vievässä johtimessa duplekserin jälkeen on myös sovittamiseen (eng. matching) käytetty kondensaattori, jonka kapasitanssi on CM. Kapasitanssia säädetään, jotta käämeiltä näytteeseen tuleva ja näytteestä sitten käämeille tulevan sähkösignaalin energia saadaan maksimoitua.Levitt, s. 35 ===Mittaus=== Mitattavalle ytimelle ja spektrometrin ilmaisimelle valitaan sopiva pulssiohjelma. Tämä on NMR-laitteistoon kytketyn tietokoneen ohjelmiston tulkitsema koodinpätkä, jonka arvoja eli parametrejä määritetään halutusti. Valmisteluiden (mm. lukitseminen, shimmaus, virittäminen ja sovittaminen) jälkeen ydinten resonanssi mitataan pulssiohjelman ja sen parametrien määrittämällä tavalla. Vaihtovirtapulssi(t) kulkee (kulkevat) kaapelistoa pitkin vahvistimien kautta duplekserille. Ytimet antavat analogisen signaalin, joka kulkee duplekserista toiseen kaapelistoon ja siinä oleviin vahvistimiin. Näistä signaali kulkee lopulta A/D-muuntimille. Näissä digitoitu signaali tallennetaan tietokoneelle.Levitt, s. 73-77 Mittaus toistetaan useasti, jotta heikoista ja ei-satunnaisista ydinsignaaleista saadaan vähennettyä satunnaista kohinaa. Kohina on lähtöisin lähinnä ilmaisimen käämien elektronien lämpöliikkeestä ja osin näytteen varautuneiden hiukkasten kuten ionien lämpöliikkeestä. Lopuksi digitoitu raakasignaali muutetaan NMR-spektriksi Fourierin muunnoksella. Muitakin matemaattisia muutoksia usein tehdään.Levitt, s. 86 Toistuvien mittausten takia koko mittaus voi kestää jopa päiviä riippuen mm. mitatusta ytimestä, molekyylistä, näytepitoisuudesta ja käytetyistä mittausmenetelmistä. 1H mittaus vie harvoin yli tunnin. 13C mittauksia tulee 13C-ydinten harvinaisuuden takia toistaa useammin kuin 1H-ydinten kohdalla, jolloin mittaus voi kestää useita tunteja.Lambert, s. 45 Mittausten välissä tulee odottaa, jotta ytimet ehtivät T2-relaksoitua (katso Relaksaatio-sarake). 1H kohdalla mittaus voidaan usein toistaa 4 sekunnin välein.Macomber, s. 39 ===Vaarat ja huomiot=== Toimintavalmiin NMR-spektrometrin ympärillä on aina magneettikenttä. Siksi kyllin lähellä laitetta sydämentahdistimet tai muut elektroniset implantit voivat häiriintyä. Ferromagneettiset implantit voivat vetäytyä kohti laitetta vahingoittaen tai tappaen henkilön, jolla niitä on. Ferromagneettiset esineet voivat lentää kohti laitetta tai vetää niitä pukevan henkilön kohti laitetta. Muuttuva magneettikenttä voi myös kuumentaa näitä esineitä aiheuttamalla niihin pyörrevirtoja. USB-tikuissa, maksukorttien magneettiraidoissa ja muissa tallennuslaitteissa olevat tiedot voivat tuhoutua lähellä kenttää. Magneettikenttä ei silti itsessään ole vaarallinen ihmisille. Suprajohteen varaus voi purkautua, jolloin sen magneettinen energia muuntuu lämmöksi. Tämä kuumentaa johteen saaden siten nesteheliumin ja -typen kiehumaan nopeasti kaasuksi. Ilmiön nimi on englanniksi quench. Kaasu purkautuu laitteesta ulos ja täyttää NMR-mittaushuoneen syrjäyttäen ilman happea. Huoneesta on poistuttava heti sillä kaasu voi tukehduttaa huoneessa olijat. Huoneessa on siten myös hyvä olla kunnon ilmanvaihto. Suprajohteen purkautuminen voi olla vahinko tai tarkoituksellinen teko. Jälkimmäisessä pyrkimyksenä voi olla esimerkiksi ferromagneettisen kappaleen ja magneetin väliin jääneen henkilön vapauttaminen. Nestetyppi ja -helium voivat aiheuttaa vakavia paleltumia – erityisesti spektrometrin jälleentäytössä. ==Katso myös== *Infrapunaspektroskopia *Massaspektrometria *Röntgenkristallografia ==Lähteet== * * * * ===Viitteet=== == Aiheesta muualla == Luokka:Spektroskopia