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user: 4. 毛状根组织在植物修复研究中的应用 目前毛状根组织在农业领域重金属污染物的富集，工业领域酚醛、染料和PCBs污染物的去除，军事领域TNT和放射性核素污染物的降解，医药领域抗生素污染物的消除等方面都有应用，并且取得了较好的研究进展。 4.1. 毛状根在农业重金属污染物富集研究中的应用 与有些污染物可以完全被植物降解不同，土壤中的重金属是不能被化学或生物降解的，而植物吸收 Table 1 Induced hairy root tissue used in phytoremediatio 污染物的种类 应用于污染修复的毛状根 作者及时间 重金属 褐脉少花龙葵(Solanum nigrum L. var pauciflorum) 施和平等(2010) [ 15 ] 镉 黄瓜(Cucumis sativus L.) 张艳等(2007) [ 16 ] (2009) [ 17 ] 三叶鬼针草(Bidens pilosa) 谌金吾等 (2005) [ 18 ] 油菜(Brassica campestris L.) 李晓丽等 (2015) [ 19 ] 白花曼陀罗(Datura metel L.) 王凤英等 (2014) [ 20 ] 裂叶沙参(Adenophora lobophylla) Wu et al. (2001) [ 21 ] 泡沙参灯花草(Adenophora potaninii) Wu et al. (2001) [ 21 ] 伯士隆庭荠(Alyssum bertolonii) Boominathan et al. (2003) [ 22 ] 天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens) Boominathan et al. (2003) [ 22 ] 南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata) 施和平等(2012) [ 37 ] 镍 番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) Gonzalez PS et al. (2008) [ 26 ] 伯士隆庭荠 Boominathan et al. (2003) [ 22 ] 天蓝遏蓝菜 Boominathan et al. (2003) [ 22 ] 锌 Alyssum murale Vinterhalter B et al. (2008) [ 34 ] Berkheya coddii Boominathan Ret al.(2004) [ 35 ] 龙葵(Solanum nigrum) Subroto MA et al. (2007) [ 36 ] 烟草(Nicotiana tabacum L.) Ibanez SG et al. (2011) [ 27 ] Talano MA et al. (2010) [ 50 ] Sosa Alderete LG et al. (2009) [ 47 ] (2012b) [ 48 ] (2012a) [ 49 ] 甜菜(Beta vulgaris) Singh S et al. (2006) [ 9 ] 萝卜(Raphanus sativusL.) Singh S et al. (2006) [ 9 ] 酚类化合物 胡萝卜(Daucus carota L. var. sativa Hoffm.) Santos de Araujo B et al. (2006) [ 28 ] 甘薯(Ipomoea batatas) Santos de Araujo B et al. (2004) [ 29 ] 澳洲茄(Solanum aviculare) Santos de Araujo B et al. (2004) [ 29 ] 金盏花(Calendula officinalis L.) Morita M et al. (2001) [ 24 ] 欧洲油菜(Brassica napus L.) Coniglio MS et al. (2008) [ 51 ] Gonzalez PS et al. (2012a) [ 46 ] Agostini E et al. (2003) [ 6 ] 番茄 Gonzalez PS et al. (2006) [ 45 ] Gonzalez PS et al. (2008) [ 26 ] 含氮染料 金盏花 Morita M et al. (2001) [ 24 ] Patil P et al. (2009) [ 30 ] 芥菜(Brassica juncea) Telke AA et al. (2011) [ 31 ] 孔雀草(Tagetes patula L.) Telke AA et al. (2011) [ 31 ] 颠茄(Atropa belladonna) Morita M et al. (2001) [ 24 ] 表1. 已诱导出用于植物修复技术的毛状根组织 Continued 代谢重金属的机制差别很大 [ 32 ] 。因此毛状根主要被用于研究植物对重金属的耐受和摄取机制、筛选超富集植物与农药脱毒等方面。 4.1.1. 利用毛状根开展的植物超富集和耐受重金属机制的研究 毛状根已经被证明是研究超累积植物在重金属吸收、累积和耐受方面的有效工具以及重要的生理学和生物化学模型生物 [ 33 ] 。Boominathan R和Doran PM通过镉超富集植物遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)、镍超富集植物伯士隆庭荠(Alyssum bertolonii)的毛状根研究重金属的吸收和分布，发现遏蓝菜和伯士隆庭荠的毛状根在高浓度的镉或镍中能够健康生长，遏蓝菜毛状根可以吸收约13%的镉，并且遏蓝菜和模式植物烟草(Nicotiana tabacum L.)毛状根中的绝大部分镉存在于细胞壁上；伯士隆庭荠毛状根可以吸收28%的镍，但伯士隆庭荠和烟草毛状根中85/95%的镍与合胞体有关。同时他们发现在细胞膜H-ATPase抑制剂DES (diethylstilbestrol)存在的情况下遏蓝菜和烟草毛状根的鲜重显著减少；DES的处理使遏蓝菜毛状根合胞体中镉的浓度以及根的保留能力增加了6倍，而在伯士隆庭荠毛状根合胞体中镍的保留量和跨膜转运却减少了。这些结果显示在遏蓝菜毛状根中镉的耐受和超富集的机制能够耐受细胞膜的去极化效应，而镍耐受和超富集植物伯士隆庭荠的毛状根却不能 [ 22 ] 。Vinterhalber B等发现Alyssum murale的毛状根具有高浓度镍耐受能力且能达到干重24，700 μg∙g −1 [ 34 ] 。在证明了庭荠属的毛状根能够超富集累积镍以后，这个物种的毛状根就开始作为模式生物应用于研究如何从收获的植物中提取丰富的镍；这一方法也适应于从采矿区附近的植物中收获富含重金属的植物材料 [ 35 ] 。Subroto等通过龙葵(Solanum nigrum)毛状根研究了锌的提取和累积，发现A4和K1这两种菌株诱导的毛状根都能够在含有13.98 mg∙l −1 锌的培养基中生长，并且在15~18天的培养周期里对锌的累积率依次达到98%和90% [ 36 ] 。施和平等通过外源添加钙对镉胁迫下南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)毛状根的生长、抗氧化酶活性和镉吸收效应的研究发现，Cd和10~30 mmol∙l −1 钙组合培养可促进毛状根生长，提高毛状根中可溶性蛋白的含量，降低根中丙二醛(Malondialdehyde， MDA)含量，并且抑制毛状根的过氧化物酶(Peroxidase， POD)活性及超氧化物歧化酶(superoxidedismutase， SOD)活性 [ 37 ] 。Wu等把裂叶沙参(Adenophora lobophylla)和泡沙参灯花草(Adenophora potaninii)的毛状根对镉的反应做了一个系统的比较，发现这两个密切联系的物种可能应用不同的镉脱毒策略，前者能够合成高水平的植物螯合肽(phytochelatin， PC)，而后者有一个镉排出系统 [ 21 ] 。王凤英等发现白花曼陀罗(Datura metel L.)再生植株及毛状根具有很强的耐重金属镉的能力，其中毛状根对重金属镉的耐受力比再生植株的要强，这为今后利用具有生长能力强、根系发达的白花曼陀罗毛状根再生植株来提高对重金属镉污染的环境进行植物修复奠定了前期的工作基础和提供了可能性 [ 20 ] 。另外，镉对植物生长、根的形态和侧根发生及其毒害的影响具有浓度剂量效应和因植物类型而异 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] 。张艳等液体培养黄瓜(Cucumis sativus L.)毛状根时发现，培养液中的镉浓度小于10 mg∙l −1 l时能促进毛状根生长，镉浓度大于15 mg∙l −1 则抑制黄瓜毛状根的生长 [ 17 ] 。施和平等的研究发现，镉浓度小于50 μmol∙l −1 时几乎不影响褐脉少花龙葵(Solanum nigrum L. var pauciflorum)毛状根的生长，甚至还能略促进生长；镉浓度大于100 μmol∙l −1 即高浓度镉会抑制毛状根的生长，且浓度愈高抑制作用愈明显 [ 15 ] 。 4.1.2. 毛状根在植物转基因改造研究中的应用 重金属超富集植物是植物修复技术的关键，目前已发现的重金属超富集植物国内外共约450余种，其中镍超富集植物最多，约320种；铜超富集植物34种；锌超富集植物18种 [ 38 ] 。目前超富集植物要真正大规模应用于实际污染土壤的修复，还需要进一步提高其对重金属的特异性吸收和富集的能力。转基因技术的发展为超富集植物的基因改造提供了广阔的空间。理论上，凡是参与重金属吸收、转运等过程的基因均可作为目的基因在超富集植物中表达，并介导对重金属污染土壤的修复。因此在重金属耐受途径和基因调控研究的基础上利用转基因技术表达与重金属耐受或积累有关的关键基因以进一步提高超富集植物的修复能力是目前植物修复领域的热点，而毛状根体系可以成为开展转基因改造研究的实验平台。 目前对超富集植物的基因改造主要围绕生产金属螯合肽或复合物基因的改造，如金属硫蛋白(metallothionein， MT)和植物络合素的相关基因改造，异源基因MT的改造，以及对金属离子运载蛋白基因改造方面改造。已有不少文献报道了利用毛状根体系开展的转基因改造工作，如曹庆丰和慕平利等分别在黄瓜毛状根和烟草毛状根中转入GFP基因，探究外源基因在毛状根中的遗传稳定性 [ 39 ] [ 40 ] ；杨致荣等探究了转GUS长春花(Catharanthus roseus)毛状根体系的构建；张晓军探究了转rol基因杨树(Populus L.)毛状根生长状况的改变 [ 41 ] [ 42 ] 。刘静轶开展的应用转基因IRT1油菜(Brassica campestris L.)毛状根对镉吸附的研究表明，野生型和转IRT1基因的毛状根都能有效富集培养基中的镉；在不同浓度的镉环境下，转入了IRT1基因的毛状根比野生型毛状根的生长状况更好，对镉的富集量更高 [ 43 ] 。 4.2. 毛状根在工业污染物去除研究中的应用 在工业领域污染物的降解方面，利用毛状根进行研究的物质主要包括酚类化合物、含氮染料和PCBs。 4.2.1. 毛状根在酚类化合物去除中的应用 酚类是最主要的有机污染物之一，酚类污染物能够通过杀虫剂的应用和芳香族有机污染物的部分降解进入环境中。它们能够对人体健康产生威胁，甚至产生致命或致畸的影响。近年来，植物修复技术已经成为酚类污染物脱毒的有利手段；在某些情况下也用于检测植物耐受高水平酚类的能力。例如通过筛选一些植物物种如芥菜(Brassica juncea)、甜菜(Beta vulgaris)、萝卜(Raphanus sativus L.)、印楝(Azadirachta Indica A. Juss)等发现芥菜对酚类的去除表现出了极大的潜能 [ 6 ] [ 9 ] 。研究者继而研究了不同植物物种的毛状根对苯酚和氯酚的敏感性，发现装饰性植物澳洲茄(Solanum aviculare)的毛状根对于这些污染物的修复具有最大效率 [ 28 ] 。此外，来自芥菜、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)、烟草、胡萝卜的毛状根都被成功地应用于去除水体中的酚类和2，4-DCP (2，4-Dichlorophenol)，并且研究者还对过程中的影响因素如pH、温度、共基质的浓度、处理时间都进行了优化 [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] 。更重要的是，毛状根能够连续高效地去除含酚化合物，但其降解产物往往不同，这就预示着异生型生物分子的转化模式与植物物种有关。另外，最终降解产物的毒性是需要阐明的另一个重要特征，因为植物修复转化为非毒性的物质具有偏爱性，毛状根能够帮助研究者进行这样的研究。 植物代谢污染物的能力取决于同化酶的生化特征和其他能够延长组织寿命的保护机制，像过氧化物酶(Peroxidase， Px)同工酶具有底物偏爱性，对酚类化合物的催化效率也不同，从这层意义上来说，毛状根的培养为与污染物代谢有关的酶提供了有用的信息。油菜毛状根被用来研究酸性氧化酵素在2，4-DCP和酚类化合物去除过程中的作用；来自番茄毛状根的基本氧化酵素同工酶极有可能与2，4-DCP和分子化合物的去除有关，烟草毛状根也具有相同的效果 [ 6 ] [ 8 ] [ 26 ] [ 44 ] 。众所周知，在酚类的去除过程中，Px能够被3个明显的机制灭活；然而通过应用番茄毛状根的Px同工酶显示，添加保护性化合物聚乙二醇(Polyethylene glycol， PEG)能够减少聚合物吸附到酶的活性位点，增加活性酶的寿命并且增加酚类化合物的去除效率，保持处理后Px的活性 [ 26 ] 。值得注意的是，建立和理解污染物降解相关酶的机制研究是非常重要的，而利用毛状根能够筛选和大量生产应用于降解污染物的酶。人们研究了胡萝卜、甜薯(Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill)毛状根降解酚类、苯邻二酚醛的动力学机制以比较它们对酚类脱毒的能力，得出了的结论是毛状根可以作为Px同工酶的酶源。利用毛状根获得的一些纯化或部分纯化的酶可以作为有害酚类修复的高效催化剂。此外，在进行酚醛去除的基础实验时，其产生成本是要考虑的。因此，使用植物材料，像根组织作为酶源即可形成一种好的替代品。在这层意义上，毛状根是一类具有广阔前景的系统，它们能够生产和释放像Px一样的酶，去除像酚类一样的有机污染物。另外，毛状根也为污染物与组织之间的接触提供了一个更大的表面积，可以应用于生物反应器大规模地去除酚类 [ 29 ] [ 49 ] [ 50 ] 。 4.2.2. 毛状根在含氮染料去除中的应用 近年来，有超过2000种的不同含氮染料应用于不同的材料染色，如纺织品、皮革、塑料、化妆品和食品。这些工业生产的化学品都是异型生物质，都对生物降解过程都有抵抗能力。通过植物去除纺织染料的污染是植物修复中最易忽视的一个领域，而利用毛状根对探索酶的状态和染料的代谢产物极有助益。金盏花(Calendula officinalis L.)毛状根是从其他植物毛状根培养物中筛选出来的、应用于活性红198脱色最好的模式生物，能够去除浓度高达100 mg∙l −1 的活性红198 [ 30 ] 。它能够成功地应用于至少5个连续的脱色循环，并且也可以应用于其他染料的脱色，像甲基橙。近期Telke等证明芥菜的毛状根也具有为纺织染料脱色的高潜能，它要比孔雀草(Tagetes patula L.)毛状根为甲基橙脱色的效率更强，能够在4天里脱色92% [ 31 ] 。应用植物或毛状根为纺织染料脱色与细胞内的酶有关，像漆酶、木质素过氧化酶、酪氨酸酶和NADH-DCIP还原酶 [ 30 ] [ 52 ] 。在2011年有人报道了从芥菜毛状根中提取细胞内漆酶应用于纺织染料的去除 [ 31 ] ；并且提取出的漆酶的脱色效率因不同氧化还原剂的存在而不同，其中ABTS(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)具有最高的催化效率。这些结果从另外一个方面证明了毛状根或植物修复的另一个优势是从可以根的分泌液中提取酶和相关化合物应用于有害物质的脱毒或隔绝。 4.2.3. 毛状根在PCBs污染物降解中的应用 PCBs是异型含氯芳香族化合物，应用于很多领域，包括电路板、杀虫剂、粘合剂、除尘剂、除油剂、火焰缓凝剂、热量转换器、液压机密封剂等等，当地生产、使用、溢出及不正当处理都会导致环境污染。PCBs能够在有机体的脂肪组织和组成生态系统的几乎每一个部分中被检测到。因此利用植物修复去除环境中的PCBs极为重要 [ 53 ] 。2001年，Morita等人发现颠茄(Atropa belladonna)毛状根能够吸收和有效地分解大量的PCBs和二恶英，提出了一种低成本的处理方法并获得了专利 [ 24 ] 。 理解PCBs这些化合物的代谢机制对于有效地提高植物对其的修复能力至关重要。研究者利用近40种植物品种的体外组织培养物开展了PCBs的代谢机制研究，这些研究主要使用的是一种叫Delor103的商业模式污染物，它由59种PCB同源化合物构成，平均每个联苯有3个氯原子 [ 54 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] 。在降解PCBs时，毛状根比愈伤组织表现出更强的潜能，如龙葵毛状根，SNC-9O，是目前代谢PCBs能力最高的植物组织 [ 66 ] 。根据Sandermam提出的绿色肝脏模型 [ 58 ] ，使用龙葵毛状根，人们发现活化的PCBs的转化代谢产物随着PCBs分子的碳原子数的增加而减少 [ 59 ] [ 60 ] 。另外，人们还发现不同的植物品种，甚至不同植物组织对代谢不同的PCBs同分异构体也有不同的潜能。 4.3. 毛状根在军事领域污染物转化研究中的应用 4.3.1. 毛状根在放射性核素污染物积累中的应用 超累积植物的毛状根也应用于研究植物根中放射性核素的提取和累积的生理学。芥菜和苋色藜(Chenopodium amaranticolor)的毛状根通过一小段时间的孵化可以从浓度高达5000 μM的污水中去除铀，无磷酸盐存在时去除效率接近86%，而添加磷酸盐后去除效率可以达到98% [ 23 ] 。另外有文献描述了辣根(Armoracia rusticana)毛状根累积铀的能力，发现磷酸盐的存在对辣根毛状根的生长和污染物的累积有刺激作用 [ 63 ] 。有人利用胡萝卜毛状根提出了一种用于确定铀毒性临界值的试验，这一实验有助于研究在控制变量的情况下铀在根中的毒性和分布；它也应用于检测进一步的生理学过程如应激酶、基因材料、脂质过氧化反应效应以及微生物相互作用的影响 [ 64 ] 。 4.3.2. 毛状根在爆炸性化合物TNT降解中的应用 爆炸性化合物具有严重的环境污染风险，爆炸性化合物的植物修复是减少环境污染水平的另一个重要领域。TNT是一种常见的环境污染物，具有分布广、滞留时间长的特点。目前人们主要研究了植物转移爆炸性化合物的能力，毛状根尤其在阐明硝基衍生物转化途径方面做出了贡献。例如，研究者发现小长春花毛状根是一种能够吸收、转化TNT为二硝基苯胺衍生物的体外培养物；进而他们使用小长春花(Vinca minor L.)毛状根开展了关于硝基衍生物转化产物、化学本质、转化顺序的基础研究 [ 26 ] [ 65 ] 。由于毛状根是无菌培养，获得的所有结果都代表了植物根系降解TNT的潜能，而不包括任何与某些重要微生物或生物体系的关系。这些结果可以延伸到整个植株上去，因为众所周知植物代谢物光谱与植物细胞培养在原则上是一致的，尽管数量上可能会有不同。然而就实际应用而言，需要进一步在真实情况下开展体外实验。研究人员通过比较不同植物种系转化TNT的结果发现，TNT和其衍生物的最终去向会因植物种系的不同而不同，降解产物的浓度也不同，这揭示了TNT的代谢是由不同的酶系控制的，它们在不同植物种系中有不同的基质特异性。这些发现表明筛选和研究不同植物种系降解TNT能力十分重要 [ 14 ] 。另外，有科学家使用辣根毛状根作为模式生物探索了DNT、TNT、ADNTs、DANTs爆炸物在植物体内的代谢途径，并且研究了这些污染物对与其代谢有关的像GST、Px等物质的活性的影响，由此他们认为硝基苯胺衍生物能够对植物造成巨大压力，导致植物产生强烈的防御反应 [ 66 ] 。 所有的这些利用毛状根开展的与TNT转化途径有关的研究都有助于理解其吸收与去除的动力学。更重要的是这些发现为研究TNT转化途径的基因学和生化方法打开了一扇大门。然而关于最终产物的毒性和其对生态系统的影响还有待研究。 4.4. 毛状根在医药领域污染物消除研究中的应用 人们在水环境和饮用水中检测到了药品及其代谢物；然而，人们却很少了解药品在植物中的去向和毒性。同时基于生态毒理学的研究，扑热息痛、抗生素这样的药物是对水生生物有害的。扑热息痛是一种广泛应用的退烧药，其主要代谢产物扑热息痛葡萄糖苷是一种不能溶解且结合残留物的前体，可与细胞壁的木质素部分相连接，使这些异生型化合物以一种稳定的、不能降解的形式存在。有科学家以山葵毛状根作为模式生物，在植物组织中研究了扑热息痛的去向和代谢途径 [ 61 ] 。这一结果标志着研究植物体内扑热息痛去向的开始，也为用植物学方法从废水中去除药品提供了新观点。太阳花(Helianthus annuus)毛状根及其渗出液能够催化四环素和氧四环素在废水培养基中的快速降解，证明了这些毛状根具有体外修复这两种抗生素污染的潜能 [ 62 ] 。