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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 2.1.1. 实验动物 BALB/c小鼠45只，清洁级，6周龄，雄性，购自山东大学实验动物中心。 2.1.2. 实验试剂 淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技责任有限公司) 胰酶-EDTA(Gibco公司) 胎牛血清(Gibco公司) MEM-α培养基(Hyclone公司) DMEM培养基(Hyclone公司) UltraGRO TM 细胞营养添加物(美国Helios公司) 青霉素&链霉素(Hyclone公司) 乙醇(国产分析纯) PBS (Gibco) 台盼蓝(Sigma公司) DMSO (Sigma公司) Pristane (Sigma 公司) FITC-CD90抗体(BD公司) PE-CD73抗体(BD公司) PE-CD105抗体(BD公司) PE-CD44抗体(BD公司) FITC-CD34抗体(BD公司) PE-CD45抗体(BD公司) FITC-HLA-DR抗体(BD公司) 细胞因子添加物FGF、PDGF、VEGF、EGF (美国R & D公司) 细胞培养板、细胞培养瓶(美国Corning公司) 2.1.3. 实验仪器 流式细胞仪：Millipore公司 倒置显微镜：CKX31，OLYMPUS公司 CO 2 培养箱：HF240，上海力申科学仪器有限公司 酶标仪：BIO-TEK，ELx 808 2.2. 实验方法 2.2.1. 无血清培养脐带间充质干细胞 1) 细胞原代培养及无血清传代培养 UC-MSC细胞原代培养：采用组织块贴壁法。健康足月胎儿脐带经产妇同意后，根据伦理委员会通过的指导原则采集。75%酒精浸泡消毒，将脐带剪成2~3 cm小段，用生理盐水加双抗冲洗5~6次，洗去脐带表面血液。剥离脐静脉及脐动脉，将脐带剪成1 mm 3 ，平铺于T150的细胞培养瓶中，37℃ 5% CO 2 培养箱放置24 h，加含有胎牛血清的MEM-α培养基。用倒置显微镜观察细胞的生长情况，4~6天后换液，弃去非贴壁细胞后，每3天换液一次。 UC-MSC的无血清传代与培养：当细胞长至80%融合时，用生理盐水冲洗两遍，0.25%胰蛋白酶37℃消化1 min，按照5 Í 10 4 细胞/ml密度，使用含有UltraGRO TM 细胞营养添加物的DMEM培养基与含有胎牛血清的DMEM培养基1:3配比的混合培养基进行传代，记为P2。当细胞长至80%融合时，用生理盐水冲洗两遍，0.25%胰蛋白酶37℃消化1min，按照5 Í 10 4 细胞/ml密度，使用含有UltraGRO TM 细胞营养添加物的DMEM培养基与含有胎牛血清的DMEM培养基1:2配比的混合培养基进行传代，记为P3。当细胞长至80%融合时，用生理盐水冲洗两遍，0.25%胰蛋白酶37℃消化1 min，按照5 Í 10 4 细胞/ml密度，使用含有UltraGRO TM 细胞营养添加物的DMEM培养基与含有胎牛血清的DMEM培养基1:1配比的混合培养基进行传代，记为P3。当细胞长至80%融合时，用生理盐水冲洗两遍，0.25%胰蛋白酶37℃消化1min，按照5 Í 10 4 细胞/ml密度，使用含有UltraGRO TM 细胞营养添加物的DMEM培养基与含有胎牛血清的DMEM培养基2:1配比的混合培养基进行传代，记为P4。当细胞长至80%融合时，用生理盐水冲洗两遍，0.25%胰蛋白酶37℃消化1min，按照5 Í 10 4 细胞/ml密度，使用含有UltraGRO TM 细胞营养添加物的DMEM培养基进行传代，记为P4。P4之后传代均用含有UltraGRO TM 细胞营养添加物的DMEM培养基进行传代。 2) 常规观察和检测 a) 倒置显微镜观察 取第P5的UC-MSC进行常规倒置显微镜观察和HE染色。 b) 扫描电子显微镜观察 取第5代UC-MSC进行扫描电子显微镜观察。预置的盖玻片在爬满细胞后取出，在含2.5%戊二醛的0.1 mol/L PB (pH7.2)中固定12~24 h，0.1 mol/L PB清洗2 h (中间换2~3次新液)；再用1%的锇酸固定1.5 h，用双蒸水洗至无锇酸气味；梯度酒精脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥；IB-5离子溅射仪中镀铂；日立S-570扫描电子显微镜观察并拍照。 2.2.2. 免疫表型检测 取第5代对数生长期的UC-MSC，0.25%胰蛋白酶-EDTA液消化，待大部分细胞脱离瓶底后，用无血清培养基中止消化，1000转/min × 5 min收集细胞，再用含0.1% BSA的PBS悬浮，调整细胞密度为1 × 10 6 个/ml，分别降入标记的鼠抗人CD90、鼠抗人CD105、鼠抗人CD73、鼠抗人CD44、鼠抗人CD45、鼠抗人CD34、鼠抗人HLA-DR 10 μl，另取一管做IgG同型对照，4℃避光孵育30min；PBS清洗两次，离心收集细胞，加入0.5ml PBS重悬，流式细胞仪上机检测。 2.2.3. 诱导分化实验 1) 成骨细胞：取第5代对数生长的UC-MSC，约60%融合时加入成骨诱导培养基(含10%小牛血清，地塞米松0.1 umol/L，Vc 0.2 mmol/L，β-甘油磷酸钠50 mmol/L)，每3天全量换液一次，2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。 2) 软骨细胞：取培养第5代处于对数生长期的UC-MSC，约60%融合时加入软骨诱导培养基(含10%小牛血清，TGF-β1 3 ng/mL，地塞米松0.1 umol/L，β-甘油磷酸钠5 mmol/L，Vc 0.2 mmol/L，胰岛素2 ug/mL，丙酮酸钠30 ug/ml，牛血清白蛋白0.4 mg/ml，亚硒酸2 ug/ml，亚油酸2 ug/ml)，诱导2周后甲苯胺蓝染色检测胶原表达，RT-PCR检测软骨特异性II型、X型胶原和aggrecan基因表达。 2.2.4. 系统性红斑狼疮小鼠模型建立 取6~8周龄雌性BALB/c小鼠单次腹腔注射pristane 0.5mL，对照组单次腹腔注射PBS 0.5 mL，注射前及注射后每2周行流式细胞术(FCM)检测外周血中IFN-α分泌细胞(CD11b + Ly6Chigh)的比例及细胞活化状态B220 + Aβ1dhigh)，ELISA检测血清中自身抗体(anti-dsDNA，anti-sm RNP，antiribosomal P0)的含量。至6个月处死动物，FCM检测腹腔细胞中IFN-α分泌细胞(CD11b + Ly6Chigh)的比例和脾脏中细胞的活化(B220，Aβ1d)，采用直接免疫荧光法标记小鼠肾脏免疫球蛋白复合物及HE染色评估小鼠肾脏免疫复合物的沉积及损伤情况。饲养条件：室温25℃左右，湿度60%，每日12 h光照周期(6 am~6 pm)，分笼喂养，每笼5~6只，自由进食。 2.3. UC-MSC移植治疗系统性红斑狼疮小鼠有效性评价 2.3.1. 分组与给药 SLE小鼠随机分为模型组和治疗组，每组15只。对照组为健康小鼠，15只。对照组和模型组给予等量的生理盐水；治疗组给予UC-MSC 4 × 10 5 cells/ml，0.2 ml，给药方式均为尾静脉注射(iv)。 2.3.2. 指标检测 每日观察小鼠的疾病活动度评分、尿蛋白抗双链、肾脏病理情况、DNA (ds-DNA)抗体检测浓度等。 1) 尿蛋白浓度的检测 每三四周测定动物体质量及尿蛋白定量(24 h)。采用代谢笼留取小鼠24 h尿量。尿蛋白浓度测定采用Bradford法以小牛血清蛋白作为标准品，于分光光度计595 nm下测吸光度(A)值，绘制蛋白定量标准曲线，计算实验组和对照组小鼠24 h尿蛋白浓度值。 2) 小鼠肾脏病理学检查 每组取小鼠的肾脏组织于体积分数10%中性甲醛液固定24 h，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，厚4 μm，苏木精–伊红染色，显微镜下观察小鼠肾脏细胞数、肾小球硬化、新月体的性质和数目、肾小球毛细血管袢坏死及肾小球毛细血管袢内血栓形成等。 3) 抗ds-DNA抗体检测 按照试剂盒操作说明，在标准品孔中加入标准品50 μL；待测样本孔中。 先加入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL；37℃恒温箱温育30 min；重复洗板4次；每孔加入酶标工作液50 μL；37℃恒温箱温育30 min；重复洗板4次；每孔依次加入显色剂A、B液50 μL，平板混匀器混匀30 s，37℃避光显色15 min；取出酶标板，每孔加终止液50 μL，终止反应；用450 nm波长测量各孔的吸光度值(A值)；计算出标准曲线的直线回归方程。