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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 对采自我国海南省不同市县的八成熟诺丽果和叶，用纯净水洗净，依次以2.6%次氯酸钠 + 75%酒精做6个梯度32组进行表面消毒：次氯酸钠溶液消毒的时间为60~300 s，乙醇溶液消毒的时间为30~180 s。然后用无菌水洗涤3次，用无菌滤纸吸干水分后，用灭菌过的手术刀将果和叶边缘部分去除，果内部或中心部分切分成1 cm × 1 cm大小的组织块，叶内部或中心部分切分成0.5 cm × 0.5 cm大小的组织块 [ 7 ] 。果块和叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将果块和叶块置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min，移去果块和叶块，25℃、黑暗条件下、恒温培养8~10天，无杂菌长出即说明消毒后的果块表面和叶块表面无菌；然后把果块和叶块放在灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上，25℃、黑暗条件下、恒温培养8~10天，得到多株内生真菌，采用26 s rDNA D1/D2区域和ITS rDNA测序鉴定菌株，筛选出抗氧化性较高的8株菌(表1)并构建其系统发育树。 2.2. 培养基与试剂 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基，马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基。 乙酸乙酯、无水乙醇均为国产分析纯，没食子酸、芦丁、水溶性维生素E来自中国药品生物制品鉴定所；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、过硫酸钾、甲醇、醋酸钠缓冲液、三氯化铁、福林酚、碳酸钠、氯化银。 2.3. 粗提物发酵及制备 在超净工作台上，将保留菌种接种到新PDA上开始活化，用打孔器在活化菌落边沿处打孔获得直径为6 mm菌饼，转接到装300 mL PDB的500 mL锥形瓶内，在25℃，130 rpm摇床内孵育8~10天。用减压抽滤法分离发酵液，收集菌液，然后用乙酸乙酯溶剂在12个小时之内等体积萃取3次，静置待分层后收集萃取液，40℃旋转蒸发浓缩，在烘箱内加热烘干得粗提物。称重，配制成1.0 mg/mL浓度供测试。 2.4. 抗氧化活性的研究 2.4.1. Trolox标准溶液的配制 母液：0.0626 g的Trolox标准品用无水乙醇定容到25 mL，浓度为10 mmol/L。 ABTS法中的Trolox标准溶液：200 µmol/L、400 µmol/L、600 µmol/L、800 µmol/L、1000 µmol/L、1200 µmol/L和1400 µmol/L。 DPPH法中的Trolox标准溶液：400 µmol/L、800 µmol/L、1200 µmol/L、1600 µmol/L、2000 µmol/L、2400 µmol/L和2800 µmol/L。 Table 1 The Endophytic Fungus libraries of Non Code Closest (published) Genbank match Accession number Max Identiy Parts used a Source b M22 Colletotrichum LL-2015 isolate LJTJ30 KP748221.1 99% F H (N 20˚03'35''E 110˚19'44'') M10 Ascomycota sp. AR-2010 isolate ATT242 HQ607907.1 100% F Q (N 19˚16'56''E 110˚37'46'') M20 Uncultured fungus clone CMH541 KF800630.1 99% F S (N 18˚20'38''E 109˚34'41'') M19 Fungal endophyte sp. g32 HM537036.1 100% L W (N 18˚45'24''E 110˚72'06'') M18 Cladosporium cladosporioides isolate SZ8M-5 JN226994.1 99% F W (N 18˚45'24''E 110˚72'06'') j22 Cryptococcus sp. 3 TMS-2011 HQ631014.1 99% F D (N 19˚30'38''E 109˚34'21'') j20 Rhodotorula mucilaginosa strain KKUY-0221 KM816742.1 99% F S (N 18˚20'38''E 109˚34'41'') j19 Sterigmatomyces halophilus KX791366.1 95% L Q (N 19˚16'56''E 110˚37'46'') 表1. 诺丽内生真菌样本库 a ：L：叶；F：果实。The letter of L represents Noni leaf， and F is the meaning of Noni fruit。 b ：H：海口；D：儋州；S：三亚；Q：琼海：W：万宁。The letter of H， D， S， Q， W represents Haikou city， Danzhou city， Sanya city， Qionghai city and Wanning city， respectively FRAP法中的Trolox标准溶液：800 µmol/L、1600 µmol/L、2400 µmol/L、3200 µmol/L、4000 µmol/L、4800 µmol/L和5600 µmol/L。 2.4.2. ABTS ＋ ∙自由基清除法(ABTS) 自由基的产生使用ABTS与K 2 S 2 O 8 反应体系 [ 8 ] 。ABTS自由基的制备：1) 配制7 mM ABTS：称0.0960 g ABTS粉末，用蒸馏水定容至25 mL；2) 配制140 mM K 2 S 2 O 8 ：称0.3784 g K 2 S 2 O 8 ，用ddH 2 O定容至10 mL。ABTS由5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 µL 140 mmol/L K 2 S 2 O 8 水溶液避光反应12 h后获得，该溶液提前24 h配制，必须当天使用。使用前用无水乙醇稀释，使吸光值在732 nm为0.70 ± 0.02。粗提液加到2 mL ABTS溶液中黑暗条件6 min，测定吸光值，以溶剂作为对照，最终结果以µmol/L Trolox等量抗氧化能力(Trolox equal antioxidant capacity TEAC)表示。 2.4.3. DPPH清除能力测定(DPPH) [ 9 ] 12.5 mg DPPH溶解到甲醇中，定容到100 mL，使用时稀释5倍到25 mg/L，现配现用。适当体积的粗提液加入2 mL DPPH甲醇溶液中，黑暗条件20 min后在517 nm测量吸光值，以提取溶剂作为对照，最终结果以TEAC表示。 2.4.4. 总还原能力测试(FRAP) [ 9 ] TPTZ溶液的配制：由0.3 mol/L醋酸盐缓冲液25 mL，10 mmol/L TPTZ工作液25 mL，20 mmol/L FeCl 3 溶液25 mL组成。现用现配。适当体积的粗体液按次加入1 mL ddH 2 O 和1.8 mL TPTZ溶液，摇匀，水浴37℃反应10 min，593 nm测量吸光值，溶剂做对照。最终结果TEAC表示。 2.5. 抗氧化成分测定 2.5.1. 总多酚含量(TPC)测定 TPC测定使用福林–肖卡法 [ 10 ] 。待测粗提液0.05 mL放到5 mL的Eppendorf试管中，加入3.85 mL ddH 2 O，揺匀，再加0.25 mL FC (用前1:1稀释)，充分揺匀，1 min之后，加入20%的饱和Na 2 CO 3 溶液0.75 mL，混匀，黑暗条件2 h，提取溶剂做对照，765 nm测量吸光值，三个重复，结果以没食子酸等价值(mg/100 g FW)表示。没食子酸标准溶液浓度：0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L，250 mg/L、500 mg/L和1000 mg/L。 2.5.2. 总黄酮含量(TFC) 测定 总黄酮含量测定采用AlCl3显色法 [ 11 ] ，稍作修改。待测提取液0.3 mL加入5 mL Eppendorf试管中，然后分别加入2 mL 0.1 mol/L AlCl 3 ，1 mL pH为5.2的NaAC-HAC缓冲溶液，用甲醇定容至4 mL，摇匀，40℃水浴显色10 min，以0.1 mol/L AlCl 3 溶液为空白，采用紫外–可见分光光度法，510 nm测量吸光值，三个重复。结果以芦丁等价值(mg/100g FW)表示。芦丁标准溶液浓度：0.1 g/L，0.2 g/L，0.4 g/L，0.5 g/L，0.6 g/L，0.8 g/L，1 g/L。 2.6. 统计分析 DPPH、FRAP、ABTS法的抗氧化能力数据用Microsoft Excel版软件分析，TPC、TFC与其抗氧化活性之间的相关性分析用SAS V8。 2.7. DNA序列分析及系统发育树构建 登陆NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用BLAST将测序获得的霉菌以基于核糖体ITS区域的序列和酵母菌以基于26s rDNA D1/D2区域的序列，与GenBank中的已知序列进行比对，寻找相似度最高菌种，联合形态学特征，确定分离菌株的分类地位。并用MEGA 5.2.1软件按照邻接法(Neighbour-Joining，N-J)，自展数(boostrap)为1000，构建系统发育树 [ 12 ] 。