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user: 2. 环状RNA概述 2.1. 环状RNA的形成机制及其分类 环状RNA (circRNA)是一种封闭结构的内源性长链非编码RNA，是通过对前体mRNA (pre-mRNAs)片段的反向剪切后并以共价键形式首尾相连而形成，被认为是非编码RNA这一大家族中最为稳定的RNA分子 [ 3 ] [ 4 ]。其形成机制主要有以下三种：(1) 在pre-mRNAs上，通过索尾插接使外显子下游的5’末端位点与上游的3’末端位点环化连接，再进行修饰剪接形成 [ 5 ] [ 6 ]。(2) 内含子的互补配对形成。Ivanov，A等 [ 7 ] 发现人与线虫的circRNA外显子的侧翼内含子上有丰富的反向互补配对序列(RCMs)可经双链RNA编辑酶ADAR1介导形成circRNA，同时这些互补序列配对可以拉近剪接位点的距离促进外显子环化。Hansen等 [ 8 ] 发现人工添加800个完全互补配对的核苷酸序列包绕外显子同样能启动外显子侧翼内含子环化形成circRNA [ 8 ]。(3) RNA结合蛋白(RNA binding protein， RBP)促进外显子环化，Ashwal-Fluss，R等 [ 3 ] 发现果蝇中存在一种称为Musclebind (MBL)蛋白，能与circMBL外显子侧面的内含子序列上的MBL结合位点结合促进外显子的自身环化，使circMBL的表达增高3倍。在circRNA分类方面，主要根据结构来源划分为四类：外显子circRNA (ecircRNA)、内含子circRNA (ciRNA)和外显子–内含子circRNA (EIciRNA)，以及由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRNA，在哺乳动物中尤以外显子circRNA (ecircRNA)最为多见。 2.2. 环状RNA的生物学特征 (1) 高丰度性：1976年，Sanger等 [ 9 ] 首次公开报道在某些病毒内发现了circRNA后，经多年的研究后发现circRNA广泛存在于各大物种的细胞中，如人类、小鼠、果蝇、线虫等 [ 5 ] [ 7 ] [ 10 ] [ 11 ]。在大多数生物体内，circRNA含量比与之相对应的miRNA要高。Jeck等 [ 5 ] 通过qRT-PCR等技术检测发现circHIPK3的第二外显子的转录本约是相应的miRNA的5倍。并且近年来发现，circRNA广泛存在于人体的唾液，血液，胸腔积液以及外泌体中 [ 12 ] [ 13 ]。 (2) 高稳定性：与miRNA不同，circRNA虽不具有5’末端帽子和3’末端多聚核苷酸尾巴结构，但因其特殊的环状结构，缺乏游离的3’poly A末端，使之能避免被3’-5’核酸外切酶RNase R和脱支酶识别降解，更具有稳定性 [ 4 ]。阻断DNA转录24小时后发现circRNA的含量仍高度稳定，甚至超过了管家基因GAPDH31的稳定性 [ 11 ]。 (3) 高度保守性：大量研究发现circRNA在不同的哺乳动物间有着大量的高度保守性序列。如表达于小鼠大脑神经元中的circRNA部分也能在人类或者果蝇的大脑神经元中被发现 [ 10 ]。同时还发现在circRNA剪接点周围的内含子序列保守性更高，均存在相似的RCMs [ 10 ] [ 14 ]。这一特性同时也能证实circRNA并非是pre-mRNA的随意错误剪接而成的无功能副产品，而是带有特殊生物学功能的物质。 (4) 空间和时间表达差异性：在时间表达差异上，如CDR1as在小鼠突触神经元成熟的不同时间点含量不同，在出生后的发育过程中富集；在空间表达上也有明显差异性，大多数的ecircRNA存在细胞质中，而ciRNA存在细胞核中。如circPlxnd1在大脑皮质高度富集circRims2仅存在于小脑颗粒层存在，而circElf2和circPhf21a在小脑和嗅球颗粒层表达占优势 [ 10 ] [ 11 ]。同时Li等 [ 13 ] 还发现外泌体中的circRNA约是细胞内的两倍。 2.3. 环状RNA的生物学功能 (1) miRNA 海绵作用 miRNA是一类通过碱基配对结合相应mRNA内的靶位点来调节相应基因表达，在癌症的增殖、侵袭、转移上起着重要作用 [ 15 ]。越来越多的证据表明，circRNA可以充当miRNA的海绵分子来调节基因表达，与其他的内源性RNA (ceRNA)相比，circRNA不但有高度稳定性，而且具备更多的miRNA反应元件和结合位点，因此被称为：“超级海绵” [ 8 ]。例如，ciRS-7 (也称为CDR1as)是一种充当miR-7海绵的circRNA，含有70多个选择性保守的miRNA靶位点，通过抑制miR-7的活性，使得miR-7靶标水平增加。同时在小鼠脑中，尤其是在新皮质和海马神经元中，发现ciRS-7与miR-7的表达高度重叠，表明两者具有高度内源性相互作用 [ 8 ]。此外还发现circFBLIM1可以通过使miR-346海绵化来调节FBLIM1表达。抑制circFBLIM1可抑制肝细胞癌细胞生长和侵袭，并促进肝细胞癌细胞凋亡 [ 16 ]。 (2) 调控基因的转录 尽管只有少部分的circRNA位于细胞核中，但其对调控基因的剪接，转录和翻译具有不可或缺的作用。EIciRNA是一种主要位于细胞核中的circRNA，可与U1 snRNP相互作用并促进其亲本基因的转录，它的存在增强了顺式中亲本基因表达 [ 17 ]。circPOK是一种新发现的于肿瘤细胞中的circRNA，其由Zbtb7a基因编码而得，它通过编码Pokemon转录因子参与基因转录调控，从而通过共同激活ILF2/3复合物来调节促增殖和促血管生成因子 [ 18 ]。此外，circRNA还可以通过与miRNA 结合改变其相应结构来影响基因的转录或转录后水平来调控基因表达，含有circRNA位点的miRNA可以通过与相应的circRNA相互作用来解除miRNAs对靶基mRNA的调控作用，从而在转录后水平调控靶基因表达 [ 8 ] [ 19 ]。 (3) 与RNA结合蛋白(RNA binding protein， RBP)相互作用 RNA结合蛋白(RNA binding protein， RBP)是一组广泛参与基因转录和翻译的蛋白。证据表明circRNA可以充当蛋白支架作用促进两个或多个蛋白质之间的接触并发挥其作用。circ-Foxo3存在于大多数的肿瘤细胞。它可以充当蛋白支架连接MDM2和p53，促进了MDM2介导的p53降解，避免了MDM2诱导Foxo3泛素化从而对肿瘤细胞的凋亡起作用 [ 20 ]。RBM3是一种常见的RNA结合蛋白，在肝癌细胞中，它可以动态调节SCD-circRNA 2的合成，实验干扰SCD-circRNA 2的表达可以消除RBM3促进的细胞周期转变，这表明SCD-circRNA 2可能是RBM3的下游靶分子，来影响肝细胞癌的细胞增殖 [ 21 ]。此外，一些含有RBP结合位点的circRNA可以与阿格蛋白(Argunaute， AGO)相互作用，控制mRNA的转录和翻译的过程 [ 22 ]。 (4) 翻译成特定的蛋白质来发挥作用。 在过去，circRNA因其编码蛋白基因的起始密码子和/或终止密码子被删除故被认为是一种不能被编码为蛋白质的长链非编码RNA。但近年来研究发现，部分circRNA可以编码为特定的蛋白质来影响肿瘤的发生发展。Circβ-catenins是一种在肝癌组织中高度表达的circRNA，Liang等 [ 23 ] 发现它可以表达一种新颖的含370个氨基酸的β-catenin同工型(β-catenin370)，它使用线性β-catenin mRNA转录物作为起始密码子并在环化产生的新的终止密码子处终止翻译。这种新颖的β-catenin370可通过拮抗GSK3β诱导β-catenin的磷酸化和降解，从而稳定β-catenin并激活Wnt信号通路，敲除Circβ-catenins发现可以降低β-catenin水平，但不会影响其mRNA水平。