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user: 2. DNA甲基化在胃癌发生发展中作用机制研究现状 2.1. 表观遗传学 表观遗传学：由英国生物学家Conrad Waddington 1942年在Endeavour第一次提出。近几年随着分子生物学、基因组学的进步，逐渐成为热点，并且迅速发展的一门遗传学分支学科 [ 2 ]。主要指DNA序列未出现改变，遗传表达却发生可遗传改变。其修饰可于多个水平调控遗传表达，主要包括：遗传印记、染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。其在细胞生长发育、增殖分化以及肿瘤发病等方面有重要作用。 2.2. DNA甲基化研究现状 DNA甲基化为表观遗传学现象之一，为真核生物在染色质水平控制转录重要机制，这种改变可遗传、可逆。由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase， DNMT)作用，把甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methyonine， SAM)的甲基转到相应碱基上的过程。一般主要转移至真核基因组胞嘧啶第五位C原子，而成为5-甲基胞嘧啶，并且以序列GC甲基化更为常见，如在大多数基因启动子区都存在的CpG岛 [ 3 ]。 正常的甲基化状态可对于细胞生长、发育、增殖、分化等有重要的作用，而异常的甲基化状态会使得细胞周期、DNA损伤修复、基因转录等发生异常，导致肿瘤的发生。 高甲基化：未出现甲基化的正常DNA位点被甲基化。正常状态启动子区域CpG岛呈现非甲基化，染色质松散，利于基因转录。而高甲基化后，染色质变紧密，进而干扰转录 [ 4 ]。真核生物启动子区域CpG岛甲基化修饰对于调节转录至关重要，甲基化水平与基因的表达呈负相关。DNA损伤修复基因、抑癌基因等CPG岛高甲基化可致其转录不表达或者低表达，出现抑癌基因失活、相关DNA损伤后无法修复，从而致癌 [ 5 ]。 低甲基化：已有甲基化正常DNA位点被去甲基化。可致原本表达沉默的相关基因(原癌基因多见)被激活、染色质的结构发生改变，可致基因组突变，遗传不稳定性上升，最终可导致癌症。并且相关研究发现，DNA低甲基化与肿瘤发生、进展与转移高度相关 [ 6 ]。而局部DNA高甲基化与全基因组DNA低甲基化通常可出现在同一肿瘤中 [ 7 ]。相关研究表明胃癌与甲基化的失衡密切相关，研究结果显示胃炎组织、癌旁正常组织均可发生全基因组的低甲基化 [ 8 ]。 基因甲基化主要通过下面的途径导致肿瘤形成与进展：1) 影响染色质结构的稳定。2) 影响癌基因或抑癌基因正常表达。3) 影响细胞周期：干扰细胞分裂增殖或凋亡。4) 影响信号转导通路。5) 影响细胞侵袭和转移。 目前普遍认为肿瘤发生过程中启动子区异常甲基化与DNA甲基转移酶高表达有关 [ 9 ]。目前已经知道的DNMT家族中能够发挥明显作用的有三种：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1的作用是维持甲基化状态的稳定，使得已有的甲基化状态不发生变化。使其可以继续特异性辨别子代DNA中相对应的位点，复制时催化其反应过程 [ 10 ]。DNMT3a、DNMT3b的作用为催化未发生甲基化的DNA出现新甲基化。可参与机体在各种环境应答时动态甲基化过程 [ 11 ]。目前主要认为CpG岛甲基化导致转录抑制的机制主要为：1) 直接影响了转录因子和启动子区域特异性识别位点结合。2) 甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG-binding proteins)与异常相关调控序列结合，影响转录起始复合物形成，从而抑制相关基因表达 [ 12 ]。 2.3. 胃癌相关基因的甲基化 异常甲基化和胃癌关系十分紧密。包括抑癌基因：细胞周期相关基因(P16、PAX5、p15等)、细胞凋亡相关基因(DAPK、RNF180、Bcl-2等)、信号转导相关基因(RUNX3、RASSF1A、PTEN、APC等)、细胞黏附和转移相关基因(CDH1、TIMP1、TIMP3等)，原癌基因(Ras、c-myc等)以及DNA修复基因(hMLH1、XRCC1、GSTP1、MGLT等)等多种基因。下面主要介绍几个研究较多的胃癌相关基因研究情况： P16 (亦称多肿瘤抑制因子1，multiple tumor spppressor1，MTS1)基因：位于染色体9P21区，是细胞周期中的基本调节因子。是肿瘤抑制基因，其表达产物参与细胞周期调控，负性调节细胞增殖和分裂。主要参与CDK6-PRb-E2F/cyclinD1-CDK4环路的负性调节。P16表达产物P16蛋白通过抑制细胞分裂周期关键酶之一CDK4正常功能，进而影响与细胞周期素结合，从而控制G1-S的转换，最终阻止细胞进入S期。一旦P16基因发生失活，就无法抑制CDK4，细胞发生无限制增殖，导致恶性肿瘤发生，而启动子区甲基化为导致其失活重要因素之一 [ 13 ]。相关研究 [ 14 ] 发现在从胃黏膜正常组织到癌前病变再到胃癌疾病进展进程，P16甲基化阳性率明显呈现出递增表现，并且在胃癌发生淋巴结转移的P16基因甲基化阳性率明显较高，可见P16在胃癌的进展以及转移中均起到作用，可作为胃癌诊断的重要标志物。Peng等 [ 15 ] 研究发现，P16基因启动子甲基化是诊断胃癌的一种有用的方法，其灵敏度相对较低，但特异性很高。Wu等 [ 13 ] 研究发现，胃癌p16甲基化率(85.9%; 79/92)显著高于其癌旁正常组织(12.0%; 11/92) (P < 0.0001)。其甲基化和淋巴转移、腹膜转移、TNM分期等密切相关(P < 0.05)。肿瘤组织P16甲基化程度升高的患者生存率低于P16甲基化程度不高患者(P = 0.042)。可见血清P16甲基化为评估胃癌发生发展以及预后不错的标志物。Lim等 [ 16 ] 研究发现，P16甲基化诱导P16沉默，从而加速细胞周期，增加S期细胞数量，进而使得癌细胞容易吸收5-FU进入S期细胞，可明显提高药效。 人类RUNT相关转录因子3 (Runt-related transcription factor3， RUNX3)基因：位于染色体1p36.1区，一种肿瘤抑制基因。主要参与转化生长因子-β (TGF-β)转导通路调节，对TGF-β上皮细胞生长等起到负性调节作用。一旦RUNX3失活则会引起肿瘤发生。Wen等 [ 17 ] 研究发现RUNX3甲基化对胃癌具有良好的诊断能力，其敏感性为63.2%，特异性为97.5%，RUNX3基因的启动子甲基化可能是临床实践中检测和诊断血液样本中胃癌的有力和潜在的无创生物标志物。SAKAKURA等 [ 18 ] 研究发现，在胃癌病人外周循环检测出高水平甲基化RUNX3序列，RUNX3甲基化指数和肿瘤分期、组织学、淋巴管和脉管浸润等指标一致，比癌胚抗原更敏感。手术切除后血清RUNX3甲基化指数中位数明显减少。表明了外周血RUNX3甲基化监测在胃癌治疗后的临床价值和有效性。 E-钙黏蛋白1 (E-cadherin-1， CDH1)基因：位于16号染色体的基因，负责编码E-钙黏蛋白。该基因的编码蛋白是维持上皮细胞间黏附的主要蛋白，一种通过钙离子介导细胞间黏连的跨膜蛋白。若该基因发生突变，可使肿瘤增殖、侵袭、浸润、转移加剧。Kim等 [ 19 ] 研究发现，CDH1甲基化为胃癌发病常见早期事件，和E-cadherin表达下调显著相关，可能和早期胃癌的转移有关，并在分化中发挥重要作用。Yu等 [ 20 ] 研究发现，92例(81.5%)胃癌组织，其中75例(81.5%)均发现CDH1甲基化，和肿瘤的大小、生长模式、分化、浸润深度、淋巴结转移、和TNM分期均显著关联(均P < 0.05)。术前腹腔冲洗中，有或没有CDH1甲基化患者其生存率存在显著性差异。结果表明术前腹腔冲洗中CDH1甲基化为胃癌病人独立危险因素。 人类同源突变体1 (human Mut L homolog1， hMLH1)基因：一种碱基错配修复基因。参与维持基因组稳定，在多种组织均有表达。其出现功能缺失后，可出现染色体和微卫星不稳定，导致肿瘤发生。高甲基化的hMLH1通过调节 hMLH1蛋白而导致胃癌。Shen等 [ 21 ] 研究发现，hMLH1甲基化是预测胃癌的生物标志物，但可能不会影响胃癌行为。Li等 [ 22 ] 研究发现，胃癌患者MLH1甲基化与奥沙利铂耐药有关。Shigeyasu等 [ 23 ] 研究表明，MLH1甲基化状态可能是胃癌患者预后标志物。