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user: 3. 结果与讨论 3.1. 有序介孔碳的表征 我们采用X 射线粉末衍射法、氮气等温吸附法、拉曼光谱测定法以及透射电镜等手段对合成的有序介孔碳OMC进行一系列表征。 如图1(a)所示为有序介孔碳的X射线粉末衍射图。从图中我们可以看到，在(100)、(110)和(220)面上有三个较强的布拉格衍射峰，表明有序介孔碳的碳孔道为长程高度有序的六方形介观结构。并且通过与SBA-15的XRD衍射图相比较，可知制备的OMC仍然保持了类似SBA-15的典型六方孔道结构。这是因为在OMC的合成过程中，碳化和去模板以后，介孔碳结构与原来的SBA-15模板是完全对称的，就好像被复制了一样。这一点与第一章中的理论是相符合的。 图1(b)所示为OMC与SBA-15的氮气等温吸附–脱附曲线。比表面积BET和孔体积BJH分别根据Barrett-Emmett-Tellter公式和 Barrett-Joyner-Halanda模型由吸附曲线计算得到。其中BET比表面积是由相对压力在0.04到0.3之间的吸附数据计算得到。而总孔容Vt是由相对压力在0~3的总吸附量求得。经过计算，OMC的BET面积900 m 2 /g，孔径4.5 nm，孔体积1.29 cm 3 /g。因而可以预计其含有更多的表面活性位可以吸附蛋白质分子，有利于提高吸附量。而SBA-15的BET面积607 m 2 /g，孔径5.4 nm，孔体积0.96 cm 3 /g。 图1. (a) CMK-3和SBA-15的X 射线粉末衍射图；(b) CMK-3 and SBA-15的氮气等温吸附图；(c) CMK-3的拉曼光谱图 图1(c)为有序介孔碳的拉曼光谱图。从中我们可以看出它们均具有两峰。位置在1680 cm −1 左右的是G峰，在1357 cm −1 左右的是D峰，D键与G键的相对强度比值(ID/IG)与石墨碳层内的缺陷点位的数量成正比 [ 24 ] 。经计算可知OMC的拉曼光谱比值约为0.903。根据文献 [ 25 ] [ 26 ] 可知在OMC表面有很多的缺陷。 图2是有序介孔碳材料的TEM图。从TEM照片图中可以看出，有序介孔碳呈现出有序的纳米棒阵列结构。根据图中标尺，可估算其孔径在5 nm左右，为典型的有序介孔结构，这与XRD测试结果吻合。由第二章扫描电镜(SEM)图片显示，在有序介孔碳材料薄膜中有许多裂缝，这使得其孔道开放性提高，可能更加有利于生物分子在薄膜中的扩散和传输。这些结构特征使有序介孔碳材料薄膜可以有效地固定葡萄糖氧化酶等生物分子。 3.2. OMC/GCE的电化学行为 在本文中采用5 mmol/L的铁氰化钾溶液作为氧化还原体系，在20 mV/s的扫描速度下分别得到了OMC/GCE和裸GCE的循环伏安图(如图3)。通过Randles-Sevcik equation方程可知，Ip = 2.69 × 10 −5 AD 1 / 2n 3 /2v 1 /2c，n是氧化还原反应过程中参与的电子数，A是电活性表面区域的面积(cm 2 )，D是粒子在溶液中的扩散系数(cm 2 /s)。根据上述方程计算得到，OMC/GC电极的电活性面积的平均值为0.108 cm 2 ，而裸GCE电极的电活性面积约为0.076 cm 2 。表面经过有序介孔碳修饰后的电极具有较高的电活性面积，再加上它本身又具有大的比表面积，因此可以有效吸附GOD分子。 3.3. Fc/GOD/OMC/GCE的电化学行为 由于Nafion独特的离子交换和生物兼容性，被广泛用作修饰电极和构建电化学传感器的材料 [ 27 ] [ 28 ] 。因此我们在葡萄糖氧化酶与二茂铁中间覆盖了一薄层Nafion溶液，一方面可以防止葡萄糖氧化酶在电极表面的脱落，另一方面由于Nafion分子中含有负电荷的-SO 3 基团，是一种含电离基团的全氟化聚合物，根据静电作用原理，会吸引带正电荷的铁离子，因此可以更好地将二茂铁修饰到电极表面上来，并且Nafion膜性质稳定。在这里Nafion薄层相当于起着“导线”的作用，加速电子的转移。图4所示为Fc/GOD/ OMC/GCE电极在Na 2 HPO 4 -KH 2 PO 4 缓冲溶液中(0.1 M， pH 7.0)的循环伏安图。 从图4上我们可以清楚地观察到两对明显的氧化还原峰。在−0.45 V和−0.54 V处出现了一对可逆的氧化还原峰，根据文献我们认为这是由GOD产生的峰。而+0.3 V左右出现的这对则是二茂铁在修饰电极表面产生的氧化还原峰。图4说明葡萄糖氧化酶和二茂铁已经成功地固定在了OMC/GCE表面。 图2. CMK-3的透射电镜扫描图 图3. GCE (1)和OMC/GCE (2)在5 mmol/L铁氰化钾和0.1 mol/L氯化钾的混合溶液中的循环伏安图，扫速为50 mV/s 图4. Fc/GOD/OMC/GCE在pH = 7.0的0.1 M磷酸缓冲溶液中的循环伏安图，扫速为100 mV/s 3.4. 扫速对Fc/GOD/OMC/GCE的影响 图5是Fc/GOD/OMC/GCE电极在磷酸盐缓冲液(0.1 M， pH 7.0)中不同扫速下的循环伏安图。由图5可见，在10~200 mV/s扫速范围内，随着扫描速度的增加，所有的氧化还原峰电流均增大，而氧化还原峰电位基本不随扫速的增加而改变，峰电位之差(DEp)约为65 mV，与单电子反应的理论值比较接近。表面该修饰电极具有良好的氧化还原可逆性。另外我们发现，在10~200 mV/s的扫速范围内，GOD的峰电流与扫速的平方根成正比。如图6所示。线性回归方程为I pa = −7.02 × 10 −6 + 7.67 × 10 −6 v 1/2 (I: A， v: mV/s)， 图5. 在不同扫描速度下，Fc/GOD/OMC/GCE在pH = 7.0的0.1 M磷酸缓冲溶液中的循环伏安图，从里到外扫速分别为10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100， 120， 150， 160， 180， 200 mV/s 图6. 峰电流与扫速平方根的关系 相关系数为0.998，I pc = 6.82 × 10 −6 − 7.17 × 10 −6 v 1/2 (I: A， v: mV/s)，相关系数为0.998。表明媒介体在电极上的氧化还原过程受扩散控制，这是由于修饰在电极表面的膜具有一定的厚度，媒介体从膜中扩散到电极表面发生氧化还原反应。 3.5. pH对Fc/GOD/OMC/GCE的影响 图7为不同pH条件下Fc/GOD/OMC/GCE在磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图。从图7中我们可以发现，随着溶液pH的增大，所得Fc/GOD/OMC/GCE循环伏安图上的氧化还原峰电位均向负方向移动，表明其氧化还原过程伴随着质子的转移。在pH值为3.0~8.0范围内，将式量电位Formal potential [(Epa + Epc)/2]与pH作图(图8)，我们发现GOD的阳极峰电位和pH值的关系为：Ep a 1 = 0.65 − 0.063pH，r = 0.999，其斜率为−63 mV/pH，该值与等电子等质子传递的理论值−58 pH/mV非常接近，表明GOD在修饰电极上质子数与参加反应的电子数相等。根据Randles-Sevick公式计算n a = 2，所以我们认为GOD在修饰电极上反应过程为两步两电子两质子过程[ 29 ] 。 3.6. Fc/GOD/OMC/GCE对葡萄糖的催化氧化 称取0.5 g β-D-葡萄糖，配制成0.1 mol/L的葡萄糖储备溶液，该溶液于4℃环境中放置24小时使其达到变旋平衡后再使用。图9为Fc/GOD/OMC/GCE中GOD部分在不同葡萄糖浓度下的循环伏安曲线。 图7. Fc/GOD/OMC/GCE在不同pH值的0.1 M磷酸缓冲溶液中的循环伏安图，扫速为100 mV/s 图8. E 1/2 与pH的关系 图9. Fc/GOD/OMC/GCE在空白溶液(1)和含有0.5 mM葡萄糖(2)的0.1 M磷酸缓冲溶液中的循环伏安图，扫速为100 mV/s 当向溶液中加入0.5 mmol/L葡萄糖溶液后，在−0.45 V左右的氧化峰电流显著增大，还原峰电流减小，表明修饰在电极外表面的二茂铁和基底物质OMC共同在GOD的氧化还原中心和电极表面起到了电子传递的作用，同时说明该Fc/GOD/OMC/GCE电极对葡萄糖具有良好的催化氧化能力。我们认为Fc/GOD/ OMC/GCE电极对葡萄糖的催化机理如下[ 30 ] ： 图10为Fc/GOD/OMC/GCE在−0.45 V的工作电位下对葡萄糖的计时电流曲线。随着葡萄糖的加入，Fc/GOD/OMC/GCE在5 s内即可达到最大响应电流的95%，表明该酶电极对葡萄糖的响应时间短，说明该电极响应灵敏。由标准曲线(图11)可知，Fc/GOD/OMC/GCE的线性范围为5.00 M~10.00 mM；检出限为1.03 ± 0.15 M (S/N = 3)；相关系数为0.996；灵敏度为220 ± 10.4 A∙mM −1 ∙cm −2 (由直线部分斜率和电极的几何面积计算得出)。 3.7. Fc/GOD/OMC/GCE修饰电极的稳定性和选择性 修饰电极的稳定性和选择性是衡量生物传感器性质的一个重要标准。我们采用循环伏安法对该修饰电极的稳定性与重现性进行检测。结果表明，将Fc/GOD/OMC/GCE修饰电极置于含1 × 10 −3 mmol/L葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描。经过连续扫描2小时以后，Fc/GOD/OMC/GCE修饰电极的峰电流仍然保持原来的94%。而当把Fc/GOD/OMC/GCE修饰电极放在冰箱中保存4周后，对葡萄糖的电流响应基本保持不变，这表明Fc/GOD/OMC/GCE电极稳定性良好。对 Fc/GOD/OMC/GCE进行干扰试验(结果如表1所示)，待背景电流稳定后分别加入与葡萄糖相同浓度的多巴胺、尿酸和抗坏血酸，尿酸和多巴胺对响应电流几乎没有影响，不足之处是加入抗坏血酸时电流有所下降。说明该电极能很好的消除尿酸和多巴胺的干扰，我们也将对该电极进行进一步改进。