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user: 3. 海藻油的萃取方法 由于海藻油保健品的兴起和生物柴油技术的发展，海藻油萃取技术得以迅猛发展。海藻油的提取多依赖于有机溶剂的浸提，1959年Bligh和Dyer提出用氯仿、甲醇和水萃取油脂的方法是油脂萃取中的常用方法 [ 6 ] 。大部分海藻细胞壁一般由纤维素和果胶组成，比较坚韧，可阻碍胞内脂肪酸的萃取，因而在海藻油萃取前一般先对海藻进行破壁处理以提高海藻油萃取率。另外，脂类在海藻细胞中的分布和组成受海藻种类及生长环境等的影响 [ 7 ] ，很难采用统一的方法高效的萃取海藻油 [ 8 ] 。目前已见报道的藻油萃取技术有溶剂法、索氏提取法、溶剂法、离子提取法、酸水解法、尿素包合法、反复冻融法、超声/微波法、超临近流体萃取法、亚临界萃取法、微负压法等 [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] 。本文作者重点阐述了冻融法、超声/微波法、酶解法、超临界流体萃取法、亚临界萃取法五种技术近几年的研究进展。 3.1. 冻融法 冻融法萃取海藻油指通过反复冷冻与融化过程中海藻细胞内形成的冰晶及剩余液体所发生的盐浓度的变化所引起的细胞破裂后海藻细胞内油脂得以经萃取剂中萃取而得的过程。图1为冻融法萃取海藻油的工艺流程。刘圣臣等发现小球藻反复冻融一次，以95%乙醇，料液比1:3 (g:ml)、45℃提取，出油率最高达24.28% [ 13 ] ，而，小球藻−20℃反复冻融4次后小球藻的破壁率为53.83%，海藻油提取率为0.0230 g/ml，是未冻融处理组的2.19倍 [ 14 ] 。杜晓凤等将微绿球藻反复冻融后经工业酒精65℃提取2 h后海藻油的提取率为34.62% [ 15 ] 。冻融法可以使细胞内近90%的水分脱离细胞 [ 16 ] [ 17 ] ，利于胞内油脂被溶剂浸提，提高海藻油的萃取效率。反复冻融法对设备要求低，简单方便，易于实施，尤其适合光热敏感型活性物质的提取 [ 13 ] ，但冻融法与其他方法相比能耗、时耗相对较高，实际生产中的使用率较低。 3.2. 超声/微波法 超声波是一种频率高于2 × 10 4 Hz的声波、超声波的易于获得集中性的能量，穿透能力强、方向性好，可以使细胞剧烈受迫发生机械损伤 [ 18 ] 。微波是指频率为300 MHz~300 GHz的电磁波。微波穿透性良好、热惯性小，可使细胞内部的温度迅速上升，导致细胞热涨发生破裂，使胞内物质流出 [ 19 ] [ 20 ] 。超声–微波协同萃取技术是指将超声振动和微波两种作用相结合，使细胞被充分破坏，溶剂穿透力增强的一种新型萃取技术 [ 21 ] (图2)。刘圣臣等发现小球藻超声处理24 min后小球藻的破壁率达到90.86%以上，是未超声处理组的2.24倍 [ 14 ] 。郑捷等利用超声法对小球藻的EPA和DHA提取1 h后，获得的提取率分别是79.48%和81.52% [ 22 ] 。徐椿慧等在用乙醇超声强化提取海藻油时，以料液比为1:3 (g:ml)、温度为45℃、超声功率为100 W、微波功率为250~400 W、提取时间为40 min为最佳提取条件 [ 23 ] 。胡爱军等采用超声法获得的EPA和DHA的萃取率分别为982.96%和81.87% [ 24 ] 。万益琴等利用微波裂解技术所得的海藻油得率为44.79%，高于同技术条件下秸秆、木质纤维素材料的生物油得率 [ 25 ] 。翟量采用超声辅助溶剂法萃取微拟球藻中的藻油脂肪酸，料液比为1:15 (g:ml)、50℃超声30 min重复提取3次获得最好的藻油提取率，为37.6%，其中EPA占藻油脂肪酸的总量的39.0% [ 26 ] 。超声–微波协同萃取技术 图1. 冻融法萃取海藻油的工艺流程 图2. 超声/微波法萃取海藻油的工艺流程 有效地集合了超声法和微波法的技术优点 [ 21 ] ，可以快速高效的萃取海藻油，同时存在溶剂用量小、能耗低、易于工厂化等优点而被广泛使用。 3.3. 酶解法 酶解法是指利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等将海藻的细胞壁水解破坏胞内油脂浸出从而获得海藻油的方法(图3)。刘颖等发现pH为7.0、底物浓度为25 g/L、中性蛋白酶4 g/L在42℃下反应4 h，小球藻的油脂提取率可达80%以上 [ 27 ] 。张雨倩等用复合蛋白酶提取海洋微藻中的海藻油时发现，超声辅助下料液比1:25 (g:ml)添加2.0%的酶、45℃水解2.0 h，可获得最佳的藻油提取率，为17.1% [ 28 ] 。Wang等发现在超声辅助下酶解法对微拟球藻(Nannochloropsis)的油脂提取率达38% [ 29 ] 。酶解法要根据藻类的细胞壁组成来选择酶的种类，藻种的不同、酶的选择都是影响海藻油提取率的因素。酶解法可以有效地提高海藻油的提取效率、与其他技术相比可以适当减少溶剂的使用，降低污染的同时还可以降低海藻油提取过程中产生的能耗 [ 6 ] [ 30 ] 。 3.4. 超临界流体萃取法 超临界流体萃取(SFE)是近年来兴起海藻油提取技术之一，是代化工分离中出现的高新技术。SFE把有机溶剂萃取技术和传统蒸馏技术结合在一起，利用CO 2 将萃取物从基质中进行分离纯化。宋启煌等采用超临界CO 2 从小球藻中萃取EPA和DHA，萃取率分别为89.7%和88.1%，图4为其萃取海藻油的工艺流程 [ 31 ] 。胡爱军等采用SFE法获得的EPA和DHA的萃取率分别为79.60%和76.32% [ 24 ] 。胡爱军等采用超声强化超临界萃取法(USEF)获得的EPA和DHA的萃取率分别为94.15%和92.28% [ 24 ] 。丘泰球等发现超声强化超临界萃取法可以是EPA和DHA的萃取率达到90%以上 [ 32 ] 。Qiu等发现USEF提取海藻油时，温度为35℃、压力为25 Mpa、以CO 2 流速为3 L/h提取3.0 h时，可获得EPA和DHA的最佳提取率 [ 33 ] 。在萃取过程中，超临界CO 2 是一种安全无毒价格低廉的液体，且其扩散系数与气体相近，能迅速渗透进固体物质之中，有临界条件好、无毒安全、无化学污染等特点。SFE具有选择性好、提取率高、无溶剂残留、可以有效地萃取热敏性及易挥发性物质而被广泛应用于食品工业 [ 34 ] 。但SFE操作压力较高，因而设备的使用成本昂贵。此外，SFE采用单一萃取溶剂时，常常选择性与溶解性偏小，导致提取能力较低，进而需要更高的萃取压力和溶剂循环次数，导致萃取效率的降低和设备能耗过大 [ 24 ] 。 图3. 酶解法萃取海藻油的工艺流程 图4. 超临界CO 2 萃取海藻油的工艺流程 图5. 亚临界萃取海藻油的工艺流程 3.5. 亚临界萃取法 亚临界溶剂萃取技术是一种可以加速提取的性技术，一般是指原料置于封闭容器后通过加压来提高溶剂的沸点，使溶剂在高于沸点时保持液体状态，从而加速目标萃取物从原料中的分离并快速被溶剂浸提的过程 [ 35 ] [ 36 ] 。陈闵等从微拟球藻(Nannochlorsis sp.)提取油脂时发现硫酸辅助亚临界乙醇–正己烷法要优于亚临界乙醇法和亚临界乙醇–正己烷法，在正己烷/乙醇体积比为3:1、料液比为1:7 (g:ml)、硫酸6%、1.5 Mpa下90℃萃取30 min获得的油脂提取率在90%以上 [ 37 ] 。用于亚临界萃取海藻油的萃取溶剂除乙醇、正己烷外还有甲醇、石油醚、氯仿、丙酮、烃醇等 [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] ，图5为其亚临界萃取海藻油的工艺流程。在亚临界流体状态时，溶剂分子的扩散能力增强，对天然产物中弱极性和非极性物质的渗透性和溶解能力显著提高 [ 42 ] [ 43 ] ，可保持天然产物的活性不被氧化或破坏 [ 44 ] ，而且亚临界流体萃取技术成熟、运行成本低、易于产物分离，因而被广泛应用于工业生产，如菜籽油、椰子油、小麦胚芽油、茶籽油等的生产 [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ] 。