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user: 2. 材料和方法 2.1. 材料和试剂 试验所使用的BMSCs提取自无特定病原体(SPF)级，体重100~120 g的雄性Wistar大鼠，实验动物由成都达硕实验动物有限公司提供。主要试剂及耗材如表1所示。 Table 1 Experimental reagents and consumable 名称 分级 来源 α-MEM培养基 生物级 Gibco， USA 胎牛血清 生物级 Bovogen Biologicals， Australian 胰酶1:250 生物级 Biosharp， China 青链霉素溶液 生物级 HyClone， USA 地塞米松 生物级 北京百灵威科技有限公司 β-甘油磷酸钠 生物级 Sigma， USA 维生素C 生物级 北京百灵威科技有限公司 I型DNA酶 生物级 北京索莱宝科技有限公司 ALP活性检测试剂盒 生物级 南京建成生物工程研究所 ALP显色试剂盒 生物级 碧云天生物技术研究所 茜素红S 生物级 Sigma， USA DAPI溶液(即用型) 生物级 北京索莱宝科技有限公司 PLGA 75/25 山东省医疗器械研究所 PGA/PCL 30/70 山东省医疗器械研究所 表1. 实验试剂及耗材 2.2. 细胞获取及培养 动物试验由四川大学动物护理及使用委员会批准，遵循中国科技院出版的《实验动物护理及使用指南》进行。Wistar大鼠经过颈椎脱臼法处死后，75% (v/v)乙醇浸泡消毒，取出两侧后肢股骨及胫骨并剔除多余的软组织和结缔组织。无菌条件下将股骨的两端剪开暴露骨髓腔，用一次性医用注射器吸取5 mL标准培养基(α-MEM，10%胎牛血清(FBS)和1%青链霉素溶液(P/S)，4℃预冷)在无菌玻璃瓶中反复冲洗骨髓腔至骨髓完全被冲出，之后使用移液器反复吹打骨髓抽吸物并接种于25 cm 2 的一次性培养瓶中，在37℃，5% CO 2 的细胞培养箱中静置培养，胫骨与股骨操作类似。细胞培养72 h之后半换液，144 h后全换液，待贴壁细胞增殖到70%铺满瓶底用0.25%胰蛋白酶(Try)消化传代后作为第一代BMSCs，传代第二天全换液并在贴壁细胞增殖到70%时再次传代，得到第二代BMSCs用于后续试验，经过上述操作可以实现去除全部悬浮细胞和纯化BMSCs的目的。 2.3. 诱导培养及细胞和遗传物质的脱除 将第二代BMSCs消化并接种在75 cm 2 一次性培养瓶中，在标准培养条件下用诱导培养基(α-MEM， 10% FBS， 1% P/S， 10 nM DXMS， 10 mM β-GP， 50 μg/mLVC)培养14天，每三天更换一次培养基。培养结束后，用PBS洗涤，然后放入−80℃超低温冰箱冷冻30 min后转移到37℃烘箱中保温30 min，反复循环三次，通过让细胞内形成冰粒和细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。利用PBS洗涤除去细胞残片后，加入酶活力为150 units/mL的I型DNA酶(DNase-I)，在37℃下孵育30 min以破环残留的DNA，再次使用PBS洗涤除去DNA碎片之后，用细胞刮刀缓慢地从瓶底将dECM刮下并收集在10 mL一次性离心管中，其中每3瓶的dECM保存在一个离心管中。 检验脱细胞效果，将第二代BMSCs消化计数后以5 × 10 3 个/孔接种在24孔板中，通过上述培养方法培养14天后，利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在脱细胞前后进行染色，培养好的细胞利用PBS清洗后加入即用型DAPI染色覆盖，室温下染色10 min，用PBS清洗三次之后，在倒置荧光显微镜下观察，激发波长为360~400 nm。DNA脱除情况的检测，利用DNA定量检测试剂盒测定脱细胞前后的DNA含量，具体试验操作遵循试剂盒说明书进行。 2.4. 酶联免疫吸附测定 装有dECM的离心管中加入0.02 mol/L的醋酸溶液并密封，在4℃条件下，利用涡旋分散仪处理10 min，经过低温离心机离心3 min (1500 r/min)收集上清液，未充分分散的dECM再次加入醋酸溶液重复上述操作直至分散完全，获得的dECM分散液全程保存在4℃条件下以保护其中的活性物质。收集的dECM分散液转移到截留分子量为3 kD的超滤管，在4℃条件下，4000 rpm超滤30 min，进行浓缩。再次通过低温离心机离心20 min (2500 r/min)并取上清液，利用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kits)测定其中的活性物质如COL-I、BMP-2、VEGF和骨钙素(OC)的浓度，具体操作遵循试剂盒说明书进行。 2.5. 含dECM的培养基中的细胞培养 经过超滤浓缩后的dECM分散液以体积比为0%、2%、4%、6%、8%、10%、14%、20%和30%与标准培养基配置为含不同浓度dECM分散液的培养基，BMSCs通过消化计数后以5 × 10 3 个/孔接种在24孔板中，待细胞完全贴壁后，用先前配置的不同培养基在标准培养条件下进行培养，每个浓度设置4个平行。利用MTT在培养了1、3、5、7天后测定细胞增殖的情况，利用试剂盒在培养7天后对细胞分泌的ALP进行定性和定量的检测，操作步骤参见试剂盒说明书进行。在培养了28天之后，利用茜素红S对BMSCs形成的矿化结节进行染色。 2.6. dECM涂装的支架材料的构建 将PLGA以10%的比例溶解在三氯甲烷中，通过磁力搅拌器搅拌至完全溶解，将6倍于PLGA质量的粒径为35~48 μm的NaCl颗粒作为致孔剂加入PLGA溶液中，继续搅拌使致孔剂均匀分散在PLGA溶液中。将混合液加入到无水乙醇中，析出物放入不锈钢模具中，利用液压机在15 MPa压力下压制成直径为10 mm的圆柱体，自然晾干之后，在超纯水(UP水)中浸泡3天使支架材料中的致孔剂溶解在水中，期间每12小时更换一次UP水。PGA/PCL支架材料的制备除溶剂为六氟异丙醇和压制压力为10 MPa外，与PLGA支架材料的制备过程类似。去除致孔剂之后的支架经过自然晾干和液氮速冻后切割为厚度为1~2 mm的薄片材料备用。 薄片支架材料用75%乙醇浸泡并用紫外照射和臭氧联合灭菌处理之后放置在一个25 mL，配有带阀门的支口的玻璃反应管中，管口用装有10 mL分液漏斗的橡胶塞封住，支口与循环水真空泵相连，准备好的dECM分散液装在分液漏斗中。首先关闭分液漏斗的阀门，开启反应管支口的阀门，启动循环水真空泵，待真空泵的真空表指针到达−0.09 MPa时，轻轻旋动分液漏斗的阀门，让dECM分散液以1滴/秒的速度滴入反应管中，待支架材料完全被分散液浸没之后关闭分液漏斗的阀门并维持5 min，随后先关闭支管阀门再关闭真空泵，防止真空泵中的水回流到反应管内造成污染。断开支管与真空泵的连接之后，缓慢打开支管阀门，使反应管内压力恢复常压，取出涂装之后的支架材料，在无菌干燥箱中干燥备用。 2.7. 支架与BMSCs的体外共培养 第二代的BMSCs经过消化计数后以5 × 10 3 个/孔接种在24孔板中，实验组每孔放入一个涂装了dECM的聚合物支架，对照组为没有涂装的聚合物支架，每组设置4个平行，在标准培养条件下用标准培养基进行培养，培养7天之后，利用ALP显色试剂盒和ALP活力检测试剂盒对BMSCs分泌的ALP进行检测，培养28天后，利用茜素红S对矿化结节进行染色。 2.8. 数据处理及统计学方法 MTT试验数据通过均一化处理，将酶标仪测定的光密度(OD)值换算成为细胞活力，ELISA试验数据利用试剂盒提供的标准样品绘制标准曲线，将测定的OD值换算为GFs浓度。数据采用SPSS 24.0统计软件包进行分析数据均数及标准差，组间比较采用单因素方差分析，P值<0.05为有统计学意义，柱状图由Origin2017软件包绘制。