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user: 3. 结果与分析 3.1. 实验结果 3.1.1. 红花转录组中EST-SSR的分布 在NCBI上搜索到红花的EST序列共41584条，大小为33.68 Mb。用SSR-HUNTER对拼装后的高质量Contigs进行SSR位点搜索，结果在红花转录组中发现了987个SSR位点。基序为二核苷酸的SSR位点中，TC和CT出现次数较多，以CG和GC为重复单位的位点并没有出现。三核苷酸基序在所有SSR位点中占比最多(66.8%)，其中以TTC、TCT、CTT、GAA为基序的位点出现的频率最高，未发现以CGT、GTT、GTC为基序的重复序列。三核苷酸比例最高反映了来自于基因表达序列的SSR的特征，因为三核苷酸的重复不会造成基因的移码突变带来的蛋白序列提前终止。四核苷酸基序中AATC和TTTC出现次数较其他重复单位多；五核苷酸基序中仅TTCAA出现2次，其余重复单位均只出现一次；六核苷酸基序的位点均为单拷贝(如图1所示)。 其中(a)为二基序的位点重复次数，(b)为三基序的位点重复次数，(c)为四基序的位点重复次数，(d)为五基序的位点重复次数。 图1. 不同基序的SSR位点分布 3.1.2. EST-SSR引物的筛选结果 根据拼装后的高质量Contigs序列利用Primer 3软件设计引物，选取96对引物进行引物合成和初步筛选。扩增结果显示共有35对引物可以扩增得到清晰的条带(如图2所示)。 图2. 96对SSR引物扩增结果 3.1.3. EST-SSR引物的多态性检测 根据可以扩增出清晰条带的35对引物的序列信息合成荧光引物，并对11个红花进行毛细管电泳扩增，部分扩增结果如图3所示，35对荧光引物的引物序列、多态性条带的条数以及扩增片段大小(bp)信息如表3所示。 35对荧光引物共计扩增出135条带，平均每对引物对扩增3.94条多态性条带。多态性最高的两对引物是26号和28号引物对，有效扩增条带数均为11条。15号引物对的多态性条带数为8个，16、17号引物对的多态性条带数为9个。其余引物条带数范围为2~4个。其中，扩增片段最小的是29号引物对的扩增结果(157 bp)，扩增片段最大的28号引物对的扩增结果(351 bp)。 Table 3 Fragment sizes of SSR primer amplificatio 引物编号 引物序列 多态性条带数 扩增片段大小(bp) 1 F-GGAAAACACACTGAGAAAGG R-TTAGTAGATGGATCCGGTTG 3 235~241 2 F-GACTGGGTTGCTGCTACTAC R-GTGCCTGCTTGATTATTACC 4 180~226 3 F-GACCATGCAATGGATAGTTT R-AATCAGCTGAGAAGTGGAAA 3 200~206 4 F-CGCATGAAGTTATCAGTCAA R-GTTACATGGTGAATGGCTCT 3 240~244 5 F-GATCAGAATGGTCGGAAATA R-AAGTAAGGCCAGACATCAAA 3 181~211 6 F-GAGTTCGAATCCAACAACAT R-TAGATCGCTAACCTCTGAGC 2 233~239 7 F-GATCTCTAACAACCCACCAA R-CATTGCCAACTTTCTCTCTC 4 204~213 8 F-CATGTAATGCCACGGTTT R-TTGAGATGTATGGACGTGTG 2 179~223 9 F-TTTCGCTCCTTGTAGTTTGT R-AGCAACAAAAGCAGGTGTAT 2 238~239 10 F-AGTGAGGATTGAATTGGTTG R-TCACCTTGCCGTCTATAGTT 3 222~224 11 F-CAAGTGTGTGTGTCAGATCC R-ATCTGTCGTGCTTTTACTGC 4 229~290 12 F-GACGAATCTTGATCTCTCACA R-GTGATGGATGGCATAAGAGT 4 176~192 13 F-CTTCCACGCCAAATACTATC R-AATTGAGCAAAGAGAGTGGA 3 203~210 14 F-TCACCAAACCCTATCTCATC R-ATAGCAGTAATTGGCGTCAT 3 173~181 15 F-ACTATGTAGCCTGCTTTGGA R-AGAGATAGGTGGTGATGACG 8 201~222 16 F-ACTATGTAGCCTGCTTTGGA R-AGAGATAGGTGGTGATGACG 9 198~219 17 F-TTTCACGAGCTCTCTCTCTC R-AAGTGAAGCTTGCTTTTACG 9 227~285 18 F-AAAAGCAAGCTTCACTTCAC R-CCAAAACCTCAAACTCACAT 3 231~260 19 F-GCACCAAATATCTCATTTCC R-CGAAGTCAAAATCACATCAG 3 239~259 20 F-AATACCCCTCGCTCACTATT R-CTACAAAAGCAACCAAAAGG 3 224~237 21 F-AGACAACAACAACAACAACG R-GTGAAATCGTTGAGAGGAAG 3 221~234 22 F-TCCATGTAACAGAGTTGCAG R-GATTTTGTCCTTCCAGTTGA 1 168 23 F-TCTCCTTCTACCTCCTCCTC R-GTCCGTATTTGGATTTGAAG 3 198~213 24 F-CTTCAACTCCACTTCACCAT R-TTCGAAGTCATAAACGAGGT 2 180~182 25 F-CAGGAAGATCCACTTCAAGA R-CACCACATAGAAACACCTGA 3 258~260 26 F-TGCTATTCTCCTCCCTCTCT R-ACGTGAGATTGCTGAAGATT 11 182~218 27 F-CTTGCTGACACCCACTTACT R-CCTCTTCAAATAGACGTGGT 4 162~184 28 F-ATGTATGCCCTGCTAACAAT R-AATCGATCGTGAAATCTCTG 11 204~351 29 F-GTTGTAAGCAAGCTCCAAAT R-TGAATTAGGGAAGAAGGATG 3 157~168 30 F-AACAAGAAGAGAGCACTGGA R-GTCGAAAGAGGCAAAGATT 2 209~222 31 F-TTCGAGATAGTTCGATTCGT R-ACTTGATTGTGATCGTTTCC 4 243~252 32 F-ATTAGTCCCACCACAACAAC R-CGAGATGGAGACATGAGATT 3 222~230 33 F-GGACCAATCCTATGTAAGCA R-TCTACACCTTCCCAATCATC 2 238~266 34 F-TAAAGTCCTTGCCTTTGTTG R-GATGGATTGCAGAGATGAAT 3 224~226 35 F-TGCTCCGACCTATTTGTACT R-TTGATGTCGATGTAGGTGAA 2 196~202 表3. SSR引物序列及其扩增片段大小 图3. 编号为22，26，28号引物对部分的电泳结果 (a)为22号引物对对1号红花的扩增结果的峰图；(b)为26号引物对对6号红花的扩增结果的峰图；(c)为28号引物对对10号红花的扩增结果的峰图，图3中的峰值的高低与荧光强度有关，达阈值后确定为有效峰，代表该扩增片段的大小为有效扩增。对于扩增片段的大小则采用GeneMapper 4.0将扩增得到的原始数据与内标相比较来确定。 3.1.4. 红花的农艺性状统计结果 如图4所示，11个不同品种的红花中出现4种不同的花色，分别为红色、黄色、白色和桔红色。开红花的品种来源为云南省，开白花的品种来源为印度。开黄色花品种数较多，来源为土耳其，印度，中国新疆、辽宁省和云南省。而桔红色花的品种则来源于甘肃省和云南省。来源于甘肃省的17H14和云南省的17H21的苞叶性状为无刺但是叶片性状为有刺，其余品种的叶片刺和苞叶刺的性状均为同时有刺或者同时无刺。来源于云南省的17H20的基生叶缘性状为深裂型，其他品种的基生叶缘性状主要包括全缘和浅裂。 图4. 11种红花的开花图片 数量性状的统计如表4所示。11个红花品种的出苗期为6~9天，开黄色花的红花品种出苗天数浮动较大，开红色花、白色花和桔红色花的品种的出苗期均为6天。在11个红花品种的单株花果数统计结果中，单株花果数最少的品种是17H25，平均每株只有5个花果。单株花果数最多的品种是17H20，平均每株花果数为52个。植株株高最高的品种为来源于云南省的17H16，平均高度为139 cm，而株高最低的品种为新疆的17H11，平均株高约81 cm。红花一级分枝数的数量范围为5~30个，二级分支数的数量范围为7~54个。离地高度最低的一级分枝的高度范围为0 cm~95 cm，在离地高度最低一级分支的比较中，离地高度最低的品种为17H20，离地高度最高的品种为17H14。具有离地高度最高的一级分枝的高度范围为48 cm~113 cm，在离地高度最高一级分支的比较中，离地高度最低的品种为17H20，离地高度最高的品种为17H21。 3.1.5. 红花叶片的光学显微镜观察结果 红花叶片的光学显微镜观察结果如图5所示，17H20与其余红花品种差异较大，其特征为叶片的上表面间隔生有刺，栅栏组织细胞结构相比其余品种相对松散，其余10个品种的红花的表皮细胞均排列规则，大小比较一致。栅栏组织细胞共2层，排列结构相对比较紧密。所有材料的海绵组织结构疏松，结构差异不大。细胞结构紧密度范围为53.8%~67.4%，细胞结构疏松度范围为21.47%~29.28%，细胞结构紧密度最高的是17H25，来源于云南省，细胞结构疏松度最高的是17H14，来源于甘肃省。11个的红花叶片厚度范围为241.98 μm~321.33 μm，其中，17H14的叶片厚度最小，17H25叶片厚度最大。红花叶片的角质层厚度范围为1.94 μm~5.65 μm，其中，17H14的角质层厚度最小，17H25角质层厚度最大。叶片上表皮厚度范围为11.30 μm~20.56 μm，下表皮厚度范围为9.94 μm~15.56 μm。其中，17H25具有最厚的叶片厚度和角质层厚度，而且细胞结构紧密度也是最高的。17H14叶片和角质层最薄，疏松度也最高。红花叶片横切面结构如图2所示，具体统计结果如表5所示。 Table 4 Statistics of agronomic traits of 11 safflower 实验编号 来源 花色 叶片刺 苞叶刺 基生叶缘 出苗期 (天) 花果数 (个) 株高 (cm) 一级 分枝数 二级 分支数 最低一级 分枝高度 (cm) 最高一级 分枝高度 (cm) 17H01 土耳其 黄 有刺 有刺 全缘 6 6 94 6 7 42 73 17H05 印度 黄 有刺 有刺 全缘 9 17 104 5 17 58 70 17H08 印度 白 有刺 有刺 浅裂 6 11 113 5 15 65 84 17H09 印度 白 有刺 有刺 全缘 6 11 106 6 10 70 81 17H10 新疆 黄 有刺 有刺 全缘 8 26 133 10 25 70 94 17H11 新疆 黄 有刺 有刺 全缘 6 7 81 5 7 55 61 17H14 甘肃 桔红 无刺 有刺 浅裂 6 13 133 5 12 95 107 17H16 辽宁 黄 有刺 有刺 浅裂 6 31 139 7 25 80 93 17H21 云南 红 无刺 有刺 浅裂 6 5 130 23 44 48 113 17H25 云南 桔红 有刺 有刺 全缘 9 22 111 9 24 67 79 17H20 云南 黄 有刺 有刺 深裂 8 12 131 30 54 0 48 表4. 11个红花的农艺性状统计 图5. 11种红花的叶横切面结构 其中，图5中所有图片的放大倍数均为200倍，(a) = 17H01，(b) = 17H05，(c) = 17H08，(d) = 17H09，(e) = 17H10，(f) = 17H11，(g) = 17H14，(h) = 17H16，(i) = 17H21，(j) = 17H25，(k) = 17H20。 Table 5 Statistics of anatomical structures of leave 编号 原产地 角质层厚 (μm) 叶片厚 (μm) 叶中脉厚 (μm) 上表皮厚 (μm) 下表皮厚 (μm) 栅栏组织 厚度 (μm) 海绵组织 厚度 (μm) 紧密度(CTR) 疏松度(CSR) 17H01 土耳其 4.58 285.81 28.88 12.84 9.94 182.83 75.63 64.0% 26.46% 17H05 印度 3.29 288.36 16.24 11.3 10.37 185.13 78.27 64.2% 27.14% 17H08 印度 3.29 276.04 35.88 14.28 15.56 164.93 77.98 60.0% 28.25% 17H09 印度 3.83 277.90 32.55 17.09 13.48 165.01 78.51 59.4% 28.25% 17H10 新疆 3.19 248.96 30.39 16.53 14.61 146.35 68.27 58.8% 27.42% 17H11 新疆 3.9 263.57 25.33 14.65 13.79 159.65 71.59 60.6% 27.16% 17H14 甘肃 1.94 241.98 28.18 14.11 11.05 130.136 84.73 53.8% 35.02% 17H16 辽宁 3.46 274.26 27.34 15.86 11.82 177.03 66.08 64.5% 24.09% 17H21 云南 3.45 279.3 33.35 16.02 12.1 182.026 65.71 65.2% 23.53% 17H25 云南 5.65 321.33 27.46 13.7 15.51 216.73 68.99 67.4% 21.47% 17H20 云南 3.47 266.12 18.2 20.56 12.79 151.31 77.89 56.9% 29.28% 表5. 叶片的解剖学形态统计 3.1.6. 红花种子的含油率和脂肪酸组成测定结果 如表6所示，11个品种的红花种子的种壳除17H20外为黄色外，其余品种种壳均为白色，红花种子的长度范围为5.000 mm~8.714 mm，宽度范围为3.420 mm~4.839 mm，种子长度最大的是17H14，种子宽度最大的是17H01，种子长度和宽度最小的均为17H20。种子的长宽比例最大的是17H11。在红花种子的百粒重统计中，种子重量的范围是1.415 g~4.750 g。17H20的质量最小，质量最大的是17H25。在本实验中的11个红花种子的大小和长宽比都表现出一定的差异。研究中编号为17H25的品种的百粒重最大，但是种子的长度和宽度是所有栽培红花中最小的，种子的密度较大。 11个红花品种的种子含油率范围为13.20413%~20.69606%。平均含油率为17.24409%。其中含油率最高的是17H10，含油率最低的是17H11，两个品种均来源于新疆。17H21，17H25，17H20均来源于云南省，四个品种的含油率分别为13.6836%，15.35505%，17.55138%和19.50467%。两个来源于印度的红花品种(17H08，17H09)含油率分别为16.70813%和17.24753%，相对比较接近。从红花种子的脂肪酸组成来看，所有红花的脂肪酸的组成均以C16:0 (棕榈酸)和C18:0 (硬脂酸)，C18:1 (油酸)，C18:2 (亚油酸)为主，其中亚油酸所占比例最大，是红花脂肪酸中最主要的成分。在11个品种的红花脂肪酸组成中，不饱和脂肪酸所占的比例远高于饱和脂肪酸的比例。其中，17H20的C16:0 (棕榈酸)比例最高(10.150%)，17H16的C16:0 (棕榈酸)的比例最低(3.057%)。17H20的C18:0 (硬脂酸)比例最高(4.530%)，17H16的C18:0 (硬脂酸)的比例最低(1.577%)。17H20的C18:1 (油酸)比例最高(22.016%)，17H16的C18:1 (油酸)比例最低(8.930%)。17H16的C18:2 (亚油酸)比例最高(83.450%)，17H20的C18:2 (亚油酸)比例最低(62.092%)。C18:3只在部分品种的红花中被检测到，其中具有最高C18:3含量的是17H11。17H20的C20:0 (花生酸)比例最高(0.623%)，17H10的C20:0 (花生酸)比例最低(0.258%)。17H20的C22:1 (鲸油酸)比例最高(0.239%)，而在17H08中没有检测到C22:1 (鲸油酸)。 Table 6 Oil content and fatty acid composition of 11 cultivars of safflower 编号 种壳颜色 长度(mm) 宽度(mm) 长宽比 百粒重(g) 含油率 C16:0 (%) C18:0 (%) C18:1 (%) C18:2 (%) C18:3 (%) C20:0 (%) C20:1 (%) C20:2 (%) C22:1 (%) 17H01 白色 7.818 4.839 1.62:1 4.160 20.20346 6.105 2.334 12.388 78.327 0.000 0.305 0.120 0.260 0.160 17H05 白色 7.534 4.558 1.65:1 3.950 19.50467 5.787 2.062 10.449 80.790 0.040 0.272 0.116 0.310 0.174 17H08 白色 7.526 4.238 1.78:1 2.690 16.70813 5.441 2.080 12.638 79.021 0.087 0.261 0.123 0.349 0.000 17H09 白色 7.398 3.976 1.86:1 2.550 17.24753 5.302 2.104 10.392 81.240 0.061 0.302 0.110 0.315 0.174 17H10 白色 7.440 4.148 1.79:1 3.695 20.69606 5.491 1.955 8.374 83.353 0.034 0.258 0.095 0.306 0.133 17H11 白色 8.472 4.210 2.01:1 3.675 13.20413 5.794 1.916 8.942 82.432 0.095 0.276 0.105 0.302 0.138 17H14 白色 8.714 4.458 1.95:1 3.675 18.28973 4.827 1.702 17.253 75.237 0.000 0.264 0.158 0.258 0.300 17H16 白色 6.886 3.924 1.75:1 3.640 17.24034 4.640 1.577 8.930 83.450 0.035 0.292 0.164 0.360 0.553 17H21 白色 6.900 4.634 1.49:1 3.645 15.35505 5.405 2.393 12.604 78.826 0.000 0.271 0.119 0.257 0.126 17H25 白色 6.314 3.656 1.73:1 4.750 17.55138 6.421 2.072 10.291 80.308 0.000 0.308 0.136 0.283 0.182 17H20 黄色 5.000 3.420 1.46:1 1.415 13.68448 10.150 4.530 22.016 62.092 0.000 0.623 0.068 0.281 0.239 表6. 11种红花的含油率和脂肪酸比例 3.2. 红花的聚类分析与相关性分析 3.2.1. 红花EST-SSR的聚类结果 红花EST-SSR的聚类结果如图6所示，17H05，17H08，17H09 (印度来源的红花)与17H01 (土耳其)，17H14 (甘肃)，17H16 (辽宁)，形成一个大的分支；17H10 (新疆)，17H21 (云南)形成第二个分支；17H11 (新疆)和17H25 (云南)形成第三个分支；17H20 (云南)表现出与其它红花具有较远的亲缘关系。从分子水平上，EST-SSR反映了这11个品种之间的遗传距离。虽然似乎并不与来源地完全匹配，这可能暗示了11个品种在引种入中国后记载的混乱。 图6. 11个品种红花的EST-SSR聚类结果 3.2.2. 红花性状的聚类结果 农艺性状的调查聚类结果显示3个印度的品种(17H08，17H09，17H05)与云南省的品种17H25被聚类在类群I中，类群II中包括17H01与17H11，两个品种分别来自土耳其和新疆；来自新疆的17H10和来自辽宁的17H16被聚类在类群III中，来源于甘肃省的17H14，独自划分为类群IV，类群I和类群II的关系较近，类群III和类群IV的关系较近；来源于云南省的17H21单独被划分为类群V；而17H20则显示出与其余10个品种红花较远的关系(类群VI) (图7(a))。 叶片形态的观察聚类结果显示来源于印度的17H08、17H09包含在类群I中，来源于新疆的17H11、来源于云南的17H20包含在类群II中。类群III中包括来源于辽宁省的17H16和云南省的17H21。17H01和17H05分别来自土耳其和云南省，它们为聚类为类群IV，类群I和类群II关系较近，类群III和IV的关系也比较接近。类群V则包括来源于新疆的17H10和来源于甘肃省的17H14。来源于云南的17H25被独立划分至类群VI (图7(b))。 图7. 11个品种的红花性状的聚类结果 种子的大小、含油率和脂肪酸组成的聚类结果显示类群I包括印度红花17H08，云南红花17H21和土耳其红花17H01，类群II中包括印度17H09，云南红花17H25和17H05，辽宁红花17H16以及新疆红花17H10，类群III中只有新疆红花17H11，类群IV中只包括甘肃红花17H14。17H20被单独划分至与其余10个品种红花较远的分支(类群V) (图7(c))。 其中，(a)为红花的农艺性状聚类结果，(b)为红花的叶片形态学数据的聚类结果，(c)为红花的种子的大小、含油率和脂肪酸组成的聚类结果。 3.2.3. 红花性状的相关性分析 如表7所示，C16:0脂肪酸比例与最低一级分支高呈显著负相关、与最高一级分支高呈极显著负相关，C18:0脂肪酸与最低一级分支高呈极显著负相关。C20:0脂肪酸的比例与角质层厚度呈极显著相关，与最高一级分支高呈显著负相关。C20:2脂肪酸与C18:1脂肪酸、C18:2脂肪酸呈显著相关性，而且C18:2脂肪酸与C18:1脂肪酸呈极显著负相关。C22:1脂肪酸与叶中脉厚度呈显著负相关，与花果数数呈显著相关性。红花种子的含油率与种子的百粒重呈显著相关性。