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user: 3. 结果与讨论 3.1. 不同蛋白酶对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物 DPPH自由基清除率的影响研究 不同蛋白酶对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响结果如表3所示。 从表中可以看出，在加酶量为3000 U/g的条件下酶解1 h，3种蛋白酶的酶解产物均有一定的抗氧化活性，以碱性蛋白酶作用效果最佳。在碱性蛋白酶作用下，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度为18.48%，获得的玉米胚芽粕清蛋白水解物对DPPH清除率达到29.71%。因此确定碱性蛋白酶为酶解玉米胚芽粕醇溶蛋白制备抗氧化肽的最佳蛋白酶。 3.2. 酶解温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物 DPPH自由基清除率的影响研究 不同酶解温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响结果如图1所示。从图1可以看出，温度在30℃~ 50 ℃ 范围内，DPPH自由基清除率和水解度均呈先上升后下降的趋势，随着温度逐渐升高，酶活增强，促进底物水解。当温度为 35 ℃ 时，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度和DPPH清除率均达到最高，分别为24.46%和34.48%。随着温度的升高，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率均呈下降趋势。其原因可能是由于温度升高，酶部分 变性，酶活降低导致酶水解玉米胚芽粕醇溶蛋白能力下降，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度降低；而随着温度的升高，可能使部分玉米胚芽粕醇溶蛋白肽变性，导致玉米胚芽粕醇溶蛋白肽DPPH自由基清除率下降。 Table 1 The optimal conditions of enzymatic hydrolysi pH 温度/℃ 酶活 加酶量 胰蛋白酶 3.5 45 18777.715 U/g 11.64 mg 中性蛋白酶 7 50 36491.105 U/g 5.67 mg 碱性蛋白酶 9 55 118830 U/mL 1.74 μL 表1. 酶水解的最适条件 Table 2 The scheme of factors level cod 因素 编码 水平编号 −1 0 1 pH X 1 6 8 10 酶解温度/℃ X 2 30 40 50 酶解时间 X 3 60 105 150 表2. 因素水平编码表 Table 3 Effects of different proteases on the DH of corn germ meal gliadin and its free radical scavenging rate of DPP 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 胰蛋白酶 DH/% 18.48 17.12 9.35 DPPH清除率/% 29.71 23.06 12.53 表3. 不同蛋白酶对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响 图1. 酶解温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响 3.3. pH对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物 DPPH自由基清除率的影响研究 不同酶解温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响结果如图2所示。从图2可以看出，pH在6~10范围内，随着pH值的升高，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度逐渐增大，当pH值达到9时，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度达到最大值23.52%，再升高pH值，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度反而下降，因此，在pH值为8时，酶水解玉米胚芽粕醇溶蛋白肽键作用最强。同时，随着pH值的升高，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率先下降，其原因可能为随着pH值的升高，玉米胚芽粕醇溶蛋白肽的氨基、羧基的解离程度反而下降，导致DPPH自由基清除率下降；当pH值达到9时，此时玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度达到最大，溶液中暴露在外的氨基、羧基数量增加，同时在此pH值条件下，暴露在外的氨基、羧基也容易解离释放出H + [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] ，从而使玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率在pH值为9时达到36.36%；再升高pH值，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率下降，其原因可能是：(1) 由于玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度下降，溶液中暴露在外的氨基、羧基数量减少；(2) 在pH 10条件下，玉米胚芽粕醇溶蛋白肽的氨基、羧基的解离程度下降。 3.4. 酶解时间对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物 DPPH自由基清除率的影响研究 不同酶解时间对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影 响结果如图3所示。从图3可以看出，随着时间的延长，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率均有所增加，当酶解时间达到90 min时，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度达到24.18%，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率达到37.19%。时间再延长，玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率增加不明显，从生产效益角度考虑，酶解时间选择90 min。 3.5. 响应面试验结果分析 3.5.1. 响应面优化玉米胚芽醇溶蛋白抗氧化肽制备工艺研究 由单因素实验结果可知，水解度与玉米胚芽粕醇溶蛋白肽DPPH自由基清除活性并不呈现正相关性，同时由于本实验的目的是为了获得具有高DPPH自由基清除活性的玉米胚芽粕醇溶蛋白肽。因此，依据单因素实验结果，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以DPPH自由基清除率为响应值，选取pH值(X 1 )、酶解温度(X 2 )和酶解时间(X 3 )三个因素，通过建立响应面模型，对响应面模型结果进行方差分析，优化玉米胚芽粕醇溶蛋白抗氧化肽的制备工艺。实验结果如表4所示。 3.5.2. 模型建立及显著性分析 利用Design-Expert实验设计软件，对以上17组结果进行相应的分析。应用Box-Behnken对试验结果进行方差分析见表5及模拟多远响应回归模型，得出的方程为： 由表5可知，P > F值小于0.001，表明模型是显著的，说明该实验所采用的二次模型是非常显著的，在统计学上来说是有意义的。模型的绝对系数为R 2 = 0.9535，这表明该模型能解释95.35%的响应值变化。因此此模型拟合程度较好，实验误差较小，与实际情况吻合，可以用该模型对玉米胚芽粕醇溶蛋白抗氧 图2. pH对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响 图3. 酶解时间对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解度及玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH自由基清除率的影响 Table 4 Experimental design and result analysis of response surface methodology for optimization of preparation technology of antioxidant peptide from corn germ protei 试验号 因素 DPPH清除率/% X 1 X 2 X 3 1 −1 0 −1 17 2 0 0 0 40 3 0 −1 1 25 4 0 0 0 40 5 −1 1 0 17 6 0 0 0 40 7 0 0 0 40 8 0 1 1 22 9 0 0 0 40 10 1 1 0 34 11 1 0 1 25 12 1 0 −1 25 13 0 0 0 29 14 0 −1 −1 17 15 −1 −1 0 14 16 1 −1 0 30 17 0 1 −1 30 表4. 响应面优化玉米胚芽醇溶蛋白抗氧化肽制备工艺试验设计与结果分析 化肽提取效果进行分析和预测。因素X 2 酶解温度的P值为0.0007 < 0.0001，说明因素X 2 酶解温度对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH清除率的影响是极为显著的，而的X 1 二次方，X 2 的二次方，X 3 的二次方的P值均小于0.05，说明X 1 、X 2 、X 3 对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH清除率均有显著影响。交互项X 1 X 2 、X 1 X 3 、X 2 X 3 的P值也均大于0.05，所以交互项对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH清除率影响也不大。 3.5.3. 响应面分析 各因素之间的交互作用如图4所示。 Table 5 Variance analysis of regression mode 变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P > F 显著性 模型 1317.99 9 146.44 15.9543 0.0007 显著 X 1 18.00 1 18.00 1.9666.50 0.2041 --- X 2 300.13 1 300.13 32.70 0.0007 --- X 3 3.13 1 3.13 0.34 0.5779 --- X 1 X 2 0.000 1 0.000 0.000 1.000 --- X 1 X 3 4.00 1 4.00 4.00 4.00 --- X 2 X 3 0.25 1 0.25 0.027 0.8736 --- X 1 2 277.96 1 277.96 30.28 0.0009 --- X 2 2 497.96 1 497.96 54.25 0.0002 --- X 3 2 121.64 1 121.64 13.25 0.0083 --- 残差 64.25 7 9.18 --- --- --- 失拟 64.25 3 21.42 --- --- --- 纯误差 0.000 4 0.000 --- --- --- 总和 1382.24 16 --- --- --- --- 表5. 回归模型的方差分析 图4. 各因素交互作用对玉米胚芽粕醇溶蛋白水解物DPPH清除率的影响 Table 6 Verification tes 序列号 1 2 3 DPPH清除率(%) 36.36% 40.22% 36.09% 水解度DH (%) 23.52 20.58 20.58 表6. 验证试验 由Design-Expert实验设计软件输出结果显示出的三维图像中可以看出，DPPH清除率的影响因素对应的影响程度大小依次为A > C > B，即酶解温度 > 酶解时间 > pH，最终得出的碱性蛋白酶酶解玉米胚芽醇溶蛋白获得玉米胚芽醇溶蛋白抗氧化肽的最优条件为酶解温度40℃，pH 8，酶解时间105 min。 3.6. 制备玉米胚芽抗氧化肽验证性试验 根据所得出的最优条件，进行3次验证试验，验证试验结果如表6所示。实验结果表明：在加酶量为3000 U/g，pH为8.0，酶解温度40℃，酶解时间分别105 min条件下，玉米胚芽醇溶蛋白水解度(DH)高达21.56%，酶解产物相应的DPPH自由基清除率37.55%。