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user: 5. 甜瓜白粉病的抗性鉴定及分子标记辅助育种 开展甜瓜抗白粉病品种选育，必然涉及对白粉病抗病性的鉴定。从已有的报道看，进行白粉病抗病性鉴定的寄主材料一般采用幼苗或离体圆叶片，病原物的接种采用孢子悬浮液接种法 [ 41 ] 和风媒(气流)接种法 [ 42 ]。但是，在甜瓜白粉病抗性鉴定中有两个较复杂的问题：一是白粉病病原菌只能采用活体保存，不能进行离体保存，这给白粉病抗病性鉴定带来不便；二是由于只能采用活体保存白粉病的病原菌，使得接种时或病原菌获得后难以进行病原菌生理小种的鉴定，从而只有在借助鉴别寄主的条件下，确定白粉病病原菌是一个生理小种还是两个或更多个生理小种，这样，鉴定结果将受白粉病病原物的影响。这可能是在甜瓜白粉病抗性鉴定、抗性遗传研究结果中出现不同观点的原因之一。 鉴于上述问题，近年来，一些研究者开始采用分子标记辅助育种的手段开展甜瓜抗白粉病品种的选育研究，以提高抗病育种效率 [ 43 ]。利用与甜瓜白粉病抗性共分离的分子标记可以对甜瓜的基因型进行准确的选择。根据抗白粉病基因的已知序列或者与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记的序列设计特异性引物，通过PCR反应对该基因的有关区域进行特异性扩增，进而可以准确地筛选抗病甜瓜植株 [ 44 ]。目前，在甜瓜抗病育种中常用的标记方法有 RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SRAP、CAPS等(见表3)。 Table 3 Molecular markers linked to powdery mildew resistance genes in Melo 实验方法 标记 连锁的抗性基因 出处 RAPD pUBC411 QTL位点 McGrath M T 2001 [ 45 ] RAPD RAPD-S329 - 王建设等2005 [ 42 ] AFLP M75/H35-155 Par 1 Teixeira A P M et al. 2008 [ 46 ] AFLP E42M50 对PX-1，2，5小种有抗性的基因 Yuste-Lisbona F J 2008 [ 47 ] AFLP E38M82 对PX-1，2，5小种有抗性的基因 Yuste-Lisbona F J 2008 AFLP M60/E25-520 - 王怀松等2009 [ 48 ] ；程振家2006 SSR CMBR120 对PxA有抗性的QTL位点 Fukino N et al. 2008 SSR CMBR8 对PxA有抗性的QTL位点 Fukino N et al. 2008 [ 49 ] SSR CMBR111 对PxB有抗性的QTL位点 Fukino N et al. 2008 SSR CMBR120-172 Par2F 张海英等2008 [ 50 ] SSR CMBR8-98 Par2F 张海英等2008 SSR CSAT42598 PMR5抗性基因 王强2009 [ 51 ] SSR SSR04816 对PX小种1有抗性的基因 马鸿艳2011 SSR SSR01498 对PX小种1有抗性的基因 马鸿艳2011 RGA RPW ParAN Wang X et al. 2011 [ 52 ] RGA MRGH63B ParAN Wang X et al. 2011 SRAP me46em51 — 赵光伟等2010 [ 53 ] SRAP me3em6 — 赵光伟等2010 CAPs 李冰2017 [ 34 ] 表3. 甜瓜白粉病抗性基因连锁的分子标记 Wang等对Ano2 × Hami413和Ano2 ×Queen 2杂交组合，包括SSR标记、GRA标记和AFLP标记，在抗病材料Ano2中定位出抗病基因Pm-AN。王建设等(2005)以1A151(抗) × 恒进红瓤酥(感)构建6个世代群体，运用RAPD分子标记结合抗性遗传分析找到1个由1对不完全显性抗病基因控制的抗病位点S329，其遗传距离为6.81 ± 1.67 cM。Yuste-Lisbona等利用AFLP对抗病材料TGR-1551和感病材料Bola de Oro配制杂交组合构建分子标记体系，构建出1张包含14个连锁群的遗传图谱，定位主效QTL位点Pm-R第五连锁群上 [ 47 ]。Teixeira等使用AFLP法在抗病材料AF426-R中找到与抗病基因Pm-1距离为4.9 cM 的分子标记M75/H35-155 [ 46 ]。Fukino等利用高抗AR5和高感Harukei配制重组自交系，定位抗病基因于第II和第VII染色体连锁群上。Liu等在抗性材料PI 134198中发现了1个单显性抗性基因，并且在距离该基因3.9 cM处获得了1个SRAP标记。Ning等用抗病材料Edisto47和感病材料Queen构建BC1群体，发现抗病基因Pm-Edisto47-1在SSR标记CMGA36和SSＲ252089之间，与两标记距离均为2.1 cM。艾子凌(2016)研究发现抗病材料MR-1所含有的甜瓜白粉病基因为单显性基因。×Topmark (感病)所构建的F2代群体进行分析，检测到1个与白粉病抗性有关的位点，位于7号染色体上，距离上端7-4E标记17.00 cM，距离下端7-1H标记12.35 cM，为今后甜瓜白粉病抗性基因的精细定位及克隆奠定了基础 [ 54 ]。由此可见使用抗病材料不同也会导致抗病位点不同。法国perin等完成了品种Védrantais × PI 161375和Védrantais × PI 414723杂交组合形成的重组自交系，并将Pm-x定位于第II连锁群，Pm-w定位于第V连锁群，nsv与Pm-y定位于第XII连锁群 [ 55 ]。法国Perchepied等通过PI 124112×Védrantais杂交产生的群体，经数量性状作图，表明2个独立的基因对甜瓜白粉病均具有抗性，分别位于第II、V连锁群，并且可能与Pm-x和Pm-w一致 [ 56 ]。日本Fukino绘制了AR5 × Earl’s Favourite遗传群体的抗白粉病基因的QTL遗传图，分别在第Ⅱ与第Ⅻ连锁群发现抗白粉病位点，也可能与Pm-X和Pm-y一致 [ 49 ]。韩瑞(2013)前期已利用抗病材料AN分别与新疆甜瓜感病品种“皇后”、“K413”建立杂交遗传群体，并将该抗白粉病基因定位在第Ⅴ连锁群，位于2个共显性分子标记AF与CA之间，这个抗病基因可能与Pitrat发现的第V连锁群的Pm-w相同 [ 57 ]。王贤磊(2014)以甜瓜白粉病抗性品种PMR5，感病甜瓜“伽师”的杂交F1以及BC1、BC2分离群体为试材，接种白粉菌生理小种1，利用SSR分子标记方法，共有11个位于LGII的SSR分子标记与抗白粉病基因连锁，抗病基因位于标记CMGA36和SSR25208之间约104 - 113 bp [ 58 ]。李冰(2017)以甜瓜高抗白粉病自交系MR-1为母本，易感白粉病自交系Top Mark为父本，构建BC1P2和F2群体，用生理小种1感染，甜瓜MR-1对P. xanthii生理小种1的抗性由单显性基因控制。通过CAPS标记分析，将抗病基因PXR定位在第12号染色体上M12-GH和M12-TE 2个标记之间，4个基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457为甜瓜白粉病抗病候选基因 [ 34 ]。宁雪飞(2013)利用SSR (Simple Sequence Repeat)分子标记技术，对甜瓜抗性基因进行定位。结果：① 抗性亲本PMＲ45和Km7符合单显性基因的遗传规律抗性亲本Edisto47和红心脆(HXC)均不符合单基因遗传规律，其中Edisto47构建的群体符合双基因的遗传规律② 抗性亲本PMR45和Km7的抗性基因定位于LGII。抗性亲本HXC含有两个抗性基因位点，位于LGV和LGXII上 [ 59 ]。王晓娟(2012)以甜瓜抗白粉病品种‘PMR5’、感病品种‘黄河蜜3号’及其杂交的F2代群体为材料，采用SSR标记筛选标记并定名为CSAT42598 [ 60 ]。 分子标记还应用于甜瓜白粉病致病菌S. fuliginea和E. cichoracearum的遗传多样性分析。检验葫芦科白粉病病原菌群体的遗传差异、致病性和交配类型等。Bardin等(1997)对来自不同国家地区、不同寄主、生理小种分别是0、1、2的28个S. fuliginea菌株进行毒性差异、交配类型及DNA多态性的测验。1994年Bardin等还对法国5个地区、不同寄主、生理小种分别是0、1的41个E. cichoracearum菌株的遗传结构、致病力、交配类型进行ITS-RFLP、RAPD标记分析，对白粉病致病菌的致病性有更深层次的认识 [ 61 ]。目前，已经有5种白粉病菌进行了基因组测序 [ 62 ]。