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user: 3. 自噬与ADPKD 目前有研究表明自噬与某些肾脏疾病如急性肾损伤、糖尿病肾病和多囊肾病的病理进程相关。然而，对于自噬如何发挥作用仍在探究之中。 常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease， ADPKD)由Pkd1或Pkd2基因的突变引起，两个基因分别编码多囊蛋白1 (polycystin-1， PC1)和多囊蛋白2 (polycystin-2， PC2)。Pkd1突变约占ADPKD患者的80%~85%，而Pkd2占15%~20% [ 7 ] 。PC1和PC2均定位于初级纤毛上，膜蛋白PC1可以与瞬时感受器电位(transient receptor potential， TRP)家族非选择性钙离子通道蛋白PC2相互作用，形成跨膜受体离子通道复合物，感受液体流动。液体流经肾小管上皮细胞的顶面使纤毛弯曲，并引发钙内流，继而诱发Ca 2+ 胞内的释放 [ 8 ] [ 9 ] 。而PKD患者由于基因突变使得纤毛感受液体流动异常，Ca 2+ 内流减少，通过刺激Ca 2+ 抑制的腺苷酸环化酶6或抑制Ca 2+ 依赖的磷酸二酯酶使得cAMP浓度增多，cAMP激活肾脏上皮细胞MAPK/ERK等信号通路，促进细胞异常增殖，并增加液体分泌，进而导致囊泡的形成和生长 [ 10 ] 。 囊泡的生长机制涉及到mTOR、血管加压素、环腺苷酸、生长因子、caspases和凋亡等 [ 11 ] ，这些信号通路也参与自噬和凋亡的调节。抑制囊泡的化合物如mTOR抑制剂、二甲双胍 [ 3 ] 、雷公藤甲素 [ 12 ] 和姜黄素 [ 11 ] 等也是自噬的诱导剂。因此，PKD的病理机制与自噬之间存在密切联系。以下主要从PKD动物模型中自噬的缺陷以及自噬与凋亡、mTOR信号通路和纤毛功能之间的关系等方面进行讨论。 3.1. PKD动物模型中的自噬缺陷 在ADPKD中由于囊泡扩张，组织存在局部低氧。ADPKD终末期肾病患者红细胞生成素水平升高，肾脏囊泡表皮细胞缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α)表达亦升高 [ 13 ] 。而自噬能被生理刺激如低氧所诱导 [ 14 ] 。 Belibi等通过电镜、免疫荧光和免疫印迹法检测LC3-II和BECN1，观察到大鼠和小鼠的多囊肾中自噬的存在，同时也探究了HIF-1α与自噬的关系 [ 13 ] 。电镜可以观察到野生型大鼠和小鼠肾脏及Han:SPRD多囊肾大鼠和cpk多囊肾小鼠肾脏中均出现自噬体、线粒体自噬和自溶酶体。而自噬体在肾小管细胞中的存在并不意味着自噬增加。因此，作者又检测了一种调节自噬体形成和成熟的蛋白BECN1以及自噬的标志蛋白LC3-II，这两种蛋白在同源性Han:SPRD大鼠和cpk小鼠的PKD晚期表达增加，代表了自噬增强，同时HIF-1α在PKD晚期阶段表达也升高，表明其与自噬之间可能存在的联系。而在软骨细胞中HIF-1α表达沉默导致BECN1表达及自噬降低，说明增高的HIF-1α能诱导自噬 [ 15 ] [ 16 ] 。 溶酶体抑制剂菌丝霉素A1对于cpk小鼠肾脏LC3-II的水平并无影响，从而证明PKD的自噬缺陷源于自噬体–溶酶体的融合与降解受到阻滞。另外，在异源性Han:SPRD大鼠肾脏PKD的早期阶段出现凋亡，而LC3-II的水平并未增加，反而是在同源性PKD肾脏疾病的晚期阶段发现有增加。表明凋亡延缓了Han:SPRD大鼠PKD肾脏中自噬的发生。 3.2. PKD中凋亡和自噬的关系 在ADPKD囊泡的发生发展过程中，细胞凋亡发挥了重要作用。研究表明，凋亡促进了PKD囊泡的形成 [ 17 ] ：1) 凋亡的药理性抑制(使用caspase抑制剂治疗小鼠 [ 18 ] )或凋亡的基因抑制(Casp3敲除 [ 19 ] )导致PKD发生减少；2) Bcl2敲除小鼠凋亡增加，且在肾脏部位发生囊泡 [ 20 ] 。BCL2下调在人类白血病细胞中通过激活caspase诱发自噬 [ 21 ] 。另外，自噬的诱导可以被其他BCL2家族成员如BCL211/BIM，BAD和BCL2L1所调节 [ 22 ] 。目前还未发现Bcl2敲除小鼠的多囊肾中是否存在自噬。3) 凋亡对于1型胶原基质胶中MDCK细胞囊泡的形成十分重要，囊泡形成可由抗凋亡基因Bcl2的过表达所抑制 [ 23 ] ；4) 细胞周期抑制剂roscovitine致使囊泡形成受阻，且凋亡减少 [ 24 ] 。 近年来，有研究对PKD中突变的基因Pkd1与凋亡之间的关系进行了探讨，发现敲降Pkd1基因的细胞凋亡增加，且形成囊泡，而人类Pkd1基因的表达减缓囊泡增大并降低其细胞凋亡水平 [ 25 ] 。Rowe等研究了Pkd1基因、凋亡和自噬之间的关系 [ 26 ] 。野生型细胞经葡萄糖剥夺后LC3-II表达上调，且电镜观察到的自噬小体数目增加，表明激活自噬。而Pkd1敲降的细胞葡萄糖剥夺后并未激活自噬反应，而是凋亡应答增加。由于自噬效应部分依赖于mTORC1，因此用雷帕霉素处理细胞后可部分恢复自噬，且增加葡萄糖剥夺后的细胞存活率。这项研究表明Pkd1基因与自噬间的联系。Pkd1敲除细胞自噬减少和凋亡增加提示自噬减少与凋亡增加是PKD的一个特征。 而调节PKD中凋亡的许多信号分子如BCL2家族蛋白同时也调控自噬 [ 27 ] 。但对于细胞应对相似的刺激时，发生自噬还是凋亡目前尚未明确，如Caspase抑制剂抑制凋亡，但也诱发自噬 [ 28 ] 。凋亡和自噬的关系十分复杂，这取决于细胞类型、损伤的本质或发生时期 [ 29 ] 。例如，自噬会导致凋亡延迟 [ 30 ] ，而正常细胞和癌细胞对凋亡或自噬诱导的刺激反应有所不同。编码重要自噬蛋白的基因敲除会增加凋亡细胞死亡 [ 4 ] ，因此可推测PKD中自噬的抑制与凋亡增加及囊泡生长相关。 3.3. PKD中mTOR信号通路和自噬的关系 一般来说，mTOR的激活会抑制自噬潮，mTOR及自噬信号通路亦与细胞内溶酶体的定位相关 [ 31 ] 。而在啮齿动物和人类PKD中均存在mTORC1信号通路的激活 [ 31 ] 。 mTORC1抑制剂雷帕霉素或其类似物在Han:SPRD大鼠和Pkd1或Pkd2敲除的PKD动物模型中具有保护PKD及预防肾衰的作用 [ 32 ] [ 33 ] 。雷帕霉素在多种细胞中会诱导自噬 [ 34 ] ，其对自噬的影响依赖于对PKD的凋亡作用。Shillingford JM等发现高剂量的雷帕霉素会增加PKD囊泡上皮细胞的凋亡 [ 33 ] 。然而，其他研究发现低剂量雷帕霉素能有效抑制PKD，而对凋亡无影响 [ 35 ] [ 36 ] 。研究发现，雷帕霉素对PKD动物模型并无完全的保护作用，且并未能改善临床患者的肾功能 [ 37 ] 。 除了在PKD中mTORC1的信号传导增强，mTORC2活性标志物pAKT1 Ser 473 表达增加反映出mTORC2的信号通路也激活 [ 38 ] 。直接抑制mTORC1和mTORC2的mTOR激酶抑制剂(TORKs)能有效地诱导自噬 [ 39 ] 。TORKs对凋亡、自噬、PKD的效应仍需探讨。 3.4. 纤毛功能缺陷与自噬的抑制 纤毛是一种指状微管结构，从肾小管上皮细胞的顶膜伸入肾小管腔，与尿液有直接接触。PKD中两种突变蛋白PC1和PC2即位于初级纤毛上，感受液体流动变化出现异常从而导致病变 [ 8 ] 。 PKD中mTOR信号通路激活，而纤毛弯曲下调了mTOR信号通路，且不依赖于钙离子内流和Akt [ 40 ] 。Pampliega等 [ 41 ] 证明参与纤毛形成的信号分子亦参与到自噬过程的起始步骤中。与纤毛作用相关的信号通路如Hedgehog信号通路通过直接作用于纤毛底部的自噬相关蛋白诱导自噬，而纤毛受损部分抑制自噬，反过来自噬抑制却增强初级纤毛的生长和纤毛相关的信号通路。这项研究表明基础状态的自噬通过降解鞭毛内运输所需蛋白而调节纤毛的生长，进而提出假说即自噬水平降低与纤毛缺陷相关疾病如PKD相关。 Tang等 [ 41 ] 证明自噬促进初级纤毛形成。Wang等 [ 42 ] 研究发现，纤毛短的细胞中自噬受到抑制，且纤毛发育不全的细胞mTOR活性增强，使用雷帕霉素处理可逆转自噬的抑制作用。另外，在人的近曲小管上皮细胞(HK-2)中，自噬的诱导与纤毛伸长相关，相反，抑制自噬导致纤毛变短。由此证明纤毛与自噬可通过mTOR信号通路相互调节。 3.5. PKD中自噬的其他相关研究 在ADPKD中，除了凋亡、mTOR信号通路及纤毛功能缺陷与自噬存在联系之外，已知可调控自噬的蛋白在PKD肾脏或细胞中也具有一定作用 [ 43 ] 。如一种转录因子——信号传导子与转录激活子1 (STAT1)在Pkd1敲除的多囊肾和ADPKD患者肾脏中的持续激活能够调节凋亡、坏死和自噬。然而，Stat1敲除小鼠并无多囊肾表型，表明STAT1并不是PKD的调控者。 MAPK8是凋亡和自噬的调节因子。在PC-1敲除的MDCK细胞中可见MAPK8介导的凋亡增加，提示PKD中MAPK8与自噬的联系 [ 44 ] 。另外，AMPK也是自噬的一个调控信号分子，AMPK的激动剂二甲双胍能增加自噬，在体内外均能缓解囊泡的形成，证明由二甲双胍诱导的自噬在PKD中可能具有一定的治疗效应 [ 45 ] [ 46 ] 。未来有关PKD动物模型中STAT1、MAPK8和AMPK与自噬的关系的研究可能会成为热点。 Cebotaru等研究发现PC1以一种自噬依赖的途径控制了PC2的降解，而PC1突变体并无此功能，但PC1一般并不激活自噬。当PC1表达时，不结合PC1的PC2靶向于聚集体，通过自溶酶体依赖的自噬途径所降解，进而在ADPKD的病理进程中发挥作用 [ 47 ] 。 此外，ADPKD是结节性硬化症(tuberous sclerosis， TSC)和Von Hippel-Lindau综合征(VHL)的一个特征。在TSC中肿瘤发生是自噬依赖性的，抑制自噬相关蛋白ATG4或BECN1能降低肿瘤发生 [ 48 ] 。在VHL基因敲降的肾癌细胞中，小分子化合物STF-62247能诱导自噬性细胞死亡，ATG5下调能减少STF-62247杀伤VHL缺乏细胞的敏感性 [ 49 ] 。对于自噬在TSC和VHL中对肿瘤发生的作用是否能应用到PKD的治疗仍需深入探究。