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user: 2. 实验部分 2.1. 材料与试剂 Rac(±)-YM0402，A-YM0402和B-YM0402以及内标Z10 (专利号201210145152.1)均由本实验室合成。大鼠血浆来自SPF级大鼠禁食12 h血浆。大鼠的饲养及取血过程均经广州医科大学伦理委员会审核通过。PBS (0.1 M， pH 7.4)购自美国GIBCO公司。色谱级甲醇和乙腈购于美国Fisher。其它试剂为化学纯。RED快速平衡透析装置购于美国Thermo。液质联用系统为Agilent1260-6460三重四级杆液质联用系统。 2.2. 方法与结果 2.2.1. 样品预处理 内标储备液10 μL 20 μg/mL NZ-10置于2 mL离心管中，N 2 吹干后，加入样品100 μL，后加入300 μL 甲醇，涡旋混合5分钟，于4℃下13，000 × g离心5分钟，取上清，N 2 吹干，残渣用200 μL流动相复溶，2 μL进样。 2.2.2. RRLC-MS/MS方法及方法验证 液相和质谱条件 色谱柱：大赛璐Chiralpak IA-3 (150 mm × 2.1 mm， 3 μm)；流动相：甲醇；流速：0.25 mL/min；柱温度：25℃；质谱采集设置为：正离子模式；对目标化合物的检测采用多反应监测，离子通道分别设为m/z 393~249，0.6 V (YM0402)和m/z 427~235，0.4V (I.S.)。基质中A-YM0402和B-YM0402以及内标Z10的保留时间分别为3.5 min，5.9 min和4.9 min (如图1)。 方法验证 方法验证按照中国食品药品监督管理局相关规定实施。验证包括选择性，基质效应，回收率，线性，准确度，精密度和稳定性。 分别取6个不同供体的大鼠空白血浆，以及空白PBS溶液，按照“样品预处理”项下方法操作，得到各空白基质。血浆样品和含蛋白样品中低、中和高浓度质控样品(QC)终浓度为4，80，和160 μM；PBS中低、中和高浓度质控样品终浓度为0.06，0.96和3 μM。在YM0402和内标的出峰时间未见干扰信号。基质效应通过计算生物基质中YM0402对映体峰面积和流动相中YM0402对映体标准品峰面积比值获得，每种基质做三个平行样品。所测基质中，基质效应影响均小于15%。回收率通过比较预处理空白基质加入YM0402对映体峰面积与空白基质加入YM0402对映体再进行预处理后的峰面积获得，回收率为74.3%~92.6% (结果见表1)。线性通过对YM0402对映体与内标峰面积比值和YM0402对映体浓度进行绘图，得出标准曲线的回归系数。批内及批件准确度通过批内和批间不同浓度QC获得浓度与标示浓度的百分比值衡量。要求准确度在85%~115%，最低定量限范围80%~120%。批内和批间精密度通过计算批内和批间QC样品的变异系数获得。变异系数要求不超过15%，定量下限变异系数不超过20% (结果见表2)。不同基质中YM0402对映体的稳定性考察条件为室温，−20℃，三次冻融，以及预处理后室温放置24小时内。以上条件下，样品均稳定。 图1. YM0402对映体在大鼠血浆中的色谱图。(A) 空白大鼠血浆色谱图；(B) YM0402对映体及内标在大鼠血浆中色谱图 Table 1 Recovery (%) of YM0402 enantiomers from rat plasma and PBS (mean (SD)， n = 6 Matrix A-YM0402 B-YM0402 Low Medium High Low Medium High rat plasma 84.4 (4.0) 83.2 (5.3) 85.6 (7.0) 87.6 (5.0) 85.6 (7.7) 82.2 (7.9) PBS 90.7 (3.2) 91.6 (3.9) 93.1 (7.1) 90.8 (3.3) 92.6 (2.7) 93.9 (6.3) 表1. YM0402对映体在大鼠血浆和PBS中的回收率(平均值(标准差)，n = 6) Table 2 Calibration curves， accuracy and precisions of YM0402 enantiomers in rat plasma and PBS (mean (SD)， n = 6 Validation parameter rat plasma PBS A-YM0402 B-YM0402 A-YM0402 B-YM0402 Intra-repeatability (RSD%) Low 9.1 8.4 8.6 7.9 Medium 8.7 7.1 5.5 7.1 High 6.2 6.5 4.2 5.7 Inter-repeatability (RSD%) Low 2.1 3.3 6.9 5.0 Medium 2.1 0.8 4.3 6.4 High 1.1 3.1 1.4 3.8 Accuracy (%) Low 98.3 (7.3) 102.0 (8.3) 99.2 (3.8) 100.8 (4.4) Medium 100.6 (2.3) 101.0 (7.2) 103.2 (6.3) 98.7 (6.9) High 98.7 (4.9) 100.7 (5.9) 105.7 (6.5) 101.6 (8.4) LOQ (μM) 0.1 0.1 0.03 0.03 Linear range (μM) 0.1~200 0.1~200 0.03~200 0.03~200 y-Intercept (S.D.) 0.416 (0.084) 0.501 (0.059) 0.088 (0.006) 0.019 (0.003) Slope (S.D.) 0.167 (0.083) 0.163 (0.001) 0.509 (0.009) 0.102 (0.002) r 0.999 0.999 0.99 0.99 表2. 大鼠血浆和PBS中YM0402对映体浓度测量方法学验证参数(平均值(标准差)，n = 6) 2.2.3. 药物与蛋白结合数学模型及数据处理 药物与蛋白的结合可以描述成： Cu + P → CB 。根据质量作用定律，药物蛋白结合动力学可描述成： Ka = [ CB ] / [ P ] [ CU ] (1) 其中Ka为结合常数，[CB]指结合药物浓度，[CU]指游离药物浓度，[P]指蛋白浓度。总药物浓度和游离药物浓度在利用数学模型拟合后，一般利用图解法可以得到nKa的粗略值。对于方程式(1)我们可以改写其为： CB / CU = nPKa − CBKa (2) 利用该Scatchard方程，以CB为X轴，CB/CU为Y轴，由非线性最小二乘法估计得出Y轴上的截距，即nKa，从而得到药物的结合常数。药物与蛋白结合率按 B = ( 1 − CU / CB ) × 100 % 计算；对映体之间血浆蛋白结合差异的显著性考察按照双样本t检验进行统计。 2.2.4. 孵育时间筛选 对含有YM0402对映体5 μM (有机溶剂含量小于1%)的大鼠血浆于37℃分别孵育2，4，6小时。LC-MS/MS按照1.2.3项下方法进行检测。发现4 h和6 h，血浆中YM0402对映体含量无差异。因此，平衡透析孵育时间设定为4 h。 2.2.5. YM0402对映体与大鼠血浆蛋白结合反应 取空白大鼠血浆，分别加入YM0402对映体和外消旋体使其终浓度为0.2、1、5、10、15 mM。取200 μL含药血浆加入样品室，取350 μL PBS加入缓冲液室，于37℃孵育4 h。样品室和缓冲液室分别吸取100 μL和250 μL，按照“样品预处理”项下方法操作，由LC-MS检测血浆样品药物总浓度(CB)，缓冲液样品Z中游离药物浓度(CU)。 YM0402对映体与大鼠血浆蛋白在考察浓度范围内(0.2~20 μM)结合率均高于90%。在低浓度范围呈现浓度依赖性，随着药物浓度的增大，结合率升高，当对映体浓度达到5 μM后，结合率趋于饱和。在低浓度范围(0.2、1 μM)，A-YM0402的结合率略高于B-YM0402。在消旋体的形式下，YM0402对映体与大鼠血浆蛋白结合均明显高于对映体单体的血浆结合率(见图2)。