DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 4. 电荷诱发的固–气沿面闪络理论模型 固–气沿面闪络的发生受到固体侧、气体侧、固–气界面三方面的综合影响，其中固体侧和气体侧的物理模型较为成熟 [ 54 ] [ 55 ]。由于固–气界面电荷问题的重要影响的关注，相关学者开始建立考虑表面电荷、电场、闪络三者关系的物理模型。 1) 综合模型(Comprehensiveanalyticalmodel) 综合模型将闪络过程中可能涉及到的所有物理过程对闪络电压的影响都各自归结为一组特征函数，每组特征函数在基于实验研究的基础上，以尽可能少的关键物理量作为系统参数，并按闪络发生时的电场条件为各个过程分配权重系数，用于表示该过程在整个闪络中所占据的重要程度 [ 56 ]： V h d = ∑ ​ A n ( p r o c e s s ) n (2) 这些过程包括初始电子的产生、二次电子的产生、电荷扩散、电场的畸变等，在闪络发展的不同阶段，由不同的过程占据主导作用，在模型中，各个过程的权重系数也会随之变化。 综合模型对电荷–闪络的分析具有指导意义，能够全面描述闪络电压的变化。但是在计算某种具体情况时仍然需要具体分析，将所有过程量化到综合公式中还具有一定的困难。 2) 异极性电荷簇影响闪络模型(Charge cluster model) 该模型主要关注了加压过程中出现在介质表面的异极性电荷及其分布形状对闪络的影响。在GIL与盆式绝缘子组合的电极系统中，接地外壳上存在着微小缺陷，会导致气体分子电离，产生异极性的电荷并向绝缘子的表面迁移。这些异极性电荷最终将以圆形电荷簇的形式驻留在绝缘子的表面，如图2所示 [ 57 ]。电荷簇边缘的电场强度很高，容易诱发产生局部小流注，这降低了绝缘沿面距离，促进了沿面闪络的发生。 图2. 电荷簇诱导的闪络路径 圆形电荷簇是混合型电场作用下一种典型的表面电荷积聚模式。适用于分析气体侧电荷来源对表面电荷以及闪络的影响。 3) “近似失效绝缘区”(Analogous ineffective region)扩张的闪络模型 该模型是在综合模型基础上，考虑到了GIL运行时的温度梯度对绝缘子的影响 [ 58 ]。随着中央导杆中工作电流不断流过，环境温度随之升高。介质的体积电阻率和表面电阻率随温度的升高而降低，并导致高压电极附近出现高电位。将介质中表面电位达到高压导体60%电位以上的部分定义为近似失效绝缘区。由于近似失效绝缘区的存在，大部分电压降都降落在靠近接地电极的绝缘区域。因此，增大的电场将可能使电极的三结合处产生气体电离，从而形成电子崩。 在近似失效绝缘区的延伸过程中，自由电子主要受到切向电场的作用力产生移动，并将使切向电场逐渐发生畸变。该模型结合温度梯度的影响，揭示了切向分量主导型电场下，绝缘子电荷分布的演化过程。能够体现出固体侧在外加电压作用下的性质变化对电荷-闪络过程的影响。 4) 气体吸附模型(Synergic effect of adsorbed gas and charging model) 该模型分析了绝缘气体吸附在固体绝缘材料表面形成的气体层对闪络过程的影响。在该层中，气体分子与介质的表面之间存在较为强烈的相互作用，表现为致密的固体状薄层 [ 59 ]。 在表面吸附层中，气体分子主要通过两种方式影响闪络的发生。一方面分子容易产生垂直于介质表面的取向，这会增大对自由电子的散射，削弱一次电子过程；另一方面气体分子本身的电荷分布中心会发生分离，转化成电偶极子的状态，并增加吸引表面电荷的效果。这两种影响方式都将导致闪络电压的升高。 在GIL/GIS中，气体分子在绝缘子表面的吸附是普遍存在的，表面吸附层对闪络电压的影响在切向分量主导型电场和混合型电场中都能得到体现。
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user: 5. 结论与展望 本文以GIL/GIS盆式绝缘子表面不同电场分布类型产生的表面电荷积聚模式为基础，综述了目前直流电压下固–气界面电场分布、电荷积聚、闪络特性三者关联关系的研究进展，总结了切向分量主导型和混合型两种电场分布类型所产生的电荷积聚模式，及其对沿面闪络的影响规律。本文总结了四种主要理论模型，从主导物理过程、表面电荷极性与分布、固–气相互作用等角度对该现象进行了解释。可以看出，固–气界面电荷的积聚及其对沿面闪络的影响机制十分复杂。因此，对相关研究提出以下几点展望： 1) 高气压环境中，对于绝缘子表面电荷更为直观的在线观测手段需要突破，以深入考察电荷诱导闪络的动态过程，并对电荷积累–沿面放电的相互作用过程，给出准确的分析。 2) 现有气体沿面闪络模型大都基于气体放电和真空沿面放电，然而，高气压环境中的载流子与固–气界面的作用机制需要更深入的理论研究和实验证据。需要建立能够反映电荷与闪络相互作用机制的定量物理模型。 3) 金属微粒等缺陷是引发GIL/GIS设备中的绝缘破坏事故的重要因素。缺陷与表面电荷之间的作用作为沿面闪络过程中的重要影响因素，需要得到更加深入的分析。 4) 针对现有的改性方法，需要开发面向工业的加工工艺，以用于实际固体材料沿面闪络性能的提升。同时改性处理的长期有效性需要得到进一步的研究与验证。
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user: 摘要 目的：通过生物信息学方法分析与三阴性乳腺癌发生发展有关的关键miRNA。方法：从GEO数据库中找到三阴性乳腺癌miRNA数据集GSE121657，利用GEO2R鉴定差异表达的miRNA，通过starBase数据库预测出差异表达的miRNA所对应的靶基因，并对靶基因进行GO基因功能富集分析以及KEGG信号通路分析，最后建立编码蛋白互作网络并且从中筛查出关键的miRNA。结果：筛选出61个差异表达的miRNA，获得与之相对应的165个靶基因，这些靶基因主要涉及到细胞的定位、细胞周期、细胞分裂、细胞凋亡等生物学过程，参与PI3K-Akt、多巴胺能突触、Hippo、MAPK等信号通路的调控，找到关键性的调控因子hsa-miR-141-3p。结论：生物信息学分析提示hsa-miR-141-3p可能是三阴性乳腺癌重要的调控因子。
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user: 1. 引言 乳腺癌逐渐成为女性的高发病症，位居于中国女性癌症发病的首位 [ 1 ]。三阴性乳腺癌(TNBC)是雌激素受体、孕激素受体和原癌基因Her-2的检测结果全都呈现为阴性的一种乳腺癌，在乳腺癌的所有分类中占据10.0%~20.8% [ 2 ] [ 3 ]。其病原体在病患体内有着高度扩散性和浸染性，容易在内脏间发生转移，且缺少有用的靶向治疗和内分泌靶点，晚期化疗效果欠佳。由于具有侵袭早、转移快、病死率高的特点，TNBC是乳腺癌中预后最差的亚型 [ 4 ] [ 5 ]。为了找到有效的治疗策略，降低TNBC的复发率、提高预后，许多研究人员做了大量的工作 [ 6 ] [ 7 ]，寻找有效的治疗靶点是TNBC有效治疗的关键 [ 8 ] [ 9 ]。 微小RNA (miRNA)为一段长度约在19~25 nt的非编码单链RNA，靶基因3’-非编码区(UTR)能和其相结合，因而获得抑制靶基因表达的功能并且能够参与很多种生物过程，比如：细胞的增殖、凋亡和分化等生物过程。microRNA对于肿瘤发挥着双重作用，着重表现为抑癌和致癌。据探究，miRNA作为肿瘤抑制因子在TNBC中起着诱导肿瘤细胞凋亡和分化的功能；同时，miRNA调节TNBC的进展主要就是通过上皮–间充质转化(EMT)参与的，这也许与乳腺癌的诊断以及治疗有关系 [ 10 ]。导致TNBC患者死亡的主要理由是癌细胞的转移，miRNA有可能通过EMT参与调节TNBC的侵袭性进展。 生物信息学是生命科学和计算机科学相结合综合性学科。研究证明，整合的生物信息学方法可以帮助研究人员更好地探索疾病潜在的分子生物学机制，为临床提供新的诊断标志物和治疗靶点 [ 11 ]。本研究以GEO数据库中三阴性乳腺癌(TNBC)上皮间充质转换(EMT)模型的miRNA芯片数据集GSE121657为研究对象，分析三阴性乳腺癌患者差异表达的miRNA，预测与其相匹配的靶基因，并对靶基因进行生物信息学分析，最终获得调控三阴性乳腺癌的核心miRNA，以此为三阴性乳腺癌的相关研究供给新的思路。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 三阴性乳腺癌(TNBC) miRNA芯片数据 本研究运用到的芯片数据集GSE121657来自于美国国立生物技术信息中心基因公共表达数据库GEO，由Boston University Microarray and Sequencing Resource上传 [ 12 ]，为三阴性乳腺癌(TNBC)的上皮–间质转化(EMT)模型的miRNA表达数据，共6个样本，其中GSM3442850、GSM3442851、GSM3442852为MIIIshGFP对照组，GSM3442853、GSM3442854、GSM3442855为MIIIshSMAD2处理组。上皮–间质转化使原发癌细胞获得间质特征，并且在转移部位上皮再生形成继发性肿瘤。在该过程中癌细胞的蛋白转录调节会引起细胞特征性改变，所以可以通过对MIIIshGFP对照组与MIIIshSMAD2处理组两组样本进行差异分析，并能够提供预测依据和治疗靶点。对该数据集进行质量分析，结果显示，数据集中包含的六个样本的中心大致处于同一水平线(图1)，样本数据总体上差异不大，对其进行差异分析结果可靠。 图1. 样本GSE121657数据箱线图 2.2. 三阴性乳腺癌miRNA芯片数据的生物信息学处理 2.2.1. 差异表达miRNA的获取 运用GEO数据库自带的GEO2R在线分析工具，根据|logFC| > 1，P-Value < 0.05，筛查出三阴性乳腺癌患者差异表达的miRNA。 2.2.2. 差异表达miRNA的靶基因预测 本研究使用ENCORI (starBase v3.0)预测靶基因 [ 13 ] [ 14 ]。starBase数据库是miRNA靶基因预测的综合数据库，整合了多个数据库如TargetScan、miRanda等的信息，大大降低了预测的假阳性。将之前获得的差异miRNA依次输入到ENCORI中，设定Number of supporting Experiments ≥ 5，Program Number ≥ 5 prediction software进行预测。 2.2.3. 差异表达微小RNA对应靶基因的相关功能分析、信号通路分析 使用DAVID在线工具对预测到的靶基因进行GO生物学功能分析和KEGG信号通路分析。把上述的靶基因输入DAVID，从Biological Process、Molecular Function以及Cellular Component三个方面阐明靶基因的生物学功能，分析其参与调控的信号通路。 2.2.4. 靶基因编码蛋白相互作用(PPI)网络的构建与分析 将靶基因上传至STRING在线分析工具，构建靶基因编码的蛋白质相互作用网络，并利用Cytoscape软件对网络进行处理和筛查，筛选出较为关键的靶基因，进一步获得三阴性乳腺癌关键的miRNA分子。
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user: 3. 结果 3.1. 差异表达的miRNA 经分析共获得61个差异miRNA，与MIIIshGFP对照组相比，表达上调的miRNA有27个，下调的有34个，见表1和图2。 3.2. 差异miRNA对应的靶基因 将61个差异表达的miRNA输入到在线靶基因预测数据库starBase v3.0后，共获得165个与之相对应的靶基因。 Table 1 Differentially expressed miRNA Up Regulation (27) Down Regulation (34) hsa-miR-125b-1-3p hsa-miR-494-3p hsa-miR-3609 hsa-miR-4433-3p hsa-miR-4492 hsa-miR-935 hsa-miR-224-5p hsa-miR-27b-3p hsa-miR-4649-5p hsa-let-7a-5p hsa-miR-4463 hsa-miR-146a-5p hsa-miR-125b-5p hsa-miR-224-3p hsa-miR-125a-5p hsa-let-7c-5p hsa-miR-1271-5p hsa-miR-140-3p hsa-miR-100-5p hsa-miR-6780b-5p hsa-miR-99a-5p hsa-miR-4485 hsa-miR-125a-3p hsa-miR-23b-3p hsa-miR-3135b hsa-miR-6126 hsa-miR-210-3p hsa-miR-4417 hsa-miR-200c-3p hsa-miR-205-5p hsa-miR-3648 hsa-miR-1307-3p hsa-miR-342-3p hsa-miR-1972 hsa-miR-708-5p hsa-miR-92a-1-5p hsa-miR-193b-5p hsa-miR-106b-3p hsa-miR-6789-5p hsa-miR-6831-5p hsa-miR-500a-5p hsa-miR-503-5p hsa-miR-3929 hsa-miR-18a-3p hsa-miR-141-3p hsa-miR-4632-5p hsa-miR-23a-5p hsa-miR-584-5p hsa-miR-4674 hsa-miR-3195 hsa-miR-4665-5p hsa-miR-4669 hsa-miR-93-3p hsa-miR-4449 hsa-miR-1231 hsa-miR-3180 hsa-miR-378f hsa-miR-200b-5p hsa-miR-3187-3p hsa-miR-30a-5p hsa-miR-1233-5p 表1. 差异表达的微小RNA 图2. GSE121657差异miRNA的表达值图(红色代表上调，蓝色代表下调) 3.3. 基因功能(GO)富集分析 运用DAVID对靶基因进行Gene_Ontology功能分析，结果显示，165个靶基因主要参与了细胞的定位、细胞过程的正调控等生物学过程，参与了细胞器部分、细胞内外组分等细胞成分的构成，涉及蛋白质及杂环化合物结合等分子功能(如图3)。 图3. 靶基因的GO功能富集分析(P < 0.05)柱状图 3.4. KEGG Pathways分析 通过DAVID在线数据库对165个靶点基因进行信号通路富集分析，以P < 0.05为筛选标准，共获得10条KEGG信号通路，涉及PI3K-Akt、血小板活化、黏附斑激酶、激动蛋白细胞骨架的调节、癌组织中的miRNA等信号通路(表2、图4)。 Table 2 Signaling pathways involved in target genes (P < 0.05 Term Count P-Value Genes bta04151：PI3K-Akt信号通路 10 1.40E−04 YWHAG， EIF4EBP1， MCL1， GRB2， CSF1， PPP2CA， NR4A1， LAMC1， GNG5， DDIT4 bta04611：血小板活化素 5 0.006164 TLN1， PPP1CA， FYN， ARHGEF12， PPP1CB bta04510：粘附斑激酶 6 0.006858 TLN1， PPP1CA， GRB2， FYN， LAMC1， PPP1CB bta04810：肌动蛋白细胞骨架的调节 6 0.007422 PPP1CA， CFL2， MSN， ARPC5ARHGEF12， PPP1CB bta05206：癌组织中的MicroRNA 6 0.01403 MCL1， GRB2， ZEB2， MARCKS， ZEB1， DDIT4 bta04114：卵母细胞减数分裂酶 4 0.028359 YWHAG， PPP1CA， PPP2CA， PPP1CB bta05205：癌组织中的蛋白多糖 5 0.029795 PPP1CA， GRB2， MSN， ARHGEF12， PPP1CB bta05034：酒精中毒 5 0.03572 PPP1CA， GRB2， PPP1CB， PKIA， GNG5 bta04728：多巴胺能突触 4 0.038072 PPP1CA， PPP2CA， PPP1CB， GNG5 bta04910：胰岛素信号通路 4 0.044296 PPP1CA， EIF4EBP1， GRB2， PPP1CB 表2. 靶基因涉及的信号通路(P < 0.05) 图4. 靶基因涉及的KEGG气泡图(P < 0.05)柱状图 3.5. 核心基因及关键miRNA 将差异表达的miRNA所对应到的靶基因导入STRING，得到一个涵盖124个靶基因蛋白节点和126条互作关系的蛋白质相互作用网络(图5)，利用Cytoscape对蛋白互作网络进行进一步的分析处理。以Degree > 10为筛选条件，从蛋白互作网络中筛选出3个核心靶基因，分别是YWHAG、ACTR2、ACTR3 (图6)，并找到了与这3个靶基因相对应的miRNA，即hsa-miR-141-3p，图7显示了该miRNA在TNBC中的表达情况。 图5. 靶基因编码的蛋白互作网络图 图6. 显示出关键靶基因的蛋白互作网络，图中蓝色显示且形状较大的节点为关键靶基因 图7. hsa-miR-141-3p在平均差异图中的位置
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user: 4. 讨论 TNBC是指ER、PR以及原癌基因Her-2检查结果全都为阴性的乳腺癌，尽管其有许多的生物学特征与BLBC相类似，但是TNBC和基底细胞样型乳腺癌之间还存在着处在某些免疫表型和基因表达谱上的差异。目前缺乏与之相对应靶向治疗受体，而且对TNBC发生的分子机制也没有完整的了解，对于TNBC的医治手段有限。为此，对TNBC的靶向治疗的探究在如火如荼的开展。 微小RNA是一种非编码小RNA分子，截止到目前人们已经发现了三千多种微小RNA，在这之中绝大多数在动植物体内发挥着关键性的调控作用，是最主要的基因表达调控因子之一。预计在人体内将近2/3的基因都会受到某一个或一组微小RNA的调控 [ 15 ]。近几年来，有研究表示单个miRNA可以同时靶向多个mRNA，单个mRNA可以被不同的miRNA协同靶向，miRNA拥有着高度的保守性，参与多种生物学过程，如细胞增殖、细胞脂肪代谢、糖代谢和胰岛素信号转导等 [ 16 ]。近些年来，更多的人开始对微小RNA在很多相关疾病中的作用增加关注。在本研究中，采取了生物信息学的手段对三阴性乳腺癌的微小RNA芯片数据进行了研究，筛选后得到61个差异表达微小RNA中，预测得到165个靶基因，这些靶基因主要涉及细胞的定位、细胞周期、细胞分裂以及凋亡、PI3K-Akt信号通路等生物学过程。 PI3K-Akt信号转导通路宽泛分散在细胞中，是一条重要的信号传导途径在细胞内。这一通路过度激活后会促进细胞的过度增殖、抑制细胞凋亡、促使细胞分化异常以及参与细胞自噬等导致肿瘤形成和促进肿瘤转移 [ 17 ] [ 18 ]。有学者发现，PI3K-Akt信号转导通路在TNBC的发展中起着十分关键作用 [ 8 ]，这可能与TNBC侵袭性强、预后差的生物学特征和临床特点有紧密关联。所以，找到存在于这一通路中的关键靶点能够为TNBC的患者提供新的医疗方法并且拥有相对稳定的医治结果 [ 18 ]。 通过分析蛋白质互作网络，获得了与TNBC相关的核心基因及其对应的miRNA分子，即hsa-miR-141-3p，其在TNBC中表达降低(表1、图7)。研究表明，hsa-miR-141-3p可以通过沉默下游靶点来调节多种癌症如前列腺癌、结肠癌、卵巢癌细胞的迁移和侵袭 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]。Wong [ 12 ] 等人发现，hsa-miR-141-3p与其他一系列假定的肿瘤抑制miRNAs如hsa-miR-4417、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-210-3p等在恶性TNBC细胞中显著下调，经过对hsa-miR-4417、miR-200c-3p、miR-210-3p的RT-qPCR验证，认为hsa-miR-4417是三阴性乳腺癌的抑癌和预后标志物。而本文生物信息学分析结果显示，hsa-miR-141-3p有可能才是调控TNBC发展的更加重要的miRNA分子，需要进一步进行实验验证。
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user: 摘要 言语行为作为语用学的重要课题，一直深受语言学者的重视，其研究视角、方法等也不断丰富。本文以日语请求为例，分析了目前日语请求行为的研究现状，并尝试分析了请求言语行为的多模态使用特征，探讨了多模态分析法在言语行为研究中的应用。
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user: 1. 引言 日常生活中人们经常会发出请求，或者接受、拒绝他人的请求。请求是以获得自身利益为前提，促使对方展开行动的行为(施.2006) [ 1 ]。其性质是威胁被请求者的消极面子(B & L，1987) [ 2 ]。因此在交流中如何兼顾请求行为顺利完成与维持友好人际关系尤为重要。 先行研究表明，自言语行为理论提出后，言语行为成为语用学的重要课题，请求作为言语行为之一同样备受关注。主要包括三个方面：以请求动词、请求句为中心研究请求的表现形式(山岡・李，2004 [ 3 ]；关口，2007 [ 4 ] )，从礼貌的角度分析请求中的使用策略(猪崎，2000 [ 5 ]；高木，2003 [ 6 ]；相原，2008 [ 7 ]；和田・堀江・吉本，2010 [ 8 ] )，依据话语礼貌原则分析请求语篇的展开模式(毋，郅2010 [ 9 ]；毋，2014 [ 10 ] )。 现有研究主要对语言本体进行考察，没有充分考虑到语言之外的图像、神态等其他非语言因素，忽视了其与语言共同构建话语意义的重要作用。 本文通过回顾目前日语请求行为的研究现状，分析现有言语行为研究的局限性，旨在尝试提出多模态视域下分析言语行为的可能性。
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user: 2. 请求行为的定义 请求行为作为常见的言语行为之一，一直备受关注。关于请求行为的定义，学者们论述不尽相同。前田(1990) [ 11 ] 提出请求是通过听话者的行为，达成说话者利益的言语行为之一。同时，请求不像命令那样，说话人占有立场的优势，也不像恳求那样听话者占有绝对的立场优势；柏崎(1993) [ 12 ] 主张请求是指说话人获得利益，听话人承受负担的行为；施(2006) [ 1 ] 指出，请求是一种按照自己的意图促使对方展开行动的“行动展开表现”，是通过对方的行动来实现自己利益的行为；关口(2007) [ 4 ] 认为所谓“请求”是指请求者为使自己或与自己相关人员受到恩惠，有礼貌地寻求他人采取某种行动的行为，会给他人造成一定负担。 不难看出，请求是通过被请求者的行动实现请求者利益的言语行为。并且，满足请求者的行为对于被请求者具有一定的负担。因此，请求者首先需要权重请求内容对于对方的负担大小，其次为了得到对方的协作，思考如何使用请求的策略。另外，笔者认为请求与恳求行为相似，只是两者带给被请求者和被恳求者的负担程度不同，因此本文并不明确区别请求与恳求。
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user: 4. 日语请求行为研究述评 基于上述章节对日语请求行为先行研究的概述，本章将分别从研究方法和研究内容两个方面，对先行研究进行整体性、系统性的分析。 4.1. 研究方法 笔者对本文先行研究中的研究方法整理发现，使用最多的调查方法是语篇补全测试(Discourse Completion Test，简称DCT)。DCT可以实现在短时间内收集大量实验资料，精准地设置场景和任务关系。但这一方式收集的数据并非自然话语，而且因回答栏空格长度的限制，被调查者很容易选择习惯性和公式化表达形式，不能有效反映语言的自然使用。 有部分研究采取角色扮演的方法进行数据收集。角色扮演是被调查者根据事先设定的情景，来进行模拟会话的手段。因此更加贴近自然语言，还可以观察到除语言外其他符号形式。但该方法很难得到大规模的数据，并且在转写过程中转写者的主观判断影响结果的客观性。 同时，也有部分研究借助影视片段进行分析考察。但因剧本设定等问题，所得数据并非自然话语，同样不同反映语言的自然使用情况。 4.2. 研究内容 从研究内容来看，请求语法研究集中于对日语请求句分类研究，如将「てください」、「てくれませんか」、「てほしい」、「お願いします」等分别成为命令句、疑问句、愿望句、施为句等；以及对不同语言间的请求表达形式对照研究。研究内容局限于单个句子层面。 请求策略研究将研究内容从单个请求句子扩大至请求片段。并依据B & L的礼貌原则理论，从礼貌的角度考察日语请求中语言使用策略。多数研究表明日本人为避免威胁对方消极面子，多采用消极策略。 话语礼貌原则在礼貌原则的基础上，指出将会话看成动态的整体，在话语层面上考察请求行为。因此，请求展开模式研究将研究内容进一步扩大为整个语篇，从会话开始到结束的整个范围内分析请求的展开模式。 综上所述，从研究内容看，目前请求行为的着眼点都在语言本体，忽视了其他类型的符号形式对意义传达的重要作用。
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user: 5. 日语请求行为研究述评 5.1. 多模态话语 针对先行研究的内容仅局限于语言文本的使用的不足，本章试探讨多模态视域下言语行为分析的可行性。 “模态”是指人类通过感官(如视觉、听觉、触觉等)跟外部环境(如人、机器、物件、动物等)之间的互动方式。多模态话语则指运用视觉、听觉、触觉等多种感觉，利用语言、音调、动作等多种符号进行交际的现象。“多模态话语研究”就是关注人类语言使用的多模态本质，挖掘蕴含在音频、视频、图像等各种媒介中的各种信号、数据，考察各种信号之间的相互关系，从而多维地解读人们言语交际的意义和机制。 张德禄(2009) [ 19 ] 在其提出的多模态话语分析综合理论框架中，将话语分析分为文化层面、语境层面、内容层面和表达层面四个层面。其中，内容层面中的表达层面由语言与非语言两大部分组成。语言包括纯语言(声音与文字)和伴语言(音响、音调、字体、布局)；非语言包括身体(比拟、面容、肢体)和非身体(工具、环境)。为多模态视域下言语行为研究提供了方法论。 5.2. 多模态视域下请求实例分析 以面对面请求为例，请求者选择口语作为听觉模态来完成声音意义的表达，选择身体媒体，包括动作、表情等作为视觉模态来完成图像意义的表达。两种模态之间相互配合、相互协作共同完成请求这一话语意义的表达(见图1)。 图1. 请求行为的多模态过程 1 为考察请求行为中多模态的使用特征，本研究采取角色扮演的方法，设定请求内容为代班兼职一个月，对两个日本大学生朋友的请求过程进行录像，并利用ELAN分析软件对视频进行标注，尝试分析其中的多模态特征。 下表为会话的一部分(见表2)。 Table 2 One example of request conversation 请求者(A) 被请求者(B) 01A: え、なんかなんか、 02B:うん 03A: 昨日アパート別に帰る時に(手比骑自行车姿势)、 04B:うん 05A: め、転んちゃった大きな、転んちゃっ、大回みだいに(手做翻滚姿势)、 06B:うん 07A: もう、転んちゃって、なんか手をけがしちゃった(手摸受伤处)、めっちゃ痛くてっていう強度(笑)。 08B:え、やばいじゃ …… …… 09A: いろんな人に聞いたんだけど，みんなううんだったんだけど， 10A:うん 11A: ちょっとどうかなあみたいな。 12A:私？(手指向自己) 13A: そうそう …… …… 14A: うんん、絶対大丈夫と思うんだけど、もし無理だったら全然。 15B:うん。 16A: (点头 + 歪头) 17B:そうだね。 表2. 请求会话例 分析上述对话可知，视觉模态或听觉模态可以独立完成意义表达。如A16处，请求者的“点头 + 轻歪头”动作中，“点头”是对被请求者的话语进行回应，“歪头”是再一次确认对方的态度，是否接受请求，相当于语言的「どうですか」。 另外，除独立完成意义表达外，两种模态还存在同时完成意义表达的场合。如03A、05A、07A三处，请求者同时运用语言产生的听觉模态以及手势产生的视觉模态向被请求者讲述自己受伤的经历。03A及05A处请求者的“骑自行车姿势”以及“翻滚姿势”手势，是为了更加生动地向对方描述状况，强化语言的表达效果。而07处“摸受伤部位”的手势，是为了补充语言「なんか手をけがしちゃった」，准确表明受伤部位，对听觉模态起非强化的作用。 分析结果表明，本研究中请求过程主要包括听觉模态和视觉模态两种模态。两种模态时而独立完成意义表达，时而相互配合完成意义表达。当两种模态同时存在时，两者之间又进一步可分为强化和非强化关系。
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user: 6. 结语 本文旨在丰富言语行为研究的维度，尝试将多模态分析方法用于言语行为分析。首先梳理、概述了当前日语请求行为现有研究现状，指出了现有研究的共性，即多关注语言研究，忽略了语言外其他因素在话语意义分析中的作用；探讨了多模态视域下言语行为研究的可行性，并以日语请求行为为例，探讨了多模态视域下请求言语行为的分析方法。
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user: 摘要 依托典型黄泛区高速公路工程，开展了松铺高度为4 m的粉土路基强夯填筑试验研究，通过试验路测试，优化了相关工艺参数，分析了强夯法加固粉土路基的效果。结果显示，采用1500 kN∙m的夯击能填筑松铺高度为4 m的黄泛区粉土路基是可行的，其合理设计和工艺参数为夯击能采用1500 kN∙m，夯击数为10击，夯间距为3.2 m，土的含水率宜控制在最佳含水率的−5%~3%范围内；经多点夯、满夯之后，强夯路基的空间密度仍呈现不均匀分布，其中夯锤下的土体压实度略高于夯间2个百分点，上部土体的压实度则显著高于下部土体约6个百分点；夯后路基的平均静回弹模量约为52 MPa，其中夯间承载能力略低于夯锤以下约2.7 MPa；为保证路基支撑的均匀性，强夯路基上部应该设置一定厚度的均匀过渡层，强夯路基上部设置2 × 20 cm石灰处置土过渡层后，路基静回弹模量约提高1倍，路基支撑均匀。
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user: 1. 引言 强夯法是反复将夯锤提至一定高度然后自由落下，通过对地基的冲击和振动作用加固地基的一种经济、高效的土体加固方法，目前被广泛应用于各种地基加固。自20世纪70年代初法国人梅纳首次采用强夯法加固填土地基以来，强夯技术已广泛的应用于世界各地地基加固工程。随着技术的成熟，强夯法在公路路基的加固中也得到了一定的应用 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]，并因其施工效率高、工程经济等突出特点引起工程界的广泛关注。但由于强夯动力填筑路基的空间密度是不均匀的，这与传统的路基填筑采用压路机碾压并以压实度作为路基压实质量控制和评价的主要技术指标不同，强夯路基的相关设计和工艺参数尚不明确，也无法采用现行的路基设计和施工标准进行质量评价。合理确定强夯路基的设计、工艺参数并评价强夯填筑路基的加固效果，成为目前道路工程界普遍关心、并严重制约强夯技术在路基工程中应用的重要技术问题。 目前，国内外对强夯加固地基的工程应用和工程技术的研究成果十分丰富，其中大部分是通过物理模型试验和数值模拟的方法分析地基强夯加固机理和效果，优化相关工艺参数，为了有效模拟地基强夯动力加固问题，部分学者也对数值模拟的方法开展了相关研究 [ 4 ] - [ 10 ]。为了解决强夯加固过程模拟，姚占勇等基于ABAQUS通用软件开发了土体模量、粘聚力、摩擦角等力学参数随夯击过程动态变化的强夯用户子程序 [ 11 ]。郑颖人等对不同地基强夯加固机理及加固效果进行了研究，拓宽了强夯在地基加固中的应用范围 [ 12 ] - [ 17 ]。路基强夯加固方面，罗恒等对红砂岩路基强夯加固进行了较为系统的研究 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]；乔兰等对湿陷性黄土路基强夯加固效果进行了研究 [ 21 ] [ 22 ]；姚占勇、崔新壮等通过现场试验，验证了采用强夯填筑高速公路含砂砾黏性土路基的可行性 [ 23 ] [ 24 ]。总体而言，强夯法经过多年的发展已经是一种较为成熟的地基加固技术，但在路基加固方面的研究上相对比较滞后，尚未见针对黄泛区粉土路基强夯填筑的相关报道，不同土质强夯路基的工艺参数和工程效果尚待系统研究。 本文依托黄泛区典型高速公路–济(南)东(营)高速公路工程，开展了4 m松填高度的黄泛区粉土强夯填筑试验，通过现场检测，系统分析了强夯路基的工程质量，优化了相关工艺参数，对黄泛区高速公路路基的快速填筑具有重要意义。
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user: 2. 依托工程概况 济(南)东(营)高速处于黄泛区平原，该地区地势平坦，主要由黄河冲(淤)积而成，在地表沉积了10 m左右厚的泛滥沉积物，形成了以黄泛区粉土为主的特殊黄泛区地质地貌。该区域粉土及粘粒颗粒含量较少，级配不良，颗粒磨圆度高，难以压实，且在压实过程中表层水分极易蒸发散失，为保证压实质量，需多次洒水，压实质量难以控制。选取150 m典型路段开展粉土路基强夯，路基宽度为28.0 m，路基设计高度为4.95 m，路基断面组成为：中央分隔带宽度为3.0 m，左侧路缘带宽度为2 × 0.75 m，车辆行驶车道宽度为2 × (2 × 3.75) m，路基右侧硬路肩宽度为2 × 3.5 m，土路肩宽度为2 × 0.75 m。路基松填高度为4 m。地基为典型黄泛区粉土地基，地下水位低，不考虑地下水位的影响。路面结构为4 cm改性沥青玛蹄脂碎石(SMA13) + 5 cm中粒式改性沥青混凝土(AC16C) + 6 cm中粒式沥青混凝土(AC20C) + 12 cm大粒径透水性改性沥青混合料(LSPM30) + 36 cm水泥稳定碎石 +18 cm二灰土，路面结构总厚度为81 cm。为提高路基承载能力，路床区设置2 × 20 cm石灰处置土。 路基土的颗粒组成和主要物理性质指标见表1、表2。 Table 1 Grain size distributio 粒径/mm >0.5 0.5~0.25 0.25~0.075 0.075~0.05 0.05~0.01 0.01~0.005 <0.005 粉土 0 0 2.9 8.4 57.1 12.2 19.4 表1. 土的颗粒组成 Table 2 Main physical property of the soi 指标 液限/% 塑限/% 塑性指数 比重 最大干密度γ d /(g∙cm −3 ) 最佳含水率w op /% 粉土 19.3 32.1 12.8 2.72 1.81 13.6 表2. 试验用土的主要物理性质指标
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user: 3. 试验方案 路基松填高度为4 m，筑路材料为典型黄泛区粉土，通过初步试夯，土的含水率宜控制在最佳含水率的−5%~3%范围内。为保证足够的强夯侧限，经计算分析，路基两侧超填2.0 m。参考《建筑地基处理技术规范》(JGJ 79-2012) [ 25 ] 并经初步试夯，点夯的夯击能采用1500 kN∙m，止夯标准为最后两击平均夯沉量小于5 cm。 路基填筑完成后先开挖检测路基初始压实度并进行静力触探试验，得到路基的初始状态。初步在试验区中部随即选取互不影响的点位进行逐击试夯，记录每一击的夯沉量数据。夯击结束后对夯点的压实度、含水率进行检测，并进行静力触探试验，分析不同夯击次数下土体密度、强度等的变化规律，确定单点夯的最佳夯击次数、夯击能的影响深度与宽度。静力触探检测点位如图1所示，开挖检测压实度的测点位置如图2所示。为方便对比分析，静力触探检测和压实度检测均以夯锤底部为零基准面。 图1. 静力触探检测点位 图2. 压实度测点位置 点夯完成后，按照确定的工艺参数进行试验路全段点夯，夯坑整平后采用800 kN∙m夯击能满夯2遍，之后振动压实1遍 + 静压1遍。检测路基回弹模量和工后沉降。
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user: 4. 试验结果与分析 4.1. 单点夯的夯沉量检测 夯击过程中的夯击沉降量可间接反映出强夯的夯击压实效果。试夯结束后，分别对各夯点的单击夯沉量和累计夯沉量进行统计分析，得到了强夯夯沉量与击数的关系如图3所示。 图3. 夯沉降量与夯击次数关系曲线 图3显示，随夯击次数的增加，土体逐渐密实，累计夯沉量增长的幅度逐渐减小，总沉降量1 m左右，且地面隆起量较小，强夯加固效果较好；第1击沉降量最大，随夯击次数增加快速收敛，6击以后单击夯沉量逐步趋于平稳，在第9击之后沉降量均已小于5 cm；试验区不同夯击点位的夯击沉降量基本相同，离散型较小，以5 cm作为止夯标准时可初步确定单点强夯最佳夯击次数为9击或10击。与地基加固不同，《公路路基设计规范》(JTG D30-2015) [ 26 ] 对高等级公路路基压实度均作了明确规定，因此仍需通过其他试验进一步确定最佳夯击次数。 4.2. 单点夯后土体的静力触探检测 点夯完成后，对于9击、10击的夯点的夯锤正下方、夯锤边缘、夯锤外侧、强夯前路基进行静力触探检测，检测结果见图4~6。 图4、图5显示，强夯前的贯入阻力Ps在深度2.8 m左右明显上升，这是由于该部分已经到达原有地基位置，地基在填筑路基之前已经加固处理；试验区填土经过强夯处理后，填土范围内的土体Ps值均有了不同程度的提高，且地基处的Ps值相较强夯前也有不同程度的提高，表明试验所采用的强夯能级能够满足本试验区有效加固深度 [ 27 ] 的要求，且在此填土高度情况下能够对地基进行二次加固；图示4个测点位置的贯入阻力Ps的大小依次为夯锤正下方 > 夯锤边缘 > 夯锤外侧 > 强夯前，表明强夯竖向的加固效果要优于径向的加固效果，径向加固范围大于1.6 m，竖向加固深度大于3 m，这是由于强夯动应力径向衰减速度大于竖向衰减速度 [ 18 ] [ 28 ]，故径向有效加固范围不大；试验填土经过强夯处理后，Ps平均值从强夯前的1.54 MPa提高到了强夯后的3.03~5.51 MPa，土体强度发生了明显的提高，提高幅度在97%~258%之间，加固效果明显。 强夯完成之后上部土体的Ps值较下部偏小，主要是因为路基填土为非饱和黄泛区粉土，对强夯具有较强的动力响应，随着夯击次数的增加，下部土体逐渐密实，而表层已经夯实的土体会因振动形成夯击扰动层，土体由密实变得相对松散，强度偏低。由于该扰动区域厚度一般在1 m范围内，通过后期的低能满夯可以对此扰动层进一步加固。 图6为9击、10击的Ps值对比情况。图6显示，10击土体的Ps值比9击土体的Ps值提高了12%~20%，表明加固区域的土体在夯击作用下进一步密实，夯击能量得以向外传递，加固影响范围逐渐增大，夯点周围土体随着夯击次数的增加强度会有进一步的提高，但提高幅度不大。这是由于强夯下土体的变形是耗散结构，强夯时向土体系统内部输入负熵流，系统熵减小，最后趋于某个与夯击能对应的相对稳定状 图4. 9击的静力触探曲线 图5. 10击的静力触探曲线 图6. 单点夯9击和10击的静力触探结果对比 态 [ 29 ]。因此，在夯击能不变的情况下夯击次数的增加对土体并不会有明显的加固效果，相反可能破坏已加固区域的土体，起到相反作用，这与夯沉量检测结果呈现的规律是相吻合的。在满足设计要求的前提下强夯存在一个临界最少夯击次数，即最佳夯击次数 4.3. 单点夯的压实度检测 压实度是路基填土工程的质量控制指标。《公路路基设计规范》(JTG D30-2015) [ 23 ] 对路堤压实度的规定如表3所示。 对单点夯9击、10击后的夯点开挖，采用灌砂法检测不同层位的压实度，测点布置如图2所示。0测点位于夯锤下方，距夯锤中心1.6 m为测点1.6，距夯锤中心2.3 m为测点2.3。压实度检测结果如图7~9所示。 Table 3 Degree of compaction of embankmen 路基部位 路面底面以下深度/m 压实度/% 高速公路、一级公路 二级公路 三、四级公路 上路堤 轻、中等及重交通 0.8~1.5 ≥94 ≥94 ≥93 特重、极重交通 1.2~1.9 ≥94 ≥94 — 下路堤 轻、中等及重交通 1.5以下 ≥93 ≥92 ≥90 特重、极重交通 1.9以下 表3. 路堤压实度 图7、图8显示，强夯后路基的压实度均有较大程度的提高，检测范围内9击、10击土体的压实度均在84%以上，平均压实度增幅在10.9%~17.9%之间，进一步说明试验所采用的强夯能级能够满足4 m松填高度强夯填筑有效加固深度的要求，且能够对地基进行二次加固，加固效果明显。9击、10击中测点0、测点1.6、测点2.3的压实度依次递减，由测点2.3的压实度可知，9击、10击的径向有效加固范围已超过2.3 m。 图7. 9击压实度 图9为9击、10击的压实度对比情况。由图9可知，10击后测点2.3的压实度增加较明显，较9击平均增加了4.4个百分点；其次为测点1.6和测点0，压实度增加了2.3~4.4个百分点，表明土体在强夯作用下加固区域继续增大，但增加幅度较小。 综合静力触探和压实度检测结果，对于松铺厚度为4 m的黄泛区粉土路基，采用3.2 m行间距点夯10击是合理的。 图8. 10击压实度 图9. 单点夯9击和10击压实度对比 图10. 多点夯后压实度检测结果 Table 4 Dynamic compaction process parameter 夯击能/kN∙m 夯点间距/m 最佳击数/次 止夯标准/cm 有效加固深度/m 径向有效加固范围/m 1500 3.2 10 ≤5 >3 >2.3 表4. 强夯工艺参数 注：为保证工程质量，实际夯击次数要同时满足最佳夯击次数和止夯标准。 4.4. 多点夯与满夯后的检测 根据点夯试验结果，拟定强夯工艺参数如表4。夯点采用正方形布置，采用隔行跳夯的方式进行路基强夯。点夯后推平夯坑进行满夯。满夯后选择典型夯点进行路基的压实度检测，结果如图10。 图10显示，经多点夯和满夯后，夯点间以及路基上部压实度得到了显著提高：其中测点0 (即夯锤下)土体的压实度达到92%~98%，测点1.6 (正向夯间)土体的压实度达到91%~97%，测点2.3 (斜向夯间)土体的压实度达到90%~96%。整体上，强夯路基的空间密度呈现不均匀分布，夯锤下的土体压实度略高于夯间测点1.6、测点2.3约1~2个百分点，上部土体的压实度则显著高于下部土体约6个百分点。 采用承载板法检测强夯后路基的回弹模量，结果表明，夯锤以下路基的回弹模量为53 MPa，夯间的路基承载能力略低于夯锤以下路基的承载能力约2.7 MPa，平均约为52 MPa。根据设计方案，夯后路基上部设置2层灰土处置层，经检测设置两层灰土层后3个测点的静回弹模量约提高1倍，路基支撑均匀。
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user: 5. 主要结论与建议 本文通过现场试验，验证了采用1500 kN·m的夯击能填筑松铺厚度4 m的黄泛区高速公路粉土路基的可行性，得到以下主要研究结论和建议。 1) 强夯填筑松铺厚度4 m的黄泛区高速公路粉土路基合理设计和工艺参数为：夯击能1500 kN∙m，夯击数为10击，采用正方形布点的合理夯间距为3.2 m，土的含水率宜控制在最佳含水率−5%~3%范围内。 2) 松铺厚度4 m的粉土路基点夯10击后的夯坑累计深度约为1 m，经多点夯、满夯之后，整体上，强夯路基的空间密度呈现不均匀分布：夯锤下的土体压实度略高于夯间测点1.6、测点2.3约1~2个百分点，上部土体的压实度则显著高于下部土体约6个百分点；夯间的路基承载能力略低于夯锤以下路基的承载能力约2.7 MPa。为保证路基支撑的均匀性，强夯路基上部应该设置一定厚度的均匀过渡层。 3) 强夯路基上部设置2 × 20 cm石灰处置土层后，路基静回弹模量约提高1倍，路基支撑均匀。
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user: 摘要 完整的内皮屏障功能与机体正常的生理活动密不可分，血管内皮屏障功能受损，会出现血管渗漏、水肿等一系列病理变化，而凝血酶正是目前经典的内皮屏障功能破坏剂。从18世纪至今，人们追寻于研究凝血酶诱导内皮渗透性升高的相关机制，希望能从中找到对抗凝血酶破坏屏障功能的方法。本文将针对研究中凝血酶诱导血管内皮细胞渗透性增加的机制，包括凝血酶及其受体的相关特性，以及Ca 2+ 、PKC、Rho GTPases家族、酪氨酸激酶/磷酸酶途径等在凝血酶诱导EC渗透性增加中的作用，结合近年来有关S1P及自噬相关通路的作用作一综述。
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user: 1. 引言 血管内皮细胞层是血液和组织交换物质的一个半透性动态屏障，与体内物质渗透、炎症反应、血液凝固及其他生理病理活动密切相关 [ 1 ] [ 2 ]。正常血管内皮细胞(Endothelial Cell， EC)之间通过肌动蛋白–肌球蛋白偶联的内皮细胞收缩机制及肌动蛋白细胞骨架锚定的粘附连接(Adheren Junction， AJ)，即细胞骨架蛋白通过连环蛋白与VE-钙黏蛋白相连来调节血管屏障功能 [ 2 ] [ 3 ]；诸如凝血酶、组胺、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF)的炎性介质会通过改变细胞连接的状态来影响EC渗透性变化 [ 4 ] [ 5 ]，当血管EC屏障功能受损时，就会出现血管渗漏、水肿等一系列病理变化，同时也是动脉粥样硬化的损伤因素之一 [ 6 ] [ 7 ]，其中以凝血酶对于血管EC渗透性改变最为经典。从80年代至今的科学研究中，凝血酶已被明确证实具有升高血管EC渗透性的作用，但其具体作用机制仍未完全明确，本文将总结当前凝血酶引起血管EC渗透性改变的相关机制，为防治凝血酶诱导的血管EC渗透性升高提供参考。
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user: 2. 凝血酶及其受体 凝血酶分子量大小为37 kda，是由A和B两条多肽链组成的异二聚体，轻链A由36个残基组成，通过残基C1和C122之间的二硫键共价连接到重链B上，重链B则有259个残基，其中含有3个链内二硫键 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]。作为凝血级联中的关键效应蛋白酶，凝血酶本质上是一种Na + 激活的变构丝氨酸蛋白酶 [ 9 ] [ 10 ]，其上Na + 结合位点的占据控制了凝血酶的某些活性，对于凝血酶的变构作用至关重要 [ 10 ]。当血管受损后，通过内源性与外源性凝血途径，FX被激活，生成凝血酶原酶复合物，促进凝血酶原激活从而形成凝血酶 [ 9 ]。凝血酶在血液循环中存在的时间很短，这是因为抗凝血酶(肝脏与血管内皮细胞产生)的存在，可与之结合从而灭活凝血酶，同时，凝血酶在产生后，也会通过激活蛋白质C，负反馈抑制凝血酶自身的产生 [ 9 ]，凝血酶的短暂存在及快速灭活，与凝血酶对于血管内皮渗透性短暂升高后恢复有一定关系。除了参与生成纤维蛋白单体、激活F XIII以及激活蛋白质C系统等凝血相关过程外，凝血酶与血管内皮细胞屏障功能密切相关。 凝血酶的绝大多数细胞效应，是通过激活与异三聚体G蛋白相偶联的蛋白酶激活受体(Protease Activated Receptor， PARs)超家族来发挥的 [ 11 ] [ 12 ]。PARs是一种独特的G蛋白偶联受体(G Protein Coupled Receptor， GPCR)，其独特之处在于它们能被细胞外的丝氨酸蛋白酶水解PARs的N末端序列，从而产生新的末端，称之为“栓系配体(Tethered Ligand)”，而被凝血酶特定区域所激活，进而产生信号转导。PARs在血管内皮细胞、血小板，平滑肌细胞和其他细胞类型中表达。目前在人及鼠中已知的PAR家族有PAR1、PAR2、PAR3、PAR4，而人的PAR1、PAR3及PAR4能够被凝血酶激活，PAR2则是被胰蛋白酶激活，不能被凝血酶激活。凝血酶的四个受体中，又以PAR1最为主要，PAR1的激活，涉及G 12/13 、G q 、G i 蛋白通路，其被蛋白水解的N末端位于第41位精氨酸(Arg41)与42位丝氨酸之间(Scr42) [ 9 ] [ 13 ]。 与野生型小鼠相比，G 12/13 或G q 缺乏的小鼠，表现出明显的凝血酶诱导后MLC磷酸化水平降低，表明G蛋白以及偶联的PARs在当中的重要性 [ 14 ]。在抑制PAR1或PAR3后，凝血酶诱导的内皮细胞渗透性受到明显抑制 [ 15 ] [ 16 ]，同时PAR1具有与PAR3形成异源二聚体的能力，该异源二聚体很容易在生理条件下形成，PAR3可以促进凝血酶与PAR1的结合作用，从而增强凝血酶的效应 [ 17 ]，提示PARs在凝血酶破坏EC屏障功能中发挥着重要作用。凝血酶引起的血管EC渗透性改变涉及多种通路机制，而在众多的通路当中，PARs占据着核心位置，研究表明，其中包括凝血酶刺激后胞内Ca 2+ 升高、PKC的激活、RhoA信号的诱导在内途径，皆与PARs (特别是PAR1)的激活密切相关 [ 18 ]。
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user: 3. 凝血酶的酶活性对内皮细胞单层渗透性的影响 早期学者认为，凝血酶作为一种丝氨酸蛋白酶，其本身具有酶活性，除了通过受体介导机制外，凝血酶可通过其本身的酶活性直接影响血管EC单层渗透性 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。α-凝血酶的衍生物可分为：δ-凝血酶(具有89%凝血酶活性的凝血酶制剂，因此有结合活性及酶促活性)、γ-凝血酶(具有酶促活性的胰酶制剂，据报道该酶缺乏受体结合活性)、DIP-α-凝血酶(Diisopropylphosphorofluoridate-α-thrombin)以及PPACK-α-凝血酶(D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone-α-thrombin)，后两者酶活性不高，但具有高亲和的受体结合活性) [ 19 ]。使用Transwell小室渗透研究模型，在单用δ-凝血酶或γ-凝血酶处理牛肺动脉内皮细胞时，可见 125 I-白蛋白渗透率明显升高，而在该用DIP-α-凝血酶及PPACK-α-凝血酶这两种非酶促形式的衍生物时，并不能增加 125 I-白蛋白渗透率 [ 19 ] [ 20 ]。 另外，有研究表明，α-凝血酶及γ-凝血酶都能激活磷脂酶C (Phospholipase C， PLC)，导致1，4，5-三磷酸肌醇(Inositol Triphosphate 3， IP 3 )的产生及蛋白激酶C (Protein Kinase C， PKC)的激活，从而通过影响Ca 2+ 浓度来发挥升高渗透性的作用，而DIP-α-凝血酶及PPACK-α-凝血酶是无酶活性的，在人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell， HUVEC)中，该两者并不能增加胞内Ca 2+ 浓度 [ 21 ]，上述情况表明，缺乏酶活性、单有受体结合活性的凝血酶衍生物，并不能发挥影响通透性的作用，这提示酶活性在凝血酶对内皮细胞单层渗透性的作用上是必不可少的。当前关于凝血酶与EC渗透性的研究，很少提及酶活性的作用，至于酶活性本身通过增强受体结合作用还是酶活性本身通过其他相关机制来作用于内皮屏障功能，目前尚未有明确定论。
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user: 4. Ca 2+ 在凝血酶诱导的内皮细胞渗透性升高的作用 作为常见的胞内信使物质，Ca 2+ 很早就被证实与凝血酶诱导的屏障功能息息相关 [ 22 ]。凝血酶通过上述机制水解与G蛋白相偶联的凝血酶受体，激活磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol， PI)依赖的PLC催化水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(Phosphatidylinositol 4，5-diphosphate， PIP 2 )，并生成两个重要的第二信使，分别是1，2-二酰基甘油(Diacylglycerol， DAG)和IP 3 。DAG可激活PKC，IP 3 更是经典的促Ca 2+ 分泌剂，可激活Ca 2+ 内流，而这引起的持续激活的PKC以及内流Ca 2+ 的增加，与骨架蛋白、连接蛋白的改变密切相关 [ 21 ] [ 23 ] [ 24 ]。 内皮细胞在静息状态下，细胞浆维持着非常低的游离Ca 2+ 浓度，范围为30~100 nmol/l，在细胞膜两侧的Ca 2+ 浓度大概为胞浆的20，000倍，而胞浆低Ca 2+ 浓度的维持，跟细胞膜上的跨膜通道(如浆膜钙ATP酶通道，Plasma Membrane Calcium ATPase， PMCA)及内质网膜上的跨膜通道(如sarco/ER Ca 2+ -ATPase通道)密切相关 [ 25 ] [ 26 ]。凝血酶作用于EC后，会通过刺激GPCR或者酪氨酸激酶受体(Receptor Tyrosine Kinase， RTK)，激活PLC，进而引起IP 3 生成增加，IP 3 会先介导内质网膜上的钙离子释放，而后待内质网钙离子储存耗竭后，再通过钙库依赖性阳离子通道(Store-Operated Cation Channels， SOCs)启动胞外Ca 2+ 内流 [ 24 ] [ 27 ]。据研究报道，凝血酶也可以通过水解G蛋白偶联受体而产生的DAG来激活受体依赖性阳离子通道(Receptor-Operated Cation Channels， ROCs)来直接促进胞外Ca 2+ 内流，而无需先耗尽内质网钙库 [ 28 ]。另外，有实验表明，凝血酶也可通过介导内质网钙离子浓度感受器(stim1)来实现钙库依赖性Ca 2+ 内流(Store-Operated Calcium Entry， SOCE)，而该过程涉及到钙释放激活钙通道蛋白1 (Orai1)的参与 [ 27 ]。 研究表明，升高的Ca 2+ 与钙调蛋白(Calmodulin， CaM)结合后，会引起CaM构象发生改变，使CaM的疏水面暴露，从而使下游蛋白质与CaM相结合，如特异性钙调蛋白激酶(CaM-Kinases， CaMK)——肌球蛋白轻链激酶(Myosin Light-Chain Kinase， MLCK)，导致肌球蛋白轻链(Myosin Light-Chain， MLC)磷酸化，细胞骨架重排，同时，VE-钙黏蛋白之间的连接分解，细胞骨架收缩力大于细胞间黏附力，细胞间隙增加，渗透性升高 [ 24 ]。多功能CaMK-CaMKII被证明对于内皮屏障功能有明显的影响。例如，凝血酶增加了CaMKII的活化，而用KN-93抑制CaMKII的活化则减弱了凝血酶介导的内皮渗透性的增加 [ 29 ]。在凝血酶诱导的EC高渗透性过程中，升高的胞内Ca 2+ 除了通过Ca 2+ /CaM-CaMK-pMLC来介导屏障功能的变化，还会去影响PKC、Rho、cAMP信号来发挥屏障受损作用(见下文描述)。 Ca 2+ 也会通过影响Ca 2+ 结合蛋白的作用来影响屏障作用，如膜联蛋白A2，具有将VE-钙黏蛋白复合物连接至细胞膜表面及肌动蛋白丝的能力，有研究得出，A2的缺乏，显示出微血管内皮渗透性升高的表现 [ 30 ]，这也进一步说明Ca 2+ 在整个EC屏障功能中的重要作用。
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user: 5. PKC在凝血酶诱导的内皮细胞渗透性升高的作用 PKC属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，目前至少存在11种同工型，按照不同的特性，其同工型可分为三个亚家族：经典型PKC (cPKC，包括α，βI，βII，γ)、新型PKC (nPKC，包括δ，ϵ，η和θ)和非经典型PKC (aPKC，ζ，λ)，其中，经典型PKC是钙离子依赖性的，且受DAG、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、佛波酯(Phorbol Myristate Acetate， PMA)等的调节，新型PKC受DAG或PMA双重调节，但不受钙离子激活 [ 31 ]，而非经典型目前其确切的激活机制尚不清楚，人们只知道这两种亚型的激活不依赖于Ca 2+ 、DAG及PMA，但依赖于PS并可被磷酸肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3 Kinase， PI3K)的两种产物(PIP2和PIP3)激活 [ 31 ]，这提示aPKC可能是PI3K的下游靶标。 PIP 2 经水解后产生的DAG会激活PKC的产生，虽然PKC会负反馈抑制PI-PLC的激活，但PKC的激活与钙离子的增加对凝血酶诱导的磷脂酶A 2 (Phospholipase A 2 ， PLA 2 )以及磷脂酶D (Phospholipase D， PLD)水解膜磷脂酰胆碱(卵磷脂，Phosphatidylcholine， PC)产生花生四烯酸(Arachidonate， AA)和磷脂酸(Phosphatidic Acid， PA)的释放至关重要 [ 23 ]，据国外研究报道，PA很可能作为细胞内的第二信使直接激活PKC或促进磷脂酸磷酸酯酶水解为产生DAG，从而产生PKC的持续激活 [ 21 ] [ 23 ]。另外，凝血酶引起的胞内高钙，也会进一步促进PKC的激活 [ 23 ]。 凝血酶刺激后可引起Caldesmon77和波形蛋白的磷酸化来增加血管内皮渗透性，而在使用PKC抑制剂星形胞菌素后，可明显看到上述两种蛋白磷酸化减少，这也进一步证实了PKC在其中的重要性 [ 32 ]。同时，PKC同样介导凝血酶诱导的肌动蛋白、肌球蛋白、Ca 2+ /钙调蛋白结合蛋白及中间丝蛋白磷酸化，综合影响AJ的多个相关蛋白 [ 32 ]。 另外，PKC还与凝血酶刺激后p120-连环蛋白及VE-钙黏蛋白的解离、钙黏蛋白复合物稳定性减弱密切相关 [ 33 ] [ 34 ]。研究表明，凝血酶诱导的PKCα活化，可经过Rho-GDI (鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂)的磷酸化或者p115RhoGEF磷酸化途径激活RhoA，进而降低HUVECs的跨上皮电阻(Trans-epithelium electrical resistant， TER) [ 35 ]。 新型PKC与Ca 2+ 调控无关，而在使用PKCδ抑制剂或者沉默PKCδ后，皆显示出凝血酶诱导的TER及MLC磷酸化降低，提示PKCδ同样参与到凝血酶作用通路当中，且不受胞浆内Ca 2+ 的影响 [ 36 ]。