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user: 3. 讨论 本研究通过中药网络药理学技术分析，共筛选出槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、刺芒柄花素(formononetin)、甘草查尔酮a (licochalcone a)、异鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)等98个与治疗UC密切相关的活性化学成分，PTGS2、ESR1、CALM1、HSP90AA1、NOS2、PPARG、ESR2、PTGS1、CHEK1、MAPK14等107个潜在靶点，通过cytoscape3.6.0版本软件，得到了附子理中汤–药物靶标–疾病–潜在靶点网络图，利用STRING在线平台，最低相互作用阈值设为最高信度0.9 (high confidence)并选择隐藏游离节点，将TSV结果导入cytoscape3.6.0版本软件获得89节点，通过该软件中cytoHubba插件中的Degree算法，筛选出STAT3、JUN、TNF、RELA、AKT1、MAPK1、MAPK3、IL6、TP53、HSP90AA1等10个核心靶点，该结果表明附子理中汤治疗UC具有多成分、多靶点综合作用的特点。筛选出的10个核心靶点在PPI网络中扮演着重要的角色，预测它们可能是附子理中汤治疗UC的主要靶标。 筛选出的十个核心靶点主要与炎症、免疫与增殖有关，信号转导与转录激活因子3 (STAT3)是STAT蛋白家族的一员，在炎症和免疫控制方面具有关键作用，被认为是免疫和炎症的关键蛋白，在Jak/STAT3通路中发挥着重要作用 [ 4 ]。IL-6炎症因子激活JAK2，使其转变为p-JAK2，刺激STAT3磷酸化，磷酸化后的Stat蛋白发生构象变化，易位至细胞核，结合靶基因抑制细胞因子信号抑制物(SOCS)的表达，导致STAT3磷酸化持续进行，进一步产生IL-6因子，进而加重炎症 [ 5 ] [ 6 ]。转录因子AP-1 (JUN)与结肠直肠癌(CRC)细胞中的特定肽酶(USP28)促进剂结合，参与激活KRAS介导的结肠直肠癌(CRC)细胞特定肽酶(USP28)的转录激活，KRAS通过以ZNF304依赖的方式诱导结肠直肠癌(CRC)细胞中的肿瘤抑制基因(TSG)的转录沉默，在促进肿瘤事件方面发挥作用 [ 7 ]。肿瘤坏死因子(TNF)指一组可以引起细胞死亡(凋亡)的细胞因子，也是一种主要炎症细胞因子。TNF-α是TNF/TNFR细胞因子超级家庭的成员，是UC发病的主要炎性启动因子，它能与炎症细胞相互作用，导致肠组织内各种炎症细胞浸润，加重肠黏膜的炎症反应，还能刺激单核巨噬细胞、中性粒细胞合成IL-1β，IL-6，IL-8等细胞因子进一步加重炎症反应 [ 8 ]。NF-κB p65蛋白(RELA)是存在于几乎所有细胞类型的全息转录因子，参与炎症、免疫、分化、细胞生长、肿瘤形成和凋亡等生物过程，UC发生后，通过活化NF-κB使体内迅速产生IL-1β，引起炎症介质释放，同时刺激TNF-α、IL-6、IL-8等其他细胞因子的分泌，进一步诱导产生更多的细胞因子，形成级联性释放，从而加重炎症反应，造成组织损伤 [ 8 ]。AKT1 (AKT serine/threonine kinase 1)是3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1，AKT2，AKT3)之一 [ 9 ]，通过参与AGE-RAGE，PI3K-Akt和MAPK等多个与炎症、免疫、代谢和细胞增殖相关的信号通路对相关生物学过程进行调节。热休克蛋白90A家族(HSP90AA1)是一类能促进特定靶蛋白成熟、结构维持和适当调节的分子伴随蛋白，参与细胞周期控制和信号转导；细菌脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外壁的主要结构成分，是引起炎症反应的有效因子，可作为细菌感染的指标之一。脂多糖(LPS)激活单核巨噬细胞和活化的Ｔ淋巴细胞产生和释放TNF引起炎症反应，HSP90AA1与细菌脂多糖(LPS)结合，调解LPS引起的TNF释放导致的炎症反应 [ 10 ]。IL-6主要由巨噬细胞和中性粒细胞分泌，是一种炎症标志物，通过激活STAT3信号通路，诱导黏膜机械屏障通透性增加，促进慢性炎症的持续发生 [ 11 ]。MAPK家族是能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶，通过三级激酶模式共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理病理过程。丝裂原活化蛋白激酶1 (MAPK1)和丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)是MAPK家族中的重要组成部分，广泛存在于哺乳动物各种组织，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，MAPK1/ERK2和MAPK3/ERK1是2个在MAPK/ERK级联中发挥重要作用的MAPK，MAPK/ERK级联通过对转录、翻译、细胞骨质重新排列的调节，调节细胞生长、粘附、生存和分化等多种生物功能 [ 12 ] [ 13 ]。 附子理中汤治疗UC靶点富集的信号通路主要涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF、PI3K-Akt、Th17细胞分化、HIF-1以及部分癌症疾病等通路(详见图8)，呈现出中药多成分协同、多靶点联合、多通路协调的整体性作用的机制。白细胞介素信号17通路(IL-17信号通路)、AGE-RACE、PI3K-Akt信号通路、HIF-1、Th17细胞分化主要与代谢、免疫炎症以及氧化应激有关，肿瘤坏死因子信号通路(TNF信号通路)主要涉及炎症与免疫调节。 根据附子理中汤–药物靶标–疾病–潜在靶点网络图，运用“network analysis”进行拓扑分析，按照Degree值，对中药化合物成分进行排序，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、刺芒柄花素(formononetin)、甘草查尔酮a (licochalcone a)、异鼠李素(isorhamnetin)等中药化合物排名前列，预测它们可能是附子理中汤治疗UC的关键药物有效活性成分。UC发病与自身免疫炎症反应及炎症细胞因子相关，根据相关文献 [ 9 ]，槲皮素具有抗氧化及清除自由基的作用、抗炎、抗病毒、降糖、降脂、免疫调节的作用。槲皮素在治疗UC过程中，一方面，槲皮素可降低细胞内活性氧自由基，对氧化损伤的细胞具有保护作用，另一方面可以通过抑制免疫细胞分泌促炎细胞因子(TNF-a、IL-2)，促进分泌抗炎细胞因子(IL4、IL-10和转化生长因子-β1)，还可以通过抑制与转录因子(NF-κB)、重组人信号转导与转录激活因子(STAT)相关的基因表达来抑制炎症细胞因子的分泌，从而发挥抗炎作用 [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]。山柰酚具有很好的抗炎作用，通过抑制肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-6水平及核因子-κB (NF-κB)、STAT信号通路的活化来抑制炎症细胞因子的分泌，进而达到抗炎的功效 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。研究表明 [ 22 ]，柚皮素具有抗凋亡、抗氧化、抗线粒体、抗纤维化和抗炎的作用。刺芒柄花素通过抑制NF-κB信号通路的激活来抑制炎症细胞因子的分泌，进而发挥抗炎效果 [ 23 ]。甘草查尔酮a具有抗炎、抗氧化的作用，主要通过抑制NF-κB通路，导致TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达减少来发挥抗炎作用 [ 24 ]。异鼠李素通过调节PI3K/Akt、NF-κB、MAPK等信号通路，在抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等方面发挥着重要作用，在治疗UC过程中，异鼠李素可以通过调节MAPK、NF-κB信号通路抑制TNF-α导致的炎症，进而达到治疗效果 [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]。