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user: 3. 结果与分析 3.1. 影响菌体浓度的显著性因子 采用Plackett-Burman设计对主要因素的6个因子进行考察，各组分分别取高水平(+1)和低水平(−1)，见表2；各因子水平方差分析结果见表3。 Table 2 Plackett-Burman design and response result 序号 A B C D E F 活菌数(10 8 cfu/mL) 1 −1 −1 −1 1 −1 1 3.8 2 1 −1 1 1 −1 1 4.6 3 1 1 1 −1 −1 −1 6.1 4 1 −1 1 1 1 −1 4.7 5 −1 −1 1 −1 −1 1 4.7 6 −1 1 1 −1 1 1 5.1 7 −1 1 1 1 −1 −1 3.5 8 −1 1 −1 1 1 −1 3.3 9 1 1 −1 −1 −1 1 5.4 10 −1 −1 −1 −1 −1 −1 4.0 11 1 −1 −1 −1 1 −1 5.7 12 1 1 −1 1 1 1 3.9 表2. Plackett-Burman设计及响应值 Table 3 The levels of Placket-Burman and analysis of variance for regression mode 因素来源 平方和 均方 F p-value Prob > F 重要性 Model 7.89 1.31 7.68 0.0205 X 1 -葡萄糖 3 3 17.51 0.0086 2 X 2 -MgSO 4 0.01 0.01 0.019 0.8945 5 X 3 -牛肉膏 0.56 0.56 3.28 0.1295 3 X 4 -酵母膏 4.32 4.32 25.21 0.0040 1 X 5 -K 2 HPO 4 0 0 0 1.0000 6 X 6 -CaCO 3 0.01 0.01 0.019 0.8945 4 表3. Placket-Burman实验水平及回归模型方差分析 由表3可知，培养基中各因子菌株对C3发酵液活菌浓度影响的重要性排序为：X 4 > X 1 > X 3 > X 6 > X 2 > X 5 。即酵母膏、葡萄糖和牛肉膏的影响比较明显，酵母膏对于菌体数量呈现负效应，而葡萄糖和牛肉膏呈正效应。即 W = 4.25 + X 1 − 0.03 X 2 + 0.87 X 3 − 2.4 X 4 + 2.56 × 10 − 14 X 5 + 0.67 X 6 ，方程R 2 = 0.9021，表明该回归方程拟合良好。从方程中还可以看出，要提高菌体数量，应适当降低酵母膏添加量，提高葡萄糖和牛肉膏添加量。 3.2. 最陡爬坡试验研究最大响应值的响应区域 利用爬坡实验快速逼近最大响应值稳定响应区，根据Plackett-Burman试验设计筛选出的主要组分的效应大小设计步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找最优菌数。如表4所示，第2组试验发酵菌体浓度最大，即当葡萄糖浓度为17.5 g/L，牛肉膏浓度为8 g/L，酵母膏浓度为6.5 g/L时发酵菌液浓度达到最大值，故以此为中心点进行响应面试验分析。 Table 4 Steepest ascent procedure and corresponding result 试验号 葡萄糖(g/L) 牛肉膏(g/L) 酵母膏(g/L) 活菌数(10 8 cfu/mL) 1 15 7.5 7.5 3.3 2 17.5 8 6.5 5.4 3 20 8.5 5.5 4.2 4 22.5 9 4.5 3.1 5 25 9.5 3.5 2.4 表4. 最陡爬坡试验设计及结果 3.3. 响应面试验数据分析 根据爬坡试验结果，采用Box Behnken模型，以葡萄糖、牛肉膏和酵母膏为主要考察因子，以+1、0、−1分别代表自变量的高、中、低水平，以发酵液活菌数为响应值，通过响应曲面分析(RSM)进行培养基主要成分的优化。因子编码及水平如下，见表5。 Table 5 Factors and levels of Box-Behnken desig 符号 因子 水平(g/L) −1 0 1 E 葡萄糖 15 17.5 20 F 牛肉膏 7.5 8 8.5 G 酵母膏 5.5 6.5 7.5 表5. Box-Behnken设计因子代码与水平 通过Box Behnken模型进行三因素三水平试验设计，见表6。利用Design Expert 8.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到了菌体数量为响应值Y对葡萄糖E、牛肉膏F、酵母膏G的二次多项回归模型方程为： Y = − 195.35 − 27.85 E + 464.75 F + 105.88 G + 26 E F + 23 E G + 5 F G − 2.2 E 2 − 315 F 2 − 113.75 G 2 Table 6 Box Behnken design and response value 试验号 E F G 活菌数(10 8 cfu/mL) 1 −1 −1 0 4.2 2 1 −1 0 3.7 3 −1 1 0 4.4 4 −1 0 −1 5.2 5 0 0 0 4.3 6 1 0 −1 3.2 7 −1 0 1 3.7 8 1 0 1 4.9 9 0 −1 −1 2.7 10 0 1 −1 3.7 11 0 −1 1 3 12 0 1 1 4.1 13 0 0 0 5.6 14 0 0 0 5.6 15 0 0 0 5.2 16 0 0 0 4.9 17 0 0 0 5.2 表6. Box Behnken模型设计和响应值 Box Behnken设计的方差分析见表7，模型的拟合度可通过决定系数来衡量，Joglekar和May建议，一个良好的模型，决定系数至少为0.80，该模型的决定系数为0.9691，且回归模型极显著(p < 0.01)，因此，该模型能充分地表明各因素之间的关系。 Table 7 Analysis of variance of the regression parameters for Box Behnken design mode 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值Prob > F 显著性 模型 12.71 9 1.412255 24.41 0.0002 ** E-葡萄糖 0.02 1 0.02 0.35 0.5750 F-牛肉膏 1.81 1 1.81 31.20 0.0008 ** G-酵母膏 0.41 1 0.41 7 0.0331 * EF 0.42 1 0.42 7.30 0.0305 * EG 1.32 1 1.32 22.86 0.0020 ** FG 0.01 1 0.01 0.04 0.8412 E 2 0.08 1 0.08 1.38 0.2792 F 2 2.61 1 2.61 45.13 0.0003 ** G 2 5.46 1 5.46 94.16 <0.0001 ** 残差 0.41 7 0.06 失拟项 0.05 3 0.02 0.17 0.9136 纯误差 0.36 4 0.09 总回归 13.12 16 决定系数R 2 0.9691 校正决定系数AdjR 2 0.9294 表7. Box Behnken模型设计方差分析表 注：p < 0.0100极显著( ** )；p < 0.0500显著( * )；p > 0.0500不显著。 根据方差分析和回归方程系数显著性检验的结果，将差异不显著的因子剔除后得到的回归方程为： Y = − 195.35 + 464.75 F + 105.88 G + 26 E F + 23 E G − 315 F 2 − 113.75 G 2 由表7方差分析可知，失拟项P = 0.9136 > 0.05，差异不显著，说明残差由随机误差引起；复相关系R为0.9844，表明实测值和预测值高度相关；R 2 为0.9691，拟合度>90%，说明模型能够反应响应值变化，试验误差小，可以用此模型培养基主要成分进行分析和预测。 3.3.1. 自变量对响应值的影响 回归方程的回归系数影响菌体数量，由表7可知，F、G、EF、EG、F 2 、G 2 项对菌体数量有显著影响，其他因素影响不显著。回归方程一次项的回归系数绝对值大小依次为F、G、E，表明牛肉膏添加量对菌数的影响最大，其次为酵母膏添加量、葡萄糖添加量。 3.3.2. 葡萄糖添加量与牛肉膏添加量对菌体数量的影响 由图1可知，葡萄糖添加量与牛肉膏添加量对菌体数量的交互作用。当其他条件一定时，菌体数量随着葡萄糖添加量的提高而下降，随着牛肉膏添加量的提高呈现先上升后下降的趋势，当葡萄糖添加量在15 g/L、牛肉膏添加量在8 g/L附近时菌体数量达到最大，此时牛肉膏添加量对菌体数量的影响极显著(p < 0.01)，葡萄糖添加量影响不显著(p > 0.05)，两者交互作用显著(0.05 < p < 0.01)。这是因为15 g/L葡萄糖能够提供菌体生长的C源，过多的葡萄糖反而抑制菌体生长。 图1. 葡萄糖与牛肉膏交互作用对菌体数量影响的响应面 3.3.3. 葡萄糖添加量和酵母膏添加量对菌体数量的的影响 由图2可知，葡萄糖添加量与酵母膏添加量对菌数的交互作用。在一定条件下，菌数随着酵母膏添加量提高呈现先上升后下降的趋势，当葡萄糖添加量大于17.5 g/L时，菌体数量的增长趋于平缓，随着葡萄糖添加量的提高呈现下降的趋势，葡萄糖添加量、酵母膏添加量交互作用极显著(p < 0.01)，酵母膏添加量对菌数的影响显著(0.01 < p < 0.05)。 图2. 葡萄糖和酵母膏对菌体数量影响的响应面 3.3.4. 牛肉膏添加量和酵母膏添加量对菌体数量的影响 由图3可知，牛肉膏添加量和酵母膏添加量对菌体数量的交互作用。当其他条件一定时，菌体数量随着牛肉膏添加量和酵母膏添加量的提高呈现先上升后下降的趋势，当牛肉膏添加量在8 g/L、酵母膏添加量在6.5 g/L附近时菌体数量达到最大，牛肉膏添加量对菌数的影响极显著(p < 0.01)，酵母膏添加量对菌数的影响显著(0.01 < p < 0.05)，两者交互作用不显著(p > 0.05)。 图3. 牛肉膏和酵母膏对菌体数量影响的响应面 3.3.5. 最佳条件的确定与验证 通过Design Expert 7.0软件分析，得出培养基主要成分添加量为：葡萄糖20 g/L，牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，预测最优值为5.56 × 10 8 cfu/mL。3次重复试验以优化，其检测结果为5.4 × 10 8 cfu/mL，与真实值的相对误差为2.88%＜5%，表明所优化的最佳条件合理可靠的，验证了所建模型的正确性。故，浅黄假单胞菌C3菌株的最优培养基配方为：葡萄糖20 g/L，MgSO 4 0.2 g/L，牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，K 2 HPO 4 1 g/L，CaCO 3 1 g/L。