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user: 4. 抗氧化性能的化学检测方法 目前多种试剂和方法被广泛用于抗氧化能力的检测，有些试剂还被开发成商业化的标准试剂盒。然而，由于抗氧化剂种类众多、结构各异，使用的环境也不尽相同，每种抗氧化检测方法都有一定的优点和局限性。基于反应机理，抗氧化能力测定法可分为两大类：基于单电子转移(SET)反应[ 46 ] [ 47 ] 和基于氢转移(HAT)的反应的抗氧化能力测定方法。其实，有些测试方法可能同时涉及HAT和SET反应。 按照反应机理，抗氧化能力检测法大致可以分为以下几类[ 46 ] ：Folin-Ciocalteu (Folin-C)总酚测定法，DPPH自由基清除法，Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)总抗氧化能力测定法，抗氧化剂还原 图8. 谷胱甘肽的抗氧化机制 图9. 多酚类抗氧化剂的抗氧化机制 三价铁离子的能力(Ferric-reducing antioxidant power，FRAP)测定法和氧自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC)测定法，β-胡萝卜素/亚油酸模型测定法和抑制磷脂过氧化反应测定法等。 4.1. 基于电子转移(SET)的测定法 4.1.1. DPPH法 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基法是最常用的评价植物样品抗氧化活性的方法之一。DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色(最大吸收波长517 nm)，能接受一个电子或氢离子。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在517 nm处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系[ 47 ] [ 48 ] ，其原理如图10所示。使用紫外-可见分光光度计测量DPPH自由基的吸光度，可以定量检测抗氧化剂的抗氧化性能[ 49 ] 。抗氧化剂清除自由基的活性(RSA)可以用下面的公式计算： 式中：AE为样品的吸光度，AD为空白试剂的吸光度。DPPH法具有简单和快速的优势，适用于快速筛选和评价多种样品清除自由基的活性，在筛选天然抗氧化剂(植物提取物)和评价抗氧化活性方面具有广泛应用。但是，DPPH是一个稳定的氮自由基，存在的时间较长，而脂质氧化生成的自由基活性高、存在时间短暂(瞬间存在)，由于空间阻碍作用，许多能与脂质自由基快速反应的抗氧化剂与DPPH的反应却很慢，或对DPPH无活性。一些小分子的抗氧化剂更容易 接近自由基，因此该法测得的小分子物质的抗氧化活性会比较高[ 50 ] 。使用DPPH法时，生色团的存在也会干扰测定结果，如类胡萝卜素在515 nm附近有吸收，会对测定结果产生影响。此外，单羟基酚类物质(如酪氨酸)、单糖(如葡萄糖)、嘌呤和嘧啶等不能与DPPH反应，蛋白质遇DPPH容易生成沉淀，所以该法不适合测定这些物质的抗氧化性。低价无机离子也会干扰测定结果，测量时必须将这些干扰除去。 4.1.2. Folin-Ciocalteu法 Folin-Ciocalteu试剂即磷钨酸和磷钼酸混合试剂，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成蓝色的钨兰和钨兰混合物[ 51 ] ，其原理如图11所示。生成的蓝色混合物在765 nm处有最大吸收峰，且吸光度与总酚的含量在一定浓度范围内呈线性关系。使用没食子酸作为标准，以吸光度为纵坐标，没食子酸溶液质量浓度为横坐标可绘制标准曲线。样品与Folin-Ciocalteu试剂在适宜的温度下，反应特定时间，显色后在765 nm处测其吸光度，通过标准曲线并按下列公式可计算出多酚的含量： 式中W为多酚含量(pg/mL)；C为没食子酸质量浓度(g/mL)；V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；M为取样量(mL)。 Folin-Ciocalteu比色法是植物多酚类化合物含量的常用测定法，具有成本低廉、操作简便、准确度和精密度高等优点[ 52 ] 。但Folin-Ciocalteu试剂和形成的蓝色产物在碱性或高温下都易分解，而酚在碱性条件下才能反应，所以升高温度和碱性条件虽可以加速反应，提高检测效率，但会影响测定精度。植物中存在的非酚类化合物如抗坏血酸、糖、芳香胺、有机酸和蛋白，可能与Folin-Ciocalteu试剂反应[ 53 ] 。还有一些无机物如硫酸铁，亚硝酸钾，磷酸钠和硫酸锰也可能与酚试剂反应，都会导致酚类化合物浓度的测定值偏高。 4.1.3. TEAC法 TEAC法也叫ABTS assay，是用Trolox作为标准抗氧化剂，来测定其他抗氧化物质总抗氧化能力的一种测定方法[ 54 ] 。(2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与过硫酸钾反应可生成稳定的ABTS . + ，而且呈现深蓝色[ 9 ] ，其原理如图12所示。有其他抗氧化物质存在的时候，ABTS . + 的生成会受到抑制，待一定浓度的抗氧化剂与ABTS试剂作用一定时间后，测量734 nm的吸光度变化即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)是一种维生素E的类似物，和维生素E的抗氧化能力相近，其他物质的抗氧化能力可用其抗氧化能力与同浓度下Trolox相比的倍数来表示，得到的数据叫做TEAC值。 ABTS自由基既溶于水又溶于有机溶剂，不受离子强度影响，可以用来同时测量样品中亲水性和亲脂性化合物的抗氧化能力。另外，ABTS . + 具有低的氧化还原电位(0.68 V) [ 55 ] ，适用于评估酚的抗氧化能力。但是，ABTS . + 与抗氧化物质反应较慢，TEAC法高度依赖于保温时间、样品量与ABTS自由基浓度的比值。选取较长的反应时间能获得高的准确性和可重复性，但不能表征不同物质间抗氧化反应速度之间的差异。 图11. Folin-Ciocalteu总酚测定法的反应原理[ 47 ] 图12. TEAC法的反应机理 4.1.4. FRAP法 FRAP测定法是以铁氰化钾为氧化性试剂，与抗氧化物质反应后生成Fe 2+ ，Fe 2+ 进一步与三吡啶三吖嗪(TPTZ)结合生成蓝色络合物(如图13所示)，在波长593 nm处有最大光吸收[ 47 ] [ 56 ] 。蓝色络合物的生成量与受试物的还原能力成一定比例，吸光度值越大，表明由抗氧化物质还原的Fe 2+ 越多，即该物质的抗氧化活性越强。 FRAP法具有操作简单、测定速度快等优点，而且对定量测定亲水和亲脂性抗氧化剂都是有效的。FRAP法的氧化还原反应在大多数情况下都能迅速(4分钟内)完成，但有些酚类化合物反应较慢，就需要较长的反应时间。FRAP法的一个局限是铁(III)盐的氧化还原电位约为0.70 V，理论上氧化还原电位低于0.70 V的任意化合物都可以还原铁造成干扰[ 47 ] 。例如蛋白质与巯基抗氧化剂如谷胱甘肽就不能由FRAP法来测量。另外，FRAP法是在pH 3.6条件下进行的，与人体生理环境pH 7~7.4相差较大。 4.2. 基于氢转移(HAT)的测定法 4.2.1. ORAC法 ORAC测定法涉及一个相对复杂的反应体系和反应过程，反应体系主要包括自由基产生源、被自由基攻击起氧化反应的靶指示剂、抗氧化物质(标准品或被测样品)和反应介质几部分。反应的基本过程如图14所示，自由基产生剂如水溶性化合物2，2’-偶氮(2-甲基丙基脒)-二盐酸盐AAPH首先与氧反应，产生过氧自由基，后者攻击靶指示剂(荧光探针) [ 57 ] [ 58 ] 。随着靶指示剂被攻击，发生氧化反应，靶指示剂的指示信号(荧光)逐渐减弱。如果反应体系中加入抗氧化物质，由于其竞争性地与自由基作用，减弱、延缓了靶指示剂的氧化过程，对靶指示剂起到了保护作用，通过监测靶指示剂信号的变化，可记录这一过程[ 59 ] 。这一竞争性反应被认为是最可能接近体内抗氧化物质的作用形式。目前已成功应用于生物样品、植物或食品提取物以及纯化合物等多种样品的体内外抗氧化能力分析，也可检测化合物的氧自由基清除能力。 ORAC法检测过程中能提供稳定可控的自由基，这些自由基与生命现象中的自由基具有高度的一致性，而且作为靶指示剂的荧光分子与待测样品之间不发生相互作用，不会干扰样品的测定结果。因此，该方法与其他抗氧化活性分析方法相比，在灵敏度、精密度、准确度、重复性及应用范围等方面均有一定的优势。但ORAC法也存在一些不足，例如荧光分子的荧光强度对反应体系的pH值可能相对敏感，而且AAPH自发分解产生过氧自由基的速率主要取决于温度，因此ORAC方法需要在一定pH范围内恒温测定。 图13. FRAP测定法的反应机理 图14. ORAC法的反应原理[ 47 ] 4.2.2. β胡萝卜素-亚油酸褪色测定法 β胡萝卜素-亚油酸氧化法是基于亚油酸在高温下分解产生的过氧化氢能使β-胡萝卜素褪色来进行的光谱分析方法[ 47 ] [ 60 ] ，如图15所示。 一个典型的测试过程如下[ 61 ] ：将0.2 mg β胡萝卜素溶于0.2 mL氯仿中，然后加入20 mg亚油酸及200 mg吐温−40。混合均匀后置于40℃水浴中除去氯仿，再加入50 mL蒸馏水剧烈振荡并鼓入氧气2~3 min，即配成反应介质溶液。除不加β-胡萝卜素氯仿溶液外，其他步骤同前配成空白对比溶液。在具塞试管中逐一加入4.0 mL反应介质溶液，再分别加入0.2 mL样品液(浓度为100和200 mg/kg)，同时设置空白调零管、对照管、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)管和PG管。其中空白调零管中不含β-胡萝卜素与试样，对照管不含试样，以0.2 mL溶剂代替试样溶液。上述溶液混匀后，置于50℃水浴中恒温，在470 nm波长下测定t = 0时的吸光度，之后每间隔15 min测定吸光度，直至对照管中β胡萝卜素颜色消失(约120 min)，平行测定3次。 β胡萝卜素-亚油酸法的优点是只使用少量的样品和试剂，重现性好，对脂溶性样品测定效果好。缺点是相对于Folin-Ciocalteu法操作繁琐、费时。该方法还有一个重要的限制是β胡萝卜素可通过多种途径在470 nm发生褪色，使得结果可能比较复杂。而藏红花素只能经过自由基氧化途径漂白，用藏红花素取代β胡萝卜素可提高测定的可靠性[ 62 ] 。 4.2.3. 抑制磷脂过氧化测定法 该方法是利用Cu催化脂质发生过氧化反应生成丙二醛(MDA)，MDA在酸性加热条件下可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成粉红色(最大吸收峰在532 nm)的硫代巴比妥酸 (TBARS) [ 63 ] (如图16所示)。当体系中有抗氧化物质存在时，MDA生成量减少，终产物TBARS的产量也会减少，因此可通过吸光值的变化来评价脂质过氧化反应的程度。 巴比妥测试法是非专一性的检测，不仅能测量生成的MDA的含量，还容易受其他含氧化合物的干扰。另外，实验过程需要高温条件，对于某些脂质在检测过程中可能发生氧化甚至导致过氧化物的过度氧化。因此，相对于对于大多数其他检测方法，该检测方法的灵敏度相对较低[ 64 ] 。 图15. β胡萝卜素-亚油酸褪色法的反应机理 图16. 抑制磷脂过氧化测定法的反应机理 4.3. 其他ROS清除能力测定 4.3.1. 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)检测法 NBT法是利用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)与超氧阴离子O 2 .− 反应生成甲臜，后者为蓝色物质，在560 nm波长处有强吸收[ 65 ] (如图17所示)。当加入抗氧化物质后，可竞争性与超氧阴离子反应，抑制NBT的还原，从而导致甲臜含量降低和560 nm附近吸光度的减弱。茶多酚和维生素C都能有效清除O 2 .− ，所以都可以用此法检测。抑制蓝色甲臜生成的量与抗氧化剂的用量在一定范围内呈正比关系[ 66 ] 。该方法可用于实验室抗氧化剂的筛选与研究，也可用于次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶生成超氧阴离子浓度的检测，但不适用于一些非酶抗氧化剂的定量检测。 4.3.2. DHE法 荧光探针二氢乙锭(DHE)检测法是利用DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并与O 2 . − 反应生成具有红色荧光的氧化乙啶的一种光谱检测方法[ 67 ] ，其原理如图18所示。氧化乙啶可插入染色体DNA中，并仍然产生红色荧光，荧光强度与体系中O 2 .− 的量有关，根据活细胞中红色荧光的强度，可以判断细胞ROS含量和变化[ 65 ] 。 通过荧光显微镜可直接用DHE荧光检测法研究细胞内ROS的含量和分布。DHE法还具有高的DNA绑定特异性，能帮助理解血管重塑过程中的氧化还原[ 67 ] ，是一种快速简便的检测组织或培养活细胞中ROS的经典方法。该测试方法的缺点是DHE探针见光易分解，保存过程中应尽量避光，长时间测量也可能导致明显的光漂白现象。