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user: 2. 实验材料 2.1. 实验物品 2.1.1. 实验对象 购自济南朋悦实验动物繁育有限公司SPF级雌性C57BL/6小鼠(7~8周龄)小鼠，经检疫均合格，实验前检查小鼠全身情况并于裂隙灯下检查眼部情况确保眼部健康，所有动物使用均符合中国科学技术部实验动物的人道待遇指导(vgkfcz-2006-398)，并且均符合美国眼科和视觉研究协会的有关伦理要求和相关规定。 2.1.2. 实验烟曲霉菌 购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的标准烟曲霉菌菌株(编号3.0772)。 2.1.3. 实验细胞 购自中国科学院(上海)的小鼠RAW 264.7细胞系。 2.2. 实验主要相关耗材 2.2.1. 细胞培养及真菌培养所需实验试剂和耗材 细胞培养瓶 美国Corning公司；Sabouroud培养基 北京Solarbio公司；组织研磨棒 美国Corning公司；无水乙醇江苏强盛功能化学股份有限公司；PBS磷酸盐缓冲液粉末(2 L)北京Solarbio公司；蛋白胨北京Solarbio公司；Tween 20、Tween 80 美国Sigma-Aldrich公司。 2.2.2. 构建动物模型所需的实验耗材与试剂 微量注射器(10 μl) 瑞士Hamilton公司，Parafilm封口薄膜上海生物有限公司；一次性注射器(30 G)上海康德莱公司；组织研磨棒(玻璃)江苏金佩有限公司；眼科专用手术显微器械上海眼科耗材中心。 2.2.3. 实验用药 CS(CS) MCE公司。 2.2.4. PCR实验试剂及耗材 EP管(1.5 ml， 2 ml)美国Corning公司；RNAiso Plus日本TaKaRa有限公司；三氯甲烷(氯仿)江苏强盛功能化学股份有限公司；异丙醇江苏强盛功能化学股份有限公司；SYBR PremixExTaq (Til RNaseH Plus)日本TaKaRa有限公司；无水乙醇江苏强盛功能化学股份有限公司；Prime Script RT逆转录试剂盒日本 TaKaRa有限公司；PCR八联排薄壁管(0.2 ml，含平盖)美国Axygen公司；DEPC-treated water (100 ml)北京Byotime公司；Tip枪头(1000 μl、200 μl、10 μl) 美国Axygen公司。 2.3. 实验方法 2.3.1. 烟曲霉菌的培养与制备 在无菌超净操作台上将复温的标准烟曲霉菌株吹打后采用平板划痕法接种于Sabouroud琼脂固体培养基上，置于30℃恒温孵育箱内孵育4~5天，确保其在培养基内正常生长，并且在显微镜下密切关注菌株的生长状态，待培养基长出菌丝后，在无菌超净操作台上使用含有0.1% Tween20的PBS缓冲液冲洗培养基，收集孢子。经洗涤、离心(4℃、12，000 g、5分钟)、弃上清、重悬，4℃低温保存。 2.3.2. 建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型 使用1 ml无菌注射器腹腔注射浓度为8%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉小鼠。在眼科手术显微镜下，使用30 G一次性注射器针头在瞳孔缘对应的角膜做一深达中部基质层的点状划痕，使用10 μL Hamilton微量注射器将2 μL孢子悬液(2.5 × 10 7 cfu/mL)注射至小鼠右眼中央角膜基质层，左眼不予处理，作为空白对照组。将小鼠随机分为两组，分别为400 μg/ml浓度的CS处理组和PBS处理组。给药方式为滴眼液点眼，给药频率为一天四次，在建模后的第1、3天，对小鼠角膜使用眼科裂隙灯下拍照观察并进行临床评分。评分标准参照WU [ 26 ]。 2.3.3. RAW细胞处理 将RAW细胞接种于12孔板上，于恒温箱培养至融合率达到80%时，使用灭活的烟曲霉菌菌丝悬浮液(菌丝终浓度为5 × 10 6 cfu/ml)刺激1小时后，加入不同浓度的CS (100 μg/ml、200 μg/ml和400 μg/ml)或PBS，灭活的烟曲霉菌菌丝悬浮液刺激8小时后使用细胞刮收集RAW细胞于EP管中，用于Real-Time RT-PCR实验，用于检测TLR-2，Dectin-1和LOX-1的mRNA表达。 2.3.4. Real-Time RT-PCR实验方法 1) 提取Total RNA 将12孔板RAW细胞每孔中加入500 μl RNA裂解液，细胞刮轻刮孔底，移液枪收集样本至EP管中；将取小鼠角膜组织置于装有800 μl RNA裂解液的EP管中，超声细胞破碎仪破碎角膜组织。将两者置于冰盒裂解30分钟。4℃，12，000 rpm，离心10分钟后提取上清液移至EP管中。向提取的上清液中加入与RNA裂解液1/5体积量相等三氯甲烷，，振荡混匀，室温静置5 min，4℃，12，000 rpm，离心15分钟后提取上清液移至EP管中。继续将提取上清液中加入等体积异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min，4℃，12，000 rpm，离心10分钟后弃上清液，保留RNA沉淀。75%乙醇洗涤RNA沉淀，重复振荡混匀，4℃，12，000 rpm，离心10分钟后弃上清液，保留RNA沉淀，待EP管中的液体完全蒸发后，向管底加入10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，充分振荡–离心–振荡，操作结束后即刻测定RNA的含量、纯度和纯度。 2) Total RNA含量及浓度测定 调整核酸蛋白分析仪的OD值(optical density， OD)至0后，取1 μl样本进行测定，在260 nm、280 nm处OD值以及OD260/OD280的比值R，(RNA纯净度：R值 > 1.6)，测量三次取平均值。 3) PCR 将SYBR Premix Ex Tap 10 μL、引物1 μL、cDNA模板2 μL、DEPC水7 μL混合后加至八连排，充分离心、振荡、再离心后立即置PCR仪上，进行扩增反应。PCR反应条件：95℃ 30 s (预变性)；95℃ 45 s (变性)；60℃ 30 s；95℃ 15 s (退火、延伸)；60℃ 30 s；95℃ 15 s (溶解)。根据循环数计算样本mRNA 的相对表达量。引物序列见表1。 Table 1 Primer sequence of target gen Gene Primer Nucleotide Sequence GenBank β-Actin (mouse) F R 5’-GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C-3’ 5’-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C-3’ NM_007393.3 TLR-2 (mouse) F R 5’-CTC CTG AAG CTG TTG CGT TAC-3’ 5’-TAG TTT ACC CAG CTC GCT CAC TAC-3’ NM_011905.3 Dectin-1 (mouse) F R 5’-GAC CCA AGC TAC TTC CTC-3’ 5’-GCA GCA CCT TTG TCA TAC T-3’ NM_020008.3 LOX-1 (mouse) F R 5’-AGG TCC TTG TCC ACA AGA CTG G-3’ 5’-ACG CCC CTGGTC TTA AAG AAT TG-3’ NM_138648.2 表1. 目的基因引物序列 F， forward; R， reverse. 2.4. 统计学方法 细胞及小鼠角膜中有关目的基因结果的实验数据通过x ± s来表示。两组之间的临床评分差异采用 Mann-Whitney U检验。实验数据用x ± s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)对三组或三组以上的数据进行比较，并采用未配对双尾t检验对多组数据进行比较。P < 0.05差异具有统计学意义，所有实验进行两次以上以确保实验的可行性和可重复性。