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user: 3. 结果与分析 3.1. 检测波长的选择 本实验中所采用的荧光增白剂标准物质均具有三嗪基氨基二苯乙烯阴离子结构，以水溶液做空白液体，对0.10 mg/L标准溶液进行荧光光谱扫描。选取350 nm为激发波长进行扫描，获得最佳发射波长，再固定最佳发射波长对激发波长进行扫描，获得最佳的发射波长和激发波长。十种物质最大激发波长和发射波长基本一致，故经过荧光光谱扫描，选取350 nm为激发波长，选取430 nm为发射波长进行定量测定。具体见图1。 图1. 0.10 mg/L标准浓度的FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm、FWA134、FWA71的吸收波长和发射波长 3.2. 调节酸碱度(pH)提取液试剂的选择 本实验中，分别考察无机氨水、乙二胺、三乙醇胺等碱性试剂配制提取液对标准物质和样品分析的影响。通过测定结果发现，荧光增白剂在含有机胺的提取液中更稳定，其在流动相中峰形要比无机氨水作为提取液的峰形更加对称，且不发生拖尾现象。原因在于有机胺可以更加有效地与C18柱上固定相的硅羟基结合紧密，使固定相的吸附、解吸附性能更强。查得资料显示，在工业生产中，三乙醇胺是荧光增白剂常用的稳定剂，所以该实验选择三乙醇胺作为提取液的酸碱度调节剂。 3.3. 离子对试剂作为流动相的选择 本实验考查的碱性离子对试剂有四丁基溴化铵、三乙基氯化铵、四丁基硫酸氢铵。烷基链的长度与荧光增白剂和固定相结合的强度成正比，与流动相的溶解度成反比。碱性条件时，阴离子型荧光增白剂以离子形式存在溶液中，即使有机溶剂含量很低，保留时间也相当短，如图2所示，以FWA220为例，出峰时间很短。离子对试剂中离子与被测物形成疏水性离子对，它具有较长烷基链大大增加和固定相的结合力，延迟了出峰时间，达到良好的分离效果。本实验选择烷基链长短居中的阳离子型四丁基溴化铵作为实验使用的离子对试剂。实验证明，即使有机相含量高达60%~70%的情况下，荧光增白剂FWA220的出峰时间也能控制在5~7 min，有效地与杂质进行了分离。同时考查离子对试剂浓度对荧光增白剂出峰情况的影响，发现随着离子对试剂浓度的增加，保留时间增加，当离子对试剂达到一定浓度时，保留时间变化不大，本实验考虑到离子对试剂在高浓度有机流动相条件下易产品盐析现象，所以最后选择离子对试剂最佳使用浓度在0.025 moL/L。 图2. 流动相未使用离子对试剂时荧光增白剂的色谱图 3.4. 分离条件的优化 本实验所用设备高效液相色谱中选择使用的有机流动相有三种，分别是四氢呋喃、乙腈、甲醇。经实验证明使用四氢呋喃作为流动相时，FWA113与FWA357不能完全基线分离，FWA5bm与FWA134不能完全基线分离。用纯乙腈作为流动相，色谱峰和甲醇同样都能够实现基线分离，但是色谱峰拖尾较为严重，影响精密分析的要求。Agilent XDB -C18 250 mm × 4.6 mm，5µm柱与Diamonsil C18 250 mm × 4.6 mm 5 µm柱对比，Agilent XDB -C18 250 mm × 4.6 mm，5 µm柱的峰形与分离度良好。考查不同梯度条件后，2.3.3节中的洗脱条件下可获得最佳分离效果。10种荧光增白剂混合标准溶液的分离色谱图如图3所示。 图3. 浓度为10 µg/L荧光增白剂标准溶液的高效液相色谱图 3.5. 线性关系、检出限和定量限(表2) Table 2 Linear relationships， limits of detection (LOD， S/N = 3) and limits of quantification (LOD， S/N = 10) of the analyte 目标物 Analyte 线性范围 Linear range/(µg/L) 线性方程 Linear equation 相关系数 Correlation coefficient (r 2 ) 检出限 LOD/(mg/L) 定量限 LOQ/(mg/L) FWA210 0~200 y = 2693x − 1490 0.9992 0.020 0.050 FWA220 0~200 y = 2845x − 1479 0.9999 0.020 0.050 FWA264 0~200 y = 3338x − 3388 0.9998 0.020 0.050 FWA353 0~200 y = 3201x − 1013 0.9994 0.020 0.050 FWA85 0~200 y = 3150x − 1510 0.9990 0.020 0.050 FWA113 0~200 y = 4147x − 2351 0.9992 0.020 0.050 FWA357 0~200 y = 3965x − 1654 0.9994 0.010 0.050 FWA5bm 0~200 y = 5625x − 748 0.9999 0.010 0.050 FWA134 0~200 y = 4650x − 2556 0.9994 0.005 0.020 FWA71 0~200 y = 7636x − 3816 0.9995 0.005 0.020 表2. 目标物的线性关系与检出限、定量限 y: peak area; x: mass concentration， mg/L 3.6. 方法回收率和精密度 取空白样品进行加标测定回收率和精密度。准确称取空白面粉、淀粉样品1 g，分别添加高、中、低3个水平的混合标准溶液，按照2.3.2. 2)样品处理方法平行处理，并按照2.3.3节色谱条件进行检测，每一加标水平平行测定6次，计算平均回收率。得到10种目标组分(FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm、FWA134、FWA71)的加标回收率和精密度，结果见表3。在不同的加标水平下，10种目标化合物回收率稳定，精密度良好，可以满足样品中10种FWAs测定的分析要求。 Table 3 Recoveries and precision of 10 FWAS from flour sample 化合物 Analyte 添加量 Add the amount/(µg/kg) 面粉回收率 recovery rate in flour/% 淀粉回收率 recovery rate in starch/% 面粉相对标准偏差 Relative standard eviation in flour/% 淀粉相对标准偏差 Relative standard eviation in starch/% FWA210 10 100 1000 95.4 96.3 98.2 96.4 95.3 92.2 6.6 3.2 5.0 4.2 2.8 4.5 FWA220 10 100 1000 87.2 97.6 95.3 88.0 96.3 90.1 4.4 3.8 5.9 5.6 4.2 2.5 FWA264 10 100 1000 90.7 96.3 99.2 95.4 93.2 98.2 4.7 4.9 5.0 4.2 3.2 5.9 FWA353 10 100 1000 92.7 91.0 98.4 95.4 92.3 96.7 4.1 3.2 3.6 5.0 6.1 4.7 FWA85 10 100 1000 93.2 98.6 91.1 98.2 99.4 90.0 3.2 3.5 4.2 3.9 2.1 3.0 FWA113 10 100 1000 88.8 84.5 82.0 90.2 86.3 84.2 5.4 3.6 5.1 4.6 4.4 5.0 FWA357 10 100 1000 94.5 93.5 90.1 88.4 87.6 89.2 4.2 3.2 2.7 2.6 3.3 5.0 FWA5bm 10 100 1000 94.6 95.7 97.0 99.0 92.1 94.2 4.8 3.2 3.5 4.5 4.5 5.0 FWA134 10 100 1000 93.5 94.7 88.0 80.2 81.5 89.0 3.5 3.8 4.8 3.6 4.0 1.8 FWA71 10 100 1000 88.4 84.0 80.7 87.4 86.0 90.0 2.0 3.2 5.5 1.8 3.2 5.6 表3. 10种目标物的方法回收率和精密度 3.7. 实际样品的分析 应用所建立的方法对市场上40批次的预包装面粉、10批次预包装淀粉以及15批次散装面粉、10批次散装淀粉进行检测，发现1批次散装面粉中有FWA71检出，含量在0.022 mg/kg，该物质的检出可能来自环境的污染，同时不排除人为非法添加的。