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user: 3. 结果与讨论 3.1. LC-MS/MS条件的优化 分别在电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)正、负离子扫描模式下对刺五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶、原儿茶酸标准品进行扫描，结果5种物质在正离子扫描模式下电离信号明显高于负离子扫描模式，因此采用正离子扫描模式，对野生刺五加和人工刺五加茎、叶的5种化合物进行质谱分析，多离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)扫描方式。通过对质谱条件的优化得出最优的质谱条件为：锥孔电压是3 KV；离子源雾化温度5000℃；雾化气25 psi，气帘气15 psi；5种主要药用次生代谢物碎片离子、去簇电压、碰撞电压、碰撞室射出电压见表1。 在此条件下，5种物质的质谱信号最强。对高效液相的流动相的组成和比例进行了考察，结果表明使用水–甲醇溶液为流动相的组成梯度洗脱时，分离效果好，灵敏度高，梯度洗脱(表2)。 Table 1 MS analysis of parameters of 5 objective compound 名称 m/z DP CE CXP 刺五加苷E 765.3 → 603.1 70 62 23 异嗪皮啶 223.1 → 206.3 60 40 9 绿原酸 355 → 162.7 50 18 5 齐墩果酸 479.3 → 435.5 70 28 17 原儿茶酸 155 → 92.9 70 21 17 表1. 5种目标化合物的质谱分析条件参数 Table 2 Gradient elution progra A1 B1 Time A%水 B%甲醇 0 75 25 1.5 75 25 2 50 50 4 50 50 4.5 10 90 5.5 10 90 6 75 25 7 75 25 表2. 梯度洗脱程序 对流动相组成进行考察，结果表明流动相中使用水–甲醇溶液为流动相的组成梯度洗脱时，分离效果好，灵敏度高，同时色谱峰的峰形更加尖锐，并能有效地减少拖尾现象的产生。由图2可知，采用上述LC-MS/MS方法对样品进行检测，获得色谱图2，绿原酸的色谱保留时间0.60 min；原儿茶酸的保留时间为0.86 min；刺五加苷E的保留时间为2.69 min；异嗪皮啶的保留时间为2.76 min；齐墩果酸的保留时间为5.66 min。 3.2. 分析方法的考察 将五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸标准品连续进样6次，计算峰面积RSD，分别为0.65%、0.44%、1.26%、2.11%和2.25% (表3)，表明仪器的精密度良好；取刺五加茎、叶实样品溶液，室温放置24h内不同时间进样，测定峰面积计算RSD，五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸在室温条件下24 h内的峰面积RSD分别为0.66%、0.05%、0.79%、0.58%和0.79% (表3)，表明样品在室温24 h内稳定；取6份野生刺五加和短梗五加茎、叶，分别按1.3.1项方法进行样品制备后得到6组平行样品，分别进样后计算峰面积RSD值，五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶、原儿茶酸峰面积RSD分别为0.85%、0.36%、2.30%、2.30%和0.23% (表3)，说明此方法重现性好；取6份刺五加果实样品溶液，加入适量已知浓度的标准品溶液后，分别按1.3.1项方法制备样品，分别进样后计算两种物质的平均回收率和RSD，结果表明五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶、原儿茶酸的平均加标回收率为96.21%、97.02%、96.66%、95.74%、97.03%，RSD为0.85%、0.81%、1.17%、1.04%、0.95% (表4)。 图2. 目标化合物的MRM色谱图。1. 绿原酸；2. 原儿茶酸；3. 刺五加苷E；4. 异嗪皮啶；5. 齐墩果酸 Table 3 Wild acanthopanax and artificial acanthopanax leaf precision， repeatability， stability result 化合物名称 RSD(%) 精密度 重复性 稳定性 刺五加苷E 0.65% 0.85% 0.66% 异嗪皮啶 0.44% 0.36% 0.05% 绿原酸 1.26% 2.30% 0.79% 齐墩果酸 2.11% 2.30% 0.58% 原儿茶酸 2.25% 0.23% 0.79% 表3. 精密度、重复性、稳定性结果 Table 4 Acanthopanax five plus glycoside E， isothiazine， chlorogenic acid， oleanolic acid， protocatechuic acid extraction recover 化合物名称 样品原含量 (ng/mL) 标准品加入量 (ng/mL) 测定量 (ng/mL) 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD (%) 刺五加苷E 5190 500 5489 96.47% 1000 5996 96.87% 96.21% 0.85% 1500 6375 95.29% 异嗪皮啶 1240 500 1679 96.49% 1000 2165 96.65% 97.02% 0.81% 1500 2683 97.92% 绿原酸 3461 500 3876 97.85% 1000 4351 95.61% 96.66% 1.17% 1500 4789 96.53% 原儿茶酸 119 50 160 94.67% 100 210 95.89% 95.74% 1.04% 150 260 96.65% 齐墩果酸 8240 500 8464 96.84% 1000 9058 98.03% 97.03% 0.95% 1500 9371 96.21% 表4. 提取回收率 3.3. 标准曲线的绘制 在上述分析方法条件下取五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸标准品溶液进行LC-MS/MS分析，将浓度和峰面积(3次平均值)进行线性回归，得到回归方程和相关系数，结果见表5。结果表明，刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸、齐墩果酸线性范围：10~10，000 mg/mL、0.1~5000 mg/mL、1~10，000 mg/mL、0.1~10，000 mg/mL 和100~30，000 mg/mL范围内线性关系良好，R 2 均 > 0.9993。 3.4. 刺五加茎、叶样品的测定 3.4.1. 野生刺五加和人工刺五加叶中的5种目标化合物的含量 经过优化提取条件，野生刺五加叶中特异性物质刺五加苷E含量大于人工种植刺五加，具有显著性差异(p < 0.05)，分别为0.068 ± 0.01 μg∙g −1 和0.029 ± 0.006 μg∙g −1 ；异嗪皮啶野生中含量高于人工种植，具有显著性差异(p < 0.05)，分别为0.025 ± 0.007 μg∙g −1 和0.007 ± 0.001 μg∙g −1 ；绿原酸野生中含量高于人工种植，无显著性差异，分别为0.031 ± 0.008 μg·g −1 和0.025 ± 0.008 μg∙g −1 ；原儿茶酸野生种植小于人工种植含量，具有显著性差异(p < 0.05)，分别为2.252 ± 0.94 μg∙g −1 和3.952 ± 0.73 μg∙g −1 ；齐墩果酸野生种植小于人工种植含量，具有显著性差异(p < 0.05)，分别为3.087 ± 0.04 μg·g −1 和2.507 ± 0.93 μg∙g −1 ；结果见图3。 3.4.2. 野生刺五加和人工刺五加茎中的5种目标化合物的含量 从图4可以看出野生刺五茎中五种物质含量均大于人工种植刺五加，具有显著性差异(p < 0.05)，从图由左到右野生刺五加五种含量分别是3.650 ± 0.83 μg∙g −1 、2.140 ± 0.85 μg∙g −1 、2.546 ± 3.72 μg∙g −1 、0.380 ± 0.12 μg∙g −1 、4.574 ± 1.53 μg∙g −1 ；人工刺五加的含量分别为1.540 ± 0.52 μg∙g −1 、0.020 ± 0.007 μg∙g −1 、0.359 ± 0.15 μg∙g −1 、0.872 ± 0.14 μg∙g −1 、2.574 ± 0.62 μg∙g −1 。 图3. 野生刺五加和人工刺五加叶中的5种主要物质的含量 图4. 野生刺五加和人工刺五加茎中的5种主要酚酸类化合物的含量 Table 5 Regression equation， correlation coefficient and linear range result (n = 3 化合物 回归方程(y = ax + b) 相关系数(R 2 ) 线性范围(ng/mL) 刺五加苷E y = 4E + 10x + 183557 R 2 = 0.9999 10~10，000 绿原酸 y = 2E + 08x + 64305 R 2 = 0.9998 1~10，000 齐墩果酸 y = 3E + 07x + 37388 R 2 = 0.9993 100~30，000 异嗪皮啶 y = 7E + 07x + 5358.3 R 2 = 1 0.1~5000 原儿茶酸 y = 2E + 08x + 33494 R 2 = 1 0.1~10，000 表5. 回归方程、相关系数及线性范围结果(n = 3) 3.4.3. 野生刺五加和人工刺五加叶和茎中5种目标化合物综合分析 由图5可以看出五种目标化合物总体上在野生刺五加茎和叶中较大量的积累，相比于人工种植刺五加，野生刺五加在这五种化合物的积累上更有优势。 图5. 野生刺五加和人工刺五加茎中5种目标化合物综合分析