DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
system: [SYSTEM]

user: 2. 拓扑结构的线性引导作用 根据接触引导理论，在周围神经损伤的修复过程中，再生轴突向着其突触目标不断生长的方向性会显著影响周围神经的修复效果 [ 10 ]。因此，在细胞水平上通过创建高度有序的微/纳米结构的表面形貌来起到物理支撑和引导结构的作用是引导神经轴突和施万细胞的有效途径之一 [ 11 ]。 事实上，已经有大量研究发现神经细胞可以对一系列线性引导因素做出反应，而且已经证明以通道和微槽形式的拓扑结构因素可以增强细胞排列和轴突生长 [ 12 ] [ 13 ]。例如，Mobasseri等人的实验结果显示，内腔带有凹槽的PCL/PLA导管与自体神经移植物具有相似的实验结果，是一种潜在的替代治疗方法 [ 14 ]。此外，以微/纳米纤维形式排列的拓扑结构也被认为是模仿神经内管的定向内部结构的因素之一，并通过物理引导神经元生长来最大限度地增加靶神经再支配的机会 [ 14 ] [ 15 ]。排列的微/纳米纤维(250 nm至2 µm)具有独特的形貌特性，可显著增强细胞功能，并通过改善神经细胞及其轴突的排列，以及随后施万细胞向Büngner带的过渡，起到细胞接触引导的作用 [ 16 ]。除了纤维取向外，纤维直径的变化也被报道在调节增殖和分化行为方面起着至关重要的作用 [ 17 ]。例如，研究表明，神经干细胞前体细胞的增殖、分化和细胞沿单个纤维轴的伸展程度随着纤维直径的减小而增加，细胞聚集程度较低 [ 18 ]。接下来，本综述将从宏观、微观和纳米尺度介绍神经导管中拓扑结构的线性引导作用。 2.1. 神经导管的宏观线性引导作用 人工神经移植物的基本结构是单通道导管，然而，中空的导管修复较大的神经缺损时表现出次优的性能(见图1)。为了提高导管的线性引导作用，许多研究人员转向使用填充管道来提供额外的支撑结构，如纤维、凝胶等，以提高其生物学性能 [ 19 ] [ 20 ]。这些管腔内置的填充物有助于细胞的导向迁移，更好地起到桥梁作用。例如，Wang等人制备了内置聚乙醇酸(PGA)内取向纤维的微孔壳聚糖神经引导导管，并用于修复犬30 mm的坐骨神经缺损，实验结果发现其可以获得与自体神经移植相似修复效果 [ 21 ]。 另一种提高引导作用的方式是制备多通道导管。与空心神经引导导管相比，该结构的管腔内的多个通道可以帮助减少轴突分散，并帮助控制靶向轴突再支配，动物实验结果提示一定通道数量的导管具有较好的修复效果。然而，尽管多通道管道可以减少轴突的分散，但大尺度的管腔信号本身并不能提供增强轴突寻路和施万细胞迁移所需的细胞–材料相互作用 [ 22 ]。 图1. 人工神经导管的结构模式 2.1.1. 神经导管的微观线性引导作用 随着更先进的制造技术的出现，管腔内微观结构的修改已经成为可能。微尺度引导信号通过影响轴突寻径和增加施万细胞迁移，提供指导单向排列的能力，以增强细胞水平的修复 [ 23 ]。例如，在20世纪90年代末，使用聚酰胺微丝(10~20 µm)成功地修复了从小到大的神经间隙缺损，可以单独使用，也可以作为管腔的一部分使用 [ 23 ] [ 24 ]。此外，Hsu等人在壳聚糖和PLA表面制备了微槽，并检测到施万细胞和胶质细胞系C6可以通过微沟成功对准，并表达与神经营养因子产生相关的基因，将内表面有微槽的聚合物导管植入大鼠体内来修复损伤的坐骨神经，与光滑导管相比，这种微槽导管可以促进周围神经再生 [ 25 ]。与此同时，除了促进轴突生长和施万细胞迁移，微尺度信号已被证明可以减少炎症反应并限制异物对构建物的反应 [ 26 ]。在这方面，Reeves等人通过丝素蛋白开发出了基于加入抗炎细胞因子的治疗策略，将巨噬细胞表型从M1调节到M2极化(即减少炎症和促进组织修复)，并可用于为神经修复提供增强的再生反应 [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]。 2.1.2. 神经导管中的纳米尺度因素 目前，纳米尺度上构筑图案已被实现，并可能对神经再生产生重大影响。大多数已有的关于纳米尺度的研究都是在2D基质上进行的，已经探索了宽度在500 nm到2 µm之间的沟槽，实现了更好的神经排列 [ 30 ] [ 31 ]，研究报告称，小于神经前体细胞大小(<20 µm)的2D表面图案化可实现出色的细胞排列，并通过限制每个细胞的神经突起数量来最大化轴突长度，从而限制非靶标再神经支配的风险 [ 32 ] [ 33 ]。这开辟了图案化技术应用于具有纳米结构修改的管状结构的可能性。 目前已有多种制造技术应用于神经支架微结构的开发 [ 34 ]，其中，用于神经修复的大多数纤维丝基支架都是基于电纺结构的。静电纺丝是一种简单、通用、低成本的技术，广泛用于制备排列有序的纳米/微纤维多孔神经导管 [ 35 ]。例如，250~400 nm范围的静电纺丝再生丝素纤维已被用作植入体内的中空神经导管的纳米形貌图，并显示出与自体神经移植物相当的良好的运动功能恢复 [ 36 ]。在大鼠坐骨神经10 mm的缺损中，移植物的再生效果和功能恢复也得到了改善 [ 37 ]。此外，还有研究使用模板电纺法，在3D电纺结构中用排列好的缝线对微通道进行微图案化，作为一种模拟在天然神经中发现的束状结构和纤维细胞外基质的方法 [ 38 ]。材料科学的进步表明，纳米尺度将很快完全融入下一代神经引导结构中，导管管壁和管腔内的微/纳米尺度排列的组合可能实现定向引导神经突起的长距离延伸。
system: [SYSTEM]

user: 3. 负载蛋白或生长因子 为了使人工神经导管更具生物活性，以促进损伤后的组织修复和再生，加入可以增强细胞功能、减少神经元死亡的元素也是至关重要的。这些疗法大多基于生物化学信号的共价连接，如蛋白质、肽序列和生长因子 [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ]。 3.1. 蛋白质和多肽序列的修饰 周围神经的发育和修复受到层粘连蛋白和纤维连接蛋白的重要影响，这两种基质蛋白存在于周围神经中，与施万细胞密切相关 [ 43 ]。与其他细胞外基质成分相比，层粘连蛋白调节雪旺细胞的增殖和存活，并促进一些感觉神经元的轴突生长 [ 44 ] [ 45 ]；另一方面，纤维连接蛋白在外周神经系统细胞的迁移中起着至关重要的作用 [ 46 ]。例如，施万细胞的运动和轴突的生长都受纤维连接蛋白的调节 [ 47 ]。目前在重组蛛丝蛋白的研究中，已经报道通过基因工程将纤维连接蛋白衍生的序列掺入，以进一步增强它们的细胞支持能力，据报道，这些基底层蛋白与丝素蛋白的共价结合可以促进神经再生 [ 48 ]。 多肽序列也被用于改善神经组织修复的结果。纤维连接蛋白中发现的精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸(Arg-Gly-Asp， RGD)通过启动特定的内部信号通路来促进细胞粘附和分化 [ 49 ]。其他序列，如Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)和Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)，主要存在于层粘连蛋白中，也被证明了能促进轴突生长，并增强施万细胞在底物上的附着 [ 50 ] [ 51 ]。例如，Zhu等人在聚己内酯(PCL)导管表面通过自组装的方式修饰了RGD和YIGSR多肽，体外研究表明，这两种多肽能协同增强PCL支持施万细胞黏附和增殖的能力，并能促进背根神经节轴突的生长，同时，该导管可以用于修复大鼠15 mm坐骨神经缺损，展现了良好的轴突再生和功能修复的效果，RGD/YIGSR/PCL导管组还可以观察到更多的血管形成 [ 52 ]。Chen等人的研究发现，YIGSR接枝聚丙烯酰胺/氧化石墨烯/明胶/海藻酸钠复合水凝胶可以促进施万细胞的体外生长和体内坐骨神经再生 [ 53 ]。 3.2. 生长因子的修饰 神经营养因子天然参与神经细胞的存活、生长和分化；它们主要由施万细胞产生，在神经细胞周转中起着稳态作用。考虑到它们在神经损伤和再生中的作用，它们的靶向传递有望减少神经元死亡，促进再生，并支持施万细胞聚集 [ 54 ]。这一点已经在实验研究中得到证实，这些生物分子中的几个已经单独或联合被结合到人工神经导管中 [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ]。例如，Rich等人在硅胶中预先填充了NGF的生理盐水溶液，来桥接大鼠坐骨神经缺损，实验发现，在神经引导导管中加入NGF可以增加有髓轴突的数量和髓鞘厚度，有效地改善了再生神经的成熟度 [ 9 ]。在本课题组之前的实验中，通过京尼平成功地将NGF固定在壳聚糖导管中，来桥接大鼠坐骨神经缺损，取得了良好的修复效果 [ 59 ]。在另一项研究中，Fine等人基于乙烯–乙烯乙酸酯共聚体、牛血清白蛋白和神经营养因子(GDNF或NGF)制备了一种神经引导导管，该导管可以缓慢释放神经营养因子，同时通过大鼠15 mm坐骨神经缺损模型发现，术后7周，加入神经营养因子的两种导管中均可见到再生神经，而且GDNF组无论在髓神经纤维的数量、荧光金逆行标记的脊髓前角运动神经元数量还是逆行标记的背根神经节感觉神经元数量均远远多于NGF组，提示GDNF可能有更好地促进坐骨神经再生 [ 57 ]。 尽管使用几种生长因子单独或联合使用的各种体外和体内研究都显示了令人振奋的结果，但它们可能存在不可预测的相互作用：过量的生长因子可能不利于再生。为了让细胞重新分化和重新成髓鞘，生长因子的水平可能需要随着时间的推移逐渐降低。神经组织的修复是由多种生长因子和细胞因子通过多步骤过程调控的，这些生长因子和细胞因子以一种集中的、依赖于时间的方式发挥作用，其作用可能取决于各种不同的因素。理想的因素组合，以及控制它们的连接和释放仍然是具有挑战性的。因此，可控以及浓度梯度化的负载近期受到了很大关注 [ 60 ] [ 61 ] [ 62 ]。 3.3. 浓度梯度化负载 梯度化处理可以有效避免了异常修复和细胞过量，并可提供更长时间的持续输送来增强神经的长期修复，确保细胞获得更合适的及时暴露剂量。目前，各种图案形状和分布的浓度梯度对细胞的影响已逐渐被研究 [ 63 ]。例如，含有浓度梯度NGF的聚甲基丙烯酸2-羟乙酯微孔凝胶可在8 d内保持释放，并以引导轴突在体外生长 [ 60 ]。在另一项研究中，一种空间控制的NGF和GDNF多组分梯度被固定在3D打印硅胶/明胶–甲基丙烯酸酯水凝胶管道中，它们的释放显示在1个月内保持良好 [ 61 ]。Shoichet等人于2006年首次将神经营养素-3按照一定的浓度梯度固定在聚甲基丙烯酸2-羟乙酯和聚(L-赖氨酸)的细胞穿透性粘合支架中 [ 62 ]。此后，人们探索了几种梯度浓度的细胞外基质分子，通常涉及纤维连接蛋白和层粘连蛋白的组合，显示出促进轴突沿着更复杂的模式延伸 [ 64 ]。例如，表面结合层粘连蛋白和含有IKVAV多肽的梯度被证明足以指导轴突生长 [ 65 ]。
system: [SYSTEM]

user: 4. 神经导管中的电刺激和电活性成分 4.1. 充足的电刺激以增强修复 虽然健康组织的电位差通常很小，但损伤后会增加，上皮屏障被打破，跨上皮电位差被短路，形成流向受损上皮的电流，并建立横向电场。这些被认为是被动离子泄漏的结果，并在控制和整合多种细胞行为(例如，增殖、分裂、迁移和神经萌芽)中发挥作用 [ 66 ]。外源性电刺激(ES)可以模拟这些内源性电场，并且从1952年以来，大量研究表明，ES能促进施万细胞增殖、神经细胞分化、轴突生长和伸展，并促进神经营养因子的产生 [ 67 ]。有研究认为，细胞质在细胞极化和组织方面的重新分布、跨细胞膜离子电流的变化、基因表达的上调、生长分子的释放，这些都受到细胞外电信号的影响和调节 [ 68 ]。 众所周知，导电材料可以将ES直接输送到细胞。然而，在不同的参数下，ES对组织修复可能具有双重作用。例如，调控外加频率的大小可以影响神经纤维密度，与无刺激和高频率(20~200 Hz)相比，2 Hz的频率促进更快的神经传导速度和更大的轴突密度 [ 69 ]。另外，据报道，与4 mA以上的电流相比，1 mA左右的电流强度可以改善轴突和血管的数量，这表明虽然适当的电流强度可以加速神经的成熟，但过高的电流强度可能会阻碍其功能恢复 [ 70 ]。同样，在大鼠坐骨神经缺损中，在损伤后一到两周内短暂延迟ES的应用，已被证明可以促进神经成分的成熟度 [ 71 ]。 4.2. 电活性材料与细胞的相互作用 在基质中加入电活性部分可以增强缺损组织的再生能力。研究表明，与非导电支架相比，含有电活性部分(不需要外源性ES，即被动刺激)的支架可以显著促进干细胞的分化 [ 72 ]。研究报道，添加电活性部分，如苯胺、吡咯和碳基填充物或金粒子，对参与肌肉收缩、松弛和电耦合以及细胞骨架排列的心脏基因的表达有更广泛的影响 [ 73 ] [ 74 ]。然而，这些电活性部分对组织修复的影响研究很少。虽然确切的机制还没有被充分发现，但这可能是通过增强相邻细胞之间的电信号传输来实现的 [ 75 ]。导电基质可以改变支架的局部静电电荷，改善蛋白质的吸附，促使更多的血清蛋白质被吸附在支架上，这能够加速细胞粘附和促进细胞增殖和迁移。同时，支架中的电活性也作为静电结合位点与带负电荷的细胞膜结合，使细胞更接近支架表面，并建立更强的附着位点，有助于恢复受损组织中动作电位的传导，促进组织生长和细胞分化 [ 75 ] [ 76 ]。 电活性材料在神经组织中也可以产生类似的效应，促进细胞增殖和轴突生长，并通过改善传导速度和运动功能来跨越缝隙缺损。而内源性电场可以通过调节细胞因子的分泌，在调节组织再生方面发挥重要作用 [ 77 ] [ 78 ] [ 79 ]。例如，Wu等人的研究发现，可降解的导电聚氨酯材料可以增强施万细胞的髓鞘基因表达，并能促进其持续分泌神经营养因子，证明电活性材料在神经再生应用方面具有巨大的潜力 [ 79 ]。
system: [SYSTEM]

user: 5. 结论和未来展望 周围神经的再生取决于轴突的大量和快速生长、施万细胞对轴突的再髓鞘化以及再生神经纤维的成熟。广泛的动物实验证明，加入生长因子、蛋白质、多肽序列等生化因素对调节上述细胞行为是有效的，然而，使用什么哪些因子以及如何释放它们仍是持续存在的问题。虽已经考虑了浓度梯度策略，但这可能会导致巨大的成本，需要进一步的研究来充分开发它们在天然材料中的潜力。另一个问题是，生物分子的加入不允许在加工过程中出现极端的温度范围或极具侵蚀性的化学条件，这也是神经支架制造过程中需要克服的挑战。然而，这些疗法都还没有获得临床批准。此外，电刺激也可以促进神经再生，因此利用导电聚合物构建组织工程化神经移植物也是一个值得深入研究的新途径。目前许多工作都集中在评估电刺激(主动)后的效果，而将电活性部分引入支架(被动)的效果还没有得到充分的研究。这为电活性支架在促进受损神经修复过程中的使用提供了机会，它可以放大细胞间的交流，并在不需要外部刺激的情况下调节生长和细胞分化。针对如何改善人工神经移植物的生物功能以促进神经快速再生的研究层出不穷，然而，仅仅依靠单一因素，很难达到修复长距离神经缺损的理想效果。因此，开发具有多种因素组合调控的人工神经移植物，用以最大程度修复长距离神经缺损，或成为神经再生领域的热点。
system: [SYSTEM]

user: 摘要 涡虫结构简单，具有极强的再生能力。再生，是指机体受损后，细胞、组织和器官的修复，并重建适当的组织极性、结构。在同一动物的不同组织中可以采用多种模式。当受到创伤后，涡虫的任意部位均可以再生出完整的个体。这种强大的再生能力是由neoblast介导的，neoblast是一种含有多能干细胞的增殖细胞群，具有异质性。涡虫具有明显的极性，受损后，严格按照前后轴、背腹轴、左右轴进行再生。涡虫有发达的体壁肌肉组织，在整个有机体内形成复杂的肌肉网络。涡虫的体壁肌肉细胞产生的位置信息基因(position control genes， PCGs)，在再生过程中控制前后模式，对干细胞介导的组织替换和再生起着重要的指导作用。文章讨论了涡虫肌肉再生以及肌肉与极性基因之间的联系。
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 涡虫属于扁形动物门(Platyhelminthes)，涡虫纲(Turbellaria)，三肠目(Tricladida)。分布广泛，为淡水种，有的生活在海水、陆地或寄生。涡虫是广泛生活在洁净水质的池塘和溪流中的生物。在动物系统演化的历史中，涡虫纲占有十分重要的地位，从扁形动物开始出现了中胚层和两侧对称体制。 涡虫背腹扁平，虫体细长且柔软，体长一般0.5~2 cm左右，背部颜色深，呈黑褐色，腹面颜色浅，头呈三角形，两侧有2个明显的耳突。解剖结构复杂，包括大脑、眼睛、肌肉、肠道、神经、表皮、生殖系统 [ 1 ] 等。大脑由不同类型的神经元和胶质细胞组成，并由两条腹神经索相连。体壁肌肉系统包括纵向纤维、环形纤维和斜线纤维。表皮产生粘液，腹侧纤毛浓密，便于运动 [ 1 ]。原肾管广泛分布，用于排泄废物和调节渗透压。口位于腹面近体后的1/3处，内有肌肉质咽，是三角涡虫摄食的器官，生殖孔位于口后。围绕内脏的是间充质组织室(实质)，包括成体中唯一具有分化增殖能力的细胞——neoblast [ 2 ]。雌雄同体，异体受精，体内具有雌雄生殖器官，生殖方式包括无性繁殖和有性繁殖。无性繁殖通常以横分裂的方式进行，其分裂面常发生在咽后方，有性生殖主要在夏季、冬季和初春进行。 涡虫的再生能力极强。能够再生出身体任意损伤的部位，这种功能依赖于一种称为neoblast的干细胞，是涡虫体内唯一能够分化的细胞。实质组织是分化新细胞和再生组织的主要来源。将虫体横切为2段或多段，每段均可再生出完整的涡虫。如将虫体切为3段，前段再生出尾，后段生头，中段前部再生头，后部再生尾。不仅如此，涡虫的再生过程也非常迅速，它能在一周内重新长出被切割掉的肌肉、皮肤、肠道、生殖系统，甚至整个大脑。涡虫独特的结构和极强的再生能力是研究再生、胚胎发育和细胞分化重要的实验材料，也是研究后生动物起源进化的极佳模式生物。 当动物受到损伤后会产生创伤反应，包括细胞募集、细胞增殖、免疫反应等。涡虫能够识别创伤反应和再生修复，可以完全再生出身体缺失的部分。再生需要干细胞，涡虫中的neoblast是唯一能够进行增殖分化的干细胞，由多能干细胞、γ-neoblast、σ-neoblast及不同的祖细胞亚群组成，分布全身，在截肢后，伤口处出现芽基，neoblast在创面增殖分化 [ 3 ]。这些祖细胞是neoblast标记的Smedwi-1和特定转录因子的表达来定义的，将其沉默会损害不同类型细胞的再生 [ 4 ]。 再生的细胞类型有两种：再生的潜能以及指导再生的信息。再生的潜能性指特异性成体细胞替代缺失细胞。再生的信息指的是指引哪种类型细胞再生的分子机制。位置调控信息(position control genes， PCGs)被认为是一个关键的问题。 涡虫中，多能干细胞有产生所有新组织的能力。PCGs可以调控再生以及组织的替换。皮下细胞与许多PCGs共表达(见图1)。推测皮下细胞含有机体平衡和再生的位置调控。所有涡虫的肌肉均表达PCGs，意味着涡虫的肌肉组织有两种功能：调控涡虫机体模式以及机体的收缩。受损后，PCGs在肌肉中的表达是动态的，说明肌肉对再生是有指导意义的。涡虫的再生包括两个高度灵活的系统：具有多能性的neoblast可以再生出任何新的细胞类型，肌肉可以提供位置信息 [ 5 ] [ 6 ]。 图1. 涡虫中位置调控基因在背腹轴、左右轴和前后轴中的分布 [ 7 ]
system: [SYSTEM]

user: 2. 涡虫肌肉系统结构 涡虫缺乏循环系统、骨骼系统和呼吸系统，被不同方向排列的表皮下肌肉纤维组成的致密而紧凑的网络所包围。腹部表皮下分布纤毛，运动基本是通过纤毛的滑行进行，肌肉可以支持这种运动，主要是用来确定运动的方向。 一些脊椎动物与无脊椎动物可以通过肌肉的形态特征区分为横纹肌或平滑肌。但涡虫没有明显的肌肉类型 [ 8 ]，具有介于横纹肌和平滑肌之间的特征 [ 9 ]，即有由肌丝组成的螺旋条纹，但含有致密的平滑肌小体。其结构与平滑肌相似，没有条纹但有致密的小体，且细胞核位于细胞的外围区域，有与肌膜直接相连的Z形线状结构，这是横纹肌的特征 [ 10 ]。涡虫的体壁肌肉组织，在整个机体内形成复杂的肌肉网络，分为环肌、纵肌以及斜肌。这种肌肉网络在某种程度上弥补了这些动物缺乏真正的骨骼系统，肌肉网络对由肠道、实质组织和其他器官的液体组成的静水骨骼起作用 [ 11 ]。 肌球蛋白在所有真核细胞中都高度保守，在真核细胞中为各种运动提供必要的动力，包括胞质分裂、吞噬、细胞器运动和肌肉收缩等 [ 12 ]。在涡虫中鉴定出两种不同的肌球蛋白重链(MHC)基因，编码两种不同的肌肉纤维类型。一种表达于咽部的肌纤维，胃皮周围的肌肉，遍布体壁的几个散在细胞，以及咽底部间充质的一些肌纤维 [ 13 ]。另一个MHC基因在表皮下体壁肌肉组织和背腹纤维中表达。MHC蛋白具有ATP酶活性，提供肌肉收缩所需的能量。由于肌肉纤维的收缩速度和ATPase活性随其MHC亚型组成的不同而不同，有可能涡虫MHC基因的不同表达模式赋予了涡虫肌肉纤维不同的生理特性。每种MHC亚型可能介导不同的生物学功能 [ 14 ]。 在日本三角涡虫中分离得到两个MHC基因DjMHC-A和DjMHC-B，二者都是横纹肌型，尽管在日本三角涡虫的肌肉中没有观察到横纹肌 [ 8 ]。DjMHC-A在咽部、肠管周围、咽腔和部分体壁肌肉中表达，DjMHC-B在体壁肌、垂直肌和水平方向的肌肉总表达。由此可见，DjMHC-A标记的肌肉类型可能与涡虫的蠕动运动相关，DjMHC-B标记的肌肉类型可能与身体运动相关 [ 8 ]。
system: [SYSTEM]

user: 3. 涡虫的极性 动物有不同的解剖结构并且大小有很大的差异，但他们有共同的信号通路，比如BMP信号，能够调节两侧对称动物的背腹(D/V)轴 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]。在涡虫中，切除DV轴后，BMP基因家族蛋白BMP4和ADMP可以促进组织的修复。ADMP的同源基因Smed-Admp在腹侧表达，Smed-Bmp4在背部表达。Smed-Admp可以促进Smed-bmp4的表达，Smed-bmp4抑制Smed-Admp的表达。Admp(RNAi)后，截取涡虫的头部与尾部，发现在涡虫再生的过程中出现头部与尾部的缺陷，这是BMP信号通路典型的功能障碍表型。ADMP是涡虫截断后外侧边缘、背部及腹部的组织再生所必需的。BMP信号对矢状截取的涡虫再生至关重要 [ 19 ] [ 20 ]。矢状面截肢面会出现两个左右不对称的片段：一个薄片段必须重新生成一个大小适中的BMP4表达结构域，另一个厚片段重新定位并调节BMP4表达结构域，以适应新的动物尺寸。ADMP(RNAi)能够在已存在的组织内沿前后轴再生一些结构但不能再生新的侧向标记的表达。未截取的ADMP(RNAi)表现出异常的身体尺寸。表明ADMP在动物动态平衡期间维持体型和正确的ML模式至关重要。BMP4能够促进背部组织的维持和再生。在左右不对称片段的再生过程中，ADMP促进了BMP4的表达并调控了BMP4的表达定位。 表明Bmp/Admp调节两侧对称动物的中心特征，广泛用于D/V轴的建立、维持和再生。前端伤口应答(截肢后3~18小时)，创面肌细胞中的信号机制决定是否再生出一个新的头部。创伤反应迅速。Wnt信号被前端伤口选择性抑制，包括notum的激活。头部再生的第一阶段导致wnt信号在创面前端抑制，在创面后端激活。在创伤诱导的wnt1和notum表达的最初阶段，FoxD在伤口的中线表达 [ 21 ]。 Wnt/β-catenin和Hedgehog (HH)信号通路在再生和细胞的动态平衡中的前后轴(A/P)的确定中起重要的作用。位于涡虫前端和后端两个不同的区域，称为前极和后极，前极表达Notum，后极表达wnt。前端受损后，创伤反应在创伤处触发wnt的表达，wnt信号在前端选择性抑制 [ 22 ]，同时Notum被激活，FoxD在多数伤口的中线激活。FoxD突出了中线与极点再生之间的联系。在中线有一小群表达Notum、Flolistin和FoxD的细胞从neoblast中出现，在再生过程中可以分化形成眼睛等 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 23 ]。因此创面中线附近的neoblast对基因的诱导是形成新的前极细胞的最初步骤。随着neoblast的增殖分化，头部前极模式建立，FoxD(RNAi)抑制前极的再生，虽然前极仍然有脑细胞的存在，但缺乏野生型头部芽基中正常组织结构，同时，中线表达基因的表达域也出现了异常。再生的前极促进了中线的再生，从而促进了头部的双侧模式的建立，并促进了头部A/P模式的基因结构域的建立 [ 22 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]。
system: [SYSTEM]

user: 4. 涡虫的肌肉再生研究进展 在再生过程中，肌肉纤维通过收缩来闭合伤口，从而发挥早期功能。除体壁肌外，涡虫在消化系统、生殖器官，咽部周围均有肌肉纤维。涡虫的体壁肌肉系统由位于不同方向的不同数量的肌肉纤维层组成，其结构随身体大小而变化。大量的背腹纤维连接背侧和腹侧的身体表面。这些纤维在动物的尖端和边缘比在身体的中心区域更丰富。所有的纤维排列成致密、紧凑的肌网。动物前端部的背侧和腹侧的内纵纤维形态不同，背侧的纤维向前端部的中心区汇聚，腹侧纤维在接近前端时平行分布，甚至呈扇形发散的形式 [ 27 ]。 再生过程中，涡虫干细胞如何再生出肌肉系统，新的肌肉细胞如何整合到先前存在的肌肉网络中，以及控制肌源性基因程序的分子途径的识别，是研究涡虫肌肉再生的关键因素。目前需要解决肌肉再生的问题：在再生的过程中，新的肌肉如何整合到先前存在的肌肉网络中，控制成肌基因程序的分子途径的识别 [ 5 ]。 随着再生的进行，肌细胞可以沿着两条主要途径：1) 进入芽基形成新的肌纤维，2) 在芽基后区域完成分化并插入肌纤维。两种机制同时间进行，若肌细胞进入芽基，意味着芽基不仅通过neoblast的积累而生长，而且还通过不同分化阶段的neoblast的亚基向不同类型的细胞生长，这是恢复缺失组织所必需的 [ 27 ]。 涡虫中不同的肌肉纤维在再生过程中具有不同的调节作用见图2。MyoD是进化上保守的bHLH转录因子家族，在骨骼肌源性谱系的分化中发挥关键作用。研究发现，保守的转录因子MyoD在可能的肌源性祖细胞中表达，分化后的肌肉细胞存在位置调控基因，可以为涡虫的neoblast的增殖分化提供位置信息，使其在缺失的位置再生出正确的组织。MyoD指定了体壁肌细胞中的一个子集：纵向纤维，Nkx1-1编码了涡虫中的环状纤维。将MyoD(RNAi)后，抑制再生，将Nkx1-1(RNAi)后，中线分叉，再生出两个头 [ 28 ]。 图2. 涡虫体壁肌纤维及其在再生中的关键作用 [ 28 ] 在涡虫中，不同的转录因子指定了不同的肌肉亚群。对揭示纵向和环状纤维的不同作用提供了重要依据。环状纤维是正常的内侧再生所必需的，在环状纤维减少后，出现两个头而不是一个头。另外，需要纵向纤维启动再生程序，缺乏纵向纤维的涡虫不能够重建肌肉中的位置信息，即使涡虫仍然具有组织更新的能力，但缺乏干细胞对损伤的反应。两种纤维类别的同时丢失则导致涡虫结构的紊乱。肌肉在涡虫的生理作用中，除了收缩，不同的肌肉纤维在协调涡虫的再生过程中起着重要的调节作用 [ 28 ]。
system: [SYSTEM]

user: 5. 肌肉与极性 涡虫被切割成微小片段也可以再生出完整的个体，这个过程依赖于干细胞的增殖与分化，另外也需要PCGs调控机体的构造。在涡虫的再生过程中，众多PCGs在多个体壁肌中表达。但是不同的肌肉纤维以及他们对于再生应答的作用尚不清楚。Neoblast是涡虫中未分化的细胞，具有分化出各个组织的能力。对于neoblast的增殖，涡虫的再生依赖PCGs确定再生过程中的组织特异性。受伤后，PCG在体壁肌中表达。MyoD编码肌肉发生中具有进化保守作用的螺旋–环–螺旋转录因子，MyoD(RNAi)后导致纵向肌肉纤维丢失而不干扰环形或斜线纤维，以增加涡虫的长宽比例。对未受损MyoD(RNAi)的涡虫进行RNA测序(RNA-seq)发现，PCGs的一个子集与MyoD共表达，并显著下调，说明在纵向肌肉纤维中显著表达。另外，在MyoD(RNAi)处理后的动物片段受损后不能启动再生即使neoblast有分化成各种细胞类型的能力。虽然MyoD(RNAi)可以进行小的创伤比如眼睛的修复并且通过neoblast分化进行组织的更新，但是祖细胞停止增殖以限制大的组织修复。MyoD(RNAi)RNAs-seq的动物揭示了两种伤口诱导基因的表达明显下调。两种基因通过在损伤后的纵向纤维中富集：notum和fst [ 29 ]。这两种基因在再生应答中有重要的作用：notum编码WNT脱氨酶并通过负调控wnt信号通路调节受损后涡虫头尾的结构。Fst编码follistatin并能够维持伤口诱导基因的持续表达，在再生过程中促进neoblast的增殖。当fstRNAi与MyoDRNAi相似，允许组织更替，但完全阻止再生。Myod(RNAi)与fst(RNAi)的尾部片段不能限制后部PCGs的表达，也不能正确的启动前部PCGs的表达。纵肌不仅仅是创伤后维持收缩能力所必需的，而且也是再生反应的关键调节因素 [ 26 ]。
system: [SYSTEM]

user: 6. 总结 涡虫的再生能力极强，即使被切割成279份，每一碎片均能再生出完整的个体。这一过程依赖于干细胞的增值与分化。干细胞是一种能够自我更新、持续分化的一类细胞，能够在动物体内产生所有类型的细胞。在涡虫中唯一具有干细胞多能性的一类细胞称为neoblast，具有异质性。 虫体受创后，再生早期会触发neoblast有丝分裂两个高峰：1) 对任何损伤的全身反应，当损伤导致组织缺失时，诱导第二个neoblast反应；2) 在伤口处招募neoblast以增殖分化出所缺失的组织。Neoblast创伤反应存在两个功能不同的信号阶段，并以此可区分受伤和组织缺失再生的情况。 创伤反应由创伤处任何细胞类型中激活的基因和体内广泛分布的细胞中激活的特定细胞类型的基因组成，共三个组成部分：1) 创伤后几乎所有类型的细胞都有基因表达，包括多个应激反应基因，2) 71%的细胞特异性基因优先在三种细胞类型(neoblast，肌肉，表皮)中的一种，转录因子和与增殖相关的基因中表达，3) 部分创伤诱导基因在肠道、咽旁细胞和神经元中表达，反映了创伤后组织独特的生理反应。在干细胞与分化组织之间，整个虫体发生转录变化。并可以通过早期反应基因分析出不同类别的创伤反应基因。预先存在在原组织中的这些早期转录因子对于启动再生是必不可少的。 受损后，涡虫会迅速愈合伤口并重新建立正确的轴向极性，在几乎任何类型的损伤中，都能够正确地再生出所缺失的部位，确定涡虫虫体适当的比例。 在涡虫发育的动态平衡中，许多模式基因在不同的结构域中表达。去头去尾都会扰乱这种正确的模式，导致不成比例的表达模式。截肢后，不同结构域的标志物会前向后向的聚集，即使在没有干细胞存在的情况下也是如此，表明这些标志物可以提供再生过程中的轴向信息。而涡虫中提供位置信息的基因在皮下肌肉细胞亚群中表达，为再生创造出一个坐标系统，通过转录激活模式基因提供位置信息。如此，neoblast可以在受损位置分化出缺失的组织与器官。 然而，肌肉是如何被指定的，不同的肌肉亚群是如何影响再生的还不得而知。 MyoD是helix-loop-helix转录因子，在肌肉发育过程中具有保守作用，与Myf5和Mrf4一起作用于脊椎动物骨骼肌的形成 [ 29 ]。在线虫中，myoD同源物hlh-1与UNC-120和HND-1协同作用，协调体壁肌肉的发育。果蝇则需要myoD同系物NAU来分化有限的肌肉 [ 29 ]。涡虫中myoD主要在体壁肌肉细胞中表达，一小部分myoD+细胞共表达neoblast标记的smedwi-1。在地中海涡虫中，只有46%的体壁肌细胞表达myoD，说明myoD可能在特定肌肉细胞亚群或短暂分化阶段表达。在涡虫中存在于沿前后轴定向的纵向纤维中。将MyoD(RNAi)后，纵向纤维缺失，环状纤维和斜线纤维保持正常，而纵向纤维丢失导致再生失败，环状纤维的形成需要不同的转录因子编码基因nkx1-1，环状纤维的缺失导致前后轴分叉。在未受损的涡虫中，myoD(RNAi)后显示，肌肉特异性基因表达减少，其他编码的保守转录因子的基因(snail，lbx，nkx6-2和lhx2/9)表达降低。这些基因在体壁肌中表达，部分与myoD一起表达，snail，lbx和nkx6-2的RNAi不会引起主要肌肉表型的变化但可以调节纵向纤维。一些与myoD共表达的PCGs基因的表达也明显降低 [ 29 ]。 myoD(RNAi)后，肌肉创伤诱导的notum和fst的表达显著减少，同时纵向纤维缺失。同时，fst和notum在myoD+细胞中的表达丰富，说明notum和fst在创伤诱导基因中的表达是独一无二的且他们的表达仅限于纵向纤维。肌肉与极性密切相关，但两者之间如何相互影响还不得而知。
system: [SYSTEM]

user: 摘要 精子长期保存的最佳方法是低温冷冻保存，该方法具有保存时间长、生产成本低等优点。在养猪生产中广泛使用此项技术对精子进行长期保存，但由于猪精子质膜上的胆固醇/磷脂较低，所以较其他物种更容易受到低温的损伤，从而导致冷冻后的猪精子活力降低、受精率降低。本文就低温冷冻保存对猪精子超微结构、能量代谢等方面的影响进行了综述，阐明冻融精子的损伤机理，为提高冻精的活力奠定基础。
system: [SYSTEM]

user: 1. 研究背景 精子低温冷冻保存，是指将采精后的精液经检查、稀释后分装于冷冻细管中，再进行降温，后使用干冰或液氮冷冻，冷冻后再贮于−196℃的液氮罐中，进行长期保存。在进行人工授精(Artificial insemination， AI)或体外授精(In vitro fertilization， IVF)时，采用37℃，30 s进行解冻 [ 1 ]。家畜动物精子冷冻保存可以有效地提高优质品种公畜的资源利用率并且可以加速其育种过程，节约成本且不受地域、时间的限制，可以很好地发挥各个品种公畜的遗传潜力 [ 2 ]。 目前，人 [ 3 ]、小鼠 [ 4 ]、牛 [ 5 ] 等精子超低温冷冻保存技术已得到迅速发展，并建立起了商业冷冻精子库，但猪的冻精技术还未得到广泛应用。猪精子中脂质含量相对较高，且质膜上的胆固醇/磷脂比例较低，致使精子抗低温损伤能力减弱，冻融后精子活力、质膜及顶体完整率显著降低 [ 6 ]。有效冷冻保存的精液可以保存优良种质资源，改良品种，但是猪精子对低温异常敏感，导致在冷冻过程中会受到一定程度的损伤，这给猪精子的冷冻保存带来很大的困扰。 猪精子通常分为头部、颈部和尾部三个部分(如图1所示)，长度约50~60 μm。精子是含有遗传物质、表面由质膜覆盖、具有活动能力的雄配子。1) 头部长约8.5 μm；形状为扁卵圆形，由细胞核、顶体和质膜构成。细胞核内含遗传物质DNA；顶体呈帽状双层结构，位于质膜下，内含多种与受精有关的酶；质膜是位于精子头部最外层的膜结构。2) 颈部位于头部的基部，是头尾相接的部分。3) 精子尾部是是代谢和运动器官，是精子最长的部分。根据其结构不同又分为中段(约10 μm)、主段(约30 μm)和尾段(2~5 μm)，有一条贯穿全尾的轴丝 [ 7 ]。轴丝是由9个双连微管和2个单连微管组成的中心复合体，在横截面上呈保守的“9 + 2”结构排列 [ 8 ] (如图2所示)。中段内含线粒体，是精子分解营养物质，产生能量的主要部分，由颈部延伸而来。
system: [SYSTEM]

user: 2. 低温冷冻保存对精子超微结构的影响 2.1. 对顶体的影响 顶体是由高尔基体小泡发育而来的特化溶酶体，位于精子头部最前端。精子受精能力的前提条件是顶体的完整性。羊建平等 [ 9 ] 实验证明，在扫描电镜下，新鲜的猪精子(图3(a)、图3(b))头、颈、尾结构完整；顶体结构完整，边界清晰，边缘整齐，局部无隆起，表面无空洞。冻融后，猪精子头部和颈部发生全部或部分断裂(图3(c)~(e))，颈部肿胀(图3(e))；顶体结构损伤或消失(图3(f))。 图1. 猪精子结构 图2. 轴丝横截面“9 + 2”结构 精子的受精能力与精子的形态结构密切相关 [ 10 ]。顶体内含有透明质酸酶、酸性磷酸酶、顶体酶、ATP酶和等多种与受精相关的酶 [ 11 ]。精卵融合前精子必须发生顶体反应，顶体酶才能发挥作用 [ 12 ]。可见，完整的顶体结构是正常顶体反应的基础。 2.2. 对鞭毛的影响 鞭毛，也就是精子的尾部，是精原干细胞经过有丝分裂、减数分裂之后，在精子变态发育过程中形成的 [ 7 ]。鞭毛是精子的代谢与运动器官 [ 13 ]，与精子的运动能力有密切关系，而精子的运动能力是完成受精的重要前提条件。精子进入阴道后，需要很长时间才能与卵子结合形成受精卵。精子运动功能与精子结构紧密相关，只有结构正常的精子才具有良好的运动功能和受精能力。当精子的活力低下、尾部形态异常或行动方向不规律都会导致雄性不育。全球约有15%的育龄夫妇无法正常生育，一半原因是男方精子形态异常导致的 [ 14 ]。研究表明，原发性纤毛运动障碍或称原发性纤毛不动综合征(primary ciliary dyskinesia， PCD)是由精子鞭毛的超微结构缺陷，从而引起精子活力异常，导致精子失活 [ 15 ]。 图3. 扫描电镜下，冷冻保存前后猪精子的超微结构 [ 9 ] 冷冻会使鞭毛的超微结构造成一定程度的损伤，从而会使精子的活率降低。王亮等 [ 16 ] 通过实验证明，东北虎精液冷冻后造成会精子鞭毛损伤，电镜下，可以清楚地看到新鲜精子中段纵截面：线粒体呈念珠状般整齐而有序的排列在轴丝的两侧(图4(a))；横截面：线粒体鞘的内侧包裹着“9 + 2”结构(见图4(b))。冻融精子尾部出现质膜膨胀，破损及线粒体裸露在外等现象。在中段，质膜肿胀，横截面的线粒体相互嵌合式结构出现断裂倾向，有的甚至出现线粒体缺失(见图4(c))。 图4. 透射电镜下，东北虎精子尾部冻融前后的变化 [ 16 ] Ni-Hao Gu [ 8 ] 等人使用透射电镜观察猪精子中段(图5(a))、主段(图5(b))和尾段(图5(c))的横截面。徐慧明等 [ 17 ] 研究也证明，冷冻前人精子形态正常，细胞膜完整，顶体内、外膜结构清晰，鞭毛结构正常。冷冻后精子的损伤主要在顶体，电镜下可见顶体内、外膜间出现空隙，内膜与质膜相贴，鞭毛外膜不紧密与鞭毛脱离。根据比较发现猪精子正常的鞭毛结构与东北虎、人一致，故推测冷冻损伤也会导致猪精子出现类似的情况。 图5. 新鲜猪精子鞭毛的横截面 [ 8 ] 鞭毛是精子的运动器官，其摆动是精子向前活动的动力。鞭毛外周致密纤维和纤维鞘是保障精子可以向前运动的主要结构 [ 18 ]，正常形态的鞭毛对精子运动和受精都十分重要，鞭毛异常可导致精子运动障碍，受精率低 [ 19 ]。 2.3. 对质膜的影响 精子质膜不仅是精子头部的重要组成部分，也是最易损伤的部位，它可以保护精子头部内细胞器和细胞结构 [ 11 ]。质膜的破裂会导致其内三磷酸腺苷(ATP)、代谢酶等相关组分流失，直至精子死亡 [ 19 ]。精子质膜的结构完整，对于受精过程中获能、顶体反应、新陈代谢等都至关重要 [ 20 ]。张斌 [ 21 ] 等人的实验结果表明，新鲜猪精子质膜、顶体内外膜和核膜均完整(见图6(a))；头部质膜和顶体外膜结合紧密(见图6(b))。冻融后精子超微结构变化表现出：质膜轻度或极度膨胀(见图6(c))，与顶体外膜分离(见图6(d)、图6(e))；有的甚至出现质膜缺失，发生内容物外露(见图6(f))。 图6. 透射电镜下，猪精子冷冻前后的质膜结构变化 [ 21 ] 有研究提出冷冻保存处理主要损伤精子头部的质膜与顶体 [ 21 ]。质膜与顶体在顶体反应中的获能、释放顶体酶、溶蚀放射冠和透明带等的过程中扮演首要角色。 对精子超微结构的研究有助于进一步检测冷冻对精子的影响，为解决冷冻精子受精率低的原因提供理论依据。
system: [SYSTEM]

user: 3. 低温冷冻保存对能量代谢的影响 所有活细胞发育和发挥功能都需要能量，精子也不例外 [ 22 ]。哺乳动物精子的代谢活动是维持其生命和运动的重要基础活动 [ 23 ]。精子射入阴道内，在经宫颈管进入输卵管腔的过程中，生殖道分泌物中的α、β淀粉酶将精子顶体表面的糖蛋白降解，同时顶体膜结构中胆固醇与卵磷脂比率及膜电位发生变化，各种离子内流，精子变得极度活跃，这种现象称为获能(Capacitation)。因此，精子的获能是最终受精的先决条件。精子从能量代谢中获得大量ATP，变成极度活跃的状态 [ 24 ]，来维持自身运动 [ 25 ]。因此，精子能量代谢情况和运动能力可作为衡量精子质量的指标 [ 26 ]。 在精子形成并最终成熟的过程中，丢弃大部分的细胞质，只保留了与部分代谢相关的细胞器与蛋白酶 [ 27 ]。成熟的精子能够利用能量代谢底物比如果糖、甘露糖、葡萄糖、丙酮酸、乳酸和乙酸等进行代谢供能 [ 28 ]，使用三磷酸腺苷(ATP)来维持细胞内环境，并用于成功受精所必需的细胞过程，如运动、获能、过度激活和顶体反应 [ 29 ] [ 30 ]。一般来说，精子可以通两条代谢途径产生能量，即糖酵解和氧化磷酸化(也称线粒体呼吸)，前者发生在精子的头部和鞭毛的主段部分；后者发生在线粒体。许多精子的细胞质富含大量的乳酸，而且大多数哺乳动物的生殖道内也含有乳酸，因此科学家们推测，乳酸脱氢酶会催化乳酸转化成丙酮酸，之后丙酮酸进入线粒体，进行三羧酸循环(TCA)产能。也有实验证明，乳酸比葡萄糖更容易诱导哺乳动物精子获能 [ 31 ]。因此，有学者认为，精子能量代谢的主要来源是氧化磷酸化。 如图7所示，位于精子尾部中段的线粒体鞘呈紧密螺旋状排列，包裹外周致密纤维，周边无多余胞质和其他细胞器。当受到外界损伤(理化损伤、冷热应激、冷冻损伤等)，线粒体极易受到损伤，导致线粒体功能受损 [ 32 ]。同时，氧化磷酸化也是在线粒体上进行，当线粒体功能受损时，线粒体膜上电子传递链断裂，致使TCA停滞、ATP减少，造成精子出现能量匮乏与氧化受损 [ 33 ]。 图7. 精子尾部中段的横截面 有研究表明，冻融后的精子因线粒体受到损伤，所以活力比新鲜精子低。傅龙龙 [ 32 ] 通过透射电镜观察到人的精子冷冻后，精子线粒体结构疏松，线粒体嵴增宽，空泡样改变增多。可以说明线粒体形态改变会造成其功能的改变。ATP和线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential， MMP)也是衡量线粒体功能的重要指标，与精子存活率、活力和受精率成线性相关 [ 34 ]。MMP是线粒体在呼吸氧化过程中，在内膜中所产生的能量以电化学势能储存，导致膜两侧质子及其他离子浓度的不对称分布。MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能，在进行氧化磷酸化、产生ATP的过程中其重要作用。MMP降低说明线粒体的供能出现了障碍，ATP就会减少。线粒体活性的改变会影响精子的受精能力 [ 35 ] [ 36 ]。所以，由于线粒体损伤造成的能量减少，为精子冷冻损伤提供了一定的理论支持。
system: [SYSTEM]

user: 4. 小结与展望 冷冻后的猪精子容易出现顶体损伤、尾部结构异常、质膜膨胀或缺失、能量代谢障碍等一系列问题，所以优化猪精子冻存方案和技术对于提高猪精子的活力是非常重要的 [ 37 ] [ 38 ]。精子顶体结构的完整性是正常顶替反应的基础以及成功受精的关键；正常形态的鞭毛是精子运动以及获能的关键；精子是否存活的重要指标是质膜完整性 [ 38 ]。精子的超微结构与受精能力密切相关 [ 39 ]。精子代谢所需的能量主要由线粒体提供。 哺乳动物精子与畜牧业以及医药行业都息息相关，是一直以来的研究热点。因此低温冷冻保存精子过程中减少精子冷冻损伤、提高精子冷冻复苏活率是目前需要解决的重要问题，需从多层次、多角度了解低温冷冻保存对猪精子功能损害的机理，提高冷冻精子质量，使冻融后的精子得到广泛应用。
system: [SYSTEM]

user: 摘要 目的：rs9263726位点(G>A)之A等位基因是预测别嘌呤醇致严重不良反应风险的遗传标记，本研究旨在建立一种直接使用口腔上皮细胞进行PCR结合FokI酶切检测该位点基因型的方法。方法：自行设计扩增产物包含FokI内对照识别序列的引物，以样本的口腔上皮细胞粗处理物为模板，通过巢式PCR扩增跨越rs9263726位点的靶片段，进而根据PCR产物的FokI酶切图谱判断样本基因型。结果：所检样本均能扩增出预期大小的PCR产物，3种基因型的酶切图谱特征明显，且经测序验证结果一致。结论：初步建立了一种基于巢式PCR-RFLP检测rs9263726位点的改良方法，具有简便、快速、准确、低成本等特点。
system: [SYSTEM]

user: 1. 背景介绍 别嘌呤醇作为抑制尿酸生成的首选药物被广泛应用，但在临床实践中该药物有许多副作用，其中别嘌呤醇致严重皮肤不良反应(SCARs)不容忽视，如史蒂文斯–约翰逊综合征(SJS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)和药物超敏反应综合征(DRESS)等，病死率高达30% [ 1 ] [ 2 ]。大量研究表明，HLA-B*58:01等位基因与别嘌呤醇致严重不良反应(SCARs)有强相关性 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。不同民族的人群中该等位基因的携带率具有一定的差异，且HLA等位基因的分布频率在南方民族中显著高于北方民族，但在不同性别间无显著性差异 [ 7 ]，因此在痛风患者使用别嘌呤醇药物之前，有必要进行HLA-B*58:01等位基因的检测。 HLA (human leucocyte antigen)复合体是人类多态性最丰富的遗传系统，定位于第6号染色体短臂6p21.31区，长3600 kb，遗传特征主要有多态性、多基因型，其多样性决定了HLA等位基因的检测方法具有复杂性 [ 8 ]。越来越多的研究显示，位于6号染色体的银屑病易感基因1候选基因1 (Psoriasis susceptibility 1 candidate 1， PSORS1C1)的rs9263726位点和别嘌呤醇导致的SJS/TEN有很大关联 [ 9 ] [ 10 ]，可替代难于分型检测的HLA-B*58:01基因，用于别嘌呤醇个体化用药的指导。 聚合酶链反应–限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism， PCR-RFLP)技术是最经典的SNP分型方法，常用于基因突变的快速检测 [ 11 ]。Keiko Maekawa [ 12 ]、曾大勇 [ 13 ] 等使用同样的PCR-RFLP法成功检测了rs9263726位点多态性(见表1)，其以静脉血来源的DNA为模板，扩增260 bp的目的片段，用限制性内切酶FokI酶切分型。 传统PCR-RFLP检测基因型的主要不足之处在于酶切不完全的情况下，会残留PCR产物从而导致基因型误判 [ 14 ]，具体到rs9263726位点，使用表1的引物，一个AA型样品，其完全酶切的条带为141 bp、119 bp，当酶切体系含有未发生酶切的260 bp的PCR产物时，将出现260 bp、141 bp、119 bp的条带，与杂合子GA的带型一致，从而被误判为GA型。 Table 1 The existing PCR-RFLP methods for detecting rs9263726 locu 引物序列 上游引物 下游引物 5’-AAGCTCCATCCACCCCTGGT-3’ 5’-ACACATTGGGTGGGGGACAT-3’ 判断3种基因型样品的依据(酶切条带) 野生型纯合子GG 260 bp 杂合子GA 260 bp、141 bp、119 bp 突变型纯合子AA 141 bp、119 bp 表1. 已有的检测rs9263726位点的PCR-RFLP方法 本研究旨在对上述的传统方法加以改进，不提纯基因组DNA而是直接使用口腔上皮细胞粗处理物作为模板，以提高操作的简便性，同时通过合理巧妙地设计引物，在PCR产物中引入内对照酶切位点以提高分型的准确性。
system: [SYSTEM]

user: 2. 实验材料和仪器 2.1. 试剂 引物由北京擎科生物科技有限公司(广州)合成；聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；庄盟50 bp Ladder和DNA marker I购自广州左臣生物科技有限公司；限制性内切酶FokI购自昂科生物医学技术(苏州)有限公司，测序由北京擎科生物科技有限公司(广州)完成。 2.2. 样本 采自广东药科大学本科生志愿者，均签署知情同意书，按照本实验室的样本处理流程处理后备用。 2.3. 主要仪器 BIO-RAD T100基因扩增仪购自上海伯乐生命医疗产品公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪和WD-9403F紫外仪购自北京市六一仪器厂；三用恒温水箱购自姚奥特仪表有限公司；北京大龙手动单道移液器式移液购自上海高致精密仪器有限公司。
system: [SYSTEM]

user: 3. 实验内容 3.1. 引物设计 根据GenBank中PSORS1C1基因全序列(登录号：NG_021348.1，其中28892位的碱基R为多态位点碱基，R = G或A)及db SNP数据库的序列信息，采用primer premier 5.0软件设计外引物对F1、R1和内引物对F2、R2，见图1。巢式PCR产物理论长度为388 bp，突变型等位基因A的PCR产物在多态位点含有限制性核酸内切酶FokI识别位点，野生型等位基因G的PCR产物在多态位点不含FokI识别位点，此外，两者均在多态位点上游含有一个天然的内对照酶识别位点(28743-28747位的catcc)。 3.2. PCR扩增 第一轮PCR：PCR反应体系为5 μl：口腔上皮细胞粗处理物0.5 μl，2×TransDirect® PCRSuperMix (+dye) 2.5 μl，外引物F1、R1各0.2 μl，ddH 2 O 1.6 μl。PCR反应条件为：94℃预变性8 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环，72℃再延伸5 min。 第二轮PCR：PCR反应体系为25 μl：第一轮PCR产物0.2 μl，2×EasyTaqPCRSuperMix 12.5 μl，内引物F2、R2各0.2 μl，ddH 2 O 11.9 μl。PCR反应条件为：94℃预变性，3 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸15 s，30个循环，72℃再延伸5 min。 图1. 巢式PCR外、内引物设计示意图 3.3. PCR产物鉴定 用胶染法制备含溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶，取2 μl第二轮PCR产物于150 V电泳25 min，用紫外透射仪观察结果，并拍照保存。 3.4. PCR产物酶切消化 酶切反应体系为30 μl，其中PCR产物2 μl，10×FastDigestGreen Buffer 2 μl，FastDigest FokI 0.5 μl，ddH 2 O 25.5 μl，37℃水浴15 min。 3.5. 酶切片段电泳分型 用胶染法制备含溴化乙锭(EB)的2.5%琼脂糖凝胶，取18 μl酶切产物于180 V电泳25 min，用紫外透射仪观察结果，并拍照保存。 3.6. 3种基因型样品的测序验证 取3种基因型样品各1例，扩增388 bp的靶序列送至擎科基因公司测序，测序引物为上游内引物F2。
system: [SYSTEM]

user: 4. 实验结果 4.1. 巢式PCR产物电泳结果 图2的1~3号分别为3个不同样品的PCR产物电泳条带，条带单一，与预期产物片段大小(388 bp)相符，表明PCR取得成功。 图2. 巢式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 4.2. 酶切产物电泳结果 图3为本实验室保存的已知的3种基因型样品的酶切图谱。预期条带如下： 野生型纯合子GG：278 bp、110 bp 杂合子GA：278 bp、148 bp、130 bp、110 bp 突变型纯合子AA：148 bp、130 bp、110 bp 图3实验结果与预期完全一致。 图4为10个随机样品的酶切图谱，尽管PCR产物有不同程度的残留，但通过278 bp、148 bp两条特征条带仍然能分辨3种基因型。 4.3. 基因测序结果 PSORS1C1基因rs9263726位点附近的序列为……ACTCRTCCCCC……，3种基因型样品的测序结果与本法的分型结果完全一致，见图5，证明了方法的准确性。 图3. 3种基因型样品巢式PCR产物的酶切产物电泳图 图4. 10个随机样品酶切产物电泳图 图5. rs9263726位点三种基因型样品测序峰图
system: [SYSTEM]

user: 5. 讨论 传统的限制性核酸内切酶识别序列一般为“回文”结构，且酶切位点位于识别序列处或者旁边。FokI酶属于限制性内切酶家族中的IIs型酶 [ 15 ]。特异性地识别DNA上特定的非对称识别位点 [ 16 ]，即DNA上的特定序列5’-GGATG-3’或者前者的互补序列5’-CATCC-3’，然后非特异性地剪切一条链上距离识别位点9个碱基距离处的磷酸二酯键，另一条链(互补链)上距离识别位点13个碱基距离处的磷酸二酯键。rs9263726位点中28743~28747位的序列为FokI酶的识别序列，它是野生型等位基因G和突变型等位基因A都拥有的序列，可作为内对照识别序列，无论哪种等位基因来源的PCR产物都能在该识别位点对应的切割位点发生切割，从而可用作提示酶切的程度。在酶切完全的情况下，所有切割后的条带都应小于原来的PCR产物；如果出现PCR产物残留，则提示酶切不完全。在没有内对照酶切位点的情况下，酶切不完全残留的PCR产物会被当作G等位基因对待，造成AA型样品被误判为GA型样品；而本研究中即便酶切不完全、有PCR产物残留，也可通过特征条带对基因型进行判断，其中G等位基因的特征条带为278 bp，A等位基因的特征条带为148 bp，故图4的10个样品，虽然有PCR产物残留，但基因型都能正确判断。 本研究所用的FokI价格比较昂贵，公司网站报价为1019元/100次反应 (https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/FD0874#/FD0874)，每次反应推荐用酶1 μl。为了节省实验成本，本研究中，把每个样品的酶切体系中的FokI的用量减半即改为0.5 μl，虽然会造成一定程度的酶切不完全，但丝毫不影响结果判断，有赖于巧妙的内对照酶切识别位点的设计。 值得一提的是，148 bp的条带是在多态位点和内对照酶切位点识别序列对应的切割位点均发生切割后形成的中间片段，FokI这种酶在酶切反应完成后很容易与DNA片段粘在一起，从而影响DNA片段对核酸染料的结合，造成该条带观察起来略显暗淡，但通过对图片的亮度、对比度加以调整或者对图片进行反色处理，是能够看得非常清楚的，而且它与5’端切割产生的130 bp片段有较好的区分度。 本研究前期的引物设计筛选过程中发现，如果将内引物对的下游引物设在现有的R2引物的下游(见图1之R3)，部分PCR产物酶切后在得到预期条带的同时，还出现了一些非特异性条带。PCR产物测序的结果发现，图1之29035~29039位的基因组原碱基序列CGTCC在产物中变为了CATCC，从而形成了新的FokI识别序列，导致酶切条带出现异常。这提示运用PCR-RFLP法进行基因分型具有一定的局限性，设计的引物需经实践验证，以避免PCR产物中带有可能的突变而干扰基因分型。
system: [SYSTEM]

user: 6. 结论 本研究对现有的基于PCR-RFLP法检测rs9263726位点的方法进行了成功的改良，可以使用简便易得的口腔上皮细胞作为模板直接进行巢式PCR获得靶序列；靶序列带有FokI的内对照酶切识别序列，可提高RFLP分型的准确性，并且可以节省FokI的用量，降低成本；直接PCR和快速核酸内切酶的应用还能缩短检测周期。故本研究建立的方法在指导别嘌呤醇的个体化用药方面有良好的应用前景。
system: [SYSTEM]

user: 摘要 针对心音特征具有随其可分割性而改变的性质，提出一种基于心音分割的自适应特征提取算法，进而创建一种创新型的心脏病诊断系统。其创新点主要体现在：基于短时修正希尔伯特变换的第一复杂心音( C S 1 )，第二复杂心音( C S 2 )或完整心音( C S )的自适应分割提取；基于分割心音的自适应频率特征FF1 或FF2 提取；基于主成分分析的多尺度特征[ γ 1 1 、 γ 1 2 ]和[ γ 2 1 、 γ 2 2 、 γ 2 3 ]降维处理。实现此研究目标的2个阶段概括为：① 自动统计分析两个连续峰值之间的时间间隔，以此来确定心音的可分割特性；② 基于心音分割的自适应特征提取以及降维处理。通过在线数据库和临床数据库中提取的心音特征的散点图对系统性能进行初步评估验证。