system: [SYSTEM]

user: 2. 材料与方法 2.1. 供试材料 植物材料：防风(Saposhnikovia divaricata (Trucz.) Schischk.)，采自云南省曲靖市师宗县高良乡岭黑村老庄科。 病原真菌：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、禾谷丝核菌(Rhizoctoniazeae)、串珠镰胞菌(Fusarium moniliforme)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和灰霉菌(Botrytis cinerea)。 病原细菌：梨火疫病菌(Erwinia amylovory)、稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、丁香假单胞杆菌桑致病变种(Pseudomonas syringae pv. mori)。 2.2. 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化钠10 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1 L (pH 7.4)。 PDA培养基：马铃薯200 g，削皮，洗净切小块，加适量蒸馏水煮沸20 min，四层纱布过滤。滤液中加入葡萄糖20 g，琼脂15~20 g，蒸馏水定容至1000 mL。pH自然。 NB培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL (pH 7.4~7.6)。 KB培养基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K 2 HPO 4 1.5 g，MgSO 4 ∙7H 2 O 1.5 g，水1000 mL (pH 7.0~7.2)。用于丁香假单胞杆菌桑致病变种的培养。 2.3. 内生细菌菌株的筛选 防风成熟根，流水洗净表面附属物，切成3~4 cm长小段，1%次氯酸钠溶液浸泡2 min后，无菌水冲洗多次，再用75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗多次。根在超净工作台中晾干表面水分，切成0.5~1 cm长小段，纵切成两半，切面贴附于PDA平板中，28℃培养3~7天。期间分离根周边生长的可挑取细菌菌落，并转接于新的PDA平板进行纯化。纯化后菌株接种于PDA培养基斜面，4℃冰箱中保存备用。其中一株命名为FFR3的菌株经初筛后用于实验。 取最后一次清洗的无菌水100 μL涂布于PDA培养基平板，培养后无菌生长，表明根表面附生菌已清除，分离菌株为防风根部内生细菌。 2.4. 内生细菌FFR3的鉴定 2.4.1. 电镜形态学鉴定 将FFR3接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养24 h后(120 rpm)，取250 μL菌液加入到含有3 mL LB液体培养基的六孔板中，加入细胞爬片，封口膜密封。静置4 h后，置于摇床中37℃振荡培养(30 rpm)。24 h和72 h后取出细胞爬片，经前固定、清洗、后固定、脱水、干燥、镀金等，扫描显微镜下观察菌细胞形态。 2.4.2. 分子生物学鉴定 采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取内生菌基因组DNA，使用通用上游8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和下游1510R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')引物进行PCR扩增。50 μL PCR扩增体系：10×buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，上下游引物各1 μL，细菌基因组DNA 2 μL，MgCl 2 (15 mmol/L) 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH 2 O 39 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，25个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序工作。 菌株FFR3的16S rRNA基因在NCBI数据库中进行BLAST比对，筛选同源序列。选择同源性较高的序列，采用MEGA(version 6.06)软件包中的neighbor-joining法构建系统进化树分析系统发育地位。 2.5. 内生细菌FFR3的广谱抗性分析 2.5.1. 对病原细菌的抑制效应分析 采用平板涂布法分析FFR3对病原细菌的抑制效应 [ 15 ]。取直径6 mm的在PDA培养基上生长24 h的FFR3小块，接种在涂有病原细菌菌悬液的PDA平板中(丁香假单胞杆菌桑致病变种用KB培养基，下同。)，于37℃培养箱中培养3 d，分析FFR3对病原细菌的抑制效果。抑菌圈直径(mm) = 总直径 − FFR3小块直径(6 mm)。 2.5.2. 对病原真菌的抑制效应分析 采用平板对峙法分析FFR3对病原真菌的抑制效应 [ 16 ]。在PDA培养基上以真菌菌块(f = 6 mm)为中心，距离1 cm左右的三个位置点接FFR3菌株，28℃培养箱中静置培养3 d，分析FFR3对病原真菌的抑制效果。菌株与病原真菌之间的距离表示抑制效果的强弱。 2.5.3. 对病原真菌的形态影响 取出预先浸泡在75%乙醇中的盖玻片并晾干，在2.5.2方法的基础上，成30˚角斜插在真菌菌块和FFR3之间。28℃培养箱中静置培养3天后，取出盖玻片，菌丝面朝下，盖在洁净的载玻片上，光学显微镜下观察菌丝形态。 2.6. 内生细菌FFR3胞外抑菌物质抑菌效果检测 将菌株FFR3分别接种在LB培养基、NB培养基和PD培养基中(50 mL/150 mL)，120 rpm、37℃条件下震荡培养3 d。培养液在8000 rpm、4℃条件下离心20 min，收集上清液并用0.2 μm无菌滤膜过滤除菌。将灭菌干燥后的滤纸片(f = 6 mm)完全浸泡在上述除菌上清液中30 min，用于分析胞外抑菌物质对病原菌的抑菌效果。 参照2.5.1的方法，将滤纸片取出晾至微干，贴在涂有病原细菌菌悬液的培养基平板中。37℃培养箱中培养3 d，观察对病原细菌的抑制效果。 参照2.5.2的方法，取直径6 mm病原真菌小块贴在PDA培养基平板中央，以真菌菌块为中心，距离1 cm左右的位置贴附晾至微干的滤纸片，28℃培养箱中培养3 d，观察对病原真菌的抑制效果。 2.7. 内生细菌FFR3胞外抑菌物质的初步分离 将FFR3接种在LB液体培养基中，在120 rpm、37℃条件下震荡培养3 d，8000 rpm、4℃条件下离心20 min后得到含胞外抑菌物质的上清液。 2.7.1. 蛋白质或多肽类物质的分离 分别将上清液用20%、30%、40%、50%、60%、70%硫酸铵分级沉淀，10000 rpm离心20 min，弃去上清，获得蛋白质或多肽类物质沉淀。用PBS缓冲溶液(0.1 moL/L， pH 7.2)将沉淀悬浮，悬浮液在透析袋(截留分子质量8000~14000 D)中透析去盐后冷冻干燥。用PBS缓冲液将沉淀配制成1 mg/mL稀释液，采用2.6滤纸片法测定蛋白质或肽类物质的抑菌性。 2.7.2. 多糖类物质的分离 分别将上清液用20%和40%的乙醇醇沉，收集沉淀获得多糖类物质。用PBS缓冲溶液(0.1 moL/L， pH 7.2)将沉淀配制成1 mg/mL稀释液，采用2.6滤纸片法测定多糖类物质的抑菌性。 2.7.3. 次生代谢物的分离 以等体积石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯对上清液进行分级萃取，萃取后旋转蒸发仪浓缩。甲醇溶解沉淀物配成10 mg/mL稀释液，以甲醇为对照，采用2.6滤纸片法测定次生代谢物的抑菌性。 2.8. 内生细菌FFR3胞外硫酸铵沉淀抑菌物质的稳定性 在得到的最佳硫酸铵沉淀条件下，以指示菌为实验对象，采用2.6滤纸片法检测FFR3胞外抑菌物质对温度、蛋白酶和酸碱(pH)的稳定性。 2.8.1. 抑菌物质的温度稳定性 将溶解于PBS缓冲液(0.1 moL/L， pH 7.2)的等体积1 mg/mL抑菌物质溶液分别在30℃、50℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中处理30 min，在121℃的灭菌锅中灭菌30 min，检测胞外抑菌物质对温度的稳定性。 2.8.2. 抑菌物质的蛋白酶稳定性 分别滴加20 μL浓度为1 mg/mL的蛋白酶K和胰蛋白酶于2 mL PBS缓冲液溶解的抑菌物质溶液中，颠倒混匀(轻缓)，37℃静置反应10 min后，以相同浓度的不做处理的溶液作为对照，检测胞外抑菌物质对蛋白酶的稳定性。 2.8.3. 抑菌物质的酸碱稳定性 用浓度为1 mol/L的盐酸和氢氧化钠溶液分别将1 mg/mL的抑菌物质的pH调节为2、4、6、8、10、12，颠倒混匀(轻缓)，室温静止5 min后，检测抑菌物质对酸碱的稳定性。