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user: 2. 浸出微生物对金精矿生物氧化环境的适应性机制 目前，在金精矿生物氧化过程中使用的最常见的、成功的微生物，主要有氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、硫杆菌属(Sulphobacillus sp.)和铁原体属(Ferroplasma sp.)等 [ 13 ]。这些浸出微生物生存在金精矿生物氧化导致的极端环境中，但它们对高盐、强酸和其他恶劣环境条件的适应机制仍不完全清楚，缺乏揭示潜在功能细胞成分的系统分析 [ 14 ]。因此，有必要运用高通量测序、生物信息学分析、系统生物学方法等手段，在基因、RNA和蛋白质等尺度上进一步研究抗性机制中潜在功能成分，以探索极端微生物的全部代谢潜能并构建具有更强抗逆性的高效工程菌株。 2.1. 极端环境下单菌株的适应性机制 2.1.1. 极端酸性环境下单菌株的适应性机制 金精矿进行生物氧化的极端酸性环境(pH < 3.0)是适应酸性和有毒金属的微生物的独特生态位 [ 15 ]。在这一环境中，浸出微生物的集体适应是通过形成生物膜来实现的。生物膜为嵌入其自身生成的细胞外聚合物(EPS)基质中的微生物聚集体 [ 16 ]，这些彼此粘附或粘附于矿物表面的微生物群体具有高度结构化，因此其耐酸性有了显著提高。浸出微生物单个细胞内部的适应防御策略为机械防御 [ 17 ]、膜电位逆转 [ 18 ]、质子外排系统 [ 19 ]、细胞内缓冲 [ 20 ]、生物大分子的保护或修复系统 [ 14 ] 等。这些适应通过恢复pH稳态和相关的能量代谢来维持正常的生理活动。浸出微生物主要通过外排蛋白将金属离子从细胞质中泵出并将其转化为毒性较小的形式来适用高浓度金属离子的胁迫 [ 21 ]。微生物适应极端酸性环境的这些策略可通过组学研究来揭示特定基因、RNA、蛋白质的表达与调控。 采用基因组学方法，为氮碳循环、硫铁吸收和体内平衡、胞外多糖生物合成、重金属抗性和能量代谢等关键过程中涉及的基因和途径建立初步模型有利于理解对微生物应对极端环境的复杂响应过程 [ 22 ]。通过对极端嗜酸菌A. caldus和A. thiooxidans的系统基因组学分析均发现插入序列和基因组岛等多种可移动的遗传元素，这表明它们存在频繁的遗传流动(如侧向基因转移、基因重复、基因突变和基因组重排等) [ 23 ] [ 24 ]。通常，在极酸性环境中，铁离子的浓度远高于中性环境 [ 25 ]。在铁负载异常高的生物氧化过程中，基因组分析揭示了A. ferrooxidans用于铁吸收，感测，存储和调节铁稳态的以操纵子结构存在的候选基因，且这些基因可以编码至少11个铁离子系统以吸收Fe 3+ [ 26 ]。对44株生活在高铁浓度下的嗜酸细菌和古细菌的基因组序列分析表明，这些细菌缺乏编码Fenton反应调节因子的基因，表达的酶不足以解毒活性氧(ROS) [ 27 ]。因此，可以通过补充ROS去除的替代系统及保留DNA损伤的修复系统来缓解ROS对细胞的损害。 采用转录组学方法，对极端环境下的浸出微生物进行分析，如A. thiooxidans、A. caldus等。分析可得菌株在抵抗极端环境时差异表达的基因与能量代谢、双组分系统、氨基酸代谢和信号转导等代谢途径有关 [ 28 ]。微观特征表明，浸出微生物在金属胁迫下显示出较高的细胞聚集及EPS分泌，且EPS分泌的物质可以与金属离子形成沉淀来缓解氧化压力 [ 29 ]。采用KEGG和GO对A. thiooxidans的差异表达基因进行注释和分类可用于分析得到其涉及的代谢途径 [ 30 ]。例如，硫代谢途径相关基因(sor和soxABXYZ)的上调可以为细菌提供能量，而H + -ATPase活性的增强促进多余质子的流出。相反，参与碳代谢和鞭毛组装的基因下调可能会减少不必要的能量消耗 [ 30 ]。同时，天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸通过消耗质子增加碱度以抵抗酸胁迫，而不饱和脂肪酸(特别是C19-cyc)增加细胞膜密度以防止质子入侵 [ 30 ]。A. caldus抵御极端酸性环境的机制与A. thiooxidans基本相同。因此，其参与谷胱甘肽合成的氨基酸水平、抗氧化酶活性、细胞膜流动性和ATP合成相关酶的活性也都有所增加 [ 28 ]。 蛋白质组学方法分析表明L. ferriphilum对砷胁迫的反应涉及砷抗性系统、磷酸盐调节和谷胱甘肽合成 [ 31 ]。通过分析耐温氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermotolerans)对抗高砷含金硫化物浓缩物的差异表达蛋白，可以得到MBL折叠金属水解酶，醌氧化还原酶和GroEL伴侣蛋白等抗应激蛋白在抵抗砷和硫化物中发挥重要作用 [ 32 ]。 2.1.2. 高盐环境下单菌株的适应性机制 在高盐环境下，高浓度的氯离子会对浸出微生物的亚铁氧化酶系统的活性、pH稳态、生长动力学产生较大的不利影响 [ 33 ]。例如，氯化物可穿过嗜酸性铁氧化剂的细胞质膜来降低细胞质的pH值，从而抑制细胞甚至致其死亡 [ 34 ]。此外，浸出微生物产生的黄钾铁矾沉淀会妨碍金精矿的生物氧化 [ 35 ]。因此，研究浸出微生物在高盐环境下对这些损伤的抵御机制有利于驯化得到极端耐盐微生物。在高盐胁迫下，浸出微生物可以通过合成海藻糖、四氢嘧啶、甘氨酸甜菜碱等相容性溶质来缓解内外部渗透压不均衡对细胞的胁迫 [ 36 ] [ 37 ]。例如，A. ferrooxidans和A. thiooxidans使用脯氨酸和甜菜碱作为渗透保护剂来防止细胞干燥及蛋白质变性 [ 38 ]。 比较基因组学可揭示渗透耐受性的分子决定因素。嗜酸性铁氧化微生物除含有渗透胁迫反应的典型基因外，还含有K + 转运蛋白Kdp和Ygg完整或部分组成的基因，这可能使微生物能够吸收钾响应高水平的外部可溶性阴离子 [ 39 ]。生物信息学预测结果表明嗜酸菌对氯化物的耐受型取决于代谢类型，如混合营养细菌Sb. thermosulfidooxidan和Fm. acidiphilum比严格的化能自养菌A. ferrooxidans和L. ferriphilum具有更高的耐受性 [ 39 ]。此外，L. ferriphilum对氯化物的耐受性高于A. ferrooxidans [ 39 ]。 比较蛋白组学在不同氯化物水平下对Acidihalobacter prosperus DSM 14174的分析揭示了该菌株对高酸度和高氯离子环境的响应 [ 40 ]。该菌株的适应变化包括四氢嘧啶、谷胱甘肽、氨基酸、与DNA修复和膜生物合成相关蛋白质的合成均增加，而核糖体蛋白质产生减少，以及碳通量变化 [ 40 ]。同时，铁氧化和硫氧化产生的能量减少可能通过存储的糖原代谢产生能量来补偿，从而使菌株能够在高盐和低pH的刺激下保持正常的生命活动 [ 40 ]。 采用系统生物学的方法，详细分析了在强酸性和盐溶液等极端环境下，单菌株在物质流动方面的适应机制。从能量流出发，与极端环境下ATP浓度和NADH、NADPH、FADH 2 等辅因子相关的文献报道很少。如何实现物质流、能量流和辅助因子的高效耦合平衡，从而提高微生物对金精矿的降解能力，将是今后研究的热点之一。从信息流出发，进一步的研究可以通过调节菌株内部的信息流来增强其定向合成蛋白质的能力。因此，研究极端环境下单菌株内部物质、能量和信息流动的差异性、系统性、完整性和方向性能力，将成为今后金精矿生物氧化过程研究的重点。 2.2. 极端环境下多菌株的适应性机制 在极端环境下单菌株研究成果基础上，将耐受能力强的多种单菌株混合在一起培养使它们形成高效协同群落。因此，形成的群落在能量物质利用率、环境适应性、氧化效率等方面的表现大幅度提升，进而取得更高的经济效益。 硫氧化微生物与铁氧化微生物的混合培养物对金精矿的氧化效果更好已被证明 [ 41 ]。硫氧化微生物(如A. thiooxidans、A. caldus等)能氧化硫和还原态硫化合物，但不能氧化Fe 2+ [ 42 ]；铁氧化微生物(如L. ferriphilum、Ferroplasma acidiphilum等)则与之相反 [ 43 ]。因此，铁氧化微生物在金精矿上产生的硫膜会阻碍硫化物基体的浸出，而硫氧化微生物可以氧化这层硫膜，从而使硫化物基质更好地被铁氧化微生物氧化释放金。采用A. ferrooxidans和A. thiooxidans处理难处理金精矿时，两菌的混合培养物对金精矿中As的去除率高于纯培养物 [ 13 ]。 自养微生物与异养微生物和/或混合营养微生物的混合培养物也被证明可以强化金精矿生物氧化过程。在含砷金矿的生物氧化系统中，自养微生物产生的有机物可为异养和兼性异养微生物(如Acidibacillus、Thermoplasma和Sulfobacillus)提供能量和碳。这些物种表现出协同效应，如有机碳和无机碳的转移，或铁和硫的转化 [ 44 ]。详细研究了异养菌Rhizobium phaseoli与自养菌A. ferrooxidans在矿物溶解中的协同机制 [ 45 ]。R. phaseoli代谢多糖产生的有机酸能螯合或沉淀有害重金属，减少对A. ferrooxidans的伤害，同时破坏矿物的晶格。 采用Illumina宏基因组测序技术对极端酸性环境中的驯化后菌群进行测序后，对其结果进行物种组成及物种丰度分析可表征群落的生物多样性组成，这有助于重新构建驯化后的微生物群落 [ 46 ]。对群落中优势菌株(A. ferrooxidans)的测序数据进行后续数据库注释、基因丰度统计、功能基因差异分析发现，与重金属运输和压力管理相关的功能基因得到了富集，这很大可能与浸出微生物在逆境中适应和生存有关 [ 46 ]。因此，宏基因组学可用于研究金精矿的生物氧化过程中的微生物多样性、种群结构进化关系、功能活性相互协作关系以及群落与环境之间的关系，从而为改善群落并提高协同效率提供依据 [ 46 ]。 极端环境中多菌株群落的宏转录组数据、生化参数和微生物演替之间的相关性表明共培养群落中的微生物通过其内在的功能特性，早期适应生物浸出环境，后期抵抗有毒环境 [ 47 ]。早期，微生物通过促进细胞增殖来维持生命活动，表现为：参与细胞部分的基因、S. thermosulfidooxidans中涉及结合作用的基因和A. caldus中涉及催化活性的基因表达上调 [ 47 ]。后期，微生物主要抵抗由金属离子、毒素和代谢物积累引起的严重环境胁迫，表现为：L. ferriphilum中与信号转导和应激反应相关的基因、A. caldus中与建立定位相关的基因和S. thermosulfidooxidans中的转运蛋白基因被高度表达 [ 47 ]。因此，共培养系统加深了我们对菌株之间沟通与协调的理解，这将有助于我们利用分解代谢途径的多样性促进协同作用在生物氧化过程中的有效应用 [ 48 ]。 关于极端环境下金精矿生物氧化过程中多菌落协同效应的科学问题，国际研究者在宏基因组、宏转录组和生理学分析已经取得了一些可喜的成果。但是缺少开展新的多酶体系和代谢途径构建的研究，也缺少开展新的酶结构和代谢物鉴定研究。因此，利用新获得的蛋白质组和代谢组的相关信息来提高发酵水平将是国际研究的热点和发展趋势。 综上，探究浸出微生物在极端环境下的响应机制可获得多菌株群落及其优势菌株如何运作以及如何将这些相互作用转化为更高的金精矿生物氧化率的信息。因此，收集到的调控信息可用于添加特定物质和优化生物浸出发酵罐的操作条件，从而使菌株在极端环境中实现高效的转化平衡和合成代谢产物的能力。同时，将计算流体力学(CFD)模型的最新研究成果应用于大型生物反应器中进行高浓度金精矿浆的生物氧化也有助于工业生产。