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user: 3. 结果 3.1. 过表达/沉默MARCH2对卵巢癌细胞自噬水平的影响 3.1.1. MARCH2在自噬体形成早期阶段的作用 我们构建了过表达MARCH2质粒以及MARCH2 shRNA，将MARCH2-MYC、Vector、shMARCH2或shControl转染卵巢癌HO-8910细胞，经过嘌呤霉素以适合的浓度筛选得到过表达/沉默MARCH2的稳定细胞系，并对其有效性进行mRNA及Western blot水平的鉴定(图1)，结果显示MARCH2-MYC能有效增加细胞中MARCH2的mRNA及蛋白水平，并且MARCH2 shRNA能有效敲减细胞中MARCH2的mRNA及蛋白水平，证实我们合成的MARCH2-MYC和shMARCH2有效。 图1. MARCH2-MYC、shMARCH2的鉴定 然后分析对自噬的效应。结果如图2所示，与对照组相比，MARCH2过表达能够减低本底LC3B-II的蛋白水平(图2，lane 2 vs lane 1)。减低的LC3B-II可能源于自噬体生成的减少或降解的增多，为了区分这两种可能性，我们使用了自噬体晚期抑制剂巴弗洛霉素A1 (BafA 1 ，抑制囊泡H + -ATPase，溶酶体酸化受抑，从而阻碍自噬体与溶酶体的融合)。结果显示，经BafA 1 处理(孵育6小时)后，MARCH2过表达细胞和对照细胞中LC3B-II蛋白水平明显高于未处理的细胞，但过表达MARCH2细胞依然低于对照组(图2，lane 4 vs lane 3)。上述结果表明，MARCH2过表达引起的LC3B-II水平减低源于自噬体生成减少，而不是自噬体降解增多。 图2. Western blot检测LC3B-II水平变化(*， p < 0.05; **， p < 0.01) 3.1.2. MARCH2在自噬流(Autophagic Flux)中的作用 上述结果表明，MARCH2过表达减少自噬体形成，那么它对自噬流是否有影响？ 与对照细胞相比，过表达MARCH2细胞会导致内源性自噬底物SQSTM1水平有所升高(图3(a)和图3(b))，预示着自噬水平的减低，表明过表达MARCH2抑制自噬流。 图3. MARCH2过表达抑制自噬流(**， p < 0.01) 重复实验的数据显示，与对照组相比，敲减MARCH2能升高内源性LC3B-II的水平(图4，lane 2 vs lane 1)。升高的LC3B-II可能由于自噬体生成增多，也可能是自噬体降解减少，用BafA 1 处理阻断溶酶体降解后，与对照组相比，MARCH2沉默细胞中内源性LC3B-II的水平进一步升高(图4，lane 4 vs lane 3)，表明MARCH2沉默促进了自噬体的生成，而不是阻断其降解。 图4. Western blot检测LC3B-II水平变化(*， p < 0.05; **， p < 0.01) 为了进一步确定MARCH2对自噬作用的特异性，我们还进行了补救实验。用对照HO-8910细胞(野生型)、shMARCH2HO-8910细胞或转染MARCH2-MYC过表达质粒24小时的shMARCH2HO-8910细胞进行Western blot检测，如图5(a)和图5(b)所示，转入MARCH2-MYC过表达质粒可以逆转沉默MARCH2引起的LC3B-II增多。 与对照组相比，沉默MARCH2细胞中内源性自噬底物SQSTM1 (图6(a)和图6(b))明显减少，表明沉默MARCH2促进自噬流。 3.1.3. 确定MARCH2调控卵巢癌细胞自噬的关键作用点 为了进一步明确MARCH2在自噬过程中作用的节点，我们利用Western blot检测敲减自噬起始阶段将PIK3C3-BECN1复合体重新定位到内质网的关键分子ULK1对于沉默MARCH2诱导自噬的影响，研究发现，敲减ULK1能阻断MARCH2失活导致的LC3B脂化(图7(a)和图7(b)，lane 4 vs lane 2)。上述结果表明ULK1参与了MARCH2调控的细胞自噬。 图5. 外源性MARCH2的表达能够补救MARCH2沉默上调的自噬体形成(**， p < 0.01) 图6. 沉默MARCH2促进自噬流(**， p < 0.01) 图7. ULK1敲减能够抑制沉默MARCH2诱导的自噬(**， p < 0.01; ***， p < 0.001) 此外，我们还检测了BECN1-PIK3C3复合物对于敲减MARCH2诱导自噬的影响。3-MA (3-methylpurine)是PIK3C3的抑制剂，能够抑制PI3P的形成，被广泛用来作为自噬的抑制剂。我们利用Western blot检测3-MA对于沉默MARCH2诱导自噬的影响，结果显示沉默MARCH2能够明显上调LC3B-II的水平(图8(a)和图8(b)，lane 2 vs lane 1)，而3-MA处理减弱沉默MARCH2诱导的LC3B转换(图8(a)和图8(b)，lane 4 vs lane 2)。上述的研究结果证明PIK3C3的活性与沉默MARCH2诱导的自噬相关联。上述结果表明MARCH2缺失介导的自噬作用在ULK1和PIK3C3-BECN1复合物的上游。 图8. 沉默MARCH2诱导的自噬与PIK3C3的活性相关(**， p < 0.01) 3.2. MARCH2调控的卵巢癌细胞自噬与信号通路 调节自噬的信号通路有多个，其中最重要的是MTOR信号通路。为了证实MARCH2缺陷是否通过抑制MTOR通路来启动自噬，我们对MTOR通路进行了检测。数据显示MARCH2缺陷的HO-8910细胞中MTOR (Ser2448)以及其下游的效应分子RPS6KB1激酶(Thr389)的磷酸化水平减低(图9(a))，表明MARCH2失活减弱了MTOR信号。相反地，在MARCH2过表达细胞中RPS6KB1激酶的磷酸化水平升高(图9(b))，表明MARCH2过表达促进MTOR信号通路。 图9. MTOR信号通路参与MARCH2调控的自噬 3.3. MARCH2调控的自噬对卵巢癌细胞生长的影响 3.3.1. 体外实验：Cas9-MARCH2细胞的增殖情况 我们针对MARCH2基因第二外显子设计的CRISPR/Cas9干扰靶序列为 TCCAAGGTCGTGGAGGCTACGGG，通过载体构建、质粒纯化、转染、流式分选、单克隆培养、测序、分析、鉴定得到了敲除MARCH2基因的HO-8910细胞系。然后，我们检测了Cas9-MARCH2HO-8910细胞系的活力，进行了MTS细胞增殖实验，将对照组细胞(野生型细胞)和Cas9-MARCH2HO-8910细胞铺在96孔板(每孔3000个细胞，做5个复孔)，血清饥饿18 h，然后加入10% FCS 24 h，48 h，96 h，144 h。检测结果显示，与对照组相比，Cas9-MARCH2HO-8910细胞的活力减低(图10)。 图10. MTS细胞增殖实验检测Cas9-MARCH2 HO-8910细胞的活力(**， p < 0.01；***， p < 0.001) 3.3.2. 体内实验：动物移植瘤的生长情况 为了证实MARCH2在体内的效应，我们进行了BALB/c裸鼠体内卵巢癌移植瘤的实验。将野生型HO-8910细胞或Cas9-MARCH2 HO-8910细胞注射入BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下。接种第20天后，处死小鼠，剥离出肿瘤、拍照。如图11(a)，Cas9-MARCH2组比对照组的肿瘤体积小，表明沉默MARCH2降低HO-8910细胞的肿瘤形成能力(图11(a))。Western blot结果显示，与对照组相比，Cas9-MARCH2组的肿瘤内源性SQSTM1的水平减低，LC3B-II的水平升高(图11(b))，表明发生了自噬。提示在体内HO-8910细胞中沉默MARCH2诱导的自噬有抗肿瘤的作用。 图11. 敲除MARCH2抑制卵巢癌移植瘤生长 3.4. 临床卵巢癌标本中MARCH2蛋白表达的检测 接下来，我们检测了原发性卵巢癌组织和相邻的非肿瘤组织中MARCH2的表达情况。在非肿瘤组织中，MARCH2呈现阴性表达(图12(a))。相反的，在大多数卵巢癌组织中，MARCH2呈现中度的表达(图12(b))。这些结果进一步提示MARCH2的高表达可能促进卵巢癌的发生发展。 图12. MARCH2在人卵巢癌组织中表达上调(SP， ×200)