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user: 3. 结果和讨论 3.1. 三维微纳CaTiO 3 /TiO 2 纳米管的表征 从图1(a)可以发现TNT阵列管径约为100 nm，管长约为4 mm。MPT表面(b)有10~20 mm大小不一的微孔，且出现大孔嵌小孔的复杂三维结构。阳极氧化后MNT(c)试样表面微孔形貌依然清晰可见，并以微孔为基底生成的纳米管均匀排列，形成了多级尺寸的微纳米结构，试样的比表面积和表面能增加。图2(d)~(f)为多尺度的微纳CaTiO 3 /TiO 2 复合材料的SEM图。在MNCT (1 h)的标的纳米管顶端有少量的立方体颗粒物沉积，通过之后的XRD分析(图2(a))得知此颗粒沉积物CaTiO 3 晶体；MNCT (2 h) (图2(e))可以发现CaTiO 3 晶体颗粒基本覆盖了微孔表面，观察不到纳米管，随着水热时间的延长，MNCT (4 h) (图2(f))微孔表面与MNCT (2 h)一样被CaTiO 3 颗粒覆盖而不见纳米管，并且CaTiO 3 纳米晶体颗粒明显增多，并且晶粒也因继续膨胀而变大。 图1. 各试样的SEM图(a)：TNT；(b)：MPT；(c)：MNT；(d)：MNCT (1 h)；(e)：MNCT (2 h)和(f)：MNCT (4 h) 图2. (a) MNCT (1 h)，MNCT (2 h)和MNCT (4 h)的XRD图和MNCT (2 h)的TEM (b)和高分辨图(c) 图2(a)为MNCT (1 h)，MNCT (2 h)和MNCT (4 h)的XRD图谱。三种试样都出现了Ti、锐钛矿TiO 2 以及CaTiO 3 的衍射峰。随水热时间延长，锐钛矿TiO 2 的峰变弱而CaTiO 3 峰变强，因为经过水热处理TiO 2 逐渐的转变生成了CaTiO 3 削弱了锐钛矿的峰。图2(b)为MNCT (2 h)的TEM图，可以清晰地发现破裂的纳米管，晶体颗粒分布在管内外并且部分聚集。因为在水热反应中TiO 2 转变为CaTiO 3 ，TiO 2 纳米管因为结晶膨胀被破坏，这也是在SEM图中观察不到纳米管的原因。由HRTEM (图2(c))测得晶粒的晶面间距0.265 nm和0.351 nm，分别对应CaTiO 3 (112)晶面和锐钛矿TiO 2 (101)晶面。说明微纳CaTiO 3 /TiO 2 复合材料通过酸腐蚀、阳极氧化水热法已经成功制备。 上述测试结果表明，TiO 2 在Ca(OH) 2 溶液中通过水热反应形成CaTiO 3 晶粒，但是在TiO 2 转化成为CaTiO 3 的过程中，由于晶格参数不匹配，CaTiO 3 晶粒膨胀造成TiO 2 纳米管破坏，破坏的程度随着水热时间而增加，直到原位TiO 2 完全转变成CaTiO 3 层而失去纳米管结构。TiO 2 完全转变成CaTiO 3 层遵循“奥斯瓦尔德熟化”机制，其“溶解–沉淀”的过程如下 [ 12 ] ： 三维微纳CaTiO 3 /TiO 2 复合材料中CaTiO 3 和TiO 2 的比例，也即钙含量可以通过水热时间来调控，并改变其表面形貌和表面化学，从而影响生物学性能。 3.2. 蛋白吸附分析 图3(A)为各试样蛋白吸附2 h后的蛋白吸附量百分比。MNT试样表面比TNTs和MPT表面吸附更多的蛋白质。这是因为微纳结构的表面比单纯的纳米结构和微孔结构具有更大的比表面积，并且含有更丰富的锐钛矿晶体，增加了蛋白吸附的活性位点。水热反应后，含CaTiO 3 的材料表面蛋白吸附能力比MNT 更强，由此可以推测Ca的存在能促进蛋白吸附。MNCT (1 h)纳米管保持较好，但CaTiO 3 含量太低。而MNCT (4 h)表面虽然CaTiO 3 含量较大，但CaTiO 3 晶粒的膨胀转化破坏了纳米管结构，减小了比表面积。MNCT (2 h)既具有较大的比表面积，又有适量CaTiO 3 ，所以MNCT (2 h)具有最高的蛋白吸附量。 图3(B) MNT及MNCT蛋白吸附后的XPS图。通过全谱可以发现MNCT (2 h)表面不仅出现了Ca、Ti、O和C的峰，还出现了N的峰(图3(B) a)，说明蛋白吸附到材料表面 [ 13 ] [ 14 ] 。据相关研究报道 [ 15 ] ，CaTiO 3 中Ca 2p3/2的结合能为347.0 eV，Ca 2p1/2的结合能为350.5 eV，从图3(B) b发现经过蛋白吸附后Ca 2p的结合能分别向低结合能方向偏离了0.6 eV和0.7 eV，变为346.4 eV和349.8 eV。这表明蛋白吸附后改变了Ca的化学状态，可以推测出Ca对蛋白具有亲和性，并发生了化学反应。图3(B) c和d分别为MNT和MNCT (2 h)的N 1s高分辨率谱，c图显示MNT仅在结合能399.8 eV处有峰，此峰为蛋白质中氨基的峰。而MNCT (2 h)的N 1s除了399.8 eV以外，在396.4 eV还出现了一个亚峰，由此说明MNCT (2 h)表面的蛋白存在另外一种化学态。蛋白吸附的过程极其复杂，仅此难以判断结合能为396.4 eV来自于N的何种化学态，可能与CaTiO 3 表面吸附的蛋白构型和含氮基团的价键变化相关。通过以上分析得知蛋白质在三维微纳CaTiO 3 /TiO 2 表面表现出化学吸附特性。 3.3. 成骨细胞评价 图4(a)为3天和7天时细胞在各试样表面的增殖情况，(b)为14天细胞在各试样表面的ALP活性测试结果。在不同的时间点，试样表面细胞增殖情况呈现MNCT (2 h) > MNCT (1 h) ≈ MNCT (4 h) > MNT > TNTs > MPT的变化规律。ALP呈现MNCT (2 h) > MNT ≈ MNCT (1 h) > MNCT (4 h) > TNTs > MPT的变化规律，提示MNCT (2 h)最有利于成骨细胞增殖和成骨分化。 图3. (A) 各样蛋白吸附量百分比和(B) MNT及MNCT蛋白吸附后的XPS图((a)：MNCT (2 h)全谱，(b)：MNCT Ca 2p高分辨谱，(c和d)：MNT和MNCT (2 h) N 1s高分辨谱) 图4. (a) 3天和7天细胞增殖情况和(b) 14天细胞的ALP活性 图5. (a) TN，MPT和MN以及(b) MNCT (1 h)，MNCT (2 h)和MNCT (4 h)上成骨细胞培养3天和7天的SEM图 图5(a)和图5(b)为各试样表面成骨细胞培养3天和7天的SEM图。从(a)中可以观察到无论是在3天或是7天，与MPT和TNT表面的细胞相比，MNT表面的成骨细胞有更多的伪足伸展，细胞铺展成星状，并且细胞形态良好，丝状伪足沿着孔内壁或是沿着孔的边缘伸展。这是因为MNT的微纳表面能够提供三维构型和更大的比表面积，可以有效促进细胞的粘附和增值，具有较好的生物活性。MNCT(1h)试样表面的细胞形貌(b)与MNT (a)的细胞形态相似。MNCT (4 h)细胞虽有伪足伸展，但细胞形态和铺展仍较差。MNCT (2 h)试样表面细胞呈多伪足交叉的现象，并且细胞与细胞沿孔相互桥联，显示出最好的铺展与生长行为。 水热反应后，材料表面被CaTiO 3 所覆盖。由于有大量的Ca 2+ 成为表面正电荷活性位，成骨细胞外基质中某些配体蛋白例如纤维连接蛋白(FN)和玻连蛋白(VN)趋向于正电性的材料表面 [ 16 ] ，与钛表面发生作用，形成强的结合，促进成骨细胞在表面粘附以及增值。另外，除了材料的表面成分，影响细胞粘附和增值的因素还有材料的表面形貌。随着水热时间的增加，TiO 2 转变为CaTiO 3 ，而CaTiO 3 晶粒的膨胀会造成纳米管逐渐被破坏，材料的比表面积减小，表面能降低，蛋白吸附量相应减少。因此，钛表面具有适宜的微纳多孔结构和适量CaTiO 3 成分，如MNCT (2 h)，能有效地促进细胞黏附、增殖与生长，展现出优异的生物学性能。