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user: 3. 结果与分析 3.1. 甘油脱氢酶底物谱分析 通过Brenda数据库搜索获得甘油脱氢酶的底物谱。甘油脱氢酶的底物谱较为宽泛，其中部分底物列出如表1所示 [ 12 ] 。除了天然底物甘油外，还包括文献报道的多种短链多羟基醇、氨基醇等。我们选取与天然底物甘油结构相近，具较高工业应用价值的重要手性医药中间体，含氨基、羟基双功能基团的手性对映体R-1-氨基-2-丙醇(R-1-amino-2-propanol)和S-1-氨基-2-丙醇(S-1-amino-2-propanol)作为模型底物对接配体 [ 13 ] 探寻甘油脱氢酶的催化多功能性。 3.2. 甘油脱氢酶与底物的对接 分子对接是依据底物与酶作用的“锁-钥原理”模拟配体小分子与受体生物大分子的非共价相互作用的计算机模拟技术。分子对接程序Autodock可以预测小分子与已知蛋白的结合，广泛应用于药物筛选和酶的底物谱研究。AutoDock采用半柔性对接方法(允许小分子构像发生变化)以结合自由能评价对接结果。用于能量优化的拉马克遗传算法(LAG)是遗传算法与局部搜索方法的结合(以遗传算法迅速搜索势能面，用局部搜索方法对势能面进行精细的优化) [ 14 ] 。 用Autodock 4.0对甘油脱氢酶和R-1-氨基-2-丙醇对接结果进行分析，共运行100次，得到100个对接结果。由于结合能量越低，小分子与酶的状态越稳定，在真实情况中发生的可能性也越高。选取前十 Table 1 Substrates specificity of glycerol dehydrogenase (section) [12 Substrate Commentary substrate Substrate Commentary substrate (2R，3R)-2，3-butanediol Better substrate than glycerol Diglycerol Relative activity is 21% compared to oxidation of glycerol (R)-1，2-propanediol Better substrate than glycerol Ethanol Relative activity is 1% compared to oxidation of glycerol 1，2-propanediol 105% of the activity with glycerol Ethylene glycol - 1，3-butanediol Relative activity is 6.5% compared to oxidation of glycerol Glycerol-alpha- monochlorohydrin Relative rate of oxidation is 71% compared to oxidation of glycerol 1，3-propanediol Relative rate of oxidation is 18% compared to oxidation of glycerol Hydroxy-2-propanone Relative activity is 27% compared to oxidation of glycerol 1，4-butanediol Relative activity 17% compared to oxidation of glycerol i-inositol Relative activity is 18% compared to oxidation of glycerol 3-amino-1，2-propanediol 104% of the activity with glycerol Isopropanol Relative activity is 17% compared to oxidation of glycerol 3-bromo-1，2-propanediol 109% of the activity with glycerol Methylglyoxal Relative rate of reduction is 56% compared to reduction of dihydroxyacetone 3-chloro-1，2-propanediol 130% of the activity with glycerol R-1-amino-2-propanol 33% of the activity with glycerol 3-mercapto-1，2-propanediol 155% of the activity with glycerol S-1-amino-2-propanol 9% of the activity with glycerol beta-glycerophosphate Relative activity is 2% compared to oxidation of glycerol Sorbitol Relative activity is 3% compared to oxidation of glycerol 表1. 甘油脱氢酶(EC1.1.1.6)的底物谱(部分) [ 12 ] 个能量最低的结果进行分析发现参与形成氢键的氨基酸残基集中在ASP123，THR177，SER243，GLU180上。从出现频率分析，ASP123最多，其次是THR177和SER243，可知ASP123，THR177，SER243是参与形成氢键的主要残基。其位置如图1中标注所示。 利用同样的方法对甘油脱氢酶和R-1-氨基-2-丙醇对接结果进行分析。甘油脱氢酶与S-1-氨基-2-丙醇结合，形成氢键的蛋白质残基主要集中在GLU180，ASP123，SER243上，THR177，SER121，ASP173，THR122等残基也有参与氢键的形成(图2)。相比R-1-氨基-2-丙醇的对接结果，参与氢键形成的残基增加了SER121和THR122。并且上述残基出现的频率也与R-1-氨基-2-丙醇的不同。其中ASP123依然是最多的，其次是SER243和GLU180。由图1和图2可知，SER243，ASP123，THR122，SER121和THR177，GLU180，ASP173分居活性反应部位裂缝两侧，形成口袋状包裹态，锌离子位于中心部位。 3.3. 结合自由能计算 图3为R-1-氨基-2-丙醇与甘油脱氢酶活性中心在对接过程中出现概率较高的常见结合构型，结合能为−5.11 kcal/mol，共有三个氢键形成。R-1-氨基-2-丙醇的羟基与甘油脱氢酶的ASP123形成一个氢键，氨基分别与甘油脱氢酶的ASP123和另一个残基SER243或THR177各形成一个氢键。 图4为S-1-氨基-2-丙醇与甘油脱氢酶结合出现概率较高的常见结合构型图。结合能量为−5.01 kcal/mol，共共有两个氢键，有一个是配体上羟基的H9原子与GLU180形成的氢键，一个是配体氨基上氢原子H7与ASP123形成的氢键。由图3，图4可知，甘油脱氢酶的活性中心更容易与R-1-氨基-2-丙醇结合。酶对手性底物的选择性由酶活性中心的口袋形状决定，根据底物的与活性中心部位的契合程度和形成的氢键数目，可以推测酶对底物的催化活性。 3.4. R-1-氨基-2-丙醇、S-1-氨基-2-丙醇的对接结果分析对比 对R-1-氨基-2-丙醇与S-1-氨基-2-丙醇这一对手性对映体与甘油脱氢酶的对接结果进行比较(表2)。 图1. 甘油脱氢酶与R-1-氨基-2-丙醇的结合示意图 图2. 甘油脱氢酶与S-1-氨基-2-丙醇的结合示意图 图3. R-1-氨基-2-丙醇与甘油脱氢酶活性中心的结合模式 图4. S-1-氨基-2-丙醇与甘油脱氢酶活性中心的结合模式 Table 2 Comparison of docking results of R-1-amino-2-propanol and S-1-amino-2-propano 底物 R-1-氨基-2-丙醇 S-1-氨基-2-丙醇 最低结合能量(kcal/mol) −5.22 −5.19 最高结合能量(kcal/mol) −4.33 −4.08 参与氢键形成的原子 H7， H8， H9 H7， H8， H9， O 参与形成氢键的残基及其出现频率 ASP123 > THR177 > SER243 > GLU180 > ASP173 ASP123 > SER243 > GLU180 > SER121 > THR177 > ASP173 > THR122 出现频率小于五次的残基 GLU180， ASP173 SER121， THR177， ASP173， THR122 表2. R-1-氨基-2-丙醇与S-1-氨基-2-丙醇对接结果比较 分子对接同时考虑了分子间的几何构型和能量的匹配与识别能力。手性对映体由于其几何构型不同，与酶结合时匹配性质和结合能力存在差异，从而使对接结果中的结合能有一定的差异。R-1-氨基-2-丙醇的最低结合能量比S-1-氨基-2-丙醇的低，在一定程度上验证了文献 [ 13 ] 关于甘油脱氢酶对R-1-氨基-2-丙醇的催化活性高于S-1-氨基-2-丙醇的实验结果。 通过比较底物和酶的最高结合能量和最低结合能量可知，R-1-氨基-2-丙醇与酶的最高结合能和最低结合能均低于S-1-氨基-2-丙醇，说明前者更容易与甘油脱氢酶结合。甘油脱氢酶与R-1-氨基-2-丙醇结合比S-1-氨基-2-丙醇结合紧密。酶活性部位的关键氨基酸残基对酶的手性立体选择性有重要作用。甘油脱氢酶与底物结合的关键氨基酸残基位点，包括ASP123，THR177，SER243和GLU180，主要作用在于与底物结合时形成氢键。这可能就是甘油脱氢酶优先选择催化R-1-氨基-2-丙醇的原因。