DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 4. 验案举隅 李某，男，52岁。初诊日期：2018年5月13日。 主诉：反酸嗳气间作3年余，加重伴胃脘不适半年。 病史：患者于3年前无明显诱因下出现反酸、嗳气，曾于2016年12月在当地医院就诊。查胃镜示：反流性食管炎(B)级，慢性浅表性胃炎，HP(-)。予雷贝拉唑10 mg，日服2次，后感症状稍减轻，但易反复发作，稍有饮食不慎或情绪不佳则反酸加重。后转诊于其他医院，服用艾斯奥美拉唑、兰索拉唑等约3月余，疗效欠佳。近半年来，患者感嗳气反酸发作较前频繁，伴胃脘部憋闷不适感，情绪波动较大，常悲伤欲哭，好操劳焦虑。现诊：反酸，嗳气，胃部有憋闷感，两胁肋部偶有刺痛感，每于情志欠佳时加重，纳食欠佳，稍食则胀，入睡困难，大便时稀，舌质偏淡，舌下少许瘀点，苔薄，脉弦。 西医诊断：难治性胃食管反流病。中医诊断：吐酸病。辩证：肝郁气滞型。治则：疏肝和胃理气。处方：柴胡8 g、炒白芍10 g、香附10 g、炒枳壳10 g、陈皮6 g、炒白术10 g、茯苓10 g、川芎10 g、当归10 g、钩藤10 g、海螵蛸20 g、合欢皮10 g、酸枣仁10 g、鸡内金10 g、麦芽10 g。14剂，400 mL水煎服，每日1剂，早晚2次饭后温服。并嘱患者忌辛辣生冷，勿贪凉，忌多思多虑，适当运动，放松心情。 二诊(5月27日)：患者感反酸较前减轻，饭后嗳气仍作，胃部憋闷症状及两胁肋刺痛感较前明显好转，进食较前增多，睡眠困难尚未缓解，舌质淡红，苔薄，脉弦。上方柴胡减量为6 g，加旋复花10 g、浙贝母10 g，酸枣仁加量至20 g。14剂。 复诊(6月10日)：患者感嗳气反酸较前明显减轻，偶在进食后发作，睡眠改善，余无特殊不适。上方去鸡内金、麦芽、酸枣仁、合欢皮。14剂。续服上方巩固半年。后电话随访1年，每月1次，询问患者大致病情、生活饮食习惯及心理状态，患者表示偶有饱食后反酸，嗳气、胃胀等症状皆平，睡眠质量尚可，饮食清淡，常有饭后散步、跳广场舞等活动，情绪大为改善。 按：患者反酸嗳气3年余，服标准量PPI制剂超过8周，且症状未明显缓解，可诊断为难治性胃食管反流病。患者反酸嗳气，胃脘部憋闷，每随情志波动而加重，又长期治疗未效，每受其苦，反加重焦虑抑郁。以上症状，结合其舌脉，舌淡，舌下少许瘀点，苔薄，脉弦，辩证为肝郁气滞证。《四明心法·吞酸》曰：“凡为吞酸尽属肝木，曲直作酸也。”且肝之疏泄影响脾胃之运化。脾胃居中焦，是气机升降之枢纽，胃气不降，故持续性的胃酸增多，脾气不升，故时常腹泻，故此患者用疏肝和胃法。根据郑师多年经验，以抑肝散合柴胡疏肝散加减。方中柴胡疏肝解郁，香附、枳壳、陈皮理气行滞，与柴胡升降相和，以升清降浊；患者久病致瘀，故予血中气药的川芎，与当归相配伍，活血而不留瘀滞；白芍、甘草酸甘化阴，养血柔肝，缓急止痛；钩藤清热平肝，泄肝内相火；茯苓、白术健脾和胃，使脾胃气血生化有源，又能防木病及土而生痰湿；海螵蛸有制酸止痛之效，合欢皮、酸枣仁安神定志，鸡内金、麦芽消食化积。诸药相和，共奏疏肝和胃理气之效。二诊中，柴胡升散劫肝阴，患者舌苔已转淡红，应及时减量避免伤及阴分；反酸虽减轻，嗳气仍作，故予旋复花降逆止呃，浙贝母、海螵蛸合用有乌贝散之意，增强制酸之功；酸枣仁加量以安神。三诊时，患者饮食睡眠改善，故停鸡内金等。诊治过程中，郑师强调一定要适应患者病情变化调整用药，灵活化裁治疗，方能获得良效。
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user: 5. 小结 难治性胃食管反流病目前西医仍以药物治疗为主，缠绵难愈，反复发作，中医药治疗有其独有的优势。吾师结合多年来临床经验，主张从“肝胃”入手，辨寒热，探虚实，或有兼痰瘀或食积者，辨证施治，在中医药的基础上配合科学的生活饮食及情绪调节，可大大提高患者生活质量，减少痛楚。
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user: 摘 要 为探讨农村青少年负性生活事件与抑郁的关系，并在此基础上提出一个有调节的中介模型，考察孤独感的中介作用和同伴支持的调节作用。采用问卷法对348名农村青少年(M = 14， SD = 1.21)进行调查。结果表明：1) 负性生活事件对抑郁有显著的正向预测作用；2) 负性生活事件通过孤独感的中介作用间接影响抑郁；3) 该间接效应受到同伴支持的调节。相对于同伴支持水平高的青少年，间接效应对于同伴支持水平低的青少年更显著。研究结果有助于揭示负性生活事件“如何”及“何时”影响青少年抑郁，对农村青少年抑郁的干预和身心健康发展有一定启示意义。 关键词 :抑郁，负性生活事件，孤独感，同伴支持，农村青少年 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 青少年需要经历生理、心理等诸多方面的压力与挑战，极易产生焦虑、抑郁等心理健康问题。值得关注的是，正处于社会转型期的农村青少年，由于受到农村经济相对落后、生活条件较差、教育资源相对不足等因素的影响，其健康成长面临着诸多困境和挑战(金洁，2006；刘万里，2006)。但是，有关农村青少年心理健康的研究却极为有限。针对当前现状，本研究旨在探讨农村青少年所经历的负性生活事件与抑郁之间的关系，并考察孤独感和同伴支持在其中的作用机制。 1.1. 农村青少年负性生活事件与抑郁的关系 研究表明，负性生活事件和心理健康之间存在高相关，个体经历的负性事件是导致心理健康问题出现的风险因子，例如心理压力、焦虑、抑郁、低生活满意度和幸福感(Franko et al.， 2004; Marum， Clench-Aas， Nes， & Raanaas， 2014; Peng et al.， 2012; Sanchez et al.， 2012)。Flouri和Panourgia (2011)针对英国农村三个初级中学青少年的调查发现，负性生活事件对情感行为问题有正向预测作用，青少年经历越多的负性生活事件，多动、情绪症状、行为问题、同伴交往问题出现的可能性越大。Lewis，Byrd和Ollendick (2012)也发现，负性生活事件与非裔美国青少年的焦虑症状密切相关。Johnson，Whisman，Corley，Hewitt和Rhee (2012)在纵向研究中用潜在增长模型评估个体内的改变和个体间的差异，发现从儿童晚期到青少年，越多的负性生活事件，伴随越高的抑郁发展迹象。因此，本研究假设，农村青少年经历的负性生活事件对抑郁存在正向的预测作用。 1.2. 孤独感的中介作用 De Jong-Gierveld (1987)把孤独感界定为一种主观上的社交孤立状态，伴有个人知觉到的自己与他人隔离或缺乏接触而产生的不被接纳的痛苦体验，长期的孤独会对其自身的血压和免疫力产生不良影响，导致孤独患者的健康恶化。在农村青少年这一群体当中，有相当一部分是留守儿童，即父母外出务工连续三个月以上，由父母单方或其他亲属监护接受义务教育的适龄儿童少年。与同龄城市学生相比，农村青少年，尤其是留守儿童，一方面存在物质生活相对匮乏，文化生活相对欠缺，教育条件相对不足等问题，更为主要的是缺乏来自于父母的关心与支持，孤独感受更为强烈。以往研究表明，留守儿童的孤独感显著高于非留守儿童，留守儿童普遍表现出对外出父母的强烈思念和内心孤独(叶敬忠，莫瑞，2005)。刘正奎等人的研究表明，农村留守儿童更容易感到孤独寂寞(刘正奎等，2007)。留守所导致的亲子分离现象对儿童行为适应及情绪发展存在不利影响(凌辉等，2012)。孤独感会给造成儿童相当大的痛苦，尤其在青少年时期，这种孤独体验与抑郁和被遗弃感相联系，使儿童找不到社会归属感，并导致自尊下降(周宗奎等，2003)。 已有的大量研究表明，孤独感强烈的人群与非孤独的人群相比有更高的患病率和死亡率(Caspi et al.， 2006; Luo et al.， 2012; Perissinotto et al.， 2012; Thurston & Kubzansky， 2009)。Luo等人(2012)的纵向研究发现，孤独感可以预测6年间死亡率的变化。孤独和抑郁的表现常常是相伴相生的，相关系数约为0.4~0.65，其因果关系尚无定论(Cacioppo et al.， 2006)。研究表明，在控制人口统计学信息(包括性别、年龄、经济收入、婚姻状况等)和共同影响孤独和抑郁的风险因素(包括敌对性，社会支持，压力感受性等)之后，孤独感仍然和抑郁症状显著相关(Cacioppo et al.， 2006)。这表明孤独是引发抑郁情绪的一个独立的风险因子。值得一提的是，近年来有一项连续5年的纵向研究发现，孤独感可以预测每个一年间隔的抑郁症状的增加，而在相同时间内抑郁症状不能预测孤独感的增加(Cacioppo et al.， 2010)。 1.3. 同伴支持的调节作用 对于农村青少年而言，同伴支持是社会支持的一个重要组成部分。社会支持对青少年抑郁的发生起着关键作用，良好的社会支持既可对应激状态下的个体提供保护作用，又能维持个体良好的情绪体验网(Bergeron et al.， 2007)。青少年抑郁与低家庭支持(Marcotte et al.， 2002)和同伴支持均存在相关(Klein et al.， 1997)。社会支持能够调节孤独感对青少年抑郁的影响(凌宇等，2009)。有研究指出，拥有社会支持较多的个体和与家庭成员及朋友关系更为亲密的个体，较少产生抑郁体验(Peirce et al.， 2000)。关注社会支持、应激事件与抑郁的研究者提出两种模型来解释他们之间的相关。第一种模型被称为应激–缓冲模型，强调社会支持与应激事件之间的交互作用，认为社会支持能够有效缓冲应激事件对个体心理状态的影响，对遭受应激事件的个体起到保护性作用(Huang et al.， 2009；郭学东等，2006)。第二种模型为主效应模型，强调社会支持对个体抑郁的独立预测，即无论个体有没有遭遇应激事件，社会支持都能有效预测个体心理疾病的发生(Dubois et al.， 1994)。以青少年为对象的一系列研究对两种模型进行了验证，但并没有达成一致结论。 综上，本研究拟考察负性生活事件影响农村青少年抑郁的中介(负性生活事件怎样起作用)和调节机制(负性生活事件何时起作用)，探讨孤独感在其中的中介作用以及同伴支持对中介链条的调节作用，以期为农村青少年抑郁的预防和干预提供实证支持和理论指导。
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user: 2. 方法 2.1. 被试 本研究的被试选取自贵州省农村地区的一所中学，采用分层整群抽样的方法选取被试，以班级形式团体施测。经学校领导和青少年本人知情同意，共有380名学生参与调查，由于部分数据丢失，有效被试数为348人，问卷的有效回答率为91.58%。其中，男生为52.30%，女生为47.70%。初一为29.6%，初二为21.6%，初三为48.9%。被试平均年龄为14岁(SD = 1.206，全距为12~16)。留守儿童占56.78%，非留守儿童占43.22%。 2.2. 工具 2.2.1. 负性生活事件量表 采用《青少年生活事件量表》 (刘贤臣等，1997)对负性生活事件进行调查。要求被试对每个题项中所描述的事件对自己的影响程度进行评估，选项为5点量表，1~5表示“没有影响”到“影响极大”。题项如“学习负担重”，“远离家人”等。问卷得分越高，预示着更多的生活担心，得分越低则意味着更少的生活担心。本研究中，量表的α系数为0.87。 2.2.2. 同伴支持量表 本研究使用的同伴支持量表是陈妮娅对肖水源于1986年设计并于1990年加以修订的《社会支持评定量表》的改编版(陈妮娅，2007)，由于研究目的在于探究与同伴之间的相处状况，因此其将涉及与其他人群交往的题项删除，如“近年来与邻居相处如何”；将一些题目在表述上进行调整，调整后的题项如“如果您遇到急难情况，您从您同学或朋友那里得到经济支持和解决实际问题的帮助”、“如果您遇到急难情况，您从您同学或朋友那里得到的安慰和关心”，对应地将备选答案改为“无”、“极少”、“一般”、“全力支持”的四级评分形式。得分越高，意味着被试获得越多的同伴支持。在原研究中，量表的内部一致性系数为0.82。本研究中此量表的α系数为0.80。 2.2.3. 孤独感量表 孤独感量表由李晓巍，邹泓和刘艳(2014)在Asher编制的《儿童孤独量表》的基础上修订而成。修订后的量表共21个项目，采用李克特5级评分法，1~5表示“完全不符合”到“完全符合”。题项如“周围虽然有许多同学，但他们并不关心我”，“我常感到没有人值得信赖”。该量表被广泛应用于青少年孤独感的测量，具有良好的信效度(李若璇等，2019；陈云祥等，2019)。本研究中此量表的α系数为0.88，符合心理测量学的要求。 2.2.4. 抑郁量表 儿童抑郁量表(CDS)由Fendrich，Weissman和Warner (1990)根据流行病学研究中心的儿童抑郁量表(CES-DC)编制而成，用于测量6~23岁被试的量表。该量表共有20个题目，涉及到抑郁的6个主要症状，包括抑郁心境、感到内疚/没有价值感、无助感、精神活动迟滞、没有食欲和睡眠困扰。题项如“我觉得情绪低落不开心”、“我觉得太累不想做事情”。量表采用4级计分，从0“没有”到3“总是”，测量被试在过去的一周内感知到的抑郁症状，原量表克伦巴赫α系数为0.89，本研究中抑郁量表的α系数为0.87。 2.2.5. 控制变量 本研究的控制变量包括性别和年龄。 2.3. 数据分析 数据使用SPSS 22.0和SPSS宏程序PROCESS (Hayes， 2013)来整理和分析数据。该SPSS宏程序可以基于偏差校正百分位的Bootstrap法对多种有中介的调节以及有调节的中介模型进行验证，许多学者都使用过该程序检验中介效应前半段或是后半段是否受到调节(Chardon et al.， 2016; Nyadzayo & Khajehzadeh， 2016)。通过抽取1000个Bootstrap样本(每个样本容量均为251人)，获取参数估计的稳健标准误和Bootstrap 置信区间，若置信区间不包含0，则表示结果有统计显著性(Erceg-Hurn & Mirosevich， 2008)。
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user: 3. 结果 3.1. 各变量的平均数、标准差及相关矩阵 表1列出了各变量的平均数、标准差和相关矩阵。 首先，农村青少年抑郁平均分为21.52，将农村青少年抑郁得分与流调中心11~18岁年龄组常模抑郁得分进行单样本T检验，前者显著高于后者(t = 10.21， p < 0.001)；女生抑郁水平高于男生(t = −2.147， p < 0.05)，这与常模相一致。其次，农村青少年在各变量上存在人口学差异，具体而言，生活事件存在年级差异(F = 11.658， p < 0.01)，高年级学生经历的负性生活事件高于低年级；留守儿童与非留守儿童的孤独感存在差异(t = −2.006， p < 0.05)，留守儿童的孤独感显著高于非留守儿童；同伴支持存在性别和年级差异(t = −2.020， p < 0.05; F = 4.500， p < 0.05)，女生的同伴支持高于男生，初三学生的同伴支持水平低于低年级学生。此外，相关分析表明，负性生活事件与孤独感和抑郁呈显著正相关，说明农村青少年经历的负性生活事件水平越高，他们的孤独感和抑郁水平越高；孤独感与抑郁呈显著正相关；同伴支持与负性生活事件、孤独感和抑郁呈显著负相关。 Table 1 Mean， standard deviation and correlation coefficient of each variabl 平均数 标准差 1 2 3 4 5 6 7 8 1.年龄 14 1.21 1 2.性别 1.48 0.50 −0.099 1 3.年级 8.19 0.87 0.848 ** −0.093 1 4.父母外出务工情况 1.58 0.51 −0.025 0.013 −0.026 1 5.负性生活事件 20.20 10.77 0.184 ** −0.026 0.247 ** −0.025 1 6.孤独感 61.19 13.37 0.030 0.104 0.077 0.127 * 0.168 ** 1 7.同伴支持 22.21 4.10 −0.084 0.108 * −0.139 ** −0.049 −0.187 ** −0.384 ** 1 8.抑郁 21.52 10.53 0.75 0.113 * 0.115 * 0.070 0.306 ** 0.521 ** −0.203 ** 1 表1. 各变量的平均数、标准差和相关系数 注：N = 348；性别为虚拟变量，男生 = 1，女生 = 2； * p < 0.05， ** p < 0.01。 3.2. 农村青少年负性生活事件与抑郁的关系：有调节的中介模型的检验 检验孤独感在负性生活事件与抑郁之间的中介作用后半段是否受到同伴支持的调节，结果见表2：负性生活事件显著正向预测孤独感(β = 0.17， p < 0.01)；孤独感显著正向预测抑郁(β = 0.48， p < 0.01)，负性生活事件显著正向预测抑郁(β = 0.22， p < 0.01)，孤独感与同伴支持的交互项对抑郁有负向预测作用(β = −0.11， p < 0.01)。 Table 2 Moderated mediation tes 预测变量 抑郁 孤独感 β t 95% CI β t 95% CI 年龄 0.02 0.65 [−0.05， 0.10] 0.01 0.19 [−0.08， 0.10] 性别 0.15 1.68 [−0.03， 0.33] 0.22 2.11 [0.01， 0.43] 负性生活事件 0.22 4.77 ** [0.13， 0.31] 0.17 3.14 ** [0.06， 0.27] 孤独感 0.48 9.92 ** [0.39， 0.58] 同伴支持 0.01 0.24 [−0.09， 0.11] 孤独感 × 同伴支持 −0.11 −2.79 ** [−0.18， −0.32] R2 0.34 0.41 F 29.13 4.83 表2. 有调节的中介效应检验 * p < 0.05， ** p < 0.01。 在同伴支持得分为平均数减一个标准差、平均数以及平均数加一个标准差三个水平时，孤独感在负性生活事件与抑郁之间的中介效应值及其95% Bootstrap置信区间见表3。 Table 3 Moderating effects of different levels of peer support on negative life events and depressio Effect Boot SE 95% CI M = −1 0.09 0.04 [0.04， 0.18] M = 0 0.08 ** 0.03 [0.03， 0.15] M = +1 0.06 0.03 [0.01， 0.14] 表3. 同伴支持的不同水平对负性生活事件和抑郁的调节作用 为了更清楚地解释孤独感与同伴支持对抑郁的交互效应的实质，将同伴支持按照正负一个标准差分成高、低组，采用简单斜率检验考察在不同同伴支持水平上孤独感对抑郁的影响，相应的简单效应分析见图1。结果表明，同伴支持水平较低时，孤独感对于抑郁的正向预测作用显著(β simple = 0.74， t = 8.54， p < 0.001)；当同伴支持水平较高时，孤独感对于抑郁的正向预测作用减弱(β simple = 0.34， t =2.7， p < 0.01)。 图1. 同伴支持对孤独感和抑郁的交互作用
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user: 4. 讨论 本研究构建了一个有调节的中介模型，考察孤独感在青少年负性生活事件与抑郁之间的中介作用及这种作用是否受到同伴支持的调节。研究发现有助于回答负性生活事件通过什么(怎样起作用)和在什么条件下(何时起作用)影响抑郁两大关键问题。研究结果对未来本领域研究和抑郁的预防干预具有一定理论和现实意义。 4.1. 孤独感的中介作用 本研究发现，农村青少年抑郁水平显著高于同龄青少年，这与以往的研究结果相一致(吉园依等，2017；周爱华等，2016)。孤独感在负性生活事件与抑郁之间起到中介作用。该结果说明，孤独感相对于负性生活事件，是农村青少年抑郁的近端因素。负性生活事件水平高的青少年孤独感更强，从而导致抑郁。原因可能为青春期是个体身心发展的一个关键时期，同时又是一个半幼稚、半成熟的时期，是独立性和依赖性相互矛盾的时期，其心理健康的发展势必关系到中学生价值观的形成、人格的完善。而对于青少年来说，孤独感是个体在与其主要的交往群体(家庭、同伴等)交往的过程中，情感需要得不到满足而产生的孤单、寂寞、失落、疏远和苦恼的主观情绪体验，是一种消极的、弥漫性的心理状态。对于农村青少年特别是留守儿童而言，需要独自面对生活中的许多困难，这一方面提高了青少年独立自主解决问题的能力，培养他们的独立性；但另一方面，当他们在遇到挫折，体验到消极情绪时，父母无法给予他们关心与帮助，或者由于父母文化水平、学校老师的关注不足而导致他们的孤独感增加。在本研究中，孤独感是抑郁的一个重要的风险因素，这一结果与以往的研究相一致(Cacioppo et al.， 2006; Cacioppo et al.， 2010)。总之，该结果说明，各变量之间是相互联系的，青少年负性生活事件的增加可能会导致多重不良后果，负性生活事件与抑郁之间除了直接效应以外，孤独感在其中还起到中介桥梁的作用。 4.2. 同伴支持的调节作用 本研究考察了同伴支持对孤独感在负性生活事件和抑郁的中介作用中的调节效应，发现该调节作用发生在负性生活事件和抑郁的中介作用的后半段，即孤独感与抑郁之间，在负性生活事件与孤独感之间的调节效应不显著。相对于同伴支持水平高的青少年，间接效应对于同伴支持水平低的青少年更显著。该结果支持以往研究结果的观点，即社会支持能够调节孤独感对青少年抑郁的影响(凌宇等，2009)，同伴支持作为青少年的一个重要的保护性因素在以往的众多研究中得到证实(Huang et al.， 2009；郭学东等，2006)。在本研究中，同伴支持调节作用显著的原因可能因为一方面，在农村青少年这一群体当中，有相当大的一部分是留守儿童，本研究中，留守儿童所占比例超过半数，父母双方或单方外出务工，亲子之间缺乏交流，父母无法提供有效的帮助与支持。另一方面，自2001年以来，国家为优化乡镇资源配置，大量撤销农村原有的中小学校，将学生集中到部分乡镇学校，为了解决这些农村学生上学路途遥远的问题，实行住宿制，但与此同时，学校的设施与管理并没有相应的提高，老师往往身兼多职，无法提供给每一个孩子，特别是正处于心理困扰的青少年相应的关注。鉴于主客观方面的原因，同伴便成了农村青少年生活中重要的组成部分之一。在青少年遭遇生活事件的打击，体验到孤独感的时候，同伴能够给予他们安慰，提供解决问题的办法，甚至于挺身而出，这会大大降低青少年罹患抑郁等心理问题的可能性。另外，在负性生活事件和孤独感之间，同伴支持的调节作用不显著，这说明负性生活事件的发生会给青少年带来一定的影响，其负面作用是客观存在的(Lasgaard et al.， 2016; Hensley et al.， 2012)。 有调节中介作用结果对于农村青少年家长和学校具有一定的启示：首先，负性生活事件会对青少年造成消极影响，应尽量避免负性生活事件发生的可能性。外出工作的家长应和孩子保持联系，或者经常回家看望，了解孩子在学习生活中遇到的种种问题，与监护人和老师进行沟通；学校应完善教学管理体制，加强教师对于心理健康的认识，对青少年的学习情况、身心健康给予全方位的关注。其次，及时与经历负性生活事件的青少年进行沟通，必要时进行心理辅导，减少其孤独感和其他的不良情绪，防止负面情绪累积恶化，从而诱发抑郁等严重的心理问题。最后，同伴在青少年的成长过程中起到关键性的作用，同伴支持能够有效减少心理问题出现的可能性，应引导青少年建立健康的同伴关系，学会正确处理与同伴之间的矛盾和问题。
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user: 5. 结论 本研究得出以下结论：1) 负性生活事件与孤独感和抑郁呈显著正相关，孤独感与抑郁呈显著正相关，同伴支持与负性生活事件、孤独感和抑郁呈显著负相关。2) 在控制了性别、年龄后，负性生活事件对抑郁具有直接预测作用，同时通过孤独感的中介作用间接影响抑郁。3) 中介作用受同伴支持的调节。相对于同伴支持水平高的青少年，间接效应对于同伴支持水平低的青少年更显著。因此，负性生活事件与抑郁之间既有间接效应，又存在调节效应。
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user: 摘 要 秽语是指粗俗、禁忌的语言，一般在侮辱他人、强调观点等时候出现。实验结果表明，作为疼痛的一种情绪反应，秽语能够缓解生理疼痛，在冷水中重复秽语的被试疼痛忍耐度更高、疼痛感知更低，心率的变化表明某种情绪反应被引发从而使疼痛得到减轻；基于疼痛重叠理论，研究发现秽语也能够缓解由社会排斥带来的社会疼痛及生理疼痛敏感，秽语频率能影响疼痛减退效应，秽语频率越高的被试生理疼痛忍耐度越低。秽语缓解疼痛的神经机制还有待进一步研究和探索。本文旨在对这一主题的文献进行梳理和总结。 关键词 :秽语，生理疼痛，社会疼痛 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 秽语，广义上指使用禁忌、粗俗、亵渎、冒犯或污秽淫秽的语言(Jay & Duncan， 2006)。有研究者根据语言特点将秽语的定义概括为以下三点：指秽语使用者所在的文化中禁忌或侮辱性的事物；不能按照字面意思直接解释；可以用来表达强烈的情绪或态度(Güvendir & Emre， 2015; Vingerhoets et al.， 2013)，它与历史、文化密切相关，例如，在西方，秽语的繁荣与宗教的重要性下降有关(Baruch & Jenkins， 2007)；中国文化中的秽语则反映了封建统治给人们带来的尊卑分明的传统观念(周元琳，2006；袁焱，张胜隆，2014)。 秽语是一种常见的现象，其使用频率占个人每天口头表达词汇的0.3%~0.7% (Jay & Timothy， 2009b)，它或多或少影响了每一个人(Lancker & Cummings， 1999)。秽语能给人带来轻松的感觉(Jay & Timothy， 2009b)，也会给人带来极大的痛苦(Stone， Mcmillan， & Hazelton， 2010; Stone， Mcmillan， Hazelton， & Clayton， 2011)。在语言神经病理学方面，它也发挥着重要作用，临床环境中的秽语行为表现可能与疾病状况有关(Lancker & Cummings， 1999)，如失语症和阿尔茨海默病患者由于大脑功能出现障碍而遗忘了家人的名字，但他们依旧记得如何使用秽语(Jay & Janschewitz， 2008; Jay & Timothy， 2009a)。使用秽语的原因有发泄情绪、强调观点或侮辱他人等，有时甚至只是出于习惯，宣泄则是最常见的理由(Rassin & Muris， 2005; Jay & Timothy， 2009a)。然而，即便被禁止使用，秽语至今没有消失(Rassin & Muris， 2005; Stone & Hazelton， 2008)。那么人为什么说秽语？本文试图通过梳理秽语对疼痛的缓解作用一系列文献，对这一问题进行考察与展望。
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user: 2. 秽语对生理疼痛的缓解作用 秽语作为一种情绪性反应，在受到疼痛时也常有体现，如生孩子或者被锤子砸到手指。当个体身体外部或内部遭受到伤害性刺激时，这种生理上的主观感觉、心理上的不愉快情绪体验被称为生理疼痛(Price， 2000；张天锡，印其章，2003)，许多研究者认为杏仁核与疼痛中负性情绪的产生有密切联系(黄进，康晓征，罗非，2005)。Simon和Craig等人(2008)通过给被试呈现动态的基本表情和疼痛表情发现，观看疼痛表情的被试体验到了更强烈的不愉快感觉和唤起。疼痛也是使用秽语的一个原因(Jay， King， & Duncan， 2006)，从进化的角度来看，秽语就像动物的咆哮，属于发声的远古形式，它作为一种本能使情绪得到缓和，能够帮助人们释放愤怒的攻击性情绪，缓解痛苦的压力，并带来愉快的感觉(Patrick， 1901; Montagu & Ashley， 1942)。一些疼痛理论认为(未找到相关证据)秽语是与疼痛有关的灾难化标志，灾难化是一种放大疼痛感觉的威胁的倾向，使人产生消极和无助的想法，如果这一理论正确，那么使用秽语会使个体的疼痛加剧(Sullivan et al.， 2001; Stephens， Atkins， & Kingston， 2009)。 秽语作为疼痛的不适应反应却如此常见，Stephens等人(2009)出于疑惑设计实验，假设与非秽语相比，秽语会降低疼痛忍耐度、提高疼痛感知，结果却与假设正好相反。实验采用了冷加压范式，需要被试将手浸没在冷水中，直到疼痛无法忍受时停止，每一试验结束后立即测量被试的心率及疼痛感知，在冷水中的浸没时长作为疼痛忍耐度的指标。结果表明，与非秽语相比，重复秽语使被试的疼痛忍耐度升高，同时伴随着心率的提高，疼痛感知的降低。因此Stephens认为秽语并不是对疼痛的不适应反应，相反，它产生了疼痛减退效应。在实验开始前测量被试的疼痛灾难化、疼痛恐惧以及特质焦虑分数，这些与疼痛有关的因素作为协变量以控制误差，对数据分析后发现，随着疼痛灾难化分数的提高，疼痛忍耐度逐渐下降，这一结果只在重复秽语的男性被试中出现，即男性秽语的疼痛减退效应的消散与灾难化倾向的提高有关，女性疼痛减退效应与疼痛灾难化倾向无关。Stephens & Umland (2011)的另一项重复实验中，却无证据表明秽语的疼痛减退效应与疼痛灾难化之间存在联系。 疼痛感知会受疼痛恐惧的影响，这可能是导致秽语产生疼痛减退效应的一部分原因(Stephens， Atkins， & Kingston， 2009)。当个体在预期或体验到组织损伤时所产生的紧张、恐惧的情绪反应被称作疼痛恐惧，此时伴随着对疼痛的负性解释，或“疼痛就是伤害”的灾难化信念(Turk & Wilson， 2010)，它与疼痛灾难化之间存在显著相关(Stephens， Atkins， & Kingston， 2009; Stephens & Umland， 2011)。有证据表明疼痛恐惧能降低个体对疼痛的敏感(Rhudy & Meagher， 2000)，但这一影响似乎与疼痛的诱导方式有关，实验中使用热加压和电刺激诱发疼痛时，被试的疼痛感知受疼痛恐惧的影响；使用冷加压诱发时，疼痛恐惧不影响被试的疼痛感知，疼痛忍耐度却发生显著变化(苏琳等，2016)。Stephens的结果证明疼痛恐惧只影响男性被试在冷水中的疼痛忍耐度。在重复非秽语词汇时，被试疼痛感知的升高与疼痛恐惧提高有关，重复秽语词汇时这种关系却不显著，研究者认为是秽语带来的镇痛效果使两者之间的联系消失(Stephens， Atkins， & Kingston， 2009)，这一结果在新的实验中也未得到验证，疼痛恐惧对秽语的疼痛减退效应的影响仍然模糊不清(Stephens & Umland， 2011)。 秽语的镇痛效果并不对所有人有效，参与实验的67名被试有9名未表现出疼痛减退效应(Stephens， Atkins， & Kingston， 2009)。Stephens等人(2011)基于习惯化的心理现象重复进行先前的实验，习惯化是指个体对重复出现的刺激的反应呈逐渐下降的趋势(Rankin， Abrams， Barry， Bhatnagar， & Thompson， 2008)。实验中新增“每天秽语频率”(“How many times per day do you swear?”)为协变量，假设与每天秽语频率低的被试相比，每天秽语频率高的被试表现出的疼痛减退效应弱。主试在选取词汇材料方面也有所变化，实验开始前安排被试写下“当突然被打到头时可能说出的一个秽语”，以及“描述一个桌子时可能会用到的一个词语”。在先前的实验中，被试在实验开始前需要写下“当被锤子砸到的时候可能会说出的五个词语”，采取列表里的第一个秽语词汇作为其秽语词汇材料，再写下“描述桌子时使用的五个词语”，最后采取与秽语词汇序列位置相同的词汇作为非秽语材料(Stephens， Atkins， & Kingston， 2009; Stephens & Umland， 2011)。 与先前结果相似，大多数被试重复秽语词汇时比重复非秽语词汇时的疼痛忍耐度更高(然而疼痛感知未出现显著变化)；心率在冷水中比在室温水中更快，重复秽语词汇使心率变化更大；性别差异同样表现为男性的疼痛忍耐度显著高于女性。秽语频率更高的被试在秽语条件下冷加压额外增加的时长更短，但疼痛感知或心率的变化都与秽语频率无关(Stephens & Umland， 2011)。为了排除文化差异的影响，在对日本学生被试的重复实验中发现秽语同样能够缓解生理疼痛(Robertson， Robinson， & Stephens， 2017)。 研究发现，与中性词或情绪词相比，秽语词汇引起被试更强烈的生理唤醒(Tomash & Reed， 2013)。秽语可能引发了某种情绪反应从而减轻疼痛，问题在于它引发的是哪种情绪反应，Stephens & Allsop (2012)通过实验证实增加被试的攻击性同样能够提高疼痛忍耐度，因此他认为由情绪而引起的秽语能够提高疼痛忍耐度。
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user: 3. 秽语对社会疼痛的缓解作用 使用秽语会潜移默化地影响使用者(尤其是女性)得到的社会支持(Bird & Harris， 1990)。研究者通过调查一批乳腺癌女患者，发现当患者独处时，秽语能减少病痛带来的负面效应(如抑郁症状)；当他人在场时，使用秽语的患者得到的情感支持更低，秽语带来的积极影响随之减弱，即秽语通过降低社会支持而破坏心理调节(Robbins， Focella， Kasle， Ana María López， Weih， & Mehl， 2011) 。研究表示个体的生理疼痛忍耐度和疼痛感知能够通过秽语得到缓解(Stephens， Atkins， & Kingston， 2009; Stephens & Umland， 2011)，秽语也被证明能缓解与生理疼痛有关的社会疼痛(Philipp & Lombardo， 2017)。 疼痛一般是指痛苦经验，与实际或潜在的组织损伤有关，包括感觉、情绪、认知成分(Eisenberger， 2012)。与疼痛相似，社会排斥也是一种表示危险的信号，由许多因素导致，如遭到拒绝、爱人的死亡或分离等。排斥能引起社会疼痛，这种主观痛苦感受意味着社会联结受到威胁或断裂(Macdonald & Leary， 2005)。社会排斥将威胁个体的归属感、存在的意义、控制感和自尊等基本需求(Weschke & Niedeggen， 2013)，此外，受到重要群体的排斥后，会引发焦虑的情绪(Baumeister & Tice， 1990)，Leary (1990)认为社会排斥的出现与社交焦虑、孤独、嫉妒、抑郁等因素有关；在行为层面，排斥使个体的亲社会行为减少，实验中被排斥的被试捐助的金额更少、也更不愿意再次充当被试，研究者认为排斥使被试的情绪调节受到干扰，导致同理心降低(Twenge， Baumeister， DeWal， Ciarocco， & Bartels， 2007)。受到排斥的被试攻击行为的倾向也会有所提高(Twenge， Baumeister， Tice， & Stucke， 2001; DeWall， Twenge， Gitter， & Baumeister， 2009)。实验证明，在自传体书写任务中写自己“被排斥”经历的被试，情绪得分与需要满足得分显著低于“被接纳”的被试(Philipp & Lombardo， 2017)。 归属的需要导致社会联结在人的生存中占据重要地位(Baumeister & Leary， 1995)，许多研究表明，更高级更复杂的社会活动与一些较为基础的神经系统的活动有关，例如，Lamm等人(2011)发现疼痛共情和疼痛体验的神经网络具有重叠部分。社会疼痛是与社会联结有关的疼痛感觉，它和生理疼痛有着相同的神经生物学基础；研究表明两者共同拥有一个报警系统，威胁社会联结的信号同样会受到机体的重视(Eisenberger， Lieberman， & Williams， 2003; Eisenberger & Lieberman， 2004; Eisenberger， 2012)。有研究者发现社会疼痛也会带来生理上的痛苦感觉(Bernstein & Claypool， 2012)。Eisenberger认为，在进化初期，社会联结与生存息息相关，人类和其他哺乳动物需要依靠群体的力量来获取食物、哺育下一代以及抵挡天敌的侵害，一旦脱离社群，个体存活的几率将大打折扣，因此经过长期的进化，社会疼痛也具备了警告和保护生命安全的作用。一种名为疼痛重叠的理论认为，生理疼痛是一种心理现象，能够被期望、态度和情绪调节，而社会疼痛由数百万年的进化后融入大脑和身体，变成一种生理现象(Eisenberger， 2012)，该理论表示对生理疼痛有效的干预对社会疼痛同样有效(Eisenberger & Lieberman， 2004)，这一观点得到许多研究的证实——社会疼痛可以用常见的止痛药缓解，如大麻(Deckman， DeWall， Way， Gilman， & Richman， 2014)；社会支持也能使生理疼痛得到缓解(Brown， Sheffield， Leary， & Robinson， 2003)。 基于疼痛重叠理论，研究者假设缓解生理疼痛的秽语同样能够缓解社会疼痛，实验证明，与重复非秽语词汇相比，重复秽语词汇的被试感受到的社会疼痛更少，生理疼痛感知也更低(Philipp & Lombardo， 2017)。社会疼痛虽然比生理疼痛更容易愈合，人们也更容易再次体验到与社会疼痛相关的痛苦，即便伤痛已经过去了很久(Chen， Williams， Fitnes， & Newton， 2008; Meyer， Williams， & Eisenberger， 2015)；Philipp和Lombardo (2017)在实验中采用自传体书写任务范式操纵社交苦恼，将被试分为接纳组和排斥组，分别写下一段被接纳(included condition)的经历，或者是一段被排斥(excluded condition)的经历，随后立即将手浸没在室温水中大声重复秽语或非秽语两分钟，填写问卷后通过冷加压任务测量疼痛忍耐度和疼痛感知；被试在冷水中浸没时需要大声重复无意义音节，以避免内隐的秽语行为。结果发现，接纳组的社会疼痛与生理疼痛得分显著低于排斥组——适度的社会排斥会带来疼痛过敏效应，与先前的研究结果一致(Bernstein & Claypool， 2012)，而大声重复秽语缓解了排斥组的痛苦(Philipp & Lombardo， 2017)。 Philipp和Lombardo所选取的秽语及非秽语词汇材料的方式与Stephens在2009年的实验中一致，秽语频率同样只与疼痛忍耐度有关，而与社会疼痛与生理疼痛感知无关，但总的来说，秽语能够缓解社会排斥的后果。研究者对上述结果的解释是，秽语引起了某种应激反应，从而使秽语使用者的疼痛感觉得到缓解(Philipp & Lombardo， 2017)。
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user: 4. 总结与展望 总之，在疼痛刺激下重复秽语能够提高人的疼痛忍耐度，降低疼痛感知，这种疼痛减退效应对平时不经常说秽语的人来说更加明显，在这一过程中，心率的提高意味着某种情绪活动被引发，从而达到缓解疼痛的效果；此外，基于疼痛重叠理论，秽语同样能够减弱社会排斥的后果，即秽语降低了个体的社会疼痛，并减轻了社交苦恼的后果——生理疼痛敏感。 但是先前研究的过程还存在需要细化的地方，如对“每天秽语频率”及秽语词汇的收集、主试性别对被试的秽语疼痛减退效应的影响。有研究表明，不同性别的被试在表达疼痛时会受到主试性别的影响，男性被试在异性主试面前表现出了更高的疼痛忍耐度和更低的生理疼痛感知，而对女性被试来说这种倾向并不显著(胡佩诚，陈冬梅，1998)，在Philipp和Lombardo (2017)的实验中，主试一直是一位女性，鉴于此，可以推测秽语产生的部分疼痛减退效应可能是由主试性别导致的。未来研究可进一步改良实验，深入探究秽语疼痛减退效应的作用机制，揭示秽语的神经生物学过程，从而以科学的角度说明其成因及影响。
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user: 摘 要 从土壤中分离筛选一株高产胞外多糖的菌株PYQ4，运用分子生物学技术对其进行鉴定，并探究其胞外多糖(EPS)对短波紫外线(UVC)引起人永生化角质细胞(HaCaT)损伤的保护作用和保护机制。结果表明，筛选并分离得到的菌株PYQ4为罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)。菌株PYQ4发酵48 h后多糖产量可达2.50 g/L，其所产EPS在100~1000 µg/mL的浓度范围内对HaCaT细胞均无细胞毒性。在UVC辐照后，EPS的加入使得HaCaT细胞存活率上升，细胞内活性氧(ROS)含量下降同时减轻线粒体膜电位(MMP)的降低，差异均具有统计学意义(p < 0.05)，说明该EPS对UVC辐射HaCaT细胞引起的氧化损伤有显著保护作用。 关键词 :罗氏假单胞菌，胞外多糖，UVC，细胞损伤，生物活性 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 按照波长的不同，紫外线可以分为三种类型：长波紫外线(UVA， 320~400 nm)，中波紫外线(UVB， 280~320 nm)和短波紫外线(UVC， 190~280 nm) [ 1 ]。其中UVA和UVB的穿透力较强可以抵达地球表面，而绝大部分的UVC被臭氧层吸收，但UVC是三者中破坏力最高的类型，可以对人体皮肤组织和细胞产生巨大伤害，诱发细胞癌变。近年来，得益于其独特的灭菌功能，UVC越来越广泛地应用于工业生产和日常生活，而相关人员暴露于UVC下的风险也越来越大。 研究表明，紫外线辐射对生物体有多种生理影响，过度暴露于紫外线可以诱导细胞产生过量的活性氧(ROS)，破坏其自身的抗氧化防御系统，引起脂质过氧化和DNA损伤，影响相关的信号传导途径，破坏细胞结构或功能，并导致光老化、炎症、免疫抑制甚至恶性肿瘤的产生 [ 2 ]。因此，寻找合适的方法来降低UV引起的损害十分有必要。一些植物和大型真菌的提取物由于其良好的抗氧化活性已被研究者们关注并应用于这方面。在众多降低UV引起的损害作用的物质中，多糖由于其良好的抗氧化活性而成为近年来的研究热点之一。目前，研究主要聚焦在植物多糖和大型真菌多糖上 [ 3 ] [ 4 ]，对细菌多糖在这方面的生物活性作用报道较少。 细菌胞外多糖是细菌产生的一类大分子聚合物，在许多重要生命过程中起关键作用 [ 5 ]。在体外和体内研究中，细菌胞外多糖均表现出广泛的生物活性，如持水、抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤等 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]，在食品和医学等领域受到越来越多的关注。相比于植物多糖或真菌多糖，细菌多糖具有生产周期短、可大量发酵提取、品质稳定等优势，具有良好的应用前景。 本研究从土壤中筛选了一株高产胞外多糖的罗氏假单胞菌菌株PYQ4，并运用HaCaT细胞模型评估了PYQ4所产胞外多糖对UVC辐射所致细胞损伤的保护作用，为未来保健食品、护肤品的开发提供了理论基础，具有广阔的应用前景。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料与设备 2.1.1. 材料与试剂 筛选培养基：蔗糖20.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，磷酸氢二钠3.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 L，115℃灭菌25 min。 发酵培养基：蔗糖50.0 g，胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉1.0 g，磷酸氢二钠3.0 g，蒸馏水1 L，115℃灭菌25 min。 人永生化角质形成细胞(HaCaT)购自中国典型培养物保藏中心。细菌基因组DNA提取试剂盒购自宝日医生物工程有限公司。2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、罗丹明123 (Rh123)荧光探针购自上海碧云天生物技术有限公司。噻唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich。使用的其他试剂均为分析纯。 2.1.2. 仪器与设备 SW-CJ-1FD净化工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-250生化培养箱，上海一恒科技有限公司；A3K15冷冻离心机，德国sigma公司；FreeZone冷冻干燥机，美国Labconco公司；Spark 10M多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；HF90 CO 2 培养箱，上海力申仪器有限公司；石英紫外灯管，北京精英特种灯泡厂；Nikon ECLIPSE Ti倒置显微镜，日本尼康公司。 2.2. 试验方法 2.2.1. 产胞外多糖菌株的筛选与鉴定 从山东菏泽的公园、湖滨等地收集土壤样本，每个样本中取10 g加至90 mL无菌生理盐水中，混合均匀后梯度稀释，取合适稀释度的稀释液100 µL涂布于筛选平板上，30℃培养48 h。观察并记录菌落特征。选取粘稠，有拉丝的单菌落至筛选平板上进行划线纯化并保存，将该菌株命名为PYQ4。 根据宝日医生物细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取该菌株的总DNA，以通用引物27F和1492R扩增该菌的16S rDNA基因，回收扩增产物后进行测序，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。使用BLAST将PCR产物的测序结果与NCBI GenBank中的基因序列进行比较。 2.2.2. 胞外多糖的制备 胞外多糖提取方法参考已有文献并稍作修改 [ 10 ]。将分离菌株以2 %的接种量接种至发酵培养基中，在30℃，转速为150 rpm的摇床中振荡培养48小时。所得发酵液于冷冻离心机中4℃、4000 × g下离心15 min除去菌体，所得上清液在60℃的旋转蒸发仪中浓缩。随后用Sevag法去除蛋白质5次。取上清液与三倍体积的无水乙醇混合，并在4℃下沉淀过夜。将沉淀物重新溶解在去离子水中，透析(截留量3500 Da) 2天后冷冻干燥，获得EPS。 采用Bradford法 [ 11 ] 和苯酚–硫酸法 [ 12 ] 测定EPS中总蛋白和碳水化合物的含量，分别以牛血清白蛋白和D-葡萄糖为标准。 2.2.3. HaCaT细胞培养 HaCaT细胞在含有100 μg/mL青霉素，100 U/mL链霉素和10% (v/v) FBS的DMEM高糖培养，并置于37℃，5% CO 2 条件下的培养箱中。当细胞融合度达到80%后，弃去培养基，将细胞用含0.02% EDTA的胰蛋白酶消化并接种到不同规格的孔板中以待后续实验，具体规格取决于检测指标。 2.2.4. 胞外多糖对HaCaT细胞的毒性试验 采用MTT法测定EPS对HaCaT细胞存活率的影响。将细胞以5000个/孔的密度接种至96孔板中，培养24 h后加入含不同浓度EPS (100，200，300，600，1000 µg/mL)的新鲜培养基。孵育24 h后移去培养基，PBS清洗后每孔加入0.5 mg/mL的MTT，避光孵育4 h后移去上清液，每孔加入150 µL的DMSO，充分溶解生成的甲臜后在570 nm下检测吸光度。 2.2.5. UVC损伤模型的建立与分组 参考现有文献报道 [ 13 ]，采用8 mJ/cm 2 剂量的UVC用于实验。细胞培养24 h后，用PBS洗涤并暴露于8 mJ/cm 2 UVC下，然后与含有不同浓度EPS (100，200，300，600，1000 µg/mL)的新鲜培养基一起孵育24小时。对照组不经UVC和EPS处理，UVC模型组只用UVC处理。 2.2.6. 胞外多糖对UVC引起HaCaT细胞损伤的影响 将细胞以5000个/孔的密度接种至96孔板中，培养24 h后将细胞用PBS洗涤并暴露于UVC，然后与一系列浓度的EPS共孵育24小时，同时实验采用5.68 mmol/L的Vc作为阳性对照 [ 14 ]。随后，采用MTT法测定EPS对UVC引起的HaCaT细胞损伤的影响。 2.2.7. 胞外多糖对HaCaT细胞内ROS水平的影响 使用DCFH-DA荧光探针表征细胞内ROS的含量 [ 15 ]。将HaCaT细胞以4 × 10 4 个/孔的密度接种到24孔板中。处理后，将HaCaT细胞与10 μM DCFH-DA在37℃，5% CO 2 下孵育30分钟，之后用PBS洗涤。加入无酚红培养基后，立即用荧光显微镜观察细胞。使用Image-Pro Plus 6.0软件对荧光强度进行定量。 2.2.8. 胞外多糖对HaCaT细胞线粒体膜电位的影响 使用Rh123荧光探针表征细胞线粒体膜电位(MMP) [ 16 ]。将HaCaT细胞以4 × 10 4 个/孔的密度接种到24孔板中，经上述处理后，将HaCaT细胞与2 μM Rh123在37℃，5％ CO 2 条件下孵育30分钟，PBS清洗后用荧光显微镜观察。使用Image-Pro Plus 6.0软件对荧光强度进行定量。 2.2.9. 统计分析 实验数据均使用平均值±标准差来表示，对所有数据采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，进一步使用Duncan检验对每组之间的差异进行分析。p < 0.05表示差异具有统计学意义。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 菌株的筛选鉴定与胞外多糖的制备 通过大量筛选和不断纯化，从土壤中筛选出一株高产胞外多糖的菌株PYQ4。菌株PYQ4的菌落形态及菌体形态如图1所示。由图1(A)可知，在筛选培养基上菌株PYQ4单菌落呈圆形凸起，微黄色不透明且湿润粘稠。图1(B)革兰氏染色结果可知PYQ4为杆状革兰氏阴性菌。 由图2可知，将该菌株的16S rDNA序列与GenBank中相关种属的序列进行比对后发现，PYQ4与罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)同源性最高，将该菌株鉴定为Pseudomonas rhodesiae PYQ4，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 16674 [ 17 ]。 通过苯酚-硫酸法测定，菌株PYQ4在30℃，150 rpm，48 h的条件下可发酵得胞外多糖2.50 ± 0.13 g/L，显著高于多种乳酸菌胞外多糖的产量 [ 10 ] [ 18 ] [ 19 ]。不仅如此，与其他假单胞菌的产量相比也处于较高水平，刘凤等 [ 20 ] 报道的海洋假单胞菌pf-6发酵产量为1.22 g/L，范秋苹 [ 21 ] 优化依氏交替假单胞菌HZ (Pesudoalteromonas issachenkonii HZ)发酵条件后，其发酵产量才达到2.603 ± 0.022 g/L，比优化前提高114.95%。对所获胞外多糖的成分进一步分析发现，菌株PYQ4发酵所得胞外多糖中糖含量为94.35% ± 2.20%，蛋白质含量为2.47% ± 0.26%，说明所获胞外多糖纯度较高。 图1. 菌株PYQ4的菌落形态(A)及菌体形态(B) 图2. 菌株PYQ4的系统发育树 3.2. 罗氏假单胞菌PYQ4胞外多糖对HaCaT细胞存活率的影响 罗氏假单胞菌PYQ4胞外多糖对HaCaT细胞的毒性实验结果如图3所示。与浓度为100，200，300，600，1000 µg/mL的EPS共孵育24 h后，HaCaT细胞存活率在101.82%~106.25%之间，与对照组相比无显著性差异。实验结果表明上述浓度的EPS不会对HaCaT细胞造成损伤，可以用于后续实验和进一步产品开发。 3.3. 罗氏假单胞菌PYQ4胞外多糖对UVC引起HaCaT细胞损伤的影响 罗氏假单胞菌PYQ4胞外多糖对UVC引起HaCaT细胞毒性的保护存活效果如图4所示。经UV辐射处理，HaCaT细胞存活率大幅下降，仅为对照组的69.06 ± 3.76%，说明UVC具有显著的细胞毒性。而EPS的加入使得HaCaT细胞的存活率较UV模型组显著上升。此外，对于不同浓度的EPS处理组来说，浓度越高对细胞的保护效应越强，最高浓度的EPS处理组(1000 µg/mL)细胞存活率为84.63 ± 2.70%，与Vc阳性对照组(87.60 ± 4.41%)相当无显著性差异。该实验结果说明，针对UVC引起的细胞损伤，该EPS有显著的保护效应，且具有剂量依赖性。适当浓度EPS对UVC损伤的修复效果可与Vc相当，性质稳定，潜在应用价值高。 图3. EPS对HaCaT细胞的细胞毒性评估 图4. EPS对UVC引起的HaCaT细胞损伤的影响(不同标记字母a， b， c， d统计学结果显示差异显著) 3.4. 罗氏假单胞菌PYQ4胞外多糖对HaCaT细胞内ROS水平的影响 上述实验结果已经证明罗氏假单胞菌PYQ4所产胞外多糖能有效修复UVC引起的细胞损伤，在接下来的实验中对这种细胞保护作用的机制进行了进一步的探究。正常机体内过氧化物质与抗氧化物质处于平衡状态 [ 22 ]，已有研究表明紫外线辐射会引起细胞内大量ROS的产生，而过量的ROS对脂质、蛋白质和DNA均有严重不利影响 [ 23 ]。考虑到这一现象，本研究使用DCFH-DA探针评估HaCaT细胞内ROS水平。 根据图5所示，UVC造模处理组的细胞荧光强度达到对照组的3.87倍。EPS以剂量依赖性的方式显著降低了UV诱导的细胞内ROS的产生。在100、200、300、600、1000 µg/mL EPS的存在下，HaCaT细胞内ROS的荧光强度分别下降至295.21 ± 43.88%、263.33 ± 43.65%、226.39 ± 20.35%、179.06 ± 13.66%、171.78 ± 30.04%，表明菌株PYQ4所产EPS能够有效清除因紫外线诱导而产生的过量ROS从而保护细胞，这与Lee等人的报道具有一致性 [ 24 ]。 图5. EPS对UVC引起的HaCaT细胞内过量ROS的影响(不同标记字母a， b， c， d统计学结果显示差异显著) 3.5. 罗氏假单胞菌PYQ4胞外多糖对HaCaT细胞线粒体膜电位的影响 作为一种重要的细胞器，线粒体为细胞提供生存所需的能量，于此同时，伴随着呼吸链中电子的泄漏，ROS在线粒体内快速产生并影响其代谢 [ 25 ]。现有研究表明 [ 26 ]，紫外辐射会导致线粒体功能障碍，从而引发一系列不良反应。鉴于罗氏假单胞菌PYQ4所产胞外多糖能够有效清除过量ROS的实验结果，我们猜测EPS也可能通过减轻线粒体功能障碍发挥其保护作用。本研究中使用Rh123探针来表征线粒体膜电位。 图6中的数据表明，与对照组相比，UVC模型组的荧光强度下降至78.24 ± 2.42%，而在EPS存在的情况下，MMP的损失明显受到剂量依赖性的抑制，尤其是当EPS浓度600 μg/mL和1000 μg/mL时，HaCaT细胞的荧光强度分别可以达到101.19 ± 2.96%和102.87 ± 2.56%。根据以上实验结果可知，UVC辐照会导致细胞MMP的大幅崩解，从而导致线粒体功能障碍，而罗氏假单胞菌PYQ4所产EPS能够显著缓解这种不利影响，从而在一定程度上恢复细胞的正常生物活性。 图5. EPS对UVC引起的HaCaT细胞内线粒体功能紊乱的影响(不同标记字母a， b， c， d统计学结果显示差异显著)
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user: 4. 结论 本研究从土壤中筛选出1株高产胞外多糖的菌株PYQ4，经分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)。通过HaCaT细胞模型，本研究初步证实了罗氏假单胞菌PYQ4所产胞外多糖可通过显著清除过量ROS的产生、抑制线粒体膜电位的崩解，从而有效缓解UVC引起的细胞毒性损伤的能力，且这种保护作用呈剂量依赖性方式。上述研究成果展示了EPS发挥修复作用的部分机制，为开发基于菌株PYQ4所产胞外多糖的UV防护剂提供了理论基础，进一步拓展了微生物多糖在食品和化妆品领域的应用前景。
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user: 摘 要 人类正常性活动是提升经济发展水平和社会活动凝聚力的有力杠杆。人口需要控制，生殖科学和医学的进步使人们有可能操纵人类的生育。水凝胶具有很多优势，被用来作为避孕功能材料。用四层水凝㬵结构堵塞输精管和抑制精子活力，在男性避孕领域具有广阔的应用前景。 关键词 :避孕，水凝胶，可注射，可降解，非激素 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/