DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 摘 要 随着车载自组网的发展，如何优化底层通信是车载自组网中研究的热点。为提高网络容量及信道利用率，本文提出了一种基于混合分配的VANET信道优化策略。在网络拥塞控制方面，针对车载自组网的特殊性，本文提出了一种基于缓冲区优化的拥塞预防策略，对缓冲区内的消息包进行一定的丢包，尽可能地降低网络拥塞发生的可能性。最后，通过仿真实验对提出的策略进行验证。仿真结果表明：该策略合理分配了信道，显著提高了网络的吞吐量。 关键词 :车载自组网，混合信道分配，拥塞预防，缓冲区优化
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user: 1. 引言 随着车载自组网[ 1 ] 的规模越来越大，有限通信带宽的VANET通信压力也随之增加，如何优化底层通信，使之更适应未来车载自组网的发展需求，是该领域的研究热点。美国联邦通信委员会(FCC)将5.850~5.925 GHz之间75 MHz的频段用于车载通信。具体划分为7个子信道，1个控制信道(CCH，CH178)和6个服务信道(SCH)。 现有对车载自组网信道分配的研究取得了较大的成果。文献 [ 2 ] 中提出静态分配策略，给所有节点的接口分配固定信道，该方法实现相对简单，但是信道一旦分配之后就不在变化，造成信道浪费。文献 [ 3 ] 中提出动态分配策略，该策略采用动态伪随机序列保证通信双方同步切换到相同信道上。该策略中节点能够根据网络的运行状态动态改变信道，但增加了切换开销。文献 [ 4 ] 中提出混合信道分配算法。接口分为静态接口和动态接口，静态接口在固定信道上接收数据，当需要与邻居节点通信时，将可切换接口切换到邻居节点的固定信道上。该策略动态切换接口可提高信道利用率，同时每个节点都有一个固定信道避免了动态信道分配中信道同步和协商过程。但存在一些不足：1) 没有明确提出静态接口和动态接口的数目；2) 较大广播成本。 为解决拥塞问题，文献 [ 5 ] 中提出基于队列的模糊拥塞控制FCCA算法，从数据缓冲区的占用情况的实际状态出发，用模糊理论来描述缓冲区占用率的状态问题，采用整体和局部相结合的方法，该模型建立时，较复杂繁琐、实现较难。基于排队队列管理是对到达的数据分组进行传输控制，包括缓冲管理和分组调度。缓冲管理是根据一定策略决定是否允许分组进入缓冲队列。常用的队列管理策略是尾部丢弃(去尾)，它是在队列到达一定阈值时，不接收后续分组，直到队列小于阈值。当网络发生拥塞时，由于去尾是在队列满时才丢弃分组，会经常维持满队列状态，因此排队延迟也较大。
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user: 2. 一种混合分配的VANET信道优化策略 2.1. 接口数与信道分配策略制约关系 车载自组网拓扑结构可用无向图G(V，E)来表示。其中，V表示网络中的车辆节点集合，E表示网络中直接通信的链路集合。设： 1) 对于v，配置相同数量的接口，令 表示节点i的射频接口数目， 表示网络中信道数目，且必须保证 。 2) 车辆节点的接口是半双工的，即每个接口不能同时发送数据和接收数据。 3) 若A，B为一对相邻节点，如果要通信，双方必须将接口调制到相同信道上。 引用鸽笼原理(重叠原理) [ 6 ] ，若使网络不出现网络分割，接口数m须满足： 其中 代表信道数，车载自组网中信道数为7，得出4 ≤ m < 7。通过分析，总结如下： 1) 当m = 7时，只需将每个接口固定在各个信道上，该策略中采用静态信道分配策略。 2) 当1 ≤ m < 4时，依据鸽笼原则，此时网络可能会出现分割，为保证网络连通性，采用动态信道分配策略。 3) 当4 ≤ m < 7时，网络的连通性能有所改善，可将部分接口采用静态信道分配，余下的部分接口采用动态信道分配方式，节点根据网络中流量情况，将动态接口调制到协商好的通信信道上，这样做既保证了通信的可靠性，又提高了信道利用率。 2.2. 基于混合分配的VANET信道优化 依据鸽笼原理，车辆接口数在保证连通性的情况下，应满足m ≥ 4。且考虑到车载自组网中接口成本问题，接口数目 小于信道数目 ，即 。不失一般性，本文在车辆接口数m满足4 ≤ m < 7的前提下，探讨出一种基于混合分配的VANET信道优化分配策略，旨在提高网络性能。 1) 消息包的种类 ① 控制功能类消息 该类消息包较小且实时性要求高。例如管理帧、时间广播帧等等。车载自组网中控制信道正是传输该类消息，因此将一个固定接口固定在控制信道用于传输该类消息。 ② 广播类消息。 车载自组网中许多安全应用都依赖于广播操作，且一些紧急消息需实时传输给邻居车辆。为保证传输的实时性和可靠性，将接口固定在某个特定的信道上用于广播传输。该信道按照其用途称为广播信道。 ③ 点对点消息。 该类消息是用于传输车辆间、车辆与路边设施间、车辆与路边用户间的视频传输或语音通信等，这类消息包实时性较低，可通过动态接口传输。消息包传输前须通过发送方和接收方协商确定某个信道后，再将接口调制到协商的信道上进行传输。 2) 接口的分配 美国国家公路交通安全管理局、美国交通部、车辆安全通信联盟确定的八种应用以及它们的通信要求[ 7 ] 。 由表1可以看出，车辆间的应用主要分为点对点、点对多点、基础设施到车辆、车辆到车辆、车辆到基础设施等五种方式。例如，“左转协助”车辆安全应用，通过不同的通信方式来通知车辆或基础设施。 Q代表广播操作与点对点操作的比重。 ① 当接口数为4时，根据Q的值，一个接口固定在控制信道上，一个接口固定在广播信道，两个接口作为动态信道。由表1可见，点对点通信的重要性。分配两个接口作为动态接口，使车辆间能够并行传输。 ② 当接口数为5时，根据Q的值，三个作为静态接口，固定接口中一个固定在控制接口，两个固定在广播接口。剩下两个作为动态接口。 ③ 当接口数为6时，三个作为静态接口，固定接口中一个固定在控制接口，两个固定在广播接口。剩下三个作为动态接口。 接口分配策略(静态接口数 = 用于控制信道接口数 + 用于广播信道接口数)，如表2所示。 Table 1 Eight kinds of security applications and communication requirement 应用 类型 频率(Hz) 延迟(ms) 传输的数据 范围(m) 违反交通信号警告 I2V单向，P2M 10 100 信号状态，时间，路面方向，灯光位置，天气 250 弯道速度警告 I2V单向，P2M 1 1000 弯道位置、弯度，限速，倾斜过弯，斜坡，表面 200 紧急制动灯 车辆-车辆，双向，P2M 10 100 位置，减速方向，速率 200 碰撞预警 车辆-车辆，双向，P2M 50 20 车辆类型，角速度，位置，方向，加速器 50 左转协助 I2V，V2I，单向，P2M 10 100 信号状态，时间，位置趋势，道路地势，速度方向 300 车道变换警告 车辆-车辆，单向，P2M 10 100 位置，方向，速度，加速度，转弯信号状态 150 “停车”标志协助 I2V，V2I，单向 10 100 位置，方向，速度，预警 300 碰撞警告 车辆-车辆，双向，P2M 10 100 车辆类型，位置，前进速度，角速度，加速器 150 表1. 八种安全应用及其通信要求 注：P2P表示“点对点”，P2M表示“点对多点”，I2V表示“基础设施到车辆”，V2V表示“车辆到车辆”，V2I表示“车辆到基础实施”。 Table 2 Interface assignmen 接口总数 静态接口数 动态接口数 用于控制信道接口数 用于广播信道接口数 4 2 2 1 1 5 3 2 1 2 6 3 3 1 2 表2. 接口分配 3) 信道分配规则 控制信道是车载自组网中固有的，只需将接口固定在控制信道上。 广播信道的选择主要考虑的是信道间干扰的因素，其选择依据如下： ① 当仅指定一个信道作为广播信道时，选用CH184作为其广播信道。因为信道中一旦发生冲突，信号叠加会干扰其他信道。因此将频段最高的信道CH184作为广播信道。 ② 当指定两个信道作为广播信道时，其中一个广播信道为CH184。另一个广播信道的选择，注意不能与控制信道CH178和广播信道CH184相邻。经排除后，只有CH172和CH184可供选择。CH172为最佳，因为CH172为频段最低的信道，不会被其他信道的冲突所干扰。 综上所述，广播信道的选择是在CH184、CH172中选择。其中CH184作为主广播信道，CH172为辅助广播信道。
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user: 3. 基于缓冲区优化的拥塞预防策略 通过为缓冲区维护着一张消息等待表，该表中包括消息分组的身份ID i 、优先级P和开始等待时间 等字段，如图1所示。将车载自组网中的消息分为三类：紧急安全消息、非安全类消息、周期性安全消息。其优先级分别为0、1、2，如图2所示。通过消息等待表中的优先级及等待时间两个字段的加权值，决定是否丢包。并对由丢包引起的缓冲区碎片进行管理以及消息等待表管理，消息分组在缓冲区存放的数据结构如图3所示。 1) 拥塞预防算法参数： 图3. 缓冲区中数据结构 综合考虑消息分组的优先级和等待时间两个因素，q是加权系数。q的取值决定了P和T所占的比重。 2) 拥塞预防算法 ① 对消息缓冲区进行检测，一旦检测到使用程度超出阈值时，转步骤②。未达到，不处理。 ② 顺序扫描消息等待表，计算出 值。若 值小于阈值，保留记录及分组；若 值大于阈值，则删除表中该条记录及存放在缓冲区中的分组。具体删除分组方法，转步骤③。 ③ 依据表中被删除记录的ID i ，查询缓冲区中实际位置。头指针指向缓冲区的第一个分组，对比ID i 。若不同，根据其后向指针对比下一个分组的ID i ，直到查找到相同ID i 。若相同，则停止查找，将该分组的后向指针地址赋给该分组的前一个地址。便完成删除分组过程。 3) 消息等待表及缓冲区管理 ① 消息等待表管理 当有新的分组进入缓冲区，需向消息等待表中插入记录时，算法如下： a) 先顺序扫描表，若发现有空闲区域，则向该空闲区域中插入记录。无空闲区域，转步骤b)； b) 向消息等待表的尾部插入消息分组的记录； ② 缓冲区管理 算法参数： [ 1 ] 常促宇， 向勇， 史美林 (2007) 车载自组网的现状与发展. 通信学报， 11， 116-126. [ 2 ] Draves， R.， Padhye， J. and Zill， B. (2004) Routing in multi-radio， multi-hop wireless mesh networks. 10th Annual International Conference on Mobile Computing and Networking， Philadelphia， 26 September-1 October 2004， 114-128. [ 3 ] Bahl， P.， Chandra， R. and Dunagan， J. (2004) SSCH: Slotted seeded channel hopping for capacity improvement in IEEE 802.11 ad-hoc wireless networks. Proceedings of the 10th Annual International Conference on Mobile Computing and Networking， 26 September-1 October 2004， Philadelphia， 216-230. [ 4 ] Kyasanur， P. and Vaidya， N.H. (2006) Routing and link-layer protocols for multi-channel multi-interface Ad hoc wireless networks. ACM Sigmobile Mobile Computing and Communications Review， 10， 31-43. [ 5 ] 綦朝晖， 孙济洲， 李小图 (2005) 基于队列的模糊拥塞控制算法. 软件学报， 2， 286-294. [ 6 ] Zhao， T.， Lu， S.， Yan， W.， et al. (2013) A connectivity invariant dynamic multichannel assignment method for VANET. Communications in Computer & Information Science， 2013， 182-193. [ 7 ] 孙利民， 何云华， 周新运， 刘鸿亮， 赵茂华 (2013) VANET车载网技术及应用. 清华大学出版社， 北京， 219-228.
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user: 摘 要 在小波变换对间谐波检测的基础上，特定函数对采样信号调制后，改变信号的频率结构，利用基于MATLLAT算法的小波多分辨分析在低频段具有高频率分辨率特点，分离出信号调制后信号的直流分量用于计算间谐波分量。经过MATLAB仿真验证，该方法能够准确检测谐波和间谐波分量。 关键词 :小波变换，信号调制，直流信号，间谐波检测
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user: 1. 引言 谐波和间谐波测量是谐波问题的一个重要分支，也是分析和治理谐波问题的出发点和主要依据[ 1 ] 。随着电力电子技术的日益发展，以及非线性负荷的接入，在给电网注入谐波的同时，也注入了大量间谐波。间谐波的存在带来电网波形过零点偏移和闪变等新的问题，其高精度的检测越来越受到学者们的关注。目前对间谐波的检测方法主要有：快速傅里叶变换法、Prony方法、改进型支持向量机(SVM)算法和小波变换法等 [ 2 ] [ 3 ] 。傅里叶要求分析窗宽度为各个频率信号周期的公倍数，才可得到精确的信号频谱，Prony方法对噪声比较敏感需要先进行消噪 [ 4 ] ，改进型支持向量机(SVM)算法改进的是利用函数拟合来检测间谐波，能准确地检测出电力系统间谐波的频率，但是检测范围和精度都受预设模型影响，而且在小样本条件下幅值误差较大。由于小波变换具有时–频窗口可以自适应变化的特点，不但可以分析稳态信号，也可以分析非平稳信号的优点，已经成为电力系统谐波检测中新的研究方向 [ 5 ] - [ 9 ] 。 基于Mallat算法的小波多分辨分析将信号按一定的尺度进行划分，不同频率的信号被划分到不同的频段中，然后对各子频段进行重构，从而分离出各频段谐波信息。Mallat算法对信号频带划分并不是均匀的，而是高频部分宽而低频部分窄，所以在信号的多分辨率分析中，信号的低频部分能够得到精确的分解，但高频段频率相近的谐波分量难以分离 [ 5 ] - [ 10 ] 。 本文在对信号进行小波变换之前，利用正弦和余弦函数对信号调制得到调制后的信号，改变了信号的频率结构，调制后的信号包含直流分量和其他频率分量两部分，而我们需要的信号包含在直流分量中，然后再利用基于Mallat的多分辨分析提取调制后信号的直流分量，滤除其他频率分量，相比直接利用小波变换对原始信号处理，这样能够很好的利用多分辨分析中低频频率分辨率高，并且经过调制后分离出的直流分量，能够直接用于计算对应的谐波和间谐波幅值相位。经过MATLAB实例仿真验证，该方法在解决小波变换在高频段频率分辨率低缺点下，能够准确检测谐波和间谐波分量。
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user: 2. 基于小波变换的谐波检测算法 2.1. 基于Mallat的多分辨率分析 基于MATLAB快速算法的谐波提取方法是目前应用较为广泛的谐波检测方法。其基本原理如下[ 11 ] ： 分解算法为 (1) (2) h和g分别是选定小波基函数以及尺度函数所生成的低通和高通滤波器。 称为离散逼近信号，它描述了信号的低频部分信息， 称为离散细节信号，它描述了信号的高频部分信息。 而重构公式为 (3) 小波函数和尺度函数之间存在如下关系 (4) (5) 小波的多分辨率分析将信号按一定的尺度进行划分，不同频率的信号被划分到不同的频段中，然后对各子频段进行重构，从而分离出各频段谐波(如图1)。 2.2. 谐波检测分析 设电流信号为 ，如式中 (6) 式中 、 和 分别表示谐波幅值、频率和相位角，M是最高次谐波阶数。 设 ， ，其中 (7) (8) 当 时，整理式(3-2)和式(3-3)，得到 (9) (10) 从式(9)中可以看出调制后信号包含直流分量 和其他频率分量，式(10)中可以看出调制后信号包含直流分量 和其他频率分量，传统的fourier变换实际上是对调制后信号 ， 进行周期内的积分，如式 图1. 多分辨率分析分解示意图 (11) (12) (13) 式中 ，而谐波的幅值与相位信息可以由 ， 计算得到，而积分的作用是保留了需要检测的频率分量信息，其他频率分量经过周期内的积分后都被消除了，这样做的好处是能够准确的得到各次谐波分量信息，然而由于积分的存在，使得信号缺乏时域信息，并且因为必须是在周期内的积分才能消除调制后除直流分量外的其他频率分量，当信号所含频率分量除了含信号基波频率整数倍外，还有其他非整数倍频率时，即间谐波，在周期内积分使fourier难以检测含间谐波信号，并且丢失了信号的时域信息。 前面介绍了基于Mallat的多分辨率分析能够对信号进行有效的分频，然后利用基于Mallat的多分辨率分析对调制后的信号进行分频，得到调制后信号的直流分量。那么对I k 计算可以转化为对 的直流分量 ， 的直流分量 的提取，这样利用小波变换频带划分，提取的直流分量不但保留了时域信息，而且还能检测含间谐波信号，电力系统电网侧谐波参数I k 的计算如式(14)。 (14) 相位角 (15)
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user: 3. 电网的间谐波仿真分析 假定信号为 (16) 频率 、 和 分别取50Hz、175.5Hz、450Hz，对应的幅值分别为 、 、 ，其中50 Hz为基波分量，450 Hz为9次谐波分量，175.5 Hz为信号所含的间谐波成份。 采用2.2对信号的分析方法，将需要检测的频率调制后，转换为对调制后信号直流分量的检测，然后利用基于Mallat算法的多分辨分析，选用db44小波基函数小波变换的滤波器基本组件。 设 ， ，当 时 按照式(9)和式(10)可知调制后的信号 和 中包含的频率成份 ， 、 ，并且我们需要的信息就是调制后信号的直流分量，即 中的 和 中的 ，然后利用基于Mallat算法的多分辨分析将 中的 和 中的 从 和 提取出来。信号的175.5 Hz的谐波分量幅值和相位计算如式(14)和式(15)。 在进行谐波分析时，以采样频率1200 Hz对信号进行采样，并取1024个采样数据点为一组进行谐波分析。根据采样定律，能检测到的最大频率为600 Hz。按照式(17)确定分解层数 (17) 式中f s 和W b 分别是采样频率和最低频率分辨率，从电网谐波分析中可以知道信号调制后得到的调制信号g a (t)，g b (t)所含的最低频率为125.5 Hz，为了分离直流分量，最低频带宽度必须低于125.5 Hz，为了减少频带混叠的影响，这里选择W b = 75 Hz，故分解层数为3层。 对信号分别作余弦和正弦调制后得到的如图3(a)和图4(a)所示，原始信号如图2所示。用基于Mallat算法的多分辨分析对调制后的信号分解，得到的各层逼近部分如图3(b)和图4(b)，因为采样频率为1200 Hz，信号调制后所含的最低频率是125.5 Hz，而我们需要的是调制后信号的直流分量，故分解后我们需要的直流分量在逼近部分的a3中，这一点也可以在图1中得到，因为a3所含的频率范围是0~75 Hz，d3所含的频率范围是75~150 Hz，125.5 Hz的频率分量在d4中，125.5是信号调制后所含的最低频率，其他更高的频率分量更加不会出现在a3中，但从图3(b)和图4(b)的a3所示波形并不是一条直线，这是因为小波变换存在的频率混叠造成的，而且MATLAB的小波变换工具对信号分解前会对信号做一个周期延拓的预处理，这也就是为什么a3两边会有一定的波动，并不是理论上的直流分量，为了减少这种误差，本文对图3(b)和图4(b)中a3所示的含少了其它非直流分量做均值处理，得到图3(b)中a3的均值为0.2173，图4(b)中a3的均值为0.1249，故175.5 Hz出信号的谐波分量幅值为0.5013，相位为60.1138˚。 其它频率分量的检测方法类似，检测结果如表1。 图2. 原始信号 Table 1 Harmonic component test result 频率 幅值 相位 真实值 测量值 误差 真实值 测量值 误差 f 1 = 50 Hz 1 0.9983 0.0117 0˚ 0.2137˚ 0.2137˚ f 2 = 175.5 Hz 0.5 0.5013 0.0013 60˚ 60.1138˚ 0.1138˚ f 3 = 450 Hz 0.3 0.3013 0.0013 45˚ 45.0799˚ 0.0799˚ 表1. 谐波分量检测结果
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user: 4. 结论 本文利用小波变换频率划分能力，利用正弦和余弦函数对原始信号调制，改变原始信号的频率结构，再利用基于Mallat的多分辨分析提取调制后信号的直流分量，用于计算原始信号对应的谐波分量幅值与相位。利用基于Mallat的多分辨分析在低频分辨率高优点，避免多个频率分量被划分在同一个频段内，降低了采样要求，并不需要采样整周期数据。由于小波变换的频率混叠现象，使得在计算时存在一定的误差，所以今后工作需要提出更好的方法消除或则抑制频率混叠，或则找到一种更好的调制函数，使得需要检测的谐波分量调制低频段，而其他不需要的频率分量则远离这一频段，这样也能很好的减少频率混叠的影响。随着小波变换的不断发展和完善，小波变换在谐波检测分析的优势会越加明显。
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user: 摘 要 聚乙烯醇缩丁醛中间膜(PVB)在过去几十年被广泛应用于夹层玻璃中。如今新型的离子性中间膜(SGP)较之PVB具有更好的强度和刚度，SGP的采用使得夹层玻璃从之前的仅仅作为安全玻璃发展为结构的一部分。基于其良好的力学性能，SGP在幕墙结构中得到越来越广泛的应用，特别是一些超高层和大型城市公共建筑。然而，到目前为止，对SGP的力学性能尚未有系统的研究，这对夹层玻璃的设计造成了一定困难。本文主要介绍了国内外关于SGP力学性能的研究现状，并根据试验目的和方法的不同进行了归纳总结。 关键词 :SGP，力学性能，温度敏感，试验研究，应变率相关
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user: 1. 引言 目前，夹层玻璃被广泛应用于幕墙结构，广泛采用的中间膜是聚乙烯醇缩丁醛，英文名称是polyvinyl butyral，简称PVB。爆炸时，玻璃即使发生破碎，但也能粘附在PVB上，极大地减少飞溅的玻璃碎片，从而减少人员伤亡和经济损失。PVB在幕墙结构中的使用已经有多年历史。但是，这种夹层膜最初是为汽车玻璃而开发的，富于弹性，比较柔软，剪切模量小，受力后两块玻璃间会有显著的相对滑移，承载力较小，弯曲变形较大。PVB夹层玻璃可以用于一般玻璃幕墙，不适宜用于有高性能要求的玻璃幕墙。 现在，能满足建筑幕墙夹层玻璃高性能要求的夹胶膜—离子性中间膜已经由美国杜邦公司开发出来，并批量生产，称为SGP。与PVB相比，SGP具有更高的强度和刚度，因此已开始在大型公共建筑和超高层建筑玻璃幕墙中使用。但SGP的力学性能尚未得到充分的研究，为此，需要研究SGP在静载和冲击荷载下的材性。本文简要总结了国内外研究SGP力学性能的进展以及主要的实验方法。
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user: 2. SGP的基本特性 SGP的撕裂强度是普通PVB的5倍，硬度是普通PVB的100倍[ 1 ] 。SGP夹层玻璃破损后保持有较高的残余承载力，一般不会整块坠落 [ 2 ] 。SGP夹胶膜本身无色透亮，不容易泛黄，SGP膜的泛黄系数小于1.5，而PVB膜的泛黄系数为6~12 [ 3 ] ，并且SGP夹层玻璃具有良好的耐光性，将样本置于亚利桑那州的沙漠的实验装置实验，得到相当于正常阳光照射下的10年后的玻璃样本，数据表明，以普通肉眼观察样本看不出颜色变化和风化痕迹 [ 4 ] 。SGP夹层玻璃的射外线透射率不到1%，而普通的浮法玻璃高达70% [ 5 ] 。在苛刻的自然环境下随时间的风化作用可以反映夹层玻璃的耐久性，SGP夹层玻璃边部外露于大气条件下，不会开胶、分离，因此在使用时无须采用专门的封边措施 [ 6 ] ，即使在热带高温和暴风雨的极端气候情况下，SGP夹层玻璃也具有良好的边缘稳定性 [ 7 ] 。SGP夹层对密封剂、陶瓷色釉料和玻璃镀膜等都具有很好的粘结性 [ 8 ] [ 9 ] 。因此近几年SGP开始在大型公共建筑和超高层建筑中推广应用。
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user: 3. 力学性能指标 目前，国外进行的SGP力学材性实验工作不是很多，已有的数据很少，表1 [ 1 ] [ 10 ] [ 11 ] 给出了SGP的一些基本材料参数，并与PVB参数值进行对比，可以看出抗拉强度和杨氏模量明显增大，SGP具有很好的延性，伸长率可以达到400%，玻璃化温度Tg范围为55℃~60℃，因此在常温下SGP表现为玻璃态，其中弹性模量是在室温下的参考值，而SGP在不同温度下的弹性模量值并不相同[ 12 ] 。因为SGP的粘弹 Table 1 Material parameters comparison between SGP and PV 项目 SGP PVB 比重(g/m 3 ) 0.95 1.07 杨氏模量(MPa) 300 18 抗拉强度(MPa) 34.5 >20 伸长率 400% >250 玻璃化温度T g 55℃~60℃ 10℃~15℃ 表1. SGP和PVB材料参数对比 性特性，SGP夹层玻璃的整体刚度随着温度的上升而下降，温度不变时，随着荷载持时的增加整体刚度下降 [ 13 ] 。
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user: 5. 总结 SGP是半晶态的热塑性高分子聚合物，具有明显粘弹性特性，其力学性能受温度和荷载持时影响，有蠕变和松弛现象。静力拉伸试验得到的结果表明低于玻璃化转变温度时，SGP适用粘弹性模型，当高于玻璃化转变温度时，SGP适用超弹性模型；对于小变形时，适用线性粘弹性模型。迄今为止未有大家公认的低应变和低应变率下的剪切模量和剪切强度值。而且，关于SGP在中高应变率的力学性能研究工作还很少，未有明确的力学性能描述。SGP对比PVB的优异性能，使之将越来越多的应用到需要满足高性能要求的建筑结构中，因为非常有必要对SGP的力学性能进行全面的试验研究，进行不同应变率与温度下的拉伸试验、直接剪切试验与层间剪切试件，并通过动态力学试验研究SGP的粘弹性特性，进一步提出合理的本构模型，以应用于夹层玻璃的抗爆研究、结构设计等。
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user: 摘 要 构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体，在CHO-S细胞中快速高效表达，探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合，构建pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体，电转染至CHO-S细胞，挑选G418抗性的高表达单克隆，斑点杂交半定量分析和Western blot分析sTNFRII-gAD-Fc的表达，Protein A-Agarose纯化，以及拮抗TNFα的生物活性测定。最后在摇瓶、转瓶及生物反应器中进行了逐级放大的无血清悬浮批次及流加培养，即：2.0 × 10 6 cells/mL的接种密度，当达到4.0 × 10 6 cells/mL以上时开始流加培养并以每日葡萄糖的残余量2 g/L左右作为流加体积的控制参数。成功构建pMH3- sTNFRII-gAD-Fc表达载体，检测到sTNFRII-gAD-Fc在CHO-S细胞培养上清中以二聚体和多聚体形式表达，获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株，且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L。利用CHO-S细胞系统成功实现了sTNFRII-gAD-Fc 融合蛋白的快速高效表达，为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。 关键词 :可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部，人免疫球蛋白G1 Fc，TNF拮抗剂，“富含GC”表达体系，悬浮流加培养
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user: 1. 引言 TNFα是一种多能性细胞因子，参与许多重要的生理功能，但其过表达则会破坏机体的免疫平衡，导致自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)的发生。中和体内过剩的TNFα或抑制TNFα活性是治疗这类疾病的有效措施。可溶性TNFRII(sTNFRII)单体是TNFα的天然拮抗剂[ 1 ] ，但其与TNFα间的亲和力低，且在血液循环中的半衰期很短，故拮抗TNFa的能力非常有限。因二聚体化效应，sTNFRII-Fc融合蛋白(Etanercept)拮抗TNFa的能力是相应sTNFRII单体的50~1000倍[ 2 ] [ 3 ] 。借助脂联素球部(gAD)可自行形成同源三聚体的特性 [ 4 ] ，本实验室构建了优于sTNFRII-Fc融合蛋白、三聚体化的sTNFRII-gAD融合蛋白 [ 5 ] 。然而，我们发现，sTNFRII-gAD在制备过程中仍大量以单体蛋白形式存在 [ 6 ] [ 7 ] 。因此，本研究拟借助人IgG1的Fc片段肽链间的二硫键能形成同源二聚体的特性，将sTNFRII-gAD基因与IgG1 Fc基因相连，成功利用“富含GC”的哺乳动物细胞CHO-S表达体系 [ 8 ] ，实现了sTNFRII-gAD-Fc的快速高效表达，且以二聚体和多聚体的形式存在，从而避免了单体sTNFRII的形成。同时，初步探索了无血清悬浮流加培养工艺，为建立一套高密度、高效表达融合蛋白的中试流加培养工艺奠定了基础。
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user: 3. 结果 3.1. 重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc的结构 重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc结构如图1所示。其中包括鸡β-actin启动子、sTNFRII-gAD-Fc融合基因、polyA加尾信号、新霉素抗性的neo基因及三个非编码的富含GC的DNA片段。新霉素抗性的neo基因便于转染后G418筛选，以得到稳定转染的细胞株。该载体最大的优势是在目的基因的N’和C’端分别加入一段非编码的富含GC的DNA片段，另一非编码的富含GC的DNA片段位于β-actin启动子N’端，这有利于大幅度提高目的蛋白在哺乳动物宿主细胞中的表达。 3.2. 酶切鉴定 用EcoR I、Not I双酶切重组质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳可见酶切出的条带与sTNFRII-gAD-Fc预期大小(1887 bp)一致(如图2)。通过DNA直接测序，在IgG1 Fc片段上存在2个点突变，即其第90位的GTC (缬氨酸)突变为ATC (异亮氨酸)，186位的GTC (缬氨酸)突变为GAC (天冬氨酸)，但后期蛋白的表达及活性测定分析均表明这两处的点突变并不影响蛋白的结构与生物活性。 3.3. 稳定高表达sTNFRII-gAD-Fc的单克隆细胞株的获得 重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc转染CHO-S细胞后，瞬时转染24 h时，分别用抗人脂联素单抗和抗TNFRII单抗进行dot blot检测分析，结果均可见转染后的CHO-S细胞的培养上清中有sTNFRII-gAD-Fc的分泌表达(如图3(a))。随后通过G418筛选及三次单克隆挑选，利用dot blot半定量分析筛选出高效稳定表达sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的单克隆细胞株IIIF12。用已知浓度的sTNFRII-Fc融合蛋白作为标准品，分别稀释成100、75、50、25、12.5、6.25 µg/mL，dot blot半定量分析转染后的最高表达株，96孔板中最高表达的单克隆细胞培养24 h上清中sTNFRII-gAD-Fc的含量约相当于75 μg/mL (如图3(b))。 用免疫印迹法分析还原状态/非还原状态的sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白样品(图3(c)，图3(d))。对于还原状态的样品，用抗人脂联素单抗检测在约75 kDa处有特异性条带，比sTNFRII-gAD-Fc预期的蛋白分子量69 kDa要大，这可能是由于糖基化作用导致的；而用抗人sTNFRII单抗检测未见特异性条带。这正好与先前实验的结果抗TNFRII单抗只能识别sTNFRII的空间表位(而非线性表位)，而抗脂联素单抗可识别gAD线性表位一致 [ 6 ] 。然而，对于非还原状态的样品，用脂联素单抗及TNFRII单抗检测培养上清在约75 kDa处均未见特异性条带，在大约170 kDa处及远大于250 kDa处分别出现特异性条带，提示CHO-S细胞表达分泌至上清中的sTNFRII-gAD-Fc以二聚体和多聚体形式存在，不存在单体蛋白。 3.4. 无血清悬浮批次和流加培养的比较及sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的纯化 将最终选出的高效稳定的单克隆CHO-S/pMH3-sTNFRII-gAD-Fc IIIF12成功驯化适应悬浮生长，依次进行无血清悬浮批次及流加培养，逐级放大悬浮培养规模以探索流加培养工艺，培养时间平均在6~8 d，每天取样dot blot检测上清中sTNFRII-gAD-Fc的表达(如图4(a))，可见工程细胞株在无血清悬浮培养过程中持续累积分泌sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白。比较批次与流加培养细胞生长状况及sTNFRII-gAD-Fc蛋白产量(如表2)，流加培养的培养时间较批次培养延长，蛋白产量也明显增加。此外，由转瓶中流加培养放大到生物反应器中时，细胞活力及密度保持较好，sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的产量也较稳定且有所提高，提示小规模悬浮流加培养可放大，为后期更大规模的流加培养奠定基础。 经Protein A-Agarose亲和层析分离纯化收获的培养上清时出现一个洗脱峰，收集该峰，经6% SDS- 图1. pMH3-sTNFRII-gAD-Fc质粒结构示意图 图2. sTNFRII-gAD-Fc的PCR鉴定和pMH3-sTNFRII-gAD-Fc质粒的酶切鉴定 图3. 蛋白斑点杂交(a)，(b)和免疫印迹分析(c)，(d)鉴定培养上清中sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的表达 图4. 蛋白斑点杂交分析验证融合蛋白的持续表达及SDS-PAGE分析 Table 2 Comparison of the growth and sTNFRII-gAD fusion protein production of engineered cells in suspension batch and fed-batch culture 60 mL batch culture 200 mL fed-batch culture 3 L fed-batch culture Culture time (d) 6.00 8.00 7.00 Max cell density (cells/mL) 5.60 5.82 5.00 Collecting the supernatants (L) 0.06 0.22 3.30 Protein concentration (mg/L) a 10.00 18.30 20.50 Protein purity (%) b 95.00 表2. 60 mL批次培养和200 mL及3 L流加培养时工程细胞株生长情况及sTNFRII-gAD-Fc蛋白产量比较 a BCA蛋白测定法检测， b 用凝胶密度定量(数据未显示)。 PAGE电泳分析，结果与显示免疫印迹分析的条带位置一致(如图4(b))，说明该收集峰是sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白。 3.5. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白生物活性鉴定 体外检测了该融合蛋白对TNFα杀伤L929细胞的中和活性。结果表明sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白具有中和TNFα的活性(图5)，且其抑制TNFα杀伤L929细胞的活性呈剂量依赖性(p < 0.05)。
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user: 4. 讨论 TNFa位于细胞因子免疫网络的中枢环节，参与淋巴细胞的迁移、活化、增殖与分化以及淋巴组织的再生，还可诱发细胞凋亡，调节免疫反应，促进慢性炎症的发生发展等。一旦组织中TNFa浓度过高或TNFa信号的持久激活，将导致机体免疫环境和功能的紊乱，诱发疾病如全身炎症反应综合征、风湿性关节炎、炎性肠病、糖尿病、癌症、同种异体移植排斥、多发硬化症等。TNFa的生物学活性是通过细胞表面特异的受体传递信号的。因而，用其受体中和过剩的TNFa是抗TNFa治疗最直接的策略。TNFa受体分为TNFRI(p55)和TNFRII(p75)两种，在自然状态下，TNFa以同源三聚体的形式结合游离的或跨模型的TNFR从而激活胞内一系列信号转导途径引起相应的生物学效应。只有两个或两个以上的TNFR形成聚 图5. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白对TNFα中和活性的检测 合体才能介导下游信号的传递，单个受体分子则不能传导信号。因此，为了使TNFR与TNFa更好地结合从而发挥拮抗TNFa的活性，我们模拟TNFa同源三聚体的复合物研发了sTNFRII-gAD融合蛋白，其在体内外均显示明显优于sTNFRII-Fc融合蛋白拮抗TNFa的活性 [ 10 ] 。但sTNFRII-gAD在制备过程中仍大量以单体蛋白形式存在，故本实验室借助Fc片段形成同源二聚体的效应对sTNFRII-gAD进行了改构，制备了sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白，实现了sTNFRII的二聚体化及多聚体化。虽然没有出现预期的六聚体sTNFRII，但却避免了低亲和力sTNFRII单体的形成。此外，IgG1 Fc结构可延长该融合蛋白在血液循环中的半衰期。 近年来，已发展起来许多制备重组蛋白的表达系统，选择哪种表达系统取决于目的蛋白的天然性质及其用途。其中哺乳动物细胞用于表达外源蛋白越来越受重视，但是其存在着产量低，大规模细胞培养技术不成熟等缺陷。在此，利用富含GC的真核表达载体pMH3在可无血清悬浮生长的CHO-S细胞中表达sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白，其优势是在结构基因和/或基因启动子的5’和/或3’端分别加入了一段非编码的富含GC的DNA片段(包括内含子)。一般染色体的开放性决定真核细胞基因表达水平，研究发现非编码的富含GC的DNA片段(包括内含子)是一种超级“打开染色质元件” [ 8 ] ，参与哺乳动物细胞基因表达调控，有利于大幅度提高目的蛋白的表达量。在此，仅经过一轮的单克隆挑选(大约1个月)就通过斑点杂交(dot blot)方法半定量筛选出最高表达量相当于75 μg/mL的单克隆细胞株。随后进行第二、三轮的单克隆挑选筛选出更纯更稳定的高表达株。该方法避免了目前最常使用的、最成熟的哺乳动物细胞表达系统CHO/dhfr - 表达系统 [ 11 ] [ 12 ] 的不足，如通过大量的筛选及目的基因拷贝数的扩增来提高外源蛋白的表达水平，长期使用甲氨蝶呤(MTX)等筛选药物对细胞有一定的毒性且影响下游的蛋白纯化，大大缩短了生物制药的研发周期，减少了劳动力，降低了成本，因而具有更广阔的市场应用价值。 随着哺乳动物细胞培养技术的不断成熟，哺乳动物细胞大规模培养已成为生物制药行业最重要的技术之一，尤其是无血清悬浮培养技术。无血清培养基化学成分明确，杜绝了血清的外源性污染和对细胞的毒性作用，而且使产品易于纯化、回收率高、成本低。然而，当细胞从有血清的状态进入无血清环境时，由于存在代谢转换，会出现细胞生长缓慢甚至细胞死亡的现象，因此，细胞需要在无血清环境中逐渐适应才能高密度悬浮生长 [ 13 ] [ 14 ] 。尽管本实验选用的CHO-S细胞曾经过无血清培养基B001成功悬浮驯化，但转染、G418筛选及细胞单克隆化的过程均在有血清贴壁生长的情况下进行的，因而仍然需要对挑取的高表达细胞株进行无血清悬浮驯化培养，为后期大规模悬浮培养提供更加稳定高表达的工程细胞株。 细胞无血清悬浮培养包括批次培养、流加培养及灌注培养。批次培养较直观地反映了细胞在生物反应器中的生长及代谢变化，操作简单，但随着培养时间的延长，不断消耗的营养物质及积累的有害代谢产物(如氨、乳酸、甲基乙二醛)可能成为细胞密度、细胞活力及外源蛋白表达的主要限制因素 [ 15 ] - [ 17 ] 。本实验我们在500 mL摇瓶中进行批次培养观察蛋白的基础分泌表达，蛋白产量约10.0 mg/L，由于营养等的限制，培养条件的转换等原因使得产量远不及单克隆在96孔板中24 h表达量。为解决细胞在批次培养过程中营养限制的问题，保证细胞高密度高活力生长，提高蛋白产量，又选择了流加培养。流加培养易操作、易放大、产量高，应用较为广泛。然而，流加培养效果的好坏直接影响细胞的生长及产品的表达量。我们初步探索了流加培养的工艺，采取逐级放大培养模式，从小规格的摇瓶及转瓶培养逐步扩大到生物反应器中。一般来说，合格的小规模培养工艺可以为大规模生产提供重要的参考，并能解决大规模生产过程中可能出现的一些问题 [ 18 ] 。本实验在悬浮流加培养过程中选择了适合CHO-S细胞悬浮生长的无血清培养基B001，同时添加了100 μM次黄嘌呤、16 μM胸腺嘧啶核苷及胰岛素生长因子(IGF)促进细胞生长，添加流加培养基F001以弥补长期培养过程中营养的消耗。选择2.0 × 10 6 cells/mL的初始接种密度，既能保证细胞高活力，又有利于缩短扩种时间。过早或过晚流加都会极大地影响流加的最终效果。过早流加，细胞的生长虽然不会出现营养不足，但会导致培养体系中营养过剩，增加了培养体系的渗透压，在培养后期有可能会抑制细胞的生长，导致细胞密度及活力下降。因此，当细胞生长进入平台期或产品生产期间歇(每隔24 h或48 h)添加F001，以葡萄糖水平作为流加体积的控制参数，经反馈法控制每日葡萄糖的残余量，使其维持在较低水平2 g/L左右，既能补充培养过程中营养物质的消耗，又保证了细胞高活力。Erika等 [ 19 ] 曾报道，由于细胞存在易化运输和高亲和运输两个系统，细胞能在较低的葡萄糖浓度条件下生长。还有研究发现，在连续或间歇的流加培养过程中，将培养体系中葡萄糖的浓度限制在培养体系中较低的范围内，可以使细胞的新陈代谢从高乳酸生产转为低乳酸生产 [ 20 ] ，保持细胞的活力及最大生产力。本研究最终在转瓶和生物反应器中完成了流加培养，产量分别为18.3 mg/L和20.5 mg/L，较批次培养有所提高，但是培养时间未得到明显延长，产量同样也没有单克隆在96孔板中培养24 h表达量高。因而，后期仍需进一步优化培养条件以提高产量，如控制合适的转速，尽量减少对细胞的剪切力，生产期适当的降温，低温可以延长细胞有丝分裂的时间，延迟新陈代谢，虽然这对CHO细胞生长有一定抑制性，但却可能提高重组蛋白的特异性表达 [ 21 ] [ 22 ] 。 本研究成功构建了pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体，利用CHO-S细胞系统实现了sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的快速高效表达，检测到sTNFRII-gAD-Fc在培养上清中以二聚体和多聚体形式表达，获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株，且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L，为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。然而，大规模培养条件的优化、产品批次间的稳定性和过程成本的控制仍需要深入细致的研究。
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user: 摘 要 Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒已被广泛的应用于肿瘤的成像与治疗，但限制其应用的一个主要因素是磁性纳米颗粒在肿瘤部位达不到足够的功能剂量。在磁性纳米颗粒表面偶联特异性靶向配体可使其结合于特定肿瘤细胞。目的：将特异性结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的短肽(TVNFKLY)与特异性结合卵巢肿瘤细胞A2780的短肽(QQTNWSL)合成的双功能多肽用于修饰Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒，并研究其对正常细胞的毒性及对A2780细胞的靶向效果。方法：采用傅立叶转换红外光谱、热重分析、荧光显微镜等方法分析多肽与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的结合，采用MTT法检测多肽结合后的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的细胞毒性，并通过普鲁士蓝染色法验证靶向性。结果：合成的多肽(QQTNWSLTVNFKLY)能与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合，结合多肽后的纳米颗粒对L929等正常细胞无明显细胞毒性，对肿瘤细胞有较好的靶向性。结论：合成的双功能多肽能与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合并具有主动靶向A2780细胞的能力，具有潜在的应用价值。 关键词 :Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒，特异性多肽，主动靶向，肿瘤细胞
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user: 1. 前言 Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒已被广泛用于生物医学领域，例如作为磁共振成像造影剂、药物靶向载体及磁热疗介质等[ 1 ] -[ 3 ] 。但体外细胞试验研究证明Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒具有较强的细胞毒性[ 4 ] -[ 6 ] ，并且Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒在应用于临床肿瘤成像与治疗方面也因其不具有对特定肿瘤细胞的靶向性而受到限制。利用生物分子进行表面修饰通常可改善Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的生物相容性并可以通过偶联靶向配体使其具有靶向肿瘤细胞的能力。恰当的表面修饰可以使Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒避免被肝、脾、肺等网状内皮系统吞噬，延长血液循环半衰期，此外通过在Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒表面偶联特定的靶向配体如叶酸、多肽等可使其功能化，靶向于特定肿瘤细胞[ 7 ] -[ 11 ] 。主动靶向Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒可提高粒子在肿瘤细胞的浓度，使其达到较好的成像或治疗效果，并能降低对正常组织的毒性，已成为国内外研究的热点。 多肽因其免疫原性低，生物相容性好，分子小易修饰等特点已被广泛用于纳米材料的表面改性。噬菌体展示肽库技术已成为筛选纳米材料及肿瘤细胞特异性结合肽的有效手段[ 12 ] -[ 15 ] 。通过该技术得到的材料特异性结合肽通常用于材料的表面修饰，而细胞特异性结合肽通常用于细胞靶向研究。 本研究拟利用我们前期通过噬菌体展示技术筛选得到的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒特异性结合肽(TVNFKLY，记为TVN)与卵巢肿瘤细胞A2780靶向肽(QQTNWSL)按照不同的顺序偶联形成QQTNWSLTVNFKLY及LSWNTQQTVNFKLY两条14肽，考察其结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的能力及对A2780细胞的靶向能力。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒，购自南京艾普瑞纳米材料有限公司；QQTNWSLTVNFKLY肽(记为QT肽)及LSWNTQQTVNFKLY肽(记为LT肽)及荧光标记的两种多肽均委托上海波肽生物有限公司合成。人卵巢肿瘤细胞A2780及鼠成纤维细胞系L929均购自四川大学华西第二医院。RPMI1640培养基购自Gibco公司，碳酸氢钠、磷酸二氢钾、亚铁氰化钾等化学试剂均购自成都科龙化工试剂公司。 主要使用仪器有X射线衍射仪(Philip)、透射电子显微镜(Carl Zeiss)、傅立叶红外光谱仪(Thermo)、热重分析仪(Mettler Toledo)、倒置荧光显微镜(Olympus)、恒温细胞培养箱(Thermo)、酶联免疫检测仪(Molecular Devices)。 2.2. 方法 2.2.1. Fe 3 O 4 纳米颗粒表征 X射线衍射(XRD)对Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒进行物相分析，并采用透射电子显微镜(TEM)进行形貌观察。 2.2.2. 合成多肽与Fe 3 O 4 纳米颗粒结合及表征 将浓度为500 μg/mL的QT肽与LT肽分别与20 mg的Fe 3 O 4 混合后孵育1 h，离心洗去未结合多肽，将结合产物37℃真空干燥。荧光标记多肽与Fe 3 O 4 的结合分析则采用透析法去除未结合多肽。以纯Fe 3 O 4 作为对照。将制备的样品分别进行红外光谱检测分析、热分析、荧光显微镜观察。 2.2.3. Fe 3 O 4 结合多肽后的细胞毒性试验 分别将QT肽及LT肽以500 μg/mL浓度与5 mg的Fe 3 O 4 结合1 h后洗去未结合多肽，再用RPMI1640培养基将Fe 3 O 4 纳米颗粒分别稀释至6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，以未加Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒(0 μg/mL)组为对照。将L929细胞及A2780细胞分别接种至96孔细胞培养板。待细胞贴壁后，将不同浓度的纳米颗粒悬液分别加至培养板中，与细胞共同培养1 d、2 d、3 d后，分别取出培养板，加入20 μL的噻唑蓝(MTT)溶液后继续培养4 h。将液体吸出后，每孔分别加入200 μL的二甲亚砜(DMSO)将沉淀溶解，用酶联免疫检测仪在37℃，490 nm波长下检测吸光度值(OD)。 2.2.4. 普鲁士蓝染色法 QT肽与TVN肽分别以500 μg/mL浓度与5 mg的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合1 h，洗脱未结合的多肽，然后用无血清培养基将材料稀释至100 μg/mL。将培养的L929细胞及A2780细胞分别接种到24孔板上。待细胞贴壁后，将稀释好的材料加入细胞中共培养4 h。培养结束后吸出培养液，用PBS洗涤细胞两遍。每孔加入4%多聚甲醛400 μL固定细胞10 min后吸出固定液风干10 min。再加入400 μL PBS浸泡5 min后吸出。将2%的亚铁氰化钾溶液与2%的HCl溶液以1:1混合后加入细胞培养板，每孔400 μL，室温染色30 min。染色结束后吸出染色液，用PBS洗涤细胞3遍后用显微镜观察染色结果并记录。 2.2.5. 数据分析 实验数据均以平均数 ± 标准差表示。数据分析是采用SPSS 18.0数据分析软件中单因素方差分析(ANOVA)，p < 0.05表示具有显著性差异。
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user: 3. 结果 3.1. Fe 3 O 4 纳米颗粒表征 Fe 3 O 4 纳米颗粒的XRD图谱如图1(A)所示。由图可看到在2θ值为30.3˚、35.7˚、43.5˚、53.9˚、57.5˚、63.2˚分别出现6个较明显的衍射峰。这些衍射峰的位置与强度与尖晶石型Fe 3 O 4 标准卡片(PDF No.75-0449)对比能较好的匹配，分别对应于立方晶相的(220)、(311)、(400)、(442)、(511)和（440）晶面，说明纳米颗粒是尖晶石型Fe 3 O 4 。图1(B)为Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的TEM图片，由图可见，纳米颗粒为不规则形状，且粒径约为10~30 nm。 图1. (A) Fe 3 O 4 的XRD图谱；(B) Fe 3 O 4 的TEM图 3.2. 合成多肽与Fe 3 O 4 纳米颗粒结合表征 图2是QT肽及LT肽与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合的红外谱图。图2(A)中，QT肽由氨基酸组QT肽及其与Fe 3 O 4 结合后(QT-Fe 3 O 4 )的谱图均存在波数为1645 cm −1 、1525 cm −1 和1454 cm −1 处的吸收峰，分别对应酰胺I键、酰胺II键及酰胺III键，QT-Fe 3 O 4 谱图所示波数为570 cm −1 处的峰为Fe 3 O 4 中的Fe-O键的吸收峰，说明QT肽存在。并且QT肽与Fe 3 O 4 结合后，波数为1204 cm −1 及1138 cm −1 的吸收峰(对应于C-O键的伸缩振动)消失，进一步说明QT肽与Fe 3 O 4 并非单纯物理混合而是发生了键联。而在图2(B)中，LT肽与Fe 3 O 4 发生结合后的红外谱图中LT肽的特征峰非常微弱，说明LT肽与Fe 3 O 4 结合能力很弱。 图3为QT肽及LT肽与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合的热分析图。QT肽结合Fe 3 O 4 (图3(B))的TG/DSC曲线中在630℃左右有失重台阶，对比纯Fe 3 O 4 (图3(A))可知，这是结合在Fe 3 O 4 表面的肽分解所造成。说明QT肽与Fe 3 O 4 发生了结合，结合量约为总质量的1%。而LT肽结合Fe 3 O 4 后的TG/DSC曲线(图3(C))与纯Fe 3 O 4 基本相同，说明LT肽未与Fe 3 O 4 纳米颗粒结合或结合量很少。 图4为荧光显微镜观察荧光标记的QT肽及LT肽与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合结果。图4(a)为荧光标记LT肽与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合结果，由图可见，荧光非常微弱甚至无荧光，说明LT肽几乎与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒不发生结合。图4(b)显现的荧光说明荧光标记的QT肽已与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒发生结合。此结果与红外分析结果及热分析结果均说明LT肽不能与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒结合或结合非常微弱，因此仅采用能较强结合的QT肽进行后续试验。 3.3. 细胞毒性及细胞靶向试验 图5为QT肽结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒后对L929及A2780细胞的毒性试验结果。图5(A)表明纯Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒对L929细胞无明显毒性，图5(B)表明QT肽结合的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒对L929细胞具有一定促进增殖的作用，图5(C)表明纯Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒在第1天与A2780细胞作用时稍微抑制细胞增殖，而在第2天与第3天促进细胞增殖，可能是由于在第1天A2780细胞对Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒应激效应明显，而第2、第3天纳米颗粒被细胞吞噬形成表面包覆层而减少对细胞伤害。图5(D)表明QT肽结合的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒对A2780细胞增殖具有一定抑制作用。 图6为QT肽结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒后与A2780细胞结合的普鲁士蓝染色结果。图6(A)所示为QT肽结合的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒，由图中可见，较多的纳米颗粒结合于A2780细胞表面，图6(B)及图6(C) 图2. Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒与短肽结合的FT-IR图谱：(A) QT-Fe 3 O 4 ；(B) LT-Fe 3 O 4 分别为TVN肽结合的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒及纯Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒对A2780细胞的结合，两图中均只见少量纳米颗粒结合于细胞而被染色，比较可知QT肽结合的Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒对A2780细胞具有一定程度的特异亲和性，推断QT肽具有靶向A2780细胞的作用。 图4. 荧光显微镜观察多肽与Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的结合：(A， a) LT-Fe 3 O 4 ；(B， b) QT-Fe 3 O 4 ；(C) 纯Fe 3 O 4 (标尺：100 μm) 图6. 普鲁士蓝染色观察QT-Fe 3 O 4 与A2780细胞的结合：(A) QT-Fe 3 O 4 ；(B) TVN-Fe 3 O 4 ；(C) 纯Fe 3 O 4 (标尺：100 μm)
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user: 4. 讨论 本研究中首先将特异性结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的TVNFKLY肽与特异性结合肿瘤细胞A2780的QQTNWSL肽按照不同顺序合成了两条14肽，分别是QQTNWSLTVNFKLY肽及LSWNTQQTVNFKLY肽，并研究合成多肽是否具有结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒及靶向肿瘤细胞的能力。通过不同材料分析方法说明合成的14肽QT仍具有结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的能力，而另一条14肽LT则丧失了结合能力。通过细胞毒性试验说明QT肽结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒后对L929细胞具有较好的细胞相容性，而对肿瘤细胞A2780则有一定抑制作用。普鲁士蓝染色法证实QT肽结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒后对A2780细胞具有较好的结合能力。说明合成的14肽QQTNWSLTVNFKLY具有同时结合Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒与A2780细胞的能力。此外，多肽在磁性纳米颗粒表面的修饰还可能具有降低其免疫原性，改善磁性纳米颗粒分散性等作用。因此，所合成双功能多肽用于Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒的主动靶向是可行的。 目前，Fe 3 O 4 磁性纳米颗粒应用于肿瘤主动靶向的研究是一个热门课题，其发展迅速，随着纳米生物技术的发展，主动靶向磁性纳米颗粒必将显示出巨大的应用价值。
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user: 摘 要 MnFe 2 O 4 纳米粒子在核磁共振成像和肿瘤磁热疗的应用上具有很大潜力。但是其应用于生物医学领域的主要障碍是难以制备形貌均一、分散性好、磁性能优异且生物相容性良好的MnFe 2 O 4 纳米粒子。目的：通过F127调控下的共沉淀法制备粒径均匀且磁性能较好的MnFe 2 O 4 纳米粒子，且通过普朗尼克F127的修饰提高其分散性并降低MnFe 2 O 4 纳米粒子的细胞毒性。方法：以F127为模版，采用共沉淀法制备MnFe 2 O 4 磁性纳米粒。利用X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、振动样品磁强计(VSM)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)等对样品的成分、微观结构、形貌和粒径以及磁性能进行表征。通过MTT实验对样品的细胞毒性进行评价。结果：采用普朗尼克F127调控下的共沉淀法成功制备大约50 nm的球形MnFe 2 O 4 铁磁性纳米粒子，其比饱和磁化强度为44.8 emu/g，对HUVEC细胞无明显毒性。结论：共沉淀过程中，F127能够控制MnFe 2 O 4 纳米粒子的形貌、粒径，从而提高其磁性能，另外还可以降低其细胞毒性。该方法在生物医学应用上具有很大的潜力。 关键词 :MnFe 2 O 4 纳米粒子，普朗尼克F127，共沉淀法，铁磁性，细胞相容性