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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 紫玉淮山块茎：薯块均匀、表面粗糙，长圆柱形半径1.5 cm，长1 m，肉质深紫色，有许多芽眼，种薯来源于桂林市永福县罗锦镇淮山种植基地。 2.1.1. 实验试剂 硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锌、铝酸钠、硫酸亚铁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖、琼脂粉、多效唑、萘乙酸、6-苄基氨基嘌呤、苯并吡喃酮等，均为化学纯。 2.1.2. 主要试验器材 SW-CJ-JC型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、JZ-II接种器械灭菌器(济南普朗特生物科技有限公司)、YXQ-LS-75II型高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。 2.2. 方法 2.2.1. 薯种催芽 将紫玉淮山块茎置于经0.1 mg/L的高锰酸钾溶液消毒过的河沙中，放在大棚(温度约25℃~27℃)内催芽，定期浇水。待到的茎芽长到3~5 cm长时，剪取生长旺盛的约2 cm长的带节茎段作为启动培养的外植体。用软毛刷在自来水下轻轻刷洗茎尖，用清洁液轻轻洗3~4次，再将初步清洁的带节茎段置于流动的自来水下冲洗2 h。把处理后的茎段放到超净工作台中，备用。 2.2.2. 不同时间的0.1% HgCl 2 灭菌处理对外植体的影响 将催芽长出的茎段先用0.001 mg/L浓度的扑海因对茎段喷雾1小时后，取茎段作外植体，先用75%的酒精消毒30 s，再用0.1% HgCl 2 灭菌，时间分别为5 min、6 min、7 min，分别标记为A、B、C；消毒过程要不断摇动锥形瓶，接着用无菌水清洗3~5次，用镊子将上述方法消毒后的紫玉淮山茎段夹到装有无菌滤纸的培养皿，备用。 2.2.3. 培养基 ① MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L; ② MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 5% 马铃薯; ③ MS + PP 333 (0.1~0.6) mg/L; ④ MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA (0.1~0.6) mg/L; ⑤ MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.4 mg/L; ⑥ MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 香豆素(10~60) mg/L; ⑦ MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.4 mg/L + 香豆素(50~300) mg/L。 所有培养基中均加入30 g/L蔗糖 + 活性炭1 g/L + 5.2 g/L琼脂粉，pH 6.8 (下同)。 2.2.4. 有关指标的计算 1) 污染率 = (污染材料数量/接种材料总数量) × 100%； 2) 成活率 = (成活材料数量/接种材料总数量) × 100%； 3) 愈伤组织诱导率 = (产生愈伤组织材料数量/接种材料总数量) × 100%； 4) 芽增殖数 = 增殖后芽的总数 − 增殖前芽的总数。 2.2.5. 培养条件 培养室温度25˚C ± 2˚C，湿度65%~70%，光照强度为2000~2500 Lx，光照时间为14 h/d (下同)。 2.2.6. 启动培养 将经过不同时间消毒的紫玉淮山茎段，放在装有无菌滤纸的无菌培养皿里，用解剖刀切掉茎段的伤口，去掉幼叶，直到露出光滑生长点，用解剖刀切下长0.5~1 cm的芽点，接种在①号培养基上培养，每瓶接3个芽，放在培养室培养。定期观察外植体生长情况，培养30 d后，统计顶芽的污染率和死亡率。 2.2.7. 继代培养 把在培养室启动培养所得无菌芽，剪成约1~1.5 cm长的带有一个腋芽的茎段，接到②号培养基上进行继代培养，每瓶接5个茎段，再放在培养室里继续培养，30 d后对紫玉淮山的生长状况进行观察、记录。 2.2.8. 不同浓度的PP 333 对芽增殖的影响 本实验主要研究单因子激素PP 333 对紫玉淮山芽增殖的影响。把在培养室继代无菌培养30 d后的无菌芽，剪成约1~1.5 cm长的带有一个腋芽茎段，接到添加不同浓度PP 333 (0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L)的MS培养基上，每瓶接5个茎段，每个实验重复10次，放在培养室里培养。30 d后，观察并记录每个实验芽的生长状况，统计芽增殖数，见表1。 2.2.9. 不同激素组合对生根的影响 把诱导生根的培养基配置成添加6-BA 0.2 mg/L和NAA (0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L)浓度的组合MS培养基，在超净工作台，将继代培养所得到的健壮、没有生根的试管苗切成1.5 cm左右长的带 Table 1 Bud induction culture medium formula of different concentrations of PP33 培养基编号 PP 333 (mg/L) D1 0.1 D2 0.2 D3 0.3 D4 0.4 D5 0.5 D6 0.6 表1. 不同PP 333 浓度的丛生芽培养基配方 注1：D1~D6分别表示0.1~0.6 mg/L的PP 333 浓度的诱导丛生芽培养基编号(下同). Note 1: D1~D6， respectively， indicates the number of the induced cluster buds of the PP333 concentration of 0.1~0.6mg/L， (the same below). 有一个腋芽的茎段，每瓶接5个茎段，每个实验重复10次，放在培养室里培养，30d后观察并记录生根数，见表2。 2.2.10. 不同浓度香豆素对试管薯诱导的影响 把诱导试管薯的培养基配置成添加6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.5 mg/L和不同浓度的香豆素(10、20、30、40、50、60 mg/L)的MS培养基，将继代培养所得的长势良好、健壮的试管苗切成约2.5~3 cm的茎段，接到⑥号培养基上，在培养室内培养。30 d后观察并统计紫玉淮山的结薯数，见表3。 2.2.11. 不同浓度香豆素对零余子诱导的影响 淮山除地下长薯外，还有一个独特的繁殖生物学特性，即地上的藤蔓上也长有零余子；零余子就是珠芽着生于叶腋，呈球形或卵圆形不等。零余子不仅可食用，还具重大的医疗价值 [ 16 ] 。此外，零余子易成活，且易进行种质交换；繁殖系数高，是淮山重要的繁殖器官。因此，诱导紫玉淮山的零余子有很大研究意义。 在实验过程中把诱导试管薯的培养基配置成添加6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.4 mg/L和不同浓度的香豆素(50、100、150、200、250、300 mg/L)的MS培养基，每个梯度设置8瓶，共48瓶。将继代培养所得的长势良好、健壮的试管苗切成约3 cm左右的茎段，每瓶转接5个茎段到各个梯度的⑦号培养基上，并放置培养室内培养，见表4。 Table 2 Root induction culture medium formula of different concentrations of NA 培养基编号 6-BA (mg/L) NAA (mg/L) E1 0.2 0.1 E2 0.2 0.2 E3 0.2 0.3 E4 0.2 0.4 E5 0.2 0.5 E6 0.2 0.6 表2. 不同NAA浓度的生根诱导培养基配方 注2：E1~E6分别表示0.2mg/L 6-BA和0.1~0.6 mg/L的NAA浓度组合的生根培养基编号(下同). Note 2: E1~E6， respectively， indicates the number of the rooting medium of the combination of NAA concentration of 0.2 mg/L 6-BA and 0.1~0.6 mg/L (the same below). Table 3 Microtuber induction culture medium culture medium formula of different concentrations of coumari 6-BA (mg/L) NAA (mg/L) 香豆素(mg/L) F1 0.2 0.5 10 F2 0.2 0.5 20 F3 0.2 0.5 30 F4 0.2 0.5 40 F5 0.2 0.5 50 F6 0.2 0.5 60 表3. 不同香豆素浓度的试管微薯诱导培养基配方 注3：F1 ~F6分别表示10~60 mg/L的香豆素浓度的诱导试管微薯培养基编号(下同). Note 3: F1~F6， respectively， indicates the number of the induced microtuber medium of the coumarin concentration of 10~60 mg/L， (the same below). Table 4 Bulbil induction culture medium formula of different concentrations of hormon 培养基编号 6-BA (mg/L) NAA (mg/L) 香豆素(mg/L) H1 0.2 0.4 50 H2 0.2 0.4 100 H3 0.2 0.4 150 H4 0.2 0.4 200 H5 0.2 0.4 250 H6 0.2 0.4 300 表4. 不同激素浓度的试管零余子诱导培养基配方 注4：H1 ~H6分别表示50~300 mg/L的香豆素浓度的诱导试管零余子培养基编号(下同). Note 4: H1~H6， respectively， indicates the number of the induced Purple yam bulbil (Pearl bud) medium of the coumarin concentration of 50~300 mg/L， (the same below). Table 5 Effect of 0.1%HgCl2 sterilization on explants at different time 灭菌时间min 接种个数(个) 污染率(%) 死亡率(%) 成活率(%) A(5) 33 70.00 20.56 79.44 B(6) 47 50.00 17.64 6.38 C(7) 45 30.00 13.78 15.55 表5. 不同时间的0.1%HgCl 2 灭菌处理对外植体的影响 注5：A(5)、B(6)、C(7)分别为0.1% HgCl 2 灭菌处理外植体5 min、6 min和7 min. Note 5: A (5)， B (6)， C (7) were sterilized with 0.1% HgCl 2 ， respectively， 5 min， 6 min and 7 min.