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user: 3. 慢性HBV感染的免疫治疗 3.1. 靶向固有免疫系统 在病原体感染机体的过程中，病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns， PAMP)与主要表达在宿主固有免疫细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)相互作用，使微生物病原体被固有免疫系统识别，从而诱导固有免疫应答。PPR包括Toll样受体(Toll-like receptors， TLR)，RIG-I样受体(RIG-I like receptors， RLR-I)和NOD样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors， NLR)等。最近的研究表明，宿主PPR可以识别HBV，诱导细胞因子释放，限制病毒的复制 [ 15 ]。 3.1.1. TLR激动剂 TLR参与抗病毒反应的多个环节，能够激活固有免疫系统，启动细胞内信号传导途径，诱导IFN和其它细胞因子释放，具有连接固有免疫和适应性免疫的桥梁作用。研究发现，CHB患者的抗病毒治疗会引起TLR表达的上调和其先天抗病毒功能的恢复 [ 16 ]。因此，活化TLR可以作为治疗CHB的一种免疫治疗方法。 GS-9620是一种口服的TLR7激动剂，目前处于治疗CHB的Ⅱ期临床试验阶段。在动物模型中，GS-9620能长期抑制HBV抗原和HBV DNA的血清水平。GS-9620能优先激活肠道和肝脏中的pDCs，诱导产生IFN-α [ 17 ]，然后诱导B细胞反应和CD8 + T细胞反应。同时GS-9620诱导的肝内B细胞应答可能在HBsAg血清学转换中起重要作用 [ 18 ]。TLR8主要表达在单核细胞和髓样树突状细胞中，与抗病毒免疫应答密切相关，但在CHB患者体内，TLR8功能障碍。GS-9688是一种口服的TLR8激动剂，能诱导免疫调节性细胞因子和抗病毒性细胞因子产生，激活CD8+T细胞和NK细胞，目前处于治疗CHB的II期临床试验阶段。根据已公布的前期临床数据来看，GS-9688具有良好的安全性和耐受性，并能诱导病毒学应答 [ 19 ]。 3.1.2. RIG-I和NOD激动剂 SB9200是由Spring Bank Pharmaceuticals开发的新型小分子核酸杂交化合物，通过激活PRR (RIG-I蛋白与NOD2蛋白)，参与细胞识别病毒RNA的过程。目前处于治疗HBV感染的II期临床试验阶段。SB9200具有双重抗病毒机制，一方面通过诱导内源性IFN，选择性上调宿主对病毒的免疫应答，促进病毒清除。另一方面，通过抑制病毒聚合酶活性，阻断病毒的复制。由于SB9200是通过靶向宿主参与免疫应答的蛋白发挥抗病毒作用，而不是直接作用于病毒，所以其产生耐药性的可能较小 [ 20 ]。 3.2. 靶向适应性免疫系统 在CHB患者体内，虽然体液免疫障碍的机制尚不明确，但高水平的抗原、HBV DNA、免疫抑制性细胞因子、免疫抑制的微环境和多种抑制信号导致特异性T细胞耗竭和功能障碍，机体对HBV感染呈现免疫耐受状态，不能启动有效的适应性免疫应答清除HBV。因此，借助免疫疗法打破CHB患者的免疫耐受状态，增强或重建患者病毒特异性免疫应答，成为治疗CHB的热点方向。 3.2.1. 治疗性疫苗 自1982年预防性HBV疫苗应用以来，HBV感染的发病率已显著下降，但是每年仍有数百万人感染HBV，而预防性HBV疫苗对已感染的患者无治疗作用。近年来随着对CHB感染病理机制的研究，通过诱导特异性免疫应答，达到治疗目的治疗性疫苗开始受到人们关注。治疗性疫苗主要分为基因工程蛋白疫苗、DNA疫苗、细胞疫苗等。 基因工程蛋白疫苗是将具有较强抗原性的HBV核衣壳蛋白或核心抗原(hepatitis B core antigen， HBcAg)进行修饰后接种给病人，诱导机体产生特异性细胞免疫。在转基因小鼠模型中，由HBsAg、HBcAg和CpG寡脱氧核糖核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides， CpG ODN)佐剂组成的疫苗制剂可以诱导强烈的HBV特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，克服HBV转基因小鼠的耐受性。CpG ODN佐剂不仅诱导了强烈的Th1反应性，而且在C57BL/6和HBV转基因小鼠中，促进了针对HBcAg的Th1应答强度，平衡了针对HBsAg的Th1/Th2应答强度，这对于HBV治疗性疫苗发挥预期疗效十分重要 [ 21 ]。 DNA疫苗是将包含HBV抗原蛋白DNA序列的表达载体导入机体，在体内表达病毒抗原，诱导机体产生特异性免疫应答。INO-1800是一个多抗原(A基因型和C基因型HBsAg、HBcAg)DNA治疗性乙肝疫苗。临床Ⅰ期数据显示，INO-1800具有良好的安全性和耐受性，能激活并促进CD8 + T细胞增殖，受试者能够产生HBV特异性T细胞免疫应答，这些T细胞能识别HBV的关键组分，并产生细胞因子(如IFN-γ)清除肝脏内的HBV [ 20 ]。 DC细胞是目前已知抗原呈递功能最强的专职抗原呈递细胞，能诱导特异性的T细胞免疫应答。有临床研究发现，体外用HBsAg冲击致敏DC后，皮下注射DC疫苗两次，19名患者中，10人HBeAg消失，5人发生HBeAg血清学转换，2人HBV DNA水平降至检测限以下 [ 22 ]。而在另一项试验中，5名健康受试者接受单次DC疫苗注射，2名anti-HBs(+)受试者和2名anti-HBs(−)受试者体内的anti-HBs水平均上调，且没有任何不良反应出现 [ 23 ]。这些结果表明DC疫苗具有良好的应用前景。 3.2.2. 免疫检查点抑制剂 程序性死亡受体1 (programmed cell death protein 1， PD-1)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4， CTLA-4)在CHB患者病毒特异性CD8 + T细胞上过表达，已被证实与病毒特异性CD8 + T细胞的功能障碍有密切联系。与CD8 + T细胞类似，CTLA-4上调后，CD4 + Th细胞增殖受阻，CD4 + Th细胞的分化向Th2极化，抗炎细胞因子水平升高，而促炎细胞(Th1和滤泡辅助性T细胞)的活化被阻断，促炎细胞因子的水平下降 [ 24 ] [ 25 ]。因此利用免疫检查点抑制剂阻断相关信号通路，或许可以重新激活CHB患者体内的病毒特异性T细胞应答，达到治疗目的。 研究发现，在小鼠模型中，利用anti-PD-1 mAb阻断PD-1/PD-L1信号通路，肝内T淋巴细胞IFN-γ表达量上调，并且逆转了肝内T淋巴细胞的耗竭表型，恢复其部分功能，实现病毒清除。这证明阻断PD-1可逆转CHB患者的免疫功能障碍和HBV持续性感染状态，anti-PD-1 mAb可成为治疗CHB的良好候选药物 [ 26 ]。2017年开展了一项评估anti-PD-1 mAb nivolumab与治疗性疫苗GS-4774联合治疗HBeAg(−)CHB患者的临床Ⅰ期试验，结果表明患者对高达0.3 mg/kg的单剂量nivolumab具有良好的耐受性，接受nivolumab治疗的患者HBsAg显着下降，而联合GS-4774用药没有额外的治疗益处，证明检查点阻断或类似的方法可以让HBeAg(-)患者达到功能性控制HBV的疗效 [ 27 ]。 3.2.3. 嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy， CAR-T) 嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy， CAR-T)是指利用基因工程技术赋予患者T细胞不依赖人类淋巴细胞抗原(human lymphocyte antigen， HLA)特异性识别抗原的能力，在体外大量扩增改造后的T细胞，然后回输至病人体内，从而发挥靶向杀伤作用，增强机体免疫应答。由于CHB患者体内HBV特异性免疫细胞数量较少，且呈耗竭状态，尤其是在具有高水平HBsAg和HBV DNA的HBeAg(+)患者体内，想要通过激活体内现存的HBV特异性T细胞，恢复HBV特异性免疫应答十分困难 [ 9 ]，所以将CAR-T用于CHB治疗，或许能改善这一情况。 HBsAg-CAR-T已经被证明可以在体外清除感染HBV肝细胞中的cccDNA，并在转基因HBV小鼠中展现出短暂的抗HBV活性 [ 28 ]。但由于HBV转基因小鼠每个细胞均整合有病毒基因组，所以无法评估HBV-CAR-T能否清除肝细胞中的病毒。为此研究人员在HBV感染的人肝脏嵌合小鼠模型中进行了试验，结果表明HBsAg-CAR-T可以有效降低HBV DNA和HBsAg的水平，并浸润到肝脏组织中，以非细胞溶解的方式发挥抗病毒作用。但在另一项人肝嵌合的 TK-NOG 小鼠试验中，发现在给小鼠输入供体HBV血清反应阳性的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMCs)后，谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase， ALT)水平上升，肝细胞受损。说明靶向细胞表面和分泌型HBsAg的T细胞与靶向HLA分子呈递的病毒多肽的T细胞在发挥抗病毒作用时，机制有所差别 [ 29 ]。2015年，研究人员首次利用HBsAg-CAR-T治疗HBV相关肝癌转移的患者，结果表明在适应性免疫应答重建过程中，HBsAg水平被显著抑制 [ 30 ]。 尽管CAR-T免疫治疗法展现出良好的治疗前景，但是由于其定制化治疗的特性以及生产工艺复杂的难点，导致费用高昂，目前还无法在临床上大规模应用。 3.2.4. T细胞双特异性抗体(T cell engaging bispecific antibody， T-BsAb) 鉴于CAR-T个体化治疗费用高，技术复杂的难点。研究人员设想构建一种同时靶向HBV抗原表位和T细胞表位的T-BsAb，该抗体具有生产可控性，不针对个体开发，可以供给大多数患者使用，能激活CHB患者体内的T细胞产生HBV特异性细胞免疫应答，以细胞溶解或非细胞溶解的方式清除HBV。早期研究表明，在裸鼠肝癌移植瘤模型中，anti-HBxAg/anti-CD3 BsAb不仅增强了效应细胞对肿瘤细胞的靶向性，特异性裂解乙肝X抗原(hepatitis B x antigen， HBxAg)阳性的HCC细胞，还诱导了外周淋巴细胞浸润肿瘤组织 [ 31 ]。 鉴于蛋白类的T-BsAb，也存在如生产工艺复杂，半衰期短需持续给药，血液循环中的病毒粒子与抗体结合形成免疫复合物可能致使病人患免疫复合物病，以及由抗体激活全身T细胞引起继发性副作用等缺点。研究人员尝试通过将编码anti-HBsAg/anti-CD3 BsAb的载体导入肝脏细胞，在肝脏局部区域表达T-BsAb来解决上述问题。在小鼠模型中，注射编码抗体的质粒一天后，抗病毒反应达到峰值，T-BsAb介导了有效的抗病毒反应，T-BsAb主要以非细胞溶解的方式介导抗病毒作用。研究还发现抗体并未将外周的T细胞募集到肝脏，而是直接激活肝脏中T细胞发挥抗病毒作用，并检测到高水平anti-HBsAg IgG抗体的产生，表明T-BsAb促进了宿主的适应性免疫应答。但由于该动物模型属于急性HBV感染模型，所以目前无法判定T-BsAb能否在CHB患者中发挥同样效果 [ 6 ]。