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user: 2. 材料与方法 2.1. 采样过程 于2016年11月24日在江苏省某滨海化工园区临近河流采集排水口下游10 m处的水体。使用采样瓶为10 L的棕色玻璃瓶，实验所采用的玻璃样品瓶在使用前用经自来水、纯净水、丙酮和纯净水依次冲洗，确保样品容器清洁。玻璃瓶在采样前用实际水样冲洗3次，所采水样当天运回实验室，低温冷藏环境下保存。 2.2. 样品前处理 样品前处理过程是影响调查分析方法准确度和重现性的重要因素 [ 3 ]。入海河流水体中含有多种有机污染物，这些有机物的理化性质差异很大，本工作拟采用广泛应用于水样前处理的固相萃取技术(Solid-Phase Extraction， SPE)。通过选择不同的固相吸附剂和洗脱溶剂能够将目标化合物与其他成分和基质进行较好地分离。但现有方法通常仅针对已知目标组分设计，不符合污染物定性调查的需求。为达到快速筛查水中多组分污染物的目标，需要在样品前处理过程中尽可能多的富集和洗脱不同性质的多组分物质。 根据有机物的理化性质，从以下四个方面建立前处理方法： 1) 固相萃取吸附材料的选择。HLB(由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物)和C18(十八烷基硅烷粉)为常用固相萃取小柱的填充材料。根据商业固相萃取小柱说明，HLB柱对非极性物质的回收率偏低，适用于分离极性较强的物质；而C18柱适合萃取非极性或弱极性物质，对强极性物质的回收率则明显下降 [ 4 ]。有研究证明，包括不同极性农药、多环芳烃、雌激素和酚类等水体中不同类型物质的前处理，C18柱串联HLB柱固相萃取的效果较为理想 [ 5 ]。因而，采取C18柱串联HLB柱固相萃取的方法可同时提高水样中不同性质化合物的富集效率。 2) 调节水样的pH。在对极性物质的固相萃取时，调节水样的pH值可以提高目标物的回收率，如酚类和羧酸在酸性条件下萃取效果较好，而胺类在碱性条件下的萃取效率更高。有部分水体有机污染物定性研究采用液液萃取法，先后在中性、碱性(pH > 11)以及酸性(pH < 2)条件下分别萃取并合并有机相 [ 6 ]，目的在于尽可能提高各极性有机污染物的萃取效率，但该方法会造成不同极性的有机污染物在不同萃取条件下的差异性无法体现，不利于后期的物质定性。因此，本研究将水样分成三份，分别调至酸性(pH = 3)、中性(pH = 7)和碱性(pH = 11)分别进行固相萃取。 3) 选择适当的洗脱溶剂。洗脱溶剂对目标物具有选择性，根据相似相溶原理，选择溶剂极性差异较大的正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇等按一定比例配成混合液，可提高对不同极性的目标物的萃取效率。根据相关研究结果 [ 5 ]，本研究选用过量的二氯甲烷和甲醇混合液(体积比1:1)和正己烷和二氯甲烷混合液(体积比1:1)分别洗脱HLB柱和C18柱。 4) 温度控制。由于某些有机物具有较强的挥发性和热不稳定性，如酚类，在萃取浓缩过程中应注意温度控制，氮吹浓缩温度控制40℃以下。 根据以上要求设计样品前处理实验步骤见图1。 将4 L水样经0.7 μm玻璃纤维滤膜(英国Whatman)过滤，去除悬浮颗粒物；将过滤后的水样分装于4个玻璃瓶中，每瓶盛有水样1 L，其中1份水样留作备用，将其余3份水样分别用盐酸和氢氧化钠调至酸性(pH = 3)、中性(pH = 7)和碱性(pH = 11)；将经过pH调节的3份水样，分别用Oasis HLB(200 mg，6 mL，美国Waters公司)和C18 (200 mg，6 mL，美国Supelco Inc.公司)固相萃取小柱串联对水样进行固相萃取，HLB柱同时适用于极性较强和较弱化合物的萃取，而C18柱适用于萃取非极性和弱极性化合物。HLB柱和C18柱依次用5 mL的二氯甲烷、5 mL甲醇和15 mL超纯水进行活化，水样通过SPE小柱的流速控制为5 mL/min。富集水样的HLB 和C18小柱用不同的溶剂进行洗脱，其中，HLB柱用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合液15 mL分3次(各5 mL)进行洗脱，C18柱用体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷混合液15 mL分3次(各5 mL)进行洗脱，洗脱速度控制为1~2 mL/min，所用溶剂均为色谱纯，来自德国默克公司。2种柱子的6份洗脱液分别用无水硫酸钠脱水，氮吹定容至1.0 mL，氮吹温度控制在40℃以下。 图1. 样品前处理实验步骤示意图 2.3. 样品分析 样品使用Agilent7890A-5975C气相色谱质谱联用仪分析测定，仪器条件设置为：载气为高纯氦气；采用不分流进样，进样体积为1 μL；进样口温度260℃；采用Full scan模式。初始柱温为50℃；稳定2 min，程序升温(5℃/min)至300℃；恒温10 min。质谱仪采用EI离子源；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；EI电压为70 eV；扫描范围为50~300 amu。 通过以下步骤获得目标物的定性分析结果：1) 将实验测得的水样总离子图与工作站里贮存的NIST11谱库中的谱图相比较，筛选出可能性最高的对应谱图来确定该有机污染物的名称；2) 对于未知物质的定性，以谱库检索匹配度大于50%并结合人工解谱来确定；3) 当基线干扰过高或目标物响应偏低时，应采用解卷积技术(DRS)以提高解谱的准确性。 2.4. 重点目标物定量 根据样品定性分析结果，选择出现频率高、色谱峰面积大、对水环境影响较严重的邻苯二甲酸酯和农药乐果进行定量分析，以评估入海河流的水质污染情况。 16种邻苯二甲酸酯标准溶液，浓度为1000 mg/L，来自美国o2si公司，标准物质包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸双(2-甲氧基乙)酯(DMEP)、邻苯二甲酸双-4-甲基-2-戊酯(BMPP)、邻苯二甲酸双-2-乙氧基乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二正己酯(DHXP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁氧基乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)；乐果农药标准溶液，浓度为100 mg/L，来自美国o2si公司。以正己烷为溶剂配制邻苯二甲酸酯和乐果的标准溶液，浓度分别为0.5，1，2，5，10 μg/mL，用于标准曲线的测定。 2.5. 重点目标物定量 根据美国国家环保局生态毒性数据库(http://cfpub.epa.gov/ecotox)获得邻苯二甲酸酯类化合物对不同物种(藻类、脊椎动物、无脊椎动物)水生生物的毒性参数(NOEC/LOEC、LC 50 、EC 50 )，其中脊椎动物选择鱼类，无脊椎动物选择甲壳类，评价终点选择反映物种死亡率、存活率或繁殖率等。毒性数据的选择 [ 7 ]：对于藻类，一般选择4~7天的毒性数据；鱼类选择96 h的LC 50 /EC 50 ，大于14天的NOEC/LOEC，且测试条件为淡水、实验室环境；大型溞选择48 h的LC 50 /EC 50 ，大于7天的NOEC/LOEC。 使用商值法表征风险，商值法可以针对选定的评价受体计算化合物的风险商值(Risk Quotient， RQ)： R Q = M E C / P N E C (1) 式中，MEC为测定环境浓度(measured environmental concentration，MEC)，PNEC为预测无影响浓度(predicted no effect concentration， PNEC)。若RQ < 0.1，则为低风险，0.1 ≤ RQ < 1，则为中等风险，RQ ≥ 1，则为高风险 [ 8 ]。 水体中的PNEC值的推导采用评价因子(assessment factor，AF)法 [ 9 ]，依据表1的评价因子选取原则。PNEC为L(E)C 50 或NOEC与相应AF的比值。 Table 1 The values of assessment factors (AF) for deriving the predicted no-effect concentrations (PNEC 序号 现有毒性数据 AF 1 3个营养级(鱼、溞和藻)中至少1种生物的急性L(E)C 50 数据 1000 2 1种生物(鱼或溞)的慢性NOEC数据 100 3 代表2个营养级的2种生物(鱼、溞和藻中任意2种)的慢性NOEC数据 50 4 至少代表3个营养级的3种生物(鱼、溞和藻)的慢性NOEC数据 10 表1. 推导预测无影响浓度(PNEC)所用的评价因子(AF)的取值 注：L(E)C 50 为半致死(效应)浓度；NOEC为无观察效应浓度。