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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 2.1.1. 实验原材料 医用明胶海绵1块，由青岛大学附属医院提供。MC3T3-E1细胞，由青岛大学再生中心提供，新鲜猪膝关节，由青岛大学再生中心提供。海藻酸钠，由青岛大学再生中心提供。 2.1.2. 主要试剂 1) 高糖DMEM培养液：将高糖DMEM粉末1袋加入1 L容量大烧瓶，以超纯水注入至终体积1 L，搅拌均匀后分装至无菌盐水瓶，密封、高温灭菌后保存，并加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素备用。 2) PBS液配制：将PBS粉一袋加入1 L容量大烧瓶，以超纯水注入至终体积1 L，搅拌均匀后分装至无菌盐水瓶，密封、高温灭菌后保存。 3) 0.25%胰蛋白酶溶液(含有0.02% EDTA二钠)：将胰蛋白酶溶解于PBS中并加入EDTA。 4) 诱导液：将DMEM (10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素) 118.5 ml和240 ul地塞米松、120 ul VitC、1.2 ml β-磷酸甘油钠混合所得。 5) 2D培养基：DMEM添加20%胎牛血清，0.4 × 10 −3 ml脯氨酸，0.1 × 10 −3 ml非必需氨基酸，0.01mg 4-(2-羟乙基)-哌嗪1-乙基磺酸，0.05 mg/mL维生素C，100单位/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素。 6) 3D培养基：DMEM添加20%胎牛血清，0.4 × 10 −3 ml脯氨酸，0.1 × 10 −3 m非必需氨基酸，0.01 mg 4-(2-羟乙基)-哌嗪1-乙基磺酸，0.05 mg/mL维生素C，100单位/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素和含有10%胎牛血清的DMEM，其比率为1:2。 2.1.3. 主要仪器及实验物品 电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；电热鼓风干燥箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；微量天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；荧光显微镜，Nikon ECLIPSE Ti；微波炉，美的；无菌50 mL离心管；无菌15 mL离心管；24孔板；血球计数板；镊子；无菌吸水纸；无菌剪刀；全功能微孔板检测仪，美国伯腾仪器有限公司；高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；细胞筛，北京索莱宝科技有限公司。 磷酸盐缓冲液(PBS)，以色列BI公司；DMEM高糖培养基，以色列BI公司；非必需氨基酸，大岛生物公司；青霉素，链霉素，美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)，以色列BI公司；胰蛋白酶，美国Gibco公司；乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠)，北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖粉末，广州赛国生物科技有限公司；碱性磷酸酶活性检测试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司；RIPA裂解液，北京索莱宝科技有限公司；糖胺多糖检测试剂盒，上海一研生物科技有限公司。 2.2. 实验方法 2.2.1. 明胶海绵支架制备 准备适量明胶海绵，在超净台下使用灭菌后的手术刀或剪刀将明胶海绵切成0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm小块，共40块，放置于干净培养皿中，紫外灯照射约5小时。 2.2.2. 消化MC3T3-E1细胞 1) 取MC3T3-E1细胞(在DMEM含10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素中培养)于超净台下分别使用吸管吸除培养基。 2) 使用吸管吸取PBS约3 ml加入到每个培养皿中，前后震荡几次，吸除PBS。 3) 吸取胰蛋白酶约3 ml于每个培养皿中，放置37℃含5%的CO 2 培养箱中约4~5 min，取出培养皿，于光镜下观察确定。 4) 确认细胞已被胰酶消化下来(细胞由梭形变为椭圆形即为被胰酶消化下来，部分细胞可能与皿底粘附较紧，可适当震荡培养皿使细胞悬浮)。 5) 于含MC3T3-E1细胞的每个培养皿中加入DMEM (含10% FBS + 1% P/S培养基)约3 ml稀释胰酶，吸取细胞悬液置于离心管中。分别计算离心管中的细胞悬液体积。 6) 分别于光镜下在计数板中计算每ml细胞悬液中消化MC3T3-E1细胞密度，计算离心管中总的细胞数量。 2.2.3. 向明胶海绵支架上种植细胞 1) 将含MC3T3-E1细胞悬液在37℃下于离心机1000 rmp离心5 min，倒掉上清液。 2) 向含MC3T3-E1细胞离心管中加入DMEM (10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素)将细胞密度浓缩为5 × 10 6 /ml，吹打混匀，将细胞悬液平均加到之前紫外照射过的40块明胶海绵上，可用枪头挤压海绵，使海绵充分吸收细胞悬液，将含有细胞悬液的明胶海绵放到37℃含5%的CO 2 培养箱约30 min，后取出备用。 3) 配置1%琼脂糖溶液，取4块12孔板，每孔加入1 ml琼脂糖溶液，待其充分凝固后，每孔加入DMEM含10% FBS + 1% P/S培养基3 ml，用灭菌过的镊子夹取含有细胞悬液的明胶海绵放入(1个/孔)，后放入37℃含5%的CO₂培养箱中培养。 4) 增殖细胞：培养前3天，不进行处理使细胞充分增殖。 2.2.4. 诱导MC3T3-E1细胞分化 1) 培养3天后，即第4天，配置诱导液，对培养的细胞进行诱导分化。 2) 诱导7天即培养第10天停止诱导。 2.2.5. 提取猪软骨细胞 1) 从5月龄猪新鲜关节获得的软骨组织被切成块(1 mm 3 )。 2) 将切成块的软骨组织在胶原酶溶液(1.5 mg/mL)中消化。 3) 将消化后的软骨组织培养在含10%胎牛血清(FBS)的II型胶原酶改良Eagle培养基(DMEM)中，并放在37℃含5%的CO 2 培养箱中培养。 4) 将细胞悬浮液通过一个70微米的细胞过滤器过滤。 5) 然后将软骨细胞离心和再悬浮后，在2D培养基中培养软骨细胞。 6) 然后将悬浮液接种在培养皿中(细胞密度：3 × 10 4 /cm²)在37℃含5%的CO 2 培养箱中培养。 2.2.6. 消化猪软骨细胞 1) 取猪软骨细胞(2D培养基培养)于超净台下分别使用吸管吸除培养基。 2) 使用吸管吸取PBS约3 ml加入到每个培养皿中，前后震荡几次，吸除PBS。 3) 吸取胰酶约3 ml于每个培养皿中，放置37℃含5%的CO 2 培养箱中约4~5 min，取出培养皿，于光镜下观察确定。 4) 细胞被胰酶消化下来(细胞由梭形变为椭圆形即为被胰酶消化下来，部分细胞可能与皿底粘附较紧，可适当震荡培养皿使细胞悬浮)。 5) 于含猪软骨细胞每个培养皿中加入DMEM含10% FBS + 1% P/S培养基约3 ml稀释胰酶，吸取细胞悬液置于离心管中。分别计算离心管中的细胞悬液体积。 6) 分别于光镜下在计数板中计算每ml细胞悬液中消化猪软骨细胞密度，计算离心管中总的细胞数量。 2.2.7. 构建复合支架 1) 取将含猪软骨细胞悬液在37℃下于离心机1000 rmp离心5 min，倒掉上清液。 2) 向含MC3T3-E1细胞离心管中加入灭菌后的海藻酸钠溶液将细胞密度浓缩为10 × 10 6 /ml，吹打混匀。 3) 取20块含MC3T3-E1的明胶海绵(剩余20块含MC3T3的明胶海绵作为对照)，用1 ml移液枪吸取多余的培养基，每个加入适量配置好的100 mmol/L CaCl 2 溶液(加入适量即可，避免明胶海绵过湿)，后向明胶海绵加入含软骨细胞的海藻酸钠溶液，约100 ul/个，再向明胶海绵上滴加适量的100 mmol/L CaCl 2 溶液，待凝胶凝固后，将明胶海绵-海藻酸钠凝胶复合体重新放入培养基中，后更换培养基为3D培养基，放入37℃含5%的CO 2 培养箱培养。 4) 取1个96孔板，向其中20个孔洞内加入含软骨细胞的海藻酸钠溶液每个孔洞约50 ul，后加入100 mmol/L CaCl 2 溶液20 ul，盖上盖子，放入4℃冰箱放置10 min，待凝胶凝固，取出凝胶放入2块含3D培养基12孔板中，放入37℃含5%的CO 2 培养箱中培养作为对照。