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user: 3. 方法与结果 3.1. 色谱条件 仪器为Agilent UPLC 1290；色谱柱型号为Waters ACQUITY UPLC® Peptide CSH™C18 column，130 Å，1.7 mm，2.1 × 150 mm；流动相：以0.05%三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，0.05%三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B；梯度洗脱程序见表1。柱温45℃，检测波长为214 nm；进样量为2 ml；流速为0.3 mL∙min −1 。 3.2. 溶液配制 3.2.1. 供试品溶液 取Ex4c适量，加30%乙腈水溶液溶解并稀释成每1 ml中约含1 mg的溶液，作为Ex4c供试品溶液。 3.2.2. Ex4c储备液 精密称取Ex4c 102.8 mg，置10 ml量瓶中，加30%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为Ex4c储备液。 3.2.3. 杂质储备液 精密称取杂质A、B、C、D各约10 mg，分别置10 ml量瓶中，分别用30%乙腈溶解并稀释至刻度，作为杂质A、B、C、D储备液。 3.3. 方法学考察 3.3.1. 专属性 1) 空白溶剂 取空白溶剂30%乙腈适量，滤过，依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(a)。由图可知，空白溶剂不干扰本品的有关物质的检查。 2) Ex4c定位 (氨基酸序列：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPGGSGGSC-NH 2 ) 取Ex4c适量，加30%乙腈水溶液溶解并稀释制成1 mg∙ml −1 的溶液，依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，Ex4c保留时间为11.734 min，且主峰与杂质均能有效分离。 3) 杂质A定位 (氨基酸序列：HGEGTFTS[Asu]LSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2) 取杂质A对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质A对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质A保留时间为16.251 min。 Table 1 Gradient elution progra 时间 (time)/min 流动相A (mobile phase A)/% 流动相B (%) (mobile phase B)/% 0 76 24 20 73 27 35 55 45 37 76 24 45 76 24 表1. 梯度洗脱程序 图1. 专属性色谱图 4) 杂质B定位 (氨基酸序列：DLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2) 取杂质B对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质B对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质B保留时间为7.435 min。 5) 杂质C定位 (氨基酸序列：EGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2) 取杂质C对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质C对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质C保留时间为17.286 min。 6) 杂质D定位 (氨基酸序列：GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2) 取杂质D对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质D对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质D保留时间为18.334 min。 7) 混合对照品溶液 取Ex4c约10 mg，至10 ml量瓶中，加上述各杂质定位溶液各0.4 ml，加30%乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀。依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(c)。由图可知，主成分和各杂质分离度均符合规定。 3.3.2. 破坏试验 1) 酸破坏 精密称取Ex4c约10 mg，置10 ml量瓶中，加1.0 ml 30%的乙腈水溶液溶解，加入0.1 mol∙L −1 的盐酸溶液1 ml，于80℃水浴中破坏30 min，冷却至室温后中和至中性，用30%乙腈水溶液稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 µl注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。 2) 碱破坏 精密称取Ex4c约10 mg，置10 ml量瓶中，加1.0 ml 30%的乙腈水溶液溶解，加入0.1 mol∙L −1 的氢氧化钠溶液0.5 ml，室温放置60 min，中和至中性，用30%乙腈水溶液稀释至刻度，作为供试品溶液。取2 µl供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。 图2. 破坏试验色谱图 M. 高温破坏(high temperature hydrolysis) N. 酸破坏(acid hydrolysis) G. 酸破坏空白(blank solution of acid) H. 碱破坏(base hydrolysis) I. 碱破坏空白(blank solution of base) J. 氧化破坏(oxidation hydrolysis) K. 氧化破坏空白溶剂(blank solution of oxidation)。 3) 高温破坏 精密称取Ex4c约10 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，于105℃高温破坏90 min，冷却至室温后用30%乙腈水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 µl注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。 4) 氧化破坏 精密称取Ex4c约10 mg，置10 ml量瓶中，加30%的乙腈水溶液1.0 ml溶解，加入0.3%的双氧水溶液0.5 ml，室温放置80 min，用30%乙腈溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 µl注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。 除不加样品外，同法配制各破坏条件的空白溶液同法测试，色谱图见图2。 结果表明，各破坏条件下所产生的降解产物均能与Ex4c很好的分离，各降解产物之间也能较好的分离，峰纯度分析显示各破坏溶液的色谱图中Ex4c峰纯度合格。 3.3.3. 系统适用性试验 精密量取Ex4c储备液1 ml，杂质A、B、C、D储备液各100 ml，置5 ml量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，作为系统适用性溶液。取系统适用性溶液，连续进样六次，分别计算各色谱图中Ex4c主峰、杂质A、B、C、D保留时间和峰面积的相对标准偏差，考察主峰与各杂质的分离度。结果表明Ex4c主峰、杂质A、B、C、D保留时间的相对标准偏差均小于2%，峰面积的相对标准偏差均小于3%。主峰与相邻杂质峰分离度均大于1.5，理论板数按Ex4c峰计算均大于5000。 3.3.4. 检测限与定量限 取杂质A、B、C、D储备液，采用逐步稀释法，以S/N ≈ 10时的浓度作为定量限，以S/N ≈ 3时的浓度作为检测限，结果见表2。 Table 2 Results of LOD and LOQ tes 序号(No.) 组分(constituents) 检测限(LOD)/ng 定量限(LOQ)/ng 1 杂质A 5.4 16.4 2 杂质B 4.0 12.0 3 杂质C 5.6 17.0 4 杂质D 5.6 16.6 表2. 检测限与定量限试验结果 3.3.5. 线性关系考察 精密量取Ex4c储备液0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.5 ml分别置10 ml量瓶中，分别精密量取杂质A、B、C、D储备液各80 ml、120 ml、160 ml、200 ml、240 ml、300 ml置上述10 ml量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，摇匀，分别得到40%、60%、80%、100%、120%、150%的溶液。取上述溶液依法测定，记录色谱图。以Ex4c及杂质A、B、C、D的浓度C (mg∙ml −1 )为横坐标，以Ex4c及杂质A、B、C、D峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表3。 由表3可知，该方法线性关系良好。 3.3.6. 精密度试验 1) 重复性分别取本品6份各约10 mg，精密称定，加各杂质A、B、C、D储备液各200 ml，置10 ml量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，作为供试品溶液，依法测定，记录色谱图。按面积归一化法，计算各个色谱图中Ex4c的纯度及杂质A、B、C、D百分含量，并计算其相对标准偏差，结果见表4。 2) 中间精密度实验员A、B于第二天分别同法配制6份供试品溶液，依法测定，记录色谱图。按面积归一化法，计算各个色谱图中Ex4c的纯度及杂质A、B、C、D百分含量，并计算其相对标准偏差，试验结果见表4。 由表4可知，方法精密度良好。 3.3.7. 回收率试验 精密量取Ex4c储备液1.0 ml，置10 ml量瓶中，配置9份，分别精密量取杂质A、B、C、D储备液160 ml、200 ml、240 ml置上述容量瓶中，每个浓度配置3份，加30%乙腈稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取Ex4c储备液1.0 ml，置10 ml量瓶中，分别精密量取杂质A、B、C、D储备液200 ml，加30%乙腈稀释至刻度，同法配置两份，作为对照溶液。精密称取Ex4c适量，加30%乙腈溶解并稀释制成1 mg∙ml −1 的溶液，作为样品测定溶液。 取上述各溶液依法测定，记录色谱图，计算各浓度项下的回收率，试验结果见表5。 由表5可知，本方法对杂质和Ex4c均具有良好的回收率。 3.3.8. 耐用性试验 分别通过改变柱温(±2℃)、流速(±0.02 ml∙min −1 )和更换色谱柱，考察供试品溶液中Ex4c及各杂质的变化情况，试验结果见表6。 结果表明：测定结果没有明显差异，峰形、分离度均符合要求，本方法的耐用性良好。 3.4. 样品测定 精密称取本品3批样品适量，分别加30%的乙腈溶解并稀释制成每1 ml含Ex4c 1 mg的溶液，作为供试品溶液。依法测定，有关物质按面积归一化法计算，结果见表7。 Table 3 Results of linear equations tes 杂质 (solvent) 回归方程 (regression equation) 相关系数r (correlation index) (n = 6) 杂质A A = 7972.44 C + 2.28 0.9982 杂质B A = 8528.42 C − 9.07 0.9989 杂质C A = 7401.09 C − 2.59 0.9985 杂质D A = 8651.86C − 5.03 0.9960 Ex4c A = 4081.96 C − 59.76 0.9995 表3. 线性关系试验结果 Table 4 Results of precision tes 序号 (No.) 组分 (constituents) 重复性 (repeatability) RSD/% 中间精密度 (intermediate precision) RSD/% 1 杂质A 1.00 2.97 2 杂质B 2.38 2.27 3 杂质C 1.18 2.03 4 杂质D 1.73 2.01 5 Ex4c 0.27 0.22 表4. 精密度试验结果 Table 5 Results of recovery tes 组分 (constituents) 加入浓度 (added concentration)/% 平均回收率 (average recovery rate)/% RSD/% 杂质A 80 99.8 3.5 100 96.5 2.8 120 97.3 4.1 杂质B 80 98.3 2.9 100 96.6 4.6 120 97.6 3.8 杂质C 80 96.3 4.2 100 96.8 3.6 120 96.9 1.9 杂质D 80 98.4 2.8 100 96.7 4.2 120 98.2 3.5 Ex4c 80 97.5 1.6 100 100.3 2.1 120 101.1 1.6 表5. 回收率试验结果(n = 3) Table 6 Results of serviceability tes 指标 名称 标准条件 柱温 流速 换色谱柱 (0125351561) 43℃ 47℃ 0.28 ml/min 0.32 ml/min 主成分纯度(%) 74.82 74.99 74.79 74.68 75.02 75.02 杂质A (%) 2.93 2.98 3.11 2.99 2.94 2.91 杂质B (%) 2.99 2.98 2.92 2.94 3.00 2.96 杂质C (%) 2.76 2.73 2.76 2.77 2.81 2.74 杂质D (%) 2.93 2.91 2.96 2.89 2.91 2.90 表6. 耐用性试验结果 Table 7 Contents of residual solvent in sample 批号 (lot No.) 杂质A (impurity A) 杂质B (impurity B) 杂质C (impurity C) 杂质D (impurity D) Ex4c 160201 未检出 (not detected) 0.15 未检出 (not detected) 0.36 97.30 160301 未检出 (not detected) 0.10 未检出 (not detected) 0.40 97.59 160401 未检出 (not detected) 0.24 未检出 (not detected) 0.49 97.49 表7. 样品有关物质测定 由表7可知，本法能准确地测定Ex4c的有关物质，能较好地控制本品质量。