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user: 3. 三聚氰胺检测技术 自从2008年发现“奶粉事件”之后，生鲜乳及奶制品中三聚氰胺的检测技术迅速发展。文献报道的检测方法有：高效液相色谱法、紫外分光光度法、近红外光谱法、表面增强拉曼光谱法、酶联免疫吸附法等。报道较多的是将各种仪器联用，如：高效液相色谱–串联质谱法、气相色谱–串联质谱法、固相萃取-高效液相色谱法、固相萃取–表面增强拉曼光谱法、胶体金免疫层析法、介孔分子印迹聚合物分离法、金纳米粒子比色探针检测法等。另外，有研究者制备了试剂盒和测试试纸，如：三聚氰胺ELISA试剂盒、三聚氰胺多克隆抗体的制备、三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条的研制。以下就国内外食品中三聚氰胺的检测方法作以介绍。 3.1. 高效液相色谱法 高效液相色谱法对液态奶和奶制品中三聚氰胺进行测定，需要对样品进行提取、净化等前处理，选择适当的色谱条件进行检测，可以达到分离效率高、分析速度快、准确度高的效果。高效液相色谱法适用于含少量三聚氰胺的液态奶及奶制品的快速检验。样品的前处理比较复杂，难以实现对大量样品的快速检测。实验结果的不确定度也给检测自动化的实现带来一定难度。 乔勇升 [ 8 ] 建立了有机溶剂提取和离子对色谱相结合的三聚氰胺快速检测方法。通过对实验条件的选择和优化，确定了色谱条件，对丙酮、乙腈、乙醇和异丙醇的提取物分别在甲醇–离子对试剂流动相体系和乙腈–离子对试剂流动相体系中进行测定和比较。结果显示，在本实验条件下提取物的提取效果较好。在甲醇–离子对试剂流动相体系中，三聚氰胺的质量浓度在1.0~100.0 mg/L范围内，线性关系良好，检出限为0.1 mg/kg，加标回收率为97%~103%。 杨洋 [ 9 ] 等人建立高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺结果不确定度评定的数学模型。他们全面考虑测量过程中的不确定度来源，分别运用最小二乘法对标准曲线拟合的不确定度，以及极差法对测定次数较少时引起的不确定度进行评定。结果表明，取样量2.00 mg时，测定奶粉中三聚氰胺含量为(2.00 ± 0.088) mg/kg。本方法适用于高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺的不确定度评定。 邸万山 [ 10 ] 采用高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺含量。以双氰胺为内标物，优化色谱条件，样品经20 mL 50℃热水，0.5g无水硫酸镁，10 mL乙腈提取后，采用Nova-Pak C18色谱柱分离，以0.01 mol/L乙酸铵:乙腈 = 90:10 (V:V)作为流动相，波长选择218 nm。结果表明，双氰胺在该条件下能够与三聚氰胺完全分离，双氰胺可以作为内标物，在0.500~1.500 mg/kg的添加范围内，三聚氰胺的回收率为98.2%~100.5%。 3.2. 高效液相色谱–串联质谱法 为了使分析技术更快速，准确，人们将高效液相色谱–串联质谱法(LC-MS/MS)进行三聚氰胺的检测，把液相色谱的分离能力同质谱的高灵敏、特异性相结合，简化了样品的处理步骤，并且提高了检测速度和准确性，该方法已得到广泛应用。 刘红河 [ 11 ] 建立高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定奶及奶制品中双氰胺和三聚氰胺的方法。用乙腈沉淀蛋白，经微孔滤膜净化，色谱柱分离，含0.1% (V/V)的乙腈–水为流动相，梯度洗脱，采用串联四极杆质谱、电喷雾电离源正离子多反应监测模式检测，外标法定量。结果双氰胺和三聚氰胺浓度在5.0~1000.0 μg/L时，线性关系良好，双氰胺和三聚氰胺的检出限均为10.0 μg/kg；该法快速、准确、灵敏，优于传统的HPLC 分析方法。 初晓娜 [ 12 ] 等人采用高效液相色谱–串联质谱法测定生鲜乳中三聚氰胺残留量。样品经乙腈溶液超声提取，过Waters OasisMCX固相萃取小柱净化，50℃氮气吹干，再用1.0 mL乙腈溶解后供高效液相色谱–串联质谱分析。以Waters Hilic色谱柱为固定相，用乙腈–乙酸铵溶液洗脱，采用电喷雾正离子模式多反应监测，内标法定量。三聚氰胺的质量浓度在10.0 μg∙L −1 以内呈线性，检出限(3 S/N)为0.5 μg∙kg −1 。用该法重复性好，灵敏度高，可满足乳制品中的三聚氰胺残留检测分析的需要。 邹游 [ 13 ] 等人以GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》为基础改良方法，测定婴儿奶粉中的三聚氰胺。对液相色谱–串联质谱法测定婴儿奶粉中的三聚氰胺的不确定度进行评估。结果显示，内标法的线性拟合对测量不确定度贡献较小，对三聚氰胺的常规检测具有重要意义。 3.3. 气相色谱–质谱联(GC-MS) 气相色谱-质谱法(GC-MS)测定三聚氰胺时具有灵敏度高、重现性好、可靠性强等优点，适用于进行微量三聚氰胺的定量分析。 李红敏 [ 14 ] 等人采用气相色谱–串联质谱检测羊肉中三聚氰胺。样品经0.1%三氯乙酸溶液和乙腈超声提取，乙酸铅沉淀蛋白，酸性氧化铝脱脂，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，采用多反应监测质谱扫描模式。在0.0050~1.0 mg/L范围内线性关系良好，三聚氰胺平均回收率范围为80%~110%，定量限为0.0050 mg/kg。此方法样品前处理简单、定性准确，适用于测定羊肉中的三聚氰胺。金春爱 [ 15 ] 采用气相色谱–质谱联用法测定牛奶中三聚氰胺的含量。采用三氯乙酸溶液提取牛奶中的三聚氰胺，选择离子监测模式，外标法定量。在优化的条件下，三聚氰胺的回收率达90%~110%，相对偏差0.3%~6%。结果表明该方法重现性好、回收率高等优点。 3.4. 分子印迹聚合物 胡静 [ 16 ] 等人利用分子印迹固相萃取技术结合紫外分光光度法检测奶粉中三聚氰胺的残留量。以三聚氰胺为模板分子，α-甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，采用本体聚合方式合成三聚氰胺分子印迹聚合物(MIP)，样品经分子印迹固相萃取法进行净化，紫外分光光度计测定。结果表明，该方法的线性范围为0.007 mmol/L~0.1 mmol/L；试验数据的稳定性、重现性、准确度较好，因此利用分子印迹固相萃取技术结合紫外分光光度法检测奶粉中三聚氰胺可作为一种简单快速检测三聚氰胺的方法。 臧顺平 [ 17 ] 以灭蝇胺为虚拟模板分子，采用溶胶凝胶技术制备灭蝇胺介孔分子印迹聚合物(MIP)。将MIP作为固相萃取吸附剂，与高效液相色谱联用检测奶粉样品中的三聚氰胺。应用合成的MIP对2 g奶粉样品提取液中痕量三聚氰胺进行净化和富集，回收率为94.73%~98.56%，检出限为0.015 μg/g。此方法快速、选择性高，为三聚氰胺的残留分析开辟了一条新途径。 3.5. 表面增强拉曼散射效应 曲干 [ 18 ] 等人利用表面增强拉曼散射效应无标记、无分离检测奶粉中的三聚氰胺。通过柠檬酸钠还原法制得平均粒径为30 nm的纳米金溶胶，利用Au-S之间的共价键作用，将对巯基苯硼酸自组装到纳米金的表面，溶液中三聚氰胺与巯基苯硼酸之间存在强烈的氢键作用，使巯基苯硼酸功能化的纳米金发生聚集。三聚氰胺的浓度越高，纳米金的聚集程度越大，拉曼信号越强。以I 715 与I 1076 的特征峰的比值为依据，可以实现三聚氰胺的定性及定量的检测，线性检测范围为0.1~1. 5 μmol/L，检出限为0.02 μmol/L。本方法适用于奶粉中三聚氰胺的检测，是一种快速、灵敏、无标记、无分离的检测三聚氰胺的分析方法。 陈小曼 [ 19 ] 建立了奶粉中三聚氰胺分析的固相萃取–表面增强拉曼光谱法，对标准奶粉进行了表面增强拉曼光谱分析，同时使用国家标准HPLC方法进行比对。待测物经乙腈提取、活性碳吸附及氢氧化钠溶液洗脱后进行表面增强拉曼光谱检测。该方法的线性范围为0.005 0~1.6 mg/L，检出限为0.100 mg/kg，回收率为75.3%~125%。该法灵敏度高、杂质干扰小、结果准确可靠，能满足奶粉中三聚氰胺的快速检测，在奶粉质量监控方面具有良好的应用潜力。 3.6. 酶联免疫法 酶联免疫分析(CLEIA)法检测奶制品中的三聚氰胺具有一定的优点。汤慕瑾 [ 20 ] 采用酶联免疫吸附法在奶制品(奶粉、液态奶)、成品饲料、饲料原料、肉类等样品基质中添加一定浓度的三聚氰胺进行测定，并对检测结果进行分析。结果酶联免疫试剂盒对奶制品和肉类检出限均能达到1.0 mg/kg；对成品饲料基质中的三聚氰胺的检测，检出限可达到2 mg/kg，而对饲料原料中的三聚氰胺的检测，检出限都不能达到2 mg/kg。结论对奶制品、成品饲料中的三聚氰胺检测完全符合我国的临时限量标准；而对饲料原料中的三聚氰胺的检测，由于不同基质中检出限不同，不能直接采用酶联免疫法进行快速筛查；酶联免疫法也适用于肉类中的三聚氰胺的检测。此快速检测方法，为快速筛查不同种类食品中非法添加三聚氰胺提供技术保障。酶联免疫法操作较为简单，特异性强，灵敏度高，适于现场大量样本的筛查，并且不需要昂贵的仪器和复杂的样品制备过程。