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user: 3. 结果与讨论 3.1. Topomer CoMFA模型分析 采用Topomer CoMFA方法分别对以香豆素为基础的苯扎酰胺类化合物作为HDAC抑制剂的21种化合物的HCT116细胞系和A2780细胞系研究结果如下： Table 2 Results of Topomer CoMFA mode System Com q 2 r 2 q 2 stderr r 2 stderr SEE HCT116 3 0.517 0.880 0.36 0.18 0.178 A2780 2 0.572 0.869 0.27 0.15 0.150 表2. Topomer CoMFA模型结果 如表2所示，Topomer CoMFA模型HCT116细胞体系的统计学参数为最佳主成分值为3，交叉验证相关系数q 2 为0.517，非交叉验证系数r 2 为0.880；A2780细胞体系的统计学参数为最佳主成分值为2，交叉验证相关系数q 2 为0.572，非交叉验证系数r 2 为0.869。数据显示，两者的q 2 大于0.5，r 2 大于0.6，说明通过该方法建立的模型是比较理想的Topomer CoMFA模型，其统计结果具有很高的预测能力。同时预测值的SEE为0.039，q 2 stderr为0.36，r 2 stderr为0.18，进一步说明所建立的模型具有较高的可靠性。 图2和图3分别是HCT116细胞体系与A2780细胞体系的训练集和测试集化合物的实验值与预测值之间的线性回归相关图和柱状分析图。从图中可以看出，线性回归图中所有样本均匀地分布在45°线附近，柱状分析图中所有样本基本在同一水平高度。由图可知两种细胞系构建的QSAR模型是比较可靠的，具有较好的拟合力。 3.2. 3D-QSAR分析 图4是以活性最高的11号分子为模板建立的Topomer CoMFA模型的分子场三维等势图，根据切割方式，所有化合物的R1基团都是一样的，所以无法对R1基团进行比较分析，因此本文只对两种细胞系的R2基团进行比较分析。 图4(a)与图(b)分别为HCT116细胞系R 2 基团的立体场等势图和静电场等势图；A2780细胞系R 2 基团的立体场等势图和静电场等势图为图4(c)与(d)。在图4(a)和(c)中，绿色的部分表示提高取代基的体积可以增加活性；黄色的部分则相反，减少取代基的体积可以提高化合物活性；在图4(b)和(d)中，红色部分表示引入带负电子的基团可以提高化合物活性，而蓝色部分则表示引入带正电子的基团可以提高化合物活性 图2. HCT116细胞体系的线性回归图(左)和柱状分析图(右) 图3. A2780细胞体系的线性回归图(左)和柱状分析图(右) 对于HCT116细胞系，在图4(a)中的R 3 、R 4 和R 5 取代基的位置上有绿色区域，若在此区域有大面积基团则活性相对较高。例如，化合物10、11、16、17、18和21 (pIC 50 值分别为5.88、6.60、5.75、6.38、6.00和6.10)相比化合物8 (pIC 50 值为5.60)都是增加了取代基的体积(分别用−C、−C、−Cl、−Br、−CO和−Cl取代了−H)，体积增大，活性明显升高；同理，化合物R 6 位置有大面积黄色区域，需要在此位置引入小基团的基团以提高化合物的活性。例如，化合物12和15 (pIC 50 值分别为5.03和5.32)与化合8 (pIC 50 值为5.60)相比，在R 6 取代基的位置上用−F和−Cl取代了−H活性降低。 从图4(b)中可以看出R 4 、R 5 和R 6 取代基上有蓝色区域，因此在这些基团上减小取代基的电负性或者引入带正电荷的基团有利于提高活性。例如，R 6 取代基的位置上化合8、9和15 (pIC 50 值分别为5.60、5.85和5.32)分别在用−H、−C和−Cl取代化合物12 (pIC 50 值为5.030)的−F，电负性增强，活性明显升高；在R4取代基的位置上化合物14 (pIC 50 值为5.61)用-F取代化合物11、16、17和18 (pIC 50 值分别为6.60、5.75、6.38、6.00和6.10)相同位置上的−C、−Cl、−Br和−CO基团活性明显降低。另外，在图4(b)中R 1 、R 2 取代基的位置被红色区域包围，因此需要增加这些基团上取代基的电负性来提高活性。例如，化合物4、5和7 (pIC 50 值分别为5.51、5.64、和5.18)相比化合物1 (pIC 50 值为4.94)都是在取代基上引入了高电负性的基团，活性都有所提高。 同理，对于A2780细胞系也是如此。 图4. 基于模板11的Topomer CoMFA模型的三维等势图 因此，要想提高化合物的活性应该优先增大整个取代基的体积尤其是R4基团取代基的体积，并且减少R 6 基团取代基的体积。同时在R 4 、R 5 和R 6 取代基上减小取代基的电负性或者引入带正电荷的基团，在苯环的内、外侧和R 1 基团上增加取代基的电负性或者引入带负电荷的基团。 3.3. 分子设计结果 本文的分子设计是以3D-QSAR分析作为参考，基于化合物11的R 2 基团，采用Topomer Search技术在ZINC数据库中的Drug-like分子库中进行搜索 [ 25 ]，以R 2 基团作为提问结构，在化合物数据库中进行筛选。在筛选出的这些分子结构片段中挑选出活性贡献值高于11号模板分子的结构片段作为新的R 2 基团。本文中所建立的Topomer CoMFA模型中HCT116细胞系的R 2 基团贡献值为1.36，挑选的时候选择Topomer距离越接近185且片段的贡献值超过模板分子R 2 基团的贡献值的R基团。选择出符合条件的16个集团，最终设计出16个新的化合物。按照训练集分子的构建方法，在SYBYL-X 2.0中构建出新分子的三维结构，然后优化、命名，用化合物11作为模板预测其活性，16个新设计的化合物结构和预测活性值(pIC50)见表3。 Table 3 Molecular design and predicted activity values of HCT116 cell lines and A2780 cell line NO R pIC 50 Pred NO R pIC 50 Pred 1-01 6.85 1-09 6.64 1-02 6.91 1-10 6.61 1-03 6.68 1-11 6.62 1-04 6.72 1-12 6.63 1-05 6.64 1-13 6.62 1-06 6.66 1-14 6.60 1-07 6.66 1-15 6.61 1-08 6.64 1-16 6.72 表3. HCT116细胞系与A2780细胞系的分子设计和预测活性值 如表3所示，新设计出的16个分子的预测活性值(pIC 50 )都在6.60以上，比模板分子的活性值高。 3.4. 分子对接结果分析 将模板分子和新设计出的16个分子都进行分子对接，模板分子作为对照，以打分函数Total-Score、Crash和Polar的值作为评判标准，结果如表4所示。 Table 4 Molecular docking scoring function and number of hydrogen bond NO pIC 50 pred total-score crash polar H-bonds contrast 6.51 8.2690 -4.2223 1.7664 3 1-01 6.85 8.9593 -3.2400 2.4539 4 1-02 6.91 -0.6480 -8.2273 1.0733 2 1-03 6.68 5.4217 -2.5780 1.2330 3 1-04 6.72 1.2597 -1.0678 0.0670 2 1-05 6.64 6.6386 -2.0465 2.0208 3 1-06 6.66 8.0846 -0.8779 2.2192 3 1-07 6.66 3.8777 -2.3619 0.2803 2 1-08 6.64 6.7794 -1.4545 2.1260 4 1-09 6.64 6.2089 -2.7046 0.7645 3 1-10 6.61 7.1137 -2.9435 1.4274 3 1-11 6.62 8.4407 -2.4090 2.0832 3 1-12 6.63 6.9264 -1.2237 2.3765 2 1-13 6.62 6.5047 -1.1232 2.2471 3 1-14 6.60 8.4058 -1.3742 3.2605 4 1-15 6.61 5.1668 -1.5203 0.9896 2 1-16 6.72 7.3831 -1.2547 2.1163 3 表4. 分子对接打分函数和氢键个数 对接分析图见图5，其中棒状化合物代表分子配体，球棍状化合物代表氨基酸残基，黄色虚线为氢键。从图5(a)可以看出，11号模板分子配体与3JSX蛋白晶体结构中的主要氨基酸残基共形成了3个氢键，与Tyr128、Tyr126、和Trp105形成氢键相互作用，Total-score，crash和polar分别为8.2690，−4.2223，1.7664。 图5. 分子对接氢键作用图 如图5(b)~(d)分别表示设计的新化合物1-01，1-14，1-02与3JSX蛋白晶体进行分子对接的活性位点，黄线色虚线表示氢键作用力。图5(b)所示，化合物1-01与蛋白酶晶体的His11，Tyr128，Gln104，和Trp105氨基酸残基形成氢键；图5(c)为化合物1-14与3JSX蛋白中的Trp105，His161，和Phe65氨基酸残基形成氢键。结果显示所设计的化合物对接结果是可靠。另外，从表4可以看出，新设计的化合物1-02、1-04和1-07均具有较高的预测活性，但总打分函数相对较低。特别是化合物1-02，在设计的16个分子中化合物1-02的预测活性值(pIC 50 )最高，但总打分函数最低。因此，新分子的设计不仅需要有较高的活性值，还需要分子与大蛋白之间的空间匹配和能量匹配。