DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 1. 引言 组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在表观遗传调控方面起重要作用，可调节组蛋白、转录因子、分子伴侣和信号分子等多种蛋白质的乙酰化水平 [ 1 ]。HDAC通常与染色质的浓缩以及多种转录基因的沉默相关 [ 2 ]。因此，HDAC抑制剂(HDACi)可用于治疗癌症，炎症 [ 3 ]，神经退行性疾病 [ 4 ] 和代谢紊乱等多种疾病 [ 5 ]。目前已有五个HDAC抑制剂批准上市，SAHA、belinostat (PXD-101)、panobinostat (LBH-589)、romidepsin (FK-228)和西达本胺(Chidamide)，其结构见图1。SAHA和PXD101分别于2006年和2014年被FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤；LBH589在2015年被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤以及皮肤和外周T细胞淋巴瘤；西达本胺在2014年被NMPA批准用于治疗复发及难治性外周T细胞淋巴瘤 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]。 图1. 批准上市的HDACi的结构 在人类中已发现四类HDAC同工酶：I类包括HDAC1、2、3和8；IIa类包括HDAC4、5和7，IIb类包括HDACs 6和10；III类HDAC，命名为sirtuins 1-7；IV类只包含HDAC11 [ 11 ]。I类，II类和IV类HDAC属于精氨酸酶–去乙酰酶折叠 [ 12 ] Zn 2+ 依赖性酶，而III类HDAC为不相关折叠NAD + 依赖性酶 [ 13 ]。 上述已上市的HDACi为非选择性或部分选择性的抑制剂，它们通常会引起许多副作用，如疲劳、味觉障碍、恶心、呕吐、腹泻、骨髓抑制、心脏毒性等。这些毒性作用可能与抑制剂作用于多个种型或缺乏对同种型成员的选择性有关系，因此，越来越多的研究集中在开发选择性HDAC抑制剂作为抗癌药物。HDAC6选择性抑制剂可通过避免多个组蛋白乙酰化诱导的全基因表达变化而显示出较低毒性 [ 14 ]。因此以HDAC6为靶标的抗肿瘤药物研究已成为目前研究项目最多、应用最广的方向之一 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]。本文对HDAC6的结构及其晶体复合物进行了综述，将为更好地开发选择性HDAC6抑制剂提供理论依据。
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user: 2. HDAC6的结构 HDAC6的基因位于Xp11.23中，含有1216个氨基酸，是人类HDAC家族中最大的成员。HDAC6主要由强核输出信号(NES)、两个催化结构域(CD1和CD2)、八个连续重复的十四肽(SE14)和泛素结合锌指结构域(ZnF-UBP)组成，其结构见图2。HDAC6是组蛋白去乙酰化酶家族中唯一的一个含有串联催化结构域成员。大多数HDAC位于细胞核，但由于HDAC6结构中含有NES和确保蛋白质在细胞质中的稳定锚定的SE14，所以HDAC6主要存在于细胞质中 [ 18 ]，并影响细胞质中微管蛋白、cortactin [ 19 ] 和Hsp90 [ 20 ] 等非组蛋白底物的功能。抑制HDAC6会导致α-微管蛋白亚基中的K40超乙酰化进而使微管动力减弱，而HDAC6的过表达则会减少α-微管蛋白乙酰化并增加细胞运动性 [ 21 ] [ 22 ]。通过HDAC6的ZnF-UBP结构域，多聚泛素化错误折叠的蛋白质被招募到动力蛋白上再运输到聚集体。在心脏、肝脏、肾脏、睾丸、脑和胰腺中都可以观察到HDAC6的表达。 图2. HDAC6的结构 在HDAC6的两个催化结构域中，编码CD1序列中不同的点突变不会导致对α-微管蛋白去乙酰化的活性受损。但编码CD2序列中的几个点突变(W459A，D460A双取代突变，或N530A，N530D或S531A的单取代突变)会对α-微管蛋白去乙酰化活性造成严重的损害。说明CD2是影响α-微管蛋白去乙酰化活性的关键部位。此外，CD2还表现出广泛的底物特异性，而CD1则对C-末端具有乙酰基赖氨酸底物的水解具有高度特异性。但CD1、CD2水解底物都需要完整的串联结构域，单独CD1不具有催化活性，单独CD2的活性也会降低，而将单独CD1和CD2混合，也不能使两结构域的活性提高 [ 23 ]。 在CD1-CD2的晶体结构中(见图3) [ 24 ]，CD1和CD2均采用经典的精氨酸酶–去乙酰酶折叠并具有保守的去乙酰酶活性位点 [ 12 ]。但CD2活性位点和底物识别区域比CD1的位点更加保守，可能是因为两个结构域具有不同的功能。这两个结构域彼此紧密相连，连接面由CD1的H13、H14、H15和H18螺旋以及CD2的H32、H33和H34螺旋，通过环连接的CD1的螺旋H17、H18和CD2的H36、H37，以及连接两个结构域的连接子(418-442)和CD2的C-末端部分(794-806)所组成。连接面的面积大约为2100 Å 2 。CD1和CD2在结构上非常相似，并且参与域间界面形成的结构元素也基本相同，最终形成垂直于两侧α-螺旋界面的伪双重轴。界面只有几个保守残基片段。 在单独结构中，CD1和CD2的主链也非常相似。HDAC6催化结构域N-末端和C-末端部分与其他HDAC亚型有显著区别：在每个活性位点附近催化结构域中都存在一个独特定位的10个氨基酸残基形成的α-螺旋，在CD1中为H6，CD2中为H25；以及存在于N末端部分独特的环，在CD1中是含有W78和D79的H1-H2，在CD2中是含有W459和D460的H20-H21。当用HDAC8的H6-H7取代CD2中H25时，其催化α-微管蛋白去乙酰化的活性严重降低，但HDAC6的催化功能没有受到损害，而是其选择α-微管蛋白作为底物的能力受损。当CD1中H6被取代时则对活性几乎没有影响。由于螺旋H25和后续环 图3. CD1-CD2的晶体结构 [ 24 ] 结构的存在，只有HDAC6存在一个开放的约14 Å宽的凹槽。HDAC6 CD1和CD2活性位点都是典型疏水空腔，空腔长度约10 Å，Zn 2+ 离子位于空腔的底部。形成疏水空腔的残基在CD1中是P83、G201、F202和W261，在CD2中是P464、G582、F583、F643和L712。Zn 2+ 在CD1中与D230，H232和D323配位，在CD2中与D612、H614和D705配位。此外，Zn 2+ 还与一个水分子结合，该水分子还可与H573和H574形成氢键。配体除与Zn 2+ 上空的配位点结合外还可与Y745相互作用。位于催化锌离子旁的酪氨酸残基可以稳定反应中间体，在CD1是Y363，在CD2中是Y745 [ 24 ]。 研究发现，人HDAC6的CD2 (hCD2)和斑马鱼HDAC6的CD2 (zCD2)活性位点区域高度相似，且活性位点氨基酸残基高度保守，只有位于活性位点外缘并与结合的配体相距很远的两个氨基酸残基不同。在zCD2与衍生自α-微管蛋白K40乙酰化位点和衍生自组蛋白H4底物的共晶结构中可以观察到催化反应中所有关键步骤(见图4)。酶-底物复合物晶体结构显示(分辨率为1.82 Å)：首先，乙酰赖氨酸的可裂变羰基与Zn 2+ 上空位点配位，且不会取代Zn 2+ 结合的水分子，从而形成五配位的金属离子，可用于催化。此外，配体也与Y745相互作用。然后，乙酰赖氨酸的可裂变羰基经H573和Zn 2+ 激活的水分子亲核进攻，产生一个四面体中间体。羰基氧原子通过与Zn 2+ 的配位和与Y745形成氢键而稳定；羟基氧原子稍微远离Zn 2+ ，但羟基氢可以与H573形成氢键作用。最后，四面体中间体裂解产生赖氨酸和乙酸产物。在这个复合物中，HDAC6 zCD2活性位点中的串联组氨酸可以作为单独的碱和酸发挥作用：H573可以辅助Zn 2+ 激活亲核水分子，H574使离去的氨基质子化，促进底物的崩解 [ 23 ]。 图4. HDAC6催化反应中关键步骤
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user: 3. HDAC6-抑制剂晶体复合物的结构 为确定选择性HDAC6抑制剂的分子特征，已有多种蛋白–抑制剂的晶体复合物结构被报道 [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]。总结众多HDAC6抑制剂与HDAC6 CD2结构域的晶体复合物，发现存在两种结合模式(见图5)：① 以HDAC6与Ricolinostat (ACY-1215)的复合物晶体结构为代表的双齿异羟肟酸-Zn 2+ 结合模式。② 以HDAC6与HPB、ACY-1083 [ 25 ] 、HPOB [ 23 ] 等形成复合物的晶体结构为代表的单齿异羟肟酸-Zn 2+ 结合模式。而泛抑制剂Trichostatin A (TSA)的两个异构体分别以上述两种结合模式与CD2结构域中的Zn 2+ 离子结合。 图5. 抑制剂的两种结合模式示意图 Ricolinostat是第一个进入临床试验的选择性HDAC6抑制剂，它与来那度胺联合用于复发和难治性多发性骨髓瘤治疗，正进行Ⅱ期临床评估 [ 28 ]，而用于复发性或难治性淋巴系统恶性肿瘤的治疗，也已进入Ⅱ期临床研究阶段。HDAC6-Ricolinostat复合物的晶体结构(分辨率为1.70 Å)显示与抑制剂结合后不会使蛋白发生明显的构象变化。Ricolinostat的异羟肟酸部分的羟基氧和羰基氧以双齿模式与Zn 2+ 配位(见图6) [ 25 ]，形成规范的五元螯合物，其中Zn 2+ 与异羟肟酸的羟基氧和羰基氧的距离分别为2.0 Å和2.4 Å。Y745的侧链作为氢键供体与异羟肟酸的羰基形成氢键，H573作为氢键供体与异羟肟酸的羟基形成氢键，此外，H574与异羟肟酸的氨基基团也可形成氢键。与Ricolinostat通过氢键作用的串联组氨酸残基中的H573处于带正电荷的咪唑鎓状态，而H574处于中性咪唑状态。Ricolinostat以两种单体存在于该酶-抑制剂复合物的不对称单元中。在这两种单体中，抑制剂Cap基团采用两种相互排斥的构象。一种构象中，抑制剂Cap基团的酰胺羰基与L1环上S531形成水介导的氢键。氨基嘧啶环上的氮原子还与D460形成水介导的氢键。在另一种构象中，抑制剂的Cap基团的酰胺羰基和H614 (Zn 2+ 配体之一)之间形成水介导的氢键。氨基嘧啶环上的氮原子与P711的羰基形成水介导的氢键。 HDAC6-ACY-1083复合物的异羟肟酸部分则采用单齿Zn 2+ 配位模式(见图7(a)) [ 25 ]：仅异羟肟酸的羟基氧与Zn 2+ (距离为1.9 Å)配位，该羟基同时还与Y745相互作用。异羟肟酸羰基可与Zn 2+ 结合的水分子形成氢键，该水分子还与H573和H574形成氢键。异羟肟酸氨基基团与Y745的侧链相互作用。氨基嘧啶Linker的芳环夹在F583和F643之间(见图7(b)) [ 25 ]，形成π-π堆叠的相互作用。L2环上S531的羟基侧链可与抑制剂连接基团(linker)的氨基产生氢键作用。Cap基团中的二氟环己基采用椅式构象，氟原子包裹在F643侧链的边缘。抑制剂Cap区的苯基与P464和F583侧链通过范德华力相互作用。 泛HDAC抑制剂TSA的两个异构体分别以两种结合模式与Zn 2+ 离子作用(见图8(a)) [ 25 ]。在TSA的主要构象异构体(70%占据率)中观察到二齿异羟肟酸-Zn 2+ 配位模式(见图8(b)) [ 25 ]。Zn 2+ 与异羟肟酸羟基氧和羰基氧配位，距离分别为2.2 Å和2.0 Å。此外，Y745与异羟肟酸的羰基形成氢键，而H573和H574 图6. Ricolinostat及HDAC6-Ricolinostat复合物结合模式图 [ 25 ] 图7. ACY-1083及HDAC6-ACY-1083复合物结合模式图 [ 25 ] 与异羟肟酸得羟基形成氢键。TSA的次要构象异构体(30%占据率)采用与HDAC6选择性抑制剂如HPOB，HPB和ACY-1083类似的单齿异羟肟酸-Zn 2+ 配位模式(见图8(c)) [ 25 ]。TSA的异羟肟酸基团仅通过其羟基与Zn 2+ 配位。与Zn 2+ 结合的水分子与异羟肟酸的羰基形成氢键。Y745的羟基与异羟肟酸的亚氨基和羟基也能形成氢键，距离分别为2.7 Å和2.8 Å。除了异羟肟酸基团的构象和取向差异外，TSA的主要和次要构象没有其他明显区别。二甲基庚二烯的Linker和对二甲基氨基苯基的Cap以相同的方式结合在两种构象中。而且，单齿异羟肟酸-Zn 2+ 结合模式的能量仅比二齿异羟肟酸酯-Zn 2+ 结合模式高0.5 kcal/mol。 图8. TSA及HDAC6-TSA复合物结合模式图 [ 25 ]
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user: 4. 小结 对HDAC6的结构以及HDAC6-配体的晶体复合物的解析和研究将有利于进一步开发活性和选择性更优的小分子抑制剂。与pan-HDAC抑制剂TSA相比，对HDAC6的选择性可能是由庞大的Cap或连接基团决定。HDAC6选择性抑制剂的linker区基团可与S531形成直接或水介导的氢键。该残基接受来自乙酰基-L-赖氨酸底物的主链氨基基团的氢键，并且这种相互作用对于HDAC6活性位点是独特的。因此，靶向作用于这些特异性位点的抑制剂可表现出与HDAC6结合的高选择性和强活性。抑制剂Cap基团与HDAC6活性位点口袋的相互作用揭示了L1环中的结构差异也有助于提高对HDAC6的选择性。因此，设计合适的Linker和Cap基团，特异性地作用于这两个位点将有助于提高对HDAC6作用的选择性。
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user: 摘 要 国内页岩气的研究已开展多年，页岩气地球物理预测与评价技术也逐步完善。通过几年的技术攻关和在川南地区海相页岩气的勘探开发实践，基本建立了完整的地球物理技术体系，主要包括：地震资料目标精细处理、页岩气测井综合评价与储层特征分析、构造及地震地层解释、地球物理反演及目标预测、页岩裂缝预测、含气性检测、页岩保存条件分析等方面。通过部分技术在川南某地龙马溪组页岩气勘探开发中的应用，展示了页岩气地球物理技术的重要作用。 关键词 :海相页岩气，目标预测，地震反演，龙马溪组，综合评价 Copyright © 2019 by author and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 四川盆地及其周缘地区是我国最早发现页岩气的地区，被认为是最具潜力的页岩气勘探地区。其中川南地区下古生界海相页岩(下寒武统筇竹寺组(筇竹寺组)、下志留统龙马溪组)构造变形较弱，埋藏适中；沉积环境处于深水陆棚和深浅海沉积盆地的环境；富有机质页岩厚度大，有机碳丰度高，下寒武统筇竹寺组(筇竹寺组) TOC平均3%~4%；龙马溪组平均2.5%，演化程度高，页岩脆性矿物丰富，发育多种类型纳米孔–微裂缝，被公认为中国最有潜力，可望实现商业突破的重点有利区 [ 1 ] [ 2 ] 。 四川盆地古生界海相页岩气勘探进展迅速，尤其是在焦石坝地区，页岩气勘探开发成果显著。2012年11月28日，在多方努力下，焦页1HF井试气获日产气20.3万立方米，取得中国石化页岩气勘探重大突破。2013年底，中国石化批准了涪陵焦石坝区块50亿立方米页岩气建设意见。2014年初，中国石化在香港宣布焦石坝地区计划2017年建成年产能100亿立方米的页岩气田。如今涪陵页岩气田的百亿产能建设目标已全面完成 [ 3 ] 。焦石坝的成就极大地鼓舞了页岩气勘探人，坚定了页岩气勘探的信念。随着页岩气勘探开发的不断深入，相应的页岩气地球物理预测与评价技术也成为必不可少的一环，不断成熟进步。
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user: 2. 页岩气地球物理预测技术 就地球物理学而言，地震技术在油气勘探开发中是一种非常有效的工具，已得到广泛应用 [ 4 ] 。但在美国加拿大的页岩气前期勘探开发中，地震应用较少。主要原因是经营者认为页岩气属于非常规连续型气藏，分布广，勘探成功率较高(勘探成功率近90%)，并且总体上与构造关系不密切。但后来随着页岩气勘探开发不断深入，不少公司应用三维地震技术来查明页岩气产区的断层和裂缝发育状况、地层厚度变化、侧向连续性及页岩的特性，进而确定高产带的位置，即所谓的“甜点”。越来越多的经营者认识到要降低页岩气的勘探风险、提高勘探成功率、增加储量，采用三维地震技术不可避免。如美国西南能源公司在阿科马盆地的Fayetteville页岩气远景区开展三维地震调查，2007年底估计三维地震调查面积为400平方英里。目前，该公司所有钻井地区都经过三维地震调查证实。另外，应用三维地震数据检查非常规气藏中裂缝，在加拿大阿尔伯达Mannville煤层气和页岩气以及美国怀俄明州Pinedale气田的致密气砂岩中都获得了良好的效果。 国内页岩气的相关研究不断深入，页岩气地球物理预测与评价技术也逐步完善 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] 。通过几年的技术攻关和在川南地区海相页岩气的勘探开发实践，基本建立了完整的川南海相页岩气地球物理技术体系，形成了大规模的工业化生产能力，能够解决勘探开发难题。这些技术主要包括：地震资料目标精细处理、页岩气测井综合评价与储层特征分析、构造及地震地层解释、地球物理反演及目标预测、页岩裂缝预测、含气性检测、页岩保存条件分析等方面的技术。 1) 页岩气地震资料目标精细处理技术 解决好页岩气勘探区地震资料处理中的静校正问题、信噪比问题、分辨率问题、各向异性速度分析问题、偏移成像问题以及各向异性的保持与消除处理问题，采用有针对性的处理方法和技术措施，建立一整套合理的处理流程，为解决页岩气勘探开发区地质任务，特别是为寻找和落实构造细节、储层研究等提供基础数据体。 2) 页岩气测井综合评价与储层特征分析技术 页岩气层与常规孔隙性、裂缝性砂岩和砂泥岩储层的测井评价方法差别较大，需要一套适用的专门针对泥页岩求取物性的测井解释评价方法，需要基于岩心分析数据建立合适的测井模型，求取岩石物性参数，得到地区经验公式。页岩的有机质含量TOC是反映岩石有机质丰度最主要的指标，有机质的成熟度是表征其成烃有效性和产物性质的重要参数，它们都是页岩生烃能力的重要指标。通过页岩气的测井综合评价研究建立不同地区页岩气的解释模型，开展储层物性参数、页岩生烃潜力测井评价。 3) 页岩气地震地层解释技术 页岩气有利区块通常是页岩发育程度高、油气生烃能力强的区域。充分收集区域沉积相研究的相关资料，进行单井和连井沉积相分析，在前期工作的基础上，以层序地层学理论和方法为指导，结合地震地层学解释，对主要研究目的层进行地震相分析，为沉积特征、沉积相分析提供基础。 4) 页岩气地球物理反演及目标层预测技术体系 在储层精细标定的基础上，针对不同类型储层，利用模型正演开展储层地震响应特征分析，建立储层的含气地震响应识别标志；在储层有利相带预测的基础上，利用振幅、频率、相位、反射极性等常规属性开展目的层储层平面预测；开展波阻抗反演，在地震属性储层预测基础上，实现主要目的层页岩段页岩分布预测以及页岩厚度预测；通过地震叠前反演，实现储层岩性、物性、脆性综合预测和生烃能力的地球物理预测。 5) 页岩气裂缝预测技术 页岩生烃潜力是页岩气钻井获产的基础，而裂缝发育与否是页岩气获产的关键。在区域应力场研究、构造精细解释的基础上，基于高精度构造解释开展构造应力场反演分析，结合各种裂缝预测方法技术进行裂缝综合预测，实现裂缝发育区综合预测。 6) 页岩气含气性检测技术 地震含气性检测常用的频率、衰减等含气性检测技术基本上都是基于孔隙介质理论，主要针对砂岩储层，对于页岩储层其实用性需要通过验证。叠前叠后反演得到的岩石弹性参数，在页岩层段参数的变化可以在一定程度上反映页岩含气性的变化。通过不断的探索和创新，形成适应川南地区页岩气的含气性检测技术。 7) 页岩气保存条件分析技术 保存条件是页岩气藏的关键。断裂与裂缝的发育与页岩气的生产关系密切；页岩气在储层中主要以吸附状态存在，而吸附气量与有机碳含量和地层压力成正比；顶底板为相对致密、具有油气封盖能力的油气盖层能够保证页岩层中的高压流体不至于散失。通过构造形态、埋深、断裂系统及断层性质分析，以及地层压力预测、地层对置关系、顶底板完整性等分析，评价页岩气保存条件。
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user: 3. 页岩气主要评价参数预测方法 对于一个页岩气探区，要评价页岩目标层的品质，最主要的参数包括页岩的厚度、页岩的TOC、页岩的孔渗性等，这些参数是对页岩本身最直观的评价，是决定页岩气能否富集、是否存在开采价值的基础 [ 10 ] - [ 15 ] 。以川南某区龙马溪组页岩为例，对这几个参数的预测进行阐述。 3.1. 页岩厚度预测 一般通过地震波阻抗反演来进行优质页岩储层厚度的预测。纵波叠后反演实现较为方便，反演结果可为储层的空间展布、厚度等刻画提供重要数据。利用叠后地震数据，通过反演模型建立、迭代反演，得到反演的波阻抗数据，如图1所示，在波阻抗剖面上，蓝色区域的低波阻抗对应着优质页岩的发育。 图1. 阻抗反演结果 根据井上分析，选定合适的波阻抗阈值，提取龙马溪组底部最优质页岩的厚度，结果如图2所示，区内优质页岩厚度都在20米以上，西侧较厚，可超过30米。 图2. 优质页岩厚度平面分布 3.2. 有机质含量预测 页岩储层的有机质含量(TOC)是一个非常重要的参数，很大程度上反映了页岩储层产气的潜力。有机质含量(TOC)与页岩的产气率密切相关，同时也是与吸附气量密切相关的。这主要是由页岩气的特征决定的，有机质可以为吸附气提供载体，其含量的高低可以影响吸附气含量发生数量级的改变。另外，丰富的TOC也是形成大量纳米级孔隙的重要载体。 利用地震方法获取页岩TOC参数信息是页岩气目标层地震预测方法研究的重点之一。如果工区范围内只完成了叠后地震的反演，刚可通过建立波阻抗与TOC之间的交会关系，利用叠后地震反演波阻抗计算TOC数据。如图3所示，波阻抗与TOC交会，获取两者之间的指数曲线拟合关系： 图3. 阻抗与TOC交会 利用此关系得到TOC数据，根据TOC数据，提取龙马溪段下段的平均TOC分布图，如图4所示，可以看到，平均TOC能达到2%~3%，西侧大部分地区能达到4%及以上，有机质条件总体较好。TOC值高的区域与优质页岩发育较厚的区域基本对应，说明其本身沉积条件较好。 图4. 优质页岩TOC平面分布 3.3. 孔渗性预测 孔渗性条件也是影响页岩气富集成藏的关键因素，其受到多种因素控制，包括页岩孔隙度是否发育，影响渗透性的节理缝、微裂缝等是否发育，地层压力是否足够大等。从地震的角度开展孔渗性的预测则主要是利用地震技术开展与孔渗性条件相关的物性、物理参数等进行预测从而实现间接的孔渗性描述。目前一般主要针对孔隙度进行预测。 交会分析表明，孔隙度与波阻抗具有较好的相关性，可以通过地震反演得到的波阻抗数据体预测孔隙度。如图5所示，为该区龙马溪段孔隙度数据与波阻抗数据的交会，通过交会，确定了孔隙度与阻抗之间的线性关系： 孔 隙 度 = 11.8346 − 0.0008 * 波 阻 抗 图5. 阻抗与孔隙度交会 依上述关系，利用叠后地震反演得到的波阻抗数据体，计算得到了对应的孔隙度数据体。图6即为利用该孔隙度数据体，获取的龙马溪组底部优质页岩的平均孔隙度分布图。可看到，该段平均孔隙总体为自东向西逐渐增加的趋势，可能因为页岩沉积相对较好的区域，厚度相对较厚，有机质含量增加，有机孔也相对发育，总的孔隙度增加，孔渗性增强。 图6. 优质页岩孔隙度平面分布
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user: 4. 综合评价方法 针对川南海相页岩气的地球物理综合预测与评价的思路以地质分析为指导，以页岩气富集成藏条件为依据，以岩石物理分析为基础，以解决页岩气富集成藏主控因素为目标，形成包含TOC预测、压力预测、页岩分布特征预测、孔渗性预测、脆性预测、含气性预测的技术体系，通过针对性的地震预测技术(包括：构造解释技术、地震反演技术、压力预测技术、TOC预测技术、地震属性分析技术及裂缝预测技术等)开展页岩气富集有利区的分布预测，实现页岩气富集区的综合评价。因此在进行综合评价分析的过程中主要考虑的页岩气富集成藏控制因素包括页岩分布特征、压力条件、TOC特征、含气性、孔渗性特征、保存条件等，具体控制因素涉及到页岩构造形态特征、储层厚度、压力条件、TOC含量、含气性特征、孔隙度条件、裂缝发育程度、脆性条件、顶板岩性条件等。考虑到有效优质页岩的主控因素，确定了基于构造、储层及保存条件的优质页岩综合评价因素，开展优质页岩综合评价(图7)。 图7. 优质页岩综合评价
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user: 5. 结论 目前对于页岩气的预测与评价，基于地震反演的页岩主要评价参数预测是重要的一个方面。在地震综合预测基础上，结合地质成藏条件和富集规律，综合有利沉积相带预测，岩性、物性、脆性、生烃能力、含气性、裂缝预测，开展目标层段“甜点”综合评价。在综合评价、甜点预测的基础上，优选开发目标，提出井位部署建议。随着页岩气勘探开发的深入以及三维地震资料的丰富，地球物理技术的作用也将越来越重要。
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user: 摘 要 目的：探讨内蒙古地区过敏原流行特征及过敏原与特禀体质的相关性，为临床诊断、治疗及预防提供参考依据。方法：采用临床流行病调查统计的方法收集了内蒙古医科大学附属医院2016年6月至2017年5月内蒙古地区不同年龄过敏性疾病患者20种过敏原特异性IgE抗体检测结果，并对过敏原阳性患者进行特禀体质的判断。结果：4902例患者中过敏原阳性率为48.3%，其中女性过敏原阳性率较高(P < 0.01)；不同年龄阶段同一过敏原阳性率表现为D1、H1、E1、E5、I6、W14、F91、F202、WxCHN、Tx-CHN均在青年时期阳性率最高(P < 0.05)，F1、F2则在幼儿时期阳性率最高(P < 0.05)；不同月份同一过敏原阳性率也不同，表现为H1、T70、E1、E5、W14、F1、F2、F27、F91、F202、WxCHN、Tx-CHN均在8月份阳性率最高(P < 0.05)，具有统计学意义，D1则在11月份阳性率最高(P < 0.05)，F23 (P < 0.05)则在10月份阳性率最高；，具有统计学意义，同一种过敏原不同季节阳性率也不同，表现为H1、T70、E1、E5、W14、F1、F2、F91、F202、WxCHN均在夏季阳性率最高(P < 0.05)，D1、F27、F23则在秋季阳性率最高(P < 0.05)，F210、Tx-CHN则在冬季阳性率最高(P < 0.05)，而过敏原阳性患者中有74.7%为特禀体质。结论：20种过敏原特异性IgE抗体在不同年龄段、在不同月份、在不同季节的阳性率均有不同高低表现差异，同时过敏性疾病患者与特禀体质可能存在一定的相关性，但需要进一步研究，望其可以为内蒙古地区治疗过敏性疾病提供部分参考依据。 关键词 :内蒙古地区，过敏原检测，特禀体质 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 过敏性疾病又称为变态反应性疾病，临床表现各有不同，主要表现为过敏性鼻炎、过敏性哮喘、荨麻疹、过敏性湿疹、过敏性皮炎等一系列的疾病。近年来随着工业化程度的增高、环境因素的变化以及饮食结构的变化，人类接触过敏原的方式、种类均存在着不同程度的变化，但基本上其患病率呈现逐渐上升趋势 [ 1 ] [ 2 ] 。而本研究将回顾性分析内蒙古地区常见过敏原的在年龄、月份及季节间的分布性差异，以为临床预防、诊断、治疗提供参考依据。
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user: 2. 资料与方法 1) 对象收集内蒙古医科大学附属医院检验科2016年6月至2017年5月份的所有体外特异性IgE检测过敏原的患者，其中包括门诊及住院部所有患者共计4902例。纳入标准：患者均居住在内蒙古自治区内，患者有明显过敏反应的临床症状。排除标准：非长期居住在内蒙古地区的患者，无过敏临床症状的患者。 2) 方法所有患者采集静脉血3~4 ml，3000 r/min离心10 min，分离血清，用免疫印迹定量检测血清中20种过敏原特异性IgE抗体，操作均严格按照使用说明进行，所有数据均在室内质控在控后获得。共检测20项，其包括户尘螨(D1)、屋尘(H1)、桑树(T70)、猫毛/猫屑(E1)、狗毛/狗屑(E5)、蟑螂(I6)、苋(W14)、鸡蛋白(F1)、牛奶(F2)、虾(F24)、牛肉(F27)、贝(F37)、蟹(F23)、芒果(F91)、腰果(F202)、菠萝(F210)、点青/分枝/烟曲/黑曲/交链霉(MX3)、蒿/矮豚草/藿草/藜(WxCHN)、柏榆柳栎桦枫(Tx-CHN)。并对其结果中有过敏原存在的患者进行特禀体质的判定。 3) 统计处理采用SPSS21.0统计软件处理。计数资料用率表示，各组之间的阳性率比较采用X 2 检验，以P < 0.05或P < 0.01为差异有统计学意义。
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user: 4. 讨论 在过敏性疾病研究中，检测过敏原则是诊断疾病至关重要的依据。其检测的目的是为了明确可疑性过敏原，而防治过敏性疾病的关键在于找到过敏原并避免与之接触，同时特异性脱敏治疗也是过敏性疾病有效的治疗的手段 [ 4 ] 。研究发现过敏原特异性免疫球蛋白E的检测可以确定过敏原的致敏状态，并且可以有效的回避和去除识别的过敏原，从而为免疫脱敏提供指导帮助 [ 5 ] 。 本研究发现在4902例患者中过敏原阳性率为48.3%，其中男性阳性率为38.3%，女性阳性率为43.4%，而在不同年龄段则发现户尘螨(44.6%)、屋尘(32.9%)、猫毛/猫屑(34.8%)、狗毛/狗屑(32.1%)、蟑螂(35.7%)、苋(38.6%)、芒果(35.5%)、腰果(34.2%)、蒿/矮豚草/藿草/藜(45.9%)、柏榆柳栎桦枫(35.8%)均在青年时期阳性率最高(P < 0.05)，鸡蛋白(36.3%)、牛奶(34.3%)则在幼儿时期阳性率最高(P < 0.05)。因此作者发现青年时期过敏原的种类相对较多，这可能与不同年龄儿童接触过敏原的概率不同及与免疫耐受力不同有关，而幼儿的过敏原则主要集中在鸡蛋白和牛奶上，这可能与幼儿食入的蛋白质的量有关系，有研究发现婴幼儿胃肠功能尚不健全，分泌型IgA水平低，同时肠道的通透性增加，使其更容易受到食入性过敏原侵扰而过敏 [ 6 ] 。而随着年龄的增长，幼儿脾胃功能的逐渐健全免疫耐受力的增强，则过敏原的种类也发生着变化；儿童与幼儿相比户外运动会相对增加，饮食习惯也会发生着变化，则过敏的种类有所增加。因此，我们应该加强对幼儿、儿童的过敏原筛查，来有效的预防过敏性疾病的发生。 研究同时对过敏原进行了月份阳性率高低的比较，最后发现屋尘(17.9%)、桑树(19.7%)、猫毛/猫屑(19.7%)、狗毛/狗屑(19.2%)、苋(24.5%)、鸡蛋白(18.3%)、牛奶(20.5%)、牛肉(15.2%)、芒果(30.5%)、腰果(18.3%)、蒿/矮豚草/藿草/藜(26.5%)、柏榆柳栎桦枫(16.8%)均在8月份阳性率最高(P < 0.05)，户尘螨(12.3%)则在11月份阳性率最高(P < 0.05)，蟹(14.5%)则在10月份阳性率最高(P < 0.05)。蒿/矮豚草/藿草/藜的花期多在7~9月份，随着花粉的成熟和花粉的释放数量的增加，空气中的含量也会随之增加；同时8月份是内蒙古地区温度最高的时节，因此屋尘、桑树、猫毛/猫屑、狗毛/狗屑、苋、柏榆柳栎桦枫在8月份的过敏阳性率最高，所以在这个时期我们应该更加注意避免与这些过敏原的接触来有效的预防过敏性疾病的发生。而在不同季节中的变化研究中则发现，屋尘(37.7%)、桑树(35.2%)、猫毛/猫屑(37.8%)、狗毛/狗屑(40.6%)、苋(41.5%)、鸡蛋白(41.4%)、牛奶(42.5%)、芒果(54.0%)、腰果(36.3%)、蒿/矮豚草/藿草/藜(40.0%)则在夏季阳性率最高(P < 0.05)，户尘螨(32.6%)、牛肉(39.4%)、蟹(34.8%)则在秋季阳性率最高(P < 0.05)，菠萝(32.5%)、柏榆柳栎桦枫(30.6%)则在冬季阳性率最高(P < 0.05)。在内蒙古地区一年四季的气候为冬季漫长严寒，春季风大少雨，夏季温热短促，秋季气候剧降；昼夜温差较大，光照充足。又由于内蒙古地区夏季的气候从入夏开始气温逐渐上升，在气温处于蒸腾状态时；并且夏季的温度最适合植物的生长，而大多数的植物开花期从4月一直延续到9月 [ 7 ] ，因此屋尘、猫毛/猫屑、狗毛/狗屑、桑树、蒿/矮豚草/藿草/藜则在夏季则过敏阳性率最高。 由于对有过敏原存在的患者进行特禀体质的判定研究较为表浅，故其结果只能说明过敏性疾病可能存在一些相关性，同时也为以后针对过敏性患者与特禀体质进行进一步深入研究提供了参考方向。 综上所述，在内蒙古地区全年中的过敏主要集中在屋尘、户尘螨、桑树、猫毛/猫屑、狗毛/狗屑、苋、蒿/矮豚草/藿草/藜、柏榆柳栎桦枫、鸡蛋白、牛奶、牛肉、芒果、腰果、蟹共14种比较常见的过敏原。全年中8月份为过敏原的高发时期，在一年四季中多集中于夏季，而对于蟑螂、虾、贝、点青/分枝/烟曲/黑曲/交链霉4种过敏原来说在统计学研究中发现其无论是在不同月份、不同季节中均无统计学意义。由此可见，我们应该在夏季加强自身的防护工作，其中尤为重要的是夏季中的8月份，在此月份在过敏原的种类最多，为过敏性疾病可能发生的最高月份，希望其可以为临床过敏性疾病的诊断、治疗、预防及过敏原改进等提供一些参考。
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user: 摘 要 幽门螺杆菌(HP)是一种能够长期定植于胃黏膜的革兰阴性杆菌。HP感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤，近几年的研究显示HP感染与肠道外的疾病也有一定的相关性。代谢综合征(MS)是以腹型肥胖、脂代谢异常、高血压、糖尿病、高尿酸血症等合并症为特点的一组临床症候群，以多种物质代谢异常为基础的病理生理改变，存在多个致动脉粥样硬化危险因素，最终导致心脑血管疾病的发生和发展。近些年来，越来越多的研究显示出HP感染与MS之间有一定的相关性。 关键词 :幽门螺杆菌，代谢综合征 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 前言 近年来研究发现幽门螺杆菌感染除了与胃肠道疾病有关外，还和代谢综合征之间具有一定的相关性，现将二者之间的相关性进行如下综述。
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user: 2. HP感染与血脂的关系 HP感染是与动脉粥样硬化密切相关的感染因素之一，HP感染通过影响脂质代谢降低高密度脂蛋白(HDL-C)水平，并升高总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三酯(TG)水平，促进动脉粥样硬化 [ 1 ] 。芬兰研究者在1996年发现HP感染者的血脂指标TC和TG均高于非感染者，此后的多项研究显示HP感染者的血液中TC、TG、LDL-C浓度升高，HDL-C浓度降低 [ 2 ] [ 3 ] 。Papamichael等研究发现，HP感染可以导致患者血中TC、LDL、TG增高，血清HP抗体阳性患者的血脂水平明显高于HP抗体阴性患者 [ 4 ] 。Ando等研究显示，根除HP后患者血清中的HDL-C水平显著升高，TG和LDL-C水平则明显降低，因此认为抗HP感染对于减轻患者动脉粥样硬化的程度、减少不稳定斑块的出现均有重要意义 [ 5 ] [ 6 ] 。HP感染与血脂代谢紊乱可能的机制为：HP感染引起了炎症细胞的聚集和激活，这些激活的炎症细胞能分泌肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，而TNF能抑制脂蛋白酶的活性，使脂质从组织中转移出来，从而使血液中TG水平升高，HDL-C水平降低 [ 7 ] 。
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user: 3. HP感染与高血压的关系 原发性高血压(EH)是一种以体循环动脉压升高为主要表现，且呈持续进展的心血管综合征。长期的血压升高可引起患者心、脑、肾等靶器官的损伤，导致心肌肥厚、心肌梗死、脑出血、脑梗死、肾功能不全等多种疾病。Amrani等研究表明对于原发性高血压患者来说，患者幽门螺杆菌感染与临床发病存在一定的相关性 [ 8 ] 。国内也有研究发现EH可能与HP感染有关 [ 9 ] [ 10 ] 。Vahdat等通过进行相关病原抗体检测发现，HP感染与EH发病呈正相关 [ 11 ] 。Rasmi等选取冠状动脉微循环病变患者和健康对照组各选取60例，用ELISA方法检测HP细胞毒素相关基因A (CagA)。结果显示患者HpCagA (+)率显著高于健康对照者，因此认为HpCagA (+)在HP慢性感染的过程中对冠状动脉微循环病变的发病或在冠状动脉微循环病变发病时起触发作用 [ 12 ] 。杨光等研究表明，原发性高血压患者的HP感染率水平较高，患者的C-反应蛋白水平高于健康人群，给予抗HP感染治疗后患者的C-反应蛋白水平显著低于治疗前 [ 13 ] 。HP感染与高血压的可能机制：HP感染原位激活血管活性物质的细胞因子级联反应，使血清纤维蛋白原增高，从而干扰血管内皮一氧化氮的释放，导致正常肌纤维松弛能力下降、血管收缩，最终引起血压增高 [ 14 ] 。
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user: 4. HP感染和糖尿病的关系 糖尿病(DM)是由多种环境因素、遗传因素、生活方式等共同作用而引起的一种慢性全身性代谢疾病。目前国内外关于HP感染与I型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)的相关性研究有一定的争议。HP感染与DM的关系是当前研究热点，有研究显示T1DM患者HP感染率升高 [ 15 ] [ 16 ] ，也有研究表明HP感染与T1DM无关 [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] 。来自2016年的Meta分析表明HP感染与1型糖尿病的发生存在相关性 [ 20 ] 。研究显示HP感染可显著增加T2DM的发病率，随着对T2DM的深入研究发现炎症和T2DM有非常密切的关系，而且HP感染引起的慢性炎性反应可能通过引起胰岛素抵抗(IR)和胰岛B细胞凋亡而导致T2DM，并且HP感染与IR之间可能存在正相关性 [ 21 ] [ 22 ] 。Wang等分析了1997~2012年关于HP与糖尿病的相关文献发现HP感染会增加糖尿病患病率，并且发生2型糖尿病的风险高于1型糖尿病 [ 23 ] 。我国有研究结果也显示HP阳性组胰岛素水平明显高于HP阴性组，提示HP感染有可能增加IR风险 [ 24 ] 。2018年研究显示HP感染可提高患者空腹血糖水平，并降低胰岛素敏感性 [ 25 ] 。国内外研究表明HP感染阳性患者人群较非感染人群T2DM的发病率明显升高，HP感染组患者糖化血红蛋白(HbA1C)、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素，胰岛素抵抗指数(HOMR-IR)均较HP感染阴性组升高 [ 26 ] [ 27 ] 。根除HP后空腹血浆胰岛素水平和HOMR-IR较治疗前均明显下降，表明HP根除在一定程度上改善了IR，进而对T2DM的发生可能有一定的预防作用 [ 28 ] 。HP感染与T1DM的可能制有：1) 感染胃黏膜的HP释放大量炎性反应因子和血管活性物质诱导自身免疫，破坏胰岛β细胞引起胰岛素分泌不足与T1DM产生关联；2) 改变胃黏膜环境，影响胃肠激素分泌，增加糖异生，降低糖利用，导致糖毒性诱发糖尿病发生；3) 产生氧化应激、影响脂质代谢、增强血小板的活化和聚集功能，参与胰岛素抵抗的发生发展；4) 长期HP感染引起慢性萎缩性胃炎减少叶酸和VitB12吸收，导致血同型半胱氨酸浓度升高，参与胰岛素抵抗 [ 20 ] 。HP感染与T2DM的可能制有：1) 对于糖调节受损者，细胞免疫和体液免疫可能使个体对HP的敏感性增加；2) 糖调节受损可能会使胃黏膜表面产生化学变化，进而促进HP感染；3) 患有糖尿病的个体较健康对照组更频繁的暴露于病原体。胰岛素不敏感是一种早期现象，随着时间推移，在出现临床高血糖症状之前，胰岛B细胞的功能逐渐下降，HP感染后许多因素可受到影响如胰岛素抵抗、糖毒性、脂毒性、慢性炎症、遗传和表观遗传因素 [ 29 ] 。
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user: 5. HP感染与高尿酸血症的关系 高尿酸血症(HUA)又称痛风，是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病。尿酸是人体细胞代谢和饮食中嘌呤代谢等的终产物，不仅能够反映肾功能，而且是引起痛风的主要原因。近年来研究显示HUA与HP感染的发生率不断上升，并且HP感染与MS可能存在一定的相关性 [ 30 ] [ 31 ] 。2017年研究同时对HUA合并HP感染与MS的患病情况进行分析，结果显示，HUA、HP感染均可导致MS患病风险增加，两者同时存在加重胰岛素抵抗以及血管内皮损伤，HUA、HP感染可能是MS的危险因素 [ 32 ] 。HP感染与MS发生机制目前尚不明确，但慢性炎症可能发挥关键作用。 综上所述，幽门螺杆菌感染不仅与消化系统疾病有关，还和脂代谢异常、高血压、糖尿病、高尿酸血症有一定的联系，几者之间的相互作用最终导致心脑血管疾病的发生和发展，危害人类健康。故HP感染的人群，应该积极抗感染治疗，并且监测代谢指标，防治心脑血管疾病的发生。
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user: 摘 要 目的：为研究特禀体质与过敏性疾病之间的联系提供研究基础，本研究运用全基因组DNA甲基化技术研究了内蒙古地区特禀体质和平和体质人群的差异甲基化基因。方法：在前期流行病学调查及中医体质辨识量表筛选的基础之上，选取了特禀体质及平和体质各2例受试者进行全基因组DNA甲基化测序，并选取差异基因进行qPCR验证。结果：实验共获得47150个差异甲基化读数，qPCR验证结果显示，与平和体质比较特禀体质XKR6、PLCL1在白细胞中的表达量均降低(P < 0.05)。结论：1) 本实验通过运用全基因组DNA甲基化方法对特禀体质及平和体质进行研究，共确定了47，150个基因，各种甲基化类型中，甲基化区域均主要位于内含子区且比值较高。2) qPCR验证结果与基因高度甲基化结果一致，表明特禀体质人群基因差异甲基化，可能是导致相关基因表达异常的原因之一，是易罹患过敏性疾病的关键。3) 本实验对内蒙古地区特禀体质人群差异甲基化基因的研究，为地区过敏性疾病患者的预防及治疗提供了理论依据，同时为特禀体质与过敏性疾病之间的关系提供研究基础。 关键词 :特禀体质，DNA甲基化，过敏性疾病 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 表观遗传是指不改变基因型而改变表型的基因表达改变的现象或机制。目前表观遗传学在基因调控对疾病影响方面提出了很多思路，并且肯定了一些疾病的发生受表观遗传学的影响，如过敏性鼻炎、过敏性哮喘等疾病的发生与表观遗传学存在着密切的联系 [ 1 ] 。DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传修饰方式，与组蛋白修饰等方式一起，在调控基因表达和染色质构象等方面发挥了重要的作用。DNA甲基化功能是最早发现的基因表观修饰方式之一，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶，这一过程主要发生在CpG的胞嘧啶上 [ 2 ] 。DNA甲基化既可以调控转录水平，又可以在染色体结构稳定性、基因印记、X染色体失活等方面发挥作用 [ 3 ] 。因此DNA甲基化作为表观遗传学中实验研究较多、技术相对完善的一种方法具有很好的应用价值，同时也对深入理解基因表达、个体发育以及疾病的发生、发展机制都具有重要意义。 特禀体质是中医体质类型中的一种，它是由于先天禀赋不足和禀赋遗传等因素造成的一种特殊体质类型，其成因与先天禀赋不足、遗传因素、环境因素、药物因素等密切相关 [ 4 ] 。最近的研究已经发现特禀体质人群与过敏性疾病发生发展的关联性很高 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]，而由于地理环境、生活习惯和气候的独特性，内蒙古地区已成为特禀体质人群的集中区域，进而成为过敏性疾病的高发病地区 [ 8 ] [ 9 ] 。然而，对其在遗传水平表观的调节机制上，如通过其DNA甲基化的作用，我们知之甚少。在这项研究中，我们的目的是比较特禀体质(过敏组)和平和体质(正常组)的DNA甲基化图谱，以确定差异表达的基因，并进行了DNA甲基化水平和差异表达的基因之间的关联分析。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 研究对象 本课题的研究对象均来源于2016~2017年内蒙古医科大学第一附属医院体检中心，通过前期进行的临床流行病学调查，共收集到2000余份体质量表，并以此为基础按照中医体质辨识结果及纳入、排除标准进行筛选，由经过培训的具有中医知识的研究生进行横断面现场调查，当场收回并确认资料合格。最终得到特禀体质154例及平和体质170例作为实验样本选择的范围人群。从范围人群中随机选择了4例研究对象进行全基因组DNA甲基化实验，其中特禀体质2例，平和体质2例。并从剩余范围人群中随机选择10例研究对象进行后续qPCR实验验证，其中特禀体质与平和体质人数各5例。两组受试对象性别均衡，年龄在20~60岁之间，无统计学差异。 2.1.1. 纳入标准及排除标准 纳入标准： 1) 符合特禀体质、平和体质判定标准者； 2) 祖辈三代均生活在内蒙古自治区境内； 3) 年龄满15周岁以上，80周岁以下； 4) 不患有传染性、精神类等影响试验的疾病； 5) 受试者及其一级亲属均愿意接受临床试验者； 6) 签署知情同意书者； 排除标准： 1) 有传染性疾病、先天缺陷或精神异常不能自主思考者； 2) 问卷填写不完整或因故未能完成问卷者； 3) 未签署知情同意书者。 2.1.2. 样本采集 采血前告知受试者实验目的、意义及相关注意事项，然后签署知情同意书。嘱受试者采血前一天禁酒和劳累，女性避开月经期，在空腹12小时后于清晨使用EDTA抗凝管采集肘静脉血8 ml，并充分颠倒使EDTA和血液混合，以防出现局部凝血的问题，保证在8小时内成功分离单个核细胞。 2.2. 实验材料 2.2.1. 实验试剂 主要试剂：生产厂家 红细胞裂解液：北京天根生化科技有限公司 TRIzol® Reagent：美国Invitrogen公司 氯仿：中国医药集团上海化学试剂公司 异丙醇：国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司 RNase-free水：Qiagen (中国)生物技术公司 DEPC：美国Sigma公司 EB：上海博光生物科技有限公司 Certified Low-Range Ultra Agarose：美国Bio-Rad公司 TruSeq TM RNA Sample Prep Kit：美国Illumina公司 TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS：美国Illumina公司 TruSeq SBS Kit (300cycles)：美国Illumina公司 Picogreen：美国Illumina公司 UltraPure Agarose：美国ABI-invitrogen公司 SuperScript III RT反转录Kit：美国ABI-invitrogen公司 Sybr qpcr mix：美国ABI-invitrogen公司 2.2.2. 实验仪器 主要仪器：生产厂家 微量移液器：德国Eppendorf 台式低速离心机himac CT6E：厦门名大科技有限公司 无菌超净工作台SW-CJ-2D：苏州净化设备有限公司 Bio-Gen PRO200精密匀浆器：相马科学仪器(北京)有限公司 NanoDrop2000c微量紫外可见分光光度计：美国THERMO公司 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell Gt Cell：美国Bio-Rad公司 磁力架：美国Invitrogen公司 TBS380：美国Invitrogen公司 台式高速冷冻离心机：美国THERMO公司 核酸浓度测定仪：美国THERMO公司 qPCR仪：美国Applied biosystems公司 电泳仪：美国Bio-Rad公司 凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司 2.3. 方法 2.3.1. DNA甲基化实验方法 登记各样本编号，白细胞分离，提取DNA，并进行质检。在通过测试后的样本中加入一定比例的阴性对照(lambda DNA)，并使用Covaris S220将基因组DNA随机打断至200~300 bp。对碎片化的DNA片段进行末端修复，添加A尾，并附加具有全部甲基化胞嘧啶修饰的测试接头。随后进行Bisulfite处理(采用EZ DNA Methylation Gold Kit，Zymo Research)，经过处理，未发生甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变。进行PCR扩增，得到最终的DNA文库。构建文库后，首先使用Qubit2.0进行初步定量，将文库稀释至1 ng/μl，然后使用Agilent2100检测文库的插入长度。在达到预期的结果后，使用Q-PCR来准确量化文库的有效浓度(有效文库浓度 > 2 nM)，以保证文库质量。文库检测合格之后，根据有效浓度和目标数据量的要求合并不同的文库，进行Illumina HiSeq/MiSeq测序。测序的基本原理是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。将四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶和接头引物加入重新测序的流式细胞中进行扩增，当每个测序簇延伸互补链时，每个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，序列发生器捕获荧光信号，并使用计算机软件将光信号转换为测序峰，从而获得待测片段的序列信息 [ 10 ] 。 2.3.2. qPCR实验方法 登记各样本编号，白细胞分离，提取RNA，并进行质检。按照以下步骤建立反转录反应体系(RNA均取200 ng，补水到10 μl)：RNA 10 μl、Oligo-dT 1 μl、Random 1 μl混匀后离心，65℃，五分钟，结束后置于冰上。在上述反应体系中加入下列反应液：dNTP (10 μM) 1 μl、0.1 M DTT 2 μl、5 × Buffer 4 μl、RT酶1 μl混匀后离心。置于42℃，水浴一小时。取出后置于85℃，灭活逆转录酶反应10分钟。反应结束后置于−20℃待用。每个样本分别用待检测基因和内参基因引物扩增，每个反应做3个重复，按照以下体系建立扩增体系(20 μl)：cDNA 2 μl、qPCR mix 10 μl、primer F 1 μl、primer R 1 μl、ddH 2 O 6 μl于ABI 7900qPCR仪上，按照以下条件反应：95℃ 2分钟、94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s共进行40个循环 [ 11 ] 。 2.3.3. 统计学方法 采用SPSS 20.0软件分析。计量资料采用 x ¯ ± s表示，对符合正态性检验和方差齐性检验采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，不符合采用非参数检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
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user: 3. 结果 3.1. DNA甲基化测序结果 在本研究中，设置2例平和组和特禀组2人进行原始数据的分析，4个样本分别产生了361、505、363、366、854、706、321、750、877、334、567、882个纯读数，且其定位读数分别占相应读数的84.6%、83.92%、81.90%、82.02% (表1)。 Table 1 Data from genome-wide bisulfite sequencing: 1 and 2 normal T1 and T2 allergic group Sample name Raw reads Raw bases (G) Clean reads Clean bases (G) Mapped reads Mapping rate (%) Duplication rate (%) 1 367，821，691 110.35 361，505，363 104.36 305，833，537 84.60 18.63 2 373，441，482 112.03 366，854，706 105.70 307，864，469 83.92 17.66 T1 327，710，705 98.31 321，750，877 92.76 263，513，968 81.90 16.39 T2 339，144，238 101.74 334，567，882 96.59 274，412，576 82.02 19.78 表1. 全基因组重亚硫酸盐测序产生的数据：1、2正常组T1、T2过敏组 为了表征不同环境条件下样本间基因组甲基化水平的差异，我们进行了差异甲基化分析，两组共确定了47，150个DMR，在CG型甲基化中，低甲基化相较高甲基化为高。而在CHG型和CHH型甲基化中结果则恰恰相反，高甲基化较低甲基化为高。但无论发生哪种甲基化类型，其甲基化区域均主要位于内含子区且比值很高(图1)。 我们将基因分为特定的基因特征：启动子，外显子，内含子，5’UTR和3’UTR等。并且在这些功能区域进行MLs评估。正常组与过敏组CG型甲基化比较结果显示，5’UTR区域检测到最低的MLs，但在内含子和3’UTR区域内增加，而且3’UTR的ML较内含子高。正常组与过敏组CHG型和CHH型甲基化比较结果显示，两者之间具有相似的发展模式，在内含子区域检测到最低的MLs，而在外显子及3’UTR区域反而增加，以3’UTR的ML增加更为显著(图2)。 图1. 3种序列环境(CG， CHG， CHH) DMR锚定区域展示 图2. 样本甲基化水平在不同基因组元件上的分布左一和二为正常组，右一和二为过敏组 3.2. qPCR结果 通过对XKR6、PLCL1这两个甲基化位于内含子区的基因进行了qPCR实验验证，溶解曲线为单峰，引物特异性高，可以进行下一步定量实验验证(图3~5)。qPCR结果ct值用2 −ΔΔCt 检验，平和体质组表达为1.00，特禀体质组中XKR6基因结果为0.20，PLCL1基因结果为0.22，两个基因的表达均表现为下降(P < 0.05)，(P < 0.01)，差异有统计学意义(表2、图6)。 Table 2 Gene expression levels of endogenous constitution， and peace constitution (X ± sem 组别 n XKR6 PLCL1 平和体质 5 1.13 ± 0.86 2.33 ± 2.25 特禀体质 5 0.20 ± 0.23 * 0.06 ± 0.06 ** 表2. 特禀体质和平和体质两个基因mRNA表达量(X ± sem) 与平和体质组比较， * P < 0.05， ** P < 0.01。 图3. 基因actin扩增曲线(左、中)和溶解曲线(右) 图4. 基因XKR6扩增曲线(左、中)和溶解曲线(右) 图5. 基因PLCL1扩增曲线(左、中)和溶解曲线(右) 图6. 特禀体质和平和体质两个基因mRNA表达量