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user: 3. 实验结果与分析 3.1. 真核表达载体构建结果与分析 Cdc42基因扩增结果见图2，获得的基因片段长度与预期(576 bp)一致。扩增得到的目的片段、载体pEGFP-C1、pDsred-C1均用EcoR I和BamH I进行双酶切，检测结果见图3。双酶切后的目的基因在500 bp~750 bp之间，双酶切载体条带在5000 bp附近，初步判断双酶切是正确的。 图2. 目的基因Cdc42-2/3的扩增。(a)：从pT-Cdc42-2/3中扩增用于连接pEGFP-C1载体的Cdc42-2/3目的基因；(b)：从pT-Cdc42-2/3中扩增用于连接pDsred-C1载体的Cdc42-2/3目的基因；M：DNA Maker 2000；1~3：Cdc42-2基因；4~6：Cdc42-3基因 图3. 目的基因和载体的双酶切。(a)：目的基因和载体pEGFP-C1的双酶切；(b)：目的基因和载体pDsred-C1的双酶切；M：DNA Maker 5000；1：双酶切Cdc42-2；2：双酶切Cdc42-3；3：双酶切pEGFP-C1 (a图)、pDsred-C1 (b图)；4：pEGFP-C1 (a图)、pDsred-C1 (b图) 回收酶切产物，连接转化大肠杆菌，分别挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，结果如图4，所构建的重组子均能扩增出目的大小的片段(576 bp)。提取重组质粒，结果见图5，重组质粒pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3、pRed-cdc42-2和pRed-cdc42-3均提取成功(重组质粒大小为5276 bp)，然后以重组质粒为模板，进行质粒PCR鉴定，结果见图6，均能扩增出目的大小的片段(576 bp)。 重组质粒进一步进行双切分析，结果如图7，可以看出，成功的切出了大小在567 bp左右的目的基因条带，可以得出Cdc42-2/3成功克隆到pEGFP-C1和pDsred-C1载体上。构建好的表达载体送去测序， 图4. 重组子菌落PCR鉴定。(a)：pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3重组子菌落PCR鉴定；(b)：pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3重组子菌落PCR鉴定；M：DNA Maker 2000；(a1)~(a3)：pGFP-cdc42-2重组子菌落PCR；(a4)~(a6)：pGFP-cdc42-3重组子菌落PCR；(b1)~(b3)：pRed-cdc42-2重组子菌落PCR；(b4)~(b6)：pRed-cdc42-3重组子菌落PCR 图5. 提取重组质粒DNA。(a)：提取pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3 重组质粒DNA；(b)：提取pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3 重组质粒DNA；M：DNA Maker 5000；(a1) & (a2)：重组质粒pGFP-cdc42-2；(a3) & (a4)：重组质粒pGFP-cdc42-3；(b1) & (b2)：重组质粒pRed-cdc42-2；(b3) & (b4)：重组质粒pRed-cdc42-3 图6. 以重组质粒为模板进行PCR鉴定。(a)：以pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定；(b)：以pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定；M：DNA Maker 2000；(a1) & (b1)：以pT-cdc42-2为模板做PCR；(a2) & (a3)：以pGFP-cdc42-2为模板做PCR；(a4) & (b4)：以pT-cdc42-3为模板做PCR；(a5) & (a6)：以pGFP-cdc42-3为模板做PCR；(b2) & (b3)：以pRed-cdc42-2为模板做PCR；(b5) & (b6)：以pRed-cdc42-3为模板做PCR 图7. 重组质粒双酶切鉴定。(a)：重组质粒pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3双酶切鉴定；(b)：重组质粒pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3双酶切鉴定M：DNA Maker 5000；A1&B1：Cdc42-2片段双酶切；(a2)：pGFP-cdc42-2重组质粒双酶切；(a3)：pEGFP-C1空载体双酶切；(a4)：pGFP-cdc42-3重组质粒双酶切；(a5) & (b5)：Cdc42-3片段双酶切；(b2)：pRed-cdc42-2重组质粒双酶切；(b3)：pDsRed-C1空载体双酶切；(b4)：pRed-cdc42-3重组质粒双酶切 测序结果与NCBI里面Cdc42比对分析，序列一致，没有碱基缺失与突变。通过以上鉴定分析可以得出，目的基因已经成功插入荧光表达载体中。 3.2. 重组质粒转染293T细胞实验结果与分析 将重组质粒分别转染293T细胞，转染结果见图8，单独的pEGFP-C1转染见图8(b)，转染效率高达90%。pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3单独转染293T细胞见图8(d)、图8(f)，均能有效表达。没有单独的pEGFP-C1亮(见图8(b))，这可能是Cdc42-2/3蛋白与GFP蛋白形成融合蛋白折叠的过程中，Cdc42-2/3遮盖了部分GFP所致。 图8. 重组质粒转染293T细胞。(a) & (b)：pEGFP-C1转染293T细胞；(c) & (d)：pGFP-cdc42-2转染293T细胞；(e) & (f)：pGFP-cdc42-3转染293T细胞；(a)、(c)、(e) 图为白光；(b)、(e)、(f)图为激发光 携带红荧光基因报告基因的质粒转染293T细胞结果见图9，图9(h)是pDsRed单独转染293T细胞的情况。pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3分别转染293T细胞见图9(j)和图9(l)，观察到比较亮的红色荧光，与pGFP-cdc42-2 (见图9(d))相比，pRed-cdc42-2/3更有利于Cdc42的表达。 图9. 重组质粒转染293T细胞。(g) & (h)：pDsRed-C1转染293T细胞；(i) & (j)：pRed-cdc42-2转染293T细胞；(k) & (l): pRed-cdc42-3转染293T细胞；(a)、(c)、(e)图为白光；(b)、(e)、(f)图为激发光 由图8和图9可以看出，Cdc42的同源异构体基因克隆至pDsRed-C1载体上的表达量要高于该基因克隆至pEGFP-C1载体，这表明后续实验可以采用红荧光报告基因系列重组质粒。 3.3. CCK-8法测定化合物细胞毒性实验结果与分析 在不同拟肽化合物浓度下，用CCK-8法测定的细胞活度结果见表2。所以后续细胞实验时，选择了对细胞毒性较弱的10 μmol/L拟肽化合物浓度，作为试验工作浓度。 Table 2 Cell viability assay by CCK- 拟肽化合物4浓度 0 μmol/L (DMSO对照) 1 μmol/L 10 μmol/L 100 μmol/L A549细胞活度 1.00 0.98 0.95 0.82 表2. CCK-8法测定细胞活度表 3.4. Cdc42协同化合物对细胞迁移的影响实验结果与分析 将重组质粒转染至迁移能力较强的A549细胞，进行细胞划痕实验。根据细胞划痕实验结果，制作细胞迁移对比图，如图10所示。通过对比分析表3和图10，可以得出以下结论： ① 细胞中过表达基因Cdc42后，细胞迁移率提高； ② 加拟肽化合物刺激细胞后，细胞迁移率同样是升高的； ③ 细胞中过表达基因Cdc42，同时用化合物刺激，细胞迁移率更大。 图10. 细胞划痕实验 Table 3 The results of Cell wound scratch assa 是否加化合物 转染质粒 48 h细胞迁移率(%) 促进系数 是 pEGFP-C1 44.27 1.18 是 pGFP-cdc42-2 47.79 1.27 否 pDsred-C1 37.67 1.00 否 pRed-cdc42-2 39.13 1.04 否 pRed-cdc42-3 39.59 1.05 表3. 细胞划痕实验结果