DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 1. 引言 为了适应新的消费形势、满足卷烟市场个性化需求，烟草行业对烟包在包装设计上不同的款式的需求 [ 1 ] [ 2 ]。常见的条盒包装形式多为二五平包，如今立式包装在很多品牌中也得以应用，尤其常用于中支烟、细支烟的条盒包装中。目前对于YB65A型硬条包装机也有许多改进，申敏亮 [ 3 ] 等采用分体式剔除板解决成型不良烟包剔除卡死问题，降低了剔除通道卡机故障率；郑以龙 [ 4 ] 等设计可调节凸轮，通过调整螺钉在弧形槽内的位置进而凸轮外轮廓形状和周长，以适应多个吸风时长不同的各种设备；万斌 [ 5 ] 等通过改变条盒纸库托架尺寸并增加光纤检测装置有效保证条盒输送稳定性，准确监测错位条盒，基本控制了条盒包装错位产品流入市场，但翻包夹持装置作为烟包立式排列重要组成部分却少有改进，现有翻包夹持装置可满足低速，小批量生产。随着YB65A型硬条包装机投入中支烟生产，现有翻包夹持装置已不能满高速平稳运行，因此，设计一种新型翻包夹持装置以适应不同尺寸烟包，并夹持牢固不损坏，进而提高卷烟生产效率。
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user: 2. 存在问题 翻包夹持装置作为烟包立式排列的主要组成部分，其夹持位置准确和导向推动直接影响烟包成条。在YB65A型硬条包装机设备实现立式包装需要烟包经透明纸裹包成型及热封系统，并在推包器的推动下，双包叠加在一起向前传送，经翻包夹持器使平放叠加的两个烟包翻转90度转为竖向，再输送到条盒包装机的烟包输入通道，实现立式包装 [ 6 ]。现有翻包夹持装置在实现翻包夹持运动中存在烟包与翻包夹持装置位置不契合，导致烟包变形和触皱，易引起烟包堵塞在翻包夹持装置中 [ 7 ]。YB65A型硬条包装机运动速度快，高速往复运动易使烟包在惯性驱使下飞出翻包夹持装置盒模，影响输送线正常运行，甚至发生烟条少包严重质量事故。翻包夹持装置紧固力不足，完成翻包运动后夹持装置内有烟包竖向相对位移，推杆推出竖向烟包易引起烟包阻塞和夹坏现象。因此，翻包夹持装置需要有足够的夹持力，确定位置的夹持位置和可靠的夹持结构才能满足设备的正常运行和效益。
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user: 3. 原因分析 现有翻包夹持装置在实现翻包夹持运动中存在许多问题，停机频率过高，根据表1所示，实验人员在三组YB65A型硬条包装机的翻转盒模垂直跳动实验中发现翻转盒模在水平接烟工位与渐进分包并包通道的高度差大于等于2.8 mm，并通过图1可直观反映出翻转盒模在水平戒烟工位存在大幅度垂直跳动，不能满足使用要求，并且实现烟包进入翻包夹持装置盒模过程中由于缺少烟包导向机构，存在挤压变形和触皱情况，常在卷烟品牌换号前期尤为突出。 Table 1 Flip box mode and progressive subcontracting and parcel channel height statistics tabl 机台 测算时间内通道高度差/(mm) 8:00 10:00 12:00 14:00 B7# 3.0 3.2 3.2 3.0 B8# 3.2 3.0 3.0 2.8 B10# 3.1 3.0 3.0 3.2 表1. 翻转盒模与渐进式分包并包通道高度差统计表 图1. 盒模与渐进式分包并包通道的高度差折线图 烟包进行翻包运动中常因夹持机构的与烟包的摩擦力无法满足烟包在翻转中惯性需求，从而使烟包甩出，影响输送线的正常运行 [ 8 ]。翻包夹持装置的烟包夹持力不足，缺少可调节的柔性紧固装置，为此，实验人员采用弹簧弹片夹持机构，择优选择适合的压缩弹簧避免造成翻转后位置不对引起烟包堵塞和夹坏。因此，设置一种夹持位置准确，翻转不发生烟包飞出的翻包夹持装置有助于提高立式排列烟条的生产。
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user: 4. 改进措施 新型翻包夹持装置基于现有YB65A型硬条包装机推条空间尺寸设计，为保证烟包夹持位置准确，夹持力适宜和翻转运动平稳等要求，将于烟包盒模开槽且设有固定倒角，并采用弹簧弹片柔性机构满足不同规格烟包导向翻转输送和紧固烟包的功能，满足稳定高速下烟包竖立排列的需求。翻包夹持装置如图2，图3所示。 图2. 翻包夹持装置结构示意图 图3. 翻包夹持装置烟包排列示意图 4.1. 结构组成 翻包夹持装置由盒模、弹片、底座组成。根据图2，图3所示，模盒通过螺栓固定于底座上，底座对整个装置起支撑作用，底座与驱动装置和导向装置相连，驱动装置和导向装置能够带动底座发生翻转。底座的翻转角度为90度，使水平叠放的两个烟包转为竖直放置，底座上设有长螺栓孔，左，右模盒上均设有圆形螺栓孔，螺栓同时置于圆形螺栓孔及长螺栓孔中并与螺母配合，即可将左，右模盒固定于底座上，且螺栓能够在长螺栓孔中滑动，使得左，右模盒之间的距离可调节以适应不同规格烟包。 4.2. 弹簧弹片的设计 模盒上设有用于放置烟包的开口槽，根据图2，图4，弹片通过弹簧固定于模盒的内侧壁上，开口槽的尺寸与烟包的尺寸相适应，弹片用于夹紧烟包。根据左，右模盒对称设置，为满足烟包推入盒模具有导向机构，左，右模盒的顶端及弹片顶端均设有第二倒角；为保证烟包在实现翻包过程后，推杆将烟包推出翻包夹持装置具有导向机构，在弹片左侧设置第一倒角。 图4. 弹簧弹片示意图 4.2.1. 弹簧弹片尺寸设计 根据烟包盒模实际尺寸与烟包二五平包的包装方式，弹簧弹片内嵌于盒模内部，便于烟包推条的导向和夹紧，将弹簧弹片长度尺寸小于烟包盒模4 mm，便于弹片的安装与更换。弹片采用两层结构，其两层弹片间距则有4 mm的间距，弹片距离盒模边缘则采取4 mm间距，根据弹片设计尺寸 [ 9 ] [ 10 ]，利用ANSYS软件对弹簧弹片进行盒模与烟包推入盒模进行有限元受力分析，根据表2弹片受力满足使用要求。 Table 2 Elastic sheet stress and strain statistics tabl 应力应变 整体应变/(mm) 等效弹性应变/(mm) 等效应力/(MPa) 最小 0 2.2236e − 15 3.4909e − 10 最大 1.3521e − 5 5.5622e − 6 1.1122 平均 5.7639e − 7 3.3556e − 7 6.5069e − 2 表2. 弹片应力应变统计表 弹簧弹片结构内部弹簧安装于弹片与盒模位置，为保证烟包推入盒模过程中不发生烟包挤压变形，弹簧设计参数经过实验对比绘制不同伸长量弹簧，根据图5结果所示，采取1.5 mm伸长量弹簧。 图5. 不同伸长量弹簧烟包挤压数折线图 4.2.2. 弹片倒角设计 为保证烟包推入盒模具有导向功能，新型翻包夹持装置设计弹片倒角满足烟包导向推入功能，根据图2所示，为满足烟包推入盒模具有导向机构，左，右模盒的顶端均设有第二倒角，第二倒角选择在45˚~55˚；参照图4，弹片为长方形弹片，其顶端设有第二倒角，优选角度范围在45˚~55˚；为保证烟包在实现翻包过程后，推杆将烟包推出翻包夹持装置具有导向机构，在弹片左侧设置第一倒角，优选角度范围在45˚~55˚。如图6所示，实验人员对第一倒角采用45˚，50˚，55˚三组对照进行烟包推入实验对比，并参考实验结果选择第一倒角50˚和55˚进行倒角耐磨性实验(图7)，最终根据零件磨损条件下择优选择50˚为第一倒角度数。 新型翻包夹持装置对已夹持烟包进行翻转后，竖立烟包在推杆往复推入进入下个工位。为保证第二烟包的顺利推入，已对第二倒角进行择优选择，根据加工便捷性，第二倒角采用第一倒角相同度数，即50度。模盒顶部设置的第二倒角和弹片顶部设置的第二倒角对烟包起到导向作用，使烟包能够准确、顺利地被推入模盒内。在上述操作过程中，烟包定位准确，烟包的四个面被模盒及弹片固定，且弹片能够有效夹紧烟包，防止烟包在翻转过程中飞出，整个烟包翻转过程运行平稳，大大提高工作效率。 图6. 不同弹片倒角烟包堵塞数折线图 图7. 不同弹片倒角磨损角度叠加量折线图
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user: 5. 改进效果 新型翻包夹持满足YB65A型硬条包装机设备对立式翻包需求，实验人员对三组YB65A型硬条包装机设备进行为期三周(工作时间18天)的跟踪调查，统计结果如表3所示。根据图8所示，YB65A型硬条包装机在采用翻包夹持装置的停机频次由19.6次降至日均5.68次，翻包器故障停机频率降低了71.02%，满足使用需求。 Table 3 Flipper failure downtime statistics tabl 故障部位 故障次数/(次) 所占频率/(%) 累积频率/(%) 双包推入 28 27.7 27.7 翻转 21 20.7 48.4 双包并包 18 17.8 66.2 交接 16 15.8 82 推出 15 14.9 96.9 其他 3 3.1 100 合计 101 100 100 表3. 翻包器故障停机频次统计表 图8. 翻包器日均故障停机频次柱状图 设计改进后的翻包夹持装置在公司车间包装机上进行了试验，新型翻包夹持装置与YB65A型硬条包装机兼容性高，机器运行状况良好，相较改进前的翻包夹持装置而言，结构简单、操作方便，通过调节模盒之间的间距，使该装置能够适用于不同尺寸的烟包。模盒对烟包的四个面进行固定，通过长方形弹片确保烟包在模盒中处于夹紧状态，在将烟包进行90˚翻转时保证烟包位置准确，防止其跑偏，以立式形式输送到下一环节。采用新型翻包夹持装置能够大大提高工作效率及装置的使用寿命。
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user: 摘要 B7分子作为参与免疫反应中的重要信号分子，在免疫反应发生及肿瘤免疫中发挥了重要的作用，本文就B7分子的发现、特点、功能及在肿瘤免疫中的作用做一综述。
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user: 1. 引言 T细胞活化的“双信号学说”表明：T细胞的有效活化需要两个信号，第一信号是T细胞表面受体(TCR)与抗原提呈细胞(APC)提呈的抗原肽——主要组织相容性复合体(MHC)结合提供的抗原特异性信号，第二信号是APC或靶细胞与T细胞间辅助分子配对作用提供的协同刺激信号。其中APC表达的B7-1、B7-2分子与T细胞上表达的相应受体结合提供最基本、最重要的共刺激信号。越来越多的研究表明B7-1和B7-2分子在空间结构、与受体结合和行使功能方面存在许多不同之处，本文对B7-1和B7-2分子的一些最新研究做一综述。
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user: 2. B7-1、B7-2分子的发现与命名 1982年Yokochi等研究B细胞时发现一种特异表达于B细胞表面的B细胞激活抗原BB1 (B lymphoblast antigen l)，相对分子质量(Mr)约为37，000；1987年Freeman等发现B7，但其Mr约为60，000，并于1989年克隆出人和鼠的B7分子的基因，通过序列分析及抗体免疫沉淀方法，证实B7与BB1为同一分子，Mr的差异可能是由于糖基化程度不同所致。1993年Boussiotis等发现B7-2；Freeman等克隆出B7-2基因，证实B7-2的存在，原B7被命名为B7-1；1994年Caux和Azuma等证实B7-0、B7-2完全相同，B7-0/B7-2命名为B7-2。1996年国际统一命名B7-1和B7-2分子。
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user: 3. B7-1、B7-2分子的结构特点、受体和表达 3.1. 结构特点 B7-1、B7-2分子都为I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，编码带信号肽的糖蛋白，含胞外免疫球蛋白V样结构域和C样结构域、疏水性跨膜区和胞浆区。 B7-1的编码基因位于人类染色体3q13.3~q21区内，长度为1491 bp，容易二聚化，多以同源二聚体 [ 1 ] 形式表达于抗原提呈细胞(APC)表面，且有两个结合位点。其胞外区有8个潜在的糖基化位点，之前报道的相对分子质量的差异可能是其胞外区8个糖基化位点的糖基化程度不同所造成的。 B7-2的编码基因位于人类染色体3q13.3~q23区内，其mRNA长度为1120 bp，不易二聚化，多以单体 [ 1 ] 形式表达于APC表面，不能形成稳定的二聚体结构。胞外区也有8个潜在的糖基化位点。B7-2和B7-1仅有25%的氨基酸同源性，其胞浆区有很大不同，B7-2胞浆区较长，含3个蛋白激酶C磷酸化位点，可能参与信号传导。人与鼠的B7-2基因有70%的同源性，在胞浆区存在许多不同，人类B7-2胞浆区存在更多的磷酸化位点。 3.2. 受体及表达 B7-1、B7-2受体包括CD28和CTLA4，两者在DNA序列上有70%的同源性，也属于免疫球蛋白超家族，都以同源二聚体的形式存在，但CD28仅有一个配体结合位点，是单价的二聚体，而CTLA4为二价的同源二聚体 [ 2 ]。CD28和CTLA4 IgV区的互补决定区MYPPY序列是B7-1、B7-2分子识别的关键部位。晶体结构研究表明B7-1、B7-2的V区与CD28和CTLA4直接接触，通过CD28传导有效的共刺激信号；而B7-1、B7-2的C区与CTLA4非直接接触，但对与CTLA4的亲和力及调节T细胞活性等方面起着间接而又极其重要的作用 [ 3 ]。B7-1与CD28、CTLA4的亲和力高于B7-2，其平衡解离常数(Kd)分别为4和0.2 uM；B7-2与CD28、CTLA4的Kd分别为20和2.6 uM [ 4 ]。 B7-1、B7-2主要表达于树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等抗原提呈细胞(APC)。生理情况下，未经刺激的APC不表达B7-1，而B7-2组成型表达于APC表面且受刺激后快速上调，约48h达到高峰；B7-1受刺激后诱导性地表达较慢，但可以持续较长的时间(4~5天)。这种表达模式在单核细胞和脾细胞是没有争议的，但在培养DC和朗格汉斯细胞时发现其从前体转变为非成熟状态时B7-1比B7-2优先表达，这可能与iDC主要发挥免疫耐受的作用而B7-1与CTLA4结合促进对自身抗原产生耐受有关 [ 5 ]。不同的表达模式说明它们的功能不同，有研究表明B7-2在免疫反应初期发挥重要作用，而B7-1对于免疫反应的维持和调节起着关键作用。
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user: 4. B7-1、B7-2分子的功能 4.1. 对T细胞的作用 对T细胞活化的影响：B7-1、B7-2分子对T细胞的活化起重要作用，CD28/B7通过活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT进而激活NF-kB、IL-2、Bcl-XL等分子从而促进T细胞的活化和增殖。有研究认为B7-1、B7-2分子对CD4 + T细胞的活化都发挥着重要的作用，亦有研究认为B7-1、B7-2分子对CD4 + T细胞的活化有选择性作用，B7-2分子对T细胞免疫反应起主要作用，可能与它是组成型表达且受刺激后快速上调有关。Thomas [ 6 ] 等用单克隆抗体证实了在体内阻断B7-2能够抑制CD4 + T的活化，而阻断B7-1则加强了CD8 + T的活化及CTL效应。Zhang [ 7 ] 等采用基因敲除鼠也发现B7-2 −/− 鼠其CD4 + T的活化和增殖明显下降。 对T细胞分化的影响：B7-1、B7-2分子调节Th1/Th2型T细胞分化，在体内外采用不同的实验模型，研究B7-1、B7-2分子对Th1、Th2型反应的影响结果存在争议。有研究认为B7-1有利于Th1型T细胞分化，B7-2有利于Th2型免疫反应。Carlos [ 8 ] 等研究发现对于可以作为粘膜递呈系统载体的减毒沙门氏菌，B7-1既影响Th1相关IgG亚型反应，也影响Th2相关IgG亚型反应；B7-2选择性地影响Th2相关IgG亚型反应。而对于沙门氏菌载体上的变形链球菌唾液黏附区克隆抗原，B7-1、B7-2对Th1相关IgG亚型反应具有协同作用；B7-2对Th2相关IgG亚型反应发挥着重要的作用。Zhang等研究B7分子在牙龈卟啉单胞菌重组血凝素B的免疫反应中的作用时发现B7-2 −/− 小鼠的IgG1明显下降，而B7-1 −/− 小鼠IgG1水平与野生型小鼠相似，表明B7-2在Th2型反应中发挥重要作用。而且发现B7-2 −/− 小鼠的IgG2a明显增加，表明B7-2分子可能下调IgG2a水平，抑制Th1型反应 [ 7 ]。而在研究粘膜佐剂CTB、MPL时发现初次免疫时B7-1影响Th1型反应，B7-2影响Th2相关IgG亚型反应；第二次免疫后则主要是B7-2对Th1、Th2相关IgG亚型反应的影响 [ 9 ]。不一致的结果可能与抗原性质、免疫途径及佐剂的类型有关。 4.2. 对B细胞的作用 有研究表明B7-2分子能提高B细胞的活性，促进其增殖和分化及IgG的产生；而B7-1分子抑制B细胞的增殖和分化，通过上调一些促凋亡分子及下调抗凋亡分子从而减缓B细胞淋巴瘤的生长 [ 10 ]。Zhang [ 9 ] 等研究发现B7-2 −/− 小鼠的特异性IgG水平明显下降，而B7-1 −/− 小鼠其IgG水平与野生型小鼠相似，B7-1/B7-2 −/− 小鼠没有检测到特异性IgG的产生。而且发现B7-2 −/− 小鼠的粘膜特异性IgA也明显降低。表明B7-1和B7-2分子在系统免疫中既发挥独特的作用又相互补充，而在粘膜免疫中B7-2分子发挥着独特的作用。而Carlos [ 8 ] 等研究发现B7-1 −/− 小鼠的特异性抗沙门氏菌的IgA明显下降，B7-2 −/− 小鼠的IgA水平与野生型小鼠相似，表明B7-1对于特异性IgA的产生也发挥着重要作用，而且B7-2不能完全代偿B7-1的缺失；但对于产生特异性抗克隆抗原SBR的IgA，B7-1和B7-2的作用是互补的。研究结果的不同可能与抗原的性质有关。 B7-1、B7-2分子也影响B细胞生发中心的形成、T-B细胞之间的相互作用。Salek-Ardakani [ 11 ] 等认为对B7-1、B7-2分子的需要根据APC类型及免疫反应阶段的不同而有所差异: 牛痘病毒(VACV)感染早期，CD4 + T细胞与DC相互作用，同时需要B7-1、B7-2分子提供共刺激信号从而激活CD4 + T、产生VACV特异性Th1型分化，表明在这个过程中B7-1、B7-2分子都起着关键作用；对于VACV特异性CD8 + T细胞反应，B7-2发挥重要作用；在T FH 与B细胞作用阶段，B7-2对于T FH 表型维持、生发中心的形成、抗体的产生等方面起着重要作用。Good-Jacobson [ 12 ] 等研究发现B7-1 −/− 小鼠T FH 细胞减少，尚存的T FH 成熟、生发中心形成障碍，产生很少的浆细胞，表明B7-1对于生发中心的形成、T FH 的成熟、晚期生发中心反应的维持、记忆B细胞和浆细胞的分化也起着重要作用；之前研究认为B7-1不影响B细胞生发中心和抗体的形成，但B7-1/B7-2 −/− 小鼠其表型比B7-2 −/− 小鼠要严重许多，表明B7-1在其中也发挥重要作用。
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user: 5. B7-1、B7-2分子在肿瘤免疫中的作用 研究表明B7-2基因的多态性可参与多种癌症的形成，Xiang [ 13 ] 等研究发现B7-2基因变异者易患胰腺癌，B7-2的+1057G/A多态性与AG (+1057， +2379)单倍型均与中国人群胰腺癌的易感性增加有关，B7-2基因多态性可能是胰腺癌的遗传危险因素，其机制可能是+1057A等位基因能导致8号外显子的氨基酸转换(由丙氨酸转变为苏氨酸)，从而改变酪氨酸激酶磷酸化水平并影响细胞因子如IL-2和IL-4的表达，这些细胞因子对于激活特定的免疫细胞群如B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等发挥着重要作用，而这些免疫细胞在胰腺癌的形成过程中可能起着关键的作用；+2379可能影响B7-2的表达。 众多研究表明B7-1、B7-2分子的表达可以作为监测肿瘤预后的标志。Martinez-Escribano [ 14 ] 研究表明黑色素瘤患者其外周血淋巴细胞表达B7-1、B7-2数目的变化对于评价其预后有重要价值。CD19 + B7-1 + 及CD19 + B7-1 + B7-2 + 表达数目增多的黑色素瘤患者其预后较好，这些标志可以作为黑色素瘤患者随访的重要监测指标。Chang [ 15 ] 等发现B7-1、B7-2表达增多降低了早期鼻咽癌的致癌性，可以作为鼻咽癌患者良好预后的标志。Thomas [ 16 ] 等发现B7-1的表达与口腔鳞状细胞癌的消退有密切关系，早期口腔鳞状细胞癌形成时B7-1表达不足是引起肿瘤免疫逃逸的重要原因之一，而B7-1内源性或转染性地表达增多有利于早期肿瘤的消退，这一研究对于发现更加有效地抗肿瘤免疫治疗有重要的意义，可以通过增加或增强B7-1、B7-2的表达以达到治疗肿瘤的目的。 之前的研究发现在肿瘤的转基因治疗中，将B7-1、B7-2基因导入肿瘤细胞可增强其免疫原性，启动并诱导产生抗肿瘤免疫反应，而且这种效应不局限于某一特定的细胞类型，其作用机制与T细胞依赖型免疫应答的诱导和扩增有关。王斌 [ 17 ] 等将B7-1、B7-2基因以腺病毒为载体转染到表面几乎不表达B7分子的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株，发现B7-1、B7-2表达明显增加，促进T淋巴细胞的增殖及活化T细胞分泌IFN-γ、IL-2，明显提高了肿瘤的免疫原性，从而产生有效的抗肿瘤免疫反应。刘伟 [ 18 ] 等采用小鼠EL-4淋巴瘤模型研究发现，B7-1治疗组的成瘤时间延长，成瘤率降低，平均肿瘤体积较对照组小，抗淋巴瘤效应增强，明显延长了荷瘤小鼠的平均生存期，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。 肿瘤细胞转导表达B7-1和B7-2产生的生物效应是复杂的。某些情况下，B7-1、B7-2在诱导产生抗肿瘤免疫应答上会产生相反的效应。有研究证实B7-1基因转染到不同实验小鼠的肿瘤模型能显著提高其免疫原性，Foreman [ 19 ] 等采用卡波西氏肉瘤模型研究发现B7-1而非B7-2能显著诱导T细胞的活化和增殖、Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)的产生从而增强抗肿瘤免疫反应。而Martin-Fontecha [ 20 ] 研究发现在小鼠乳腺癌模型上表达B7-2的TS/A小鼠乳腺癌细胞(TS/A-2)其免疫原性强于表达B7-1的TS/A细胞(TS/A-1)，但将B7-2的cDNA转染到TS/A-1细胞并不能提高其免疫原性，将B7-1的cDNA转染到TS/A-2细胞会降低其免疫原性，在TS/A-2/1体内注射之前用抗体阻断B7-1会恢复到只转染B7-2时其较高的免疫原性，表明B7-1调节B7-2相关的共刺激信号，而且B7-1也调节TS/A-2疫苗内源性IFN-γ和IL-4的平衡。Johnson [ 21 ] 采用神经母细胞瘤模型研究认为这两个共刺激分子在诱导抗肿瘤免疫反应上具有协同作用。因此，肿瘤疫苗表达的B7-1和B7-2的功能是相似还是相反这一问题仍需进一步探讨。 B7-1、B7-2分子也与细胞因子等联合应用诱导抗肿瘤免疫反应。IL-12可以诱导产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞、增强自然杀伤细胞的毒性，也刺激T细胞、NK细胞、自然杀伤T细胞产生IFN-γ从而诱导基因10和单核因子发挥有效的抗血管生成的效应。但IL-12全身应用会产生严重的毒性效应，所以Pan [ 22 ] 构建了膜结合型IL-12 (scIL-12-B7TM)，其包含单链IL-12和B7-1的跨膜区和胞浆区，能显著抑制皮下肿瘤的生长、肺转移以及局部及全身肿瘤的形成，并且能产生记忆反应，其机制与CD4 + T、CD8 + T细胞有关。Bozeman [ 23 ] 等也发现共表达B7-1和GPI-IL-12的疫苗能够显著降低4TO7肿瘤的致瘤性、诱导长期保护性免疫反应及抑制远隔部位伴发的肿瘤生长从而显著降低整体肿瘤治疗的负担，其机制可能与降低了肿瘤微环境中的髓源性抑制细胞和调节性T细胞有关。
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user: 6. 结论 B7-1、B7-2作为重要的协同刺激分子，两者既有相似之处又存在很多不同。越来越多的证据表明，B7-1和B7-2分子有不同的功能特征。两者的协调作用和各自具有的独特功能对于研究免疫细胞分化、免疫调节、肿瘤治疗等方面有着很大的潜在研究价值，只有全面地认识并验证出两者的区别才能更好地理解这两种分子在发挥作用时是如何被调控的，从而为其在临床上的应用提供更好的理论依据。
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user: 摘要 目的：幽门螺杆菌(H. pylori， HP)感染是胃炎发病率和胃癌死亡率逐年增长的主要原因之一。我们前期研究表明PGRN在胃炎组织中的表达增加，HP感染可促进胃黏膜上皮细胞PGRN的表达。因此，本研究旨在探讨HP感染诱导胃黏膜上皮细胞白细胞介素-8 (IL-8)表达变化中PGRN表达的作用及机制，以阐明PGRN在相关炎症反应中的作用。方法与结果：采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法和ELISA法检测HP26695感染胃上皮细胞中IL-8的表达水平，该作用是通过NF-κB通路介导的。采用qRT-PCR和western blot (WB)检测慢病毒干扰载体PLKO.1-PGRN shRNA-GFP诱导的IL-8在胃上皮细胞中的表达变化。通过干扰PGRN的表达，HP可以诱导胃黏膜上皮细胞P65的磷酸化水平，进而促进胃黏膜上皮细胞中IL-8 mRNA和蛋白的表达。进一步加入NF-κB通路信号抑制剂BAY11-7082，可干扰PGRN对胃黏膜上皮细胞P65磷酸化的影响，并显著抑制HP感染后IL-8的变化。结论：PGRN通过NF-κB信号通路抑制HP感染诱导的IL-8表达上调，在胃炎的发生发展中起重要的抗炎和保护作用。
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user: 1. 介绍 在中国，胃炎的发病率高达50%~80%，80%的成年人出现不同程度的胃炎。此外，随着老年人口增多、城市工业化进程加快、环境污染严重、人们生活习惯和饮食结构的改变，其发病率进一步上升；受影响的人口也趋于年轻化 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]。如果不积极治疗，胃炎就会由急性转为慢性、慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎，甚至肠上皮化生、异型增生，最终导致胃癌。目前最常见的胃炎治疗方案是根除HP的同时对症治疗，即三联疗法、胃酸抑制剂和胃黏膜保护剂 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。 胃炎是多种因素共同作用的结果，其中，HP感染是主要原因。HP目前被世界卫生组织列为一类致癌物。全球有一半的人口感染了HP，几乎所有被感染的患者都可以发展为慢性胃炎。HP与宿主相互作用，介导机体对细菌的免疫反应，导致白细胞介素8 (IL-8)、环氧合酶-2 (COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、干扰素γ (IFN-γ)等因子的上调。这些细胞因子通过多种渠道产生免疫反应，损害局部组织，导致胃炎。其中，IL-8在炎症的发生发展中尤为重要。IL-8又称炎性趋化因子或促炎性趋化因子，是中性粒细胞的趋化剂，主要由IL-1、TNF、受脂多糖刺激的单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和T淋巴细胞产生 [ 7 ]。由于IL-8能够刺激趋化因子的释放，吸引免疫细胞到炎症部位，对细菌感染做出反应，进行免疫监测，控制免疫细胞趋化，因此IL-8又称为中性粒细胞趋化因子 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]。 颗粒蛋白前体(PGRN，也称为GEP [Granulin-Epithelial Protein Precursor])，是通过连接区(P1-7)连接7个保守谷蛋白(A、B、C、D、F、G)单元而形成的功能前体 [ 11 ]。PGRN是一种分泌型糖蛋白，具有非常广泛的生理功能。作为介导细胞周期过程和细胞运动的多功能生长因子，在细胞生长、转化、促进细胞周期、伤口愈合和细胞毒性耐药性等方面具有普遍的调节作用。我们前期研究发现，胃炎时，胃黏膜上皮细胞中PGRN的表达增加。此外，PGRN可诱导多种炎性细胞因子的分泌，如IL-8、IL-6、IL-10、TNF-α等 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]。同时，PGRN可促进肾损伤、神经退行性变等多种相关疾病的发展，与神经炎症、人动脉粥样硬化斑块、急性肾损伤、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病等相关。总之，PGRN在损伤修复和免疫调节中发挥着重要作用，为临床诊断和治疗提供了新的方向，是未来研究的目标。然而，PGRN在HP感染引起的胃炎中的作用尚不清楚。本文就其在胃炎中的作用机制及潜在的治疗价值进行了讨论。 本研究以HP26695株和胃黏膜上皮GES-1、SGC7901细胞为模型，探讨PGRN对HP诱导IL-8表达的影响，以及二者在蛋白和mRNA水平上的相关性。探讨HP感染在胃炎发生发展中可能的机制，为其临床诊断和治疗提供新的靶点。
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user: 2. 材料和方法 2.1. 细胞培养和试剂 人胃黏膜上皮GES-1细胞和胃癌细胞SGC7901在RPMI 1640培养基中培养(Invitrogen， Carlsbad， CA)，添加10%胎牛血清(Hyclone， Logan， UT)，青霉素/链霉素(1:100稀释；Sigma-Aldrich， St. Louis， MO， USA)，在37℃，5% CO 2 的气体环境中培养。 特异性抑制剂PI3k/AKT抑制剂UO126、MEK1/2抑制剂LY294002和核因子-kappa B (NF-kB)抑制剂bay11-7082从Invitrogen公司购入。在二甲亚砜(DMSO)溶液中制备储备溶液。在HP刺激后用上述抑制剂处理细胞。没有抑制剂的对照组用培养基和相同浓度的DMSO单独处理。 2.2. 动物饲养 将SPF级C57BL/6雄性6周龄小鼠40只，在相对湿度40%~60%、室温23.2℃、噪音 < 60 dB、光–暗循环12小时的标准实验室条件下观察驯养7 d。动物由潍坊医学院实验动物中心提供的水和营养完整的饲料(高压蒸汽灭菌)饲养。 2.3. 幽门螺杆菌培养 本研究使用的幽门螺杆菌菌株为实验室保存的标准菌株(NCTC26695、NCTC11637、Sydney菌株1或SS1)。所有菌株的培养基均为含5%胎牛血清的布氏肉汤培养基，在37℃，低氧环境(5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气)下培养。收集时以6000 rpm离心3分钟。感染细胞时按照荷菌量MOI为100:1。 2.4. 免疫组织化学 取新鲜小鼠胃黏膜上皮，在低温恒温器中切成5 μm厚。石蜡固定切片。将切片置于烘箱中化蜡。然后置于玻片架上分别浸入，二甲苯I 15 min，二甲苯II 15 min，100%乙醇10 min，95%乙醇6 min，80%乙醇min，75%乙醇2 min，单蒸水1 min。然后进行抗原修复。滴加适量内源性过氧化物酶阻断试剂，后用山羊血清封闭，并洗涤。滴加一抗后置于避光湿盒内4℃孵育过夜或37℃孵育60分钟，后用PBS洗涤。滴加生物素标记山羊抗兔IgG并置于避光湿盒内室温孵育10~15分钟。最后用DAB法显色并拍照。 2.5. RNA提取与实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 用TRIzol (Invitrogen)按照制造商的方案提取细胞总RNA。使用Revert Aid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)随机引物进行逆转录。从1 μg总细胞RNA中合成第一链cDNA。然后，扩增PGRN和β-actin的cDNA。使用的特异性引物为： PGRN正向引物5’-GGACAGTACTGAAGACTCTG-3’，反向引物 5’-GGATGGCAGCTTGTAATGTG-3’； β-actin正向引物5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，反向引物 5’-CACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’； IL-8正向引物5’-ACACTGCGCCAACACAGAAATTA-3’，反向引物 5’-TTTGCTTGAAGTTTCACTGGCATC-3’。 实时PCR反应包括ABI7000快速实时PCR系统与SYBR ® 预混ExTaq™根据规定的程序。 HP与GES-1和SGC7901细胞在培养基中孵育达6、12和24 h。菌/细胞比例为100:1。然后用PBS洗涤细胞两次，在无血清的RPMI-1640培养基中培养。分别于0、6、12、24 h后收集培养上清液进行蛋白检测。IL-8的表达采用酶联免疫吸附试验(中国南京森贝佳生物技术有限公司)，按照生产厂家的方案进行检测。各组在450 nm处测定吸光度，用分光光度法测定IL-8浓度。每个实验至少重复三次。 2.6. Western Blot 用细胞裂解缓冲液裂解细胞，用BCA法测定蛋白含量。每孔加入40 μg蛋白，后进行SDS-PAGE电泳，再转移到PVDF膜上。室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1.5 h，用TBST洗脱3× 10 min。一抗孵育过夜，洗涤后与二抗室温孵育2小时。β-actin作为内参。 2.7. 慢病毒载体转染的干扰 成功构建的PLKO.1-PGRN shRNA-GFP干扰慢病毒能有效抑制胃黏膜上皮细胞中PGRN mRNA和蛋白的表达。GES-1和SGC-7901细胞在6孔板上传代，2 × 10 5 细胞/孔，培养过夜。PGRN shRNA组和对照组均以Lipofectamine 2000作为转染剂。PGRN shRNA的干扰序列为：PGRN shRNA正向序列为：5’-CCGGGGCCACTCCTGCATCTTTACTCGAGTAAAGATGCAGGAGTGGCCTTTTTG-3’，反向序列为：5’-AATTCAAAAAGAGGCCACTCCTGCATCTTTACTCGAGTAAAGATGCAGGAGTGGCC-3’。它们均由上海生物工程技术有限公司合成。Lipofectamine™2000试剂(Invitrogen)用于脂质体细胞感染。这一步采用60%感染浓度的慢病毒载体。 2.8. 裸鼠成瘤实验 选用适龄裸鼠，将裸鼠固定后，选择腋下为成瘤位置。用75%乙醇消毒裸鼠背部，侧腰部及腋下皮肤，用无菌的一次性注射器吸取细胞悬液，接种细胞时选择裸鼠侧腰部以上部位进针，在皮肤和肌肉层时间穿行一段距离后在目标注射点注射。每个部位约注射0.2 mL。然后将裸鼠放适宜的饲养环境。每日观察成瘤情况并记录。 2.9. 统计数据分析 所有实验数据均采用SPSS软件进行统计分析，采用T检验确定统计学意义，以P < 0.05为标准。
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user: 3. 结果 3.1. 幽门螺杆菌感染致胃炎小鼠胃黏膜中PGRN的表达明显升高 为了探讨HP感染对PGRN表达的影响，本研究建立了小鼠HP感染模型。用HP SS1株感染小鼠48周后，W-S银染结果显示，所有小鼠均成功定植(如图1(A))。免疫组织化学染色结果显示，小鼠模型中出现HP相关性胃炎(图1(B))。病理改变早期，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，主要位于腺下区。随着感染时间的延长，细胞浸润的范围和程度扩大，嗜中性粒细胞浸润，可通过固有层扩散至腺腔。HP自然感染动物的胃黏膜中常可见嗜酸性粒细胞浸润，正常人和动物均无嗜酸性粒细胞浸润。免疫组织化学染色结果显示，正常小鼠胃黏膜中PGRN表达较低，而HP导致的慢性炎症后PGRN表达明显升高(图1(C))。 图1. 幽门螺杆菌感染小鼠和对照组小鼠胃黏膜的组织染色和免疫组织化学染色 3.2. 幽门螺杆菌感染诱导胃上皮细胞中IL-8的表达呈时间依赖性 采用琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR、ELISA检测HP感染胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC7901中IL-8的表达变化。分别用HP26695株感染细胞0、6、12、24小时，MOI为100:1。如图2(A)所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示，HP与胃黏膜上皮细胞相互作用时间延长，IL-8 mRNA表达量增加。也就是说，HP26695株的感染可以诱导胃上皮细胞GES-1和SGC7901中IL-8的表达上调，且这种诱导与HP感染的时间呈正相关。实时荧光定量PCR检测结果与ELISA检测结果一致(图2(B)、图2(C))。 图2. 人胃黏膜上皮细胞中HP感染时间与IL-8表达的关系 3.3. 幽门螺杆菌通过NF-κb通路调控IL-8在胃黏膜上皮细胞中的表达 为探究HP感染对胃上皮细胞GES-1和SGC7901诱导IL-8表达的调控作用，当细胞融合度达到70%时，分别加入PI3K/AKT、MEK和NF-κb信号抑制剂LY2940021、U0126和BAY11-7082作用2小时。前期结果显示，将HP按MOI为100:1感染细胞12小时后，IL-8 mRNA表达量应明显增加。qRT-PCR结果显示，将NF-κb抑制剂BAY11-7082提前2小时作用于细胞再加菌作用，可显著抑制胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC7901中HP对IL-8的诱导表达(图3(A))。ELISA检测结果与检测mRNA水平一致(图3(A))。此外，分别用HP26695株感染GES-1和SGC7901细胞0分钟，15分钟，30分钟，60分钟和120分钟。结果表明，HP感染可能大大增加细胞P65磷酸化水平，并且，在HP感染胃黏膜上皮细胞2小时的时候，P65的磷酸化最为显著，进一步证实HP感染诱导IL-8的产生可能受NF-κb通路的调控。 图3. HP菌株26695感染胃黏膜上皮细胞后IL-8信号通路的变化 3.4. PGRN对慢病毒感染的干扰可增加HP诱导的胃黏膜上皮细胞IL-8的表达 为验证PGRN在HP感染诱导胃黏膜上皮细胞中IL-8变化中的作用，我们还成功构建了PLKO.1-PGRN shRNA-GFP干扰慢病毒，并成功感染细胞，该慢病毒能有效抑制PGRN mRNA和蛋白在细胞中的表达。慢病毒感染后，PGRN表达降低后，胃黏膜上皮细胞中IL-8 mRNA的表达明显增加(图4(A))。qRT-PCR和ELISA结果显示，慢病毒感染的胃黏膜上皮细胞与HP (MOI = 100:1)相互作用12小时后，可以诱导IL-8 mRNA和蛋白的表达(图4(B))。此外，用HP感染慢病毒PLKO.1-PGRN shRNA-GFP的胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC7901，与对照组相比，PGRN表达降低后，IL-8 mRNA表达明显升高，在蛋白水平上也有相同的结果。 图4. 慢病毒感染干扰PGRN在HP感染诱导胃黏膜上皮细胞中IL-8变化中的作用 3.5. PGRN通过NF-κB通路对HP感染胃黏膜上皮细胞P65磷酸化的影响 为了进一步分析HP是否通过PGRN对NF-κB信号通路产生影响，用PLKO.1-PGRN shRNA-GFP转染细胞72小时后，与HP26695共孵育2小时。如图5(A)所示，与HP感染相比，PGRN shRNA感染可以激活P65。与病毒对照组相比，PGRN shRNA组的P65磷酸化水平升高，与HP合并感染后P65磷酸化水平上调更加明显。然而，同时感染HP的PGRN shRNA组的磷酸化水平明显高于对照组，这些结果在两种胃黏膜上皮细胞中都是一致的。提示PGRN可能通过上调P65的磷酸化来影响HP感染后IL-8的表达。 为了进一步阐明HP介导的胃上皮细胞中IL-8的产生是否通过是由PGRN通过NF-κb信号通路调控，我们采用了该通路的抑制剂BAY11-7082进行治疗。如图5(B)所示，与未感染细胞相比，HP感染可通过NF-κb信号通路促进P65磷酸化。NF-κb信号通路抑制剂BAY11-7082能显著降低HP感染后P65磷酸化的增强的水平。在PGRN干扰慢病毒的作用下，HP感染后P65的磷酸化水平明显高于对照组。然而，在BAY11-7082的作用下，慢病毒感染干扰PGRN与HP相互作用导致的P65磷酸化被明显抑制，在两种胃黏膜上皮细胞系中均得到了相同的结果。因此，PGRN慢病毒通过NF-κb信号通路干扰胃黏膜上皮细胞IL-8的产生。 图5. PGRN对HP感染胃黏膜上皮细胞GES-1和SGC7901 P65磷酸化的影响
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user: 4. 讨论 胃炎的发生和发展是由多种因素引起的，其中感染是最常见的原因。HP引起的疾病的特征包括胃黏膜炎症、胃酸生成的变化和组织损伤。此外，持续性HP感染可导致胃黏膜的慢性炎症。在易感人群中，胃黏膜上皮的HP感染与胃炎、胃溃疡、胃腺癌和胃黏膜相关B细胞淋巴瘤(MALT)的发生密切相关 [ 6 ]。HP的致病潜能是由细胞毒素相关抗原A (CagA)和空泡细胞毒素(VacA)等毒性因子提供的。HP成功地在严苛的胃内环境中定植需要特殊的机制 [ 11 ] [ 14 ]。外膜蛋白(OMPs)被认为是HP适应宿主的关键蛋白。OMP家族中一些被广泛研究的成员如BabA、SabA、HopZ在HP感染的致病过程中发挥粘附作用，而外膜炎症蛋白A (The outer membrane inflammatory protein A， OipA)对炎症因子IL-8的诱导和胃黏膜上皮细胞的粘附是必不可少的 [ 15 ]。 细胞内和细胞外PAMPS受体或免疫效应物在HP感染的发病机制中发挥不同的作用。NOD1驱动的IL-33可能阻止HP介导的炎症反应，对人体来说是有益的，因为细菌在胃内的持续存在。TH-17t辅助细胞亚型通过分泌细胞因子和激活效应细胞来预防HP菌血症；Th1和Th-17反应是在HP感染期间引起的。例如，有相关研究显示，瑞典HP感染患者体部和胃窦中Th-17细胞因子IL-17A和Th1淋巴因子IFN-γ编码基因表达水平升高 [ 16 ]。更重要的是，HP感染患者的IL-17A+和IFN-γ+细胞数量也增加。此外，伊朗和法国HP感染患者胃组织中IL-17A mRNA也显著增加 [ 17 ]。在斯里兰卡一个研究中显示，HP感染与IL-17血清浓度的增加相关。Sutton等人发现，MUC1通过抑制TLR/NF-κB通路的激活，调控NLRP3的表达，作用于免疫细胞(可能是巨噬细胞)，从而防止IL-1β的过度产生和胃发育不良的发生。IL-1B-511T/P基因型或IL-1RN 2等位基因携带者感染HP后黏膜IL-1β水平高于非携带者 [ 18 ]。因此，白细胞介素-1基因多态性可能影响HP相关白细胞介素-1β在HP感染的胃中的水平，而HP相关白细胞介素-1β又与胃炎和萎缩有关 [ 19 ]。 HP感染的临床结果取决于感染株、宿主免疫应答和环境之间复杂的相互作用，其特征是产生大量炎症细胞因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-17 [ 17 ]。这些炎症细胞因子水平的升高在胃炎的发生发展中起着关键作用。其中最重要的是第一个特征化因子IL-8，也称为促炎趋化因子，诱导中性粒细胞沿着血管壁积累 [ 7 ]。该细胞因子的释放是由不同细胞类型的特定炎症信号触发的，通过对中性粒细胞活性的影响，在防御机制中发挥关键作用。然而，在炎症刺激下，IL-8在循环中持续、长期存在可能导致不同程度的组织损伤。由于IL-8具有刺激丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞蛋白酪氨酸磷酸化的作用，因此被认为不适合用于治疗目的 [ 8 ] [ 9 ]。IL-8的主要受体结合于所有趋化因子NH2端附近的结构域，其拮抗剂可通过截断或取代这一区域获得 [ 10 ] [ 20 ]。作为促进血管生成的趋化因子，CXCL8/IL8与CXCR2受体相互作用，而作为抗血管生成的趋化因子，干扰素诱导蛋白相关的IL-10 (CXCL10/IP10)与CXCR3受体相互作用 [ 21 ]。HP感染过程中产生的促炎细胞因子IL-6、IL-8和TNF依赖于AQP3的水平 [ 22 ]。在HP感染的AGS细胞中，α-硫辛酸激活NRF2/HO-1通路，抑制促炎细胞因子IL-8的产生，减少活性氧(ROS)。因此，食用富含α-硫辛酸的食物可以通过降低活性氧诱导的胃黏膜上皮细胞中IL-8的表达水平来预防HP相关胃病的发生 [ 23 ]。 HP感染可显著增加胃黏膜PGRN的表达，但PGRN在HP引起胃炎中的作用尚不清楚。PGRN是一种表达于内皮细胞、免疫细胞、神经元和脂肪细胞的富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，具有抗炎和免疫调节活性，可间接调节细胞周期进程和细胞运动。因此，它是细胞生长、迁移和转化、伤口愈合、炎症和细胞毒性抵抗的重要调节因子。它最初被认为具有生长因子样特征，与组织重塑、发育、炎症和蛋白稳态有关 [ 24 ] [ 25 ]。PGRN水平升高与许多炎症疾病密切相关，如慢性阻塞性肺气肿(COPD) [ 26 ]、胰岛素抵抗 [ 27 ]、哮喘 [ 28 ]、关节炎 [ 29 ]、II型糖尿病 [ 30 ]、骨坏死 [ 31 ] 和其他疾病。程序素具有抗炎特性，是一种有用的预后生物标志物。在流感病毒感染过程中，PGRN的体内外表达水平显著升高。通过PGRN敲除试验和PGRN缺陷小鼠模型，证实流感病毒诱导的PGRN通过抑制NF-κB和IRF3信号的激活负调控I型干扰素的产生 [ 32 ]。此外，PGRN通过其Grn CDE结构域直接与NF-κB调控因子相互作用 [ 33 ]。 考虑到PGRN在各种炎症中具有重要的抗炎和保护作用，本研究旨在通过成功构建PLKO.1-PGRN shRNA-GFP慢病毒来阐明其在胃炎中的作用，该慢病毒能有效抑制PGRN感染胃黏膜上皮细胞后的表达。并在感染细胞中持续表达，以便日后研究PGRN影响的机制。我们的研究发现PGRN可以显著降低HP感染引起的胃炎中炎症因子IL-8的表达水平，从而抑制胃炎的发生发展。因此，HP感染促进胃黏膜上皮细胞PGRN的表达是一种保护性反应，PGRN减少了相应的炎症反应。
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user: 5. 结论 综上所述，PGRN可能通过NF-κB信号通路调控HP26695株感染的胃黏膜上皮细胞中IL-8的分泌和表达，调控胃炎的发生发展。在此过程中，PGRN诱导某些下游基因通过NF-κB调控IL-8的表达，进而发挥抗炎和保护作用，从而影响胃炎的病理生理变化。这一过程的确切机理值得进一步探讨。总体而言，PGRN在胃病损伤修复和炎症过程中起着关键作用，可作为临床诊断和治疗的新靶点，为胃炎的后续研究提供新的方向。
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user: 摘要 对比增强能谱乳腺X线摄影(CESM)是近年来新兴的影像学技术，在乳腺病变的诊断领域正在迅速发展。它结合了全数字化乳腺摄影(FFDM)与静脉注射碘对比剂，在提供肿瘤形态影像的同时，又可提供肿瘤灌注信息。CESM的诊断效能较传统乳腺X线有所提高，相比于乳腺MRI诊断价值相似并且成本更低，检查时间更短。本文就CESM的原理及临床应用进展进行综述。
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user: 1. 引言 乳腺癌(Breast Cancer)是全球女性最常见的恶性肿瘤，已成为威胁女性生命安全的重大健康问题。近年来，恶性肿瘤早期筛查、早诊早治的重要性逐渐被越来越多的人们所认识，根据统计表明，乳腺癌患者在发生晚期远处器官转移之前，约70%~80%的早期非转移性乳腺癌患者是可以被治愈的 [ 1 ]。目前，常规的乳腺癌影像学诊断技术包括乳腺X线摄影、MRI及乳腺超声，其中乳腺X线摄影(mammography， MG)检查是乳腺癌筛查和诊断的首选影像技术。中国拥有大量致密型乳腺的女性乳腺癌患者，因致密型乳腺的高腺体密度，使得乳腺钼靶对其的诊断准确性有所下降 [ 2 ]。对比增强能谱乳腺X线摄影(contrast-enhanced spectral mammography， CESM)是近年来兴起的新成像技术，它结合了全数字化乳腺摄影(FFDM)与静脉注射碘对比剂，在提供肿瘤形态影像的同时，又可提供肿瘤灌注的功能学信息，CESM的独特优势为乳腺病变的影像诊断提供新的选择。本文将对CESM的临床应用进展现状进行综述。
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user: 2. CESM技术的概述 全数字化乳腺摄影(full-field digital mammography， FFDM)虽然对脂肪型腺体的敏感性较高，但由于自身成像模式的局限性，对于中国女性常见的致密型乳腺进行诊断时容易造成假阴性或假阳性结果的出现 [ 3 ]。对比增强能谱乳腺X线摄影(CESM)通过利用造影剂在恶性肿瘤新生血管区域的高积聚，展现出独特的成像优势。这项技术在2011年获得了FDA的批准用于临床应用。 CESM运用了碘化造影以及双能量采集技术，可获得基于恶性肿瘤新生血管形成的形态以及生理信息。双能量采集又称双能剪影技术，原理是碘造影剂在K-edge (33.2 keV)的边缘效应，在对比剂注射之后分别采集低能(低于33.2 keV)和高能(高于33.2 keV) X线图像，低能图拥有和FFDM相似的形态细节，高能图则可突出对比度吸收区域。利用碘和乳腺组织在这两个能级的X射线衰减差异来抑制背景乳腺组织，并对低能和高能图像进行特定的加权重组，得到剪影图像，以最大限度地提高病变中低浓度碘的可见性。因此对于CESM的检查设备，除了乳房X光检查中常用的钼和铑过滤器外，还添加了一种新的铜质过滤片。 CESM检查所注射的对比剂为与CT成像相似的低渗碘对比剂，注射剂量为1.5 mL/kg体重(最高的总注射剂量通常不超过150 ml)，浓度为300~350 mg/ml，速度为2~3 ml/s。在对比剂注射后延迟两分钟开始低能(26到30 kVp)到高能(45到49 kVp)图像的采集，有利于对比剂吸收进去到组织中。双能量采集系统最终采集到的图像包括每个乳房的标准头尾位(craniocaudal， CC)和内外斜位(mediolateral oblique， MLO)的4张低能图与4张减影图 [ 4 ]。
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user: 3. CESM的临床应用 近年来，对比增强能谱乳腺X线摄影(CESM)的临床应用日益增加。CESM在评估乳腺疾病方面表现出与MRI几乎相当的准确性及灵敏性，但阳性预测值(PPV)较高，背景强化较小，CESM同时可以显著降低检查时间，并且成本更低 [ 5 ]。因此CESM现在正被用来代替MRI用于提供多种诊断指标，包括评估其他检查的异常结果、提高乳腺癌的诊断效能以及新辅助化疗相关的评估。 3.1. 评估其他检查的异常结果 常规的乳腺X线摄影(MG)在诊断致密型乳腺时存在局限性，MRI可以极大地提高诊断灵敏性，但其特异性较低，同时人们也在寻找当存在禁忌症或者没有条件进行MRI检查的情况下的替代检查方法。在一项针对121名已在MG或超声检查中发现异常患者的报告中，患者在之后两个月内分别进行了CESM和MRI的检查，比较两种检查方法在全组和特定乳腺结构类型中的灵敏性和特异性。结果表明在全组及在致密型乳腺患者中，CESM表现出和MRI相似的结果，表明CESM可作为MRI不能提供或有MRI禁忌症的情况下的替代检查方法 [ 6 ]。在另一项针对致密型乳腺患者的研究中，纳入了115例致密型乳腺患者的共131个病灶，将这些病灶的CESM和超声检查结果同组织学检查结果相对照，结果表明两者对致密型乳腺的诊断效果相当 [ 7 ]。在一项CESM与MG对乳腺病变检查结果的对比研究中，MG漏诊恶性病变27个，其中就有25个是致密型的乳房，而在这25例中，CESM阳性的为20例(80.0%)，可见与MG相比，CESM可显著减少致密型乳腺病例的假阴性结果 [ 8 ]。 3.2. 提高乳腺癌的诊断效能 通过辅助检查对乳腺癌患者的病变严重程度评估分析，有助于临床医生准确制定后续的肿瘤治疗方案，CESM的加入为乳腺癌患者提供了一个创新性的检查选择，在近年来的相关报告中，CESM也展现出对乳腺癌极好的诊断效能。CESM的诊断基础是肿瘤组织相对于周围正常乳腺组织的表现出的异常强化影像，在2020年的一项荟萃分析中，CESM发现阳性病灶的前测概率为57%，测试后的概率为83%，而阴性发现的后测概率为20%，在MG及超声不能确定病灶严重程度及MRI禁忌症或不可用时，CESM被认为是评估乳腺癌严重程度的可靠方式 [ 9 ]。乳腺癌的腋窝淋巴转移与其严重程度及预后紧密相关，国外有学者建立了基于CESM的乳腺癌腋窝淋巴结转移的放射组学诺模图，并验证其对淋巴结转移的预测效果，最终构建的诺模图对于乳腺癌腋窝淋巴结转移的灵敏度在95%以上，在乳腺癌淋巴转移的术前预测中具有良好的应用前景 [ 10 ]。在一项针对乳腺癌术后患者的复发型乳腺癌的研究中，和传统X线相比，CESM将复发癌的诊断效能显著提高，灵敏度达到91.17%，特异度75%，准确率82.85%，再次表明了CESM的诊断可靠性 [ 11 ]。 3.3. 新辅助化疗相关的评估 乳腺癌患者的新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy， NAC)应用可以大幅度提高保乳概率，利用影像学手段评估肿瘤对NAC的反应可以了解当前NAC的有效性，发现治疗效果差的原发肿瘤，从而指导临床进行治疗策略的选择，合理安排手术时机，避免毒性反应。在2020年的一项针对NAC的荟萃分析中，作者比较对比增强磁共振成像(CE-MRI)和CESM检测NAC病理反应的准确性，结果显示，CESM与CE-MRI相比，具有同等的特异性、更高的敏感性和优异的性能，在评价乳腺癌对NAC的病理反应方面有更广阔的前景 [ 12 ]。在另一项研究中，为了早期预测新NAC后的病理反应，进行了CESM增强扫描的定量分析，将经过NAC治疗并手术切除病灶的患者随机分为病理完全应答组(PCR组)和非病理完全应答组(Non-PCR组)，比较两组CGV灰度值降低百分率(Δ-CGV)是否有统计学差异。结果证明了CESM对NAC后早期评估病理反应的有效性 [ 13 ]。国外一个团队设计了一种基于CESM的放射组学诺模图，用于在治疗前预测NAC不敏感的乳腺癌。该诺模图包含11个放射组学特征以及Ki-67指数、背景实质增强和人表皮生长因子受体-2 (HER-2)状态3个独立临床危险因素，结果显示其在临床应用中具有一定实用性 [ 14 ]。
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user: 4. CESM临床应用的挑战 CESM在临床中应用日渐增多，表现出比传统MG检查更高的准确性及灵敏性，和MRI相比拥有更低的检查时间和检测成本，但其目前还存在诸多局限性限制着CESM的更进一步应用。与MG相同，CESM检查中可能会遗漏深部组织的病变或位于图像投影盲点的病变，背景实质性的增强以及非强化乳腺癌的掩蔽效应也会造成假阴性结果的出现 [ 15 ]。另外，一些良性病变也存在新生血管增多的表现，在CESM上也会表现为增化表现，这造成了假阳性率的提高。由于CESM检查所注射的对比剂为与CT成像相似的低渗碘对比剂，出现碘对比剂不良反应的情况也和CT相似。CESM相比于传统的MG检测，在提高诊断能力的同时也增加了辐射剂量(100%到180%)，额外的辐射剂量与被检查乳房的厚度有关。总之，CESM自身存在的局限性可能会影响它的更广泛应用，解决这些有待于技术各方面的进一步改进提升。
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user: 5. 总结 对比增强能谱乳腺X线摄影(CESM)作为新兴的影像学技术，在乳腺病变的诊断领域正在迅速发展。相比于其他检查方式，CESM拥有自身独特的优势，它在提供肿瘤形态影像的同时，又可提供肿瘤灌注的功能学信息，同时也存在自身的局限性有待进一步优化，以获得更广大应用空间。
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user: 摘要 复合造山和叠加转换共同导致了三江特提斯域复杂的构造岩浆活动和复合成矿系统，构造动力体制转换是成矿的根本驱动。温泉断裂是研究区内的主要导岩、导矿构造，区内成矿系统以斑岩–矽卡岩型Cu-Fe-Pb-Zn和云英岩型Sn、W矿床为主，成矿与燕山晚期中特提斯洋的关闭以及新特提斯洋的俯冲消减引发的酸性岩浆期后热液系统关系密切，形成于后碰撞陆内伸展构造环境。研究认为温泉断裂构造–岩浆带内岩浆热液型Sn-W-Be成矿系统与矽卡岩型/岩浆热液型Fe-Pb-Zn-Cu-Ag-Hg多金属成矿系统属于相同构造岩浆热事件在不同标高和不同围岩环境的成矿响应，为复合成矿作用的产物。通过复合成矿系研究探索构建了温泉断裂构造–岩浆带成矿模式，认为进一步探寻燕山晚期–喜山期花岗岩体是后续找矿的关建环节，与酸性岩有关的Pb、Zn、Sn、W、Be多金属成矿系列是区内的重点找矿方向；研究显示石缸河锡钨铍矿床的铍矿化在空间上依附于海西期蚀变辉长辉绿岩脉(307.9 ± 3.2 Ma)，但成矿年龄集中在68~56 Ma，与燕山晚期酸性岩浆期后热液关系密切，提出石缸河以北的外岩房一带是寻找铍矿资源的首选靶区；温泉断裂北东侧的松坡、光山、中和一带，以及温泉断裂南西侧核桃坪一带其深部具有寻找与晚期酸性岩体相关的钨铍矿的找矿远景。