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user: 3. 结果与分析 3.1. LAMP体系的优化 CMV LAMP体系的优化。CMV Mg 2+ ：对于CMV Mg 2+ 的浓度，设置5个不同的梯度，终浓度分别为2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM，反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。Mg 2+ 的浓度从2 mM到10 mM逐渐增加，反应条带也越来越清晰，当Mg 2+ 的浓度达到6 mM时，亮度最亮，且再增加浓度，条带的亮度没有很明显的变化，因此确定CMV LAMP Mg 2+ 的最佳浓度为6 mM (图1)。 图1. Mg 2+ 浓度对于CMV LAMP反应的影响 CMV dNTPs：对于CMV dNTPs的浓度，设置5个不同的梯度，终浓度分别为0.4 mM、0.8 mM、1.2 mM、1.6 mM、2.0 mM，反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。dNTPs的浓度从0.4 mM到2.0 mM逐渐增加，反应条带也越来越清晰，当dNTPs的浓度达到1.2 mM时，亮度最亮，且再增加浓度，条带的亮度没有很明显的变化，因此确定CMV LAMP dNTPs的最佳浓度为1.2 mM (图2)。 图2. dNTPs浓度对于CMV LAMP反应的影响 CMV反应时间：为了确定CMV LAMP反应的最佳反应时间，对于LAMP的反应时间设置5个不同的梯度，分别为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。从图中可以看出，在所设置的5个时间梯度中，LAMP都可以正常的进行，在反应时间为30 min的时候就可以产生反应条带，但是条带比较淡，40min的时候条带的亮度明显增强，随着反应时间的延长，条带亮度基本上没有变化，因此确定CMV LAMP的最佳反应时间为40 min (图3)。 图3. 反应时间对于CMV LAMP的影响 CMV反应温度：为了确定CMV LAMP反应的最佳反应温度，对于LAMP的反应温度设置6个不同的梯度，分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。从图中可以看出，当温度为60℃时，LAMP出现微弱的反应条带，当温度为61℃时，LAMP条带亮度陡然增强，温度继续增加，条带亮度不变，因此确定CMV LAMP的最佳反应温度为61℃ (图4)。 图4. 反应温度对于CMV LAMP的影响 3.2. PVY LAMP体系的优化 PVY Mg 2+ ：对于PVY Mg 2+ 的浓度，设置5个不同的梯度，终浓度分别为2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM，反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。Mg 2+ 的浓度从2 mM到10 mM逐渐增加，反应条带也越来越清晰，当Mg 2+ 的浓度达到6 mM时，亮度最亮，且再增加浓度，条带的亮度没有很明显的变化，因此确定PVY LAMP Mg 2+ 的最佳浓度为6 mM (图5)。 图5. Mg 2+ 浓度对于PVY LAMP反应的影响 PVY dNTPs：对于PVY dNTPs的浓度，设置5个不同的梯度，终浓度分别为0.4 mM、0.8 mM、1.2 mM、1.6 mM、2.0 mM，反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。dNTPs的浓度从0.4 mM到2.0 mM逐渐增加，反应条带也越来越清晰，当dNTPs的浓度达到1.2 mM时，亮度最亮，且再增加浓度，条带的亮度没有很明显的变化，因此确定PVY LAMP dNTPs的最佳浓度为1.2 mM (图6)。 图6. dNTPs浓度对于PVY LAMP反应的影响 PVY反应时间：为了确定PVY LAMP反应的最佳反应时间，对于LAMP的反应时间设置5个不同的梯度，分别为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。从图中可以看出，在所设置的5个时间梯度中，LAMP都可以正常的进行，在反应时间为30 min的时候就可以产生反应条带，但是条带比较淡，40 min的时候条带的亮度明显增强，随着反应时间的延长，条带亮度基本上没有变化，因此确定PVY LAMP的最佳反应时间为40 min (图7)。 图7. 反应时间对于PVY LAMP的影响 PVY反应温度：为了确定PVY LAMP反应的最佳反应温度，对于LAMP的反应温度设置6个不同的梯度，分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。反应中的其他条件不变，以健康的叶片作为阴性对照来进行LAMP反应。LAMP反应完成之后，进行2%的凝胶琼脂糖电泳，120 V电泳30 min。从图中可以看出，当温度在60℃~62℃时，LAMP出现微弱的反应条带，当温度为63℃时，LAMP条带亮度陡然增强，温度继续增加，条带亮度不变，因此确定PVY LAMP的最佳反应温度为63℃ (图8)。 图8. 反应温度对于PVY LAMP的影响 3.3. LAMP反应的最佳体系 在体系中无论是否添加甜菜碱，都能产生梯状条带，所以，本试验最终确定在LAMP反应体系中，不添加甜菜碱。为了综合考虑CMV和PVY的反应体系以及反应条件，最终确定了LAMP的最佳反应体系(表3)，最佳反应条件为63℃反应40 min，80℃终止2 min。 3.4. LAMP产物的检测 LAMP反应完成后，进行快速离心，发现阳性反应管底有白色沉淀的产生，在加入1 µL的SYBR Green I后显示为绿色，凝胶琼脂糖电泳结果显示有梯状条带的产生。而阴性反应管和阴性对照没有白色沉淀，染色结果为橘黄色，也无梯状条带的产生(图9)。 Table 3 The optimum reaction system of 3-LAMP reactio 成分 体积 终浓度 FIP/BIP (10 μM) 4 μL 1.6 μM F3/B3 (10 μM) 0.5 μL 0.2 μM MgSO 4 (100 mM) 1.5 μL 6 mM dNTPs (10 mM) 3 μL 1.2 mM 10× ThermoPol buffer 2.5 μL 1× (Bst) DNA polymerase (8 U/μL) 1 μL 8 U DNA 1 μL 表3. LAMP反应的最佳反应体系 图9. LAMP产物的检测 3.5. LAMP灵敏性检测分析 3.5.1. CMV LAMP体系的灵敏性分析 CMV的菌液提取质粒，测得质粒的浓度为1.987 × 10 3 ng/μL，以10倍的梯度稀释质粒，依次稀释10 1 ~10 8 倍，以此为模板，分别进行PCR反应和LAMP反应。电泳的结果显示(图10)，PCR检测的最高限度为1.987 × 10 −1 ng/μL，继续稀释，没有反应条带的产生，此时，质粒的稀释倍数达到10 4 ，在10 1 ~10 4 稀释过程中，反应条带的亮度会随着稀释倍数的增加而减弱。而LAMP检测的最高限度是在质粒浓度稀释到1.987 × 10 −3 ng/μL时，继续稀释，没有产生反应条带。此时，质粒的稀释倍数为10 6 。在10 1 ~10 6 稀释过程中，反应条带的亮度会随着稀释倍数的增加而减弱，到了10 5 和10 6 ，反应条带已经很模糊，但是还是可以隐约看到有条带。综上所述，CMV LAMP的灵敏度高于常规的PCR，大概为100倍。 3.5.2. PVY LAMP体系的灵敏性分析 PVY的菌液提取质粒，测得质粒的浓度为2.045 × 10 −3 ng/μL，以10倍的梯度稀释质粒，依次稀释10 1 ~10 8 倍，以此为模板，分别进行PCR反应和LAMP反应。电泳的结果显示(图11)，PCR检测的最高限度为2.045 × 10 −1 ng/μL，继续稀释，没有反应条带的产生，此时，质粒的稀释倍数达到10 4 ，在10 1 ~10 4 稀释过程中，反应条带的亮度会随着稀释倍数的增加而减弱。而LAMP检测的最高限度是在质粒浓度稀释到2.045 × 10 −3 ng/μL时，继续稀释，没有产生反应条带。此时，质粒的稀释倍数为10 6 。在10 1 ~10 6 稀释过程中，反应条带的亮度会随着稀释倍数的增加而减弱，到了10 5 和10 6 ，反应条带已经很模糊，但是还是可以隐约看到有条带。综上所述，PVY LAMP的灵敏度高于常规的PCR，大概为100倍。 图10. CMV PCR和CMV LAMP灵敏度的比较测定 图11. PVY PCR和PVY LAMP灵敏度的比较测定 3.6. 田间样品的检测分析 在郴州各地采集的14份田间样品的CMV检测中，PCR检测到9份阳性样品，LAMP检测到10份阳性样品，两种检测方法的结果基本一致(图12)。 图12. 田间样品CMV的PCR和LAMP结果 在郴州烟区采集的13份田间样品的PVY检测中，PCR检测到7份阳性样品，LAMP检测到7份阳性样品，两种检测方法的结果一致(图13)。 图13. 田间样品PVY的PCR和LAMP结果