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user: 3. 川崎病(KD)免疫性血管炎动物模型的发病机制研究 (一) 单核/巨噬细胞的免疫激活 早期Lehman等 [ 9 ] 首次通过LCWE诱发小鼠冠状动脉炎的研究中，给予C57BL/6， Balb/c， A/J， C3H/HeJ和C3Heb/FeJ小鼠分别单次腹腔注射等量的LCWE，结果发现只有C3H/HeJ小鼠全部未出现冠状动脉炎，而C3H/HeJ小鼠的巨噬细胞在加工脂多糖抗原、减轻细胞毒素活性及方面有缺陷，并且相对于正常巨噬细胞含有更少的Fc受体，其他小鼠巨噬细胞则正常，据此提出巨噬细胞可能在LCWE诱发冠状动脉炎发病机理中起着重要作用。Danica J. Schulte等 [ 30 ] 将C57BL/6小鼠进行基因敲除，以人类重组激活基因缺陷小鼠(RAG1-/-)、B淋巴细胞缺陷小鼠(B-null)及野生型小鼠进行对比分析，发现RAG1-/-小鼠均未出现冠状动脉疾病，然而有70%的野生型小鼠和100%的B-null小鼠均表现出冠脉疾病，免疫组化显示F4/80+巨噬细胞及髓样MIDC-8+树突状细胞、类浆细胞样树突状细胞等在冠脉损伤中表现出抗原驱动过程，因而认为固有免疫和适应性免疫皆参与了LCCWE诱发的KD冠状动脉疾病，T淋巴细胞和B淋巴细胞在其发病机制中发挥了重要作用，而巨噬细胞和树突状细胞则与二者起着协同作用，共同诱发小鼠的冠状动脉炎。这与单核/巨噬细胞的激活在KD患者急性期起着重要作用相一致，病理学也证实KD的血管组织中有大量巨噬细胞浸润，这表明在相应趋化因子的作用下，单核细胞由血液中浸润到血管组织损伤血管内皮 [ 31 ] ，从而在免疫性血管炎中发挥重要作用。 (二) 超抗原 超抗原是指能在极低浓度下即可非特异地刺激多数T细胞克隆活化增殖，产生极强免疫应答的物质。它与一般抗原的区别在于：超抗原与T细胞识别前无需抗原提呈细胞(APC)处理，以完整蛋白质形式结合；选择性识别T细胞表面TCR-β链的V区；非限制性结合MHC-II类分子抗原结合槽外侧区；刺激T细胞不受MHC限制 [ 32 ] 。1992年JUN ABE等 [ 33 ] 通过检测急性期和恢复期KD患者外周血T细胞受体Vβ基因的表达情况，发现KD急性期外周血Vβ2+和Vβ8.1 + T细胞明显增加，且在恢复期下降，提出超抗原可能参与了KD的发病机制，为KD免疫机制的研究提供了一个新的方向 [ 34 ] 。Trang T. Duong等 [ 35 ] 则利用LCWE诱导的小鼠模型研究超抗原活性在其发病机制中的作用，结果发现LCWE可诱导原始T淋巴细胞显著增殖，在LCWE介导的免疫反应中虽然需要抗原提呈，但却不需要抗原提呈细胞APC的处理加工，且LCWE刺激T细胞不受MHC-II分子的限制；超抗原介导的免疫反应的特点在此模型上均有体现，提示LCWE是作为一种超抗原诱发KD冠脉损伤，且其活性与疾病发展有关。在KD患者的免疫机制研究中也发现其免疫反应与超抗原介导的免疫反应的特点一致，KD患者因为在APC呈递的自身多肽和模拟感染的自身信号刺激下，一部分被超抗原活化的T细胞逃避了免疫清除，产生持续性的免疫反应，而运输到冠脉的淋巴细胞持续呈递冠状动脉自身抗原，产生免疫反应破坏血管壁，最终导致血管的局部破坏，冠脉瘤形成。 (三) 肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1α和IL-1β干扰素(IFN-γ)的作用 TNF-α是一种主要由T淋巴细胞和单核/巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子，主要可以结合两种受体：TNFRp55 (TNFRI)或者TNFRp75 (TNFRII)，其中TNF-α的炎症活动主要由TNFRI介导 [ 36 ] 。已有相关研究发现KD患者血清TNF-α、白细胞介素(IL)和干扰素(IFN-γ)等炎性因子明显升高 [ 37 ] [ 38 ] ，可能机制为免疫应答作用T淋巴细胞和单核/巨噬细胞分泌活化增殖以及细胞因子IL-1β， IL-6和TNF-α可以通过促进血管内皮内基质金属蛋白酶(MMP-9)表达增加 [ 39 ] ，从而发挥抗炎及动脉内膜弹性纤维组织破坏作用。Joyce S. Hui-Yuen等 [ 15 ] 利用LCWE诱导的KD小鼠模型研究TNF-α在KD冠脉损伤机制中的作用，与TNFRI-/-和TNFRII-/-小鼠进行对比研究，LCWE注射后小鼠外周免疫系统中TNF-α的mRNA表达逐渐增加，且与炎症的严重程度相一致；TNF-α主要通过与TNFRI受体结合在冠脉损伤中发挥作用，相反抑制TNFRI受体介导的TNF-α活性将会阻止弹性蛋白的破坏及动脉瘤的形成，因此提出TNF-α对于KD小鼠模型中的局部炎症反应和冠脉损伤均有重要作用。国内张艳兰等 [ 40 ] 通过检测LCWE诱导的KD小鼠TNF-α表达及其活性变化来探讨TNF-α在KD发病机制中的作用，发现KD急性期TNF-α等炎性细胞因子分泌是KD心脏及冠状动脉炎症发生的重要通路之一。Toshiaki Oharaseki等 [ 41 ] 则利用TNF-α拮抗剂依那西普和英夫利昔单抗(etanercept和infliximab)处理小鼠，结果发现经etanercept处理的小鼠不仅血管炎的发生率降低且炎症程度和冠脉损伤的范围均有所减轻，据此提出TNF-α与CAWS诱发的KD免疫性血管炎密切相关。单核/巨噬细胞的激活在急性期KD患者中发挥重要作用，且其异常活化与冠状动脉损伤有关，激活的单核/巨噬细胞可以通过分泌TNF-α、IL-6、IFNγ等炎性细胞因子，以及通过自分泌方式作用于单核／巨噬细胞本身释放炎性介质加剧炎性反应 [ 40 ] 。因而，持续的炎症反应及TNF-α的产生导致KD模型中弹性蛋白降解、血管壁及冠状动脉损伤 [ 15 ] ，而KD患者过表达的非编码RNA参与了TNF-α诱导的血管内皮细胞凋亡，有望为KD治疗提供一个新靶点 [ 42 ] 。 近年来有学者发现，细胞因子IL-1在LCWE诱导的KD小鼠模型中发挥重要作用。Young Ho Lee等 [ 13 ] 利用LCWE诱发的KD血管炎小鼠模型探讨IL-1β在其发病机制中的作用，发现野生型小鼠可成功诱发冠状动脉炎，而C57BL/6与caspase1和IL-1R基因敲除小鼠均未表现出血管炎和冠状动脉损伤，且IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)能够阻止LCWE诱发小鼠的冠状动脉损伤，表明IL-1β在KD小鼠模型冠状动脉损伤中发挥重要作用。之后Youngho Lee等 [ 43 ] 复制了此模型来探讨IL-1的来源细胞即CD11c+树突状细胞和巨噬细胞及其效应细胞在KD血管炎模型中的作用，结果发现Il1a−/−和Il1b−/−小鼠相对于野生型小鼠表现为较轻的血管炎症、冠状动脉损伤和心肌炎，提示IL-1α和IL-1β在KD血管炎小鼠模型中均有重要作用，而CD11c+树突状细胞和巨噬细胞作为IL-1α和IL-1β的主要来源细胞在其发病中也是必不可少的。Youngho Lee的团队 [ 45 ] 在此基础上还发现IL-1α和IL-1β在LCWE诱发的KD血管炎模型中伴发的腹主动脉瘤中发挥重要作用，而IL-1R受体抑制剂可能为KD冠状动脉炎及其他免疫性血管炎提供新的治疗靶点。这与KD患者IL-1β水平明显增加相一致 [ 46 ] ，且有学者发现KD患者中丙种球蛋白(IVIG)治疗无反应者IL-1β表达增加，而IL-Ra则表达减少，提示IL-1可能在KD发病机制中具有重要作用，可能为KD提供新的治疗方法 [ 47 ] 。 关于IFN-γ在KD小鼠模型中的作用尚存在争议，有研究发现KD患者干扰素(IFN-γ)水平明显升高 [ 38 ] ，然而Wesley C. Chan等 [ 48 ] 在LCWE诱发的KD血管炎小鼠模型中，阻断IFN-γ的表达并不能抑制炎症反应，IFN-γ缺乏小鼠在对LCWE的免疫反应中相对于野生型小鼠淋巴细胞增殖更加活跃，且LCWE诱发的冠状动脉炎在IFN-γ缺乏小鼠于野生小鼠表现相同，据此认为IFN-γ仅在冠状动脉炎的行程中起免疫调节作用，但并不能诱发冠状动脉损伤。 (四) 金属基质蛋白酶(MMPs)的作用 金属基质蛋白酶(MMPs)是一类以Zn+为辅助因子的蛋白酶家族，在体内主要降解细胞外基质和基底膜蛋白，诸如胶原蛋白和弹性蛋白，其主要抑制剂为金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs) [ 49 ] ，MMPs和TIMPs失衡会导致肿瘤、风湿性关节炎、主动脉瘤等疾病的病理性基质降解 [ 50 ] [ 51 ] 。ANDREW C. LAU等 [ 52 ] 为了研究MMPs与KD冠状动脉瘤的关系，分别以KD患者和LCWE诱导的KD冠脉损伤动物模型为研究对象检测其血清中MMP-2和MMP-9含量及其活性，发现MMP-2和MMP-9可能仅在KD冠脉损伤局部发挥一定的弹性蛋白破坏作用，然而外周血含量及其活性与冠脉损伤并没有明确关系。Andrew C. Lau等 [ 53 ] 则MMP-9基因敲除小鼠进行研究发现MMP-9/-小鼠冠状动脉的炎症反应与野生型并无明显不同，但MMP-9/-小鼠的血管壁弹性蛋白降解程度却明显减轻，提示MMP-9的酶活性在KD模型中的弹性蛋白降解和冠状动脉损伤中具有重要作用。之后，Andrew C. Lau等 [ 14 ] 进一步通过多四环素(doxycycline)抑制MMP-9的产生及活性来进一步验证MMP-9在KD冠脉损伤中的作用 [ 53 ] ，发现多四环素(doxycycline)可明显减轻LCWE诱发的小鼠模型中冠状动脉的弹性蛋白降解与损失，对冠脉具有一定的保护作用，据此通过应用MMP-9酶活性及产生的抑制剂将有望改善KD冠状动脉损伤的结局。在KD患儿的研究中也发现MMP-2和MMP-9与其冠脉损伤密切相关，可能是川崎病冠状动脉病变的高风险因素，动态监测血清MMP-9含量和(或)MMP-9/TIMP-1比值对预测和早期诊断川崎病合并冠脉病变具有重要的临床意义 [ 54 ] [ 55 ] 。 (五) 模式识别受体TLR2和MyD88的作用 模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)是一类主要表达于固有免疫细胞表面、非克隆性分布、可识别一种或多种病原体相关分子模式(PAMP)的识别分子，Toll样受体(TLR)是在识别病原相关模式分子(PAMPs)中发挥重要作用的模式识别受体，而髓系分化因子88 (MyD88)是配体活化状态的TLRs募集的第一个基质分子，MyD88与TLRs结合后进一步通过下游信号分子参与免疫反应 [ 56 ] 。目前已发现的TLRs有10种，异常TLR样信号通路与严重败血症、脑膜炎、动脉粥样硬化、炎症性肠病，自身免疫综合征如多发性硬化、系统性红斑狼疮、肝炎、风湿性疾病等密切相关 [ 57 ] [ 58 ] 。人动脉硬化斑块及动脉粥样硬化模型中均有TLR9、TLR4、TLR2和TLR1的表达 [ 59 ] [ 60 ] ，且TLR4、TLR2和MyD88在固有免疫、炎症反应及动脉粥样硬化中发挥中重要作用，而TLR4拮抗剂类似物可减轻糖尿病早期动脉粥样硬化 [ 61 ] [ 62 ] 。 Rosenkranz等 [ 12 ] 研究发现TLR2及其下游髓系分化分子MyD88在LCWE诱发的KD冠状动脉炎模型中发挥重要作用，机制为LCWE通过TLR2诱发NF-κB依赖的细胞因子大量释放从而导致炎症反应。这与I-Chun Lin等 [ 17 ] 的研究结果相一致，即KD患者和小鼠表现为相似的单核细胞表面TLR2表达增加、异常免疫反应及心血管损伤的特点。表明TLR2及其下游髓系分化分子MyD88可能在KD发病早期及LCWE诱发KD免疫性血管炎早期阶段的固有免疫反应、触发大量炎性细胞因子的释放及其冠状动脉炎中具有相当重要的作用，而TLR2拮抗剂类似物可能为KD冠脉损伤提供新的治疗靶点。 (六) 其他机制 Cristina M. Alvira等 [ 63 ] 报道了转化生长因子-β(TGF-β)在LCWE诱导的KD冠状动脉炎模型中可以通过抑制血纤维蛋白酶介导的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性而抑制弹性蛋白的降解，进而减轻冠脉损伤。也有学者发现血管内皮生长因子-A (VEGF-A)及其信号通路在LCWE诱发的KD冠脉损伤模型中起着重要作用 [ 16 ] ，而巨噬细胞外源凝集素/酪氨酸激酶(dectin-1/Syk)介导的信号通路参与了小鼠模型中血管炎的发生以及IL-6和MCP-1的产生 [ 64 ] 。Akiko Hamaoka-Okamoto等 [ 65 ] 在CAWS诱发的KD免疫性血管炎模型研究中发现KD血管炎的发生首先是以滋养血管的功能紊乱开始的，而某些病原体能够通过激活甘露糖结合凝集素(MBL)依赖性补体系统通路诱发或者加重KD小鼠模型中的免疫性血管炎 [ 66 ] 。最近Yukako Yoshikane等 [ 67 ] 的研究发现C-Jun氨基端激酶(JNK)对于CAWS诱发的KD小鼠模型中的血管损伤至关重要，有望为KD的治疗提供一种新的方法。在并发症方面，Shuang Chen等 [ 68 ] 的研究结果表明KD小鼠模型中的冠状动脉炎或血管炎会加速之后动脉粥样硬化的形成，并且认为在KD患者中会有类似情况发生。而GM-CSF可触发CAWs诱导的小鼠KD模型中的心肌炎，主要机制是通过活化区域巨噬细胞释放在免疫聚集过程中所需要的炎性细胞因子和趋化因子，从而触发心肌炎；相反阻断GM-CSF信号通路可避免使CAWS诱发小鼠的心肌炎，从而可能为KD的治疗提供新的靶点 [ 69 ] 。Kei Takahashi等[ 70 ]利用KD的血管炎模型探讨了免疫抑制剂咪唑立宾(MZR)在KD治疗中的作用，结果发现MZR不仅可以抑制血管炎的发生率、范围和程度还可以抑制炎性因子和趋化因子的分泌，据此认为MZR可能成为一种对KD有效的治疗方法。