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user: 2. 实验部分 2.1. 材料与仪器 2.1.1. 药材 11批药材分别收集或采集于四川成都、云南腾冲、大理等地(表1)。10批美洲大蠊药材经贵阳中医学院生药实验室王祥培教授鉴定，为蜚蠊科昆虫美洲大蠊Periplaneta americana (Linnaeus)的干燥全体；1批黑胸大蠊为自己捕获，经贵阳中医学院生药实验室王祥培教授鉴定，为蜚蠊科昆虫黑胸大蠊Periplaneta fulginosa (Serville)的干燥全体。 2.1.2. 仪器与试剂 Agilent1100型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦，包括四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、Chemstation工作站)，AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版》(国家药典委员会)。 葫芦巴碱(中国药品生物制品检定所，批号：110883-200502)、尿嘧啶(中国药品生物制品检定所，批号：100469-200401)、次黄嘌呤(中国药品生物制品检定所，批号：140661-200903)、腺苷(中国药品生物制品检定所，批号：879-200001)、肌苷(中国食品药品检定研究院，批号：40669-201104)、表皮生长因子(sigma公司，批号：62253-63-8)；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。 Table 1 Source of medicinal material and the results of the Similarit 序号 样品 产地 批号 相似度 S1 美洲大蠊 成都荷花池药材市场 2012-07 0.953 S2 美洲大蠊 云南腾冲 2012-04 0.978 S3 美洲大蠊 云南大理弥渡县 2012-04 0.996 S4 美洲大蠊 云南宾川 2012-05 0.998 S5 美洲大蠊 云南宾川 2012-04 0.994 S6 美洲大蠊 云南大理弥渡县 2012-04 0.980 S7 美洲大蠊 云南腾冲 2012-04 0.998 S8 美洲大蠊 云南腾冲 2011-12 0.986 S9 美洲大蠊 云南腾冲 2012-05 0.969 S10 美洲大蠊 四川科伦药业 2012-04 0.963 S11 黑胸大蠊 四川成都 2012-06 0.990 表1. 药材来源及相似度结果 2.2. 方法与结果 2.2.1. 色谱条件 色谱柱：Dikma公司Diamonsil C 18 (1) (250 mm × 4.6 mm， 5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%三氟乙酸水溶液(B)进行线性梯度洗脱，0~30 min， 1% A~5% A， 30~40 min， 5% A~18% A， 40~60 min， 18% A~30% A， 60~75 min， 30% A~38% A， 75~85 min， 38% A~46% A， 85~90 min， 46% A~100% A， 90~100 min， 100% A~100% A；检测波长：256 nm；柱温：25℃；流速：0.8 mL/min；运行时间：100 min；进样量7 μL。 2.2.2. 供试品溶液的制备 1) 药材供试品溶液的制备 精密称取约1.0 g美洲大蠊、黑胸大蠊药材粉末(过40目筛)，置于圆底烧瓶中，加入85%乙醇50 mL，回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，于水浴挥干，加50%甲醇定容至10 mL容量瓶，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。 2) 对照品溶液的配制 分取葫芦巴碱、尿嘧啶、表皮生长因子、次黄嘌呤、腺苷、肌苷适量，精密称定，加水溶解制成含有葫芦巴碱、尿嘧啶、表皮生长因子、次黄嘌呤、肌苷、腺苷分别约为20， 20， 20， 20， 20， 50 µg∙mL −1 的混合对照品溶液，经0.22 µm微孔滤膜滤过，作为参照物溶液。 2.2.3. 空白试剂干扰 精密吸取制备供试品溶液的试剂(50%甲醇)，进样7 μL，注入高效液相色谱仪，按规定的梯度条件进行洗脱，记录色谱图，从色谱图可知，所用试剂除了93 min后的图谱外，对指纹图谱测定基本无干扰。见图1。 2.2.4. 方法学考察 1) 稳定性试验 取同一份药材供试品溶液，分别在0、8、16、24、32 h进行检测，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件计算，得各色谱指纹图谱的相似度均大于0.995。各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积RSD分别在0%~2.88%和0%~0.51%之间，表明样品溶液在32 h内稳定。 图1. 空白溶剂色谱图 2) 精密度试验 取同一份药材供试品溶液，重复进样5次，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件计算，得各色谱指纹图谱的相似度均大于0.995。各共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD分别在0%~1.24%和0%~0.66%之间，表明该仪器精密度良好。 3) 重复性试验 取同一批药材的供试品5份，同法分别进行检测，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件计算，得各色谱指纹图谱的相似度均大于0.995。各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别在0%~2.75%和0%~2.83%之间，表明该方法具有重复性。 2.2.5. 指纹图谱的构建和解析 1) 共有峰的标记 对10批美洲大蠊药材进行指纹图谱分析，以肌苷(11号峰)作为内参比峰，以峰的共有率大于90%为依据，标定了22个共有峰，分别为1号峰(4.326 min)，2号峰(6.546 min)，3号峰(7.450 min)，4号峰(9.146 min)，5号峰(10.288 min)，6号峰(10.953 min)，7号峰(12.813 min)，8号峰(13.290 min)、9号峰(15.068 min)、10号峰(16.375 min)、11号峰(21.446 min)、12号峰(22.385 min)、13号峰(30.219 min)、14号峰(38.643 min)、15号峰(45.118 min)、16号峰(45.544 min)、17号峰(46.757 min)、18号峰(47.243 min)、19号峰(47.851 min)、20号峰(62.244 min)、21号峰(89.930 min)和22号峰(92.654 min)。通过与对照品图谱比对，指认3号峰为尿嘧啶，4号峰为次黄嘌呤，11号峰为肌苷。见图2~4。 2) n强峰标定 把10批药材的色谱图与生成的对照图谱进行比较，发现S7与之相似度最高，于是把S7作为标准药材。通过峰面积的比较，选取峰面积较大且稳定的图谱共有峰，得到10个强峰，分别为共有峰3号(4.9488%)，4号(10.6527%)，5号(41.1724%)，7号(3.3767%)，8号(1.5296%)，9号(4.5672%)，11号(17.0318%)，13号(1.1086%)，14号(2.9320%)，18号(1.2523%)，其峰面积之和占总峰面积的85%以上。这10个强峰都是共有峰，可反映美洲大蠊药材内在特征，可控制药材的质量。 3) 共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积 在供试品色谱图中，以肌苷色谱峰(11号峰)为参照峰，其保留时间和色谱峰面积为1，将其他特征峰的保留时间与峰面积与肌苷相比，得到各峰的相对保留时间和相对峰面积，其中10批美洲大蠊药材有22个共有峰，而美洲大蠊与黑胸大蠊只有18个共有峰(表2和表3)。 4) 相似度计算 将10批美洲大蠊药材样品的HPLC指纹图谱以AIA格式导入中国药典委员会推荐使用的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，计算各色谱图的整体相似度，见表1。S11为同科同属昆虫黑胸大蠊的图谱，各峰在整体面貌上与美洲大蠊非常相似，且相似度达0.99，见表1和图5。 图2. 对照指纹图谱 图3. 混合对照品溶液色谱 5) 美洲大蠊与黑胸大蠊药材指纹图谱比较 从美洲大蠊与黑胸大蠊的指纹图谱中，可以直观地看出各自的色谱指纹图谱较为相似，但10批美洲大蠊药材有22个共有峰，而美洲大蠊与黑胸大蠊只有18个共有峰，并且美洲大蠊药材指纹图谱的21号峰(89.930 min)和22号峰(92.654 min)为特有峰，见图5和图6。 6) 聚类分析 10批美洲大蠊药材聚类分析：采用SPSS数据统计软件，将表3中10批美洲大蠊样品的22个共有 图4. 10批美洲大蠊药材指纹图谱 图5. 黑胸大蠊与美洲大蠊药材指纹图谱比较 峰相对峰面积数据，选用组间联接(between groups linkage)进行聚类，用相关性(Pearson)计算样品相似性程度，聚类结果见图7。从树状聚类图中看到，10批样品大体上聚为2类，S2 (云南腾冲)、S3 (云南弥渡)、 图6. 黑胸大蠊与美洲大蠊药材86 min后指纹图谱放大比较 Table 2 Relative retention time of common peaks for 11 batches of medicinal materia 峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 1 0.202 0.203 0.202 0.201 0.201 0.201 0.203 0.201 0.201 0.2 0.202 2 0.305 0.306 0.305 0.303 0.305 0.305 0.308 0.305 0.305 0.304 0.305 3 0.348 0.349 0.348 0.346 0.347 0.347 0.35 0.347 0.346 0.347 0.346 4 0.427 0.429 0.427 0.424 0.426 0.426 0.429 0.428 0.425 0.426 0.424 5 0.479 0.482 0.480 0.476 0.479 0.478 0.482 0.482 0.478 0.480 0.478 6 0.513 0.513 0.511 0.508 0.511 0.509 0.513 0.512 0.511 0.511 0.503 7 0.597 0.599 0.597 0.594 0.598 0.596 0.599 0.6 0.597 0.598 0.595 8 0.619 0.621 0.619 0.617 0.62 0.618 0.62 0.622 0.619 0.621 0.617 9 0.704 0.704 0.702 0.701 0.703 0.701 0.703 0.704 0.701 0.702 0.699 10 0.764 0.765 0.762 0.762 0.764 0.762 0.765 0.765 0.763 0.763 0.762 11 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 12 1.045 1.044 1.044 1.044 1.045 1.044 1.044 1.043 1.043 1.043 1.043 13 1.409 1.411 1.409 1.408 1.412 1.409 1.416 1.404 1.407 1.405 1.408 14 1.802 1.809 1.802 1.794 1.807 1.797 1.812 1.793 1.801 1.791 1.801 15 2.103 2.113 2.101 2.091 2.109 2.095 2.118 2.093 2.104 2.088 2.105 16 2.123 2.133 2.122 2.111 2.130 2.115 2.138 2.113 2.123 2.108 2.123 17 2.180 2.190 2.178 2.167 2.185 2.170 2.196 2.170 2.180 2.165 2.180 18 2.203 2.213 2.201 2.189 2.209 2.194 2.218 2.191 2.202 2.186 2.201 19 2.230 2.242 2.229 2.217 2.237 2.222 2.247 2.220 2.231 2.216 - 20 2.902 2.916 2.899 2.883 2.910 2.890 2.924 2.887 2.900 2.883 - 21 4.192 4.211 4.187 4.169 4.203 4.225 4.220 4.172 4.191 4.162 - 22 4.320 4.337 4.314 4.296 4.330 4.350 4.348 4.299 4.319 4.288 - 表2. 11批药材相对保留时间 Table 3 Relative area of common peaks for 11 batches of medicinal materia 峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 1 0.290 0.018 0.036 0.032 0.026 0.025 0.022 0.019 0.022 0.196 0.050 2 0.124 0.036 0.022 0.039 0.023 0.028 0.013 0.024 0.016 0.086 0.060 3 0.477 0.225 0.413 0.22 0.297 0.126 0.291 0.266 0.236 1.049 0.318 4 2.678 0.482 0.678 0.909 0.667 0.244 0.625 0.536 0.684 2.839 1.257 5 10.24 1.570 3.036 2.693 2.458 2.143 2.417 1.902 1.524 7.159 3.315 6 0.216 0.043 0.042 0.054 0.027 0.037 0.028 0.04 0.064 0.051 0.033 7 0.631 0.089 0.249 0.293 0.208 0.054 0.198 0.145 0.145 1.443 0.165 8 1.563 0.15 0.13 0.171 0.111 0.138 0.09 0.099 0.139 0.537 0.288 9 0.403 0.121 0.318 0.159 0.189 0.089 0.268 0.189 0.391 0.269 0.442 10 0.121 0.014 0.027 0.020 0.020 0.008 0.021 0.017 0.013 0.133 0.014 11 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 12 0.228 0.063 0.077 0.081 0.046 0.058 0.065 0.057 0.08 0.153 0.055 13 0.965 0.273 0.311 0.208 0.014 0.246 0.172 0.45 0.164 0.257 0.071 14 1.870 0.214 0.352 0.220 0.049 0.128 0.134 0.183 0.168 0.703 0.117 15 0.699 0.024 0.127 0.052 0.033 0.017 0.050 0.052 0.045 0.180 0.019 16 0.454 0.030 0.052 0.051 0.051 0.022 0.040 0.045 0.037 0.260 0.067 17 0.213 0.024 0.021 0.03 0.046 0.042 0.021 0.027 0.029 0.226 0.012 18 0.238 0.048 0.090 0.047 0.034 0.038 0.074 0.068 0.068 0.131 0.183 19 0.400 0.029 0.018 0.026 0.021 0.033 0.016 0.020 0.016 0.215 - 20 0.149 0.012 0.049 0.022 0.011 0.011 0.015 0.021 0.016 0.076 - 21 0.095 0.031 0.037 0.030 0.021 0.041 0.029 0.056 0.039 0.161 - 22 0.122 0.006 0.005 0.009 0.005 0.007 0.007 0.009 0.006 0.106 - 表3. 11批药材相对峰面积 图7. 10批美洲大蠊聚类分析树状图 S4 (云南宾川)、S5 (云南宾川)、S6 (云南弥渡)、S7 (云南腾冲)、S8 (云南腾冲)、S9 (云南腾冲)为一类，S1 (四川荷花池)与S10 (四川科伦)为一类。