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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 2.1.1. 试验动物 雌性ICR小鼠，18~22 g，购自上海实验动物中心。小鼠饲养于22℃清洁环境，自由采食和饮水，自然光照，适应3 d后分组。 2.1.2. 试剂 卵清白蛋白(OVA， grade V)，美国sigma公司；羊抗小鼠IgG抗体，CHEM ICON Internati onal Inc.；TMB，SIG2MA-ALDR ICH公司；IgG2a，Santa CruzBi otechnol ogy Inc.；硅胶G 200~300目，青岛洋化工有限公司；D101中性大孔树脂，天津市海光化工有限公司产品。 2.1.3. 北虫草多糖粗提物制备 木鳖子3000 g，用石油醚脱脂3次，每次10.5 L，共去掉脂质601.5 g。残渣用70%乙醇 60 ℃ 回流提取5次，每次12 L，合并提取液，减压浓缩至1.25 g/ml。 2.2. 方法 2.2.1. 实验动物及其免疫 ICR小鼠35只随机分成7组，每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA (10 μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS (50 μg)的生理盐水溶液，对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液。2周后进行二免，二免后3周采血，制备血清。 2.2.2. I gG效价的测定 在96孔酶标板每孔加入 100 μL包被液(含5 μg OVA/mL的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液)，置 4 ℃ 孵育18 h后，洗涤液(pH 7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次，每次3 min。每孔加入300 μL含1%小牛血清的PBS封闭液(0.01 mol /L， pH 7.4)，于 37 ℃ 孵育1 h后，再用洗涤液洗涤3次，每次3 min。用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释，使血清稀释度为1:50~1:3 200。于 37 ℃ 孵育2 h后，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体100 μL/孔，37℃孵育2 h，再用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入T MB底物溶液显色，100 μL/孔，37℃孵育15 min加1 mol/L H 2 SO 4 50 μL/孔终止反应。用酶标仪在450 nm波长测定OD值。 2.2.3. IgG亚类测定 在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100 μL/孔)，37℃孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG 2a 100 μL/孔，37℃孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100 μL/孔，37℃孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入TMB底物溶液显色，100 μL/孔，37℃孵育15 min加1 mol/L H 2 SO 4 50 μL/孔终止反应。用酶标仪在450 nm波长测定OD值。 2.2.4. 淋巴细胞转化试验 将小鼠脱颈椎处死，75%酒精液浸泡5~10 min，无菌操作取小鼠脾脏，加入1 mL Hank’s研磨，研磨均匀后将脾细胞吹悬入平皿，过200目铜网后转移入10 mL离心管；25℃下1500 rpm离心10 min；PBS洗涤2次；细胞计数后，调整细胞浓度至2.5 × 10 6 /mL，按100 µl/孔的量加入96孔细胞培养板中。用细胞培养液配制各种刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS终浓度为5 µg/mL，ConA终浓度为7.5 µg/mL，设阴性对照和空白对照)。 37 ℃ 、5% CO 2 培养箱中培养48 h。在培养结束前4 h，每孔加入50 µl MTT (2 mg/mL)。然后将培养板取出，离心(1500 rpm， 10 min)沉淀细胞，轻轻倾去培养液上清，纸巾吸干。每孔加入150 µl二甲基亚砜，避光充分振荡，直至蓝色颗粒完全溶解，570 nm波长酶标仪检测OD值。计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index， SI)： SI = (刺激孔OD − 空白孔OD)/(未刺激孔OD − 空白孔OD)。 2.2.5. 细胞因子mRNA检测 1) 脾淋巴细胞体外刺激。将述分离到的脾淋巴细胞悬液调整细胞浓度至1 × 10 7 cell/ml，铺板培养于24孔板，每孔2 ml。向培养板内加入刺激物(H1N1流感抗原)，至HA终浓度为2 μg/ml，将细胞培养于37℃，5% CO 2 的环境中，抗原刺激15 h后离心收集细胞，加入RNA提取试剂溶解后保存细胞裂解液于−80℃。 2) Total RNA提取。RNAiso TM Plus (TaKaRa Co.， Ltd.)提取细胞总RNA，方法参照厂家说明书。RNA提取效果电泳鉴定：使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。 3) 反转录。采用iScript cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录成cDNA，方法见说明书；获得的cDNA样品置于−20℃保存备用。 4) 引物及探针设计。采用实时荧光定量双重PCR方法检测目的基因的相对表达量，以小鼠β-acting为内参基因，使用ABI 7300荧光定量PCR仪；目的基因探针 5’ 端以FAM标记，β-actin探针 5’ 端HEX标记，目的基因和内参基因 3’ 端均采用BHQ-1标记。引物和探针序列设计采用软件Primer Express 3.0；基因产物均经过DNA测序鉴定。 5) Real-time PCR反应体系及条件。采用总体积为25 μl的反应体系，依次加入1 × Taq-Man通用反应预混液、目的基因引物和探针、β-actin引物和探针(见表1)、cDNA模板(2 μl)。PCR反应程序采用标准TaqMan条件：95℃ (15 sec)，60℃ (30 sec)，45个PCR循环。 Table 1 Sequences of primer and probe for quantitative RT-PCR of cytokine and transcription facto Gene Sequences ß-Actin Forward: 5’-AGCGGTTCCGATGCCCT-3’ Reverse: 5’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3’ Probe:5’HEX-TCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGC-BHQ-13’ IL-4 Forward: 5’-GAGACTCTTTCGGGCTTTTCG-3’ Reverse: 5’-CAGGAAGTCTTTCAGTGATGTGG-3/ Probe: 5’FAM-CCTGGATTCATCGATAAGCTGCACC-BHQ-13’ IL-10 Forward: 5’-CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG-3/ Reverse: 5’-CTTGCTCTTATTTTCACAGGGGAG-3/ Probe: 5’FAM-CAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAA-BHQ-13’ IL-12p40 IL-12p40 Forward: 5’-TTGCTGGTGTCTCCACTCATG-3/ Reverse: 5’-GTCACAGGTGAGGTTCACTGTTTC-3/ Probe: 5’FAM-CTGGACTCCCGATGCCCCTGG-BHQ-13/ IFN-γ Forward: 5’-GCTTTGCAGCTCTTCCTCATG-3/ Reverse: 5’-CTTCCACATCTATGCCACTTGAG-3/ Probe: 5′FAM-CTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGC-BHQ-13/ 表1. 细胞因子及转录因子RT-PCR用引物和探针序列 6) 相对定量计算方法。设定荧光阈值(处于基因扩增信号的对数增长期(logarithmic phase)内的某个阀值(thresholds)被指定为Ct值)，根据不同管内扩增曲线中对应荧光阈值确定样品Ct值。采用2 -∆∆CT 法(29)进行相对定量分析。 2.2.6. 统计学分析 采用SPSS 12.0单因素方差分析方法比较组间均数差异，显著性水平设P < 0.05。