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user: 3. 拮抗酵母菌对柑橘绿霉病、酸腐病的防控机制及应用效果 随着对拮抗酵母菌的不断分离筛选，人们逐渐发现了更多的拮抗酵母菌种类。拮抗酵母菌主要从果实表面、根际土壤、叶片、海水等中分离出来。已发现能有效控制柑橘采后真菌病害的酵母(表1)。 3.1. 拮抗酵母菌的拮抗机制 拮抗酵母菌可以有效抑制病原菌的生长和发病，其拮抗作用机制一直是人们研究的热点。现已有的拮抗酵母菌的生防作用机理主要包括(表2)：1) 营养及空间竞争；2) 直接寄生作用；3) 产生抑菌物质；4) 诱导寄主抗性。而寄主、病原菌、拮抗酵母菌三者以及与环境之间的相互作用机理见图4。 Table 1 Effective control of actionagainstic yeasts against postharvest diseases on citru Yeast Pathogen Reference(s) Kloeckera apiculata Botrytis cinerea P. digitatum and P. italicum [ 28 ] Yarrowia lipolytica P. digitatum and P. italicum [ 29 ] Pichia guilliermondii P. digitatum [ 30 ] [ 31 ] Candida membranifaciens P. digitatum [ 32 ] Saccharomyces cerevisiae P. italicum [ 33 ] Rhodosporidium paludigenum P. digitatum and P. italicum [ 34 ] Rhodotorula minuta G. citri-aurantii [ 35 ] Candida azyma Saccharomyces cerevisiae Metschnikowia citriensis sp. nov. P.digitatum and G. citri-aurantii [ 36 ] [ 37 ] Debaryomyces hansenii Lodder P. digitatum and P. italicum [ 38 ] Clavispora lusitaniae P. digitatum [ 39 ] Pichia fermentans Cryptococcus laurentii P. Italicum and G. citri-aurantii [ 40 ] [ 41 ] Aureobasidium pullulans P. Digitatum and G. citri-aurantii [ 42 ] [ 43 ] 表1. 有效控制柑橘采后病害的拮抗酵母 3.1.1. 营养及空间竞争 营养和空间竞争是绝大多数拮抗酵母菌的抑菌机制。柑橘采后病原菌首先在伤口上定植，利用寄主的营养物质生长繁殖，而拮抗酵母可以在寄主伤口处群集，与病原菌抢占伤口处的营养物质和氧气，抢占空间位点 [ 44 ]，并开始在寄主伤口处大量繁殖，使的病原菌得不到足够的营养和生存空间进行营养和生殖生长，从而抑制病原菌的增殖，拮抗柑橘采后病害。研究发现浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus) 2株菌对葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌菌丝生长均有明显的抑制作用，通过显微观察，酵母菌迅速占位，先于病原菌消耗掉大量的营养和空间，意味着酵母菌活菌数量越多，接种时间越早，抑制病原菌效果越显著 [ 45 ]。在克莱门氏小柑橘的伤口上接种青绿霉病原菌和拮抗菌C. oleophila，发现先接种拮抗菌24 h后再接种病原菌，青绿霉的发病率均为0%。所以提前接种拮抗酵母菌有利于酵母先在伤口处定植，摄取营养占领空间 [ 44 ]。研究人员先将梅奇酵母(M. citriensis)接种在柑橘伤口处，2 h后接种病原菌G. citri-aurantii，培养2 d后通过SEM观察发现酵母细胞能迅速在创面上定植并紧密附着于创面表面，建立了一个密集的网络，减少了柑橘表面可供病原菌发育的物理空间。在体外也表现出生物膜的形成作用，更有助于抢夺营养和空间，从而使得G. citri-aurantii无法繁殖 [ 45 ]。所以酵母菌与病原菌存在营养及空间竞争关系。 Table 2 Mechanism of actionagainstic yeasts against postharvest diseases on citru Yeast mechanism Reference(s) Yarrowia lipolytica 诱导寄主抗性 [ 29 ] Saccharomyces cerevisiae (ACBL-08) 直接寄生、β-1，3-葡聚糖酶 [ 35 ] Rhodotorula minuta (ACBL-23) 营养竞争、β-1，3-葡聚糖酶 Candida. Azyma (ACBL-44) 营养竞争、几丁质酶 Candida guilliermondii (US7) 营养竞争 [ 43 ] Aureobasidium pullulans 营养竞争、直接寄生 [ 44 ] Cryptococcusalbidus 营养竞争 [ 46 ] Pseudocyma antarctica 几丁质酶、蛋白水解酶 [ 47 ] Kloeckera apiculata (34-9) 营养竞争、直接寄生、产生挥发性抑菌物质(PEA) [ 49 ] Metschnikowia citriensis sp. nov. 营养竞争、直接寄生、诱导寄主抗性 [ 50 ] Pichia galeiformis (BAF03) VOCs [ 52 ] Hanseniaspora uvarum 诱导寄主抗性 [ 53 ] Rhodosporidium paludigenum β-1，3-葡聚糖酶，几丁质酶，诱导寄主抗性 [ 54 ] Wickerhamomyces anomalus (BS91)， A. pullulans (PI1) VOCs [ 55 ] Candida Oleophila (I-182) 营养竞争、VOCs、β-1，3-葡聚糖酶 [ 56 ] [ 57 ] Debaryomyces hansenii (CBS767) β-1，3-葡聚糖酶 [ 58 ] Pichia guilliermondii (BCC5389) 营养竞争 [ 59 ] 表2. 柑橘采后拮抗酵母生物防控作用机制 3.1.2. 直接寄生作用 拮抗酵母菌对病原菌的直接寄生作用是寄主伤口处酵母菌紧密附着在病原菌的菌丝上，形成一层生物膜，并且分泌一些水解酶类，如几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，从而水解病原菌的细胞壁或菌丝体 [ 48 ]，使得病原菌生长受限甚至病原菌菌丝体死亡。人们发现拮抗酵母菌菌株K. apiculata的主要抑菌机理就是拮抗菌株对病原菌株的直接寄生作用，通过扫描电镜可观察到酵母菌株(34-9)紧紧包围柑橘青、绿霉病菌菌丝或附着在柑橘青、绿霉病菌菌丝上，最终使柑橘青、绿霉病菌菌丝浓缩、畸形 [ 49 ]。研究发现酵母菌P. antarctica分泌出较高的胞外水解酶活性，包括几丁质酶和蛋白水解酶，从而水解指状青霉细胞壁，并导致指状青霉的菌丝断裂 [ 50 ]。前人证实了拮抗酵母M. citriensis sp. nov. FL01和FL02能紧密的附着在绿霉病病原菌菌丝上，并形成色素圈来消耗培养基和果实伤口组织中的铁，使病原菌的可用铁减少，从而导致P. digitatum和P. italicum的孢子萌发和菌丝生长受到抑制 [ 37 ]。 3.1.3. 产生抑菌物质 许多拮抗酵母菌可以分泌一些抗菌物质从而抑制病原菌的生长。主要是一些醇类以及酯类等挥发性有机物；如：乙醇、乙酸乙酯、苯乙醇等。利用高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)等分离纯化与鉴定方法，分离出了可以抑制柑橘青、绿霉病的拮抗酵母菌K. apiculata (34-9)的抗菌物质，表明该抗菌物质为苯乙醇(2-Phenylethanol， PEA) [ 51 ]。且通过气相色谱–质谱法鉴定拮抗酵母Pichia galeiformis (BAF03)共产生八种挥发性有机化合物(VOCs)来抑制柑橘绿霉病病原菌P. digitatum的生长 [ 52 ]。 3.1.4. 诱导寄主抗性 拮抗酵母菌寄生在果实表面时，可以使寄主产生抗病性来抵御病原菌入侵。主要包括1) 诱导寄主产生一些水解酶类，分解病原菌的细胞壁。2) 诱导寄主产生抗病性的次生代谢物，如：异黄酮类、萜类物质和植保素。3) 使寄主细胞结构发生变化，如：细胞壁加厚，产生特异结构等 [ 12 ]。研究发现葡萄汁有孢汉逊酵母(H. uvarum)诱导了柑橘产生更多的多酚氧化酶(PPO)、类黄酮含量、过氧化氢酶(POD)、几丁质酶和过氧化物酶等抗性酶，从而起到抵抗病原菌入侵的效果 [ 53 ]。前人研究了拮抗酵母Y. lipolytica，并发现其能诱导柑橘的防御酶活性、黄酮类化合物和总酚类化合物的产生，提高了柑橘的抗青绿霉病的能力 [ 29 ]。 图4. 寄主、病原菌、拮抗酵母菌三者以及与环境之间的相互作用机理 3.2. 拮抗酵母的应用效果及生防效力的改良 拮抗酵母菌虽然通过对病原菌的拮抗作用来控制柑橘采后病害的发生，但是一般拮抗酵母菌的抑菌谱较窄，抗菌效果没有化学杀菌剂强，而且拮抗酵母菌是活体，易受环境条件的影响，在使用过程中不宜调控。拮抗酵母菌与其他抗菌方法相结合可以有效提高拮抗效力，并延长使用期限。 3.2.1. 拮抗酵母与其他拮抗菌混合使用 由于拮抗微生物的抑菌谱较窄，施用单一拮抗微生物很难防治果实上的所有病原菌。所以可以将拮抗酵母菌与其他拮抗微生物混合，从而防治果实采后的多种病害。将细菌(Rahnella aquatilis)与酵母(Rhodotorula glutinis)混合来研究其对苹果采后病原菌P. expansum和B. cinerea的拮抗活性。在冷藏条件下，R. aquatilis-R. glutinis的混合物能抑制苹果采后灰霉菌和扩展青霉生长，其发病率降低到几乎为零。但并不是任何两种拮抗微生物都可以混合，要保证混和的拮抗微生物彼此无影响，且相容 [ 60 ]。 3.2.2. 拮抗酵母与化学物质混合使用 拮抗酵母菌可以与化学物质混合用于柑橘采后病害的防治，一方面可以提高拮抗酵母对环境的耐受性，另一方面可以提高其生防效力。研究结果表明，膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)与壳聚糖复合处理可通过增强柑橘的抗病性来提高拮抗酵母对柑橘炭疽病的防治效果 [ 61 ]。将葡萄汁有孢汉逊酵母(H. uvarum)与卵磷脂(1.5% w/v)结合使用后显著增强了拮抗酵母对柑橘采后绿霉病引起的腐烂的抑制作用 [ 53 ]。研究结果表明肉桂酸可以破坏指状青霉的细胞膜，导致膜完整性的丧失和细胞质内容物的泄漏。将肉桂酸与罗隐球酵母C. laurentii结合使用，提高了拮抗酵母对柑橘果实上由意大利青霉(P. italicum)引起的青霉病的防治效果 [ 62 ]。 3.2.3. 拮抗酵母与物理方法结合 许多研究都证实了拮抗酵母菌与物理方法，例如：热处理、紫外线照射、微波处理等相结合可以提高其生防效力。研究酵母P. guilliermondii结合热空气处理对桃采后病害(Rhizopus stolonifer and P. expansum)的防治效果，结果表明热空气和毕赤酵母结合处理后抑制病害发生的效果最好，并延缓桃果实品质和抗氧化参数的下降，达到桃果采后保鲜的目的 [ 63 ]。研究表明，紫外线照射处理(UV-C)与拮抗酵母菌株(Candida tropicalis)结合使用对菠萝黑腐病的防治效果明显增强 [ 64 ]。 3.2.4. 拮抗酵母遗传体系建立 随着人们对拮抗微生物分子机理研究的不断深入，利用基因工程，转化体系来构建生防效力更高的拮抗酵母已成为现在的趋势。将细菌的鞭毛蛋白基因转入拮抗菌酿酒酵母(S. cerevisiae EBY100)体内表达，可以增强该酵母对番茄灰霉病的拮抗效率 [ 65 ]。