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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料和试剂 2.1.1. 样品的定点采集 本实验所用的样品取自黄岛尹家山盐场的晒盐池底泥，该底泥处在高盐环境中，可判定此处具有丰富的嗜盐菌菌群。在该处盐场随机收集样品，并用过滤法去除样品中的杂质并编号。 2.1.2. 培养基 1) 富集培养基：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 200 g/L； 2) 纯化培养基1：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 200 g/L； 3) 纯化培养基2：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 250 g/L； 4) 固体纯化培养基1：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 150 g/L，琼脂20 g/L； 5) 固态纯化培养基2：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 200 g/L，琼脂20 g/L。 2.1.3. 实验试剂 牛肉膏、胰蛋白胨、琼脂、酵母浸粉、NaCl、CaCl 2 ∙2H 2 O、MgCl 2 ∙6H 2 O、NaHCO 3 、Na 2 CO 3 、CaCO 3 、30%过氧化氢、无水乙醇、蛋白胨、浓盐酸、KOH、甲基红、十六烷基三乙基溴化烷、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠。 2.1.4. 试验设备仪器 SW-CJ-ID型单人净化工作台：苏州净化设备厂；FC204电子分析天平：上海精密天平有限公司；LD2X-50FBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；101-1SB型电热鼓风干燥箱：龙口市电炉制造厂；TG16-W微型高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；DHP-9050B智能型电热恒温培养箱：上海琅琊实验设备公司；THGX台式恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司PHS-3EpH计：江苏江分电分析仪器有限公司；TCT3梯度基因扩增仪：上海领成生物科技有限公司；YS2-H1112438偏振光显微镜：Nikon CHINA；X射线衍射(XRD) (UltimaIV2036E202)；722型分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；测序仪(3730XL)：Applied Biosystems；恒温培养箱(DHP-9162)：太仓市科教器材厂。 2.2. 试验方法 2.2.1. 菌种的富集和纯化 1) 菌株的富集培养 取样品的土壤浸出液20 ml接种10 ml于200 mL盐度20%的富集培养基进行富集培养，然后置于28℃120 r/min条件下震荡培养。当培养基变浑浊时，说明此时已经有大量的优势嗜盐菌存在。 2) 菌株的纯化培养 经过富集后的细菌培养液中仍含有大量的杂菌，需要进行细菌固液交替培养，使菌种得到分离和纯化，主要步骤如下： ① 制备梯度菌悬液，在无菌条件下向已灭菌的PE管中加入0.1 mL菌液和0.9 mL浓度为20%的盐水，充分震荡后制备10 −1 、10 −2 、10 −3 、10 −4 、10 −5 、10 −6 和10 −7 个稀释度的菌悬液。 ② 平板涂布，首先向培养皿分别中加入约三分之一培养皿体积的盐度为15%纯化培养基1，待其冷凝后，向平板培养皿中分别加入10 −3 、10 −5 、10 −7 梯度的菌悬液100 μL，均匀涂布等到培养基表面涂干后，盖上皿盖，编号，每个梯度涂三个平板，最后用封口膜封住皿口，然后放恒温培养箱28℃静置培养。 ③ 当平板培养皿上出现单菌落时，在无菌环境下用接种环画线，三区划线法，固体培养两代后，在平板培养皿上挑取单菌落，在无菌环境下用接种环挑取单菌落接种于25%盐度的液体培养基中，封口后置于摇床培养箱中震荡培养，测量其OD值。 ④ 液体培养基变浑浊后，制备梯度菌悬液，涂布于盐度为20%的固体培养基中，划线分离，重复步骤③④，培养三代后保种。 以上，考虑到固体培养基有水分损失。所以将盐度下降5%。 2.2.2. 细菌16SrDNA的鉴定 将保藏的菌株重新活化涂布后得到单菌落，将其送往上海生工生物工程技术公司测序中心进行测序。获得序列后，利用DNAMAN6.0软件进行序列拼接，并将拼接结果上传到NCBI网站，进行Blast，获得该菌株16SrDNA同源性(identity)检索结果，通常认为同源性大于99%定义为种，在95%和99%之间，则定义为属，小于95%则定义为科。下载与待测菌株16SrDNA相近属的内外群菌株16SrDNA基因序列。利用MEGA6.0软件根据菌株的比对结果进行16SrDNA遗传距离分析，采用邻接法(Neighbor-Joining method)获得系统进化树 [ 24 ]，并通过自举分析(Bootstrap)进行置信度检测，自举数据集为1000次。并构建系统发育树，确定LMZ2的种属。 2.2.3. LMZ2菌株的形态学及生理生化鉴定 1) 革兰氏染色实验 取少量菌液涂抹固定于载玻片上，通过草酸铵结晶紫初染和碘液媒染，酒精进行脱色，番红染色液复染后，蒸馏水冲洗。干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 2) 芽孢染色实验 吸取培养至对数生长期的待测菌株的菌液2滴涂抹在载玻片上，干燥、固定。滴加3~5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。夹住载玻片在火焰上加热，使保持染液冒蒸汽但不沸腾状态4~5 min。倾去染液，待玻片冷却后用蒸馏水将多余孔雀绿染液冲洗掉。用番红水溶液复染，再用蒸馏水冲洗干净。待玻片干燥后，置于油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 3) 接触酶活性鉴定实验 吸取4 mL菌液于EP管中，转速4000 r/min，4℃离心5 min，弃掉上清液，留下菌体细胞。在离心管中加入3%的过氧化氢2 mL，观察有无气泡产生以及产生气泡的速率大小。若立即出现大量气泡为阳性，无气泡为阴性。 4) 氨气定性实验 配置成分为蛋白胨0.5%、K 2 HPO 4 0.05%、MgSO 4 0.05%、pH 7.0~7.2的培养基。对照组不接菌，实验组按1%的比例接种液体种子液恒温30℃培养24~48 h。在培养液中加入3~5滴纳氏试剂，出现黄色(或棕红色)沉淀则为阳性反应，未接菌的培养基加入纳氏试剂后无黄色(或棕红色)沉淀出现。 2.3. 碳酸盐矿物功能初步探究 2.3.1. 诱导矿化培养基 碳酸盐矿物沉积研究所用培养基含量见表1。 Table 1 Gradient concentration in Mg/Ca ratio for inducing mineralizatio Mg/Ca N (Ca 2+ )/mol∙L −1 N (Mg 2+ )/mol∙L −1 0 0.01 0 3 0.01 0.03 5 0.01 0.05 7 0.01 0.07 9 0.01 0.09 表1. 诱导矿化梯度浓度Mg/Ca比含量 方法： i) 配制不含Mg、Ca的富集培养基，121℃，灭菌20 min； ii) 配制NaHCO 3 母液，使培养基终浓度为0.01 mol∙L −1 ，过滤灭菌； iii) 配制MgCl 2 和CaCl 2 母液，121℃，灭菌20 min。 2.3.2. 微生物诱导矿化培养 根据表1设置Mg/Ca比梯度0、3、5、7、9，每个梯度设置2个平行样，分两组，分别为实验组和对照组。实验组接菌量为1%，对照组作无菌空白对照。培养液总体积为200 mL。接种完毕后，将实验组和对照组置于30℃恒温培养箱中静置培养。定期观察锥形瓶中是否有矿物沉淀。 2.3.3. 偏光显微镜的观察 取培养基底部沉淀于离心管中，静置10 min后弃去上清液，然后每个离心管中各加入1 mL蒸馏水，振荡、混匀，静置10 min后，弃去上清液，如此用蒸馏水洗涤三次。最后加入1 mL酒精，振荡、混匀后，弃去上清液，如此清洗2次。最后加入大约300 μL酒精，振荡、混匀后，取少量混匀液滴于载玻片上，置于偏光显微镜下观察。 2.3.4. XRD分析 取培养基底部沉淀于离心管中，取培养基底部沉淀于离心管中，静置10 min后弃去上清液，然后每个离心管中各加入10 ml蒸馏水，振荡、混匀，静置10 min后，弃去上清液，如此用蒸馏水洗涤三次。静置10 min后弃去上清液，然后每个离心管中各加入6 ml无水乙醇，振荡、混匀，静置10 min后，弃去上清液，如此用无水乙醇洗涤三次。之后晾干，放入凹槽内，进行XRD的观察分析。XRD扫描角度为10˚~90˚，步长为0.02，扫描速度8˚/min。 2.4. LMZ2生长曲线，pH曲线及碳酸酐酶曲线的测定 2.4.1. 生长曲线的测定 用移液枪移取2.00 mL种子液的过夜培养液(培养10~12 h)转入盛有200 mL培养液的锥形瓶中，在相应的培养时间(0 h、1.5 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、20 h、24 h、26 h、30 h等)在无菌环境中取出4 mL培养液于离心管中，最后同比浊测定其光密度值；用未接种的培养液作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。将所得的OD600值与培养时间作图，绘制生长曲线。 2.4.2. pH变化曲线 用移液枪移取2.00 mL菌种的过夜培养液(培养10~12 h)转入盛有200 mL培养液的锥形瓶中，在相应的培养时间(0 h、1.5 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、20 h、24 h、26 h、30 h等)在无菌环境中取出4 mL培养液于离心管中，测定培养液的pH值。将所得的pH与培养时间作图，绘制pH变化曲线。 2.4.3. 碳酸酐酶曲线 根据Zhuang等人分析微生物碳酸酐酶活性的方法进行测定 [ 25 ]：将菌液和工作液1:1混合(各取1.5 mL)，取适量在400 nm处测定反应前吸光度；放在35度水浴锅中反应30 min，迅速置于冰浴中冷却(可以放置在冰箱中进行冷却)，取适量在400 nm处测定反应后吸光度；得到数据，后期对数据进行处理。