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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验物品及试剂 2.1.1. 实验对象 雌性易感型C57BL/6小鼠(自江苏省常州Cavens动物实验中心获取，实验前于裂隙灯下检查小鼠眼部发育正常。实验动物的使用均符合美国眼科和视觉研究协会The Association for Research in Vision and Ophthalmology关于在眼科和视觉研究中动物使用的原则和标准)。 2.1.2. 实验细胞 人永生化角膜上皮细胞株(HCECs)由厦门眼科中心提供。 2.1.3. 实验菌种烟曲霉菌 烟曲霉菌菌种(编号 3.0772) (自中国普通微生物培养物保藏中心获取)。 2.1.4. 实验用药 虾青素(粉剂) (自美国Sigma Aldrich Chemical 公司获取)。 2.1.5. 实验所需试剂及耗材 RNA提取试剂：RNAiso Plus (自大连TaKaRa有限公司获取)、实时荧光定量PCR试剂盒：SYBR Premix Ex Taq (自大连TaKaRa有限公司获取)、逆转录试剂盒：Prime Script RT试剂盒(自大连TaKaRa有限公司获取)。小鼠IL-1β、IL-6及TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(自武汉Elabscience公司获取)。 2.2. 烟曲霉菌培养及菌丝刺激液的制备 取出冻存的标准烟曲霉菌菌株，在超净台将其溶解吹打后接种在Sab-ouroud琼脂培养基上。将培养基置于在28℃恒温箱中并观察菌株的生长情况，约5~7天后，当烟曲霉菌生长良好布满培养基时，用无菌接种环刮取烟曲霉菌的孢子及菌丝，将其接种于含Sabouroud液体培养基的无菌锥形瓶内，用无菌纱布严密包扎瓶口，在37℃摇床培养箱内120 rpm条件下培养5天左右，待生长至呈团状菌丝状态时，收集无菌锥形瓶内的烟曲霉菌菌丝于离心管内，仔细并多次研磨以制备烟曲霉菌菌液。研磨充分后在12，000 rpm、4℃条件下进行离心15分钟，弃去上清，用吸管吸取无菌PBS溶液充分洗涤菌液，重复3遍。最后一遍弃去洗涤液，一部分菌液加入75%的酒精充分混匀后于4℃冰箱过夜灭活菌丝。次日再次离心，弃去上层酒精，用无菌PBS溶液洗涤并再次离心3遍后弃去洗涤液，加入DMEM培养液混匀制成菌丝悬液，用血细胞计数板于显微镜下进行菌丝计数，配制成最终浓度为 1×10 8 /CFU的菌丝刺激液。 2.3. 小鼠真菌性角膜炎模型的建立 准备30只C57BL/6小鼠(年龄：8周；体重：20 ± 2 g)。小鼠通过腹腔注射8％水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉小鼠。在立体显微镜下，用角膜基质注射针将体积为5 μL的烟曲霉菌菌液注射于右眼角膜基质中。左眼不做任何处理，为未建模的正常眼。将小鼠随机分为两组，分别为DMSO处理组和ASX处理组。每天三次给药处理，给药方式为眼水点眼，ASX治疗组给与浓度为64 μM (ASX浓度的设定：通过CCK-8确定ASX自0 μM到128 μM均对小鼠角膜上皮细胞无明显毒性，为可选范围，故选择测量最大值的一半为实验用药浓度)，溶质为灭菌PBS溶液，DMSO处理组给与同等体积的灭菌PBS溶液，由于药物最初是溶于DMSO溶质，所以对照组中加入了与ASX处理组相同量的DMSO，使DMSO浓度一致，确保ASX为唯一变量。在实验需要的不同时间点麻醉小鼠后并在裂隙灯下拍摄小鼠角膜照片度并根据角膜的炎症程度进行临床评分。在实验需要的不同时间点麻醉小鼠后通过颈椎脱臼法处死小鼠，根据PCR、ELISA等具体的实验方法及时处理小鼠眼球和角膜组织。小鼠角膜的炎症评分分级见表1 [ 24 ]。 Table 1 Inflammation grade of mouse fungal keratitis mode I级(1分) II级(2分) III级(3分) IV级(4分) 溃疡面积 1%~25% 26%~50% 51%~75% 76%~100% 浑浊程度 虹膜纹理尚清 瞳孔可见轻度浑 虹膜可见 角膜较浑浊 虹膜不见 角膜不均匀浑浊 角膜均匀浑浊 溃疡形态 轻度不规则 轻度水肿不规则 重度水肿 龛样溃疡 或后弹力层膨出 穿孔或后弹力 层膨出 表1. 小鼠真菌性角膜炎模型炎症分级 [ 24 ] 注：角膜炎症评分的总分为三项观察指标的分数之和。 2.4. 细胞的刺激试验 在十二孔板细胞培养基中细胞生长均匀并达到约80%融合时即为可以开始使用，将细胞分为6组，分别为：1) 正常组；2) DMSO组；3) ASX处理组；4) 烟曲霉菌组；5) 烟曲霉菌 + DMSO组；6) 烟曲霉菌 + ASX组，每组至少3个孔，在相应的孔里加入对应处理条件后处理2小时，后在培养基中加入灭活的烟曲霉菌菌丝刺激液，菌丝终浓度为5 × 10 6 个/ml，烟曲霉菌菌丝刺激8小时后收取十二孔板的HCECs，用于PCR法检测下游促炎细胞因子(IL-1β， IL-6， TNF-α)的mRNA表达。24小时后收取十二孔板细胞，用于ELISA法检测下游炎症因子(IL-1β， IL-6， TNF-α)的蛋白表达。 2.5. Real-time RT-PCR实验方法 在Pubmed的GeneBank中查找小鼠引物：mβ-actin、mIL-1β、mIL-6、mTNF-α，及人的引物：hβ-actin、hIL-1β、hIL-6、hTNF-α的mRNA 序列，设计引物，并在Pubmed中验证引物的特异性。引物的合成由大连TaKaRa有限公司负责完成。目的基因的引物序列见表2。 Table 2 Real-time RT-PCR primer sequenc 因子 序列(F-) (5’-3’) 序列(R-) (5’-3’) mβ-actin GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C mIL-1β CGC AGC AGC ACA TCA ACA AGA GC TGT CCT CAT CCT GGA AGG TCC ACG mIL-6 CACAAGTCCGGAGAGGAGAC CAGAATTGCCATTGCACAAC mTNF-α ACC CTC ACA CTC AGA TCA TCTT GGT TGT CTT TGA GAT CCA TGC hβ-actin CGCGAGAGAAGATGACCCAGATC GCCAGAGGCGTACAGGGATA hIL-1β ATG CAC CTG TAC GAT CAC TGA ACA AAG GAC ATG GAG AAC ACC hIL-6 ACC CCC AGG AGA AGA TTC CA CAC CAG GCA AGT CTC CTC ATT hTNF-α GAA CCC CGA GTG ACA AGC CTG TCA GCT CCA CGC CAT TGG CCA 表2. Real-time RT-PCR引物序列 注：各引物退火温度为95℃。 使用RNA裂解液(RNAiso Plus)分离小鼠角膜(充分研磨)和细胞(HCECs)各个样本的总RNA，测出每个样本RNA含量后，按照逆转录试剂盒步骤进行逆转录得到样本DNA。根据PCR试剂盒步骤配置相应混合待测液，立即置PCR仪上，进行内参及目的基因扩增反应。扩增条件为：95℃预变性30 s → 95℃变性5 s、60℃ 30 s (重复40个循环) → 95℃退火、延伸15 s → 60℃30 s → 95℃溶解15 s。反应结束后，根据各样本的内参及目的基因循环数，计算目的分子的mRNA相对表达量。 2.6. ELISA实验方法 将小鼠角膜组织取下后，置于500 μl无菌PBS液中，充分破碎角膜组织，将上清液转移至EP管中。分别设空白孔、不同浓度梯度的标准孔、待测样品孔。注意不要有气泡，加样时尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板上覆膜，37℃恒温箱孵育90分钟。弃去液体，甩干。加入生物素化抗体工作液，酶标板上覆膜，37℃恒温箱温育1小时。弃去液体，甩干，大约350 μl/每孔，洗板3次，每次浸泡2分钟，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加酶结合物工作液100 μl，加上覆膜，37℃温育30分钟。弃去液体，甩干，每孔加洗涤液350 μl，洗板3次，每次浸泡2分钟，甩干并在将孔内剩余液体在吸水纸上拍干。迅速向每孔加底物溶液(TMB) 90 μl，酶标板加上覆膜并避光37℃温育15~30分钟。当一半数量的标准孔出现明显的蓝色梯度时终止反应。迅速向每孔加入50 μL反应终止液，加入顺序与加底物，底物顺序保持一致，之后孔内液体由蓝色转为黄色。将96孔板中液体轻轻混匀，置于酶标仪中，检测并记录各孔在450 nm波长的吸光度值。根据检测结果，计算出各组样品目的蛋白的浓度。 2.7. 统计学分析 所有数值数据均表示为平均值的平均值±标准误差(SEM)。所有实验都至少进行了三次。采用单因素方差分析(ANOVA)对三组或三组以上的数据进行比较，并采用未配对双尾t检验对多组数据进行比较。P值小于0.05具有统计学意义。