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user: 2. 实验部分 2.1. 主要仪器和试剂 Bruker Smart APEX II CCD单晶X-射线衍射仪(德国Bruker公司)，Bruker AV500型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)，Agilent 质谱仪(美国Agilent公司)；Varian 640-IR傅立叶变换红外光谱仪(安捷伦公司)，Sarteorius-BS110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，SGW X-4B显微熔点测定仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)，Vario ELIII型元素分析仪(德国Elementar公司)。SW-CJ-1F博讯超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；YXQ-SL-100G博讯高压蒸汽灭菌锅(上海东亚压力容器制造有限公司)；LRH-250生化恒温培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)；DHG-9246A精宏电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。 化学试剂：5-(2-苯酚)-4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫醇 [ 18 ] 进行制备、亚硫酰氯、水合肼(85%)、二硫化碳、苄溴、氯乙酸甲酯及3-氯甲基吡啶盐酸盐等均购自山东西亚化学工业有限公司，其余试剂均为市售分析纯，实验前未作纯化处理。 供试菌种：大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 8739)，白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus CICC 10786)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)。 2.2. 5-(2-苯酚)-4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫醚(化合物2)的合成 参照文献 [ 19 ] 进行，以2a的合成为例，在100 mL二口瓶中加入5-(2-苯酚)-4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫醇2.083 g (0.01 mol)和水50 mL，冰浴搅拌下加入氢氧化钾1.125 g (0.02 mol) (合成2c时改用0.02 mol的碳酸钾)，待全部溶解为透明溶液后滴加氯乙酸甲酯2.5 mL，反应4 h后薄层析跟踪至反应结束，析出大量白色固体，抽滤，滤液缓慢用盐酸中和至沉淀完全为止，抽滤，合并两次所得固体产物，用大量水反复洗涤。固体烘干即得粗产物，用热无水乙醇重结晶，冷却自然会发即可析出大量的白色粉末产物，过滤后烘干后即得2.042 g白色粉末固体产物2a。 5-(2-苯酚)-4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫代乙酸甲酯(化合物2a): 白色粉末，产率73%，m.p.: 196 ~ 197 0 C。 1 H NMR(DMSO-d6， 500 MHz) δ: 2.97 (s， 3H， -CH 3 )， 4.13(s， 2H， -CH 2 -)， 6.07(s， 2H， -NH 2 )， 6.96-7.05(m， 2H， PhH)， 7.37-7.40(t， H， J = 15， PhH)， 7.80-7.81(d， H， J = 5， PhH)， 11.00(s， H， -OH). 13 C NMR(DMSO-d6， 125 MHz，)δ: 169.5， 156.1， 154.3， 152.9， 132.1， 130.0， 119.7， 116.9， 113.3， 52.9， 33.0. ESI-MS， m/z: 303.05[M+Na] + ， 281.08[M+H] + . IR(KBr)， n， cm -1 : 3431.65， 3431.65， 3202.87， 3043.13， 2955.62， 2850.77， 2706.39， 2603.82， 1736.80， 1620.37， 1597.32， 1532.79， 1500.68， 1471.13， 1437.06， 1391.76， 1306.51， 1269.72， 1251.88， 1229.41， 1191.30， 1173.34， 1129.56， 1100.52， 1048.63， 1011.83， 995.18， 966.33， 946.94， 906.37， 886.70， 832.36， 765.79， 746.69， 710.74， 676.30， 600.55， 555.02， 534.36. 元素分析， C 11 H 12 N 4 O 3 S， 实测值(计算值)， %: C 47.20(47.13)， H 4.30(4.32)， N 20.07(19.99). 5-(2-苯酚)-4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫代苄(化合物2b): 白色固体粉末，产率89%，m.p.: 204 ~ 205 0 C。 1 H NMR(DMSO-d6， 500 MHz) δ: 4.46(s， 2H， -CH 2 -)， 6.01(s， 2H， -NH 2 )， 6.97-7.04(m， 2H， PhH)， 7.28-7.48(m， 6H， PhH)， 7.86-7.88(d， 1H， J = 10， PhH)， 11.06(s， H， -OH)。 13 C NMR(DMSO-d6， 125 MHz，)δ: 156.2， 154.3， 153.2， 138.0， 132.0， 129.8， 129.5， 128.8， 127.9， 119.7， 116.9， 113.3， 35.2. ESI-MS， m/z: 321.08[M+Na] + ， 299.11[M+H] + . IR(KBr)， n， cm -1 : 3440.56， 3303.50， 3189.83， 3027.36， 2917.45， 2817.60， 2446.85， 1829.15， 1607.02， 1585.50， 1522.54， 1494.75， 1470.86， 1455.02， 1435.73， 1413.16， 1403.92， 1386.90， 1345.34， 1292.00， 1264.38， 1250.32， 1223.98， 1157.41， 1132.33， 1104.02， 1070.39， 1042.32， 1010.16， 946.00， 830.73， 770.92， 762.03， 750.86， 726.36， 696.11， 683.31， 671.26， 597.02， 563.30， 532.87。元素分析， C 15 H 14 N 4 OS，实测值(计算值)， %: C 60.56(60.38)， H 4.69(4.73)， N 18.85(18.78)。 5-(2-苯酚)-4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫代-3-亚甲基吡啶 (化合物2c): 白色固体粉末，产率62%，m.p.: 173 ~ 174 0 C。 1 H NMR(DMSO-d6， 500 MHz) δ: 4.47(s， 2H， -CH 2 -)， 6.02(s， 2H， -NH 2 )， 6.94-6.98(t， 1H， J = 20， PhH)， 7.01-7.04(d， 1H， J = 15， PhH)， 7.34-7.39(m， 2H， PhH)， 7.81-7.83(d， 1H， J = 10， PyH)， 7.87-7.90(d， 1H， J = 15， PyH)， 8.46-8.47(d， 1H， J = 5， PyH)， 8.67(s， 1H， PyH)， 11.03(s， H， -OH)。 13 C NMR(DMSO-d6， 125 MHz)δ: 156.1， 154.4， 152.7， 150.4， 148.9， 137.0， 134.3， 132.0， 129.9， 123.9， 119.7， 116.9， 113.3， 32.1. ESI-MS， m/z: 300.10[M+H] + ， 322.07[M+Na] + . IR(KBr)， n， cm -1 : 3432.82， 3304.81， 3189.08， 2919.95， 2850.67， 2665.56， 2426.63， 1830.67， 1606.84， 1586.35， 1522.53， 1470.62， 1452.20， 1439.29， 1426.49， 1412.85， 1387.41， 1345.08， 1292.02， 1264.65， 1249.57， 1223.78， 1158.81， 1132.84， 1104.03， 1040.63， 1025.05， 1010.80， 945.27， 859.66， 824.15， 805.45， 761.53， 749.77， 725.37， 707.72， 684.08， 626.96， 597.70， 532.97。元素分析， C 14 H 13 N 5 OS，实测值(计算值)， %: C 56.24(56.17)， H 4.35(4.38)， N 23.47(23.40)。 2.3. 单晶培养 化合物1：取少许化合物1，用乙醇加热溶解为饱和溶液，然后滴入少许的盐酸混匀，搅拌混匀后自然冷却后过滤，滤液室温下静置数天后即可析出无色透明颗粒晶体，收集晶体用于晶体结构测试。 化合物2a：取少许化合物2a用5:1的乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂加热溶解为饱和溶液，薄膜穿孔封口，静置自然缓慢挥发，数天后析出无色透明针状晶体，收集晶体用于晶体结构测试。 2.4. 晶体结构的测定 选取尺寸大小适当的单晶置于Bruker Smart APEX II CCD衍射仪，以石墨单色化的CuKα (λ = 0.154184 nm)射线在低温下进行测试晶胞参数并收集晶体衍射数据。分子结构用SHELX-97程序进行解析和结构优化，用直接法解出非氢原子坐标，氢原子坐标由Fourier合成法得出，经各项异性修正，表1为化合物1与化合物2a的主要晶体学数据和结构修正参数。 2.5. 抑菌活性测试 采用96孔板倍比稀释法来测定中间体化合物1与目标产物化合物2a和2b的最低抑菌浓度(MIC)。细菌用LB培养，真菌用PDB液体培养。各供试菌株液体培养8 h，用0.5麦氏标准比浊法作对照，调整菌液浓度到1 × 10 5 cfu/mL的菌液待用。准确称取待测化合物1和化合物2a及2b，分别用DMSO溶解配制成100 mg/mL母液，再用LB稀释成1 mg/mL工作液，采用倍比稀释法用LB依次稀释第1~11孔大待测物的浓度为：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125、0.9765625和0.48828125 μg/mL，第12孔为空白培养基对照，再分别加入100 μL浓度为1 × 10 5 cfu/mL菌液，细菌置于30℃恒温箱中培养24 h，真菌置于28℃恒温箱中培养24 h。培养结束后，比较检测组与空白对照组浑浊度差异，观察孔内无明显细菌生长且液体相对澄清、无沉淀，所含的药物浓度即为最低抑菌浓度(MIC)值。测试结果如表2~5所示，表中“−”表示澄清且无肉眼可见菌落，“+”表示略浑浊且有肉眼可见菌落，“++”表示十分浑浊。 Table 1 Main crystal data and structure refinement for compound 1 and 2 参数 化合物1 化合物2a 经验分子式 C 8 H 8 C l0 N 4 OS C 11 H 12 N 4 O 2 S 相对分子质量(g/mol) 208.24 264.31 测试温度/K 293(2) 293(2) 辐射波长λ/nm 1.54184 1.54184 晶系 单斜 正交 空间群 P21/c Pbca 晶胞参数a/nm 1.36915(15) 0.76084(2) b/nm 0.59888(5) 1.44068(5) c/nm 1.19513(14) 2.15001(8) α/˚ 90.00 90.00 β/˚ 114.343(13) 90.00 γ/˚ 90.00 90.00 体积V/nm 3 0.89283(16) 2.35668(13) Z值 4 8 计算密度/(g/cm 3 ) 1.549 1.186 吸收系数μ (CuKa)/mm − 1 0.331 0.308 单胞中电子数目F(000) 432 138 晶体尺寸/mm 3 0.17 × 0.18 × 0.20 0.16 × 0.19 × 0.20 扫描收集范q/˚ 3.27 ~ 29.53 4.11 ~ 73.70 极限指数 -18 ≤ h ≤ 15 -9 ≤ h ≤ 3 -8 ≤ k ≤ 8 -17 ≤ k ≤ 16 -12 ≤ l ≤ 15 -18 ≤ l ≤ 26 最终偏离因子[I > 2σ (I)] R1 = 0.0393 0.0501 Rw = 0.0893 0.1355 偏离因子(全部) R1 = 0.0536 0.0569 wR2 = 0.0978 0.1411 表1. 晶体结构测试条件及主要晶体学数据表 Table 2 The antibacterial activity of compounds 供试菌株(strains) 浓度concentration (μg/mL) 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81 3.9 1.95 0.97 0.48 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 大肠杆菌 Escherichia coli + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus − − + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 白色念珠菌 Candida albicans − − − − − − − − − − − − 表2. 化合物1的抑菌活性 Table 3 The antibacterial activity of compounds 2 供试菌株(strains) 浓度concentration (μg/mL) 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81 3.9 1.95 0.97 0.48 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 大肠杆菌 Escherichia coli + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 白色念珠菌 Candida albicans + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 表3. 化合物2a的抑菌活性 Table 4 The antibacterial activity of compounds 2 供试菌株(strains) 浓度concentration (μg/mL) 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81 3.9 1.95 0.97 0.48 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 大肠杆菌 Escherichia coli + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 白色念珠菌 Candida albicans + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 表4. 化合物2b的抑菌活性 Table 5 The antibacterial activity of compounds 2 供试菌株(strains) 浓度concentration (μg/mL) 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81 3.9 1.95 0.97 0.48 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 大肠杆菌 Escherichia coli − − + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 白色念珠菌 Candida albicans − − − − − − − − − − − − 表5. 化合物2c的抑菌活性