DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 9. 从人体及动物模型实验，找寻刺激手及臂区穴位，可能强化呼吸功䏻的证据 9.1. 根据人体脑电图及在颈椎、三角肌、斜角肌和膈的肌电图，发现电压刺激某头盖区域会激发电讯号从运动皮层传递到膈肌–这头盖区域应处于手臂在脑皮层的反射区 很多脑皮层及脊髓反射的实验都采用动物模型。在这9.1节里，先介绍八十年代在人体进行的实验，但只能证实反射作用的一部分。在9.2节里，加上九十年代的人体实验，就可以确立人体体感反射的成立。 在一个早期的实验，作者把阳电极贴安于头盖(一)顶点(相应于膈在脑皮层的反射区)及(二)离顶点前一厘米cm的冠状面两侧旁开，约5至7厘米cm处，这两定点区域就恰对应处于本文图11，在脑皮层的手臂区。阴极贴就安放在头盖顶点前6~7厘米cm处。其它两组电极就固定贴在(三)第四颈椎的枕外隆凸尖处及(四)斜角肌中部。这是个健康活人体实验，所以只能用一套经食道的细小导管系统，把第(五)组电极伸入到食道近膈肌处，以量度那区域的肌电图。在极短时间内(数十毫秒)用高电压分别刺激上述的(一)及(二)处。上面提及的导管系统结构及操作，在文献 [ 45 ] 中有详述。 根据分析上述实验时电讯图的结果，他们推算出从运动皮层激发的讯号，要经4.3厘秒时间，由经神经系统传递，到达膈神经的“头部”(即C4及C5神经根的连接点)。从C4根发出的电讯号，要经8.0厘秒，由神经元传递，可以到达膈肌。即是说，如果一个人有意识的使膈肌收缩，他/她最少要花(4.3 + 8.0)厘秒，即12.3厘秒的时间。从脑干的固有呼吸中心系统递送讯号到膈的时间是少于这个时段。在八十年代，脑电波测量技术(只有不超过二十个电极贴的系统)，比现时的落后许多，而且激发电压讯号要经过头盖骨及筋膜才到达脑皮层，所以位置不太准确。现在一套电极贴头帽有128至256个电极贴，大大提升了测量有关区域的准确度，而且有软件可以计算电极在三维脑皮层的“发源区域”(请参看关于测量脑电波的新技术) [ 46 ]。不过，从定性的角度，这类实验是重要的，因为结果显示，如果剌激手臂感觉神经，上行的神经元会把讯号输送到脑体感皮层，经过体感反射，初级运动皮层的神经元就会收到这反射讯号。上述实验告诉我们，从初级运动皮层下行的神经元，就会突触膈神经，从而激发膈的活动。因为上述的分辨率低，在八十年代还未能准确的找到反应区，只知约在臂区。从7.1、7.2、7.3及9.1节的结果，得知：(A) 在脑干有一个固有机制可以令膈收缩；(B) 在脊髓的膈核能激发膈活动；(C) 膈与脑某些部分及脊髓的中间神经元都有神经性的联系；(D) 刺激脑运动皮层一带区域会激发膈的活动。 9.2. 追寻体感反射能调节膈功能的直接证据——这证据与中医学的治疗法有关 体感反射的基本机制，是周边感觉神经递送刺激到某特定位置的讯号至体感皮层。在这皮层的神经元会突触初级运动(或辅助运动、前运动)的神经元，令下行神经元的轴突突触在脊髓的中间神经元，导致激发某组肌肉的活动。从上一节的结果，理解到剌激脑运动皮层会激发膈的活动。理解怎样直接经体感反射去调节膈的功能，当然是治疗COPD重要的一环。Zifko等 [ 47 ] 在锁骨上窝用电脉冲经皮肤刺激了健康人体的右侧膈神经，并使用具有20个电极贴的脑电图器在头盖上记录了诱发的电位。图16代表观察头顶所见的电极贴(每一小圆圈代表一个电极贴)。在图中左方红色的小圈就是测量到最强诱发电压的位置(称为CP3点位)；如果刺激左膈神经，右方红色小圈(称为CP4)就是相应测到最强诱发电压的位置。在脑皮层的神经元活动所发出的电讯，要经过筋膜及髗骨才到达电极贴，所以根据只有20个电极贴测到的电压只能大约显示出脑皮层体感神经元(群)活动的位置。但尽管如此，注意在CP3、CP4测到最强诱发电压代表大约在手臂区(参看本文图10及图11)有激发活动。在文献 [ 47 ] 中描述在电激发实验过程中的，还在身体康健人的头、颈部进行(围绕垂直中线的)磁力共振成像扫描。从文献 [ 47 ] 所报告的图像，得知活动的区域包括初级运动皮层、前运动皮层、辅助皮层及后脑。这结果代表刺激躯体感觉神经，会把讯号投射到数区。而明显的是，最活跃区域恰好在代表上肢的部位，与脑电图类似，活跃大约包括了手臂和手指/掌部。在人体上，刺激膈神经递送讯号传入于C3-C5节的背角。刺激邻近正中神经、桡神经或皮肌神经的位置，可以把刺激传入C5 (及C4、C3...)神经根(参看图4、图5、图6及第4节的解释)。古典的肺经穴位都邻近于以上三条神经的位置；所以针刺这些肺经穴位就会达到像扭动躯体的胸腹的效果——让膈感觉神经输送讯号至体感皮层。上行的神经轴突可以通过脊髓丘脑束(在第5节已详细解释)或像垂直于脊髓横切面的背柱一内侧系白质束(参看图7)。 根据现代神经生理学，如刺激正中神经，输入各有关手丛脊髓根(C5-T1)讯号的强度分布还在研究阶段，所以现在还未能确立刺激那一个肺经穴位(甚至那个属于其它经络，但与正中神经邻近的穴位)会带来最大调节呼吸的影响。尽管神经系统如此复杂，在临床上得到正面疗效结果的穴位组合都可沿用，但必须研究其有效机制。这一点在第13节也会综合论述。请注意在文献 [ 47 ] 报告的另一结果：用电讯号刺激膈神经会增强膈的收缩功能。因为每条脊髓神经纤维都包裹着上行的感觉神经纤维和下行的运动神经纤维(参看3.2及4节)。用电脉冲刺激膈神经同时刺激了感觉神经(导致上述的体感反射)及运动神经(导致众所周知的膈收缩活动)。除了在健康人体，利用猫模型，也得到属于前肢的体感皮层与膈功能的关系 [ 48 ]，现简述如下。 图16. 诱发电位实验的俯视图。蓝色圈代表利用“二十个电极贴”进行脑电图(EEG)实验时的十九个电极贴位置。通常参考电极贴放在耳附近的颞叶位。电极贴间有线相连，所以测电压的“帽子”可以畧移动。文献 [ 47 ] 指出，当刺激右边膈神经时，测到最大诱发电压位的位置在CP3位。在神经学上，CP3位置，对于某一位人士是固定的，就约在图左边红圈地点。所以本文作者认为在实验中，把电极贴帽子畧移位，就可以测到CP3点的诱发电位。与图11的定位标记相比对，便知CP3相应于上肢的位置 在脑皮层，有多处形成有裂隙的内折；那凸起成罔/丘状的组织称为脑廻(Gyrus)。小丘周围的凹陷区就称为脑沟(sulcus)。在初级运动皮层有一个名为乙状脑廻的小丘，就是相对于臂部的体感–运动反射区。以猫模型，应用电生理学技术及常用的辣根过氧化酶染色法注入膈核，Rikard-Ball等发现：(甲)位于前乙状廻区(ASG)的前/腹外侧边界(ventrolateral boarder)与及在前外侧边缘十字沟(anterolateral/edge of crucial sulcus)的神经元，会投射至膈核。同时，(乙)位于ASG及后乙状廻区(posterior sigmoid gyrus)的神经元却投射到数胸脊髓前角；而从这些前角位置又存在有中间神经元，可以启动肋间肌的运动神经元，激发肋间肌的活动。因为乙状廻区和相关的十字沟组织，没有一个明确的几何结构，所以作者们发现在上述(甲)及(乙)区的二组神经元有重迭的部分，提示着这两组神经元可能有一个共通的功能。还有，他们测度到在相应手臂的脑廻区及膈核显示着同步的电压图 [ 48 ]，表示经臂区在脑皮层的反射，就能激发呼吸活动。这节分析的结果，提示着用中医学的方法刺激肺经穴位，能够加强呼吸活动。
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user: 10. 运动–耦合系统及斜角肌核的发现——这发现应用于解释第12.2节的针刺疗效结果 10.1. 运动–呼吸耦合系统存在于大脑与脊柱；在系统里面也有个别中心控制呼吸功能和部分肌肉的运动 神经科学的一个主要研究项目是指中枢神经系统(CNS)生成的各种形式的节奏。神经细胞，能够以引起振动的特定模式发射电讯号。因此中枢神经拥有许多具有不同频率和不同类型的振荡器。已经确定，成年哺乳动物的脑干和脊髓包含中央模式的耦合发生器(central pattern generator， CPG)，其产生的讯号，类似于运动期间，肌肉表现的启动模式中有节奏的输出讯号。已经确定/推断出大脑中局限的CPG组位于“中脑运动区”和下丘脑外侧 [ 49 ] (并参看 [ 50 ] 的图1)。在整个动物种类中，切除脑部后但未麻醉的大鼠、兔、猫、猴的孤立脊髓中含有产生运动节律性的网络(请参见 [ 49 ] 中的讨论)。CPG系统中的中间神经细胞使用谷氨酸或去甲肾上腺素或-5-羟色胺作为神经元递质。另一方面，呼气肌肉的收缩使内脏的惯性位置移动，从而影响隔肌/膜的位置，及增加胸膜内和肺内的压力。运动必须与呼吸速率配合，以满足相关运动期间肌肉收缩的氧气需求。所以研究运动–呼吸耦合系统的结构体和运行机制对治疗COPD 定必有帮助。 关于CPG和呼吸中心之间的联系，Le Gal等准备了大鼠的脑干–脊髓标本，浸于脑脊液中 [ 51 ]。记录了C4和脊柱L2的前/腹角根部运动神经输出突发而有节律性实时电压图。得悉在这两处每一分钟都有1.68 次电脉冲式讯号。这是一个参考频率值。另一方面，使用面呼吸组(对于pFRG的部位，见图15)的细胞进行全细胞的膜片钳(whole-cell patch clamp)实验，也获得面呼吸组的参考频率值。 接着，作者把脊髓的腰段，包括L2及L5的前角神经纤维放在神经调节剂N-甲基-D，L-天门冬氨酸(N-methyl-D， L-aspartate， NMA)及血清素中，以引发类似活体，稳定的虚构运动。注意在L2和L5前角的运动神经元分别支配后肢的屈肌和伸肌。当脊髓腰段的样品放在上述的神经调节剂后，在L2和L5的实时电讯记录图中找到左、右交替的脉冲式的模式，代表仿真后肢运动的成功。而且，在C4及L2前角根的电脉冲频率，增加到每分钟2.74次的数值。因为C4前角运动神经元支配膈肌，亦即呼吸的活动，所以这结果代表启动后肢屈肌及伸肌的运动亦同时增加呼吸的频率。换言之，这实验对于运动–呼吸耦合系统的存在给出有力的证据。人与脊椎动物的运动主要在上、下肢。肺和心操作的功率，必需配合每一个动作，所以运动–呼吸耦合系统的存在，有其必然性。从医学的角度，我们关注于寻找(如本节标题所述)个别控制呼吸功能的中心在脊髓的位置，然后在需要调节呼吸时，想办法怎样调节这些中心的操作。在下一节，将介绍数月前一研究组的发现：一个控制斜角肌的中心/核，竟然就在大鼠数个脊髓节段的前角。 10.2. 最近已发现，大鼠腹角存在一神经元群(称为斜角肌核)；它支配斜角肌的收缩，还显示与膈核有同步的电压活动。这结果对于理解新肺经筋成员(包括参加呼吸的主要肌肉)的功能与肺经络之间的关系很有作用。我们提出斜角肌核其实就是运动–呼吸耦合系统实体的一部分 在十多年前，已经知道人在安静呼吸过程中，三组斜角肌都显示出韵律性活动 [ 52 ]。接着，一个功能磁力共振成像系统(FMRI)，配上一套可以测度在脑及脊髓组织里氧分子状态变化的软件于2010年发展成功 [ 53 ]。 在呼吸时，脑部组织的含氧量，就显示韵律性的变化。还有，脊髓前角接连运动神经元，支配有关肌肉活动。根据基础解剖学，一组血管必然与运动神经纤维相向而行，滋养神经细胞的活动。所以配有检测血中氧含量(blood oxygen level dependent， BOLD)功能的FMRI，就成为(在脑及脊髓)寻找与呼吸相关神经组织的有效工具。 最近，利用新生大鼠模型，Shinozaki等寻找在脊髓灰质，支配斜角肌活动的中间神经元位置 [ 54 ]。第一步，先注入染色体在三组斜角肌。跟着把脑干及脊髓分隔出来，应用其聚焦激光扫描显微镜及荧光显微镜(epifluorescent microscope)，以记录第四脊髓横切面的视像。他们找到一组伸延于脊髓C3至C7灰质的细胞团及另一组位于C3至C6灰质的细胞团。根据文献 [ 54 ] 的发现，在图17中绘出在一垂直截面(相应于在图右水平虚线的位置)。垂直截面显示出上述两团细胞团的示意分布。到了现在，明确得悉黄色的组织就是大鼠膈核。而作者从影像分析，指示出红–橙色的细胞团就是支配斜角肌的中间神经元，称为斜角肌(神经)核；而此两细胞团显示出同步的活动。注意，这模型是十多天的新生大鼠，所以灰质在C4的形状与成长的大鼠有所不同。最近二、三年，研究者提出在脊椎动物及人体中存在一个功能性的运动–呼吸耦合系统，正如在第10.1节所论述，可惜现时仍很难找出在这耦合系统的具体解剖结构。我们认为斜角肌核的发现，正好填上了第二个实体的部分，而第一个实体就是膈核。 图17. Shinozaki等发现新生大鼠斜角肌核位于脊髓C3-C7的灰质。根据该论文图6和图7中显示的结果 [ 54 ]，此图示意性地描绘斜角肌核(橙–红色)与膈核(黄色)在一个垂直平面的细胞分布。垂直平面对应于右图的水平虚线，而右图是小箭嘴指着，在C4和C6之间的横截面(参见 [ 54 ] 的图1)。作者冯戬云手绘此图
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user: 11. 一个自然调节呼吸的机制：传自膈肌的感觉神经把讯号输入C3-C5的背角——这结果提示针刺肺经穴位也是一个类似的呼吸调节机制 本文已谈论过不少膈运动神经元的细节。和在第3.2节解释过的周边(体躯)神经纤维、膈神经纤维内藏有下行的运动神经纤维及上行的感觉神经纤维。研究呼吸功能的文章，比较少报导膈感觉神经纤维的作用。早在1986年，已有学者把大鼠模型的膈神经切断，而从断口注入HRP染剂，去寻找与膈神经连接在脊髓的神经胞体；其主要目的就是想知道膈感觉神经传入脊髓的分布 [ 55 ]。他们在C3至C7的背根神经节(参看本文图7)都找到了HRP-染色的胞体。从C4、C5背根神经节的胞体，都有轴突延伸至C3-C7背角的内侧白质位置，而其主轴形成一纵向背柱神经束，接近在图7中A-β背柱–内侧丘系白质束的路径。只有在C4、C5脊髓节段，才有轴突分支经灰质背角进入第I、II、III、IV板层的地域。已知大鼠的膈核在C3-C6节。在图十八中，可以看到膈感觉神经(较深绿色)的简单解剖示意位置；这里没有绘出中颈交感神经节(如在图8)及与C5根连接的分支，以方便立论。在膈肌的感觉神经轴突末端，会自然封装有疼痛感觉接收器，如Pacianian小体等以检测膈的感觉及压力。当身体运动时，不同的姿态会令膈的两侧感受到不同的压力/刺激，而身体必须把这讯息通知影响膈活动的神经元。最近，关于膈感觉神经对呼吸功能的影响，有进一步的认识 [ 56 ]；大致上，此文献支持 [ 55 ] 的发现及分析感觉神经在膈肌的分布。在膈核节段背角传入感觉讯号，可以经中间神经元(图18中在灰质的淡红或白色的较细小神经元)，把讯号传至同侧或对侧的膈核(以一个较大、白色的神经元代表膈核的中间神经元)，从而启动从膈核接连膈的运动神经元(橙色)，作出调整。这种调整，是一个神经脊髓节段的反射，不必经过脑皮层。在第8、9.1、9.2节，已经讨论过影响膈运动，即呼吸操作主要动作，可以通过三个机制完成：固有的呼吸起搏系统、经脑皮层的反射系统、及只经脊髓节段反射的程序。既然膈感觉神经可以经膈核节段的背角调节膈的活动。同理，利用针、灸、徒手操作的穴压、砭石深层次按压C3-C5的脊髓神经根，同样可以把不同的刺激讯号输送至膈核节段的背角。严格说，刺激手六经的穴位都可以透过不同强度的刺激讯号传入颈椎背角。在灰质与白质的中间神经元，有过千种类别。虽然它们所用的主要神经递质只有以十计的数字，但每种中间神经元会表达不同的功能性蛋白和受体，所以研究中间神经元的类别、功能是近十年的一个艰巨难题，但亦是极之重要的神经学课题。作者将会在下一篇论文讨论这议题。在本文中，只能根据神经学，说出在人体或脊椎动物，在脊髓节段性的反射过程中，对膈功能作出调整的存在机制。 图18还包括与脑皮层反射过程有关的解剖组织，在第5.1及5.2节已经开始讨论。有了9.1、9.2、10.1、10.2及11节的分析作为背景，可以接着解释脑皮层反射能够影响呼吸功能的机制。这点在第13节继续论述。
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user: 13. 本文分析结果的撮要 本文牵涉的课题较广，为了方便理解多种复杂过程，及连接下篇文的内容，在这节我们写出较详细的“撮要”。在图18中，我们显示了一个摘要图，帮助撮要的解释本文中的几个关键问题。其中一要点是提出证据说明刺激肺经络穴位之所以能加强呼吸功能的机制。 1) 图18右面是脊髓C5。大脑存在一个拥有数个中心的呼吸起搏器，不停的发出韵律性讯号，由数条延髓脊髓束下行至脊髓——其中红核脊髓束(经过彩蓝色的圆圈)是最关键的一束。在脊髓C3至C5中，这束有轴突分支突触个别中间神经元(浅淡红)；这些中间神经元突触在膈核的胞体，从而启动膈运动神经(橙色)。已经有实验显示出经脑皮层的体感反射是另一个可强化呼吸的机制(参考第9节及文献 [ 73 ] [ 74 ] [ 75 ] )。经刺激手臂肺经穴位反射下行的皮质脊髓侧束(深蓝)所包括的白质区与红核脊髓束所占的有大部分是重迭的(参看文献 [ 14 ] 的图III.37)。如果这两束的中间神经元是同一类别，它们便会以同一机制启动膈核。若是那两类细胞以不同方式突触膈核细胞，将是一项对中、西医学极有趣的研究课题。 2) 延髓脊髓束系统另一重要神经束是网状脊髓束(图15及在图18中脊髓前端的两浅蓝色柱状体)。它们在胸段T2至T11节有分支接触近前角的运动神经元，令外肋间肌收缩，使胸腔扩大，与膈肌收缩有协同的吸气作用。脊髓每节的横截面的面积及灰质的形状都不同，所以网状脊髓束会经过像L一字形态的一部分，如图18所示。在经过L一字垂直部分的称为网状脊髓内侧束，而经过L一字横部的就称为(网状)前庭脊髓束。在另一方面，针刺手部在脑皮层反射下行的路径称为皮质脊髓前束(图18中较蓝色的柱状体)；这束与同侧的网状脊髓内侧束有部分重迭，在L一字形的垂直部分。既然有实验指出它能启动呼吸，这束应当会有分支突触膈核(如图18中的淡粉红神经元)，及会在胸脊髓突触肋间肌神经胞体(参看图15)。到现时为止，没有明确的实验结果顕示那一种神经接触是活化呼吸的主要机制；这也是中、西医学研究者想知的结果。 3) 根据第7.2、7.3节的解释(参看图12、图13及图14)，了解到胞体在板层II，III的神经元，与同侧及对侧的膈联系。即是说，突触板层II、III的中间神经元，可以激发膈核(或膈肌)的活动。到现时所知，在板层II、III间，没有一个自发性的起搏器，只有从脊髓背角进入的感觉神经轴突会把讯号输入至在背角的中间神经元。在第11节，已解释清楚膈的上行感觉神经可以调整膈的活动。要知道膈是人体内唯一一个器官是不受副交感神经支配的，这种由感觉神经的调整也是必然的。此类脊髓节段的反射，与脑皮层反射是两个不同位置旳机制。其实，在九十年代，已有大鼠等模型实验证实了脊髓反射的存在 [ 76 ]。 从生理学而言，如果上颈椎(C1、C2)患有严重结构性的损伤，在脑桥、脑干呼吸起搏器发出的韵律性讯号便不能到达膈核。最近，文献 [ 77 ] 报导利用“上椎完全损伤大鼠模型”用“硬膜外刺激器”(epidural stimulation)，以电讯号刺激膈核脊髓节段的胶原蛋白硬膜，可以令大鼠膈肌恢复活动。这种刺激方法，就类似用中医学的电针去刺激进入背角的感觉神经元，诱发膈神经的活动。这实验也左证了脊髓(内)的反射现象。从常理来说，体躯受到剌激，自然会加速呼吸作相应变动。所以，针刺周边神经纤维可以引发上述两种反射。 4) 在第10.1节中已较详述人体的运动–呼吸耦合系统。生存在有地心吸力的行星，站立时间长的人类必需有坚强的腿部肌肉。中医学也常提及増强下肢运动的重要性。还有，人及脊椎动物的运动，主要在上、下肢。本文作者认为前数月Shinozaki等找到的斜角核 [ 54 ] (第10.2节，图16)，是除膈核外，在大脑外第二个运动–呼吸耦合中心。相信以后会发现更多的“分区耦合中心”，与呼吸运动肌肉或上、下肢肌肉有关。以中医学的语言，本文作者认为，每一个中心都联系到一组肺经筋的成员。 5) 在第12.2节，根据神经生理学，已简单解释了在三个临床报告上都用了相同的十一组穴位去治疗COPD而达到疗效的原因。简言之，疗效都归因于膈及其他呼吸肌肉及运动–呼吸耦合系统的启动。 6) 正如在第12.1节所简述，呼吸操作必须在有意识及无意识(睡眠中)连续的进行。在生活中，呼吸操作大部分时间是有节奏性的，但有时(如吞咽、说话)是必须以非节奏性的形式进行。还有，影响呼吸的有呼吸性的和非呼吸性的(如情緖影响)输入。所以呼吸是一项极之复杂的生理功能。如果食道操作有问题，在吞咽时就会遇上呼吸危险的时刻。在中医学古籍文献里，通常会先谈肺经络，这罗辑是正常的。因为影响呼吸正常操作，有上述的三大类原因，所以发展治疗呼吸障碍症就必须从多方面考虑。这也是本文作者先发表肺经络、肺经筋文献的原因。 7) 每条周边神经纤维都包裹着数条上行的感觉会阴神经纤维及数条下行的运动会阴神经纤维(图3)。引用本文提及中医学的方法刺激周边神经纤维会导致(iii)所述的两类反射，及活化运动端板与肌肉的连接(参看图2及图3)，使肌肉的灵活性增加。 8) 虽然本文只集中讨论神经系统如何参与膈及一部分有关肌肉的活动，但中间神经元有三维的结构及突触能力，所以一条脊髓丘脑束就从下腹脊髓直上丘脑。因此，内脏器官的互动就是神经学的“必然结果”。在文献 [ 11 ]，作者用神经生理学解释了古籍中医学为甚么有“肺与大肠互为表里”之说。近二十年，在临床上发现多种不同的呼吸障碍症与过敏性肠炎病及溃疡性结肠炎有相关性 [ 78 ] [ 79 ] [ 80 ] [ 81 ]。到了2007年，文献 [ 82 ] 报道大鼠吸入刺激性气体后，在腰椎尾端(L6-S5)的脊髓神经元，会收到结肠及肺部的讯息。有鉴于此，他们提出“肺与结肠相对话”的概念。
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user: 14. 总结 根据现代神经生物学，用中医学的方式刺激肺经络穴位及与运动–呼吸耦合系统有关的神经，可以通过大脑及/或脊髓反射作用训练来加强呼吸有关的肌肉，调节呼吸功能。膈核及斜角肌核是两组在颈脊髓灰质的中间神经元，能以同步形式活动；这两组是上述耦合系统中至现时为止已肯定知道的成员。分析中间神经元的功能是很重要的课题。肺经筋是帮助呼吸的肌肉、结缔组织、筋腱和韧带。用中医学的述语，要医治COPD，可以从刺激肺经络及肺经筋着手。
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user: 摘 要 本文对超几何方程的一类非齐次边值问题的解做了深入分析，发现可以通过构造引解函数和左、右相似核函数，得到解的相似结构式，并提出求解相似结构式的相似构造法。对一个具体的超几何方程边值问题的求解进一步说明：相较于传统的求解步骤，运用相似构造法求解边值问题更加快速便捷；解的相似结构式表示为连分式乘积，不仅体现了解的形式美，更反映出定解方程的解与边界条件系数之间的相互联系。 关键词 :超几何方程，非齐次边界，相似核函数，解的相似结构，连分式 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 微分方程的应用渗透于许多的工程问题，要解决工程中所遇到的问题免不了会涉及微分方程的求解，早在十七世纪Legendre、Euler就开始了对微分方程解的研究，并在十八世纪被Kummer、Hermite、Laguerre等人进一步丰富和加深 [ 1 ] [ 2 ]，在随后的时间里研究工作者也纷纷投入到微分方程解的研究中。纵观微分方程解研究的发展历史，微分方程的求解常需要用到特殊函数，如：Bessel函数、Hermit函数、Legendre函数、Jacobi函数等超几何函数，正是如此，针对超几何方程的求解问题的研究显得极为重要。近年，李顺初等人研究了二阶齐次常微分方程边值问题 [ 3 ] - [ 8 ]，并对其解的相似结构做了深入分析，得到微分方程的解具有某种相似结构：可以表示为连分式的乘积形式且其结构形式只与某一边界条件有关，而其所谓的相似核函数与定解方程和另外的边界条件有关。 基于以上研究，本文探讨了双边非齐次的欧拉超几何的第三类边值问题解的问题，通过对其解结构特点的观察及分析，提出了超几何方程边值问题解的相似结构法，得到了边值问题解的相似结构式。解的相似结构式由两个相似核函数与边界系数构成，并且一个边界条件影响一个相似核函数。本文针对超几何方程边值问题解的研究为解决计算机仿真、电磁场分析等实际工程问题奠定了相应的理论基础；解的相似构造法极大地缩减了繁琐的求解过程和计算时间，为工程模型的求解提供了一种简捷、实用的新方法；解的相似结构也为编制相应的分析软件提供了极大便利。
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user: 3. 相似构造法的提出 定理证明了超几何方程存在解的相似结构式，那么如何迅速得到相似结构式？本文作出了如下三点总结。 第一步：构造引解函数 根据所给方程类型以及方程系数限定，得到方程的两个线性无关的解 F ( a ， b ， c ， x ) ， x 1 − c F ( a + 1 − c . b + 1 − c ， 2 − c ， x ) ，利用这两个线性无关解构造引解函数如下 φ 0 ， 0 ( x ， y ) = | x 1 − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， x ) F ( a ， b ， c ， x ) y 1 − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， y ) F ( a ， b ， c ， y ) | φ 0 ， 1 ( x ， y ) = | ( 1 − c ) x − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， x ) + ( a + 1 − c ) 2 − c ⋅ ( b + 1 − c ) ⋅ x 1 − c F ( a + 2 − c ， b + 2 − c ， 3 − c ， x ) a b c F ( a ， b ， c ， x ) y 1 − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， y ) F ( a ， b ， c ， y ) | φ 1 ， 0 ( x ， y ) = | x 1 − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， x ) F ( a ， b ， c ， x ) ( 1 − c ) y − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， y ) + ( a + 1 − c ) 2 − c ⋅ ( b + 1 − c ) y 1 − c F ( a + 2 − c ， b + 2 − c ， 3 − c ， y ) a b c F ( a + 1 ， b + 1 ， c + 1 ， y ) | φ 1 ， 1 ( x ， y ) = | ( 1 − c ) x − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， x ) + ( a + 1 − c ) 2 − c ⋅ ( b + 1 − c ) x 1 − c F ( a + 2 − c ， b + 2 − c ， 3 − c ， x ) a b c F ( a + 1 ， b + 1 ， c + 1 ， x ) ( 1 − c ) y − c F ( a + 1 − c ， b + 1 − c ， 2 − c ， y ) + ( a + 1 − c ) 2 − c ⋅ ( b + 1 − c ) y 1 − c F ( a + 2 − c ， b + 2 − c ， 3 − c ， y ) a b c F ( a + 1 ， b + 1 ， c + 1 ， y ) | 第二步：构造左、右相似核函数 根据左边值条件中所涉及的系数 m ， n 、边界值 α 以及引解函数 φ k ， l ( x ， y ) ， k ， l = 0 ， 1 构造左边界的相似核函数 Φ 1 ( x ) ，将边界值 β 带入左边界的相似核函数，计算出 Φ 1 ( β ) ；根据得右边值条件中涉及的系数 e ， f 、边界值 β 以及引解函数构造右边界的相似核函数 Φ 2 ( x ) 将边界值 α 带入右边界的相似核函数，计算出 Φ 2 ( α ) 。 第三步：求得解的相似结构 对于超几何方程的非齐次边值问题(1)，结合左右边值条件中涉及的系数 m ， n ， e ， f 以及所求得的左、右相似核函数，根据(2)式，得到边值问题解的相似结构。
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user: 4. 相似构造法的举例 求解如下超几何方程非齐次边值问题 { x ( 1 − x ) y ″ − 2.25 y ′ − y = 0 ( 2 y + y ′ ) x = 1 = 5 [ 4 y + y ′ ] x = β = 10 (13) 与边值问题(1)相比，本例中的 a = 1 ， b = 1 ， c = 0.75 ， m = 2 ， n = 1 ， e = 4 ， f = 0 ， α = 1 ， β = 2 ， Q = 5 ， T = 10 ，根据相似构造法的步骤，直接求出(13)式得解相似结构。 第一步：构造引解函数 根据方程 x ( 1 − x ) y ″ − 2.25 y ′ − y = 0 的两个线性无关解 x 0.25 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.75 ， x ) 、 F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， x ) 得到非齐次边值问题(13)的引解函数 φ 0 ， 0 ( x ， y ) = | x 0.25 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.75 ， y ， x ) F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， x ) y 1 − 0.25 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.75 ， y ) F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， y ) | φ 0 ， 1 ( x ， y ) = | 0.25 x − 0.75 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， x ) + 1.25 ⋅ x 0.25 F ( 2.25 ， 2.25 ， 2.25 ， x ) 8 3 F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， x ) y 0.25 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， y ) F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， y ) | φ 1 ， 0 ( x ， y ) = | x 0.25 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， x ) F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， x ) 0.25 y − 0.75 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， y ) + 1.25 y 0.25 F ( 2.25 ， 2.25 ， 2.25 ， y ) 8 3 F ( 2 ， 2 ， 1.75 ， y ) | φ 1 ， 1 ( x ， y ) = | 0.25 x − 0.75 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， x ) + 1.25 x 0.25 F ( 2.25 ， 2.25 ， 2.25 ， x ) 8 3 F ( 2 ， 2 ， 1.75 ， x ) 0.25 y − 0.75 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， y ) + 1.25 y 0.25 F ( 2.25 ， 2.25 ， 2.25 ， y ) 8 3 F ( 2 ， 2 ， 1.75 ， y ) | 其中 F ( 1.25 ， 1.25 ， 1.25 ， x ) = ∑ k = 0 ∞ ( 1.25 ) k ( 1.25 ) k k ! ( 1.25 ) k x k F ( 1 ， 1 ， 0.75 ， x ) = ∑ k = 0 ∞ ( 1 ) k ( 1 ) k k ! ( 0.75 ) k x k F ( 2.25 ， 2.25 ， 2.25 ， x ) = ∑ k = 0 ∞ ( 2.25 ) k ( 2.25 ) k k ! ( 2.25 ) k x k F ( 2 ， 2 ， 1.75 ， x ) = ∑ k = 0 ∞ ( 2 ) k ( 2 ) k k ! ( 1.75 ) k x k 第二步：构造左、右相似核函数 根据(3)式，得到边值问题(13)的左相似核函数 Φ 1 ( x ) = 2 φ 0 ， 0 ( 1 ， x ) + φ 0 ， 1 ( 1 ， x ) 2 φ 1 ， 0 ( 1 ， 2 ) + φ 1 ， 1 ( 1 ， 2 ) 进一步求得 Φ 1 ( 2 ) = 2 φ 0 ， 0 ( 1 ， 2 ) + φ 0 ， 1 ( 1 ， 2 ) 2 φ 1 ， 0 ( 1 ， 2 ) + φ 1 ， 1 ( 1 ， 2 ) 同理，根据(4)式，得到边值问题(13)的右相似核函数 Φ 2 ( x ) = 4 φ 0 ， 0 ( x ， 2 ) + φ 1 ， 0 ( x ， 2 ) 4 φ 0 ， 1 ( 1 ， 2 ) + φ 1 ， 1 ( 1 ， 2 ) 进一步求得 Φ 2 ( 1 ) = 4 φ 0 ， 0 ( 1 ， 2 ) + φ 1 ， 0 ( 1 ， 2 ) 4 φ 0 ， 1 ( 1 ， 2 ) + φ 1 ， 1 ( 1 ， 2 ) 第三步：求得解的相似结构 根据(2)式并结合左、右相似核函数以及 Φ 1 ( 2 ) ， Φ 2 ( 1 ) ，得到超几何方程非齐次边值问题(13)的解的相似结构如下 y = 10 ⋅ 1 4 + 1 Φ 1 ( 2 ) ⋅ 1 Φ 1 ( 2 ) ⋅ Φ 1 ( x ) + 5 ⋅ 1 2 + 1 Φ 2 ( 1 ) ⋅ 1 Φ 2 ( 1 ) Φ 2 (x)
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user: 5. 结论与认识 1) 通过构造引解函数 φ 0 ， 0 ( x ， y ) ， φ 1 ， 0 ( x ， y ) 、 φ 0 ， 1 ( x ， y ) 以及 φ 1 ， 1 ( x ， y ) ，构造左、右相似核函数 Φ 1 ( x ) 、 Φ 2 ( x ) ，得到方程的解式为一个简单优美的连分式乘积表达式，解的相似结构中的参数与边界条件中参数相对应，不同边界条件确定不同的相似核函数。 2) 若将相应结果应用于石油工程问题中，在编制分析软件时更能体现结果的优越性。
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user: 摘 要 为探究莼菜粗多糖对Hela细胞生长的抑制作用，本研究以湖北省利川市莼菜嫩芽为原材料，提取粗多糖(BSP)，通过MTT法测抑制率，AO-PI双染观察细胞，对不同非正常细胞形态进行计数，用RT-qPCR方法检测部分癌症相关基因表达情况。在2000个/孔细胞初始密度时，500 µg/mL BSP就对Hela细胞有抑制作用，2000 µg/mL BSP处理Hela细胞72 h，抑制率可达到96.88%。BSP诱导Hela细胞产生四种非正常形态，随BSP浓度升高，I型比例减小，II、III、IV型比例增大。250 µg/mL BSP处理Hela细胞12 h，p53、Cyclin D1、CDK2和CDK7基因相对表达水平均在2倍左右。BSP对Hela细胞的抑制作用呈时间浓度依赖，且会破坏细胞膜，改变细胞形态。抑制作用可能与p53及细胞周期等调控基因的积累有关。 关键词 :多糖，莼菜，Hela，MTT，AO-PI Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 多糖是由十个以上单糖通过糖苷键结合形成的大分子物质，广泛存在于动物、植物、微生物中。和DNA、蛋白质等大分子一样，多糖是植物维持正常生理活动必不可少的重要物质。有大量关于多糖的研究显示出植物多糖具有广泛的药理作用，如免疫调节、抗肿瘤作用、抗氧化、抗病毒、降血糖、降脂和抗辐射作用。比如，啤酒花(Humulus lupulus)多糖能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化，具有成骨作用 [ 1 ]。灰树花(Grifola frondosa)多糖通过TLR4-MyD88-IKKβ-NF-κBp65信号途径激活巨噬细胞 [ 2 ]。野生仙人掌(Opuntia dillenii Haw)多糖能抑制SK-MES-1细胞的生长，诱导细胞周期S期阻滞，还可引起细胞凋亡 [ 3 ]。凹顶藻(Laurencia obtusa)多糖对丙型肝炎病毒(HCV)的抑制率达82.36%，马尾藻(Sargassum vulgare)多糖对自由基的清除剂能力高达81.5% [ 4 ]。西府海棠(Malus micromalus)多糖对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子均有不同程度的清除作用，还能提高抗氧化酶系统的活性，发挥一定的抗衰老作用 [ 5 ]。桑树(Morus alba L.)枝多糖可通过调节胰内JNK/p38途径发挥明显的降血糖作用 [ 6 ]。芦荟(Aloe vera)多糖可能通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路对NGF激活的皮肤神经细胞PC12的UVB损伤具有修复作用 [ 7 ]。 莼菜(Brasenia schreberi)属睡莲科莼属，多年生水生植物，是中国历史悠久的药食兼用的珍贵蔬菜。莼菜嫩芽外裹有一层厚厚的透明胶质，其中的主要成分多糖 [ 8 ]，也是莼菜嫩芽药用价值的主要来源。莼菜味甘性寒，具有清热、利水、消肿、解毒的功效。治热痢、黄疽、痈肿、疔疮，胃病(包括慢性胃炎，胃溃疡，胃癌等)。《医林纂要》载“除烦，解热，消痰”。《本草纲目》记载，莼菜可以消渴热痹，和鲫鱼作羹时下气止呕，补大小肠虚气，治热疸，厚肠胃，安下焦，逐水解毒。研究表明，莼菜多糖具有降血糖 [ 9 ] 、降血脂 [ 10 ] 以及抗氧化活性 [ 11 ]，而莼菜多糖对癌症的抑制作用未见详实报道。本实验以湖北省利川市莼菜嫩芽为原材料，提取粗多糖，初步探究了莼菜粗多糖对Hela细胞生长的影响，提高莼菜综合利用的可能途径。
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user: 2. 材料和方法 2.1. 实验材料 新鲜莼菜嫩芽于2018年7月在湖北省利川市佛宝山基地和凉雾基地采摘，冰盒保鲜运回。Hela细胞(GDC009)购自中国典型培养物保藏中心武汉大学保藏中心。 2.2. 莼菜嫩芽粗多糖提取 新鲜莼菜嫩芽，用自来水缓流冲洗3 min，灭菌超纯水洗涤三次。放入0.1 mol/L NaOH溶液中，料液比1:2 (w/v)，60℃搅拌提取1.5 h；提取液冷却至室温，过200目网筛，去除大块残渣。抽滤，取上清，用HCl调节溶液pH至7.0。Sevag法 [ 12 ] 除蛋白，用分液漏斗分离有机相和无机相，重复至离心后无蛋白层。收集上层水相，12，000 rpm常温离心10 min，留取上清，得莼菜粗多糖蛋白质层，加入四倍体积95%乙醇，4℃醇析过夜，然后12，000 rpm，4℃离心，取沉淀。用超纯水溶解沉淀，12，000 rpm，4℃离心，取上清，分装，冷冻干燥，得莼菜粗多糖固体(BSP)。 2.3. Hela细胞复苏与传代培养 取出冻存于液氮中的Hela细胞，迅速37℃水浴融化，将1 mL冻存液转至T25细胞培养瓶，加4 mL DMEM培养基，在37℃的5% CO 2 气氛中培养。次日用5 mL PBS轻柔洗涤细胞，换新鲜DMEM培养基。待细胞长至约10 6 个/mL时(占瓶底85%左右)，吸弃旧培养基，5 mL PBS轻柔洗涤细胞，加入1 mL胰酶(含EDTA) 37℃消化约2 min，吸弃胰酶，加入2 mL DMEM培养基，吹匀，根据所需比例留存细胞悬液，补新鲜DMEM培养基至5 mL。 2.4. MTT法测定Hela细胞生长曲线 待细胞密度长至10 6 个/mL左右时，吸弃旧培养基，5 mL PBS轻柔洗涤细胞，加入1 mL胰酶(含EDTA) 37℃消化约2 min，吸弃胰酶，加入2 mL DMEM培养基，吹匀。对细胞悬液进行计数，将细胞悬液稀释成1000个/mL、2500个/mL、5000个/mL、7500个/mL、1 × 10 4 个/mL、2 × 10 4 个/mL、2.5 × 10 4 个/mL、5 × 10 4 个/mL、1 × 10 5 个/mL，96孔板每孔200 µL细胞稀释液，每个浓度六个重复孔。培养24~168 h后，每孔加入20 µL MTT (5 mg/mL)。37℃孵育4 h后，吸净培养上清液，每孔加入150 µL二甲基亚砜(DMSO)，90 rpm震荡10 min，用酶标仪测定490 nm处吸光度。 2.5. MTT法测BSP对细胞生长抑制率 细胞活力的测定按照Zhang et al.的方法进行 [ 13 ]。Hela细胞长至10 6 个/mL左右时，吸弃旧培养基，5 mL PBS轻柔洗涤细胞，加入1 mL胰酶(含EDTA) 37℃消化约2 min，吸弃胰酶，加入2 mL DMEM培养基，吹匀。对细胞悬液进行计数，根据需要体积稀释细胞悬液至2 × 10 4 个/mL。将细胞分为以下4组：1) 零对照组，只含培养基；2) 阴性对照组，加入细胞，不加多糖；3) 阳性对照组：加入细胞，50 µg/mL 5'-Fu (5'-氟尿嘧啶)；4) 实验组，加入细胞和不同浓度多糖溶液。除零对照组100 µL DMEM培养基外，96孔板每孔加入100 µL细胞稀释液，6个重复孔。周围一圈填200 µL PBS溶液。4~6 h细胞贴壁，零对照组和阴性对照组每孔加100 µL 2 × 多糖溶液。每隔12 h测一组490 nm处吸光值。用以下公式计算细胞的抑制率： 细胞抑制率 = (Ac − A1)/(Ac − A0) × 100%；A0：空白组吸光度；A1：实验组(包含阳性对照组)吸光度；Ac：阴性对照组吸光度。 2.6. 吖啶橙–碘化丙啶(AO-PI)双染 吖啶橙(AO)用PBS配制5 mg/mL储存液，过滤除菌。同样方法配制3 mg/mLPI储存液。使用时，将 1 μL AO和1 μL PI储存液加入1 mL PBS混匀。用培养皿(3 cm， Nest)培养细胞，BSP处理一定时间后，吸净培养皿上清，加入500 μL染液，立即在荧光显微镜下观察细胞，蓝光激发。 2.7. RT-qPCR 细胞总RNA的提取按照总RNA小量制备试剂盒的方法进行。用反转录试剂盒对提取的总RNA进行逆转录，获得用于实时荧光定量PCR的cDNA。实时荧光定量PCR采用2xT5 Fast qPCR Mix (SYBR Green I)试剂盒，按照说明书进行操作，引物见表1。RT-qPCR采用三步法，反应程序为：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，53℃退火15 s，72℃延伸10~15 s，40次循环。用 2 − Δ Δ Ct 计算相对表达量。 Table 1 Primers of RT-qPC 引物名称 引物序列(5’→3’) GAPDH-F GGAGTCCACTGGCGTCTTCA GAPDH-R GTCATGAGTCCTTCCACGATACC P53-F CCTGGATTGGCCAGACTGC P53-R TTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGT Cyclin D1-F AAAGAATTTGCACCCCGCTG Cyclin D1-R GACAGACAAAGCGTCCCTCA CDK2-F TCTTTGCTGAGATGGTGACTCG CDK2-R CACTTGGGGAAACTTGGCTTG CDK7-F GAAGTGGGTGTTGGAGGCTT CDK7-R TAACGCTTTGCCCGAGACTT 表1. RT-qPCR引物
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user: 3. 结果 3.1. 生长曲线确定2000个/孔作为Hela细胞培养的起始密度 Hela细胞在初始密度低于2000个/孔时，72小时内吸光值低于0.3，初始密度大于2000个/孔时，吸光值在72小时时超过0.7，均不能使吸光值与细胞密度保持良好的线性关系(图1)。初始密度为2000个/孔时，处理时间24~72 h范围内，吸光值和培养时间能呈良好的线性关系，且吸光值在0.3~0.7的范围内，能够保证吸光值和细胞密度呈较好的线性关系初始浓度(图1)。所以后续的细胞实验选用2000个/孔作为起始密度。 3.2. BSP对Hela细胞生长的抑制呈现时间和剂量依赖效应 细胞活力测定结果表明，BSP对Hela细胞的生长抑制作用，呈时间和浓度依赖性，随BSP浓度升高，处理时间增加，抑制率升高(图2)。在BSP浓度为500 µg/mL时，开始有抑制作用，处理72 h，抑制率达13.58%；BSP浓度为1500 µg/mL时，相同处理时间较1000 µg/mL抑制率提高一倍左右；2000 µg/mL BSP处理12 h时，抑制率已经达到24.60%，处理72 h抑制率高达96.88% (图2)。实验结果表明，所有浓度BSP处理Hela细胞12 h~48 h抑制率增长明显，48 h后抑制率增长缓慢。 图1. Hela细胞生长曲线 图2. BSP对Hela细胞生长抑制率 3.3. BSP导致Hela细胞皱缩变圆 用2000 µg/mL BSP处理Hela细胞48 h，含10%胎牛血清DMEM高糖培养基处理48 h的Hela细胞作为对照组。用AO-PI双染料对细胞进行染色处理，绿色的为活细胞，红色的为死细胞。可以看到对照组细胞均为绿色(图3(A))，绝大部分细胞形态都为清晰的梭形；用BSP处理后的83%的细胞被染成红色，已完全失去梭形形态，变为圆形，少量被染成绿色的细胞也呈圆形，17%的细胞被染成绿色，且保持梭形(图3(B))。 图3. AO-PI双染 3.4. BSP诱导Hela产生四种非正常形态细胞 BSP处理Hela后，在10×物镜下观察到大量细胞皱缩变圆，在40×物镜下观察变圆的细胞，按形态可分为四种。第一种是细胞变圆，但细胞膜光滑完整(图4(A))，记为I。第二种是细胞膜出现少量突起(图4(B))，细胞内部密度不均匀，记为II。第三种是有许多突起伸出细胞膜(图4(C))，记为III。第四种是细胞皱缩成不规则形状，呈现小泡形态(图4(D))，记为IV。BSP系列浓度(500~2000 µg/mL)处理48 h后的Hela后，细胞形态统计分析表明，随着BSP浓度从500 µg/mL上升到2000 µg/mL，I型细胞从48.04%下降到8.62%，II型细胞从20.59%上升到31.19%，III型细胞从20.00%上升到38.72%，IV型细胞从11.37%上升到21.47% (n > 500) (图4(E))。 图4. BSP诱导的四种非正常形态细胞 3.5. BSP诱导部分癌症相关基因表达上调 分别用250 µg/mL、500 µg/mL、1000 µg/mL浓度BSP处理Hela细胞12 h后，用RT-qPCR检测细胞p53，Cyclin D1，CDK2，CDK7的相对表达水平，用GAPDH作为内参基因。所用引物见表1。在三个浓度下，p53和CDK2均保持2倍左右相对表达水平。在250 µg/mL和500 µg/mL时，Cyclin D1和CDK7的表达水平是对照的2倍，但是BSP浓度上升到1000 µg/mL后，Cyclin D1相对表达水平上升到7倍，CDK7相对表达水平上升到5倍(图5)。 图5. 部分癌症相关基因相对表达水平
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user: 4. 讨论 本研究的结果初步表明，BSP对Hela细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖性，浓度越高，处理时间越长，抑制作用越强。AO-PI双染和非正常形态统计结果显示，BSP处理后，Hela细胞的形态发生改变，由正常的梭形皱缩变圆，细胞膜也有一定程度改变。 BSP处理Hela细胞12 h就有一定的抑制作用，到48 h抑制率增长趋于平缓，说明在12 h甚至之前就已经有相关基因发生变化。p53基因编码一种包含转录激活、DNA结合和寡聚结构域的肿瘤抑制蛋白。这种基因的突变与多种人类癌症有关，包括遗传性癌症，如李·弗劳门尼综合征 [ 14 ]。有研究发现灵芝多糖对大肠癌细胞突变型p53抑癌作用有恢复作用 [ 15 ]。BSP在250 µg/mL浓度处理12 h，p53基因相对表达水平增加1倍，说明BSP确实能够刺激p53基因的表达，从而抑制癌细胞增殖。 Cyclin D1基因编码的蛋白质属于高度保守的细胞周期蛋白家族，是CDK激酶的调节因子。该基因编码的细胞周期蛋白与CDK4或CDK6形成复合物，并作为其调节亚单位发挥作用，其活性是细胞周期G1/S转换所必需的。大英素通过Cyclin D1/CDK4介导的途径抑制MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞的增殖 [ 16 ]。Cyclin D1的表达水平显示BSP对Hela的抑制作用可能与细胞周期相关蛋白积累有关。 CDK2基因编码细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)，该蛋白是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶复合物的催化亚单位，它调节整个细胞周期的进展。这种蛋白的活性在G1到S期转变过程中尤为重要。CDK2通过DNA损伤、细胞内转运、蛋白质降解、信号转导、DNA和RNA代谢和翻译等途径与蛋白质相互作用并磷酸化。CDK2及其调节亚单位在许多人类癌症中被解除调节，研究表明CDK2抑制在具有明确遗传特征的肿瘤子集中引起抗肿瘤活性 [ 17 ]。所以CDK2的表达水平提高也显示了BSP对Hela的抑制作用。 CDK7基因编码的蛋白是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)家族的成员，是细胞周期进程的重要调控因子。该蛋白与细胞周期素H和MAT1形成三聚体复合物，发挥CDK激活激酶(CAK)的作用。CDK7的抑制扰乱了小细胞肺癌(SCLC)的细胞周期进程，诱导DNA复制应激和基因组不稳定，同时触发免疫应答信号。这些肿瘤的内在事件激发由T细胞诱导的强大的免疫监视程序，而通过增加免疫检查点阻断，免疫监视程序进一步增强 [ 18 ]。BSP处理后，Hela细胞内CDK7表达水平增高正是其通过增加免疫检查点阻断发挥抑制作用的体现之一。 本研究初步证实了BSP对Hela细胞的生长具有抑制作用，但作用浓度偏大，可能是因为粗多糖中多糖组分多导致，后期还需对BSP进行分离纯化，筛选出抑制作用贡献最大的组分，并详细探究BSP对癌细胞发挥抑制作用的机理。
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user: 摘 要 大肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，在香港社会中，大肠癌为最常见之癌症。2016年，在香港新确诊癌症病例中有17.3%均为大肠癌，而且，发病率和死亡率有逐年上升的趋势。近年来，随着医疗科学技术的发展，大肠癌的中医药外治法受到关注。外治法优点在于避开手术及放疗化疗，是一种安全、有效、快捷、易操作又经济的新疗法。本文论述近年有关使用中医外治法治疗大肠癌之研究进展，包括中药灌肠、中药外敷、针灸及耳穴。 关键词 :大肠癌，中医药外治法，灌肠法，外敷法，针灸法，耳穴刺激 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 背景 在香港，大肠癌为最常见之癌症。2016年，香港新确诊癌症病例中有17.3%均为大肠癌，而且从1983~2016年间发病率均呈上升趋势 [ 1 ]。大肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。在中国，近年的大肠癌发病率亦呈上升趋势 [ 2 ]，可见大肠癌之防治在香港及中国均为急切之公共卫生议题。 由于大肠癌患者早期临床症状不明显，所以早期诊断率较低，临床症状明显时，已多属中晚期，而目前大肠癌的主要致死因素是复发和转移。中医认为大肠癌是由于脾胃虚弱，中焦气机不畅以致水谷不化，导致痰、湿、热、瘀、毒内阻而形成。目前中医证型主要以脾虚气滞、脾肾阳虚、肝肾阴虚、瘀毒内阻、湿热蕴结、气血两虚居多。中医文化源远流长，早已记载了多种防治大肠癌的方法。 在过去相关的中医药防治大肠癌研究中，学术界多以中医内治研究为主，本文将重点回顾近年在中医界倍受关注的外治法，包括中药灌肠、外敷、针灸及耳穴等方面之研究进展。外治法在提高大肠癌患者存活率、生存质量、降低经济负担方面有独特的优势，使其成为防治大肠癌不可或缺的方法之一。
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user: 2. 外治中药灌肠法提高体内药物浓度 中医对大肠癌的外治法中，中药灌肠是一个比较有特色之治疗手段。早在汉代张仲景《伤寒论》已有记载以中药灌肠治疗便秘之方法，如「又大猪胆一枚，泻汁，和少许法醋，以灌谷道内，如一食顷，当大便出宿食恶物，甚效。」中药灌肠即利用中草药煎成水剂，从肛门灌入直肠。灌肠法治疗肠癌可令药物可直达病所，使药物之有效成份从肠黏膜中吸收，并绕过肝脏之首过效应，提高体内药物浓度。 雷麸尔 [ 3 ] 在50例大肠癌肠梗阻患者中使用中药灌肠治疗配合胃肠减压和补液支持。灌肠方药内容为生大黄15 g、熟大黄15 g、菜菔子50 g、厚朴30 g、枳实30 g、木香10 g、青皮10 g、陈皮10 g、丁香10 g、炮姜10 g；伴证为血瘀较甚之患者，加赤芍15 g、红花10 g；热毒较甚者，加蚤休30 g和败酱草30 g，每日保留灌肠2次，每次一剂。研究以腹痛腹胀感、排便情况、肠鸣音及腹部X线片作为判断有效率之参数，结果显效者33例，有效11例，无效6例，总有效率为88%，表示中药灌肠可有效减轻大肠癌肠梗阻患者之症状。李智菊 [ 4 ] 使用大承气汤加减治疗大肠癌伴肠梗阻33例，处方为生大黄(后下)、枳实、厚朴、蒲公英、大腹皮各20 g，莱服子、木香、廷胡索各15 g，芒硝9 g；每日以水煎剂100~200 ml灌肠两次。治疗7日后，总有效率及排气、排便情况均明显优于对照组。郑玉玲等 [ 5 ] 将120例湿热蕴结型大肠癌病例分为三组，当中50例采用5-Fu针剂及肠达顺灌肠液(组成为大血藤、苦参、败酱草、生地榆、薏苡仁)灌肠；40例单用肠达顺灌肠液灌肠；30例单用5-Fu针剂。结果发现单用肠达顺灌肠液效用与5-Fu相当，两者联合应用则有明显增效作用，且无明显不良反应。粟艳琴 [ 6 ] 将50例直肠癌术后患者随机分配，治疗组采用加味大承气汤高位保留灌肠，并针刺足三里、上巨虚、天枢及中脘穴，对照组则以生理盐水灌肠。结果显示治疗组之肠鸣音出现时间、首次肛门排气时间、排便时间均早于对照组，有效率为96%，高于对照组之76%。指出中药灌肠结合针灸可促进直肠癌术后之胃肠功能恢复。王爱华等 [ 7 ] 在27例老年大肠癌急性肠梗阻病例上使用大黄液灌肠，当中只有1例发生创口感染。作者认为大黄液灌肠可减低手术感染机会并缩短手术时间。 不同研究表明，中药灌肠对于治疗大肠癌，及大肠癌手术后恢复都有正面效用。另外，该方法操作比较简单，在医生指导下熟练后，可以自行给药。灌肠法药物目前价格相对低廉，深受患者青睐。