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user: 2. 结果与分析 2.1. 时间对酶解液肝素效价的影响 图1是酶解时间对酶解液肝素效价的影响结果图。由图1可以看出，在水解时间1.5~3 h范围内，随着时间的延长，酶解液效价逐渐增大；水解3 h时达到最大，为6.65 U∙mg −1 ，而且显著高于其他各水平；在3~4.5 h范围内，酶解液效价显著降低。因此，在规定条件下，3 h是最佳水解时间。 2.2. 温度对酶解液肝素效价的影响 图2是温度对酶解液肝素效价的影响结果图。由图2可以看出，随着水解温度的升高，酶解液效价显著增大；55℃~60℃时酶解液效价达到7.68 U·mg −1 ，显著高于其他各水平；60℃以后，酶解液效价显著下降。因此，胰蛋白酶水解猪肠黏膜最佳酶解温度为60℃。 图1. 水解时间对酶解液效价的影响。注：图中不同字母表示差异显著，P < 0.05。下同。 图2. 水解温度对酶解效价的影响 2.3. 酶底物浓度对酶解液肝素效价的影响 图3是酶底物浓度对酶解液肝素效价的影响结果图。 由图3可以看出，随着水解酶底物浓度的升高，酶解液效价显著增大；0.70%时酶解液效价达到9.46 U·mg −1 ，显著高于其他水平；0.70%以后，酶解液效价显著下降。因此，胰蛋白酶水解猪肠黏膜最佳底物浓度为0.70%。 图3. 酶底物浓度对酶解效价的影响 2.4. 盐浓度对酶解液肝素效价的影响 图4是盐浓度对酶解液肝素效价的影响结果图。由图4可以看出，盐浓度为0.15~0.30 mol·L −1 范围内，随着盐浓度的升高，酶解液效价显著增大；当盐浓度达0.30 mol·L −1 时，酶解液效价达到8.84 U·mg −1 ，显著高于其他各水平；0.30 mol·L −1 以后，酶解液效价显著下降。因此，胰蛋白酶水解猪肠黏膜最佳食盐浓度为0.30 mol·L −1 。 图4. 盐浓度对酶解效价的影响 2.5. pH值对酶解液肝素效价的影响 图5是pH值对酶解液肝素效价的影响结果图。由图5可以看出，pH值7.0~8.5范围内，随着pH值的升高，酶解液效价显著增大；酶解溶液pH值8.5时酶解液效价达到7.85 U·mg −1 ，显著高于其他各pH水平；酶解溶液pH值8.5以上，酶解液效价显著下降。因此，选择最佳的料液pH值为8.5。 图5. pH对酶解效价的影响 2.6. 料液比对酶解液肝素效价的影响 图6是料液比对酶解液肝素效价的影响结果图。由图6可以看出，随着料液比的降低，酶解液效价显著增大；料液比1:7 g·L −1 时，酶解液效价达到8.15 U·mg −1 ，显著高于其他水平；料液比比1:7 g·L −1 以后，酶解液效价呈下降趋势。因此，选择最佳的料液比为1:7 g·L −1 。 图6. 料液比对酶解效价的影响 2.7. 响应面优化及结果 依据胰蛋白酶酶解猪肠黏膜单因素试验结果，利用Box-Behnken设计，进行三因素(水解温度、时间、酶底物浓度)三水平响应面优化试验，试验因素及水平编码见表2，试验结果见表3。 根据响应面统计方法对试验结果进行拟合，得出酶解液效价和底物浓度、水解时间，水解温度的拟合方程： Table 2 Code and level of factors chosen for the experiment 因素 Factors 编码 Codes 水平 Levels −1 0 1 酶底物浓度/% Enzyme substrate content/% X 1 0.60 0.70 0.80 温度(℃) Temperature/˚C X 2 55 60 65 时间/h Time/h X 3 2.5 3.0 3.5 表2. 试验因素水平及编码 Table 3 The results of the response surface test 试验序列 Run 酶底物浓度/% Enzyme substrate content/% 温度/℃ Temperature/℃ 时间/h Time/h 酶解液效价/U·mg −1 Validity of enzyme hydrolysis solution/U·mg −1 1 0.80 60 3.5 8.73 2 0.70 65 3.5 8.81 3 0.70 60 3.0 9.65 4 0.70 65 2.5 8.43 5 0.60 60 3.5 7.15 6 0.70 60 3.0 9.72 7 0.70 60 3.0 9.67 8 0.80 65 3.0 9.81 9 0.60 65 3.0 8.25 10 0.60 60 2.5 6.73 11 0.80 60 2.5 8.16 12 0.70 60 3.0 9.57 13 0.60 55 3.0 7.55 14 0.70 60 3.0 9.62 15 0.70 55 3.5 8.15 16 0.80 55 3.0 9.06 17 0.70 55 2.5 7.45 表3. 响应面试验结果 酶 解 液 效 价 ( U / mg ) = 9.65 + 0.76 × A + 0.39 × B + 0.26 × C − 0.75 × A 2 − 0.23 × B 2 − 1.21 × C 2 + 0.012 × A × B + 0.037 × A × C − 0.08 × B × C 同时，对回归模型进行方差分析，结果见表4。从表4可以看出，回归模型具有高度的显著性(P < 0.0001)，失拟项在α = 0.05水平上不显著(P = 0.0722 > 0.05)，说明回归方程与实际情况吻合的较好，误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。 由表4可知，该模型极显著，该模型能很好地解释数据差异性。其中酶底物浓度、水解时间，对肝素提取的影响表现为极显著。另外，该模型的确定系数为0.9988，调整确定系数为0.9973，说明该回归模型对数据的拟合程度较好，适于对肝素提取进行分析及预测。该模型的失拟项为0.0060，表现为不显著，因此该模型稳定性较好，能很好预测各因素对响应值的影响。 2.8. 响应面分析 响应面图形是响应值对应于试验因素所构成的可以反映各因素及因素间的交互作用对响应值的影响。将一个因素固定在零水平，可以作出两因素交互作用的响应曲面图和等高线图。等高线越圆，说明它们之间相互作用对肝素提取的影响越小；而等高线越接近椭圆，表示因素之间的相互影响越大。图7~9是酶底物浓度、酶解温度、酶解时间对应的酶解液肝素效价构成的三维空间曲面图。从结果可以看出，酶底物浓度和水解时间交互作用对酶解液肝素效价影响最小。 Table 4 The variance analysis results of regression model 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 Variation sources Quadratic sum Variance Mean square F value P value 模型 Models models 15.77 9 1.75 663.08 <0.0001 A 4.62 1 4.62 1748.88 <0.0001 B 1.19 1 1.19 451.72 <0.0001 C 0.54 1 0.54 202.72 <0.0001 A 2 2.36 1 2.36 891.62 <0.0001 B 2 0.22 1 0.22 84.67 <0.0001 C 2 6.12 1 6.12 2315.87 <0.0001 AB 0.000625 1 0.000625 0.24 0.6416 AC 0.0256 1 0.0256 9.69 0.0170 BC 0.005625 1 0.005625 2.13 0.1879 残差 Resides 0.018 7 0.002642 失拟项 Quasi loss terms 0.005975 3 0.001992 0.64 0.6299 误差项 Error terms 0.013 4 0.00313 总和 Total 15.79 16 表4. 回归模型方差分析结果 R = 0.9988; R Adj 2 = 0.9973 图7. 酶底浓度和温度对酶解液效价的影响 图8. 酶底物比和时间对酶解液效价的影响 图9. 温度和时间对酶解液效价的影响 2.9. 验证试验 利用回归方程，在优化条件下，对酶底物比、水解温度、水解时间对应的酶解液效价进行预测和实际测定。结果见表5，预测值与真实值之间具有95.2%的相关性，可以利用上述回归方程对胰蛋白酶水解肠黏膜过程进行预测和控制。 同时，选择表5中编号为“1”的参数进行中试试验，中试结果与预测结果基本一致。因此，胰蛋白酶水解猪肠黏膜最适条件为：温度 60 ℃ ，时间3 h，酶底物比0.70%。 Table 5 The relation of predicted response values and practised value 编号 Run 酶底物浓度/% Enzyme substrate content/% 温度/℃ Temperature/˚C 时间/h Time/h 酶解液效价/ U·mg −1 预测值 Predicted values 真实值 True values 1 0.68 55.70 3 9.65 9.74 2 0.63 64.98 3 8.25 8.35 3 0.76 61.54 3 8.47 8.14 4 0.73 59.84 3 8.16 8.33 表5. 响应优化值与真实值之间的关系 相关性R 2 = 0.952; Correlation R 2 = 0.952。