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user: 2. 结果 2.1. 附子理中汤药物化学成分及相关靶点搜寻 以口服生物利用度OB ≥ 30%且类药性DL ≥ 0.18为筛选条件，通过TCMSP查找附子理中汤中药(人参、附子、干姜、白术、甘草)药物活性化学成分，获得活性成分108个(含重复)，分别为附子6个，人参5个，白术4个，甘草88个(见表1)。其中干姜和人参共同活性成分1个：beta-sitosterol，对应靶点37个；甘草和人参共同活性成分1个：kaempferol，对应靶点60个，附子、干姜、甘草共同活性化学成分1个：sitosterol，对应靶点3个。删除重复数据后得到104个活性成分，对应391个作用靶点，其中存在164个重复靶点。 Table 1 Active ingredients of Fuzilizhong Decoctio 中药 Mol ID Molecule name MW (相对分子质量) OB (%) > 30 DL > 0.18 白术 MOL000022 14-acetyl-12-senecioyl-2E，8Z， 10E-atractylentriol 356.45 63.37 0.3 白术 MOL000033 (3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-dimethyl -17-[(2R，5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4， 7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H -cyclopenta[a]phenanthren-3-ol 428.82 36.23 0.78 白术 MOL000049 3β-acetoxyatractylone 274.39 54.07 0.22 白术 MOL000072 8β-ethoxy atractylenolide III 276.41 35.95 0.21 干姜 MOL002464 1-Monolinolein 354.59 37.18 0.3 干姜 MOL002501 [(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4 -oxo-1-cyclopent-2-enyl](1R，3R)-3-[(E) -3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl] -2，2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate 360.49 62.52 0.31 干姜 MOL002514 Sexangularetin 316.28 62.86 0.3 干姜 MOL000358 beta-sitosterol 414.79 36.91 0.75 干姜 MOL000359 sitosterol 414.79 36.91 0.75 人参 MOL002879 Diop 390.62 43.59 0.39 人参 MOL000449 Stigmasterol 412.77 43.83 0.76 人参 MOL003648 Inermin 284.28 65.83 0.54 人参 MOL000358 beta-sitosterol 414.79 36.91 0.75 人参 MOL000422 kaempferol 286.25 41.88 0.24 附子 MOL002211 11，14-eicosadienoic acid 308.56 39.99 0.2 附子 MOL002388 Delphin_qt 303.26 57.76 0.28 附子 MOL002392 Deltoin 328.39 46.69 0.37 附子 MOL002395 Deoxyandrographolide 334.5 56.3 0.31 附子 MOL002398 Karanjin 292.3 69.56 0.34 附子 MOL000359 sitosterol 414.79 36.91 0.75 甘草 MOL000098 quercetin 302.25 46.43 0.28 甘草 MOL000211 Mairin 456.78 55.38 0.78 甘草 MOL000239 Jaranol 314.31 50.83 0.29 甘草 MOL000354 isorhamnetin 316.28 49.6 0.31 甘草 MOL000359 sitosterol 414.79 36.91 0.75 甘草 MOL000392 formononetin 268.28 69.67 0.21 甘草 MOL000417 Calycosin 284.28 47.75 0.24 甘草 MOL000422 kaempferol 286.25 41.88 0.24 甘草 MOL000497 licochalcone a 338.43 40.79 0.29 甘草 MOL000500 Vestitol 272.32 74.66 0.21 甘草 MOL001484 Inermine 284.28 75.18 0.54 甘草 MOL001792 DFV 256.27 32.76 0.18 甘草 MOL002311 Glycyrol 366.39 90.78 0.67 甘草 MOL002565 Medicarpin 270.3 49.22 0.34 甘草 MOL003656 Lupiwighteone 338.38 51.64 0.37 甘草 MOL003896 7-Methoxy-2-methyl isoflavone 266.31 42.56 0.2 甘草 MOL004328 naringenin 272.27 59.29 0.21 甘草 MOL004805 (2S)-2-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl) phenyl]-8，8-dimethyl-2，3-dihydropyrano [2，3-f]chromen-4-one 390.51 31.79 0.72 甘草 MOL004806 euchrenone 406.56 30.29 0.57 甘草 MOL004808 glyasperin B 370.43 65.22 0.44 甘草 MOL004810 glyasperin F 354.38 75.84 0.54 甘草 MOL004811 Glyasperin C 356.45 45.56 0.4 甘草 MOL004814 Isotrifoliol 298.26 31.94 0.42 甘草 MOL004815 (E)-1-(2，4-dihydroxyphenyl)-3-(2，2 -dimethylchromen-6-yl)prop-2-en-1-one 322.38 39.62 0.35 甘草 MOL004820 kanzonols W 336.36 50.48 0.52 甘草 MOL004824 (2S)-6-(2，4-dihydroxyphenyl) -2-(2-hydroxypropan-2-yl)-4-methoxy -2，3-dihydrofuro[3，2-g]chromen-7-one 384.41 60.25 0.63 甘草 MOL004827 Semilicoisoflavone B 352.36 48.78 0.55 甘草 MOL004828 Glepidotin A 338.38 44.72 0.35 甘草 MOL004829 Glepidotin B 340.4 64.46 0.34 甘草 MOL004833 Phaseolinisoflavan 324.4 32.01 0.45 甘草 MOL004835 Glypallichalcone 284.33 61.6 0.19 甘草 MOL004838 8-(6-hydroxy-2-benzofuranyl) -2，2-dimethyl-5-chromenol 308.35 58.44 0.38 甘草 MOL004841 Licochalcone B 286.3 76.76 0.19 甘草 MOL004848 licochalcone G 354.43 49.25 0.32 甘草 MOL004849 3-(2，4-dihydroxyphenyl) -8-(1，1-dimethylprop-2-enyl) -7-hydroxy-5-methoxy-coumarin 368.41 59.62 0.43 甘草 MOL004855 Licoricone 382.44 63.58 0.47 甘草 MOL004856 Gancaonin A 352.41 51.08 0.4 甘草 MOL004857 Gancaonin B 368.41 48.79 0.45 甘草 MOL004863 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-5，7-dihydroxy -8-(3-methylbut-2-enyl)chromone 693.71 32.89 0.27 甘草 MOL004864 5，7-dihydroxy-3-(4-methoxyphenyl) -8-(3-methylbut-2-enyl)chromone 352.41 30.49 0.41 甘草 MOL004866 2-(3，4-dihydroxyphenyl)-5，7-dihydroxy -6-(3-methylbut-2-enyl)chromone 354.38 44.15 0.41 甘草 MOL004879 Glycyrin 382.44 52.61 0.47 甘草 MOL004882 Licocoumarone 340.4 33.21 0.36 甘草 MOL004883 Licoisoflavone 354.38 41.61 0.42 甘草 MOL004884 Licoisoflavone B 352.36 38.93 0.55 甘草 MOL004885 licoisoflavanone 354.38 52.47 0.54 甘草 MOL004891 shinpterocarpin 322.38 80.3 0.73 甘草 MOL004898 (E)-3-[3，4-dihydroxy-5-(3-methylbut -2-enyl)phenyl]-1-(2，4-dihydroxyphenyl) prop-2-en-1-one 340.4 46.27 0.31 甘草 MOL004903 liquiritin 418.43 65.69 0.74 甘草 MOL004904 licopyranocoumarin 384.41 80.36 0.65 甘草 MOL004907 Glyzaglabrin 512.75 34.32 0.55 甘草 MOL004908 Glabridin 324.4 53.25 0.47 甘草 MOL004910 Glabranin 324.4 52.9 0.31 甘草 MOL004911 Glabrene 322.38 46.27 0.44 甘草 MOL004912 Glabrone 336.36 52.51 0.5 甘草 MOL004913 1，3-dihydroxy-9-methoxy-6-benzofurano [3，2-c]chromenone 298.26 48.14 0.43 甘草 MOL004914 1，3-dihydroxy-8，9-dimethoxy-6-benzofurano [3，2-c]chromenone 328.29 62.9 0.53 甘草 MOL004915 Eurycarpin A 338.38 43.28 0.37 甘草 MOL004924 (-)-Medicocarpin 432.46 40.99 0.95 甘草 MOL004935 Sigmoidin-B 356.4 34.88 0.41 甘草 MOL004941 (2R)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl) chroman-4-one 256.27 71.12 0.18 甘草 MOL004945 (2S)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl) -8-(3-methylbut-2-enyl)chroman-4-one 324.4 36.57 0.32 甘草 MOL004948 Isoglycyrol 366.39 44.7 0.84 甘草 MOL004949 Isolicoflavonol 354.38 45.17 0.42 甘草 MOL004957 HMO 268.28 38.37 0.21 甘草 MOL004959 1-Methoxyphaseollidin 354.43 69.98 0.64 甘草 MOL004961 Quercetin der. 330.31 46.45 0.33 甘草 MOL004966 3’-Hydroxy-4’-O-Methylglabridin 354.43 43.71 0.57 甘草 MOL004974 3’-Methoxyglabridin 354.43 46.16 0.57 甘草 MOL004978 2-[(3R)-8，8-dimethyl-3，4-dihydro-2H-pyrano [6，5-f]chromen-3-yl]-5-methoxyphenol 338.43 36.21 0.52 甘草 MOL004980 Inflacoumarin A 322.38 39.71 0.33 甘草 MOL004985 icos-5-enoic acid 310.58 30.7 0.2 甘草 MOL004988 Kanzonol F 420.54 32.47 0.89 甘草 MOL004989 6-prenylated eriodictyol 356.4 39.22 0.41 甘草 MOL004990 7，2’，4’-trihydroxy-5-methoxy -3-arylcoumarin 300.28 83.71 0.27 甘草 MOL004991 7-Acetoxy-2-methylisoflavone 294.32 38.92 0.26 甘草 MOL004993 8-prenylated eriodictyol 356.4 53.79 0.4 甘草 MOL004996 gadelaidic acid 310.58 30.7 0.2 甘草 MOL005000 Gancaonin G 352.41 60.44 0.39 甘草 MOL005001 Gancaonin H 420.49 50.1 0.78 甘草 MOL005003 Licoagrocarpin 338.43 58.81 0.58 甘草 MOL005007 Glyasperins M 368.41 72.67 0.59 甘草 MOL005008 Glycyrrhiza flavonol A 370.38 41.28 0.6 甘草 MOL005012 Licoagroisoflavone 336.36 57.28 0.49 甘草 MOL005016 Odoratin 314.31 49.95 0.3 甘草 MOL005017 Phaseol 336.36 78.77 0.58 甘草 MOL005018 Xambioona 388.49 54.85 0.87 甘草 MOL005020 dehydroglyasperins C 340.4 53.82 0.37 表1. 附子理中汤活性成分 2.2. “溃疡性结肠炎”疾病靶点搜集 以“Ulcerative Colitis”为关键词在在线人类孟德尔遗传数据库OMIM、DisGeNET数据库中进行检索，得到UC相关基因靶标，两个数据库合并、去重得后导入UniProt数据库对靶标进行标准化处理，得到1402靶标基因，OMIM数据库181个，DisGeNET数据库1331个。 2.3. 韦恩图的绘制、药物疾病交集靶点及药物–成分–疾病–靶点网络的构建 将附子理中汤药物成分相关靶点、溃疡性结肠炎疾病相关靶点导入venny2.1.0在线作图工具，共获得STAT3、IL10、SELE、CXCL10、IL6、IL4等107个交集靶点及韦恩图(见图1)；将药物–疾病交集靶点与药物有效成分相互作用关系及属性文件导入Cytoscape3.6.0软件并进行映射，构建药物–成分–靶点–疾病网络图(见图2)。 图1. 附子理中汤–溃疡性结肠炎靶点韦恩图 图2. 药物–成分–靶点–疾病网络 2.4. 蛋白互作网络构建及核心靶点的筛选 将药物–疾病107个交集靶点导入STRING11.0数据库，选择multiple proteins模式，将研究物种设置为人类，最低相互作用阈值设为最高信度0.9 (high confidence)并选择隐藏游离节点，下载TSV数据文件，并将其导入Cytoscape3.6.0软件生成蛋白互作网络PPI，共得到89节点，452条边，蛋白互作网络图节点(node)大小、颜色与Degree成正相关(见图3)。用cytoHubba插件的Degree算法分析筛选综合评分排名前10位的靶点作为附子理中汤治疗溃疡性结肠炎的核心靶点，根据STAT3、JUN、TNF等核心靶点生成核心靶点蛋白互作网络，网络中节点(node)的颜色默认按Degree从高到低，由红色向黄渐变(见图4)。 图3. 蛋白互作网络图(PPI) 图4. 核心靶点蛋白互作网络图 2.5. 基因本体(Gene Ontology， GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)通路富集分析 利用Metascape在线数据库(https://metascape.org/)，将附子理中汤治疗溃疡性结肠炎的交集靶点上传至Metascape，参数设置为Homo species，采用“Custom Analysis”模式进行GO功能分析，共获得生物过程(biological process， BP) 1978个，分子功能(molecular function， MF) 124个，细胞组成(cellular component， CC) 55个，根据−log10 (pvalue)大小，运用R语言分别对前20条通路进行可视化分析(见图5、图6、图7)。根据图5、图6、图7可知附子理中汤治疗溃疡型结肠炎可能参与了炎症反应、对脂多糖的反应、对细菌原分子的反应、活性氧代谢过程、细胞迁移的正调节等生物过程；也参与了细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体调节器活动、受体配体活性、信号受体活化器活性、蛋白质同化、DNA结合转录因子绑定、转录因子绑定、RNA特异性聚合酶IIDNA结合转录因子结合、蛋白质激酶结合等分子功能；还参与了膜筏、微膜区、囊泡腔、分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔、髓鞘等细胞部位的形成。 图5. GO生物过程分析(top 20) 图6. GO分子功能分析(top 20) 图7. GO细胞组分分析(top 20) 通过Metascape进行KEGG信号通路富集分析获得164条信号通路，根据−log10 (pvalue)排序，运用R语言对前20条KEGG通路进行可视化分析(见图8)。靠前的通路有AGE-RACE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、致癌通路(Pathways in cancer)、流体剪应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、白细胞介素信号17通路(IL-17 signaling pathway)、乙型肝炎通路(Hepatitis B)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、丙型肝炎通路(Hepatitis C)、查加斯病(美国锥虫病) (Chagas disease (American trypanosomiasis))、麻疹(Measles)、癌蛋白(Proteoglycans in cancer)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K-Akt)等。表2列出了排名前十的富集通路相关信息 图8. KEGG信号通路富集分析(top 20) Table 2 Information of KEGG signaling pathway (top 10 通路 基因 基因数 P值 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications AKT1， BAX， CCND1， BCL2， CASP3， MAPK14， F3， ICAM1， IL1A， IL1B， IL6， CXCL8， JUN， MMP2， NOS3， SERPINE1， PRKCB， MAPK1， MAPK3， MAPK8， RELA， CCL2， SELE， STAT1， STAT3， TGFB1， TNF， VCAM1， VEGFA 29 9.95E-47 Pathways in cancer AKT1， BAX， CCND1， BCL2， CASP3， CASP8， CASP9， CDKN1A， EGF， EGFR， ERBB2， FOS， GSTP1， HIF1A， HSP90AA1， IKBKB， IL6， CXCL8， JUN， MMP1， MMP2， MMP9， MYC， NFKBIA， NOS2， PPARG， PRKCB， MAPK1， MAPK3， MAPK8， PTEN， PTGS2， RELA， STAT1， STAT3， TGFB1， TP53， VEGFA， RASSF1 39 8.26E-45 Fluid shear stress and atherosclerosis AKT1， BCL2， CALM1， MAPK14， FOS， GSTM1， GSTP1， HMOX1， HSP90AA1， ICAM1， IFNG， IKBKB， IL1A， IL1B， JUN， KDR， MMP2， MMP9， NFE2L2， NOS3， MAPK8， RELA， CCL2， SELE， TNF， TP53， VCAM1， VEGFA 28 3.23E-40 IL-17 signaling pathway CASP3， CASP8， MAPK14， FOS， CXCL2， HSP90AA1， IFNG， IKBKB， IL1B， IL4， IL6， CXCL8， CXCL10， JUN， MMP1， MMP3， MMP9， NFKBIA， MAPK1， MAPK3， MAPK8， PTGS2， RELA， CCL2， TNF 25 6.83E-40 Hepatitis B AKT1， BAX， CCND1， BCL2， CASP3， CASP8， CASP9， CDKN1A， MAPK14， FASN， FOS， IKBKB， IL6， CXCL8， JUN， MMP9， MYC， NFKBIA， PRKCB， MAPK1， MAPK3， MAPK8， PTEN， RELA， STAT1， STAT3， TGFB1， TNF， TP53 29 1.04E-39 TNF signaling pathway AKT1， CASP3， CASP8， MAPK14， FASN， FOS， CXCL2， ICAM1， IKBKB， IL1B， IL6， CXCL10， IRF1， JUN， MMP3， MMP9， NFKBIA， MAPK1， MAPK3， MAPK8， PTGS2， RELA， CCL2， SELE， TNF， VCAM1 26 1.49E-39 Hepatitis C AKT1， BAX， CCND1， CASP3， CASP8， CASP9， CDKN1A， CLDN4， MAPK14， EGF， EGFR， FASN， IFNG， IKBKB， CXCL8， CXCL10， IRF1， MYC， NFKBIA， PPARA， MAPK1， MAPK3， MAPK8， RELA， STAT1， STAT3， TNF， TP53 28 1.79E-38 Chagasdisease (American trypanosomiasis) AKT1， CASP8， MAPK14， FASN， FOS， IFNG， IKBKB， IL1B， IL2， IL6， CXCL8， IL10， JUN， NFKBIA， NOS2， SERPINE1， MAPK1， MAPK3， MAPK8， RELA， CCL2， TGFB1， TNF 23 1.91E-34 Measles AKT1， BAX， CCND1， BCL2， CASP3， CASP8， CASP9， FASN， FOS， IFNG， IKBKB， IL1A， IL1B， IL2， IL4， IL6， JUN， NFKBIA， MAPK8， RELA， STAT1， STAT3， TP53 23 3.07E-30 Proteoglycans in cancer AKT1， CCND1， CASP3， CDKN1A， MAPK14， EGFR， ERBB2， ESR1， FASN， HIF1A， IGF2， IL6， KDR， MMP2， MMP9， MYC， PLAU， PRKCB， MAPK1， MAPK3， STAT3， TGFB1， TNF， TP53， VEGFA 25 3.87E-30 表2. KEGG信号通路信息(top 10)