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user: 3. 结果与分析 3.1. 方法学验证 3.1.1. 线性关系结果分析 经过线性实验，以苍术素标准品(mg/mL)为横坐标，以峰面积(µv×s)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程(图1)，苍术素回归方程为Y = 331352X-99172，R 2 = 0.9999，表明苍术素在进样质量为0.02~0.25 μg之间呈线性关系。 图1. 线性关系回归方程 3.1.2. 精密度结果分析 制备标准品溶液连续进样6次，通过所得谱图结果进行计算。计算RSD值(n = 6)为0.38%，实验结果表明仪器精密度良好，结果可靠。 3.1.3. 重复性结果分析 制备12号北苍术样品6份，设置每次进样量20 μL，连续进样6次，通过计算RSD值(n = 6)为2.43%。实验结果表明实验方法合理，实验结果可靠。 3.1.4. 稳定性结果分析 通过制备样品在24 h内进行上机检测，计算得到RSD值(n = 6)为1.58%，实验结果表明供试品溶液在24 h内进行测定，实验结果稳定，样品没有降解现象，能够保证实验的准确性。 3.1.5. 加样回收率结果分析 制备12号样品并加入1 mg苍术素标准品制备成混合溶液，通过色谱仪进行检测，计算加样回收率为100%，RSD (n = 6)为3.27%。 3.2. 苍术素含量 16个产地北苍术干燥根状茎药用成分苍术素含量如表2所示，色谱结果图如图2，图3所示。 对16份北苍术干燥的根状茎进行检测，参照药典(2015版) [ 6 ] 中对苍术素含量测定方法进行样品制备检测等，药典要求检测结果理论板数按苍术素峰计算不低于5000，苍术素含量不低于0.3%为合格可入药。研究结果得出有11个地点北苍术含量达到入药标准，5个地点的未达入药标准。其中河北滦平邓厂与北京密云交界处北苍术样品含量最高，为1.226%；最低的为北京房山区四马台村，仅有0.011%。 16个北苍术样品苍术素的含量从高到低依次是：河北滦平邓厂与北京密云交界处(1.226%) > 河北丰宁天桥镇(0.925%) > 河北滦平虎什哈金台子村(0.680%) > 内蒙古赤峰(0.596%) > 河北隆化(0.486%) > 北京延庆区(0.474%) > 河北承德(0.396%) > 山西野生(0.363%) > 内蒙野生(0.337%) > 怀柔区北农林场(0.326%) > 门头沟区百花山(0.320%) > 怀柔区孙栅子村(0.298%) > 东北北潮(0.275%) > 东北(0.238%) > 山西人工种植(0.199%) > 房山区四马台村(0.011%)。 研究表明河北省承德市、隆化县、滦平县虎什哈金台子村、丰宁县天桥镇、滦平县邓厂与北京密云区交界处的苍术素含量分别是0.396%、0.486%、0.680%、0.925%及1.226%，都超出了药典(2015版)规定的0.3%。 北京延庆区小河屯、门头沟区百花山自然保护区、怀柔区北农林场、怀柔区孙栅子村、房山区四马台村5个地点的北苍术苍术素的含量分别是：0.474%、0.320%、0.326%、0.298%及0.011%，有2个样品的含量未达到药典标准。 从安国药材市场购买了6个北苍术样品，6个样品分别来自山西(2个)、东北(2个)、内蒙古(2个)。山西的两个样品苍术的含量分别为0.363%和0.199%，东北的两个样品的含量依次为0.238%和0.275%，内蒙古的2个样品苍术素分别为0.337%和0.596%。根据研究结果表明东北的2个样品均未达到药典标准。内蒙古的样品含量都达到了药典的规定。山西野生的样品达到了药典标准，人工种植的3年生样品未达标。 Table 2 Content of atractylin in rhizoma atractylodis from 16 producing area 样品序号 Sample number 进样量(μL) Injection volume 保留时间(min) Retention time 峰面积 Peak area 含量(%) Content S0 20 13.256 6，529，054 S1 20 13.254 1，028，161 0.396 S2 20 13.264 942，307 0.363 S3 20 12.791 617，972 0.238 S4 20 12.784 714，274 0.275 S5 20 13.271 873，973 0.337 S6 20 13.252 517，845 0.199 S7 20 13.247 1，229，308 0.474 S8 20 13.264 829，129 0.320 S9 20 13.244 846，618 0.326 S10 20 13.248 773，160 0.298 S11 20 13.256 28，722 0.011 S12 20 13.252 1，545，229 0.596 S13 20 13.256 1，260，501 0.486 S14 20 13.069 1，762，320 0.680 S15 20 12.935 3，177，195 1.226 S16 20 13.038 2，397，693 0.925 表2. 16个产地北苍术入药成分苍术素含量 注：《中华人民共和国药典》(2015)：按干燥品计算，苍术中含苍术素(C13H10O)不得少于0.30%。 图2. 苍术中苍术素HPLC色谱图(对照品) 图3. 苍术中苍术素HPLC色谱图(样品S1~S16) 3.3. 16个产地北苍术HPLC指纹图谱建立及相似度评价 将苍术素标准品及16个产地北苍术样品数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，相似度是以特征指纹图谱为基础，计算出待鉴药材与标准药材间的相似程度，可以显示二者在特征指纹上的相似性，以苍术素标准品为参照图谱生成对照峰R (图4)，进行多点校正，通过色谱图上重叠峰进行对比，非共有峰占比较大，表明各样品间含量差距明显(图5)。通过将色谱图匹配到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》中通过相似度软件进行计算(表3)，与对照谱图进行比对，北苍术样品相似度在0.202~0.941之间，不同地点谱图之间重叠基本全为非共有峰，结果表明16个产地北苍术样品差异显著。 图4. 北苍术HPLC对照图谱 图5. 16个不同产地北苍术HPLC指纹图谱匹配结果。注：R为对照指纹图谱 Table 3 Similarity calculation results of HPLC spectra of Atractylodes lancea samples from 16 different area S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S1 1 S2 0.982 1 S3 0.458 0.517 1 S4 0.429 0.513 0.867 1 S5 0.888 0.911 0.643 0.747 1 S6 0.700 0.720 0.635 0.647 0.766 1 S7 0.918 0.930 0.571 0.634 0.946 0.804 1 S8 0.927 0.937 0.519 0.584 0.927 0.759 0.958 1 S9 0.937 0.927 0.535 0.516 0.899 0.761 0.964 0.905 1 S10 0.844 0.851 0.581 0.682 0.944 0.783 0.963 0.907 0.928 1 S11 0.191 0.166 0.117 0.091 0.177 0.215 0.149 0.158 0.236 0.158 1 S12 0.893 0.888 0.501 0.610 0.941 0.741 0.952 0.961 0.895 0.942 0.163 1 S13 0.970 0.948 0.493 0.505 0.927 0.703 0.940 0.945 0.943 0.911 0.184 0.951 1 S14 0.499 0.546 0.344 0.387 0.491 0.463 0.540 0.530 0.530 0.468 0.216 0.470 0.484 1 S15 0.390 0.431 0.327 0.355 0.419 0.396 0.441 0.430 0.430 0.408 0.027 0.385 0.394 0.930 1 S16 0.385 0.438 0.358 0.473 0.494 0.452 0.501 0.492 0.492 0.497 0.035 0.468 0.422 0.908 0.971 1 R 0.911 0.914 0.580 0.615 0.935 0.777 0.941 0.932 0.932 0.922 0.202 0.934 0.940 0.678 0.627 0.663 表3. 16个不同产地北苍术样品HPLC图谱相似度计算结果 3.4. 讨论与结论 3.4.1. 生长年限与苍术素含量相关 本研究中人工种植北苍术样品有一年生、三年生和四年生。其中S3 (东北)、S10 (北京怀柔孙栅子村)为一年生，S4、S6为三年生，S7为四年生，从谱图中可以看出没有共有峰，峰谱差异显著，其相似度计算在0.202~0.941之间，并且通过苍术素含量对比，发现差异显著，野生样品生长年限不详，但苍术素含量普遍高于人工种植的样品，其中人工种植四年生样品与野生样品相似度差异不大，可以得出生长年限与苍术素含量有关，建议人工种植4年以上才可收获。 3.4.2. 生长方式与苍术素含量相关 本研究采集的样品有从山上采集的野生样品和人工种植的样品。其中S1、S2、S5、S8、S9、S11、S12、S14、S15、S16等10个样品为野生样品，S3、S4、S11、S6、S7、S10、S13等6个样品为人工种植样品。野生样品除了北京房山区四马台村的含量未达到药典标准外，其它的全部达标；河北省野生样品中苍术素的含量都高，为良好的种源。人工种植的样品中，东北1年生、3年生、山西3年生的、怀柔1年生的均未达标，建议人工种植4年以上方可进入药材市场。高丽等用RE-HPLC法对湖北、四川、安徽、江苏、河南、陕西等17个不同地点的野生苍术和人工种植的苍术进行了苍术素含量的测定，结果表明不同产地苍术素含量差异较明显，种植技术、地理环境与生长年限对苍术素含量有影响 [ 25 ]，这与本研究结果一致。 根据HPLC指纹图谱野生样品相似度在0.580~0.940之间，人工种植品相似度在0.202~0.941之间，样品间基本为非共有峰，差异显著。 3.4.3. 生长地域与苍术素含量相关 本研究收集的16个样品分别来自于河北省(5个)、内蒙古(2个)、北京(5个)、山西省(2个)、东北地区(2个)，根据苍术素含量对比，河北省含量普遍偏高，其次是内蒙赤峰、北京怀柔区、延庆区，东北地区北苍术样品在进行含量测定时均不达标，且相似度较其他地点差异显著，峰谱与其他地点均为非共有峰，差异显著。有文献报道指出药材生长环境不同，温度、湿度和光照会对药用植物成分积累产生较大影响 [ 26 ]，东北地区气候、土壤等环境因子是造成差异显著的主要原因。湖北襄阳保康和河南信阳桐柏县茅苍术的苍术素含量不达标，且不同产地苍术素含量有所差异 [ 25 ]；山西运城县栽培北苍术苍术素含量高达0.93% [ 27 ]；吉林省集安产的北苍术苍术素含量最高为0.80%，白山的最低仅0.22% [ 28 ]，主要原因是生长环境和生长年限不同所致。本研究中河北省5个地方的样品含量高于其它地区，这与生长环境息息相关。河北省承德地区的野生北苍术可以作为优质种源进行种子生产。 3.4.4. 结论 本研究运用高效液相色谱法对16个产地的北苍术入药成分苍术素进行含量测定，建立了16个不同地点北苍术HPLC指纹图谱，结果表明河北滦平邓厂与北京密云交界处的样品含量最高，承德地区的样品中苍术素的含量都高，该地区可作为北苍术种子生产基地及北苍术人工种植的首选地域。建议人工种植时采用块茎繁殖的北苍术至少种植4年以上收获，这样才能保证药效。 目前，北苍术人工种植刚起步，研究时难以收集到生长年限一致的材料，因此材料中主要药用成分苍术素含量的多少是否与生长年限和地域相关，有待深入研究。在本研究中发现产地不同含量差异显著，东北地区、北京地区、承德地区的北苍术含量差异明显，可能与生长气候、土壤等自然环境有关，这也有待于后续研究，以得到更准确的结论。另外，用种子直播种植的与用块茎种植的区别有待以后探究。