system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与讨论 3.1. LGT基因序列比对与功能性分析 将所设计的引子对LGTase1/LGTase2扩增文旦柚、蜜柚LGTase基因，可扩增出长度约为1600 bp (图1)的DNA片段。将LGTase1/LGTase2扩增出的DNA序列与NCBI上的柠檬苦素葡萄糖转移酶mRNA序列进行比对，结果发现序列长度相同，因此可知此基因中并没有内含子(intron)的存在；而后将LGTase1/ LGTase2扩增出的PCR产物使用限制酶Hinc II进行酶切，其共存在两种型态的柠檬苦素葡萄糖转移酶基因，第一型可以被Hinc II作用酶切为四个DNA片段，长度分别为1000 bp、650 bp、600 bp及400 bp，第二型则可以被酶切为长度分别为650 bp和1000 bp的DNA片段，由图1中可以发现仅存在第一型的只有蜜柚，而同时存在此两型的柠檬苦素葡萄糖转移酶基因则为文旦柚。 将文旦柚和蜜柚定序所得柠檬苦素葡萄糖转移酶序列于NCBI数据库与多种柑橘样品(Citrus sinensis ACD14147; Citrus x paradise ACD14144; Citrus maxima ABY27084; Citrus unshiu BAA93039 ; Citrus limettioides ACD14143; Citrus aurantium ACD14146; Citrus cv. Shiranuhi ABL63751)之柠檬苦素葡萄糖转移酶序列进行比对，此段序列相似性达98%~100% (表2)，因此可推论此段序列具高保守性，将其序列转换为胺基酸于motifscan、prosite软件(图2)对其活性位置作预测，由图表结果得知此段序列含有一段44 amion acid UDP-Glycosyltransferase signature (表3，图3)，同时具有启动码ATG与终止码TGA为一段完整开放框架(表1)。未来可将此段序列进行选殖与表现，有助解决加工柑橘果汁时产生苦味问题。 3.2. LGT gene于生长阶段表现量分析 针对文旦柚、蜜柚之lgt，分别对开花至成熟果lgt之表现情形作探讨。由cDNA序列设计两型专一性引子利用实时定量PCR技术进行其表现量测定，由图4可知，引子对扩增出片段大小为208 bp，文旦柚于生长阶段同时具有两型lgt存在，文旦柚第一型基因于开花时期有大量表现，根据文献可推测lgt在植物体对植物花色稳定与生长调节皆十分重要，因此在开花期此基因会大量表现，到了果实生长后其150天后又可看到此基因的表现出现，此结果与前人研究相同，第一型基因于果实生长后期阶段表现，而蜜柚于第一型lgt中是不表现的。于第二型基因表现量测定上文旦柚和蜜柚于此型都同时具有表现能力，并且于生长阶段都一直持续表现，文旦柚虽同时具有两型lgt存在，但表现量却相较于蜜柚低，此结果可推测文旦柚于果实成长后期采收后，也会因lgt表现量不足，而使其果实中仍含有大量苦味化合物存在，导至于加工过程中苦味化合物的生成。 图1. LGT基因PCR扩增后电泳图及Hinc II酶切切位图 图2. Motifs (a)和Prosite (b)两系统lgt功能性区域之预测 Table 2 Amino acid sequence of UDP-Glucosyltransferase Species Sequence GenBank accession number Similarity Citrus grandis (L.) Osbeck var. Wentan WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ 100% Citrus grandis (L.) Osbeck var. Miyu WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ 100% Citrus sinensis WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ ACD14147 100% Citrus x paradisi WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ ACD14144 100% Citrus maxima WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ ABY27084 100% Citrus unshiu WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ BAA93039 100% Citrus limettioides WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ ACD14143 100% Citrus aurantium WSPQEKVLAHPSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ ACD14146 100% Citrus cv. hiranuhi WSPQEKVLSYSSVACFVTHCGWNSTMESLASGVPVITFPQWGDQ ABL63751 98% 表2. 比较UDP-Glucosyltransferases胺基酸序列 Table 3 lgt functional region prediction by Motifscan softwar C. grandis (L.) Osbeck var. Wentan C. grandis (L.) Osbeck var. Miyu ASN_GLYCOSYLATION 343-346 37-40 346-349 CAMP_PHOSPHO_SITE 448-451 CK2_PHOSPHO_SITE 149-152 23-26 199-202 91-94 233-236 147-150 322-325 202-205 344-347 236-239 392-395 325-328 347-350 395-398 MYRISTYL 111-116 4-9 303-308 118-123 378-383 187-192 384-389 306-311 381-386 387-392 PKC_PHOSPHO_SITE 142-144 147-149 149-151 236-238 158-160 436-438 178-180 189-191 233-235 433-435 TYR_PHOSPHO_SITE 113-120 65-72 UDPGT UDP-glycosyltransferases signature. 321-364 324-367 表3. Motifscan分析软件对lgt功能性区域之预测 图3. 文旦柚(a)、蜜柚(b) Glucosyltransferases cDNA序列与胺基酸序列之比对 图4. 利用实时定量系统测定LGT gene type I (a)与type II (b)于开花后不同天数表现量 3.3. LGTase纯化分析 将文旦柚、蜜柚两样品之内果皮部位经粗酵素萃取、35%~75% (NH 4 ) 2 SO 4 硫酸铵沉淀、FPLC HiTrap Q管柱进行三步骤纯化(图5)，以BCA (bicinchoninic acid)定量出纯化蛋白质为0.6、1 mg/ml，并以HPLC分析LGTase作用于受质limonin后产生limonin glucoside的能力换算其酵素活性，HPLC分析条件于0.4 ml/min、207 nm下于13分钟有波峰出现(图6)，经酵素活性换算得文旦柚LGTase纯化产率达41%、51% (表4、表5)，将纯化酵素进行SDS-PAGE (图5(b)、图6(b))电泳分析得分子量大约40 kDa，与软件预测分子量大小相近，同时将纯化后的酵素作其基本特性测定，文旦柚内果皮纯化出LGTase其最适与最稳定pH为7.8与5.5~8.5 (图7)，蜜柚内果皮纯化出LGTase其最适与最稳定pH为7.8与4.5~8.5，文旦柚内果皮纯化出的LGTase最适温度37℃与最稳定温度测得为20℃~40℃ (图8)，蜜柚内果皮纯化出的LGTase最适温度37℃与最稳定温度为20℃~45℃，由结果可知文旦柚与蜜柚纯化出的LGTase基本特性测定上没有太大差异，但又以蜜柚较好之。