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user: 3. 结果与讨论 3.1. 一般描述 本研究涉及的目标文献发表于2001~2018年间，其中，前期(2001~2012)为零星研究阶段，十二年间仅有5篇相关文献；后期(2013~2018)则有持续报道，年均发表文献数量为3篇左右。显然，近5年来不同学者对茶叶或茶汤中有机硒的研究相对较多。这与国家食品安全标准《食品中污染物限量》(GB 2762-2017)取消了硒的限量规定在时间上基本吻合 [ 26 ] 。此外，从研究对象的产地来看，绝大部分的茶叶样品来自于湖北恩施和陕西紫阳，这与两地是我国较早发现的富硒地区且当地气候条件比较适宜茶树生长有着非常密切的联系 [ 27 ] 。 总体来看，我国茶叶总硒和有机硒的含量分别为0.85 ± 1.07 mg kg −1 (0.11~6.54 mg kg −1 ，n = 65)和0.74 ± 0.94 mg kg −1 (0.03~5.54 mg kg −1 ， n = 65)，茶叶中有机硒的比例约占87.6% (表1)。相似地，茶汤总硒和有机硒的含量分别为0.43 ± 0.27 μg/100ml (0.15~0.99 μg/100ml， n = 15)和0.40 ± 0.28 μg/100 ml (0.10~0.96 μg/100ml， n = 15)，茶汤中有机硒的比例约占91.2%。受我国居民饮茶习惯等因素影响，绿茶是本研究中最主要的茶叶种类 [ 28 ] 。比如，目标文献中绿茶的数据记录数为51条(茶叶46条与茶汤5条)，占总数的60%以上(51/80)。此外，红茶、黑茶、绞股蓝茶等也有一定的研究。 3.2. 茶叶中总硒、有机硒的含量特征 3.2.1. 不同种类茶叶总硒、有机硒的含量特征 不同种类的茶叶其含硒水平及有机硒比例存在一定的差异(表1)。无论总硒还是有机硒，各类茶叶含硒水平均为：绞股蓝茶 > 绿茶 > 未知 > 靑茶 > 藤茶 > 红茶。其中，绿茶和绞股蓝茶中有机硒的含量相对较高(约为0.85 mg kg −1 )，而红茶中有机硒的含量最低(仅为0.34 ± 0.23 mg kg −1 ，n = 8)，前者约为后者的2.5倍。不过，各类茶叶中有机硒的比例则为：靑茶 > 红茶 > 未知 > 绿茶 > 藤茶 > 绞股蓝茶。这一结果明显与茶叶总硒及有机硒含量的排序不同。除数量较少的靑茶、藤茶和绞股蓝茶外，红茶有机硒的比例(92.0 ± 6.3%， n = 8)最高，它比绿茶(85.2 ± 13.0%， n = 46)平均高6.8个百分点。进一步的方差分析表明：总硒含量、有机硒含量及有机硒比例的F值分别为0.490、0.463和0.817(对应的P值分别为0.782、0.803和0.543)，说明不同茶叶种类之间的差异均未达到显著性水平(P > 0.05)。 Table 1 Contents of total Se， organic Se and its proportions in different types of te 种类Type 极小值Min. 极大值Max. 均值Average 标准差SD n 总硒含量/mg kg −1 Total Se 绿茶 0.11 6.54 0.96 1.23 46 红茶 0.17 0.95 0.38 0.26 8 绞股蓝茶 0.48 1.73 1.11 0.88 2 靑茶 0.56 0.56 0.56 - 1 藤茶 0.48 0.48 0.48 - 1 未知 0.19 1.54 0.67 0.45 7 总体 0.11 6.54 0.85 1.07 65 有机硒含量/mg kg −1 Organic Se 绿茶 0.03 5.54 0.84 1.08 46 红茶 0.15 0.86 0.34 0.23 8 绞股蓝茶 0.42 1.29 0.86 0.62 2 靑茶 0.55 0.55 0.55 - 1 藤茶 0.41 0.41 0.41 - 1 未知 0.17 1.27 0.59 0.37 7 总体 0.03 5.54 0.74 0.94 65 有机硒比例/% Percent of organic Se 绿茶 27.3 98.7 85.2 13.0 46 红茶 77.9 97.7 92.0 6.3 8 绞股蓝茶 74.8 87.6 81.2 9.1 2 靑茶 98.0 98.0 98.0 - 1 藤茶 84.0 84.0 84.0 - 1 未知 82.6 95.6 88.8 4.0 7 总体 27.3 98.7 86.5 11.6 65 表1. 不同种类茶叶的总硒含量、有机硒含量及其比例 注：“未知”表示文献中无法获知具体的茶叶种类；“-”表示无值。 3.2.2. 不同产地茶叶总硒、有机硒的含量特征 如表2所示，不同产地茶叶的总硒含量依次为：产地不详(0.96 ± 1.68 mg kg −1 ，n = 15)>湖北恩施(0.88 ± 0.90 mg kg −1 ， n = 42) > 安徽天方(0.53 ± 0.02 mg kg −1 ， n = 3) > 陕西紫阳(0.47 ± 0.44 mg kg −1 ， n = 2) > 湖南保靖(0.41 ± 0.11 mg kg −11 ， n = 3)。相似地，不同产地的茶叶有机硒含量依次为：湖北恩施(0.79 ± 0.81 mg kg −1 ， n = 42) ≈ 产地不详(0.79 ± 1.41 mg kg −1 ， n = 15) > 安徽天方(0.45 ± 0.01 mg kg −1 ，n = 3) > 陕西紫阳(0.38 ± 0.32 mg kg −1 ， n = 2) > 湖南保靖(0.36 ± 0.08 mg kg −1 ， n = 3)。可见，无论总硒或有机硒，湖北恩施茶叶的含硒水平均高于其它产地。 对于有机硒的比例来说，仍然是湖北恩施的茶叶最高，为90.6 ± 6.7% (n = 42)，而产地不详的茶叶有机硒比例最低，仅为75.7 ± 16.9% (n = 15)。除此之外，其它产区的茶叶有机硒比例均在80%~90%范围内波动。方差分析的结果也表明：除了湖北恩施的茶叶有机硒比例显著高于产地不详的茶叶外(P < 0.05)，其它各产地茶叶之间并无明显差异(P > 0.05)。 Table 2 Contents of total Se， organic Se and its proportions in different areas of Chin 产地 Area 变量 Variable 总硒含量/mg kg −1 Total Se 有机硒含量/mg kg −1 Organic Se 有机硒比例/% Percent of organic Se 均值 0.53 0.45 83.7 安徽天方 标准差 0.02 0.01 2.9 (n = 3) 极小值 0.52 0.44 80.5 Tianfang， Anhui 极大值 0.55 0.46 86.2 均值 0.88 0.79 90.6 湖北恩施 标准差 0.90 0.81 6.7 (n = 42) 极小值 0.16 0.15 66.0 Enshi， Hubei 极大值 4.34 3.87 98.7 均值 0.41 0.36 87.9 湖南保靖 标准差 0.11 0.08 7.6 (n = 3) 极小值 0.29 0.27 79.2 Baojing， Hunan 极大值 0.48 0.43 93.1 均值 0.47 0.38 83.7 陕西紫阳 标准差 0.44 0.32 9.6 (n = 2) 极小值 0.16 0.15 76.9 Ziyang， Shaanxi 极大值 0.78 0.6 90.5 均值 0.96 0.79 75.7 不详 标准差 1.68 1.41 16.9 (n = 15) 极小值 0.11 0.03 27.3 Unknown 极大值 6.54 5.54 91.1 表2. 不同产地茶叶的总硒含量、有机硒含量及其比例 3.2.3. 不同提取测定方式茶叶有机硒的含量与比例 差减法是目前最常用的茶叶有机硒含量测定方法，即分别测定茶叶的总硒和无机硒含量，然后，以总硒减去无机硒得到(本文称为“间接法”)。也有报道中采用透析袋法 [ 3 ] [ 17 ] 或不同种类有机硒加和法 [ 18 ] 进行有机硒的测定(本文称为“直接法”)。统计结果表明，通过直接法和间接法测定的茶叶有机硒含量为0.49 ± 0.08 mg kg −1 (n = 4)和0.76 ± 0.97 mg kg −1 (n = 61)，分别占总硒含量(0.60 ± 0.12 mg kg −1 和0.86 ± 1.11 mg kg −1 )的82.0%和86.8%。由此可知，直接法获取的茶叶有机硒比例约比间接法低5个百分点。 透析袋可以直接用于茶叶等物质中的有机硒和无机硒分离，不过，其分离效果与透析袋的截留分子量大小关系非常密切。比如，截留分子量为100Da时只能将富硒酵母中绝大部分的有机硒(主要是硒蛋白等大分子)留在袋内 [ 3 ] 。通过茶叶中硒蛋白、硒多糖和硒核酸等含量测定求和的方法也可计算茶叶有机硒比例。如谢娟平(2016) [ 18 ] 采用此法测得茶叶有机硒的比例不到80% (仅为76.9%)，说明除了硒蛋白、硒多糖等大分子外，茶叶中的少部分有机硒还可能以硒氨基酸等其它小分子形式存在。更为确凿的证据是，高柱等(2014) [ 17 ] 同时采用了透析袋法和加和法来考察茶叶中有机硒的比例，发现加和法得到的有机硒比例约为透析袋法的83.7 ± 3.4% (81.5%~87.6%， n = 3)。 而间接法则大多采用超纯水 [ 19 ] 或一定比例的稀盐酸 [ 29 ] 来浸提并测定茶叶中的无机硒，然后，以总硒减去无机硒含量得到有机硒的含量。若茶叶中天然存在或在一定条件下可水解产生少部分小分子含硒氨基酸等物质，则很可能造成对茶叶有机硒含量或比例的低估。田鄂等(2014) [ 19 ] 使用环己烷对水提无机硒溶液连续萃取3次，减少了小分子有机硒对无机硒测定结果的干扰，得到茶叶有机硒的比例约为94.2%。这一数值明显高于我国天然茶叶中有机硒的比例(86.5 ± 11.6%， n = 65) (表1)。综上所述，若直接法(如透析袋法)对易流失含硒有机小分子物质考虑不周将造成对茶叶有机硒含量的低估，而间接法特别是较强浸提液(如1:1盐酸溶液，v/v)提取无机硒时也很容易将少部分可溶性有机硒当作无机硒来看待，从而也造成一定的低估。因此，除浸泡温度、时间、次数等浸提条件外 [ 18 ] ，提取测定方式对茶叶有机硒含量的影响也不容忽视。 3.3. 茶叶总硒与有机硒之间的相关关系 我国天然茶叶有机硒的含量随总硒含量升高而升高，两者的相关系数高达0.996 (n = 65)。根据线性拟合方程(y = 0.8687x + 0.0062， n = 65)可知推断，茶叶总硒每升高100 mg kg −1 ，有机硒的含量平均能增加86.87 mg kg −1 (图2，P < 0.05)。然而，茶叶有机硒比例与总硒之间的关系却并非如此。如图3 (P < 0.05)所示，有7个茶叶样品有机硒的比例低于75%，其中，<50%、50%~60%、60%~70%和70%~75%的样本数分别为1、1、2和3。除此之外，其它茶叶(58/65)有机硒的比例高达89.5 ± 6.0% (n = 58)。总体上，我国天然茶叶有机硒的比例随茶叶总硒含量的升高略有增加(y = 0.0083x + 08578， n = 65)。 3.4. 茶汤中有机硒的比例及其与茶叶总硒的关系 茶汤中有机硒的含量范围为0.10~0.59 μg/100ml (n = 15)，其占总硒(0.16~0.62 μg/100ml， n = 15)的比例为64.7%~100.0%。总体上，茶汤有机硒的含量随茶叶总硒含量的升高而增加，两者呈显著的正相关关系(r = 0.996， n = 15， P < 0.05)；而茶汤中有机硒的比例虽然也随茶叶总硒含量的升高而增加，但两者之间的相关性明显减弱，相关系数仅为0.489 (n = 15)。且不同产地、不同种类茶叶浸出液的硒含量并无明显差异(P > 0.05)。 不同产地、种类及是否天然富硒茶汤总硒含量、有机硒含量及其比例如表3所示。茶汤有机硒研究的茶叶全部来自陕西紫阳(n = 10)和湖北恩施(n = 5)两地，且前者有机硒的含量和比例均明显高于后者(P < 0.05)。与数量较少的红茶、绞股蓝茶、靑茶、黑茶、花茶等其它茶叶种类(n = 9)相比，绿茶(n = 6)茶汤中的总硒含量、有机硒含量及其比例均无明显差异(P > 0.05)。然而，天然富硒茶叶(n = 11)泡制的茶汤中其总硒含量、有机硒含量及其比例均显著高于非富硒茶叶(n = 4) (P < 0.05)。 图2. 天然茶叶中有机硒与总硒含量之间的关系 图3. 天然茶叶中有机硒比例与总硒含量之间的关系 Table 3 Contents of total Se， organic Se and its proportion in tea soup 分类Classification 名称Name 总硒含量/mg kg −1 Total Se 有机硒含量/mg kg −1 Organic Se 有机硒比例/% Percent of organic Se n 产地Area 陕西紫阳 0.53 ± 0.28* 0.51 ± 0.27* 95.7% ± 2.6%* 10 湖北恩施 0.24 ± 0.11 0.18 ± 0.10 71.7% ± 6.1% 5 种类Type 绿茶 0.45 ± 0.13 0.40 ± 0.14 87.7% ± 9.8% 6 其它 0.43 ± 0.35 0.39 ± 0.35 87.6% ± 14.4% 9 天然富硒Natural Se-enriched 是 0.52 ± 0.27* 0.49 ± 0.27* 94.2% ± 5.6%* 11 否 0.19 ± 0.03 0.14 ± 0.03 69.8% ± 5.2% 4 表3. 茶汤中的总硒含量、有机硒含量及其比例 注：*表示组间差异0.05显著水平。 3.5. 天然茶叶硒的质量标准划分 按照总硒含量并结合茶叶样本量的分布共分为五组，即V级(<0.20 mg kg −1 )、IV级(0.20 ~ 0.40 mg kg −1 )、III级(0.40 ~ 0.60 mg kg −1 )、II级(0.60 ~ 1.00 mg kg −1 )和I级(>1.00 mg kg −1 ) (表4)。统计结果表明：随总硒含量的升高，茶叶有机硒的含量逐步升高，而茶叶有机硒的比例则呈先升高(从74.8%到88.4%)然后逐步趋于稳定(为88%左右)的变化规律(表4)。总体来看，全部天然茶叶中仅有4个样品的有机硒比例低于70% (分别为27.3%、53.8%、63.6%和66.0%)，而绝大部分茶汤样品中有机硒的比例均超过了70% (来自于湖北恩施的1个黑茶和1个靑茶茶汤有机硒比例分别为64.7%和66.6%)。考虑到茶叶或茶汤有机硒提取测定(直接法或间接法)时均有对结果低估的可能，本研究初步提出以茶叶总硒含量(分为5级)、茶叶有机硒比例(≥70%)及茶汤有机硒比例(≥70%)作为我国天然茶叶中硒的质量划分标准。 早在2005年，我国《食品中污染物限量》(GB 2762-2005) [ 30 ] 就限定粮食类食物硒的含量不得超过0.3 mg kg −1 ，但是，这一标准并没有对茶叶硒含量上限进行约束。近年来，为了促进和适应我国富硒产品的开发和富硒产业的发展，新版的《食品中污染物限量》(GB 2762-2012、GB 2762-2017) [ 23 ] [ 26 ] 则取消了食物中硒的限量指标。关于富硒茶，我国供销合作行业标准(GH/T1090-2014) [ 22 ] 中规定其硒含量范围为0.2~0.4 mg kg −1 ，这一标准值明显低于我国茶叶总硒水平(0.85 ± 1.07 mg kg −1 ， n = 65)，也不利于我国富硒茶产业的发展及富硒茶产品的开发。虽然我国富硒茶农业标准(NY/T 600-2002) [ 31 ] 规定茶叶中硒含量应为0.25~4.00 mg kg −1 ，但是，这一范围由于过于宽泛并不利于分级管理。因此，很有必要探讨一下我国富硒茶的质量标准。 天然富硒茶叶是天然茶叶最重要的组成部分，当然，其质量标准自然应更为严苛。为此，本研究参照上述有关硒国家标准值(包括上限值和下限值)及我国茶叶中硒的含量特征，将天然富硒茶分为三组，即III级(0.40~0.60 mg kg −1 )、II级(0.60~1.00 mg kg −1 )和I级(1.00~4.00 mg kg −1 )。同时，根据茶叶和茶汤中硒的组成情况提出我国天然富硒茶中有机硒的比例应不低于80%。最新调查发现，我国消费者每日茶叶(以绿茶为准)的消费量一般为3~5 g [ 28 ] ，且在最佳冲泡条件下(水温95℃、时间3 min、冲泡2次)茶叶硒的浸出率通常可以达到30%以上 [ 18 ] 。也有报道称天然富硒茶汤中硒的浸提率为8.3%~50% [ 20 ] 。这样，假定正常成年人每天消费5 g天然富硒茶叶、茶叶硒的浸出率为30%，则人体硒的摄入量为0.6~6.0 μg d −1 ，占中国居民膳食硒推荐摄入量(60 μg d −1 ) [ 32 ] 的0.1%~10%。由表4可知，随着茶叶总硒含量的升高其有机硒的比例逐步趋于稳定甚至会略有降低，这就意味着茶叶总硒含量越高，人体摄入的无机硒的量也会越多。一般来说，人体有机硒的摄入相对安全，而无机硒的大量摄入则具有一定的潜在健康危害 [ 33 ] 。所以，对天然富硒茶，除了总硒含量外，有机硒的比例必然是一个关键的质量指标。 Table 4 Classification of Se quality standard for the natural tea and its statistical result 级别 Grade 总硒范围 Range of total Se 总硒均值/mg kg −1 Average of total Se 有机硒均值/mg kg −1 Average of organic Se 有机硒比例/% Percent of organic Se n V <0.20 0.153 0.120 74.8 8 IV [0.20~0.40) 0.291 0.256 88.0 14 III [0.40~0.60) 0.499 0.441 88.4 18 II [0.60~1.00) 0.755 0.664 87.7 12 I ≥1.00 2.447 2.143 88.2 13 表4. 天然茶叶硒的质量标准划分及其统计结果