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user: 3. 结果 3.1. 逍遥散和柴胡疏肝散活性成分和靶点筛选 通过TCMSP、BATMAN-TCM数据库检索，结合文献查找逍遥散和柴胡疏肝散各自的组分、单味药材的活性成分及对应靶点，删去重复值。结果显示，逍遥散的活性成分有75个、对应的基因靶点有1960个，柴胡舒肝散的活性成分、对应的基因靶点有138个、1548个。两个药方中共有的单味药有柴胡和白芍。两个不同的药方如果有相同的成分和共有靶点与疾病相作用，即可达到“同病异治”的效果，即治疗同一种疾病。同时药方因为组分不同，其特有靶点也可能是抑郁症的潜在作用靶点。 3.2. 抑郁症相关靶点 将疾病数据库所得到的抑郁症相关靶点与GEO数据库GSE94988基因芯片数据及分析得出的差异基因合并，得到需要分析的总的抑郁症靶点集合，去除重复基因靶点。在NCBI-GEO中搜索GSE94988经过GEO2R分析下载原始数据，然后经P < 0.05，log 2 FC < −2或log 2 FC > 2筛选，排除无对应基因名的基因，得到128个差异基因，并绘制火山图。再通过PharmGKB，DrugBank，OMIM，TTD，GeneCards五个疾病数据库的关键词检索，去除重复值，收集整合出抑郁症靶点共1538个。使用R语言软件绘制火山图(见图1)，其中log 2 FC > 2且P值<0.05的基因为抑郁症患者体内表达上调的基因，图中呈现为红色，共62个；log 2 FC < −2且P值<0.05的基因呈现绿色，共66个；P值>0.05，无显著性差异，即无统计学意义的基因呈现为黑点。将筛选得到的差异基因绘制热图(见图2)。 图1. GSE94988基因芯片数据集差异基因火山图 图2. 差异基因热图 3.3. 逍遥散–柴胡疏肝散–抑郁症共有靶点 将逍遥散和柴胡疏肝散基因靶点数据导入到Calculateand draw custom Venn diagrams (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线统计分析平台，得到逍遥散—柴胡疏肝散共有靶点和特有靶点。 使用Venny 2.1. (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线画图软件绘制逍遥散–柴胡疏肝散–抑郁症共有靶点的维恩图，见图3，得到交集265个，说明药物共有活性成分与抑郁症有关的靶点有265个，即两个药方治疗抑郁症的潜在靶点，整理得到基因靶点具体信息。 图3. 逍遥散–柴胡疏肝散–抑郁症共同靶点 3.4. 药物活性成分–疾病靶点互作网络及拓扑和模块分析 运用Cytoscape3.8.0软件中的Tools-Network Analyzer来进行拓扑分析，通过大小、颜色、网络边数密集程度差异可视化评价逍遥散和柴胡疏肝散的潜在抗抑郁靶点。在Cytoscape中分别导入逍遥散、柴胡疏肝散活性成分及靶点(见图4及图5)；两者共有或特有的活性成分及靶点作图(见图6)。根据Degree大小分别得到度值前十的拓扑分析，逍遥散潜在靶点的拓扑分析(见表1)；柴胡疏肝散潜在靶点拓扑分析(见表2)；同病异治潜在靶点的拓扑分析(见表4)。表3为逍遥散和柴胡疏肝散特有和共有活性成分相关信息。在拓扑分析中，一个节点的介度(Degree)越大就提示着这个节点的度中心性越高，该节点即靶点，在网络中就越重要，该是在网络分析中反应节点重要性的最直接指标。 图4. 逍遥散活性成分–靶点蛋白质互作网络 图5. 柴胡疏肝散活性成分–靶点蛋白质互作网络 图6. 逍遥散、柴胡舒肝散共有或特有化学成分–抑郁症靶点互作网络 Table 1 Topological analysis of potential targets of Xiaoyao powder (top 10 序号 基因靶点 平均最短路径 介度 (Degree) 中介中心性(Betweenness) 中心接近度(Closeness) 1 PTGS2 1.987096774 25 0.089986305 0.503246753 2 NCOA2 2.225806452 24 0.054429305 0.449275362 3 PTGS1 2.032258065 20 0.06686081 0.492063492 4 HSP90-1 2.264516129 14 0.02572542 0.441595442 5 PGR 2.95483871 14 0.030302125 0.338427948 6 PRKACA 2.238709677 12 0.02453043 0.446685879 7 GABRA1 2.438709677 11 0.015266549 0.41005291 8 PRSS1 2.522580645 10 0.0102497 0.396419437 9 PIK3CG 2.296774194 10 0.019280335 0.435393258 10 AR 2.387096774 10 0.02106464 0.418918919 表1. 逍遥散潜在靶点(介度前十)的拓扑分析 Table 2 Topological analysis of potential targets of ChaihuShugan powder (top 10 序号 基因靶点 平均最短路径 介度 (Degree) 中介中心性(Betweenness) 中心接近度(Closeness) 1 PTGS2 1.7825 116 0.10397894 0.56100982 2 HSP90-1 1.9775 88 0.05435557 0.505689 3 CALM 2.5725 86 0.01755302 0.38872692 4 ESR1 2.6375 83 0.01884549 0.37914692 5 PPARG 2.0825 82 0.03461861 0.48019208 6 AR 2.1575 78 0.02834164 0.46349942 7 NOS2 2.6425 77 0.01162611 0.37842952 8 NCOA2 2.1725 75 0.04955221 0.46029919 9 PTGS1 2.0425 69 0.04661656 0.48959608 10 PRSS1 2.2225 68 0.02513472 0.44994376 表2. 柴胡疏肝散潜在靶点(介度前十)的拓扑分析 Table 3 Unique and common active ingredients of Xiaoyao powder and ChaihuShugan powde Molecule ID 化学成分 Type MOL004624 Longikaurin A A MOL004653 (+)-Anomalin A MOL000490 petunidin A MOL004598 3，5，6，7-tetramethoxy-2-(3，4，5-trimethoxyphenyl)chromone A MOL004609 Areapillin A MOL000492 (+)-catechin A MOL001689 acacetin A MOL000471 aloe-emodin A MOL001645 Linoleyl acetate B MOL005815 Citromitin B MOL002157 wallichilide B MOL004071 Hyndarin B MOL000392 formononetin B MOL000449 Stigmasterol C MOL000354 isorhamnetin C MOL000422 kaempferol C MOL000098 quercetin C MOL004328 naringenin C MOL000358 beta-sitosterol C MOL000006 luteolin C MOL001924 paeoniflorin C MOL002776 Baicalin C 表3. 逍遥散和柴胡疏肝散特有和共有活性成分 A：TCMSP数据库中逍遥散特有活性成分Molecule ID；B：TCMSP数据库中柴胡疏肝散特有活性成分Molecule ID；C：TCMSP数据库中逍遥散–柴胡疏肝散共有活性成分Molecule ID。 A: Molecule IDs of the unique active ingredients of Xiaoyao Powder in TCMSP database; B: Molecule IDs of the unique active ingredients of ChaihuShugan powder in TCMSP database; C: Molecule IDs of the common active ingredient of Xiaoyao Powder and ChaihuShugan powder in TCMSP database. Table 4 Topological analysis of potential targets for treatment of the same diseas 序号 基因靶点 平均最短路径 介度 (Degree) 中介中心性(Betweenness) 中心接近度(Closeness) 1 MAPK14 3.348484848 3 0.026941406 0.298642534 2 NOS3 3.106060606 3 0.036404751 0.32195122 3 TOP2A 3.106060606 3 0.045807392 0.32195122 4 PTGS1 3.5 2 0.040746112 0.285714286 5 PTGS2 3.5 2 0.040746112 0.285714286 6 NCOA2 3.651515152 2 0.037306 0.273858921 7 PTPN1 3.696969697 2 0.012528429 0.270491803 8 GABRA1 3.590909091 2 0.011088591 0.278481013 9 ESR2 3.590909091 2 0.011088591 0.278481013 10 AR 3.5 2 0.005657166 0.285714286 表4. 同病异治潜在靶点的拓扑分析 使用Cytoscape中Tools-Network Analyzer可以依托Degree值评价网络，通过数值比较更好地展现药材活性成分、靶点与抑郁症靶点的关系。Degree值越大，在图中显示出的形状越大，则该物质在网络中越重要。由于TCMSP数据库中不含有炙甘草这一单味药的化学成分和靶点，因此在使用Cytoscape绘制网络时采用了BATMAN-TCM中的炙甘草相关化学成分和靶点，进入TCMSP中通过搜索chemicalname找到对应Molecule ID，以方便可视化绘制PPI。 由网络图和表中的拓扑分析可得，度值前十的逍遥散抗抑郁的潜在靶点有：PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90-1、PGR、PRKACA、GABRA1、PRSS1、PIK3CG、AR，(见表1)；柴胡疏肝散抗抑郁的潜在靶点有：PTGS2、HSP90-1、CALM、ESR1、PPARG、AR、NOS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1，(见表2)；两者共同抗抑郁潜在靶点有MAPK14、NOS3、TOP2A、PTGS1、PTGS2、NCOA2、PTPN1、GABRA1、ESR2、AR (见表4)。综上，MAPK14、NOS3、TOP2A、PTGS1、PTGS2、NCOA2、PTPN1、GABRA1、ESR2、AR、HSP90-1、PRSS1这12个基因靶点都是两个方剂共同抗抑郁的潜在靶点。由图6可以得到逍遥散和柴胡疏肝散的共有活性成分MOL000422：山柰酚(kaempferol)和MOL000098：槲皮苷(quercetin)在网络图中因Degree值较高而展现出显著差异，这提示山柰酚和槲皮苷可以用以治疗抑郁症。 3.5. 蛋白质互作网络(PPI)分析 PPI是由蛋白质通过彼此相互作用构成。它用于参加基因表达调控、信息转导等重要生命活动，通过PPI网络的分析能够了解蛋白质之间的功能关系。运用String11.0在线工具，分别导入两药–疾病共有靶点，以及两药特有靶点–抑郁症靶点。在两药-疾病共有靶点的互作网络中(如图7)，有265个节点，4564条边；在逍遥散特有靶点–抑郁症靶点互作网络中(如图8)，有65个节点，123条边；在柴胡疏肝 图7. 逍遥散–柴胡疏肝散–抑郁症共有靶点蛋白质相互作用网络 图8. 逍遥散特有靶点–抑郁症蛋白质互作网络 散特有靶点–抑郁症互作网络中(如图9)，有9个节点，5条边。在PPI中，节点代表靶点，边数可以直接反映蛋白质之间的相关性，即边越多的节点指示该节点在网络作用中起枢纽作用。 图9. 柴胡疏肝散特有靶点–抑郁症蛋白质互作网络 将String分析后的逍遥散和柴胡疏肝散特有靶点分别导入Cytoscape中，经过度值分析，得到逍遥散特有抗抑郁靶点中度值较大的有：GLUL、CREB1、GAD1、SLC6A1、GAD2、DAO、ADCY5、PPP1R1B、CRHR1、SLC1A2，柴胡疏肝散特有抗抑郁靶点中度值较大的有：ALB。 采用Cytoscape-ClusterViz进行模块分析，选择MCODE算法对两药–疾病共有靶点进行聚类分析 [ 17 ]，设置默认值参数NodeScore Threshold = 0.2，K-Core Threshold = 4。K-Core是决定识别模块大小的参数，即获得的模块所对应的边应大于2。如表5所示，得到6个模块，每个模块的基因数目分别为43，34，38，24，7，17。将模块对应的基因列表导入DAVIID中进行KEGG通路分析，得到相关通路。发现不同模块间存在相同通路，如Prostate cancer， Basal cell carcinoma， Pathways in cancer， Estrogen signaling pathway， cAMP signaling pathway， Calcium signaling pathway等。 Table 5 Common targets module analysi Cluster 模块 Score 通路 1 36.476 Pathways in cancer， Transcriptional misregulation in cancer， Calcium signaling pathway， MAPK signalingpathway， Signaling pathways regulating pluripotencyof stemcells， Small cell lung cancer， Prostate cancer， HIF-1 signaling pathway， Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)， Endometrial cancer， Basal cell carcinoma， Non-small cell lung cancer 2 12.667 Dopaminergic synapse， Neuroactive ligand-receptor interaction， Tyrosine metabolism， Basal cell carcinoma， Serotonergic synapse， Cocaine addiction， cAMP signaling pathway， Phenylalanine metabolism， Signaling pathways regulating， cGMP-PKG signaling pathway， Alcoholism， Tryptophan metabolism， Endometrial cancer， Pathways in cancer， Hippo signaling pathway， Colorectal cancer， Amphetamine addiction， Prostate cancer， Focal adhesion， Rap1 signaling pathway， Estrogen signaling pathway， Melanogenesis， Thyroid hormone signaling pathway， HTLV-I infection， Sphingolipid signaling pathway， Histidine metabolism 3 11.189 Nicotine addiction， Amphetamine addiction， Cocaine addiction， Glutamatergic synapse， cAMP signaling pathway， Neuroactive ligand-receptor interaction， Circadian entrainment， Alcoholism， Dopaminergic synapse， Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) ， Calcium signaling pathway， Long-term potentiation， Rap1 signaling pathway， Ras signaling pathway， Retrograde endocannabinoid signaling， Long-term depression， Alzheimer’s disease， Serotonergic synapse， Central carbon metabolism in cancer， Pathways in cancer， ErbB signaling pathway 4 9.739 Neuroactive ligand-receptor interaction， Calcium signaling pathway， Inflammatory mediator regulation of TRP channels， Serotonergic synapse， Cholinergic synapse， cAMP signaling pathway， Vascular smooth muscle contraction， Adrenergic signaling in cardiomyocytes， Salivary secretion， Estrogen signaling pathway， Chagas disease (American trypanosomiasis)， Amoebiasis， Glutamatergic synapse， Platelet activation， Oxytocin signaling pathway， cGMP-PKG signaling pathway 5 7 Neuroactive ligand-receptor interaction， Calcium signaling pathway， Gap junction， Inflammatory mediator regulation of TRP channels， Serotonergic synapse， Cholinergic synapse， cAMP signaling pathway， Vascular smooth muscle contraction， Adrenergic signaling in cardiomyocytes， Salivary secretion， Estrogen signaling pathway， Chagas disease， Amoebiasis， Glutamatergic synapse， Platelet activation， Oxytocin signaling pathway， cGMP-PKG signaling pathway 6 6.375 Neuroactive ligand-receptor interaction， Morphineaddiction， Nicotine addiction， Retrogradeendocannabinoid signaling， Dopaminergic synapse， GABAergic synapse， Calcium signaling pathway， cAMP signaling pathway， Serotonergic synapse， Amphetamine addiction， Cocaine addiction， Glutamatergic synapse 表5. 共有靶点模块分析 3.6. 潜在靶点GO和KEGG分析 DAVID6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)是一个生物信息学常用的数据库，用以给基因或蛋白列表提供系统的生物功能注释生物学信息。将共有靶点导入DAVID中，利用R Studio作BP、CC、MF、KEGG气泡图。根据气泡图中的气泡大小和颜色可以得到在该项目中的富集程度，即气泡大小代表该项目下的靶点数，而气泡颜色的变化代表-log10 (P Value)的变化，气泡越大，颜色越深，则该项目在此通路或位置上富集程度越大，有十分重要的作用。两种药方——疾病共有靶点将成为逍遥散和柴胡疏肝散“同病异治”抑郁症的潜在抗抑郁靶点。GO和KEGG分析显示，生物过程(BP)共有52条富集结果，细胞组成(CC) 12条、分子功能(MF) 19条以及KEGG通路6条。结果指示两种方剂共同抗抑郁的生物进程主要体现在调亡过程负调控(negative regulation of apoptotic process)，GTP酶活性的正调控(positive regulation of GTPase activity)，基因表达正调控(positive regulation of gene expression) (见图10)；细胞组成主要体现在细胞外(见图11)；分子功能则集中在血红素结合(heme binding)，血红素结合铁离子(iron ion binding)以及氧结合(oxygen binding) (见图12)；通路集中在癌症中的通路(pathway in cancer)，转录调控失调(transcriptional misregulation in cancer)，钙信号通路(calcium signaling pathway)，MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)，调节干细胞多能性的信号通路(signaling pathway regulating pluripotency of stem cells) (见图13)。其中在前期我们的研究中 [ 18 ]，发现钙信号通路与抑郁症发病有关的结论是切合的，这个通路也已经被多人证实与抑郁症有关 [ 19 ]。本研究的结果提示可能抑郁症也与癌症和转录失调有关。同时将特有靶点导入DAVID中得到特有靶点的抗抑郁通路。逍遥散特有抗抑郁通路主要集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine， aspartate and glutamate metabolism)，GABA能突触(GABAergic synapse)，谷氨酸能突触(glutamatergic synapse)等通路上。而柴胡疏肝散的特有抗抑郁靶点ALB即白蛋白，这也指示了白蛋白可能在正常和抑郁症患者中有差异。 图10. 共有靶点BP富集分析气泡图 图11. 共有靶点CC富集分析气泡 图12. 共有靶点MF富集分析气泡图 图13. 共有靶点KEGG通路分析气泡图