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user: 3. 方法与结果 3.1. 五指毛桃复方制剂中补骨脂素提取工艺 五指毛桃、玉竹、桑叶和罗汉果分别净选、除杂，按照配比混合，粉碎。过孔径0.12 mm筛网，粉碎过程中物料温度不超过35℃ ± 5℃；加入体积为原料总重量一定倍数的水，混合调浆(即将固水混合物搅拌成均匀的混悬液)；将混悬液转移至连续式提取分离浓缩器中在一定温度、压力下进行连续提取，提取过程中同时在连续式提取分离浓缩器配套的高压均质机中匀浆化；提取结束后，固液混合物离心沉降；提取液经过滤芯孔径为500 nm的陶瓷膜进行微滤；滤液通过反渗透膜进行反渗透浓缩至波美度10，得到浓缩液；将浓缩液转移至喷雾干燥机中进行喷雾干燥，即得。 3.2. 色谱条件 C18 (2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)色谱柱；流动相为水(A)-甲醇(B)，按表1所示洗脱程序进行梯度洗脱，流速0.4 ml/min，柱温35℃，进样量10 μL，检测波长245 nm。 Table 1 Gradient eluted progra 时间 A% (v/v) B% (v/v) 初始 85 15 10 85 15 25 40 60 35 40 60 37 85 15 42 85 15 表1. 洗脱梯度程序 3.3. 对照品溶液的制备 对照品溶液的制备：取补骨脂素对照品适量，精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声(功率100 W，频率40 kHz)使其溶解(水温升高约1℃)，冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀，配制成补骨脂素浓度为0.188 mg/mL的溶液。色谱图见图1。 图1. 补骨脂素对照品色谱图 3.4. 供试品溶液的制备 供试品溶液的制备：取供试品0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液30 mL，超声(功率100 W，频率40 kHz)提取30 min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加入甲醇溶解，并转移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。色谱图见图2。 图2. 供试品色谱图 3.5. 响应面试验与结果分析 经单因素考察试验后，选定提取用水量(料液比)、提取温度和提取压力作为考察因素，以补骨脂素的含量为响应值，根据Box-Behnken模型的实验设计原理，安排实验组合，响应面分子因子及水平见表2；基于Design-Expert8.0.6软件进行数据分析，确定最优提取工艺。 Table 2 Factors and levels table of response surface experimen 因子 编码 水平 −1 0 1 提取温度(℃) A 20 40 60 料液比(mL:g) B 20 40 60 压力(MPa) C 10 30 50 表2. 响应面分析因子及水平表 响应面实验方案及结果见表3。 Table 3 Experimental design and results for response surface analysi 序号 提取温度(℃) 料液比(mL:g) 压力(MPa) 补骨脂素含量(mg/g) 1 −1 −1 0 3.69 2 1 0 1 4.52 3 −1 0 −1 3.39 4 0 0 0 4.95 5 0 0 0 4.91 6 1 0 −1 3.86 7 0 0 0 5.16 8 0 0 0 5.14 9 1 1 0 4.98 10 0 1 −1 3.95 11 −1 1 0 4.16 12 1 −1 0 4.32 13 −1 0 1 4.52 14 0 0 0 5.09 15 0 −1 −1 3.09 16 0 −1 1 4.25 17 0 1 1 4.87 表3. 响应面试验方案与结果 经软件Design Expert8.0.6分析，补骨脂素含量与提取温度(A)、料液比、(B)、提取压力(C)的二元多项式回归模型为： Y = 5.05 + 0.24 A + 0.33 B + 0.48 C + 0.047 A B − 0.12 A C − 0.060 B C − 0.37 A 2 − 0.40 B 2 − 0.61 C 2 。 R 2 = 0.9700 ， R 2 a d j = 0.9314 。 回归模型的方差分析结果见表4。 Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression equatio 方差来源 平方和 自由度 均方 F PProb > F 显著性 Model 6.3735 9 0.7082 25.1281 0.0002 ** A-温度 0.4608 1 0.4608 16.3508 0.0049 ** B-料液比 0.8515 1 0.8515 30.2146 0.0009 ** C-压力 1.8721 1 1.8721 66.4290 < 0.0001 ** AB 0.0090 1 0.0090 0.3202 0.5891 AC 0.0552 1 0.0552 1.9596 0.2043 BC 0.0144 1 0.0144 0.5110 0.4979 A 2 0.5609 1 0.5609 19.9044 0.0029 ** B 2 0.6653 1 0.6653 23.6068 0.0018 ** C 2 1.5796 1 1.5796 56.0499 0.0001 ** 残差 0.1973 7 0.0282 失拟项 0.1459 3 0.0486 3.7840 0.1156 纯误差 0.0514 4 0.0129 总和 6.5708 16 表4. 回归模型方差分析 注： * 代表差异显著(p < 0.05)， ** 代表差异极显著(p < 0.01)。 从方差分析结果可知，模型p = 0.0002 < 0.01，说明以补骨脂素建立的回归模型极显著。相关系数R 2 = 0.9700，修正系数R 2 adj = 0.9314，表明模型的实测值与预测吻合，失拟项p > 0.05，失拟项不显著，表明二元多项式对试验中的拟合较好。A、B、C、A2、B2、C2对试验结果影响极显著(p < 0.01)。 利用此模型，可拟合出三个响应值相应的响应面分析图。图3表明料液比与温度交互作用对补骨脂素含量的影响，随着料液比的增加和提取温度的提高，补骨脂素的含量先显著增加后轻微下降。补骨脂素的含量受料液比的影响大于受提取温度影响。图4表明压力与温度交互作用对补骨脂素含量的影响，随着压力的增加和提取温度的提高，补骨脂素的含量先显著增加后轻微下降。补骨脂素的含量受压力的影响大于受提取温度影响。图5表明压力与料液比交互作用对补骨脂素含量的影响，随着压力和料液比的增加，补骨脂素的含量先显著增加后轻微下降。补骨脂素的含量受料液比的影响和受提取温度影响都比较明显。 图3. 料液比与温度的交互作用图4. 压力与温度的交互作用图5. 压力与料液比的交互作用 通过上述Box-Behnken实验结果，以补骨脂素为响应值，确定模型优化得到本发明最佳提取工艺为温度43.30℃、料液比为51.45:1 (mL:g)、压力36.26 Mpa，在此工艺条件下预测浓缩液中五指毛桃最高含量为5.22 mg/g。但考虑实际操作可行性，故选定调整后工艺参数为温度43℃、料液比为51:1 mL:g、压力36 Mpa。为了验证模型的可靠性，在此工艺条件下重复三次试验，得到产品中补骨脂素的含量为5.25 mg/g (RSD = 1.97%，n = 3)，说明优化试验得到的最佳参数较为可靠，此时，补骨脂素的转移率为87.4% (RSD = 2.01%，n = 3)。