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user: 4. 汉防己甲素抗埃博拉病毒作用 4.1. 埃博拉病毒对细胞感染需要特定的钙离子通道 Sakurai等 [ 29 ] 通过表明钙通道称为双孔通道2 (TPC2)是所必须的病毒基因组的释放入宿主细胞中添加其他元素的病毒进入的通道。埃博拉病毒表面的糖蛋白和受体结合后，其可以是无特异性，可能包括大量的糖结合蛋白病毒通过宏胞饮进入细胞，非选择性的吞没过程。一旦内在至膜结合囊泡(内体)，埃博拉病毒切割糖蛋白，当暴露在越来越酸性还原环境，这一切都发生在胞内体必不可少的叫胞膜蛋白(NPCI)的蛋白质相互作用，提出了称引起这一过程为融合的病毒遗传物质释放。 小分子干扰RNA图像确定在宿主细胞里的钙信号，其它融合对埃博拉病毒的入口是有必要的。然而，五个化合物阻断这些通道并没有阻止埃博拉病毒的感染，这表明其他机制也参与。有效的抑制剂烟酸九二核苷酸磷酸(NAADP)刺激细胞阻断内钙通道称为TPCS。这些渠道主要定位于内涵体和溶酶体(酸性舱的内容物被降解)。Sakurai等 [ 29 ] 人通过使用细胞缺乏TPC2，小分子干扰RNA和小分子抑制剂，确定TPC2是埃博拉进入的通道。此外，已证明是针对埃博拉病毒的糖蛋白对TPC2的要求，暗示一个非常具体的内体的加工途径。以前的研究工作表明，NPCI和埃博拉病毒进入也和作为胞内受体触发的融合至关重要，建议NPCI可能不需要融合本身，因为晚期内涵体表达TPC2但不是NPCI，和培养的细胞增殖性感染相关。这表明，NPCI在和TPC2融合之前，NPCI与糖蛋白相互作用，相互作用的糖蛋白发生裂解。进一步证明了关联TPC2与药物粉防己碱阻断通道活性，提高小鼠在感染埃博拉病毒的存活，由此可见在埃博拉病毒感染上TPC2的重要作用。 来自于中国传统中药粉防己，还没有用在人类身上来对付埃博拉病毒，另外，Sakurai等 [ 29 ] 人多次组织培养半数抑制剂量给小鼠，观察到的剂量，并可能超过剂量，认为对人是安全的。汉防己甲素治疗可能优于最先进的埃博拉病毒爆发后的治疗(包括鸡尾酒三单克隆抗体和小分子干扰RNA治疗)。几乎所有的65个左右的抗病毒药物在美国已经批准其用于临床使用的治疗慢性病毒感染(免疫缺陷病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒)药物的急性病毒性感染(如，更多的流感病毒，痘病毒，和herpes病毒)。由于埃博拉感染通常进展迅速，降低病毒滴度50%标准度量，说明病毒感染得到有效的控制。降低50%病毒的浓度，目前的临床治疗还达不到这样的效果；相反，除用组合治疗外，汉防己甲素为病毒进入抑制剂，可针对性的减少90%或99%的埃博拉病毒，其有更好的预防治疗作用。目前，有超过60多种化合物已提议用于埃博拉的有效治疗，但是这些化合物的大部分没有一个清晰的作用机制，而粉防己碱在机理上已有一些这样的认识。一些化合物具有先进的临床试验，对抗埃博拉病毒感染(例如：brincidofovir和favipiravir)是有说服力的，但临床数据缺乏 [ 30 ] 。粉防己碱等药物的结构改造可能最终形成一种治疗方法(同样适用于其他抗埃博拉病毒的化合物)。研究人员接下来的实验包括灵长类动物测试和人体临床测试。Darryl估计，汉防己碱疗法可望于两到五年内用于埃博拉病毒的治疗。不过，《科学》杂志配发的另一篇评论文章泼冷水说，汉防己碱研究并不能表明“一个切实可行的治疗方法尽在眼前”，原因是尚未在更能说明疗效的恒河猴中进行测试。 4.2. 埃博拉病毒的侵入 图4表明：埃博拉病毒通过特定的钙通道侵入细胞。病毒一旦内化为一体，病毒糖蛋白裂解结合到胞膜蛋白(NPCI)。然后激活TPC2通道，释放病毒基因进入细胞。药物粉防己碱可阻断TPC2通道(见图4) [ 30 ] 。 4.3. 汉防己碱抗埃博拉病毒的作用 埃博拉病毒结合到细胞表面蛋白的几种类型开始进入宿主细胞，在这之后被巨胞饮和如下达到酸性舱室，胞内途径那里，宿主蛋白酶如组织蛋白酶裂解病毒糖蛋白(GPs)，它结合到胞膜蛋白(NPCI)，并最终促进病毒核心在细胞的细胞质中复制开始的地方释放。以前的研究表明宿主钙信号蛋白对于埃博拉病毒进入宿主细胞是重要的，但无法识别其是否可以作为治疗目标的功能机制和位点。 在埃博拉病毒感染的上下转换关系方面识别和扫描上游的效应调节钙信号传导。Sakurai等 [ 29 ] 测试 图4. 埃博拉病毒的侵入 [ 30 ] 的重要性在常见的四种渠道类型的钙离子拮抗剂，只有这组化合物(异搏定、尼莫地平、硫氮卓酮)阻断L-型钙离子通道，抑制Hela埃博拉病毒感染细胞。异搏定由美国食品药品监督管理局(FDA)，用于治疗心血管病，用4 umol的IC50= (50%的抑菌浓度)有效的抑制埃博拉病毒。同样，其他两种结构不同的L-型钙离子通道拮抗剂尼莫地平、硫氮卓酮，同时降低埃博拉病毒的感染效率，来自于中国汉防己甲素(提取或合成)是特别的有效。55 nM的IC50就有效。相比之下，加巴喷丁，第五类独特的L-型钙离子通道抑制剂即使在高浓度没有影响。这一发现表明：经典的L-型钙离子通道不是埃博拉病毒依赖的钙通道的上游因子，也证明：异搏定，尼莫地平，地尔硫卓可以抑制由烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)触发的钙离子信号。NAADP是一个高效能细胞内钙离子动员剂，并刺激细胞内钙离子通道从内涵体和溶酶体释放钙离子。小分子的拮抗剂Ned19特异性的堵塞这个通道，Sakurai等发现Ned19这种拮抗剂也能堵塞埃博拉病毒感染，所有的抑制试验显示，所有的抑制剂在最高浓度使用无细胞毒性。如，维拉帕米(异博定)和Ned19，汉防己甲素也是一个有效的NAADP刺激钙离子释放的抑制剂，这些结果表明在埃博拉病毒感染中NAADP刺激钙离子通道，汉防己甲素能够阻断宿主因子。 表明NAADP通过合并和转运在囊泡融合中成熟，这也表明病毒进入细胞担任一个角色。这里与假病毒的测试，感染细胞的重组，水泡性口炎病毒中心的糖蛋白(GP)，汉防己甲素、异搏定、Ned19对埃博拉病毒(rVSV-埃博拉病毒-GP)敏感，汉防己甲素则高度敏感。表明NAADP刺激通道活性特别影响GP介导的埃博拉病毒进入步骤。此外，汉防己甲素和异搏定有效的抑制马尔堡病毒糖蛋白重组(rVSV-埃博拉病毒-GP)的关系。但只有微弱的抑制感染马尔堡病毒、拉沙病毒、狂犬病毒、委内瑞拉马脑炎病毒，还暗示丝状病毒和其他类型的病毒相比更依赖这个路径。为了获得进一步进展，观察NAADP介质通道和埃博拉感染之间进一步的关系。Sakurai等试图发现感染所需的钙通道效应。最近研究显示这双孔通道(TPC S )是通过NAADP介导的主要钙的活性通道。他们还通过激活磷脂酰肌醇3，5-二磷酸[PI(3.5)P 2 ]和存在于人类小鼠和其它动物的TPC1和TPC 2 ，发现小鼠胚胎成纤细胞(MEFS)缺少TPC1或TPC 2( TPCN1−/−或TPCN2−/−)通道，MEFS表达抵抗埃博拉病毒，在人类的表达突变细胞的感染明显恢复，表明基因的具体作用：基因敲除。同样，尽管抑制小干扰RNA的TPC的表达，(siRNAs)是不完整的，埃博拉病毒感染无论是在传染HeLa细胞还是在TPC1或TPC2 siRNAs是减少的。另外可有效的阻塞NANDP刺激钙释放，抑制埃博拉病毒作用，此外，埃博拉病毒颗粒(VLPs)在细胞内以TPC1和TPC2的阳性的胞内舱培养。路径分析显示PI(3.5)P 2 和NAADP引起的调触电流使胞内含粉防己碱甲素阻塞了TPC1和TPC2通道。对照组，加巴喷丁，没有抑制病毒感染，没有作用在TPC2的功能，同时，数据显示TPCs中PI(3.5)P 2 和NAADP介导的信号传导在埃博拉病毒感染方面是起重要作用通道。可能当病毒在细胞内体，汉防己甲素靶向的抑制了钙离子通道TPCs，具有强效能。发现仍然局限于溶酶体相关的膜蛋白1 (LAMP1)阳性的病毒样颗粒在TPCN1−/−和TPCN2−/−细胞囊泡，以及作为抑制剂对细胞处理，表明这一步是不受影响的。然后，发生内吞体半胱氨酸蛋白酶前病毒体膜融合埃博拉病毒GP，所以下一步研究是可以克服抑制药物的作用使用rVSV埃博拉病毒GP与蛋白酶预处理。用Ned19，汉防己甲素，或维拉帕米仍然有效地阻止病毒感染，但控制半胱氨酸蛋白酶抑制剂的保护作用，没有表明钙通道抑制剂影响后期进入GP蛋白水解后的步骤内。对膜融合与病毒含量释放法进行评价，表明这些抑制剂显著使内容混合信号降低，表明逮捕了病毒体膜释放到融合和病毒衣壳细胞的细胞质。 最近研究显示，阻塞通道TPC2的结果，显示阻塞物在这些酸性的舱体内转运，这些阻塞物在表皮生长因子(EGF)里累积存在于LAMP1阳性胞内舱。Sakurai等 [ 29 ] 发现，用汉防己甲素处理Hela细胞显示表皮生长因子类似的积累，以及为TPCN2−/−MEFs，而TPCN2−/−MEFs显示EGF积累较少。此外，VLPS和EGF和汉防己甲素作用过的细胞共存，这表明通过TPCs调节他们使用或收敛于一个共同的内涵体运输路线。此前证明，埃博拉病毒进入是依赖于另一个胞膜蛋白(NPC1)，这小分子U18666A，诱导表型模拟NPCI缺陷，导致胆固醇聚集在胞内体。当细胞用U18666A处理后，EGF聚集的模式和汉防己处理后是相似的模式。然而用异搏定和U18666A治疗rVSV-埃博拉病毒-GP感染细胞，揭示了类似的抑制动力学，当感染后1.5~2小时添加药物，显示每一个受病毒感染的宿主接近相同的时间，每个变成无效。埃博拉病毒通过TPCs通道感染的各步奏、关系和表征，研究了病毒与NPC1通道和TPC2通道的共存。在未经处理的细胞中，病毒样颗粒含有NPC1和TPC2的舱体，以及一个独特的舱体只含TPC2通道。然而，汉防己甲素治疗显著(与其他通道抑制剂更有效)病毒颗粒的积累增加TPC2(+)通道中/NPC1(−)间隔共存。这个结果显示，汉防己甲素破坏胞内体运输，汉防己甲素能有效改变病毒传播，这样，在NPC1舱体保留VLPS。因为用舱体中TPC2(+)通道中/NPC1(−)减少共存来降低感染。埃博拉病毒可能使用本室进入宿主细胞，用U18666A治疗再次导致埃博拉病毒(VLP)定位相似，观察到U18666A抑制了钙通道，这可能是由最近的一份报告显示，治疗引起胞内钙缺乏。此外细胞，携带有缺陷的NPC1有一个失去NAADP响应，表明在宿主细胞的病理和NPC1关系密切，这可能会影响埃博拉病毒感染。 Sakurai等 [ 29 ] 讨论了是否TPC通道功能可以作为抗埃博拉病毒的治疗靶点，首先，原性巨噬细胞，在人类和其他动物病毒感染的最初目标，进行评论。在Hela细胞中的作用类似，汉防己甲素强效阻断人类单核细胞原性巨噬细胞感染埃博拉病毒，异搏定和Ned19有效，但需要高剂量，没有表现出细胞毒性。汉防己甲素是动物实验最好的药物，因为它高效、低毒。其中，汉防己甲素是最好的候选物，因为当前动物试验显示高效力和较低的细胞毒性。此外，所需抑制病毒感染的粉防己碱的剂量(IC50 = 55 nM)至少低于安全有效浓度40倍并在小鼠身上起到较好的药理特性，长效，很好的耐受性。因此，Sakurai等[ 29 ] 在埃博拉病毒病的小鼠模型上评价治疗效果，小鼠感染埃博拉病毒后，然后，给予汉防己甲素或生理盐水，每2天一次持续1周。汉防己甲素治疗开始后不久，感染小鼠的生存率显著提高。没有用汉防己甲素治疗的小鼠，感染开始后不久，显著提高生存率，在小鼠身上没有任何可检测到的副作用。治疗组小鼠的临床评分与对照组评分相比，显示较对照组小鼠感染Ebola病毒较低(生理盐水为对照组)。在3天测得的血清病毒滴度。接种后，9天没有检测到病毒。此外，当开始治疗，攻毒后1天，一半的小鼠存活。这些结果表明，汉防己甲素可非常有效的治疗患埃博拉病毒病小鼠。 总之，Sakurai等 [ 29 ] 确定汉防己碱的抗埃博拉病毒作用。含有病毒颗粒的胞内体这些钙离子通道表现负责控制运动。通过破坏TPC功能，防止病毒从胞内体TPC逃离进入细胞、细胞质，阻止感染。TPC被证明双苄基异喹啉类生物碱是有效的现有的药物作用靶点，证明粉防己碱，生物碱，是最有效的。这可能是由于在胞内体转运的不同阶段阻止TPC1和TPC2调节的能力。汉防己甲素是这类药物的一个代表；在植物周围世界发现其它成员，也可以阻止埃博拉病毒感染。因为一个丝状病毒有关的远亲马尔堡病毒的进入，也受到影响，所有的丝状病毒需要TPC通道这是可能的 [ 29 ] 。抗埃博拉病毒试验药物名称、药理作用机制和体外试验抗埃博拉病毒效果及结构见表5。