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user: 3. 结果与讨论 3.1. 晶型表征与确定 图2是乙胺嘧啶原料药(A晶型)根据加热时间的不同，分别加热3分钟、4分钟得出了外观不一样的B1、B2晶型。 如图2可见，B1为针状晶体，B2为片状晶体，其外观差别明显。计算B1晶型产率 = (0.12/0.5) × 100% = 24%，B2晶型产率 = (0.2/0.5) × 100% = 40%。下文的B晶型都为B2。将适量的A晶型、B1晶型、B2晶型放在BH200生物显微镜下观察并拍照，如图3。 从图3可知A晶型为块状晶型，大小较B1、B2晶型的小，B1晶型为针状晶型，B2为片状晶型，较A晶型明显不同。 取适量上述4种结晶A、B1、B2、C，分别扫描红外光吸收图谱，结果见图4。 由图4可见A和C为同一晶型，其红外光图谱与中国药典(2015年版)标准图谱一致。B1、B2为另一晶型(以下都称为B)，其红外光图谱与英国药典(2012年版)标准图谱一致。两种晶体红外光吸收图谱的差异为，在1650 cm −1 处A显双峰：1627 cm −1 、1650 cm −1 ；B显单峰：1645 cm −1 。在约1470 cm −1 处A 图2. A晶型经加热后的两种晶型 图3. A晶型和B1、B2晶型的光学显微镜图 图4. A晶型和B1、B2晶型及C晶型的红外光谱图 为单峰：1478 cm −1 ；B为双峰：1461 cm −1 、1479 cm −1 。在约 830 cm −1 处A为单峰：833 cm −1 ；B为双峰：823 cm −1 、833 cm −1 。两种晶型可以相互转换得出结论为：A、C为同一种晶型，B为另一种晶型。 分别取适量乙胺嘧啶晶型B及A，由于乙胺嘧啶的晶型都为不导电，为了防止样品电荷，减少试样表面的热损伤，以便提高试样电子的发射率，需要增加导电、导热性。我们的处理方法是在真空镀膜仪、离子溅射仪中喷镀一层金属铂。再放入扫描电子显微镜中进行观察，得图5。 由图5可知，A晶型放大倍数500倍时可见为块状晶体，B晶型放大200倍时明显可见为片状或针状晶型。二者明显不同。 将适量A、B晶型乙胺嘧啶制样后测定XRD如图6。 由图6可知乙胺嘧啶A晶型的特征衍射峰(2θ/˚)有：10.5、12.94、14.42、15.24、16.74、17.40、18.61、19.40、20.06、21.08、21.44、21.98、23.4、24.24、25.30、25.98、26.68、26.84、27.80、28.06、28.90、29.16、29.44、31.60。乙胺嘧啶B晶型的特征峰有：9.24、11.94、18.61、20.6、21.14、21.36、22.02、23.34、28.12、28.90、29.16、31.40、31.90、37.80、38.12、38.64，可见A晶型和B晶型除了存在四个重叠峰以外，二者其他峰明显不同，特别是在A晶型24.24、25.30、25.98、26.68、26.84区段和B晶型9.24、37.80、38.12、38.64更有直观上的差别，可知A晶型和B晶型为不同的晶型。 3.2. 晶型性质研究 3.2.1. 晶体的溶解性 晶型A、B乙胺嘧啶样品在不同溶液中的溶解情况如表1。 图5. 晶型A和晶型B的扫描电镜图 图6. A晶型和B晶型的XRD图谱 Table 1 Dissultion of 1 gram of A and B crystal in different solutio 晶型 pH 1.2盐酸 pH 6.8 磷酸盐缓冲液 pH 4.5 醋酸–醋酸钠缓冲液 乙醇 丙酮 三氯甲烷 A 6300 mL 12，500 mL 700 mL 350 mL 600 mL 500 mL B 11，800 mL 12，500 mL 450 mL 300 mL 600 mL 500 mL 溶解性 A：极微溶解 B：几乎不溶 几乎不溶 微溶 微溶 微溶 微溶 表1. 溶解1 g A、B晶型所需要的溶剂量及溶解性 从表1可知在pH 1.2的盐酸溶液中，A晶型的溶解度要大于B晶型。在pH 6.8磷酸盐缓冲液、丙酮、三氯甲烷三种介质中A晶型与B晶型溶解性一样。在pH 4.5醋酸-醋酸钠缓冲液、乙醇介质中A晶型的溶解度小于B晶型的溶解度。可见不同晶型的乙胺嘧啶溶解性是有差异的。 3.2.2. 晶体的引湿性 根据药典引湿性原则：潮解：吸收足量水分形成液体。极具引湿性：引湿增重大于15%。有引湿性：引湿增重大于2%但小于15%。略有引湿性：引湿增重小于2%但不小于0.2%。无或几乎无引湿性：引湿增重小于0.2% [ 14 ] 。 由实验结果可知A增重百分比为1.47%，引湿增重在0.2%到2%之间，则略有引湿性。B增重百分比为2.37%，引湿增重在2%到15%之间，则有引湿性。 3.2.3. 重量差异 20片片剂A晶型和B晶型重差异结果如表2所示。 从表2可知，晶型A、B制作的片剂均符合小于±7.5%规定。 3.2.4. 紫外–可见分光光度法 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 对照品比较法：根据药典乙胺嘧啶片，分别配制乙胺嘧啶A晶型、B晶型片剂溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100% ± 10%，所用溶剂也应完全一致 [ 14 ] ，按下式计算供试品中被测溶液的浓度： cX = ( AX / AR ) cR (1) 式中cX为供试品溶液的浓度；AX为供试品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的浓度； AR为对照品溶液的吸光度。 3.2.5. 标准曲线的绘制 分别称取乙胺嘧啶对照品10.2 mg、15.0 mg、20.4 mg、24.9 mg、29.6 mg，置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶解并稀释至刻度，分别精密量取5 mL上述溶液至100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，得到浓度分别为0.0051 mg/mL、0.0075 mg/mL、0.0102 mg/mL、0.01245 mg/mL、0.0148 mg/mL的溶液，在波长为272 nm下，以为0.1 mol/L盐酸空白，测定吸光度，见表3。 由图7可知，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，用最小二乘法绘制标准曲线，得到线性方程Y = 29.251X + 0.0144，相关系数R 2 = 0.9991，表明线性关系好。 3.2.6. 回收率 取9个100 mL容量瓶，按处方3配比分别加入各种辅料制备9份空白辅料，以中国药典2015版中乙胺嘧啶片含量测定浓度0.0125 mg/mL为100%，按高(120%)、中(100%)、低(80%)三个浓度依次加入乙胺嘧啶对照品30 mg、25 mg、20 mg至上述9份空白辅料中，每个浓度点做三个平行样，分别测定回收率，结果见表4。 Table 2 Weight difference of 20 pieces A and B crysta 20片A晶型片剂和B晶型片剂的每片重量(mg) 平均 X (1% ± 7.5%) A 73.8 74.4 76.3 78.2 76.2 77.7 78.0 74.0 75.9 76.0 76.015 70.314~81.716 70.7 71.7 73.2 78.0 77.5 76.1 77.7 77.8 77.3 79.8 B 76.9 74.7 75.9 80.2 76.9 79.7 79.3 79.8 77.7 82.2 78.49 72.603~84.377 77.3 82.2 78.5 77.6 80.7 79.7 76.8 80.8 80.8 77.5 表2. 20片A晶型片剂和B晶型重量差异 Table 3 The absorbance and concentration results of pyrimethamin 浓度(mg/mL) 0.0051 0.0075 0.0102 0.01245 0.0148 吸光度A 0.161 0.235 0.314 0.383 0.443 表3. 乙胺嘧啶线性测定结果表 图7. 乙胺嘧啶标准曲线 Table 4 The recovery results of pyrimethamin 加入浓度 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) 80% 20 19.8 99 99.17 20 19.8 99 20 19.9 99.5 100% 25 24.8 99.2 99.46 25 24.9 99.6 25 24.9 99.6 120% 30 29.7 99 99.3 30 29.9 99.7 30 29.8 99.3 表4. 乙胺嘧啶回收率结果 由表4可知，三个浓度的平均回收率在98%~102%之间，说明本法准确度好。含量测定、含量均匀度、溶出度均采用单点对照法进行计算。 3.2.7. 溶出度 1) 实验前对ZRS -8G 智能溶出仪晶型(天津天河分析仪器有限公司)进行调试，用中心盖对溶出杯中心校对，使每个溶出杯的内底部与浆底部之间的距离都一样，即25 mm ± 2 mm。分别量取经脱气处理的以0.1 mol/L盐酸溶液500 mL溶出介质，置各溶出杯内，实际量取的体积与规定体积的偏差应不超过±1%，启动仪器使溶出介质预热，设置温度 37 ℃ ，当仪器显示温度 37 ℃ 并且恒定时。取A晶型制备的片剂6片，分别投入6个溶出杯中，投下药片时表面不能存在气泡，转速启动仪器，转速为每分钟75转，计时；至10 min、20 min、30 min、45 min、60 min时，按顺序在1~6号杯中吸取溶出液5 mL，取样位置用刻度尺500 mL处取液，离溶出杯距离大于10 mm，每次取样点应一致；本品为多次取样，所量取溶出介质的体积之和超过总体积的1%时，必须及时补充相同体积的温度为37℃ ± 0.5 ℃ 的溶出介质，取液后立即用适当的微孔滤膜滤过，自取样至滤过在30秒钟内完成 [ 14 ] 。取澄清滤液，用紫外-可见分光光度计测出数据并记录，计算每片的溶出量。进行两次实验，测定12片的溶出度。 2) 取B晶型制备的片剂12片，同上操作，测出数据并记录。并制作溶出曲线。 3) 对照品的制备：取乙胺嘧啶对照品25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液70 mL，微温并时时振摇使乙胺嘧啶溶解，放冷，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；滤过，精密量取续滤液5 mL置另一100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，在波长为272 nm下，以为0.1 mol/L盐酸空白，测定吸光度。 4) 计算公式及判断标准 溶 出 度 % = ( A 样 × V 样 × g 对 ) / ( A 对 × V 对 × 规 格 ) × 100 % (2) 式中：A 样 、A 对 分别为供试品和对照品溶液的吸光度，V 样 、V 对 分别为样品和对照品的稀释倍数，g 对 为对照品的称样量。 溶出度补液计算公式：最初介质体积500 mL，每次取样5 mL，补液5 mL，则： 5 × (1st溶出度/500 + 2st溶出度/500 + 3st溶出度/500 + 4st溶出度/500 + 5st溶出度/500) 溶出曲线判断标准： 若两者在15分钟内显示大于85%的溶出度，分布图被认为是相似的。如果小于85%，则计算f 2 值，如f 2 ≥ 50，分布图被认为是相似的。 f 2 = 50 × log [ ( 1 + Q / n ) − 0.5 × 100 ] ， Q = Σ ( w R − w T ) 2 (3) 式中f 2 是相似因素，n是时间点数字；wR是对照品平均溶出百分比；wT是供试品平均溶出百分比。 5) 结论及分析：A晶型、B晶型乙胺嘧啶片各取样时间点平均累积溶出度见表5、表6，A晶型和B晶型片剂溶出曲线测定结果如表7，绘制溶出曲线如图8。 由图8可知，A晶型和B晶型片剂溶出基本可以达到90%以上，二者溶出曲线相似因子f 2 =69.04，相似性良好。 3.2.8. 含量测定 取乙胺嘧啶A晶型、B晶型片剂各20片，置于研钵中研细，精密称取药粉600 mg，用0.1 mol/L盐酸溶液适量溶解于200 mL量瓶中。微温并时时振摇使乙胺嘧啶溶解，放冷，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至 Table 5 The dissolution of A crystal pyrimethamin A晶型 各取样时间点平均累积溶出度(%) 10 min 20 min 30 min 45 min 60 min 1 95.06 96.26 96.88 96.58 97.24 2 92.17 93.35 92.92 94.12 94.23 3 94.80 96.00 96.63 97.62 97.77 4 97.69 98.92 99.03 100.07 100.24 5 92.44 92.83 92.39 93.06 93.17 6 96.64 98.12 98.75 99.52 99.95 7 93.23 93.67 94.56 94.11 94.67 8 94.86 95.25 95.78 96.28 97.74 9 92.34 93.78 94.56 94.23 96.82 10 96.28 95.33 96.57 97.68 97.68 11 98.01 98.73 99.36 100.21 100.36 12 95.31 95.67 96.11 96.52 96.66 平均 94.89 95.68 96.12 96.68 97.20 表5. A晶型乙胺嘧啶片溶出度 Table 6 The dissolution of B crystal pyrimethamin B晶型 各取样时间点平均累积溶出度(%) 10 min 20 min 30 min 45 min 60 min 1 83.72 91.99 98.55 101.82 98.43 2 80.64 99.67 105.27 110.15 111.72 3 86.29 92.79 96.01 97.72 98.91 4 89.62 98.73 101.75 103.77 105.03 5 92.45 95.68 97.90 98.59 99.03 6 96.56 99.57 101.32 101.79 102.51 7 89.28 94.376 96.87 100.17 100.88 8 92.17 98.34 100.09 101.32 101.77 9 81.93 95.08 98.12 100.65 101.62 10 87.46 93.80 97.09 99.60 100.56 11 85.08 94.09 96.85 100.15 102.43 12 91.91 97.02 97.97 99.45 100.41 平均 88.09 95.93 98.98 101.26 101.94 表6. B晶型乙胺嘧啶片溶出度 Table 7 The dissolution results of A and B crystal pyrimethamin 取样时间 10 min 20 min 30 min 45 min 60 min f 2 因子 A晶型 94.89% 95.68% 96.12% 96.68% 97.2% B晶型 88.09% 95.93% 98.98% 101.26% 101.94% 69.04 wR − wT −6.8 0.25 2.86 4.58 4.74 (wR − wT) 2 46.24 0.0625 8.1796 20.9764 22.4676 表7. A晶型和B晶型片剂溶出曲线测定结果 刻度，摇匀；滤过，精密量取续滤液10 mL置另一200 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度 [ 14 ] ，摇匀，在波长为272 nm下，以为0.1 mol/L盐酸空白，测定吸光度。 分别取A、B晶型乙胺嘧啶制备的片剂采用上述方法检测含量。以及对照品的制备(方法同溶出度对照品的制备)。 含 量 % = ( A 样 × V 样 × g 对 × 平 均 片 重 ) / ( A 对 × V 对 × g 样 × 规 格 ) × 1 00 % (4) 检测结果及结论：A为97.20%，B为100.12%，A、B晶型乙胺嘧啶制备的片剂含量在中国药典2015版乙胺嘧啶片含量应在90.0%~110.0%范围内的规定。 3.2.9. 含量均匀度 1) 对照品的制备：方法同溶出度对照品的制备。 2) 取A晶型制备的片剂10片，分别置10个100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液适量，超声处理使乙胺嘧啶溶解，放冷，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，各精密量取续滤液5 mL置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度 [ 14 ] ，摇匀，在波长为272 nm下，以为0.1 mol/L盐酸空白，测定吸光度。 3) 取B晶型制备的片剂10片，分别置10个100 mL量瓶中，操作同上。 4) 记录数据A 对 、A 样 、V 对 、V 样 、g 对 。根据公式求其均值X和标准差S以及标示量与均值之差的绝对值 ；计算结果见表8。 图8. A晶型和B晶型片剂溶出曲线 Table 8 The content results of A and B crystal pyrimethamin 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 晶型A含量 102.92 101.89 96.7 103.7 98.78 99.96 99.04 96.97 99.81 101.11 晶型B含量 98.78 96.44 98.2 103.7 95.92 98.78 98.26 100.85 100.07 98 A = |100−X| A晶型：0.088 B晶型：1.1 S A晶型：2.344 B晶型：2.233 A + 1.8 * S A晶型：4.307 B晶型：5.120 A + S A晶型：2.432 B晶型：3.333 结果判定 A + 1.80 * S ≤ 15.0，A + S ≤ 15.0符合规定 A + 1.80 * S ≤ 15.0，A + S ≤ 15.0符合规定 表8. A晶型与B晶型片剂含量均匀度 结论：A晶型与B晶型片剂含量均匀度均符合规定。