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user: 2. AOC生物分析的进展 AOC生物分析的进展如表1所示。 2.1. 菌种的选择 由于AOC生物分析是基于在巴氏消毒过的水中细菌的生长，所以测试细菌的选择和表征十分重要。一些研究利用单一菌种、混合菌种或者本土菌种进行测定。由于缺少外酵素和不同细菌之间的交互作用，单一的纯菌种不能完全利用水中的AOC，所以Van der Kooij [ 1 ] ] [ 6 ] 在单一菌种P17 (荧光假单胞菌)中加入NOX (螺旋菌)来扩大营养利用的多样化。Kemmy [ 7 ] 选择了包括P17在内的四个特殊菌种来测定水中的AOC值，细菌在生长五天后达到极限，因此与传统AOC生物分析相比可缩短培育周期。Zhao Xin等人 [ 8 ] 使用G3， ZJ2， G6与P17和NOX共同作为测试菌种，用于再生水的AOC测定。由于ZJ2和G3可以更好的利用聚合物和糖类，G6可以利用更多的胺类和糖类，所以可以更快更准确地得到再生水中的AOC值。E.LW.Sack等人 [ 9 ] 在贫瘠水环境中挑选出了一种新的AOC菌种(A3)，可以利用淡水中浓度为微克每升的多种化合物，包括低聚糖、多糖，可以弥补P17和NOX无法利用低浓度的多糖和低聚糖的不足，进一步扩大测试细菌的营养多样性。Werner [ 10 ] ，Sathasivan [ 11 ] 和Hammes [ 4 ] 分别使用本土微生物作为培养菌种进行研究。虽然本地微生物在AOC生物分析中可以更全面的利用AOC，但是利用大分子有机化合物仍需要复杂的胞外酶和多种细菌之间复杂的交互作用。并且作为检测AOC的指标，菌种的必要特性必须是重复且可比较的。目前，由于本地菌种有许多未定特性，且其生长速率受碳浓度、PH及温度等条件影响，使定量更复杂，所以难以满足上述必要条件，尚难以标准化。 Table 1 Research progress on the AOC biological analysi 发表时间 作者 菌种 测试方法 测试所需时间 备注 参考文献 1982 Van der Kooij NOX 平板计数法 12~14天 [ 1 ] 1989 Kemmy 包括P17的四个菌种 平板计数法 5天 [ 7 ] 1992 Van der Kooij NOX， P17 平板计数法 12~14天 [ 6 ] 1993 Kaplan NOX， P17 平板计数法 9天 [ 3 ] 2000 刘文君 NOX， P17 平板计数法 6~7天 9~12天 [ 15 ] 2004 桑军强 NOX， P17 平板计数法 6~7天 9~12天 [ 16 ] 2006 方华 NOX， P17 平板计数法 6天或9天 [ 17 ] 2008 白晓慧 NOX， P17 平板计数法 8天 [ 18 ] 2013 Zhao xin P17， G3， ZJ2， G6 平板计数法 4~8天 用于再生水 [ 8 ] 1993 LeChevallier NOX， P17 ATP冷光法 2~4天 [ 5 ] 2004 Haddix P17和NOX生物发光衍生物 生物发光法 2~3天 [ 19 ] 2004 刘路 费希尔弧菌 Check light 试剂盒 2~3 h [ 24 ] 2009 Weinrich P17和NOX生物发光衍生物 生物发光法 3天 用于再生水 [ 20 ] 2011 Weinrich 哈维氏弧菌 生物发光法 3天 用于海水 [ 21 ] 2013 Sanghyun 费希尔弧菌 生物发光法 1 h 用于海水 [ 22 ] 2005 Hammes P17或本地菌种 流式细胞术 5天或3~6天 [ 4 ] 2016 Elhadidy 本地菌种 流式细胞术 4天 用于再生水 [ 26 ] 1999 Sathasivan 本地菌种 细胞直接计数法 5天 [ 11 ] 2014 Quek 海洋微生物 微生物燃料电池 5 min 用于海水 [ 23 ] 1986 Werner 本地菌种 浊度测定法 2~4天 [ 10 ] 表1. AOC生物分析的研究进展 2.2. 接种条件和培育条件的优化 有关优化接种条件和水样培养条件的研究主要集中于，细菌培养液的选择，水样的预处理和培养条件的优化。Kaplan [ 3 ] 提出用40 ml的市售无有机碳的硼硅玻璃小瓶代替1 L烧瓶，增加了反应的面积与体积比，使AOC值提高，并且这种小瓶易于操作和运输，简化了AOC分析实验的操作。此外Kaplan还建议在对水样巴氏消毒前，用无碳玻璃纤维过滤器除去大部分的颗粒有机碳。Le Chevallier等人 [ 5 ] 通过提高培养温度至25℃，同时增加培养物浓度至104 CFU/mL，可使细菌在2-4天内生长至稳定期，缩短了实验周期。Escobar [ 12 ] 优化了水样的储存条件，研究表明样品在72℃加热30分钟后马上冰浴30分，之后储存于4℃，样品的AOC值至少七天内不会有显著变化。Miettinen等人 [ 13 ] 发现无机物营养，尤其是磷可能限制饮用水中的微生物生长。在富含腐殖质的软饮用水中添加无机营养物(N， P， K， S， Ca， Mg)会增加AOC产量，消除磷的限制。 国外接种P17和NOX主要有三种方法；第一种方法将水样分为两份，分别接种P17和NOX，将测定结果相加作为总的AOC，该方法称为分别接种法 [ 6 ] ；第二种方法在水样中同时接种P17和NOX，根据两种菌的形态与大小不同分别对其计数，这种方法称为同时接种法 [ 3 ] ：第三种方法在水样中先接种P17，待其生长至稳定期计数，过滤水样后接种NOX，培养至稳定再进行计数，然后将P17细菌数和NOX细菌数分别转化为AOC-乙酸浓度和AOC-草酸浓度，该方法称为先后接种法 [ 14 ] 。在国内，刘文君等人 [ 15 ] 对第三种接种方法进行改进，P17生长至稳定期后，巴氏消毒杀死P17，然后再接种NOX进行培养。此外，刘文君等人对三种接种方法进行比较。总结得到，同时培养法和连续培养法对AOC生物分析优于分别接种法，但分别接种法与同时接种法比先后培养法用时短，而同时接种法易受稀释倍数影响。所以在对水样浓度范围了解时可使用同时培养，连续培养更利于不同水样间的横向比较。 桑军强等人 [ 16 ] 认为基于刘文君的传统AOC分析忽略了磷对P17和NOX生长的影响，在实验过程中引入了一定数量的外来磷，不能够客观地反映细菌在待测水样中的再生能力。研究对刘文君等人的连续培养测定AOC值的传统工艺进行了改进，通过降低接种液中K 2 HPO 4 和KH 2 PO 4 的浓度并去掉稀释溶液中的磷酸盐以避免将额外的磷引入水样，使得到的AOC值更客观地反映出水样的营养情况。 方华等人 [ 17 ] 优化了AOC分析操作条件，并且提出了由不同的醋酸盐浓度导出计算有机物产率系数的改良方法，该方法的适用范围为10~300微克每升的醋酸盐。白晓慧等人 [ 18 ] 优化了先后接种法的接种和培养条件，同时得到了AOC-NOX修正计算公式，减去了连续培养过程中由于P17细胞裂解引起的AOC增量，使测定结果更加准确，并且使测定时间缩短一天。 2.3. 细菌生长测定方法的改进和展望 目前，AOC生物分析可以通过平板计数法，浊度法，ATP冷光法，CheckLight试剂盒，和流式细胞技术等方法来测定菌落和细胞数量或其它等值量，从而得到细菌的生长情况。 ATP即三磷酸腺苷存在于所有活的生物体中，容易被储存和利用，是活细胞新陈代谢的能量源泉。当细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失。基于这一原理，检测细胞内的ATP含量，可反应细胞的存活状况，即ATP浓度与活细胞的数量密切相关。LeChevallier等人 [ 5 ] 将ATP冷光法引入AOC生物分析。待P17和NOX生长至稳定期后，用荧光素–荧光素酶对其进行标记，通过生物发光仪测得ATP含量即可得到细菌数量。LeChevallier的研究表明，利用ATP得到的细胞含量与用传统的平板计数法测得的细胞含量有较好的相关性，并且可以将测试时间减少到2~4天。 Haddix等人 [ 19 ] 用P17和NOX的生物发光衍生物作为测试细菌，可在水样中细菌生长至稳定期之前便利用细菌的早期发光峰值作为生理指标，得到细胞数量，进一步缩短测试时间。Haddix用平板法分别利用天然和生物发光的P17和NOX对36个水样进行AOC分析，得到的结果没有明显差别，说明该P17和NOX的生物发光衍生物保留了AOC分析能力。此外，Weinrich等人 [ 20 ] 利用P17和NOX的生物发光衍生物作为再生水AOC生物分析的培养物，并利用该方法探究水中的微生物生长和变化。 Weinrich等 [ 21 ] 利用哈维氏弧菌，一种可以发冷光的海洋微生物，其能够利用氨基酸，羧酸，碳水化合物，醛和醇作为营养。可作为海水的AOC生物发光法的测试细菌，该细菌使AOC生物分析的应用从淡水扩大到海水。Sanghyun [ 22 ] 建立了一个新的测定海水AOC的方法，该方法基于海洋细菌–费希尔弧菌的生物体之发光，能够更快更准确的得到海水的AOC值，并可作为海水生物淤积潜能的指示器。Quek等人 [ 23 ] 建立了一种利用生物电化学传感器快速检测海水中AOC值的方法，利用在阳极电极上生长的微生物，能够将来自溶液中氧化有机物的电子转移至阴极电极而产生电流。该方法可以在5分钟之内测得低醋酸盐浓度海水的AOC值，并且结果可重复，可有效地作为海水反渗透系统的生物淤积潜能指示器。 刘路等人 [ 24 ] 引进了一种ChckLight AOC试剂盒。利用海洋发光细菌–费希尔弧菌，该细菌一旦遇到AOC，就开始发光，发光强度取决于水样AOC的浓度，发光亮随时间而增加，由此可得到AOC值。该试剂盒可以在2~3小时内完成AOC的测定，但是水样的质量及检测时间对AOC值影响较大，准确性和可靠性还需进一步验证，并且测试费用比传统的AOC生物分析高很多。 Hemmes [ 4 ] 用SYBR green荧光染料对P17的全部核酸进行染色，用流式细胞仪进行细胞计数，代替平板计数法，可将检测时间由三天减至15分钟。除此之外，Hemmes还用该方法研究了天然微生物菌群，并且建立了可利用AOC的天然微生物菌群的完整生长曲线。Srijan等人 [ 25 ] 比较了染色–流式细胞术，无染色–流式细胞术，粒子计数法三种方法在AOC生物分析中的可行性。研究发现，染色–流式细胞术在AOC分析中可以快速准确的对P17和NOX行计数；无染色–流式细胞术对NOX无法进行准确的计数，但是得到的结果与传统平板计数法有线性相关性；粒子计数法对P17计数与传统计数得到的结果有线性相关性。无染色–流式细胞术和粒子计数都过高估计了AOC值，染色–流式细胞术在AOC分析中可以快速的对P17和NOX进行计数。Elhadidy [ 26 ] 利用流式细胞仪与天然微生物菌群监测地表水的AOC值，并进行长期的水质研究。结果表明，利用流式细胞术得到的AOC结果可靠，可重复，并且比得上传统的平板计数方法。除此之外，该方法还可分辨高核酸细菌和低核酸细菌。 在AOC生物分析中，细菌生长的测定从平板计数法发展到ATP发光法和流式细胞术等。与传统的平板计数法相比，流式细胞术得到的数据更稳定，这是由于平板计数易受人为误差或细菌生理变化的影响。与ATP发光法相比，流式细胞术更灵敏并且不易受背景干扰。ATP发光法测定的是与细胞数相关的ATP值，结果需经过两次数值转换得到AOC值，并且不同的细胞在不同的生长阶段ATP浓度都不相同。与ATP发光法相比，流式细胞术则可直接测定细菌的数值变化。 在AOC生物分析中，测定方法的进展可以更方便的了解细菌的生长动力学。Van der Kooij通过测定纯培养物进行生长动力学研究。在此之后，Weinrich [ 20 ] 和Hammes [ 4 ] 等人分别利用生物体发光法和荧光染色—流式细胞术分析AOC测定中的细菌生长动力学。Hammes总结，仅利用测定细胞数量得到的总生物生长量会稍许偏高。Weinrich等人建立了一个快速计算细菌最大生长量的模型。然而，ATP方法降低了准确性，而流式细胞计数是利用细胞数而不是细胞体积作为参数，由于细胞的尺寸不同，细胞数不能准确的定量评估AOC。在AOC生物分析中，由于细菌生长动力学可以模拟水中细菌的生长，所以具有重大的意义，并引起越来越多的关注，但仍需要测定方法的进展去完善AOC细菌的生长动力学。