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user: 3. 结果和讨论 3.1. 组蛋白修饰在两种细胞启动子区域的分布 我们首先对正常细胞和癌症细胞中所有基因在启动子区域的11种组蛋白修饰进行分析，经过计算作出启动子区域的组蛋白修饰分布图(图1)。从图中可以看出，在启动子区域11种组蛋白修饰的分布模式主要为两种类型，大部分分布模式成双峰分布(H3K9ac、H3K27ac、H3K4me2、H3K27me3、H3K4me3、H2AFZ、H3K4me1、H3K9me3)，另一种分布模式为非双峰分布(H4K20me1、H3K36me3、H3K79me2)，这11种组蛋白修饰分布的峰谷基本都位于转录起始位点。通过比较正常与癌症两种细胞中的组蛋白修饰分布，发现这11种组蛋白修饰基本都是在癌症细胞中比正常细胞中分布高，只有H2AFZ和H3K9me3这两种组蛋白修饰是正常细胞中比癌症细胞中分布高，表明这两种修饰可能起到了抑制性修饰的作用，这一点在相关的文献中也有类似报道。 3.2. 组蛋白修饰与基因表达的相关性分析 计算RPKM值与11种组蛋白修饰在80个区间上的Pearson相关系数，并将两种细胞启动子区域组蛋白修饰与基因表达的相关性结果绘制曲线图(图2)，图中纵坐标为相关系数。从图中可以看到，H3K9ac、H3K27ac、H3K4me2、H3K4me3、H2AFZ、H4K20me1、H3K36me3、H3K79me2、H3K4me1这9种组蛋白修饰与基因表达的Pearson相关系数为正，并且基本都是癌症细胞中相关性比正常细胞中高，只有H2AFZ和H4K20me1是正常细胞中比癌症细胞中相关性高，H3K4me1是在转录起始位点上下游附近正常细胞比癌症细胞相关性高，远离转录起始位点的部分相反，是癌症细胞中比正常细胞中相关性高。而H3K27me3与基因表达的Pearson相关系数为负(相关系数r值都小于0)，并且是正常细胞中比癌症细胞中相关性高，说明H3K27me3对基因表达起到了抑制作用，并且在正常细胞中抑制性比在癌症细胞中抑制性强一些。H3K9me3与基因表达的相关性却是在正常细胞中呈正相关，在癌症细胞中呈负相关，表明在正常细胞中对基因表达起到了促进作用，而在癌症细胞中对基因表达起到了抑制作用，也就是说组蛋白修饰对基因表达的角色变化，可能对癌症的发生起到了一定的作用。 我们选取正常细胞与癌症细胞中组蛋白修饰与基因表达的皮尔森相关系数在所有区间的最大值作图(图3)。可以看出正常细胞中相关性普遍比癌症细胞中低，除了H4K20me1和H2AFZ这两种组蛋白在正常细胞中比癌症细胞中相关性高，H3K4me3呈正相关、H3K27me3呈负相关与相关的研究结果一致 [ 9 ][ 11 ]。而H3K9me3在正常细胞与癌症细胞中相关性差别最大，在正常细胞中为正相关，而在癌症细胞中为负相关，表明这种组蛋白修饰可能在正常细胞中促进基因表达，而在癌症细胞中抑制基因表达。H3K36me3组蛋白修饰在正常与癌症细胞中，虽然都为正相关，但是在正常细胞中相关性比较低，而在癌症细胞中相关性相对比较强，两者差距比较大。 为了探究转录起始位点上下游组蛋白修饰与基因表达的相关性分布和组蛋白修饰分布之间的关系，我们作了曲线图(图4)，可以看出在启动子区域相关系数和组蛋白的分布走势基本相同，且大部分遵循组 图1. 所有基因的组蛋白修饰值分布 图2. 每种组蛋白修饰与基因表达的皮尔森相关系数图 图3. 组蛋白修饰与基因表达的皮尔森相关系数柱形图 图4. 组蛋白修饰分布与皮尔森相关系数的分布之间的关系 蛋白修饰值越高的细胞对应的相关性也比较大；除了H3K27me3、H4K20me、H3K4me1这三种相反，它们的组蛋白修饰值越高，对应的相关性却比较低。 3.3. 组蛋白修饰之间的相关性 组蛋白之间的共修饰可能会影响基因的表达，因此我们探究了组蛋白修饰与组蛋白修饰之间的相关性，分别作了两种细胞中的组蛋白修饰之间的Spearman相关系数热图(图5)。从正常细胞的相关系数热图可以看出，在正常细胞中有三组正相关性非常强的组蛋白修饰簇，分别是H2AFZ、H3K27ac、H3K9ac、H3K4me3、H3K4me2这5个组蛋白修饰之间Spearman相关性大于0.81，H3K27me3、H3K9me3、H3K36me3这3个组蛋白修饰之间Spearman相关性大于0.89，H4K20me1和H3K79me2这两个组蛋白修饰之间的Spearman相关性大于0.9；而H3K9me3与H3K27ac、H2AFZ、H3K9ac之间的组蛋白修饰Spearman相关性小于−0.52，H3K79me2和H2AFZ之间的Spearman相关性小于−0.53，H3K27me3与H2AFZ、H3K27ac之间的Spearman相关性小于−0.54，这三组分别构成负相关的功能簇。从癌症细胞的相关系数热图可以看出：H3K4me3、H3K27ac、H3K9ac、H3K27me3、H3K4me2之间的Spearman相关系数大于0.86，H2AFZ与H3K27ac、H3K4me3之间的Spearman相关系数大于0.79，H4K20me1和H3K79me2、H3K36me3之间的Spearman相关系数大于0.68，这三组构成正相关性强的组蛋白修饰功能簇；而H3K4me1与H3K4me3、H3K27ac、H3K9ac之间的Spearman相关性小于−0.64，H2AFZ和H3K4me1之间的Spearman相关性小于−0.61，这两组分别构成负相关的功能簇。可以看出，两种细胞的组蛋白共修饰并不相同，表明组蛋白修饰之间的变化可能也是导致肝癌发生的原因。 3.4. 高低表达基因上的组蛋白修饰分析 由于细胞中每种基因的表达水平都不相同，前面虽然对所有基因进行了总体分析，但可能会掩盖掉一些信息，因此，我们进一步将所有基因划分为高低表达基因，并对高低表达这两类基因进行分析。 为了从整体上说明在启动子区域高低表达基因上的组蛋白修饰水平，我们计算了高低表达基因在所有区间归一化的组蛋白修饰平均值，并将两种细胞高低表达基因的组蛋白修饰平均值作了对比，结果见表1。从表格看出，在正常细胞中H3K9ac、H3K4me2、H3K27ac这三种组蛋白修饰明显在高表达基因(High)中比低表达基因(Low)中修饰值高，这可能与它们是激活性修饰有关；而组蛋白修饰H3K27me3则在低表达基因中比高表达基因中修饰值高，这可能与它是抑制性修饰有关。在癌症细胞中，组蛋白修饰H3K9ac、 图5. 组蛋白修饰之间的Spearman相关系数热图 Table 1 The average of histone modifications in highly and lowly expressed gene HMs hepatocyte HepG2 HepG2/hepatocyte High Low H/L High Low H/L L/L H3K9me3 0.30 0.28 1.07 0.16 0.23 0.70 0.54 0.83 H3K9ac 2.52 0.32 7.82 5.37 0.38 14.29 2.13 1.17 H3K4me3 0.76 0.28 2.67 9.07 0.82 11.01 12.00 2.91 H3K4me1 0.67 0.30 2.26 1.15 0.39 2.94 1.71 1.31 H3K36me3 0.40 0.26 1.51 1.38 0.11 12.12 3.49 0.44 H4K20me1 0.67 0.25 2.72 0.92 0.40 2.32 1.37 1.61 H3K4me2 2.95 0.48 6.13 3.96 0.53 7.43 1.34 1.11 H3K79me2 0.63 0.23 2.75 2.13 0.19 11.40 3.35 0.81 H3K27ac 1.49 0.27 5.55 5.71 0.23 24.67 3.84 0.86 H2AFZ 0.67 0.32 2.09 0.62 0.36 1.74 0.93 1.12 H3K27me3 0.27 0.47 0.57 0.69 0.78 0.89 2.61 1.66 表1. 高低表达基因中组蛋白修饰的平均值 注：高低表达基因中组蛋白修饰平均水平差异显著大于三倍的用加粗表示，高表达基因比低表达基因平均修饰水平低的用红色来表示。 H3K4me3、H3K36me3、H3K4me2、H3K79me2、H3K27ac在高表达基因中比低表达基因中修饰值高(可能都为激活性修饰)，并且与正常细胞相比差异更显著。组蛋白修饰H3K27me3和H3K9me3在低表达基因中比高表达基因中修饰值高，这可能与这两种组蛋白修饰是抑制性修饰有关。比较发现这些激活性修饰在两种细胞中都是高表达基因中修饰值比低表达基因中修饰值高，只是在癌细胞中激活性作用更强。H3K9me3在两细胞中修饰值都不高，但癌细胞低表达基因中却高于高表达基因，这可能与它是抑制性修饰有关。从癌症细胞和正常细胞的高表达基因与高表达基因(H/H)，低表达基因与低表达基因的比(L/L)，看出低表达基因上组蛋白修饰值在两种细胞中差异并不显著，而高表达基因上的组蛋白修饰H3K4me3、H3K36me3、H3K79me2、H3K27ac在两种细胞中差异非常显著，表明肝癌的发生可能与高表达基因中这些激活性修饰的明显增加有关。