DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 页岩气清洁生产技术进展Progress in Cleaner Production Technology of Shale Gas 3.1. 压裂技术的发展趋势Development Trend of Fracturing Technology 水力压裂技术耗水量大，因此对水资源的需求量以及对地表水和地下水的威胁也较大。为了改变这一现状，可以探索新的压裂技术，如用水量少的混合压裂技术以及纤维压裂、通道压裂、干法压裂及液化石油气压裂等无水技术 [ 13 ]。这些压裂技术能够解决水资源匮乏、压裂液处理技术繁琐等问题，还能在施工时减少清水压裂铺砂不到位、强滤失、易脱砂等问题，提高页岩气的产量。尤其是液化石油气压裂，具有携砂量大、造缝能力强、对地层无伤害、返排时间短及完全返排等特点 [ 14 ]，应重点研究。在必须使用水力压裂的情况下，研究绿色无害化的化学添加剂，可以降低压裂液对水体的危害。 当前，水基压裂液的发展趋势是：减少化学添加剂品种，并要求采用“清洁”添加剂，包括使用可以进行生物降解的，且不会产生非生物降解积累效应的胍胶和淀粉基化学品。美国Chesapeake公司宣称将通过其“绿色压裂液计划”，取消应用于页岩气井水基压裂液化学添加剂品种中的25% [ 10 ]。我国渤海钻探井下技术服务公司成功应用绒囊暂堵液生物胶压裂液体系，对长庆油田苏东29-44井实施储层改造——将普通胍胶压裂液更换为环保型压裂液泵入地层，让绿色环保施工延“深”至地层3000米之下。渤海钻探井下技术服务公司积极应用低摩阻、易返排、可回收、无污染的EM50压裂液体系。通过过滤、除杂、再配置，成功在长庆油田双20-24C9井等18口井，实现了返排液再利用至下个层段或下口井，累计循环使用压裂液近2万立方米，有效解决了返排液的运输处理难题，施工后的地层深处实现了同步“清洁”，为绿色压裂提供了新的技术支撑 [ 15 ]。 3.2. 常用压裂技术的选择Selection of Common Fracturing Technology 当前，无水压裂技术大致分为三种，即LPG压裂，N 2 泡沫压裂，CO 2 干法压裂。将三种技术达到的效果、适用条件进行及优缺点进行比较，从而选择开采页岩气的最佳技术。 通过比较可以看出，CO 2 干法压裂技术是适用于低渗、低压、高水敏油层的最经济有效的改造方法，环保且节约了大量的水资源，因此CO 2 干法压裂技术具有更加广阔的发展前景。
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user: 4. 页岩气开采可持续发展方向Sustainable Development Direction of Shale Gas Exploitation 我国非常规油气资源非常丰富，目前水力压裂是实现效益开发的主要手段。但是，我国又是一个水资源严重缺乏的国家，因此，研究和发展无水压裂技术，对我国非常规油气资源的可持续开发具有重大意义。无水压裂技术的开发将是我国页岩气开采今后的发展方向。 全世界来看，仍有许多国家或者局部地区因环境污染问题以及水资源消耗问题而禁止进行页岩气生产。无水压裂技术能最大限度的避免页岩气开采对地下水和地表水的污染，节约水资源，因此未来无水压裂等页岩气清洁开采技术上的突破，将会给全世界页岩气开发带来新一轮的生机，是该领域可持续发展的重要保障。
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user: 5. 结语Conclusion 尽管我国的页岩气可采量非常丰富，居于世界第一，但我国的开采技术仍需提高，因页岩气开采技术的不成熟导致地下水污染问题还比较严重，还需深入的研究，通过页岩气开采技术的改进和国家政策的约束达到降低环境污染的目标。
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user: 摘 要 众所周知，交通系统是一个十分复杂的非线性大系统，受到诸多因素的制约，建立一个能够准确描述系统特性的数学模型是一项极具挑战性的工作。时滞车辆跟驰模型是指包含司机反映时滞的车辆跟驰模型。本文在已有模型基础上分析了司机反映时滞对车辆跟驰模型复杂动力学行为的影响，如稳定、分岔、多稳定性及混沌等。通过数值模拟与理论分析，揭示了司机反映时滞这一个体特征在驾驶过程中的重要性。 关键词 :时滞跟驰模型，交通流，稳定域，Hopf分岔，多稳定性 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 揭示交流中所蕴含的复杂非线性行为(分岔、混沌等)是人们长期关注的重要课题。研究发现分岔是交通流中各种非线性因素耦合影响的重要表现形式：当系统中某些参数发生变化越过某个临界值时，交通流系统的拓扑结构发生变化，诱发均匀流与堵塞流之间相变。目前，对交通流中的分岔等复杂现象的研究大多集中在车辆跟驰模型，详见文献综述 [ 1 ] [ 2 ] 及其中参考文献。 值得一提的是，文献 [ 3 ] 提出如下具体模型 x ¨ i ( t + τ ) = a x ˙ i m ( t ) [ x ˙ i − 1 ( t ) − x ˙ i ( t ) ] [ x i − 1 ( t ) − x i ( t ) ] l + b [ x i − 1 ( t ) − x i ( t ) − L i ] (1) 其中 m = 0 ， a ， b > 0 ， L i 为两车之间的实际存在的安全间距， x i ( t ) ， x ˙ i ( t ) ， x ¨ i ( t ) 分别为车队中车辆的位置、速度及加速度； d i ( t ) = x i ( t ) − x i + 1 ( t ) 为相邻两辆车之间的车头间距， τ 为驾驶员延时反应时间，一般为0.4~1.6秒， a ， b 分别表示对车速变化和车头间距变化的反应灵敏度系数。同时还分析由3辆车组成的系统的稳定性及其Hopf分岔特性，揭示了不同的系统时滞量(驾驶员反映时间)和不同的安全间距对系统稳定域的影响。 本文将揭示时滞所引起的系统多稳定性、高余维分岔等，并提出了一类新的非线性模型，模拟了混沌交通流等复杂动力学行为。 根据现有文献，多稳定性(Multistability)是生物学家Kenneth W. Nicker-Son在讨论多稳定蛋白质的生物功能时提出来的 [ 4 ]。该词现已在多个领域广泛应用，如声光非线性系统、学习算法、神经网络模型、寡头经济模型、人口模型以及传染病动力学模型的多稳定性研究等。从动力系统角度看，多稳定性是指系统多个平衡点或/与多个周期解(极限环)、多个混沌吸引子的同时存在性。系统最终的运动形式往往与系统地最初状态(初始条件)有关：初始条件不同，而最终的状态不一样(相空间中存在多个吸引子和相应多个吸引域)。这是复杂系统普遍存在的一种现象，如(高维或无穷维)系统中因多种分岔现象而出现多个平凡吸引子或(与)混沌吸引子的同时存在性，以及混沌映射中存在的无穷多周期层次结构等。而本文将揭示时滞车辆跟驰模型同样存在此类现象。 当L i ≡ L时 [ 3 ]，可理解为同质结构，即单一车道上跟随车辆与首车车况、车型相同；而当L i 互异时系统为异质结构，即单一车道上跟随车辆与首车车况、车型不同，鱼龙混杂。
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user: 2. 模型描述与多稳定性分析 假设车队中车辆数 ，并设头车以某一速度匀速前进，即 x ˙ = v 0 ， x ¨ ≡ 0 ，则模型(1)可写成如下四维非线性自治时滞动力系统形式： d y / d t = [ v 1 ( t ) ; − a v 1 ( t − τ ) / d 1 ( t − τ ) − b ( d 1 ( t − τ ) − L 1 ) ; v 2 ( t ) ; a v 1 ( t − τ ) / d 1 ( t − τ )                         + b ( d 1 ( t − τ ) − L 1 ) − a v 2 ( t − τ ) / d 2 ( t − τ ) − b ( d 2 ( t − τ ) − L 2 ) ] (2) 其中 y = [ d 1 v 1 d 2 v 2 ] T ， v i ( t ) = x ˙ i ( t ) − x ˙ i + 1 ( t ) 同时我们还将观察到如下系统存在的混沌交通流及其多稳定现象： d y / d t = [ v 1 ( t ) ; − a v 1 ( t − τ ) / d 1 ( t − τ ) − b ( d 1 ( t − τ ) − L 1 ) − k ( d 1 ( t ) − L 1 ) 5 ; v 2 ( t ) ;                         a v 1 ( t − τ ) / d 1 ( t − τ ) + b ( d 1 ( t − τ ) − L 1 ) − a v 2 ( t − τ ) / d 2 ( t − τ )                         − b ( d 2 ( t − τ ) − L 2 ) + k ( d 1 ( t ) − L 1 ) 5 − k ( d 2 ( t ) − L 2 ) 5 ] (3) 由文献 [ 3 ] 或直接计算可知，系统平衡点为 ( L 1 ， 0 ， L 2 ， 0 ) T ，时滞临界值为 τ j * = arctan a ω b L i + π j ω ，   j = 0 ， 1 ， 2 ， ⋯ 其中 ω = a 2 + a 4 + 4 L i 4 b 2 2 L i 2 ，     i = 1 ， 2. 当时滞 τ > τ 0 * 系统不稳定，当时滞 τ < τ 0 * 系统在平衡点附近局部稳定。 进一步验证Hopf分岔的横截性条件，可计算得当 τ = τ j * 时 ℜ d λ d τ | τ = τ j * = − a ω 2 ( a − b L i τ − 2 L i ω sin ( ω τ ) ) + L i b ω 2 ( 2 L i cos ( ω τ ) − a τ ) ( a − b L i τ − 2 L i ω sin ( ω τ ) ) 2 + ω 2 ( 2 L i cos ( ω τ ) − a τ ) 2 ， 及 ℜ d λ d a | τ = τ j * = − ω 2 ( 2 L i cos ( ω τ ) − a τ ) ( a − b L i τ − 2 L i ω sin ( ω τ ) ) 2 + ω 2 ( 2 L i cos ( ω τ ) − a τ ) 2 ， ℜ d λ d b | τ = τ j * = − ( a − b L i τ − 2 L i ω sin ( ω τ ) ) ( a − b L i τ − 2 L i ω sin ( ω τ ) ) 2 + ω 2 ( 2 L i cos ( ω τ ) − a τ ) 2 . 图1. 当b变化而a固定时，系统(2)中的(双)Hopf分岔失稳的临 图2. 当τ变化时，系统(7.2)中的(双)Hopf分岔失稳的临界值 图1画出了当参数a固定后中临界时滞与参数b及车间安全距离的相互影响。观察分析可知：有时较小的车间安全距有较高的稳定性，而有时较大的车间安全距才有较高的稳定性。之间的转化(临界状态)可用多稳定性或高余维分岔来解释。这里主要表现为双Hopf分岔。如图1(b)所示当a = 18.3时L i = D = 16所对应的临界曲线与D = 26所对应的临界曲线在b = 0.5附近相交，从而若所给系统中L 1 = 16，L 2 =26，则在对应两曲线交点邻域出现双Hopf分岔。类似现象也可以在图2中其它参数值所对应的临界曲线交点处观察到：D = 6所对应曲线与另外两曲线均相交。因此若系统(2)或(3)中L 1 = 6，L 2 = 16 (或26)，则在两曲线交点处出现双Hopf分岔。从另外一个角度说明了这种高余维现象的普遍存在性。比较图2中三幅图(τ = 0.5， 1， 1.5)还可发现，随着反应时间增长，参数平面上稳定域范围大幅缩小，从而说明驾驶员的快速反应有利于系统安全性能的提高。 图3从数值的角度验证了Hopf分岔所满足的横截性条件，并且由所给数值值(>， =或<0)，说明图1与图2中所画临界曲线的内侧区域稳定，外侧不稳定，与已有理论分析及数值结果吻合。 图3. 横截性条件
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user: 3. 进一步分析 文献 [ 3 ] 已指出模型(2)中很难数值观测到稳定的极限环。为此我们研究方程(3)。在图4中取 L 1 = L 2 = 16   m ， a=6， b= 0.8，τ=0.99， k=0.08及初值 y ( t ) ≡ [ 16.7 0.01 17.9 0.01 ] T ， t ∈ [ − τ ， 0 ] 。即设在开始 时间段内，第1、2辆车和第2、3辆车之间的车头间距分别为16.7 m和17.9 m，相对速度差均为0.01 m/s。从图4的仿真计算结果可见，系统出现了混沌交通流。图5比较了模型(2)与(3)之间动力学差异，其中L 1 = 16， L 2 = 26 m，初始值与图4同。前者(L 1 = 16)对应子系统参数位于稳定域内，而后者参数位于不稳定域。我们看到了均匀流与周期流的同时存在性。两系统(2)与(3)均出现同样现象，但频率有很大差异。可归结为车辆加速的差异，前者为低速情形，而后者为高速情形。但需要进一步运用非线性动力系统方法解释相应机理。而关于此类多稳定性现象，文 [ 3 ] 没有研究讨论。 图4. 系统(3)中的混沌行为在初始条件 y ( t ) ≡ [ 16.7 0.01 17.9 0.01 ] T 下，a = 6，b = 0.8，L 1 = 16，L 2 = 16，τ= 0.99，k = 0.08， t ∈ [ − τ ， 0 ] 。(a) 时间序列；(b) 相图 图5. 系统(2)和(3)中的多稳态性，其中a= 6， b =0.8， L 1 = 16， L 2 = 26， τ = 0.3，及初始条件 y ( t ) ≡ [ 16.7 0.01 17.9 0.01 ] T ， t ∈ [ − τ ， 0 ] 。(a) 系统(3.2)，k = 0；(b) 系统(3.3)，k = 0.08
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user: 4. 结论 本文发现了一类时滞交通流模型中存在的多稳定性现象，并提出一类新的非线性模型，模拟了混沌交通流等复杂动力学现象。尽管模型(3)可以看成模型(2)的高阶扰动模型，在适当条件下均可诱发均匀流与堵塞流的相变，但周期震荡频率有很大差异，需要进一步运用非线性系统理论加以研究。 本文没有深入分析混沌这一重要非线性特征，可以通过考察初值敏感依赖性及计算最大Lyapunov指数与分形维数等加以验证，文 [ 5 ] 的研究方法提供了很好的参考。通过数值模拟揭示了系统高余维分岔(双Hopf)的存在。进一步进行理论分析，是一个有趣的课题。由于其高维特性，相应动力学行为分析有难度。运用时滞微分方程理论 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]，揭示交通堵塞背后的各种非线性现象产生的内在机制，如交通拥堵的形成和演化机理，以及交通堵塞的分类等问题，将是我们今后研究的重点。
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user: 摘 要 针对心电信号中各构成成分(P波、QRS波、T波)波形特征，本研究提出了一种基于伯格–马夸尔特算法创建心电高斯模型以实现心电波形特征研究进而对心电特征进行定性评价研究。首先，基于小波分解对心电信号进行预处理，以消除基线漂移以及背景噪声；其次，以心电信号各R峰间距为参考，按照1:2的分割比例对心电信号进行周期分割；最后，基于Levenberg-Marquardt (LM)算法创建心电高斯混合模型以刻画各成分波形特征。本算法通过对MIT-BIH心律失常数据库中48条心电数据进行分析，利用其拟合优度均值为0.9668对本算法可行性进行了验证。 关键词 :心电信号，小波变换，高斯拟合，LM算法，置信域算法 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 近年来心血管疾病的患病率和死亡率均呈现持续增长的趋势，并且心血管疾病死亡人数连续多年位居疾病死亡之首。根据《中国心血管报告2018》 [ 1 ]，2016年农村因心血管疾病死亡人数占全部因疾病死亡人数的45.50% (见图1(a))，城市因心血管疾病死亡人数占全部死亡人数的43.16% (见图1(b))。依据心血管疾病患病率持续上升的趋势，推测我国现有2.9亿患者，其中心脏病占有很大比重。我国心血管病防治工作面临严峻挑战。 图1. 2016年中国农村和城市居民主要疾病死因构成 传统心血管疾病治疗最大弊端是需持续长时间心电信号记录，从而导致绝大多数心血管疾病患者错过了最佳理疗期。随着计算机技术，数字信号处理手段等先进技术的不断发展，借助计算机和数字信号处理手段对心电图信号进行检测、处理和分析已逐步取代传统诊断方式。心电图(ECG)包含大量用于分析心脏功能的生理信号，是用来诊断心脏疾病的主要依据之一。表征心电信号的形态特征是诊断心脏性疾病、心率变异性分析、生物统计学和心电信号自动分类中最重要的步骤，这些系统的性能很大程度上依赖于心电信号描述的准确度。而心电信号的特征提取、识别及分类已经被国内外研究人员引入了许多种算法。一般可用的特征表示方法包括形态学 [ 2 ] 、时间信息 [ 3 ] 、小波变换 [ 4 ] 、高阶统计量(HOS) [ 5 ] 、Hermite基函数 [ 6 ] 、ECG波间隔 [ 7 ] 、选定的采样点 [ 8 ] 、QRS波段镜像高斯模型 [ 9 ] 等。 心电信号特征提取经历了从单个节拍特征提取到海量心电信号特征提取的发展过程。基于滤波技术和决策规则的方法计算效率高，是任何心电分析的理想方法。一般来说，预处理阶段采用各种信号处理技术来增强心电波的特征和抑制噪声，但大多数方法都存在一定的缺点。如，基于小波变换的预处理存在母波和尺度的选择问题，基于基准点描述特征存在难度较大和精度较低的问题。对于真实的心电信号波形形态各异，单一的决策规则很难描述各种病理信号。周群一将QRS复合波建立数学模型并应用在心拍的分类，但该方法只描述了QRS复合波的形状，却丢失了其他部分信息。 本文提出了一种基于简单的小波变换和Levenberg-Marquardt算法建立函数模型表述心电节拍信号形态的方法。本文结构组织如下。第一部分讲述基于小波分解对心电信号进行简单的预处理——去除基线漂移以及背景噪声，第二部分介绍了以心电信号各R峰间距为参考，按照1:2的分割比例对心电信号进行周期分割，第三部分详细介绍了建立数学模型的两个步骤。最后给出了实验结果。使用MIT-BIH 心律失常数据库对本文提出的方法进行了实验评估。
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user: 3. 实验与分析 3.1. 拟合评价标准 为了确定拟合模型对实际的心电数据是否具有良好的逼近性，采用了误差均方根(RMSE)、误差平方和(SSE)、总平方和(SST)和确定系数(R-square)等拟合优度统计方法。计算方法如下： SSE = ∑ k n ( f ( x k ) − y k ) 2 ，     SST = ∑ k n ( f ( x k ) − 1 n ∑ k n f ( x k ) ) 2 ，     R-square = 1 − SSE SST (19) 其中SSE统计参数计算的是拟合数据与原始数据对应点的误差的平方和，其越接近于0，说明模型选择和拟合的结果越好，RMSE和SSE效果一样，这两个参数都表现在拟合结果和原始数据点与点层面的结果。R-square是通过数据整体的变化来描述一个拟合结果的好坏。确定系数越接近1，说明拟合结果对原始数据的解释能力越强。在研究中使用SSE与R-square作为拟合结果的评价指标。 图8. LM算法与TR算法拟合优度 3.2. 实验结果 本研究采用MIT-BIH心律失常数据库对提出的心电信号拟合方法进行了评价。它包含48小时的两个通道心电记录采样在360赫兹。提出的算法在2.5 GHz Intel(R) Core(TM) i5-5200U CPU上使用MATLAB 2018b实现，并使用数据库中第一通道采集的心电信号进行测试。 根据心电信形态，采用不同的高斯个数为模型，在本研究中，对比了三到七个高斯函数模型对心电节拍拟合的效果。以10，000组心电节验证了多高斯拟合结果，确定以6个高斯函数作为本研究的拟合模型。并采用置信域方法与列为伯格–马夸尔特算法对比了SSE与R-square。两种方法拟合优度对比如图8示，LM算法普遍优于TR算法。
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user: 摘 要 铸体薄片是分析孔喉结构最常用也最直接的方法，但目前多采用描述或半定量方法。为精细评价孔喉结构等特征，实现高效可靠的岩石分类，提出了基于Otsu方法与决策树自动拾取多个阈值和采用人工经验与计算机结合拾取目标像素域两种方法，分割铸体薄片图像提取不同岩石组分。采用吐哈盆地红台构造带的10幅铸体薄片图像对两种方法进行测试，并对比了从分割后的铸体薄片图像中所提取面孔率和铸体薄片实验提供数据。结果表明：两种方法可以有效区分铸体薄片中的不同组分，基于Otsu方法与决策树自动拾取多个阈值的方法可以高效的分割铸体薄片图像组分，但无法自动区分目标；采用人工经验与计算机结合的方法，在半自动化分割图像的基础上可自动提取目标，对目标定量化评价。 关键词 :数字图像处理，铸体薄片，Otsu方法，图像分割，定量分析 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 低孔低渗储集层岩石的非均质性导致同一储集层段不同部位的产液性能产生较大的差异 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]，即便对于孔隙度基本相同的储集层其渗透率差别仍很大。孔喉结构分布是影响储集层储集与渗流性能最主要的影响因素 [ 6 ]。为对孔隙结构进行有效分析，发展出了许多微观孔隙结构研究方法：光学和电子显微镜、铸体薄片分析、CT技术、氮气吸附法、细微成像技术、高压压汞法等 [ 6 ] [ 7 ]。 岩石薄片是分析孔喉结构常用方法之一，需要专业技术人士去判读，在实际工作中，同样的样品，因不同的人、环境等都可能得出不同的判定结果，从而直接导致有误差甚至错误的目测结果，即人为因素影响到鉴定人员对储层孔隙的观察 [ 8 ]，且耗时费力。为此，许多学者对薄片图像展开研究。程国建等 [ 9 ] [ 10 ] 采用图像分割结合神经网络实现孔隙自动识别，刘烨等 [ 11 ] 结合原始图像及其形态学梯度通过支持向量机方法构建特征空间与岩石图像类别的映射关系。SINGH等 [ 12 ] 利用岩石薄片图像提取27个参数。MARMO等 [ 13 ] 利用图像处理和神经网络识别碳酸盐岩纹理。GHIASI-FREEZ等 [ 14 ] 构建半自动化模型实现孔隙类别划分。MŁYNARCZUK等 [ 15 ] 结合数学形态学处理岩石图像实现岩石分类。然而目前的图像处理方法多存在原理复杂、算法求解速度慢的不足，在实际工作中使用不便。Otsu算法为解决这一问题提出了思路 [ 16 ]，该算法被认为是图像分割处理中阈值自动选取的最优方法 [ 17 ]，但不足的是经典的Otsu算法只能计算单阈值，区别单个目标和背景，笔者在Otsu算法的基础上提出了一种多阈值拾取的方法，该方法原理简单、求解速度快，可满足工作需求。同时为满足专业技术人员的需求，另提出一种人工经验与计算机结合的图像分割方法 [ 18 ]，应用效果较好。
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user: 2. 铸体薄片简介 铸体薄片是分析孔喉结构最常用也最直接的方法，在孔隙识别和求取、储层评价等方面具有直观、可视的技术优势。它能清晰地显示储层空间的微观结构特点及孔喉在储集层中的存在方式，揭示储层中油气分布与孔隙结构、构造之间的关系，为准确识别油气层提供可靠依据 [ 19 ]。 铸体薄片的原理是将染色(红色或蓝色)环氧树脂注入到被洗油和抽空的岩样孔隙内，待树脂凝固后，再将岩心切片(按需要的方位，定向或不定向)、制片放在显微镜下观察。铸体薄片中带色的树脂部分即代表岩石二维空间的孔隙结构状态。利用铸体薄片中孔喉被染色，孔喉与骨架在色彩空间距离差异较大的原理，结合图像分割技术可以有效地区分铸体薄片组分、分析孔喉特征。同时假设该图像共有像素N个，其中被染色区域像素个数为M个，P为面孔率，则由面孔率的定义可知 [ 20 ]： P = M / N (1) 式(1)中：P为面孔率，小数；M为图像被染色区域像素个数；N为图像像素总数。
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user: 3. Otsu算法原理 Otsu法又称大津法或最大类间方差法。它是一种基于灰度直方图用最小二乘法原理推导出来的、具有统计意义上的最佳分割阈值的方法。基本原理为以最佳阈值将灰度直方图分割为目标和背景，使其类间方差最大，以达到最佳分割灰度图像的目的。 设X是一幅具有L灰度级的图像，其中第i级像素为N i 个，则： N = ∑ i = 0 L − 1 N i (2) P i = N i N (3) 式(2)、(3)中：N为图像像素总数；N i 为第i级像素个数；P i 为第i级像素出现概率，小数。 选定一个阈值k将所有的像素分为C 0 、C 1 两类。其中C 0 类的像素灰度级为0~k，C 1 类的像素灰度级为k + 1~L − 1。则图像总平均灰度级及C 0 、C 1 的平均灰度级为 [ 21 ]： μ T = ∑ i = 0 L − 1 i P i (4) μ 0 ( k ) = ∑ i = 0 k i P i (5) μ 1 ( k ) = ∑ i = k + 1 L − 1 i P i = μ T − μ 0 ( k ) (6) 式(4)、(5)、(6)中：i为像素灰度级；μ T 为图像总平均灰度级；μ 0 为C 0 类的平均灰度级；μ 1 为C 1 类的平均灰度级。 两部分图像所占面积比例分别为： ω 0 = ∑ i = 0 k P i (7) ω 1 = ∑ i = k + 1 L − 1 P i = 1 − ω 0 (8) 式(7)、(8)中：ω 0 为C 0 类图像所占比例，小数；ω 1 为C 1 类图像所占比例，小数。 令k从1~L − 2变化，使其类间方差 σ k 2 最大的k值即寻找的最佳阈值 [ 16 ]： σ k 2 = ω 0 ( μ 0 − μ T ) 2 + ω 1 ( μ 1 − μ T ) 2 (9) 式(9)中： σ k 2 为阈值为k下的类间方差。
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user: 4. 多阈值图像分割讨论 4.1. 基于Otsu方法和决策树拾取多个阈值 Otsu方法可以有效将图像分割为两类，但实际图像常常存在多个目标，所以需要对图像进行多阈值分割。这里引入决策树或多级分类器的概念：决策树是模式识别中对于多类或多峰问题进行分类的有效方法，它采用分级问题使分类问题逐步得到解决 [ 22 ]。一般一个决策树由一个根节点N 1 ，一组非终止节点N i 和一些终止节点N j 组成，从而把特征空间分成若干个区域(如图1所示)。 图1. 决策树示意图 笔者采用二叉树(指除叶节点外，每个树的节点仅分为两个分支)的方式，在每个节点处利用Otsu方法确定的阈值作为每个节点的决策规则，将图像在灰度空间的像素值划分为两类。在该二叉树成型后，各节点处所取阈值即为最终图像分割所取阈值，可知阈值个数为(i + j)个，图像被分割为(i + j + 1)个部分。设分割后的图像为 C 1 ， C 2 ， ⋯ ， C i + j + 1 ，可知对于任意两个图像 C m ， C n ( m ， n ∈ [ 1 ， i + j + 1 ] ) 交集为空集，且 C 1 ， C 2 ， ⋯ ， C i + j + 1 的并集为原始图像。 值得一提的是，利用此方法确定的多个阈值对于整个图像来说不一定是最优阈值，但各阈值是对应节点处Otsu准则下的最优分割阈值。 4.2. 人工经验与计算机结合实现图像分割 专业鉴定人员的孔喉判定经验是宝贵的，为充分利用其长期的经验，笔者借助matlab平台 [ 23 ] 采用人工经验和计算机结合的方式提取铸体薄片图像的不同组分。图像可以分割是因为各目标位于色彩空间中的不同区域，显然这些区域之间距离越大可分割性就越大。所以，对于目标与背景的色彩级有明显差别的图像，图像分割可以取得很好的效果。 铸体薄片图像中不仅因孔喉被染色而呈现出不同色彩，而且矿物骨架由于含有物、颜色、密度等不同其在图像色彩空间中也表现为不同的像素值。对于图像，同一个目标拥有相似的色彩，同时由于各目标非均匀，其在像素值表现为一个像素值区域，也就是说若能到得到各目标像素值上下限，即可实现对目标的提取。基于此，利用人工选取目标在色彩空间的特征，即像素值范围，介于该像素范围内的像素点即属于相应目标，采用像素扫描方式对图像分割、实现目标提取。
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user: 5. 计算机实现与实例分析 5.1. 实现流程 基于以上分析，采用图2所示流程图实现了图像分割。 图2. 图像分割实现流程图 图2所示流程可分为两条线路，其中左侧为基于Otsu方法和决策树拾取多个阈值实现图像分割的方式，右侧为人工经验与计算机结合实现图像分割的方式(为方便起见，后文统称左侧线路为方式一，右侧线路为方式二)。实现过程中，在输入图像后用户可选择实现图像分割的方式，对于方式一首先需要选择合适的灰度化方式 [ 24 ] 对图像进行预处理以提高后续处理效率(本文采用加权平均法实现灰度化)，同时在观察图像和分析实验资料基础上，确定图像中分布的几种主要岩石组分以输入阈值个数，采用4.1节所述原理对图像实现分割；对于方式二，则需要在观察图像的基础上，拾取各目标在色彩空间的特征，确定各目标像素值上下限后，采用像素扫描方式实现图像分割。 5.2. 实例分析 为验证两种方法的可靠性与有效性，笔者采用吐哈盆地红台构造带的10幅铸体薄片图像对两种方法进行测试，并对比了采用方式二分割后的铸体薄片图像所提取面孔率和实验提供数据。分析使用图片格式为JPG，颜色模式为RGB，使用计算机处理器为Intel(R) Core(TM) i5-7400 CPU@3.00GHz，四核，实现的基础平台为MATLAB系统。 表1给出了双阈值和双目标分割图像的耗时(其中方式二各目标输入特征为4个，人工输入时间不计入耗时)。图3给出了其中两张铸体薄片图像采用方式一的分割效果，图4给出了相同图像采用方式二分割后的铸体薄片图像，图5给出了10幅图像采用方式二分割的铸体薄片图像所提取面孔率与薄片实验数据的对比表。 Table 1 Time consuming comparison of 10 image 图片大小 耗时(s) otsu方法与决策树结合 人工经验与计算机结合 762*141*3 0.770996 1.590401 652*1204*3 0.587614 0.952892 768*1416*3 0.778709 1.635152 771*1419*3 0.746581 1.646929 767*1414*3 0.739085 1.603513 770*1415*3 0.743292 1.577627 769*1419*3 0.741107 1.578972 764*1419*3 0.741434 1.573107 768*1421*3 0.744957 1.577184 765*1418*3 0.732701 1.632375 表1. 10幅图像的耗时对比 由表1可知，两种方式分割铸体薄片图像的效率是极高的，同时基于Otsu方法和决策树拾取多个阈值下的分割效率优于人工经验与计算机结合的铸体薄片分割效率。 图3. 基于Otsu方法和决策树的多阈值铸体薄片分割效果 从图3可以看到，采用单阈值Otsu方法分割图像时可以将原始铸体薄片中像素差异大的目标和背景区分开来，由图3(b)~图3(d)、图3(f)~图3(h)可知将Otsu和决策树方法结合可对铸体薄片进行有效多重划分，随着阈值个数的增加，图像被分割的更加精细。不足的是，由于目标在各图像中的不一致性，且在该自动拾取阈值的过程中没有加入经验因素，使得该方法目前虽可以有效分割图像，但在分割过程中无法识别所要提取目标。 图4. 人工经验与计算机结合实现多目标图像分割效果 从图4可以看到，采用人工经验与计算机结合的方式分割图像可提取图像中感兴趣的目标(图4(b)，图4(c)，图4(e)，图4(f)中，黑色部分为铸体薄片中被染色的孔喉，图4(c)，图4(f)中，深灰色部分为铸体薄片中黑色矿物)。结果表明该方法可以有效分割图像、提取目标。同时在实现该过程中，只需拾取目标像素值(目标色彩空间的特征)，即可完成对图像的分割以及目标的提取，大大降低了对专业知识和经验的依赖程度。 图5. 分割图像提取面孔率与薄片实验数据对比 图5为分割图像提取的面孔率与薄片实验数据的对比，个别点偏移y = x较大，绝大部分点分布在y = x周围，说明此方法提取目标的结果可靠性受人为影响，但无疑这种方法是简单且可行的。
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user: 6. 结论 对于本文中提出的两种分割图像的方法，结合铸体薄片图像，得到如下结论与认识： ① 基于Otsu方法与决策树自动拾取多个阈值的方法可以高效的分割铸体薄片图像，将铸体薄片图像中岩石的不同组分区分开来，但无法自动区别目标。 ② 采用人工经验与计算机结合的方法可以半自动分割图像，提取目标分布特征，且该方法提取结果的可靠程度与经验有关，但大大降低了对经验的依赖程度并提高了工作效率。 ③ 基于Otsu方法与决策树自动拾取多个阈值和采用人工经验与计算机结合分割铸体薄片图像、分析孔喉特征的方法是可行且有效的。
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user: 摘 要 本文主要阐述的是通过计算购物者在购物过程中脑波数据和外在面部情绪表情来判断和辅助选择商品。通过对购物者进行购买欲望建模，通过建立计算体系模型来模拟其思维活动，进而实现决策——从中选出需要或可能需要的产品。同时在决策过程中，购物者会产生相应的思维情绪，本模型也考虑了情绪因素在决策中的影响。 关键词 :脑机接口，情绪计算，辅助决策，潜意识，购物欲望 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial International License (CC BY-NC 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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user: 1. 脑波的分析概述 脑波(英语：brainwave)亦称“脑电波”，脑波是神经元细胞之间传递信息时产生的生物电信号；是大脑皮质中的锥体细胞突触活动时产生的离子交换而产生的电波信号 [ 1 ] 。脑细胞只要是活动就会产生相应的生物电，也是这些电通过树突来跟别的脑细胞进行联接，形成思维的网络。 不同的脑波对应不同的特性，如：Theta (θ)属于“潜意识层面”的波。存有记忆、知觉和情绪。影响态度、期望、信念、行为。创造力与灵感的来源。深睡做梦、深度冥想时，心灵觉知、个人见识较强、个性强。Alpha (α)属于临睡前头脑茫茫然的状态。意识逐渐走向糢糊。Beta (β)属于放松但精神集中。思考、处理接收到外界讯息、激动、焦虑等 [ 2 ] 。情感计算的概念由Picard提出，1997年正式出版《Affective Computing (情感计算)》。在书中指出“情感计算就是针对人类的外在表现，能够进行测量和分析并能对情感施加影响的计算”。人类的情绪最显著的外在表现为脸部表情，但是人类也可以控制自己的脸部表情，但是在放松环境下面部表情会在下意识的情况下表现出来。靠面部表情来判断一个人的情绪会有所误差。人的情绪在外在表现的同时内在思维环境也会发生显著的变化，这点会在脑电波的变化中显现出来。在购物环境中，购物者购物过程中我们可以通过特定的、有针对性的几种类型的脑波记录和分析以及结合购物者外部情绪表情特征来判断购物者的情绪，这样会使情绪计算更为准确。
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user: 2. 脑电波分析和外部表情分析模型 购物者在购物过程中会主动的去接受和搜索寻求满足和丰富他们生活需求的产品和服务。此时，产品的信息会通过信号经过购物者的接收媒介转化为购物者思维环境中的大脑的信号。购物者通过认知处理对消费产品信息进行理解和记忆 [ 3 ] ，同时激发购物者的心里活动，即内心对商品进行评估和购买决策的过程。这个过程中购物者会根据需求产生购买的动机，以及产生消费目标。购物者从接收外部商品的信息到购物者内部心里活动的过程中，购物者的脑电波也会从产生一系列的变化。如所需的商品符合购物者的需求或超过购物者预期的需求时，购物者内心同时会产生满足或惊喜、商家的活动如打折、促销、免费体验等也会影响到购物者的情绪变化。当然有真面的情绪也有负面的情绪。这些情绪会不由自主的在消费者的外在表情和行为表现出来。对情绪最容易表现的是人脸上不同情绪的反应，当然也比较能克制脸部情绪表现的，但是克制过程中人情绪变化而不能忽略的是脑波的变化。所以购物过程中购物者会根据内心活动情绪反应产生脑电波的一系列剧烈变化再结合外部情绪的表现来计算购物欲，我们根据这两点结合，设计了此消费选择模型。 如图1所示，此消费模型实际可以分为外部环境和购物者的本身的内部环境，从信息传输和处理的过程来说，我们可以看成购物者通过转换媒介将外部环境的信息转换为内部环境的信息，最后通过外部环境的设备进行收集购物者处理信息时候所呈现的信息进行加工，最后反馈给购物者做决策。购物者在进行购物过程中，首先是对不同商品信息的认知，这个过程中就是对相关商品及与商品相关信息的输入，购物者的不同决定了购物者得出的结论也是不同的。而且即使同一个购物者在不同的条件下如时间、方式等对同样的商品认知的结论一样有差别。当着写商品以及与商品关联的信息被购物者所认知，当这些认知和购物者的需求相关联的时候，购物者会对商品的注意力会加强，商品的各类信息以及与之相关的信息如广告、促销等会被购物者加强输入。购物者会根据当前的信息结合自身情况进行分析、推理、判断等一系列思维活动，而这过程中会加剧的思维活动，而且思维活动会通过购物者的外部表现所呈现。会被脑电波收集装置所接收，然后进行处理，同时外部设备会捕捉当前购物者的外部表现如脸部表情等 [ 4 ] ，进而通过脑电波计算和外部表现来综合计算购物者购物需要。并通过软件将商品加入到购物者的虚拟购物车内。这是一个辅助选择的过程，辅助选择减少了对商品手动添加的过程，这个过程是被动的，是一种智能手段，简化了购物的流程和时间。不过最终的购买的决策还是主动掌握在购物者手中而且大 图1. 购物者购买欲计算模型 大加强了购物者的购物体验。从外在环境的刺激因素来看，外部环境的商品和与商品关联的信息是最初的外部刺激因素，这种刺激会引起购物者的内在心理反应，产生购物需求，在需求刺激下产生购买动机，最后在动机驱使下产生购买商品的决策。我们这个模型在传统的最初刺激因素下，加强了购物的体验，在辅助选择的后反馈给购物者，在购物者产生购物决策前，再次加强了刺激因素，是消费者增加了购买决策可能性。
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user: 3. 购物过程中消费欲中计算算法设计 对于消费场景的脑波融合情绪的计算系统，我们可以设计用于购物欲望值的计算体系模型如图2所示，包括外部环境系统、内部环境系统、主控制系统和转换系统，所述外部环境系统通过转换系统与内部环境系统进行连接，所述内部环境系统安装在主控制系统内，其外部环境系统包括商品信息采集模块、面部信息采集模块、脑电波采集模块和智能选择模块，所述商品信息采集模块、面部信息采集模块、脑波采集模块与智能选择模块进行电连接。 对于消费场景中商品信息采集模块用于采集消费产品信息的采集和商家活动信息的采集，所述商家活动信息包括打折、促销及免费体验。面部信息采集模块用于进行消费者面部进行的采集，所述面部信息模块将采集后的信息通过情绪计算模型进行计算； 情绪计算模型具体如下：Sf → (if(max(Te， Ef) > sum(Te， Ef) * 0.618)， 1， 0)；其中Te表示眼聚焦时间，Tf表示脸部表情变化时间。 整个脑电波采集模块用于采集消费者的脑电波信息，所述脑电波采集模块将采集后的信息通过脑电波计算模型进行计算，其整个脑电波计算模型具体如下： u = R / ( 1.8 / 4096 ) / 2000 图2. 购物欲望值的计算体系模型 对于其中所述u表示脑电波电压数据，所述R表示原始脑电波数据； 放大电压信号U = u * 2000； 平均电压信号：Ave (U)； 累计场景脑波信息 ， 其中 ，m大于0小于等于1； 因此，消费欲望脑波信号判定Sb → (if (Ave(U) * n < Ss， 1， 0)。 整个智能选择模块用于根据商品信息采集模块采集到的信息、脑电波采集的信息和面部信息采集模块识别到的信息，进行商品的虚拟化选择，虚拟化的选择即通过将商品放入虚拟购物车中，从而刺激消费者产生购买动机，最后的动机的驱动下使消费者产生购买商品的决策。其转换系统用于将外部系统中采集的信息转换为内部系统中的脑信号。对于内部环境系统用于接受外部环境系统采集的信息，并将信息传递给主控制系统，所述主控制系统用于对信息进行分析、处理，从而完成购物过程。 综合上述设计，我们可以描述购物欲望值采用LF-BCI-EC计算模型，所述LF-BCI-EC计算模型具体如下： Buy → (if (Sb * Sf > 1)， Ss * ((max (Te， Ef)/sum(Te， Ef) * 0.618)， 0)； 其中Buy表示购物欲望值，Sf表示购物欲望面部情绪信号判定，Sb表示购物欲望脑波信息判定。上述计算模型的设计，主要用于阐述消费者通过脑电波计算模型和情绪计算模型综合判定购买欲望的理论框架和实现值，同时也给出了对于认知理论体系中关于正向刺激能带来认知增强的逻辑描述。
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user: 4. 结论与展望 本文阐述了通过购物者在购物过程中脑波变化和外在面部情绪表情来判断和辅助选择商品 [ 5 ] 。主要是通过特定种类的脑波在购物过程中产生的特有的变化来计算出购物者的消费意向。提出了更新的消费体验，同时这种辅助决策节省了购物过程时间，但最终的决策还是掌握在购物者手中，不会出现错误的购买现象。同时脑波计算和表情的集合会使计算的结果相互参照，也大大提高了脑计算的准确性 [ 6 ] 。将来也可以根据客户数据的反馈来修正计算公式，使用脑计算的公式更加完善。 本模型创新点在于不仅仅只是通过情感计算及脸部识别来增强预测用户消费欲望，进而进行辅助购物决策，同时还整合了脑波生理数据辅助决策，进而提高整体准确率。 关于脑波计算研究越来越多元化，并逐渐向着复合指标与大数据结合的整合方向发展，随着计算机语言在不同领域的渗透与应用，基于人工神经网络和人工智能的方式使得脑波计算有了更多的选择，同时应用面也会越来越广。因此，可以预见的是，随着互联网技术的发展、多维度大数据分析手段的运用和人工智能以及其学习技术的融合 [ 7 ] ，对于脑波计算的发展会越来越成熟，相应的应用也会更为广泛。
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user: 摘 要 Stolz定理是求解未定式型数列极限的一个有效工具。本文弱化了Stolz定理成立的条件，给出了更一般形式的Stolz定理及其严格的证明过程。通过一道大学生数学竞赛题目阐述推广后的Stolz定理在求解数列极限中的灵活应用。 关键词 :Stolz定理，未定式型数列，极限 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 Stolz定理是求解未定式型数列极限的一个非常有效的工具，常被称为数列极限的“L’Hospital法则”，在研究生入学考试和大学生数学竞赛中得到了广泛应用。目前，有很多学者对其推广形式进行了研究，如文献 [ 1 ] [ 2 ]。本文对Stolz定理进行了分析，弱化了其成立的条件，给出了更一般形式的Stolz定理。不同于已有文献，给出了其严格的证明过程。最后，通过一道大学生数学竞赛题目具体说明了推广的Stolz定理的应用。
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user: 2. Stolz定理 文献 [ 3 ] 中给出的两种形式的Stolz定理是处理 ∗ ∞ 型和 0 0 型数列极限的有效工具，阐述如下： 定理1：( ∗ ∞ 型)设数列 { x n } 、 { y n } 满足：1) 数列 { y n } 从某一项开始严格单调增加；2) lim n → ∞ y n = + ∞ ；3) lim n → ∞ x n + 1 − x n y n + 1 − y n = A (其中 A 为有限数、 + ∞ 、 − ∞ )，则 lim n → ∞ x n y n 存在，且 lim n → ∞ x n y n = lim n → ∞ x n + 1 − x n y n + 1 − y n 。 注1：定理1在应用过程中，不能笼统地说若 A = ∞ ，即 lim n → ∞ x n + 1 − x n y n + 1 − y n = ∞ ，不一定有 成立。 例如，分别取 x n = 1 2 [ 1 + ( − 1 ) n ] n 2 ， y n = n 。即 { x n } = { 0 ， 2 2 ， 0 ， 4 2 ， ⋯ } ，虽然 lim n → ∞ x n + 1 − x n y n + 1 − y n = ∞ ，但是 { x n y n } = { 0 ， 2 ， 0 ， 4 ， ⋯ } ，显然 lim n → ∞ x n y n ≠ ∞ 。 定理2：( 0 0 型)设数列 { x n } 、 { y n } 满足：1) 数列 { y n } 从某一项开始单调递减趋于0；2) 数列 { x n } 趋于0 (但未必单调)；3) lim n → ∞ x n − x n + 1 y n − y n + 1 = A (其中 A 为有限数、 + ∞ 、 − ∞ ，则 lim n → ∞ x n y n 存在，且 lim n → ∞ x n y n = lim n → ∞ x n − x n + 1 y n − y n + 1 。 注2：由Stolz定理，能得到以下几个非常有用的结论：1) 若 lim n → ∞ x n = a ，则 lim n → ∞ x 1 + x 2 + ⋯ + x n n = a ；2) 若 lim n → ∞ x n = a ，且 x i > 0 ，则 lim n → ∞ x 1 x 2 ⋯ x n n = a ；3) 若 lim n → ∞ x n = a ，则 lim n → ∞ x 1 + 2 x 2 + ⋯ + n x n 1 + 2 + ⋯ + n = a ；4) 若 x i > 0 ， lim n → ∞ x n + 1 x n = a ，则 lim n → ∞ x n n = a 。 以上结果分别称之为算术平均值、几何平均值、加权平均值极限定理；第4个结果从理论上说明了正项级数敛散性判别法中，根值法较比值法的判别范围更加广泛。
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user: 摘 要 牛β防御素4 (BNBD4)是一种天然存在于牛肺脏肺泡巨噬细胞内的抗菌肽，本研究拟通过克隆BNBD4成熟肽片段的编码区序列，连接至真核表达载体pPIC9K构建重组质粒mBNBD4-pPIC9K，转化至毕赤酵母菌株GS115诱导表达，镍柱纯化后，经Tricine-SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定，成功获取重组蛋白mBNBD4，为进一步研究牛防御素BNBD4的作用机制提供试验材料。 关键词 :防御素，BNBD4，成熟肽，真核表达，纯化 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 防御素是阳离子抗菌肽(Antimicrobial peptides， AMPs)中最常见的类型之一 [ 1 ] [ 2 ] ，和其它抗菌分子一起存储于嗜中性粒细胞和巨噬细胞的细胞质颗粒中，通过上皮细胞被分泌至细胞外环境中发挥作用，因此防御素作为宿主早期防御系统的成员具有重要的抗感染作用 [ 3 ] 。1991年，β-防御素在牛舌上皮细胞中被首次发现 [ 4 ] ，随后又从牛中性粒细胞中分离到其它13种β-防御素 [ 5 ] 。研究已证实牛肺泡巨噬细胞中共检测到4种β-防御素基因的表达，其中就包括BNBD4 [ 6 ] ，并且关于抗菌肽在分枝杆菌感染患者中的表达情况也说明抗菌肽类物质(包括防御素)具有发展成为新型抗结核药物的可能性 [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] 。 本研究拟采用真核表达的方法获取重组蛋白mBNBD4，并通过镍柱纯化，以及Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法检测验证，为后续进一步研究BNBD4的作用机制提供试验材料。
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user: 2. 材料和方法 2.1. 材料 毕赤酵母宿主菌株GS115，购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；pPIC9K毕赤酵母表达载体，购自美国invitrogen公司；无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒，购自美国OMEGA公司；遗传霉素G418 (Geneticin)，购自美国INALCO公司；镍离子琼脂糖蛋白纯化柱，购自美国GE Healthcare公司；TOP10大肠杆菌感受态细胞，购自北京天根生化科技有限公司。 2.2. 引物设计 根据GenBank上公布的BNBD4基因的CDs序列，以及真核表达载体pPIC9K上的酶切位点EcoR I和Not I设计PCR引物，为了方便以后的蛋白纯化，设计时需在下游引物中插入一个6 × His·tag序列 [ 10 ] [ 11 ] ，因此，获得的PCR引物序列如表1所示。 Table 1 Primers for mature BNBD4 gene clon 名称 引物 mBNBD4 F: 5-GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3 EcoR I R: 5-GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT-3 Not I 6 × His·tag 表1. BNBD4成熟肽基因克隆引物序列 2.3. BNBD4基因扩增 以正常牛肺脏RNA反转录后获得的DNA为模板进行PCR反应，反应条件：95℃，1 min；95℃，20 sec，62℃，20 sec，72℃，30 sec (35 cycles)；72℃，5min。琼脂糖凝胶电泳分析之后，试剂盒回收PCR产物。 2.4. 真核表达载体的构建 使用内切酶EcoR I和Not I分别对PCR产物和表达载体pPIC9K进行双酶切后，使用T4 DNA连接酶将PCR产物导入载体中，并将连接产物转化至TOP10大肠杆菌感受态细胞，转化完成后涂布200 μL转化产物于平衡至室温的LB/Amp + 固体培养基培养板，37℃培养14~16 h，挑取LB/Amp + 固体培养基上的单克隆菌落，大量培养后提取重组质粒DNA，进行双酶切鉴定后，送检测序，同时将构建好的重组载体命名为pPIC9K-mBNBD4。 2.5. 阳性转化子的筛选及PCR鉴定 采用电转化方法分别将5~20 μg纯化后的线性化质粒DNA (pPIC9K-mBNBD4和pPIC9K)转化至100 μL新鲜制备的GS115感受态细胞中，将转化液涂布于MD平板后置于28℃恒温培养箱中培养，2天以后观察转化子的生长情况，生长出的单克隆即为His+转化子。然后再依次对His + 转化子进行G418抗性(高拷贝转化子)筛选和Mut + 转化子(甲醇诱导型)筛选。筛选完成后，根据真核表达载体pPIC9K上的通用引物序列和插入片段mBNBD4的引物序列合成两对引物，以提取的毕赤酵母阳性转化子DNA为模板进行PCR鉴定。 2.6. 重组蛋白mBNBD4的诱导表达 将PCR鉴定后的阳性转化子首先接种于10 mL的YPD液体培养基中，28℃培养16~18 h；收集菌体后接种至25 mL的BMGY诱导表达前培养基中，28℃培养18~24 h；离心收集菌体接种至200 mL的BMMY诱导表达培养基中，28℃连续培养4天，每隔24 h需补充甲醇至终浓度为1%；每隔12 h收集1 mL表达培养液，离心取上清，Tricine-SDS-PAGE [ 12 ] 鉴定蛋白表达结果。 2.7. 重组蛋白mBNBD4的纯化及Western Blot鉴定 将大量诱导表达后的重组蛋白mBNBD4培养液离心取上清后，通过镍离子琼脂糖蛋白纯化柱进行纯化。纯化后的mBNBD4重组蛋白首先使用Tricine-SDS-PAGE电泳进行分离检测，然后再使用鼠抗6 × His·tag单克隆抗体进行Western Blot鉴定。