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user: 3. 结果与讨论 3.1. 材料的组成与结构 纳米复合材料的形貌、粒径和荷电性是决定载药系统是否能够以稳定的形态通过循环聚集到肿瘤组织区域、实现靶向运载和协助胞吞的关键。因此，利用DLS和SEM观察了所制备材料的形貌、粒径分布以及材料荷电情况。所制备PDA，ICG/PDA NPs的组成与结构表征结果如图2所示。 SEM结果表明，PDA与ICG/PDA纳米材料的形态完整均匀，均是单分散状态微球(图2(a)，图2(b)，图2(d)，图2(e))，这有利于材料实现胞吞。PDA NPs和ICG/PDA NPs的最终的平均水合粒径分别为222 nm，226 nm (图2(f))，与SEM结果一致。ICG/PDA NPs的ζ电位较PDA NPs呈现负向增加，侧面说明ICG实现了成功装载(图2(c))。 图2(g)是DA·HCl与PDA的UV-vis吸收光谱对比图，在DA聚合形成PDA后不仅在溶液颜色上发生了明显的改变，从无色透明的DA溶液变成了深棕色的PDA溶液，也在UV-vis光吸收上实现了从无到有的变化。从图中可知深棕色的聚多巴胺在紫外到近红外的波长范围内有宽频段的单调吸收。如图2(h)所示，图中红色曲线和蓝色曲线分别代表了冻干处理后的PDA NPs和DA·HCl粉末的红外光谱图。与DA·HCl相比，PDA在1300~400 cm −1 指纹区的吸收峰精细性较差。众所周知，指纹区对分子结构的变化高度敏感，由此可推测出DA·HCl分子结构在聚合形成PDA过程中发生了结构性的变化，黑色虚线标志的1520、1615和3420 cm −1 处的吸收带分别对应了先按结构中的N-H、芳环上的C-H和儿茶酚基团中的-OH的剪切振动，这些特征吸收带的明显变化也在结构变化上证明了PDA生成。 UV-vis吸收曲线显示，复合后的ICG/PDA材料较ICG的特征吸收峰明显红移，这是由于当ICG分子吸附到正在聚合的PDA纳米颗粒表面后，相互接触的ICG分子通过离域电子的传导致使材料吸收峰发生红移，说明PDA的大量离域π电子与芳香分子ICG之间发生了π-π共轭，实现了ICG的成功装载(图2(i))，通过UV-vis测得的吸光度与材料浓度的对应关系，对ICG/PDA复合纳米材料进行载药量计算，最终算的ICG/PDA材料的ICG装载率达到了4%，包封效率约69%。 图2. 组成与结构表征结果图。(a， b) PDA的SEM图；(d， e) ICG/PDA的SME图；(c) zeta电位；(f) 水合粒径；(g) PDA与DA的UV-vis吸收曲线比较图；(h) PDA与DA的傅里叶红外(FT-IR)曲线；(i) ICG/PDA体系的UV-vis吸收曲线比较图 PDA复杂的连接方式决定了PDA对光的吸收在一定波长范围内呈现出连续性，结构的变化也赋予了PDA在近红外光照辐射下可实现光吸收与光热转换，其过程可描述为PDA分子的价电子吸收近红外光子能量后发生量子化的能级跃迁，而PDA独特的聚合方式所形成的分子内与分子间氢键与π-π堆叠决定了PDA分子的激发价电子以热的形式释放能量发生非辐射衰减来实现PDA的光热转换，而这种非辐射衰减的方式决定了激发态电子不经过发射荧光，而是通过猝灭或能量转移的方式回到基态，这种能量转移形式能够解决光热剂与光敏剂协同治疗过程中吸收不匹配或能量转移、复杂的共轭化学等问题。因此，理论上PDA独特结构决定其能够在与光敏剂ICG共同制备合成的光热/光动力协同治疗体系能够实现合适能量吸收匹配与转移，并猝灭ICG的荧光，保证ICG在体系内的稳定性，从而达到提高了ICG的单线态氧产率的目的。与此同时，ICG装载到纳米颗粒表面之后，与周围的水/氧分子之间接触减少，相互作用减弱，有利于降低光漂白作用，并且其分散性增加，阻止了ICG分子间的进一步聚集，解决了ICG单独存在时所具有的浓度聚集性以及ICG单独存在时更容易出现光漂白现象的问题，这也从理论上证明了后续材料体外光热转换实验结果。 3.2. 光热转换与活性氧产生 本研究制备的ICG/PDA体系是用于光热/光动力联合治疗的纳米载药体系，因此，我们采用近红外照相机和UT325接触式数字测温仪测试了不同材料光热转换能力以及光热循环稳定性，以次来评估所制备的ICG/PDA材料是否具备光热治疗的能力。此外，我们通过DCFH-DA对材料产生活性氧的速度和最终产量进行测试，以评估所制备ICG/PDA材料是否具备光动力治疗的能力。我们按照图3(b)所示方法对材料进行了近红外光照辐射并测试，结果如图3所示。 图3. 材料性能表征结果图。(a) ICG/PDA体系光热转换吸收曲线比较图；(b) 光照试验示意图；(c) 光热转换原理图；(d) ICG；(e) ICG/PDA与(g) PDA的光热循环曲线；(h) ICG/PDA体系的光热循环稳定性比较图；(f) ICG/PDA的活性氧测试结果图；(i) ICG的活性氧测试结果图 从图3(a)，图3(c)可直观的发现，在相同PDA浓度和光照条件下，不同材料温度随时间上升，且上升速度呈现为ICG/PDA > PDA > ICG > UP水，充分说明了所制备的ICG/PDA材料较ICG和PDA具有更好的光热转换效果，材料分散溶液温度能够在光照10 min后升高约31.5℃，此外，ICG/PDA材料在光照下温度上升速度较ICG和PDA更快。 图3(d)，图3(e)，图3(g)分别是ICG、ICG/PDA、PDA的光热循环温度变化曲线，图3(h)是ICG/PDA体系的光热循环温度变化比较图，结果表明，ICG/PDA和PDA具有较好的光热循环稳定性，而ICG在近红外光照辐射下温度上升幅度逐渐减小，这说明与PDA复合形成ICG/PDA复合纳米材料之后，实现了光照循环的稳定，避免了ICG光照漂白失效的发生。 图3(f)，图3(i)分别是用DCFH-DA溶液分散的ICG/PDA和ICG在1 W/cm 2 的近红外光照辐射下照射10、20、30、40、50、60 min后的荧光发射曲线。上升幅度越高，说明产生活性氧越多，曲线斜率越大，说明活性氧产生速度越快。结果表明，随着照射的进行，材料的活性氧产量逐渐增加，且ICG/PDA的活性氧产生速度较ICG更快，在最终试验结束时活性氧终产量较ICG更多。 3.3. 细胞毒性与抑癌效应 材料的生物相容性决定了材料是否能够应用于人体，因此，生物安全性与生物相容性是生物医学材料在临床应用中必需高度关注的性能，也是评价所有肿瘤纳米载药体系的重要环节。在本节中，对制备的复合纳米材料的细胞毒性、细胞内化以及光照毒性抑制等进行评价。ICG/PDA材料对人脐静脉内皮细胞HUVECs的细胞毒性，结果如图4(a)，图4(b)所示。 图4. ICG/PDA材料的细胞毒性和内化结果图。(a) 与ICG/PDA材料共培养24 h后HUVECs形态图；(b) HUVECs细胞毒性定量图；(c) SKOV3细胞内化结果图 图4(a)结果表明，材料对HUVECs细胞的细胞数量与细胞生长状态都没有较显著的影响，仅在高浓度材料共孵育条件下有极少数细胞呈圆缩、疏松贴壁，但无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变，能够观察到轻微的细胞生长抑制现象，没达到细胞毒性的标准。如图4(b)所示，随着材料浓度的上升，不同材料组细胞存活率均 > 80%，说明本实验制备的材料均具有较好的细胞生物相容性(c ≤ 200 μg/mL)。 图4(c)是SKOV3细胞与浓度为100 μg/mL的ICG/PDA共培养2 h后，在功率密度为1 W/cm 2 的近红外光照下材料内化的结果图，红色的荧光是ICG通过能量转换发射出的荧光，蓝色的荧光是核定位染料DAPI的荧光，结果表明，ICG/PDA能够有效进入细胞内部，此外，在近红外光照下，ICG/PDA能够解离开来，并释放ICG分子，解离下来的ICG不仅在细胞质内扩散，还能够进入细胞核内，有利于进一步的治疗开展。 为了进一步测试材料入胞后活性氧产效，本研究采用DCFH-DA试剂盒对细胞进行了活性氧测试。将含相同ICG浓度(10 μg/mL)的不同材料溶液分别与不同细胞共培养后进行光照辐射，通过在倒置荧光显微镜下拍取SKOV3细胞荧光照片对材料经过近红外光照后在胞内产生的活性氧量进行评价与分析，结果如图5所示。 图5. 材料在细胞内活性氧生产测试结果图 图示蓝色荧光是核定位染料DAPI的荧光，绿色荧光是DCFH-DA试剂被材料产生的活性氧所氧化，形成了绿色荧光物质，荧光越强说明产生的活性氧越多。Control组和PDA组的细胞未出现显著绿色荧光，说明细胞本身和PDA材料无活性氧产生，而在与含有ICG的材料共孵育后的细胞组光照后均出现了绿色荧光，说明活性氧是ICG在近红外光照条件下产生的，且合成的ICG/PDA材料具有较好的活性氧产生量。 最后，我们通过Calcein-AM/PI细胞活死染色定性评价了ICG/PDA材料对细胞的光毒抑制作用。通过控制激光照射距离和输出功率，获得激光功率密度为2.2 W/cm 2 、辐照圆圈直径为1 cm的光照条件。将前一天用6孔板接板的细胞与含有ICG浓度为10 μg/mL的ICG/PDA材料共孵育2 h后，将激光光斑中心调节至与6孔板(d = 3 cm)中心重叠后进行时长10 min的近红外激光辐照。 图6是SKOV3细胞的未光照区域、光照过渡区域和光照辐射区域细胞活死染色图，绿色是Calcein-AM染料染色的活细胞，红色是PI染料染色的死细胞，染色不明显的细胞可能存在凋亡趋势。Calcein-AM/PI细胞活死染色图结果表明，没有光照的部分细胞边缘清晰且形态饱满，核质分明；而进行了光照部分的细胞周围材料沉积显著且细胞扁平而破碎，核质不清；过渡区域由于处于能量边界区域，出现了活细胞死细胞共存的现象。结果表明光热–光动力协同治疗具有高选择性，同时也提示临床选择合适的光照辐射区域与激光辐照强度是实现肿瘤根治的必要条件。 图6. 材料对细胞的光毒抑制作用测试结果图