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user: 2. 材料与方法 2.1. CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligonucleotides， CpG-ODN)的制备 本实验使用之不同序列的CpG-ODN是收集过去已发表且与鱼类有关的30段ODNs和与人类有关的11段ODNs，利用Perl程序语言撰写的oligo-mer计数程序，找出这些ODNs序列中出现较多频率的连续5个核苷酸(5-mer)或6个核苷酸(6-mer)以CpG为核心的基序后，将这些序列随机组合成21~24个核苷酸长度的四段CpG-ODNs，包括：ODN2050、ODN2051、ODN3006及ODN4006 (表1)。此外，本实验使用已知能增强虾子免疫力的ODN2006 [ 15 ] 以及已知对虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为抑制性的ODN2140 [ 20 ] 分别作为促进性和抑制性的对照组，以进行各项实验分析与比较。所有ODN皆委请生工有限公司(MDBio， Inc.)代为制作。于体外实验时，各种CpG-ODN以M199配制成1、2、5、10、20、30及40 μg/mL Table 1 Six CpG-oligonucleotides used in the stud CpG-ODN’ Sequence (5’®3’) CpG-ODN’ Sequence (5’®3’) ODN2050 GCGGCGCGCGGCGCGCGCGC ODN4006 TCGTCGTTTTGCGTCGTTTTCGTT ODN2051 GTCGTTTCGTCGTCGTCGTTTCG ODN2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT ODN3006 TCGTCGTTTTGGTCGTCGCTCGTT ODN2014 TCGTCGTTTTGCGTGCGTTT 表1. 本实验所使用之六种CpG寡聚脱氧核苷酸 等不同浓度；虾体实验时，以PBS配制成20、30、40及50 μg/mL等不同浓度。为了利于流式细胞仪的分析与观察，制备5’端带有羧基荧光素之琥珀酰亚胺基酯(Carboxyfluorescein-5-succimidylester)，即5-FAM的ODN，简称FAM-ODN。实验前，以磷酸盐(Phosphate buffered saline， PBS)缓冲液分别配制成不同浓度。 2.2. 实验用虾 购买自养殖场外观健康的淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii) (体重平均约25公克)，置于充分打气的淡水循环养殖池中，养殖密度约为每平方公尺4~5尾，至少驯养三天后抽血进行实验。养殖期间每日喂食人工饲料二次，饲料来自屏东科技大学郑文腾教授，配方详见Chiu等(2010) [ 21 ] 。 2.3. 活血球细胞制备 以内含0.5 mL抗凝剂的3.0 mL塑料针筒搭配24 G x1” (0.55 × 25 mm)针头(TERUMO， Japan)，由淡水长臂大虾头胸部处，抽取血淋巴液(hemolymph)至1.1 mL；将抗凝剂与血淋巴液迅速上下摇晃混合均匀。混合液以300 ×g于4˚C，离心10分钟；去除上清液后，加入1.0 mL PBS悬浮细胞。取10 μL血球悬浮液，加入等量的trypan blue (Sigma T-6164；0.4% trypan blue in 1.4% NaCl)后，以血球计数器(hemocytometer)计算血球总数；其余血球悬浮液置于冰上备用。 2.4. CpG-ODN与虾血球细胞结合分析 为确认不同序列的ODN与虾血球表面受器结合饱和浓度，实验中以不同浓度FAM-ODN与血球作用后，利用流式细胞仪(Cytomics FC 500; BECKMAN COULTER)分析之。实验中，将来自同一尾虾子且悬浮于0.01 M PBS的细胞悬浮液(约5 ´ 10 6 cells/mL细胞数)，分装至5管，每一管200 mL；接着，每一管分别加入100 mL的PBS及四种不同浓度的FAM-ODN，置于室温作用1分钟后，离心，去除上清液，以10%甲醛(formaldehyde)固定液处理细胞10分钟后，以4˚C于800 ×g离心5分钟，去除上清液，以PBS悬浮细胞。接着，以流式细胞仪进行分析，观察FAM-ODN于细胞表面结合之变化。 2.5. 虾子酚氧化酵素(phenoloxidase， PO)活性的测定 本实验分别测定体外血球胞外液和虾子血球及血浆内的PO活性。根据Chuo等(2005)实验步骤进行体外血球胞外液样本PO的测定 [ 15 ] 。不同浓度的CpG-ODN溶液100 μL分别与200 μL虾血球悬浮液混匀后，静置15分钟；经4˚C，800 ×g离心5分钟后，吸取10 μL上清液，利用Bradford方法测定蛋白质浓度外，另取50 μL胞外上清液测定酚氧化酵素(PO)活性。至于虾子血球和血浆之PO活性的测定前，取100 mL的ODN溶液由虾体腹节处注射后1小时，分别抽取虾血淋巴液。经离心后，取上清液即血浆样本，沈淀即为血球样本。血球样本经悬浮并高速離心后的上清液即为血球细胞萃取液(hemocyte lysate supernatant; HLS)。取50 μL待测样本、加入50 µL浓度1 mg/mL胰蛋白酶(Trypsin)后，置于室温下反应15分钟后，加入200 μL新鲜配置之受质溶液L-DOPA (L-3，4-dihy-droxyphenyl-alanine， 1.6 mg/mL)，并立即在波长490 nm下测定吸光值(OD 490 )。取前五分钟内且单位时间内最大变化的OD数值，以变化0.001为1 U，获得PO活性，以(ΔU/Δt)/mg表示。根据Chao等实验指出，样本加入胰蛋白酶后所测得的PO活性，视为样本内原含有的proPO总量，以PO T 表示 [ 15 ] 。 2.6. 基因之mRNA表现量的测定 本实验利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行分析。首先制备血球RNA样本。取虾血球(约1 × 10 7 细胞)加入1 mL的Trizol试剂(Boehringer Mannheim， Roche)于室温下作用、离心后，取上清液；以异丙醇(isopropanol)沈淀出RNA，以酒精进行盐洗、风干。以核酸测定仪定量RNA浓度为A260/A280介于1.8~2.0，方能进行后续的RT-PCR。本实验测定之五种防御相关基因的专一性引子序列如表2所示。使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)进行，实验中取5 μg的RNA样本，加入1 μL的Oligo-d(T)18引子，再加入适量的DEPC水使总体积为11.5 μL。在65˚C加热5分钟后使温度缓慢降至室温。接着，依序加入4 μL的5X反应缓冲液、2 μL的10 mM之dNTP混合液、0.5 μL的RNase抑制剂(20 U/μL)、以及1 μL的反转录酵素(reverse transcriptase， 20 U/μL)，使总体积为20 μL。于42˚C水浴一小时后，以85˚C加热5分钟后，置于冰上备用。 配制1%胶体，于迷你电泳槽(RunOne， EmbiTec)，在电压100伏特下进行电泳约30分钟，取出胶体用溴化乙锭(ethyl bromide)染色10秒，再以清水退染20~30分钟，最后置于紫外光源下照像存档。接着，使用ImageMaster2D软件分析目标片段，将目标片段之条带亮度量化。本实验以虾血球中正常表现的β-actin基因作为参考基因(internal control)，以其mRNA表现量于胶体中的条带亮度当作分母，目标基因之条带亮度当作分子，所得比值即为目标基因之mRNA表现量。 2.7. 易感性分析 虾子驯养至少1周后，每一尾虾子注射2.5 μg的LPS刺激虾子1小时后，测定血浆中PO T 和血球GPx活性表现确认虾子处于发炎状况。接着，将虾子分为四组，每一组20尾虾子。一天后，其中两组分别注射2 mg的ODN2140和ODN3006，并同时感染100 mL致病菌Lactococcus garviae (10 8 cells)，两个对照组分别为注射PBS取代ODN以及PBS取代ODN和致病菌。接着连续观察并记录虾子死亡尾数， Table 2 The primers of selected genes for semi-quantitative RT-PC 基因名称 Gene title 基因库编号 GenBank number 引子序列 Primer sequence (5’®3’) 大小 Size (bp) Prophenoloxidase (propo) AY947400 SP9 F: GATACTGCCACTTGCTCTCT SP8 R: CTTGCAGGGTTCAAGAAG 2098 Anti-LPS factor (alf) EU826055 amp F: CTACTTCAAGGGCCGGATGT amp R: TTTTATTTAAAAACAGTCTCATGTTGA 453 α2-Macroglobulin (α2-M) FL657275 α2M F: CGAGGTGCGAACAGGAAG α2M R: CCGGGCAGGTACTGTGAC 245 Peroxinectin (pon) AY606270 pon F: CCTTTGGCATCAGCACCCGTTC pon R: CCGTGATCTCTGCCTCGGTGGA 373 Cytochromeoxidase subunit (cos) FL657276 cos F: CGCGCAGGTACCCCTAATA cos R: GCCGCTAGTGGTGGATAAAC 162 β-actin AY947402 β-actin F: CCCAGAGCAAGAGAGGTA β-actin: RGCGTATCCTTCGTAGATGGG 309 表2. 用于半定量反转录聚合酶链式反应之目标基因的引子 注：所有目标基因进行PCR的退火温度为58˚C，循环24次。 直到连续48小时无死亡发生为止。换算出专一性死亡率，12小时内死亡属非专一性死亡。 专一性死亡率(%) = (实验组死亡只数 − 非专一死亡数)/(总数 − 非专一死亡数) × 100%。 2.8. 统计分析 血球细胞之PO活性和免疫相关基因mRNA表现量的数据以one-way ANOVA进行各不同喂食处理组间的比较，分析后有显着差异者(p < 0.05)，再以Duncan比较各组间的差异。