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user: 3. 结果与分析 3.1. 植物类型及生态学特性 本实验所用的早春植物分布在百合科和毛茛科，都是多年生草本植物，且生长环境都在林下或灌丛，早春开花植物的花期都在4~5月，而采集的未开花植物花期都在7~9月，其主要生物学特性和药用价值见表1。 3.2. 光合色素含量比较分析 叶绿素是植物体内最重要的光合色素，大量存在于绿色植物的组织中 [ 23 ]。高等植物叶绿素主要有叶绿素a (Chl a)和叶绿素b (Chl b)两种，早春开花植物和未开花植物的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素(Chla + b)含量的测定结果如图1。由图可知，早春开花植物的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素均低于未开花植物，结果表明，早春开花植物的叶绿素含量在开花过程中显著下降，光合作用降低。 3.3. 可溶性糖和可溶性蛋白含量比较分析 早春开花植物与未开花植物的可溶性糖含量的测定结果见图2，结果显示：早春开花植物的可溶性糖含量均高于未开花植物，表明早春开花植物的可溶性糖代谢较活跃，早春植物在开花期间的整体调控与可溶性糖含量增加关系密切。 可溶性蛋白通常是参与各种代谢过程的酶，其含量是衡量植物整体代谢的重要指标。早春开花植物与未开花植物的可溶性蛋白含量的测定结果如图3，早春开花植物的可溶性蛋白含量均低于未开花植物。 Table 1 Information sheet of ten early spring plant 植物名 学名 科属 植被类型 植株高度 叶片大小 根特征 花期 生境 药用价值 冰凌花 Adonis amurensis Regel et Radde 毛茛科； 侧金盏花属 多年生 草本 高15~20 cm 长7 cm， 宽约8 cm 根状茎短而粗，有多数须根 3~4月 山坡草地 或林下 可治充血性心力 衰竭、心脏性 水肿、心房纤 维性颤动等症 黑水银莲花 Anemone amurensis (Korsh.) Kom. 毛茛科； 银莲花属 多年生 草本 高20~25 cm 长约3 cm， 宽2.5~3.5 cm 根状茎横走， 细长 4~5月 山地林下 或灌丛下 可供药用，有发汗、增强肾和 肝功能的作用 平贝母 Fritillaria ussuriensis Maxim 百合科； 贝母属 多年生 草本 长可达1 m 长7~14 cm， 宽3~6.5 mm 鳞茎扁圆形， 基部簇生须根 5月 林下、草甸 或河谷 用于肺热燥咳， 干咳少痰， 阴虚劳嗽， 咳痰带血 鹿药 Smilacina japonica A. Gray 百合科； 鹿药属 多年生 草本 高30~60 cm 长6~15 cm， 宽3~7 cm 根状茎横走， 多少圆柱状， 有时具膨大结节 4~5月 林下荫湿处 或岩缝中 治风湿疼痛， 跌打损伤， 月经不调 顶冰花 Gagea lutea (L.) Ker-Gawl. 百合科； 顶冰花属 多年生 草本 高15~20 cm 长15~22 cm， 宽3~10 mm 鳞茎卵球形， 无附属小鳞茎 4~5月 林下、灌丛 或草地 民间常用本品 治疗心脏病 耧斗菜 Aquilegia viridiflora Pall. 毛茛科； 耧斗菜属 多年生 草本 高15~50 cm 宽4~10 cm， 长1.5~3 cm， 根肥大，圆柱 形，简单或 有少数分枝 6~7月 山地路旁、 河边或 潮湿草地 去瘀，止血， 镇痛 升麻 Cimicifuga foetida L. 毛茛科； 升麻属 多年生 草本 高1 m 长5~10 cm， 宽3.5~9 cm 根茎为不规则 块状，呈结节状，须根多而细 8~9月 山坡草丛、 林边、 灌丛中 用于风热头痛， 齿痛，口疮， 咽喉肿痛， 子宫脱垂 乌头 Aconitum carmichaeli Debeaux 毛茛科； 乌头属 多年生 草本 高60~200 cm 长6~11 cm， 宽9~15 cm 块根倒圆 锥形 9~10月 草坡或 灌丛中 治水肿， 精神不振， 以及风寒湿痹， 脚气等症 藜芦 Veratrum nigrum L. 百合科； 藜芦属 多年生 草本 高可达1 m 长22~25 cm， 宽约10 cm 根茎短而厚 7~9月 山坡林下 或草丛中 主治中风痰壅， 癫痫，疟疾， 疥癣 东北 百合 Lilium distichum Nakai 百合科； 百合属 多年生 草本 高60~120 cm 长8~15 cm， 宽2~4 cm 鳞茎卵圆形， 白色，有节 7~8月 生山坡林下、林缘、路边 或溪旁 主治结核久咳， 痰中带血， 或神经衰弱， 失眠等 表1. 十种早春植物信息表 图1. 早春开花植物与未开花植物的叶绿素含量测定结果，不同小写字母表示差异显著，P < 0.05 图2. 早春开花植物与未开花植物的可溶性糖含量测定结果，不同小写字母表示差异显著，P < 0.05 图3. 早春开花植物与未开花植物的可溶性蛋白含量测定结果，不同小写字母表示差异显著，P < 0.05 3.4. 早春开花植物的代谢特性分析 3.4.1. 样品间的差异代谢物确定 为判别早春开花植物和未开花植物两类植物的代谢物累积差异，使用有监督的偏最小二乘-判别分析对代谢物进行分析，PLS-DA模型分析可以有效过滤掉与分类无关的信息以更为准确地发现代谢物在两类植物中的差异情况 [ 24 ]。从图4可以看出，通过PLS-DA方法能较好的将两类早春植物区分开(R 2 = 0.987，Q 2 = 0.514)，早春植物样品主要分布在置信区间的左侧，而未开花植物样品分布在置信区间的右侧。 根据PLS-DA分析得到的投影变量权重值(VIP)来反映代谢物对分组的贡献大小，并结合t检验的结果值P值来筛选差异代谢物。当VIP > 1且P < 0.05时表明差异显著，数据处理后结果如图5，筛选出132种差异标志代谢物，包括18种氨基酸、18种糖和50种有机酸。 图4. 两类植物代谢物PLS-DA得分图 图5. 各类差异代谢物数量 3.4.2. 差异代谢产物通路分析 为了探索两类植物的潜在差异代谢途径，我们将差异化合物导入到MetaboAnalyst数据库进行分析得到气泡图(图6)，其中气泡大小代表影响因子大小，气泡越大影响因子越大；颜色深浅代表P值大小，颜色越深P值越大，差异代谢物积累程度越高 [ 25 ]。根据-log P值和途径影响得分，确定了与差异代谢物相关的代谢通路5条：氨酰-tRNA生物合成、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、氰氨基酸代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢和苯丙氨酸代谢并标记在图6中，我们发现两类植物差异化合物影响较大的途径都与氨基酸代谢相关。 在表2和图7中显示的是参与代谢途径的主要代谢物的含量差异。其中，在丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径中的差异代谢物富马酸、丙氨酸和甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢途径中的色氨酸，以及苯丙氨酸代谢途径中的苯丙氨酸、苯乙酸在早春开花植物中积累较多；氨酰-tRNA生物合成和氰氨基酸代谢途径中的差异代谢物在早春开花植物中都较少或几乎没有，同时甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢途径中的苏氨酸也在未开花植物中积累较多。 图6. 各类差异代谢物数量 Table 2 Number of different metabolite 代谢途径 −log(P) 影响因子 差异代谢物 氨酰-tRNA生物合成 6.3933 0.51855 谷氨酰胺↓ 蛋氨酸↓ 异亮氨酸↓ 缬氨酸↓ 脯氨酸↓ 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢 2.2427 0.47826 天冬酰胺↓ 富马酸↑ 丙氨酸↑ 氰氨基酸代谢 1.76211 0.15 天冬氨酸↓ 甘氨酸↓ 丝氨酸↓ 甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢 1.4956 0.35136 苏氨酸↓ 色氨酸↑ 苯丙氨酸代谢 0.92019 0.25 苯丙氨酸↑ 苯乙酸↑ 表2. 各类差异代谢物数量 注：↑和↓表明早春开花植物比未开花植物代谢物的上调和下调。 图7. 差异代谢物热图