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user: 3. CS在生物材料领域的应用 3.1. 生物粘合剂 Wang等 [ 60 ] 开发了适用于软骨组织的CS粘合剂，弥补了临床上骨科粘合剂中生物相容性和粘合力度不足的缺陷。对CS进行甲基丙烯酸酯和醛基化学官能化，形成两个功能臂：一个臂提供与生物材料共价结合位点和增强材料强度，另一个臂通过醛基与组织表面上存在的胺共轭联接。CS粘合剂作为植入的生物材料和天然软骨组织之间的粘附层，具有很强的粘附力和稳定的整合性，显著促进植入物和软骨组织之间的融合。 Reyes等 [ 61 ] 报道了一种基于氧化硫酸软骨素与聚乙烯醇胺通过席夫碱反应合成的粘合剂，在兔眼模型中，伤口渗漏前最大眼压明显高于标准缝合技术。Strehin等 [ 62 ] 在猪眼模型中使用羟基琥珀酰亚胺活化的CS/聚乙二醇胺封闭角膜小切口，能够恢复大于200毫米汞柱眼压，且该粘合剂对角膜中发现的主要细胞类型无毒，术后炎症反应小，无疤痕形成。这些结果证实了硫酸软骨素基粘合剂不仅简化手术过程，还可以可以解决缝线引起的炎症、散光、继发性新血管等并发症 [ 63 ]。 3.2. 药物递送系统 已有实验证明使用CS构建的药物载体具有合适的流体动力学直径，可控制的表面电荷，优选的包封率，无毒性和抵抗原性 [ 64 ] [ 65 ]，由于其与CD44有极强的亲和力，利用CD44受体介导的内吞作用设计的CS药物载体是肿瘤治疗研究热点 [ 66 ] [ 11 ]。近期更多的研究将CS设计多种形式的药物载体应用于医疗领域，具有良好的前景。 3.2.1. 水凝胶 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell， MSC)及其分泌因子具有抗炎和抗血管生成以及促进伤口愈合的特性 [ 67 ]，Fernandes-Cunha等 [ 68 ] 制备了CS-透明质酸粘弹性凝胶递送冻干的MSC，实验证明水凝胶可促进大鼠的角膜机械伤和化学烧伤的愈合，还能减少碱性角膜烧伤后的疤痕和新血管。Giuseppina等 [ 69 ] 开发了一种CS和羟丙基甲基纤维素的热敏水凝胶载体，利用静电结合方式装载血小板溶解产物，协同发挥刺激细胞增殖的作用，可有效治疗角膜损伤。肿瘤组织中的谷胱甘肽浓度远高于正常组织，CS可与谷胱甘肽敏感的二硫键交联，在CD44介导的内化作用后在肿瘤细胞中特异性降解，降低对正常组织的毒性。Zhang等 [ 70 ] 利用该原理开发了靶向CD44的可编程药物输送系统，利用CS水凝胶外壳包裹化疗药物核心粒子。24小时内在血浆谷胱甘肽浓度下仅检测到低于10％的游离药物，正常组织谷胱甘肽浓度下检测到约20%的游离药物，而在肿瘤谷胱甘肽浓度下，药物分子在最初的30分钟内释放可达50%，之后24小时内持续释放。体内实验证明给药体系具有CD44靶向输送能力，显著增强药物对肿瘤的抑制。 3.2.2. 纳米颗粒 Liu等 [ 71 ] 设计了氧化还原/酶响应硫酸软骨素–脱氧胆酸(CSCD)自组装的纳米粒子，由于透明质酸酶-1可以降解CS，该纳米粒子具有谷胱甘肽/透明质酸酶-1双敏感药物释放特性。CSCD纳米颗粒装载多烯紫杉醇与单纯给药相比，可使黑色素瘤的体积和肺转移均减少。基因治疗是近年研究热点，在治疗性基因靶向递送中使用纳米颗粒作为载体可以达到避免遗传物质降解、定向输送、提高转染率的目的。Zorzi等 [ 72 ] 制备了CS与阳离子明胶杂化纳米颗粒装载基因片段，证明聚阴离子CS的加入有效降低了阳离子聚合物的细胞毒性，并保证稳定的细胞摄取率及pDNA的转染率。Chen等 [ 73 ] 使用CS在聚酰胺酰胺树状大分子上进行改性制成纳米颗粒，通过CD44介导的内吞作用提高肿瘤细胞对颗粒内装载的miR-34a的摄取效率，增强了诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的作用，并且显示出良好的安全性。非淀粉多糖大分子无法被胃和小肠中的酶消化，但可以被结肠中的微生物水解，因此非常适合制备结肠靶向药物递送系统。Zu等 [ 74 ] 证明CS的表面修饰赋予了纳米粒子结肠癌靶向给药的能力，并显著提高了喜树碱抗结肠癌活性。最新研究中 [ 75 ]，将CS附着到超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION)表面，CS-SPION注射到大鼠的黑质中后，纳米粒子表现出低毒性和低内吞作用，并高度分布在靠近神经元细胞体和突触的细胞间隙中。这可能是因为CS是神经纤维网的主要组成部分之一，有包围神经元细胞体、树突和突触的趋势。Tan等 [ 76 ] 制备了装载有地塞米松的(3-氨基甲基苯基)硼酸硫酸软骨素(APBA-CS)基纳米结构脂质纳米颗粒，存在于颗粒外层的APBA-CS可以与眼粘蛋白中的唾液酸形成复合物，提高药物的角膜渗透性，克服泪液周转，鼻泪管引流，瞬目及生理屏障对角膜药物利用造成限制 [ 77 ]，是药效增强。 3.2.3. 纳米胶囊 近年来，药物输送和诊断成像集成给药系统在医药领域成为研究焦点 [ 78 ]。在代谢活跃癌细胞表面，乳铁蛋白(lactoferrin， LF)被发现与乳铁蛋白膜内化受体(LRP1， LRP2)和转铁蛋白受体(TFR1， TFR2)结合增加 [ 79 ]。量子点 [ 80 ] (quantum dots， QD)是一种高荧光产量的半导体纳米粒子，在电子/能量转移机制下，QD与乳铁蛋白在体外结合时，QD处于荧光淬灭状态，被细胞摄取后恢复荧光功能，可用作癌细胞的荧光成像探针。AbdElhamid等 [ 81 ] 使用逐层静电组装技术制备了具有荧光标记功能的CS纳米胶囊，装载难溶性药物塞来昔布和厚朴酚治疗乳腺癌。具有阴离子特性的CS为中间层，既可以包裹脂质载药颗粒，又可以将带阳离子的LF-QD共轭物结合到胶囊表面，可利用共聚焦激光扫描显微镜进行体内追踪。该团队还尝试将一层阳离子明胶结合到荧光CS纳米胶囊表面，阳离子明胶可被肿瘤过表达的基质金属蛋白酶降解 [ 82 ]，进一步增强了胶囊与肿瘤细胞结合的特异性 [ 83 ]。实验证明，纳米胶囊有效提高药物水溶性，双重靶向作用增强肿瘤细胞药物摄取率，显著抑制肿瘤生长，体内免疫原性实验证明了纳米胶囊良好的生物相容性。这种稳定、安全、高效、多功能给药系统具备强大的开发潜力和广阔的应用前景。 3.3. 细胞支架 优质细胞支架的关键特性是为细胞粘附，增殖和分化提供合适的底物。细胞与ECM之间的相互作用在初期细胞迁移到伤口区域以及肉芽组织的收缩中起着至关重要的作用 [ 84 ]，因此，将CS、明胶(gelati， GEL)、透明质酸(hyaluronic acid， HA)等ECM成分加入生物支架是影响细胞活性以促进组织再生的有效方法。CS可以提供丰富的信号识别位点，通过结合多种生长因子来调节细胞生长和发育 [ 13 ]，是设计细胞支架时不可忽视的生物材料。 3.3.1. 纳米纤维支架 静电纺丝是一种制备纳米级连续纤维的技术，电纺纤维支架具有高表面积体积比值适合细胞附着，并促进营养供应和氧气的运输以促进细胞生长 [ 85 ]。Pezeshki-Modaress等 [ 86 ] 应用静电纺丝技术制备GEL-CS纳米纤维支架，经过CS改良后的纳米纤维支架具有稳定性和高孔隙率，更近似于天然ECM结构，人成纤维细胞可在支架上可呈梭形样附着并分布良好。Bhowmick等 [ 87 ] 制备了GEL-HA-CS负载丝胶蛋白电纺纳米纤维支架，来模拟皮肤天然ECM的微观结构和组成，研究表明纳米纤维支架可促进人成纤维细胞、角质形成细胞和骨髓间充质干细胞的粘附和增殖，从基因表达分析等实验证实角质形成细胞可刺激骨髓间充质干细胞分化，达到加快愈合、减少瘢痕的生物学功能。 CS能够改良纤维支架的机械性能。Sadeghi等 [ 88 ] 制备了CS杂化纳米纤维支架，并且研究了不同CS含量对纳米纤维的机械性能、生物学性能的影响。CS比率为15%时，这种纳米纤维在干燥状态下拉伸强度高达4 MPa，在湿润状态下断裂伸长率为200%，增强韧性材料可增强临床应用的灵活性。Saporito等 [ 89 ] 将GEL-CS纳米纤维制成植入贴片，并且负载血小板裂解物作为生长因子的来源，用于先天性心脏缺陷手术后的心脏修复。纳米纤维结构中CS的存在增强了贴片的弹性，适合体内适应心脏收缩。实验中还发现纤维支架有效地促进了内皮细胞、心肌细胞的粘附和增殖，但没有明显刺激成纤维细胞的增殖，这一性能可协助年轻患者进行心肌修复，保持心肌细胞活力并减少手术后成纤维细胞生长失控导致的的胶原沉积。 3.3.2. 水凝胶支架 CS是软骨细胞生存为环境的重要组分，并且具备抗炎、促进血管生长等功效 [ 90 ]，是制备软骨组织工程中的复合生物材料的研究热点。在软骨工程中，可注射水凝胶是极具发展潜力的替代细胞输送支架，因为它们可以原位成形，模拟自然组织，并填充任何形状的缺损。Gao等 [ 91 ] 研制了以Ⅱ型胶原和活化CS为基质的可注射、可自交联的仿生水凝胶。水凝胶中的软骨细胞形态良好，基质发生重塑，具有良好的再生活力。Zhou等 [ 92 ] 制备CS-II型胶原复合水凝胶支架负载干细胞治疗椎间盘髓核退行性变。体外研究表明支架具有诱导干细胞分化的作用；大鼠尾椎模型中注射水凝胶后，椎间盘高度、含水量、细胞外基质合成和变性髓核的结构部分恢复，并能促进髓核特异性基因的表达。Fan等 [ 93 ] 用羧甲基壳聚糖和氧化的CS制备的可注射水凝胶，加入了壳聚糖–牛血清白蛋白微球结构改善其机械及生物性能，该体系可作为注射支架输送软骨细胞和大分子药物。 如目前研究认为CSPG对人神经中枢损伤的重塑过程具有双重影响，可能通过轴突的硫酸化方式来调节 [ 94 ]，但其机制仍存在争议。Karumbaiah等 [ 95 ] 使用光交联方法制备了CSA为主的水凝胶，发现水凝胶对神经营养因子如碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、和抗炎因子IL-10有富集作用，并且具有促进神经干细胞生长和自我更新的潜力。神经干细胞在治疗脊髓损伤时优先分化为星形胶质细胞，神经元形成相对较少。Liu等 [ 96 ] 证明将神经干细胞包裹在硫酸软骨素甲基丙烯酸酯(CS-MA)水凝胶中可以抑制星形胶质细胞分化，促进脊髓损伤的修复。体外实验表明CS-MA水凝胶中星形胶质细胞比例明显少于对照组；在大鼠后肢瘫痪模型中，应用CS-MA水凝胶后在第1周观察到2个关节恢复运动，3周后观察到后肢承重能力，明显领先于对照组，同时前肢的异常性疼痛样反应减少，相应的组织改变也在基因、分子层面得到印证。CS-MA水凝胶支架无疑在恢复功能和减轻感觉异常方面起着重要作用。 3.3.3. 多孔支架 Lai等 [ 97 ] 利用明胶0.25% CS制备的泡沫角膜支架具有较高的含水量、透光率和渗透营养素含量，亲水性和力学性能与天然角膜相当，与兔角膜基质细胞具有良好的生物相容性，表现出较强的细胞增殖和生物合成能力。Zhou等 [ 98 ] 采用盐浸，冷冻干燥和交联方法制备了建了用于关节软骨修复的CS-丝素蛋白多孔支架，在兔骨软骨缺损模型中观察到应用了CS的支架能够更好的保持软骨细胞表型，减少白介素-1β诱导的软骨细胞炎症反应，增强软骨自我修复的能力。Yu等 [ 99 ] 模仿气管软骨细胞外基质的组成和结构，采用单向冷冻干燥法制备了明胶–硫酸软骨素–透明质酸–聚乙烯醇支架，湿润状态下支架均表现出与天然软骨相似的压缩弹性模量，具有良好的机械稳定性，利用定向的微管结构，采用动态培养的方法促进细胞向支架内生长。Singh等 [ 100 ] 制备了聚电解质络合介导的壳聚糖(chitosan， CH)和CS的纳米生物玻璃复合支架。CS改良后的支架具有较大的孔径，利于细胞向支架中心的迁移或浸润，在潮湿条件下进行压缩测试中表现出海绵状的行为，溶涨率测试中减少了CH支架过度的溶胀表现，增强了在水合条件下支架的结构稳定性。生物学实验观察到培养的成骨细胞在CS-CH上的生物矿化显着高于CH，有利于新骨的形成。 3.4. 表面涂层 Yang等 [ 12 ] 通过聚乙二醇(PEG)与CS偶联制备了CS-PEG纳米涂层，用于改良门静脉胰岛移植。CS的羧基经化学修饰后与胰岛膜蛋白表面的伯胺基团交联，完整稳定的结合在胰岛表面。实验观察到，CS优异的机械稳定性，保水能力和强大的生物相容性有力的保证了胰岛活性，表现出减少血液凝固，增强胰岛原位血运的重建，提高胰岛细胞在促炎条件下的存活率的积极效果。体外实验显示，在培养7天后胰岛对葡萄糖刺激反应显著增强，且胰岛素分泌量与CS涂层厚度具有一定程度的浓度依赖性，培养第14天时CS-PEG表面工程化的胰岛仍保持完整结构。这种CS-PEG表面涂层可提高胰岛移植的成功率，临床应用前景广阔。 角膜移植术是角膜失明患者视觉康复最常用的方法，高质量供体角膜的短缺促使人们研制人角膜供体的替代品。角膜是无血管组织，房水、泪液中溶解的氧气及活性成分对角膜细胞的存活起到至关重要的作用。Liu等 [ 101 ] 通过CS的表面接枝增强了一种新型胶原蛋白(collagen， Col)角膜的保湿容量。Col-CS膜的吸水率为81.9% ± 2.1%，显着高于Col膜的吸水率，并且材料厚度较为恒定，光学性能良好。CS表面接枝后胶原蛋白膜的极限拉伸强度接近天然角膜组织，人角膜上皮细胞在培养12小时后即可随薄膜的伸缩由圆形变为梭形，表现出更紧密的粘附性。 Liu等 [ 102 ] 采用逐层法将氧化CS和I型胶原组装到聚丙交酯–乙交酯共聚物(PLGA)支架表面，作为附着无机矿物质的粘合剂涂层。利用CS的矿化功能刺激成骨，同时CS能够调节细胞行为，引导支架与宿主组织之间的骨整合。经过多层修饰PLGA表面纳米羟基磷灰石晶体附着更加均匀牢固，骨髓间充质干细胞的附着、铺展和增殖、成骨分化行为更加活跃。因此，这种新型的多层修饰复合支架可能在骨组织再生方面取得理想的治疗效果。