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user: 3. 结果与分析 3.1. 单因素实验结果 3.1.1. 乙醇浓度对PEO产率的影响 固定料液比1:10 g/mL、提取温度90℃、提取时间4 h条件下，评价乙醇在不同浓度(55%、65%、75%、85%、95%)条件下对PEO产率的影响见图1(a)。可以观察得出，乙醇浓度对PEO产率的影响极为明显。随乙醇浓度的增加，PEO产率也持续增加。较高乙醇浓度有利于溶剂的扩散和渗透，可提取较多的弱极性物质。本实验结果与文献 [ 3 ] 结论相一致。因此，选择95%的乙醇浓度作为最佳提取浓度。 3.1.2. 料液比对PEO产率的影响 固定乙醇浓度95%、提取温度90℃、提取时间4 h，评价不同料液比(1:6、1:8、1:10、1:12、1:14)对PEO产率的影响见图1(b)。可以观察得出，在一定范围内，伴随着料液比的增大，PEO产率先增加，在料液比为1:10时，产率最高，不断增大料液比后，产率逐步趋于平稳。合理的增加料液比，可以增大反应溶剂和提取物之间的接触面积，过多溶剂也会增加回收溶剂成本，过大料液比不利于PEO的回收处理，因此选择料液比为1:10 g/mL作为最佳提取料液比。 3.1.3. 提取温度对PEO产率影响 同样在固定乙醇浓度95%、料液比1:10、提取时间4 h，评价不同提取温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)对PEO产率的影响见图1(c)。可以观察得出，PEO产率与温度呈正相关趋势，即温度越高，产率越大，90℃时达到峰值，100℃时趋于稳定。高温条件下更有利于传质，但提取温度超过乙醇溶液的沸点时，传质无明显变化。因此，提取温度选择为90℃。 3.1.4. 提取时间对PEO产率的影响 固定浓度95%，料液比1:10，提取温度90℃，评价不同提取时间(2、3、4、5、6 h)对PEO产率的影响见图1(d)。可以观察得出，在2~4 h，PEO产率与时间呈正相关趋势，在4 h时达到最大值，继续增加提取时间，产率不在继续增加。过长的提取时间，增加了溶质与氧的接触，导致更多氧化反应的发生，不利于PEO的提取。故提取时间设为4 h。 图1. (a) 乙醇浓度对PEO产率的影响；(b) 料液比对PEO产率的影响；(c) 提取温度对PEO产率的影响；(d) 提取时间对PEO产率的影响 3.2. 正交实验结果 本研究采用L 16 (4 5 )正交实验对实验条件进行了优化。表2为正交实验结果。每个影响因素对PEO产率影响表现为极差(R)值的大小，R值的大小与PEO的产率呈正相关趋势，R越小，表明影响因素对PEO产率的影响越小，各影响因素对PEO产率的影响顺序由高到低依次为：A > B > C > D。根据(表3)方差结果分析观察得到，四个反应因素中影响最大的因子是乙醇浓度(因素A)，第二位是固液比(因素B)，其次为提取温度(因素C)，最后为提取时间(因素D)。提取PEO的最佳工艺分别为：A4，B3，C3和D3 (乙醇浓度为95%，固液比为1:10 g/mL，提取温度为90℃，提取时间为4 h)。在此条件下，PEO产率为24.68 ± 1.27% (n = 3)，油脂和非油脂部分产率分别为5.16和19.52%。PEO中油脂部分的产率与SEO基本相同(4.77%)。PEO中多糖、总酚和总黄酮含量分别为8.72、5.85和10.19%。 Table 2 PEO L16(45) orthogonal experiment result 水平 乙醇浓度/% 固液比/(g/mL) 提取温度/℃ 提取时间/h PEO产率/% 1 1 1 1 1 15.79 ± 0.95 2 1 2 2 2 20.85 ± 1.25 3 1 3 3 3 22.03 ± 1.54 4 1 4 4 4 20.01 ± 1.21 5 2 1 2 3 21.23 ± 1.73 6 2 2 1 4 20.54 ± 1.03 7 2 3 4 1 21.72 ± 1.95 8 2 4 3 2 22.13 ± 1.77 9 3 1 3 4 23.07 ± 0.89 10 3 2 4 3 23.26 ± 1.16 11 3 3 1 2 22.52 ± 1.68 12 3 4 2 1 22.59 ± 1.81 13 4 1 4 2 22.36 ± 1.33 14 4 2 3 1 23.12 ± 1.62 15 4 3 2 4 24.37 ± 1.95 16 4 4 1 3 23.68 ± 1.18 K1 19.670 20.612 20.633 20.805 K2 21.405 21.943 22.260 21.965 K3 22.860 22.660 22.587 22.550 K4 23.383 22.102 21.838 21.997 R 3.713 2.048 1.954 1.745 最佳 A4 B3 C3 D3 表2. PEO L 16 (4 5 )正交实验结果 Table 3 Orthogonal experiment analysis of varianc 因素 平方和 自由度 F-值 F 0.05 显著性 A 33.270 3 18.062 9.280 * B 9.032 3 4.903 9.280 C 8.771 3 4.762 9.280 D 6.461 3 3.508 9.280 误差 1.840 3 表3. 正交实验方差分析 3.3. 形态分析 图2(a)~(d)为牡丹籽壳原料、提取剩余物的实物照片和SEM扫描电镜照片。从图可以看出，它们的表面形态存在明显的差异，其中牡丹籽壳原料表面呈现光滑的块状结构，而提取剩余物表面则呈现多孔隙的片层结构。对比观察得出，乙醇溶液对牡丹籽壳的提取效果作用比较明显。 图2. (a) 牡丹籽壳原料；(b) 牡丹籽壳原料提取剩余物；(c) 牡丹籽壳原料电镜图片(1000×)；(d) 牡丹籽壳提取剩余物电镜图片(1000×) 3.4. 热重结果 图3(a)和图3(b)分别为SEO和PEO的热重图。DTG曲线上的峰值代表在该温度范围的最大失重率 [ 16 ] [ 17 ]。从图中观察到，SEO和PEO低分子量组分分解峰分别在259℃和277℃处，SEO和PEO高分子量组分分解峰在367℃和406℃处。由于PEO中含有较多的多糖和其他活性成分，导致PEO的分解温度低于SEO。 图3. (a) SEO热重图；(b) PEO热重图 3.5. 芍药苷与白藜芦醇含量分析 HPLC检测分析结果(见图4)可得PEO样品中提取的活性成分含量与SEO样品相比，其含量更高，PEO中白藜芦醇含量为0.014%，对比SEO中白藜芦醇的含量仅为0.0011%，PEO中白藜芦醇含量为SEO的12.72倍。此外，在PEO样品中，含有芍药苷成分，其芍药苷含量为1.40%，而SEO样品中不含有芍药苷成分。 图4. (a) 白藜芦醇、PEO、SEO液相色谱图；(b) PEO、芍药苷液相色谱图 3.6. 红外光谱分析 白藜芦醇、角鲨烯、芍药苷、PEO、SEO、EPA红外谱图如图5。观察得出，芍药苷在3420 cm −1 处有明显的羟基振动吸收峰，PEO在3420 cm −1 也有了明显的羟基振动吸收峰，对比SEO在3420 cm −1 处没有振动吸收峰，三者说明PEO中含有芍药苷成分，在SEO中没有芍药苷。角鲨烯、EPA、PEO和SEO在3009、2925和2854 cm −1 处的峰分别为顺式双键(-C=C)上的-CH伸缩振动 [ 18 ]、亚甲基(-CH 2 )和甲基(-CH 3 )伸缩振动，这表明PEO和SEO均含有角鲨烯和EPA。白藜芦醇、PEO和SEO在3293和1147 cm −1 处有明显的羟基和醚键振动吸收峰，这一结果表明SEO和PEO两者中皆含有白藜芦醇。波数为938 cm −1 处的吸收峰，代表双键 [ 19 ] 上的-CH平面外变形振动。苯环特征吸收峰的波数在1604~1450 cm −1 之间。另外，在1712 cm −1 的峰被和酮(-C=O)的振动相关，红外光谱结果表明PEO富含活性成分，包括白藜芦醇、芍药苷、EPA和角鲨烯，这结果也被HPLC和GS结果所证实。 图5. 芍药苷、白藜芦醇、角鲨烯、EPA、SEO、PEO红外谱图 3.7. 脂肪酸成分分析 SEO和PEO油脂部分的脂肪酸组成见图6，观察得出，SEO和PEO脂肪酸组成成分比较相似。此次实验SEO油脂部分中的油酸含量(27.0%)，亚油酸的含量(22.9%)和PEO油脂部分中的油酸含量(28.2%)，亚油酸的含量(23.0%)均与文献 [ 20 ] 已经报道的牡丹籽油中含有油酸含量(27.73%)和亚油酸的含量(21.4%)基本一致。而PEO油脂部分中的α-亚麻酸含量(39.8%)和棕榈酸的含量(5.8%)和SEO油脂部分中的α-亚麻酸含量(41.8%)和棕榈酸的含量(5.2%)，与已报道牡丹籽油中α-亚麻酸含量(33.87%)和棕榈酸的含量(0.54%)相比数值高一些。此外，首次在PEO的油脂部分中中发现角鲨烯和EPA，其含量经计算分别为0.007%和0.0526%，在SEO中的含量分别为0.0397%和0.0134%。PEO油脂部分中所包含的肉豆蔻酸、十七烷酸、油酸、γ-亚麻酸、二十碳三烯酸和二十碳五烯酸的量比SEO包含的量要高。这可以说明乙醇作为提取物的溶剂对比石油醚作为提取溶剂具有一定的优势，可以将更多的活性成分提取出来。 图6. PEO和SEO油脂部分的脂肪酸组成 3.8. 体外抗氧化活性分析 SEO与PEO对DPPH自由基清除能力见图7(a)。观察得出，样品浓度与DPPH自由基清除能力呈正相关趋势，即浓度越大，DPPH自由基清除能力越强。清除能力，Vc高于PEO，PEO高于SEO。SEO与PEO的DPPH自由基清除IC50值分别为13.393与0.209 mg/mL。 SEO与PEO对羟自由基的清除能力见图7(b)。观察得出，Vc的羟自由基清除能力比SEO和PEO强。PEO的羟自由基清除能力比SEO要强，SEO与PEO的羟基自由基清除IC50值分别为9.195与12.347 mg/mL。 SEO与PEO对ABTS自由基的清除能力见图7(c)。观察得出，PEO的ABTS自由基清除能力高于SEO，比Vc的清除能力也略强一些。SEO与PEO的ABTS自由基清除IC50值分别为1.294与0.003 mg/mL。 SEO与PEO对超氧阴离子自由基的抑制能力见图7(d)。PEO对超氧阴离子自由基的抑制能力明显高于SEO，与Vc相比的抑制能力弱一些。SEO与PEO的超氧阴离子自由基清除IC50值分别为51.680与1.493 mg/mL。 自由基介导的链式反应的结果是脂质过氧化，其终产物直接或间接造成DNA损伤 [ 21 ]。SEO与PEO抗脂质过氧化的能力见图7(e)。SEO与PEO的抗脂质过氧化能力IC50值分别为19.024与7.997 mg/mL。结果显示，PEO抗脂质过氧化的能力比SEO强。 图7. (a) PEO和SEO对DPPH自由基的清除能力；(b) PEO和SEO对羟自由基的清除能力；(c) PEO和SEO对ABTS自由基的清除能力；(d) PEO和SEO对超氧阴离子自由基的清除能力；(e) PEO和SEO抗脂质过氧化的能力 综上所述，牡丹籽壳提取物PEO由于富含活性成分，包括多糖和活性小分子物质，具有很强的综合抗氧化活性。 3.9. 毒性实验结果分析 在本研究PEO的给药范围内(0.05~0.8 g/kg)，大鼠连续灌胃45天后，未发现PEO具有毒性。MDA通常被用于氧化应激的标记物 [ 22 ] [ 23 ]。另外，细胞中存在多种抗氧化机制阻止细胞内活性氧的产生和氧化损伤，CAT和SOD为其中两种常见的细胞抗氧化酶，它们可以有效减少过氧化氢的产生和脂质过氧化 [ 24 ] [ 25 ]。本研究通过对大鼠血清中CAD、SOD和MDA含量与对照组含量进行比对分析。实验结果表明，大鼠血清中CAD (见图8(a))和SOD (见图8(b))的值随着PEO口服灌胃剂量的增加而升高，而MDA却呈现降低的趋势(见图8(c))。与对照组(盐水–羧甲基纤维素钠盐)相比，PEO能有效抑制体内MDA的产生，促进大鼠血清中CAT和SOD的升高。该实验结果也与PEO体外抗氧化活性相契合。 图8. (a) CAT活性与PEO剂量变化图；(b) SOD活性与PEO剂量变化图；(c) MDA活性与PEO剂量变化图