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user: 2. 实验材料与设备 2.1. 实验材料 赤灵芝粉(林源珍宝参茸销售有限公司)、平盖灵芝粉(白山市名源特产有限公司)。 不同产地的不同种灵芝由于其生长环境、栽培条件的不同，会导致多糖含量的差异。 2.1.1. 主要试剂 主要试剂如表1。 2.1.2. 主要仪器 主要仪器如表2。 2.2. 实验方法 2.2.1. 灵芝多糖提取的工艺流程 灵芝多糖的提取：原料烘干至恒重→索氏提取→热水浸提并调节pH值→离心分离(常温3000 r/min，20 min)，得上清液→Sevage法脱蛋白→乙醇沉淀→过滤，得沉淀物→干燥得灵芝多糖。 2.2.2. 灵芝多糖提取的操作要点 1) 原料的处理 将灵芝粉用滤纸分批包好，放进索氏提取装置中进行脱脂肪。 注：灵芝要尽量粉碎，不要留大块，以便提取完全。 Table 1 List of experimental drug 实验药品名称 规格 生产厂家 3.5-二硝基水杨酸 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 酒石酸钾钠 分析纯 天津市光复科技发展有限公司 亚硫酸钠 分析纯 北京化工厂 苯酚 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 正丁醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 石油醚 分析纯 天津天泰精细化学品有限公司 三氯甲烷 分析纯 北京化工厂 乙醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 氢氧化钠 分析纯 北京化工厂 盐酸 分析纯 北京化工厂 葡萄糖标准品 分析纯 北京化工厂 表1. 实验药品清单 Table 2 List of experimental instrument 仪器名称 型号 生产厂家 气浴恒温振荡器 THZ-82B 金坛市医疗仪器厂 旋转蒸发器 RE 3000D 上海亚荣生化仪器厂 723A可见分光光度计 UV762 上海佑科仪器仪表有限公司 低速离心机 XiangYi-L-550 北京医疗仪器修理厂 电热鼓风干燥机 101—1AB 天津市泰斯特仪器有限公司 电子天平 AL104 梅特勒-托利多仪器有限公司 恒温水浴锅 02060705-023 余姚市东方电工仪器厂 表2. 实验仪器清单 2) 多糖的浸提 灵芝多糖的浸提法有水浸提、碱法水解、酶解等，在此次实验中，我们通过对热水浸提法的研究选出最佳的浸提方法，在实验中用浸提率的高低为标准来衡量浸提各因素对浸提效果的影响。 在提取时要避免温度浮动，并通过不断搅拌使局部温度不会过度偏高。浓缩水提液时应尽量缩短时间，减少料液受热时间，以减少多糖分解的机会。 3) 蛋白质的去除 灵芝中的蛋白质、胶质、粗纤维及脂肪等成分不利于糖类物质析出。分离之前，必须去除蛋白质。Sevage法脱蛋白：Sevage法是利用蛋白质遇到有机溶剂会变性而不溶于水的特点分离去除蛋白的。 将上述澄清溶液中，加入用氯仿和正丁醇按4:1比例所配制成的Sevage试剂，使溶液产生絮状凝聚物在摇床上45℃下振摇30至40 min，离心1 min，然后将两相分开。再向水相中加入其体积1/3的氯仿–正丁醇，重复操作，直至无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成。 注：灵芝多糖在实际提取和应用上，对其产品和色泽无特别要求时，尽量不要去脱色。因为我们在提取多糖的同时也应注重其他有效成分的提取。 4) 醇沉 将乙醇慢慢注入脱蛋白和冷却后的浓缩液中，此时灵芝多糖呈现絮状凝胶物沉淀析出，而大部分的蛋白质和其他成分保留在溶液中，并边加边搅至完全混合均匀，静止过夜。然后过滤，得沉淀物。 2.2.3. 灵芝多糖提取条件研究 采用热水浸提法对灵芝多糖的提取工艺条件进行优化根据前人研究结果 [ 3 ] ，以多糖得率为评价指标，考察浸提比、pH值、浸提温度、乙醇浓度、浸提时间等5个因素对对灵芝多糖得率的影响，得出最佳提取条件。 1) 采用单因素试验和L18 (35)正交实验设计得出热水浸提最佳条件； 2) Sevage法脱蛋白得多糖样品。 2.3. 灵芝多糖含量测定 测定灵芝多糖含量采用3.5-二硝基水杨酸(DNS)法。取提出的灵芝多糖5 mg，加7.5 mL蒸馏水及5 mL 6 mol/L HCl溶液于50 mL的锥形瓶中，置沸水浴中加热水解30 min。待水解液冷却，定容至50 mL作为总糖测试液。另取5 mg多糖配置单糖供试液。其他操作与制作标准曲线相同。 2.3.1. 配制标准葡萄糖溶液 取一定量的葡萄糖放入烘箱中，105℃干燥至恒质量，冷却后，精确称取50 mg，定容至500 mL，即为0.1 mg/mL的标准液。 2.3.2. 配制显色剂DNS溶液 将6.3 g 3.5-二硝基水杨酸(DNS)溶于262 mL 2 mol/L NaOH溶液中，将此溶液与500 mL含有182.0 g酒石酸钾钠的热水(不超过50℃)混合，向该溶液中再加入5.0 g重蒸酚和5.0 g亚硫酸钠，充分搅拌使之溶解，待溶液冷却后，以蒸馏水稀释到1000 mL储存于棕色瓶中(在冰箱中放置1周后方可使用)。 注：3.5-二硝基水杨酸和NaOH加入的时间要很接近，或者先加入NaOH，否则将产生难容的沉淀，导致溶液配置失败。 2.3.3. 制作葡萄糖标准曲线 取6支20 mL具塞刻度试管，编好号后，按表3分别加入0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 Table 3 Glucose standard curve reagent tabl 管号 试剂 0.1 mg/mL葡萄糖标准体积(mL) 蒸馏水体积(mL) DNS体积(mL) 葡萄糖质量(mg) 吸光度A540 0 0 2 1.5 0 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 0.231 2 0.4 1.6 1.5 0.4 0.504 3 0.6 1.4 1.5 0.6 0.775 4 0.8 1.2 1.5 0.8 1.095 5 1.0 1.0 1.5 1.0 1.353 表3. 葡萄糖标准曲线试剂表 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，用0号管调零，测出1~5号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。 2.4. 灵芝多糖提取的单因素分析方法 2.4.1. 材料预处理 分别称取灵芝粉2 g，放入编号的三角瓶中，加蒸馏水，使其组织软化，备用。 2.4.2. 不同浸提比提取灵芝多糖方法 取5个三角瓶，按表4的浸提比加蒸馏水(以干品重量计) pH 7下置于90℃恒温水浴锅中浸提2 h，3000 r/min离心20 min，弃沉淀留上清液，加入约1/3原体积的Sevage试剂，置于气浴恒温振荡器中45℃振荡30 min，取上清，再加4倍于热水浓缩后体积的95%乙醇，醇析24 h，过滤得到粗多糖。 2.4.3. 不同pH值提取灵芝多糖方法 取5个三角瓶，以1:30浸提比加蒸馏水(以干品重量计)，按表4调pH值，置于90℃恒温水浴锅中浸提2 h，离心、脱蛋白、浓缩、醇析、过滤，得到粗多糖。 2.4.4. 不同浸提温度提取灵芝多糖方法 取5个三角瓶，以1:30的浸提比加蒸馏水(以干品重量计)，pH 7下置于不同温度下(见表4)恒温水浴浸提2 h，离心、脱蛋白、浓缩、醇析、过滤，得到粗多糖。 2.4.5. 不同浸提时间提取灵芝多糖方法 取5个三角瓶，按1:30的浸提比(以干品重量计)、pH 7下置下90℃恒温水浴锅中浸提不同时间(见表4)，离心、脱蛋白、浓缩、醇析、过滤，得到粗多糖。 2.4.6. 不同乙醇浓度提取灵芝多糖方法 取5个三角瓶，按1:30的浸提比加蒸馏水(以干品重量计)，pH 7下置于90℃恒温水浴锅中浸提2 h，离心、脱蛋白、浓缩，再加4倍于浓缩后体积的不同浓度乙醇(见表4)醇析24 h，再过滤，得到粗多糖。 2.5. 正交试验方法 本实验通过对各单因素影响灵芝多糖提取效果的分析，确定正交试验的因素和水平(表5)。采用热水浸提法提取多糖，对实验结果进行极差分析，确定灵芝最佳的提取工艺。实验数据用Microsoft Excel 2007进行统计分析。 Table 4 The single factor extraction conditions of Ganoderma lucidum polysaccharide 提取因素 因素水平 多糖提取条件 pH值 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 浸提温度90℃、浸提时间2 h、乙醇浓度95%、浸提比1:30 浸提温度 60℃、70℃、80℃、90℃、100℃ pH 7、浸提时间2 h、乙醇浓度95%、浸提比1:30 浸提时间 1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h pH 7、浸提温度90℃、乙醇浓度95%、浸提比1:30 乙醇浓度 80%、85%、90%、95%、100% pH 7、浸提温度90℃、浸提时间2 h、浸提比1:30 浸提比 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 pH 7、浸提温度90℃、浸提时间2 h、乙醇浓度95% 表4. 灵芝多糖的单因素提取条件 Table 5 Extraction of Polysaccharides from Ganoderma lucidu 水平 A pH值 B 浸提时间(h) C 浸提温度(℃) D 乙醇浓度(%) E 浸提比 1 6.5 1.5 70 85 1:20 2 7.0 2.0 80 90 1:30 3 7.5 2.5 90 95 1:40 表5. 提取灵芝多糖因素水平