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user: 2. TGF-β相互作用组在膀胱癌发展中的作用 2.1. TGF-β分子结构及生物学功能 转化生长因子β (TGF-β)是一个具有多功能的多肽类细胞因子超家族，包括TGF-βs、激活素、抑制素、胚胎成形素(Nodal)、骨形成蛋白(BMPs)、抗苗勒管抑制素(AMH)和生长分化因子(GDFs)组成，其在所有多细胞中都有发现 [ 3 ]。由于其受体也广泛表达于机体组织细胞，而TGF-β与其受体具有高度亲和力，因此TGF-β对多数细胞可发挥调节作用。TGF-β超家族C-末端包含9个半胱氨酸残基的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体，其中8个形成紧密的半胱氨酸结，而第9个对同源二聚化(homodimerization)至关重要 [ 4 ]。脊椎动物基因组包含30多种TGF-β超家族的多效性配体，TGF-β超家族中的许多配体的异常表达和活性与发育缺陷与人类疾病有关 [ 5 ]。TGF-β有5种异构体：TGF-β1-5，在哺乳动物中存在3种高度同源的亚型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们的表达水平因组织不同而不同，并且它们的功能也不同。 TGF-β参与了胚胎发育和成人组织中的动态平衡的一系列生物学过程。包括抑制细胞增殖、上皮–间充质转化的诱导、免疫抑制和炎症以及细胞外基质调节等功能。其最显著的特征是：肿瘤发生早期的抑瘤作用和肿瘤发生后期的促瘤作用。TGF-β强烈抑制多种细胞增殖，如上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、免疫细胞等。在肿瘤发生早期阶段，TGF-β激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1A和CDKN2A (分别编码p21CIP1和P12INK4b)的转录，介导细胞周期阻滞于G1期，从而抑制肿瘤细胞增殖 [ 6 ]。但在肿瘤发生后期，TGF-β信号转导通路介导差异基因表达，导致细胞对TGF-β的抑制信号无反应，肿瘤微环境中反馈性增加TGF-β分泌，TGF-β过表达，导致上皮–间充质转化(EMT)，引起上皮细胞表型和极性变化，同时促进肿瘤内血管生成，增强肿瘤细胞的运动性和侵袭性 [ 7 ]；抑制免疫细胞活性，参与肿瘤细胞免疫逃逸。 2.2. TGF-β介导EMT过程与膀胱癌的关系 TGF-β1在膀胱癌组织中特异性表达，作为TGF-β的亚型之一，其主要通过EMT途径调节细胞外基质的组成来参与膀胱癌的侵袭和转移过程 [ 8 ]。上皮–间充质转化(Epithelial mesenchyme transformation， EMT)是一个多步骤过程，通过EMT途径，尿路上皮细胞将获得高侵袭性与运动鞋的间充质特性 [ 9 ]。EMT典型特征是上皮标记物如E-钙黏蛋白(E-cadherin)和细胞角蛋白下调，间充质标记物如波形蛋白(vimentin)上调 [ 10 ]。上皮细胞具有重要的屏障功能，这一功能是通过细胞间的粘附介质紧密连接实现的，而上皮细胞中最重要的粘附介质是钙黏蛋白(cadherin)。钙黏蛋白水平下调使屏障功能丧失，引起上皮细胞的形态学改变，增加细胞的运动能力，这与肿瘤的侵袭和转移密切相关，在膀胱癌的发展中起重要作用。第一批被鉴定的钙黏蛋白是E-cadherin、P-cadherin、N-cadherin [ 11 ]。E-cadherin在上皮间的相互作用起最至关重要的作用，它介导相邻细胞间的紧密连接，并维持上皮细胞的表型和顶端极性。由于E-cadherin这些功能，它在抑制肿瘤侵袭性方面起关键作 [ 12 ] [ 13 ]。钙黏蛋白转换(cadherin switch)是EMT过程中的一个关键性变化，在此过程中，E-cadherin的正常表达被P-cadherin和N-cadherin的异常表达所取代，从而导致E-cadherin (CDH1)水平下调，而它的下调可能有助于肿瘤进展的另一种方式，即释放β-连环蛋白(β-catenin，又CTNNB1)。CDH1的胞质结构域通过CTNNA1和CTNNB1锚定在肌动蛋白细胞的骨架上，为粘附连接提供机械稳定性 [ 14 ] [ 15 ]。当CDH1下调时，CTNNB1被释放，并迁移到胞核激活WNT靶基因，导致EMT和更多的转移形成 [ 16 ]。基于以上分析，CDH1和CTNNB1常被用来检测胚胎发育和肿瘤发展过程中的EMT进展。TGF-β1通过激活Smad3/4信号通路诱导锌指转录因子1 (Snail1)的强烈启动，而Snail1再激活ZEB-1/ZEB-2和Snail2，后两者共同抑制CDH1水平，进而导致EMT进展 [ 17 ]。除此之外，TGF-β还可通过增强转录因子Snail/Ets-1的表达来调节基质金属蛋白(MMP-9)，促进肿瘤EMT [ 18 ]。POK红系髓系成体因子(Pokemon)是POK家族转录抑制因子的成员，在细胞转化和恶性肿瘤中起着重要作用。Wei Li [ 7 ] 等发现TGF-β1抑制代表膀胱癌细胞的T24细胞的增殖和迁移，Pokemon在膀胱细胞中高度表达，TGF-β1可能抑制Pokemon和CDH1的表达，Pokemon和CDH1的低表达导致了上皮细胞表型改变和根尖极性增加，这些细胞的改变引起EMT并最终导致膀胱癌的复发和转移。 2.3. TGF-β在膀胱癌免疫抑制和炎症中的作用 TGF-β对免疫系统的大多数前体细胞有较强的生长抑制作用，是T细胞的有效抑制因子和B细胞的凋亡的诱导剂。Rosemary等 [ 19 ]。发现敲除TGF-β1基因的小鼠出现出生后致死性炎症反应，表明该配体具有重要的免疫抑制作用。TGF-β受体在所有类型的免疫细胞上广泛表达。TGF-β阻碍树突状细胞的抗原提呈作用，使肿瘤细胞失去免疫应答；IL-2诱导产生NK细胞，在膀胱癌中，TGF-β的过量表达阻断IL-2的产生而导致NK细胞减少并同时破坏宿主CD8+细胞等介导的细胞毒作用，共同完成肿瘤细胞的免疫逃逸。研究显示树突状细胞和NK细胞在头颈鳞癌中存在功能性失活；此外，转录因子Foxp3的表达驱动的抑制性Treg细胞对于维持外周免疫耐受以及调节肿瘤免疫和感染至关重要；至于天然免疫系统的细胞，TGF-β通过Smad3途径对干扰素γ启动子的转录作用，直接抑制NK细胞介导的干扰素γ的产生。它还将巨噬细胞和中性粒细胞从I型表型(攻击和吞噬癌细胞)转变为II型表型(产生大量炎症分子)。这些分子会加重局部的疾病状态，导致实体肿瘤进展或炎症与纤维化；Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效地介导了组织的炎症反应。相关研究报道，TGF-β可诱导Smad2与RORgt途径结合，促使CD4+T细胞向Th17细胞分化 [ 20 ]。然而围绕这一话题仍存在巨大争议。还有些研究发现，过量表达的TGF-β下调主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达，并使激活杀伤细胞的淋巴因子失活，阻止免疫球蛋白的合成 [ 21 ]。由此可见，TGF-β通过免疫抑制在肿瘤微环境中发挥了促癌作用。进一步的研究也显示抑制肿瘤微环境中的TGF-β，可以促进免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应，这一发现也奠定了以TGF-β为中心的免疫疗法的理论基础。 2.4. TGF-β对膀胱癌转移的作用 膀胱癌的发展过程离不开血管的营养支持，并且膀胱癌内新生的血管有助于其转移。诱导新生血管由肿瘤细胞释放的血管内皮生长因子(VEGF、FGF等)来完成，而TGF-β在血管内皮生长因子起到旁分泌调节作用，刺激内皮细胞和毛细血管腔生成，TGF-β也在膀胱癌的转移中发挥着至关重要的作用。 在组织中，TGF-β结合蛋白与TGF-β结合，在胞外基质中储存，TGF-β的II型受体(II-R)被刺激后自动磷酸化与TGF-β结合，其蛋白激酶活性催化I-R磷酸化——磷酸化后的I-R继续磷酸化下游分子，使信号传到胞内并进一步磷酸化Smad2或3，之后再与Smad4结合形成复合物转入胞核内进行基因调控。该过程正常情况下可抑制肿瘤生长，然而在肿瘤发展阶段，信号通路的主要蛋白出现基因突变和缺失，引起该通路转导异常从而导致肿瘤的浸润转移，其中具有代表性的有miR-211。Chu等 [ 22 ] 的研究表明，超过60％的转移性头颈部鳞状细胞癌组织表现出II-R表达下调，miR-211可能通过抑制II-R，破坏Smad3磷酸化和上调c-Myc表达而促进头颈部鳞状细胞癌。表明II-R的表达下降与和肿瘤的高度侵袭性、高度淋巴结转移率、预后不良呈正相关。在两个受体的启动子基因突变或者甲基化下，mRNA水平下降，进而两者同时下降；纯合子Smad4的基因缺失，导致Smad失去TGFβ分子的核转运功能，致使下游的靶基因不能启动，下游信号中断。Smad4蛋白的缺失或者失活在胰腺癌、结肠癌、头颈癌中均有相关表达 [ 18 ]。