system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与分析 3.1. 黄芪多糖超声提取的单因素实验 3.1.1. 液料比对多糖提取率的影响 取5 g干粉置于锥形瓶中，根据固液比(1:10， 1:15， 1:20， 1:25， m/V， g/mL)加入蒸馏水。在单槽式超声清洗机中超声15 min后，将锥形瓶置于HH-2数显恒温水浴锅中，在60℃的温度下水浴提取40 min。水浴提取后，用纱布过滤掉大部分滤渣，收集提取液。将提取液于4000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，放置过夜。次日以4000 r/min离心10 min，取沉淀在烘箱内50℃烘干，得到粗多糖。将该粗多糖溶解于100 ml容量瓶中稀释后进行分光光度的测量。结果如图2数据表所示： 图2. 多糖提取率与液料比关系图 由图2的结果分析，由于不同比例的液料比的影响，多糖含量的提取率出现了先增加后减少的趋势。黄芪多糖从黄芪细胞到溶剂是一个由浓度差推动的扩散过程。溶剂用量越多，将会导致外部溶剂与黄芪细胞内部的浓度差越大。这样使得推动力越大，扩散到溶剂里的多糖就越多。增加溶剂的用量在一定程度上能通过增大浓度差来促进多糖的提取。但是随着溶剂的增加，溶液的粘度增加，导致向内部组织扩散距离的延长，从而提取率减小 [ 11 ]。从实验结果显示，当液料比在1:15时，多糖提取率最高。 3.1.2. 超声时间对多糖提取率的影响 取5 g干粉置于锥形瓶中，根据固液比1:15加入蒸馏水。在单槽式超声清洗机中超声(10， 15， 20， 25 min)后，将锥形瓶置于HH-2数显恒温水浴锅中，在60℃的温度下水浴提取40 min。水浴提取后，用纱布过滤掉大部分滤渣，收集提取液。将提取液于4000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，放置过夜。次日以4000 r/min离心10 min，取沉淀在烘箱内50℃烘干，得到粗多糖。将该粗多糖溶解于100 ml容量瓶中稀释后进行分光光度的测量。结果如图3数据表所示： 图3. 多糖提取率与超声时间关系图 由图3的结果分析，由于不同的超声时间的影响，多糖含量的提取率出现了先增加后减少的趋势。由于超声波可能引起植物的声空化和细胞壁破裂，气泡的破裂将促进渗透将溶剂溶解到植物细胞中，溶解多糖 [ 12 ]，从而使多糖的含量增加。但是当超声时间增加到一定值时，多糖的溶解会受到抑制的影响，导致含量降低。从实验结果显示，当超声时间为15 min时，多糖提取率最高。 3.1.3. 水浴时间对多糖提取率的影响 取5 g干粉置于锥形瓶中，根据固液比1:15加入蒸馏水。在单槽式超声清洗机中超声15 min后，将锥形瓶置于HH-2 数显恒温水浴锅中，在60℃的温度下水浴提取(30， 40， 50， 60 min)。水浴提取后，用纱布过滤掉大部分滤渣，收集提取液。将提取液于4000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，放置过夜。次日以4000 r/min离心10 min，取沉淀在烘箱内50℃烘干，得到粗多糖。将该粗多糖溶解于100 ml容量瓶中稀释后进行分光光度的测量。结果如图4数据表所示。 由图4的结果分析，由于不同的水浴时间的影响，多糖含量的提取率出现了先增加后减少的趋势。水浴提取时间的增加能让黄芪中的多糖在水中充分溶解，使多糖含量增加。但过了一定时间后，水浴提取时间的延长不再使多糖产量得到提高。可能是多糖提取达到动态平衡，因此不会使提取率提高。随着时间的增加，多糖甚至会分解，导致含量降低。实验结果显示，当水浴时间为40 min时，多糖提取率最高。 图4. 多糖提取率与水浴时间关系图 3.1.4. 水浴温度对多糖提取率的影响 取5 g干粉置于锥形瓶中，根据固液比1:15加入蒸馏水。在单槽式超声清洗机中超声15 min后，将锥形瓶置于HH-2数显恒温水浴锅中，在(55℃， 60℃， 65℃， 70℃)的温度下水浴提取40 min。水浴提取后，用纱布过滤掉大部分滤渣，收集提取液。将提取液于4000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，放置过夜。次日以4000 r/min离心10 min，取沉淀在烘箱内50℃烘干，得到粗多糖。将该粗多糖溶解于100 ml容量瓶中稀释后进行分光光度的测量。结果如图5数据表所示： 图5. 多糖提取率与水浴温度关系图 由图5的结果分析，由于水浴温度的不同，多糖含量的提取率出现了先增加后减少的趋势。当温度过低的时候，多糖在水中的溶解能力会降低，导致在低温下溶解多糖的量降低。由于温度的升高，分子的动能也会增加。溶剂的渗透力和溶解力也会随之提高，促进了多糖溶解在提取溶剂中。但随之温度升高到一定值时，多糖不再溶解。反而因温度的过高而导致多糖的分解，从而使含量降低。实验结果显示，当水浴温度为60℃时，多糖提取率最高。 3.2. 黄芪多糖提取的优化 3.2.1. 正交旋转中心结合设计 以单因素的实验最佳值的结果(即液料比为1:15、超声时间为15 min、水浴时间为40 min、水浴温度为60℃)为基准，设计二次旋转正交实验优化黄芪多糖的水浴加热提取工艺。设计四因素五水平的二次旋转正交实验：液料比(X 1 )，超声时间(X 2 )，水浴时间(X 3 )，水浴温度(X 4 )。四个因素变量从小到大被编码成五个水平从−2到2，以黄芪多糖的提取率为目标，运用数据处理软件SAS得出，整个实验36组。二次旋转正交实验设计具体如表2、表3如下 [ 5 ] [ 6 ]： Table 2 Factor and level design in orthogonal rotating desig 因素 标志 水平 −2 −1 0 1 2 液料比(W) X 1 1:5 1:10 1:15 1:20 1:25 超声时间(min) X 2 5 10 15 20 25 水浴时间(min) X 3 30 40 50 60 70 水浴温度(℃) X 4 50 55 60 65 70 表2. 正交旋转设计中的因素和水平设计 Table 3 Design table of two rotating orthogonal experimen 试验号 X 1 X 2 X 3 X 4 产率(%) 1 1 1 1 1 1.64 2 1 1 1 −1 1.22 3 1 1 −1 1 1.67 4 1 1 −1 −1 0.97 5 1 −1 1 1 1.14 6 1 −1 1 −1 1.46 7 1 −1 −1 1 1.08 8 1 −1 −1 −1 0.93 9 −1 1 1 1 2.00 10 −1 1 1 −1 0.80 11 −1 1 −1 1 2.19 12 −1 1 −1 −1 0.81 13 −1 −1 1 1 2.11 14 −1 −1 1 −1 1.00 15 −1 −1 −1 1 1.46 16 −1 −1 −1 −1 0.76 17 −2 0 0 0 0 18 2 0 0 0 1.66 19 0 −2 0 0 1.03 20 0 2 0 0 1.61 21 0 0 −2 0 0.17 22 0 0 2 0 1.25 23 0 0 0 −2 0.48 24 0 0 0 2 1.46 25 0 0 0 0 1.66 26 0 0 0 0 1.92 27 0 0 0 0 1.72 28 0 0 0 0 1.73 29 0 0 0 0 1.77 30 0 0 0 0 1.90 31 0 0 0 0 1.64 32 0 0 0 0 1.68 33 0 0 0 0 1.69 34 0 0 0 0 1.74 35 0 0 0 0 1.68 36 0 0 0 0 1.73 表3. 二次旋转正交实验设计表 3.2.2. 建立和回归方程试验 Table 4 Variance analysis of experimental result 因子 自由度 参数估计 标准差 t值(F值) Pr > t Intercept 1 −53.53 15.72 −3.40 0.0027 X 1 1 17.58 6.99 2.51 0.0202 X 2 1 −1.74 6.99 −0.25 0.8059 X 3 1 56.44 19.40 2.91 0.0084 X 4 1 56.27 23.96 2.35 0.0288 X 1 2 1 −4.14 1.50 −2.76 0.0118 X 4 2 1 −1.07 1.50 −0.71 0.4825 X 3 2 1 −28.14 8.64 −3.26 0.0038 X 4 2 1 −25.57 11.77 −2.17 0.0414 X 1 *X 2 1 0.66 2.12 0.31 0.7602 X 1 *X 3 1 0.44 5.09 0.09 0.9313 X 1 *X 4 1 −15.05 5.94 −2.53 0.0193 X 2 *X 3 1 −5.47 5.09 −1.08 0.2946 X 2 *X 4 1 9.01 5.94 1.52 0.1443 X 3 *X 4 1 −5.46 14.25 −0.38 0.7055 表4. 实验结果的方差分析表 Table 5 Table of the variance analysis of two rotating orthogonal experiment (1 来源 自由度 平方和 均方 F值 Pr>F 模型 14 7.13 0.51 4.42 0.0011 误差 21 2.42 0.12 合计 35 9.55 表5. 二次旋转正交实验方差分析表(1) Table 6 Table of the variance analysis of two rotating orthogonal experiment (2 均方误差 因变量均值 变异系数 R 2 Adj R 2 0.34 1.38 24.57 0.75 0.58 表6. 二次旋转正交实验方差分析表(2) 实验数据根据SAS软件拟合结果表4，黄芪多糖的提取率Y与各因素变量遵循以下相关方程： Y = − 53.53 + 17.58 X 1 − 1.74 X 2 + 56.44 X 3 + 56.27 X 4               − 4.14 X 1 2 − 1.07 X 2 2 − 28.14 X 3 2 − 25.57 X 4 2               + 0.66 X 1 ∗ X 2 + 0.44 X 1 ∗ X 3 − 15.05 X 1 ∗ X 4               − 5.47 X 2 ∗ X 3 + 9.01 X 2 ∗ X 4 − 5.46 X 3 ∗ X 4 . 其中Y是黄芪多糖的提取率，X 1 、X 2 、X 3 ，X 4 变量分别为液料比、超声时间、水浴时间、水浴温度。 由表5、表6所示二次旋转正交实验的方差分析，二次回归方程的较高的F值(F = 4.42)以及低P值(P = 0.0011)，表明了该二次回归方程有比较可靠的统计学意义。该模型能够满足预测变量的范围，F值和P值一般是用来检测每一个系数的意义。由表5的数据可以知道，X 1 ，X 3 ，X 4 ， X 1 2 ， X 3 2 ， X 4 2 ，X 1 X 4 的系数具有较高显著性(Pr < 0.05)，除此之外其他因子的系数均没有显著性。除去没有显著性的因子，用SAS软件再拟合，得到以下优化的方程： Y = − 53.53 + 17.58 X 1 + 56.44 X 3 + 56.27 X 4 − 4.14 X 1 2               − 28.14 X 3 2 − 25.57 X 4 2 − 15.05 X 1 ∗ X 4 . 根据对优化后的二次回归方程求导可以得出：最佳的条件为X 1 (液料比) = 1:7，X 2 (超声时间) = 15 min，X 3 (水浴时间) = 50 min，X 4 (水浴温度) = 70℃。由该条件进行三次平行实验可得： Table 7 Best conditions for parallel experimental table 项目 1 2 3 平均值 提取率(%) 2.09 2.21 2.11 2.14 表7. 最佳条件的平行实验表 由表7可知：在该条件下得出的提取率(Y)接近预测值(Y = 2.19%)，表明了该条件为最优实验条件，适用于黄芪多糖的提取。 如表4所示，根据F值可以看出，四个因素对黄芪多糖提取率的影响程度分别是X 3 (水浴时间) > X 1 (液料比) > X 4 (水浴温度) > X 2 (超声时间)。另外，方差分析结果显示：除X 2 (超声时间)对提取率没有显著影响(Pr > 0.05)外，其他3个单因素对黄芪多糖的提取率都有显著的影响(P < 0.05)。 3.2.3. 响应面分析 响应面的三维空间图是对二次回归方程的解释，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法 [ 13 ]。它是一种用直观的方法来了解每个变量之间的关系，从而测量两个变量之间的关系 [ 14 ]。陡峭的响应面表明变量之间有统计学意义。另外，响应面平面投影反映了两因素之间的相互作用强度，平面投影的形状，圆形或椭圆形反映相互作用是否明显。另外，每一幅图都表示当两个因子在二次旋转正交实验的零水平时，其他两个因子相互作用的情况。故使用matlab软件进行分析，得到分析图排列具体如图6~11所示。 由图6~11分析可知：液料比与超声时间，液料比与水浴时间，水浴时间与水浴温度对于多糖的提取率的影响比液料比与水浴温度，液料比与水浴时间，超声时间与水浴温度的影响要大。 图6. 液料比与超声时间相互关系 图7. 液料比与水浴时间相互关系 图8. 水浴时间与水浴温度间相互关系 图9. 液料比与水浴温度间相互关系 图10. 液料比与水浴时间相互关系 图11. 超声时间与水浴温度间相互关系 3.3. 黄芪多糖的红外光谱分析 糖类通常在3600~3200 cm −1 会出现一组宽峰，即O-H的伸缩振动，而且在更低的区域2920~2990 cm −1 会出现比较弱的吸收峰C-H，在这区域的两组吸收峰即为糖类的特征峰 [ 15 ]。 图12. 黄芪多糖的傅里叶红外光谱图 如图12所示，对黄芪多糖的红外光谱进行分析，进一步确定其含有的官能团结构。在3355.04 cm −1 出现一组宽而大的吸收峰，这是由于O-H的伸缩振动引起的，表明样品中应该含有-OH基团；在2932.07 cm −1 出现比较弱的C-H吸收峰，而在1643.88 cm −1 处的吸收峰主要是由CO-基团的C=O非对称伸缩振动引起的，1408.27 cm −1 吸收峰是由-COOH的C-O伸缩振动引起的。以上分析表示实验样品的结构符合多糖的官能团结构 [ 16 ]。 3.4. 黄芪多糖的抗氧化活性分析–自由基的清除能力 3.4.1. 芬顿法 Table 8 Measurement of absorbance results by Fenton metho 项目 1 2 3 平均值 A 2 0.126 0.124 0.121 0.124 A 1 0.114 0.110 0.111 0.112 A 0 0.187 0.190 0.190 0.189 表8. 芬顿法测量吸光度结果 由表8可知，根据清除率 I 1 % = [ ( A 2 − A 1 ) / ( A 0 − A 1 ) ] ∗ 100 可以算出，在芬顿法下，黄芪提取液浓度为1 mg/L时，OH-自由基清除率为15.58%。 3.4.2. 水杨酸法 Table 9 Measurement of absorbance results by salicylic acid metho 组别 A X A C A 0 羟自由基清除率 平均清除率 1 0.811 0.168 27.8 2 0.786 0.195 0.890 33.6 33.2 3 0.768 0.218 38.2 表9. 水杨酸法测量吸光度结果 由表9可知，根据清除率 I 2 % = [ A 0 − ( A X − A C ) ] / A 0 ∗ 100 可以算出，在水杨酸法下，黄芪多糖浓度为1 mg/L时，OH−自由基清除率为33.2%。 比较文献的黄芪多糖的抗氧化活性二次正交旋转组合加上超声辅助制备的黄芪多糖其抗氧化性能相对较好，可能是由于提取工艺相对复杂得到的产物纯度更高 [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]。