DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 结果与讨论 3.1. P(AM-AA-DBQA)合成的影响因素研究 反应物料配比为：丙烯酰胺、丙烯酸和DBQA的质量和占反应体系总质量的50%，异烷烃油、水、乳化剂、溴酸钾、焦亚硫酸钠和偶氮二异丁脒盐酸盐分别占反应体系总质量的15%、32.15%、2.5%、0.17%、0.08%和0.1%。在上述物料配比下分别考察了不同乳化剂配比和不同DBQA加入量对目标产物的影响。 3.1.1. 乳化剂配比的考察 在固定DBQA的投加量占单体摩尔量的0.5 mol%的条件下，考察乳化剂配比对P(AM-AA-DBQA)的影响，其结果如下表1所示。 Table 1 Effect of emulsifier ratio on P(AM-AA-DBQA m span 85 :m span 80 :m WT2524 聚合状态 转化率(%) 分子量(×10 6 g/mol) 0:2:1 团聚，凝胶状 — — 1:2:1 分层 — — 2:2:1 有颗粒存在 81.60 2.69 3:2:1 微乳液稳定 88.55 3.52 4:2:1 微乳液稳定 97.70 4.59 5:2:1 少量颗粒存在 74.80 3.14 6:2:1 团聚严重 — — 表1. 乳化剂配比对P(AM-AA-DBQA)的影响 乳化剂的选择很大程度上决定反应体系的聚合状态，将不同的乳化剂按合适配比复配使用，乳化剂之间可以发挥协同效应有利于形成稳定的微乳液体系。Span85的HLB值比Span80和WT2524的HLB值低，随着乳化体系中Span85配比的增加，体系的HLB值逐渐下降，体系聚合状态从团聚到稳定的微乳液再到团聚。由表1可知，体系HLB值过低和过高都不利于微乳液的稳定，当乳化体系中三者的质量比为4:2:1时，反应体系更加有利于微乳液聚合反应。 3.1.2. DBQA投加量的考察 在复合乳化剂体系Span85、Span80和WT2524的质量比为4:2:1的条件下，考察了DBQA投加量对P(AM-AA-DBQA)的影响，其结果如下图2所示。 图2. DBQA加量对P(AM-AA-DBQA)的影响 由图2可得，随着DBQA投加量不断增加，P(AM-AA-DBQA)的转化率先增加后减少，在投加量占单体摩尔量的0.6%时转化率最高为98.90%；随着DBQA投加量不断增加，P(AM-AA-DBQA)的分子量同样程现出了先增加后降低的趋势，在投加量占单体摩尔量的0.6%时产物分子量最大，为4.9 × 106 g/mol。综合考虑转化率和分子量两个因素，选择DBQA投加量为0.6 mol%。 3.2. DBQA红外谱图分析 将合成的DBQA进行红外测试，其红外谱图如上图3所示，在3428.28 cm −1 存在酰胺基中N-H的伸缩振动吸收峰；在3019.91 cm −1 存在苯环上不饱和C-H的伸缩振动吸收峰；在1626.93 cm −1 存在Ar-H的倍频和复合频特征吸收峰；在1418.89~1482.86 cm −1 存在苯环上C=C环骨架振动吸收峰；在704.69~783.64 cm −1 存在苯环C-H面内振动吸收峰；在884.82 cm −1 存在季铵盐特征吸收峰。综上，红外谱图与目标产物DBQA结构相符。 图3. DBQA的红外图 3.3. DBQA氢谱分析 将合成的DBQA进行核磁共振氢谱测试，其氢谱如上图4所示，DBQA中的H的化学位移分析如下：δe = 3.354 ppm和δf = 3.049ppm分别是N+上连接的C-H的伸缩振动和-CH2-的伸缩振动，δa = 7.516 ppm为苯环上C-H的伸缩振动，δd = 4.454 ppm为与苯环相连的亚甲基上C-H的伸缩振动，δg = 2.249 ppm为N-H的伸缩振动。该谱图与目标产物DBQA结构相符。 3.4. P(AM-AA-DBQA) 红外谱图分析 将合成的P(AM-AA-DBQA)进行红外测试，其红外谱图如上图5所示，在3425.41 cm −1 存在酰胺基N-H键的吸收峰；分别在2955.37 cm −1 和2925.69 cm −1 处存在分子链中-CH3和-CH2-的特征吸收峰；在1563.69 cm −1 处为苯环的特征吸收峰；在1454.29 cm −1 和1406.57 cm −1 处为N+相连的-CH3的振动吸收峰；羧基中C-O键的吸收峰出现在1177.24 cm −1 和1121.32 cm −1 处。综上可得目标产物P(AM-AA-DBQA)已合成。 图4. DBQA的 1 H NMR谱图 图5. P(AM-AA-DBQA)的红外谱图 3.5. 反相微乳液P(AM-AA-DBQA)的粒径分布 取适量反相微乳液P(AM-AA-DBQA)聚合产物，加入到一定体积的无水乙醇中，超声分散后置于激光纳米粒度仪样品池中，测定聚合物粒子的粒径及其分布。测得聚合产物粒径为80~110 nm左右，测试结果如下图6所示。 图6. 反相微乳液P(AM-AA-DBQA)的粒径分布 3.6. 反相微乳液P(AM-AA-DBQA)的稳定性分析 采用法国Formulaction公司的UPH-I-20L型全能近红外稳定分析仪，对反相微乳液P(AM-AA-DBQA)的稳定性进行分析。测试温度为35℃，设定合适的程序，进行连续六周的扫描，并通过程序计算得到扫描过程中SI值的变化(曲线1~6分别表示存放1~6周下得到的SI变化曲线)。其结果如图7所示，由图可得微乳液的SI值基本无变化，所以储存稳定性较强。 图7. 反相微乳液P(AM-AA-DBQA)的稳定性分析 3.7. 反相微乳液P(AM-AA-DBQA)的净水性能研究 为了探究P(AM-AA-DBQA)的净水性能，采用吉林某油田的含油污水进行瓶试。具体方法为将100 mL含油污水加入到100 mL比色管中，在恒温水浴中预热至试验温度后，加入一定量的药剂，拧紧盖子，手动震荡200下，继续放入水浴中加热，持续观察试验现象并定期取样检测水中含油量。为了和现场条件保持一致，将试验温度设置为60℃，加药量统一为15 mg/L。试验选取现场所用药剂(阳离子型聚丙烯酰胺)和两种市售药剂A、B (聚季铵盐类、非离子有机胺类)作为对照。试验结果见表2。 Table 2 Comparison test results of various types of pharmacy performanc 药剂名称 加药量/(mg/L) OIW/(mg/L) 水色 15 min 30 min 45 min 60 min 现场药剂 15 89 87 82 78 无色 市售A 15 150 145 144 141 微黄 市售B 15 178 178 176 175 微黄 P(AM-AA-DBQA) 15 77 70 67 67 无色 表2. 各类药剂性能对比试验结果 从上表可以看出，在加药量相同时，P(AM-AA-DBQA)的处理效果最好，所分出的水无色透亮，说明该产品在处理含油污水方面有自己独特的优势。这主要得益于其本身的特殊结构，这种疏水缔合两性聚丙烯酰胺不仅有很好的渗透性和增黏性，而且还增强了电中和和吸附桥架作用，从而能够提高除油效率。
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user: 4. 结论 1) 本文合成了一种疏水缔合两性聚丙烯酰胺P(AM-AA-DBQA)，并对其结构进行了红外谱图分析，与目标产物结构一致。在乳化剂span 85、span 80、WT2524的质量比为4:2:1，DBQA投加量占单体摩尔量的0.6%时，原料转化率高达98.90%。 2) 实验测得P(AM-AA-DBQA)的粒径分布在80~110 nm，采用近红外稳定分析仪对其稳定性进行分析，其SI值在六周内基本无变化，说明该产品储存稳定性较强。 3) 在瓶试中，该产品表现出了良好的净水性能，在加药量为15 mg/L时，处理后水中含油量为67 mg/L，处理效果优于现场药剂及市售的两种药剂。
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user: 摘 要 视网膜母细胞瘤(retinoblastoma， RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，临床表现复杂，可表现为结膜充血水肿、角膜水肿、虹膜新生血管、玻璃体混浊、眼压升高及斜视等。本病易发生颅内及远处转移，常危及患儿生命，因此早发现、早诊断及早治疗是提高其治愈率、降低死亡率的关键。近年来，该病的治疗方式也不断发展，从最初的手术治疗，到近年研究较热的玻璃体腔内注射化疗药物、眼动脉介入治疗、基因靶点治疗等。随着分子生物学水平技术的发展、基因诊断和治疗水平的提高及分子测序技术的广泛应用，人类对该病本质的认识更加深刻，基因靶向治疗将成为未来治疗的潜在策略。本文阐述了视网膜母细胞瘤的治疗方法并对其未来的治疗方向进行了展望。 关键词 :视网膜母细胞瘤，眼动脉介入治疗，基因治疗，靶向治疗 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma， RB)是原发于视网膜的一种眼内恶性肿瘤，常见于3岁以下的儿童，成人罕见，发病率占小儿各类恶性肿瘤的4% [ 1 ] ，位于小儿恶性肿瘤第二位，可单眼、双眼或者同时发病，严重威胁患儿视力，甚至生命。随着医学的发展，RB的治疗方式经历了一系列变化，从最初的全身化疗到眼球摘除，再到保留视功能的治疗，但仍以全身化疗为基础的综合治疗为最常用的治疗方法 [ 2 ] 。根据Murphree [ 3 ] 等对RB提出的RB国际分类法(International Intraocular Retinoblastoma Classification， IIRC)中，不仅涉及到了肿瘤的大小、部位，还提到了肿瘤与黄斑、视盘等的位置关系以及肿瘤在视网膜下、玻璃体腔播散情况的评估，由此来评估肿瘤的分类、治疗方式和化学治疗药物的剂量。在此分类法中，虽然玻璃体腔内注射化疗药物、眼动脉介入治疗对于D、E期复发的视网膜母细胞瘤有一定的疗效，但是对其的复发我国的治疗手段仍以眼球摘除为主，对患儿的外观造成了严重的影响。鉴于患儿自身的情况及视网膜母细胞瘤发展的不同阶段，所用的治疗方法也不相同，所以接下来将对该病的治疗方法分别进行介绍。
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user: 3. 结论及展望 随着对眼部肿瘤的研究的不断深入，视网膜母细胞瘤的治疗得到了进一步的提升。虽然对D、E期顽固性或复发性的肿瘤也有了很好的方法，但是保眼率并不理想，这仍需要我们进一步研究有效的治疗方法。同时，基因治疗、靶向治疗将具有更加广阔的研究前景，如果可以将局部经眼动脉化学疗法或者玻璃体腔注射化学药物联合基因治疗，这将是治疗视网膜母细胞瘤的一重大突破，同时靶向纳米胶束也将成为一种肿瘤治疗的替代方案。
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user: 摘 要 目的：研究跨膜蛋白176B (Transmembrane protein 176B， TMEM176B)在乳腺癌中凋亡作用及机制。方法：qRT-PCR、western blot法检测乳腺癌组织中TMEM176B表达；小分子干扰RNA和干扰TMEM176B后研究其作用和分子机制。MTT法和CCK8实验检测乳腺癌细胞生长情况；流式细胞实验检测乳腺癌凋亡作用。结果：干扰TMEM176B后明显抑制乳腺癌活力和诱导乳腺癌凋亡，抑制细胞增殖蛋白Ki67表达，且下调抑凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax表达水平。在机制方面，我们发现干扰TMEM176B后下调p53表达和p-AKT水平。结论：TMEM176B通过调控p53表达和p-AKT水平进而调控乳腺癌凋亡作用。 关键词 :乳腺癌，TMEM176B，Bcl-2，Bax，Ki67，p53和p-AKT信号通路 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来已成为全球女性第二大死因 [ 1 ]。2015年，约430万中国妇女诊断患有乳腺癌，其中75%人死于乳腺癌 [ 2 ]。乳腺癌治疗包括外科手术切除、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗和其他补充治疗 [ 3 ]。但是，这些传统治疗方法大多数会产生副作用或疗效不佳。因此，寻找新的靶点抑制乳腺癌生长和诱导其凋亡，可延长乳腺癌患者生存期和改善生活质量。跨膜蛋白176B (Transmembrane protein 176B， TMEM176B)，也称为耐受相关诱导蛋白，是一种免疫调节的阳离子通道 [ 4 ] [ 5 ]。TMEM176B蛋白包含四个跨膜结构域及C端的ITIM基序。TMEM176B及其同源TMEM176A是MS4A蛋白家族的成员 [ 6 ]，主要表达于单核细胞、巨噬细胞和CD11B + 树突状细胞 [ 7 ]。随后研究发现TMEM176B广泛存在于肺脏、肝脏、肾等 [ 8 ]。最近研究发现TMEM176B调控肿瘤微环境中免疫细胞功能，且阻断TMEM176B后增强抗肿瘤免疫作用 [ 9 ]。但是，TMEM176B在乳腺癌中表达及其对乳腺癌作用和分子机制尚未清楚。 在这篇文章中，我们探讨TMEM176B在乳腺癌中表达及其在乳腺癌中作用，同时阐明其分子机制。本文采用小分子干扰片段敲低乳腺癌细胞TMEM176B表达，用MTT实验、CCK8实验和流式细胞实验检测乳腺癌生长和凋亡情况。同时检测相关凋亡蛋白Bax\Bcl-2、增殖蛋白Ki67，以及抑癌基因p53和AKT信号通路，初步阐明TMEM176B在乳腺癌癌中作用及分子机制。此外，我们也初步评估TMEM176B在乳腺癌诊断中价值。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 细胞培养 乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自ATCC。用DMEM+10%的胎牛血清完全培养基无菌于37˚、5% CO 2 的细胞培养箱中培养。 2.2. 试剂和耗材 MTT购自北京鼎国公司。CCK8试剂盒购自乐研生物公司。Real time PCR的SYBER Green和逆转录酶试剂盒购自Takara公司。RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司。干扰TMEM176B的siRNA小分子干扰片段购自上海吉玛公司。转染试剂Lipo3000购自Invtrogen公司。细胞培养液购Hyclone公司。TMEM176B抗体购自Proteintech公司；Bax、Bcl-2、p53、Ki67、β-actin抗体购自Abcam公司。 2.3. 方法 MTT法检测乳腺癌细胞活力：采用噻唑兰颜色反应法，即MTT法进行细胞增殖活力的测定。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色晶体甲缵，并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。MDA-MB-231细胞种植于96孔板，转染siRNA-TMEM176B，处理24 h后，每孔加入10 µl的MTT工作液(浓度为5 mg/ml)，于37˚、5% CO 2 的细胞培养箱中继续培养4小时；去掉上清，加入150 µl DMSO，1000转/min，摇床震荡10 min，用酶标仪测定OD 490 的光密度值。实验中每份样品设6个复孔，实验至少重复3次。 CCK8法检测乳腺癌细胞活力：该试剂中含有WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。每孔接种5000个细胞，设定6个重复孔，细胞贴壁后，转染siRNA-TMEM176B，24 h后加入PBS润洗后吸出，加入稀释好的CCK8溶液，放入培养箱中30 min后测定OD值。 qRT-PCR实验 qRT-PCR检测乳腺癌组织TMEM176B的转录水平。步骤如下：收集20例乳腺癌组织，以癌旁组织为对照组，提取RNA，逆转录为cDNA，用Takara公司的SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验。PCR条件为：95℃ 30 s，1个循环；PCR反应，95℃ 5 s，60℃ 10 s，40个循环；溶解，95℃ 0 s，65℃ 20 s，95℃ 0 s，1个循环。PCR结束后，根据反应得到的Cp值，使用相对定量的分析方法，以标准曲线进行校正，最后计算出样品中各mRNA的相对浓度。进行qRT-PCR引物序列如表1。 Table 1 The primer of qRT-PC NCBI ID 基因 引物 引物序列 退火温度 NM_NM_001101311.1 TMEM176B 上游 5’-TACATGCAGATGCTGAGGAAG-3’ 60℃ 下游 5’-GAAGACCTACTCCCAAGGAAAC-3’ NM_002046.5 GAPDH 上游 5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’ 60℃ 下游 5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’ 表1. 实时荧光定量PCR引物 干扰TMEM176B实验 TMEM176B干扰小分子片段siRAN购自上海吉玛公司。 具体步骤如下：MDA-MB-231细胞种植于六孔板中，待其融合度为50%~60%时候，用Lipo3000转染试剂转染干扰小分子片段siRNA，一定时间后进行MTT实验、CCK8实验和流式细胞实验。 流式细胞实验 MDA-MB-231细胞种植于六孔板中，待其融合度为50%~60%时候，用Lipo3000转染试剂转染干扰小分子片段siRNA，24小时后收集细胞，重悬在1 × binding buffer中，调浓度为1 × 10 6 /ml，加入PI和Annexin V，孵育15 min，流式细胞仪分析。 Western blot实验 收集处理好的乳腺癌细胞蛋白或乳腺癌组织蛋白，进行蛋白定量，跑胶，电转电泳。加入一抗，4度过夜，收集一抗，加入二抗，然后加入ECL显色，拍照。 2.4. 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示。采用t检验。P < 0.05表示具有统计学意义。
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user: 3. 实验结果 3.1. 乳腺癌组织中TMEM176B表达情况 收集诊断为乳腺癌患者的乳腺癌组织，取癌旁组织为对照组。采用实时荧光PCR和Western blot分别检测TMEM176B在乳腺组织中表达。结果显示，相对于癌旁组织，TMEM176B在乳腺癌组织中高表达(图1(A)和图1(B))。 图1. TMEM176B在乳腺癌组织中表达 3.2. TMEM176B在乳腺癌细胞中作用 用小分子干扰片段siRNA转染MDA-MB-231细胞，进行MTT实验、CCK8实验检测乳腺癌细胞活力，以及流式细胞实验检测乳腺癌细胞凋亡作用。结果显示，小分子干扰片段siRNA敲低乳腺癌细胞TMEM176B后，乳腺癌细胞活力明显受抑制(图2(A)和图2(B))。流式细胞实验结果显示干扰TMEM176B后诱导乳腺癌细胞凋亡(图2(C))。这些结果表明TMEM176B调控乳腺癌细胞的凋亡过程。 3.3. TMEM176B调控乳腺癌细胞相关凋亡蛋白Bax/Bcl-2和增殖蛋白Ki67表达 为了阐明TMEM176B调控乳腺癌细胞生长和凋亡作用的分子机制，我们检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达。结果显示，干扰TMEM176B后明显上调促凋亡蛋白Bax表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2表达(图3(A))，明显上调Bax/Bcl-2比例(图3(B))。此外，我们也检测了增殖蛋白Ki67情况。图3(C)显示，沉默TMEM176B后明显下调Ki67蛋白表达。这些结果表明敲低TMEM176B后可能通过调控凋亡蛋白Bax/Bcl-2和增殖蛋白Ki67表达进而调控乳腺癌细胞凋亡作用。 (图3(A)和图3(B)) TMEM176B调控乳腺癌细胞Bax和Bcl-2蛋白表达。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测Bax和Bcl-2表达。 ** p < 0.01。图3(C) TMEM176B调控乳腺癌细胞Ki67蛋白表达。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测Ki67表达。 图2. 敲低TMEM176B后抑制乳腺癌细胞生长和诱导其凋亡 图3. TMEM176B调控乳腺癌细胞Bax/Bcl-2和Ki67蛋白表达 3.4. TMEM176B调控乳腺癌细胞p53和p-AKT水平 为了进一步阐明TMEM176B调控乳腺癌细胞凋亡作用的分子机制，我们检测抑癌p53蛋白和p-AKT水平。结果显示，干扰TMEM176B后，上调抑癌p53蛋白表达和下调p-AKT水平(图4(A)和图4(B))。以上结果表明，TMEM176B可能通过p53和p-AKT通路调控凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和增殖蛋白Ki67表达，进而调控乳腺癌凋亡作用。 3.5. TMEM176B在乳腺癌诊断价值评估 为了评估TMEM176B在乳腺癌诊断中价值，我们进行了ROC曲线分析。结果显示，TMEM176B在乳腺癌诊断中具有较好价值，AUC面积为0.919 (图5(A))。同时ROC曲线分析表明TMEM176B对乳腺癌诊断敏感性和特异性分别为81.5%和89.5%；95%置信区间为0.832~1.005 (图5(B))。 图4. 干扰TMEM176B后上调乳腺癌细胞p53蛋白表达和下调p-AKT水平 图5. TMEM176B在乳腺癌诊断中评估
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user: 4. 讨论 乳腺癌在女性恶性肿瘤中排第一位，虽然近几年治疗水平提高，患者病情得到很好的控制。但是，发生远处转移的患者平均生存率极低(低于24个月) [ 10 ]。因此，寻找新的靶点诱导乳腺癌凋亡有望提高乳腺癌患者的生存期。人TMEM176B最初发现于人肺成纤维细胞中 [ 11 ]，最近研究发现其与小细胞肺癌有关 [ 12 ]。越来越多证据表明TMEM176B与肿瘤发生发展密切相关。TMEM176B蛋白异常积累与癌症的发病机制显著相关 [ 13 ]，并且在胃肠道肿瘤中TMEM176B高表达 [ 14 ]。但是，TMEM176B在乳腺癌凋亡中作用及分子机制尚未清楚。我们研究发现TMEM176B在乳腺癌中高表达，且敲低TMEM176B后抑制乳腺癌细胞生长和诱导其凋亡。分子机制方面，我们发现TMEM176B调控凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、增殖蛋白Ki67、抑癌基因p53表达和p-AKT水平。此外，ROC曲线分析表明TMEM176B对乳腺癌诊断有良好价值，可辅助乳腺癌诊断。 细胞凋亡也是肿瘤的一个重要特征 [ 15 ]。细胞凋亡主要由细胞凋亡蛋白Bcl-2家族调控。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白Bak和Bax以及抑凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1 [ 16 ]。我们实验中发现敲低TMEM176B后明显上调促凋亡蛋白Bax水平，下调抑凋亡蛋白Bcl-2水平，明显升高Bax/Bcl-2比例；且功能实验表明阻断TMEM176B后抑制乳腺癌生长和诱导凋亡，表明TMEM176B可能通过调控凋亡蛋白Bcl-2家族调控进而调控乳腺癌凋亡过程。抑癌基因p53作为细胞应激传感器而发挥作用，由DNA损伤和癌基因激活等应激条件激活，在肿瘤凋亡中起着重要作用。正常情况下，p53蛋白水平较低，这是由于p53靶向E3泛素蛋白连接酶mdm2的反馈调节，后者靶向p53进行蛋白酶体介导的降解 [ 16 ]。我们实验发现TMEM176B也可调控p53蛋白表达。PI3K-Akt信号通路在乳腺癌的发展中起着重要作用。p-Akt作为这一途径中最关键的信号分子，作为一种治疗靶点引起了广泛的关注 [ 17 ]。在我们实验中，发现沉默TMEM176B后下调p-Akt，提示TMEM176B也可能作为p-Akt抑制剂成为治疗乳腺癌新的靶点。此外，ROC曲线表明TMEM176B也是乳腺癌诊断的潜在指标。但是，TMEM176B在体内是否调控乳腺癌凋亡过程以及TMEM176B如何调控p53蛋白表达和p-Akt水平尚需进一步研究，这也是本文不足之处。 总之，在这篇论文中我们研究TMEM176B在乳腺癌中作用和初步探讨分子机制，同时分析其在乳腺癌中诊断价值。我们发现阻断TMEM176B后抑制乳腺癌细胞生长和诱导其凋亡，其机制与Bax/Bcl-2、Ki67、抑癌基因p53和p-AKT通路有关，这些结果表明靶向TMEM176B可诱导乳腺癌凋亡，为将来临床靶向TMEM176B治疗乳腺癌提供实验基础，具有一定的临床意义。
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user: 摘 要 随着科技不断进步，人类对不可再生资源的开采速度不断增加。在开采过程中，又不断加强对资源的节约。考虑到人类资源最终将枯竭，本文建立了一个模型来描述地球资源在科技进步和资源节约共同作用下的开采趋势。通过建立模型得出每个时期资源的开采趋势，包括剩余资源总量、当期开采量、已开采资源量，并进行了模拟。 关键词 :科技进步，资源节约，资源开采模型，常微分方程 Copyright © 2019 by author and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 本文的资源指煤、石油、天然气等不可短时间内再生成的资源，即不可再生资源。当今世界，随着科技的飞速发展，人类对资源的开采日益增加。同时，为了减少资源消耗，保持可持续发展，人们也在加强对资源的节约。科技发展、技术进步会导致资源的开采越来越快，而不断加强的节约又会延缓资源的开采速度。这个过程中，必将存在一个资源开采的增加期、最高点和减少期，直至资源最终枯竭。 为了描绘这种趋势，本文通过建立数学模型，来寻求在科技进步和资源节约共同作用下，地球资源开采的规律或者说总体开采趋势。目前，现有的研究都是从文字的角度阐述科技进步与资源的关系，或者是提倡节约资源。并未见有用数学模型来描述科技进步和节约对资源的影响。
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user: 2. 建立模型 科技进步对不可再生资源的影响是：随着时间的发展，人类对资源的开采速度增加。设t时期不可再生资源的剩余总量为 R ( t ) ，t时期的当期资源开采量为 E ( t ) 。同索罗模型 [ 1 ] ，设t时期的科技 A ( t ) = A ( 0 ) ⋅ e g ⋅ t ，因此可取当期资源开采量 E ( t ) 与时间t也呈指数变化。又由于开采过程将导致资源存量 R ( t ) 减少，伴随着资源存量的减少，人类会逐步加强对资源的节约。因此可取： E ( t ) = E ( 0 ) ⋅ e m ⋅ t ⋅ R ( t ) R 0 ( E ( 0 ) > 0 ， m > 0 ) (1) R 0 为初始资源量。乘以 R ( t ) R 0 可以理解为，随着资源存量的减少，当期开采量与加强的节约成反比。 R ( t ) 又等于初始资源量 R 0 减去0至t时期的资源开采量总数 ∫ 0 t E ( t ) d t ，即： R ( t ) = R 0 − ∫ 0 t E ( t ) d t (2) 将(2)式代入(1)式得： E ( t ) = E ( 0 ) ⋅ e m ⋅ t ⋅ R 0 − ∫ 0 t E ( t ) d t R 0 ( E ( 0 ) > 0 ， R 0 > 0 ， m > 0 )(3) 再设0至t时期的资源开采量总数为 T ( t ) ，即： T ( t ) = ∫ 0 t E ( t ) d t (4) 以上(2)、(3)、(4)式完成模型描述。下一节求解模型中的 E ( t ) 、 R ( t ) 、 T ( t ) 。
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user: 3. 模型求解 通过求解(3)式，可以得到 E ( t ) 关于时间t的一个函数。设 y ≡ T ( t ) = ∫ 0 t E ( t ) d t ，则 y ′ = E ( t ) ，代入到(3)式得： ， 化简为： y ′ + E ( 0 ) R 0 ⋅ e m ⋅ t ⋅ y = E ( 0 ) ⋅ e m ⋅ t (5) 常数变易法解此常微分方程(5)： y ′ + E ( 0 ) R 0 ⋅ e m ⋅ t ⋅ y = 0 ⇒ d y y = − E ( 0 ) R 0 ⋅ e m ⋅ t d t ⇒ ln | y | = − E ( 0 ) R 0 ⋅ 1 m ⋅ e m ⋅ t + C 1 ⇒ y = C ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t 常数变易： y = u ( t ) ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t ，代入到方程(5)得： u ′ ( t ) ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t = E ( 0 ) ⋅ e m ⋅ t ⇒ u ′ ( t ) = e m ⋅ t + E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t ⋅ E (0) ⇒ u ( t ) = E ( 0 ) ⋅ ∫ e m ⋅ t + E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t d t + C 2 (6) 又： E ( 0 ) ⋅ ∫ e m ⋅ t + E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t d t = E ( 0 ) m ⋅ ∫ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t de m ⋅ t = R 0 ⋅ ∫ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t d E ( 0 ) R 0 ⋅ m e m ⋅ t = R 0 ⋅ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t ， 代入到(6)式得： u ( t ) = R 0 ⋅ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t + C 2 ， 则由常数变易： y = u ( t ) ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t = ( R 0 ⋅ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t + C 2 ) ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t = R 0 + C 2 ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t 再由(2)、(4)式得： R ( t ) = R 0 − T ( t ) = R 0 − y = − C 2 ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t = C 3 ⋅ e − E ( 0 ) R 0 ⋅ m ⋅ e m ⋅ t (7) 当 t = 0 时， R ( t ) = R 0 ，代入到(7)式解得： C 3 = R 0 ⋅ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ，则t时期剩余的资源总量为： R ( t ) = R 0 ⋅ e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ( 1 − e m ⋅ t ) ( E ( 0 ) > 0 ， R 0 > 0 ， m > 0 ) (8) 将 R ( t ) 代入(1)式，得t时期的当期资源开采量为： E ( t ) = E ( 0 ) ⋅ e m ⋅ t + E ( 0 ) R 0 ⋅ m ( 1 − e m ⋅ t ) ( E ( 0 ) > 0 ， R 0 > 0 ， m > 0 ) (9) 且从0至t时期的资源开采量总数为： T ( t ) = R 0 − R ( t ) = R 0 ⋅ ( 1 − e E ( 0 ) R 0 ⋅ m ( 1 − e m ⋅ t ) ) (10) 以上(8)、(9)、(10)式完成模型求解。
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user: 4. 模拟分析 对模型中的 R ( t ) 、 E ( t ) 进行模拟，因 T ( t ) = R 0 − R ( t ) ，即 T ( t ) 与 R ( t ) 变化趋势相反，因此 T ( t ) 未在图中进行模拟。模拟结果如图1。 图1. t时期不可再生资源的剩余量和当期开采量 R ( t ) 为t时期剩余的不可再生资源的总量， E ( t ) 为t时期的当期资源开采量。图1中的Panel A为 R ( t ) 随时间变化的趋势，Panel B为 E ( t ) 随时间变化的趋势。取初始值 R 0 = 10 6 ， E ( 0 ) = 1 ， m = 0.0015 。改变初始参数值，可以得出不同的数据结果，但是图像趋势是相同的。 由图1中可见，存在 t ′ 时期，在 t ′ 时期当期资源开采量 E ( t ) 取最大值，剩余资源总量 R ( t ) 处于拐点处。 R ( t ) 值始终呈减少趋势。当剩余资源总量 R ( t ) 减少至0时，当期资源开采量 E ( t ) 也减少至0，此时煤、石油、天然气等不可再生资源将开采完。改变模型中的初始参数值，可以得出不同的数据结果，但是图像趋势是相同的。改变初始参数值，并且参照已有的矿产开采数据，可以对未来矿产资源的开采程度进行一定的预测。由于存在较多不确定因素，我们并不能确定目前的地球资源开采处于模型中的哪一个时期，本文只是通过模型给出一个总体的资源开采趋势。
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user: 5. 总结 不可再生资源终将耗尽，人们最终将依靠可再生资源生存，可再生资源指太阳能、风能、核能等不会枯竭的资源。本文提出了一个科技进步伴随节约的资源开采模型。本模型揭示了在科技进步以及资源节约的共同作用下，地球上矿产等不可再生资源的开采趋势。参照此模型，可以预测矿产资源未来的开采趋势。本模型对于资源的开采具有一定的参考意义。通过本文，也在于给人类提出警示，不可再生资源的开采量将遵循模型中的趋势并直至枯竭，在资源枯竭之前，我们应加大对可再生能源的利用。以及如何加大开发和利用可再生能源，更应该及早规划。
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user: 摘 要 目的：共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1 (Coactivator-associated arginine methyltransferase 1， CARM1)在肝癌细胞中生长作用及机制研究。方法：qRT-PCR、western blot法检测肝癌细胞中CARM1表达；MTT法和台盼蓝实验检测肝癌细胞的生长情况；Caspase-3试剂盒检测Caspase-3活性；小分子干扰RNA干扰CARM1研究其作用和分子机制。结果：小分子干扰RNA明显敲低CARM1水平；干扰CARM1后明显抑制肝癌细胞生长，且下调抑凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax表达水平，同时激活Caspase-3活性。结论：CARM1通过调控Bax/Bcl-2表达和Caspase-3活性进而调控肝癌生长作用。 关键词 :肝癌，CARM1，Bcl-2，Bax，Caspase-3 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 肿瘤的发生是由于促癌基因和抑癌基因的突变引起的。近些年发现，除促癌基因和抑癌基因的突变外，肿瘤表观遗传学也在肿瘤的发生发展中起着关键的作用 [ 1 ]。DNA甲基化和共价组蛋白修饰是表观遗传调控的重要组成部分。研究发现肿瘤基因调控区高甲基化可促进肿瘤发生和发展 [ 2 ]。因此，调控肿瘤表观遗传学的调控因子是潜在的肿瘤治疗靶点，目前几种DNA甲基转移酶和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂已被批准用于癌症治疗 [ 3 ]。共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1 (Coactivator-associated arginine methyltransferase 1， CARM1) CARM1是一种重要的甲基转移酶，也称为精氨酸甲基酶4 (protein arginine methyltransferase 4， PRMT4)。最初发现CARM1和核受体辅助因子p160结合调控生物学功能 [ 4 ]。后来研究发现CARM1与转录因子cAMP反应元件结合蛋白CBP、β-catenin和NF-κB的p65结合调控下游靶基因的转录 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]。很多研究表明CARM1在肿瘤的发生、发展和转移过程发挥着重要作用。文献报道CARM1促进乳腺癌、胰腺癌、骨肉瘤增殖和转移 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]。在早期肝癌中，CARM1水平增高 [ 12 ]。研究发现SKP2通过调控细胞核内的AMPK-SKP2-CARM1 信号通路诱导自噬并影响肝癌进展 [ 13 ]。但是，CARM1在肝癌中直接作用尚不清楚。 在本篇论文中，我们采取小分子干扰片段抑制肝癌细胞中CARM1的表达，用MTT实验和台盼蓝实验检测肝癌的生长情况。同时检测相关凋亡蛋白Bax\Bcl-2和Caspase-3活性，初步阐明CARM1在肝癌中作用及分子机制。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 细胞培养 肝母细胞瘤细胞HepG2和肝癌细胞Huh7购自ATCC。用DMEM + 10%的胎牛血清完全培养基无菌于37˚、5% CO 2 的细胞培养箱中培养。 2.2. 试剂和耗材 Caspase-3活性试剂盒购自Biovision公司。Real time PCR的SYBER Green和逆转录酶试剂盒购自Takara公司。RNA提取试剂盒购自康为世纪公司。siCARM1小分子干扰片段购自锐博公司。转染试剂Lipo2000购自Invtrogen公司。细胞培养液购Hyclone公司。细胞培养皿购自康宁公司。CARM1、Bax、Bcl-2、β-actin抗体购自CST公司。MTT和台盼蓝购自北京鼎国公司。 2.3. 方法 MTT法检测HepG2和Huh7细胞增殖能力：采用噻唑兰颜色反应法，即MTT法进行细胞增殖活力的测定 [ 14 ]。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色晶体—甲缵(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。HepG2和Huh7细胞种植于96孔板，处理24h后，每孔加入10 µl的MTT工作液(浓度为5 mg/ml)，继续培养4小时；加入三联溶液，培养箱中过夜以使蓝色结晶颗粒(甲缵)完全溶解，用酶标仪测定OD 570 的光密度值。实验中每份样品设3个复孔，实验至少重复3次。 台盼蓝法检测HepG2和Huh7细胞活力：台盼蓝能使死细胞染色，而不能使活细胞染色。HepG2和Huh7细胞种植于96孔板，处理24 h后，胰酶消化细胞，离心，重悬细胞，吸10 μl细胞悬液和10 μl 0.4%的台盼蓝溶液混合，充入细胞计数板，显微镜下计数四个大方格中染色和非染色细胞总数。非染色细胞除以非染色细胞和染色细胞的总数的百分数即细胞活力。 qRT-PCR实验 qRT-PCR检测CARM1的mRNA水平。具体实验如下：收集处理后的HepG2和Huh7细胞RNA，逆转录为cDNA，用Takara公司的SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验。PCR条件为：95℃ 30 s，1个循环；PCR反应，95℃ 5 s，60℃ 15 s，45个循环；溶解，95℃ 0 s，65℃ 20 s，95℃ 0 s，1个循环。PCR结束后，根据反应得到的Cp值，使用相对定量的分析方法，以标准曲线进行校正，最后计算出样品中各mRNA的相对浓度。进行qRT-PCR引物序列如表1。 Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primer NCBI ID 基因 引物 引物序列 产物大小 NM_199141.2 CARM1 上游 5’-GAAGGAGATTTGCACAGGATAGA-3’ 125 bp 下游 5’-GACAGCCACACGGTCATTAT-3’ NM_002046.5 GAPDH 上游 5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’ 71 bp 下游 5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’ 表1. 实时荧光定量PCR引物 CARM1干扰实验 CARM1干扰小分子片段购自锐博公司。 CARM1干扰实验具体方法如下：HepG2和Huh7细胞种植于六孔板中，待其融合度为50%~60%时候，用Lipo2000转染试剂转染CARM1干扰小分子片段，24小时后收集细胞RNA和蛋白，检测CARM1转录和蛋白水平。干扰CARM1小分子序列如表2。 Table 2 HE4 interference sequenc 基因 干扰片段 干扰序列 CARM1 SiCARM1 5’-GCAAGCAGUCCUUCAUCAUCACUC-3’ 表2. HE4干扰序列 Caspase-3活性实验 5×10 6 HepG2和Huh7细胞种植于6孔板中，干扰CARM1基因24 h后，将细胞重新悬浮在50 μl冷冻细胞溶解缓冲液中，冰上10分钟。在微型离心机(10，000 × g)中离心1分钟。将上清液(细胞溶质提取物)转移到新鲜的试管中，然后放在冰上。测定蛋白质浓度，将50 μg~200 μg蛋白质稀释到50 μl，添加50 μl 2X反应缓冲液和5 μl的Devd PNA (200 μm终浓度)，在37˚培养1~2小时。分光光度计405 nm读数。 Western blot实验 Western blot [ 15 ] 实验检测CARM1蛋白水平，具体实验方案如下：收集处理好的HepG2和Huh7细胞蛋白，进行蛋白定量，跑胶。加入CARM1一抗，4度过夜，收集一抗，加入二抗，然后加入ECL显色，拍照。 2.4. 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示。采用t检验。P < 0.05表示具有统计学意义。
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user: 3. 实验结果 3.1. 肝癌细胞中有效干扰CARM1基因 用小分子干扰片段siCARM1转染HepG2和Huh7细胞24小时后收集细胞RNA和蛋白。结果显示小分子干扰片段siCARM1明显敲低肝癌细胞的CARM1转录水平，沉默效果近80% (图1(A)和图1(C))。Western blot结果也显示小分子干扰片段siCARM1明显敲低CARM1蛋白水平(图1(B)和图1(D))，这些结果为进一步的功能实验提供基础。 图1. 小分子干扰片段siCARM1敲低CARM1水平效果 3.2. 干扰CARM1后抑制HepG2和Huh7细胞生长 用小分子干扰片段siCARM1转染HepG2和Huh7细胞24小时后，MTT实验和台盼蓝实验检测HepG2和Huh7细胞的生长能力。MTT实验结果显示沉默CARM1后明显抑制HepG2和Huh7细胞的生长(图2(A)和图2(C))。台盼蓝实验也表明敲低CARM1后明显抑制HepG2和Huh7细胞的生长(图2(B)和图2(D))。这些结果提示CARM1调控肝癌细胞生长过程。 图2. 干扰CARM1后抑制HepG2和Huh7细胞生长 3.3. CARM1调控肝癌细胞Bax和Bcl-2蛋白表达 为了阐明CARM1调控肝癌细胞生长作用分子机制，我们首先检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达。结果显示，沉默CARM1后明显上调促凋亡蛋白Bax表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2表达(图3(A)和图3(C))。同时，也明显上调Bax/Bcl-2比例(图3(B)和图3(D))。这些结果表明阻断CARM1后可能促进肝癌细胞凋亡过程进而抑制肝癌细胞的生长。 图3. CARM1调控肝癌细胞Bax和Bcl-2蛋白表达 3.4. CARM1调控肝癌细胞Caspase-3活性 为了进一步阐明CARM1通过调控肝癌细胞凋亡进而影响肝癌细胞生长作用的分子机制，我们检测细胞凋亡过程关键酶Caspase-3活性。结果显示，干扰CARM1后，Caspase-3活性明显升高(图4(A)和图4(B))。以上结果表明，CARM1通过调控凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和Caspase-3活性进而调控肝癌的凋亡过程，从而抑制肝癌的生长。 图4. CARM1调控肝癌细胞Caspase-3活性
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user: 4. 讨论 肝癌是一个全球性的健康问题，其发病率越来越高，死亡率也越来越高 [ 16 ]。表观遗传的改变，如组蛋白修饰、DNA甲基化和小RNA介导过程，与多种癌症的增殖和转移密切相关 [ 17 ]。越来越多证据表明肝癌和表观遗传改变有关 [ 18 ]。共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1 (Coactivator-associated arginine methyltransferase 1， CARM1)是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族的一员，催化蛋白质底物中精氨酸(arg)残基甲基化，调控肿瘤表观遗传，进而改变基因转录过程 [ 19 ]。在这篇文章中，我们采用小分子干扰RNA敲低CARM1水平，研究其在肝癌中作用及分子机制。我们发现敲低CARM1后抑制肝癌细胞的生长，促进凋亡蛋白Bax表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2水平，同时促进Caspase-3活性，表明CARM1通过调控肝癌细胞的凋亡过程进而调控肝癌细胞生长。 除了异常分化和增殖外，细胞凋亡也是肿瘤的一个重要特征 [ 20 ]。细胞凋亡主要由细胞凋亡蛋白Bcl-2家族调控。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白Bak和Bax以及抑凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1 [ 21 ]。文献报道许多肝癌中Bcl-2表达增高，抑制肝癌凋亡促进其增殖 [ 22 ] ，同时Bcl-2高表达的病人比低表达病人的无病生存期明显缩短 [ 23 ]。在我们实验中发现沉默CARM1后明显上调促凋亡蛋白Bax水平，下调抑凋亡蛋白Bcl-2水平，明显升高Bax/Bcl-2比例，表明阻断CARM1后促进肝癌细胞凋亡过程进而抑制肝癌细胞生长，后者被MTT实验和台盼蓝实验所证明。我们结果与其他文献报道阻断CARM1后抑制乳腺癌、骨肉瘤和胰腺癌生长作用类似 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]。Caspase是调控细胞凋亡的重要酶。Caspase-3 (也称为cpp32、sca-1和cpp32b)是一种位于染色体4q34的casp-3基因编码的半胱氨酸蛋白酶 [ 24 ] ，在细胞凋亡中起着关键作用，其可切割和激活Caspase-6、Caspase-7和Caspase-9。我们实验结果发现阻断CARM1后促进Caspase-3活性，进一步表明CARM1通过调控肝癌细胞凋亡过程进而调控肝癌的生长。但是，CARM1调控肝癌的Caspase-3活性的分子机制尚未清楚，还值得我们进一步研究，这块也是这篇文章不足之处。 总之，在这篇论文中我们研究调控甲基化关键酶CARM1在肝癌细胞生长中作用及机制。发现沉默CARM1后抑制肝癌细胞生长，进一步研究发现阻断CARM1后上调促凋亡蛋白Bax水平，下调抑凋亡蛋白Bcl-水平，且促进Caspase-3活性，这些结果表明CARM1通过调控细胞凋亡过程进而调控肝癌细胞生长，提示着CARM1可能成为肝癌治疗新的靶点，具有一定的临床意义。
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user: 摘 要 随着肿瘤学、免疫学及分子生物学等学科的不断发展，肿瘤免疫治疗及转化研究也取得了巨大的成就，为抗肿瘤治疗模式带来了革命性的改变。免疫治疗发展潜力巨大，今后也将成为精准医疗的关键武器，但目前也面临着诸多挑战。本文将从特异性的及非特异性的肿瘤过继免疫治疗、免疫检验点阻断(ICIs)等几个方面来论述免疫治疗的现状及发展方向。 关键词 :肿瘤，免疫疗法，过继性细胞免疫治疗，肿瘤疫苗，免疫检查点 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 癌症因为其癌细胞异质性、内源性和突变抗药性等原因成为当下医学发展中的难点和重点。传统的治疗方式是：手术、化疗和放疗。 随着肿瘤学、免疫学及分子生物学等学科不断发展和交叉渗透，过继性免疫疗法(ACI， Adoptive Cellular Immunotherapy)应运而生，其能够调动宿主自身免疫系统来控制机体的免疫应答，用于配合常规疗法以减少转移、复发。 免疫治疗发展轴如下 [ 1 ] (图1(a)，图1(b))： 图1. (a) 免疫治疗的发展时间轴(1893~1991)；(b) 免疫治疗的发展时间简轴(1998~2016) [ 2 ]
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user: 2. 理论基础 正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，这个过程中有七个环节：1) 肿瘤抗原释放；2) 肿瘤抗原呈递；3) 启动和激活效应性T细胞；4) T细胞向肿瘤组织迁移；5) 肿瘤组织T细胞浸润；6) T细胞识别肿瘤细胞；7) 清除肿瘤细胞 [ 3 ]。其中任何一个环节出现问题都会导致免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤效果受到抑制从而产生免疫耐受，甚至促进肿瘤的发生、发展。免疫治疗就是通过解决这些问题恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。 3. 特异性肿瘤过继免疫治疗 3.1. EBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte) Epstein-Barr病毒(EBV)是传染性单核细胞增多症的病原，并与Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌等恶性肿瘤有密切关系 [ 4 ]。 以治疗鼻咽癌(Nasal Pharyngeal Cancer—NPC)为例，有两个临床试验值得关注。STRAATHOFKC [ 5 ] 等对10个晚期NPC病人进行了自体CTL治疗。结果在治疗后的19到27个月，4个治疗后好转的病人仍保持健康。Patrizi a Comolli [ 6 ] 等对10例EBV相关的IV期NPC病人进行了自体EBV特异性CTL静脉注射治疗。在6例病人中获得了进展控制，其中2例有效，4例病情稳定。王胜军的定量显示 [ 3 ] ：在其它条件不变的情况下，加入CTL的间隔为肿瘤细胞增殖1次的时间的42倍时，可取得最好的治疗效果；而增加CTL数量也可以优化治疗效果，但是CTL数量增加到某种程度后，再增加等量的CTL，改善程度将明显下降。 因此，利用该免疫疗法来治疗鼻咽癌病人是效果肯定，且副作用小的方法之一。 3.2. 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T) 嵌合抗原受体是一类经人工改造，由胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号转导域组成，集特异性识别靶向肿瘤抗原和激活T细胞两种作用于一身的T细胞受体 [ 7 ]。CAR识别肿瘤抗原绕过了抗原呈递阶段，无需MHC限制，同时拥有增加的共刺激信号增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，此外CAR-T细胞有望在体内循环多年抑制肿瘤复发。 不足之处：1) 跳过免疫检查点的限制很可能对正常细胞造成非期望性损伤，即脱靶效应。2) 在体外进行的细胞转染需要已知目标癌细胞的特异性抗原，而目前很多癌细胞特异性抗原仍未知。3) 细胞整个改造过程基因载体不稳定不特异，可能导致基因突变。4) 体外基因改造会造成细胞凋亡或无法长期表达该基因。5) 大量CAR-T细胞的引入可能产生超量的细胞因子引发细胞因子释放综合征。 3.3. TCR-T细胞治疗技术 T细胞可以通过基因编辑在细胞表面表达识别肿瘤抗原的T细胞受体(TCRs)或嵌合抗原受体(CARs)，以此提高免疫细胞的特异性及反应性 [ 8 ]。标准的T细胞受体由6个多肽链组成，其中主要的两条肽链a链和β链构成了TCR的结合区域，能够识别胞内加工处理后并经MHC提呈的抗原分子，而由其他肽链所形成的共刺激区域和黏附分子能够将TCR-MHC的结合作用放大并传导给F游信号通路，从而引起T细胞的增殖。其中特异性TCR-T细胞治疗技术主要包括了： 1) NY-ESO-1特异性TCR-T细胞治疗技术； 2) PLAC1介导的特异性TCR-T细胞治疗技术； 3) 个体化新抗原介导的特异性TCR-T细胞治疗技术：新抗原即突变蛋白产生的抗原和脂瘤病毒整合进基因组产生的抗原，属于肿瘤特异性抗原范畴 [ 9 ]。自体TILs中存在部分新抗原反应性的T细胞，这类TILs具有抗肿瘤效应，且经过TCR基因修饰的合适的T细胞亚群可避免因扩增培养导致其进入终末分化状态，细胞复制能力消失的问题 [ 8 ]。但到目前为止，尚未有针对突变抗原的个体化TCR-T细胞治疗临床应用的报道。 不足之处：1) 已有研究证明并非所有TCR基因治疗靶抗原是安全的，仍需要调整临床的方案以限制T淋巴细胞活化诱导的毒性。2) 中枢耐受和外周耐受机制会大大降低TCR同抗原肽的亲和能力，因此如何设计生产具有强结合能力的TCR成为TCR-T技术的研究焦点。
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user: 4. 非特异性肿瘤过继免疫治疗 4.1. CIK细胞治疗癌症 CIK细胞是一种异质细胞，是混合的细胞群体 [ 10 ]。 CIK细胞通过5种不同途径作用于肿瘤细胞：1) 引发毒性颗粒依赖性溶细胞作用。2) CIK细胞与T细胞抗原受体结合，合成并释放毒性颗粒，作用于靶细胞。3) CIK细胞自身分泌细胞因子作用于靶细胞或反作用于效应细胞。4) CIK细胞群合成并释放穿孔蛋白，溶解靶细胞。5) CIK细胞激活靶细胞的凋亡基因，使凋亡基因转录并表达。因此，CIK细胞治疗技术有安全性高，特异性明显并且可高效广泛的杀灭肿瘤和病毒的独特优势。 有研究发现将DC细胞和CIK细胞共同培养时，T细胞促使DC进一步成熟后释放大量IL-12、IFN-γ等细胞因子，使CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性明显增强，且细胞扩增倍数上升，极大程度的提高了杀伤肿瘤细胞效率，且无明显毒作用，使治疗达到1 + 1 > 2的效果 [ 11 ]。 4.2. IL-2与LAK细胞合用 从带瘤宿主中分离具有抗肿瘤反应性的淋巴样细胞时，观察到淋巴细胞在IL-2中培养后导致活化的淋巴样细胞的增殖，后者能溶解自体的同系的或同种的新鲜肿瘤细胞，但不溶解正常新鲜细胞 [ 12 ]。LAK细胞不同于经典的溶细胞性T淋巴细胞，杀伤作用不受MHC限制。它的杀伤能力与自然杀伤细胞明显不同。NK细胞对肿瘤细胞的影响很小或无影响。无NK活力的细胞群都能产生良好的LAK活性。 4.3. TILs肿瘤浸润淋巴细胞 肿瘤浸润淋巴细胞即为从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，TIL细胞在体内经肿瘤抗原激活后成为细胞毒T淋巴细胞，对肿瘤细胞具有靶向特异性且能在肿瘤部位聚集，对肿瘤细胞的杀伤活性显著提高。 在基础和临床实验研究中发现对于LAK细胞治疗无效的晚期肿瘤病人，TIL仍有一定治疗效果 [ 13 ] ：回输病人后TILs可在肿瘤组织聚集且辅以注射IL-2可使TIL聚集量提高5~l0倍 [ 14 ]。
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user: 5. 免疫检验点阻断(ICIs) 免疫检验点(immune checkpoint)是指保持机体自身免疫耐受，调节免疫应答答复以及产生强度免疫抑制的信号通路 [ 15 ]。阻断这些分子的活性可提升T细胞对癌细胞的杀伤能力。目前已鉴定了多种免疫检验点分子，包括细胞毒性T细胞相关抗原4 (CTLA-4)、程序性死亡分子1 (PD-1)、程序性死亡配体l (PD-L1)和 PD-L2等。 PD-1：基因敲除小鼠的试验表明，PD-1是一种免疫抑制分子，局限于外周组织，主要在激活的T细胞、树突细胞和单核细胞等细胞上表达，参与细胞抑制，亦增强Treg细胞的免疫抑制作用。目前，纳武单抗正应用于非小细胞肺癌、晚期黑色素瘤、难治性或复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤、复发性或转移性头颈部肿瘤等的临床试验。目前已有多个国家批准该药的使用。 PD-L1和PD-L2：癌细胞的PD-L1通过与免疫细胞表面PD-1结合，启动免疫抑制信号而诱发免疫耐受，一方面促进Tc和TH细胞无能、耗竭、反应迟钝和凋亡，另一方面诱导Treg扩展，从而增强对免疫杀伤和凋亡信号的抵抗，最终达到逃脱机体免疫监控的目的。PD-L1单克隆抗体目前主要集中于I/II期临床试验，有3种PD-L1单克隆抗体BMS-936559、MPDL3280A和MEDl4736尚未被FDA正式批准。其中BMS-936559对黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和卵巢癌等均有一定疗效，且临床不良反较少，须进一步全面评估临床效果。 虽然免疫检验点单克隆抗体在癌症治疗上取得了一定突破，但与期望仍有较大距离，也存在很多亟待解决的问题，一方面须提升单一抗体的治疗效果，另一方面应加强联合应用。
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user: 6. 免疫疗法组合 在一针对治疗小鼠的横纹肌肉瘤的实验中，除了癌症病毒疗法之外，研究者们还阻断了T细胞表面PD-l的活性，从而解开其对T细胞活性的抑制 [ 16 ]。如果病毒的感染能够导致更多T细胞的产生，而PD-1的阻断能起到T细胞杀伤肿瘤的能力。两者的结合能够达到更佳的效果。