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user: 3. 实验结果和分析 3.1. 超高压提取松籽油各因素的影响 通过超高压优化实验对液料比，超高压处理的压强，处理时间，处理次数进行优化，比较各个参数对提取率的影响，得出最佳提取的条件为：固液比1/8，使用300 MPa的压强，处理时间5分钟，进行4次处理时得到最大产油率为31.74%。 实验发现在进行超高压水相进行提取的时候，由于过大的压力，使得水与松籽细胞中的脂肪酸进行了微妙的包合作用，导致最终的产油率相比传统物理压榨的低出一些，在第二次离心分离的水相中检测出了含有一些不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸与水分子形成了一种稳定的水包油的状态，通过萃取旋蒸并不能将其分离 [ 15 ]。通过超高压水相提取的红松松籽油进行理化性质的检测，其不饱和脂肪酸基本没有被破坏，极大程度的保留了红松松籽中的不饱和脂肪酸的种类以及含量，虽然相比于传统物理压榨的产油率有所下降，但是对于其不饱和脂肪酸的总体产量并没有造成影响 [ 16 ] [ 17 ]。 根据2.2.1所提取的松籽油与β-环糊精包合物的状态如图1所示。 图1. 样品 (a) 松籽油；(b)包合复合物 3.2. 工艺因素对包合率的影响 根据目前的研究和结构研究，脂肪酸作为客体分子很容易被复合，由于β-环糊精与“客体”分子的结合能力，复合物具有其自身的熵和焓驱动性质。随着影响因素的变化，尤其是加热温度与时间的变化，“主客体”分子结构也会发生可逆变化，因此研究了四个主要因素对于包合率的影响。 图2. 每个参数对包合率的影响。(a) 包合时间(温度50℃，乙醇加入量4.5倍，油与β-环糊精的摩尔比1:1)；(b) 包合温度(时间2小时，乙醇加入量4.5倍，油与β-环糊精的摩尔比1:1)；(c) 乙醇加入量(温度50℃，时间2小时，油与β-环糊精的摩尔比1:1)；(d) 松籽油与β-环糊精的摩尔比(温度50℃，时间2小时，乙醇加入量4.5倍) 图2(a)显示了包合率随加热时间的变化，在1到2小时包合率出现上升趋势，在2到7小时包合率呈现下降趋势。包合率在2小时达到最大值。在较长时间的加热过程中，不可避免的是未埋入的不饱和双键会被氧化，并且与不饱和双键相比，饱和结构对β-环糊精亲和力更高，因此包合率下降。在加热时间中选取2小时为最佳加热时间。 图2(b)显示了包合率与包合温度的变化，从初始温度升高到50℃，温度高于50℃时，随着温度的进一步升高，包合率明显降低。这是因为持续的过热会促进复杂的形成，但也会破坏它的稳定性。另一方面，升高的温度也可以促进松籽油的不饱和键的氧化，因此它需要一个平衡。在60℃也达到了相似的平衡，但是相比较来说50℃时的包合率更高。因此，50℃被认为是最佳的包含温度。 图2(c)显示了乙醇与油的比率对包合率的影响。包含率在0倍至4.5倍的比例下持续增加，然后观察到下降。当比例为4.5倍时，获得最高的包含率。这可能是由于适当量的用油乳化的乙醇增加了甘油三酯和脂肪酸的溶解度，从而促进了包合物的形成；但当系统达到平衡时，乙醇与松籽油比率的进一步提高降低了复合物形成的驱动力，即腔体与溶液之间疏水性的差异，从而导致包含率降低 [ 18 ]。因此，4.5倍被认为是最佳的乙醇与油的比率。 由于松籽油结构复杂，研究了松籽油与β-环糊精的摩尔比。图2(d)显示了松籽油与β-环糊精的摩尔比对包合率的影响。在松籽油的比例大于β-环糊精时，包合率很低。当松籽油与β-环糊精的摩尔比为1:2时，包合率达到最大值，这与许多研究一致 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。在本实验中，通过添加不同量的松籽油的环糊精饱和溶液法制备包合复合物。当实验中松籽油与β-环糊精的摩尔比大于1:3时，部分松籽油在制备过程中漂浮在表面上，油–水界面减少，这导致包合率降低。因此，1:2被认为是油与β-环糊精的最佳摩尔比。 在单因素实验的基础上，包合过程的最佳条件为：包合时间2小时；包合温度50℃；乙醇与油的比例为4.5倍；松籽油与β-环糊精的摩尔比为1:2。在最佳条件下，松籽油的包合率为70.19% ± 1.93%，松籽油含量为33.01%。随后对在最佳条件下制备的样品进行了表征。 3.3. 包合物的表征分析 3.3.1. 傅里叶变换红外光谱分析 图3. 傅里叶变换红外光谱图 如图3所示，包合物的FT-IR光谱类似于β-环糊精的FT-IR光谱，但也存在甘油三酯的特征峰。观察到松籽油的FT-IR光谱波段在3012.81 cm −1 处存在−CH = CH−的伸缩振动；2926.01 cm −1 和2856.58 cm −1 处为−CH伸缩振动和1749.44 cm −1 处是在酸性酸中的−C=O伸缩振动；所有这些都与甘油三酯结构有关。β-环糊精的FT-IR光谱显示在3373.50.14 cm −1 处突出的宽吸收带是用于−OH伸缩振动；2927.94 cm −1 的尖锐带是用于−CH伸缩振动；在1159.22 cm −1 和1031.92 cm −1 处的突出带分别用于拉伸−CO和拉伸−COC−的伸缩振动。然而，包合物在3429.43 cm -1 处的特征谱带变得不如β-环糊精那么突出。在2924.09 cm −1 峰旁边的2858.51 cm −1 处的峰值与松籽油所产生的−CH伸缩振动相关。在1747.51 cm −1 处的新的尖峰可以认为是脂肪酸中的强烈−C = O伸缩振动。这些变化很可能与松籽油和β-环糊精之间的分子内键的形成有关，并且很可能是由于主客体的相互作用 [ 22 ]。 3.3.2. X射线衍射分析 图4. X射线衍射图谱 为了确认包合物的形成，我们进行了XRD分析。特征峰的消失或新峰的出现表明包合物的形成。图4(b)显示了β-环糊精和包合复合物的XRD衍射图。β-环糊精的XRD衍射图证明，该分子以2θ 6.30˚，9.09˚，12.76˚，17.20˚，19.67˚，22.72˚的衍射角峰显示出明显的晶态。该衍射图与Kayaci等人提出的β-环糊精晶体结构中的笼型填充一致 [ 23 ]。此外，包含复合物的衍射图案与β-环糊精的衍射图案不同，显示出更多的非晶结构。几个强烈而尖锐的特征峰消失了；如图4(a)所示，在2θ 6.92˚，12.31˚，16.51˚，18.71˚，20.02˚，23.94˚的衍射角出现明显的一系列主峰；在2θ 37.66˚处还可以观察有一个较为平缓的小峰。X射线衍射图案的可见变化表明了分子结构的改变；这些变化可能与包合物的形成有关。因此XRD结果证实了FT-IR结果。 3.3.3. 差示扫描量热分析 图5. 差示扫描量热图 差示扫描量热分析用于描述加热过程中β-环糊精和油包合物的解离过程。当客体分子被引入β-环糊精腔时，热峰可能会移位甚至消失。图5显示了β-环糊精，包合物，松籽油的DSC曲线。 松籽油的DSC曲线没有明显的吸收峰，符合非晶体特征，而β-环糊精的DSC曲线显示在314.00℃周围有大的吸热峰，这是由于β-环糊精的糊化和分解所产生的。包合物的DSC曲线在约289.65℃呈现低强度峰，其不同于β-环糊精和松籽油分子的峰。差异可能表明疏水性脂肪酸基团被掺入环糊腔。对于用天然化合物(例如红辣椒素)的β-环糊精包合物的DSC检测，以观察到类似结果 [ 24 ]。 这些检测的差异表明松籽油可以通过掺入β-环糊精以形成“主客体”分子结构。 3.3.4. 1 H核磁共振光谱分析 图6. 1 H NMR光谱 1 H NMR谱是包合物形成的最直接证据。在种子油主要成分的综述中表明大多数脂肪酸是单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸(主要是油酸，亚油酸和亚麻酸)以及饱和脂肪酸(主要是棕榈酸和硬脂酸) [ 25 ]。松籽油和β-环糊精的 1 H化学位移通过它们的 1 H NMR光谱测定(图6)。图中显示包合物的氢谱主体为β-环糊精的图谱，并存在一些松籽油的特征峰值。 图7. 甘油三酯和β-环糊精单元的化学结构 Table 2 Chemical shifts δ (ppm) of β-CD in the 1H NMR of β-CD and inclusion comple 化学位移Chemical shifts δ (ppm) 质子Proton β-环糊精β-CD 包合物Inclusion complex Δδ(ppm) H-1 4.830 4.831 0.001 H-2 3.299 3.299 0 H-3 3.635 3.635 0 H-4 3.369 3.369 0 H-5 3.548 3.548 0 H-6 3.648 3.648 0 表2. 在β-环糊精和包合物 1 H核磁共振谱中β-环糊精的化学位移δ (ppm) 图7展示了甘油三酯和β-环糊精单元的化学结构。表2显示了β-环糊精的质子和包合物的重要化学位移以及相互作用中氢原子的化学位移的差异。松籽油的主要化学位移的值示于表3中。 1 H NMR光谱5.319 ppm表示来自不饱和的双键脂肪酸，从5.192到3.968 ppm的光谱代表甘油酯中的甘油基；从2.730到1.181 ppm的光谱代表亚甲基部分；0.851和0.770 ppm的那些代表甲基端 [ 26 ]。在包合物中，由于腔外的双键，包合物的质子峰值位移到5.314 ppm处，0.850处的峰值归因于末端甲基，而1.054到1.493 ppm处的峰值表示存在−CH 2 −；而一些甘油基等消失掉了。因此，PSO的主要甘油三酯结构成功进入b-CD腔，主要成分保留了几个末端甲基和亚甲基。该分析进一步支持了FT-IR结果。 Table 3 Chemical shifts δ (ppm) and assignment of fatty glyceride in the 1HNMR spectrum of Pine nut oil and inclusion complex [26 峰值 化学位移 质子 质子的功能基团 包合物 Δδ (ppm) Peak Chemical shifts δ (ppm) Proton Functional groups of proton Inclusion complex 1 0.770 −CH 3 饱和酸、油酸、亚油酸 无 / 2 0.851 −CH 3 亚麻酸 0.850 −0.001 3 1.181 −(CH 2 )n− 所有的酰基链 1.054 −0.127 1.244 1.235 −0.009 1.500 1.493 −0.007 4 1.915 −OCO−CH 2 −CH 2 − 羰基β位质子氢 无 / 5 2.002 −CH 2 −CH=CH− 烯丙基质子氢(所有不饱和脂肪酸) 1.964 −0.038 2.127 无 / 6 2.284 −OCO−CH 2 − 羰基α位质子氢 2.272 −0.012 7 2.633 =HC−CH 2 −CH= 双烯丙基质子氢(多不饱和脂肪酸) 无 / 2.730 无 / 8 3.968 −CH 2 OCOR 甘油骨架的Sn-1位置 无 / 9 5.192 >CHOCOR 甘油骨架的Sn-2位置 无 / 10 5.319 −CH=CH− 所有不饱和脂肪酸 5.314 −0.005 表3. 在松籽油和包合物 1 H核磁共振谱中的化学位移δ (ppm)和脂肪甘油酯的分配 [ 26 ]