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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验动物 健康雌性Wistar大鼠，体重200~220 g，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证为SCXK(苏)2012-0004，使用许可证为SYXK(苏)2012-0029。室温保持在25℃左右，自由饮水饮食，12 h明/12 h暗制度人工光照。实验随机分组为正常对照组和成功模型组两组，每组15只大鼠。 2.2. 试剂与仪器 2.2.1. 实验仪器 单臂脑立体定位仪(68025型，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，脑立体定位微量注射泵(KDS-310-PLUS，美国KDS公司)，大小鼠通用Morris水迷宫(RD1101-MWM-G，上海移数信息科技有限公司)，大鼠避暗箱(163030型，上海移数信息科技有限公司)大鼠穿梭箱(163028型大鼠穿梭箱，上海移数信息科技有限公司)，PCR仪(Thermal Cycler 2720型，ABI公司)，凝胶成像系统(INFINITY型，VL)，Step OneTM Real-Time PCR System (ABI公司) 2.2.2. 主要试剂及材料 阿扑吗啡(Apomorphine， APO) (美国Sigma公司)，总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)，氯仿、无水乙醇(国产分析纯)，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMII (TaKaRa公司)，八联排PCR管(GE-BIO公司)，RNaseZAPTM (Sigma)，1.5 ml Rnase microtube、0.6 ml Rnase microtube (AXYGEN)，Rnase-ddH20 (TIANGEN)，6 × loading buffer (TIGEN)，琼脂糖(Oxoid)，TH及GAPDH引物(宝生物)。 2.3. 方法 2.3.1. 实验动物筛选 在PD模型制备前，分别以Morris水迷宫和阿扑吗啡(Apomorphine， APO) (0.5 mg/kg)腹腔注射诱导大鼠的旋转行为，淘汰记忆障碍或有旋转行为的大鼠 [ 3 ] 。 2.3.2. PD模型大鼠的制备 腹腔注射2%戊巴比妥钠2 mL/kg麻醉大鼠。头部去毛，将大鼠固定于脑立体定位仪上，颅顶消毒，头皮正中线切开皮肤，充分暴露颅骨，找到前囟点，参照George Paxinos主编的《大鼠脑立体定向图谱》，确定注射位点，即位点1的x、y和z轴坐标分别为−2.5、−1.8和−8 (mm)，位点2的x、y和z轴坐标分别为−2.5、−1.8和−4 (mm)。于注射位点牙科钻头骨钻孔，10 μl微量进样针吸取8 μl 6-OHDA，据上述两点通过自动进样泵各注4 μl，进样速度1 μL/min，位点1注射完成后，停针5 min，缓慢提升至位点2，继续上述操作，停留5 min后缓慢提针，缝合创口，消毒，编号，自然苏醒后正常饲养，第一周每天注射抗生素防止感染 [ 4 ] 。术后注意保暖、补水。术后第14天腹腔注射APO (4 mg/kg)，诱发大鼠产生向健侧旋转行为，平均转速 > 7 r/min的大鼠判定为成功PD模型。选择15只成功PD模型动物备用。 2.3.3. PD大鼠模型的评价 采用APO诱导旋转行为和PD模型大鼠脑内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase， TH)表达量检测的方法来对PD大鼠模型进行评价。 APO诱导旋转行为：术后第14天腹腔注射APO (0.5 mg/kg)，诱发大鼠产生向健侧旋转行为，平均转速 > 7 r/min的大鼠判定为成功PD模型，备用。 PD模型大鼠脑内TH表达量检测：在行为学实验全部结束时，将15只PD模型大鼠和15只正常大鼠均取脑，并且检测其脑内TH表达量，用以对之前制备的成功PD模型大鼠进行确证。通过NCBI数据库，查找大鼠TH的基因和内参GAPDH的基因编码序列，应用Primer 5引物设计软件设计引物(表1)，引物由宝生物公司合成。 用试剂盒提取大鼠脑组织总RNA，将RNA进行反转录成cDNA，将反转录得到的cDNA放置在−20℃保存，用于之后PCR实验和荧光定量PCR实验。 将反转录得到的cDNA用于荧光定量PCR反应，并且配制荧光定量PCR的反应液，PCR反应及数 Table 1 Primer sequence and amplification length of TH gen 目的基因 Genebank号 引物名称 引物序列 引物长度 TH NM＿012740 TH-F 5’-GACGGCGACAGAGTCTCAT-3’ 141 bp TH-R 5’-GAACAGCATTCCCATCCCT-3’ GAPDH BC059110 GAPDH-F 5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’ 291 bp GAPDH-R 5’-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’ 表1. TH基因引物序列及扩增长度 据采集在ABI公司的Step OneTM Real-Time PCR系统上进行，以GAPDH为内参对所有样品进行处理，每个cDNA样品设置3个重复实验。并且计算大鼠脑组织TH mRNA的表达量。 2.3.4. PD模型大鼠学习记忆能力的测定 本研究以经典的Morris水迷宫、避暗反应和穿梭箱被动回避实验测定PD模型大鼠的学习记忆能力，并与正常对照大鼠进行比较。 1) Morris水迷宫实验：分别通过获得性训练、探查训练对实验动物进行空间探索实验。将Morris水迷宫的水池分为4个象限，并分别作标记(分别为不同颜色的正方形、圆形、五角星形、三角形)。训练和实验时，四周用遮光窗帘围住Morris水迷宫，使四周环境除标记外均一致。放水至适宜大鼠游泳的高度，透明平台置于其中一个象限区的中央低于水平面2 cm，保证实验过程中透明平台于同一象限内。保持水温22℃，适宜大鼠游泳。每天的同一时间进行获得性训练，在第六天进行探查训练。 I. 获得性训练：将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。在几次训练中，如果这个时间超过60 s，则引导大鼠到平台，并且让动物在平台上停留15 s。后将动物移开、擦干。每只大鼠每天训练5次，两次训练之间间隔20 min，连续训练5 d。 II. 探查训练：最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60 s的探查训练，摄像记录其1 min内水中游泳路径。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间(s)和在目标象限(原先放置平台的象限)所经过的路程(cm)，以此作为空间记忆的检测指标。 2) 避暗反应实验：实验前将避暗潜伏期大于180 s的大鼠弃去不用 [ 5 ] 。避暗仪暗室底部铜栅通30 v、0.4 A交流电，先将大鼠放入避暗仪反应箱中训练3 min，大鼠受电击逃往明室。正式测试开始时将大鼠背对洞口放入明室，大鼠进入暗室则受到电击，避暗仪自动记录5 min内大鼠进入在明箱呆的时间占总实验时间的百分比，记录明箱观察时间百分比 [ 6 ] - [ 8 ] 。第1天上午9:00开始训练实验，当日下午15:00、次日上午9:00和第3天上午9:00(训练实验48 h后)分别测试3次。 3) 穿梭箱被动回避反应：实验分为记忆获得和记忆保持两个阶段。 实验开始时首先设定实验参数，包括安全期(非条件刺激与条件刺激之间的间隔时间)、条件刺激(高频率的稳定声音刺激和闪光灯强光刺激)时间、非条件刺激(电击)时间及强度、穿梭次数等。 在记忆获得阶段首先把实验鼠放入一侧室，接近并面向端壁，适应5 min后开始训练。穿梭实验视频分析系统按照预先设定好的程序，先给高频率的稳定声音刺激和闪光灯强光刺激，持续一定时间后，如果实验鼠仍停留在同侧，则再给一个电击刺激。动物受到电击后将从圆洞逃至对侧一定时间后，对侧再给予条件和非条件刺激，如此反复。每只大鼠连续训练30~50次，直到大鼠学会。24 h后，对大鼠进行检测。经过反复训练后，只给条件刺激，大鼠即逃到对侧安全区以逃避电击，此即形成了条件反射或称主动回避反应。 全部训练结束后，计算机显示出每次穿梭的轨迹，记录大鼠的主动回避反应(active avoidance response，AAR，即大鼠在条件刺激后，非条件刺激到来之前就产生的穿梭)次数、主动逃避平均时间(秒)。以AAR作为其学习记忆成绩的主要评价指标 [ 9 ] 。 2.4. 统计学方法 采用统计学处理数据，计量资料以( )表示，进行t检验，比较PD模型大鼠与正常大鼠在Morris水迷宫中穿过原平台象限的路程(cm)和处于原平台象限的时间(s)、避暗箱中避暗潜伏期及穿梭箱被动回避反应中的主动逃避次数(次)和主动逃避平均时间(秒)的差异，分析PD模型大鼠相关的学习记忆变化。