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user: 4. F-Hal F-Hal属于黄素依赖型单加氧酶超家族，需要利用黄素还原酶(Flavin-Reductase， Fre)产生的还原型黄素二核苷酸(FADH2)来活化分子氧，生成FAD-OOH参与卤化反应 [ 31 ] [ 32 ]。首例黄素依赖型色氨酸7-卤化酶PrnA的晶体学分析显示，其底物和黄素结合位点在空间上存在位阻，被一个长约10 Å的通道隔开，底物无法与辅因子的直接进行相互作用 [ 33 ] [ 34 ]。在催化起始阶段，FADH2活化分子氧，生成 FAD-OOH复合物。然后，卤化物对FAD-OOH亲核攻击，导致次氯酸的生成。最终卤化物阴离子与底物的芳香环反应，从而产生Wheland中间体，然后由保守的谷氨酸残基(E346)去质子化，得到卤化产物(图5) [ 35 ]。PrnA中高度保守基序(WxWxIP)与负责结合FADH2的基序(GxGxxG)是鉴定F-Hal基因的特征基序。 图5. F-Hal的催化循环 [ 9 ]。在催化起始阶段，FADH2活化分子氧，生成 FAD-OOH复合物。然后，卤化物对FAD-OOH亲核攻击，导致次氯酸的生成。最终卤化物阴离子与底物的芳香环反应，从而产生Wheland中间体，然后由保守的谷氨酸残基(E346)去质子化，得到卤化产物 4.1. 黄素依赖型色氨酸卤化酶(Flavin-Dependent Tryptophan Halogenases， FDT-Hal) FDT-Hal首先在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)吡咯菌素(pyrrolnitrin， Prn)生物合成途径中被鉴定 [ 36 ] [ 37 ]。广谱抗真菌化合物吡咯菌素生物合成需要两个色氨酸卤化酶：PrnA氯化色氨酸的7号位，属于色氨酸7-卤化酶；PrnC氯化吡咯中间体。随后，从产气列契瓦尼尔氏菌(Lechevalieria aerocolonigenes)瑞贝卡霉素生物合成途径中发现并鉴定出另一种色氨酸-7-卤化酶RebH，它与PrnA有55%的序列同源性，负责色氨酸的7号位氯化 [ 38 ]。 库茨涅尔氏菌(Kutzneria) sp.744中二氯化非核糖体肽(kutzneride)生物合成途径需要两个色氨酸卤化酶(KtzQ和KtzR)和一个Fe(II)/α-KG依赖性卤化酶(KtzD) [ 39 ] [ 40 ]。其中KtzQ催化7-氯色氨酸的形成，KtzR随后卤化6号位，生成6，7-二氯色氨酸。最近还鉴定了许多游离的色氨酸6-卤化酶，海洋白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)中的ThaL负责合成6-氯化色氨酸，参与吲哚生物碱thienodolin噻吩环生物合成 [ 41 ]；毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)的SttH和紫黑链霉菌(Streptomyces violaceusniger)SPC6中的Th-Hal也有色氨酸6-卤化酶活性 [ 42 ]。 皱胃链霉菌(Streptomyces rugosporus)中的PyrH是第一个被研究的色氨酸5-卤化酶，负责吡咯菌霉素生物合成，PyrH氯化色氨酸的5号位碳 [ 43 ]。色氨酸-5-卤化酶ClaH参与了钩状链霉菌(Streptomyces uncialis)中双吲哚生物碱克拉多尼酰胺(cladoniamide)的生物合成，负责色氨酸的氯化 [ 44 ]。在羊毛硫抗生素NAI-107生物合成途径中，色氨酸5-卤化酶MibH负责肽链中色氨酸残基的卤化，而不是卤化游离色氨酸 [ 45 ]。 4.2. 黄素依赖型吡咯卤化酶(Flavin-Dependent Pyrrole Halogenases， FDPR-Hal) FDPR-Hal是能卤化吡咯类底物的卤化酶，已发现的FDPR-Hal主要包括两类：一类酶能卤化游离的吡咯，如上述所提到的PrnC；另一类卤化吡咯-2-羧基硫酯底物。一个典型的例子是来自假单胞菌藤黄绿菌素(pyoluteorin)生物合成途径中的PltA [ 46 ]。PltA的C端含有一个阻止酶与底物结合的裂隙(cleft)，是一个独特的螺旋区域(helical region)；底物的结合引起酶构象变化，允许底物进入裂隙。与色氨酸卤化酶相比，PrnC和PltA似乎都具有很强的区域选择性，大多数体外酶活产物是单氯化和二氯化产物的混合物 [ 47 ]。与PltA类似的吡咯卤化酶还包括游动放线菌(Actinoplanes) sp. ATCC3302中参与五氯联苯(pentachloropseduilin)生物合成的HalB和链霉菌sp. CNQ-418中参与chlorizidine A生物合成的Clz5 [ 48 ] [ 49 ]。此外，藤黄紫假交替单胞菌(Pseudoalteromonas luteoviolacea)中还存在一个有趣的吡咯卤化酶 Bmp2。Bmp2与同基因簇的硫酯酶Bmp1和脯氨酸腺苷酸转移酶Bmp4相关。Bmp2负责溴化吡咯-2-羧基-S-Bmp1复合物，生成一溴、二溴和三溴产物 [ 50 ]。不同于迄今为止所研究的F-Hal，Bmp2催化底物溴化和碘化，但无法完成氯化反应 [ 50 ]。与相应的芳香族氯化物或溴化物相比，芳香族碘化物通常更具反应性，更易于后续的化学反应。因此，Bmp2能催化碘化反应这一特征引起了科学家的兴趣。 4.3. 黄素依赖型酚类卤化酶(Flavin-Dependent Phenolic Halogenases， FDP-Hal) 4.3.1. 作用于游离底物的黄素依赖型酚类卤化酶 (Free-Standing Substract Flavin-Dependent Phenolic Halogenases) 厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)中的卤化酶Rdc2和Chaetomium chiversii中的卤化酶RadH都作用于游离的酚类底物，参与间苯二酸内酯类代谢产物的生物合成 [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]。在体外反应体系中Rdc2能卤化多种大环类天然产物，如玉米赤霉烯酮(zearaleone)、dihydrosorcylide、弯孢霉菌素(curvularin)和姜黄素(curcumin)等 [ 54 ]；如果芳香环上存在多个羟基时，Rdc2催化的氯化或溴化反应均能形成二卤代产物。 作用于独立底物的黄素依赖型酚类卤化酶还包括Gsfl、AclH、CazI、AcOTAhal和GedL，它们分别参与了一系列真菌天然产物，包括灰黄霉素(griseofulvin) (Gsfl)、aspirochlorine (AclH)、chaetoviridin (CazI)、赭曲霉毒素(ochratoxin) (AcOTAhal)和dihydrogeodin (GedL) [ 55 ] - [ 60 ] 的生物合成。它们中的大部分与Rdc2和RadH一样，卤化芳香环酚羟基的邻位碳原子，但 AcOTAhal卤化底物芳香环酚羟基的对位碳原子。盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)中的ChlA参与分化诱导因子1 (DIF-1)生物合成，负责卤化THPH，产生氯化THPH或二氯化THPH [ 61 ]，而安丝菌素(ansamitocin)生物合成途径中的Asm12能卤化游离的酚类底物 [ 62 ] [ 63 ]。链霉菌sp. CNQ-525 napyradiomycin生物合成途径中NapH2能卤化萘醌前体的C2位置，促进后续化合物的异戊二烯化 [ 64 ]。最近，在藤黄绿菌素的生物合成中还发现了一种酚类卤化酶PltM， 负责间苯三酚的一氯化和二氯化。此外，通过体外酶活分析，PltM对一些酚醛和苯胺衍生物也具有卤化活性 [ 65 ]。 4.3.2. 作用于载体蛋白-底物中间体的黄素依赖型酚类卤化酶 (Carrier Protein Tethered Substrate Flavin-Dependent Phenolic Halogenases) 玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)中参与氯新生霉素(chlorobiocin)生物合成的Clo-Hal、地中海拟分枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)中参与巴尔赫霉素(Balhimycin)生物合成的BhaA﹑淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)中负责氯化合成Complestatin的ComH和浮游放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)中参与替考拉宁(teicoplanin)生物合成的Tcp2 [ 66 ] [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ] 都是作用于载体蛋白-底物中间体黄素依赖型酚类卤化酶。这些酶都是负责卤化PCP-酪氨酸或PCP-β-羟基酪氨酸中间体，生成相应的产物。氯化物卤化酶CndH的晶体结构已被解析，其底物是PCP-酪氨酸中间体，具有较大的非极性表面口袋，可以容纳载体蛋白 [ 70 ]。 C-1027是球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)合成的一个色素蛋白类抗肿瘤类产物，SgcC3是其生物合成途径中的一个卤化酶 [ 71 ]。异源表达与体外酶活实验表明：只有当底物与载体蛋白SgcC2相连时，SgcC3才具有卤化活性，表明这个酶催化的真正底物是(S)-或(R)-β-酪氨酸-S-SgcC2 [ 72 ]。这一类的酚类卤化酶还包括Ram20和End30，它们分别在脂肽类抗生素雷莫拉宁(ramoplanin)和恩拉霉素(enduracidin)生物合成过程负责卤化羟苯基甘氨酸残基 [ 73 ] [ 74 ]。 4.3.3. 遵循脱羧卤化机制的黄素依赖型酚类卤化酶 (Decarboxylative Mechanism Flavin-Dependent Phenolic Halogenases) 藤黄紫假交替单胞菌中的甲苯酚脱羧溴化酶Bmp5是第一个被鉴定的遵循脱羧卤化机制的黄素依赖型酚类卤化酶 [ 75 ]。Bmp5与其他黄素依赖性卤化酶氨基酸序列同源性不大，与已知的单组分黄素依赖性单加氧酶具有一定的序列同源性。Bmp5不需要额外的黄素还原酶，但需要溴化物和NADPH同时存在，表明Bmp5本身具有黄素还原和溴化双重酶活。在溴化物、NADPH和FAD存在下，Bmp5与4-羟基苯甲酸反应形成3-溴-4-羟基苯甲酸，通过脱羧进行第二次溴化，得到二溴苯酚。Bmp5没有氯化活性，但形成碘酚类物质，表明该蛋白质中存在高度进化的溴化物或碘化物结合位点，而其他黄素依赖性卤代酶均不存在 [ 75 ]。 4.4. 脂肪族黄素依赖型卤化酶(Aliphatic Flavin-Dependent Halogenases， AFD-Hal) AFD-Hal能够卤化脂肪链的C-H键。委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)的氯霉素卤化酶CmlS晶体结构的解析显示出在其它F-Hal中未发现的结构特征：包括存在与活性位点相连的T形通道；FAD通过碳8α与卤化酶共价结合，而不是5号位碳；存在许多与激活剂或底物载体蛋白结合的非极性表面口袋；活性位点残基甘氨酸E44负责催化次氯酸的生成，酪氨酸Y350负责稳定烯醇化中间体，该烯醇中间体充当亲核试剂以生成氯化产物 [ 76 ]。 最近，Chankhamjon等 [ 77 ] 在米曲霉(Aspergillus oryzae) RIB40中鉴定出的一种双功能甲基转移酶卤化酶AoiQ，负责腐皮壳菌素(diaporthin)的甲基化和氯化双重反应，生成双氯化腐皮壳菌素衍生物。卤化的位置表明了AoiQ与之前的F-Hal存在不同的催化机制 [ 77 ]，基因组分析表明AoiQ同源酶也存在于其他真菌中。 4.5. 改造黄素依赖型卤化酶，开发新型生物催化剂 4.5.1. 扩宽黄素依赖型卤化酶的底物选择性 通过定点诱变来改变或提高黄素依赖性色氨酸卤化酶的区域选择性。PrnA是色氨酸-7-溴卤化酶，将活性位点残基的苯丙氨酸(F103)突变为丙氨酸，导致7-溴色氨酸和5-溴化色氨酸以2:1的比率形成 [ 78 ]。Shepherd等 [ 79 ] 用同样的方法突变卤化酶SttH，得到一个三突变体改变了该酶的区域选择性， 卤化位点从3-吲哚丙酸酯的6号位碳变为5号位碳。 Andorfer等 [ 80 ] 通过采用随机诱变和定向进化方法，对色氨酸-7-卤化酶RebH进行了六轮筛选，发现了两个RebH突变体，能卤化吲哚类底物的6号位碳和5号位碳。Payne等 [ 81 ] 对野生型卤化酶RebH进行四次易错PCR (error PCR)后，野生型RebH被突变为一个五突变体，该突变体能够区域选择性卤化吲哚类底物的4号位碳。 4.5.2. 提高黄素依赖型卤化酶的活性和稳定性 通常黄素依赖性卤化酶Kcat值较低，稳定性较差以及易被底物产物所抑制，所以很难有极高的活性。两种策略可以改善F1-Hal的生物催化性能，一种策略是寻找嗜热生物的卤化酶，因为热稳定酶具有寿命较长、对有机溶剂有较高的耐受性和不易水解等优点。Chen等 [ 82 ] 从紫黑链霉菌SPC6中鉴定出嗜热色氨酸-6-卤化酶(Th-Hal)，其区域选择性与类似的色氨酸-6-卤化酶SttH相同，但熔融温度(Tm)比SttH高近10℃，且Kcat值也高于许多其他色氨酸卤化酶。Takahashi等 [ 83 ] 将Th-Hal与嗜热的芽孢杆菌的黄素还原酶结合在一起，该反应体系能在45℃条件下与多种非天然底物发生卤化反应。Th-Hal的晶体结构发现：Th-Hal表面存在大量极性残基，导致表面产生大量电荷，阻止蛋白质聚集，增加与水的氢键数量，这赋予了Th-Hal的热稳定性 [ 84 ]。 另一种策略是利用易错PCR进行定向进化，利用温度作为筛选指标，从中筛选出具有热稳定性的突变体。Poor等 [ 85 ] [ 86 ] 对卤化酶RebH进行了三轮易错PCR，发现两个突变体的Topt值和Tm值比野生型高七到八倍，且两者均具有比野生型更长更稳定的反应时间，但Kcat值降低。其中一个突变体的三维结构特征与Th-Hal类似，突变体表面的谷氨酰胺突变为精氨酸，导致表面电荷增加。其他部分电荷密度降低，以减少与附近残基的排斥，N-端丝氨酸突变为脯氨酸，提高了酶的稳定性。 4.5.3. 利用黄素依赖型卤化酶合成非天然产物 将F-Hal掺入天然产物的生物合成途径中，可以增加产物的多样性。Sanchez等 [ 87 ] 将瑞贝卡霉素和星形孢菌素生物合成基因基因重组，即将编码不同区域选择性色氨酸卤化酶的基因导入至天然产物生物合成基因簇中，从而形成氯化吲哚并咔唑非天然产物的不同区域异构体。Roy等 [ 88 ] 将色氨酸7-卤化酶引入生产pacidamycin的链霉菌菌株中，形成了氯化的pacidamycin。