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user: 2. 材料与方法 2.1. 试验材料与试剂 试验材料为银杏叶片，取自北京林业大学校园内。筛库用酵母单杂交体系Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Aureo-basidin A(AbA)、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2均购自Clontech公司；GFP酵母单杂交体系The Grow’n’Glow GFP One-Hybrid Kit购自Mo Bi Tec公司；Easyspin Plus植物RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；mRNA分离试剂盒PolyATtract mRNA Isolation Systems购自Promega公司；反转录试剂盒FastQuant RT Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；高保真DNA聚合酶TransStart® FastPfu DNA Polymerase、E. coil DH5а感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶均购自NEB公司；DNA序列合成由生工生物工程股份有限公司完成；DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。 2.2. 银杏酵母单杂交体系建立 2.2.1. 诱饵酵母载体pBait-AbAi构建 为了提高端粒序列与端粒结合蛋白的识别率和结合率，合成端粒序列(TTTAGGG)的3次和5次串联重复序列与诱饵载体pAbAi进行连接。由于合成片段过短和载体连接效率较低，本研究以载体pBI121为模板，利用PCR扩增其部分GUS基因片段，延长与诱饵载体的连接序列，从而提高连接成功率。根据GUS基因序列设计上、下游引物(表1)。反应体系25 μL，包括上、下游引物(10 μmol/L) 1 μL、pBI121载体(20 ng/μL)稀释100倍取1 μL、2 × Taq Mix 12.5 μL、ddH 2 O 9.5 μL。扩增程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化与载体pMD-18T连接，16℃连接3 h，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄西林的LB固体培养基筛选阳性克隆，并测序鉴定。载体pAbAi和测序正确的T载体同时用限制性内切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物胶回收纯化进行连接，转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆单菌落提取质粒，并以限制性内切酶KpnⅠ进行酶切，去除GUS基因片段，剩余片段16℃自连接过夜转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆单菌落测序鉴定。 2.2.2. 诱饵载体转化酵母获得诱饵酵母 pAbAi载体(图1(a))含有尿嘧啶报告基因URA3和AUR1-C，其中AUR1-C基因使载体对金担子素A(AbA)具有抗性，在AUR1-C上游的多克隆位点插入诱饵序列，如有顺式作用元件与诱饵序列结合，激活AUR1-C基因表达，诱饵酵母便可在含有AbA培养基上生长，故可利用AbA筛选获得阳性酵母单菌落。 游离的pAbAi载体不能在酵母细胞中表达，只有经限制性酶切位点BstB I或Bbs I线性化的pAbAi载体与Y1HGold酵母基因ura3-52位点进行同源重组，整合到酵母基因组中，才能在酵母中稳定表达。同时使酵母细胞具有编码Ura的能力，可用SD-Ura筛选培养基筛选阳性诱饵酵母单菌落。 参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2说明制备酵母菌Y1HGold感受态细胞。用经BstBⅠ酶切线性化的pBait-AbAi 1μg转化Y1HGold感受态细胞，涂布于SD/-Ura固体培养基上，30℃培育3 d，挑取直径在2~3 mm单菌落，利用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1进行菌落PCR鉴定，如获得长度为1.35 kb加上三次或五次端粒重复序列产物，则说明诱饵载体正确整合到酵母基因中。 2.2.3. 测定报告基因本底表达水平 为了排除酵母内源转录因子与目的顺式元件相互作用的干扰，需要在筛库之前确定AbA最低使用浓度。挑取在SD/-Ura固体培养基上正常生长的诱饵酵母，悬浮在0.9% NaCl中，将OD 600 调整至0.002并分别涂布在含0、100、300、500、800、1000和1500 ng/mL AbA的SD/-Ura固体培养基上，根据酵母生长情况，确定筛库所需AbA的最低浓度。 2.2.4. cDNA文库合成 采用TRIzol法提取银杏叶片总RNA。使用PolyATtract mRNA Isolation Systems试剂盒分离出mRNA。以0.5 μg mRNA为模板，采用SMART技术合成单链cDNA，并利用LD-PCR扩增技术获得双链cDNA。 Table 1 PCR primer sequences used for amplifying GUS fragment 引物名称 引物序列 上游引物1 5’CCCAAGCTT(TTTAGGG) 3 GGTACCACGAACTGAACTGGCAGAC-3’ 上游引物2 5’CCCAAGCTT(TTTAGGG) 5 GGTACCACGAACTGAACTGGCAGAC-3’ 下游引物 5’CCGCTCGAGGGTACCATCTCTTCAGCGTAAGGGT-3’ 表1. 扩增GUS基因片段的引物序列 图1. pAbAi、pGNG2和pJG4-5载体示意图 取7 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余使用CHROMA SPINTE-400树脂层析柱(Clontech公司)纯化。 2.2.5. 酵母单杂交文库构建及初步筛选 将20 μL经过纯化的双链cDNA(2~5 μg)和3 μg经Sma I线性化的pGADT7-Rec载体混合，参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2方法共转化诱饵酵母感受态细胞。将酵母细胞悬浮液分别稀释至1/10、1/100、1/1000和1/10000，各取100 μL分别涂布在SD/-leu和SD/-leu/AbA固体培养基上，以便计算建库的总克隆数，总克隆数小于1.0 × 10 6 会降低结果的可信度。将剩余的菌液涂布在SD/-leu/AbA固体培养基上，30℃培育3 d，挑取直径在2~3 mm单菌落，利用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2进行菌落PCR鉴定，对cDNA插入片段进行测序和初步的鉴定和分析。 2.3. GFP酵母单杂交鉴定 2.3.1. 诱饵载体pGNG2-bait构建 为了保持研究一致性，仍设计端粒序列(TTTAGGG) 5次串联重复序列与诱饵载体pGNG2 (图1(b))进行连接，方法同pBait-AbAi载体的构建，限制性酶切位点为Not I、Spe I和Nru I。构建好的载体测序鉴定。 2.3.2. 诱饵酵母构建 诱饵载体pGNG2含有选择标记URA3和报告基因GFPuv，其中URA3能使酵母细胞在SD/-Ura培养基上生长。GAL1，10启动子启动GFPuv基因，在GAL1，10启动子上游的多克隆位点插入诱饵序列，如待鉴定序列所表达蛋白能正确结合诱饵序列，则能使GFPuv基因表达，酵母细胞在紫外(360~400 nm)下发绿色荧光。故可以通过酵母细胞是否发绿色荧光鉴定待测序列和端粒重复序列的结合特异性。 采用LiAc法制备酵母菌EGY48感受态细胞，将构建好的pGNG2-bait诱饵载体转化到EGY48酵母细胞中，涂布在SD/-Ura(Glu)固体培养基上，30℃培养3 d，挑取单克隆提取质粒，通过PCR鉴定并测序。 2.3.3. 表达载体pJG4-5构建 载体pJG4-5 (图1(c))含有GAL1诱导型启动子，控制融合蛋白的表达，在含有半乳糖的培养基中正常表达，抑制其在含葡萄糖的培养基上的表达。载体上的TRP1标记基因使酵母细胞能在缺少色氨酸培养基上生长。 在待鉴定序列首尾两端分别添加限制性酶切位点EcoR I和Xho I，并与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆单菌落测序鉴定。构建好的T载体与载体pJG4-5同时用EcoR I和Xho I进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化，回收产物连接，转化大肠杆菌DH5α，双酶切鉴定。 2.3.4. 构建GFP酵母单杂交体系 采用LiAc法制备诱饵酵母感受态细胞。将构建好的含有待鉴定序列的表达载体pJG4-5转化到诱饵酵母细胞中，涂布在SD/-TRP-URA(GAL/RAF)固体培养基上，30℃培养3 d。挑取单菌落置于荧光显微镜下观察，发绿色荧光即可认为待测序列能与端粒序列(TTTAGGG)特异性结合。