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user: 3. 结果与分析 3.1. 内生生防细菌FFR3的筛选 实验从防风根中共筛选出内生细菌14株，经初步分析，编号为FFR3的菌株对多种病原细菌和真菌有明显的抑制作用。菌株FFR3的菌落中间薄，边缘厚且有褶皱，粘稠难以分离。接种24 h内颜色为透明状，之后逐渐变暗，接近暗橘色(图1)；革兰氏染色后，菌细胞部分呈红色，部分呈紫色(图2)，属于革兰氏可变菌。 图1. 菌株FFR3的菌落形态 图2. 菌株FFR3的革兰氏染色(10 × 100倍)。左箭头：革兰氏阳性菌(G + )；右箭头：革兰氏阴性菌(G − ) 3.2. 内生生防细菌FFR3的鉴定 光学显微镜和扫描电子显微镜形态分析表明，在培养24 h内，FFR3菌细胞呈杆状，主要以无丝分裂方式繁殖，表面多糖分泌物较多(图3(a)和图3(c))。培养72 h后，部分菌细胞变椭圆形，菌体一端膨大后细胞壁变薄，随后破裂释放出芽孢；或者向内凹陷碎裂，芽孢随之释放(图3(b)和图3(d))。推测FFR3在不同的环境中可通过两种不同的方式繁殖，具体繁殖方式可能受培养时间、培养基成分、湿度等影响。结合FFR3的16S rRNA序列和进化树分析(图4)，鉴定该菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)。 图3. 菌株FFR3的形态。(a)和(b) 光学显微镜形态(10 × 100)；(c)和(d) 扫描电镜形态(×10，000) 图4. 依据菌株FFR3的16S rRNA基因序列构建的系统发育树 3.3. 内生生防细菌FFR3的广谱抗性 3.3.1. FFR3对病原细菌的抗性 菌株FFR3与病原细菌共培养3 d后结果如表1所示。抑菌圈直径越大，抑制效果越显著。FFR3对实验用5种病原细菌均具有一定的抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径可达24.70 ± 5.30 mm；对丁香假单胞杆菌桑致病变种和梨火疫病菌的抑制效果相当；对稻黄单胞菌水稻致病变种和苏云金杆菌的抑制效果较弱。FFR3对5种病原细菌的抑制强度有一定的差异性，后述实验以抑菌效果强的金黄色葡萄球菌和丁香假单胞杆菌桑致病变种为监测菌。 Table 1 Inhibitory effects of strain FFR3 on pathogenic bacteri 病原细菌 Pathogenic bacteria 抑菌圈直径(mm) Diameter of bacteriostatic zone (mm) 梨火疫病菌Erwinia amylovory 12.00 ± 1.32 b 稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae 8.30 ± 0.92 bc 苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis 4.67 ± 1.76 c 丁香假单胞杆菌桑致病变种Pseudomonas syringae pv. mori 14.07 ± 5.34 b 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 24.70 ± 5.30 a 表1. 菌株FFR3对病原细菌的抑制效果 注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 3.3.2. FFR3对病原真菌的抗性 共培养3 d后，菌株FFR3对病原真菌的抑制效果如表2所示。菌株与病原真菌之间的抑菌距离越大，抑菌效果越好。FFR3对5种供试病原真菌均具有一定的抑制效果，其中对核盘菌、禾谷丝核菌和辣椒疫霉的抑制效果最好，对串珠镰胞菌和灰霉菌的抑制强度相对较弱。灰霉菌是一种广寄主性的、能够引起多种植物致病的病原真菌。截止2013年，世界上尚未发现任何一种植物对灰霉菌产生抗性 [ 17 ] [ 18 ]。核盘菌是危害作物和蔬菜的世界性重要病原菌，防治主要依靠化学农药 [ 19 ] [ 20 ]。综合实验可行性以及病原菌研究背景，后续实验选择核盘菌和灰霉菌为监测菌。 Table 2 Inhibitory effects of strain FFR3 on pathogenic fung 病原真菌 Pathogenic fungi 抑菌距离(mm) Bacteriostatic distance (mm) 核盘菌Sclerotinia sclerotiorum 20.33 ± 7.09 a 禾谷丝核菌Rhizoctonia zeae 13.40 ± 0.36 a 串珠镰胞菌Fusarium moniliforme 5.57 ± 1.69 b 辣椒疫霉Phytophthora capsici 15.03 ± 3.82 a 灰霉菌Botrytis cinerea 6.33 ± 1.15 b 表2. 菌株FFR3对病原真菌的抑制效果 注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 3.3.3. FFR3对病原真菌菌丝体形态的影响 FFR3对核盘菌表现出明显的抑制，抑制边缘的菌丝颜色比正常菌丝深，菌丝密且短(图5(a))。核盘菌的正常菌丝表面光滑饱满(图5(b))；受FFR3影响菌丝呈脱水皱缩状态，原生质体透明，菌体扁平(图5(c))；新生菌丝受FFR3影响后脱水，最终被破坏脱落(图5(d))。 FFR3显著抑制灰霉菌的生长(图6(a))；正常菌丝表面光滑(图6(b))；受抑制菌丝皱缩断裂，较正常菌丝变短变细(图6(c))，且环状或U型打环(图6(d))。 3.4. 内生生防细菌FFR3胞外抑菌物质的初步分析 3.4.1. 产抑菌物质优势培养基筛选 采用2.6滤纸片法筛选不同发酵培养基中FFR3胞外抑菌物质的抑菌强度，以抑菌圈直径减去滤纸片(f = 6 mm)直径表示抑菌强度。PDA培养基发酵产物对2种监测病原细菌均无抑制作用；NB培养基发酵 图5. 菌株FFR3对核盘菌形态的影响。(a) FFR3与核盘菌对峙实验；(b) 核盘菌正常菌丝(10 × 40)；(c)和(d) 核盘菌对峙培养菌丝(10 × 40) 图6. 菌株FFR3对灰霉菌形态的影响。(a) FFR3与灰霉菌对峙实验；(b)灰霉菌正常菌丝(10 × 40)；(c)和(d) 灰霉菌对峙培养菌丝(10 × 40) 产物对丁香假单胞杆菌无抑制作用，但对金黄色葡萄球菌抑制效果显著；LB培养基发酵产物对2种监测菌均有抑制作用，且彼此间无显著差异(表3)。此结果表明，抑菌物质可能是多种物质，不同的培养基对不同产物的产生效果不同，对不同病原细菌的抑制效果也不同。LB培养基发酵液的抑菌谱广且抑菌强度稳定，因此采用LB发酵培养基进行后续实验的菌株培养发酵。 Table 3 Antibacterial effects of fermentation broth with different mediu 病原细菌 Pathogenic bacteria LB培养基 LB medium PDA培养基 PDA medium NB培养基 NB medium 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 4.00 ± 0.87 b mm 0.00 ± 0.00 c mm 9.00 ± 1.00 a mm 丁香假单胞杆菌桑致病变种 Pseudomonas syringae pv. mori 2.00 ± 0.46 b mm 0.00 ± 0.00 c mm 0.00 ± 0.00 c mm 表3. 不同培养基发酵液抑菌效果 注：表中数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 3.4.2. 盐析和醇沉法分离胞外抑菌物质 以金黄色葡萄球菌和丁香假单胞杆菌两种病原细菌为监测菌，以LB培养基为发酵培养基，以硫酸铵盐析和乙醇醇沉法分离FFR3胞外物质，采用2.6滤纸片法检测抑菌效果，结果如表4所示。多糖溶于水而不溶于乙醇，随着乙醇的加入，发酵液中的多糖产物逐步析出。20%和40%的醇沉产物对2种监测菌均无抑制作用，表明多糖类物质不是抑菌物质的成分。发酵产物中加入硫酸铵，可有效降低蛋白质(或肽类)的溶解度，使蛋白质(或肽类)脱水凝聚沉淀。20%、30%和40%硫酸铵沉淀对2种监测病原细菌均有较好抑制效果；50%硫酸铵沉淀仅对金黄色葡萄球菌表现抑制作用，70%硫酸铵沉淀仅对丁香假单胞杆菌表现抑制作用，且抑制效果均较弱。因此推测，FFR3的抑菌产物可能是蛋白类(或肽类)物质，可用20%、30%和40%硫酸铵初步盐析分离。 3.4.3. 有机溶剂萃取胞外抑菌物质 液体中混合物各组分在不同有机溶剂中的溶解度不同，利用不同的有机溶剂可有效的萃取发酵液中的不同组分。FFR3发酵液不同萃取相对金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，其中以乙酸乙酯相和二氯甲烷相的抑制效果最强。仅乙酸乙酯相对丁香假单胞杆菌表现出一定的抑制效果，且与LB发酵液的效果相当(表5)。石油醚是一种极性小的有机溶剂，可有效萃取混合液中小极性脂溶性的化合物，如油脂、蜡、挥发油以及固醇、三萜化合物等物质；二氯甲烷的极性比石油醚略大，可溶解色素、酯类等小极性物质；而乙酸乙酯对游离生物碱、有机酸、黄酮及苷元等中等级性化合物的萃取效果较好；水可提出糖类、无机盐、氨基酸等水溶性的成分。不同监测菌对不同次级代谢产物的敏感度不同，可利用有机溶剂的萃取成分差异性筛选出最有效的代谢产物。FFR3胞外抑菌物质主要分布在二氯甲烷相和乙酸乙酯相，推测某些生物碱或者黄酮类物质参与了FFR3的抑菌效应。 Table 4 Antibacterial effects of alcohol precipitation and salting-out components in FFR3 fermentation brot 病原细菌 Pathogenic bacteria PBS对照 PBS control 醇沉 Alcohol precipitation 硫酸铵沉淀 Ammonium sulfate precipitation 20% 40% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 丁香假单胞杆菌桑致病变种Pseudomonas syringae pv. mori - - - ++ ++ ++ - - + 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus - - - ++ ++ ++ + - - 表4. FFR3发酵液醇沉和盐析成分的抑菌效果 注：“-”无抑制作用，“+”有抑制作用，“++”抑制作用较强。 Table 5 Antibacterial effects of antibacterial substances extracted by different organic solvent 病原细菌 Pathogenic bacteria 不同萃取段 Different extraction segment 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 丁香假单胞杆菌 Pseudomonas syringae pv. mori LB发酵液LB fermentation broth 5.67 ± 4.93 a mm 2.33 ± 4.04 a mm 石油醚相Petroleum ether phase 3.33 ± 5.77 b mm 0.00 ± 0.00 b mm 二氯甲烷相Dichloromethane phase 6.17 ± 5.39 a mm 0.00 ± 0.00 b mm 乙酸乙酯相ethyl acetate phase 6.33 ± 5.69 a mm 2.50 ± 4.33 a mm 水相Water phase 2.67 ± 4.62 b mm 0.00 ± 0.00 b mm 甲醇对照Methanol control 0.00 ± 0.00 c mm 0.00 ± 0.00 b mm 表5. 不同有机溶剂萃取的抑菌物质的抑菌效果 注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 3.5. 内生生防细菌FFR3蛋白类(或肽类)抑菌物质的稳定性 3.5.1. 对温度的稳定性 30%和40%的硫酸铵沉淀对指示菌的抑制效果受到温度的影响。当温度低于90℃时，30%硫酸铵沉淀的抑菌效果比较稳定；在温度达到100℃时，沉淀的抑菌活性大幅下降；在高压蒸汽灭菌条件下，沉淀失去抑菌活性(图7(a))。40%硫酸铵沉淀在温度低于80℃时对丁香假单胞杆菌的抑制效果稳定保持，在温度低于90℃时对金黄色葡萄球菌的作用效果比较稳定，而后随温度升高急剧下降，在高压蒸汽灭菌条件下，失去抑菌活性(图7(b))。表明FFR3的蛋白类(或肽类)抑菌物质对温度具有良好的耐受性。 3.5.2. 对蛋白酶的稳定性 蛋白酶K是一种高活性蛋白酶，可有效降解生物样品中的蛋白质；胰蛋白酶属肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，是特异性最强的蛋白酶。经蛋白酶处理后，30%和40%的硫酸铵沉淀对2种监测菌的抑制活性均明显下降(图8)，表明抑菌物质对蛋白酶敏感，属于蛋白质(或肽类)物质。 图7. 温度对硫酸铵沉淀抑菌活性的影响。(a) 30%硫酸铵沉淀的抑菌活性；(b) 40%硫酸铵沉淀的抑菌活性 图8. 蛋白酶对硫酸铵沉淀抑菌活性的影响。(a) 对丁香假单胞杆菌的抑制活性；(b) 对金黄色葡萄球菌的抑制活性 3.5.3. 对酸碱的稳定性 30%的硫酸铵沉淀和40%的硫酸铵沉淀的抑菌活性均受pH值的影响很大，在中性条件下抑菌活性比较稳定，在强酸性和强碱性条件下不稳定，在pH值达到10以上或者5以下抑菌活性急剧下降，说明该抑菌物质的活性pH范围比较广(图9)。 图9. 酸碱性对硫酸铵沉淀抑菌活性的影响。(a) 30%硫酸铵沉淀的抑菌活性；(b) 40%硫酸铵沉淀的抑菌活性