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user: 3. 结果 3.1. 菌落特征及镜检结果 该菌株在PDA固体培养基上气生菌丝发达，生长迅速，培养2天时，菌落直径较小，颜色呈灰黄色，且边缘长有一圈白色菌丝，6天后直径达到2.5 cm，菌落呈黑色或墨绿色的绒状或带粉状，伴随培养时间延长，边缘白色菌丝消失最终为全黑色。 镜检特征，菌丝灰色至黑色，扩散较快，形状呈倒棒状，中褐色，具横隔，分生孢子常数个成链。具体见图1，据以上结果结合手册及文献初步鉴定为交链孢霉目，黑霉科，半知菌纲，交链孢霉属 [ 5 ] [ 6 ] 。 Table 2 The test level of factor 编号 NO. 温度Temperature (℃) 酸度值 pH 震荡频率Rotation rate (r/min) 接种量 Medium capacity (mL) 1 25 5.5 100 0.5 2 28 6.0 125 0.5 3 30 6.5 150 0.5 4 32 7.0 175 0.5 表2. 试验因素水平表 图1. PDA培养基上的Alternaria的形态及显微结构图(×400) 3.2. PCR扩增结果 以提取的霉菌DNA为模板进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检验结果，由图2可知，电泳检测该DNA片断大小为550 bp左古。 经上海生物工程有限公司测序，其ITS序列为556 bp，所得序列为： CCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC。 将所得基因序列提交到NCBI数据库中获得登陆号为(Acession number) KT031402，进行同源序列搜索，利用CustalX软件对扩增的ITS序列进行对比。最后用MEGA5.0软件构建进化树，并进行统计学检验，所建系统发育树如图3所示。结果表明该菌种与Alternaria eichhorniae (KC146356)聚于同一分支中，其同源性达到97%，结合形态特征，镜检结果和基于18S rRNA基因序列分析结果，可将该菌株确定至属的水平，即确定该霉菌为交链孢霉属。 3.3. 培养条件的优化结果 分别将温度、pH、摇床震荡频率做为变量，在其它因素相同的培养条件下，用570 nm波长的分光光度计测定每4 h五组菌液的平均OD值。 3.3.1. 不同温度对霉菌生长的影响 在pH为6.5，摇床频率为125 r/min，温度分别为25℃、28℃、30℃、32℃条件下，霉菌40 h内5组平行实验的平均OD值及相应的生长曲线分别见表3，图4。 温度是影响霉菌生长与存活的显著因素之一，从图中可能明显看出，28℃与32℃前期生长状况相同，但12 h之后28℃明显较32℃生长较快。其而30℃前期生长最慢，24 h后呈上升趋势较明显，综合来看，8 h到36 h，28℃生长状况较好。 图2. PCR扩增电泳图 图3. 系统发育树构建 图4. 霉菌在不同温度下的生长曲线 Table 3 The OD of Alternaria under different temperature Test number Culture times (h) Average OD 25℃ 28℃ 30℃ 32℃ 1 4 0.032 0.054 0.014 0.038 2 8 0.095 0.116 0.023 0.228 3 12 0.26 0.874 0.045 0.877 4 16 0.682 1.413 0.048 1.028 5 20 1.167 1.566 0.758 1.093 6 24 1.379 1.633 1.331 1.263 7 28 1.389 1.649 1.567 1.397 8 32 1.412 1.714 1.799 1.495 9 36 1.423 1.835 1.803 1.507 10 40 1.462 1.941 1.812 1.564 表3. 霉菌在不同温度下的OD值 3.3.2. 不同PH对霉菌生长的影响 在温度为28℃，摇床频率为125 r/min，培养基pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5条件下，霉菌40 h内的OD值及相应的生长曲线分别见表4，图5。 众所周知培养基pH可引起细胞膜电荷的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变营养物质的可给性和有害物质的毒性。介质的pH不仅影响微生物的生长，甚至影响微生物的形态。为了得到更好的菌斑形态，对菌的PH进行优化是非常有必要的。从图5可见，pH在6.0时最有利于菌体生长，而5.5生长状态也较好，其它三种条件都不利于霉菌的生长。 3.3.3. 不同震荡频率对霉菌生长的影响 在温度为28℃，pH为5.5，摇床震荡频率分别为100 r/min、125 r/min、150 r/min、175 r/min条件下，霉菌40 h内的OD值相应的生长曲线分别见表5和图6。 震荡频率主要是通过与增加瓶内气液接触面积、增加液体的湍动程度、增加泡在液体中的停留时间(即增加接触时间)来增加培养瓶内溶解氧的浓度 [ 7 ] [ 8 ] 。氧的溶解度对菌体的分散程度，营养物质的吸收都产生很大的影响，与此同时，对微生物的生长代谢，产物活性都有很大关系。因而对震荡频率的控制也很重要。 从图6可以看出最有利菌的生长的震荡频率为125 r/min，其次为150 r/min。 3.3.4. 正交试验结果 根据单因素结果，进行L16(4^5)正交试验，正交试验结果是以8 h到36 h之间的OD值的平均值作为菌种生长的速率。 由表6均值极差分析可知，三种因素均对OD值产生显著影响。其中温度影响最大，其次为摇床震荡频率、酸度值。温度最优水平为28℃，pH最优水平为5.5，摇床震荡频率最优水平为125 r/min，最佳组合方法为，温度28℃，pH5.5，摇床震荡频率125 r/min。从图7正交试验效应曲线图知最佳组合是温度为28℃，pH5.5，摇床震荡频率125 r/min，与正交试验结果相符合。 Table 4 The OD of Alternariaunder different p Test number Culture times (h) Average OD 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 1 4 0.016 0.034 0.065 0.012 0.015 2 8 0.17 0.185 0.078 0.035 0.062 3 12 0.205 0.331 0.109 0.092 0.081 4 16 0.793 1.022 0.107 0.169 0.069 5 20 1.314 1.549 0.901 0.202 0.123 6 24 1.67 1.645 1.611 0.758 0.934 7 28 1.699 1.725 1.558 0.641 1.442 8 32 1.711 1.796 1.642 0.747 1.724 9 36 1.831 1.915 1.714 0.644 1.742 10 40 1.835 1.975 1.723 0.673 1.756 表4. 霉菌在不同pH下的OD值 图5. 霉菌在不同PH条件下的生长曲线 Table 5 The OD of Alternaria under different rotation Test number Culture times (h) Average OD 100 r/min 125 r/min 150 r/min 175 r/min 1 4 0.01 0.02 0.023 0.035 2 8 0.011 0.075 0.045 0.254 3 12 0.024 0.926 0.048 0.305 4 16 0.099 1.571 0.758 0.457 5 20 0.785 1.879 1.331 0.984 6 24 1.319 2.11 1.567 1.264 7 28 1.86 2.113 1.799 1.284 8 32 1.883 2.181 1.873 1.327 9 36 1.89 2.259 1.898 1.541 10 40 1.904 2.264 1.897 1.587 表5. 霉菌在不同摇床震荡频率下的OD值 图6. 霉菌在不同震荡频率下的生长曲线图 Table 6 The orthogonal experiment intuitive results analysi Test number 影响因素Factors OD均值 Mean 温度Temperature (℃) 酸度值pH 震荡频率Rotation rate (r/min) 1 25 5.5 100 0.782 2 25 6.0 125 0.732 3 25 6.5 150 0.824 4 25 7.0 175 1.029 5 28 5.5 125 1.537 6 28 6.0 100 1.762 7 28 6.5 175 0.929 8 28 7.0 150 1.07 9 30 5.5 150 0.723 10 30 6.0 175 1.226 11 30 6.5 100 0.772 12 30 7.0 125 1.762 13 32 5.5 175 1.697 14 32 6.0 150 0.756 15 32 6.5 125 1.078 16 32 7.0 100 0.565 K1 0.842 1.185 0.970 --- K2 1.325 1.119 1.277 --- K3 1.121 0.901 0.843 --- K4 0.483 1.107 1.220 --- R 0.483 0.284 0.434 --- Important order A > C > B Excellent level A2 B1 C2 Excellent combination A2B1C2 表6. 正交试验直观结果分析表 图7. 正交试验效应曲线图