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user: 3. 诱导子对药用植物毛状根次生代谢产物的影响 在药用植物毛状根培养实验中，利用诱导子来提高其次生代谢产物合成量已成为常用方法，以下按中药活性成分结构类别分述诱导子在对提高药用植物毛状根中次生代谢产物的影响，先游离成分，如酚酸类、生物碱类，后含苷类，如三萜皂苷类(见表1)。 3.1. 酚酸类成分 酚酸类成分广泛存在于药用植物中，如忍冬科的金银花，菊科的蒲公英，唇形科的鼠尾草，蔷薇科的仙鹤草，橄榄科的方榄，伞形科的当归等。这些植物中的酚酸类成分(如绿原酸、原儿茶酸、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸等)具有重要的药理活性，如清除自由基、抗炎、抗病毒、免疫调节、抗凝血及抗肿瘤作用等，因此受到越来越多的人关注 [ 5 ] 。 酚酸类成分的生成与植物所受外界胁迫有很大关联，酚类物质本身具有抗病性，且其氧化醌类杀菌力更强，可氧化胞外连丝而导致病原菌扩展受阻，从而引起植株过敏抗性反应；同时酚类物质也可以形成木质素的前体，使寄主细胞木质化而产生抗病作用。因此当植物受到外界胁迫后，植物为了适应这一环境，体内就会积累酚类物质，酚类物质积累越多，抗胁迫能力越强 [ 6 ] 。 实验研究证明，利用诱导子可以提高酚酸类成分在药用植物毛状根中的合成量。张顺仓 [ 7 ] 等使用真菌诱导子和茉莉酸甲酯使丹参毛状根中迷迭香酸的含量分别提高了50%和20%，而两种诱导子的协同使用却只提高了30%；Bais HP [ 8 ] 等使用疫霉的真菌细胞壁诱导紫花罗勒毛状根，发现其中迷迭香酸含量是对照的1.9倍。 3.2. 醌类成分 醌类成分是天然药物中一类重要的化学成分，它是一类分子内具有不饱和环二酮结构(醌式结构)或容易转变成这样结构的天然有机化合物。按化学结构主要分为苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种，其中蒽醌及其衍生物种类最多。其生源合成主要通过乙酰-丙二酸、莽草酸-琥珀酰苯甲酸、芳香氨基酸等多种途径实现。 醌类成分在高等植物中广泛分布，如蓼科的大黄、何首乌、虎杖，唇形科的丹参、茜草科的茜草、豆科的决明子、番泻叶、百合科的芦荟、紫草科的紫草等。醌类在一些低等植物，如地衣类、菌类和藻类的代谢产物中也有存在。这些成分具有泻下、抗菌、抗肿瘤、利尿和止血等多个方面的生物活性 [ 9 ] [ 10 ] 。 实验研究证明，利用诱导子可以提高醌类成分在药用植物毛状根中的合成量。张璞 [ 11 ] 等使用黑曲霉和米曲霉诱导新疆紫草毛状根，其萘醌含量分别是对照的2.4倍和2.3倍，同时发现在生物反应器中添加黑曲霉和米曲霉的混合诱导子及大孔吸附树脂NKA-9，其总萘醌含量是对照的4.17倍；阎岩 [ 12 ] 等使用4%密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根，促进丹参酮积累增加，最高达到对照的10.2倍，同时发现4%密旋链霉菌Act12处理可以提高丹参毛状根中活性氧含量，同时上调HMGR和DXR基因表达，从而提高毛状根中的丹参酮含量。 3.3. 生物碱类成分 生物碱类是指来源于生物界的一类含氮有机化合物。目前已知的生物碱主要生源途径有两个：一是氨基酸途径，二是甲戊二羟酸(异戊烯)途径。采用生源结合化学分类法，生物碱分为源于鸟氨酸途径的生物碱类、源于赖氨酸途径的生物碱类、源于苯丙氨酸和酪氨酸途径的生物碱类、源于色氨酸途径的生物碱类、源于邻氨基苯甲酸途径的生物碱类、源于组氨酸途径的生物碱类、萜类生物碱和甾体类生物碱。 Table 1 The effects of biosynthetic amount of secondary metabolites in hairy roots of medicinal plants induced by elicitor 次生代谢产物名称 药用植物名称 诱导子 次生代谢产物量 + 增重(mg/g) 诱导子促进增量(%) 参考 文献 酚酸类 迷迭香酸 Rosmarinic acid 丹参 Salvia miltiorrhiza Bung 内生菌 3.98 + 1.99 mg/g (DW) 50.00 [ 7 ] 茉莉酸甲酯 3.41 + 0.68 mg/g (DW) 19.94 [ 7 ] 内生菌 + 茉莉酸甲酯 3.85 + 1.15 mg/g (DW) 29.99 [ 7 ] 紫花罗勒 Ocimumbasilicum L 疫霉 79.2 + 71.9 g/L 90.78 [ 8 ] 总酚酸 Total phenolic acid 丹参 Salvia miltiorrhiza Bung 茉莉酸甲酯 74.36 + 14.87 mg/g (DW) 20.00 [ 7 ] 醌类 萘醌 Shikonin 新疆紫草Arnebiaeuchroma (Royle) Johnst 黑曲霉 0.35% + 0.50% 142.86 [ 11 ] 米曲霉 0.35% + 0.46% 131.43 [ 11 ] 丹参酮 Tanshinone 丹参 Salvia miltiorrhiza Bung 山梨醇 0.25 + 0.5 mg/g (DW) 200.00 [ 23 ] PGPR蜡样杆菌 0.19 + 1.4 mg/g 736.84 [ 24 ] 密旋链霉菌Act12 0.5 + 4.6 mg/g (DW) 920.00 [ 12 ] 酵母提取物 0.46 + 0.91 mg/g (DW) 197.83 [ 25 ] 细菌多糖 0.19 + 1.4 mg/g 736.84 [ 26 ] 蜡样芽孢杆菌 1.4 + 9.0 mg/L 642.86 [ 27 ] 丹参酮II A Tanshinone II A 丹参 Salvia miltiorrhiza Bung 茉莉酸甲酯 0.252 + 1.311 mg/g 520.24 [ 28 ] 二氢丹参酮I Dihydrotanshinone I 丹参 Salvia miltiorrhiza Bung 半知菌 0.067 + 0.93 mg/g (DW) 1388.06 [ 7 ] 茉莉酸甲酯 0.033 + 0.957 mg/g (DW) 2900.00 [ 7 ] 真菌诱导子 + 茉莉酸甲酯 0.07 + 1.3 mg/g (DW) 1857.14 [ 7 ] 隐丹参酮 Cryptotanshinone 丹参 Salvia miltiorrhiza Bung 半知菌 0.11 + 2.94 mg/g (DW) 2672.73 [ 7 ] 酵母提取物 (胞内) 0.001 + 0.059% (DW) (胞外) 0.002 + 0.076 mg/L 5900.00 3800.00 [ 22 ] 茉莉酸甲酯 0.115 + 1.775 mg/g (DW) 1543.48 [ 7 ] 0.024 + 0.548 mg/g 2283.33 [ 28 ] 真菌诱导子 + 茉莉酸甲酯 0.114 + 3.326 mg/g (DW) 2917.54 [ 7 ] 生物碱类 莨菪烷类生物碱 Tropane alkaloids 木本曼陀罗 Brugmansia candida Pers. Ag + (胞内) 1400 + 4800 μg/g (胞外) 60 + 20 μg/g 342.86 33.33 [ 29 ] 莨菪碱 Hyoscyamine 曼陀罗 Datura stramonium L. NaCl 3.90 + 8.07 mg/g 206.92 [ 30 ] 茉莉酸甲酯 0.655 + 0.838 mg/g 127.94 [ 14 ] 表1. 诱导子对药用植物毛状根次生代谢产物合成量的影响 Continued Continued DW：干重，FW：鲜重。 生物碱类成分主要分布在植物界，绝大多数存在于高等植物的双子叶植物中，其中最重要的18个科为：石竹科、番荔枝科、夹竹桃科、菊科、小檗科、紫草科、黄杨科、卫矛科、蝶形花科、樟科、豆科、防己科、罂粟科、胡椒科、毛茛科、茜草科、芸香科和茄科等。单子叶植物代表性类群有石蒜科、百合科、兰科等。裸子植物有麻黄科、红豆杉科、三尖杉科等类群。 生物碱类成分结构式样丰富，生物活性多样，常为许多药用植物的有效成分。如鸦片中的吗啡具有强烈的镇痛作用，可待因具有止咳作用；麻黄中的麻黄碱具有平喘作用；黄连、黄柏中的小檗碱具抗菌消炎作用；长春花中的长春花碱、三尖杉中的高三尖杉酯碱、喜树中的喜树碱等均具有很好的抗肿瘤作用等 [ 13 ] 。 实验研究证明，利用诱导子可以提高生物碱类成分在药用植物毛状根中的合成量。孙际薇 [ 14 ] 等采用HPLC测定茉莉酸甲酯处理后不同浓度梯度及不同时间段(0， 3， 6， 9， 12 d)曼陀罗毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的含量以及其在培养基中的含量，曼陀罗毛状根经茉莉酸甲酯处理后3，6，9，12 d的东莨菪碱的质量分数分别达0.419，0.439，0.43，0.374 mg/g，分别是对照组的1.36，1.42，1.17，1.12倍；莨菪碱的质量分数达1.493，0.817，0.723，0.698 mg/g，分别是对照组的2.28，1.11，0.63，0.70倍，从而证明茉莉酸甲酯能显著促进曼陀罗毛状根中东莨菪碱成分的积累并向培养基中释放；能显著促进处理3 d和6 d后曼陀罗毛状根中莨菪碱成分的积累并向培养基中释放。 3.4. 黄酮类成分及其苷类衍生物 黄酮类成分及其苷类衍生物是指由C 6 -C 3 -C 6 单位组成的化合物，C-2或C-3位上苯环，以游离态与糖结合为苷的形式存在。根据结构特点可将主要的天然黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇类、查尔酮、橙酮、异黄酮类、花青素类，以及各类二氢衍生物。 黄酮类成分多存在于高等植物及蕨类植物中，苔藓类中含有的黄酮类成分为数不多，而藻类、微生物(如细菌)及其他海洋生物中没有发现黄酮类成分的存在 [ 13 ] 。据报道，黄酮类化合物集中分布于被子植物中，尤以唇形科、玄参科、爵麻科、苦苣苔科、菊科等植物中存在较多；黄酮醇类较广泛分布于双子叶植物中，特别是一些木本植物的花和叶中；二氢黄酮类特别在蔷薇科、芸香科、豆科、杜鹃花科、菊科、姜科中分布较多；二氢黄酮醇类较普遍地存在于豆科植物中；异黄酮类以豆科蝶形花亚科和鸢尾科植物中存在较多。在裸子植物中也有存在，如双黄酮类多局限分布于裸子植物，尤其是松柏纲、银杏纲和凤尾纲等植物中 [ 15 ] 。 黄酮类成分的生物活性丰富多样。芦丁、橙皮苷、d-儿茶素等具有降低毛细血管脆性和异常通透性作用；川陈皮素、槲皮素具止咳祛痰作用；染料木素、金雀花异黄酮、大豆素等异黄酮类具雌性激素样作用和抗氧化、抗肿瘤作用；木犀草素、黄芩苷、黄芩素以及槲皮素、桑色素等具有抗菌、抗病毒作用；牡荆素、桑色素、d-儿茶素等具有抗肿瘤作用。 实验研究证明，利用诱导子可以提高黄酮类成分在药用植物毛状根中的合成量。Shinde AN [ 16 ] 等使用不同诱导子诱导补骨脂毛状根，发现2 mg/L的壳聚糖促使染料木黄酮的干重增加46.84%，1 mM的水杨酸促使染料木黄酮的干重增加20%，200 mg/L的酵母提取物促使染料木黄酮的干重增加21.05%；Zhang HC [ 17 ] 等使用0.1%酵母提取物和2%聚乙二醇诱导甘草毛状根中黄酮的合成，发现黄酮的干重分别增加60.49%和17.28%，同时发现0.1%酵母提取物和2%聚乙二醇的混合诱导子可以促使黄酮的合成量干重达到对照的2.29倍。 3.5. 萜类成分 萜类成分是由甲戊二羟酸衍生、且分子式符合(C 5 H 8 ) n 通式的化合物及其衍生物。萜类成分根据分子骨架中异戊二烯单元的数目进行分类，如单萜、倍半萜、二萜等，再根据分子中碳环的数目，进一步分为链萜、单环萜、双环萜、三环萜和四环萜等。 萜类成分是天然产物中数量最多的一类成分，其在植物界中的分布极为广泛，藻类、菌类、地衣类、苔藓类、蕨类、裸子植物及被子植物中均有萜类的存在。单萜在唇形科、伞形科、樟科及松科等植物腺体、油室及树脂道内大量存在；倍半萜集中分布于木兰目、芸香目、山茱萸目及菊目等植物中；二萜主要分布于五加科、马兜铃科、菊科、橄榄科、杜鹃花科、大戟科、豆科、唇形科和茜草科等植物中，是形成树脂的主要物质；二倍半萜数量较少，主要分布于羊齿植物、菌类、地衣类、海洋生物及昆虫的分泌物等中；三萜是构成植物皂苷、树脂等的重要物质；四萜主要是一些脂溶性色素，广泛分布于植物中，一般为红色、橙色或黄色结晶 [ 13 ] 。 实验研究证明，利用诱导子可以提高萜类成分在药用植物毛状根中的合成量。王剑文 [ 18 ] 等将从胶孢炭疽菌菌丝体中提取纯化的寡糖提取物用于诱导黄花蒿毛状根合成青蒿素，发现培养23 d的毛状根经诱导子(0.4 mg/mL)处理4 d后，青蒿素产量可达13.51 mg/L，比同期对照产量提高51.63%；Zhang B [ 19 ] 等也使用寡糖诱导黄花蒿毛状根合成青蒿素，发现培养16 d的毛状根加入诱导子(60 μg/mL)处理4 d后，青蒿素最高产量达11.3 mg/L，比对照增加55.2%。 3.6. 三萜皂苷类成分 三萜皂苷类成分是三萜皂苷元与糖结合而成的化合物，常见的苷元为四环三萜与五环三萜，常见的糖主要是葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖等。根据糖链的多少，可将三萜皂苷分为单糖链苷、双糖链苷、三糖链苷。 三萜皂苷广泛存在于植物中，是一类重要的植物次生代谢产物，尤其在双子叶植物中分布最多，目前发现的已达2万多种 [ 20 ] 。三萜皂苷具有多种生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、降低胆固醇、保肝和增强植物抗病、抗虫害的能力。 实验研究证明，利用诱导子可以提高三萜皂苷类成分在药用植物毛状根中的合成量。Zhou LG [ 21 ] 等使用寡糖诱导人参毛状根合成人参皂苷，结果实验组的含量最高可达对照组的1.18倍；徐立新 [ 22 ] 使用茉莉酸甲酯来诱导人参毛状根合成人参皂苷，发现茉莉酸甲酯在较低浓度的时候对总皂苷的积累和人参毛状根的生长有促进作用，当其浓度为0.001 mmol/L时，总皂苷含量为2.56%，比对照增加了32.64%。 由表1可见，在适宜的条件下，在药用植物毛状根中加入诱导子均表现出次生代谢产物含量的增加，最高的可增加59倍，如隐丹参酮(cryptotanshinone)，表明诱导子可以促进药用植物毛状根次生代谢产物的合成；不同诱导子对同一次生代谢产物的增量有显著差异，如对莨菪碱(Hyoscyamine)诱导，NaCl与茉莉酸甲酯相差197倍，提示选择适宜的诱导子可定向、高效、大量的获取具有药理活性的次生代谢产物。 另外，研究显示茉莉酸类物质作为诱导子，可以引发植物的防御反应，其通过影响植物相关防御基因的表达从而促进次生代谢产物的合成。于丽莉 [ 42 ] 实验发现给人参毛状根外源添加茉莉酸甲酯作为诱导子后，过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶的酶活变化趋势与人参皂苷生物合成关键酶基因的表达量变化的趋势一致，这说明植物抗性酶类的酶活变化可以作为植物防御反应的重要生理生态指标。酶活性的增强，意味着植物次生代谢活动的提高，次生代谢产物的积累增加。