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user: 3. 结果与讨论 3.1. TiO 2 微球合成原理 为避免因使用无机钛醇盐引入的杂质阴离子，实验中使用钛酸四异丙酯作为前驱物，采用异丙醇作为溶剂减缓前驱物的水解速度，添加EDTA使微球表面更加光滑。溶剂热法反应完成之后使用乙醇进行清洗以除去溶液中残留的钛酸四异丙酯。充分干燥之后对TiO 2 微球进行煅烧，以提高TiO 2 的结晶度及除去残留的有机物。 溶剂热法反应中TiO 2 微球的形成过程如下(图1)： 1) TiO 2 晶核的形成：钛酸四异丙酯首先在异丙醇溶液中析出一批极细微的颗粒作为晶核中心，晶核大小与钛酸四异丙酯浓度有关。随着反应温度和气压的不断上升，钛酸四异丙酯水解程度逐渐增大，晶核中心逐步长大，形成TiO 2 纳米颗粒并从溶液中析出。 2) TiO 2 微球的形成：随着越来越多的TiO 2 纳米颗粒从溶液中析出，原溶液水解平衡被打破，反应速度加快，溶液中TiO 2 组分不断转为固相，在EDTA的作用下有序排列生长，最终变为TiO 2 微球并沉淀下来。 图1. TiO 2 微球的形成过程 3.2. TiO 2 微球的合成及条件优化 参考Yu [ 18 ] 等人的做法制备TiO 2 微球，采用溶剂热法在200℃条件下于含聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜内反应制备TiO 2 微球。利用环境扫描电子显微镜进行表征，结果如图2所示。从图中可以看出制备的TiO 2 微球存在粒径不均匀、形状不规则、表面粗糙、黏连团聚严重、球形颗粒占比低等问题。 图2. TiO 2 微球的SEM图 3.2.1. 探究包裹剂EDTA对TiO 2 微球表面形貌的影响 在溶剂热反应过程中，加入EDTA对TiO 2 微球表面结构进行修饰。在TiO 2 纳米颗粒形成之后，EDTA被吸附在颗粒表面，在EDTA的作用下纳米颗粒有序的在晶核表面堆积长大，形成TiO 2 微球。此外，若控制EDTA浓度使其能完整包覆TiO 2 微球，则能在微球之间产生空间位阻作用，避免颗粒聚集，从而提高TiO 2 微球的分散性和均匀性 [ 19 ]。将未添加EDTA制备的TiO 2 微球(图3(A))与加入EDTA制备TiO 2 微球(图3(B))进行对比，结果如图3所示。通过对比分析可知加入EDTA后，制得的TiO 2 微球表面更加光滑，表面毛刺明显减少。 图3. TiO 2 微球的SEM图，(A) 未添加EDTA和(B) 添加EDTA 3.2.2. 差速离心法处理TiO 2 微球 首先尝试利用离心方法分离不同粒径的TiO 2 微球，溶剂热法反应之后，将TiO 2 微球溶解于EP管中，利用超声波震荡使其充分分散，然后在500 r/min下离心5 min，沉淀进行充分干燥。剩余上清液用1000 r/min进行离心5 min，将不同转速得到的产品进行干燥，并将离心处理后的TiO 2 微球进行SEM表征，结果如图4所示。与未进行离心处理的微球(图4(A))进行对比，500 r/min离心处理后的TiO 2 微球(图4(B))平均粒径增大，但仍存在许多小颗粒，并且TiO 2 团聚物也会被沉淀下来。1000 r/min离心处理的TiO 2 微球(图4(C))粒径几乎都小于1 μm。可以得出结论，采用离心法不能完全去除小颗粒TiO 2 ，且会把团聚物一起分离出来，但是离心法可以在一定程度上将大粒径的TiO 2 微球筛选出来。 图4. TiO 2 微球SEM图。(A) 未离心；(B) 500 r/min离心处理；(C) 500 r/min离心之后的上清液1000 r/min离心 3.2.3. 微孔滤膜分离TiO 2 微球 离心处理不能完全除去纳米尺寸的颗粒，因此尝试采用0.8 μm的微孔滤膜对TiO 2 进行过滤。将TiO 2 微球溶解在EP管中，并通过超声波震荡使其充分分散，然后利用微孔滤膜对溶液进行抽滤，用乙醇清洗三次。对过滤前后的TiO 2 微球进行SEM表征，结果如图5所示。可以看到未过滤时TiO 2 微球(图5(A))存在许多纳米级别的颗粒，而用微孔滤膜过滤之后(图5(B))几乎无小于800 nm的颗粒。因此，利用微孔滤膜对TiO 2 微球进行处理可以有效除去纳米级别的TiO 2 颗粒。 图5. TiO 2 微球SEM图。(A) 未用微孔滤膜过滤和(B) 0.8 μm微孔滤膜过滤 3.2.4. 钛酸四异丙酯的用量对TiO 2 微球形貌的影响 为了研究溶剂热法反应中前驱物的浓度对TiO 2 微球形貌的影响，以初始用量1.1 mL (3.8 mM)为对照组，分别增设60% (2.3 mM)、80% (3.0 mM)、120% (4.6 mM)作为实验组。对制备的TiO 2 进行扫描表征，结果如图6所示。钛酸四异丙酯用量为120% (4.6 mM)时(图6(A))，TiO 2 微球出现非常严重的硬团聚，颗粒形状非常不规则；用量为100% (3.8 mM)时(图6(B))，存在由多个TiO 2 微球构成硬团聚；用量为80% (3.0 mM)时(图6(C))，软团聚基本发生在两个或三个TiO 2 微球之间，可以看见许多未团聚TiO 2 微球，但有较多的微球呈不规则形状；用量为60% (2.3 mM)时(图6(D))，TiO 2 微球几乎不发生团聚，且分散均匀，形状都呈圆形或椭圆形。 图6. 不同用量钛酸四异丙酯制备的TiO 2 微球的SEM图。(A) 4.6 mM；(B) 3.8 mM；(C) 3.0 mM；(D) 2.3 mM 因此可以得出结论，前驱物钛酸四异丙酯的用量在一定范围内时(2.3 mM~4.6 mM)，随着前驱物浓度增加，TiO 2 微球硬团聚程度增加，颗粒愈不规则，当用量达4.6 mM时，几乎无单颗粒的TiO 2 微球，TiO 2 微球都团聚在一起。因此本实验制备TiO 2 微球采用钛酸四异丙酯的用量为2.3 mM。 优化合成条件制备微球，使用2.3 mM的钛酸四异丙酯作为前驱物，0.0220 g EDTA作为包裹剂，使用微孔滤膜对TiO 2 微球进行过滤，用玛瑙磨对煅烧后的TiO 2 微球进行研磨。如图7(D)所示，优化条件之后合成的TiO 2 微球颗粒规则、分散性好、表面无毛刺、无团聚现象，粒径较均匀，约0.8~3 μm左右。 3.3. TiO 2 微球的表征 使用透射电子显微镜(TEM)对TiO 2 微球进行表征，观察TiO 2 微球的亚显微结构，结果如图7所示。从图7(A)中可以看到制备的TiO 2 微球粒径约为0.8~1.6 μm左右，制备的二氧化钛球形度较佳。从图7(B)中可以看出二氧化钛微球是由许多二氧化钛纳米颗粒堆积而成的。图7(B)中FFT插图显示为衍射环，也表明微球是有纳米颗粒堆积而成。 采用纳米粒度及Zeta电位分析仪对TiO 2 微球的粒径分布进行表征，图7(C)为优化合成条件之后制备的TiO 2 微球的粒径分布图。三条曲线分别表示同一溶液样品间隔一分钟测一次所得到的结果。从图中可以看出TiO 2 微球粒径分布为1.1~2.3 μm左右，多数TiO 2 微球粒径为1.5 μm左右，随着时间推移，粒径分布峰位置不变，但峰高变低，峰型变宽，这是由于微米颗粒在溶液中聚沉引起的。 在溶剂热法反应完成之后对TiO 2 微球进行清洗、干燥之后取部分留样待测，剩余TiO 2 微球进行煅烧，对煅烧前后的TiO 2 微球进行表征，结果如图7(D)所示。从图中可知，衍射角2θ在25.36˚、37.94˚、48.14˚、54.02˚、55.22˚、62.72˚分别对应TiO 2 的(101)、(004)、(200)、(105)、(211)和(204)衍射面。将各衍射面对应的衍射峰与锐钛矿型TiO 2 的标准PDF卡(JCPDS 21-1272)进行对比，煅烧前后的TiO 2 微球均为锐钛矿型。对比衍射角为25.36˚的衍射峰，可以看到煅烧后的TiO 2 微球衍射峰强度增大，即煅烧后TiO 2 微球的结晶度更高。 对煅烧前后的TiO 2 微球进行红外光谱表征，检查有无有机物残留、及分析合成的二氧化钛的晶型结构，结果如图7(E)所示。钛酸四异丙酯富含甲基，然而2960 cm −1 与2876 cm −1 附近未出现吸收峰，可确定TiO 2 微球中没有钛酸四异丙酯残留；700~400 cm −1 宽峰为峰锐钛矿型二氧化钛的特征峰；1300~1000 cm −1 内无吸收峰，说明无醇的C-O的伸缩振动，即无乙醇或异丙醇残留；1600 cm −1 附近的吸收峰为C=O伸缩振动峰，3500~2000 cm −1 宽而散的峰为氢键缔合的羧基的O-H的吸收振动峰，1400 cm −1 处的峰是O-H 面内弯曲振动峰，综合上述条件可知煅烧前TiO 2 粉体中有EDTA残留。煅烧后1400 cm −1 处的吸收峰与1600 cm −1 附近的吸收峰消失，3500~2000 cm −1 的吸收峰变窄，推测为经过煅烧EDTA转化为CO 2 而除去，煅烧后的样品中3500~3000 cm −1 的吸收振动峰为TiO 2 微球表面的O-H所产生的。2345 cm −1 的峰是CO 2 弱吸收峰，产生的原因有两种，第一种原因是测量时仪器样品光路和参与光路不平衡而导致的，另一种是高温煅烧时EDTA分解产生CO 2 吸附在TiO 2 微球表面 [ 20 ]。通过红外光谱表征图谱可知，本次制备的二氧化钛为锐钛矿构型，经过450℃煅烧可以有效去除TiO 2 粉末中残留的微量EDTA。 图7. TiO 2 微球的(A、B)TEM图；(C) 动态光散射图；(D) XRD图；(E) 红外光谱图。B中的插图为傅里叶变换图 3.4. TiO 2 微球吸附和洗脱外泌体 一些金属氧化物可以可逆地与磷酸盐基团结合，具有较高的特异性 [ 17 ]。而在外泌体囊泡膜上，磷脂的亲水性磷头暴露在脂质双层的外表面。TiO 2 表面Ti 3+ 具有悬挂键，可以与磷酸根形成化学键合。利用这一特性，TiO 2 可有效捕获外泌体，并进行富集。 碱性溶剂(pH 10~12)通常被用来破坏磷酸基团和TiO 2 之间的结合作用 [ 21 ]。在碱性溶液中，TiO 2 微球表面带负电，与磷酸根带相同电荷，产生电荷互斥，外泌体从TiO 2 微球表面脱落，但溶液pH过高时，会导致膜上的通道蛋白、转运蛋白以及信号通路蛋白等组分失去正常功能，使外泌体膜失去选择性透过功能，发生不可逆破坏。因此实验采用10% NH 3 ·H 2 O洗脱吸附在TiO 2 微球表面的外泌体。 利用TiO 2 微球对外泌体进行分离，经过一系列前处理之后，利用透射电镜观察在80 kV下TiO 2 微球对外泌体吸附情况，表征结果如图8所示。从图8(A)和图8(B)中可以看出外泌体成功的被吸附在TiO 2 微球的表面，透射电镜下被吸附的外泌体呈球形或扁球状，膜状结构明显。然后使用10% NH 3 ·H 2 O作为洗脱液洗脱外泌体，溶液进行一系列前处理后进行透射电镜表征(图8(C))，可以观察到粒径约80~100 nm、呈球形或扁球形、单分散的外泌体，且膜结构完整。采用纳米粒度及Zeta电位分析仪(LitesizerTM 500)对外泌体的粒径分布进行表征，结果图8(D)所示，外泌体粒径分布约为80~280 nm左右。 图8. (A、B)外泌体吸附在TiO 2 表面和(C)单独外泌体的TEM图；(D) 外泌体的动态光散射图