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user: 4. 讨论与结论 4.1. 海藻糖对低温胁迫下长春花幼苗生理生化的影响 低温胁迫反应到植物体上有许多可见的变化即植株的表型变化，是环境因素干扰的最直观表现。随着低温胁迫时间的延长，植物叶片有萎蔫、生长迟缓、黄化等直观的现象 [ 12 ]。在本实验中，长春花幼苗在低温胁迫下，呈现出了叶片萎蔫植株矮小等明显的胁迫症状，外加海藻糖后有一定程度的恢复。说明在表型变化上直观反应了海藻糖可缓解低温胁迫带来的伤害。 植物叶绿体对低温胁迫高度敏感，进而会抑制光合作用及其碳代谢，从超微结构来看这是由于低温损伤细胞器的结构，而且还会改变色素和叶绿体中的代谢物浓度以及气孔调节 [ 13 ]。越来越多的证据表明，叶绿体可以感知外部刺激并迅速响应外部压力，根据外部胁迫信号并调节与胁迫相关核基因的表达以适应不利的环境条件 [ 14 ]。低温条件下，光合速率被严重负影响。低温条件下番木瓜(Carica papaya L.)叶片中总糖和可溶性蛋白质含量增加，可能是由于低温诱导的渗透胁迫所致 [ 15 ]。前人研究结果均发现温度降低会导植物叶片中叶绿素缺失甚至导致植物中叶绿体的结构被破坏，光合能力削弱。本研究中对长春花幼苗的生长表型的观察和光合色素含量测量，发现在低温胁迫下，长春花幼苗长势较差，叶片发黄萎蔫，光合色素含量都降低，严重影响其正常的生长发育，与前人研究结果一致。然而外源施加海藻糖后，长春花叶片中叶绿素含量显著上升，说明含海藻糖能够有效缓解低温胁迫对长春花幼苗叶绿素与光合作用带来的这种负面影响，促进其生理机能。 丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的分解产物，MDA容易与植物体和细胞内的各类蛋白质结合，通过破坏蛋白质的活性，从而破坏膜的结构，因此MDA通常可以作为膜受损程度的指标参数。前人研究发现温度降低与丙二醛含量增高呈现正相关光系。低温(LT)和低辐射(LI)是对植物造成极大危害的常见因素。本研究旨在阐明LT和LI及其恢复对草莓幼苗光合机构、PSII光抑制和活性氧代谢的影响。结果表明，在LI、LT和复合胁迫下，草莓生长缓慢甚至停止，过氧化氢和丙二醛含量增加 [ 16 ]。另有研究发现低温胁迫损伤了羊草的生长和光合色素，提高了其丙二醛(MDA)、渗透压和酶抗氧化物的积累 [ 17 ]。在本研究中，低温胁迫中长春花幼苗叶片的MDA含量显著增加，但外源添加不同浓度海藻糖溶液后，MDA含量显著降低，实验结果证明海藻糖能显著降低低温胁迫对细胞膜脂过氧化程度，缓解低温胁迫对长春花幼苗叶片的伤害。 4.2. 海藻糖对低温胁迫下长春花幼苗保护性酶活性的影响 SOD、POD和CAT是一类可以有效清除植物体内活性氧的酶促系统，可反映出植物体内生理代谢状况 [ 18 ]。在低温胁迫和恢复条件下，研究了施硒对两个草莓品种Akihime和Benihoppe的影响，测定了抗氧化酶活性变化，发现随着低温胁迫时间的延长，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活性显著降低 [ 19 ]。对番茄(Lycopersicon esculentum)进行低温胁迫处理，发现低温胁迫显著降低叶片中SOD、CAT、POD和APX活性，抑制番茄植株的生长 [ 20 ]。在对西瓜氧化代谢的影响研究中发现，低温胁迫导致：i) 地上部重量降低；ii) H 2 O 2 的积累；iii) SOD活性降低；iv) 与H 2 O 2 解毒相关的酶活性降低 [ 21 ]。以玉米杂交种335为材料，发现低温胁迫显著降低了SOD、POD、CAT、GR等抗氧化酶活性，增加GSH、脯氨酸等非酶抗氧化物的含量，诱导一氧化氮(NO)的积累。NO清除c-PTIO和NOS抑制剂L-NAME降低，但NO供体SNP增加CAT和POD酶活性及脯氨酸含量，表明NO介导了EBR诱导的抗氧化能力。说明LT应答基因受NO调控通过调节抗氧化能力和LT反应基因的表达，参与了EBR诱导的玉米胚LT耐受 [ 22 ]。为了解低温处理(LTC，12℃处理3d)提高猕猴桃(Actinidia chinensis)抗寒性的机制，研究结果发现低温胁迫下丙二醛、超氧自由基和过氧化氢的显著积累和膜透性的增加，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的活性显著降低。处理还保持了较高的内源脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)和玉米素核苷(ZR)水平，较低的赤霉素(GA(3))水平和较高的ABA/GA(3)和ABA/IAA比值 [ 23 ]。烟草(Nicotiana tabacum)和黑麦(Secale cereale)在低温下表现出不同的抗氧化防御策略。烟草植株通过提高SOD、APX和CAT的活性，对低温硬化过程中的氧化损伤起到保护作用。由于SOD活性在细胞内的均匀分布，维持了SOD、APX和CAT的组成活性，并且可能由于非酶抗氧化剂的积累，冬黑麦植株能够避免在硬化过程中产生氧化应激 [ 24 ]。与前人研究结果一致，在本研究中，LT处理后，抗氧化酶的活性显著降低；外源添加不同浓度的海藻糖后，抗氧化酶的活性显著增强，海藻糖可以提高低温胁迫下长春花幼苗的抗氧化活性，缓解低温处理所带来的抑制作用。 4.3. 海藻糖对低温胁迫下长春花幼苗初生代谢的影响 植物代谢组学的研究包括分析各种具有不同物理性质的化学物质，从离子无机化合物到生物化学衍生的亲水性碳水化合物、有机酸和氨基酸，以及一系列疏水性脂质相关化合物。这种复杂性给当前植物代谢组学研究中所采用的分析技术带来了巨大的挑战，需要强有力的分析工具来分离和表征生物样品基质中存在的这种极高的化合物多样性。利用质谱(MS)分析平台来分析胁迫反应的代谢物，使一些植物能够适应不利的环境条件，是当前植物生物技术研究项目中理解和开发耐胁迫植物的基础 [ 25 ]。植物应对寒冷的反应是增加糖、有机酸、胺和具有冰点降低、低温保护和抗氧化特性的特殊代谢物的浓度 [ 26 ]。在对茶树(Camellia sinensis L.)的低温胁迫实验中，采用气GC-MS和多变量分析方法，发现茶树对不同程度低温胁迫响应有所不同，并能以不同的方式改变自身的代谢途径。这可能有助于从代谢水平上了解茶树抗寒机理，为今后研究冬性茶多酚(DP)和茶多酚(OA)在茶树体内的基因和蛋白表达提供依据 [ 27 ]。紫罗勒(Ocimumbasilicum)是罗勒的重要形态变种之一，通过GC/MS测定挥发油成分，并用HPLC测定三种重要酚酸含量(mg/kg)。在较低温度下芳樟醇含量较高。在两种温度条件下，控制CO 2 浓度(400 ppm)苯丙酸总含量最高，并呈规律性下降，迷迭香酸和咖啡酸产量的最高数据是在较低的温度下获得的，而二氧化碳浓度没有规律的趋势 [ 28 ]。在对矮牵牛(Petunia hybrida)低温栽培实验中通过GC-MS/MS测定，数据显示了三个连续的低温反应阶段。最初几天的特点是糖的大量积累，特别是在源叶中，同一组织中的基因优先上调，茎尖的几个基因下调，特别是那些参与非生物胁迫反应的基因。中期阶段的特点是碳水化合物水平和基因表达的部分正常化。冷暴露3周后，建立了一个新的稳定平衡。茎尖己糖含量降低，茎尖与叶之间的糖含量比值降低，顶端蔗糖/己糖比值升高，与细胞壁转化酶活性和表达降低有关，表明长时间低温诱导源叶糖积累，而减少糖向和的转运降低了茎中蔗糖的利用率 [ 29 ]。说明糖类化合物代谢在植物应对低温胁迫中起着重要作用。本研究发现糖类化合物半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、蔗糖在低温处理后含量显著降低，与前人研究一致有研究采用GC-MS分析发现，低温上调了蔗糖代谢、糖酵解、糖异生、发酵和GABA分流等一级代谢相关基因，导致蔗糖和苹果酸、柠檬酸、酮戊二酸等有机酸含量下降，己糖和GABA积在不同温度条件下(以播种期为基础)生长的花生基因型中分析了各种代谢物 [ 30 ]。用GC-MS对叶片组织进行非靶向代谢组学分析，用HPLC (多胺)和UPLC-MS/MS (酚类)另有实验对pegging和pod灌浆期的代谢产物进行靶向分析。低温胁迫下腐胺的积累量较高 [ 31 ]。本研究中也证明低温胁迫后腐胺含量显著增高，而低温胁迫外加海藻糖后腐胺含量显著降低，说明海藻糖可能通过调控腐胺代谢来缓解低温胁迫带来的伤害。石莼(Ulva lactuca)是一种具有药用和食用潜力的海洋大型藻类，采用GC-MS分析了多产链霉菌在温度胁迫下的代谢变化，共鉴定出67种化合物。PCA和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结果表明，而低温胁迫下有9种和6种代谢物水平分别显著升高和降低。三羧酸循环和淀粉/蔗糖、酪氨酸和精氨酸/脯氨酸代谢参与低温胁迫反应 [ 32 ]。与前人研究有相似，亦有不同。本研究通过对差异化合物进行代谢途径富集分析发现半乳糖代谢、硫代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、柠檬酸循环和果糖和甘露糖代谢是6条受影响最严重的代谢途径。证明了不同植物在应对低温胁迫时所形成的代谢调控是有差异的，根本原因是基因水平的差异导致物种差异进而导致应对低温胁迫所形成的生活史策略不用，这恰恰也验证了物种间的统一性与差异性。 4.4. 海藻糖对低温胁迫下长春花幼苗关键酶基因表达的影响 酚类化合物由于其氧化还原特性而在植物驱动的抗氧化剂活性中起着重要作用，酚类物质是植物中广泛分布的次生植物代谢物的一大类 [ 33 ]。低温诱导黄瓜(Cucumis sativus)叶片CaPAL基因的表达和酶活性。AOPP处理的幼苗CaPAL活性较低，酚类和黄酮类物质积累较少。低温对黄瓜幼苗造成伤害，AOPP预处理加重了这种伤害 [ 34 ]。在对拟南芥冷敏1-1 (chs1-1)的研究中发现AtCHS1或AtCHL1的过度表达减轻了低温伤害，促进了植物在中等(24℃)和低温(13℃)温度下的生长，表明这两种蛋白质在生长稳态中都起作用。在红叶芥菜(Brassica juncea)的幼苗暴露于低温(8℃) 52 h胁迫处理中，发现低温胁迫后，BjPAL的表达迅速增加 [ 35 ]。低温诱导了欧芹(Petroselinum crispum)花青素的积累，RNA凝胶杂交分析表明，二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)的表达尤其受低温的影响并且苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)和查尔酮合酶基因(CHS)在12℃和25℃时均呈协同表达 [ 36 ]，表明酚类化合物的代谢调控受到低温的显著影响，PcPAL、PcCHS等酚类化合物合成途径的关键酶基因的表达受到低温的显著调控。另有研究发现短期的低温胁迫显著影响上调果沙棘(Hippophaeneurocarpa)试管苗叶片HnPAL、HnC4H和Hn4CL的活性，苯丙烷类代谢被激活，调控黄酮类等次生代谢物质的合成 [ 37 ]。在非生物胁迫的刺激下，苯丙氨酸经过一系列酶催化合成花色素苷，最终通过谷胱甘肽S-转移酶运输到液泡中，参与机体防御。Dong等(2020)通过15℃/5℃昼夜低温处理秋海棠(Begonia grandis)植株发现低温诱导花色素苷含量显著升高，并且对响应低温的差异表达基因进行了验证，结果显示在花色素生物合成途径中关键基因苯丙氨酸解氨酶(BsPAL)、查耳酮合酶(BsCHS)、黄烷酮3-羟化酶(BsF3H)和花青素合酶基因(BsANS)在低温培养条件下显著上调 [ 38 ]。前人的研究结果说明低温胁迫可显著上调酚类化合物合成途径的关键酶基因的表达，这与我们的研究结果一致。我们发现低温胁迫下CrPAL、CrC4H、CrICS、CrCM、CrDXR和CrOMT基因表达均显著上调，外加海藻糖后这些基因的表达显著下调恢复到CK组的表达量。说明海藻糖在基因层面缓解低温对长春花带来的伤害。 长春花中生物碱代谢受到多条代谢途径与多种转录因子的调控。大量研究表明，在低温胁迫中，CBFs显著上调可以有效调控表达的功能基因有COR、DHN (脱水蛋白)、RD (响应脱水)和LTI (低温诱导)等，通过调控这些基因的表达可提高植物抵御低温的能力 [ 14 ]。虽然目前对长春花生物碱途径关键酶基因在低温胁迫下的具体变化研究甚少，但是先前的研究足以表明生物碱途径受到低温生理因素的影响。本研究通过测定生物碱代谢途径关键酶基因的表达情况发现，该途径的上游途径在低温胁迫后显著上调，外加海藻糖后显著下调。与前人研究结果一致，生物碱与低温胁迫正相关，低温胁迫会促进生物碱的积累。 低温胁迫显著抑制长春花幼苗的生长发育，降低了长春花幼苗叶片叶绿素的含量与保护性酶的活性，提高了MDA的含量；低温胁迫后施加不同浓度的海藻糖，SOD、POD、APX和CAT活性呈现先升高后降低趋势，MDA含量显著降低；并且5 mmol/L海藻糖浓度效果最佳。GC-MS及PLA-SD分析从59种初生代谢产物中发现23种化合物具有显著差异。糖类化合物(如甘露糖)以及一些抗逆物质(如尸胺、硅烷)在低温处理后明显积累，而外源添加海藻糖后其含量显著下降。有机酸类化合物像丙酸、苹果酸、没食子酸等却表现出相反的趋势。说明海藻糖通过调控一些糖类、有机酸和抗逆性等初生代谢物来减少低温带来的伤害。根据长春花已知酚类代谢途径选取4个酶基因(CrPAL、CrC4H、CrDXR和CrOMT)和生物碱代谢途径选取4个关键酶基因(CrTDC、CrSTR、CrLAMT和CrGES)这些关键酶基因在低温胁迫后均显著上调，外加海藻糖后显著下调。UPLC-MS测定长春花叶片中6种生物碱发现，文多灵、长春质检、色胺、马钱苷、长春碱和它波宁在低温处理后显著上升，外加海藻糖后含量均显著下降。说明海藻糖的调控作用也会通过长春花的次生代谢途径缓解低温带来的胁迫。