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user: 2. 方法和分析 HS 3 D (Homo Sapiens Splice Sites Dataset) [ 7 ] 是意大利Pollastro从GeneBank DNA序列数据库中提取的基因剪接位点序列数据集，数据集中的每个条目记录剪切位点从上游到下游总长为140个字符的DNA序列数据，剪接符均遵从GT-AG规则，GT位于位点71到72，AG位于位点69到70。数据集分为四个部分：真EI (exon to intron)、假EI、真IE (intron to exon)和假IE，真EI和真IE记录的数据条目数相对较少，分别为2796和2880个，而假EI和假IE数据条目数相对极多，分别为271，928和329，360个。为了观察真假剪切位点临近序列的差异，本研究依据HS 3 D数据集中的数据，对140个位点真、假EI和IE (的四种碱基(A、T、C、G)出现频率进行了比较，分别如图2、图3所示。其中横坐标代表临近序列位置，纵坐标表示某位置的真(左)、假(右) EI、IE碱基A (红)、T (绿)、C (蓝)或G (黄)出现频率(0到1之间)。从图2、图3中可以观察到，总体来说，从剪接点上游位点到下游位点，真剪接位点临近序列的碱基呈现随位置变化的出现频率，特别在剪接特征符左右十个位置(统计数据见表1)，而假的除特征符GT和AG左右一两个位置以外，在其余位点呈现近似接近的碱基出现频率。真EI序列在剪接位点的一致序列 图1. 真核基因的结构、转录和剪接 Table 1 The base frequency comparison in sites from −10 to 10 between true splicing sequences and false splicing sequence 位置 真EI 假EI 真IE 假IE A T C G A T C G A T C G A T C G −10 0.24 0.21 0.27 0.28 0.25 0.26 0.23 0.26 0.08 0.43 0.37 0.12 0.24 0.28 0.25 0.23 −9 0.27 0.18 0.26 0.28 0.26 0.27 0.23 0.24 0.07 0.48 0.34 0.11 0.25 0.28 0.24 0.23 −8 0.23 0.22 0.28 0.26 0.27 0.26 0.23 0.23 0.08 0.44 0.38 0.11 0.24 0.28 0.23 0.24 −7 0.24 0.21 0.28 0.26 0.26 0.27 0.24 0.23 0.07 0.43 0.39 0.11 0.25 0.28 0.23 0.24 −6 0.27 0.19 0.27 0.27 0.27 0.26 0.23 0.24 0.09 0.38 0.41 0.12 0.26 0.28 0.22 0.24 −5 0.26 0.23 0.27 0.24 0.27 0.27 0.25 0.21 0.09 0.39 0.42 0.09 0.25 0.28 0.23 0.24 −4 0.27 0.18 0.30 0.26 0.25 0.26 0.27 0.22 0.06 0.40 0.47 0.07 0.24 0.29 0.24 0.23 −3 0.33 0.11 0.36 0.19 0.26 0.26 0.24 0.23 0.07 0.47 0.39 0.07 0.22 0.29 0.26 0.22 −2 0.58 0.14 0.14 0.14 0.29 0.24 0.25 0.22 0.21 0.22 0.35 0.23 0.24 0.27 0.24 0.24 −1 0.09 0.07 0.03 0.81 0.31 0.34 0.08 0.27 0.04 0.19 0.76 0.01 0.26 0.17 0.34 0.23 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 1 0.47 0.03 0.03 0.47 0.19 0.26 0.21 0.34 0.23 0.09 0.14 0.54 0.27 0.22 0.23 0.29 2 0.70 0.08 0.08 0.13 0.25 0.30 0.22 0.23 0.23 0.32 0.21 0.24 0.28 0.24 0.24 0.23 3 0.06 0.05 0.05 0.83 0.24 0.28 0.25 0.23 0.22 0.24 0.28 0.25 0.28 0.26 0.22 0.24 4 0.15 0.44 0.18 0.23 0.25 0.29 0.23 0.23 0.22 0.24 0.30 0.24 0.26 0.26 0.23 0.25 5 0.26 0.16 0.21 0.37 0.25 0.26 0.23 0.26 0.25 0.24 0.29 0.22 0.26 0.26 0.21 0.26 6 0.20 0.23 0.28 0.29 0.25 0.29 0.23 0.24 0.22 0.23 0.30 0.25 0.26 0.25 0.22 0.27 7 0.19 0.22 0.32 0.28 0.26 0.27 0.23 0.25 0.25 0.22 0.26 0.28 0.26 0.25 0.22 0.27 8 0.18 0.22 0.27 0.33 0.25 0.28 0.22 0.25 0.24 0.22 0.29 0.25 0.26 0.27 0.22 0.25 9 0.20 0.20 0.29 0.31 0.25 0.28 0.24 0.24 0.24 0.23 0.26 0.27 0.26 0.26 0.22 0.26 10 0.19 0.22 0.28 0.31 0.25 0.29 0.22 0.23 0.24 0.21 0.27 0.29 0.26 0.26 0.23 0.25 表1. 真、假剪切位点序列−10到10各碱基出现频率比较 图2. 真、假EI剪接位点临近序列碱基统计频率比较 图3. 真、假IE剪接位点临近序列碱基出现频率比较 是MAG GT RAG (M: A/C， R: A/G)真IE序列在剪接位点的一致序列是YYNC AG RN (Y: T/C， N: A/T/C/G)。 参考真EI、IE数据集，本研究对以剪切位特征符(GT、AG)为中心的碱基六聚体出现百分频率进行了统计，若总频率为1，则真EI和真IE频度靠前的六聚体EI、IE数据集中真剪接位点多聚体出现频率数据分别如表2和表3所示，这些六联体总频度占真EI和真IE数据集中样本量的绝大多数，分别为82.53% Table 2 The top 24 frequency statistic of 6-mer base close to splicing sites in true EI datase 真EI六聚体出现频率统计 序号 六聚体 出现频率 序号 六聚体 出现频率 序号 六聚体 出现频率 1 5'-AGGTGA-3' 0.1516 9 5'-AGGTAC-3' 0.0393 17 5'-AAGTGA-3' 0.0132 2 5'-AGGTAA-3' 0.1195 10 5'-GGGTAA-3' 0.0368 18 5'-AAGTAA-3' 0.0129 3 5'-TGGTGA-3' 0.0497 11 5'-AGGTAT-3' 0.0315 19 5'-CAGTGA-3' 0.0129 4 5'-AGGTAG-3' 0.0490 12 5'-AGGTGC-3' 0.0190 20 5'-CTGTGA-3' 0.0125 5 5'-AGGTGG-3' 0.0476 13 5'-AGGTCA-3' 0.0154 21 5'-AGGTGT-3' 0.0104 6 5'-GGGTGA-3' 0.0465 14 5'-CTGTAA-3' 0.0154 22 5'-ATGTAA-3' 0.0097 7 5'-CGGTGA-3' 0.0454 15 5'-CGGTAA-3' 0.0143 23 5'-CAGTAA-3' 0.0097 8 5'-TGGTAA-3' 0.0401 16 5'-ATGTGA-3' 0.0136 24 5'-TGGTAT-3' 0.0093 表2. 真EI剪接位点六聚体碱基出现频率统计(前24个) Table 3 The top 63 frequency statistic of 6-mer close to splicing sites in true IE datase 真IE六聚体出现频率统计 序号 六聚体 出现频率 序号 六聚体 出现频率 序号 六聚体 出现频率 1 5'-CCAGGT-3' 0.0469 22 5'-CTAGGT-3' 0.0128 43 5'-ATAGGA-3' 0.0073 2 5'-CCAGGC-3' 0.0410 23 5'-GCAGAC-3' 0.0128 44 5'-TCAGAG-3' 0.0073 3 5'-CCAGGG-3' 0.0392 24 5'-GCAGGC-3' 0.0128 45 5'-TCAGCT-3' 0.0073 4 5'-CCAGGA-3' 0.0313 25 5'-GCAGCT-3' 0.0125 46 5'-GCAGCA-3' 0.0073 5 5'-GCAGGT-3' 0.0281 26 5'-ACAGAT-3' 0.0118 47 5'-ATAGGT-3' 0.0069 6 5'-ACAGGT-3' 0.0271 27 5'-TCAGAT-3' 0.0115 48 5'-CTAGGC-3' 0.0069 7 5'-TCAGGA-3' 0.0229 28 5'-TCAGGC-3' 0.0115 49 5'-CCAGTG-3' 0.0069 8 5'-GCAGGG-3' 0.0226 29 5'-GCAGAA-3' 0.0115 50 5'-CCAGAA-3' 0.0066 9 5'-TCAGGT-3' 0.0212 30 5'-TTAGGA-3' 0.0108 51 5'-TCAGTG-3' 0.0063 10 5'-TCAGGG-3' 0.0208 31 5'-ACAGAA-3' 0.0101 52 5'-CTAGAA-3' 0.0063 11 5'-ACAGGG-3' 0.0205 32 5'-ACAGCC-3' 0.0097 53 5'-ACAGTG-3' 0.0059 12 5'-GCAGGA-3' 0.0205 33 5'-CCAGCC-3' 0.0097 54 5'-CCAGCA-3' 0.0059 13 5'-CCAGAG-3' 0.0177 34 5'-ACAGCT-3' 0.0094 55 5'-ATAGGG-3' 0.0056 14 5'-ACAGGA-3' 0.0174 35 5'-TTAGGT-3' 0.0094 56 5'-TTAGAT-3' 0.0056 15 5'-CCAGAC-3' 0.0160 36 5'-GCAGCC-3' 0.0094 57 5'-TTAGGC-3' 0.0056 16 5'-CCAGCT-3' 0.0160 37 5'-TCAGAA-3' 0.0090 58 5'-TCAGCC-3' 0.0056 17 5'-GCAGAG-3' 0.0153 38 5'-TCAGAC-3' 0.0083 59 5'-CTAGGG-3' 0.0056 18 5'-ACAGGC-3' 0.0149 39 5'-ACAGAG-3' 0.0080 60 5'-CCAGTT-3' 0.0056 19 5'-CCAGAT-3' 0.0146 40 5'-TTAGGG-3' 0.0076 61 5'-GTAGGA-3' 0.0056 20 5'-GCAGAT-3' 0.0146 41 5'-GCAGTT-3' 0.0076 62 5'-ACAGAC-3' 0.0049 21 5'-CTAGGA-3' 0.0142 42 5'-GCAGTG-3' 0.0076 63 5'-ACAGTT-3' 0.0049 表3. 真IE剪接位点六聚体出现频率统计(前63个) 和82.65%。统计发现，剪切位特征符左右各有两个碱基核苷酸，应有4的4次方(256)中可能性，数据集中真，EI和IE剪接六聚体至少出现一次分别占118和181种可能性，而假EI和IE剪接六聚体覆盖所有的256种可能性，反映剪接位点临近序列的特异性。本研究依次对EI、IE数据集中真、假剪接位点多聚体重合度统计，包括6聚体、8聚体(4096种可能性，特征符前三后三)、10聚体(65，536种可能性，特征符前四后四)、12聚体(1，048，576种可能性，特征符前五后五)和14聚体(16，777，216种可能性，特征符前六后六)，如图4所示。图中反映6聚体、8聚体和12聚体，真假剪接聚体的重合度很高(重合是指，某个位于剪接位点的多聚体，若真、假数据集中都至少出现1例，则该聚体重合)，若依此聚体序列为特征进行识别会导致极高的错误率，而14聚体以上真、假聚体序列的重合度大幅度下降，特异性显著增强，有利于以此为特征进行训练和进行真剪接位点识别判断。 那么总长相同的聚体，不同的选取方式，会对重叠率有什么影响呢？本研究做了一个实验，这些多聚体总长相同，但在剪接特征符GT或AG前后选取的核苷酸数目不同，然后统计真、假多聚体的重叠率，结果如表4所示，其中示例EI和IE数据集中真、假剪接位点前五后五模式多聚体分布比较分别如图5和图6所示。十二聚体中，选取方式前6后4 (前6 GT后4)在EI真、假数据集中获得最低的重叠率，前2后8 (前2 AG后8)在IE真、假数据集中获得最低的重叠率。十四聚体中，选取方式前8后4 (前8 GT后4)在EI真、假数据集中获得最低的重叠率，前3后9 (前3 AG后9)在IE真、假数据集中获得最低的重叠率。获得最低重叠率的十二聚体位置与十四聚体接近，但十二聚体重叠率远高于十四聚体，如果以十二聚体作为特征进行真、假剪接位点识别，虽然特征碱基数目少、速度快，但会产生过高的错误率，因此真假剪接位点识别训练应选择十四聚体以上作为特征模式。 Table 4 The overlap rate comparison between true and false dataset of 12-mer and 14-mer close to splicing sites by different selection method 选取方式 EI重叠率 IE重叠率 十二聚体 前1后9 35.59% 39.12% 前2后8 36.10% 38.01% 前3后7 35.01% 41.58% 前4后6 34.90% 43.29% 前5后5 34.81% 45.61% 前6后4 34.31% 48.68% 前7后3 36.82% 48.59% 前8后2 35.11% 52.12% 前9后1 37.94% 54.75% 十四聚体 前1后11 5.54% 5.92% 前2后10 4.99% 5.04% 前3后9 5.08% 5.00% 前4后8 4.99% 5.93% 前5后7 4.49% 6.73% 前6后6 4.42% 6.85% 前7后5 4.70% 6.60% 前8后4 4.21% 6.98% 前9后3 4.77% 7.81% 前10后2 5.30% 8.70% 前11后1 5.67% 10.55% 表4. 剪接临近十二和十四聚体在不同选取方式下真、假数据集的重叠率比较 图4. EI、IE数据集中真、假剪接位点多聚体重合度统计 图5. EI数据集中真、假剪接位点GT前五后五模式多聚体分布比较 图6. IE数据集中真、假剪接位点AG前五后五模式多聚体分布比较