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user: 3. 结果与分析 3.1. SCAR和CAPS引物适用性验证 已有的研究报道 [ 5 ] [ 9 ] [ 10 ] 认为CRF-SCAR、3336-last2-SCAR、120K-end-SCAR为显性标记，在恢复系材料中分别能扩增出890 bp、1639 bp和1026 bp特异带；Co1Mod1-CAPS为共显性标记 [ 10 ] ，在辣椒中扩增特异片段长度为1177 bp，恢复系特异扩增片段经Bgl II限制性内切酶酶切后可产生601 bp和576 bp两条片段。根据2016年Jo等 [ 10 ] 的遗传连锁图谱和物理图谱结果，Rf基因定位于一个821 kb的区间，其中3336-last2-SCAR、120K-end-SCAR和Co1Mod1-CAPS与Rf候选基因的物理距离分别为246 kb、32 kb和2 kb。 将SCAR和CAPS引物对已知育性的16份辣椒材料进行引物适用性验证(图1)，结果发现在不育系(CMS line)和保持系(Maintainer line)中CRF-SCAR、3336-last2-SCAR、120K-end-SCAR均无恢复系特异性条带，而在恢复系(Restores line)中均含有恢复系特异性条带；Co1Mod1-CAPS引物经PCR扩增和Bgl II限制性内切酶酶切后在恢复系中可产生恢复系特异性带型。说明这4对引物在鉴定是否含有恢复基因的辣椒材料中具有较强的一致性。 Table 2 Information of SCAR and CAPS primer 引物名称 引物序列(5’-3’) 参考文献 3336-last2-SCAR F: CATCGAACTGATACGGAAGGAC R: TAACACTACTTGGGGAAAGCG [ 9 ] 120K-end-SCAR F: TAAAAAAATAGCGGGGGGTAAG R: CCACTTGTCTTGAAGCACTC [ 9 ] Co1Mod1-CAPS F: CCACCCCAAACGTAAGGGATC R: CAACTTAGCCAATACAATCCCAC [ 9 ] CRF-SCAR F: GTACACACCACTCGTCGCTCCT R: TTCTTGGGTCCCTTTCTTCCAA [ 10 ] 表2. SCAR引物和CAPS引物信息 3.2. SCAR和CAPS标记辅助筛选辣椒恢复系材料 上述结果显示，这4对引物在已知育性的辣椒材料中表现了较强的一致性。因此，利用这些引物对112份未知恢复基因辣椒材料开展恢复系筛选。CRF-SCAR检测结果显示，55份辣椒材料含有恢复基因，见图2；3336-last2-SCAR检测结果显示，56份辣椒材料含有恢复基因，见图3；120K-end-SCAR检测结果显示，58份辣椒材料含有恢复基因，见图4；Co1Mod1-CAPS引物经PCR扩增和Bgl II限制性内切酶酶切后显示，57份辣椒材料含有恢复基因，其中有22份为纯合恢复基因位点的材料，见图5。 将以上PCR检测结果进行整合与分析(见表3)，4对引物检测结果中，有104份辣椒材料在这4对标记中的检测结果一致，占比92.86%，仅有8份材料的结果不一致，占比7.14%。8份检查结果不一致的材料编号分别为C132、C174、C179、C180、C210、C210-1、C220和C414，其中C132和C174仅在120K-end-SCAR标记中出现不一致；C179、C180、C210、C210-1和C414在CRF-SCAR标记中出现不一致；C85在Co1Mod1-CAPS标记中出现不一致。不同标记之间检查结果的差异可能是由于不同的标记与Rf基因遗传连锁关系强弱导致。检查的结果表明，联用三对显性SCAR标记和一对共显性CAPS标记检测结果仍具有较高的一致性，其检测方便、重复性好、实验成本低，并且能区别恢复基因的杂合度，因此具有广泛的实用性。 图1. SCAR和CAPS分子标记检测结果 图2. CRF-SCAR引物检测结果 图3. 3336-last2-SCAR引物检测结果 图4. 120K-end-SCAR引物检测结果 图5. Co1Mod1-CAPS引物检测结果 Table 3 The test results of four molecular marke 实验编号 A B C D 实验编号 A B C D 实验编号 A B C D 1 r r r rr 39 r r r rr 76 R R R Rr 2 r r r rr 40 r r r rr 77 R R R RR 3 r r r rr 41 r r r rr 78 R r r rr 4 r r r rr 42 r r r rr 79 R r r rr 5 r r r rr 43 r r r rr 80 r r r rr 6 r r r rr 44 R R R Rr 81 R R R RR 7 R R R RR 45 r r r rr 82 R R R Rr 8 R R R Rr 46 R R R Rr 83 R R R Rr 9 R R R Rr 47 r r r rr 84 R R R Rr 10 R R R RR 48 r r r rr 85 r r r Rr 11 R R R RR 49 r r r rr 86 R R R RR 12 R R R RR 50 r r r rr 87 r r r rr 13 R R R RR 51 R R R Rr 88 r r r rr 14 R R R RR 52 R R r Rr 89 R R R Rr 15 R R R RR 53 R R R Rr 90 R R R RR 16 R R R RR 54 r r r rr 91 r r r rr 17 r r r rr 55 R R R Rr 92 R R R RR 18 r r r rr 56 R R R Rr 93 r r r rr 19 R R r Rr 57 r R R Rr 94 r r r rr 20 R R R Rr 58 r R R Rr 95 r r r rr 21 r r r rr 59 R R R Rr 96 r r r rr 22 r r r rr 60 R R R Rr 97 r r r rr 23 R R R RR 61 R R R Rr 98 r r r rr 24 R R R Rr 62 R R R Rr 99 r r r rr 25 R R R RR 63 r r r rr 100 r r r rr 26 R R R RR 64 r r r rr 101 r r r rr 27 R R R RR 65 r r r rr 102 R R R Rr 28 r r r rr 66 r r r rr 103 r R R Rr 29 R R R RR 67 R R R Rr 104 r r r rr 30 R R R RR 68 R R R Rr 105 R R R Rr 31 R R R Rr 69 r r r rr 106 R R R Rr 32 r r r rr 70 r r r rr 107 r r r rr 33 r r r rr 71 r r r rr 108 r r r rr 34 R R R RR 72 r r r rr 109 R R R Rr 35 r r r rr 73 R R R RR 110 R R R Rr 36 r r r rr 74 r r r rr 111 R R R Rr 37 r r r rr 75 R R R RR 112 R R R Rr 38 r r r rr 表3. 4对分子标记引物检测结果 注：R为显性Rf基因缩写；r为隐形rf基因缩写。A、B、C和D对应编号分别为CRF-SCAR、3336-last2-SCAR、120K-end-SCAR和Co1Mod1-CAPS引物。 Table 4 Four molecular markers detection result in the 104 pepper material 园艺学类型 检测总数 含恢复基因数及比例 Co1Mod1-CAPS检测结果 RfRf Rfrf 羊角椒 46 21 (20.19%) 16 5 炮椒 19 14 (13.46%) 3 11 线椒 12 7 (6.73%) 2 5 牛角椒 18 5 (4.81%) 0 5 朝天椒 3 3 (2.88%) 2 1 螺丝椒 2 1 (0.96%) 0 1 甜椒 4 0 (0%) 0 0 总数 104 51 (49.04%) 22 29 表4. 4对分子标记在104份材料中的鉴定结果 3.3. 恢复基因与辣椒园艺学性状关联分析 综合表2和表3辣椒园艺学性状和恢复基因筛选结果，4对引物检测结果一致的104份辣椒材料中有51份含有恢复基因，占比49.04%。Co1Mod1-CAPS检测结果表明，22份为纯合恢复基因辣椒材料。羊角椒、炮椒、线椒、牛角椒、朝天椒、螺丝椒和甜椒有恢复基因的材料所占数量和比例分别为21 (20.19%)、14 (13.46%)、7 (6.73%)、5 (4.81%)、3 (2.88%)、1 (0.96%)和0 (0%) (表4)。说明恢复基因在短果形的羊角椒和小果形炮椒中均有较高分布。先前的研究表明 [ 5 ] [ 11 ] ，小果型辣椒较为原始，不育恢复基因在相对原始的类型中分别较多，本研究结果与前人的结果基本一致。但随着辣椒的近缘种杂交及人工选育，不育恢复基因出现了向多种类型分布扩大的趋势。