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user: 2. 方法和材料 2.1. 数据来源 我们的数据主要分为四个部分：第一部分是来自Lestyn Whitehouse等人测出的在WT和ISW2两种情况下两组核小体占位率数据 [ 17 ] (Shivaswan S. et al.， 2007)。第二部分是来自Noam Kaplan等人实验合成的酿酒酵母体外核小体定位数据(YPD) [ 18 ] (Kaplan N. et al.， 2009)。第三部分则来自NCBI数据库中的酵母16条染色体DNA编码序列。第四部分为David等人文献中给出的4792个高置信度酵母基因组实验数据(David L. et al.， 2006)，其中包括了转录起始位点(TSS)座标。 2.2. 数据处理 2.2.1. 数据预处理 YPD这组数据给出了转录起始位置到转录结束位置核小体的占位率数据，我们把没有占位率数据的位置设置为0 [ 19 ] 。WT和ISW2两种情况下核小体占位率的数据为每隔4 bp测量一次的数据，我们把没有测得数据的位置设置为0。按照16条染色体的长度设置三组16个空矩阵，将WT、ISW2、YPD这三组数据分别放入三组16个空矩阵中，就可以分别得出三组16条染色体上核小体占位率数据。 2.2.2. 对齐处理 以David等人所提供(David L. et al.， 2006)的高置信度转录实验数据中给出的4792条基因的TSS为参照坐标，我们分别将上述不同实验平台和实验条件下得到的三组酵母16条染色体核小体实验数据，以4792条基因的TSS为中心，选取上、下游各800 bp数据进行了对齐(考虑到基因的方向性，对于C型基因所对应的数据还要进行镜像反折)，然后将这些数据进行叠加、平均、平滑及归一化处理，得到了以基因TSS对齐的核小体平均占位图谱，如图1所示。 由图可以得出三种情况下核小体位置的变化，如表1所示。 由表1可以看出以WT核小体位置为基准，ISW2缺失情况下核小体位置有变化，ISW2缺失相对于WT的位置是远离TSS的，所以在ISW2缺失的情况下，核小体的位置是远离TSS。YPD情况下相对于WT变化规律不明显，可以观察到在TSS下游YPD相对于WT的位置的远离TSS。而且YPD的占位率明显比另外两种情况要高。 2.2.3. K均值聚类 K均值聚类是先随机选取K个对象作为初始的聚类中心。然后计算每个对象与各个种子聚类中心之间的距离，把每个对象分配给距离它最近的聚类中心。聚类中心以及分配给它们的对象就代表一个聚类。一旦全部对象都被分配了，每个聚类的聚类中心会根据聚类中现有的对象被重新计算。这个过程将不断重复直到满足某个终止条件。 为了更加进一步了解三种情况下的基因的功能，用K均值聚类的方法对对齐后的三种占位率数据进行聚类，经过多次试验结果，聚为20类为最佳聚类，聚类后的20种核小体占位率情况可以分为5大类。第一类：−1核小体不存在；第二类：−1核小体不明显；第三类：+1核小体不明显；第四类：核小体位置不变；第五类：核小体位置不明显。图形如图2所示。 图2中核小体的位置变化以WT和ISW2缺失条件下的核小体位置为基准，核小体的位置移动是YPD相对于WT和ISW2缺失两种情况下核小体位置的变化。将4792个基因名称导入SGD数据库中得到了75种基因功能，为了进一步了解基因的功能，将上述五种情况的基因分别与75种功能的基因进行比对，把相同的基因提取出来，并且计算出相同基因的个数，得出的结果如表2所示。 分析后发现有2种基因功能可能会影响−2，−3，+2，+3核小体形成，这2种基因功能分别为：核糖体的结构成分(structural constituent of ribosome)，磷脂酰肌醇磷酸结合(phosphatidylinositol phosphate binding)。有6种基因功能可能会影响−1核小体的形成，这6种基因功能分别为：mRNA结合(mRNA binding)，泛素蛋白转移酶活性(ubiquitin-protein transferase activity)，ATP酶活性，耦合(ATPase activity， 图1. 三种情况下核小体占位率图谱 图2. 五种情况下核小体的占位率图谱 Table 1 Three kinds of nucleosome center positio −3 −2 −1 +1 +2 +3 +4 WT −552 −390 −215 46 218 379 542 ISW2 −567 −392 −216 47 220 381 554 YPD −580 −385 −218 77 243 405 560 表1. 三种情况下核小体中心位置 Table 2 The same number of genes which compared with five types of genes and seventy-five kinds of gene functio 核小体位置不明显 −1核 小体位置不存在 −1核 小体位置不明显 核小体位置不变 +1核小体位置不明显 核糖体的结构成分 (structural constituent of ribosome) 29 15 5 13 12 磷脂酰肌醇磷酸结合 (phosphatidylinositol phosphate binding) 0 2 3 2 1 mRNA结合 (mRNA binding) 12 12 8 2 4 泛素蛋白转移酶活性 (ubiquitin-protein transferase activity) 3 9 6 1 5 ATP酶活性，耦合 (ATPase activity， coupled) 9 11 5 7 4 S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的活性(S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase activity) 3 6 2 1 3 基底的特异性转运蛋白活性 (substrate-specific transporter activity) 16 21 15 7 12 转运活性 (transporter activity) 19 22 16 7 15 转录因子结合 (transcription factor binding) 1 3 1 3 6 转移酶活性，转移含磷基团 (transferase activity， transferring phosphorus-containing groups) 11 10 15 12 9 转移酶活性，转移酰基 (transferase activity， transferring acyl groups) 6 10 5 10 4 表2. 把五种类型基因与75种基因功能比较有相同基因的个数 coupled)，S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的活性(S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase activity)，基底的特异性转运蛋白活性(substrate-specific transporter activity)，转运活性(transporter activity)。这6种基因功能可能会抑制−1核小体的形成。有3种基因可能会影响+1核小体的形成，这3种基因分别为：转录因子结合(transcription factor binding)，转移酶活性，转移含磷基团(transferase activity， transferring phosphorus-containing groups)，转移酶活性，转移酰基(transferase activity， transferring acyl groups)。其中转录因子结合(transcription factor binding)可能抑制+1核小体的形成，转移酶活性，转移含磷基团(transferase activity， transferring phosphorus-containing groups)和转移酶活性，转移酰基(transferase activity， transferring acyl groups)可能促进+1核小体的形成。 2.2.4. 碱基Logo 我们为了更加深入了解基因的功能，对以上11种基因功能中的9种基因功能的基因分别画出碱基图，对−1核小体有影响的就以WT−1核小体的位置为基准前后各取15 bp共31 bp的碱基画图谱，同理对+1核小体有影响的以WT+1核小体位置为基准前后各取15 bp共31 bp的碱基画图谱。以下图谱仅分析对−1核小体和+1核小体的影响，图谱结果如图3~11所示。 由图3~8可以看出−1核小体周边的碱基以TTT或AAA为多，TTT与AAA的硬度为−0.274属于硬度较强的密码子 [ 20 ] ，一定程度上可能会抑制−1核小体的形成，有的碱基不明显但硬度偏硬的密码子比较多，从而抑制了−1核小体的形成。 图3. mRNA binding碱基Logo图谱 图4. Ubiquitin-protein transferase activity碱基Logo图谱 图5. ATPase activity， coupled碱基Logo图谱 图6. S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase activity碱基Logo图谱 图7. Substrate-specific transporter activity碱基Logo图谱 图8. Transporter activity碱基Logo图谱 图9. Transcription factor binding碱基Logo图谱 图10. Transferase activity， transferring phosphorus-containing groups碱基Logo图谱 图11. Transferase activity， transferring acyl groups碱基Logo图谱 由图9可以看出碱基以A偏多，其中可以明显看到AAA和AAT这两种密码子，AAT的硬度为−0.28，属于硬度最强的密码子，从而抑制了+1核小体的形成。 由图10和图11可以看出，有多种密码子，而且密码子的软硬度不同，以硬度较软的密码子比较多，从而促进+1核小体的形成。