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user: 2. 材料与方法 2.1. 试验材料 供试生物：日本鹌鹑(Coturnixcoturnix japonica)，由佛山市南海区大沥沥丰市场鸡档10号提供，雌雄各半，在实验室中驯养7天。选用35 d鸟龄的试验鸟；试验周期为7 d；在温度为25℃~28℃(>14 d鸟龄)，相对湿度为50%~75%，14 h~16 h光照的试验条件下进行。 意大利工蜂(Apis mellifera L.)由佛山市三水区西南街野山花蜂蜜店提供，试验前在人工气候室内饲养观察24 h，饲养条件为：温度25℃ ± 1℃；相对湿度60%~70%；微光。试验时选用大小一致、健康、活泼的工蜂，试验前饥饿2 h。 家蚕(Bombyx mori L)，选用品种为7湘 × 9芙，由广东省蚕业技术推广中心提供，在温度：25℃ ± 2℃，湿度：70%~85%微光条件下，选择孵化出的1龄蚁蚕开始驯养，至2龄眠起开始试验。 斑马鱼(Brachydanio rerio)，由广州杨氏水族馆提供，体长为24.30 mm/尾~27.63 mm/尾，体重为0.241 g/尾~0.303 g/尾。购回后驯养7 d，水温22℃~23℃；每天喂食2次刚孵化的丰年虫幼体，试验前24 h停止喂食。 赤眼蜂(Trichogramma ostriniae)，从衡水田益生防有限责任公司引进蜂种，待羽化出蜂后以米蛾(Corcyra cephalonica)卵为寄主扩大繁殖。采用继代饲育的新羽化的成虫进行试验。温度25℃ ± 1℃，相对湿度70%~80%，光周期L/D = 14 h/10 h。羽化后48 h内的成蜂用于急性毒性试验。 大型溞(Daphnia magna)由中国疾病预防控制中心提供，实验室自行保种繁育，每日喂食1次绿藻。水温20℃ ± 1℃；光照强度1151-1201lx溶解氧：7.0~8.0 mg·L −1 。试验用溞为同一母体孤雌繁殖3代以上，出生时间为6~4 h健康的幼溞。 供试药剂：8000 IU/微升苏云金杆菌(GDX026)悬浮剂(广东省微生物农药工程技术研究中心)，5%苏云金杆菌·茚虫威悬浮剂(3%茚虫威 + 2%苏云金杆菌GDX026，广东省微生物农药工程技术研究中心) 2.4%甲维·苏云金杆菌悬浮剂(2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 + 0.4%苏云金杆菌GDX026，广东省微生物农药工程技术研究中心)。 仪器：人工气候室、人工气候箱(PYX-300Q-B)、电子天平(精确至0.0001 g)、水质参数测定仪(HACH HQ40d)、pH计(MP511)、试验蜂笼(自制)。 2.2. 试验方法 2.2.1. 鸟类毒性实验 本次试验选用35 d鸟龄的试验鸟；试验周期为7 d；在温度为25℃~28℃，相对湿度为50%~75%，14 h~16 h光照的试验条件下进行。试验用鸟以经口灌注法一次性给予供试药液1 mL/100 g体重。各处理浓度和空白对照均设立1个平行实验，每个平行10只试验鸟，雌雄各半。试验期间，于试验开始后每天观察试验鸟的饮食、外观、行为、排泄物以及试验鸟死亡情况等，并及时取出死鸟。 2.2.2. 蜜蜂经口毒性试验 试验在人工气候室内进行，温试验温度为25℃ ± 2℃，相对湿度为50%~70%，黑暗。用50%的蔗糖水溶解供试药剂，得到系列处理浓度染毒蔗糖水溶液。试验设计1个空白对照组和7个受试物试验组，每组设置3个平行，每个平行10只蜜蜂。将蜜蜂麻醉后分装于试验蜂笼中，每笼10只蜜蜂。先测定饲喂器重量m0，在饲喂器中加入100 μL不同浓度受试物试验溶液，测定总重量m1，然后把饲喂器置于蜂笼中。试验进行至4 h时受试物试验组受试物试验溶液已完全消耗，取出饲喂器，称量其重量m2，换上不含受试物的蔗糖溶液进行饲喂。计算药液的消耗量m3 (m3 = m1 − m2)。空白对照组在饲喂器中加入100 μL 50%蔗糖溶液进行试验。试验期间，于试验开始后48 h观察并记录蜜蜂的异常行为、病理症状和死亡情况。 2.2.3. 蜜蜂接触毒性试验 试验在人工气候室内进行，温试验温度为25℃ ± 2℃，相对湿度为50%~70%，黑暗。供试药剂用2%吐温溶液溶解，得到系列处理浓度染毒吐温水溶液。试验 设计1个空白对照组、1个溶剂对照组和1个受试物试验组，每组设置3个平行，每个平行10只蜜蜂。用氮气把蜜蜂麻醉后，用微量移液器对准蜜蜂中胸背板处，点滴受试物试验溶液2.0 μL，待蜂身晾干后转入试验笼中。其中空白对照组不进行点滴，溶剂对照组点滴2.0 μL 2‰吐温溶液。试验周期48 h，于试验开始后48 h观察并记录蜜蜂的异常行为、病理症状和死亡情况。 2.2.4. 斑马鱼毒性试验 试验用水为过滤曝气的自来水，总硬度为118.40 mg/L(以CaCO 3 计)，pH变化范围为7.70~7.95；温度变化范围为22.0℃~23.3℃；溶解氧含量的变化范围为64%~83%。用试验用水溶解供试药剂，得到系列处理浓度染毒溶液。试验设计1个空白对照组和1个受试物试验组，每组设置3个平行，每个平行10尾试验鱼；以半静态方式(分别在试验24 h、48 h和72 h更换一次试验溶液)进行试验。试验周期96 h，于试验开始后24 h、48 h、72 h和96 h观察记录各容器内的鱼的活动状态和死鱼数，并及时取出死亡鱼。试验期间禁食。 2.2.5. 家蚕毒性试验 试验在温度范围为24.6℃~25.7℃，湿度范围为74.7%~76.9%，微弱光照，16 h光照/8 h黑暗的环境条件下进行。供试药剂用去离子水溶解，得到系列处理浓度的供试溶液。试验设计1个空白对照组和7个受试物试验组，每组设置3个平行，每个平行20头家蚕。受试物试验组：用8 mL不同浓度的受试物溶液浸渍5 g桑叶约10 s，放置在通风处，于塑料纱网上晾干。取约1/4晾干的桑叶饲喂培养皿中的试验家蚕，其余置于4℃环境中保存，并于试验开始后24 h、48 h和72 h进行饲喂。空白对照组：用8 mL去离子水浸渍5 g桑叶约10 s，放置在通风处，于塑料纱网上晾干。取约1/4晾干的桑叶饲喂培养皿中的试验家蚕，其余置于4℃环境中保存，并于试验开始后24 h、48 h和72 h进行饲喂。试验周期96 h，每隔24 h观察并记录家蚕的异常行为、病理症状和死亡情况。 2.2.6. 大型溞毒性试验 试验用水为过滤曝气的自来水，总硬度为105.37 mg/L(以CaCO 3 计)，pH变化范围为7.89~8.21；温度变化范围为20.7℃~21.3℃；溶解氧含量的变化范围为7.0 mg/L~7.9 mg/L。光照强度1151-1201lx。用试验用水溶解供试药剂，得到系列处理浓度染毒溶液。试验设计1个空白对照组和1个受试物试验组，每组设置4个平行，每个平行5只试验溞；将试验用溞转移至试验溶液中，以静态方式进行试验。试验周期48 h，试验开始后24 h、48 h观察记录各容器内的溞的活动状态和死溞数，并及时取出死亡溞。试验期间禁食。 2.2.7. 赤眼蜂接触毒性试验 试验在环境温度范围为24.00℃~24.5℃，相对湿度范围为72.8%~76.3%，避光的条件下进行。供试药剂用甲醇溶解，得到系列处理浓度的供试溶液。试验设计1个空白对照组、1个溶剂对照组、1个受试物试验组，每组设置3个平行，每个平行100 ± 10只赤眼蜂成蜂。溶剂对照组：在内表面积为31.39 cm 2 (内口径为1.38 cm，内高为6.90 cm)的平底指形管中加入0.200 ml甲醇，将甲醇在平底指形管中充分滚吸，使甲醇均匀地涂于平底指形管内壁，待甲醇完全挥发后即成溶剂对照组药膜管。然后转入赤眼蜂自由爬行1 h后转入未经任何处理的平底指形管中，放入浸有20%蜜蜂水的滤纸条，封紧管口，开始试验。受试物实验组：在内表面积为31.39 cm 2 (内口径为1.38 cm，内高为6.90 cm)的平底指形管中加入0.200 ml受试物试验溶液 ，将受试物试验溶液在平底指形管中充分滚吸，使受试物试验溶液均匀地涂于平底指形管内壁，待受试物试验溶液完全挥发后即受试物试验组药膜管。然后转入赤眼蜂自由爬行1 h后转入未经任何处理的平底指形管中，放入浸有20%蜜蜂水的滤纸条，封紧管口，开始试验。空白对照组：将赤眼蜂成蜂转入未经任何处理的平底指形管中爬行1 h后转入另一只未经任何处理的平底指形管，放入浸有20%蜜蜂水的滤纸条，封紧管口，开始试验。试验周期24 h，药后24 h内观察受试赤眼蜂生长和中毒状况，统计死亡数和死亡率。 2.3. 数据处理 采用SPSS数据处理软件中的概率单位回归模块(Regression-probit)处理数据，计算半数效应浓度(LC 50 、LR 50 、EC 50 、LD 50 )及其95%置信限。 [ 7 ]