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user: 3. 结果与分析 3.1. 单体多酚化合物抗氧化能力比较 单体多酚化合物的DPPH自由基清除率和总还原能力与其浓度之间的关系如图1。 由图1和表1、表2可知，不同多酚单体的总还原能力和DPPH自由基清除能力有明显差异，且与多酚浓度存在明显的剂量-效应关系。C 6 -C 3 型多酚(原儿茶酸和绿原酸)与C 6 -C 3 -C 6 型(槲皮素和儿茶素)在总还原能力和DPPH自由基清除能力方面与其碳链结构没有明显关系。 3.2. 两种单体多酚1:1混合的协同抗氧化作用 3.2.1. 清除DPPH自由基能力 由图2可知，在低浓度范围时，两种单体混合前的DPPH自由基清除率大于混合后的清除率，当浓度超过一定值后，绿原酸与原儿茶酸，槲皮素与儿茶素，两种单体混合后的DPPH自由基清除率分别小于或等于混合前的清除率，绿原酸与槲皮素，槲皮素与原儿茶酸，绿原酸与儿茶素，原儿茶酸与儿茶素，两种单体混合后的DPPH自由基清除率均大于混合前的清除率，尤其是绿原酸与槲皮素之间的协同清除能力极大地增强；两种单体多酚混合前后DPPH自由基清除率差异随浓度变化的显著关系见表3。 由表3可知，槲皮素-原儿茶酸，儿茶素-原儿茶酸，绿原酸-儿茶素，绿原酸-槲皮素，均呈现协同清除作用，可见，C6-C3-C6与C6-C3型多酚混合后，清除DPPH自由基能力增强；而具有相同结构类型的多酚，槲皮素-儿茶素，绿原酸-原儿茶酸，均呈现出拮抗清除作用。因此，如果两个单体多酚是同型结构，混合在一起表现为拮抗清除作用；如果是异型结构，则为协同作用。 图1. 多酚单体化合物的DPPH自由基清除率和总还原能力与浓度之间的关系 Table 1 Linear equation for scavenging effect on DPPH radicals versus concentration of polyphenols monomer compound 多酚样品 浓度范围(mg/L) 线性方程 R 2 IC 50 槲皮素 2.5~15 y = 5.32871x + 0.98272 0.9973 9.20 ± 1.52 原儿茶酸 2.5~10 y = 7.52759x + 0.10939 0.9951 6.63 ± 2.08 儿茶素 2.5~20 y = 3.62147x + 11.48467 0.9981 10.64 ± 1.13 绿原酸 2.5~30 y = 2.75502x − 3.1333 0.9981 19.29 ± 1.26 表1. 单体多酚的DPPH自由基清除率与其浓度的线性关系 Table 2 Linear equation for total deoxidization capability versus concentration of polyphenols monomer compound 样品 浓度范围(mg/L) 线性方程 R 2 原儿茶酸 20~100 y = 0.0087x − 0.00333 0.999 槲皮素 20~100 y = 0.00443x + 0.02142 0.9985 儿茶素 20~100 y = 0.00481x + 0.031 0.9996 绿原酸 20~100 y = 0.00417x − 0.01555 0.9998 表2. 单体多酚总还原能力与其浓度的线性关系 图2. 两种单体多酚混合物的DPPH自由基清清除率与浓度之间的关系 Table 3 Interaction analysis for phenolic mixtures (1:1， m/m) of scavenging effect on DPPH radical 浓度(mg/L) 清除率(%)实测值与预算值之差 槲皮素-原儿茶酸 槲皮素-儿茶素 儿茶素-原儿茶酸 绿原酸-槲皮素 绿原酸-原儿茶酸 绿原酸-儿茶素 2.5 −1.643 −1.914 −2.139 −1.321 −2.948 * −1.919 5 −3.179 −2.381 −3.676 −1.244 −5.893 * 0.192 7.5 −3.626 −3.620 * −3.997 −1.682 −7.086 ** 0.671 10 −1.498 −4.728 * −2.484 −1.023 −5.937 ** 0.023 15 4.339 ** −3.505 7.226 * 4.368 * 0.526 −0.220 20 4.510 ** −0.628 3.007 * 14.288 ** 0.195 −0.070 25 3.726 ** −0.486 2.158 13.374 ** −2.840 6.441 ** 30 3.290 * −0.259 1.763 9.813 ** −4.691 * 6.266 ** 表3. 两种单体多酚混合前后DPPH自由基清除率差异的显著性分析 “ * ”代表实测值与预测值之间差异显著(0.01 < P < 0.05)，“ ** ”代表差异极显著(P < 0.01) 3.2.2. 总还原能力 两种单体多酚混合前后的总还原能力随浓度的变化关系如图3。 由图3可知，两种单体多酚混合前后的总还原能力均随浓度的增加而增强，而且混合后的总还原能力均比混合前强。两种单体多酚混合前后总还原能力差异随浓度变化的显著关系见表4。 由表4可知，槲皮素与儿茶素，绿原酸与原儿茶酸，绿原酸与儿茶素，混合前后总还原能力的差异不显著，槲皮素与原儿茶酸，只有在200 mg/L时，混合前后总还原能力的差异才是显著的，儿茶素与原儿茶酸，绿原酸与槲皮素，在较宽的浓度范围内均表现为极显著差异。因此，异型结构多酚的总还原能力也表现为协同作用，而同型结构多酚既无协同也无拮抗作用。 3.3. 三种单体多酚化合物复合协同抗氧化作用 3.3.1. 清除DPPH自由基能力 三种单体多酚等比例混合前后的DPPH自由基清除率随浓度的变化关系如图4。 由图4可知，三种单体多酚混合前后的总还原能力均随浓度的增加而增强，而且混合后的总还原能力均比混合前强。三种单体多酚混合前后清除DPPH自由基能力的差异显著性见表5。 由表5可知，与汤晓等 [ 10 ] 的结果类似，当含有较多B环羟基的黄酮类化合物混合时，更易发生拮抗作用。 3.3.2. 总还原能力 三种单体多酚混合前后的总还原能力差异比较如图5。 由图5可知，三种单体多酚混合前后的总还原能力均随浓度的增加而增强，而且混合后总还原能力均比混合前强。三种单体多酚混合前后总还原能力的差异显著性见表6。 由表6可知，3种多酚单体按质量比1:1:1混合后，在总还原能力体系中的相互作用与DPPH体系不同，儿茶素-绿原酸-原儿茶酸协同作用最强，在各个浓度下几乎都呈现出极显著的协同效果，其余组合协同作用从强至弱依次为槲皮素-儿茶素-绿原酸、原儿茶酸-槲皮素-儿茶素以及原儿茶酸-槲皮素-绿原酸，其中原儿茶酸-槲皮素-绿原酸在各个浓度下吸光度实测值与预测值之间均差异不显著，表现为加和作用。 3.4. 四种单体酚类化合物等比例复合协同抗氧化作用 四种单体多酚等质量比混合后DPPH自由基清除能力及总还原能力如图6。 由图6可知，四种单体多酚等质量比混合后DPPH自由基清除能力及总还原能力均与理论加和值存在明显差异。在清除DPPH自由基体系中，当总多酚质量浓度较低时(2.5~7.5 mg/L)拮抗作用显著，随着质量浓度的增加，协同作用明显增强，当浓度为20 mg/L时，清除率(%)实测值与预算值之差达到9.930，继续增加质量浓度，其协同作用缓慢减弱；在总还原能力体系中，混合多酚在各个质量浓度下基本都呈现出极显著的协同作用，且协同效果随质量浓度的增加而加强。抗氧化能力与混合多酚质量浓度存在明显的剂量-效应关系，且在一定范围内质量浓度与抗氧化指标线性关系良好，清除DPPH自由基体系中，在2.5~15 mg/L范围内，得到线性方程y = 4.996x − 1.39，R 2 = 0.9996，EC 50 = 10.29 ± 0.57，总还原能力体系中，在20~100 mg/L范围内，得到线性方程y = 0.006x + 0.003，R 2 = 0.9984。为比较不同数量多酚等比例混合下的抗氧化协同效果，分别选取其中协同作用最强的组合进行比较，如图7。 由图7可知，不同数量多酚单体等质量比混合后的抗氧化协同作用差异明显，在清除DPPH自由基体系中，当质量浓度为20 mg/L时，三个组合的协同作用均最为显著，混合物中多酚数量越多，其协同作用越弱，绿原酸-槲皮素的协同效果明显优于其他两组，而在总还原能力体系中，多酚数量最多的组合协同效果较强，多酚数量为2、3的组合协同作用差别不大。 图3. 两种单体多酚混合前后的总还原能力随浓度的变化关系 Table 4 Interaction analysis for phenolic mixtures (1:1， m/m) of total reducing powe 浓度(mg/L) 吸光度实测值与预测值之差 槲皮素与原儿茶酸 槲皮素与儿茶素 儿茶素与原儿茶酸 绿原酸与槲皮素 绿原酸与原儿茶酸 绿原酸与儿茶素 20 0.026 −0.001 0.011 0.024 ** 0.012 −0.012 40 0.036 0.014 0.041 * 0.042 ** 0.027 −0.002 60 0.057 0.019 0.057 * 0.055 ** 0.024 −0.001 80 0.081 0.034 0.080 * 0.071 ** 0.033 0.007 100 0.088 0.034 0.095 ** 0.082 ** 0.040 0.005 200 0.146 * 0.073 0.150 ** 0.133 ** 0.074 0.009 表4. 两种单体多酚混合前后总还原能力差异显著性分析 图4. 三种单体多酚混合前后的DPPH自由基清除率随浓度的变化关系 Table 5 Interaction analysis for phenolic mixtures (1:1:1， m/m/m) of scavenging effect on DPPH radical 浓度(mg/L) 清除率(%)实测值与预测值之差 原儿茶酸与槲皮素与绿原酸 原儿茶酸与槲皮素与儿茶素 槲皮素与儿茶素与绿原酸 儿茶素与绿原酸与原儿茶酸 2.5 0.381 −3.421 ** −2.049 ** −3.085 ** 5 0.074 −5.634 ** −1.373 −4.687 ** 7.5 0.188 −7.584 ** −1.651 −6.160 ** 10 2.422 −5.690 ** −1.078 −5.507 ** 15 8.797 ** 2.920 ** 0.994 4.120 * 20 10.683 ** 0.307 4.928 ** 10.362 ** 25 8.466 ** −0.231 3.056 * 9.487 ** 30 5.512 ** −0.111 1.167 6.907 ** 表5. 三种单体多酚混合物清除DPPH自由基能力的差异显著性 3.5. 不同比例绿原酸与槲皮素抗氧化协同作用比较 绿原酸与槲皮素以不同质量比混合后，其抗氧化协同作用效果如图8。 由图8可知，绿原酸与槲皮素以不同质量比混合后，其抗氧化协同作用有明显的差别，在清除DPPH自由基体系中，不同比例混合多酚的清除DPPH自由基协同作用趋势基本一致，绿原酸与槲皮素之比为 Table 6 Interaction analysis for phenolic mixtures (1:1:1， m/m/m) of total reducing powe 浓度(mg/L) 吸光度实测值与预测值之差 原儿茶酸与槲皮素与绿原酸 原儿茶酸与槲皮素与儿茶素 槲皮素与儿茶素与绿原酸 儿茶素与绿原酸与原儿茶酸 20 0.003 0.007 0.010 * 0.023 * 40 0.014 0.022 0.028 * 0.044 ** 60 0.021 0.039 0.034 * 0.064 ** 80 0.035 0.056 0.049 ** 0.087 ** 100 0.034 0.066 0.055 * 0.092 ** 200 0.066 0.127 * 0.083 * 0.152 ** 表6. 三种单体多酚混合前后总还原能力差异的显著性分析 图5. 三种单体多酚等质量比混合物的总还原能力 图6. 四种单体多酚等质量比混合物的DPPH自由基清除能力(左)及总还原能力(右) 图7. 不同数量多酚等质量比混合下的抗氧化协同作用 图8. 绿原酸与槲皮素不同质量比混合下的抗氧协同作用 3:1以及2:1时，协同作用最显著时的质量浓度为25 mg/L，而当其比例为1:1、1:2、1:3时，协同作用最显著时的质量浓度在20 mg/L处，以各比例下协同作用最强的点相比较，绿原酸与槲皮素协同效果由强至弱的比例依次为1:1、2:1、3:1、1:2、1:3；在总还原能力体系中，不同比例混合多酚的总还原能力协同作用均随质量浓度的增加而升高，以200 mg/L质量浓度下的协同效果相比较，协同作用由高到低的比例依次为1:1、2:1、1:2、3:1、1:3，该结果与DPPH自由基清除体系相似。由此可见，绿原酸与槲皮素等质量比时抗氧化协同作用最强，高绿原酸比重的组合协同作用强于高槲皮素比重的组合，槲皮素比重越高，其协同作用越弱。