system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与分析 3.1. 不确定度来源分 通过对样品中喹诺酮类药物残留量检测过程进行分析，发现引入的不确定分量主要有图1所示的不确定度来源。 图1. UPLC-MS/MS测定鸡肉中喹诺酮类药物残留量的不确定度来源 3.2. 不确定度的评定 3.2.1. 目标物浓度(C)引入的不确定度 1) 储备液配制过程产生的不确定度u(C 1 ) 分别准确称取11.81 mg盐酸环丙沙星(94%)、10.15 mg恩诺沙星(98.5%)、10.10 mg氧氟沙星(99%)，11.26 mg恩诺沙星D5盐酸盐(99%， 0.2%)、11.20 mg环丙沙星D8盐酸盐(99.8%， 0.2%)、10.06 mg氧氟沙星D3盐酸盐(99.4%， 0.2%)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至，得到1000 mg/L的各标准储备液。该过程引入的不确定度见表3。 Table 3 Uncertainty resulting from reserve-fluid preparatio 项目 环丙沙星 恩诺沙星 氧氟沙星 标准品纯度 纯度最大允差 ±1.0% ±1.0% ±1.0% 计算公式 1.0 % / 3 1.0 % / 3 1.0 % / 3 不确定度u(p) (%) 0.577 0.577 0.577 相对不确定度u rel (p) 0.00614 0.00586 0.00583 天平称量 天平误差 ±0.1 不确定度u(m 1 ) (mg) 0.0577 相对不确定度u rel (m 1 ) 0.00489 0.00568 0.00571 定容 容量瓶允差(mL) [ 11 ] ±0.02 不确定度u(V V ) (mL) 0.00817 甲醇体积膨胀系数 1.1 × 10 −3 ℃ −1 温度产生的体积不确定度 0.00317 定容产生的相对不确定度u rel (V) 0.00876 相对合成不确定度u rel (C 1 ) 0.00683 0.00672 0.00660 表3. 储备液配制过程引入的不确定度 2) 储备液稀释过程产生的不确定度u(C 2 ) 用200 μL移液器移取储备液100 μL于10 mL容量瓶(A级)中，用乙腈定容，摇匀，得到10 mg/L的混合标准溶液，再移取100 μL该标准溶液于10 mL容量瓶(A级)中，用0.1%甲酸乙腈溶液定容，得到0.1 mg/L的标准工作液，再移取100μL浓度为0.1 mg/L的标准工作液于10 mL容量瓶(A级)中，用0.1%甲酸乙腈溶液定容，得到0.01 mg/L的标准工作液。 按照均匀分布处理，该过程引入的不确定度见表4。 Table 4 Uncertainty resulting from stock solution dilutio 项目 乙腈为溶剂 10 mL容量瓶 (0.1%甲酸乙腈为溶剂) 0.2 mL移液器 10 mL容量瓶 刻度误差 容量允差/mL ±0.00012 ±0.02 ±0.02 不确定度u(V 1 ) 0.0000692 0.0115 0.0115 温度波动 温度误差/℃ ±5 ±5 ±5 乙腈体积膨胀系数 1.37 × 10 −3 ℃ −1 不确定度u(V 2 ) 0.000791 0.0395 0.0395 相对不确定度u rel (V) 0.00791 0.00411 0.00411 表4. 储备液稀释过程产生的不确定度 则储备液稀释过程中引入的不确定度为： u ( C 2 ) = 0.000791 2 + 0.00411 2 × 2 = 0.00585 。 3) 标准系列溶液配制过程产生的不确定度u(C 3 ) 分别移取0.1 mg/L的喹诺酮类药物混合标准溶液200、100、50、20 μL，0.01 mg/L的喹诺酮类药物混合标准溶液100、50、20 μL，各加入同位素标记混合标准溶液100 μL，分别加入流动相700、800、850、880、800、850、880 μL，得到制得20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2 ng/mL各对照溶液，从低浓度到高浓度逐一测定，每一浓度进样2次，按所得目标物与其同位素标记物峰面积之比与相应的对照溶液浓度作标准曲线，并依此计算回归方程及相关系数。 移液器刻度误差参考JJG 646-2006《移液器检定规程》 [ 12 ] 均匀分布处理，系列标准溶液配制过程中，由器具及温度波动带来的不确定度见表5。 Table 5 Uncertainty resulting from standard solution preparatio 项目 浓度(ng/mL) 0.2 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0 20.0 刻度误差 200 μL移液器容量允差(%) ±4.0 ±4.0 ±2.0 ±4.0 ±4.0 ±2.0 ±1.5 移取外标不确定度u(V 外 ) 0.0231 0.0231 0.0115 0.0231 0.0231 0.0115 0.00866 移取内标不确定度u(V 内 ) 0.0115 1000 μL移液器容量允差(%) ±1.0 移取流动相不确定度u(V 流 ) 0.00577 合成不确定度u(V 1 ) 0.0265 0.0265 0.0173 0.0265 0.0265 0.0173 0.0155 重复性 200 μL移液器测量重复性(%) 2.0 1.0 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 移取外标不确定度u(V 外 ) 0.0115 0.00577 0.00577 0.0115 0.00577 0.00577 0.00577 移取内标不确定度u(V 内 ) 0.00577 1000 μL移液器测量重复性(%) 0.5 移取流动相不确定度u(V 流 ) 0.00289 合成不确定度u(V 2 ) 0.0168 0.00865 0.00865 0.0168 0.00865 0.00865 0.00865 温度波动 温度误差(℃) ±5 乙腈体积膨胀系数 1.37 × 10 −3 ℃ −1 移取外标不确定度u(V 外 ) 0.000079 0.000198 0.000395 0.000079 0.000198 0.000395 0.000791 移取内标不确定度u(V 内 ) 0.000395 水体积膨胀系数 2.1 × 10 − 4 ℃ −1 移取流动相不确定度u(V 流 ) 0.000533 0.000515 0.000485 0.000533 0.000515 0.000485 0.000424 合成不确定度u(V 3 ) 0.000663 0.000679 0.00074 0.000663 0.000679 0.00074 0.000897 相对合成不确定度u(V) 0.0314 0.0279 0.0194 0.0314 0.0279 0.0194 0.0299 表5. 系列标准溶液配制过程产生的不确定度 则由系列标准溶液配制过程产生的相对标准不确定度为： u r e l ( C 3 ) = 0.0314 2 + 0.0279 2 + 0.0194 2 + 0.0314 2 + 0.0279 2 + 0.0194 2 + 0.0299 2 = 0.0719 。 4) 标准曲线拟合产生的不确定度u(C 4 ) 取2.2.1.3中配制的7个标准系列浓度，从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样2针，按所得目标物与其同位素标记物峰面积之比与相应的对照溶液浓度作标准曲线，计算得到回归方程及相关系数，其中氧氟沙星 Y = 0.81365 X − 0.00911 ， R = 0.99563 ；环丙沙星 Y = 0.32927 X + 0.02059 ， R = 0.99905 ；恩诺沙星 Y = 2.63845 X + 0.01318 ， R = 0.99698 。对阳性样品中各目标化合物浓度C 0 重复检测3次，检测结果为氧氟沙星5.011、4.983、5.007 ng/g；环丙沙星4.997、4.967、5.014 ng/g；恩诺沙星5.021、5.014、4.982 ng/g。标准曲线拟合产生的不确定度按照(1) (2)计算。 (1) S R = ∑ i = 2 n 2 [ Y − ( b X i + c ) ] 2 n − 2 (2) n 1 为同一溶液测量次数；n 2 为标准溶液测量次数；X i 为标准溶液理论值； X ¯ 为标准溶液浓度平均值；Y为标准溶液峰面积与内标峰面积的比值；b为标曲斜率；c为标曲截距。 由(1)、(2)算出标准曲线拟合产生的不确定度分别为：氧氟沙星 u r e l ( C 4 ) = 0.0356 ，环丙沙星 u r e l ( C 4 ) = 0.0148 ，恩诺沙星 u r e l ( C 4 ) = 0.0368 。 根据 u r e l ( C ) = u r e l ( C 1 ) 2 + u r e l ( C 2 ) 2 + u r e l ( C 3 ) 2 + u r e l ( C 4 ) 2 可计算出被测物质量浓度C引入的不确定度，相关量值见表6。 Table 6 Calculation of uncertainty resulting from analyte concentratio 待测化合物 u rel (C 1 ) u rel (C 2 ) u rel (C 3 ) u rel (C 4 ) u rel (C) 氧氟沙星 0.00660 0.00585 0.0719 0.0356 0.0807 环丙沙星 0.00683 0.0148 0.0739 恩诺沙星 0.00672 0.0368 0.0813 表6. 被测物质量浓度C引入的不确定度 3.2.2. 样品称量引入的不确定度u(m) 称取5.00 g鸡肉样品，所用天平校准证书中天平的最大允许误差为±0.02 g，按照均匀分布进行计算，引入的不确定度 u ( m ) = 0.02 / 3 = 0.0155   g ，则相对不确定度 u r e l ( m ) = u ( m ) / m = 0.0155 / 5 = 0.0031 。 3.2.3. 体积量取产生的不确定度u(V) 1) 定容容量产生的不确定度u(V 1 ) 加入5%的甲酸乙腈溶液5.0 mL，移液器体积允许误差为±0.0091 mL，按均匀分布进行计算， u ( V 1 ) = 0.0091 / 3 = 0.00525   mL ；由温度变化引起的乙腈容积变化为 ，同样， u ( V 1 温 ) = 0.00685 / 3 = 0.00395   mL 。则定容时产生的不确定度为： ，相对不确定度为 u r e l ( V 1 ) = u ( V 1 ) / 5 = 0.00131 。 2) 仪器进样体积产生的不确定度 u(V 2 ) LC-MS/MS进样针容积的相对标准偏差为±1%，则其相对不确定度 u r e l ( V 2 ) = 1 % / 3 = 0.00577 。 由1)和2)看出，体积量取引入的相对不确定度为： u r e l ( V ) = 0.00591 。 3.2.4. 加入内标引入的不确定度u(V 内 ) 由于样品与对照使用同一内标溶液，内标物的称量和稀释定容所产生的不确定度在计算过程中抵消，则对目标物含量测定有影响的不确定因素主要是内标溶液的移取引入的 [ 10 ] 。 测定过程中使用200 μL移液器，最大允差为±0.0012 mL，按照三角分布计算，移液器产生的不确定度为： u ( V 内 1 ) = 0.0012 / 6 = 0.000490   mL 。试验温度与校正温度不同也会引入不确定度，按照均匀分布，温度差异产生的不确定度为： u ( V 内 2 ) = 0.05 × 5 × 2.1 × 10 − 4 ˚ C − 1 / 3 = 0.0000303   mL 。 则供试品中加入内标量引入的不确定度为： u ( V 内 ) = u ( V 内 1 ) 2 + u ( V 内 2 ) 2 = 0.000490 2 + 0.0000303 2 = 0.000490   mL 。 相对不确定度为： u r e l ( V 内 ) = u ( V 内 ) / 0.05 = 0.000490 / 0.05 = 0.0098 。 同理，对照品中加入内标量引入的相对不确定度 u r e l ( V 对 ) = 0.0098 。 3.2.5. 回收率引入的不确定度u(R) 在空白鸡肉试样中添加1 μg/kg的环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星混合标准溶液，平行测定10次。将平均回收率 R ¯ ，标准偏差S(R)分别代入公式 u ( R ) = S ( R ) / 10 和 u r e l ( R ) = u ( R ) / R ¯ ，得到由回收率带来的不确定度以及相对不确定度，测定结果见表7。 Table 7 Results of determination of Ofloxacin， Ciprofloxacin and Enrofloxacin in commercialized samples of chicke 编号 氧氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星 含量(μg/kg) 回收率(%) 含量(μg/kg) 回收率(%) 含量(μg/kg) 回收率(%) 1 0.966 96.6 0.951 95.1 0.943 94.3 2 0.972 97.2 0.973 97.3 0.962 96.2 3 0.981 98.1 0.970 97.0 0.955 95.5 4 1.103 110.3 0.959 95.9 0.925 92.5 5 1.012 101.2 1.108 110.8 1.085 108.5 6 0.953 95.3 1.002 100.2 1.071 107.1 7 0.995 99.5 0.951 95.1 0.948 94.8 8 1.010 101.0 1.019 101.9 0.987 98.7 9 1.017 101.7 1.007 100.7 0.992 99.2 10 0.984 98.4 0.988 98.8 0.973 97.3 平均值 0.999 99.9 0.993 99.3 0.984 98.4 S(R) 0.0421 4.207 0.0469 4.692 0.0535 5.349 u(R) 0.0133 1.330 0.0148 1.484 0.0169 1.692 u rel (R) 0.0133 0.0133 0.0149 0.0149 0.0172 0.0172 表7. 鸡肉中氧氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星测定结果 3.2.6. 测量重复性引入的不确定度 u ( X ¯ ) 按照3.2.5的方法，将平均含量 X ¯ ，标准偏差 S ( X ¯ ) 结果分别代入公式 u ( X ¯ ) = S ( X ¯ ) / 10 和 u r e l ( X ¯ ) = u ( X ¯ ) / X ¯ ，计算得到测量重复性引入的不确定度和相对不确定度，如表7所示。 3.3. 合成不确定度 综上各不确定度分量，根据公式 u c r e l ( X ) = u r e l ( C ) 2 + u r e l ( m ) 2 + u r e l ( V ) 2 + 2 u r e l ( V 内 ) 2 + u r e l ( R ) 2 + u r e l ( X ¯ ) 2 ，计算可得氧氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的合成不确定度，结果见表8。 Table 8 Uncertainty evaluation for the determination of three Quinolone 项目 氧氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星 合成相对不确定度u crel 0.0843 0.0784 0.0863 实测值(μg/kg) 0.999 0.993 0.984 扩展不确定度U(μg/kg) 0.168 0.156 0.170 检测结果k = 2(μg/kg) 0.999 ± 0.168 0.993 ± 0.156 0.984 ± 0.170 表8. 三种喹诺酮类药物测定不确定度评定结果 3.4. 扩展不确定度 依据JJF 1135-2005，对于大多数测量采用包含因子k = 2衡量，则3种喹诺酮类药物含量的扩展不确定度 U = u c r e l ( X ) × X ¯ × 2 ，由此得到超高效液相色谱–串联质谱法测定鸡肉中3种喹诺酮类药物含量的结果，见表8。