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user: 3. 结果与分析 3.1. Reads与参考基因组比对情况统计(表1) 选取HISAT软件将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。不同处理的样品wt得到43657504 reads，wt-1得到44090468 reads，经过与毛白杨基因组比对，分别比对上30486927和27708170个reads。 3.2. 差异基因GO富集分析 使用Gene Ontology数据库以及毛果杨基因组注释数据库对wt-1与wt对比组获得的显著性差异基因功能进行富集及注释分析。分析显示wt-1与wt对比组中，总基因数为3495，其中上调基因个数为1683，下调基因个数为1812(图1)。显著差异表达的上调基因中被功能注释且主要涉及383个生物学功能，富集在分子功能、生物学过程、细胞组分的3种GO分类中，分别为156，211和16种生物功能。显著差异表达的下调基因中被功能注释且主要涉及380个生物学功能，富集在分子功能、生物学过程、细胞组分的3种GO分类中，分别为78，246和78种生物功能。 GO功能中的差异基因进行分析得出，生物学过程在调控RNA代谢过程，转录调控，大分子代谢过程的调控等功能中都存在显著性上调基因，包括CIGR1，DRE1D，ERF19，AP2等基因，其中CIGR1 Table 1 Reads and reference genome alignment lis Sample_name wt wt_1 Total reads 43657504 44090468 Total mapped 30486927 (69.83%) 27708170 (62.84%) Multiple mapped 791368 (1.81%) 796130 (1.81%) Uniquely mapped 29695559 (68.02%) 26912040 (61.04%) Reads map to “+” 14808943 (33.92%) 13429257 (30.46%) Reads map to “-” 14886616 (34.1%) 13482783 (30.58%) Non-splice reads 16757193 (38.38%) 16265478 (36.89%) Splice reads 12938366 (29.64%) 10646562 (24.15%) 表1. Reads与参考基因组比对情况一览表 图1. 差异基因火山图。有显著性差异表达的基因用红色点(上调)和绿色点(下调)表示，无显著性差异表达的基因用蓝色点表示；横坐标代表基因在不同样本中表达倍数变化；纵坐标代表基因表达量变化差异的统计学显著性 的上调对植物防御和发育具有双重作用 [ 12 ] ，DREB1D的上调是植物对压力反应性转录调控的适应性策略，从而减轻环境胁迫的不利影响 [ 13 ] 。在分子功能中核酸结合转录因子活性，DNA结合等功能中都存在显著性上调基因，包括SCL14，WRKY6，WRK33等基因上调是植物氧化应激在转录水平上的调节作用 [ 14 ] ，从而减轻氧化应激对于细胞的损伤(图2)。 图2. GO富集柱状图，纵坐标为富集的GO term，横坐标为该term中差异基因个数 光合作用中光能的捕获、电子传递等一系列的光反应都是由在光合膜上的色素蛋白复合物所推动的，其中植物光系统中捕光蛋白质复合物LHC是与色素分子结合的膜蛋白复合物，主要参与光合作用中光能的捕获与传递 [ 15 ] 。植物光系统II中的Psb复合蛋白是植物进行光合电子传递、水的裂解和氧气释放的重要蛋白复合物 [ 16 ] 。ATPc1所代表的的磷酸肌醇信号传导是早期发育阶段和微卫星形成过程中液泡形成的重要线索 [ 17 ] 。go功能中的差异基因进行分析得出，与生物学过程-光合作用相关的功能中，包括光反应，光调节，光采集等功能中都存在这显著性下调的基因，这些基因包括：PRK、Lhca、Lhcb、cp24、ACSF、ATPc1、CHL27、CP24、CP26、geranylgeranylreductase family protein、Lhca、Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、LIL3、phytochrome A、PsaG、PsaK、Psb27、Psbp、PsbQ、PsbS、PsbW、PsbY、PsbX等蛋白(图2)。说明在氧化胁迫后，在光合作用中，相关天线蛋白复合物的光采集与电子传递传递，磷酸肌醇信号传导等蛋白都出现了下调的异常。 在光系统II(PSII)中，光合叶绿素结合蛋白，质体蛋白家族对于叶绿体光捕捉和类囊体的基粒的堆积与膜重组都具有关键作用 [ 18 ] 。go功能中的差异基因进行分析得出，与细胞组分–光合膜相关的功能中，包括光合膜，光系统I(PSI)，光系统II(PSII)，叶绿体类囊体膜，质体类囊体膜，叶绿体类囊体，膜蛋白复合物等功能中都存在这显著性下调的基因，这些基因包括：ACSF、ATPc1、CHL27、CP24、CP26、cytochrome b6f、geranylgeranylreductase family protein、Lhca、Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、LIL3、PetE、phytochrome A、PsaD、PsaG、PsaK、Psb27、Psbp、PsbQ、PsbS、PsbW、PsbY、PsbX等蛋白(图2)。说明在氧化胁迫后，叶绿体遭到破坏，与光合作用有关的定位在叶绿体光合膜上以及类囊体膜上的膜脂蛋白被氧化，导致与叶绿体光合膜上以及类囊体膜上的蛋白等都出现了下调的异常。 高等植物光系统I是一种多蛋白色素复合物，其中由四个色素蛋白复合(Lhca1-Lhca4)组成的LHCI参与协调叶绿素a，叶绿素b，叶黄素，紫黄质，和β胡萝卜素的合成 [ 19 ] 。go功能中的差异基因进行分析得出，与分子功能-叶绿素，色素结合相关的功能中，包括光反应，光调节，光采集，光合膜，光系统I，光系统II，叶绿体类囊体膜等功能中都存在这显著性下调的基因，这些基因包括：ACSF、ATPc1、CHL27、CP24、CP26、cytochrome b6f、geranylgeranylreductase family protein、Lhca、Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、LIL3、PetE、phytochrome A、PsaD、PsaG、PsaK、Psb27、Psbp、PsbQ、PsbS、PsbW、PsbY、Psb等蛋白(图2)，说明在氧化胁迫后，叶绿体光系统I内蛋白色素复合物降低了对叶绿素和叶黄素等色素的合成，导致与叶绿素、色素结合相关的蛋白等都出现了下调的异常。 通过对go功能的生物学过程，细胞组分，分子功能的结果分析，在氧化胁迫条件下，野生型毛白杨中与抗性相关的存在着显著性上调，而与光合作用相关功能基因的存在显著性下调，说明经过氧化胁迫后，叶绿体产生氧化损伤，叶绿体光合作用受到破坏，光合膜相关蛋白可能被氧化。 3.3. 差异基因KEGG分析 在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。通过分析得出Pathway的代谢通路在显著性上调基因主要富集在在植物病原体相互作用，蛋白质在内质网中的加工，胞吞作用等代谢通路中(图3)。而显著性下调基因主要富集在植物激素信号转导代谢通路中，光合作用–天线蛋白谢通路中，光合作用谢通路中，卟啉和叶绿素代谢通路中(图4)。 氧化应激条件下，植物病原体相互作用通路相关的抗性信号的基因的表达上调，可能是由于ROS累积的毒性直接作用于植物病原体而引起的 [ 20 ] 。蛋白质在内质网中的加工通路中ERAD_C的泛素连接酶 图3. 蛋白质在内质网中的加工，红色代表上调基因 Doa10基因上调，可能是氧化应激条件下，蛋白质被氧化，导致ERAD_C的泛素连接酶Doa10识别并降解异常的内质网蛋白 [ 21 ] (图3)。 在光合作用中，光系统I(PSI)和光系统II(PSII)是通过捕光天线蛋白来调节光能的分配，促进过剩光能的耗散，降低ROS在叶绿体中的积累，从而保护植物光合作用 [ 22 ] ，并在光捕获和适应光照变化方面起着重要的作用。在光合作用–天线蛋白通路中，LHC (采光天线蛋白)中，显著性下调基因包括Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6 (图4(b))说明在氧化胁迫后，光合作用受损，叶绿体PSII中LHC遭到破坏，从而使光系统II主要捕光色素蛋白复合体(LHCII)结合相关的蛋白等都出现了下调的异常。 在光能传递中，植物光系统II(PSII)中的psb复合蛋白是植物进行光合电子传递、水的裂解和释放氧气的重要蛋白复合物 [ 23 ] 。而PsbW蛋白对于类囊体膜基粒区域中PSII-LHCII超复合体的组装和稳定性是起关键作用的 [ 24 ] ，type-ATP中叶绿体F1Fo-ATP合成酶(CF1Fo)驱动ATP合成和ATP水解的逆反应，尤其是在胁迫条件下，ATPase氧化还原调节可以增加叶绿体对于H 2 O 2 的耐受性 [ 25 ] 。而LDH3对于植物中活性氧中间体的水平有调节作用 [ 26 ] 。在光合作用通路PSI中，显著性下调基因包括PsaD、PsaE、PsaF、PsaG、PsaK、PsaL。PSII中，显著性下调基因包括PsbO、Psbp、PsbQ、PsbW、PsbY、Psb27。F-type ATP中，显著性下调基因包括gamma、delta (图4(a))。说明在氧化胁迫后，ROS在叶绿体中的积累破坏了光合作用，导致了PsaG、psbW、CF1Fo等基因的下调，从而导致了电子传递，类囊体膜蛋白形成受到影响。 通过对Pathway显著性富集通路的分析，氧化胁迫条件下，抗性信号的基因的表达上调，相关降解异常内质网蛋白的酶表达上调，而光合作用有关的蛋白以及与光合膜，类囊体膜有关蛋白存在着显著性下调，说明氧化胁迫后，植株的光合作用降低，光合相关膜脂结构被氧化。