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user: 3. 结果与分析 对产脂肪酶菌株A-16进行酶学性质研究，结果发现：该酶的最适温度为50℃、pH 4.5，并且在70℃范围内热处理1 h后酶活力还保持在78%以上；同时该酶在酸性环境中保温1 h后可保持70%以上的酶活力。因此，说明该酶具有良好的热稳定性以及在酸性条件下稳定性较好。 3.1. 紫外诱变结果 菌株A-16经紫外诱变处理后，致死率、正突变率与照射时间的关系见图1。 由图1可知：致死率随着紫外照射时间的延长而逐渐增大，但正变率并不是随着照射时间的延长而增大的，在照射时间180 s内，正变率随着照射时间的延长而增大，当超过180 s后，正变率逐渐降低。因此，选择照射时间为180 s。将诱变处理后的菌悬液经平板初筛，摇瓶复筛，得到12株产酶活力高于原始出发菌株的突变菌株。通过对这12株正突变株的遗传稳定性测定，结果见表2，由表2可知，突变株U-08相对酶活 Table 1 Factors and the level of response surface experimen 因素 水平 −1 0 1 温度(℃) 35 45 55 pH值 3.5 4.5 5.5 吐温-80% (w/v) 0.05% 0.1% 0.15% 表1. 响应面试验因素与水平 Table 2 The results of UV mutagenesis strain 突变株 U-01 U-02 U-03 U-04 U-05 U-06 U-07 U-08 U-09 U-10 U-11 U-12 相对酶活(%) 118.4 118.6 115.2 117.6 119.3 119.8 113.5 121.8 116.8 120.1 118.6 121.5 表2. 紫外诱变菌株的筛选结果 最高，较原始菌株提高了21.8%，且酶活力为12415.5 U/mL。以U-08突变株为出发菌株进行EMS诱变。 3.2. 甲基磺酸乙酯诱变结果 以菌株U-08为出发菌株，采用不同浓度的EMS处理不同时间，菌株致死率、正突变率随处理时间的变化见图2。 由图2可以看出，菌株对甲基磺酸乙酯诱变极为敏感，致死率随着EMS浓度的增大及处理时间的延长而逐渐增加，当EMS终浓度在2.5%、3%时，处理10 min致死率达到80%，处理20 min菌体几乎无存活。但正变率与EMS浓度以及处理时间并不满足线性关系，当EMS终浓度为1%、1.5%时，菌株的正变率都随着EMS处理时间的延长而增加；当EMS终浓度为2%时，菌株的正变率随着EMS作用时间的延长先上升后下降；当EMS终浓度为2.5%、3%时，菌株的正变率都随着EMS作用时间的延长而降低。综合EMS在不同诱变条件下对出发菌株的诱变效果，选择EMS终浓度为2%，作用时间为20 min，此时正突变率达到最大值。将诱变处理后的菌悬液经平板初筛，摇瓶复筛，得到8株Hc值高于出发菌株的突变菌株，对其遗传稳定性测定，结果见表3，由表3可知，突变株UE-03相对酶活最高，较原始菌株提高了73.6%，且酶活力为17695.6 U/mL。 3.3. 突变株UE-03的遗传稳定性 将选育到的突变株UE-03在斜面培养基上连续5次传代培养，并转接到发酵培养基培养48 h，观察各子代产脂肪酶能力的稳定性，结果见图3。 图1. 不同照射时间对正变率和致死率的影响 图2. 不同EMS浓度的诱变效果 由图3可以看出UE-03突变株经过5次连续传代后，产脂肪酶活力无显著差异，说明其具有良好的遗传稳定性。 3.4. 不同初始pH值对菌株产酶的影响 不同的pH值对菌体的生长和发酵产酶影响较大，将UE-03菌株在不同pH值(3.0~7.0，间隔一个pH单位)、45℃、180 r/min条件下培养48 h后，离心，取上清液测脂肪酶活力，以初始 pH 4.0 时的发酵液酶活为基准，计算相对酶活，结果如图4所示。从图4中可以看出，pH值4. 0时，菌体产酶量达到最大。 3.5. 不同温度对产酶的影响 温度也是影响菌体生长和产脂肪酶的重要因素之一。将菌体分别置于不同温度下(30℃~60℃，间隔5℃)培养，以发酵温度为45℃时的发酵液酶活为基准，计算相对酶活，结果见图5。由图5可知，菌株在45℃时，相对酶活最高。 Table 3 The results of EMS mutagenesis strain 突变株 UE-01 UE-02 UE-03 UE-04 UE-05 UE-06 UE-07 UE-08 相对酶活(%) 155.1 168.6 173.6 157.9 169.5 171.8 173.3 161.8 表3. EMS诱变菌株结果 图3. UE-03的遗传稳定性 图4. pH对UE-03产脂肪酶的影响 3.6. 表面活性剂吐温-80 添加量对菌株产酶的影响 由于表面活性剂具有增加细胞膜的通透性作用，因此在培养基中加入表面活性剂可以促进菌体产脂肪酶。在最佳温度、pH条件下，研究不同吐温-80添加量对菌体产酶的影响。以培养基未添加吐温-80时的发酵液酶活为基准，计算相对酶活，结果如图6。从图6可以看出，吐温-80添加量在0%~0.15% w/v时，尽管相对酶活有所升高，但对菌体产酶影响不大。 3.7. 响应面法优化实验 根据单因素试验条件，pH值(A)、温度(B)以及吐温-80添加量(C)为变量对菌株产酶影响比较显著。因此，以pH值(A)、温度(B)以及吐温-80添加量(C)为变量为变量，菌株相对酶活为响应值，用Design Expert8.0 Trial软件通过中心组合法寻求最优发酵工艺参数[ 18 ] ，实验设计及结果见表4，方差分析见表5，根据回归方程作出不同因子的响应面分析图见图7。 试验数据使用Design-Expert8.0 Trial软件进行二次回归拟合后，得到以下回归方程：Y = 105.88 + 2.28A − 2.75B + 2.18C − 2.35AB + 0.47AC − 0.13BC − 8.00A 2 − 7.34B 2 + 0.70C 2 ，式中：Y为相对酶活；A为温度；B为初始pH；C为吐温-80添加量。 运用Design Expert8.0 Trial软件进行回归分析，回归方程的方差分析见表5，由表5可知，模型的P值<0.0001，说明模型显著。同时模型中自变量一次项A，B，C，二次项AB，A 2 ，B 2 显著(α = 0.01)。模 图5. 温度对UE-03产脂肪酶的影响 图6. 吐温-80添加量对UE-03产脂肪酶的影响 图7. 响应面立体分析图；(a) 温度和pH交互作用；(b) 温度和吐温-80添加量交互作用；(c) pH和吐温-80添加量交互作用 Table 4 The design and results of response surface experiment 试验号 温度(℃) pH值 吐温-80 (w/v) 相对酶活(%) 1 55 4.5 0.05% 98.92 ± 0.02 2 55 5.5 0.1% 86.83 ± 0.16 3 45 3.5 0.05% 98.61 ± 0.13 4 45 4.5 0.1% 105.4 ± 0.06 5 45 4.5 0.1% 106.7 ± 0.12 6 45 5.5 0.15% 99.62 ± 0.14 7 35 5.5 0.1% 87.05 ± 0.22 8 35 3.5 0.1% 89.57 ± 0.21 9 55 3.5 0.1% 98.73 ± 0.16 10 45 3.5 0.15% 103.67 ± 0.08 11 45 4.5 0.1% 105.39 ± 0.11 12 45 5.5 0.05% 95.07 ± 0.11 13 45 4.5 0.1% 106.52 ± 0.05 14 35 4.5 0.15% 98.16 ± 0.13 15 35 4.5 0.05% 94.35 ± 0.17 16 55 4.5 0.15% 102.92 ± 0.10 17 45 4.5 0.1% 105.39 ± 0.10 表4. 响应面试验设计及结果 型失拟项的P值>0.05，说明模型选择合适。因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析[ 9 ] 。同时，由软件分析得到模型的校正决定系数R 2 = 0.9884，说明该模型最多只有约1.16%的变化不能用此模型来解释。本实验偏差系数(CV)为1.08%，其值较低，能由该模型解释，进一步说明模型拟合优度较好[ 19 ] 。 对回归方程进行分析，得出最佳产酶条件(见表6)为：pH 4.28，温度46.8℃，吐温-80添加量0.15% w/v，相对酶活为109.29%。采用最优发酵条件进行产酶实验，重复三次，相对酶活为(109.27 ± 0.16)%，与模型预测值接近，说明该模型较可靠。