DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 结果 3.1. 临床特征 72例PG1L患者中男36例，女36例，男女比例为1:1。发病中位年龄60 (30~78)岁。病理类型以弥漫大B细胞淋巴瘤为主，占83.8%。随访时间3~110个月不等，中位随访56个月。临床基本资料及实验室检测结果，见表1。 Table 1 Basic clinical data of PGL patient 因素 例数 因素 例数 年龄 ALB (g/L) ≤60岁 38 <35 23 > 60岁 34 ≥35 47 性别 LDH 男 36 升高 18 女 36 正常 52 临床分期 β2微球蛋白 a I~II期 35 升高 19 III~IV期 37 正常 29 B症状 病理分型 有 20 B细胞源性 62 无 52 T细胞源性 10 IPI评分 治疗方式 0~2 52 单纯手术 7 3~5 20 手术 + 化疗 35 HGB (g/L) 单纯化疗 27 <100 22 拒绝治疗 1 ≥100 50 放疗 2 表1. PGL患者临床基本资料 注：B症状：有38℃以上、不明原因发热或盗汗、6个月内原因不明的体重减轻10%症状之一；IPI：国际预后指数；ALB：白蛋白；LDH (乳酸脱氢酶)升高：>271 U/L；β2微球蛋白升高：>2.71 mg/L。 a 随访满三年且具有完整资料的例数为31例。 3.2. 胃淋巴瘤分布部位 本研究收集的72位PGL患者中，胃窦部22 (30.5%)例，胃角部4 (5.6%)例，胃底部7 (9.7%)例，胃体部9 (12.5%)例，贲门部4 (5.6%)例，多部位26 (36.1%)例，见图1。 图1. 不同部位分布情况 3.3. PGL患者生存分析 截止至2020年11月08日，72例患者中有62例获得完整随访资料，中位随访56 (3~110)个月。72例PGL患者1年、3年预期生存率分别为98.3%、81.6%，共死亡9例(14.5%)。研究结果显示手术联合化疗及单纯化疗的预后生存明显优于单纯手术的患者，但是差异不具有显著性(p > 0.05)，见图2(a)、图2(b)，但是随访过程中发现单纯化疗的生活质量要高于手术患者，其中1例拒绝治疗，2例放疗患者，因数量太少未纳入统计。 3.4. PGL的预后情况 收集的PGIL患者中随访满3年生存情况，49例纳入此次统计。49例PGL患者的3年生存率为83.6%。通过对PGL患者3年生存率单因素分析结果提示，年龄 > 60 岁(p = 0.028)、临床分期为III/IV期(p = 0.001)、B症状(p < 0.001)、国际预后指数(IPI)评分3~5分(p = 0.028)、ALB < 35 g/l (p = 0.003)、高水平LDH (p = 0.003)、病理分型为T细胞淋巴瘤(p = 0.006)为影响总生存期的预后因素，差异具有统计学意义，见表2。COX回归模型多因素分析显示，国际预后指数(IPI)评分3~5分(p = 0.022)为预后不良的独立危险因素，见表3。 图2. 不同治疗方式对比 Table 2 Single factor analysis of prognostic factors in patients with primary gastric malignant lymphom 因素 例数 b 3年生存率 χ 2 P值 年龄 4.848 0.028 ≤60岁 26/2 96.9 >60岁 14/7 66.7 性别 0.001 0.982 男 18/4 81.8 女 23/5 82.1 临床分期 11.409 0.001 I~II期 28/1 96.6 III~IV期 12/8 60 B症状 16.163 0.000 有 7/6 53.8 无 33/3 91.7 IPI评分 4.846 0.028 0~2 33/5 86.8 3~5 7/4 63.6 HGB 0.003 0.954 <100 14/3 82.4 ≥100 26/6 81.3 ALB 8.752 0.003 <35 8/6 57.1 ≥35 32/3 91.4 LDH 4.697 0.03 升高 6/4 60 正常 34/5 87.2 β2微球蛋白 a 3.381 0.066 升高 9/5 64.3 正常 15/2 88.2 病理分型 7.426 0.006 B细胞源性 38/7 84.4 T细胞源性 2/2 50 治疗方式 2.676 0.102 单纯手术 4/3 57.1 手术 + 化疗 22/4 84.6 单纯化疗 14/2 87.5 表2. 原发胃恶性淋巴瘤患者影响预后的单因素分析 注：B症状：有38℃以上、不明原因发热或盗汗、6个月内原因不明的体重减轻10%症状之一；ALB：白蛋白；LDH (乳酸脱氢酶)升高：>271 U/L；β2微球蛋白升高：>2.71 mg/L； a 随访满三年且具有完整资料的例数为31例， b 随访满3年的例数总共为49例。 Table 3 Multivariate analysis of prognostic factors in patients with primary gastric malignant lymphom SE 瓦尔德 P值 HR 95.0% Exp(B)的CI 下限 上限 年龄 1.546 1.342 0.247 0.167 0.008 3.452 B症状 1.169 3.538 0.060 0.111 0.011 1.097 病理分型 1.437 2.974 0.085 0.084 0.005 1.403 IPI 1.292 5.262 0.022 0.052 0.004 0.650 临床分期 1.298 1.545 0.214 0.199 0.016 2.536 LDH 1.895 1.537 0.215 0.095 0.002 3.916 ALB 1.637 3.781 0.052 0.041 0.002 1.026 表3. 原发胃恶性淋巴瘤患者预后影响因素多因素分析 注：B症状：有38℃以上、不明原因发热或盗汗、6个月内原因不明的体重减轻10%症状之一；IPI：国际预后指数；ALB：白蛋白；LDH (乳酸脱氢酶)升高：>271 U/L。
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user: 4. 讨论 结外恶性淋巴瘤(Extra-nodal lymphoma， ENL)是指位于淋巴结以外的淋巴器官或者非淋巴组织聚集器官的恶性淋巴瘤，发病部位最常见于胃其次是肠道，其发病率分别为60%~70%、20%~30% [ 5 ]，占胃肠道恶性肿瘤的0.9%~6.5%，男性略多于女性 [ 6 ]。近年来，PGL 的发病率呈现出升高趋势，这可能与人们饮食习惯及生活方式改变有关，也与人们的就医观念、诊断技术及仪器的提升有关。但是对于PGIL患者的临床特征、影响预后的因素、治疗方案的选择等方面仍存在明显短板。目前PGL患者发病原因未明，但是有部分学者提出其可能与幽门螺旋杆菌感染、患者自身免疫状况、EB病毒感染及长期慢性炎症等存在关联 [ 7 ]。 本次研究结果显示，72例PGL患者中男女比例为1:1，发病的中位年龄是60岁，以中老年多见，与现有的大多数研究结果相符合，但是性别方面略有不同 [ 6 ]，这与收集的样本量不足及样本中不包含肠道淋巴瘤存在相关性。大多数患者最开始发病时缺乏特异性临床表现，仅以腹痛、腹胀、呕血、反酸等消化道表现为主诉入院，也有部分以B症状为唯一表现，常被误诊为其他消化道肿瘤，因此对于中老年患者特别注意鉴别胃淋巴瘤。PGL患者确诊主要依赖于胃镜、超声或CT穿刺及外科手术取得的标本经病理学证实。PGL主要来自黏膜的淋巴组织恶变，内镜下多为溃疡浸润等表现，缺乏特异性，特别是早期黏膜破坏尚不明显，使得取材诊断难度很高，易产生假阴性结果 [ 8 ]，因此对PGL患者建议多点深部取材，可以降低漏诊率。 PGL细胞起源分为B细胞源性和T细胞源性。本研究中的72例PGL患者，B细胞源性淋巴瘤最为多见，占86.1% (62例)，T细胞源性13.9% (10例)，三年生存率分别为84.4%、50%，结果提示T细胞源性患者预后更差，差异具有统计学意义。Fang JC等发现B细胞源性的淋巴瘤临床表现以腹部包块较为多见，而T细胞源性的淋巴瘤以穿孔、疼痛以及B症状更为常见，这与T细胞源性预后生存更差存在相关性 [ 9 ]。在实际临床工作中一旦发现T细胞源性淋巴瘤，尽早对患者采取个体化治疗措施。但是关于T细胞型PGL患者的治疗方案仍存在巨大的短板，缺乏标准的治疗方案，需要进一步开发新的针对T细胞型淋巴瘤的靶向药物 [ 10 ]。 目前，PGL的治疗方式主要为手术、放化疗、HP根除治疗以及联合治疗等。但是针对PGL的治疗缺乏一个“金标准”，外科手术曾一度被认为是PGL的首选治疗方式，但随着对该病研究的不断深入，人们发现由于淋巴瘤是一种全身性疾病，单纯手术并不能使患者产生较好的预后，反而会增加机体创伤、术后感染及死亡率，然而以蒽环类药物为基础的CHOP方案和R-CHOP方案在治疗PGL方面取得了较满意的疗效，因此已逐渐替代手术成为首选治疗方式 [ 11 ]。但是外科手术治疗仍具有其特有的优势，例如减轻肿瘤的压迫、明确病理、控制消化道出血、穿孔等并发症。在本次研究中共有42例患者接受了手术治疗，其中有35例患者术后辅以CHOP/R-CHOP方案化疗，27例接受单纯化疗，单纯手术、手术联合化疗及单纯化疗三者的三年生存率分别为57.1%、84.6%、87.5%。虽然差异不具有统计学意义，但是经过随访发现，化疗、手术结合化疗患者的3年及远期预后要优于单纯手术患者，尤其是化疗患者的生活质量更高，这与手术创伤及术后出现的消化道并发症密不可分，PGL易感人群主要偏向于中老年人群，其机体的恢复能力相对较低。这也提醒我们，在面对PGIL患者时一定要严格把控手术适应症。 在实际临床中，我们发现血清肿瘤负荷相关标志物(LDH及β2微球蛋白水平)在反映淋巴瘤大小、侵袭性及预后预测中具有较高的应用价值。本研究结果提示LDH水平升高(P = 0.008， χ 2 = 7.001)比LDH正常水平的患者预后差，这可能与PGIL患者体的内淋巴瘤细胞大量增殖分化，需要大量的能量供应，而此时糖酵解成为其能量来源的最佳选择 [ 12 ]，血清LDH水平也随之升高，同时临床分期晚、治疗效果差的患者体内淋巴瘤瘤细胞的增殖分化更加活跃，因此其LDH水平也更高。β2微球蛋白是一种低分子血清蛋白质，正常人其合成速度和细胞模释放量维持在一种稳定的状态，而PGL患者体内特定微环境血清导致淋巴瘤细胞合成β2微球蛋白的速度加快导致平衡打破。Kanemasa Y等推荐血清β2微球蛋白水平作为评估PGL患者预后的新指标 [ 13 ]。本组研究结果提示PGL血清β2微球蛋白水平的升高(χ 2 = 3.381， P = 0.066)的患者比血清β2正常的患者预后较差，但是差异不具有统计学意义。这可能与样本量不足导致分析结果出现差异，需要收集更多的样本进行验证。 综上所述，临床分期、B症状、IPI、ALB < 35 g/l、病理分型、LDH对评估PGL患者的预后情况具有重要价值，而HGB < 100 g/L及β2微球蛋白患者虽然不具有统计学差异(P > 0.05)，但是分析结果提示HGB < 100及β2微球蛋白患者预后更差，这可能与我们收集的样本量不足及随访时间存在相关性。其中IPI评分3~5分为预后不良的独立危险因素，对患者预后状况及总体生存存在负面影响，对此类PGL患者应尽早采取积极的个体化应对措施。
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user: 摘要 2019年10月青岛大学附属医院美容整形外科收治1例头皮皮角患者，男性，84岁，渔民。头皮顶部肿物7年，加快生长1年。皮肤科检查：头皮顶部一灰白色角质物，表面呈菜花样分叶状，质脆；肿物边界清楚，边缘红肿。手术切除肿物后行游离皮片移植修复术，术区恢复好。组织病理诊断：头皮疣状癌伴皮角。
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user: 1. 引言 皮角是一种临床实体，通常表现为皮肤损害。主体由致密的角质构成，基底部可以呈现不同的病理变化。因此对皮角的关注并不在其本身，而是在皮角基底部。皮角的基底部可能是恶性病变，以并发鳞状细胞癌最为常见，而疣状癌是分化良好的特殊类型鳞癌。我科收治1例头皮疣状癌伴皮角患者，经手术治愈，术后恢复好。征得患者知情同意，现报道如下。
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user: 2. 临床资料 患者男，85岁，渔民，主因“头皮左顶部肿物7年余，生长加快1年余。”入我科就诊。7年前患者头顶部出现一个黄豆粒大小的皮肤突起，后增大成羊角样，无痛痒。患者间断自行切除后继续增大，近1年肿物增长加速并向四周扩散，且伴痛痒。体格检查：一般情况好，全身浅表淋巴结未触及肿大，各系统检查均无明显异常。皮肤科检查：头皮左顶部可见体积大小约5 cm × 4 cm × 3 cm灰白色角质性增生物，表面呈菜花样分叶状，质硬；肿物边界清楚，周缘有红肿伴少量渗出液(图1)。患者完善相关辅助检查，排除手术禁忌后，在局部浸润麻醉下行皮肤病损扩大切除术 + 游离皮片移植术，术中沿肿物边缘外1 cm设计线切开头皮至帽状腱膜下，完整剥离肿物(图2)。组织病理学检查示：表面角化亢进，呈疣状，下方呈杵状推挤式浸润深部组织；癌细胞异型性小，无挖空细胞(图3)。根据临床及组织病理学诊断：头皮疣状癌并发皮角。手术顺利，术后13天拆线，见皮瓣红润，生长良好(图4)。随访1年未复发(图5)。 图1. 头顶部大小约5 cm × 4 cm × 3 cm灰白色角质性增生，表面呈菜花样分叶状 图2. 沿肿物边缘外1 cm设计线切开头皮至帽状腱膜下 图3. 组织病理：表面角化亢进，呈疣状，下方推挤式浸润深部组织；癌细胞异型性小，无挖空细胞。(HE染色，×40) 图4. 术后13天 图5. 术后1年恢复情况
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user: 3. 讨论 皮角是一种形状类似动物犄角，质硬、凸起于皮肤的赘生物。1931年Moeorps首先用皮角这个词来描述在形态、硬度等方面与兽角相似的角化过度皮肤 [ 1 ] [ 2 ]。1670年，丹麦解剖学家Thomas Bartholin对一位有皮角的患者进行详细描述并对其病因学做出正确推断。1971年，英国外科医生John Hunter and Everard Home证实了他的推断 [ 3 ]。 皮角好发于40岁以上身体经常暴露在阳光下的老年患者，好发部位以头面部和颈部居多 [ 4 ]。也会发生于非暴露区域，如阴茎、足跟等处。来自印度的Pal D [ 5 ] 等报道了阴茎皮角，杨露露 [ 6 ] 等报道了足跟疣状癌的病例。长期的日光照射能诱发角质形成细胞增生、变性，促进皮肤光老化，导致皮角的发生 [ 7 ]。皮角形状各异，如圆柱形、圆锥形、尖形、横向或纵向波纹，或者酷似羊角。皮角本身的组织病理学表现为角化过度(皮肤角质层增厚)和角化不全(角质层细胞核滞留)，通常与非典型角质形成细胞有关。皮角仅仅是一种形态学描述，并不是一种病理学诊断，它是从一个可能是良性、癌前病变或恶性的基底部肿块中突起的。因此，皮角良恶性的诊断取决于基底部 [ 8 ]。在良性病变中，病毒疣、角化棘皮瘤及脂溢性角化病最常见。在癌前病变的病例中，日光性角化病(actinic keratosis， AK)最常见；在癌性病变的病例中，以鳞癌(SCC)最常见。当基底部出现充血、浸润时，考虑为恶变征兆。根据Yu等人的一项研究，61%的皮角来源于良性病变，23.2%来源于癌前病变，15.7%来源于恶性病变 [ 2 ]。此外，皮角也会出现由恶性肿瘤转移形成，如肾癌的皮肤转移 [ 9 ]。皮角的癌变发生率是10%~40%，皮角只是肉眼上的诊断，一旦皮角出现，应及时进行病理学检查鉴别良恶性，并采取相应的治疗。手术切除仍然是大多数情况下的首选治疗方法 [ 10 ]。 疣状癌属于皮肤或黏膜恶性肿瘤，组织学属于低度恶性鳞状细胞癌，呈疣状或菜花状生长。好发于皮肤–黏膜交界处或被覆鳞状上皮的黏膜 [ 11 ]。张伟 [ 12 ] 等报道过头皮疣状癌一例。疣状癌以局部侵袭性生长为主，极少发生局部淋巴结及远处转移，治疗以手术切除为主，确保切除范围足够。疣状癌对放化疗不敏感，一般不主张行放化疗。疣状癌属于细胞分化良好的低度恶性肿瘤，术中应完整切除肿瘤，确保切缘阴性，减少复发率，提高患者的生存质量。 本例为一圆柱形菜花样皮角，患者为渔民，因长期海上工作暴露在阳光下。皮角起初为黄豆粒大小，考虑为AK，其形成可能与紫外线照射有关。患者多次切除对肿物造成刺激，致肿物生长更加迅速并发生恶性病变。行手术切除及游离皮片移植术后痊愈。Lober等认为AK到SCC是一个延续的进展过程，若不及时阻止AK的进展，最终可能会转变为皮肤鳞癌 [ 13 ]。根据患者病史考虑该病例是在日光性角化病基础上进展为鳞癌，又在鳞癌基础上伴发皮角。
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user: 4. 总结 皮角基底部的病变可能是良性、癌前病变或恶性。手术是最基本的治疗方法，主要涉及病变的切除活检。皮角的存在对患者的身心健康均会造成影响，一旦发生，应及时明确诊断并治疗，以避免对病人造成身体和心理压力。
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user: 摘要 脑微出血是脑内微小血管病变导致的以微小出血为主要特征的亚临床损害，是脑小血管病的重要表现之一。脑微出血好发于老年人，目前研究认为，脑微出血与卒中风险的增加、认知功能障碍、步态障碍等密切相关。高龄、高血压和脑淀粉样血管病是公认的脑微出血的病因，同时一些危险因素与脑微出血的发病相关，这些危险因素与脑微出血发病相关的机制目前尚未完全清楚。本文对脑微出血相关危险因素的研究进展进行综述，旨在为脑微出血的预防和治疗提供一定依据。
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user: 1. 引言 脑微出血(Cerebral Microbleeds， CMBs)是一种常见的亚临床脑血管疾病，由脑小血管的破裂或结构异常导致血液从受损血管泄漏后产生的含铁血黄素沉积引起，其在核磁共振梯度回波T2*加权成像和磁敏感加权成像上呈均匀的圆形或卵圆形的(通常直径为2~5 mm，最大可达10 mm)低信号缺损 [ 1 ]。CMBs的患者没有明显的临床症状或体征，在健康人群中CMBs的患病率为4.5% [ 2 ]，在卒中患者中的患病率因卒中类型的差异而波动在16.1%~71% [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]，在血管性痴呆患者中CMBs的患病率约为14.3% [ 6 ]，而在阿尔茨海默病患者中CMBs的患病率高达37.3% [ 7 ]。虽然CMBs没有明显的临床症状，但会导致认知功能障碍、情绪改变、老年精神病综合征、步态异常、溶栓后出血转化等一系列并发症 [ 8 ]。此外，CMBs与未来卒中风险增加有关，可作为卒中复发的预测因子 [ 9 ]。目前研究表明，CMBs的发生率与高龄、高血压、糖尿病、血脂异常、脑淀粉样血管病、脑白质病变等危险因素有关 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]。不同位置的CMBs涉及不同的病因，脑叶微出血与脑淀粉样血管病有关，深部或幕下微出血与高血压或动脉粥样硬化性微血管病变有关 [ 13 ]，这些危险因素与CMBs发病相关的机制尚未完全清楚。现就CMBs发病危险因素的研究进展进行综述。
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user: 2. 不可干预的危险因素 2.1. 年龄 年龄是CMBs最重要的独立危险因素之一，既往研究表明，CMBs的患病率随着年龄的增长而逐渐增加，其发生率从45~50岁人群的6.5%上升至80岁以上人群的35.7% [ 13 ]。国外的一项动物实验研究对注射了低剂量脂多糖的幼龄(3个月)和老龄(18个月)小鼠的大脑切片进行组织化学染色后发现，与幼龄小鼠相比，老龄小鼠的CMBs数量、大小及总面积显著增加(p < 0.01)，表明衰老使小鼠的大脑更容易受到炎症诱导而产生急性的CMBs。同时研究者还发现，用脂多糖处理的老龄小鼠的星形胶质细胞活化增加，进一步表明衰老增加了大脑对神经炎症的敏感性 [ 14 ]。目前，与年龄相关的CMBs增加的潜在机制尚不清楚，可能与衰老使血脑屏障通透性增加 [ 15 ] 和大脑对炎症的易感性增加有关 [ 14 ]。 2.2. 性别 性别对CMBs的影响目前尚存争议，Tomohiro等 [ 16 ] 发现男性在任何部位患CMBs的风险均高于女性，在对多种危险因素进行调整后，深部和幕下CMBs的性别差异较前缩小，而脑叶CMBs的性别差异没有变化，这可能是由于男性比女性有更多的心血管危险因素所致。也有研究表明，性别不是CMBs的危险因素 [ 17 ]。目前，CMBs患病率存在性别差异的相关机制尚不清楚，需进一步研究。 2.3. 遗传因素 与CMBs发生相关的遗传因素包括与散发性CMBs相关的基因多态性和家族性疾病相关的基因突变。与散发性CMBs相关的最常见的基因多态性是19号染色体上的载脂蛋E (APolip-oprotein E， ApoE)基因，其编码一种参与脂质和胆固醇代谢的蛋白质，在神经元生长、突触可塑性、膜修复和β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein， Aβ)清除中起重要作用 [ 18 ]。在人类中，存在3种ApoE等位基因，分别是ε1、ε2和ε4 [ 19 ]。Silvia [ 20 ] 等对比了564名受试者ApoE基因分型与CMBs的关系后发现，ApoE-ε4与脑叶微出血显著相关，而ApoE-ε2和CMBs没有关联，可能与APOE-ε4增加Aβ血管沉积和血管壁增厚有关。ApoE-ε2对CMBs的影响尚存争议，有研究者提出ApoE-ε2与CMBs呈正相关，可能是因为ApoE-ε2会导致血管纤维蛋白样坏死，加重血管内皮损伤，诱发CMBs [ 21 ]。此外，全基因组关联研究也证实，ApoE-ε4与CMBs的存在和进展独立相关，同时还发现单核苷酸多态性与CMBs有关 [ 22 ]。家族性疾病中与CMBs相关的基因突变包括常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病中的NOTCH-3 (neurogenic locus notch homolog protein 3)基因突变 [ 23 ]，家族性阿尔茨海默病中的APP (amyloid precursor protein)和早老素基因突变 [ 24 ]。基于目前的研究结果，需进一步探索这些已确定的基因多态性及突变引发CMBs的相关机制。
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user: 3. 可干预的危险因素 3.1. 高血压 高血压是CMBs最重要的危险因素，有效控制血压能降低CMBs的发生。研究表明，血压未得到控制的患者患CMBs的风险高于血压正常的患者 [ 25 ]。林 [ 10 ] 等对比460例高血压患者血压水平和CMBs严重程度的关系后发现，与无CMBs的患者相比，CMBs的患者收缩压和舒张压均显著升高，同时CMBs的严重程度随着高血压等级的增加而显著增加。说明应重视高血压患者的降压治疗，以避免CMBs的增加。有研究者提出，高血压会增加大脑后动脉区域以及深部和幕下部位CMBs的风险，穿透深部灰质核团和白质的小血管更容易受高血压影响，引起血脑屏障破坏，血管渗漏，最终导致CMBs [ 26 ]。因此，高血压能预测CMBs发生的位置。目前高血压诱发CMBs的机制尚不完全清楚，除了血脑屏障破坏和异常渗透外，可能与动脉硬化有关，高血压会引起一系列的微血管结构改变，例如管壁增厚、管腔狭窄、微血管延长和弯曲，导致脑血管自动调节紊乱，进而引起血管壁弹性和顺应性降低，血管壁脆性增大，使血管更容易受血压波动和由此产生的机械应力损伤的影响，最终引起CMBs的发生 [ 25 ]。 3.2. 糖尿病 糖尿病也是一个重要的危险因素。一项基于人群的梅奥衰老临床研究(The Mayo Clinic Study of Aging， MCSA)发现，糖尿病与CMBs的进展有关，在已存在CMBs的基础上，可增加后续发生CMBs的风险 [ 27 ]。国内的一项前瞻性研究表明，较高的血糖水平与深部或幕下的CMBs相关，与脑叶CMBs无关 [ 28 ]，证实CMBs的血管病理改变因位置而异。Shima [ 5 ] 等对比不同种族的缺血性卒中患者CMBs的数量及相关因素后发现，糖尿病与多发性CMBs密切相关。既往研究表明 [ 29 ]，糖尿病前期状态或糖尿病家族史可能与血管内皮功能障碍和血管壁损伤有关。血管内皮功能障碍可能会增加血脑屏障通透性，从而导致血浆成分泄露到血管壁和周围脑实质中，形成CMBs [ 30 ]。研究发现 [ 31 ]，糖尿病药物的合理使用与CMBs呈负相关，目前尚需进行更大规模的研究来阐明使用药物控制的糖尿病患者是否比未控制的糖尿病患者具有更少的CMBs。 3.3. 血脂异常 血脂异常被认为与CMBs密切相关，其中血清总胆固醇(total cholesterol， TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、甘油三酯(triglyceride， TG)均与CMBs相关。日本的一项研究发现，较低的TC和HDL-C水平与深部CMBs的高患病率有关 [ 32 ]。Tomohiro [ 16 ] 等在社区老年人群中进行的前瞻性研究显示，较低水平的TC是深部或幕下CMBs的重要危险因素，表明TC是与CMBs发生相关的保护性因素。胆固醇是细胞膜的基本结构元素，随着脂质水平的降低，红细胞膜的渗透性会增加 [ 33 ]。据报道，TC水平较低会导致脑内小动脉平滑肌变性和内皮损伤，增加血管壁的脆性，进而形成微动脉瘤，从而导致CMBs的发生 [ 34 ]。也有研究者认为，较高水平的HDL-C与任何部位CMBs的风险增加显著相关，TG水平与CMBs风险呈负相关 [ 35 ]。目前尚不清楚HDL-C引起CMBs的相关机制，HDL-C水平的增加对脑血管有“双重相反的影响”，一方面，HDL-C具有抗氧化及抗炎特性，能改善内皮功能，促进内皮修复 [ 36 ]；另一方面，较高水平的HDL-C可能会导致胆固醇从大脑向外周组织的反向转运减少，造成胆固醇堆积，这可能有助于淀粉样蛋白的血管沉积，进而导致淀粉样血管病 [ 37 ]。需要进一步研究HDL-C对CMBs产生差异性影响的相关机制，同时监测CMBs患者的血脂水平，可能有助于预防新发的CMBs。 3.4. 高同型半胱氨酸血症 同型半胱氨酸(homocysteine， Hcy)是一种含硫氨基酸，参与甲硫氨酸循环。较高的同型半胱氨酸水平会对血管壁的内皮细胞和神经元产生毒性反应，导致内皮功能障碍，并通过各种机制促进动脉粥样硬化形成，因而高同型半胱氨酸血症被认为是CMBs的一种独立危险因素 [ 38 ]。国内的一项回顾性研究发现 [ 39 ]，Hcy水平与CMBs的存在呈正相关，尤其与脑叶CMBs显著相关。Nam [ 40 ] 等的研究也证实，Hcy水平是脑叶CMBs的独立预测因素。其可能的相关机制是：较高的Hcy水平通过触发内质网应激和炎症级联反应来破坏血脑屏障 [ 41 ] [ 42 ]，使血脑屏障通透性增加，导致血浆成分泄露到血管周围，形成CMBs。此外，升高的Hcy水平也可能会增加Aβ的形成，同时通过淋巴途径使Aβ清除减少，导致Aβ的血管沉积，加剧血脑屏障的破坏，最终诱发脑叶CMBs [ 43 ]。既往研究表明 [ 44 ]，补充叶酸和维生素B12能降低血浆Hcy水平，叶酸具有抗氧化作用，有助于血管内皮修复。目前补充B族维生素是否有助于降低CMBs发生的风险，有待前瞻性干预研究的进一步探讨。 3.5. 抗栓治疗 一些研究者提出抗血栓治疗可能与CMBs的进展有关。先前发表的一项研究表明，阿司匹林与缺血性卒中患者CMBs的发生率显著相关，长期服用阿司匹林的患者容易出现CMBs [ 45 ]。Jia [ 46 ] 等在急性卒中患者中进行的研究显示，在抗血小板治疗前，有5个或更多CMBs的急性脑梗死患者接受抗血小板治疗后CMBs的数量显著增加，表明抗血小板治疗增加了缺血性卒中患者新发CMBs的风险。Cheng [ 47 ] 等的研究发现，既往使用抗血栓药物与伴有房颤或风湿性心脏病的缺血性卒中患者CMBs的存在独立相关，尤其与脑叶的CMBs有关。抗血栓药物本身是否会引起CMBs仍不清楚，需进一步研究。抗栓治疗会增加CMBs发生的风险，在开始长期抗栓治疗前筛查CMBs可能有助于降低药物相关性CMBs的发生率，此外，在CMBs尤其是多发性CMBs的患者中，需权衡与CMBs进展相关的风险与抗栓治疗的益处之间的关系，慎用抗血栓药物。
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user: 4. 其他危险因素 4.1. 脑淀粉样血管病 脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy， CAA)是广泛认可的危险因素，既往研究已证实，脑叶CMBs与脑淀粉样血管病有关 [ 13 ]。一个针对老年人群的MCSA研究发现，即使考虑了已存在的CMBs，淀粉样蛋白负荷依然会增加新发的脑叶CMBs的风险，尤其是枕叶的CMBs [ 27 ]。Jonathan [ 11 ] 等的研究显示，淀粉样蛋白负荷与脑叶CMBs相关，尤其在顶叶、枕叶和颞叶区域，但与深部或幕下CMBs无关，这与CMBs不同部位的血管病理学研究结果一致 [ 8 ]。CAA首先累及软脑膜和皮质血管，而高血压性血管病首先累及深部的穿支动脉。血管受累的差异可能与血流速度有关。在CAA中，当皮质表面的小动脉到达血流减慢的毛细血管时，淀粉样蛋白容易沉积在软脑膜血管壁上；而穿支动起源于大动脉，血流速度较快，较少引起淀粉样蛋白的沉积 [ 48 ]。因此，CMBs在CAA和高血压性血管病中具有明显的分布差异，这两种血管病理机制均会对血脑屏障造成破坏，引起血液渗漏，最终形成CMBs。 4.2. 脑白质病变 脑白质病变(white matter lesions， WMLs)是多种病因引起的神经传导纤维脱髓鞘的改变，在老年人群中较常见 [ 49 ]。WMLs和CMBs均属于脑小血管病，既往研究显示，较严重的WMLs是CMBs的显著独立预测因素，且这一相关性比年龄更密切 [ 12 ]。Zhou等的研究也得出了相同的结论。CMBs是含铁血黄素沉积在病变血管周围，而WMLs是神经纤维脱髓鞘改变，这两种病变同时存在时，可能会加重对血脑屏障的破坏，引起CMBs [ 50 ]。目前CMBs与WMLs相关的机制尚不清楚，有待进一步研究证实二者是否存在共同的发病机制。
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user: 5. 小结与展望 综上所述，高龄、高血压、糖尿病、高同型半胱氨酸血症、抗栓治疗、脑淀粉样血管病及脑白质病变均与CMBs的发病密切相关，而其他危险因素目前尚存争议，有待进一步研究证实。随着影像技术的发展，CMBs的检出率日益增高，明确CMBs的危险因素，阐明其相关的发病机制，对CMBs的预防和治疗具有重要意义。未来的研究应将发病机制与危险因素作为可干预的靶点，探索有效的治疗策略，以减少CMBs的发生。
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user: 摘要 神经毡蛋白(Neuropilin， NPN/NRP)是分泌糖蛋白的细胞表面受体，为非酪氨酸激酶受体，有NPN1及NPN2两种亚型。NRPs最初分别通过介导3类信号素和血管内皮生长因子驱动的信号通路参与神经元引导、血管生成和胚胎血管生成的过程。除此之外，NPN目前已知的调节众多信号通路的配体还包括表皮生长因子(Epidermal growth factor， EGF)，成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors， FGF)，血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor， PDGF)和转化生长因子-β (transforming growth factor-β， TGF-β)等。本文总结了NPN的相关配体，并对其信号传导通路作简单介绍，为NPN的研究提供新的思路。
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user: 1. 引言 神经毡蛋白(NPN/NRP)是分泌糖蛋白的细胞表面受体，是一类分子量为120~140 KD的I型跨膜蛋白，在神经生长、心血管发育、免疫反应以及肿瘤生长和血管化中发挥作用，可参与机体的一系列生理和病理过程 [ 1 ]。首先利用原位杂交和免疫标记技术在胚胎脑切片上研究Neuropilin受体NPN1和NPN2的表达，再用这两种方法，在端脑背侧皮质板观察到NPN1和NPN2，这表明NPN在分化的神经元中表达 [ 2 ]。两种Neuropilin亚型NPN-1和NPN-2在55个人中有44%的序列同源性，并在不同的通路上发挥作用。它们都具有三个胞外结构域、一个跨膜螺旋和一个短的细胞质尾巴的模块化结构 [ 3 ]。胞外区包括两个CUB (complement-binding protein homology)结构域(a1/a2)、凝血VIII同源结构域(b1/b2)和MAM (Meprin/A5-protein/PTPmu)结构域(c)。a1a2模块，与信号量3A (SEMA3A)相互作用，介导发育中的神经元生长锥崩溃的刺激。c结构域，与meprin、A5和mua-磷酸酶(MAM)同源，最初被认为参与二聚，但更有可能通过将前面的结构域从膜上定位而促成复杂的组装。单一的跨膜螺旋结构有助于homo和异源二聚化，c端细胞质尾部被认为有助于通过连接素信号，刺激受体介导的内吞作用 [ 3 ] [ 4 ]。人类基因组NPN2与孤独谱系疾病及癫痫等多种神经系统疾病相关，总结NPN的不同配体，特别是阐明其发挥作用可能涉及的信号传导通路，对于深入认识神经系统疾病，具有至关重要的意义 [ 5 ] [ 6 ]。
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user: 3. 总结 由于NPN在神经生长、心血管发育、免疫反应以及肿瘤生长等过程中都起重要作用，因此，研究NPN的病理生理功能及信号传导通路对寻找治疗神经系统疾病、心血管疾病和肿瘤等中国高发疾病的潜在靶点具有重要意义。以上总结了NPN的相关配体及其发挥作用的信号传导通路，为NPN参与致病机制的疾病的治疗提供了新的思路，也为相关靶点的研究提供了新的切入点，可以通过抑制配体与受体的结合或抑制配体的表达从而对疾病的治疗提出更有效的治疗方案，早日为患者带来福音。
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user: 摘要 含有锌指的TiaS (tRNA Ile2 agmatidine synthetase)蛋白是来自古菌的酶，具有四个结构域，功能是利用ATP水解释放的能量在tRNA Ile2 反密码子CAU的简并碱基胞嘧啶Cyt34的2’碳原子上面加上胍基丁胺Agmatine修饰，从而让tRNA Ile2 成熟不识别AUG，而正确识别AUA密码子。单独TiaS蛋白，TiaS蛋白与tRNA复合物结构已经解析，酶催化修饰的分子机制获得了较深入解读。生化实验表明，TiaS蛋白N端三个结构域具有催化活性，TiaS为焦磷酸酶，可以水解ATP。并且TiaS蛋白的N端结构域可以起到激酶的作用，自磷酸化Thr18氨基酸残基。C端锌指距离酶核心较远，对于识别结合底物具有重要作用。本文总结TiaS蛋白研究进展。对于TiaS蛋白的深入研究，将为深入理解酶催化机制，为酶的工程改造，为锌指的工程改造开辟思路。包括锌指与CRISPR/Cas在内的靶向核酸元件在生命医药和研究领域有广泛应用，TiaS蛋白锌指结构新特性的研究也为基于锌指的靶向核酸组件设计打下基础。
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user: 1. RNA修饰与tRNA Ile 反密码子胞嘧啶Cyt34的修饰 目前已经发现自然界中有百余种RNA的修饰，在三界生物系统中均有存在。其中tRNA的修饰种类最多样 [ 1 ] [ 2 ]，对于正常生命活动过程有很重要的作用。有些tRNA的修饰，改变了tRNA的性状，使其更加稳定不易被RNA酶降解。有一些修饰改变了tRNA的身份，使其可以被其它的氨酰tRNA合成酶识别，携带另一种氨基酸。真核生物用tRNA Ile 第34位的假尿嘧啶(pseudouridine)或者肌苷酸碱基(inosine)，来识别AUA密码子的腺嘌呤碱基 [ 3 ]。tRNA Ile 反密码子中第34位胞嘧啶Cyt34上的修饰对于细菌和古菌AUA密码子的解码都是必需的。细菌中TilS蛋白使用赖氨酸来修饰tRNA Ile 前体的Cyt34，从而改变了tRNA Ile 对于氨酰tRNA合成酶以及密码子的特异性识别 [ 4 ] - [ 9 ]。 细菌的TilS蛋白催化tRNA Ile 前体的Cyt34修饰后，形成包含新碱基Lysidine34的新型反密码子LAU，可以识别AUA密码子，而不修饰的此tRNA Ile 前体可以被甲硫氨酰tRNA合成酶(MetRS)加上甲硫氨酸，并识别AUG密码子 [ 4 ] [ 10 ]。TilS识别tRNA的接受臂位置，包括核苷酸Cyt29-Gua41，还识别反密码子环附近的Ade35、Ura36和Ade37等核苷酸 [ 8 ]。更有趣的是，如果将tRNA Met 的接受臂替换成为tRNA Ile 的接受臂，此tRNA可以被TilS进行修饰，生成可以与Ade配对的Lysidine碱基。所以通过逻辑推理可以想象，细菌内必然有一定的机制来保证TilS对tRNA Ile 前体的修饰及时快速的进行，以避免MetRS错误的将甲硫氨酸连接到未修饰的tRNA Ile 前体上面，造成遗传信息表达的错误。将大肠杆菌的RNaseE敲除掉，抽提其中的tRNA，分离纯化出来其中的tRNA Ile ，使用RNaseT1进行水解，质谱分析，发现所有成熟的tRNA Ile 都已经被修饰成Lysidine34，而未成熟的tRNA Ile 多数也已经被lysine修饰，只有少量的尚未被修饰(第34位仍然以胞嘧啶Cyt34的形式存在) [ 8 ]。所以推测，细菌内对于tRNA Ile 的修饰是在其刚被转录出来的前体时期就开始进行的，在其成熟时保证被修饰，从而保证遗传信息的高保真表达 [ 8 ]。 依据密码子表(附表1)，AUA密码子编码异亮氨酸。在以Archeoglobus fulgidus为代表的很多古菌中，前人通过一系列基因组序列分析与实验只发现了反密码子为CAU/CAT的tRNA基因，并没有发现反密码子是UAU/TAT的tRNA Ile 基因。以古菌Archeoglobus fulgidus为例，2009年以前已确知的唯一的Af-tRNA Ile 是tRNA数据库中编号为tdbD00005900的Af-tRNA Ile1 (http://trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/Search)，反密码子是GAU，解码AUC并编码异亮氨酸。根据已知，存在编码异亮氨酸的AUA密码子，可以推测存在解码AUA密码子的Af-tRNA Ile ，在A. fulgidus基因组里并没有发现包含反密码子UAU/TAT的tRNA基因，只发现了包含反密码子为CAU的tRNA基因，推测存在一定的修饰或者编辑等生物学过程使得Cyt与Ade能够很好的配对，从而解码AUA密码子。1984年科学家在Halobacterium volcanii古菌中发现了结构未知的tRNA Ile 胞嘧啶修饰 [ 11 ]。这是发现新型tRNA反密码子修饰的其中一种方法。Haloarcula marismortui，Methanococcus maripaludis，Sulfolobus solfataricus，Sulfolobus tokodaii，Archaeoglobus fulgidus等古菌细胞内分离获得转录出来的包含反密码子CAU的tRNA，对其进行质谱分析，发现了新型的tRNA修饰 [ 12 ] [ 13 ]，经过质谱等实验鉴定Af-tRNA，这就发现了胞嘧啶的胍基丁胺修饰。这些古菌中没有类似于细菌TilS的同源蛋白 [ 4 ]。
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user: 2. tRNA Ile2 修饰酶TiaS蛋白 TiaS蛋白(tRNA Ile2 agmatidine synthetase)是来自于古菌中的酶，功能是在tRNA Ile2 前体反密码子CAU的Cyt34上面加上胍基丁胺Agmatine修饰，从而使其不识别AUG，而识别AUA密码子。2010年Tsutomu Suzuki及Uttam RajBhandary等，在Euryoarchaeota，Crenarchaeota和Thaumarchaeota等中，发现了古菌的AUA解码系统 [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]。该系统使用Agmatine这一个在哺乳动物神经系统中也存在的多氨基化 图1. TiaS酶利用ATP催化Agmatine修饰到tRNA Ile2 的Cyt34 合物 [ 15 ] [ 16 ] 来修饰tRNA Ile2 前体，将Agmatine的氨基共价连接到Cyt34嘧啶环的2’碳原子上，生成的碱基被称为Agmatidine或者Agm 2 C。此共价修饰使嘧啶环的3’氮原子发生质子化，这样在碱基配对时就能够与带负电荷的原子形成氢键，而发生质子化前形成氢键的话是通过接受质子来形成的。C4原子上面连接的氨基转变成为亚氨基，从而改变了氢键配对的形成方式，如图1。进一步实验发现，此反密码子为CAU的tRNA Ile2 前体经过TiaS蛋白的修饰后，生成可以解码AUA密码子的成熟tRNA Ile2 [ 13 ]。没有修饰的tRNA Ile2 前体会被连接上甲硫氨酸，而不是异亮氨酸。催化这个反应的酶就被命名为TiaS。在这些微生物细胞中，刚转录生成的tRNA Ile2 前体需要迅速被修饰成熟，以保证在合成蛋白质时遗传信息的高保真性传递。确实，TiaS蛋白可以修饰未经剪切的含有5’与3’冗余序列的tRNA Ile2 前体(precursor tRNA Ile2 ) [ 13 ] [ 17 ] [ 18 ]。TiaS蛋白的活性存在自然选择压力，会向催化速率更高的方向进化，所以，经过自然界长期的自然选择，野生型的TiaS蛋白，在保证底物特异性、蛋白高温稳定性等要求的条件下，应该是朝着其能够达到的最高酶综合活性趋近。在细胞中，酶(TiaS蛋白)、底物(tRNA Ile2 前体、Agm)、酶–底物复合物、辅因子ATP等的浓度可能与传统酶学方程中的假设有所不同。TiaS具有较高的底物选择性 [ 19 ]，不像TilS可以将许多种不同底物类似物分子修饰到tRNA上面。 Af-TiaS蛋白的来源物种古菌A. fulgidus是嗜热菌，最适生长温度为83℃，可以生存的温度范围是约60℃~95℃。Af-TiaS蛋白有420个氨基酸残基，理论分子量约48 kDa，理论等电点5.7。目前有Archeoglobus fulgidus物种来源的TiaS蛋白的若干个晶体结构得到解析 [ 17 ]，有力的推动了对于tRNA Ile2 修饰成熟机制的理解。TiaS蛋白有4个结构域，酶催化功能主要由N端3个结构域组成的酶核心完成，它们可以结合tRNA Ile2 的反密码子环。Tsutomu Suzuki等解析的TiaS蛋白结合tRNA Ile2 的两个晶体结构(3AMT.pdb，TiaS-tRNA Ile2 -ATP；3AMU.pdb，TiaS-tRNA Ile2 -AMPCPP-Agmatine)，第4个结构域都是无序的，看不到半胱氨酸以及鳌合的金属原子 [ 17 ]。另外一个结构不结合tRNA (3AU7.pdb)，去除了整个锌指结构域，是只有酶N端3个结构域的截短体 [ 17 ]。中国科学家解析了首个自由全长的单独的TiaS蛋白结构(3U02.pdb，5XOB.pdb)，首次展示了TiaS蛋白完整的第4个结构域 [ 19 ] [ 20 ]，如图2。TiaS蛋白C端的第4个结构 图2. 目前解析的典型的4个结构域TiaS蛋白的晶体结构，a. 自由单独的TiaS蛋白结构(5XOB.pdb，2.5埃分辨率)，b. 结合了ATP类似物AMPPCP与Agmatine的TiaS蛋白结构(6AGG.pdb，2.7埃分辨率)，c. TiaS-tRNA Ile2 -ATP复合物晶体结构(3AMT.pdb，2.9埃分辨率)。ab具有完整的锌指结构。a/b与c之间的主要区别在于锌指结构域的构象，abc之间P2-loop的构象也有区别(摘自ref. 20) 域是锌指结构域(zinc ribbon domain， ZRD)，锌指通过一段长长的反向平行β折叠片与酶核心相连接，距离催化中心较远，锌指识别结合底物tRNA Ile2 的接受臂。不同古菌物种来源的TiaS蛋白序列比对发现，TiaS的锌指序列特征是CX2CX14CX2C。四个保守的负责鳌和锌原子的半胱氨酸残基是Cys352，Cys355，Cys370，Cys373。TiaS蛋白的4个结构域均可以找到同源结构，比如TiaS锌指结构域与RNA聚合酶II的锌指具有较高的三维结构相似性。但是这四种结构域的组合(TCKD，FLD，OBD，ZRD)是在TiaS蛋白家族中首次发现的，如图2。嗜热菌来源的TiaS蛋白有非常大范围的氢键网络和疏水相互作用，可能对于适应高温环境、稳定蛋白结构有重要作用。
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user: 3. TiaS蛋白的构象 依据锌指结构的差异，目前解析的TiaS蛋白晶体结构有两种主要的构象，一种主要构象是不结合底物tRNA的TiaS蛋白构象，硒代蛋白的结构与Native的结构相同，同时结合了AMPPCP与胍基丁胺Agmatine的TiaS蛋白晶体结构与自由的TiaS蛋白晶体结构基本相同，结合了另一种不同的ATP类似物AMPCPP的构象与此锌指构象也基本相同 [ 20 ]，如图2。第二种主要构象是结合了底物tRNA Ile2 与ATP的构象(3AMT.pdb)，结合了Agmatine形成的TiaS-tRNA Ile2 -AMPCPP-Agmatine四元复合物晶体结构(3AMU.pdb)与这一个三元复合物的结构基本相同 [ 17 ]。这两种主要构象之间的差别在于锌指结构的差异，如图3。引起这种锌指构象差异的主要原因是底物tRNA Ile2 的结合与否。除了这两种主要的构象之外，结合辅因子ATP或者ATP类似物与否，P2-loop会呈现不同的构象 [ 20 ]。不同古菌物种来源的TiaS蛋白序列比对发现，负责ATP结合的P2-loop比较保守。自由的TiaS蛋白，解析的结构中没有观察到负责ATP结合的P2-loop电子密度，表明了其构象的不均一性。结合了辅因子ATP或者ATP类似物以后，可以观察到P2-loop的主链，侧链不清晰 [ 20 ]。结合了底物tRNA Ile2 与ATP的构象显示，P2-loop主链侧链均可以清晰的观察到(3AMT.pdb)。tRNA Ile2 的反密码子环从一侧结合P2-loop，ATP从另一侧结合P2-loop。从这几个结构的不同之处，以及P2-loop的变化过程可以看出来，自由的P2-loop存在柔性，构象不均一，夹在中间的P2-loop随着两侧底物、辅因子的结合，构象逐步稳定下来。这几个结构的分辨率较为接近，如图2，图3。 图3. 蛋白质晶体学发现的TiaS蛋白的两种主要构象的区别(摘自ref. 20)
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user: 4. TiaS蛋白的分子动态特征 TiaS蛋白在不同状态下构象的差异，表明了TiaS蛋白分子很可能存在结构的动态变化现象。分子动力学模拟(Molecular dynamics simulation)，对于运动轨迹的主成分分析(Principle component analysis)，常规模态分析(Normal mode analysis) [ 21 ] 等方法都可以用来研究蛋白质分子的动力学特征。 研究表明，三种方法的研究结果基本一致 [ 20 ]。首先，TiaS蛋白分子结构动态变化的主要位置均显示是在锌指结构域，这与蛋白质晶体学实验观察到的两种主要不同构象的差异位置是一致的 [ 20 ]。其次，TiaS蛋白分子动态变化的模式，三种方法都显示，是TiaS蛋白分子锌指结构域与酶核心连接的linker扭动或者伸展收缩运动引起的锌指结构域的大幅度构象变化 [ 20 ]。第三，TiaS蛋白锌指结构运动的方向，结合底物tRNA Ile2 的构象显示，锌指结构域比自由的TiaS蛋白朝向OBD结构域方向摆动了一些，锌指距离酪氨酸Tyr185更远，同时，锌指结构域有一定角度的扭动。总体来说，结合底物tRNA Ile2 的构象其锌指朝向底物结合的方向进行了大幅度的运动，如果以自由的TiaS蛋白结构与底物tRNA Ile2 构建的复合物为起始模型，分子动力学模拟显示，锌指结构域也朝向底物tRNA Ile2 方向运动 [ 20 ]。下面总结常规模态分析给出的TiaS蛋白分子的运动特征 [ 22 ] [ 23 ]。 图4. 常规模态分析自由TiaS蛋白的分子动力学特征。abc，从锌指一侧沿着Af-TiaS蛋白的长轴俯视图；ad，be，cf分别对应展示第一二三种模态的动力学特性。def，Af-TiaS蛋白侧视图，催化活性中心朝向纸面外。g，为方便讨论，人为给Af-TiaS蛋白指定的方位图 TiaS蛋白的第一种运动模态是锌指结构域向远离活性中心方向的摆动。如果以反密码子结合的口袋一面为腹面或前面，以对面为背面或后面，以锌指为头部，锌指运动的方向为上方，类似于抬头运动，朝上并略朝向后方的抬头运动。如图4。这个运动方向与结合底物tRNA Ile2 引起的运动方向是相反的。TiaS蛋白第二种运动模态是锌指朝向Tyr185残基方向的摆动，类似于锌指朝左侧下方的点头运动。自由TiaS蛋白锌指朝左下方侧向点头，与结合底物tRNA Ile2 引起的运动方向相反。第三种运动模态是绕着连接linker扭动或者称作转动，参照图4(g)，扭动方向是向TiaS的左侧。这三个方向上的往复运动已经可以为锌指提供多位置多角度灵活定位的可能性。所以，连接linker反向平行β折叠片的柔性使得锌指具有了多种可选择的构象，来适配结合底物核酸。 图5. 底物tRNA结合引发TiaS构象变化模式图。左图，解析的首个自由全长的4结构域TiaS蛋白结构(5XOB.pdb，2.5Å)，锌指结构域有大面积的正电荷，是与底物tRNA Ile2 接受臂结合的区域。右图，推测的底物tRNA Ile2 (棕色)与TiaS蛋白(紫色，无构象变化)结合的结构模型，底物tRNA的结合很可能引发TiaS锌指结构域发生构象变化，模拟的发生构象变化后的TiaS与tRNA Ile2 结合模式图中TiaS结构标记成了蓝色(摘自ref. 20)
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user: 5. TiaS蛋白催化tRNA Ile2 修饰的酶工作机制 Af-TiaS蛋白在有ATP-Mg存在的条件下，催化ATP水解，生成磷酸化修饰的Cyt34。活化的Cyt34与Agmatine反应生成产物Agm 2 C [ 18 ]，TiaS完成修饰反应。这是生化实验的研究结果。依据解析的Af-TiaS蛋白全长的晶体结构(5XOB.pdb)、TiaS-AMPPCP-agmatine结构(6AGG.pdb)、TiaS-tRNA Ile2 -ATP结构(3AMT.pdb)等，TiaS的催化机制从生物物理学角度也得到解读 [ 20 ]。截至目前为止，人们已知的TiaS蛋白修饰tRNA Ile2 的分子机制，总结在了这两张图中，如图5、图6。从图中可以看出，锌指结构域在酶发挥催化修饰活性过程中发挥着重要的作用。 溶液中，通过自由扩散、静电吸引等过程，TiaS蛋白与底物tRNA Ile2 前体(precursor tRNA Ile2 )的距离被拉近，由于酶N端3个结构域与tRNA Ile2 结合面积与结合能量巨大，很可能首先与tRNA Ile2 的反密码子区域接触结合，这时候配体ATP、Agmatine可能与二元复合物结合，也可能稍后再与二元复合物结合。由于结合面外形基本互补，通过相互诱导契合等过程，TiaS酶核心与底物tRNA Ile2 前体的反密码子区域结合逐渐紧密，然后锌指结构域发生巨大的构象变化，移动达14Å，扭转达18º，从而与底物tRNA Ile2 图6. TiaS修饰tRNA Ile2 的分子机制(摘自ref. 20) 的接受臂建立起相互作用。至此，TiaS蛋白与底物tRNA Ile2 的识别结合过程完成，进入催化修饰过程。在镁离子存在条件下TiaS酶水解ATP，发挥针对Cyt34的Agmatine修饰活性。修饰后的tRNA Ile2 由于化学结构的改变，改变了反密码子区域的物理化学性质，与TiaS的亲和力低于未修饰的tRNA Ile2 前体，因此，未修饰的tRNA Ile2 前体的反密码子区域会首先竞争占据酶N端3个结构域。由于TiaS蛋白与底物tRNA Ile2 的结合能量与结合面积主要由酶与反密码子区域提供，所占总的结和能量与总的结合面积比例均约2/3，因此tRNA Ile2 前体占据酶N端3个结构域以后，会把修饰后的成熟tRNA Ile2 竞争走。每一次催化反应都会进行一轮这样的结合–催化修饰–解离的循环 [ 20 ]。
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user: 6. 远离催化中心的TiaS锌指结构域与酶的催化功能 TiaS锌指结构域影响酶催化活性的已有研究结果总结如下。去除锌指结构域的TiaS截短体，以及置换掉tRNA Ile2 接受臂的底物突变体，均不能够完成正常的催化修饰过程 [ 18 ]。锌指结构域的Cys352Ala-Cys355Ala双突变体酶催化修饰底物的活性显著下降 [ 18 ]，这些结果都表明了锌指结构域对于酶修饰功能的重要性。实际上，从解析的结构可以清晰看到，Cys352、Cys355对于维持锌指结构域的三维空间结构非常重要 [ 20 ]。实验发现TiaS蛋白催化ATP水解活性可以不依赖于tRNA Ile2 修饰反应发生。只包含酶N端3个结构域的截短体仍然具有ATP水解酶活性，不具有tRNA Ile2 修饰活性 [ 18 ]。 锌指结构域远离催化活性中心，两者距离超过60Å (5XOB.pdb)。可以推测锌指结构域可能对于识别结合底物过程，在薅住底物放置于正确位置上发挥作用。TiaS蛋白使用酶催化核心和锌指结构域识别结合底物tRNA Ile2 。从静态的三维结构上看，锌指结构域结合底物tRNA Ile2 的接受臂。晶体结构(3AMT.pdb)中可以观察到TiaS蛋白的Glu360侧链羧基与tRNA Ile2 的Cyt70的N4原子存在氢键相互作用。
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user: 7. TiaS锌指与核酸相互作用的研究 锌指是典型的蛋白质结构单元之一，可以介导蛋白与蛋白，蛋白与核酸的相互作用。含有锌指结构的蛋白质参与了多种重要的生命过程，是全球酶学、生物化学等领域的典型研究对象 [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]。CRISPR/Cas系统和锌指都是靶向核酸的重要工具，靶向核酸酶在基因矫正、基因组编辑、基因治疗等新兴生命医药以及研究领域具有巨大的应用前景。核酸靶向蛋白的改造是其中的热点之一。设计改造锌指结构单元一直是核酸靶向蛋白组件研究的前沿阵地 [ 27 ]。与CRISPR/Cas系统相比，使用锌指作为核酸序列特异性结合元件的挑战之一，是锌指组件数目的增加并不一定达到预期的亲和力增加，因为存在空间位阻 [ 27 ]。也由于存在这样的难点，使用锌指靶向核酸的应用受到限制，将其成功利用仍需大量研究。 TiaS锌指以柔性来适配与核酸的结合。对于TiaS蛋白的研究发现，锌指与N端3个结构域的连接部位细长，可以通过伸缩扭动使锌指结构域空间位置与取向发生变化，具有较大的柔性和多种可选择的构象(4)，来适配底物核酸。这是TiaS蛋白新型锌指的第一个优点。 TiaS锌指以序列特异性识别核酸。对于核酸靶向锌指的改造来说，实现靶向性的一个关键要求是，对于核酸碱基的识别是序列特异的。研究发现，TiaS锌指的若干氨基酸残基通过碱基特异性方式识别底物tRNA Ile2 。TiaS锌指的Glu360，Ser361，Ala362，Gln366，Arg369氨基酸残基识别底物tRNA Ile2 的一段特定碱基序列Cyt70Cyt71Cyt72Ade73 (其中Cyt71-Gua2，Cyt72-Gua1部分识别的是双链碱基)，6对氢键是与4个连续的碱基一一形成的，不是与糖磷酸骨架形成的。晶体结构3AMT.pdb中，也观察到了Glu360、Ser361、Arg369与碱基的氢键，是相互吻合的。这是TiaS蛋白新型锌指的第二个优点。目前发现的锌指的这些开创性的新特征，有可能会拓展锌指作为靶向核酸工具的科学前沿。进一步探索TiaS蛋白识别结合底物tRNA Ile2 过程中锌指结构域的作用，深入发掘以前未知的锌指及其连接部位的新功能特性，将为锌指的工程改造提供依据。 目前，利用TiaS特异性识别结合核酸的特性，科研工作者进行了应用研究的开发。让TiaS使用具有点击反应活性的化合物对RNA进行靶向定点修饰，利用点击反应在体外和哺乳动物细胞中实现了目标RNA的特异性共价荧光标记 [ 19 ]，这是一种进行RNA标记的新方法，而目前科学领域诸多重要的RNA研究依赖于优越的新型标记方法 [ 28 ]。
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user: 8. 结论 目前，对于TiaS蛋白的工作机制已经有了较多的实验证据和较为充分的理解，TiaS蛋白的新型锌指的新特性值得进一步研究，针对TiaS蛋白锌指关键氨基酸残基与核酸相互作用的深入研究，将为靶向核酸锌指的改造设计以及应用研究打下基础，也将拓宽加深人们对于酶催化机制的理解。近年来，锌指的一些新特性被发掘出来，包括通过人工设计与实验室进化获得的以锌指为核心的具有催化活性的小分子量的生物酶，该酶可以特异性水解酯键 [ 29 ]。另使用沙利多安及其类似物(Thalidomide，lenalidomide，pomalidomide)联合其它分子来靶向结合包含锌指的蛋白(很多是细胞内的转录因子)，从而对一些以前认为是不可成药的蛋白质靶点通过其锌指进行了特异性的靶向降解 [ 30 ]。这些研究进展，使得锌指的应用范围被拓展的更加广阔。