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user: 3. 结果与讨论 3.1. Zr-MOF-PPa@PAH的表征 用SEM和TEM拍摄了Zr-MOF-PPa@PAH的形态(如图1(a))。Zr-MOF-PPa@PAH的表面光滑，纳米的平均粒径为68 nm，动态光散射(DLS)表明Zr-MOF-PPa@PAH在去离子水中的粒径为98 nm (如图1(b))。如图1(c)可知，Zr-MOF、Zr-MOF-PPa、Zr-MOF-PPa@PAH的Zeta电位分别为−22.1 ± 1.12 eV、−13.12 ± 1.5 eV、20.7 ± 1.08，由于PAH为盐酸盐，带有大量正电荷，产生电位反转。在7天内Zr-MOF-PPa@PAH在含有血清的培养基和PBS中尺寸没有显著的变化(如图1(d))。 图1. (a) Zr-MOF-PPa@PAH的SEM图像。插图是TEM图像；(b) Zr-MOF-PPa@PAH的DLS；(c) Zr-MOF、Zr-MOF-PPa、Zr-MOF-PPa@PAH Zeta电位图；(d) Zr-MOF-PPa@PAH的水动力大小在PBS或DMEM (含10%胎牛血清)中培养7天 如图2(a)为傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy， FT-IR)，Zr-MOF在3100~3550 cm −1 有强振动峰，归属于羧基和氨基伸缩振动峰，双峰是伯氨基的N-H伸缩振动特征峰。1574 cm −1 为苯环骨架上C=C双键的伸缩振动，1386 cm −1 ，1258 cm −1 分别为C-O单键和C-N单键的伸缩振动，690~900 cm −1 三个峰为1，2，4-三取代苯环的C-H面外弯曲振动，1528 cm −1 峰为PAH的亚甲基C-H变形振动峰，1100 cm −1 的峰为C-C单键骨架振动峰。这些特征峰在Zr-MOF-PPa@PAH的红外吸收曲线上中均有对应的峰，证明成功地得到Zr-MOF-PPa@PAH。如图2(b)为纳米材料的X-射线衍射(XRD)，Zr-MOF在2θ = 7˚，8˚，12˚，26˚处特征峰均与文献报道的相符 [ 21 ]，2θ = 7˚峰对应晶面(111)，2θ = 8˚峰对应晶面(200)。尖锐的峰型表明Zr-MOF是高度结晶体。Zr-MOF-PPa@PAH的衍射峰均与Zr-MOF的衍射峰相同，说明表面PAH化晶体的结构没有发生变化，具有结构稳定性。图2(c)为Zr-MOF-PPa@PAH的X射线光电子能谱。由图可知，Zr-MOF-PPa@PAH中存在C、O、N、Zr元素。Zr-MOF、Zr-MOF-PPa@PAH、PPa的紫外吸收光谱如图2(d)所示，Zr-MOF在可见光及红外光区没有吸收，PPa在可见光区400~800 nm有5个吸收峰，其中400 nm附件有一个最强的吸收峰，在660 nm附近有次强峰，其余3个吸收峰在500~630 nm区域，这些峰是PPa (卟吩类化合物)的特征峰。Zr-MOF-PPa@PAH在400~800 nm也有5个吸收峰，在400 nm处有一个最强的吸收峰，在680 nm处有一个次强峰，说明PPa成功负载于Zr-MOF上，并且660 nm峰红移了10 nm，这可能是Zr-MOF材料的中心离子与PPa络合的结果。 图2. (a) Zr-MOF、Zr-MOF-PPa@PAH、PAH的红外吸收光谱；(b) Zr-MOF、Zr-MOF-PPa@PAH的XRD衍射谱；(c) Zr-MOF -PPa@PAH的XPS能谱；(d) Zr-MOF、Zr-MOF -PPa@PAH、PPa的紫外–可见光吸收光谱 3.2. Zr-MOF-PPa@PAH的活性氧( 1 O 2 )量子产率 光敏剂PPa在660 nm的激光照射下产生活性氧( 1 O 2 )。我们以DPBF为活性氧( 1 O 2 )探针，亚甲基蓝(MB)为参照光敏剂，测量Zr-MOF-PPa@PAH的 1 O 2 量子产率。DPBF在415 nm处有很强的吸收，当DPBF被活性氧氧化降解吸收峰逐渐减弱直至消失。将DPBF和与待测样品混合后光照，DPBF吸光度变化和降解速率与时间关系图如图3(a)，图3(b)所示，DPBF降解显著，Zr-MOF-PPa@PAH的 1 O 2 量子产率为38.6%，单独 PPa的 1 O 2 量子产率58.4%，Zr-MOF-PPa@PAH的 1 O 2 量子产率低的原因可能是是纳米载体接受了部分PPa的能量，导致PPa与O 2 分子之间的能量转移效率降低。虽然量子产率低了，但是Zr-MOF载体抑制了PPa因疏水性导致的自聚荧光猝灭现象，从而有利于提高光动力治疗的效果。 图3. (a) DPBF在Zr-MOF-PPa@PAH NPs的DMF溶液中光降解紫外–可见光光；(b) DPBF降解速率与光照时间关系曲线 3.3. Zr-MOF-PPa@PAH中PPa的pH响应释放 该纳米材料在化学上具有稳定性，可在人体中性生理环境中随血液到达病变部位，并可在肿瘤微环境中轻易释放，避免对正常细胞的损伤。人体人的生理环境约为7.4，肿瘤组织的pH值为6.0~6.8，而在某些细胞器和核内体中，pH值可低至5.2。因此，我们在不同pH值(5.6， 6.5， 7.4)进行了释放实验。记录样品在0~12 h内释放PPa的量。如图4可以看出，pH值为5.6，PPa的释放率最高，6 h释放率为45.8%， 图4. Zr-MOF-PPa@PAH pH刺激响应释放PPa 12释放率为76%，pH = 7.4时，PPa的释放率最低，综上所述，Zr-MOF-PPa@PAH在酸性肿瘤微环境下能有效释放PPa，而在正常人体生理环境下释放较少。因此，该Zr-MOF-PPa@PAH纳米粒子在正常生理环境下正常，使能更好的在肿瘤部位聚集，提高光动力疗效。 3.4. Zr-MOF-PPa@PAH的细胞摄取及细胞内活性氧检测 在癌症治疗过程中纳米药物能否进入细胞内尤为重要。我们研究了HepG-2细胞对Zr-MOF-PPa@PAH纳米颗粒的吞噬行为。DAPI为核染色剂，在荧光倒置显微镜下显蓝色。Zr-MOF-PPa@PAH纳米颗粒在荧光显微镜下显红色。用Zr-MOF-PPa@PAH处理HepG-2细胞，在CO 2 培养箱孵育之后，用荧光倒置显微镜下观察细胞的内化行为，结果如图5(a)所示。药物处理后15 min时，细胞内有微弱的红色荧光出现，表明Zr-MOF-PPa@PAH进入细胞内，随着时间的延长，细胞内红色荧光越来越强，说明Zr-MOF-PPa@PAH完全进入细胞，而在整个过程，细胞状态没有发生变化，说明Zr-MOF-PPa@PAH无暗毒性。清晰的活细胞红色荧光图像表明Zr-MOF-PPa@PAH能够成为细胞的荧光成像剂。 在前面已经讨论过关于 1 O 2 量子产率的问题(图3)，但是细胞内生理环境复杂，有多种因素影响 1 O 2 的产率。因此，我们用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为ROS的检测器，测试了Zr-MOF-PPa@PAH在细胞内产生 1 O 2 的能力 [ 22 ]。DCFH-DA可被细胞吸收，细胞内酯酶水解为DCFH，再被ROS氧化为7-二氯荧光素(DCF)，在488 nm的光激发下产生绿色荧光 [ 23 ]。用Zr-MOF-PPa@PAH处理的实验组加入DCFH-DA (50 μM)，并用660 nm激光(功率10 mW/cm 2 )照射10分钟(图5(b))。在荧光倒置显微镜下观察到，10分钟后发出绿色荧光非常强，说明纳米粒子几乎都进入细胞，在660 nm光照射下进入细胞后会产生大量 1 O 2 。说明Zr-MOF-PPa@PAH具有良好的产氧能力。 图5. (a) HepG-2细胞吞噬Zr-MOF-PPa@PAH后的荧光成像；(b) 用DCFH-DA定性检测HepG-2细胞内活性氧( 1 O 2 ) 3.5. Zr-MOF-PPa@PAH的PDT疗效 纳米材料作为药物传递系统，要求其在运输过程中对机体具有低毒性或无毒性，通过MTT法在HePG-2细胞中研究纳米粒子在无光和光照条件下的细胞毒性，采用MTT法评价MOF-PPa@MnO 2 -PAH纳米药物对HePG-2细胞的细胞毒性，用PPa与含有相同PPa浓度的Zr-MOF-PPa@PAH (0.625， 1， 1.25， 2.5， 3.75， 5 μg/mL)纳米粒子处理HePG-2细胞，验证该纳米粒子在光照与不光照下的细胞毒性。如图6(a)所示，在无光照射下，PPa与Zr-MOF-PPa@PAH纳米粒子处理后的HePG-2细胞的存活率将近100%，说明二者无暗毒性，很安全。如图5(b)所示，光照后，PPa比Zr-MOF-PPa@PAH纳米粒子处理过的HePG-2细胞存活率要高，这表明Zr-MOF-PPa@PAH具有良好的生物相容性，更好的进入细胞，解决单独PPa在生理环境下的自聚合，提高了光动力疗效。 HePG-2细胞双染可以清楚直观的反应上述两种物质的致死率(如图6(b))，在共聚焦激光扫描显微镜下，AM染色的活细胞为绿色，PI染色的死细胞为红色，由此可见，当用670 nm照射10 min后，PPa处理的细胞显示出荧光变化微弱，而用Zr-MOF-PPa@PAH处理过的细胞，绿色急剧减少，红色急剧增加，表明处理后的细胞受到了明显的破坏，这种结果与上述毒性结果一致，经过纳米材料负载的光敏剂可以提高光动力疗效。 图6. (a) PPa、Zr-MOF-PPa@PAH的无光照的柱状图；(b) PPa、Zr-MOF-PPa@PAH的光照下的柱状图；(c) HepG-2细胞双染色实验细胞成像