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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 白藜芦醇标准品、芍药苷标准品：美国Sigma公司；芦丁标准品：成都普思生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒：南京建成生物科技有限公司；没食子酸、亚硝酸钠、氯化铝、过氧化氢、三氯化铁、苯酚、抗环血酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、硫酸亚铁、3，5-二硝基水杨酸等均为分析纯。 2.2. 仪器与设备 UV-5500紫外–可见光分光光度计：IRAffinity-1傅里叶变换红外色谱(FTIR) ：日本岛津公司；QUANTA200电子扫描显微镜(SEM) ：FEI；7890A气相色谱仪：安捷伦有限公司；1525高效液相色谱仪(HPLC) ：WATERS；Infinite M200 PRO酶标仪：长沙泰肯生物技术有限公司；STA449F5 Jupiter®热重分析仪：德国耐驰。 2.3. 方法 2.3.1. 样品处理 油用牡丹(凤丹)加工剩余物牡丹籽壳是由江苏国色天香油用牡丹技术开发有限公司惠赠，牡丹籽壳置于阴凉通风处，吹干，使用多功能粉碎机将样品碎成粉末状，过筛，目数20。0℃~4℃低温干燥处保存，留作备用。 2.3.2. 牡丹籽壳的提取 将40.0 g牡丹籽壳粉与一定体积的乙醇溶液混合于圆底烧瓶中，回流提取，一定时间后，5000 r/min离心8 min，取出上清液，置于旋转蒸发仪上负压旋出溶剂乙醇，剩余物为牡丹籽壳提取物，标记为PEO，−20℃低温保存备用。 将PEO用十倍体积的石油醚置于分液漏斗中进行萃取，分离得到石油醚相，旋蒸回收溶剂，所获得的部分为PEO的含油部分，剩余部分为PEO的非油部分。另外，采用传统索氏提取法，以石油醚为溶剂，抽提，干燥后得到的提取物，标记为SEO。 得 率 公 式 / % = m 1 m 0 × 100 % (1) 式中： m 0 为粉碎后的牡丹壳粉的质量/g， m 1 为离心干燥后牡丹壳提取物的质量/g。 2.3.3. 单因素及正交实验设计 单因素实验部分：以PEO产率为响应值，分别探讨乙醇浓度(55%、65%、75%、85%、95%)、固液比(1:6、1:8、1:10、1:12、1:14)、提取温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)和提取时间(2 h、3 h、4 h、5 h、6 h) 4个单因素对PEO产率的影响。 正交实验部分：以单因素实验为基础，PEO产率为响应值，采用正交实验设计表L 16 (4 5 )对PEO提取工艺进行优化，因素与水平设计如表1，每组实验进行三次平行。 Table 1 L16 (45) orthogonal experiment factors and level 水平 乙醇浓度/% 固液比/(g/mL) 提取温度/℃ 提取时间/h A B C D 1 80 1:6 70 2 2 85 1:8 80 3 3 90 1:10 90 4 4 95 1:12 100 5 表1. L 16 (4 5 )正交实验因素与水平 2.3.4. SEM分析方法 用导电双面胶将样品固定在样品台上，真空喷镀，通过扫描电子显微镜观察牡丹籽壳原料和提取后残渣的表面形态。 2.3.5. TG分析方法 称取25~30 mg样品放在氧化铝坩埚，以空坩埚作为基线，氮气气氛，加热温度从40℃~800℃，升温速率为10℃/min，对样品的热分解规律进行检测。 2.3.6. FTIR分析方法 称取2.0 mg样品与200.0 mg KBr研磨混合压片，采用红外光谱仪在500~4000 cm −1 范围对样品进行红外光谱检测。 2.3.7. 多糖、酚类和总黄酮含量测定 1) 采用苯酚–硫酸法 [ 8 ] 检测多糖含量 以葡萄糖为标准品制作标准曲线，波长设定为490 nm，测定数值，并计算出回归方程及相关系数R 2 。将牡丹籽壳油样品(1 mg/mL)吸光值，带入回归方程，计算出总糖在样品溶液中的含量。 2) 检测牡丹籽壳油样品中总酚 [ 9 ] 含量 标准曲线的制作：在试管中加入不同体积的(0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL)没食子酸标准品(1 mg/mL)，没食子酸标准品用甲醇溶解，加入甲醇将各管补至相同的体积(1 mL)。加入福林酚1.5 mL和Na 2 CO 3 (20%)溶液2 mL，混匀后，静置0.5 h，波长设定为765 nm，测定数值，并计算出回归方程及相关系数R 2 。 样品中总酚含量的测定：甲醇溶解样品，浓度为5mg/mL。按照上文标准曲线的制作方法，用配置好的牡丹籽壳油样品来替代没食子酸，测定吸光值，带入回归方程，计算出总多酚在牡丹籽壳油样品溶液中的含量。 样品中总黄酮含量采用氯化铝比色法 [ 10 ]：用5.0 mL蒸馏水溶解一定质量的牡丹籽壳油样品，加入0.3 mL的亚硝酸钠(6%)，混匀，室温静置5 min。然后，加入0.3 mL的氯化铝(10%)和2.0 mL的氢氧化钠(1 M)，再静置6 min。最后，用蒸馏水定容至10 mL。波长设定为510 nm。测定数值，并计算出回归方程及相关系数R 2 。对应样品中总黄酮含量用每克样品芦丁当量毫克来表示。 2.3.8. 牡丹籽壳油中白藜芦醇和芍药苷含量测定 1) 白藜芦醇含量检测：配置白藜芦醇标准储备液(1 mg/mL)，稀释成不同的浓度，采用HPLC仪检测，Diamonsil反相C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm， 5 μm)；流动相为乙腈–乙酸水(0.2%) (30:7， V/V)；流速1.0 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；检测波长306 nm。其保留时间为7.9 min，白藜芦醇的回归方程为Y 白藜芦醇 = 23861X + 34896 (R 2 = 0.9994， n = 8)。通过比较其与白藜芦醇标准品的保留时间比对，算出白藜芦醇在样品中的含量。 2) 芍药苷含量检测：配置芍药苷标准储备液(1 mg/mL)，稀释成不同的浓度，采用HPLC仪检测，Diamonsil反相C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm， 5 μm)；流动相为乙腈–水(16:84， V/V)；流速1 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；检测波长230 nm。芍药苷的保留时间为13.2 min，芍药苷的回归方程为Y 芍药苷 = 4173.9X + 5245.3 (R 2 = 0.9994， n = 8)。通过比较其与芍药苷标准品的保留时间比对，算出芍药苷在样品中的含量。 2.3.9. 脂肪酸成分分析 样品前处理：正己烷溶解一定量的样品，定容至25 mL。将样品进行甲酯化，用移液枪吸取PEO样品2 mL至试管中，向其再加入氢氧化钠-甲醇溶液2 mL(0.5 mol/L)。混匀后，静置5 min，向混合液中加入一定体积的超纯水，摇匀，静置后，弃去下层液体，上层液体用超纯水反复洗涤，直至PH为7，并弃去水层。用于GC分析。 GC条件：Agilent HP-55%苯基甲基硅氧烷毛细管柱(30 m × 0.32 mm， 0.25 μm)；载气：高纯氮气；载气压力：0.25 mpa；分流进样，分流比：10:1；流速：0.90 mL/min；进样量：1.0 μL；进样口温度：250℃；检测器温度：280℃；升温程序：初始温度设置为130℃，以4℃/min的速率升至230℃，在230℃保持30 min直至分析完成。 2.3.10. 体外抗氧化活性分析 1) DPPH自由基清除：参照文献方法 [ 11 ]，并稍作修改。用80%乙醇配置不同浓度样品，对照组为抗坏血酸。用无水乙醇配制25 mg/mL的DPPH溶液。在各试管中，加入2 mL配置好的PEO样品和2 mL的DPPH溶液，混匀，避光处理，0.5 h后，波长设定为517 nm，检测吸光值。清除率表示样品PEO清除DPPH的能力。平行3次，计算清除率。其公式为： 清 除 率 / % = A 0 − A 1 + A 2 A 0 × 100 % (2) 式中： A 0 为DPPH溶液与80%乙醇的混合液； A 1 为DPPH溶液与样品溶液的混合液； A 2 为80%乙醇与样品溶液的混合液。 2) ABTS自由基清除：用80%乙醇配置不同浓度样品，对照组为抗坏血酸。在各试管中，加入2.0 mL样品和2.0 mL ABTS [ 12 ] 溶液(7 mmol/L)，避光处理，0.5 h后，波长设定为734 nm，检测吸光值。清除率表示PEO样品清除ABTS的能力。平行3次，计算得出清除率。其公式为： 清 除 率 / % = A 0 − A 1 + A 2 A 0 × 100 % (3) 式中： A 0 为ABTS溶液与80%乙醇的混合液； A 1 为ABTS溶液与样品溶液的混合液； A 2 为PBS溶液与样品溶液的混合液。 3) 超氧自由基清除：用80%乙醇配置不同浓度样品，对照组为抗坏血酸。在各试管中，加入待测样品1 mL，Tris-HCl缓冲溶液4 mL (PH = 8)，邻苯三酚 [ 13 ] 溶液0.4 mL，5 min后加入1 mL HCl (8 mmol/L)，波长设定为322 nm，检测吸光值。清除率表示样品PEO清除超氧自由基的能力。平行3次，计算得出清除率。其公式为： 清 除 率 / % = A 0 − A 1 + A 2 A 0 × 100 % (4) 式中： A 0 为空白对照； A 1 为待测样品的吸光值； A 2 为无邻苯三酚时样品的吸光值。 4) 羟自由基清除：用80%乙醇配置不同浓度样品，对照组为抗坏血酸。在各试管中，加入1 mL样品和2 mL浓度为6 mmol/L的FeSO 4 溶液，混匀后加入6 mmol/L的H 2 O 2 2 mL，避光处理，混匀，静置8 min，再加入2 mL的水杨酸 [ 14 ] 溶液(6 mmol/L)，37℃，水浴反应0.5 h，波长设定为510 nm，检测吸光值。清除率表示样品PEO清除羟自由基的能力。平行3次，计算得出清除率。其公式为： 清 除 率 / % = A 0 − A 1 + A 2 A 0 × 100 % (5) 式中： A 0 为空白对照； A 1 为样品的吸光值； A 2 为无水杨酸时样品的吸光值。 5) 脂质体过氧化抑制活性：采用硫代巴比妥酸(TBARS) [ 15 ]，通过硫代巴比妥酸反应物测定牡丹籽壳中PEO和SEO样品对脂质过氧化抑制的活性(TBARS)分析。将小鼠的肝脏加入生理盐水(W/V = 1:100)，使用高速匀浆机进行匀浆，在各试管中加入1 mL小鼠肝脏溶液，和1 mL不同浓度的样品，0.5 mmol/L的FeCl 3 ，0.05 mL的H 2 O 2 (0.5 mmol/L)，混匀后37℃条件下静置30 min，再加入1.5 mL TCA (20%， W/V)溶液，1.5 mL硫代巴比妥酸(TBA)溶液(0.8%， W/V)终止反应，混匀，置于99℃水浴中加热10 min，冷却后，4000 r/min离心10 min，上清液在532 nm处进行检测。其公式为： 清 除 率 / % = A 0 − A 1 + A 2 A 0 × 100 % (6) 式中： A 0 为空白对照； A 1 为待测样品的吸光值； A 2 为小鼠肝细胞溶液的吸光值(80%无水乙醇和小鼠肝细胞溶液的混合液)。 2.3.11. 鼠体内毒性分析 30只体重60~80 g的雄性Wistar大鼠(六周)购买于中国上海SLAC动物实验室，每5只为一组，将其随机分为六组。在一定条件下(每12 h进行明暗循环，温度20℃~24℃和相对湿度35%~60%)饲养在不锈钢笼中，食物和水自由供应。实验前12小时，自行饮水，禁食。使用盐水–羧甲基纤维素钠盐(99:1， V:V)制备PEO样品溶液。将该溶液在室温搅拌直至使用，大鼠实验组使用不同剂量0.0546~0.8736 mg/kg的PEO溶液，对照组使用相同剂量的盐水–羧甲基纤维素钠盐(99:1， V:V)的溶液。每天下午2点进行灌胃，连续灌胃45天后，将大鼠禁食24 h，并通过脊椎脱臼法处死，本研究依据《黑龙江省实验动物管理条例》进行。将大鼠的血清收集，分离并在−80℃保存。大鼠血清中CAT、SOD、MDA水平的测定是按照CAT、SOD、MDA检测试剂盒说明书进行操作的。