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user: 4. 讨论 黄连素，可从传统中药黄连、黄柏、三颗针等植物中提取，黄连素及其衍生物在治疗心血管疾病、抗肿瘤、免疫调节、精神疾病、骨质疏松等多方面具有一定的药理作用。近年研究显示黄连素可通过诱导ROS生成 [ 6 ] 、调节HIF-1α、抑癌因子p21WAFl/CIPl、细胞周期蛋白CyclinB1的表达 [ 7 ] [ 8 ] 、触发Caspase-3、Caspase-8和Caspase-7的活性 [ 9 ] 、抑制NF-κB的活性及其通路影响VEGF mRNA和蛋白的表达 [ 10 ] 、提高GRP78/HSPA5的表达 [ 11 ] 等多种途径影响肿瘤细胞的增殖、调控细胞周期、抑制侵袭及转移、调节自噬、增敏增效等方面发挥其抗肿瘤作用。 BTG2 (B-cell translocation gene-2)作为一种抗增殖基因，是早期瞬时反应基因之一，属于BTG/Tob抑癌基因家族成员之一。已有大量研究证实，BTG2在许多肿瘤中的表达下调，在多种肿瘤细胞的分化、 Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers were used in this stud 基因 序列(5’-3’) 长度(bp) BTG2 正向：GCCAGCCAGATCGGACTC 反向：TCGTACAAGACGCAGATGGAG 128 Cyclin B1 正向：GGTCGGGAAGTCACTGGAAAC 反向：CAGCATCTTCTTGGGCACAC 153 Cyclin D1 正向：CAATGACCCCGCACGATTTC 反向：CATGGAGGGCGGATTGGAA 146 β-actin 正向：CTGGGCTACACTGAGCACC 反向：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG 218 表1. 本研究使用的实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Comparison of the growth inhibition rate of hepg2 cells with different concentrations of berberine at different time levels (%， 组别 12 h 24 h 48 h 72 h 空白对照组 0 0 0 0 12.5 μmol/L 7.76 ± 0.13 a 17.40 ± 0.10 a 18.97 ± 0.14 a 25.03 ± 0.23 a 25 μmol/L 14.95 ± 0.07 ab 22.97 ± 0.04 ab 26.82 ± 0.97 ab 37.16 ± 0.21 ab 50 μmol/L 39.36 ± 0.09 abc 52.49 ± 0.04 abc 56.83 ± 0.16 abc 62.27 ± 0.13 abc 100 μmol/L 56.32 ± 0.06 abcd 62.46 ± 0.69 abcd 66.18 ± 0.15 abcd 71.90 ± 0.01 abcd 200 μmol/L 62.37 ± 0.77 abcde 70.25 ± 0.24 abcde 71.23 ± 0.14 abcde 74.32 ± 0.05 abcde 表2. 不同浓度的BBR培养HepG2不同时间后细胞生长抑制率的比较(%， ) 注：BBR为黄连素；Hep-G2为人肝癌细胞株；每组每个时间点的样本量为3； a 代表与空白对照组的比较P < 0.01； b 代表与12.5 μmol/L的比较P < 0.01； c 代表与25 μmol/L的比较P < 0.01； d 与50 μmol/L的比较P < 0.01； e 与100 μmol/L的比较P < 0.01。 图1. 流氏细胞仪测BBR对Hep-G2细胞凋亡的影响 Table 3 The comparison of the apoptosis rate of Hep-G2 cells with a certain concentrations of berberine at different time levels (%， 分组 凋亡期 24 h 48 h 72 h 对照组 实验组 早期 0.05 ± 0.09 3.72 ± 0.17 a 2.20 ± 0.32 6.58 ± 0.39 ab 0.84 ± 0.15 10.70 ± 1.20 abc 对照组 实验组 中晚期 0 3.13 ± 0.24 a 2.16 ± 0.24 5.59 ± 0.28 ab 0.69 ± 0.27 14.82 ± 1.43 abc 表3. 一定浓度的BBR培养Hep-G2不同时间后细胞凋亡率的比较(%， ) 注：BBR为黄连素；Hep-G2为人肝癌细胞株； a 代表与对照组相比P < 0.01； b 代表实验组之间与24 h的比较P < 0.01； c 代表实验组之间与48 h的比较P < 0.01。 图2. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1mRNA表达的影响 图3. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达的影响 增殖、DNA损伤修复以及凋亡中起重要作用 [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] ，且与肿瘤的大小、分级、转移、复发及预后不良都有一定关系 [ 17 ] 。多个实验研究表明上调BTG2的表达，可抑制乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] 。目前，也有学者证实BTG2在肝癌组织中不表达或者表达非常低，而相应的癌旁组织或正常肝细胞中表达则较高，提示BTG2的高表达对肝癌的发生、进展均具有抑制作用 [ 22 ] [ 23 ] 。本实验结果发现一定剂量的黄连素干预Hep-G2细胞后，BTG2蛋白及mRNA的表达都随着时间延长逐渐增强，差异具有统计学意义。 细胞周期蛋白Cyclin B1作为Cyclins家族的一员，活化并与CDKs即CDC2 (cell division cycle)形成复合物，促使细胞进行G2/M期转变。有多项研究表明，Cyclin B1的表达，在肿瘤细胞的增殖中起重要作用 [ 24 ] [ 25 ] 。有研究 [ 26 ] 发现人肝癌组织中CyclinB1 mRNA表达水平与临床分期、门静脉癌栓、术后复发、肿瘤直径和肿瘤低分化等成正相关。在本实验中当一定剂量的黄连素干预HepG-2细胞后，CyclinB1 mRNA和蛋白的表达均随着时间延长逐渐增强，具有明显时间依赖性，差异具有统计学意义。 Cyclin D1作为一种潜在的原癌基因蛋白，且是调控G1期的关键蛋白，并且在多种肿瘤中过表达。有研究表明下调Cyclin D1的表达，可使细胞周期阻滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡 [ 27 ] [ 28 ] 。目前，另有学者研究cyclin D1在丙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织中的表达较癌旁组织，以及基本正常肝脏组织明显增高，且与肝癌组织的病理学分级及患者的不良预后呈正相关，提示cyclin D1高表达的致癌作用 [ 29 ] 。在本实验中当一定浓度的黄连素干预HepG-2细胞后，CyclinD1 mRNA和蛋白的表达均随着时间延长逐渐增强，具有明显的时间依耐性，差异具有统计学意义。 肿瘤发生的本质原因是癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。BTG2作为抗增殖蛋白基因，是细胞周期动力学的重要调节因子，与细胞周期的控制和细胞对DNA损伤反应有关。研究 [ 8 ] [ 28 ] 发现提高BTG2的表达可抑制CyclinD1蛋白的转录活性，降低CyclinD1蛋白表达，然后通过经视网膜母细胞瘤基因(Rb)途径使细胞阻滞在G1期，促使细胞凋亡。BTG2也可通非Rb途径阻止CyclinB1和Cdc2的结合，抑制Cdc2激酶活性，导致G2期的停滞，而诱导G2/M期的细胞周期阻滞及细胞凋亡。在该实验中我们发现随着一定剂量的黄连素作用时间的延长，细胞的凋亡率逐渐增多，且BTG2蛋白表达逐渐上升，同时CyclinB1、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达逐渐下调，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。 由此我们推断，黄连素具有抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。这与前期，我们实验组研究的48 h的半数抑制浓度IC50 = 41.18 μmol/L的黄连素调节肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的结果相一致。其机制之一可能是通过上调抑癌基因BTG2的表达，同时引起CyclinB1、Cyclin D1的表达下调。但是在该实验中黄连素对抗增殖基因BTG2的作用机制并不清楚，有待进一步研究，且BTG2抗肿瘤的作用与Cyclin B1、Cyclin D1的表达抑制是否有直接相关性，也需要进一步实验来证实。若将黄连素用于肝癌的临床治疗，是否具有临床疗效，还需要临床试验及进一步深入探讨。