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user: 3. 结果分析 3.1. 材料学结果分析 3.1.1. X射线光电子能谱 XPS全谱显示，四种不同多酚所制备的涂层均出现了儿茶酚和CySA的特征元素C、N、O和S峰，而基底材料316L SS的Fe，Ni，Cr特征元素消失(图2)，说明Ca/CySA、Dopa/CySA、EGCG/CySA和GA/CySA涂层已成功覆盖于基底材料表面。XPS结果显示，不同儿茶酚所制备的聚合涂层的S含量显示出明显的差异(表1)。这就表明使用不同种类儿茶酚可调控聚合涂层的S含量，继而调控NO催化释放速率。 图2. 316L SS表面沉积的Ca/CySA，Dopa/CySA，EGCG/CySA和GA/CySA涂层的XPS Table 1 Elemental composition of Ca/CySA， DOPA/CySA， EGCG/ CySA and Ga/CySA coatings deposited on 316L SS surfac 样品 C (%) N (%) O (%) S (%) S/N (%) Ca/CySA 70.6 8.7 13.4 7.3 83.9 Dopa/CySA 74.7 8.4 13.7 3.2 38.1 EGCG/CySA 73.3 4.0 19.5 3.2 80.0 GA/CySA 69.7 7.2 17.3 5.8 80.6 表1. 316L SS表面沉积Ca/CySA，Dopa/CySA，EGCG/CySA和GA/CySA涂层元素组成 3.1.2. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析 MALDI-TOF MS对不同儿茶酚制备的NO催化涂层的聚合机理进行分析研究。首先，对N1s高分辨进行拟合分析。结果表明，四种不同儿茶酚制备的NO催化聚合涂层的N1s拟合峰在400.5 eV处出现了儿茶酚和CySA分子中均不存在的芳香C-N和芳香C=N (图3(A))。芳香C-N的产生证实了儿茶酚与CySA或Tris之间发生了迈克尔加成反应，而芳香C=N的出现证明了儿茶酚与CySA或Tris存在西佛碱反应。结合MALDI-TOF MS质谱(图3(E)，图3(G)，图3(I))分析，推导出Ca/CySA、Dopa/CySA和EGCG/CySA涂层形成的可能反应途径(图3(F)，图3(H)，图3(J))。与GA/CySA形成的聚合机理类似，Ca/CySA和EGCG/CySA的聚合形成也主要涉及两类反应类型，其中一类是以Tris和CySA静电作用为主的物理自组装，另外一类是以儿茶酚Ca和EGCG与CySA进行希夫碱和迈克尔加成共价反应(图3(F)，图3(J))。由于PDAM的形成涉及到较为复杂的氧化聚合方式，因此，在解析Dopa/CySA聚合机理之前先对PDAM的聚合涂层进行MALDI-TOF MS分析。MALDI-TOF MS质谱分析发现419、409、271和253 m/z峰位的出现证实了Tris参与多巴胺聚合。在多巴胺中加入CySA制备共聚涂层Dopa/CySA时，我们发现CySA的加入削弱了多巴胺的自聚合行为。在与多巴胺的聚合反应过程中，CySA与多巴胺主要以迈克尔加成的方式进行反应(图3(H))。此外，Dopa/CySA涂层N1s高分辨图谱中401.7 eV处出现的 NH 3 + 强吸收峰以及MALDI-TOF MS质谱中的274 m/z峰证实了CySA与Tris以物理自组装的形式参与了聚合(图3(B))。 图3. (A) Ca/CySA，(B) Dopa/CySA，(C) EGCG/CySA和(D) GA/CySA涂层的N1s高分辨谱。(E) Ca/CySA涂层的MALDI-TOF MS结果解析及其(F)可能涉及到的物理自组装和共价氧化聚合反应两条途径。(G) Dopa/CySA和对照PDAM涂层的MALDI-TOF MS解析结果和(H)可能涉及到的物理自组装和共价氧化聚合反应两条途径。(I) EGCG/CySA涂层的MALDI-TOF MS解析结果和(J)可能涉及到的物理自组装和共价氧化聚合反应两条途径。而N1s高分辨率图谱中401.2到401.7 eV结合能处新峰出现证实了CySA的 -NH 3 + 和Tris的 O − 之间的物理自组装。400.5 eV处芳香C-N和C=N峰的出现证实了聚合过程中涉及到的共价氧化聚合方式主要为希夫碱和迈克尔加成反应 3.1.3. 表面亲水性和形貌分析 我们采用AFM对涂层的表面形貌和粗糙度进行分析。每个样品表面随机选择6个不同20 × 20 µm 2 区域进行检测，所得形貌图谱用于粗糙度的计算。从图4(A)中的AFM图片可以看出，经过抛光后的316L SS表面相对光滑，其表面均方根粗糙度(RMS)为3.4 ± 0.2 nm。涂层的沉积导致了316L SS表面粗糙度的增加，其涂层的RMS范围为5.8~10.4 nm，均远小于血液相容性的限制要求粗糙度的最小值50 nm。 图4. 316L SS表面沉积的Ca/CySA，Dopa/CySA，EGCG/CySA和GA/CySA涂层的厚度(图上方)、AFM形貌图(A)和水接触角(B) 3.1.4. NO催化释放 我们制备具有不同S-S含量涂层的目的是为了实现NO释放速率的调控，以满足不同临床应用的需求。图5的NO催化速率评价结果显示，4种具有不同S-S含量的涂层在NO催化释放速率上表现出显著性的差异。NO催化涂层的催化释放速率均表现出两种NO催化释放模式即快模式和慢模式。快模式的发生是由S-S直接通过裂解供体产生NO。而慢模式主要涉及到S-S与还原性谷胱甘肽和供体之间的多级反应。在反应进行的前三分钟内，NO催化速率表现出一级释放模式。3分钟之后，NO催化释放速率开始显著下降表现为慢速模式，其催化速率由3分钟的1.5 × 10 −10 mol × cm −2 × min −1 下降到60分钟的0.1 × 10 −10 mol × cm −2 × min −1 ，且数值均落在正常药理学范围内(4~0.5× 10 −10 mol × cm −2 × min −1 )。而NO催化释放速率的逐渐下降是由于反应过程中供体SNAP和GSH的不断消耗而导致。 3.2. 生物相容性结果分析 3.2.1. NO催化涂层对血小板和HUASMCs的影响 在心血管系统中，NO的其中一个重大生理作用是通过促进cGMP的合成，在NO-cGMP信号通路的介导下发挥着许多重要生理作用如：抑制血小板激活和聚集和HUASMCs增殖等。因此，我们首先对与NO催化涂层作用的血小板以及HUASMCs的cGMP合成进行评价。如图6(A)、图6(B)所示，四种不同儿茶酚聚合所得的NO催化涂层在添加供体条件下与血小板和SMCs作用后，均大幅上调了血小板和HUASMCs的cGMP合成，有效地证实了NO对cGMP的生理效应，同时间接地证明了涂层的NO催化作用。然而，我们发现四种不同儿茶酚聚合所得的NO催化涂层的血小板和HUASMCs合成cGMP浓度与NO释放速率并未显示严格的线性相关性。NO催化释放速率最大的Ca/CySA涂层，其血小板和HUASMCs合成的cGMP浓度最低。这可能是由于涂层在PRP和培养基环境下与PBS环境下催化供体产生NO能力不同导致的。在PRP和含SMCs的培养基中，涂层表面的血小板和SMCs快速粘附导致其NO催化位点的掩盖，而不同的涂层表面性质相差较大，其表面快速粘附的血小板和SMCs也会有所差异，从而导致涂层表面NO催化位点掩盖程度不一，进而导致不同程度的NO催化能力的下降。为了研究血小板在NO催化涂层表面的粘附行为，我们选择了无供体SNAP/GSH添加的PRP和额外添加供体SNAP/GSH的PRP进行血小板培养实验。如图7所示，在未添加SNAP/GSH的对照组中，NO催化涂层表面均有大量血小板粘附，且粘附的血小板处于高度激活、聚集状态，大部分血小板伴随内容物在材料表面完全铺展。在添加SNAP/GSH组中，316L SS上的血小板粘附数量和激活程度与未添加SNAP/GSH组相比并无显著性改变。然而，添加供体SNAP/GSH后，四种NO催化涂层均表现出极大的血小板抑制作用，其表面只有少量血小板粘附，且粘附的血小板为典型的静息圆球形态。血小板的粘附实验有力地证实了血小板的cGMP合成结果。进一步的，开展了对SMCs生长行为的评价。图8显示，SMCs的生长行为表现出与血小板粘附相类似的现象。HUASMCs在样品表面培养2小时后，我们发现，培养基中无论添加供体SNAP/GSH与否，316L SS表面粘附的HUASMCs都充分铺展(图8(A))。与此形成鲜明对比的是，培养基中未添加SNAP/GSH时，与316L SS表面一样，四种NO催化涂层表面粘附了大量铺展的HUASMCs，而当培养基里添加供体SNAP/GSH后，NO的产生促进了HUASMCs的cGMP合成(图6)，进而抑制了HUASMCs粘附、铺展(图8(A))、骨架伸展(图8(B))和增殖(图8(C))。 图5. Ca/CySA，Dopa/CySA，EGCG/CySA和GA/CySA的NO催化释放速率(平均值 ± 标准差，n = 4；供体由10 μM SNAP/GSH和500 μM EDTA组成；内插图为纵坐标放大的3~60分钟的部分释放曲线) 图6. (A) 血小板在316L SS，Ca/CySA，Dopa/CySA，EGCG/CySA和GA/CySA表面培养30分钟的cGMP合成浓度。HUASMCs在316L SS，Ca/CySA，Dopa/CySA，EGCG/CySA和GA/CySA表面培养2小时的cGMP合成浓度(供体组成：10 μM SNAP/GSH；平均值 ± 标准差，n = 4；单因素方差分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001) 图7. 不同样品表面粘附血小板的SEM形貌图 图8. HUASMCs在不同样品表面培养2小时(A)、1天(B)的荧光染色图以及培养1天的增殖结果(C) (供体组成：10 μM SNAP/GSH；平均值 ± 标准差，n = 4；单因素方差分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001) 3.2.2. NO催化涂层对HUVECs的影响 尽管NO在心血管疾病治疗中具有许多独特的优势，但是过量的外源性NO引入会导致与超氧化物发生反应，反应形成的过氧硝酸盐会引起许多副反应，典型的如细胞毒性。因此，我们进一步开展了NO催化涂层对EC生长行为的评价。图9为HUVECs在NO催化涂层表面培养不同时间的粘附和增殖结果。HUVECs培养2小时后的典型荧光染色结果显示(图9(A))，培养基在没有添加SNAP/GSH条件下，316L SS表面粘附的细胞大多呈现圆球形，而四种涂层表面粘附的细胞大部分呈铺展状态，这说明NO催化涂层表面具有适宜的HUVECs粘附和生长微环境。细胞粘附统计结果显示，四种涂层均显著的促进了细胞的初期粘附(图9(C))。图9(D)和图9(E)中的细胞形态统计结果表明，四种催化涂层上的单个细胞铺展面积较316L SS表面粘附的细胞面积增大了80%~150%，细胞短/长轴比值却无显著性差异。当细胞培养基中添加供体SNAP/GSH后，316L SS表面粘附的细胞生长行为并未发生明显变化。与此不同的是，培养基中SNAP/GSH的添加对NO催化涂层上的细胞生长行为造成了显著性的影响。添加SNAP/GSH后，NO催化涂层表面细胞粘附数量显著增加，细胞铺展面积显著增大。其中Ca/CySA和Dopa/CySA涂层表面粘附的细胞短/长轴比明显下降，这意味着其表面具有更强的细胞迁移能力。这些数据表明，NO催化涂层催化产生的NO可有效促进HUVECs粘附、铺展和骨架发展，且有利于细长型HUVECs的形成，进而增强细胞的迁移和增殖能力。为了证实这个推论，我们进行了长时间的细胞培养实验。如图9(B)和图9(F)所示，在没有添加SNAP/GSH的条件下，与316L SS相比，四种儿茶酚制备的NO催化涂层提供了更有利于细胞生长的微环境，其表面具有更好的细胞粘附和增殖。在添加SNAP/GSH后，四种儿茶酚制备的NO催化涂层因NO的催化释放进一步促进了细胞的增殖。 图9. HUVECs于316L SS和4种不同NO催化涂层表面培养2小时(A)和1天(B)后的荧光染色图片；(C) 细胞培养2小时的粘附数量统计结果(用于细胞粘附数量统计的图片不少于12张)；(D) 单个细胞铺展面积(E)和短/长轴比值(用于细胞形态统计学分析的图片不少于12张，且细胞个数大于100)；(F) HUVEC增殖结果(供体组成：10 μM SNAP/GSH；供体组成：10 μM SNAP/GSH；平均值 ± 标准差，n = 4；单因素方差分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001) 3.2.3. NO催化涂层对HUASMCs和HUVECs共培养的影响 为了评价HUVECs与HUASMCs之间的竞争行为，进一步开展了细胞共培养实验，用于细胞共培养的HUVECs和HUASMCs的接种比值为1。如图10所示，细胞在无SNAP/GSH添加的培养基中培养2小时后，316L SS表面的HUVECs/HUASMCs比值为0.96，非常接近接种比值1。而NO催化涂层HUVECs/HUASMCs比值增加至1.9~2.1，这说明NO催化涂层表面具有选择性促HUVECs粘附和生长能力。当培养基添加SNAP/GSH后，316L SS表面的HUVECs与HUASMCs比值为0.94，无显著性变化。然而，NO催化涂层因供体SNAP/GSH的添加连续催化释放NO，而NO的出现进一步增强了对HUVECs的选择性，其表面粘附的HUVECs与HUASMCs比值提高至2.4~3.1。其中GA/CySA表面粘附的HUVECs/HUASMCs比值最高，为3.1，是316L SS表面粘附的HUVECs/HUASMCs比值的3.3倍。这说明NO具有选择性调控HUVECs和HUASMCs生长的生物学功能。 图10. (A) 316L SS，Ca/CySA，Dopa/CySA，GA/CySA和EGCG/CySA表面HUVECs与HUASMCs共培养2小时的荧光图(CMFDA标记HUVECs为绿色，CMTMR标记HUASMCs为红色)；(B) 非供体组样品表面的细胞粘附数量统计结果；(C) 供体组样品表面的细胞粘附数量统计结果。(供体组成：10 μM SNAP/GSH；平均值 ± 标准差，n = 4；单因素方差分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)