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user: 3. 结果和讨论 3.1. 姜黄素发酵乳的成分优化 由于姜黄素在水溶液中的溶解度非常低，所以增加其水溶性是更好地应用姜黄素于前提条件。奶粉中含有三种主要蛋白质，其中酪蛋白和乳清含量最多。据报导，姜黄素可通过疏水作用与酪蛋白和乳清蛋白形成复合物，大大提高其水溶性 [ 6 ] [ 8 ] 。在这里，我们认为奶粉中的蛋白质可以和姜黄素形成复合物，因此可用于制备姜黄素发酵乳。 经过几次初步实验，我们优化了姜黄素发酵乳的制备步骤。具体制备过程如下：在100 mL蒸馏水中溶解12 g奶粉(全脂奶粉：脱脂奶粉重量比为5:1)和0.5%~0.8%姜黄素(基于奶粉的重量)，超声处理1小时，磁力搅拌2小时。将奶粉溶液在室温下储存过夜以沉淀未溶解的姜黄素。发酵过程与方法部分中描述的相同。因为姜黄素与酪蛋白和乳清蛋白分子复合，同时超声和搅拌都增加了姜黄素在乳溶液中的溶解。 姜黄素发酵乳发酵后，颜色为淡黄色且有姜黄素的轻微气味。主要物理性质总结在表1中。普通发酵乳和姜黄素发酵乳的pH值和酸度没有显著差异，这意味着添加姜黄素对发酵过程的影响较小。发酵乳的酸度是衡量发酵乳品质的重要指标 [ 21 ]，反映了发酵乳中有机酸的含量。在发酵乳发酵5小时后，发酵乳的pH值从中性降低至约4.35 [ 22 ] 。持水性反映了发酵乳的持水能力和质地特性。结果表明，姜黄素发酵乳的持水力略低，但差异不显著。以前的报告表明，在制备发酵乳时可以使用超声处理，由于总脂肪膜表面积增加，可以增加发酵乳的持水能力 [ 23 ] 。但由于姜黄素与酪蛋白和乳清蛋白相互作用，这可能会降低发酵乳中蛋白质的持水能力。添加姜黄素对发酵乳主要营养成分的影响结果列于表2中。显然，添加姜黄素对pH值，酸度，持水力和主要营养成分的影响非常有限，说明姜黄素发酵乳和普通发酵乳相比，理化性质没有显著差异。 Table 1 Major physical property of CFY and plain yogur 姜黄素添加量/% pH值 酸度(g/100 g) 持水性(mL/100 g) 0 4.33 ± 0.14 0.81 ± 0.01 55.57 ± 5.54 0.5 4.21 ± 0.11 ns 0.86 ± 0.03 ns 51.34 ± 7.51 ns 0.6 4.16 ± 0.05 0.88 ± 0.03 53.37 ± 7.94 0.8 4.26 ± 0.07 0.86 ± 0.02 51.76 ± 6.86 表1. 不同姜黄素添加量制备发酵乳的物理性质 注：ns表示同一列中没有显着差异 Table 2 Nutritional parameters of CFY and plain yogur 姜黄素添加量/% 含水量/% 灰分含量/% 蛋白质含量/% 脂质含量/% 碳水化合物含量/% 0 69.82 ± 0.87 0.39 ± 0.05 4.20 ± 0.33 5.50 ± 0.68 20.09 ± 1.49 0.5 68.86 ± 1.21 ns 0.43 ± 0.03 ns 4.26 ± 0.21 ns 5.52 ± 0.57 ns 20.35 ± 1.09 ns 0.6 68.31 ± 1.45 0.44 ± 0.02 4.04 ± 0.35 5.53 ± 0.63 21.68 ± 2.33 0.8 68.53 ± 2.04 0.47 ± 0.06 4.10 ± 0.09 5.73 ± 0.31 21.17 ± 2.54 表2. 不同姜黄素添加量制备发酵乳的主要营养成分 注：ns表示同一列中没有显着差异 3.2. 姜黄素含量和总酚含量 姜黄素的特点是溶解度低，在紫外线照射和热处理等环境中不稳定。即使通过姜黄素与乳蛋白形成复合物有助于溶解姜黄素，但实际溶解的姜黄素并不多。在搅拌和超声处理后，可以在乳液的底部检测到姜黄素沉淀。但发酵后，观察到部分的姜黄素溶解在发酵乳中，这与之前的研究一致 [ 24 ] 。在发酵乳发酵期间，pH值降低，而姜黄素在酸性溶液中的溶解度较低，因此我们推测乳酸菌发酵可以促进姜黄素与乳蛋白或其水解产物的络合作用，但这仍需要进一步研究证明。表3是发酵乳和姜黄素发酵乳的姜黄素含量和总酚含量结果。姜黄素发酵乳的姜黄素浓度在0.25至0.30 mg/g之间，这意味着前处理和发酵过程溶解了约40%至50%的姜黄素，姜黄素–蛋白质复合物比率为2.06~2.67 mg/g，而在0.5%姜黄素发酵乳中姜黄素的溶解性和复合物比率较高。因此，在随后的检测中选择姜黄素发酵乳(0.5%)进一步研究。酪蛋白和乳清蛋白可以以不同方式与姜黄素相互作用以增强其溶解度，但由于使用的方法不同，文献中报导的结合比率也不同 [ 8 ] [ 25 ] 。此外，乳蛋白在发酵过程中部分水解产生短肽，短肽可能更容易接近吸附姜黄素，进一步增加其在发酵乳中的溶解度 [ 26 ] 。 如上所述，姜黄素在水性环境中具有非常低的溶解度，这是食品中添加姜黄素的一大障碍。在最近的一项研究中，姜黄素的水溶度为0.39 ± 0.05 μg/mL [ 27 ] 。与报导值相比，姜黄素发酵乳中的姜黄素浓度比天然姜黄素浓度高650倍，这也表明发酵乳可以有效地提高姜黄素溶解度。 Table 3 Curcumin content and total phenol content of CFY and plain yogur 姜黄素添加量/% 姜黄素含量(mg/g) 装载效率(％) 蛋白质络合比(mg/g) 总酚含量(mg/g) 0 - - - 0.19 ± 0.05 b 0.5 0.26 ± 0.04 ns 52.0 ± 0.94 a 2.17 ± 0.13 b 0.48 ± 0.08 a 0.6 0.25 ± 0.05 41.7 ± 1.37 b 2.08 ± 0.09 b 0.45 ± 0.06 a 0.8 0.31 ± 0.03 38.8 ± 2.69 c 2.67 ± 0.07 a 0.44 ± 0.11 a 表3. 不同姜黄素添加量制备发酵乳的姜黄素和总酚含量 注：姜黄素基于校准曲线Y = 0.1645*X − 0.0158，r 2 = 0.9999计算，其中X代表姜黄素浓度(ppm)， Y代表419 nm处的吸光度; 总酚含量基于校准曲线Y = 0.0089*X + 0.0714，r 2 = 0.998计算；ns表示同一列中没有显着差异，同列字母不同表示差异显著 3.3. 微观结构 由于姜黄素具有典型晶体结构，可以在显微镜下进行检测，姜黄素发酵乳微观结构如图1和图2所示。在显微镜下放大100，200和400倍数的图像结果显示，在普通发酵乳和姜黄素发酵乳中，主要结构是酪蛋白胶束或其聚集体，这和先前所报导结果一致 [ 28 ] 。明显可以看出，姜黄素发酵乳中的姜黄素晶体消失，推测其与酪蛋白和乳清蛋白相互作用，主要以分子或无定型状态存在。通过如图2所示的SEM图像进一步证明了这一点，在普通发酵乳和姜黄素发酵乳图像中酪蛋白和酪蛋白聚集体均占优势。 图1. 姜黄素发酵乳的微观结构(100×、200×、400×) 图2. 姜黄素发酵乳的电镜扫描图(1000×、2300×) 之前报道的姜黄素SEM图像显示姜黄素通常为长的板状或针状，其尺寸约为30 μm [ 29 ] 。据推测，姜黄素可能存在于姜黄素发酵乳中作为无定形状态，这之前的报导一致 [ 6 ] [ 8 ] 。当存在于无定形状态时，姜黄素不仅具有较高的溶解度，而且具有较高的抗氧化性和生物利用率，因此在下面的研究中，我们研究了姜黄素发酵乳的抗氧化性，释放曲线和其它主要理化性质。 3.4. 质构性质 姜黄素发酵乳和普通发酵乳的质构性质参数如表4所示。姜黄素发酵乳和普通发酵乳具有相似的硬度，稠度和粘聚性，但普通发酵乳的粘性指数高于姜黄素发酵乳。姜黄素发酵乳的较低粘度指数是由于超声处理以及姜黄素添加引起。一方面，超声和热处理联合诱导更强的发酵乳结构；另一方面，姜黄素减少了酪蛋白聚集体之间的氢键的相互作用，因此降低了粘度指数。 Table 4 Texture properties of CFY and plain yogur 姜黄素添加量/% 硬度(g) 稠度(g/sec) 黏聚性(g) 粘性指数(g/sec) 0 105.07 ± 5.37 ns 1804.70 ± 126.89 ns −36.17 ± 6.86 ns −377.92 ± 33.58 a 0.5 100.38 ± 4.67 1676.46 ± 77.82 −53.01 ± 8.31 −68.34 ± 1.13 b 表4. 姜黄素发酵乳(0.5%)和普通发酵乳的质构性质 注：ns表示同一列中没有显着差异，同列字母不同表示差异显著。 3.5. 抗氧化能力 三种姜黄素发酵乳样品中的姜黄素浓度在0.26~0.31 mg/mL范围内，但没有显著差异。但姜黄素在姜黄素与奶粉的重量比为0.5%时与奶粉中蛋白质结合效率最高，所以选取0.5%的姜黄素发酵乳测定其抗氧化能力。 通过四种常规方法评估发酵乳的抗氧化性，包括DPPH，ABTS，FRAP和OH自由基清除试验，结果如图3所示，普通发酵乳在所有抗氧化试验中显示出强抗氧化能力。在发酵期间，作为乳蛋白的主要成分的酪蛋白和乳清被水解成具有显著抗氧化活性的寡肽 [ 30 ] 。姜黄素发酵乳的DPPH自由基清除能力与普通发酵乳类似，因为两种发酵乳样品均显示出超过90%的DPPH自由基清除率。在ABTS，FRAP和OH清除试验中，由于姜黄素是一种强抗氧化剂，因此姜黄素发酵乳表现出更高的抗氧化能力。因此我们可以看出，添加姜黄素提高了发酵乳的抗氧化能力。 图3. 姜黄素发酵乳(0.5%)和普通发酵乳的抗氧化性 3.6. 乳酸菌数量 测定了乳酸菌数，结果如图4所示。在本研究中，我们使用Anaero Pack为乳酸菌培养提供厌氧环境。普通发酵乳和姜黄素发酵乳的菌落形成单位与报告值相近。从结果可以看出，添加姜黄素对嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌的生长没有显著影响。据报导，因为姜黄素可显著抑制产气荚膜梭菌，大肠杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌等病原体的生长，但对青春双歧杆菌，双歧杆菌，长双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌无抑制作用 [ 31 ] [ 32 ] 。所以姜黄素的选择性抗微生物性质可以促进发酵乳的安全性并延长其储存时间，同时不会对发酵过程产生负面影响。 图4. 姜黄素发酵乳(0.5%)和普通发酵乳的乳酸菌含量 3.7. 感官品质 研究中根据外观，质地，风味和整体可接受度评价发酵乳和姜黄素发酵乳的感官品质。结果表明如图5所示，姜黄素发酵乳的外观和质地与普通发酵乳的外观和质地没有显著差异。姜黄素发酵乳的颜色类似于芒果或香蕉的黄色，因此，姜黄素发酵乳的外观评分略高于普通发酵乳。添加姜黄素对发酵过程几乎没有影响，所以姜黄素发酵乳的质地特性与普通发酵乳的质地特性相似。由于姜黄素可以完全溶解，在感官评价试验中未检测到颗粒感或砂砾感。然而，姜黄素发酵乳有一种类似于草药的特殊的味道，这也是姜黄素发酵乳在感官评价和整体可接受性方面得分较低的原因。针对这一问题，有人提出用环糊精等材料包裹姜黄素以掩盖令人不快的味道 [ 33 ] 。另外，其他的添加了功能性材料的配方发酵乳，如添加茶，知母和山核桃的发酵乳，也同样面临其风味问题 [ 12 ] [ 13 ] [ 34 ] 。 图5. 姜黄素发酵乳(0.5%)和普通发酵乳的感官评价 3.8. 姜黄素的释放曲线和生物利用率 在体外胃和肠道消化条件下，检测来自姜黄素发酵乳中的姜黄素的释放曲线。结果如图6所示，姜黄素可以以缓释的方式释放出来。在胃消化阶段，消化90分钟后姜黄素释放达到平衡状态。在胃消化阶段结束后，姜黄素发酵乳中约37.25%的姜黄素被释放到胃消化物中。当肠道消化开始时，释放速度显著增加并达到姜黄素含量的约60%。在肠道消化结束时，约63.90%的姜黄素被释放到消化物中。在肠道消化中，胰腺分泌液中含有的蛋白酶进一步降解了姜黄素发酵乳的蛋白质和短肽，加快了姜黄素的释放速度。另外，体外消化后，在模拟消化容器的底部可以看到少部分未消化的发酵乳碎片，因此并非所有的姜黄素都被释放到模拟的消化溶液中。生物利用率表示为在完成肠道溶液模拟消化后，释放到消化物中的姜黄素与姜黄素发酵乳中姜黄素总量的比率。姜黄素在姜黄素发酵乳中的生物利用率确定为63.90%。 图6. 姜黄素发酵乳(0.5%)的姜黄素释放曲线