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user: 3. 结果与分析 3.1. SSR位点数目及特征 分别对十字花科物种进行了全基因组序列和基因序列的SSR扫描，在全基因组中共发现了1，786，619个SSR位点，在基因序列中共发现了63，915个SSR位点，占总基因组序列SSR的3.58%。在十字花科物种的全基因组序列中，平均每100，000，000个碱基中都会存在324~596.8个SSR。拥有两个较大基因组的物种B. napus和C. sativa其Genome-SSR和Gene-SSR也居于前两位。各物种Gene-SSR占Genome-SSR的比值在(B. oleracea) 1.86%~(A. lyrata) 6.14%之间趋于相对的平稳(见表2)。 不同SSR重复单元具有较大的偏向性，在全基因组序列和基因序列中的SSR重复单元也存在差异。在全基因组序列中一单元重复的SSR数目占了总数目的一半以上为68.4%，其次是二单元重复和三单元重复的23.32%和7.59% (见图2(a))，然而在基因序列中的三单元重复的SSR数目高达79.47%，其次为一单元重复和二单元重复的11.12%和8.47%(见图2(b))。 对不同十字花科物种基因组序列的不同SSR重复片段分布频率做了一个统计，将每个物种每个重复单元数目前两位的重复片段提取出来。各个物种各个重复单元类型的前两位SSR片段基本上是相同的，其中二碱基重复的AT/TA，三碱基重复的GAA及TCT和四碱基类型的AAAT/TAAA在每个物种中数目都是非常高。在三碱基重复单元中大部分物种数目前两位为GAA和TCT，然而S. parvula物种为GAA和TTC (见表3)。 3.2. SSR引物设计及验证 利用十字花科物种的全基因组序列以及基因序列扫描到的SSR进行批量的设计了引物并进行了电子 图1. SSR开发以及引物设计技术路线图。1) SSR开发，引物设计以及特意引物和通用引物的确定；2) 将所有数据导入MySQL数据库中；3) PHP和Perl语言连接前台和后台；4) Apache前台页面展示 Table 2 The statistics of Genome-SSR and Gene-SSR in Brassicacea Item A. arabicum A. lyrata A. thaliana B. napus B. oleracea B. rapa C. sativa C. rubella L. alabamica S. parvula S. irio T. halophila T. salsuginea Total Genome-SSRs 94，773 103，106 50，092 362，529 174，199 145，843 367，769 80，450 61，345 44，482 85，325 110，234 106，472 1，786，619 Gene-SSRs 3，042 6，335 2，647 9，743 3，233 4，568 13，008 3，549 3，167 2，724 3，856 3，308 4，735 63，915 Ratio 3.21% 6.14% 5.28% 2.69% 1.86% 3.13% 3.54% 4.41% 5.16% 6.12% 4.52% 3.00% 4.45% 3.58% No. of SSRs (Mb) 475.3 498.8 418.5 426.4 452.5 511.9 573.3 596.8 352.2 324.0 328.8 453.5 455.6 - 表2. 十字花科物种Genome-SSR和Gene-SSR数目表 模拟PCR扩增验证，最终，在全基因组序列中共有1，919，464对引物被确定，同时在基因序列中有54，619对引物被确定。在不同的物种的全基因组序列中引物的密度从(L. alabamica) 112.94对/Mb到(T. halophila) 1177.68对/Mb不等，在基因序列中为(A. arabicum) 42.65对/Mb到(C. sativa) 139.69对/Mb不等(见表4)。 3.3. 特异性引物和通用引物 在全基因组序列和基因序列中分别找到435，414和30，141对特异性扩增引物，同时11对能在十字花科物种中扩增的SSR引物被确定(Universal-primer-01~ Universal-primer-01)，其中有三条来自于C. rubella， 图2. Genome-SSR和Gene-SSR不同单元重复数目分布图 Table 3 The statistics of different SSR top two repeat unit Species Dimer Trimer Tetramer Pentamer Hexamer A.arabicum AT(11，437) TA(8993) GAA(464) TCT(386) AAAT(51) TTTA(44) AAAAT(14) TTTTA(8) TAAAAT(7) ACATAC(4) A.lyrata AT(5993) TA(4539) GAA(730) TCT(672) AAAT(31) AAAG(19) GAAGA(3) TTCGG(3) TTCTTG(3) AGAAGG(2) A.thaliana AT(2641) TA(2054) GAA(514) TCT(475) TTTG(13) AAAG(8) AAACA(3) AGAGA(3) CGACCA(3) CAAACT(2) B.napus AT(28，081) TA(19，905) GAA(1435) TCT(1422) AAAT(148) TTTA(96) TTCGG(15) TTTTG(15) TGGGCT(19) CCCAAG(17) B.oleracea AT(13，474) TA(9200) TCT(642) GAA(607) AAAT(77) TATT(44) TATTT(34) AAAAT(34) CCCAAG(7) CTCTCC(5) B.rapa AT(10，743) TA(8039) GAA(678) TCT(610) AAAT(184) TATT(161) TTTTA(10) TTCGG(6) CCCAAG(7) TTTTGT(4) C.sativa AT(25，786) TA(17，597) GAA(2528) TCT(2368) AAAT(87) TTTC(63) TTTTG(80) ACAAA(61) GAGGTA(20) GGGTTA(9) C.rubella AT(5423) TA(4218) GAA(696) TCT(646) AAAT(55) ATTT(54) TTTTG(7) AATAA(5) CAAAAA(2) AAAAAC(1) L.alabamica AT(6477) TA(5003) GAA(510) TCT(438) TTTA(55) AAAT(53) AAAAT(13) TTTTA(10) TATTTA(3) TTTTAA(3) S.parvula AT(4463) TA(3132) GAA(610) TTC(537) TTTA(20) AAAT(18) AAAAG(5) AAATA(3) TCACTC(4) TTTTGT(4) S.irio AT(6953) TA(4700) GAA(578) TCT(576) AAAT(29) ATTT(17) TTTTA(6) AAAAT(5) CATAAA(2) GGTGCT(2) T.halophila AT(7128) TA(5283) GAA(698) TCT(614) AAAT(26) AAAG(21) AAAAT(7) TTTTA(4) AAAAAT(2) CCCGAG(2) T.salsuginea AT(6960) TA(5015) GAA(685) TCT(590) TTTA(20) AAAT(19) AAAAT(7) GAAAA(4) AAAAAC(2) AGAGAA(2) 表3. 不同SSR重复单元数目前两位的重复片段统计 S. irio和T. halophila分别占用两条，其余来自于B. oleracea，A. arabicum，S. parvula ，T. salsuginea分别占一条(见表5)。 3.4. BSSRD数据库的构建和应用 基于实验中的所有的数据包括物种的序列信息，SSR位点信息，e-PCR信息以及各类引物信息，构建了十字花科SSR数据库(BSSRD， Brassicaceae Simple Sequence Repeats Database http://biodb.sdau.edu.cn/BSSRD)，该数据库包括SSR，Primer，Tools三个部分，用户可以在SSR和Primer界面中利用SSR ID和Primer ID等个性化搜索有目的的进行SSR及其引物的检索，同时在Tools界面能够使用一些简单的工具，包括界面化的 Table 4 Statistics of the SSR primers in Brassicacea Species No. of Genome Primes Genome Primer (Mb) No. of Genome Primes Gene Primer (Mb) A. arabicum 43，217 216.74 1915 42.65 A. lyrata 92，470 447.36 3131 80.49 A. thaliana 25，620 214.04 1899 56.86 B. napus 586，594 689.87 9908 97.91 B. oleracea 210，585 546.97 2584 70.22 B. rapa 71，954 252.56 3659 76.07 C. sativa 403，231 628.58 16，162 139.69 C. rubella 33，039 245.10 2404 67.34 L. alabamica 21，417 122.94 2304 49.13 S. parvula 19，585 142.64 2018 55.75 S. irio 37，828 145.77 3072 54.18 T. halophila 286，293 1177.68 2650 73.41 T. salsuginea 87，631 374.97 2913 82.06 Average 147651.08 400.40 4201.46 72.75 表4. 十字花科物种中SSR引物的统计 Table 5 The detail information of 11 pair of universal primer 编号 引物名称 前引物 后引物 Universal-primer-01 Bol-C08-17368332-17368462 GACACAGCTGCTTTCAAAAA ATTCAATGTCTCCCCACCTG Universal-primer-02 Cru-scaffold_1-17431124-17431282 GAGTGGCAGTGAGCTGTCAA AGGGACAAACAGCGTCAGAG Universal-primer-03 Aar-AA_scaffold6649-155781-155912 TGACATGGAAGATTCGGTTC ACTCGTCAAACATTGCTTCTTG Universal-primer-04 Spa-Sp6-18047624-18047764 AGGGCACGTGCATTACTAGC AGATGGGCACATGAAGAACT Universal-primer-05 Tha-scaffold_22-1282063-1282197 CATTCTTCTCTTTGGCCTTT GCACCTGTGTCCACTTCGTA Universal-primer-06 Tsa-ch1-01-1287940-1288076 CCTTGTACAAACGCTCCTTCA TCCTGCTGTTGATTTAGGACAG Universal-primer-07 Sir-SI_scaffold2431-6850-6980 CGAGCGCCTAAAGTTAAAAA ATGACAGAGCTGCGGTGAC Universal-primer-08 Cru-scaffold_1-429966-430108 TATCATTCATGGGCCCCTAC TGGTGGCTTGAGATTCTTGA Universal-primer-09 Cru-scaffold_6-26067-26247 GGAAGATGGGCACATGAAGA TTGAGCAAGATGGAGAAGCA Universal-primer-10 Sir-SI_scaffold2301-134273-134433 GAGTGGCAGTGAGCTGTCAA AGGGACAAACAGCGTCAGAG Universal-primer-11 Tsa-ch4-82-2961373-2961507 CATTCTTCTCTTTGGCCTTT GCACCTGTGTCCACTTCGTA 表5. 11对通用引物信息表 SSR的检测和e-primer3的在线使用(见图3)。