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user: 3. 结果与分析 3.1. 低共熔溶剂的组成 选取氢键受体氯化胆碱和氢键供体多元醇(1，4-丁二醇和乙二醇)分别以1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9的摩尔比加热熔融，配制成低共熔盐，分别取40 mL低共熔盐与40 mL蒸馏水混合均匀，放入8g油樟叶原料进行微波萃取，获得萃取精油的体积随配比不同的变化数据如图1(a)所示。将其与水分别以9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的体积比比混合均匀配制成低共熔溶剂，分别取80 mL上述溶剂，加入8g油樟叶原料进行微波萃取，获得油樟精油的体积随低共熔溶剂与水的配比不同的变化数据如图1(b)所示。根据精油的提取率，确定低共熔溶剂最佳的组成。 3.2. 单因素实验分析 3.2.1. 微波提取精油动力学 精密称取8.00 g (绝干)风干样品，转移至圆底烧瓶中，加入80 mL低共熔溶剂，室温浸渍12 h，使原料与溶剂充分浸润，然后放入微波辅助萃取仪，接上精油提取器收集蒸馏出的精油，每隔1 min读取一次获得精油的体积，如图2(a)所示。在5 min后，提取精油体积大约保持不变。 3.2.2. 微波功率对精油提取率的影响 精密称取8.00 g (绝干)风干样品，转移至圆底烧瓶中，加入80mL低共熔溶剂，室温浸渍12 h，使原料与溶剂充分浸润，然后放入微波辅助萃取仪，接上精油提取器收集蒸馏出的精油，将微波反应时间设置为5 min，加热温度为120℃，微波功率分别为500 W、600 W、700 W、800 W、900 W，记录获得精油的体积，如图2(b)。在500W、600W时，提取精油体积为12.5 mL/Kg；在700 W时，提取精油体积为25 mL/Kg；在800 W时，提取精油体积为11.25 mL/Kg；在900 W时，提取精油体积为13.75 mL/Kg。萃取完成后收集油樟精油，−20℃冷冻保存。 图1. 低共熔溶剂的组成对精油提取率的影响。(a) 氯化胆碱与1，4-丁二醇的摩尔比对精油提取率的影响；(b) 低共熔盐与水的体积比对精油提取率的影响 图2. 微波提取精油单因素分析。(a) 微波提取精油动力学曲线；(b) 微波功率对精油提取率的影响；(c) 微波温度对精油提取率的影响；(d) 料液比对精油提取率的影响 3.2.3. 微波温度对精油提取率的影响 精密称取8.00 g (绝干)风干样品，转移至圆底烧瓶中，加入80 mL低共熔溶剂，室温浸渍12 h，使原料与溶剂充分浸润，然后放入微波辅助萃取仪，接上精油提取器收集蒸馏出的精油，将微波反应时间设置为5 min，微波功率为700 W，加热温度分别为105℃、110℃、115℃、120℃、125℃，记录获得精油的体积，如图2(c)。萃取完成后收集油樟精油，−20℃冷冻保存。从105℃至120℃，提取精油体积增加，120℃与125℃提取精油体积均为25.0 mL/Kg。 3.2.4. 料液比对精油提取率的影响 精密称取8.00 g (绝干)风干样品，转移至圆底烧瓶中，分别以1:6、1:8、1:10、1:12、1:14的料液比加入低共熔溶剂，室温浸渍12 h，使原料与溶剂充分浸润，然后放入微波辅助萃取仪，接上精油提取器收集蒸馏出的精油，将微波反应时间设置为5 min，微波功率为700 W，加热温度为120℃，记录获得精油的体积，如图2(d)。萃取完成后收集油樟精油，−20℃冷冻保存。1:6至1:10，精油体积增加，在1:10时提取精油体积为25.0 mL/Kg，但随后精油体积逐渐减小。精油的提取率出现下降，原因是水油比例增加，部分物质与水结合形成水包油结构，导致挥发油溶解现象 [ 17 ] 。 3.3. 响应面优化实验 3.3.1. 响应面试验设计与结果分析 在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以精油提取率(Y)为响应值，选取A (微波时间)、B (微波功率)、C (微波温度)、D (液料比)四个因素，进行响应面优化实验，实验结果见表1。 3.3.2. 回归模型的建立与显著性分析 运用Design-Expert对表1进行多元回归拟合，得到精油提取率(Y)对自变量微波时间(A)、微波功率(B)、微波温度(B)、液料比(D)的多元回归方程：Y = 25.05 + 2.32A + 0.77B + 1.01C + 1.74D + 1.09AB − 0.32AC + 1.32AD + 0.78BC + 0.53BD + 0.51CD − 1.93A 2 − 3.05B 2 − 1.48C 2 − 1.26D 2 。对回归模型进行方差分析，结果见表2。 为了进一步研究各因素之间的相互作用，我们对微波功率、提取时间和液料比进行了测定。在表2中，F值5.89表明模型具有显著性，但这种模型F值出现的概率仅为0.08%，可以作为噪声处理。“可能性 > F”小于0.0500表明模型具有显著性，在表格中，A，B，C，D，A 2 ，B 2 ，C 2 ，D 2 都是显著模型。大于0.1000的数值表明模型不具有显著性。如果有很多显著模型(不包括那些需要支持层次结构的)，模型降阶(或提纯)是必须的。失拟项1036.19表明失拟项是显著的，F值失拟项发生的概率只有0.01%，，可被作为噪声处理。显著的拟合不足是不利的，所以希望模型能够拟合。在表3中，决定系数是0.8461，调整平方是0.7024，两者之间存在合理的一致性。精密度测量了信噪比，比值大于4是可取的。目前比值为7.924，表明存在一个错误信号。此模型可用于导航设计空间。最终萃取效率(Y)方程为Y = 25.05 + 2.32A + 0.77B + 1.01C + 1.74D + 1.09AB − 0.32AC + 1.32AD + 0.78BC + 0.53BD + 0.51CD − 1.93A 2 − 3.05B 2 − 1.48C 2 − 1.26D 2 。由方程可知，我们需要研究A与B、A与C、A与D、B与C、B与D、C与D相互作用对萃取效率的影响。该软件对精油提取率条件进行了预测，精油的理论提取率为26.87 mL/Kg；精密称取三份油樟叶片粉末8.00 g进行验证试验，选择微波功率为700 W，微波提取温度为120℃，料液比1:10 g/mL，微波加热5.0 min，精油的提取率分别为25.82、25.64、26.10 mL/Kg，与理论值误差为3.78%。 从表3中得知，预测平方0.1136与调整平方0.7024是合理的，“精密度”测量的是信噪比，比值大于4时可取的，目前的比值是7.924，是合理信号。从图3中看出，六个因素的曲面都比较陡峭，说明微波提取时间、微波温度、微波功率、料液比对提取效果都有明显的显著。另外，微波提取时间、微波温度、微波功率、料液比在所选的水平范围内都有定点，说明最佳值在所选的范围内。由响应面图曲面坡度越陡峭、等高线越密集成椭圆形表示两两因素交互影响越大的原则 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] ，因子A(微波时间)与因子D(微波功率)之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面中最为陡峭，即微波时间与微波功率之间具有最强的交互作用。 Table 1 Response surface test design and result 序号 因素A 因素B 因素C 因素D 响应结果 微波时间(min) 微波功率(W) 微波温度(℃) 液料比(mL/g) 精油提取率(mL/Kg) 1 5.00 700.00 130.00 10.00 25.22 2 4.00 800.00 125.00 9.00 17.42 3 5.00 900.00 120.00 10.00 14.27 4 3.00 700.00 120.00 10.00 10.93 5 4.00 600.00 115.00 9.00 16.67 6 5.00 700.00 120.00 8.00 14.44 7 5.00 500.00 120.00 10.00 12.65 8 7.00 700.00 120.00 10.00 24.96 9 6.00 600.00 125.00 9.00 10.88 10 6.00 800.00 125.00 11.00 24.55 11 6.00 800.00 115.00 11.00 22.96 12 6.00 800.00 125.00 9.00 18.43 13 6.00 600.00 115.00 11.00 16.57 14 6.00 800.00 115.00 9.00 17.22 15 4.00 600.00 125.00 9.00 15.65 16 4.00 800.00 115.00 11.00 15.51 17 5.00 700.00 120.00 10.00 24.89 18 5.00 700.00 120.00 10.00 25.10 19 4.00 800.00 125.00 11.00 15.23 20 4.00 600.00 125.00 11.00 14.77 21 4.00 600.00 115.00 11.00 14.62 22 6.00 600.00 125.00 11.00 20.41 23 5.00 700.00 120.00 12.00 26.87 24 5.00 700.00 120.00 10.00 24.94 25 5.00 700.00 110.00 10.00 14.33 26 5.00 700.00 120.0 10.00 25.16 27 5.00 700.00 120.00 10.00 25.07 28 5.00 700.00 120.00 10.00 25.12 29 6.00 600.00 115.00 9.00 18.89 30 4.00 800.00 115.00 9.00 12.45 表1. 响应面试验设计方案及结果 图3. 两两因素交互作用的响应面图 Table 2 Regression coefficient tes 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性 模型 655.56 14 46.83 5.89 0.0008 * A-微波时间 129.04 1 129.04 16.23 0.0011 B-微波功率 14.34 1 14.34 1.80 0.1993 C-微波温度 24.46 1 24.46 3.08 0.0999 D-液料比 73.05 1 73.05 9.19 0.0084 AB 19.49 1 19.16 2.41 0.1414 AC 1.68 1 1.68 0.21 0.6520 AD 27.90 1 27.90 3.51 0.0807 BC 9.81 1 9.81 1.23 0.2841 BD 4.46 1 4.46 0.56 0.4654 CD 4.15 1 4.15 0.52 0.4811 A 2 102.47 1 102.47 12.88 0.0027 B 2 255.83 1 255.83 32.17 <0.0001 C 2 59.70 1 59.70 7.51 0.0152 D 2 43.22 1 43.22 5.44 0.0341 残差 119.29 15 7.95 - - 失拟项 119.23 10 11.92 1036.19 <0.0001 * 纯误差 0.058 5 0.012 - - 总离差 774.85 29 - - - 表2. 回归系数检验 Table 3 Reliability analysis of regression equatio 指标 响应值 标准偏差 2.82 平均值 18.87 C. V. % 14.94 PRESS 686.85 决定系数 0.8461 调整R 2 0.7024 预测R 2 0.1136 精密度 7.924 表3. 回归方程的可信度分析 3.4. 油樟精油抗氧化能力测试 在人体内，当电子流变成非耦合(出现未配对单电子)时就会产生自由基 [ 21 ] ，自由基对人类有着双重影响，在生命系统中扮演着双重角色 [ 7 ] 。正常情况下，机体自由基的产生与消退处于平衡状态 [ 22 ] 。在本研究中自由基清除率用SC%表示，SC% = (1 − A样品/A对照) × 100%，其中A样品为样品溶液在固定波长下的吸光值，A对照为不加样品的溶液在t = 0处的吸光值 [ 15 ] 。 精油清除DPPH阴离子自由基能力 测定新配的不加精油样品的DPPH阴离子溶液在517 nm处的吸光值，此吸光度值是最大吸光度值，为1.244。待精油样品与DPPH阴离子溶液反应30 min后，在517 nm处测得各样品的吸光度值，不同浓度的精油对DPPH阴离子的清除率如图4(a)所示。DPPH阴离子溶液浓度为 0.0015 g/100 mL，空白对照组吸光值0.420。由图可知，10%浓度的精油对DPPH阴离子的清除率为7.4%，50%浓度的精油对DPPH阴离子的清除率为55.47%，随着精油浓度的提高，对DPPH阴离子的清除率也逐渐提高。可见油樟精油对DPPH阴离子的抗氧化活性很高。对比微波水蒸气蒸馏和传统水蒸气蒸馏，微波水蒸气蒸馏中50%浓度的精油对DPPH阴离子的清除率为45.68%，传统水蒸气蒸馏中50%浓度的精油对DPPH阴离子的清除率为33.45%。可见微波低共熔溶剂蒸馏出的精油比微波水蒸气蒸馏和传统水蒸气蒸馏对DPPH阴离子的清除率要高。 精油清除ABTS阳离子自由基能力 新配置的ABTS阳离子溶液在744 nm处取得最大吸光度值为1.095，空白对照组吸光度值为1.812。不同浓度的精油对ABTS阳离子的清除率随精油浓度的变化曲线如图4(b)所示。1%浓度的精油对ABTS阳离子的清除率为56.34%，5%浓度的精油对ABTS阳离子的清除率为98.78%，可见较低浓度的精油对ABTS阳离子有较高的清除率。而且随着精油浓度的提高，对ABTS阳离子的清除率也逐渐提高。对比微波水蒸气蒸馏和传统水蒸气蒸馏，微波水蒸气蒸馏中5%浓度的精油对ABTS阳离子的清除率为95.24%，传统水蒸气蒸馏中5%浓度的精油对ABTS阳离子的清除率为85.11%。可见微波低共熔溶剂蒸馏出的精油比微波水蒸气蒸馏和传统水蒸气蒸馏对ABTS阳离子的清除率要高。 3.5. 油樟精油化学组成分析 使用Agilent气质联用仪对三种方法提取所得的油樟精油进行化学组成分析，主要的化学组成见表4所示。由表4可知，油樟挥发性成分主要由烯烃和醇类化合物组成。低共熔溶剂微波水蒸馏法、微波水蒸馏法、传统水蒸馏法获得的精油中成分种类大致相同，但含量稍有差异。低共熔溶剂微波水蒸馏法获得的精油中，含量最高的为桉叶油醇，相对含量为63.43%；其次是桧烯，相对含量为12.54%；α-松油醇的含量也较高，相对含量为10.28%。微波水蒸馏法获得的精油中，含量最高的也为桉叶油醇，相对含量为62.81%；其次是桧烯，相对含量为12.23%；α-松油醇的含量也较高，相对含量为9.45%。传统水蒸馏法获得的精油中，含量最高的也为桉叶油醇，相对含量为54.55%；其次是α-松油醇，相对含量为19.87%；桧烯的含量也较高，相对含量为10.22%。由于在低共熔溶剂微波水蒸馏法获得的精油中不饱和烯烃成分所占比例较大，所以清除自由基效果更强。而在传统水蒸馏法获得的精油中，醇类成分所占比例较大。 Table 4 Volatile compounds in C. longepaniculatum essential oi 序号 化合物名称 保留时间 (min) 分子式 相对百分含量 (%) 低共熔溶剂微波水蒸馏法 微波水蒸馏法 传统水蒸馏法 1 α-侧柏烯 4.6 C 10 H 16 0.74 0.68 0.47 2 α-蒎烯 5.5 C 10 H 16 1.93 1.89 0.69 3 莰烯 5.6 C 10 H 16 0.35 0.27 0.11 4 桧烯 6.2 C 10 H 16 12.54 12.23 10.22 5 α-水芹烯 7.1 C 10 H 16 0.56 0.45 0.24 6 α-松油烯 7.4 C 10 H 16 0.83 0.73 0.13 7 桉叶油醇 7.8 C 10 H 18 O 63.43 62.81 54.55 8 α-罗勒烯 8.2 C 10 H 16 1.57 1.24 0.04 9 γ-松油烯 8.6 C 10 H 16 1.52 1.31 0.83 10 α-异松油烯 8.9 C 10 H 16 0.86 0.71 0.59 11 樟脑 10.0 C 10 H 16 O 1.05 1.82 2.15 12 4-松油醇 10.9 C 10 H 18 O 1.04 3.44 6.67 13 α-松油醇 11.4 C 10 H 18 O 10.28 9.45 19.87 14 环孢素 16.4 C 15 H 24 0.19 0.15 0.02 15 β-波旁烯 16.6 C 15 H 24 0.4 0.3 - 16 β-榄香烯 16.8 C 15 H 24 0.35 0.27 - 17 异香树烯 18.0 C 15 H 24 0.3 0.22 0.14 18 α-蛇麻烯 18.4 C 15 H 24 0.11 0.41 0.95 19 β-愈创木酚 19.0 C 15 H 24 0.26 0.17 0.08 20 γ-古芸烯 19.3 C 15 H 24 0.92 0.72 0.16 21 α-双比烯 19.4 C 15 H 24 0.16 0.09 - 22 铜烯 19.7 C 15 H 24 0.09 0.05 0.03 23 α-法尼烯 20.5 C 15 H 24 0.39 0.28 0.07 24 9，10-脱氢异龙烯 20.8 C 15 H 22 0.09 0.07 0.05 总量(%) 99.96 99.76 98.06 表4. 油樟精油挥发性成分分析 注：“-”代表未检出。 图4. 清除自由基能力测试结果。(a) 不同浓度的精油对DPPH阴离子自由基的清除率；(b) 不同浓度的精油对ABTS阳离子自由基的清除率