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user: 3. 飞秒激光在生物方面的应用 a) 飞秒激光在活细胞微手术中的应用 飞秒激光在材料科学领域所表现出来的微纳加工和处理优势在生命科学方面同样适用，其在生物体内所能实现的三维精确微创手术为医学领域的发展提供了新的机会。在对细胞和组织的处理和切除方面，飞秒激光已逐渐成为一个重要的工具，并取得了很多令人振奋的实验结果。 Ø 飞秒激光亚细胞器手术 为了研究细胞的生长、运动、新陈代谢、有丝分裂、分化和凋亡等行为，需要对细胞内的细胞骨架或细胞器进行处理，传统的工具由于空间分辨率不高且对细胞损伤较大制约着该领域的发展，飞秒激光的出现无疑为该领域注入了新的活力。 2006年哈佛大学hmar等人采用飞秒激光手术在活细胞内切割了单根肌动蛋白丝，研究其收缩动力学及细胞形状的变化，如图1所示。日本大阪大学采用飞秒激光在活的NIH 3 T 3 细胞内切割了单根肌动蛋白丝，发现切割后十分钟后，断裂的肌动蛋白丝重新愈合 [ 4 ] ，从而实现了对细胞内纤维解聚和组装的人为调控，为各种细胞内动力学过程的研究奠定了基础。 大阪大学用飞秒激光手术在海拉细胞中实现了单个线粒体的蚀除，而没有破坏细胞周围其它结构，实验后12小时，被手术的细胞进行了正常的有丝分裂 [ 5 ] 。德国耶拿大学的TirlaPur等人用飞秒激光在植物细胞里实现了半个叶绿体的蚀除，应用80 MHz钦篮宝石激光对人类的染色体进行点蚀除和线切割，同时应用原子力显微镜对细胞进行观察 [ 6 ] 。 Ø 飞秒激光细胞膜手术 由脂和蛋白质分子构成的细胞膜是防止细胞外物质进入细胞的屏障，它保证了细胞细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序进行。细胞膜的流动性不仅是膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活动的必要条件。通过膜脂质流动性的改变可反应出细胞膜的功能状态及膜受损伤的程度，同时，膜的流动性也决定了其具有自动愈合的能力。细胞膜与飞秒激光结合具有广泛的应用前景，如细胞融合、细胞分离、转基因、辅助受精等。 2002年，Tirlapur等人用钦蓝宝石飞秒激光器产生的飞秒激光在细胞膜上产生单个的!特定位置的瞬时穿孔，允许DNA通过并保存了细胞的完整性 [ 6 ] 。 2005年，Kohil等人用飞秒激光对哺乳动物细胞进行亚微米细胞膜切割和细胞分离，并保持了细胞的活性 [ 7 ] 。2008年，天津大学的王清月等人用波长800 nm，脉宽40 fs的飞秒激光对酵母细胞进行融合，同时用CCD检测细胞的融合过程，靶细胞在手术160分钟后成功实现了细胞融合 [ 8 ] ，如图2所示。 Ø 飞秒激光生物活体手术 图1. 肌动蛋白丝的荧光照片，白色圆圈表示激光切割部位。(a) 激光切割前；(b) 切割数秒后；(c) 切割后18 min；(d) 切割后40 min 图2. 细胞融合过程。(a) 融合前；(b) 融合后23 min；(c) 融合后90 min；(d) 融合后160 min 生物活体是一个复杂开放的系统，其内部存在着物质!能量和信息的持续不断的变换。在活体的环境开展研究无疑是对医学技术水平的一大挑战。飞秒激光作为一项新兴技术，自产生以来对生物活体的研究就非常受人们的重视。 国内外学者利用飞秒激光在生物活体上开展了大量的研究工作，其中最为成熟并在临床上有应用的是飞秒激光角膜屈光手术和角膜移植手术，该技术的应用使手术本身更安全并且术后视觉质量恢复的更好，此外还有不少的研究停留在实验阶段，如斯坦福大学Ginzton实验室 [ 9 ] 使用飞秒激光对线虫的轴突进行外科手术，手术后这些轴突实现了功能性再生，采用飞秒激光手术对细胞和组织的修正和切除在生物和医学领域逐渐成为一个重要的工具，在神经损伤再生、组织病变的诊断和治疗、皮肤美容等方面无疑都具有一定的应用前景(图3)。 b) 飞秒激光直写微纳加工应用 飞秒激光微纳加工，概括来讲，其实现是基于紧聚焦超短激光脉冲(飞秒量级)的高能量密度光焦点内与物质发生的非线性作用，例如，多光子吸收引起的材料聚合、还原、相变、烧蚀、化学键断裂等。通过计算机控制飞秒激光焦点在目标材料表面或内部的二维和三维直写扫描，完成微纳精度的材料加工与成型，如图4所示。飞秒激光微纳直写技术在很多场合，也被称为多光子光刻加工技术。 哈佛大学Mazur教授课题组，以多光子吸收和碰撞离化理论为基础，提出飞秒激光在玻璃和蓝宝石等透明介质内的激光诱导微爆炸模型，并将该现象用于实现三维光存储 [ 11 ] [ 12 ] 。吉林大学 孙洪波 教授利 图3. 飞秒激光线虫轴突手术，用绿色荧光蛋白标记的神经轴突实验前后荧光图像，箭头指向断裂点，标尺长5 µm 图4. 飞秒激光直写加工示意图 [ 10 ] 用飞秒激光在玻璃内部诱导产生的缺陷中心可发出较强荧光的现象，将飞秒激光微纳加工技术用于三维光存储，并通过荧光读出机制实现了10 12 Bit/cm 3 超高存储密度 [ 13 ] 。浙江大学 邱建荣 教授在玻璃基质内掺入稀土离子等功能组分，飞秒激光直写制备微光波导等器件；因为激光辐射引起了掺杂金属离子的价态变化，微结构呈现缤纷的色彩 [ 14 ] 。京都大学的 司金海 博士利用飞秒激光诱导自聚焦，制备规则排列的三维波导阵列 [ 15 ] 。上海光机所的程亚研究员利用飞秒激光在玻璃介质内制备光学微腔，并加镀金属微镜，从而实现了其光振荡激射 [ 16 ] 。中国科技大学 吴东 教授利用玻璃内的飞秒激光直写，实现了复杂的三维微流控系统 [ 17 ] 。 c) 飞秒激光应用于生物成像 将飞秒激光应用于生物样品成像，主要是通过多光子荧光显微镜来实现。双光子荧光显微成像技术的出现使得对较厚的生物组织进行生物显微成像成为可能。与激光共聚焦显微镜不同的是，双光子荧光显微成像技术利用近红外的飞秒激光作为光源而非利用紫外光源。而且双光子吸收的非线性本质使得双光子荧光显微成像技术无需共焦小孔的加入，与传统的单光子激光共聚焦显微镜相比，双光子荧光显微成像技术具有以下几个优点 [ 18 ] [ 19 ] ：① 成像深度大：可见光或近红外光比紫外光的穿透性强，一般情况下，共聚焦荧光显微成像技术的成像深度只能达到50 µm左右，而双光子显微成像技术的成像深度可达1600 µm，共聚焦和双光子荧光显微成像技术原理如图5所示；② 光损伤小：双光子荧光显微镜的激励源使用可见光或者近红外光，它们对生物活体组织的光损伤小，因此可以对样品进行长时间的科学研究；③ 空间分辨率和对比度高：由于在双光子显微成像中，荧光只有在焦平面很小的区域内产生，焦点外无荧光产生，背景荧光影响小；④ 光漂白区很小：焦点外不发生漂白现象。⑤ 荧光收集率高：双光子显微成像无需共焦小孔的加入，因此荧光收集效率大大提高；⑥ 对探测光路的要求低：对于双光子显微成像而言，发射荧光的波长值与激发光相差很大，因此对探测收集系统的要求比单光子共焦显微镜低；⑦ 适合多标记复合成像：由于很多染料荧光探针的双光子激发光谱比较宽，多种探针可以同时被单一波长的激发光激发，进而得到同一样品的不同信息。但是，荧光标记技术会导致细胞死亡，这是此项技术的一大缺陷。除此之外，成本昂贵也限制了双光子荧光显微成像技术在生物、化学等各个领域的应用。 K. Schenke-Layland等 [ 18 ] 用多光子成像来分析细胞外基质成分(如肺部和大动脉心瓣膜的胶原质、弹性蛋白)的结构特点。实验结果表明利用近红外波段飞秒激光的多光子成像可能成为对心脏血管进行无损检测和表征的有力工具。 P. Vérant等 [ 19 ] 用双光子荧光显微镜得到了老鼠大脑皮层的血液体积。他们将荧光染料注入循环血液用于血管成像，包括毛细血管的成像，成像深度可达到大脑表面脑膜下400 µm，血液体积由每个深度的荧光归一化计算得到。这种方法既快速，又对背景噪声的敏感度极弱。它的用途可扩展到测量血管的泄露物。 如图6所示，为一套双光子荧光显微成像系统 [ 20 ] 。掺钛蓝宝石飞秒激光器振荡级Tsunami发出的激光入射到分束片被分束片分成两束，一束用多模光纤与光谱仪连接，从而监控激光器的工作状态。另一束入射到IX71生物显微镜，经过二向色镜后被物镜聚焦用于激励样品。前向透射光被聚光镜收集后被光电二极管收集，光电二极管输出的信号由数据采集卡采集后送入计算机后进行透射成像。后向出射光被物镜收集后，通过二向色镜将基频光与荧光分开，再通过发射滤波片被光电倍增管进行探测采集，光电倍增管输出的信号由数据采集卡采集后送入计算机进行双光子荧光显微成像。此外，计算机还通过控制器向平移台发送移动命令，从而实现扫描。