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user: 2. 材料和方法 2.1. 实验动物 本研究选用健康雄性Wistar大鼠，体重240 g~340 g，年龄8~10周，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心，不限制其饮食和饮水，鼠笼内饲养。实验中所有动物操作都严格遵循哈尔滨医科大学实验动物保护和使用的相关规定，并取得了哈尔滨医科大学附属第三医院动物保护与使用委员会的批准。 2.2. 实验分组 本实验共分为6组：常温组(N组)，该组大鼠行窒息性心脏骤停后8 min开始进行心肺复苏(Cardiopulmonary resuscitation， CPR)，待自主循环恢复(Return of spontaneous circulation， ROSC)后，维持鼓膜及直肠温度为37℃ ± 0.5℃；HOE 1 mg组，HOE 5 mg组，这两组大鼠在行CPR前分别静脉注射HOE-642 1 mg/kg和HOE-642 5 mg/kg，待ROSC后，维持鼓膜及直肠温度为37℃ ± 0.5℃；低温组(Hypo组)，该组大鼠在心脏骤停后行CPR，待ROSC后立即进行低温处理，维持鼓膜及直肠温度为33℃ ± 0.5℃，并持续1 h，随后开始恢复体温至37℃ ± 0.5℃，并持续1 h；HOE 1 mg复合低温组(Hypo + HOE 1 mg组)，HOE 5 mg复合低温组(Hypo + HOE 5 mg组)，这两组大鼠在行CPR前分别静脉注射HOE-642 1 mg/kg和HOE-642 5 mg/kg，待ROSC后立即进行低温处理，维持鼓膜及直肠温度位33℃ ± 0.5℃并持续1 h，随后开始恢复体温至37℃ ± 0.5℃，并持续1 h。 2.3. 实验方案 对实验大鼠用4%的异氟烷麻醉后行气管内插管，插管成功后连接呼吸机(Harvard-683，美国Harvard仪器)进行机械通气，呼吸频率为40次/min，并进行呼气末正压(5 cmH 2 O)通气，吸呼比I:E = 1:1，吸入氧分数FiO 2 = 0.5。维持呼吸末二氧化碳分压在35~45 mmHg之间并以此为根据调节潮气量的大小(8~12 ml/kg)，用2%的异氟烷进行麻醉维持。应用加热毯使大鼠鼓膜温度及直肠温度维持在37℃ ± 0.5℃。动静脉穿刺后开始记录动脉血压，并维持平均动脉压(MAP)，心率(HR)及血气值在正常范围内。待大鼠的各项生命体征保持平稳后，静脉给予2 mg/kg的维库溴胺，夹闭气管导管，以诱导窒息性心脏骤停。当MAP < 20 mmHg时视为大鼠窒息性心脏骤停，大鼠窒息期间维持体温在37℃ ± 0.5℃。窒息发生8 min后开始进行CPR，在复苏开始之前，静脉给予0.01 mg/kg的肾上腺素，并根据不同的组别要求静注不同剂量的HOE-642，复苏即刻开始进行胸外按压，按压频率为200~300次/min，并打开呼吸机进行纯氧吸入。待ROSC后，根据不同的组别要求应用加热毯或冰水维持相应的体温。所有实验组动物在复苏成功后均进行机械通气1 h，并维持MAP在50 mmHg以上，如果MAP < 50 mmHg，静注1 µg的肾上腺素。若胸外按压3 min后仍未恢复自主循环，则再给予一次0.01 mg/kg肾上腺素，若胸外按压超过5 min仍未恢复自主循环，则视为复苏失败。复苏成功的大鼠存活24 h后，对其进行神经功能损伤程度评估，该项评估使用神经缺损评分量表(Neurologic deficit score， NDS)，共分为5部分，分别为呼吸功能，运动功能，感觉，意识和反应能力，每一部分100分，共500分，0分为正常，500分为脑死亡 [ 16 ] 。其后在深麻醉下将大鼠断头，提取大脑海马组织，分离海马组织的线粒体，用以检测线粒体的膜电位，肿胀，ROS的产生，以及线粒体复合物I和III的活性。 2.4. 海马线粒体的分离 将断头后的大鼠分离脑组织，识别并夹取出两侧的海马组织。海马线粒体的分离采用组织线粒体分离试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology)，将海马组织的匀浆液在4℃，1000 g条件下进行第一次离心，离心5 min以去除细胞核及破损的细胞残片；将上清液在4℃，3500 g条件下进行第二次离心，离心10 min以获得高纯度线粒体。以上所有操作步骤均在冰浴条件下进行。 2.5. 线粒体膜电位的检测 线粒体膜电位的检测采用荧光探针JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)以及荧光酶标仪(Infinite®M1000)，所有操作均在避光条件下进行。将线粒体(1 μg/10 μl)加入JC-1染色工作液中，立即用荧光酶标仪检测。激发光波长为490 nm，发射光波长为530 nm，以检测加样孔中JC-1聚合物的量；激发光波长为525 nm，发射光波长为590 nm，以检测加样孔中JC-1单体的量。聚合物与单体的比值即为膜电位的大小，比值越大，膜电位越高。 2.6. 线粒体肿胀的测定 线粒体肿胀的测定采用线粒体肿胀光度法测定试剂盒(美国GENMED SCIENTIFICS公司)。线粒体的肿胀是因线粒体膜的mPTP开放，线粒体外的离子或大分子物质通过mPTP进入线粒体内引起的，以致线粒体的吸光度减少。将线粒体(200 μg/20 μl)加入缓冲液中，混匀，即刻放用酶标仪检测，波长为520 nm，得初始吸光度值。室温下静置1 min后，加入肿胀触发液CaCl 2 ，即刻用酶标仪检测，波长为520 nm，动态记录10 min吸光度值的变化，每1 min记录一次。计算加入CaCl 2 之前和之后线粒体吸光度的下降比即代表线粒体的肿胀程度，下降越大，肿胀越明显。 2.7. 线粒体ROS产生的测定 线粒体ROS产生的测定采用线粒体ROS初级荧光测定试剂盒(美国GENMED SCIENTIFICS公司)。在线粒体(50 μg/50 μl)中加入缓冲液及染色液后置于37℃温箱中孵育15 min。然后放入荧光酶标仪中检测，激发波长为490 nm，发射波长为530 nm，测定其荧光强度，即代表ROS的产生量。以上所有操作均在避光条件下进行。 2.8. 线粒体呼吸链链复合物I和III活性的比色法定量检测 2.8.1. 复合物I(NADH-辅酶Q还原酶)的活性 线粒体呼吸链复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体的能量转移反应，同时NADH转化为NAD，在分光光度计340 nm波长下产生吸收峰值的变化，复合物I的活性即取决于NADH的氧化量。采用复合物I活性比色法定量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，将100 μl浓度为0.1 μg/μl的线粒体蛋白以及900 μl的反应液加入比色皿中，用分光光度计检测在340 nm波长下吸光度的变化，用鱼藤酮敏感的抑制剂以验证检测的特异性。通过计算NADH的氧化率即为复合物I的活性(nmol NADH oxidized/min/mg protein)。 2.8.2. 复合物III(辅酶Q-Cyt c还原酶)的活性 线粒体呼吸链复合物III催化线粒体内电子由供体还原型辅酶Q传递到Cyt c上的能量转移反应，同时氧化型Cyt c被还原为还原型Cyt c，在分光光度计550 nm波长下产生吸收峰值的变化，复合物III的活性即取决于氧化型Cyt c的还原量。采用复合物III活性比色法定量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，将100 μl浓度为0.1 μg/μl的线粒体蛋白以及900 μl的反应液加入比色皿中，用分光光度计检测在550 nm波长下吸光度的变化，用抗霉素A抑制剂以验证检测的特异性。通过计算氧化型Cyt c的还原率即为复合物III的活性(nmol ferricytochrome c reduced/min/mg protein)。 2.9. 统计分析 研究数据用SPSS 22.0软件进行统计分析。除非另有说明的数据外，其他所有数据均以平均数±标准差表示。符合正态分布的计量资料，各组组间比较采用单因素方差分析，两两比较选用LSD检验。各组存活率的分析采用χ 2 检验，NDS的比较采用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验。P < 0.05认为有统计学意义。