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user: 4. 结果与分析 4.1. 萘普生、尼莫地平标准曲线线性关系考察 在3.4色谱条件下，配置相同浓度的萘普生和尼莫地平标准溶液，以浓度(mg/L)作为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，回归方程及相关系数。萘普生和尼莫地平在0~1.0 mg/L范围内线性关系良好，线性相关系数r ≥ 0.999，具有较好的灵敏度。以3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)确定方法的定量限(LOQ)，具体见表2，萘普生和尼莫地平标准品的峰面积如下图1所示。 Table 2 Regression equations， correlation coefficients (r)， LODs and LOQ 分析物 线性方程 相关系数 检出限/(mg/L) 定量限/(mg/L) 萘普生 Y = 9909.9x + 63.231 0.9995 0.06 0.19 尼莫地平 Y = 11844x + 74.333 0.9993 0.04 0.13 表2. 标准曲线的线性方程、相关系数r、检出限及定量限 图1. 标准品的HPLC色谱图 4.2. 不同条件对超声波辅助双水相萃取效果的影响 4.2.1. 双水相体系的选择 本研究考察了① 聚乙二醇400–硫酸铵、② 乙醇–硫酸铵、③ 乙醇–磷酸二氢钠、④ 乙醇–磷酸氢二钾、⑤ 乙腈–磷酸氢二钾共5种双水相体系对萘普生和尼莫地平的萃取效果。 如图2所示，在五种双水相体系中，由KH 2 PO 4 与乙醇组成的双水相体系萃取效率最高：加入0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平，后加超纯水至10 g，温度为20℃，超声功率为200 W，超声时间为10 min的条件下，萘普生的萃取率可达87.02%，尼莫地平可到达81.31%。故本研究后续考察的是优化KH 2 PO 4 与乙醇组成的双水相体系条件对水体中萘普生和尼莫地平的萃取。 图2. 不同萃取体系对萃取率的影响 4.2.2. 超声时间 在16% KH 2 PO 4 与36%乙醇组成的双水相体系中，加入0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平，后加超纯水至10 g，温度为20℃，超声功率为200 W的条件，选择超声时间5~25 min，考察时间对萃取率的影响。 由图3所可知，随着时间的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率先是逐渐上升，在超声时间为15 min时，二者萃取率达到最大值，当超声时间过长，将其他杂质更充分溶出，抑制了萘普生和尼莫地平的溶出，导致萃取率的降低。所以最佳时间为15 min。 图3. 时间对萃取率的影响 4.2.3. 超声功率 在16% KH 2 PO 4 与36%乙醇组成的双水相体系中，加入0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平，后加超纯水至10 g，温度为20℃，超声时间为15 min的条件下，选择超声功率120~200 W，考察功率对萃取率的影响。 从图4看出，随着功率的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率也逐渐上升，在超声波清洗器功率最大限度时，萘普生和尼莫地平的萃取率也达到最大值。所以最佳功率为200 W。 图4. 功率对萃取率的影响 4.2.4. KH 2 PO 4 质量分数 在温度为20℃，超声功率为200 W，超声时间为15 min的条件下，选择改变KH 2 PO 4 的质量分数，分别称取1.2~2.0 g (即质量分数12%~20%)的KH 2 PO 4 与质量分数36%的乙醇，0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平构建10.0 g双水相体系。 如图5所示，随着KH 2 PO 4 的质量分数的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率先是逐渐上升，在KH 2 PO 4 的质量分数为18%时，二者萃取率均达到最大值，当KH 2 PO 4 的质量分数过高时，KH 2 PO 4 析出慢慢变多，导致萃取率的下降。所以最佳KH 2 PO 4 的质量分数为18%。 图5. KH 2 PO 4 的质量分数对萃取率的影响 4.2.5. 乙醇质量分数 在温度为20℃，超声功率为200 W，超声时间为15 min的条件下，选择改变乙醇的质量分数，分别称取3.2~4.8 g (即质量分数32%~48%)的乙醇与质量分数18%的KH 2 PO 4 ，0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平构建10.0 g双水相体系。 在图6中，随着乙醇的质量分数的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率先是逐渐上升，在乙醇的质量分数为40%时，二者萃取率均达到最大值，当乙醇的质量分数过高时，可能是下相中的萘普生和尼莫地平的质量浓度也在增加，从而抑制了二者的析出，导致萃取率的下降。所以乙醇的质量分数最佳为40%。 图6. 乙醇的质量分数对萃取率的影响 4.3. 响应曲面法优化实验结果与分析 4.3.1. 模型建立 根据单因素结果，在超声功率200 W的条件下，选择超声时间、KH 2 PO 4 质量分数和乙醇质量分数为自变量，萃取率为因变量，采用Desgin-Expert 8.0.6.1软件进行3因素3水平响应曲面试验设计及结果见表3。 Table 3 Design and the results of the response surface analysi 试验号 超声时间/min KH 2 PO 4 质量分数/% 乙醇质量分数/% 萘普生萃取率/% 尼莫地平萃取率/% 1 −1 1 0 85．01 83.83 2 0 −1 −1 88.11 85.87 3 −1 0 1 84.44 81.09 4 1 0 −1 90.1 84.80 5 0 0 0 95.23 88.17 6 0 1 1 87.70 83.05 7 0 0 0 95.20 89.32 8 0 0 0 94.98 89.15 9 0 −1 1 84.40 81.09 10 1 −1 0 85.32 79.84 11 0 0 0 97.23 89.74 12 1 0 1 89.67 81.37 13 −1 0 -1 91.74 82.77 14 0 1 −1 89.04 83.36 15 0 0 0 92.32 88.03 16 1 1 0 89.44 83.19 17 −1 −1 0 87.31 81.04 表3. 响应面试验设计与结果 4.3.2. 萘普生响应面试验结果 1) 响应面结果及方差分析 由表4得，萘普生(P = 0.0015 < 0.05)二次回归方程模型显著，萘普生(P = 0.7693 > 0.05)的失拟项不显著。通过该模型的方差分析可知，A和B对萘普生的萃取率的影响不显著，C对萘普生的萃取率的影响显著。各因素对萘普生萃取率影响效应的大小依次为乙醇质量分数 > KH 2 PO 4 质量分数 > 时间。 Table 4 Analysis of the variance of the secondary regression model of the influence factor of the extraction rate of NP 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 Modle 254.59 9 28.29 12.53 0.0015 A 2.03 1 2.03 0.9 0.3746 B 4.58 1 4.58 2.03 0.1976 C 27.31 1 27.31 12.10 0.0103 AB 10.30 1 10.30 4.56 0.0700 AC 5.93 1 5.93 2.63 0.1491 BC 1.40 1 1.40 0.62 0.4562 A 2 52.27 1 52.27 23.16 0.0019 B 2 92.95 1 92.95 41.17 0.0004 C 2 37.42 1 37.42 16.57 0.0047 Residual 15.80 7 2.26 Lack of Fit 3.55 3 1.18 0.39 0.7693 Pure Error 12.25 4 3.06 R 2 270.39 16 表4. 萘普生萃取率影响因子二次回归模型方差分析 经回归模型拟合，三因素对响应值的影响可以用以下三元二次方程表示： 萃 取 率 = − 472.06 − 1.00 A + 37.29 B + 12.20 C + 0.16 A B + 0.061 A C + 0.074 B C − 0.14 A 2 − 1.17 B 2 − 0.19 C 2 2) 各因素交互作用响应面与优化验证 如图7所示，萘普生萃取率的响应面的开口向下，萃取率和双水相萃取体系中的三个因素均呈现二次抛物线关系。AB曲面较陡，表明时间和KH 2 PO 4 质量分数之间的相互作用最为明显；而AC、BC曲面较为平缓，表明时间和乙醇质量分数以及KH 2 PO 4 质量分数和乙醇质量分数之间的相互作用较小，随数值的增加或减少，响应值变化也小，这与方差分析结果一致。该回归模型具有稳定点，稳定点即使最大值，采用Desgin-Expert软件得到萘普生萃取率的最大响应值时，时间、KH 2 PO 4 质量分数、乙醇质量分数对应的值分别为15.18 min、18.14%、38.82%，萃取率最大值为95.30%。 图7. 两个萘普生萃取率因素间的交互作用图。(a) 超声波时间和KH 2 PO 4 质量分数对NPX萃取率的影响；(b) 超声波时间和乙醇质量分数对NPX萃取率的影响；(c) KH 2 PO 4 质量分数和乙醇质量分数对NPX萃取率的影响 4.3.3. 尼莫地平响应面试验结果 1) 响应面结果及方差分析 由表5得，尼莫地平(P = 0.0011 < 0.05)二次回归方程模型显著，尼地平(P = 0.1010 > 0.05)的失拟项不显著。通过该模型的方差分析可知，A和B对尼莫地平的萃取率的影响不显著，C对尼莫地平的萃取率的影响显著。各因素对尼莫地平萃取率影响效应的大小依次为乙醇质量分数 > KH 2 PO 4 质量分数 > 时间。 经回归模型拟合，三因素对响应值的影响可以用以下三元二次方程表示： 萃 取 率 = − 345.15 + 5.35 A + 21.97 B + 9.97 C + 0.014 A B − 0.022 A C + 0.12 B C − 0.16 A 2 − 0.74 B 2 − 0.15 C 2 Table 5 Analysis of the variance of the secondary regression model of the influence factor of the extraction rate of NMD 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 Source Sum of squares Df Mean squares F P Modle 165.41 9 18.38 13.98 0.0011 A 0.028 1 0.028 0.021 0.8889 B 4.64 1 4.64 3.53 0.1025 C 14.31 1 14.31 10.88 0.0131 AB 0.078 1 0.078 0.060 0.8141 AC 0.77 1 0.77 0.58 0.4703 BC 3.94 1 3.94 3.00 0.1270 A 2 65.15 1 65.15 49.55 0.0002 B 2 37.23 1 37.23 28.31 0.0011 C 2 25.09 1 25.09 19.08 0.0033 Residual 9.20 7 1.31 Lack of Fit 6.97 3 2.32 4.16 0.1010 Pure Error 2.23 4 0.56 R 2 174.61 16 表5. 尼莫地平萃取率影响因子二次回归模型方差分析 2) 各因素交互作用响应面与优化验证 如图8所示，尼莫地平萃取率的响应面的开口向下，萃取率和双水相萃取体系中的三个因素均呈现 图8. 两个尼莫地平萃取率因素间的交互作用图。(a) 超声波时间和KH 2 PO 4 质量分数对NMDP萃取率的影响；(b) 超声波时间和乙醇质量分数对NMDP萃取率的影响；(c) KH 2 PO 4 质量分数和乙醇质量分数对NMDP萃取率的影响 二次抛物线关系。AB曲面较陡，表明时间和KH 2 PO 4 质量分数之间的相互作用最为明显；而AC、BC曲面较为平缓，表明时间和乙醇质量分数以及KH 2 PO 4 质量分数和乙醇质量分数之间的相互作用较小，随数值的增加或减少，响应值变化也小，这与方差分析结果一致。该回归模型具有稳定点，稳定点即使最大值，采用Desgin-Expert软件得到尼莫地平萃取率的最大响应值时，时间、KH 2 PO 4 质量分数、乙醇质量分数对应的值分别为15.11 min、18.17%、38.97%，萃取率最大值为89.09%。 4.3.4. 最优萃取条件验证 现检测试验结果是否与真实情况一致，考虑到实际操作的便利，将萃取萘普生和尼莫地平最佳条件修正为：功率200 W，时间15 min，KH 2 PO 4 质量分数18%，乙醇质量分数39%，在此条件下进行3次验证实验，测出萘普生的萃取率为94.73%，尼莫地平的萃取率为88.57%，与预测试验结果基本相符，且重复性良好。 4.4. 结论 通过双水相提取并富集环境水样中的萘普生和尼莫地平，建立了一种检测环境水样中萘普生和尼莫地平的高效液相色谱联用技术的方法。实验发现，双水相可以提取环境水样中萘普生和尼莫地平，所建立的方法绿色环保、操作简便、选择性好、灵敏度高、试剂用量少且提取率高，能够满足实际样品分析的要求。运用该方法有可能为应用于测定环境水样中的萘普生和尼莫地平提供理论科学依据。