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user: 2. 常规噬菌体疗法 所谓传统的常规噬菌体治疗就是将从自然环境中分离出来的毒性噬菌体直接用于患者以溶解造成急慢性感染的病原体 [ 10 ]。噬菌体根据其生长周期可以分为毒性噬菌体和溶原性噬菌体两种类型，用于治疗细菌感染的噬菌体大部分为毒性噬菌体。毒性噬菌体的生活周期一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、成熟和释放等过程(图1) [ 1 ]。噬菌体疗法就是使用毒性噬菌体裂解宿主菌以达到杀灭细菌的目的来治疗细菌感染。首先裂解噬菌体通过其尾丝与细菌胞壁受体特异性结合、再通过其尾髓的收缩向细菌内注射噬菌体的遗传物质、宿主菌提供复制噬菌体遗传物质和产生后代噬菌体所需要的成分和酶，当细胞内的噬菌体达到一定数量时，噬菌体会编码一些如穿孔素和裂解酶这样的蛋白，在这些蛋白共同作用下裂解宿主菌并迅速释放出大量的子代噬菌体到周围环境中，毒性噬菌体继续感染并摧毁邻近的细菌，如此循环来实现其抗菌作用 [ 11 ] [ 12 ]。传统噬菌体疗法对比抗生素治疗细菌感染其优势有以下几点： 图1. 噬菌体的生命周期 [ 1 ]。毒性噬菌体经历裂解周期，宿主菌被裂解，子代噬菌体被释放到环境中。溶原性噬菌体可经历溶菌或溶源周期，一些噬菌体依靠小分子交流来决定执行溶酶或溶源周期 2.1. 毒性噬菌体所具有的高度特异性是现有的抗生素无法比拟的 噬菌体仅仅感染其敏感菌株，而对非敏感菌株一般是不会感染的，因此噬菌体不会损害系统中的共生微生物，这是噬菌体治疗细菌感染最突出的优势 [ 13 ]。再者，噬菌体不会感染真核细胞，因此理论上噬菌体完全可以用于治疗人类的细菌性感染 [ 13 ]。而事实上，目前的研究也证实噬菌体疗法是安全的，其副作用也很小 [ 14 ]。 2.2. 噬菌体在非常恶劣的环境条件下仍然具有在其宿主细菌内进行繁殖的能力 噬菌体在非常恶劣的环境条件下仍然具有在其宿主细菌内进行繁殖的能力，倾向于继续复制，直到寄主细菌的种群密度显著降低。它们可通过一种“自动给药”的现象来确定剂量，这样就可避免在治疗部位重复多次使用噬菌体 [ 15 ]。这些特性表明，与传统的抗生素治疗相比，噬菌体疗法可以需要更少或更有限的给药，从而减少了多次给药的麻烦，而治疗效果表现得更出色。 2.3. 在缺少噬菌体所特有的细菌的情况下，噬菌体不会持续存在太长的时间 也就是说当宿主菌被裂解杀灭到一定程度后，噬菌体就会因为缺少宿主菌很快的自动清除 [ 16 ]。因此噬菌体达到治疗目的后不会长期存在于人体中，从而可以避免外来噬菌体可能带来的相关副作用。 2.4. 噬菌体感染和杀灭细菌的机理与抗生素不同，因此可用于治疗多重耐药细菌引起的感染 大部分噬菌体是利用由穿孔素(holin)和裂解酶(lysin)构成的穿孔素–裂解酶系统协同作用于细菌细胞壁并裂解细菌来杀死宿主细菌的 [ 17 ]。穿孔素是一组噬菌体编码的膜蛋白，到目前为止一共发现有三类穿孔素，目前研究最广泛最深入的是属于I类穿孔素的大肠杆菌噬菌体λS105蛋白。宿主细胞的裂解由穿孔素触发，然后裂解酶通过由穿孔素在宿主细菌胞膜上形成的孔接触到细菌肽聚糖，破坏内肽酶、酰胺酶以及糖苷酶来水解细菌的肽聚糖使宿主细菌裂解，从而达到灭菌的效果 [ 18 ] [ 19 ]。在噬菌体复制周期结束后子代病毒被释放出来去侵染周围的细菌。 2.5. 噬菌体可单独或混合多种噬菌体使用以扩大其抗菌谱 噬菌体的高度特异性既是其优势也是其缺点，于是就出现了混合多种噬菌体等方法来改变或扩大噬菌体的宿主谱和裂解特性 [ 20 ]。混合多种噬菌体治疗细菌感染除了扩大噬菌体的宿主谱和裂解特性外还能延缓细菌对噬菌体产生抗性和提高噬菌体疗效 [ 21 ] [ 22 ]。 2.6. 噬菌体在预防生物被膜的形成和清除已形成的生物被膜方面也具有抗生素无法 比拟的优势 细菌在一定条件下可以形成生物被膜，此时抗生素、免疫细胞和抗体对细菌的作用微乎其微，这样就容易导致慢性感染 [ 23 ]。很多研究尝试用噬菌体来解决由生物被膜所引起的耐药问题。Hughes和其同事曾分离出可针对性降解肠细菌产生的粘多糖(EPS)的肠细菌噬菌体，该噬菌体能够破坏生物被膜并溶解细菌。相关研究发现，噬菌体在感染细菌后，会大量表达β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(dispersin B， DspB)，其DspB酶可水解肺炎克雷伯菌等细菌生物被膜中关键交联基质1，6-N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而破坏生物被膜并杀灭细菌，而且当抗生素与特定的噬菌体联合使用时，表现出对生物膜结构的更大破坏作用 [ 24 ]。这种联合治疗表现出的另一个优势是可以阻止耐药突变体的形成，因为这些突变体在单独使用噬菌体或抗生素时很容易形成 [ 25 ]。 2.7. 噬菌体可以针对不断进化的细菌进行自我修正，以便继续感染和裂解细菌 宿主细菌为了在噬菌体的感染中存活下来，针对噬菌体吸附、穿入、生物合成、成熟和释放等过程，进化出各种机制来应对噬菌体的侵入、增殖和扩散。与之相对应，噬菌体也不断发展以对抗宿主细菌各种防御方式从而继续感染和裂解细菌。比如有一些噬菌体可以针对宿主菌的改变进化出一种被称作 “DGRs”的遗传元件，“DGRs”通过依赖模板的逆转录酶介导的作用，在噬菌体主要取向决定因素基因(major tropism determinant， mtd)中引入核苷酸置换，mtd基因编码的蛋白质的主要功能是对宿主菌进行识别，因此噬菌体也可以通过进化来改变甚至拓宽噬菌体的宿主谱以应对宿主菌的进化 [ 26 ] [ 27 ]。另外，噬菌体还可以通过基因突变来对抗宿主细菌的反制措施，例如，噬菌体T4rII可以通过基因motA的突变来逃脱宿主菌Rex系统对其的清除 [ 28 ]。与此类似，噬菌体同样可以通过基因突变来应对宿主菌的CRISPR-CAS系统和流产感染(Abi)系统。 经过多年的研究发现噬菌体治疗细菌感染还存在很多问题，正是这些问题和缺陷在阻碍噬菌体的应有。归纳总结出以下几点： 2.8. 噬菌体的宿主谱窄 噬菌体通过其尾丝与细菌表面的受体相互识别，受体的特异性决定了大部分噬菌体只能够识别并感染特定种类的细菌 [ 29 ]。因此在多病原菌感染的临床病例的情况下，传统的常规噬菌体疗法显然不能够满足需要。要解决这个尖锐的问题，可以通过筛选出同时具有广宿主谱和较强裂解能力的噬菌体。比如Yu和其同事通过连续多宿主分离噬菌体的方法，挑选出的噬菌体在裂解能力增强的同时还能裂解大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 [ 30 ]。另外一种增加噬菌体宿主谱的方法叫噬菌体鸡尾酒疗法。用噬菌体鸡尾酒疗法对多例链球菌感染受试者进行治疗，其效果明显提高 [ 31 ]。此外，应用现代的生物信息学研究噬菌体基因组学也为筛选广谱噬菌体提供新思路。 2.9. 存在抗噬菌体的宿主菌 噬菌体与细菌在亿万年的斗争中，彼此都进化出了许多相互防御约束的策略，宿主菌和噬菌体任何一方发生突变都会影响噬菌体对宿主菌的吸附率以及最终能否导致宿主菌的裂解。宿主细菌进化出了多种抗噬菌体的机制，包括修饰表面受体、超级感染排除(Sie)系统、限制修饰系统、规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR)和流产感染(Abi)等机制(图2) [ 32 ]。这些抗噬菌体的机制表现在抑制噬菌体的吸附、阻止噬菌体的遗传物质进入胞内、干扰甚至降解噬菌体遗传物质等，以应对噬菌体对宿主细菌的杀灭作用。 图2. 细菌对噬菌体的防御 [ 32 ]。系统目前还没有发现一个细菌拥有所有这些防御系统，但是每个细菌可以有一个或者几个。粉红色的星代表基本的机制，包括DNA复制、转录、翻译、潜在的遗传和表型变异。红色的叉代表感染过程的停止。红色三角代表与流产感染(Abi)系统和超级感染排斥(Sie)机制相关。蓝色的DNA分子代表细菌的DNA。绿色的DNA分子代表噬菌体的DNA 2.10. 机体的免疫系统对噬菌体颗粒具有灭活作用 有研究证实作为大分子颗粒的噬菌体具有抗原性，人体的先天免疫和适应性免疫都参与了噬菌体的清除。根据噬菌体的类型不同和给药途径的不同，对噬菌体的免疫反应也有所不同 [ 33 ]。人类免疫系统可能会将噬菌体识别为外来抗原，并产生噬菌体中和抗体来做出反应 [ 34 ]。另外，给患者注射高滴度的噬菌体可能会引起如过敏反应这样的强烈反应，如果反复给动物注射噬菌体可以导致血清中的抗体效价升高，尽管还没有观察到这种负面副作用 [ 34 ]。不仅如此，由于噬菌体无法进入真核细胞，也就无法对已经进入细胞内的宿主细菌产生杀菌作用，从而细胞内的病原体具有在宿主细胞内存活的优势 [ 34 ]。 2.11. 噬菌体在体内的作用机制尚未研究清楚，有可能对机体造成我们尚不知道的危害 首先，常规噬菌体疗法裂解细菌会产生后续的影响，当革兰氏阴性菌被噬菌体裂解时，内毒素(Endotoxin)等细胞内成分就会被释放出来进入血液循环后引起发热、血压下降、休克、全身炎症综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome， SIRS)、多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome， MODS)及播散性血管内凝血(DIC)等一系列疾病，严重威胁到患者的生命安全 [ 12 ] [ 35 ] [ 36 ]。Dufour和他的同事们 [ 37 ] 提出可以通过比较暴露于噬菌体后细菌细胞裂解过程中内毒素(Endotoxin)释放的数据，来解决噬菌体治疗的临床安全性问题。其次，为防止机体的免疫系统在噬菌体尚未完成它的使命之前就把其清除，通过研究给药途径和方式来解决这一问题一直是研究噬菌体疗法的热点。由于胃部的酸性环境和胃肠道的蛋白酶的存在，因此选择口服噬菌体治疗细菌感染可能会导致噬菌体的失活 [ 38 ]。Brown等人 [ 39 ] 将处理痤疮丙酸杆菌的噬菌体制成乳膏，发现制成乳膏的噬菌体不仅可以长期保留噬菌体的活性和具有润肤的效果，而且还能使噬菌体与皮肤上的痤疮丙酸杆菌更加紧密接触。Bodier-Montagutelli对用吸入噬菌体的方式治疗呼吸道感染的相关问题进行了详细的描述 [ 40 ]。另外，通过对噬菌体T7进行基因编辑，使其脂质能够与其衣壳结合，发现在不同条件下噬菌体的稳定性均得到提高 [ 41 ]。静脉注射噬菌体还需要解决的一个主要问题是静脉注射的噬菌体溶液要与其他化学药物一样纯净。 2.12. 噬菌体基因组可能会携带毒素和抗药性基因并且可以将这些特征赋予细菌 常见的大肠杆菌、化脓性链球菌等常见菌的毒素基因大部分都可以在对应的噬菌体基因组中发现。噬菌体可以通过溶源过程把噬菌体的毒素基因和耐药基因赋予细菌，这样一般菌株就可以转化为高致病性菌株，从而增强细菌的致病性导致急性和严重感染 [ 42 ] [ 43 ]。Keen和同事们报道了两个大肠埃希菌噬菌体可以通过溶源过程促进基因的转移，显著增加了抗生素抗性基因的传播 [ 44 ]。经抗生素处理的噬菌体群体的基因组中抗生素抗性基因有聚集现象，这种抗生素抗性基因聚集现象在肺囊肿纤维化病人中 [ 45 ] 和老鼠的粪便中都有发现 [ 46 ]，因此在挑选噬菌体的时候，进行全基因的测序和分析是很有必要的。