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user: 3. 内质网应激信号通路 内质网应激的发生会导致非折叠蛋白反应。目前，有许多研究显示未折叠蛋白反应与多种疾病之间存在内在联系，如癌症、糖尿病、代谢性疾病、动脉粥样硬化及神经退行性疾病等 [ 12 ]。在早期，未折叠蛋白反应主要通过清除错误折叠的蛋白和抑制蛋白质的合成来减轻内质网内堆积蛋白的负荷 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]，以此来重建内质网内环境的稳态。但长期严重的内质网应激则会促进细胞凋亡的发生 [ 16 ]。目前的研究发现未折叠蛋白反应包括三条信号转导通路：肌醇需求酶1 (inositol-requiring enzyme 1， IRE1)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase，PERK)和激活转录因子(activating transcription factor 6， ATF6) [ 17 ]。在正常的生理状态下，这三种蛋白分别与葡萄糖调节蛋白78 (glucose- regulated protein 78， GRP78/BIP)结合，处于无活性状态。而当内质网应激发生时，内质网内累积的蛋白会促使GRP78/BIP与IRE1、PERK、ATF6发生解离，启动UPR，调节相关基因的表达，促使内质网内环境趋向稳定。有研究表明，蛋白质错误折叠导致的内质网应激是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的重要原因 [ 18 ]。 3.1. GRP78/BIP-PERK通路 PERK信号通路正逐渐作为治疗神经退行性疾病的治疗靶点 [ 19 ]。Smith and Mallucci等 [ 15 ] 和Wong等 [ 20 ] 的研究发现对PERK进行药理学和遗传学调控可以抑制神经退行性病变。PERK是位于内质网膜上的I型跨膜蛋白激酶，氨基端位于膜内侧与GRP78/BIP结合，羧基端则位于膜外侧，含有一个激酶结构域。当内质网应激发生时，GRP78/BIP的ATP激酶结构域与PERK的氨基端解离，从而使PERK发生磷酸化和二聚化而激活 [ 21 ]。激活的PERK则会使其下游蛋白eIF2α的第51位丝氨酸发生磷酸化。 eIF2由α，β和γ三部分亚基构成，当α亚基发生磷酸化时，会阻断GDP-GTP的交换反应，降低eIF2和eIF2β的解离率，从而抑制一般蛋白质的翻译。这样的机制在ERS发生早期时，可以通过减少进入内质网内的蛋白质达到缓解内质网应激的效果。但是在晚期的ERS过程中，由于eIF2α长期处于磷酸化状态，长时间抑制蛋白质的合成，会使得细胞正常合成的蛋白质的需求也得不到满足，造成细胞功能发生障碍，引起神经退化和记忆缺陷 [ 22 ] [ 23 ]。同时虽然eIF2α磷酸化能够抑制大部分蛋白质的翻译，但持续大量磷酸化的eIF2α却能促进某些mRNA的的表达，对这些基因进行特异性翻译上调。ATF4就是被特异性翻译上调的蛋白之一。 ATF4的上调还可以调节多种信号转导。宋成洁等 [ 24 ] 在实验中通过探讨综合应激反应抑制剂(inte⁃grated stress response inhibitor， ISRIB)对Aβ1⁃42诱导的内质网应激和细胞凋亡的影响中发现，ISRIB能有效抑制GRP78/BIP-PERK-eIF2α-ATF4通路中相关蛋白的表达。ATF4在ERS后期中能激活CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein， CHOP) [ 25 ] 和抑制cAMP反应元件结合蛋白(CREB)依赖的转录 [ 26 ]。CREB在动物实验中表明与长时记忆形成和突触可塑性有关 [ 27 ] [ 28 ]。活化的CHOP又能够激活凋亡信号通路。正常生理状态下CHOP的表达量极低，但在ERS条件下，CHOP和ATF4会协同诱导细胞凋亡的发生，比如上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的，促使神经细胞发生凋亡。黄倩倩等 [ 29 ] 在研究中发现能量障碍的AD小鼠脑组织中GRP78/BIP-PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路被激活，且Bcl-2表达量减少，Bax的表达增多，从而促使神经细胞凋亡。ATF4与早老素-1 (Presenilin-1， PS-1)基因调节区域的结合对PS-1的活性至关重要，PS-1又是刺激γ-分泌酶的重要辅助因子，也能从促Aβ-淀粉样蛋白生成的水平上加重阿尔茨海默病的发病进程 [ 30 ]。此外，也证据显示ATF4在阿尔茨海默病患者的中还能作为糖原合成酶激酶-3 (glycogen synthase kinase-3β， GSK-3β)的表达启动子，促进阿尔茨海默病中Tau的磷酸化 [ 31 ]。 β-分泌酶(BACE1)促进Aβ-淀粉样蛋白生成的关键酶，长期持续的eIF2α磷酸化还能特异上调BACE1的表达。所以在阿尔茨海默病患者和5XFAD小鼠的脑组织中，磷酸化eIF2α水平的改变与Aβ-淀粉样斑块之间存在显著的关联性 [ 32 ]。在9月龄以上的5XFAD小鼠的脑组织中，减少PERK的水平能有效降低eIF2α磷酸化，减少BACE1的表达，使Aβ淀粉样蛋白的水平降低 [ 25 ]。 综合上述证据，表明阿尔茨海默病患者中PERK依赖性eIF2α磷酸化途径的异常激活在导致记忆缺陷和神经退行性变的多种致病机制中起着重要作用 [ 33 ]，而且在长期调节下，该途径还能诱导神经细胞的凋亡。这提示我们，通过抑制PERK-eIF2α信号通路的过度激活，可以从多个方面抑制阿尔茨海默病的发生，也为我们在研发抗阿尔茨海默病的药物提供了更多的方向，成为治疗阿尔茨海默病极具前景的药物靶标。如ISRIB，能通过抑制内质网应激造成的PERK-eIF2α通路激活，减少ATF4，CHOP和细胞凋亡相关蛋白的表达，为延缓阿尔茨海默病的发展提供了可能。 3.2. GRP78/BIP-IRE1通路 在哺乳动物细胞中，IRE1存在两种亚型，IRE1α和IRE1β [ 34 ]。两者都为I型跨膜蛋白，但是前者的表达更为广泛，IRE1α敲除小鼠存在胚胎致死性；后者的表达仅限于呼吸和胃肠组织，IRE1β敲除小鼠无胚胎致死性 [ 35 ]。由于两者的差异，使得研究者将更多的注意力放在了IRE1α上。IRE1α的氨基端位于内质网腔内，称为内质网腔结构域(luminal domain， LD)，与BIP相结合，羧基端位于胞质侧，称为胞质结构域，有丝氨酸/络氨酸特异的蛋白激酶和RnaseL结构 [ 34 ] [ 36 ]。IRE1α也是唯一一种被报道具有核糖核酸内切酶活性和蛋白激酶活性的蛋白质 [ 36 ]。虽然关于GRP78/BIP-IRE1通路的具体激活机制目前有多种假设，包括直接关联模型，竞争模型和变构模型 [ 37 ]，但结果是一致的。通路激活之后，GRP78/BIP会与IRE1α发生解离，解离之后的IRE1α会发生二聚化和磷酸化，诱导胞质结构域发生构象改变，激活其核糖核酸内切酶结构域。激活后的IRE1α被进一步切割，其羧基端片段被送进细胞核内，删除了转录调控因子未剪切型X盒结合蛋白1(unspliced X-box binding protein 1， XBP-1u)的mRNA中一段含26个核苷酸的内含子，剪切后的mRNA翻译出具有活性的X盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1， XBP-1s) [ 38 ] [ 39 ]。XBP-1是亮氨酸拉链家族(bZIP)的转录因子，可以刺激与蛋白质折叠相关基因的表达，促进蛋白质的的正确折叠 [ 40 ]。此外，IRE1α还可通过调节IRE1依赖性mRNA衰减(regulated IRE1-dependentdecay of mRNA， RIDD)来减少mRNA的含量，从而减少蛋白质的合成，促使内质网功能恢复正常。如还不能恢复内质网稳态，RIDD则会选择性降解分子伴侣mRNAs，加重内质网应激的，当内质网应激达到一定程度时，RIDD会降解抗凋亡前体mRNAs，诱导细胞凋亡的启动 [ 41 ]。John-Paul等 [ 42 ] 对IRE1α的作用做出了补充，IRE1α的核糖核酸内切酶活性加速了microRNAs的降解，从而使得caspase-2蛋白水平提高，刺激了线粒体凋亡途径。最近的一项研究还显示，被衣霉素诱导的SH-SY5Y细胞中，XBP-1、IRE1α和GRP78/BIP的表达增加，而MicroRNA-34a-5p的含量显著降低(p ≤ 0.05) [ 43 ]。 除了IRE1α-XBP-1信号级联外，IRE1α还与细胞凋亡途径有关。激活的IRE1α对肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2， TRAF2)存在募集作用，募集到内质网膜上的TRAF2可能会引起以下三种反应：1) 激活下游的凋亡信号调控激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1， ASK1)，后者再激活线粒体依赖caspase凋亡途径 [ 44 ] [ 45 ]；2) 激活的ASK1进一步激活下游蛋白，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase， JNK)，继而使Bcl-2发生磷酸化失活，诱导神经细胞凋亡，加重神经损伤 [ 46 ] [ 47 ]；3) 激活的JNK也能反过来能磷酸化TRAF2，使原本与TRAF2结合的Procaspase-12 (Caspase-12前体)从复合物上解离下来，寡聚化后经切割，形成具有活性的Caspase-12，引导细胞凋亡的发生 [ 48 ]。 综上所述，GRP78/BIP-IRE1途径从多个方面调节内质网应激的发生和发展，是非折叠蛋白反应当中重要的三条通路之一。在内质网应激发生的早期通过调控细胞内的mRNA，减少蛋白质的合成和促进蛋白质的折叠，以期恢复内质网稳态。但当内质网稳态长时间无法恢复时，则会通过激活其他蛋白通路，如TRAF2，ASK1，caspase-2等蛋白因子的激活，以促进细胞凋亡的发生。 3.3. GRP78/BIP-ATF6通路 ATF6与PERK和IRE1不同，后两者属于内质网上的I型跨膜蛋白，而ATF6属于II型跨膜蛋白，具有ATF6α和ATF6β两种亚型。其羧基端位于内质网膜腔内，具有GRP78/BIP的结合位点，氨基端位于胞质侧，具有转录激活的DNA结合区和亮氨酸拉链家族结构域 [ 49 ]。在内质网应激发生时，GRP78/BIP与ATF6α分离并被转移运输到高尔基体中。在高尔基体中，先后经过蛋白酶S1P(site-1 protease)和蛋白酶S2P(site-2 protease)的水解，剪切去除大部分腔结构域和部分跨膜结构域，才形成具有转录活性的ATF6f片段 [ 50 ]。ATF6f从胞质被运送进细胞核，调节多种内质网应激和非折叠蛋白反应相关蛋白的表达，如GRP78/BIP、蛋白质二硫键异构酶(PDIs)等，促进蛋白质的折叠，缓解内质网压力 [ 51 ]。ATF6的激活还能上调XBP-1的表达 [ 50 ]，与IRE1协同作用调节下游基因的表达。这也提示我们，非折叠蛋白反应的三条通路之间存在相互作用联系。 Du等 [ 52 ] 研究发现，ATF6能通过调节BACE1启动子的活性，减少BACE1的表达，从而减少Aβ1-42的产生，从而改善小鼠的学习记忆能力，减慢阿尔茨海默病的病理进程。这项研究提示我们ATF6可能作为治疗阿尔茨海默病的潜在靶标。此外，也有研究表明，ATF6的过度磷酸化可以激活Beclin-DAPK1信号通路，促进Bcl-2的磷酸化，激活自噬，促进细胞凋亡 [ 18 ] [ 53 ]。 虽然，目前对ATF6与阿尔茨海默病之间联系的研究较少，但ATF6在调节内质网应激的过程中仍有多方面的作用，与其他两条非折叠蛋白反应的信号通路存在内在联系。目前的研究提示我们，ATF6通过调节内质网应激来影响阿尔茨海默病的相关蛋白表达可能有更深的联系。但长期的内质网应激，也可能使ATF6激活细胞自噬和细胞凋亡相关蛋白的表达，加快神经细胞的凋亡，加重神经系统退变。