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user: 5. 细胞毒性和抗氧化性能的细胞检测方法 当天然抗氧化剂被作为功能食品和药品使用之前，首先要对其进行细胞毒性评价，确定合理的浓度使用范围。此外，前面总结的化学测定方法大都忽略了生物体系的复杂性，不能模拟真实的生理环境，也没有涉及到抗氧化剂跨膜进入细胞的能力，在细胞内的分布以及与细胞器或酶的相互作用等过程，因此还有必要进行生物实验[ 68 ] 。体外细胞实验由于操作简便、可重复性好、成本低等优势，通常用于天然抗氧化剂的毒性初步评价、对细胞内抗氧化酶活性的调控评价以及对不良环境中抗氧化剂的保护作用评价等。已有文献中报道的体外细胞实验所用的模型细胞种类众多，选择合适的细胞模型和正确的培养测试方法，对实验结果的可靠性和可比性也具有重要意义。 5.1. 细胞毒性测试 判断细胞毒性大小最常用的方法之一就是细胞增殖实验。在细胞增殖实验中，四甲基偶氮唑盐法(MTT)是最早报道且应用最广泛的方法[ 69 ] ，但是由于MTT经活细胞线粒体脱氢酶转化生成的蓝紫色结晶物需要加入二甲基亚砜(DMSO)进行溶解，操作步骤繁琐，导致实验结果稳定性差。目前已经有一些改进 图17. 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)检测法的反应机理 图18. DHE检测法的反应机理 型的试剂盒可用来检测细胞毒性，如甲胺四氮唑盐(MTS)法、水溶性四唑盐(WST-1)法、水溶性四氮唑-8(CCK-8)法和3，3’-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)法等 [ 70 ] 。 5.1.1. MTT法 MTT法的原理如图19所示：活细胞的线粒体脱氢酶能将3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)还原成不溶于水的紫色甲臜(formazan)结晶，formazan的生成量与细胞释放出的酶活性成正比例，而酶活力与细胞数及细胞活力成比例[ 65 ] 。MTT法是最经济、适用范围也较广的细胞生长检测方法，但灵敏度不高，并且需添加DMSO以溶解甲臜，同时DMSO具有比较强烈的细胞毒性可导致蛋白质沉淀，从而致使背景可变，操作不当会给实验带来极大误差[ 69 ] 。 5.1.2. MTS法 MTS法的反应机理见图20。与MTT法类似，活细胞的线粒体脱氢酶能将3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS)还原成水溶性的黄色甲臜(formazan)，formazan的生成量与细胞数及细胞活力成比例[ 71 ] 。MTS法的适用范围很广且灵敏度较高，但该法需要加入中间电子受体吩嗪甲硫酸盐PMS，且试剂的储存方法要求严格，储存时间也较短，比MTT的价格高很多倍[ 72 ] 。 5.1.3. WST-1法 WST-1法也是MTT的改进技术，反应机理如图21所示。活细胞的线粒体脱氢酶能将WST-1还原成水溶性的橘黄色甲臜(formazan)，formazan的生成量与细胞数及细胞活力成比例。WST-1法是最快捷、最敏感的且实验结果稳定的检测方法，直接产生水溶性的甲臜，WST-1较稳定、重复性好，可作即用型试剂。例如，Puriya Ngamwongsatit分别用MTT和WST-1法测定5芽孢杆菌对中国仓鼠卵巢细胞CHO的毒性，发现MTT法需要44-52 h而WST-1法只需3 h [ 73 ] 。但是WST-1法的局限性在于WST-1不能被所有的细胞所代谢[ 74 ] 。 图19. MTT法的反应机理 图20. MTS法的反应机理 图21. WST-1法的反应机理 5.1.4. CCK-8法 CCK-8法也是近年商业化的一个细胞毒性检测盒，反应机理如图22所示。活细胞的线粒体脱氢酶能将2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(CCK-8)还原成水溶性的黄色甲臜(formazan)，formazan的生成量与细胞数及细胞活力成比例。CCK-8法也具有使用方便、检测快速、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度、重复性优于MTT、对细胞增殖影响小、细胞毒性小。但是CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。 5.1.5. XTT法 XTT法也是MTT的改进方法[ 75 ] ，反应机理如图23所示。活细胞的线粒体脱氢酶能将3，3'-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)还原成水溶性的橘黄色甲臜(formazan)。当XTT与电子偶合剂吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)联合应用时，其所产生的水溶性的甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。XTT测定法与MTT法相比，能减少样品处理、提高检测效率，消除增溶过程可能出现的错误，同时提供等效灵敏度。但是XTT法也需要加入中间电子受体PMS，而XTT/PMS混合试剂容易生成电荷转移复合物而不太稳定[ 72 ] ，可能影响检测结果。 5.2. 细胞内抗氧化酶的活性测试方法 天然抗氧化剂作为体内抗氧化酶的有益补充，能清除体内过量的ROS。但外源性抗氧化剂的引入， 图22. CCK-8法的反应机理 图23. XTT法的反应机理 必然也会影响体内抗氧化酶的活性变化。除了前面所述部分化学检测法可以检测细胞内ROS的含量和分布外，还有一些商业化的试剂盒可以用来测试抗氧化剂存在下的细胞内抗氧化剂活性酶(SOD，CAT，GPx，GR，GST)的活性变化。 5.2.1. SOD活性检测 INT法是最常用的SOD活性检测方法，主要是利用碘硝基氯化四氮唑蓝(INT)与超氧自由基反应生成红色甲臜来进行光谱分析的一种办法，反应机理如图24所示。超氧化物歧化酶(SOD)也可以消耗超氧自由基，因此INT和SOD与超氧自由基的反应是竞争性反应，通过测定SOD对INT与超氧自由基反应的抑制程度可以评估SOD的活性。反应液红色愈深，说明INT的反应程度越大而SOD活性愈低，反之酶活性愈高[ 76 ] [ 77 ] 。INT法测SOD的活性具有精确、方便等优势，但应该综合考虑保存时间、保存温度及保存方式这些因素带来的影响。 除了使用最多的INT法，还可以用黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和氮蓝四唑(NBT)光还原法等检测SOD的活性。其中黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法是利用细胞色素C与O 2 .− 反应，将高铁细胞色素C还原为亚铁细胞色素C时在550 nm波长处有明显的吸光度(A)变化[ 78 ] 。氮蓝四唑(NBT)光还原法是利用NBT与超氧自由基反应生成蓝色甲臜来进行光学分析的方法[ 79 ] 。 5.2.2. CAT活性检测 CAT能催化过氧化氢分解成水和氧气，所以通过测定体系中剩余H 2 O 2 的量来评价CAT的活性大小。钼酸铵法是常用的一种检测方法，机理如图25所示。过氧化氢能氧化 (VI)成 (VIII)，而 (VIII)接受氢氧根的电子成键并使分子间立即脱水缩合，分子内也形成众多-O-H-O-氢键，得到稳定的黄色复合物(H 2 MoO 4 ·XH 2 O)n，在405 nm处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405 nm的吸光值，可得到剩余过氧化氢的量，就得到了CAT的催化活性。钼酸铵法测定CAT活性，具有准确、高效的特点，重现性好，相对于滴定法可以减少误差，但钼酸铵法操作较复杂，提取的酶液浓度、显色反应的时间等也可能干扰结果。 图24. INT法测SOD活性的反应机理 图25. 钼酸铵法测定CAT活性的反应机理 其他测定CAT活性的方法还有亚铁离子与硫氰酸盐分光光度法和流动相注射法(FIA)。亚铁离子与硫氰酸盐分光光度法测定过氧化氢酶的活性是通过孵育后残留的H 2 O 2 与Fe 2+ 反应，生成Fe 3+ ，Fe 3+ 与硫氰酸盐反应生成红色Fe(SCN) 3 ，酶标仪测吸光度从而计算出剩余H 2 O 2 的量 [ 80 ] 。流动相注射法(FIA)测定H 2 O 2 的活性是将过氧化氢酶固定，而待测基质被连续泵输送经过，过氧化氢酶分解H 2 O 2 产生O 2 ，从而利用Clark型氧电极检测增加的溶解氧来评价过氧化氢酶的活性[ 81 ] 。 5.2.3. GPx活性检测 GPx能催化还原型谷胱甘肽(GSH)与过氧化物反应，所以GPx的活性测定是以催化GSH氧化的反应速度，即单位时间内GSH减少的量来表示的。DTNB法是最常用的GPx活性检测方法[ 82 ] [ 83 ] ，其反应机理如图26所示。GSH和DTNB在GPx催化下反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子，在412 nm附近有最大吸收峰，通过吸收强度的变化可计算出GSH减少的量并求得GPx的活性。由于GSH也能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须减去非酶反应所引起的GSH减少量。 DTNB法不需特殊的设备，测定的精密度、灵敏度和稳定性基本符合要求，而且使用的DTNB试剂性能稳定，便于使用。DTNB法除了适于GPx活性的测定，也可以用于其他含巯基化合物的测定。但如果生物样品中含有其他巯基化合物可能会导致GPx活性的检测值偏高[ 82 ] 。 5.2.4. GR活性检测 谷胱甘肽还原酶(GR)能催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)被还原型辅酶II (NADPH)还原为GSH(如图27所示)。NADPH在340 nm附近有特征吸收，通过测定吸光度在340 nm处的下降就能获得NADPH的减少量，即可测定GR的活性[ 84 ] 。NADPH法测定GR活性具有快速、灵敏度高，可同时测定多个样品等特点，但如果有其他NADPH-消耗酶的存在会使得GR活性的测定值偏高[ 85 ] 。 5.2.5. GST的活性测定 1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)法常用来检测谷胱甘肽转移酶(GST)的活性。CDNB与GSH在GST的催化下能生成复合物CDNB-SG，其最大吸收在340 nm，用酶标仪或分光光度计检测此波长吸光度的变化即可计算GST的活性[ 86 ] [ 87 ] ，反应机理如图28所示。CDNB法具有操作简便和灵敏度高的优势，但该反应对GST缺乏专一性，其它巯基物质的存在可能对检测结果造成干扰。 5.3. 极端条件下抗氧化剂的防护和修复性能检测 实验中通常选用紫外线(UVB)照射来模拟极端条件对细胞的伤害。波长短能量较高的UVB (290~320 图26. DTNB法测GPx活性的反应机理 图27. NADPH法测GR活性的反应机理 图28. CDNB法测GST活性的反应机理 nm)能诱导皮肤病变，包括红斑、水肿、增生、细胞晒伤、炎症等，甚至发生癌变[ 88 ] 。UVB可诱导细胞产生大量ROS，引起一系列的氧化性损伤，并释放多种介导炎症反应、调节免疫应答和诱导细胞凋亡等细胞因子，这些细胞因子以负反馈形式作用于细胞，进一步加剧细胞的损伤[ 89 ] 。紫外线照射而形成的活性氧(ROS)被推定为在导致细胞反应的传导中起重要作用的物质，而且氧自由基的升高导致炎症增加，从而对皮肤产生伤害。因此，在UVB照射条件下可以研究抗氧化剂对辐照损伤的预防和修复作用。细胞的损伤程度与UVB的照射剂量有关，照射剂量(J/cm 2 ) = 照射强度(W/cm 2 ) × 照射时间(s)，照射强度通过紫外线辐照计来测量[ 89 ] 。 一个典型的实验方法如下[ 90 ] ：将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，待细胞单层贴壁后(24 h)，弃培养液，每孔加入200 μL PBS，分为空白对照组(空白组用铝箔盖住)、抗氧化剂组、UVB照射组、UVB照射 + 抗氧化剂组，UVB照射剂量为30 mJ/cm ２ ，照光完毕后弃去PBS覆盖液，加入DMEM维持液继续孵育24 h后，进行检测。用前面介绍的MTT、MTS、WST-1、CCK-8、XTT等方法可以检测细胞增殖活性，用比色法检测细胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽转移酶(GST)及过氧化氢酶(CAT)的活性。 选择的细胞模型和抗氧化剂用量和使用方法也会对实验结果产生影响。Liu J等证实螺旋藻(节旋螺旋藻)的活性乳酸菌发酵产品具有抗氧化和UVB防护作用[ 90 ] 。Sara Salucci发现羟基络醇能够防护人类角化细胞暴露于紫外线下引起的细胞凋亡，从而防止皮肤损害[ 91 ] 。Mariane A通过大鼠模型实验证实芦荟皂质对UVB引起的爪晒伤具有抗炎及抗氧化作用[ 92 ] 。