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user: 3. 结果与分析 3.1. 科尔希小麦叶绿体基因组的测序与分析 利用Nie等的方法，通过高通量测序组装、获得了科尔希小麦的完整叶绿体全基因组序列，并将注释完成的基因组序列提交至GenBank数据库，登录号为MK253668。分析发现，科尔希小麦叶绿体基因组大小为136，445 bp，这与其他禾本科物种叶绿体基因组大小相似 [ 15 ] (图1)。其具有典型的高等植物叶绿体基因组环状四分体结构，包括一对反向重复序列(IRA和IRB，大小为21，815 bp)，一个SSC区域(大小为12，832 bp)和一个LSC区域(大小为79，993 bp)。基因注释共注释了109个非冗余的基因，其中76个为编码蛋白的基因，29个为tRNA基因以及4个rRNA基因。同时，7个蛋白质编码基因(nadhA，rpl2，rpl23，rp12，rps7，rps15和rps19)，4个rRNA基因(rRNA23，rRNA16，rRNA5和rRNA4.5)和8个tRNA 图1. 科尔希小麦叶绿体基因组图谱 基因(trnH-GUG，trnL-CAU，trnL-CAA，trnV-GAU，trnL-GAU，trnA-UGC，trnR-ACG和trnN-GUU)位于反向重复区域，使得这19个基因具有两个拷贝。因此，科尔希小麦总共编码了128个基因，与其他小麦属物种一致 [ 16 ] 。进一步分析发现，SSC区包含了10个蛋白质编码基因和2个tRNA，而LSC区有61个蛋白质编码基因和22个tRNA组成。在108个非冗余基因中，其中14个基因各自具有一个内含子(即rps16，atpF，petB，petD，rpl2，ndhB，ndhA，trnK-UUU，trnG-UUU，trnA-UGC，trnL-UAA，trnV-UAC，rpl16和trnI-GAU)，一个基因(ycf3)有两个内含子(表1)。具有内含子的这14个基因中，9个基因位于LSC区中，包括6个蛋白质编码基因和3个tRNA，1个位于SSC，4个位于IR区域中(两个蛋白质编码基因和两个带有一个内含子的tRNA基因)。另外，rps12是一个特殊的反式剪切基因，其5′端外显子位于LSC，3′端外显子位于IR区，这在其他高等植物叶绿体中也有发现。在科尔希小麦叶绿体基因组结构中，由于IR区域中存在4个核糖体RNA(rRNA)基因，导致了IR区的GC含量(43.91%)远高于其LSC (36.28%)和SSC区域(32.19%)的GC含量，这与以前报道的其他高等植物叶绿体基因组特征一致 [ 16 ] 。 Table 1 The genes having introns in Triticum paleocolchicum cp genome and the length of the exons and introns (bp Gene Location ExonI IntronI ExonII IntronII ExonIII rps16 LSC 54 788 216 atpF LSC 158 812 409 ycf3 LSC 132 750 226 732 161 petB LSC 6 749 642 rps12* LSC 114 -- 32 542 223 petD LSC 8 750 475 rpl2 IR 391 664 431 ndhB IR 777 713 756 ndhA SSC 550 1037 539 trnK-UUU LSC 38 2503 33 trnG-UCC LSC 34 678 48 trnA-UGC IR 38 803 35 trnL-UAA LSC 35 589 50 trnV-UAC LSC 37 599 37 rpl16 LSC 9 1044 402 trnI-GAU IR 37 883 35 表1. 科尔希小麦叶绿体基因组中含有内含子基因及其外显子和内含子的长度(单位为bp) 注：rps12基因是个反式剪切基因，5’位于LSC区，3’在IR区。 3.2. 蛋白编码基因的功能归类 将科尔希小麦叶绿体基因组编码的128个基因根据其功能进行了归类，大体可以分为蛋白编码基因、转运RNA基因(tRNA)和核糖体RNA (rRNA)三大类。同时，蛋白编码基因又可进一步分为10小类(表2)，其中包括7个光系统I基因，15个光系统II，6个细胞色素复合物b/f亚基基因，6个ATP合酶亚基基因，11个NADH脱氢酶亚基基因，9个核糖体大亚基基因，12个核糖体小亚基基因，4个DNA依赖核酸聚合酶基因，以及1个Rubisco酶大亚基基因和5个其他功能的基因。这些蛋白编码基因的组成与已发现的单子叶植物叶绿体基因组成基本一致 [ 17 ] 。这76个蛋白编码基因合计总长度为59，667 bp，共编码了19，889个密码子。 Table 2 Genes found in the assembled Triticum paleocolchicum chloroplast genom 基因产物 Gene product I. 蛋白编码基因(protein-coding gene) 1. 光系统I (Photosystem I): psaA， B， C， I， J， ycf3， ycf4 2. 光系统II (Photosystem II): psbA， B， C， D， E， F， H， I， J， K， L， M， N， T， Z 3. 细胞色素复合物b/f亚基(Cytochrome b/f): petA， Bb， Db， G， L， N 4. ATP合酶亚基(ATP synthase): atpA， B， E， Fb， H， I 5. Rubisco酶大亚基(Rubisco): rbcL 6. NADH脱氢酶亚基(NADH oxidoreductase): ndhAb ， Bb，c ， C， D， E， F， G， H， I， J， K 7.核糖体大亚基(Large subunit ribosomal proteins): rpl2b，c ， 14， 16b， 20， 22， 23c， 32， 33， 36 8.核糖体小亚基(Small subunit ribosomal proteins): rps2， 3， 4， 7c， 8， 11， 12b， c， d， 14， 15c， 16b， 18， 19c 9. DNA依赖核酸聚合酶 (RNAP): rpoA， B， C1， C2 10. 其他类型蛋白(Other proteins): ccsA， cemA， clpP， matK， infA II. 核糖体RNA (Ribosomal RNAs): rrn23 c， 16c， 5c， 4.5c III. 转运RNA (Transfer RNAs): trnA-UGCc， trnC-GCA， trnD-GUC， trnE-UUC， trnF-GAA， trnfM-CAUc， trnG-UCC， trnH-GUGc， trnI-CAUc， trnI-GAUc， trnK-UUU， trnL-CAAc， trnL-UAA， trnL-UAG， trnM-CAU， trnN-GUUc， trnP-UGG， trnQ-UUG， trnR-ACGc， trnR-UCU， trnS-GCU， trnS-GGA， trnS-UGA， trnT-GGU， trnT-UGU， trnV-GACc， trnV-UAC， trnW-CCA， trnY-GUA 表2. 在科尔希小麦叶绿体亚种中存在的基因 注：a含有两个内含子；b含有单个内含子；c位于IR区具有两个拷贝；d具有分离的两个独立转录单元的基因。 3.3. 科尔希小麦叶绿体基因组的RNA编辑位点的预测 将科尔希小麦叶绿体基因组编码的76个非冗余的蛋白质编码基因递交到Prep-Cp数据库进行RNA编辑位点的预测(表3)。结果在科尔希小麦叶绿体基因组中共预测到分布于15个基因上的35个编辑位点，所有的预测的编辑位点均发生了从C到U的变化，并且所有的编辑均引起了氨基酸的变化，是有义编辑。35个编辑事件共造成了的氨基酸转变类型有9种，分别为A→V、H→Y、L→F、P→S、P→L、S→F、S→L、T→M、T→I，其中S→L和P→L两种转变形式出现次数最多，这与其它禾本科叶绿体基因组RNA编辑的组成特征相似。在发生编辑的所有基因中，ndhB的编辑位点数最多，达9个；之后依次是rpoC2，有5个位点；rpoB有4个位点，ndhA有3个位点、atpB、ndhF和ycf3有2个位点，其余的基因均为1个编辑位点(表3)。对编辑发生的密码子位置进行分析发现这些编辑位点中有4个发生于密码子的第一位，剩余的31个均位于密码子的第二位，在密码子第三位没有编辑现象的发生，这与其他麦类作物的叶绿体RNA编辑位点分布特征相似 [ 18 ] 。 Table 3 Prediction of the RNA editing sites in Triticum paleocolchicum chloroplast genom 基因 位点 核苷酸位置 氨基酸位置 氨基酸转变 Gene Site Codon Editing site Amino acid conversion matK 1 1261 421 Cat (H) ≥ Tat (Y) rpoB 1 467 156 tCg (S) ≥ tTg (L) 2 545 182 tCa (S) ≥ tTa (L) 3 560 187 tCg (S) ≥ tTg (L) 4 617 206 cCg (P) ≥ cTg (L) rpoC2 1 2009 670 cCa (P) ≥ aTa (L) 2 2030 677 cCa (P) ≥ cTa (L) 3 2158 720 Ccc (P) ≥ Tcc (S) 4 3002 1001 cCg (P) ≥ cTg (L) 5 4031 1344 tCg (S) ≥ tTg (L) atpA 1 1148 383 tCa (S) ≥ tTa (L) ycf3 1 44 15 tCc (S) ≥ tTc (F) 2 188 63 aCg (T) ≥ aTg (M) atpB 1 35 12 gCt (A) ≥ gTt (V) 2 1487 496 tCg (S) ≥ tTg (L) rpl20 1 308 103 tCa (S) ≥ tTa (L) petB 1 662 221 cCa (P) ≥ cTa (L) rpoA 1 1009 337 Ctc (L) ≥ Ttc (F) rps8 1 182 61 tCa (S) ≥ tTa (L) rpl2 1 62 21 aCt (T) ≥ aTt (I) ndhB 1 149 50 tCa (S) ≥ tTa (L) 2 467 156 cCa (P) ≥ cTa (L) 3 586 196 Cat (H) ≥ Tat (Y) 4 611 204 tCa (S) ≥ tTa (L) 5 704 235 tCc (S) ≥ tTc (F) 6 737 246 cCa (P) ≥ cTa (L) 7 833 278 tCa (S) ≥ tTa (L) 8 839 280 tCa (S) ≥ tTa (L) 9 1484 495 cCa (P) ≥ cTa (L) ndhF 1 62 21 tCa (S) ≥ tTa (L) 2 1487 496 aCg (T) ≥ aTg (M) ndhD 1 878 293 tCa (S) ≥ tTa (L) ndhA 1 473 158 tCa (S) ≥ tTa (L) 2 563 188 tCa (S) ≥ tTa (L) 3 1070 357 tCt (S) ≥ tTt (F) 表3. 科尔希小麦叶绿体RNA编辑位点的组成与分布 注:“氨基酸转变”列中大写字母代表该碱基发生了编辑。 3.4. 系统发育分析 为了明确科尔希小麦与其他小麦属物种的系统进化关系，利用科尔希小麦与其他8个小麦属物种的叶绿体全基因组序列进行了比较并构建了系统进化树。结果发现，小麦属物种的叶绿体基因组高度保守，尤其在基因区域基本完成一致，但在基因间隔区存在一定的序列差异。系统进化分析发现，科尔希小麦与具有AABB基因型的硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticum turgidum)、波斯小麦(Triticum carthlicum)、野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)等四倍体小麦，以及具有AABBDD基因型的普通小麦(Triticum aestivum)聚为一类，它们具有非常近的亲缘关系，而与AAGG基因型的提莫菲维小麦(Triticum timopheevii)分属两个不同的进化分支，表明它们间存在遗传差异，亲缘关系较远(图2)。系统进化分析初步揭示了科尔希小麦的系统发育地位和进化关系。 图2. 科尔希小麦与其他小麦属物种的系统进化关系