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user: 4. 结果与表征 4.1. 5-FU的载药率评价 4.1.1. 检测波长的确定 精密称取0.1 mg 5-FU置于50 mL烧杯中，加入适量甲醇，充分溶解后转移至10 mL容量瓶定容，得到10 mg/L的5-FU甲醇溶液，以甲醇作为空白对照，在200~500 nm扫描波长内对样品进行紫外扫描，得图3，确定5-FU在266 nm处有最大吸收波长，故选择266 nm作为高效液相色谱的检测波长。 图3. 5-FU在甲醇中的UV扫描图 4.1.2. 标准曲线的建立 液相色谱条件： Agilent 1200高效液相色谱仪，配套DAD检测器； 色谱柱：C18反相柱，(4.6 × 250 mm， 5 μm)； 柱温：25℃； 检测波长：266 nm； 流动相：甲醇:水 = 10:90；以磷酸调pH为6.2 流速：0.8 mL/min； 进样量：20 µL； 精密称取1 mg 5-FU标准对照品，加入去离子水配制成浓度为0.1 mg/mL的标准储备液，继续稀释成浓度梯度为5，10，20，40，80，160 μg/mL的溶液，每个浓度样品分别进样3针，5-FU在甲醇-水(10:90)流动相中的色谱图如图4所示，计算线性回归方程，得图5。 回归方程：A = 117.53C + 696.18，R = 0.9999； 线性范围：0~160 μg/mL； 保留时间：7.62 min。 图4. 5-FU在甲醇-水(10:90)流动相中的色谱图 图5. 5-FU标准曲线图 4.1.3. 载药率的测定 取3.3中制备5-FU@UiO-66-NH 2 -GA时保留的上清液，进行适度稀释后进高效液相色谱仪检测上清液中的5-FU含量，与载药前加入5-FU的初始量进行比较，结果表明采用浸渍法可以有效实现UiO-66-NH 2 -GA对5-FU的装载，且载药率高达80.9 %。 4.2. 红外光谱表征 使用红外光谱仪对5-FU、UiO-66-NH 2 、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU与UiO-66-NH 2 -GA的物理混合物(5-FU&UiO-66-NH 2 -GA)进行表征。分别称取少量的5-FU、UiO-66-NH 2 、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA粉末与KBr混匀 [ 10 ] ，用玛瑙研钵研磨成粉末后，压制成透明薄片，用红外光谱仪测定，分析特征吸收峰，扫描范围为4000~400 cm −1 。 < img src=//html.hanspub.org/file/4-1710184x15_hanspub.png width=850.374984741211 height=706.25 class=100 /> A—5-FU；B—UiO-66-NH 2 -GA；C—5-FU@UiO-66-NH 2 -GA；D—5-FU&UiO-66-NH 2 -GA 图6. 5-FU、UiO-66-NH 2 -GA、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA (5-FU与UiO-66-NH 2 -GA的物理混合物)的红外光谱图 如图6所示，其中UiO-66-NH 2 -GA对应的谱图：3500~3000 cm −1 区域宽峰，对应于O-H伸缩振动峰；1650~1570 cm −1 对应OCO不对称伸缩振动峰；1440~1380 cm −1 对应OCO对称伸缩振动峰；1220~1300 cm −1 对应C-N伸缩振动峰。 5-FU对应的谱图：1680~1630 cm −1 对应C=O伸缩振动峰；1655~1590 cm −1 对应N-H弯曲振动峰，载药后该峰仍存在，可得5-FU已成功载入UiO-66-NH 2 -GA中。 5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA的红外光谱图对比表明，5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA的红外谱图明显不同，说明5-FU已经成功载入UiO-66-NH 2 -GA中，而不是两种物质的简单物理混合。 4.3. DSC表征 采用差示扫描量热法对5-FU、UiO-66-NH 2 -GA、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA进行分析表征，测验温度范围为25℃~400℃，以10 ℃/min升温速率测定样品的DSC曲线，检验UiO-66-NH 2 -GA和5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的热稳定性并对比载药是否成功 [ 11 ] 。对比图7四条热吸收曲线可知，5-FU@UiO-66-NH 2 -GA与UiO-66-NH 2 -GA类似，未出现5-FU的吸收峰。5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA的热吸收曲线明显不同，说明5-FU被包载到载体UiO-66-NH 2 -GA中，而不是两种物质的简单物理混合。 图7. 5-FU、UiO-66-NH 2 -GA、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA (5-FU与UiO-66-NH 2 -GA的物理混合物)的DSC图谱 4.4. XRD表征 使用X射线衍射仪来表征5-FU、UiO-66-NH 2 -GA、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA，称取适量干燥的5-FU、UiO-66-NH 2 -GA、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU&UiO-66-NH 2 -GA粉末加入到X射线衍射仪中得到相应的衍射曲线，如图8所示，UiO-66-NH 2 -GA和5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的晶型结构类似，均有高强度的尖锐衍射峰，形态结构稳定。在2θ = 7.46˚、12.09˚、14.21˚、16.85˚、22.38˚、31.32˚处出现特征峰，分别与(111)，(022)，(113)，(004)，(115)，(121)晶面相对应 [ 12 ] 。载药前后UiO-66-NH 2 -GA的晶型结构未发生改变，说明载药过程不会影响UiO-66-NH 2 -GA的晶型结构。 图8. 5-FU、UiO-66-NH 2 -GA、5-FU@UiO-66-NH 2 -GA及5-FU&UiO-66-NH 2 -GA (5-FU与UiO-66-NH 2 -GA的物理混合物)的XRD图谱 4.5. SEM表征 通过扫描电子显微镜观察5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的表面结构形貌特征 [ 13 ] ，如图9所示，5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的晶型结构完整，呈正八面体结构，粒径分布均匀，粒径为200 ± 10 nm。载药后的UiO-66-NH 2 -GA晶体结构仍然呈良好的正八面体结构，说明载药过程对UiO-66-NH 2 -GA的晶型结构未产生影响。 图9. UiO-66-NH 2 -GA与5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的SEM图像 4.6. 5-FU的体外释放研究 使用正向动态透析法 [ 14 ] 对5-FU的释放进行测定，分别配制pH = 7.4，pH = 6.5，pH = 5.5的PBS缓冲溶液作为释放介质，精密称取适量5-FU@UiO-66-NH 2 -GA分散在5 mL的PBS缓冲溶液中，置于透析袋(MWCO: 3500 D)中，将透析袋紧密密封后放入盛有250 mL PBS缓冲溶液的锥形瓶中，在37℃恒温振荡器中震荡(100 r/min)。分别于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h各时间点取2 mL PBS释放介质，及时补充新鲜PBS缓冲溶液。计算各时间点的累积释放率，各时间点的累积释放率(Q)计算公式为： Q ( % ) = ( V 0 ⋅ C t + V ⋅ ∑ n − 1 t − 1 C t ) ⋅ 100 % ⋅ W − 1 式中C t 为各时间点测得释放介质中的药物浓度(mg/mL)，W为投入药物的总量(mg)，V 0 为释放介质的总体积，V为每次取样的体积。 如图10所示，5-FU@UiO-66-NH 2 -GA在pH 5.5时表现出较高的累积释放率，对不同pH下的释放曲线进行分析，当pH = 5.5时，5-FU在前12 h释放迅速，约70%，48 h后稳定在84%，48 h基本释放完全；当pH = 6.5时，在前12 h释放迅速，约60%，48 h后稳定在73%，48 h基本释放完全；pH = 7.4时，在前12 h释放迅速，约50%，48 h后稳定在56%，48 h基本释放完全。 4.7. 5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的体外抗肿瘤活性研究 本研究采用MTT法对比考察5-FU@UiO-66-NH 2 -GA和5-FU的体外抗肿瘤的活性。 MTT溶液的配制：称取0.5 g MTT粉末，溶于100 mL PBS缓冲液中，最终获得浓度为5 mg/L的 图10. 5-FU@UiO-66-NH 2 -GA在pH 5.5、pH 6.5和pH 7.4释放介质中的释放曲线图 MTT溶液，超声促进溶解，在超净实验台中用0.22 μm无菌滤膜过滤除去溶液中的细菌，在−20℃冰箱冷冻避光保存。 本研究选用人肝癌细胞HepG2作为MTT检测对象，收集对数期的HepG2细胞，调细胞密度至10万/mL，向96孔板每孔中加入100 μL细胞悬液，置于含5 % CO 2 ，37℃的恒温培养箱中孵育，培养24 h后，加入浓度梯度的5-FU及5-FU@UiO-66-NH 2 -GA药物，设7个梯度，分别为100、200、400、600、800、1000、1200 μmol/L，设一组空白对照，空白对照组每孔加入100 μL不含胎牛血清的DMEM培养液，设6个复孔，培养24 h，加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，弃去培养液，加入200 μL的DMSO，置振荡器振荡5 min，在酶标仪OD = 490 nm处测量各孔的吸光度。最后计算各组IC 50 值。MTT试验重复五次，筛选最佳结果，结果如图11所示。 MTT试验结果如下： 5-FU@UiO-66-NH 2 -GAIC 50 = 869 μmol/L 5-FU IC 50 = 1095 μmol/L 结果表明5-FU@UiO-66-NH 2 -GA的IC 50 值明显小于单独使用5-FU时的IC 50 值，说明使用UiO-66-NH 2 -GA材料作为5-FU的药物载体可以明显提高5-FU的抗肿瘤效果。