system: [SYSTEM]

user: 4. 讨论 Krieg等(1995)设计合成许多长度不同的CpG-ODN以进行活性研究指出，具有刺激免疫功能的最佳 图5. 不同CpG-ODNs注射虾子后PO活性及免疫相关基因的表现 ODN是以CpG为核心且由20个核苷酸组成 [ 7 ] ；但是邻近CpG的区域序列不同，在小鼠和人类的刺激效果有异 [ 22 ] ；其他研究也证明，CpG基序(CpG motif)的刺激效应具有序列特异性的(sequence specific)，且核心的CpG改成GpC会丧失活性的刺激效应 [ 7 ] [ 23 ] 。在哺乳类，对于合成对免疫细胞有效CpG-ODN的相关研究已多有了解，但是在其他物种或脊椎动物了解则非常有限。在鱼类养殖，已知CpG寡脱氧核醣核酸(简称CpG-ODN)具有刺激免疫活性，可做为疫苗的佐剂；但是序列不同对相同免疫反应的效果不 Table 3 Mortality of LPS-stimulated prawn treated with inhibitory CpG-ODN after infectio 处理方式Treatment 攻击处理Challenge 感染后不同时间之虾子的死亡数目Number of death after challenge 死亡百分率Mortality (%) 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d ODN2140 (N = 20) + 4 4 1 1 1 1 0 0 60 ODN3006 (N = 20) + 5 3 2 1 2 0 0 0 65 PBS (N = 20) + 7 4 3 3 1 0 0 0 85 PBS (N = 10) - 1 0 0 1 0 0 1 0 10 None (N = 10) - 0 0 0 0 1 0 0 0 0 表3. 脂多醣刺激之虾子以抑制性CpG-ODN处理后感染的死亡率 注：d表示感染后天数。N表示实验用的数目。连续2天没有死亡发生后再出现的死亡被认定为非专一性死亡(详见材料方法)。 同外，核心基序反向则会使刺激性消失 [ 23 ] [ 24 ] 。 本研究室曾利用不同序列CpG-ODN刺激虾子的血球细胞后发现，ODN2006激发虾血球基因proPO的表现会被os-ODN13抑制 [ 16 ] ，推测不同序列的ODN可能对虾免疫力具有不同效应。Sun等(2013)曾将5种分别对哺乳类和水生动物有效的CpG-ODNs连结成一段富含CpG且110个核苷酸组成的ODN，发现可以诱发白虾的细胞性免疫力 [ 25 ] 。Su等(2016)曾根据已发表的6段ODNs以及3段能刺激草鱼(Ctenopharyngodon idella)头肾单核细胞增生的ODNs，组合成一段新的ODN1670A，证明此ODN能激发TLR9表现以及在病毒感染时促进第二型干扰素(IFNγ)表现 [ 26 ] 。因此，我们认为利用不同策略发展不同影响效应的CpG-ODN以应用在养殖虾，以调节不同状况时虾子的免疫力，应该是非常重要且可行的。 本研究室曾收集已发表且分别与鱼类和人类有关的CpG寡聚脱氧核苷酸各30段和11段，其中32段为刺激序列和9段为抑制序列。以oligomer计数程序进行序列分析后，分别根据在刺激序列和抑制序列中出现次数较多的5-mer和6-mer核心基序，以头尾相接方式随机排列获得数段疑为刺激性和抑制性之不同序列ODN (未公开)。本研究随机选择一段四段疑为抑制性或刺激性的ODN2050、ODN2051、ODN3006及ODN4006进行免疫调节作用的分析。由于本研究试图找到对虾子免疫力具有不同影响的CpG-ODN，实验虾在进行分析前会以M199缓冲液于体外处理血球细胞，分别测定胞内和胞外PO T ，当胞外PO T 低于胞内PO T 的虾子，则被认定为未发炎的虾子。 4.1. CpG-ODN于体外对血球细胞的作用 Sung等(2010)实验指出，CpG-ODN直接结合血球细胞以刺激活性 [ 17 ] 。因此，本研究首先确定四种CpG-ODNs是否结合血球细胞，接着再利用体外实验，初步决定四种CpG-ODNs对血球细胞的直接影响效应。相较于ODN2006和ODN2140分别于30和40 mg/mL时可以结合近95%和92%的血球细胞，本研究的四种ODNs中，ODN2050和ODN2051也可以与超过95%的细胞结合，但所需浓度较低；然而ODN3006和ODN4006于50 mg/mL时，只能与72%和88%的细胞结合。这些结果推测，ODN2050和ODN2051可以作用大部分的血球细胞，ODN3006和ODN4006则与特定的血球族群结合，尤其是ODN3006。此外，由图1的低浓度ODN与血球结合率和结合50%血球细胞所需浓度(BC 50 )结果发现，ODN2050于0.5 mg/mL能与8.1%细胞结合，1 mg/mL能结合21%血球，均高于其他的ODNs，且BC 50 也远低于其他ODNs。由本研究的图3结果，ODN2050和ODN3006能与相同细胞族群的相同分子结合，随ODN2050浓度增加，能与ODN3006结合者下降。这些结果推测的可能原因包括：ODN2050结合血球细胞的亲和力高于其他ODN或是血球细胞上能与ODN2050结合的分子种类不只一种。这些推测仍须进一步利用竞争实验和其他方法作验证。 不论细胞结合率是否有差异，在没有其他因子的影响下，正对照的ODN2006和四种ODNs都能增加虾子血球胞外的PO T ，即刺激释颗粒作用；但是效刺激浓度有差异(图3)。负对照的ODN2014则会抑制释颗粒作用。研究曾指出，核心的CpG改成GpC后会失去对小鼠和鱼类的刺激效应 [ 7 ] [ 23 ] 。有趣地，ODN2050则是根据此原则而设计，将具有CG且为抑制性的ODN2014序列中再增加CG而获得，预测可能具抑制作用，但本次的体外测定结果却与预期相反。推测其可能原因有三：需要虾体内其他因子的偕同作用才会具有抑制作用、CG重复次数与ODN效果有关、以及物种差异所致。 4.2. CpG-ODN于虾体内对血球免疫反应的影响 由于虾体内影响因子复杂，为了解体外实验所测得ODNs的作用是否在进入虾体后仍是一致的，本研究进一步将不同序列的CpG-ODNs注射入虾体腔后，分析血球的释颗粒作用(POT表现)以及血球内三个原酚氧化酵素活化系统(PAS)相关的基因(propo、pon和α2-m)和一个抗微生物基因alf的表现(mRNA表现量)。结果显示，正对照之促进性ODN2006能增强血球释颗粒作用和促进四种免疫基因的转录；ODN2050和ODN2051对三种PAS相关基因的转录均都具促进作用，且增强血浆PO T 的结果与体外实验结果一致，其中ODN2050效果优于ODN2051。Xu等(2016)研究指出，亲和力强的ODN刺激虾子免疫力的效果强于亲和力弱者 [ 27 ] 。根据图1和图2血球结合率的结果，我们推测ODN2050的亲和力可能高于ODN2051。 意外地，ODN3006于体外能刺激释颗粒作用，但在虾体内不但对血浆PO T 和基因α2-m无影响，且抑制基因propo和pon的转录，对血球的影响效应与抑制性的ODN2140雷同(图5)。针对淡水长脚大虾，过往的研究已经证明ODN2006进入虾体后可以经由不同讯号路径来激活虾血球的PAS 活性和促进基因propo的转录；而os-ODN13不影响propo表现但会抑制ODN2006的促进效应 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] 。由上述结果推测，ODN2050、ODN2051和ODN3006可能透过不同路径以影响虾子的PAS，前两种ODNs如ODN2006应该属促进性；而ODN3006则可能是抑制性。至于ODN4006可能与os-ODN13相似，可能具有中和其他ODN的影响效应，属中和型。 前人实验指出，不同物种能辨识的ODN可能有差异 [ 8 ] ，邻近CpG的区域序列不同，在不同物种之间的刺激效果也不同 [ 22 ] ，显示CpG基序的刺激效应具有序列特异性的 [ 7 ] [ 23 ] 。本研究的四种CpG-ODNs是根据已知对鱼类和人类有影响的ODN设计而获得。体外及体内实验发现，ODN2050的影响效应均与设计所预测的相反。之前曾推测ODN2050可能需要虾体内其他因子的偕同作用才会具有抑制作用。但是体内实验证明此推测不成立。另外，ODN3006核心中不具CG且GC重复数多于ODN2006，但于虾体内的影响效也与预测相反。根据本研究的免疫反应与细胞结合率等结果推测本实验的四种CpG-ODNs效应之差异，除了可能因物种不同造成ODN2050和ODN3006的影响与预测有差异外，ODN核心中GC和CG出现频率以及ODN对血球的结合率和亲和力都可能与ODN的影响效应与关。这些必须更多实验已证明之。 4.3. 抑制性CpG-ODN降低发炎性虾子感染后的死亡 脂多醣分子(LPS)为病原相关的分子模式(PAMP)之一，可以增强动物的发炎反应，包括虾类 [ 28 ] 。为确认实验虾处在发炎状态，我们在预备实验中，以虾子血浆中的PO T 和血球内谷胱甘肽过氧化酶活性( Glutathione Peroxidase， GPx)作为发炎指标，测得每一尾虾子注射2.5 μg的脂多醣分子(LPS)后1小时，虾子之PO T (45.7 ± 9.92 U/min/mg)高于未注射LPS的对照组组(64.4 ± 8.10 U/min/mg)，GPx活性(6.1 ± 1.7 U/mg)也高于对照组(2.6 ± 1.5 U/mg)。因此，本研究将2.5 μg/尾LPS剂量注射处理后之虾子定义为发炎性虾子。本研究假设感染后虾子能因给予抑制性ODN减缓发炎作用而降低因感染造成的死亡率。以易感性实验发现，疑似抑制性ODN3006或ODN2140处理之发炎性虾子在感染后的死亡率确实低于未处理组死亡率(表3)，显示虽然无法大幅度降低发炎状态虾子的易感性，但此两种抑制性ODNs仍然具有降低虾子死亡的效用，证明ODN3006和ODN2140应为抑制性。至于ODN3006的抑制性是否与亲和力(图1)较低和仅结合特定血球族群(图2)有关，须进一步厘清。