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user: 3. 结果和讨论 3.1. 基于石墨烯/金铂纳米粒子的工作电极的表征 SEM和EDS的表征基于AChE/GR-Au-Pt修饰工作电极的SEM图2所示。图2A显示了固定于在工作电极表面的石墨烯的2维结构，可以看出石墨烯典型的褶皱状和薄如纱的形貌。图2B显示的是基于AChE/GR-Au-Pt工作电极表面在放大10，000倍之后的SEM图像，证明了纳米粒子分散在基于石墨烯的工作电极表面。金铂纳米粒子的直径可从图C中观察到，大约在150~400 nm之间。图2D是固定在修饰AChE/GR-Au-Pt工作电极表面的AChE的SEM图。与图2B相比，可以观察到薄薄的一层覆盖物。石墨烯和GR-Au-Pt纳米复合物的相应能谱分析(如图3所示)也证实了工作电极表面金、铂、碳元素的存在(图3A， B， C)。 3.2. 氧化还原探针表征 如图4所示，可以观察到一个半圆对应裸的工作电极(Rct = 750 Ω，曲线a)，GR修饰在工作电极上之后，电阻值下降(Rct = 500 Ω，曲线b)，证明了GR具有良好的导电性能。当Pt纳米粒子或Au纳米粒子修饰到基于GR纸基系统上时，半圆的直径明显减少，表明了界面的电化学阻抗(Rct = 270 Ω，曲线c；Rct = 250 Ω，曲线d)减小。然而，Au-Pt共沉淀的双合金使得半圆的直径进一步减少(Rct = 50 Ω，曲线e)，这是因为双金属系统具有更好的类似于导线和电子通道的作用。在AChE固定在GR-Au-Pt修饰纸基系统之后，可以看到Ret显著增加(Rct = 1500 Ω，曲线f)，这是因为AChE对电子转移的阻碍作用。 图5表示了不同扫速下，GR-Au-Pt修饰纸基电极在0.1 mmol/L探针溶液检测的CV图。在半无限线性扩散条件和可逆反应下，Randles-Sevcik等式可描述为 [ 49 ]： i p = kAn 3 / 2 AD 1 / 2 C o V 1 / 2 在等式(1)中，i p 代表峰值电流，单位安培，A是电极表面积，单位cm 2 ，n是转移电子数目，D电活性材料的扩散系数，C o 是电活性材料的体积浓度，单位cm 2 ∙s −1 ，v是扫速，单位V∙s −1 。对铁氰化钾来说，n是1，D是7.6 × 10 −6 cm 2 ∙s −1 ，Co是浓度，i p 相对于ν 1/2 的斜率是4.0 × 10 −5 (R 2 = 0.9997)，如图5B所示，用来计算有效工作表面积大小。AChE/GR-Au-Pt的A计算得出大小为0.53 cm 2 。研究得出基于GR-Au-Pt修饰纸基系统的电活性表面积三倍大于其物理面积(0.13 cm 2 )。 代表电子转移速率的常数–标准速率常数(k s )可以通过以下方式计算。k s 是快速简单的方式来评估电极反应动力学程度的参数。在Nicholson理论 [ 49 ] 中： ψ = ( D O / D R ) α / 2 K s [ D O π v ( nF / RT ) ] 1 / 2 图2. SEM图 (A) GR修饰的工作电极和(B) GR-Au-Pt修饰的工作电极在放大10，000倍的图(C) GR-Au-Pt修饰的工作电极在放大5000倍的图 (D) AchE/GR-Au-Pt修饰的工作电极在放大5000倍的图 图3. 裸的工作电极 (A)， GR修饰工作电极 (B)， GR-Au-Pt纳米复合物修饰工作电极(C)的能谱分析 图4. 不同材料修饰PADs在0.1 mo/L KCl含有10 mmo/L [Fe(CN) 6 ] 3 − / 4 − (1:1)溶液中的交流阻抗图 (a) 裸电极， (b) 石墨烯， (c) 石墨烯/金 纳米复合物， (d) 石墨烯/铂 纳米复合材物， (e) 石墨烯/金-铂纳米复合物， (f) 乙酰胆碱酯酶/金-铂纳米复合物 对于[Fe(CN) 6 ] 3− / 4− 这个体系，n是电子数目，α是转移系数，D是电活性材料的扩散系数，ν是扫秒速度(单位V/s)。当△Ep = 67 mV，Ψ = 4，k s 的数值为0.039 cm/s，该研究表明GR-Au-Pt纳米材料和工作电极之间有良好电子传递过程，该过程可逆。 图5. A图是AChE/GR-Au-Pt修饰PADs在0.1 mmol/L KCl/1 mmol/L [Fe(CN) 6 ] 3−/4− 溶液中的CV图扫描速度从a到g分别是：50，80，100，150，180，200和250 mV∙s −1 (B) 3.3. 研究基于AChE/GR-Au-Pt的纸基系统应用于杀螟硫磷检测 不同材料修饰的基于AChE的传感器上对于ATCl的电化学响应，通过DPV进行研究如图6中所示，电位范围在−0.2 V到 0.7 V之间，约在+0.26 V处可以观察的氧化电流峰，如图6A。在图6B中所示，峰值电流的改变在基于不同材料修饰的AChE的传感器上对比图。很显然，基于GR的纸基系统的峰值电流高于仅仅在纸基系统上修饰AChE (图6B(a)~(b))，这也许是因为GR具有极好的导电性能，可以加快电子转移 [ 23 ] [ 24 ]。在Au-Pt纳米粒子电沉积到纸基系统上之后，峰电流进一步增加(图6B(c)~(d))。 图6. (A) 1 mmol/L ATCl在不同修饰材料的电极上DPV图(a) PAD修饰AChE， (b) PAD修饰AChE/graphene， (c) PAD修饰AChE/Au-graphene (d) PAD修饰AChE/Pt-graphene， (e) PAD修饰AChE/Au-Pt-graphene(B)不同材料修饰PADs的峰电流比较柱状图 我们可以通过DPV曲线研究pH和固定AChE的量对于峰值电流的影响。氧化峰值电流随着pH的增加而增加并且在pH 7.2达到最大，随后pH进一步增加时，峰电流持续降低(图7A)，pH值为7.2。图7B显示了固定在酶生物传感器上的AChE响应的影响。很明显峰值电流随着AChE数量的增加而增加并且在20 U/mL达到最大，当AChE的浓度大于20 U/mL时仍保持不变。这是因为过量的AChE可能阻碍底物和电极之间的电子转移。因此，在这项研究中20 U/mL被选择作为AChE的最佳浓度。 图7. pH值(A)和AChE固定值(B)的含量对AChE/GR-Au-Pt-修饰PADs的峰电流值的影响 如图8所示，在上述优化条件下，研究该系统对杀螟硫磷的检测。可在+0.26 V处观察到明显的氧化峰，其来源于胆碱的氧化(TCh)。在滴加杀螟硫磷溶液后(静置30s)，纸基电极上电流的改变与杀螟硫磷浓度的对数(log (FT) )呈线性相关(图8)。杀螟硫磷的浓度从1.0 × 10 −7 到2.3 × 10 −3 mol/L范围内，氧化峰(Δi p )的减少与浓度的对数(log (FT) )成比例。线性方程表达为“Δi p (μA) = 35.99 + 12.67lgC FT (R 2 = 0.9809)”，基于3倍信噪比计算得到杀螟硫磷的检测限为5.4 × 10 −8 mol/L。 图8. (A) DPV图采集于20 μL of 1 mmmol/L ATCl和不同浓度的杀螟硫磷在AChE/Au-Pt-GR修饰PADs；从a到g：0，0.353，0.706，1.42，1.71，2.06和2.59 × 10 −6 mol/L (B)杀螟硫磷的线性关系图 在相同的电极上进行6次连续安培测量来研究生物传感器的重复性，得到相对标准偏差(RSD)为4.07%，这证明了很好的可重复性。当基于酶修饰的工作电极修饰不使用时，要存储于4℃冰箱里。28天之后，酶电极的响应电流仅比初始响应减少了8%，表明很好的稳定性。 3.4. 蔬菜样品分析的实际应用 为了研究酶生物传感器在实际样品分析中的应用，基于该传感器被用于检测从当地超市购买的四种常见蔬菜中有机磷农药的残留量(表1)。通过四种蔬菜样品中加入1.44 × 10 −6 mol/L杀螟硫磷进行回收实验，将该传感器的结果与气相色谱法的结果进行比较，该方法的回收率从89.3%到103.8%，结果表明实际样品中农药检测的准确性，有实际应用的潜能。 Table 1 Recovery of bothophos measured by this sensor in vegetable samples and compared with gas chromatograph 样品 基于AChE/GR-Au-Pt的传感器 气相色谱法 抑制率(%) 均值(μmol/L) 回收率(%) 相对平均偏差(%) (n = 3) 均值(μmol/L) 芹菜 2.8 0.31 ± 0.04 none 7.8 none 大白菜 5.6 0.82 ± 0.06 none 4.9 none 花椰菜 9.4 1.73 ± 0.14 none 2.3 none 卷心菜 16.6 9.85 ± 0.29 none 3 8.76 ± 0.13 加入的量(1.44 × 10 −6 mol/L) 芹菜 51.3 12.9 ± 7.4 89.3 6.4 14.4 ± 2.4 大白菜 59.9 14.7 ± 3.1 103.8 5.4 14.6 ± 3.4 花椰菜 62.1 22.3 ± 5.2 100.1 3.2 22.34 ± 5.2 卷心菜 69.6 24.3 ± 3.9 103.2 2.4 23.0 ± 3.7 表1. 本传感器在蔬菜样品中检测杀螟硫磷的回收率实验，并且和气相色谱相比。