DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 1. 引言 在谈及“傣-泰民族医疗文化”之前，有必要先澄清“傣-泰民族”这一概念。在我们寻常认识之中，傣族为中国云南省南部的少数民族，而泰族为泰国的主体民族，这泰、傣之间有着何种联系？陈吕范对泰族起源的研究中得出如下结论：“早在二千多年前，泰族傣族的先民掸人就活动在今缅甸掸邦、泰国北部和东北部，老挝中部与北部以及云南德宏与西双版纳的广大地区。” [ 1 ] “自唐宋至近代，由于历史的演变，这一地区先后分别归入中缅泰老等国版图；也是由于历史的演变，这一地区的掸泰族群才逐步形成为泰国泰族、老挝老族、越西北泰族、云南傣族和缅甸掸邦的掸族。” [ 1 ] 可见泰族、傣族为民族史意义上的同源民族，两者的社会文化虽因自然环境、历史过程及政治原因而有所不同，但从大体上看，可将其纳为一体。因此笔者可将傣-泰民族定义为：居住在中国云南的西南部，中南半岛的中部及东北部的，具有相同文化的民族。民族医疗文化是民族文化的部分，可由傣-泰民族文化一体性推知傣-泰民族医疗文化的一体性。所以在本文中，笔者将从傣-泰民族医疗发展历程入手，结合傣族与泰族的医疗知识理论与医疗实践，以求能较为完整地介绍傣-泰民族医疗文化。
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user: 2. 傣-泰民族医疗文化的历史发展 根据泰傣民族历代生活之地——在现在看来是北至中国云南、南及泰国暹罗湾，跨缅甸东部、泰国北部、老挝中北部与越南西北部的东南亚地区。根据该区域的核心——泰国的历史可以将傣-泰民族医学的发展分为如下几个时期： 1) 史前时期(BC200之前) 根据傣-泰民族医经《罗格牙坦》记载，史前的傣-泰民族经历过“神农尝百草”的时代，在寻食时积累了各种植物、动物、矿物的知识。傣-泰的先民们辨识植物、观察食用他们之后给身体带来的变化；猎取、分食动物，认识动物的器官并发现其药用价值；为了适应恶劣的气候环境，先民们依据不同的季节，把一些御寒、解暑、可预防疾病的植物用来煎煮当茶饮 [ 2 ] 。这被视为傣-泰民族医药认识的起源。由于没有文字，医药知识只能通过“口传心受”的方式传承。受原始宗教影响，巫医一体，医药知识与巫术、仪式紧密相连。这一特点至今尤存。 2) 前素可泰王朝时期(BC200~AC1238) 自公元前后东南亚早期国家形成一直到13世纪泰国素可泰王朝建立之前，泰傣民族并未发展出独立国家，其生活区域为他族征服。这一时期被认为是“前素可泰王朝时期”。其中，扶南、堕罗钵底、三佛齐和真腊这四个国家文化对傣-泰民族影响深远，至今我们依然能探寻这些古国留下的痕迹 [ 3 ] 。 由吉蔑人建立的扶南文化为婆罗门文化，扶南国的开国之君便为婆罗门教徒，扶南从建立之初便受婆罗门统治。傣-泰民族医疗在这一时期汲取了印度传统医学阿育吠陀(Ayurveda)的精髓，如今也可从傣-泰医学中“四塔”(风、火、土、水四元素)理论中看到阿育吠陀“五元素”(风、火、土、水、以太)的影子。 扶南之后，由孟人建立的堕罗钵底文化中心在如今看来位于泰国。其以佛教文化为源头，沿袭金地国上座部佛教信仰，糅合大乘佛教与婆罗门文化，形成了极具民族色彩的文化，成为构成现代泰国民族文化的重要基石 [ 3 ] 。后继者三佛齐文化又为当时大乘佛教的中心。这两个文化之中佛教之兴盛，应为当今泰国“佛国”一说之源头。在佛教的影响之下，傣-泰民族医学接收其“五蕴”学说，以解释人精神活动规律与身心关系，成为泰傣民族医学的基础理论。 同时，在前素可泰时期中，各王朝与古代中国各朝代均有来往。中原的药材与东南亚的药材通过朝贡体系与贸易交互流动，两地的医药知识的流传往来在此时已有迹可循。南宋末年，一部分潮州人拥宋抗元，失败之后逃居泰国，这是第一批有规模地移居泰国的华人，其中有些人通晓医药，中医学作为独立的体系开始在泰国流传 [ 4 ] 。 3) 素可泰时期(AC1238~1377) 素可泰王朝的建立被视为泰国文化真正成型的起点。在这一时期之中，傣-泰地区中傣-泰医学、孟医学、印度医学以及中医学并存，不同的医学传统之间相互交流、沟通、借鉴。泰可泰王朝的统治者为摆脱柬埔寨的统治与影响，积极与印度和斯里兰卡交好，大力扶持上座部佛教，将其定位泰国国教。得利于南传佛教的影响，傣-泰民族医学知识被用巴利文记载进入佛经之中。至兰甘亨国王一代，泰语创立，泰国书面文字诞生，医学知识又被刻入碑铭之中得以世代流传。根据兰甘亨石碑的记载，当时已有规模较大的药园出现以为医者提供药材 [ 5 ] 。 素可泰时期，中与泰关系密切。元曾四度遣使入泰，两国间贸易往来频繁，中国也向泰可泰传授了多方面的知识与技艺，其中包括医疗知识的输入。 4) 阿瑜陀耶时期(AC1350~1767) 与素可泰时期相比，阿瑜陀耶王朝与中国交流更加频繁。明朝的朝贡贸易空前繁盛，两地的贸易与文化交流吸引了大量华人进入傣-泰地区经商、定居。华侨在市集出售药品，中医草药、针灸、太极拳等与傣-泰医药结合成为当地百姓重要的治疗、保健手段之一。中国医生进入王廷，成为国王御医。可见中医对于傣医影响之大，通过对现代傣-泰医学的理论研究分析，能在傣-泰医学的药学、诊断学中发现不少中医的烙印。 阿瑜陀耶时期的一方面持续地吸纳外来文化，一方面更加注重外来文化与本土文化的整合，傣-泰民族的文化主体性愈发凸显。傣-泰医生们将中、印、傣-泰三者的医疗知识糅合成为独立的傣-泰医学体系。在此期间，凝聚了傣-泰医生集体智慧的《纳耐处方集》问世。然而泰缅战争中不少存有医疗知识的贝叶经与教科书被毁，仅有23种药物的记载存留。 5) 曼谷王朝(AC1782~) 在皇室的扶持与指导之下，傣-泰民族医疗逐渐复兴：拉马一世期间有两部本草著作问世；拉玛二世期间则大力搜罗药方以补充泰缅战争中流失的泰医药文献；拉玛三世命令将1000多个药物处方刻在大理石碑上，并镶在佛寺中主要建筑物的墙壁上，佛寺内也大量种植药用植物 [ 5 ] 。 拉玛四世是近代泰国文化的先行者。为应对西方强国在东南亚进行殖民渗透的严重危机，他提倡西方文化与现代科学。在西方文化的强势进入与统治者对西方文化的提倡的双重作用之下，西医进入泰国并在开始在泰国盛行。至拉玛五世，西医在泰国生根发芽的同时，传统民族医学也在发展。1888年，泰国第一所西医医院Siriraj医院建立。该院由现代医学和传统医学两部分组成，传统医学被列入三年的医学教程之中 [ 5 ] 。1907年，泰国历史上第一部药典《Tumra Peatsar Sonkhrau Chabub Laung》问世。拉玛七世时，传统医学在法律意义上获得认可，民族医疗知识与传统草药在二战药品短缺时期发挥极大作用。 然而现代医学的冲击力是巨大的。20世纪之后，傣-泰传统医学已有式微之态，西医医生数量的增加与西药的普及使得西医在城市地区几乎完全取代了传统的医疗方式，傣-泰民族医学退居乡村地区。进入20世纪末21世纪初，泰、中政府意识到“多元医疗模式”的重要性，随即开始大力扶持傣-泰民间医疗，促进傣-泰医学、傣-泰药学、傣-泰推拿等的发展，但其用生化医学(biomedicine)的模式来解构、改造民族医学使之符合现代标准的扶持策略仍值得商榷。 从傣-泰民族医疗的发展历程来看，傣-泰民族医学生根在泰傣民族史前时期，在它的生长过程之中，先后汲取了印度阿育吠陀医学、佛教理论以及中医学的养分，在素可泰时期初成体系，在阿瑜陀耶时期初具规模，在近代达到顶峰，又受西医冲击而转而式微。从历史发展可见其古老，但和印度医学、中医学相比，它又是一个年轻的医学体系，不似前两者之完备，因此在其理论体系与治疗方法之中能见到大量的印度医学、佛学、中医学与巫术、仪式治疗的影子。鉴于此，在下一节中，笔者会在介绍傣-泰民族医疗理论与治疗方法的同时，将其与印度阿育吠陀、佛教理论以及中医相对比，以求能更为全面地了解傣医。
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user: 4. 作为“具体性的科学”的傣-泰民族医学 傣-泰民族的先民们在史前时代“尝遍百草”，从而形成了关于植物的一套分类体系，逐渐发展出了草药学；在“万物有灵”的观念之下，又形成了一套巫术与仪式体系，一面“药解”，一面“神解”，使得仪式治疗诞生。这从无至有的发展，按照列维-斯特劳斯的观点，是由一种“真正的科学态度”、“一种为了求知的喜悦而追求知识的愿望”所推动，“因为只有一小部分观察和实验(应当认为它们主要是被求知欲激起的)才能产生实际的、直接有用的结果 [ 18 ] 。 进入有史时代，傣-泰民族族人如同“修补匠”一般，将来自于印度文化的“阿育吠陀”医术、佛教的“五蕴”观念、以及中医学的辨证方法、诊断方法与药物分类方法收集、拼接、整合起来，缝补到傣-泰民族原始医学的主干之上，形成一套独特的傣-泰民族医疗体系。这套体系不仅仅局限于“生理的医学”：“四塔五蕴”中体现的“身心一体”、“天人同一”的观念，仪式治疗有整合患者意识、引导患者情绪发泄的功能，以及佛教仪式治疗对戒毒的功效，使得傣-泰医学包容了“生理的医学”、“心理的医学”以及“社会的医学”这三个方面，其内蕴之丰富非生化医学所能比拟。 然而20世纪以来，生化医学(也就是通常所说的“现代医学”或“西医”)凭借其“科学性”在医疗领域之中占据了霸主地位，“医疗科学化”成为了现代国家在医疗层面上的一种“政治正确”，民族医疗逐步边缘化，退居乡村，成为一种“风俗”甚或是“野趣”，其“猎奇价值”甚至超出了医疗价值，更别说作为“专业医疗”抛头露面。即便是在将中医学定位“专业医疗”的中国，也是使用“中医科学化”的手段来为中医谋得合法地位。20世纪后期，大力发展泰医的泰国政府，也未能走出“泰医科学化”的套路。用科学的利刃将民族医学解构之后再重构的方法，表面上让民族医疗得以“复兴”，但实质上使得民族医疗体系支离破碎，难以作为一个整体发挥效用，沦为生化医学的附庸。这种看似理性的“科学化”的手段，背后隐含着“科学中心主义”的优越感与民族医学、传统医学为谋生路的无奈。 而民族医学，按照列维-斯特劳斯的理解，又何尝不是一种“具体的科学”呢？傣-泰民族医疗文化中的巫术思维、神话思维分类体系以及傣-泰族人对“修补术”的应用，体现的是一套与科学不同的、获取知识的平行的方式，是人类打量、思考自然的另一种角度与方式。它们的主要价值就在于把那些曾经(无疑目前仍然如此)恰恰适用于某一类型的发现的观察与反省方式，一直保存至今日。它与科学在实用的结果上完全不同，但它并不因此就使其科学性减色，因而也并不为其结果的真实性减色。在万年之前，它们就被证实，并将永远作为我们文明的基础 [ 18 ] 。 在文化变迁之下，傣-泰民族医疗文化将走向何方？是被逆涵化成为生化医学一部分？还是像历史中那样，再将生化医学“修补”进入自己的体系之内？这值得我们继续关注。
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user: 摘 要 测试AGCU Database Y30试剂盒的六色荧光标记复合PCR检测体系，评估其技术指标及在法医学的应用价值。采集300份无关男性样本，对AGCU Database Y30试剂盒性能(灵敏度、稳定性、准确性、种属特异性，对男女混合样本、常见普通检材样本及建库样本的扩增能力)进行测试。该试剂盒检测样本准确，且灵敏度较高，最小检出量为0.125 ng；同一来源不同载体样本具有同一性、种属特异性高、抗抑制性效果良好，女性DNA或其他男性DNA存在下(19:1)仍然分型准确，且在不同批次试剂间结果稳定，对于血液痕迹、唾液、骨骼等不同常见检材样本的检测结果具有一致性，不同PCR环境均可获得完整分型。AGCU Database Y30试剂盒可应用于法庭科学实际检案与建库实验。 关键词 :Y-STR，法医遗传学，复合PCR，六色荧光标记，AGCU Database Y30 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 司法鉴定及案件排查中，Y染色体的STR检验已成为常规手段。Y染色体是呈父系遗传、单倍型及连锁遗传的染色体，为男性特有，在亲权鉴定及家系案件排查中发挥重要作用 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] 。目前，主流的Y-STR商品化检测试剂盒很多，如Yfiler (ABI)、Yfiler Plus (ABI)、DNATyper Y21 (公安部二所)、Powerplex Y23 (Promega)、AGCU Y24 (中德美联)等，但它们检测的基因座数目在17~27个之间，有的试剂盒引入了3~7个快速突变的基因座位点。而Y-STR快速突变的基因座的突变率过高，达到1 × 10 − 2 以上，虽然在某种程度上提升了Y-STR的个体识别能力(Discrimination power， DP) [ 5 ] ，但是并不适合家系搜索，不利于刑侦案件的排查。而AGCU Database Y30试剂盒是由30个突变率低的Y-STR基因座位点组成的6色荧光复合扩增体系，低突变基因座组成的单倍型具有更好的家族谱系代表性，更加有利于Y-STR DNA数据库建设、案件侦破、法庭证据及亲权鉴定，降低了同系异型的风险 [ 6 ] [ 7 ] 。 本文根据SWGDAM和GA/T815-2009的具体要求，对AGCU Database Y30试剂盒的准确性、一致性、灵敏度、特异性、抗抑制性、同一性和混合样本进行检测评价。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 样本 随机抽取本实验室日常案件的无关男性血液样本300份，无关女性血样20份，包括各类常见检材若干份，如血液痕迹、骨骼、唾液斑等DNA提取样本。购自农贸市场的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼、鼠、兔血用于种属特异性检测。 2.2. 主要试剂与仪器 扩增试剂：AGCU Database Y30试剂盒；扩增仪：9700型PCR仪(美国ABI公司)；遗传分析仪：3130xl遗传分析仪(美国ABI公司)；DNA标准品：9948及007(男性DNA)，9947A(女性DNA)；血红素、靛蓝、腐植酸、钙离子、血红蛋白和EDTA等抑制剂均使用sdH 2 O进行稀释。 2.3. 测试方法 2.3.1. 准确性与一致性测试 Control DNA 9948准确性测试：选取Database Y30试剂盒内的Control DNA 9948，根据试剂盒的说明要求，配制25 µL和10 µL扩增体系，进行三次平行检测，与说明书上的阳性分型进行比较。 样本一致性测试：选取20份无关男性样本，根据试剂盒的说明要求，用Database Y30进行检测；同样的20份无关男性样本，用AB公司的Y filer或Y filer plus试剂盒进行重复位点验证(10 µL扩增体系)。 2.3.2. 灵敏度测试 取Control DNA 9948和Control 007标准品，用超纯水分别稀释至1.0 ng/µL、0.5 ng/µL、0.25 ng/µL、0.125 ng/µL、0.1 ng/µL、0.05 ng/µL，扩增体系为25 µL，每个浓度重复扩增三次，统计两种标准品各个基因座的检出情况。 2.3.3. 同一性测试 选取同一来源不同载体上的样本，如FTA血卡、FTA唾液卡、汗斑、毛发、肌肉组织、肋软骨等样本；根据试剂盒的说明要求，配制10 µL扩增体系，进行扩增、电泳检测，分析其等位基因检出情况。 2.3.4. 稳定性测试 AGCU Database Y30试剂盒扩增前组份反复冻融5次和10次，对照组一直存放在−20˚C，根据试剂盒的说明要求，配制25 µL扩增体系，进行扩增、电泳检测，分析不同条件下，其分型结果有无明显差异。 2.3.5. 抗抑制测试 向标准品1 ng Control DNA 9948中加入选取的血红素、靛蓝、腐植酸、钙离子、血红蛋白和EDTA等抑制剂，制备模板(表1)。根据试剂盒的说明要求，配制25 µL扩增体系，分析其等位基因检出情况。 2.3.6. 特异性测试 种属特异性测试：选取猪、狗、牛、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA，按照Database Y30试剂盒说明书，配制10 µL扩增体系，进行扩增、电泳检测，分析其有无出峰情况。 Table 1 Concentration of inhibitor in templat 抑制剂 抑制物浓度 血红素 25 μM 50 μM 75 μM 100 μM 125 μM 靛蓝 10 μM 12 μM 14 μM 16 μM 18 μM 腐植酸 40 μg/µL 50 μg/µL 60 μg/µL 70 μg/µL 80 μg/µL Ca 2+ 0.5 μM 0.75 μM 1.0 μM 1.5 μM 2.0 μM 血红蛋白 20 μM 30 μM 40 μM 50 μM 60 μM EDTA 500 μM 750 μM 1000 μM 1500 μM 2000 μM 表1. 模板中抑制物浓度 性别特异性测试：选取20例女性无关个体血样，用本实验室常用的提取试剂盒提取DNA；按照Database Y30试剂盒说明书，配制10 µL扩增体系，进行扩增、电泳检测，分析其有无出峰情况。 2.3.7. 混合样本测试 男/男混合样品测试：取Control DNA 9948与Control 007标准品，在两者浓度比1:1、1:4、1:9、1:19、1:29的比例混合，进行PCR扩增和DNA分型检测，每种混合比例进行三次平行试验。 男/女混合样品测试：取Control DNA 9948 (男性DNA)与Control 9947A (女性DNA)标准品，在两者浓度比1:1、1:4、1:9、1:19、1:29的比例混合，进行PCR扩增和DNA分型检测，每种混合比例进行三次平行试验。 2.3.8. PCR环境测试 分别采用10 μL、25 μL扩增体系，采用l×、2×引物量，对l ng Control DNA 9948标准品分别进行检验并重复3次；设置退火温度为56˚C、57˚C、58˚C、59˚C、60˚C、61˚C、62˚C、63˚C；热循环次数为29、30次，对同一样品分别进行检验并重复3次。
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user: 3. 测试结果 3.1. 准确性与一致性 以Control DNA 9948、滤纸、FTA卡为扩增模板，进行反复多次扩增，更换实验仪器，与对照比较，扩增效率无明显差异，分型结果稳定、图谱完整清晰，未见明显非特异性峰。与AmpFISTR®Yfiler plus®试剂盒在共有基因座上分型结果完全相同(图1)，说明该试剂盒具有良好的准确性与一致性。 3.2. 灵敏度 将6种浓度的标准品9948和007分别检测，检验结果发现，当模板含量低至0.125 ng时，所有基因座的等位基因均能被检测到，如图2所示；而当模板含量降至0.10 ng时，D12S391、DYS635、DYS389II、DYS390、Y_GATA_H4和DYS392等六个基因座的等位基因峰高过低；进一步降低模板含量至0.05 ng时，AGCU Database Y30系统80%的等位基因未被检出。所以本试剂盒可有效检测样本的灵敏度为0.125 ng。 3.3. 同一性 实验结果发现，同一来源的血斑、唾液斑、汗液、毛发等样本DNA分型结果均具有同一性(图3)，表明该试剂盒能够准确判断基因型。对不同的样本种类，如FTA卡(博坤)、FTA卡(国产)唾液卡、提取样本、Control DNA 9948均适用。 3.4. 稳定性 试剂盒成分稳定性测试发现，如图4所示，将试剂盒组分反复冻融10次，在第10次时进行PCR扩增及电泳检测，分析结果发现，不同载体样本(FTA卡与滤纸)与对照阳性比较，扩增效率无明显差异。 3.5. 抗抑制剂测试 通过抗抑制剂测试发现，当标准品加入浓度为50 μmol/L和75 μmol/L的血红素，仍可获得完整分型；血红素浓度大于75 μmol/L时，则只能获得部分基因座分型，且随着浓度增加，获得的基因座逐渐减少。相比其他试剂盒，本试剂对血红素具有较高的耐受性。扩增体系可耐受的抑制剂浓度见表2。 图1. 准确性测试结果(a)：AGCU Database Y30试剂盒；(b)：Yfiler Plus试剂盒 图2. 灵敏度测试结果(0.125 ng 9948) 图3. 同一性测试结果 图4. 冻融10次的分型图谱 Table 2 Inhibitor concentrations tolerance of AGCU Y30 ki 抑制剂 血红素 靛蓝 腐殖酸 Ca 2+ 血红蛋白 EDTA 浓度 ≤75 μM ≤14 mM ≤60 μg/mL ≤1 mM ≤40 μM ≤1 mM 表2. 扩增试剂可耐受抑制剂浓度 3.6. 特异性 对本研究选择的样本如猪、牛、狗、猫、鸡、鸭、兔、鱼、鼠和大肠杆菌DNA进行检验，在分型范围内，除阳性对照，不出现特异的DNA分型。说明该试剂盒具有种属特异性。检测20例女性无关个体血样，结果发现无出峰情况(图5)。说明该试剂盒具有良好的性别特异性。 3.7. 混合样本检测效果 混合样本实验结果显示当模板总量为1.25 ng，Control DNA 9948与Control DNA 9947A及Control DNA 007的混合比例均为1:19时，能够准确检出ControlDNA 9948的每个基因座的基因分型。实验结果 图5. 特异性测试结果 如图6和图7所示。 3.8. PCR环境测试结果 扩增体系与引物量：不同体系扩增检测结果如图8所示，25 μL和10 μL扩增体系检测中，等位基因分型一致，未出现等位基因丢失及非特异性峰，峰高无明显差异。分别用1×、2×引物量进行扩增时，分型结果一致，未出现等位基因丢失及非特异性峰。 退火温度与循环次数：由结果可知，无论是以FTA卡还是滤纸为载体，59˚C退火温度下，扩增29个循环分型结果一致(如图9、图10)。63˚C时，等位基因分型出现不均衡现象，部分等位基因峰值低于100。
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user: 4. 讨论 综上对AGCU Database Y30试剂盒进行的技术指标及性能评价，结果证明，该试剂盒能够准确分型，且检出成功率高，在男女混合样本中(女:男 = 19:1)仍然能够准确检测分型，同时具有较好的种属特异性。并且该试剂盒符合DNA检测试剂的标准，可适用于不同检材。此外，由于采用直接扩增，可省去DNA提取部分，缩短操作时间，简化操作流程，并降低样品污染几率。 我们的法庭科学DNA数据库自建立以来，已在公安实际检案中发挥了重要作用。由于各类犯罪案件中，男性居多，在DNA数据库中增加男性家系的Y染色体的遗传特性及比对功能，将会进一步拓展DNA数据库的功能。Yfiler、Yfiler Plus、Powerplex Y23等试剂盒主要以欧美人为主进行基因座选择，而且加 图6. 男/女混合样本测试结果(9948: 9947A = 1:19) 图7. 男/男混合样本测试结果(9948:007 = 1:19) 图8. 25 μL和10 μL扩增体系测试结果 入了3~7个快速突变的基因座位点 [ 8 ] 。快速突变的基因座在某种程度上提高了个体识别能力，以及同一父系遗传男性个体间的区分能力 [ 5 ] ，但是削弱了Y染色体遗传的应用价值。 本研究采用毛细管电泳的方式检测Y-STR位点，检测位点多，且简便易行；而新一代测序检测方式还未普及，测序繁琐且昂贵。AGCU Database Y30试剂盒采用六色荧光检测技术，实现了30个Y-STR基因座在同一管内的复合扩增、检测。筛选了中国人群的低突变率的基因座，其单倍型具有更好的家族谱系代表性，更加有利于中国人群的Y-STR DNA数据库建设及案件侦破 [ 9 ] 。Database Y30试剂盒中，各基因座的分布及荧光标记类型见表3。分型标准物(Allelic Ladder)包括了中国人群Y-STR中常见的等位基因，检测结果见图11。由图11可见，各位点分型清晰，且峰高均衡。综上，本文测试结果证明，AGCU 图9. FTA卡在59˚C退火温度下的分型 图10. FTA卡在63˚C退火温度下的分型图谱 图11. Database Y30试剂盒中分型标准物(Allelic Ladder)检测结果 Table 3 The loci distribution of Database Y30 ki 荧光标记颜色 FAM (蓝) HEX (绿) TAMRA (黄) ROX (红) VIG (紫) DYS392 DYS391 DYS481 DYS393 DYS549 DYS389I DYS456 DYS437 Y_GATA_H4 DYS557 DYS447 DYS19 DYS390 DYS439 DYS520 DYS389II DYS388 DYS460 DYS635 DYS438 DYS448 DYS533 DYS444 DYS527a/b DYS385a/b DYS458 DYS643 DYS522 表3. Database Y30试剂盒中基因座分布 Database Y30试剂盒在Y染色体数据库建设及实际案件排查中具有良好的应用前景。
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user: 摘 要 目的：对比双侧全膝关节置换(total knee arthroplasty， TKA)术中运用关节腔周围注射鸡尾酒与股神经阻滞的镇痛效果。方法：选取2015年1月至2017年10月，我院收治的20例行双侧TKA的患者(40膝)，其中男6例，女14例；年龄50~78岁，平均63岁。对双膝随机进行镇痛，一侧使用膝关节腔鸡尾酒注射，一侧使用股神经阻滞，术后常规镇痛，肌注帕瑞昔布钠(40 mg，2次/天)，2天后改为口服塞来昔布(0.2 g，2次/天)，记录术后72 h内疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale， VAS) (1~10分)、手术时间、出血量、出院时膝关节活动度、住院时间等指标，并运用t检验及χ2检验统计分析。结果：20例40膝例均获6周随访，术后24 h VAS评分：试验组(3.0 ± 1.2)分，小于对照组的(4.4 ± 1.5)分，差异有统计学意义(P < 0.05)，关节活动度术后1周实验组(100˚ ± 8˚)，对照组(90˚ ± 10˚)，差异有统计学意义(P < 0.05)；而手术时间、出血量、术后6周关节活动度差异无统计学意义。结论：TKA应用关节腔周围注射鸡尾酒术后镇痛效果更佳，不显著延长手术时间，术后早期关节活动度更大。 关键词 :膝关节，关节成形术，置换，膝，鸡尾酒 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 TKA治疗终末期膝关节炎取得了满意效果，但是术后早期的疼痛不可忽视。临床镇痛模式多样，以股神经阻滞和关节腔注射鸡尾酒较为普遍。本研究对20例40膝双侧全膝置换术患者，双膝随机进行鸡尾酒及股神经阻滞镇痛，报道如下。
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user: 2. 资料与方法 一、一般资料 2015年1月至2017年10月，我院收治的20例行双侧TKA的患者(40膝)，均采用全身麻醉，手术由同一组医生完成，随机进行双膝鸡尾酒、股神经阻滞镇痛，两组所用假体均为后稳定型假体。 二、手术操作、围术期处理及术后镇痛方案 1) 手术方法：患者均采用全身麻醉，双膝分次手术，取仰卧位，常规使用止血带(压力50 kPa)，采用髌旁内侧入路，切开关节囊后，先切除髌骨骨赘，依次切除内外侧半月板及前后交叉韧带，行胫骨髓截骨并测量胫骨平台大小，再行股骨截骨并测量股骨髁大小，四合一截骨完成后，行髁间窝截骨，予相应大小试模测试，假体及力线满意后取下试模，脉压冲洗枪持续冲洗1000 ml，调骨水泥，先安装平台假体，再安装股骨髁假体，最后安装聚乙烯垫片，复位膝关节，伸直位至骨水泥完全硬化，期间可行髌骨去神经化处理并进一步修整髌骨关节面，松止血带，彻底止血，留置负压引流管，缝合关节囊，缝合皮下组织，关闭切口。一侧手术完成后再行另一侧手术。 2) 围术期处理：术后8 h予速碧林1支qd皮下注射抗凝，使用一代头孢预防感染，使用时间不超过48小时；术后第1天行CPM训练，主动直腿抬高锻炼，视患者恢复情况行助行器辅助下床锻炼；常规行踝泵锻炼。 3) 鸡尾酒配方：1%罗哌卡因(300 mg)、吗啡(2.5 mg)、肾上腺素(10滴，约0.25 ml)、氨甲环酸(2 g)、德宝松1 ml，总量约80 ml，于截骨后、安装假体后行关节腔周围注射鸡尾酒约30 ml，缝皮后经负压引流管灌注剩余药物约50 ml，夹管，至术后6小时恢复引流，术后均使用肌注帕瑞昔布钠(40 mg，2次/天)，2天后改为口服塞来昔布(200 mg， BID)，疼痛仍较重可加用曲马多缓释片1片。 4) 股神经阻滞：术后由麻醉医生于B超引导下予罗哌卡因进行股神经阻滞。 四、数据收集 收集两侧关节置换手术时间，出血量，采用疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale， VAS) (1~10分)评估术后第1天、第3天疼痛程度，出院时记录膝关节ROM。 五、统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组数据采用配对t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
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user: 3. 结果 20例患者全部获6周随访，无感染、深静脉血栓、股神经损伤、假体早期松动等并发症。两组的手术时间、出血量无统计学意义(P > 0.05)；术后第1天两组VAS评分差异有统计学意义(P < 0.05)。术后第3天时两组疼痛评分差异无统计学意义(P > 0.05)。两组患者出院前的关节活动度差异无统计学意义(P > 0.05) (表1)。
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user: 4. 讨论 目前骨关节炎患者的数量日益增多，其总患病率约为15%，60岁以上人群的患病率为50% [ 1 ] 。终末期膝关节骨关节炎患者多因疼痛无法忍受而进行膝关节置换手术 [ 2 ] 。随着无痛病房理念的推广，围手术期镇痛尤为重要。膝关节置换手术本身存在骨和软组织创伤，所有在术后早期可能存在较术前更明显的疼痛，引起患者的恐惧及满意度降低。已有大量报道术中行膝关节鸡尾酒注射可能有效缓解疼痛 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] 。研究表明，在合适的患者应用正确的“鸡尾酒”关节周围注药方案会产生最好的镇痛效果且不良 Table 1 Comparison of surgical effects between the two group 项目 鸡尾酒组 股神经阻滞组 P值 手术时间(min) 110.9 ± 4.7 107.7 ± 5.1 0.63 出血量(ml) 104.3 105.6 0.75 VAS评分 术后第一天 2.7 ± 1.2 4.5 ± 1.5 0.003 术后第三天 2.61 ± 1.4 2.87 ± 1.6 0.68 关节活动度术后1周 100 ± 8 90 ± 10 0.002 关节活动度术后6周 110.8 ± 10.2 109.5 ± 10.4 0.69 表1. 两组手术效果比较 其中，术后第一天，术后1周关节活动度差异有统计意义，P < 0.05。 反应最小 [ 7 ] 。但研究多为单侧膝关节手术，存在个体差异的偏倚。本研究为同一患者双膝置换患者，一侧行鸡尾酒注射，而另一侧使用股神经阻滞，尽量避免了因个体的痛阈、体重、基础疾病等差异。鸡尾酒配方在文献报道中有很多种 [ 8 ]，主要包含吗啡、罗哌卡因、去甲肾上腺素、类固醇激素等药物，以减轻手术后疼痛和局部炎症。已经有研究发现在鸡尾酒中加入激素可以明显降低患者局部和全身炎性反应的同时，明显减轻TKA术后患者疼痛，加快患者的康复 [ 9 ] 。本研究20膝均使用了德宝松这一激素药物，术后未发生感染病例。本研究中鸡尾酒中加入了氨甲环酸，目的在于减少手术失血及关节腔积血。已有大量文献报道了其有效性及安全性 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] 。 TKA围术期采用的多模式镇痛方案各有不同，但是超前镇痛作为疼痛管理的重要组成部分，作用不容忽视 [ 13 ] 。Aasvang EK [ 14 ] 却认为研究表明，术前使用阿片类药物会增加术后疼痛，降低术后满意度。股神经阻滞目前亦为较普遍的镇痛模式，但其存在股神经损伤风险，且镇痛效果与麻醉医生的股神经穿刺经验密切相关。本研究采用同一病人双膝随机对照，故可避免药物的干扰。虽然多项研究认为“鸡尾酒”配方局麻药与常规镇痛治疗TKA术后疼痛，两者术后关节活动度相似 [ 15 ] 。但本研究发现同一病人双膝比较，鸡尾酒镇痛侧膝关节活动度明显好于对侧，可能与疼痛改善更明显有关。“鸡尾酒”配方药物多为膝关节周围局部给药，多数学者主张全覆盖注射，即于手术前后向膝关节囊后壁、内外侧副韧带、股四头肌肌腱、髌腱、髌下脂肪垫、骨膜下及皮下组织中多点注射“鸡尾酒”镇痛药物混合液 [ 16 ] [ 17 ] 。本研究行鸡尾酒注射时位置基本与上述相同。但笔者认为术前MRI有益于明确膝关节炎症部位及炎症程度，从而可以有计划的分配注射部位的药物剂量，膝关节切口关闭后通过关节腔的药物灌注即可以增加关节腔压力达到止血，也可以通过药物的药理作用达到止血止痛，效果更佳。
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user: 摘 要 以银耳干品为实验材料，研究了超声提取法对银耳多糖提取效率的影响。通过考察料液比、温度及提取时间对银耳多糖提取率的影响，发现在料液比为1:40，温度为60˚C，提取时间为30 min为最佳提取条件。以2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为自由基模型，考察了银耳多糖的抗氧化性能。结果表明，该法提取的银耳多糖具有明显的抗氧化能力。 关键词 :银耳多糖，超声提取，抗氧化 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 银耳，是一种胶质真菌，素以肉质厚、胶质重、口感好、营养丰富、药用价值高而闻名于世 [ 1 ] 。银耳的药用记录始见于陶弘景所著《名医别录》，后来的《神农本草经》、《本草纲目》及《中国药学大辞典》均记载了银耳的功效 [ 2 ] 。银耳多糖占银耳干重的60%以上。银耳多糖的药用功效主要在于加强机体免疫力，抑制肿瘤，降血压降血脂。 曲萌等人研究发现，银耳多糖能激活和提高细胞因子和淋巴细胞的抗肿瘤作用，并且在用药期间对身体内的主要内脏器官无明显的形态学的变化 [ 3 ] 。韩英等人研究证实了银耳多糖能较好的抑制肿瘤细胞的增殖 [ 4 ] 。过量的自由基可以诱导细胞走向衰老和凋亡。抗氧化就是抑制自由基活动，银耳多糖就有良好的抗氧化作用，周萍等通过比对多种多糖，在体外进行自由基清除的实验发现银耳多糖有较强的抗氧化能力 [ 5 ] 。早在之前薛惟建等人研究了银耳多糖调节血糖的作用，结果表明了银耳多糖能调节血糖的含量 [ 6 ] 。田春雨等人通过对用链脲佐菌素和高能量饲料喂养的大鼠进行研究，得出结论：模型大鼠的血糖、血脂有效地降低了 [ 7 ] 。此外韩英等人通过给小鼠的腹腔内注射银耳多糖，观察银耳多糖是否会使辐射小鼠损伤减少，结果表明银耳多糖对有辐射损伤的小鼠有保护作用 [ 8 ] 。 崔蕊静等人通过对比热水浸提、酶法浸提和碱浸提，发现提取效果最好的是酶法浸提，其次是碱浸提；提得银耳多糖最少的是水浸提法 [ 9 ] 。黄秀锦对比了酶法浸提和碱浸提，得出结论酶法浸提的效果是最好的，用果胶酶酶解制得银耳多糖效果较好 [ 10 ] 。用水提取银耳中多糖的方法操作简单，但是在提取过程中一些非糖物质被提出，后续粗多糖的分离纯化会变得不容易；利用酸碱浸提银耳中多糖的方法，可以提到的多糖中含有水法无法提到的多糖。要注意用酸法提取时多糖易酸解，用碱法时碱的用量可能会破坏多糖结构，会影响多糖的进一步研究；利用酶浸提银耳中多糖的方法，多糖提取量是最大的，杂质也是最少的，但是成本太高，只适用于实验室提取多糖、研究多糖结构 [ 11 ] 。提取出来的多糖要在工厂中大量生产，所以不能只考虑提取量，要综合比较多糖的提取方法，选出最适的方法，并不断地探究寻找更好的提取方案。 银耳多糖非常容易溶于水，采用水提法就能提取到银耳中所含的大多数的多糖，热水浸提法操作简单，容易实行并且成本低。但是水提法的缺点就是提取率低，何伟珍等人利用水煮法来提取银耳多糖，银耳粗多糖的提取率只有2.75% [ 12 ] 。为了得到更多的银耳多糖，可以在水浸提的基础上加上微波、超声等物理方法来辅助提取。微波是一种超高频电磁波，利用其在300 MHz~300 GHz之间的频率，吴琼等用微波辅助提取银耳中多糖的方法，提取率大都高于10%。微波加热，细胞内水分子吸收微波能，产生热量，终导致细胞破裂，减少了多糖类的残留，提高了提取率 [ 13 ] 。超声波的声波频率比20，000赫兹还高，超声波有着定向性、穿透性。银耳多糖的提取是利用超声波的空化效应，造成细胞瞬间破裂，有利于物质溶出，提高银耳多糖的提取率。周雅琳等人通过超声波辅助提取，观察银耳多糖的制得量，比较不同处理方式的影响，结果得出没有进行处理的银耳，粗多糖提取量低了22.48% [ 14 ] 。 本研究的对象是银耳子实体，根据超声波辅助水提的方法提取银耳多糖，通过单因素实验优化提取工艺，并且测量不同浓度的银耳多糖抗氧化能力。以希望优化银耳多糖的提取方法并为银耳多糖的开发利用提供参考。
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user: 2. 实验材料与方法 2.1. 实验材料与试剂 实验材料：银耳干样； 实验试剂：95%乙醇；1%葡萄糖：准确称取1 g葡萄糖，定容至100 mL，配制成10 mg/mL的葡萄糖溶液，备用；浓硫酸；5%苯酚溶液：准确称取5 g苯酚放入100 mL容量瓶定容，配制成5%苯酚溶液，避光低温保存待用；ABTS；过硫酸钾；PBS缓冲液(PH = 7.4)。 2.2. 实验主要仪器 万能粉碎机；60目筛；电热恒温鼓风干燥箱；电子天平；高速离心机；超声清洗仪；紫外分光光度计；旋转蒸发仪；循环水式多用真空泵。 2.3. 实验方法及步骤 2.3.1. 银耳多糖的提取 (一) 原料的预处理 银耳用自来水清洗干净，放入烘箱中，在50˚C下烘干至恒重，用粉碎机粉碎并且过60目筛，得到银耳粉末备用。 (二) 超声波提取银耳多糖预实验 按一定的料液比混匀，放入超声清洗仪，在温度为60˚C超声强度为40 kHz条件下立即超声20 min，4˚C，8000 rpm/min离心5 min，将上清液收集起来，加入4倍体积的95%乙醇，摇匀，放入4˚C冰箱，沉淀过夜(12~24 h)，然后于4˚C，10，000 rpm/min离心机中离心5 min，倒掉上清液，置于烘箱中，调节温度(50˚C ~60˚C)，烘干，加1 mL蒸馏水，得多糖原液。 (三) 标准曲线的绘制 将配制好浓度为10 mg/mL的葡萄糖溶液，分别取0 μl、50 μl、100 μl、150 μl、200 μl、250 μl、300 μl，加水补充至1 mL。浓度分别为0.0 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL，分别取100 μl于离心管中，加入5%的苯酚溶液100 μl，混匀，然后再加入0.5 mL浓硫酸，混匀，室温避光放置20 min后，在490 nm处测其吸光度。以加入葡萄糖浓度为横坐标，490 nm下吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。 2.3.2. 超声提取的单因素试验 1) 提取时间的确定：向各个蒸馏瓶中加2 g样品粉末80 mL蒸馏水(料液比1:40)，混合均匀，放于60˚C超声清洗仪中，立即超声提取，分别提取5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min后，4˚C，8000 rpm/min离心5 min，将上清液收集起来，加入4倍体积的95%乙醇，摇匀，放入4˚C冰箱，沉淀过夜(12~24 h)，然后于4˚C，10000 rpm/min离心机离心5 min，倒掉上清液，置于烘箱中，调节温度(50˚C~60˚C)，烘干，加1 mL蒸馏水，测其多糖得率。 2) 提取温度的确定：向各个蒸馏瓶中加2 g样品粉末和80 ml蒸馏水(料液比1:40)，混合均匀，分别置于40˚C、50˚C、60˚C、70˚C的超声清洗仪中，立即超声提取20 min后，4˚C，8000 rpm/min离心5 min，将上清液收集起来，加入4倍体积的95%乙醇，摇匀，放入4˚C冰箱，沉淀过夜(12~24 h)，然后于4˚C，10，000 rpm/min离心机离心5 min，倒掉上清液，置于烘箱中，调节温度(50˚C~60˚C)，烘干，加1 mL蒸馏水，测其多糖得率。 3) 料液比的确定：分别向各组锥形瓶中加入一定量的蒸馏水，使其料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，放入超声清洗仪，在温度为60˚C超声强度为40 kHz条件下立即超声20 min后，4˚C，8000 rpm/min离心5 min，将上清液收集起来，加入4倍体积95%乙醇，摇匀，放入4˚C冰箱，沉淀过夜(12~24 h)，然后于4˚C，10，000 rpm/min离心机离心5 min，倒掉上清液，置于烘箱中，调节温度(50˚C~60˚C)，烘干，加1 mL蒸馏水，测其多糖得率。 2.3.3. 银耳多糖抗氧化的实验 (一) 配制ABTS母液 试剂一：准确称取0.0384 g ABTS，定容至10 mL； 试剂二：准确称取0.0134 g过硫酸钾，定容至10 mL； 试剂一与试剂二等比例混合，避光16 h。 (二) 抗氧化的测定 使用PBS稀释母液至734 nm吸光度值为0.7左右，作为工作液，将制得的多糖储备液取200 μl，加800 μl的蒸馏水，配制成银耳多糖原液，分别稀释1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、0倍，取20 μl各样品加入工作液，用PBS缓冲液调零，在734 nm处测其吸光度，并且测量出各个浓度的多糖溶液的吸光度，观察银耳多糖的抗氧化性。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 葡萄糖的标准曲线 图1以葡萄糖溶液为标准品，绘制的标准曲线，回归方程为y = 0.8271x + 0.0421，R 2 = 0.9913。根据样品测定的吸光度值对照标准曲线回归方程计算银耳多糖浓度，算出多糖提取率。 3.2. 超声波提取的单因素试验结果 3.2.1. 提取时间 由图2可知，通过观察不同时间银耳多糖提取率，呈现了先增大后减小的趋势，当提取时间为40 min时，有最大的银耳多糖得率4.6%，由此可知银耳多糖的多糖得率并不是随着时间的增加而一直增加，当到40 min时达到最大值后，多糖得率开始下降，所以并不是提取时间越长，提取的多糖越多，由图可知超声提取最佳的提取时间在30~50 min之间。 3.2.2. 提取温度 由图3可知，银耳多糖的多糖得率随着温度的增加而增加，当到60˚C时多糖得率达到最大值4.0%，再随温度升高银耳多糖的得率开始小幅度的下降，所以当温度达到60˚C时，超声波破坏样品细胞最好，使用超声提取70˚C以上的温度不好控制，因此，银耳多糖超声提取的最佳温度控制在60˚C~70˚C之间。 3.2.3. 料液比 由图4可知，银耳多糖的得率随着料液比的增大呈现先增大后减少的趋势，当料液比为1:40时达到最大的多糖得率3.8%，之后料液比继续增大，多糖得率呈下降趋势。当料液比为1:40时，银耳中多糖的提取已经基本完全，再增大水量只会增加多糖的损失，减少多糖的得率，因此，超声提取银耳多糖的最佳料液比是1:40。 图1. 葡萄糖标准曲线 图2. 提取时间对多糖得率的影响 3.3. 银耳多糖的抗氧性 由图5可知，银耳多糖具有抗氧化性，随着稀释倍数的减小银耳多糖抗氧化能力增强。银耳多糖原液浓度为44.4 mg/mL，原液是具有最佳抗氧化性的。
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user: 4. 讨论与结论 4.1. 讨论 具有高生物活性的银耳多糖，在医药和保健品领域中得到越来越多的重视，其中，提取技术是大规模应用银耳多糖的关键。银耳多糖主要是酸性和中性多糖，用热水提取，可以得到大部分的多糖成分， 图3. 提取温度对多糖得率的影响 图4. 料液比对多糖得率的影响 超声处理可以在同一时间使细胞空泡化，增加细胞膜和细胞壁的通透性，从而多糖溶出，提高多糖率。 一般认为，水提取法温和、提取率较低，本实验采用了单因素分析法优化银耳多糖的提取条件，并辅以超声波处理，提取效果好。优化方法后，提取率相对较高，但相比于与碱提取法和酶水解法，还存在一定的差距，要根据多糖的保留和成本预算情况的实际应用需要，择优选择。 4.2. 结论 通过单因素试验，研究了银耳多糖提取时间、提取温度和料液比对提取效果的影响，在此基础上，确定了超声提取方法优化的提取条件：提取时间40 min，提取温度65˚C，料液比1:40，在此条件下得到的银耳多糖的多糖得率为5.1%。通过用过硫酸钾作为氧化剂、ABTS作显色剂，得到银耳多糖具有抗氧化性。 图5. 银耳多糖浓度对抗氧化的影响
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user: 摘 要 人博卡病毒1型(human bocavirus 1， HBoV1)是全球流行的重要呼吸道病毒，对其的研究尚处于初期阶段。本研究针对HBoV1的VP1独特区(VP1u)通过原核表达的方式进行蛋白表达，并通过纯化、免疫小鼠成功获得了蛋白的抗体血清，通过ELISA评价了抗体对相应蛋白及临床病毒阳性样品的效价，并在后者发现制备抗体在1:50稀释时A450对阴性对照有4倍升高。利用所制备的抗体成功用于HBoV1广州株(GU338055)反向遗传系统的VP1u的免疫荧光研究中。本研究成功制备了HBoV1抗原VP1u抗体并应用，为HBoV1后续深入研究提供了重要的工具，具有重要意义。 关键词 :人博卡病毒1型，VP1u，抗体，免疫荧光 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 人博卡病毒1型(Human bocavirus 1， HBoV1)，是Allander等人于2005年首次发现，归属于细小病毒科，细小病毒亚科，博卡病毒属 [ 1 ] 。HBoV1后被证实是一种全球流行的重要呼吸道病原体，感染呼吸道可引起上、下呼吸道感染，并常与其他病原体产生共感染 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] 。HBoV1本身是一种体积较小、具有二十面体衣壳、无包膜的单链线性DNA病毒，病毒粒子直径约为26 nm。目前仅有一例HBoV1完整基因组被测序，其长度为5543 nt (JQ923422)，其基因组序列、转录谱和表达谱分析表明，其至少表达两种衣壳蛋白：VP1和VP2；两种非结构蛋白NS1和NP1。其中VP1、VP2分别有672aa、542aa，具有典型的基因重叠区，其中VP1-N端为非重叠区，长度为129aa，即VP1独特区(VP1-unique， VP1u)、后面为两个衣壳蛋白的重叠区(VP1/2)，长度542aa，序列完全相同 [ 1 ] [ 5 ] [ 6 ] 。HBoV1由于其感染具有很强组织特异性，有文献报道其与AAV2/HBoV1形成的嵌合病毒有作为肺囊性纤维化(cysticfibrosis， CF)基因治疗载体的潜质 [ 7 ] [ 8 ] 。研究表明HBoV1的VP2可独立形成病毒样颗粒(Virus-like particles， VLP) [ 9 ] ，而HBoV1的VP1u区有磷脂酶A2样活性(Phospholipase A2-like activity)，可以破坏细胞紧密连接 [ 10 ] [ 11 ] ，可见VP1u在HBoV1的感染和组织特异性方面可能都起到重要的作用。 为进一步对HBoV1进行深入研究，本研究针对VP1u区进行原核表达、纯化并通过免疫小鼠获得其抗体，为后续HBoV1感染研究奠定基础。
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user: 2. 材料与方法 2.1. HBoV广州株VP1u片段扩增 1) 主要抗原片段PCR引物设计 本研究针对前期获得的来源于60岁女性肺炎患者的HBoV1广州株(Access number: GU338055)进行抗原VP1u (aa 1–129)片段PCR引物设计，产物长度390 bp。 其中正向引物VP1u-gst-SalIF为5’-AAAGTCGACATGCCTCCAATTAAGAGACAGCCTA-3’； 反向引物VP1u-gst-NotIR为5’-AAAGCGGCCGCTTATGAGGTTCCTGGTTTAGGTTCACTC-3’。 2) 扩增条件：使用HBoV1广州株(Access number: GU338055)构建的反向遗传系统全长质粒(pHBoV-S2)作为模板，使用PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 25 μl体系(Takara)对VP1u目标片段进行扩增反应 反应条件如下：预变性94˚C 5 min；循环条件(30×)：98˚C 10 sec、55˚C 15 sec、72˚C 30 sec；延伸温度72˚C 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测2 μl扩增产物。 3) 扩增产物纯化：使用Axygen® AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行目标DNA的凝胶回收及纯化。 2.2. 原核表达载体构建、蛋白表达及纯化 2.2.1. 利用pGEX-4T-3质粒构建HBoV1 VP1u原核表达载体pGEX-VP1u。 1) 质粒与纯化的扩增片段酶切 使用Sal I和Not I(NEB)对pGEX-4T-3及PCR扩增的VP1u片段进行双酶切，50 μl酶切条件如下： 至37˚C水浴中2 h后，使用Axygen® AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit进行目标DNA的凝胶回收及纯化。 2) 连接 使用T4 DNA ligase (NEB)连接酶切的pGEX-4T-3与VP1u的双酶切产物，构建原核表达载体pGEX-VP1u。10μl连接条件如下： 至于16˚C中2 h。 3) 转化 使用E. coli TOP10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)转化连接产物，步骤如下：冰上融化感受态细胞，吸取连接产物至感受态中，冰浴30 min，42˚C热激45 sec，迅速转至冰浴2 min，加入无抗性LB培养基 500 μl至37˚C摇床中250 rpm 1 h，取200μl涂布氨苄青霉素LB固体平板(LB-Amp+平板)，37˚C培养箱中倒置过夜培养。 4) 挑取单菌落并验证 挑取平板上的单菌落至含0.8 ml LB-Amp+液体培养基的1.5 ml离心管中，37˚C摇床中250 rpm培养4~5 h，使用菌落PCR进行阳性克隆筛选，即使用前述VP1u扩增引物VP1u-gst-SalIF/VP1u-gst-NotIR1中各片段扩增引物进行分别验证。菌落PCR条件如下： 反应条件：预变性95˚C 5 min；循环条件(30×)：94˚C 30 sec、55˚C 30 sec、72˚C 30 sec；延伸温度72˚C 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段。挑选2例测序验证。 5) 使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen)提取最终确认正确的pGEX-VP1u。使用0.5 μl提取质粒转化E. coli BL21感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，方法同前述。 2.2.2. 蛋白表达及纯化 1) 蛋白表达 使用IPTG (Sigma)诱导蛋白表达，为获得可溶性蛋白，调整IPTG浓度、诱导时间、诱导温度，但最终目标蛋白未能获得可溶性目标蛋白，使用KCL染色切胶回收目标蛋白。步骤如下：挑取pGEX-VP1u阳性E. coli BL21接种至10 ml LB-Amp+液体培养基，37˚C摇床中220 rpm培养过夜；将培养物接种至100 ml LB-Amp+液体培养基中，37˚C摇床中220 rpm培养1~2 h，加入IPTG进行蛋白诱导表达；诱导条件为：IPTG终浓度0.8 mM、37˚C 220 rpm诱导5 h。 2) 蛋白纯化 5000 rpm 4˚C离心15 min收集菌体，加入10 ml PBS重悬细菌，使用冰上超声破碎细菌(20 sec开、5 sec停、70%功率、10~20 min)至菌液变青色。10，000 rpm 4˚C离心30 min弃上清。沉淀中加入8 ml PBS重悬沉淀，加入2 ml 5 × SDS上样缓冲液，100˚C变性5 min，10，000 rpm 4˚C离心30 min获得上清。使用上清进行SDS-PAGE，用经过预冷的0.25M KCL对蛋白胶进行染色(目标条带呈白色)。用干净的刀片切下目标条带，在蒸馏水中润洗脱盐，取出至干净的管中。剪碎凝胶，加入过量PBS，放入4˚C冰箱中过夜。第二天收集浸泡液(吸之前振荡)，再加入PBS 4˚C过夜浸泡收集一次。使用10KD超滤管(Millipore)浓缩目标蛋白；12% SDS-PAGE检测目标蛋白，Bradford法检测蛋白浓度。 2.3. 小鼠免疫及效价检测 1) 目标蛋白使用100 μl完全弗氏佐剂(Sigma)与100 μl含50 μg目标蛋白充分乳化，腹腔注射BALB/c 六周龄小鼠，总计4次免疫。免疫后取血清。 2) 使用制备的抗原及临床HBoV1阳性样品分别进行ELISA抗体评价。将所用抗原用包被液稀释到2.5 μg/ml(制备的蛋白抗原)或使用确认的临床病毒阳性样品，酶标板每孔加入100 μl， 置4˚C，24 h包被；弃去孔中液体，使用150 μl封闭液37˚C封闭2 h；弃去孔中液体并洗涤5次，每次3 min；加入不同稀释梯度的血清样品进行检测，使用未免疫小鼠血清作为阴性对照，置于37˚C，30 min。用洗涤液满孔洗涤5遍，每遍3 min；加入酶标抗体(HRP-羊抗鼠)37˚C，30 min之间；洗涤5次后使用TMB-过氧化氢尿素溶液底物反应(Millipore)，37˚C避光放置3~5 min，加入终止液显色，测A450。 2.4. 抗体在HBoV1免疫荧光实验中的应用 使用所制备的VP1u抗体血清对转染HBoV1反向遗传系统全长质粒pHBoV-S2的AD293细胞进行免疫荧光实验。 1) 提前一天于24孔板中接种AD293细胞，使用Lipofectamine 3000化转试剂转染质粒至细胞，转染后在37˚C 5% CO 2 培养箱中培养72 h。 2) 使用所制备抗体进行VP1u的免疫荧光检测。步骤如下：24孔板中细胞PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15~30 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；0.5% Triton X-100 (PBS配制)室温通透20 min；PBS浸洗孔3次，每次3 min，吸干PBS，在孔中加正常10%山羊血清，室温封闭30 min；吸掉封闭液，每孔加足够量的稀释好的所制备的一抗血清(1:50)，并使用阴性小鼠血清作为阴性对照，放入湿盒，37˚C 1 h；PBST浸洗孔3~6次，每次3 min，吸干孔中多余液体后滴加稀释好的荧光二抗(FITC-羊抗鼠) (联科生物)，湿盒中37˚C孵育1 h，PBST浸洗孔3次，每次3 min；(注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行)。吸干孔中的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
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user: 3. 实验与结果 3.1. HBoV1 VP1u片段原核表达载体构建 实验通过PCR获得了VP1u的目标片段(图1)，并利用pGEX-4T-3构建了原核表达载体pGEX-VP1u(图2)，并最终通过测序验证正确。 3.2. 蛋白表达与纯化 通过KCL染色切胶回收，获得VP1u目标蛋白(GST-VP1u融合蛋白分子量为40.2KD) (图3)，浓度 图1. HBoV1抗原VP1u DNA扩增产物；M：DNA marker 图2. HBoV1 VP1u原核表达载体构建；M：DNA marker；1：pGEX-VP1u；2：pGEX-4T-3 图3. HBoV1 VP1u蛋白SDS-PAGE；M: Protein marker；1：GST-VP1u融合蛋白；2：IPTG诱导菌；3：IPTG未诱导菌 为1.055 μg/μl。 3.3. 免疫与抗体效价 通过免疫BALB/c小鼠，获得一批免疫血清，分别使用蛋白抗原和阳性临床标本对其进行评价(表1) (表2)。与阴性小鼠血清对比2倍以上升高的稀释度起始于1:1，000，000；使用阳性样品进行的评价表明，其在1:50情况下约有4倍升高。 3.4. 抗体在HBoV1免疫荧光实验中的应用 使用制备的抗体，对利用反向遗产系统制备的HBoV1进行主免疫荧光检测(图4)。实验结果显示VP1u在细胞中的分布。