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user: 2. 材料与方法 2.1. 试验地点 以洛阳市农林科学院梨园梨树为试材，洛阳市地处九州腹地，东经112˚19'，北纬34˚41'，属于暖温带气候，具有春季多风、气候干旱，夏季炎热、雨水集中，秋季晴和，日照充足，冬季干冷、雨雪稀少的显著特点。全年四季分明，热量、降水量随时间分布具有显著的季节性特点。全年日照时数为2141.6小时，各地差异不大，四季分布为夏多冬少，春秋居中，年降雨量600~800 mm。该园中栽有6年生的若光梨、红香酥梨、秋月梨等品种，果园表层土壤为淤积黏土和砂壤土， 1 米 以下为河沙，保肥保水能力较差。采用根部追施微生物菌肥。 2.2. 供试植物 供试植物为6年生晚秋黄梨。 2.3. 供试微生物菌肥 本试验所用微生物肥料为：A：枯草芽孢杆菌，武汉科诺生物科技股份有限公司生产，有效成分含量1000亿活芽孢/克，农药登记证号：PD 20140209，属可湿性粉剂。B：武夷菌微生物菌剂：有潍坊万胜生物农药有限公司提供，有效活菌数 ≥ 70亿/克，属可湿性粉剂。C：菌酵抗重茬土壤调理改良剂，潍坊东方润泽农业科技开发有限公司生产，登记证号：农肥准字1725号；标准证号：NY 1428-2010。有效菌枯草芽孢杆菌/蜡质芽孢杆菌，有效菌 ≥ 2.0亿/克，可湿性粉剂。D：VT-100菌剂：该产品是由北京沃土天地生物科技有限公司和中国农业大学合作开发的复合微生物菌剂，产品中主要有光合细菌、放线菌、乳酸菌、酵母菌等近10个菌株构成，属水剂。 2.4. 试验的处理方法 试验以清水为对照加4种菌肥共5个处理。以3株为一个小区，每小区间隔3棵树，顺栽植行随机处理，每个重复间隔1行，重复3次。为试验尽量准确，每次重复的小区也随机排列。施肥时每株梨树与行向垂直，距树干60 cm两边各开1条深15 cm，宽30 cm，长60 cm的条形沟，粉剂以20 g稀释1000倍(用少量清水充分溶解后加入剩余的清水)，然后浇灌到1株树的两个条形沟内，水剂为20 ml稀释1000倍浇灌，对照为20 kg清水浇灌(表1)。 Table 1 Species of bio-bacterial manure and using quality of fertilize 菌肥 清水 枯草芽孢杆菌 武夷菌 菌酵抗重茬 VT-100菌剂 用量 ＼ 20 g 20 g 20 g 20 ml 表1. 供试生物菌肥种类及施肥量 注：生物菌肥土壤处理时间 2015 年 7 月 20 日 ， 8 月 9 日 和 8 月 29 日 间隔20天进行重复，共3次。 2.5. 土壤样品的采集 2016年3月28日进行土样采集，采用多点混合采样法，土样共分两次采集，第一次统一在梨树左边选取20 cm × 20 cm大小的取样区域。清除梨树周围的枯枝败叶等杂物，并清除表层土2 cm。用土钻在清除表土的区域选取三个点，钻10 cm深度，取钻下面3 cm左右的土壤，放入无菌塑料袋内(取样时为防止土壤污染，双手戴塑料手套)，然后在梨树右边进行重复操作，同一处理的土壤放在同一个袋子内并及时封口。取样后及时放入 4 ℃ 冰箱避光冷藏。 2.6. 微生物培养与检测 2.6.1. 土壤微生物培养 土壤微生物的培养条件见表2。 Table 2 Culture conditions of soil microbia 微生物 重复次数 稀释度 培养时间(d) 培养温度(℃) 亚硝化细菌 3 10 −2 ~10 −7 12 28 硝化细菌 3 10 −2 ~10 −7 14 28 反硝化细菌 3 10 −4 ~10 −8 13 28 放线菌 3 10 −2 ~10 −4 6 28 好氧纤维分解菌 3 10 −1 ~10 −5 14 28 霉菌 3 10 −2 ~10 −4 2 28 自生固氮菌 3 10 −2 ~10 −4 7 28 氨化细菌 3 10 −8 ~10 −13 7 28 厌氧纤维分解菌 3 10 −1 ~10 −6 14 28 表2. 土壤微生物的培养条件 注：液体培养基以接种1 ml无菌水作为对照，固体培养基以接种0.05 ml无菌水作为对照。 2.6.2. 土壤微生物的培养基配置方法 土壤微生物培养基的见表3。 Table 3 Soil microbiological mediu 微生物种类 培养基 配方 亚硝化细菌 氨氧化细菌培养基 K 2 HPO 4 0.75 g，蒸馏水1 L，NaH 2 PO 4 0.25 g，(NH 4 ) 2 SO 4 2.0 g， MgSO 4 ∙7H 2 O 0.03 g，MnSO 4 ∙4H 2 O 0.01 g，CaCO 3 5.0 g，pH7.2 反硝化细菌 反硝化细菌培养基 蒸馏水1 L，K 2 HPO 4 0.5 g，KNO 3 2.0 g，酒石酸钾钠20.0 g， pH7.2，MgSO 4 ∙7H 2 O 0.2 g 好氧纤维分解菌 赫奇逊培养基 NaNO 3 2.5 g，MgSO 4 ∙7H 2 O 0.3 g，NaCl 0.1 g，KH 2 PO 4 1.0 g， CaCl 2 ∙2H 2 O 0.1 g，蒸馏水1 L，pH7.2，FeCl 3 0.01 g 厌氧纤维分解菌 磷酸铵钠培养基 CaCO 3 5.0 g，蛋白胨1.0 g，NaNH 4 HPO 4 2.0 g，KH 2 PO 4 1.0 g， CaCl 2 ∙6H 2 O 0.3 g，MgSO 4 ∙7H 2 0 0.5 g，蒸馏水1 L 放线菌 改良高氏I号培养基 KNO 3 1.0 g，可溶性淀粉20.0 g，琼脂18 g，K 2 HPO 4 0.5 g， NaCl 0.5 g，FeSO 4 ∙7H 2 O 0.01 g，MgSO 4 ∙7H 2 O 0.5 g，蒸馏水1 L，pH7.2~7.4 自生固氮菌 瓦克斯曼77号培养基 K 2 HPO 4 0.5 g，葡萄糖10.0 g，刚果红溶液5 ml，琼脂18 g，蒸馏水1 L，pH7 氨化细菌 瓦克斯曼77号培养基 蛋白胨5.0 g，K 2 HPO 4 0.5 g，NaCl 0.25 g， MgSO 4 ∙7H 2 O 0.5 g， FeSO 4 0.01 g，蒸馏水1 L，pH7.0 表3. 土壤微生物营养基 2.6.3. 土壤微生物的检测 微生物的检测方法如表4。 Table 4 Methods for detecting soil microbe 微生物 检测方法 亚硝化细菌 滴2滴于培养好的培养液于制作好的白纸板上，加格利斯试剂A、 B液各1滴，试剂出现绛红色，说明产生了 NO 2 − 。 反硝化细菌 首先看培养基状况，确定是否长菌，然后检查有无N 2 、NH 3 、 NO 2 − 产生及 NO 3 − 是否存在：① 在培养过程中若有还原性氮气产生，在培养基表面会有气泡，或在试管内聚有气体。② 取2滴培养液滴于白纸板，加1滴纳氏试剂，如还原产生了NH 3 则试剂呈现橙色。③ NO 2 − 。同亚硝化细菌的操作。④ NO 3 − 。同硝化细菌的操作。 好氧纤维分解菌 根据滤纸条出现的情况包括断裂、变薄、色素等，确定是否有细菌菌落出现。 厌氧纤维分解菌 如果试管中滤纸条的溶解区出现黄、黑或褐色的色斑，及是否断裂确定是否有厌氧分解菌产生。 放线菌 菌落较小且质地致密，表面较干燥，多具皱纹，难以挑起，有的含有色素。 自生固氮菌 显微镜下观察菌落有微微突起，表面光滑或是具有皱纹，偶有呈三角形或菱形的埋藏菌落呈褐色或不透明状。 氨化细菌 根据培养基的情况看有无氨化细菌的生长，加入加納氏试剂看颜色变化确定有无氨的生成。 表4. 土壤微生物的检测方法 注：液体培养的微生物，查MPN表求出该菌的近似值，换算为每克烘干土重中的微生物数量；固体培养的通过划分区域进行计数。