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user: 3. 结果与分析 3.1. 潮霉素B对铁皮石斛致死浓度筛选 3.1.1. 不同潮霉素B浓度下铁皮石斛死亡率随培养时间的变化 对不同潮霉素B浓度下铁皮石斛原球茎死亡率随时间变化的跟踪统计，图1表明：随着培养时间的增加，铁皮石斛原球茎死亡速度表现出慢–快–平稳的规律。浓度越高，开始死亡时间越提前，最终死亡时间也提前，死亡速度加快。培养在60 mg/L浓度下的原球茎在84天后死亡率达100%，50 mg/L浓度下90天死亡达100%，40 mg/L浓度下稍微滞后，直到第98周时死亡率达100%，而20 mg/L、30 mg/L浓度下的原球茎没有完全死亡，死亡率达到85%后不再增加，既成活率保持在15%左右。 图1. 不同潮霉素浓度下铁皮石斛死亡率随培养时间的动态变化 3.1.2. 潮霉素B浓度对铁皮石斛死亡率影响 由下表3可见，在设置的6个潮霉素B浓度梯度中，铁皮石斛原球茎死亡率随着潮霉素B浓度逐渐变大而升高。5 mg/L浓度下的原球茎成活率稳定保持在80%左右，而没有任何抗生素的情况下，成活率达95%以上。浓度0 mg/L与浓度5 mg/L的死亡率相对于其它几组极显著。由此说明，潮霉素浓度越低对铁皮石斛原球茎的死亡速度影响越小。临界浓度为30~40 mg/L，即今后在遗传转化时，潮霉素B浓度必须在临界浓度以上，才能筛选到阳性转基因植株。 Table 3 Effects of different concentrations of hygromycin on mortality of D. officinal 浓度mg/L Concentration mg/L 接种数 Inoculation number 死亡数 Number of deaths 死亡率% Mortality% 0 60 7 11.67Aa 5 60 15 25.00Aa 20 60 50 93.33Aa 30 60 56 96.67Aab 40 60 60 100.00Ab 50 60 60 100.00Bc 60 60 60 100.00Bc 表3. 不同浓度潮霉素对铁皮石斛死亡率影响 Note: Capital letter means significant at 1%. Small letter means significant at 5%. Different letters indicate significant differences between treatments. The same letters indicate same significant differences between treatments. 注：大写字母表示1%极显著水平，小写字母表示5%显著水平，不同的字母表示处理间差异显著，相同字母表示处理间差异不显著。 3.1.3. 不同潮霉素B浓度对铁皮石斛生长状态的影响 高浓度的潮霉素B对植物起到致死作用，低浓度的潮霉素会抑制植物生长。随着潮霉素浓度的增加，植物生长受到抑制程度就越大，当超过40 mg/L的浓度，培养时间达17周时，对铁皮石斛原球茎生长状态进行观察，发现原球茎失绿，变白色，几乎死亡，而对照组的铁皮石斛多数生长正常，逐渐分化成完整植株。5 mg/L浓度下生长受到一定抑制，有部分原球茎能分化形成较弱的小苗，另一部分依旧保持着原球茎的状态，且呈现出浅绿色，颜色不均匀，分化的真叶叶尖偏白。当浓度达到20 mg/L时，多数接种的原球茎死亡，剩余的无法分化出植株，一直保持着原球茎的状态且原球茎未见增大，浓度为30 mg/L的情况和20 mg/L相似，浓度为40 mg/L以上，植株白化，全部死亡，见表4、图2和图3。 Table 4 Effects of different concentrations of hygromycin on the growth of D. officinal 不同潮霉素浓度(mg/L) Different hygromycin concentration 生长情况 Growth 死亡率% Mortality 原球茎颜色 Protocorm color 原球茎状态 Protocorm state 0 +++++ 5Aa 绿色 全部分化、正常生长 5 ++++ 25.00Bb 浅绿，部分褐化 部分分化、缓慢生长 20 +++ 73.33Cc 黄绿，部分褐化 部分分化、缓慢生长甚至停滞生长 30 + 96.67Dd 黄绿，部分褐化 仅有少量分化、缓慢生长甚至停滞生长 40 − 100.00Dd 白化 死亡 50 − 100.00Dd 白化 死亡 60 − 100.00Dd 白化 死亡 表4. 不同浓度潮霉素对铁皮石斛生长的影响(17周) 注：“−”代表死亡；“+”代表停滞生长，和接种时大小(5 mm)同等水平；“++”代表平均高度为5~10 mm，缓慢生长；“+++++”代表正常生长，平均高度10 mm以上。 图2. 潮霉素浓度为40 mg/L原球茎生长情况 图3. 潮霉素浓度为30 mg/L原球茎生长情况 图4. 卡那霉素不同浓度下铁皮石斛死亡率随筛选时间的变化 3.2. 卡那霉素在抗性筛选中的作用 3.2.1. 不同培养时间下，卡那霉素浓度对铁皮石斛死亡率变化的影响 由图4可知，铁皮石斛对卡那霉素的敏感性较弱，培养至第三周才有极少量的植物材料死亡，随着培养时间的增加，死亡率有所增加，但增加速度平缓，之后保持平稳。没有加卡那霉素的对照，第8周前有少量死亡，死亡率达到10%左右，之后保持平稳，不再有死亡发生。当浓度在600 mg/L时，培养17周，死亡率最高，达78%，之后一直保持在78%。浓度在600 mg/L以下时，都有一定死亡率，在50 mg/L时，培养17周时，死亡率达45%，之后不再出现死亡。 3.2.2. 不同浓度卡那霉素对铁皮石斛死亡数影响 由下表5可见，在设置的6个卡那霉素浓度梯度中，随着卡那霉素浓度增加，铁皮石斛死亡率不断升高。当浓度为600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L，培养17周后，死亡率不显著，但与浓度100 mg/L、50 mg/L相比时，死亡率达极显著，不加卡那霉素的，死亡率最低。说明卡那霉素对铁皮石斛的生长有明显的抑制作用。卡那霉素对铁皮石斛生长没有临界值，由此可见，卡那霉素不能用于铁皮石斛遗传转化筛选。 Table 5 Effects of different kanamycin concentrations on mortality of D. officinal 浓度mg/L Concentration mg/L 接种数 Inoculation number 死亡数 Number of deaths 死亡率% Mortality% 600 60.00 47.00 78Aa 400 60.00 41.00 74Aa 200 60.00 43.00 72Aa 100 60.00 27.00 48Bb 50 60.00 29.00 45Bb 0 60.00 7.00 12Cc 表5. 不同浓度卡那霉素对铁皮石斛死亡数影响(17周) Note: Capital letter means significant at 1%. Small letter means significant at 5%. Different letters indicate significant differences between treatments. The same letters indicate same significant differences between treatments. 注：大写字母表示1%极显著水平，小写字母表示5%显著水平，不同的字母表示处理间差异显著，相同字母表示处理间差异不显著。 3.2.3. 不同卡那霉素浓度对铁皮石斛生长状态的影响 高浓度的卡那霉素对铁皮石斛没有起到完全致死作用，既仍有部分存活植株，低浓度的卡那霉素会抑制植物生长，随着潮霉素浓度的增加，植物生长受到抑制程度就越大。从表6、图5和图6可知，当200~600 mg/L的浓度，培养时间达17周时，对铁皮石斛原球茎生长状态进行观察，发现原球茎黄绿，部分褐化，少量分化、缓慢生长，而对照组的铁皮石斛多数生长正常，逐渐分化成完整植株。50~100 mg/L浓度下生长受到一定抑制，有部分原球茎能分化形成较弱的小苗，另一部分依旧保持着原球茎的状态，且呈现出浅绿色，颜色不均匀，缓慢生长。 Table 6 Effects of different kanamycin concentrations on the growth of D. officinal 不同卡那素浓度(mg/L) Different kanamycin concentration 生长情况 Growth 死亡率% Mortality 植株颜色 Plant color 植株状态 Plant state 0 +++++ 12Aa 绿色 全部分化、正常生长 50 +++ 45Aab 浅绿，部分褐化 部分分化、缓慢生长 100 +++ 48Aab 浅绿，部分褐化 部分分化、缓慢生长 200 ++ 72ABab 黄绿，部分褐化 少量分化、缓慢生长 400 ++ 74ABb 黄绿，部分褐化 少量分化、缓慢生长 600 ++ 78Bc 黄绿，部分褐化 少量分化、缓慢生长 表6. 不同浓度卡那霉素对铁皮石斛生长的影响(17周) 注：“−”代表死亡；“+”代表原球茎停滞生长，为接种时大小(5 mm)；“++”代表原球茎缓慢生长，平均大小为5~10 mm；“+++”代表原球茎正常生长，平均大小10 mm以上。“+++++”代表原球茎正常生长，平均大小15 mm以上。 图5. 卡那霉素浓度为400 mg/L原球茎生长情况 图6. 卡那霉素浓度为600 mg/L原球茎生长情况