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user: 3. 基于静电作用的富集材料 经典IMAC材料固定的金属离子密度不高，因而不易实现磷酸化多肽的高效率富集，并且普遍存在金属离子丢失等问题 [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]，于是，用有正电荷属性的官能团(例如，氨基、胺基、胍基等)代替金属离子成为不少新型材料的设计思路。一般认为此类官能团与磷酸化肽之间形成了静电作用，主要涉及离子交换、氢键等作用形式。一方面，在酸性不是很强的情况下氨基即可被质子化，而此条件下磷酸基往往仍然呈现负电荷状态，两者之间存在异性电荷吸引力(图2) [ 17 ] [ 22 ]；另一方面，磷酸基中含孤对电子的O原子可以与胺基形成氢键(图3) [ 19 ] [ 41 ]。总之，通过材料表面的氨基/胺基与磷酸基产生相互作用，可较为选择性地捕获磷酸化肽。 图2. 氨基功能化材料的富集示意图 [ 17 ]。材料末端的氨基通过离子之间的相互作用将磷酸肽捕获 3.1. 基于与氨基/胺基的静电作用 利用被氨基/胺基功能化的溶胶−凝胶可从0.2 pmol的β-酪蛋白(β-casein)、10 pmol的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin， BSA)混合酶解物中鉴定4条磷酸化多肽，而在未被富集的样品中几乎检测不到目标肽 [ 17 ]。将该材料填充到移液器吸头中制备成固相萃取小柱后，可从25 μL的脱脂牛奶(中鉴定25条磷酸化多肽 [ 17 ]，初步表明氨基/胺基功能化的材料在复杂生物样品的磷酸化修饰分析方面有重要的开发价值。聚酰胺-胺(poly(amidoamine)， PAMAM)是一种富含氨基/胺基的亲水性树枝状分子，可作为有生物相容性的材料发挥作用。被PAMAM功能化的复合纳米微球对磷酸化多肽有着良好的选择性(β-casein/BSA = 1:500)以及抗干扰性，使用该材料可从55 μL的脱脂牛奶中鉴定20条磷酸化多肽；0.5 mL人唾液中鉴定17条内源性磷酸化肽 [ 27 ]。另外，因溶液的极性与酸度会影响材料的富集效率与选择性，故可以通过调节缓冲液、洗脱液的组成从而实现单磷酸化与多磷酸化肽的分别富集 [ 27 ]。 图3. 胺基功能化材料的富集示意图 [ 19 ]。材料表面的胺基与磷酸肽形成氢键 尽管蛋白质的酪氨酸残基上可以发生磷酸化修饰(图1)，但相对丰度太低，可能仅占总磷酸化位点数量的0.05% [ 42 ]，这导致经典MOAC方法在富集含磷酸化酪氨酸的多肽(tyrosine-phosphorylated peptides， pY peptides)方面较为乏力。于是，一些研究者将目光转移至其他材料上。使用含有胺基的分子印迹聚合物处理复杂的生物样品(目标肽与小鼠脑组织裂解物的含量比为1 pmol:0.2 μg)，研究者可以鉴定其中全部的4条pY肽；使用TiO 2 只能鉴定3条且非目标肽较多 [ 18 ]，这一结果初步表明，基于胺基的材料有望被应用于对pY肽有更优选择性的富集方法中。 一种含胺基的共聚物，其聚合物链在适宜pH条件下可由收缩态转变为溶胀态，由此被暴露出的胺基能够用于捕获磷酸化肽；当pH降至2.0时，分子间的作用力遭到破坏，磷酸化肽即被释放 [ 19 ]。特别值得一提的是，该材料对多磷酸化肽有卓越的富集效果，能够从50 μg的HeLa细胞裂解物中鉴定1257条磷酸化肽，其中超过70%为多磷酸化；而使用TiO 2 鉴定到的多磷酸化肽总量少于15% [ 41 ]。而且，因聚合物对磷酸苯酯和磷酸氢盐的结合能力有差异，使得其对pY肽、含磷酸化丝氨酸/苏氨酸的多肽有不同的吸附能力，选择性较IMAC和MOAC材料更加灵活 [ 41 ]。另外，因含唾液酸修饰的糖基化多肽可通过相似的原理被捕获，故而该材料能够同时富集生物样品中的磷酸化肽与唾液酸化糖肽 [ 19 ]，为开发多层次的翻译后修饰多肽富集技术提供了一种新的思路。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine， PEI)可在宽pH范围内(pH = 3~11)保持带正电荷状态，继而与磷酸基产生以离子交换为主导的相互作用。被PEI包覆的纳米粒子对α-酪蛋白(α-casein)与β-酪蛋白酶解物的富集灵敏度可达5 fmol且选择性非常高(β-casein/BSA = 1:1000) [ 20 ]。应用此材料能够从1.0 mg的脱脂奶粉中检测到11条磷酸化肽且近乎无非磷酸化肽，进一步表明其拥有良好的选择性。被PEI功能化的大粒径介孔二氧化硅可被填充到移液器枪头中，制备成固相萃取小柱。此小柱对β-酪蛋白酶解物的富集灵敏度达到10 fmol；使用其能够从0.05 μL的脱脂牛奶中鉴定19条磷酸化肽；从0.5 mg的小鼠脑组织裂解物中鉴定2251条，而使用商业化的TiO 2 材料仅能鉴定1520条 [ 22 ]。这些结果表明，以PEI为核心的富集材料拥有卓越的灵敏度与选择性，可能成为替代MOAC材料的强有力竞争者。 综合而言，引入适当密度的氨基/胺基可有效地增强材料对磷酸化多肽(特别是多磷酸化肽)的灵敏度与选择性(表1 No.1~6)，相关思路应当是富集技术的重要发展方向之一。 3.2. 基于与三嗪类物质的静电作用 以三嗪为基础的材料具有亲和力强、选择性好、稳定性高、开发速度快、成本低等优点，在蛋白质组学研究中已有较为广泛的应用，可作为亲和配体用于分离纯化蛋白质 [ 43 ] [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ]。被组胺和苯乙胺修饰的三嗪配体，在pH = 3时能够对单磷酸化肽、多磷酸化肽表现出高结合能力和选择性，而且，当配体被固定在磁性纳米粒子上时表现更佳，可能与粒子形态增加了官能团(主要是胺基)的密度有关 [ 47 ]。应用此材料，可以从α-酪蛋白、β-酪蛋白、BSA的混合酶解物中鉴定9条磷酸化多肽，富集效果与常规的Ti 4+ -IMAC材料相当 [ 47 ]。 以三嗪环为基本组成单元的石墨相氮化碳(graphitic carbon nitride， g-C 3 N 4 )，因含氮量高而表现出明显的富电子表面特性，可被视为一种阴离子交换材料 [ 22 ]。有研究者使用被g-C 3 N 4 包覆的磁性二氧化硅微球可从1.0 μL的脱脂牛奶酶解物中鉴定20条磷酸化肽；也可从0.5 mg的小鼠脑组织裂解物中鉴定出2576条，在总检测多肽中占比超过80%，而使用商业化的TiO 2 材料仅能鉴定1236条 [ 22 ]。这些结果充分展现了以g-C 3 N 4 为核心的材料的高灵敏度与高选择性，可能成为替代MOAC材料的另一个重要选择。值得一提的是，微球与TiO 2 富集结果的重叠率并不高，这可能意味着，除材料自身的性质外，富集原理对可鉴定的磷酸化多肽种类也有显著影响。 3.3. 基于与胍基的静电作用 类比于氨基/胺基，胍基可以依据相似的原理富集磷酸化肽。使用被胍基功能化的石墨烯，能够从0.4 μM的α-酪蛋白酶解液中富集3条单磷酸化肽、11条多磷酸化肽 [ 23 ]。该方法对具有连续磷酸化修饰的多肽呈现出高富集能力，据推测可能与易于形成盐桥效应(Salt bridge)有关。在酸性不是很强的情况下，多肽含有的连续磷酸基能够与石墨烯表面散布的胍基形成盐桥效应，从而显著增强了此类多肽被富集的效率 [ 23 ]。利用共价有机骨架(covalent organic frameworks， COFs)材料的表面积大、孔隙率高、可修饰位点多等特点，可将胍基高密度地分布于材料表面，从而实现磷酸化肽的高效率富集。与一种商业化的MOAC材料相比，该COF材料对β-酪蛋白酶解物中的磷酸化肽选择性更高(β-casein/BSA = 1:1000)，检测限更低(0.5 pM) [ 25 ]。不仅如此，应用此材料可从10 μL的人唾液样品中鉴定63条内源性磷酸化肽，其也显现出了优越的抗干扰性 [ 25 ]。另外，被胍基功能化的材料甚至可以用于富集完整的磷酸化蛋白质。当非磷酸化蛋白质与β-酪蛋白或卵清蛋白(ovalbumin， OVA)的质量比小于40时，含有胍基的二氧化硅磁珠均能够提供较高的富集效率(超过50%)；即便将磁珠用于富集真实生物样品中的β-酪蛋白、OVA，目标蛋白的损失量也不大，展现了其对磷酸化蛋白质的高结合能力与高选择性 [ 24 ]。 作为合成蛋白质的基本氨基酸之一，精氨酸经常作为有生物相容性的胍基供体。聚精氨酸能够提供连续的胍基，使用其包覆的金刚石纳米粒子可与同一条肽段形成多个相互作用位点，从而对多磷酸化肽有良好的富集效率与选择性。该材料对α-酪蛋白酶解物的检测限达1.0 nM；可从1.0 pmol的β-酪蛋白酶解物中仅鉴定出四磷酸化多肽，而使用商品化的IMAC、MOAC材料可以同时富集到单磷酸化与多磷酸化多肽，其对后者的选择性并不强 [ 26 ]。通过羧基将精氨酸固定到复合纳米微球表面后，同时富含胍基与氨基的微球显现出优异的灵敏度(1.0 pM的β-酪蛋白)以及良好的选择性(β-casein/BSA = 1:500) [ 28 ]。使用此微球可从0.5 mg的大鼠脑组织裂解物中鉴定出1059条磷酸化多肽，包括近13%的多磷酸化肽，表明其在高通量的磷酸化修饰分析方面有着不错的应用潜力 [ 28 ]。 综合而言，基于静电作用的材料，其富集性能一般优于经典的IMAC、MOAC材料，而功能基团的密度与空间分布情况是影响其性能的关键因素。一方面，含高密度基团的材料往往富集性能也相对优越(例如，被PEI功能化的材料)；另一方面，含连续正电荷官能团的材料会对多磷酸化肽呈现更高的选择性与灵敏度(例如，含胍基的材料)。不过，当功能基团密度过高时富集性能也会降低，需要考虑材料结构在吸附位点与空间位阻、分子间氢键之间的平衡 [ 27 ]。 3.4. 其他基于离子交换作用的富集材料 正如前文所述，基于离子交换作用富集磷酸化肽是一种可行的策略。事实上，已有研究者通过引入季铵基等方式发展了以阴离子交换为核心的材料。采用被季铵化的纤维素/壳聚糖微球富集磷酸化肽，其对β-酪蛋白酶解物的灵敏度达到10 fmol；可从25 μL的脱脂牛奶中鉴定15条磷酸化肽 [ 29 ]。另一个有趣的研究则是将丝瓜海绵(luffa sponge)季铵化。基于此天然高分子材料的高孔隙率、低密度、多活性基团等特性 [ 48 ]，可将大量季铵基分布于材料表面，使其呈现出强阴离子交换能力 [ 30 ]。此被修饰过的丝瓜海绵对β-酪蛋白酶解物的灵敏度约为30 fmol；应用其可从脱脂牛奶中鉴定21条磷酸化肽，而使用TiO2仅能鉴定13条 [ 30 ]。不过，相对于被氨基/胺基修饰的材料而言，季铵化材料的富集性能并不突出(表1 No.13~16)，这可能与其选择性不强有关，有待进一步被优化。 冠醚常作为金属离子的配位剂发挥作用，不过，有研究者将聚(二苯并-18-冠-6) (poly(dibenzo-18-crown-6)，PDC)质子化后，发现其也可以依赖于离子间的作用力而捕获磷酸化多肽。使用被质子化的PDC，能够从5.0 μg的α-酪蛋白、β-酪蛋白、OVA混合物的酶解液中鉴定19条磷酸化肽，在鉴定数量与信号强度方面均优于TiO 2 材料 [ 49 ]。考虑到PDC是一种易于获得的材料，其可能成为短期内替代TiO 2 的不错选择。