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user: 3. 结果与分析 3.1. 线虫环状RNA的基本特征 我们共鉴定出1531个环状RNA，舍去79个位于线虫基因组rRNA簇chrI：15，060，128~15，071，020上的环状RNA，共1452个作为候选的circRNA。根据circRNA的供体和受体所处的位置(图2)，统计得出： 1) canonical：circRNA的起始和终止点都在相同基因的外显子边界上，共1112个； 2) alt_donor：circRNA的起始位点在外显子边界上而终止位点不在，共68个； 3) alt_acceptor：circRNA的终止位点在外显子边界上而起始位点不在，共65个； 4) antisense：circRNA与基因区重叠且处于反义链上，共20个； 5) intergenic：circRNA与基因间区重叠，共162个； 6) other：其他情况，共25个。 在这1452个环状RNA中，仅119个在线虫的各个时期中均有表达。在某一特定时期表达的环状RNA数目相对于其他时期而言，具有相同环状RNA的比例都不高(表2)，说明线虫环状RNA在不同生长发育阶段会表达不同的环状RNA，具有生长发育阶段特异性。 图2. 环状RNA的类型 Table 2 The number of the same circular RNA among different stage Stage same embryo L1 L2 L3 L4 adult embryo 592 L1 286 716 L2 305 397 683 L3 323 381 422 693 L4 159 168 179 192 224 adult 241 243 259 272 153 367 表2. 各个生长时期间相同的环状RNA数目 此外，我们将预测出的1112个canonical环状RNA映射回基因上，由于一个基因的选择性剪切会形成多个不同组成的转录本，我们无法判断环状RNA真实来自于哪一个转录本，所以我们假设只要含有该环状RNA边界外显子的转录本都会形成，那么我们一共可以对应到2056个转录本。我们对这些环状RNA使用的外显子数目和长度分布进行统计，可以看到环状RNA由中间外显子组成的比例最大(90.08%)，并且值得注意的是由第一个外显子的数目组成的环状RNA有203个(图3(a))，这个数目和比例远远超过了人类环状RNA的情况，而环状RNA形成的两个模型中也并没有描述由第一个外显子形成环状RNA的情况；由两个外显子组成的环状RNA数目最多，其次为由三个外显子和一个外显子组成的情况(图3(c))，包含外显子越多的环状RNA数目越少，最多的环状RNA可由12个外显子构成(cel_circ_F08B 4.2a 和cel_circ_F08B4.2b)；对比组成环状RNA的外显子长度可以发现，在只由一个外显子组成的环状RNA中，外显子的中位数长度达到了333 bp，要明显高于由多个外显子组成的环状RNA中的外显子长度(p < 0.0001) (图3(c))，因此我们推测，环状RNA需要达到一定长度才会形成。另外，我们统计了环状RNA的长度分布，最短环状RNA长度为116 bp，最长为4131 bp，中位数长度为395 bp (图3(d))。 我们将环状RNA对应的转录本和环状RNA之间的表达量进行相关性分析，发现在97个在所有时期都表达的canonical环状RNA中，仅有11个环状RNA同其线性转录本相关系数大于0.8，1个小于负0.8。表明多数环状RNA同线性RNA表达量间并没有明显的相关性，环状RNA并不是简单地由线性RNA中的一部分形成，它还受到其他多种因素的调控，呈现出复杂的调控机制。 3.2. RNase R对环状RNA丰度的影响 RNase R是一种3' -> 5'核酸外切酶，可以切割线性的RNA分子，因此认为它在mRNA降解过程中扮演着重要的角色[ 25 ] 。在环状RNA的研究中，认为环状RNA是对RNase R不敏感的，因此RNase R的处理会对环状RNA起富集作用，并且为判定RNA是否成环的一个重要条件。在本文的实验中，我们通过对比前后经过RNase R处理的RNA-seq数据，虽然RNase R处理后的RNA-seq数据深度提高了，但经过归一化比较后发现大部分环状RNA在经过RNase R处理后的确是富集了，但是仍有一部分没有富集，还有一小部分环状RNA对RNase R敏感(图4)。 在对RNase R敏感的环状RNA中，大部分是intergenic类型，图4所展示的chrX: 925，367~926，302是唯一表现出敏感的canonical类型的环状RNA。而目前尚没有关于intergenic类型环状RNA的研究，故不能确定这一类环状RNA是否真的存在并对RNase R敏感还是软件预测的假阳性。 3.3. 环状RNA的多样性和可选择性 环状RNA可以由一个外显子或多个外显子构成，一个基因中也会有形成多个环状RNA的情况：环 图3. 线虫环状RNA的基本特征分析 图4. RNase R处理前后环状RNA读数变化：共富集、敏感、中等三种情况 状RNA可能由基因的不同外显子组成，也可能供体或受体为相同的外显子，也可能多种情况在一个基因中同时发生，不同的可变剪接体间形成的环状RNA还会竞争外显子等情况(图5)。环状RNA对外显子具有选择性，称为可变环化[ 14 ] 。 3.4. 线虫环状RNA侧翼内含子特征 线虫环状RNA上游和下游内含子的中位数长度分别达到了907 bp和962 bp，它们之间没有显著差异性(p = 0.157)，但同线虫所有内含子的中位数长度(69 bp)有极其显著差异(p < 0.0001) (图3(d))，说明具有较长的侧翼内含子序列是环状RNA的一个基本特征。 图5. 线虫环状RNA多样的环化方式 Alu元件是人类基因组上大量存在的短散在重复序列，也是人类环状RNA形成的主要原因，同时环状RNA两侧的内含子序列内(IRwithin)和序列间(IRacross)的反向互补配对的竞争(图6(a))也是造成环状RNA形成的重要原因[ 14 ] 。由于在线虫基因组中83%都是非重复序列，因此线虫环状RNA形成的主要原因不会是因为基因组上的重复序列。我们根据环状RNA的位点信息，提取出环状RNA侧翼内含子序列，并用blast来统计IRwithin和IRacross的情况。我们发现96.33%的环状RNA侧翼内含子都存在序列反向互补情况(图6(b))，只有约0.3%的内含子间不含有IRacross，在1852个序列对中，IRacross − IRwithin >= 1的有1374对，占74.19%。说明具有反向互补配对的侧翼内含子序列也是线虫环状RNA的一个重要的基本特征。 同时我们也统计了203个由第一个外显子构成的环状RNA的上游基因间区序列和其下游第一个内含子之间的序列比对情况，发现具有IRacross的有180对，占88.67%，IRacross − IRwithin >= 1的有107对，占52.71%(图6(b))。真核基因转录产物一般是单顺反子，但线虫中约25%的基因会产生多顺反子，因此我们推测这些顺反子之间的基因间区可能会和intron区的序列反向互补配对，从而造成第一个外显子也参与成环的现象。 3.5. miRNA在环状RNA上的结合位点 在canonical和antisense类型的环状RNA中，每个环状RNA都有一个或多个miRNA的靶位点，最多的可以有95个不同miRNA的靶位点，但可结合相同miRNA的数目却大多只有1~3个。其中环状RNA位点(chrIII：6758887-6763523)可由K07E 12.1 a .1、K07E 12.1a .2、K07E12.1b三个不同转录本中的三个外显子形成，该环状RNA对cel-miR-77-3p有16个结合位点，跟SRY基因对miR-138结合的数目相同[ 11 ] ，故该circRNA可能具有潜在的miRNA分子海绵作用，而其他的环状RNA由于可结合相同miRNA的数目太少，因此认为它们不具有分子海绵的功能。 我们的结果中可以看出，在线虫中环状RNA可作为分子海绵的数量和能力十分有限，而在目前已报导的circRNA中，也只有CDR1as和SRY两个环状RNA被证明具有分子海绵作用。 3.6. GO功能富集 我们将可以产生环状RNA的转录本进行GO功能富集分析[ 26 ] (图7)，GO富集结果表明多数基因在细胞成分上为细胞和细胞器成分，具有结合蛋白，催化，传输等分子功能，参与到生物调节，细胞过程，生长过程，免疫，代谢等多种生物过程中。 图6. 线虫环状RNA侧翼内含子序列反向互补情况 图7. 可产生环状RNA的基因GO功能注释