system: [SYSTEM]

user: 2. 实验材料和方法 2.1. 分子构建与数据来源 本文分子构建中化合物所包含的小分子结构是利用SYBYL2.0-X软件中的sketch molecule绘图工具进行构建。全部分子加载Gasteger-Huckel电荷，采用标准的Tripos分子力场和Powell能量梯度算法对所有小分子进行能量优化，最大迭代次数1000次，能量收敛限定设为0.005 Kcal∙mol −1 ，其余参数均采用系统默认值 [ 3 ] [ 4 ]。能量最小化使得化合物都处于能量最低的稳定状态。 本文对Abdizadeh [ 5 ] 组报道的21种以香豆素为基础的苯扎酰胺类新一类抗癌药物和HDACs抑制剂进行了QSAR研究，研究其降低半数感染细胞有效浓度(IC 50 单位mol∙L −1 )。为了计算方便，把这些IC 50 值转换为相应的pIC 50 (-lg IC 50 )值用来表征其生物活性。21种以香豆素为基础的苯扎酰胺类HDAC抑制剂化学结构与活性数据见表1。将数据集随机分为两个部分，分别为用于生成QSAR模型的训练集(14个化合物，占2/3)和用于模型外部验证的测试集(7个化合物，占1/3)。 Table 1 Compounds structure and activity valu Compd R pIC 50 (HCT116) pIC 50 (A2780) Exper Pred Exper Pred 1 4.94 5.16 4.26 4.40 2 5.29 5.16 4.40 4.40 3* 5.69 5.46 4.48 4.40 4 5.51 5.45 4.67 4.70 5 5.64 5.52 4.77 4.76 6* 5.96 5.58 4.83 4.80 7 5.18 5.16 4.56 4.40 8 5.60 5.76 4.89 5.06 9* 5.85 5.59 4.68 4.89 10 5.88 6.01 5.00 5.04 11 6.60 6.51 5.69 5.39 12* 5.03 5.35 4.76 4.69 13 5.43 5.39 4.80 4.69 14 5.61 5.52 5.01 5.03 15* 5.32 5.32 5.00 4.68 16 5.75 6.02 5.22 5.28 17 6.38 6.01 5.27 5.30 18* 6.00 6.19 5.19 5.29 19 5.21 5.12 4.53 4.40 20 5.37 5.52 4.62 4.84 21* 6.10 5.76 5.31 4.99 表1. 化合物的结构及pIC 50 值 *为测试集。 2.2. 三维定量构效关系 定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationship， QSAR)是一种探索分子结构与其生物活性关系的常用研究手段。通常使用数学模型来研究分子结构和分子生物活性之间的定量关系，以分子结构参数为自变量，分子生物活性为因变量来建立出活性与结构之间的定量关系表达式 [ 6 ]。三维定量构效关系(3D-Quantitative Structure-Activity Relationship， 3D-QSAR)是根据化合物和生物大分子的三维结构进行QSAR的研究。与传统的QSAR方法相比，3D-QSAR增添了生物活性分子的三维构象的性质，在QSAR中引入了与生物活性分子三维结构信息有关的参数作为变元，因此能更加精确地反映生物活性分子与受体作用的真实情况，更深刻地说明药物与受体之间的相互作用机制，为新药的研发设计提供一定的理论基础。 2.3. 比较分子力场分析法 比较分子力场(Comparative molecular field analysis， CoMFA)是研究药物–受体三维定量构效关系(3D-QSAR)最常用的方法之一。CoMFA能够充分考虑分子的三维结构信息，通过分子结构表征立体场和静电场，再用偏最小二乘法(Partial least squares method， PLS)获取这些三维特征信息与化合物活性之间的联系 [ 7 ]。通过构建分子结构，获取分子的最低能量构象，选择公共骨架进行分子叠合，根据探针原子计算化合物周围的分子力场，分析药物结构与活性的关系。其中，分子叠合结果对模型预测的精准性有很大的影响 [ 8 ]。因此要想获取更精确的结果往往需要尝试多种方式进行分子叠合，并且需要花费大量的时间。 2.4. 易位体比较分子力场 易位体比较分子力场(Topomer CoMFA)是在2004年，由Cramer等人 [ 9 ] 提出，是一种可以预测化合物生物活性或性质的新型3D-QSAR方法。不同于CoMFA，Topomer CoMFA是同时结合了Topomer与CoMFA技术。它弥补了传统CoMFA方法中的手动叠合分子的缺点，它结合了3D-QSAR构建技术和基于配体的虚拟筛选技术，并且可在短时间内构建较为可靠的3D-QSAR模型，具有便捷、快速、准确的特点 [ 10 ]。另外，Topamer CoMFA还具有重复性高的优势。利用Topomer CoMFA可快速建立预测模型并进行分析与评价，为同类小分子抑制剂的结构优化提供理论依据 [ 11 ]。 2.5. 虚拟筛选 本文中的分子设计采用的是虚拟筛选的方法，使用SYBYL2.0-X中Topomer Search技术进行分子虚拟筛选。此工具是在数据库中基于R基团的搜索技术进行搜索，可以找到训练集中没有出现过的更高活性的化学结构片段，进而将找到的高贡献值的片段通过重新排列组合的方式设计出更高活性的化合物 [ 12 ]。本文中，将具有最高活性的11号化合物作为模板分子进行切割以获得分子的结构片段，用获得的模型预测其对活性的贡献值大小 [ 13 ]。采用Topomer search技术在ZINC数据库中对基于R基团的虚拟筛选，用距离作为打分的依据，去评判搜索化合物小片段与数据库化合物片段之间的相似性 [ 14 ]。Topomer的最大距离设置为185，在数据库中筛选出来的化合物片段Topomer距离要尽量接近185，且片段的贡献值超过模板分子R基团的贡献值，筛选出来符合条件的片段，最后将筛选出来的小分子片段重新进行组合排列去替换模板分子中相应的R基团片段进行分子设计 [ 15 ]。 2.6. 分子对接 分子对接(molecular docking)是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。其主要研究化合物与所选蛋白质活性位点残基之间的相互作用，比较它们之间的亲和性，并根据停靠能量最低来评价最佳构象。通过小分子配体和受体之间的几何、能量匹配与识别，预测其结合模式和亲合力，找到两者之间最佳的结合模式 [ 16 ]。是计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。 本文中采用的是SYBYL-X2.0 软件中的Surflex-Dock模块进行分子对接。本次对接所使用的蛋白酶晶体来源于PDB数据库(Protein Data Bank)，晶体结构的ID为：3JSX。在进行分子对接前对3JSX大分子蛋白进行预处理，将需要的小分子配体从大分子复合物中提取出来，不需要的小分子配体及所有的水分子删除，给蛋白加氢、添加Castelger电荷。根据小分子配体确定对接的活性位点，设置对接格子的格点为40 × 40 × 40，格点间距为0.375Å。然后采用拉马克遗传算法对分子对接的配体构象进行搜索，每个配体分子进行50次独立对接操作，能量评估的最大值设置250万。 先将活性最高的11号化合物作为模板与蛋白晶体进行对接，之后再将设计的分子全部与之对接，最后观察所有化合物的打分函数Total-Score、Crash和Polar的值 [ 17 ] [ 18 ]。Total-Score 的打分函数值表示从大分子蛋白中提取出来的小分子配体与受体的亲和力，其值越高亲和力越高；Crash表示从大分子蛋白中提取出来的配体与受体之间的不适度，其值越接近零越好。Polar为极性函数得分，当结合位点在分子表面时，其值越大越好；在分子内部时，其值越小越好 [ 19 ]。 2.7. Topomer CoMFA模型的建立 不同于CoMFA和CoMSIA，Topomer CoMFA不需要采用基于骨架的三维结构叠合。通常Topomer CoMFA的操作流程大致可分为以下两个步骤： 第一、根据训练集分子结构片段建立Topomer的三维模型。通过化合物的结构特点确认化合物结构的断裂方式，Topomer CoMFA可以自动识别结构片段的化学结构和电荷排布，将整个配体分子切割成两个或两个以上的小片段，没有被切割的化合物可以进行手动切割，然后小片段会自行调整，自动生成Topomer模型和小片段的三维构像。 第二、采用偏最小二乘法分析(PLS) [ 20 ]。先通过抽一法(Leave-One-Out)进行交叉验证的CoMFA分析，形成一个预测模型。在生成模型的过程中，CoMFA方法可处理大量数据客观分析和自动匹配相应的化合物结构，以使Topomer CoMFA形成的预测模型更有效 [ 11 ]。然后根据交叉验证得到的最佳主成分数，进行非交叉验证回归，建立回归模型表达式。 采用LOO交叉验证方法作为内部验证，通过公式计算得到交叉验证系数q 2 ，非交叉验证系数r 2 。相关公式与说明如下 [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]： q 2 = 1 − ∑ n = 1 ∞ ( y l ^ − y i ) 2 ∑ n = 1 ∞ ( y i − y ¯ ) 2 式中 y l ^ 和 y i 分别为预测值和实验值， y ¯ 和 y ^ 分别为训练集的实验值和预测值的平均活性值。 ∑ n = 1 ∞ ( y l ^ − y i ) 2 是预测残差平方和(PRESS)。 良好的内部验证只能说明化合物训练集的q 2 较高，但并不表明所建立模型的预测能力较高，因此外部验证是必要的，通过计算测试集的化合物的生物活性来进一步验证3D-QSAR模型的预测能力 [ 22 ]。在交叉验证之后，通常采用常规相关系数r 2 进行非交叉验证分析，计算出的估计标准误差(SEE)和F值。 r 2 = [ ∑ ( y i − y ¯ l ) ( y l ^ − y ^ ) ] 2 ∑ ( y i − y ¯ l ) 2 × ∑ ( y l ^ − y ^ ) 2 通常，交叉验证系数q 2 越大，相关系数越大，SEE越小，表示相关性越好，方程的预测能力越强，q 2 的标准误差(q 2 stderr)和r 2 的标准误差(r 2 stderr)越小说明模型质量越高 [ 11 ]。通常，当交叉验证系数q 2 大于0.5且非交叉验证系数r 2 大于0.6时，说明由该方法所建立的模型是比较理想的Topomer CoMFA模型 [ 25 ]。 2.8. 分子片段划分 以活性最高的化合物11作为模板，将所有化合物按照图1所示的分割方式分割，将分子划分为三个部分，未自动分割的分子进行手动切割，切割后的化合物被自动划分为R1 (红色)、R2 (蓝色)和公共骨架(绿色)。 图1. 模板分子分割方式(左)和片段示意图(右)