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user: 2. 地龙抗肿瘤活性物质 2.1. 成分分类 2.1.1. 蚓激酶 蚯蚓纤溶酶作为地龙主要活性成分之一，具有纤溶活性。沈珊珊等 [ 7 ] 采用体外培养人肝癌细胞系SMMC-7721，通过体外细胞基质黏附实验与侵袭实验，检测蚯蚓纤溶酶对细胞内黏着斑激酶(FAK) mRNA及蛋白表达量的变化，发现蚯蚓纤溶酶可以抑制肝癌SMMC-7721细胞的侵袭和转移。余玲俐 [ 8 ] 对不同浓度的蚓激酶进行研究，通过MTT法检测，流式细胞仪检测以及RT-PCR检测，发现蚓激酶可以明显抑制7402、A549和H1299，肿瘤细胞的形态皱缩，通过建立鼠肝癌细胞H22肝腹水模型研究小鼠的生活状态，发现蚓激酶可以延长小鼠的生存期限，通过体内外的研究，说明蚓激酶具有抑制肿瘤细胞的作用。 2.1.2. 丝氨酸蛋白酶 赵锐 [ 9 ] 等从赤子爱胜蚓提取分离得到一组活性蛋白质成分，进一步研究发现D2(8)组分条带9 (band 9)为同一成分，为一种丝氨酸蛋白酶，其不仅具有抗肿瘤的作用还具有激酶活性。谢江碧等 [ 10 ] 对赤子爱胜蚓提取分离得到一组蛋白含量达到60.43% ± 2.36%，含有多种微量元素如Fe、Zn、Cu以及Se的抗肿瘤活性蛋白组分，研究发现其具有纤溶酶活性还具有纤溶酶原激活酶的活性，还发现该组成分对肿瘤细胞有一定的杀伤力，并发现丝氨酸蛋白酶是细胞杀伤的必要成分之一，认为杀伤肿瘤细胞的是丝氨酸蛋白酶类成分。 2.1.3. 蛋白组分 黄敬文等 [ 11 ] 研究得到地龙蛋白DB-2样品，其分子量为38 kDa，pH值的平均值为7.82，并发现其可以明显抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增值，为治疗增生性瘫痕研发新型药物提供理论基础。陈学东等 [ 12 ] 发现地龙蛋白组分III可以抑制瘤旁微血管生长，抑制肿瘤细胞的转移，从而抑制鼻咽癌的转移，但抑制鼻咽癌生长转移的有效蛋白还需要进一步的研究探讨。林少琴等 [ 13 ] 从太平II号蚯蚓中提取纯化得到糖蛋白组分QY-I，实验表明该组分含糖量为2%并含有16种氨基酸，其可以明显抑制小鼠肝癌H22 (腹水型)增长，延长荷瘤小鼠的生命率，但QY-I组分的生物活性有待进一步研究探讨。 2.1.4. 氨基酸与抗氧化组分 郭建等 [ 14 ] 对地龙活性蛋白进行研究，发现地龙活性蛋白含有丰富的蛋白质和人体必需的微量元素以及氨基酸组分，并发现地龙活性蛋白可以提高免疫细胞的功能，具有抗肿瘤的作用，其抗肿瘤的成分与地龙丰富的氨基酸与所必需的微量元素有关，但具体的有效成分还需要进一步的研究探讨。Hrzenjak等 [ 15 ] 从5蚯蚓中提取分离得到一种糖脂蛋白混合物，其命名为G-90，该物质可以抑制肿瘤细胞在体内生长。Grdisa等 [ 16 ] 研究发现G-9O不仅具有纤溶酶活性，还具有抗氧化酶作用其抑制肿瘤生长可能与这两种活性有关。 2.1.5. 蚯蚓纤溶酶 陈晓彤 [ 17 ] 对蚯蚓进行提取纯化得到抗肿瘤活性蛋白EFP，研究发现该蛋白可以显著抑制MCF7细胞的增值、迁移、运动，其作用机制可能与AK、CD44v6有关系，经过分析鉴定EFP可能与蚯蚓纤溶酶A为同一蛋白。 2.1.6. 其他 何道伟等 [ 18 ] 研究地龙提取液的抗肿瘤作用，发现蚯蚓提取物成分II可以抑制肿瘤细胞的增值，抑制肿瘤内血管的生长，具有抗肿瘤的作用。Tsunada等 [ 19 ] 从蚯蚓中提取分离得到一种含胍乙基基团类物质，且实验发现其可以抑制小鼠自发性乳瘤生长，其抗肿瘤的作用与其所含的胍乙基基团有关。 2.2. 抗肿瘤活性物质提取的方法 2.2.1. 水提法与醇提法 何超等 [ 20 ] 采用冰浴超声提取法的方法提取地龙可溶性蛋白，考察搅碎时间、料液比、提取液的pH对提取物的影响。张宁等 [ 21 ] 采用正交实验的方法，考察浸泡时间、加水量、提取时间对提取物的影响，选出最佳的提取工艺。蒋艳红等 [ 22 ] 采用水提正交法、渗漉法、水提醇沉法提取地龙中氨基酸，考察发现加11倍量水，提取1次，时间2 h，醇沉浓度70%，醇沉时间24 h的提取方法最佳。 2.2.2. 匀浆法与沉淀法 陈晓彤 [ 17 ] 利用匀浆仪加水制备地龙匀浆液，4000 rpm，离心20分钟后取清液进行饱和硫酸铵分级盐析，最终得到不同浓度的抗肿瘤蛋白沉淀。吴庆等 [ 23 ] 采用比较的方法考察地龙可溶性蛋白的提取方法，结果发现匀浆提取法是最佳的提取方法，提取条件为温度25℃，破碎时间1 min，匀浆时间5 min，浸泡时间4.7 h，料液比为1:6，离心时间5 min，离心机转速10，000 r/min。徐晟 [ 24 ] 利用沉淀法提取蚯蚓纤溶酶，加入磷酸缓冲液，用研磨皿组织匀浆蚯蚓得到匀浆液放置离心取上清液，加入硫酸铵晶体离心取沉淀则得到蚯蚓纤溶酶粗提液。郑慧 [ 25 ] 利用热变性沉淀的方法提取蚯蚓纤溶酶，将蚯蚓洗净绞碎后置于4℃预冷的抽提液中，处理后的匀浆离心后收集上清液迅速升温至一定温度，进行选择性热变性处理，再离心取上清液即得到蚯蚓纤溶酶粗提液。 2.3. 抗肿瘤活性物质分离纯化的方法 赵旭壮 [ 26 ] 采用分段式盐析的方法分离纯化地龙抗肿瘤的活性成分，分别观察提取温度、水解时间、pH、底物浓度对提取的影响。代萌 [ 27 ] 利用凝胶过滤层析、DEAE阴离子交换层析、疏水层析的方法对蚯蚓纤溶酶进行分离纯化，最终得到浓度最大，最有活性的D5组分。周鑫悦等 [ 28 ] 应用毛细管区带电泳对地龙多肽成分进行研究，结果发现在20 KV电压下地龙多肽可在10 min内到达基线分离，该方法简单有效，可以快速的分离地龙蛋白。Mahendra等 [ 29 ] 采用Sephadex G-50和deae-纤维素树脂，采用粒度和电荷色谱分离技术对动物进行提取分离，得到一种丝氨酸蛋白酶，研究发现该蛋白酶具有良好的抗肿瘤活性。Zhang Hua等 [ 30 ] 采用超滤的方法提取蚯蚓蛋白、利用凝胶层析和离子交换层析技术从体腔液(ECFP)中分离纯化蚯蚓蛋白。 2.4. 地龙抗肿瘤活性物质含量测定方法 地龙抗肿瘤活性物质含量测定的方法包含光谱法、化学分析法、色谱法三种方法，色谱法分离效率高、分析速度快、选择性好，但定性能力较差；光谱法灵活简单，但易受光学系统参数等外部或内部因素影响；化学分析法应用领域广泛，局限性小。 2.4.1. 光谱法 光谱法有紫外分光光度法与荧光分光光度法等。卓燊等 [ 31 ] 应用紫外分光光度法研究发现地龙蛋白质在0.02~0.10 gm耐范围内线性关系良好，稳定性在50 min内良好，地龙蛋白质含量为2.33 mg/g，RSD为0.627%，此方法简单可行。 2.4.2. 化学分析法 陈丽艳等 [ 32 ] 采用Bradford法(考马斯亮兰可溶性蛋白微量测定法)测定地龙蛋白质含量，研究发现鲜地龙提取液中蛋白质含量为(63.14 ± 0.38)%，干地龙提取物中蛋白质含量为(45.16 ± 0.12)%，该方法简单有效。段晓杰等 [ 33 ] 采用考马斯亮蓝法研究地龙蛋白质含量，结果发现地龙提取液保存在30℃左右，溶液pH值为7时活性最好，蛋白质的含量最高。李婷等 [ 34 ] 利用考马斯亮蓝法、纤维蛋白平板法对地龙提取液中蛋白质进行研究，结果发现地龙蚓激酶在2000~10，000 U∙mL −1 与溶圈面积呈良好线性关系，此方法操作简便有效。 2.4.3. 色谱法 董洪霜等 [ 35 ] 采用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)法对广地龙总蛋白进行分离，结果发现广地龙的蛋白提取物中分离得到3个高丰度蛋白(条带B2，B4，B6)，该方法可行性高。刘阳等 [ 36 ] 采用柱前衍生HPLC法测定地龙中氨基酸含量，该方法安全有效，准确度好，所测氨基酸具有良好的线性关系，r值均在0.9995以上(n = 6)，此方法准确有效。