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user: 3. 结果 3.1. 测序数据统计 文库测序获得的Raw Data经过去除低质量的序列、3’端接头、5’端接头污染物、polyA，以及小于18 nt序列等，6个样品获得的clean reads分别为：23046850 (YJ1)、12556786 (YJ2)、23949192 (YJ3)、20472150 (ZJ1)、18567950 (ZJ2)、22197840 (ZJ3)。通过对6个样品的sRNA进行了长度统计，大多数已知功能的sRNA的长度介于20~24 nt，6个样品的sRNA长度分配模式一致，21 nt的sRNA的丰度最高，占clean reads的比例都在47.75%以上，接着是24 nt、22 nt和23 nt，符合植物sRNA的长度分配。 3.2. sRNA分类注释 在所有注释信息中，可能存在一个sRNA同时比对上两种不同注释信息的情况。为了保证每个unique sRNA只有一个注释，根据rRNAetc > known miRNA > piRNA > repeat > exon > intron的优先顺序将sRNA进行比对 [ 18 ]，没有比对上任何注释信息的sRNA用unann来表示。本实验6个样品的sRNA的分类注释信息见表1。 Table 1 Annotation of sRNA classificatio YJ1 YJ2 YJ3 ZJ1 ZJ2 ZJ3 Total resds 23，674，636 14，465，682 24，805，180 21，113，205 19，050，972 22，881，662 Intron_antisense 131，674 48，028 109，090 106，744 83，648 101，808 Intron_sense 233，195 86，556 213，500 190，080 146，821 183，147 snRNA 176，025 56，293 173，644 205，567 283，041 271，680 Exon_sense 460，594 218，320 509，796 369，665 313，847 415，809 piRNA 48 14 71 11 36 22 unann 9，094，074 4，637，853 8，450，224 7，412，571 6，682，942 8，169，189 rRNA 4，431，366 3，514，466 7，630，749 4，151，611 3，477，815 5，658，974 snoRNA 26，485 17，699 52，689 15，361 21，136 28，442 Exon_antisense 449，479 192，013 421，629 372，045 303，387 365，746 miRNA 7，790，619 3，566，187 5，959，941 7，499，949 7，112，740 6，724，324 tRNA 253，291 219，357 427，859 148，546 142，537 278，699 表1. sRNA分类注释 3.3. 已知miRNA的家族分析 将6个样品所获得的sRNA通过blast或bowtie比对到miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)，获得已知miRNA及所属家族。结果表明6个样品中已知的miRNA属于27个家族和一个尚未定义的家族，结果与甜橙所含有的miRNA家族一致。 3.4. 新miRNA的预测 对未注释上任何RNA但比对上基因组外显子反义链、内含子以及基因间的sRNAs，利用生物信息学分析软件Mireap或mirdeep对其进行分析。经过比对注释，在YJ1、YJ2、YJ3、ZJ1、ZJ2、ZJ3中分别鉴定出1184、476、836、640、739和801个新miRNA。 3.5. 自交与异交花柱间差异表达的已知miRNA和新miRNA分析 分别比较YJ1/ZJ1、YJ2/ZJ2、YJ3/ZJ3归一化表达水平的miRNA，以log2绝对值大于1为筛选条件，寻找差异表达miRNA。结果在YJ1/ZJ1、YJ2/ZJ2、YJ3/ZJ3的比对中共获得了16个差异表达的已知miRNA以及23个差异表达的新miRNA (表2)。 Table 2 Differential expression miRNA between cross-pollinated and self-pollinated style 基因号 序列 Fc (YJ1/ZJ1) Fc (YJ2/ZJ2) Fc (YJ3/ZJ3) novel_mir_220 CCACCGTTGTATTGTATGAGA 1.80 −5.39 3.91 novel_mir_152 TTGGCCCCTGTAGAATTAGAATT −4.24 −3.97 −5.11 novel_mir_1801 AGAGAAACAAGGAAAGTAGAATT −5.14 −4.89 4.40 miR9479−3p AGAGAATGGTCAGAGGTGTCGGA −5.22 −6.642 −7.26 novel_mir_83 GAGAACCTTGGACTTAGACTCTT −5.41 4.00 −6.27 miR5139 AACCTGGCTCTGATACCA 1.07 1.37 1.33 novel_mir_103 CTAGCTGCTGTAACTTAGAAACT 4.85 −4.39 4.84 novel_mir_122 ATTTACTGACACACTTTGACAG 3.93 −4.50 −4.73 novel_mir_14 TGACTCGTGAGTTGGCCTTG −13.68 −12.87 −13.91 miR6171 TTGTGAGAATCTGAAGGCTTT −6.70 −5.54 1.40 novel_mir_125 CAAAGCTTGTAGAACTTGGCATC 6.57 −1.30 −6.99 miR419 TTGATGAATGGTTAGGATTTG −6.70 −5.54 9.67 novel_mir_310 TTACCAACATTCTGAAGCCGT 1.18 −1.00 7.57 novel_mir_172 TATTGTTAGAGGATAGACTGCCT −4.94 −5.39 −4.73 miR5813 AACAGCCTCTGGTCGATGGA −10.77 −7.79 2.89 miR5492 AGAAGGAAGAATTATGAATGAGTT 6.59 −4.07 6.48 novel_mir_1995 CTGGACTTCTTTGACATGAAG −5.41 −5.26 −3.99 miR7708b−3p AGAATGGACTGAGAATTGAATGG −9.99 10.19 10.74 novel_mir_48 CTAGATGGAACTGTGGCACGG 5.85 −1.75 4.68 novel_mir_453 CAGGATACCTCGTGGATAAGACT 5.93 −4.80 5.50 miR7995 TTAACACGTAGAACAATAGACATT −1.16 −4.89 6.68 miR6173 TAGCCGTAAACGATGGATACT 4.75 6.26 8.11 novel_mir_965 GGGGGGTTCGAACTGCTGCCC 3.76 −4.26 −4.99 novel_mir_1345 TGGATGCAACTGTAGTACGGT −6.04 −1.26 −4.87 novel_mir_187 GCAACTGTGGTACTGTGCCA −7.41 −5.66 6.15 novel_mir_339 TAATCAAAGATACACAAGGCT −6.79 −5.33 6.26 novel_mir_1178 AAATCTGTGACTTCGAAACCT 1.55 −1.39 5.95 novel_mir_488 ACCAGCGCTGCACTCGATCAT −1.49 −5.39 5.88 miR9759 TCATAACAATTGTAGAATTATAAT 1.31 −5.63 7.30 novel_mir_87 TTGGTTGAATGAAAATATAAAAT −4.70 −4.12 −4.99 novel_mir_208 TTGACAGAAGAGAGTGAGCAC −7.87 −8.33 7.19 novel_mir_397 GGGCATCGGATCGGATTTGGA 4.93 4.52 4.29 miR9496 CAGGTTGGGCTTGCTGGGTC 8.02 9.20 9.57 miR172a−5p GCAGCGTCCTCAAGATTC 1.87 1.96 1.68 miR5712 AATTATTAAATAATTGAGTGGAGC 8.84 −6.82 8.63 miR841a−5p GACGAGACCTTGAAAGCTGAA −7.59 8.65 −7.44 miR8024a−5p CGAGATTTTAAAGACTTACAACT −7.286 −6.01 −7.51 novel_mir_379 TGACTCGTGAGTTGGCCTTGT 12.63 12.67 13.3 miR2089-5p TTACCTATGCCACCCATTCCT 7.63 7.92 7.86 表2. 异交/自交花柱差异表达miRNA 注：表中数值为2个样品间表达量的log2值。 3.6. 自交和异交上调或下调差异表达miRNA分析 对自交和异交花柱中持续上调或下调的miRNA的分析有助于自交不亲和相关miRNA确定。因此本文对自交和异交授粉花柱中持续上调或下调的miRNA进行统计，在异交1~3 d花柱中持续上调的miRNA为28个，其中，已知miRNA 23个，新miRNA 5个。而在异交1~3 d持续下调的miRNA仅为4个，其中，已知miRNA 2个，新miRNA 2个。 在自交在异交1~3 d花柱中持续上调的miRNA为21个，其中，已知miRNA 20个，新miRNA 1个。持续下调的miRNA为12个，其中，已知miRNA 7个，新miRNA 5个。 3.7. 自交和异交花柱特有差异表达miRNA及其靶基因功能 对沙田柚自交授粉和异交授粉的特有miRNA及靶基因参与的GO与KO代谢途径进行分析，发现自交花柱特有的miRNA为40个，异交花柱特有的miRNA共32个。这些miRNA靶基因的功能涉及到RNA降解、转录因子、植物激素、植物与病原菌相互作用、结合功能、激酶以及蛋白质在内质网的合成等代谢过程。