system: [SYSTEM]

user: 3. 结果 3.1. 苓荷颗粒潜在活性成分筛选 苓荷颗粒中8味药的成分共有8137个，共筛选到潜在活性成分134个。包括茯苓15个；陈皮5个；荷叶15个；玉米须12个；佛手5个；丹参65个；决明子14个；山楂3个(表1)。 Table 1 Active ingredients of 8 herbs in Linghe granules (only 3 active ingredients are listed for each herb MOL Name MW OB DL Fu Ling MOL000273 (2R)-2-[(3S，5R，10S，13R，14R，16R，17R)-3，16-dihydroxy-4，4，10，13，14-pentamethyl-2，3，5，6，12，15，16，17-octahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-enoic acid 470.76 30.93 0.81 Fu Ling MOL000275 trametenolic acid 456.78 38.71 0.8 Fu Ling MOL000276 7，9(11)-dehydropachymic acid 526.83 35.11 0.81 Chen Pi MOL004328 Naringenin 272.27 59.29 0.21 Chen Pi MOL005100 5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman -4-one 302.3 47.74 0.27 Chen Pi MOL005815 Citromitin 404.45 86.9 0.51 He Ye MOL000098 Quercetin 302.25 46.43 0.28 He Ye MOL000354 Isorhamnetin 316.28 49.6 0.31 He Ye MOL000359 Sitosterol 414.79 36.91 0.75 Yu Mi Xu MOL013357 (3S，6R，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-17- [(1R，4R)-4-ethyl-1，5-dimethylhexyl]-10，13-dimethyl-2，3，6，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3，6-diol 430.79 34.37 0.78 Yu Mi Xu MOL003044 Chryseriol 300.28 35.85 0.27 Yu Mi Xu MOL010862 α-tocopheryl quinone 446.79 35.91 0.5 Fo Shou MOL001323 Sitosterol alpha1 426.8 43.28 0.78 Fo Shou MOL013253 5，2'，5'-Trihydroxy-6，7，8-trimethoxyflavone 376.34 37.49 0.43 Fo Shou MOL001506 Supraene 410.8 33.55 0.42 Dan Shen MOL001601 1，2，5，6-tetrahydrotanshinone 280.34 38.75 0.36 Dan Shen MOL001659 Poriferasterol 412.77 43.83 0.76 Dan Shen MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 414.79 36.91 0.75 Jue Ming Zi MOL006486 Obtusin 344.34 31.24 0.4 Jue Ming Zi MOL006472 Aurantio-obtusin 330.31 31.55 0.37 Jue Ming Zi MOL005043 campest-5-en-3beta-ol 400.76 37.58 0.71 Shan Zha MOL005384 Suchilactone 368.41 57.52 0.56 Shan Zha MOL000073 Epicatechin 290.29 48.96 0.24 Shan Zha MOL001645 linoleyl acetate 308.56 42.1 0.2 表1. 苓荷颗粒中8味药活性成分(每味药只列出3个活性成分) 3.2. 苓荷颗粒–靶点构建 基于TCMID数据库中现存所有的中药成分–靶点数据信息，输入前述134个苓荷颗粒潜在活性成分，寻找苓荷颗粒–靶点。共获得258个潜在靶点基因(图1)。 3.3. MAFLD疾病靶点的预测 OMIM共检索获得MAFLD的238个靶点基因；Genecards共检索获得MAFLD的847个靶点基因；去除重复的，共获得1029个MAFLD的靶点基因。 3.4. 苓荷颗粒作用靶点与MAFLD相互作用网络 将获得的258个苓荷颗粒作用靶点与1029个MAFLD疾病靶点共同输入STRING数据库，构建药物作用靶点–疾病靶点PPI网络。本实验中：degree = 37，closeness = 0.425256，clustering coefficient = 0.403129，topological coefficient = 0.145755 和betweenness = 0.000416。选取同时满足上述三个阈值的节点作为此网络的关键节点，共77个(表2)。 图1. 苓荷颗粒成分–靶点网络图(134个潜在活性成分及258个潜在靶点基因) Table 2 77 key target gene Target name Gene name Degree Betweenness Centrality Closeness Centrality Clustering Coefficient Topological Coefficient E2F1 E2F transcription factor 1 55 4.37E−04 0.448 0.494 0.149 FGF19 fibroblast growth factor 19 53 7.22E−04 0.459 0.430 0.160 GGT1 gamma-glutamyltransferase 1 75 1.70E−03 0.484 0.412 0.152 IL18 interleukin 18 107 7.84E−04 0.472 0.540 0.157 SLC2A1 solute carrier family 2 member 1 72 4.85E−04 0.479 0.512 0.165 TIMP1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1 129 1.05E−03 0.489 0.477 0.151 TGFB1 transforming growth factor beta 1 122 1.04E−03 0.492 0.496 0.152 HGF hepatocyte growth factor 121 1.35E−03 0.494 0.486 0.150 CD68 CD68 molecule 103 1.29E−03 0.480 0.485 0.147 TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2 65 4.88E−04 0.463 0.569 0.173 NCF1 neutrophil cytosolic factor 1 69 6.08E−04 0.469 0.490 0.158 NOS2 nitric oxide synthase 2 98 1.67E−03 0.487 0.464 0.151 MMP3 matrix metallopeptidase 3 101 9.66E−04 0.474 0.528 0.164 LCN2 lipocalin 2 73 9.45E−04 0.455 0.415 0.152 VDR vitamin D 73 6.19E−04 0.471 0.460 0.168 CYP19A1 cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 66 7.55E−04 0.466 0.449 0.164 SELE selectin E 83 9.33E−04 0.457 0.622 0.178 F3 coagulation factor III， tissue factor 71 6.98E−04 0.455 0.531 0.171 CTGF connective tissue growth factor 89 1.07E−03 0.475 0.550 0.166 CNR1 cannabinoid receptor 1 77 5.51E−04 0.455 0.501 0.154 GPX7 glutathione peroxidase 7 48 6.92E−04 0.451 0.470 0.152 LEPR leptin receptor 70 6.99E−04 0.455 0.448 0.158 LOX lysyl oxidase 86 2.28E−03 0.476 0.470 0.159 EGR1 early growth response 1 106 6.39E−04 0.486 0.493 0.159 IRF1 interferon regulatory factor 1 79 6.78E−04 0.465 0.510 0.155 CDH2 cadherin 2 102 1.10E−03 0.484 0.463 0.150 GJA1 gap junction protein alpha 1 66 1.29E−03 0.468 0.450 0.168 TERT telomerase reverse transcriptase 78 4.64E−04 0.482 0.493 0.157 PGR progesterone receptor 89 8.33E−04 0.479 0.472 0.157 CASP9 caspase 9 106 7.39E−04 0.496 0.519 0.151 ESR2 estrogen receptor 2 69 5.79E−04 0.473 0.490 0.171 ALPL alkaline phosphatase， liver/bone/kidney 48 8.03E−04 0.464 0.443 0.158 TLR9 toll like receptor 9 104 6.60E−04 0.484 0.534 0.152 BGLAP bone gamma-carboxyglutamate protein 70 5.81E−04 0.474 0.489 0.160 RUNX2 runt related transcription factor 2 97 1.05E−03 0.487 0.459 0.150 IGF2 insulin like growth factor 2 101 1.28E−03 0.480 0.448 0.147 CDKN1A cyclin dependent kinase inhibitor 1A 111 2.84E−03 0.492 0.474 0.148 ALOX5 arachidonate 5-lipoxygenase 55 7.80E−04 0.457 0.457 0.168 VIM Vimentin 49 6.24E−04 0.460 0.412 0.158 MCL1 BCL2 family apoptosis regulator 97 8.43E−04 0.488 0.503 0.151 LMNA lamin A/C 64 1.66E−03 0.481 0.430 0.159 ITGB3 integrin subunit beta 3 61 4.86E−04 0.457 0.430 0.160 IRF3 interferon regulatory factor 3 76 9.55E−04 0.468 0.458 0.151 PDGFRB platelet derived growth factor receptor beta 94 1.11E−03 0.478 0.440 0.151 TGFBR1 transforming growth factor beta receptor 1 64 8.98E−04 0.469 0.436 0.153 CCR2 C-C motif chemokine receptor 2 89 5.35E−04 0.458 0.550 0.158 CCL5 C-C motif chemokine ligand 5 125 9.25E−04 0.477 0.489 0.149 NAMPT nicotinamide phosphoribosyltransferase 63 1.41E−03 0.465 0.427 0.148 IGFBP1 insulin like growth factor binding protein 1 72 6.02E−04 0.455 0.437 0.152 CEBPB CCAAT/enhancer binding protein beta 87 2.60E−03 0.476 0.425 0.151 SOCS3 suppressor of cytokine signaling 3 104 2.60E−03 0.484 0.433 0.149 SIRT6 sirtuin 6 64 1.27E−03 0.475 0.404 0.148 NLRP3 NLR family pyrin domain containing 3 76 8.08E−04 0.467 0.582 0.170 ADIPOR1 adiponectin receptor 1 43 2.15E−03 0.447 0.563 0.179 PTPN1 protein tyrosine phosphatase， non-receptor type 1 69 6.01E−04 0.474 0.518 0.171 IGFBP3 insulin like growth factor binding protein 3 93 5.56E−04 0.473 0.454 0.155 TNFSF11 tumor necrosis factor superfamily member 11 110 7.21E−04 0.482 0.474 0.153 DDIT3 DNA damage inducible transcript 3 72 4.52E−04 0.479 0.500 0.160 VTN Vitronectin 57 4.90E−04 0.458 0.503 0.162 MET MET proto-oncogene， receptor tyrosine kinase 79 3.31E−03 0.478 0.537 0.163 MYD88 myeloid differentiation primary response 88 102 1.22E−03 0.483 0.528 0.147 RAF1 Raf-1 proto-oncogene， serine/threonine kinase 84 5.64E−04 0.482 0.443 0.150 PLAU plasminogen activator， urokinase 76 7.48E−04 0.475 0.477 0.160 AHR aryl hydrocarbon receptor 80 9.65E−04 0.476 0.429 0.154 TNFRSF1A TNF receptor superfamily member 1A 111 1.25E−03 0.488 0.496 0.148 BIRC3 baculoviral IAP repeat containing 3 64 2.09E−03 0.458 0.511 0.159 BIRC2 baculoviral IAP repeat containing 2 65 7.52E−04 0.462 0.446 0.147 XBP1 X-box binding protein 1 68 1.42E−03 0.472 0.475 0.158 ERBB3 erb-b2 receptor tyrosine kinase 3 58 4.37E−04 0.466 0.604 0.182 BIRC5 baculoviral IAP repeat containing 5 49 5.75E−04 0.445 0.514 0.154 CTSB cathepsin B 69 5.43E−04 0.466 0.503 0.166 EPHA2 EPH receptor A2 47 4.29E−04 0.460 0.537 0.173 MAP3K5 mitogen-activated protein kinase kinasekinase 5 70 4.76E−04 0.473 0.492 0.158 ATF6 activating transcription factor 6 51 4.21E−04 0.461 0.511 0.165 MAPK9 mitogen-activated protein kinase 9 90 6.02E−04 0.484 0.498 0.159 TNFAIP3 TNF alpha induced protein 3 57 1.35E−03 0.446 0.486 0.146 TGFBR2 transforming growth factor beta receptor 2 52 4.78E−04 0.466 0.470 0.156 表2. 77个关键靶点基因 3.5. 中药–成分–直接靶点–间接靶点-pathway网络构建 将苓荷颗粒258个潜在靶点基因与77个关键靶点基因进行交集，得到的交集中的28个基因视为直接靶点基因。其余49个基因为间接靶点基因(图2)。 图2. 苓荷颗粒258个潜在靶点基因与77个关键靶点基因交集分析 进一步将此中药–成分–靶点网络与2.4中苓荷颗粒作用靶点与MAFLD相互作用网络整合，获得中药–成分–直接靶点–间接靶点–pathway整体网络，包括36个潜在活性成分，28个直接靶点，49个间接靶点及部分关键基因通路(图3)。 图3. 中药–成分–直接靶点–间接靶点-pathway网络 对77个关键靶点基因进行生物功能注释，分析GO下的分子功能BP和KEGG pathway。发现77个关键靶点基因涉及TNF信号通路，MAPK信号通路，非酒精性肝病等通路(前15个term) (图4)。 图4. 77个关键靶点基因的GO和KEGG pathway功能分析 3.6. WGCNA分析MAFLD相关潜在靶点基因 运用GEO下载的MAFLD数据集进行差异基因分析，找到差异基因2796个。将上述差异基因进行WGCNA分析。为使构建的网络更符合无标度网络的特性，软阈值设置为4 (图5(a))。基于加权算法进行层次聚类分析，根据设定的软阈值和临床指标聚类结果进行分割，得到不同的基因模块(图5(b)~(d))。根据软阈值 = 4，模块内基因数n ≥ 20，模块切割高度0.25的标准化，确定14个模块。这14个模块与MAFLD的疾病与否、严重程度活动度积分及肝纤维化分期相关性见图5(c)。greenyellow，salmon，blue和brown前四个模块(图5(c)绿色框)和MAFLD的疾病发展显著相关性(P < 0.0001)。将这四个模块中的1213个基因和77个关键基因相对比，发现GGT1，E2F1，LMNA，CDKN1A和IGFBP15个重复出现的基因。因此，推测这5个基因可能参与MAFLD的发生发展，并且有可能成为苓荷颗粒治疗MAFLD的潜在靶点，从而选择它们进行下一步研究。 图5. WGCNA分析。(a) WGCNA分析中的尺度独立性和平均连通性分析；(b) 聚类树状图；(c) 14个基因模块和临床特征值的相关性分析热图；(d) 不同模块间相关性热图 3.7. GGT1，E2F1，LMNA，CDKN1A和IGFBP1在数据集中的表达 对这5个基因在MAFLD患者中的表达情况进行分析，随着MAFLD的发展，GGT1，E2F1，LMNA，和CDKN1A的表达显著升高；而IGFBP1则相反，随着MAFLD的发展，其表达显著降低(图6)。 图6. GGT1，E2F1，LMNA，CDKN1A和IGFBP1在MAFLD不同阶段患者中的表达情况