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user: 3. 结果与讨论 3.1. 不同菌株培养历程比较 3.1.1. 培养历程中的pH、还原糖的变化 培养历程中，5株木葡糖酸醋杆菌的培养液pH值在头3天内急剧下降，随后转变为缓慢下降趋势直至培养终止(如图1(a)所示)。该变化趋势与文献报道的以葡萄糖为碳源木葡糖酸醋杆菌产纤维素时的pH变化过程一致 [ 9 ] 。五株细菌中，ATCC23770培养液的pH值从初始5.0迅速降低至3 d后的3.6，随后下降趋势变慢，至21 d培养终止时为3.2。在整个培养历程中，该菌株的pH值均高于其余4株菌。实验室选育的其它4株菌的培养历程pH值变化曲线较为接近，其中DHU-ZGD-1培养液中的pH值不仅在3 d内快速降至3.2，而且随后缓慢降至2.5 (21 d)，为所有菌株中最低水平。以葡萄糖为碳源时，木葡糖酸醋杆菌首先利用细胞膜上的葡萄糖脱氢酶及酮基葡萄糖酸脱氢酶将胞外培养基中的葡萄糖转化为(酮基)葡糖酸，以提供大量的还原氢供给菌体生长繁殖所需的能量，这使得培养基中的pH迅速下降 [ 10 ] 。Yang发现以葡萄糖为唯一碳源时，木葡糖酸醋杆菌在延迟及生长期中倾向利用葡萄糖转为(酮基)葡糖酸用于细胞增殖及代谢，而后利用(酮基)葡糖酸进一步生产纤维素及其它代谢产物 [ 11 ] 。培养3 d后，pH值变化趋缓，这是由于(酮基)葡糖酸转化完全后，木葡糖酸醋杆菌的多种产酸代谢途径利用葡萄糖及(酮基)葡糖酸产生的多种有机酸在培养基中逐步累积，使得pH值进一步缓慢下降 [ 12 ] 。 图1. 不同菌株培养过程中pH和还原糖的变化 五株菌培养过程中的残糖变化如图1(b)所示，培养基中残糖浓度呈现逐步下降趋势。培养头3 d内，ATCC23770和DHU-YQ-1的耗糖降幅最大，说明初期耗糖速率明显高于其它3株菌。而在3 d后，ATCC23770培养液中的残糖浓度下降速度迅速变慢，残糖浓度曲线呈现平缓但稳定地下降。ATCC23770菌株在培养终止时的糖消耗率仅为37.5% (如表1所示)，远远低于其它菌株。ATCC23770糖代谢利用水平低于其它菌株的情况，与其pH变化所反映的该菌株远低于其它菌株的代谢产酸水平的情况相一致。而DHU-YQ-1在3 d后的残糖浓度仍保持较高的糖消耗速率，消耗速率随着残糖浓度的减少逐步降低。除ATCC23770外，其它四株菌在9-12 d内均能够保持较高的糖消耗速率。菌株DHU-ATCC-1在初始3 d内的糖消耗降幅较低，3 d糖浓仅下降了2.0 g/L，明显低于其它菌株，但随后的糖消耗情况类似于其它菌株，保持了较高的糖消耗速率。 总体上，21 d培养过程中，菌株DHU-ZCY-1的日均耗糖速率最高，为平均每天1.68 g/L (见表1)，21 d的总消耗量达到了88.3%；其次是菌株DHU-ZGD-1，每天1.52 g/L，消耗量达到80.0%；而ATCC23770的糖耗速率最低，平均每天仅0.73 g/L，21 d后糖浓由最初的40 g/L降到25 g/L，利用率仅占总添加量的37.5%。耗糖量与平均耗糖速率由高到低依次排序为DHU-ZCY-1 > DHU-ZGD-1 > DHU-ATCC-1 > DHU-YQ-1 > ATCC23770。其中DHU-ZCY-1的糖利用率是ATCC23770的近2.5倍。以上结果表明，以40 g/L初始糖浓培养生产细菌纤维素，相比于对照标准菌ATCC23770，自选育的4株菌能够更充分利用培养基中的葡萄糖，具有更高的葡萄糖利用率(利用率达74%~88%)。 3.1.2. 培养历程中细菌纤维素产量的变化 图2(a)为细菌纤维素产量随培养时间的变化趋势。从图2(a)可知，5株菌株的BC产量均呈现典型的微生物产物增长曲线，即随着培养时间的延长BC产量逐步累积增加，增加幅度随着接近最终稳定期而逐步减少，直至达到稳定。其中ATCC23770的BC产量远低于其它四株菌，BC产量在前12 d中均仅少许增加，直到12 d后才出现小幅提升，在18 d接近稳定期。而另外4株菌的BC产量均在前3 d内增加缓慢，随后开始迅速增加。其中DHU-ZCY-1的纤维素合成速率最快，增长期持续时间最长，直到15 d后纤维素产量才基本不再增加，最终产量达3.9 g/L。该变化趋势与糖消耗过程中(图1(b))的糖浓下降过程高度一致。其余3株自选育菌株的BC增长曲线比较接近，在3 d缓慢增长后，能快速提升，最后的产量增速虽不及DHU-ZCY-1，但仍然能持续增长，与其葡萄糖消耗情况也非常吻合。 图2(b)为各菌株培养历程中BC的耗糖转化率随着培养历程的变化。其中，菌株ATCC23770的BC耗糖转化率总是最低的，随着培养进行逐步增加，直至稳定。这是由于通常菌株在培养初期，消耗糖的目的主要用于菌体自身的生长繁殖 [ 13 ] ，而并不用于BC的生产，在培养的中后期葡萄糖代谢才逐步转向纤维素合成路径进行BC生产。但值得注意的是，自选育菌株DHU-ATCC-1在BC累计耗糖转化率的最高水平出现在其培养初期第3天，随着培养进行累计糖转化率水平逐步下降至稳定水平。这表明DHU-ATCC-1在培养初期就将所消耗的葡萄糖大量用于纤维素的合成，但随着菌体的增殖，用于纤维素生产的葡萄糖占总糖消耗的比例反而大幅降低。 Table 1 Total consumption and daily average consumption of glucose in the 21-d cultivation of G. xylinu 分析指标 ATCC23770 DHU-ZCY-1 DHU-ZGD-1 DHU-ATCC-1 DHU-YQ-1 糖消耗量(%) 37.5 ± 0.8 88.3 ± 0.5 80.0 ± 0.8 76.5 ± 1.1 74.0 ± 0.9 平均耗糖速率 (g∙[L∙d] −1 ) 0.73 ± 0.12 1.68 ± 0.14 1.52 ± 0.04 1.46 ± 0.13 1.40 ± 0.14 表1. 培养21 d内的葡萄糖消耗率和日平均消耗速率 图2. 不同菌株培养过程中细菌纤维素产量和产物耗糖转化率的变化 3.1.3. 不同菌株培养结果的比较 从各菌株培养结束后的结果来看(如表2显示)，培养21 d后各菌株BC产量由高到低依次排序为：DHU-ZCY-1 (3.91 g/L) > DHU-ATCC-1 (2.62 g/L) > DHU-ZGD-1 (2.34 g/L) > DHU-YQ-1 (1.72 g/L) > ATCC23770 (0.61 g/L)，与葡萄糖消耗率排序一致。从最终BC产率来看，葡萄糖用于纤维素生产的产率由高到低的依次排序为：DHU-ZCY-1 (0.19 g·(L∙d) −1 ) > DHU-ATCC-1 (0.12 g·(L∙d) −1 ) > DHU-ZGD-1 (0.11 g·(L∙d) −1 ) > DHU-YQ-1 (0.08 g·(L∙d) −1 ) > ATCC23770 (0.03 g·(L∙d) −1 )，与BC总产量、葡萄糖消耗率均一致。其中ATCC23770菌株的产率不到其它菌株的一半。各菌株获得的BC膜的含水率均达到99%以上，即木葡糖酸醋杆菌不同菌株对BC含水率基本没影响。总的来看，所研究的5株木葡糖酸醋杆菌中，DHU-ZCY-1、DHU-ATCC-1和DHU-ZGD-1属于具备较高BC产量性能的菌株，更能够较彻底地利用培养基中葡萄糖，并且所耗糖中用于纤维素生产的比例也更高。 3.2. 不同菌株生产的细菌纤维素性能比较 3.2.1. 细菌纤维素微结构比较 由于结构类似，这里每一菌株仅各呈现一张SEM显微照片作为代表。如图3所示，A-E分别依次代表菌株DHU-ATCC-1、DHU-ZGD-1、DHU-YQ-1、DHU-ZCY-1和ATCC23770。这些照片显示各菌株的每个样品均呈现BC典型的致密纳米纤维网络结构，不同菌株生产的BC膜间，其微观结构并无显著差异。通过对纤维随机取100处测量的结果显示，木葡糖酸醋杆菌5株菌种之间生产的细菌纤维素的平均直径有差异，平均直径在67~91 nm之间，且DHU-ATCC-1、DHU-ZGD-1、DHU-YQ-1、DHU-ZCY-1获得的细菌纤维素的平均直径比标准菌株ATCC23770的大。 3.2.2. 细菌纤维素结晶度比较 表3显示5株木葡糖酸醋杆菌生产的BC都具有较高的结晶度，其中DHU-ZGD-1生产的BC结晶度最高，为83.5%，DHU-ATCC-1生产的BC结晶度最低，为78.5%。另外，木葡糖酸醋杆菌DHU-ZCY-1、DHU-YQ-1和ATCC23770生产的BC结晶度分别为80.5%、79.1%和78.8%。以上结果表明以葡萄糖为碳源，五种木葡糖酸醋杆菌生产的BC的结晶度差异不大。 3.2.3. 拉伸性能比较 用万能材料测试机测定细菌纤维素湿膜的拉伸强度，结果如表3所示。菌株DHU-ZGD-1所生产的 Table 2 Comparison of the cultivation results with the different strains of G. xylinu 菌株 BC最大产量 /g∙L −1 终点残糖 /g∙L −1 含水率 /% BC最大耗糖转化率 /g∙g − 1 BC产率 /g∙(L∙d) −1 ATCC23770 0.6 ± 0.1 25.0 ± 1.2 99.6 ± 0.1 0.042 (21 d) ± 0.001 0.03 ± 0.01 DHU-ATCC-1 2.6 ± 0.1 9.4 ± 1.1 99.0 ± 0.1 0.19 (3 d) ± 0.02 0.12 ± 0.02 DHU-YQ-1 1.7 ± 0.1 10.4 ± 0.8 99.3 ± 0.1 0.11 (6 d) ± 0.01 0.08 ± 0.01 DHU-ZCY-1 3.9 ± 0.1 4.7 ± 1.4 99.1 ± 0.1 0.10 (15 d) ± 0.01 0.19 ± 0.02 DHU-ZGD-1 2.3 ± 0.1 8.0 ± 1.9 99.3 ± 0.1 0.072 (21 d) ± 0.002 0.11 ± 0.01 表2. 不同菌株培养结果比较 图3. 细菌纤维素膜的扫描电镜照片(10，000×)和纤维直径分布图 Table 3 Effects of strain types of G. xylinus on the crystallinity and tensile properties of B