DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 疲劳S-N曲线 表1给出了采用升降法获取含BVID冲击损伤复合材料试验件疲劳门槛值(10 6 次疲劳寿命对应的疲劳强度)的数据表。由表1可以看出，其升降法的应力区间在59%~63%，应力区间较小，该材料表现出较好的疲劳稳定性。按照GB/T 24176-2009计算其疲劳门槛值，可得其按照强度表示的疲劳门槛值为163 MPa，按照应变表示的疲劳门槛值为3880 με。按疲劳门槛值强度/静强度百分比表示的疲劳门槛值为63.4%。 Table 1 Data sheet for determination of fatigue threshold by up-down metho 应力水平 疲劳试验结果(X表示未达到10 6 ，O表示件达到10 6 ) σ max /σ CAI σ max (MPa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 65% 167.1 X X X X X 63% 161.9 O X O O O O X O 61% 156.8 O O 表1. 升降法测定疲劳门槛值的数据表 图2给出了采用组合法绘制的含BVID冲击损伤复合材料试验件中值S-N曲线。由图2可见，含BVID冲击损伤T300级织物复合材料层压板的S-N曲线可以拟合为对数线性曲线。 图2. 中值S-N曲线
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user: 4. 刚度变化 疲劳试验过程中试验件的刚度可以简单的表征为试验机夹头在载荷峰值与载荷谷值之间的位移差。如果在整个疲劳过程中，该位移差保持始终恒定，则表明试验件在整个疲劳过程中刚度未发生变化。如果该位移差在疲劳试验过程中不断变大，则表明该试验件的刚度在不断变小。 图3为典型的80%应力水平疲劳试验过程中载荷峰值与谷值处夹头位移差和循环次数之间曲线。可以看出：对于这类疲劳破坏循环次数在几万次之内的试验件，疲劳试验的初期和中期其刚度一直在缓慢减小；在临近疲劳破坏时(约破坏前的100次循环开始)，试验件的刚度开始快速减小，直至突然破坏。 图4为典型的70%应力水平疲劳试验过程中载荷峰值与谷值处夹头位移差和循环次数之间曲线。可以看出：对于这类疲劳破坏循环次数在10万次之上的试验件，疲劳试验的初期和中期其刚度基本保持为恒定值，没有明显变化(变化小于1%)；在疲劳试验的后期(约剩余5万次疲劳寿命)，试验件刚度缓慢减小；临近疲劳破坏时(约破坏前的100次循环开始)，试验件的刚度开始快速减小，直至突然破坏。 图5为典型的应力水平在疲劳门槛值之下(小于63.4%)未发生破坏试验件在疲劳试验过程中载荷峰值与谷值处位移差与循环次数之间曲线。可以看出：对于10 6 次循环疲劳试验过程中未发生破坏的试验件，在整个疲劳试验过程中试验件的刚度基本保持为恒定值，没有明显变化(实际上也一直在缓慢减小，但变化小于1%)。 图3. 80%应力水平疲劳试验过程中试验件刚度的变化曲线 图4. 70%应力水平疲劳试验过程中试验件刚度的变化曲线 图5. 应力水平在疲劳门槛值之下且未疲劳破坏的试验件在疲劳试验过程中的刚度变化曲线
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user: 5. 损伤扩展 图6为一件在70%应力水平下进行疲劳试验的试验件在试验过程中采用超声C扫描无损检测所得的冲击分层损伤图像。该试验件的疲劳寿命为230，017次。由图中可以看到，在除疲劳末期的整个疲劳试验过程中，分层损伤一直在非常缓慢扩展，这种扩展主要发生在轮廓的边缘处，使“尖锐”或者“不连贯”的分层边界轮廓趋于“平滑”或者“连续”，而且这种损伤扩展不仅发生在层压板的最下面或者上面，而是同时出现在多个铺层之间。 图6. 疲劳试验过程中的分层损伤扩展 图7中分别给出了两件分别在63%和61%应力水平下经过10 6 次循环未发生疲劳破坏的试验件在疲劳试验之前和疲劳试验之后的超声C扫描无损检测图片。由该图可以看出，即使这些试验件在疲劳门槛值附件的应力水平下经历了10 6 次循环未发生破坏，但在疲劳过程分层仍发生了缓慢地扩展。 图7. 疲劳试验前后的分层损伤扩展 根据上面的超声C扫描无损检测结果的对比分析，可以看出：在较高的疲劳应力水平下(约55%~70%)，含BVID冲击损伤复合材料层压板的分层损伤实际上一直在非常缓慢的扩展，这种扩展主要发生在轮廓的边缘处，使“尖锐”或者“不连贯”的分层边界轮廓趋于“平滑”或者“连续”，而且这种损伤扩展出现在多个铺层之间。该结论和前面的第5节的刚度变化规律是一致的，这是因为刚度变化的正是由于冲击损伤的扩展所导致的。疲劳试验过程中随着分层的缓慢扩展，复合材料层压板试验件的整体刚度会发生缓慢的较小。 在使用“损伤无扩展”设计理念进行复合材料结构设计时，一定要关注结构所遭受的疲劳应力水平，在较高的疲劳应力水平下(约含冲击损伤结构静强度的55%~70%)冲击分层损伤会发生缓慢的扩展。因此在采用“损伤无扩展”设计理念进行复合材料结构设计时，进行适量的含冲击损伤复合材料结构疲劳试验(并在疲劳试验中监控损伤扩展情况)是非常有必要的。
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user: 6. 研究结论 a) 采用升降法获取该国产T300织物复合材料层压板含BVID冲击损伤的疲劳门槛值时，其升降法的应力区间在59%~63%，应力区间较小，该国产复合材料具有较好的疲劳稳定性。含BVID冲击损伤T300织物复合材料层压板的S-N曲线可以拟合为对数线性曲线。 b) 对于疲劳破坏循环次数在几万次之内的复合材料层压板：疲劳试验的初期和中期，其刚度一直在缓慢减小，在临近疲劳破坏时(约破坏前的100次循环开始)其刚度开始快速减小，直至突然破坏。 c) 对于疲劳破坏循环次数在10万次之上但不超过100万次的复合材料层压板：疲劳试验的初期和中期，其刚度基本保持为恒定值，没有明显变化(变化小于1%)，在疲劳试验的后期(约剩余5万次疲劳寿命)，其刚度开始慢减小，在临近疲劳破坏时(约破坏前的100次循环开始)，其刚度开始快速减小，直至突然破坏。 d) 对于10 6 次循环疲劳试验过程中未发生破坏的试验件，在整个疲劳试验过程中试验件的刚度基本保持为恒定值，没有明显变化(变化小于1%)。 e) 在较高的疲劳应力水平下(约静强度的55%~70%)，含BVID冲击损伤复合材料层压板的分层损伤实际上一直在非常缓慢地扩展，这种扩展主要发生在轮廓的边缘处，使“尖锐”或者“不连贯”的分层边界轮廓趋于“平滑”或者“连续”，而且这种损伤扩展出现在多个铺层之间。 f) 在使用“损伤无扩展”设计理念进行复合材料结构设计时，一定要关注结构所遭受的疲劳应力水平。在较高的疲劳应力水平下(约静强度的55%~70%)，冲击分层损伤会发生缓慢的扩展。因此在采用“损伤无扩展”设计理念进行复合材料结构设计时，进行适量的含冲击损伤复合材料结构疲劳试验(并在疲劳试验中监控损伤扩展情况)是非常有必要的。
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user: 摘 要 本文利用修正的Darken模型研究了二元Pd-X和三元Pd-X-PdO (X = Ag， Au， Cu， Ni， Pt)合金平衡及动态的表面偏析，利用Miedema模型计算了合金体系的偏析能和相互作用系数。通过模拟氧化物PdO与合金元素表面偏析的竞争，预测了氧化物PdO对Pd-X合金表面偏析的影响。这些结果为研究由偏析引起Pd基合金表面成分的变化提供了指导。 关键词 :表面偏析，修正的Darken模型，Miedema模型，Pd-X合金，PdO Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 合金是由两种金属元素混合形成，可以在一定程度上调整所得材料的热、机械和电子性能。合金的表面偏析具有重要的意义，因为表面偏析可以增强或抑制理想和不理想的表面化学反应 [ 1 ]，而合金催化剂的催化活性也几乎完全由表面性质所决定 [ 2 ]。 合金的表面反应性，通常是由与大气接触形成的氧化层来调节的，可能会发生化学反应与它不同组分的反应性有本质的不同。这是由于合金元素在表面附近的选择性偏析过程所产生的特殊的表面电子性质。例如，与纯元素相比，双金属合金可能具有更好的催化性能 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]。特别是铂和钯的混合物广泛应用于氢气反应 [ 8 ] [ 9 ] 和氧化 [ 10 ] [ 11 ]，以及电化学氧还原反应 [ 6 ] [ 7 ]。此外，易于腐蚀的金属表面可以通过选择性地形成稳定的元素合金化来钝化氧化层，如用于生物医学应用的FeCr或CoCr合金 [ 12 ]。无论是用于催化的贵金属合金，还是用于承受氧化环境腐蚀侵蚀的非贵金属合金，都需要对其表面成分和反应活性有详细的了解，以使合金性能合理化和最优化。在这两种情况下，裸露表面与氧气的反应都会严重影响其表面性质。然而，当合金膜被保存在气体环境中时，其氧化及表面偏析是一个必须要考虑的问题 [ 13 ] [ 14 ]。表面偏析的驱动力一般被认为是：i) 表面自由能的降低；ii) 由于溶剂和溶质原子尺寸的不同而引起的表面应力的降低；iii) 根据所考虑的元素的键强度，在断键方法中反映的元素汽化热的减少。全面了解表面偏析对进一步改进钯合金膜、催化剂或传感器至关重要。 自从表面偏析现象被Gibbs预言后，已有许多理论方法(模型)用来描述表面偏析现象，如第一性原理 [ 15 ] 和密度泛函理论 [ 16 ] 的计算方法太过复杂且耗时长；Langmuir-Mclean模型 [ 17 ]，虽然能定量的描述部分简单合金体系的表面偏析现象，但是没有考虑原子间的相互作用；Monte Carlo方法 [ 18 ]，需要确定正确的原子间相互作用势；在热力学框架下导出的修正Darken模型，计算简便，且能够描述体块材料和薄膜材料平衡态和动态的表面偏析 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。表面偏析通过改变体系表面成分和结构直接影响材料的性能，氧化物的存在会影响合金的偏析能，从而影响合金偏析元素的偏析。 本文以修正Darken模型为基础，分别模拟了二元合金Pd-X和三元合金Pd-X-PdO (X = Ag， Au， Cu， Ni， Pt)的表面偏析。通过模拟预测了PdO对Pd-X二元合金表面偏析的影响，为研究氧化物对Pd基合金表面浓度的改变提供了一种有效的研究方法。
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user: 4. 总结 本文通过Darken模型预测二元Pd-X (X = Ag， Au， Cu， Ni， Pt)和Pd-X-PdO三元合金平衡态与动态的表面偏析现象，考虑氧化物对合金表面偏析的影响，从而更加准确地预测了合金在氧气环境下可能的偏析现象。计算结果表明：在PdAg、PdAu、PdCu和PdNi二元合金中偏析原子是溶质原子(Ag， Au， Cu， Ni)，而在PdPt合金中偏析原子是Pd。对于PdAg二元合金，PdO的存在促进了Ag在PdAgPdO合金的表面偏析。在PdCu二元合金中，当温度T < 850 K，x > 30 at%时，PdO的存在促进了Cu在PdCuPdO合金的表面偏析，35 at% PdO的促进作用最强；当温度T > 850 K，PdO的存在抑制了Cu在PdCuPdO合金的偏析。而其他合金PdO的存在会抑制偏析元素(Au， Ni， Pd)在Pd-X (Au， Ni， Pd)二元合金的表面偏析。该模型提供了一种简便、准确的方法来预测氧化物对合金表面偏析的影响。
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user: 摘 要 为了探究短柄草的快速繁殖体系，本文以短柄草为研究材料，利用组培技术，通过对短柄草的愈伤组织的诱导，建立起一套高效、重复性好的短柄草再生系统；同时对短柄草的遗传转化体系进行了探索。研究结果如下：(1) 选择种子作为短柄草的外植体，通过愈伤组织的诱导及分化，可以实现短柄草的高效再生；(2) 对农杆菌介导的短柄草幼胚愈伤组织遗传转化进行了探索，(3) 对短柄草幼胚愈伤组织进行了GUS染色。 关键词 :短柄草，幼胚，愈伤组织，农杆菌，遗传转化 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 短柄草(Brachypodium distachyon)，是禾本科短柄草属一年生草本植物，原产在亚洲中部、非洲以及欧洲南部。植株较弱小，广泛种植于温带地区，在我国主要分布在海南、广东、广西、台湾等地 [ 1 ]。 植物的组织培养，不受季节限制，因此可全年连续生产，这对于植物实际生产应用具有重要的现实意义。近年来，水稻、玉米、大麦、黑麦、燕麦、小麦等很多禾本科植物的外植体在离体情况下也可以诱导出愈伤组织 [ 2 ] - [ 8 ]。而在遗传转化方面，水稻、高羊茅、玉米、假俭草、甘蔗、小麦等通过组培技术来建立遗传转化体系的报道更是非常多 [ 6 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]。 人们对短柄草的栽培和种子产量方面做了一些研究 [ 14 ] [ 15 ]，此外，细胞遗传学方面的研究表明，短柄草属于二倍体，染色体的基数为5，包括六倍体、四倍体和二倍体三种类型 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]。分子方面的研究则表明，其基因组大小为300 Mbp，在演化树上短柄草属于一个独立的分支，与麦类植物的亲缘关系较近 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。在短柄草的组织培养及遗传转化方面，也已经有了较多研究 [ 22 ] - [ 27 ]。 然而，利用短柄草愈伤组织诱导来实现植株的高效再生的研究报道非常少，尤其是实验室短柄草愈伤组织的诱导及植株再生相关报道较少，通过本文的研究，不仅可以为短柄草组培快繁体系的建立提供参考，还可以为短柄草的遗传转化体系的建立提供依据。
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user: 2. 材料和方法 2.1. 试验材料 本文选用的试验材料为短柄草。 2.2. 试验方法 2.2.1. 外植体的选择及消毒 采用短柄草种子中的幼胚为外植体，将短柄草的种子用75%乙醇消毒5 min，无菌水清洗3次，20% NaClO消毒5 min，无菌水清洗5次，在超净工作台内，借助显微镜剥取幼胚。 2.2.2. 愈伤组织的诱导 外植体消毒后，接种于愈伤组织诱导培养基CIM (4.4 g/LMS + 5.0 mg/L 2，4-D + 30 g/L蔗糖 + 2.0 g/L植物凝胶)，将平板放入暗培养箱中，培养温度为25℃，培养2~4周。等愈伤组织成熟后，将愈伤组织切下转入继代培养基RGM (4.4 g/LMS + 5.0 mg/L 2，4-D + 30 g/L蔗糖 + 2.0 g/L植物凝胶，生长4周。愈伤组织诱导率 = (形成愈伤组织的外植体个数/接种的外植体个数) × 100%。 2.2.3. 愈伤组织的分化及植株的再生 将不同来源的愈伤组织转入分化培养基GSE (4.4 g/LMS + 1.0 mg/L KT + 30 g/L蔗糖 + 2.0 g/L植物凝胶)，约3~4周后分化培养基上出现不定芽，同时将不定芽转入继代培养基GSE (4.4 g/LMS + 1.0 mg/L KT + 30 g/L蔗糖 + 2. 0g/L植物凝胶)生长30天，统计分化率，愈伤组织分化率 = (分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数) × 100%。愈伤组织转生根培养基RTM (4.4 g/LMS + 0.5 mg/L NAA + 30 g/L蔗糖 + 2.0 g/L植物凝胶)，4周后统计生根率。生根率 = (生根的不定芽数/接种的不定芽数) × 100%，生根的小苗接种于组培瓶中继续培养，等组培苗长大后，进行盆栽培养。 2.2.4. 愈伤组织的遗传转化 在冰箱中取出农杆菌菌液，接种于YEB培养基中(含有利福平等抗性)，选择生长旺盛、颜色鲜黄的愈伤组织，将其置于农杆菌菌液中浸染5~10分钟，用吸水纸吸去菌液，用灭菌的滤纸吸去愈伤组织表面的菌液。上述愈伤组织转移到灭菌干燥滤纸上，25℃~28℃，共培养72 h。 2.2.5. 抗性愈伤及植株的筛选 转化3周后，将愈伤组织转移到新的抗性诱导培养基上(Rif， Kan r )，2次继代培养后，将愈伤组织转移到分化培养基上培养，等抗性再生绿苗出后，转移到生根培养基中进行生根筛选，2~3周后，抗性苗会陆续生根。 2.2.6. Gus顺时表达的检测 将转化后的愈伤组织浸入X-Gluc溶液，至于37℃培养中8小时，用95%乙醇脱色，观察愈伤颜色变化。 2.2.7. 实验数据的处理 本文的实验图片采用数码相机拍照，数据的处理和分析采用软件Sigma Plot 8.0。
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user: 3. 结果 3.1. 短柄草外部形态及外植体 如图1所示，本文选取短柄草为研究材料，短柄草是一年生草本植物，叶片较小较宽图1(A)，纺锤型穗子与小麦等植物的相似图1(B)，柄较短。选取种子的幼胚作为外植体图1(C)，经过75%乙醇和20% NaClO消毒后，接种于愈伤诱导培养基，进行愈伤组织的诱导。 图1. 短柄草外植体 3.2. 胚型愈伤组织的诱导 如图2所示，幼胚在培养平板上培养一周后，开始出现淡黄色的颗粒状愈伤组织图2(A)，将这些愈伤组织切下，转入继代培养基中继续培养，如图2(B)所示，此时，会逐渐出现大块黄色颗粒块状愈伤组织。由下图可见，愈伤组织诱导率较高，每个幼胚都能长出很多愈伤组织块，愈伤组织诱导率为100%。 图2. 愈伤组织的诱导 3.3. 愈伤组织的分化 如图3所示，将黄色致密愈伤组织切下(D)，转入分化培养基GSE进行不定芽的诱导，3周后开始出现不定芽(E)，每个愈伤组织团可以分化出多个不定芽，将不定芽切下转入继代培养基继续培养，不定芽逐渐长出幼嫩细小的叶和茎(F)。由下图可见，愈伤组织分化率较高，每团愈伤组织都能分化出多个不定芽，愈伤组织分化率为98%，接近100%。 图3. 愈伤组织的分化 3.4. 植株的再生 如图4所示，该图为不定芽的生根阶段。不定芽在生根培养基上生长1周后，开始长出幼嫩的小根图4(G)，实现了短柄草植株的再生。再培养一段时间后，幼苗逐渐长成健壮的植株图4(H)，则可以移到小盆中进行土栽培养。 图4. 短柄草植株再生 3.5. 愈伤组织的浸染及共培养 如图5所示，选择结构比较密实的愈伤组织，将愈伤组织在农杆菌菌液中浸染5 min后，将其转移到灭菌的干净滤纸上，共培养2~3天，将愈伤组织转移到抗性筛选培养基上进行愈伤组织的筛选。 图5. 愈伤组织的转化 3.6. 愈伤组织的抗性筛选及分化 如图6所示，将共培养后的愈伤组织转移到抗性平板上进行抗性筛选，2~3周后，大部分愈伤组织在抗性筛选压力下，逐渐褐化，将鲜亮的愈伤组织继代培养后，转移到分化培养基上进行再生芽体的诱导。3~4周后，一部分愈伤组织逐渐分化出再生苗(芽)，再将其进行继代培养。 图6. 抗性愈伤组织的分化 3.7. 再生苗的生根 如图7所示，将抗性再生幼苗(芽)转移到生根培养基上，进行生根诱导，同时生根培养基是含抗性的培养基，2~3周后，植株逐渐生根。 图7. 抗性苗的生根 3.8. GUS顺时表达的检测 如图8所示，将共培养后的愈伤组织进行GUS染色，结果中出现无色到深蓝色，无色的说明GUS基因没有在愈伤组织中表达，深蓝色和浅蓝色说明GUS基因在愈伤组织中进行了表达。 图8. GUS染色
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user: 4. 讨论与结论 目前，对短柄草的组织培养方面有了一些研究 [ 26 ] [ 27 ]，但研究并不系统，尤其是短柄草的遗传转化研究不多。生长旺盛、分裂能力强的细胞和组织器官更有利于植物的遗传转化，故本文选择生长致密的愈伤组织作为转化材料，来进行农杆菌的转化。农杆菌侵染浓度及时间、共培养时间及温度，以及适当的预培养对转化的成功与否有着很大的影响，本文在结合文献的基础上，共培养时间选择72 h。 此外，由于不同培养基、不同激素对禾本科植物植株的再生体系以及遗传转化也有较大影响，故不同培养基的优化实验以及不同激素的优化实验，包括抗性植株分子方面的检测等，这些后续实验正在进行中。 综上所述，本文通过组织培养，建立了短柄草的再生体系。同时对短柄草的遗传转化体系进行了初步探索。
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user: 摘 要 柱细胞是根冠中两种细胞类型之一，位于根尖的最前端。在模式植物拟南芥中，柱细胞的产生与分化过程高度同步，形成规则的层状结构。柱细胞之间是否存在差异目前并不清楚。本研究通过对野生型和WOX5过表达幼苗的主根中的柱细胞的分裂模式和排列方式的分析，发现不同位置的柱细胞在分裂模式，细胞形态和细胞排列方式等方面呈现出明显差异。在野生型幼苗中，外围区的柱细胞与中央区的柱细胞相比更容易出现不规则细胞分裂与不规则细胞排列。在WOX5过表达的幼苗中，中央区的柱细胞的分裂模式，细胞形态和细胞排列方式与正常柱干细胞接近，而外围区的柱细胞与侧根冠细胞更为接近。本研究的结果为进一步了解柱细胞的发育及其调控机理提供了一个新实验系统和一条新的研究思路。 关键词 :拟南芥，根冠，柱细胞，位置效应 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 根冠(Root Cap)是陆生植物中的一个非常重要的器官，担负着保护根尖分生组织和从土壤中获得环境信息，包括地球重力信息等重要功能。根冠中含两种不同类型的细胞，称为柱细胞和侧根冠细胞，前者位于静止中心下方和根冠的中央，后者分布于根冠的侧面，成空心倒錐筒形状包裹在柱细胞和根尖分生组织的外围。柱细胞和侧根冠细胞来源于各自的干细胞 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。负责提供新的柱细胞的干细胞称为 图1. 拟南芥根冠细胞结构示意图 柱干细胞。在模式植物拟南芥中，每个根尖含大约12个柱干细胞，排列在同一层中。从纵截面上看为4个细胞，成一排；横截面可见所有12个柱干细胞，按空间位置可分为两个区，即中央区含4个细胞和外围区含8个细胞，成一圈包围着中央区细胞(图1)。柱干细胞定期进行水平方向的不对称分裂，所产生的两个子细胞中，位于上方的细胞维持干细胞特性，位于下方的细胞则分化成柱细胞。由于柱干细胞的分裂与柱细胞的分化均高度同步，导致柱细胞区内细胞按其世代顺序，成层状排列，同层细胞间形态与发育阶段相似，而相邻两层细胞层间相差一个细胞分裂时代。除上述发育世代的差异以外，柱细胞间是否存在其它差异，是否受空间位置的影响目前尚不清楚。 本研究通过对野生型幼苗和WOX5 (WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5)过表达幼苗 [ 5 ] 的主根根尖中柱细胞的分裂模式及细胞排列的观察，发现位于中央区和外围区中的柱(干)细胞之间存在明显差异。如在野生型幼苗的主根中，观察到的不规则细胞分裂绝大部分出现在外围柱细胞中，极少出现在中央柱柱细胞中；在WOX5过量表达幼苗的根尖中，中央区和外围区的细胞的分裂方向明显不同，中央区的细胞的分裂方向与柱干细胞相同，与根的纵轴垂直，而外围区的细胞的分裂方向更接近于侧根冠细胞的分裂方向，有些与根的纵轴平行，有些与根的纵轴呈小于90度的角度。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 本实验所用的野生型(Columbia)拟南芥种子最初来源于欧洲拟南芥种子中心(http://www.arabidopsis.org.uk/)；35SSGVG/UAS::WOX5转基因株系 [ 5 ] 种子由日本奈良科技大学(Nara Institute of Science and Technology) Keiji Nakajima教授赠与。地塞米松(英文名dexamethasone，简称DEX)购自天根生化科技有限公司。 2.2. 植物的培养和生长条件 种子消毒和培养方法如前报道 [ 6 ] [ 7 ]，种子用10%次氯酸+90%酒精混合溶液浸泡10分钟灭菌消毒，用酒精洗3~4遍，在无菌台吹干后点种于配制在10cm × 10cm方形塑料无菌培养皿中固化的1/2 MS琼脂(1%， w/v)培养基上。地塞米松母液(10 mM)配置于水中，用孔径为0.2微米的过滤膜过滤灭菌，在培养基高温(121℃，20分钟)灭菌后冷却至60℃左右加入。点种后的培养皿用Nescofilm封口膜密封，在上方封口膜的中央打开1~2个小开口允许培养皿内外空气交换，将培养皿垂直放置于22℃，16 h光照/8 h黑暗周期的培养箱中萌发，光照强度为12000 Lx。 2.3. 显微镜观察 共聚焦显微镜观察：将幼苗根浸于滴加在载玻片上的10 µg/ml碘化丙啶(propidium iodide)溶液中，轻轻盖上盖玻片，用奥林巴斯FV1200共聚焦显微镜观察和拍照，波长设置为激发光488nm，检测波长510 nm。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 野生型柱干细胞/柱细胞中不规则细胞分裂集中于外围柱细胞 在本实验室的培养条件下，大多数野生型(Columbia)幼苗主根根尖的细胞结构与图1(A)所示的相近，在柱细胞区纵向可见典型的4细胞，横向可见规则的层状排列，无额外(不规则)分裂。但少数幼苗的根中在柱细胞区出现不规则细胞排列或不规则细胞分裂。本实验中我们观察了526个野生型(Columbia)幼苗的主根的细胞结构，在86个幼苗的主根柱细胞区中发现有不规则细胞排列或不规则细胞分裂现象(图2)，如柱细胞分裂(2(A))，柱细胞分裂 + 柱干细胞分裂不同步(2(B))，柱细胞列数减少及柱细胞形状异常(2(C)、2(E))，柱干细胞分裂 + 柱细胞分裂(2(D)，2(F))等。值得注意的是在所观察到的86个不规则细胞分裂中有83个出现在外围区的细胞中，只有3个不规则细胞分裂出现在中央区的细胞中，表明这些不规则分裂与细胞所在的位置(区)有明显的对应关系。 图2. 野生拟南芥幼苗根尖柱细胞的不规则细胞分裂 3.2. 在WOX5过量表达的幼苗根尖中，柱细胞区中细胞的分裂模式受其空间位置的影响 为了进一步验证柱细胞间的差异，我们观察了WOX5过量表达(35S::GVG/UAS::WOX5)的幼苗中柱细胞的分裂模式。此前已报道WOX5过量表达可导致未分化细胞在根冠中积累，且这些细胞可持续分裂 [ 4 ] [ 5 ]。图3展示3个典型的35S::GVG/UAS::WOX5幼苗的根尖共聚焦照片，从中可见中央区和外围区的细胞在细胞分裂模式上存在明显差异。中央区的细胞排列规则，分裂方向与正常柱干细胞的分裂方向基本一致，与根的纵轴大致垂直；外围区的细胞分裂排列相对较乱，细胞分裂方向有的与根的纵轴平行，有的与根的纵轴呈<90的角度，与侧根冠的细胞分裂模式比较接近。 图3. 35S::GVG/UAS::WOX5幼苗主根冠中的细胞分裂模式
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user: 4. 讨论与结论 植物细胞无法在器官内部自由移动，其分裂，分化活动及形态变化必须与其所在的空间位置，以及其相邻细胞的相关活动相匹配。了解植物体内的位置信息，植物细胞感知与传导这些信息的机理以及它们对细胞分裂，分化活动及形态变化的影响及其调控途径等是植物发育学研究的重要内容。本实验对拟南芥根冠柱细胞的分裂模式与空间位置之间的关系进行了初步分析，发现在野生型和WOX5过表达幼苗的主根中位于中央区的柱细胞与外围区中的柱细胞间存在明显差异。在野生型幼苗的主根中，外围区的柱细胞与中央区的柱细胞相比更容易出现不规则细胞分裂与不规则细胞排列。在WOX5过表达的幼苗的主根中，中央区和外围区柱细胞在细胞分裂模式，细胞形态和细胞排列方式上都呈现出明显差异，中央区的细胞的分裂模式，细胞形态和细胞排列方式与正常柱干细胞非常接近，而外围区的细胞在这些特征上与侧根冠细胞更为接近。由于柱细胞的规则排列，高度同步化的分裂分化活动以及易于观察等特点，本研究的结果为研究组织细胞位置信息及其传导机理提供了一个比较合适的实验系统与研究对象。 造成中央区和外围区柱细胞间差异的原因可能包括：1) 不同的相邻细胞环境。比如外围区的细胞直接与侧根冠细胞接触，可能从后者获得某些信息，从而导致这些细胞的活动模式与细胞形态学特征更接近于侧根冠细胞。中央区的柱干细胞直接与静止中心细胞接触，可从后者获得某些信息，导致其活动模式与细胞形态学特征与后者类似；2) 不同的细胞发育来源。按照目前的理解，中央区与外围区的柱细胞均来自于静止中心细胞 [ 2 ] [ 3 ]。但有可能柱干细胞的形成并不是按照上述方式，可能只有中央区的柱细胞来源于静止中心细胞，而外围区的柱细胞则来源于静止中心外围的细胞，如此中央区与外围区的柱细胞间的差别可能归结于它们的不同发育来源。如果后一种假设成立，对柱细胞间的位置效应的研究有可能为柱干细胞的发育途径提供新的实验证据。
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user: 摘 要 本文采用化学气相沉积法在GaN上调控生长了单层WS 2 ，并研究了基底耦合效应对其光学性质的影响。研究结果显示，生长温度为850℃，可以生长出质量较好的单层三角形WS 2 ；当温度大于900℃时，GaN基底表面开始发生分解，不利于材料生长。通过载气H 2 流量调节，可在基底上生长出满覆盖的WS 2 。GaN基底上生长的三角形WS 2 呈现良好的60˚旋转对称性，通过GaN纳米柱上WS 2 的生长与第一性原理模拟计算，推测出了WS 2 /GaN样品的稳定结构。通过拉曼表征发现，GaN基底会对WS 2 产生一定的张应力作用，使E1 2g拉曼峰和激子峰出现红移，并且由于WS 2 与GaN基底形成Ⅱ型异质结能带结构，WS 2 /GaN样品出现发光淬灭现象。本文为开发新型二维光电子器件提供了一定的实验依据。 关键词 :二硫化钨，化学气相沉积，氮化镓，异质结 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 近年来，二维材料由于具有奇特或优异的光电性能受到人们的广泛关注。早期研究较多的石墨烯由于零带隙的特点，限制了其在光电器件和逻辑器件方面的应用 [ 1 ]。科学家们逐渐把目光投向其它二维材料，其中层状过渡金属硫族化合物(transition metal dichalcogenides， TMDs)因具有带隙可调、高激子结合能和高开关比等特点而备受瞩目 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。WS 2 是其中一个典型代表，通过厚度调节，其可实现从块材~1.3 eV间接带隙到单层~2.0 eV直接带隙的转变 [ 7 ]。另外，单层WS 2 由于缺少空间反演对称性且具有较强的自旋轨道耦合效应，在价带顶出现~420 meV的自旋劈裂 [ 8 ]，并导致其布里渊区内相邻的两个K点不再等效，出现能谷特性 [ 9 ]。这些性质使得WS 2 在光电子器件，尤其是自旋电子器件和谷电子器件方面有着广阔的应用前景。 为构筑新型二维功能器件，通常需要对二维材料性质进行调控，构造异质结是其中一种常用的方式。GaN是一种宽带隙半导体(带隙~3.39 eV)，已在光电子器件领域获得广泛应用 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]。报道显示，GaN衬底能够提高MoS 2 的谷极化率 [ 13 ]，且MoS 2 /GaN异质结表现出很高的电导率 [ 14 ]；另外，基于TMDs/GaN异质结研制的紫外探测器也表现出优异的性能 [ 15 ] [ 16 ]。由于GaN和WS 2 的晶格失配很小(GaN: 3.189 Å [ 17 ]， WS 2 : 3.153 Å [ 18 ])，有望在GaN基底上有望长出高质量、高对称性的单层WS 2 ，并出现新奇性质。 本实验采用化学气相沉积法(chemical vapor deposition method， CVD)在GaN上调控生长了单层WS 2 ，探究了生长温度和H 2 载气流量对材料生长质量以及结构形貌的影响。我们结合GaN纳米柱上WS 2 的生长结果与第一性原理计算，推测出了WS 2 /GaN样品的稳定结构。通过拉曼和光致发光谱表征，研究了GaN基底耦合效应对WS 2 光学性质的影响。结果显示，通过优化生长参数，我们可制备出高质量的三角形单层WS 2 或满覆盖的WS 2 。另外，GaN基底会对WS 2 产生一定的张应力作用，对其光学性质产生一定影响。
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user: 2. 实验和理论计算方法 2.1. 实验方法 我们使用双温区的管式炉进行WS 2 生长，以(0001)方向Ga极性面的GaN外延片作为衬底(Nanowin， GaN-T-C-U-C50)。生长前，我们依次分别用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗GaN衬底10分钟，并用高纯氮气吹干。我们预先通过热蒸镀法在硅片上沉积一层5 nm厚的WO 3 (ALDRICH， 99.999%)薄膜，作为W的前驱体源，将其放在石英舟中，并把GaN衬底倒盖在硅片上，两者之间间隔500 μm，将石英舟放在管式炉的下游温区。1 g高纯硫粉(Aladdin， 99.999%)平铺在一个小石英舟中，置于气路上游的温区。生长前，本底真空度为4 × 10 −2 Torr。生长时，腔内保持大气压，Ar气流量保持50 sccm。我们采用扫描电子显微镜(SEM， Carl Zeiss， sigma_HD)、原子力显微镜(AFM， NSK， SPA400-Nanonavi)和透射电子显微镜(TEM， JEOL， JEM-2100)表征了样品的表面形貌和结构；通过共聚焦显微镜(WITec， alpha 300RA)表征了材料的拉曼谱和光致发光(photoluminescence， PL)谱，激发波长为488 nm。 2.2. 理论计算方法 理论计算采用基于密度泛函理论(density functional theory， DFT)的第一性原理计算方法，使用VASP (Vienna ab initio Simulation Package)软件包进行计算 [ 19 ]。通过缀加投影波方法描述价电子和原子实之间的相互作用 [ 20 ]，使用广义梯度近似的PBE泛函作为交换关联泛函 [ 21 ]。所有原子采用的价电子组态分别为：W-5d 4 6S 2 、S-3S 2 3p 4 、Ga-4S 2 4p 1 和N-2S 2 2p 3 。采用Monkhorst-Pack方法对倒空间取样，按照包含Γ点的15 × 15 × 1的网格进行取点。使用带电量为0.75 e的氢原子饱和GaN底部氮原子的悬挂键。采用半经验的DFT-D2方法修正异质结层间范德华相互作用 [ 22 ]。z轴方向上的真空层设为20 Å。为保证计算精度，截断能统一设置为500 eV。沿c轴选取了12个GaN的原子层作为衬底，底部加氢后固定中间6个原子层，对表面6个原子层和氢原子层进行弛豫，直到总能收敛至10 −6 eV，并且每个原子受到的Hellmann-Feynman力小于0.01 eV/Å为止。不同堆叠结构下仅优化W和S原子的纵向位置以得到相对稳定的结构。
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user: 4. 结语 我们采用CVD方法在GaN上调控生长了单层WS 2 并研究了它的光学性质。研究结果显示，850℃是一个比较适合的生长温度，当温度大于900℃时，GaN基底表面开始发生分解，变得粗糙，不利于材料生长。另外，载气中加入一定的H 2 可以提高生长成核密度。当H 2 流量为9 sccm时，可生长出满覆盖的WS 2 。相比于WS 2 /SiO 2 样品，GaN基底上生长的三角形WS 2 呈现良好的60˚旋转对称性。基于GaN纳米柱上的WS 2 生长结果以及第一性原理计算，我们推测了WS 2 /GaN样品稳定结构，即W和S原子分别落在衬底表面N和Ga原子正上方。通过拉曼表征发现，GaN基底会对WS 2 产生一定的张应力作用，使得E1 2g特征峰发生红移。同时，通过PL谱测量发现，相对于WS 2 /SiO 2 样品，WS 2 /GaN样品的中性激子峰和带电激子峰都因为张应力而出现红移，并且由于WS 2 与GaN基底形成Ⅱ型异质结能带结构，WS 2 /GaN样品出现发光淬灭。本文为高质量二维材料生长以及新型二维光电子器件开发提供一定的实验依据。
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user: 摘 要 叶绿体是植物光合作用的重要场所。根据不同的功能，叶绿体蛋白分布在叶绿体的不同区域。只有当蛋白质运输到特定的位置时，才能发挥其功能并参与细胞的生命活动。因此，确定蛋白质在细胞中的位置对于理解蛋白质的功能和结构是重要的。近年来，在植物蛋白质定位研究中，常用生物信息学预测法辅助实验方法，增加蛋白质定位的研究的准确性。本文对近几年来常用的叶绿体蛋白质定位研究的预测方法以及实验方法的主要进展进行综述，为高效进行叶绿体蛋白亚细胞定位方法提供参考。 关键词 :叶绿体蛋白质，亚细胞定位方法 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 叶绿体是植物细胞特有的细胞器，是进行光合作用的重要场所。叶绿体是半自主的细胞器，叶绿体蛋白质约占高等植物蛋白质的10%~25%，仅有一小部分叶绿体蛋白由叶绿体基因编码，大部分是核基因编码 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]。叶绿体蛋白主要分为叶绿体膜蛋白、叶绿体基质蛋白、类囊体膜蛋白和类囊体腔蛋白 [ 4 ]。蛋白质的功能与其自身的结构和亚细胞定位密切相关。只有当蛋白质运输到特定的亚细胞位置时，才能发挥其功能并参与细胞生命活动 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]。因此，了解蛋白质的亚细胞定位有助于了解蛋白质的生物学功能，解释蛋白质与其他生物分子之间的相互关系 [ 8 ] [ 9 ]。叶绿体蛋白定位方法常见的有实验定位和生物信息学预测两种方法 [ 10 ] [ 11 ]。本文介绍了近几年来常用的叶绿体蛋白质定位研究的预测方法以及实验方法，为高效进行叶绿体蛋白亚细胞定位方法提供参考。
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user: 2. 生物信息学预测方法 随着后基因组时代的到来，生物信息学分析技术的不断发展，利用计算机系统理论预测蛋白质亚细胞定位的手段也越来越成熟，涌现大量的预测方法和在线预测网站。计算机预测方法低成本、高效率，为生物学工作者的实验研究提供了一种高效的辅助手段，主要涉及以下五个步骤。 2.1. 叶绿体蛋白质预测相关数据集的建立 UniProt数据库集合了SWISS-Prot、PIR-PSD和TrEMBL三大数据库的序列信息，是序列信息资源最全面、最丰富的数据库 [ 12 ]。除了这些综合性的数据库以外，目前还出现了一些针对亚细胞定位的数据库，例如，由Du和Li针对于亚叶绿体蛋白定位所建立的SubChlo原始数据库和针对亚线粒体蛋白定位的SUBMITO原始数据库 [ 13 ] [ 14 ]。 蛋白质数据集的建立方法有① 使用已有的数据集；② 在已有的数据集的基础上增加或减少数据；③ 创建新的数据集。而目前常用的预测亚叶绿体蛋白定位的几种理论数据集是由Du和Li创建的SubChlo原始数据库，再经由CD-HiT程序处理后，去除相似性大于80%、60%、40%的同源性序列，所得到的S80、S60、S40的数据集 [ 15 ]。 2.2. 特征参数的提取 蛋白质特征参数的提取是蛋白质亚细胞定位预测的基础，根据蛋白质的序列特征能够决定蛋白质在合成过程中分选到特定的位置并发挥正确的生物学功能，参数提取方法有四： 一是根据氨基酸组分进行分析，氨基酸是组成蛋白质的基本单位，多种氨基酸的排列组合构成了多种多样的蛋白质序列，根据蛋白质氨基酸的组成信息可以有效地预测蛋白质的亚细胞定位，但这种方法忽略了蛋白质氨基酸的顺序和空间结构等信息； 二是根据氨基酸序列N端的信号肽进行分析，蛋白质可根据蛋白质序列上的特殊的信号序列分选到特定的位置，并被细胞器上的特异性分选受体识别。1999年Nakai和Kanehisa [ 16 ] 首次提出依据氨基酸序列N端的分选信号预测亚细胞定位并结合机器学习的方法设计出蛋白质亚细胞定位的预测软件PSORT。之后Emanuelsson等人 [ 17 ] 根据氨基酸序列N端的信号肽并结合神经网络的方法，开发出TargetP定位预测软件。蛋白质序列N端的信号肽可以提高预测蛋白的亚细胞定位的效率，但并非所有蛋白质都含有分选信号，存在一定的局限性； 三是根据氨基酸残基性质，位于不同的亚细胞区域的蛋白质，其氨基酸序列含有不同的理化性质。2000年Chou等人 [ 18 ] 首次提出将氨基酸组分信息与物理化学属性信息相结合，将氨基酸分成亲疏水性、极性、酸碱性和R基等化学结构，以此来降低蛋白质组分的20维序列信息，增加精确度； 四是根据序列同源相似性、蛋白质功能结构域。利用BLAST同源相似性搜索工具进行序列对比，可得到保守序列的同源信息。但该法需要大量蛋白质功能结构域数据的支持，目前尚无较为完整数据库，使用受限。 2.3. 预测算法设计 分类预测算法能够正确、高效地预测不同蛋白质的亚细胞位置的，为确定蛋白质亚细胞定位提供了重要信息。目前常用的预测算法主要都是基于机器学习分类法，其中包括人工神经网络、支持向量机(SVM)、马尔可夫模型、贝叶斯网络组合耦合等。而在机器学习分类法中，支持向量机(SVM)算法是成功率最高、操作运行最为简便的算法之一 [ 19 ]。该算法采用了大间隔的线性分离，计算结果错误率极低，能够处理多种的机器学习问题上，因此被广泛地应用于各种生物信息学研究。 2.4. 预测结果评估 得到的预测结果的可信度需要用科学的方法进行检测和评估，常用的方法包括自洽检验(Self-consistency)、交叉检验(Cross validation)和留一交叉检验(Jackknife) [ 20 ]。其中留一交叉检验是交叉检验中的一种特殊状况，其原理就是训练集中的每一个蛋白质轮流作为待测蛋白，将剩余蛋白质作为训练样本进行测试，是当前比较客观的检验方法之一 [ 21 ]。由于在检测蛋白过程当中会出现较高的假阳性，因此在预测过程中要尽可能的预测出正确的界面残基，以减少假阳性和假阴性。并分别用敏感性(Sensitivity， Sn)、特异性(Specificity， Sp)、预测成功率(Accuracy， Acc)、马修相关系数(Matthews’s Correlation Coefficient， MCC)指标进行度量 [ 22 ]，预测结果与真实数据的相关性。 2.5. 软件和Web网站的建立 当预测算法通过预测结果评估被证实具有较高可信度时，可借助互联网建立一个在线预测网站，以方便更多的研究人员在线获得待测蛋白的预测结果。目前已有大量的在线预测网站应用于叶绿体蛋白质亚细胞定位研究中(见表1)。
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user: 3. 实验定位的方法 在蛋白质亚细胞定位研究中生物信息学预测结果具有一定的参考价值，但并不能完全确定蛋白质的亚细胞定位，最后还需要通过实验确定蛋白质的具体定位。实验定位法包含免疫胶体金标记、免疫荧光技术和融合报告基因定位法。 Table 1 Main prediction websites for subcellular localization of chloroplast protein 名称 网址 预测依据 Ipsort http://ipsort.hgc.jp/ 根据N末端分选信号 TargetP http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ 根据叶绿体信号肽 ChloroP http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/ 根据叶绿体信号肽 WoLF PSORT https://wolfpsort.hgc.jp/ 根据氨基酸组成 SubLoc https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/5768 根据氨基酸组成 Cell-PLoc http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/ 根据氨基酸组成 Euk-mPLoc 2.0 http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/ 根据氨基酸组成 CELLO http://cello.life.nctu.edu.tw/ 根据氨基酸组成 PCLR http://www.andrewschein.com/cgi-bin/pclr/pclr.cgi 根据叶绿体信号肽 SLP-Local https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~smatsuda/slplocal.html 根据氨基酸组成 Plant-mPLoc http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ 根据蛋白质功能域和氨基酸组成 表1. 主要叶绿体蛋白质亚细胞定位预测网站 3.1. 融合报告基因定位法 对2016年以来植物叶绿体蛋白的亚细胞定位实验方法进行搜集整理发现，近年来，以绿色荧光蛋白基因作为报告基因的融合报告基因定位法被广泛使用，利用瞬时表达技术使融合基因在植物细胞中瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察进行活体跟踪检测，确定细胞中蛋白质分子的定位以及代谢途径 [ 23 ]。 绿色荧光蛋白(GFP)可以自发荧光，易于检测、性质稳定并且对宿主细胞无毒害作用，因此可以作为报告蛋白在植物、动物、微生物中广泛使用。由于叶绿体自带红色荧光，因此常用绿色荧光蛋白基因以及其突变体黄色荧光蛋白(YFP)基因作为融合报告基因进行亚细胞定位实验，也可以使用EGFP、EYFP等增强型绿色荧光蛋白(荧光强度比GFP高6倍以上更强)的GFP的突变体，改善检测效果 [ 24 ]。 瞬时表达的宿主细胞主要有拟南芥原生质体、烟草叶片细胞以及洋葱表皮细胞。但通过瞬时表达技术进入细胞的外源DNA并不与宿主细胞染色体DNA进行整合，而是直接随载体进入细胞，迅速表达，在2~4 d内就能检测到表达产物 [ 25 ]。瞬时表达技术能够表达多种外源基因并且不会受基因位置以及基因沉默等方面的影响，具有简单、快捷、准确、效率高等优点，是一种快速研究基因表达、蛋白质亚细胞定位以及基因互作的重要手段 [ 26 ]。因此利用瞬时表达技术，使目的基因与含有绿色荧光蛋白基因的表达载体连接，成功表达出的融合产物就能散发出绿色荧光，最后利用特殊的显微镜对融合产物进行跟踪观察检测。 3.2. 利用激光共聚焦显微镜观察 蛋白质的功能虽然与蛋白质的定位相关，但蛋白质功能的发挥是一个动态的过程，涉及到蛋白质之间的互作和修饰，需要保证实验材料必须是活细胞。20世纪80年代激光共聚焦显微镜的出现，实现了细胞的活体3D成像 [ 27 ] [ 28 ]。激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜的基础之上配置激光器和扫描装置，利用计算机技术对观察样品进行处理，以获得清晰图像。激光共聚焦显微镜结合了显微镜技术、光电技术和计算机技术，解决了传统显微镜观察方法在观察之前需要对样品进行脱水、脱蜡、染色等处理，会对细胞产生损伤的问题，激光共聚焦显微镜可以在不损伤细胞的前提下，对活体细胞进行观察和跟踪，观察过的样品还可以用于后续实验 [ 28 ]。传统的光学显微镜使用的是场光源，样品需要在场光源下一次性成像，样品成像会受到附近的物体的衍射光和散射光的影响，会形成色差 [ 29 ]。激光共聚焦显微镜的光源为激光，加上采用了共聚焦技术，减小了色差，样品在成像过程中被分解成二维甚至三维的多个点，逐点扫描成像，最终导入计算机中形成一个完整的图像，彻底消除了色差 [ 28 ]，并且表现更出色的成像清晰度和精确度。 虽然激光共聚焦显微镜解决了活细胞的成像问题，但受分辨率的限制，还不能精准的定位到植物亚细胞器内的具体位置。 3.3. 利用超分辨率显微镜观察 融合报告基因定位法广泛应用促进了一系列以提高分辨率为目的的显微镜成像技术的发展 [ 30 ]。继激光共聚焦显微镜之后，超分辨率显微镜也因其强大的分辨率，精确的定位，突破了显微镜成像技术的一大难关。 超分辨率显微镜能对亚细胞器中的蛋白质进行精确定位，可在植物和动物细胞中广泛使用。2011年，Zheng等人 [ 31 ] 利用超分辨率显微镜将海马脊柱的突出细胞骨架蛋白精确定位于突触和神经元胞质中。2015年，刘玥等人 [ 32 ] 利用3D-SIM超分辨率显微镜确定植物蔗糖合成酶ZmSUS-SH1定位于烟草表皮细胞叶绿体的基粒周围。激光共聚焦显微镜能将融合蛋白精确于具体的细胞器，而超分辨率显微镜能将融合蛋白精确于细胞器中的具体位置。 超分辨率成像技术提高了显微镜的分辨率，成功克服了融合蛋白荧光不易区分以及叶绿素自发荧光等缺点，实现了叶绿体蛋白质在细胞器内的精确定位 [ 32 ]。同时利用计算机软件可以对样品进行3D重构，并对样品的3D模型进行任意角度的旋转和切割，甚至还可以导出3D模型，实现蛋白质在亚细胞器内的可视化精确定位。
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user: 4. 结论 综上，叶绿体蛋白质亚细胞定位的两种方法各有千秋，实验定位方法测量结果精准，但耗时长、成本高，仪器设备昂贵，而且实验结果需要人为的经验判断，具有一定的主观性。生物信息学预测方法具有利用大数据提供预先参考信息的优势，因而对传统的实验方法发挥良好的辅助作用，也节省了时间成本。 叶绿体蛋白质的功能与蛋白质的亚细胞定位联系紧密，具体功能的发挥需要由蛋白质之间相互作用、修饰等动态变化来体现。多种的蛋白质亚细胞定位实验方法的出现、发展以及使用，为叶绿体蛋白质数据库积累了大量的数据。计算机软件技术的崛起，生物信息学技术的发展，使互联网在线预测蛋白质亚细胞定位成为可能，也为高效率分析叶绿体蛋白亚细胞该行为提供了有益参考。
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user: 摘 要 拟南芥根冠中的细胞分裂被认为受到严格的调控。一般认为柱干细胞只进行水平方向的分裂，且在时间上高度同步，由此产生排列规则的柱细胞层，而侧根冠干细胞的分裂方向与柱干细胞的分裂方向相差约90度，其子细胞则以水平方向分裂为主。本研究中，我们通过对根冠区横切片的观察，发现在野生型幼苗根中柱干细胞，柱细胞均和侧根冠细胞均可进行纵向分裂。同时还观察到柱干细胞膨大挤压外围柱细胞圈的现象，但对其正常的功能以及根冠的结构无明显影响。本研究的结果为进一步研究拟南芥根冠细胞的分裂调控奠定了一定的基础。 关键词 :拟南芥，根冠，柱细胞，纵向分裂 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 根冠为陆生植物根尖分生组织的保护性器官，其型如帽状包裹在根尖分生组织的顶端与外围。根冠中含两种不同的细胞类型，称之为柱细胞和侧根冠细胞。柱细胞由柱干细胞的不对称性分裂而产生，后者位于静止中心下方。每个拟南芥幼苗的主根中含12个柱干细胞，排成一层 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。柱干细胞层可细分为两个区，即中央区和外围区，前者含4个细胞，其形状与空间排列方式与静止中心细胞相似；后者含8个细胞，成一圈包裹在中央区的外围。柱干细胞的分裂高度同步，且方向一致，沿水平方向横裂成两层，上层(又称近端层)细胞保留柱干细胞的特性，下层(又称远端层)细胞分化成柱细胞。柱细胞的分化过程也高度同步，由此导致该细胞区内呈现出按世代顺序排列的层状结构，同层细胞形态与分化程度相似，不同层中的细胞其年龄与分化程度按世代顺序逐层递增，直至最终在顶端脱落。侧根冠细胞由侧根冠干细胞平周分裂而成，其方向与柱干细胞的分裂方向接近垂直。侧根冠干细胞由侧根冠/表皮干细胞纵向分裂而来，共16个细胞，成一圈排列。侧根冠细胞每次分裂后，位于外侧的子细胞进入分化，同时可进行数轮水平方向的分裂，按世代顺序逐步向外移与向上延伸，最终从外层剥离 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]。 在根生长过程中，根冠的形状虽然维持恒定，但其内的细胞则在不断更新，因此根冠中的细胞分裂无论在速度还是分裂方式上均受到严格控制。正因如此，根冠是研究植物细胞分裂调控的理想材料 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。此外拟南芥的根冠由于结构简单，易于生长与观察，遗传与分子资源丰富等优点备受青睐。即便如此，我们对拟南芥根冠细胞的分裂的许多调控细节仍然知之甚少。例如目前并不清楚柱干细胞是否进行纵向分裂，侧根冠细胞分裂除在水平方向外是否在其它方向也进行分裂等。 本研究通过对根冠区的横切片的观察，发现在部分野生型幼苗的主根中，柱干细胞和柱细胞均可进行纵向分裂，侧根冠细胞中可出现在平周和垂周方向的纵向分裂。同时还观察到一例柱干细胞向外围膨大，由此挤断外围柱干细胞圈的现象，该形态异常可在多代子细胞中维持，对柱干细胞功能和根冠的整体结构无明显影响。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 本实验所用的材料为野生型(Columbia)拟南芥种子，其最初来源为英国诺丁汉大学的欧洲拟南芥种子中心(http://www.arabidopsis.org.uk/)。 2.2. 植物的培养和生长条件 种子消毒和培养方法如前报道 [ 5 ] [ 6 ]，种子用10%次氯酸 + 90%酒精混合溶液浸泡10分钟灭菌消毒，用酒精洗3~4遍，在无菌台吹干后点种于配制在10 cm × 10 cm方形塑料无菌培养皿中固化的1/2 MS琼脂(1%，w/v)培养基上。点种后的培养皿用Nescofilm封口膜密封，在上方封口膜的中央打开1~2个小开口允许培养皿内外空气交换，将培养皿垂直放置于22℃，16 h光照/8 h黑暗周期的培养箱中萌发，光照强度为12，000 LX。 2.3. 根切片 幼苗根切片制备方法参照文献记载 [ 7 ]。幼苗根先用固定液(含1% 戊二醛，4%多聚甲醛溶解于50-mM，pH 7.0的磷酸缓冲液中)固定，后用Technovit 7100树脂包埋，切片，具体操作方法参照树脂供应商Technovit的说明书。切片厚度为5~6微米，用0.05%钌红(Sigma)染色，DePeX (BDH)装片，Nikon ECLIPSE 80i微分干涉相差显微镜观察，DS-Ri1数码相机+NIS-Elements软件拍照和图像处理。