DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 4. 强降水成因分析 4.1. 不稳定条件 强降水发生时，大气层结的状况对其有很好的指示意义。图3是沿44˚N的假相当位温剖面图。强降水发生前12小时，在暴雨区的东西侧分别存在θse的大值中心，中心值为330 K。9日20时(图4(a))，暴雨西侧的高能中心减弱消失，东侧的高能中心向西伸展，高层的冷空气开始向低层侵入，此时暴雨区东侧的大气具有高温高湿的特性，处于对流不稳定状态，并且低层的θse与东侧θse大值中心水平梯度加大，暴雨区中有明显的能量锋区存在。偏东气流向暴雨区输送不稳定能量，为暴雨的产生积累了能量。10日02时(图4(b))，随着暴雨区上空的θse减小，强降水基本结束。 4.2. 水汽条件 沿暴雨大值区木垒双湾村做了6月9日14时到10日08时的水汽通量散度剖面图(图5)，可以看出 图4. 2015年6月9日20时(a)和10日02时(b)沿44˚N的假相当位温(实线，单位：K)及比湿(阴影，单位：g∙kg −1 )的垂直剖面 在9日14时之后，700 hPa以下为水汽辐合，随着水汽通量的偏西分量加大，9日20时在900 hPa附近出现了强的水汽辐合，辐合中心值为−25 × 10 −5 g∙cm −2 ∙s −1 ∙hPa −1 ，与双湾村22时16.5 mm的强降水相对应。9日23时之后，水汽通量散度中心值下降到−10 × 10 −5 g∙cm −2 ∙s −1 ∙hPa −1 ，高度在850 hPa~700 hPa之间。这与10日2时、3时双湾村的每小时23.7 mm、22.8 mm的强降水不相对应。由此可以看出，水汽通量散度在降水开始前明显增大，降水开始后，由于大气对水分的消耗，水汽通量散度的值处于相对的低谷。因此，水汽通量的大值区对明显降水的大小有一定的指示意义，但与降水量并无严格的正比关系。 图5. 2015年9日14时~10时08时木垒双湾村(43.7˚N，90.3˚E)水汽通量散度随时间剖面图(单位：10 −5 g∙cm −2 ∙s −1 ∙hPa −1 ) 4.3. 高低空急流配置对暴雨过程的作用 沿90˚E做垂直速度、u分量的剖面图(图6)，可以看出，43˚N(天山山区分水岭的位置)以南为东风带，以北为西风带，在天山两侧出现了东西风的切变。在东风带里，>5 m/s的风速区由1000 hPa伸至650 hPa，>10 m/s的大风速区集中在700 hPa以下。西风带的强度强于东风带，>10 m/s的风速区从1000 hPa伸至650 hPa，在200 hPa附近出现>20 m/s最大风速区，是高层最大西风气流轴的位置所在。东西风的切变为暴雨的持续辐合上升运动提供了有利的条件。在西风带的南侧出现了强的上升运动区，上升运动区从900 hPa升至500 hPa，最大中心值为3 × 10 −3 hPa∙s −1 ，与切变对应[ 8 ] 。 沿44˚N分别作了10日02时散度、垂直速度和涡度的剖面图(图略)，暴雨区对应中低层辐合，高层辐散以及正的涡度中心，散度场的垂直结构变化不仅有利于涡旋内上空抽吸作用的加强，而且有利于上升运动的增强，为暴雨提供了有利的动力条件。 4.4. 地形作用 昌吉 州地处欧亚大陆腹地，位于四周环山的盆地中，海拔从西部的441 m逐渐升到东部1858 m的倾斜谷地。此次暴雨天气过程集中在昌吉州东部，其地形作用不容忽视。暴雨开始前，昌吉地区受偏西气流控制，由于特殊的西低东高倾斜谷地的作用，随着偏西气流的加强及强迫抬升，在昌吉州上空形成垂直环流圈，为暴雨过程提供了强的垂直上升运动。同时，偏西气流将中低层暖湿气流向暴雨区输送，水汽在迎风坡辐合，为暴雨的产生提供了充沛的水汽。
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user: 5. 结论 通过上述分析，得出以下主要结论： 图6. 2015年6月9日20时沿90˚E u、w垂直剖面(阴影区为东西风带，虚线为上升运动区(单位：10 −3 hPa∙s −1 )) 1) 本次暴雨是在南亚高压双体型的大尺度环流背景下中小尺度天气系统造成的强对流天气过程。 2) 卫星云图上的中尺度系统，结构密实云区对应降水大值区，大降水的分布与云系的发展、强盛、消散紧密联系。 3) 天山两侧的东西风切变为暴雨提供了持续的动力条件，特殊的倾斜谷地的地形也使暴雨强度增大，暴雨区对应着强烈的辐合上升区，偏东气流将不稳定能量和水汽向暴雨区输送，为暴雨的形成提供了必要的条件。
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user: 摘 要 本文运用1998~2013年青藏高原低涡切变线年鉴分析高原切变线的活动特征。结果表明，高原切变线主要生成于高原东部，位于27˚~39˚N，高频中心位于昌都地区西北部。切变线向东移可到达湖南，向北移可到达内蒙古，向南移可到达广西等地。近16年来高原切变线的出现次数和移出次数均成增加趋势，1998~2013年高原切变线共生成571次，移出92次。夏半年高原切变线的活动次数高于冬半年，夏半年主要位于8月份，冬半年主要位于4月份，东部横切变线为主。93.8%的高原切变线的生命史在48 h内。影响高原切变线移出的主要系统有西风槽、青藏高压、西藏高压、副热带高压。早期青藏高原西部测站稀少，统计时选取的资料和样本长度以及对于高原切变线的定义标准不同是导致统计结果存在差异的主要原因。 关键词 :高原切变线，移出切变线，影响系统，降水
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user: 1. 引言 青藏高原是产生高原天气系统的源地，高原切变线就是它创造的产物。高原切变线的发生、发展和移动与我国夏季广大地区的暴雨、冰雹等灾害性天气相关[ 1 ] 。早在50年代后期杨鉴初等 [ 2 ] 对高原切变线的个例进行了分析，指出高原切变线是向北倾的。徐国昌 [ 3 ] 利用1960~1969年的高空气候平均资料研究指出高原切变线是夏季高原地面加热使高原北侧西风加大，高原主体风减弱的基础上，由地形绕流等动力作用形成的。低涡切变线降水是影响我国高原下游降水主要的天气系统 [ 4 ] ，1995年郁淑华等 [ 5 ] 分析了高原切变线对长江上游突发性暴雨的影响。胡长元 [ 6 ] 对1998~2009年夏半年影响青海地区的高原切变线进行统计分析，指出24.2%的切变线造成青海地区大降水，主要是以局地性大降水为主。曾皓 [ 7 ] 对川西高原南部暴雨的初步研究指出造成甘孜州暴雨的天气系统中高原切变线最为主要，占总暴雨次数的47.2%。普贵明等 [ 8 ] 对2007年云南7次强降水过程的分析研究，指出高原切变线与西南急流的有利配置是7次持续性强降水过程必不可少的条件。 关于切变线的统计研究前人已经有了一定的成果，四川乐山地区气象局 [ 9 ] 对1959~1974年7~8月份的历史天气图资料进行了普查和个例分析，指出高原切变及其大片雨区对乐山地区夏季降水有显著影响。青藏高原气象科学研究拉萨会战组，刘福明，师锐，何光碧，郁淑华等人 [ 1 ] [ 10 ] - [ 13 ] 分别对1969~1976年，1977~1981，2000~2004，2000~2007年的5~9月高原切变线活动进行了普查分析以及对1998~2010年逐月的高原切变线活动进行了统计研究。 从以上的研究可以看出对于高原切变线的统计工作年限并不连续，统计时段主要集中在每年夏季，关于这些统计结果之间存在怎样的差异以及造成差异的原因究竟是什么？在高原切变线中，西横、竖切变线的分布情况如何？高原切变线主要是在什么系统的影响下东移的？这都是需要研究的问题。本文利用中国气象局成都高原气象研究所出版的《青藏高原低涡切变线年鉴》对1998~2013年高原切变线活动进行更加全面的普查分析并探究各种统计结果造成差异的原因，为下一步研究高原切变线东移对我国异常降水的影响研究奠定基础。
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user: 2. 资料选取和相关定义 资料来源于中国气象局成都高原气象研究所出版的《青藏高原低涡切变线年鉴》以下简称“年鉴” [ 14 ] 。 为了方便描述高原切变线的活动特征，给出以下相关定义。 高原切变线：500 hPa等压面上反映在青藏高原上，温度梯度小、三站风向对吹的辐合线或二站风向对吹的辐合线长度大于5个经/纬距。 高原切变线过程：在每日08时或20时的500 hPa图上，从切变线生成或连续出现直至消失或移出高原为止，无论其维持时间长短均定为一次高原切变线过程。一次高原切变线过程可以有多次高原切变线出现，出现一次记为12 h，依此类推。 高原横(竖)切变线出现几率：高原横(竖)切变线出现次数与高原横(竖)切变线总数之比。 高原横(竖)切变线移出几率：高原横(竖)切变线移出次数与高原横(竖)切变线总数之比。
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user: 3. 高原切变线活动的空间分布 根据切变线生成时刻中点的位置分别在92.5˚E以东(西)，将切变线分为东(西)部切变线。将切变线生成时刻于经线的夹角 < 45˚的高原切变线，为竖切变线，否则为横切变线 [ 14 ] 。可以将切变线分为四类：东(西)部横切变线、东(西)部竖切变线。由图1结合表1可以看出，1998~2013年高原切变线共生成571次，其中东部横切变线共512次，主要位于青海南部以及西藏东北部地区，西部横切变线7次，主要位于西藏中部地区，东部竖切变线52次，主要位于唐古拉山的东段，西部竖切变线0次。高原切变线源地主要位于高原的东部，介于27˚~39˚N，高原切变线高频中心位于昌都地区的西北部。 高原切变线中点移出海拔高度 ≥ 3000 m的青藏高原区域称之为高原切变线的移出 [ 14 ] 。由图2结合表2可知，生成的571次切变线中有92次移出了高原，移出几率为16.1%，低于同期高原低涡的移出几率 [ 15 ] 。其中，高原东部横切变线移出77次，占83.7%，西部横切变线移出1次，占1.1%，东部竖切变移出14次，占15.2%，西部竖切变0次。高原切变线的移出主要以东部横切变线为主，其次是东部竖切变，生成于高原西部的切变线仅有1次移出。高原东部横切变线的移出可到达中国东部的湖南，北部的甘肃、内蒙古，南部的广西、云南等地。东部竖切变的移出到达四川的中东部、甘肃南部、云南东北部。高原西部唯一移出的横切变线向东移动可达四川东北部。
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user: 4. 高原切变线活动的时间分布 4.1. 高原切变线年变化特征 由图3，图4可知，近16年来高原切变线的出现次数和移出次数均成增加趋势，高原切变线活动主要是以东部横切变线为主，所以东部横切变线出现、移出次数和总的切变线出现、移出次数趋势相一致。 图1. 1998~2013年高原切变线源地分布，阴影区表示海拔高度 ≥ 3000 m，(a) 东部横切变线，(b) 西部横切变线，(c) 东部竖切变线 图2. 1998~2013年高原切变线移出分布，红色虚线为高原切变线过程中各切变线中点的连线表示切变线的移动情况，阴影区表示海拔高度 ≥ 3000 m，(a) 东部横切变线，(b) 西部横切变线，(c) 东部竖切变线 图3. 1998~2013年高原切变线出现次数年变化 图4. 1998~2013年高原切变线移出次数年变化 Table 1 The occurrence times of plateau shear lines from 1998 to 201
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user: 摘 要 近年来，云南遭受了百年不遇的严重旱灾，林业工程造林正面临着艰巨的考验，培育优良的抗旱树种及探索其抗旱机制显得尤为重要。因此，通过水分梯度法控水，我们从生长指标和生理生化指标等方面研究两种不同繁殖方式的膏桐(扦插苗与实生苗)的抗旱性，并利用SPSS软件进行方差分析和相关性分析、应用隶属函数法对其抗旱能力作出综合评价及比较。结果表明：1) 在不同程度干旱胁迫下，两种不同繁殖方式的膏桐苗木成活率均达到了100%，在重度干旱胁迫的中后期和末期部分叶片才出现了萎蔫、叶片卷曲、枯萎、落叶等现象；2) 膏桐实生苗和扦插苗的苗高生长均受到抑制，且随着干旱胁迫程度的加剧、时间的延长，苗高生长量受抑程度增加；3) 植株总干重、茎干重、叶干重和根干重均呈现下降趋势，与对照相比，膏桐实生苗上述指标的降幅均低于膏桐扦插苗；4) 与对照相比，膏桐实生苗及扦插苗苗木的根冠比都随着干旱胁迫强度的加强和胁迫时间的延长而呈现出明显的上升趋势；5) 苗木叶片相对含水量下降，下降幅度与干旱胁迫强度及时间成正比，且繁殖方式不同，下降幅度不同。由此可知：无论哪种繁殖方式的膏桐在干旱胁迫条件下苗木仍能维持较正常的生理过程，保持相对高的生长速率，抗旱能力较强。根据各项生长指标来判断，膏桐实生苗的抗旱生长略高于膏桐扦插苗。 关键词 :膏桐，抗旱性，生长性状，实生苗，扦插苗
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user: 1. 引言 近年来，云南遭受了百年不遇的严重旱灾。如何高效地应用抗旱树种来改善生态环境，涵养水源，促进自然水良性循环已成为云南林业所迫不及待需解决的问题。膏桐具有很强的抗旱、耐贫瘠、耐高温的特性，且具有很高的经济价值、药用价值、农用价值、生态价值和潜在的开发价值[ 1 ] -[ 5 ] 。由此可见，膏桐可作为云南抗旱造林的优良树种，进而对其抗旱性的研究成为了首当其冲的任务。 通过在干旱胁迫下直接研究苗木生长和产量等指标的受害程度，进而对苗木抗旱能力做出判断是应用最广泛的最直接的鉴定方法。在水分胁迫条件下植物仍维持较正常的生理过程，保持相对高的生长，是抗旱品种选育的根本目的所在。生长行为是植物受多种环境因子综合作用的最终表现[ 6 ] 。膏桐是金沙江干热河谷的速生树种，广泛分布于干热河谷，该地域气候炎热干燥、降雨量少，土壤干旱贫瘠，而膏桐对其表现了很强的适生性[ 7 ] 。谢安德等的研究表明[ 8 ] ：土壤自然干旱胁迫14 d，各种源麻疯树质膜相对透性与MDA起到清除活性氧和自由A含量增加幅度缓慢，而POD与CAT活性随胁迫时间的增加积极响应，充分基透性与抑制膜脂过氧化的作用；一旦超过14 d这个阈值，质膜相对透性与MDA含量急剧增加，由于细胞膜系统被过度氧化损伤以致难以恢复。伊丽等对膏桐幼苗的研究表明[ 9 ] ：干旱胁迫条件下，麻疯树幼苗茎和根部的游离脯氨酸、可溶性蛋白质和茎部可溶性糖大量积累，叶片中脯氨酸含量也随干旱胁迫程度的增加大幅度上升。吴涛等研究表明[ 10 ] ：随着干旱胁迫时间的延长，红河、永涛和元阳3个种源膏桐的叶绿素含量逐渐缓慢降低，饱和水分亏缺、质膜相对透性、丙二醛含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量值呈上升趋势，其中后3个指标的增幅明显，表明膏桐这一树种具有较强的抗旱能力。 在不同环境条件下，选择更适宜的繁殖方式，来满足生态环境建设及林业发展的需要显得尤为重要，然而对比膏桐的实生育苗与扦插育苗两种不同繁殖方式下的抗旱性研究鲜见报道。因此，本研究通过水分梯度法控水，从生长指标和生理生化指标等方面研究膏桐两种不同繁殖方式的抗旱性，利用SPSS软件进行方差分析和相关性分析；应用隶属函数法对其抗旱能力作出综合评价及比较，从而为膏桐抗旱性理论的研究打下基础，并为云南省的森林植被恢复、生态环境建设中培育种植膏桐的繁殖方法选择上提供科学的理论依据和实践上的指导意义。
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user: 2. 研究材料 以采自云南省元阳县海拔218 m的实验林场内同批膏桐种源的种子及扦插枝条为材料。将采集的种子及扦插枝条于2012年3月上旬实生、扦插于云南省林业科学院温室大棚中的苗床内。选择生长势比较一致的苗木于2012年5月下旬移植于塑料盆内(盆高30 cm，内径25 cm)，每盆栽1株，置于温室中，室内温度保持在 25 ℃ 左右。苗木在充足的阳光、温度、水分条件下生长。
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user: 3. 研究方法 3.1. 干旱控水处理方法 试验的干旱控水处理方法采用Hsiao (1973)提出的关于植物的水分梯度法[ 11 ] 。共设四个干旱胁迫处理水平，分别为：对照正常处理(CK)、轻度干旱胁迫(T1)、中度水分胁迫(T2)和重度干旱胁迫(T3)，即土壤含水量分别控制在基质田间最大持水量(40.4%)的75%~80%、55%~60%、40%~45%、30%~35%。选择生长势比较一致的苗木于9月份开始进行抗旱试验。干旱梯度形成前使各盆的土壤相对含水量基本达到饱和，然后停止浇水让其自然干旱至设定标准。用烘干和称重相结合的方法控制土壤含水量，每天下午六点向盆中插孔用量杯补充消耗的水分，使各处理稳定在设定的土壤含水量范围内。每个处理6盆，即6个重复。为了防止雨水和处理外的其他水分影响，实验在两面通风的塑料遮雨棚内进行。在测量土壤相对含水量取土样时，同时记录土盒号和盆号，测定完土壤含水量的土样重新放到原来的苗木盆中，以保证每次取土样不会对试验结果产生影响。 3.2. 试验测定 试验过程中对苗木的形态特征、生长指标进行观察、测定， 2012 年 9 月 1 日 试验开始，每10天测定一次，共测定4次。 3.2.1. 苗木存活率的测定 分别在 9 月 1 日 、 9 月 11 日 、 9 月 21 日 、 10 月 1 日 观测膏桐实生苗与扦插苗的存活率。存活率 = 干旱胁迫后苗木存活株数/苗木总株数 × 100%。 3.2.2. 苗高的测定 分别在 9 月 1 日 、 9 月 11 日 、 9 月 21 日 、 10 月 1 日 测量每株苗木的高度。 3.2.3. 生物量的测定 将不同程度干旱处理的各苗木，用自来水洗去灰尘及根部的土壤，再用滤纸和吸水纸擦净苗木上的水分，将各部分剪断，分别置于托盘中，放入烘干机中 80 ℃ 烘干约10小时，直至相隔30分钟的两次测量值不变为止，再用电子天平称量出各部分干重，得出叶片生物量、茎枝生物量、根系生物量、根茎生物量、苗木总生物量。 3.2.4. 根冠比的测定 根冠比 = 地下部分生物量(干重)/地上部分生物量(干重) 3.2.5. 叶片相对含水量的测定 剪下叶片后立刻称鲜重，然后将它们放入装有蒸馏水的烧杯中，黑暗中放置24 h后称饱和重，之后于鼓风烘箱中80℃烘干48 h，称干重。每个处理重复三次，取平均值做为该次取样植物叶片的相对含水量。叶片相对含水量RWC(%) = (鲜重 − 干重)/(饱和重 − 干重) × 100%。 3.3. 数据处理 实验测定数据经过初步整理后输入Excel软件绘制表格及制图，并应用SPSS软件进行数据分析处理。
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user: 5. 结论与讨论 5.1. 结论 从研究结果可以看出：1) 膏桐实生苗及扦插苗在不同程度干旱胁迫条件下均能正常生长，且成活率均达到了100%。只有在重度干旱胁迫的中期和末期，膏桐实生苗及扦插苗部分叶片才出现了萎蔫、叶片卷曲、枯萎、落叶等现象；2) 随着干旱胁迫时间的延长和胁迫程度的加剧，两种不同繁殖方式膏桐苗高的相对增长量、生长速率和抗旱系数均呈现下降的趋势。且无论是实生苗还是扦插苗在干旱胁迫条件下苗木仍能维持较正常的生理过程，保持相对高的生长速率，抗旱能力较强；3) 在生物量研究方面，两种 图1. 不同程度干旱胁迫期间膏桐实生苗与扦插苗的根冠比变化 图2. 不同程度干旱胁迫条件下膏桐实生苗与扦插苗的叶片相对含水量变化 不同繁殖方式的膏桐植株总干重、茎干重、叶干重和根生物量均出现不同程度的下降；4) 对根冠比研究的结果还可看出，随着胁迫的增强膏桐实生苗及扦插苗的根冠比呈现出了显著的增加的趋势，即根部的干物质的积累呈现出上升的趋势。 5.2. 讨论 植物对水分需求及对水分亏缺的反映是与植物本身外部形态特征、生长状况及生态条件密切相关的。一般来说，当水分条件不能满足植株需要时，即会带来一系列的缺水生理反应，以适应水分不足的条件，维持植株的生存，经过长期的作用，就会逐渐表现出适应性的外部形态特征。随着水分亏缺程度的加重，植物生长受到严重影响，甚至导致全株枯死。由于植物种类及受水分胁迫的状况不同，其规律性及表现也不完全一致[ 12 ] -[ 14 ] 。在不同程度的干旱胁迫过程中，两种不同繁殖方式的膏桐外部形态发生着一系列的变化。干旱胁迫对膏桐的伤害最先表现在顶芽上，顶芽发生萎蔫。随着干旱胁迫强度的增加和干旱胁迫时间的延长，叶片萎蔫逐渐向下蔓延，苗木中下部的叶片出现黄化，最后萎蔫的叶片逐渐枯萎。干旱胁迫过程中，从苗高的测量可以看出，苗木生长较慢。也就是说干旱胁迫的强度越大、时间越长，植株所受伤害越严重。 生物量的变化，综合反映了外界因子对苗木生长的影响以及苗木对外界环境的适应能力。生物量是膏桐获取能量能力的主要体现，对植株的发育和结构的形成具有十分重要的影响。在生长发育过程中，植株要不断调整其生长和生物量的分配策略来适应环境变化。在干旱胁迫条件下，膏桐通过调整生物量分配将逆境伤害降低到最小来适应环境胁迫。当膏桐植株受到干旱胁迫时，根系生物量在整个植株生物量中所占比重提高，有助于植株从干旱的土壤中吸收水分，保持体内水分平衡。由研究结果可知，在不同程度干旱胁迫条件下膏桐实生苗及扦插苗的根系生物量占总生物量的比重升高，而且从根部干重和总生物量的相关分析可以看出，根干重和总的生物量呈现极其显著的正相关。 根冠作为相互作用的共同体，在二者的消长变化及干物质的分配关系中水分扮演着重要角色。从本研究的结果看，随着胁迫的增强，膏桐实生苗及扦插苗的根冠比呈现出了显著的增加的趋势，即根部的干物质的积累呈现出上升的趋势。造成根冠关系的原因可能是：在植株的生长过程中，由于干物质优先供应于作物的根系，从而促进了根系的发育，提高或维持根的活性，吸收更多的水分，减少水分不足对根、冠的损坏。因此根冠比增大有利于缓解干旱胁迫、防止水分以更快速度丧失，使苗木更加有效地利用水分资源，长时间维持生存。 随着干旱时间的延长和干旱强度的增加，苗木会发生一系列的生理生化反应，如细胞膜相对透性增大，呼吸强度减弱，叶片水势降低，相对含水量减少，pH值改变，破坏了离子平衡，酶失活，代谢失调，最终导致植株伤害甚至死亡[ 15 ] [ 16 ] 。随着干旱程度的增加，膏桐叶片含水量逐渐减少，以此来适应干旱对膏桐植株造成的影响。 综上所述，膏桐实生苗和扦插苗均具有良好的抗旱性，说明膏桐是一种耐旱的树种，可以运用到云南抗旱造林中。在不同程度的干旱胁迫条件下，膏桐实生苗的保存率、抗旱系数、根冠比和叶片相对含水量均大于扦插苗的，说明膏桐实生苗比膏桐扦插苗对干旱胁迫的适应能力大一些。因此，在抗旱造林时，可以多培育膏桐实生苗，以增大旱期保存率。
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user: 摘 要 新媒体为校园文化带来了新的机遇和挑战，是校园文化建设的必由之路。新媒体下校园文化建设呈现时代性与多样性融合、交互性与个性化共存、内容和形式扩展的特点，也带来了信息监管难、信息碎片化、多元文化对主流文化冲击、网络依赖等问题。在校园文化建设中要加快校园数字平台建设、丰富校园文化内容与形式、发挥舆论宣传作用、加大网络监督，提高学生的媒体素质。 关键词 :新媒体，校园文化
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user: 1. 引言 随着社会的不断发展，文化的重要性越来越凸显出来。不同的文化环境中成长的群体，在潜移默化的影响中会形成该文化背景中所特有的价值观念、思维方式、生活态度、情感意向以及生存意识。对于一个国家和名族而言，文化是核心竞争力，是创造力、生命力和凝聚力的重要影响因素。校园文化从属于社会文化，是社会文化的重要组成部分。对学校而言，校园文化体现了学生教师的精神状态和价值追求，是学校人文氛围的体现和表达。作为国家人才的聚集区，高校校园文化能够很大程度上影响社会文化大系统，更为重要的是高校校园文化为青年学生提供了最直观最贴近的社会环境，能够直接作用于学生人生观和世界观的塑造，在很大程度上影响学生的成长。 新媒体是相对于报纸、电话、广播、电影等传统媒体而言，依托于数字技术、互联网技术和移动通信技术等向受众提供信息服务的新兴媒体。具体来说，包括手机网络和互联网网络等多种形式  (廖祥忠，2008) 。新媒体的出现，对人们的学习、生活和交往方式都产生重大影响，快闪、微博打拐、微博问政、各类微信平台的建立等都表现出了新媒体对社会文化的深刻影响。而新媒体校园文化建设的影响也极为深刻。在学生的生活中，上网占用了大量时间，而微信、微博等新媒体已然成为了学生了解社会的重要甚至主要渠道，影响着学生的态度和行为方式。新媒体是社会发展的潮流，也是校园文化建设的趋势，它是校园文化的载体，也为校园文化带来了更贴近世界、贴近时代、贴近生活的内容，当然一些糟粕也不可避免得冲击着主流校园文化建设。新媒体师生学习、工作、生活、娱乐提供便利的同时，也在不知不觉地改变着人们原有的意识习惯，塑造和培养着新的思维方式，进而影响到了校园文化生活的方方面面。课外一件事便可能将教师在课上所有的努力带来的成效归为零，在新媒体条件下，学生接受外界的信息是更为开放和自主的，因此，提高学生的媒体素养，加强新媒体与校园文化资源的整合与协作，充分利用新媒体，合理应对新媒体形势带来的冲击成为校园文化建设必须解决的问题。
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user: 2. 新媒体下校园文化的建设的特点 新媒体作为一种新生事物，本身就是一把双刃剑。在它身上既有前沿、新颖、精华的内容，又有消极、腐朽、低糜的信息。新媒体具有内容形式丰富、覆盖面广，分众性、交互性、实时性强、传播广泛、传播成本低廉等特点。在新媒体的影响下，校园文化建设也有了新的变化： 2.1. 时代性与多样性融合 网络上信息的传播和接收都是无时间限制的，可以随时的发布消息，利用新媒体，可以让信息的传播和接受达到同时、同步。信息的传播途径多种多样，达到前所未有的速度。校园文化借由新媒体发展的契机能够紧跟时代发展的步伐，创设更多平台，使每一个学生都能成为校园文化建设的直接受众，让每一个学生都参与到校园文化建设中来。 2.2. 交互性与个性化共存 信息的传播不再是简单的“一对多”，或者“多对一”线性传播方式，而是一种交互性的裂变传播，有利于增加信息的来源和信息量以及信息的反馈，其信息内容的传播速度和影响范围呈现出几何级速度增长。同时新媒体提供一个自由快捷的信息传播平台，人们可以发表个性化的言论，是所有人对所有人传播的方式，相较于传统媒体而言，人与人之间有更强的互动。当代学生在其中无疑占据了重要部分，他们是信息的接受者，也是信息的传播者，可以借由个性化的网络语言、网络恶搞等展现活跃的思想，充分展现自己的个性。 2.3. 内容和空间的拓展 新媒体技术上的革新带来了传播方式和内容的变化。新媒体既是一种文化载体，也是一种文化形式，为校园文化建设带来了大量丰富的文化资源。同时，新媒体也是知识技术应用创新的前沿阵地，拓展了学生活动的空间，加强了各单位、各组织、个人之见的联系，扩大了文化的覆盖面，为校园文化建设和传播提供了新的平台。
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user: 3. 新媒体环境下校园文化建设的挑战 3.1. 信息监管难度大 新媒体“个人–个人”的传播方式架构了一个四通八达的信息传播网络平台，在交互性空间发展，给学校文化建设带来交流便利的同时，也使信息传送处于一个毫无限制的状态。面对铺天盖地的信息，学生除了依靠自身认知能力和经验进行甄别判断以外，没有一个有力的监控系统能够充当信息的“过滤网”。学生一旦获取不良信息，就会立即在学校传播，造成的消极影响效应会瞬间放大，许多子虚乌有的事情也会成为心中的现实。虽然目前对校园网站、BBS论坛、博客等内容加大了监控力度，但对于手机终端的上网信息却没有十分有效的监控手段，不良信息追查的难度加大。新媒体传播方式可控性弱的特点，使学校文化建设过程中，维护正确舆论导向的成本增加、难度加大。 3.2. 信息碎片化 新媒体的出现加速了知识和信息的碎片化。通过新媒体获取的知识不再完整、系统，而变成了零散、无序和互不关联的，在短期内能够获取海量信息，但学生在这种方式之中，容易缺乏思考的逻辑性和连贯性，也易产生被信息淹没的感觉，进而产生一种不信任感。在校园文化建设过程中，要避免新媒体自身传播信息碎片化的缺陷，维护学生心理健康与思维的发展。 3.3. 多元文化对主流文化的冲击 新媒体环境是一个开放的系统，其信息传播的无屏障性是高校校园文化建设面临的首要问题。高校作为国内外各种思想文化的交汇中心，西方文化及其生活方式通过新媒体快速而深入的传播到校园当中。新媒体环境下，高校文化建设将直面外来文化与本土文化的冲突与交融。“一个文化因素，在他本土的社会体内本来无害或是有利的，但是把它移植于另一个社会体内，却很容易产生意外的、极大的破坏作用”  (陈湘舸，吴太贵，2006) 。高校校园已不能像过去那样“象牙塔”般游离于社会之外，以互联网为代表的新媒介正以不可挡之势向广大师生传递各式各样的价值观，其中混杂着大量渲染暴力、色情、享乐主义、拜金主义等消极颓废的思想观念。同时，大学生触觉敏锐、判断力不够、可塑性极强，这使得多元的文化趋势、多维的价值视角对他们的世界观、人生观和价值观产生严重的负面影响。这也给高校校园文化建设带来严峻的挑战。 3.4. 网络过度依赖带来的负面影响 新媒体的出现给学生提供了新的交流方式与方法，丰富多样的内容和生动有趣的形式无疑能够引起学生的兴趣。但网络交往本身是缺位的交流，过度以来可能造成学生现实中的人际交往能力下降，导致自卑、孤僻等不良的影响，而一些社交平台、社交游戏的广泛流行也会有成瘾的风险。
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user: 4. 着眼新媒体，抓住校园文化建设主动权 新媒体为校园文化建设带来了机遇，同时也带来了挑战。在现实过程中，要扬长避短，充分发挥新媒体的积极作用。新媒体是社会发展不可逆转的潮流，学校在校园文化建设过程中，要适应潮流的发展，抓住主动权，占领教育的高地。具体措施包括： 4.1. 把握新媒体数字化、网络化趋势，加快校园文化数字平台建设 新媒体作为人类新技术革命的最新成果，已经融入现代人生活的方方面面。校园文化建设必须针对这一现实，加快校园文化数字和网络平台建设。应适当超前规划大学校园的信息化平台建设，加大投入，提升大学校园网络基础设施的水平；应加强大学校园网络信息资源的统筹整合和开发利用，提升广大师生使用新媒体的基础平台条件；应加大技术投入和研发力度，也可借助移动、联通和电信等运营平台，开发校园独立的新媒体专用平台，以提升校园文化网络和数字平台建设的质量  (李彬，吴一敏等，2014) 。 4.2. 丰富校园文化内容，创新校园文化形式 应加强引导，按照新媒体特有的信息采集、制作、存储、传输的方式方法，大力提高内容生产水平，大力提高内容制作的科学性、针对性和传播形式的适应性，用品类丰富、内容清新、格调健康、使用方便的信息增强校园文化的吸引力和影响力。如创新学校办学理念、校风校训、教风学风以及学校全体成员的精神风貌、价值取向等，提升校园精神文化质量。可通过引领行为文化，以师生员工在从业、为学、休闲娱乐时的具体行为展示，全方位打造契合校园生活的独特品牌。如可通过校园微博直播校园迎新节目、毕业晚会、歌手大赛等，以独具特色的现场感吸引大学生注意；还可以通过“转发有奖”、“公益募捐”、“读万卷书”、“看红色电影”等形式加强大学生的参与的亲近感等。 4.3. 发挥舆论宣传作用，适应学生个性发展 处于新媒体环境中的校园文化建设，应坚持正确的舆论导向，强化校园文化核心价值观培育，提高舆论引导的及时性、权威性、公信力和影响力。要是弘扬主旋律，通过大量正面、客观、权威的信息发布进行引导，使新媒体上有正面声音和正向能量；应加强校园文化宣传阵地建设，传递美好情感、守护道德良知，把校园文化作为建设主流价值观的倡导者、推动者和实践者。与此同时，新媒体平台建立需考虑学生特点，为学生所接受才能达到教育的效果。在平台中强化互动内容，让学生能够发表自己的看法，参与其中，顺应学生个性的发展，提升校园文化的亲和力。 4.4. 加强网络监管，重视学生新媒体素养的培养 学校要加强网络监管，学校可培养一批网络意见领袖，并对已存在的网络意见领袖进行培训，引导网络舆论的积极导向；针对新媒体去中心化的传播方式、手机网络信息难追踪等问题，可发挥学校的技术优势，开发校园新媒体监控的绿色软件，与手机网络等运营商合作，共同研究重点区域信息监控技术的创新  (刘昌成，2013) 。 大学生新媒体素养主要包括对网络信息的辨别、分析能力，能较好的使用操作新媒体的技能，以及增强网络道德法律意识等内容。应将大学生新媒体素养培养有机融入学校文化建设等活动中。通过讲座、倡议公约等形式倡导网络文明建设，加强学生自身的网络道德修养。
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user: 摘 要 校园欺负是指力量相对强势的一方学生重复攻击力量弱势的学生，这是学校里普遍存在的问题。欺负是群体社交过程，在大多数校园欺负情境中，大部分学生不是直接作为欺负者或受欺负者，而是作为旁观者出现其中。有实验证据表明旁观者如果采取干预欺负行为，能够有效地降低学校欺负事件的发生率。早期对校园欺负的研究主要集中在欺负和受欺负者两类群体。然而，最近旁观者群体对欺负行为的影响研究开始崭露头角。本文试图对国内外有关校园欺负旁观者的研究成果进行梳理，主要介绍了校园欺负旁观者的分类、与欺负事件中其它参与角色的关系、测量工具，并提出以往研究存在的问题和未来的研究方向。 关键词 :校园欺负，旁观者，参与角色
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user: 1. 引言 欺负行为是校园内经常发生的一种特殊形式的攻击行为，以力量的不均衡性，通常是力量强的一方欺负力量弱的一方，与重复发生性，即欺负者与受欺负者在一定时间内，形成稳定的欺负/受欺负关系为特点。早期对欺负行为的关注集中在欺负者和受欺负者这两类二元群体中，很少有对旁观者这一群体的研究。而校园欺负现象的群体本质，要求我们的研究不应该只关注欺负者和受欺负者，而应该将欺负情境中的旁观者也纳入主要研究范围之内。目前，国外有关校园欺负旁观者的研究已相当广泛和深入。国内学者对该领域的研究正在逐渐兴起。大量文献表明如果旁观者群体帮助受欺负者，积极干预欺负行为，能够降低学校欺负事件的发生。本文试图对国内外有关校园欺负旁观者的研究成果进行梳理，主要介绍了校园欺负旁观者的分类、与欺负事件中其它参与角色的关系、测量工具，并提出以往研究存在的问题和未来的研究方向。
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user: 2. 旁观者的分类 在欺负事件中，根据 Salmivalli (1996) 对旁观者群体的细致划分及定义，能够分为四种不同的角色：第一，跟随者，指协助、跟随欺负者参与到欺负行为中；第二，强化者，指通过某些行为方式来强化欺负者的行为，比如，起哄，煽风点火等；第三，助人者，指帮助受欺负者，比如，制止欺负行为或安慰，支持受欺负者；第四，局外人，指什么也不做，回避欺负情境。 当旁观者用正面反馈去煽风点火欺负者，实际上他们是在强化欺负者的行为，这会让欺负者变得更加具有攻击性。而且，旁观者的强化行为和班级里高频率的欺负事件相关 (Salmivalli， Voeten， & Poskiparta， 2011) 。正反馈既能够通过加入欺负者去实施欺负行为，也能够通过展示出你支持欺负行为来达成。有时候，只是消极地旁观，不作为，都能给欺负者提供正反馈。同时，强化欺负者的行为，会使受欺负者体验到更多的负面影响，比如更高的焦虑，抑郁和更低的自尊 (Salmivalli， 2010) 。相反的，当旁观者站在受欺负者这一方，就能够威胁到欺负者的地位，进而让欺负者决定中止欺负行为。旁观者能够通过试着阻止欺负者，支持受欺负者，来缓冲欺负带来的负面影响。
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user: 3. 旁观者与其他参与角色的关系 3.1. 旁观者的行为和欺负者的受欢迎度 在欺负中，旁观者扮演着重要的角色。因为欺负者经常实施欺负的其中一个目的是，为了获得更高的同伴地位，满足统治欲，在同伴群体中展现同伴地位优势。通常，这一目的的达成，需要依靠同伴群体也就是同伴旁观者 (Salmivalli， 2010) 。因此，欺负行为的实施很大程度上依赖于旁观者在欺负情境中的行为。 通过同伴题名的方法调查一个班级的助人者和强化者的比例，发现如果教室里的学生倾向于帮助受害者，避免强化欺负者，那么通过自我报告调查出的，此班级欺负发生率会较低 (Salmivalli， Voeten， & Poskiparta， 2011)  。同样，如果一个班级有高比例的强化者，低比例的助人者，那么班级中的被欺负同学的比例将增加 (Kärnä et al.， 2010) 。 助人和强化这两种行为会欺负者的受欢迎程度影响，主要是因为欢迎度会相互感染的本质 (Marks， Cillessen， & Crick， 2012) 。有研究表明，与高度受欢迎的同伴关系亲密，能够提高自己受欢迎的程  (Dijkstra， Cillessen， Lindenberg， & Veenstra， 2010) ，可以用光环效应解释这一现象。因为学生们都高度重视自己的受欢迎度，特别是青年早期 (LaFontana & Cillessen， 2010) ，所以在光环效应的作用下，大多数青少年在选择朋友时，倾向于和受欢迎的同伴做朋友 (Cialdini & Richardson， 1980) 。 这些偏好对他们在欺负情境中的行为有重要的预示作用。帮助受欺负者，这一行为本身就是有风险的，因为那意味着，当你帮助受欺负者时，可能你不仅要面对欺负者，有时还要面对他/她的支持者 (Pozzoli & Gini， 2010) 。而对于潜在的助人者而言，他们会更加觉得有危险，因为反对一个受欢迎的欺负者，更有可能导致欺负者的同伴群体的报复和自己地位的丧失。近来有研究表明，通过同伴题名的方式，如果班级里，欺负者更受欢迎，那么班里会更少出现助人的行为。另一方面，公开地支持一个受欢迎的欺负者也许是被视为一种特殊的方式去增强自己的受欢迎度。因此，在反对欺负的干预项目中，对受欢迎的欺负者之所以效果不明显，不仅是因为他们自身的负面行为能满足他们的统治欲望，而且也因为他们的同伴较少地抵抗欺负的行为。 3.2. 旁观者影响受欺负者对欺负行为的反应 研究发现在欺负事件发生后，同伴旁观者群体中，会出现鼓励受欺负者进行报复和不鼓励其进行报复两种反应。 研究者在与高中生的访谈中，发现他们有时会鼓励报复，把鼓励报复当作一种自利而又低风险的方式去伤害一个自己不喜欢的同伴。比起自己本身的行为模式来说，来自于朋友的鼓励报复的建议对受欺负者有更大的影响力，会推动受欺负者采取攻击行为 (Gasser & Malti， 2012) 。 相反，亲社会的朋友可以帮助受欺负者不产生报复行为 (Lamarche et al.， 2007) 。他们阻止朋友产生报复行为的方式，也许与那些干预项目里所提倡的相比，没有那么明显的亲社会，比如：他会劝告说：“考虑下你这样做之后的结果”，但是在帮助恢复受欺负者的自我效能感上是更加有效的。 比如，一个旁观者帮助一个受欺负者抑制他的愤怒，通过冷嘲热讽欺负者，说到：“他不值得你这样做”，这能够让受欺负者在不能实施报复时，感觉面子上有所挽回。而且，这个行为除了表示对欺负者的蔑视，还意味着相信受欺负者是有能力为自己复仇的，这起到了安抚受欺负者的作用。同时，这个行为对被羞辱事件和立即反应之间起了延迟反应作用，这一策略也应用于干预的项目中。 3.3. 旁观者的反应对未参与的学生的影响 Gini (2008) 采用了混合实验设计，来检验学校中旁观者对不同欺负类型的反应是否会影响到学生们对欺负的看法，对受欺负者的态度以及他们在学校的安全感。在研究一中，1217名中学生被随机分配到一个描述直接欺负的假设情境中，在研究二里，给376名小学生和390名中学生呈现两种情境，一种是直接欺负，另一种是间接欺负情境。 在所有情境中，操纵旁观者对欺负的反应和受害者的性别。被试支持帮助受害者的亲社会行为，不支持赞成欺负者行为。而且他们也把对欺负的消极不作为反应也看作是负面的行为。在被试对受害者的积极态度方面，低年级的显著高于高年级的，女生显著高于男生。旁观者的行为影响到被试对欺负者的看法和被试在学校感知到的安全感。 研究结果证明了欺负会负面地影响学生感知到的在学校的安全感，更重要的是本研究表明周围同伴群体的行为也会对感知到的安全感有一个直接的影响。 当旁观者帮助受欺负者时，被试的安全感最高。这样的反应可能是由于传递出了一个观点即欺负在同伴群体中不被接受，在面对欺负事件时，同学们会准备干预和帮助受欺负者。相反，当旁观者协助欺负者时，被试感知到的安全感非常的低，可能归于一种恐惧和不确定的氛围在整个群体的蔓延。最后，从安全感的数据看来，在旁观者不作为的情境下，安全感的平均数得分低，这也说明了，被试不把旁观者的不作为行为解读为中立反应，而是把这当作是默许欺负的行为。 同伴群体在欺负发生时，特别是以旁观者对欺负的反应，对学校的氛围，那么没有直接参与进来的学生的安全感有直接的影响。 Gini在研究中还发现一个有意思的结果是当把责备受害者当作一个实验条件进行操控时，被试会把旁观者的不作为行为当作是暗示受欺负者应当为欺负行为负责。虽然总体上来看，学生们认为受害者应当对自己被欺负负责的比率很小。但是当旁观者消极不作为时，相比于另两种情境的出现，即旁观者帮助受欺负者和强化欺负者，被试会更多地认为受欺负者应当为自己的遭遇负责。也就是说，当一个人被欺负，而没有人进行干预时，被试会趋于认为受欺负者活该这样的遭遇。 从韦勒的归因理论来看，在面对潜在的有伤害性的事件中，责备他人是一个非常真实的自我服务归因，而且，特别是责备受欺负者本人要为自身的遭遇负责，这是一种使被试自己情感隔离的方式，能从心理上避免去体验这样的窘境下带来的不适感 (Weiner， 1995) 。 也许是当旁观者积极参与时，无论是正面的或是反面的，被试的注意力都放在旁观者身上，这样就较少地去关注和责备受欺负者。在旁观者采取正面行为时，被试看见旁观者帮助受欺负者，也许会让被试认为被欺负的同学是无辜的。而在旁观者采取负面行为时，被试的注意力有可能被欺负者和强化者所吸引，而这并不是被试推崇的行为，所以会导致被试认为这些攻击者而不是受欺负者，应该为所发生的欺负事件负责。相反的，当旁观者消极不作为时，被试的注意力都在欺负者–受欺负者这个关系上，也就更容易把归因放在这两个角色上，从而也就更有可能去指责受欺负者。
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user: 4. 旁观者干预行为的测量 尽管同伴旁观者能够加剧或防止校园欺负行为的发生，但研究一直受到阻碍，缘于缺乏有效的评估工具来测量出旁观者干预模型的过程和顺序步骤。 Nickerson (2014) 以Latane和Darley提出的旁观者行为模型为理论依据，编制了欺负行为中旁观者干预量表。 旁观者行为模型具体指，旁观者在做出行为之前会有五个步骤：第一，注意有什么事发生；第二，对事件进行解读，并决定是否干预；第三，假定介入后所负的个人责任；第四，决定要去做什么；第五，掌握必要的技巧和资源以采取行动。 通过对旁观者效应的研究，Latane和Darley (1970)发现四种作用机制：第一，自我觉察，一个人的行为依赖于事件发生时其他人的在场；第二，社会线索，一个人的行为依赖于环境中其他人的行为或不作为；第三，阻止，一个人的行为会受另一个旁观者行为的阻止；第四，责任分散，一个人的行为依赖于旁观者的人数，旁观者人数越多，一个人越不可能觉得有义务采取行动。虽然Latane和Darley的研究是针对在紧急情况下的旁观者，后来的学者们将他们的旁观者效应理论有效地应用于非紧急情况 (Anker & Feeley， 2011) 。旁观者干预模型被成功地应用于许多不同的领域，比如说家庭暴力 (Hoefnagels & Zwikker， 2001) ，性骚扰的预防 (Burn， 2009) 等等。 值得说明的是，Latane和Darley关注的是特殊的社会紧急事件比如，一个陌生人在大街上遭遇攻击，这和欺负情境有一个不同，那就是前者经常是没有预料到的，包括陌生人，而后者是重复的，包括身边同学。所以两者并不是完全的一致。但是，社会紧急事件和欺负事件还是有一些相关点：第一，都有受害者的出现，第二，个体需要帮助的事实；第三，对做出干预行为的人有潜在的威胁。 Nickerson (2014) 研究结果验证了五大步骤的旁观者干预模型可以用于欺负情境中，并且此量表与共情，对欺负的态度，认知，呈正相关，这与实验假设相一致。此研究的结果支撑以欺负中旁观者干预中的五大决策步骤为框架。 在此框架下，对学生进行评估，有几方面的优势。比如说，未来的研究可以收集形成一个国家或地区的数据库，以便科研人员和实践人员开发出对模型的每一个步骤的标准化或规范化。鉴别出，学校中不同学生个体或学生群体在这些步骤上的差异，能够有助于干预措施的制定。经过验证的有效的旁观者干预的决策过程的五个步骤，其本身也就对干预的实施有很好的启示。干预的制定可以去细化模型中的每个步骤，为了当校园欺负发生时，增加同学们对欺负的辨识，诠释欺负为是需要干预的问题行为，接受欺负情境中，应当提供帮助的个人责任感，学会安全干预的技能和手段，以及实践如何实施干预的决定。
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user: 5. 研究展望 回顾已有研究与理论可以看出，对校园欺负中旁观者的重要性，对减少欺负事件的发生具有显著作用，已经得到了公认，探讨了关于校园欺负旁观者的理论模型、对未来校园干预方案的启发。但是，目前仍然存在一些亟待解决的问题。 第一，校园欺负旁观者的行为机制还没有统一的理论解释。虽然研究者对校园欺负旁观者的行为机制提出了多种解释，但是只有某些理论得到了验证或者部分验证。所以，对于校园欺负旁观者行为机制的原理还需要进一步的探索。第二，缺乏校园欺负旁观者的本土化研究。校园欺负旁观者在不同文化中开展了系列的研究，也验证了其在多种文化中的适用性，但是对于亚洲文化，尤其是中国文化中的校园欺负旁观者的实证研究却几乎没有。所以，对校园欺负旁观者的本土化研究应该引起国内学者的重视。第三，对校园欺负旁观者作为干预对象的应用研究有待扩展。从前文的论述中可以看出，校园欺负旁观者的帮助行为可以降低欺负事件的发生，如何通过干预的方式使跟随者，强化者，局外人这三类旁观者得以改变，进而影响欺负者的行为，改善受欺负者的心理健康状况，在以后的研究中可以开展其作为减少校园欺负行为的干预探究。
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user: 摘 要 根据小反刍兽疫病毒(PPRV) P、N基因保守序列设计了两对引物，分别扩增部分P基因及N基因的全长阅读编码框(ORF)，对疑似小反刍兽疫病毒的样品抽取RNA并以其为模板，在RT-PCR的体系中能扩增出预期大小分别为766 bp、1578 bp的目的片段，同时对退火温度，敏感性及特异性等RT-PCR反应条件进行了优化。在最佳反应条件下，该RT-PCR能检出最低850拷贝的PPRV基因组。对N全基因进行RT-PCR扩增并对PCR产物克隆于pMD-19T载体，转化感受态细胞DH5α后，对重组质粒测序，结果表明N基因全长大小与预期完全一致。并且这两个基因与新疆伊犁、北京所发生的小反刍兽疫病毒同源性高达100%，说明该病毒在中国南北方都有存在，其亚型为基因4型。 关键词 :小反刍兽疫病毒，P、N基因，逆转录–聚合酶联反应，同源性，序列分析
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user: 1. 引言 小反刍兽疫(peste des petits ruminants， PPR)又别名为小反刍兽伪牛瘟、羊瘟、Kate、胃肠炎–肺炎综合征、传染性脓包状胃炎[ 1 ] 。属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbolivirus) [ 2 ] ，与牛瘟病毒(Rinderpest virus， RPV)，犬瘟热病毒(Canine distemper virus， CDV)，海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus， PDV)同一属[ 3 ] 。PPRV是危害山羊及绵羊的高度接触性传染病，以引起口腔溃疡、脓性鼻液及出血性胃肠炎和肺炎为特征的烈性传染病，基于高度接触性传染速度快而被我国农业部列为一类烈性传染病，畜牧生产中一旦发生该疫情必须上报并进行扑杀处理[ 4 ] 。该病毒最早于1940年在西非报道，在中东、非洲、阿拉伯半岛及南亚地区都有所波及，至今中国新疆、北京都有所发现。这应引起我国相关地区的高度重视[ 4 ] 。 PPRV基因组为单股负链RNA病毒，核苷酸全长大小为15，948 bp [ 5 ] ，病毒基因组RNA从3’端至5’端依次排列6个基因片段并编码6种蛋白和2种非结构蛋白，分别是N-P-M-F-H-L，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素(H)、多聚酶蛋白(L)和非结构蛋白C/V [ 6 ] 。P基因除了编码P蛋白之外，还编码两种非结构蛋白C和V，P蛋白由509个氨基酸组成，分子量大约为54.9 ku，P蛋白以寡聚体形式参与病毒的复制[ 7 ] [ 8 ] 。N蛋白为核衣壳蛋白并与RNA紧密结合，对核酸起到保护的作用。M蛋白与病毒的成熟、释放有关；而F、H蛋白与病毒的吸附、侵入有关并决定着病毒的感染性[ 9 ] 。 PPRV的诊断方法有很多种，主要有病毒分离鉴定、抗体血清学检测、抗原检测等。自从1995年Forsyth和Barrett根据N基因和F基因设计引物，建立了PPR的RT-PCR检测方法以来，RT-PCR方法在检测PPR得到广泛应用[ 10 ] 。本研究通过对P、N基因的保守序列进行分析，分别设计了2对引物，一对通过RT-PCR扩增的方法，用以快速、准确检测小反刍兽疫病毒；一对用于对N全基因全长扩增以及序列比对，分析该毒株与其它毒株的同源性，从而为小反刍兽疫病毒的有效鉴定及输入性疫病的监控奠定良好的基础。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料、试剂 病毒株(CH/GDDG/2014)分离自广东某羊场，克隆载体pMD-19T、DL2000、PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2均为生物工程(大连)有限公司产品，AxyPrep病毒DNA/RNA提取小量试剂盒，购自康宁生命科学(吴江)生物有限公司，Trizol试剂、胶回收试剂盒及小量柱式质粒提取试剂盒均购自上海华舜公司。氯仿、异丙醇等其他试剂均为国产分析纯试剂。 2.2. 方法 2.2.1. 引物设计 参考GenBank下载的序列，设计下列2对引物，用于扩增P、N基因的扩增，引物由北京睿博有限公司合成，在N上游引物的5’端分别引入SphI，下游引物的5’端引入BamHI酶切位点。 Pf: 5’GGTACCATAGCATCACCGACTC3’ Pr: 5’CCCTTGCTCCTAAGTTTTTTGTAAT3’ Nf: 5’ACATGCATGCATGGCGACTCTCCTTAAAAG3’ Nr: 5’GGGGTACCTTAGCCGAGGAGATCCTTGT3’ 预期P、N的扩增产物分别为766 bp、1578 bp。 2.2.2. 病毒RNA的提取 参照AxyPrep病毒DNA/RNA提取小量试剂盒的说明书按步骤对病毒株(CH/GDDG/2014)提取RNA，用DEPC水溶解RNA，于−80℃保存备用。 2.2.3. 目的基因RT-PCR扩增 以提取的RNA为模板进行RT-PCR，分别以Pf、Pr，Nf、Nr为引物，反应体系(25 µL)：12.5 µL 2 × 1 step buffer，8.5 µL ddH 2 O，0.5 µL正向引物，0.5 µL反向引物，2.5 µL模板，0.5 µL Prime Script Enzyme MIX；反应条件：50℃ 30 min，95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s，进行35个循环后72℃ 10 min，4℃保存。扩增结束后在1.2%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 2.2.4. 退火温度优化试验 以上述提取的RNA为模板进行RT-PCR，且设定退火温度分别为53.0℃、54.0℃、55.0℃、55.5℃、56.0℃、56.5℃其他反应条件及体系不变，扩增结束后在1.2%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果，来确定最佳的退火温度。 2.2.5. 特异性试验 以广东分离的小反刍兽疫山羊毒株(CH/GDDG/2014)，犬瘟热病毒，新城疫病毒，疫苗Nigeria75/1株的RNA为模板及DEPC水为空白对照，并以Pf、Pr为引物进行RT-PCR，扩增结束后在1.2%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 2.2.6. 敏感性试验 取200 µL提取的RNA，用浓度测定仪测定其初始浓度为108.50 ng/µL，之后对其10倍稀释到10 −8 ng/µL并以各自浓度为模板，以Pf、Pr为引物进行RT-PCR，结束后在1.2%的琼脂糖凝胶电泳。 2.2.7. N基因双酶切鉴定 分别以Nf、Nr为引物扩增N全基因，将PCR产物回收后连接到pMD-19T载体，转化到DH5α感受态细胞后，经蓝白斑筛选挑取白斑的单菌落摇菌，抽提质粒并对其进行双酶切鉴定后送测序公司。 2.2.8. N全基因测序结果分析 为了解全球的PPRV毒株的亲缘关系及遗传演化关系，用DNAStar软件比对了本研究分离的PPRV流行毒株(CH/GDDG/2014)和GenBank已发表的国内外代表毒株，选取了包括中国北京分离株(KP260624)、西藏分离株(JF939201)、新疆分离株(KM091959)、埃塞尔比亚分离株(KJ867540)、加纳分离株(KJ466104)、科特迪瓦分离株(EU267273)、肯尼亚分离株(KM463083)、乌干达分离株(KJ867543)、中东分离株(KJ867545)、印度分离株(KJ867542)、塞内加尔分离株(KM212177)、摩洛哥分离株(KC594074)的同源性。用Clustalx 1.8.1和MEGA 6.0软件将选取的各基因型代表参考毒株PPRV1系((EU267273)；PPRV2系(KJ466104)、(HQ197753)；PPRV3系(KM463083)、(KJ867543)、(KJ867544) 、(KJ867545)、(KM212177)；PPRV4系(KP260624)、(KM091959)、(JF939201)及本研究分离的PPRV毒株(CH/GDDG/2014) N基因进行序列比对分析并构建系统进化树。
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user: 3. 结果 3.1. RT-PCR检测结果 针对P基因序列的保守区所设计的1对引物，单独对PPRV有正确的扩增，扩增片段大小为766 bp，并且扩增的目的条带没有任何杂带，说明针对小反刍兽疫病毒所设计的引物特异性较好。其扩增结果见图1。 3.2. 退火温度优化试验 以Pf、Pr为引物进行RT-PCR的退火温度的优化，将不同退火温度的PCR产物进行电泳检测，结果表明，在不同的退火温度下均能扩增出目的条带，而在退火温度为55℃的条件下能扩增出明显的条带，因此本实验最佳退火温度为55℃ (见图2)。 3.3. 特异性试验 在以上毒株的RT-PCR扩增并在琼脂糖凝胶电泳中，只有广东分离的小反刍兽疫山羊毒株出现了与预期大小一致的正确条带，而其他的及空白对照都没有条带，结果表明以Pf、Pr为引物的RT-PCR扩增具有明显的特异性(见图3)。 3.4. 敏感性试验 用RT-PCR方法扩增浓度为108 ng/µL的RNA模板以及依次按10倍稀释模板的浓度均出现了明显的目的条带，即可知能检测到的目的基因的最低RNA模板的浓度为1.085 × 10 −5 ng/µL (见图4)。 3.5. N基因双酶切鉴定 经过以Nf、Nr为引物扩增N全基因，将回收的PCR产物与pMD-19T载体连接获取的重组质粒分别进行SphI、BamhI双酶切(见图5)，说明扩增的DNA片段成功连接到pMD-19T载体上。经引物移步法后，测的N基因的ORF全长序列为1578 bp。 3.6. N全基因核苷酸同源性比对和系统进化树分析 N全基因核苷酸同源性比对结果显示本研究分离的PPRV流行毒株(CH/GDDG/2014)基因组与国内的毒株同源性为90.8%~99.9% (见图6)，其中与国内CH/XJYL/2013的同源性高达99.9%；与国外代表毒株基因组的同源性为88.9%~97.7%，其中与Sungri1996MSD分离株(HQ693093)的同源性最高。由此可见我们分离的CH/GDDG/2014毒株的与国内的其他毒株同源性高达99.9%，与其他国家和地区分离株也具有较高的同源性，没有明显的地域性。但总的看来与国内毒株的同源性还是稍高于国外毒株。PPRV目前分为四个系，其中I、II、III型存在于非洲国家，IV系主要来源于亚洲，至今国内还未发现其它3个亚型的PPRV。从系统进化树结果(图7)可以看出，本分离株属于IV系，并且与国内其它地区的毒株处于同一个大分支上，再次说明国内主要流行IV系。 图1. RT-PCR样品检测图M. DNA标准DL2000；1. 为检测样品；2. 阳性对照；3. 阴性对照 图2. PPRV的退火温度优化试验结果图M. DNA标准DL2000；1-6：退火温度分别为53.0℃，54.0℃，55.0℃，55.5℃， 56.0℃， 56.5℃ 图3. PPRV的特异性试验结果图M. DNA标准DL2000；1. 小反刍兽疫病毒；2. 犬瘟热病毒；3. 新城疫病毒；4. 疫苗Nigeria75/1株；5. 阳性对照；6. 阴性对照 图4. PPRV的敏感性试验结果图M.DNA标准DL2000；1~6样品稀释度为10 −1 、10 −2 、10 −3 、10 −4 、10 −5 、10 −6 图5. N的双酶切鉴定图M. DNA标准DL5000；1. 双酶切；2. 重组质粒对照 图6. 分离毒株与各亚型参考毒株核苷酸同源性比较 图7. 分离毒株和参考毒株N基因系统进化树分析