DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 1. 引言 我国作为世界第二大经济体和能源消费大国，长期以来如何解决能源紧张一直是我国国民经济和社会发展的热点和难点。我国能源需求旺盛，能源供给存在缺口，能源自给能力无法满足国民经济和社会发展的需求。在未来，面对巨大的能源供需缺口，实施能源“走出去”战略成为必然选择。因此，我国在此形式下势必要积极参与国际能源资源的开发，不断开拓中国的能源市场，保证能源市场的稳定供给。 哈萨克斯坦与我国作为邻邦，历史渊源深厚，资源互补性较强，具有经济合作的天然优势与现实基础，其前景非常可观。在以“未来能源”为主题的2017阿斯塔专项世博会期间举办的“中哈能源合作论坛”上，中国贸促会会长姜增伟表示，能源合作是中哈务实合作的一项重要内容，目前在中哈贸易中的占比已达30%。哈萨克斯坦能源部长巴祖巴耶夫公开表示，哈萨克斯坦太阳能和风能资源丰富，可与中国技术形成互补，两国产能合作前景广阔，希望利用中国技术提升中哈能源产业。 文献 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 从经济学角度，运用区域经济学理论、国际经济学理论、博弈论、国际政治理论等为理论依据分析了我国与中亚能源合作策略及我国未来能源战略构想和实施。文献 [ 4 ] [ 5 ] 在中亚五国矿产资源勘测的基础上，详细的描述了哈萨克斯坦的矿产资源分布。文献 [ 6 ] [ 7 ] 根据俄罗斯、美国和中亚各国资源状况实地调查和统计资料等，对区域资源开发现状与潜力进行了分析，对共同面对的问题，合作的基础，和条件及合作前景等都进行了探讨，为我国提供了有利借鉴。文献 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] 分析了中哈在丝绸之路、“一带一路”政策下多方面的合作，提出了我国近年来的重点合作策略。文献 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] 综合描述了哈萨克斯坦的能源现状，本文在此基础上，深入研究哈萨克斯坦清洁能源的能源现状、生产潜力以及其在电力生产中电力能源开发状况、前景，分析了中哈合作的机遇与风险，为中资企业提出相应投资建议。
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user: 5. 结论 哈萨克斯坦具有独特的地缘优势以及分丰富的清洁能源储量丰富，本文深入调查哈萨克斯坦清洁能源以及电力能源市场现状，得到如下结论： 1) 哈萨克斯坦煤炭资源丰富，电力装机以火电为主。清洁能源在电力电源结构中的作用将提高，但火电依然是主体，清洁能源是电力电源结构的重要补充。 2) 根据哈萨克斯坦《2013~2020年可替代能源及清洁能源行动计划》，2020年前，哈萨克斯坦清洁能源发电功率将达到1040 MW，其中13座风电站为793 MW，14座水电站170 MW，4座太阳能发电站77 MW。2020年前水电和风电是清洁能源的投资重点，核电发展具不确定性。在水电和风电领域，中国企业具备比较强的竞争力。 3) 中亚五国的“资源立国”战略与中国能源“西进”战略在政治和经济两个层面上形成重要节点，为中国企业与哈萨克斯坦的能源合作带来重要机遇。同时哈萨克斯坦技术落后、政策等一系列问题又给中国企业的能源合作带来一定的风险。中国企业需多方面协调，以寻求能源合作的最佳途径与路线，从而达到双赢。 本文的研究结果对于中国企业在哈萨克斯坦能源市场的投资具有重要参考意义。
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user: 摘 要 本文研究了含圆形衬砌的直角平面无限区域对任意角度入射的出平面的动力响应问题。利用数学物理方法，将作用于直角平面无限区域内的出平面波场扩展成半无限空间区域内的出平面波场，借助于边界条件推导出问题模型的应力场和位移场，其解为一组无穷代数方程组。算例结果表明，模型的地表位移幅值受入射波频率、入射波角度、衬砌的位置和衬砌的厚度比等参数影响。 关键词 :出平面动力，直角平面无限区域，圆形衬砌，动力响应，地表位移幅值 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 人们对由地振动动力引起地表地形变化的研究，大部分以地表凹陷地形和凸起地形两种形式为主。文献 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] 应用Green函数法和复变函数法求解了出平面动力波动对地表任意形凹陷地形的动力响应。文献 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] 采用波函数展开法研究了地表含半圆形和任意圆弧形凸起对出平面波动的动力响应问题。文献 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] 利用Fourier-Bessel级数展开法求解出圆弧形层状凹陷地形对出平面动力响应二维问题的解析解；利用波函数展开法求解出地表含多个沉积层凹陷地形对出平面动力波响应二维问题的解析解。文章利用数学物理方法，将作用于直角平面无限区域内的出平面波场扩展成半无限空间区域内的出平面波场，借助于边界条件推导出问题模型的应力场和位移场，不仅为研究由地振动动力引起地表地形变化问题提供了一个新模型，对研究弹性介质缺陷问题成果在矿产石油勘探、定量无损检测以及雷达、水下声纳和爆破等许多工程技术的应用和发展具有重要意义。
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user: 2. 力学模型 图1为所研究问题内含的圆形衬砌平面直角域力学模型，两域内介质符合各向同性、均匀、连续假设，直角域内介质参数质量密度用用 ρ 表示，切变模量用 μ 表示，衬砌内介质参数质量密度用 ρ 1 表示，切变模量用 μ 1 表示，所建立的二维直角坐标系用xoy表示。出平面动力波在平面内振动引起区域内介质位移的 W ( x ， y ， t ) 的方向和二维平面xoy垂直。 在稳态情况下，在复平面 ( z ， z ¯ ) 内本问题的Helmholtz方程： ∂ 2 W ∂ z ∂ z ¯ + 1 4 k 2 W = 0 (1) 其中： z = x + i y ， z ¯ = x − i y ， k = ω / c s 为出平面波的波数， ω 为入射波圆频率， c s = μ / ρ 为介质的出平面波的波速。 图1. 内含的圆形衬砌平面直角域力学模型 直角坐标应力表达式为： τ x z = μ ( ∂ W ∂ z + ∂ W ∂ z ¯ ) τ y z = μ ( ∂ W ∂ z − ∂ W ∂ z ¯ ) (2) 极坐标应力表达式为： τ r z = μ ( ∂ W ∂ z e i θ + ∂ W ∂ z ¯ e − i θ ) τ θ z = i μ ( ∂ W ∂ z e i θ − ∂ W ∂ z ¯ e − i θ ) (3)
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user: 4. 地表位移幅值 利用叠加法，问题模型空间区域内的总波场的位移函数为： W ( t ) ( z ， z ¯ ) = W ( i ， e ) ( z ， z ¯ ) + W ( r ， e ) ( z ， z ¯ ) + W ( s ) ( z ， z ¯ ) (16) 如果入射的出平面波的位移幅值为 W 0 ， W d 代表水平地表的无量纲位移幅值，计算式为： W d = | W ( t ) / W 0 | (17) 衬砌对地表动位移分布的影响用系数 d ∗ 表示，计算式为： d ∗ ( x h ) = | W ( t ) ( x h ) / ( W ( i ， e ) + W ( r ， e ) ) | − 1 (18) 式中： x h 为地表的水平方向坐标。 d ∗ ( x h ) > 0 说明衬砌对地表位移有增强作用； d ∗ ( x h ) < 0 说明衬砌的对地表位移有减弱作用， d ∗ ( x h ) = 0 说明衬砌对地表位移没有影响。
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user: 5. 算例与结果分析 图3给出了图1所示问题模型在衬砌内外半径比值为30.0，出平面动力波动入射角度为90˚条件下，自由表面 Γ 2 水平地表无量纲位移幅值W d 的变化情况。 图3(a)给出了入射波波数ka = 0.25时，圆形衬砌距离地表不同位置对水平地表位移幅值W d 的影响情况。由图中可看见，地表位移幅值以衬砌中心的Y轴为对称轴，向两侧振荡衰减变化。随着衬砌的埋深增加，地表位移幅值的振荡幅度变小。衬砌正上方处地表位移幅值W d 达到最大值。图中的地表位移幅值W d 最大值不超过4，说明当入射波波数ka = 0.25，出平面动力波动入射角度为90˚，即低频垂直入射时，衬砌对水平地表位移幅值W d 的影响不大。 图3(b)为衬砌中心到地表的垂直距离与衬砌内半径的比值h/a = 1.5 (即衬砌埋深不变)，出平面波以不同波数垂直入射时，自由表面 Γ 2 水平地表无量纲位移幅值W d 的变化情况。图中给出了波数ka分别为0.1、0.5、1.0和2.0四种情况时地表的幅值W d 的变化情况，随着入射波数ka的增加，地表位移振荡逐渐加剧，同样以衬砌中心的Y轴为对称轴，向两侧振荡衰减变化。当ka = 1.0和ka = 2.0时，衬砌中心上方地表位移幅值W d 最大值达到了11。说明出平面高频垂直入射时对地表动位移的影响明显。 图3(c)给出了波数不同且垂直入射时， x H = 12.0 位置的水平地表处无量纲位移幅值W d 随衬砌埋深变化的情况。随着衬砌埋深的增加，衬砌对位移幅值W d 呈脉动较小趋势。 图3. 地表面幅值W d 的变化分布 图4. 地表位移影响系数 图3(d)给出了波数不同且垂直入射时，水平地表位移幅值W d 随衬砌厚度变化的情况。由图可见，衬砌厚度的变化对位移幅值W d 的变化影响不明显。 图4(a)给出了入射波波数ka为0.25，不同埋深的圆形衬砌存在情况下，垂直入射时，衬砌对地表动位移分布的影响系数d * 的随圆形衬砌埋深变化分布规律。由图可见，在低频入射波且衬砌的埋深较大时，衬砌对地表的动位移有减弱作用。 图4(b)给出了衬砌埋深h/a = 1.5，出平面垂直入射时，衬砌对地表动位移分布的影响系数d * 随入射波波数变化的分布规律。图中看见，ka = 1.0和ka = 2.0时，d * 增强了1.7倍；ka = 0.1时，d * 减弱了将近50%。
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user: 6. 结论 数值结果表明，在本问题模型中，衬砌的埋深，入射波波数对地表位移幅值有较大的影响。浅埋衬砌时，在高频入射时，衬砌与直角平面区域自由表面之间存在强烈的相互作用，地振动将明显加剧，且在衬砌中心的正上方幅度最大，随衬砌埋深的增加，其影响逐渐减弱。所以工程上必须对直角平面区域自由表面及地下浅埋衬砌的存在予以充分重视。对于本文数值结果的可靠程度，有待于实验数据加以验证，篇幅有限，不再加以论述。
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user: 摘 要 本文通过对中煤塔山矿3~5 # 层煤样的TG-DTG及红外光谱分析，找出了煤样氧化热解过程的着火点等特征温度点和最大增重比，得出了煤表面分子结构在不同温度下的增/失重微观变化和结构特征，对预防煤炭自燃发火提供了参考数据。 关键词 :氧化自燃，TG-DTG热重分析，特征温度点，物理化学吸附 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 煤分子是由基本结构单元交联的大分子空间网络，每个大分子结构以相似六角形芳香稠环叠加成石墨碳晶体核骨架，通过桥键聚合联结而成，带有多种活性侧链基团，即基本核体、核外官能团和烷基侧链及桥键。 核心为缩合芳环及少量氢化芳环、烷环、脂环和杂环，每个碳原子、三个价电子在基面内形成稳定的化学键，键力较强、稳定牢固；而且变质程度越高，环数越多、含碳量也越高、活化能越高，越难以被氧化(环数及含碳量均随碳化变质程度的增加而增加，2环C = 70%~83%、3~5环C = 83%~90%、≥4环C ≥ 95%)；而第四个价电子则分布在基面之间的空间内，核体周围的各种侧链、官能团组成低分子化合物，主要有酮、酸、烷、醇类等，键力较弱，极易断裂，与空气中的氧结合发生物理吸附(常温下即可快速吸附且可逆解脱附，1 min即达到吸附平衡)，放出物理吸附热(3.41 kJ/mol)，并为氧分子进一步化学吸附提供能量条件，是化学吸附和氧化反应的推动基础，只有在物理吸附放热升温至较高温度时，才能使气体分子内能较高、相对速度较大、进行高速碰撞，使氧分子的一个键削弱甚至断开，形成较高内能与速度能的单氧自由基，侵入晶格表层内的基面空隙(自由基是未成对电子的碎片，其中心原子上未成对电子的存在，使其具有强烈地取得电子的倾向)，并与碳原子碰撞结合形成新键、或碳与氧形成低分子固溶络合物，生成CO 2 和CO，发生化学吸附与氧化反应，放出较高的化学吸附热(80~420 kJ/mol)与化学反应热。 煤中的官能团则以含氧官能团为主，还有含硫官能团和含氮官能团等，如甲氧基-OCH 3 、羟基-OH、羧基-COOH、羰基C=O、醚键C-0-C、及甲基-CH 3 、亚甲基-CH 2 、次甲基-CH、苯酚、伯胺基团、烷基-CH 2 -CH 3 、乙烯基团C=C双键，硫醚键R-S-R等，这些桥键的键能小，易于在氧化热解过程中断裂成自由基碎片；随煤化程度的提高，甲氧基、羧基很快消失，其它含氧基团在各种煤化程度的煤中均有存在，而不能自燃的煤以上基团含量则很少。故自燃煤中有机大分子侧链基团和低分子化合物对煤的自燃具有极其重要的影响。 煤的电子轨道理论也证实，煤分子主要是C 9 H 13 N已占有电子的能级最高的HOMO轨道和O 2 未占有电子能级最低的LUMO轨道作用，即电子从煤分子片段C 9 H 13 N向O 2 转移，从而降低了煤分子片段的苯环中C=C双键电子的密度，削弱了C=C双键的强度，使C=C双键的键长变长，这与吸附态C 9 H 13 NO 2 的结构理论以及原子净电荷计算结果是一致的，都说明煤大分子结构的侧链与官能团易被首先氧化，桥键断裂、侧链与官能团脱落，进一步热解则放出挥发分，是煤体氧化自燃的根本原因。 煤中含有的大量活性基团的氧化强弱顺序为：与芳香环相连接的醛基 > 次甲基醚键 > α位碳原子带羟基的次甲基烷键 > α位碳原子带支链的次烷基键 > 甲氧基α位碳原子带羟基的烷基侧链 > 与芳环相连的次甲基键。
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user: 3. 结论 通过热重分析确定了煤样失重速率的最大的临界点温度T 1 、失重最小点的增速温度T 2 、失重终止点的干裂温度T 3 、增重开始点的活性温度T 4 、煤样着火温度点T 5 等特征温度点和最大增重比(20~40目为0.57%、40~80目为0.22%)，直观的反应了煤样不同氧化阶段不同温度下增/失重的变化，得出不同温度下的产气量的强弱和煤分子活性侧链基团的关系，为自燃防灭火提供了有益参考。
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user: 摘 要 高速列车进入隧道产生的压缩波传播至隧道出口时会生成微气压波，某些情况下还会出现隧道口音爆，对周围环境产生负面影响。为分析隧道出口外音爆现象的产生原因，本文采用大涡模拟法计算隧道出口流场参数，并基于Lighthill声类比理论运用有限元法计算隧道出口声场分布，参考人耳听阈曲线分析了隧道出口外音爆现象的发生机理。在本文计算模型中，对比不同车速条件下隧道出口微气压波声场计算结果，发现当车速高于300 km/h时，隧道出口将会出现音爆现象。 关键词 :高速列车，微气压波，音爆，声类比理论，PML，听阈曲线 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 高速列车进入隧道时产生的压缩波在隧道内近似以当地声速沿列车运行方向向前传播，当压缩波传播至隧道出口时，由于隧道洞口的影响，一部分能量以膨胀波的形式在隧道内反向继续传播，另一部分能量快速向隧道出口外部释放形成微气压波。前人研究成果表明，微气压波属于次声波，通常情况下人耳不会感觉到，主要会引起隧道出口建筑的低频振动 [ 1 ] 。但在日本新干线和德国佛罗伦萨–罗马高速铁路线上，某些情况下隧道出口还会出现了人耳可听的音爆的现象。图1给出了隧道出口外微气压波产生过程的示意图。 目前，国内外研究人员针对铁路隧道出口微气压波现象的研究方法主要分为实测分析、理论推导和数值计算三类。在实测方面，日本学者在新干线铁路隧道中做了大量实验测试，得到了丰富的实验数据，实验数据表明隧道出口微气压波噪声主要能量集中在10 Hz以下，属次声声波 [ 2 ] ；德国学者M. Hieke [ 3 ] [ 4 ] 基于Euerwang隧道的测试结果给出了微气压波噪声的评价标准；王学英、高波等 [ 5 ] 搭建隧道空气动力学试验模型，分析了缓冲结构对微气压波减缓作用。理论推导方面，Yamamoto [ 6 ] 在线性声学理论的基础上，用低频近似和远场近似的方法得到了微气压波的理论计算公式，证明了微气压波幅值与隧道出口位置的压缩波波前梯度最大值成正比，与微气压波的传播距离成反比。数值计算方面，梅元贵 [ 7 ] 基于特征线法编写了隧道洞口微气压波的一维计算程序；杨志刚 [ 8 ] 用基于高阶谱差分的CAA技术对高速列车在隧道出口产生的微气压波进行二维数值模拟；史宪明 [ 9 ] 、张雷 [ 10 ] 基于三维有限体积法分别计算了隧道出口微气压波的不同影响因素。 上述研究主要分析了隧道出口微气压波的压力特性及其影响因素，但无法解释隧道外出现人耳可听的音爆现象的原因，更没有相关判定依据。因此，有必要对隧道出口外微气压波声学特性做进一步的分析。本文试图通过混合计算方法分析微气压波声学特性，即根据有限体积法求解隧道出口微气压波流场参数，并基于Lighthill声类比理论，运用有限元法求解隧道出口声场分布，以期对改善高速铁路隧道出口环境噪声提供参考依据。 图1. 高速铁路隧道出口微气压波的产生过程示意图
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user: 2. 研究方法 计算微气压波声学特性时，采用基于Lighthill声类比理论的混合噪声计算方法，该方法将气动噪声计算分为流场参数计算和声场分布计算两部分。 2.1. 微气压波流场计算方法 计算微气压波流场参数时，利用动网格技术 [ 11 ] 实现列车相对于隧道的运动，并采用结合两方程 紊流模型的有限体积法 [ 12 ] 求解三维、粘性、可压缩N-S方程，得到隧道内压缩波传播至隧道出口时的流场参数。此时，为保留微气压波流场脉动参量，需要通过大涡模拟法求解微气压波流场进行模拟。 2.2. 微气压波声场计算方法 2.2.1. Lighthill声类比理论 Lighthill根据流体流动的连续性方程和动量方程，直接推导得到了将流体与声波动相联系的声学波动方程，并被命名为Lighthill方程。Ffowcs Williams和Hawkings仿照Lighthill方程的推导方法，考虑运动边界对噪声的影响，根据广义格林函数给出了物体表面存在非定向运动的声场FW-H方程 [ 13 ] ： (1) FW-H方程右侧A项被视作四极子源项，B项视作偶极子源项，C项视作单极子源项。在计算隧道出口微气压波噪声时，由于微气压波是隧道内压缩波向出口外部空间快速释放产生的，并且当压缩波传播至隧道出口时，并不会引起气体明显的宏观流动，因此计算时可忽略偶极子源的影响；此外，单极子源与壁面的法向气流脉动速度相关，流场计算时将隧道出口壁面看作刚体，不会产生垂直于壁面方向的气流振动，因此计算时同样不考虑单极子源。 2.2.2. 有限元法求解声波方程 由于计算微气压波声学特性时主要关注的是声场分布状态，一般不考虑声波随时间的传递过程，可将简化后的FW-H方程通过分离变量法得到只包含空间变量的Helmholtz方程 [ 14 ] ： (2) 采用有限元法求解Helmholtz方程时，进行有限元格式离散后，得到数值形式的声压计算表达式 [ 15 ] ： (3) 式中，Q i 表示输入的声源向量，V n i 表示质点速度边界条件，P i 表示输入的声压边界条件，F a i 表示声学激励，p i 表示待求解的网格节点声压。 表示方程矩阵，属于稀疏矩阵。 2.2.3. 完美匹配层 能够在满足计算精度的前提下缩小计算域以减少计算工作量，在包含微气压波主要流场参数的空间边界处设置完美匹配层(Perfect Matched Layer，简称PML [ 16 ] )。当声波进入PML层后会被吸收，并以指数形式衰减。而远场空间的声辐射情况可通过基于Green函数的Kirchhoff积分计算得到 [ 17 ] 。
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user: 3. 微气压波声学计算模型的建立 进行隧道出口流场计算时，建立的列车模型参照日本E2系高速列车 [ 18 ] ，隧道阻塞比约为0.2。不考虑隧道出入口缓冲结构和山体的影响，对简化后得的列车-隧道模型进行划分网格，如图2所示。经 图2. 列车–隧道模型入口处局部网格 网格无关性验证后，流场计算网格总数量约为430万。 基于三维有限体积法求解N-S方程，得到列车以200 km/h的速度进入长度为500 m的隧道后，距离隧道出口中点不同距离测点处的微气压波波形，如图3所示。微气压波噪声计算分析范围为1.8~2.8 s。 根据隧道出口不同距离处微气压波幅值大小，为尽可能保留微气压波流场参数，设置隧道出口外半径为30 m，并向隧道内部延伸30 m的隧道出口附近空间作为微气压波声学计算域，如图4所示。 对于图5所示的微气压波噪声计算域边界，由于隧道出口实体边界处(隧道内壁面、地面和出口立面)的吸声属性没有实际的测试结果，且根据常用混凝土材料对次声声波吸声性能极低的特性，尝试性的将其定义为全反射边界条件。具体参数大小和其余边界条件类型如表1所示。
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user: 4. 隧道出口外部声场分析 当列车进入隧道时生成的压缩波传播至距离隧道出口35 m左右，采用大涡模拟法进行隧道出口微气压波流场瞬态计算。在得到稳定的隧道出口附近流场后，开始提取计算域内空间流场参数的脉动信号。为体现图3所示的隧道出口压力主要变化过程，在满足Nyquist采样定理的最高频率(取200 Hz)与时间步长关系条件下，定义采样时间步长为5 × 10 −4 s。连续保存2000个时间步的时域脉动信号，采样总时长为1s。运用有限元法计算得到隧道出口中垂面和水平高度3.5 m处的横截面上微气压波噪声声压级分布情况，如图6所示。 隧道出口微气压波噪声声压分布云图中，次声频段内声压分布在隧道出口外呈现明显的球面形状，且噪声的次声频段集中了大部分能量，1 Hz的微气压波噪声最大声压级达177 dB。 读取隧道出口外隧道中线上高度为3.5 m距离洞口20 m的测点处不同频率对应声压级，如图7中所示。由于100 Hz以上频率噪声声压级低于20 dB，在计算微气压波噪声时，100 Hz以上的微气压波噪声极易被实际情况的环境噪声淹没，在后续计算分析时，主要分析100 Hz以下频率的微气压波噪声。
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user: 5. 隧道出口微气压波音爆成因分析 为分析高速铁路隧道出口音爆的发生机理，即判定隧道出口微气压波噪声能否可以被人耳听到，参考GB/T4963-2007《声学标准等响度级曲线》，我们引入人耳听阈曲线作为音爆的判定依据。 由于人耳对不同频率的声音的敏感程度不同，不同频率声音的声压级只有在图8中虚线所示的听阈曲线之上才能被人耳听到，并且同一频率的响度级(单位phon)越高，人耳对该频率声音的感觉越明显(图9)。 对比可知，当列车运行速度为200 km/h时，隧道出口附近20 Hz以上的微气压波噪声声压级位于人耳听阈曲线下方，即该速度条件下生成的微气压波无法被人耳听到。列车运行速度为300 km/h时，对应计算得到的声压级变化曲线会有部分进入到人耳听阈曲线以上的区域，但响度级低于10 phon。而当列车 图3. 隧道出口微气压波 图4. 隧道出口微气压波噪声计算域示意图 图5. 声学计算域边界 Table 1 Boundary condition type and parameter setting of calculate domai 边界面 边界条件类型 参数说明 隧道内横截面A 全吸收 声阻抗实部416.5 kg∙m −2 ∙s −1 声阻抗虚部0 kg∙m −2 ∙s −1 隧道内壁面B 出口立面C 地面D 全反射 声阻抗实部9500 kg∙m −2 ∙s −1 声阻抗虚部0 kg∙m −2 ∙s −1 空间辐射面E PML层 保持默认属性 表1. 声学计算域边界条件类型和参数设定 图6. 不同频率下隧道出口微气压波噪声的声压级分布情况(单位：dB) 图7. 隧道出口外微气压波噪声的声压级曲线 图8. 等响曲线图 [ 19 ] 图9. 隧道出口附近的微气压波噪声声压级变化曲线 运行速度为400 km/h时，20 Hz以上的部分微气压波频率噪声响度级将达30 phon，已经能被人耳听到。可见，当列车以高于300 km/h的车速进入长度为500 m、阻塞比为0.2时，隧道产生的压缩波传播至隧道出口后，产生的隧道出口外微气压波噪声将可能被人耳听到，即产生隧道出口音爆现象。
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user: 6. 结论 本文采用大涡模拟法计算隧道出口流场参数，基于Lighthill声类比理论运用有限元法计算隧道出口声场分布，并引入人耳听阈曲线分析了隧道出口外微气压波音爆现象的发生机理。得到结论如下： 1) 隧道出口微气压波噪声声源可类比为四极子源的发声； 2) 微气压波噪声频率主要集中在20 Hz以下，当频率高于100 Hz时微气压波噪声极易被环境噪声淹没； 3) 在长度为500 m、阻塞比为0.2的隧道中，当列车进入隧道的速度高于300 km/h时，引起的隧道出口外微气压波噪声将会出现人耳可听的音爆现象。 4) 计算分析是基于日本新干线E2车型建立的简化计算模型，若考虑缓冲结构，并且隧道长度和阻塞比的不同时，可能会得到不尽相同的结论。
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user: 摘 要 柿树的果实是著名传统食物。在过去几十年，由于城市化和环境破坏，柿树的种质资源受到威胁。柿科的柿属植物，在全世界约有400多种。为了保护和利用，急需评价柿属植物的遗传多样性。然而，由于形态和DNA标记数量少，灵敏度有限，柿属植物的鉴定仍然存在困难，开发分子鉴定方法仍然是全球的挑战。本文中，利用E3泛素–蛋白连接酶UPL3 DNA区域研发出新的DNA序列标记，可用于柿属植物分类。该DNA序列标记揭示，德阳柿和油柿是栽培柿的最近缘物种。对于深入理解栽培柿的起源、研究全球柿属植物的遗传多样性以及系统发育关系具有重要意义。 关键词 :柿属植物，E3泛素–蛋白连接酶，DNA序列标记，栽培品种，起源，遗传多样性 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 柿属植物广泛分布于热带和温带，全世界约有400种。该属的栽培柿品种的果实，在中国、韩国和日本自古以来是食物来源。其树皮、叶、木材和种子也作为药材。目前，中国约有1000多个栽培柿品种 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 。 柿(Diospyros kaki)是果树产业发展的最佳选择之一。在中国，不同地区有当地的品种。甜柿品种和抗病品种是新品种培育的目标。通常，近缘物种具有优良的遗传背景，是重要的育种亲本来源，也是研究栽培柿起源的重要材料 [ 3 ] 。柿D. kaki的起源、柿属植物的精确鉴定及遗传关系一直是研究的重点和热点 [ 1 ] [ 3 ] - [ 15 ] 。 过去几十年来，由于人类活动，如城市化、畜牧业、农业、矿业以及火灾等影响，柿的种质资源受到威胁 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] 。柿属植物种质多样性的评价和保护急需深入研究。 柿属植物的形态特征，例如，果实形态、颜色、品质以及花部特征，已有较详细的调查记载 [ 1 ] [ 3 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] 。根据染色体数目，柿属植物分为4个倍性类型，二倍体(2n = 2x = 30)、四倍体(2n = 4x = 60)、六倍体(2n = 6x = 90)及九倍体(2n = 9x = 135) [ 7 ] 。 在柿属植物的分子鉴定研究方面，开发了一些叶绿体DNA标记(如，rbcL、matK、trnH-psbA)和细胞核DNA标记(例如，核糖体DNA内转录间隔区，internal transcribed spacer of ribosomal DNA，ITS) [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] 。近年来，叶绿体基因组信息也开始应用于柿属植物的遗传分析 [ 21 ] [ 22 ] 。然而，上述DNA分析对于近缘种和品种的鉴定，分辩能力有限 [ 16 ] - [ 23 ] 。有待开发更高效的DNA序列标记，来揭示柿属植物的遗传多样性和遗传关系。 本课题组研究发现，利用泛素连接酶基因序列开发的分子标记，在胡桃科(Juglandaceae)植物的种、变种及品种水平上具有分辨力 [ 16 ] 。泛素连接酶基因是泛素–蛋白酶系统的相关基因的一类，在植物界广泛存在，属于进化速率较高的基因组区域之一 [ 16 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 24 ] [ 25 ] 。 “泛素–蛋白酶体系统”的作用是降解蛋白质，对于维持细胞的自动调节与稳恒性必不可少，存在于已知的所有真核生物中 [ 24 ] 。待降解的蛋白质需要泛素化和靶定，通过如下3种酶的参与来实现：即泛素活化酶E1 (ubiquitin activating enzyme E1)、泛素交联酶E2 (ubiquitin conjugating enzyme E2)以及泛素连接酶E3 (the ubiquitin ligase E3)。加了泛素标记的需要降解的蛋白质(底物蛋白质)只有移动到桶状的蛋白酶的腔体内，才能最终被分解为较小的多肽或其它具有生物活性的小分子，以便重复利用。Aaron Ciechanover、Avram Hershko和Irwin Rose因发现特定的蛋白质在被降解之前会被泛素标记，获得了2004年诺贝尔化学奖 [ 24 ] 。在植物中，不仅是蛋白质降解过程，而且包括DNA修复过程、细胞周期调控、细胞生长、免疫系统功能、激素介导的信号传递等许多细胞功能方面，泛素都具有重要作用。近年来，据报道泛素连接酶E3，能够提供用于系统发育分析的有价值的信息 [ 24 ] 。 本研究的目的在于：1) 为柿属植物鉴定开发新的DNA序列标记；2) 评价泛素连接酶基因序列在柿属植物遗传分析方面的应用价值。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 取样和DNA提取 柿属植物的供试样品(野生种和品种)见表1，包含了中国国内可采集到的全部野生种。2016年在北京植物园以及陕西省杨凌的西北农林科技大学管理的国家柿种质资源圃(北纬34˚16'56.24''，东经108˚04'27.95''，海拔420 m)采集嫩叶，利用变色硅胶快速干燥备用。利用天根生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取基因组DNA。 2.2. PCR扩增与测序 新设计开发出的引物DUB_5498F (5’-ACTTAGGGTAGGGAGGTTGC-3’)和DUB_6322R (5’-GGATAGCCAGGAAGGGTGA-3’)用于扩增柿样品的E3泛素-蛋白连接酶UPL3基因区域。Taq DNA聚合酶和PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)缓冲液(TaKaRa Code: DR100B)来自宝生物技术有限公司(TaKaRa Biotechnology Co. Ltd.) (中国大连)。根据宝生物技术有限公司的实验指南(protocol of TaKaRa Code: DR100B)进行PCR扩增。PCR程序为：94℃预变性4.5 min；94℃变性55 s，引物的退火温度57.2℃ 15 s，72℃延伸1.2 min，34个循环；最后，72℃延伸10 min。 利用热循环仪(Applied Biosystems Veriti TM 96-Well Thermal Cycler， Model#: 9902， made in Singapore)扩增目标区域的DNA序列。PCR产物送到上海美吉生物医药公司(Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology Co.， Ltd. (Beijing))，利用同样的引物，在3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems， 115 Foster City， CA， USA)测序仪上进行测序。根据BigDye ® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems， Foster City， CA， USA)实验指南做测序反应。测序反应条件为：96℃预变性1 min；96℃变性10 s，引物的退火温度50℃ 5 s，60℃延伸4 min，25个循环；最后，在4℃保存。获得了高质量的序列。Gen Bank的序列号为MF156269-MF156286，见表1。 2.3. 数据分析 利用Sequencher (v.4.6)软件，手工校对DNA序列和排序。利用Mega6.0软件比对 [ 26 ] 。比对序列数据的长度为696 bp，包含18条泛素连接酶基因序列。利用Mega6.0软件，采用Tamura 3-parameter参数，重复抽样1000次，构建邻接树状图(Neighbor-joining， NJ)。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 柿属植物样品的鉴定 在696 bp长的比对序列数据中，包含了被扩增的核基因组的泛素连接酶基因区域的全部可变碱基位点。可变碱基位点的位置编号如表2、图1、图3所示。根据Suo et al. (2012， 2015， 2016)报道的方法 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] ，选择关键的单核苷酸多态位点构建简化的核苷酸分子式(表2)，用于进一步编制分子分类检索表(图1)。利用泛素连接酶基因序列，成功检测到柿属植物的种间、品种间以及种内个体间的遗传差异(表2、图1、图2以及图3)。 Table 1 Diospyros accessions used in this stud No. Taxon Resource No./Sex Chromosome No. 序号 分类单位 资源号/性别特征 染色体数目 1# 台湾乌木D. discolor ----/----/雌雄异株 ----- 2 乌柿D. cathayensis X3/雄株/雌雄异株 2n = 6x = 90 3 乌柿D. cathayensis 5/雌株/雌雄异株 2n = 6x = 90 4 老鸭柿D. rhombifolia 863/雌株/雌雄异株 2n = 4x = 60 5 金枣柿D. jinzaoshi 635/雌株/仅雌株 2n = 2x = 30 6 浙江柿D. glaucifolia 164/雄株/雌雄异株 2n = 2x = 30 7 浙江柿D. glaucifolia 873/雌株/雌雄异株 2n = 2x = 30 8 君迁子D. lotus 4/雌株/雌雄异株 2n = 2x = 30 9 君迁子D. lotus 8/雌株/雌雄异株 2n = 2x = 30 10 美洲柿D. virginiana 20-80/雄株/雌雄异株 2n = 6x = 90 11 美洲柿D. virginiana 20-82/雌株/雌雄异株 2n = 6x = 90 12 油柿D. oleifera 20-75/雌雄同株 2n = 2x = 30 13 油柿D. oleifera 20-76/雌雄同株 2n = 2x = 30 14 德阳柿D. deyangensis 1101/雄株/雌雄异株 2n = 4x = 60 15 德阳柿D. deyangensis 1115/雌株/雌雄异株 2n = 4x = 60 16 安溪油柿D. kaki ‘AnxiYoushi’ 199/雌株/仅雌株 2n = 6x = 90 17 甜宝盖D. kaki ‘TianBaogai’ 788/雌株/仅雌株 2n =6x = 90 18 怀胎柿D. kaki ‘Huaitai Shi’ 179/雌株/仅雌株 2n = 6x = 90 表1. 供试的柿属植物样品 #引自中国西南地区，栽培于中国科学院北京植物园展览温室。其它样品来自陕西省杨凌的国家柿种质资源圃。 3.2 遗传关系 E3泛素–蛋白连接酶UPL3DNA序列揭示，18个样品属于7个谱系(图2)。谱系I包括台湾乌木Diospyros discolor，在遗传关系上，是距离柿D. kaki最远的谱系。谱系II包括老鸦柿和乌柿，均为雌雄异株，与柿属的其它谱系的特征相比，具有显著狭小的叶片，与形态分类结果一致(图2) [ 1 ] 。谱系III (金枣柿)、谱系V (油柿)以及谱系VI (德阳柿)各含有1个种。谱系IV包含浙江柿、君迁子和美洲柿三个种，浙江柿和君迁子共同构成的一支，与美洲柿互为姐妹群。 在本研究中，油柿(Lineage V)和德阳柿(Lineage VI)被识别为柿D. kaki (LineageVII)的最近缘的物种。柿D. kaki所属的谱系用3个品种代表，分别为‘怀胎柿’和‘安溪油柿’ (完全涩柿，pollination-constant and astringent，PCA)以及‘甜宝盖’ (完全甜柿，pollination-constant and non-astringent，PCNA)。
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user: 摘 要 β-葡萄糖苷酶能有效解除纤维二糖对纤维素酶活性的抑制，是限制纤维素彻底水解的重要因素。由于β-葡萄糖苷酶酶活相对较低、成本高等因素，通过基因工程手段对其定向改造，异源表达获得高酶活、耐热耐酸碱的β-葡萄糖苷酶，使其更适用于工业生产和应用。文中从β-葡萄糖苷酶的分类、微生物来源β-葡萄糖苷酶基因的克隆、酶活力测定方法等几方面对β-葡萄糖苷酶进行综述，以期为β-葡萄糖苷酶的研究提供借鉴。 关键词 :β-葡萄糖苷酶，基因克隆，酶活力测定 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 纤维素水解的过程需要大量的酶参与，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶随机切割纤维素链的糖苷键得到短链，外切葡聚糖酶则作用于所得短链的非还原端，得到纤维二糖和纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶催化外切葡聚糖酶的水解产物，得到葡萄糖 [ 1 ] 。但是酶解过程中产生过多的纤维二糖会成为非竞争性抑制物，反馈抑制纤维素酶的活性。而β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖，有效地解除其对纤维素酶活性的抑制，是纤维素酶组分中的关键酶类，也是影响纤维素彻底水解的瓶颈。 β-葡萄糖苷酶来源也十分广泛，既可以存在于植物、微生物中，又可以存在于动物体中，便于获得。随着科学技术的不断发展，这类酶己被定向改造，获得具有更适合工业大规模生产特性的菌株，不仅降低了工业生产的成本，同时提高了生产效率。β-葡萄糖苷酶具有很好的发展前景，在食品方面，可以提高酒香，使茶叶的香味增加；在工业方面，可以大量生产大豆异黄酮苷元产品；在医药方面，其浓度可以作为肠损伤的早期生化指标，同时β-葡萄糖苷酶的底物特异性 [ 2 ] 、转糖苷功能 [ 3 ] 和葡萄糖耐受性 [ 4 ] 等也备受关注。因此，深入研究β-葡萄糖苷酶，使其在科学研究和工业应用中发挥重要作用，对于人类的生产和生活具有重大意义。
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user: 2. β-葡萄糖苷酶分类 β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶，该酶可以水解连接烃基或芳香基与糖原子团间的糖苷键，最终得到单体葡萄糖。 β-葡萄糖苷酶根据其不同的特点可以有多种分类方法。根据β-葡萄糖苷酶所存在的部位来划分，可分为胞内和胞外两种。根据其作用的底物不同可以将β-葡萄糖苷酶分为3类：第一类是单一水解含有烃基的β-葡萄糖苷的酶，其作用的底物一般为纤维二糖等；第二类是单一水解含有芳香基的β-葡萄糖苷的酶，该酶作用的底物为对硝基苯-β-葡萄糖苷等；最后一类是能水解含有烃基或芳香基的β-葡萄糖苷的酶，其作用的底物一般为纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等。微观方向基因序列的不同，可以将β-葡萄糖苷酶分为A、B两大类。刘震等人利用MEGA5软件构建系统发育树 [ 5 ] ，发现不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列上均存在很大的差别，如图1。因此根据氨基酸序列的不同可将β-葡萄糖苷酶进行分类。CAZy网站根据结构相似性，将所有糖苷水解酶分类为153个家族(http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html，2018年4月更新)，但是目前报道较多的一般为家族1和3两类。依据不同的特点对β-葡萄糖苷酶进行分类，为更深入的科学研究提供了方便。 图1. 不同来源β-葡萄糖苷酶的系统发育树 [ 5 ]
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user: 3. 不同来源β-葡萄糖苷酶及其活力比较 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶。经过长期的研究发现，β-葡萄糖苷酶既可以存在动物中又可以存在植物的果实中，同时在微生物中也发现了该酶的存在，该酶来源十分广泛。 可以产生β-葡萄糖苷酶的植物有橄榄果、甘蓝、玉米、大豆等，但是植物来源β-葡萄糖苷酶活性要比微生物中的β-葡萄糖苷酶活性低；可以产生β-葡萄糖苷酶的动物有蜜蜂、牛肝等。相比较，关于微生物来源的β-葡萄糖苷酶的研究内容较多。微生物主要包括细菌、丝状真菌、放线菌、酵母和古细菌等；同时在如盐碱湖、热泉等一些生存环境苛刻的条件中，也发现一些具有产β-葡萄糖苷酶能力的微生物，其中丝状真菌中主要有曲霉属、青霉属、热子囊菌属、木霉属、踝节菌属等，相比较，青霉属菌类能产生大量的β-葡萄糖苷酶，霉菌可以产生活性高的β-葡萄糖苷酶。现在的研究主要集中在酵母、真菌、细菌和放线菌。原核微生物产该酶的菌株有柠檬酸杆菌属菌株 [ 6 ] 、脑膜脓毒性黄杆菌、约氏黄杆菌、特异腐质酶、胶质类芽孢杆菌等；一般来说，来自极端环境的β-葡萄糖苷酶与普通生物来源的相比，其酶的最适温度和热稳定性都会偏高 [ 7 ] 。不同来源的β-葡萄糖苷酶其理化性质和催化活力均存在很大差别。部分不同来源β-葡萄糖苷酶的性质如表1所示。
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user: 4. 基因的克隆和表达 随着分子技术的快速发展，自然选育、诱变育种、原生质体融合等技术已经远远不能满足人类需求，而基因重组技术具有定向性，也越来越受到关注，利用该技术来获得高产β-葡萄糖苷酶工程菌株已经成为现在的研究热点。 对β-葡萄糖苷酶研究的不断深入，目前，多种不同来源的β-葡萄糖苷酶已被成功克隆在不同的载体中并异源表达得到高活性蛋白。表达宿主一般是大肠杆菌或者巴斯德毕赤酵母，但由于大肠杆菌是原核生物，不能有效修饰真核基因，表达量相对来说也比较低，故现在更倾向于毕赤酵母表达系统。毕赤酵母具有有效修饰真核基因、操作简单和蛋白表达水平高等优点 [ 13 ] 。表2中是近十几年来β-葡萄糖苷酶基因成功表达在真核系统的部分实例，其中使用毕赤酵母表达系统的研究居多。 微生物可以产生大量的β-葡萄糖苷酶，酶活比植物来源的要高，但在工业生产上，其产量远远不能满足工业要求。将产β-葡萄糖苷酶微生物的基因克隆在异源表达载体中，其分子量、比活、热稳定性以及催化效率等酶学性质发生较大的变化，热稳定性提高，更有利于工业生产和应用。 细菌具有较高的纤维素降解能力，但是大部分细菌产生的都是胞内酶。因此利用细菌来源的葡萄糖苷酶 Table 1 Characteristics of β-glucosidases from different source 来源 分子量(kDa) 最适pH 最适温度(℃) 构型 Km/(mM·L −1 ) p-NPG Vmax/(U·mg −1 ) p-NPG 比活(U·mg −1 ) 疏水层析 Brassica oleracea [ 8 ] 130 6.0 35 二聚体 0.755 604 1719.63 Putranjiva roxburghii [ 9 ] 68 5.0 65 NR 0.52 11.73 s −1 119.1 Bursaphelenchus xylophilus [ 10 ] 52 8.0 38 NR 2.334 9.017 180.3 Aspergillus oryzae [ 11 ] 90 4.5 55 NR 2.906 (纤维二糖) 0.138 μmol·(L·min) −1 (纤维二糖) 40.84 Bacillus korlensis [ 12 ] 90 7 40 NR 0.73 NR 1.64 × 105 表1. 部分不同来源β-葡萄糖苷酶的性质 注：NR表示文献中未有具体的数据。 Table 2 Examples of β-glucosidase genes expressed in eukaryotic system 菌株 表达宿主 基因序列长度 GenBank登录号 Saccharomycopsis fibuligera [ 14 ] 酿酒酵母 NR NR Paecilomyces thermophila [ 15 ] 毕赤酵母 2557bp/858aa HM998770 Aspergillus fumigatus Z5 [ 16 ] 毕赤酵母 2622bp/844aa HQ836475 Trichoderma reesei [ 17 ] 酿酒酵母 2622bp/847aa NR Aspergillus niger NL-1 [ 18 ] 毕赤酵母 2583bp/861aa HQ385276 Aspergillus oryzae GIF-10 [ 19 ] 毕赤酵母 2586bp/862aa NR Putranjiva roxburghii [ 9 ] 酿酒酵母 1617bp/539aa KF006311 表2. β-葡萄糖苷酶基因在真核系统的成功表达的部分实例 注：NR表示文献中未有具体的数据。 基因进行克隆和表达以获得高活性重组酶对生产具有重要的意义。KIM等 [ 20 ] 将来自Thermococcus pacificus P-4中的Tpa-glu基因在大肠杆菌中进行克隆和蛋白表达，其重组β-葡萄糖苷酶在pNPG为底物时最适pH为7.5，最适温度75℃，Km值较小，该重组酶具有较高的耐热性和底物特异性，在一定程度上降低了工业生产成本。同时也有研究 [ 21 ] 将Humicola insolens RP86中的bglhi基因在大肠杆菌中进行克隆和异源表达，其重组蛋白pH稳定范围更大，在pH为4.5~8.0范围内其酶仍然保持稳定，最适温度上升为60℃，最适pH为5.0~7.0，最适pH范围的扩大减少了工业生产中调节发酵液酸碱度的费用；重组酶对纤维素的催化效率提高，是原始菌株的三倍多，这为生物质资源化的研究方向提供了有价值的借鉴，同时利用废弃的生物质不仅减少资源浪费也降低了环境污染。综和比较可以发现，大部分的葡萄糖苷酶经过克隆和异源表达后，其对温度的耐受性和pH的稳定性都有了较大的提高，并且对纤维素物质的水解效率提高，而这些特征在工业应用中具有重要的实践意义，甚至可以较好地利用纤维素材料生产乙醇、L-乳酸等重要产品。 相对于细菌，真菌生产的酶大部分为胞外酶，但是关于利用真菌进行克隆和表达的报道较少，主要原因是真菌基因中含有内含子和外显子，其糖基化过程复杂。但是大部分真菌通过质粒进行基因转移的特性促使其可以作为表达宿主，尤其是毕赤酵母其特殊的高细胞外蛋白生产性能已经成为用于工业酶生产的理想基因表达系统并且被用于异源蛋白表达 [ 22 ] 。表3为部分微生物在毕赤酵母中成功表达的实例。毕赤酵母具有生产β-葡萄糖苷酶的能力并且成功表达真菌来源的重组蛋白 [ 23 ] 。里氏木霉可以产生大量的酶组分，因此基因改造里氏木霉获得理想特性如热稳定性和酸性耐受性的重组酶具有很高的价值，大量的葡萄糖苷酶可以更好地促进生物质水解。对里氏木霉进行工程化使其产生包括β-葡萄糖苷酶在内的 Table 3 Properties of recombinant β-glucosidases expressed in P. pastori 来源 基因 载体 宿主 分子量 (kDa) 最适 pH 最适 温度 (℃) Km (mM) Vmax (μmol·(min·mg) −1 pNPG Cellobiose pNPG Cellobiose P. thermophila J18 [ 2 ] PtBglu1 pMD18-T P. pastoris GS115 56.7 6 55 0.55 1 NR NR Aspergillus fumigatus Z5 [ 16 ] Bgl3 pPICZα P. pastoris X33 130 6 60 1.76 2.2 131.4 52.9 Neosartorya fisheri P1 [ 24 ] NfBGL1 pPIC9 P. pastoris GS115 80 5 70 0.51 NR 2172 NR Penicillium funiculosum NCL1 [ 23 ] Bgl4 pPICZα P. pastoris KM71H 130 5 60 2.5 1.25 3332 2083 表3. 重组β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母过表达的特性 一系列糖化酶，这可以成为降低加工成本的途径之一。
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user: 5. 酶活力测定 国内外对β-葡萄糖苷酶的酶活力测定有多种方法，总结起来酶活力的测定主要有四种方法，包括电化学法、荧光法、分光光度法、高效液相色谱法等。但是对于其活性测定尚没有确定的统一方法，其中以分光光度法最为常用。 5.1. 电化学法 Guilbault和Kramer设计通过电化学法测定β-葡萄糖苷酶的活力。主要方法是以扁桃苷作为底物，通过酶的作用发生反应生成氢化物，然后利用与自发(内)电解池相联结的一对银–铂电极来测定葡萄糖苷酶活性。该方法比较复杂，灵敏度低，很少使用。 5.2. 荧光法 由Robinson设计利用荧光吸光度来测定β-葡萄糖苷酶酶活力。依据4-甲基伞形酮能发出强烈的荧光，以4-甲基伞形酮的β-D-葡萄糖苷作为底物，经过β-葡萄糖苷酶水解可以产生游离的4-甲基伞形酮，根据其荧光吸光度来计算酶的活力 [ 25 ] 。荧光法最初的用途是检测动物组织中β-葡萄糖苷酶的含量，该方法灵敏度高且快速，但是操作复杂，且重现性不好，现在多不使用。 5.3. 分光光度法 分光光度法，又称Barush和Swiain法，是应用较广的一种方法，该法简单方便，普遍使用。 5.3.1. 水杨苷为底物 水杨苷经过酶的水解可以产生水杨醇和β-D-葡萄糖。该方法以水杨苷为底物，利用DNS试剂对其产物葡萄糖进行比色测定；或者利用4-氨基安替比林对水解产物水杨醇进行显色，并利用分光光度计测定其吸光度。该方法的反应过程易被周围环境干扰，且灵敏度不高，很少使用。 5.3.2. 对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为底物 对硝基苯基β-D-葡萄糖苷，又称pNPG，经过酶解可以产生对硝基苯，且在400~420 nm处有吸光度。基本原理是利用pNPG为底物并对产物进行吸光度测定来确定酶的活力。该方法具有操作简单快速、灵敏度高且其重现性好的优点，现在实验室普遍使用，但不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质存在较大的差别，故使用该方法测定酶活力时测定条件也需要发生不同的变化 [ 26 ] 。 5.3.3. 京尼平苷 京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，经过酶水解后产物京尼平能与氨基酸发生显色反应，生成蓝色物质，且在590 nm处有吸光度。梁华正等人通过多次研究发现以京尼平苷为底物可以确定β-葡萄糖苷酶的活力 [ 27 ] 。同时发现酶活力在0.05~1 U/mL范围里时，吸光度和酶活力呈线性相关，且能检测出的最低酶活力为0.02 U/mL。与以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为底物的测定方法相比较，该法灵敏度低，但是精密度和准确度较好，结果稳定。 5.4. 高效液相色谱法 以纤维二糖为底物，利用高效液相色谱，通过测定水解生成的葡萄糖量来判断酶活也是现在比较新颖的方法。但是该方法只适用于稀释后酶活力范围为0.17~0.37 IU/mL，且葡萄糖产量在2.0 mg以内的酶活力测定 [ 28 ] 。该方法简单、快速、灵敏度高，但是现在实验室很少使用。同时研究发现，β-葡萄糖苷酶以纤维二糖为底物时，其酶活性偏高。 综合比较，电化法和荧光法操作复杂、灵敏度，不适合用于精确测定酶活；分光光度法是操作最简单、快速的方法，适合酶活测定，也是现在实验室测定酶活经常用的方法；高效液相法现在使用的频率不高，但是灵敏度度相对来说比较高，是一种新颖的酶活测定方法，有可能成为实验室酶活测定的常用方法。
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user: 6. 应用 β-葡萄糖苷酶的应用范围极广，可以应用于食品、工业、医药等各个领域中，对其催化机制、克隆和性质等进行深入研究对于工业和科学发展都有重大的意义。 6.1. 在食品中的应用 在食品工业中，β-葡萄糖苷酶的主要作用是改善产品口味，符合人群需求。比如在青梅饮料中，青梅本身富含营养，但其中存在的苦杏仁苷使产品出现苦味，通过添加适量的β-葡萄糖苷酶可以使其苦味降低，饮料口味也更符合人群需求。评价葡萄酒品质高低的标准之一是其风味，β-葡萄糖苷酶能够水解风味前体物质，产生具有挥发性香气的成分，是影响葡萄酒品质的重要酶类，同时它对葡萄酒的抗氧化保健功能也具有重大的影响 [ 29 ] 。 6.2. 在工业中的应用 在工业中利用纤维素酶对木质纤维素材料进行发酵生产乙醇或者乳酸等产品，不仅降低了工业生产成本减少环境污染，同时也为新能源的开发与利用提供了基础。此外，β-葡萄糖苷酶还可以用于水解大豆异黄酮，生产大豆异黄酮苷元产品 [ 30 ] 等。 6.3. 在医药中的应用 坏死性小肠结肠炎(NEC)主要在早产儿或患病的新生儿中发生，在我国新生儿疾病中死亡率高达10%~50% [ 31 ] ，严重威胁其生命。研究发现，患儿血液中β-葡萄糖苷酶浓度上升早于肠壁出现组织学变化，故可以将该检测作为肠损伤的早期生化指标，为患儿争取更多的治疗时间 [ 32 ] 。
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user: 7. 总结与展望 β-葡萄糖苷酶通过保留型和反转型两种催化机制将纤维寡糖和纤维二糖水解为葡萄糖，减少了纤维二糖对其他纤维素酶的抑制作用，提高了酶的水解效率。除此之外，β-葡萄糖苷酶在其他领域的应用也十分广泛。该酶可以用于工业生产乳酸或者大豆异黄酮苷元产品等，同时还可以用于医疗中判断新生儿疾病等。目前，通过基因工程技术定向改造获得工程菌株或通过蛋白质工程技术获得高活性、具有耐热耐酸碱等特性的β-葡萄糖苷酶已成为现在研究的热点。 对于酶活力的测定方法，发现实验室最常用的方法仍是以pNPG为底物测定酶解产物的吸光度，此方法简单、快速，结果也比较准确；根据β-葡萄糖苷酶的特性，高效液相色谱法也有可能成为主要的测定方法。但是，针对不同来源的β-葡萄糖苷酶尚没有建立更加简便精准的活力测定方法体系，加深对β-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究将有利于对β-葡萄糖苷酶进行更深入的研究。同时尝试从基础领域出发，研究酶的催化机制，找到酶活力测定方法误差来源，真正从根本上减少误差，提高测定方法的精确度也是现在的研究内容之一。