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user: 3. 结果与分析 3.1. 大白菜和甘蓝CBL基因的鉴定和特征分析 笔者利用生物信息学的方法深入挖掘，分别从大白菜和甘蓝的基因组中鉴定出16个CBL基因。大白菜染色体A01上有6个CBL基因，A02和A09上分别有2个CBL基因，A03上有3个CBL基因，A06和A10上分别有1个CBL基因。而在甘蓝基因组中，染色体C01、C02和C07上分别有4个、3个和5个CBL基因，C03和C09上各有2个CBL基因。它们编码区大小为585 bp到822 bp不等。大白菜CBL基因除BrCBL16外显子数为7以外，其余外显子数均为8 (见表1和表2，图1和图2)。而甘蓝CBL基因外显子情况比较复杂，其中Bol033796外显子数为5，Bol043185外显子数为10，Bol017520和Bol033796外显子数为9，Bol027877和Bol035821外显子数为7，其余基因外显子数均为8.等电点分析显示，甘蓝CBL基因编码蛋白的等电点在4.23和4.90之间，差异不大，而大白菜的CBL编码蛋白有三个等电点在5 Table 1 Molecular feature of Chinese cabbage CBL gene Name Chr locus cds exons pI Subcellular location BrCBL1 A01 2318789-2320114 642 8 4.41 chlo BrCBL2 A01 4449274-4451276 642 8 4.43 nucl BrCBL3 A01 9159114-9160610 666 8 4.62 chlo BrCBL4 A01 9397063-9398450 822 8 4.64 nucl BrCBL5 A01 9399149-9400482 681 8 4.54 extra BrCBL6 A01 11151015-11152289 684 8 6.43 extra BrCBL7 A02 7361132-7362567 681 8 4.66 cyto BrCBL8 A02 25418218-25419717 666 8 4.51 extra BrCBL9 A03 5558818-5559993 717 8 4.59 nucl BrCBL10 A03 22897484-22899346 642 8 4.38 cyto BrCBL11 A03 26322227-26320863 681 8 4.55 cyto BrCBL12 A03 28830456-28831888 750 9 4.22 cyto BrCBL13 A06 16967951-16969375 666 8 4.71 mito BrCBL14 A09 6808374-6809938 645 8 5.04 cyto BrCBL15 A09 15836083-15837869 642 8 4.37 nucl BrCBL16 A10 10416811-10414782 585 7 5.03 nucl 表1. 大白菜CBL基因的分子特征 Table 2 Molecular feature of cabbage CBL gene 基因 染色体 位置 编码区大小 外显子数 等电点 亚细胞定位 Bol013539 C01 2923450:2924919:- 732 8 4.36 cyto Bol019687 C01 5945569:5947591:+ 642 8 4.48 nucl Bol039648 C01 12826398:12832444:- 759 4 4.42 nucl Bol039649 C01 12833165:12834563:- 714 8 4.50 nucl Bol018174 C02 10094646:10095996:- 681 8 4.66 extr Bol020153 C02 32764538:32766241:- 642 8 4.41 nucl Bol016477 C02 43888893;43890362;+ 666 8 4.51 cyto Bol017520 C03 53295970;53297424;- 741 9 4.62 cyto Bol027877 C03 6220816:6221968:- 663 7 4.81 cyto Bol043185 C07 19459500:19463414:- 780 10 4.47 cyto Bol022447 C07 36322654:36324095:+ 666 8 4.87 cyto Bol037119 C07 39013053:39015033+ 642 8 4.55 nucl， cyto Bol042297 C07 44223627:44224956:- 681 8 4.55 cyto Bol033796 C07 46466299:46467724:+ 750 9 4.23 cyto Bol018933 C09 8888828:8890657:- 642 8 4.37 cyto Bol035821 C09 30161917:30164294;- 618 7 4.90 chlo 表2. 甘蓝CBL基因的分子特征 图1. 大白菜CBL基因的外显子–内含子结构 图2. 甘蓝CBL基因的外显子–内含子结构 以上(BrCBL6，BrCBL14和BrCBL16)，其余都在在4.21和4.71之间。亚细胞定位预测发现，大白菜的CBL蛋白定位在细胞核和细胞质中的分别有5个，定位在叶绿体、线粒体和胞外基质的分别为2个、1个和3个；而甘蓝CBL蛋白的亚细胞定位情况与大白菜CBL蛋白定位情况一致，分别有5个定位于细胞核和细胞质中，2个定位于叶绿体中，3个位于胞外基质中，1个位于线粒体中。 3.2. 大白菜和甘蓝CBL的遗传进化和序列分析 遗传进化分析发现，大白菜的CBL基因分为五个不同的类群(见图3)，类群I有五个基因：BrCBL4、BrCBL5、BrCBL6、BrCBL8和BrCBL10；类群II有两个基因，BrCBL1和BrCBL11；类群III包含三个基因：BrCBL2、BrCBL9和BrCBL14；类群IV有两个基因，BrCBL15和BrCBL16；类群V包含四个基因：BrCBL3、BrCBL7、BrCBL12和BrCBL13。 甘蓝的CBL基因划为四个不同的类群(见图4)，类群I有四个基因，Bol018933、Bol09687、Bol020153及Bol037119；类群II包含三个基因Bol035821、Bol016477和Bol022447；类群III有五个基因，Bol039648、Bol039649、Bol042297、Bol018174和Bol027877；类群IV包含四个基因，Bol017520、Bol013539、Bol033796和Bol043185。从进化分析来看，大白菜和甘蓝的基因组中存在多个CBL姊妹对基因，这可能是基因复制的结果。 从大白菜和甘蓝CBL蛋白序基序来看(见表3和表4)，这些蛋白都含有3个EF手结构域。此外，除Bol043185外，其余CBL都有1~3个糖基化位点；除BrCBL4、7、12和Bol039648、Bol018174、Bol017520和Bol03379外，都含有1~3个豆蔻酰化位点；除Bol013539、Bol039648和Bol027877外，其余CBL都含有1~3个磷酸激酶c磷酸化位点。从大白菜和甘蓝CBL蛋白序列比对分析结果来看，它们存在一些十分保守的氨基酸位点，如100%保守的氨基酸位点有多个f位点，还有K、g、i、e、p、ke、fd和fhp，相对保守的与CIPK互作的FPSF位点等。这些保守的氨基酸位点可能对CBL功能的发挥具有重要影响。 图3. 大白菜CBL基因的遗传进化 图4. 甘蓝CBL基因的遗传进化 Table 3 Motifs of Chinese cabbage CBL protein gene N-glycosylation site N-myristoylation site PKC phosphorylation site EF hand BrCBL1 1 1 2 3 BrCBL2 1 1 2 3 BrCBL3 1 2 1 3 BrCBL4 1 0 3 2 BrCBL5 2 1 1 3 BrCBL6 2 2 1 3 BrCBL7 1 0 1 3 BrCBL8 1 1 2 3 BrCBL9 1 1 1 3 BrCBL10 1 1 1 3 BrCBL11 2 1 1 3 BrCBL12 2 0 3 3 BrCBL13 1 2 1 3 BrCBL14 1 1 2 3 BrCBL15 1 1 1 3 BrCBL16 1 2 2 3 表3. 大白菜CBL基序分析 Table 4 Motifs of cabbage CBL protein 基因 N-糖基化位点 豆蔻酰化位点 PKC磷酸化位点 EF手结构 Bol013539 1 1 0 3 Bol019687 1 1 2 3 Bol039648 1 0 0 3 Bol039649 2 1 1 3 Bol018174 1 0 1 3 Bol020153 1 1 1 3 Bol016477 1 1 2 3 Bol017520 1 0 2 3 Bol027877 1 1 0 3 Bol043185 0 3 2 3 Bol022447 1 2 2 3 Bol037119 1 1 1 3 Bol042297 2 1 1 3 Bol033796 2 0 3 3 Bol018933 1 1 1 3 Bol035821 3 2 3 3 表4. 甘蓝CBL蛋白基序分析 3.3. 大白菜和甘蓝CBL基因的顺式调控元件和功能预测 顺式调控元件分析预测可为基因功能的研究提供线索。笔者研究发现，在大白菜和甘蓝的CBL基因上游序列中(启始密码子ATG上游1500 bp)存在多个应答不同激素和逆境的顺式元件，且不同成员拥有的顺式元件的种类和数目各不相同(见表5和表6)。根据遗传进化和顺式元件分析的结果，推测BrCBL1在盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫、脱落酸、乙烯、赤霉素、水杨酸等多种激素应答过程中具有一定功能，BrCBL2在脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯、赤霉素以及干旱胁迫、钾铁离子吸收、花粉管萌发伸长等方面具有一定功能，BrCBL3在盐胁迫、热、干旱胁迫及茉莉酸甲酯、赤霉素、生长素等应答中具有一定功能，BrCBL4在盐、干旱胁迫以及茉莉酸甲酯应答方面发挥作用，BrCBL5在茉莉酸甲酯、赤霉素、生长素应答及干旱、温度胁迫应答中具有一定作用，BrCBL6在茉莉酸甲酯、赤霉素、ABA应答和干旱胁迫、镁离子胁迫、种子发育及花粉管伸长和光反应中具有一定功能，BrCBL7可响应盐胁迫、干旱、低温胁迫及赤霉素、水杨酸信号，BrCBL8可应答茉莉酸甲酯、赤霉素和水杨酸信号，在低温、干旱逆境响应及植物发育过程中具有一定功能，BrCBL9在乙烯和赤霉素信号响应及盐胁迫、干旱、低温胁迫和缺钾应答中具有一定功能，BrCBL10参与植株生长发育、ABA、茉莉酸甲酯、赤霉素信号应答和镁离子胁迫、钾离子吸收、干旱和防卫反应，BrCBL11参与盐、干旱、热胁迫应答以及茉莉酸甲酯、水杨酸等激素信号响应，BrCBL12可响应茉莉酸甲酯、生长素和水杨酸信号，以及热和干旱等逆境胁迫，BrCBL13可响应脱落酸等多种激素信号，在干旱、温度胁迫及钾等养分吸收过程中具有一定功能，BrCBL14可应答脱落酸、赤霉素等多种激素信号以及钾、铁的转运吸收，BrCBL15和BrCBL16在干旱胁迫及热胁迫应答中具有一定功能。根据甘蓝CBL顺式元件分析结果以及与拟南芥CBL基因的遗传进化关系(见图5)，推测甘蓝的各个CBL成员也具有与拟南芥的直系同源CBL基因相似的功能。总之，它们在多种激素应答和逆境应答中发挥各不相同的功能。 Table 5 Cis-elements of Chinese cabbage CBL gene ABRE /motif IIb CGTCA -motif ERE GARE-motif /P-box HSE LTR MBs TGA-box /element TC-rich repeats TCA -element w-box BrCBL1 4 2 1/2 2 3 /1 3 2 BrCBL2 2 1 2 2 3 3 BrCBL3 1 /1 2 2 /1 1 BrCBL4 1 3 2 1 BrCBL5 2 3 3 1 1 1/2 1 BrCBL6 1 4/1 1 BrCBL7 2 1 1 2 1 BrCBL8 2 1/1 2 1 2 BrCBL 9 1 2 1 1 1 BrCBL10 2/1 1 2 2 3 BrCBL11 2 1 1 /2 1 1 BrCBL12 4 2/1 1 3 /2 1 3 BrCBL13 1 1 /1 1 2 2 /1 1 BrCBL14 2 2 1 3/1 /2 1 BrCBL15 /1 1 1/1 8 1 1 BrCBL16 1 2 3 2 4 表5. 大白菜CBL顺式元件分析 注：ABRE为脱落酸应答元件，CGTCA-motif为茉莉酸甲酯(MeJA)应答元件，ERE为乙烯应答元件，GARE-motif和P-ox为赤霉素应答元件，HSE为热胁迫应答元件，LTR为低温应答元件，MBS为干旱应答元件，TC-rich repeats为逆境和防卫应答元件，TGA-element位生长素应答元件，TCA-element为水杨酸应答元件，W box为病原物答元件。 Table 6 Cis-elements of cabbage CBL 基因 ABRE/CE3 CGTCA-motif ERE GARE-Motif/ Pbox HSE LTR MBS TCA-element TC-rich repeats TGA-box/element W box Bol039649 0/1 2 4 3 1 1 1 1 Bol042297 1 1/1 5 1 4 1 1 Bol039648 8 1 1 1 1 1 1 2 1 Bol018174 1 1 1 Bol027877 2 1 1 1 2 Bol019687 4 1 1 3 1 3 3 Bol018933 2 1 2 3 1 1 1 Bol020153 1 3 3 1 4 1 1 1 Bol017520 1 1 2 Bol033796 1 4 0/1 1 2 3 3 Bol013539 3 1 2 1/1 1 1 1 1 Bol022447 1 2 1 1 1 3 1 Bol016477 1 1 1 2 3 1 Bol043185 4/2 4 2 1 1 2 3 1 Bol037119m 1 1 4/1 1 3 Bol035821m 1 1 2 1 2 表6. 甘蓝CBL顺式元件 图5. 大白菜和甘蓝CBL的遗传进化