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user: 2. 昆虫脑结构的三维重建 三维重建技术是根据相关的仪器设备获取二维图像信息，再对图像信息进行处理，最后根据相关理论用计算机重建出三维的物体表面轮廓的一种方法 [ 22 ]。三维重构技术按绘制方法主要分为面绘制法( surface rendering)和体绘制法(volume rendering)两大类。面绘制法指需要集合单元拼接来拟合物体的表面，从而描述物体的三维结构，按其重建过程所需处理的基本元素分为两大类：轮廓线重建法和体素重建法。常用的形态学三维重建软件有Amira、Imaris、Maya等，这三项软件系统功能比较相似，均可以根据显微CT、CLSM、MRI、连续组织切片等二维连续序列数据，重建相关三维结构 [ 23 ]。 2.1. 三维重建技术的优缺点 传统的显微CT、CLSM、MRI、连续组织切片等二维成像研究方法获得的数据大多为一组断层图像，优点是获得数据便捷、快速，缺点是单图像信息一般都不完整，需要观察者在大脑中进行“空间重建”，此过程常因每个人的经验差异而产生不同程度的偏差 [ 24 ]，难以确定实验样本的空间位置、大小、几何形状以及与周围生物组织之间的对应关系，更进一步表现为难以确定具体的长度、宽度、面积、体积等。 三维重建的技术可以有效缓解上述二维数据存在的弊端。已有医学研究表明，当采用基于CT的三维重建方式和传统二维X线两种方式对先天性脊柱侧凸患者进行诊断，发现三维重建技术可以很好显示椎体畸形程度，帮助判断畸形位置的变化，还能能对椎体类型进行判断，包括：完全分节，部分分节，不分节等。三维重建方式能提供X线无法显示的信息，其诊断成功率是二维X射线近1.3倍，对比二维研究方法，其优势明显 [ 25 ]。 通过以上分析不难发现，三维重建的优点是能提高观察者对复杂解剖结构、变异结构在空间上的认知，在这点上是CT、MR等二维成像软件无法比拟的，而且重构后的图像质量和正确率都优于传统方法，具有极高的可行性 [ 26 ]；但其也存在一个弊端，三维重建的过程比较复杂、获得三维数据耗时较长。三维重建技术具有可视化、形象化、立体化、精确化等优点，是实现微小、复杂结构可视化的一种良好技术，现已被运用到昆虫脑结构的研究中。 2.2. 基于三维重建技术下标准脑创建的两种方法 特定物种大脑的解剖学和功能特性遵循相似的结构设计，但不存在完全相同的脑结构。一方面，同类昆虫的脑结构会存在大小以及形状等方面的差异，另一方面，在许多物种中，都非常需要标准化的大脑模型作为组织和分析数据的一种工具。为了让昆虫大脑在三维重建过程中具有统一的标准，前人开发了以果蝇为代表的虚拟昆虫脑程序the Virtual Insect Brain (VIB) procedure [ 14 ] [ 27 ] 和以蜜蜂Apis mellifera为代表的迭代形状平均程序the Iterative Shape Averaging (ISA) procedure两种方法 [ 17 ] [ 28 ]。 虚拟昆虫脑(VIB)程序是一款基于三维重建和AMIRA可视化软件的技术，采用全局刚性、局部刚性变换再加上局部非刚性变换等方法来实现昆虫三维脑结构。用VIB程序创建标准脑可以实同类昆虫或种内昆虫大脑之间的对比(包括形状的变化、应用体积等)。在传统的切片图像比较中，如果不特别注意这种结构，即使是35%左右的体积效应的变化也很容易被忽略 [ 14 ]，但如果将这些变化的大脑放在透明的标准脑中进行对比，则会很明显发现这些结构的差异。当前VIB程序已重建了果蝇 [ 27 ]、沙漠蝗虫Schistocerca gregaria [ 29 ]、烟草天蛾Manduca sexta [ 3 ]、赤拟谷盗 [ 19 ] 等昆虫的神经解剖学标准化模型，该程序也可用于其它昆虫脑结构三维标准化的重建。由此种方法发现了果蝇的突变体基因 [ 14 ]，它提供脑区的体积测量，并有助于描述大脑结构突变体。使用VIB程序创建标准昆虫三维脑结构时可以保持各个神经纤维的体积不发生变化。此种程序可用来定量评估、比较和展示神经解剖学的数据 [ 27 ]，便于直接比较基因表达模式，也方便描述其个体间的可变性。此重建标准非常适合对神经纤维水平的个体间变异性进行种间和种内比较分析。 迭代形状平均(ISA)程序是使用仿射变换后再迭代非刚性配准来实现标准脑的一种方法，通过重复应用基于强度的非刚性配准算法校正全局尺寸和位置差异去创建一系列平均标签图像来重建出昆虫三维脑结构模型 [ 17 ]。ISA方法是Rohlfing等人引入的技术的改进版本 [ 28 ]，并由Brandt等人将其应用于蜜蜂Apis mellifera的大脑 [ 17 ]，其主要功能是生成一个可以将不同个体的单个重建神经元映射到其中的一个人为合成的真实的大脑 [ 3 ]。在迭代过程中，通过平移、旋转和各向异性缩放(即通过使用仿射变换)对齐所有输入的CLSM (激光共聚焦)图像之后，从模糊平均开始生成连续精化的平均图像。在随后的迭代中，通过使用单个图像与当前平均图像的非刚性对齐，可以将越来越精细的个体间形状差异平均化。当前应用ISA程序创建的昆虫三维脑结构有蜜蜂 [ 17 ]、沙漠蝗虫 [ 29 ]、蟑螂 [ 2 ]、烟芽夜蛾Heliothis virescens [ 11 ]、澳大利亚博贡蛾the Australian Bogong moth [ 21 ] 等。此种方法在构建昆虫脑结构中与ISA的作用相反，会使体积形状差异平均化。所得的初始平均图像某种意义上可以理解为是神经区域的“形状质心” [ 17 ]，所以ISA方法更适合表达各大脑区域的相对位置。 创建标准的大脑模型不仅可以用来整合已识别的不同区域的神经元，还可以轻松地从视觉上访问神经元在三个维度上的相对位置，从而促进对不同区域神经元功能关系的理解，更可以直观的筛选出异常的脑结构，为基因突变的发现提供一个渠道。此外标准脑的建立也为神经数据库的发展提供了一种规范化的统一标准。实验中具体选择哪种方法创建标准的昆虫三维脑结构，因根据研究所需目的来选择。 两种标准脑创建方法的优缺点见表1。 Table 1 VIB versus IS 方法methods 优点advantage 缺点disadvantage 应用场合Application VIB 构建的模型能明显发现某些结构的微小差异(包括形状、应用体积变化) 不易找到各个结构之间的统一性 比较种内或种间脑区域的差异性 ISA 构建的模型可以使不同结构的体积形状差异平均化 无法突出样本的差异性 测量各区域的相对位置 表1. VIB与ISA对比 2.3. 脑结构三维重建的步骤 昆虫脑结构的三维图像主要由以下步骤获得，如图1。其中步骤4对于创建昆虫非标准脑不必采用。 图1. 昆虫脑结构三维重建的步骤 (1) 样本制作：根据实验目的及现实情况先对对样本进行简单的解剖、洗涤、固定等处理，而后进行神经免疫组织化学染色标记。神经染色时，一抗通常会使用一种抗突触蛋白突触素的单克隆抗体 [ 21 ] [ 30 ] (SYORF1)溶液孵育，二抗通常使用Cy2偶联的羊抗鼠抗体溶液进行孵育，以此对昆虫大脑中神经区域进行双重标记。 (2) 二维图像获得：一般采用共聚焦激光扫描显微镜(LSM)或显微CT对昆虫大脑进行扫描，扫描时可使用氩激光488 nm来激发荧光Cy2。由于昆虫大脑的厚度和宽度以及物镜的工作距离等原因的限制，为了全面扫描整个大脑，通常每个大脑被扫描成四个或以上图像堆栈，其中两个来自前部，两个来自后部 [ 2 ]，以确保每个区域都被扫描覆盖。 (3) 神经区域分割与重建：用自定义模块将步骤(2)中所获得的图像堆栈合并到AMIRA三维分析软件中，并使用AMIRA中的分段编辑器“label field”，逐层使用轮廓或魔术笔来手动标记已识别的大脑结构。在这个过程中，属于特定大脑结构的任何一组体素都会被赋予唯一的标签，即同一神经区域标记为相同的颜色，层层标记直到所需构建的神经区域全部标记完毕，产生一堆与底层共聚焦图像相对应的相同区域的标签图像 [ 11 ]。在分割的过程中，处理不同昆虫大脑的相同结构时应采用相同的标签。最后对一些特定的轮廓可能需要进行一些精细编辑或平滑处理。 (4) 标准脑的生成：无论是采用VIB还是ISA方法，都需要先选择一个大脑作为模板。选择模板大脑前，先要计算已重建的每个神经元的相对位置，然后选择体积和位置与已计算的平均体积和平均距离差异最小的大脑作为配准模板大脑 [ 2 ]。VIB标准脑要采用全局刚性、局部刚性变换再加上局部非刚性变换等方法来重建，而ISA方法要使用基于强度的非刚性配准通过仿射变换后重复迭代来生成标准脑模型。ISA方法的结果取决的模板大脑的选择 [ 28 ]。详细两种方法标准脑的重建过程可参考沙漠蝗虫 [ 29 ]、蟑螂 [ 2 ] 等文献。 (5) 统计与分析：可使用AMIRA软件的“TissueStatistics”功能对昆虫各个神经区域进行测量和计算，以获得相对应结构的长度、宽度及体积。在利用Excel表格计算昆虫大脑各部分体积的平均值、标准差和相对体积，即各神经髓体积大小占脑神经髓的百分比。