system: [SYSTEM]

user: 2. 材料和方法 2.1. 样品 浙江泛亚保健食品有限公司提供。按照每升添加13.3 g蝉花子实体干品和1.4 g酒炙黄精，用42˚基酒浸泡60天，用纯水调配至38˚；同样用26.5 g蝉花子实体干品和2.9 g酒炙黄精，用42˚基酒浸泡60天，用纯水调配至38˚；分别得到低剂量和高剂量成品酒。然后通过蒸馏浓缩和调配使低剂量和高剂量含药量分别为18.18 g/L和36.36 g/mL，酒精度为15%。4℃冷藏。按照人体推荐量为2.66 g/日·60 kg BW进行免疫学试验研究 [ 14 ]。 2.2. 实验动物 ICR小鼠180只，清洁级，初始体重18~22 g，雄性，合格证号：201804353，由扬州大学比较医学中心提供。ICR小鼠60只，SPF级，初始体重18~22 g，雄性，合格证号：201808403，由南京医科大学提供。实验鼠粮，规格：20 kg/袋，江苏省协同医药生物工程有限公司提供。饲养环境：屏障实验室，温度18℃~24℃，相对湿度40%~70%。 2.3. 试剂与仪器 2.3.1. 主要试剂 小牛血清，Gibco，批号：1517927；谷氨酰胺，上海源叶生物科技有限公司，批号：L17J7G16278；刀豆蛋白，aladdin，批号：D1628065；MTT，Amresco提供；2，4二硝基氟苯(DNFB)，MACKLIN公司，批号：L10061077；绵羊红细胞(SRBC)，南京茂捷微生物科技有限公司，批号：20170904001；2%绵羊红细胞(SRBC)，平睿生物科技(北京)有限公司，批号：170911；1%鸡红细胞悬液，平睿生物科技(北京)有限公司，批号：170918；氧化性辅酶I，Amresco提供；Triton，天津市光复精细化工研究所等。 2.3.2. 主要仪器 XDS-1B显微镜，重庆光电仪器有限公司；UV1750分光光度计，日本岛津；HERA cell 150i CO 2 培养箱，美国Thermo Electron公司；NU-430-400E超净工作台，美国NUAIRE；DS-671电子秤，上海寺冈电子有限公司；AL104电子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；鼠静脉注射固定架；JS-306电子秒表，深圳市君斯达实业有限公司；550型酶标仪，Biorad公司等。 2.4. 剂量选择、受试样品给药方式和时间 人用剂量为2.66g/日，以人体60 kg计，即为0.045g/kg。以人体推荐量的20倍设为高剂量组(0.9 g/kg)，以10倍设为低剂量组(0.45 g/kg)。因样品本身分为两个浓度：16号，15 g/825mL (0.018 g/mL)，17号，30 g/825mL (0.036 g/mL)，故直接取原液进行实验。16号作为低剂量，17号作为高剂量。灌胃容积为均为0.25 mL/10g。蒸馏水作为阴性对照组，灌胃给药，每组10只。各组给相应的受试样品，每天1次，连续30天。 2.5. 实验方法 按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的规定检测指标，参照白巍、吴小丽等人的方法进行 [ 15 ] [ 16 ]。 2.5.1. ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法) 无菌取脾，置于适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液；将细胞悬液用200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次1000 rpm离心10 min；将细胞悬浮于1 mL完全培养液中；台酚蓝染色计数活细胞数，并调整细胞浓度至3 × 10 6 个/mL。将每份脾细胞分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，其中一孔加75 μL ConA液，另一孔作为对照，将培养板置于5%CO 2 、37℃培养箱中培养72h。培养结束前4 h，每孔吸去上清0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT (5 mg/ mL) 50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶液直接移入2 mL比色杯中，紫外分光光度计570 nm测定OD值。 2.5.2. 二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)实验 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3 cm × 3 cm，用DNFB溶液50 μL均匀涂抹致敏。5天后，用DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24 h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片，称重。 2.5.3. 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法) 在清洁玻片上刷一薄层琼脂糖，干后保存备用。将压积SRBC用生理盐水配成2% (v/v)的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000 r/min) 10 min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬液在5 mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10 6 个/mL。将表层培养基加热溶解后，放45℃~50℃水浴保温，与等量pH7.2~7.4的2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加50 μL 10% SRBC，20 μL脾细胞悬液(5 × 10 6 个/mL)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入CO 2 培养箱中孵育1~1.5 h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1~1.5 h后，计数溶血空斑数。 抗 体 水 平 = ( S 1 + 2 S 2 + 3 S 3 ⋯ n S n ) 式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。 0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。 I级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。 II级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。 III级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。 IV级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。 2.5.4. 血清溶血素的测定实验(血凝法) 将2% (v/v)压积SRBC的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出。2000 r/min离心10 min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于96孔微量血凝实验板内，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5% (v/v)的SRBC的悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度。 2.5.5. 小鼠碳廓清实验 按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨水(0.1 mL/10g)，待墨汁注入，立即计时。注入墨水后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL，并立即将其加到2 mL 0.1% Na 2 CO 3 溶液中。用紫外分光光度计在600 nm波长处测光密度值(OD)，以Na 2 CO 3 溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力，按下式计算吞噬指数a。 K = lg O D 1 − lg O D 2 t 2 − t 1 吞 噬 指 数 a = 体 重 肝 重 + 脾 重 × K 3 2.5.6. 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法) 每只小鼠腹腔注射1%的鸡红细胞悬液1 mL。间隔30 min，脱臼处死。将其腹部朝上固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min。之后打开腹腔吸出腹腔液1 mL，平均分滴于2片载玻片上。在湿片盒内垫半湿的纱布(用温水湿透，置于培养箱内备用)。将加入腹腔液的载玻片小心放入垫有湿纱布的盒内，放置在37℃培养箱内孵育30 min。孵育结束后于生理盐水中漂洗，以除去未贴片的细胞，晾干。以丙酮甲醇固定液固定5 min，Giemsa应用液染色3 min。用蒸馏水冲洗干净，晾干。玻片于40×显微镜下计数吞噬率和吞噬指数。每张片计数100个巨噬细胞，吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。 吞 噬 百 分 率 ( % ) = × 100 吞 噬 指 数 = 被 吞 噬 的 鸡 红 细 胞 总 数 计 数 的 巨 噬 细 胞 数 2.5.7. NK细胞活性测定 实验前24 h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为4 × 105个/mL。无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，收集滤液；用Hank’s液洗2次，每次1000 r/min离心10 min；弃上清并将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水20 s (裂解红细胞)；再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1000 r/min离心10 min；用1 mL含有10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬；用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)；用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为2 × 107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100 μL (靶效比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL；靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5% Triton各100 μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5% CO 2 培养箱中培养4 h；然后将96孔培养板以1500 r/min，离心5 min；每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL；37℃，反应3 min，每孔加入1 M HCl 30 μL，在 酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性： 吞 噬 鸡 红 细 胞 的 巨 噬 细 胞 数 计 数 的 巨 噬 细 胞 数 N K 细 胞 活 性 ( % ) = 反 应 孔 O D − 自 然 释 放 孔 O D 最 大 释 放 孔 O D − 自 然 释 放 孔 O D × 100 % 2.6. 数据统计处理 实验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，使用Duncan新复极差法对不同实验组间数据进行差异显著性比较分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。