DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 1. 引言 谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，是最丰富的非蛋白质硫醇，且存在于所有哺乳动物组织中 [ 1 ]。GSH在氧化剂防御，细胞增殖和凋亡，信号转导和免疫反应调节中发挥着关键作用 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。GSH的合成失调会导致许多疾病的发生，包括心血管疾病 [ 5 ]、神经退行性疾病 [ 6 ] [ 7 ]、；艾滋病 [ 8 ] [ 9 ]；酒精性肝病 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]、肺部疾病 [ 13 ]、糖尿病 [ 14 ] 与癌症 [ 15 ] 等。谷胱甘肽一般通过酶法、溶剂萃取法、化学合成法 [ 16 ] 和微生物发酵法来生产 [ 17 ]，其中微生物发酵法是目前生产谷胱甘肽的主要方法，因此，要提高谷胱甘肽的生物合成水平，必须进行菌种选育及对培养条件进行优化。 本文通过对本实验室保存的产朊假丝酵母菌株进行紫外诱变及致死率实验，筛选到高产GSH的突变菌株，同时对高产谷胱甘肽突变菌株进行培养条件的优化，以期提高GSH在菌体中的含量。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 2.1.1. 菌株 产朊假丝酵母菌(Candida utilis)，由本实验室保存。 2.1.2. 试剂与仪器 5’5-双硫代对硝基苯甲酸(DTNB)采购自索莱宝生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。 SPX-0128型生化培养箱，宁波江南仪器厂；THZ-98恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；YJ-1340双人单面净化工作台，苏州市苏信净化设备厂；HVE-50高压蒸汽灭菌锅，日本HIRAYMA公司；PB-10酸度计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UNIVERSAL 320R冷冻离心机，德国Hettich公司；UV-550PC紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；移液器，Eppendorf公司。 2.2. 方法 2.2.1. 培养基 斜面种子培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L。 种子培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L。 发酵培养基：葡萄糖30 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，蛋白胨15 g/L，葡萄糖单独灭菌后再与其他成分混合。 2.2.2. 菌株活化及种子悬液的制备 将保藏菌株接入YEPD斜面培养基上，30℃培养2 d，二次转接至斜面上，待菌体活化后，再用接种环从活化的斜面上挑取一环菌体，接种到含20 ml YEPD种子培养基的250 ml三角瓶中，30℃，200 r/min摇瓶振荡培养一段时间以制备种子液。 2.2.3. 紫外诱变 将制备的新鲜菌体悬液，分别取5 ml的菌悬液置于直径为90 mm的无菌平皿中，调整紫外灯高度约30 cm，磁力搅拌器和灭菌的转子放入无菌操作台，将培养箱中存放的培养皿放至磁力搅拌器上，使用紫外灯对菌悬液进行不同时间的照射(0~120 s) [ 18 ]，每隔10 s取样，每个平皿吸出200 μl。紫外诱变后的菌体在稀释后平行涂布3个平板培养基，倒置平板于30℃恒温箱避光培养2~3 d后，同时以未经UV诱变的菌液涂布到YEPD平板作为对照。每个诱变平板和对照组平板进行活菌数计数，比较UV诱变时间对菌株的致死率的影响。 2.2.4. 抗性筛选物乙硫氨酸对出发菌株致死率的检测 将适量的菌体悬液涂布到含不同浓度乙硫氨酸(0 g/L、0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L)的平板培养基上，在30℃培养箱中培养2~3 d，观察菌落生长情况，对平板活菌计数，计算各浓度乙硫氨酸对菌体的致死率，从而选择合适的浓度，抗性筛选物乙硫氨酸对出发菌株的致死率计算参考文献 [ 19 ]。当致死率在60%~70%时，则选此条件下乙硫氨酸的浓度进行筛选。 2.2.5. GSH高产菌株的筛选及遗传稳定性实验 将筛选后的菌株连续传代10次培养，摇瓶发酵后测定谷胱甘肽产量，以检测出产量较高，且遗传稳定的高产菌株进行后续实验。 2.2.6. 正交实验设计 参考文献 [ 20 ] 及结合单因素实验设计正交实验方案，即对培养温度、摇床转速、初始pH值、含有机氮的蛋白胨与无机氮的硫酸铵的浓度比和接种量5因素5水平组成，分别在含50 mL培养液的500 mL摇瓶中按照实验方案进行试验，通过测定GSH的含量来进行优化。 2.2.7. 提取与谷胱甘肽含量的测定 酵母生物量的测定(DCW)：用去离子水将离心后得到的菌体洗涤2次，离心收集菌体，于60℃烘干至恒重称量，计算出细胞干质量(g/L)。 抽提方法参考文献 [ 21 ] 进行提取，之后采用DTNB [ 22 ] 法测定细胞内GSH的含量。 2.2.8. 数据统计分析 图形绘制用Origin2018，采用SPSS17.0软件进行正交试验设计与显著性分析，不同处理间比较用单因素方差分析，当P < 0.05时认为差异显著，每组试验重复三次。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 紫外诱变结果 在紫外灯功率和照射距离保持不变情况下，照射时间越长，致死率越高，结果如图1所示。一般认为，对于工业生产用菌种，致死率在75%~80%之间时，诱变效果最好，即正突变率最高，基于此，确定在紫外线功率为20 W照射距离约30 cm处，时间为80 s时达到诱变效果。 图1. 不同紫外照射时间条件下的菌体致死率曲线 3.2. 抗性物乙硫氨酸剂量选择结果 乙硫氨酸浓度与致死率的关系如图2所示，培养基中乙硫氨酸的浓度与实验菌株的致死率之间存在着明显的剂量效应关系，随着乙硫氨酸浓度的提高，致死率也逐渐提高。当乙硫氨酸浓度为900 mg∕L时致死率为73%，本文选取该浓度作为平板筛选剂量，经平板筛选到一株突变菌株，GSH产量达到113.02 mg/L，比出发菌株提高了23%。 图2. 不同乙硫氨酸浓度条件下的菌体致死率曲线 3.3. 发酵工艺的优化分析 本研究设计采用L25 (5 5 )正交设计考察培养基中蛋白胨和硫酸铵浓度之比、初始pH值、接种量、发酵温度及摇床转速组成的五个因素五水平试验(表1)。将制备好的种子悬液按方案加入培养基，培养基总量为50 mL，测定胞内GSH的含量。正交设计试验结果如表2所示，从正交试验结果分析得出，摇床转速的各水平极差最大，其为最主要影响因素，各因素对胞内谷胱甘肽合成的影响顺序为摇床转速 >培养温度 > 蛋白胨和硫酸铵浓度之比 > 初始pH值 > 接种量，理论的最佳组合为E5D3A3B5C3，摇床转速方差分析结果见表3，从正交试验方差分析结果得出，摇床转速对GSH的产量影响显著、其次为培养温度、蛋白胨和硫酸铵浓度之比，其他因素对GSH的产量影响不显著，确定了培养基优化条件为：200 r/min、培养温度26℃、蛋白胨和硫酸铵浓度之比5:2、初始pH值5.0、接种量10%。 Table 1 Factors and level 水平 A C蛋白胨/C硫酸铵 B 初始pH值 C 接种量(%) D 温度/(℃) E 转速(r/min) 1 15:2 4.0 2 22 120 2 15:4 4.5 4 24 140 3 5:2 5.0 6 26 160 4 15:8 5.5 8 28 180 5 3:2 6.0 10 30 200 表1. 因素水平表 Table 2 Results and analysis of orthogonal test desig 实验号 A B C D E GSH含量/(mg/L) 1 2 1 2 5 2 165.26 2 5 1 5 2 5 177.18 3 3 2 4 5 1 164.18 4 5 3 2 4 1 161.68 5 1 5 5 5 3 178.13 6 5 4 3 5 4 178.72 7 2 5 1 4 4 172.33 8 3 5 2 3 5 187.31 9 3 4 1 2 2 168.46 10 1 1 1 1 1 160.36 11 4 3 1 5 5 179.23 12 4 4 2 1 3 163.36 13 2 4 5 3 1 165.66 14 1 4 4 4 5 183.72 15 5 2 1 3 3 175.36 16 3 1 3 4 3 177.89 17 4 1 4 3 4 172.89 18 1 3 3 3 2 176.27 19 3 3 5 1 4 175.44 20 1 2 2 2 4 171.79 21 2 3 4 2 3 169.63 22 4 5 3 2 1 162.69 23 2 2 3 1 5 170.42 24 5 5 4 1 2 165.55 25 4 2 5 4 2 167.12 k 1 174.054 170.716 171.148 167.026 162.914 k 2 168.660 169.774 169.88 169.950 168.532 k 3 174.656 172.450 173.198 175.498 172.874 k 4 169.058 171.984 171.194 172.548 174.234 k 5 171.698 173.202 172.706 173.104 179.572 R 6.00 3.43 3.32 8.47 16.66 表2. 正交试验设计结果与分析 Table 3 Various analysis of orthogonal test resul 因素 偏差平方和 自由度 F值 R A 152.365 4 6.687 0.046 B 37.745 4 1.656 0.318 C 35.506 4 1.558 0.339 D 209.980 4 9.215 0.027 E 784.849 4 34.443 0.002 误差 22.787 4 表3. 正交试验结果方差分析
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user: 4. 结论 本文采用紫外诱变、乙硫氨酸为筛选模型选育到一株高产谷胱甘肽的产朊假丝酵母菌株。通过正交实验设计进行优化培养条件，实现了细胞内谷胱甘肽浓度达到187 mg/L，超过黎明等报告 [ 23 ] 的谷胱甘肽的含量，下一步我们将利用常压室温等离子体诱变的方法，对产朊假丝酵母进行诱变，力争提高其生产GSH的能力，以达到工业化生产的目的。
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user: 摘要 目的：通过对极低出生体重儿(Very low birth weight infants， VLBWI)补充骨化三醇与维生素D3的临床对照研究，探讨活性维生素D制剂对VLBWI骨代谢及相关疾病的影响。方法：前瞻性对照研究，选择2019年1月~2019年10月期间入住青岛大学附属医院NICU、并取得家长知情同意的40例VLBWI为骨化三醇组，随其后入院的第1个VLBWI 40例为对照组。两组VLBWI在喂养耐受后(骨化三醇组为10.26 ± 3.76天，对照组为10.65 ± 5.20天)均给予维生素AD每日1粒(含维生素D 500 IU、维生素A 1500 IU)，骨化三醇组每日加服骨化三醇(0.125 ug)，对照组每日加服维生素D3 (400 IU)。两组VLBWI在生后24小时内及生后1月时分别测定血清25-(OH)D、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase， ALP)、血磷、血钙水平，矫正胎龄(Corrected gestational age， CGA) 40周时测量身长、体重、头围体格发育指标，并收集两组VLBWI住院期间临床资料。进行统计学处理。结果：1) 骨代谢指标比较：两组生后24小时及1月龄时血清25-(OH)D、血ALP、血钙、血磷水平差异均无统计学意义(P > 0.05)；两组喂养方式、TPN时间及钙磷摄入差异无统计学意义(P > 0.05)；CGA 40周时身长、体重、头围比较差异无统计学意义(P > 均0.05)。2) 围产期合并症比较：骨化三醇组机械通气时间(2.5 ± 0.5 vs 5.8 ± 0.8 d)及住院时间(49.50 ± 2.8 vs 56.00 ± 3.5 d)均低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。两组支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia， BPD)总体发生率(23.68% vs 35.14%)，差异无统计学意义(P > 0.05)，但骨化三醇组轻度BPD发生率显著高于对照组(88.89% vs 38.46%)，中度BPD发生率明显低于对照组(0% vs 46.15%)，差异均有统计学意义(P < 0.05)；骨化三醇组败血症发生率较对照组低(10.53% vs 32.43%)，差异有统计学意义(P < 0.05)；两组VLBWI无创通气时间以及新生儿呼吸窘迫综合征(Respiratory distress syndrome， RDS)、代谢性骨病(Metabolic bone disease， MBD)发生率比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。结论：1) VLBWI生后补充骨化三醇替代补充维生素D3对骨代谢的影响无明显差异。2) VLBWI补充骨化三醇可以缩短机械通气时间及住院时间，减轻BPD的严重程度，降低败血症的发生率。
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user: 1. 引言 早产儿为维生素D缺乏的高危人群，生后及时补充维生素D已成为早产儿的诊治共识。维生素D除了对极低出生体重儿(very low birth weight infants， VLBWI)骨代谢至关重要外，亦与早产儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome， RDS)、支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia， BPD)等合并症的发生具有相关性。维生素D摄入后在小肠吸收入血，继而经过肝脏及肾脏中酶的羟化作用转变为最终活性形式，即1，25-(OH) 2 D (骨化三醇)。有研究表明，骨化三醇在治疗早产儿代谢性骨病(metabolic bone disease， MBD)方面，可较好地改善其骨代谢指标及骨密度 [ 1 ] [ 2 ]，因此，活性维生素D或许可以成为早产儿更好的选择。本研究旨在通过骨化三醇与维生素D3在VLBWI中的对比研究，探讨骨化三醇对VLBWI骨代谢及早产儿合并症的影响。
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user: 2. 对象与方法 2.1. 研究对象 研究对象选自2019年1月~2019年10月期间青岛大学附属医院出生体重 < 1500 g、生后2小时内入住NICU，住院时间 ≥ 30天、住院资料完整的VLBWI，随机选取1名符合标准的VLBWI纳入骨化三醇组(n = 40)，随其后入院的第1名VLBWI纳入对照组(n = 40)。 排除标准：先天性遗传代谢病、消化道畸形、肝肾功能异常；患NEC等疾病需长时间禁食；母亲患有骨代谢性疾病、甲状腺和肝肾疾病、孕期长期应用激素类药物史、住院期间死亡或自动出院的VLBWI。骨化三醇组中1例因新生儿坏死性小肠结肠炎(Neonatal necrotizing enterocolitis， NEC)、1例因先天性巨结肠被剔除，对照组中2例因NEC、1例自动出院被剔除，共获得研究对象骨化三醇组38例，对照组37例。本研究获得青岛大学附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均获得家长知情同意并签署知情同意书。 2.2. 方法 所有研究对象均于生后24小时内及生后1月龄测定血清25-(OH)D、ALP、血磷、血钙水平。收集患儿住院期间全肠内营养(Total parenteral nutrition， TPN)持续时间、呼吸支持(机械通气、无创通气、吸氧)时间、咖啡因使用时间，MBD、RDS、BPD、败血症等发生情况，出生时及矫正胎龄(Corrected gestational age， CGA) 40周时测量身长、体重、头围体格发育指标。 干预方法：目前关于维生素D的补充形式及剂量尚未完全统一，临床上推荐早产儿应用维生素D3剂量为800~1000 IU/天 [ 3 ]。所有研究对象在其可耐受胃肠营养时每日均给予1粒维生素AD制剂(每粒含维生素A 1500 IU、维生素D 500 IU，山东达因海洋生物制药股份有限公司)；骨化三醇组每日加服骨化三醇0.125 ug (罗盖全，上海罗氏制药有限公司)，对照组每日加服维生素D3 400 IU (青岛双鲸药业股份有限公司)。
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user: 3. 相关疾病诊断标准 1) MBD：ALP > 900 IU/L且血P < 1.8 mmol/L [ 4 ]；或ALP > 500 IU/L且血P < 1.45 mmol/L [ 5 ]。2) RDS [ 6 ]：生后不久出现进行性加重的呼吸困难，同时有典型的X线胸片表现。3) BPD [ 7 ]：氧依赖(FiO 2 > 21%)超过28天的新生儿。根据矫正胎龄36周/生后56天或出院时需氧情况分为：轻度：未用氧；中度：FiO 2 < 30%；重度：FiO 2 ≥ 30%或需机械通气。4) 败血症 [ 8 ]：确诊败血症：具有临床表现并具备下列任意一条：① 血培养或无菌体腔培养出致病菌；② 如果血培养培养出机会致病菌，则必须于另次血，或无菌体腔内，或导管头培养出同种细菌。临床诊断败血症：具有临床表现且具备下列任意一条：① 非特异性检查非特异性检查 ≥ 2条(白细胞计数减少或增多)，白细胞分类未成熟中性粒细胞/中性粒细胞比率 ≥ 0.16，C反应蛋白升高，血清降钙素原 > 2.0 ug/L，血小板计数 ≤ 100 × 10 9 /L，微量血沉 ≥ 5 mm/h ≥ 2条；② 血标本病原菌抗原或DNA检测阳性。
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user: 4. 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件处理数据，计量资料先进行正态性检验，符合正态分布的用均数 ± 标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的用中位数M (P25， P75)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用构成比(%)描述，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。结果以P < 0.05差异有统计学意义。
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user: 5. 结果 5.1. 两组早产儿一般资料分析 骨化三醇组38例，胎龄26 + 4周~34周，其中胎龄 < 28周4例，28周~31 + 6周25例，≥32周9例；出生体重770 g~1499 g，其中<1000 g 7例，≥1000 g 31例。对照组早产儿37例，胎龄25 + 2周~33 + 3周，其中胎龄 < 28周5例，28周~31 + 6周28例，≥32周4例；出生体重580 g~1498 g，其中<1000 g 8例，≥1000 g 29例。两组早产儿胎龄、胎龄分组、出生体重、体重分组等一般资料比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。两组早产儿出生时及CGA40周体重、身长、头围指标比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)。两组早产儿出生时和生后1月龄骨代谢指标比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)，见表1。 Table 1 Comparison of physical development indexes and bone metabolism indexes between two groups of premature infant 例数(n) 骨化三醇组 38 对照组 37 t/χ 2 P 出生 体重(g) 1253 ± 222 1202 ± 249 −0.928 0.357 身长(cm) 37.5 ± 3.1 36.6 ± 3.4 −1.164 0.248 头围(cm) 27.4 ± 2.6 26.7 ± 2.4 −1.299 0.198 CGA40周 体重(g) 2821 ± 41.1 2910 ± 4.12 0.939 0.351 身长(cm) 48 ± 4.9 48 ± 5.1 −0.455 0.649 头围(cm) 33 ± 5.3 33 ± 4.7 −0.250 0.802 25-(OH)D水平(ng/mL) 出生 9.94 ± 1.53 10.28 ± 1.36 −0.779 0.436 1月龄 12.24 ± 4.72 12.80 ± 4.77 0.511 0.611 血钙(mmol/L) 出生 1.98 ± 0.57 1.96 ± 0.52 −0.032 0.975 1月龄 2.36 ± 0.75 2.30 ± 0.62 −1.920 0.055 血磷(mmol/L) 出生 1.86 ± 0.30 1.83 ± 0.41 −0.414 0.680 1月龄 1.72 ± 0.51 1.84 ± 0.86 1.220 0.227 ALP(U/L) 出生 187.03 ± 58.15 178.24 ± 51.56 −0.691 0.491 1月龄 350.00 ± 56.49 330.00 ± 55.68 −0.085 0.932 表1. 两组早产儿体格发育指标及骨代谢指标比较 注：SGA：小于胎龄儿(small for gestational age)。 5.2. 住院期间喂养及合并症比较 两组VLBWI住院期间TPN持续时间；喂养方式、钙磷摄入量；维生素 D添加时间比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。骨化三醇组机械通气时间、住院时间较对照组VLBWI短(P < 0.05)，败血症发生率明显低于对照组VLBWI (P < 0.05)；两组BPD发生率无明显差异(P > 0.05)，但骨化三醇组VLBWI轻度BPD发生率明显高于对照组，中度BPD发生率明显低于对照组(P < 0.05)。两组VLBWI住院期间无创通气时间、MBD、RDS差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表2。 Table 2 Comparison of feeding and complications of VLBWI during hospitalization between two group 倒数(n) 骨化三醇组 38 对照组 37 t/χ 2 /Z P TPN持续时间(d) 10.00 (7.00， 10.25) 10.00 (8.00， 11.00) −0.086 0.931 喂养方式 0.622* 母乳(n， %) 15 (39.47) 15 (40.54) 母乳 + 强化剂(n， %) 17 (44.74) 19 (51.35) VLBWI配方奶(n， %) 6 (15.79) 3 (8.11) 钙摄入量(mg/kg/d) 121.60 ± 12.76 116.20 ± 13.65 −0.646 0.518 磷摄入量(mg/kg/d) 65.93 ± 9.3 63.00 ± 8.55 −0.572 0.567 开始添加维生素D制剂时间(d) 10.26 ± 3.76 10.65 ± 5.20 −1.242 0.214 咖啡因时间(d) 20.00 ± 5.64 28.00 ± 6.57 −1.242 0.214 RDS (n， %) 33 (86.84) 35 (94.59) 0.430* BPD (n， %) 9 (23.68) 13 (35.14) 1.186 0.276 BPD分度 0.019* 轻度(n， %) 8 (88.89) 5 (38.46) 中度(n， %) 0 (0.00) 6 (46.15) 重度(n， %) 1 (11.11) 2 (15.38) 机械通气时间(d) 2.5 ± 0.5 5.8 ± 0.8 −2.268 0.023 无创通气时间(d) 9.5 ± 2.1 10 ± 2.6 −0.934 0.350 MBD (n， %) 5 (13.16) 8 (21.62) 0.937 0.333 败血症(n， %) 4 (10.53) 12 (32.43) 5.361 0.021 住院时间(d) 49.50 ± 2.8 56.00 ± 3.5 −2.286 0.022 表2. 两组VLBWI住院期间喂养及合并症比较 注：*为Fisher精确检验所得P值；钙磷摄入量是指达到完全肠内喂养时的量；RDS为呼吸窘迫综合征；BPD为支气管肺发育不良；MBD为代谢性骨病。
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user: 6. 讨论 随着围产医学的进步和VLBWI救治水平的提高，极低及超低出生体重儿存活率逐年增高，随之而来的MBD、BPD等并发症发生率也日益增多。既往研究表明，维生素D作为钙磷代谢的调节因子，在VLBWI骨骼健康中发挥重要作用。随着对维生素D与VLBWI健康的研究逐渐深入，人们发现1，25-(OH) 2 D尚有促进胎肺及新生肺发育和成熟，调节免疫细胞生长、分化及抑制炎症因子活化等多种作用，与VLBWI常见疾病如 RDS、BPD、败血症等密切相关。研究发现骨化三醇应用于VLBWI MBD治疗在改善骨代谢指标及骨密度方面有较好的疗效，且未增加高血钙、高血磷、高尿钙等副作用 [ 2 ]，因此骨化三醇作为维生素D的活性制剂，进入体内后无需代谢可直接发挥作用，对于脏器功能不成熟、酶活性低下的VLBWI不失为一种更好的选择。 本研究中两组早产儿临床资料匹配，结果提示提示骨化三醇联合维生素D对于早产儿血清骨代谢指标以及体格发育的影响与900 IU维生素D的作用相当，MBD发生率差异亦无统计学意义。表明VLBWI生后补充骨化三醇替代补充维生素 D3对骨代谢的影响无明显差异，维生素D对钙磷代谢的调节以及成骨作用的发挥均是通过其最终活性形式1，25-(OH) 2 D完成的。 1，25(OH) 2 D 可以与形成 PS 的Ⅱ型肺泡上皮细胞中的VDR结合，从而促进PS相关磷脂的合成以及 PS 的分泌 [ 9 ]。研究发现，孕期补充维生素D改善新生儿维生素D营养状况可降低RDS发生率 [ 10 ]。邱杰等人 [ 11 ] 的研究发现，1，25-(OH) 2 D还可通过促进肺发育、降低气道敏感性及抑制炎症因子活化等多个途径降低BPD发生。1，25-(OH) 2 D可通过炎症细胞因子间接调节BPD的发病，如Chen等 [ 12 ] 用1，25-(OH) 2 D处理高氧暴露的动物发现，该动物炎症细胞因子和肿瘤坏死因子-α的表达显著下调，高氧诱导后的肺损伤明显减轻。本研究中骨化三醇组BPD严重程度明显降低，既往研究一致 [ 13 ]。研究还发现维生素D能减少与氧气有关的肺部炎症以及缩短早产儿呼吸机使用时间等 [ 14 ]，缩短有创通气时间、降低呼吸机相关感染风险，缩短住院时间、降低医院内感染风险。本研究表明，极低出生体重儿生后补充骨化三醇较维生素D3可明显减轻BPD严重程度、缩短机械通气时间及住院时间，此与已有研究相一致。 既往研究发现，出生时维生素D缺乏的新生儿，其发生败血症发生率增加，母亲妊娠期和新生儿期补充维生素D可降低败血症发生率 [ 15 ] [ 16 ]。印度Dhandai R [ 17 ] 等人一项前瞻性观察性研究发现缺乏维生素D的新生儿比维生素D水平充足的新生儿有更大的风险发生败血症。本研究中骨化三醇组败血症的发生率低于对照组。其可能机制是维生素D诱导释放抗菌肽，诱导调节性T细胞的分化改善免疫力，减少与氧气有关的肺部炎症有关 [ 14 ]。而这种诱导是通过其最终活性形式1，25-(OH) 2 D (骨化三醇)与不同组织及器官中相应的VDR结合来发挥的。
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user: 7. 结论 本研究结果表明，VLBWI生后补充骨化三醇替代补充维生素D3对骨代谢的影响无明显差异，补充骨化三醇可以缩短机械通气时间及住院时间，减轻BPD的严重程度，降低败血症的发生率。但本研究样本量较少，观察时间相对短，对于骨化三醇发挥作用的具体生物学机制尚未明确，未来需要进行更大样本、远期临床对照研究，以进一步评价骨化三醇在VLBWI中的应用疗效。
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user: 摘要 本文概述了近年来生产高碳醇的方法及发展趋势，主要综述了通过密度泛函理论对钴基催化剂界面在费托反应条件下制备高碳醇的最新研究进展，及钴基催化剂结构敏感性对产物分布的影响。最后对钴基催化剂制高级醇的主要挑战提出了展望和建议。
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user: 1. 引言 费托合成(Fischer-Tropsh Synthesis)是一种将合成气(由煤，天然气或生物质产生的一氧化碳和氢气的混合物)转换成有价值的液体燃料和化学品的一种重要方法，但通过费托合成制高级醇是非均相催化中最复杂的系统，因为其催化表面上有很多基元反应，并且它们彼此互连，这些基元反应的活化过程会随催化剂的改变而发生变化，从而对所需产物的分配有着不同程度的影响 [ 1 ] [ 2 ]。 常用的制备碳二含氧化合物费托合成催化剂有Rh基和Co基催化剂，铑基催化剂虽有较好的CO吸附和解离能力，但其昂贵的价格不适应于大规模的工业应用；而钴基催化剂相对于Rh价格较为便宜，可大量应用于工业生产中，且具有较好的反应活性和选择性，特别是Co 2 C基催化剂具有类贵金属特性，虽然Co 2 C的形成是催化剂失活的标志，但它在直接转化成含氧化合物和低烯烃方面具有良好的活性和选择性，在高醇合成反应中广泛运用而备受人们关注 [ 3 ]。因此本文综述了在基本理论指导下，合理设计出费托反应条件下通过Co 2 C基催化剂制备高碳醇的最新研究进展，以及在理论指导下，对Co 2 C基催化剂制高碳醇的主要挑战提出了展望和建议。
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user: 2. 费托合成制高碳醇原理 高碳醇(High Alcohols Synthesis)指含有6个碳原子以上一元醇的混合物。它是重要的精细化工原料，常用作增塑剂、洗涤剂、表面活性剂等多种精细化学品，如用高碳醇作原料可生产高碳α-烯烃，从而缓解我国润滑油基础油供应的紧张局面 [ 4 ]。在过去，运用最多的是通过羰基合成法来制备高碳醇，即在催化剂作用下，烯烃、一氧化碳和氢气反应生成比原烯烃多一个碳原子的醛，然后醛经过氢化反应生成醇的过程，反应通式如(1)~(2)：式中R表示烷基 [ 5 ]，其产能也相对较高。 RCH = CH 2 + CO + H 2 → RCH 2 CH 2 CHO 或 RCH ( CH 3 ) CHO (1) RCH 2 CH 2 CHO 或 RCH ( CH 3 ) CHO → H 2 RCH 2 CH 2 CH 2 OH 或 RCH ( CH 3 ) CH 2 OH (2) 对于钴基催化剂体系，高碳醇反应中涉及的碳链增长依照F-T合成反应机理进行，研究者提出的醇生长机理模型图如图1所示。主要的高碳醇的合成方法有以下几种：传统上通过多步铝醇工艺生产 [ 7 ]，此方法操作过程繁琐，步骤复杂，副产物较多；接着研究人员又发现了均相催化用于氢甲酰化反应 [ 8 ]，产物难以分离一直是此方案最大的困扰；另一种方法是把多相催化剂用于氢甲酰化反应，然后经由费托合成反应加氢制备高碳醇，制备的产物中不仅含有高碳醇，还有其他不易分离的副产物生成 [ 9 ]。近期，丁云杰团队发现了一种新型的制成高碳醇的方法，通过碳材料负载的新型钴-碳化钴基催化剂，在大型浆态床反应器中完成了世界首例合成气一步制高碳醇联产液体燃料的万吨级工业试验，合成气的总转化率大于84%，甲烷选择性低于6%，醇/醛总选择性高于42% [ 4 ]。此发现为合成气中氧元素的高值催化利用提供了新的发展方向。 图1. CO在催化剂上加氢合成高碳醇的机理模型图 [ 6 ]
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user: 3. 碳化钴基催化体系费托合成高碳醇 3.1. 密度泛函理论对碳化钴基体相结构及表面稳定性研究 赵永慧 [ 10 ] 等人通过计算软件得到了如图2所示的Co 2 C结构，可以看出Co 2 C是正斜方晶结构，Co原子和C原子是等价的，且可以看出Co 2 C中Co原子的堆积方式是ABAB…型，计算得到的的Co-C键长为1.91 Å，Co-Co键键长为2.62 Å，比hcp Co的Co-Co键长长0.13 Å。因此，Co 2 C可看作是C渗入hcp Co的间隙所形成的化合物。 图2. (A) 体相的单胞结构示意图；(B) 从001的方向看体相Co 2 C的堆积方式 [ 10 ]；灰色和蓝色球分别代表碳、钴原子 为进一步解释Co 2 C中Co原子与C原子的作用，又对Co 2 C的投影态密度进行了分析，从图3(A)，图3(B)中看出在Fermi能级处没有带隙，说明了Co 2 C是有金属性的。图3(C)中可以得到Co 2 C投影态密度可以分为三个区域：稍低的价带(−14至−11 eV)，稍高的价带(−7.5至Fermi能级)以及Fermi能级以上未占据导带，同时这三个部分的上下能带基本是对称的，说明体相Co 2 C是基本没有磁性的。同时他们还计算了体相Co 2 C的差分电荷密度，得到Co原子与C原子之间有着很明显的共价键。Co 2 C的成键作用与文献报道 [ 11 ] 的η-Fe 2 C的成键方式类似，兼有金属性，共价性和离子性的特点。 图3. Co 2 C的投影态密度：(A) Co 的总态密度和(PDOSs)；(B) C 的总态密度和(PDOSs)；(C) Co 2 C的总态密度 [ 10 ]；虚线代表费米能级 该课题小组同时对Co 2 C七个低指数面(100)， (001)， (010)，(101)， (011)， (110)和(111)的表面能及钴原子的微分吸附热进行了计算，可以得出，在这个七个表面的表面稳定性顺序为(101) > (011) >(010) > (110) > (100) > (001) = (111)。并且此结果与等人 [ 12 ] 描述的Fe基催化剂大致相同。根据进一步对非化学计量比表面稳定性的分析发现，非化学计量比表面很可能比相应的化学计量比表面要稳定的多。 3.2. 钴/碳化钴界面对高碳醇合成的影响 刘等人 [ 3 ] 通过密度泛函理论提出形成Co和Co 2 C界面是生成高碳α-醇的关键。Co 2 C可以提供非解离吸附的CO分子，金属Co用来解离CO和生成长链烃类，在Co 2 C和Co界面形成的双中心可以为合成含氧化物提供活性位。根据Volkova [ 13 ] 等人的研究，对高醇的选择性与Co 2 C的量有关。醇的形成应在两个活性位点的界面处，其中一个使CO与H原子的存在解离以生成烷基链(CnH2n*)，另一个使CO缔合吸附CO并促进其插入烷基链以形成醇。作为一种过渡金属碳化物，Co 2 C具有类贵金属性质，并能结合吸附CO分子。赵等人 [ 14 ] [ 15 ] 发现醇的形成可以发生在金属Co和Co 2 C相的界面上，但在含有一定Mn助剂下，可在一定程度上促进CO在催化剂表面的解离和歧化，阻止了H 2 的吸附，形成了相对富碳贫氢的表面化学环境，对醇类的选择性(−20%)不太高。它的值低于Subramanian等人 [ 16 ] [ 17 ] 研究的以CuCo双金属纳米催化剂，在300℃，P = 2 MPa，H 2 /CO = 2的反应条件下，双金属纳米催化剂表现出更高的C 2+ 醇选择性(35.2%)。但是这些都未对的钴和碳化钴的具体晶面进行深层次的探究，对于其更深层次的机理尚不清楚，需要进一步探究。 3.3. 碳化钴不同晶面对高碳醇合成的影响 一直以来人们都对碳化钴的不同晶面进行探究，但以钴中断形式存在的Co 2 C晶面对FTS反应中C 2 物种选择性的影响尚不清楚。张等人 [ 18 ] 最新的研究中总结了费托合成中C 2 物种对Co 2 C催化剂晶面的依赖性研究，如图4所示，为了获得高选择性的C 2 含氧化合物，应暴露更多(011)和(111)晶面，当CO插入形成C 2 含氧化合物更有利时，C 2 HxO的C-O键断裂形成C 2 Hx可能比其氢化成高级醇更易发生，这将会改变产物的选择性，并且给出的解释是C 2 氧化物在(011)和(111)晶面上的高选择性归因于其表面d价带中心的态密度升高，可以与反键轨道相互作用以减少排斥，使暴露出密度更高的B 5 型活性单元，有利于CO插入CHx中；已有工作者发现Co 2 C纳米颗粒(101)和(020)独特形貌可能是造成选择性的原因。CO可以游离在Co 2 C (020)台阶面上。在较高的反应压力下，随着钴金属的出现，Co 2 C形貌由纳米颗粒转变为纳米球，氧合物的选择性增加，较低的烯烃产生 [ 19 ]。 图4. Co 2 C不同晶面上C 2 氢化物和C 2 氧化物形成的有效势图 [ 18 ]
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user: 4. 结语 钴基催化剂一直以来都被广泛应用于大型工业生产当中，它是作为成产长链碳氢化合物较为理想的催化剂，碳化钴基催化剂用于高醇合成、长链烯烃的制备等仍然一直是大家所关注的重点。因此，能够根据理论设计出更高效合理的碳化钴基催化剂，用于制备选择性更高、产率更大的费托产物仍需进一步探究。目前对碳化钴基催化剂用于高碳醇的机理尚未有一个明确的机理，能够通过理论指导产物合成，是研究者需要探讨的内容。为积极扩大高醇品种，并能实现环境友好型目标将一直是我们面临的一个重要课题。
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user: 摘要 目的：探讨海藻糖在动脉内皮细胞冻存过程中的保护作用。方法：通过在传统细胞冻存液中添加一定浓度的海藻糖对人主动脉内皮细胞进行液氮深低温冻存，根据cck-8结果将冻存液分为对照组(A组)，50 mmol∙L −1 海藻糖组(B组)以及100 mmol∙L −1 海藻糖组(C组)，运用台盼蓝染色法观察复苏后细胞的存活率，免疫印迹检测自噬标志性蛋白LC3B，Beclin-1、P62的表达情况，以及CCK-8检测细胞复苏后的增殖活性。结果：人主动脉内皮细胞经6个月液氮冻存后，细胞计数结果显示与A、C组相比较，B组活细胞比例明显增多(F = 7.50， P < 0.05)；免疫印迹结果表明与A、C组相比，B组自噬标志性蛋白LC3B，beclin-1表达水平明显上升(F LC3B = 36.88， F beclin-1 = 135.6， P < 0.05)，P62表达较对照组下降(F = 163.1， P< 0.05)。复苏后细胞增殖活性显示随时间的增加，细胞增值率逐步升高且B组增殖率较A、C组高(F 24 h = 14.14， F 48 h = 19.95， P < 0.05)。结论：低浓度海藻糖可在一定程度上有效提升冻存后细胞的活性，这种作用可能是通过促进自噬的发生而实现的。
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user: 1. 前言 同种瓣移植广泛应用于瓣膜病和先心病的外科治疗，但移植后的衰败钙化是影响其使用效果的主要原因。研究发现，移植前冻存过程中细胞活性的变化是影响移植后耐久性的因素之一 [ 1 ]。因此，如何提升冻存过程中组织细胞的活力是一个不可忽视的问题。二甲基亚砜(DMSO)是最常用于组织细胞冻存的渗透性冷冻保护剂，但其细胞毒性在冻存过程中会对细胞造成一定的影响 [ 2 ]。课题组前期研究发现，在冷冻保护剂中添加一定浓度的海藻糖有助于提升冻存后组织细胞的活性；此外，我们还通过在纳米颗粒的介导下将海藻糖导入细胞内，进一步提升冻存后细胞的活性 [ 3 ]，但其具体机制仍然不清。有研究表明，海藻糖是一种自噬激活剂 [ 4 ]。因此，验证自噬海藻糖是否通过自噬途径在冻存过程中发挥一定的作用是本次实验的主要目的。
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user: 2. 材料和方法 2.1. 材料 细胞 人主动脉内皮细胞(HAECs)来源于青岛大学转化医学院。 试剂F12培养基购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；胎牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自北京金克隆公司；胰蛋白酶购于大连美伦生物技术公司；海藻糖，RIPA蛋白裂解液购于北京Solarbio公司；LC 3B Antibody，Beclin-1Antibody；β-Actin Rabbit mAb购于美国Cell Signaling Technology公司；P62 Antibody购于AbMole奥默生物技术(上海)有限公司；Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody购自上海爱必信生物公司；PageRuler™ Prestained Protein Ladder购于美国Thermo Scientific公司。 2.2. 实验方法 2.2.1. 细胞培养 将人主动脉内皮细胞(HAECs)置于含0.1胎牛血清的F12培养基中，于37℃、0.05 CO 2 培养箱中培养，期间在显微镜下观察细胞生长状态并进行换液，当细胞密度涨至80%~90%时进行传代和下一步实验。 2.2.2. CCK-8检测不同浓度海藻糖对细胞活力的影响 取对数生长期的主动脉内皮细胞，以适宜密度接种于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、0.05 CO 2 培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，每孔加入100 μl含有不同浓度海藻糖的F12培养基继续培养，24 h后吸出培养基，并用PBS清洗三次，每孔加入100 μl新鲜的F12培养基及10 μl CCK-8溶液，于37℃、0.05 CO 2 培养箱中继续培养1 h后，用酶标仪检测波长为450 nm处的吸光度，并计算细胞存活率(细胞存活率(%) = ((实验组OD值 − 空白组OD值)/(正常组OD值 − 空白组OD值)) × 100%)。 2.2.3. 细胞冻存 称取一定量的海藻糖溶于胎牛血清中，分别配置不同浓度的含海藻糖的血清冻存液，并用0.22 μm的滤器于超净台滤过。将消化后的细胞接种在六孔板，待细胞长满至六孔板面积的90%以上时，进行细胞冻存，冻存体系控制在1 × 10 6 个/ml。冻存方案根据CCK-8结果分为三组：① control组(A组)：FBS + 0.1 DMSO；② 50 mmol/L Tre组(B组)：FBS + 0.1 DMSO + 50 mmol/L Tre；③ 100 mmol/L Tre组(C组)：FBS + 0.1 DMSO + 100 mmol/L Tre。先将细胞放入程序性降温盒中放入−80℃冰箱保存24 h，随后转移至液氮中深低温冻存，经6个月冻存后取出细胞进行下一步检测。 2.2.4. 细胞复温后台盼蓝染色计数 将冻存后的细胞从液氮罐中取出，于37℃水浴锅中快速复苏，将冻存管中的细胞悬液转移至1.5 ml EP管中，1000 r离心5 min，弃上清，加入含有0.1胎牛血清的F12培养基重悬细胞，做成细胞悬液。取细胞悬液与0.004台盼蓝溶液按9:1混合后，取10 μl加入细胞计数板，进行显微镜下细胞计数。活细胞率(%) = 活细胞总数/(活细胞总数 + 死细胞总数) × 100 %。 2.2.5. 蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白的表达 细胞复苏后，将冻存管中的细胞悬液转移至1.5 ml EP管中，1000 r离心5 min，弃上清，每管加入100 μl细胞裂解液置于冰上30 min，4℃，12000 r离心30 min，取上清，加入蛋白上样缓冲液，于金属浴上98℃煮沸10 min使其变性。继续进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗(LC3B， Beclin-1， β-actin) 4℃孵育过夜，相应二抗37℃孵育2 h，随后进行化学发光成像检测。 2.2.6. 冻存后的细胞增殖检测 细胞复苏后，离心，用含有0.1胎牛血清的F12培养基重悬细胞，每孔加入100 μl细胞悬液，放入37℃、0.05 CO 2 培养箱中分别培养12 h、24 h、48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，放入培养箱中继续培养1 h，检测OD 450 nm处的吸光度。计算每组不同时间段与12 h相比，细胞数的比例作为细胞增殖率。 2.3. 统计学分析 运用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多组在不同时间点的比较采用析因设计的方差分析，结果以 x ¯ ± s表示，P < 0.05具有统计学意义。
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user: 3. 结果分析 3.1. 不同浓度海藻糖处理细胞后细胞活性 细胞经不同浓度海藻糖处理24 h后结果显示(见图1)，随海藻糖浓度的升高，细胞活力逐渐降低，细胞活力依次为(97.98 ± 2.21)%、(94.42 ± 2.42)%、(79.66 ± 4.58)%、(54.47 ± 4.78)%、(2.66 ± 2.74)%；其中50 mmol/L海藻糖和100 mmol/L海藻糖组相比较，P > 0.05，两组间无明显差异。因此，我们将以50 mmol/L和100 mmol/L 海藻糖浓度分别作为实验组。 图1. 不同浓度海藻糖处理后细胞活力(*P < 0.05，**P < 0.01) 3.2. 台盼蓝染色后计数 复苏后细胞计数结果显示(见图2) A、B、C三组的活细胞数占总细胞数的百分比分别为(92.90 ± 2.28)%、(96.75 ± 1.38)%、(92.49 ± 2.48)%，B组与A组及C组相比较，差异有显著性(F = 7.50， P < 0.05)。 图2. 细胞复苏后台盼蓝染色活细胞比例(*P < 0.05，**P < 0.01) 3.3. 自噬相关蛋白的表达 免疫印迹结果显示(见图3)，与对照组(A组)相比，B组及C组LC3II/I比值的相对表达量依次为 1.14 ± 0.01，1.05 ± 0.03，B组LC3B蛋白的表达量与A组及C组相比，差异有统计学意义(F = 36.88， P < 0.05)；P62蛋白的相对表达量为0.86 ± 0.05，1.24 ± 0.02，差异有统计学意义(F = 163.1， P < 0.05)；Beclin-1蛋白的相对表达量为1.08 ± 0.04，0.72 ± 0.05，差异有统计学意义(F = 135.6， P < 0.05)。结果表明细胞自噬的激活在此过程中发挥着一定的作用，且细胞自噬水平在50 mmol/L海藻糖组(B组)更为明显。 图3. 细胞自噬相关蛋白的表达((a) 蛋白印迹图；(b) LC3II/I相对表达量；(c) Beclin-1蛋白相对表达量；(d) P62蛋白相对表达量) 3.4. 复苏后细胞功能评估 通过cck-8结果计算不同实验组不同时间段的细胞增殖率(见图4)，单因素方差分析结果显示细胞培养后24、48 h细胞增值率逐步升高且B组增殖率较A、C组明显升高，差异有统计学意义(F 24 h = 14.14， F 48 h = 19.95， P < 0.05)。析因设计的方差结果显示(F 组别 = 33.42， F 时间 = 2973， F 时间 * 组别 = 9.799， P < 0.05)，表明不同冻存液浓度、培养时间以及其交互作用均对细胞增殖有一定的影响(见表1)。 Table 1 The comparison of cell proliferation in different time point 组别 24 h 48 h A 130.62 ± 2.86 234.40 ± 5.61 B 145.89 ± 6.31 251.89 ± 7.20 C 129.30 ± 2.46 224.99 ± 0.93 表1. 各组细胞个时间点细胞增殖率比较(%) 图4. 细胞复苏后增殖率
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user: 4. 讨论 细胞自噬是一种自发降解胞内受损细胞器及错误折叠蛋白质的溶酶体降解途径 [ 5 ]。通过自噬，细胞可以将降解后所获得的氨基酸和能量再次代谢利用，从而保证了内环境的稳态。在正常生理条件下，自噬维持在一种较低的水平，且这种低水平的自噬是细胞生存所必需的 [ 6 ]。除此之外，当细胞受到一定信号的刺激时，如营养缺乏、缺氧、氧化应激等，将促进细胞自噬的发生，回收能量，从而在不利条件下维持细胞活力 [ 7 ] [ 8 ]。根据物质进入囊泡的机制，细胞自噬大致可以分为三大类，即巨自噬 [ 9 ]，微自噬 [ 10 ] 及分子伴侣介导的自噬 [ 11 ]。 自噬标志性蛋白–微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associatedprotein1 lightchain 3， LC3)是一种参与自噬体成熟的受体蛋白 [ 12 ]，它有LC3 I和LC3 II两种形式，其数量与自噬体形成的程度相关；SQSTM 1/p62是一种参与蛋白质聚集和连接多泛素化靶点的受体，两者都是自噬的标志基因。在动脉粥样硬化斑块与自噬的相关研究中发现，斑块早期的特点是高水平的LC3与SQSTM 1/p62共定位，表明早期自噬的发生以应对早期斑块的应激反应。而晚期病变的特征是LC3和SQSTM 1解离，表明该晚期中存在广泛的自噬功能障碍 [ 13 ]。Beclin-1又称BECN1，它不仅是自噬过程的另一个重要基因，在细胞凋亡中也发挥着一定的作用 [ 14 ]。现今的研究发现，自噬不仅存在于人体正常的生理代谢过程，它在疾病的发生发展中也扮演着重要的角色。人类的衰老 [ 15 ] 以及许多疾病，包括癌症 [ 16 ]、心血管疾病 [ 9 ]、神经退行性疾病 [ 17 ] 和免疫紊乱 [ 18 ] 等，都与细胞自噬具有相关性 [ 19 ]。 海藻糖是一种天然的非还原性二糖，广泛存在于如酵母、细菌、昆虫等低等生物中 [ 20 ]。当细胞暴露于如寒冷、炎热、干燥、氧化等环境变化时，海藻糖能作为一种典型的应激代谢物，以保护机体抵抗外部环境压力 [ 21 ] [ 22 ]。海藻糖是一种出色的生物保护剂，其特殊的结构和性质能够替代水分子中的氢键，稳定脂质、蛋白、病毒、血细胞，提高真核细胞应对失水环境的能力 [ 23 ]。有研究表明，低浓度细胞内海藻糖的引入可以大大提高冷冻保存过程中哺乳动物细胞的存活率 [ 24 ]。因其拥有无毒、高效的特点，海藻糖作为一种非渗透性冷冻保护剂被用于各种细胞、组织器官的冷冻保存 [ 25 ]。在细胞自噬方面，海藻糖是一种不依赖于雷帕霉素靶蛋白受体(mTOR)的自噬激活剂，如在神经系统疾病中，它可以通过促进自噬，从而加速亨廷顿疾病相关蛋白的清除，从而达到一定的治疗效果 [ 26 ]。在心血管系统中，有研究者发现海藻糖也能通过激活自噬减缓心肌梗死所致的心脏重塑以及心功能紊乱 [ 27 ]。综上所述，海藻糖介导的细胞自噬在许多疾病中都发挥着一定的作用。
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user: 5. 结论 本次研究，我们通过在传统DMSO冻存方案的基础上添加一定浓度海藻糖拟进一步提升经低温冻存后细胞的活性，研究结果显示低浓度海藻糖的存在一定程度上促进了细胞自噬的发生，且与对照组相比，海藻糖能对细胞发挥一定的保护作用。本次实验我们旨在初步探索海藻糖的低温保护作用与细胞自噬的相关性，有望为将来组织细胞冻存提供新靶点和新的思路。
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user: 摘要 畸形舌侧沟(Palatogingival Groove， PGG)是常见的牙齿发育畸形，多发于上颌侧切牙。PGG能破坏龈沟底封闭的完整性，引起牙周组织破坏，至晚期常伴发严重的牙周牙髓联合病变，使得临床治疗难度增加。目前对复杂PGG的治疗以多学科综合治疗为主，但具体诊疗方案各异且缺乏长期跟踪随访。本文基于现有的病例报道，对PGG治疗的研究进展进行总结，重点关注体内或体外联合治疗的疗效分析，探讨可能出现的术后并发症，为临床诊疗方案设计提供参考。
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user: 1. 引言 畸形舌侧沟(palatogingival groove， PGG)又称为发育性根异常、腭侧沟或根面沟，流行病学调查研究显示，其发生率约为2.8%~18% [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]，由Lee等 [ 4 ] 在1968年正式命名。目前认为，PGG是一种牙根发育的解剖异常，是由内釉上皮和Hertwig上皮根鞘的折叠导致的 [ 5 ]，常发生于上颌切牙的舌面，尤以上颌侧切牙最为多见 [ 6 ]。PGG通常起始于舌侧窝或舌隆突，并向根方延伸至不同距离与深度，导致该凹陷区域的结合上皮难以严密附着，造成菌斑的滞留与定植，并随着沟槽向根方延伸。这些因素使患牙难以自洁，引起局部区域的牙周组织破坏、形成窄而深的局限性牙周袋 [ 4 ]。同时由于裂沟部分牙体组织薄弱，袋内细菌可通过根尖孔、根管侧支或牙本质小管等途径感染牙髓从而引起牙髓病变 [ 7 ]，最终发展为牙周–牙髓联合病变 [ 8 ]。患者多因上前牙出现不明原因的瘘管或者咬合不适、牙齿伸长等症状就诊。因其病损的隐蔽性，多数患牙在就诊时已出现严重的根尖周或牙槽骨吸收，临床预后较差，严重者需拔除，故为临床多学科的综合治疗带来挑战。
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user: 2. PGG分类 学者们依据PGG位置 [ 9 ]、内陷深度 [ 10 ]、延伸长度等不同因素提出多种分类方法，迄今无法统一。Gu等 [ 11 ] 根据畸形沟的延伸长度、深度以及对应根管系统的复杂程度，通过运用微计算机断层扫描(micro-CT)将PGG分为3类：I型：畸形沟延伸不超过牙根面的颈1/3；II型：畸形沟延伸超过牙根面的颈1/3，但沟裂较浅，根管基本正常；III型：畸形沟延伸超过牙根面的颈1/3，且沟裂较深，对应相对复杂的根管系统。临床上常依据此分类方法制定治疗策略。
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user: 4. 小结 综上，根据目前已有的临床证据，PGG患牙的治疗方法尚无统一标准，尤其是对II型及以上的PGG患牙并且存在严重牙周组织破坏时，主张在对症治疗的基础上联合采用牙周手术治疗(翻瓣术、引导组织再生术、植骨术)以及意向性牙再植术等多学科综合治疗，可获得较好的临床预后。同时术后需进行定期随访和牙周维护治疗，及时发现并解决牙体变色、牙龈退缩、牙根吸收等并发症状，以利于患牙的长期留存。因现有的多数报告观察时间较短，且缺乏两类联合治疗的疗效对比分析。因此需要更多的长期随访研究来进一步确定联合治疗的长期稳定性，并亟需高质量的随机对照临床研究验证不同治疗方案的有效性。
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user: 摘要 中国共产党人历来重视青年一代的责任教育问题，特别是党的十八大以来，更是把青年一代的责任教育提到了一个新的高度。习近平同志在多次会议的讲话内容中针对青年的身心发展特点提出了一系列的关于青年责任的表述，形成了习近平新时代青年责任观。习近平新时代青年责任观是对马克思主义青年观、责任观以及中华民族自古以来的责任意识的继承和发展，是立足于新时代中国特色社会主义时代特点以及当代青年责任担当现状提出的关于青年责任的科学阐述。
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user: 1. 引言 青年一代的社会责任感问题历来受到党和国家的高度重视，青年一代是推动社会进步的重要力量，他们是否有理想、有担当，直接关系到国家和民族的希望和未来。从党的十八大以来，习总书记在讨论青年发展和培育问题时就多次提到“责任”“使命”“担当”这些关键词。党的十九大，更是提到“青年一代有理想、有本领、有担当，国家就有前途，民族就有希望。”“中华民族伟大复兴的中国梦终将在一代代青年的接力奋斗中变为现实。” [ 1 ] 习近平同志先后在多次的青年座谈会和回信中都对新时代青年能够勇担时代赋予的责任提出了殷切期望。习近平新时代青年责任观的形成是历史与现实、理论与实践相结合的产物，探究习近平新时代青年责任观的现实价值对于深刻领会新时代青年责任的丰富内涵具有重要意义。与此同时，根据马克思主义哲学中实践和认识的辩证关系原理，研究习近平新时代青年责任观的现实价值也将有助于为青年责任教育提供新的实践思路和教育路径。