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user: 3. 生物信息学分析解析 3.1. 基因组评估 对初步组装得到的基因组序列进行质量评估，目的如下：① 判断基因组是否存在污染。一些杂菌的污染在进行测序前质检时可能无法检测出来，比如一些亲缘关系较近的杂菌的污染，或占比较低的轻度污染等，会对基因组的精确组装和后续分析造成干扰，因此需进行评估，以保证结果的准确性。② 评估测序质量③ 评估基因组情况。 通过GC_depth分布图可以看出测序是否有明显的GC偏向，也可以判断是否存在污染等情况。一般情况下，相对于中等GC含量区域来说，高GC含量区域或者低GC含量区域的测序深度都比较低。通过GC_depth分布图可以看出测序是否有明显的GC偏向，也可以判断是否存在污染等情况 [ 17 ]。一般情况下，相对于中等GC含量区域来说，高GC含量区域或者低GC含量区域的测序深度都比较低；利用PE测序reads，选取中间高质量测序区域，逐碱基取某一长度为K-mer进行基因组大小评估。以统计各17-mer深度和各个深度的频数所占比例为例，计算作图获得深度–频率分布图 [ 18 ]。该分析可对真核类基因组进行杂合度、基因组大小评估。 3.2. 基因组组装与预测 利用质控后的符合要求的clean data进行从头组装得到基因组序(scaffold)，对组装序列进行基因预测 [ 19 ]，得到每个样本的基因信息。 3.2.1. 基因组组装 利用短序列组装软件对优化序列进行多个K-mer参数的拼接，得到最优的组装结果，相关结果参数见表1。 Table 1 Results parameters for genome assembl 类型Category 属性Property No. of all scaffolds 组装后得到的基因组片段，完成图组装结果为全基因组，所以数目为1，扫描图组装到 scaffold水平，此数目即为scaffold数目 Bases in all scaffolds 组装用列的总长，完成图即为基因组大小，扫描图为所有scaffold全长 No. of large scaffbrds (>1000 bp) 长度 > 1000 bp的scaffold的数目 Bases in large scaffolds 长度 > 1000 bp的所有scaffold的全长 Largest length 最长的scaffold的长度 Scaffold N50 见注释 Scaffold N90 见注释 G + C content 组装序列中的GC含量 N rate 组装序列中未知碱基的占比，reads组装到contig，contig再连接形成scaffold，contig和 contig在连接中可能存在未知碱基 Bases in all contigs 所有contig的全长 No. of large contigs (>1000 bp) 长度 > 1000 bp的contig的数目 Bases in large contigs 长度 > 1000 bp的所有contig的全长 Largest length 最长的contig的长度 Contig N50 见注释 Contig N90 见注释 表1. 基因组组装的结果参数 注释：N50、N90长度的概念：将各个序列按长度大小排序，从大至小逐一扫描各个序列的长度值，进行累加，当该累加值第一次超过所有序列总长的50%时，此时扫描到的序列，其长度值即为N50值，N90值亦同理。N50、N90长度值比平均长度更能准确表示拼接序列的好坏。Contig：重叠群，拼接软件基于reads之间的overlap区而拼在一起的序列，中间没有Gap。Scaffold：框架序列，基于paired-end文库的序列信息，确定contigs之间的顺序关系，将contigs按顺序排列在一起形成的更长序列，即为scaffold，中间可能有Gap。 3.2.2. 编码基因预测 利用maker2软件进行真菌的基因预测，对基因组中的编码序列(CDS)进行预测结果参数见表2，获得功能基因的核酸序列和氨基酸序列 [ 20 ] [ 21 ]，用于后续功能和系统进化分析。 3.2.3. 基因注释 对预测得到的编码基因进行基础的功能注释，通过与5大数据库(NR库，swiss-prot库，Pfam库，COG数据库，GO数据库)进行比对进行功能注释 [ 22 ]。基因注释主要是基于蛋白序列比对。将基因序列与各个数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。 Table 2 Result parameters of coding gene predictio 种类Category 属性Property Gene num 预测基因的数目 Gene total length (bp) 所有预测基因的总长(bp) Gene average length (bp) 每个基因的平均长度(bp) Gene density 整个基因组上基因的密度 GC content in gene region (%) 基因编码区的GC含量 Gene/Geonme (%) 所有基因的全长/基因组全长 Intergenetic region length (bp) 基因组上基因间区的长度 GC content in intergenetic region (%) 基因间区的GC含量 Intergenetic length/Genome (%) 基因间区在基因组上的占比 表2. 编码基因预测的结果参数 (1) NR/Swiss-prot数据库注释分析：NR数据库是NCBI推出的整合型蛋白数据库，所包含的蛋白序列信息相对丰富。而Swiss-prot数据库是Uniprot Knowledge-Base推出的高质量数据库 [ 23 ]，虽然其所含序列信息少于NR数据库，但其包含的是经过人工认证过的序列，可信度比较高。根据实验样本特性和分析目的，可以灵活选用数据库来达到更好的分析效果。 (2) COG功能分析：COG是Clusters of Orthologous Groups of Proteins的缩写。进行COG数据库比对可以对预测蛋白进行功能注释、归类以及蛋白进化分析。 (3) KEGG功能分析：在生物体内，基因产物并不是孤立存在而各自发挥作用的，不同基因产物之间通过有序的相互协调来一起行使具体的生物学功能。因此，KEGG数据库中丰富的通路信息将有助于我们从系统水平去了解基因的生物学功能 [ 24 ]，例如代谢途径、遗传信息传递以及细胞学过程等一些复杂的生物过程。 3.2.4. 结构基因组查询 基因结构查询从基因组整体层面进行分析，包括启动子预测，基因组图谱绘制，通过结构分析可以更全面的掌握该样本基因组情况。 (1) 启动子预测：启动子是调控基因表达的调控元件，决定了基因表达的强度和时机，通过启动子的插入或缺失，可以改变基因的表达模式，实现对菌体生长发育以及代谢的调控研究 [ 25 ]。启动子预测结果以基因为单位，展示相应基因的启动子序列，包括启动子的位置、长度、序列信息等，此外可以通过筛选功能直接获得某个基因或基因组某个区域内的启动子信息，结果参数见表3。 (2) 基因组图谱：真菌组装结果是scaffolds水平，通过线性图展示每条scaffold上编码基因组的排列情况，标注每个基因的编码方向，用颜色代表每个基因的COG功能分类。通过筛选功能可以搜索某个基因名称，展示相应scaffold的图谱，从而查看目的基因上下游的基因，对相关的研究分析具有重要意义。 (3) 基因功能查询：嵌入各种基因查找小工具，通过基因名称或关键字搜索就可以获得相应基因的详细信息，综合基因多个注释库信息，对基因进行多维度数据挖掘。 3.2.5. 代谢系统分析 (1) 碳水化合物活性酶注释：碳水化合物活性酶数据库是关于合成或分解复杂碳水化合物和糖复合物酶类的专业数据库，根据蛋白质结构域中氨基酸序列的相似性，可将不同物种来源的碳水化合物活性酶分成糖苷水解酶，糖基转移酶，多糖裂合酶，碳水化合物酯酶，碳水化合物结合模块，辅助氧化还原酶等六大类蛋白质家族。 Table 3 Result parameters of promoter predictio 种类Category 属性Property Gene ID 基因的ID编号 Location 基因所在的scaffold名称 Sample Name 样本名称 Upstream Pos 上游位置 Promoter Len (bp) 启动子长度 Promoter Seq 启动子序列 Lsp Least stable window centre，最稳定窗口值 Lspe Least stable window centre energy，最稳定窗口能量值 Dmax Pos 最大差异值位置 Dmax 最大差异值 Dave 平均差异值 表3. 启动子预测的结果参数 (2) 细胞色素P450注释：细胞色素P450 (Cytochromes P450，简称CYP450)是一大类以亚铁血红素为辅基的蛋白家族。它们能催化许多种底物的氧化反应。因这类蛋白的还原态与CO结合后会在450 nm处检测到最大吸收波长，故又命名为P450。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。 3.2.6. 比较基因组分析 (1) 同源基因分析：采用OrthoMC软件对不同蛹虫草菌株的氨基酸(或核苷酸)序列进行比对，选取一定阈值(阈值一般在30%~80%之间，视具体项目情况而定)进行相似性聚类，获得同源基因的列表 [ 26 ]。统计每一个蛋白聚类cluster的物种分布情况，可以进行属内或种内的泛基因组、核心基因组的研究。 (2) 系统发育树分析：基于同源基因分析的结果，选取单一拷贝的同源基因进行多序列比对和比对质量控制。然后基于单拷贝基因法构建系统发育树(图2)。 (3) 基因簇比较分析：微生物基因簇是一组紧密连锁的且功能上密切相关的结构基因，这些基因各自编码的酶常能组成多酶复合物，能催化代谢中的特定反应。基于已知的基因簇信息，通过基因簇比较作图分析，可以直观的了解研究的菌株间的基因簇信息。 (4) 共线性分析：共线性一般是指不同物种中染色体之间的某些区域有着相似的基因排列顺序。一般而言，进化距离越远的物种之间基因共线性越差 [ 27 ]，因此两个物种之间的共线性程度可以作为衡量它们之间进化距离的标尺 [ 28 ]。同时，我们还可以通过共线性分析来获得物种间基因组在进化过程中所发生结构变异的情况。 (5) 泛基因组分析：泛基因组是指某一类物种(或菌株)全部基因总和，包括核心基因组和非必需基因组 [ 29 ]。核心基因组是在该类物种(或菌株)中都存在的基因，一般与必需的生物学功能和重要表型特征相关，反应物种的稳定性。非必需基因组是指某一(或以上)种物种(或菌株)中存在的序列，一般与蛹虫草菌对特定环境的适应性或特有的生物学特征相关，比如产虫草素、耐受性和退化等，反映了这类物种(菌株)的表型特性 [ 30 ]。 图2. 系统发育树