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user: 3. 结果 3.1. 喂食不同浓度褐藻多醣后之虾子的自然存活率 连续喂食不同浓度褐藻多醣10天，观察虾子存活以选择适当喂食浓度。结果如表1所示，30-mg喂食组在喂食至第5天的虾子存活率仍为100%；第10天的存活率为63%，高于对照组与20-mg及40-mg喂食组(36%、50%及25%)。观察虾子发现，40-mg喂食组的虾子在第3天开始出现死亡或肌肉白浊症状，对照组及20-mg喂食组则在第5天出现虾子死亡或肌肉白浊症状。因此，后续实验选择喂食褐藻多醣的剂量是每一尾虾30 mg。 Table 1 Survival of freshwater prawn after feeding with laminarin for different day 表1. 褐藻多醣喂食不同天数后之淡水长脚大虾的存活率 注：喂食后0天表示喂食前一天且虾子未经任何处理。喂食剂量0 mg为喂食等体积100 mL PBS以取代褐藻多醣。 3.2. 喂食褐藻多醣前后虾子肝胰脏中微生物的组成 喂食前一天之驯养时之虾子肝胰脏内原本就带有病原菌Lactococcus garvieae，分离率16.7%；然并未分离到常见之革兰氏阴性(G-)致病菌Aeromonas hydrophila或A. veronii等(表2)。相较于对照组虾子肝胰脏可持续分离到L. garvieae且分离率13.3%至16.7%，连续喂食褐藻多醣之虾子肝胰脏于喂食后第5天未分离到L. garvieae，且喂食后3天和10天虽分离到L. garvieae (10%及6.7%)，但分离率均低于对照组。另外，A. hydrophila可持续在对照组虾子分离到，但在喂食褐藻多醣的虾子都未分离。实验期间发现，在喂食褐藻多醣的虾子肝胰脏中持续分离到梅奇酵母菌Metschnikowia bicuspidata，且在第5天的分离率最高，达23.3%；然而，此酵母菌不曾在对照组虾子分离到。接着在所有梅奇酵母菌分离株随机选取编号为MB58及MB550两株，进行后续益生菌的评估。 3.3. 梅奇酵母菌MB58及MB550对虾子的毒力(virulence) 选择来自哺乳动物且被认定是益生菌株的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ATCC10012)与来自褐藻多醣处理之虾子的两株分离株梅奇酵母菌MB58及MB550进行对虾子的毒力测试。结果显示，对照的植物乳杆菌造成87%的虾子死亡，明显高于梅奇酵母菌MB58及MB550的致死率，分别为12%和22% (表3)。 3.4. 梅奇酵母菌MB58及MB550与致病菌的相互抑制力 为了解两株梅奇酵母菌MB58及MB550与常见致病菌A. hydrophila、A. veronii及L. garvieae之间是否会互相影响生长，本实验以两菌株于不同生长时期的胞外液分别与三株致病菌共同培养后，观察的抑菌结果如图1所示，两菌株在对数期(log phase)、对数晚期(late log phase)及稳定期(stationary phase)的胞外液皆能抑菌两株G-致病菌A. hydrophila和A. veronii的生长，其中对数晚期的抑制作用优于其他两个时期的胞外液；另外，只有菌株MB550对数晚期的胞外液能抑制L. garvieae生长。相对地，三株致病菌的胞外液皆无法抑制MB58的生长，且仅L. garvieae三个时期的胞外液会抑制菌株MB550的生长(图2)。 3.5. 喂食梅奇酵母菌MB58及MB550的虾子易感性 为评估两株梅奇酵母菌是否能提高虾子对抗致病菌的感染，本实验对连续喂食5天后的虾子进行注射感染致病菌L. garviae，观测并记录72小时内虾子死亡数。结果如表4所示，对照组虾子在感染后全数死亡(死亡率100%)；菌株MB58及MB550之喂食组虾子的死亡率分别为26.6%及29.4%，至于两菌株混合喂食组的虾子则100%存活。 3.6. 虾子喂食梅奇酵母菌MB58及MB550的酚氧化酵素活性 为厘清两菌株提高虾子的抵抗力与虾子酚氧化酵素(PO)的表现是否有关，本实验于喂食菌株期间分 Table 2 Pathogens and special microbes present in prawn hepatopancreas before and after treatment with laminari 表2. 褐藻多醣处理前后虾子肝胰脏内出现的致病菌与特定微生物 注：喂食后0天表示喂食前一天且虾子未经任何处理。括号内数据为各菌种由不同处理之虾子肝胰脏内分离到的百分率。特定菌株为只出现于口服褐藻多醣的虾子。 Table 3 Mortality of freshwater prawn after injection with Lactobacillus plantarum and Metschnikowia bicuspidata MB58 and MB55 表3. 淡水长脚大虾注射植物乳杆菌和梅奇酵母菌MB58及MB550后的死亡率 注：N表示实验用的数目。 Table 4 Mortality of prawn fed with MB58 and MB550 after infectio 表4. 喂食梅奇酵母菌株MB58及MB550后淡水长脚大虾的感染死亡率 注：N表示每组实验用虾子数目。 别测定虾血浆和血球内的PO活性。结果如图3所示，菌株MB58喂食组虾子的血浆PO S 高于对照组，但PO T 低于对照组；血球内的PO S 与PO T 皆与对照组无显著差异。菌株MB550喂食组虾子的血浆中PO S 与对照组无差异，PO T 却低于对照组；然而，血球内PO S 及PO T 均高于对照组PO S 及PO T 。将两菌株混 图1. 梅奇酵母菌MB58和MB550胞外液对致病菌生长的影响 合喂食虾子后，血浆的PO S 和PO T 与对照组无差异，然而血球内的PO S 及PO T 则高于对照组。 3.7. 虾子喂食添加奇梅酵母菌株饲料后的易感性 为评估两株奇梅酵母菌株混合入饲料后是否仍具有提升虾子抗病力，本实验以海藻酸(alginic acid)为黏着剂，分别制作成仅含海藻酸及海藻酸分别加MB58、MB550和混合两菌株的四种饲料，对照组饲料则未包裹任何物质。含菌株的饲料保存于4˚C下5天后，测得每颗饲料中的菌数与第一天实无差异，仍能维持在2 ´ 10 4 CFU/mL。将不同饲料分别喂食虾子5天，并于停喂第一天口服感染L. gariveae后，观察纪录72小时内虾子的死亡数。结果如表5所示，对照组虾子感染后持续死亡，累积死亡率为47.8%，海藻酸组的死亡率为23.8%，至于添加菌株的实验组虾子的死亡率均低于对照组与海藻酸组，分别是MB58组10.3%、MB550组12.0%及混合组11.5%。 图2. 致病菌胞外液对梅奇酵母菌MB58和MB550生长的影响 图3. 喂食菌株MB58和MB550之淡水长脚大虾的血浆及血球内酚氧化酵素活性 3.8. 虾子喂食添加奇梅酵母菌株饲料后的酚氧化酵素和谷胱甘肽过氧化酶的活性 虾子分别喂食含株菌MB58及MB550的饲料5天以及停喂后经L. garvieae感染的1天或3天，抽取血淋巴，分别测定血浆和血球中PO T 和血球中谷胱甘肽过氧化酶(GPx)活性。结果显示，各组虾子于喂食不同饲料五天后之血浆PO T 都高于对照组(图4(a))；除MB58喂食组与对照组无差异外，其他三组的血球 Table 5 Mortality of prawn fed with strain MB58- and MB550-added feed after infectio 表5. 喂食添加菌株MB58及MB550的饲料后淡水长脚大虾的感染死亡率 注：N表示每组实验用虾子的数目。 图4. 淡水长脚大虾连续喂食不同饲料后再以致病菌感染之血浆及血球内总酚氧化酵素活性 PO T 亦高于对照组(图4(b))。停喂并经感染后3天的虾子PO T 显示，MB550和混合喂食组的血浆PO T 活性皆高于对照组，且MB550组活性高于混合组(图4(c))；至于血球内活性，MB550组高于对照组，而混合组的活性明显低于对照组，其他喂食组虾子于感染后的血浆及血球内PO T 表现均与对照组无差异(图4(c)和图4(d))。喂食不同饲料之虾血球内GPx活性结果显示，混合喂食之虾子于喂食5天和感染后1天及3天的GPx活性均高于对照组；海藻酸和菌株MB58及MB550喂食组于喂食5天和感染后1天的活性均与对照组无差异，但是在感染后3天，前两组的活性明显低于对照组，MB550组则明显高于对照组(图5)。相较于感染后一天，感染后3天测得的每一组活性皆明显大幅降低。