DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
system: [SYSTEM]

user: 2. 材料与方法 2.1. 中华被毛孢菌丝体制备方法 本研究中使用的试验品是冷冻干燥的Hirsutella sinensis菌丝体粉末。18℃下培养30天，将其转移到1 L的培养基(含2% sucrose，1% peptone，1% yeast extract)，在18℃下培养14天，再以500 L的发酵槽培养14天，再转移到5 t的发酵罐中培养。分离培养液后冻干，并研磨成粉末。 2.2. 试验动物与饲养 本次试验遵守动物伦理委员3R规范，由财团法人国家实验研究院国家实验动物中心(台北市，台湾)订购36只6周龄之雌性BALB/cByJ小鼠。动物房温度控制在23℃ ± 2℃，湿度制在50% ± 10%，光照与黑暗各十二小时，饲料饮水不限制。 2.3. 试验设计 36只试验动物给予正常成鼠饲料(PMI 5001，Purina，美国)与饮用蒸馏水适应环境1周后，将其随机分为三组，每组12只。其分组为：对照组(等体积二次水)、低剂量组(每天4毫克)与高剂量组(每天40毫克)。采用胃管口服给予喂食，每日一次，每周六天，连续五周。试验期间，小鼠自由摄食饲料和蒸馏水，每周纪录小鼠体重。试验结束后，利用二氧化碳迷昏小鼠后，进行心脏采血，收集血样。再续以二氧化碳牺牲，以无菌操作方式采取腹腔细胞与脾脏细胞。 2.4. 脾脏细胞悬浮液制备 将脾脏放置于已加入适量培养基(RPMI-1640，10% FBS)的3 cm patch dish内，以无菌针筒的尾端将脾脏磨碎，使成为细胞悬浮液。静置5分钟后，取上清液，在25℃下，以600×g离心5分钟，倒掉上清液。拍散细胞加入5 mL RBC lysing buffer，静置1分钟，加入5 mL的培养基，在25℃下，600×g离心5分钟，倒掉上清液，拍散细胞。以10 mL HBSS缓冲液清洗两次，后将细胞悬浮于10 mL的培养基中。以trypan blue染色法计算细胞总数，调细胞数至1 × 10 7 cells/mL medium。 2.4.1. 淋巴细胞增生反应 先于96 well培养盘中分别加入100 μL之培养基(spontaneous)或裂殖素(分别为ConA(concanavalin A) 10 μg/mL；PHA (phytohemagglutinin) 20 μg/mL；LPS (lipopolysaccharide) 50 μg/mL)，加入100 μL脾脏细胞悬浮液(4 × 10 6 cell/mL)，以5% CO 2 ，37℃之条件下培养72小时后，加入20 μL/well之MTT (5 mg/mL)，并于37℃培养4~6小时后，于25℃下，以250×g离心10分钟，吸弃上清液，加入200 μL/well之DMSO，震荡5分钟后，测其A570 nm之吸亮度。增生指数(stimulation index)计算公式为(A570 nm mitogen − A570 nm medium control)/(A570 nm spontaneous − A570 nm medium control)。 2.4.2. 细胞激素分泌试验 先于24 well培养盘中分别加入600 μL之培养基(spontaneous)或600 μL之ConA (10 μg/mL)与100 μL之培养基，再加入400 μL脾脏细胞悬浮液(10 7 cell/mL)，以5% CO 2 ，37℃之条件下分别培养24与72小时后，收集细胞上清液，保存在−20℃冰箱。利用sandwich-ELISA法测试lL-2、IFN-γ、IL-4(24小时)及IL-5 (72小时)的含量。 2.4.3. 免疫细胞数量分析 每只老鼠共有六管，每管加入100 μL脾脏细胞悬浮液(1 × 10 7 cell/mL)。六管分别加入不同的荧光抗体(isotype controls-FITC/PE、α-H2K FITC、α-I-Ad FITC、α-NK 1.1 FITC、α-CD3 FITC/α-CD19 PE、α-CD4 FITC/α-CD8 PE/αCD3)，于4℃下染色30分钟。每管加入1 mLPBS，4℃下600×g离心10分钟，吸弃上清液，重复三次。加入500 μL之2% formaldehyde-PBS，避光保存于4℃冰箱中，于72小时内以流氏细胞仪分析MHC I/II，T，B，CD4，CD8与NK细胞消长情形。 2.5. 血清抗体测定 将保存于−20℃之血清样本，解冻后以 sandwich-ELISA测定其中所含IgM及IgG抗体浓度。 2.6. 腹腔巨噬细胞功能试验 以吸入CO 2 法使小鼠窒息死亡，剪开小鼠腹腔外侧皮毛，用手撕开，露出整个腹膜，以镊子轻挑起腹膜，以针筒缓缓打入HBSS buffer (Hank’s balanced salts solution)，晃动鼠体后，再将腹腔细胞抽出，将所取得的细胞悬浮液，在25℃下，以600×g离心10分钟，吸弃上清液，加入5 mL培养基(DMEM， 10% FBS)使细胞均匀悬浮。以trypan blue染色法计算细胞总数，调细胞数至2 × 10 6 cells/mL medium。96 well培养盘中分别加入100 μL之培养基(spontaneous)或100 μL之LPS (50 μg/mL)，再加入100 μL腹腔细胞悬浮液(2 ×10 6 cells/mL)，以5% CO 2 ，37℃之条件下分别培养24小时后，收集细胞上清液，保存在−20℃。利用sandwich-ELISA法测试lL-6的含量。 2.7. 统计分析 统计分析使用SPSS软件进行。实验结果均以平均值±标准误差(Mean ± SD)表示。数据以One-way ANOVA分析，继以Duncan’s Multiple Range test进行固处理见间比较，并以Dunnett’s t-test来检定处理组与对照组两组间差异显著性，将显著性水平设定为p < 0.05。
system: [SYSTEM]

user: 4. 讨论 本篇研究主要探讨喂食中华被毛孢菌丝体(Hirsutella sinensis)对小鼠非特异性免疫功能影响，由试验中发现中华被毛孢菌丝体对小鼠生长状况无显著改变，显示中华被毛孢菌丝体的安全性 [ 5 ] [ 6 ] 。在非特异性脾脏细胞增生能力方面，以ConA、PHA及LPS等三种裂殖素与脾脏细胞共同培养，发现增生指数在低剂量与高剂量组明显增加相较于对照组，说明中华被毛孢菌丝体显著促进免疫细胞之增生能力 [ 7 ] 。 非特异性免疫系统为动物体在正常情况下没有特定抗原存在时，对抗外界环境因子免疫力的综合表现。研究显示人工培养之冬虫夏草菌丝体可经由抑制嗜中性白血球吞噬作用及抑制cyclooxygenase pathway，并调控CD4(+)及CD8(+)淋巴球细胞数的比例，以达到抗发炎的作用 [ 8 ] 。而后天性免疫反应包含了淋巴球及抗原呈献细胞(antigen-presenting cell， APC)两种，其中淋巴球分为T淋巴球及B淋巴球。T淋巴球又分为辅助型细胞(T helper cell， Th cell)及毒杀型T细胞。辅助型T细胞又分为Th1及Th2两种，主要功能为分泌细胞激素参与体液及细胞免疫反应，而毒杀型T细胞则针对被病毒感染的细胞或其它外来物进行细胞毒杀免疫反应。每一种细胞有它特定的功能及特定的CD标帜，如Th1/ Th2为CD4+阳性，杀手T-细胞为CD8+阳性。B淋巴球在成熟后会表现出专一性的抗原接受器，而当细胞受到感染，B淋巴球会生成抗体且对特定抗原产生记忆性。APC可将抗原摄入后表现于细胞膜上，使T细胞能够辨认抗原而结合。主要组织兼容性复合物(major histocompatibility complex， MHC)是一种细胞表面醣蛋白复合物，人类的MHC蛋白可以分为两大类：第一型MHC分子(MHC I)和第二型MHC分子(MHC II)，前者位于个体中所有核的细胞上，后者则只分布在APC上，如巨噬细胞、B 细胞、树突细胞等。本试验利用具专一性荧光抗体标帜细胞表面抗原，以流式细胞仪分析发现在MHC II、T、B及NK等细胞中三组间没有显著差异。但是，在高剂量组MHCI、CD4及CD8细胞数目显著较对照组增加(p < 0.05)，显示中华被毛孢菌丝体对调节Th1/Th2的表现与小鼠后天性免疫反应有帮助。他人研究也发现中华被毛孢菌丝体有明显的免疫促进作用，在给予200 mg/kg和800 mg/kg的剂量下，中华被毛孢菌丝体能明显增强小鼠巨噬细胞吞噬功能、体液免疫功能和细胞免疫功能 [ 9 ] 。IgG是血浆中含量最高的免疫球蛋白，IgM是对抗抗原之初级反应所产生的第一种免疫球蛋白。试验中发现喂食高剂量与低剂量的中华被毛孢菌丝体，小鼠血清中IgG显著较对照组高，而高剂量喂食也显著增加血清中IgM的含量，显示中华被毛孢菌丝体可促进非特异性抗体的生成，而且对于调节入侵的细菌及对抗外来抗原的初级反应上有帮助。 由脾脏细胞激素分泌量实验得知，于ConA裂殖素处理下，喂食中华被毛孢菌丝体可增加Th1-type细胞激素lL-2、IFN-γ之生成，并抑制Th2-type细胞激素IL-4及IL-5的分泌，说明中华被毛孢菌丝体对调节Th1/Th2细胞激素分泌有帮助。他人研究发现冬虫夏草水萃物可以通过树突细胞调节发炎反应时Th1/Th2平衡 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] 。于自发情况与LPS刺激处理下，与对照组相较，腹腔巨噬细胞之IL-6分泌量随中华被毛孢菌丝体剂量增加而上升，因此，显示中华被毛孢菌丝体可促进腹腔巨噬细胞功能 [ 13 ] [ 14 ] 。 高剂量的中华被毛孢菌丝体喂食可刺激小鼠淋巴细胞增生、增加血清IgG的含量、促进Th1-type细胞激素之生成，并抑制Th2-type细胞激素的分泌。综合以上，中华被毛孢菌丝体可以调节小鼠体内非特异性免疫功能。
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 随着机动车礼让行人规定的贯彻实施，提高了行人过街的安全性，但同时也在一定程度上增加了路段追尾事故发生率，并降低了城市路段的通行效率。针对以上问题，本文设计了城市路段行人过街辅助系统。利用红外检测装置以及压力传感装置检测行人的过街方向以及实时动态，并根据行人的位置变化，准确地为车辆提供分车道预警。设计的系统能够在一定程度上提高行人过街的安全性，预防机动车追尾事故的发生，提高城市交通运行效率。 关键词 :行人，人机冲突，协同控制，智能交通 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 根据《中华人民共和国道路交通安全法》第四十七条第一款的规定，机动车行经人行横道时，应当减速行驶；遇行人正在通过人行横道，应当停车让行；机动车行经没有交通信号的道路时，遇行人横过道路，应当避让 [ 1 ] 。礼让行人，让出的不仅是安全，更是一种关爱和温暖。马晓明 [ 2 ] 认为礼让行人不仅是最基本的法律法规，也是驾驶人最起码的道德准则；章继光 [ 3 ] 认为礼让行人能够培育先进的行车文化；谭湘客 [ 4 ] 认为引导礼让行人体现了行车文明。 礼让行人的强化落实提高了行人过街的安全性，与此同时，机动车在避让斑马线上的行人或非机动车时，当前车突然急刹，非常容易使后车措手不及从而导致追尾事故的发生。由行人过街引发的安全问题，不止停留在法律和道德层面，实则反映出交通设施配备不完善引发的供需矛盾。本文在充分利用城市现有道路资源的基础上，设计了基于车流量分析与分车道管理的城市路段行人过街辅助系统以提高行人路段过街安全性和提高路段机动车通行能力。
system: [SYSTEM]

user: 2. 已有行人过街系统的比较分析 目前已有的城市道路路段行人过街设施主要有：1) 行人过街请求系统(主动触发式)；2) 基于红外检测的行人过街自动预警系统；3) 基于热感成像和人体识别的智能斑马线系统。已有三种系统各有优缺点，例如，主动触发式行人过街请求系统具有行人安全系数高和路权分配明确的优点，但会降低机动车通行效率和道路利用率。目前已有的三种行人过街设施总结如表1所示。 随着我国机动化水平的不断提高以及礼让行人规范的贯彻实施，已有的城市路段人行横道行人辅助过街设施亟待改善优化。本文利用基于先进的计算模型和合理的系统设计，在确保行人安全的前提下，最大化提高城市道路利用率，实现路网协同控制和精细化管理城市道路的目标。
system: [SYSTEM]

user: 3. 系统的设计原理与工作流程 基于车流量分析与分车道管理的城市路段行人过街辅助系统包括车流量监测、车速监测、行人检测、预警提示四个单元。系统工作依靠“两值双模式”框架，充分结合道路实况，对城市路段人行横道处的 Table 1 The existing pedestrian crossing facilities on urban road 现有装置 优点 缺点 主动触发式行人过街请求系统 1. 行人安全系数高 2. 路权分配明确 1. 降低机动车通行效率 2. 道路利用率低 基于红外检测的行人过街自动预警系统 1. 行人安全系数较高 2. 行人检测精度高 1. 降低机动车通行效率 2. 道路利用率低 基于热感成像和人体识别的智能斑马线系统 1. 行人安全系数较高 2. 行人检测精度高 1. 降低机动车通行效率 2. 道路利用率低 表1. 已有主要的行人过街设施及优缺点比较 机动车提供诱导、警示服务。“两值”分别为根据车流量计算模型计算的车流量界值和设计车速值，“双模式”为自由通行模式和机动车优先模式，系统在实际工作中根据道路实况启用不同的通行模式。系统的工作原理图如图1所示。 该系统主要由以下两种工作模式： 1) 自由通行模式：有行人通过人行横道时，机动车根据信号提示予以让行。 2) 机动车优先模式：机动车优先通行，行人禁止进入人行横道。 正常情况下，系统默认启用自由通行模式，当车流量实时监测值大于车流量界值或车速监测值大于设计车速值时，启用机动车优先模式。利用速度模型计算出密集车流到达车速监测单元的时间(t 1 )和密集车流通过人行横道的时间(t 2 )，系统在t 1 时刻启用机动车优先模式，在t 2 时刻恢复自由通行模式。
system: [SYSTEM]

user: 4. 系统各组成部分说明 4.1. 车流量监测单元 利用人行横道上游交叉口处的摄像头，监测即将到达人行横道的实时车流量。进一步推广至城市路网内所有交叉口的车流量监测单元协同配合，通过监测与预测之间的结合，为城市配置合理的管控方案。 4.2. 车速监测单元 采用激光测速技术，测量道路上的机动车的实时速度。车速监测单元安置位置与人行横道之间的距离x的计算公式如公式(1)所示： x = ( 3.5 N v 人 ) v 设 + v 设 2 2 a (1) N——单侧车道数； v 人 ——行人过马路平均速度； a——机动车紧急制动减速度； v 设 ——该路段设计车速。 4.3. 行人检测单元 行人检测单元包括路侧等候区红外检测装置和人行横道下方的压力感应装置。路侧红外检测装置可以检测行人并确定行人过街方向。铺设在人行道下方的压力感应装置实时感应过街行人的具体位置(图2)。 4.4. 预警提示单元 分为车辆预警单元和行人预警单元两部分。 图1. 系统工作原理图 图2. 行人检测单元工作原理 1) 车辆预警单元包括注意行人标志和人行横道两侧的道钉灯。注意行人标志能够在行人过街过程中被点亮，向车辆传递预警信号，提醒驾驶员提前减速。道钉灯可以在行人过街时向不同车道内的机动车传递不同信号，诱导机动车停车让行或减速通过。 2) 行人预警单元是一个安装在行人等候区的LED显示屏，车流量或车速过大时LED显示屏会显示禁止通行字样，提醒行人停止通过斑马线(图3)。
system: [SYSTEM]

user: 5. 创新特色 5.1. 分车道管理模式提高路网运行效率 已有的行人过街辅助装置大都不能兼顾行人安全与机动车通行效率。主要体现在当有行人通过人行横道时，行人所在机动车道和行人尚未到达所有机动车道内的所有车辆均需停车让行，大幅降低了道路使用率。 本文设计的行人过街辅助装置中特别加入了分车道管理模式，该模式可根据行人所在实时位置，对不同车道实施不同信号控制，在保障行人安全的前提下充分利用道路空间，将安装此类装置对路段产生的影响降至最低。 如图4所示，当行人进入等候区并触发红外检测装置时，1号机动车道的车道警示灯亮起，此时1号机动车道内的车辆需停车让行，2号机动车道内的车辆可减速通过；当行人进入2号机动车道时，1号机动车道的车道警示灯熄灭。 5.2. 依据车流量界值分配人行横道路权 系统能够利用上游交叉口处的车流量监测单元，获得进入交叉口的车流量，同时可以通过计算得到对应不同的服务水平的车流量值，并根据道路实际情况确定不同的临界值。当车流量临界值时，机动车获得优先通行权，对过街行人采取信号控制，当车流量小于临界值时，恢复自由通行模式(图5)。依据车流量界值分配人行横道路权，能够降低行人与机动车的总延误，有效提高交通运行效率。 图3. 预警单元布设图 图4. 分车道管理规则 图5. 优先模式判断规则
system: [SYSTEM]

user: 6. 结束语 随着交通设施建设的不断完善，出行者对出行服务质量要求也越来越高，建设更精细、更合理的交通设施来提高城市交通服务水平也是智能化交通管理的必然趋势。结合礼让行人的贯彻实施，论文设计了基于车流量分析与分车道管理的城市路段行人过街辅助系统。该系统能够在保证行人安全通过人行横道的基础上，极大程度上辅助机动车驾驶员做出判断，提高路段通行能力，最终达到双赢的目的，也将为城市交通管理注入新的活力。
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 针对厦蓉高速漳州段改扩建产生的大量RAP，本文采用马氏法进行了ATB-25再生沥青混合料的设计，设计结果显示：当RAP掺量在30%，最佳沥青含量为4.0%时，设计的再生混合料动稳定度4676次/mm，残留稳定度为85.1%，满足规范和设计的技术要求，并成功在厦蓉高速漳州段实体工程中得到了成功验证与应用。 关键词 :沥青回收料，再生，设计，应用 Copyright © 2018 by author and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 经过三十多年的高速公路建设，高速公路建设已经从早期规模建设转向建养过渡，初步统计自2015年以来每年至少产生6000万吨的沥青路面回收料(RAP)，大量RAP的产生不仅污染环境，占用耕地，而且不适应未来绿色循环经济的发展需要 [ 1 ] 。基于RAP的再生利用需求 [ 2 ] ，本文将厦蓉高速漳州段改扩建产生的沥青路面回收料RAP进行ATB-25热再生沥青混合料设计 [ 3 ] [ 4 ] ，并将设计的ATB-25再生沥青混合料应用到改扩建沥青路面的上基层。
system: [SYSTEM]

user: 2. ATB-25再生混合料设计 2.1. 原材料分析 1) 胶结料：胶结料采用70号重交石油沥青，对给定的针入度、软化点、延度等指标(见表1)其结果符合《沥青路面施工技术规范》(JTG F40-2004)中关于普通沥青的相关技术要求 [ 5 ] 。 2) 矿料：集料采用自行破碎加工的0~5 mm、5~10 mm、10~20 mm、20~30 mm辉绿岩集料，填料选用石灰石矿粉，所选取的集料、矿粉其指标均满足JTG F40-2004中对集料、矿粉的相关技术要求。 3) RAP：RAP选用厦蓉高速原沥青路面的上中面层的铣刨料，并在后场加工成成0~8 mm、8~15 mm以及15~20 mm的规格。RAP检测包括旧沥青油石比，旧料级配以及回收沥青针入度等三项指标，检测结果如表2。根据美国标准，针入度在15 (0.1 mm)以下一般不适宜再生利用，从表2结果看本次选取的厦蓉高速漳州段改扩建RAP针入度均大于15 (0.1 mm)，可以进行再生混合料的设计。 2.2. 掺量及级配设计 进行级配设计时首先确定RAP中集料与新加集料之间的比例关系r(%)，根据《公路沥青路面再生技术规范》(JTG F41-2008)中表B.4.2 [ 6 ] ，本文选取的RAP中旧沥青含量均大于20 (0.1 mm)，按照新旧沥青调和原则，其RAP最大掺量为25%，考虑到0~8 mmRAP中旧沥青含量均大于30 (0.1 mm)，RAP掺量r可以适当提高，但根据施工经验，当r > 30%，应掺加再生剂，本次再生混合料设计时，不外掺再生剂，因此确定RAP的最大掺量r = 30%。设计级配如表3所示。 Table 1 Asphalt Inspection Specification 检测项目 单位 技术要求 试验结果 针入度(25℃，5 s，100 g) 0.1 mm 60~80 64.5 软化点(R & B)(环球法) ℃ ≥46 48.6 延度(15℃，5 cm/min) cm ≥100 >100 密度(15℃) g/cm 3 实测记录 1.027 表1. 沥青检测技术指标 Table 2 RAP performance test result 检测项目 RAP规格 0~8 mm 8~15 mm 15~20 mm 油石比/% 6.4 4.3 4.7 针入度/0.1 mm 35.2 28.2 21.8 筛孔尺寸/mm 26.5 19.0 16.0 13.2 9.5 4.75 2.36 1.18 0.6 0.3 0.15 0.075 通过率/% 0~8 mm 100 100 100 100 99.9 87.3 62.9 44.5 36.8 24.2 18.0 13.1 8~15 mm 100 100 100 99.0 81.7 29.1 22.0 16.5 14.2 10.0 7.6 5.5 15~20 mm 100 94.8 86.8 67.9 41.7 27.2 20.6 15.2 12.8 8.8 6.8 5.2 表2. RAP性能检测结果 Table 3 Design Gradation of ATB-25 Asphalt Mixtur 孔径(mm) RAP/mm 0~5 mm 5~10 mm 10~20 mm 20~30 mm 矿粉 级配范围 0~8 8~15 15~20 中值 下限 上限 31 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100 100 100 26.5 100.0 100.0 98.9 100.0 100.0 100.0 91.7 100.0 95 90 100 19 100.0 100.0 94.8 100.0 100.0 96.0 9.0 100.0 70 60 80 16 100.0 100.0 86.8 100.0 100.0 78.0 0.1 100.0 58 48 68 13.2 100.0 99.0 67.9 100.0 100.0 47.8 0.1 100.0 52 42 62 9.5 99.9 81.7 41.7 100.0 95.0 5.8 0.1 100.0 42 32 52 4.75 87.3 29.1 27.2 91.0 2.9 0.1 0.1 100.0 30 20 40 2.36 62.9 22.0 20.6 56.5 0.4 0.1 0.1 100.0 23.5 15 32 1.18 44.5 16.5 15.2 34.5 0.3 0.1 0.1 100.0 17.5 10 25 0.6 36.8 14.2 12.8 26.7 0.3 0.1 0.1 100.0 13.0 8 18 0.3 24.2 10.0 8.8 15.6 0.3 0.1 0.1 100.0 9.5 5 14 0.15 18.0 7.6 6.8 10.0 0.3 0.1 0.1 100.0 6.5 3 10 0.075 13.1 5.5 5.2 5.8 0.3 0.1 0.1 98.1 4.0 2 6 比例 15 5 10 16 8 11 33.5 1.5 表3. ATB-25沥青混合料设计级配 2.3. 沥青用量确定 热再生沥青混合料中沥青的用量可以按照下式进行估算：P = 0.035a + 0.045b + Kc + F进行估算，其中P：混合料中的大概沥青用量(%)；K：当0.075 mm筛孔通过率为6~10%时，取0.18；当0.075 mm筛孔通过率 ≤ 5时，取0.2；a、b、c分别是2.36 mm以上、0.075 mm~2.36 mm之间、0.075 mm以下的集料比例；F：经验系数，取0.7%。 根据以上经验公式计算出本级配中的沥青用量为4.3% (即油石比4.5%)，显然偏大，但是配合比设计时应不受其局限，在实际操作中选取3.2%、3.7%、4.2%、4.7%、5.2%等四个油石比成型试件，并计算体积参数如表4所示。 根据以上参数，计算出OAC1 = 3.72%、OAC2 = 3.90%，其最佳油石比为OAC = (OAC1+ OAC2)/2 = Table 4 Marshall test result 油石比 (%) 理论最大 相对密度 毛体积相对 密度 VV (%) VMA (%) VFA (%) 稳定度 (kN) 流值 (0.1 mm) 3.2 2.504 2.319 7.4 14.4 48.6 9.88 22.6 3.7 2.487 2.347 5.6 13.8 59.2 11.4 26.5 4.2 2.470 2.370 4.1 13.4 69.7 12.8 31.5 4.7 2.454 2.372 3.3 13.7 75.7 9.97 36.8 5.2 2.438 2.366 2.9 14.3 79.5 9.54 39.2 表4. 马歇尔试验结果 3.81%。因此基于RAP设计的ATB-25混合料的最佳油石比为3.81%，折合成最佳沥青用量为4.0%。 2.4. 性能验证 为验证采用4.0%的最佳沥青用量设计的ATB-25混合料的路用性能，室内进行高温性能和水稳性能测试，结果见表5所示。表5结果反映，采用本文的设计级配和最佳沥青用量设计的再生混合料路用性能满足要求，完全可以替代非再生ATB-25混合料进行应用。
system: [SYSTEM]

user: 3. 工程应用 厦蓉高速改扩建漳州段于2016年开始高速公路的改扩建，为充分将铣刨出来的RAP再生利用，并验证本文设计的ATB-25再生沥青混合料使用效果，2017年11月在厦蓉高速龙岩-漳州方向(桩号范围K77+200-K78+000)铺筑了约长800 m、宽10.58 m共计约8464 m 2 的ATB-25再生上基层实体工程(如图1、图2)。 3.1. 生产配合比设计 本次ATB~25再生试验段原材料均采用福建路桥料场材料，其中沥青为70号重交沥青，集料采用自行破碎加工的0~5 mm、5~10 mm、10~20 mm、20~30 mm辉绿岩集料，填料选用石灰石矿粉，RAP采用厦蓉高速漳州段改扩建中上面层的铣刨料，参照室内设计的目标配合比，进行了生产配合比设计，设计配比如表6所示，从表7可以看出设计的生产级配和目标级配偏差在 ± 2%以内，满足《公路沥青路面设计规范》(JTG D50-2006)对沥青混合料级配范围允许偏差要求。 根据目标配合比最佳沥青含量4.0%，试验时选择4.0% ± 0.3%三种沥青用量(即3.7%、4.0%、4.3%沥青含量)成型试件，根据体积参数确定出最佳沥青含量为4.0%，然后进行了混合料的路用性能试验(表8)，试验结果显示设计的ATB-25再生混合料具有良好的路用性能，满足公路沥青路面施工技术规范对密级配沥青混合料的各项技术要求。 3.2. 现场施工 为确保ATB-25再生混合料施工质量，现场提出了以下具体的控制措施： 1) 混合料的拌合温度控制在170℃~175℃； 2) 摊铺过程禁止料斗频繁收斗，铺筑后路面发现混合料离析应立即换填或撒布细料； 3) 混合料摊铺温度不低于165℃，复压不低于135℃，终压不低于110℃； 4) 碾压采13T钢轮静压1~2遍，25T胶轮负压4遍，13T钢轮终压1~2遍，总遍数不低于6遍。 从现场施工情况看，整个过程各项措施基本都得到了控制，但也出现了一些问题，比如在初始阶段 Table 5 ATB-25 Recycled Mix Performance Tes 检验项目 单位 技术要求 试验结果 试验方法 动稳定度 次/mm ≥1000 4676 T0719 残留稳定度 % ≥80 85.1 T0709 表5. ATB-25再生混合料性能测试 Table 6 Production Ratio of ATB-25 Asphalt Mixtur 材料种类 矿料/mm RAP 0~4 4~7 7~12 12~24 24~40 矿粉 0~8 8~15 15~20 比例(%) 15 5 10 10.5 8 6 23 20 2.5 表6. ATB-25沥青混合料生产配合比例 Table 7 Production Ratio of ATB-25 Asphalt Mixtur 筛孔/mm 31.5 26.5 19.0 16.0 13.2 9.5 4.75 2.36 1.18 0.6 0.3 0.15 0.075 生产配合比 100 96.7 69.5 61.7 56.3 47.0 31.8 22.3 17.1 13.2 8.9 7.4 5.5 目标配合比 100 96.5 69.0 63.8 57.7 47.2 32.7 21.3 15.6 11.8 8.7 7.4 5.6 级配偏差 0.0 0.2 0.2 −2.1 −1.4 −0.2 −0.9 +1.0 +1.5 +1.4 +0.2 0.0 −0.1 级配范围 100 90~100 60~80 48~68 42~62 32~52 20~40 15~32 10~25 8~18 5~14 3~10 2~6 表7. ATB-25沥青混合料生产配合比例 图1. 现场施工 由于压路机操作手违反操作，复压时洒水过多，导致路面温度降低过快，这一问题在发现时及时得到了纠正。总体上看本次ATB-25再生试验路的施工整体进展顺利，达到了预期的要求。 3.3. 后期检测 为检验ATB-25再生试验段施工的质量，施工后第二天进行了现场压实度、平整度、渗水测试(表9)，从检测的压实度、平整度及渗水系数等指标看，均满足设计技术要求，达到了预期的要求。施工至今对该路段进行后期跟踪观测，ATB-25再生沥青路面无发生任何病害，验证了设计的ATB-25再生混合料的使用可行性，具有在高速公路大面积推广的前景。 图2. 施工后效果 Table 8 ATB-25 Recycled Mix Performance Test Result 检验项目 单位 技术要求 试验结果 试验方法 动稳定度 次/mm ≥1000 4852 T0719 残留稳定度 % ≥80 87.5 T0709 表8. ATB-25再生混合料性能试验结果 Table 9 ATB-25 Recycled Asphalt Pavement Inspectio 检测项目 压实度/% 平整度标准差/mm 渗水系数ml/min 检测结果 98.9 0.86 12 设计要求 ≥97 ≤1.2 ≤120 ml/min 表9. ATB-25再生沥青路面检测
system: [SYSTEM]

user: 4. 结论 本文基于厦蓉高速漳州段改扩建产生的RAP，采用马歇尔设计法进行ATB-25再生混合料配合比设计，设计出的各项技术指标均满足相关规范和设计技术要求，并在厦蓉高速龙岩-漳州方向铺筑了约800 m长的试验路段，从后期的使用效果看，设计的ATB-25具有良好的使用性能，具有在高速公路大面积推广的应用前景。
system: [SYSTEM]

user: 项目来源 福建省交通厅科技项目《基于旧料再生应用的高速公路扩建拼宽段抗裂型路面关键技术研究》。
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 本实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了一条虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)LRCH2-like基因的全长cDNA序列。SiLRCH2-like基因全长为2446 bp，其中编码区为1644 bp，3’-UTR为609 bp，5’-UTR为193 bp，编码548个氨基酸，预测的蛋白分子量为59.9 KDa，理论等电点为4.07，为酸性蛋白，有1个Na-Ca-ex-superfamily结构域和7个LRR结构域。我们采用实时定量PCR技术分析了SiLRCH2-like基因在各组织中的表达情况。他在所有检测的组织中均有表达，在雌性性腺中表达量最高，其次是肠道、管足，体腔细胞和围口膜中表达量较少，在雄性性腺中几乎检测不到表达。我们也检测了该基因在强壮弧菌(Vibrio fortis)、脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)、聚肌胞苷酸(polyI:C)五种病原刺激后的体腔细胞中的表达情况。SiLRCH2-like基因在PGN处理后在12 h出现了表达高峰，在WGP处理后出现了表达下调，而其他病原处理后表达上调不明显。研究结果表明，SiLRCH2-like基因参与了虾夷马粪海胆的NLR信号通路，它在海胆的天然免疫系统中发挥了重要的作用。 关键词 :虾夷马粪海胆，LRCH2-Like，RACE，实时定量PCR Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)又称中间球海胆，原产于日本北海道及以北沿海，在俄罗斯远东地区的萨哈林岛等地也有分布。大连海洋大学于1989年将其从日本引进到中国，现已成为中国北方沿海特别是辽东和山东半岛重要的养殖种类，其养殖规模也越来越大，随着海胆养殖业的发展，其也面临着多种病害的威胁，因此研究其免疫相关基因的表达模式就显得尤为重要，也能为虾夷马粪海胆的免疫学基础研究提供参考依据。目前虾夷马粪海胆的NLR基因家族 [ 1 ]，TLR基因家族 [ 2 ] 等均有其与免疫相关的研究结果，通过这些免疫相关的研究已经对虾夷马粪海胆的免疫应答有了初步的了解，但并不完善。通过对高通量测序得到的虾夷马粪海胆转录组数据的分析 [ 3 ]，发现了一个与免疫反应相关的基因LRCH2-like基因，该基因可能与NLR信号通路有关，参与NLR信号通路中的一条途径的免疫反应。本研究通过对虾夷马粪海胆转录组数据的分析，筛选出LRCH2-like基因的部分片断，采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到了一条虾夷马粪海胆LRCH2-like基因的全长cDNA序列，通过实时定量的方法研究了LRCH2-like基因在虾夷马粪海胆的不同组织中的表达情况，使用5种病原对虾夷马粪海胆的体腔细胞进行刺激，对不同时间点的体腔细胞进行实时定量PCR检测LRCH2-like基因的表达量变化。 LRCH2样蛋白是LRCH (leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein)蛋白亚家族的一员，该蛋白亚家族隶属于LRR蛋白超家族。LRR蛋白至少可以分为7个不同的亚家族，如核糖核酸酶抑制剂(RI)样的亚家族，包括核糖核酸酶抑制剂(RI)和GTP酶活化蛋白malp；SDS22样亚家族，包括Rab脂酯转移酶(geranylgeranyltran sferase)，internalin B，动力轻链蛋白1(dynein light chain 1)；含半胱氨酸的LRR亚家族，包括Skp2，SLRP，NLRR，LRRC4；细菌LRR，包括YopM，lpa4，lpa7；植物特异性LRR；TpLRR；典型的LRR蛋白 [ 4 ] 。LRR蛋白中富亮氨酸重复序列的数目可以从血小板糖蛋白中的1个，到植物疾病抑制蛋白Cf-2中的38个。真核LRR蛋白的富亮氨酸重复基序一般为20~29个，LRR最常见的长度一般为23~24个含保守亮氨酸的氨基酸残基。LRR蛋白广泛存在于病毒、酵母和哺乳动物的各个组织中 [ 5 ]，越来越多含LRR的蛋白已被发现 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]，其表达定位十分广泛，可以定位在细胞浆、细胞核、细胞质基质、血清和细胞膜的膜内区和膜外区。LRR蛋白在不同生物体中的分布促使其具有不同的细胞定位和功能。根据LRR蛋白细胞定位的特点可以将其分为两类，一类为细胞内LRR蛋白，另一类为细胞外或跨膜LRR蛋白。细胞内的LRR蛋白，如人的flightlessUL37，果蝇flightlessLRR47，秀丽线虫sur-8，鼠rsp1，酵母腺苷酸环化酶等，这些细胞内LRR蛋白的共同特点是其序列具有高度相似性，可以与Ras-like GTP酶相互作用，调控Ras-like GTP酶的活性 [ 10 ] 。细胞外或跨膜的LRR蛋白的功能主要是作为细胞粘附分子或受体参与神经系统的生长、发育及重塑 [ 11 ] 。这类LRR蛋白的LRR重复序列的两端通常由富含半胱氨酸的N端和C端LRR包裹。这两端的LRR具有高度保守性。含有LRR的蛋白参与多个生物学过程，如信号转导，细胞粘附，细胞凋亡，细胞重塑，细胞周期的调控，细胞支架，酶的抑制，DNA修补，RNA的加工和转录等。 LRCH蛋白是一类新发现的在进化上相对保守的LRR蛋白亚家族，该蛋白含有LRR (leucine-rich repeats)重复结构和一个CH (calponin homology domain)结构域，具有细胞骨架蛋白的特性，LRR重复结构提供了一个蛋白与蛋白之间相互作用的结构骨架 [ 12 ]，而CH结构域通常被看作是一个肌动蛋白结合结构 [ 13 ] 。尽管LRR重复结构和CH结构域在真核生物中是普遍存在的，但是这两个结构域的组合同时出现在一个蛋白中仅限于动物物种。LRCH蛋白首次在果蝇中发现，人类与果蝇的dLRCH表现出高度相关性的蛋白只有4种(hLRCH1-4)，说明它们共有一个进化起源，根据它们保守的氨基酸序列表明它们是细胞骨架的支架因子 [ 14 ] 。
system: [SYSTEM]

user: 2. 材料与方法 2.1. 研究流程 2.2. 海胆的饲喂和组织获取 试验用2龄虾夷马粪海胆取自大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，海胆饲养于16℃~25℃的海水中，每日投喂新鲜的海带。抽取体腔细胞前一日停止投喂。 选取8枚健康的海胆(雌、雄各4枚)，分别用注射器抽取虾夷马粪海胆的体腔液，在4℃下离心10 min，转速为5000 r/min，离心后丢弃上清，收集沉淀的体腔细胞，接着解剖海胆个体，获得围口膜、肠、管足、卵巢和及精巢，并将这些组织放置于液氮中冻存，最后转移至-80℃冰箱中保存。 2.3. 海胆个体的免疫诱导 虾夷马粪海胆体腔细胞是主要的免疫组织，我们选取四种病原物(脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)和聚肌胞苷酸(polyI:C))和一种致病菌(强壮弧菌(Vibrio fortis))对健康的海胆个体进行免疫刺激，来检测目标基因对免疫刺激的应答情况。强壮弧菌是虾夷马粪海胆的一种致病菌，属于革兰氏阴性菌，可以用来诱导虾夷马粪海胆的免疫反应 [ 15 ] 。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，也是细菌内毒素的主要成分，具有抗原性，是一种内源性免疫增强剂 [ 16 ] 。肽聚糖是细菌(主要是革兰氏阳性菌)等原核生物细胞壁内的一类大分子聚合物，在革兰氏阳性菌中肽聚糖含量高达30%~95%，在革兰氏阴性菌中也有5-20%的含量，是一种重要的水产动物免疫增强剂 [ 17 ] 。葡聚糖是存在于酵母细胞壁中一种具有增强免疫力活性的多糖，可刺激机体免疫反应 [ 16 ] 。聚肌胞苷酸是一种合成型的双链RNA类似物，一种病毒感染相关的分子模式，是用来模拟RNA病毒的免疫抑制剂。 采用直接体腔注射的方法对虾夷马粪海胆个体进行免疫刺激，同时体腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组。强壮弧菌使用半致死量注射50只海胆，防止由于死亡导致数量不足。其余4种病原物的注射量为LPS：2 mg/ml、PGN：200 µg/ml、WGP：600 µg/ml，每组注射20只，PBS注射20只。体腔细胞在注射后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五个时间点进行抽取，按前面的方法处理后保存于−80℃冰箱中备用。 2.4. RNA的制备及cDNA合成 按照RNAprep Pure Tissue Kit 总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)方法提取虾夷马粪海胆各组织总RNA，用凝胶电泳检测RNA的质量，核酸蛋白检测仪检测RNA浓度。为了减少个体差异及性别对试验结果的影响，各组织均使用4枚海胆的RNA等量混合后用于反转录，其中精巢、卵巢各使用4枚雄性或雌性海胆，其余组织均使用2枚雄性海胆和2枚雌性海胆。制备好的RNA样品保存于-80℃冰箱中备用。 使用cDNA第一链合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)合成cDNA第一条链。反转录产物于−20℃冰箱保存用于实时定量PCR检测。按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech公司)说明进行反转录，合成cDNA第一条链，反转录产物于−20℃冰箱保存用于RACE克隆。 2.5. 引物设计 根据虾夷马粪海胆转录组数据 [ 3 ] 中筛选到的LRCH2-like基因部分片段设计引物，应用Primer 5.0软件分别设计扩增LRCH2-like 基因全长3’和5’的RACE引物和用于实时定量的引物，内参基因选取18S rRNA，内参基因的引物根据GenBank中虾夷马粪海胆的18S rRNA(D14365)序列设计。所有引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。 2.6. LRCH2-like基因cDNA全长的克隆及回收测序 使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech公司)进行RACE克隆虾夷马粪海胆 Table 1 Primers used in this experimen 引物名称 引物序列 用途 LRCH2-3 LRCH2-5 CAGGTGAGGTGGCCCCATGCGGTTC CAAGCTCCGAAGGTTGGCCATGTCC 3'RACE引物 5'RACE引物 rLRCH2-s GCTTACTTCACTGCCAAGGGATA 实时定量引物 rLRCH2-a CTGGTTTCCATTCACCACCAA 实时定量引物 r18S_S GCGTTTAGCCAGGCGAGAT 内参 r18S_A GGAGGAGGTTCAGCGGATTA 内参 表1. 本实验使用的引物 LRCH2-like基因全长cDNA的克隆。以合成的cDNA第一链为模板，分别用LRCH2-5和LRCH2-3与试剂盒提供的UPM引物配对进行PCR扩增。使用降落PCR进行扩增：94℃预变性5 min；94℃ 30 sec，72℃ 3 min共5个循环；94℃ 30 sec，70℃ 30 sec，72℃ 3 min共5个循环；94℃ 30 sec，65℃ 30 sec，72℃ 3 min共25个循环；72℃ 10 min；4℃保存。取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。 按照EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)方法对目的片段进行胶回收，使用全式金公司的p-easy-T1载体，进行TA克隆，使用M13通用引物进行菌液PCR扩增，鉴定重组子。取5 µl进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认包含重组子的克隆，将得到的阳性克隆菌株送至上海英俊有限公司进行测序，使用通用引物进行测序。 2.7. 利用生物信息学方法进行序列拼接及分析 将测序结果进行序列拼接，完成全长拼接后，首先使用NCBI的blastx (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线工具进行比对，确认为目的序列后，用NCBI上的CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行保守结构域分析，寻找信号肽和跨膜结构域，使用clustalw与其他物种相似序列进行相似性比对，并根据比对结果用MEGA5.0软件构建进化树。 2.8. 使用实时定量PCR进行表达特征分析 采用实时荧光定量PCR法检测LRCH2-like基因在健康虾夷马粪海胆体腔细胞、围口膜、肠道、管足、卵巢和精巢中的表达情况，同时也检测它在免疫刺激之后的虾夷马粪海胆体腔细胞中的表达情况。 选取虾夷马粪海胆的18S rRNA为内参基因，在life technology的7500实时定量PCR仪上进行qRT-PCR，按照试剂盒SYBR Premix EX Taq Ⅱ Kit(takara公司)使用说明进行实时定量PCR扩增反应。PCR反应体系(20 µl)：SYBR Realtime PCR Master Mix 10 μl，上下游引物 (10 μM) 各0.8μl， ROX Reference Dye (50×) 0.4 μl，cDNA模板 2 μl，RNase free H 2 O 6 μl。PCR反应条件：95℃ 30 sec预变性；95℃ 5 sec，60℃ 34 sec，40个循环；在检测引物特异性及制备标准曲线时需加上溶解曲线的过程：95℃ 15 sec，60℃ 1 min，95℃ 15 sec，60℃ 25 sec。每个样本重复检测三次。应用2 –ΔΔCt 法检测LRCH2-like基因的表达情况。
system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与分析 3.1. LRCH2-Like基因全长cDNA的克隆及序列分析 通过条件优化，虾夷马粪海胆LRCH2-like基因的RACE克隆获得了较好的结果，条带单一，符合预期片段大小，将选取的单克隆送去测序，测序结果去除载体后进行分析，获得LRCH2-like基因的3’RACE和5’RACE片段。将转录组筛选到LRCH2-like基因的部分片段，与3’RACE和5’RACE去除载体后得到的片段进行拼接，得到LRCH2-like基因的全长cDNA，利用NCBI网站的blastx工具进行比对分析，发现与该基因相似性最高的是紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus)的LRCH2-like基因，该基因为LRR基因家族的一员，故命名为SiLRCH2-like。SiLRCH2-like基因全长cDNA为2446 bp，其中编码区为1644 bp，3’-UTR为609 bp，5’-UTR为193 bp。编码区编码547个氨基酸，预测的蛋白分子量为59.9 KDa，理论等电点为4.07，为酸性蛋白(图1)。保守结构域分析发现该基因的蛋白中含有1个Na-Ca-ex-superfamily结构域，该结构域的主要功能是调节细胞内Ca 2+ 浓度，以及7个LRR重复，该结构域是NLR家族蛋白识别病原体的主要区域。通过序列比对发现，SiLRCH2-like基因的LRR结构域非常保守，存在多个LxLxLxxN/CxLx结构域重复，该结构域赋予了SiLRCH2-like蛋白辅助NLR家族蛋白识别病原体的功能，但是SiLRCH2-like的LRR结构域较短，可能与SiLRCH2-like基因识别的病原体种类有关。 3.2. 系统发育分析 利用MEGA5软件对来自紫海胆等13个物种的LRCH同源蛋白氨基酸序列进行了系统发育分析，以 图1. SiLRCH2-like基因全长cDNA序列(上)及预测的氨基酸序列(下) (7个LRR结构域用阴影方框标识， Na-Ca-ex-superfamily结构域用下划线表示，星号表示终止密码) 图2. 基于氨基酸序列的LRCH同源蛋白系统进化树(标尺表示遗传距离，分支处数字代表自展置信值，重复1000次) 邻接法构建系统进化树，设定Bootstrap值为500。如图2所示，所有的脊椎动物的LRCH同源蛋白聚为一支，这些物种有斑马鱼(Danio rerio)、深裂眶锯雀鲷(Stegastes partitus)、斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)、大鼠(Rattus norvegicus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)，而虾夷马粪海胆SiLRCH2-like与紫海胆(S. purpuratus)的LRCH 2-like单独形成最外缘的一簇。结合物种的分类地位，可以推测，海胆的LRCH2-like基因很有可能和脊椎动物的LRCH同源蛋白源于共同祖先。 3.3. SiLRCH2-like基因在虾夷马粪海胆不同组织的表达情况 采用相对定量的方法对未经过处理的虾夷马粪海胆各个组织进行表达量的检测，使用18S rRNA作为内参基因，检测结果如图3所示，SiLRCH-2like基因mRNA在所有检测的组织中均进行转录，但是在不同的组织中表达量有差异。SiLRCH2-like基因在卵巢中表达量最高，其次是肠道、管足，体腔细胞和围口膜中表达量较少，在精巢中表达相对来说很低。 3.4. 免疫刺激后SiLRCH2-like基因的表达特征 本实验使用四种病原物LPS、PGN、PolyI:C、WGP以及病原菌强壮弧菌(V. fortis)对虾夷马粪海胆的体腔进行刺激后，检测SiLRCH2-like基因在实验选取的病原体刺激后的6 h，12 h，24 h，48 h，72 h的表达量变化(图4)。 经过LPS处理后(图4(a))，SiLRCH2-like基因在24 h出现了一个表达高峰，表达量增加了0.5倍，但未出现显著性差异变化，说明SiLRCH2-like基因对LPS刺激并无明显应答。经PGN处理后(图4(b)) SiLRCH2-like基因在12 h达到表达高峰，显著性上调，在24 h表达量趋近于0，随后又呈现上升趋势，SiLRCH2-like基因对PGN的刺激表现出强烈的应答。Poly I：C处理后(如图4(c))，SiLRCH2-like基因表达量变化不大，与0 h相比，其他5个时间表达量都在下降，在72 h表达量最低，说明Poly I:C抑制SiLRCH2-like基因的表达使其表达量下降，呈现下调趋势。WGP处理后(图4(d))，SiLRCH2-like基因表达量持续降低，在48 h表达量达到最低，呈现表达下调的趋势，说明WGP同样抑制SiLRCH2-like基因的表达使其表达下调。经过强壮弧菌处理后(图4(e))，SiLRCH2-like基因在12 h表达量达到最大，其余时间表达量都在下降，SiLRCH2-like基因表达量整体无明显变化，说明SiLRCH2-like基因对强壮弧菌的免疫应答不明显。由此可见，SiLRCH2-like基因对LPS和强壮弧菌的刺激并未产生明显表达反应，说明LPS和强壮弧菌对SiLRCH2-like基因有一定的免疫刺激，但并不剧烈；对PolyI:C和WGP的刺激出现表达下调，说明PolyI:C和WGP对SiLRCH2-like没有免疫刺激，甚至抑制SiLRCH2-like基因的表达；PGN通常是NLR受体识别的分子模式，SiLRCH2-like对PGN的刺激产生的表达反应最剧烈，由此可以推测SiLRCH2-like基因可能参与NLR信号通路的免疫反应。
system: [SYSTEM]

user: 4. 讨论 在使用RACE技术得到SiLRCH2-like基因的全长cDNA后，通过序列比对发现，SiLRCH2-like基因的LRR结构非常保守，属于LRR-RI超家族，该家族的LRR通常由20~29个氨基酸残基组成，存在于多种蛋白中，参与蛋白与蛋白之间的相互作用，有许多不同的功能和细胞定位。LRR重复对应的结构单位是由一个β片层和一个α螺旋组成，β片层是一保守的LxxLxLxxN/CxL序列 [ 18 ]，这段序列包含12个片层与11个全重复相一致，与之前在该超家族观察到的范围一致，作为RanGTPase激活蛋白发挥作用，LRR也可作为富亮氨酸重复受体激酶发挥作用，还可作为LRR蛋白参与包括信号转导、细胞调亡、细胞重塑、固有免疫反应、细胞支架，激素受体的相互作用或者酶的抑制等多个生物学过程。由于LRR是NLR家族蛋白识别病原体的主要区域，因此可以表明SiLRCH2-like基因参与NLR信号通路的免疫反应，但是SiLRCH2-like基因的LRR重复域较短，可能与SiLRCH2-like基因识别的病原体种类有关。 从SiLRCH2-like基因在虾夷马粪海胆组织中的表达量结果中可以发现，SiLRCH2-like在卵巢中的表达量最高，而在精巢中表达量很低。这可能是因为有性繁殖动物具有性别二态性的特点，性别二态性的形成与不同基因的表达有关 [ 19 ] [ 20 ]，雌性性腺作为海胆繁殖的重要器官，在进行取样时处于发育成熟期，而SiLRCH2-like基因在细胞生长发育、分化和凋亡等方面发挥重要作用，因此SiLRCH2-like基因在雌性性腺中的表达量最高，这也可能与保护卵子存在一定关系。 图3. SiLRCH2-like基因在健康虾夷马粪海胆不同组织中的表达情况。纵轴数值表示相对表达量，横轴为不同组织 图4. 免疫刺激后SiLRCH2-like基因在体腔细胞中的表达特征(a)-(e)：SiLRCH2-like分别在LPS、PGN、Poly I:C、WGP及强壮弧菌刺激下的表达情况。纵轴数值表示相对表达量，横轴为免疫刺激后不同时间点 图4中，我们可以发现PGN刺激的体腔细胞表达量显著上升，在12 h达到表达高峰，呈表达上调。PGN是细菌等原核生物细胞壁特有的成分，在天然免疫中，PGN是一种重要的病原体相关分子模式，是免疫系统的激活剂，宿主可以通过模式识别受体识别PGN结构，对入侵的细菌作出相应的免疫应答，通过不同的信号转导途径释放免疫调控物质，发挥免疫功能 [ 21 ] 。研究证明NOD蛋白可以识别细菌PGN，而NOD1作为胞质受体识别革兰氏阴性菌的PGN，NOD2作为胞浆受体识别革兰氏阳性菌的PGN [ 22 ] [ 23 ]，由NOD2的LRR结构域介导PGN直接与NOD2相互作用 [ 24 ] 。SiLRCH2-like基因对PGN的刺激反应剧烈，而PGN是NLR信号通路中参与NOD2反应途径的反应物，说明SiLRCH2-like基因可能参与了NOD2介导的NLR信号通路。LPS作为一种内源性免疫增强剂，主要作用于巨噬细胞和嗜中性白细胞，对许多动物的免疫系统都有深远的影响，它能刺激许多真核生物包括鱼类等的非特异性免疫，提高机体的免疫力 [ 25 ]，经过LPS处理的体腔细胞表达量在24 h达到高峰，在其余的时间并没有显著变化，上述实验结果表明，虽然LPS对SiLRCH2-like基因有一定的刺激，可以作为免疫刺激物激发SiLRCH2-like基因的表达，但对SiLRCH 2-like基因的刺激作用微弱，这可能与LPS内毒素的核心结构类脂A的高度保守有关 [ 26 ] 。WGP通常存在于真菌的细胞壁中，应用于水产动物的WGP大多为酵母葡聚糖，即β-葡聚糖。WGP可以选择性地作用于吞噬细胞、自然杀伤细胞和颗粒细胞的特异性受体并激活这些细胞，通过吞噬作用来吸收、破坏和清除侵入体内的病原微生物，同时还能产生细胞因子来增强鱼类对细菌病原体的抵抗力 [ 16 ] [ 27 ] 。WGP可以使SiLRCH2-like基因表达下调，表明SiLRCH-like基因对WGP没有免疫应答，也进一步暗示了SiLRCH2-like基因不参与真菌引发的免疫反应。Poly I:C作为一种模拟RNA病毒的免疫抑制剂刺激体腔细胞，抑制SiLRCH2-like基因的表达，可以推测SiLRCH2-like基因不参与RNA病毒引发的免疫反应。强壮弧菌是虾夷马粪海胆条件性致病菌，实验证明强壮弧菌对虾夷马粪海胆的半致死浓度是10 5 cfu/ml [ 15 ] [ 28 ]，用半致死浓度刺激体腔细胞，其表达量在12 h达到最高，表达量整体差异不大，可以推测SiLRCH2-like基因不是直接参与强壮弧菌引发的免疫反应。
system: [SYSTEM]

user: 5. 结论 本实验获得了虾夷马粪海胆LRCH2-like基因的全长cDNA，并对其在不同组织以及不同病原刺激后的表达情况进行了分析，并推测虾夷马粪海胆的LRCH2-like基因是一个免疫相关基因，参与了NLR信号通路。本实验为后续有关SiLRCH2-like基因作用机制研究奠定了基础。