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user: 5. 苹果砧木抗旱、寒分子机理研究 在模式植物中，抗旱、抗寒机理研究已有较多报道，形态、生理、分子水平研究也已较深入。植物体对抗旱、抗寒的调节可归纳为四种途径：渗透调节、抗氧化调节、胁迫蛋白调节和信号转导调节(表1)。各调节途径组分多、家族成员数量不等且在不同物种中抗性贡献不尽相同。随着更多物种抗旱、抗寒机理研究的开展，发现多种调节组分在不同物种中的抗性功能呈现出多样性。如被广泛认为参与抗旱胁迫的游离脯氨酸，在拟南芥、烟草、玉米等干旱胁迫下含量显著增加，而在草莓、柑橘及部分小麦品种中与抗旱能力却无显著相关性。苹果砧木抗旱、抗寒机理的研究还很有限，在借鉴其他物种研究结果的同时，还需要有大量的前期基础研究。 5.1. 生理组分调节 渗透调节研究中，苹果砧木的研究对象主要有游离脯氨酸、甜菜碱、壳聚糖和山梨醇。其中，检测游离脯氨酸含量变化能否作为抗旱、抗寒指标的研究最为广泛。据报道，低温胁迫下，M26、SH12、新疆野苹果等砧木中游离脯氨酸大量合成[ 21 ] [ 29 ] ；干旱胁迫下，除雅江变叶、德钦海棠外，楸子等砧木品种中游离脯氨酸的合成受干旱诱导，但诱导强度、时间与抗性的相关程度不尽相同[ 17 ] [ 22 ] 。向碧霞(1995)等通过检测电导率、SOD活性、丙二醛(MDA)含量、气孔导度、游离脯氨酸含量等指标系统调查了16种乔化砧木的抗旱性，但结果显示脯氨酸含量变化与砧木的抗旱能力不存在显著相关性[ 17 ] 。 此外，通过內源调节或外施增加壳聚糖、甜菜碱或山梨醇等有机小分子浓度，提高细胞渗透势或抗氧化能力能够增强砧木的抗旱、抗寒能力。但在渗透调节组分中，尚没有公认的与抗旱、抗寒性显著相关的检测指标；且包括游离脯氨酸及其他渗透调节组分在内，在干旱、低温逆境中的含量变化，是属于主动应答调节还是逆境伤害导致的结果，尚没有明确的研究结论。 活性氧(ROS)是植物体遭受干旱、低温、病害等多种生物/非生物胁迫的防卫性反应，但同时过多活性氧的产生亦使植物体自身受到氧化胁迫[ 30 ] -[ 32 ] 。在干旱、低温胁迫下，苹果砧木活性氧含量迅速上升，活性氧的清除能力在一定程度上反应了砧木的抗旱、抗寒能力[ 33 ] [ 34 ] 。活性氧过氧化产物MDA含量与砧木抗性呈显著负相关，是评价各种苹果砧木抗旱、抗寒能力最为稳定的重要指标[ 35 ] [ 36 ] 。在植物体内，活性氧清除系统包含多个组分，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)六大酶系，活性氧的清除是多种酶系的协同作用(图1) [ 37 ] -[ 39 ] 。在轻度或短期水分胁迫下，苹果砧木SOD活性呈上升趋势， 而在严重或长期胁迫条件后期则出现下降走向，综合表现为抗旱性强的品种较抗旱性弱的品种 Table 1 Regulation pathway and major components in fruit trees under stress condition 渗透调节 Osmotic regulation 抗氧化防御调节 Antioxidant defense regulation 胁迫蛋白调节 Stress proteins regulation 信号转导调节 Signal transduction regulation 游离脯氨酸Free proline 超氧化物歧化酶(SOD) 胚胎发生后期丰富蛋白(LEA)水通 脱落酸(Abscisic acid， ABA) 甜菜碱Betaine 过氧化氢酶(CAT) 道蛋白(AQP) DREB1/CBF， DREB2 海藻糖Trehalose 抗坏血酸过氧化物酶(APX) 抗冻蛋白(AFP) bZIP， WRKY 甘露醇Mannitol 谷胱甘肽还原酶(GR) 磷脂酰甘油(PG) MYC/MYB 无机离子Inorganic ions 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX） 脂酰基载体蛋白(ACP) ICE 表1. 果树逆境调节途径及其主要组分 图1. 植物体活性氧的产生及清除系统[ 38 ] 能够维持较高的SOD活性，而CAT活性则呈双峰曲线变化。在抗旱能力相差较大的新疆野苹果和平邑甜茶砧木的对比研究中，抗旱性较强的新疆野苹果APX、GR、DHAR酶活性本底水平及干旱诱导下的上升幅度均高于抗旱性较差的平邑甜茶[ 40 ] 。前人研究表明，干旱胁迫下抗旱性较强的砧木品种往往表现出较高的抗氧化酶活性。 苹果砧木在干旱、低温逆境条件下，各酶系活性/含量的上调先于渗透调节物质的积累。当活性氧含量超出清除酶系的抗氧化能力时，细胞结构与功能的完整性受到破坏，各酶系活性、活性氧及MDA含量迅速降低，而后脯氨酸、可溶性糖等含量开始上升。综合已有研究报道，本底水平的活性氧清除酶系是苹果砧木应对逆境胁迫的第一道屏障，而游离脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的含量变化更大程度上是细胞遭受氧化胁迫的结果而非抗氧化过程的主动应答反应，活性氧清除酶系是苹果砧木抗旱、抗寒能力的首要构成。 5.2. 信号转导调节 随着模式植物抗逆机制研究的日益深入，抗逆信号转导路径中越来越多关键组分功能得以阐明，从信号感知、传递、基因调控、蛋白表达到生理生化机制的阐明，模式植物为果树抗逆机理的研究提供了丰富的借鉴信息(图2) [ 41 ] [ 42 ] 。随着苹果基因组序列的公布，越来越多的以苹果砧木为试材的抗旱、抗寒调控基因获得克隆。 苹果砧木中，DREBs家族广泛参与抗逆调控，DREB1/CBFs、DREB2分别在抗旱、抗寒信号转导应答中发挥功能[ 42 ] -[ 44 ] 。Du等通过对低温处理后苹果叶片基因的表达变化，证实DREB1/CBFs为受低温诱导最为强烈的基因成员[ 45 ] 。Zhao等检测了苹果基因组中68个DREB家族成员，分别鉴定获得了干旱、低温应答基因[ 43 ] 。在ABA调控路径中，Kondo等克隆获得了ABA合成关键酶基因MdNCEDs及ABA活性调节基因MdCYP707A，并对其在干旱胁迫下的表达模式进行了分析[ 46 ] 。此外，转录因子家族MYB [ 47 ] [ 48 ] 、bZIP [ 49 ] 、MAPK [ 50 ] 及信号组分ICE [ 51 ] 、LOS5 [ 52 ] 等在植物抗旱、抗寒调节中起着重要作用，并在苹果砧木中已有较多获得了克隆。相对于拟南芥、小麦等草本植物，苹果砧木中基因家族成员 图2. 干旱、低温逆境下植物信号转导调节路径[ 42 ] 数量更多，通过借鉴途径开展苹果砧木研究，难度在于如何从众多家族成员中鉴定出相应的主效基因及对其功能的验证。 除通过借鉴模式植物同源获得功能基因外，苹果砧木抗旱、抗寒研究通过消减杂交、转录组测序、分子标记等方法也获得了较多原初抗性基因。Feng等利用苹果数据库表达序列标签，调取了bHLH转录因子家族，通过RT-PCR法鉴定出了低温胁迫应答成员[ 53 ] 。Wang等以楸子叶片为试材构建了干旱胁迫下抑制消减杂交(SSH) cDNA文库，分离获得了苹果属首个RBP家族抗旱相关基因MpGR-RBP1 [ 54 ] 。此外，Wisniewski等以嘎啦苹果为试材，分别进行干旱、低温处理，构建了叶片、韧皮部、木质部、根组织的转录组文库，获得了大量干旱、低温调节基因，其中20%为新发现基因[ 55 ] 。以苹果栽培品种/砧木为试材获得原初抗性基因，构建基于试材本身的信号转导路径，是促进分子标记技术从随机扩增向功能基因标记转变的必要前期基础。同时，挖掘试材自身的功能基因进行遗传转化，将减少依赖源自拟南芥、农杆菌、病毒、动物等外源基因改善砧木抗性的现状，避免物种间的基因交叉，减少转基因育种的安全隐患和公众顾虑。