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user: 3. 16sRNA序列分析方法 3.1. 克隆文库的Sanger测序 Sanger双脱氧链特异测序法是最为传统的经典测序方法，也是实验室常用的序列分析方法 [ 8 ] 。首先应用通用引物或是特意引物对目的基因进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆，建立克隆文库，随后对克隆文库进行Sanger测序。将测得的序列与数据库中的序列进行比对，应用统计学软件构建系统发育树，从而分析未知生物与已知物种的关系。此方法的优势就是能够扩增培养和非培养的细菌，目前单次测序长度可长达1000 bp，一次能进行96或384个样本的测序，准确率高达99.999%。因此获得的信息位点较多，获得的系统发育关系较精细 [ 9 ] 。其缺点就是存在PCR退火偏差 [ 10 ] ，克隆偏差，并且因耗时耗力，取样量往往不够，测序深度较浅 [ 11 ] 。因此，该测序方法测定的主要是PCR产物中的优势拷贝，对于混合菌株中的低含量的菌株序列则很难获得，对特定环境中的菌群多样性进行分析不如二代测序技术灵敏。应用Sanger测序法分析16sRNA基因已经广泛应用到牙周疾病与健康的研究中了。例如，Hutter等人通过对26个牙周疾病患者牙菌斑进行Sanger测序法分析以后发现12种与牙周疾病相关的致病菌 [ 12 ] ，而Kumar等人通过比对健康人群与牙周疾病患者的口腔细菌多样性发现，牙周疾病是这个口腔菌落平衡被扰乱的结果而不是某一特定病原菌的变化造成的 [ 13 ] 。 3.2. 通用引物高通量指纹技术 变性梯度凝胶电泳，温度梯度凝胶电泳，单链构象多态性(DGGE，T-RFLP，SSCP等)及限制性酶切长度多态性等都是基于PCR技术发展起来的指纹技术，省去了建立克隆基因文库的麻烦，因此被广泛应用于微生物群体多样性的研究。将特定微生物群落DNA库中的16sRNA基因进行PCR扩增，将PCR混合产物进行DGGE/TGGE，DGGE和TGGE分别通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度和线性温度梯度可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。DNA序列不同，在不同变性浓度下变性获得的电泳条带位置也不相同，理论上认为一个条带就代表一种细菌 [ 14 ] 。实验所获得的指纹图谱反应了群落的结构，包括其复杂性以及每一个被检测种属的相对含量。将凝胶上的条带进行回收、克隆及测序，便可鉴定对应微生物的种属。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对条带的序列分析特异性探针杂交分析鉴定群落组成。例如，Ledder等人对47个牙菌斑样本进行DGGE分析，并对其中的特异条带进行测序分析，结果表明在牙周炎患者中放线杆均属中的伴放线菌聚集菌含量较高 [ 15 ] 。PCR-SSCP技术则是利用单链DNA因序列不同而具有不同的空间构象，其在凝胶中具有不同的迁移率，因此长度相同可以进行序列差异的测定，而敏感度会随着片段长度的增加而降低。但是只要条带被凝胶电泳分离开就可以进行系统发育的研究。该方法受电泳条件限制，对操作手法要求较为苛刻，因此，影响了该技术在口腔微生物中的应用。PCR-RFLP是一种非常流行的被广泛应用的高通量指纹图谱技术。因为不同的菌属在16sRNA基因的不同位置含有不同数量的限制性内切酶的酶切位点，因此也可以将PCR产物应用不同的限制性内切酶切进行水解，水解后产物进行电泳则得到不同细菌的酶切图谱，实验获得的“指纹”图谱反应了菌群的结构。PCR-RFLP结合测序技术被广泛应用到口腔微生物研究中，特别是对临床疗效的评估中。例如，Sakamoto等人发现对牙周疾病治疗三个月以后，牙龈卟啉单胞菌，连翘菌，齿垢密螺旋体等含量下降 [ 16 ] ，表明这些菌种与牙周疾病有关。总之，指纹技术是一种高效可重复的技术，常常用于监测菌群结构和组成的变化 [ 17 ] - [ 19 ] ，其缺点就是不同的指纹图谱数据难以进行比较。 3.3. 通用引物结合基因芯片法 该技术的原理是基于DNA-DNA杂交技术。DNA-DNA杂交技术就是两个单链DNA分子互补碱基退火的过程。应用一个带有标签的已知DNA序列作为探针来结合目标序列，从而达到鉴定目标序列的目的。将一种菌的16sRNA基因的多个可变区域的序列制作成探针，若目标群落中有这种菌在这几个探针位点上会有信号显示。从而达到鉴定的目的。将已知菌种的16sRNA基因序列制成探针，将他们以点的形式固定到一块固体基片上就成了基因芯片。芯片技术操作简单、检测快速，但是芯片检测出的菌必须是数据库里含有的16sRNA的基因，因此会忽略了一些未知的、未被发现的细菌的存在。这个方法比较适合在特定环境中寻找某种特定的菌以及测定特定微生物种群16sRNA在总sRNA中的比例。例如，Haffajee等人应用DNA-DNA杂交技术研究了吸烟对口腔微生物构成的影响，结果发现吸烟与非吸烟的人菌群差异主要在分布在上颌牙菌斑中，并且其差异并不表现在菌的数量和比例上，而是表现在流行菌株的不同 [ 20 ] 。 3.4. 焦磷酸测序 焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的 [ 21 ] 。该技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、快速、直观的特点。为了增加同时测序量及降低成本，一些研究者在引物前面加入模板特异性的“条形码”序列，在边合成边测序时就可根据“条形码”序列得知模板来源 [ 22 ] 。焦磷酸测序技术早在1996年就被用于口腔微生物的研究中 [ 23 ] 。但是由于最初价格昂贵，大多数研究者都只是对少量样本采用此方法。近年来由于测序成本的降低，该方法被大规模广泛的应用到临床口腔微生物的研究中 [ 24 ] - [ 27 ] 。Ahn J等人比较了芯片法和焦磷酸测序技术，结果表明焦磷酸测序技术获得的菌谱更广，检测更加灵敏 [ 28 ] 。与Sanger测序法相比，焦磷酸测序技术具有高通量快速等优势，已经成为口腔细菌多样性研究的重要手段。该技术的缺点就是测序长度有一定的限制，一般长度在150 bp左右，因此，焦磷酸测序的策略，不能针对整个基因进行测序，而主要针对各个可变区进行测序。既要考虑测序长度的限制又要尽可能获得更多的信息位点，通常情况下都是几个可变区联用 [ 24 ] [ 26 ] [ 27 ] 。由于研究者所选取的区域并不相同，给数据的比较带来了较大的问题，为了探讨哪些可变区域更适合研究口腔细菌，Kumar等人将16sRNA基因的9个高可变区分成三段，通过与sanger测序法比较，发现V1-3结合V7-9区所获得的结果与克隆全长测序结果相一致，表明焦磷酸测序16sRNA基因的V1-3和V7-9区是研究口腔细菌多样性最为合适的方法 [ 5 ] 。最近，美国Thermofisher公司针对16sRNA基因高可变区开发了一个试剂盒(Ion 16S metagenomics kit)，此试剂盒包含的引物对覆盖V2-V4及V6-V9区，可以获得极为准确的微生物信息，使得口腔细菌16sRNA基因序列多样性研究更为简单快捷。 总之，以上各种序列分析方法各有优缺点(见表1)，我们应该根据研究目的的不同选择相适宜的方法。 Table 1 The advantages and disadvantages of the 16sRNA gene sequence analysis methods and their applicable scop 序列分析方法 优点 缺点 适用研究方向 Sanger 测序 读长长，质量高，信息量高 测序深度浅，只检测优势菌种，费时 对特定菌种进行研究 通用引物高通量指纹技术 可重复，操作简单 不同指纹数据无法进行比较 菌群的时空变化 通用引物结合基因芯片法 操作简单、检测快速 无法检测未知的菌种 特定环境中特定的菌的分析 焦磷酸测序(二代测序技术) 测序深度深，灵敏，高通量，快速 昂贵，读长短，信息量少 对未知环境菌群多样性进行分析 表1. 16sRNA基因序列分析方法优缺点的比较及其适用范围