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user: 2. CS的生物学活性 2.1. 角膜修复 CS是角膜基质的成分之一，化学性质稳定，无毒、无刺激性，被用于保存角膜以及眼科手术复合黏弹剂。CS能稳定细胞代谢的微环境，为细胞的移行提供构架，促进角膜上皮细胞的移行，减轻炎症反映，从而促进角膜创伤的愈合 [ 14 ]，因此CS复方滴眼液在临床被用于治疗角膜损伤以及干眼症 [ 15 ]。角膜损伤后的修复过程由ECM、细胞因子和HCEC等常驻细胞共同参与的 [ 16 ]，血小板裂解物是富含血液生长因子的血液衍生物质，CS每个重复的双糖单位带有两个负电荷，可通过静电作用与血小板裂解物中的带正电的生长因子结合。Sandri等 [ 17 ] 向市售隐形眼镜中加载了CS以及血小板裂解物，增强药物在角膜前区域的持久性并促进伤口愈合。 Wang等 [ 18 ] 用羟基琥珀酰亚胺基团修饰的CS与兔角膜进行交联，能够改善正常角膜和圆锥角膜的力学性质，恢复圆锥角膜的胶原密度和排列，并且角膜细胞的促炎基因表达显著下调，提供了一种有效、安全和生物相容的角膜加固方法。从其他物种获得的脱细胞角膜用于角膜移植是角膜工程研究热点之一，然而脱细胞角膜在去除细胞内容物和抗原后仍会引起免疫反应导致移植排斥 [ 19 ]。最新研究 [ 20 ] 发现CS的引入可以恢复纤维基质扭曲的构象变化，减少移植排斥。将山羊脱细胞角膜与氧化的CS交联后植入兔角膜基质中培养3个月，发现胶原纤维构象恢复，角膜上皮细胞向植入结构的迁移，消除了脱细胞角膜的高免疫反应性。因此认为CS交联脱细胞角膜基质可作为同种异体移植物的有效替代物。 2.2. 免疫调节 不同生物组织中提取的CS具有不同的硫酸化模式和不同分子量结构，在免疫调节中的作用也不尽相同 [ 21 ]。早年研究中，CS 通过细胞表面受体介导，降低p38丝裂原活化蛋白激酶和信号调节激酶1/2的磷酸化，从而抑制NF-κB的核易位，减少促炎细胞因子如TNF-α、IL-6以及促炎酶如磷脂酶A2、环氧合酶2、基质金属蛋白酶-13和一氧化氮合酶2释放的抗炎途径在软骨细胞中得到证明 [ 22 ] [ 23 ]，CS还可能通过该途径增加骨保护素的表达，抑制破骨细胞的激活 [ 24 ]。Calamia等 [ 25 ] 从人类关节软骨细胞分泌组中鉴定出18种可被CS调节的蛋白质，并且用IL-1b刺激正常软骨细胞后观察到CS通过减少几种补体成分(CFAb，C1S，CO3和C1R)直接降低炎症反应，并且发现CS以浓度依赖的方式促进血管生成抑制剂血小板反应蛋白-1的增加，可能是CS在骨关节炎(osteoarthritis， OA)中抗新生血管生成的潜在机制。Korotkyi等 [ 26 ] 发现CS可使大鼠膝关节软骨中OA诱导的前列腺素过氧化物酶2和转化生长因子-β表达上调被抑制。表明CS作为药物可能有助于控制炎性应激的关节分解代谢作用，可用于预防关节退行性变。这些研究解释了CS减轻OA症状，缓解关节损伤的潜在机制。 Canas等 [ 27 ] 证实大鼠星形胶质细胞炎症中CS阻止NF-κB p65亚基转运到细胞核从而抑制NF-κB活化，同时该过程没有涉及Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)途径的蛋白，最可能是通过抑制Toll样受体-4 (TLR-4)介导的炎症通路来实现的。炎症过程中巨噬细胞可被激活为促炎表型或抗炎表型，前者可分泌多种促炎细胞因子和趋化因子，例如活性氧(ROS)，一氧化氮(NO)，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，白介素-1β (IL-1β)，IL-6，IL-8等清除抗原 [ 28 ]，而后者可以产生炎症抑制因子，例如IL-10和精氨酸酶-1以抑制炎症和促进组织修复 [ 29 ]。CS的抗炎活性众所周知，但对巨噬细胞的激活机制尚不明确。Wu等 [ 30 ] 发现CS以浓度依赖方式刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7产生ROS，促进巨噬细胞吞噬大肠杆菌，程度与阳性对照组近似。CS对促炎因子NO，IL-6和TNF-α的生成具有一定的增强作用，但均低于阳性对照组，而对抗炎因子IL-10的增强作用明显高于阳性对照组。认为CS具有潜在的促进清除外来入侵并增强宿主免疫的功能。实验中还应用多种模式识别受体抗体探究CS对巨噬细胞激活的通路，首次发现TLR-2参与CS介导的巨噬细胞活化。 环磷酰胺是一种常用化疗药物，有骨髓抑制以及心脏毒性等副作用 [ 31 ]。粒细胞集落刺激因子是造血糖蛋白增殖因子，可刺激中性粒细胞、血细胞增殖。Niu等 [ 9 ] 从海参中提取了两种FCS (FCShp， FCSht)，证明二者对CTX诱导的骨髓抑制小鼠的造血功能恢复具有有益的作用。FCShp、FCSht实验组小鼠血浆中白细胞、红细胞、中性粒细胞，淋巴细胞和血小板再生良好，与粒细胞集落刺激因子对照组无显著差异。实验组中小鼠脾脏组织形态恢复，而对照组仅表现为细胞聚集。另外，TNF-α和IL-6被认为是心脏毒性反应中炎症反应的指标，FCShp、FCSht治疗可将血浆中TNF-α，IL-6降低到接近正常水平。 CS糖链的硫酸化模式、功能基团可修饰性，以及CS的来源和分子量等都是影响CS在免疫调节中发挥不同作用的因素，对其机制的深入研究可以为治疗多种疾病提供新的思路。 2.3. 保护软骨 骨关节炎属于退行性病变，并且伴随各种促炎因子的释放，目前常用的抗炎药及镇痛药仍以缓解症状为主，因此新的治疗途径以降低骨关节结构伤为重点，CS的抗炎活性及软骨保护活性对骨关节炎中的软骨细胞增殖和ECM再生有益 [ 32 ]。 近期临床试验 [ 33 ] 比较了CS联合氨基葡糖与塞来昔布治疗膝骨关节炎的疗效和安全性，结果表明6个月后CS联合氨基葡糖用药在减轻疼痛、僵硬、功能受限和关节肿胀方面具有与塞来昔布相近的疗效。研究 [ 34 ] 显示单独口服CS在缓解症状性膝骨关节炎患者疼痛和改善功能方面优于安慰剂，与塞来昔布相似。足够的临床数据支持口服CS是对症治疗OA安全、有效方法，Wildi等 [ 35 ] 使用核磁共振成像观察到使用CS治疗膝关节OA患者从6个月开始软骨体积损失显著减少。Terencio等 [ 36 ] 在大鼠骨关节炎模型上证明了CS-氨基葡糖在体内有软骨保护作用，并观察到炎症因子水平降低。最新研究 [ 37 ] 还发现在全膝关节置换术女性患者的骨关节炎样品中总的CS浓度和CSA二糖显著降低(p < 0.05)，推测CSA下调是软骨破坏的潜在机制，可作为骨关节炎软骨退化的诊断标志和治疗方向。 这些发现提示了CS对关节结构修复作用，并为其在膝骨关节炎中的作用方式提供了新的体内信息。CS对软骨的保护作用，使它在软骨粘合剂，软骨细胞支架，可注射水凝胶药物载体等软骨工程中大量应用。 2.4. 调节肿瘤生长 天然CS广泛存在于细胞表面和ECM中，影响细胞行为和ECM生物力学和生物化学性质。最新的研究发现CS硫酸化模式的改变可能对某些抗体结合能力产生影响。Pudelko等 [ 38 ] 提出了肿瘤细胞中CSC的积累对癌症进展和转移的可能存在双重影响。仍然可以肯定的是，肿瘤转移可以被外源CS有效抑制 [ 39 ]，如外源性CSE通过竞争机制干扰癌细胞自身的CSE与正常组织高亲和性受体结合 [ 40 ]，FCS可以通过阻断P选择素和L选择素介导的信号传导而抑制肿瘤转移 [ 41 ]，近期Liu等 [ 42 ] 提取并制备了低分子量FCS，在鼠Lewis肺癌模型中低分子量FCS以剂量依赖性方式显著抑制LLC的生长和转移，低分子量FCS还可抑制血管内皮生长因子的表达、诱导细胞周期停滞、下调基质金属蛋白酶水平来发挥抗肿瘤作用。 Pan等 [ 43 ] 指出与正常脑组织相比，CSA和CSC在人脑胶质瘤组织中的表达上调，并且上调的程度与脑胶质瘤恶性程度正相关，因此可能代表了神经胶质瘤治疗中的目标。Zhang等 [ 44 ] 发现小鼠癌症模型及卵巢癌，宫颈癌，食道癌或肺癌患者的血浆胎盘样硫酸软骨素A含量均高于健康对照组，提出血浆胎盘样硫酸软骨素A可能是一种非侵入性生物标志物，可用于多种类型实体肿瘤患者的筛查和监测硫酸软骨素蛋白聚糖-4 (CSPG-4)在黑色素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤等多种恶性疾病中过表达，在肿瘤细胞的生长和存活以及扩散和转移中发挥作用，因此许多研究致力于以CSPG4为靶点开发抗癌方法，例如在嵌合抗原受体T细胞免疫治疗中，胶质母细胞瘤中CSPG4的高表达极大地降低了细胞逃逸的风险 [ 45 ]。Harrer [ 46 ]、Kristina [ 4 ] 对上述机制做了详细综述。 2.5. 促进生物矿化 生物矿化 [ 47 ] 是机体代谢产物中无机元素在有机环境调控下选择性析出并形成高度有序的矿化物的过程，如牙齿、骨骼中羟基磷灰石(hydroxyapatite， HAP)的形成。在新骨形成过程中非胶原糖蛋白对HAP成核起到重要调节作用，因为它们丰富的酸性基团对钙离子具有很强的亲和力，通过增加局部钙浓度来加速羟基磷灰石晶体成核 [ 48 ] [ 49 ]，富含硫酸盐和羧酸盐基团的CS被认为是羟基磷灰石成核和生长的有效促进剂 [ 50 ] [ 51 ]，可充当组织矿化的中间体，在成骨过程中调节矿物质晶体的沉积和生长形态 [ 52 ]。有人指出CS通过抑制HAP晶体介导的矿化过程中“过饱和驱动界面结构失配”过程 [ 53 ] 来帮助形成高度有序的HAP。 Xiao等 [ 50 ] 发现CS对HAP形态的影响可能与CS的结构有关。CS是重复的二糖单元的线性多糖，其阴离子特性使带正电的钙离子均匀地沉积在材料表面，吸引带负电的磷酸根离子，从而启动了HAP在ChS上的结晶过程。在低浓度的CS中获得了纤维状HAP，当溶液中CS的浓度增加时，糖链相互交联形成二维网络结构，可获得较大的片状HAP，HAP的结晶度与CS浓度成正相关。天然胶原蛋白在ECM中为生物矿化提供了重要的机械支撑和生物调节作用。最新实验 [ 54 ] 将CS交联固定在胶原纤维上能够提高HAP矿化速度，且HAP晶体在材料中的排列近似于生物中胶原矿物形态。随机光学重建显微术结果证实了CS为HAP优先形成提供了特定的成核位点。将CS固定在脱矿牙本质模型中进行48小时再矿化，观察到4~5 μm的新形成的再矿化层，类似于完整牙本质，未经修饰的牙本质仅出现了极薄的修复层。这些研究为理解生物大分子CS在生物矿化功能提供了新见解。 2.6. 抗病毒作用 CS具有多种抗病毒的生物活性。登革热病毒分泌的NS1通过与CSE和硫酸乙酰肝素的相互作用附着在宿主细胞表面 [ 55 ]，因此外源性CSE具有靶向登革病毒包膜蛋白的抗病毒活性 [ 56 ]。Jinno等 [ 57 ] 发现来源于鱿鱼软骨的CSE具有抗1型人T细胞白血病病毒的活性。CSE可以与重组1型人T细胞白血病病毒包膜蛋白直接相互作用抑制病毒粒子与白血病细胞的结合，并抑制合胞体形成。FCS-1对艾滋病病毒，特别是T-20耐药株表现出高效的抗病毒活性，他能有效地结合重组HIV-1 gp120蛋白，通过干扰病毒进入细胞而有效抑制艾滋病毒复制 [ 58 ]。2型单纯疱疹病毒进行粘膜感染的第一步是通过与宿主细胞膜上天然存在的某些糖胺聚糖结合，Galus等 [ 59 ] 利用这种相互作用设计了基于CS的仿生超分子六角形纳米组件，这种生屏障可以像“陷阱”一样专门捕获病毒并避免其附着在细胞上，具有更好的抗病毒活性。因此，特定类型的CS作为病毒抑制剂有进一步开发的巨大潜力。