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user: 3. 结果与讨论 3.1. 细胞及DNA脱除的有效性 脱细胞前后细胞和DNA的脱除情况如图1所示，经过反复冻融之后，倒置荧光显微镜下能观察到几乎所有细胞都被脱除，剩下的荧光也大多为不完整的细胞残片，说明通过反复冻融法脱除细胞的方法可行。DNA的脱除率达到了97%以上，认为达到了脱除免疫原性的目的。 图1. 脱细胞前后细胞及DNA残留情况：脱细胞前DAPI染色(a)；脱细胞后DAPI染色(b)；脱细胞前后DNA定量试剂盒测定结果(c) 经过反复冻融和DNA酶解法的处理，仍然有少量的细胞碎片和DNA残留。目前，在脱细胞的研究方面，如何完全脱除细胞和免疫物质的同时更好地保留ECM中的活性成分仍然是一个矛盾的问题。基于已有的研究，反复冻融法对于细胞和DNA的去除程度来讲并非最佳方法，但对相关活性成分的保护相对更优，考虑到本研究重点为其中的活性物质对BMSCs向成骨细胞分化的促进作用，故而采用上述方法以保留更多的活性物质。另一方面，在实际应用中，允许可接受范围内免疫反应发生，上述结果表明的细胞碎片和DNA的残留量是否满足应用的条件可以考虑通过动物实验进行验证，可通过将获取的dECM直接植入大鼠皮下来验证免疫反应。 3.2. dECM中活性物质的保留 dECM分散液中及冻干的dECM中的活性物质的浓度由ELISA试剂盒测定，结果如表2所示，干重计算通过冷冻干燥测定质量，计算分散液中活性物质的总量，换算出dECM干重中的含量。 Table 2 Determination results of ELIS Samples COL-I (ng/mL) BMP-2 (pg/mL) VEGF (pg/mL) OC (pg/mL) Group 1 5.804 150.73 230.36 332.12 Group 2 5.864 148.81 214.29 326.35 Group 3 5.971 171.88 221.43 336.95 Average 5.877 157.14 222.03 331.81 Contents in dried dECM 230.89 ng/mg 10，047.34 pg/mg 10，857.16 pg/mg 16，866.42 pg/mg 表2. ELISA测定结果 已有的研究在动物实验中加入的外源性BMP-2溶液浓度为μg/mL级，在体外细胞试验中外源性VEGF使用浓度为ng/mL级，与本研究中分散液中的GFs浓度差异较大，考虑已有研究中的GFs为人工合成，测定的浓度为添加的浓度，在一系列操作之后活力会大大降低，最终有效的作用浓度远远小于添加的浓度，而本研究中获取的GFs为细胞自身表达，测定结果为具有活力的浓度，另外，通过在无菌条件下制成冻干粉再进行复溶预计可以获得活性成分浓度更高的分散液。 3.3. dECM对BMSCs行为的影响 MTT对BMSCs增殖情况的测定结果如图2所示，从图2的结果可以看出不同时间下的细胞增殖情况表现为低浓度下细胞活力更强，高浓度下细胞活力不仅没有促进作用甚至在培养第3天表现出显著的抑制作用。 图2. 不同dECM含量不同培养时间的细胞增殖 ALP的定性和定量检测结果如图3、图4所示，如图3所示，2%和4%的实验组ALP的显色情况明显强于0%的对照组，4%以上的实验组相对于对照组没有明显差异甚至弱于对照组。如图4所示，2%和4%的实验组ALP的活力显著高于0%的对照组，8%及以上的实验组则表现出明显的抑制效果。矿化结节的染色结果如图5所示，0%的对照组完全没有矿化结节的存在，实验组虽然都存在矿化结节，表现为2%和4%的矿化结节的生长量最大，之后随着浓度的上升表现出一个逐渐下降的趋势，最高浓度和对照组之间仍存在显著性差异，故而说明了所有含有dECM分散液的实验组中均存在成熟的成骨细胞，即均含有一定数量的BMSCs完成了向成骨细胞分化的过程。 图3. 不同dECM含量培养的ALP显色试剂盒测试的结果 图4. 不同dECM含量培养ALP活力检测试剂盒测试的结果 图5. 不同dECM含量培养茜素红染色的结果 在上述试验中，针对细胞增殖、ALP定性定量检测和矿化结节染色结果中表现出的低分散液浓度下促进效果显著，高浓度下促进效果相对较差，甚至出现抑制作用的问题。理论上讲，分散液中各活性成分的浓度远没有达到已有研究的常用浓度，随分散液浓度上升，对BMSCs的增殖和分化的促进效果应该呈现上升趋势，分析认为由于稀醋酸的引入导致培养基pH值出现一定的下降，同时培养基中的酚红指示剂也证明了培养基的酸碱度存在下降的情况。由于BMSCs属于嗜碱细胞，在7.2左右的弱碱性环境下细胞状态最佳，故而pH值随着分散液浓度的增加而下降会导致细胞增殖受到一定的影响，同时也会影响细胞向成骨细胞分化过程中ALP的分泌和矿化结节的产生。另一方面，ALP是一种含锌的糖蛋白，最适宜pH为10，在微酸性条件下活性可能受到严重影响或是高浓度组ALP表现为明显抑制的另一个原因。综合分析低浓度下对BMSCs增殖分化的显著促进效果，本研究认为利用醋酸分散的dECM用于促进BMSCs的增殖和分化的方式具有可行性，且如果解决醋酸引入的问题，推测促进效果还会更佳。针对解决醋酸引入的问题，因为本研究的重点是使用dECM涂装可降解的多孔聚合物支架材料，通过干燥过程可以除去引入的醋酸，因此在本研究中未进行除去醋酸的相关试验，建议可以通过引入一定的弱碱性物质综合其中的酸性，但是引入弱碱物质是否会导致分散液中活性成分浓度的进一步下降以及引入物对细胞是否有其他的影响还有待考证。 3.4. dECM涂装支架的成骨促进作用 dECM涂装的支架与BMSCs共培养之后ALP的定性和定量检测结果如图6所示，可以观察到实验组和对照组之间也存在显著性差异。由此证明涂装了dECM的多孔聚合物支架的生物学功能得到了有效的提升，实现了促进BMSCs向成骨细胞分化的作用。利用茜素红S对矿化结节的染色情况如图7所示，同样相比于没有涂装的多孔聚合物支架，矿化结节有显著增加，矿化结节为BMSCs向成骨细胞分化后期，即成骨细胞成熟阶段的标志，由此可以得出通过涂装的多孔聚合物支架可以促进BMSCs向成骨细胞分化。 图6. ALP测试的结果：(a) 空白PGA/PCL显色结果；(b) dECM涂装PGA/PCL显色结果；(c) 空白PLGA显色结果；(d) dECM涂装PLGA显色结果；(e) PGA/PCL定量结果；(f) PLGA定量结果 图7. 矿化结节染色结果：(a) 空白PGA/PCL；(b) dECM涂装PGA/PCL；(c) 空白PLGA；(d) dECM涂装PLGA 从ALP定性和定量试验的结果来看，对于ALP的促进作用大于之前含有分散液的培养基培养BMSCs的效果，可以推测涂装在支架上，随支架材料降解而进入培养基中具有促进作用的活性成分含量应该更高，同时因为支架材料在涂装之后经过无菌干燥处理，分散液中的乙酸本身具有一定的可挥发性且含量相对较低，在干燥过程中挥发并脱离支架材料，从而因为乙酸改变培养环境pH值而影响BMSCs增殖和成骨分化的问题得以解决。 另一方面，目前也有研究将BMSCs提前种植在聚合物支架材料上，让细胞在支架材料上黏附增殖，再利用地塞米松诱导其向成骨细胞分化并脱除细胞和免疫物质，从而得到涂装了dECM的聚合物支架材料。两种方式对比，虽然通过先种植细胞的方式获得的dECM涂层理论上没有经过分散处理，应该具备更加完整的三维空间结构，在后续BMSCs的再种植时可以更好地促进细胞在支架材料上的黏附。但是本身没有进行涂装的聚合物支架材料由于其不利于细胞的黏附的限制，在进行第一步种植过程中，细胞在支架上的增殖必然受限，另外经过脱细胞处理后支架材料上的dECM涂层存在容易脱落的问题。同时，由于细胞增殖进入多孔聚合物支架的孔隙内部，脱除细胞和免疫物质的彻底程度也会受到影响，另外在整个过程中，支架材料会在培养液中浸泡较长时间会导致可降解材料发生降解而发生形态上的变化以及相对于将dECM分散后涂装的方式在应用于批量化生产时存在更多的技术难点。 综上所述，本研究认为通过醋酸分散dECM后，利用真空浸渍法对可降解多孔聚合物支架材料进行涂装的方式具有研究价值和应用前景。