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user: 5. TFR1抗体在跨血脑屏障药物脑内递送方面的研究进展 5.1. TFR1抗体跨血脑屏障脑内转运潜力开发 早期的研究表明，TFR1在啮齿类动物和灵长类动物的脑毛细血管内皮细胞上有功能性表达，且表达量显著高于外周毛细血管内皮细胞。这种高表达属性在脑毛细血管内皮细胞离体培养初始就会丢失，结合脑内TFR1广泛存在这一事实，说明脑毛细血管内皮细胞上TFR1表达增加在维持脑内铁稳态方面具有重要作用 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]。早期的同位素示踪实验已经证明，无论是铁元素还是转铁蛋白(transferrin， Tf)都可以被高度选择性内吞入脑毛细血管内皮细胞，只不过两者在细胞内的命运不同。铁元素在细胞内被富集随后很快分散于脑实质中，有关铁元素由内皮细胞进入脑实质的机制目前依旧处于研究中。Tf在内皮细胞中的饱和度远远小于铁元素，这种现象与受体介导的转包吞相符，不过Tf-TFR1复合物在脑毛细血管内皮细胞内转包吞确切路径目前依旧不是很清楚 [ 12 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]。从21世纪开始，研究者对TFR1抗体跨血脑屏障脑内转运能力进行了广泛的研究，如早期设计靶向TFR1非配体结合部位的TFR1抗体(8D3， OX26)。8D3为一种大鼠来源针对小鼠TFR1的非配体竞争性抗体。OX26为一种小鼠来源针对大鼠TFR1的非配体竞争性抗体。非配体竞争性旨在不影响受体功能和BBB完整性的同时，希望通过TFR1介导的转包吞作用实现TFR1抗体脑内渗透。虽然Pardridge WM [ 17 ] 等人将8D3作为药物转运载体明显增强了中风 [ 18 ]、阿尔兹海默症 [ 19 ]、帕金森病 [ 20 ]、黏多糖贮积症 [ 21 ] 等中枢神经系统疾病治疗药物小鼠脑内药效，但这些实验中缺乏直接证据表明TFR1抗体脑实质的广泛存在。这些实验缺少恰当的同型对照，同时不可忽略的抗8D3抗体在长期给药过程中的存在是否会对BBB完整性产生破坏进而影响实验结果这一点也没有得到验证。后期Gemma Manich等人的实验验证了8D3脑毛细血管内皮细胞的靶向性，但同时确认8D3无法有效实现向远腔侧转移，并且随着时间的推移8D3趋向于胞内降解。同样地，OX26也被证明更趋向于胞内降解 [ 22 ] [ 23 ]。 近十年来，研究者针对8D3、OX26等高亲和力抗体较低水平的脑内渗透原因提出了多种假设，并对这些假设进行了实验验证。Jens Niewoehner等人提出抗体价态可能在TFR1抗体跨血脑屏障转运中起到重要作用。天然配体的单价结合转包吞模式可能会被抗体双价结合模式打破，造成TFR1间的广泛交联，最终导致抗体滞留在细胞内走向溶酶体降解途径。这种假设在针对TFR1的单价抗体结合模式中得到了验证，实验中TFR1单价抗体更倾向于向远腔侧转运，具有更广泛的脑内暴露。单价抗体内吞后与溶酶体标志物共定位情况符合天然配体正常溶酶体降解命运，成功使运载的药物脑内暴露量增加了一个数量级，而正常双价抗体仅仅被发现定位于脑毛细血管内皮细胞内，与溶酶体共定位率超过了50%。这些结果表明TFR1抗体价态影响TFR1细胞内分选及命运 [ 24 ]。Y. Joy Yu等人提出了另一种假设，认为抗体的亲和力可能影响TFR1胞内转运，最终影响TFR1和抗体细胞内命运。作者通过对TFR1双价抗体和TFR1单价抗体进行亲和力改造，证明了无论是单价还是双价高亲和力抗体相比低亲和力单/双价抗体趋向于引起更多的TFR1内吞后降解。增加的TFR1降解显著减少TFR1的循环和BBB管腔膜上TFR1密度，这些可能最终导致高亲和力TFR1抗体脑内暴露减少。相比而言，低亲和力TFR1抗体更多地保持了TFR1正常胞内转运路径，显著增加TFR1抗体脑内暴露 [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]。除了TFR1抗体亲和力和价态对TFR1内化后分选途径产生影响外，抗体的pH敏感性也被认为对TFR1内化后命运产生影响。Hadassah Sade等人通过比较两个亲和力相当的TFR1抗体内吞入脑毛细血管内皮细胞后命运发现，在低pH下亲和力降低的抗体可以实现有效的转包吞，如同天然配体的转包吞一样，而pH不敏感的抗体则明显滞留在内皮细胞中最终被降解。这种pH敏感型抗体转包吞可以被内体酸化抑制剂所抑制。这些结果表明抗体在进入内体后因pH敏感性使之在内体酸性增加的条件下更趋向与TFR1解离，这有助于抗体摆脱降解命运，胞吐出细胞 [ 28 ]。除此之外，TFR1抗体识别的表位也可能会对TFR1内吞及胞内分选途径产生影响，因为从目前已知的Tf-TFR1复合物转包吞机制来看，无论是Tf与TFR1的结合，还是Tf-TFR1复合物内吞后内体酸化，TFR1本身一直经历蛋白空间结构的变化，而这种结构变化可能正是促发相应内吞及内体分选的关键信号，TFR1抗体与TFR1间的相互作用可能影响TFR1这一过程中正常的结构变化。相信随着对受体介导的转包吞机制研究深入，TFR1抗体跨血脑屏障转运潜力将会得到更大的开发。 5.2. 在脑部疾病治疗中的应用 血脑屏障阻挡外源病原体进入大脑的同时也阻挡了几乎所有生物大分子和超过98%小分子物质进入脑内。针对脑部疾病，虽然有很多候选药已经进入临床，如用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF) [ 29 ]、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor， CNTF) [ 30 ]；用于治疗脑卒中的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF) [ 31 ]、促红细胞生成素(erythropoietin， EPO) [ 32 ]；用于治疗帕金森病(Parkinson’s disease， PD)的胶质细胞源神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor， GDNF) [ 33 ]；用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease， AD)的bapineuzumab [ 34 ] 等。但由于缺少足够的脑内渗透，导致这些药物的临床治疗效果都不是很理想。药物要想发挥作用需要与靶标直接接触并且达到药效浓度。Yu YJ团队在之前的工作中已经验证了降低亲和力的TFR1抗体脑内生物利用度的显著提高。β分泌酶(BACE1)作为一种天冬氨酰蛋白酶，其有助于β淀粉样肽形成，是阿尔兹海默症治疗有效的靶点之一。研究表明，靶向TFR1和BACE1的双特性抗体(anti-TFR1/BACE1)无论是在hTFR1转基因小鼠还是在食蟹猴中都显示出高于亲本BACE1抗体的脑渗透和抑制β淀粉样肽产生的能力。同时该抗体并未对食蟹猴造血系统和全身铁稳态产生较大影响 [ 35 ]。黏多糖贮积症II (MPSII)为一种X染色体隐性遗传病，主要起于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)基因突变所致的IDS酶活丧失，引起包括硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS)在内的糖胺聚糖(GAGs)全身累积。目前该病的主要治疗方法为酶替代疗法，但传统的酶替代疗法无法实现脑内治疗。Hiroyuki Sonoda等研究人员将hIDS与hTFR1抗体融合，融合蛋白JR-141在3 mg/kg静脉注射剂量下，不仅使MPS II模型小鼠外周组织GAGs水平恢复正常，而且克服了传统酶替代疗法无法实现脑内治疗的局限，使大脑中GAGs水平降低到接近正常水平，MPSII相关中枢神经系统症状得到明显缓解 [ 36 ]。已完成的JR-141治疗MPS II的I/II期临床试验结果显示，以每周2 mg/kg剂量静脉给予JR-141，持续四周，安全且耐受性良好。四周疗程后患者脑内硫酸乙酰肝素(HS)相对治疗初始减少了约31.5% ± 3.9%，部分患者表现出运动和行为的改善 [ 37 ]。 多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme， GBM)是成人中最具侵袭性和致死性的脑肿瘤。外科手术切除和放化疗联合治疗依旧是目前最经典的方法，但GBM患者预后仍然较差。不良预后除了跟GBM自身的高侵袭性和浸润性有关外，还跟药物抗性密不可分。GBM对标准化学治疗剂替莫唑胺(Temozolomide， TMZ)的抗性目前认为主要是跟GBM细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)的过表达有关。因为该酶可以通过去除鸟嘌呤O6位上的简单烷基来修复TMZ诱导的DNA损伤。许多研究已经表明，增加p53抑癌基因表达可以下调DNA修复基因(如MGMT)的表达，增加肿瘤细胞对烷化剂的敏感性。Sang-Soo Kim团队通过将p53基因表达质粒封装于TFR1单链可变区抗体(TFR1scfv)修饰的脂质体中，构建好的免疫脂质体SGT-53已被证明可以实现脑内递送，有效降低GBM细胞内MGMT的表达。研究表明，SGT-53可以有效克服GBM对TMZ的抗性，SGT-53与TMZ联合给药可以增加GBM对TMZ的敏感性，显著延长GBM模型小鼠的生存期，甚至使肿瘤消退 [ 38 ] [ 39 ]。目前SGT-53和TMZ联合用于治疗GBM的二期临床试验已经结束，不过临床数据尚未公布。M.J. Ramalho等人使用OX26修饰的聚乳酸–乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒(NPs)包封TMZ，构建好的TMZ-loaded mAb-PLGA NPs免疫纳米颗粒显著增强TMZ对GBM的细胞毒性，同时OX26的存在降低了TMZ对BBB完整性的损伤 [ 40 ]。创新型纳米材料的迅速发展，使针对人体深部组织的远程物理刺激成为可能，比如在纳米肿瘤学领域应用的光热、光动力、磁热和机械能电能转换的纳米材料。这些纳米材料已被广泛用于开发治疗肿瘤的新疗法。压电纳米颗粒是一种可以实现机械能和电能相互转换的纳米材料，Attilio Marino等人用TFR1抗体修饰压电纳米材料钛酸钡纳米颗粒(BTNPs)，产生的AbBTNP实现了血脑屏障和脑胶质瘤的双重靶向。实验证明，在外界超声波的机械能激发下，BTNP转化的电能可以对脑胶质瘤增殖产生抑制作用，促进其凋亡。AbBTNP与TMZ联合给药具有协同作用，可以明显增强脑胶质瘤对TMZ的敏感性，体外实验显示出增强的抗肿瘤能力 [ 41 ]。不可否认，TFR1抗体的存在使得这些药物的脑部生物利用度得到显著提高，显著增加了药物的治疗潜力。随着TFR1抗体转包吞潜力的进一步开发，TFR1介导的转包吞有希望成为药物脑内递送安全可靠的途径。