DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 2. 实验材料与方法 2.1. 主要材料 液质联用仪，低温高速离心机，美国Beckman公司。多功能微孔板分析仪，美国Molecular Devices公司。基因扩增仪，美国Perkin Elmer仪器公司。实时荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司。甘油三酯(TG)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司。 2.2. 实验方法 2.2.1. 金芪降糖方对KKA y 小鼠肝脏和骨骼肌中糖脂代谢相关蛋白表达水平的影响 将C57BL/6J小鼠作为空白对照组， KKA y 小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)根据所测血糖值随机分为模型组、罗格列酮(市售，葛兰素史克(天津)有限公司，批号：09120151)组(10 mg/kg，5%的阿拉伯胶)、金芪降糖高剂量组(500 mg/kg，5%的阿拉伯胶)、金芪降糖低剂量组(250 mg/kg，5%的阿拉伯胶)。给药组给予相应剂量药物，空白组C57BL/6J小鼠和模型组KKA y 小鼠灌胃等体积阿拉伯胶，灌胃体积为20 ml/kg。每日各组于16:00~17:00灌胃一次。末次给药前禁食12 h，过量麻醉处死动物，解剖，分别取肝脏、骨骼肌组织进行蛋白质的提取和定量。应用SDS-PAGE电泳方法(具体方法：配制10%分离胶和5%浓缩胶，样品首先在70 V恒定电压下电泳至溴酚蓝接近分离胶的顶端，然后在100 V的恒定电压下电泳至溴酚蓝刚出胶底部即可终止电泳，进行转膜，使用半干转仪17 V恒定电压下转膜45 min。将转移好的膜移至封闭液中，室温下摇动封闭3 h，加入一抗(1:800)，4℃孵育过夜。洗涤后加入二抗(1:10，000)，室温下摇动孵育2 h后进行显色反应。应用多功能成像分体系统结合Quantity one v 4.62软件进行扫描和拍照，分析目标条带的灰度值)，然后测定PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GYS、p-GYS、GLUT4、PPAR-γ蛋白的表达。 2.2.2. 金芪降糖方对HepG2细胞脂质蓄积的影响 1) 细胞的培养 HepG2细胞株(购于中国医学科学院协和细胞库)。使用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸的MEM培养液，在37ºC，5% CO 2 的恒温培养箱中培养细胞，培养24 h后诱导分化，并采用MTT比色法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)计算细胞存活率。存活率% = A 样品组 /A 对照组 × 100。 2) 金芪降糖方对HepG2细胞脂质蓄积的影响 金芪降糖全方及各组分提取物(天津中医药大学中医药研究院中药化学实验室)用DMSO配制为64 mg/ml，-20℃保存，供细胞加药使用，实验终浓度为10 μmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L。 将HepG2细胞分为空白组、模型组(200 μmol/L油酸钠)、阳性药组(1 μmol/L Orli)、金芪降糖方及其组分高、低剂量组。制造TG蓄积模型。加药后作用48 h后，GPO-PAP法检测TG含量。 3) 金芪降糖方及其组分对HepG2细胞脂质蓄积作用机制的研究 将HepG2细胞分为空白组、模型组(200 µM油酸钠)、阳性药组(1 μM Orli)、黄芪总皂苷组(10 µg/ml AS)、黄芪总黄酮组(10 µg/ml HT)、黄连总生物碱组(10 µg/ml CA)、金芪降糖方全方组(10 µg/ml JQ)、金银花总有机酸组(10 µg/ml LA)以及相应抑制剂与激动剂处理组诱导分化细胞，制造TG蓄积模型。给药48 h后，GPO-PAP法检测TG含量。 2.3. 统计学处理 所有数据应用SPSS16.0统计软件进行分析。检测结果以均数±标准差( x ¯ ± s )表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)(Fisher检验)或者Wilcoxon秩和检验，符合正态性检验和方差齐性检验者使用F检验，多组间两两检验用LSD、图凯检验法(Tukey’s studentized range tests)或者Student-Newman-Keuls法。P < 0.05表明具有统计学差异。
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user: 4. 讨论 4.1. “脾主为卫”功能正常是糖脂代谢平衡的重要前提 脾运化水谷精微，充养卫气，行使卫外防御功能，即“脾为之卫”理论。该理论最早可追溯至《灵枢·五癃津液别》“五脏六腑，心为之主……脾为之卫，肾为之主外”的论述，《灵枢·师传》亦见“脾者主为卫”记载。“脾”护卫功能的临床意义在于 [ 8 ]：未病护脾可防发病，已病健脾可促病愈，病愈补脾可防复发。现代医家对其理解为：脾脏对于致病因素有主导防御作用，且在此基础上还可协同他脏发挥祛邪抑病、维持内环境稳态的功能 [ 5 ]。 中医精微物质转化与西医糖脂能量代谢存在着高度一致性 [ 9 ]。糖、脂是精微物质的主要构成成分，“脾主为卫”功能正常是可能糖脂代谢平衡的重要前提 [ 10 ]。正如李东垣所云：“脾受胃禀，乃能熏熟五谷”，脾病则运化无力，水谷精微堆积，壅滞日久的“湿浊、痰浊、血瘀”成为糖脂代谢病的“病原”和“病理”，故从中医理论出发，将糖脂代谢病命名为“瘅浊” [ 11 ]，由“瘅”致“浊”、相互交织、相互促进，与后期血管病变、多器官及系统损害的病理过程和临床表现具有一致性 [ 12 ]。 4.2. 内环境稳态失衡是“脾主为卫”糖脂代谢紊乱的关键环节 中医所指的“阴平阳秘”与西医所言“内环境稳态”均是通过相似的机体自身调节机制实现的 [ 13 ]。前者通过多成分、多靶点、多环节发挥作用，同步干预疾病发生发展的多个病理节点，逐步恢复机体内稳态，达到“治本”的作用，后者通过内环境系统内各通路间的平衡协调反馈控制完成。内环境稳态失衡则糖脂代谢出现紊乱，与中医“脾虚”失去了运化功能，水谷精微输布障碍的理论相符合，故“脾主为卫”环节在保证糖脂代谢稳态过程中起着至关重要的作用。 中药通过同时干预多条通路以调节疾病状态下失衡的代谢网络发挥整体疗效 [ 14 ]。虽然每条信号通路都有自身的路径引起激活状态，但是不同通路之间往往又会产生交互作用和影响，这或许就是“脾主为卫”环节通过多通路多靶点改善糖脂代谢紊乱的基础和综合疗效所在。在本实验中，金芪降糖方明显上调KKA y 小鼠骨骼肌内PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达，且不同程度地作用于AMPK及上游的各个靶点。实验结果表明，金芪降糖方具有多组分(益气–活血–化痰)、多层次(气–血–津液)、多途径(血管–脾脏–肌肉)作用特点，可同时激活AMPK和PI3k/Akt途径，活化的AMPK和AKT促进并加强GLUT4转位，加快葡萄糖利用，进而对细胞中的脂肪蓄积起到抑制作用，从而系统揭示了“脾主为卫”环节改善糖脂代谢紊乱的科学内涵。 在坚持辨证论治的基础上，“脾主为卫”失常与糖脂代谢病的病变特点是相吻合的。通过对其拓展运用，可更全面、准确地解释现代研究发现的 [ 15 ] [ 16 ] 益气活血法可以对脂肪蓄积起到抑制作用的中医内涵，真正意义上实践“不治已病治未病”的思想，为深入理解机体代谢内稳态及其调控机制提供了重要支撑。
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user: 摘要 真菌感染疾病是一类通过真菌感染动物的皮肤、粘膜、毛发以及手指甲和脚趾甲所导致的一类皮肤性疾病。一些抗生素类药物在防治由真菌感染导致的疾病方面发挥着重要的作用，由于真菌耐药性越来越严重，迫使科研学者们不得不继续研发与寻找新的对真菌有作用的药物。中药具有价格低廉、不易产生耐药性等特点，对开发新的中药抑制真菌疾病提供了坚实的基础。
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user: 1. 引言 真菌感染疾病是人和动物常见的皮肤病之一，主要是由一类浅表性真菌皮肤癣菌引起的 [ 1 ]。其传播途径为感染动物的皮肤、粘膜、毛发以及手指甲和脚趾甲等。由真菌感染的皮肤病很难治愈，且病程延续时间比较长，极易复发 [ 2 ]。目前，市场上用于治疗真菌感染疾病的药物大多为化合物，主要包括多烯类药物、唑类药物、棘白霉素类药物以及丙烯胺类药物，这类药物属于抗生素类药物，长时间的使用会使真菌产生耐药性，降低临床使用的效果 [ 3 ]。基于我国的中医药学研究，发现越来越多的中草药可以治疗皮肤癣菌 [ 4 ]。中药的优点在于作用途径比较广泛，作用的靶点多，不易产生耐药性且中草药是我国特有的天然药物资源，药源广泛、价格低廉，这对开发新的中药抑制真菌疾病提供了坚实的基础。
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user: 2. 真菌致病相关的病原菌 由真菌感染导致的皮肤癣菌很难治愈，其原因主要归结为以下几点。1、真菌的生长和繁殖对环境的要求比较低，在有机质和潮湿的环境中易生长。2、真菌易附着于表面，一般的消毒剂很难将其杀灭。3、真菌感染很难治愈，停药后易在原来部位复发。皮肤癣菌根据生长的位置不同可以分为亲人性皮肤癣菌、亲动物性皮肤癣菌和地生皮肤癣菌。根据菌种的不同可以分为表皮癣菌、毛癣菌和小孢子属类，除此之外还包括马拉色氏霉菌属和假丝酵母菌属 [ 5 ]。 浅表部真菌感染疾病是威胁人类皮肤健康的主要原因，目前最常见致病的皮肤真菌约有40多种，主要包括红色毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、糠秕马拉色菌等 [ 6 ]。红色毛癣菌是浅表性致病菌，是临床上最常见的亲人性皮肤癣菌，一般的体癣、股癣和手足癣的致病均为红色毛癣菌所致 [ 7 ]。犬小孢子菌是引起犬、猫真菌性皮肤病的主要病原菌，一般高发于冬季，夏季则比较少 [ 8 ]。絮状表皮癣菌属于人畜共患病，但更倾向于人类，指甲和皮肤易受到感染，毛发则很少 [ 9 ]。糠秕马拉色菌易引起动物的皮肤病，症状表现为丘疹并伴随着严重的瘙痒和色素沉着 [ 10 ]。 真菌疾病的治疗主要以抗生素为主，目前临床上用于治疗真菌的化合物主要包括多烯类、唑类、丙烯胺类和棘白霉素类。多烯类化合物主要包括两种药物，两性霉素B和制霉素，它们是通过与麦角甾醇相结合，从而影响细胞膜的流动性。两性霉素B是治疗由真菌引起的内脏感染的首选药物，而制霉素与两性霉素B相比毒性稍低，作用范围更广，主要用于治疗对两性霉素B有抗性或者不敏感的真菌引起的一些疾病 [ 11 ] [ 12 ]。唑类药物是一类应用比较广泛的药物，它主要是通过抑制麦角甾醇合成酶使麦角甾醇不能合成，从而使细胞膜结构受到破坏而杀死真菌。唑类药物的具有广谱的抗菌性，与多烯类药物相比毒副作用小，抗菌范围广。唑类药物主要包括咪唑类和三唑类，三唑类药物在市场上流通更加广泛，我们常见的有酮康唑，伏立康唑，达克宁等 [ 13 ]。丙烯胺类是一类广谱抗菌药物，主要用于治疗孢子丝菌病患者皮肤及淋巴系统感染患者，主要包括两类药物，萘替芬和特比奈芬。棘白霉素类是二十一世纪新研发的一种新型的抗真菌药物，其是通过抑制真菌的细胞壁的生长杀灭真菌的生长。动物细胞没有细胞壁，在使用棘白霉素类药物具有高效低毒的作用 [ 2 ]。棘白霉素类药物抗菌谱广，与多烯类和唑类不存在交叉的耐药性，故可用于全身真菌病感染疾病的治疗。目前上市的药物有卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净，由于这类药物是大分子药物，口服不能吸收，需要静脉注射给药 [ 14 ]。以上的这些化学药物如果长期使用，会使真菌产生严重的耐药性，其作用效果越来越低，增加了真菌类疾病治疗的困难。因此亟需找到一种新的广谱性抗菌物质，中药中许多抑菌物质的发现给真菌疾病的治疗提供了广泛的思路，为开发中药治疗相关的真菌感染疾病提供了有力的环境。
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user: 3. 相关的中药制剂抑制皮肤癣菌的生长 目前，许多临床工作者采用中药药方治疗由真菌感染导致的疾病，通过单味中药和复方中药来抑制真菌感染已有很多报道。药典中显示具有抑制皮肤癣菌的中药有几十种，例如千里光，主要用于主治痈肿疮毒，皮肤湿疹；豆科植物苦参主治阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风。松花粉可以治疗黄水疮，皮肤糜烂，湿疹等。五倍子可治疗痈肿疮毒，皮肤湿烂。 越来越多的研究者对中药中的成分进行了研究，上官新一等研究表明蒺藜中的甾体皂苷成分TTS-12可以抑制红色毛癣菌耐氟康唑和酮康唑菌株的生长，且甾体皂苷对氟康唑耐药菌株的最小抑菌浓度范围在4~16 μg∙mL −1 ，对酮康唑耐药菌株的最小抑菌浓度范围在4~8 μg∙mL −1 [ 15 ]。孙凯等研究表明五倍子溶液可以抑制由须癣毛癣菌、石膏样孢子菌和犬小孢子菌感染的真菌疾病，且对动物本身的血液指标无任何影响，都在正常范围内 [ 16 ]。阿米娜·阿不拉的研究显示地锦草的有效成分鞣花酸，其对红色毛癣菌最为敏感，MIC值为64 μg∙mL −1 ，对念珠菌的平均MIC值为256 μg∙mL −1 ，对石膏样毛癣菌的平均MIC值为128 μg∙mL −1 [ 17 ]。桂蜀华等的研究表明苦参碱可以抑制武汉羊毛状小孢子菌、武汉白色念珠菌，MIC值为0.78 μg∙mL −1 [ 18 ]。 研究表明复方中药的抑菌效果要好于单味中药，主要是由于中药的配伍会大大提升单味中药的效果。药典中记载的癣宁搽剂、乌蛇止痒丸、九圣散都可以治疗皮肤相关的疾病。癣宁搽剂具有清热除湿，杀虫止痒的功效可以有较的抑制真菌的生长，主要用于脚癖、手癖、体癣、股癖皮肤癣症等。癣宁搽剂含有土荆皮，苦参，白鲜皮等十味中药材，通过乙醇溶液进行提取，最终制成的浓缩液称为癣宁搽剂。乌蛇止痒丸采用十一味中药熬制而成，可以治疗慢性荨麻疹以及皮肤瘙痒等。九圣散是由九味中药的粉末混合而成，具有解毒消肿，燥湿止痒。用于湿毒瘀阻肌肤所致的湿疮、臁疮、黄水疮，症见皮肤湿烂、溃疡、渗出脓水等疾病。复方透骨草溶剂是由夏涵教授组方、研制的院内制剂，主要由透骨草、花椒、皂荚等中药组成，具有杀虫止痒，清热燥湿之功效。在临床上主要用于预防和治疗足癣，有效率可以达到87.5%，大大的清除了真菌 [ 19 ] [ 20 ]。
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user: 4. 中药抗真菌的活性成分分析 研究表明中药中具有抑菌功能的活性成分有很多，例如，恩醌类衍生物，生物碱，黄酮类，酚类，萜类，内酯类等。董波等的研究表明从大黄中提取的大黄素可以作用于白色假丝酵母的细胞膜，破坏细胞膜的完整性，降低生物膜的活性，从而抑制真菌的生长 [ 21 ]。 黄连的主要抑菌成分是黄连碱，黄连碱通过与真菌的细胞壁相结合，细胞膜的渗透性会发生改变，从而影响真菌的结构和功能 [ 22 ] [ 23 ]。黄连的乙醇提取无可以抑制糠秕马拉色菌的生长 [ 24 ]。研究表明云南地黄连可以很好的抑制石膏样小孢子菌和红色毛癣菌的生长 [ 25 ]。杜蜀华等研究表明苦参中的苦参碱可以抑制并杀灭多种皮肤癣菌的作用 [ 18 ]。 白鲜皮中的有效成分为白鲜碱，梣酮和黄柏酮，白鲜皮可以用于治疗由真菌感染的皮肤病，孙欣峰等用白鲜皮汤治疗皮肤瘙痒症患者，治愈率达到93.2% [ 26 ]。国外学者利用白鲜皮的提取物进行冻干后治疗小鼠的皮炎，研究结果表明白鲜皮的使用可以大大降低小鼠体内IFN-γ，TNF-α，IL-6的表达水平，影响了皮肤角质层的厚度，减轻了小鼠的皮炎情况 [ 27 ]。白鲜皮水煎剂或者乙醇提取物可以抑制皮肤真菌的生长例如对红色毛癣菌的最小抑菌浓度(MIC)为50 mg生药∙mL −1 ，紫色毛癣菌的MIC为50 mg生药∙mL −1 ，羊皮状小孢子菌150 mg生药∙mL −1 ，絮状表皮癣菌MIC为200 mg生药∙mL −1 [ 28 ]。 地肤子利尿通淋，清热利湿，祛风止痒，其活性成分主要是皂苷类物质。林秀仙等研究发现通过超临界CO 2 萃取的地肤子油可以抑制红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、石膏样毛癣菌、表皮葡萄球菌和羊毛小孢子菌的生长 [ 29 ]。紫君子兰用乙醇提取物中的皂苷可以抑制须疮癣菌、白念珠菌和孢子丝菌的生长并且抑菌效果高于其他溶剂提取 [ 30 ]。
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user: 5. 中药抗皮肤癣菌的作用机制 中药的成分很复杂，其作用机质主要是中药中含有的天然成分破坏真菌细胞膜或者细胞壁的合成，从而让真菌不能正常的繁殖。同时一些研究显示中药提取的天然物质可以抑制一些酶的合成，达到影响基因表达的目的。 5.1. 损伤真菌的细胞膜和细胞壁的结构 真菌的细胞壁和细胞膜在保护细菌不受伤害方面起到了重要的作用，真菌细胞壁的主要成分包括几丁质，葡聚糖等组分构成，细胞膜主要由蛋白质，脂质和多糖等成分组成。多糖是存在于真菌细胞壁中的特有成分，麦角甾醇是存在于真菌细胞膜中的独特成分，因此，研究杀灭真菌的主要思路是集中于抑制此类物质的生物合成，从而达到抑制或者杀灭真菌的作用。一些中药通过破坏真菌的细胞壁，使得细胞膜的透性发生改变影响真菌的生长。 黄连碱结构中的季铵盐氮原子和2个亚甲氧基对易和真菌的细胞壁相结合，使黄连碱可以进入真菌的细胞，使细胞的通透性发生改变，内容物流出，细胞停止生长 [ 22 ] [ 31 ]。赵明月等研究表明地锦草有效部位可使真菌中羊毛甾醇蓄积，导致细胞膜麦角甾醇的合成受阻来发挥其抗真菌作用 [ 32 ]。安慧霞等发现地锦草的有效部位对真菌细胞膜的结构有影响，透射电镜下观察，真菌细胞壁不完整，厚薄不均匀且局部有缺损，细胞膜的轮廓不清晰，细胞内细胞器损伤严重，细胞内的成分聚集成电子密度较高的团块。高效液相色谱检测发现，红色毛癣菌中的麦角甾醇的含量显著性降低 [ 33 ]。 5.2. 抑制真菌核酸和蛋白质的合成 皮肤真菌是通过侵染人的皮肤和指甲达到存活的目的，在侵染的过程中金属蛋白酶(MEP)和枯草菌素蛋白酶(SUB)发挥着重要的作用。李治建等研究表明鞣花酸抑制了红色毛癣菌体内的金属蛋白酶和枯草菌素蛋白酶的基因表达，水解酶的合成受阻影响了真菌的侵染过程，真菌的活力下降，最终导致死亡 [ 34 ]。王理达等研究表明紫檀芪和白鲜碱可以作用于真菌的DNA，导致染色体在G2期到M期重复的复制，大量DNA的合成，造成了细胞代谢紊乱，导致细胞死亡 [ 35 ]。反式查尔酮和槲皮素会抑制红色毛癣菌体内的脂肪酸合酶基因(FAS1)的表达，降低麦角甾醇相关合成基因(ERG6)的表达，从而降低麦角甾醇的含量，致使细胞死亡 [ 36 ]。 5.3. 破坏真菌的能量代谢 线粒体是真菌细胞的能量代谢场所，是真菌细胞完成呼吸链的场所，同时可以合成各种酶类。活性氧(ROS)是真菌凋亡的关键调节因子，能激活线粒体信号转导通路，从而诱发细胞的凋亡。尹秀芝等研究发现苍术的浸出液可以抑制铁锈小孢子菌、黄癣菌、絮状表皮癣菌的生长，电镜观察发现细胞线粒体严重损伤，超薄切片结果显示细胞器–线粒体模糊不清，这可能是苍术影响了细胞能量的代谢，致使细胞死亡 [ 37 ]。
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user: 6. 讨论与展望 近年来大量的文献报道中药参与治疗各种由皮肤癣菌引起的疾病，对改善皮肤癣菌的感染具有明显的改善作用 [ 38 ]，且中药来源广泛，副作用比较小，长期使用不易产生耐药性，使得中药的研究越来越受到重视。目前使用单味中药和复方中药治疗皮肤癣菌有很多的报道。王玲等的研究选取六味具有抗真菌活性中药(黄连、黄柏、土槿皮、白藓皮、蛇床子和地肤子)的水提取成分和乙醇提取成分对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的体外抗真菌活性进行研究，结果显示醇提蛇床子、白藓皮和黄连对皮肤癣菌有较强抑制作用，醇提蛇床子对皮肤癣菌有较强杀菌作用 [ 39 ]。张伊娜等研究发现凤仙花和马齿苋水提取液对红色毛癣菌、须癣毛癣菌两种皮肤癣菌的体外抑菌作用 [ 40 ]。这些研究很多都局限于实验阶段，很多动物实验和临床观察的数据仍不完善。中草药作为我国传统医学的一部分，有着悠久的研究历史。现代药理学研究表明，多种中草药具有广泛的生物活性，能够治疗和预防多种疾病，有着广阔的应用前景。我们应该将实验药物尽快的转化成临床可应用的药物，为人类的健康做成贡献。
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user: 摘要 目的：主要针对灵芝多糖的针对性疗效展开了细化的分析，据此尝试对其对于精子膜和DNA完整性的影响形成全面而深刻的认识，从而在临床上为少弱精子症提供针对性的治疗方案。方法：为实现这一研究目的，本次实验的开展主要选取了正常的成年男性，取其精液进行对照比较，形成对照的主要有等量的生理盐水及不同浓度灵芝多糖溶液(0.25， 1.0， 5.0 mg/ml)。通过伊红–Y染色试验、精子低渗肿胀实验(HOS)以及精子染色质扩散(SCD)实验，针对不同浓度的灵芝多糖所产生的影响展开了细化的研究与探讨，试图了解到其对精子膜以及DNA实际产生的作用力情况表现。结果：从结果表现来看，不同浓度的灵芝多糖都可以对精子的存活时间起到拉长效果，从而使得精子的存活率因此得到切实的提升，并且在这一过程中切实使得精子膜和DNA得到不同程度的保护功效。从具体对比分析来看，中高灵芝多糖起到的作用效果明显更高，呈现出更为优秀的结果表现。结论：灵芝多糖有体外提高精子存活率和保护精子 DNA完整性的作用。
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user: 1. 引言 从世界范围来看，不育症是重要的影响较大的健康问题。精液异常，主要表现为弱精子症、少精子症、畸形精子症(简称少弱畸精子症，OAT)或无精子症，是引起男性不育的常见病因之一，而弱精子症最为常见 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。特发性少弱畸精子症的主要治疗方法仍是药物治疗，例如抗氧化剂和能量补充，这些方法有局限性，存在着一些相对不良的反应，而中医药在特发性少精子症的治疗中具有一定的优势和特点 [ 2 ] [ 3 ]。我们以在前期对中草药灵芝所做的研究为基础，对灵芝多糖采取体外精子培养的方式，探讨灵芝体外活化精子机制，为研制新的精子培养液及通过中药治疗的方式来针对性治疗少弱精症提供数据上的支撑，进而推动其治疗取得较好的成效，也切实通过这样的方式，不断开阔我们的研究视野，推动我们的针对性研究能够切实取得较大程度的突破。
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user: 2. 材料与方法 (一) 灵芝中药材选取及多糖制备 取100克干燥的灵芝原料研碎(购自山东省济南市漱玉平民大药房)。，放置在0.9%的生理盐水中浸泡1小时，放置在100℃的金属浴中加热，取出后过滤去渣得到灵芝提取液。将灵芝提取液置于62℃的条件下干燥2小时。然后加入250毫升石油醚，于62℃~90℃回流1小时，进行脱脂，过滤，回收石油醚。滤渣、挥干溶媒，用250毫升80%浓度的乙醇浸渍过夜，于80℃~90℃温度下回流提取2次，每次1.5小时。接着，于过滤所得的药渣中加蒸馏水500毫升浸1小时，于90℃温浸提取40分钟。过滤，接着再加蒸馏水250毫升相同温度下温浸30 分钟后，过滤，合并滤液，减压浓缩至体积75毫升。脱去蛋白质，加入1%的活性炭脱色2次。过滤得褐色灵芝粗多糖。灵芝多糖的分离纯化：应用蒸馏水洗脱纤维素柱，然后梯度洗脱，上过滤柱5次，共上样16克，收集洗脱液，流水透析3天。 (二) 体外活化精子试验 1、精液采集及常规分析： 1) 选择成年(25~35岁)男性50名，入选标准为无心血管系统、呼吸系统、泌尿系统及神经系统疾病，无传染病史，身体健康、已婚且至少生育有1个子女，填写知情同意书。精液质量标准：量2毫升~6毫升，pH 7.0~8.0，液化时间 < 30分钟，精子前向运动率> 32%，前向运动率与非前向运动率 > 40%，精子密度 > 15 × 106/毫升，畸形精子率 < 4%。2) 活化精子实验：将选定的精液按1:1的比例分别加入不同浓度的药物，观察精子活动情况。加入药液后30分钟、24小时及48小时等分别进行观察。 2、分组 每份精液分为5组，每组分别加入0.2毫升精液，对应的分别为正常组(A，单纯精液)，生理盐水组(B)和灵芝多糖低、中、高剂量组(0.25 mg/ml，1.0 mg/ml和5.0 mg/ml，C，D和E)。各组分别与精液共同孵育24 h及48 h后，从而对精子膜的实际存活力等综合表现加以检测。 3、精子存活率检测 按照邱毅等报道的方法 [ 5 ]，于0.5克曙红-Y和0.1克吉姆萨(Q/GHSC1092-1999上海试剂三厂)混合物中，加入0.9%的生理盐水至100毫升，充分混匀溶解，配置成0.5%浓度的曙红–Y染液(EY)。然后过滤所得的滤液室温保存备用。取等体积温育24小时后的精子悬液和等量的EY染液，室温下放置2分钟，加盖玻片观察。 4、EY结合低渗膨胀(HOS， EY-HOS)实验检测精子膜完整性 精子低渗肿胀实验(HOST)同样采用邱毅等报道的方法 [ 5 ]，具体步骤如下：首先称取0.735克柠檬酸钠和1.35克果糖，加双蒸水至100毫升，配置成离子强度为0.15，渗透压150 mOsm的低渗液。取0.5克伊红及0.1克吉姆萨，按照上节曙红-Y染液的配制方法配制伊红–吉姆萨(EG)染液：双层滤纸过滤观察在灵芝提取液的作用下精子膜的完整性；取0.1毫升精液加入1毫升150 mOsm的低渗液中，混匀，37℃水浴30分钟后，加入0.1毫升的伊红–吉姆萨染液，混匀。2分钟后吸取50微升精液–伊红–吉姆萨混合液滴在清洁载玻片上，观察并计算。 5、精子染色质扩散(SCD)实验 按照Qiu等 [ 5 ] [ 6 ] 描述的方法进行SCD实验，将结果划分为大光晕、中光晕、小光晕和无光晕４个等级。 (三) 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件分析。计量资料以x ± s表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett法，P ≤ 0.05为差异统计学意义。
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user: 3. 结果 (一) 结果发现，可以对正常状态下的男子精液的具体表现得到清晰的了解，从而了解其普遍的水准情况，便于我们进行对照分析。 (二) 在对精液进行孵育24 h及48 h之后，通过对比研究的方式，我们进一步发现，从精子存活率的综合表现来看，中高组的实际表现明显更优，呈现出综合状况较为令人满意的整体态势(见表1)。 Table 1 Sperm survival rate of each group was determined by EY after 24 h and 48 h ( x ¯ ± s 组别 n 剂量(C/mg·ml -1 ) 精子存活率(%) 24 h 48 h A 50 -- 17.9 ± 2.3 3.2 ± 1.3 B 50 -- 13 .2 ± 4.1 3.4 ± 2.1 C 50 0.25 mg/ml 31.0 ± 3.9 6.8 ± 2.6 a D 50 1.0 mg/ml 37.1 ± 3.1 9.7 ± 2.7 b，c E 50 5.0 mg/ml 38.2 ± 3.6 9.2 ± 3.2 b，c 表1. 各组24 h及48 h后EY检测精子存活率( x ¯ ± s ) (三) 灵芝多糖对精子膜及DNA完整性的影响 50例精液分别加入生理盐水(对照)、维生素C组和灵芝多糖低、中、高剂量孵育48 h后各组的精子。精子DNA碎片比例0.25 mg/ml灵芝多糖组低于对照组和生理盐水组，维生素C组，1.0 mg/ml和5.0 mg/ml灵芝多糖组的精子DNA碎片低于正常组及生理盐水组及维生素C组(见表2)。对照组及灵芝多糖体外孵育48 h后对人精子DNA的影响见图1。 图1. 对照组及灵芝多糖体外孵育48 h后对人精子DNA的影响。(a) 对照组精子均为无光晕(DNA完整性损伤)；(b) 灵芝多糖可见大光晕精子 Table 2 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharide on human sperm membrane and DNA after 48 h incubation in vitro (n = 50， x ¯ ± s 剂量(C/mg∙ml −1 ) HOS-EY后精子膜改变类型(%) SCD (%) A B C D DNA碎片 A -- 5.4 ± 1.3 1.6 ± 0.5 44.2 ± 1.7 48.8 ± 2.1 41.6 ± 2.1 B -- 4.5 ± 1.2 a 1.5 ± 0.8 44.0 ± 2.1 50.0 ± 3.1 a 42.1 ± 3.1 C 0.25 mg/ml 10.9 ± 1.5 a 2.1 ± 0.6 41.3 ± 4.1 45.7 ± 4.9 a 29.5 ± 2.2 b ， c D 1.0 mg/ml 12.3 ± 1.8 b ， c 2.7 ± 0.6 40.0 ± 3.1 45.0 ± 3.2 b ， c 28.5 ± 2.2 b ， c E 5.0 mg/ml 13.9 ± 1.3 b ， c 2.1 ± 0.7 39.5 ± 3.1 44.5 ± 3.2 b ， c 27.9 ± 1.8 b ， c 表2. 灵芝多糖体外孵育48 h后对人精子膜及DNA的影响(n = 50， x ¯ ± s ) 与对照组比较， a P < 0.05， b P < 0.01；与生理盐水组、维生素C组及低剂量灵芝多糖组比较， c P < 0.01。
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user: 4. 讨论 灵芝(Ganoderma ucidum)是一味名贵中药，又叫灵芝草、木灵芝等。灵芝既可以日常食用，又具有较高的药用价值，特别是在药用表现上受到了较高的推崇。灵芝原来均为野生，昧甘，性平，归心、肺、肝、肾经。灵芝昧甘，性平，归心、肺、肝、肾经。在中医看来，灵芝对人体的益处是较为突出的，可以实现较好的滋补、消炎等综合功效，而且本身也是安全的，没有什么副作用；调节免疫功能；并推动骨髓细胞蛋白质、核酸的形成，从而使得放射性损伤能够得到较大程度的保护。 通过深入的研究，我们进一步认识到灵芝之中有着较多的有效成分，从生理活性成分的角度来看，主要有灵芝多糖、腺苷、灵芝酸和氨基酸等重要组成。其中灵芝多糖是其中的重要成分，产生的作用也是其中最为突出的，里面富含多种异多糖，其中不仅有葡萄糖的成分，还同时有着多种单糖的组合。一些多糖还有着明显的肤链，这样一来则通过研究我们发现其药理活性表现更佳，呈现出明显更好的整体态势，通过其形成的综合作用，可以进一步使得血液微循环因此得到加速的呈现，使得血液的供氧功能因此得到切实的提高，并且使得整个人体的无效供氧情况得到较大程度的缓解，进一步消除体内自由基，进而使得细胞膜的封闭度因此得到较大程度的提高，抗放射性，促进肝脏、血液等能够更好地合成蛋白质，使得机体所需要的蛋白质因此得到较大程度的补充。灵芝多糖还能够进一步使得单核巨噬细胞系统得到相应的刺激，从而使其奋噬异物的能力能够最大程度地发挥出来，便于机体能够在此基础上快速地形成抗体，这样一来，机体整体的免疫力能力便大大加强，从而能够很好地对抗肿瘤的侵袭，能够保持机体运转取得更为顺畅的实现。但灵芝多糖对精子体外及体内作用研究则较少报道，呈现出综合研究相对较少的状态，这又进一步限制了我们研究活动的进一步推动。 从实验表现来看，我们可以清晰地看到，灵芝多糖的存在可以对精子膜以及精子DNA产生较强的保护作用，这也在一定程度上使得精子的活动能力因此增强，进而使其体外存活时间据此实现了有效的延长。从发生作用的具体情况来看，灵芝多糖对剂量有着较为明显的依赖性，中高剂量下可以使得精子的存活时间进一步得到较为明显的延长。 要想提高人工受精的成功概率，需要加强离体精液的处理，在对其进行针对性处理之后，可以进一步得到精子密度较高并且综合活力较强的精子，将这些精子用于体外人工受精之中，多用于临床治疗弱精子症等相应的病症，可以使得患者的病症能够取得针对性的疗效。不仅如此，在生殖医学领域范围内，高质量的精子培养液是较受欢迎的，特别是辅助生育技术的不断发展与成熟的基础上，这一培养液越发受到了医学的关注与重视，对其展开了细化的尝试运用。 通过本次实验的开展，我们进一步发现，适量的灵芝多糖可以使得精子的体外存活率得到较大程度的提高，进而减少精子膜和DNA的损失，从而使得精子膜据此得到了较大程度的保护，进而在对弱精症患者提供针对性治疗的基础上，可以使得体外精子得到相应的营养液的支持，从而使得弱精症男性不育问题能够得到针对性的解决，形成一条新的发展路径，也便于我们在研究这一系列问题时能够开阔眼界，从全新的视角来看待这一问题，找到针对性较强的解决之道。 近年以来，国内学者针对性地通过中医药来尝试治疗稍弱精子症，并且从整体的疗效来看，还是较为理想的 [ 6 ]。当前，我们对中草药的实际特征了解的还是较为粗浅的，还有不少地方很不清楚，需要在不断的实践之中予以挖掘。我们如果可以根据此研制出中草药体内外活化精子制剂，用来代替西药制剂，应用前景将十分广阔 [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]。而从灵芝多糖对精子功能产生的实际影响来看，目前尚未见报道。
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user: 摘要 Fe 3 O 4 纳米粒子(Fe 3 O 4 -NP)在生物医学领域发挥着越来越重要的作用。由于纳米粒子的独特性质，基于生物功能化的Fe 3 O 4 -NP表面改性是研究热点之一。因此，本文提出了一种新型的Fe 3 O 4 -NP表面改性的方法，将DGEA多肽与Fe 3 O 4 -NP结合，得到了具有良好生物相容性的改性Fe 3 O 4 -NP。傅里叶变换红外光谱、水合粒径等检测结果共同证明了DGEA多肽表面改性Fe 3 O 4 -NP的成功制备。体外血小板粘附实验与细胞学实验证实了其良好的生物相容性。该改性Fe 3 O 4 纳米粒子为Fe 3 O 4 纳米粒子的生物应用提供了一个良好的平台。
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user: 1. 引言 Fe 3 O 4 纳米粒子可应用于生物医学和治疗，例如成像 [ 1 ]、细胞特异性靶向 [ 2 ] 和药物递送 [ 3 ] 等，这是由于Fe 3 O 4 纳米粒子具有的磁性 [ 4 ]。更重要的是，Fe 3 O 4 纳米粒子的表面可以用具有良好生物相容性的分子进行修饰 [ 5 ] [ 6 ]，为后续Fe 3 O 4 纳米粒子在药物输送系统、医疗诊断等生物医学应用提供了一个良好的平台。因此，Fe 3 O 4 -NP的表面改性是至关重要的。 为了改善Fe 3 O 4 -NP的性能，一些化合物被用于修饰Fe 3 O 4 -NP，比如硅烷偶联剂。硅烷偶联剂是一种有机化合物，化学结构通式可以表示为RSiX 3 [ 7 ]。Fe 3 O 4 -NP与不同的硅烷偶联剂反应可使Fe 3 O 4 -NP表面带不同的活性基团 [ 8 ]，如羰基、羧基和环氧基等。这些基团的存在，使其既能够通过化学键进行表面改性，又可以用π-π堆积、离子键和氢键等非共价键作用进行表面改性。Fe 3 O 4 -NP表面带有-OH [ 9 ]，因此，利用γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(KH560)对Fe 3 O 4 -NP进行表面修饰，使得Fe 3 O 4 -NP表面带有环氧基。环氧基是一种化学性质相对活泼的基团，其可与氨基、羧基等基团发生反应。 目前，抗体 [ 10 ]、蛋白质 [ 11 ]、DNA [ 12 ]、酶 [ 13 ] 等都被用来作为Fe 3 O 4 -NP表面改性的材料，以改善其生物相容性。但研究表明，纳米颗粒与大分子结合时，不可避免地会影响其空间结构 [ 14 ]。肽作为生物小分子，具有更加简单的结构。DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala)来源于I型胶原，其可以作为胶原受体的拮抗剂。胶原蛋白是细胞外基质中最具血栓形成性的成分，它与血小板表面膜受体之间直接相互作用，在这个过程中，两种糖蛋白是至关重要的：粘附受体整合素α 2 β 1 和GPVI，它们负责这一过程的信号转导。研究表明，DGEA肽对整合素α 2 β 1 具有特异性，可以拮抗胶原蛋白介导血小板粘附并诱导血小板活化和聚集的过程 [ 15 ]。 因此，本文将生物小分子多肽DGEA用于Fe 3 O 4 -NP的表面改性，通过各种材料学对其进行了表征，并研究了DGEA多肽改性Fe 3 O 4 -NP的生物相容性。
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user: 2. 实验部分 2.1. 实验材料及设备 Fe 3 O 4 纳米颗粒，AR，Aladdin；KH560，AR，Aladdin；DGEA多肽，1 g，吉尔生化(上海)有限公司；甲苯胺蓝(TBO)，纯度99%，成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇，AR，成都市科伦化工试剂厂。 恒温水浴锅(S212，郑州长城科工贸有限公司)；恒速搅拌机(W-0不升降，上海申顺生物科技有限公司)；傅立叶反射红外光谱仪(NICOLET 5700，美国Thermo公司)；激光粒度仪(ZetasizerZS90， Malvern)，酶标仪(Epoch12， biotech USA)。 2.2. DGEA多肽改性Fe 3 O 4 纳米颗粒的制备 (1) KH560修饰Fe 3 O 4 -NP的制备(Fe 3 O 4 -EG )：将2 g Fe 3 O 4 纳米颗粒置于50 ml两口烧瓶内，加入30 ml无水乙醇和5 ml KH560，在机械搅拌下，水浴60℃反应5 h，将产物磁性吸附，分别用无水乙醇洗涤产物数次，真空干燥得产品Fe 3 O 4 -EG。 (2) DGEA多肽改性Fe 3 O 4 -NP的制备(Fe 3 O 4 -DGEA)：称取Fe 3 O 4 -EG纳米颗粒20 mg和18.8 mg DGEA多肽于50 ml 两口烧瓶内，超声分散于30 ml无水乙醇，加入NaOH调节体系的pH为碱性，在机械搅拌下，水浴80℃反应5 h，将产物磁性吸附，分别用无水乙醇洗涤产物数次，真空干燥得产品Fe 3 O 4 -DGEA。 2.3. 改性Fe 3 O 4 -NP材料学表征 (1) Fe 3 O 4 -DGEA的水合粒径测定。任何悬浮于液体的颗粒都会不停的做布朗运动，其运动强度与颗粒本身的大小，性质有关。本文采用ZetasizerZS90激光粒度仪表征Fe 3 O 4 -DGEA的水合粒径。 (2) Fe 3 O 4 -DGEA结构表征。通过红外光谱分析(FTIR)可以表征材料的结构。本文采用NICOLET5700 FTIR表征DGEA多肽改性Fe 3 O 4 -NP前后的结构变化。 (3) Fe 3 O 4 -DGEA表面官能团-COOH定量表征。甲苯胺蓝(TBO)是常用的碱性染料之一 [ 16 ]。在碱性溶液中，其阳离子可与带负电荷的基团或阴离子结合，在酸性溶液中解脱，发挥染色作用，使得水溶液呈现蓝色，在530 nm处有明显吸光度变化。这一反应迅速且准确，因此，该方法可定量检测Fe 3 O 4 -DGEA表面-COOH的含量。标准曲线制作：配制pH = 11浓度为2.12 mmol/L的TBO溶液，使用移液枪吸取20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL，加入pH = 11 NaOH溶液使其总体积为2000 μL，在530 nm处测量吸光度值。Fe 3 O 4 -DGEA表面-COOH测定：称量一定质量的Fe 3 O 4 -DGEA，加入1000 μL 2.12 mmol/L的TBO溶液，室温下静置6 h，使Fe 3 O 4 -DGEA表面充分吸附TBO，待反应结束后，使用pH = 11 NaOH溶液漂洗6次，最后加入pH = 3的HCl溶液，在530 nm处测量吸光度值。 2.4. 改性Fe 3 O 4 -NP生物相容性评价 (1) 血小板的粘附与激活实验。取新鲜的抗凝人血，在离心机中以1500 r/min的速度离心15 min，离心结束后，取上层富板浆(platelet rich plasma， PRP)备用；将200 µg Fe3O4-DGEA放入24孔板中，通过磁性分离的方式除去液体；在孔板中加入300 µL PRP，使Fe 3 O 4 -DGEA浸没，所有样品在37℃孵箱中孵育30 min；计时完毕后，使用NaCl清洗三次，用浓度为2.5%的戊二醛固定24小时；将固定好的样品再次使用NaCl清洗三次，在避光条件下使用罗丹明对其进行染色15 min。再次用NaCl清洗三次，使用荧光显微镜对其进行观察。 (2) 平滑肌细胞静态培养。从新生儿脐带中分离平滑肌细胞(Smooth muscle cell， SMCs)，5% CO 2 和37℃条件下传代培养。在24孔板中分别加入细胞悬液和Fe 3 O 4 -DGEA，使得SMCs接种浓度为2 × 10 4 cells/cm 2 ，Fe 3 O 4 -DGEA的浓度为50 μg/mL，培养1天和3天后用CCK-8检测细胞活性，使用戊二醛将样品固定，罗丹明染色，每个样品设3个平行样。 (3) 内皮细胞静态培养。从新生儿脐带中分离内皮细胞(Endothelial cells， ECs)，5% CO 2 和37℃条件下传代培养。在24孔板中分别加入细胞悬液和Fe 3 O 4 -DGEA，使得ECs接种浓度为1 × 10 4 cells/cm 2 ，Fe 3 O 4 -DGEA的浓度为50 μg/mL，培养1天和3天后用CCK-8检测细胞活性，使用戊二醛将样品固定，罗丹明染色，每个样品设3个平行样。 (4) 内皮细胞迁移实验。细胞划痕实验常常用来分析细胞迁移能力和损伤组织的修复能力，当细胞长到融合的单层细胞状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合 [ 17 ]。将ECs接种于24孔板中，使其接种密度为5 × 10 4 cells/cm 2 ，培养，待细胞长满后，使用200 μL枪头在样品上垂直轻轻划过，使得划过的地方细胞被擦掉，在光镜下拍照取值；将制备好的Fe 3 O 4 -DGEA在紫外的条件下，灭菌30 min，计时结束后，用培养基对Fe 3 O 4 -DGEA溶解，使其溶度为50 μg/mL；向24孔板中加入1 mL样品溶液，将样品放回细胞培养箱培养24 h，计时结束后，在光镜下拍照取值。 2.5. 统计学分析 本文中，使用单因素方差分析方法(ANOVA)进行统计，样品设置3个平行样，结果均以平均值土标准差的方式展示。*P < 0.05被认为是统计学上的显著差异。
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user: 3. 结果与讨论 3.1. 改性Fe 3 O 4 -NP水合粒径表征结果 由图1可得，Fe 3 O 4 -NP、Fe 3 O 4 -EG 和Fe 3 O 4 -DGEA样品的水合粒径分别为683.8，592.4和517.2 nm。Fe 3 O 4 -NP 样品水合粒径较大，这是由于Fe 3 O 4 -NP颗粒直径存在磁性，在水中容易聚集。Fe 3 O 4 -NP表面引入KH560后，Fe 3 O 4 -NP在水中的分散性有所提高，因此水合粒径下降。Fe 3 O 4 -EG样品引入DGEA肽后，使得Fe 3 O 4 -NP的水合粒径大幅度下降，说明接枝了DGEA肽的Fe 3 O 4 -NP的分散性有所提高。 图1. 不同样品水合粒径检测结果(mean ± SD， N = 3) 3.2. 改性Fe 3 O 4 -NP的FTIR结果 图2为样品表面结构变化的红外光谱。Fe 3 O 4 -NP样品588 cm − 1 出现了Fe-O特征吸收峰，这是Fe 3 O 4 -NP的典型特征峰。1632 cm − 1 和3432 cm − 1 处的分别出现了C=O和-OH伸缩振动峰，这表明Fe 3 O 4 -NP表面既存在-OH，又存在C=O结构，Fe 3 O 4 -NP表面存在-OH，表明Fe 3 O 4 -NP与硅烷偶联剂KH560成功发生反应。Fe 3 O 4 -EG样品在1110 cm − 1 处出现的Si-O特征吸收峰，说明此反应成功将KH560引入Fe 3 O 4 -NP表面。Fe 3 O 4 -DGEA样品1540 cm − 1 出现了N-H的弯曲振动峰，1403 cm − 1 处出现了C-N伸缩振动峰，这是环氧基开环生成-OH和与氨基结合之后生成的C-N键。以上结果表明在Fe 3 O 4 -NP表面成功引入DGEA肽。 图2. 不同样品的FTIR表征结果 3.3. 改性Fe 3 O 4 -NP表面-COOH定量表征结果 图3(a)为不同浓度梯度下甲苯胺蓝的标准曲线。拟合方程为： Y = 3.406 X + 0.013 (1) 其中Y代表的是530 nm处吸光度值，X代表的是TBO浓度，拟合度R 2 = 0.936。 通过测定Fe 3 O 4 -DGEA样品的吸光度值，代入公式(1)中，得到Fe 3 O 4 -DGEA表面-COOH含量，由公式(1)可得，Fe 3 O 4 -DGEA表面-COOH含量为(4.50 ± 0.65) × 10 −5 mol/L.从测定结果看，进一步证明Fe 3 O 4 -NP表面成功引入DGEA。 3.4. 血小板粘附与激活实验 如果血管有任何损伤，血小板会立刻响应，血小板粘附、聚集是血小板活化的标记，通过血小板的黏附实验从而对Fe 3 O 4 -DGEA样品的血液相容性进行初步评估，实验结果如图所示。从图4可知，空白对照样及Fe 3 O 4 -NP样品血小板数量明显多于Fe 3 O 4 -DGEA样品，并且出现了大量聚集，聚集的血小板会释放出内部物质促进血小板激活，血小板激活后，会呈铺展形态。而Fe 3 O 4 -DGEA样品中，粘附的血小板数量与空白对照样相比显著下降，基本无呈现铺展形态的血小板。 3.5. 平滑肌细胞培养实验结果 将SMCs与各样品共培养，检测样品对SMCs的影响，细胞培养1天和3天的荧光染色图如图5(a)所示。图5(a)中，各样品与SMCs共培养后，SMCs都出现了典型的长梭形，观察发现，各组样品中，SMCs的细胞骨架都出现了一定程度破坏，其中，Fe 3 O 4 -NP样品最为明显，但是，在Fe 3 O 4 -NP表面引入多肽以后，其细胞相容性大大增加，SMCs细胞骨架的破坏程度下降。图5(b)中，不同样品对SMCs活性产生了不同的影响，通过对比Fe 3 O 4 -NP样品与空白对照组，可以发现，培养SMCs 1天和3天后，Fe 3 O 4 -NP样品SMCs的细胞活性比空白对照样下降，这是因为Fe 3 O 4 -NP本身具有一定的毒性。Fe 3 O 4 -DGEA样品的细胞活性与Fe 3 O 4 -NP样品相比较小，说明Fe 3 O 4 -DGEA样品可以抑制SMCs的增殖。 图3. (a) TBO测定的标准曲线；(b) Fe 3 O 4 -DGEA样品表面-COOH测定结果(0.001 < *P < 0.01， mean ± SD， N = 3) 图4. 不同样品表面血小板粘附的荧光染色结果 图5. (a) 不同样品平滑肌细胞免疫荧光图片；(b) 不同样品平滑肌细胞CCK-8结果(***P < 0.001， mean ± SD， N = 3) 3.6. 内皮细胞培养实验结果 图6(a)中，各样品与ECs共培养后，ECs都出现了明显的铺路石状，观察发现，各组样品中，内皮细胞的细胞骨架都出现了一定程度破坏，其中，Fe 3 O 4 -NP样品最为明显，但是，在Fe 3 O 4 -NP表面引入多肽以后，其细胞相容性大大增加，ECs细胞骨架的破坏程度下降。各组样品与ECs培养1天和3天后，ECs CCK-8检测结果如图6(b)所示。图6(b)中，不同样品对内皮细胞活性产生了不同的影响。通过对比Fe 3 O 4 -NP样与空白对照样，可以发现，培养ECs 1天和3天后，Fe 3 O 4 -NP样品ECs的活性明显下降，这是因为Fe 3 O 4 -NP本身具有一定的毒性。而Fe 3 O 4 -DGEA样品的细胞活性明显增加。 3.7. 内皮细胞迁移实验结果 内皮细胞在划痕模型下的迁移距离对于受损组织的修复起着至关重要的作用，其结果是ECs的粘附、迁移以及增殖等细胞基本生理活动的综合表现。当划痕实验构建成功以后，立刻在倒置相差显微镜下，记录此时划痕的宽度，记为0 h，继续培养24 h后，再次记录划痕的宽度，记为24 h。各样品在划痕模型下培养24 h前后的划痕结果如图7(a)所示。图7(b)中，经过24 h的培养，Fe 3 O 4 -NP样品ECs迁移距离小于空白对照样，这说明Fe 3 O 4 -NP本身具有一定的毒性，不能为ECs的迁移提供较好的诱导环境，细胞创伤愈合能力下降，因此ECs迁移的距离下降。Fe 3 O 4 -DGEA样品ECs迁移的距离远远大于空白对照样ECs迁移的距离，产生此结果的可能原因是DGEA肽的引入，使得Fe 3 O 4 -NP的毒性大大降低。 图6. (a) 不同样品内皮细胞免疫荧光图片；(b) 不同样品内皮细胞CCK-8结果(0.01 < *P < 0.05， mean ± SD， N = 3) 图7. 各样品ECs划痕(a) 24 h前后迁移图；(b) 24 h前后Es迁移结果统计图(0.01 < *P < 0.05， mean ± SD， N = 3) Fe 3 O 4 -NP具有广泛的应用，研究也发现，Fe 3 O 4 -NP对生物具有毒性效应。作为介于氨基酸和蛋白质之间的一种中间产物，多肽具有良好的生物相容性，将多肽用于Fe 3 O 4 -NP的表面改性，可以提高其生物相容性。同时，由于DGEA多肽的功能，DGEA多肽改性Fe 3 O 4 -NP具有抑制血小板粘附与激活的能力。
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user: 4. 结论 本文通过固–液反应，将DGEA多肽与KH560修饰的Fe 3 O 4 -NP共价结合，对Fe 3 O 4 -NP表面进行改性，该结构为Fe 3 O 4 纳米粒子的生物应用提供了一个良好的平台。 1、水合粒径检测结果表明，在Fe 3 O 4 -NP表明固定DGEA多肽增加了Fe 3 O 4 -NP在水中的分散性。 2、FTIR结果表明，DGEA多肽结构中的氨基与KH560结构中的环氧基在碱性条件下发生反应，使得改性后的Fe 3 O 4 -NP为羧基化的表面。 3、血小板黏附结果表明Fe 3 O 4 -DGEA不会导致血小板激活程度增加，细胞培养结果表明，Fe 3 O 4 -DGEA对内皮细胞和平滑肌细胞无明显的细胞毒性作用，同时，可以促进损伤内皮细胞的迁移，具有一定的生物相容性。 综上所述，DGEA多肽改性Fe 3 O 4 -NP不仅提供了有效的表面改性方法，同时也为Fe 3 O 4 -NP表面生物修饰的进一步应用开辟了的新途径。
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user: 摘要 小儿推拿是在中医辩证理论指导下，通过推拿穴位起到调理脏腑、疏通经络、平衡阴阳的作用，是一种改善小儿的体质、提高机体免疫力的保健、治疗方式。本文对推拿治疗小儿呼吸系统疾病的运用进行综述，分析其运用特点及临床疗效，为小儿推拿在呼吸系统疾病的临床应用提供理论依据。
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user: 1. 小儿推拿概述 1.1. 定义 小儿推拿是在中医辩证理论指导下，按照特定的技巧动作，在小儿身体的特定部位进行按摩，疏通全身经络、调理脏腑气血，从而达到预防和治疗疾病目的的方法 [ 1 ]。推拿手法是千百年来我国历代医家长期临床实践中不断积累和总结的结果，具有悠久的历史，是我国传统医学的宝贵遗产之一。其临床应用广泛，对发热、感冒、咳嗽、哮喘、滞颐(流口水)、腹痛、腹泻、便秘、厌食、疳积(营养不良)、夜啼、遗尿、近视、小儿肌性斜颈等多种常见病有良好的治疗作用。小儿脏气清灵，肌肤柔嫩，反应敏感，手法治疗易于取效。 1.2. 小儿推拿的现状 小儿推拿绿色健康，正确应用安全无副作用，操作简便，疗效突出，深受广大患儿及家属喜爱。在健康中国背景下，国家也在大力扶持和推广小儿推拿，其发展动力强大，发展前景光明。1) “卫生部国家十二五规划教材将《小儿推拿学》纳入中医院校针灸推拿专业必(选)修课程，组织专家制定了教学大纲，编写了教材，使小儿推拿正式登上了高等中医药院校的神圣殿堂。2) 2012年青岛市人民政府大力推广“小儿推拿三字经流派”技术，将其作为国家非物质文化遗产分别申请青岛市和山东省级项目获得成功。3) 国家人力资源与社会保障部统一制定了全国“推拿技师”标准，通过培训，考试合格将获得资格认定，凭此可以开展与推拿相关的防病治病与调节体质的业务。说明推拿有市场，有需求，能增加就业 [ 2 ]。
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user: 2. 推拿治疗小儿呼吸系统疾病的研究 2.1. 小儿呼吸系统的生理特点 小儿因其固有的呼吸道生理特点，易发生呼吸道感染 [ 3 ]。小儿的鼻腔相对短小，鼻腔狭窄无鼻毛，鼻粘膜柔嫩且血管丰富，易于感染，造成鼻粘肿胀，甚至闭塞，出现呼吸困难等症状。鼻泪管短，开口接近于内眦部，且瓣膜发育不全，鼻腔感染易侵入结膜引起炎症。咽鼓管短，且直而宽，呈水平位，发生鼻咽炎时易引起中耳炎。咽部相对狭小，且较垂直，咽后壁有颗粒性的淋巴滤泡，因此易发生咽后壁脓肿，小儿扁桃体1岁末逐渐长大，4~10岁发育达到最高峰，14~15岁逐渐退化，因此学龄前儿童易患扁桃体炎。小儿的喉相对较成人长，喉腔较窄，粘膜薄弱，血管及淋巴组织丰富，因此易发炎导致喉头狭窄，影响呼吸。婴幼儿气管较短，管壁较薄，管壁平滑肌不发达，故容易受压导致通气障碍。小儿肺泡数目较成人少，弹性较差，肺间质血管丰富，当发生炎症时，肺的换气面积更加减少，会出现呼吸困难等症状。小儿胸廓短小呈桶装，肋骨呈水平位，横泾与前后径几乎相等，呼吸时胸廓的活动范围受到限制，影响换气，分泌物易堵塞，进一步加重感染。 呼吸系统疾病是小儿最常见病证之一，常占到小儿门诊量的10%以上，一年四季均可发生，尤以冬春季节或气候骤变时多见。西医学认为咳嗽是气道因细菌或病毒感染诱发了气道炎症，导致短暂的气道反应性增高和气道黏液分泌增加，从而使气道对外界多种刺激如冷空气、烟雾、异常气味及病原体包括病毒和细菌的再度感染等产生了过度反应。主要是因普通感冒和急性气管．支气管炎而引起。小儿肺部和呼吸道发育尚未完善，对病毒等外界刺激比成人敏感，更容易出现咳嗽症状，且易反复发作。中医认为肺居胸中，上连气道、喉咙，开窍于鼻，合称肺系。肺主气，司呼吸，开窍于鼻，外合皮毛，与大肠互为表里。肺又主宣发肃降，通调水道，故肺系病变主要反应在呼吸功能活动减退，水液代谢输布失常及卫外功能失职等方面。肺系疾病为儿童各系统疾病发病率之首。肺为“娇脏”，由于气候变化剧烈或寒暖不知自调，易受风、寒、湿、燥、火等外邪侵袭而致肺卫功能失调，肺失宣降，肺气上逆发为咳嗽。小儿形气未充，冷暖不知自调，故极易感触外邪引发肺系疾病。故外感、内伤皆可引起咳嗽，外感咳嗽常伴有表证，如迁延失治，邪伤肺气，更易反复感邪，而咳嗽屡作。治疗小儿外感咳嗽以散表邪、通肺气为主。 2.2. 推拿治疗小儿呼吸系统疾病的研究进展 对小儿推拿的相关文献总结可以发现，推拿临床应用最广的是呼吸和消化系统疾病，其中对发热、咳喘、反复呼吸道感染、腹泻、便秘、厌食等疗效尤为突出。小儿推拿是从整体上对小儿的身体进行调节，从而达到治疗疾病、改善小儿体质、增强免疫力的作用，手法独特、效果显著。 现代医学认为 [ 4 ]，推拿疗法是通过神经体液因素，反射性地提高机体的防御机能，扩张毛细血管，使局部血流增加增快，改善血液循环；另一方面可以增加血液中的红细胞、白细胞的数量，增强白细胞吞噬能力，提升免疫机能，抑制病原体繁殖，清除毒素。脊柱两旁为身体各脏腑交感神经的分布区域，捏脊可影响相应脏器。实验表明按摩肺腧可调理胸腔和肺脏的气血，起到了消炎、解痉、止咳、化痰的作用，从而达到扶正祛邪，治疗疾病的目的。 推拿重在感知，医者手一下，需知病症之所在、病情之轻重、知寒热虚实；推拿又重在可控，控制自身之气力、肢体，令其平衡稳定。要求操作者熟悉自身、控制自我，包括气息、躯体、意识、情绪，进而因势利导，调控他人。 古今医家用推拿治疗小儿外感咳嗽多以疏散外邪，宣通肺气为主。但在具体选穴操作上，根据流派、地域、个人经验等不同，又呈现出多样化的特点。总的来说，古今医家均多取上肢部穴位为主，配合背部及头部穴位。运用较多的穴位或手法有“肺经”、“脾经”、“内八卦”、“捏脊”、“二扇门”、“太阳”、“三关”、“天河水”、“退六腑”、“平肝”、“膻中”、“背部介字推”等，具体治疗中又分单纯手法治疗和手法配合其他疗法治疗。不少研究者在单纯手法治疗以外，也进行了推拿与其他疗法结合治疗的尝试。 严芳 [ 5 ] 通过研究发现推拿3~6天，可以有效缓解小儿呼吸道感染症状，采用推拿治疗反复呼吸道感染的总有效率在91%以上，而单纯采用西药治疗反复呼吸道感染的总有效率一般在80%左右。宋颖 [ 6 ] 研究中采用三字经派小儿推拿手法治疗60例咳嗽患儿。其中取穴：运内八卦、清肝经、清肺经、清天河水、揉二马。针对痰多患儿加揉小横纹治疗，治疗效果达到100%。苗青 [ 7 ] 研究中实施推拿治疗咳嗽患儿124例中，其中主要处方为运内八卦、清肺、平肝、清天河水。针对外感风寒患儿加揉一窝风，外感风热加清天河水和退六腑，针对少痰或者无痰患者加揉四横纹，痰多患儿加揉小横纹，纳呆呕吐患儿加清胃，体虚者伴有多汗患儿加揉二马；惊悸烦躁者加揉小天心。其针对此些患儿治疗有效率高达99%。安柏好 [ 8 ] 应用中医推拿手法治疗54例外感咳嗽患儿，总有效率为90.74%；表明推拿手法治疗小儿外感改善临床症状显著，疗效确切。胡波 [ 9 ] 通过研究发现中药加推拿总有效率明显高于中药治疗，痊愈时间组明显短于中药治疗。杨成 [ 10 ] 通过研究结果表明小儿推拿疗法配合常规疗法治疗儿童反复呼吸道感染在疗程结束后4~6个月内疗效更佳，为临床上治疗小儿反复呼吸道感染提供了新的思路和依据，对多种方法综合治疗小儿反复呼吸道感染提供了临床依据。姚霞 [ 11 ] 研究表明推拿在对小儿咳嗽风热犯肺型的总体症状改善方面要优于中药治疗。牛瑞敏 [ 12 ] 研究发现推拿疗法比小儿消积止咳口服液总体疗效显著；说明推拿治疗感染后咳嗽(痰热蕴肺型)可明显改善患儿咳嗽咯痰等多种症状，且起效快。王丽清 [ 13 ] 研究发现肃肺法可帮助患儿排痰降逆。肃肺法是以两掌掌面相对置于患儿胸背进行搓揉、挤压以刺激患儿肺部，有良好的降逆，排痰作用。