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user: 3. 帕米卡作用机理 如图2所示，2011年诺贝尔生理学和医学奖获得者Bruce BA [ 3 ] 和Hoffmann JA [ 4 ] 发现TLRs膜式识别受体可以与微生物基本成分结合活化非特异性免疫，Steinman RM [ 5 ] 发现树突状细胞(DC)具有促进机体非特异免疫并进而活化淋巴细胞启动特异性免疫，帕米卡在免疫中具有这两方面的促进作用，是帕米卡作用机理的依据。 图 1 . PolyI:C-NH 2 -Ca 2+ 的复合物结构示意图 Table 1 Pamica multi targetly activate system immunit 靶点targets 方法及结果Methods and results 结果来源Souses of results 是TLR3、TLR4配体(文献报道还是PKR、RIG1、MDA5配体) 通过细胞信号通路试验证明帕米卡是TLR3、TLR4配体 香港InvivoGen公司检测2018.3 IL-6：产生细胞主要是单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞 利用抗原夹心磁珠法检测，帕米卡(100-5000BP)免疫1~5小时，小白鼠体内IL-6均显著提高，比对照组提高300倍 欣博盛生物科技公司2018.1.19；2018.2.11 IL-12P40产生细胞主要是APC细胞包括DC细胞、单核巨噬细胞、B细胞 方法同上，比对照组提高近20倍 同上 TNFα产生细胞主要是白细胞 方法同上，比对照组提高87倍 同上 IFNα产生细胞主要是单核细胞、巨噬细胞产生 方法同上，比对照组可提高60倍 同上 IFNγ产生细胞主要是NK细胞 方法同上，比对照组可提高近20倍 同上 佐剂作用：抗体显著提高，产生V细胞 肌红蛋白帕米卡免疫家兔，ELISA方法检测抗体较完全弗氏佐剂提高6倍 中科爱博公司2017.11.21 体外试验： 上调肿瘤细胞TLR3mRNA：上调A549人癌细胞和LL/2鼠癌细胞TLR3mRNA 抑制肿瘤细胞分裂和细胞数： 促进鼠癌细胞凋亡显著抑制S和G1期细胞分裂 促进人癌细胞凋亡 显著抑制S和G1期细胞分裂 抑制癌细胞增殖，减少细胞移动 帕米卡促进DC细胞成熟，上调MHC I和II分子 RT-QPCR检测帕米卡经24、48小时处理细胞后P值<0.01和0.001 抑制LL/2鼠癌细胞、A549人癌细胞分裂周期和细胞数 LL/2鼠癌细胞通过V-FITC/PI染色检测细胞凋亡率11.43%，对照组2.73% P < 0.001； 人癌细胞A549通过PI染色检测细胞到位率32.01，对照为17.11 P < 0.001 A549人癌细胞通过V-FITC/PI染色经流氏细胞仪检测细胞凋亡率20.14%，对照组0.13% P < 0.001 通过PI染色检测细胞到位率55.16，对照为46.52 P < 0.001； 抑制癌细胞CCK8繁殖，促进细胞凋亡，减少G1期细胞分裂，减少细胞移动 上调DC细胞MHC I和II分子、促进共刺激分子CD80，CD86产生 中国医学科学院药物研究所吴叶丹等信福公司林海祥 [ 2 ] 帕米卡促进荷瘤小白鼠DC细胞促进CD80、86分泌 帕米卡活化信号传导绑定话化TRIF，TRAF帕米卡活化信号传导绑定话化TRIF，TRAF 以CD11c标记DC、PBS对照组CD11c细胞从4.96，帕米卡组7.85%，同型动物阳性对照6.02%。说明肺癌降低脾DC，帕米卡组可提高脾DC： 在肺癌小白鼠中同型对照小白鼠CD80阳转率和MFI (流式细胞术平均的荧光强度)，分别为0.25%和68.49；肺癌小白鼠PBS组为13.60%和785.9；帕米卡注射组小白鼠为20.16%和1210.76。 促进CD86分泌：同型对照CD86阳转率和MFI分别为0.73%和135.97；肺癌小白鼠PBS组为1.67%和221.38；帕米卡注射组小白鼠为4.01%和353.20%。总之，帕米卡提高DC成熟，上调脾MHC I和II分子、CD80， CD86共刺激分子水平，刺激体内T细胞。 在肺癌小白鼠中，同型对照CD80阳转率和MFI分别为0.25%和68.49%；PBS组为13.60%和785.9%；注射组为20.16%和1210.76%。CD86阳转率和MFI分别为0.73%和135.97%；PBS组为1.67%和221.38%；注射组为4.01%和353.20% 中国医学科学院药物研究所吴叶丹等信福公司林海祥 [ 2 ] 肺癌小白鼠体内试验： 1、抑制荷瘤小白鼠肿瘤生长体积 2、促进荷瘤小白鼠肿瘤细胞的凋亡 3、抗小白鼠肺癌自然转移活性和坏死 4、延长肺癌小白鼠存活期 抑制荷瘤小白鼠肿瘤生长体积：帕米卡肌注组51%，喷鼻组39%，PD1组15%，统计学测定P < 0.05、0.01、0.001；肌注组小白鼠体重明显较喷鼻组轻P < 0.05 Tunel荧光检测显示注射组凋亡和坏死细胞多于喷鼻组，并抑制了肿瘤体积 与PBS对照组小白鼠肺癌转移灶比：喷鼻组和PD1组明显有转移而注射组未见转移灶，但有肺癌前期病变；肝转移除注射组没有，对照组、喷鼻祖、PD1组都有，均没有发现脑转移 PBS对照组小白鼠存活25天，帕米卡组44天，P < 0.001 中国医学科学院药物研究所吴叶丹等，信福公司林海祥 [ 2 ] 帕米卡调节P13k/Akt/mTOR信号转导通路，抑制肿瘤细胞分裂，促进肿瘤细胞凋亡 通过Western blot方法在LL/2鼠癌细胞和A549人癌细胞检测帕米卡增加Akt P21和P53表达，而对照组抑制P21和P53表达。流式细胞仪检测表明帕米卡封闭了细胞分裂的分裂间期。帕米卡能够通过降低P-Akt的表达，诱生依赖P53凋亡蛋白的LL/2鼠癌细胞和A549人癌细胞细胞凋亡 同上 帕米卡降低P13k/Akt表达引起依赖P53-caspase (含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的LL/2鼠癌细胞和A549人癌细胞凋亡 在免疫组织化学通过计算也获得上述同样结果。与对照组比较P-Akt和cyclingD1减少而P53、P21、caspa3增加。帕米卡调节P13k/Akt/P53通路改变细胞死亡繁殖相关的分子组成 同上 荷瘤小白鼠试验(肺癌、乳腺癌肺转移、黑色素瘤非转移) 均能显著抑制荷瘤小白鼠体积P < 0.0001，延长存活期从对照组22天至帕米卡组44天P < 0.001 中国医学科学院药物研究所(乳腺癌、黑色素瘤小白鼠2份报告) 辉源(上海)科技公司肺癌小白鼠1份报告) 异常毒性检测 小白鼠(16~18 g)腹腔0.5 ml；豚鼠(250~350 g)腹腔5 ml注射后一周健存，体重增加。符合要求 信福(北京)医药科技有限公司 表1. 帕米卡多靶点激活全身免疫力 图2. DC对细菌病毒的保守成分的识别 Toll样受体(Toll-like receptors， TLR)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子，当微生物突破机体的物理屏障如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。帕米卡是多种膜式识别受体(PRR)的配体，包括TLR3、4 (Toll样受体3、4)、NOD (细胞内核苷酸结合寡核苷酸域)蛋白家族、RIG-I (RNA螺旋酶视黄酸诱导基因I)、MDA5 (黑色瘤分化相关基因5)依赖dsRNA蛋白激酶等。这些受体广泛存在于上皮细胞和树突状细胞里，还存在NK、T、巨噬细胞中，也在几种肿瘤细胞中表达。TLR3作为病毒双链RNA识别受体在机体抗病毒天然免疫中发挥十分重要的作用，TLR3与配体结合后，活化转录因子NF-KB和干扰素调节因子3 (IRF3)，诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反应，同时诱导I型干扰素的释放，使DC细胞成熟，介导抗病毒抗肿瘤非特异性免疫。这些信号传导不仅通过TLR3还可通过MDA5和RIG-1胞浆受体。人体的巨噬细胞、嗜中性细胞、不同癌细胞、上皮细胞具有MDA5和RIG-1。双链RNA被MDA5和RIG-1识别后，与其相关的线粒体接头分子相互作用信号级联式启动，导致IRF3、NF-κB活化产生IFN1。帕米卡喷剂属于双链RNA (dsRNA)药物，双链RNA制剂作为配体一旦与这些受体结合，通过细胞内信号传导激活机体一系列非特异性和特异性免疫(如图3所示)，在机体保护性免疫方面发挥重要作用，是调节抗感染抗肿瘤初始免疫的中心环节。 帕米卡另一主要成分“非抗生素类氨基化合物”是TLR4受体的配体，被识别后启动信号转导途径诱导NF-κB和蛋白激酶-1 (activator protein 1， AP-1)等的活化，通过促进巨噬细胞、NK细胞、T细胞功能发挥抗病毒抗肿瘤作用 [ 6 ]。 树突状细胞(DC)，是功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，是连接初始免疫和继发免疫的中心环节。当受到外源性抗原或肿瘤抗原危险信号刺激时，树突状细胞摄取、加工处理这些抗原为抗原肽并与树突状细胞表面MHCI、II类分子(信号1)结合，通过抗原递呈激活初始T细胞。为保证诱发抗原特异性的免疫刺激反应，树突状细胞还需分泌共刺激分子(信号2)及特征性细胞因子白细胞介素12 (IL-12)等(信号3)。帕米卡喷剂能够通过上调DC细胞MHC I和II分子、促进共刺激分子CD80，CD86产生，促进IL-12产生，促进抗原呈递，连接初始免疫(非特异性免疫)和继发免疫(特异性免疫)。另一方面帕米卡本身就具有抗病毒、抗肿瘤作用(如图4所示)。 图3. TLR3、4等受体与配体结合后信号传递途径及产生的免疫反应 图4. 树突状细胞的功用