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user: 4. 讨论 通过肿瘤RNA测序(RNA-Seq)监控基因和转录组的表达变化可以协助了解肿瘤的分类和发展，全转录组测序不仅可以得到每种RNA的全套分析结果，还可通过二重、三重关联分析，对目标基因的范围进行有效的缩小，进而得到准确的关键基因。本研究基于二代测序技术的全转录组测序研究，同时分析样本中差异表达的mRNA，lncRNA，miRNA，并且通过两两关联分析、三元关联分析，建立可能的ceRNA调控网络，使研究内容更加系统化，致力于深入挖掘生命现象背后的转录调控问题。 4.1. 差异lncRNA的分析 在本次测序结果中，已知有注释的差异lncRNA四种：HOXD-AS2 [ 26 ]、LINC01088 [ 27 ]、DNMBP-AS1 [ 28 ]、Metazoa_SRP [ 29 ]。其中HOXD-AS2与多种癌症密切相关，在其与胶质瘤相关研究中，研究人员对胶质瘤细胞系和正常星形胶质细胞系进行了针对lncRNA表达谱高通量的芯片检测，结果表明：HOXD-AS2在神经胶质瘤细胞中升高，与神经胶质瘤的分级和预后不良有关；HOXD-AS2的丢失可通过诱导体外细胞周期G1阻滞来抑制神经胶质瘤细胞的生长，进而胶质瘤的增殖受到抑制。除胶质瘤外还与肺癌细胞的耐药性、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和皮肤鳞状细胞癌的发生及恶化密切相关；DNMBP-AS1已有明确研究证实其可作为肝癌患者预后的重要生物标记。Metazoa_SRP已有研究表明其与肺纤维化 [ 30 ]、骨肉瘤 [ 31 ] 的发生有关，同时在乳腺癌、结直肠癌表型的易感性标记有极高的关联性 [ 32 ]，并且在人脑的发育及相关精神疾病 [ 29 ] 的研究中具有深远影响；在非小细胞肺癌(NSCLC)的研究中，linc01088和EZH2在NSCLC组织和细胞系中均高表达：抑制linc01088就抑制了NSCLC细胞的增殖，并延长了G1期，同时缩短了S和G2-M期；RIP分析揭示了linc01088与EZH2之间的直接结合关系；抑制linc01088或EZH2诱导p21表达的上调，随后抑制了肿瘤的生长；证明了linc01088可以通过与EZH2结合抑制p21来促进细胞增殖，从而加剧NSCLC的肿瘤发生。因此，linc01088可能是潜在的癌基因和新型抗肿瘤治疗的靶标 [ 33 ]。在卵巢癌中，linc01088可通过靶向miR-24-1-5p抑制卵巢上皮细胞的肿瘤发生 [ 34 ]，并且与胃癌、肝癌 [ 35 ] 和子宫内膜癌 [ 34 ] 发生发展的多个重要通路相关。而CTC-458G6.2和CTB-1I21.1在目前的研究中尚未有明确机制表明其与疾病发生或预后的影响及意义，但现有数据及分析可知，这两个lncRNA在大脑中特异性表达，并且与多个已知与胶质瘤相关基因具有互作关系，可作为日后研究的重要方向。这些lncRNA与相关文献报道表达水平相一致，目前在胶质瘤发病机制研究领域也有多篇报道 本次测序也发现多个未注释的差异lncRNA，但其对胶质瘤的调控机制还有待进一步实验验证。而lncRNA：LNC_002514、LNC_001173、LNC_002436和LNC_001254目前在人类疾病方面尚未研究，因此作为潜在生物标记，为今后的研究验证工作提供方向。 4.2. 差异miRNA的分析 在本次测序结果中，差异表达的miRNA：hsa-miR-296-3p在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)中的miRNA和mRNA表达谱相关研究中差异调节涉及细胞粘附，血管生成，细胞周期，JAK-STAT信号传导，MAPK信号传导，一氧化氮信号传导，VEGF信号传导和伤口愈合途径的基因。此外，基于q-PCR的miRNA和mRNA上调和下调实验研究表明，hsa-miR-296-3p等miRNA有效地影响斜管恒温器刺激微重力(MG)条件下HUVEC的细胞增殖和血管功能。对相互作用组结果的共识表明，暴露于短期MG的HUVEC转录组的波动受限，这可能导致较高水平的内皮功能，如血管生成和血管形成 [ 36 ]。hsa-miR-6761-5p、hsa-miR-3157-3p在最新研究中被列为颅内动脉瘤发展的潜在靶标 [ 37 ]，hsa-miR-3157-3p在大肠癌相关的ceRNA调控网络中重要节点 [ 38 ]。与hsa-miR-299-3p相关的研究较为广泛，与黑色素瘤 [ 39 ]、多形性胶质母细胞瘤 [ 40 ]、透明肾细胞癌 [ 41 ] 等多种常见癌症相关，并且被列为喉癌 [ 42 ]、结肠癌 [ 43 ]、颅内动脉瘤 [ 37 ] 等疾病的独立预后因素。 4.3. 下游靶基因分析 受差异miRNA调控的下游靶基因共12种：PDGFRB [ 44 ]、MRAS [ 45 ]、INO80E [ 46 ]、hnRNPUL1 [ 47 ]、FOSL1 [ 48 ]、ZNF875 [ 49 ]、AIFM3 [ 50 ]、GABBR1 [ 51 ]、TRIM26 [ 52 ]、PNMA3 [ 53 ]、KIAA0586 [ 54 ]、SLC19A1 [ 55 ]。 血小板衍生的生长因子(PDGF)信号通路驱动高度神经胶质瘤(HGG)进程，并且PDGF受体(PDGFRs)的表达增强是胶质母细胞瘤(GBMs)子集中的一种普遍的突变。PDGFRA在神经胶质瘤细胞中表达，而PDGFRB主要限于与神经胶质瘤相关的基质。相关研究还显示，小胶质细胞(TAMMs)的空间位置与已经获得PDGFRB在小鼠和人类低级神经胶质瘤和HCGs中表达的肿瘤细胞亚群的扩展相关。此外，M2极化的小胶质细胞诱导神经胶质瘤细胞中PDGFRB的表达并刺激其迁移能力 [ 56 ]。 MRAS是相对于经典RAS癌蛋白而言最接近的，并且共享大多数调节和效应子相互作用。但是它也具有独特的功能，包括与SHOC2和蛋白磷酸酶1 (PP1)结合时，具有磷酸酶调节亚基的功能。这种磷酸酶复合物调节RAF激酶激活周期中的关键步骤，并提供有效的ERK途径激活和RAS转化所需的关键坐标输入。MRAS突变很少在癌症中发生，但在某些情况下表达失调可能在肿瘤发生中起作用。在RAS病Noonan综合征中确实发生了MRAS的激活突变(以及SHOC2和PP1)，这强调了RAS-ERK途径中MRAS的关键作用。MRAS在细胞迁移和分化中也具有独特作用，其性质与细胞极性调节中的关键作用相一致 [ 45 ]。 INO80E在评估异基因造血干细胞移植(HSCT)在胰腺导管腺癌治疗中的免疫学作用中，是及其重要的免疫应答指标。并能够对临床和生物学相关细胞免疫组库的建立产生影响 [ 46 ]。 2020年4月FOSL1在低级神经胶质瘤(LGG)的研究中，通过比较不同类型肿瘤之间的FOSL1表达，探索TCGA-LGG和亚组中FOSL1表达与总体生存(OS)之间的关联。结果表明：LGG中的FOSL1表达在21种不同的癌症中排名第一。FOSL1表达较低的LGG的OS较长(P < 0.001)。星形细胞瘤组的FOSL1表达最高，OS最短，其次是少星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤(P < 0.05)。1p19q共缺失或IDH突变亚组具有较低的FOSL1表达和较长的OS (P < 0.001)。与相应的组相比，FOSL1表达较低的LGG的OS比以下组更长，因此0FOSL1是LGG和亚组的预后标志物 [ 47 ]。 4.4. LNC_002514-hsa-miR-296-3p-FOSL1轴向调控的分析 在lncRNA (down)-miRNA (up)-mRNA (down)网络中，经过生物信息学分析后发现LNC_002514表达量下降，释放hsa-miR-296-3p作用于下游基因：FOSL1。 在2019年12月发表的关于冠状动脉疾病(CAD)的生物标记文章中，研究人员建立一个用于诊断CAD的circRNA-miRNA-mRNA三重网络。使用接收器工作特性(ROC)曲线评估了hsa-miR-21-3p和hsa-miR-296-3p、circYOD1的预后价值。circ-YOD1的ROC曲线下面积(AUC)为0.824，hsa-miR-21-3p的AUC为0.731，hsa-miR-296-3p为0.776。因而在对cad中circRNA-miRNA-mRNA的三重调控网络的研究表明，hsa-miR-296-3p在潜在生物标记的研究过程中有着及其重要作用 [ 57 ]。 FOSL1 (Fos样抗原1，也称为Fra-1)是FOS家族的成员，它由四个基因成员c-FOS，FOSB，FOSL1和FOSL2组成，所有这些基因编码包含亮氨酸拉链的蛋白质。与Jun (c-jun， junB， junD)，激活转录因子(ATF)和肌腱膜纤维肉瘤(MAF)结合的FOS是激活蛋白1 (AP-1)复合物的成员。FOSL1是调节正常细胞生长，分化和凋亡的重要核转录因子。在宫颈癌发病机制的最新研究中，研究人员发现Fra-1抑制宫颈癌细胞的增殖，同时还促进细胞凋亡并影响细胞周期分布。此外，Fra-1上调子宫颈癌细胞中的STAT1表达并调节p53信号通路活性。Fra-1的过表达通过改变HeLa细胞中的sirtuin 1 (SIRT1)表达来抑制细胞衰老，而Fra-1的过表达恢复了线粒体疾病并抑制了HeLa细胞中的代谢重编程。STAT1沉默会削弱Fra-1对宫颈癌细胞生长的抑制作用，而STAT1的敲低则逆转了由Fra-1引起的HeLa细胞对细胞衰老和线粒体功能障碍的影响。STAT1沉默也恢复了子宫颈癌细胞的代谢重编程。其研究结果表明，Fra-1通过STAT1介导的p53信号通路调节来抑制子宫颈癌细胞的生长和Warburg效应 [ 48 ]。此外，已发现它在包括肺癌在内的许多癌症中具有重要作用。在胶质瘤的相关研究中，当FOSL1沉默时，改变了恶性神经胶质瘤细胞的形态，锚定非依赖性生长和体内肿瘤形成。它的过表达赋予非致瘤性神经胶质瘤细胞系致瘤性 [ 56 ]。 LNC_002514在目前的研究中尚未有明确的研究结果，通过生物信息学分析结果可知LNC_002514与hsa-miR-296-3p及其下游基因FOSL1存在可能的调控关系，因而可作为潜在的研究方向。 在本次检测结果中，FOSL1的表达量与预期结果相反，因而有如下可能：1. 在组织切取过程中因癌组织与癌旁组织边界不明显、难以准确区分，所以所取得的样品可能不完全是胶质瘤组织，故而检测结果与理论依据不符。2. 本次测序样本容量较小，因此可能无法准确展现FOSL1在恶性胶质瘤中的表达特点。