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user: 3. 结果与讨论 3.1. Hg 2+ 传感器组装情况的表征 我们设计的Hg 2+ 生物传感器是基于该传感器能够形成G-四联体DNA酶，可以催化H 2 O 2 氧化ABTS的反应 [ 8 ] [ 9 ] 。为了验证该实验机理，我们使用紫外–可见分光光度计测试了hemin，MNPs-SA4和MNP-SA4/SB4/SC4/henin复合物存在和不存在Hg 2+ 的情况下，ABTS-H 2 O 2 体系的紫外吸收光谱，结果如图2所示。曲线a为基底物质ABTS的吸收曲线。b为MNPs/SA4复合物催化ABTS后的吸收曲线，由图可知，MNPs/SA4复合物对ABTS具有很低的催化活性，几乎可以忽略。Hemin的催化曲线如图c所示，虽然hemin本身对H 2 O 2 氧化ABTS的反应具有一定的催化效应，但是游离的hemin在洗涤的过程中被除去，因此它的催化活性也非常的低。在MNP-SA4/SB4/SC4/henin复合物中，当没有Hg 2+ 存在时，MNP-SA4不能利用Hg 2+ 捕获SB4和SC4，它们以游离的形态存在溶液中，不能形成DNA酶，hemin会通过清洗过程被除去，所以催化效果并不理想，其催化曲线如图d所示。但当体系中存在Hg 2+ 时，MNPs/SA4通过结合Hg 2+ 形成T-Hg-T结构成功捕获SB4和SC4，经过培育后SB4和SC4中富含G碱基部分将形成G-四联体DNA酶，催化H 2 O 2 氧化ABTS反应的进行，催化结果如曲线e所示，在421nm处吸收峰急剧增大。依据我们的设计思想，只有当Hg 2+ 存在时，MNPs/SA4才能成功捕获SB4和SC4，G-四联体DNA酶才能形成，随即发生ABTS的氧化反应，从曲线e中ΔA 421nm 值比较理想。可以推测，该体系形成了G-四联体DNA酶，表明我们成功组装了G-四联体DNA酶Hg 2+ 生物传感器。 为了进一步验证只有在Hg 2+ 存在时，体系才能形成G-四联体DNA酶，在没有Hg 2+ 时，游离形态的 图2. 不同组分存在时Hg 2+ 传感器的紫外吸收曲线 SB和SC不会形成G-四联体，否则这将导致高的背景和错误的响应。为此，我们设计了四组不同序列和长度的SA，SB，SC，以确保只有当Hg 2+ 存在时，才能形成G-四联体DNA酶。设计的四组链中，同组SB和SC链长度相等。其中SA1和SA2为16个碱基，链最短，SA4其次，为20个碱基，SA3链最长，为24个碱基。而第2组和第4组中SA与SB和SC的G-C碱基互补率为50%，第1组和第3组分别为62.5%和66.7%，结果见图3。由图可知，1、2、3组中无目标时的吸光度均大于有目标存在时的吸光度，这是由于SA和SB及SC因互补的碱基数量较多(1、3组)和链较短(1、2组)，在hemin的存在下部分形成具有催化活性的酶，使吸光度信号有所增加，当有Hg 2+ 存在时，这不稳定的G-四联体结构发生改变，导致吸光度下降。第4组中由于所选用的链长与SA和SB及SC中的G-C碱基互补程度合适，获得了设计所需的结果。这说明所选的链长度与互补性在传感器的检测准确度与灵敏度方面均有重要的影响。因此，试验中选用第4组的序列作为传感器的目标捕获和信号发生的寡聚核苷酸链。 为了更好地说明要成功构建G-四联体DNA酶生物传感器取决于SA，SB，SC链的碱基序列和长度，我们利用CD光谱法对分裂式G-四联体的构型进行了表征(如图4所示)。如图4(C)可知，SA，SB，SC混合物在有无Hg 2+ 存在时，在260 nm处出现正峰，240 nm处出现负峰，说明体系中出现了平行的G-四联体结构 [ 10 ] [ 11 ] 。第1、2和4组的CD光谱图与第3组完全不同，它们分别在260 nm和290 nm处出现了两个正峰，在240 nm出现负峰，属于平行和反平行结构混合物 [ 12 ] 。第1、2组中当有Hg 2+ 存在时，峰强度反而弱一些，可能是因为Hg 2+ 的存在使SA/SB/SC聚合物分解了，其催化活性更弱。仅第4组在有Hg 2+ 时，CD光谱峰的强度明显增高，说明形成了稳定的具有催化活性的G-四联体DNA酶。CD实验结果与前面的光度实验结果相吻合。 3.2. 实验条件的优化 为了获得最好的实验结果，我们对实验的最佳条件进行了摸索。Hg 2+ 捕获时间是影响Hg 2+ 传感器性能 图3. 四组不同序列组成的SA、SB和SC对Hg 2+ 检测的影响，其紫外吸光度对比图：hemin (黑色)，SA+SB+SC (浓密)， SA+SB+SC+Hg 2+ (稀疏)。实验条件：[ABTS] = 4 mM， [H 2 O 2 ] = 1.2 μM， [hemin] = 50 nM， [Hg 2+ ] = 100 nM，[SA] = 150 nM，[SB] = 150 nM，and [SC] = 150 nM 图4. 不同体系下的CD光谱图。SA1/SB1/SC1 (A)，SA2/SB2/SC2 (B)，SA3/SB3/SC3 (C) and SA4/SB4/SC4(D)体系在有Hg 2+ (黑色实线)和没有Hg 2+ (红色虚线)条件下的CD图。实验条件：[SA] = 3 μM，[SB] = 3 μM，[SC] = 3 μM and [Hg 2+ ] = 20 Μm 图5. (A) Hg 2+ 捕获时间对ΔA 421nm 值的影响，(B) K + 浓度对ΔA 421nm 值的影响。实验条件：[SB4] = 150 nM，[SC4] = 150 nM，[Hg 2+ ] = 100 nM，[hemin] = 50 nM，[ABTS] = 4 mM；and [H 2 O 2 ] = 1.2 μM 的重要因素之一，实验得到的Hg 2+ 捕获时间结果如图5(A)所示。随着捕获时间的延长(从1 h至4 h)，ΔA 421nm 值是逐渐增大的，4 h后反应时间再延长，ΔA 421nm 值的增大趋势极缓慢，故我们选择4 h作为该Hg 2+ 传感器的捕获时间。本实验与其他检测Hg 2+ 实验相比 [ 13 ] ，捕获时间较长，可能是因为用磁颗粒作载体时存在一定的空间位阻，导致反应时间的延长。 K + 是构成稳定的G-四联体DNA酶的重要条件 [ 14 ] ，适当的K + 浓度是Hg 2+ 传感器构建的基础。我们依据构建的Hg 2+ 传感器的催化性能对K + 浓度进行了选择优化，结果如图5(B)所示。当体系中的K + 浓度从5 mM增加到50 mM时，该体系的ΔA 421nm 值逐渐增大并达到最大值，随后再增加K + ，其吸光度值反而急剧下降。说明K + 浓度较低时，SB4和SC4形成的G-四联体结构不稳定，随着K + 的不断加入，极大地提高了G-四联体的稳定性；当体系中的K + 浓度过高时，溶液中较强的离子强度可能使DNA的活性受到了影响，导致DNA酶的活性有所降低。所以该传感器的最佳K + 浓度为50 mM。 3.3. Hg 2+ 选择性实验 Hg 2+ 传感器对共存金属离子的抗干扰能力也是该体系研究的重要内容。由于实际水样的成分极其复杂，往往是多种金属离子同时存在，Hg 2+ 的检测可能会受到如Ni 2+ ，Co 2+ ，Cd 2+ 或Pb 2+ 的干扰，但是我们的传感器是由分子间分裂式G-四联体DNA酶构成的 [ 15 ] ，只有当Hg 2+ 存在时，才能形成T-Hg-T结构，使SB和SC中富含G碱基部分相互靠近形成DNA酶，从而减弱了Pb 2+ 带来的干扰，提高了Hg 2+ 的选择性。我们选择了12种共存离子进行研究，其紫外吸收强度如图6所示。向Hg 2+ (25nM)所在体系加入2.5 μM共存离子后，测得的ΔA 421nm 值与Hg 2+ 单独存在时相差不大。这说明即使共存离子浓度与Hg 2+ 浓度的比值为100:1时，我们设计的传感器对Hg 2+ 的检测仍旧灵敏，证明了该方案可以特异性的检测目标物Hg 2+ 。 3.4. Hg 2+ 的定量检测 我们还就传感器对不同浓度的Hg 2+ 响应情况进行了研究，结果如图7所示。随着Hg 2+ 浓度的增加，ΔA 421nm 值逐渐增大，在2 nM~50 nM之间呈现良好的线性，线性方程为ΔA 421nm = 9.17 × 10 − 3 + 6.26 × 10 − 4 c Hg2+ (nM)，相关系数R 2 为0.9890，检测限为0.8 nM，说明这种分裂式G-四联体DNA酶传感器能够 图6. Hg 2+ 传感器的选择性，柱状图表示25 nM Hg 2+ 和2.5 uM其他共存离子(Cl − 浓度为0.25 mM)同时存在的紫外吸光度值 定量检测Hg 2+ 。该体系Hg 2+ 的检出限为0.8 nM，说明我们设计的传感器能够识别低浓度的Hg 2+ ，远远低于标准饮用水中对Hg 2+ 含量的限制(10 nM)。 3.5. 传感器对实际样品的检测 为了证明该Hg 2+ 传感器能够应用于实际样本的检测，我们选择了三种水样(自来水，河水和工业废水)进行了评价，结果如表2所示。经过实验分析，自来水和河水中没有发现Hg 2+ ，说明可能Hg 2+ 含量很低，而工业废水中约有4.6 nMHg 2+ 。为了进一步证实该方法的可靠性，我们引入加标回收实验法 [ 16 ] 。通过加标回收得到的回收率范围为95.0%~106.0%，回收率在可靠范围内，说明我们设计的传感器可以检测实际水体样品中的Hg 2+ 。