DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 摘 要 党的十九大报告提出“乡村振兴”战略，通过全面振兴，乡村在原有农业生产之外找到新的发展空间，从而催生了大量的创业、就业机会。其中，大学生回乡创业是促进乡村振兴战略实施的重要行为。对于自我认同尚在发展阶段的大学生创业者来说，创业者的身份认同显得尤为敏感而重要。本文基于身份认同理论解释大学生乡村创业意愿的形成逻辑，构建了“身份认同–乡村创业态度–乡村创业意愿”之间的理论联系，构建大学生乡村创业意愿的整合模型。针对杭州下沙7所高校在校本科生352人进行问卷调查，并利用AMOS分析收集数据，结果显示：乡村创业情感和乡村创业评价对大学生开展乡村创业的行为态度具有的正向影响；乡村创业情感和行为态度对行为意向的影响呈现出正向的影响。基于上述结论，我国推动大学生乡村创业意愿的产生和稳定应突破“至上而下”的模式，从观念上改变大学生对于“在农村工作”的固化偏见，通过情感支持、制度鼓励、身份联系等渠道，激发大学生乡村创业的意愿，促进乡村创业行为的发生。 关键词 :身份认同，行为态度，行为意向，大学生，乡村创业 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 乡村振兴人才先行，自党的十九大报告提出“乡村振兴”战略，中央连续出台政策鼓励大学生返乡就业创业，2018年，2019年中央“一号文件”都明确提出支持大学生乡村创业，出台乡村创业的配套优惠政策，鼓励高校毕业生下乡创业。但从现状来看，大学生回乡村创业的实际情况并不容乐观，虽然当前政策积极鼓励和引导大学生回乡创业，大学生回乡创业的意愿不高，比率也很低。总体上，大学生乡村创业的现状离助力乡村振兴的要求仍有较大差距，如何提高大学生乡村创业意愿是个亟待解决的重大问题。 关于大学生乡村创业及返乡就业的问题与现象，学术界已经取得了相当的研究成果，重点集中在大学生返乡创业的客观支持要素，但从大学生乡村创业意愿及行为的心理形成视角所做的研究显得不足，特别是关于影响大学生乡村创业意愿的心理因素及其机制作用的研究更为匮乏。有学者指出由于特定历史时期发展需要，政府所推行的以户籍制度为核心的城乡二元分割体制，在一定程度上形成了城乡身份的认同固化 [ 1 ]。传统上，上大学被学生和家长视为改变个人命运的重要途径，大学毕业后跳出“农门”，在大城市、大企业谋得一份稳定的，朝九晚五的工作成为学生和家长的主流追求。 大学生受到传统观念以及城乡资源分配差异的影响，为了争取更好的发展机会与社会资源，毕业后往往选择在城市工作，人才竞争激烈。乡村却存在着人才稀缺的问题，造成教育资源的浪费，人才资源未能得到有效利用。创业作为自主性的经济行为，研究表明创业者的身份认同对于创业决策的影响巨大。基于此，本研究以身份认同理论来解释大学生乡村创业意愿的形成逻辑，构建“身份认同–乡村创业态度–乡村创业意愿”之间的理论联系，分析大学生身份认同对于乡村创业意愿的影响机理。
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user: 2. 文献综述 (一) 身份认同理论 身份认同的含义是错综复杂的。一方面由于研究者的研究视角不同、身份认同的切入点不同，其所表现的内涵与外延就不同；另一方面身份认同是一个动态的过程，即使是同一个群体在不同时间、不同空间的身份认同也会不一样。但唯一不变的是身份认同始终围绕着两个问题：我是谁，我属于哪一个阶层。 身份认同是是人们对自我身份的确认，是有关个人在情感和价值意义上视自己为某个群体成员以及隶属某个群体的认知；角色身份认同提供了一个自我在角色中的定义，它包括和角色有关的目标、价值观、信念、规范、时空和角色间相互作用模式的认知 [ 2 ]。社会认同理创始人Tajfel认为，一个人的社会群体成员身份和群体类别是一个人自我概念的重要组成部分，并主张人们努力地获得和维持积极的社会认同，从而提升自尊。这种积极的认同很大程度上来自内群体和相关外群体的比较 [ 3 ]。社会身份认同理论指出，身份认同的概念不是孤立、割裂的，而是与个体所处的环境相联系和适应的。这种联系性和适应性所带来的结果是双向的，在个人层面表现为积极的自我认同，进而上升为对自我社会身份的认同，从而诱发相应的行为表现；在社会层面，个体将自我和外群体区分出来，利用自身的比较优势定位身份，成为外群体的参照对象。 个体身份作为解释行为的认知框架促使其寻求和他们的身份一致的行为和行动 [ 4 ]。Bird等人 [ 5 ] 认为创业行为是一种价值驱动型的创造性活动，包含了机会识别行为和资源获取行为，通过促进新企业创办、成长和转型的活动得以完成。身份认同在创业过程中的构架，为个体的创业行为提供了持续的动力和源泉。个体对自我身份的认可与社会期望值之间的匹配度，将通过个体最终的行为态度表现出来。因此，个人对自我身份的认同担当着行为态度的输入端，创业者的创业行为是其身份和创业动机的体现。基于此，社会认同理论为阐释创业者群体成员之间的观念和行为及其影响因素提供了理论基础。 身份认同理论在过往的研究中，广泛运用于对个人行为态度的影响分析当中，所涉及的领域包括：新闻传播学、社会语言学、教育学等多个不同的专业维度，亦有学者将其迁移运用到创业者身份构建的过程中。本文运用身份认同理论探讨大学生乡村创业的意愿，旨在突破乡村创业这一概念在大学生思维中的固有印象，激发大学生内在的认同感，以此带动乡村振新战略的落实。 (二) 大学生创业者的身份建构 我国学者王晶晶等人 [ 6 ] 认为大学生创业者的身份建构除了受创业经历、个性特征、原有身份特征等个体自身因素影响，还被网络关系、社会文化等外界环境制约。在外界环境因素中，尤以父母和亲朋好友的态度影响最大。王秀芝 [ 7 ] 指出农村学生的教育投资需要回报，家族门庭需要光耀，生存问题需要解决。传统观念的影响和父母家庭的期盼使那些即使有意愿想回到农村发展的大学生畏缩不前。 在现代社会学和心理学的研究中，常常将身份视为个体的一个相对稳定的特征，会在创业过程中决定创业行为。但现实实践表明，身份建构是一个不断发展的动态前进的过程。现代主义对创业者身份的研究目的在于发现创业者身份的普遍特征，将对其进行分类，并从工具性的视角去探索身份对创业结果的影响以及提升创业成功率和效率的可能性 [ 8 ]。但是，创业并不是由具有固定心理特征的创业者实施的普遍过程。由此，其局限性便凸显出来。因此，本文在研究过程中重点关注了创业者身份建立的动态过程，强调其形成的发展轨迹与成长历程，探索大学生对乡村创业的意向从产生到成熟，再到实施落地的全程。 依据身份认同理论，创业者身份是在社会互动与交往中形成的，它是某种特定的职业身份认同与社会身份认同的综合体，人们需要理解创业者身份包含的意义，以指导自己的创业行为。创业身份被赋予了一定的社会期望，因此，为了回馈这种社会期望，创业者就会实施与社会期望一致的创业行为。Murnieks等人 [ 9 ] 认为创业者身份是一个多维度的概念。组成自我概念的身份维度有中心性和突出性之分。中心性指的是与其他身份相比，焦点身份对于创业者的相对重要性;突出性是指创业者表达焦点身份的意愿强度。由于意愿是预测行为的最直接的指标，因此，创业者对自我身份越是认同，通过行为来表达身份的可能性就越大。 创业者身份认同会驱动目标导向行为 [ 10 ]。同时，个人的创业行为又会受到其身份认同的限制。自我所归属群体的特征往往具有同一性，这势必会在个体发展中局限其思路的走向，并对其行为产生偏正性影响；基于比较优势基础上的自我定位，很大程度上难以体现个体的真实心理意愿，对其后续的行为发展的自主性与积极性都会产生相应的阻滞。也就是说，个体的身份认同与创业行为的实施有着密切的联系。大学生对乡村创业者群体的认知度越强，评价越高，对该职业的涉入程度就会越深，因此身份认同是研究乡村创业意愿的重要因素。 (三) 研究模型和假设 职业身份的认同维度结构大多基于社会认同理论结构的基础上并加以改进。社会身份认同理论创始人Tajfel & Turner [ 11 ] 认为，一个人的社会群体成员身份和群体类别是一个人自我概念的重要组成部分，他将身份认同分为三个维度：1、对特定群体成员资格的认知2、对特定群体的承诺3、对特定群体的评价。成员资格认知是对自我的一种归类过程，即认识到自己属于哪一类群体，这是身份认同形成的基础。对特定群体的情感在行动上反映为对该群体的涉入程度。在涉入的过程中，成员能够加强社会成员的关系，加深对群体价值与意义的认同。在对特定群体的评价方面，人们出于自尊往往会积极评价自己所处的群体，从而产生内群偏好和外群歧视。 创业者基于个人经验、内在动机和自我身份的创业行为是存在明显差异的，这些差异对于解释同样类型的创业者之间的创业结果提供了新的见解。创业者的社会身份通过创业行为加以显现，因此，在创业者身上能找到共同之处，但是，不同创业者在自我概念形成的内在动机和参照标准上存在差异，因此，还可以看到同一类型创业者之间的个体差异。 Hoang & Gimeno [ 12 ] 认为，创业者身份认同会驱动目标导向行为。也就是说，个体的身份认同与创业行为的实施有直接联系。创业者对身份认同的认可度、精确度，都会影响到其后续的创业行为的发生。这种影响是交叉性的，其所产生的效果往往也具有叠加性。因此本文从创业情感、创业评价、创业认知等三方面来来探讨创业者的身份认同到底如何影响其创业意图，并通过营造乡村创业这个细分的创业环境，来显示不同个体身份的创业意愿差异性。根据前人的研究成果和上文的分析，本文将乡村创业身份认同维度与行为态度相联系，对其进行身份认同视角下的修正，从而构建大学生乡村创业意愿的整合模型(图1)，并提出相关假设(表1)。 图1. 乡村身份认同与意向的理论模型 Table 1 Research hypothesi 研究假设 假设内容 H1 乡村创业情感对乡村创业态度有正向调节作用 H2 乡村创业评价对乡村创业态度有正向调节作用 H3 乡村创业认知对乡村创业态度有正向调节作用 H4 乡村创业情感对乡村创业意向有正向调节作用 H5 乡村创业认知对乡村创业意向有正向调节作用 H6 乡村创业态度对乡村创业意向有正向调节作用 表1. 研究假设
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user: 3. 研究思路 (一) 数据收集 本文基于身份认同理论模型，采用定量分析的方式，对影响大学生乡村创业意愿强度的因素进行了分析与研究。研究数据来自研究者在2018年11月至2019年2月期间，在杭州各大高校群中调查所得。 2019年1月1日至2019年2月28日，本文对杭州电子科技大学、浙江理工大学、中国计量大学、浙江工商大学、浙江财经大学、浙江水利水电学院、杭州师范大学等七所大学本科生的乡村创业意愿进行了实地调研。通过判断抽样的样式线上发放问卷180份，实地发放问卷197份，其中有效问卷共352份，有效率为93.37%。Nielsen和Gartner (2017)指出，不同创业者身份以一种可预测和有意义的方式影响创业者的机会识别行为和资源获取行为。在研究创业者时，学者们不再将创业者当作凭借先前知识和经验或者内在动机做出创业行为的个体，而是基于自我身份做出特定决策的个体。因此，本文的研究样本选取具有特定自我身份的个体——在杭高校本科生。样本显示被调查者中男生125人，女生227人；专业大都集中于理工类(45.178%)和经管类(26.70%)；居住在城镇(51.70%)或乡村(48.30%)的比例相近。样本结果基本符合7所高校的总体情况。 (二) 问卷设计 为了保证问卷调查的科学性和有效性，本研究依据文献综述和对研究模型的探索总结，以及通过小范围地对周边同学、朋友的访谈后，确定问卷的题目设置，并对题目顺序进行调整，并确定问卷终稿，正式进入调查阶段。 (三) 数据分析方法 本研究利用统计软件Amos21.0和SPSS.19，对测试性发放所搜集到的38份问卷进行了信度和效度分析，结果显示问卷题项有较好的内部一致性和有效性。收回352份问卷后，首先对其进行了描述性统计分析。在对模型假设进行检验之前，我们排除了自相关性和多重共线性的可能，然后通过AMOS测量出了变量之间的标准化系数β，反映了变量之间的关系。最后我们通过方差分析测量出以人口统计学因素为自变量的因变量差异性。
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user: 4. 数据分析 (一) 人口统计学特征描述 样本的人口统计学特征如下：男生占35.51%，女生占64.49%；大一学生最多，占38.07%，大二占29.26%，大三占21.31%，大四最少，占11.36%；在专业分布上，理工类占45.17%，然后依次是经管类26.70%，文史哲7.95%，农学与医学7.67%，其他专业6.82%，艺术体育3.41%，法教类2.27%；居住地分布基本持平，城镇和乡村分别占51.70%，48.30%；父亲教育程度在硕士、博士及以上占1.70%，本科/大专占24.72%，高中/中专占36.65%，初中及以下占35.51%，其他占1.42%；母亲教育程度在硕士、博士及以上占1.99%，本科/大专占17.90%，高中/中专占34.09%，初中及以下占44.60%，其他占1.42%； (二) 信度与效度检验 信度(Reliability)即可靠性，它是指采用同样的方法对同一对象重复测量时所得结果的一致性程度。当Cronbach’s Alpha值越高，则表明题项内部一致性越高。问卷信度分析结果见表2： Table 2 Reliability test result 测量题项 题项序号 Cronbach’s Alpha 乡村创业认知 A1~A4 (共4题) 0.744 乡村创业情感 A5~A8 (共4题) 0.824 乡村创业评价 A9~A12 (共4题) 0.797 乡村创业态度 B5~B9 (共5题) 0.87 乡村创业意向 B16~B20 (共5题) 0.903 表2. 问卷信度检验结果 每一类题项的Cronbach’s Alpha都大于0.7，说明该问卷的内部一致性良好。 (三) 方差分析 表3列出了个体和环境等因素变量对大学生乡村创业行为意向的方差分析结果，自变量包括性别、专业、出生地、父母亲职业和父母亲文化程度，从结果来看，专业、年级、父亲职业、父亲文化程度的差异对大学生乡村创业行为意向并无显著性影响，而性别、出生地(城市/乡村)、母亲职业及母亲文化程度对大学生乡村创业行为意向具有显著影响。 Table 3 The influence of individual and environmental factors on behavioral intentio 自变量 方差Sig. 组间P F 1专业 0.041 0.16 1.555 2年级 0.073 0.278 1.288 3父亲职业 0.484 0.062 1.783 4父亲文化程度 0.996 0.066 2.22 5性别 0.154 0.026 4.975 6居住地 0.072 0.034 4.518 7母亲职业 0.981 0.03 2.083 8母亲文化程度 0.774 0.025 2.814 表3. 个体和环境等因素对行为意向的影响 a.因变量：行为意向。 (四) 模型检验 模型的整体拟合指标χ 2 /df = 3.447，位于2~5之间，表示模型具有良好的简约度。本研究综合选择GFI、RMSEA、TLI、CFI、NFI等指标全面检定结构模型的拟合情况。结果显示：GFI = 0. 832.小于一般接受临界值0.9，但十分接近；RMSEA = 0.083，十分接近临界值0.08；TLI = 0.866、CFI = 0.884、NFI = 0.845表明本研究提出的概念模型与样本数据拟合良好，见表4。 本文提出的假设大部分得到数据的支持。数据分析结果验证了乡村创业情感、乡村创业评价对行为态度的正向影响，以及乡村创业情感和行为态度对行为意向的正向影响。 Table 4 Results of research hypothesis tes 研究假设 标准化路径系数 显著性 标准误 假设检验 H1：乡村创业情感→创业态度 β 1 = 0.55 *** 0.126 成立 H2：乡村创业评价→创业态度 β 2 = 0.174 ** 0.083 成立 H3：乡村创业认知→创业态度 β 3 = 0.017 0.864 0.227 不成立 H4：乡村创业情感→创业意向 β 4 = 0.335 ** 0.06 成立 H5：乡村创业认知→创业意向 β 5 = 0.048 0.613 0.115 不成立 H6：乡村创业态度→创业意向 β 6 = 0.38 *** 0.19 成立 表4. 研究假设检验结果 注：***表示p < 0.01，** 表示p < 0.05。
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user: 5. 总结 本文以身份认同理论为基础框架，通过将行为态度和行为意向纳入到一般性的身份认同理论之中，从“认知–情感–评价”多维度的视角，深入探讨了大学生乡村创业意愿的催生和影响因素，实证研究得出的主要结论为： 结论一：论证了本文提出的假设模型，证实了乡村创业情感、乡村创业评价对大学生开展乡村创业的行为态度和行为意向具有显著的正向影响；乡村创业情感、行为态度对行为意向的影响均呈现出正相关的影响；乡村创业认知对行为态度虽然不存在直接的明显性影响，但根据问卷发放过程中的反馈，乡村创业认知的偏差性会导致行为态度的误差进而导致行为意向的误差。 结论二：乡村创业情感对行为态度的影响(β 1 = 0.55， Sig. < 0.01)，乡村创业评价对行为态度的影响(β 2 = 0.174， Sig. < 0.05)，乡村创业情感对行为意向的影响(β 4 = 0.335， Sig. < 0.05)，行为态度对行为意向(β 6 = 0.38， Sig. < 0.01)的影响也与假设模型相一致。说明大学生乡村创业的意愿来自于对创业者身份的认可和归属感以及创业这一行为对大学生所产生的心理和情感的支持。 结论三：大学生乡村创业意愿的强弱，不仅受到自身认知与想法的影响，还受到家庭环境和成长经历的重要影响，家庭中母亲角色的影响更为显著。从组间显著性水平(P. < 0.05)可以看出，母亲是务农人员和公务员的孩子意愿最高，专业/文教/科技人员和离退休人员的孩子比较不愿意去乡村创业。从显著性水平(P = 0.025 < 0.05)上看，行为意向和母亲文化程度呈现出一种负相关趋势，即母亲文化程度越高，孩子越不愿意去乡村创业。与此同时，男生的乡村创业意向要比女生强烈一些；在农村成长的孩子较城市的孩子意愿更为强烈。 以上研究结论不仅对我国政府制定引导大学生乡村创业政策具有参考价值，而且对于高校创业教学课程的设置与教学内容设计具有指导意义。第一，应出台政策树立大学生乡村创业典型，让大学生接触乡村、了解乡村创业者，引导大学生对乡村创业的情感与评价，让大学生对乡村创业身份产生归属感与自豪感，提高大学生对乡村创业身份的认同度；第二，以学校为单位，学生为载体，开展一系列普及乡村创业概念与利好的展览、竞赛与讲座，形成“至下而上”的乡村创业观念，从观念上改变大学生对于“在农村工作”的固化偏见；第三，高校应积极与村镇合作建设乡村实践基地，开设与乡村创业有关的社会实践或课程，成立创业学院，聘请成功的乡村创业家作为创业导师，设立乡村创业专项基金等，将乡村实践教学活动融入课程设计与教学内容中，通过实践教学，指导学生更为现实、系统、深入地认识乡村创业身份所需的能力与担当；第四，积极通过媒体宣传，在全社会营造对乡村创业的正面评价，让大众充分感知到乡村创业的正面形象与社会认同度，通过周边亲友的影响，改变大学生对乡村创业身份的认知；第五，指导镇(乡)、行政村等出台或制定相关政策或制度，鼓励具有特定背景的大学生进行乡村创业活动，对其已经在开展的乡村创业行为进行资金、技术和政策上的支持，以加强和巩固其乡村创业意愿。如对农村户籍、家庭中直系亲属有一方从事农业相关工作的大学生的创业项目给予启动资金补贴和风险投资支持，同时优先与在当地开展科研型实验的科研团队合作，引进高科技的技术和先进的管理理念以支持乡村创业项目的可持续发展。
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user: 摘 要 书写功能是影响儿童学习成就和学业功能的主要因素之一。Tourette综合征儿童存在书写抽动，可表现为模仿言语性书写和重复言语性书写。TS儿童常共患其他神经发育障碍，这些神经发育存在不同性质和程度的书写功能损害。本文就TS及其共患神经发育障碍儿童的书写功能研究进行综述，概括其书写特点及功能损害，旨在为临床干预提供依据。 关键词 :Tourette综合征，神经发育障碍，儿童，书写功能 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 Tourette综合征(Tourette syndrome， TS)是儿童抽动障碍中较为严重的类型，以多发性运动抽动和发声抽动为特征，其症状多变、病程迁延、且容易合并多种共患病，对儿童的学业、社交、情绪和生活质量产生一定影响。TS是一种慢性神经精神障碍，流行病学研究表明TS人群患病率约为0.52%，男性比女性更常见，男女比例约为4:1 [ 1 ]。按照美国精神障碍诊断与统计手册DSM-V的标准，TS属于神经发育障碍的范畴。神经发育障碍是一组在发育阶段起病引起个体社交、学业或职业等社会适应功能损害的疾病，包括儿童抽动障碍、智力障碍、孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder， ASD)、注意缺陷多动障碍(Attention defecit hyperactivity disorder， ADHD)、学习障碍(Learning disorder， LD)等 [ 2 ]。TS常与其他神经发育障碍如ADHD、强迫症(Obsessive-compulsive disorder， OCD)、ASD、发育协调障碍(Developmental coordination disorder， DCD)等共病。在一项基于临床的大型研究中发现，TS患者共患其他神经发育障碍高达85.7%；57.7%的TS患者有2种或2种以上的神经精神障碍 [ 3 ]。相当一部分神经发育障碍儿童存在不同程度的学习困难，而书写功能是影响儿童学习成就和学业功能的主要因素之一，然而神经发育障碍儿童尤其是TS儿童的书写功能损害并没有引起广泛关注，本文就TS及其共患神经发育障碍儿童的书写功能研究进行综述，概括其书写特点及功能损害，旨在为临床干预提供依据。
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user: 2. 书写的脑神经基础 传统观念认为人的言语功能主要与大脑额叶及颞叶的皮层有关，如额叶下部(IFG，Broca区)和颞上回后部(STG，Wernicke区)，与其他言语功能相比，书写是人类特有的更为复杂的高级技能。书写活动需要多个大脑功能区及神经反射通路的共同参与完成，其基本的反射弧为“感受器(视听觉和其他感受器)–传入神经–中枢(语言、运动、视听觉、动觉及视空间各功能区)–传出神经–效应器(手)”，因此书写过程需要认知(语言、言语工作记忆和组织)与运动计划和执行相协调 [ 4 ]。神经影像学研究如磁共振成像、功能磁共振、正电子发射断层扫描等表明书写过程中大脑的颞叶、额叶、顶叶、枕叶、基底神经节、小脑等部位均得到激活。基底神经节通过基底节–小脑–大脑皮质网络参与拼写加工、正字法加工、书面语加工、语音加工、语义处理、言语记忆等复杂的认知和记忆过程 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]，并通过充当不同神经网络之间的中心枢纽来调节广泛认知和运动行为的启动和终止，起到协调整个言语过程及维持书写运动的连贯和流畅的作用 [ 8 ]。以基底神经节损害为主的一些神经系统疾病会导致不同性质和程度的书写功能障碍，如视空间性书写(书写部位定向障碍，导致内容/字体结构紊乱，甚至无法辨认)、重复性书写、书写错误、书写缓慢等 [ 9 ]。
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user: 3. TS儿童的书写功能 TS是一种以基底神经节病变为基础的运动调节障碍，病变部位可能涉及皮质–纹状体–丘脑–皮质环路(CTSTC)中的任意部分，引起抽动的主要原因与多巴胺神经递质代谢异常有关(纹状体多巴胺活动过度或突触后多巴胺受体超敏感)。神经影像学研究证实了抽动的发作主要源于将运动和感觉系统结合起来的皮质–纹状体–丘脑–皮质通路异常激活 [ 10 ]，也有研究表明小脑和皮质与基底神经节密切合作(基底节–小脑–丘脑–皮质网络)参与抽动的发生 [ 11 ]。 Cavanna等发现TS儿童存在模仿言语性书写(echographia)和重复言语性书写(paligraphia)，模仿言语性书写表现为重复书写阅读的单词或句子；重复言语性书写表现为重复书写自发的单词或句子，如在签名区域反复书写自己的名字 [ 12 ]。Mitchell等发现TS患者的书写功能损害呈现出反复和空间失写的特征，在书写过程中多次勾勒每个字母，该重复书写行为严重影响了书写的清晰度和流畅性 [ 13 ]。TS儿童存在书写抽动(Handwriting Tics， HT)，HT的患病率高达40%，且在男性中更显著。HT可能有不同类型的表现，如重复书写，即一遍又一遍地书写相同的字母、单词或句子；多次勾勒出每个字母的轮廓；在书写时将笔向后拉。HT与其他书面表达学习障碍(如书写障碍)不同：第一、书写抽动有典型的起伏波动的趋势(抽动发作)，而书面表达学习障碍是持续存在的；第二、抗抽动药物治疗可以减轻书写抽动(药物和/或习惯逆转训练对56%的HT患者有效)，但对书面表达学习障碍无效；第三、HT通常会在青春期以后随着运动抽动的缓解而减轻或消退，而书面表达学习障碍可能持续存在 [ 14 ]。
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user: 4. TS共患其他神经发育障碍儿童的书写功能 TS儿童常共患其他神经发育障碍，常见的有ADHD、OCD、ASD、DCD等 [ 3 ] [ 15 ] 这些神经发育障碍在症状表现上有广泛的重叠，如书写功能损害、重复行为、社交和沟通障碍、睡眠障碍、感觉处理异常、焦虑、抑郁和仪式性行为等，提示其有相近的生物学背景 [ 16 ]。各种神经发育障碍有着不同表现形式的限制性重复行为：TS儿童常出现模仿动作(不由自主地重复或模仿他人的动作)、模仿言语(重复他人发声)和言语重复(重复自己说的最后一个词或短语) [ 17 ]；ASD儿童刻板、重复的动作举止，如不停地拍手、旋转身体或身体的某个部位；OCD儿童重复无目的的动作，如强迫性触摸、频繁计数、重复排序；ADHD儿童兴趣和活动的重复和定型模式 [ 18 ]。在书写功能方面，ASD儿童书写的整体清晰度与书写结构差 [ 19 ]；ADHD儿童的书写问题主要表现在空间组织差、字体大小和形状不稳定、书写错误较多等方面 [ 20 ]；DCD儿童通常书写缓慢且结构不佳 [ 21 ]。不同神经发育障碍儿童的书写功能损害的异质性特点是大脑神经机制异常的外在表现，因此，应该重视TS及其共患病的书写功能损害。 值得进一步探讨的是TS共患OCD患者的书写功能损害，Cavanna等报道共患OCD的TS患者的书写功能损害表现为重复书写，重复书写单词与单词的语音特征有关，类似“强迫性抽动” [ 12 ]。这就提出了一个问题，该患者的书写功能损害的表现更类似TS？还是更像是OCD？大约有60%的TS患者共患OCD，而在OCD患者中约有30%共患TS。TS和OCD都被认为是皮质–纹状体–丘脑–皮质回路功能障碍的结果，两者之间的相似之处是重复的动作或行为 [ 22 ]。正如TS的多种抽动症状如重复摩擦、拍击行为被认为是界于抽动和强迫行为之间，一些强迫症的症状，如重复的触摸仪式、痴迷于对称性等，可能既代表复杂抽动，也代表强迫行为，重复性书写是否是两者症状之间的边缘形式或者说是混合形式需要更广泛、更深入的研究。 综上所述，书写是一项复杂的语言处理过程，需要高级认知(语言、言语工作记忆和组织)、运动规划、运动协调能力等多种高级神经功能的参与，需要基底节–小脑–大脑皮质网络协同合作才能完成。TS儿童存在书写抽动，具有与其他书面表达学习障碍不同的特点，可表现为模仿言语性书写和重复言语性书写。TS儿童常共患其他神经发育障碍，各种神经发育障碍有着不同表现形式的限制性重复行为，存在不同性质和程度的书写功能损害，在临床上应该引起重视并及时干预，以便更好的改善TS及其共患病儿童的功能损害，提高其生命质量。未来希望有更多的研究关注TS及其共患神经发育障碍儿童的书写功能，通过这类儿童的书写功能的研究，能够制定出系统的书写功能损害评定量表，为不同神经发育障碍儿童的功能损害的诊断、治疗及预后提供更有效且直观的临床诊疗工具。此外，通过对TS及其共患神经发育障碍儿童书写功能的深入研究或许能够对不同神经发育障碍儿童的发病机制有更进一步的了解。
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user: 摘 要 超极化激活环核苷酸门控(HCN)离子通道分布于神经组织中，在不同类型的神经元中表达丰富，在调控细胞膜兴奋性等方面发挥重要作用。HCN通道广泛参与了神经元的突触传递和可塑性变化以及中枢神经系统疾病的病理生理过程。HCN通道已成为慢性疼痛及一些神经系统疾病的潜在治疗靶点。本文将重点围绕HCN通道在突触传递和可塑性中的作用及其调节机制进行综述。 关键词 :超极化激活环核苷酸门控离子通道，长时程增强，长时程抑制，神经疾病 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 超极化激活环核苷酸门控通道(Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channel， HCN)由HCN1~4基因家族编码，有四个亚型。HCN亚基(HCN1~4)具有独特的表达模式和生物物理特性 [ 1 ]。HCN通道主要在中枢神经系统和心脏中表达，在平滑肌、肾脏和胰腺等组织中存在HCN通道蛋白。在中枢神经系统，HCN1主要在大脑皮质和海马中表达，HCN2在脑内核团的表达丰富，HCN3的表达可见于下丘脑、嗅球及视网膜，在脊髓、丘脑、基底神经节和海马等脑内结构主要表达HCN4 [ 2 ]。研究表明，HCN 通道广泛参与了神经元的突触传递和可塑性变化以及中枢神经系统疾病的病理生理过程。长时程增强(Long-term potentiation， LTP)或长时程抑制(Long-term depression， LTD)是神经元突触可塑性的两种形式，被公认参与学习和记忆的细胞过程 [ 3 ] [ 4 ]。本文就HCN通道对神经元突触可塑性和认知功能的作用及其机制的研究进展进行探讨。
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user: 2. HCN通道的生理学特性 HCN通道是由HCN1~4基因家族编码的四个HCN亚型(HCN1~4)组成，具有特异性的表达模式和生物物理特性 [ 1 ]。此外，环核苷酸及各种激酶和磷酸酶在内的多种细胞内物质可调节HCN亚型的表达和功能，HCN通道是各种细胞信号作用的靶标，参与神经元对外部刺激反应的精细调节。比如HCN通道在沙鼠听觉神经元的轴突始段中表达，并降低锋电位概率，其方式与胞体和树突中的HCN通道不同。此外，通过5-HT对5-HT1a受体的调节，从而超极化HCN通道的激活范围。随着5-HT信号的释放，轴突的HCN通道提供了一种将这些信号转化为感官刺激阈值变化的机制 [ 5 ]。 HCN通道是一种电压门控阳离子通道，在膜电位大于−50 mv时激活，主要对Na + 和K + 离子通透，HCN通道电流也被称为“有意思的电流(funny current， If)”、“奇怪的电流(queer current， Iq)”或“超极化激活的电流(hyperpolarization-activated current， Ih)” [ 6 ]，并在神经系统中传导一个内向的、外在电流的Ih。Ih充当起搏器电流，启动节律性放电，抑制树突兴奋性并调节神经递质释放。因此，Ih电流可能会因神经元亚型的不同而具有不同的特征。在许多神经元亚型中，Ih主要出现在突触后，在膜电位和膜电阻中起着关键作用。通过影响这些膜的内在电学特性改变突触电位的形状和总和，进而影响神经元的兴奋性。在一些神经元中，Ih也可出现在突触前神经元的轴突和突触终末，调节神经递质的释放。此外，Ih对共振特性和内在神经元振荡也有影响 [ 7 ]。Ih影响神经元兴奋性，对学习和记忆等生理状态以及癫痫等病理生理状态具有重要作用。HCN通道在中枢神经系统的功能则与它具有的电生理特征密切相关。
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user: 3. HCN通道在突触传递中的作用 3.1. HCN通道在LTP中的重要作用 证据表明，HCN通道参与了海马LTP，促进突触整合和可塑性。据报道选择性HCN通道抑制剂ZD7288可阻断海马穿通纤维–颗粒细胞突触和苔藓纤维CA3突触诱导LTP [ 8 ] [ 9 ]。ZD7288抑制海马LTP诱导的机制可能涉及AMPA和NMDA门控谷氨酸受体的非特异性抑制及递质释放机制的调节 [ 9 ] [ 10 ]，如ZD7288抑制LTP诱导的机制可能与显著减少突触前谷氨酸的释放有关 [ 10 ]。 Li等的研究表明永久性双侧颈总动脉闭塞引起的大脑低灌注5周后，空间和非空间学习和记忆能力明显下降，神经元丢失和树突棘密度显著降低，schaffer侧支CA1LTP受损，HCN1表达减少，而 HCN2表面表达增加。恢复大鼠海马CA1区HCN1/ HCN2的表面表达平衡，可改善认知功能障碍 [ 11 ]。局灶性脑缺血会损害海马活动依赖性LTP的诱导。兴奋毒性和随后对海马LTP相关递质系统(包括NR2B和PSD-95)的干扰可引起海马突触可塑性的损伤。HCN通道可能在调节细胞膜兴奋性和节律性神经元活动中起重要作用。选择性HCN通道阻滞剂ZD7288可通过降低谷氨酸释放，对schaffer侧支突触诱导CA1区LTP具有剂量依赖性的抑制效应 [ 10 ] [ 11 ]。研究发现局灶性脑缺血/再灌注损伤诱导的CA1区活性依赖性LTP及 NR2B和 PSD-95表达均明显降低，而低剂量ZD7288可减轻LTP诱导损伤，减轻脑缺血/再灌注损伤常见NR2B和PSD-95 mRNA及其蛋白的下调，研究表明阻断HCN通道可改善海马CA1区缺血/再灌注损伤的神经元上午突触可塑性 [ 12 ]。 大麻素1型受体(CB1R)通过HCN通道控制海马突触可塑性和空间记忆，而HCN通道是 Ih电流的基础，是树突兴奋性的关键调节器。CB1R-HCN通路涉及c-Jun-N末端激酶(Jnks)、一氧化氮合酶和胞内cGMP对CA1区锥体细胞表层的Ih有选择性的增强作用，而深层细胞则无此效应。CB1R-HCN通路的激活损害了兴奋性输入、长时程增强作用和空间记忆形成的树突整合。药理学上抑制Ih或HCN1的敲除可以消除CB1R引起的LTP和记忆缺陷。这些研究表明海马的CB1R-Ih通路是大麻素对LTP和空间记忆形成作用的必需途径 [ 13 ]。 HCN通道在大脑内源性神经元兴奋性调节中起重要作用。在海马锥体神经元中，海马 CA1区内的HCN通道明显富集于远端树突。这种独特的分布模式对调节树突的兴奋性至关重要。据报道，在锥体神经元的树突中，Ih的作用影响兴奋性突触后电位传导的动力学和振幅 [ 14 ]。有人认为ZD7288诱导的基础的突触传递和活性依赖性突触可塑性的抑制可能是由于其对海马AMPA和NMDA门控谷氨酸受体的非特异性抑制 [ 9 ]。有证据表明ZD7288可以调节和减少突触前递质的释放 [ 15 ]，消除cGMP引起的海马谷氨酸释放增加，突触后NO/cGMP通过HCN通道增加海马NMDA受体电流对于海马CA1区LTP的诱导是必需的 [ 16 ]。ZD7288阻断了HCN通道，引起了神经元膜的超极化和膜电导的降低，它或者导致了突触前神经末梢神经元活性的大幅度降低，从而降低了脑缺血期间谷氨酸释放的增强，或者导致了超极化，从而降低了突触后神经元的兴奋性，抑制了缺血诱导的谷氨酸和细胞质去极化的过度激活，减轻了异常的Ca 2+ 进入和Ca 2+ 超载 [ 12 ] [ 14 ]。因此，ZD7288可能导致兴奋性毒性级联反应的中断，防止NR2B水平的下调，这种调节可能导致缺血后病理性突触可塑性的衰减，并解救活动依赖性LTP的损伤。 Matt等 [ 17 ] 为评估HCN2通道对海马突触可塑性的作用，在直接穿通路径至CA1区椎体神经元诱导LTP。LTP在HCN2基因敲除小鼠中得到增强，但在敲除受限的椎体神经元并未增强。进而排除了HCN2位于突触后椎体神经元的可能。同时发现在特异性敲除HCN2的中间神经元的小鼠的穿通路径中增强了LTP。研究揭示局部抑制性间神经元HCN2通道通过促进γ-氨基丁酸(GABA)输出到椎体神经元调节穿通路径中的突触可塑性。HCN1主要在海马区表达，并在很多病理环境中改变。在慢性缺血性大鼠模型，研究发现慢性脑缺血后LTP受损，大鼠的空间学习和记忆功能减弱。海马CA1区和新皮质的HCN1 mRNA明显降低 [ 18 ]。该结果为进一步研究HCN1在慢性不完全性全脑缺血的生理和病理意义提供了新的见解。 HCN1通道是海马CA1椎体神经元远端树突空间学习、突触整合和长时程可塑性的抑制约束。然而，由于HCN1通道提供兴奋性电流，HCN1通道可抑制CA1远端树突Ca 2+ 火花，这与远端兴奋性突触LTP的诱导有关。研究表明HCN1通道通过降低远端兴奋性突触后点位的时间整合和增加T型和N型电压门控Ca 2+ 通道的静息失活导致Ca 2+ 火花 [ 19 ]。因此HCN通道通过这种双重机制可调控树突的兴奋性。 HCN通道是神经元生理学或病理生理学活动的重要调节器，有助于膜的被动电学特性，如静息电位和输入电阻，以及内在振荡活性和突触整合。TRIP8b(辅助HCN通道蛋白)的基因缺失导致功能性HCN通道的消除，从而影响突触后神经元的整合特性 [ 20 ]。Brager等研究发现来自野生型和TRIP8b基因敲除小鼠的Schaffer侧枝 LTP没有显著差异。但在敲除小鼠神经元中短时程增强明显。而且在基因敲除鼠，通常在LTP诱导后出现的Ih的持续增加并不存在。缺乏Ih的可塑性并不限于活动依赖性诱导，因胞内钙储存的耗竭也未能产生预期增加的Ih [ 20 ]。上述研究揭示TRIP8b缺失的生理影响并不仅限于神经元的整合特性，也包括突触和内在可塑性。 3.2. HCN通道在LTD中的重要效应 LTD同LTP一样，也是一种与学习和记忆有关的活动依赖性突触可塑性的形式。HCN通道调节膜电位和膜电阻，在突触可塑性中起重要作用。在海马的研究表明，在低频电刺激(15 min， 1 Hz，一种可诱导LTD的实验刺激协议)之前应用特异性HCN通道阻断剂 ZD7288显著提高幼年大鼠LTD ，表明HCN通道抑制LTD诱导。但在LFS后应用ZD7288时，LTD无明显变化，表明HCN通道不调节LTD的表达。研究揭示内侧穿通纤维–颗粒细胞突触的HCN通道可影响LFS诱导的幼年大鼠LTD [ 21 ]。而在小脑的研究发现浦肯野细胞的编码不仅取决于突触可塑性，而且还依赖于其内在膜的兴奋性。在平行纤维与浦肯野细胞突触诱导LTD，导致放电反应的增益增加，兴奋性增加伴随着输入电阻增加和HCN通道介导的电压幅度的降低。HCN通道阻断剂可抑制输入电阻和兴奋性增加，而没有阻断突触LTD 的诱导 [ 22 ]。上述研究说明平行纤维-浦肯野细胞LTD的诱导通过降低HCN介导的Ih电流增高浦肯野细胞的兴奋性。因此，HCN的下调与维持突触LTD的生化途径有关。鉴于平行纤维信息的多样性，内在兴奋性的变化增强浦肯野细胞对特定输入的编码能力。上述研究为HCN通道通过调节神经元的内在特性参与调制突触传递和突触可塑性提供了实验依据。
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user: 4. HCN通道参与神经系统疾病的发生 HCN通道涉及多种神经元功能，包括学习和记忆，调节警觉状态和疼痛。这些通道的功能障碍或遗传缺失已被证明会导致人类疾病，如癫痫 [ 23 ]、抑郁症 [ 24 ]、精神分裂症 [ 25 ] 和帕金森氏症 [ 26 ]。用基因敲除小鼠模型分析了神经系统HCN和HCN2通道的生理功能，研究HCN3通道在调节昼夜节律和决定行为方面的作用。结果发现HCN基因缺陷小鼠表现出正常的视觉、感光和非感光昼夜节律功能，但在处理情景情境信息方面受到损害 [ 27 ]。 神经退行性疾病，如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症和脊髓髓肌肉萎缩症是与年龄相关的慢性进行性神经系统疾病，主要发生在大脑特定区域的神经元退化。虽然这些疾病病理机制仍未阐明，但离子通道功能障碍已经越来越被认为是神经退行性疾病的潜在机制。HCN1~4基因家族编码HCN通道，引导超极化激活电流，在调节细胞的兴奋性、节律性活动、树突整合和突触传递中起着重要作用。HCN通道在神经退行性疾病中的重要作用 [ 24 ]。 癫痫动物的CA1神经元容易受到离子通道表达的选择性改变的影响，这种改变被称为获得性通道病，它可以增加神经元的兴奋性。在癫痫持续状态模型中，背侧CA1神经元兴奋性增加，而腹侧CA1神经元兴奋性不增加，放电频率增加，锋电位间期)减小，输入阻抗增加。应用药理学和免疫组织化学及电流钳记录技术发现在背侧CA1区HCN通道表达下调。研究结果表明，背侧CA1区神经元自发性兴奋性增加，与腹侧CA1区神经元的内在特性相似，这可能使海马神经元回路更易与癫痫发作相关联，并导致慢性癫痫相关的认知功能损伤 [ 23 ]。
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user: 5. 小结与展望 HCN通道有兴奋和抑制两种功能状态，可通过药理学和遗传学的方法来进行修饰调节。因此，HCN通道有望成为治疗中枢神经系统疾病潜在的理想靶标。由于HCN通道对膜电位、膜电阻、神经元兴奋性的调节，在突触传递、突触可塑性和一些神经系统疾病中起着重要作用，HCN通道已成为慢性疼痛及一些神经系统疾病的潜在治疗靶点。而一些临床使用的药物可能为科学研究者提供不同的HCN通道亚基选择性拮抗剂的线索。随着HCN通道亚基选择性拮抗剂的出现，应用分子生物学和神经电生理学技术在细胞和分子水平研究HCN通道在生理和病理生理情况下的神经系统的功能和相关分子机制，有助于进一步揭示HCN通道在慢性疼痛、癫痫、抑郁症、精神分裂症及神经变性疾病中的作用机制，为类似疾病的治疗提供新的策略和药物作用靶点。
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user: 摘要 本实验通过PCR方法检测34株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中喹诺酮类耐药基因qnrC、qnrS和qnrVC的分布情况。耐药基因检测结果表明，34株副溶血弧菌中qnrC、qnrS和qnrVC基因的检出率分别为2.9%、0.0%与2.9%。qnrC基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率分别为16.7%、0%、0%。qnrS基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率均为0%。qnrVC基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率分别为0%、0%、6.3%，三种耐药基因的检出率在三个市的副溶血弧菌之间差异均不显著(P > 0.05)。基于qnrC基因的氨基酸序列同源性比较结果表明，防城港株F17383与副溶血弧菌TOE26912.1、TOP53441.1、OQU02262.1亲缘关系最近，氨基酸同源性分别为100.0%、98.8%和98.8%。基于qnrVC基因氨基酸序列同源性比较结果表明，北海株B13121与副溶血弧菌AXI69764.1亲缘关系最近，同源性为99.4%。
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user: 1. 引言 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有营养价值高、肉质鲜美、生长快以及对盐度和温度的适应性较强等特点，是全球养殖产量最高的对虾品种之一 [ 1 ]。然而近年来，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的病害问题已成为影响凡纳滨对虾养殖成功的重要因素。因此，深入研究副溶血弧菌的生物学特性，寻找控制副溶血弧菌病的办法尤为重要 [ 2 ]。目前，副溶血弧菌病的常用控制措施是使用抗生素或消毒剂。喹诺酮类药物是一种具有广谱杀菌作用的合成类抗生素 [ 3 ]，其种类包括恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等 [ 4 ]。该类抗生素的抑菌原理主要为通过抑制细菌的DNA促旋酶和DNA拓扑异构酶IV来阻止细菌DNA的合成 [ 5 ]。已有研究表明，细菌对喹诺酮类耐药性产生机制主要包括DNA促旋酶和DNA拓扑异构酶IV基因的突变、通过改变细胞膜来主动外排药物 [ 6 ] 以及质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)的参与 [ 7 ] 等。qnrC、qnrS、qnrVC均为PMQR基因，其编码蛋白可与DNA促旋酶及拓扑异构酶IV结合，从而保护喹诺酮类的作用靶位，使细菌形成对喹诺酮类的抗性，这些PMQR基因通常与整合子或插入序列相连、并与其他耐药基因一起在菌株间进行水平传播 [ 3 ]。目前，有关副溶血弧菌对喹诺酮类耐药分子机制的研究已有不少报道 [ 8 ] [ 9 ]。但是关于广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中qnrC、qnrS、qnrVC基因分布情况的相关研究仍为少见。本试验对34株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌进行三种喹诺酮类耐药基因qnrC、qnrS、qnrVC基因的检测和相关序列分析，其结果可为凡纳滨对虾副溶血弧菌病的科学防控提供指导，为副溶血弧菌的喹诺酮类耐药分子机制的深入研究提供基础数据。
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user: 2. 实验材料与方法 2.1. 实验材料 试验菌株为本实验室于2013年至2018年从广西防城港市、钦州市和北海市患病凡纳滨对虾中分离的34株副溶血弧菌(表1)，在试验前均已进行API生化鉴定和16S rRNA分子鉴定以确认。细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司。2 × Taq MasterMix由北京艾德莱生物科技有限公司生产。 Table 1 Source information of 34 strains of Vibrio parahaemolyticu 采样地点 菌株数 菌株编号 防城港 6 F17383、F17386、F17387、F17388、F18281、F18282 钦州市 12 Q13031、Q13017、Q13023、Q13030、Q13031、Q13079、 Q13085、Q14017、Q14018、Q14020、Q17438、Q15056 北海市 16 B17131、B17134、B17135、B17136、B17137、B17139、B17143、B17144、 B13062、B13121、B13138、B14135、B17129、B17130、B18228、B18229 表1. 34株副溶血弧菌来源信息 2.2. 细菌DNA的提取及耐药基因PCR鉴定 依照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书来进行细菌总DNA的提取。qnrC、qnrS和qnrVC的PCR反应引物分别参照Wu [ 10 ] 等、Kim [ 11 ] 等和Liu [ 12 ] 等的方法进行设计并由生工生物工程(上海)有限公司合成(表2)。通过PCR法检测3种耐药基因，其25 µL反应体系为：DNA模板2 µL，上、下游引物各1 µL，2 × Taq Master Mix 12.5 µL，灭菌去离子水8.5 µL。设置PCR反应程序为95℃预变性3 min；95℃ 30 s，退火30 s (退火温度见表2)，72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸10 min。以1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，在凝胶成像系统观察电泳结果。将符合预计片段长度的PCR产物送广州华大基因科技有限公司进行测序。 Table 2 Primer sequences of PCR reactio 耐药基因 引物序列 退火温度 预计片段长度 qnrC F: 5'-GGGTTGTACATTTATTGAATCG-3' R: 5'-CACCTACCCATTTATTTTCA-3' 47℃ 308 bp qnrS F: 5'-CAATCATACATATCGGCACC-3' R: 5'-TCAGGATAAACAACAATACCC-3' 55℃ 642 bp qnrVC F: 5'-AATTTTAAGCGCTCAAACCTCCG-3' R: 5'-TCCTGTTGCCACGAGCATATTTT-3' 50℃ 521 bp 表2. PCR反应引物序列 2.3. 序列分析 在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站搜寻不同细菌来源的耐药基因序列。使用DNAStar软件的Megalign模块计算耐药基因的氨基酸序列的同源性。采用ClustalX进行序列完全比对分析后采用Mega5软件的邻接法构建系统发育进化树，Bootstrap重复1000次检验其可信度。 2.4. 统计分析 使用SPSS18.0软件的χ 2 检验分析在防城港市、钦州市和北海市之间qnrC、qnrS和qnrVC基因检出率的差异性，当P < 0.05时表示差异显著。
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user: 3. 实验结果 3.1. 耐药基因的PCR检测结果 对34株副溶血弧菌进行喹诺酮类耐药基因qnrC、qnrS、qnrVC检测，结果表明部分受试菌株可扩增出大小约为308 bp的qnrC基因片段或521 bp的qnrVC基因片段(图1)，与预计片段长度基本一致。将阳性PCR产物送测序，其测序结果经比对确认这些产物片段均为qnrC基因或qnrVC基因的序列片段。经反复PCR验证，所有菌株均未扩增出约为642 bp的qnrS基因片段。 图1. qnrC、qnrS和qnrVC基因PCR扩增结果 3.2. 耐药基因的序列分析 qnrC基因的氨基酸序列同源性比较(图2)结果表明，防城港株F17383与副溶血弧菌广西株TOE26912.1、湖北株TOP53441.1、美国株OQU02262.1亲缘关系最近，氨基酸同源性分别为100.0%、98.8%和98.8%；与噬海藻弧菌V. algivorus (WP_144389023.1)、V. gangliei (WP_105901077.1)和奇异变形杆菌Proteus mirabilis (ACK75961.1)的氨基酸同源性为98.8%、97.6%、97.6%；与Moritella viscosa (CED58093.1)氨基酸同源性相对较低，为61.9%。 图2. 不同物种qnrC基因的氨基酸序列的同源性比较 进化树构建结果如图3所示，可见F17383与副溶血弧菌广西株TOE26912.1、湖北株TOP53441.1、美国株OQU02262.1聚为一支，在进化关系上相对较近；与Moritella viscosa (CED58093.1)在进化关系上相对较远。 图3. 基于qnrC基因氨基酸序列构建的进化树 qnrVC基因氨基酸序列同源性比较(图4)结果表明，北海株B13121与副溶血弧菌香港株AXI69764.1亲缘关系最近，其同源性为99.4%；与副溶血弧菌深圳株AXA19787.1、藤江弧菌(V. fujianensis) WP_099610042.1、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) AQT26619.1、鳗弧菌(V. anguillarum) TYC88856.1的氨基酸同源性在97.5%~98.7%之间；与副溶血弧菌深圳株ANS55787.1、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) BCD58983.1、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) AXV36521.1、创伤弧菌(V. vulnificus) WP_072606284.1、拟态弧菌(V. mimicus) TXZ06185.1、霍乱弧菌(V. cholerae) KAA1213539.1的同源性在84.9%~85.5%之间。 图4. 不同物种qnrVC基因的氨基酸序列的同源性比较 进化树构建结果如图5所示，可见北海株B13121与副溶血弧菌香港株AXI69764.1、副溶血弧菌深圳株AXA19787.1、藤江弧菌WP_099610042.1、弗氏柠檬酸杆菌AQT26619.1、鳗弧菌TYC88856.1聚为一支，在进化关系上相对较近；与副溶血弧菌深圳株ANS55787.1、肺炎克雷伯菌BCD58983.1、嗜水气单胞菌AXV36521.1、创伤弧菌WP_072606284.1、拟态弧菌TXZ06185.1、霍乱弧菌KAA1213539.1等在进化关系上相对较远。 图5. 基于qnrVC基因氨基酸序列构建的进化树 3.3. 耐药基因在广西三个市菌株的检出率 34株副溶血弧菌中，qnrC、qnrS、qnrVC基因总检出率分别为2.9% (1/34)、0% (0/34)、2.9% (1/34)。三种耐药基因在三个市的分布情况如表3所示，qnrC基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率分别为16.7% (1/6)、0% (0/12)、0% (0/16)。qnrS基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率均为0%。qnrVC基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率分别为0% (0/6)、0% (0/12)、6.3% (1/16)。比较分析结果表明，三种耐药基因的检出率在三个市的副溶血弧菌之间差异均不显著(P > 0.05)。 Table 3 Comparison of the detection rates of three resistance genes of Vibrio parahaemolyticus in three citie 耐药基因 检出率% 总检出率% P值 防城港市 钦州市 北海市 qnrC 16.7% (1/6) 0% (0/12) 0% (0/16) 2.9% (1/34) 0.090 qnrS 0% (0/6) 0 (0/12) 0 (0/16) 0% (0/34) - qnrVC 0% (0/6) 0% (0/12) 6.3% (1/16) 2.9% (1/34) 0.560 表3. 三个市之间副溶血弧菌三种耐药基因检出率比较 注：括号内的数值为携带耐药基因的菌株数与受试菌株总数之比。“-”表示P值无法计算。