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user: 3. 棉花抗蚜虫研究现状 近年来，随着Bt转基因抗虫棉的大规模种植，棉铃虫数量急剧减少。蚜虫已经取代棉铃虫成为危害棉花的主要害虫之一。尽管抗虫棉体内表达的各种Cry毒蛋白对蚜虫也有一定的抑制作用，但由于蚜虫肠胃内较低的pH值，导致Bt毒蛋白对蚜虫的毒性比较低 [ 10 ] ，无法有效地抑制蚜虫取食和繁殖；蚜虫具有极强的繁殖能力，很容易产生抗性蚜 [ 6 ] ；另外，蚜虫一般在棉花叶片的背面取食，使棉花叶片成为其天然的保护屏障 [ 11 ] 而难以灭杀 ，仅依靠研发新型灭蚜化学农药已经很难取得长期且良好的防治效果，且化学农药对生态环境的破坏作用促使科技人员寻找更为环保高效的灭蚜途径。 随着基因工程理论基础研究和分子生物技术的日益成熟，通过转基因方法增强植物的抗蚜性或耐害性已成为可能，根据防治对象不同，当前大致可将抗蚜基因工程研究方向分为两大类：1) 广谱性抗蚜途径；2) 特异性抗蚜途径。 3.1. 广谱性抗蚜途径 该类抗蚜途径对半翅目具有刺吸式口器的蚜虫以及白粉虱均具有一定的抗性，由于抗虫谱较广，使得该类途径具有较大的应用范围和价值，主要有以下几类： 3.1.1. 植物凝集素 在抗蚜虫基因工程研究中，目前研究最多和最深入的是植物所编码的凝集素基因。凝集素是能够与一个或多个单糖或寡聚糖特异性可逆性结合的蛋白质，广泛存在于动植物和微生物中 [ 10 ] ，通常为二聚体或四聚体。在植物中，其主要功能是介导植物防御体系的建立 [ 12 ] 。植物表达的凝集素主要存在于细胞内的蛋白体中，在被蚜虫等昆虫取食后会释放出来并与昆虫消化道围食膜上的蛋白糖链结合，降低膜的通透性，阻碍营养物质的正常吸收，同时诱发病灶和促进细菌繁殖对昆虫造成伤害。许多植物来源的凝集素具有较高的稳定性，在波动较大的pH值范围内，高温、蛋白酶作用下，甚至在一些化学溶液中也不会变性。因此，在长期的自然进化中，凝集素逐渐被植物当作防御自身安全的重要物质 [ 13 ] 。根据凝集素的分子结构和进化关系将凝集素分为7类不同家族：单子叶半乳糖结合凝集素；几丁质结合凝集素；豆科凝集素；甘露糖结合凝集素(GNA相关超家族)；苋科凝集素家族；葫芦科韧皮部凝集素；木菠萝相关凝集素和II型核糖体失活蛋白及相关凝集素。当前研究较为深入的植物凝集素主要有如下几类： 1) 雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin， GNA) 雪花莲凝集素是属于结合甘露糖的植物凝集素，源自植物雪花莲，是目前使用最为广泛的抗蚜虫基因，雪花莲凝集素可与消化道中的消化酶以及中肠表皮细胞的末端为α-1，3-甘露糖的多糖链结合，介导抗蚜功能。除对蚜虫具有很高的抗性之外，对其它刺吸式害虫如飞虱也具有一定的抑制作用。雪花莲凝集素基因已经广泛应用于植物抗蚜基因工程，例如Elaine Fitches [ 15 ] 等将蜘蛛毒素δ-amaurobitoxin-PI1a或ω-hexatoxin-hv1a与GNA进行融合表达；王志斌、郭三堆 [ 16 ] 曾将Cry基因和GNA同时导入烟草中；Stoger [ 14 ] 将GNA导入小麦中。 2) 苋菜凝集素(Amarauthus caudatus agglutinin， ACA) 苋菜凝集素存在于苋菜种子细胞的细胞质中，是一种贮藏蛋白，属于苋菜凝集素家族的典型代表。此类凝集素富含多种人体必需氨基酸，是改善食物营养成分及含量的一种新途径。研究表明，ACA可中肠围食膜上的2-乙酰氨基-2-脱氧-D半乳糖缀合物专一性结合介导抗蚜性。对ACA的研究仅次于GNA，例如Guo [ 17 ] 等利用来自竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)的韧皮部特异性启动子驱动ACA基因在烟草中表达，使转基因烟草获得了一定的抗蚜能力。还有学者将ACA基因导入棉花中表达，转基因棉花的最高抗蚜率可达64.5% [ 18 ] ，该基因工程棉花现已经进入田间试验阶段，表现出一定的实用前景。 3) 半夏凝集素(Pinellia ternate agglutinin， PTA) 半夏凝集素基因源于半夏属天楠星科，后者是一种药用植物。从掌叶半夏或半夏中提取的半夏凝集素，对麦管蚜、桃蚜、棉蚜、白粉虱及一些病原菌均有致死作用。目前，已有学者将PTA基因导入烟草并得到转基因植株，抗蚜实验表明，转PTA烟草T0和T1代的桃蚜数量比非转基因烟草植株减少89%~92%，白粉虱数量减少91%~93%；另外，对耳虫、食心虫和甜菜夜蛾等三种害虫的致死率达到100% [ 19 ] 。该基因已经应用于棉花抗蚜虫基因工程研究，如雒珺瑜 [ 8 ] 得到的转半夏凝集素棉花具有一定的抗蚜能力，肖松华 [ 20 ] 对得到的转半夏凝集素棉花检测也得到同样的结论。 4) 大蒜凝集素(Allium sativum agglutinin， ASA) 大蒜凝集素是一种源自单子叶植物的甘露糖凝集素，是由印度人Dutta在2005年首次克隆得到的 [ 21 ] 。曾经先后导入烟草、印度芥菜和鹰嘴豆等植物，其中转大蒜凝集素基因在鹰嘴豆具有较好的抗蚜虫能力，对蚜虫致死率超过90% [ 22 ] 。大蒜凝集素对蚜虫的影响与其他凝集素不同，Sadeghi [ 23 ] 等人在将大蒜叶子凝集素和鳞茎凝集素分别转入烟草，在进行抗蚜分析时发现，大蒜凝集素对蚜虫从若虫变成成虫的过程几乎没有影响，但对成虫的抑制率效果较好，可减缓虫体的发育使虫口密度降低40%。 5) 韭兰凝集素(Zephyranthes grandiflora agglutinin， Zga) 韭兰凝集素是源自石蒜科葱莲属中的一种凝集素，具有三个可与甘露糖特异性结合位点。对桃蚜具有抗性作用，Zhou [ 24 ] 等人将该基因导入烟草中表达，整株蚜口密度降低77.9%，若虫密度降低35.6%。尽管韭兰凝集素对于提高烟草的抗蚜能力较好，但尚未发现其在棉花抗蚜基因工程中有应用。 6) 菊芋凝集素(Helianthus Tuberosus agglutinin， HTA) 菊芋凝集素源于菊科植物菊芋，介导对桃蚜的抗性。HTA是由四个15.5KD的亚基形成的同源四聚体，结构于GNA相似。HTA由hta-a，hta-b，hta-c和hta-d基因家族表达。Chang [ 25 ] 等人利用花椰菜花叶病毒35S启动子调控该基因，然后导入烟草中表达，获得的转基因烟草植株可使绿桃蚜的虫口密度降低70%，此外，还观察到菊芋凝集素能够降低绿桃蚜的繁殖力并延缓其发育，HTA对蚜虫的抗性在抗蚜基因工程具有一定的应用价值，是个较佳的候选基因。 7) 菜豆凝集素(phaseolus vulgaris agglutinin， PHA) 菜豆凝集素对哺乳动物的毒性相对较强，在没有正确加工后食用会造成食物中毒现象，故需谨慎使用 [ 5 ] 。但针对于棉花的非食用性，该基因具有参考价值，但迄今尚未发现用于棉花抗蚜虫基因工程的报道。 8) 山药块茎凝集素1 (Dioscorea batatas tuber lectin 1， DB1) 山药块茎凝集素1是发现于山药块茎中的一种甘露糖凝集素，其糖链结合位点与雪花莲凝集素具有高度相似性 [ 26 ] ，Kato [ 27 ] 用含1 mg/mL山药块茎凝集素1的人工饲料饲喂桃蚜时发现，桃蚜的存活率和繁殖率明显降低。随后，Kato首先将该基因分别与不同的植物启动子拼接，然后导入烟草中表达，DB1表达量约占到烟草总可溶性蛋白中分别为1.8%和0.25%，但其植株蚜虫虫口密度均降低60%，故推测DB1的抗蚜虫效果与表达量的关系不大。虽然DB1可以在一定程度上增强转基因植株的抗蚜虫能力，但增强程度有限。 9) 伴刀豆凝集素A (Concanavalin A agglutinin， ConA) 该凝集素源于刀豆，属于甘露糖凝集素。ConA可与消化道表皮细胞的甘露糖受体结合，影响蚜虫进食以及细胞的正常代谢 [ 28 ] ，Angharad [ 29 ] 用含有ConA蛋白的饲料饲喂甘蓝夜蛾幼虫发现，在最高剂量时不仅对夜蛾幼虫可产生90%的致死作用，而且能够减缓若蚜的发育；在饲喂桃蚜时，可以使蚜虫的虫体积减少30%，发育迟缓和繁殖率降低35%以上，但对于蚜虫并不致死；这一点与菊芋凝集素相似，目前尚无人将其转入棉花中，故而该基因在棉花上的实际效应有待验证。 10) 小麦胚芽凝集素(Wheat germ agglutinin， WGA) 小麦胚芽凝集素可与几丁质结合，它对芥菜蚜具有较好抑制作用，可诱使菜管蚜拒食，发育迟缓，并具有一定的致死作用。目前，该基因主要应用在印度芥菜中 [ 30 ] ，对于芥菜上的蚜虫抑制效果明显。芥菜蚜并不是危害棉花的主要蚜虫，因此，小麦胚芽凝集素基因在棉花抗蚜虫基因工程中的应用价值有限。 11) 西洋接骨木凝集素(Sambucus nigra Agglutinin， SNA-1) 它是一种核糖体钝化蛋白(RIP)，属于II型核糖体失活蛋白。与前面所述的所有凝集素作用机制都不相同，并不与糖基结合，具体机制尚不清楚。但该蛋白对蚜虫的存活率、繁殖率、寿命及体重均能产生明显的抑制效应 [ 31 ] 。 3.1.2. 蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor)基因 蛋白酶抑制剂是一类小分子多肽或蛋白质，可与蛋白酶的活性部位或变构部位相结合抑制蛋白酶的催化活性。根据酶催化反应底物，蛋白酶抑制剂可分为四类：1) 丝氨酸蛋白酶抑制剂；2) 酸性蛋白酶抑制剂；3) 半胱氨酸蛋白酶抑制剂；4) 金属蛋白酶抑制剂 [ 32 ] 。蚜虫主要取食植物韧皮部汁液，而韧皮部汁液中多为游离或结合的氨基酸，因而认为蚜虫对氮元素营养的需求并不依赖于对蛋白质消化，故多数蛋白酶抑制剂对蚜虫作用较小，但是，少数的丝氨酸蛋白酶抑制剂如抑糜酶素(Chy8)却表现出对蚜虫一定的毒害作用 [ 33 ] 。 3.1.3. 细胞分裂素 细胞分裂素具有调节细胞分裂的功能，在结构上多为腺嘌呤的氨基上连接着一个异戊稀基侧链。细胞分裂素可调节植物的生长发育，同时产生的次生代谢产物对蚜虫具有抗性。如异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase， IPT)是细胞分裂素合成途径中的限速酶。细胞分裂素在调节植物生长时会使得叶片中异戊烯基转移酶增多从而导致N-异戊烯腺嘌呤的水平相应增加，抑制桃蚜的取食，延迟虫体的发育，减少虫体的体重。从而抑制桃蚜的发育使种群密度降低 [ 34 ] 。 3.1.4. 植物防御机制相关基因 在长期的进化过程中，植物与植食性昆虫间的不断斗争，使得两者之间互有克服对方的方法与彼此的优势。植物进化出一条完整的防御机制，因此可从植物本身的防御机制入手，通过改进其现有的防御机制来提高目标植物针对某种害虫的抗性或对于虫害的耐受性。当前已经发现的能增强植物抗性或耐受性的基因如下： 1) 过量表达GhPSAKl增强植物对蚜虫的抗性和耐受性 棉花光合作用相关基因(Cotton photosynthesis-related gene， GhPSAK1)属于PSI-PSAK家族，编码含162个氨基酸的蛋白。PSAK是光合系统I的反应中心亚基，是维持捕光复合体反应中心反应稳定的关键。棉花受到棉蚜危害或轻度伤害后，GHPSAK1在叶片中的转录水平上升 [ 35 ] ，证明GHPSAK1在拟南芥中的过表达可以提高植株对绿桃蚜害的耐受性。但是过表达GHPSAK1增强植物的抗蚜性和耐受性的详细机制以及过表达GHPSAK1对植物其他方面是否存在损害尚不清楚。有待进一步研究。 2) 过量表达GhTCTP1增强植物对蚜虫的抗性和耐受性 GhTCTP1属于TCTP亚家族，为编码含有168个氨基酸的蛋白，GhTCTP1具有95个氨基酸的保守序列。张建民等 [ 7 ] 发现，GhTCTP1在棉花的下胚轴、真叶受到伤害后表达水平上调，推测GhTCTP1在棉花受到棉蚜侵害后的反应机制中起到一定作用。通过农杆菌介导法，将GhTCTP1导入拟南芥中使其过表达。发现桃蚜对转基因拟南芥选择性低于野生型拟南芥。转基因拟南芥叶片上桃蚜的种群密度低于野生型。因此，GhTCTP1在增强植物对桃蚜的抗性方面具有一定的作用。 3) ω-3脂肪酸去饱和酶7 (ω-3 FATTY ACID DESATURASE7， FAD7) Avila [ 36 ] 发现抑制植株体内FAD7基因的表达量可以增强植物的抗蚜性。FAD7通过中间物SA和NPR1来调节植物的防御力，下调FAD7基因的表达量会降低马铃薯蚜虫的迁移能力、生存能力和繁殖力，降低感蚜性，而且还可以增强植物的耐旱、耐盐及环境适应能力。 4) Hpa1基因 Hpa1 (harpin protein 1)是水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)产生的一种过敏致病性蛋白，该基因10~40 (hpa110~40)区域编码的功能性片段作用于水稻可以增强对致病菌和病虫害的抗性。Fu M [ 37 ] 将该基因与诱导型启动子结合转入烟草，表达蛋白质作用于植株韧皮部，可以增强韧皮部对蚜虫的抵抗力。 5) ATPP2-A1基因 ATPP2-A1基因是棉花韧皮部含量最高的蛋白之一，Zhang等 [ 38 ] 研究发现：ATPP2-A1的过表达可以阻止植食性昆虫尤其是绿桃蚜吸食汁液在叶片繁殖，可以通过基因工程调节该基因的表达量来达到抑制蚜虫的目的，但具体作用机制目前并不清楚。 蚜虫和病害诱导的植物防御级联反应是部分交叉重叠的。而且不同的蚜虫激活不同的信号传导途径，如Mi-1.2基因对马铃薯蚜虫(Macrosiphum euphorbiae)的抗性依赖于水杨酸信号途径，而对蓝绿蚜(M.truncatula)的抗性则依赖于茉莉酸响应途径 [ 39 ] 。有趣的是，依赖于水杨酸的植物响应途径被激活的同时，依赖于茉莉酸的植物响应途径则被抑制。这些现象的出现预示着在特定植物与蚜虫相互作用涉及到植物的整体代谢系统和调控机制，涉及到多种信号途径的交叉对话，牵一发而动全身，在提高植物本身单一物质表达量来防治蚜虫方面较为复杂需要进一步深入研究。在抗蚜棉花基因工程研究中不能只依赖于已有的模式。 3.2. 特异性抗蚜途径 该类途径只能在特定的植物上或对特定种类的蚜虫具有抗性，当转基因植株或标靶蚜虫发生变化时会导致抗虫谱或者抗虫能力的改变。特异性抗蚜途径又分为导入特异性抗蚜基因途径和其他抗蚜途径。 3.2.1. 特异性抗蚜基因 1) Vat (Virus aphid transmission) 抗病毒蚜传基因是源自朝鲜一个甜瓜品种中的基因，通过化学因子抑制蚜虫在植物器官上的繁殖或者通过较高的氧化还原反应电位短时间堵塞虫口末端 [ 40 ] ，转Vat基因植株可抑制棉蚜毒素的传播，但对于桃蚜则没有效果 [ 39 ] 。在棉花抗蚜基因工程中的应用价值不大。 2) Nr 基因 Nr基因源于野生莴苣，它对莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri)具有专一抗性，故此得名 [ 41 ] 。目前该基因只应用于莴苣的育种，未见其它转Nr基因的植物，原因在于该基因对于其它种类蚜虫没有抗性或者只有较弱的抗性，这也是特异性抗蚜基因不能广泛应用的主要原因 [ 42 ] 。 3) Sd-1 Gene Sd-1基因具有抗苹果红尾蚜生物型I和II功能。Cevik等 [ 43 ] 绘制的精密遗传物理图谱，为最终克隆该基因提供了依据，由于苹果红尾蚜不在危害棉花的五大蚜虫之列，故该基因在棉花抗蚜基因工程中应用价值有限，但可为棉花抗蚜的理论研究提供参考。 4) Mi-1.2 Gene Mi-1.2基因源自番茄，为一显性单基因 [ 44 ] ，其表达产物主要分布在植株的韧皮部，可遏制筛管部的取食性昆虫，如蚜虫、根瘤线虫和粉虱。该基因是研究的比较清楚的一个特异性抗蚜基因，Godshen [ 45 ] 发现，该基因表达产物虽然不影响以捕食蚜虫为生的小黑花椿象的产卵量，但却会降低未成熟的小黑花椿象的存活率，即转Mi-1.2 Gene植物对生态潜在的影响力较大。由于其对非标靶昆虫会造成伤害，所以在用于棉花抗蚜基因工程研究时需慎重考虑。 5) 大豆Rag family 2006年，Hill等通过遗传分析，首次发现在PI 548663 (Dowling)和PI548657 (Jackson)等大豆材料中，抗蚜能力表现为单基因显性遗传；随后，2个抗性基因被发现并被定位于7号染色体(M连锁群)，且命名为Rag和Rag1。在其后的几年又发现的其他隐形抗蚜基因被分别命名为rag2、rag3和rag4 [ 44 ] [ 46 ] 。大豆中发现的这些抗性基因均可通过基因工程的方式应用于棉花的育种研究。 3.2.2. 其他抗蚜途径 在大家将注意力集中在抗蚜基因的搜寻时，Gong等 [ 47 ] 从已产生变异的抗氧化乐果或有机磷农药的蚜虫入手，发现抗药蚜虫体内的CarE基因表达量升高。CarE基因编码羧酸酯酶，可以降解氧化乐果和有机磷等农药，通过人工饲喂含CarE基因的dsRNA的食物后，蚜虫体内的羧酸酯酶基因表达受到干扰，对上述两种农药的抗性降低，通过RNA干扰途径，可达到控制目标蚜虫的目的，当属特异性抗蚜途径。此外，Zhang等 [ 48 ] 也在谷类中的蚜虫抗性方面验证了此种方法的可行性。这种抗蚜虫新途径的最大好处就是无需费力寻找新的抗蚜基因，只需要分析抗药蚜虫的体内基因便可以找到有效的控制方法，为大田蚜虫防治提供新思路。但此种方法是否会作用于具有与蚜虫相似基因序列的非标靶昆虫还有待观察，而且在大田中如何能更便捷地让ds-RNA导入蚜虫体内仍有待探索。