DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 大学生在直播中的消费特征 3.1. 大学生对合理消费的认识浅薄 “网红现象”会使大学生在网络平台的消费过程中产生比较盲目的从众心理。网红在直播过程中都会打扮得非常漂亮，然后借助“颜值”优势向观看直播的观众索要礼物，并取得一定的成效。许多大学生作为网络的原住民在频繁使用互联网时跟风从众，对网红带货进行消费的频率增加。还有一些网红在网络上推销产品，大学生出于从众心理或受网红吸引，往往不考虑产品是否符合自身实际需要，也无法真正了解产品的质量与安全性，见大多数人都购买便也跟着购买。网红便利用粉丝对其的信任心理潜移默化影响了其消费行为 [ 4 ]。 当代大学生群体是一个追求新鲜感、追求时尚潮流并且购买欲相对较强的群体，网红推销的产品往往售价相对低廉，这在一定程度上缓和了大学生精神上和物质上之间的矛盾。根据相关调查发现，当代大学生中有半数以上声称自己身边存在受到网络红人的影响而进行购物的同学，并且有很多参与调查的大学生也表示自己同样受网络红人的影响购买过商品。 大学生群体的消费还体现出冲动性的特点，当代大学生的经济来源大多是父母，他们暂时体会不到金钱的来之不易，于是，在花钱的同时相对“理想化”，也更具盲目性。网红的营销模式恰恰利用大学生“意志薄弱”的特点，通过网络等新媒体传递大量关于时尚的信息，在时尚、潮流的标签庇护下使大学生群体显现出非理性的消费行为。 3.2. 大学生的消费动机多样化 在消费过程中，大学生有不同的消费动力。根据数据显示，55.6%的大学生购买网红产品是由于自身需求原因，51.43%的大学生进行消费是因为产品折扣力度大、价格优惠，这表明大部分同学消费动机比较理智，基本上做到理性消费；41.76%的大学生愿意相信具有一定粉丝基础的主播，并在主播的推荐下进行消费，这表明大学生容易受到“网红效应”的影响，追求新鲜事物，从而冲动消费；17.14%的大学生存在受家人、朋友影响的现象，这表明了大部分大学生仍具有从众心理的特点。 3.3. 大学生的消费方式多样化 大学生不同于普通的消费群体，他们有着巨大的消费需求和超前的消费观念，他们的消费方式也具有多样性。购买的网红产品中，服装类占56.48%，美妆占60%，表明了大学生喜欢追求时尚潮流。直播带货的形式打开了购物的新思维，让消费者接触到一些跳出固有消费观念的东西，更快接受适合自己的新产品。
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user: 4. 直播带货对大学生消费行为的影响 4.1. 大学生超额消费现象增加 进入21世纪以后，我国的经济水平飞速发展，越来越多的产品进入市场，得到更多年轻人的青睐，这也造成了很多大学生出现超额消费。根据调查结果显示，31.21%的大学生表示在接触直播带货后网购消费额较之前增加。在网红经济的诱导下，部分大学生即使生活费不足，也会选择通过花呗等方式提前进行消费。网红经济效应在促进经济的同时，也助长了大学生超额消费的现象 [ 5 ]。 4.2. 大学生容易冲动消费 大学生存在许多典型的冲动消费行为。很多时候大学生并不是因为需要某件物品才购买，而仅仅是因为一时喜欢就买或者是产品折扣力度大，但买回去之后，却常常发现这件物品并没有发挥自己预期的作用。这种无计划的消费导致学生入不敷出，也正是现代大学生“三分热度”心理和缺乏勤俭节约意识的表现。 4.3. 大学生从众攀比消费心理增强 部分网红的奢侈品推荐和高消费生活，使大学生的消费目标转向于追求名牌和档次。大学生追求时尚、从众的心理，是出现攀比消费现象的原因。很多大学生缺乏独立意识，认为和身边的人行为一致才是正确的；另一方面，不分大学生以身着名牌、使用奢侈品作为自己时尚个性的标志，来得到同龄人的羡慕和认可。这些现象都表现出大学生的消费观念存在问题 [ 6 ]。 4.4. 大学生线上消费占比增加，对比选择更优商品 线上购物不易受到时间和空间的限制，而且往往比线下购物更具有价格优势。数据显示，42.86%的大学生表示直播带货使线下消费占比减少，线上消费占比增多。同时，由于购买渠道的丰富，消费者选择的空间也随之扩大。例如同一件产品在不同网红的直播间中的折扣力度、同一类产品在不同店铺的销售对比等，都会作为大学生消费的依据，从而选择更适合自己的产品。
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user: 5. 网红经济对大学生消费影响的原因 5.1. 经济水平提高，消费水平提高 网红消费选择的增加以及社会经济水平的提高都促进了大学生的网红消费，甚至出现过度消费的现象。随着我国经济水平的日益提升以及生产力的提高，网红商品的种类数量不断增加，大学生的消费水平也日益提高，这为大学生的网红消费提供了更多的选择与可能，如直播打赏、购买游戏装备、购买网红种草商品等方式 [ 7 ]，这也为大学生的网红消费提供了更多的途径，大学生的消费选择增多，并在一定程度上增加了网红消费的数额。 5.2. 直播带货盛行，受社会氛围影响 随着社交媒体在互联网技术中居于主导地位，特别是微博、微信等平台的诞生以及各类直播平台的大量涌现，网红的产生和迭代的迅速与便捷。“网红经济”的出现不仅带动了大学生消费，而且对大学生的消费习惯、心理和行为产生了重大影响。大学生是对新兴事物接受能力最强的群体，从而大学生群体成为网红消费的主力军。 5.3. 缺乏理性消费观念，易受周围事物影响 作为已经成年的大学生，其消费行为更易受到外部经济环境以及周边氛围的影响，而网红经济就是其中比较重要的影响因素。网红经济时代快速发展，现代大学生对网红产品消费的投入也日益增加。据有关调查显示，有83.94%的大学生表示会因为羡慕等原因去购买和别人有相同价值甚至价值更高的商品，其中“经常会”和“总是会”的大学生共占比33.42%，随着物质生活水平的不断提高，大学生在一个相对自由的环境中由于自制力的不足，心智不够成熟，容易互相攀比，逐渐形成不良风气，合理消费观念淡薄。 5.4. 缺少正确消费观的培养 部分高校缺乏大学生消费价值观的教育，导致部分大学生没有足够理性的消费意识，消费观念不够成熟。据调查可知，仅有17.22%的大学生表示受到过社会、学校里关于正确价值观的引导教育，其他人均表示没有或没留意。这表明，当今社会以及大多数学校对于大学生的理性消费教育问题并未表现出太多的关注与重视，导致许多大学生的理性消费意识不足，容易轻易相信网红主播，落入消费陷阱并产生不理智的消费行为，甚至产生超额消费的现象。
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user: 6. 解决对策 6.1. 加强对大学生的引导 家庭和学校应承担起教育和监护之责。学校要强化理性消费观的培育，将理性消费观念融入教育中；父母要树立健康理性的消费观和财富观，以身作则，教育子女做到量入为出，加强对子女的消费心理和消费行为的监督，及时制止和纠正年轻人错误的消费观，反对超前消费以及攀比炫耀性消费，教育他们应适度消费，帮助子女树立理性的消费观 [ 8 ]。 6.2. 加强有关部门的管理 首先，从内部看，网络直播平台应善用大数据、云计算等先进管理技术，智能化甄别“直播带货”中违规现象，创新监督管理技术。也可以在设置主播行业“黑名单”，根据网络平台监督管理结果，对存在重大或多次违规的主播，将其纳入“黑名单”，并与其他网络直播平台共享信息，既有助于提高直播行业整体素养，又利用信息共享降低了网络平台监管成本，对于网络平台未来发展极为有益。从外部看，媒体应加强直播带货乱象的曝光，借助官方网站、微信、微博等渠道宣传“直播带货”中违法违规现象，帮助社会公众甄别非法“直播带货”。同时，应畅通社会公众维权渠道，鼓励社会公众通过网站、微信、微博提交投诉 [ 9 ]，确保维权落实到行动。提高公众参与感。社会公众也应提高维权意识，学会利用法律武器保障自身合法利益。 6.3. 出台相关法律制度进行监督 政府部门应健全法律法规。目前我国诸多法律法规都涉及“直播带货”规范和监管，但始终未能明确“直播带货”法律责任，应在《广告法》、《消费者权益保护法》中明确“直播带货”监管细则，积极应对日益增多的“直播带货”违法违规行为。制定《网络直播法》，用于专项治理网络直播及带货行为，在专项立法中明确直播平台、主播的权利和义务 [ 10 ]。既为管理者提供执法依据，也能够让主播们明确自身行为，更为网络直播消费者提供全面的维权依据。
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user: 7. 结论 自媒体时代的兴起和社交媒体的迅速发展孕育了“网红经济”，但以直播带货为首的网红经济营销模式现今仍然存在很多问题，商品鱼龙混杂的现象并不少见，平台监管也漏洞百出。同时在物质生活水平的不断提高的情况下，大学生在一个相对自由的环境中由于自制力不足、心智不够成熟且虚荣心强，合理消费观念淡薄，容易受“网红效应”的影响产生非理性的消费行为和消费观念，逐渐形成不良的消费风气。解决直播行业中存在的问题，加强对直播行业的监管力度，打压具有欺骗消费者行为的现象刻不容缓。教育建设和平台监管也应双管齐下，提高大学生群体正确消费意识，助于大学生的健康发展，建立良好的消费环境。
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user: 摘要 目的：探讨慢性心力衰竭(CHF)患者血清成纤维生长因子21 (FGF21)水平变化情况及临床意义。方法：选取2019年5月~2020年1月我院收治的72例慢性心力衰竭患者作为病例组，并进行NYHA心功能分级，其中心功能II级、心功能III级、心功能IV级患者分别为20例、22例、30例，选取同期体检的54例健康者作为对照组。收集各组患者临床基线资料，采取酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清FGF21水平，并通过心脏超声测定左室射血分数(LVEF)。结果：血清FGF21水平在CHF组[(330.07 ± 91.98) pg/ml]明显高于对照组[(195.64 ± 27.08) pg/ml]，差异有统计学意义(P < 0.05)；CHF组不同NYHA心功能分级患者之间血清FGF21水平差异有统计学意义(P < 0.05)，即：心功能IV级[(399.24 ± 75.94) pg/ml] > 心功能III级[(314.93 ± 61.96) pg/ml] > 心功能II级[(242.96 ± 52.56) pg/ml]。Pearson相关分析显示：CHF组患者血清FGF21水平与NT-proBNP呈正相关(r = 0.534， P < 0.01)，与LVEF呈负相关(r = −0.723， P < 0.01)。ROC曲线分析示：血清FGF21用于诊断CHF时曲线下面积为0.902，此时FGF21的截断值为251.52 pg/ml，对应的灵敏度和特异度分别为80.6%、92.1%。结论：CHF患者血清FGF21水平显著升高，且升高程度与慢性心力衰竭严重程度呈正相关，有可能成为诊断慢性心力衰竭的新型生物学标志物。
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user: 1. 引言 成纤维生长因子21 (fibroblast growth factor 21， FGF21)是一种调节机体中脂肪、葡萄糖动态平衡及能量代谢的肽类激素，主要在肝脏、脂肪组织中表达 [ 1 ]，并通过旁分泌、内分泌等方式发挥各种生理作用 [ 2 ]。早期研究证实，FGF21最显著的功效在于降低机体血糖、甘油三酯水平，因此FGF21被认为是代谢性疾病诊断或预后的生物学标志物，如糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等 [ 3 ]。近几年研究表明，FGF21在心脏、血管组织中也有表达，具有减轻氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡等作用 [ 4 ]，并参与高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病等心血管疾病的病理生理过程。但是，关于FGF21在慢性心力衰竭(chronic heart failure， CHF)患者中的水平变化少有研究。本研究通过ELISA法测定CHF患者血清中FGF21水平，旨在探讨血清FGF21对CHF是否具有诊断价值。
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user: 2. 资料与方法 2.1. 研究对象 选取青岛市市立医院心血管内科2019年5月~2020年1月收治的72例慢性心力衰竭患者作为病例组，其中男性41例，女性31例，平均年龄(73.31 ± 13.12)岁；选取同期体检的54例健康者作为对照组，其中男性26例，女性28例，平均年龄(70.83 ± 8.02)岁。CHF组患者根据2018年中国心力衰竭诊断和治疗指南 [ 5 ] 进行NYHA心功能分级，其中心功能II级组20例、心功能III级组22例、心功能IV级组30例。1) 纳入标准：① CHF诊断符合2018年中国心力衰竭诊断和治疗指南；② 具有完备的临床基线资料；③ 本人及家属均同意，并签署知情同意书。2) 排除标准：① 无自主意识、不能应答患者；② 合并严重的肾脏、肝脏、内分泌系统、血液系统等疾病患者；③ 合并严重感染患者；④ 恶性肿瘤患者。以上所入选的研究对象均经本院医学伦理委员会同意批准。 2.2. 研究方法 1) 一般临床资料：记录入选者性别、年龄、入院体重、身体质量指数(body mass index， BMI)、吸烟史、高血压史、冠心病史、糖尿病史。测量入院后次日清晨患者静息状态下收缩压、舒张压。 2) 血样收集并测定：采集病例组、对照组患者入院后次日清晨空腹外周静脉血2份，一份送至医院实验室，测定并记录甘油三酯(triglyceride， TG)、总胆固醇(total cholesterol， TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein， HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein， LDL)、空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)、氨基末端脑钠肽前体(nitrogen-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP)。另一份血样以3000 r/min的速度离心15 min，并分离出血清，保存于−80℃冰箱中。采用酶联免疫吸附试验法检测血清中FGF21水平。FGF21试剂盒(编号SEC918Hu)购自武汉云克隆公司。其原理具体为：将FGF21抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中FGF21与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的FGF21抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的FGF21浓度呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。 3) 超声心动图：患者入院当天行超声心动图检查，记录左室射血分数(left ventricular ejection fraction， LVEF)。 2.3. 统计学方法 使用SPSS22.0软件进行数据分析。据进行正态分布检验，符合正态分布的计量资料用均数 ± 标准差表对数示，非正态分布的的计量资料以中位数(四分位数)表示；两组间符合正态分布的数据比较采用独立样本t检验，非正态分布的计量资料采用Mann-Whitney U非参数检验；计数资料结果用例数(%)表示，各因素间相关性分析应用Spearman秩相关分析法；绘制ROC曲线，评估血清FGF21对CHF的诊断价值。以P < 0.05为差异有统计学意义。
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user: 3. 结果 3.1. 一般资料的比较 CHF组与对照组相比，在年龄、性别、入院体重、BMI、收缩压、舒张压、LDL、HDL、TC、TG、FBG、吸烟史、高血压史、糖尿病史、冠心病史上差异无统计学意义(P > 0.05)；CHF组患者LVEF水平低于对照组，血清NT-proBNP、FGF21水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.001)，见表1。 Table 1 Comparison of general clinical data [ x ¯ ± s ， n(%) 项目 对照组 CHF组 P值 年龄(岁) 70.83 ± 8.06 73.31 ± 13.12 0.195 性别 26 (48.1) 41 (56.9) 0.327 入院体重(kg) 69.79 ± 9.04 70.54 ± 10.25 0.671 BMI (kg/m 2 ) 25.37 ± 2.01 25.13 ± 2.28 0.543 收缩压(mmHg) 72.81 ± 9.37 73.54 ± 12.86 0.726 舒张压(mmHg) 132.63 ± 14.58 127.39 ± 16.64 0.068 LDL (mmol/L) 2.44 ± 0.76 2.22 ± 0.72 0.095 HDL (mmol/L) 1.16 ± 0.25 1.09 ± 0.40 0.265 TC (mmol/L) 3.85 ± 0.57 4.05 ± 0.75 0.110 TG (mmol/L) 1.46 ± 1.04 1.15 ± 0.77 0.052 FBG (mmol/L) 5.84 ± 0.79 6.46 ± 2.21 0.051 吸烟史 14 (25.9) 19 (26.4) 0.953 高血压史 37 (68.5) 44 (61.1) 0.829 糖尿病史 19 (35.2) 30 (41.7) 0.285 冠心病史 40 (74.1) 51 (70.8) 0.796 LVEF (%) 59.06 ± 3.06 27.93 ± 4.97 <0.001 NT-proBNP (pg/ml) 109.01 ± 124.75 4621.94 ± 2551.70 <0.001 FGF21 (pg/ml) 195.64 ± 27.08 330.07 ± 91.98 <0.001 表1. 一般临床资料比较[ X ¯ ± S，例(%)] 3.2. 不同NYHA心功能分级患者血清FGF21、NT-proBNP、LVEF的比较 CHF组患者血清FGF21、NT-proBNP水平随心功能分级增加而升高，而LVEF水平随心功能分级增加而降低，差异有统计学意义(P < 0.01)，见表2。 Table 2 CHF comparison of serum FGF21， NT-proBNP and LVEF of patients with different NYHA ( x ¯ ± s 组别 例数 FGF21 (pg/ml) NT-proBNP (pg/ml) LVEF (%) 心功能II级 20 242.96 ± 52.56 2648.21 ± 748.76 33.00 ± 3.96 心功能III级 22 314.93 ± 61.96 ＃ 3910.99 ± 1211.27 ＃ 28.59 ± 3.45 ＃ 心功能IV级 30 399.24 ± 75.94 ＃ * 6459.13 ± 2819.51 ＃ * 24.07 ± 2.86 ＃ * P值 <0.01 <0.01 <0.01 表2. CHF不同NYHA患者血清FGF21、NT-proBNP、LVEF的比较( X ¯ ± S) 注：与心功能II级组相比较， ＃ P < 0.01；与心功能III级组相比较， * P < 0.01。 3.3. CHF患者血清FGF21水平与其他临床指标间的相关性分析 CHF患者血清FGF21水平与NT-proBNP水平(r = 0.534， P < 0.001)呈正相关，与LVEF水平(r = −0.723， P < 0.001)呈负相关，与年龄、性别、入院体重、BMI、收缩压、舒张压、LDL、HDL、TC、TG等指标无显著相关性(P > 0.05)，见表3。 Table 3 Analysis of correlation between serum FGF21 level and other clinical indexes in patients with CH 指标 r值 P值 年龄 0.048 0.687 体重 0.033 0.786 BMI −0.075 0.532 收缩压 0.054 0.651 舒张压 −0.084 0.485 LDL 0.101 0.400 HDL −0.083 0.487 TC 0.098 0.413 TG −0.17 0.154 FBG 0.109 0.362 LVEF −0.723 <0.001 NT-proBNP 0.534 <0.001 表3. CHF患者血清FGF21水平与其他临床指标间的相关性分析 3.4. 血清FGF21对CHF诊断的价值分析结果 血清FGF21诊断CHF的ROC曲线下面积(area under curve， AUC)为0.902 (95% CI: 0.825~0.907， P < 0.01)，最佳截断值为251.52 pg/ml，对应的灵敏度和特异度分别为80.6%、92.1%，见图1。 图1. 血清FGF21诊断CHF的ROC曲线
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user: 4. 讨论 CHF是由心脏结构或功能异常引起的心室充盈和(或)射血能力受损的临床综合征，以体循环和(或)肺循环淤血为临床表现，是各种心脏疾病发展的终末阶段，其预后差、死亡率高 [ 6 ]。心力衰竭标志物的出现与应用有利于临床上心衰的诊断，如BNP、NT-proBNP等，随着研究的不断进展，越来越多心衰标志物被发现，对心衰的诊断及预后的评估具有极高的临床意义。Chou等 [ 7 ] 在一项针对舒张性心力衰竭患者的研究中发现，血浆FGF21和NT-proBNP水平在舒张性心力衰竭患者中显著升高，研究首次指出血浆FGF21水平与心脏舒张功能障碍有关。随后Shen等 [ 8 ] 研究发现，血清FGF21水平升高是左室收缩功能不全的独立危险因素，且高水平血清FGF21患者发生心力衰竭等心血管不良事件风险显著升高。本研究显示，CHF组患者中血清FGF21水平与对照组相比显著升高，且不同NYHA心功能分级患者中血清FGF21水平比较：心功能IV级组 > 心功能III级组 > 心功能II级组，提示血清FGF21水平与心功能分级呈正相关，表明血清FGF21在一定程度上可反映患者慢性心力衰竭的严重程度。 NT-proBNP是一种比BNP半衰期长、稳定性好的分子，在临床上通常与LVEF结合以评价心力衰竭患者心脏功能。在健康人体内，NT-proBNP含量较少，但当出现心肌缺血缺氧、心脏负荷过大时，左心室分泌NT-proBNP增多，起到扩张血管、利尿排钠、抑制交感神经等作用，且NT-proBNP升高程度与心衰的严重程度呈正相关，可作为心力衰竭诊断的指标之一 [ 9 ]。本研究中，Spearman秩相关分析示：血清FGF21水平与NT-proBNP水平呈正相关，与LVEF呈负相关，进一步表明血清FGF21水平在一定程度上可评估CHF的严重程度。本研究还绘制了ROC曲线以分析FGF21在CHF中的诊断价值，结果分析示血清FGF21诊断CHF的AUC为0.902，提示血清FGF21对CHF有较高的诊断价值，对应的灵敏度和特异度分别为80.6%、92.1%，表明血清FGF21诊断CHF的灵敏度稍差，特异性较好，提示FGF21在诊断CHF时仍需与患者临床症状或其他指标相结合。 FGF21是FGF家族的第21个成员，最早由Nishimura等 [ 10 ] 首先在小鼠肝脏组织中发现，近年来，FGF21在冠心病 [ 11 ]、高血压 [ 12 ]、房颤 [ 13 ] 等心血管疾病中的研究较多，而FGF21与慢性心力衰竭之间的关系却少有研究。根据现有研究，血清FGF21水平在慢性心力衰竭患者中升高的机制可能有以下几点：1) FGF21可参与心脏中氧化应激反应。心脏中过量的活性氧物质(reactive oxygen species， ROS)可导致心脏收缩功能减低、心室重构加快，进一步可导致慢性心力衰竭 [ 14 ]。Ruperez等 [ 15 ] 证实，FGF21基因敲除的小鼠中，抗氧化基因如解偶联蛋白(uncoupling protein， UCP) 2、UCP3、表达减少，活性氧物质增多，氧化应激作用增强，引起小鼠心室重构、心脏功能受损。2) FGF21可参与心肌细胞能量代谢。研究发现，心肌细胞能量代谢紊乱常是导致慢性心力衰竭的重要原因之一 [ 16 ]。FGF21可通过提高三磷酸腺苷(adenosine triphosphate， ATP)合成酶水平恢复受损心肌的能量供应；另外，FGF21还可通过促进糖酵解途径产能，减少慢性心力衰竭的发生 [ 17 ]。3) FGF21可抑制心脏中炎症反应。实验证实，大量的炎性因子可介导心室重构，炎症反应与慢性心力衰竭的发生发展密切相关 [ 18 ]。Planavila等 [ 19 ] 发现，FGF21基因敲除的小鼠输注异丙肾上腺素后，单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein， MCP)-1、白细胞介素(interleukin， IL)-6等炎性因子活性增强，心脏重量增加、左心室扩张、心脏功能减退，给予外源性FGF21治疗后，小鼠心脏炎症反应减轻，心脏功能明显改善。更多作用机制尚需进一步研究。
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user: 5. 结论 综上所述，血清FGF21水平在慢性心力衰竭患者中升高，且升高程度与慢性心力衰竭严重程度呈正相关，有可能成为诊断慢性心力衰竭的新型生物学标志物。然而，本实验纳入样本量少，仍需大规模的多中心临床研究进一步证实。
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user: 摘要 目的：了解帕米卡体外细胞生物学水平的作用及其机理。方法：HEK-Blue hTLR3细胞、HEK-Blue hTLR4细胞经信号传导检定相应配体试验；RT-qPCR (实时荧光定量PCR技术)试验，细胞活力试验，单层细胞增殖试验，Annexin V和PI双染色法定量试验，细胞分裂周期分析试验，细胞划痕实验，细胞迁移小室和侵袭试验。结果：帕米卡是TLR3、4受体的配体，极其显著地提高LL/2 and A540细胞TLR3 mRNA水平，是对受体敏感性的标志，极其显著地抑制肿瘤细胞存活率，显著地减少肿瘤存活细胞数，封闭 肿瘤细胞在G1期继续分裂使肿瘤细胞凋亡，显著降低肿瘤细胞的移动和侵袭，抑制了肿瘤转移。结论：帕米卡是一个能够引起非特异免疫响应显著增强机体抗肿瘤免疫的敏感性、抑制肿瘤细胞增殖、降低肿瘤细胞分裂和转移的有潜力的广谱抗癌抗病毒制剂。
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user: 1. 引言 前两篇《帕米卡 ® 制剂抗病毒抗肿瘤作用及瞻望》和《帕米卡 ® 对几种荷瘤小白鼠的效果观察》报道了帕米卡概况、有效性、前景以及在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤荷瘤小白鼠模型中的有效性(P < 0.05~0.0001)，阐明了使用帕米卡非特异性免疫促进剂作为广谱抗肿瘤抗感染治疗的可行性 [ 1 ] [ 2 ]。本篇通过细胞生物学水平实验研究进一步揭示了帕米卡是TLR3和TLR4的激动剂，在体外能够引起非特异免疫响应显著活化对TLR3受体的敏感性，抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用及其机理，增强了作为广谱抗癌抗病毒制剂的信心。本文实验是与中国医学科学院药物研究院及香港InvivoGen公司协作完成。
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user: 2. 材料和方法 2.1. 帕米卡TLR3、TLR4配体检测 样品：帕米卡3 mg/ml信福(北京)医药科技有限公司制备2018.01.15；细胞系：人肺癌细胞A549分化的双基因细胞(A549-dual cell)含有胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因和荧光素酶基因，二者是稳定结合的报告基因结构。HEK-Blue hTLR3细胞在A549-dual cell基础又携带人TLR3基因，携带的分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因通过TLR3激动剂活化NK-kB和AP-1 (细胞内转录激活因子)产生SEAP产物和分泌荧光素酶检测活化活性；HEK-Blue hTLR4能过表达人TLR4受体蛋白和NK-kB诱发的SEAP报告基因，工作原理与HEK-Blue hTLR3细胞相同。 方法：帕米卡3 mg/ml稀释至1 mg/ml→100 µg、25 µg、6.25 µg、1.56 µg、391 ng、97.7 ng、24.4 ng、6.1 ng，从100 µg/ml开始。在96孔板中分别加入20 µl/孔试验样品或参考品，HEK-Blue Null1 hTLR3细胞、HEK-Blue hTLR4细胞约50，000细胞，总体积200 µl/孔。置37℃ 5%CO 2 温箱16~24小时，使用酶标仪或分光光度计在630 nm检测读取OD值。 计算：OD值﹣非诱导平均值NI，取平均值，以直方图表示。 2.2. 帕米卡在肿瘤细胞的细胞生物学作用机理研究 样品：帕米卡3 mg/ml：信福(北京)医药科技有限公司制备，批号：20171101；阳性对照药：PD1：BioXcell公司，货号BE0033-2 24MG批号：662817J3；CCK8试剂盒：Dojindo日本公司；Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡试剂盒：Neobioscience公司；TUNEL-POD试剂盒：Leica公司。上述试剂均为分析级。LL2鼠癌细胞、A549人癌细胞：中国医学科学院基础医学研究所提供，细胞在10%胎牛血清、1%青、链霉素MEM培养液中置5%CO 2 37℃孵箱内培养。 方法： RT-qPCR (实时荧光定量PCR技术)：用Invitrogen公司生产的Trizol试剂溶解帕米卡处理和未处理细胞，用DNA酶1 (Fermentas 公司)消化样品中的DNA，提取细胞RNA，经反转录酶M-MLV转录成cDNA，再以cDNA为模板，用罗氏公司的2 × TaqMix480II预混液，按照如下条件试验：95℃ 5分钟，95℃15秒→65℃30秒，经45周期，以荧光检测扩增合成目的的片段。TLR3引物为：5’-CCAGACCTAGC ACAACTGACTCC-3’ (forward) and 5’-AGCAGCCAGAAGCAGAACTACAGA-3’ (reverse); β-actin， 5’-GA GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3’ (forward) and 5’-GGACTCATCGTACTCCTGCTTG-3’ (reverse) [ 3 ]，通过三次重复试验分析qPCR产物。该技术是在反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 细胞活性试验：LL2细胞以7 × 10 3 /孔、A549细胞以5 × 10 3 /孔，加入96孔板中，培养液为10%胎牛血清DMEM，置37℃孵箱24小时，换液加入不同浓度的帕米卡及设对照组和空白孔，继续置37℃孵箱24、48小时后所有细胞孔换入含10%CCK8试剂(Dojindo日本公司)的无血清维持液，在黑暗处孵育2小时，分别在450和650 nm通过微板阅读器(美国BioTek公司)读取OD值，细胞存活% = OD试验值 − OD空白值/(OD对照值 − OD空白值) × 100%。 单层细胞增殖试验：LL2细胞、A549细胞以5 × 10 4 /孔，加入6孔板中，培养液为10%胎牛血清DMEM，置37℃孵箱24小时，换液加入帕米卡100 µg/ml和不加帕米卡的无血清MEM维持液，继续置37℃孵箱48小时后每24小时测定细胞总数。每孔收集细胞用台酚蓝(美国Solarbio公司)染色，用血细胞仪计数比较。 Annexin V和PI双染色法定量检测细胞凋亡试验：LL2细胞、A549细胞以1 × 10 5 /孔加入6孔板中，培养液为10%胎牛血清DMEM，置37℃孵箱24小时，换液加入帕米卡100 µg/ml无血清MEM维持液，同时设不加帕米卡对照组继续置37℃孵箱48小时，收集细胞，用冷PBS洗2次，用结合缓冲液重悬浮细胞，用Annexin V和PI双染色法标记细胞(试剂盒，欣博盛科技公司，中国)，细胞凋亡通过美国BD公司流式细胞仪和细胞寻找软件(Cell Quest Software)分析。 细胞分裂周期分析试验：LL2细胞、A549细胞以1 × 10 5 /孔接种在6孔板中，培养液为10%胎牛血清DMEM，置37℃孵箱24小时，换液加入帕米卡100 µg/ml无血清MEM维持液和DMEM孔作为对照，继续置37℃孵箱48小时，收集细胞，置75%乙醇中−20℃ 24小时，用冷PBS洗2次，加入100 µlRNA酶(美国Solarbio公司)重悬浮细胞，37℃水浴30分钟，所有细胞用400 µl PI试剂(美国Solarbio公司)标记，置4℃黑暗处30分钟，用流式细胞仪(美国BD公司)在波长488 nm检测红色荧光。 细胞划痕试验：当细胞长成单层时，在融合的单层上人为制造一个空白区域，称为划痕，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使划痕愈合，模拟了体内细胞迁移过程，以研究细胞迁移的体外实验方法。分别将约5 × 10 4 LL2细胞、A549细胞/孔接种到12孔板中，置37℃ CO 2 温箱培养24小时，成片的细胞用200 µl枪头划痕，PBS冲洗2次。设加入帕米卡100 µg/ml实验组和未加帕米卡对照组，于0、24、48小时捕获划痕位置，用映像软件测量缝隙距离。 细胞迁移小室试验：LL2细胞、A549细胞分别加入帕米卡100 µg/ml无血清MEM维持液试验组和仅加MEM维持液对照组，置37℃孵箱培养48小时，收集细胞，用无血清MEM悬浮细胞，加入5 × 10 4 细胞/孔至含有嵌入物的24孔膜板(3422 美国康宁公司)即细胞迁移小室中，同时在小室膜板下方加10%胎牛血清作为诱导剂孵育24小时。除去小室膜上未迁移细胞，无水甲醛固定迁移至小室膜下细胞，用结晶紫在暗处染色30分钟，在显微镜下对不同视野拍照。迁移率(%) = (A样品 − A空白/A对照 − A空白) × 100% 侵袭试验：用无血清MEM1:5稀释基质凝胶加入到上述细胞迁移小室，置37℃孵箱培养过夜。定量测定方法：用33%乙酸溶解结晶紫染色的细胞，在分光光度计570 nm处测定OD值，结果帕米卡处理与未处理的LL2细胞、帕米卡处理与未处理的A549细胞比较。侵袭率 = (A样品 − A空白/A对照 − A空白) × 100%。
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user: 3. 实验结果 3.1. 帕米卡是具有强烈作用的hTLR3激动剂 HEK-Blue hTLR3是A549 (人肺癌细胞)携带人TLR3和SEAP报告基因与荧光素酶的HEK-Blue Null1细胞。图1结果表明帕米卡能通过激活NK-kB和AP-1通路引起HEK-Blue hTLR3细胞激活的分泌碱性磷酸酶的SEAP报告基因和通过激活干扰素调节因子基因分泌荧光素酶，检测效果优于阳性对照药Poly(I:C) HMV。证明帕米卡是具有较阳性对照药更强烈作用的hTLR3激动剂。 图1. 阳性对照药Poly(I:C) HMV和帕米卡在HEK-Blue hTLR3细胞作用效果 3.2. 帕米卡也是hTLR4激动剂 HEK-Blue hTLR4细胞是A549细胞携带人TLR4基因和SEAP报告基因与荧光素酶的HEK-Blue Null2细胞，图2结果表明帕米卡能通过NK-kB和AP-1信号传导也能引起HEK-Blue hTLR4细胞分泌碱性磷酸酶的SEAP报告基因和干扰素调节因子基因分泌荧光素酶，效果不如阳性对照药脂多糖，但优于Poly(I:C) HMV，表明帕米卡也是hTLR4激动剂。 图2. 阳性对照药脂多糖及Poly(I:C) HMV和帕米卡在HEK-Blue hTLR4细胞作用效果 3.3. RT-QPCR(实时荧光定量PCR)分析 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，将RNA的反转录和c DNA的聚合酶链式扩增相结合检测细胞中基因表达水平。用对起始模板定量分析方法检测帕米卡在体外对LL-2和A549细胞TLR3的扩增。图3结果表明RT-QPCR检测帕米卡经24、48小时处理细胞后上调A549人癌细胞TLR3 mRNA含量，从1.26至1.52，P < 0.01；上调LL/2鼠癌细胞TLR3 mRNA含量，从0.90至1.37，P < 0.001，极其显著地促进细胞TLR3 mRNA，表明帕米卡对TLR3受体具有极其显著的敏感性。 3.4. 帕米卡在体外抑制LL-2和A549 细胞增殖 用CCK8试剂按照细胞存活试验方法检测，图4表明帕米卡经24、48小时以不同剂量处理细胞，24小时抑制LL/2细胞存活数20%，抑制A549细胞数13%，均P < 0.01；48小时抑制LL/2鼠癌细胞存活数52%~67%，抑制A549人癌细胞数45%~61%，P < 0.001，显示帕米卡能极其显著地抑制肿瘤细胞存活率，而剂量依赖性不明显。本文有关研究均采用帕米卡剂量为100 µg/ml。 图3. 实时荧光定量PCR分析帕米卡在体外对LL-2和A549 细胞TLR3 mRNA水平的影响 图4. 不同剂量帕米卡(10， 50， 100， 200 µg/ml)经24、48小时处理对A549和LL/2细胞存活率的影响 用测定细胞数的方法进一步检测帕米卡抑制癌细胞的作用：用单层细胞增殖试验方法收集细胞，用台酚蓝染色计算细胞数。图5表明帕米卡经24处理、降低LL/2细胞总数至1.47倍，降低A549细胞总数至1.24倍；经48小时处理细胞后，降低LL/2细胞总数2.07倍，降低A549细胞总数2.07倍，均P < 0.01，表明帕米卡能显著地减少肿瘤细胞数。 图5. 帕米卡处理24、48小时对降低LL/2和A549细胞总数的影响 3.5. 帕米卡对LL/2和A549细胞凋亡及细胞分裂周期的影响 用Annexin V和PI双染色法定量检测帕米卡对LL/2和A549细胞凋亡及分裂周期的影响。图6表明帕米卡处理48小时后细胞凋亡率LL/2细胞为11.43% ± 0.46%，对照组为2.73% ± 0.61，A549细胞20.04% ± 0.85%，对照组为0.13% ± 0.06%，统计学测定均P < 0.001。 图6. 用Annexin V和PI双染色法定量检测帕米卡处理48小时后对LL/2和A549细胞分裂周期及凋亡的影响(±S， n = 3) 图7. 用流式细胞仪分析帕米卡处理LL/2和A549细胞48小时后对细胞分裂周期的影响(±S， n = 3) 为了进一步观察帕米卡是如何影响细胞分裂周期，通过PI染色，用流式细胞仪分析，如图7所示，表明帕米卡处理48小时后LL/2细胞积聚在G1期，而在S和G2期显著降低，抑制总率32.01% ± 0.09%，对照组为17.11% ± 1.12% P < 0.001；A549细胞抑制总率55.16% ± 0.97%，对照组为46.52% ± 0.58% P < 0.001。表明帕米卡极其显著地抑制了细胞在G1期继续分裂，引起细胞凋亡降低了细胞增殖。 3.6. 帕米卡对LL/2和A549细胞转移的影响 下述两项试验从细胞横向和竖向移动试验显示帕米卡抗肿瘤转移效果。文献报道肿瘤细胞在体外的移动和侵袭表明可引起肿瘤的转移 [ 3 ]。 3.6.1. 细胞划痕伤口愈合试验 图8划痕试验表明A549对照组细胞几乎完全愈合，但LL/2细胞愈合不明显，表明A549细胞具有 图8. 帕米卡通过48小时比较对处理与未处理LL/2和A549细胞划痕域运动的作用(图片放大200倍) 较好的转移性质。帕米卡处理LL/2细胞48小时后，划痕域LL/2细胞从1，673，025 µm 2 减少至902，610 µm 2 ，对照组从1，714，904 µm 2 减少至749，944 µm 2 ，统计学测定帕米卡处理24小时P < 0.05，处理48小时P < 0.01；帕米卡处理A549细胞48小时后划痕域从1，067，701 µm 2 减少至525，084 µm 2 ，对照组从1，166，710 µm 2 减少至363，945 µm 2 ，帕米卡处理A549细胞24和48小时，均P < 0.01。表明帕米卡处理的细胞明显降低了细胞的移动。 3.6.2. 细胞迁移小室和细胞侵袭试验 这两项试验检测帕米卡抑制LL/2和A549细胞纵向移动的作用。图9的左边图表明上述细胞能跨过迁移小室膜，移至小室膜外的作用，在对照组细胞100%未移动下，帕米卡抑制LL/2细胞跨膜移动作用是对照组的85.80% ± 3.31%；帕米卡抑制A549人癌细胞跨膜移动作用是对照组的82.96% ± 1.27%，统计学测定均P < 0.01。 帕米卡抑制肿瘤细胞的侵袭试验即在细胞迁移小室底部加入基底膜胶观察细胞的侵袭能力。图9的右边图表明在对照组细胞100%未有侵袭作用下，帕米卡降低LL/2细胞侵袭至对照组的58.09% ± 1.34%；降低A549人癌细胞的侵袭至对照组的82.26% ± 2.24%，统计学测定均P < 0.01。 图9. 帕米卡对LL/2和A549细胞移动和侵袭作用的影响(*P < 0.05， **P < 0.01)
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user: 4. 讨论 癌细胞具有不死性、迁移性和失去接触抑制性，其细胞分裂周期失控不受正常生长调控系统的控制，能持续地分裂与增殖，尤其具有局部移动、浸润和远处转移能力是致人死地最重要的生物学特性。本篇研究揭示帕米卡极其显著有效地抗击肿瘤这些特性： 1) 帕米卡能显著抑制肿瘤细胞存活数及细胞总数：通过CCk8试剂盒细胞活性检测表明帕米卡显著降低肿瘤细胞存活率，通过单层细胞增殖用台酚蓝染色细胞计数也表明帕米卡显著抑制肿瘤细胞总数，克服了肿瘤细胞无限增殖的问题。 2) 帕米卡对肿瘤细胞分裂周期的影响试验证明帕米卡能促进LL/2和A549细胞凋亡，统计学测定P < 0.001；又进一步通过染色经流式细胞仪分析，表明帕米卡能封闭LL/2和A549人细胞在G1期继续分裂，统计学测定P < 0.001，表明帕米卡是封闭了肿瘤细胞在G1期继续分裂引起细胞凋亡，抑制了细胞增殖。进一步揭示了帕米卡能够减少肿瘤细胞、缩小肿瘤体积和抑制了肿瘤细胞无限增殖的作用机理。 3) 帕米卡阻碍肿瘤细胞移动和侵袭试验是从肿瘤细胞横向和竖向移动和侵袭证实了帕米卡具有阻碍肿瘤细胞移动、侵袭。文献报道肿瘤细胞在体外的移动和侵袭可引起体内肿瘤的转移 [ 4 ]。在前篇荷瘤小白鼠试验中，帕米卡体内阻止肿瘤转移效果优于传统化疗药紫杉醇和靶向药PD-1 [ 2 ]，这一作用是十分重要的，因为移动和侵袭而致转移是肿瘤细胞最重要特征，90%肿瘤患者死亡是由于肿瘤转移造成的。 4) 试验证实帕米卡是TLR3、4受体的激动剂。本试验是通过激活HEK-Blue hTLR3和HEK-Blue hTLR4细胞NF-kB和A1信号通路证实证实帕米卡是TLR3、4膜式识别受体的配体。由此，不仅证实了帕米卡是TLR3、4受体的配体，也证明了帕米卡与TLR3、4受体结合后激活了NF-kB和A1 (蛋白激酶-1，activator protein 1， AP-1)信号通路，该通路在调节抗肿瘤抗感染的免疫应答中促进巨噬细胞、NK细胞、T细胞功能特别倾向诱导肿瘤细胞发生凋亡，并诱生IFNα、IFNβ、IFNY、TNFα、白细胞介素等细胞因子的分泌，引起一系列促进非特异性免疫的效果。文献也报道NF-κB和A1等的活化，具有发挥抗病毒抗肿瘤作用 [ 5 ] [ 6 ]。Bruce BA [ 7 ] 和Hoffmann JA [ 8 ] 发现TLRs膜式识别受体可以与微生物基本成分结合活化非特异性免疫而获得2011年诺贝尔生理学和医学奖。该试验奠定了帕米卡作用机理的基础。 5) RT-qPCR试验(实时荧光定量PCR技术)证实帕米卡上调A549人癌细胞和LL/2鼠癌细胞TLR3 mRNA，统计学测定P < 0.01~0.001，该结果显示的是帕米卡对TLR3的启动具有极其显著的基因敏感性，这是帕米卡又一重要特性，因为在治疗中需要机体对药物反应的高度敏感性才能达到治疗目的。另外，TLR3广泛存在于上皮细胞和树突状细胞里，还存在NK、T、巨噬细胞中，也在几种肿瘤细胞中表达，有文献报道肿瘤细胞TLRs携带肿瘤抗原，可唤起初次抗肿瘤免疫反应 [ 9 ]，又通过去除肿瘤抗原防止形成炎性肿瘤环境 [ 10 ]。结合上一条试验结果表明帕米卡在具有刺激机体细胞水平的免疫力效果基础上又进一步扩大了作为TLR3受体的敏感性，则进一步说明了帕米卡抗肿瘤抗病毒的作用机理。 6) 本试验所使用的细胞包括LL/2鼠癌细胞、A549人癌细胞包括转基因细胞HEK-Blue hTLR3细胞、HEK-Blue hTLR4细胞，再次证明帕米卡具有广谱抗肿瘤抗病毒效果。 2020.12.28中国新闻网报道：六国出现七种新冠变异病毒，全人类或许到了最凶险的时候。提到只要疫情得不到控制，全球将会变成巨大的病毒培养皿，病毒不断变异，不断有新的亚型诞生。笔者大胆提出不管病毒如何变异提高机体系统非特异性的免疫制剂也许就是当前治疗新冠病毒变异的一条出路。 帕米卡细胞生物学作用机理的研究确定了帕米卡是TLR3、4的配体，确定了能激活Nk-B和A1信号传导通路、确定了具有激活TLR3受体的高度敏感性，确定了促进肿瘤细胞的凋亡降低细胞数、确定了使肿瘤细胞在G1间期降低继续分裂、确定了减少肿瘤细胞移动和侵袭从而抑制了肿瘤细胞的转移。帕米卡在这抗肿瘤这些关键处都给予了肯定回答并具有极其显著的效果，特别是这种效果是非特异的而具有重要的现实意义，进一步增强了用非特异性免疫促进剂开启抗病毒抗肿瘤治疗性革命大门的信心和希望。
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user: 摘要 医源性胆管损伤在临床上屡见不鲜，且胆管损伤后果严重，是肝胆外科医生面临的一个较为棘手焦点问题。胆管损伤后如果处理不当，可能导致胆管狭窄、反复发作的胆管炎、胆汁淤积性肝硬化甚至肝衰竭而死亡，对胆管损伤的诊断、分型及处理方式，直接影响病人预后，因此临床医师需要对胆管损伤有充分的认识，术中要做到仔细辨认局部解剖关系，谨慎操作，一旦发生医源性胆管损伤，要准确把握手术时机，选择合理的手术方式，改善病人的长期预后。
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user: 1. 前言 胆管损伤是指各种原因导致的胆管结构的完整性和通畅性遭到破坏。包括创伤性胆管损伤和医源性胆管损伤，其中在临床上最为常见的是医源性胆管损伤(iatrogenic bile duct injury， IBDI)，IBDI是指在医疗活动的过程中发生的正常胆管的损伤，在胆囊切除术、胃大部切除术、肝切除术等一些上腹部手术及有创检查中均有可能发生，据统计约有80%的医源性胆管损伤发生在胆囊切除术中 [ 1 ]。腹腔镜胆囊切除术胆管损伤的发生率维持在0.30%~0.64% [ 2 ]。近年来随着肝胆外科和腹腔镜技术的飞速发展以及腹腔镜胆囊切除术的普及，医源性胆管损伤的问题也日趋凸显 [ 3 ] [ 4 ]。胆管损伤一旦出现，则可能会对病人造成严重创伤，甚至是永久性损害。如果处理不及时或方法不合理，后期很容易导致胆管炎的反复发作、胆管狭窄、肝脓肿，最终导致胆汁性肝硬化和门静脉高压，严重影响病人的生活质量甚至危及生命。胆管损伤性狭窄是影响胆管损伤修复术后远期效果的主要原因，如何预防和处理胆管损伤一直是肝胆外科临床上需要艰难面对的一大棘手难题 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]。因此，明确胆管损伤的类型、原因、分型，能有效预防并正确处理胆管损伤、改善病人的预后。
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user: 2. 胆管损伤的分型 目前已有多种胆管损伤的分型系统，但尚无统一标准，目前国际上已有胆管损伤分型系统达10多种 [ 9 ] [ 10 ]。常见的分型有Bismuth分型、Strasberg分型、Steward-Way分型等。 2.1. Bismuth分型 20世纪80年代初，Henri Bismuth根据胆管狭窄的部位介绍了一种5型胆管狭窄分型方法，被外科界广泛认可 [ 11 ]：I型：损伤部位距肝总管起始部向远端 ≥ 2 cm；II型：损伤部位距肝总管起始部向远端 < 2 cm；III型：损伤部位在左右肝管汇合部；IV型：左右肝管汇合部顶端受损，左右肝管系统被隔离不连通；V型：指I型、II型或III型合并右侧副肝管或迷走胆管狭窄。Bismuth分型出现在腹腔镜胆囊切除术盛行时期，它主要是针对胆管损伤引起的胆管狭窄，而并没有涉及到撕裂、横断等其他急性胆道损伤，因此在腹腔镜胆囊切除术导致的胆管损伤分型中有其固有的缺陷。 2.2. Strasberg分型 90年代之后随着腹腔镜胆囊切除术的开展和普及，胆管损伤的原因和特征出现“变异”，Bismuth分型的局限性凸现出来，不能完全适应于腹腔镜胆囊切除术中胆管损伤的临床分型，此时Strasberg结合腹腔镜胆囊切除术胆管损伤的特点，对胆管损伤的特点做了进一步的完善，提出了一种适应于腹腔镜胆囊切除术所造成的胆管损伤分型方法，即Strasberg分型 [ 12 ]：A型：胆囊管和肝内小胆管损伤；B型：指副右肝管闭塞；C型：指副右肝管断裂且未结扎，伴有胆漏；D型：指主胆管侧方损伤，伴有胆漏；E型：指胆道狭窄。E1~5对应Bismuth分型I~V型。Strasberg分型相对于Bismuth分型比较完善，是目前被普遍接受的胆管损伤分型系统 [ 13 ]，2013年中华医学会外科学分会胆道外科学组推荐Strasberg分型可作为腹腔镜胆囊切除术所导致的胆管损伤评估的主要参考系统 [ 14 ]。 2.3. Steward-Way分型 Stewart-Way分型 [ 15 ] 将胆管损伤分为4类。I类为胆管不完全性离断，连续性存在，常因术中未能将胆囊管与胆总管区分开而引起的胆总管的误伤。II类为肝总管外侧损伤所导致的胆管狭窄或胆漏，多为电灼损伤和手术钳夹损伤。III类是最常见的损伤类型，为把胆总管误认为胆囊管后离断所导致的横断性损伤，根据损伤位置高低可细分为IIIa (肝总管损伤，肝总管残端有剩余)，IIIb (汇合部损伤)，IIIc (汇合部缺失)和IIId (汇合部以上二级肝管损伤)，常见于开腹胆囊切除时。IV类为伤及右肝管或其主要分支，常伴有肝右动脉损伤。多为将右肝管误认为胆囊管，或将肝右动脉误认为胆囊动脉所致。Stewart-Way分型是一种更新的分类系统，包括了胆管损伤的损伤机制和解剖特点，可用于帮助预防IBDI的发生。 2.4. 中华医学会外科学分会胆道外科学组依据胆管损伤的临床病理学特征、解剖部位、致伤因素和防治措施等多个方面，制定了中国的胆管损伤分型系统 这一系统化分型将胆管损伤分为3型4类。I型：指胰十二指肠区胆管损伤。又根据是否合并胰腺和(或)十二指肠损伤分为3个亚型。I1型：指远段胆管单纯损伤；I2型：指远段胆管损伤合并胰腺和(或)十二指肠损伤；I3型：指胆、胰、肠结合部损伤。II型：指肝外胆管损伤。指位于肝脏和胰十二指肠之间的肝外胆管损伤。依据损伤的解剖平面分为4个亚型。II1型：指汇合部以下至十二指肠上缘的肝外胆管损伤；II2型：指左右肝管汇合部损伤；II3型：指一级肝管损伤；II4型：指二级肝管损伤；III型：指肝内胆管损伤，为三级和三级以上肝管的损伤，包括在肝实质外异位汇入肝外胆管的副肝管和变异的三级肝管损伤以及来源于胆囊床的迷走肝管损伤。依据胆管损伤的病变特征将其分为4类，a类：指非破裂伤(胆道管壁保持完整的损伤，包括胆管挫伤以及因缝扎、钛夹夹闭或其他原因造成的原发性损伤性胆管狭窄)；b类：指裂伤；c类：指组织缺损；d类：指瘢痕性狭窄(指胆管损伤后因管壁纤维化而形成的继发性胆管狭窄) [ 14 ]。 2.5. 另外黄志强 [ 16 ] 将损伤平面和程度结合进行分类 按胆树平面分为3级：I：肝内胆管系统(一般为2级肝管分支及以上平面)；II：围肝门区胆管(一般为胆囊管与肝总管汇合部以上，包括第1级肝管)；III：肝外胆管或胆总管(一般指胆总管，胆总管下端壶腹部损伤作为特殊部位损伤)。根据损伤的程度可分为4级：A：部分性损伤；B：横断性损伤；C：横断性损伤并部分胆管组织缺失[根据手术治疗特点，可以再分为：1) 肝管汇合部完整；2) 肝管汇合部缺失]；D：胆管狭窄(如缝合、钛夹使用不当和缺血或炎症的结果，无明显损伤史，此分类法未将胆囊管夹闭不全引起的胆漏列入胆管损伤的范围。
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user: 3. 胆管损伤的原因 胆管损伤临床上多见于胆道手术，尤其是胆囊切除术。胆囊切除术中胆管损伤的原因是多方面的。 3.1. 术者本身原因 术者的经验、技术、态度至关重要。术者的手术经验的欠缺，操作技术欠规范，对局部解剖常见的变异缺乏正确的判断，盲目操作或动作“潇洒”；思想上对胆管损伤的认识不足或错误认知，致使麻痹大意，失去应有的警惕性，最终导致胆管损伤 [ 17 ]。或是主观上过于追求速度和小切口，术野暴露欠佳；过分自信不能及时中转或不愿意中转开腹手术；另外，由于微创理念的推广，国内广泛开展“日间手术”，在某种程度上削弱了临床医生的风险意识。因此，外科医生在思想上要有高度的认识，经验再充足也不能盲目自信，亦无捷径可走。 3.2. 解剖变异 胆囊变异如胆囊缺如、胆囊重复及胆囊异位 [ 18 ] 等因素显著增加了胆管损伤的几率；胆囊管汇入肝总管的位置极高或极低或汇入十二指肠后位；胆囊管汇入右肝管；胆囊管在汇入肝总管前与之紧密粘连并行；胆囊管过短；存在迷走胆管；存在副肝管；右肝管缺如。 3.3. 胆道出血 胆道手术中突然的异常出血可能导致术者慌忙大块钳夹或缝扎止血，从而造成胆管损伤。 3.4. 病理因素 胆囊周围组织充血、水肿、炎症明显时，将会使在解剖Calot三角、分离粘连、钳夹或结扎胆囊管时难度增加，可导致医源性胆管损伤。Mirizzi综合征、胆囊萎缩纤维化等可引起Calot三角区广泛粘连、瘢痕增生等使彼此关系分不清可能误伤胆总管。
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user: 4. 胆管损伤的处理时机 正确把握手术修复时机是胆管损伤修复成功的前提条件。医源性胆管损伤一经确诊，必须在造成不可逆肝脏损害以前进行手术，应由专科医师联合多学科共同制定个体化治疗方案，精准评估，实施确定性修复手术，最大程度恢复胆道系统的连续性和通畅性，这需要遵循“建立在无炎症、无缺血、无瘢痕的健康胆管之上”及“黏膜对黏膜无张力吻合”的胆道重建原则。根据胆道重建的原则制订术中修复、早期修复和延迟修复的个体化手术方案 [ 13 ]。 4.1. 术中处理 如果在术中发现胆管损伤，不管是何种损伤，均应当紧急行损伤修复，这样对病人的打击最小，修复效果最好，对病人基本不造成严重后果。胆管损伤发现越早，病人的生理病理变化越小，处理也越容易，效果越好。因此术中即时修复损伤胆管被认为是最佳修复时机。因为此时损伤的胆管组织健康无炎症，组织愈合能力强，对于误扎肝外胆管时间较短者拆除缝扎线即可。若结扎时间较长则可留置T管支撑以防坏死或狭窄。已引起胆管壁血运障碍时可切除该段胆管，行胆管端端吻合或胆肠吻合术；肝外胆管撕裂伤小于管径50%者应缝合损伤管壁，并留置T管支撑，以防止修补后的胆管狭窄，T管留置时间应不少于3个月。损伤较大者可行脐静脉、胆囊等修复，并留置T管支撑3~6个月；肝外胆管横断伤可行端端吻合或胆肠吻合术，并留置T管，留置时间应不少于6个月。总之术中发现的胆管损伤，应根据损伤的部位、类型和程度，一期采取相应的修复方式。Tornqvist等 [ 19 ] 研究显示术中一期修复损伤胆管，可以提高病人的预后和延长生命。 4.2. 早期处理 术后早期诊断的胆管损伤(术后24小时以上)应尽早再次手术修复。这时由于组织很脆难以成功修复损伤的胆管，手术主要是针对胆管损伤所造成的并发症，如胆漏、胆汁性腹膜炎或黄疸等，以达到有效引流目的为主。胆漏性胆道损伤引流量少且无腹膜炎表现者，可暂行非手术治疗。引流情况不满意或出现胆汁性腹膜炎表现时，应果断手术探查。有研究认为损伤胆管及周围组织无严重感染时应积极进行早期修复 [ 20 ] [ 21 ]。此时局部组织水肿和炎症反应尚不明显，局部解剖层次相对清晰，局部粘连尚容易分离，损伤的胆管组织相对新鲜，有利于吻合口愈合，可获得满意的长期疗效。钟华 [ 22 ] 等研究显示胆管损伤后经早期修复，预后效果良好。随着胆道外科对胆管损伤治疗经验的积累和相应技术的发展，早期修复理念逐渐确立，进一步提高了胆管损伤的治疗效果 [ 23 ]。 4.3. 延期处理 晚期胆道损伤(术后6天或以上)常表现为胆道狭窄，传统的观念及理论认为胆管损伤后至少需要3个月才可以进行确定性的胆管修复手术，此时胆管壁及损伤周围组织的炎症水肿已消退、胆管缺血范围已可清楚辨认。有研究认为胆管损伤后延期修复损伤胆管可降低术后胆管狭窄的发生几率 [ 24 ]。