system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与讨论 3.1. 头孢他啶与胃蛋白酶的荧光猝灭光谱与猝灭机制 蛋白质中含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等残基而发射较强的荧光。图2显示了胃蛋白酶固定激发波长在276 nm时荧光猝灭光谱，在pH = 1.81的模拟胃环境条件下，固定胃蛋白酶浓度，向其中增加头孢他啶浓度时，可以看到蛋白质中色氨酸在340 nm左右荧光强度逐渐下降，表明了头孢他啶与胃蛋白酶可能发生了相互作用。 荧光淬灭是由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起的荧光强度降低的现象。荧光淬灭的机制主要有静态淬灭和动态淬灭两种，二者都需要荧光发色基团与淬灭剂之间的分子接触 [ 1 ] ，对于动态淬灭，淬灭剂必须在激发态寿命时间内扩散到蛋白质的荧光发色基团，一旦接触，荧光发色基团不发射光子；对于静态淬灭，荧光发色基团和淬灭剂形成了复合物，该复合物不发光。这两种猝灭均符合Stern-Volmer方程 [ 2 ] [ 3 ] ： (1) 式中 和F分别为加入淬灭剂(头孢他啶)前后混合溶液的荧光强度， 为淬灭剂的浓度， 为无荧光猝灭剂时胃蛋白酶的平均荧光寿命，约10 ns数量级， 为双分子碰撞淬灭常数，单位是L/mol/s，它描述了生物大分子与荧光猝灭剂分子之间因分子的扩散作用和彼此碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响， 为，Stern-Volmer淬灭常数，单位是L/mol，且 ，它反映了生物大分子与荧光猝灭剂在动态猝灭过程中彼此扩散和相互碰撞达到平衡时的关系。在温度分别为290，310 K条件下，以 对 作图结果如图3。 由图3(a)可以看出，头孢他啶与胃蛋白酶作用的曲线是向上弯曲的二项式曲线。由图3(b)可以看出，头孢他啶浓度从0.50 × 10 −6 到2.50 × 10 −6 mol/L区间与胃蛋白酶作用的曲线是直线。他们都显现出良好的线性关系，其对应的斜率就Stern-Volmer猝灭常数。从而可以求得由扩散碰撞的动态猝灭常数，所得数据列于表1。 静态猝灭是药物分子与蛋白质分子间形成了不发荧光的复合物而导致的荧光碎灭，且所生成的复合物会随着温度的升高而发生解离，故猝灭常数会随着温度的升高而降低。动态猝灭是药物和蛋白质的激 图2. 头孢他啶与胃蛋白酶的荧光猝灭光谱 图3. 头孢他啶和胃蛋白酶体系的Stern-Volmer方程曲线 Table 1 Stern-Volmer quenching constants for pepsin-CEF system at different temperature T (K) Ksv × 10 5 (L/mol) R Kq × 10 13 (L/mol/s) 290 0.3370 0.9986 0.3370 310 0.3701 0.9976 0.3701 表1. 不同温度下头孢他啶与胃蛋白酶相互作用的猝灭常数 发态分子之间的相互碰撞而导致的荧光碎灭，随着温度的升高，激发态分子之间的相互碰撞更加剧烈，故猝灭常数会随着温度的升高而增大 [ 4 ] 。 随着温度的升高，Stern-Volmer猝灭常数Ksv增大，这表明，头孢他啶和胃蛋白酶之间为动态猝灭。然而不同温度下的表观猝灭常数Kq值均大于最大动态扩散碰撞速率常数2.0 × 10 10 L/mol/s。因此，我们推断头孢他啶和胃蛋白酶荧光猝灭过程主要由静态猝灭体系的形成产生的，而不是由一个动态猝灭过程构成 [ 5 ] 。 3.2. 结合常数及结合位点 在静态猝灭过程中，在静态猝灭中，荧光体的荧光强度与其游离浓度成正比，蛋白质与小分子的结合常数可由荧光体和猝灭剂的结合常数表达式导出 [ 6 ] [ 7 ] ： (2) 其中K是荧光体和猝灭剂的结合常数，n是结合点数。以 对 作图，得到图4，直线斜率代表结合位点数n，直线截距为 。得到以下两式： 290 K (3) 310 K (4) 由(3)式、(4)式可求得结合常数K，见表2，可看出在头孢噻肟钠和胃蛋白酶之间存在强烈的相互作用，同时头孢他啶和胃蛋白酶之间有1~2个结合位点。 3.3. 热力学计算及作用类型 小分子与蛋白质等生物大分子之间的作用力主要包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等。当温度变化不太大时，反应的焓变可看作一个常数。根据方程式(5)、(6)、(7)可分别计算出反应焓变ΔH，吉布斯自由能变ΔG和熵变ΔS。 (5) (6) (7) 上式中K是结合常数，R是摩尔气体常数，由17、37℃两个温度下的结合常数可以计算出头孢他啶和胃蛋白酶相互作用的反应焓变ΔH，吉布斯自由能变ΔG和熵变ΔS，如表3。 生物大分子与小分子间的相互作用的作用力通常有氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等，根据其相互作用的有关热力学参数可以简单判断其相互作用力的类型 [ 8 ] ： 1) 若 且 ，主要表现为疏水作用； 2) 若 且 ，主要表现为静电作用； 3) 若 且 ，主要表现为氢键或范德华力作用。 根据实验结果17、37℃时 ，且 ，表明头孢他啶与胃蛋白酶的结合是一个放热反应，熵增加是该作用过程的主要热力学驱动因素。 ，表明该结合过程是一个自发的过程。因此可以推测在该温度范围内，该体系头孢拉定和胃蛋白酶之间的作用力是静电作用力。 3.4. 同步荧光的构象变化 同步荧光调查的蛋白质构象变化是一个有用的工具，可以提供荧光发色基团附近微环境的变化信息。 图4. CEF和胃蛋白酶体系的双对数方程曲线 Table 2 Biding constants and thermodynamic parameters for pepsin-CEF system at different temperatures， PH = 1.8 T(K) K × 10 6 (L/mol) n R 290 2.7 1.4427 0.9978 310 1.2 1.3490 0.9962 表2. 在PH = 1.81，不同温度下头孢他啶与胃蛋白酶相互作用的结合常数 Table 3 Thermodynamic parameters of CEF with Pepsin at different temperature T(K) ΔG 0 (kJ/mol) ΔH 0 (kJ/mol) ΔS 0 (J/mol/K) 290 −35.705 −30.311 18.6 310 −36.077 −30.311 18.6 表3. 不同温度下头孢他啶与胃蛋白酶相互作用的猝灭常数 固定 和 所作出的同步荧光光谱分别表现为色氨酸残基和酪氨酸残基的光谱特性 [ 9 ] 。色氨酸的最大荧光发射峰位对环境很敏感 [ 10 ] ，所处环境的疏水性降低，其最大发射波长红移，所处环境的疏水性增强，其最大发射波长蓝移。这是研究蛋白质的构象的一种方法。蛋白质的最大发射波长在330~332 nm范围，表明色氨酸残基处于非极性环境中，既完全处在蛋白质的疏水腔内;最大发射波长为342 nm，部分处在疏水环境中，最大发射波长在350~352 nm范围，色氨酸残基暴露于水相中，即蛋白质的疏水腔瓦解，结构较为松散 [ 11 ] 。图5为头孢他啶和胃蛋白酶体系的同步荧光光谱。从图中可以看出，色氨酸残基的荧光强度相对较大(图5(a))，随着头孢他啶浓度的增加，最大发射波长缓慢地红移，荧光强度逐渐减弱；酪氨酸残基的荧光强度较弱(图5(b))，随着头孢他啶浓度的增加，酪氨酸残基的最大发射波长缓慢地红移，荧光强度逐渐减弱。这些结果表明，头孢他啶与胃蛋白酶发生作用时，不仅影响了色氨酸残基的微环境，也影响了酪氨酸残基的微环境，头孢他啶结合到胃蛋白酶的疏水腔中，使色氨酸、酪氨酸残基周围的极性增加，疏水性减小，导致胃蛋白酶的结构松散。 3.5. 头孢他啶与胃蛋白酶作用距离的计算 根据Förster偶极–偶极非辐射能量转移理论 [ 12 ] ，可以求出结合位置与蛋白质分子中发荧光集团之间的距离。能量转移效率E与供体－受体间的距离R和临界距离R 0 的关系为 [ 13 ] [ 14 ] ： (8) 图5. 头孢他啶和胃蛋白酶体系的同步荧光光谱 式中，F 0 为不存在药物时胃蛋白酶的荧光强度；F为胃蛋白酶和药物摩尔比为1:1时胃蛋白酶的荧光强度；R 0 为转移效率为50%的临界距离，被称为Förster距离；R是供体与受体的真实距离，其中， (9) 式中，K 2 为偶极空间取向因子，通常取向因子为供体和受体各向随机分布的平均值 ；N为介质的折射指数，取水和有机物的平均值1.336；Φ为供体的荧光量子产率。 一般来讲，蛋白质作为给体进行荧光共振能量转移的残基只有色氨酸和酪氨酸，而最大荧光峰在344 nm处的能量转移在Pepsin中只有色氨酸残基，其量子产率F以色氨酸为标准物 [ 15 ] ；J为供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分： (10) 式中， 为供体在λ至λ + dλ以波数间隔内的校正荧光强度； 为药物在波长λ处的摩尔吸收系数。图6是头孢他啶与胃蛋白酶物质的量为1:1时，胃蛋白酶的荧光光谱和位点药物的紫外吸收光谱重叠图，发现胃蛋白酶的荧光光谱和位点药物的紫外吸收光谱有一定的重叠。 通过计算处理荧光和紫外数据得光谱的重叠积分J = 6.69 × 10 −17 cm 3 L/mol，依次可求得：R 0 = 1.06 nm，E = 0.30，R = 1.23 nm。从计算结果来看，头孢他啶的结合位点与胃蛋白酶分子中色氨酸残基的距离为1.23 nm。R 0 和R皆小于8 nm [ 16 ] ，说明头孢拉定与胃蛋白酶作用过程中发生了非辐射能量转移，两者形成了复合物，且结合紧密。同时也进一步说明了低浓度下头孢他啶与胃蛋白酶的荧光猝灭属于静态猝灭机理。