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user: 3. 序列分析 3.1. 基因注释 3.1.1. tRNA基因定位及调零 将原始序列缺口补齐后放在tRNAscan-SE网站上搜索，得到15个tRNA基因(见表2)。由tRNA基因排序可知，生物公司给出的原始序列为J链，为了便于注释，首先将序列调零。本实验选择tRNA met 基因为起始基因，因此将补齐后的原始序列的前端1826 bp截取到序列尾部形成一个新序列，即序列调零。 Table 2 The tRNA genes were searched on tRNAscan-S 序号 tRNA 起始 终止 反密码子 得分 1 Ile 1666 1733 GAT 12.3 2 Met 1827 1895 CAT 15.3 3 Trp 3100 3174 TCA 27.0 4 Leu 5011 5077 TAA 18.4 5 Lys 5782 5850 TTT 35.6 6 Asp 5851 5922 GTC 6.9 7 Asn 8232 8297 GTT 11.7 8 Thr 12，140 12，211 TGT 24.9 9 Ser 14，077 14，145 TGA 13.8 10 Pro 12，281 12，214 TGG 12.5 11 His 10，401 10，337 GTG 14.9 12 Phe 8615 8548 GAA 17.1 13 Tyr 3398 3333 GTA 15.5 14 Cys 3271 3203 GCA 1.8 15 Gln 1977 1909 TTG 29.6 表2. 在tRNAscan-SE上搜索得到的tRNA基因 3.1.2. tRNA二级结构 tRNA的二级结构一般由氨基酸接受臂、TΨC臂、TΨC环、反密码子臂、反密码子环、二氢尿嘧啶臂、二氢尿嘧啶环，及一个多变的额外环组成(见图2)，有时某些tRNA会缺少二氢尿嘧啶臂。通常，这些tRNA都能形成倒L型的三级结构，一般反密码子臂和氨基酸接受臂比较保守，而二氢尿嘧啶臂、TΨC臂变异性较高，存在一些错配的情况。本文统计了搜索到的15个tRNA的二级结构(见图3)。 图2. tRNA二级结构模式图 图3. 在tRNAscan-SE上搜索得到的tRNA基因二级结构 由图3可知，tRNA Ile 、tRNA Thr 、tRNA Gln 基因的氨基酸接受臂均发生了U-U错配(红色箭头标出)。 3.1.3. 相近种的线粒体基因组全序列获取及比对 为定位其它的tRNA基因、蛋白质基因和rRNA基因，从NCBI网站上用BLAST功能进行相似性搜索并选择相似性最高的序列。本研究从NCBI中选择了编号KT266831的双齿多刺蚁Polyrhachis dives的线粒体基因组全序列作为参考，用ClustalX(1.83)软件将其蛋白质基因、rRNA基因和7个tRNA基因(tRNA Gly 、tRNA Ala 、tRNA Arg 、tRNA Ser (TCT) 、tRNA Glu 、tRNA Leu 、tRNA val )截取保存。然后将西藏粗角猛蚁调零后的线粒体NDA序列导入ClustalX(1.83)软件中，再分别添加之前保存的双齿多刺蚁各基因序列进行比对，从而逐个确定西藏粗角猛蚁线粒体基因组其它的基因位置和序列，并最终得到其线粒体基因组注释结果(见表3)。 Table 3 The mitochondrial genome annotation of Cerapachys xizangensi 基因 N/J链 基因位置 基因长度(Bp) 反/起始 密码子 终止 密码子 基因间隔区(bp) tRNA-Met tRNA-Gln ND2 tRNA-Trp tRNA-Cys tRNA-Tyr COI tRNA-Leu COII tRNA-Lys tRNA-Asp ATP8 ATP6 COIII tRNA-Gly ND3 tRNA-Ala tRNA-Arg tRNA-Asn tRNA-Ser tRNA-Glu tRNA-Phe ND5 tRNA-His ND4 ND4L tRNA-Thr tRNA-Pro ND6 Cytb tRNA-Ser ND1 tRNA-Leu lrRNA tRNA-Val srRNA CR(A+T) tRNA-Ile J N J J N N J J J J J J J J J J N J J J J N N N N N J N J J J N N N N N J 1~69 83~151 289~1192 1274~1348 1377~1445 1507~1572 1630~3165 3185~3251 3252~3935 3956~4024 4025~4096 4097~4258 4265~4927 4936~5718 5795~5863 5873~6214 6237~6298 6346~6403 6406~6471 6494~6558 6578~6632 6722~6789 6837~8510 8511~8575 8650~9996 10，022~10，309 10，314~10，385 10，388~10，455 10，476~11，012 11，091~12，190 12，251~12，319 12，388~13，341 13，341~13，412 13，418~14，824 14，850~14，914 14，918~15，764 15，765~16，608 16，609~16，676 69 69 904 75 69 66 1536 67 684 69 72 162 663 783 69 342 62 58 66 65 55 68 1674 65 1347 288 72 68 537 1100 69 954 72 1407 65 847 843 68 CAT TTG ATA TCA GCA GTA ATG TAA ATA TTT GTC ATA ATA ATG TCC ATT TGC TCG GTT TCT TTC GAA ATT GTG ATG ATT TGT TGG ATG ATG TGA ATA TAG TAC GAT T TAA TAA TAA TAA TAA TAA TAA TAA TAA TAG TA TAA 13 137 81 27 61 57 19 0 20 0 0 6 8 76 9 22 47 2 22 19 89 47 0 74 25 4 2 20 78 60 68 -1 5 25 3 0 0 93 表3. 西藏粗角猛蚁线粒体基因组注释 3.1.4. 蛋白质基因翻译结果 西藏粗角猛蚁的13个蛋白质基因均是典型的ATN起始密码子，大多数蛋白基因以完全终止密码子ATT结尾，只有ND2基因以T，Cytp基因以TA作为不完全终止密码子，而ND6以TAG作为终止密码子。本文用MEGA4.1软件选择invertebrate mitichondrial密码子对13种蛋白质进行翻译(见表4)。 Table 4 Translation results of protein gen 基因 蛋白质一级结构 ND2 CO1 CO2 ATP8 ATP6 CO3 ND3 ND5 ND4 ND4L ND6 Cytb ND1 MFYFYMIMLMLMLTSVFSLFLNNMLTIWFLMEINNFIFLFYLSLFMKNKKMIFLYFFIQIMSSLVLILFLL INFYTFLNNNYLTSIFLFFSLLLKLGVPPLHFWMPLISMYMNWNMITVFFTLQKIIPLIFISLTNTPSIIYFTI ISLCMIIPPIFMINNNNFKKLLAYSSINQMGWMILLIMISPIMWFLYMVIYSLSLYIITSFMKLKNIKANL WIKMNSSMKLIIMLMMLNMSGLPPFTFFIMKWYTIFLFISQMNFNIILIIMLLSSLILMYIYMNMIIKISL FYSTNLKLMNLTYQ MIKWMYSTNHKDIGILYFIFALWAGMIGSSMSMIIRMELGTCGMMITSDQIFNILVTSHAFIMIFFMV MPFMIGGFGNFLVPLMLGAPDMAYPRMNNMSFWLLPPSLTLLIMSNFISSGAGTGWTIYPPLASSTF HSGPSVDFTIFSLHIAGMSSILGAINFISTIMNMYHKNMSMDKIPLLVWSIMITAILLLLSLPVLAGAITM LLTDRNLNTSFFDPSGGGDPILYQHLFWFFGHPEVYILILPGFGLISHIITNESGKKETFGSLGMIYAIMAI GFLGFIVWAHHMFTIGMDVDTRAYFTSATMIIAIPTGIKVFSWITTLHGVKINHSPSPALLWSMGFVFL FTMGGLTGIMLSNSSIDIILHDTYYVVAHFHYVLSMGAVFSIIASFIHWYPLITGYTLNNYYLFSQFFTMF IGVNLTFFPQHFLGLSGMPRRYSDYPDAFLFWNIISSIGSMISIISLIYLIFILWESLASKRKIISMFYLSSSLE WTSSCPPANHSYNEVPAV MNTWMFTMQNSNSPIFDLMIWFHDTTMAILIFITLMISYMMIIISCNLFTNRFLLQGHSIELIWTIAPIFI LIFIAIPSLKILYLSDDTCSSKLTIKTIGHQWYWSYEYSDFLNIQFDSFMINTSTLTPYEFRLLDVDNRCVLP FQLNIRILTTSVDVIHSWTVPSLGIKMDSTPGRLNQCHLHMYRPGLFFGQCSEICGINHSFMPIVIESTS FSYFKIWLNLQQS MPQMKPMIWLLFLILTIILLLALVILLYYFFIPHPPKSLTTLIKKIKYYKYRW MTNIFSIFDPSTSLNCSLNWLSLLIIFILAPYTYWLEPSRYIMFWWLSISYIMKEFKILLKYSYSNLIIFISLFL MIIVNNFLGLFPYIFTASSHMSICLSLSLTMWLGTMIYSIVNHSNNFCSHMTPQGTPYILMPFMVMIETI SLFIRPLTLAIRLTANMIAGHLLLSLLGSSGEMINMHFVPLLISLEILLFTLELAVSIIQAYVFSILSTLYSSEI MTKYHHPFHLVTPSPWPLLTSLSIFNNLITTIAWMHKMNYSFVFTIPATLLCSLLWWQDIVREATFSGS HTKQVYSIMRLGMILFILSEIFFFISFFWAYFHSSLSPTIEIGQLWPPLGINPFNPYSIPLLNTIILISSGLTITW SHHSMLMSNFYESKKSLMISISLGVYFSYIQLTEYIESPFTMADSVYGSTFFIATGFHGLHVIIGTSFLLVC LWRLSFLHFSPTHHFGFEAAAWYWHFVDVVWLFLYMSIYWWGY ILLFSMVIVLLPILMMLMNLSLSKKKNYNYEKMSPFECGFDPLSKSRLPFSIQFFMISLIFLIFDIEIALLIPLIL LMKKFSLTLIFTSLFFLLILLLGLLYEYTEKSLEWKI IYKLIFYSYVLFLLFIMNMFFSMYLYMMSKDFLIEWVIYSVNSVMMEMYVLLDWISLLFISFVLMISSMV VLYSVIYMKSDKFLERFMYLLLLFILSMLMMILSPNLISILLGWDLLGLVSYCLVIFYQNYSSFNSGMVTV LSNRIGDVGILLSIGVSLMYGSWNIYLLENKVLLFSMILLGAITKSAQMPFSTWLPMAMAAPTPISSLVH SSTLVTAGVYLIIRFNNFIMSTKLNFVLLYLSVLTMLMSGIMALCEFDLKKIIALSTLSQLGLMMMILSMG LKLLGLYHLLTHAIFKSLLFLCAGILIHLSKGNQDIRCFGNFSDMLPFVNMSFFISILSLMGMPFFSGFYSK DLIMEMLFIKEVNLVMMSLILVSLSFTVFYSLRLYYFLYFNELKLESSVMVSENWLMNISMMFLMIFSVII GSLLNWLFFFDFSIIYLSVFVKMMSLFFLFLGALSWGLSVMLIKVLYMKSTIVVCSSMWFLNYFHYCMN IFFITFSEYFKLVDLEWVENISGKFSVKVKINTMKFYYSSYKLYNIIYSQMFMILFMYFILMN MMKIFMMIIFMLVMIYYNMMIMFYMNLCFIVVFFMFFYFSISAGDYLGALSLYFGGDSYTFFMMMLS FWVVGLMFMTLLFENVSKMKLFMFNMMLLILVMFFSVYNLMLLYFFFEVSLIPTFFIVLFWGGNLERLE AGLYLMLYMLFISFPLLIYIMKIYWCSSSLDMSILSILVFNSMDKTVGSWEFLVMFGAFFIKLPIYLFHIWL PKAHVEAPVFGSMLLAAVLLKLGGYGLLRMMLMFIYSCQIYKNMVLSLGIMGALFVSVLCLTQVDMK SLVAYSSVVHMNFMLCAMLVLSKFSFMGSYIVMVSHGLCSSGLFFFVNVFYKRSFSRLISLNKGLISLM PSIGFWWFLLCVSNFSFPLSLNFLGEVMLIMMILNWGGEIFVFFIGLISFFSGAYSLYLFSVVYHGDIYYE QKIDMGFLSEHLVGFLHYFPLILLFLNLYMYTY IFFDLYFYLYLSLIAVGFLLIGVKYFLLLLIMMEMIIMNIAMFMYCVFLSSGLESVFIYYLVFSVCESVMGLV ILVLVIRYYGDDYYKSVSLVKF MTNNLMILSLIWGMSLLMILIILTNLIHPSLMIMMMLMFNSLLCLNMNFWKSSLILPIIFFLIMVSGVLIIF LYFSSLISNEKIFPQVNLLSLMIFFINLLLMNLVNLYYFYSPPMDYIDHESLHTLKNYNNFMNSMMMLY KYPWSNLTLMSMIYLLIVLISTIKICSPKNKTMRKLQ MNKMLKTANSTLLNLPTPINISYWWNYGSLLGLFLMIQLISGTLLSMHYCPSTTHAFMSIIHIIQNVNQ GWLLHNIHINGASMFFICIYIHMGRGMYYHSFNLKKTWMVGTTIFALSMATAFLGYVLPWGQMSFW GATVITNLVTTTPYVGTMIVEWLWGGFAISNSTLNRFFSFHFLLPFIIIMMIILHLYFLHETGSKNPLGVN SNLYKIPFHIYFTIKDILGFLLFLMFFMMINLQYPYFFSDPDNFTQANPMITPTHIQPEWYFLFAYAILRAI PNKLGGVLALILSIMILYTQSWNKYFMGSNQFYPINQLLFWMFINTFVLLTFSGAQIIEFPYTNISQMLS FTYFIYFLLIHYTSMLWD MMINLLIYFMMNLCSVLMVVIFVLVGVAFLTLLERKILSYLQLRKGPNKLGMVGIFQPFSDAIKLFTKEG LVILKSNYYIFYLCPMVFMFSMLFSWFLIPWFTNVYFMNYSLLFMFILMSLSGFMLLMMGWSSNSMFS LMGAVRFVAQSISYEVSFLLIIYCFMLLSESYSLSMLGVWQKYVWNIVFLFPIFVIFFISVLAEMNRSPMD LIEGESELVSGFNIEYFGGSFALIFMAEYGMIIFFSFIMGLIFFKVNTCGGFIFILMLFMILIIFMRGIMPRMR YDELMQLCWKVILPLVLIYLIILISFKFILLVIF 表4. 蛋白质基因翻译结果 3.2. 蛋白质编码基因相对同义密码子使用 蛋白质编码基因相对同义密码子使用(Relative Synonymous Codon Usage， RSCU)，是指对于某一特定的密码子在编码对应氨基酸的同义密码子间的概率，它除去了氨基酸组成对密码子使用的影响。理论上，如果没有选择压力，所有同义密码子的使用频率应该是相同的，即RSCU应该等于1，当某一密码子的RSCU大于1时，说明该密码子为使用较多的密码子，反之亦然。本研究用MEGA4.1软件统计了13种蛋白质基因的序列(终止密码子除外)，总共10，938 bp，然后计算了它们的RSCU (见表5)。 Table 5 Frequency statistics of relative synonymous cod on usag 密码子(aa) 数量 RSCU 密码子(aa) 数量 RSCU 密码子(aa) 数量 RSCU UUU(F) 296 1.63 UCU(S) 72 1.61 UAU(Y) 142 1.42 UUC(F) 67 0.37 UCC(S) 39 0.87 UAC(Y) 58 0.58 UUA(L) 296 3.18 UCA(S) 82 1.84 UAA(*) 0 0 UUG(L) 56 0.6 UCG(S) 14 0.31 UAG(*) 0 0 CUU(L) 66 0.71 CCU(P) 54 1.79 CAU(H) 44 1.19 CUC(L) 39 0.42 CCC(P) 38 1.26 CAC(H) 30 0.81 CUA(L) 91 0.98 CCA(P) 25 0.83 CAA(Q) 42 1.58 CUG(L) 11 0.12 CCG(P) 4 0.13 CAG(Q) 11 0.42 AUU(I) 328 1.51 ACU(T) 71 1.81 AAU(N) 134 1.58 AUC(I) 90 0.43 ACC(T) 17 0.43 AAC(N) 36 0.42 AUA(M) 259 1.74 ACA(T) 64 1.63 AAA(K) 97 1.6 AUG(M) 38 0.26 ACG(T) 5 0.13 AAG(K) 24 0.4 GUU(V) 82 1.9 GCU(A) 28 1.18 GAU(D) 40 1.36 GUC(V) 23 0.53 GCC(A) 30 1.26 GAC(D) 19 0.64 GUA(V) 55 1.27 GCA(A) 31 1.31 GAA(E) 51 1.34 GUG(V) 13 0.3 GCG(A) 6 0.25 GAG(E) 25 0.66 UGU(C) 30 1.58 CGU(R) 12 1.14 AGU(S) 24 0.54 UGC(C) 8 0.42 CGC(R) 2 0.19 AGC(S) 7 0.16 UGA(W) 78 1.81 CGA(R) 20 1.9 AGA(S) 86 1.93 UGG(W) 8 0.19 CGG(R) 8 0.76 AGG(S) 33 0.74 GGU(G) 35 0.84 GGA(G) 64 1.53 GGC(G) 22 0.53 GGG(G) 46 1.1 表5. 相对同义密码子使用频率统计 3.3. 基因重排 果蝇Drosophila yakuba为第一个被测序的昆虫线粒体基因组 [ 16 ] ，一般将果蝇的线粒体基因排列作为昆虫线粒体基因的模式排列(见图4)。随着分子生物学研究的逐步深入与成熟，越来越多的昆虫线粒体基因组被测序，基因重排事件也不断被发现，其中以tRNA基因重排为主，同时还存在着基因的重复 [ 17 ] - [ 22 ] 。基因重排事件主要有四种形式包括基因移位、基因洗牌、倒置和异位倒置，其中CR-ND2、ND2-COI、COII-ATP8、ND3-ND5是基因重排的热点区域 [ 23 ] [ 24 ] 。本研究中的西藏粗角猛蚁发生两处基因重排，即发生在CR-ND2区的基因洗牌和ND3-ND5区的基因倒置(见图5)。 图4. 昆虫线粒体基因组原始排列(推测) 图5. 基因重排示意图