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user: 3. 结果与分析 3.1. 单因素试验 3.1.1 . 微波时间对菌丝体多糖提取的影响 固定料液比1:20，微波强度400 W，浸提温度45℃，浸提时间30 min，微波时间对菌丝体多糖的提取有一定的影响(图1(a))。在试验微波时间范围内多糖得率呈现先升后降趋势，在微波时间30 s时，多糖得率最大可达2.11%。由于微波加热升温极其迅速，处理时间过短，多糖溶解不充分；处理时间过长，多糖会受热分解，因此选用30 s作为最佳的微波时间。 图1. 单因素对多糖得率的影响 3.1.2. 料液比对菌丝体多糖提取的影响 固定微波强度400 W，浸提温度45℃，浸提时间30 min，微波时间30 s，料液比对菌丝体多糖提取的影响如图1(b)所示。随着料液比的增大，菌丝体多糖得率逐渐提高，当料液比在1:20时，多糖得率达到最大，为3.18%。料液比较低时，多糖溶解不充分；当料液比增大后，多糖虽能充分溶胀，但由于溶液体积的增加，微波对菌丝体的作用效果下降，多糖得率随之降低。确定1:20为最佳料液比。 3.1.3 . 浸提时间对菌丝体多糖提取的影响 固定微波强度400 W，浸提温度45℃，微波时间30 s，料液比1:20，浸提时间对菌丝体多糖提取的影响如图1(c)所示。在试验浸提时间范围内，多糖得率呈现先上升后下降的总体趋势，在浸提时间为30 min时，多糖得率达到最大值，为2.37%。多糖的浸出过程与时间密切相关，时间过短，多糖溶解不充分；时间过长，会引起产物结构的变化进而使提取率降低 [ 16 ] 。确定30 min为最佳浸提时间。 3.1.4 . 微波强度对菌丝体多糖提取的影响 固定浸提温度45℃，微波时间30 s，料液比1:20，浸提时间30 min，微波强度对菌丝体多糖的提取有一定的影响(图1(d))。在试验微波强度范围内，随着微波强度的增大，多糖得率也随之迅速增大，在强度为480 W时多糖得率达到最大值；但当微波强度进一步提高时，多糖得率又急剧下降。微波强度过大，溶液中分子震荡加剧，温度急剧升高，多糖部分分解从而造成多糖的损失。选用480 W为最佳微波强度。 3.1.5 . 浸提温度对菌丝体多糖提取的影响 固定微波时间30 s，料液比1:20，浸提时间30 min，微波强度480 W，浸提温度对菌丝体多糖提取的影响如图1(e)所示。在试验设定的浸提温度范围内，随着浸提温度的升高，多糖得率逐渐增加；当浸提温度高于35℃时，多糖的得率又随温度的升高而下降。伴随温度的升高，原料溶胀度增大，传质强化，从而使多糖溶出率增加；但由于多糖是活性物质，温度过高易破坏其结构 [ 16 ] ，从而使多糖得率下降。选用35℃为最佳浸提温度。 3.2. 响应曲面法优化菌丝体多糖提取工艺 在单因素试验基础上，采用中心组合试验Box-Behnken设计方案，微波时间(s)、料液比(mg/mL)、浸提时间(min)、微波强度(W)和浸提温度(℃)，分别用A、B、C、D和E表示，并以+1、0和−1分别代表变量的水平，响应值Y为菌丝体多糖得率(%)，试验自变量因素及水平编码详见表1，试验设计方案及结果见表2。 表2共46个试验点，其中41个为析因点，5个为零点。析因点为自变量取值在A、B、C、D和E所构成的顶点，零点为区域的中心点，其中零点试验重复5次，用以估算试验误差。 利用Design-Expert 7.0软件对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到菌丝体多糖得率(Y)对微波时间(A)、料液比(B)、浸提时间(C)、微波强度(D)和浸提温度(E)的二次多项回归模型为： Y = 6 . 32 + 0.0 69A + 0. 17B + 0. 53C + 0. 34D − 0. 11E − 0. 13AB + 1 .0 6AC − 0. 64AD − 0. 37AE + 1 . 45BC             + 0. 12BD + 0. 47BE − 0. 48CD + 0. 84CE + 0. 32DE − 1 . 31A 2 − 1 . 48B 2 − 1 . 24C 2 − 1 . 6 0 D 2 − 0. 96E 2 . 对模型方程进行显著性检验(表3)，模型的F = 1.94，p > 0.05，表明回归模型不显著；矢拟项F = 83.04，p < 0.0001，极显著。由于回归系数R 2 = 0.998，所以实际值与预测值具有高度相关性，这表示模型和实验值拟合良好，具有99.8%数据拟合，试验方法的可信度较高，此模型能够对撕裂蜡孔菌多糖的提取率进行准确的预测与分析。模型一次项A、B、C、D和E对Y影响不显著；二次项A 2 、B 2 、D 2 和E 2 对Y影响显著，C 2 不具显著性；交互项对Y均不具显著性影响，因此各个具体试验因子对Y值的影响不是简单的线性关系。 根据一次项F值，试验5个因素对菌丝体多糖提取的影响程度大小依次是浸提时间(C) > 微波强度(D) > 料液比(B) > 浸提温度(E) > 微波时间(A)。 图2为各因素交互作用的曲面图，表示某一因素取零水平时，其余两因素对菌丝体多糖提取的影响。从响应面分析图上可看出最佳参数以及各参数之间的相互作用。等高线可直观反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不明显，而曲率半径较大的椭圆表示两因素交互作用显著，且曲率半径越大，交互作用越显著 [ 17 ] 。 通过Design expert 7.0软件分析得到撕裂蜡孔菌菌丝体多糖的最优提取条件为：微波时间32.27 s、料液比1:24.17、浸提时间36.56 min、微波功率480.49 W、浸提温度37.89℃。为了操作方便，修正最佳提取条件为微波时间30 s、微波功率480 W、液料比1:20、浸提时间30 min、浸提温度35℃。测得撕裂蜡孔菌多糖提取率为6.437%，与理论预测值6.523%基本一致。表明所得模型可以较好的预测撕裂蜡孔菌多糖的提取情况。 3.3. 菌丝体多糖体外抗氧化活性 羟自由基是活性氧中毒性最强的氧自由基，可造成有机体中生物大分子物质的氧化性损伤，使细胞坏死。在试验浓度范围内，菌丝体多糖对羟自由基有一定的清除作用，清除效果与多糖浓度呈正相关。当浓度为1 mg/mL时，清除率可达60.74%；但与同浓度抗氧化剂Vc相比，清除率较低(图3(a))。 菌丝体多糖对过氧化氢也表现出一定的清除能力(图3(b))，且清除能力随浓度的增加而增加，当多糖浓度为1 mg/mL时，清除率达44.46%，为0.2 mg/mL浓度时的4.16倍，但明显低于Vc的清除能力。 多糖的还原能力与其抗氧化性之间存在相关性，多糖通过自身的还原能力给出电子而清除自由基。还原力越强，抗氧化性越强 [ 18 ] 。菌丝体多糖还原力随浓度的升高而增强，但远远低于同浓度Vc的还原能力(图3(c))。 菌丝体多糖对蛋黄脂质过氧化表现出较高的抑制效果(图3(d))，显著高于同浓度Vc。当多糖浓度为1 mg/mL时，抑制率可达82.23%，比Vc增加了29.70%。 Table 1 Independent variables and levels in Box-Behnke 水平 A微波时间 (s) B料液比 (mg/mL) C浸提时间 (min) D微波强度 (W) E浸提温度 (℃) −1 20 1:10 20 320 25 0 30 1:20 30 480 35 1 40 1:30 40 640 45 表1. Box-Behnken设计的因素及水平编码 Table 2 Design matrix and responses values of polysaccharide yield in myceliu 试验编号 A B C D E Y (%) 1 −1 0 0 0 −1 5.782 2 0 0 0 0 0 6.184 3 0 0 0 0 0 6.461 4 −1 1 0 0 0 3.676 5 0 0 0 0 0 6.533 6 1 0 −1 0 0 1.996 7 0 0 0 1 1 6.342 8 0 0 1 −1 0 4.648 9 0 0 1 0 1 6.509 10 0 0 −1 −1 0 4.141 11 0 −1 0 1 0 3.222 12 1 0 0 1 0 2.873 13 0 0 0 0 0 6.237 14 0 −1 0 0 1 2.156 15 1 0 0 −1 0 4.098 16 −1 0 0 1 0 3.854 17 0 −1 −1 0 0 4.833 18 0 0 1 0 −1 3.562 19 −1 0 0 −1 0 2.504 20 0 1 0 1 0 3.418 21 −1 0 −1 0 0 2.586 22 0 0 0 0 0 6.131 23 −1 0 0 0 1 3.112 24 0 0 0 −1 1 2.758 25 1 0 0 0 1 2.193 26 −1 −1 0 0 0 4.618 27 0 0 0 1 −1 3.854 28 0 1 0 −1 0 2.573 29 0 0 0 −1 −1 1.533 30 1 0 1 0 0 6.452 31 0 1 0 0 −1 4.781 32 1 0 0 0 −1 6.351 33 −1 0 1 0 0 2.815 34 0 0 −1 1 0 4.155 35 0 1 1 0 0 5.484 36 0 −1 0 0 −1 3.657 37 1 −1 0 0 0 3.781 38 0 1 0 0 1 5.149 39 0 0 −1 0 −1 2.954 40 0 −1 1 0 0 2.002 41 0 −1 0 −1 0 2.845 42 1 1 0 0 0 2.312 43 0 0 −1 0 1 2.523 44 0 1 −1 0 0 2.506 45 0 0 0 0 0 6.366 46 0 0 1 1 0 2.758 表2. 试验设计方案及菌丝体多糖得率测定值 Table 3 Variance analysis of the regression mod 方差来源 平均和 自由度(df) 均方 F值 Prob > F 显著性 A 0.077 1 0.077 0.045 0.8339 B 0.48 1 0.48 0.28 0.5993 C 4.55 1 4.55 2.66 0.1154 D 1.81 1 1.81 1.06 0.3142 E 0.19 1 0.19 0.11 0.7435 AB 0.069 1 0.069 0.041 0.8420 AC 4.47 1 4.47 2.61 0.1188 AD 1.66 1 1.66 0.97 0.3345 AE 0.55 1 0.55 0.32 0.5747 BC 8.44 1 8.44 4.93 0.0357 BD 0.055 1 0.055 0.032 0.8595 BE 0.87 1 0.87 0.51 0.4817 CD 0.91 1 0.91 0.53 0.4736 CE 2.85 1 2.85 1.67 0.2086 DE 0.4 1 0.4 0.23 0.6336 A 2 15.04 1 15.04 8.78 0.0066 * B 2 19.07 1 19.07 11.14 0.0026 * C 2 13.33 1 13.33 7.79 0.0099 D 2 22.29 1 22.29 13.02 0.0013 * E 2 8.07 1 8.07 4.71 0.0396 * 残差 42.8 25 1.71 失拟项 42.67 20 2.13 83.04 < 0.0001 ** 纯误差 0.13 5 0.026 总误差 109.25 45 模型 66.45 20 3.32 1.94 0.0586 不显著 表3. 回归模型方差分析 注： ** 表示差异极显著(P < 0.01)， * 表示差异显著(P < 0.05)。 ** significant at 0.01 level， * significant at 0.05 leve1。 图2. 多糖得率的响应曲面 图3. 菌丝体多糖的抗氧化活性 超氧阴离子( O 2 − )是弱的氧化剂，其能在有机体内通过歧化等反应产生羟自由基、过氧化物、单线态氧等，对细胞膜和DNA造成损害 [ 19 ] [ 20 ] 。由图3(e)可知，菌丝体多糖对超氧阴离子自由基的抑制作用较为明显，随糖浓度的增加而增强。当糖浓度为1 mg/mL时，抑制率可达85.65%，仅比同浓度的Vc低8.84%。