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user: 5. PGCCs功能 5.1. PGCCs具备胚胎样干性 5.1.1. PGCCs是卵裂球等价物 在胚胎植入前胚胎的卵裂球阶段，由于失败的有丝分裂/细胞分裂和核内复制而导致的巨细胞形成是很常见的。通过光学显微镜、扫描电镜或三维共聚焦扫描显微镜观察，从形态学上看，来自PGCCs的早期球状体与卵裂球、多倍体卵裂球、卵裂球致密融合样胚胎、桑葚胚和囊胚等阶段的人类胚胎难以区分(图1)。 在胚胎发生过程中，单核或多核巨卵裂球通常被认为是由于频繁的有丝分裂/细胞分裂失败和核内复制，而有丝分裂或细胞分裂失败可能代表一种正常的机制调节胚胎植入前胚胎的发育 [ 1 ] [ 11 ]。 与卵裂球相似，PGCCs可以向三个胚层分化。N Niu等在卵巢癌细胞系Hey和SKOV3中研究了甲胎蛋白(AFP)、平滑肌肌动蛋白(SMA)和β3-tubulin(也称为PAX6)的激活动力学，分别是内胚层、中胚层和外胚层的标记物。在Hey细胞中，从PTX处理的第一天开始，AFP和SMA的mRNA水平增加，在第21天达到顶峰，在第28天减少，这时PGCCs衍生的子细胞已经形成。相比之下，在此期间，PAX6的mRNA水平保持相对不变。这三种标记的蛋白质水平，Hey-PGCCs表达最高，而Hey-PGCCs子细胞要比普通Hey高得多。与普通SKOV3和子细胞相比，在SKOV3的PGCCs中，SMA和β3- tubulin的蛋白质水平更高。然而，在SKOV3的mRNA或蛋白质水平上，AFP的表达没有变化。故N Niu等提出PGCCs代表的是卵裂球等价物，这是迄今为止报告的最原始的癌症干细胞，这揭示了一种体细胞中进化上保守的古老的胚胎程序，可以被去抑制为肿瘤发生，这也为癌症的起源和疾病的复发提供了一个新的范例 [ 1 ]。 图1. 癌症起源与复发的卵裂球模型示意图 在胚胎发生过程中，单核或多核巨卵裂球通常被认为是由于频繁的有丝分裂/细胞分裂失败和核内复制，而有丝分裂或细胞分裂失败可能代表一种正常的机制调节胚胎植入前胚胎的发育 [ 1 ] [ 11 ]。 与卵裂球相似，PGCCs可以向三个胚层分化。N Niu等在卵巢癌细胞系Hey和SKOV3中研究了甲胎蛋白(AFP)、平滑肌肌动蛋白(SMA)和β3-tubulin(也称为PAX6)的激活动力学，分别是内胚层、中胚层和外胚层的标记物。在Hey细胞中，从PTX处理的第一天开始，AFP和SMA的mRNA水平增加，在第21天达到顶峰，在第28天减少，这时PGCCs衍生的子细胞已经形成。相比之下，在此期间，PAX6的mRNA水平保持相对不变。这三种标记的蛋白质水平，Hey-PGCCs表达最高，而Hey-PGCCs子细胞要比普通Hey高得多。与普通SKOV3和子细胞相比，在SKOV3的PGCCs中，SMA和β3- tubulin的蛋白质水平更高。然而，在SKOV3的mRNA或蛋白质水平上，AFP的表达没有变化。故N Niu等提出PGCCs代表的是卵裂球等价物，这是迄今为止报告的最原始的癌症干细胞，这揭示了一种体细胞中进化上保守的古老的胚胎程序，可以被去抑制为肿瘤发生，这也为癌症的起源和疾病的复发提供了一个新的范例 [ 1 ]。 5.1.2. PGCCs Xist表达缺失 胚胎干性的另一个公认特征是Xist表达缺失，Xist基因的非编码性RNA是哺乳动物细胞中X染色体失活过程的关键性起始物，Xist表达通常与体细胞的分化状态有关。N Niu等发现Xist表达在紫杉醇处理的卵巢癌细胞系Hey和MDA-HGSC-1形成的PGCCs中丢失，并在PGCCs衍生的子细胞中重新获得，进一步支持PGCCs获得胚胎干性 [ 1 ]。 5.1.3. PGCCs干细胞标记的表达 N Niu等 [ 1 ] 将卵巢癌细胞系(HEY、SKOV3和MDA-HGSC-1)采用PTX诱发有丝分裂的失败。在第7天(球状体第1天(sD1))，PGCCs用三维(3D)培养，或者转移到干细胞培养基中，以生长成球状体。从sD1到sD21，球状体在不同的时间点被收集，并固定用以免疫荧光和免疫组织化学染色(IHC)。在sD14，球状体被重新附着在盖玻片上，并在分化培养基中培养14天。在sD28，细胞分化通过免疫荧光和IHC进行评估。在sD1，在HEY-PGCCs被转移到无血清干细胞培养基中培养超过14天。SSEA1的表达在sD1被激活，在sD7中被限制在核或胞质，并在sD14减少。OCT4表达在sD3激活，并在sD14，在PGCCs核中被激活。SOX2和NANOG的表达在sD1被激活。MDAHGSC-1的PGCCs的OCT4、NANOG、SOX2和SOX4表达都有所增加。WB表明，在HEY衍生的PGCCs中，OCT4和NANOG的表达是从sD1上调，在sD14上达到顶峰，在sD21当PGCCs开始出芽时几乎消失。在HEY衍生的PGCCs中，SOX2的表达从sD7上调，在sD14上达到峰值，然后sD21在子细胞开始出现时略微减少。在SKOV3的PGCCs中也观察到类似的表达方式。 并且N Niu等 [ 1 ] 推理，应该能够观察到化疗后患者的卵巢癌中进行的去分化。他们检查了在化疗前后获得的人类卵巢癌的配对标本。尽管化疗前的标本具有相对同质的细胞，但化疗后的标本中PGCCs和具有巨大奇异形核的细胞数量增加了。化疗后的标本中可以看到小的子细胞从一个PGCC出芽和在PGCC细胞质中的红细胞状胞体。出芽子细胞的细胞核区域比化疗前的癌细胞要小得多。在化疗后，38个样本中有3个OCT4呈阳性(在细胞质和细胞核中)，有12个NANOG呈阳性(主要在细胞质中)，有17个SOX2 (主要是细胞核)呈阳性，在化疗之前，没有任何病例对OCT4或NANOG呈阳性，38个病例中只有2个SOX2是阳性的(主要在细胞质中)。在化疗后有三个病例观察到YAP的核定位。这些发现表明，癌细胞在化疗后表现出胚胎干细胞标记的表达增加。而且在化疗前，Xist在癌细胞和基质细胞的细胞核中强烈的表达，但在化疗后PGCCs细胞核中大量丢失，进一步支持了PGCCs获得胚胎干性的观念 [ 1 ]。 5.2. PGCCs可进行多向分化 5.2.1. PGCCs的分化能力取决于YAP的核位置 YAP是一种重要的Hippo途径蛋白，它参与了干细胞和癌症发展的调节，并负责肿瘤抑制途径细胞分裂失败诱导的激活。N Niu等 [ 1 ] 研究了YAP在对PGCCs的干性和分化的调节中所起的作用。卵巢癌细胞系Hey用紫杉醇处理以后，发现YAP主要位于HEY及其子细胞的细胞质中，但主要集中在PGCCs的细胞核中。用多巴酚丁胺来处理PGCCs，它能抑制YAP核转录，消除YAP的核定位。由HEY衍生的PGCCs可以分化成内胚层(由AFP、c-Kit和CXCR4表达标记)及类似于星形胶质细胞的细胞(由GFAP表达标记)，但是多巴酚丁胺抑制了这种分化 [ 1 ]。 5.2.2. 多向分化 人类癌症由上皮癌细胞和多种良性细胞组成，包括成纤维细胞、内皮细胞、肌上皮细胞、炎症细胞和红细胞共同形成基质。这些基质细胞在肿瘤生长、入侵和转移中起着重要作用，它们可以为肿瘤细胞提供营养和氧气，以促进癌症的生长，然而，目前尚不清楚的是，上皮癌细胞系是否能够产生多种良性的基质细胞谱系 [ 10 ]。PGCCs表现出比传统癌干细胞具有更高的可塑性，可分化成多种组织，包括脂肪组织、软骨、骨和其他基质细胞或成纤维细胞 [ 11 ]。 张诗武等发现，PTX处理后乳腺癌细胞系MCF-7形成球状结构。他们将球状结构进行包埋进行组织学检查，观察到多细胞结构，命名为器官样结构(COSs)，与在患者观察到的分化良好的导管癌相似，包括乳头状、腺样和血管状。COSs的IHC对广谱细胞角蛋白呈阳性，波形蛋白呈阴性，确认了COSs的上皮性质。并对COSs进行了CD31和平滑肌肌动蛋白(SMA)IHC。虽然在乳头状结构中只有少数细胞对CD31阳性，但在腺样和血管状结构中观察到丰富的CD31阳性细胞。在腺样和血管状结构周围的细胞中也观察到SMA阳性染色，但在乳头状结构上表现得很弱。证明这些上皮细胞在接受PTX处理后，已分化成内皮细胞和肌上皮细胞以形成器官样结构。并通过组织形态以及血红蛋白的表达证明癌细胞也能产生红细胞 [ 10 ]。 N Niu等 [ 1 ] 为了确定在体内从PGCCs衍生的球状体中发展出来的肿瘤性质，他们用PTX处理卵巢癌细胞系HEY，并将绿色荧光蛋白(GFP)-泛素标记的对照HEY细胞衍生的球状体(10000个细胞)和PGCCs衍生的球状体(1000个细胞)(这些细胞是在成球培养第7天sD7收集的)注射到严重联合免疫缺陷小鼠的皮下或睾丸。所有球状体都形成了皮下或睾丸肿瘤，但是PGCCs衍生的球状体形成1厘米的肿瘤需要更长的时间(60~120天比30天)。为了进一步确定生殖细胞的成熟程度，他们连续切片进行IHC。对照细胞起源的癌表现出高级别的形态学特征、角蛋白的弱表达以及没有生殖细胞标记SALL4和OCT4的表达。由PGCCs衍生的球状体引起的无性细胞瘤和胚胎性癌展示了SALL4染色，以及细胞角蛋白和OCT4不同强度的阳性。而且PGCCs起源的球状体形成一系列的肿瘤，包括无性细胞瘤、胚胎性癌，伴有骨骼肌分化的无性细胞瘤，高级别癌，高级别和低级别混合的癌以及良性肿瘤等。上述发现表明，PGCCs能够分化成原始的生殖细胞和广泛的上皮肿瘤谱，包括从高级别肿瘤到良性肿瘤。 此外，他们研究了由HEY衍生的PGCCs的分化能力。当PGCCs衍生的球状体在干细胞培养基中培养时，检测出了AFP、SMA和β3-tubulin的表达，当球状体在脂肪生成培养基中培养时可以观察到油红染色，在软骨形成培养基中培养时观察到软骨形成的标志，即硫酸软骨素，当球状体在成骨培养基中培养时观察到片状骨生成阳性信号 [ 1 ]。 S Zhang等 [ 7 ] 通过小鼠实验做了进一步的验证。他们对裸鼠皮下注射了10，000个PGCCs，并用脂肪生成培养基培养。对形成的肿瘤进行组织学检查显示大量的脂肪组织与肿瘤细胞混杂在一起。脂肪分化通过FABP4免疫组织化学染色证实。这些细胞的人类起源是由人类特有的vimentin确认的。 在软骨形成介质中进一步培养了PGCCs和普通的HEY细胞。虽然普通的细胞没有明显的形态变化，但PGCCs形成了软骨球，Alcian Blue和PAS强烈染色。接下来，他们在五只裸鼠的肋骨附近皮下注射了软骨球，并皮下注射到另外五只裸鼠的腹腔内。五只肋骨附近皮下注射的裸鼠都表现出半透明的肿瘤结节，类似于注射部位附近的软骨。5只腹腔注射的裸鼠中有4个形成了实体肿瘤。组织学检查显示肿瘤组织内的骨样结构。骨样分化通过Safranin O/Fast Green染色得到证实。骨样组织对anti-eGFP也是阳性的，确认骨组织的人类起源。有趣的是，5个腹腔注射的老鼠中有一只形成直径为1~2毫米的小而松散的肿瘤组织。这些松散的组织HE染色显示了组织中心的软骨状组织，且对骨蛋白素(osteopontin)是阳性的，证明了PGCCs可以分化成软骨和骨骼 [ 7 ]。 5.2.3. PGCCs产生红细胞并共同形成血管生成拟态(VMs)以供应肿瘤快速生长 PGCCs可以在体内、外产生红细胞。张诗武 [ 8 ] 等用CoCl 2 处理乳腺癌细胞系BT-549，发现PGCCs产生了红细胞，这些红细胞对血红蛋白α、β/γ/δ/ε、ζ、δ和胎儿血红蛋白的免疫组化染色呈不同程度的阳性，证明了其红细胞的身份。当BT-549细胞被注射到裸鼠体内时，在裸鼠的异种移植肿瘤中，BT-549癌细胞的细胞质中发现了大量的红细胞。且对人类特有的抗血红蛋白ε免疫组化染色呈阳性，确认了红细胞的人类起源。为了进一步验证上述发现，他们处理了其他细胞系，包括MDA-MB-231、hras-转化的输卵管上皮细胞株FTE187SV40hT-Hras以及Phoenix细胞，并通过CoCl 2 诱导的球状体来检查红细胞的生成。在所有这些细胞系中可以清楚地观察到红细胞。此外，他们培养了人类的卵巢癌组织。高级别卵巢癌细胞体外培养2周后，培养基中癌细胞的涂片证实红细胞的存在。石蜡包埋切片的组织学检查还显示，红细胞在高级别卵巢癌细胞的细胞质中出现。此外，在癌细胞的细胞质和周围也可以看到多个圆形、红色的胞体。卵巢癌组织连续切片免疫组织化学染色表明这些胞体对血红蛋白ζ呈阳性但对胎儿血红蛋白是阴性的。综上表明，PGCCs能激活胎儿和胚胎血红蛋白，并能在体外和体内产生红细胞，并进一步支持PGCCs可能有类似于干细胞的属性。由于这些胚胎和胎儿血红蛋白与成人血红蛋白相比，更容易从周围的微环境中获取氧气，它们的激活将提高这些细胞获得氧气的能力并促进正常组织和肿瘤的生长 [ 8 ]。此外，不同的细胞系有不同的血红蛋白表达模式，不同的血红蛋白有不同的氧气结合和释放能力 [ 8 ]。这些数据表明，在癌组织中存在胚胎造血机制，特别是当这些组织处于环境压力下，如缺氧 [ 8 ]。 血管生成是一种生理过程，涉及到从已有血管中新血管的生长。血管生成是生长和发育的一个正常而重要的过程，在伤口愈合和造粒组织中也是如此。血管生成通常被认为是为肿瘤生长的系统循环提供血液所必需的。特别是肿瘤，被认为是经历了最初阶段的无血管生长然后是血管生成或血管生成拟态(VMs)与内皮依赖性血管(EVs)相连以获得足够的血液和氧气供应来供应肿瘤生长、入侵和转移 [ 3 ] [ 8 ]。 据报道，有三种肿瘤供应模式，包括内皮依赖性血管(EVs)、马赛克血管(MVs)和血管生成拟态(VMs)，在肿瘤生长的早期阶段，VMs是主要的血液供应模式。随着肿瘤大小的增加，在VMs血管壁上排列的肿瘤细胞被内皮细胞所取代。在VMs和EVs之间有一个过渡，MVs成为肿瘤的主要血液供应模式。最后，EVs成为了血液供应的主要模式。这三种微循环模式代表了肿瘤生长的一系列阶段，即从VMs开始，到MVs，最终导致EVs，且这三者的转换是受低氧微环境调节的，缺氧可以激活一些与侵袭、转移相关的肿瘤基因，包括EPO、血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体Fit-139，使细胞变得更具侵入性并形成VM [ 8 ]。VMs是一种替代性的肿瘤微循环模式并且在某些高级别恶性肿瘤中存在，包括炎性乳癌、前列腺癌以及肝细胞癌。 由HE、CD31IHC和PAS双重染色的结果表明，在浆液性卵巢癌中有伴梭形内皮细胞的EVs。梭形内皮细胞对CoD31是阳性的，且EVs基底膜对PAS染色是阳性的。VMs通道壁是由肿瘤细胞和红细胞组成的，基底膜可能存在也可能不存在。CD31阳性的EVs和CD31阴性的VMs结构在卵巢肿瘤组织中共存 [ 9 ]。VMs结构可以由PGCCs和它们新生成的红细胞组成。红细胞状的胞体通常位于癌细胞和PGCCs的细胞质或其周围，且对血红蛋白抗体染色阳性。为了进一步验证VMs与人浆液性卵巢肿瘤的生物学行为之间的关系，Li Zhang等 [ 9 ] 分析了80例石蜡包埋的浆液性卵巢肿瘤样本，发现转移瘤的VMs数量最多，而交界性浆液性囊腺瘤VMs的数量是最低的。统计分析表明，这些组之间的VMs数量差异具有统计学意义。而且，转移瘤的PGCCs的数量也是最多的，这与Fei Fei等 [ 2 ] 在乳腺肿瘤中的发现是一致的。这表明PGCCs和VMs结构的数量与恶性等级有关，而Yang Qu等在神经胶质瘤 [ 3 ] 以及Dan Zhang等在结直肠癌中 [ 6 ] 也有同样的发现。 缺氧在VMs的形成过程中也扮演着重要的角色。对缺氧的正常反应是刺激新血管的生长。缺氧可以激活一些入侵和转移相关的肿瘤基因，包括红细胞生成素、血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体Fit-1，使细胞变得更具侵袭性，并在恶劣条件下形成VMs结构。这些VMs通道可与EVs连接，以获得充足的血液供应 [ 8 ] [ 9 ]。更有侵略性的肿瘤比低级别的肿瘤需要更多的血液供应来支持它们快速的细胞生长。在恶性肿瘤中，VM的形成与肿瘤转移呈正相关 [ 8 ]。VMs越来越被认为是血管生成的一种模式 [ 3 ]。因此，这些数据可能解释了传统的抗血管生成疗法对癌症的无效，因为肿瘤细胞有能力直接生成红细胞并适应低氧微环境。了解癌细胞产生红细胞的详细机制，可能有助于设计有效的癌症治疗策略 [ 8 ]。VM的存在表明抗血管生成疗法的有效性较低。VM的存在是预后不良的一个指标，因为在恶性黑素瘤、间皮肉瘤和肺泡横肌肉瘤患者中，有VM存在的患者5年存活率较低 [ 8 ]。