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user: 3. 结果与讨论 3.1. 材料结果与表征 图1为二氧化硅泡沫分子MCFs和以其为硬模板碳化后所制备得到的介孔碳分子筛C-MCF的SEM和TEM图。从SEM图a和d中我们可以观察到，碳化前后分子筛呈现出均匀的颗粒分布，并且其外观形貌保持稳定，颗粒粒径都大约为2 μm，而从进一步放大的SEM图(b)，(e)中我们可以看出，经过碳化后的C-MCF的3D孔道结构更加明显，这也更有利于其对酶等生物大分子的吸附。从TEM图片c和f中可见，以糠醇为碳源经过碳化后的C-MCF不仅维持了二氧化硅泡沫分子筛的外部形貌，同时也很好的复制出了泡沫分子筛典型的3-D蜂窝状介孔泡沫结构，并且大致可以看出碳化后的C-MCF的胞体孔径相比较之前的二氧化硅模板的胞体孔径有所下降。 图2为二氧化硅泡沫分子筛MCFs和以其为硬模板碳化后所制备得到的介孔碳分子筛C-MCF的氮气吸附–脱附等温曲线及其孔径分布曲线。从孔径分布曲线可以观察到，碳化后的C-MCF样品的吸附支和脱附支在3.9 nm附近处出现了明显的峰值，这说明经过碳化后的C-MCF材料除了拥有之前硬模板MCFs的“墨水瓶”结构以外，胞体周围还环绕着去除硅模板后留下的次级孔道，这些在胞体周围大量存在的小孔道使得酶在进行氧化还原催化时有利于增加所固定酶的催化效率，因为其为催化反应提供了一条能够有效降低传质阻力的“基底传输通道(substrate-transport channel)” [ 11 ] 。从图中我们可以发现，经过高温碳化的样品吸附支和脱附支的孔径分布集于在10 nm和20 nm，分别与其胞体孔径与窗口直径相对应，这样较大的胞体孔径和窗口直径非常有利于介孔碳泡沫分子筛对于生物大分子的吸附。 根据氮气吸附–脱附等温曲线计算得到硬模板MCFs和碳化后所得到的介孔碳泡沫分子筛C-MCF样品的胞体孔径、窗口孔径、孔容和比表面积(表1)。我们发现，经过高温碳化C-MCF的孔容相比于之前的硅基硬模板从1.66 cm 3 /g下降到了1.42 cm 3 /g，可见碳源糠醇的的引入将会占据之前硅模板孔道内部的一些空间而导致介孔材料孔容的减小。但是在孔容减小的同时，介孔碳泡沫分子筛的比表面积却由之前硅基材料的611.4 m 2 /g增大到了795.5 m 2 /g，这主要因为碳化后的介孔材料胞体周围还存在着去除硅模板后留下的次级孔道，这与之前孔径分布结果相一致。 3.2. 葡萄糖氧化酶的吸附性能 图3为将GOD溶液初始浓度固定在1 mg/mL时，pH值在4.0到6.0之间MCFs和C-MCF的葡萄糖 图1. MCF ((a)， (b)， (c))和C-MCF ((d)， (e)， (f))的SEM和TEM图片 图2. MCFs和C-MCF的氮气吸附-脱附等温曲线和孔径分布曲线 Table 1 Surface area and pore -structure parameters of MCF and C-MC 样品 胞体孔径 a (nm) 窗口直径 a (nm) 孔容 a (cm 3 /g) 比表面积 b (m 2 /g) MCFs 24.3 10.7 1.66 611.4 C-MCF 3.9， 19.8 3.6， 10.1 1.42 795.5 表1. MCF和C-MCF的比表面积和孔结构参数表 注： a 表示该数据采用BJH模型计算得出，其中胞体孔径和窗口直径分别由吸附质和脱附支得出，用其峰值的横坐标表示； b 表示该数据采用BET模型计算得出。 图3. 不同pH条件下，GOD在MCFs和C-MCF的固定量与时间关系图 氧化酶负载量与时间的关系曲线图。从图中我们可以直观地发现碳化后的介孔分子筛C-MCF的葡萄糖负载量有了很大的提高。从图中我们还可以得到对于MCFs模板来说，在吸附大约进行至4 h时，其对葡萄糖氧化酶的吸附达到平衡点，而对于C-MCF载体材料却在吸附开始后大约8个小时后才达到吸附平衡点，说明了相对于碳化前的硅基模板MCFs，C-MCF载体与葡萄糖氧化酶分子间有着更强的相互作用力，这可能是由于碳化过程使得C-MCF表面暴露出了很多具有较强静电引力的基团。缓冲溶液pH值对于介孔材料的载酶能力也有着巨大的影响，图中MCFs和C-MCF两者对葡萄糖氧化酶的吸附能力都随溶液pH值的不同有着很大的变化。当缓冲溶液的pH值为5.0时，MCFs和C-MCF对葡萄糖氧化酶的吸附能力都达到最大值，而当缓冲溶液的pH值低于或者高于5.0时，二者对于葡萄糖氧化酶的吸附能力都有着不同程度的下降。这是因为葡萄糖氧化酶的等电点接近于5.0 [ 6 ] [ 12 ] ，由酶分子等电点与溶液pH的关系我们知道，当GOD分子在pH值低于5.0的溶液中时带正点而在pH值高于5.0的溶液中时带负点，当溶液pH值恰好在5.0附近时则GOD分子表面几乎不带电。 由于MCFs和C-MCF均在GOD分子表面成电中性的情况下达到最大的吸附量，说明泡沫状介孔材料对于GOD的吸附主要是依靠二者之间的分子间力，因此对于外界溶液的pH值的变化并不敏感。另一方面，GOD分子之间的库仑作用力是随着pH值的增加先减小后增大，其最小值正好在GOD的等电点处获得，即在溶液pH值为5.0时GOD分子间的斥力最小，使得GOD分子的排列最紧密。吸附在介孔材料内部的GOD分子之间紧密堆积表现表现为介孔材料固定化酶量的增加；反之，当pH值高于或者低于等电点时，带正电或带负电的GOD分子之间的库仑斥力随这自身所带电量的增大而逐渐增大，GOD分子之间无法紧密排列，其平均间距增大，表现为介孔材料的固定化酶量的减少。 随后，我们比较了MCFs和C-MCF载体在不同初始浓度(1 mg~7.0 mg/mL)的GOD溶液中固定化酶量的变化以进一步研究GOD在硅基和碳基介孔材料样品上的吸附行为。通过之前的研究结果我们将测试的所有酶溶液的pH均固定为5.0，吸附等温线图如图4所示。从图中我们可以看出，随着GOD溶液浓度的增加，GOD的固定量也随之有着明显的增加，C-MCF对酶的吸附能力大大地强于MCFs，但二者都在酶溶液浓度为6.0 mg/mL时达到GOD固定量的最大值。当底物浓度继续增大时，固定化酶量不再随着GOD浓度增加而不断增加，这也和Lee等人 [ 11 ] 的研究结果相同，说明GOD的固定于介孔材料的机制是基于将酶束缚于样品的介孔孔道内部，而不是将酶吸附于载体的表面，由于当酶溶液浓度达到6.0 mg/mL时，GOD分子之间的距离已经足够接近，无法更紧密的堆积。 由于在实际使用过程中吸附上的酶可能会因为外界条件的变化而发生脱附，所以即使载体材料在最开始拥有对目标生物酶很强的吸附性能，但是如果其固酶稳定性不好容易发生脱附的话，也极大限制了其在实际的生活生产中的应用。因此，我们研究了GOD在MCFs和C-MCF上的脱附行为以比较硅基的介孔材料和碳基的介孔材料载体对GOD固定的稳定性：我们分别将10 mg的MCFs和C-MCF载体材料分散于3 ml pH为5.0、GOD浓度为6 mg/mL的缓冲溶液中，于室温20℃条件下在摇床中振荡(150 rpm) 12小时达到吸附平衡，得到其初始固定化酶量，最后将固定化GOD载体用缓冲液冲洗3次，测试其残余固定化酶量。结果如表2所示。碳化后的C-MCF相比之前的模板剂MCFs对酶有着更好的抗脱附作用，在经过同样的3次缓冲溶液的冲洗后，C-MCF上的葡萄糖氧化酶还有92.0%残留，而未经过碳化的MCFs上仅有86.3%的酶还存在。 通过研究我们发现残余固定化酶量则与球形孔室的储存空间和窗口的尺寸相关。C-MCF的球形孔室由10.1 nm的窗口相互连通，该窗口直径小于MCFs的窗口直径。一旦GOD分子进入其球形孔室，随着孔道内部的GOD分子越来越多，GOD分子会在其窗口处发生聚集甚至部分酶分子会堵住窗口。这时，窗口直径越小的介孔材料其孔道内部的GOD分子越难以离开孔道，因此孔室内部的酶分子也就难以发生脱附，C-MCF也就表现出更高的对于葡萄糖氧化酶的储存力。由此可以推断，GOD的固定化机制是基于将酶束缚于介孔材料孔道内部，而不是吸附于载体表面。结果表明，碳基介孔泡沫分子筛材料相比硅基介孔泡沫分子筛更有潜力成为一个良好的固定GOD的载体。 图4. 在pH为5.0时，GOD固定于MCF和C-MCF的等温吸附线图。样品(10 mg)分散于各指定浓度的GOD溶液(3 mL)中，于室温条件下振荡(150 rpm) 12小时 Table 2 Desorption of GOD on MCF and C-MCF at pH 5. 样品 初试固定化酶量 a 残余固定化酶量 b 比例 c (mg/g) (mg/g) (%) C-MCF 410.7 378.2 92.0 MCF 83.7 72.3 86.3 表2. 当pH为5.0时，MCF和C-MCF上GOD的脱附行为 注： a 所有载体都在6 mg/mL的GOD溶液中吸附12小时， b 残余固定量于缓冲液彻底冲洗之后测定， c 为残余固定化酶量与初试固定化酶量之比。