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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料与试剂 橡子，采自秦岭山脉西麓，自然风干，超微粉碎，置棕色瓶阴凉处存放备用。 1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH， C 18 H 12 N 5 O 6 )，美国Sigma公司。单宁类物质标准品：没食子酸、原儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B 2 、绿原酸、4-羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、表儿茶素没食子酸酯、芦丁、金丝桃苷、鞣花酸、槲皮苷、根皮苷、槲皮素，纯度 ≥ 98%，购自中国国家标准物质中心，其它试剂均为国产分析纯。 2.2. 仪器与设备 722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪(Fourier Transform Infrared Spectrometer， FTIR)，德国布鲁克公司；热分析系统，美国TA公司；粉末X射线衍射仪，德国布鲁克公司；Motic BA 200双目生物显微镜，北京翔天智远科技有限公司；高效液相色谱仪，美国Waters公司。 2.3. 方法 2.3.1. 橡子淀粉的制备及其基本理化特性分析 橡子淀粉的制备：参考文献 [ 15 ] 的方法。 1) 橡子淀粉溶胀能力、转化葡萄糖能力及其直/支链淀粉含量的测定 分别参考文献 [ 16 ]、文献 [ 16 ] [ 17 ]、文献 [ 18 ] 的方法。 2) 橡子淀粉特征官能团傅里叶变换红外光谱分析 称取约0.1 g橡子淀粉，加入10~20 g干燥KBr，将两者混匀，用研钵研磨，然后用药勺小心将磨好混合粉末移入模具中，将压好片的溴化钾薄片取出模具进行傅里叶变换红外光谱分析，以马铃薯淀粉和糯米淀粉为对照。 3) 橡子淀粉差示扫描量热仪(DSC)分析 配制质量浓度为5、10、15 g/100g的橡子淀粉乳液，DSC分析条件为：配制橡子淀粉乳液室温条件下置约1 h，温度范围30℃~120℃，加热速率为10℃/min，氮气流量为40 mL/min。 4) 橡子淀粉颗粒晶体结构X-射线衍射仪(XRD)测定 分析条件：Cu靶，陶瓷X光管(2.2 kW)，θ/θ测角仪(采用光学编码器技术与步进马达双重定位)，LynxEye阵列探测器。 2.3.2. 橡子淀粉形貌显微观察及其单宁含量测定 1) 橡子淀粉形貌显微观察 配制质量百分数为1%的橡子淀粉溶液，向载玻片中央滴入少许样液，滴2滴碘液，进行光学显微镜观察。 2) 橡子淀粉单宁含量测定 采用酒石酸亚铁分光光度比色法。无水乙醇配制浓度分别为0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL的单宁酸标准溶液，即分别取1 mg/mL的单宁酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，依次加入到装有5、4.8、4.6、4.4、4.2、4.0、3.8、3.6 mL pH为7.5磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液的10 mL容量瓶中，再加入酒石酸亚铁溶液5 mL，在680 nm处测定吸收值，作线性回归分析，求得回归方程y = 4.803x − 0.0061，R 2 = 0.9987。 样品制备：以1:10 (g/mL)的料液比，用无水乙醇浸提橡子淀粉12 h，400× g离心15 min，倾出上层清液即为橡子淀粉单宁样品液。依照上文标准曲线制作方法测定样品吸光值，代入下式即得橡子淀粉单宁质量百分数。 Y = C × 10 0.01 × 1000 × 100 (1) 式中：Y，橡子淀粉单宁质量百分数，%；C，样液质量浓度，mg/mL。 2.3.3. 橡子淀粉抗氧化活性的测定 1) 橡子淀粉对铁氰化钾还原能力的测定 采用普鲁士蓝法，参考Amarowicz等 [ 19 ] 和Kaur等 [ 20 ] 的方法。以1:10 (g/Ml)的料液比，用70% (v/v)分别制备质量浓度为1.00、0.75、0.50、0.25、0.10 mg/mL的样液，各取1 mL，分别加入2.5 mL磷酸缓冲液(pH 6.6， 0.2 M)、1 mL 1% (质量百分数) K 3 Fe(CN) 6 溶液，于50℃水浴处理20 min，冰浴冷却，加入2.5 mL 10% (质量百分数)三氯乙酸溶液，在400× g下离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 质量分数为0.1%氯化铁溶液，摇匀，在可见分光光度计710 nm处测定吸光值A。样品还原能力越强，反应后溶液的吸光度越大。按下式计算其还原能力。 Y = A 0 − ( A 1 − A 2 ) A 0 × 100 (2) 式中：Y，还原能力，%；A 1 ，样液吸光值；A 0 ，对照吸光值；A 2 ，空白组吸光值。 2) 橡子淀粉对 O 2 − 清除能力的测定 采用PMS-NADH体系测定橡子淀粉对超氧阴离子的消除能力，参考Guorong等 [ 21 ] 的方法，作部分修改。50 μL不同质量浓度的样液加入到1 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(Ph = 7.4)中，并依次加入150 μmol/L的NBT、60 μmol/L的PMS和468 μmol/L的NADH。置于25℃条件下8 min，测量其在波长560 nm处的吸光度。 Y = ( 1 − A 1 A 0 ) × 100 (3) 式中：Y，样液对超氧阴离子清除能力，%；A 1 ，样液吸光值；A 0 ，对照吸光值。 3) 橡子淀粉对∙OH清除能力的测定 采用水杨酸法 [ 22 ]，测定橡子淀粉对∙OH清除能力。在10 mL试管中加入2 mL不同浓度的样品，2 mL 6 mmol/L FeSO 4 溶液，2 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，2 mL 6 mmol/L H 2 O 2 溶液，充分混匀后于37℃水浴30 min，于562 nm处测定吸光值A，以加蒸馏水为空白对照，按下式计算对∙OH的清除能力。 Y = A 0 − ( A 1 − A 2 ) A 0 × 100 (4) 式中：Y，羟自由基清除率，%；A 1 ，样品吸光值；A 0 ，蒸馏水代替样品的对照吸光值；A 2 ，以蒸馏水代替样品和H 2 O 2 的空白吸光值。 4) 橡子淀粉对DPPH∙清除能力的测定 参考Dudonné等 [ 23 ] 和Negi等 [ 24 ] 的方法。取1 mg DPPH溶于约20 mL无水乙醇中，取DPPH溶液2 mL，向其中逐渐加样品液，当溶液颜色基本褪去时，此加样量即为样品的最大用量，以等差递减设置5个加样量；取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加无水乙醇1 mL，充分混合，测定其A 0 值(519 nm)；取DPPH溶液2 mL加入到小试管中，加样品液x μL，再加(1000 − x) μL无水乙醇至总体积为3 mL，静置30 min后测定其A值(519 nm)，依次测定样品不同添加量A值，按下式计算其对DPPH∙的清除能力。 Y = A 0 − A A 0 × 100 (5) 式中：Y，DPPH∙清除率，%；A 0 ，对照吸光值；A，样品吸光值。 2.3.4. 橡子淀粉单宁组成HPLC分析 分析条件：Waters 2478型紫外检测器和示差折光检测器，波长280 nm，色谱柱Agilent5 TC-C18 (250 mm × 4.6 mm × 5 μm)，柱温30℃，进样体积20 μL，流动相B 为0.1% (v/v)甲酸水溶液，流动相D为甲醇。 梯度洗脱：流速为0.5 mL/min，0~7 min (95% B液，5% D液)；7~9 min (70% B液，30% D液)；9~14 min (50% B液，50% D液)；14~22 min (10% B液，90% D液)；22~25 min (95% B液，5% D液)。所有样品进样前用0.45 μm的滤膜过滤。HPLC分析所得组分以其标准品进行比对确认。 标准曲线制作：16种多酚标准品分别配成质量浓度为1.2 mg/mL的甲醇溶液，按1:1、1:2、1:4稀释后分别进样20 μL，以峰面积对浓度分别制作各种标准品的标准曲线，求回归方程。橡子多酚纯化物样品用甲醇溶解后，进样检测，用回归方程计算各种成分的含量。 2.4. 数据处理 所有试验均平行重复5次，试验数据采用SPSS16.0软件进行方差分析(One-Way ANOVA)，Turkey’s检验5%水平进行多重比较，结果以平均值 ± 标准差 ( X ¯ ± S D ) 表示。