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user: 2. 资料与方法 2.1. 研究对象 ① 收集2019年7月至2020年8月期间在青岛大学附属医院行甲状腺切除患者的手术标本，所有患者均有完整临床资料。将所有患者分为甲癌和癌旁2组，甲状腺乳头状癌(甲癌组) 20例、配对癌旁正常组织(癌旁组) (癌旁组织取自距癌灶边缘 > 0.8 cm的位置) 20例，以上所有甲状腺标本均经我院病理科确诊，并且患者均签署实验知情同意书。② 3株甲状腺乳头状癌细胞系(BCPAP， TPC-1， KTC-1)。③ 人293T细胞。 2.2. 纳入标准 ① 各项临床资料完整；② 无其他恶性肿瘤病史；③ 无桥本甲状腺炎病史；④ 无内分泌相关疾病病史；⑤ 术前无放疗、化疗治疗史及甲状腺手术史；⑥ 无严重的心脑血管疾病。 2.3. 研究方法 2.3.1. 仪器和试剂 RNA提取试剂等来自TAKARA公司，PCR反应膜来自ABI公司，DMEM培养基等来自Gibco公司；BCPAP、TPC-1、KTC-1细胞及293T细胞来自中科院细胞库，FISH探针等来自广州锐博生物，引物由上海生工合成，PAGE纯化。 2.3.2. 实验方法 1) PTC癌组织及其癌旁组织中LncRNA XIST，miR-204及FN1表达水平检测 将新鲜组织50~100 mg研磨至糜状，Trizol法提取组织总RNA，而后进行逆转录得到RNA总量，将产物cDNA取出后利用无酶水稀释至500 μl并保存待用，miRNA逆转录反应体系为10 μl，包含RT-Primer (10 μM) 3 μl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl、RNA 500~1000 ng、RNase Free 水up to 10 μl，反应条件：65℃，5 min，冰上预冷。在上述反应管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl，包括上述变性后反应液10 μl、5 × PrimeScript II Buffer 4 μl、RNase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl (20 U)、PrimeScript II RTase (200 U/μl) 1 μl (200 U)、RNase Free水up to 20 μl，移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后按下列条件进行反转录反应：42℃，60 min，95℃，5 min (酶失活)，将反转录产物放在冰上冷却备用。mRNA逆转录反应体系为20 μl，包括5 × primeScript RT Master Mix (perfect Real Time) 4 μl、Total RNA 0.5 μg、RNase Free水up to 20 μl，反应条件：37℃，60 min，85℃，5 s，将反转录产物放在冰上备用。而后进行qPCR检测，其中lncRNA XIST正向引物：5’-GACACAAGGCCAACGACCTA-3’，反向引物： 5’-TCGCTTGGGTCCTCTATCCA-3’；hsa-miR-204-5p正向引物： 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaggcat-3’；hsa-miR-204-5p反向引物：GCGCGttccctttgtcatcct，引物由上海生工合成，PAGE纯化，PCR反应条件：温度50℃、2 min；95℃、2 min；95℃、15 s；60℃、60 s，共重复40个循环，每个样本重复测量3次取平均Ct值，相对定量采用2-ΔΔCt法，ΔCt = Ct (目的基因) − Ct (管家基因)，ΔΔCt = 实验组ΔCt − 对照组ΔCt。 2) QPCR检测3株甲状腺癌细胞系(BCPAP， TPC-1， KTC-1) lncRNA XIST、miR-204-5p的表达水平 (1) RNA提取：① 将收集的细胞样本，加入1000 μl RNAiso Plus (Trizol)充分裂解，随后加入200 μl氯仿，振荡混匀后室温放置5 min。② 4℃，12000 g离心15 min，吸取上层水相，至另一离心管中。③ 加入0.5 ml异丙醇混匀，4℃，12000 g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。④ 加入1 ml 75%乙醇，温和颠倒离心管，4℃，7500 g离心5 min，尽量弃上清。⑤ 室温晾干10 min，用20 μl DEPC H 2 O溶解RNA沉淀。⑥ 检测RNA纯度和浓度：以DEPC H 2 O为对照(Blank)，取2 μl RNA溶液于分光光度计检测。DEPC H 2 O为对照(Blank)，取2 μl RNA溶液于酶标仪上检测样本浓度和质量。 (2) miRNA反转录：按照试剂盒说明书，配制如下10 μl体系：RT-Primer (10 μM)，3 μl；dNTP Mixture (10 mM each)，1 μl；RNA，500~1000 ng；RNase Free水，up to 10 μl。反应条件：65℃，5 min，冰上预冷。在上述反应管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl：上述变性后反应液10 μl；5 × PrimeScript II Buffer，4 μl；RNase Inhibitor (40 U/μl)，0.5 μl (20 U)；PrimeScript II RTase (200 U/μl)，1 μl (200 U)；RNase Free水，up to 20 μl。移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后按下列条件进行反转录反应：42℃，60 min；95℃，5 min (酶失活)，将反转录产物放在冰上冷却备用。 (3) mRNA反转录：按照试剂盒说明书，配制如下20 μl体系：5 × primeScript RT Master Mix (perfect Real Time)，4 μl；Total RNA，0.5 μg；RNase Free水，up to 20 μl。反应条件：37℃，60 min；85℃，5 s，将反转录产物放在冰上备用。 (4) 荧光定量PCR扩增：按照试剂盒说明书，配制如下PCR扩增反应体系：SYBR Premix EX Taq (2×)，10 μl；Forward primer，10 µM，1 μl；Reverse primer，10 µM，1 μl；cDNA，2 μl；ddH 2 O，up to 20 μl。用ABI ViiA7荧光定量PCR仪进行Real time PCR反应，程序如下：50.0℃，2 min；95.0℃，2 min；95.0℃ for 15 s；60.0℃ for 60 s，共重复40个循环。熔解条件：95.0℃ for 15 s；60.0℃ for 60 s；95.0℃ for 15 s。 引物信息 3) BCPAP细胞培养及荧光原位杂交(FISH) BCPAP细胞培养：当细胞密度达80%~90%时进行传代。在超净工作台中吸弃细胞培养上清，用无菌1×PBS洗涤细胞1次，加入胰蛋白酶1~2 ml，轻轻晃动，保证胰蛋白酶充分接触细胞，在倒置显微镜下观察，细胞间隙增大开始脱落时，加入新鲜培养液终止消化，滴管吹打细胞使其全部脱落，转移细胞悬液于离心管中，1000 rpm离心5 min，然后弃去上清，加新鲜的培养液并吹打成细胞悬液，按1:2传代至新培养瓶中，补充培养液，继续培养。细胞培养基：1640 + 10% FBS + 1% PS。 荧光原位杂交(FISH)实验：(1) 细胞培养：将细胞爬片置于24孔板孔底，培养适量细胞(6 × 10 4 /孔)。实验前使细胞融合度达到60%左右。(2) 细胞固定与通透：a. 用1× PBS清洗细胞5 min；b. 用4%多聚甲醛室温固定10 min；c. 用1× PBS清洗细胞5 min，共3次；d. 每孔加入1 ml预冷的通透液(含0.5% Triton X-100的PBS)，4℃静置5 min；e. 弃去通透液后，加入1 × PBS清洗细胞5 min，3次。(3) 探针检测：a. 每孔加入200 μl预杂交液，37℃封闭30 min；b. 弃去每孔细胞中的预杂交液，加入100 μL含有探针的探针杂交液(避光条件下，把2.5 μl 20 μM FISH Probe Mix储存液加入到100 μl杂交液中)，避光，37℃ 杂交过夜；c. 避光，42℃，杂交洗液I清洗每孔细胞3次，每次5 min；d. 避光，42℃，杂交洗液II清洗细胞1次；e. 避光，42℃，杂交洗液III清洗细胞1次；f. 避光，1× PBS清洗细胞，室温5 min。(4) 封片：避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂(含DAPI)将其固定于载玻片上，荧光显微镜拍照检测。 4) 293T细胞复苏、传代及双荧光素酶报告基因检测 293T细胞复苏及传代：从液氮罐中取出293T细胞，迅速置于37℃水浴，并不断振荡使其融化，消毒冻存管表面后，在超净台中将细胞悬液转移至无菌离心管中，补加培养液5 ml，轻轻吹打成细胞悬液后，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养液吹打，吸取悬液至25 ml培养瓶内，置于细胞培养箱中培养，次日换液，观察细胞贴壁情况。细胞培养液配制如下：45 ml DMEM + 5 ml FBS + 500 μl双抗。当细胞密度达80%~90%时进行传代。在超净工作台中吸弃细胞培养上清，用无菌1 × PBS洗涤细胞1次，加入胰蛋白酶1 ml，轻轻晃动，保证胰蛋白酶充分接触细胞，在倒置显微镜下观察，细胞间隙增大开始脱落时，加入新鲜培养液终止消化，滴管吹打细胞使其全部脱落，转移细胞悬液于离心管中，1000 rpm离心5 min，然后弃去上清，加新鲜的培养液并吹打成细胞悬液，按1:2传代至新培养瓶中，补充培养液，继续培养。 质粒构建及抽提：化学合成人LncRNA XIST序列，连接至psiCHECK2质粒中，构建psiCHECK2-lncRNA XIST-WT和psiCHECK2-lncRNA XIST-MUT质粒； 化学合成人FN1 3’UTR WT (野生型)及MUT (突变)序列，连接至pGL3-promoter质粒中，构建pGL3-FN1-WT和pGL3-FN1-MUT质粒。 摇菌：配制LB培养液：称取7.5 g LB Broth Medium，加入300 ml ddH 2 O，混匀后，高温高压消毒灭菌后室温放置。用无菌牙签或枪头挑穿刺菌落，至含有抗生素的LB液体培养基(15~30 ml)中，摇菌12~14 hr左右(220 rpm，37℃)。 质粒提取：具体步骤参见Omega试剂盒步骤：(1) 取10~15 ml的菌液，室温下4000g离心10分钟，收集菌体。(2) 弃培养液，往沉淀中加入500 μl Solution I/RNase A，涡旋振荡使细胞完全重新悬浮。(3) 将细胞悬液转移至新的2 ml离心管中。(4) 加入500 μl Soulution II，轻柔的上下颠倒混匀8~10次，室温静置2~3分钟，不应超过5分钟。(5) 加入250 μl预冷的N3 buffer，轻柔的上下颠倒混匀离心管数次，直至形成白色絮状沉淀。室温静置2分钟。(6) 室温13000g离心10分钟。(7) 收集上清到新的1.5 ml离心管中。(8) 加入0.1倍体积的ETR Solution，上下颠倒混匀10次，裂解液变浑浊，然后冰浴静置10分钟后将逐渐澄清。(9) 将上述裂解液于42℃水浴5分钟。裂解液将再次出现浑浊。(10) 室温12000g离心3分钟。ETR溶液将在底部形成蓝色分层。(11) 将上清转移至新的1.5 ml离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀6~7次，室温静置2分钟。(12) 把HiBind DNA MiniColumn II套入2 ml收集管中。(13) 转移步骤11得到的混合液700 μl到结合柱中，室温13000g离心1分钟，弃滤液。(14) 重复步骤13，直至步骤11所得混合液全部结合到结合柱中。(15) 加入500 μl HBC Buffer，室温13000g离心1分钟，弃滤液。(16) 加入700 μl DNA Wash Buffer，室温13000g离心1分钟，弃滤液。(17) 加入700 μl DNA Wash Buffer，室温13000 g离心1分钟，弃滤液。(18) 室温13000 g离心1分钟，空甩。(19) 把HiBind DNA MiniColumn II套入新的1.5 ml离心管，加入120 μl H 2 O，室温下静置3分钟，室温13000g离心1分钟。(20) 用紫外分光光度计测量质粒浓度及纯度。−20℃保存。 双荧光素酶报告基因检测：细胞种板：收集培养至对数生长期的293T细胞，用无PS的完全培养液重悬细胞，细胞计数，按每孔1 × 10 4 个细胞，将细胞接种至96孔板中，放置细胞培养箱中静置培养过夜。转染：(1) 细胞换成无血清培养基，每孔500 μl (2) a1：Lipofectamin 3000 (0.2 μl/孔) + 无血清Opti-MEM培养基(10 μl/孔)；b1：miRNA-204-5p mimic或NC (100 nM) + psiCHECK2-LncRNA XIST-WT或psiCHECK2-LncRNA XIST-MUT或psiCHECK2空载(0.4 μg/孔) + 无血清OMEM培养基(10 μl/孔)；a2：Lipofectamin 3000 (0.2 μl/孔) + 无血清OMEM培养基(10 μl/孔)；b2：miRNA-204-5p mimic或NC (100 nM) + pGL3-FN1 3’UTR WT或pGL3-FN1 3’UTR MUT或pGL3-Promoter空载(0.4 μg/孔) + pRL-TK (0.2 μg/孔) + 无血清OMEM培养基(10 μl/孔)，室温静置5 min。(3) 将上述中的a1和b1混合或a2和b2混合，室温静置20 min。(4) 更换细胞培养基为无血清培养基，加入制备的转染混合液。6小时后换液，加入完全培养基常规培养48 hours，以未转染组为阴性对照组。收样、酶标仪检测：吸尽细胞培养液后，加入100 μl的报告基因细胞裂解液，充分裂解后，10，000~15，000g离心3~5分钟，取上清用于测定。融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰浴或冰盒上备用。按照每个样品需100 μl的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100×)配制成海肾萤光素酶检测工作液。按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。每个样品测定时，取样品50 μl，加入100 μl萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU (relative light unit)。在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100微升海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU (relative light unit)。 2.4. 统计学处理 作图软件为Graphpad prism 5 (Graphpad Software， San Diego， CA)；荧光定量软件为Image J，数据分析软件Graphpad prism 5 (Graphpad Software， San Diego， CA)；t-test分析LncRNA XIST，miR-204及FN1三者在PTC癌组织及癌旁组织的表达差异(表1)，以单因素方差分析和TUKEY法进行事后检验研究LncRNA XIST，miR-204在BCPAP、TPC-1及KTC-1三组细胞系中的表达差异(表2)，以双因素方差分析和TUKEY法进行事后检验研究人293T细胞中LncRNA XIST与miR-204、FN1与miR-204的关系(表3)。以P < 0.05和P < 0.01为显著性差异和极显著性差异的筛选标准。