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user: 3. 多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂发展概况 酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)是小分子抑制剂，能够渗透过细胞膜并靶向肿瘤细胞和周围内皮和血管激酶受体的特定部位，从而阻断细胞增殖信号传导途径 [ 23 ] 。TKIs从结构上大致可以分为以下几大类：喹唑啉类、喹啉类及苯胺、苯酰胺类等，这些抑制剂的母核大多模拟ATP中腺嘌呤结构即含有含氮原子杂环的同时结构中都有一个或多个杂原子。它们分别对特定或多个酪氨酸激酶具有专一或选择性抑制作用 [ 24 ] 。 3.1. 喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂 目前，经 FDA审核批准了一批 EGFR 小分子靶向抑制剂，大多数属于喹唑啉类——已发现的选择性最好、活性最高的要属苯胺喹唑啉类化合物，其主要作用于EGFR，目前已有数个该类抑制剂上市，还有大量正在开发或已经进入临床的化合物 [ 25 ] [ 26 ] 。为了提高活性一般采用以下形式对结构进行改造：在苯胺3位取代基添加亲脂性取代基，将苯胺上的H替换为F、Cl、Br或I原子；在喹唑啉的6、7位上连接给电子基团；在喹唑啉环上的7位取代位置引入N、O原子 [ 27 ] 。目前上市的各种含喹唑啉基团的酪氨酸激酶抑制剂的结构均符合以上构效关系。 AstraZeneca [ 28 ] 公司开发的苯胺喹唑啉类化合物——吉非替尼(Gefitinib， ZD-139)可以竞争结合EGFR-TK催化区上Mg 2+ -ATP，选择性抑制ErbB受体同时也可以抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化。在异种移植模型中，对降低肿瘤细胞生长速度、缩小甚至使其生长停滞起很大作用，经IDEAL-1 (Iressa Dose Evaluation in Advanced Lung Cancer)研究 [ 29 ] 对其250 mg∙d −1 和500 mg∙d −1 剂量组治疗进行安全性和缓解性测试结果显示有效率分别为18.4%和19.0%，IDEAL-2 [ 30 ] 实验结果显示有效率分别为11.8%和8.8%，不良反应率为6.9%和17.5%，两组的症状缓解率分别为43%和34%，该药物通过口服可以广泛分布于身体组织和器官中，药物生物利用率高达50%~60%，2002年首次于日本上市，2003年5月作为三线单一治疗药物在美国及澳大利亚获准用于治疗晚期非小细胞肺癌，常见副反应为皮疹、粉刺、腹泻、恶心、呕吐等 [ 31 ] 。 Enetech公司与OSI公司联合开发的厄洛替尼(Erlotinib， Genentech)是一种以EGFR为靶点的小分子酪氨酸酶抑制剂。体内体外实验资料表明Erlotinib可以特异地抑制EGFR激酶活性(IC 50 = 2 μM)，对比其他酪氨酸激酶抑制剂相比效果显著。经Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验结果显示，它可以明显延长患者平均生存期效果优于同期另一药物吉非替尼，主要副反应为头痛、疲劳、恶心、呕吐、腹泻及痤疮样皮疹。2002年进入FDA新药审批程序，两年后获得美国FDA批准用于治疗一线化疗失败的局部晚期或转移性非小细胞肺癌 [ 32 ] ，目前已经在瑞士、德国、英国、爱尔兰等国上市。 李冬冬 [ 33 ] 等设计并合成了一系列靶向EGFR酪氨酸激酶的喹唑啉骨架肉桂酰胺类衍生物(1-25) (见表1)，并初步测试了它们对肿瘤细胞抗增殖活性和体外EGFR激酶抑制活性。其中大部分化合物表现出对非小细胞肺癌细胞A549和小鼠黑色素瘤细胞B16-F10细胞抗增殖活性。经构效分析和优化，得到活性较好的两种化合物24和25，它们对EGFR激酶的抑制活性IC 50 值分别为0.12 μM和0.19 μM。 HU [ 34 ] 等人报道了25个作为C-Kit的强效抑制剂的化合物，它们都属于芳氨基喹唑啉类，抑制作用是蛋白酪氨酸磷酸酶(Src)、丝裂原活化蛋白激酶(p38)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)和血管内表皮生长因子受体(KDR)的200倍，具有理想的药代动力学特性．通过在啮齿类动物肥大细胞活化的药效学模型实验证明了化合物26 (见图1)具有成为抗肝癌药物的潜质。 VANBROCKLIN [ 35 ] 等通过EGFR酪氨酸激酶放射性实验证明了苯胺二烷氧基喹唑啉化合物对EGFR酪氨酸激酶有一定的亲和性，可作为筛选表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的潜在的肿瘤成像探针。化合物4-(2’-氟苯氨基)-6，7-二乙氧基喹唑啉(27)、4-(3’-氟苯氨基)-6，7-二乙氧基喹唑啉(28)、4-(2’-氯苯氨基)-6，7-二甲氧基喹唑啉(29)、4-(3’-溴苯氨基)-6，7-二甲氧基喹唑啉30) (见图2)与EGFR酪氨酸激酶有较强的结合能力。 Fatmah [ 36 ] 等报道了一系列噻唑并[2，3-b]喹唑啉类化合物(化合物31-34) (见图3)，体外抗癌活性测试表明这四个化合物具有广谱的抗癌活性。化合物31，32的平均IC 50 、TGI、LC 50 值分别为2.5、>100、>100 μM和2.4、9.1、36.2 μM，活性是氟尿嘧啶的9倍。 Chen [ 37 ] 等以埃罗替尼为先导化合物，设计并合成了8种新型三嗪并喹唑啉类化合物(化合物35-42)，如图4，和埃罗替尼相比，这8种化合物具有更高的抗癌活性，其中化合物39和40对N87、A431、H1975、BT474和Calu-3 5种癌细胞系的EGFR的IC 50 都为0.043 μM经过更进一步研究可以发现含有嗪环的化合物比噁嗪环化合物具有更高的抗癌活性。 3.2. 喹啉类酪氨酸激酶抑制剂 含喹啉结构的酪氨酸激酶抑制剂是在喹唑啉类化合物的构效关系基础上设计开发的。研究发现，对比喹唑啉类化合物，为了获得更好的构型和更稳定的电荷分布可以将喹唑啉3位上的N替换为C并引入吸电基团而对其活性并不产生影响。 伯舒替尼(Bosutinib， SKI-606)是由Wyeth公司开发的3-氰基喹啉类双重抑制剂，作用靶点为SRC和ABL。主要用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌等实体瘤和急性淋巴性白血病、慢性粒细胞白血病等。对SRC的IC 50 值为1.2 μM，它的抑制性作用很强，对成纤维细胞的IC 50 值为100 μM [ 38 ] 。 DAN LIU [ 39 ] 等在吉非替尼的基础上设计并合成了22个新型喹啉类酪氨酸激酶抑制剂(化合物43-64)，以Gefitinib作为参照，其中化合物43、48和59对HeLa和BGC-823癌细胞系具有显著的抑制活性(见表2)，其IC 50 值分别为17.92、10.18、7.15 μM和3.63、8.32、4.65 μM。 LIU [ 40 ] 通过在结构上进行新型药物设计的方法，设计合成了以BMX激酶为靶点的小分子化合物65 (见图5)，它可以很好地抑制重组BMX激酶(IC 50 = 8 μM)，作为目前为止首个被报道的高选择性BMX激酶抑制剂，它的出现为以后针对BMX激酶的抗癌药物的研发奠定了基础。 Table 1 The chemical structures of compounds 1-2 化合物 R 1 R 2 R 3 R 4 1 H H H Br 2 Cl H H Br 3 H H Cl Br 4 Br H H Br 5 H H Br Br 6 OCH 3 H H Br 7 H H OCH 3 Br 8 H OCH 3 H Br 9 - - - Br 10 CH 3 H H Br 11 NO 2 H H Br 12 H H NO 2 Br 13 H H H Cl 14 Cl H H Cl 15 H H Cl Cl 16 Br H H Cl 17 H H Br Cl 18 H OCH 3 H Cl 19 - - - Cl 20 CH 3 H H Cl 21 - - - Cl 22 NO 2 H H Cl 23 H H NO 2 Cl 24 H NO 2 H Br 25 H NO 2 H Cl 表1. 化合物1-25的化学结构 图1. 化合物26的结构 图2. 化合物27-30的结构 图3. 化合物31-34的结构 图4. 化合物35-42的结构 图5. 化合物65的结构 Table 2 Antiproliferative activity of the target compounds on Hela and BGC-823 cell line Compound Substituents Inhibition Rate % a IC 50 (μM) b HeLa BGC-823 HeLa BGC-823 43 X=F， Y=H， R=3 ’ -Cl 46.9 77.5 17.29 3.63 44 X=F， Y=H， R=4 ’ -Cl 40.3 63.1 20.39 7.83 45 X=F， Y=H， R=3’-F 37.0 65.3 19.82 9.10 46 X=F， Y=H， R=4’-F 20.4 49.5 43.25 11.10 47 X=F， Y=H， R=3’-Cl， 4’-Cl 40.8 56.9 36.69 8.29 48 X=F， Y=H， R=3’-Cl， 4’-F 46.8 67.5 10.18 8.32 49 X=F， Y=H， R=4’-CH 3 41.7 59.4 18.9 7.08 50 X=F， Y=H， R=4’-OCH 3 36.1 35.1 55.76 21.61 51 X=H， Y=OCH 3 ， R=3’-Cl 35.3 19.5 66.69 >10 52 X=H， Y=OCH 3 ， R=4’-Cl 31.5 13.1 >10 >10 53 X=H， Y =OCH 3 ，R=3’-F 31.9 48.1 75.87 11.67 54 X=H， Y=OCH 3 ，R=4’-F 18.9 37.5 >10 46.41 55 X=H， Y=OCH 3 ， R=3’-Cl， 4’-Cl 30.8 48.7 45.87 11.45 56 X=H， Y=OCH 3 ， R=3’-Cl， 4’-F 37.2 20.2 45.84 >10 57 X=H， Y=OCH 3 ， R=4’-CH 3 30.5 31.1 99.54 61.52 58 X=H， Y=OCH 3 ， R=4’-OCH 3 21.9 32.0 >10 74.60 59 X=H， Y=OCH 3 ， R=4’-CH(CH 3 ) 2 59.1 78.4 7.15 4.65 60 X=H， Y=OCH 3 ， R=3’-Cl， 4’-CH 3 32.7 24.5 71.26 >10 61 X=H， Y=OCH 3 ， R=2’-F， 3’-F，4’-F 32.5 27.6 57.88 >10 62 X=H， Y=OCH 3 ， R=4’-NO 2 35.8 36.8 13.48 >10 63 X=H， Y=OCH 3 ， R=4’-OH 32.7 25.6 3.58 >10 64 X=H， Y=OCH 3 ， R=3’-CN 28.6 16.0 30.61 >10 Gefitinib 42.6 46.0 17.12 19.27 表2. 目标化合物对Hela和BGC-823细胞系的抑制活性 a Inhibitory percentage of cells treated with each compound at a concentration of 10 μM for 96 h; b The agent concentration that inhibited Hela and BGC-823 cells growth by 50%. 李伟 [ 41 ] 等通过研究一系列酪氨酸激酶抑制剂的构效关系，利用计算机辅助药物设计手段以及生物电子等排、骨架迁越原理等设计合成了一系列多靶点喹啉类衍生物(见表3化合物66-85)，其中化合物66抑制活性最强，对HeLa，Eca-109及A549细胞的IC 50 值分别为(1.04 ± 0.12) (0.37 ± 0.06) (2.16 ± 1.05) μM，对肿瘤细胞的抑制活性强于舒尼替尼。 Table 3 The chemical structures of compounds 66-8 化合物 R o- m- p- 66 - - - 67 -CH 3 - - 68 - - -CH 3 69 -CH 3 - -CH 3 70 -OCH 3 - - 71 - -OCH 3 - 72 - - -OCH 3 73 -OCH 3 - -OCH 3 74 - -OCH 3 -OCH 3 75 -NH 2 - - 76 -NH 2 - -CH 3 77 - -NH 2 -CH 3 78 - -OCH 3 -Cl 79 - -Cl -F 80 - - -F 81 - -F， -F - 82 - -F -F 83 - -F， -F -F 84 -F - -F 85 - -Br - 表3. 化合物66-85的化学结构 Morphy [ 42 ] 等在伯舒替尼的结构基础上进行结构修饰，在其4-苯氨基位置引入2-氨基噻唑基团，获得的化合物86 (见图6)对Src有很好的抑制作用，其IC 50 值为15 μM。 3.3. 苯胺、苯酰胺类酪氨酸激酶抑制剂 张晶 [ 43 ] 等以4-氯-6，7-二甲氧基喹啉、6-氯-7氮杂吲哚、4-氯-7-氮杂吲哚为原料与具有多种生物活性的优势结构噻吩环、呋喃环、及邻甲氧基苯环进行连接，经取代、还原、缩合反应合成9个酰胺类化合物(见图7化合物87-95)。并对其进行体外抗肿瘤活性筛选，结果显示化合物87、88、89在GTL-16细胞上有较好的药效活性。 刘长春 [ 44 ] 等在对达沙替尼的研究基础上设计合成了2-氨基-N-(1-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺(见图8化合物96)，该化合物对诱生型NO合成酶有选择抑制作用 [ 38 ] 。 图6. 化合物86的结构 图7. 化合物87-95的结构 图8. 化合物96的结构 3.4. 其他类型 GANGNJEE [ 45 ] 等设计合成的6种新颖N4-取代苯基-6-取代苯甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺可作为多种受体酪氨酸激酶抑制剂(见图9)，其中化合物97、98、99对多种RTK显示出强有效的抑制作用，化合物100和101对VEGFR-2 ((0.048 ± 0.06)和(0.1 ± 0.021) μM)的强效抑制作用明显超过了PDGFR-β ((193.2 ± 20.1)和(145 ± 23.8) μM)及VEGFR-1 (>200和(185.6 ± 27.5) μM)。 LANG [ 46 ] 等设计合成的5个9-苯乙氨基吖啶类化合物102-106可以作为潜在的酪氨酸激酶和拓扑异构酶Ⅰ的多靶点抑制剂，对人肝癌细胞HEPC-2显示强抗增殖活性，其中化合物106对VEGFR-2和Src具有抑制活性(见表4、表5)。 图9. 化合物97-101的结构 Table 4 The structure and antiproliferative activity of the target compounds on HepG-2 cell line 化合物 R 1 R 2 Z IC 50 (μM) 102 H OCH3 NH 13.70 ± 1.21 103 CH 3 H NH 11.43 ± 0.25 104 Cl H NH 20.21 ± 1.64 105 H Br NH 9.12 ± 1.08 106 H H O 8.78 ± 0.32 Colchicin 1.8 ± 0.23 表4. 目标化合物结构及对HepG-2细胞系的抑制活性 Table 5 Percent inhibition effect of compounds 105 and 106 selected at 20 μM on the activity of two kinase 化合物 Src VEGFR-2 105 (12.3 ± 6.1)% (9.2 ± 0.9)% 106 (63.8 ± 2.4)% (12.6 ± 3.7)% Staurosporine (99.7 ± 0.1)% (99.4 ± 2.5)% 表5. 化合物105和106在20 μM时对Src和VEGFR-2两种酶的抑制率