DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 1. 引言 随着我国社会经济的发展，城市人口迅速增长，现有的城市地面资源呈现匮乏状态，因而，大力拓展地下空间有利于解决推进现代化进程中所面临的土地紧缺问题。地铁作为发展地下空间的一种有效手段，可有效缓解交通堵塞问题，从而被广泛应用。但是，为保证地铁安全性往往将其设计成长直线状态进行运营，从而不可避免的会与已有建筑交叉。在地铁建设中，近距离的采用土压平衡盾构机施工时则会对周围构筑物产生影响，造成土体变形沉降，从而引发安全性问题。故此，先期分析盾构施工的变形沉降及其影响因素，并据此提出相关施工建议措施，对后续施工作业有重要指导意义。 近距离的采用盾构施工推进，将会对周围结构如桥桩、已有建筑等造成不利影响。根据王立峰 [ 1 ] 的研究可知，盾构施工时会产生土体扰动，使得周围土体松动而造成隧道周围土体应力重分布，对近距离穿越的已有铁路桥桩基而言，在其垂直于桩体纵向上，桩体两侧存在不小的压力差异，从而引起桥桩发生变形或位移，大大改变了桩基的承载状态。而姜忻良 [ 2 ] 等人分析得出，地铁隧道施工会对建筑物产生影响，使得横向倾斜和纵向倾斜随盾构施工出现不同变化，且整体建筑结构的扭矩出现显著变化。因此，盾构近距离施工时会对周围已建成结构产生影响而出现不同程度的沉降危害，减小盾构推进产生的不利风险并采取有效措施加以消除则显得尤为重要。 在工程实际中，大量研究发现盾构施工的掘进参数与周围地表变形沉降有着极大关联性。颜波 [ 3 ] 等人的研究通过广州某地铁区间进行现场监测和智能化施工，得出了最优盾构掘进参数；且提出三阶段的技术工艺，将地表沉降控制在最佳范围。此外，金明 [ 4 ] 等人现场监测多个掘进参数对沉降量的影响，并直接进行结果分析后得出了该区间施工参数与变形相关关系，对后续工程具有指导意义。 鉴于以上简述，盾构侧穿施工对乌准铁路正常运营和桩基存在潜在影响。为了保证铁路股道的安全，将推进前的20环作为盾构穿越桥桩的试推进阶段，在此20环的实验段内，需要把握分析出土量、推进速度、刀盘扭矩等六个主要因素与施工过程中的变形沉降关系，进而更好把控土体性质分析和土体变形沉降规律，从而达到正确设定盾构施工参数和正确采用减少土体沉降变形措施的目的。
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user: 2. 盾构穿越桥桩预掘进实验 2.1. 工程概况 本次实验取用新疆地铁1号线某区间作为研究现场。该区间位于城北主干道下方，东西向布设，区间右线全长2667.232 m，左线全长2663.604 m。区间出站后，向西穿越乌准铁路桥。乌准铁路桥为双线桥(现状为单线运营)，铁路桥下方为城北主干道，施工中的乌鲁木齐1号线隧道下穿范围桥梁结构型式为后张预应力混凝土连续梁桥。该区间拟采用土压平衡盾构机盾构法施工，区间隧道在里程YJDK2+650~YJDK2+765处侧穿乌准铁路桥桩。区间左线隧道距离桥梁桩基最近距离为6.6 m，区间右线隧道距离桥梁桩基最近距离为4.6 m。 2.2. 确定掘进参数 采用盾构施工法新建地铁隧道时，根据朱嵘 [ 5 ] 等人的研究可知，地铁隧道近距离穿越已建铁路桥桩会造成土体松动，由于松动会诱导整个工作面上土层的土体扰动从而发生变形。所以，确定施工中各掘进参数对本实验中所观测的变形沉降量的影响具有重要意义。参考颜波 [ 3 ] 等人的研究并结合本实验区间具体工况，得出了各主要掘进参数的确定原则如下： 1) 推进速度：由于推进速度过快可能造成正面土体受压而变形隆起；而过慢的推进速度则易产生较为严重的叩头现象，使得在施工高程上产生移动而偏离原有的设计轴线。因此，施工过程中对推进速度有严格要求。理想的推进速度应选取合理参数来保证刀盘切削土壤而非挤压土体。过量的挤压会造成过大地层扰动量，实际中只需根据实际情况选取稳定参数匀速推进即可。 2) 土仓压力：土仓压力是一个极为重要的对土体沉降变形产生直接影响的掘进参数，且其侧面反映影响沉降的数值大小 [ 6 ] 。例如过大的土仓压力，易造成桥桩上周的地表易发生突出隆起现象，威胁到安全性能。根据土压盾构平衡原理，推进土仓压力要与开挖正面土体压力保持平衡来保证施工平稳推进。参考土力学原理，即可计算出开挖正面土压力值，但由于侧穿既有结构则必须考虑附加应力，故而其压力值应当适当增加0.2~0.3 bar。 3) 出土量：通过颜波 [ 3 ] 等人的研究可知，盾构施工排土量多少直接影响到盾构开挖面稳定盾构正面土压力，控制排土量是控制地表变形的重要措施。实际工程中，考虑到可能存在超挖和地层损失等现象，往往出土量的取值为计算理论值的90%左右为最佳。 4) 注浆量：盾构机施工前进时，由于存在盾构外围的建筑空隙，工程上采用注浆法填充空隙。注浆的质量直接反应后期变形沉降的控制好坏，因而，注浆量必须控制在合理范围。盾构施工中由于是机器与人工共同操作会产生渗漏现象，故此注浆量一般取外围建筑空隙的1.5~1.8倍为宜。 5) 总推力：总推力作为盾构施工的重要参数，往往直接反映其对土壤扰动的情况。例如，过大的推力会造成盾构机上方土体向上隆起。故此，严格控制总推力取值对施工具有重要意义。但实际工程中，由于地质条件的复杂性决定了准确预算总推力大小的困难性。本次预掘进实验中，参考了孙捷城 [ 7 ] 等的研究，确定了总推力在数值计算上主要由盾构侧面与周围土层的摩阻力和盾构掘进的正面阻力之和所构成。 6) 刀盘扭矩：将刀盘扭矩控制在合理的范围，以减小对盾构机的磨损，同时，以防止推进速度过慢或者产生超挖施工，进而避免造成施工工期延迟或地表沉降值变化过大。刀盘扭矩主要由刀盘切削土体扭矩等六部分组成，因此本次实验采用孙捷城 [ 7 ] 等人的计算方法，在此不过多赘述。 总之，多重因素对盾构施工中的地表沉降变形产生影响，且盾构在施工中对不同因素的敏感不一。所以本次实验通过各盾构掘进参数与地表沉降的实时敏感性分析，兼顾把握各施工地区地质、土层情况，定量的研究主要的施工参数与变形沉降值的相关关系。 2.3. 确定变形监测位置 盾构施工过程中，由于土体缺失造成周围土体不同程度的变形而土压力释放。本次预掘进实验采用近距离匀速施工，则必须对推进影响范围内的掘进参数和沉降量进行重点监测。 本次实验中，取盾构穿越的50 m范围作为监测区段。并沿隧道中心线每5 m布置一个沉降监测点，同时，各布设2条垂直于隧道轴线监测横断面，每个横断面布设11点，轴线中心一点，轴线左右各布5点，距离轴线分别为2.5 m、6.5 m、11.5 m、16.5 m、21.5 m。乌准铁路桥变形监测详细布置如图1所示。 图1. 乌准铁路桥监测点布置示意图 2.4. 其他要求 1) 前期准备：①穿越桥桩前，对所有施工人员进行技术交底，使他们清楚准确的知道各桥桩和盾构穿越时的相对位置，并针对不同复杂情况应掌握的施工技术。②在施工过程中，应该及时总结该穿越地段土层地质条件，掌握其对应的盾构施工方案以及把握施工阶段的盾构推进施工参数和同步压浆量，进而不断优化施工方案。③盾构掘进至桥桩前50米时，需对盾构施工的各仪器、部件和系统进行检查与调试以达到最优工作状态，保证穿越桥桩过程中不发生机械故障和压浆管路堵塞情况。 2) 控制要求：①监测要求：施工侧穿时，可适当增加对地面变形、桩位变形和桥桩倾斜程度的观测次数，并根据实际施工情况而加以合理的调整。②切口土压力施工参数控制：在盾构穿越桥桩下土层进程中应严格把控切口的平衡土压力与切口压力相关的如总推力、刀盘扭矩等施工参数；同时，还应该尽可能的降低土压力变化波动频率。因此，在此次实验中，盾构推进速度要以2 cm/min为最佳，出土量也宜不超过计算的理论数值33.1 m³/m。③均匀施工：为降低推进穿越进程可能产生的不利影响，需做到平衡均匀的推进通过。④管片拼装控制：为保证施工按时完成，拼装时必须安排最干练的工人进行作业以尽量降低安装时间，与此同时，拼装结束后，要继续以合理的速度立即进行下一环的推进工作来防止土体表面的变形。⑤盾构纠偏量控制：保持盾构前进姿态尽可能的变化不太，也不可过频的变换其前进姿势。每一环都需检查管片超前量，隧道轴线和折角变化不能超过0.4%。⑥同步注浆控制：把控好同步注浆的剂量和浆液质量；同时为减少施工中变形沉降，必须保证同步注浆及时有效的填充掘进前进产生的建筑空隙。⑦信息化施工：施工时必须密切监测地面变形沉降数值，做到最少每四小时进行一次全面测量，且将监管数据及时传递给值班人员，在分析过后还必须立即反馈盾构现场人员以供及时调整；穿越铁路桥必须按照实际工况进行全天候的连续跟踪检测。⑧后期补压浆控制：对于施工产生的建筑空隙，在完成填补其空隙的同步注浆工作完成后，会产生由于盾构机不断推进而浆液随时间推移而收缩变形而导致地面沉降的问题，因此视实际情况，在管片脱出盾尾5环后，对管片的建筑空隙进行二次注浆。⑨壁后跟踪控制：待盾构穿越后，必须对桥桩继续进行跟踪监测直至桥桩变形趋于稳定。
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user: 3. 预掘进实验掘进参数与沉降分析 推进前20环作为盾构预掘进实验区段，在本实验段内，主题把握推进速度、注浆量、土压力、出土量、盾构施工总推力和刀盘扭矩等几个主要因素与地表变形沉降的关系，同时，密切监测实验段的变形量和变形速率，从而把握此区间的土体性质和土体变形特点，进而更好的设定施工参数和采取减少沉降的措施，以保证施工的安全可靠。 3.1. 试验段掘进参数分析 本次实验中，对预掘进区段的20环按每两环进行划分，并且对每两环施工过程中的推进速度等六个参数进行跟踪监测。图2至图7所示为各主要掘进参数在预掘进实验阶段内的监测图： 图2. 测点所在环数与推进速度 图3. 测点所在环数与土压力 图4. 测点所在环数与出土量 图5. 测点所在环数与注浆量 图6. 测点所在环数与总推力 图7. 测点所在环数与刀盘扭矩 研究表明，各掘进参数总会不同程度的影响地表沉降变形。故此，本次实验参考了国内大量具体施工案例分析，并结合图2至图7中所描述的该区间内预掘进实验的各参数情况，确定了后期施工的掘进参数调整方法。具体如下： 1) 推进速度主要分布在40~50 mm/min范围内，是为了保证盾构施工平稳推进，且不影响周围桩基承载力所必须采取的措施之一。推进速度要保持均匀稳定，若土层情况良好时，可适当加快推进速度，同时合理增加顶部土压力和推顶力，可有效控制地表沉降。 2) 掘进土压力在前十环由于处于盾构始发阶段，还未形成稳定土仓压力，故而，此后基本保持在0.2 bar左右。掘进过程中，存在软质土层与管片拼装过程，故而在施工中存在土压力下降甚至到零值附近。具体施工时，可由土力学原理计算盾构掘进土压力，并考虑到附加引力情况，适当增加0.2~0.3 bar。 3) 出土量在前期出现小量增加是由于盾构开始是未稳定现象，而后，随着盾构机匀速平稳前进，其出土量保持在46~49 m 3 左右则更利于减少土体扰动。出土量与推进速度、土压力密切相关，由于该地区土质条件良好，推进速度保持均匀，但考虑到土压力出现波动，取土量为0.9倍左右的理论计算出土量。 4) 注浆量主要控制在5~7 m 3 /环左右，土层复杂情况不一，掘进速度在出现波动而导致注浆量在该范围内上下波动。应该注意的是，出现渗透量较大的土层则可以适当增加注浆量来减少土层损失。此外，注浆过程实际是为了填充建筑空隙，因此，要保证浆液质量，避免沉降过大，若需要时，可采取二次注浆法以减少地表变形沉降。 5) 盾构推进总推力主要在7000~11，000 kN范围内。前期盾构机始发状态则不稳定，造成波动向上；而后遇到相对硬质土层，则推力适当增加来保证推进速度均匀。由于总推力过大，而注浆液体需要硬化稳定期，则会加快土体变形速率，因此，总推力应该维持在稳定范围达到控制沉降的目的。根据监测情况，总推力在9000 kN左右为宜。 6) 刀盘扭矩主要分布在3000~4000 kN·m，相对来说，该区段内的土层总体上较均匀，故而扭矩的波动范围还算较小。当然，盾构施工开始后，将会逐渐增加到维稳数值而匀速推进。图中监测表明存在波动情况，为防止过大的地表沉降，因此，本实验区间刀盘扭矩是根据实际地质条件并结合刀盘切削土壤等各部分扭矩计算得出。 3.2. 实验段沉降监测分析 盾构施工过程中会对土体产生挤压或松动，从而引起地表及构筑物出现沉降现象。因而，需对预掘进实验区段的沉降量、变形速率进行监测，以防止出现过大的变形，保证盾构后期施工的安全性和地面铁路的正常运营。图8至图15为预掘进实验阶段在某几天对各监测点的沉降量和变形速率的监测图。 图8. 测点所在环数与变形速率 图9. 测点所在环数与沉降量 图10. 测点所在环数与变形速率 图11. 测点所在环数与沉降量 图12. 测点所在环数与变形速率 图13. 测点所在环数与沉降量 图14. 测点所在环数与变形速率 图15. 测点所在环数与沉降量 以国内多条盾构穿越铁路桥桩的施工案例作参考，提出了下穿沉降监测预警值要求如下：地表的累计沉降控制在不大于10 mm内，沉降速率报警值为±1 mm/天 [ 5 ] 。且由图中可知，7月25~28日的监测沉降量和沉降速率处于监测预警范围之内，因此符合实验阶段的施工要求。 同时，为了后期盾构施工有一个合理的控制标准，并结合本次预掘进实验的新疆地区的土层情况与施工难易程度总结出以下的监测预警方案和处理措施： 地表累计沉降控制在±10 mm，沉降速率报警值为±1 mm/天。依据设计沉降控制标准，监控量测实施按照三级预警进行反馈和控制，一旦出现预警马上启动应急预案，按照应急预案要求采取相应的措施，见表1。 Table 1 Three level warning mechanism decision tabl 预警级别 措施 预警状态描述 黄色预警 增加监测频率 “双控”指标(变化量、变化速率)均超过监控量测控制值(极限值)的70%时， 或双控指标之一超过监控量测控制值的85%时； 橙色预警 加强支护 “双控”指标均超过监控量测控制值的85%时，或双控指标之一超过监控量测控制值时； 红色预警 暂停施工 “双控”指标均超过监控量测控制值，或实测变化速率出现急剧增长时。 表1. 三级预警机制判定表
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user: 4. 结论与建议 通过上述研究，本文获得了以下几点结论和建议： 1) 本文总结了盾构近距离穿越铁路桥引起地表变形沉降隧主要影响因素为推进速度等六方面。并结合工程案例，确定了该区间施工时各个掘进参数的确定原则和简单调整方法。但六个参数有机结合对盾构施工和沉降变形的影响还有待研究。 2) 盾构施工穿越已建成铁路桥桩时，根据预实验段沉降量和变形速率的监测，参考大量实际工程案例，分析得出预掘进试验期间并未引起铁路桥出现超出范围的变形沉降。 3) 结合该地区具体工况，确定了变形沉降监测预警值，并据此建立了三级预警机制，为后期盾构施工中出现超出预警值范围的不同情况提供了处理措施。 4) 依据预掘进实验段掘进参数和地面沉降数据，并结合该区间施工情况，于后期施工中提出了以下几点建议：①上部土压力不得低于0.2 bar，保持满仓推进。②推进速度不宜过快或过慢，保持在4~5 cm/min。③严格控制出土量，不得超挖，每环出土量控制在47~48 m³左右。④严格控制注浆量，保证建筑间隙填充完全，每环注浆量6.5 m³，并根据注浆压力适度调整。⑤严格控制总推力和刀盘扭矩，不宜有过大波动。⑥成型的隧道要及时开孔检查注浆填充情况，填充不饱满的要及时进行二次注浆，二次注浆压力不得超3.5 bar。
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user: 摘 要 蜡样芽孢杆菌是一种食源性条件致病菌，它能产生一种呕吐毒素cereulide和多种肠毒素；该菌引起的食物中毒在亚洲以呕吐型比较常见，致吐毒株(Bc emetic strains， Bce)在淀粉类食物和乳制品中分布较广，所致食物中毒的报道近年激增，但防治措施研究鲜有报道。通过综述蜡样芽孢杆菌毒素作用、致吐毒株的分布、cereulide生物合成与调控方面的进展，为防治该类食物中毒提供依据。 关键词 :蜡样芽孢杆菌，呕吐毒素，生物合成，食物中毒 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 蜡样芽孢杆菌与食物中毒 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus， Bc)为革兰氏阳性、产芽孢的兼性厌氧杆菌，在普通琼脂平板上菌落较大，灰白色，表面粗糙似融蜡状。该群中还有与Bc同源性高度相似的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、覃状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)和韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)等。 该菌广泛分布于土壤、水、尘埃、可食的块茎 (如马铃薯)中，常污染淀粉类制品和乳制品，在芽孢杆菌中致病性仅次于炭疽芽孢杆菌；Bc作为一种条件致病菌，偶尔引起人的眼部感染，更常见的是引起食源性中毒 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 和菌血症、急性脑病甚至横纹肌溶解 [ 4 ] [ 5 ] 。通常中毒症状较温和而且病程不超过24 h，通常导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。 1) 呕吐型：由致吐毒株(Bcemetic strains， Bce)预产生(pre-form)呕吐毒素(cereulide)引起。该毒素耐高温、耐pH值、能抗消化酶解。进食0.5 h ~6 h后出现恶心、呕吐，严重者可出现爆发性肝衰竭而迅速死亡 [ 1 ] [ 6 ] ；目前的各种食品加工方法，包括灭菌，均无法使cereulide失活。如果摄取的食物中含cereulide，它能够保持完整并可能转化成活性毒素吸附于内脏。 2) 腹泻型：由非致吐毒株产生不耐热肠毒素引起，进食后6 h~15 h发病，持续24 h后自愈 [ 1 ] [ 3 ] 。迄今已发现至少有5种不同的肠毒素，包括2个三元毒素：溶血素HBL(hbl)、非溶血性的肠毒素Nhe(nhe)；3个单一基因的产物：细胞毒素K(cytK)、肠毒素T(bceT)和肠毒素HlylI。肠毒素进入胃中会被破坏，故腹泻型食物中毒是因残留的Bc在小肠中产肠毒素引起的。引起该类中毒的食物包括肉类、海鲜、乳品和蔬菜等，欧美国家多见。主要症状是水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，少见呕吐。一般导致中毒的食品中Bc数量在10 5 cfu/g ~10 8 cfu/g，也有在数量较低的情况下(10 3 cfu/g ~10 4 cfu/g)致病 [ 1 ] 。 该菌引起的食物中毒在亚洲以呕吐型比较常见 [ 3 ] [ 7 ] 。引起呕吐型中毒的致吐毒株多分布在淀粉类食品(炒饭、米粉或土豆泥等)以及乳制品中(表1)。章乐怡等调查了国内市售的34份婴幼儿奶粉和5份米粉，Bc检出率为71.8%，其中致吐毒株占17.9% [ 8 ] 。特别适合致吐毒株产毒的食材包括熟米饭，熟米饭于20℃ 12 h~16 h后产生呕吐毒素达0.36 μg/g，土豆泥、面条以及意大利通心粉产毒 0.08 μg/g~0.16 μg/g、紧随其后，面包、蛋糕仅产cereulide 0.02 μg/g，蛋、鱼以及肉制品可维持该菌生长但产毒不明显(<0.005 μg/g) [ 13 ] [ 14 ] 。另一项研究显，28℃ 48 h条件下，致吐毒株在土豆泥中产毒高达4.080 μg/g，在意大利面中3.30μg/g，在米饭、牛奶中分别产毒2.01 μg/g和1.14 μg/ml [ 13 ] [ 15 ] 。对于大规模食源性呕吐中毒事件的研究显示cereulide剂量为0.01 μg/g~1.28 μg/g食物，即体重约70 kg的成年人摄取100 g此类食物就可引起呕吐中毒 [ 12 ] [ 13 ] 。除了淀粉类食物之外，乳制品中检出致吐毒株的比率居高不下，比如：研究者于2014年~2015年从321份牛奶、环境样本以及蜡样芽孢杆菌益生菌产品样本中分离得到110株蜡样芽孢杆菌(分离率为34.5%)，其中从1株牛奶样本中分离到的蜡样芽孢杆菌(编号CAU45)分泌cereulide能力是标准菌DSMZ4312的17倍 [ 17 ] 。过去几十年因缺乏灵敏的检测方法以及Bc所致的胃肠道症状常归因于其它食源致病菌(如金黄色葡萄球菌)，蜡样芽孢杆菌致吐毒株(Bce)发生率被大大低估。近十年来随着多重PCR、荧光素酶报导菌株原位检测与质谱技术的发展，食源性致吐毒株的检出率和诊断率显著提高。自2006年以来，致吐毒株所致食物中毒的报道激增，而且还在持续升高 [ 9 ] 。最近的典型例子包括比利时一个幼儿园爆发蜡样芽孢杆菌所致食物中毒，在食物中检测到了高含量(达4.2  μg/g)的cereulide [ 18 ] 。 Table 1 Distribution of B. cereus emetic strains in food specimen 样本来源 n Bc Bce % 参考文献 西兰花(生) 25 8 0.0 [ 43 ] 胡萝卜(生) 25 21 0.0 [ 43 ] 胡萝卜(生) 25 22 0.0 [ 44 ] 马铃薯(生) 25 21 16.0 [ 44 ] 马铃薯(生) nd 8 60.0 [ 2 ] 香菜(生) 25 11 0.0 [ 43 ] 莴苣(生) 25 17 0.0 [ 43 ] 莴苣(生) 48 44 0.0 [ 29 ] 大米(煮熟) 54 41 17.1 [ 45 ] 大米(生) nd 103 26.2 [ 46 ] 大米(生) 78 44 11.3 [ 29 ] 水果 27 15 0.0 [ 29 ] 干蘑菇 135 110 10.0 [ 29 ] 乳制品 212 110 18.5 [ 29 ] 乳制品 809 508 4.7 [ 47 ] 乳制品 nd 161 10.0 [ 48 ] 肉制品 121 0 0.0 [ 29 ] 肉制品 nd 24 0.0 [ 48 ] 表1. 食品中蜡样芽孢杆菌致吐毒株的分布 n，样品数；nd，未统计；Bc，样品中分离到的蜡样芽孢杆菌数目；Bce %，分离到的蜡样芽孢杆菌群中致吐毒株(Bc emetic strains)百分比。
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user: 2. 蜡样芽孢杆菌致吐毒株(Bce)的分布 Bce在环境中分布率很低，如土壤检出率为0%~0.2%，但一些植物的根/块茎则是其最适定殖场所，Bce以共生菌或生物膜形式存在其中 [ 9 ] 。水稻根部为Bce的大本营 [ 10 ] 。植物地上部分在收获时易被含Bce的根围菌污染、或经啮齿动物污染，进而污染粮食(图1)。植物地上部分用作草料后可污染奶牛乳房，进而使Bce污染乳制品 [ 9 ] 。2013年，Bce作为共生菌在马铃薯块茎的细胞间隙中被发现，该菌对马铃薯块茎无害 [ 2 ] 。已知活植物体间质空间和维管系统是缺K的微环境 [ 11 ] 。Bce所产生的cereulide能在贫钾环境中搜寻钾，还可抗真菌以保护块茎免受病原真菌的侵袭 [ 11 ] [ 12 ] ，因此cereulide生物合成有利于Bce适应环境。
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user: 3. 呕吐毒素(cereulide)的生物合成与调控 作为蜡样芽孢杆菌致吐毒株(Bc emetic strain， Bce)的毒力因子，cereulide是一种环肽，其结构为[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] 3 ；cereulide结构与活性上类似于已知的线粒体毒肽−−缬氨霉素，均为特异性K + 载体。cereulide与K + 亲和力强于缬氨霉素，故前者对哺乳动物毒性更强；cereulide通过异常升高线粒体内K + 浓度而使线粒体肿胀、膜电势消失、呼吸链受抑。除了破坏线粒体功能之外，医学研究表明cereulide对人体有多种毒性，如：抑制天然杀伤细胞(natural killer cell， NK)而影响免疫力；在胃中干扰血清素(5-HT3)神经感受器的信号传入而导致肠胃炎；引起急性肝衰竭 [ 4 ] [ 5 ] 。另据比利时公共卫生中心Vangoitsenhoven教授团队的报道，cereulide在极低浓度下(~4 ng/g食物)能破坏胰岛β细胞，导致细胞凋亡和胰岛功能异常；研究人员指出长期食用污染cereulide的食品与糖尿病发生密不可分，并认为食源性cereulide可能是近年亚洲地区糖尿病发生率持续上升的元凶之一 [ 16 ] 。 图1. 蜡样芽孢杆菌致吐毒株的潜在生态位 (修改自：参考文献 [ 9 ] ) 致吐毒株(Bce)中， 呕吐毒素cereulide的生物合成由ces-非核糖体肽合成酶(ces-NRPS)负责，ces基因簇(24kb)位于大型质粒pCER270上(图2)，由cesH，cesP，cesT，cesA，cesB，cesC和cesD组成 [ 6 ] [ 9 ] [ 19 ] 。其中cesPTABCD组成一个操纵子(ces-operon)，在主要启动子P1驱动下转录成一条23 kb多顺反子mRNA链，而相邻的cesH由自身启动子P H 驱动转录成单顺反子。ces基因簇包括典型的非核糖体肽合成酶(ces-NRPS)基因，如：启动NRPS合成必需的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因cesP、II型硫酯酶的编码基因cesT、负责肽链装配的酶模块基因—结构基因cesA和cesB。此外，ces基因簇还有3个ORF：位于ces基因簇5’-端的cesH基因，编码产物推定为水解酶；位于基因簇 3’-端的cesC/D 基因，产物推定为ABC转运蛋白 [ 6 ] [ 20 ] 。 图2. Cereulide生物合成基因簇的组成(修改自：参考文献 [ 6 ] [ 20 ] ) 蜡样芽孢杆菌亚群(Bacillus cereus group或Bacillus cereussensulato) 包括狭义的蜡样芽孢杆菌(B. cereus sensustricto)、苏云金杆菌(B. thuringiensis)、炭疽杆菌(B. anthracis)、韦氏芽孢杆菌(B. weihenstephanensis)等，它们具有相似的生理生化特征和极高基因组同源性，主要差异在于携带不同的产毒质粒而各具致病与宿主特异性 [ 21 ] 。已发现Bce毒株大多属于狭义的蜡样芽孢杆菌，也有几株鉴定为韦氏芽孢杆菌(B. weihenstephanensis)。ces-NPRS基因簇已公认为Bce的分子标记，十年来发展起来的多重PCR检测毒素合成基因(ces A， B)转录水平的技术即基于此原理 [ 19 ] [ 20 ] 。环境中产毒质粒会自然丢失，同时也具很高的水平转移潜能 [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] 。2014年研究发现ces-NRPS在蜡样芽孢杆菌亚群成员——狭义的蜡样芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌之间有水平转移 [ 21 ] 。 呕吐毒素的生物合成受细菌内在因素与环境诸多条件的影响：1) 只有细菌密度达到一定阈值(>10 6 cfu/mL)时，毒素合成才启动 [ 12 ] ；2) 环境中的营养物、NaCl、温度、氧、pH和水活度等均可影响毒素的合成 [ 9 ] 。然而这些环境因子如何被致吐毒株所感知、如何调节细胞生理/代谢并作用于毒素合成通路的机制尚不清楚。 大量研究表明，ces-NRPS基因转录(即cereulide的合成)在Bce的对数生长期后期启动，进入稳定期后迅速关闭，体现出严格的时间控制，并与环境中营养物质等因素有关 [ 9 ] 。这种调控可能是由细菌的多效性转录调节子如CodY、Spo0A等来实现的。在Bce中，CodY调节染色体与质粒pCER270间的信息交流，从而将细菌的营养/能量状态与致病性紧密联系起来。当CodY辅阻遏物(支链氨基酸，GTP等)下降、但细胞饥饿状态不太严重、且产孢通路已启动时，ces-NRPS才启始表达。当细菌感知氨基酸缺乏，则进入分岔途径——细胞分化：大幅度下调分泌型蛋白(如：不耐热肠毒素)的产生而转向到cereulide的生物合成通路 [ 9 ] 。Spo0A不仅调控产孢而且调控生物膜形成以及呕吐毒素的合成启始。Spo0A主要经由跨膜蛋白KinC/D (histidine kinase C/D，组氨酸激酶C/D)引起Spo0A磷酸化(Spo0A~P)，进而下调转录阻遏子AbrB和SinR，而SinR的去阻遏则导致生物膜形成中胞外基质合成相关基因的激活，故Spo0A磷酸化(Spo0A~P)能触发生物膜形成，是细菌迅速应对环境中竞争菌的一种群体感应(quorum-sensing， QS)机制 [ 24 ] [ 25 ] 。同时，Spo0A的磷酸化也能通过AbrB的去阻遏而启动cereulide合成 [ 9 ] 。 另一个可能的调控机制是LuxS QS (群体感应)系统。LuxS QS广泛存在于G+和G-细菌中，LuxS蛋白作为自诱导剂-2 (Autoinducer-2， AI-2)合成酶，是LuxS QS系统的必需元件。AI-2调节依赖于细胞密度的细菌种内/种间通信，参与到细菌致病性、毒素产生、生物膜形成以及生物发光等次生代谢的调控中 [ 24 ] 。在混杂的微生物群体中，AI-2能感知它种菌的细胞密度、进而决定是否启动有利自身生存的策略，比如细菌素的合成。蜡样芽孢杆菌具有AI-2介导的LuxS QS信号通路 [ 24 ] [ 26 ] [ 27 ] ，而且呕吐毒素cereulide能抑制其它蜡样芽孢杆菌但不抑制致吐毒株，可视为细菌素 [ 12 ] 。Qian等研究表明， 碱性环境中蜡样芽孢杆菌AI-2的产生依赖于细菌生长周期：在对数期晚期达最高，稳定期初期开始下降 [ 26 ] ，此与cereulide生物合成的动态特征相一致。迄今研究表明，蜡样芽孢杆菌生物膜受Spo0A调节机制与同属的枯草芽孢杆菌 (模式微生物) 高度类似，均由QS调控 [ 24 ] 。2016年Duanis-Assaf等揭示，枯草芽孢杆菌生物膜形成受AI-2介导的LuxS QS调控，乳糖可促进AI-2产生而参与调控生物膜形成 [ 24 ] 。这与以往报道的葡萄糖刺激细菌AI-2合成 [ 28 ] 、葡萄糖对呕吐毒素的合成有刺激效应 [ 29 ] 相似。 Lücking等报道cesH基因编码的CesH蛋白也能抑制呕吐毒素的合成：cesH插入失活突变后比野生型产毒更多，而在致吐毒株F4810/72 (致吐毒株的参考菌株)中过表达CesH则丧失产毒表型，cesA、B的转录水平大幅下调 [ 6 ] 。作者认为cesH是关闭mRNA合成的一个“切断”信号，但其具体的分子机制有待进一步研究。
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user: 4. 蜡样芽孢杆菌的抗生素耐药性 蜡状芽孢杆菌对抗生素表现出抗性。最熟知的抗性是针对β-内酰胺类抗生素比如青霉素、氨苄西林、苯唑西林，因为几乎所有的蜡状芽孢杆菌(除炭疽芽孢杆菌之外)，都携带β-内酰胺酶基因。虽然炭疽芽孢杆菌携带β-内酰胺酶基因bla1和bla2，但因其表达被抑制而导致对β-内酰胺的敏感性 [ 30 ] 。大多数蜡状芽孢杆菌对复方增效磺胺具有抗性 [ 31 ] [ 32 ] ，虽然抗性水平因菌株而异。同样的，对于磷霉素的抗性在这些细菌类群中普遍存在。有趣的是，研究发现在某些菌株中，抗性相应基因位于移动插入盒(MIC)上 [ 33 ] 、或者炭疽芽孢杆菌特异性的γ-噬菌体上 [ 34 ] ，提示其具有潜在的可移动性。 蜡状芽孢杆菌对其它抗生素的抗性差异较大而且与菌株相关 [ 35 ] [ 36 ] 。四种最常见的抗性分别是针对氯林可霉素（林肯酰胺）(多达60%)、四环素(10%~33%)和左氧氟沙星(氟喹诺酮) (约10%)。针对万古霉素与红霉素的抗性并不常见。最后，针对环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、利福平、链霉素或者卡那霉素的抗性在狭义的蜡状芽孢杆菌或者苏云金芽孢杆菌中尚未报道。 一个有趣的现象是关于蜡状芽孢杆菌针对某些抗生素的行为：暴露于氨基糖苷类抗生素会诱导蜡状芽孢杆菌致吐毒株的表型转变为缓慢生长的小菌落变种，提示其通过缓慢生长的方式来逃避抗生素的杀菌作用 [ 37 ] 。 蜡状芽孢杆菌的这些抗生素抗性基因一般位于染色体上，虽然有些抗性基因位于潜在的可移动组件(如对于磷霉素而言的移动插入盒与噬菌体上)或者位于可移动组件比如质粒上。早在1978年，Bernhard等描述了一个携带四环素抗性的蜡状芽孢杆菌小质粒pBC16。同样的，质粒相关tetA，tetB已在食源性蜡状芽孢杆菌菌株中被发现 [ 32 ] 。蜡状芽孢杆菌类群里的细菌具有通过接合和转导方式来相互交换遗传物质的潜力，特别是当遗传因子(比如抗生素抗性基因)位于接合质粒或者可移动的质粒上。
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user: 5. 蜡状芽孢杆菌cereulide防治的进展 近年来，全球范围内食品安全事件时有发生，食源性疾病的发生率也居高不下，而Bc在自然界广泛分布，特别是致吐毒株Bce所产毒素cereulide由于耐热、毒性较强引起了人们的极大关注。虽然目前关于Bce的生态位以及cereulide结构与活性的研究取得较大进展，但是针对其所致的呕吐型中毒以及其它健康威胁(如糖尿病)的防治才刚刚起步。目前采用的防治方法包括物化手段(如添加有机酸、萜类化合物、壳聚糖季铵盐、ε-聚赖氨酸)、非特异性的生物抑菌方法(如细菌素、乳酸菌素) [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] 。这些措施均着眼于抑制致吐毒株的生长，而不是阻抑呕吐毒素的合成。即使致吐毒株的生长受抑，其毒素cereulide在食材中已预先合成，仍具有毒性，其含量在0.02 μg/kg~1.83 μg/kg体重时即达到呕吐中毒的剂量 [ 13 ] 。抑制食材中cereulide的生物合成应是防治的重点。然而迄今国内外只有一则此类报道：采用食品添加剂长链多聚磷酸盐(polyPs)抑制cereulide的生物合成 [ 42 ] 。鉴于所有细菌中都存在polyPs的天然类似物而发挥生理作用，外源添加polyPs会对胞内ATP合成、蛋白质折叠或酶活性产生不利影响 [ 42 ] 。若长期使用可能造成一些不良后果，比如：致吐毒株抗性菌株出现。因此探索和开发从源头阻抑cereulide生物合成的防治方法迫在眉睫。 与此同时，还需要监控蜡样芽孢杆菌的耐药性。随着抗生素的普遍使用，蜡样芽孢杆菌能够对抗菌药物产生耐药性，该菌携带抗性基因在自然界中可转移，对人类健康的危害不容小视。
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user: 摘 要 本实验克隆并构建了携带红荧光报告基因的Nudel真核表达载体，为后续研究Nudel基因的功能打下基础。查阅Gene card可知，Nudel基因在肺组织中的RPKM值为7.97，本研究以人肺癌细胞A549细胞为材料，提取总RNA并反转录出cDNA，再以cDNA为模板扩增Nudel基因；将目的基因与pMD18-T载体连接，测序鉴定并命名为pT-Nudel；然后再将Nudel基因亚克隆至含红荧光报告基因的载体pDsRed-C1，构建的表达载体命名为pRed-Nudel；提取去内毒素的超纯质粒，转染COS7细胞，检测Nudel的表达情况以及抑癌基因Pten对Nudel表达的影响。结果表明，克隆的Nudel基因经测序鉴定正确；将Nudel基因亚克隆至红荧光表达载体pDsRed-C1，成功构建pRed-Nudel，并在COS7中成功表达。同时观察到与突变型的PtenC124S相比，野生型的Pten有抑制Nudel表达的可能，需要后续的实验进一步验证。 关键词 :Nudel基因，cDNA克隆，基因表达，抑癌基因Pten，COS7细胞 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 Nudel是一类进化上保守的蛋白，在体内参与多个信号通路的调控与疾病的发生。Nudel与多种蛋白质相互作用，包括dynein、lissencephaly 1蛋白(Lis1)、精神分裂症1 (Disc1)和 14-3-3 ζ [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 。Eva Klinman等人的研究显示，Nudel/Lis1复合体通过直接调控动力蛋白的活性，激活异常的CDK5，进而引起神经轴突的运输中断，而轴突运输的中断与很多神经退行性疾病有关 [ 4 ] 。Moon等人的研究表明，Nudel集中于着丝粒附近，调控有丝分裂纺锤体的形成和有丝分裂的过程 [ 5 ] 。另外，Nudel具有寡肽酶活性，有望作为潜在的精神分裂症的生物分子标记 [ 6 ] 。Nudel可以与动力蛋白相互作用而影响细胞运动和物质运输，例如溶酶体运输 [ 7 ] 和细胞器的定位 [ 8 ] 。Nudel也可以不依赖细胞质动力蛋白而参与细胞迁移，它通过与Cdc42竞争结合Cdc42GAP，使Cdc42从Cdc42GAP上释放而被活化，从而阻止细胞的极化与伪足的形成。除此之外，Nudel通过与黏着斑蛋白桩蛋白相互作用，而有助于在迁移细胞的前缘形成新的吸附 [ 9 ] 。细胞迁移与肿瘤转移密切相关，Pten是著名的肿瘤抑制因子，很多研究表明，Pten是细胞运动的负调控因子 [ 10 ] [ 11 ] ，在Pten突变体中，细胞运动和增殖会加剧，这是细胞癌变的标志 [ 12 ] 。Pten是细胞骨架的通用开关，通过调控肌动蛋白和微管防止细胞过度增殖 [ 13 ] 。本研究以A549细胞为材料，进行Nudel基因的克隆、鉴定及在COS7细胞中的表达等，并初步检测了抑癌基因Pten对Nudel表达的影响，为进一步研究Nudel基因对及细胞迁移的影响打下基础。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 A549细胞、pDsRed-C1载体、感受态细胞DH5α由本实验室保存；pMD18-T、T4连接酶购自TaKaRa公司；内切酶Xho I、BamH I购自Thermo公司；胶回收试剂盒：E.Z.N.A Gel Extraction Kit(100)试剂盒；质粒提取试剂盒：E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I(100)试剂盒；超纯质粒提取试剂盒：E.Z.N.A Endo-free Plasmid Mini II试剂盒，Trizol、逆转录试剂盒M-MLV购自Invitrogen公司；转染试剂PEI购自Proteintech公司。 2.2. RT-PCR扩增Nudel目的基因 选取生长状态良好的A549细胞(培养条件：RPMI 1640培养基，10%胎牛血清，37℃，5% CO 2 )为材料，提取总RNA。以此RNA为模板，参照Invitrogen的说明书进行反转录获得cDNA。以cDNA为模板，扩增目的基因Nudel，扩增体系：ddH 2 O 15.5 μL，cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTPs ( 10 mM ) 2 μL，10 × EXTaq Buffer，EXTaq 0.5 μL。扩增条件：预变性95℃ 5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s、72℃ 1 min 30 s，35个循环，72℃ 10 min，最后4℃保存。扩增Nudel的引物，上游引物： 5’ -ATGGATGGTGAAGATATACCAG -3’ ，下游引物： 5’ -TCACACACTGAGAGGCAGCATAC-3’(引物自行设计，由武汉擎科公司合成)。 2.3. 构建pT-Nudel和pDsRed-Nudel载体 将扩增的目的基因克隆至pMD18-T载体上，进行测序鉴定，正确的克隆命名为pT-Nudel。以测序鉴定后的质粒pT-Nudel为模板，采用高保真酶扩增Nudel目的基因。扩增体系：ddH 2 O 34 μL，pT-Nudel质粒DNA稀释100倍取1 μL (约50 ng)，上下游引物各1 μL，dNTPs ( 2 mM) 5 μL，MgSO 4 ( 25 mM) 2 μL，10 × KOD buffer 5 μL，KOD Polymerase 1 μL。扩增条件：预变性95℃ 5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s、68℃ 1 min 30 s，35个循环，68℃ 10 min，最后4℃保存。扩增Nudel的引物，上游引物： 5’ -CCGCTCGAGATGGATGGTGAAGATATACCAG -3’ ，引入Xho I酶切位点，下游引物： 5’ -CGGGATCCTCACACACTGAGAGGCAGCATAC -3’ ，引入BamH I酶切位点。 2.4. Nudel基因在真核细胞中COS7中的表达 制备去内毒素的超纯pDsRed-Nudel质粒，检测DNA的浓度与纯度，转染到COS7细胞，并在荧光显微镜下进行观察。细胞转染：采用PEI转染试剂进行转染，12孔板种细胞过夜贴壁，DNA与转染试剂比例1:3 (μg:μL)，转染步骤参照PEI说明书进行，转染后30小时置于显微镜下检测。
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user: 3. 结果与分析 3.1. A549细胞总RNA的提取与Nudel基因的扩增 培养A549细胞，选取生长状态良好的A549细胞为材料，提取总RNA。RNA浓度测定表明，1号样品浓度为730 ng/μL，A260/280比值为1.98，2号样品浓度为695 ng/μL，A260/280比值为1.97，说明提取的RNA 纯度比较高。提取的RNA进行电泳检测，结果见图1(A)。可以看到清晰的三条带，分别是28 S，18 S和5.8 S，表明提取的RNA完整性良好，可以用于反转录。 以总RNA为模板，反转录获得cDNA，再以cDNA为模板，扩增目的基因 Nudel。扩增结果见图1(B)，电泳条带单一，对比DNA Marker，扩增的目的条带大小在1000 bp附近，与NCBI数据库里提供的Nudel基因(1038 bp)大小一致，初步判断扩增产物是目标产物，也说明A549细胞中Nudel基因有较高的表达水平。 3.2. 构建pT-Nudel和pDsRed-Nudel载体 将Nudel基因插入pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，菌落PCR扩增结果见图2(A)，在对应Maker1000 bp的位置有条带出现，与cDNA做模板扩增的条带大小一致。 图1. RT-PCR扩增Nudel基因。(A) A549细胞总RNA提取电泳检测：1 & 2样品均为提取的A549细胞总RNA；(B)从A549细胞cDNA中扩增Nudel基因：M：DNA marker；1、2、3均为扩增的Nudel基因片段 图2. 构建重组质粒pT-Nudel。(A) 重组质粒pT-Nudel 菌落PCR鉴定：M：DNA marker，1、2&3为pT-Nudel菌落PCR；(B) 提取pT-Nudel重组质粒DNA：M：DNA marker，1、2&3为提取的重组质粒pT-Nudel 提取重组质粒DNA，电泳检测重组质粒大小，结果见图2(B)，提取的质粒呈现3条带，中间的条带为质粒的线性条带，对比Marker，该线性条带在3000 bp和5000 bp之间，pMD18-T质粒大小为2692 bp，Nudel基因大小为1038 bp，重组质粒理论大小为3730 bp，从电泳结果判断，所提取的重组质粒大小正确，将正确的克隆进一步进行测序定。将测序结果在NCBI中用BLAST进行比对分析，本实验从A549肺泡细胞中所克隆的Nudel基因序列与NCBI数据库中的Nudel基因匹配度为100%，序列完整，并且没有发生碱基突变。 在此基础上，进一步将Nudel基因亚克隆至携带红荧光的真核表达载体pDsRed-C1上，亚克隆的限制性酶切位点为Xho I和BamH I，构建重组质粒pDsRed-Nudel。提取重组质粒，电泳检测见图3(A)，pDsRed-C1载体大小为4700 bp，Nudel基因大小1038 bp，那么重组质粒pDsRed-Nudel的大小为5738 bp，由图3(A)中性条带大小判断，所提取的重组质粒大小正确。将提取的重组质粒pDsRed-Nudel用Xho I和BamH I进行双酶切鉴定，电泳结果显示(见图3(B))，在1000 bp和5000 bp的位置分别有条带出现，与预期相符，1000 bp附近的是Nudel基因片段，5000 bp附近的是载体片段。由此可见，Nudel基因成功的亚克隆到了红荧光表达载体上，构建了pDsRed-Nudel载体。 3.3. 重组质粒pDsRed-Nudel转染COS7细胞 利用PEI转染试剂，将重组质粒pDsRed-Nudel转染COS7细胞，检测其表达情况。结果如下(见图4)，在平行转染条件下，pDsRed-C1空载体转染COS7细胞(见图4(B))，转染效率较重组质粒pDsRed-Nudel要高(见图4(D))。重组质粒pDsRed-Nudel转染COS7细胞的效率虽然较低，但是仍然观测到了荧光，初步判断pDsRed-Nudel在COS7细胞中能够表达。 图3. 构建真核表达载体pRed-Nudel。(A) 提取重组质粒pRed-Nudel：M：DNA marker；1、2、3&4为提取的pRed-Nudel重组质粒；(B) 双酶切鉴定重组质粒pRed-Nudel：M：DNA marker；1&2为重组质粒pRed-Nudel双酶切 3.4. 抑癌基因Pten及其突变体对Nudel基因表达的影响 本实验克隆Nudel的目的，是为了考察Nudel对肿瘤细胞迁移的影响，而Pten基因是著名的肿瘤抑制基因，因此本实验将野生型的Pten和突变型的Pten即C124SPten (Pten第124位的氨基酸C突变成S)，分别与Red-Nudel共转染COS7细胞，并在荧光显微镜下进行观察。结果发现，与突变型的C124SPten相比(见图5(D))，野生型的Pten与Red-Nudel共转染(见图5(B))，红荧光更少，推测124位的突变对Nudel的表达存在一定的影响。 图4. 重组质粒pRed-Nudel转染COS7细胞。(A) (B) pDsRed-C1转染COS7细胞，(A)图为白光，(B)图为激发光；(C) (D) pRed-Nudel转染COS7细胞，(C)图为白光，(D)图为激发光；注：图中比例尺为100 μm
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user: 4. 讨论 本实验以A549细胞为材料，成功获得目的基因Nudel，并构建携带红荧光报告基因的真核表达载体 pRed-Nudel。查阅Gene card可知，Nudel基因在骨髓普遍高表达，RPKM值为18.6，其次是肾上腺，RPKM 图5. Pten和PtenC124S与pRed-Nudel共转染COS7细胞。(A) (B) Pten和pRed-Nudel共转染COS7细胞，(A)图为白光，(B)图为激发光；(C) (D) PtenC124S和pRed-Nudel共转染COS7细胞，(C)图为白光，(D)图为激发光；注：图中比例尺为100 μm 值为13.4。在另外的25种组织中均不同程度检测到Nudel的表达，具体表达情况见图6，在肺组织中的RPKM值约为7.97左右，RPKM值的大小显示的是该基因在相应的组织中表达量的高低。本实验所用的是A549细胞，该细胞为人肺泡上皮细胞。实验结果表明，Nudel基因在A549细胞中有表达，因此成功扩增到了该基因，测序结果显示，该基因在A549细胞株中，没有突变。 图6. Nudel基因在不同组织中的表达水平 Nudel是一种保守的中心体蛋白质，在细胞中绝大部分分布于细胞质，但在间期在中心体上有较强的定位，在有丝分裂期分布于整个纺锤体 [ 14 ] 。在体内，Nudel对于细胞运动的关键蛋白—胞质动力蛋白发挥功能至关重要，包括细胞内运输、有丝分裂和细胞迁移等。Nudel通过与Cdc42竞争结合Cdc42GAP，使得Cdc42释放而被活化，进而促进细胞迁移 [ 9 ] 。本实验初步尝试将野生型Pten和突变型PtenC124S与Red-Nudel共转染，观察到与突变型PtenC124S相比，野生型Pten对Red-Nudel的表达有抑制作用，需要进一步实验证实，如果Pten下调Nudel的表达，Nudel水平降低，则Nudel竞争结合Cdc42GAP水平降低，那么Cdc42GAP与Cdc42结合增加，则细胞迁移降低。也就是说，Pten通过下调Nudel进而抑制细胞迁移，这与Pten抑癌基因的功能是相符的 [ 15 ] 。
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user: 摘 要 菌黄素是由植物病原黄单胞菌产生的一类附膜溴化芳香基多烯类黄色素，在溴取代、芳香环甲基化及多烯链链长方面存在结构多样性。菌黄素不仅作为黄单胞菌属的分类和诊断标记，还能保护细菌抵抗光氧化伤害，促进细菌在寄主植物表层的附生，在黄单胞菌致病性和环境适应性方面发挥重要作用。黄单胞菌基因组上一段pig基因簇负责菌黄素的生物合成，该基因簇介导了以3-羟基苯甲酸为前体物新型的II型聚酮合酶生物合成途径。本文将系统综述菌黄素结构、生物学功能和生物合成机制的研究进展。 关键词 :黄单胞菌，菌黄素，芳香基多烯链，生物合成途径 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 微生物世界丰富多彩，微生物能产生多种色素化合物。常见的微生物色素包括类胡萝卜素、黑色素、灵菌红素、核黄素、绿脓菌素等 [ 1 ] 。微生物色素具有重要的生物学功能，如抗氧化活性、抑菌活性、作为酶的辅因子等。除此以外，微生物色素还可以用作食品、化妆品以及药物的添加剂和生物指示剂，具有广泛的应用价值 [ 2 ] 。 黄单胞菌(Xanthomonas)是一类革兰氏阴性植物病原细菌，能侵染400多种植物，包括很多重要的食品及经济作物如水稻、甘蓝、大豆、木薯、柑橘、香蕉等 [ 3 ] 。其中，侵染十字花科植物造成黑腐病的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris， 简称Xcc)和侵染水稻的水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae，简称Xoo)是两种典型的模式植物病原细菌。黄单胞菌能产生胞外酶、胞外多糖、脂多糖、III型分泌效应因子及黄色素等多种致病因子辅助其侵染植物 [ 4 ] 。黄单胞菌产生的黄色素学名为菌黄素(xanthomonadin)，附着在细菌细胞外膜，导致菌落呈现亮黄色。菌黄素的研究最早可以追溯到20世纪60年代，1964年Starr等 [ 5 ] 首先报道了菌黄素可以作为黄单胞菌属细菌的分类标记；1976年Andrews等 [ 6 ] 首次鉴定了菌黄素的化学结构。1990年至今，通过多个实验室的协作研究，菌黄素的生物学功能和生物合成机制基本得以阐明。本文将系统综述菌黄素结构、生物学功能和生物合成机制等方面的研究进展。
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user: 2. 菌黄素是一类磷脂类结构的溴化芳香基多烯类色素 早期Stephens和Starr [ 7 ] 认为黄单胞菌产生的黄色素属于类胡萝卜素，随后Andrewes等 [ 8 ] 的研究结果否定了这一观点，认为该黄色素属于新型黄色色素，并命名为即菌黄素(xanthomonadin)。1973年，Andrewes等 [ 8 ] 提取和纯化了核桃黑斑病菌X. juglandis XJ103的菌黄素，发现该菌能产生两种色素复合物(I和II)，每个色素的分子量在2200左右。作者用强碱氢氧化钾处理色素复合物得到四种单一的化合物：1a，1b和2a，2b。利用质谱、红外光谱、化学反应等方法推测以上四种化合物分别是含1或2个溴修饰的芳香基辛烯甲酯。1976年，该实验室采用X-射线晶体衍射方法鉴定了XJ103中菌黄素异丁醇酯衍生物的结构，即二溴–芳基辛烯酸异丁醇酯，即xanthomonadin I (见图1) [ 6 ] 。随后Starr等人采用同样的方法对17株黄单胞菌的菌黄素进行了分析，发现菌黄素通常以混合物形式存在，不同菌黄素在溴取代、芳香环上的甲基化和多烯链长方面具有结构多样性。 1985年，Aririatu和Kester [ 9 ] 采用改良的方法提取了X. juglandis (campestris) ATCC 11329分离株的菌黄素，得到两种磷脂类化合物，结构分析推测第一种为溴化芳香基多烯酸与甘油磷酰山梨醇酯化形成的特殊磷脂，第二种为两个溴化芳香基多烯酸分子与甘油磷酸酯化形成的磷脂。Dianese等 [ 10 ] 研究发现菌黄素存在于细菌外膜。近期，Moser等 [ 11 ] 在研究Xcc磷脂的过程发现菌黄素能与磷脂同时被提取。据此，我们推测菌黄素可能是一类磷脂类结构的溴化芳香基多烯类色素 [ 12 ] 。菌黄素准确的化学结构还有待进一步研究，目前主要有两方面的挑战需要克服：一是高效的提取、分离和纯化方法；二是提取后的菌黄素不稳定性。 图1. 菌黄素异丁醇酯的结构 [ 6 ] 。菌黄素在溴化、甲基取代、多烯链长方面具有结构多样性
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user: 3. 菌黄素的生物学功能 3.1. 菌黄素保护细菌抵抗光氧化损伤 环境因素能影响黄单胞菌的生存活力，比如光照。光照可激发光敏感剂产生活性氧或自由基，对细菌造成损伤。在多种黄单胞菌中的研究发现菌黄素能有效的保护细菌抵抗光氧化损伤，而这一功能主要依赖于菌黄素多烯链结构。Jenkins等 [ 13 ] 利用化学诱变剂甲磺酸酯(EMS)对野生型X. juglandis进行处理，获得不产菌黄素的突变株，通过比较突变株与野生株在光敏感剂甲苯胺蓝的存在下经可见光照射后菌株存活状况发现，经过2小时的照射，突变体的活菌数量比野生型降低了大概100倍。Rajagopal等 [ 14 ] 测试了水稻白叶枯菌(Xoo)对可见光的敏感性，发现白色突变株相比于野生型对光损伤的敏感性增加了10~100倍。邹华松等 [ 15 ] 研究了水稻条纹病菌(X. oryzae pv. oryzicola)菌黄素对菌体的保护作用，发现经紫外光照射后菌黄素缺失突变株的活菌数显著低于野生型。Poplawsky等 [ 16 ] 发现野油菜黄单胞菌(Xcc)菌黄素缺失突变体B24-C4经波长635 nm的可见光照射60分钟，其生存活力比野生型降低1000倍。Wang等 [ 17 ] 在黄单胞菌科产酶溶杆菌中分离鉴定一种菌黄素类似物，该菌黄素类似物能显著增加细菌对紫外光和可见光的抵抗性。 3.2. 菌黄素可抵抗寄主植物产生的过氧化因子 植物受到病原菌侵染后产生多种免疫反应，比如活性氧。He等 [ 18 ] 测定了野生型Xcc和菌黄素缺失突变体对H 2 O 2 的抗性，结果显示缺失了菌黄素的突变体对H 2 O 2 的抗性降低了50%~75%。Wang等 [ 17 ] 发现溶酶杆菌产生的菌黄素类似物也能影响细菌对H 2 O 2 的抗性。 3.3. 菌黄素参与黄单胞菌在寄主植物上的致病性 黄单胞菌侵染寄主植物的关键是在寄主表层定殖、繁殖，细菌数量达到一定水平开始侵染。菌黄素在黄单胞菌附生过程中起到重要作用。Poplawsky等 [ 16 ] 研究发现Xcc菌黄素缺失突变株在强可见光照射下，在寄主表层生存的能力大幅度降低。Xcc侵染植物的试验表明，菌黄素缺失突变体通过伤口侵染不会影响细菌致病性；而通过自然接种侵染，菌黄素缺失突变株的致病性显著下降。Goel等 [ 19 ] 从Xoo突变体库中筛选到一株既不能合成菌黄素而且致病性降低的菌株BXO65，表明菌黄素可能与致病性相关。He等 [ 18 ] 的研究也显示Xcc菌黄素缺失突变株对甘蓝的系统侵染能力显著降低(P < 0.05)。 综上所述，菌黄素能保护黄单胞菌抵抗来自外界环境或寄主植物体内的过氧化因子，从而协助细菌在寄主植物表层或维管组织中生存，进而参与细菌的致病性。由于菌黄素附于细菌外膜上，Rajagopal等 [ 14 ] 推测菌黄素通过保护脂质过氧化机制抵抗氧化损伤。除此以外，菌黄素具有开发为天然抗氧化剂的潜力，从而替代食品、化妆品中人工合成的抗氧化剂。