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user: 3. 结果与讨论 3.1. 探针A的结构表征 3.1.1. 1 H NMR表征 化合物经Bruker AM400核磁共振仪测试，得到 1 H NMR图(图2)。如图2所示，化合物有5个H，符合探针A的结构。δ 12.39 (s， 1H)为香豆素7位酚羟基的H；10.63 (s， 1H)为香豆素8位-CHO的H；7.86 (dd， J = 9.2， 1.6 Hz， 1H)为香豆素5位苯环的H，因受到6位H和4位-CF 3 的F影响，裂分为四重峰；7.01 (d， 1H)为香豆素6位苯环的H，受到5位H的影响，裂分为二重峰；6.73 (s， 1H)为香豆素3位上的H。 图2. 化合物A 1 H NMR图 3.1.2. 13 C NMR表征 化合物经Bruker AM400核磁共振仪测试，得到 13 C NMR图(图3)。如图3所示，化合物有11个C，符合探针A的结构。δ 192.82为香豆素8位相连-CHO的C；166.19为香豆素2位-C=O的C；157.39为香豆素7位的C；141.78为香豆素4位的C；133.16为香豆素9位上的C；122.65为香豆素5位上的C；119.91为-CF 3 的C；115.68为香豆素8位上的C；112.53为香豆素10位上的C；108.96为香豆素6位上的C；105.59为香豆素3位上的C。 图3. 化合物A 13 C NMR图 3.1.3. MS表征 化合物经HPLC-MS测试，得到质谱图(图4)。如图4所示，m/z 257.0 (M + − 1)。 图4. 化合物A质谱图 3.2. 探针A在不同比例的乙醇与水中的荧光性能 如图5所示，当乙醇与水的体积比为9:1或8:2时，探针A在502 nm处荧光最强，此后随着体系中水含量的升高，荧光强度逐渐降低，比例为1:9时，荧光强度最低。因此，测试溶剂乙醇与水的比例为8:2时最合适。 图5. 探针A (20 μM)在不同比例的乙醇和水中的荧光发射光谱，从上到下EtOH:H 2 O体积比分别为9:1， 8:2， 7:3， 6:4， 5:5， 4:6， 3:7， 2:8， 1:9， λ e x = 341 nm 3.3. 探针A对Cys/Hcy的有效识别 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，分别加入等当量的Cys和Hcy溶液(浓度为20 μmol/L)，测试得到紫外吸收光谱图(图6)和荧光发射波谱图(图7)。 图6. 加入Cys/Hcy后探针A的紫外吸收光谱 图7. 加入Cys/Hcy后探针A的荧光发射光谱(内嵌图为365 nm紫外灯下，加入Cys/Hcy后体系荧光变化图) 如图7所示，加入Cys/Hcy后，探针的最大吸收峰从365 nm蓝移至341 nm，且吸收峰强度有所增强，在395 nm附近吸收峰强度明显减弱。如图8所示，当激发波长λ ex = 341 nm，发射波长λ em = 502 nm时，加入Cys和Hcy后体系的荧光强度增强了约2.5倍。探针A识别Cys和Hcy效果良好，可作为检测Cys和Hcy的荧光探针。 3.4. 探针A的选择性测试 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，分别加入等当量(浓度为20 μmol/L)的Cys、Hcy、GSH、Gly、Glu、Val、Tyr、Arg、Try、Lys、His、Leu、Phe、Asp、Met 15种氨基酸，测试得到荧光发射波谱图(图8)。 如图8所示，当激发波长λ ex = 341 nm，发射波长λ em = 5502 nm时，加入Cys和Hcy后体系的荧光强度增强了约2.5倍，色氨酸(Try)和赖氨酸(Lys)荧光强度稍有降低，降低约30%，其他氨基酸无变化。 图8. 加入不同氨基酸后探针A的荧光发射光谱 3.5. 探针A检测Cys/Hcy的抗干扰性测试 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入等当量的Cys或Hcy(浓度均为20 μmol/L)，再分别加入10当量(浓度为200 μmol/L)的GSH、Gly、Glu、Val、Tyr、Arg、Try、Lys、His、Leu、Phe、Asp、Met 13种干扰性氨基酸，测试得到探针A检测Cys/Hcy的抗干扰性荧光波谱图(图9、图10)。如图9所示，其它13种氨基酸均不干扰探针A对Cys的检测，说明探针A检测Cys的抗干扰性良好。如图10所示，其它13种氨基酸均不干扰探针A对Hcy的检测，说明探针A检测Hcy的抗干扰性也良好。 图9. 不同氨基酸对探针A检测Cys的影响 图10. 不同氨基酸对探针A检测Hcy的影响 3.6. 探针A对Cys/Hcy的响应时间测试 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入等当量的Cys或Hcy (浓度为20 μmol/L)，每隔3分钟检测一次体系荧光强度，得到探针A对Cys/Hcy的响应时间曲线图(图11、图12)。如图11所示，在加入Cys 30 min后，体系荧光基本达到饱和，说明等当量探针A对Cys的响应时间约30 min。如图12所示，在加入Hcy 20 min后，体系荧光基本达到饱和，表明等当量探针A对Hcy的响应时间约20 min。说明探针A对Hcy的检测较Cys更灵敏。 图11. 探针A对Cys响应时间曲线(内嵌图为A对Cys响应时间荧光发射谱图，λ ex = 341 nm) 图12. 探针A对Hcy响应时间曲线(内嵌图为A对Hcy响应时间荧光发射谱图，λ ex = 341 nm) 3.7. pH对探针A识别Cys/Hcy的性能影响 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入等当量的Cys或Hcy (浓度均为20 μmol/L)，测定了pH从1~13时探针A对Cys或Hcy的识别性能影响，得到pH对探针A识别Cys/Hcy的性能影响图(图13、图14)。如图13所示，当pH = 2~10时，探针A对Cys具有良好的识别效果，最佳pH为6；当pH = 1或11时，探针A对Cys基本没有识别效果；当pH ≥ 12时，荧光猝灭，推测可能是探针在此条件下分子结构已遭到破坏。如图14所示，当pH = 2~10时，探针A对Hcy具有良好的识别效果，最佳pH为5；当pH = 1时，探针A对Hcy基本没有识别效果；当pH = 11时，荧光强度减弱约50%，无识别效果；当pH ≥ 12时，荧光猝灭，推测可能是探针的分子结构已被破坏。所以，探针A识别Cys/Hcy的适宜pH范围为2~10，在弱酸性体系(pH约5~6)下，测试效果最佳，探针的耐酸碱能力较强，稳定性较好。 图13. pH对探针A识别Cys的性能影响 图14. pH对探针A识别Hcy的性能影响 3.8. Cys/Hcy浓度对探针A荧光强度的影响 3.8.1. Cys浓度对探针A荧光强度的影响 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μmol/L的Cys溶液，测得Cys浓度梯度对探针A荧光强度的影响图(图15)。如图15所示，随着Cys浓度的增加，体系荧光强度逐渐增大。将混合溶液体系在502 nm处的荧光强度对Cys的浓度作图，并进行线性拟合，得探针A随Cys浓度增大的荧光强度线形图(图16)。如图16所示，在加入2~20 μmol/L Cys后，荧光强度与浓度呈良好的线性增长关系，线性方程为y = 143272.72727x + 5482000 (相关系数R 2 = 0.99221)。根据最低检测限浓度计算公式C = 3S/K得，最低检测浓度为5.7 × 10 −7 mol/L，说明该探针对Cys的检测较灵敏。 图15. 探针A随Cys浓度增大的荧光强度变化图 图16. 探针A随Cys浓度增大的荧光强度线形图 3.8.2. Hcy浓度对探针A荧光强度的影响 在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H 2 O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A4浓度为20 μmol/L)体系中，加入浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μmol/L的Hcy溶液，测得Hcy浓度梯度对探针A荧光强度的影响图(图17)。如图17所示，随着Hcy浓度的增加，体系的荧光强度逐渐增大。将混合溶液体系在502 nm处的荧光强度对Hcy的浓度作图，并进行线性拟合，得探针A随Hcy浓度增大的荧光强度线形图(图18)。如图18所示，在加入2~20 μmol/LHcy后，荧光强度与浓度呈良好的线性增长关系，线性方程为y = 157212.12x + 6150670 (相关系数R 2 = 0.99898)。根据最低检测限浓度计算公式C = 3S/K得，最低检测浓度为5.2 × 10 −7 mol/L，说明该探针对Hcy的检测较Cys更灵敏。 图17. 探针A随Hcy浓度增大的荧光强度变化图 图18. 探针A随Hcy浓度增大的荧光强度线形图