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user: 3. 统计分析 3.1. WGCNA分析 因加权基因共表达网络的结果对离群样本敏感，应去除其中的离群样本，因此本文采用了芯片间相关性(inter-array correlation， IAC) [ 14 ] 方法来评估芯片数据分布情况。其中，具有低平均IAC值或者无法在树形图上聚类的样本为离群样本。IAC方法：第一步，计算出每个芯片的平均芯片间相关性标记为A；第二步，计算出每个芯片平均芯片间相关性A的平均值标记为A'；第三步，计算出所有芯片平均芯片间相关性A的标准差标记为sd；第四步，根据(A-A')/sd计算每个样本的偏倚度标记为num。 为保证网络构建结果的可靠性，首先需要对数据源进行质量控制，包括芯片表达数据预处理和异常样本的去除。借助IAC方法去除离群样本并根据样本聚类树高度衡量去除效果。我们经过三次上述步骤操作，见图1，样本的聚类树高度由高于0.6降至低于0.4。经处理后，训练集剩余99个样本，测试集剩余92个样本。 图1. 训练集去除离群样本前后聚类树 加权基因共表达网络需满足无尺度网络条件，定义基因共表达矩阵中的元素是基因相关系数的加权值，选择权重标准是每个基因网络中包含基因之间的连接需服从无尺度网络分布(scale-free networks) [ 16 ] ，即连接数为i的概率p(i)与i的r次方成反比，即p(i)~i −r 。研究选择合适的加权系数逼近无尺度网络分布，使得连接数i的节点对数值(log(i))与此节点出现概率的对数值(log(p(i)))呈负相关，相关系数至少应达到 0.8，在不同模块中基因的平均连接度较高才使得检测的模块更有意义。 接下来，我们选择适当的加权参数P，以便对邻接矩阵加权后使之符合无尺度网络标准。经过计算，在不同的软阈值情况下，绘制节点连接度的对数log(i)与该节点出现的概率的对数log(p(i))之间的相关系数图，图2中左图展示了不同软阈值对应的log(i)与log(p(i))之间的相关系数，系数越高表示网络越符合无尺度网络分布，右图则表示不同软阈值对应基因邻接系数的均值，反映了网络的平均连接水平。我们选择p = 5构建基因网络，log(i)与log(p(i))的相关系数接近0.8。我们分析绘制了网络中节点的连接度分布图以及log(p(i))与log(i)的散点图，从图3中可以看出线性回归结果符合无尺度网络标准，其相关系数为0.84。 我们经上述研究最终选取p = 5，然后按照WGCNA算法，计算HCC差异表达的相关矩阵、邻接矩阵、以及拓扑矩阵，然后经聚类分析得到基因的系统聚类树。根据动态混合剪切法 [ 19 ] ，第一步，同样设定单个基因模块最，小基因数为30，并选择中等程度(deep Split = 2)的分类方式构建初等网络；第二步，便求得每个基因模块的ME，并对ME进行聚类，再将相似度高的ME所对应的基因模块进行合并，确定五个基因模块。如图4所示五个模块分别为blue、brown、green、turquoise、yellow，并且模块中含有37到569个基因，23个基因未能分配到任何基因模块中。见表1，显示了各模块的基因数。我们采用模块内部连接度(Intramodular connectivity， IC)来描述特定的模块中的节点与模块中其他节点的关联程度，模块身份(modular membership， MM)来表示基因在相应模块中基因的重要性。图5中可以看出blue模块的IC与MM相关系数达到0.98。 图2. WGCNA方法中软阈值的确定 图3. 训练集软阈值为5时无尺度网络检验 Table 1 Training set clustering module and the number of genes in the corresponding modul Module blue brown green turquoise yellow grew Number 168 67 37 569 63 23 表1. 训练集聚类模块及相应模块中的基因个数 图4. 训练集样本聚类树及初始划分、合并模块图 图5. 训练集blue模块和turquoise模块中MM与IC关系图 3.2. 基因模块的功能富集分析及通路分析 我们将每个模块的基因放入在线工具DAVID [ 20 ] (https://david.ncifcrf.gov/)进行GO功能和KEGG通路富集分析，以及相应的可视化分析。在五个模块富集结果中，我们发现blue模块中的基因参与了细胞周期、细胞分裂、细胞凋亡、以及p53信号通路等众多与癌症的发生发展的重要过程中。因此，为了深入了解HCC的分期发展，我们接下来对该模块的核心基因进行深入的研究分析。 首先，在GO术语富集过程中，blue模块基因分别富集到基因执行的分子功能(Molecular Function)、基因所处的细胞组分(Cellular Component)、基因参与的生物学过程(Biological Process)三大基因注释中，如图6所示。其中功能富集结果见表2显示，blue模块中的基因被富集到细胞分裂、有丝分裂核分裂、有丝分裂细胞周期的G1/S转换及G2/M转换、细胞增殖、姐妹染色单体凝聚力、DNA复制启动、DNA复制、DNA修复、对药物的反应、蛋白质SUMO化等重要的生物过程，如图7所示，左图展示的相应GO功能下基因的富集图，红点对应上调基因，蓝点对应下调基因，可以看出blue模块中的大部分基因为上调基因。右图为部分blue模块GO术语的ID号及对应的生物含义。 Blue模块基因参与到了细胞周期、卵母细胞减数分裂、p53信号通路、DNA复制、RNA转运、嘧啶代谢、错配修复、核苷酸切除修复等重要信号通路，见表3。 图6. Blue模块中基因聚类的GO术语三大功能 图7. Blue模块中部分GO功能富集及对应过程中基因上、下调展示 Table 2 Some related processes of the blue module in GO function enrichmen ID Term Count P Value GO:0051301 cell division 27 5.40E−17 GO:0006260 DNA replication 18 3.56E−14 GO:0007067 mitotic nuclear division 18 7.39E−11 GO:0000082 G1/S transition of mitotic cell cycle 16 1.47E−14 GO:0008283 cell proliferation 15 4.84E−06 GO:0007062 sister chromatid cohesion 12 1.84E−09 GO:0006270 DNA replication initiation 11 1.22E−13 GO:0000086 G2/M transition of mitotic cell cycle 10 3.65E−06 GO:0042493 response to drug 10 1.58E−03 表2. GO功能分析blue模块基因富集的相关生物学过程 Table 3 Some related paths of the blue module in the Kegg path enrichment proces ID Term Count P Value hsa04110 Cell cycle 20 9.32E−17 hsa03030 DNA replication 12 1.35E−13 hsa00240 Pyrimidine metabolism 7 1.31E−03 hsa03430 Mismatch repair 4 2.32E−03 hsa03013 RNA transport 8 3.87E−03 hsa04115 p53 signaling pathway 5 7.68E−03 hsa05166 HTLV-I infection 9 9.89E−03 hsa03420 Nucleotide excision repair 4 1.74E−02 hsa05161 Hepatitis B 6 2.72E−02 hsa04114 Oocyte meiosis 5 3.86E−02 表3. KEGG通路分析blue模块基因富集的相关通路 3.3. PPI网络分析和Cytoscape可视化分析 我们选取GO功能富集中且的生物过程的基因。通过在线工具STRING (https://string-db.org/)将得到的100个基因进行PPI网络 [ 21 ] 分析，通过Cytoscape工具 [ 22 ] 将网络可视化，选取连通度较大的前10个核心基因，进行深入学习。见表4，展示了所选的核心基因的相关连通度等信息。 Table 4 Inter-gene connectivity in the PPI network analyzed by the Cytoscape too Name Betweenness Centrality Closeness Centrality Clustering Coefficient Degree CCNB1 0.015 0.910 0.699 73 TOP2A 0.041 0.910 0.686 73 RFC4 0.019 0.900 0.683 72 MAD2L1 0.012 0.880 0.733 70 PCNA 0.027 0.880 0.680 70 CCNB2 0.010 0.862 0.752 68 CCNA2 0.007 0.853 0.776 67 MCM4 0.006 0.835 0.795 65 CDC20 0.006 0.835 0.795 65 BUB1B 0.005 0.835 0.801 65 表4. Cytoscape工具分析出的PPI网络中基因间的连通度 3.4. 随机森林对核心基因监督学习 我们通过网络分析得到重要模块基因的子集是相关的并且与癌症相关，但是构成该子集的基因对于癌症的重要性以及对于分期的作用是未知的，需要通过机器学习方法来发现和选择。随机森林分类算法本身可以对基因的重要性进行排序。我们将所选取的10个核心基因建立随机森林分类模型，通过对训练集的深度学习建立模型，然后通过测试集对模型进行检验。 我们分别绘制了基于OOB数据的模型误判率散点图以及相关误差与随机森林中决策树数量的关系图，如图8，在构造随机森林模型过程中，从散点图中可以看出，当mtry = 6时，其误判率较低，从而我们可以再进一步的确定应该使用的决策树数量。在右图中看出，当模型中决策树的数量小于400时，模型误差出现较大的波动，当决策树的数量大于400时，模型误差趋于稳定。所以我们可以将模型中的决策树数量大致确定为400左右来达到最优模型。我们还绘制出了随机森林模型中每棵树的节点个数柱形图，如图9所示，可以看出在构建的随机森林模型中，最小的决策树有12个节点，最大的决策树有26个节点，树之间的节点个数有所差异。 在随机森林分类问题中，randomForest包中提供了两个计算变量重要性的指标，一个为基于OOB，计算预测误差率的指标MeanDecreaseAccuracy，并且通过OOB数据进行验证，它在特征选择方面的可信度较高。另一个则是基于样本拟合的模型计算Gini系数的指标MeanDecreaseGini，在建立模型的过程中，通过计算每个变量在分叉节点不纯度的减少量之和来衡量变量重要性。从图10中可以看出基因中的细胞周期蛋白A2 (CCNA2)和细胞周期蛋白B1 (CCNB1)等变量较为重要，经研究发现这两个基因均参与到了免疫应答和细胞周期过程，并且在正常癌旁组织中和癌症中存在着不同的功能激活和抑制转换机制 [ 23 ] 。 图8. 误判率散点图和相关误差与随机森林中决策树数量的关系图 图9. 节点数柱状图 图10. 随机森林变量重要性测度散点图 Table 5 Classification results of training set and test se 训练集(99例) Real/Pred A B C 0 Class.error A 64 3 0 0 0.0448 B 11 1 0 0 0.9167 C 9 0 0 0 0.9090 0 10 0 0 1 1.0000 测试集(92例) Real/Pred A B C 0 Class.error A 65 2 0 0 A B 6 0 0 0 B C 11 0 0 0 C 0 8 0 0 0 0 表5. 训练集与测试集的分类结果 通过训练集建立模型，并对测试集进行预测，见表5，展示了预测结果同训练集和测试集实际结果之间的差别情况。列为数据真实的分期状况，行为预测的分期情况，可以看出训练集中处于A期真实有67例患者，预测正确的有64例，3例被预测为B期，预测的准确率高达95.52%；测试集处于A期的有67例患者，其中65例预测准确，2例被预测为B期患者，准确率高达97.01%。但是对于无分期患者以及中晚期的患者的分类效果不佳。最终得出随机森林分类率为70.65%。