DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 2. 石墨烯吸波材料 石墨烯作为一种新型的碳材料，一经发现就引起业界的研究热潮。Wang [ 3 ] 等发现，应用化学氧化还原法制得的石墨烯具有较高的吸波能力。这是因为氧化还原法制得的石墨烯具有明显缺陷以及残余的含氧官能团，不仅提高了阻抗匹配特性，促进能量从相邻态向费米能级的及时转化，而且还会产生缺陷极化弛豫和官能团电子偶极极化弛豫，这些都有利于电磁波的吸收。同时，Wang [ 3 ] 等用肼还原得到的还原氧化石墨烯表现出较好的吸波能力。如图1所示，在7 GHz时反射损耗值为−6.9 dB，明显强于文献报道的CNTs和石墨。 图1. 厚度为2 mm的石墨和还原氧化石墨烯的电磁波吸收特性 [ 3 ] Shen [ 4 ] 等采用肼-发泡法制备出微蜂窝状石墨烯泡沫，并在8.2~59.6 GHz频段分别测试了石墨烯薄膜和石墨烯泡沫的电磁波屏蔽性能。实验结果表明，虽然石墨烯泡沫具有较低的电导率，但是电磁波屏蔽性能达到−26.3 dB，强于石墨烯薄膜(−20.1 dB)。原因在于微波在石墨烯泡沫内部孔室经过多次反射，能量被削弱，实现电磁波的屏蔽与吸收。
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user: 4. 结语 随着社会的日益发展，人们对吸波材料的要求也逐渐向“薄、宽、轻、强”的方向发展。石墨烯作为一种二维结构，具有质量轻、导电性好、比表面积大等特点，但是由于其较高的介电常数使其很难与其它基材阻抗匹配。研究发现，通过将其与金属纳米材料、导电聚合物等复合可以获得优良的电磁波吸收性能。目前对石墨烯复合吸波材料的研究仅局限于增强石墨烯的吸波性能，对于石墨烯与纳米粒子协同作用机理的研究较少。因此，实现对石墨烯复合材料性能的精确控制可以更有效的进行复合材料的性能设计，也是今后石墨烯复合材料发展的一大趋势。
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user: 摘 要 通过采用问卷调查的方式，对677名高职新生展开了关于积极心理品质的自评调查，发现性别、专业类别、生源地、性格内外向、身体健康状况、参加体育锻炼情况、兴趣爱好多少、好朋友多少、参加活动多少均在不同程度上影响高职新生的积极心理品质的自评分数。学校可结合高职新生积极心理品质的现状、影响其积极心理品质自评分数的因素源以及自评分数较低的品质，实施有针对性干预策略，以期优化高职新生的个性，培养高职新生的积极心理品质，帮助高职新生建构积极防御机制，提升高职新生的生活满意度。 关键词 :高职新生，积极心理品质，调研报告 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 近年来，不少学者开展了对大学生积极心理品质的研究，但是高职学生之一群体的研究却非常少见(侯洁，张茂聪，2017)。积极心理品质作为人类发展过程中最重要的基础建构，影响着个体认识问题、感受问题和应对问题的积极取向，是个体内在力量与潜能实现的基础(吴九君，温小平，何莉，2015)。随着国家的发展，对人才的培养提出了更高的要求，高职学生的竞争力将面临更为艰巨的挑战，而加强对其智、情结合的积极心理品质的培养，有助于提升其综合素质，增强其综合竞争力(张利芹，2017)。重庆市作为四大直辖市之一，因其独特的地理环境与发展环境，高职学生的积极心理品质的现状与可行的培养策略与其他地区的可能存在差异，为此，本研究通过对重庆市高职新生积极心理现状展开调研，以期寻求培养积极心理品质的策略，促进其更好的完善自我，达到身心和谐的状态。
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user: 2. 对象与方法 2.1. 研究对象 通过整群取样的方法，在高职新生中发放问卷进行调查，共计700名学生参与，最终收回有效问卷677份，有效率为96.7%。其中男生234人，女生443人。文科生486人，理科生191人。来自农村的学生441人，中小城市的学生195人，大城市的学生41人。 2.2. 研究方法 采用由杜鹃修订的《当代高职院校学生积极心理品质问卷》(杜鹃，2013)，问卷由72道题目构成，包括六大维度，分别为灵性与超越、自我管理与谦虚、智能与知识、正直与勇气、人性与爱、正义与仁爱。问卷采用Likert式5点正向计分方式，1 = 非常不符合我，2 = 基本不符合我，3 = 不确定是否符合我，4 = 基本符合我，5 = 非常符合我。该问卷的科隆巴赫系数为0.962，各因子的科隆巴赫系数均在0.909以上，信效度较好。 2.3. 数据处理 采用SPSS17.0进行数据的统计分析和处理。
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user: 4. 讨论 本研究发现，高职学生的积极心理品质总体自评分数较高，这可能跟高职学生的学业压力较小有关系。但是整体在为自我管理方面仍然有很大的进步空间，这与李自维等人的研究结果一致(李自维，2009) (王新波，2010)。男生与女生之间在大脑加工方式上存在差异，男生的情绪与思维不容易受到外界环境影响，很少对自我产生否定。同时，从传统历史演变来看，男生的自我优越感本身就高于女生，所以男生更容易对自我产生积极评价。来自城市的学生积极心理品质自我评价分数较高，这与张小菊(张小菊，2013)等人的研究结果一致。这可能与他们从小成长的环境有很大关系，他们获得的关注较多，习得的积极应对方式、心态更为全面，知识掌握情况也更具优势(李思晴，2017)。相较于来自农村的孩子，城市的孩子因为见识广泛，表现自我的机会较多，拥有较高的自信心，积累了不少应对问题的方式与技巧，更容易形成对自我的积极肯定评价。性格非常外向、较为外向的学生拥有积极的认知模式，相较于性格内向的学生，他们能够用积极的态度、积极的情绪去应对问题从而寻找解决问题的办法。身体健康与心理健康是统一发展的，随着体质的不断发展，心理健康状况也会不断完善(索利红，2012)。经常性进行生活锻炼 Table 1 1 The score of self-assessment about positive mental characters in the frequency of joining activity among new higher vocational college student 项目 分类 N 积极心理品质六大维度自评分数 积极 心理品质 自评分数 灵性与超越 自我管理与谦虚 智能与知识 正直与勇气 人性与爱 正义与仁爱 参加 各类 活动 较少(A) 254 3.65 ± 0.52 3.35 ± 0.64 3.60 ± 0.51 3.82 ± 0.49 4.01 ± 0.55 3.70 ± 0.54 3.68 ± 0.47 一般(B) 327 3.99 ± 0.48 3.65 ± 0.61 3.89 ± 0.49 4.07 ± 0.49 4.17 ± 0.52 4.03 ± 0.51 3.97 ± 0.46 较多(C) 96 4.22 ± 0.49 3.90 ± 0.62 4.15 ± 0.51 4.30 ± 0.49 4.47 ± 0.47 4.28 ± 0.51 4.22 ± 0.46 F/P 66.03/0.000 31.29/0.000 48.86/0.000 37.53/0.000 26.74/0.000 51.46/0.000 56.26/0.000 事后多重比较 C > B > A C > B > A C > B > A C > B > A C > B > A C > B > A C > B > A 表11. 参加活动的多少对高职学生积极心理品质自评情况的影响 注：p < 0.05 的学生，因为长期在运动过程中磨砺自身毅力，较少出现生理问题的困扰，能够促进心理韧性的进一步发展，从而促进积极心理品质的完善。相较于没有多少兴趣爱好，不喜欢参加活动的学生，兴趣爱好广泛、参加活动积极的学生更容易体验到生活的多样性，由此对生活会产生较大的兴趣以及较高的愉悦感，由此建立了积极的防御机制。擅长广交朋友的学生，拥有广阔的社会支持系统，不光能够更好的与他人相处，满足自己爱与归属的需要(龚平，2016)，还能够通过与他人交往过程中，不断地认知自我与完善自我，不断增强了自我效能感，从而加强了对自我的肯定。
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user: 5. 结语 学校可结合高职新生目前的积极心理品质的现状、影响其自评分数的因素源以及自评分数较低的品质，实施有针对性的干预策略，例如：发展以优化性格为目的团体活动、开设以完善高职新生的心理韧性为目标的选修课、建设以培养高职新生积极应对策略的心理健康课程体系、帮助高职新生发展并运用有效的防御机制以及提高自我效能感等等，以期优化高职新生的个性，培养其积极心理品质，帮助其建构积极防御机制，提升其生活满意度。
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user: 摘 要 随着高光谱图像应用越来越广泛，其使用价值进一步被发掘，高光谱视频的需求也逐渐强烈。高光谱采集大多基于光栅分光原理，受微机电技术发展的推动，基于CMOS的高光谱传感器得以实现。本文采用Xilinx的Zynq处理器驱动CMOS高光谱传感器，通过Zynq内的FPGA构建DMA (Direct Memory Access)，实现了高光谱数据从光谱仪到终端的高速传输。当前大多数高光谱采集系统通过光谱仪采集数据，然后由上位机进行数据处理，对上位机的性能要求较高。本文所完成的高光谱采集系统由光谱仪采集并处理数据，终端通过浏览器即可远程实时查看高光谱图像，降低了对上位机的性能要求，具备重要的潜在应用价值。 关键词 :高光谱图像，远程，实时，Zynq，DMA Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 高光谱图像能够同时获取被测物的光谱与图像信息，不仅可以对待测物体进行定性与定量分析，还可以定位分析 [ 1 ] [ 2 ] ，很大的拓宽了光谱的应用范围。自1987年AVIRIS制成第一台成像光谱仪后，成像光谱仪的研制技术日渐成熟，应用也越来越多。高光谱图像在遥感方面可以分析大地的山川河里、矿物等信息 [ 3 ] [ 4 ] 。结合无人机技术，机载成像光谱仪用于植被、农作物生长情况的检测和病虫毒害的预防 [ 5 ] 。在农副产品检测方面，可用于对瓜果蔬菜进行水分、糖分的无损检测、农药残留的检测等 [ 6 ] [ 7 ] 。在医学研究方面，针对某些初期肉眼无法识别的皮肤病害，可以用光谱图像面对皮肤进行观察分析 [ 8 ] ，提前预防。目前成像高光谱仪巨大的潜在使用价值逐渐被发掘。 高光谱仪的微型化能给很多方面的使用带来便利，不再是只能在实验室完成采样分析工作，可以到超市、农田、郊外等地方完成实验。通常高光谱图像的采集使用光栅分光，光路的搭建占用的很大的空间，加上数据采集、处理的电路部分，使高光谱采集系统体积很难实现微型化。随着微机电的技术迅速发展，CMOS高光谱传感器的研制逐渐成熟 [ 9 ] [ 10 ] 。CMOS高光谱传感器自身可实现分光，不要另外搭建分光系统，且体积和普通CMOS传感器体积相同。欧洲微电子研究中心(IMEC)研制的CMOS高光谱传感器采集速度快、光谱波段窄、分辨率高等众多优越性能正好满足我们的需求 [ 11 ] 。 随着高光谱图像应用越来越广泛，其使用价值进一步被发掘，高光谱视频的需求也逐渐强烈。当需要测量超市里的水果、农田中的农作物时，如果能够现场测试会很方便，不必把测试样品带回实验室，节省大量时间。如果能够远程实时查看，不在测试现场的人也能够观察到测量结果，使用将更加方便。当前大多数高光谱采集系统通过光谱仪主机采集数据，然后由上位机来对数据进行处理，不能实现远程实时高光谱数据的采集且对上位机的处理性能需求较高 [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] 。 为了解决上述问题，本文基于CMOS高光谱传感器，设计实现了一套微型光谱仪。光谱仪借助Zynq的强大处理性能，采集并处理高光谱数据，通过千兆以太网或WIFI将数据传输到网络中。光谱仪内部有网络服务器，用户在智能终端的浏览器中输入特定的网址后，可远程访问光谱仪，实时预览被测样本高光谱视频。
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user: 2. 系统方案及硬件结构设计 本文的高光谱图像采集系统由高光谱传感器、主控芯片、存储模块、通信模块等部分组成，系统框架如图1所示。 已设计完成的高光谱微型光谱仪实物图如图2所示。外形尺寸为11 × 6 × 7 cm，小巧便携，能够拓宽光谱仪的应用场景和适用范围。 高光谱传感器由欧洲微电子研究中心(IMEC)研制，如图3所示。该传感器在普通CMOS芯片感光面上镀不同的光谱通带滤光膜达到分光效果，芯片总像素大小为2048 × 1088，每5 × 5个像素为一个单元，单元中的25个像素采集不同的光谱波段信息，每个波段的光谱图像大小为408 × 217。高光谱传感器测量波段范围700~950 nm(NIR)，光谱分辨率为10 nm，空间分辨率为5.5 um，时间分辨率为2.9 ms。 主控芯片使用Xilinx的Zynq-7020，该芯片属于Xilinx公司的可扩展平台Zynq系列。Zynq分为PL (Programmable Logic)和PS (Processing System)两部分，PL为大面阵FPGA，PS为2个ARM Cortex-A9核 [ 15 ] 。Zynq集成了ARM处理器的软件可编程性与FPGA的硬件可编程性。PL与PS在同一个芯片内，所以比单独FPGA和ARM通过PCB板上的布线通讯速度要更快、更稳定，免去了大量的芯片外围基础电路节省大量空间。 图1. 高光谱采集系统框图 图2. 高光谱微型光谱仪 本系统的内存空间共1 GB，芯片采用2片型号为IS43TR16256AL-125KBLI的DDR3 SDRAM，提供了足够的内存空间供高光谱图像数据缓存。通讯接口包括WIFI和网口，网口使用千兆以太网，型号为JFM3811F-FL01-4F，连接在Zynq的ENET0口，WIFI为USB转WIFI，连接在Zynq的USB0口。 高光谱传感器与Zynq间采用LVDS (Low Voltage Differential Signaling)的方式进信号传输。LVDS可以很好的屏蔽干扰，提高信号传输时的稳定性和可靠性。电路板设计为12层高器件密度PCB，为了节省空间PCB中间有一部分为软板，这样PCB弯折后可以节省很大空间，如图4所示。 Zynq中的FPGA硬件部分用VIVADO2015.4设计，ARM软件部分用Xilinx SDK2015.4设计。FPGA实现高光谱传感器驱动的实现、DMA高速数据存储。ARM实现SPI配置时的具体参数传递、帧请求的控制、DMA的工作模式设置等一些控制。ARM的控制信号通过片内AXI总线传递到FPGA中。
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user: 3. 高光谱传感器的驱动 高光谱传感器数据采集驱动结构如图5所示。 图3. 高光谱传感器 图4. 电路板 图5. 高光谱传感器驱动框图 包括SPI配置模块、LVDS信号接收模块、控制模块、串并转换模块、缓存FIFO等组成。 SPI配置模块配置高光谱传感器芯片的工作模式、曝光时间、像素采集深度等一些参数。控制模块控制高光谱传感器的电源、帧请求信号、时钟信号、复位信号等。因为高光谱传感器输出数据信号是以差分信号的形式送达Zynq，所以需要LVDS信号接收模块将差分信号转换为普通信号。高光谱传感器输出的数据是串行数据，为了存储与方便处理需要对数据串并转换。缓存FIFO模块对数据进行缓存，等待DMA将数据转移到DDR中。 高光谱传感器数据采集驱动的流程如图6所示。首先控制模块打开高光谱传感器电源，提供时钟，复位结束后，SPI配置模块开始配置高光谱传感器各种参数，控制模块发出帧请求信号后，高光谱传感器开始输出高光谱图像数据，LVDS信号接收模块将接收到的数据处理成普通信号，然后串并转换模块数据转为32 bit并行数据缓存到FIFO中。其中LVDS信号接收模块、串并转换模块为二级流水线并行工作，减少处理时间，节省FPGA中数据的缓存。 本文通过SPI将高光谱传感器像素采集深度设置为10 bit，串并转换模块首先需要将串行数据转换为10 bit的并行数据。高光谱传感器总共有17路输出，其中16路为数据通道，1路为控制通道，这17路数据是同时输出，如果能正确采集控制通道的数据，则其余16路数据通道也能正确采集。 当高光谱传感器处于空闲状态时，控制通道输出固定数据0X55，串并转换模块在高光谱传感器处于空闲状态时就开始接收串行数据，用10位宽的寄存器接收串行数据，每接收10 bit数判断当前接收的数据是否为0X55，如不是，则跳过一个数据再接收10个串行数据，再次判断当前接收数据是否为0X55，这样一直重复直至接收到0X55，寄存器不再跳过数据开始连续接收，其余16路开始串并转换的位置通控制通道相同，这样每次串并转换后的10 bit数据正好是一个完整的像素值。串并转换原理如图7所示，红圈为10 bit寄存器，每次左移一次，直到寄存器值为0X55。 由于DMA传输数据位宽32 bit，需要将10 bit位宽的像素值拼接为32 bit位宽的数据缓存到FIFO中。10与32的最小公倍数为160，首先将16个10 bit数拼接为160 bit，然后将160 bit数切分为5个32 bit数，原理示意图如图8所示。
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user: 4. DMA高速数据存储 FPGA中构建DMA，ARM通过AXI总线控制DMA的初始化、传输长度、传输宽度等参数的设置。 图6. 高光谱数据采集流程 图7. 串并转换示意图 图8. 位宽转换示意图 Zynq中有AXI_HP (AXI Hight Performance)口，专门的高速数据通道，数据可直接在FPGA和DDR间传输，AXI_HP口可支持1866Mb/s DDR3。 工作流程如图9所示。首先ARM通过AXI向FPGA发出复位，复位结束后，ARM通过调用自己编写的SPI函数，将要设置的工作参数配置到高光谱传感器中。初始化DMA，设置DMA的传输长度为一帧高光谱图像数据总长度，设置传输位宽和数据在DDR中的保存地址，然后打开DMA等待数据。ARM控制FPGA发出帧请求信号，高光谱数据经过接收初步处理后到达缓存FIFO中，DMA将FIFO中的数据通过AXI_HP口保存到DDR中，完成一次传输。因为FPGA工作速度远远高于ARM的速度，所以要先配置DMA等待数据的到来，再发帧请求。如果帧请求先发，有可能高光谱数据到达缓存FIFO中时，DMA还为准备好，导致FIFO被数据填满而后续的数据就会丢失。
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user: 5. 服务器搭建 为了实现远程实时预览高光谱视频，ARM系统中必须搭建一个嵌入式网络服务器，这样用户不论在 图9. DMA数据存储流程图 哪里只需要通过浏览器访问该服务器即可实时动态预览高光谱视频。 Boa服务器具有小巧高效、性能高、源代码开放等优点，嵌入式WEB服务器工作流程如图10所示，可分为三步。 Ø 初始化系统资源，此阶段主要包括创建TCP/IP套接字、绑定监听端口号、等待用户请求。 Ø 解析用户请求，判断是否静态请求，倘若是静态请求则返回静态HTTP静态文件。否则执行对应的CGI程序，启动相对应的应用程序、驱动程序和硬件设备，最后将处理结果以HTTP协议报文格式发送给用户。 Ø 关闭进程、断开连接以及释放所用的资源。 HTML交互界面设计如图11所示，左侧按钮控制光谱仪工作状态、工作参数、预览光谱视频通道的选择等。当需要全通道光谱图像时点击右侧第二个按钮即可采集全部通道的光谱图像。因为高光谱视频数据量大，当把所有通道的高光谱图像同时远程传输时，因为网络的原因可能导致卡顿等现象，为了优化系统的流畅性，当用户实时预览高光谱图像时，只显示某一通道波段的光谱图像，用户可选择25个通道中的任意一个进行观察，可随时切换通道，服务器中设置每隔20 ms发送一张光谱图像，即帧率为50 FPS，观看起来非常流畅。当需要全部通道光谱图像时，点击右侧按钮可捕获一张全通道光谱图像并显示在浏览器中。
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user: 6. 测试与分析 光谱仪放置于某个实验室，通过其它实验室电脑上的浏览器进行测试。调整好光圈和焦距，打开浏览器输入网址，单个通道光谱图像显示在界面中，随时可通过网页参数设置来选择某个通道的光谱图像，因为服务器中帧率设置为50 FPS，所以观察到光谱视频无任何卡顿现象非常流畅。图12为单通道光谱图像，图中物体为储物盒和魔方。 当点击右侧第二个按钮时，可以看到界面中显示了25个波段的光谱图像，如图13所示，其中每幅 图10. 服务器工作流程示意图 图11. HTML交互界面 图12. 单波段光谱图像 图13. 25通道光谱图像 图像都是某个特定波段的下的光谱图像，可以观察到25幅图像都略有差别各不相同。 本文的高光谱视频帧率为50 FPS，高光谱芯片空间分辨率为5.5 um，光谱分辨率为10 nm，综上可知高光谱视频的时间分辨率为20 ms，空间分辨率为27.5 um，光谱分辨率为10 nm。
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user: 7. 结论 本文通过Zynq驱动高光谱传感器采集光谱图像数据，Zynq对采集到的数据进行初步转换处理，保存到DDR3 SDRAM中，当用户访问光谱仪内网络服务器时，服务器将数据由DDR3 SDRAM通过网络传输到浏览器中显示出来，形成高光谱视频。本系统解决了通常高光谱采集系统不便携的问题，外形尺寸仅为11 × 6 × 7 cm。借助Zynq的强大处理性能，实现了高光谱图像数据的本地采集、处理和传输。本文解决了远程光谱视频实时动态预览的问题，连接上WIFI便可实时回传高光谱动态图像。摆脱了工作环境的束缚，使本系统适用范围更加广泛，促进了高光谱微型光谱仪走出实验室，实现民用化，具有重要的潜在使用价值。
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user: 摘 要 烟草种子萌发受到内因和外因的影响，为探究烟草种子萌发的最适条件，本研究设置了烟草类型、贮藏年限、温度、激素和酸碱对烟草种子发芽的影响试验。结果表明，同一年限不同类型的品种发芽率依次为：雪茄烟 > 烤烟 > 马里兰烟 > 野生烟 > 晒烟 > 白肋烟 > 香料烟；烟草种子发芽率随贮藏年限的增加而降低；30℃条件下，烟草种子的萌发情况最好；对种子萌发促进作用最大的是质量浓度为20%的PEG浸种48小时，可促进发芽率大幅提高；质量分数为20%的NaOH和质量分数为10%的H 2 SO 4 对烟草种子的促进作用是最明显的，分别促进2.67%和3%。 关键词 :烟草种子，萌发，影响因素，最佳条件 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 烟草是我国重要的经济作物之一，种植面积和总产量居世界第一位 [ 1 ] 。而烟草种子萌发的好坏，直接影响到烟叶的生产。烟草种子的萌发，受到内外因素的影响。内因包括种子生活力、种子类型 [ 2 ] 、种子大小 [ 3 ] 、种皮厚度、种子成熟度 [ 4 ] 、种子休眠 [ 5 ] 、种子贮藏年限 [ 6 ] 等。外因包括水分 [ 9 ] 、温度、氧气、光照 [ 8 ] 、激素 [ 7 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] 、机械处理 [ 15 ] 、酸碱 [ 13 ] [ 14 ] 、丸化 [ 16 ] 等因素。本文选择了两个内部因素和三个外部因素，研究其对烟草种子萌发的影响，为实际生产提供依据。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 本试验用到9份材料均由山东农业大学烟草实验室提供(表1)。 2.2. 试验方法 贮藏年限及不同类型试验：取100粒种子，试验按照YC/T20-1994《烟草种子检验规程》 [ 17 ] 进行。处理进行三次重复。 浸种试验：按照质量浓度配置，分别称取分析纯聚乙二醇，溶于去离子水中配置成10%、20%、30%的溶液。对照直接使用去离子水浸种。每个处理取100粒种子浸种，浸种时间分别为24 h、48 h、72 h，取出后用去离子水清洗5次后，放置到发芽床上。每处理三次重复。 酸碱浸种：按照质量浓度配置，分别称量分析纯的NaOH和H 2 SO 4 ，溶于去离子水中配置成10%、20%、30%的溶液。对照直接使用去离子水浸种。每个处理取100粒种子浸种，浸种时间为30 s，取出后用去离子水清洗5次后，放置到发芽床上。每处理三次重复。 温度试验：取100粒种子，试验按照YC/T20-1994《烟草种子检验规程》 [ 17 ] 进行。完成后分别置于0℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的培养箱内。每处理三次重复。 2.3. 数据统计与处理 每天统计发芽数，前7天的发芽总数计算发芽势，以14天的发芽总数计算发芽率。 发芽率(%) = 第14天种子发芽数/供试种子总数 × 100%。 发芽势(%) = 第7天种子发芽数/供试种子总数 × 100%。 使用EXCEL和R-3.3.3软件进行数据处理。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 同一年限不同类型的烟草种子萌发情况 不同类型同一年限的烟草种子的发芽势和发芽率从高到低依次均是：雪茄烟 > 烤烟 > 马里兰烟 >野生烟 > 晒烟 > 白肋烟 > 香料烟，且发芽势和发芽率相差不超过1.50%(表2)。本次试验结果为烟草种质资源种植保存提供的指导意见为：在不能同时进行同一年份各类型种子的种植保存情况下，优先繁育香料烟和白肋烟。 Table 1 The information of the material used in tes 材料名称 材料类型 材料年份 试验名称 Kutsaga 51E 烤烟 2005 浸种试验 温度试验 酸碱试验 黑老虎 黄花烟 1989 贮藏年限试验 1995 2011 2014 诺凡斯瑞加 雪茄烟 1989 不同类型试验 NC89 烤烟 1989 马里兰 马里兰烟 1989 N. rustica 野生烟 1989 孟山草 晒烟 1989 Burley 21 白肋烟 1989 Xanthi Basma 香料烟 1989 表1. 试验所用材料信息 Table 2 Effects of different types on germination of tobacco seed 类型 雪茄烟 烤烟 马里兰烟 野生烟 晒烟 白肋烟 香料烟 发芽势 65.33% 64.00% 62.00% 55.33% 52.00% 45.33% 37.00% 发芽率 66.33% 64.33% 63.33% 56.33% 52.67% 46.67% 37.67% 表2. 不同类型对烟草种子萌发的影响 3.2. 贮藏年限对烟草种子萌发的影响 贮藏年限试验结果显示，随着贮藏年限的增加，烟草种子的发芽率和发芽势，均有不同程度的降低，且贮藏年限越长，种子发芽力降低越大，发芽势与发芽率相差越大(表3)。 3.3. 温度对烟草种子发芽的影响 温度试验中，烟草种子在20℃ - 35℃的出芽率都在60%左右，在15℃的温度下，烟草种子的发芽势较低，但是发芽率未受到影响，而在0℃、和40℃条件下，种子的发芽力受温度影响较大，严重的甚至不会发芽(表4)。 3.4. 浸种对烟草种子发芽的影响 相比较于不浸种的对照组，不管水浸种还是PEG浸种，对烟草种子的萌发都有促进作用，促进程度因浓度和时间的改变而改变。在低浓度下，种子发芽率先随浸种时间的增加而提高，当浸种时间过长，浸种剂对发芽率的促进作用开始慢慢减弱，但仍不会低于对照；在高浓度下，促进作用会随时间延长而减弱；从时间方面来看，三个浸种时间段内，促进作用均是随浓度呈“弱-强-弱”趋势。其中对种子发芽促进作用最大的是质量浓度为20%的PEG浸种48小时，可促进烟草种子发芽率大幅提高(表5)。 Table 3 Effects of storage durations on germination of tobacco seeds (HEILAOHU 年份 平均发芽势 平均发芽率 1989 40.67% 43.33% 1995 50.00% 53.33% 2011 71.00% 72.33% 2014 93.33% 93.67% 表3. 贮藏年限对烟草种子(黑老虎)萌发的影响 Table 4 Effects of temperature on germination of tobacco seeds (Kutsaga 51E 温度 0℃ 15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 发芽势 0.00 10.33 27.33 49.33 50.67 36.33 10.67 发芽率 5.67 57.33 59.67 61.33 62.00 58.67 32.00 表4. 温度对烟草种子(Kutsaga 51E)萌发的影响 Table 5 Effects of water immersion and PEG immersion on germination of tobacco seeds (Kutsaga 51E PEG浓度 0% 10% 20% 30% 时间 0 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 发芽势 49.33 51.33 55.00 53.67 56.67 60.67 61.33 63.00 68.33 62.33 60.00 58.67 56.67 发芽率 61.33 64.00 67.33 65.33 67.33 68.67 71.33 74.00 77.33 75.67 73.33 70.33 67.67 表5. 水浸种和PEG浸种对烟草种子(Kutsaga 51E)萌发的影响 3.5. 酸碱浸种对烟草种子发芽的影响 酸碱浸种处理结果显示，低浓度的酸碱均可促进种子的萌发，浓度过高则会抑制种子的萌发，综合来看，质量分数为20%的NaOH和质量分数为10%的H 2 SO 4 对烟草种子的促进作用是最明显的，分别促进2.67%和3%(表6)。 3.6. 各因素影响下烟草种子的萌发情况 结合图1(a)、图1(b)两图，可以看出，同为1989年收获的种质资源，尽管(b)图所用的材料为相对大粒的黄花烟黑老虎的种子，但是在相同贮存条件下，仍然比大多数烟草种子的发芽率要低，仅仅比香料烟高，说明相同贮藏时间及条件下，烟草种子发芽率的大小，不能由烟草种子籽粒大小决定。而综合图1(c)、图1(d)、图1(e)则会发现，温度对烟草种子的萌发，起决定性的作用，其他因素仅是在温度合适的基础上，起促进或抑制作用。 Table 6 Effects of H2SO4 and NaOH immersion on germination of tobacco seeds (Kutsaga 51E CK NaOH H 2 SO 4 浓度 10% 20% 30% 10% 20% 30% 平均发芽势 49.33 51.67 54.33 47.67 51.00 48.67 47.33 平均发芽率 61.33 62.00 64.00 58.33 64.33 62.00 56.67 表6. H 2 SO 4 和NaOH浸种对烟草种子(Kutsaga 51E)萌发的影响 图1. 各因素影响下烟草种子的萌发情况
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user: 4. 讨论与结论 4.1. 萌发的重要性 种子的萌发，从生理生化角度来说，是恢复种子在贮藏、休眠期间延缓或暂停的代谢活动，细胞重新活化，合成与分解机制开始恢复正常运行，同时推进种胚细胞顺序性分裂与分化的过程 [ 18 ] 。烟草种子萌发和幼苗生长是烤烟优质高产栽培的基础。萌发的好坏，不仅影响到苗床期的管理，而且对烟草后期大田的生长，有重大的影响。研究表明，萌发迟几天的烟草种子培育的烟苗，在苗期、大田生长期一直滞后，甚至调制后烟叶的质量也受到影响 [ 19 ] 。 4.2. 烟草种子萌发的影响因素 烟草种子的萌发，受到内外因素的影响。种子生活力通常是指一批种子中具有生命力(即活的)种子数占种子总数的百分率。广义上的种子生活力应包括种子的发芽力。种子生活力高的，发芽率也高。生活力低的，发芽率自然也低 [ 20 ] 。每种类型的烟草种子的发芽率是存在一定差异的。有研究表明其发芽规律大体是雪茄烟 > 烤烟 > 晒晾烟 > 香料烟 > 野生烟 > 黄花烟 > 白肋烟 [ 2 ] 。烟草种子的种皮包括胶质透明层、木质厚壁细胞层、薄壁细胞层和角质化细胞层 [ 15 ] 。种皮的成分与厚度对烟草种子的萌发也有一定的影响。种子的成熟是种子形成发育过程的最后阶段，是决定种子品质的关键阶段。成熟度好的种子，发芽率相对于成熟度差的种子高 [ 4 ] 。种子在采收后，胚在生理上并未成熟，须经过一系列处理来打破种子的休眠 [ 5 ] 。种子成熟采收后的贮藏年限，对种子的发芽率影响如下：随着贮藏年限的增加，烟草种子的发芽率下降；下降的速度与贮藏的条件有关 [ 6 ] 。 烟草种子萌发，须经过三个阶段，即：物理吸水阶段、营养物质转化阶段、生理活动的生长阶段。由此过程来看，每一阶段，都是需要适当的水分，以满足正常的萌发过程。在胚根突破种皮之前，适当的干燥可以增加种皮的通透性，但是胚根突破后，缺水会影响生长甚至导致死亡。温度对烟草种子的萌发影响很大，过低或过高的温度，都不利于种子的萌发。温度过低，导致部分生理生化活动过程受到影响。温度过高，导致部分酶的活性下降，进而影响种子萌发。烟草种子萌发的温度为10℃~35℃，最适温度为25℃~28℃。另外，变温处理与恒温处理相比，可以促进种子的萌发及保持整齐度。在植物种子的萌发过程中，新陈代谢作用不断增强，呼吸作用所需的氧气也在不断增加。而烟草种子油脂成分含量较高，脂肪分解也会需要更多的氧气。此时种子周围不宜有过多的水分，以免形成水膜，隔绝氧气，导致种子变质 [ 15 ] 。关于对烟草种子萌发时是否需要光照的研究，国内外都做了较多的研究。普遍认为，烟草是需光种子，光照会促进烟草种子萌发并能保持整齐度；而在黑暗条件下，种子容易发育不良 [ 7 ] [ 8 ] 。低浓度的茉莉酸甲脂能够促进烟草种子的萌发，而高浓度则会抑制种子萌发。赤霉素、细胞分裂素和青霉素也是如此的规律 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] 。机械搓种可以将烟草种皮外层磨平，既减轻了种子重量，同时可以加快种子吸水速率 [ 15 ] 。强酸碱的作用效果：浓度太低无效果，合适浓度促进发芽，浓度过高抑制发芽 [ 13 ] [ 14 ] 。重金属对烟草种子的发芽的影响均是呈现出抑制作用 [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] 。烟草裸种属于微粒种子，为了更好适应机械化播种，我国于1993年研究出种子包衣丸化技术并推广应用。丸化又分为催芽和不催芽两种方式，催芽会进行一次筛选，不合格的种子会被淘汰，因此也提高了整体发芽率和整齐度。不催芽的丸化种与之相比较略显低一点。同时，催芽丸化的贮藏时间要比不催芽丸化的种子短 [ 16 ] 。 4.3. 结论：烟草种子萌发的最佳条件 结合上述分析及图2，可以看到，烟草种子要完成整个萌发过程，需要内外因共同作用。从烟草种子自身的内部因素来看，种子活力大、休眠完成、成熟度好、种皮厚度适中、贮藏年限短，是发芽率高 图2. 内外因影响下烟草种子的萌发示意图 的基础和保证！当内部因素满足之后，外部环境为其通时提供充足的氧气、适量的水分、温和充足的光照和周期、25℃~35℃的温度，烟草种子便会开始萌发。同时配合合适浓度的激素、酸碱处理，合理的机械处理或丸化处理，能有效提高烟草种子的发芽率。
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user: 摘 要 目的：克隆毛果杨漆酶基因PtrLAC-2，并对其进行原核表达，同时制备高特异性、高效价的PtrLAC-2多克隆抗体，为研究漆酶基因蛋白在体外结构与功能奠定基础。方法：利用拟南芥中的漆酶基因序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，PCR同源克隆并扩增得到毛果杨PtrLAC-2基因序列，将其亚克隆到pET30a(+)载体得到PtrLAC-2-pET30a(+)原核表达载体，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并纯化得到PtrLAC-2重组蛋白。采用皮下免疫法将纯化的PtrLAC-2蛋白免疫兔子制备多克隆抗体，用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。结果：克隆获得了毛果杨漆酶基因的序列(命名PtrLAC-2，基因登录号XP_002308164)，成功构建了PtrLAC-2-pET30a(+)原核表达载体，诱导表达获得了62 KDa的重组蛋白，ELISA检测显示抗体效价达1：102，400，经Western blot鉴定，制备的多克隆抗体能特异性检测毛果杨中的PtrLAC-2蛋白。结论：毛果杨漆酶PtrLAC-2基因可以在体外成功进行原核表达，同时获得了高特异性、高效价的兔抗PtrLAC-2多克隆抗体，为后续研究该酶生化功能提供了一定的理论基础。 关键词 :毛果杨，漆酶，基因克隆，原核表达，多克隆抗体 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 [研究意义]漆酶是一种含铜的糖蛋白氧化酶，广泛存在于高等植物植物、真菌、细菌和一些昆虫中。有关真菌漆酶的研究近年来取得了很大的进展，并已成功应用于造纸行业原料的处理，燃料废水的降解和食品饮料的等方面 [ 1 ] ；而高等植物中有关漆酶的研究则相对较少，近年来对植物漆酶的不断研究表明植物漆酶可能参与了木质素的合成，植物细胞壁的维持等 [ 2 ] 。木质素作为存在于高等植物中的一种天然芳香聚合物，可为植物细胞壁提供足够的强度和硬度，并能在运输水分的同时避免植物遭受水和生物的侵害 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] ；在造纸工业中木质素会严重影响纸浆质量 [ 6 ] ；在畜牧业中木质素则会影响牲畜的消化与营养吸收 [ 7 ] 。因此改变木质素的含量或组分有助于人类合理地利用木质素资源，通过基因工程的手段调控木质素合成途径中的关键基因漆酶则成为了重要的研究方向。要想深入了解植物漆酶在体内的具体生化功能，分子水平和蛋白水平上的研究是必不可少的。[前人研究进展]目前，有关漆酶的异源表达的研究主要集中在真菌漆酶。Christoph J等 [ 8 ] 克隆了担子菌中的一个漆酶基因并在毕赤酵母GS115中成功实现异源表达；Shuangxin Ma等 [ 9 ] 克隆了大斑病菌中的一个漆酶基因Stlac4并在大肠杆菌中成功实现异源表达。植物漆酶的异源表达特别是原核表达甚少见报道。[本研究切入点]毛果杨作为模式植物其基因组测序已经完成，因此研究其漆酶基因序列为进一步阐明漆酶在植物中的功能具有重要意义。[拟解决的关键问题]鉴于此，本研究以毛果杨为材料，对其漆酶PtrLAC-2进行了克隆、原核表达和纯化，并制备了多克隆抗体，旨在为进一步研究木质素合成途径中的关键酶漆酶的蛋白功能研究提供参考。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料与试剂 实验材料毛果杨为本实验室继代保存。大肠杆菌JM109和BL21(DE3)，表达载体pET30a(+)为本实验室保存；克隆载体pMD-18T购自TaKaRa公司；植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司；T4-DNA连接酶，限制性内切酶Kpn I和BamH I购自promega公司；异丙醇基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司；蛋白marker购自北京全式金生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自Roche公司，HPR标记羊抗兔IgG购自北京康为世纪生物科技有限公司；化学发光剂购自Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。 2.2. 实验方法 2.2.1. 毛果杨漆酶基因PtrLAC-2的电子克隆与序列分析 利用拟南芥中的漆酶基因序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，得到与拟南芥中的漆酶基因AtLAC17同源性较高的漆酶基因序列，用生物信息学的方法对获得的漆酶的基因序列PtrLAC-2(基因登陆号XP_002308164)进行分析。 2.2.2. 毛果杨漆酶基因PtrLAC-2的克隆和PtrLAC-2-pET30a(+)表达载体的构建 以毛果杨组培苗的叶片为材料，根据北京天根生物公司的总RNA提取试剂盒的操作步骤，提取毛果杨的总RNA，并进行反转录得到毛果杨的cDNA序列，设计特异性引物，上游引物：5’-GGGGTACCAAGAAACATATCAGAAAAATGGGC-3’(下划线为Kpn I酶切位点)，下游引物：GCCCTAGGGAGAGTACTCGAAATCAAAGGCTC-3’(下划线为BamH I酶切位点)，以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因，电泳检测完后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将回收的产物与pMD-18T载体连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含Amp (100 mg/L)的LB培养基上，于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落扩大培养并提取质粒进行PCR鉴定，将阳性个体送至北京华大基因公司进行测序鉴定。对测序正确的阳性克隆进行扩大培养，提取质粒，同时提取pET30a(+)质粒进行限制性内切酶的双酶切(Kpn I和BamH I)，电泳检测回收目的条带，用T4-DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)后涂布于含Kana (100 mg/L))的LB培养基上，于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落扩大培养提取质粒进行双酶切鉴定(Kpn I和BamH I)，得到PtrLAC-2-pET30a(+)的重组原核表达载体。 2.2.3. 重组蛋白的诱导表达 将含有PtrLAC-2-pET30a(+)重组载体的大肠杆菌BL21 (DE3)用接种环蘸取涂布在含Kana (100 mg/L)的LB固体培养基中，37℃培养12 h待长出单菌落；挑取单菌落接入10 ml含有Kana (100 mg/L)的LB液体培养基中，37℃ 200 r/min振荡培养12 h；将菌体培养液吸出5 ml接种于500 ml含有Kana (100 mg/L)的LB液体培养基中，37℃ 200 r/min震荡培养3~4 h，待OD 600 达到0.4~0.6之间，加入终浓度为0.3 mM的IPTG，37℃ 200 r/min振荡培养，4℃ 12000 rpm离心收集诱导3 h后的菌液。将收集的菌体用20 ml重悬液(300 mM Nacl， 50 mM Tris-Hcl， pH8.0)重悬后冰水浴超声裂解，4℃ 12000 r/min离心30 min弃上清，将沉淀用10 ml 8 M尿素溶解，冰水浴超声裂解，离心后收集上清4℃保存。将保存的蛋白和蛋白缓冲液按1:1混合后100℃水浴10 min，以未加IPTG组作为阴性对照，进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并用考马斯亮蓝染色检测蛋白的表达。 2.2.4. 重组蛋白的纯化 将收集的菌体用20 ml重悬液(300 mM Nacl， 50 mM Tris-Hcl， pH8.0)重悬，冰水浴超声裂解菌液，12000 r/min离心30 min弃上清；沉淀依次用20 ml含有2 M/4 M/6 M尿素的洗涤液(50 mM Tris-Hcl， 50 mM Nacl， 1 mM EDTA-NA 2 ， 2 M/4 M/6 M尿素，0.5%Triton x100， 2 mM B-巯基乙醇，pH 8.0)重悬，每级于冰上震荡30 min，离心后弃上清，最终沉淀用20 ml含有8 M尿素的包涵体预溶液(8 M尿素，50 mM Tris-Hcl，1 mM EDTA-NA 2 ， 50 mM NACl， pH 8.0)重悬，离心后收集上清，进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，考马斯亮蓝染色后检测蛋白的表达。 2.2.5. 多克隆抗体的制备 参照李芳等的方法将200 μg纯化后的融合蛋白用生理盐水稀释到200~500 μl，与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后，采用皮下6点注射法免疫新西兰大耳白兔，12d后取200 μg融合蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫，第24天和36天分别用不加佐剂的纯化蛋白200 μg加强免疫，第四次免疫10d后采全血，分离抗血清，−20℃保存。动物免疫前取血做阴性对照 [ 10 ] 。 2.2.6. 多克隆抗体效价的检测及特异性分析 用ELISA检测抗血清的效价。抗原包被封闭后用抗血清孵育，之后用HRP标记的羊抗兔IgG孵育，TMB显色后最后用终止液终止反应，酶标仪450 nm紫外光波长下检测。 用Western blot方法进行抗体的特异性分析，提取毛果杨的全蛋白并进行12%的SDS-PAGE电泳，300 mA电转1 h转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗涤3次，用1:1000倍稀释制备的多抗作为一抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，用1:1000倍稀释的HPR标记羊抗兔IgG作为二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，用HRP-ECL化学发光法鉴定蛋白。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 漆酶PtrLAC-2的序列分析 利用拟南芥漆酶基因AtLAC17对毛果杨基因组数据库同源检索，我们得到同源性较高的毛果杨的的基因PtrLAC-2，对其进行序列分析可知，其基因全长为3518 bp，其中含有6个外显子和3个内含子，其CDS序列全长为1743 bp，编码580个氨基酸，该序列没有信号肽大小约为62 KDa。由DNAMAN软件分析PtrLAC-2与拟南芥酶基因AtLAC17的序列同源性高达66.21%(如图1)。 3.2. 重组表达载体的鉴定 将重组表达载体PtrLAC-2-pET30a(+)进行Kpn I和BamH I双酶切鉴定，由酶切图可以看出重组蛋白切出了两条明显的条带，分别是5000 bp左右和1700 bp左右，结果与序列的大小一致(如图2)。将酶切鉴定的质粒测序，最终确定目的基因已正确插入pET30a(+)表达载体中。 3.3. 重组蛋白的诱导表达 将PtrLAC-2-pET30a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，取阳性单菌落扩大培养，重组菌在37℃、IPTG浓度为0.3 mM条件下诱导3 h，SDS-PAGE电泳检测可见，诱导重组菌比未诱导重组菌多出一条蛋白质条带，其分子量约为62 kDa，与预期表达蛋白的大小一致(如图3)。 3.4. 重组蛋白的纯化 将诱导表达后的重组蛋白菌体在不同浓度的洗涤液中洗涤以纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳结果发现仅在62 kDa处有一条明显条带，表明重组蛋白已成功进行纯化(如图4)。 图1. 毛果杨漆酶PtrLAC-2与拟南芥漆酶AtLAC17的氨基酸序列比对 图2. PtrLAC-2-pET30a(+)。重组质粒双酶切鉴定结果，M. DNA Marker DL15000；1. Kpn I和BamH I双酶切后的PtrLAC-2-pET30a(+) 图3. 漆酶PtrLAC-2蛋白的诱导表达；M. 蛋白marker；1. 未经诱导的重组蛋白；2. IPTG诱导3 h后的重组蛋白 图4. 重组蛋白的纯化；M. 蛋白marker；1. 纯化后的PtrLAC-2蛋白 3.5. 漆酶PtrLAC-2多克隆抗体的效价和特异性 以免疫前的兔血清为阴性对照，倍比稀释抗血清，ELISA分析结果表明多克隆抗体的效价可达1:102400(如图5)。多克隆抗体以1:1000倍稀释后进行Western blot鉴定，结果显示多克隆抗体能与毛果杨全蛋白提取液在62 kDa大小的位置呈现特异性反应条带，实验结果表明制备的PtrLAC-2多克隆抗体具有较好的特异性(如图6)。
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user: 4. 讨论 漆酶于1883年首次于漆树漆液中被发现，此后不断有新的漆酶被报道，除漆树科外，在火炬松、埃及榕、烟草、毛果杨、北美鹅掌楸、黑麦草都已被鉴定发现漆酶基因 [ 11 ] 。漆酶按照来源大致可分为植物漆酶、微生物(包括真菌和细菌)漆酶和动物漆酶。几类漆酶中研究报道较多的是真菌漆酶，植物漆酶一直缺乏有效的系统研究。早在1958年，Freudenberg就提出植物漆酶可能与木质素合成相关，随后由于较长时间无法从植物中提取高纯度漆酶，该理论一直未受到重视 [ 12 ] 。直到Sterjiades等和Bao等分别从欧亚槭和火炬松中分离得到漆酶，并证明其可以在体外催化木质素单体的氧化聚合，有关植物漆酶的作用才逐渐引起人们的关注 [ 13 ] [ 14 ] 。Berthet S等通过T-DNA插入诱变技术将拟南芥中的两个漆酶AtLAC4和AtLAC17敲除后发现植株根茎的木质部塌陷，并在双突变体的研究中发现木质素含量相比对照组有大量降低 [ 15 ] 。Zhao等通过对拟南芥AtLAC4，AtLAC11，AtLAC17的三突变体研究，发现木质素无法正常沉积，同时也严重影响了拟南芥的正常生长 [ 16 ] 。上述研究报道表明拟南芥AtLAC17和其他漆酶基因一起在木质素的合成途径中发挥重要作用。 图5. PtrLAC-2多克隆抗体效价的ELISA测定 图6. PtrLAC-2多克隆抗体特异性的Western blot检测；M. 蛋白marker；1. PtrLAC-2重组蛋白 通过在原核生物中表达目的基因的重组蛋白产物，是研究目标蛋白功能特征和酶学特性的基础。常用的原核表达系统大肠杆菌由于生长迅速，培养基成分简单，可实现外源蛋白高效表达被广泛应用。本研究首先通过生物信息学方法结合基因人工合成技术，克隆出与AtLAC17同源性高达66.21%的毛果杨漆酶基因PtrLAC-2，并构建PtrLAC-2-pET30a(+)原核表达载体，经IPTG诱导表达实现了重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达，获得了大量重组蛋白。随后采用洗涤液对重组蛋白进行了纯化，获得了高纯度的目的蛋白，最后选用4次免疫方式对兔子进行抗原免疫，最终获得特异性较好的PtrLAC-2多克隆抗体，为深入理解植物漆酶的功能以及促进其在生物工程领域的应用奠定基础。
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user: 5. 结论 本研究成功实现毛果杨漆酶在大肠杆菌原核表达系统中进行体外表达，并制备了针对毛果杨漆酶PtrLAC-2多克隆抗体。该抗体的效价理想，为进一步研究PtrLAC-2蛋白功能提供基础。
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user: 摘 要 利用安徽省气象信息中心整编的自动站十分钟降水资料数据和基准站分钟降水数据，统计形成黄山区汛期小时降水数据集。通过百分位阈值法计算18个站点的极值，通过GEV参数估计方法计算出黄山光明顶站极端小时降水阈值及其对应的重现期，最后通过降水比例、强降水频次及占比描述了黄山区强降水阈值特征分布。结果表明：整体上看，无论从汛期平均降水比率或强降水占比和频次分布上看，高海拔地区更容易出现降水，黄山景区发生降水的比例相对较高，北部地区发生降水的比例较低，降水时间多寡的南北差异比较明显。从百分位阈值分布上来看，99 th 百分位阈值分布不均匀，且变化幅度较大，高值中心主要集中在黄山景区，而95 th 百分位阈值整体分布比较均匀，整体变化幅度不大。黄山光明顶站5、10、20、50、100年一遇的小时降水阈值分别是43.3、49.7、82.4、120.8、163.9 mm/h。重现期越长，其对应的降水强度增长越快。 关键词 :汛期，强降水，阈值，研究 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 小时降水的阈值及特征研究是开展短时强降水概率预报的重要基础工作，相对于日降水量，小时尺度降水资料可以更准确地反映降水强度并描述降水过程，因而更适用于极端降水阈值的确定及其特性研究。目前，国内外对小时尺度降水的研究有一些，Zhai等 [ 1 ] 利用740站降水资料的分析发现导致中国北方降水减少的原因主要是降水日的减少，而引起南方降水增加则是降水强度的增加，在降水量增加区域，总是伴随着超出平常的极端降水事件。王小玲等 [ 2 ] 针对不同强度级别降水量和降水频次的趋势分析表明，极强降水量的趋势最为明显，降水量的趋势变化主要由强降水变化引起。目前针对山区小时降水特征变化的研究不多，多数研究成果散见于对全国降水特征变化的分析中，且由于分析时段和目标区域的差异，结果不尽相同。从资料方面来说，中国关于极端降水的研究多关注日降水量，而日累积降水量在表征降水强度时可能存在如下偏差：过高地估计长时间连续性弱降水的强度；低估短时强降水的强度；将跨过日界线的同一过程分隔到统计强度。考虑到降水强度是极端事件选取的重要因子，因此，在相关研究中应采用小时尺度降水替代日降水资料，这样可更好地反映实际降水强度，减小取样的误差，同时保留每次降水过程的更多细节。目前，小时降水资料已逐渐受到重视 [ 3 ] - [ 8 ] ，高时间分辨率的降水资料可揭示此前难以发现的降水变化的事实。在科学问题方面，目前大量工作集中在降水演变趋势分析上，而对降水事件自身特征的研究并不多。统计短时降水过程中的关键参数并了解极端降水事件的共性，是掌握此类事件规律、进行准确预报、预测和防灾、减灾的重要基础。
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user: 2. 资料与方法 2.1. 资料 资料来源于安徽省气象信息中心整编的黄山区汛期自动站十分钟降水资料数据和基准站分钟降水数据，即：2006年1月1日~2014年12月31日共计9年的17个区域自动站十分钟降水数据和1961年1月1日~2014年12月31日共计54年的3个基准站分钟降水数据，该数据经过极值检验及时间一致性、内部一致性、空间一致性综合质量控制。 2.2. 广义极值法 广义极值(Generalized Extreme Value， GEV)分布函数在极值研究领域应用很广，它具有严格的数学基础，可以更客观地外推出极值分布特征，并确定不同重现期的阈值。其表达式如下： G ( z ) = exp [ − { 1 + s ( z − a ) / b } − 1 / s ] 其中a是位置参数，b是尺度参数，s是形状参数。通过最大似然估计达到G的参数，计算出关于最大小时降水的经典模型。 2.3. 百分位法 目前国际上在气候极值变化研究中最常见的是采用某个百分位值作为极端降水阈值，超过这个阈值的降水称为极端降水，常用的百分位有第90、95和第99个百分位。这里取95 th 、99 th 百分位。具体做法是SPSS所用方法，也是SAS所用方法之一。 第一步：将n个变量值从小到大排列，X(j)表示此数列中第j个数。 第二步：计算指数，设 ( n + 1 ) P % = j + g ，j为整数部分，g为小数部分。 第三步：1) 当g = 0时：P百分位数 = X(j); 2) 当g ≠ 0时：P百分位数 = g * X ( j + 1 ) + （ 1 − g ） * X ( j ) = X ( j ) + g * [ X ( j + 1 ) − X ( j ) ] 。 2.4. 降水比率 降水比率 = (小时降水量 ≥ 0.1 mm次数/有效观测次数) × 100%，降水比率按照四舍五入保留两位小数。 强降水占比 = (小时降水量 ≥ 强降水阈值次数/小时降水量 ≥ 0.1 mm次数) × 100%，结果四舍五入保留两位小数。