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user: 3. 混合营养纤毛虫 有关混合营养的无壳纤毛虫的研究历史较短，海洋浮游无壳纤毛虫最初是被认为异养的，但是后来发现某些种类细胞内含有叶绿体和眼点。Norris (1967)在印度洋78 m水深处采得的一个纤毛虫体内排列有金黄色的物体，他怀疑这是某种金藻(Chrysophyceae)的叶绿体，而不是整个藻体 [ 30 ] 。Blackbourn等 (1973)用电镜观察纤毛虫的细胞切片，发现了完整的藻类叶绿体，从而确认浮游纤毛虫体内确实有来自藻类的叶绿体 [ 31 ] 。Laval-Peuto和Febvre (1986)用透射电镜在附属曳尾虫(Tontonia appendiculariformis)中发现了数百种质体，并由此推断这种纤毛虫是营混合营养的 [ 32 ] 。McManus和Fuhrman (1986)分析了球果螺体虫(Laboea strobila)的色素组成包括叶绿素和藻红蛋白(phycoerythrin) [ 33 ] 。Jonsson (1987)和Stoecker等(1987)则测定了寡毛类纤毛虫对无机碳的吸收 [ 34 ] [ 35 ] 。Stoecker等(1987)和Laval-Peuto和Rassoulzadegan (1988)用表面荧光显微镜方法确定纤毛虫是否含有外来色素体 [ 35 ] [ 36 ] 。纤毛虫体内的色素体有的是单独的色素体，有的是处于食物泡中，Laval-Peuto和Rassoulzadegan (1988)推测这些纤毛虫可能通过摄食行为获得这些色素体(混合营养)，但是并不确定，为谨慎起见，他们建议将这些纤毛虫统称为含有质体的纤毛虫(plastidic ciliates) [ 36 ] ，在以后的研究中，有的沿用这一称呼 [ 37 ] - [ 42 ] ，有的则称为混合营养纤毛虫(mixotrophic ciliates)。Stoecker等(1994， 1996)则把含叶绿体的纤毛虫等同于混合营养纤毛虫 [ 40 ] [ 41 ] 。 此处的关键问题是一些异养的纤毛虫体内也含有还没有充分消化的色素体，区分这种情况和混合营养的纤毛虫成为难题。Stoecker等(1987)和Laval-Peuto和Rassoulzadegan (1988)认为严格自养的纤毛虫摄食浮游植物后，在浮游植物被破坏之前，体内也会有未降解的植物色素，会对结果有影响 [ 35 ] [ 36 ] 。纤毛虫获取的叶绿体通常排列在细胞周边的表膜下 [ 43 ] ，Modigh (2001)把叶绿体遍布纤毛虫细胞的个体视作混合营养 [ 42 ] 。 3.1. 混合营养纤毛虫类群 中缢虫是研究最多的混合营养纤毛虫，其形态很容易辨认，本文仅对形态复杂的寡毛类混合营养纤毛虫进行论述。目前已确认的混合营养寡毛类纤毛虫种类有13种(表2)，其中螺体虫属(Laboea)仅有球果螺体虫一种，曳尾虫属(Tontonia)有2种，急游虫属(Strombidium)有6种，而欧米虫属(Omegastrombidium)、拟曳尾虫(Paratontonia)、伪曳尾虫属(Pseudotontonia)及拟盗虫属(Strombidinopsis)均仅有1种。在个体形态方面，由于球果螺体虫(呈锥形，有4~5圈螺纹) (图1(a))、曳尾虫属个体较大(图1(b))，且具有突出的尾部，形态容易辨认，通过光学显微镜下镜检进行计数研究 [ 46 ] - [ 48 ] 。 Table 2 Species of mixtrophic ciliate 现种类名 原种类名 中文名 体长(μm) 最大丰度(ind/L) 水深(m) 海区 文献 Laboea strobila 球果螺体虫 70~80 0 Falmouth河口， Villefranche湾 [ 36 ] [ 43 ] Omegastrombidium elegans Strombidium elegans 优雅欧米虫 55 0 Villefranche湾 [ 36 ] Paratontonia gracillima Tontonia gracillima 纤细拟曳尾虫 31~48 10 50 爱琴海， Villefranche湾 [ 36 ] [ 44 ] Pseudotontonia simplicidens T. simplicidens 简单伪曳尾虫 30~40 10 75 爱琴海 [ 44 ] Strombidinopsis batos 黑莓拟盗虫 40 10 爱琴海 [ 44 ] Strombidium capitatum 具甲急游虫 52 0 Villefranche湾 [ 36 ] S. conicum 锥形急游虫 50~75 490 1 爱琴海 [ 44 ] S. dalum 火炬急游虫 12~21 170 10 爱琴海 [ 44 ] S. stylifer 楔尾急游虫 50~60 长岛海峡 [ 45 ] S. tintinnodes Strombidium oculatum 丁丁急游虫 50~-60 爱尔兰海 [ 45 ] S. vestitum Strombidium delicatissimum 浅裂急游虫 22~26 190 1 爱琴海， Villefranche湾 [ 36 ] [ 44 ] Tontonia appendiculariformi 附属曳尾虫 80~105 0 Villefranche湾 [ 36 ] T. ovalis 卵圆曳尾虫 45~53 0 Villefranche湾 [ 36 ] 表2. 混合营养纤毛虫种类 图1. Lugol试剂固定后的(a)球果螺体虫(Laboea strobila)和(b)曳尾虫属(Paratontonia sp.)图片(光学显微镜拍摄)，比例尺20 μm 3.2. 混合营养纤毛虫的计数方法 对自然海区中自养、混养和异养纤毛虫的丰度的调查起始于Stoecker等(1989) [ 38 ] 。不同研究学者采用的计数方法不同。 方法一：荧光显微镜观察计数。用倒置荧光显微镜观察，叶绿体在蓝光下有红色荧光，从而区分有叶绿体的纤毛虫和不具叶绿体(严格异养)的纤毛虫。制备显微镜观察样品的方法有：1) 用100 g l −1 的hexamethylenetetramine缓冲成20%甲醛(formaldehyde)试剂25 ml，加入225 ml海水样品，最终成为终浓度2%的甲醛固定海水。放入黑暗中4℃保存，5周内分析完毕。如果纤毛虫在水体中丰度较低，就需要浓缩，可以2) 把自然海水中的纤毛虫用10 μm筛绢逆向过滤(reverse filtration technique)的方法浓缩500倍，用borax-buffered甲醛试剂(终浓度为3%)固定。这些样品的100 ml分样放入沉降杯，用倒置荧光显微镜检查计数 [ 49 ] [ 50 ] 。也可以3)将采集的样品过滤到黑膜上，DAPI染色后在荧光显微镜下镜检 [ 37 ] 。镜检时，每个样品检查约30个个体 [ 51 ] 。 值得一提的是，严格异养的纤毛虫摄食浮游植物后，在浮游植物被破坏之前，体内也会有未降解的植物色素，会对结果有影响 [ 38 ] [ 44 ] 。Modigh (2001)把叶绿体遍布纤毛虫细胞的个体视作混合营养 [ 42 ] 。 方法二：光学显微镜计数，通过形态判断混合营养纤毛虫。由于螺体虫和曳尾虫个体较大，形态容易辨认，所以Dolan等(1991， 1995， 1999)将它们作为混合营养纤毛虫的代表，通过Lugol试剂固定样品后在光学显微镜下镜检，而其他混合营养纤毛虫(如急游虫属种类)通常个体较小，不作为混合营养纤毛虫来计数 [ 46 ] - [ 48 ] 。 3.3. 混合营养纤毛虫所占丰度和生物量的比例 混合营养纤毛虫在不同研究海区所占丰度和生物量的比例不同(表3)，不同学者对混合营养纤毛虫的鉴定及计数方式有些差异，如Stoecker等(1987)对所有有机质体进行计数 [ 35 ] ，而Martin和Montagnes (1993)则认为螺体虫属、曳尾虫属、具甲急游虫等是主要的混合营养纤毛虫 [ 52 ] 。混合营养纤毛虫在不同海区的丰度和生物量所占比例多低于70%，近岸海区所占比例比大洋海区稍高，在地中海其所占比例可高达93% [ 48 ] 。 3.4. 混合营养纤毛虫对叶绿素的贡献 将混合营养纤毛虫分离出来，测定其叶绿素，估计出单个个体平均的叶绿素含量，可结合丰度估计混合营养纤毛虫对叶绿素的贡献 [ 53 ] 。在7~8月，在冰岛、格陵兰附件海域和巴伦支海等北方海域(Nordic Seas)，单个细胞Strombidium sp. A、Strombidium sp. B、Laboea strobila、Tontonia sp.的叶绿素含量分别为52 pg cell −1 、30 pg cell −1 、82 pg cell −1 、21 pg cell −1 ，混合营养纤毛虫的叶绿素占总叶绿素的比例小于15%，但在叶绿素浓度低(<0.2 g/L)的站位，混合营养纤毛虫Strombidium sp.自己占的比例就高达24% [ 53 ] 。在温带近岸区域，球果螺体虫的叶绿素含量可占到叶绿素浓度的2%~3% [ 33 ] 。 3.5. 混合营养纤毛虫代表——球果螺体虫(Laboea strobila) 球果螺体虫是含色素纤毛虫中个体最大的种，体积约为1.1 × 10 5 μm 3 [ 35 ] ，固定后体积约为8.1 × 10 4 μm 3 [ 38 ] ，它的螺纹使得它很容易分辨。球果螺体虫分布海区为温带和极区。极地海区如加拿大东部北冰洋 [ 59 ] 、冰岛和格陵兰岛附近海域 [ 55 ] ，温带海区有伍兹霍尔海域 [ 35 ] 、美国乔治滩 [ 38 ] [ 43 ] 、切萨皮克湾 [ 46 ] 、新西兰周围海域 [ 60 ] 、挪威峡湾 [ 37 ] 、地中海沿岸 [ 42 ] [ 48 ] 等海域。 Stoecker (1989)在地中海研究发现Laboea strobila的最大丰度达到1.7 × 10 3 ind/L，平均丰度占到含色素纤毛虫的4.7% [ 38 ] ；在地中海的Catalan sea最大丰度135 ind/L，最大丰度出现在5 m水层 [ 45 ] ；在切 Table 3 Percentage of mixtrophic ciliates in the abundance and biomass of total ciliates in different sea region 海区 水深(m) 取样时间 最大丰度(ind/L) 丰度比例(%) 生物量比例(%) 示踪物 文献 近岸海区 伍兹霍尔 0 春 51 质体 [ 35 ] 夏 47 质体 [ 35 ] 秋 22 质体 [ 35 ] 冬 22 质体 [ 35 ] 0~9 7月 2380 52 质体 [ 35 ] Nantucket海峡 0~9 早夏 48.65 质体 [ 35 ] Villefranche湾 0 10月~次年2月 41* 带荧光的纤毛虫 [ 36 ] Villefranche湾 0 22个月 51* 带荧光的纤毛虫 [ 49 ] 牙买加，加勒比海 1 1年 12 25 螺体虫属，曳尾虫属 [ 54 ] E. Pacific fjord 2 2月 57 1.6 7 螺体虫属，曳尾虫属， 具甲急游虫 [ 52 ] 北欧海区 0 夏 497 58~65 59~63* 质体 [ 55 ] 50 夏 65 14~24 质体 [ 55 ] 陆架/陆坡海区 乔治滩，西北大西洋 0~35 7月 21~70 质体 [ 38 ] 真光层 早夏 39 质体 [ 38 ] 大洋海区 马尾藻海 晚春 37 质体 [ 39 ] 墨西哥湾流 晚春 25 质体 [ 39 ] 亚北极太平洋 5~30 6， 9月，次年5， 8月 30~50 质体 [ 56 ] 北大西洋 0~20 5~6月爆发 558~3006 52 质体 [ 40 ] 0 春季 16~39 质体 [ 40 ] 威德尔海和斯科舍海 0~85 6~8月 10 质体 [ 57 ] 南极 3~4月 5 10 质体 [ 41 ] 地中海 加泰罗尼亚的海 5 6月 54 19 63 螺体虫属，曳尾虫属 [ 45 ] 0~20 70 18 48 螺体虫属，曳尾虫属 [ 45 ] 0~80 24 6 21 螺体虫属，曳尾虫属 [ 45 ] 爱琴海，南部 0~20 3月 70~210 17~55 5~89 质体 [ 48 ] 20~100 20~140 7~33 0.1~39 质体 [ 48 ] 爱琴海，N BSW 0~20 3月 40~1280 8~88 30~86 质体 [ 48 ] 20~100 0~10 0~14 0~5 质体 [ 48 ] 爱琴海，N other 0~20 30~260 28~87 18~93 质体 [ 48 ] 20~100 0~30 0~20 0~15 质体 [ 48 ] 地中海近岸 0 秋冬 41* 质体 [ 36 ] 地中海西北部 全年 平均51，春夏 > 60 质体 [ 49 ] 利古里亚海 0 5月 46 39 质体 [ 58 ] 表3. 不同海区混合营养纤毛虫占纤毛虫(无壳和砂壳纤毛虫)丰度和生物量的比例 *占无壳纤毛虫的比例，N BSW ：受黑海水团影响的爱琴海北部海区，N other ：不受黑海水团影响的爱琴海北部海区。 萨皮克湾的球果螺体虫最大丰度1800 ind/L，出现在2 m水层 [ 44 ] 。球果螺体虫的生物量可占到含色素纤毛虫的46% [ 35 ] 。 在垂直分布研究中，Dale (1987)发现球果螺体虫在水深5~10 m之间昼夜迁移 [ 61 ] 。Stoecker等(1989)发现球果螺体虫在早上日出前会升到表层，但是在中午表层和10 m (次表层)丰度相当 [ 38 ] 。球果螺体虫所处的水层可能与虫体寻找最佳光强进行光合作用有关。在季节分布相关研究中，在一年中球果螺体虫在春季丰度最大，其他季节丰度很低 [ 42 ] 。 在对球果螺体虫体内叶绿素含量研究中，McManus和Fuhrman (1986)利用一系列假设，估计球果螺体虫的叶绿素含量为49 pg cell −1 [ 33 ] 。叶绿素在每个球果螺体虫体内平均浓度为82 pg cell −1 [ 53 ] ，叶绿体在细胞体内有功能，但是不能再生，在球果螺体虫体内大约停留2周 [ 43 ] ，所以需要不断获取新叶绿体。Stoecker等(1987)测定的球果螺体虫的叶绿素含量为187 pg cell −1 [ 35 ] 。实验室培养的球果螺体虫的叶绿素含量在100~500 pg cell −1 [ 38 ] 。