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user: 3. 结果与分析 3.1. 愈伤组织的诱导 3.1.1. 植物生长素对愈伤组织的诱导 将叶片接种到愈伤组织诱导培养基后，7 d内就会产生愈伤组织。表1显示，6-BA是诱导毛建草叶片产生愈伤组织的关键植物生长调节剂，培养基中添加6-BA，可顺利诱导叶片出愈。随着6-BA浓度的升高，叶片出愈率随之升高，但愈伤组织的质地变得松散。浓度1.0 mg/L的6-BA能诱导80.77% ± 2.2%的叶片产生瘤状愈伤组织，2.0 mg/L的6-BA虽然也能诱导愈伤组织大量产生，但愈伤组织质地疏松，瘤状结构稀少，再生能力差。添加2，4-D及IAA后发现，浓度0.2 mg/L的2，4-D与浓度0.2 mg/L的IAA组合对毛建草叶片形成愈伤有促进作用。1.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L 2，4-D及0.2 mg/L IAA的组合对诱导毛建草叶片产生瘤状愈伤组织的效果最佳，诱导率高达92.75% ± 2.1% (图1(a))。 Table 1 Effect of plant growth regulators (PGRs) on callus induction from leaf of Dracocephalum rupestr 激素浓度/ mg∙L −1 Concentration of PGRs (mg∙L −1 ) 出愈率/% Callus induction rate(r/%) 愈伤组织形态 Morphology of callus 6-BA 2，4-D IAA 0.5 0 0 65.24 ± 4.0 b 紧实，瘤状结构少 1.0 0 0 80.77 ± 2.2 a 紧实，瘤状结构多 2.0 0 0 84.51 ± 4.2 a 疏松，瘤状结构少 0.5 0.1 0.1 66.29 ± 1.3 b 紧实，瘤状结构少 1.0 0.2 0.2 92.75 ± 2.1 a 紧实，瘤状结构多 2.0 0.5 0.5 76.45 ± 1.9 a 疏松，瘤状结构少 0.5 0.5 0.5 63.07 ± 1.5 b 紧实，瘤状结构少 1.0 0.1 0.1 82.36 ± 2.2 a 紧实，瘤状结构多 2.0 0.2 0.2 77.05 ± 2.0 a 疏松，瘤状结构少 0.5 0.2 0.2 69.12 ± 1.3 b 紧实，瘤状结构少 1.0 0.5 0.5 79.05 ± 2.0 a 紧实，瘤状结构多 2.0 0.1 0.1 74.54 ± 1.8 a 疏松，瘤状结构少 0.5 0.1 0.5 68.14 ± 1.6 b 紧实，瘤状结构少 1.0 0.2 0.1 88.25 ± 2.2 a 紧实，瘤状结构多 2.0 0.5 0.2 70.85 ± 2.0 a 疏松，瘤状结构少 表1. 植物生长调节剂对毛建草叶片愈伤组织诱导的影响 The different letters in the same column mean the significant difference (P ≤ 0.05) by Duncan’s LSD Test. The same below. 表中不同字母表示邓肯氏最小显著差数测验差异显著(P ≤ 0.05)。下同。 3.1.2. 光周期对愈伤组织诱导的影响 外植体分别进行光培养与暗培养20 d，观察发现光培养与暗培养均能诱导愈伤组织形成。暗培养产生的愈伤组织出现早，平均7 d就能观察到愈伤产生，且体积大、质地松散、无法分化，须在光下培养2 周，并转绿后才能恢复分化能力。光培养条件下，至少5 d后才有愈伤组织生成，但愈伤组织颜色墨绿，质地紧密，瘤状结构明显；15 d后即可转入分化培养基，15 d内就能产生不定芽。 3.1.3. 继代次数对愈伤组织的影响 多次继代培养会使愈伤组织的结构和颜色发生明显变化(图1)。表2显示，随着继代次数的增加，愈伤组织逐渐失绿褐化，增殖能力下降，质地变得松散，瘤状结构消失，不定芽再生率也随之下降。特别是第4次继代后，愈伤组织严重褐化，产生不定芽的能力下降明显。 图1. 毛建草叶片愈伤组织。(a) 叶片接种于最佳愈伤组织诱导培养基的瘤状愈伤组织；b) 经历了4次继代培养的愈伤组织出现褐化现象，瘤状结构消失；c) 经历了1次继代培养的愈伤组织) Table 2 Effect of subculture times on callus and shoot regeneration of Dracocephalum rupestr 继代次数 Subculture times 愈伤组织形态 Morphology of callus 不定芽再生率/% Frequency of adventitious shoot formation (r/%) 1 绿白色，瘤状结构丰富 75.58 ± 8.8 a 2 绿白色，瘤状结构丰富 69.82 ± 4.9 a 3 绿白色，较少瘤状结构 61.79 ± 2.5 ab 4 黄绿色，较少瘤状结构 49.15 ± 2.8 b 5 黄绿色，松散 27.65 ± 5.4 c 6 褐色，松散 19.94 ± 3.6 c 表2. 继代次数对愈伤组织形成和分化的影响 3.2. 细胞分裂素对愈伤组织分化不定芽的影响 诱导不定芽再生的实验发现，3种细胞分裂素(CTK)单一添加时，随着CTK浓度增加，不定芽再生率均呈现先增后降的趋势(表3)。其中，6-BA效果最好，TDZ其次，KT最差。6-BA的最佳浓度为0.5 mg/L，不定芽再生率高达64.17% ± 3.8%，每个愈伤组织平均产生4.06个芽。TDZ的最佳浓度为0.5 mg/L，不定芽再生率为60.85% ± 3.7%，但诱导的芽玻璃化现象严重，生长缓慢且基部产生较多愈伤组织；继续培养15 d后，愈伤组织生长过盛，抑制了不定芽的伸长生长，最后导致不定芽生长不良而死亡。3种CTK最佳浓度的两两组合发现，6-BA与TDZ组合的效果最好，诱导不定芽再生率最高，达72.54% ± 2.8%，不定芽数量多且健壮。同时，KT+6-BA和KT+TDZ的组合对不定芽诱导具有负作用，诱导效果不如单一添加6-BA或TDZ。因此，不定芽再生的最佳培养基为：MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.1 mg/L IBA。将愈伤组织接种到最佳不定芽再生培养基上7~15 d可出现不定芽，继续培养7~15 d不定芽可伸长至2~3 cm。 Table 3 Effect of CTK on induction of adventitious shoots from calli of Dracocephalum rupestr 细胞分裂素/mg∙L −1 Concentration of CTK 不定芽再生率/% Frequency of shoot formation (r/%) 每愈伤组织产生的平均芽数/个 Number of shoots 6-BA KIN TDZ 0.1 0 0 16.24 ± 3.1 d 1.25 d 0.5 0 0 64.17 ± 3.8 a 4.06 a 1.0 0 0 51.06 ± 4.2 b 3.56a b 0 0.1 0 10.55 ± 2.8 d 0.88 d 0 0.5 0 36.92 ± 3.4 c 2.72 bc 0 1.0 0 31.75 ± 1.9 c 2.45 bc 0 0 0.05 37.21 ± 1.7 bc 1.36 d 0 0 0.1 40.95 ± 2.4 bc 2.71 bc 0 0 0.5 60.85 ± 3.5 a 3.65 a 0.5 0.5 0 43.51 ± 5.5 bc 2.44 bc 0.5 0 0.1 72.54 ± 2.8 a 4.20 a 0 0.5 0.1 33.06 ± 2.5 c 1.68 cd 表3. 细胞分裂素对愈伤组织分化不定芽的影响 3.3. 再生植株诱导生根分析 诱导植株生根的常用生长素有NAA和IBA等，通过比较不同浓度的NAA和IBA对毛建草再生苗生根的影响(表4)，发现MS培养基中添加0.1 mg/L或0.2 mg/L的IBA和添加0.1 mg/L NAA均能使69%以上的再生苗在7 d内产生根系，15 d内可移栽。其中，0.1 mg/L NAA能最早的诱导根系萌动，平均5 d就有根系出现，为最佳生根培养基。而浓度达0.4 mg/L的IBA和NAA仍能诱导根系产生，但在根系与茎干的结合处会产生大量的愈伤，且其旺盛生长反而抑制根系生长。移栽试验显示，根系与茎干结合处有大量愈伤组织的生根苗存活率极低。添加0.1%的活性炭于生根培养基，虽不能影响生根率和平均根数，但能有效促进根系生长粗壮。 Table 4 Effect of NAA or IBA on rooting of the regenerated shoots of Dracocephalum rupestr 激素浓度/ mg∙L −1 Concentration of PGRs (mg∙L −1 ) 生根率/% Rooting percentage (r/%) NAA IBA 0.05 0 33.74 ± 2.0 d 0.1 0 77.82 ± 2.5 a 0.2 0 51.65 ± 2.3 b 0.4 0 47.25 ± 2.1 e 0 0.05 45.06 ± 2.1 bc 0 0.1 73.14 ± 2.9 a 0 0.2 69.51 ± 2.1 a 0 0.4 41.95 ± 2.6 bc 表4. NAA和IBA对再生苗生根的影响