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user: 3. 结果 3.1. 数据处理与分析 使用VarScan方法从TCGA数据库的第二代测序数据中提取胃癌样品的生殖/体细胞突变数据作为SNP数据，选择了945个具有SNP突变的基因。在大于50个样本数中有96个基因发生了突变(图1)。从TCGA数据库中获得了413份具有胃癌基因表达数据的样本，包括32份正常组织样本和381份癌组织样本。使用EdgeR软件包分析胃癌和正常组织样品之间的差异表达(图2)，以|logFC| > 2和P < 0.01为截止标准。我们进一步分析了胃癌中SNP突变基因和差异表达的基因，以探讨由基因突变和异常表达引起的功能障碍。 图1. 在90多个样本中突变的10个基因的瀑布图 图2. 差异基因表达的火山图 3.2. 突变基因的功能富集和途径分析 为了进一步阐明突变基因在胃癌中的功能，我们使用了DAVID在线软件对945个突变基因进行了功能富集分析和通路分析。功能富集分析表明，在生物过程类别中，SNP突变基因主要集中在通过质膜粘附分子的同性细胞粘附，动作电位和神经元动作电位的膜去极化。在细胞组分类别中，突变基因主要分类在质膜，蛋白质细胞外基质和电压门控钠通道复合物中。在分子功能类别中，这些基因主要富含钙离子结合，细胞外基质结构成分和电压门控钠通道活性(表2)。通路富集分析揭示了与癌症相关的许多信号传导途径中均含有SNP基因的富集，包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号传导途径，钙信号传导途径和环状鸟苷单磷酸(cGMP)-PKG信号传导途径(图3)。 Table 2 Gene ontology analysis of 945 mutant genes in gastric cance Category Term Count P value GOTERM_BP_DIRECT homophilic cell adhesion via plasma membrane adhesion molecules 54 1.13E−35 negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter 33 0.0075481 intracellular signal transduction 26 0.0033163 cell adhesion 23 2.98E−06 membrane depolarization during action potential 18 8.42E−15 axon guidance 17 1.11E−05 heart development 16 2.29E−04 cell migration 13 0.0085702 neuronal action potential 12 0.0337519 microtubule cytoskeleton organization 12 1.60E−09 GOTERM_MF_DIRET GO:0005509~calcium ion binding 99 3.414E−26 GO:0005524~ATP binding 99 1.153E−06 GO:0008270~zinc ion binding 65 0.0263632 GO:0003677~DNA binding 42 0.0361054 GO:0003682~chromatin binding 25 0.0180564 GO:0044212~transcription regulatory region DNA binding 18 9.495E−06 GO:0005096~GTPase activator activity 18 0.0093759 GO:0016887~ATPase activity 16 5.068E−05 GO:0004842~ubiquitin-protein transferase activity 15 0.0201426 GO:0004725~protein tyrosine phosphatase activity 14 9.479E−09 GOTERM_CC_DIRECT integral component of membrane 197 0.0385191 plasma membrane 133 2.329E−12 integral component of plasma membrane 54 0.0021151 proteinaceous extracellular matrix 32 6.187E−12 cell surface 32 0.0006393 focal adhesion 31 0.0002001 dendrite 22 8.302E−07 neuronal cell body 18 6.336E−05 voltage-gated potassium channel complex 15 6.437E−07 postsynaptic density 14 2.216E−07 表2. 胃癌中945个基因的生物学功能分析 图3. 945个突变基因的通路富集图 3.3. 构建突变基因的PPI网络 为了进一步研究突变基因之间的潜在关系，我们使用了STRING在线数据库来挖掘这些基因之间的相互作用。Cytoscape软件用于可视化复杂的PPI网络，该网络包括360个节点和1616个边缘(图4(a))。 MCODE用于从PPI网络获取重要模块，包括25个节点和245个边缘(图4(b))。功能和KEGG通路富集分析表明，重要模块的生物过程类别主要包括生物调节和细胞通讯。细胞组分类别包括细胞核，膜封闭腔和蛋白质复合物；分子功能类别主要包括蛋白质结合，离子结合和转移酶活性(图4(c))。KEGG通路富集分析表明，重要的模块基因主要富集在FoxO信号通路和甲状腺激素信号通路中(图5)。 3.4. 关键基因的筛选和生存分析 使用cytoHubba的12种算法中前30个基因的交集，我们确定了10个中枢基因：TP53，EP300，AKT1，HRAS，PTEN，PIK3CA，SMARCA4，CREBBP，BRCA1和ATM (图6(A))。使用Metascape工具来分析关键基因的通路和生物过程富集。我们观察到中枢基因主要富集在PID-P53下游，细胞凋亡，调节细胞对应激的反应等通路中(图6(B)，图6(C))。cBioPortal在线平台提供了中枢基因遗传变异的图形分析。如图所示，在胃癌中，有10个关键SNP基因均显示出高突变率，基因组变化率在8%至45%之间(图6(D))。为了确定所选的中枢基因是否具有临床相关性，我们使用Kaplan-Meier曲线分析了这些基因的单变量存活率，发现TP53，HRAS，BRCA1，PIK3CA，AKT1和SMARCA4的表达与预后相关(图7)。因此，这些关键基因可作为胃癌的预后指标。 3.5. 通过UALCAN验证集线器基因 UALCAN是一种在线工具，具有TCGA和GTEx的数据，用于验证这些关键基因在胃癌中的表达。在这项研究中，根据来自TCGA数据库的RNA序列数据，比较了胃肿瘤样品和邻近的正常组织中6个基因(TP53，HRAS，BRCA1，PIK3CA，AKT1，SMARCA4)的mRNA表达水平。发现这六个基因在415个胃癌组织中与34个正常组织相比在转录水平上高表达(图8)。我们选择P < 0.05，倍数变化 > 2作为阈值。 图4. 突变基因的PPI网络的构建和重要模块的分析 图5. 重要模块的通路富集图 图6. 关键基因的选择和分析 图7. 使用Kaplan-Meier曲线对关键基因进行单变量生存分析 图8. 关键SNP突变基因表达的分析 3.6. 预后相关基因的基因组变化 我们使用cBioPortal工具从TCGA数据库中选择了478个样品，并研究了六个预后相关基因的基因组特异性变化。对癌症类型的汇总分析显示，在TCGA的胃癌数据集(包括粘液性胃腺癌，弥漫型胃腺癌，胃腺癌，和肾小管腺癌)中，这6个基因的基因组改变频率范围为12.66%至51.90% (图9)。 图9. 5个胃癌数据集中关键基因的基因组特异性变化 3.7. 胃癌中六个基因的基因表达水平 使用qRT-PCR分析胃癌中TP53，HRAS，BRCA1，PIK3CA，AKT1，SMRACA4的表达。结果表明，与胃正常细胞GES-1相比，6个基因在胃癌细胞AGS和HGC27中的表达上调(图10)。