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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料、试剂与仪器 材料：竹叶(由宣城市中良枣业有限责任公司提供，采于安徽省宣城市水东镇)。 试剂：伞形花内酯(98%)及芦丁(98%)购自北京神州科创生物技术有限公司；聚酰胺树脂，AB-8、DM-301、D-101及HP-20四种大孔树脂购自长沙市大禹化工有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、柠檬酸、硝酸铝及亚硝酸钠均为分析纯；试验用水为去离子水。 仪器：HX-200高速中药粉碎机(浙江永康市溪岸五金药具厂)；HH-2数显恒温水浴锅(江苏金坛市杰瑞尔电器有限公司)；SC-3614低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；DZF-6020真空烘干箱(上海三发科学仪器有限公司)；SHZ-P(III) 循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；R-201旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；722E紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；1.6 × 60 cm层析柱(上海琪特分析仪器有限公司)；BT1-200恒流泵(上海琪特分析仪器有限公司)；BSZ-100自动部份收集器(上海精科实业有限公司)；LGJ-12冷冻干燥器(北京松源华兴科技有限公司)。 2.2. 材料、试剂与仪器 2.2.1. 工艺流程 竹叶→预处理→浸提→离心→浓缩 乙醇←←冷凝 ↓ ↓ ↑ 树脂→预处理→上柱→吸附→解吸→收集→蒸发→内酯溶液→冷冻干燥→竹叶内酯成品 2.2.2. 工艺要点 1) 原料：选择新鲜、无损伤的深绿竹叶。 2) 预处理：除去竹叶末端的竹枝，然后切剪，用清水洗涤，去除杂物。在60℃条件下，真空干燥至水分含量小于5%。用粉碎机粉碎3 min，然后过60目筛，得到竹叶粉末。 3) 浸提：用乙醇提取竹叶内酯，主要考察乙醇浓度、液料比、提取温度和时间对提取的影响。分别进行单因素和正交试验，得出最佳的提取条件组合。 4) 离心：将浸提液在4000 rpm下离心15 min，取上清液。 5) 浓缩：在50℃及−0.5 MPa真空度下，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至原体积的1/3。 6) 树脂的预处理：分别取50 g聚酰胺、DM301、D101、HP-20及AB-8五种树脂，先用去离子水洗去细小及破碎树脂，再用95%乙醇浸泡24小时，洗涤至无乙醇。然后，依次用5%盐酸及5%氢氧化钠溶液浸泡4小时(两次浸泡后均水洗至中性)。最后，用去离子水浸泡备用。 7) 上柱：将预处理好的树脂水浆液加入层析柱中，待树脂沉降下来，把过量的水通过柱底放出，保持水面高于树脂层面3 cm以上，上柱高度为柱高的2/3。 8) 吸附：用磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液，将上样液pH调至4后，加入装有树脂的层析柱中。加入量为2倍树脂体积，控制流速为2 mL/min，让内酯被充分吸附。 9) 解吸：吸附结束后，依次用3 BV去离子水和3 BV 20%乙醇洗脱，收集洗脱液。 10) 蒸发：用旋转蒸发仪，将收集的洗脱液浓缩至原体积的1/5 (蒸发出的乙醇可循环利用)。 11) 冷冻干燥：将浓缩后的洗脱液在−20℃下冻结后，再在−50℃及−0.1 MPa真空度下，干燥至水分含量 < 5%。 2.2.3. 测定方法 1) 内酯标准工作曲线的制备 以伞形花内酯为标准品，采用双波长分光光度法 [ 11 ] 。准确称取伞形花内酯标准样品20 mg，用40%乙醇溶解后，定容至25 mL，得伞形花内酯标准品溶液(0.8 mg/mL)。准确吸取2 mL上述伞形花内酯标准品溶液于试管中，用40%乙醇稀释至20 mL，得伞形花内酯标准对照液。分别取上述对照液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0及2.5 mL于试管中，补加40%乙醇至10 mL。以40%乙醇为空白溶液，分别在325.5和385.5 nm下测定吸光度，得线性回归方程： (1) 式中：Y——两吸光度的差值； X——伞形花内酯溶液的浓度(μg/mL)。 2) 黄酮标准工作曲线的制备 以芦丁为标准品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法 [ 12 ] 。准确称取芦丁标准样品20 mg，用40%乙醇溶解，定容至50 mL，得芦丁标准品溶液(0.4 mg/mL)。准确吸取0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0及2.5 mL上述芦丁标准溶液分别于10 mL容量瓶中。先加5% NaNO 2 溶液0.3 mL，放置6 min；再加10% Al(NO 3 ) 3 溶液0.3 mL，放置6 min；加入4% NaOH溶液4 mL后，用40%乙醇溶液定容至刻度。摇匀，放置15 min后，在510 nm处测定吸光度，得线性回归方程： (2) 式中：Y——吸光度值； X——芦丁溶液的浓度(μg/mL)。 3) 竹叶内酯提取率 浸提结束后，取离心后的上清液，稀释25倍，分别在测定波长和参比波长处测定吸光度。根据标准曲线计算出提取液的浓度，并进一步得出竹叶内酯的提取率。 (3) 式中：Q——提取率(‰)； C——内酯浓度(mg/mL)； V——提取液的体积(mL)； M——竹叶粉的质量(g)。 4) 得率和纯度测定 准确称取100 g竹叶粉，在最佳提取条件下提取，浓缩后用pH4的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液定容至500 mL。然后，将定容后的溶液上柱。吸附结束后，依次用3 BV去离子水和3 BV 20%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩到原体积的1/5。然后，干燥至水分含量 < 5%。收集密封，称重，计算内酯的得率。 (4) 式中：P——得率(‰)； M 1 ——纯化后内酯粉末的质量(g)； M 2 ——竹叶粉的质量(g)。 准确称取2 mg竹叶内酯粉末，用40%乙醇溶解，定容至250 mL。用双波长分光光度法测定吸光度值，再根据标准曲线计算出内酯的浓度，进而计算出内酯的纯度。 (5) 式中：R——纯度(%)； C——内酯的浓度(mg/mL)； V——内酯溶液的体积(mL)； M——内酯粉末的质量(g)。 2.2.4. 单因素试验 1) 乙醇浓度对内酯提取率的影响 取六个100 mL锥形瓶，均加入2 g竹叶粉和40 mL乙醇溶液(浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%及70%)，在80℃下提取2 h。提取两次，合并提取液。冷却后离心，测吸光度值，根据公式(3)计算竹叶内酯的提取率。以提取率为评价标准，考察乙醇浓度对竹叶内酯提取的影响。 2) 液料比对内酯提取率的影响 取六个100 mL锥形瓶，均加入2 g竹叶粉，分别加入40%乙醇10、20、30、40、50及60 mL，在80℃下提取2 h。提取两次，合并提取液。冷却后离心，测吸光度值，根据公式(3)计算竹叶内酯的提取率。以提取率为评价标准，考察料液比对竹叶内酯提取的影响。 3) 提取温度对竹叶内酯提取率的影响 取六个100 mL锥形瓶，均加入2 g竹叶粉和40%乙醇溶液40 mL。温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃及100℃，提取2 h。提取两次，合并提取液。冷却后离心，测吸光度值，根据公式(3)计算竹叶内酯的提取率。以提取率为评价标准，考察提取温度对竹叶内酯提取的影响。 4) 提取时间对竹叶内酯提取率的影响 取六个100 mL锥形瓶，均加入2 g竹叶粉和40%乙醇溶液40 mL。时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，在80℃下提取两次，合并提取液。冷却后离心，测吸光度值，根据公式(3)计算竹叶内酯的提取率。以提取率为评价标准，考察提取时间对竹叶内酯提取的影响。 2.2.5. 提取条件的正交试验 为了进一步考察竹叶内酯的提取条件，在单因素的基础上，设计四因素三水平L 9 (3 4 )正交试验。如表1所示，其因素和水平分别为：乙醇浓度(30%、40%及50%)，液料比(10:1、15:1及20:1)，提取时间(2.0、2.5及3.0 h)。以提取率为考察指标，优化各因素及水平对内酯提取的影响。 2.2.6. 树脂种类的确定 选取聚酰胺、DM301、D101、HP-20及AB-8五种树脂，对竹叶提取物进行静态吸附和解吸。初步选出对竹叶内酯吸附和解吸效果最好的树脂。然后，对初步选出的树脂进行动态解吸，进一步验证。 1) 树脂对竹叶内酯和黄酮的静态吸附 准确称取预处理好的五种树脂(聚酰胺、DM301、D101、HP-20、AB-8)各5.0 g于250 mL锥形瓶中，精密加入竹叶提取浓缩液50 mL (内酯、黄酮浓度分别为0.512及1.09 mg/mL)。放入振荡器，在25℃及110 r/min条件下，振荡24 h。充分吸附后，静置过滤，取滤液稀释50倍，分别用双波长分光光度法和硝酸铝–亚硝酸钠比色法测定内酯和黄酮的浓度。按下式计算各树脂对竹叶内酯和黄酮的吸附率(%)。 Table 1 Orthogonal test factor horizontal tabl 水平 因素 A B C D 乙醇 (%) 液料比 (v/m) 提取时间 (h) 空列 1 30 10:1 2.0 2 40 15:1 2.5 3 50 20:1 3.0 表1. 正交试验因素水平表 (6) 式中：Q——吸附率(%)； C 0 ——初始浓度(mg/mL)； C 1 ——吸附后浓度(mg/mL)。 2) 树脂对竹叶内酯和黄酮的静态解吸 取两组吸附饱和的五种树脂，分别加入20%及80%乙醇溶液解吸。放入振荡器，在25℃及110 r/min条件下，振荡24 h。静置过滤。用上述相同方法测解吸液中内酯和黄酮的浓度，按下式计算解吸率(%)。 (7) 式中：W——解吸率(%)； C 2 ——解吸液浓度(mg/mL)； V 2 ——解吸液体积(mL)； C 0 ——初始浓度(mg/mL)； C 1 ——吸附后浓度(mg/mL)； V 1 ——吸附液体积(mL)。 3) 树脂的吸附动力学测定 选择初步确定的最佳树脂用于装柱，样液中内酯和黄酮含量分别为0.512和1.09 mg/mL。上样量为2 BV，流速为2 mL/min。吸附结束后，依次用3 BV去离子水、3 BV 20%乙醇和3 BV 80%乙醇洗脱。用自动收集器收集，每隔3试管测一次内酯和黄酮的吸光度值。 2.2.7. 统计分析 本研究中，所有试验均平行三次，试验结果取三次的平均值。