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user: 3. 结果与分析 3.1. 愈伤组织的诱导 3.1.1. 植物生长素对愈伤组织的诱导 将叶片接种到愈伤组织诱导培养基后，7 d内就会产生愈伤组织。表1显示，6-BA是诱导民族药俄色叶片产生愈伤组织的关键植物生长调节剂，培养基中添加6-BA，可顺利诱导叶片出愈。随着6-BA浓度的升高，叶片出愈率随之升高，但愈伤组织的质地变得松散。浓度2.0 mg/L的6-BA能诱导85.35% ± 2.1%的叶片产生瘤状愈伤组织，3.0 mg/L的6-BA虽然也能诱导愈伤组织大量产生，但愈伤组织质地疏松，瘤状结构稀少，再生能力差。添加2，4-D后发现，浓度0.1 mg/L的2，4-D对民族药俄色叶片形成愈伤有促进作用。2.0 mg/L 6-BA与0.1 mg/L 2，4-D的组合对诱导民族药俄色叶片产生瘤状愈伤组织的效果最佳，诱导率高达93.25% ± 2.2%。 Table 1 Effect of plant growth regulators (PGRs) on callus induction from leaf of Malus toringoide 激素浓度/mg∙L −1 Concentration of PGRs (mg∙L −1 ) 出愈率/% Callus induction rate (r/%) 愈伤组织形态 Morphology of callus 6-BA 2，4-D 1.0 0 64.12 ± 4.0 b 紧实，瘤状结构少 2.0 0 85.35 ± 2.1 a 紧实，瘤状结构多 3.0 0 95.55 ± 4.2 a 疏松，瘤状结构少 1.0 0.05 66.18 ± 1.1 b 紧实，瘤状结构少 2.0 0.1 92.81 ± 2.1 a 紧实，瘤状结构多 3.0 0.2 96.45 ± 1.9 a 疏松，瘤状结构少 1.0 0.2 69.12 ± 1.3 b 紧实，瘤状结构少 2.0 0.1 93.25 ± 2.2 a 紧实，瘤状结构多 3.0 0.05 95.05 ± 2.0 a 疏松，瘤状结构少 表1. 植物生长调节剂对俄色叶片愈伤组织诱导的影响 表中不同字母表示邓肯氏最小显著差数测验差异显著(P ≤ 0.05)。下同。 3.1.2. 光周期对愈伤组织诱导的影响 外植体分别进行光培养与暗培养20 d，观察发现光培养与暗培养均能诱导愈伤组织形成。暗培养产生的愈伤组织出现早，平均5 d就能观察到愈伤产生，且体积大、质地松散、无法分化，须在光下培养2周，并转绿后才能恢复分化能力。光培养条件下，至少7 d后才有愈伤组织生成，但愈伤组织颜色墨绿，质地紧密，瘤状结构明显；20 d后即可转入分化培养基，15 d内就能产生不定芽。 3.1.3. 继代次数对愈伤组织的影响 多次继代培养会使愈伤组织的结构和颜色发生明显变化。表2显示，随着继代次数的增加，愈伤组织逐渐失绿褐化，增殖能力下降，质地变得松散，瘤状结构消失，不定芽再生率也随之下降。特别是第4次继代后，愈伤组织严重褐化，产生不定芽的能力下降明显。 Table 2 Effect of subculture times on callus and shoot regeneration of Malus toringoide 继代次数 Subculture times 愈伤组织形态 Morphology of callus 不定芽再生率/% Frequency of adventitious shoot formation (r/%) 1 绿白色，瘤状结构丰富 68.45 ± 9.2 a 2 绿白色，瘤状结构丰富 65.76 ± 5.5 a 3 绿白色，较少瘤状结构 53.55 ± 2.1 ab 4 黄绿色，较少瘤状结构 37.10 ± 1.3 b 5 黄绿色，松散 17.22 ± 6.1 c 6 褐色，松散 9.14 ± 3.8 c 表2. 继代次数对俄色愈伤组织形成和分化的影响 3.2. 细胞分裂素对愈伤组织分化不定芽的影响 诱导不定芽再生的实验发现，3种细胞分裂素(CTK)单一添加时，随着CTK浓度增加，不定芽再生率均呈现先增后降的趋势(表3)。其中，6-BA效果最好，TDZ其次，KT最差。6-BA的最佳浓度为0.5 mg/L，不定芽再生率高达61.32% ± 3.6%，每个愈伤组织平均产生4.15个芽。TDZ的最佳浓度为0.1 mg/L，不定芽再生率为62.43% ± 3.3%，但诱导的芽玻璃化现象严重，生长缓慢且基部产生较多愈伤组织；继续培养15 d后，愈伤组织生长过盛，抑制了不定芽的伸长生长，最后导致不定芽生长不良而死亡。3种CTK最佳浓度的两两组合发现，KT与6-BA组合的效果最好，诱导不定芽再生率最高，达69.51% ± 2.5%，不定芽数量多且健壮。同时，TDZ + 6-BA和KT + TDZ的组合对不定芽诱导具有负作用，诱导效果不如单一添加6-BA或TDZ。因此，不定芽再生的最佳培养基为：MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT + 0.15 mg/L IBA。将愈伤组织接种到最佳不定芽再生培养基上7~15 d可出现不定芽，继续培养7~15 d不定芽可伸长至2~3 cm。 Table 3 Effect of CTK on induction of adventitious shoots from calli of Malus toringoide 细胞分裂素/mg∙L −1 Concentration of CTK 不定芽再生率/% Frequency of shoot formation (r/%) 每愈伤组织产生的平均芽数/个 Number of shoots 6-BA KIN TDZ 0.1 0 0 15.15 ± 3.1 d 1.21 d 0.5 0 0 61.32 ± 3.6 a 4.15 a 1.0 0 0 50.10 ± 4.2 b 3.48a b 0 0.1 0 8.17 ± 2.8 d 0.85 d 0 0.5 0 35.30 ± 3.4 c 2.56 bc 0 1.0 0 32.57 ± 1.9 c 2.61 bc 0 0 0.05 38.77 ± 1.7 bc 1.22 d 0 0 0.1 62.43 ± 3.3 a 3.90 a 0 0 0.5 41.50 ± 2.4 bc 2.58 bc 0.5 0.5 0 69.51 ± 2.5 a 4.30 a 0.5 0 0.1 44.25 ± 6.8 bc 2.79 bc 0 0.5 0.1 32.48 ± 2.5 c 1.70 cd 表3. 细胞分裂素对俄色愈伤组织分化不定芽的影响 3.3. 再生植株诱导生根分析 诱导植株生根的常用生长素有NAA和IBA等，通过比较不同浓度的NAA和IBA对民族药俄色再生苗生根的影响(表4)，发现MS培养基中添加0.1 mg/L或0.2 mg/L的NAA和添加0.2 mg/L IBA均能使70%以上的再生苗在7 d内产生根系，20 d内可移栽。其中，0.2 mg/L IBA能最早的诱导根系萌动，平均4 d就有根系出现，为最佳生根培养基。而浓度达0.4 mg/L的IBA和NAA仍能诱导根系产生，但在根系与茎干的结合处会产生大量的愈伤，且其旺盛生长反而抑制根系生长。移栽试验显示，根系与茎干结合处有大量愈伤组织的生根苗存活率极低。添加0.1%的活性炭(AC)于生根培养基，虽不能影响生根率和平均根数，但能有效促进根系生长粗壮。 Table 4 Effect of IBA or NAA on rooting of the regenerated shoots of Malus toringoide 激素浓度/mg∙L −1 Concentration of PGRs (mg∙L −1 ) 生根率/% Rooting percentage (r/%) IBA NAA 0.05 0 28.15 ± 2.0 d 0.1 0 53.28 ± 2.3 b 0.2 0 74.05 ± 2.4 a 0.4 0 44.16 ± 2.1 e 0 0.05 48.21 ± 2.1 bc 0 0.1 71.85 ± 1.9 a 0 0.2 73.52 ± 2.0 a 0 0.4 45.92 ± 2.2 bc 表4. IBA和NAA对俄色再生苗生根的影响