DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
system: [SYSTEM]

user: 2. 尺度不变特征变换算法 David G. Lowe教授经过多年的研究，在2004年提出基于尺度不变特征变换(Scale Invariant Feature Transform， SIFT)算法，该算法将提取特征的过程分为四个步骤：在尺度空间上检测极值点、精确定位关键点位置、计算关键点主方向、计算特征点描述子。SIFT算法在实现原理上，最关键的部分就是在图像中构建多尺度空间，利用高斯金字塔寻找对尺度、光照、旋转等变化不敏感的特征点，使得提取的特征点具有较强的鲁棒性 [ 1 ]。 2.1. 尺度空间极值点检测 尺度空间是指把某个特定核函数和原有的图像函数做卷积处理从而得到一组单参数的函数族，该函数族被称为尺度空间 [ 7 ]。 在二维图像空间中，高斯核函数 G ( x ， y ， σ ) 被证实是尺度空间中的唯一空间核函数，因此常用作建立尺度空间的处理方法，高斯函数表达式如下表示： G ( x ， y ， σ ) = 1 2 π σ 2 exp ( − ( x − x i ) 2 + ( y − y i ) 2 2 σ 2 ) 利用高斯核函数 G ( x ， y ， σ ) 对图像进行卷积运算后，得到图1所示的高斯尺度空间 [ 8 ]，也成为高斯金字塔。 图1. 高斯尺度空间 实际的计算过程中，高斯差分函数(Difference of Gaussian，DoG)比高斯函数更具有健壮性。因此SIFT算法在实现上采用DoG函数尺度空间，DoG的尺度空间记为 D ( x ， y ， σ ) ： 通过上式构建得到图像尺度空间后，SIFT算法首先就是需要找出尺度空间的极值点作为备选特征点，其检测过程如图2所示。 假设上图中的“×”是目标检测点，将该点与图中空间上相邻的26个点的像素值进行比较，如果该点的像素值为最大或最小值，那么则将该点记为候选特征点。 2.2. 精确定位特征点 为了在连续空间上得到精确位置的特征点，SIFT算法利用子像素插值法(Sub-pixel Interpolation)将图像中的离散数据进行拟合，得到特征点的精确位置和尺度信息 [ 9 ]。 在DoG尺度空间里，图像函数的极大值在图像的横跨边缘出现主曲率较大且竖直边缘主曲率较小的情况。为了消除图像边缘响应，从而进一步精确确定特征点位置，SIFT算法需要降低DoG函数极大值的主曲率对图像边缘的影响 [ 10 ]。特征点的主曲率是根据其所在图像尺度上的Hessian矩阵计算得到，Hessian矩阵的表达式如下： 图2. 高斯差分尺度空间极值点检测 H = [ D X X D X Y D X Y D Y Y ] 在上式中， D X X 为DoG空间中，某一尺度下图像在计算X方向二次导数的值。矩阵D的主曲率和Hessian矩阵H的特征值呈线性关系，令 α 为矩阵H的最大特征值， β 为矩阵D的最小特征值，得到 α 和 β 的线性关系表达式： α = γ β 上述过程可以化简为以下公式： T r ( H ) = D X X + D Y Y = α + β D e t ( H ) = D X X ⋅ D Y Y − ( D Y Y ) 2 = α × β T r ( H ) D e t ( H ) = α + β α × β = ( γ + 1 ) 2 γ 当 α 和 β 的比值越大时， T r ( H ) 与 D e t ( H ) 的比值最大，此时说明图像在某个方向上梯度值与另一梯度值的差值越大，这种情况正好符合图像边缘的特征特点，为了去除特征点的边缘响应，需要将 γ 设置一个阈值范围，并对上式做进一步判断 [ 11 ]： T r ( H ) D e t ( H ) < ( γ + 1 ) 2 γ Lowe在论文中认为 γ 取值为10能得到最好的效果。 2.3. 计算特征主方向 SIFT在计算特征主方向上，首先选特征点所在的尺度大小为 3 σ 的邻域范围内像素点集，计算邻域像素点的梯度幅度和梯度方向，具体计算公式如下所示，其中 L ( x ， y ) 表示图像中特征点所在尺度的空间值。 像素梯度： g r a d I ( x ， y ) = ( ∂ I ∂ x ， ∂ I ∂ y ) 梯度幅值： m ( x ， y ) = [ L ( x + 1 ， y ) − L ( x − 1 ， y ) ] 2 + [ L ( x ， y + 1 ) − L ( x ， y − 1 ) ] 2 梯度方向： 得到特征点邻域像素的梯度和方向等信息后，利用360°的梯度方向直方图进行梯度方向统计。梯度方向直方图以10°为单位设立一个柱(bin)，共有36个柱，并将相应的梯度方向统计到对应的柱上。特征点的主方向根据这个梯度方向直方图进行选取。如图3所示，其中编号为(5)的柱统计的统计值最高，因此将该柱对应的方向设为特征点的主方向，另外编号为(2)和(8)的柱高于主方向柱高度的80%，因此将这两个柱对应的方向设为特征点辅方向。 图3. 选取特征点方向示意图 2.4. 计算特征描述子 SIFT特征描述子是在DoG尺度空间中统计特征点的周围像素梯度得到，具体过程是：首先划分特征点邻近的像素为若干个子区域，并计算和统计每块子区域的梯度直方图，最终将每个直方图的结果组成一个特征表达向量。 图4. 坐标轴旋转到特征点主方向 如图4所示，为了让特征描述子具有旋转不变性，在计算描述子之前需要将特征点坐标轴转到主方向上。 旋转后，在以特征点为中心的 16 × 16 邻域范围里，计算每个像素点的梯度幅值和方向，并以 4 × 4 像素为单位进行高斯加权统计(如图5所示)，将统计结果分配到8个方向上，最终将 4 × 4 个子区域的统计结果转化为一维向量，即得到 4 × 4 × 8 = 128 维的特征向量。 图5. SIFT描述符表达过程
system: [SYSTEM]

user: 3. 改进的SIFT算法 SIFT虽然能够在一定程度上保证了图像特征的不变性，但是仍然存在一定的不足，比如计算过程复杂、特征描述子的向量过大等问题。为了解决SIFT算法的不足，后来许多研究学者提出了改进的方案，其中SURF和ORB算法是其中较为成熟的改进方法。 3.1. SURF算法 Herbert Bay教授在2006年提出加速鲁棒特征(Speeded-Up Robust Features， SURF)算法，该算法是基于SIFT算法的改进。SURF算法在实现原理上与SIFT大致相同，在保持了SIFT算法中对尺度、光照、旋转、仿射等变化鲁棒性强的特点的同时，针对SIFT算法在设计中存在耗时长、特征描述子维度过大的问题进行了优化。 图6. 计算图像S区域面积 3.1.1. 积分图像 SURF算法利用过了积分图像能够快速得到图像中任意区域的像素和。以图6为例，利用积分图像的公式可以快速得到区域S的像素值之和，其计算过程如下式所示。 I Σ S = A + D − B − C 3.1.2. 方格滤波器 SURF算法在构建尺度空间过程中，采用了方格滤波器来替代Gaussian滤波器，图7和图8对比了在二维平面上，两种滤波器设计的不同。 图7. 二阶高斯滤波器 L ( X ， σ ) 图8. 二阶方格滤波器 显然，在实现上相较于SIFT算法采用的高斯滤波器，方格滤波器实现原理简单，处理速度更快，因此提高了SURF算法的处理效率 [ 12 ] [ 13 ]。 3.1.3. Haar小波 Haar小波是一种结构简单，且能够检测水平和垂直方向的梯度变化的滤波器。SURF利用图9(a)的Haar滤波器计算图像在水平方向的梯度，(b)计算垂直方向的梯度。 SURF算法利用Haar小波计算特征点邻域的Haar响应结果作为其特征方向，另外在计算特征描述子过程中，SURF算法统计特征点周围的 5 σ × 5 σ 区域的Haar小波系数，得到一个64维的特征向量。 图9. 不同方向的Haar小波 3.2. ORB算法 ORB(Oriented FAST and Rotated BRIEF)算法是一种基于二进制描述子的特征检测算法，该算法结合了FAST算法和BRIEF算法两种算法并加以改进。 FAST的主要思想是：若某像素与其周围邻域内足够多的像素点相差较大，则该像素可能是角点。BRIEF是一种基于二进制编码的特征点描述方法，具有匹配迅速的特点。 ORB的改进思路为：在检测特征点过程中，ORB利用Harris角点来限定FAST角点；在计算特征描述子上利用强度质心(intensity centroids)方法，提高特征描述子在特征方向描述能力。因此ORB算法具备了出色的算法实时性，同时在图像特征表达上也具备一定的稳健性 [ 14 ]。 3.2.1. 特征点检测 FAST角点检测是在检测点周围邻域上比较差值大小，如图10所示，检测点P比较其周围16个点的像素值差值，若有足够多的周围点与检测点的像素差值超过阈值，即上述16个点的差值的平均值，则认为该点为特征点。 图10. 检测特征点 ORB算法则增加了Harris检测对特征点进行排序，加入了响应函数，并在多尺度空间金字塔中计算FAST角点，增加了特征点的尺度不变性。 3.2.2. 计算特征主方向 ORB算法在计算特征主方向上，利用极值点与质心的灰度偏移量作为特征方向。假设特征点的邻域矩 M p ， q 的计算公式为： M p ， q = ∑ ( x ， y ) ∈ S x p y q I ( x ， y ) 其中， I ( x ， y ) 表示像素的灰度值，S表示特征点邻域范围，其质心C的表达式为： C = ( M 1 ， 0 M 0 ， 0 ， M 0 ， 1 M 0 ， 0 ) 特征点的主方向为该点和质心C的夹角 θ 的表达式如下： θ = arctan ( M 0 ， 1 ， M 1 ， 0 ) 3.2.3. 计算特征描述子 如图11所示，ORB算法采用了BRIEF算法的思想，将若干个像素点对进行像素差值比较，得到若干长度的比特串作为特征描述子。为了提高对像素点的噪声容忍性，ORB选择5×5的区域来替代像素点的比较，并且计算该区域的像素平均灰度值进行比较。 图11. BRIEF选取若干点对 另一方面，为了得到具有旋转不变性的特征描述子，ORB算子将得到的特征方向 θ ，计算旋转矩阵 R θ ，计算公式如下： R θ = ( cos θ sin θ − sin θ cos θ ) 最后将旋转矩阵对特征描述子主方向校正，得到具有旋转不变性的特征描述子。
system: [SYSTEM]

user: 4. 电力设备铭牌特征提取实验 电力设备铭牌图像是一类特殊的图像，其纹理和颜色信息相对单一，如图12所示，电力设备铭牌局部范围经常出现较高的相似性，而在整体性上则很少出现相似情况。基于这一特性，采用局部特征的提取方法十分适合应用在电力设备铭牌的特征提取场景。 4.1. 实验数据 本文采用5幅来自不同厂家的电力设备铭牌图像作为实验的原始图像，并且对每个原始图像做放缩、模糊、仿射、裁切、加噪、旋转共6种变换，因此每幅原始图像共产生6幅变化图像，将原始图像与对应的6幅变化图像分为一组，最终得到5组电力设备铭牌图像实验数据，图13展示了其中一组的实验图像。 图12. 电力设备铭牌 图13. 电力设备铭牌图像变化处理；(a) 原图；(b) 缩放；(c) 模糊；(d) 仿射；(e) 裁切；(f) 加噪；(g) 旋转 4.2. 评价标准 4.2.1. 特征位置分散性及不变性 从视觉角度看，特征位置是最为直观的评价维度。对于特征位置评价标准而言，主要考察其分散性以及不变性。对于一幅图像，若提取特征点越分散，表示其特征对图像的覆盖性更广，所提取的特征信息集合表达越全面。 4.2.2. 特征提取效率 本文对特征提取算法评价从时间、特征数量和单位时间提取特征个数三个层面对特征提取算法的效率进行综合性评价。 4.2.3. 正确率和召回率 正确率和召回率是对图相匹配评价的重要指标。准确率是指算法所得到的两幅图像的匹配对中，正确匹配对数量与得到的匹配对数量的比值；召回率是指正确匹配对数量与图像提取特征点数量的较小值的比值。 4.3. 实验结果分析 本文采用SIFT、SURF和ORB算法采用三种特征提取算法分别提取每幅图像的特征，图14~16为三种算法在提取不同变化的电力设备铭牌图像特征效果。 可以看出，SIFT、SURF和ORB算法都能够准确发现电力设备名牌图像中的角点位置，并提取特征点，但从特征点位置的分散性和稳定性而言，ORB算法稍显不足，相比而言，SIFT和SURF算法则具备更好的稳定性。 图14. SIFT算法提取特征点 图15. SURF算法提取特征点 图16. ORB算法提取特征点 接下来分析三种算法的特征提取效率，分别从特征提取数量、算法特征提取耗时以及单位时间提取特征数量三个维度进行考察，其统计结果如图17所示。 图17. 不同算法提取特征效率；(a)特征提取数量；(b)特征提取耗时；(c)单位时间提取特征数量 显然，无论是特征提取是数量还是特征提取效率上，ORB具有最佳的特征提取效率，SURF次之，SIFT算法在提取特征处理速度上效率最低。 图18. SIFT、SURF、ORB特征匹配实验；(a) 匹配点对数量；(b) 正确率；(c)召回率 从图18可以看出，ORB虽然在特征数量上提取最多的特征点，但是特征表达的不变性较差，在匹配过程中得到较低的正确率和召回率，SURF和SIFT算法则表现相对较好，在部分变换场景下，SURF特征在匹配正确率和召回率高于SIFT算法。
system: [SYSTEM]

user: 5. 结语 SIFT算法由于其在检测图像特征上，具备较高的稳定性和鲁棒性，得到了广泛的应用。与此同时，许多研究学者在基于SIFT算法提出了改进的方法，以提高特征提取的效率和性能。 本文针对电力设备铭牌图像的特征提取上进行深入的分析，介绍了SIFT算法，以及两种基于SIFT的改进算法SURF和ORB算法的实现原理。在实验部分，利用不同变化处理后的铭牌图像数据，将三种基于多尺度的特征提取算法进行特征提取以及匹配实验，实验结果表明SURF算法最适于电力设备铭牌图像的特征提取算法。 上文已经提到，光照变化是铭牌特征提取中的一个不确定因素。为了更好的进行铭牌特征提取，下一步的研究重点是利用图像增强算法处理光照变化。
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 本文的数据来源于广东省某肿瘤医院，共计2064个鼻咽癌病案，我们对其进行数据挖掘，并预测病人的医疗费用。本文通过以下四步对数据进行研究。首先，我们选取了病人的年龄、性别、TNM诊断分期以及住院天数等特征为预测变量。然后，基于回归决策树算法(CART)建立费用预测模型。其后，分别使用两种Boosting算法，AdaBoost和Gradient Boosting对已有模型进行改进。接着，通过直观比照和回归评价指标，分析三种算法建立的预测模型的效果并进行比较，得到效果最好的DBRT (Gradient Boosting Decision Tree)预测模型，其预测准确率约为85%。最后，通过特征重要度和部分依赖关系图，解释基于Boosting算法的模型的现实意义，为医疗保险资源的分配和单个病例预期费用提供了参考。 关键词 :CART，鼻咽癌，AdaBoost，Gradient Boosting，DBRT，回归评价指标，特征重要度， 部分依赖关系 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 尽管医疗保险资金再分配是医疗保险机制中重要的一环，但在日常的运行过程中常常遇到资源分配不合理的问题。而对患者来说，难以预先得知较为准确的治疗费用，也将对其治疗过程产生不利的影响。所以，研究医疗费用预测对建立单病种的支付额度和患者的治疗十分重要。但是，由于很多因素的影响，单病种支付额度不可能是始终不变的，尤其是癌症这类医疗费用极差较大的病种来说，其治疗过程中产生的费用更是难以准确预测。究竟该如何准确给出治疗费用是摆在研究人员面前的棘手问题。 国内外对于该问题已有一定的研究，近些年，Robert B. Fetter等人提出的DRGs (Prospective Payment System Based On Diagnosis Related Groups) [ 1 ]，即诊断相关分类，有着迅速发展，它是当今世界公认的比较先进的支付方式之一。它以病例组合为基本依据，考虑了患者的个体特征以及并发症和合并症情况等因素，将诊疗过程相似、费用支出相近的病例分到同一个组，进而接受统一标准的诊疗预付费。这一方法通过统一的诊断分组定额支付，激励医院加强质量管理、优化资源利用。而国内对于医保赔付和医疗费用预测问题也有一些成果，林倩、杜剑亮、Ai-Jing Luo等人 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] 利用决策树实现DRGs，并对医保赔付做出指导。张凯、王若佳 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] 引入数据挖掘技术解决该问题，提供了新的思路。 本文对大量鼻咽癌患者病历进行数据挖掘，根据影响疾病治疗费用的主要因素，基于回归决策树构建了针对鼻咽癌(NPC)患者个体的费用预测模型，并运用Boosting算法进行模型改进，最后解释模型的现实意义，为医疗保险资源的分配和单个病例预期费用提供参考。
system: [SYSTEM]

user: 2. 描述性统计 2.1. 数据预处理 本文处理的鼻咽癌患者数据采样于广东省某肿瘤医院，但由于原始数据存在缺失、不规范等原因，需要对数据进行预处理。针对此次课题，本小组利用莱文斯坦编辑距离算法、正则表达式、余弦相似性等方法对原始数据进行了如下处理：剔除罕见的接受手术的样本、限制ICD编码范围、去除费用大于三倍标准差的样本(如表1所示)、TNM分期标准化、费用明细整合，最终获得2064例标准化数据 [ 8 ]。 Table 1 Removing data out of three times the standard deviatio 标准差 平均值 删除前 168，842.4 244，894.1 删除后 121，342 226，751 表1. 去掉大于三倍标准差的数据 2.2. 描述性统计 2.2.1. 基本情况 对鼻咽癌病例数据进行描述性统计，具体统计情况如表2 [ 8 ]。 Table 2 Basic statistic 项目 分类 人次(人) 平均费用(元) 占比(%) 年龄 30 212 153，781 10.27 31~40 480 160，551 23.25 41~50 740 170，860 35.85 51~60 492 156，222 23.83 61 140 158，057 6.78 性别 男 1605 162，233 77.76 女 460 162，761 22.28 TNM分期 一期 660 169，298 31.97 二期 120 175，484 5.81 三期 528 169，177 25.58 四期 752 149，461 36.43 未知 4 144，164 0.19 治疗时长 0~1年 1149 106，585 55.66 1~2年 410 195，115 19.86 2~3年 227 243，938 10.99 3~4年 138 277，088 6.69 4年以上 140 278，693 6.78 表2. 基本情况统计 2.2.2. 社会学数据分布情况 在2064例鼻咽癌患者病例中，男性共1605例，占病例总数的77.76%，女性460例，占病例总数的22.24%。由年龄和支付的密度散点图，即图1，可见年龄多分布于区间[41， 50]岁，支付总费用在10万元到20万元的鼻咽癌患者是密度最大的 [ 8 ]。 图1. 住院费用随年龄变化的密度散点图 2.2.3. TNM分期数据分布情况 观察病例数据在不同分期中的分布，发现男性患者较多的现象普遍存在，并且鼻咽癌分期主要集中在三期、四期中，占比62%。 观察每个TNM分期与平均费用的关系，可知一期费用普遍较低，而二期费用最高，我们推测导致该现象的原因为二期鼻咽癌症状相对一期更为严重，但相较于三期、四期更容易被治愈，存活率相对较高，导致二期患者疗程更长，花费更多 [ 8 ]。 2.2.4. 对数据集的概况性描述 1) 男性更容易患鼻咽癌，占总患者数78%； 2) 患者多为40至60岁的中老年人； 3) 患者的治疗费用集中在20万左右，其中二期的鼻咽癌患者花费最多； 4) 就诊患者主要为鼻咽癌中晚期(三期和四期)患者。
system: [SYSTEM]

user: 3. 基于CART算法的费用预测 3.1. CART回归树生成算法原理 CART回归树的生成算法基于最小二乘法。在训练数据集所在的输入空间中，递归地将每个区域划分成两个子区域并决定每个子区域上的输出值，构建二叉决策树。例如给定数据集 ，输出回归树 ： 1) 第一步、选择数据集 中最优切分变量 与切分点 ：求解： 遍历变量 ，对固定的切分变量 扫描切分点 ，选择使上式达到最小值的二元有序数对 。 2) 第二步、用选定的有序数对 划分区域并决定相应的输出值： 其中 是一个用二元有序数对(切分变量及其取值)表示的定义域。由此进一步可以解得枝结点和叶节点的因变量的预测值(回归拟合值)为其结点内样本均值： 3) 第三步、对两个子区域(枝结点)重复前两步，直到满足停止条件(最大树深度、结点内最小样本量、复杂度参数阈值等)。 4) 第四步、输出回归决策树 ： 将输入空间划分为 个区域 ，即 个叶节点( 类) [ 8 ]。 3.2. 基于CART算法的费用预测 我们使用Python的sklearn.tree库实现CART回归预测，建立并训练最大深度为4的CART回归树，之后进行费用预测并与真实数据进行对比，得到如下预测费用与年龄分布散点图，由图2可知，CART算法预测的费用集中于1万至3万，对于费用较低或费用较高的病例预测效果较差。 图2. 基于CART算法的预测费用与真实费用对比
system: [SYSTEM]

user: 4. 基于Boosting算法的费用预测 Boosting (提升方法)是Ensemble Learning算法的一类。这类算法的思想是将弱学习器提升为强学习器。即先用初始训练集训练出一个基学习器，再根据基学习器表现对训练样本分布进行调整，那些基学习器判断错误的样本，在之后会被赋予更大的权值，然后基于调整后的样本来训练下一个基学习器，一直反复进行，直到达到理想效果。在2000年左右，Friedman的几篇论文提出Boosting算法的成功实现 [ 9 ] [ 10 ]。 Boosting常用的两种方法为AdaBoost (Adaptive Boost)和梯度提升(Gradient Boosting)。本章及下一章选取已出院鼻咽癌病例样本进行如下的费用预测，即所得到的费用可以认为是该病例治疗的最终花费。其中，取性别、年龄、住院次数、住院天数和首诊分期为自变量，建立并训练模型预测最终费用，并比较CART算法、AdaBoost算法、梯度提升算法的预测效果。经过反复的实验，最大树深度为4且弱学习器为300个的梯度提升算法表现最好。 4.1. AdaBoost算法原理 由于CART预测效果较差，我们选用集成算法中的提升方法进行改进。首先研究基于AdaBoost算法的费用预测。 4.1.1. AdaBoost算法思路 AdaBoost的思路为，先从初始训练集中训练出一个基学习器，再根据基学习器的表现对训练样本分布进行调整，对所有基学习器采用加权结合，增大分类或回归误差小的基学习器的权值，减少误差率大的基学习器的权值。 4.1.2. AdaBoost算法步骤 输入：训练集 ，其中， ；基学习算法 ；基学习器个数 。 过程： 1) 初始化训练样本的权值分布 。 2) 对迭代轮次 。 a) 使用具有当前分布 的训练数据集训练基学习器 ； b) 计算训练集上的样本最大误差： 计算每个样本的相对误差： 如果是线性误差，则 ； 如果是平方误差，则 ； 如果是指数误差，则 ； c) 基学习器在训练数据集上的回归误差率： d) 基学习器的权重系数： e) 更新训练集的样本分布： 其中， 是规范化因子： f) 构建基学习器的线性组合，得到最终的强学习器： 输出：强学习器 [ 11 ] [ 12 ]。 4.2. Gradient Boosting算法原理 由于对AdaBoost算法对异常样本敏感，异常样本在迭代中可能获得较大权重，影响强学习器的预测准确性。接下来将使用Gradient Boosting算法进一步改进费用预测模型。 4.2.1. Gradient Boosting算法 由Freidman提出的梯度提升(gradient boosting， GB)算法 [ 10 ]，若将梯度提升算法里的弱算法选择为决策树，则的到GBDT算法(Gradient Boosting Decision Tree)。该算法主要利用最速下降法的近似方法，利用损失函数的负梯度在当前模型的值 作为回归问题提升树算法中的残差的近似值，拟合一个回归树。 4.2.2. Gradient Boosting算法步骤 接下来是该算法的训练步骤 [ 11 ] [ 12 ] ： 给定训练数据集 。 其中 是变量自变量的个数。损失函数 。 1) 初始化 。 2) 对 。 a) 对 ，计算 ； b) 对 拟合一个回归树，得到第 棵树的叶节点区域 ； c) 对 ，计算 ； d) 更新 ； 3) 得到回归树 。 4.3. 基于Boosting算法的费用预测 我们使用Python的sklearn.ensemble库分别实现AdaBoost算法、GBDT算法，最终建立如下两种费用预测模型模型： 基于AdaBoost算法：以最大深度为4的CART回归树作为基学习器，基学习器300个，学习速度为1，损失函数为linear函。 基于GBDT算法：以最大深度为4的回归树作为基学习器，基学习器100个，学习速度为0.1，损失函数为l s函数。 下面进行费用预测并与真实数据进行对比，得到预测费用与年龄分布的散点图，如图3、图4。 图3. 基于AdaBoost算法的预测费用与真实费用对比 图4. 基于Gradient Boosting算法的预测费用与真实费用对比
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 科创板在现阶段允许设立双重股权结构，旨在保障科创公司中的创始人团队或管理层团队对公司的控制力度。在投资者权益保护层面，科创板在普通表决权、日落条款、特别表决权情况披露、监事会专项意见等方面存在不足之处。通过与香港交易所规则的比较来看，在法律惩戒、制度机制、监督机制及具体细节规定方面应当进行完善。本文针对这些问题进行研究总结，引导投资者进行理性投资，并对此提出行之有效的建议，以促进证券市场的良性发展。 关键词 :科创板，双层股权结构，投资者权益保护 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 2019年1月30日，中国证监会发布《关于在上海证券交易所设立科创板并试点注册制的实施意见》，6月13日科创板正式开板，华兴源创成为科创板第一股，6月27日进行网上申购。7月22日，科创板开市。科创板具有诸多制度创新，诸如注册制和双重股权结构，创新使得其风险和机遇并存 [ 1 ]。为使得有巨大发展潜力的科技型创业公司留在国内资本市场，更好利用国内资本市场为其发展提供融资机会，双重股权结构的承认成为必然。双重股权结构下，特别表决权股东权力过大，更容易使控制股东和管理团队通过控制公司侵犯投资者利益，因此投资者保护问题尤为迫切 [ 2 ]。本文基于我国科创板双重股权结构规则和实践，对我国科创板双重股权结构与港交所双重股权结构中的投资者保护进行比较，探讨科创板双重股权结构下的投资者权益保护不足，并提出完善建议，以期有助于我国科创板投资者权益保护、公司治理水平提升以及我国资本市场发展。
system: [SYSTEM]

user: 2. 我国科创板双重股权结构主要规则及相关实践 2019年1月30日证监会发布《关于在上海证券交易所设立科创板并试点注册制的实施意见》(以下简称《实施意见》)，2019年3月1日上交所发布《上海证券交易所科创板股票上市规则》(以下简称《上市规则》)等配套规则，科创板的表决权差异安排最终敲定。整体上看，双重股权结构相关规定见于《实施意见》第五条，细化规定主要见于《上市规则》第2.14条及第4.5节，具体有如下几方面的内容： 第一，双重股权结构设置时点。 1 将科创板公司设置双重股权结构的时间设置在公司IPO前，在上市之后不能再进行设置或者更改。 第二，双重股权结构设置倍数。 2 科创板公司的双重股权结构倍数设置为不得超过普通表决权的10倍，且特别表决权比例不能高于90%。 第三，双重股权结构行业及其规模。 3 设置科创板公司的行业及其规模需要符合其《上市规则》的要求，包括对科技创新企业的要求和对市值、营业收入均有所要求。 第四，双重股权结构特殊信息披露。 4 从科创板公司上市运行角度出发，科创板为双重股权结构公司设置了特殊的信息披露要求，以此保护投资者的权益。 第五，双重股权结构行使限制及强制失效情形。 5 从特别表决权行使的角度来看，科创板规定了差异化表决权的行使限制及强制失效情形，以保障在双重股权结构失去制度红利或者出现问题时，拥有予以及时终结的“日落条款”规定。 2019年7月22日，上海证券交易所科创板首批公司上市仪式在上海举办科，科创板第一批25家公司在上交所挂牌上市交易，标志着设立科创板并试点注册制这一重大改革任务正式落地。截止到2019年10月20日，我国科创板拥有36家上市公司， 6 从已有上市公司信息披露来看，还未有出现采用双重股权结构的公司，然而这并不影响对于我国现行相关规范进行分析和讨论。
system: [SYSTEM]

user: 3. 科创板中双重股权结构下投资者权益保护 结合《上海证券交易所科创板股票上市规则》和《关于为设立科创板并试点注册制改革提供司法保障的若干意见》，可以看出科创板的双重股权结构下投资者保护是规范科创板投资环境的重要议题。从实践中看，上海证券交易所和最高人民法院均对差异化表决权的公司在证券规则和司法实践层面给予规范。 3.1. 《上海证券交易所科创板股票上市规则》中投资者权益保护规定 3.1.1. 普通表决权限制条款 根据《上海证券交易所科创板股票上市规则》第4.5.7条的规定，普通表决权比例不得低于10%，有权提议召开临时股东大会股东所持股份数量不得超过10%，有权提出股东大会议案的股东所持股份数量降低到3%。如果普通投资者表决权受到限制，可以通过提议召开股东大会维护自身权益。但是，普通表决权比例不得低于10%的比例限制，在一定程度上对普通投资者不利，毕竟从我国证券投资实践看 [ 3 ]，普通表决权的投资者往往是个人投资者，“散户”居多，彼此联系和个人财力能力有限性导致其无法对抗拥有特别表决权的管理层，难以维护自身权益。 此条规定可以让普通投资者通过提议召开股东大会维护自身权益，但是规定中没有相区分两种表决权。如果特别表决权在此条下未失效，可能需要绝大多数甚至全部普通投资者的股权累计，才能达到规定的表决权比例，这种制度设计不太利于普通投资者通过召开股东大会来保护自身权益。 3.1.2. “日落条款” 根据《上海证券交易所科创板股票上市规则》第4.5.9条的规定，出现上文所述四种情形，特别表决权股份应当按照1:1的比例转换为普通股份。对于科创板而言，双重股权结构是一次大胆尝试，而日落条款是在这种尝试出现问题甚至失败后的转换方式。一旦尝试失败损失最大的一定是投资者利益，日落条款把双重股权结构公司转换为一股一权公司，最大限度防止双重股权结构公司在特殊投票权股东“缺位”情况下，公司控制权不稳定、公司管理层混乱、公司独特价值减少和商誉减损从而导致投资者利益减损 [ 4 ]。但是，现行规则并未作出时间限制，将来会出现不易启动和适用的情况。 “日落条款”理论类型上来分析，持股比例的“日落条款”指特别表决权股东的持股低于一定比例或需要收购的普通表决权股份达到一定比例使得双重股权结构的结束。其规则是借鉴了日本和欧盟的相关规则，是为了股权结构中的风险防范和公司治理之间的平衡。固定期限的“日落条款”指在在股票首次公开发行前规定双重股权结构的存续时间，期限截至时让公司决议决定维持或结束。特定事件的“日落条款”指在特定事件发生时双重股权结构权结构就此结束。科创板的双重股权结构中 “日落条款”即上文所述的双重股权结构行使限制及强制失效情形。因此，双重股权结构的公司治理优势会随着时间的推移逐渐消失，而股权结构导致的代理成本也逐渐增加。虽然后来双重股权结构能丧失了效率，但是特别表决权股东仍然会因为拥有着较大的公司控制权而保留此类股权结构。所以要依靠“日落条款”来中止没有效率的公司股权结构，妥善保护普通投资者的投资权益，以防“日落条款”不予实现时公司效益下降投资者被迫“用脚投票”的情况发生 [ 5 ]。 3.1.3. 特别表决权披露 根据《上海证券交易所科创板股票上市规则》第4.5.11条规定，上市公司应当对特别表决权差异安排在年度报告进行披露，同时规定对于特别表决权变化与调整应当及时披露。及时进行信息披露，尤其是对特别表决权情况的披露可以为投资者提供投资判断的依据。拥有特别表决权的往往是决定公司重要战略方向和有独特价值的个人或者团队，这些人一旦发生特别表决权变化，必然会影响整个公司的上市交易。因此特别表决权情况披露在一定程度上保护了投资者的知情权，进而减少投资者的投资风险的误判。 此条规定将特别表决权的信息披露放在年度报告在双重股权结构公司上市第一年较为适宜，随着公司的发展和变化，一旦进入公司的快速发展时期，公司的融资情况会导致特别表决权的变化频繁起来，如果出现问题普通投资者会很难察觉。并且其信息披露更多地是只关注股权结构本身的情况，不能同时体现出对公司控制及其治理的直接作用，普通投资者更加难以分析和判断。这种设置将来会出现关联交易、内部交易及不正当套利损害投资者权益等问题 [ 6 ]，还需要将其特别表决权的变化和作用等信息更详细披露以弥补其不足。 3.1.4. 监事会专项意见 《上海证券交易所科创板股票上市规则》第4.5.12条规定，科创板下特别表决权行使的监督机构是监事会，监事会需针对特别表决权的股东资质、股份转换、比例设置、权力滥用等问题在定期报告中出具专项意见。监事会对特别表决权的股东进行监督实质依旧是传统的《公司法》规则下的监督董事会，其是保护投资者的角色定位下的一种规则构建，其本身对于特别表决权的股东的监督效果就一直存在争议，因为双重股权结构的设置就是为了使得拥有特别表决权的股东控制公司，其实过分地控制公司本身就是使得公司架构有所偏向董事会一方，甚至出现“公司独裁”的情况出现。如若监事会无法实施监督，对于公司长远决策和投资者的风险来讲都是不利的，所以监事会专项意见对于投资者保护实效有待检验。 此条规定保留了公司法中监事会的监督职能，而不是另设专门委员会方式进行监督，这使得双重股权结构下监事会能否保持其独立性、公正性并提供针对性转向意见受到质疑。因为监事会成员由股东大会选举产生，而实际情况很可能是，由于公司的表决权较大比例的掌握在特别表决权股东手中，而使得监视对象拥有提名权，出现“自己提名的监事来监督自己”的情况 [ 7 ]。这时监事会的监督职能很有可能是一定程度上失效的，甚至出现监事会职对控股股东利益的维护的情形，在这种情况下再让监事会提供专项监督意见与信息披露的职能，根据以上可能下产生的监事会执行监督并不太现实。 3.2. 最高人民法院《关于为设立科创板并试点注册制改革提供司法保障的若干意见》 最高人民法院2019年6月21日发布《关于为设立科创板并试点注册制改革提供司法保障的若干意见》(以下简称《若干意见》)，该司法解释立基于司法实践，将保护投资者合法权益、防范化解金融风险作为其根本任务，力图为保护投资者合法权益营造良好司法环境。从内容来看，《若干意见》第10条 7 对双重股权结构的投资者权益保护予以相应规范，提供司法指导意见。 从司法实践层面，最高人民法院对科创板双重股权结构的投资者权益保护提出两项法律保障：其一，依法否定行为效力，禁止特别表决权股东滥用权利，防止制度功能异化；其二，坚持“控制与责任相一致”原则。可以看出，一方面最高人民法院法的《若干意见》进行了大量调研和预先判断，对在科创板公司使用双重股权制度予以司法支持和保障；另一方面，最高人民法院事先研究该制度的弊端和潜在问题，《若干意见》对科创板双重股权结构的投资者权益保护以事后补救为主，对可能出现的问题提出针对性补救性措施和原则性措施，以此保障投资者在面对双重股权结构上市公司时无法对公司特别表决权股东诉诸司法救济的情形 [ 8 ]。 《若干意见》是第一个从司法机关视角对科创板双重股权结构的投资者权益保护的法律文件，虽然其中规定的保护投资者权益的措施总体上过于笼统和模糊，但是由于最高人民法院的身份和地位的作用和影响，一定程度上能够使得科创板双重股权结构中投资者权益保护得以实现。当然，《若干意见》并未对科创板双重股权结构中投资者权益保护问题予以全面分析并提出相应司法规范措施，这些正是下文两个部分探讨的内容。
system: [SYSTEM]

user: 4. 科创板双重股权结构下投资者权益保护存在的问题——与港交所比较 4.1. 科创板与港交所在双重股权结构的投资者权益保护的比较 首先，从行业准入条件来看，香港联合交易所(以下简称“港交所”)中机构投资者的角色不可或缺，这一要求是在机构投资人的同意下成为公司发展背书，但这在一定程度上，也“拓宽”了公司设置结构的准入渠道，而科创板并没有这些要求，这有利于为更多的企业降低门槛，也促使投资人提高自身的风险鉴别能力。 其次，科创板是允许董事的持股主体有特别表决权股的，在另一方面，港交所则只让自然人担任特别表决权股东。与新加坡一样的是，他们都有多名创始人希望共同掌控公司的情况，科创板的种种要求是为了解决这些问题。但这种双重股权结构和多重阶梯的形式的结合只会越发分离经济利益和控制权，代理成本的风险只高不低，从而威胁到投资人的利益 [ 9 ]。需要针对此进行合理的机制完善，保护投资者的权益。针对此类情况，必须采取更为严谨有效的信息披露。 最后，科创板规则是监事会对差异化表决权行使的合理性发表建议。港交所是由独立董事组成的公司治理委员会隔半年发布一次公司治理报告。在我国，监事是由股东大会选出，控制人可以进行更换，监事的独立性得不到保障。由此，引入独立董事，可以有效防止监事因个人利益顺从控制人意愿而造成的不良后果。 4.2. 科创板双重股权结构的投资者权益保护存在的问题 通过比较，可以发现科创板双重股权结构的投资者权益保护存在下列问题： 第一，与港交所相比，科创板未对双重股权结构公司的行业规模设限，增加了投资者风险。在风险防范上，应当同时注重事前监督和事后惩治，在事前监督层面，应当更多注重科创板差异化表决权规则的贯彻落实；在事后惩治层面，科创板平台应当对完善惩罚损害投资者权益提出更具体措施。 第二，与港交所相比，科创板在特别表决权持股主体规定不同，科创板持股主体更加宽泛。在持股主体设立规则宽松情况下，当出现利益不一致的情况时公司可能更倾向于特殊表决权股东的利益，而这类股东也会努力维持现状，会导致出现一道“管理者堑壕” [ 10 ]，不利于投资者的权益保护。并且会出现代理成本增加和股东滥用权利问题，应该更加完善证券交易所对董事资格免除机制安排以保障投资者权益。 第三，与港交所相比，科创板在监事会监督、股东会和董事会设置上仍然适用《公司法》相关安排 [ 11 ]，并未要求设置独立的监事委员会监督，这使得监事会的监督职能弱化，难以预料预期实效，因此应当完善对持有特别表决权股东的监督。
system: [SYSTEM]

user: 5. 科创板双重股权结构的投资者权益保护的完善 随着小米集团和美团点评等带有双重股权结构的科创企业的成功上市，港交所在双重股权结构公司上市及交易方面积累了经验。从港交所关于双重股权结构系列规则看，有诸多值得科创板借鉴之处，其中投资者权益保护规定还需进一步完善： 5.1. 完善惩罚损害投资者权益方面的具体措施 在《上海证券交易所科创板股票上市规则》规定“持有特别表决权股份的股东应当按照所适用的法律以及公司章程行使权利，不得滥用特别表决权，不得利用特别表决权损害投资者的合法权益。若出现前款情形，损害投资者合法权益的，本所可以要求公司或者特别表决权股东予以改正。”可知，规则已考虑特别表决权可能危害投资者合法权益，但是规则只提出要求股东予以改正，尚未明确规定惩罚措施。而根据香港联合交易所的规定，若拥有特别表决权股份的股东出现欺诈或不诚实的行为，不同投票权将予以中止。科创板未来在损害股东权益处罚方面应当制定具体惩罚措施：防治特别表决权股东滥用表决权的预防措施；公司或者特别表决权股东的滥权的详细改正措施；详细规定公司或者特别表决权股东套利的惩罚措施 [ 12 ]。 5.2. 完善证券交易所对董事资格免除的机制安排 根据港交所的附属公司香港联交所发布的主板上市规则(以下简称“《联交所上市规则》”)第8A.17条注1规定，在特定条件下，香港联交所可以剥夺受益人的董事资格，具体情形主要有受益人存在欺诈或不诚实的犯罪行为、法院或法庭发出的取消资格令、受益人未遵守不同投票权股份条款更改与转让的限制以及受益人未遵守必须按照“一股一票”进行投票的规定。该机制的设置通过列举的方式赋予了交易所监督内部董事的功能 [ 13 ]。证券交易所对于双重股权结构的上市公司的董事对其进行监督，属于外部监督，防范持有特别表决权股份的股东滥用特别表决权的情况。科创板作为上交所的一个高新技术企业融资途经，必然会和港交所一样，在上交所平台上对科创企业进行监督和规制，因此完全可以借鉴港交所的监督内部董事的功能。 5.3. 完善对持有特别表决权股东的监督 [ 14 ] 科创板利用监事会的职能来保障公司的信息披露完备，并监督拥有特别表决权的股东，防止其有滥用职权或其它损害投资人行为。不过，由于部分监事由特别表决权股东和其余股东选举而产生，有特别表决权的股东可能控制监事人选，这不利于企业监督。香港则成立“企业管制委员会” [ 15 ]，委员会成员由独立董事组成，选举独立董事人选时特别表决权失效，这一定程度上保护了选举的公平公正性。科创板可以借鉴香港经验，进一步完善对持有特别表决权股东的监督。科创板双重股权结构公司董事会中特别机构设置和职能发挥，不仅要加强事后监督，更要注重事前监督。未来双重股权结构公司应设立董事会专门委员会，以独立董事为主要成员，同时也可以实行半年一次的公司治理信息披露。在董事会审议相关议案前，应当由董事会专门委员及独立董事提前进行审查 [ 16 ]。 5.4. 完善双重股权结构公司及特别表决权股东身份注明等细节规定 根据《联交所上市规则》规定，所有上市文件、财报、通函、通知及公告须带有“具不同投票控制的公司”的字样，明确表明特别表决权股东身份，还需标注“具不同投票权控制的公司”的标记；特殊投票权股份代码应在名称结尾加“W”以区分。科创板目前的信息披露准则尚未细致到如此程度，未来可参照港交所规则可以进一步完善，即科创板上市公司的上市文件、财报、通函、通知及公告，也应写有“双重股权结构公司”的相关字样，在科创板的双重股权结构公司上市后在其股份代码名称后也应该进行不用于一股一权的普通股权结构公司的显著标记，以此提醒投资者注意其公司股权结构的不同，保护投资者的权益。
system: [SYSTEM]

user: 6. 结语 要真正实现科创板双重股权结构下的投资者权益保护，应在保持《实施意见》和《上市规则》中提高投资者门槛与强化信息披露基础上，进一步加强双重股权结构公司内外部监督，为投资者提供一个健康投资环境。对投资者而言，科创板政策指导思想和规则设计目的在于杜绝投机炒作和短线套利，投资者应铭记在心、严格遵守。对于国家而言，科创板应成为科技创新公司的优质健康融资平台，成为中美摩擦背景下科创公司的融资利器，成为国家引领科技创新、站在世界科技革命潮头的关键工具。正如任何优秀证券市场一样，这一切均离不开投资者权益得到充分保护。
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 现今氨水混合工质被广泛的应用于吸收式制冷及中低品位热能利用领域。而氨水混合工质在以上两个应用领域中所对应的工况范围有较大差别，因此对其热物理性质的探讨研究具有十分重要的意义。本文简要综述了氨水混合工质热物理性质计算的整体研究现状，并分析了状态方程法及国际权威工质物性计算软件Refprop用于计算氨水混合工质热物理性质时各自的特点，在此基础上给出了研究展望。 关键词 :氨水，混合工质，状态方程，Refprop，现状，展望 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 工质在热力学循环中起着至关重要的作用。采用何种工质以及工质自身的性质将会影响一个热力学循环系统的效率、运行条件、系统对环境的影响以及系统在经济上的可行性。以氨水混合物作为工质的吸收式制冷系统以工业余热或其它可回收利用的热源为驱动能源，常被应用作工业工艺生产过程之中的冷源。为了减缓能源危机以及解决传统化石能源消耗所引发的一系列问题，必须对各种总量巨大、资源集中的中低品位热能以及余热资源加以回收利用。在此领域，有机朗肯循环(Organic Rankine Cycle， ORC)及kalina循环是被研究应用最多的两种技术。而由于现今尚不存在一种具有良好热力学性能的同时具有良好的环保指标(臭氧消耗潜势ODP为零，全球变暖潜势GWP很低)，且满足无毒不可燃的安全性要求的理想有机工质，加之Kalina循环在很多工况下的热力学性能优于有机朗肯循环，故采用氨水混合物为工质的Kalina循环引发了越来越多的关注与研究。 氨水混合工质可以说是氨水吸收式制冷循环和Kalina循环的灵魂。与纯水和纯氨均不同，氨水有其很多特有的基本特性。纯水和纯氨的混合物表现的就好比是一种全新的工质。本文简要综述了氨水混合工质热物理性质计算的整体研究现状，并分析了状态方程法及国际权威工质物性计算软件Refprop用于计算氨水混合工质热物理性质时各自的特点，在此基础上给出了研究展望。
system: [SYSTEM]

user: 3. 氨水混合工质热物理性质计算研究展望 以上一小节可知，对于不同浓度的氨水混合工质的热物理性质计算均存在无法得到准确计算结果的温度区间。且这些温度区间有的处于亚临界区，有的处于跨临界区，有的处于超临界区。这些无法得到准确计算结果的温度区间是未来需要着重研究的。 此外，当今可用的大部分氨水混合物的热力学性质关联式所适用的温度和压力较之电厂常见的温度和压力要低。当用于简单型Kalina循环的模拟时，使用一些之前用于氨水动力循环模拟的关联式所计算得到的循环效率的差别不高于3%。然而在高温高压及高氨水浓度时，使用不同关联式来计算饱和性质，则得到的结果之间差别很大。相比旧的用于动力循环模拟的关联式，即使使用新的理论上更加合理的关联式，二者对循环效率的模拟的最终结果仍然相差很小。故基于原有旧的关联式所进行的研究所得到的结论仍然是合理的。然而需要指出的是，几乎没有氨水混合工质在临界区和超临界区的实验数据报道，故在这些区域氨水混合工质的性质仍然是未知的 [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]。
system: [SYSTEM]

user: 4. 结论 针对氨水混合物的热物理性质计算，现今所提出的关联式主要可以分为9大类：立方型状态方程、维里型状态方程、Gibbs自由能理论、对应态方法、微扰动理论、基团贡献理论、Leung-Griffiths模型、Helmoltz自由能理论和多项式函数。 对于不同浓度的氨水混合工质的热物理性质计算均存在无法得到准确计算结果的温度区间。这些温度区间有的处于亚临界区，有的处于跨临界区，有的处于超临界区。这些无法得到准确计算结果的温度区间是未来需要着重研究的。 几乎没有氨水混合工质在临界区和超临界区的实验数据报道，故在这些区域氨水混合工质的性质仍然是未知的。
system: [SYSTEM]

user: 摘 要 为了探究TUSC3 (Tumor suppressor candidate 3)基因在克氏原螯虾中的生物学功能，本研究利用PCR法克隆获得了该基因序列，并采用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在克氏原鳌虾不同组织中的表达特征以及免疫诱导物(LPS和Poly I:C)对肠、腮和血淋巴细胞中TUSC3基因表达水平的影响。结果表明TUSC3基因编码326个氨基酸，预测蛋白与南美白对虾的TUSC3蛋白同源性较高(93.25%)，包含一个保守的OST3/OST6同源功能区。PCR检测结果显示该基因在被检各组织中均有表达，且在血细胞组织中表达量最高，心脏组织中最低。LPS和Poly I:C刺激后，TUSC3基因的表达量总体表现为上升趋势，但不同组织及不同诱导物之间存在差异。这些结果表明TUSC3基因在克氏原螯虾的免疫反应过程中具有一定功能。 关键词 :克氏原螯虾，TUSC3，LPS，Poly I:C Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
system: [SYSTEM]

user: 1. 引言 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾，是我国重要的淡水经济养殖虾品种，具有良好的环境适应性和繁殖力强等突出优点 [ 1 ]。然而由于养殖环境的恶化和水产病害等因素的影响，克氏原螯虾养殖业的发展受到一定程度的制约并导致可观的经济损失。因此，研究克氏原螯虾的免疫反应机制对于提高虾个体的免疫能力及抗病品种的选育等方面具有重要意义。 已有研究表明肿瘤抑制因子在人类癌症的发病机理中起到了关键作用 [ 2 ]，而TUSC3 (Tumor suppressor candidate 3)是子宫癌、前列腺癌以及胰腺癌的候选抑癌基因 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]，TUSC3基因的缺失会导致癌细胞数量增加 [ 7 ] [ 8 ]。虽然肿瘤抑制因子在高等脊椎动物的功能已经得到了广泛研究，但该基因在甲壳类动物中的功能有待于进一步研究。 本实验旨在以克氏原螯虾为材料，克隆鉴定免疫相关基因TUSC3并采用荧光定量PCR技术研究该基因的组织表达特征和免疫应答模式，为今后进一步探讨克氏原螯虾的先天免疫机制及增强虾的抗病能力提供参考依据。
system: [SYSTEM]

user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 克氏原螯虾(体长6.0 ± 1.0 cm，体重9.0 ± 1.0 g)购于合肥市琥珀市场，于室温下循环水系统中采用商业化饲料等暂养一周后再挑取具有活力且健康的个体进行实验 [ 9 ]。所选个体随机分为三组，每组21只。第一组注射20 μg LPS (细菌脂多糖)；第二组注射20 μg poly I:C (双链RNA类似物)；第三组为对照组，注射同体积的PBS。注射方式采用微量注射器进行腹部注射，注射剂量参考前期研究 [ 10 ] 并加以调整。注射3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，分别取血淋巴细胞、肠和鳃组织并提取总RNA用于实验分析。 2.2. cDNA模板的制备 取100 mg组织样品放入预冷的研钵中，加入液氮并迅速研磨成粉状，利用Trizol (Takara)法提取组织总RNA。随后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性并通过核酸微量定量仪(Nanodrop 2000 Thermo Scientific，美国)检测其浓度和纯度。最后使用PrimeScript TM RT Master Mix (Takara)试剂盒合成cDNA [ 11 ]。 2.3. TUSC3序列的解析 根据课题组之前获得的克氏原螯虾转录组信息 [ 9 ]，利用DNASTAR软件设计特异性的TUSC3扩增引物(TUSC3-F1， TCTTGTGGACTTTGATGAGG; TUSC3-R1， GAGCATAGCAACAATGTAGGT)，PCR采用20 μl反应体系，扩增程序如下：95℃预变性5 min；30个循环(95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s); 72℃延伸5 min。PCR产物经纯化后送北京华大基因科技有限公司测序。测序结果采用Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)和Clustal X [ 12 ] 程序进行比对分析。 2.4. 实时荧光定量PCR 运用Primer premier 5.0设计定量引物(TUSC3-F2， CAGATTCGTGTGTTCCGTCC; TUSC3-R2， GGCTTGGGTTTTCTGCAGAA)，同时选取18S rRNA基因(18S-F， CTGTGATGCCCTTAGATGTT; 18S-R， GCGAGGGGTAGAACATCCAA)作为内参。使用SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa)试剂盒进行荧光定量PCR操作 [ 9 ]，每个实验设置3个重复，采用2 −ΔΔCT 法计算基因的相对表达量 [ 13 ]。数据处理采用学生t测验或单因素ANOVA检验方法，数值以平均值±标准差表示，当p ≤ 0.05时为差异显著。
system: [SYSTEM]

user: 3. 实验结果 3.1. TUSC3序列分析 克氏原螯虾TUSC3基因含有一个981 bp的ORF框，编码326个氨基酸。预测的蛋白大小为36.76 kDa，等电点为6.58，包含一个与OST3/OST6同源的结构功能域(31-321aa)。该TUSC3与其他无脊椎动物的TUSC3蛋白序列比对结果表明，克氏原螯虾TUSC3与南美白对虾的TUSC3同源性最高，达93.25%，其次为美洲钩虾(相似度76.56%)，其中与其他昆虫的TUSC3蛋白序列相似度介于67%~69%之间(见图1)。这些结果表明，克氏原螯虾TUSC3在进化上具有一定的保守性。 3.2. TUSC3基因组织分布情况 取肠、鳃、心脏、肌肉、血细胞及肝胰腺组织，利用实时荧光定量PCR检测TUSC3基因的表达特征。TUSC3在各被检组织中均有表达，其中在血细胞、肠和肌肉中的表达水平较高，而在心脏和腮中的表达量较低(见图2)。 3.3. LPS刺激对TUSC3基因表达水平的影响 为了研究TUSC3在克氏原螯虾免疫刺激后的表达模式变化，本实验采用LPS处理克氏原螯虾，并以PBS处理对照组。结果表明(见图3)，LPS刺激后3 h至24 h血细胞中TUSC3的mRNA表达水平显著上调，其中12 h时最高(增加近10倍)。肠中TUSC3的转录水平在3 h至6 h时相对于对照无明显变化，但9 h至72 h内显著上调。其中9 h达到最高(增加约24倍)，随后表达量逐渐下降。在鳃中，9 h至72 h内TUSC3的表达水平明显上调，其中24 h达到最高(增加约19倍)，但在3 h至6 h时无明显变化，与肠中的表达特点相似。以上数据都说明了TUSC3可能参与克氏原螯虾的免疫反应。 图1. 克氏原螯虾TUSC3蛋白序列的同源比对图。相同的氨基酸用黑色表示，相似的氨基酸用灰色表示 图2. 克氏原螯虾TUSC3的组织表达情况图。不同字母表示不同组织中的表达量存在显著差异(p < 0.05) 3.4. Poly I:C刺激对TUSC3表达水平的影响 Poly I:C刺激后6 h至48内血细胞中的TUSC3表达水平先升高再下降的趋势，但均高于对照组，其中12 h时达最高。在刺激后3 h至12 h内鳃中TUSC3的表达量明显增加，其中9 h达到最高(增加约20倍)，但在24 h后明显下降。虽然肠中TUSC3表达在3 h时表现为上调，但其后发生了显著下降，直至72 h时与对照表达水平相近(见图4)。 图3. LPS刺激后TUSC3在血淋巴细胞(a)，肠(b)和腮(c)中的表达情况。星号(*)表示处理组与对照组相比存在差异显著 图4. Poly(I:C)刺激后TUSC3在血淋巴细胞(a)，肠(b)和腮(c)中的表达情况。星号(*)表示处理组与对照组相比存在差异显著