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user: 3. 结果与讨论 3.1. MCs色谱分析 采用外标法高效液相色谱分析：MCs标准品中，三种异构体色谱峰先后顺序为MC-RR、MC-YR、MC-LR，其保留时间约为7.961、13.964、22.054 min (图1)，本研究提取的三种化合物与标准品的保留时间基本一致(图2)，且均在238 nm具有最强的吸收峰，吸收图谱形状极为相似，因此可以确认从水样中提取的化合物就是MCs，并根据保留时间确定水样中的三种异构体为MC-RR、MC-YR、MC-LR。采用外标法定量，提取方法不同，所得藻毒素含量比例也不同。 3.2. 5%冰乙酸萃取处理 5%冰乙酸萃取法获得的三种藻毒素浓度(依次为MC-RR、MC-YR、MC-LR，下同)分别是0.73 ± 0.03、0.43 ± 0.04、0.85 ± 0.06 μg/mL。目前，不同浓度的甲醇溶液是从微囊藻细胞中提取藻毒素应用最为普遍的有机溶剂，其中50%~80%的甲醇溶液被认为是MC最有效的提取剂 [ 6 ] ，但闫海 [ 17 ] 等的研究表明40%的甲醇即可以最高效的提取出MC-RR和MC-LR，继续升高甲醇浓度反而使提取液中MC浓度下降。Nina [ 18 ] 等的研究表明，水、5%冰乙酸、70%甲醇和100%甲醇作为提取剂提取MC-RR的效率相同。唐红枫 [ 8 ] 等报道，5%冰乙酸溶液和连续抽提法可以从藻细胞中提取更多的MC-RR和MC-LR，40%甲醇提取液中MC的浓度比80%甲醇溶液和100%甲醇溶液的高，但40%甲醇从东湖水华微囊藻细胞中提取MC-RR和MC-LR的效率也远低于5%冰乙酸溶液和连续抽提法。本研究中，虽然5%冰乙酸萃取提取效率低于其他方法，但其提取操作简单，且根据唐红枫 [ 8 ] 等的研究报道，提取时间最好控制在120 min内，过长的提取时间可能影响MC-LR的稳定性，或加剧MC-LR的变异，这也可能是造成本实验提取效率偏低的原因之一。 图1. MC标准品HPLC图谱 图2. 提取物HPLC图谱 3.3. 研磨处理 如图3所示，研磨5 min获得的三种藻毒素浓度分别为：1.05 ± 0.01、0.43 ± 0.04、1.03 ± 0.06 μg/mL，研磨10 min获得的三种藻毒素浓度分别为：1.07 ± 0.02、0.46 ± 0.09、1.17 ± 0.22 μg/mL，研磨15 min获得的三种藻毒素浓度分别为：1.14 ± 0.13、0.37 ± 0.02、1.13 ± 0.12 μg/mL。研磨处理的原理是靠电动玻璃匀浆机的转头转动使藻细胞破碎从而释放出胞内的藻毒素，理论上随研磨时间增加，细胞破碎更充分，藻毒素浓度会增高，本研究在此原理的基础上还探究了最佳研磨时间，根据实验结果，使用电动玻璃匀浆机研磨约10 min可获得最大量的藻毒素(图3)，超过10 min后，MC-LR和MC-YR的含量有所降低。 3.4. 煮沸处理 煮沸法处理5 min获得的三种藻毒素浓度分别为：0.97 ± 0.03、0.76 ± 0.12、0.77 ± 0.03 μg/mL，煮沸10 min获得的三种藻毒素浓度为：0.74 ± 0.05、0.88 ± 0.12、0.63 ± 0.10 μg/mL，煮沸15 min获得三种藻毒素浓度分别为：0.84 ± 0.09、0.88 ± 0.08、0.66 ± 0.02 μg/mL。由于环状结构的微囊藻毒素性质稳定，加热处理不会破坏其结构，因此有人利用沸水浴、微波或超声等方法来提取过微囊藻毒素 [ 16 ] [ 19 ] ，但未报道过几种提取方法的效果比较。张维昊 [ 19 ] 等的实验比较了加热、超声与溶剂提取的效果，结果表明加热虽然可以缩短平衡时间，但对提取效率并无显著影响，而超声前后粗提液中藻毒素含量也没有明显差异。本实验结果表明，直接将藻毒素煮沸处理可以破碎细胞并释放出藻毒素，且最佳煮沸时间大约为5 min，超过5 min后所提取的藻毒素含量都趋于稳定(图4)，但该方法存在一定的系统误差(比如粘锅)，而且煮沸处理会使藻细胞内诸多蛋白变质，增加除杂的工作量，且操作过程伴有恶臭 [ 20 ] [ 21 ] ，可能给后续纯化带来污染与干扰。 3.5. 反复冻融处理 冻融1次获得的三种藻毒素浓度分别为：0.72 ± 0.12、0.79 ± 0.02、1.61 ± 0.02 μg/mL，反复冻融2次获得的三种藻毒素浓度分别为：0.80 ± 0.17、0.97 ± 0.03、1.78 ± 0.05 μg/mL，反复冻融3次获得的藻毒素浓度为：1.20 ± 0.15、0.93 ± 0.01、1.83 ± 0.17 μg/mL，反复冻融4次所获藻毒素浓度为：0.82 ± 0.30、0.96 ± 0.04、1.93 ± 0.06 μg/mL (图5)。本实验结果表明，冻融操作少于3次时，随着冻融次数增加，所提取的藻毒素量有所增加，冻融超过3次后，得到的藻毒素浓度趋于稳定。 本研究比较了四种方法提取藻毒素的效果，发现它们的提取效率各不相同(图6)。5%冰乙酸萃取获 图3. 研磨法提取藻毒素的浓度 图4. 煮沸法提取藻毒素的浓度 图5. 反复冻融法提取藻毒素的浓度 图6. 不同提取方法所提取的藻毒素浓度 Table 1 The comparison of four extraction method 提取方法 MCs实测含量 (μg/mL) 有机溶剂使用 提取所需仪器 优点 缺点 5%乙酸萃取 2.01 ± 0.01 有 —— 不需贵重仪器 有机溶剂对操作人员有危害性， 提取效率较低 煮沸处理 2.49 ± 0.06 无 电磁炉 适用大量藻液提取MC 操作过程中有恶臭， 杂质较多 研磨处理 2.7 ± 0.07 无 电动玻璃匀浆机 提取耗时短 大批量提取耗时太长 反复冻融 3.96 ± 0.31 无 −20℃冰箱 提取MC效率高， 操作简捷、安全 提取耗时较长 表1. 4种提取方法的对比 得的三种藻毒素浓度分别为：0.73 ± 0.03、0.43 ± 0.04、0.85 ± 0.06 μg/mL；煮沸处理最优时间是5 min，获得的三种藻毒素浓度依次为：0.97 ± 0.03、0.76 ± 0.12、0.77 ± 0.03 μg/mL；研磨处理最优时间是10 min，获得的藻毒素浓度分别为：1.07 ± 0.02、0.46 ± 0.09、1.17 ± 0.22 μg/mL；反复冻融3次获得的藻毒素浓度为：1.20 ± 0.15、0.93 ± 0.01、1.83 ± 0.17 μg/mL，这些差异主要由于不同的提取方法对藻毒素的稳定性、藻细胞的破坏力等影响不同而造成的，除此之外，微囊藻中各类型的藻毒素含量也与藻株类型、地域及水华发生时间有关 [ 20 ] 。本研究对各个提取方法进行了对比(表1)，结合实际操作，由表1可知，4种提取方法适用条件不同，研磨处理可用于短时间内小剂量的提取；煮沸处理和反复冻融法可用于大批量藻毒素提取，但煮沸时伴有恶臭，且操作中发现该方法产生的杂质不易于后续的富集、纯化，故不推荐采用；相对而言，5%冰乙酸萃取法用于大、小剂量的提取皆可，但有机溶剂的使用一定程度上降低了实验的安全性。 Lehman [ 22 ] 的研究发现反复冻融能促进细胞壁的破裂，彭亮 [ 6 ] 的研究也认为反复冻融能显著提高三种MCs样品的提取效率，是藻毒素提取的高效方法之一，本实验中反复冻融法也得到了较好的提取效果，除此之外，本实验在前人的研究基础上探究了最佳的冻融次数，并探讨了藻毒素的提取效果。研究结果表明冻融3次最为适宜，除了较高的提取效率之外，反复冻融操作还有其他优点——与有机溶剂萃取的提取方式相比，反复冻融可以省去有机溶剂做提取剂的操作，节省实验试剂，简化操作步骤，同时避免了有机溶剂对操作人员的身体健康带来损伤；与煮沸加热的方法对比，反复冻融法大大减少了提取过程中的环境污染，所得藻毒素杂质也更少 [ 20 ] [ 21 ] ；研磨处理的提取效率虽仅次于冻融法，但其操作本身不适用于大规模的藻毒素提取，因此在进行大批量藻毒素提取时，不推荐采用。综上所述，本研究认为，在实验室用反复冻融法提取藻毒素有着高效、简捷、安全、环保的优点，其实用性强，重复性高，且成本较低，便于藻毒素的大批量提取、纯化与分离。