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user: 3. 结果与分析 3.1. 无菌外植体获取 接种大约一周后，外植体的茎段侧芽开始萌动，四周左右长成1.5 cm左右的嫩梢。不同时期所采集的外植体催芽萌发生长情况差距较大，春季所萌发的嫩枝作为外植体，可以快速大量的获得无菌材料(图2)。 由表1可见，主要是次氯酸钠消毒时间对外植体处理效果的影响，外植体采集时间不同，其消毒外植体时进行初期培养时的污染率有显著差异，即一年生春季嫩枝，茎段长度约2.5 cm左右，茎上枝条外表皮的颜色呈现偏黄绿色最好，其消毒时间短，接种污染率低，且对其后期生长影响较小。若外植体直径过粗或皮色呈红褐色带蜡质的茎段则消毒效果最差，消毒时间过长易致使外植体本身被污染，影响芽的生长速度与催芽率。同时，春季(4月中旬，污染率约20%)和秋季(9月下旬，污染率约35%)所采集外植体比夏季(7月中旬，污染率达50%以上)接种污染率要低许多。 图2. 不定芽生长 Table 3 Effects of different kinds of culture medium on germinatio 培养基类型 催芽率(%) 增殖倍数 生长情况 空白MS 57 2.85 叶色绿，生长较快叶偏黄、弯曲，生长快，芽簇多 空白WPM 35 1.75 芽和叶发黄，生长慢 MS + 激素① 77 3.6 叶色绿，生长较快 表3. 不同培养基对外植体催芽效果的影响 注：表中①将外植体接种在MS培养基，附加成分为0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的激素，蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L。空白MS培养基(不含附加成分)，空白WPM (不含附加成分)。催芽数(%) ＝ 出芽数/接种外植体的芽数 × 100%。 Table 4 Effects of different hormone concentrations on secondary cultur 培养基种类 6-BA + KT (mg/L) 6-BA + KT (mg/L) 6-BA + KT (mg/L) 6-BA + KT (mg/L) NAA 0.05 0.2 + 0.2 0.5 + 0.0 1.0 + 0.0 1.5 + 0.0 NAA 0.1 0.2 + 0.2 0.5 + 0.0 1.0 + 0.0 1.5 + 0.0 NAA 0.2 0.2 + 0.2 0.5 + 0.0 1.0 + 0.0 1.5 + 0.0 表4. 不同浓度激素配比对继代培养的影响 Table 5 Effects of different kinds of secondary culture on propagation efficienc 继代培养方案 新芽生长状况 无根苗增殖倍数 芽分化速度 单一培养基A 叶易泡状畸形，发红褐色，后期生长缓慢 3.0 初期较快，后期停滞 单一培养基B 生长缓慢，芽叶小 1.5 缓慢而少 培养基A和B交替使用(隔10 d) 生长较快，叶色正常 5.5 持续较快分化成芽数量多 表5. 不同继代培养对扩繁效果的影响 污染率(%) ＝ 污染总数/接种总数 × 100%；未出芽率(%) ＝ 未出芽总数/接种总数 × 100% 同时，外植体经过适当的低温外理可提高消毒灭菌效果(表2)。常温12 h，污染率25%，出芽率75%。外植体洗净放于4℃~5℃恒温低温冷藏1周后，再进行消毒，污染率10%，出芽率90%，可见外植体低温冷藏有利于可以降低污染率，且不影响催芽的效果，催芽数量多，更有利于进行培养。 出芽率(%) ＝ 出芽总数/接种总数 × 100% 3.2. 外植体催芽 在3种培养基上外植体的腋芽均可萌发，但效果迥异(表3)。接种在MS培养基上的每个外植体均在腋芽处可催芽1~2个芽并生长，叶色绿，生长较快，出芽率与增殖倍数分别为57%和2.85，但叶色绿，生长较快叶偏黄、弯曲，生长快，芽簇多；接种在WPM培养基上外植体的腋芽萌发和生长缓慢，出芽率与增殖倍数分别为35%和1.75，芽和叶颜色成淡黄色。在加MS + 激素①的培养基中，催芽率和增殖倍数均为最大，分别为77%和3.6。因此，可以选用MS + 激素①的培养基进行催芽适合芽生长(图2)。 3.3. 继代培养与器官发生 将外植体催化的芽剪下接种在不同浓度激素配比的培养基中进行分化培养，不同种类、不同浓度激素对外植体催化产生的芽，通过继代培养最终分化生长和增殖系数的影响较大(表4)。在NAA与6-BA、KT的组合中，在NAA浓度相同的情况下，当6-BA在1.0 mg/L以上时，植株生长缓慢，分化芽生长数明显减少；当6-BA与NAA浓度配比分别为1.0 mg/L和0.1 mg/L，和0.5与0.05时，苗分化系数增殖较大，增殖倍数大约达6.5倍(图3和图4)。可见6-BA的浓度和生长素的种类及浓度对沙柳试管苗的生长影响较大，但高激素浓度下当6-BA浓度在1.0 mg/L以上时，沙柳无菌芽(或苗)生长虽然变化快而明显，但生长不够自然健康，基部有愈伤组织生长过多，分化器官系数在下降。同时发现，继代增殖培养中若长期使用一种配方的培养基，沙柳无菌苗分化生长不够自然，叶色异常，容易出现褐化、出现愈伤组织生长，而且愈伤组织形态畸形，有的生长停滞甚至坏死。在培养基中加入少量的KT，在部分培养基中可以促进无菌芽生长，使叶色更形成正常绿色，说明沙柳在NAA与KT配比不适其分化生长。 图3. 单一培养基生长的器官形成 图4. 器官分化繁殖 同时在继代培养时，从表5中得出，所采用的培养基A：MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA0.1 mg/L和培养基B：MS + 6-BA 0.2 mg PL + KT 0.2 mg PL + NAA 0.1 mg/L培养，两种6-BA与NAA不同配比的培养基交替使用效果较好，即A和B每隔10d左右交替使用，能使沙柳无菌苗生长健壮，叶色较绿，叶面舒展，很少畸形，还能保持较高的繁殖系数。说明沙柳在混合激素配比中有利于器官发生并形成小植株生长。本研究与王善娥 [ 12 ] 等选用高/低和低/高浓度的生长素与细胞分裂素配比，对一年生柳树多次继代，仍然保持较高的分化率、苗生长健壮的研究结果基本吻合。这可能是柳树所具有的特征。继代3~4周后培养形成器官发生并可以分化进行高生长，将分化出的幼芽从基部切下，在培养过程中芽接种在新配制单一培养基A上，新芽生长为叶易泡状畸形，发红褐色，后期生长缓慢，此时无根苗增殖倍数是3.0，芽分化速度为继代初期较快，继代后期停。当再将分化芽接种在新配培养基B上，新芽生长状况生长缓慢，芽叶小，无根苗增殖倍数1.5，芽分化速度缓慢而少。试验中采用A和B混合培养基进行壮苗培养，经1个月左右培养生长，苗生长成带有4~5个叶健壮的无根小苗。将小苗进行切割成带有叶的茎，再次分别接种A和B混合的分化培养基中，如此反复循环即可获得大批的无根苗的小植株，这些小植株均是由器官发生生长形成大量植株。这时将这些无根苗分别插入生根培养基中就进行准备生根繁殖。 3.4. 生根的培养 3.4.1. 生根植株的选择 选择用于生根的苗进行继代生根培养，生根培养对苗的质量对生根有很大的影响。用作生根的苗的小植株壮苗培养时间不宜太长。一般选择高度在1.5 cm以上的健壮器官发生形成的小植株，叶色深绿的小植株进行生根培养(图5)。 3.4.2. 生根培养再生体系的建立 将生根培养的小植株壮苗生长至2~3 cm的器官发生生长的苗从基部剪下，去掉下部叶片，接种到生根培养基上。培养20 d后，统计结果，以确定适合诱导生根的基本培养基(表6)。根据实验发现，在MS培养基包括1/2MS，空白培养基，除了用于小植株分化及扩繁的培养基下，沙柳经过20 d的培养小植株基部生长出主根，生长一段时间生长成多的须根，此时沙柳生长成完整的再生植株。实验表明，继代生根培养基中，苗在不同浓度激素配比不如0.3 mg/L IBA浓度下的1/2 MS培养基根生长良好，因此确定主要培养基为在0.3 mg/L IBA浓度下的1/2 MS培养基里，沙柳无菌苗生根效果相对较好，生根生长快且生根较粗壮，须根多。尽而完成再生体系的建立。 实验中我们将器官发生形成的小植株接种在1/2MS培养基中(表7)得出影响生根培养还有其它因素。本试验沙柳器官发生形成的生长并生长成完整小植株主要培养基比较，在MS培养基和 1/2 MS培养基下均可以生根，但在1/2 MS培养基须根生长时间明显的早于MS培养基，且1/2 MS培养基生根率略高；同时1/2MS培养基形成的根系发达，均匀，侧根多。因此，沙柳生根培养选用1/2MS + 0.3 mg/L IBA培养基生根培养最佳。同时培养条件在每天用12 h的光照与黑暗交替；光照强度可以降20，000 µmol/s∙m 2 以下有利于生根生长，经1个月左右培养，即可长成带有6~7个叶片健壮完整植株，从而建立沙柳再生植株体系，完成沙柳再生植株的形成培养(图6)。另外还发现在以1/2MS + 0.15 mg/L NAA为生根培养基时，生根效果接近1/2MS + 0.3 mg/L IBA，生根率可达90%以上，可以作为后期继续工厂化育苗的探索 图5. 生根培养 Table 6 The effect of different concentrations of IBA on primary root IBA浓度(mg/L) 接种小苗数 生根数(20d) 生根率(%) 生根状况 0 40 12 30 生根非常缓慢 0.3 40 38 95 生根较快，须根较多 0.6 40 28 70 根粗壮均匀，须根多 1.0 40 24 60 根细长，须根数量少；起瘤 表6. 不同浓度的IBA对无菌芽生根的影响 注：生根率(%) ＝ 生根苗数/所接种苗数 × 100%。 图6. 再生植株 Table 7 The comprehensive effects of hormone concentration and culture medium on the rooting rat IBA浓度对生根率的影响(mg/L) 0 0.3 0.6 1.0 生根情况 生根速度 根须状态 1/2MS培养基 30 95 70 60 快，约12天 根系发达、分布均匀 MS培养基 26 90 50 - 慢，约20天 根系纤细、须根较少 表7. 激素浓度与培养基对生根率的综合影响 比较的依据。这与蔡国军等组培旱生植物三倍体白毛杨 [ 13 ] 所用生根培养基及效果接近。而在1/2MS + 0.3 mg/L IBA + 0.05 mg/L NAA培养基培养时，生根时间更接近，根须更加整齐一致。 3.4.3. 再生植株移栽 当生根苗生长达到5~6 cm左右时，将已经生根的健壮完整植株在温室内打开瓶口，炼苗培养3~4 d后使其染菌，逐渐降低湿度，并间歇增强光照，洗净根部琼脂，将其移栽到通气无菌的基质中进行继续炼苗培养的口杯中。本试验选取经高温灭菌后的细沙土作为基质，保存适宜的水分，间歇日光照处理，适当提高温度(27℃ ± 2℃)。经过驯化培养15~20 d后栽入温室苗床上，成活率可达70%~80%。沙柳在定植后不需要特殊管理，栽培极易成活，对土质要求不严，疏松的沙壤土、碱性土、中性土均可，移栽后适当加以浇水、追肥。