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user: 2. 材料与方法 2.1. 质粒、菌种和细胞 pAAV2-sTNFRII-gAD由本实验室保存，pMH3质粒，CHO-S细胞由杭州安瑞普生物科技公司惠赠，CHO-S细胞已经过无血清培养基B001悬浮驯化可悬浮生长，在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中可贴壁生长；L929细胞购自美国ATCC，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。 2.2. 主要试剂和仪器 Platinum Pfx DNA聚合酶购自Invitrogen公司；EcoR I和Not I限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自宝生物公司(Takara Biotechnology Co.， Ltd.)；质粒小提试剂盒购自Qiagen公司；Ficoll试剂和Trizol试剂盒购自北京索来宝科技有限公司；G418购自Merck公司；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco；放线菌素D购自Fluka；鼠抗人脂联素单抗由本元正阳基因技术有限公司谭淑萍老师提供；鼠抗人TNFRII单抗购自Abcam公司；蛋白Marker，AP标记的羊抗鼠IgG 抗体和HRP标记的羊抗鼠的IgG抗体，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)和BCA法蛋白含量测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco；无血清培养基B001和流加培养基F001均购自杭州安瑞普生物科技公司。人TNFα国家标准品(3500 U/支)由中国药品生物制品检定所提供；hTNFR-Fc阳性对照品由复旦张江生物医药公司提供。琼脂糖亲和介质Protein A购自国家生化工程技术研究中心(北京)。细胞转瓶培养器及PY/PYC系列恒温培养箱购自美国精骐有限公司。7.5LCelliGen310生物反应器购自美国NBS (New Brunswick Scientific)公司。 2.3. 重组质粒的构建 抽取20 ml健康人外周血于肝素抗凝管中，以PBS稀释1倍后用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。按Trizol试剂盒操作说明提取总RNA，取1 μg进行逆转录，以逆转录后的cDNA为模板，设计2对引物(如表1)，引物合成由Invitrogen公司完成，利用F1和R1一对引物PCR扩增得到目的基因IgG1Fc。反应条件：95℃预变性5 min；94℃ 15 s，58℃ 30 s，68℃ 45 s，28个循环；68℃ 10 min。扩增得到目 Table 1 Oligonucleotide primers used for the amplification of human sTNFRII-gAD and IgG1 Fc coding region Primer name Primer sequence (5¢-3¢) F1 TGCTGTACCACGACACCAACGAGCCCAAATCTTGTGACAAA R1 ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG F2 ACGGAATTCGCCACCATGGCCCCCGTGGCCGT R2 TTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTGGTGTCGTGGTACAGCAG 表1. 人sTNFRII-gAD和 IgG1 Fc编码区扩增的引物序列 注释：限制性内切酶酶切位点侧翼序列已用下划线标出，EcoRI: GAATTC; Not I: GCGGCCGC。 的基因IgG1 Fc大小为699 bp。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收目的片段。同时，以融合蛋白基因pAAV2-sTNFRII-gAD为模板设计引物F2和R2。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 75 s，28个循环；68℃ 10 min，扩增得到目的基因sTNFRII-gAD大小为1183 bp。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收目的片段。然后，同时以胶回收的目的基因sTNFRII-gAD和IgG1Fc为模板，以F2和R1为引物，进行重组PCR，将这两段不相邻的基因片段连接扩增出融合基因sTNFRII-gAD-Fc大小为1887 bp。PCR扩增条件为95℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 2 min，28个循环；68℃ 10 min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收目的片段，用EcoR I和Not I进行双酶切。同样用这两种酶切载体pMH3。用T4 DNA连接酶将sTNFRII-gAD-Fc目的片段与pMH3载体片段连接，转化至DH5α，挑取氨苄抗性克隆进行酶切鉴定，并直接送上海华大基因测序鉴定，得到重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc。 2.4. 转染及稳定高表达单克隆细胞株的获得 采用电穿孔系统(Bio-Rad)进行转染，取5 × 106个CHO-S细胞，PBS洗涤2遍，200 μL PBS重悬，将25 μg pMH3-sTNFRII-gAD-Fc质粒及10 μg鲑鱼精DNA混匀加入上述细胞悬液后转移到电转杯，冰浴1 min，电转仪参数：电压160 V、电击时间15 ms，电击一次，取出，立即冰浴1 min，同法再电击一次。将电转后的细胞悬液转入2个预先加好含10% FBS的DMEM/F12培养基的细胞培养皿中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后，换用含G418的选择培养基(G418浓度为1.5 mg/mL)，G418持续加压筛选两周后，刮取法挑选单克隆，即待单个细胞长成集落斑点(克隆)后(50~100个克隆集落/培养皿最佳)，弃去皿内培养基，加入2~3 mL培养基。根据镜面反光原理，用10 μL枪头刮取单克隆细胞团于96孔板中，此时撤去G418，37℃、5% CO2培养箱中培养。培养5~7天，待细胞长满后换无血清的DMEM/F12，培养24 h后取上清，斑点杂交(dot blot)检测目的蛋白表达量。经半定量分析挑出高表达株，此单克隆记为一次克隆。为获取高纯度高表达单克隆，选取表达量前三的一次克隆，消化后计数，分别取50~100个单个细胞于9 cm细胞培养皿中培养，同法挑取二次、三次克隆。冻存表达量最高的三个克隆作为种子细胞。 2.5. 无血清悬浮批次培养和流加培养 2.5.1. 种子细胞的无血清悬浮驯化 选取稳定高表达量的种子细胞，用含10% FBS的DMEM/F12的培养基在T75方瓶中贴壁培养，待3个T75方瓶中的细胞汇合度达90%且状态良好时，胰酶消化后，弃除胰酶，用30 mL无血清培养基B001 (添加了100 μM次黄嘌呤、16 μM胸腺嘧啶核苷及胰岛素生长因子)重悬细胞，并吹打成单个细胞避免成团，接种到250 mL摇瓶中，初始密度至少约2.0 × 10 6 cells/mL，置于37℃恒温摇床，120 r/min振荡培养。每天检测活细胞密度，台盼蓝染色检测细胞活力，直到细胞生长每天可以倍增，状态良好，dot blot检测蛋白表达稳定，即得到悬浮驯化成功的工程细胞株。 2.5.2. 工程细胞株在摇瓶中无血清批次培养 以2.0 × 10 6 cells/mL初始密度接种到500 mL摇瓶中，初始工作体积为60 mL，置于37℃恒温摇床，120 r/min振荡培养，进行无血清悬浮批次培养。每天取样观察计数并台盼蓝染色检测细胞活力，dot blot检测蛋白的表达，当细胞活力降至60%时终止批次培养。 2.5.3. 工程细胞株在转瓶中无血清流加培养 在转瓶中进行无血清悬浮流加培养，以2.0 × 10 6 cells/mL初始密度接种到2 L摇瓶中，初始体积为100 mL，置于37℃恒温转瓶旋转机，720 r/h滚动培养，扩种至200 mL时，不再扩大培养体积。当细胞密度达4.0~5.0 × 10 6 cells/mL左右时开始间歇流加高糖流加培养基F001，流加体积以控制每天的葡萄糖残余量在2 g/L左右为准。每天取样观察计数并检测细胞活力，测定葡萄糖，当细胞活力降至60%时终止培养。 2.5.4. 工程细胞株在生物反应器中无血清流加培养 接种2 L密度为2.0 × 10 6 cells/mL的工程细胞株到7.5 LCelliGen 310生物反应器中，进行全悬浮无血清培养，扩种至3.0 L，不再扩大培养体积，当细胞密度达4.0 × 10 6 cells/mL左右时开始间歇流加高糖流加培养基F001，流加体积以控制每天的葡萄糖残余量在2 g/L左右为参考。反应器操作条件：pH (7.08 ± 0.1)，DO为50%空气饱和度，温度为37℃，搅拌速度为60 r/min，第3天搅拌速度下调至40 r/min。培养过程中每隔约24 h取样，观察计数并检测细胞活力，测定葡萄糖。连续培养期间以RPC软件进行数据采集，实现计算机在线控制，维持细胞培养条件的稳定，当细胞活力降至60%时终止培养。 2.6. Dot blot检测和Western blot分析融合蛋白sTNFRII-gAD-Fc 将每次收集的无血清培养24 h的上清各取5 µL，分别点到NC膜上，用封闭液(5%脱脂牛奶，TBST配制) 37℃封闭1 h。弃封闭液，TBST洗涤NC膜3次后，加入1:2000 (用TBST稀释) 的鼠抗人TNFR单抗或鼠抗人脂联素单抗，37℃孵育1 h。回收单克隆抗体，TBST洗涤NC膜3次后，加入1:3000 (用TBST稀释)的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体，室温孵育45 min，用TBST洗膜3次，ECL曝光，观察结果。 取20 μL无血清DMEM/F12培养24 h的上清，加入5 μL 5 × Loading buffer，6%分离胶进行SDS-PAGE电泳。然后用湿胶转移仪将蛋白转移至PVDF膜上，取出PVDF膜，用封闭液(5%的脱脂奶粉)封闭1 h。弃封闭液，TBST洗膜3次后，加入1:2000稀释的鼠抗人TNFR单抗或鼠抗人脂联素单抗(用TBST稀释)，室温孵育1 h。回收单克隆抗体，用TBST洗膜3次，加入1:3000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(用TBST稀释)，室温孵育1 h；用TBST洗膜3次。取出PVDF膜，在膜上滴加显色液BCIP/NBP，避光显色10~15 min，用超纯水洗涤膜终止反应，观察结果。 2.7. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的纯化 将收获的培养上清经12，000 r/min，4℃离心10 min后，用0.22 μm滤膜过滤进行蛋白的粗分离，然后用Protein A-Agarose亲和层析法分离纯化。将收集到的蛋白洗脱液峰进行6% SDS-PAGE电泳分析，收集含有目标融合蛋白的峰获的融合蛋白纯品。 2.8. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的生物活性测定 以L929为靶细胞，检测融合蛋白sTNFRII-gAD-Fc拮抗TNFα杀伤L929细胞的中和活性 [ 9 ] 。取对数生长期的L929细胞，胰酶消化计数，调整细胞密度1.5 × 10 5 cells/mL，在96孔板中每孔加入100 μL的细胞悬液，37℃、5% CO 2 培养箱培养过夜。第2天将无血清悬浮培养的CHO-S/pMH3-sTNFRII-gAD-Fc的上清用含20 μg/mL放线菌素D、20 U/mL TNFα的RPMI1640培养基4倍比梯度稀释，共10个梯度。弃去96孔板中L929细胞的上清，加入前面稀释好的待测样品，每孔100 μL，每个梯度设3个复孔。同时未转染的CHO-S细胞无血清悬浮培养的上清用含20 μg/mL放线菌素D、20 U/mL TNFα的RPMI1640培养基稀释作为阴性对照。继续37℃、5% CO 2 培养24 h，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，再培养4 h。将96孔板中的液体轻轻弃去，加入100 μL DMSO，37℃孵育30 min，检测各孔的OD 570 值。