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user: 3. 结果与讨论 3.1. 活性污泥中细菌群落的α多样性分析 本研究对上海市3座污水处理厂的活性污泥样本进行了高通量测序分析，并根据各样本在OTU的分布情况绘制了韦恩图，见图1。其中，A厂样本的活性污泥有效序列数和OTU数量均为最低，C厂最高，构建OTUs并且获得注释信息的Tags数目从29，712~37，224，OTUs平均有4622个，其中A厂特有OTUs有3100个，B厂特有OTUs有3183个，C厂特有OTUs有3593个，三厂共有OTUs为628个，说明各污水厂在微生物物种组成上具有相似性，但一致性并不高。 图1. OTU样本分布韦恩图 为了验证测序量是否能够反映样品中微生物群落的多样性，根据97%相似度的OTU分类学水平，利用mothur计算不同随机抽样下的多样性指数，三家污水处理厂活性污泥中细菌群落的α多样性指数数据见表2。ACE指数可以用来估计群落中含有的OTU数目，默认将序列量10以下的OTU都计算在内。ACE指数越大，表明群落的丰富度越高。Chao1指数也被用来估计群落中物体总数，由Chao [ 15 ] 最早提出，Chao1指数越大，OUT数目越多，说明该样本的物种数目较多。如表2所示，3家污水厂中，C厂的ACE指数和Chao1指数均为最高，因此C厂的群落物种总数也较多。Coverage是指各样品克隆文库的覆盖率，该数值越高，则样品中序列被测出的概率越高。由表2可知，所有样本的Coverage指数均大于0.98，表明测序深度足够，结果可靠。 Table 2 The α diversity of activated sludge samples from different WWTP 水厂名称 ACE_index Chao1_index Coverage Shannon_index Simpson A 32359 18414 0.98 6.31 0.0086 B 27474 16111 0.99 6.57 0.0049 C 34422 19161 0.98 6.08 0.0156 表2. 不同污水厂活性污泥的α多样性指数 Simpson指数是用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Simpson [ 16 ] 提出，常用来描述生态学中某个区域的生物多样性，该指数越高，代表群落多样性越低。但如果样品的物种丰富度相同，物种分布越均匀，则多样性越高。Shannon指数 [ 17 ] 对群落丰富度和均匀度进行了综合考量，该指数越高，表明群落的多样性越高，物种分布越均匀。图2中随着样本读取数的增加，观察到的Shannon指数曲线趋向平坦，表明测序数据量足够大，能够反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。从图2中可以看出C厂的Simpson指数最高，而Shannon指数最低，两者的数据相互对应，说明C厂的群落丰富度最高，但群落多样性较低，这可能是由于该厂的污水来源比较单一，都是生活污水。工业废水中重金属等有毒物质含量较高，会抑制微生物活性，影响微生物生长。生活污水比工业污水更利于微生物的降解利用，因此它的群落总量较高，微生物生长状况良好，但物种种类则不如工业污水多。另外，也有可能因为C厂是全地下式水厂的暗环境，有研究表明暗环境会影响微生物群落多样性和物种组成 [ 18 ]。Rank-abundance曲线可以同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。由图3的Rank-abundance曲线可知，三家污水厂的物种组成都比较丰富且均匀。 图2. 不同污水厂的Simpson指数(a)和Shannon指数(b) 图3. 不同污水厂的Rank-Abundance曲线图 3.2. 活性污泥中聚磷菌群落结构分析 Hiraishi等人利用非培养技术研究发现，β-变形菌纲(β-proteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria group)在EBPR系统中含量丰富 [ 19 ]。因此本研究从门、纲两个水平对3座污水处理厂活性污泥的OTU所属的物种信息进行分析，从而揭示其菌落组成特征。在门水平下，活性污泥中细菌群落结构见图4。从图4中可以看出，三家污水厂的主要优势菌门有：变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等，此结果与许多通过高通量测序分析活性污泥中微生物群落的研究相似 [ 20 ]。其中Proteobacteria为最优势菌门，它也是是污水处理过程最主要的细菌类群 [ 21 ]。A菌属于变形杆菌门，其在3座污水厂的比例分别占40.28%，35.73%和41.78%。Planctomycetes在B厂的含量较高，占17.89%，迄今发现具有厌氧氨氧化(Anammox)功能的细菌全部来自浮霉菌门 [ 22 ]。Bacteroidetes和Chloroflexi也是三家污水处理厂中重要的优势菌门，普遍存在于污水处理厂生物池并参与有机物的降解 [ 23 ]。Firmicutes是碱性厌氧发酵系统中的普适菌种 [ 24 ]，被认为与厌氧水解和酸化密切相关 [ 25 ]，可以代谢很多底物，包括蛋白、脂类、纤维素、糖和氨基酸等。另外可以发现，三家水厂中的Actinobacteria都占有一定比例，T菌属于放线菌门，在3座污水处理厂中的比例分别为3.67%，3.17%和5.82%。从门水平来看，C厂的变形杆菌门和放线菌门的数量均为最多，A厂次之，B厂最少。 图4. 不同污水厂的物种组成分析(门水平) 图5. 不同污水厂的物种组成分析(纲水平) 在纲水平下，活性污泥中细菌群落结构见图5。α-变形杆菌(α-proteobacteria)，β-变形杆菌和γ-变形杆菌(γ-proteobacteria)均为三家污水厂中的主要优势菌纲。Kong等人 [ 26 ] 在对群落结构鉴定的时候发现聚糖菌(GAOs)主要是α-、γ-变形杆菌。进一步的研究发现，随着反应器中磷含量的变化，微生物的结构也会发生改变，当P/C从1:10降为1:50，EBPR 系统恶化，β-变形杆菌的数量由80% 降为40%，而α-、γ-变形杆菌随之增加 [ 27 ]。A厂的α-、γ-变形杆菌数量分别为11.46%和11.89%；B厂分别为10.91%和8.47%；C厂分别为8.05%和7.56%。A菌属于β-变形杆菌，在三家污水处理厂中的比例分别为10.3%，7.42%和10.28%。由此可知，C厂的聚糖菌含量较少，而聚磷菌含量相对较高。B厂这两种菌的含量都较低。同时，T菌属于放线菌纲(Actinobacteria)，它的相对丰度在三家污水厂中分别为1.66%，1.43%和3.79%，C厂的T菌含量约为A、B两厂的两倍。 3.3. 活性污泥中聚磷菌相对丰度与进水组分的相关性 采样当天污水处理厂进出水水质及其他指标见表3，每个污水厂的污染物都达到了国家一级A排放标准。其中，A厂进水的COD最高，约为B厂、C厂的2倍，这表明A厂的碳源含量相对比较丰富，这可能是由于A厂的处理水量较多以及来源比较广泛。 Table 3 Water quality of different WWTP 水厂 进水/mg·L −1 出水/mg·L −1 去除率/% 名称 COD NH 4 + -N TN TP COD NH 4 + -N TN TP COD NH4 + -N TN TP A 480 29.6 34.5 5.1 33 0.4 7.2 0.2 93 99 79 96 B 242 18.5 23.6 3.5 11 0.3 5.8 0.2 95 98 75 96 C 264 22.3 29.2 3.1 12 0.4 6.2 0.2 95 98 79 93 表3. 不同污水厂的进出水水质 Mielczarek等对丹麦污水处理厂EBPR工艺中微生物种群与进水水质进行了连续监测分析，研究发现，T菌丰度大小与进水的工业废水占比成正相关，进水中工业废水比例越大，T菌丰度越高 [ 28 ]。Kong等调查了丹麦10座污水处理厂，其中在处理工业废水为主的污水厂中T菌平均丰度为17%~35%，而在处理生活污水为主的污水厂中T菌丰度仅为3%~16%，这说明进水组分对两种聚磷菌T菌和A菌丰度具有很大影响 [ 6 ]。Nielsen等人的研究表明，典型的废水中含有25%~35%的蛋白质和15%~25%的多糖 [ 5 ]。国内某污水处理厂进水有机物组成显示 [ 29 ]，总糖、蛋白质和油脂的平均含量分别占到进水总COD的8.93%、41.33%和8.53%。蛋白质和糖类占了总COD的半数之多，而VFA的含量很少。本研究对3家污水处理厂的进水组分进行了测量，结果为各组分占总COD的比例，结果如表4所示。 Table 4 Influent composition in different WWTPs and relative abundance of PAO 水厂名称 蛋白质 多糖 VFAs 水解氨基酸 游离氨基酸 A菌丰度 T菌丰度 A 24% 14% 6% 1.36% 0.38% 10.30% 1.66% B 30% 22% 5% 1.38% 0.37% 7.42% 1.43% C 26% 18% 10% 2.12% 0.45% 10.28% 3.79% 表4. 不同污水厂的进水组分及聚磷菌丰度 由表4可以看出，这三家污水处理常中的进水组分中，蛋白质含量在24%~30%，多糖含量为14%~22%，VFAs含量为5%~8%，水解氨基酸含量为1.36%~1.38%，游离氨基酸含量为0.37%~0.45%，与前面的研究结果基本吻合。文献中指出，T菌可以直接利用葡萄糖、蛋白质、氨基酸等大分子有机物进行生物除磷代谢 [ 30 ]。从上述结果也可以发现，C厂的水解氨基酸含量和游离氨基酸含量均高于A、B两厂，同时，C厂的T菌丰度也高于另外两厂，我们根据方差分析的结果也认为进水组分中的氨基酸含量与T菌丰度相关性较高。C厂主要以生活污水为主，进水中的易降解的VFAs含量较高，而A、B两厂的进水中有约20%的工业废水，VFAs含量相对较低。同时，T菌具有发酵能力，在厌氧条件下，能够通过发酵葡萄糖和氨基酸产生VFAs，为A菌厌氧释磷提供碳源增量 [ 8 ]。因此，C厂较高的VFAs也有可能是由T菌将蛋白质、葡萄糖等物质发酵形成的。