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user: 3. 基于检测对象的POCT分类 近年来，POCT的发展主要体现在便携式分析仪器如酶联免疫、生物传感器、生物芯片、纳米技术等现代分析技术的大量引入及POCT检验在应用范围上的拓宽，下面将根据检测对象介绍一下POCT在血液分子诊断中的近期发展状况： 3.1. 蛋白质检测 众所周知，蛋白包含大量的生物学信息和功能，从酶促反应、激素的合成到代谢平衡的维持和组织的修复 [ 4 ] ，都需要蛋白质的参与。临床上，某些蛋白质生物标志物的水平直接反映了疾病的进程，常被认为是临床疾病诊断最方便的来源之一。血液中含有大量的蛋白质，其获取方便、快速、且损伤小，因此成为临床疾病检测青睐的生物标志物。下面讲一下基于蛋白质的临床检测法。 3.1.1. 基于ELISA的蛋白质检测法 目前，大部分血液蛋白分析方法是基于酶联免疫吸附法(ELISA)，并常被作为临床检测的金标准。但是，传统的ELISA法，样品往往需要预处理、设备较大且需要精密的读取装置，检测费时又费力，尽管许多基于ELISA的新技术发展起来，但其应用在POCT诊断上仍然面临着灵敏度、重复性、定量性、便携性、操作速度及结果读取的清晰和成本的降低等挑战。 1987年引入的侧流测定法(LFA)，结合了薄层纸色谱和ELISA的原理，避免了样品反复洗涤的繁琐预处理，使一滴血的血浆成分在几分钟即可分离出来，成为当时最成功的商业技术 [ 5 ] 。最近新开发的微流体芯片(mChip)技术，简化了ELISA，需要很少的设备，即可快速、高特异性的完成样本的分析。如基于该设备的艾滋病毒(HIV)的诊断，只需要1 ml血液，20分钟内即可完成样本分析 [ 6 ] 。缺点是灵敏度低、结果半定量且吞吐量低。 另外，基于灵敏度提高而发明的数字ELISA法，可检测到血清中低至fmol浓度的蛋白；另一种提高灵敏度的方法是将新的信号放大法引入到ELISA分析中，如等离子ELISA (plasmonic ELISA)，其原理是通过过氧化氢酶控制金纳米颗粒(AuNPs)生长进而使其颜色产生变化，由此实现了血液中蛋白质的超灵敏的检测 [ 7 ] 。另外，基于ELISA平台的磁信号(GMR)传感器，可避免检测磁背景信号，因此产生较低的噪声信号 [ 8 ] ，有效的提高了灵敏度，使血清中蛋白质的检测限低至aM级别。但是，这些技术在操作上费时且需精密的读取仪器。 临床研究证明，多蛋白的定量测量能够提供更精确的诊断结果，而光刻mChips在多重蛋白分析上展现出强大的应用能力 [ 9 ] 。如最近开发的综合性血液条码芯片(IBBC)，是将显微荧光条形码作为血液多重分析报告的信号 [ 10 ] ，但定量测量仍需精密的仪器。而由复容积条形图芯片(V Chip)集成的ELISA，其通过测量mChip上产生的氧的体积实现了生物标记的即时和即视定量 [ 11 ] ，无需额外的仪器、数据处理或图形绘制即可产生可视的条形图，且可重复、定量地对目标蛋白质生物标志物进行测定，灵敏度可通过该装置中存入的多级统一铂片被放大。在未来，V Chip技术可能会通过整合样品预处理过程而得到广泛的应用。 3.1.2. 不基于ELISA的蛋白质检测法 全血清分析的传统临床方法是电泳法结合质谱法。但该方法的灵敏度和定量性在临床应用上仍存在着问题，因此，有必要开发一些用于全血清分析的优化技术。 介孔二氧化硅薄膜(MPS)的发现，加强了血清中循环低分子量蛋白质(LMWP)的富集作用，但捕获的LMWP需通过质谱(MS)进行检测和分析 [ 12 ] ，POCT诊断中MS的使用过于昂贵；最近，利用GFP和AuNPs之间静电相互作用而发明的新的传感平台GFP-AuNPs，已用于血清蛋白质的检测 [ 13 ] ，其具有足够低的检测限，故可以在POCT诊断中应用。这些测定法即快速且不需要任何洗脱步骤。 3.2. 核酸检测 核酸是细胞内遗传信息的载体，少量的存在于健康者和患病者的血清中 [ 14 ] 。血液中核酸的提取和分析为遗传疾病状态的检测提供了一种相对非侵入性、高患者兼容性方法。目前，核酸的检测方法主要基于PCR，这局限于实验室，且成本昂贵、仪器笨重。尽管微流体设备为血液中核酸的快速纯化提供了可能，但目前的核酸检测仍面临着一个巨大的挑战：如何将核酸的预处理以一种廉价、强大和用户友好的模式整合到核酸的检测中。 3.2.1. DNA的测定 来自凋亡或坏死细胞的循环DNA，被认为是人类疾病多样化的一种非侵入性生物标记物。片段大小的分析有望在癌症和产前诊断中确定DNA来源。目前开发的微流体单分子光谱技术(μCICS)，可用于血清中DNA生物标记的直接分析 [ 15 ] 。这一新技术不需要DNA分离或酶促扩增这些附加步骤，就可对体积 < 1pl的血清中循环DNA进行单步分析和量化。 另外，通过血清样品确定DNA突变是癌症治疗的另一个重要的方面。从癌症患者的血清中提取的循环DNA总是包含着肿瘤的特异性突变。标记扩增子深度排序(TAm-Seq)的新方法，是利用循环DNA的单拷贝体进行扩增和排列大型基因组，其具有较高的灵敏度和特异性，能对突变率低至2%的5995个核苷酸进行筛选检测。 甲基化的DNA是癌症和其他遗传性疾病早发现的另一有前途的生物标志物，且甲基化中组合的改变比单一改变表现出与特定癌症更强的关联。最近，基于水溶性阳离子共轭聚合物(CCP)的荧光共振能量转移法被开发出来，并用于结肠癌患者细胞DNA甲基化水平的定量测定 [ 16 ] 。这种方法在鉴别分析和累积检测中显示出较高的精确度和灵敏度。 3.2.2. RNA分子的测定 mi RNA是调节性RNA小分子，在癌症患者中常常失调，故有望成为用于癌症分类和预后的生物标志物 [ 17 ] 。但是，高灵敏度(至少fmol级)的检测血液中的mi RNA仍面临巨大的挑战。最近开发的具有低检测限和宽动态范围的三模式电化学传感器(HPD-SENS)，可用于mi RNA的定量检测，检测限低至5 amol；另外，纳米技术也被引入到高敏感传感器中用于mi RNA的检测 [ 18 ] ，如DNA的纳米结构提高了电化学mi RNA传感器(EMRS)的灵敏度，使mi RNA的检测浓度低至amol级。另外，开发的基于α-溶血素蛋白的纳米孔传感器，已用于检测肺癌患者血浆中的miRNA。 3.3. 其他类型生物分子的检测的POCT技术 血液中其他类型的生物分子大都来自代谢过程或药物的使用。代谢物的水平，包括激素和血液中的化学物质，往往是疾病的指标，而对于血液中的成瘾药物如可卡因的存在，则常被用于发现和防止药物滥用和非法贩运的监测 [ 19 ] 。由于小尺寸或类似的化学结构，识别这些分子的市售抗体常常在免疫测定中表现出高的交叉反应，故现有的检测这些小分子的方法往往缺乏足够的灵敏度或特异性。 血糖测量对于糖尿病人将血糖控制在正常的生理范围内至关重要。目前使用的血糖仪主要依赖电化学信号的测量。最近开发出来的基于石墨烯固有过氧化酶活性的石墨烯葡萄糖传感器 [ 20 ] ，使血糖的测量变得简单、低廉，并且有较高的灵敏度和选择性。其他的像碳纳米管或石墨-血红素络合物，也表现出过氧化酶活性，并且可用于铜离子、脱氧核糖核酸、溶菌酶和癌细胞的检测 [ 21 ] 。 类固醇类雌激素通常用来确诊乳腺癌的患病风险或乳腺癌抗雌激素治疗的疗效监测 [ 22 ] 。近期开发的小巧、高效和直观的数字微流体(DMF)法已用于小至1 ml的血样中雌激素的分析，该方法可用于大多数多步样本处理程序及血液或血清样品的分析 [ 23 ] 。 一氧化氮(NO)是一种由NO合成酶合成的亚稳定的自由基，参与许多重要的生理过程，如伤口愈合、血管生成和免疫反应 [ 24 ] 。新研发的基于NO-选择性干凝胶聚合物的微流体安培传感器装置已用于小血液样本(250μl)中NO检测，这一安培传感器显示出优良的选择性和较高的灵敏度，在磷酸盐缓冲液和血液中的检测限分别达840 pM和472 nM。 3.4. 基于分子分析的细胞检测 原发肿瘤部位脱落下来的存在于血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)，为了解癌症发病机制提供了难得的模型系统。这种分子信号可显著提高临床医生对癌症的诊断和控制能力。CTCs的数量非常少(平均107~109血细胞中存在1个)，因此捕获非常困难，故临床应用中，需要开发像非侵入性“液体活检”那样的具有高捕获效率、灵敏度以及较低成本的新平台。 近期的微流控技术、免疫检测和分子分析的发展逐渐满足了这一要求。如开发并用于全血样品中CTC计数的商业化的筛选系统(CellSearch)；另外，免疫芯片，则是一种广泛使用的细胞分离方法，它借用磁力将癌细胞和标记的磁性颗粒从未标记RBC和WBC中分离出来的；除了免疫标记分离法，无标记的微流体法也开始应用到细胞的分离中，如基于细胞大小的微芯片，已开发出来并用于血细胞中癌细胞的分离，其是根据癌细胞的物理性质如大小、形状、密度和不同细胞类型的变形性等差异进行分离 [ 25 ] ；其他无标记的分离技术如介质分离，则是利用癌细胞的介电性能达到分离目的的 [ 26 ] 。 另外，一些新技术如荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR、定量RT-PCR (QRT-PCR)以及数字PCR等也已用于肿瘤细胞的分子分析，为癌症的治疗策略提供诊断和预后信息。