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user: 2. 方法 2.1. BPA的PBTK模型构建 膳食摄入是成年人BPA暴露的主要途径 [ 1 ]。BPA经口摄入后经胃吸收进入小肠，后经门静脉入肝，在肝脏的葡萄糖醛酸化和硫酸化过程代谢之后，经下腔静脉进入血液循环系统，分布于全身多个器官组织。BPA在进入血液循环系统前存在明显的首过消除效应，在经过胃肠道时可被肠道粘膜细胞上的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase， UGT)作用下，代谢为BPA葡糖醛酸苷结合物(BPAG)，经过肠系膜静脉进入肝脏；在肝脏中，大部分BPA在UGTs催化作用下形成BPAG，少量BPA在肝细胞硫酸化代谢酶作用下代谢生成BPA硫酸盐共轭物(BPAS)，如图1所示 [ 25 ] [ 26 ]。由于在人体内，非结合型BPA具有生物活性，在小肠、肝脏代谢生成的产物BPAG、BPAS无明显生物活性，所以我们将其设置为单独的两个腔室。 研究表明BPA在成年人体内的半衰期很短，大约6 h，主要以BPAG和BPAS形式通过肾脏随尿液排出体外 [ 1 ] [ 24 ]。故模型中将胃、小肠、肝脏、肾和血液循环系统列为单独腔室。大量研究报道显示BPA具有生殖毒性 [ 27 ] [ 28 ]。同时，已有研究报道孕期暴露于低浓度BPA可能对儿童神经和行为发育产生影响 [ 29 ]。故生殖腺和脑作为独立腔室被纳入到模型中。由表1所示，BPA的辛醇–水分配系数对数(LogK ow )为3.32 [ 30 ]，对于亲脂性(LogK ow > 3)的化学物，需要将脂肪作为独立腔室 [ 31 ]。而对于未单独列为腔室的组织或器官，视为“其它组织器官”作为一个整体腔室考虑。图2为BPA的PBTK模型结构图。所有模型模拟均使用R语言(3.6.3版本)进行，PBTK模型在R包“desolve”中求解。 图1. 肝脏中BPA的葡萄糖醛酸化及清除途径示意图 Table 1 Physical and chemical properties of BP 目标物 参数 [ 30 ] 数值 BPA CAS号 80-05-7 相对分子质量 228.29 g/mol 分子式 C 15 H 16 O 2 化学结构式 密度 1.195~1.2 g/cm 3 (at 25℃) pK a 10.1 LogK ow 3.32 半衰期 6 h 表1. BPA的理化性质 2.2. 模型参数估计 人体PBTK模型需要的参数包括人体生理学参数、代谢动力学参数和腔室分配系数。PBTK模型参数估计的一个重要原则是符合特定人群的生物学基础。具体到本研究而言，考虑到白种人、黑人与中国黄种人在生理学参数，如体重、体脂等存在明显差异，我们在生理参数的设置上，区分了中国人群与外国人群。其中，外国人群的生理学参数引用Karrer [ 32 ] 设置的参数值，而中国人群的生理学参数参照GBZT 200.3-2014、GBZT 200.2-2007推荐值 [ 33 ] [ 34 ]，详见表2。 图2. BPA的PBTK模型结构图 Table 2 Physiological parameters of PBTK model for BP 参数 符号 中国人群 心输出量(L/min) (Cardiac Output) QC 5.6/5.3* 血液流速(占心输出量比例) (Velocity of Blood Flow) 肝脏(Liver) QLC 0.225/0.27* 肾脏(Kidney) QKC 0.19/0.17* 小肠(Small intestine) QlgC 0.1/0.11* 脂肪(Fat tissue) QFC 0.05/0.085* 脑(Brain) QBC 0.12 皮肤(Skin) QSC 0.05 生殖腺(Gonad) QGC 0.0005/0.0002* 组织器官体积(占人体总量比例) (Tissue Volume) 肝脏(Liver) VLC 0.022/0.024* 肾脏(Kidney) VKC 0.0046/0.0048* 脂肪(Fat tissue) VFC 0.14/0.23* 脑(Brain) VBC 0.023/0.025* 皮肤(Skin) VSC 0.038/0.033* 血浆(Plasma) VplasmaC 0.0411/0.04* 生殖腺(Gonad) VGC 0.0006/0.0002* 表2. BPA的PBTK模型生理学参数 注释：*男性/女性(male/female)。 BPA的分配系数(Partition Coefficients， Pts)与Karrer [ 32 ] 和Yang [ 24 ] 的研究一致，取值根据Doerge的动物实验数据，其中肾脏的Pts (P kidney /serum )无实验数据，因肾脏为快灌注器官(血流灌注大于0.1 mL/min/g组织) [ 35 ]，其P kidney /serum 引用Karrer [ 32 ] 研究中P rich 参数值，而其他器官组织(主要为肌肉、骨骼等)的Pts值引用Karrer [ 32 ] 研究中P slow 参数值，见表3。 Table 3 Partition coefficients of PBTK model for BP 脏器 符号 分配系数 肝脏(Liver) PL 0.73 脂肪(Fat tissue) PF 5 脑(Brain) PB 2.8 肾(Kidney) PK 1.5* 皮肤(Skin) PS 2.15* 生殖腺(Gonad) PGO 5.26 其他组织(Other tissue) Prest 2.7 表3. BPA的PBTK模型的分配系数 注释：*QSAR计算获得。 体外试验发现BPA在肝脏微粒体酶催化下发生葡萄糖醛酸化过程在成年人群男性、女性中未发现显著差异，因此在设置代谢动力学参数时，不区分性别、人种，参考Karrer [ 32 ] 研究中基本模型的参数设置。BPA代谢动力学参数见表4。BPA经膳食摄入后，经小肠上皮细胞吸收进入门静脉，进而进入肝脏的过程采用一阶过程进行描述(K oral C， L/h/kg −0.25 )，BPA在小肠上皮细胞、肝细胞内代谢过程采用米氏方程进行模拟，该参数值同样参考Karrer [ 32 ]。 Table 4 Metabolic kinetic parameters of PBTK model for BP 代谢动力学参数 符号 原始参数值 胃排空速率(Gastric emptying rate) GEC 3.5 (L/h/kg − 0.25 ) 小肠吸收率(Intestinal absorptivity) K oral C 2.1 (L/h/kg −0.25 ) 肝脏葡萄糖醛酸化(Glu in liver) V max L_gluC 9043 nmol/min/mg of protein K m L_glu 45，800 nmol 小肠葡萄糖醛酸化(Glu in gut) V max G_gluC 361 nmol/min/mg of protein K m G_glu 58，400 nmol 肝脏硫酸化(Sul in liver) V max L_sulC 149 nmol/h/g liver K m L_sul 10，100 nmol 小肠上皮细胞体积(Enterocytes volume) enterocytes 0.122 (L) 尿液排泄率(Urine excretion rate) BPA KurineC 0.06 (1/h/kg bw 0.75 ) BPAG KurinebpagC 0.35 (1/h/kg bw 0.75 ) BPAS KurinebpasC 0.03 (1/h/kg bw 0.75 ) 表4. BPA的PBTK模型代谢动力学参数 2.3. 模型校准 本研究参数校准只针对模型的代谢动力学参数进行校准。常用的方法是利用现有人群研究试验数据与模型预测值进行比对，通过调整代谢动力学参数，优化模型预测性能，最终确定合适的模型代谢动力学参数。本研究利用Thayer [ 36 ] 等人进行的人体口服试验。该试验研究共纳入了14名试验对象，空腹后于早晨通过饼干摄入100 μg/kg bw BPA-D 6 ，并在接下来的72小时内，间隔不同时间采集血液、尿液样本，检测样本中非结合型BPA、BPAG、BPAS等含量水平。其中三名研究对象(1男2女)初次试验三天的尿累积总BPA排泄量较低(不到摄入剂量的55%)。因此，排除三名受试对象的数据，最终纳入11人数据进行模型校准。BPA在人体内产生不良健康效应取决于非结合型BPA在血浆中、靶器官中含量水平，因此我们重点关注人膳食摄入BPA后血清中非结合型BPA、BPAG、BPAS含量的时间变化趋势和C max 值和T max 值，调整模型代谢动力学参数值，使模型拟合结果尽可能符合试验数据。 2.4. 模型评价 PBTK模型评价指的是评估模型可信度的过程。它包含评估模型的预测能力和可靠性。 2.4.1. 预测能力 模型有预测能力指的是模型模拟准确地反映了实际情况。评估化合物PBTK模型预测能力的方法主要分为两种：第一种是对浓度–时间变化趋势进行验证，通过PBTK模型预测的某个组织/器官中化学物的浓度随时间变化的曲线，与试验测定的各个时间点化学品的浓度值比较，视觉观察试验数值是否接近曲线，两者变化趋势是否一致。另一种是对平衡浓度的验证，即通过比较组织/器官中化学物质平衡态浓度的预测值与试验数值的回归系数和均方根误差(RMSE)来判断预测能力，回归系数越高或者RMSE值越低说明预测值与实测值之间的偏差越小，提示模型预测能力越强。这主要针对持久性化学污染物的模型预测 [ 37 ] [ 38 ]。BPA的半衰期仅数小时，为短寿命有机污染物，故本研究采用第一种方法评价所构建的PBTK模型预测能力。本研究采用Teeguarden等人报道的人体口服试验 [ 39 ]。该试验研究招募了10名健康成年男性，通过番茄汤摄入30 μg/kg bw BPA-D6，并在接下来的24 h内采集血样，检测BPA、BPAG和BPAS等含量水平。另一方面，本研究利用Karrer [ 32 ] 等人报道的人体PBTK模型(视为模型2)，其同样利用Teeguarden等人报道的人体口服试验数据进行了模型评价，通过比较两个模型预测的Cmax、Tmax和AUC与实测值差异，进一步评价模型的预测能力。 2.4.2. 可靠性 评价模型的可靠性主要包括敏感性分析(SA)和不确定性分析(UA)。敏感性分析能够确定对测量指标影响最大的参数。以美国FDA推荐的BPA的ADI值(50 μg/kg/day)为口服摄入量，我们设置模型应用于标准参考人(男性成年人，体重为70 kg)，一次经膳食摄入50 μg/kg的BPA情况。敏感性系数(Sensitivity Coefficient)的确定是基于模型预测的血浆浓度，由每个参数的值变化10%引起的血浆浓度变化，使用前向差分法 [ 40 ]。计算公式(1-1)如下： Sensitivity   Coefficient = ( ( A − B ) B ) ( ( C − D ) D ) (1-1) 其中，A为参数改变后得到的血浆浓度水平，B为原始参数值对应的血浆浓度水平，C为原始参数值增加10%后取值，D为原始参数值。根据WHO/IPCS (2010)推荐，敏感性系数绝对值大于或等于0.5，表示参数具有高敏感性；大于或等于0.2并且低于0.5为中敏感性；大于或等于0.1并且低于0.2为低敏感性 [ 41 ]。 模型不确定性分析目的是定量分析个体差异导致的模型生理学、解剖学及酶促反应动力学等参数变异性对模型预测造成的影响。蒙特卡罗分析是PBTK模型中最常用的概率抽样方法 [ 40 ] [ 42 ]。蒙特卡罗分析的目的是定性和定量描述模型估计中的变异性和不确定性。通过设置生理参数、(物理化学)分配系数或代谢参数等的分布，进行随机抽样模拟，就可以测量不确定性，从理论上考虑这些参数变化从何种程度上影响模型输出结果。同样在上述应用于标准参考人的情况下，我们参照了Karrer等人 [ 32 ] 不确定性分析中参数的概率分布设置，进行蒙特卡罗随机抽样100，000次。并且根据文献中不确定度计算方法，计算得到输出值分布的P5、P95百分位数 [ 32 ]。不确定度定义为第95百分位(P95)与剂量量度的P5之比，不确定度系数计算公式为： 不 确 定 度 系 数 = P 95 P 5 (1-2) 不确定度分析结果在同一数量级内，则认为可接受 [ 32 ]。