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user: 2. 实验部分 2.1. 实验材料 Dopa (纯度 ≥ 98.0%)、GA (纯度 ≥ 99.0%)、Ca (纯度 ≥ 99.0%)，EGCG (纯度 ≥ 95.0%，均购于Sigma公司)，CySA (纯度98.0%，购于Aldrich公司)，CD62p抗体(GMP-140， Serotec Co.)；HRP抗体(KPL Co.)；乙二胺四乙酸(EDTA)；Griess (Sigma-Aldrich)； JY-82接触角仪购自河北承德仪器厂；傅里叶红外光谱仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；NO分析仪购自美国GE analytical instruments公司；X-射线光电子能谱仪购自美国Thermo Electron公司；电子显微镜购自日本Jeol公司。 2.2. NO催化涂层的制备 由不同多酚化合物Dopa/GA/Ca/EGCG和CySA投料摩尔比为1:1加入到Tris缓冲溶液(1.2 mg/mL)中，尔后将清洗干净并干燥的316L SS浸没于上述反应溶液中，每个样品加入1 mL上述反应溶液，在室温下沉积12小时，然后用蒸馏水超声清洗NO催化聚合粘附涂层改性样品，清洗过程重复三次后对样品进行干燥。制备所得的共聚薄膜分别对应标记为Ca/CySA、Dopa/CySA、EGCG/CySA、GA/CySA。 2.3. 材料学表征 2.3.1. X射线光电子能谱 采用XPS进行涂层化学成分检测。其中，XPS检测设备型号为Kratos， Axis Ultra DLD。激发源为X-ray单色Al K-α (hν = 1486.6 eV)，运行参数为15 kV和150 W，荷电位移校正取C(1s) = 284.8 eV (饱和羟碳原子)，光电子起飞角为30˚。检测前，待检对照样品316L SS采用氩等离子进行表面清洗。 2.3.2. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析 MALDI-TOF MS检测采用MALDI微型MX时间飞行质谱仪(Waters， Milford， MA)的反射模式。MALDI源配置为337 nm N2激光，运行条件为4 ns持续脉冲。使用N，N-二甲基苯胺(DHB)作为基质，激光脉冲能量为200单位(AU)。质谱的检测范围设置50~4000 m/z。每组质谱结果取于十次激光束的平均值。每个样品的质谱数据综合十次质谱检测结果。DHB溶解于TFA/乙腈(体积比1:4)以获得的20 mg/mL的基质溶液。聚合薄膜直接修饰的MALDI靶(不锈钢)用于MALDI检测。在检测之前，滴加1 μL基质溶液到经聚合薄膜修饰后的MALDI靶表面。 2.3.3. 表面亲水性和形貌分析 采用原子力显微镜(AFM， SPI 3800， NSK Inc.， Japan)考察样品的表面形貌和粗糙度。 采用扫描电子显微镜(SEM， Quanta 200， FEI， Holland)对形貌进行观察。 薄膜表面静态接触角采用Krüss GmbH DSA 100 Mk 2接触角测定仪进行检测。本文选用极性溶剂双蒸水和非极性溶液二碘甲烷(CH2I2， Sigma-Aldrich， Purity ≥ 99.0%)进行接触角检测，在常温下，将5 μL的待测液体滴于样品表面，待液滴稳定时，拍取液滴图片，采用DSA 1.8软件进行接触角分析。 2.3.4. NO催化释放 采用Griess方法检测不同多酚化合物与胱胺聚合涂层在60分钟内的NO催化释放速率。将样品浸没于由0.5 mL的Griess(4 mM)与等体积供体(20 μM SNAP/GSH， 1 mM EDTA)组成的混合溶液中。在预期设定的反应时间内取出样品以终止催化反应。取每个时间点NO催化反应的反应液200 μL加入96孔板中，静止15分钟后用酶标仪于496 nm波长下读取吸光度值。同时，选取合适浓度梯度的供体来绘制标准曲线，其中选用HgCl 2 作为催化剂。具体实验步骤如下：将梯度稀释的97.5 μL供体与等体积Griess混合加入96孔板中，然后加入5 μL的HgCl 2 进行催化反应(HgCl 2 的催化供体产生NO速度极快，故此用做标准曲线的制定)，反应结束后静止15分钟，然后置于酶标仪中于496 nm波长下读取吸光度值。标准曲线所拟合的方程用于NO催化速率的计算。 2.4. 生物相容性评价 2.4.1. NO催化涂层对血小板和HUASMCs的影响 新鲜血液由成都血液中心提供。志愿者在献血前两周未服用阿司匹林药物。将采集的血液与柠檬酸钠抗凝剂以体积比9:1混合，12小时内开展血液实验评价。全血以1500转离心15分钟获得富血小板血浆(PRP)。血小板粘附具体实验步骤如下：每1 mL PRP中加入10 μL由S-亚硝基乙酰青霉胺(SNAP，10 μM)和谷胱甘肽(GSH、10 μM)组成的供体。此外，每1 mL的PRP中加入10 μL胶原溶液(50 μg/mL)用于诱导血小板激活以模仿支架在体内撑开时损伤血管的环境。每个样品中加入500 μL的PRP并于37℃条件下孵化30 min。随后样品用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗以去除未牢固粘附的血小板，随后样品浸泡在4%戊二醛中过夜固定。固定后，样品逐级脱水/脱醇和临界点干燥。最后，样品喷金于SEM下观察拍照。 HUASMCs生长行为评价选用额外添加供体(10 μM SNAP/GSH)和无供体的培养基进行细胞培养。细胞培养时间分别为2小时和24小时。罗丹明荧光染色法用于细胞形态表征，细胞增殖检测试剂盒CCK-8用于细胞增殖评价。荧光染色法用于细胞形态分析，选取密度为5 × 10 4 cells/cm 2 的HUASMCs用于材料表面接种。使用鼠抗人α-SMA抗体对材料表面粘附的HUASMCs进行免疫荧光染色。具体步骤如下：将置于含HUASMCs的培养基中的样品在分别培养1天和3天后取出，用PBS充分清洗，并于4%多聚甲醛溶液中固定细胞1小时。染色前，吸去多聚甲醛固定液，将样品用PBS清洗3次。随后，加入牛血清白蛋白(BSA， 1%)封闭30分钟，随即用PBS充分漂洗。尔后，再加入鼠抗人α-SMA抗体(1:100)，并于37℃下孵育30分钟。样品孵育后用PBS清洗，随即再加入FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白，于37℃下孵育30分钟。最终，经PBS充分清洗后用荧光显微镜进行拍照观察。 使用CCK-8试剂盒检测样品表面HUASMCs的增殖行为，材料表面HUASMCs的接种密度为5 × 10 4 cells/cm 2 。细胞培养1天和3天后取出样品，用PBS清洗两次，随后每个样品中分别加入350 μL含有10% CCK-8试剂的DMEM-F12培养基(含5% FBS，无酚红)。标准培养条件37℃下孵育3小时后，从每个样品中吸取200 µL培养基至96孔板，置于酶标仪中于450 nm处读取吸光度值。细胞在样品表面培养时间设定为2小时和24小时 采用环磷酸鸟苷cGMP ELISA试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司，中国)定量检测血小板合成的cGMP浓度。首先，将样品浸泡于PRP中孵化，其实验步骤与血小板粘附类似。孵化30分钟后，加入100 μL 10% triton-X超声破碎。接着将破碎后的PRP混合液在2500转下离心，分离细胞碎片，吸取上清液用于cGMP检测，其中cGMP检测过程参考试剂盒说明。采用cGMP ELISA试剂盒定量检测HUASMCs合成的cGMP浓度。其中，HUASMCs培养时间为2小时。实验方法与血小板合成的cGMP浓度检测类似。 2.4.2. NO催化涂层对HUVECs的影响 为了评价HUVECs的生长行为，同样使用添加供体(10 μM SNAP/GSH)和无供体的培养基作为对照。实验方法与HUASMCs类似。 2.4.3. NO催化涂层对SMCs与ECs共培养的影响 HUVECs与HUASMCs共培养用于评价细胞间竞争粘附行为。HUVECs和HUASMCs分别在含有5 mM Cell Tracker Green CMFDA和5 mM Orange CMTMRECs的DMEM/F12培养基(含15%胎牛血清FBS)中孵育20分钟；经PBS清洗过后，用无染料的DMEM/F12培养基继续孵育30分钟。随后，采用0.25%的胰酶分别对荧光标记的HUVECs与HUASMCs进行消化，收集细胞悬液并于1200 rpm离心5分钟；DMEM/F12完全培养基重悬细胞，并分别调整细胞密度至5 × 10 4 cells/mL。最后HUVECs与HUASMCs以1:1的种植密度接种到样品表面，于5% CO 2 ，37℃条件下分别培养2小时和24小时后采用荧光显微镜观察材料表面粘附的细胞并对粘附的细胞进行数量统计分析。