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user: 3. 结果与分析 3.1. 形态学标记的变异和聚类分析 3.1.1. 种质资源的形态学指标变异分析 14份大顶苦瓜种质的33个形态学性状的多样性分析见表2。从表2可以看出，所有形态学指标中叶形的变异系数最大，其次是种皮色。结瓜习性、叶色、瓜形、单瓜重、单瓜种子数、商品瓜纵径的变异系数均大于25%。而叶裂刻、性型、瓜面光泽等6个指标的变异系数为0。 Table 2 Diversity analysis of 14 bitter gourd germplasm 形态特征 Morphological character 均值 Average 最大值 Maximum 最小值 Minimum 标准差 Standard deviation 变异系数(%) Coefficient of variation 主蔓色Main vines 3.53 4.00 3.00 0.52 14.62 蔓长(m) Vine length 3.15 4.18 2.05 0.60 19.11 主蔓粗(cm) Main vine diameter 1.19 1.75 0.89 0.25 21.01 节间长(cm) Internode length 6.79 8.75 3.82 1.58 23.31 叶形Leaf shape 1.93 3.00 1.00 0.80 41.32 叶色Leaf color 3.06 4.00 1.00 0.88 28.82 叶缘Leaf margin 2.20 3.00 2.00 0.41 18.81 叶裂刻Leaf crack 2.93 3.00 2.00 0.26 8.80 裂片数Lobes count 7.00 7.00 7.00 0.00 0.00 叶片长(cm) Leaf length 11.63 14.70 10.20 1.26 10.86 叶片宽(cm) Leaf width 17.56 21.50 14.80 1.64 9.33 叶柄长(cm) Petiole length 8.64 10.50 6.50 0.93 10.74 第一雌花节位(节) First Female Flower Node 13.37 16.50 7.00 2.62 19.60 性型Sexual type 5 5 5 0 0 花柄遁形苞叶Hide subtending leaf of flower stalk 1 1 1 0 0 结瓜习性Melon habit 2.47 3.00 1.00 0.92 37.11 瓜形Melon shape 4.20 6.00 3.00 1.08 25.77 商品瓜皮色commercial melon skin color 5.47 6.00 5.00 0.52 9.44 瓜瘤类型Melon tumor type 3.60 4.00 2.00 0.83 23.00 棱瘤稀密Melon tumor density 3.40 4.00 3.00 0.51 14.91 瓜瘤大小Melon tumor size 3.47 4 3 0.52 14.89 瓜面光泽Melon surface gloss 1 1 1 0 0 近瓜蒂端面形状End face shape of proximal melon pedicel 1 1 1 0 0 瓜顶形状Melon top shape 2.29 3.00 2.00 0.47 20.51 商品瓜纵径(cm) Longitudinal diameter of commercial melon 15.45 26.00 10.50 4.49 29.05 商品瓜横径(cm) Transverse diameter of commercial melon 10.72 14.00 9.30 1.26 11.75 商品瓜肉厚(cm) Melon meat thickness 1.25 1.48 1.00 0.17 13.23 商品瓜肉色Meat color of commercial melon 3.83 4.00 3.00 0.39 10.15 单瓜重(g) Single melon weight 433.39 756.20 278.90 124.01 28.61 商品瓜成熟天数Maturity days of commercial melons 21.64 26 17 2.53 11.69 种瓜皮色Species melon skin color 1 1 1 0 0 单瓜种子数(粒) Number of seeds per melon 33.93 61.00 19.00 9.43 27.78 种皮色Seed coat color 2.27 3.00 1.00 0.88 38.77 表2. 14份大顶苦瓜种质的多样性分析 在所有茎叶性状中，叶形变异系数达到41.32%，种质中心脏形叶片居多，其次是掌形，最少的是近圆形。叶片深裂居多，叶裂数均为7，变异系数为0。从变异系数来看，叶形变异度大，可以作为大顶苦瓜种质鉴定分类的一个主要形态指标，叶色、节间长和主蔓直径等指标的变异系数也较大，也具有一定的参考价值。 在所有花果性状中，结瓜习性的变异系数最大，瓜形、瓜瘤类型和第一雌花节位的变异系数也较大。大顶苦瓜种质一般雌性强、早熟，所以性型的变异系数为0。但第一雌花节位是衡量苦瓜品种熟性的重要指标，跟经济产量密切相关，第一雌花节位低，属早熟类型，节位高，属晚熟类型。这个性状的变异系数19.60%，其中翠鼎苦瓜的第一雌花节位最低，在第7节，翠绿3号和富优1号的第一雌花节位最高，在第16节。 果实的形态特征是苦瓜种质多样性的最重要特征，包括果形、果色、瓜瘤形状大小、瓜瘤的稀密程度、单果重等。其中差异较大的是商品瓜纵径，其变异系数为29.05%，最大值为26 cm，而最小值仅为10.5 cm；其次是商品瓜的重量，变异系数28.61%，最重的是翠娘珍珠，最重达756.2 g，最轻的是国优大顶，重量为278.9 g；商品瓜的瓜棱大小、瓜皮颜色、果肉厚等性状的变异系数都不高，在10%至15%之间。 种子的形态特征同样是苦瓜分类的重要数据，种皮色在不同品种之间差异较大，变异系数为38.77%，单瓜种子数的变异系数为27.78%，金顶2号的单瓜种子数最多，为61粒，翠绿厚肉特优最少仅有19粒。 3.1.2. 基于形态学标记的聚类分析 以14份大顶苦瓜种质的33组形态学标记数据为原始矩阵，进行系统聚类，聚类结果见图1。图1显示，以遗传距离18为阈值，所有苦瓜材料被分为3大组群。组1包括富优1号(9)、翠绿3号(14)、丰秀大顶(10)、国优大顶(11)、玉和(8)和翠鼎大顶(13)。这组种质叶形以掌形居多，品种多为中早熟，种皮以棕色和深棕色居多。 组2包括江门大顶(5)、绿顶1号(7)、翠绿厚肉(1)、金菠萝(4)、金科3号(12)、金顶2号(2)和翠绿厚肉特优(6)，本组都属于早熟种，雌花多，座果力强，叶形多为心脏形和圆形，种皮以黑色居多。 组3只有翠娘珍珠(3) 1个种质，主蔓结瓜，瓜形较长呈长纺锤形，皮绿色，珠瘤肥大，钝尖，肉厚，成熟天数大约23 d，单瓜瓜重平均可达756.2 g，种皮深棕色。与其它3组的亲缘关系较远，可能还与其产自甘肃、地理区域跨度大有关，而其它种质都产自广东或接近广东。 图1. 基于形态学标记的14个大顶苦瓜种质的聚类分析 3.2. 基于分子标记的的种质多样性和聚类分析 3.2.1. SSR和SRAP分子标记反应体系及引物 图2是部分大顶苦瓜种质的DNA提取和分子标记体系扩增结果。从图2(a)可知，提取的大顶苦瓜基因组DNA完整度高，杂质污染少，可以满足SSR与SRAP分子标记中PCR反应的需要。选择扩增结果清晰、条带数量多、多态性丰富的20对SSR多态性引物和25对SRAP多态性引物，以用于种质资源的遗传多样性分析(图2(b)，图2(c))，引物多态性分析结果见表3。表3中，20对SSR引物平均扩增出4.5条清晰条带，所有条带的分子量主要分布在200~1000 bp之间。多态性条带58条，引物组合的多态性比率介于40%~100%之间，平均64.4%。N6F + N6R组合的扩增条带最多(图2(b))，其次是S13F/S13R、S33F/S33R、N9F/N9R、N5F/N5R、S15F/S15R、N1F/N1R等。25对SRAP引物平均扩增条带数18.1条，片段大小介于100~2000 bp之间。扩增总共获得452个条带，其中多态性位点282个，平均多态性比率为62.5%。这说明两种标记扩增时所用引物的多态性比率差异不大。 图2. 大顶苦瓜SSR和SRAP PCR扩增体系。(a) 大顶苦瓜供试种质的基因组DNA电泳图；(b) SSR扩增体系和筛选引物后的扩增结果，所用引物合为N6F + N6R；(c) SRAP扩增体系和筛选引物后的扩增结果，所用引物组合为Me8 + Em4 Table 3 Polymorphism of SSR and SRAP marker primer 引物序号Primer Number 引物组合Primer pair 总条带数 Quantity of total bands 多态性带数Quantity of polymorphic bands 多态性比率(%) Percentage of polymorphic bands 引物序号Primer Number 引物 Primer pair 总条带数 Quantity of total bands 多态性条带数 Quantity of polymorphic bands 多态性比率(%) Percentage of polymorphic bands SRAP SSR 1 Me2 + Em11 18 10 55.6 1 N1F/N1R 6 6 100.0 2 Me3 + Em8 24 7 29.2 2 N5F/N5R 8 6 75.0 3 Me5 + Em12 21 15 71.4 3 N6F/N6R 21 9 42.8 4 Me1 + Em17 13 6 46.2 4 N9F/N9R 10 4 40.0 5 Me8 + Em16 27 8 29.2 5 N12F/N12R 4 2 50.0 6 Me1 + Em13 16 9 56.3 6 S9F/S9R 1 1 100.0 7 Me5 + Em1 12 3 63.6 7 S13F/S13R 11 8 72.7 8 Me8 + Em12 22 13 59.1 8 S15F/S15R 6 3 50.0 9 Me9 + Em10 10 4 40.0 9 S20F/S20R 1 1 100.0 10 Me1 + Em7 11 7 63.6 10 S24F/S24R 2 2 100.0 11 Me1 + Em10 14 12 85.7 11 S26F/S26R 1 1 100.0 12 Me6 + Em15 17 14 82.4 12 S32F/S32R 2 2 100.0 13 Me8 + Em4 20 15 75.0 13 S33F/S33R 10 6 60.0 14 Me9 + Em8 21 18 85.7 14 A2F/A2R 1 1 100.0 15 Me9 + Em9 15 12 80.0 15 A47F/A47R 1 1 100.0 16 Me9 + Em11 17 10 58.8 16 C4F/C4R 1 1 100.0 17 Me9 + Em14 27 14 51.9 17 C9F/C9R 1 1 100.0 18 Me9 + Em16 19 12 63.2 18 C11F/C11R 1 1 100.0 19 Me5 + Em13 24 20 83.3 19 C17F/C17R 1 1 100.0 20 Me1 + Em1 20 17 85.0 20 C24F/C24R 1 1 100.0 21 Me1 + Em8 23 11 47.8 — — — — — 22 Me5 + Em17 13 7 53.9 — — — — — 23 Me5 + Em3 11 7 63.6 — — — — — 24 Me5 + Em8 16 15 93.8 — — — — — 25 Me5 + Em14 21 16 76.2 — — — — — 总计Total 452 282 — 总计Total 90 58 — 平均Average 18.1 11.3 62.5 平均Average 4.5 2.9 84.5 表3. SSR和SRAP分子标记引物的多态性 3.2.2. 基于SSR标记的聚类分析 基于SSR标记的14份大顶苦瓜种质的聚类分析结果见图3。由图3可以看出，14份供试大顶苦瓜种质的遗传相似度比较大，翠绿厚肉和富优1号的亲缘关系最远，其次是丰秀大顶和富优1号，金菠萝和江门大顶的遗传相似系数0.900，亲缘关系最近。绿顶1号和江门大顶次之。在遗传相似系数0.64处，供试14份大顶苦瓜材料可划分为4大类群。 第1大类群包含翠绿厚肉、丰秀大顶、翠娘珍珠、玉和和翠绿3号。这一类苦瓜为早熟或中早熟，组中5个种质除玉和外，瓜顶形状多为钝尖，瓜型圆锥形，种皮多为棕色和深棕色，珠瘤肥大，肉厚。在遗传相似系数0.71处，又可分为两个亚类，翠绿厚肉和丰秀聚为第I亚类，相似系数为0.789；第II亚类有翠娘珍珠、玉和和翠绿3号，而翠绿3号又与其它两个种质的亲缘关系较远。 第2大类群包含金菠萝、江门大顶、绿顶1号、金顶2号和翠绿厚肉特优5个种质，其中金菠萝和江门大顶遗传相似系数高达0.9，两个种质的雌性、瓜型、瓜皮色泽和珠瘤性状相似度甚高。此组5个种质早熟，叶形为近圆形和心脏形，瓜形多呈短纺锤型；座果力强，瓜瘤粗直，聚类可能与雌性、瓜形、瓜瘤、叶形等性状相关。 第3大类群包含金科3号、国优大顶和翠鼎大顶。国优大顶和翠鼎大顶在相似性系数0.822处聚为一类，两个种质叶缘波状，瓜顶近圆，棱瘤密，瓜短圆锥，种皮黑色，早熟。金科3号与其它两个品种的相似性系数都为0.667；此组种质雌性较强，叶形掌形多，瘤条粗直，肉厚。聚类可能与叶形、瓜形、瓜瘤和种皮色等性状相关。 图3. 14份大顶苦瓜种质的SSR聚类分析 富优1号独立成为第4类，此种质第一雌花节位高达16.5节，雌性最低，瓜顶钝尖，瓜形为短圆锥，种皮深棕。叶形为掌形。单独分类与第一雌花节位高低关系密切。 3.2.3. 基于SRAP标记的聚类分析 基于SRAP标记的14份大顶苦瓜种质的聚类分析结果见图4。由图4可以看出，基于SRAP标记分析的所有种质的遗传相似系数跨度较大，翠绿厚肉与富优1号的亲缘关系最远，丰秀大顶和翠绿3号的亲缘关系最近。在遗传相似系数约为0.66时，可将14份大顶苦瓜材料分为4大类群。 图4. 14份大顶苦瓜种质的SRAP聚类分析 第1大类群包括翠绿厚肉、翠娘珍珠、玉和、丰秀大顶和翠绿3号大顶苦瓜，此组分类结果与SSR标记的分类相同。不同的是丰秀大顶和翠绿3号两个种质高度聚合。 第2大类群包括金顶2号、翠绿厚肉特优、绿顶1号、金菠萝、江门大顶、金科3号，与SSR标记聚类相比，这组多了金科3号，绿顶1号、金顶2号、翠绿厚肉特优3个种质又可以聚为一个亚类，金菠萝、金科3号和江门大顶3个种质聚为1个亚类，组内每个种质的遗传相似度与SSR标记的聚类结果差异较大。从聚类结果来看，与第一雌花节位、瓜形、瓜瘤、叶形等性状相关度极高。 第3大类群则包括国优大顶苦瓜、翠鼎大顶苦瓜，在相似系数约为0.79时单独归为一个类群。这个聚类结果与SSR标记相同。 第4大类群仅有富优1号，这与SSR标记完全相同。 3.2.4. 基于SSR和SRAP两种标记的综合聚类分析 综合SSR和SRAP 两种标记所有数据，我们对14份大顶苦瓜种质再次进行了聚类分析，结果见图5。从图5可以看出，在遗传相似系数约为0.70处，可将14份大顶苦瓜材料分为4大类群，每组中的种质分类结果跟SSR标记的分类结果一致性非常高。不同的是，综合分类结果中第1大类群的翠娘珍珠和翠绿3号的亲缘关系最近，第2大类群中翠绿厚肉特优和绿顶1号的亲缘关系最近。两个聚类结果中，金菠萝和江门大顶都直接聚类，与SRAP不同。 图5. 基于SSR和SRAP标记的14份大顶苦瓜种质的聚类分析