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user: 3. 结果与分析 3.1. 单因素实验结果及分析 3.1.1. 溶液pH值对胶原蛋白提取率的影响 溶液pH值对胶原蛋白提取率的影响见图1。由图1可知，胶原蛋白的提取率在pH 2.1时达到最大，在pH < 2.1时，胶原蛋白提取率随着乳酸溶液pH值的增大而提高。当pH > 2.1时，提取率开始下降，再继续增大溶液的pH值，胶原蛋白的提取率趋于平稳。因此，当乳酸溶液pH为2.1时，胶原蛋白提取效果最好。 3.1.2. 液固比对胶原蛋白提取率的影响 液固比对胶原蛋白提取率的影响见图2。从图中可以看出，在液固比小于60(mL/g)时，胶原蛋白的提取率随着液固比的增大而增大，当液固比高于60(mL/g)时，胶原蛋白提取率略微下降之后又趋于平稳，故选择液固比为60(mL/g)较为合适。 图1. 不同pH值对胶原蛋白提取率的影响 图2. 液固比对胶原蛋白提取率的影响 3.1.3. 提取时间对胶原蛋白提取率的影响 提取时间对胶原蛋白提取率的影响见图3。从图中可以看出，随着提取时间的延长，胶原蛋白提取率逐渐增加，36 h后胶原蛋白提取率虽仍有一定程度的提高，但上升幅度明显减缓。另外，在60 h后提取率有轻微的降低，这可能是因为有小部分胶原蛋白降解。因此从经济和实际生产上考虑，确定提取时间为36 h。 3.2. 胶原蛋白最佳提取工艺条件的确定 3.2.1. 回归模型的建立及方差分析 罗非鱼皮胶原蛋白提取工艺响应面优化的具体试验方案及试验结果见表2。 图3. 不同提取时间对胶原蛋白提取率的影响 Table 2 Response surface experimental design and corresponding result 试验号 变量的编码水平 响应值(Y) X 1 (pH) X 2 (液固比) X 3 (时间) 实际值/% 预测值/% 1 1 0 −1 62.25 60.93 2 −1 0 −1 60.05 60.72 3 1 0 1 74.54 73.88 4 −1 1 0 75.23 72.89 5 −1 0 1 71.88 73.20 6 0 −1 −1 68.06 67.04 7 0 0 0 84.91 83.52 8 0 1 −1 70.34 72.01 9 −1 −1 0 64.67 65.02 10 0 0 0 83.13 83.52 11 0 0 0 84.24 83.52 12 1 −1 0 65.41 67.75 13 1 1 0 71.42 71.07 14 0 0 0 82.71 83.52 15 0 1 1 84.33 85.35 16 0 −1 1 80.80 79.13 17 0 0 0 82.61 83.52 表2. 罗非鱼皮胶原蛋白提取工艺响应面试验方案及试验结果 将表2中响应值与各因素通过Design-expert V8.0.6.1 数据分析软件进行回归拟合后得到二次多项回归方程： ，其中Y表示胶原蛋白提取率；X 1 、X 2 、X 3 分别为乳酸溶液pH值、液固比和提取时间的编码值。 由表3可知，模型得决定性系数R2 = 0.9765较大，回归方程拟合度很好；模型的变异系数CV = 2.65%，可看出实验稳定性较好；失拟P = 0.0399 < 0.05，证明模型失拟不显著；模型P < 0.0001，表明回归模型极其显著。综上所述，各因素与响应值之间的关系可通过回归方程得到较好地描述，因此可以利用该模型来确定胶原蛋白提取的最佳工艺条件。回归方程系数的显著性分析结果表明，模型的一次项回归系数X 2 和X 3 极显著；二次项回归系数X 1 (乳酸溶液pH)和X 3 (提取时间)极显著，X 2 的二次项回归系数较显著；其他项的影响不显著。由此可以看出各因素对于罗非鱼皮胶原蛋白提取率的影响并不是简单的线性关系。剔除回归方程中的不显著项，简化后的方程为： Y=83.52 + 2.80X2 + 6.36X3 − 11.52X12 − 2.82X22 − 4.82X32 3.2.2. 胶原蛋白提取工艺的响应面分析及优化 图4为通过模型方程所做的三维响应面图，曲线越陡峭，表明该因素对胶原蛋白提取率的影响越大 [ 13 ] 。从图4可以看出，提取时间的延长，可以一定程度提高胶原蛋白的提取率；但随着液固比的增大或乳酸溶液pH值的升高，胶原蛋白提取率呈现先增大后减小，之后又趋于平稳的趋势。 3.2.3 胶原蛋白最佳提取工艺条件的确定及验证试验 利用Design-expert V8.0.6.1软件分析得到胶原蛋白的最佳提取条件为乳酸溶液pH 2.1、液固比65.4、提取时间44.16 h，此条件下胶原蛋白提取率的理论值为86.42%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，对乳酸提取罗非鱼皮胶原蛋白的优化条件进行验证。考虑到实际生产与操作因素，将上述优化提取条件修正为乳酸溶液pH 2.1、液固比65、提取时间44 h，此条件下胶原蛋白提取率为85.57%，实验值与理论 Table 3 Test for significance and analysis of variance (ANOVA) of regression coefficient 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 X1 0.40 1 0.40 0.10 0.7578 X2 62.61 1 62.61 16.07 0.0051 ** X3 323.22 1 323.22 82.96 <0.0001 ** X1X2 5.18 1 5.18 1.33 0.2869 X1X3 0.053 1 0.053 0.014 0.9105 X2X3 0.39 1 0.39 0.10 0.7607 X12 558.78 1 558.78 143.43 <0.0001 ** X22 33.42 1 33.42 8.58 0.0221 * X32 97.82 1 97.82 25.11 0.0015 ** 模型 1133.72 9 125.97 32.33 <0.0001 ** 残差 27.27 7 3.90 失拟 23.18 3 7.73 3.41 0.0399 纯误差 4.09 4 1.02 总和 1160.99 16 表3. 回归方程各项系数的显著性检验及方差分析 注：R2 = 0.9765，R2：预测模型的决定系数； * 显著，P<0.05； ** 极显著，P<0.01。 图4. 两两因素交互作用对胶原蛋白提取率影响的响应面和等高线图 值的相对误差为0.99%，证明该模型得到的胶原蛋白提取工艺参数可行。 3.3. 胶原蛋白理化性质的测定 3.3.1. 胶原蛋白的SDS-PAGE电泳结果 胶原蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图5。胶原蛋白呈三股螺旋结构，每个胶原分子以3条α肽链缠绕成三股螺旋，其中每股链自身是一种左手螺旋 [ 14 ] 。从图中可以看出，酸法提取的胶原蛋白在相对分子量125 kDa左右出现2条条带，且两条带宽度不同，说明罗非鱼皮胶原蛋白是由两条α1链和一条α2链组成，类似于哺乳动物的I型胶原蛋白 [ 15 ] ；在200 kDa附近出现β链，说明胶原蛋白分子中存在分子内和分子间的交联作用 [ 16 ] 。 3.3.2. 胶原蛋白的热变性温度(Td)测定 胶原蛋白的热稳定性是由其在溶液中分子的热变性温度(Td)所表达的，同时Td也表示了胶原蛋白三螺旋结构被破坏时的温度。图6为罗非鱼皮ASC的热变性曲线。由图可知，ASC的热变性温度为32.56℃。可以看到，在最初升温阶段，ASC的黏度有明显的降低，随着温度的升高，ASC的黏度迅速降低，蛋白质分子受热迅速解螺旋并发生断裂，之后又趋于平稳。 3.3.3. 胶原蛋白的微观结构 图7为罗非鱼皮ASC在放大1000倍下的扫描电镜图。从图中可以看出乳酸提取的鱼皮胶原蛋白在放大1000倍的情况下，呈现纤维结构且分布比较均匀。有研究表明胶原蛋白的微观结构(包括折叠和薄 图5. 罗非鱼皮胶原蛋白的SDS-PAGE电泳谱图(M. marker; 1.ASC) 图6. 罗非鱼皮胶原蛋白热变性曲线 图7. 罗非鱼皮胶原蛋白的扫描电镜图 片大小、胶原网络连接性和表面积大小)是其作为生物医学材料的重要参数 [ 17 ] 。从乳酸提取的胶原蛋白的扫描电镜图来看，乳酸提取的胶原蛋白能较好的保持胶原纤维原有的纤维结构以及空间网状结构，比较适合作为生物医学材料的基料。