system: [SYSTEM]

user: 2. 材料与方法 2.1. 菌种 2.1.1. 来源 本篇报告所用虎乳灵芝菌丝体取自马来西亚虎乳灵芝朵菌种分离纯化，并以ITS-1引子进行菌珠DNA序列分析(表1)，经由NCBI 之BLAST Search 比对证实所纯化获得之菌种与虎乳灵芝序列具有99%相似度。序列比对结果如下：ITS1 Lr-230 bp (定序公司：明欣生物科技有限公司) GGGTTGTAGCTGGCTTTCTCCGGGAGGCATGTGCACGCCCTGCTCAATCCACACTCTTACACCTGTGCACTCACTGTGGGTTTTCAGCCGGCGTTTGCATCCGTGCGGCGTTGACTGTGGGCCTGCGTTATCCACTACAAACCACACTGTCAGTATCAGAATGTTCATACGTTTGCGATGTTCAAACGCATAATTACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCAT Table 1 Sequence analysis (ITS-1 Sample Query coverage MAX identity Gaps Lignosus rhinocerus 100% 229/230 (99%) 1/230 (0%) 表1. ITS-1序列鉴定结果 [ 9 ] 2.1.2. 液态发酵菌丝体发酵条件 切取虎乳灵芝菌丝体琼脂平板约1 cm3之小方块接种至2 L之三角摇瓶(内含2% 葡萄糖、0.6%酵母抽出物、0.03% MgSO4，并将溶液调整至pH 5)，并于25℃、转速120 rpm 之条件下震荡培养7天，而后逐步由摇瓶接种至500 L以及20 ton大型发酵槽。经10天的培养后，加热所得之菌丝体发酵液再经过浓缩冻干以及磨粉等程序，即可进一步分析或萃取。 2.2. 样品制备与分析方法 虎乳灵芝菌丝体萃取物之制备 将虎乳灵芝菌丝体冻干粉末与纯水依重量比1:20之比例混合，超音波震荡1小时后将去除沉淀物之上清液进行冷冻干燥即得水萃取物。另将虎乳灵芝菌丝体冻干粉末用乙醇以重量比1:20之比例混浸泡震荡萃取1小时，连续萃取三次，过滤后的萃取液经减压浓缩即为酒萃取物。接着将酒萃取物依序与正己烷、乙酸乙酯及正丁醇溶剂进行三次十倍比例之分配分离萃取(Partition)，即可得正己烷层(LrHex)、乙酸乙酯层(LrEA)、正丁醇层(LrBtOH)及水层(LrH2O)共四个分层，可分别进行活性测试。 2.3. 病毒株 2.3.1. 来源 A型流感病毒A/WSN/33 (H1N1)，由中央研究院基因体研究中心詹家琮博士所提供，在1993年分离之病毒株。 2.3.2. 培养及增幅 (Virus amplify) 将100 μL (约100 TCID50) A型流感病毒(H1N1)液注射入SPF (Specific pathogen free)鸡胚蛋的尿囊膜后以蜡封住洞口进行繁殖，放在培养箱中培养1至2天，再放入4℃等待凝结，再将尿囊膜中液体抽出，置于−80℃保存。 2.4. 细胞株 2.4.1. 来源 MDCK (Madin-Darby Canine Kidney cells)：犬肾上皮细胞，细胞株编号为BCRC 60004。购自食品工业研究所之生物资源中心(Bioresource Collection and Research Center， BCRC)。 2.4.2. 细胞保存 细胞经计数后，将其浓度调整为1 × 106细胞/mL，添加培养液与最适培养浓度之FBS，并加入10% DMSO作为抗冻剂，再注入冻管中。将冻管放入注满异丙醇(isopropanol)之渐冻盒，再置于−80℃隔夜后转存放于液态氮中保存。 2.4.3. 细胞活化 首先于细胞培养皿中加入9 mL DMEM及1 mL FBS备用，再将保存于−80℃冻藏柜或是液态氮中的细胞株在37℃水浴槽中回温至稍有残冰，尔后吸出细胞液至先前准备好的培养液中，置于37℃及5% CO2之培养箱中培养。 2.4.4. 细胞培养及继代(Cell culture and passage) 当细胞长到八分满的时进行继代培养，首先吸除旧有细胞培养液，用磷酸缓冲生理食盐水PBS洗去残留的血清及代谢物，加入1 mL胰蛋白酶typsin-EDTA后，置于37℃下作用3~5分钟，轻拍细胞盘侧促使贴附于盘底之细胞脱落，镜检确认细胞被切下后，以0.5 mL胎牛血清FBS 中止胰蛋白酶的作用，以DMEM medium冲下细胞并收集于50 mL离心管中进行离心(条件设定为500 xg，5分钟，4℃)，而后吸除上清液，再以DMEM medium回溶沉淀之细胞并进行计数，将细胞浓度调整为3 × 105细胞/盘，最后种于细胞培养皿，并加入含有10% FBS之DMEM medium共10 mL，培养于37℃及5% CO2之培养箱。 2.5. 细胞存活率试验(Cell viability assay) 将1 × 104细胞/孔的MDCK种在96孔盘中，置于含有37℃与5% CO 2 培养箱中培养24小时后，再分别加入不同浓度之虎乳灵芝萃取物作用48小时，利用MTS assay测其细胞存活率。培养液与MTS reagent添加的比例为5:1，将MTS reagent加入细胞液后，于培养箱中避光反应1小时，再使用ELISA reader在490 nm测量其吸光值进行计算。 2.6. 虎乳灵芝菌丝体萃取物对于H1N1病毒感染之影响 先将虎乳灵芝水萃物和酒萃物分别以PBS以及DMSO溶解至适当浓度，将MDCK培养至96孔盘内，隔夜培养待细胞贴附后，于不同感染时间点以MTS assay测定虎乳灵芝萃取物对H1N1感染MDCK存活率之影响。 2.6.1. 预处理试验(Pre-treatment) 先于细胞中加入不同浓度虎乳灵芝萃取液于培养箱中作用1 小时，吸除培养液，再加入moi = 0.05 (病毒感染剂量Multiplicity of infection， MOI)之H1N1溶液，置于培养箱作用1小时，再移除培养液并加入含2% FBS之新鲜DMEM 培养液，继续于5% CO 2 、37℃下培养48小时，最后以MTS assay测其细胞存活率。 2.6.2. 共处理试验(Co-treatment) 将不同浓度之虎乳灵芝萃取液与moi = 0.05之H1N1先混合共培养1小时后，将各浓度混和液分别加入细胞中，于培养箱作用1小时，再移除原培养液，并随即加入含2% FBS之新鲜DMEM培养液，于5% CO 2 、37℃下培养48小时，最后以MTS assay测其细胞存活率。 2.6.3. 后处理试验(Post-treatment) 于细胞中加入moi = 0.05 之H1N1 并放入培养箱中作用1小时后，吸除培养液，再分别加入不同浓度之虎乳灵芝萃取液于培养箱中作用1小时，然后移除原培养液并加入含2% FBS之新鲜DMEM培养液，于5% CO 2 、37℃培养箱培养48小时，最后以MTS assay测其细胞存活率。 2.6.4. 数据分析方法 采用MTS assay 测定细胞存活率。 MTS [3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-fulfophenyl)-2H-tetrazolium， inner salt]为tetrazolium salt的黄色物质，原理为活细胞内粒线体会产生NADPH能将tetrazolium salt还原成褐色的formazan，而细胞存活率与formazan的产生量呈正比。再利用波长490 nm测定吸光值即可推算出细胞存活率。