system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与分析 3.1. 蔷薇科果树SOT基因的筛选与鉴定 以MdSOT1、MdSOT2、MdSOT3、MdSOT4和MdSOT5蛋白序列为模板分别在各蔷薇科果树基因组数据库进行Blastp，获得同源序列共81个：梨26个、苹果23个、桃12个、草莓4个、梅12个、黑树莓4个。通过Pfam数据库分析所有候选基因保守结构域，移除与AtPLT家族基因保守结构域Sugar_tr(PF00083.22)不一致的序列，并在NCBI保守结构数据库CCD中进一步验证其保守结构域，将获得的拟南芥蛋白序列分别与各物种同源序列利用软件MEGA7.0构建系统进化树进行聚类分析，与苹果已经报道的5个MdSOT基因聚为一类的为候选基因。并通过在线软件MEME进一步分析目的基因蛋白序列保守motif，最终获得六个蔷薇科果树物种SOT基因62个：梨24个，苹果17个，桃9个，草莓2个，梅9个，黑树莓2个见表2。 Table 1 Forward (F) and reverse (R) primers of PbSOT for qRT-PC 基因 Name 登陆号 ID 正向引物 Forward sequence (5’→3’) 反向引物 Reverse sequence (5’→3’) 产物 (bp) Tm值 PbSOT1/2 Pbr037512.1/ Pbr018464.1 GGGATAACCAACTCCGACCACA CGGCAACACTAGATAGAAGCAACG 109 65 PbSOT3 Pbr038549.1 GCATGGTTGTTCTTCTATACGATGCTTCCG CATGCCACTCTTATTATTGCCATCACCACCA 136 65 PbSOT4 Pbr038546.1 GTGAAGACAACAAGGGTCAAATCCACTAGG TTCCGCACAAGTTATTCCAACTTGAAAAAG 166 65 PbSOT5 Pbr018903.1 CAAGGCCATCACGATCGGTGGTGC GCACTTTGGCTTTTCTCAGCAGCTTCC 174 65 PbSOT6 Pbr018463.1 GGCTGACCGGACAACTAACGATAATACAG CCCAGCAAGATTGAAGTCATCGAAGCC 117 65 PbSOT7/8 Pbr018910.1/ Pbr018908.1 AGCTAAGCAAGCTGATGGCGACG ATCAGGAAACCACCATCCATCATCAAGTGC 112 65 PbSOT9 Pbr037515.1 GGTAAATATTTCAGGTGGAGAACAGCCAATGC CAACGGAGCTTCCGATAGTTCATTCG 198 65 PbSOT10 Pbr038547.1 CTCAGGAATTTCTGCTGCCGCTTGG CAACTGACGTACCCGATACTTCATTCGAC 266 65 PbSOT11 Pbr034137.1 GCTGATCAGAGATCAAGACATAACGTCGTCTC CATAACCCAGTCAGATAGATGTCATCGAAGC 117 65 PbSOT12 Pbr022830.1 TATCAGGTATAGACTCTGTGGTGTCGTACAGC ACCGTAAGACCCACACCAAGCAGTATAAAG 199 65 PbSOT13 Pbr040466.1 TGTAGTAGAAGTGATTGGTCTGTGTTGTGAC GCCTATATTTACTAGAGAGATGCGGCAGAG 219 65 PbSOT14 Pbr018906.1 CAGGAGTCACTTCTCACAATGACAAGCTAC TGGGGATTGATCAACGACAGTAAGACCC 168 65 PbSOT16 Pbr034138.1 GCTTATGTCAGATCTATGTACAGATATTGGTG AAACATGAGGAAGGCGTAGTTCGGG 234 65 PbSOT19/21 Pbr018465.1/ Pbr037514.1 CTGTTGGTTGGATCTTCTTGTTCACAATGCTC GCTAAGAGGTTCACCCTGTTGTCCGG 161 65 PbSOT20 Pbr037511.1 GCCGCCGTTTTGTGCATTAC GACCCCACTCACCACCCTGTT 141 65 PbSOT22 Pbr038548.1 TATGTCGGGTTCTTCTCAATTGGGATTGGGC CCAACAATGCCGATGGCCGCATAAAG 186 65 PbSOT23 Pbr019075.1 CATTGCCATGTATGGGGGTAGCCG GTCTTGTTAAGCATGGCATTGGCTTCTCTC 216 65 PbSOT24 Pbrtublin Pbr018904.1 AB239681 CGGTGTGGCCTTCTTTCTTTACATGGG TGGGCTTTGCTCCTCTTAC GCTTAGTCTTGTTAAGCATGGCATTGGC CCTTCGTGCTCATCTTACC 136 169 65 表1. PbSOT基因家族成员用于qRT-PCR分析的引物序列 Table 2 SOT genes in fruit tree of Rosacea 物种名 Species name 基因名 Gene name 基因ID Gene ID 物种名 Species name 基因名 Gene name 基因ID Gene ID 白梨 PbSOT1 Pbr037512.1 苹果 MdSOT2.7 MDP0000197939 Pyrus bretschneideri PbSOT2 Pbr018464.1 Malus domestica MdSOT2.8 MDP0000311500 PbSOT3 Pbr038549.1 MdSOT2.9 MDP0000595941 PbSOT4 Pbr038546.1 MdSOT3 MDP0000896307 PbSOT5 Pbr018903.1 MdSOT3.2 MDP0000596275 PbSOT6 Pbr018463.1 MdSOT3.3 MDP0000285032 PbSOT7 Pbr018910.1 MdSOT4 MDP0000296050 PbSOT8 Pbr018908.1 MdSOT5 MDP0000841918 PbSOT9 Pbr037515.1 MdSOT5.2 MDP0000940086 PbSOT10 Pbr038547.1 MdSOT5.3 MDP0000787701 PbSOT11 Pbr034137.1 桃 PpSOT1 Prupe.8G100700 PbSOT12 Pbr022830.1 Prunuspersica PpSOT2 Prupe.8G100900 PbSOT13 Pbr040466.1 PpSOT3 Prupe.8G101000 PbSOT14 Pbr018906.1 PpSOT4 Prupe.8G101200 PbSOT15 Pbr019072.1 PpSOT5 Prupe.8G105300 PbSOT16 Pbr034138.1 PpSOT6 Prupe.8G105400 PbSOT17 Pbr034135.1 PpSOT7 Prupe.8G105500 PbSOT18 Pbr019074.1 PpSOT8 Prupe.8G105600 PbSOT19 Pbr018465.1 PpSOT9 Prupe.8G101500 PbSOT20 Pbr037511.1 梅 PmSOT1 Pm021605 PbSOT21 Pbr037514.1 Prunusmume PmSOT2 Pm021606 PbSOT22 Pbr038548.1 PmSOT3 Pm021647 PbSOT23 Pbr019075.1 PmSOT4 Pm021648 PbSOT24 Pbr018904.1 PmSOT5 Pm021649 苹果 MdSOT1 MDP0000755167 PmSOT6 Pm021715 Malus domestica MdSOT2 MDP0000688348 PmSOT7 Pm030070 MdSOT2.2 MDP0000141961 PmSOT8 Pm031233 MdSOT2.3 MDP0000250395 草莓 FvSOT1 gene20355 MdSOT2.4 MDP0000688376 Fragariavesca FvSOT2 gene20372 MdSOT2.5 MDP0000682530 黑树莓 RoSOT1 Bras_G21340 MdSOT2.6 MDP0000276801 Rubusoccidentalis RoSOT2 Bras_G27239 表2. 蔷薇科果树SOT基因 3.2. 蔷薇科果树SOT基因的基本信息 蔷薇科果树SOT基因CDS序列长度在1062 bp (MdSOT1)-2430 bp (MdSOT2.8)之间。其中，苹果MdSOT1 (1062 bp)基因序列最短，MdSOT2 (8591 bp)基因序列最长。SOT基因家族编码的蛋白序列长度为524 aa，相对分子质量在38.5 kda (MdSOT1)~88.326 kda (MdSOT2.8)之间。除了PbSOT19理论等电点(pI) < 7，显酸性，其他SOT基因的理论等点(pI) > 7，显碱性。最大疏水系数在0.251~0.561之间(>0)，为疏水性蛋白见表2。对SOT基因家族蛋白序列进行跨膜结构分析发现，SOT基因均存在10个以上跨膜结构，且在第六和第七个跨膜区间存在一个100 aa大小的亲水loop。 3.3. 蔷薇科果树SOT基因系统进化及结构分析 蔷薇科62个SOT基因家族基本上有一个相似的内含子外显子结构，但内含子和外显子数量以及位置是不一样的。蔷薇科果树SOT基因包含0-5个内含子，大多数SOT基因的内含子数量在1~3之间，除了MdSOT1没有内含子，MdSOT2.8、MdSOT3.3、MdSOT4有4个内含子，MdSOT2、PmSOT7有5个内含子(图1右)。motif分析表明，蔷薇科果树SOT基因的motif数量和分布具有相似性，其中motif 1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、16、17是SOT基因家族比较重要且保守的结构(图1中)。蔷薇科果树SOT基因家族所有成员均含有motif1和motif17，几乎所有SOT基因均motif2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、16。SOT家族成员的在各个亚枝的核苷酸水平和蛋白水平的序列结构差异小，说明SOT是典型的同源进化 [ 24 ] 。 3.4. 共线性分析 蔷薇科果树SOT基因家族中，一共有24对直系同源基因和2对旁系同源基因见表3。直系同源基因对的Ka/Ks的值均小于1，说明纯化选择在SOT基因家族进化过程中起主要作用。其中，FvSOT1-MdSOT5的Ks值比较大，说明FvSOT1和MdSOT5分化早，然而相对其他Ks较大的基因对其Ka/Ks的值比较小，说明从FvSOT1到MdSOT5的进化过程比较保守。 图1. 蔷薇科果树SOT基因进化分析 Table 3 The Ka/Ks analysis of homologous SOT genes in fruit tree of Rosace 同源基因对Homologous genes Ka Ks Ka/Ks P/O 同源基因对 Homologous genes Ka Ks Ka/Ks P/O MdSOT3-PbSOT13 0.025992 0.0678 0.383364 O MdSOT3-PpSOT1 0.155157 0.992621 0.156311 O PmSOT6-PpSOT1 0.017247 0.082737 0.208451 O MdSOT5-PpSOT4 0.137058 1.00549 0.136309 O MdSOT2-PbSOT14 0.02802 0.12346 0.226959 O PmSOT3-RoSOT1 0.115149 1.0113 0.113863 O PmSOT3-PpSOT4 0.136959 0.634743 0.215771 O RoSOT1-PmSOT3 0.115149 1.0113 0.113863 O PmSOT5-PpSOT2 0.138747 0.638019 0.217465 O RoSOT1-PbSOT6 0.113313 1.21325 0.093396 O PbSOT6-PmSOT3 0.088818 0.697867 0.127271 O PpSOT1-RoSOT1 0.187404 1.4701 0.127477 O MdSOT3-PbSOT7 0.122466 0.734647 0.1667 O RoSOT1-PpSOT1 0.187404 1.4701 0.127477 O MdSOT2-PbSOT5 0.105495 0.743119 0.141963 O FvSOT2-PpSOT3 0.177523 2.22591 0.079753 O MdSOT3-PmSOT5 0.149356 0.764935 0.195253 O FvSOT2-PbSOT7 0.167064 3.5304 0.047322 O PbSOT8-PpSOT1 0.122067 0.847723 0.143994 O FvSOT2-MdSOT4 0.188193 3.93078 0.047877 O PbSOT8-PmSOT6 0.10939 0.891309 0.122729 O FvSOT1-MdSOT5 0.099348 4.52976 0.021932 O PbSOT6-PpSOT4 0.138334 0.918762 0.150566 O PbSOT12-PbSOT23 0.04434 0.178281 0.24871 P MdSOT4-PbSOT2 0.174756 0.987376 0.17699 O PbSOT5-PbSOT23 0.132086 0.896826 0.147282 P 表3. 蔷薇科果树SOT基因家族直系和旁系同源基因Ka/Ks值 注：P：旁系同源；O：直系同源Nd: P: Paralogs; O: Ortholog SOT基因进化中比较保守也体现在结构的变异度比较小。PbSOT6-PmSOT3，PbSOT6-PpSOT4和RoSOT1-PbSOT6的Ka/Ks偏小，PbSOT6，PmSOT3，PpSOT4和RoSOT1基因结构上都具有2个内含子和3个外显子的特征，说明在选择压力下，核苷酸序列保持相对一致性，所以PbSOT6，PmSOT3，PpSOT4和RoSOT1在进化过程中比较保守。蔷薇科果树物种SOT基因的Ks值如表3所示，其中一部分同源基因对的Ks值比较大(Ks~2.3~4.6)，说明它们起源于一个更古老的重复事件。 3.5. PbSOTs基因家族基因启动子序列分析 在白梨中，PbSOTs基因对逆境有一定的抵抗作用。为了确定启动子区域与逆境相关的元件，通过在线软件PLantCARE分析PbSOTs基因上游1500 bp序列。PbSOTs基因启动子区除了存在大量的启动子元件CAAT-box和TATA-box外，还丰富存在参与光相应顺式调控元件，例如：ACE、ATCT-motif、Box 4、G-Box、GAG-motif、I-box、Sp1、TCCC-motif、chs-CMA1a、GT1-motif等，并包含大量与逆境相关的元件，包括厌氧相关的元件ARE、真菌诱导元件Box-W1、热激相关元件HSE、干旱诱导元件MBS、低温响应元件LTR、预防和胁迫应答的相应元件TC-richrepeats等。与激素相关的元件，如：MeJA响应元件CGTCA-motif、脱落酸响应元件ABRE、乙烯反应元件ERE、水杨酸响应元件TCA-element、赤霉素应答顺时调控元件 GARE-motif等(图2)。 3.6. 白梨PbSOTs基因组织表达特性 PbSOTs在白梨中存在明显的时空表达特异性。由于PbSOT1和PbSOT2，PbSOT7和PbSOT8以及PbSOT19和PbSOT21两两之间存在高度的序列相似性，无法设计特异引物，因此设计的引物的扩增结果为这两个成员的表达之和，以PbSOT1/2，PbSOT7/8和PbSOT19/21标识。在根中，PbSOT6和PbSOT19/21的表达水平很高，PbSOT1/2、PbSOT3、PbSOT20和PbSOT22表达水平较低，而其他基因几乎不表达。在茎中，PbSOT1/2、PbSOT3、PbSOT7/8、PbSOT19/21和PbSOT20的表达水平很高，PbSOT4、PbSOT5、 图2. PbSOTs启动子区域和逆境相关的元件类型 PbSOT6、PbSOT9和PbSOT22均有表达，其他基因几乎不表达。在花中，PbSOT1/2、PbSOT19/21和PbSOT20的表达水平很高，PbSOT3、PbSOT5、PbSOT6、PbSOT7/8和PbSOT22表达水平相对较低，其他成员几乎不表达。在叶中，PbSOT20的表达水平极高，PbSOT3、PbSOT6、PbSOT19/21和PbSOT22表达水平相对较低，其他成员几乎不表达。在果实中，PbSOT20的表达水平也极高，PbSOT3、PbSOT6、PbSOT7/8、PbSOT 9、PbSOT19/21和PbSOT22表达水平相对较低，其他成员几乎不表达。在种子中，PbSOT20同样表现出了极高的表达水平，PbSOT6表达水平次之，其它成员表达量极低或不表达。因此，根中的山梨醇转运主要依赖于PbSOT6和PbSOT19/21，茎中的山梨醇转运主要依赖于PbSOT1/2、PbSOT3、PbSOT7/8、PbSOT19/21和PbSOT20，花中的山梨醇转运主要依赖于PbSOT1/2、PbSOT19/21和PbSOT20，叶、果和种子中的山梨醇转运均依赖于PbSOT20 (图3)。