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user: 2. 实验部分 2.1. 主要材料和试剂 壳聚糖(脱乙酰度：85%，相对分子量：50 kDa，浙江金壳药业有限公司)；Boc-组氨酸(Boc-His，上海迈瑞尔化学技术有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (上海源叶生物科技有限公司)；VEGF siRNA及FAM标记NC siRNA (上海吉玛制药技术有限公司)；GelSafe核酸染料(原平皓(天津)生物技术有限公司)；核糖核酸酶A(RNase A， Worthington，美国)；琼脂糖(Biowest，法国)；噻唑蓝(MTT，MP，美国)；三聚磷酸钠(TPP) (上海实验试剂有限公司)；透析袋(MWCO：3，500 Da，上海绿鸟科技发展有限公司)；实验用水为二次蒸馏水。 2.2. 主要仪器 AVANCE DMX600型核磁共振仪(Bruker，德国)；ZetaNanoSizer型电位及粒度测定仪(Malvern，英国)；FR-180B电泳槽、FR-200A型凝胶成像仪(上海复日科技有限公司)；VARioSKAN Flash荧光多功能酶标仪(Thermo Fisher，美国)。 2.3. 聚合物的合成与表征 2.3.1. 聚合物的合成及表征 参考文献 [ 10 ] 合成His修饰壳聚糖。称取0.1 g Boc-His，加10 mL水溶解，加入两倍His摩尔质量的EDC和NHS，1 mol/L HCl调节pH至4.8，室温搅拌反应2 h；称取0.2 g壳聚糖，加20 mL 1%醋酸溶液溶解，1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0；混合上述两种溶液，1 mol/L HCl调节pH至4.8，室温、避光搅拌反应72 h，水透析3天(MWCO：3，500 Da)，冷冻干燥，制得壳聚糖–组氨酸共聚物(CH)，−20℃保存。 合成半乳糖基化组氨酸–壳聚糖(GCH)。称取0.1 g乳糖酸，加5 mL 10 mmol/L TEMED/HCL溶液(pH 5.0)溶解，加入两倍乳糖酸摩尔质量的EDC和NHS，室温反应2 h；称取0.1 g CH，加入5 mL 10 mmol/L TEMED/HCL溶液(pH 5.0)搅拌溶解；混合上述溶液，1 mol/L HCL调节pH至5.0；室温、避光搅拌反应72 h，水透析3天(MWCO：3，500 Da)，冷冻干燥，制得半乳糖基化壳聚糖–组氨酸共聚物(GCH)，−20℃保存。同样方法合成半乳糖化壳聚糖共聚物(GC)。 以氘水和氘代盐酸混合溶液为CS的溶剂，氘水为CH、GC和GCH的溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，测定样品的 1 H NMR图谱。KBr压片测定CS、CH、GC和GCH的傅立叶变换红外光谱(FTIR)图谱。 2.3.2. His修饰度测定 标准曲线： 精密称取100 mg His，置100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得1 mg/mL贮备液；分别精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、5 mL贮备液，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，得浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL的工作液；分别量取2 mL工作液，加0.5 mL 0.2 mol/L PBS (pH 8.0)和0.5 mL 2% (w/v)茚三酮溶液(以无水乙醇配制)，沸水浴15 min，冰浴10 min；以水为对照，测定570 nm处的吸光值。以浓度C (μg/mL)对吸光值(A)进行线性回归，制备标准曲线。 样品测定： 量取2 mL 2 mg/mL CH和GCH水溶液，加0.5 mL 0.2 mol/L PBS (pH 8.0)和0.5 mL 2% (w/v)茚三酮溶液(以无水乙醇配制)，沸水浴15 min，冰浴10 min；以水为对照，测定570 nm处的吸光值。由标准曲线计算His浓度。 2.3.3. 酸碱滴定 称取2 mg CS、CH、GC和GCH，分别加10 mL水溶解，0.1 mol/L HCl调节pH至3.0；搅拌下逐滴加入0.1 mol/L NaOH，至pH 7.0时停止滴加，记录滴定体积和相应的溶液pH值。 2.3.4. MTT试验 以1 × 10 4 细胞/孔的密度接种QGY-7703细胞至96孔板，37℃、5% CO 2 培养24 h，每6孔为一组，每组分别加入浓度为0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的CH、GC和GCH溶液，以0.2 mol/L PBS (pH7.4)的孔为对照，37℃、5% CO 2 培养24 h，吸弃孔中上清液，每孔加200 μL新鲜DMEM和20 μL MTT溶液(5 mg/mL，以0.2 mol/L PBS (pH 7.4)配制)，37℃、5% CO 2 培养3 h，吸弃孔中上清液，每孔加200 μL DMSO，37℃、100 rpm振荡孵育30 min以使甲瓒晶体完全溶解，酶标仪测定570 nm处的吸光值。对照组的吸光值记为100%，计算各试验组的相对细胞存活率(%)。 2.4. NP的制备与表征 以DEPC处理水配制2 mg/mLCH、GC和GCH溶液、0.2 mg/mL TPP溶液及0.2 mg/mL VEGF siRNA溶液；以1%醋酸溶液配制2 mg/mL的CS溶液，1 mol/L NaOH调节pH至6.0；TPP溶液与VEGF siRNA溶液按质量比10:1混匀，聚合物溶液与TPP溶液分别按质量比8:1、10:1、12:1、15:1、18:1和20:1混匀，滴加一定体积的siRNA溶液至聚合物和TPP的混合溶液中，涡旋混匀，37℃温育30 min，制得各NP，分别命名为CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP，测定粒径和Zeta电势。 2.5. 凝胶阻滞 按2.4项下方法制备不同聚合物/TPP质量比的CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP溶液，取一定体积(含100 ng siRNA)加至4%琼脂糖凝胶的上样孔中，50 V电泳1 h，GelSafe核酸染料显色，凝胶成像仪观察siRNA条带并拍照。 2.6. NP的稳定性 2.6.1. 核酶稳定性 按2.4项下方法制备聚合物/TPP质量比为15:1的CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP(以下试验无特殊说明外均用该聚合物/TPP质量比)，加入RNase A溶液(5 U)，37℃、100 rpm振荡孵育6 h，加2.5 μL 0.2mol/L EDTA溶液，80℃水浴 5 min以终止酶活反应，加肝素钠溶液(5 mg/mL)，室温静置2 h，样品溶液加至4% (w/v)琼脂糖凝胶上样孔中，50 V电泳1 h，GelSafe核酸染料显色，凝胶成像仪观察siRNA条带并拍照。以未加RNase A溶液的siRNA溶液为阴性对照，以加等体积RNase A溶液的siRNA溶液为阳性对照。 2.6.2. 肝素钠解离 量取一定体积的NP溶液，加入终浓度分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、1 mg/mL的肝素钠溶液，室温静置2 h后加至4% (w/v)琼脂糖凝胶上样孔中，50 V电泳1 h，GelSafe核酸染料显色，以裸siRNA溶液为对照，凝胶成像仪观察siRNA条带并拍照。 2.6.3. 抗稀释和离子强度稳定性 按2.4项下方法制备聚合物/TPP质量比为15:1的CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP，分别以水和0.2 mol/L PBS (pH 7.4)稀释100倍，测定NP的粒径和Zeta电势。 2.7. 体外释放 标准曲线的制作：精密量取0.5 mL 0.2 mg/mL FAM-NC siRNA溶液，置10 mL量瓶中，加DEPC处理水稀释至刻度，制得10 μg/mL FAM-NC siRNA贮备液；分别精密量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL至10 mL量瓶中，加DEPC处理水稀释至刻度，制得0.1 μg/m、0.2 μg/m、0.3 μg/m、0.4 μg/m、0.5 μg/mL FAM-NC siRNA标准溶液，酶标仪测定溶液的荧光强度(λex = 545 nm， λem = 575 nm)。以浓度C (μg/mL)对荧光强度(I)进行线性回归。 按2.4项下方法制备载FAM-NC siRNA的NP，量取一定体积NP溶液(含1μg FAM-NC siRNA)，加1mL 0.2 mol/L PBS (pH 7.4)分散NP，37℃、100 rpm振荡温育。分别于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 13300 rpm离心10 min，精密量取上清液200 μL，酶标仪测定FAM-NC siRNA荧光强度(λex = 545 nm，λem = 575 nm)，每次取样后补加200 μL 0.2mol/L PBS (pH 7.4)，分散沉淀，继续温育。由标准曲线计算FAM-NC siRNA含量，计算累积释放量(%)。