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user: 3. 结果 3.1. 古茶树叶片DNA的提取结果 经改良过的CTAB法提取茶树基因组总DNA条带基本清晰明亮，没有降解，没有断裂，说明完整性比较好，基本符合SSR-PCR的要求。 3.2. SSR标记及其位点多样性分析 本研究利用8对SSR引物在所有群体中共检测到18个等位基因，表3中显示，所观察等位基因的平均数(Na)为2.263，平均有效等位基因数Ne = 1.815，变化范围为1.023 (G5)~2.545 (G8)；观察杂合度(Ho)的变化范围0.000 (G4)~0.840 (G8)，平均为0.392；期望杂合度(He)的平均值为0.353，变化范围为0.020 (G5)~0.596 (G8)；Shannon信息指数(I)在0.069 (G4)~1.005 (G7)之间变动，平均0.578；从表3中的固定指数(Fis)可知，G3，G4和G5这3对引物的固定指数(Fis)为正值外，其余地方均为负值，8个位点的平均固定指数(Fis)值为−0.083，说明这些标记能较好的反应参试古茶树群体平均杂合度，且杂合度较高。以上结果说明，8对SSR核心引物能较好的显示参试材料的遗传多样性。 3.3. 遗传多样性 对10个不同茶区164个古茶树样品中采用8个SSR标记进行群体内遗传多样性研究表明(表4)，观察杂合度(Ho)的变化范围在0.256~0.510，平均值为0.392，最高的是老班章古茶树群体，期望杂合度(He)在0.270~0.430之间变动，平均值为0.353，期望杂合度(He)与观察杂合度(Ho)的平均值比较接近，两者之间的值越接近说明群体遗传多样性越高 [ 11 ]。Shannon信息指数(I)的平均值为0.578，大小在0.459~0.687 Table 3 Amplification information of 8 SSR primer pairs in 164 ancient tea resource 引物编号 观测等位基因数Na 有效等位基因数Ne Shanon信息指数I 观察杂合度Ho 期望杂合度He 固定指数Fis G2 2 1.638 0.545 0.413 0.368 −0.107 G3 2.6 1.975 0.754 0.413 0.462 0.374 G4 1.1 1.100 0.069 0.000 0.050 1.000 G5 1.2 1.023 0.041 0.006 0.020 0.484 G6 2.6 1.840 0.626 0.428 0.370 -0.152 G7 3.2 2.552 1.005 0.813 0.594 -0.368 G8 3.1 2.545 0.986 0.840 0.596 -0.429 G10 2.3 1.845 0.602 0.372 0.360 -0.021 Mean 2.263 1.815 0.578 0.392 0.353 -0.083 表3. 8对SSR引物在164份古茶树资源的多态性扩增信息 Table 4 The genetic diversity of ancient tea from different geographic are 居群population 观测等位基因数Na 有效等位基因数Ne 观察杂合度Ho 期望杂合度He Shanon信息指数I 多态位点百分率P (%) LBZ 2.25 1.841 0.51 0.385 0.612 87.5 NNS 2.25 1.563 0.259 0.27 0.459 75.0 MS 2.375 1.776 0.256 0.348 0.577 87.5 WJ 2.25 1.879 0.414 0.331 0.56 62.5 MJ 2.25 1.803 0.41 0.341 0.562 62.5 DPZ 2.375 2.060 0.417 0.43 0.687 75.0 LSD 2 1.593 0.344 0.316 0.499 75.0 MH 2.25 1.941 0.452 0.397 0.644 75.0 GSZ 2.25 1.760 0.423 0.345 0.57 75.0 MMS 2.375 1.930 0.434 0.362 0.616 75.0 Mean 2.263 1.841 0.392 0.353 0.578 75.0 表4. 不同地理来源的古茶树遗传多样性分析 之间，十个居群的多态位点百分率为75%，数值大小均在62.5%~87.5%之间，绝大多数为75%，表明这10个不同地区的古茶树具有高度的多态性，这说明了这10个古茶树居群遗传多样性丰富，可以为品种选育提供丰富优质的材料。表4中不同茶区古茶树居群的遗传多样性参数，说明了供试材料具有较为丰富的遗传多样性。 3.4. 遗传分化 Fst参数用来描述群体的分化程度 [ 12 ]。在表5中，群体遗传分化系数(Fst)为0.133，处于0.05~0.15之间，表明古茶树群体间属于中度分化 [ 13 ] ，87%的遗传变异来自居群内，13%的遗传变异来自居群间。古茶树的遗传多样性主要源于居群内，但水平较低，不同地区的居群存在一定的遗传分化，居群内的遗传多样性高于居群间的遗传多样性。此外，西双版纳地区不同地理区域的古茶树基因流(Nm)较高，为1.624 (>1)，说明古茶树群体存在一定的基因交流。 3.5. 遗传距离 本研究所用的样品涉及到了滇南6个乡镇，10个不同的茶山，将每一个取样的茶山看作是一个群体进行分析，对地理居群之间的遗传一致度和遗传距离分析，如表6。 遗传距离(D)和遗传一致度(I)分别是从相同和相反方面看遗传关系的指标，地理遗传距离反应了各居群之间的亲缘关系远近 [ 14 ] ，从表6中可以看出，164份古茶树的遗传距离在0.019~0.303之间，说明这些古茶树具有一定的遗传差异，遗传多样性较高。翁基和芒景遗传距离最小，只有0.019，其次是麻黑和高山寨，两者之间的遗传距离为0.021；这有可能跟两者之间的地域的远近有关。南糯山和大平掌两个地区的遗传距离相差较大，高达0.303。从一致度来看，翁基和芒景的一致度是最高的，为0.982，南糯山和大平掌的一致度最低，为0.739，这说明了遗传距离越远，遗传的一致度越低，遗传距离越近，遗传的一致度越高，而且遗传的一致度和遗传距离与古茶树所在的地理位置具有很强的关系。翁基、芒景、大平掌都位于惠民乡景迈山，遗传距离均小于0.1，所以遗传距离很近，遗传一致度也高；麻黑、落水洞、高山寨都属于勐腊县易武乡，遗传距离相对很近，遗传一致度高。 Table 5 The genetic differentiation of ancient tea trees in different region 指标 Variable AMOVA 遗传分化系数 基因流 居群间 居群内 Fst Nm Among Populations Within Populations 物种水平Species level 0.133 1.624 13% 87% (P < 0.001) (P < 0.001) 表5. 不同地区古茶树居群间的遗传分化 Table 6 The genetic identity and distances among different geographical population LBZ NNS MS WJ MJ DPZ LSD MH GSZ MMS LBZ **** 0.895 0.911 0.916 0.910 0.879 0.868 0.925 0.876 0.943 NNS 0.111 **** 0.951 0.740 0.760 0.739 0.863 0.865 0.869 0.797 MS 0.093 0.050 **** 0.830 0.839 0.835 0.871 0.903 0.887 0.877 WJ 0.088 0.300 0.187 **** 0.982 0.921 0.817 0.847 0.785 0.967 MJ 0.095 0.274 0.175 0.019 **** 0.921 0.863 0.886 0.841 0.961 DPZ 0.129 0.303 0.180 0.083 0.082 **** 0.780 0.844 0.783 0.929 LSD 0.141 0.147 0.139 0.202 0.147 0.249 **** 0.857 0.847 0.795 MH 0.078 0.145 0.102 0.166 0.121 0.170 0.154 **** 0.979 0.893 GSZ 0.132 0.141 0.119 0.242 0.174 0.244 0.166 0.021 **** 0.836 MMS 0.058 0.228 0.131 0.033 0.040 0.074 0.230 0.113 0.179 **** 表6. 地理居群间的遗传一致度和遗传距离 注：*上为遗传一致度，*下为遗传距离。 3.6. 聚类分析 根据UPGMA聚类图显示(图2)，以老班章为代表的翁基、芒景、滑竹梁子、大平掌聚在一类，以南糯山为代表的小勐宋、落水洞、麻黑、高山寨聚为一类。从遗传距离来分析，麻黑和高山寨遗传距离最小，相似度最高，两者与老班章的遗传距离最大，说明各个茶山古茶树的遗传距离与地理距离有很大的关系，该结果与遗传距离的分析结果基本一致，出现这一聚类结果可能是因为长期以来的人工养护，良好的自然生态环境和一定地域范围内少数民族的宗教信仰相关。