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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料及培养基 大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)；野生型谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC13032为本研究所用到的菌株。E. coli-C. glutamicum启动子穿梭载体为实验室前期构建的载体 [ 12 ]。表1为本研究中所用到的引物。 称取5 g的Yeast Extract、10 g的Tryptone以及10 g的NaCl配制成1 L的LB培养基(pH 7.0)，用于大肠杆菌菌株培养，培养温度为37℃；本试验还需用到LBHI培养基(pH 7.0)，配制1 L该培养基需称取5 g的Tryptone 、2.5 g的Yeast Extract、5 g的NaCl和18.5 g的脑心浸液，此培养基用于谷氨酸棒杆菌菌株的培养，培养温度为30℃。 Table 1 Primers used in this stud 引物名称 The name of primers 序列 Sequences 限制酶切位点 Restriction enzyme sites 退火温度 P1937-F atatggatccgtaacgtggcaaaacgaacaatgtctcactagactaaagtgagatcgacaaagcttaatt BamHI、HindIII 72.1℃ P1937-R aattaagctttgtcgatctcactttagtctagtgagacattgttcgttttgcctcgttacggatccatat BamHI、HindIII 72.1℃ Ptac-M-F atataagcttaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgtcaacagctcaggatccaatt BamHI、HindIII 71.7℃ Ptac-M-R aattggatcctgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaattaagcttatat BamHI、HindIII 71.7℃ 16s rDNA-F gtagggtgcgagcgttgtc — 57.6℃ 16s rDNA-R cgccattggtgttcctcctg — 55.9℃ cat-F tcagctggatattacggcct — 51.8℃ cat-R gaaagacggtgagctggtga — 53.8℃ 表1. 研究中使用的引物 2.2. 前期工作 在实验室前期工作中，获取了谷氨酸棒杆菌ATCC13032的细胞全蛋白，并在相应公司将获得的细胞沉淀进行二维电泳及质谱分析。公司返还相关数据后，利用质谱法分析我们从二维电泳图上选取的一些染色较深的蛋白点，同时使用NCBI网站查询其氨基酸序列。最后结合谷氨酸棒杆菌ATCC13032全基因组注释信息对二维电泳图上的高表达蛋白斑点进行分析，分析所含蛋白质的等电点、分子量等相关数据，以便后续与二维电泳图上的蛋白斑点进行比对。同样，我们在前期工作中在启动子预测网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)上对编码人为选择的染色较深的蛋白点基因进行了启动子分析，选择的区域为起始密码子上游的DNA序列处，获得了一系列预测的启动子片段。 2.3. 扩增目的片段 为扩增目的启动子的DNA片段，采用寡核苷酸退火法将设计好的正反引物合成双链DNA。引物序列atatggatccgtaacgtggcaaaacgaacaatgtctcactagactaaagtgagatcgacaaagcttaatt (P1937-F)和 aattaagctttgtcgatctcactttagtctagtgagacattgttcgttttgcctcgttacggatccatat (P1937-R)用于合成启动子P1937片段，利用引物序列atataagcttaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgtcaacagctcaggatccaatt (Ptac-M-F)及aattggatcctgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaattaagcttatat (Ptac-M-R)扩增启动子Ptac-M片段。正、反向引物各1 μL囊括在制备的50 μL PCR反应体系。经过10倍稀释的正反引物及所需的其他试剂充分混匀后进行PCR反应，反应条件同张献等的方法 [ 13 ]。 2.4. 构建重组载体 启动子探测载体上含有的BamHI及HindIII的酶切位点，因此在对引物进行设计时也加入这两种酶的酶切位点，利用这两种限制性内切酶分别对启动子P1937和Ptac-M以及启动子探测载体pDXW-11在相应酶切位点处进行双酶切，随后T4连接酶的使用，能让片段用与启动子探测载体相连接形成重组载体，后通过热激转化法转化进E. coli感受态细胞中。其中E. coli感受态细胞的制备以及转化方法遵循Sambrook等的方法进行 [ 14 ]。转化并利用氯霉素抗性验证成功后，即获得了携带启动子P1937的重组载体pDXW-11-P1937和携带启动子Ptac-M的重组载体pDXW-11-Ptac-M。 2.5. 谷氨酸棒杆菌电转化 首先遵循Xu等 [ 15 ] 的方法制得谷氨酸棒杆菌感受态细胞。后通过电击转化方式将重组探测载体pDXW-11-P1937和pDXW-11-Ptac-M转化进C. glutamicum ATCC13032感受态细胞中，其转化方法同样依据Xu等 [ 15 ] 的方法进行。利用氯霉素抗性验证成功后，即构建了带有启动子P1937的重组菌株C. glutamicum/pDXW-11-P1937和带有启动子Ptac-M的重组菌株C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M。 2.6. 谷氨酸棒杆菌内源启动子活性分析 2.6.1. 耐受性实验 载体上存在氯霉素筛选标记，因此制备具有不同氯霉素浓度梯度的LBHI平板，并将携带有启动子P1937的谷氨酸棒杆菌ATCC13032和携带启动子Ptac-M的谷氨酸棒杆菌ATCC13032这两种菌株在以上平板上进行接种，并观察菌落生长情况，初步判断启动子活性强弱。 2.6.2. 氯霉素乙酰基转移酶酶活检测 用100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8)溶液洗涤收集到离心管中的30 mL培养液的细胞沉淀，高速离心后，用移液枪吸取1 mL上述缓冲液吹吸细胞沉淀，使其重悬，对悬浊液进行超声波破碎，整个反应过程始终处于低温状态进行。破碎后离心获得上清，上清液即为粗酶液，依据Shaw等 [ 16 ] 的方法对氯霉素酰基转移酶酶活进行测定。同时以BCA蛋白作为标准品，绘制标准蛋白曲线。最终计算氯霉素乙酰转移酶酶比活力。 2.6.3. qPCR反应 当菌液OD 600 为3时收集菌体沉淀，依照RNA提取试剂盒的操作步骤提取谷氨酸棒杆菌细菌总RNA，该试剂盒使用的方法为TRIZOL法。将提取出的RNA进行琼脂糖凝胶电泳以判定其是否完整，同时检测RNA浓度，以便后续试验时计算相关试剂的加入量。随后对提取的RNA进行后续操作，首先使用试剂盒去除谷氨酸棒杆菌基因组DNA，其次通过反转录形成cDNA。得到相应菌株的cDNA后使用绿色荧光染料以及qPCR检测系统Archimed-X4进行qPCR反应。本试验中每次反应阴性对照以及标准品校正的设置是为了确保试验结果有效，同时还需要进行三个生物学重复和三个技术重复，以进一步保障试验结果的有效性。根据文献记载，本试验中同样以谷氨酸棒杆菌的16S rDNA作为内参基因，ΔCT记作不同菌株CT值的差。氯霉素乙酰基转移酶作为报告基因，其表达水平表示的为带有重组启动子探测载体的谷氨酸棒杆菌中相应启动子的转录水平，16S rDNA基因的转录水平则表示野生型谷氨酸棒杆菌中启动子的转录水平 [ 17 ]。对数据进行处理是使用Livak等 [ 18 ] 的2 − ΔΔCT 方法，其中ΔΔCT是处理组，即构建的工程菌株的CT值的差减去对照组，即携带强启动子Ptac-M的谷氨酸棒杆菌的CT值的差，处理组ΔCT的计算方法为靶基因，即氯霉素乙酰转移酶的CT值与内参基因，即谷氨酸棒杆菌16S rDNA的CT值的差，对照组ΔCT值应用同样的方式处理数据。最终计算得出菌株C. glutamicum/pDXW-11-P1937和C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M的cat基因的转录水平。