DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 民族地区乡村振兴的关键：激活内生动力 “乡村振兴”战略是国家发展进入新时代对“三农”问题提出的新的时代要求，直接关系到民族地区农民彻底脱贫，关系到城乡均衡发展，关系到全面建成小康社会和国家现代化的实现。基于对当前民族地区贫困人口内生动力不足的现状反思和唯物辩证法的内外因理论的认识和思考，认为当前实现乡村振兴和乡村的可持续发展其关键在于激活内生动力。 3.1. 内因是事物变化的根据：内生动力是乡村振兴的根本 根据唯物辩证法，乡村振兴的内因是乡村和村民，在实现乡村振兴、实现乡村可持续发展的过程中起根本性作用；乡村振兴的外因则是以政府为代表的外界帮扶，是实现乡村振兴、实现乡村可持续发展的必要条件。 结合当前民族地区乡村振兴的实际情况来看，国家对乡村发展投入了大量人力、物力、财力，据中央财政部统计，2016年至2019年就扶贫专项资金累计拨款高达3843.8亿元，但是扶贫效果并不明显。在调研中我们发现在某些民族地区贫困人口思想上的“等、靠、要”观念依然存在，还有争当贫困户、不愿脱贫摘帽的；在行动上，基层干部成了贫困人口的脱贫主体，贫困人口只管看不管干，对自己有益的事情都能接受，只要损害到自己利益的就坚决反对。这些问题直接影响了贫困户自身的发展能力，造成返贫现象严重以及贫困的代际传递。其根源就是没有激活乡村内生动力。作为乡村振兴主体的贫困人口如果自身的脱贫意识不强，无论外界的帮扶力量有多大，最终还是难以从根本上摆脱贫困。贫困问题作为世界性难题，难点就在于可逆性，外界的帮扶可能会帮助贫困人口暂时脱贫，但这种外力一旦消失或者减弱，贫困人口还是会还原到贫困状态，所以最终起根本性作用的还是贫困人口本身。乡村振兴战略的实质就是要缩小城乡差距，实现城乡均衡发展。这就要求乡村必须激活其内生动力，增强乡村的自我发展能力，走一条可持续的自我发展道路，从而实现真正的乡村振兴。 3.2. 外因是事物变化的条件：外生动力是乡村振兴必要条件 民族地区受地域条件、人口素质、基础设施等因素的影响，仅仅凭借乡村内部激发的内生动力是很难实现乡村振兴的，这就要求乡村必须要借助外部力量来谋发展。 回顾自新中国成立以来国家对民族贫困地区70年的扶贫历程，大致可以分为三个阶段，第一阶段是新中国成立之初到改革开放之后即1949~1985年的“救济式扶贫”，第二阶段是1986~2013年的“开发式扶贫”，第三个阶段是2014年至今的“参与式扶贫”。三个阶段的扶贫历程不仅仅体现了国家对民族地区扶贫工作的重视，更是国家对民族地区扶贫工作的不断调整和优化。外因作为事物变化发展的条件，然而从政府的扶贫历程来看，我们发现乡村振兴的初始动因存在着明显悖论，同时这也是政府扶贫工作不断进行调整的基本逻辑。所以，在乡村振兴过程中必须要明确，乡村振兴的内在动因是乡村和村民，乡村的振兴需要外因的支撑和保障，但外因通过内因而起作用，所以内因才是乡村振兴的根本原因。根据乡村振兴的内在要求，乡村必须变被动为主动，激活内生动力的基础上积极利用外部力量作为乡村振兴的支撑和保障，使乡村得到充分发展，从而使乡村的振兴成为可能。 3.3. 内因与外因的有机结合：民族地区乡村振兴的关键 民族地区的乡村振兴不仅需要激活乡村的内生动力，而且还需充分发挥国家和社会的帮扶力量，实现内部自我发展和外部支撑良性互动的发展机制。只有做到内部和外部两个方面的良性互动，民族贫困地区才能打破贫困的代际传递实现乡村可续发展，实现乡村振兴。 事物的发展是内外因共同作用的结果，乡村振兴也不例外。基于新时代我国社会主要矛盾的突出表现，2018年的中央“一号文件”中对实施乡村振兴战略做了全面部署，旨在解决当前我国城乡发展不平衡、农村发展不充分的问题。乡村振兴战略的提出无疑是对作为乡村主体的村民和乡村本身，以及政府为代表的外界力量提出更高要求。对于乡村振兴的主体而言，首先必须激活内生动力，作为乡村振兴的主体乡村是否具有内生动力是乡村振兴的关键；其次，作为乡村的主人不仅要参与到乡村振兴中，而且要充分发挥主人翁的作用，要有强烈的责任感和使命感，勇于承担起乡村振兴的责任。对于以政府为代表的外部力量而言，首先要对帮扶方式做出积极调试，我国幅员辽阔、历史悠久就注定中国的乡村各有特点，所以政府帮扶也要“因地适宜”，简单用一种模式或方法来解决所有乡村的问题显然难以见效；其次，政府帮扶要持之有度，政府始终发挥引导而非主导作用。在明确内、外因分工的条件下，二者耦合发力并且与市场接轨让国家投入的大量资金见实效，形成内外因融合发展的长效机制，从而实现乡村振兴。
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user: 4. 激活民族地区乡村振兴内生动力的实践路径 发现民族地区乡村发展过程中存在的问题，旨在于寻找解决问题的应对之策。民族地区贫困人口内生动力不足的原因有很多，从当前情况来看激活民族地区乡村振兴内生动力，应对以下几个问题有所思考： 4.1. 民族地区乡村振兴战略需要通过基层落地生根 党的领导是中国特色社会主义最大的政治优势，因此，也是我国解决贫困问题、实现乡村振兴必须始终贯彻的原则。乡村振兴战略的主要原则之一就是坚持党管农业，实行中央统筹、省负总责、市县抓落实的工作机制。这就要求基层党组织充分发挥其作用：一是要发挥好基层党组织的思想教育作用。抓好党员和扶贫干部的思想教育工作，提高党员、扶贫工作者的思想觉悟，要发扬奉献精神。通过党员致富带头人的示范、带动作用，激发村民的“攀比”心理，扭转错误的思想观念，完成从“要我发展”到“我要发展”的思想转变。二是要发挥好基层党组织的桥梁纽带作用，与村民保持密切联系，根据村民的实际情况切实解决问题，把工作落到实处。乡村振兴路上不可能一路坦途，如村民发展产业时可能遇到缺资金、少销路、少思路等问题，基层党组织只要切实解决好一个问题，就会让村民有信心，同时也会让更多的村民积极谋发展。希望是最大的动力！三是要发挥好基层党组织的带头作用。广大党员、干部必须要自身富、自身强，通过入股合作、结对帮带作用切实让村民获利，激发村民的对经济利益的追求，对美好生活的向往。四是发挥好基层党组织的带动提升作用。通过党员干部主动作为，带动村民积极参与到乡村振兴中，让村民主动承担起乡村振兴的责任和使命，推动乡村振兴落地生根。 4.2. 民族地区乡村振兴内生动力亟需科学机制激活 从内生动力的特点来看，主体的内生动力是根据内在需求所产生，但又会受到外界因素的影响，做出趋利避害的选择 [ 4 ]。调研中发现，民族地区激发内生动力较为有效的是激励机制和责任机制。激励机制主要是通过外界因素的刺激，来激发主体的内生动力、调动主体的积极性。贵州省铜仁市针对扶贫干部出台了“脱贫攻坚一线干部关怀激励机制”，从培养使用、表彰奖励、待遇保障、人文关怀、抚恤救助、能力提升、创新创业、容错纠错八个方面来强化正向激励，并且取得实效，据不完全统计2017年提拔任用脱贫攻坚干部46人次。湘西十八洞村在实践中探索出“五兴”互助的基层治理模式，建立党员和农户的双向评价、双向监督、双向考核原则，评价结果与党员评先评优挂钩、与农户享受各种优惠政策挂钩，并且将评价结果换算成星星在村民门前挂牌公示。这一治理模式在十八洞村脱贫攻坚中极大的调动了农户参与性、积极性。责任机制主要是针对党员、干部制定，把对村民的帮扶纳入职责范围之内，通过党员干部示范、帮扶实现乡村发展。但是，在运用激励机制和责任机制过程中要坚持适度原则。奖罚只是手段并非目的，激励机制和责任机制的目的是激发乡村的内生动力，调动村民积极性、增强主体意识，而非依赖机制、党员干部、政府。其次，要坚持从实际出发。好的模式、做法固然要推广，但不能忽略各地实际情况，盲目照搬。民族地区的主要问题看似都是贫困，但致贫原因各不相同。 4.3. 民族地区乡村振兴要聚焦百姓对美好生活需求 中国共产党自成立以来就把为人民谋幸福，为中华民族谋发展作为安身立命之本。乡村振兴是基于我国社会主要矛盾变化的迫切需要做出的重大选择，所以民族地区乡村振兴必然聚焦百姓对美好生活的需求。当前制约民族地区发展的因素有很多，其中表现最为突出的就是基础设施不完善、人口文化水平低、思想落后。导致乡村发展难度大、速度慢。基于民族地区发展中存在的现实问题，这就要求乡村振兴战略在实施过程中目标更聚焦，措施更具体，切实解决好百姓的生活需求。例如，民族地区的基础设施建设问题：交通是制约城乡之间交流的基本条件；教育是解决贫困问题最持久有效的办法，现在民族地区家长受教育水平低已经成为事实，而由于学校少、家庭困难，贫困人口的子女上学也很难得到保障，这是制约其发展的一个重要原因。其次，是要从根本上激发百姓对美好生活的需求和创造美好生活的动力，完成“要我发展”到“我要发展”的转变。城乡差异的实质就是发展的相对速度，所以，民族地区乡村振兴既要聚焦百姓对美好生活需求，解决好百姓最关心、最直接、最现实的利益问题，还要从根本上激发百姓的发展热情，激活对美好生活需求以及创造美好生活的动力。 4.4. 民族地区乡村振兴需要特色产业有力支撑 产业对经济发展有强大的推动作用，乡村振兴必须要有经济的支撑和保障，发展产业是乡村可持续发展的根本出路。所以民族地区的乡村振兴必须要根据当地的资源禀赋发展特色产业。产业兴旺作为乡村振兴战略的要求和目标，对乡村产业的发展方式、质量提出更高要求。首先，民族地区乡村振兴要根据当地资源禀赋发展特色产业，并且创新产业组织发展方式，积极推进“农户 + 合作社”、“农户 + 公司”等发展模式。其次，民族地区乡村振兴的特色产业要走可持续发展道路。乡村振兴是一种进行时，是随着人民生活水平的提高而不断发展、完善的过程。这就要求其选择的产业必定是绿色产业、现代产业，能满足百姓美好生活需求的产业。如大力发展现代种养业和农产品加工流通业、乡村服务业、乡村新产业新业态等。再次，民族地区乡村振兴发展特色产业必须要与市场接轨融合发展。乡村振兴战略的实质就是缩小城乡差距，实现城乡融合发展。乡村产业要积极融入城乡市场，形成一种城乡互动式的发展状态。怀化市麻阳县楠木桥村的“连村联创”做法取得了很大的成效。谭家寨乡出台了“先进带后进”责任制度，党员致富带头人谭霞飞根据当地资源禀赋创办中药材产业基地，与30多户贫困户“结穷亲”，通过组织土地入股、提供劳动岗位等措施，帮助结对贫困户每户平均增收8160元。
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user: 5. 结语 激活民族地区乡村振兴内生动力的途径有很多：也许是通过对乡村振兴主体贫困人口的内在鼓励，也许是通过外因的刺激；也许是通过贫困人口对利益的追逐，也许是乡村精英价值观念的升华；也许是因为政府主动参与的意识，也许是背水一战的勇气。但不管哪一种方式，乡村振兴都将遵循内外因理论，内生动力在乡村振兴过程中起根本作用，外生动力是实现乡村振兴的必要条件，外因通过内因而起作用。实现乡村振兴不仅要激活乡村内生动力，而且还需充分发挥国家和社会的帮扶力量，形成内部自我发展和外部支撑良性互动的发展机制实现乡村的振兴。
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user: 摘要 民国时期，夏令卫生运动作为新生活运动的重要内容在全国推行。1936年，四川省接到上级政府下达的政令后，开始按照要求在省内推行该项运动。为落实政府要求，达到运动开展的目的，四川省成立了四川省夏令卫生运动委员会来负责此项工作。为吸引民众参与，扩大受众范围，四川省举办了形式多样的宣传动员活动，并通过竞赛和督察的方式来落实运动内容。
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user: 1. 引言 夏令卫生运动是新生活运动重要内容之一，其动员、实施和成效学界目前关注不多。本文借以四川省夏令卫生运动作为个案，探讨该运动在四川省推行的背景、实施过程和产生的效果，并发掘运动背后蕴藏的中国近代公共卫生意识和理念的变化。
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user: 2. 四川省夏令卫生运动的实施背景 1934年2月，新生活运动在南昌发起。它的主要目标是通过改良民众的生活习惯来恢复原有的“礼义廉耻”的儒家道德传统，加强国家对地方的统治。当时的领导人认为，“一个人或一国的国民精神、思想、智识、道德统统可以从基本生活的方法表现出来” [ 1 ]。并主张向日本学习，希望通过军事化生活提高国民素质来达到“安内攘外”的目的，而“规矩”和“清洁”是提高国民素养这一目标的第一步 [ 2 ]。作为新生活运动中“清洁”的重要的内容，夏令卫生运动开始在全国实施。 夏令卫生运动实施的意义主要是“依据新运精神，保障国民健康，减少国民疾病，健全国民体魄，以促进国民生活军事化，而为复兴民族之基础” [ 3 ]。1936年，新生活运动促进总会正式下达在各地开展夏令卫生运动的通知，并要求各地成立专门机构负责开展此项运动。通知具体内容如下： “查时届夏令，一切病疫最易发生，苟不严加防范，一经蔓延，小之足以危及个人生命，大之足以妨害民族健康，与念及此，殊深危惧！用特订定各地新生活运动促进会夏令卫生运动工作计划大纲，分发各会，统限于本年五月二十日起，一律开始举行大规模之夏令卫生运动，以期减少民众疾病，保障国民健康。” [ 4 ] 政府实施夏令卫生运动有两方面目的：一是提高民众的卫生意识，让民众养成卫生自觉意识，从而提高民众身体素质；二是通过实施该运动来加强对民众的管控。1936年，四川省夏令卫生运动正式实施。
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user: 3. 四川省夏令卫生运动的实施过程 四川省夏令卫生运动正式实施前，各县市并没有专门负责管理卫生防疫的机构，卫生相关事宜由地方政府民政科、警察局等负责兼管 [ 5 ]。为保证夏令卫生运动的顺利开展，四川省新生活运动促进会(简称“省新运会”)按照《各地新生活运动促进会夏令卫生运动工作计划大纲》的规定，开始筹备四川省夏令卫生运动的相关事宜。 3.1. 机构的建立与健全 四川省夏令卫生运动委员会由省新运会主持，省党部、省政府秘书处、督办署、教育厅、市政府、警备部、公安局、宪五团和特务团等机关团体组成。参与夏令卫生运动的团体囊括党、政、军、学、商等社会阶层。 1936年5月12日，四川省夏令卫生运动委员会第一次筹备会议召开， 正式产生总务部、宣传部、卫生部和推行部委员。总务部主要负责拟定大会经费预算、购买大会应用物品、布置各部联席办公室、会同推行部布置大会会场；宣传部主要负责拟定告民众书、拟定各种宣传品、缮制横街标语、绘制油画漫画、编配演讲队及演讲区位；卫生部主要负责征集卫生展览陈列品、会同推行部布置卫生展览室、训练工作人员及各行业经理、聘请各医院院长担任各影院讲演；推行部主要负责确定参加大会机关团体、拟定指导队须知、拟定指导队检查表、组织视察团及指导队、派定大会各项负责人、拟定大会主席团各机关指导名单、拟定大会秩序单、会同总务部布置大会会场、会同卫生部布置卫生展览室等工作 [ 6 ]。此外，还有众多社会团体如学校和医院的服务队加入，其具体的工作是在各街道进行宣传、监督和开展卫生指导。四川省夏令卫生运动委员会经费由参会单位分担和各干事自由捐款。 四川省夏令卫生运动最先在成都市实施，后逐步在各县市推广。各地夏令卫生运动机构设立时间不一，如重庆市夏令卫生运动委员会于1936年5月成立 [ 7 ]，而北川县夏令卫生运动委员会直到1942年6月才成立 [ 8 ]。各县市夏令卫生运动的机构设置也稍有不同。如重庆市夏令卫生运动委员会下设四股，分别为总务股、宣传股、推行股和卫生股 [ 9 ]；名山县和北川县则下设宣传队、防疫队和清洁检查队 [ 10 ]。 3.2. 运动的动员与宣传 1936年5月31日，第一届四川省夏令卫生运动大会开幕典礼在少城公园举行。为了达到宣传和扩大受众范围的目的，开幕典礼特意选在节假日举行。政府参加代表有省特派处曾扩情特派员，警备部蒋尚朴司令，公安局范崇实局长，宪兵五团文重孚团长，华西大学张凌高校长，省府主任秘书赵香畹等人，参与人数达5000人以上 [ 11 ]。四川省夏令卫生运动委员会组织了形式多样的动员和宣传活动。具体的方式有： 电影宣传。放电影的地点一般选在电影院或者人数较多的公园内，且每周有固定的放映时间。如1936年四川省夏令卫生运动放电影的地点主要定在成都青年会电影部和智育电影院。前者电影播放的时间为星期一、二、三的上午八点到十点，后者电影播放的时间为星期四、五、六的上午八点到十点。播放的卫生影片有《卫生之源》、《生命之源》和滑稽笑片等 [ 12 ]。 举行卫生展览和开展公开卫生讲演。卫生展览陈列品主要有卫生挂图、卫生漫画、宣传标语、模型和药品。为了让参观民众更好的了解展品、理解意义，还会派人专门进行讲解。卫生讲演人员主要是本市医师和负责卫生管理部门的相关人员。1936年，四川省夏令卫生运动委员会的卫生讲演员主要来自督署军医处、公安局、医师公会、萧氏弟兄医院、岛晴医院和四十五军医处 [ 13 ]。讲演主题多为卫生常识。目的主要是为了让民众了解卫生与个人之间的密切关系，重视卫生工作的开展和落实。 宣传队口头宣传和印发宣传品。宣传队成员多是来自学校的学生。四川省夏令卫生运动委员会每年会给各校进行相关的工作分配。具体工作由四川省教育厅负责。分配原则为：“应派人数，概以学生数量与质量而决定，担任街道则视其组数多寡，及不妨害课程”。其主要目标也是将运动的开展广而告知，尽可能的让更多的民众知道此次夏令卫生运动举办的意义。除了口头宣传之外，四川省夏令卫生运动的宣传还用文字的方式进行。其宣传品内容多是宣传一般卫生常识、告知民众政府政令和推广夏令卫生运动的相关要求和举办活动通知，如取缔随地大小便、随地吐痰等生活陋习 [ 14 ]。 3.3. 全民卫生运动的开展 四川省通过举行大扫除、对公井和公厕进行消毒、开展清洁竞赛、举办捕鼠灭蝇比赛和注射防疫针等形式，将夏令卫生运动落实到现实生活当中。 1) 举行大扫除。大扫除的范围包括水井、公厕、各种食品店、宿舍、浴室、茶室、理发店和娱乐场所等公共区域及街巷周边和民众家里。夏令卫生运动委员会各机关组织会在规定时间内到负责区域进行卫生宣传，填写检查表格并汇报给上级。各地对大扫除次数有明确规定，如剑阁县规定各户每日最低扫除三次，每周由政警指挥全城大扫除一次；涪陵县则规定在夏令卫生运动举行期间要“定期切实大扫除三日” [ 15 ]。 2) 对公井和公厕进行消毒。该项内容是夏令卫生运动的重要内容之一。厕所是蚊、蝇、蛆、鼠的聚集地，容易散布传染病。不干净的井水使民众易患霍乱、伤寒等疾病。四川省夏令卫生运动对厕所卫生和井水的卫生进行了明确的规定，并将宣传标语粘贴在厕所和水井周边，如厕所“要远距水井五丈以外”，“井头需高出地面两尺以防，雨水流入”等 [ 16 ]。 3) 开展清洁竞赛。夏令卫生运动专门制定了《夏令卫生运动清洁竞赛暂行办法》。该办法规定竞赛以城市为单位，并按照人口的多少分为大城市、中等城市和小城市三类。竞赛种类依据学校、公寓、饮食店、澡堂、理发店、娱乐场所和巷道等场所进行划分。各类竞赛总分为一千分，按照分数划为甲、乙、丙、丁四等。四等各有相应的奖惩，甲等授予“清洁竞赛优队”奖牌，并在门口张贴“荣誉名牌”，如一连三年都为甲等，所获得者将获得“免检查”认证；乙等门上贴“清洁”二字；丙等口头奖励；丁等第一次予以警告，连续两次予以轻微惩罚，连续三次予以重罚 [ 17 ]。具体的惩罚办法由各县市政府根据自身情况制定。如北川县规定“每周星期日对所负责的区域进行逐户检查，将检查结果分最清洁、清洁、欠清洁、不清洁。四种标志分别贴于门上，并规定凡三次不清洁或将所贴门上的标志扯去者，处以二元罚金” [ 18 ]。忠县同样是在各户粘贴“最清洁”、“清洁”、“不清洁”等字样，对于不清洁的住户将要罚劳役或者科罚金 [ 19 ]。 4) 举办捕鼠灭蝇比赛。四川省夏令卫生运动举办期间，政府会向民众收买鼠蝇。1941年，仁寿县共收买苍蝇一万四千个 [ 20 ]。忠县将每只老鼠按照一只一角，蝇蚊一两一元的价格，在此期间进行收购。酉阳县则规定，“由县府严令各住户购备苍蝇拍及捕鼠药，尽量投灭与捕捉苍蝇，五百个以上者，奖法币□元，能捕获鼠一个，奖励法币五角，扑死鼠一个，奖法币二角，其数多者奖金类推。” [ 21 ] 江安县政府按照每二十蜷蝇，奖励一角，每只老鼠，奖励一角的办法，共收买苍蝇六万余只，老鼠数只 [ 22 ]。 5) 注射防疫针。为提高民众的抗病毒能力，夏令卫生运动期间还专门普及和推广防疫针注射。1942年，江安县聘请了专门的防疫队人员到县内注射防疫针，总共注射了2500多人。江油县则由该县卫生所负此项工作 [ 23 ]。
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user: 4. 四川省夏令卫生运动的实际成效 1936年，四川省夏令卫生运动的推行有正面的影响到民众的生活。时人岚光曾在《申报》发文来支持夏令卫生运动的开展，称“欲免夏秋之疾病，莫如举行夏令之卫生运动” [ 24 ]。 四川省夏令卫生运动宣传形式多样，宣传动员内容言简意赅、通俗易懂。如“衣服要洗干净”、“房屋扫清洁”、“大家讲卫生”等等 [ 25 ]。运动通过放映影片和公开卫生演讲等方式，在一定程度上减轻了民众因不识字而无法了解宣传内容的局限，扩大了受众范围。口头讲演和文字宣传多将夏令卫生运动与国家兴亡、“救民”“强国”绑定在一起，激发了民众改变不良卫生习惯和改善公共卫生的决心。正如时人所评论的，卫生运动“是一种辅助卫生行政的社会教育，一方面普及有关健康保障的各种知能，一方面亦可促成卫生设施的实现” [ 26 ]。 四川省开展该项运动之时，未对下辖各县市运动的开展时间进行强制规定，各县市有相对的自主权。绝大多数的县市有按照省下达的政令进行落实，但有的地方因经费不足、医疗设备和药物缺乏等原因，一定程度上影响了运动的效果。1936年，遂宁县政府因未及时收到省新运会通告，没有将该年度夏令卫生运动经费纳入年度预算，出现了经费不足的情况 [ 27 ]；1942年，峨边县政府呈文给四川省政府，借以“该县系山岳地带，气温不高，此需要且暑假其中，亦无集体学生可推动”为由，提出当年不开展夏令卫生运动的请求。这一定程度上反映了各地政令的实施存在问题。后因四川省政府态度强硬，在回复批文中以“查夏令卫生运动，乃推行卫生，增进民族健康之初步工作，此项运动并不仅限于夏令之交，与气温之高低无关”，“核与法令不合”为由，拒绝了峨边县政府的请求，并要求峨边县政府根据指令的要求，将该县具体的实施情况上报给省政府 [ 28 ]。
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user: 5. 结语 民国时期四川省夏令卫生运动是由政府组织领导、民众参与实施的一项社会卫生运动。该运动的实施是通过国家、省、县市层层下达，一定程度上完善了国家医疗卫生监管体制。 政府和民众在此次运动中扮演了重要的角色。政府的引导、推行和监管促进了该项运动的落实。通过政府的监管，民众认识到了开展夏令卫生运动的重要性，并有效地参与其中，从而实现了政府加强对地方管控的目的。民众则通过参与此项运动，学习和了解到了许多卫生常识和疾病预防手段，有效地提高了自身的抵抗能力，改善了人居环境。 同时，夏令卫生运动的开展推动了我国公共卫生的近代化进程。“数十年前在中国，‘卫生’两个字还是一种很生疏的名词，到近年以来，‘卫生’二字已经在社会上普遍的应用了，无论是我们日常所吃的用的，都用‘卫生’两个字加在上面作为吸引购买者的标号，可以见得‘卫生’是受大众欢迎的，并且已经深入民众的脑海了。” [ 29 ]
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user: 摘要 目的：分离培养符合用于治疗系统性红斑狼疮的产业化的脐带间充质干细胞(UC-MSC)，并进行脐带间充质干细胞产品质量控制的研究。方法：从脐带中通过贴壁法获得间充质干细胞，传代培养后，采用无血清培养体系扩增培养UC-MSC。通过流式细胞术和诱导分化技术，检测其中干细胞含量、细胞总数、细胞活率，并取样进行细菌检测、内毒素检测、支原体检测，满足质量标准方能应用。选取BALB/c小鼠，进行pristane造模，将BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，对照组和模型组给予等量的生理盐水；治疗组给予UC-MSC (4 × 10 5 cells/ml)，0.2 ml。进行抗双链DNA (ds-DNA)抗体、系统性红斑狼疮活动度评分(SLEDAI)和常规血液检查。通过裸鼠致瘤性实验、毒性试验等评估脐带间充质干细胞产品的安全性。结果：经过技术改造升级，无血清培养的UC-MSC贴壁生长，主要为典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD44；低表达CD34、CD45和HLA-DR；在不同的诱导条件下，脐带MSCs可被诱导分化为成骨细胞和软骨细胞。治疗组UC-MSC给药30天，抗ds-DNA抗体水平明显降低，与对照组相比差异有显著性意义，疾病活动度评分明显降低，蛋白尿、血肌酐、尿素氮等指标得到改善，与模型组比较差异均具有统计学意义(P < 0.05)。结论：本研究建立了工业化生产UC-MSC的质量管理体系，验证了UC-MSC治疗系统性红斑狼疮的安全性及有效性，为后续开展UC-MSC治疗系统性红斑狼疮的临床试验开展提供理论依据和技术支持。
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user: 1. 引言 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的自身免疫性疾病。主要特征为Ｔ、Ｂ淋巴细胞活化异常产生大量自身抗体并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，对肾、心血管、神经、肌肉骨骼和皮肤等多器官产生损害 [ 1 ]。84%~90%的患者会累及肾脏出现肾功能损伤，即狼疮性肾炎(lupusnephritis， LN)，主要临床表现为蛋白尿、血尿等 [ 2 ]。SLE全球发病率为12.5~39/10万，我国的患病率为0.7~1/1000，女性：男性６~10：1，20~40岁是高发年龄 [ 3 ]。目前SLE无理想的治疗方案，临床上主要是应用糖皮质激素和免疫抑制剂，但仍有部分患者出现复发或反复活动，长期使用激素和免疫抑制同样增加了患者的潜在致死率 [ 4 ]。该病早期死亡风险较高，特别是年轻人，高达45%的患者出现早期器官损害，这与疾病持续活动或肾脏疾病有关，其中肾脏受累的患者，40%~50%的患者死亡率高于预期的8倍，且临床治疗不佳 [ 5 ]。与皮质类固醇激素相比，环磷酰胺治疗并没有改善患者的生存率 [ 6 ]，有实验比较过霉酚酸酯和静脉环磷酰胺治疗狼疮性肾炎的疗效，患者完全缓解率分别仅有8.6%和8.1%，需要寻找更安全、更有效的方法 [ 7 ]。 干细胞(stem cell)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，具有可塑性。在一定的条件下能分化为组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞及心肌细胞。根据干细胞的分化潜能大小分为三类：全能干细胞，多能干细胞和单能干细胞。按其来源可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell， ESC)是从早期胚胎或原始性腺种分离出来的一类干细胞，具备体内外发育分化的全能性。其它从成体组织如骨髓、肌肉等获得的干细胞，我们称之为成体干细胞(Adult Stem Cell， ASC)，只具有部分发育分化功能，只能分化为一种或多种功能细胞。人体几乎所有组织都存在ASC。 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells， MSCs)是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。最早在骨髓中发现，后经研究证实，真皮、脂肪组织、肌肉、外周血、脐带血、脐带静脉内皮下层、胎盘中也发现MSCs。MSCs起源于中胚层，具有向内、中、外三胚层的多种细胞分化的能力。MSCs除了具有支持造血的功能，还具有免疫抑制作用，其独特的生物学特性及其临床应用越来越受到人们的重视，现在已成为多种疾病细胞治疗的首选。
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user: 3. 实验结果 3.1. UC-MSC细胞培养及鉴定 3.1.1. UC-MSC细胞形态 倒置显微镜下观察，原代培养的MSCs细胞24 h后开始贴壁，7天后可见贴壁细胞呈纺锤状。第10~14天后去掉组织块，倒置显微镜下可见散在分布、大小不等、贴壁生长的细胞集落，细胞形态与骨髓来源MSCs相似，多为长梭形细胞，细胞折光性好，核仁明显。细胞融合度达到80%时进行传代，按照5 Í 10 4 细胞/ml的密度接种。接种后的MSCs 2 h后开始贴壁，接种第二天，细胞变为长梭形，生长迅速，接种第3~4天细胞即可达到80%~90%融合度(图1(A))。MSCs可传15代以上，细胞形态无明显变化。 扫描电子显微镜下可见大部分细胞表面光滑(图1(B))，少数梭形细胞有丰富的表面片状皱褶；透射电镜观察显示膜光滑有少量微绒毛的成纤维样细胞占大多数，该细胞核/质比约为1/5，细胞核常染色质丰富、分布均匀，图1(C)可见双核仁，核仁大而结构清晰，核膜完整，可见内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体和一些髓鞘样小体，胞质中分别有大量核糖体和微丝。 图1. 体外培养的人UC-MSCs 3.1.2. 细胞表型 第5代MSCs高表达CD90、CD73、CD105和CD44，低表达CD34、CD45和HLA-DR (见图2)；本实验结果表明，脐带来源的MSCs与骨髓、脐血等其他组织来源的MSCs流式检测表型一致。 3.1.3. 细胞分化结果及其鉴定 加入成骨诱导培养基两三天后，细胞开始从长梭形缩短为多角形，细胞体积增大，诱导14天后茜素红S染色为阳性，碱性磷酸酶阳性细胞大幅增加，表现出成骨细胞的特点(图3(A)，图3(B))；加入软骨诱导培养基后，细胞由长梭形显著缩短为椭圆形，体积增大，甲苯胺蓝染色呈阳性(图4(A)~(C))，II型胶原免疫组化染色阳性(图4(D))。 图2. 流式细胞术检测UC-MSCs表型 图3. 体外诱导人UC-MSCs向成骨和脂肪细胞分化((A)， (D)×200; (B)， (C)×100) 3.2. 建立了完善的质量控制体系 参考国家政策文件、国际规范及行业规范确定细胞标准化检测体系的质控指标和检测流程。参考的文件主要有：《药品管理法》、《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》、《细胞制品研究与评价技术指导原则(试行)》、《多潜能间充质干细胞最低标准》(国际细胞治疗协会，ISCT)、《基于人类细胞的治疗产品指南》(欧洲药品审评委员会)、《21CFR1271人用细胞组织和细胞的组织培养产品》(美国食品药品监督管理局)、《干细胞制剂制备质量管理自律规范》。 图4. 体外诱导人UC-MSCs向软骨细胞分化(×100) 参考《中国药典》、国家标准、国际标准(如AAABB、FACT)等法规及行业规范进行具体检测指标质量标准的研究，包括原辅料质量标准的研究与确定、原代细胞质量标准的研究与确定、工作细胞质量标准的研究与确定、细胞终制品质量标准的研究与确定等。 检测方法的研究与确定主要分为6部分： ① 细胞生物学属性，研发并建立细胞形态、细胞染色体核型分析、代谢酶亚型谱分析、表面标志物检测、细胞存活率、生长活性、细胞纯度等快速准确的检测方法； ② 微生物学安全性，研发并建立无菌(细菌和真菌)、支原体、分支杆菌、细胞内外源致病因子、内毒素检测等高灵敏度、适应性强的检测方法； ③ 细胞生物学安全性，研发并建立细胞致瘤性、细胞促瘤性、细胞过敏反应、细胞毒性等检测方法； ④ 细胞生物学有效性，研究并建立细胞分化潜能、免疫调控能力评价、细胞特有的生物学性能评价等检测方法。 ⑤ 一般检测，研发并建立细胞外观、细胞悬液浊度、可见异物等检测方法。 ⑥ 残留检测，根据细胞的特殊工艺，分析细胞制品中可能含有的杂质情况，研究并建立杂质检测的方法。 主要内容有(图5)： 图5. 质量管理体系建立流程图 3.3. 系统性红斑狼疮小鼠模型的建立 3.3.1. 小鼠血浆中自身抗体检测 Pristane处理组小鼠血浆中自身抗体含量明显高于PBS，对照组外周高滴度自身抗体的持续存在是SLE 最主要的病理特征之一，也是SLE小鼠模型是否和人类疾病病理模型相近的主要评价指标之一。为此，首先采用ELISA方法检测了pristane处理的不同时段收集的小鼠血浆中总IgG及抗dsDNA、ribosomal P0和sm RNP的IgG含量，该3种抗原属于SLE特异性的自身核抗原，其中抗ds-DNA IgG含量也是目前临床上SLE的主要特异性诊断指标。图6所示，pristane处理组血清中总IgG及anti-dsDNA、anti-ribosomal P0及anti-smRNP IgG含量从第2个月起开始持续上升，自第3个月起抗ribosomal P0 的自身抗体的水平已经明显高于PBS对照组，从第4个月起，抗ribosomal P0和抗sm-RNP的水平均显著高于PBS处理组，至6个月处死时3种抗自身抗体的IgG含量抗体达到最高，相对于对照组均明显升高(P < 0.01)，表明pristane处理后可以导致小鼠逐渐产生抗自身核DNA和核蛋白的自身抗体，其中抗ribosomal P0及sm-RNP IgG的增高相对抗dsDNA IgG来说出现的时间更早，也更明显。 3.3.2. 小鼠肾脏病理变化 6个月后处死小鼠，取新鲜肾脏制成石蜡切片，计数小鼠肾小球断面的细胞核数，计数了20个肾小球断面并取其平均值，显示pristane处理组小鼠肾小球断面平均细胞核数明显高于PBS对照组(图7)，表明处理组小鼠肾小球发生了明显的细胞性硬化症，处理组小鼠的这种肾脏损伤与大量IgG在肾脏的沉积相一致。 图6. 小鼠血清中总IgG及自身抗体含量 图7. 小鼠肾脏免疫复合物沉积及病理损伤 3.4. UC-MSC移植治疗系统性红斑狼疮小鼠有效性评估 3.4.1. UC-MSC移植对系统性红斑狼疮小鼠尿蛋白定量(24h)的影响 对照组小鼠从16周龄始，尿蛋白逐渐升高。治疗组小鼠在治疗的初期，尿蛋白也逐渐上升，但上升趋势较对照组明显减慢。32周时UC-MSC组水平低于模型组(P < 0.01) (图8)。 图8. UC-MSCs移植对系统性红斑狼疮小鼠尿蛋白定量(24 h)的影响 3.4.2. UC-MSC移植对系统性红斑狼疮小鼠肾脏病理学检查 模型组小鼠肾脏病理显示显著的病理改变(图9)，表现为肾小球硬化、肾小球系膜细胞增殖、基质增宽，并可见新月体形成，肾间质内大量淋巴细胞浸润。脐带MSCs组表现为系膜细胞，系膜基质轻至中度增生，局灶性硬化，偶尔可见的肾间质的炎症细胞的浸润。 图9. UC-MSC移植对系统性红斑狼疮小鼠肾脏病理的影响 3.4.3. UC-MSC移植对狼疮鼠抗ds-DNA抗体的影响 UC-MSCs组(2.6 ± 0.9)抗ds-DNA抗体水平明显降低，与模型组(4.8 ± 0.7)相比差异有显著性意义，见表1。 Table 1 Changes of serum antibodies after umbilical cord MSCs transplantation ( x ¯ ± s ， A 组别 ds-DNA 对照组 0.2 ± 0.4 模型组 4.8 ± 0.7 UC-MSC治疗组 2.6 ± 0.9 a 表1. 脐带MSCs移植后血清抗体的变化 ( x ¯ ± s ， A ) a P < 0.05， vs.模型组。
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user: 4. 讨论 人脐带MSCs是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源丰富、易于采集、保存和运输、移植前无需清髓处理、避免伦理争议等诸多优点 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]。由于MSCs没有MHC限制性，在异体MSCs移植时无排斥反应发生，而且MSCs在分化成其他细胞类型时仍保留其特性，临床上已将MSCs应用于组织工程、大剂量化疗后造血支持、治疗移植物抗宿主病等。 大量研究表明可通过多种途径调节炎症因子的释放，在体内外均可发挥免疫抑制作用 [ 12 ] [ 13 ]，此外，MSCs还可诱导免疫耐受、抑制自身免疫反应，从而发挥治疗作用。目前认为MSCs的作用机制可能主要通过与免疫细胞(如T淋巴细胞，树突状细胞，B淋巴细胞等)直接接触发挥效应，还可能通过改变细胞因子分泌网络间接影响免疫细胞，但确切机制仍不清楚。 近年来对肾损伤疾病的研究也显示MSCs输注可促进肾损伤的结构修复和功能恢复，MSCs可迁移至受损的肾脏并分化为肾小管上皮细胞，加快肾小管细胞增殖速度 [ 14 ]。大量研究结果表明健康人骨髓MSCs移植治疗狼疮鼠能显著降低尿蛋白和血抗ds-DNA抗体水平，狼疮鼠肾病理显著改善 [ 15 ] [ 16 ]。结果发现，MSCs移植后，24 h尿蛋白定量降低、抗dsDNA抗体水平下降、肾脏病理改变明显好转，表明MSCs移植对狼疮肾炎具有治疗作用，这与国内外的研究报道相一致。实验结果提示MSCs移植可以通过抑制促炎因子的作用而发挥免疫抑制作用；同时，尿蛋白定量(24 h)降低、抗ds-DNA抗体水平下降，肾小球硬化、间质纤维化程度及间质炎症细胞浸润程度较对照组减轻，这些结果均表明MSCs对狼疮鼠肾脏病变具有修复作用。
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user: 摘要 脆性X综合征(Fragile X syndrome， FXS)是一种智力缺陷和自闭症谱系的单基因遗传疾病。位于Xq27.3染色体的Fmr1基因沉默，造成该基因编码的mRNA翻译抑制因子FMRP表达缺失，从而导致FXS患者神经系统发育障碍。本研究采用质粒转染293T细胞获取AAV9-FMRP腺相关病毒载体，通过立体定位方法将AAV9-FMRP注射到成年Fmr1 KO小鼠侧脑室。免疫组化检测发现AAV9介导的FMRP可以在Fmr1 KO小鼠海马和顶叶皮层等脑组织中获得性表达；免疫荧光检测发现FMRP定位于小鼠海马神经元胞质。研究结果表明，通过腺相关病毒可以介导FMRP在成年Fmr1 KO小鼠脑组织中获得性表达。
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user: 1. 引言 脆性X综合征(Fragile X syndrome ，FXS)是一种智力缺陷和自闭症谱系的单基因遗传病 [ 1 ]。FXS患者在智力发育方面存在缺陷，语言交流能力较弱，人际交流时回避直接对视，存在社交障碍和广泛性焦虑。FXS患者具有与正常人不同的体态特征，伴有前额和下颌突出、耳朵外凸、腭弓较高、嘴大唇厚、关节松弛、脊柱侧凸等外在症状 [ 2 ]。已有大量研究表明，FXS是一种单基因遗传疾病，位于Xq27.3染色体的Fmr1 (Fragile X mental retardation 1)基因在5’端的CGG三核苷酸重复系列扩增超过200拷贝，导致启动子区域的胞嘧啶发生甲基化修饰 [ 3 ]，染色质组蛋白过度乙酰化 [ 4 ]，致使Fmr1基因沉默。该基因编码的蛋白FMRP (Fragile X mental retardation protein)是一种mRNA结合蛋白，它所调控的mRNA靶分子具有广泛性和不确定性。FMRP的功能主要是抑制mRNA翻译，然而也有FMRP促进孤独症相关大分子蛋白mRNA翻译的报道 [ 5 ]。此外，FMRP通过RNA结合蛋白参与pre-mRNA的剪切 [ 6 ]。 Fmr1基因敲除(Knockout， KO)小鼠是FXS的动物模型，具有学习记忆障碍、易发癫痫、多动等行为学症状。在Fmr1基因敲除后，由于FMRP的缺失，失去FMRP抑制作用的mRNA翻译水平升高，造成神经元蛋白表达量过度增加，突触的数量呈现非活动依赖性增加，使神经网络信号传递出现异常 [ 7 ] [ 8 ]。 腺相关病毒(AAV)是一种非包膜微小病毒，病毒颗粒直径约20~26 nm，其所介导的基因独立于宿主基因组稳定表达。与其它类型的病毒载体相比，AAV具有较低的免疫原性，在宿主神经组织中可以长时间介导外来基因表达，例如，AAV介导的基因可以在帕金森疾病非人灵长类动物模型脑组织中持续表达15年 [ 9 ]，在帕金森病人脑中持续表达5年 [ 10 ]。因此，AAV作为安全性较高的病毒载体应用于中枢神经系统疾病的基因治疗受到广泛关注。据前人报道，基于AAV构建的FMRP表达载体可以有效修复Fmr1 KO小鼠的海马脑区LTD [ 11 ]，并改善幼年Fmr1 KO小鼠成年后的重复刻板行为和社交支配行为 [ 12 ]。本研究采用成年Fmr1 KO小鼠，观察AAV9-FMRP在成年Fmr1 KO小鼠各脑区的分布表达情况，为今后进一步应用基因疗法治疗成年后的FXS病患提供参考依据。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验动物 本研究采用的Fmr1 KO小鼠由美国密歇根州立大学Wang H.B.教授惠赠。动物房的温度控制在21℃~23℃、湿度保持在50%左右，每天光照时间12 h。小鼠自由饮食饮水。同窝出生的野生型(Wildtype，WT)小鼠作为对照组，所有实验小鼠均为成年(≥3月龄)雄性小鼠。 2.2. AAV9质粒共转染293T细胞 使用去内毒素的质粒提取试剂盒进行质粒提取，将获得的质粒−20℃保存。配制Ca-DNA转染液：取质粒DNA共75 μg，包括两个AAV9辅助质粒(p-Rac，p-Helper)和目的基因质粒(pAAV-SYN1-Fmr1)各25 μg，加入500 uL 0.25 M的CaCl 2 溶液，用ddH 2 O补足CaCl 2 溶液体积至2.5 mL，再加入2.5 mL 2 × BES溶液，充分混合均匀。将293T细胞培养皿中的旧培养基移除，更换为培养基A(将含10% FBS的DMEM按体积1000:1加入25 mM的氯喹溶液)15 mL，孵育15 min，向培养基中均匀滴加Ca-DNA转染液5 mL。滴加转染液后，将培养皿置于37℃、5% CO 2 培养箱中孵育3~4 h。移除所有培养基，每个15 cm皿中沿壁缓慢加入2~3 mL PBS溶液洗涤一次。吸弃PBS，加入培养基B (按体积100:1在含10% FBS的DMEM中加入500 mM的丁酸钠溶液) 25 mL，培养72 h后收集细胞。收取细胞后反复冻融3次，配制不同浓度的碘克沙醇溶液，通过离心、沉淀、透析等步骤获得纯化的AAV9-FMRP病毒载体溶液，保存于−80℃。 2.3. 实时定量PCR测定基因组拷贝数 将5 μL待测AAV9-FMRP样品或对照质粒(pAAV-SYN1-Fmr1，5 × 10 7 GC/μL)加入15 μL DNase I消化反应液中，37℃孵育30 min，对DNaseⅠ失活处理后转入95℃，孵育10min，取出放在冰盒中。对AAV9-FMRP样品或对照质粒进行稀释。实时定量PCR反应体系20 μL，包括2 × SYBR Mix 10 μL、ploy A forward primer 1 μL、ploy A reverse primer 1 μL、待测样品2 μL、无核酸酶水6 μL，每个样品各3个重复。设置以下程序运行PCR：预变性95℃ 10 min；然后95℃ 30 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，35个循环；溶解曲线：95℃ 5 s，65℃ 1 min，40℃ 10 min。Q-PCR运行结束后，利用换算系数和AAV基因组单链性质计算AAV9-FMRP载体基因组拷贝数：GC拷贝数/mL = PCR运行得到的平均拷贝数 ÷ 5 μL × 2 × 稀释倍数(DNase稀释4倍 × 后续稀释10，000倍) × 1000。 2.4. 立体定位注射 使用1%戊巴比妥钠将小鼠深度麻醉(100 mg/kg)，固定于立体定位仪，使用体温加热垫保持麻醉小鼠肛温37 ± 1℃。玻璃毛细管顶端定位于双侧侧脑室(前囟旁开±0.8 mm，前囟后0.3 mm，颅骨表面向下深度2.2 mm)。使用微量进样器，将1 μL AAV9-FMRP或PBS以0.1 μL/min的速率注入单侧侧脑室，注射完成后玻璃管静置10min。按照基因型和注射溶液把小鼠分为4组，分别是WT + PBS组、WT + AAV9-FMRP组、KO + PBS组、以及KO + AAV9-FMRP组。手术后的各组小鼠返回笼中饲养4周。 2.5. 免疫组化检测 各组小鼠深度麻醉后进行心脏灌流取脑，30%蔗糖脱水，OTC包埋，冰冻切片(15 um)。PBST (0.3% Triton X-100)浸洗切片10 min，5% BSA室温封闭1 h，FMRP (Cell Signaling Technology， USA)一抗4℃孵育过夜。二抗HRP (Millipore， USA)室温孵育1 h，DAB显色，显微镜观察、拍照。采用ImageJ软件，对脑组织切片进行DAB染色强度和阳性细胞数初步分析。 2.6. 免疫荧光检测 使用适量的EDTA-柠檬酸钠抗原修复液，在微波炉中使用低火，对切片进行20 min的抗原修复。PBST (0.3% Triton X-100)浸洗切片3次，每次10 min。5% BSA室温孵育1 h，FMRP、Neun一抗4℃孵育过夜，1 × PBS浸洗切片3次，每次10 min。DAPI室温孵育10 min，1 × PBS浸洗切片10 min。荧光二抗室温孵育1 h，对切片进行封片。荧光显微镜观察、拍照。
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user: 3. 结果 3.1. AAV9-FMRP病毒载体制备 为了验证氯化钙转染细胞方法的可靠性，我们以p-EGFP质粒转染293T细胞，在不同的时间点(24 h、48 h和72 h)用荧光显微镜观察，发现在p-EGFP质粒转染48 h和72 h后，293T细胞已经能够稳定呈现较强的绿色荧光(图1(A))。因此，我们采用氯化钙转染细胞方法，将两个辅助质粒(p-Rac，p-Helper)和目的基因质粒(pAAV-SYN1-Fmr1)共同转染293T细胞，得到包含目的基因的AAV9-FMRP病毒载体(图1(B))。在转染293T细胞72 h后，裂解293T细胞获取病毒载体，进行病毒载体富集和纯化，经基因测序证明病毒载体构建成功。Q-PCR测定结果显示AAV9-FMRP病毒载体拷贝数为1.5 × 10 11 GC/mL (图1(C))。 图1. 转染293T细胞获取AAV9-FMRP病毒载体 3.2. AAV9-FMRP介导FMRP在各脑区的表达分布 免疫组化结果发现，FMRP在野生型小鼠的额叶皮层、顶叶皮层、海马、枕叶皮层和小脑等脑区均有表达。在侧脑室注射AAV9-FMRP病毒载体后，野生型小鼠除小脑外，其它各脑区的FMRP表达水平有所增加。然而，Fmr1 KO小鼠所有脑区的FMRP表达缺失，在注射病毒载体后，其额叶皮层、顶叶皮层和海马脑区出现了表达FMRP的阳性细胞，说明AAV9-FMRP病毒载体使Fmr1 KO小鼠的这些脑区获得了FMRP的表达(图2)。 图2. AAV9-FMRP载体介导FMRP在各脑区的表达 3.3. AAV9-FMRP介导的FMRP表达与海马神经元共定位 免疫荧光检测结果显示，FMRP的表达定位于野生型小鼠海马CA3区神经元胞质。在侧脑室注射病毒载体后，Fmr1基因缺失小鼠海马CA3区可检测到FMRP阳性神经元，表明AAV9病毒载体介导的FMRP在海马神经元存在获得性表达(图3)。
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user: 4. 讨论 有多种AAVs包括AAV2、AAV5、AAV8、AAV9等可用于中枢神经系统疾病的基因治疗，其中AAV9可以在大脑和脊髓中广泛表达，优先结合神经元和胶质细胞 [ 13 ]。本研究采用氯化钙转染293T细胞的方法制备了AAV9-FMRP病毒载体，该病毒载体包含神经元特异性启动子SYN1，有助于提升FMRP在神经元的特异表达。通过侧脑室注射AAV9-FMRP，可以使Fmr1基因缺失的成年小鼠大脑重新获得FMRP的表达，其表达范围主要集中在额叶皮层、顶叶皮层和海马脑区。在Fmr1KO小鼠距离侧脑室较远的脑区，如小脑和枕叶皮层，未发现AAV9介导的FMRP表达或表达较少，其原因可能是由于病毒载体注射位点与FMRP未表达脑区之间物理距离较远；另外，前人报道发现AAV9-FMRP在幼年Fmr1KO小鼠侧脑室注射56天后，FMRP在海马神经元的表达水平达到野生型小鼠正常水平的50% [ 12 ]，因此，本研究 图3. FMRP在各组小鼠海马CA3神经元的表达情况 在AAV9-FMRP注射4周后采样检测，有可能病毒载体拷贝数量尚未达到峰值，从而影响FMRP在Fmr1KO小鼠各脑区的表达水平。 前人研究表明，从基因水平通过AAV9载体介导FMRP在FXS模型小鼠脑中获得性表达，可以改善该模型小鼠的重复刻板行为和异常的社交支配行为 [ 12 ]，恢复正常的长时程突触抑制 [ 11 ]，可以推测FMRP获得性表达之后，FXS模型小鼠某些脑区神经元的结构和功能能够得到一定程度的修复。AAVs病毒载体相较于慢病毒和腺病毒具有较低的免疫原性，可以介导不依赖于宿主基因组的目的基因进行长时间的稳定表达 [ 14 ]，因此AAVs是介导目的基因在体内表达的较优选择。有研究发现，AAV8-GFP在CMV启动子控制下，过量表达的GFP对黑质多巴胺能神经元存在一定程度的毒性作用 [ 15 ]。然而，本研究采用的AAV9-FMRP是通过SYN1启动子调控，该启动子具有神经元特异性 [ 16 ]，目前我们尚未见SYN1调控的AAV9载体具有神经毒性的报道。基于AAV9开展针对FXS以及其它中枢神经系统疾病(如帕金森病)的基因治疗手段，安全性较好，对于治疗神经系统疾病具有潜在的应用前景 [ 17 ]。
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user: 摘要 本文介绍了池塘循环微流水养殖模式的组成和优势，总结了池塘循环微流水养殖模式的发展现状及存在的问题，最后提出了优化该模式的建议。
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user: 1. 养殖模式介绍 池塘循环流水养殖技术(In-pond Raceway Aquaculture Technology， IPA)是基于2010年美国大豆出口委员会(USSEC)与奥本大学(Auburn University)合作开发的一种名为“池塘赛道系统(In pond Raceway System， IPRS)”的生态友好、可持续发展的生产性水产养殖方法 [ 1 ]。该项目由USSEC资助，经过三年的彻底测试后，于2013年正式面向中国水产养殖户进行推广。 1.1. 池塘循环微流水养殖模式的组成 池塘循环微流水养殖就是将传统的池塘水产养殖模式与流水养殖模式相结合并加以改造优化，把“生态圈养”的概念用于水产养殖，加以工厂化的管理和自动化的技术，从而实现水产品的低能耗高密度混养。整个池塘循环微流水养殖系统由微流水养殖区、净水区、粪便收集池、吸污装置、自动化投饵机、曝气格栅系统、备用发电机和水体监控系统组成(见图1) [ 1 ] [ 2 ]。每公顷养鱼面积有三个模块化的单元结构，以最大限度地利用池塘的生产能力。水产品养殖槽的规格一般设立深2 m，宽5 m，长22 m，在下方连接粪便收集池，通过吸污装置实现自动吸污，加之合理设计和组装曝气格栅系统，从而实现高效曝气和流量生成 [ 3 ] [ 4 ]。此外，良好的鼓风机和曝气栅同步系统，可在各级水柱上产生有效的曝气量和流量。在静止区利用生物净化以有效地清除系统中的有机流出物。同时在适当地方安装水质监察设备，以保证养殖户能随时得到水质信息反馈 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]。 图1. 低碳高效池塘循环流水养鱼池设计示意图 [ 1 ] 1.2. 池塘循环微流水养殖模式优势显著 IPRS实质上是四种水产养殖系统的优势集合体：再循环系统、水道模型、网箱养殖和池塘水产养殖系统 [ 8 ] [ 9 ]。前三种养殖系统更多是依赖于机械，但将它们与池塘水产养殖模式相结合带来了生物系统带来的优势。在池塘循环微流水养殖模式下能够有效提高产量，据统计，使用该生产模式的养殖户每年可以从1公顷的池塘生产80到110吨的鱼 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]。 养殖户可以在同一个循环流水系统中同时管理多个不同品种和规格的水产品。基于这种模式的高度灵活性和减轻人工成本的优势，养殖收入远远好于传统的养殖模式 [ 13 ]。此外，养殖品种长期生活在氧气充足的微流水环境中，保证成活率高、疾病爆发少、防病治病更加容易，鱼药使用率低，水产品更为绿色健康。微流水所形成的“活水”能够刺激鱼体运动 [ 14 ]，池塘中养殖的都是“跑步鱼”、“冲浪鱼”、“运动鱼”，不用依靠复杂的饲料配方改善就能大幅提高鱼体肌肉品质，肉质更为鲜美 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]。在不同的养殖池中可以实行不同品种和不同规格的混养并交替上市，规避以往单一品种养殖所带来的经济风险，确保养殖户季度收入均衡。在池塘循环微流水养殖模式下，水产养殖人员可以实现解放双手，从而将传统养殖转变为工厂化、自动化的水产养殖 [ 18 ]。依靠强大的水质处理系统，排放的污水可以忽略不计，降低对环境的污染，切实解决养殖水体富营养化的问题，利用生物手段净化养殖污染，形成资源节约、环境友好、养殖集约、产品安全的水产养殖模式，实现水产养殖行业的可持续发展 [ 19 ] [ 20 ]。
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user: 2. 国内发展现状 2.1. 养殖规模日益扩大 早在2006年江苏省就开创先河，启动了关于智能化低碳循环水养殖的试验 [ 21 ]。2013年，USSEC将池塘循环微流水养殖模式带来中国，于江苏省江苏市平望养殖场开展了该技术模式的示范养殖 [ 1 ] 并取得了良好的收益。随后，全国各地借鉴这一经验，开展了多处试点并逐步扩大规模。其中以江苏省IPA数量和规模发展最为快速，水槽数量位列全国第一。安徽省同样在2013年底启动IPA试验，在铜陵市、六安市等地逐渐展开试点，草鱼、青鱼、鲫鱼的单个水槽养殖产量可达16~23吨 [ 22 ]。2014年IPA被引入北京市，主要在郊区展开，至今已初具规模，建立了7个模式示范点并运行19条水槽 [ 23 ]。浙江省虽然起步较晚，但发展势头迅猛，这得益于政策和宣传双管齐下的策略。从2015年引入该模式后，截止2018年底浙江已经建成734条水槽投入生产使用 [ 9 ]。重庆的水产养殖饱受气候、地理条件的制约，存在养殖难度大、养殖成本高的问题，2015年底IPA引入重庆，先后在多个区县成功试点，增产效果显著，产量甚至可以达到传统池塘养殖的3倍以上 [ 24 ]。2016年，宁夏充分利用自己的淡水资源，借鉴安徽六安的池塘循环微流水养殖经验，在中卫市开展技术试验，亩均利润可达4000元以上 [ 25 ]。湖南、湖北、广东、贵州等地也均有企业开始逐步从传统池塘养殖向池塘循环微流水养殖转型 [ 26 ]。 2.2. 品种搭配百花齐放 IPA最开始的试点选用的是不同规格的草鱼混养，以达到均衡上市的效果。但短短7年，IPA已经逐步融合中国市场的需求，各地因地制宜，开启了多种混养模式组合生产的新形式。以草鱼为主养鱼种，现已建立“草鱼–鲢–鲤”、“草鱼–鲫–鳙”、“草鱼–鲢–对虾”、“草鱼-鲢-团头鲂”等多种混养生态系统模型 [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]。此外还有“青鱼–异育银鲫–青虾”、“三角鲂–鲢–鲫鱼”、大口黑鲈不同规格混养、“松浦镜鲤–鲢”、“太阳鱼–螺蛳”和“鳜鱼–鲮鱼”等多种混养模式 [ 29 ] - [ 35 ]。养殖品种的选择也日趋丰富，北京的养殖试验中，先后开展了草鱼、鲤鱼、加州鲈、大鳞鲃、斑点叉尾鮰、鲟鱼等十余个水产品种的试验养殖 [ 23 ] [ 36 ]。安徽省对团头鲂、黄颡鱼、鲈鱼、鳜鱼、斑点叉尾鮰、青鱼、鲫鱼都开展了不同规模的养殖，并对以上品种建立了科学合理的养殖模式。除了水槽内的主要经济品种的日益丰富，在净化区的混养搭配也逐渐多元化，“水草 + 甲壳类 + 鲢河蚌”、“水草 + 蚌 + 鳖 + 泥鳅”、“水草 + 鲢 + 团头鲂 + 鳙”等净水区套养模式均可带来额外的经济收益 [ 37 ]。水草品种的选择也日渐丰富，在夏季可选则在水上种植空心菜、伊乐藻、菖蒲，在温度较低的季节可选中水生植物铜钱草、狐尾藻，秋季还可种植茭白、空心莲子草等 [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]。 2.3. 科学研究逐步展开 近几年来，随着池塘循环微流水养殖模式规模的逐渐扩大，与之相关的科学研究也紧随而来。安阳市水产科学研究在IPA模式下进行了雌核发育草鱼的养殖试验，研究表明，雌核发育草鱼能够很好地适应池塘微流水环境，成活率高的同时亩均收入也十分可观 [ 42 ]。这说明，IPA模式是可以广泛推广并不断开发的可持续发展模式。江苏对净化区水域养殖空心莲子草可行与否展开试验，结果表明空心莲子草的种植对于池塘循环微流水系统的水质具有明显的改良作用，能使水体透明度提高的同时起到降低养殖水体氨氮、亚硝态氮、COD值、总氮、总磷的作用 [ 43 ]。桐乡市对其IPA系统内的水生植物进行调查，采集到了包括灯心草科在内的20个科的32种水生植物，远远高于一年前建设时人工栽培的水生植物，养殖污染在净水区得到了有效净化 [ 44 ]。周恩华等 [ 45 ] 在海南利用池塘循环微流水养殖模式与改良的豆粕饲料成功养殖两茬巴沙鱼，对巴沙鱼的产量有明显提升，开创了利用IPA养殖巴沙鱼的新模式。这表明，未来可以将IPA用于更多的养殖品种，大幅提高原本经济效益不高的养殖品种所带来的养殖利润。关于IPA的研究也不止局限于此，浙江省淡水水产研究所联合金华市水产技术推广站展开了水库串联池塘流水的养殖模式，既可以充分发挥水库资源，又可以利用IPA净化水库水质，有效的弥补了水库退养造成的经济损失，为水库实现绿色经济提供新渠道 [ 46 ]。