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user: 3. 结果与讨论 3.1. 初步筛选 用VD 3 骨架在小分子化合库ZINC15中搜寻潜在的化合物，最终获得176个候选化合物。利用RDKits对176个小分子进行性质分析。目前已经上市的VD 3 的分子量为384.63，logP为7.6，供受体均为1，环的数量为3个。分析可知，从Zinc数据库所选的化合物与VD 3 有着较高的相似性，大部分含有三个六元环并一个五元环，且都含有一条侧链骨架，为类固醇类物质，此类小分子均存在发生羟化的活性位点的可能性。另外，结合图2及图3可以发现所选取的化合物的理化性质均与化合物VD 3 相似，进一步说明Vdh可能具有羟化类固醇的潜力。 图2. 化合物的相对分子质量的统计分布 图3. 化合物的物理化学性质的统计分布 3.2. 对接结果 为进一步验证对接的准确性，我们将蛋白质晶体中的小分子VD 3 作为配体，与处理好的蛋白受体对接，对接后两者构象重叠很好，RMSD = 0.538 < 2.0 Å，说明本实验中设置的对接参数合理，对接模型可靠(图4)。将小分子库与Vdh的活性位点进行对接，对接结合能越低，说明小分子与酶结合得越好。按照对接得分，对潜在的底物小分子进行排序，挑选对接能最低的16个小分子进行验证(表2)。这些小分子的对接结合能均小于Vdh与VD 3 的对接结合能(−7.80 kcal/mol)，说明这16个小分子可能会与Vdh稳定结合。 图4. Vdh与VD 3 对接结果。图中绿色小分子表示对接后VD 3 的构型；蓝色表示原晶体中VD 3 的构型 Table 2 Docking energy and binding free energy of Vdh and small molecule Name Energy score (kcal/mol) Binding Energy (kcal/mol) VD 3 −7.80 −42.5313 ZINC000002090692 −7.88 −47.8254 ZINC000248240125 −8.04 −52.8194 ZINC000248240127 −8.37 −56.0777 ZINC000252462409 −8.23 −52.5744 ZINC000253497611 −8.04 −51.2147 ZINC000257349893 −9.28 −48.3397 ZINC000257350112 −8.06 −55.3837 ZINC000036371233 −8.27 −48.3369 ZINC000257349628 −8.15 −84.7702 ZINC000257357010 −8.87 −47.6784 ZINC000257357012 −7.97 −39.3887 ZINC000257357013 −8.49 −40.1227 ZINC000003825930 −9.00 −43.0325 ZINC000169317022 −9.20 −49.9831 ZINC000038791845 −8.50 −52.6700 ZINC000033820630 −8.60 −36.6106 表2. Vdh与小分子的对接能和结合自由能 3.3. 分子动力学结果 经过两次能量最小化，加热，两次平衡和动力学模拟之后，计算小分子及VD 3 与Vdh结合的结合自由能，结合自由能越小，表明受体与配体的亲和力越高，反之亦然 [ 22 ]。最终筛选出来16个小分子的结合自由能都与原底物VD 3 相似，部分甚至比VD 3 有更好的结合自由能打分(表2)。将16个化合物按照相似性分为4组，最后从中选出4个小分子进行进一步的分析。Vdh与VD 3 的结合自由能为−42.5313 kcal/mol，挑选的小分子ZINC000248240127为−56.0776 kcal/mol，ZINC000252462409为−55.387 kcal/mol，ZINC000253497611为−51.2147 kcal/mol，ZINC000257349893为−48.3397 kcal/mol，结合自由能均低于Vdh，说明挑选出来小分子均有可能与Vdh发生反应，这说明最终筛选出的潜在底物分子有一定的可靠性。我们分析了四种小分子与Vdh的结合作用力。范德华力和表面溶剂作用有利于化合物小分子的结合，极性溶剂化作用不利于小分子与Vdh的结合(表3)。实验结果提示，在Vdh与小分子的体系中，范德华力起主导作用，可能是与活性中心周围的非极性氨基酸如M184，V283，P287，L387等形成的疏水环境有关。 Table 3 Calculation results of each energy term of MM/GBSA of the composite system of Vdh and small molecule Name 化合物结构 范德华力 (kcal/mol) 静电势能 (kcal/mol) 溶剂化作用 (kcal/mol) 非极性溶剂化作用 (kcal/mol) ZINC000248240127 −61.8503 1.9303 10.3824 −6.5398 ZINC000252462409 −60.3752 −2.1143 16.0291 −6.1140 ZINC000253497611 −55.1539 1.0019 8.4986 −5.5613 ZINC000257349893 −55.3001 −0.4856 13.2185 −5.7725 VD 3 −48.3288 −3.8471 15.8063 −6.1617 表3. 复合体系的MM/GBSA各能量项的计算结果 RMSD的计算可用于研究蛋白质–小分子复合物的变化和稳定性。从图5可以看出，四个小分子的RMSD基本保持稳定，前30 ns出现了明显波动，之后基本维持稳定。对于Vdh-VD 3 体系，初始位置至30 ns的波动值为1.8 Å，ZINC000248240127初始位置至30ns的波动值为1.75 Å，ZINC000253497611初始位置至30 ns的波动值为2.5 Å，ZINC000257349893初始位置至30 ns的波动值为2.2 Å。其中，Vdh的收敛值为2.0 Å，ZINC000248240127为1.5 Å，ZINC000252462409为2.0 Å，ZINC000253497611为2.0 Å，ZINC000257349893为2.0 Å，说明ZINC000252462409与Vdh的结合更稳定，与动力学结果基本一致。四个小分子与Vdh的结合与Vdh-VD3相互作用的特征保持一致，说明四个小分子对蛋白整体构象的影响与VD3基本一致。 图5. 分子动力学中RMSD结果。A：ZINC000248240127；B：ZINC000252462409；C：ZINC000253497611；D：ZINC000257349893 3.4. Vdh蛋白表达及筛选结果验证 对含有重组表达载体的大肠杆菌BL21使用0.5 mM IPTG在37℃下诱导6个小时，在冰上破碎后用Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠进行纯化。使用SDS-PAGE鉴定目的蛋白。SDS-PAGE结果显示在目的蛋白大小处均有明显的条带(45 kDa) (图6)。 通过薄层色谱TLC对催化产物检测，由图7可知，四个化物反应标准品与反应物均不在同一个位置，说明发生了催化反应。其中结合最强的ZINC000248240127小分子的结果出现了两个产物点，说明可能发生了两个不同位点的羟化，结合力最差的ZINC000257349893产物中出现了底物，说明转化率不高，也进一步验证了结合自由能低。说明Vdh可以催化这些小分子，进一步证明利用虚拟筛选扩宽底物谱具有较高的准确性。 图6. Vdh蛋白SDS-PAGE电泳结果 图7. Vdh催化小分子反应结果的薄层层析。(a)：ZINC000257349893；(b)：ZINC000252462409；(c)：ZINC000253497611；(d)：ZINC000248240127