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user: 2. 农田土壤nirK和nirS型反硝化微生物影响的研究进展 2.1. 研究土壤nirK和nirS型反硝化微生物的技术方法 土壤nirK、nirS型反硝化细菌的研究方法有很多，从国内外目前采用的方法来看，大致包括以下几类：1) 传统的微生物平板纯培养方法；2) Biolog微平板分析方法；3) PLFA谱图分析方法；4) 分子生物学分析方法；5) 其他方法，如土壤酶活性分析方法、同位素示踪法，以及荧光标记蛋白、荧光染色和荧光原位杂交等(图2) [ 6 ]。 下面对几种主要的实验研究方法加以介绍和评述。 2.1.1. 传统的微生物平板纯培养方法 微生物平板培养法是一种传统的实验方法，这种方法主要是根据目标微生物选择相应的培养基，将微生物分离培养，然后通过各种微生物的生理生化特征以及外观形态等方面进行分析和鉴定。但该分析方法只能分离0.1%~0.5%的土壤微生物 [ 7 ]，很难得到微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息，具有很大的局限性。因此，在土壤微生物群落多样性的研究中，需要结合现代分子生态技术来了解更详细的土壤微生物信息。 2.1.2. Biolog微平板方法 Biolog微平板法是通过测定土壤微生物对95种碳源利用能力的不同来表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的一种方法。这种方法在土壤微生物群落功能多样性的评价中得到了广泛应用。其具体做法是利用Biolog微平板系统，将土壤溶液接种到每一个微平板孔中，由于不同微生物利用不同的碳源 图2. 实验室尺度下土壤微生物多样性的研究方法 [ 6 ] 进行代谢反应，最终通过利用碳源的种类和强度差异使得每一个孔中的溶液呈现出不同的颜色，通过酶标仪将颜色变化测定和记录下来，即可得到土壤微生物特有的“代谢指纹”(Metabolic Fingerprint) [ 6 ]。根据土壤微生物的代谢指纹图谱，结合有关的计算机分析软件和已有的菌种库资料，便可以对某些微生物进行分类鉴定。Biolog微平板法对一般细菌的鉴定可以精确到种，但目前的数据库中菌种资料不完善，有些只能得到相似的类群。因此，对于微生物的分类鉴定，仅靠Biolog系统的方法是远远不够的，还需结合其他方法如微生物生理生化方法和表型分析等方法来进行。 2.1.3. PLFA谱图分析方法 磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid， PLFA)谱图分析方法主要应用于研究复杂群落中的微生物多样性 [ 8 ] [ 9 ]。磷脂类化合物只存在于生物的细胞膜中，且不同微生物体内的磷脂脂肪酸的含量和组成不同。一旦微生物体死亡，其中的磷脂化合物便会马上消失。因此，磷脂脂肪酸分析法十分适合于土壤微生物群落的动态监测。PLFA的提取和分析是该方法的关键步骤，提取方法主要分为简单提取、扩展提取和商用微生物鉴定系统(MIDI)等 [ 8 ]。简单提取方法和MIDI方法提取土壤PLFA所得到的脂肪酸谱图相似 [ 10 ] [ 11 ]，一般可以提取到20~40种脂肪酸，采用扩展提取方法检测到的PLFA数量介于190至360种之间 [ 12 ] [ 13 ]。PLFA方法是一种快速、可靠且可重现的分析土壤微生物群落结构的方法，最适合用于总微生物群落分析，但不适合单一的微生物种类研究。因此，该方法并不适合于nirK、nirS型反硝化细菌的研究。另外，该方法一个明显的缺陷是实验条件要求高，成本高，因而在实际研究工作中会受到一定的限制。 2.1.4. 分子生物学方法 最近20~30年间，以核酸分析技术为主的分子生物学技术(如PCR、DGGE、RFLP、RAPD、AFLP等)的广泛应用 [ 14 ]，开拓了分子生物学与生态学的交叉领域，分子生物学技术也逐渐被应用到土壤微生物多样性的研究中 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]。PCR技术即聚合酶链式反应，是一种体外扩增核酸序列从而获得多个核酸拷贝的技术，可用于土壤微生物DNA的扩增和定性分析，还通过定量PCR技术对DNA的丰度进行检测；DGGE即变性梯度凝胶电泳，是根据PCR扩增产物中不同的rDNA片段在电泳胶中形成不同的rDNA指纹剖面，来直接反映土壤微生物rDNA多态性的方法。例如Sharma等首先采用RT-PCR的方法反转录nirS和nirK基因，之后用DGGE研究了不同作物根际土壤中有活性的反硝化微生物的群落结构，发现了不同作物的根际有不同活性的nirK基因 [ 19 ]；RFLP方法是利用PCR扩增产物，用限制性内切酶进行切割，通过DNA转印及分子杂交方法进行检测。例如Falk等采用T-RFLP方法，研究了海洋水体和沉积物中nirS基因的群落多样性，发现nirS基因的群落结构可能与环境条件密切相关 [ 20 ]；RAPD是以单一的序列随机的寡核苷酸为引物，由于不同样本的基因组序列不同，以致与引物互补退火结合的DNA片段可能增加或减少，导致扩增产物数目的变化；AFLP则是为了发现各样本基因组间差异的，有选择的扩增经酶切后的部分DNA片段。分子生物技术在土壤微生物多样性研究中的应用如图3所示。 2.2. 施氮肥对nirK和nirS型反硝化微生物影响的研究成果 2.2.1. 施氮肥对nirK和nirS基因丰度的影响 大量研究表明，农田土壤中施加氮肥可以显著提高nirK和nirS基因的丰度。陈晨等 [ 21 ] 采用室内培养试验和实时荧光定量PCR技术研究了施加有机肥对菜地土壤反硝化微生物功能基因丰度的影响，结果表明氮肥处理显著增加了nirK和nirS基因的丰度(P < 0.05)；在常规施氮肥的基础上，添加有机肥也可以显著提高nirK和nirS型反硝化基因的丰度(P < 0.05) [ 21 ]。杨柳青等发现长期使用尿素能增加土壤中nirK、nirS基因的丰度 [ 22 ]，这与陈晨等人 [ 21 ] 的研究结果一致。张星等利用田间取样和室内分析相结合的方法，探讨了在小麦–玉米轮作周期内，秸秆还田对土壤反硝化微生物功能基因的影响，实验结果证明秸秆还田显著提高了nirK、nirS和nosZ基因的丰度以及nirK/nirS与(nirK + nirS)/nosZ的比例 [ 23 ]。罗希茜等在不同施肥处理对水稻土亚硝酸还原酶基因多样性的影响研究中指出，平衡施化肥(氮、磷、钾及微量元素比例适宜)明显提高了nirK基因的多样性，单施氮肥使nirS基因多样性达到最高，其他施肥处理对nir基因多样性的影响并不显著 [ 24 ]。 2.2.2. 施氮肥对nirK和nirS型反硝化微生物多样性和群落结构的影响 土壤中的氮含量是影响土壤中反硝化微生物的一个重要因素，而向农田土壤中施加氮肥对nirK和nirS型反硝化微生物的影响却不一致。土壤反硝化微生物多样性和群落组成的研究在近几年来不断取得新的进展，部分研究成果见表1。氮肥的施用会明显改变nirK型反硝化微生物群落结构的组成，但对其多样性的影响并不显著，并且土层深度对nirK型反硝化微生物多样性的影响大于施肥。由此可见，nirK型反硝化微生物对土壤pH值、有机质和硝酸盐含量具有一定的敏感性 [ 32 ]。 根据表1中的研究，nirS型反硝化微生物对施肥的响应存在一定的矛盾。但不难发现，nirS型反硝化微生物群落结构对氮肥处理不敏感的研究都是以水稻土为研究对象，而在以小麦和玉米等为主的旱田中，施氮肥却可以显著改变nirS型反硝化微生物群落结构。由此可以得出：土壤含水量较高时，施氮肥促进了土壤中nirS型反硝化微生物多样性的增加，但对其群落结构影响不大；而在含水量相对较低的土壤中，nirS型反硝化微生物群落结构受氮肥影响显著，然而其多样性却没有显著变化。因此推测研究结果的不同可能与土壤条件(温度、水分、pH、含氧量等)、作物种类以及施肥方式有关 [ 33 ]。