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user: 3. 结果与分析 3.1. SbMCUs家族成员全基因组鉴定 利用AtMCUs家族成员蛋白序列进行blastp比对，从Phytozone搜索SbMCUs蛋白序列，利用PFAM、SMART和NCBI分析蛋白保守结构域，去掉不完整结构域的序列，获得4个SbMCUs家族成员(表1，SbOSCA1-SbOSCA5.2)。前人研究表明，拟南芥OSCA家族基因为6个 [ 8 ]，梨有7个 [ 10 ]。可见，SbMCUs基因家族成员数目较少。 如表1所示，SbMCU5.1和SbMCU5.2均定位在1号染色体上，虽然基因组序列差异较大，但氨基酸序列差异不大；SbMCU1和SbMCU2分别定位在3号和8号染色体上，两者的基因组序列差异较大，致使等电点和分子量差异也较大。TMHMM预测发现SbMCUs家族含有2个跨膜结构域(除SbMCU5.1外)。Softberry分析发现SbMCUs家族蛋白均定位在很多细胞器上，但根据前人已有的研究结果显示，MCU蛋白定位于叶绿体或线粒体中 [ 9 ] [ 14 ]，说明SbMCUs家族的亚细胞定位需要后续实验加以验证。 Table 1 Detailed information of the MCU family genes in Sorghum bicolo 序号 基因名 位点 染色体 染色体位置 基因长度 氨基酸 等电点 分子量 跨膜结构域 亚细胞定位 Code Gene name Gene locus Chromosome Chromosome location Gene length (bp) Protein length (aa) pI Mv (kDa) TM Subcellular localization 1 SbMCU1 Sb03g037980 3 65864989-65867979 2991 225 8.4 25900.95 2 Extr/Chlo/Pero/ER/Mito 2 SbMCU2 Sb08g002020 8 1983975-1986149 2175 291 9.22 33079.36 2 Extr/Pero/Mito/Golgi/Cyto/ER/Chlo 3 SbMCU5.1 Sb01g042210 1 72630740-72632041 1302 340 9.14 36874.58 0 Extr/Pero/Golgi/Mito/Cyto/Chlo 4 SbMCU5.2 Sb01g017910 1 18474034-18477463 3430 348 9.07 37860.64 2 Extr/Pero/Chlo/ER/Mito/Golgi 表1. SbMCUs基因家族成员信息 Note: Chlo: Chloroplast; Mito: Mitochondria; Nucl: Nucleus; Cyto: Cytoplasm; Pero: Peroxisome; ER: Endoplasmic reticulum; Extr: Extracellular; Golgi: Golgi 注：Chlo：叶绿体；Mito：线粒体；Cyto：细胞质；Pero：过氧化物酶体；ER：内质网；Extr：细胞外；Golgi：高尔基体 3.2. SbMCUs基因家族进化关系分析 为了揭示SbMCUs基因家族的进化关系，以拟南芥和水稻MCU家族基因作为参考，构建了系统进化树。对进化树进行拓扑结构分析发现(图1)，15个MCU基因被分为2个亚组(Subgroup I和Subgroup II)。每个亚组中都包含了双子叶在植物拟南芥和单子叶植物水稻、高粱中至少两个MCU家族成员，说明MCU家族的分化时间早于单、双子叶植物的分化时间。 图1. 高粱、拟南芥和水稻MCUs基因家族进化关系分析 3.3. SbMCUs基因家族染色体定位及基因复制分析 根据高粱基因组信息，对4个MCU基因进行了染色体定位分析(图2)。结果发现MCU分布在3条染色体上，其中1号染色体上有2个。 图2. 高粱MCU家族基因染色体定位 利用植物基因组复制数据库PGDD分析基因复制情况(表2)。结果发现，SbMCUs基因家族只有一对复制基因(SbMCU1和SbMCU2)；结合它们在染色体上的分布情况，判断它们以片段复制的方式实现进化，SbMCU1和SbMCU2的Ka/Ks为0.37，小于0.5，说明基因发生片段复制后，高粱基因经历了强烈的纯化选择，说明SbMCUs家族基因在结构上比较保守。 Table 2 Informations of gene duplicatio 复制基因 染色体 复制类型 Ka Ks Ka/Ks Gene duplication Chromosome Duplicate type SbMCU1和SbMCU2 3/8 片段复制 0.2929 0.7994 0.367 表2. 复制基因信息 3.4. SbMCUs家族基因结构分析 为了进一步鉴定不同组间的SbMCUs基因保守性和进化关系，本文对SbMCUs家族成员之间外显子和内含子分布的差异进行了比较(图3)。结果发现，SbMCUs家族均含有1个内含子和两个外显子；Subgroup I中，SbMCU2没有5’-UTR，Subgroup II中，SbMCU5.2没有3’-UTR。 图3. SbMCUs家族基因的进化树及结构分析 图4. SbMCUs家族功能结构域蛋白序列保守性和跨膜结构域分析。(A) SbMCUs家族MCU功能结构域蛋白序列比对。黑色框标注的为跨膜结构域；(B) SbMCUs蛋白跨膜结构域预测 3.5. SbMCUs家族蛋白序列保守性分析 通过氨基酸多重序列比对发现，SbMCUs家族蛋白具有高度的序列保守性，特别是Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU，PF04678)结构域(图4(A))。TMHMM在线软件预测SbMCUs蛋白的跨膜结构域，发现SbMCUs家族蛋白有2个跨膜结构域，除SbMCU5.1外，而且跨膜结构域均在Mitochondrial Calcium Uniporter结构域中(图4(B))。 3.6. SbMCUs家族成员蛋白保守结构域分析 为进一步明确SbMCUs家族成员的蛋白结构，分析了其功能结构域。如图5(A)所示，SbMCUs家族成员具有高度保守的1个功能结构域，即Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU，PF04678)。 为了进一步分析SbMCUs家族的保守性，利用MEME软件，鉴定了保守基序。如图5(B)所示，每个亚组的蛋白序列都高度保守，而不同亚组之间有一些差异，如SbMCU5.1和SbMCU5.2 (Subgroup II)比SbMCU1和SbMCU2 (Subgroup I)多了两个基序，为Motif 8和Motif 9。 图5. SbMCUs家族蛋白保守结构域分析。(A) SbMCUs家族蛋白保守功能结构域分析；(B) MEME分析SbMCUs家族保守Motif 3.7. SbMCUs家族组织表达模式分析 为了进一步了解SbMCUs基因家族，利用Phytozome基因表达数据，分析了SbMCUs基因在不同组织的表达(图6)。结果表明，SbMCU5.2在不同组织器官和生长发育阶段的表达量较SbMCUs基因家族的其他成员均高，在开花期下方处于生长状态的叶片和花蕾形成期处于生长状态的叶鞘表达量最高；SbMCU2和SbMCU5.1在不同组织器官和生长发育阶段的表达量在SbMCUs基因家族中最低；SbMCUs基因家族在花期的基因表达量较其他时期高。 图6. SbMCU家族组织表达分析 3.8. 逆境胁迫应答下SbMCUs基因的表达量分析 为了筛选响应逆境胁迫的SbMCUs基因，利用下载的转录组测序数据分析了SbMCUs家族在ABA、PEG和干旱胁迫下的表达(图7)。如图7(A)所示，Subgroup II中SbMCU5.1对ABA和PEG (渗透胁迫)在根和幼苗均有明显响应，在根中均显著下调(Log 2 变化倍数>2)，而在ABA处理后，SbMCU5.1在幼苗中显著上调(Log 2 变化倍数>3)；Subgroup I中2个基因在ABA和PEG处理下响应均不明显(−0.6 < Log 2 变化倍数<0.4)。如图7(B)所示，两种不同基因型(Sensitive genotype， SG和Tolerant genotype， TG)高粱在42 d时叶片的表达谱中发现，SbMCU5.1对干旱均有明显响应，其中SG的表达量上调最高(Log 2 变化倍数=5.41)；Subgroup I中2个基因在不同基因型高粱经干旱处理后响应模式不同，其中SG均呈下调表达，而TG均呈上调表达。 图7. 逆境胁迫应答的SbMCUs家族基因表达模式分析。(A) 高粱幼苗(9d)对渗透胁迫和脱落酸的影响；(B) 两个不同基因型高粱对水分利用效率的比较研究 3.9. SbMCUs基因启动子顺式元件 为进一步解析SbMCUs家族成员对ABA和干旱胁迫的应答，我们对上SbMCUs家族成员基因的启动子区域进行元件分析(表3)。通过New PLACE在线预测所检测到的顺式元件中有3个响应元件，为ABRE、CBF和DRE。其中，干旱和ABA应答的ABRE元件存在于SbMCUs家族的每一个成员中；SbMCU1中含有ABRE和DRE元件的数量最多，均为3个，但是结合转录组数据分析发现，SbMCU1对ABA和干旱的响应并不明显。 Table 3 Detailed information of stress related motif in the SbMCUs promote 元件 核心序列 功能预测 基因 SbMCU1 SbMCU2 SbMCU5.1 SbMCU5.2 ABRE ACGTGTC 干旱、ABA应答 3 2 1 1 CBF RYCGAC 干旱应答 1 DRE RCCGAC 干旱、ABA、低温应答 3 表3. SbMCUs基因启动子胁迫相关的元件分析