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user: 4. 讨论 目前，茭白的种植主要是采用茭墩分离筛选的种植方式，繁殖的系数相对较低，速度慢，种质遗传资源少，同时茭白繁殖的过程中种质受影响也有季节的局限。因此在生产上茭白若连续两年不进行选种，雄茭和灰茭的繁殖发生率将达30%左右，严重影响到当地农民的生产和经济效益 [ 21 ]。因此开展茭白组培快繁的试验，对于保存茭白种质遗传资源和促进茭白育种，加速和推广茭白种植均质化具有十分重要的科学研究意义。其中，茎尖培养快繁试验是对获得无菌茭白培养物很有效的一种方法。由于目前茭白外植体在初代或再分化和继代茭白培养的过程中存在十分严重褐化的现象，导致外植体材料大量的死亡，所以给茭白脱分化和再分化的种植带来了严重的影响。很多的研究者都认为茭白植物组培苗的褐化一直是茭白植物组培技术快速进步和发展的一大瓶颈其中，茎尖培养苗褐化是对获得无菌培养物很有效的一种方法。茭白外植体初代或者后继代幼苗在培养的过程中褐化十分严重，导致培养材料大量的死亡，从而对于茭白外植体的第一次脱分化和再次脱分化的发展带来了严重的影响，成为了制约茭白植物组培技术快速进步和发展的一个重要瓶颈 [ 22 ]，是茭白组培常见的难题之一。很多的研究者都认为茭白植物组培苗的褐化一直是当前决定茭白植物组培成功与否的一个重要关键因素，其与对菌类的污染和玻璃化被并称为茭白植物组织培养的三大常见的难题 [ 23 ]。因此，如何有效减轻茭白植物组培苗褐化的程度及其发生已经逐渐成为当前我国茭白组培技术发展过程中一个亟待解决的关键性问题。 组培种苗褐化的问题解决与否一直是影响和决定水生植物茭白组培成功与否的一个关键因素。因此，如何有效解决茭白组培苗的褐化已经发展成为当前水生植物茭白组培苗种植过程中一个亟待解决的基础性问题。 在直接到组培苗开发生产的过程中，常常可能会使种植者遇到一些实际的环境问题，比如大量的组培苗木材被污染、玻璃化苗、褐化苗等，影响直接到组培苗的生产质量和组培苗生产量，而给组培苗的生产经营单位和种植者带来直接或间接的社会经济损失 [ 20 ]。 4.1. 外植体污染 组培工作中，常出现的问题还有培养室工作台内环境的污染和培养室内人为的污染。定期对工作台和培养室环境进行清洁和消毒，检查超净环境和工作台的洁净度，及时发现并措施有效解决空气污染问题，减少对产品工作室及周围环境的直接污染，严格的产品灭菌处理消毒操作程序，熟练的员工操作各种灭菌消毒技巧，杜绝了各种细菌的频繁入侵，避免人为污染。除此之外，外植体污染主要分外植体外部污染和外植体内部污染。 不同植物来源的健康茎培养作为材料(由于植物的种类、外植体的类型及繁殖茎的大小)，其需要选择的材料和消毒处理方式不同，污染率也可能会有所的不同。长期种植于培养室或大田土壤中的茭白外植体比长期种植在其他培养室的中更容易受到细菌污染，因此，在培养室中选取健康的试验培养材料时，应该尽量选择外植体表面较干净且无任何伤口的健康茎为试验材料。对于不同的外植体培养表面，应需要选择不同的植体消毒剂和其灭菌的时间。 选择的植物杀菌剂和溶液的灭菌效果时间既要能尽可能彻底完全杀死外植体表面的所有微生物，又要尽可能不直接伤害其他植物的组织和外植体表层的细胞为宜。目前常用的植物杀菌剂主要有：乙醇、次氯酸盐、HgCl 2 和双氧水等，通常几种杀菌药液可以配合选择和使用，以达到加强其灭菌的效果 [ 20 ]。与次氯酸钠相比，HgCl 2 具有良好的杀菌效果剧毒，0.1% HgCl 2 溶液1 min即可有效杀菌并且有抑制植物组培褐化的效果 [ 10 ]，但剧毒，购买药品受制且人工操作具有较大安全隐患，故本实验中选择了75%乙醇10 min和15%次氯酸钠30 min配合使用作为杀菌剂，也有较好的杀菌效果，但褐化防治效果不佳。 内部环境污染主要是由茭白组织内部环境中存在的一些微生物受到细菌感染引起的，包括病毒、类病毒、细菌等。它们的侵染可以认为是长期潜伏的，茎尖培养也可以是对获得无菌的培养物很有效的一种培养方法 [ 20 ]。由于内生的茭白孕茭与其内生的茭白菰黑粉菌(Ustilago esculenta)的侵染互作密切相关 [ 7 ]，丁小余研究结果发现黑粉菌一直都是在茭白植株体内直接存在，只是冬天的茭白有时候以菌丝的形式直接存在于茭白体内，到第二年春天才开始生长，并非外界直接侵入的细菌所致 [ 24 ]。因此在做茭白茎尖组培时选材和对材料的处理尤为重要，本试验以茭白植株地下部分芽和高约40 cm茭白苗茎尖为外植体，剥取茭白茎尖时尽量分离肉质茎。 4.2. 褐化现象 褐化污染是指，在某一种植物的组培细胞分化过程中，在细胞脱分化或再分化的过程中，切取芽时的伤口激活组织中的多酚氧化酶，将多酚氧化成棕褐色醌类物质，导致外植体的切口发生褐变，产生可见的茶色、褐色或黑色，称为“酚氧化物污染” [ 25 ]。醌类物质将直接渗透到外植物的培养基中，导致内植物的培养基褐化，这将严重直接影响培养物的正常生长和细胞分化，甚至直接导致培养物的死亡。 褐化的现象主要由于白色多酚氧化酶(PPO)能够催化植体中的多酚化合物与培养基发生氧化反应引起的，生成的棕褐色多酚醌类物质逐渐地渗透到外植体的培养基中将会有效地抑制其他氧化酶的活性，并且会起到对外植体细胞产生毒害的作用。引起外植体褐变的因素复杂。就内因而讲，外植体的生理状态、基因型、同一基因型的不同品种栽培的条件、营养状况、生长的部位和其大小等等都会直接影响植株褐变 [ 26 ]，同时Bonga [ 11 ] 也认为外植体越小，切面与其体积的伤害程度比率越大，褐变的伤害程度就越大；就植株外因而言，培养基的各种成分、外加激素的含量及比例、培养的条件(接受温度、光照的时间、光照强度、通气的状况等)等也都会直接影响植株褐变的同时发生，褐变的同时发生往往也是多种因素同时作用的影响及结果 [ 27 ]。研究实验结果表明，1/3 MS培养基由于抑制雄性褐变的大量发生使其效果明显好于1/2 MS和MS的培养基，同时由于抑制雄性褐变的大量持续发生还明显地直接受益于培养基中某些雄性激素的受体含量的影响，比如较高浓度的6-BA和KT含量可直接有效促进抑制褐变的大量持续发生 [ 28 ]。 在腰果和培养基中同时加入一种适宜浓度的专一性抗氧化剂或专一性吸附辅助剂，这样可以有效地防止腰果的褐变。由于聚乙烯二甲基吡咯烷酮(PVP)同时是对酚类物质的专一性有效吸附辅助剂，在生化置备中常用来当作酚类专一性物质和对细胞器的保护辅助剂，可以广泛应用于有效防止细胞器的褐变 [ 29 ]。但也同时有研究报道这些吸附辅助剂有时对腰果有一定的副作用，如腰果中的活性碳(AC)和PVP可以直接使得腰果的组织培养物发生坏死 [ 16 ]。腰果中的活性炭也被认为能有效地吸附腰果培养基中的专一性激素和酚类物质，影响腰果茎尖的组织分化和生长。 故本研究中，在继续进行茭白的茎尖组织培养时，MS茎尖组织培养基中(含6-BA和KT)不选择在球茎中加入任何抗氧化剂，选择先对球茎进行预培养(注意即培养在以球茎为基础的培养基中) 2~3天(如果球茎的分泌物多，如利用花魔芋的方法对球茎进行组织培养时，适当地延长预培养的时间并多次地更换培养基)，再重新培养或种植到已经添加了激素的茭白组织培养基上。不断重复一次地(每隔1~2 d)将基本的培养物重新转移或种植到新鲜的培养基上，以彻底摆脱老培养基中褐色物质的不利生长影响。 4.3. 茭白的组织培养研究现状与展望 菰(Zizania latifolia)驯化成茭白是由于真菌内生菌黑粉菌(Ustilago esculenta)的持续侵染，导致茭白可食性茎干膨大，开花损失减少 [ 30 ]。近2000年来，由于可食性内生菌黑粉菌无性繁殖造成的开花损失一直迫使茭白通过根茎无性繁殖方式产，而受黑粉菌影响的茭白根茎无性繁殖方式一直是茭白农业生产的唯一正常繁殖途径。在田间，茭白有正常的茭白、灰茭及雄茭三种无性繁殖表型，这三种无性繁殖表型与黑粉菌在正常茭白体内的正常生长和繁殖状态密切的相关 [ 21 ]。本文的培养实验主要通过茭白的茎尖组织培养人工培育脱毒茭白幼苗，为人工培养接种菰黑粉菌的茭白提供一个良好的农业生产试验环境和材料，以期为茭白找到一种人为的控制茭白孕茭的有效方法，减少茭白农业生产中雄茭、灰茭两种植株的正常繁殖数量，为其生产高产、优质的茭白提供了一个更加快捷、有效的农业生产方法。 植物生长激素是植物代谢反应的主要产物，同时又对其的生长发育仍然起着重要的生理调控性和抑制作用 [ 31 ]。早在2005年，王怀利 [ 14 ] 等人就经过大量的试验和分析，探究出一种适合于茭白组织培养的诱导性茭白培养基。但其研究和试验的过程，还有许多的地方和技术有待进行尽一步完善，要使茭白的生产技术步入一条产业化的发展之路，还是有待进一步的研究。近期，在2018年杨峰 [ 20 ] 等在对茭白离体再生体系的探究中，茭白侧芽愈伤组织的诱导激素组合配比的最佳激素组合为NAA 1 mg/L + 6-BA 1 mg/L + 2，4-D 1 mg/L，各激素对茭白侧芽愈伤组织诱导的作用和效果分别是NAA > 6-BA > 2，4-D。虽然我们在该试验中也表明茭白有较高的愈伤组织诱导分化效率，但是从侧芽愈伤的诱导组织分化成愈伤，再由愈伤的诱导组织分化成愈伤苗的整个过程，繁殖的速度较慢，而且在该试验的过程中，愈伤的组织侧芽褐化的现象严重，其形成原因很有可能也就是愈伤的组织培养基生长过快，未能及时更换愈伤的培养基，从而直接导致了培养基中离体营养供应的不足和培养基所产生的代谢物大量积累，使愈伤的组织逐渐出现侧芽褐化 [ 32 ]。此外，激素也会直接影响材料的褐变，2，4-D，NAA和IAA等不会直接引起愈伤组织细胞的褐化。在对茭白离体再生诱导体系的侧芽诱导探究中，茭白愈伤和侧芽组织诱导分化的最佳组合是激素与侧芽配比的最佳组合激素为6-BA 2 mg/L + NAA 1 mg/L + KT 0.1 mg/L，各侧芽诱导激素间对茭白愈伤和侧芽组织诱导分化的作用和影响最佳组合是6-BA > NAA > KT。细胞分裂素6-BA或KIN能够有效地使材料中的PPO活性坏死细胞提高，在MS培养基上材料添加适量的6-BA、ZT、NAA上材料培养，戴维逊棉可以取得新的细胞再生植株，而在MS和2，4-D，ZT，NAA上材料培养14 d，全部材料褐变死亡 [ 29 ]。 在茭白科植物的组织培养的过程中，外源组织培养激素的工作是其中一个不可缺少的一种组织培养物质，是如何影响茭白组织培养激素再生效率的一个重要的因素 [ 21 ]。本试验也充分证明了NAA、6-BA和KT三种组织培养激素可以通过合理的配比和使用可以有效诱导和促进茭白茎尖的分化、生根。本试验研究中，通过对茭白的组织培养的研究，找出了适宜的诱导、增殖、生根快繁培养基，通过综合利用茭白科植物组织培养的方法可以解决茭白目前的生长繁殖系数低、种质资源少、繁殖的过程中组织培养受环境和季节的局限等问题。虽然本试验获得了一定的进展，但是目前茭白要真正的实现茭白工厂标准化的育苗与生产，还仍然需要更加深入的科学研究。