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user: 4. 讨论 DNA条形码策略成本较低，是植物分类的发展方向。然而，推荐使用的4个DNA标记(rbcL、matK、trnH-psbA和ITS)仅能够满足种级或以上水平的植物鉴定，对于近缘种和/或品种，没有分辨能力 [ 4 ] [ 5 ] [ 10 ] [ 13 ] - [ 22 ] 。寻找种内水平的植物鉴定的理想解决方案一直是巨大的挑战。 近年来，据报道泛素连接酶E3存在几种类型：环指型E3 (RING finger-containing E3s) (RBR和TRIM家族)、cullin E3复合体、Ubox型E3以及HECT型E3 [ 24 ] 。HECT蛋白的结构域足够长(约350个氨基酸)，能够提供用于系统发育分析的有价值的信息 [ 24 ] 。在胡桃科，来自泛素–蛋白酶系统的E3泛素连接 Table 2 Molecular formula constructed using 16 single nucleotide polymorphic base sites from the ubiquitin ligase gene region for characterizing molecularly the eighteen Diospyros accession No. Taxon Molecular formula 序号 种名 分子式 1 台湾乌木D. discolor C 4 T 9 A 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 A 340 C 344 T 628 2 乌柿D.cathayensis x3 (♂) C 4 C 9 G 39 C 42 A 162 C 186 A 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 C 321 A 340 C 344 T 628 3 乌柿D. cathayensis 5 (♀) C 4 C 9 G 39 C 42 A 162 C 186 A 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 Y 321 A 340 C 344 T 628 4 老鸭柿D. rhombifolia 863(♀) C 4 C 9 G 39 C 42 R 162 Y 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 C 321 A 340 C 344 T 628 5 金枣柿D. jinzaoshi (♀) T 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 A 299 C 321 A 340 C 344 T 628 6 浙江柿D. glaucifolia 164(♂) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 C 225 T 227 C 274 G 299 C 321 A 340 C 344 T 628 7 浙江柿D. glaucifolia873(♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 C 201 C 225 C 227 C 274 G 299 C 321 A 340 T 344 T 628 8 君迁子D. lotus 4 (♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 C 201 C 225 C 227 C 274 G 299 C 321 A 340 Y 344 T 628 9 君迁子D. lotus 8 (♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 C 201 C 225 C 227 C 274 G 299 C 321 A 340 C 344 T 628 10 美洲柿D. virginiana 20-80 (♂) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 T 227 G 274 G 299 C 321 A 340 C 344 T 628 11 美洲柿D. virginiana 20-82 (♀) C 4 T 9 G 39 Y 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 T 227 G 274 G 299 C 321 A 340 C 344 T 628 12 油柿D. oleifera 20-75 (monoecism) C 4 Y 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 A 340 C 344 T 628 13 油柿D. oleifera 20-76 (monoecism) C 4 C 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 A 340 C 344 T 628 14 德阳柿D.deyangensis 1101(♂) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 Y 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 A 340 C 344 T 628 15 德阳柿D.deyangensis1115(♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 A 340 C 344 T 628 16 安溪油柿D.kaki‘AnxiYoushi’ 199(♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 M 340 C 344 C 628 17 甜宝盖D.kaki‘TianBaogai’ 788(♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 R 299 T 321 M 340 C 344 C 628 18 怀胎柿D.kaki‘Huaitai Shi’ 179(♀) C 4 T 9 G 39 C 42 A 162 C 186 G 196 T 201 G 225 C 227 C 274 G 299 T 321 A 340 C 344 C 628 表2. 利用来自泛素连接酶基因区域的16个单核苷酸多态位点构建的分子式可以区分柿属18个样品 图1. 供试的柿属18个样品的分子分类检索表 图2. 基于E3泛素-蛋白连接酶UPL3 DNA序列揭示的柿属18个样品7谱系间的遗传关系 酶基因区域的DNA标记，表现出可以用于种/变种/品种水平的植物鉴定 [ 16 ] 。在紫薇属(Lagerstroemia L.)，来自泛素–蛋白酶系统的染色体重塑基因区域的DNA标记，在紫薇品种水平上具有分辨力 [ 17 ] 。在本研究中，来自泛素–蛋白酶系统的E3泛素–蛋白连接酶UPL3基因序列，表现为可用于种级/种内水平上进行柿属植物的分类。与泛素–蛋白酶系统相关的DNA序列，在开发高灵敏度的DNA序列标记方面有价值。泛素–蛋白酶系统在真核生物中广泛存在，与泛素–蛋白酶系统相关的DNA序列在开发DNA分子标记方面潜力巨大。我们的实验显示，E3泛素–蛋白连接酶基因区域，含有阶段性分布的保守区，在保守区之间，存在进化速率较快的DNA序列，通过开发引物，可以获得灵敏度较高的用于植物分类的DNA序列。有待针对不同的植物科属开展研究，积累数据，总结深层次的规律。柿D. kaki的起源及柿属内物种间的系统发育关系一直是学术界关注的重要问题之一。根据形态和细胞学证据，Ng (1978) [ 27 ] 提出油柿Diospyros oleifera是柿D. kaki的亲本之一。根据叶绿体DNA的限制性片段长度多态性，Yenomeri et al. (1998) [ 28 ] 认为美洲柿和柿D. kaki具有较为近缘的关系。然而，Choi et al. (2003) [ 12 ] 则认为，与柿属的其它物种相比，美洲柿与柿D. kaki的关系可能较远。 我们获得的DNA证据支持先前的分类提案，根据形态和分子特征以及染色体数目，德阳柿和金枣柿应该被提升为种的等级 [ 7 ] [ 8 ] 。 基于E3泛素–蛋白连接酶UPL3基因序列的遗传关系树状图，德阳柿和油柿位于最靠近栽培柿的位 图3. 来自18个柿属植物样品的泛素连接酶基因区域的696 bp长的比对序列，强调了35个简约信息位点(*)。 M = A/C，W = A/T，K = G/T，Y = T/C，R = A/G， S = G/C，D = G/A/T (为杂合碱基位点) 置。值得关注的是，柿D. kaki的染色体数目(2n = 6x = 90)，相当于德阳柿(2n = 4x = 60)和油柿(2n = 2x = 30)的染色体数目之和 [ 7 ] 。油柿自然分布于中国长江以南，适应性好，耐湿热环境。德阳柿自然分布于中国的四川省。二者的自然分布有一定的重叠 [ 1 ] [ 3 ] [ 7 ] 。它们对于理解柿D. kaki的起源，具有重要价值。 本研究中，代表柿D. kaki谱系的3个品种，分别为‘怀胎柿’、‘甜宝盖’和‘安溪油柿’。在中国，不同地区通常有适应当地环境条件的不同栽培品种。‘怀胎柿’为陕西省的传统品种，脱涩后味道甜美。‘甜宝盖’是湖北省罗田县的传统品种，果实味甜，可以直接食用。‘安溪油柿’为福建省的著名地方品种，通常用来制柿饼。 我们的结果显示，老鸦柿和乌柿在遗传上与栽培柿的关系较远，与形态分类结果一致 [ 1 ] [ 3 ] [ 7 ] 。构建的系统发育关系仅部分地与ITS或matK序列的分析结果一致 [ 8 ] 。将来，有必要扩大取样量，深入研究君迁子和浙江柿之间的物种界限。浙江柿和君迁子原产于中国，美洲柿原产于美洲。对这3个种以及这些野生种与柿D. kaki之间的关系的深入研究，有可能增进理解柿属植物的生物地理和进化。