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user: 2. 已克隆玉米隐性核不育基因 2.1. Ms1 Ms1被定位在6号染色体长臂。Zhou等 [ 6 ] 将突变体ms1-6050与自交系昌7-2(C7-2)杂交，构建了F 2 代分离群体。利用F 2 代群体的218个雄性不育个体，对ms1位点进行遗传分析。已知ms1位点与位于6号染色体的Y1基因紧密连锁 [ 22 ]，筛选Y1基因附近位于玉米6号染色体6.02bin的4个多态性SSR分子标记，并进行PCR扩增以及凝胶电泳分析，表明4个多态性标记与Ms1基因紧密连锁。利用F 2 代群体的654个雄性不育个体进行精细定位，基于B73基因组序列开发了8对与上述4对标记相邻的多态性标记，构建了ms1位点所在区间的连锁图谱。根据表型的数据，进行连锁交换分析，最终将ms1位点定位在sj10-sj30之间，遗传距离为233 kb。该区域有11个候选基因，其中GRMZM2G180319基因具有与花器官发育相关的功能，为Ms1基因。Ms1基因的长度为1286 bp，包括有2个外显子和1个内含子，编码1个218个氨基酸的蛋白。该蛋白中存在一个DUF260保守结构域，属于次生器官发育相关基因(Lateral Organ Boundary， LOB)家族。突变基因ms-6050在+468~+474处存在一个碱基的缺失，导致编码区移码突变，造成基因的翻译在+494处提前终止。基因在ms1-6050突变体中编码的蛋白少了74个氨基酸，从而造成其功能的丧失。 2.2. Ms7 Ms7被定位在7号染色体长臂。Zhang等 [ 7 ] 将突变体ms7gl1、ms7-6007分别与自交系昌7-2(C7-2)杂交，并借助分子标记辅助鉴定，F1后代均为雄性可育，F2代群体雄性可育植株与不育植株符合3:1分离比，表明ms7gl1和ms7-6007均为单基因隐性遗传。ms7-6007/ms7-6007纯合植株用ms7gl1/+杂合植株的花粉授粉，F1代群体雄性可育植株与不育植株符合1:1分离比，表明ms7-6007的突变基因与ms7gl1突变基因是等位基因。利用突变体ms7gl1与自交系昌7-2(C7-2)杂交得到的F2代群体的154个雄性不育个体进行初步定位，利用BSA技术，筛选SSR标记，并对突变位点进行遗传分析，有9对SSR标记与Ms7基因连锁，Ms7基因被初定位在SSR标记umc2617和bnlg1808之间，遗传区段为4.8 cM。利用F2代群体的611个雄性不育个体进行精细定位，在umc2617和bnlg1808之间设计了6对CAPS引物，将Ms7定位在EP299和EP302之间，遗传距离为180 kb。在这个区间中有6个候选基因，其中标记EP239与不育性状表现为共分离，该序列来源基因为GRMZM5G890224，该基因编码一个PHD-finger结构域的蛋白。Ms7基因全长2435 bp，由三个外显子和两个内含子组成，编码670个氨基酸蛋白质，第三个外显子编码的氨基酸能够形成保守的PHD-finger结构域。通过对突变体ms7-6007、ms7gl1中目的基因DNA进行测序，突变基因ms7-6007全长2453 bp，在第一个外显子的+22位点插入了3 bp，在第二个外显子的+814位点插入了7 bp，蛋白翻译发生移码在+1426处终止导致缺乏亮氨酸拉链区域和PHD结构域；突变基因ms7gl1全长3543 bp，在第三个外显子的+1179位点插入了1136 bp转座子(DTA_ZM00023)，翻译在+1225处提前终止，并导致缺乏亮氨酸拉链区域和PHD结构域。这些结果表明GRMZM5G890224为引起ms7突变体不育基因。 2.3. Ms9 Ms9被定位在1号染色体短臂。Albertsen等 [ 9 ] 利用由大约450个个体组成的小群体鉴定基因连锁的两侧标记，利用从小群体中鉴定的两侧标记和新设计的标记鉴定重组子，确定ms9基因在1号染色体的物理间隔。Ms9的一个候选基因被发现是一个R2/R3植物特异性myb转录因子。突变基因ms9-ref在第一个外显子中有4个碱基对插入，导致翻译移码突变。这种突变发生在R2结合域；突变基因ms9-AD62A在第三个外显子中有一个16-bp缺失，扰乱了R3结合结构域。 2.4. Ms22/Msca1 Ms22/Msca1被定位在7号染色体短臂。Chaubal等 [ 21 ] 利用msca1-ref等位基因，用标记物对该群体进行定位，并用跨越2个BAC(细菌人工染色体)克隆的标记pco144723和b49p15.f确定遗传距离为155 kb。BACs的测序和其他标记的发展将遗传距离缩小到9 kb。这个区域的序列显示只有一个开放的阅读框，编码一个植物特异性谷胱甘肽还蛋白基因。突变基因msca1-ref谷胱甘肽还蛋白基因缺失，有7823 bp缺失，谷胱甘肽下游4 kb处有1268 bp插入。对msca1-mg12等位基因的克隆和序列分析显示，谷胱甘肽基因3’区有490 bp的缺失。Msca1基因中存在一个氧化还原区的序列CCMC，不育植株缺少GSH结合位点，而在可育植株中存在的GSH结合区LPVVVGGRLLG在不育突变体中不存在。在mscal-6036等位基因的克隆和测序中，检测到了有850 bp的插入，这一插入创造了一个8 bp的宿主位点重复(GTCGAGA)，并且它似乎还包含小的完美的TIRs [ 10 ]。 2.5. Ms23 Ms23被定位在8号染色体短臂。Nan等 [ 11 ] 利用SNP-genotyping技术对Ms23进行高通量遗传定位，Ms23最初被定位在6号和8号染色体上。检测两个相关区域两侧的PCR标记，并确认该雄性不育表型与8号染色体上8.00~8.01 bins附近的多态性标记共同分离。利用ms23-ref、ms23-6027或ms23-6059突变体各250个以上雄性不育个体进行定位。Ms23被定位在8S染色体末端的0.75 mb范围内。该区域有15个候选基因，利用qTeller检索RNA序列数据，发现只有GRMZM2G021276，跨越位置95823到98367，编码预测的bHLH蛋白，显示tassel 特异表达。Ms23基因全长2361 bp，有四个外显子，编码365个氨基酸的bHLH蛋白。在突变基因ms23-ref中，整个基因被删除，这个删除包含高达96.5 kb。突变基因ms23-6027在1076位插入2-bp(AT)，使在预测的bHLH区域的正上游位置1091处有一个早期终止密码子，引起移码突变。Ms23编码一个花药特异性的、预测为绒毡层分化所需的碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子。RNA-seq和蛋白质组学数据以及酵母双杂交分析表明，Ms23与Ms32、bHLH122和bHLH51一起依次作为同二聚体或异二聚体来指导绒毡层发育。其中，Ms23是最早的作用因子，位于bHLH51和bHLH122的上游，控制着绒毡层的规格和成熟度。相比之下，Ms32是组成性的，独立调节的，在绒毡层分化中比Ms23晚。 2.6. Ms30 Ms30被定位在4号染色体长臂。Zhou等 [ 13 ] 将突变体ms30-6028与自交系昌7-2(C7-2)杂交，构建了F2代分离群体。利用F2代群体的118个雄性不育个体，利用BSA技术，按照maizeGDB中标记数据库信息，筛选SSR分子标记，对突变位点进行遗传分析，有5对多态性分子标记与ms30位点连锁，Ms30基因初步定位在umc1808和umc2046之间。另取F 2 代群体284株，对其进行育性调查，雄性可育株与不育株比符合3:1的单基因分离比。从maizeGDB中检索到umc1808至umc2046之间的9对多态标记(包括umc1808和umc2046)，对该F 2 群体进行了基因型鉴定，构建了ms30位点遗传连锁图谱，并根据单株的育性数据，Ms30被初定位在idp1991至tidp9194 之间，遗传距离为2.9 cM。对Ms30进行精细定位，调取B73基因组序列并设计了多态性标记ep462，将Ms30定位在ep462和tidp3747之间，遗传距离为41.2 kb。该区域有6个候选基因，其中一个预测为GDSL脂肪酶家族基因GRMZM2G174782具有与花器官发育相关的功能，为Ms30基因。该基因有2370 bp长，含有3个外显子和2个内含子，有1277bp的蛋白质编码区序列。DNA测序结果表明，突变基因ms30-6028的蛋白质编码序列有4处核苷酸存在插入或缺失，突变基因在1、2、4处分别插入1、3、9个碱基，在第3处突变缺失了4个碱基。 2.7. Ms32 Ms32被定位在2号染色体长臂。Chaubal [ 21 ] 等将突变基因ms32-ref初部定位在2号染色体UNC139标记的远端。Moon等 [ 14 ] 利用来自1:1分离群体的8个雄性可育个体和9个雄性不育个体的gDNA池，利用22对InDel引物进行初定位，遗传距离为10 cM，其中2号染色体上的引物对IDP792表现出多态性。利用249个雄性不育个体组成的更大的定位群体，利用BSA法，利用24对IDP引物进行定位，将Ms32定位在标记umc1049和JM16之间，遗传距离为0.5 mb。在该区域有15个候选基因。在GRMZM2G1633233基因模型中发现ms32-ref突变基因携带大于1.6 kb的缺失，GRMZM2G1633233基因的长度约为10 kb，包含四种带注释的转录类型，其中一种转录类型与bHLH蛋白的N-末端结构域和液泡ATP合酶亚基H的C-末端相似，而水稻、苞片和高粱基因组中bHLH基因和液泡ATP合酶亚单位H基因被注释为单独的基因。GRMZM2G1633233_T02和GRMZM2G1633233_T03对应于bHLH结构域，而GRMZM2G1633233_T04对应于液泡ATP合酶亚基，另外对EST序列和PlantGDB组装的唯一转录本研究，结果表明GRMZM2G1633233是两个基因的嵌合体，其中一个是Ms32。ms32-ref中的缺失被证实包括bHLH基因的C末端。GRMZM2G1633233是两个基因：GRMZM2G1633233_T02是编码bHLH蛋白的Ms32基因，GRMZM2G1633233_T04是液泡ATP合酶亚单位H基因。Ms32基因编码一种基本的螺旋–环–螺旋(bHLH)转录因子，在花药发育过程中起着重要的分裂和分化调控作用。Ms32基因由四个外显子和三个内含子构成。候选基因(GRMZM2G1633233_T02)由四个外显子组成，它们被预测编码219个氨基酸蛋白。ms32-ref中的缺失在第2外显子之后立即开始，并延伸到第4外显子之后，从而使N-末端bHLH域保持完整，只有该基因剩余的N-末端区域(外显子1和2)仍在ms32-ref中表达。 2.8. Ms33 Ms33被定位在2号染色体长臂。已知ms33位点位于2号染色体长臂 [ 22 ]。Zhang等 [ 15 ] 按照maizeGDB中标记数据库信息，筛选出5个在ms33位点呈多态性的SSR分子标记，利用228株雄性不育植株进行PCR扩增和凝胶电泳分析，检测不育基因与标记物之间的连锁反应。结果表明，这5个标记与ms33位点密切相关。利用从maizeGDB检索到的9对来自mmc0381到umc2214之间的多态性标记，对F 2 群体的单株进行基因分型，构建了ms33位点所在区域的遗传连锁图谱。根据单株的育性资料，Ms33基因被初步定位在EP97和bnlg1893之间，遗传距离为11.5 cM。检索B73基因组序列，设计了4对多态性标记EP198、EP603、EP605和EP480。最后，Ms33被定位于EP603和EP605之间，遗传距离为349kb。该区间有15个候选基因，其中GRMZM2G070304基因为GPAT家族基因，具有与花器官发育相关的功能，为Ms33基因。该基因全长2198 bp，含有2个外显子和1个内含子。突变体ms33-6029中突变基因ms33-6029全长3566 bp，在第一个外显子+223处插入了一个长为1368 bp的转座子(DTA_ZM00216)，基因翻译在+288处提前终止。在野生型B73中，Ms33基因的蛋白质编码序列为1578 bp长。通过该基因的cDNA序列的模拟翻译，发现该基因编码525个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列和GenBank SwissProt蛋白质数据库的blastx分析显示，该蛋白质含有Lysophospholipidacyltransferases (LPLAT)保守结构域。在突变体ms33-6029中，由于转座子插入了Ms33基因序列的核苷酸223导致氨基酸75后的改变，编码的蛋白质仅包含95个氨基酸，并且突变基因编码的蛋白质不再具有任何功能域。该实验结果显示突变体中Ms33基因的序列的改变直接导致翻译氨基酸的序列变异并提前终止翻译，尤其会破坏基因的LPLAT结构域。 2.9. Ocl4 Ocl4被定位在1号染色体短臂。Ocl4基因中包括10个外显子，编码881个氨基酸的假定蛋白，包含HD-ZIP-IV蛋白的四个特征结构域，即home、leu-cine-zipper、START和HD-SAD结构域。突变基因ocl4-1在外显子6中插入了转座子Mu8，在玉米(TUSC)的先锋性状实用系统中发现，而突变基因ocl4-2在外显子5和内含子5的接合处插入了Mu8，源于生物膜突变型集合 [ 17 ]。 2.10. Mac1 Mac1被定位在10号染色体短臂。Sheridan [ 23 ] 等将Mac1定位到10S染色体，在遗传标记oy1和T9-10b之间。该基因被定位在标记TIDP8865和IDP8390之间，遗传距离为900 kb。该区域有14个候选基因，其中基因模型GRMZM2G027522与水稻TDL1A和拟南芥TPD1基因相似，缺失等位基因导致与mac1突变体有相似的表型，GRMZM2G027522模型为Mac1基因。利用引物P222、P223和P220、P223对突变基因mac1-1进行基因型鉴定，利用引物P222、P223、P258和P292对突变基因mac1-Y211进行基因型鉴定。Mac1基因中包括4个外显子和3个内含子；通过DNA序列分析，发现mac1-1等位基因中有一个1263 bp的缺失，从内含子2开始，延伸到外显子4；mac1-Y211等位基因内含子2中插入了4.9kb的自主MuDR元件 [ 18 ]。 2.11. Ipe1 Ipe1被定位在1号染色体短臂。Chen等 [ 19 ] 前期将Ipe1基因初步定位在SSR分子标记S1和S11之间。后期对Ipe1基因进行精细定位，开发了9对多态性InDel标记，利用F2群体的4021个突变植株，最终将目的基因组区域缩小到InDel标记S4和S8之间，遗传距离约290kb。该区域有6个候选基因，通过对ipe1基因组DNA进行测序以及利用基因特异性引物P123F和Mu1转座子特异引物I10R的组合，表明突变体GRMZM2G434500基因中Mu1转座子插入在了第三个外显子开始的第64个碱基对处。通过对ipe1-1、ipe1-2、ipe1-3基因组测序组测序进一步证明GRMZM2G434500为引起ipe1突变体不育基因。利用cDNA测序，表明Ipe1基因由三个外显子和两个内含子组成，编码一个含582个氨基酸蛋白。利用SMART进行蛋白质结构域分析以及与NCBI数据库中全长蛋白进行比对分析，表明在Ipe1基因N端氨基酸和C端氨基酸包含两个GMC氧化还原酶功能域，即Ipe1编码GMC氧化还原酶。 2.12. Apv1 Apv1被定位在10号染色体长臂。Zhang等 [ 20 ] 将突变体apv1与自交系B73杂交，F 1 后代均为雄性可育，BC 1 F 1 (以突变体apv1为杂交亲本)中249个个体雄性可育植株与不育植株符合1:1分离比，F 2 代群体中311个个体雄性可育植株与不育植株符合3:1分离比，表明apv1为单基因隐性遗传。利用F 2 代群体的480个雄性不育个体进行初定位，设计了一系列多态性标记对，利用分子标记YS-38和YS-39将基因定位区域缩小到1.32 Mbps。利用2012年得到的BC 1 F 1 的不育个体组成的更大的定位群体进行精细定位，利用分子标记YS-48和YS-75将Apv1基因定位区域缩小到660 kb。有21个基因在这个区间中，而在减数分裂雄穗中表达的有5个基因，其中GRMZM5G830329在减数分裂雄穗中高表达。对目的基因进行DNA测序，apv1突变基因有848 bp的缺失，该缺失跨越以下两个相邻基因：GRMZM5G830329和GRMZM2G439268。该缺失始于GRMZM5G830329的外显子2，延伸至GRMZM2G439268的外显子1。利用CRISPR/Cas9对GRMZM5G830329基因和GRMZM2G439268基因敲除，并对GRMZM5G830329敲除和对GRMZM2G439268敲除个体花药使用I2-KI染色观察，前者不能观察到黑色染色的花粉粒，后者观察到有染色良好的花粉粒。GRMZM5G830329基因敲除系(ms/ms)与apv1(ms/+)的杂交以1:1的比例产生雄性不育和可育植株(v2 = 0.05，0.5 < P < 0.9)。这一结果证实了GRMZM5G830329的缺失导致apv1雄性不育，为Apv1。Apv1编码P450亚区CYP703A2-Zm的一个成员，CYP703A2-Zm含有530个氨基酸。 上述很多基因定位都用到了BSA这项技术，以及相关的分子标记技术，接下来简单介绍所用到的基因定位方法和分子标记技术。