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user: 5. 生物技术手段在茅苍术生产中的应用 通过化学合成途径或直接从植株中提取药用活性成分，成本过高且影响环境，商业价值过低 [ 30 ] 。然而大量实验表明，植物生物技术如组织培养、细胞培养、基因工程及微生物生产应用等都可以高效控制生产质量 [ 31 ] ，获得目标产物。通过深入研究机理并配合优化培养手段可获得大量目标产物，有效缓解茅苍术药材市场供求不平衡。 5.1. 组织培养与细胞工程 5.1.1. 组织培养 巢建国等人初步研究了茅苍术快速繁殖的组织培养方法，根据不同种激素(6-BA、NAA、IAA、IBA、KT)及配比选出最佳分化培养基、生根培养基(表2)，各组实验结果显示，各组培养基均可建立比较完整的无性繁殖体系，为茅苍术的快速繁殖研究提供了初步的科学依据。实验结果表明培养基中激素含量及各成分比例不同显著影响植株分化生根。在继代培养中，过高或过低浓度生长素及细胞分裂素组合不利于诱导组培苗芽 [ 32 ] 。 宋艳娇等人 [ 36 ] 研究发现茅苍术生长初期大量消耗蔗糖以建成自养器官。茅苍术未成熟种胚培养可保证发芽率，且炼苗成活率高于90% [ 37 ] 。 以上研究为茅苍术组织扩繁技术研究奠定基础。元素 [ 38 ] 及激素 [ 39 ] 等培养基成分对于植株的次级代谢产物积累具有重要作用，我们的研究发现培养基中大量元素的含量配比也会影响茅苍术挥发油组分积累。 Table 2 The ratio of hormone content in the tissue culture mediu MS (´) 6-BA (mg/L) NAA (mg/L) IAA (mg/L) IBA (mg/L) KT (mg/L) 参考文献 分化 培养基 1 3 0.4 [ 33 ] 1 2.0 0.4 [ 34 ] 1 3.0 0.4 [ 34 ] 1 1.0 0.4 0.4 [ 35 ] 生根 培养基 1/2 0.3 [ 33 ] 1 0.5 [ 34 ] 1 0.5 [ 34 ] 1/2 0.5 [ 35 ] 表2. 组织培养培养基中相关激素含量配比 5.1.2. 细胞培养及毛状根 细胞悬浮培养研究可为植物细胞大规模培养提供基础 [ 31 ] 。高密度细胞群体一方面可生产特定成分；另一方面可进行植物细胞代谢、生化特征等研究，以筛选突变体、人工种子等 [ 40 ] 。在制药工业中，一些价格高、产量低、需求量大化合物，如白藜芦醇 [ 41 ] 、紫杉醇 [ 42 ] 、青蒿素等植物组织代谢产物已有大量悬浮细胞研究。 方芳 [ 43 ] 首次建立茅苍术悬浮细胞系，培养周期内仅检测到β-桉叶醇，然而施加真菌诱导子后，检测出苍术酮、苍术醇、β-桉叶油醇及苍术素，表明通过条件优化，茅苍术悬浮细胞能够提高活性成分的产量。随后多项实验 [ 44 ] [ 45 ] 证实建立悬浮细胞系制备有效成分方法可行。 毛状根体系具备同样效果 [ 46 ] ，如人参皂苷的获得。袁媛等 [ 47 ] 探究诱导苍术不定根条件时证实IBA显著促进不定根生长。 但植物细胞培养存在两个阶段 [ 48 ] ：生物量积累阶段与代谢产物积累阶段。一般植物细胞培养产量不高，生产目标产物能力主要取决于培养条件 [ 49 ] (激素、糖分、温度等)和诱导子或前体的施加，与物种关系不大 [ 50 ] 。除以上培养基和种质的选择外，培养的外界条件也影响组织培养中培养物生物量和代谢物的产量。 5.1.3. 诱导培养 生物与非生物诱导子，可调节植株、植物悬浮细胞系中相应酶基因表达量，从而增加目标产物积累量 [ 51 ] 。 非生物诱导是指非细胞天然成分，如化学因子茉莉酸甲酯 [ 52 ] 、水杨酸等和物理因子如高温、低温等。Yuan等人 [ 53 ] 发现酸性土壤增加茅苍术根部密度及干重，刺激β-桉叶油醇的产生，而主根长度较短。 生物诱导子多选用植物内生菌 [ 54 ] 。内生菌能够共生定殖宿主体内，且不引发明显病症。真菌诱导子作为信号调节关键酶表达 [ 51 ] [ 55 ] 。很多天然有效成分如紫杉醇的生产过程中已应用内生真菌诱导子 [ 54 ] 。真菌诱导子诱导植物特定代谢途径具有明显种属特异性。吕立新等 [ 56 ] 发现不同种苍术有特异性内生菌，表明茅苍术的道地性与内生菌特异性相关。当茅苍术内生真菌回接，与宿主茅苍术重新建立共生关系，可明显提高组培苗的生根率、炼苗成活率，增强抗逆性 [ 57 ] ，改变茅苍术挥发油主成分含量 [ 58 ] 。高温胁迫下，AM真菌更易定殖于苍术根茎，作为诱导子促生长 [ 59 ] 。 以上结果表明添加诱导子可作为调节茅苍术药材品质的手段，能够保护茅苍术种质资源和植株扩繁。 多项实验 [ 60 ] - [ 64 ] 对内生菌诱导子诱导茅苍术植株、悬浮细胞等培养物挥发油积累信号通路进行了研究。施加真菌诱导子活化的Ca 2+ -CaM途径与油菜素内酯(Br)，皆可诱导一氧化氮(NO)和过氧化氢(H 2 O 2 )信号分子的增加，NO处于水杨酸(SA)和H 2 O 2 上游，茉莉酸(JA)为H 2 O 2 和NO下游信号分子，JA与H 2 O 2 显著刺激限制酶HMGR基因表达，进而促进挥发油产生。SA信号通路与JA信号通路存在互补互动。研究发现，这一过程涉及多种信号机制，诱导目的基因表达上调或下调，如HMGR和DXR [ 65 ] (见图1)，介导挥发油产生。通过诱导薄荷DXR合酶过表达，植株挥发油产量提高了50%，不同单萜的比率不变 [ 66 ] 。 近几年来，研究人员主要集中于诱导子介导宿主茅苍术生理生化机制、次生代谢成分产生方面研究。 5.2. 基因工程 茅苍术挥发油主成分是倍半萜类物质。倍半萜类生物合成 [ 30 ] 主要通过胞质中甲羟戊酸(mevalonic acid， MVA)途径，关键酶为HMGR；质体中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol 4- phosphate， MEP)途径，也会有部分倍半萜合成，关键酶为DXP。这两个途径之间存在串扰 [ 67 ] 。萜类生物合成途径可分为C5前体异戊二烯类物质生成阶段、直接前体法尼基二磷酸等生成阶段和萜类生成及氧化、甲基化等修饰阶段 [ 68 ] 三个阶段。其中第三阶段决定萜类化合物多样性。 图1. 内生真菌诱导茅苍术中的信号传导 在植物基因组中，萜类合酶基因数量庞大。植物转基因工程提高萜类代谢物方法主要是“开源”与“节流”：生物合成途径关键基因的过表达 [ 69 ] 、转录因子调控 [ 70 ] 、多基因共转化；抑制竞争性代谢途径等。使用可替代的亚细胞靶向 [ 71 ] 能够克服了细胞质中倍半萜生产的局限性，如将小白菊大根香叶烯合酶的靶向到烟草本塞姆氏的线粒体中并瞬时表达，大根香叶烯的产量便提高了15倍。 了解茅苍术中倍半萜类生物合成途径，有利于我们直接调控代谢生产。然而目前对于茅苍术的倍半萜合成途径基因水平研究不多。植物细胞中存在细胞器，不同细胞器之间存在信息与物质的共享，获得一株高效、稳定株系需要花费大量时间与精力。但是此方案来高效产茅苍术次生代谢物可行。 5.3. 微生物工程 部分内生菌能够合成与宿主植物相同或者相似的活性成分 [ 72 ] 。微生物发酵法生产与植物细胞生产相比较，微生物的可操控性在产业化生产方面更有前景，对于解决濒危药用植物药源危机具有重大意义。然而产苍术酮等活性成分的微生物还未有报道。因此筛选产茅苍术活性成分的内生菌或其他微生物可作为茅苍术研究热点。 随着时代进步，微生物工程生产植物次生代谢产物是更高效简便的手段。如基因导入酵母基因组中可调控代谢工程生产萜类，进而可提高酵母产植物萜类物质能力 [ 73 ] 。青蒿素半合成成功事例 [ 74 ] 标志着微生物工程生产的开端：微生物工程生产得到青蒿酸，随后青蒿酸化学合成得到青蒿素。这种由生物合成目标产物前体，再通过化学合成得到最终目标产物的方法称为半合成，这种方法能够有效解决全化学合成天然产物高成本问题。