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user: 3. 结果与分析 3.1. 单因素实验 3.1.1. PH对胰蛋白酶水解度的影响 胰蛋白酶水解鱿鱼内脏过程中，控制体系的酶解温度为50℃，酶加量为5000 U/g，酶解时间为4 h，设置不同的pH。其中，pH对鱿鱼内脏水解效果见图1。鱿鱼内脏的水解度随着pH的升高，呈现递增趋势。根据递增趋势，又增加了pH为9.0、10.0、11.0三组实验来证明pH是否在8.0时为最佳水解条件，实验结果显示样品并未水解，由此推断出pH值过高使酶失活。所以在pH为8.0时，水解效果最佳；因此选取6.0、7.0、8.0继续对鱿鱼内脏酶解做正交实验分析，并加以确定最佳的pH值。 3.1.2. 加酶量对胰蛋白酶水解度的影响 在研究加酶量对胰蛋白酶水解度的影响时控制体系pH为8.0，酶解温度为50℃，酶解时间为4 h，设置不同的酶添加量，研究酶添加量对鱿鱼内脏水解效果的影响，结果如图2所示。当胰蛋白酶的添加量小于7000 U/g时，鱿鱼内脏酶解后的水解度呈平稳状态，当胰蛋白酶的添加量为7000 U/g时达到最大值，为44.96%。因此选取3000、5000、7000 U/g继续对鱿鱼内脏酶解做正交实验分析，并加以确定最佳的酶添加量。 图1. PH对胰蛋白酶水解度的影响 图2. 加酶量对胰蛋白酶水解度的影响 3.1.3. 温度对胰蛋白酶水解度的影响 胰蛋白酶酶解鱿鱼内脏过程中控制体系pH为8.0，酶加量为5000 U/g，酶解时间为4 h，设置不同的酶解温度，研究酶解温度对鱿鱼内脏水解影响，结果如图3所示。随着酶解温度的提高，鱿鱼内脏的水解程度逐渐提高。温度达到50℃时，水解度达到最大值，为43.6%。当酶解温度超过50℃时，水解度呈现明显下滑趋势，因此选取30℃、40℃、50℃继续对鱿鱼内脏酶解做正交实验分析，以确定最佳的酶解温度。 3.1.4. 时间对胰蛋白酶水解度的影响 控制体系pH为8.0，酶加量为5000 U/g，酶解温度为50℃，设置不同的酶解时间，研究酶解时间对鱿鱼内脏水解效果的影响，结果如图4所示。鱿鱼内脏的水解在8 h时达到最大水解程度，虽然7 h所对应的水解程度要略低于6 h，但是总体要比6小时之前所对应的值要高，所以选取6、7、8 h继续对鱿鱼内脏酶解做正交实验分析，并加以确定最佳的酶解时间。 3.2. 酶解条件的优化 在初步获得的单因素实验的基础上，要从较优的水解条件中筛选出最好的水解条件，所以选择pH、加酶量、水解时间和水解温度4个因素，设计3个水平的正交实验，见表1、表2。 由表2极差分析表明，D > A > C > B，即胰蛋白酶正交水解中影响羟自由基清除率大小的因素为时间 > pH > 加酶量 > 温度，而且清除能力最优条件是7号实验组。本次实验以羟自由基清除率为第一指标，水解度为第二指标，所以综合表2和图5可以得出，7号实验组的条件为酶解最优条件，即A 3 B 1 C 3 D 2 组合。在上述找出胰蛋白酶水解的最佳条件下进行实验验证，胰蛋白酶水解液测得羟自由基清除率达28.9%，水解度为74.25%。因此确认胰蛋白酶最佳酶解条件为A 3 B 1 C 3 D 2 ，即PH8.0、温度30℃、酶量为7000 U/g、酶解时间为7 h。 在机体的新陈代谢过程中，可产生-OH自由基，容易对机体造成损伤，对细胞结构、核酸造成伤害，使得脂质和蛋白质发生氧化，在人体内堆积过多的自由基还会造成各种慢性病的发生。因此，清除体内过剩的自由基是防治疾病发生的重要途径。本次实验以羟自由基清除率为第一指标，水解度为第二指标，在单因素基础上，选用pH、酶解温度、酶解时间、酶添加量等作为自变量，确认胰蛋白酶最佳酶解条件为pH 8.0、温度30℃、酶量7000 U/g、酶解时间7 h，酶解水解度为74.25%，羟自由基清除率为28.9%，因此本研究显示鱿鱼内脏经过胰蛋白酶水解后均表现出一定的羟自由基清除能力。 图3. 温度对胰蛋白酶水解度的影响 图4. 时间对胰蛋白酶水解度的影响 图5. 胰蛋白酶正交羟自由基清除率 Table 1 Orthogonal experimental factors of trypsi 水平 A (pH) B (温度/℃) C (加酶量/U/g) D (时间/h) 1 6.0 30 3000 6 2 7.0 40 5000 7 3 8.0 50 7000 8 表1. 胰蛋白酶酶解正交实验因素水平表 Table 2 Orthogonal experiment of trypsi 实验号 A (pH) B (温度/℃) C (加酶量/U/g) D (时间/h) 水解度(%) 1 6.0 30 3000 6 63.74 2 6.0 40 5000 7 46.97 3 6.0 50 7000 8 62.84 4 7.0 40 5000 8 61.11 5 7.0 50 3000 7 70.65 6 7.0 30 7000 6 23.68 7 8.0 30 7000 7 65.29 8 8.0 40 3000 8 13.89 9 8.0 50 5000 6 16.44 K 1 0.579 0.509 0.494 0.346 K 2 0.518 0.407 0.415 0.610 K 3 0.319 0.500 0.506 0.459 R 0.260 0.102 0.091 0.264 表2. 胰蛋白酶正交实验表 3.3. 响应面法优化鱿鱼内脏酶解工艺的研究 根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，综合分析单因素实验，选取对鱿鱼内脏水解影响的4个因素，即胰蛋白酶添加量、pH、酶解温度和酶解时间，设计了4因素3水平的响应面分析实验(见表3)。(本次29组试验均是10 g鱿鱼内脏匀浆液加20 g去离子水)。 3.3.1. 实验设计及结果分析 运用Design-Expert 8.0.6程序软件，以pH、酶解温度、酶解时间、胰蛋白酶添加量为响应变量，以水解度为响应值(指标值)对表4中的数据进行处理，得到表5方程方差分析表，利用软件进行拟合非线性回归方程的二次多项式，得到的预测模型如下： 水 解 度 = 78 . 39 + 1 .0 3A + 3 . 8 0 B + 2 . 13C + 15 . 63D + 0. 84AB + 5 . 92AC − 2 . 56AD + 3 . 51BC + 6 . 64BD + 3 . 57CD − 14 . 57A 2 − 15 . 93B 2 − 13 . 22C 2 − 18 . 14D 2 回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著(p < 0.0001)。模型与实验拟合的程度用失拟项来表示，即二者之间差异的程度。本分析表中失拟项不显著(p = 0.1448 > 0.05)，对模型是有利的，因此没有失拟因素的存在。 通过对各因素之间的影响的程度分析，F值越大，表明对实验指标的影响越大，即重要性越高。从表5可知，F A = 0.71，F B = 9.68，F C = 3.03，F D = 163.95，即各因素对鱿鱼内脏酶解水解度的影响大小顺序依次为：酶解时间 > 酶解温度 > 酶添加量 > pH。 方差分析结果还表明，B和D对响应值的影响显著，二次项AC、BD、A 2 、B 2 、C 2 、D 2 对响应值的影响显著。由此可得出结论，各具体响应值以及实验因素之间的影响不是简单的线性关系。 3.3.2. 各因素之间的交互作用 作出响应面分析图，观察相应曲面的形状，图6至图11分析了pH、酶解温度、酶解时间和酶添加量对鱿鱼内脏酶解水解度的影响。 Table 3 Experimental factors of the response surfac 水平 A (pH) B (温度/℃) C (加酶量/g) D (时间/h) 1 6.0 30 0.12 6 2 7.0 40 0.20 7 3 8.0 50 0.28 8 表3. 响应面实验因素水平表 Table 4 Experiment results of Box-Behnke 实验号 A (pH) B (温度/℃) C (加酶量/U/g) D (时间/h) 水解度(%) 1 7.00 30.00 0.20 4.00 26.98 2 6.00 40.00 0.20 8.00 65.33 3 7.00 50.00 0.20 8.00 70.46 4 6.00 40.00 0.20 4.00 25.16 5 6.00 50.00 0.20 6.00 51.46 6 6.00 40.00 0.28 6.00 42.93 7 7.00 30.00 0.20 8.00 43.91 8 6.00 30.00 0.20 6.00 47.61 9 7.00 40.00 0.28 8.00 67.32 10 8.00 40.00 0.28 6.00 58.94 11 7.00 40.00 0.12 4.00 39.87 12 7.00 50.00 0.12 6.00 42.61 13 8.00 40.00 0.20 8.00 59.53 14 7.00 40.00 0.20 6.00 78.56 15 8.00 50.00 0.20 6.00 55.84 16 6.00 40.00 0.12 6.00 49.62 17 7.00 30.00 0.28 6.00 47.31 18 7.00 50.00 0.28 6.00 58.31 19 7.00 40.00 0.20 6.00 78.34 20 7.00 40.00 0.20 6.00 78.49 21 7.00 40.00 0.20 6.00 78.13 22 7.00 50.00 0.20 4.00 26.96 23 8.00 40.00 0.20 4.00 29.62 24 7.00 40.00 0.28 4.00 31.64 25 7.00 30.00 0.12 6.00 45.63 26 8.00 30.00 0.20 6.00 48.62 27 8.00 40.00 0.12 6.00 41.93 28 7.00 40.00 0.20 6.00 78.41 29 7.00 40.00 0.12 8.00 61.28 表4. Box-Behnken实验结果 Table 5 Variance analysis of the regression equatio 项目 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性 Model 7648.00 14 548.86 30.68 <0.0001 ** A 12.75 1 12.75 0.71 0.4127 B 173.13 1 173.13 9.68 0.0077 * C 54.23 1 54.23 3.03 0.1036 D 2932.81 1 2932.81 163.95 <0.0001 ** AB 2.84 1 2.84 0.16 0.6963 AC 140.42 1 140.42 7.85 0.0141 * AD 26.32 1 26.32 1.47 0.2452 BC 49.14 1 49.14 2.75 0.1197 BD 176.49 1 176.49 9.87 0.0072 ** CD 50.91 1 50.91 2.85 0.1138 A 2 1377.39 1 1377.39 77.00 <0.0001 ** B 2 1646.75 1 1646.75 92.06 <0.0001 ** C 2 1134.00 1 1134.00 63.39 <0.0001 ** D 2 2134.07 1 2134.07 19.30 <0.0001 ** 残差 250.43 14 17.89 失拟项 250.33 10 25.03 915.94 0.1448 净误差 0.11 4 0.027 总离差 7934.43 28 表5. 回归方程方差分析表 注：**表示极显著(p < 0.01)；*表示显著(p < 0.05)。 图6. PH和酶解温度对水解度影响的响应面图 图7. PH和酶添加量对水解度影响的响应面图 图8. PH和酶解时间对水解度影响的响应面图 图9. 酶解温度和酶添加量对水解度影响的响应面图 图10. 酶解时间和酶解温度对水解度影响的响应面图 图11. 酶解时间和酶添加量对水解度影响的响应面图 3.3.3. 酶解工艺条件的验证 由Design Expert 8.0.6软件分析得到胰蛋白酶酶解鱿鱼内脏的最佳工艺条件为pH 7.04，酶解温度42.43℃，酶解时间6.98 h，酶添加量5250 U/g，鱿鱼内脏酶解后的水解度为82.906%。为验证响应面模型的可行性，采用修正后的最佳工艺条件，即pH 7.0，酶解温度43℃，酶解时间7.0 h，酶添加5250 U/g进行鱿鱼内脏酶解验证试验，3次平行试验的实际值为81.836%，与回归方程所得预测值相对偏差为1.31%，该数值表明，通过响应面优化后得到的回归方程能够较好的反映各因素对鱿鱼内脏酶解的影响。