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user: 3. 实验方法 3.1. 多次皮肤刺激性试验 [ 1 ] 3.1.1. 剂量设计 根据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则(2005年)》要求，给药组设计2个浓度组，低浓度组为临床用药浓度，高浓度组为临床用药浓度的2倍。每只兔给予0.5 ml/次。 3.1.2. 给药方法 1) 准备皮肤 试验前24 h对试验兔背部两侧皮肤剃毛，每侧剃毛面积为3 cm × 3 cm左右，并用记号笔画出给药部位为2.5 cm × 2.5 cm区域。剃毛区左右各分一块；观察给药前动物皮肤表面有无红斑、破损、结痂等情况，如有，应另外更换试验兔背部其他区域皮肤。 破损皮肤制作：给予受试物前，用消毒的5号针头在破损皮肤组家兔剃毛区域划出井字，以皮肤出现渗血为度。 2) 给药部位 设置完整皮肤试验(A组)和破损皮肤试验(B组)，完整皮肤给药组设置2个浓度组，低浓度组为临床用药浓度，高浓度组为临床用药浓度的2倍。同时设计阴性对照组，给予蒸馏水；赋形剂对照组，给予辅料；上市药物对照组，给予硝酸咪康唑搽剂(阿特维斯(佛山)制药有限公司)。每只兔给予0.5 ml/只次。剂量设置给药部位、给药量见表1、表2。 Table 1 Complete skin test grouping and related experimental informatio 动物分组 动物数(只) 剂量分组 兔皮肤分区 给予受试物 硝酸咪康唑浓度 给予量(ml) A1 4 供试品低浓度组 左侧 硝酸咪康唑搽剂(临床用浓度) 2% 0.5 蒸馏水对照组 右侧 蒸馏水 0 0.5 A2 4 供试品高浓度组 左侧 硝酸咪康唑搽剂(2倍含量) 4% 0.5 赋形剂对照组 右侧 赋形剂 0 0.5 A3 4 上市药物对照组 左侧 硝酸咪康唑搽剂(上市药品) 2% 0.5 蒸馏水对照组 右侧 蒸馏水 0 0.5 表1. 完整皮肤试验分组及相关实验信息 Table 2 Grouping of damaged skin tests and relevant experimental informatio 动物分组 动物数(只) 剂量分组 兔皮肤分区 给予受试物 硝酸咪康唑浓度 给予量(ml) B1 4 供试品低浓度组 左侧 硝酸咪康唑搽剂(临床用浓度) 2% 0.5 蒸馏水对照组 右侧 蒸馏水 0 0.5 B2 4 供试品高浓度组 左侧 硝酸咪康唑搽剂(2倍含量) 4% 0.5 赋形剂对照组 右侧 赋形剂 0 0.5 B3 4 上市药物对照组 左侧 硝酸咪康唑搽剂(上市药品) 2% 0.5 蒸馏水对照组 右侧 蒸馏水 0 0.5 表2. 破损皮肤试验分组及相关实验信息 3) 给药步骤 由助手固定试验兔，并使其俯卧，准确吸取0.5 ml各相应的受试物，均匀涂布于已经做好记号的2.5 cm × 2.5 cm受试区域，待药液稍干后，用玻璃纸覆盖后再取3 cm × 3 cm双层纱布，覆盖在该区域皮肤上，再在纱布上覆盖一层玻璃纸，并用透气胶带小心的固定受试部位，保持4 h。4 h后，小心撕去胶带，取下纱布，用温水清洗给药部位，在每次去除药物后1小时以及最后一次给药1、24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况，并根据指导原则标准对红斑及水肿进行评分。皮肤刺激反应评分标准见表3。 4) 给药频率和时间 根据药物性质，最大疗程为4周，设计给药周期为4周，每天贴敷4 h，贴敷完毕后，除去受试物并用温水清洁给药部位。 Table 3 Scoring criteria for skin irritation respons 刺激反应 分 值 (1) 红斑 无红斑 0 轻度红斑(勉强可见) 1 中度红斑(明显可见) 2 重度红斑 3 紫红色红斑到轻度焦痂形成 4 (2) 水肿 无水肿 0 轻度水肿(勉强可见) 1 中度水肿(明显隆起) 2 重度水肿(皮肤隆起1 mm，轮廓清楚) 3 严重水肿(皮肤隆起超过1 mm，范围扩大) 4 最高总分值 8 表3. 皮肤刺激反应评分标准 3.1.3. 观察指标 1) 肉眼观察：观察动物物局部反应，包括红斑、水肿、充血程度及范围，并以计分的方式表示。同时观察动物的一般状态、行为、体征以及初末体重等。在每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后1，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。72小时观察后各组处死一半动物，取给药部位的皮肤组织作病理检查，留下一半动物观察恢复情况。 2) 组织病理学检查 在去除药物观察72小时及恢复期结束，将各组家兔处死，取皮肤组织，进行组织病理学检查。 3.1.4. 评分标准 每次每只动物皮肤刺激反应评分标准见表3，多次给药按下列方式计算每天每只动物平均积分。 每 天 每 只 动 物 平 均 积 分 ＝ ∑ 红 斑 和 水 肿 积 分 受 试 动 物 数 / 观 察 次 数 皮肤刺激强度评价标准见表4。 Table 4 Criteria for evaluating skin irritation intensit 平均积分值 评价 0~0.49 无刺激性 0.5~2.99 轻度刺激性 3.0~5.99 中度刺激性 6.0~8.00 重度刺激性 表4. 皮肤刺激强度评价标准 3.2. 皮肤过敏试验 [ 1 ] 3.2.1. 剂量设计 根据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》([H]GPT4-1)以及厂家提供的说明书，本品为液体制剂，试验时不需要稀释，直接取液体贴敷于实验动物皮肤表面，设供试品低、高浓度两个组，上市药物对照组，阴性对照组、赋形剂对照组和阳性对照组，阳性对照物为2，4-二硝基氯苯。其中，供试品低、高浓度组和上市药物对照组动物数为20只，赋形剂对照、阳性对照和阴性对照各10只，雌雄各半。致敏及激发剂量见表5。 Table 5 Dose setting and grouping of miconazole nitrate liniment in guinea pig skin allergy tes 组别 动物数 致敏 激发 致敏物 致敏量 激发物 激发量 阴性对照组 10 蒸馏水 0.2 ml/只 蒸馏水 0.2 ml/只 赋形剂对照组 10 空白基质 0.2 ml/只 空白基质 0.2 ml/只 上市药物对照组 20 硝酸咪康唑搽剂(阿特维斯) 0.2 ml/只 硝酸咪康唑搽剂(阿特维斯) 0.2 ml/只 供试品低浓度组 20 供试品低浓度(临床浓度) 0.2 ml/只 供试品低浓度(临床浓度) 0.2 ml/只 供试品高浓度组 20 供试品高浓度(2倍临床浓度) 0.2 ml/只 供试品高浓度(2倍临床浓度) 0.2 ml/只 阳性对照组 10 1% 2，4-二硝基氯苯 0.2 ml/只 0.5% 2，4-二硝基氯苯 0.2 ml/只 表5. 硝酸咪康唑搽剂对豚鼠皮肤过敏反应试验剂量设置及分组 3.2.2. 试验方法 1) 样品配制及给予 分别量取供试品低、高浓度，上市药物、赋形剂空白基质0.2 ml，均匀涂于2.0 cm × 2.0 cm的豚鼠皮肤上。 阳性对照组：致敏用1% 2，4-二硝基氯苯配制：将0.1 g 2，4-二硝基氯苯，溶于1:1丙酮和橄榄油的混合物10 ml中。吸取0.2 ml均匀涂于2.0 cm × 2.0 cm的豚鼠皮肤上；激发用0.5% 2，4-二硝基氯苯配制：将0.05 g 2，4-二硝基氯苯，溶于1:1丙酮和橄榄油的混合物10 ml中。阳性物现配现用。 2) 致敏 试验前24 h对豚鼠左侧肋腹部皮肤剃毛，剃毛范围约为2.0 cm × 2.0 cm。由助手固定豚鼠，操作者取量取好受试物，均匀涂抹于剃毛部位，然后用双层纱布覆盖受试部位，再用无刺激性胶布加以固定，贴敷时间为6小时。贴敷结束后，轻轻撕下胶带，去除受试物，并用温水将受试部位清洗干净。阳性对照组吸取1% 2，4-二硝基氯苯，均匀涂布于剃毛部位约2.0 cm × 2.0 cm范围，再覆盖双层纱布，用胶带固定，6 h后按同样的方法去除受试物。致敏次数为3次，分别为第0、7、14天。 3) 激发 按照同样的方法，于末次致敏后14天、第21天，对豚鼠致敏部位对侧相应部位进行激发给药，激发物和激发剂量见表1，去除受试物后24 h和4 8小时，按照表6要求对过敏反应进行评分，并记录评分结果。计算过敏反应发生率，按表7判定供试品的致敏强度。