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user: 3. 结果与分析 3.1. 鹰嘴豆发酵产NK适宜菌株的筛选 3.1.1. 初筛结果 见表1。 Table 1 The comparison of NK activity (Fibrin-thrombin Unit/gram， FU/g) between different Bacillus subtilus strains during solid fermentation with Chickpea(Cicer arietinum) medi 菌株 (Bacillus subtilus) 鹰嘴豆品种1 鹰嘴豆品种2 鹰嘴豆品种3 T 3-2 227.2 723.5 470.7 T d-1 3211.9 4053.1 5299.5 T d-2 3025.3 3522.6 4378.2 T x-2 4173.3 3553.8 4653.3 L -1 4173.3 4308.4 3777.8 L 2-1 4059.8 3617.3 2911.7 Sh -2 530.2 970.3 1184.7 G -2 1812.3 948.6 1514.1 L 3-1 3777.8 3509.6 3875.3 Z -2 2707.6 2178.6 2911.7 D 56-3 3396.9 3649.2 4604.4 D 2-3 1538.4 953.8 1244.4 R -1 3260.8 3120.7 3668.4 R -3 2804.7 2676.6 2815.5 Sh 7-1 725.6 996.6 2314.2 表1. 不同菌株发酵鹰嘴豆产NK的比较(FU/g) 由表1、图1可知，不同菌株发酵鹰嘴豆产NK的表现差异很大，鹰嘴豆品种对NK的分泌表达也有一定的影响。其中T x-2 、L -1 、L 2-1 、T d-1 、D 56-3 等菌株发酵鹰嘴豆(3个品种综合评估)分泌纳豆激酶的能力较强；菌株L 3-1 、R -1 、R -3 、T d-2 、Z -2 次之；菌株T 3-2 、Sh 2 、G -2 、Sh 7-1 、D 2-1 、D 2-3 较差。 3.1.2. 复筛结果 将在初筛时产NK能力较强的菌株T x-2 、D 56-3 、T d-1 、L -1 等进一步进行发酵培养和重复筛选，实验结果如下。 由表2可见，菌株L -1 、T x-2 在鹰嘴豆培养基上产纳豆激酶能力较强和较为稳定，其中菌株L -1 的酶活较高。综合初筛和复筛结果，选用菌株L -1 开展下面的实验研究。 3.2. 培养时间对鹰嘴豆发酵产NK的影响 鹰嘴豆培养基含水量64%，pH7.0，31℃培养，于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h取样，其他实验条件和方法如上所述，酶活测定结果如下(表3)。 由上表3可知，发酵培养36h时NK活性达到最高；进一步延长培养时间，NK活性没有提高，而且呈缓慢下降趋势；因此，鹰嘴豆发酵产NK的最佳发酵时间为36 h。 3.3. 培养温度对鹰嘴豆发酵产NK的影响 准确称量湿鹰嘴豆50克，121℃，25 min灭菌后接入培养24 h的L -1 菌液2 ml，分别放在即25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃培养箱中培养48 h，培养结束后40℃干燥、粉碎、进行酶活测定，结果如下(表4)。 图1. 不同菌株发酵鹰嘴豆产纳豆激酶的比较(图1中的T d-1 、L -1 等符号对应表1中及正文中的不同菌株的编号) Table 2 The secondary screening result for NK activity of different strains with chickpea medi 菌株 T x-2 T d-1 D 56-3 L -1 NK活性(FU/g) 4006.76 3777.80 1489.89 5748.62 表2. 不同菌株复筛结果 Table 3 The influence of cultural durations on the NK activity with chickpea mediu 培养时间(h) 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 酶活(FU/g) 0 2800.5 5192.8 5031.8 4717.4 4515.4 5112.0 5031.8 4564.0 4873.3 表3. 培养时间对NK酶活性的影响 由表4、图2可知，发酵温度对鹰嘴豆固体发酵产纳豆激酶有一定的影响，31℃时酶活性最高，温度过低或过高酶活性均有所下降。因此，确定最佳发酵温度为31℃。 3.4. 培养基含水量对鹰嘴豆发酵产NK的影响 称取鹰嘴豆和蒸馏水，配成不同含水量的培养基(55%，25 g鹰嘴豆 + 25 ml水；64%，20 g鹰嘴豆 + 30 ml水；73%，15 g鹰嘴豆 + 35 ml水；82%，10 g鹰嘴豆 + 40 ml水；91%，5 g鹰嘴豆 + 45 ml水)。4%接种量，31℃培养；其他实验步骤和方法如上所述；酶活测定结果如下(表5)。 由表5可以看出，发酵培养基含水量为64%时酶活性最高，含水量过低或过高酶活性均有所下降。因此，确定最佳含水量为64%~65%左右。 3.5. 培养基pH对鹰嘴豆发酵产NK的影响 用0.2 mol/L Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O溶液和0.2 mol/L NaH 2 PO 4 ∙2H 2 O溶液调整培养基pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；培养基含水量64%，31℃培养箱中培养36 h；其他步骤和方法同上。结果见表6。 由上表可知，培养基pH值为6.0~7.0时酶活性最高，可见，鹰嘴豆发酵产纳豆激酶的适宜培养基pH值为6.0~7.0。 3.6. 添加剂(无机盐及表面活性剂)对鹰嘴豆发酵产NK的影响 在鹰嘴豆培养基添加不同组合的无机盐和表面活性剂溶液(表7)，调整培养基pH值至7.0，含水量64%；31℃培养箱中培养36 h；其他步骤和方法同上。实验结果如下(表8)。 由表8可知，鹰嘴豆发酵培养基添加适量的无机盐和表面活性剂对NK的分泌是有利的；适宜配方 Table 4 The influence of the culture temperatures on the NK activity with chickpea medi 温度(℃) 25 28 31 34 37 40 酶活(FU/g) 4479.59 4758.70 5484.87 5262.76 4936.44 4618.33 表4. 培养温度对NK酶活性的影响 Table 5 The influence of the medium moisture content on the NK activity (Note: The chickpea moisture content were assumed 10% 含水量(%) 55 64 73 82 91 酶活(FU/g) 4410.82 5940.05 5189.54 5116.72 4308.44 表5. 培养基含水量对NK酶活性的影响 注：干鹰嘴豆含水量按10%计。 Table 6 The influence of the medium pH values on the NK activit pH 5 6 7 8 9 酶活(FU/g) 3973.75 6188.79 6529.56 5522.25 4688.31 表6. 培养基pH值对NK酶活性的影响 Table 7 The experimental combinations design of different inorganic salts and different surfactant (Tween 80) concentra- tions with chickpea medi 添加剂种类及水平 MgSO 4 (A) CaC1 2 (B) K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 (C) Tween80 (D) 1 0.02% 0.02% 0.2% + 0.1% 0 2 0.04% 0.04% 0.4% + 0.2% 0.05% 3 0.06% 0.06% 0.6% + 0.3% 0.1% 实验编号 A B C D I 1 1 1 1 II 1 2 2 2 III 1 3 3 3 IV 2 1 2 3 V 2 2 3 1 VI 2 3 1 2 VII 3 1 3 2 VIII 3 2 1 3 IX 3 3 2 1 表7. 不同组合的添加剂(无机盐及表面活性剂)的实验设计 Table 8 The influence of additive groups (inorganic salts and surfactant Tween80) on the NK activity with chickpea medi 实验编号 I II III IV V VI VII VIII IX 酶活(FU/g) 6036.72 6330.52 5129.07 4829.49 6134.02 4139.83 6330.52 6731.14 5373.36 表8. 添加剂（无机盐及表面活性剂）对NK酶活性的影响 图2. 培养温度对鹰嘴豆发酵产纳豆激酶的影响(图2中的25、28、31、34、37对应表3中的培养温度25℃~37℃) 为A 3 B 2 C 1 D 3 ，即0.06% MgSO 4 、0.04% CaCl 2 、0.2% K 2 HPO 4 、0.1% KH 2 PO 4 和0.1% Tween80。在此组合下，鹰嘴豆发酵产NK的单位酶活可达6731 FU/g。