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user: 3. 主要结果 3.1. 探测9节点模拟数据临界点 该部分本文通过构造9节点基因调控网络，生成疾病仿真数据，并将本文中算法应用在模拟数据中探测疾病临界点。 复杂疾病发展过程的动态过程无论在恶化前或者是恶化后都是非常复杂的，由于复杂疾病有超过数千个因素影响(如基因因素、遗传因素等)，因此状态方程通常具有大量变量与参数。但过去研究表示 [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] ，可以将复杂疾病动态过程简化为： Z ( k + 1 ) = f ( Z ( k ) ; Q ) (8) 其中， Z ( k ) = ( z 1 ( k ) ， ⋯ ， z n ( k ) ) 代表在第k个时间点的n维基因状态，同时也是基因或蛋白质浓度， Q = ( q 1 ， ⋯ ， q s ) 是s维参数向量，也代表多个疾病状态影响因素。若系统同时满足以下条件： 1) Z ¯ 是系统(8)的平衡点，即 Z ¯ = f ( Z ¯ ; Q ) 。 2) 存在一个 q c 使得雅各比矩阵 J = ∂ f ( Z ( k ) ， q c ) ∂ Z | Z = Z ¯ 存在一个特征值，该特征值或其复共轭对的模等于1。 3) 当 q ≠ q c 时，J的特征值的模均不等于1。 那么当q达到 时，系统在 Z ¯ 产生分岔。 根据以上特征，本文利用以Michaelis-Menten方程结合基因自身的降解速率，构建出9个节点的基因调控网络，公式(9)中9个微分方程体现了节点之间调控关系，其基因网络如图2(A)所示。 { d z 1 ( t ) d t = ( 8 − 4 | Q | ) z 2 ( t ) 15 ( 1 + z 2 ( t ) ) − 4 + 4 | Q | 15 z 1 ( t ) + τ 1 ( t ) d z 2 ( t ) d t = ( 4 − 2 | Q | ) z 1 ( t ) 15 ( 1 + z 2 ( t ) ) − 8 + 2 | Q | 15 z 2 ( t ) + τ 2 ( t ) d z 3 ( t ) d t = 4 | Q | − 10 15 + 5 − 2 | Q | 15 ( 1 + z 1 ( t ) ) + 5 − 2 | Q | 15 ( 1 + z 2 ( t ) ) − z 3 ( t ) + τ 3 ( t ) d z 4 ( t ) d t = 4 | Q | − 12 15 + ( 6 − 2 | Q | ) z 1 ( t ) 15 ( 1 + z 1 ( t ) ) + ( 6 − 2 | Q | ) z 2 ( t ) 15 ( 1 + z 2 ( t ) ) − 6 5 z 4 ( t ) + τ 4 ( t ) d z 5 ( t ) d t = 4 | Q | − 14 15 + ( 7 − 2 | Q | ) z 1 ( t ) 15 ( 1 + z 1 ( t ) ) + ( 7 − 2 | Q | ) z 2 ( t ) 15 ( 1 + z 2 ( t ) ) − 7 5 z 5 ( t ) + τ 5 ( t ) d z 6 ( t ) d t = − 11 5 + 1 15 ( 1 + z 1 ( t ) ) + 1 15 ( 1 + z 2 ( t ) ) + z 3 ( t ) 5 ( 1 + z 3 ( t ) ) + 1 5 ( 1 + z 5 ( t ) )                           + 1 5 ( 1 + z 7 ( t ) ) + 1 5 ( 1 + z 8 ( t ) ) − 8 5 z 6 ( t ) + τ 6 ( t ) d z 7 ( t ) d t = z 8 ( t ) 10 ( 1 + z 8 ( t ) ) − 19 10 z 7 ( t ) + τ 7 ( t ) d z 8 ( t ) d t = z 7 ( t ) 10 ( 1 + z 7 ( t ) ) − 19 10 z 8 ( t ) + τ 8 ( t ) d z 9 ( t ) d t = z 7 ( t ) 10 ( 1 + z 7 ( t ) ) + 3 z 7 ( t ) 10 ( 1 + z 7 ( t ) ) − 11 5 z 8 ( t ) + τ 9 ( t ) (9) 在公式(9)中，参数Q是标量控制变量， τ i ( t ) 是均值为0的高斯噪音。 z i ( t ) 代表mRNA-i浓度。其稳定平衡点为 Z ¯ = ( z ¯ 1 ， z ¯ 2 ， z ¯ 3 ， z ¯ 4 ， z ¯ 5 ， z ¯ 6 ， z ¯ 7 ， z ¯ 8 ， z ¯ 9 ) = ( 0 ， 0 ， 0 ， 0 ， 0 ， 0 ， 0 ， 0 ， 0 ) (10) 并且可以将微分方程转变为 Z ( k + 1 ) = f ( Z ( k ) ， q ) 的形式。 我们设 Z ( k + 1 ) 的雅各比矩阵为 J = ∂ f ( Z ( k ) ， q ) ∂ Z | Z = Z ¯ ，这里 J = e Δ t ⋅ A (11) A为公式(9)的系数矩阵。令 Δ t = 1 ，从J中我们可以得到9个互不相同的特征值 ( 0.67 | Q | ， 0.45 ， 0.37 ， 0.3 ， 0.25 ， 0.2 ， 0.17 ， 0.14 ， 0.11 ) 。当 时， 0.67 | Q | → 1 ，此方程在该点为一个分岔点，即当 Q ∈ ( − 1 ， 0 ] 时，平衡点 Z ¯ 是稳定，当Q从小于0接近 P c = 0 时，系统变得不稳定，即 P c 为该微分方程一个分岔点。 将本文方法应用于上述构造的模拟数据集中，其个体特异性异常指标如图2(B)所示，当参数接近Q = 0的时候，个体特异性异常指标剧烈的增长，而在当Q远离0点时，指标接近于0。另外，在Q = 0的时，实验样本的指标所形成的“箱体”变大，即趋于不稳定。 图2. 模拟数据集网络结构(A)与验证结果(B) 值得注意的是，虽然模拟数据集中已知基因连接结构，但使用本文方法时并未使用其网络结构，即探测临界点时不再需要知道原基因之间的连接结构，仅仅需要把可能相关的基因多个时间节点的值放入模型当中即可。 3.2. 探测实际数据集的临界点 将该种方法应用于肺癌数据(GSE2565)与前列腺癌数据(GSE5345)当中，数据可以从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中获得。 GSE2565数据是将小鼠暴露在氯化碳(光气)与空气当中得来的，这会导致小鼠在24个小时内发生不可逆转急性肺损伤和肺水肿，在暴露后的0.5、1、4、8、12、24、48、72小时后分别搜集对照组与实验组小鼠的RNA，而对照组、实验组在每一个时刻分别取6个小鼠样本，以判断肺癌发病的时间。 根据肺癌数据，利用本文构建的个体特异性异常指标的方法，可以得到在时间点t = 8 h时个体特异性异常指标明显增长并达到峰值(图3(A)、图3(B))。其DNB (由临界点变化基因表达最显著的前200个基因组成，下同)中55.4%基因对的 | Δ P C C | 经过z检验其p值小于0.05，于此相对比的在同一时刻对照组的基因对p值小于0.05的占25.21%。 图3. 个体特异性异常指标在急性肺损伤数据中应用 利用Cytoscape画出其基因表达与网络动态变化图(图3(C))，其中DNB基因放于左上角的圆形当中。在t = 8时DNB基因表达明显，而在其他时间表达并无明显变化。另外，个体特异性异常指标突增前后基因表达由低表达(高表达)变为高表达(低表达)的基因有40.8% (图3(D))，与其相对比，所有基因平均翻转为10.2%。 上面都指明在临界点前后，基因发生了显著的变化。这与实验结论相一致 [ 13 ] ：暴露在光气后8小时，BALF蛋白水平升高、肺水肿增加，这导致了存活率降低，在12小时观察到50%~60%的死亡率、24小时后观察到60%~70%的死亡率。这恰好说明暴露于光气8小时进入了疾病爆发期。 研究指出 [ 14 ] ，雄激素对前列腺癌细胞系LNCaP有显著的调控作用，GSE5345数据就是通过将前列腺癌细胞系LNCaP暴露在雄激素(以在乙醇作为对照)的实验中，分别在0、6、9、12、18、24和48小时采集RNA得来，每个时间点对照组、实验组分别各有4个数据。 前列腺癌数据中，通过数值实验可以看到，个体特异性异常指标在t = 24 h时候明显增长并达到峰值(图4(A)、图4(B))，其DNB中 | Δ P C C | 经过z检验后p值小于0.05的有48.18%，于此相对比的在同一时刻对照组的基因对p值小于0.05的占33.36%。 针对数据中的DNB数据利用SurvExpress进行生存分析(图4(C))，当DNB基因异常时，前列腺癌病人存活率显著下降，存活时间显著缩短。而针对其DNB中所有基因进行单个生存分析，其对患者存活率有显著影响的基因分别有POLD1，B2M，MBOAT2，DNMT3A，EGR1，SYNPO2，SORBS1，ETV6，ALDH1A2，CD47，EGFR，BCL2L2，STX12，ZNF273，EIFAY，TSTA3，共16个基因。其基因表达与网络动态变化图如图4(D)所示，DNB基因放于左上角，可以看到在t = 24 h基因表达明显，而在其他时间所有基因并无明显表达。DNB基因发生反转的比率占42.3%，而所有基因反转的比率占13.6%。 过去对该数据集的研究中 [ 15 ] 指出：在24 h时，雄激素调节的内含子RNA分为三种类型，第一组RNA在24小时内水平下降2~3倍；第二组RNA在24小时内增加2~3倍；第三组RNA在24内增加3~6倍。而三组RNA均在24小时后逐渐恢复。这说明了在24小时为前列腺癌重要临界点。 图4. 个体特异性异常指标在前列腺癌数据中应用 3.3. 功能分析 利用KEGG (https://www.kegg.jp/) [ 15 ] 对影响个体特异性异常指标最显著的200个基因进行功能分析(如表2，仅列出部分)，其对异常指标影响最显著的200个基因中，所属于通路均与疾病发展联系密切。 针对鼠类肺部损伤数据，KEGG分析结果为主要影响了代谢途径通路、癌症通路、MAPK信号通路等，MAPK与PI3K-AKT信号通路影响细胞的繁衍与凋亡过程，均为受其氧化反应影响的通路。针对前列腺癌数据，最显著的基因中与影响了癌症及相关通路有关(如癌症通路、癌症中蛋白聚糖)，同时也与影响MAPK通路等关于细胞增殖与凋亡的通路有关。 Table 2 Result of KEG 疾病名称 通路ID 通路名称 p value 急性肺损伤 mmu04060 细胞因子–细胞因子受体相互作用(9个基因) 1.5E−2 mmu05200 TNF信号通路(10个基因) 1.3E−5 mmu04010 MAPK信号通路(12个基因) 4.6E−4 mmu05166 HTLV-1感染通路(12个基因) 1.0E−3 mmu04151 PI3K-AKT信号通路(9个基因) 9.4E−2 前列腺癌 hsa05200 癌症通路(14个基因) 3.3E−3 hsa04015 RAP1信号通路(10个基因) 2.8E−3 hsa05205 癌症中蛋白聚糖(13个基因) 2.2E−5 hsa05166 HTLV-1感染通路(11个基因) 3.9E−3 hsa04810 肌动蛋白细胞骨架的调控(10个基因) 2.7E−3 hsa04010 MAPK信号通路(9个基因) 2.5E−2 表2. KEGG分析结果