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user: 4. 病理学的局限性 到目前为止，不可能准确地确定在诊断时未发生临床上可检测的转移的肿瘤是否会在随后的几年中转移。然而，该信息对于确定例如是否需要辅助治疗是至关重要的。这为患有辅助治疗的患者提供了合理的治疗原发性和隐匿性转移在临床实践中，可能发生转移，而原发肿瘤未知或不清楚某个转移是否来自已知的原发性肿瘤。最常见的是，组织病理学除了形态学免疫表型分析外，还可以揭示组织来源。尽管如此，基因表达谱可能对根据其来源组织对癌细胞进行分类有额外的帮助。结果表明，原发性肿瘤的分子特征在其转移灶中得以保留，因此可以进行明确的分配，为充分的治疗提供必要的信息。此外，可以证明DNA阵列能够区分肺腺癌和肺外转移灶。未知原发性癌症的起源可以源自特征性表达模式。由于适应治疗干预的高效力，恶性肿瘤细胞经常响应于放射或细胞抑制药物而发展逃逸机制。尽管已经进行了许多尝试，但到目前为止，还没有可靠且实用的技术来预测肿瘤对药物或辐射的反应。其原因是多种细胞机制，例如DNA修复增加，药物转运蛋白水平升高，解毒酶过度表达，以及通常参与耐药性发展的细胞凋亡率降低。为了监测在药物不敏感的肿瘤中发生的多种改变，需要高度平行的分析，例如DNA微阵列技术和蛋白质组学分析。这个机会开启了新的维度来预测治疗抵抗力和敏感性。美国国立卫生研究院最近的一项研究，研究了60种肿瘤细胞系(NCI60)，这些细胞系已经用超过70，000种不同的药剂独立治疗，一次一种。在其他结果中，该研究通过将细胞药物反应与源自DNA微阵列的转录组学信息相关联，将生物信息学和化学信息学联系起来。目的是将相关药物簇与基因改变簇相关联，从而确定药物基因关系。该方法可以有助于建立确定的表达数据库，在该数据库上可以建立肿瘤药物反应的个体化分子药理学。通过比较野生型细胞系和对胸苷酸合酶(TS)抑制剂具有抗性的衍生物 [ 16 ] 。能够识别与TS抗性相关的某些遗传改变模式。相关的基因表达谱是部分组织依赖性的，例如，YES1在上皮细胞系中过表达，而在淋巴母细胞系中没有上调。通过微阵列分析显示顺铂(cDDP)抗性伴随着编码膜蛋白和糖蛋白激素亚基的基因表达的改变，其先前未知在cDDP抗性中起任何作用。 针对通常用于临床治疗的九种抗癌药物的特征性表达谱测试了85种人癌异种移植物。鉴定了超过1，500个基因，其表达谱在某种程度上与化学敏感性相关。作者确定了一组基因，这些基因可能部分与特定肿瘤类型(结肠癌，乳腺癌，非小细胞肺癌等)对所应用的不同药物的化学敏感性相关 [ 17 ] 。为了预测辅助治疗在食管肿瘤中的疗效，将DNA微阵列技术应用于具有临床已知反应的20个癌症标本。确定了52个基因，这些基因可能与患者的结果相关，并可能与化学敏感性和化学抗性相关。该方法显示了提前确定药物反应的一些潜力。此外，研究了19例急性淋巴细胞白血病患者的骨髓样本中对ABL酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。基于95个差异表达的基因，似乎可以区分响应者和非响应者。因此，基因表达谱可以有助于抗癌疗法的预处理评估。虽然仍然需要进行748次大量实验，但可能有可能预测化疗耐药性并避免对患者无效的药物和不必要的副作用。治疗前响应者和非响应者之间的区别将进一步刺激个体化治疗策略的发展，其具有个性化的药物组合。DNA微阵列分析的缺陷许多研究已经显示出与肿瘤生物学的某些方面相关的特征性表达模式。数十个基因与预后，耐药性，转移潜力等有关；然而，到目前为止，结果的临床确认仅在途中。DNA微阵列的临床应用将需要高水平的再现性和技术可靠性，样品处理和分析。一个主要障碍是微阵列数据的实验室间和平台间的可重复性仍然很低。Tan等人在2003年描述了这个问题背后的几个原因。三种最广泛使用的商用平台的比较显示出显着的不一致，这可能部分地不仅归因于阵列类型之间的差异，而且归因于用于数据评估的不同算法 [ 18 ] 。2001年，已经提出了MIAME标准，其中包括针对某个微阵列实验的预定义信息集，该实验允许对结果进行独立评估并得出结论。该研究表明，与之前的报告一样，所使用的微阵列类型对微阵列数据的可比性影响最大。更重要的是，作者得出结论，在应用共同的商业微阵列平台时，标准化的实验图像分析和数据处理方法可以在不同实验室中进行的实验之间实现高达0.9的相关系数。 因此，仔细的实验设计和整个程序的严格标准化对于微阵列实验的再现性在未来将是至关重要的。此外，应该牢记在过去几十年中经常阻碍癌症研究的基本挑战。这些包括肿瘤间和肿瘤内异质性，标本的提取，储存或诊断不当，以及细胞系特性的意外变化。这些并发症仍然具有相关性，甚至可以通过高通量技术加速。 蛋白质组技术的快速发展将肿瘤诊断提升到了一个新的水平。尽管上面讨论的基于DNA和RNA的信息具有高度相关性，但核酸是远离决定疾病特征的生理事件的几个抽象层。蛋白质控制代谢过程，蛋白质相互作用和翻译后修饰，因此是未来分子病理学方法中的主要目标。三个应用领域开始出现：(a)高灵敏度质谱耦合基于阵列的复杂蛋白质裂解物分离(表面增强激光解吸飞行时间，SELDITOF)或显微切割肿瘤样品用于早期检测和鉴定人类肿瘤的新生物标志物。(b)直接质谱分析和肿瘤和正常组织蛋白质谱的建立，和(c)蛋白质和抗体的应用用于特定鉴定某些蛋白质及其在肿瘤中的活化形式的阵列。尽管技术上先进的筛选方法改善了早期癌症检测，但在一些癌症类型中，例如卵巢癌，迫切需要允许容易和常规筛查的新方法来改善目前令人沮丧的临床结果。为此，高度敏感的SELDI-TOF方法似乎是近年来最有前途的技术发展。通过应用来自50名健康女性和50名卵巢癌患者的血清光谱作为训练集，他们提出了蛋白质组学特征，其将癌症与非癌症分离，灵敏度为100%，特异性为95%。然而，这些结果受到严厉批评，并且在最近的出版物中对期望进行了平滑。此外，这引发了关于建立和证明新技术可靠性的未来过程的激烈辩论。因此，尽管是一种令人兴奋的新方法 [ 19 ] 。最近表示，血清蛋白质组分析的现有技术水平允许有相当大的改进空间。虽然血清蛋白质组学分析目前在鉴定新的和早期癌症标志物中进行了测试，但SELDITOF已成功应用于通过激光捕获显微切割的小心解剖的不同肿瘤区域的表征。与前列腺前列腺上皮内瘤(PIN)病变和正常前列腺上皮相比，该方法用于鉴定在前列腺癌细胞中差异表达的标志物。还开发了类似的实验方案用于膀胱癌，结肠癌和乳腺癌的蛋白质组学评估。 除了使用质谱法直接鉴定蛋白质之外，还开发了抗体阵列和所谓的反相蛋白质阵列方法，并将其应用于肿瘤相关蛋白质及其活化的磷酸化衍生物的鉴定。如今仍处于发育阶段，两种类型的阵列可能成为cDNA或寡核苷酸的有价值替代品，也可用于日常病理常规期间的免疫组织化学分析。对于这些应用而言，主要障碍是抗体特异性和亲和力的广泛范围，这使得确定的抗体-抗原相互作用的检测复杂化。一些研究使用抗体阵列来分析源自肝细胞癌或乳腺癌的肿瘤样本中的蛋白质模式，在组织微阵列上应用验证策略，例如标准免疫组织化学，以证明其平台的特异性。抗体微阵列的有趣衍生物是RPA。在这种情况下，代替抗体，将全蛋白裂解物点在玻璃表面上，通过抗体检测不同的蛋白质。该程序可与激光捕获显微切割相结合，每个患者组可应用于微型稀释曲线，以提高量化准确度并扩大动态范围。RPA由冷冻组织样品产生，因此允许使用对磷酸蛋白特异的检测抗体。因此，该技术被用于比较正常前列腺上皮，PIN和侵袭性前列腺癌中磷酸化Akt和Erk测量的存活途径激活。此外，它已被用于病理学研究滤泡性淋巴瘤中Bcl-2和Akt家族成员的相对表达水平。可以预见这些方法在阐明酪氨酸激酶受体(如HER2)下游的细胞内信号传导网络方面的未来意义。 从细胞内癌基因如RAS中出现癌症治疗。新的很多物质设计用于干扰特定分子靶标的癌症药物的产生，其被认为通过调节关键信号传导途径在肿瘤生长中具有关键作用。然而，这需要开发优化的方案和卓越的检测技术以及Sheehan等人最近描述的参考标准的使用。表观基因组学通过向CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基添加甲基基因对DNA的表观遗传修饰是目前已知的肿瘤抑制基因失活的最重要机制之一。与基于RNA的基因表达分析相比，基于DNA的甲基化分析具有几个优点。适合于这种实验的DNA的制备可以从冷冻和石蜡包埋的组织中成功获得。此外，根据目前的知识，基因的甲基化是相当稳定的修饰，由于RNA衰变而不像mRNA表达分析那样产生尽可能多的伪影。现在设计甲基化阵列用于在不同CpG位置的DNA甲基化的高通量分析。此外，最近开发了一种基于实时PCR的基因和甲基化特异性检测方法。对于甲基化阵列，来自研究组织的基因组DNA用亚硫酸氢钠处理，导致未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。在该程序之后，使用荧光标记的引物对来自含有CpG的调节区域的特定片段进行PCR扩增。在PCR扩增期间，尿嘧啶残基(UpG)被酪氨酸残基(TpG)取代。然后将这些片段与点在微阵列上的互补寡核苷酸杂交，所述微阵列对最初的非甲基化CpG二核苷酸是特异性的 [ 20 ] 。 此类应用已用于鉴定与肿瘤进展相关的CpG岛甲基化，并评估化疗后卵巢癌患者无病生存的潜在意义。此外，复杂的技术(甲基化目标阵列)能够同时检测数百个肿瘤样本中已知肿瘤抑制基因如WT1，BRCA1，p16INK4A等的CpG岛甲基化。一个有趣的进一步发展是表达和甲基化阵列的组合使用，甚至结合使用相同组织样品的组蛋白乙酰化的分析。这种方法允许甲基化数据与表达数据的相关性和具有更高准确度的含有高甲基化CpG岛的功能相关基因的鉴定。尽管已经存在大量关于肿瘤组织中DNA甲基化的高通量分析的出版物，但显然必须进一步开发该技术以进入常规临床诊断程序。然而，很明显，在将来，需要结合转录组学，蛋白质组学和表观基因组学分析来鉴定与预后和治疗具有最高相关性的肿瘤特异性改变。这种发展与在不久的将来可以显着改善肿瘤治疗的期望密切相关 [ 21 ] 。