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user: 4. 结果与分析 4.1. 热水浸提法 热水浸提法各因素对枣多糖提取率的影响，如图1。 由图A可知，在固定液料比20:1 (mL/g)、提取时间2 h，枣多糖提取率随温度的升高而不断升高，其原因是高温使枣植物细胞发生破裂，细胞内多糖类活性物质不断溶出，当温度超过90℃时，枣多糖提取率没有明显升高，溶出影响多糖产出的其他物质，因此选取提取温度90℃为最佳。 由图B可知，在固定提取温度90℃、液料比20:1 (mL/g)，随提取时间的不断增加，枣多糖的提取率随之升高，当时间为2 h时，提取率达到最高，随着提取时间的增加，枣中酚类、枣醇以及挥发油等杂质相继溶出，枣多糖的溶出相应被影响，从而使得枣多糖的提取率下降，故选取2 h为最佳提取时间。 由图C可知，在固定提取温度90℃、提取时间2 h条件下，枣多糖提取率随液料比的增加而上升，当液料比达到25:1 (mL/g)时，枣多糖提取率为53.49%，随着液料比的不断升高，枣多糖提取率下降，故选取液料比25:1 (mL/g)为最佳液料比。 另外，由表1可直观的看出，最佳试验条件为提取时间2 h，提取温度90℃，液料比25:1 (mL/g)，即A 2 B 2 C 2 ，且影响热水浸提法提取枣多糖的工艺顺序：液料比C < 提取时间B < 提起温度A，对最优实验条件进行3组平行实验验证，在最优条件下，枣多糖的提取率为54.27% ± 2.64%。 图1. 提取温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)对枣多糖提取率的影响 Table 1 Orthogonal test results analysis table (L9(33) 序号 因素 枣多糖提取(%) A (提取温/℃) B (提取时/h) C (料液比mL/g) 1 1 (80℃) 1 (1.5 h) 1 (20:1) 42.52 ± 3.24 2 1 2 (2 h) 2 (25:1) 46.57 ± 1.52 3 1 3 (2.5 h) 3 (30:1) 45.40 ± 1.12 4 2 (90℃) 1 2 46.80 ± 2.12 5 2 2 3 50.11 ± 3.70 6 2 3 1 48.67 ± 2.57 7 3 (100℃) 1 3 41.85 ± 1.34 8 3 2 1 45.68 ± 1.71 9 3 3 2 44.24 ± 1.65 K 1 134.49 131.17 136.87 K 2 145.58 142.36 137.61 K 3 131.77 138.31 137.36 R 13.81 11.19 0.74 表1. 正交试验结果分析表(L 9 (3 3 )) 4.2. 超声波冰浴提取法 超声冰浴提取法各因素对枣多糖提取率的影响，如下图2。 图2. 超声功率(A)、超声时间(B)、液料比(C)对枣多糖提取率的影响 从图A可看出，在超声时间20 min、液料比25:1 (mL/g)条件下，超声功率在100~300 W时，枣多糖提取率随超声功率的增加而不断升高，当超声功率大于300 W时，溶液中枣多糖溶出速率小于分解速率，使得枣多糖提取率呈下降趋势，故选取300 W作为最佳超声功率。 从图B可看出，当固定超声200 W、液料比20:1 (mL/g)时，枣多糖的提取率随着超声时间的增加呈先增后降的趋势，其原因为枣多糖溶出速率随超声时间的增加呈先增后减，而随着超声时间增加，多糖在溶液中分解速率不断增大。当超声时间超过20 min时，枣多糖提取率开始下降。因此，选取20 min为最佳超声时间。 从图C可看出，在固定超声功率200 W、超声时间20 min条件下，随着液料比的不断升高，枣多糖提取率也随之增加，当液料比超过30:1 (mL/g)时，枣多糖提取率开始趋于平衡，但是略有下降，则选取30:1 (mL/g)为最佳超声液料比。 另外，根据表2正交试验结果分析表所示，最佳提取工艺条件为：超声时间20 min、超声功率300 W、液料比25:1 (mL/g)，即A 2 B 2 C 2 ，且影响超声提取枣多糖的工艺顺序：液料比C < 超声时间B < 超声功率A，对最优实验条件进行3组平行实验验证，此时枣多糖的提取率为56.93% ± 2.79%。 Table 2 Orthogonal test results analysis table (L9(33) 序号 因素 提取率/% A(超声功率/W) B(超声时间/min) C(料液比mL/g) 1 1 (200 W) 1 (15 min) 1 38.22 ± 1.50 2 1 2 (20 min) 2 44.18 ± 2.81 3 1 3 (25 min) 3 40.38 ± 1.51 4 2 (300 W) 1 2 45.49 ± 2.64 5 2 2 3 51.23 ± 1.64 6 2 3 1 48.00 ± 3.18 7 3 (400 W) 1 3 38.72 ± 2.44 8 3 2 1 45.72 ± 2.42 9 3 3 2 42.17 ± 2.83 K 1 122.78 122.93 131.94 K 2 145.22 141.13 132.34 K 3 126.61 130.55 130.42 R 22.44 18.2 1.92 表2. 正交试验结果分析表(L 9 (3 3 )) 4.3. 酶解提取法 1) 酶组合优化实验结果，如表3所示，我们可以得到最佳的酶组合方案为混合酶2，其枣多糖提取率最高为52.74% ± 4.15%。 另外，由图3可知，在液料比25:1 (mL/g)、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h，pH 5条件下，随着酶的增加量，枣多糖提取率呈现出先升高后趋向于平衡，说明酶解效率已经达到饱和状态，因此选取加酶量为0.5%为最佳。 Table 3 Effect of enzyme combination on polysaccharide extraction rat 序号 酶组合 多糖提取率/% 1 纤维素酶 38.93 ± 2.00 2 果胶酶 49.02 ± 0.36 3 混合酶1 43.37 ± 4.99 4 混合酶2 52.74 ± 4.15 5 混合酶3 50.32 ± 2.14 表3. 酶组合对于多糖提取率的影响 图3. 加酶量对枣多糖的提取率影响 2) 酶解法中各因素对枣多糖提取率的影响，如图4。 由图A可知，在酶解时间2 h、液料比25:1 (mL/g)、pH值5.0条件下，酶解温度在40℃~50℃时，枣多糖提取率不断增加，当温度继续增加时，提取率开始下降，当温度超过70℃时，枣多糖提取率呈上升趋势，其原因可能为复合酶在超过70℃条件下全部失活，此时因为温度的上升使得提取率开始有所升高，因此选取50 ℃为最佳酶解温度。 由图B可知，在酶解温度50℃、pH值5.0、液料比25:1 (mL/g)条件下，枣多糖提取率随酶解时间的增加而增加，当酶解时间超过2.0 h时，枣多糖的提取率趋于下降，可能是溶出其他除多糖外的杂质，因此选取酶解时间2.0 h为最佳。 由图C可知，在酶解时间1 h、酶解温度50℃、pH值5.0条件下，当液料比15:1~25:1 (mL/g)时，枣多糖提取率不断增加，当液料比继续增加时，使得复合酶和底物在溶液中的浓度同时下降，两者间酶解时相互接触几率下降，使得提取率开始下降，因此选取25:1 (mL/g)为最佳液料比。 由图D可知，在液料比25:1 (mL/g)、酶解温度50℃、酶解时间2 h条件下，随着pH值的变化，枣多糖提取率呈现出先升高后下降，pH值低或高都会影响复合酶的生物活性，因此选取pH5.0为最佳pH。 另外，根据表4正交试验结果分析表所示，最佳酶解法提取工艺条件为：酶解温度50℃、酶解时间2 h、液料比25:1 (mL/g)、pH4，即A 2 B 2 C 2 D 1 ，且影响酶解提取枣多糖的工艺顺序：提取时间B < pH值D < 料液比C < 酶解温度A，对最优实验条件进行3组平行实验验证，此时枣多糖的提取率为55.22% ± 2.54%。 图4. 酶解温度(A)、酶解时间(B)、液料比(C)、pH (D)对枣多糖提取率的影响 Table 4 Orthogonal test design and results analysis of enzymatic extraction of jujube polysaccharide 序号 因素 提取率/% A (温度/℃) B (时间/h) C (料液比/mL/g) D (pH) 1 1 (40℃) 1 1 (20) 1(4) 47.87 ± 1.33 2 1 2 2 (25) 2(5) 49.04 ± 2.16 3 1 3 3 (30) 3(6) 46.12 ± 1.31 4 2 (50℃) 1 2 3 47.91 ± 1.40 5 2 2 3 1 52.04 ± 1.63 6 2 3 1 2 49.60 ± 2.10 7 3 (60℃) 1 3 2 44.33 ± 1.06 8 3 2 1 3 43.10 ± 1.39 9 3 3 2 1 46.75 ± 2.12 K 1 143.03 140.11 140.57 146.66 K 2 149.55 144.18 143.7 142.97 K 3 134.18 142.47 142.49 137.13 R 15.37 4.07 3.13 9.53 表4. 酶法提取枣多糖正交试验设计与结果分析 4.4. MTT毒性试验 MTT实验表明，枣多糖可以对RAW264.7产生毒性，对于细胞生长抑制作用，并且不同提取方法的枣多糖的免疫活性并不相同，结果如图5所示。可见，酶解提取枣多糖无论低中高浓度的多糖对RAW264.7细胞生长几乎没有什么毒性，而水浴在中高的多糖浓度下高于超声冰浴提取枣多糖。由此，在一定程度上，酶解法提取而来的枣多糖毒性最小，其他两种一般。该实验结果表明不同方法提取的多糖结构或包含的活性基团不同，对于不同的细胞的作用机理性质不一样，对于细胞的毒性也有所差异 [ 26 ] [ 27 ] 。 图5. MTT毒性实验 4.5. 枣多糖对RAW264.7巨噬细胞分泌免疫调节因子的影响 促进RAW264.7巨噬细胞的分泌免疫调节因子是表明多糖类具有免疫活性的重要标志之一 [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ] 。如图6所示，三种工艺在10 μg/mL低浓度的条件下，均对RAW264.7细胞分泌NO以及H 2 O 2 具有明显的促进作用，而在50 μg/mL、100 μg/mL中高浓度下具有一定的促进作用。另外，在促进RAW264.7细胞分泌NO以及H 2 O 2 的情况下，水浴的促进作用比较明显，而超声以及酶解工艺提取的枣多糖中使得枣多糖中活性发生改变，对于MTT毒性不一样，对于促进细胞分泌免疫因子活性有所不同，而且高浓度下酶解提取多糖对于RAW264.7抑制分泌免疫调节因子的释放。