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user: 3. 方法与结果 3.1. 色谱条件 色谱柱为Shim-pack GIS C18 (4.6 × 250 mm， 5 μm)，流动相为乙腈-三氟乙酸水溶液(pH = 3.25)，流速1.5 ml/min (水相0.9 ml/min，有机相0.6 ml/min)，检测波长232 nm，进样量20 μl，柱温25℃。在上述条件下毛兰素保留时间约为21 min，如图1所示。 图1. 毛兰素标准品(a)、鼓槌石斛(b)的HPLC图；1.毛兰素峰 3.2. 标准品溶液制备 精密称取毛兰素标准品10.13 mg，加入10 ml无水乙醇，配制成浓度为1.013 mg/ml的标准品溶液。 3.3. 供试品溶液制备 取所收集的39种石斛健康无病害的石斛鲜茎段，去除叶片及叶鞘，将茎洗净并剪成小段，放于70℃鼓风干燥箱中干燥后粉碎，过40目筛，取250 mg粉末，加入10 ml无水乙醇，超声处理45 min (功率250 W频率45 kHz)，冷却后用无水乙醇补足失重，作为供试品溶液。 3.4. 方法学考察 3.4.1. 线性关系考察 将2.2项下标准品溶液梯度稀释，将得到的梯度浓度标准品溶液，在2.1项下色谱条件连续进样6次，如表1所示，以进样毛兰素浓度X (mg/ml)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明毛兰素浓度在0.00395703~0.126625 mg/ml范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y = 33462744.98X − 5801.6243，R 2 = 0.99975 (n = 6)。 Table 1 Linear relationshi 编号 Code 浓度(mg/ml) Concentration (mg/ml) 峰面积 Peak area 1 0.126625 4，249，641 2 0.0633125 2，072，585 3 0.03165625 1，045，174 4 0.01582812 556，331 5 0.00791406 258，342 6 0.00395703 125，144 表1. 线性关系 3.4.2. 精密度试验 将2.2项下毛兰素标准品溶液稀释三倍，在2.1项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算得RSD为0.41% (n = 6)，如表2所示。 Table 2 Results of precision test 进样次数 Inject number 峰面积 Peak area 平均峰面积 Mean peak area RSD 1 4，256，371 2 4，238，588 3 4，205，401 4，237，560 0.41% 4 4，239，034 5 4，236，325 6 4，249，641 表2. 精密度测定结果 3.4.3. 重复性试验 精密称取六份鼓槌石斛样品，每份250 mg，按2.3项下制成供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，RSD = 2.6% (n = 6)，表明本法重复性良好(见表3)。 Table 3 Results of reproducibility test 进样次数 Inject number 峰面积 Peak area 平均峰面积 Mean peak area RSD 1 388，540 2 407，867 3 385，349 389，980 2.6% 4 394，069 5 384，180 6 379，874 表3. 重复性试验结果 3.4.4. 稳定性试验 取一份样品按2.3项下制成供试品溶液，将20 μl样品溶液在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分别注入液相色谱仪，记录峰面积，RSD = 2.3% (n = 6)，样品在10 h内稳定性良好(见表4)。 Table 4 Results of stability test 进样次数 Inject number 峰面积 Peak area 平均峰面积 Mean peak area RSD 1 387，885 2 392，769 3 388，277 382，368 2.3% 4 380，056 5 374，349 6 370，874 表4. 稳定性试验结果 3.4.5. 加标回收率试验 分别精密吸取已知含量的供试品溶液六份，每份1 ml，分别精密加入毛兰素标准品溶液1 ml，加甲醇稀释至4 ml，注入液相色谱仪，计算回收率，平均回收率为99.96%，RSD = 1.6% (n = 6)，结果表明本法具有较好的回收率(见表5)。 Table 5 Results of recovery test 样品含量(mg) Content of sample (mg) 加入量(mg) Content of standard (mg) 测得量(mg) Measured value (mg) 回收率(%) Recovery (%) 平均回收率(%) Average recovery (%) RSD 0.01169 0.01583 0.02734 98.86 0.01169 0.01583 0.02749 99.81 0.01169 0.01583 0.02717 97.80 99.96 1.6% 0.01169 0.01583 0.02777 101.58 0.01169 0.01583 0.02746 99.62 0.01169 0.01583 0.02785 102.08. 表5. 加样回收率试验结果 3.4.6. 样品测定 将2.4.3项中的平均峰面积代入回归方程，计算得本试验所用的鼓槌石斛中毛兰素(以干燥品计)含量为0.047%。所检测的39种石斛毛兰素检出率如表6所示。 Table 6 The percentage of erianin from 39 species of Dendrobiu 种 Variety 产地 Origin 含量(%) Content (%) 金钗石斛Dendrobium nobile 云南、四川 未检出 霍山石斛D. huoshanense 四川 未检出 玫瑰石斛D. crepidatum 四川 未检出 球花石斛D. thyrsiflorum 云南 未检出 黑毛石斛D. williamsonii 四川 未检出 肿节石斛D. pendulum 四川 未检出 报春石斛D. polyanthum 四川 未检出 棒节石斛D. findlayanum 四川 未检出 春石斛D. hybird 四川 未检出 束花石斛D. chrysanthum 四川 未检出 铁皮石斛D. officinale 四川 未检出 流苏石斛D. fimbriatum 四川 未检出 天宫石斛D. aphyllum 四川 未检出 鼓槌石斛D. chrysotoxum 云南 0.047 红牙刷石斛D. secundum 四川 未检出 晶帽石斛D. crystallinum 四川 未检出 短棒石斛D. capillipes 四川 未检出 叠鞘石斛D. denneanum 四川 未检出 尖刀唇石斛D. heterocarpum 四川 未检出 杓唇石斛D. moschatum 四川 未检出 剑叶石斛D. acinaciforme 四川 未检出 黄贝壳石斛D. primulinu 云南 未检出 长苏石斛D. brymerianum 四川 未检出 矩唇石斛D. linawianum 四川 未检出 滇金石斛Flickingeriaalbopurpurea 云南 未检出 反瓣石斛D. ellipsophyllum 云南 未检出 紫婉石斛D. transparens 四川 未检出 细茎石斛D. moniliforme 云南 未检出 细叶石斛D. hancockii 四川 未检出 蜻蜓石斛D. pulchellum 四川 未检出 秋石斛D. phalaenopsis 四川 未检出 重唇石斛D. hercoglossum 四川 未检出 翅梗石斛D. trigonopus 四川 未检出 龙石斛D. draconis 四川 未检出 杯鞘石斛D. gratiosissimum 四川 未检出 血喉石斛D. ochraceum 四川 未检出 紫瓣石斛D. parishii 四川 未检出 大苞鞘石斛D. wardianum 四川 未检出 红牙刷石斛D. secundum 四川 未检出 表6. 39种石斛中毛兰素含量测定