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user: 2. 材料和方法 2.1. 数据下载 癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划是在2005年由美国国家癌症研究所和国家人类基因组研究所联合发起的一项旨在对人类全部肿瘤进行基因组测序，绘制基因变异图谱的研究计划，现已收录了34种肿瘤的11，315份组织标本多组学数据。本文的数据来源于TCGA官网(https://portal.gdc.cancer.gov)，从中获取了32例正常组织样本和375例胃癌组织样本的基因表达数据(RNA-Seq)，以及所有胃癌的DNA拷贝数变异数据(Copy Number Variation)，其中包含464例正常样本，442例患癌样本。 2.2. 数据预处理 从Genecode数据库(https://www.gencodegenes.org/)下载了染色体上基因的注释GTF文件，运用Perl脚本将所获取的所有CNV样本数据进行基因注释，表1是其中一例样本注释上基因信息以后的。 Table 1 The gene annotation information of CNV sample GDC_Aliquot Chromosome Start End Num_Probes Segment_Mean Gene 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 75589078 75594274 5 0.6533 SLC44A5 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 75774375 75775015 3 −1.1047 ACADM 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 109684695 109697556 15 −0.9718 GSTM2 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 109684695 109697556 15 −0.9718 GSTM1 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 143759680 143942271 12 −0.5761 HIST2H3PS2 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 196758720 196802150 43 0.4134 CFHR3 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 248585893 248633912 32 −0.6809 OR2T10 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 1 248585893 248633912 32 −0.6809 OR2T11 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 2 86725947 86726731 2 −1.8311 RMND5A 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 2 97199600 97211436 14 −0.6583 ANKRD36 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 2 97524284 97545726 9 1.2656 ANKRD36B 5201fb7d-ec3e-4905-92c5-571073285ab7 2 160221312 160222900 3 −1.5077 ITGB6 表1. CNV样本的基因注释信息 注：Segment Mean的值为 log 2 c o p y _ n u m b e r 2 。 再把所有注释上基因信息后的样本数据文件用perl脚本进行合并与转化，在表1中当 2 1 + SegmentMean = 1 时，定义基因的表达值为0，即没有发生拷贝数的变异； 2 1 + SegmentMean < 0.5 时，定义基因的表达值为−2； 2 1 + SegmentMean < 1.5 ，定义基因的表达值为−1， 2 1 + SegmentMean > 2.5 ，定义基因的表达值为1， 2 1 + SegmentMean > 3.5 ，定义基因的表达值为2，得到cnv的表达矩阵，如表2所示，这里的1表示基因多复制了一个，−1则表示基因少复制了一个，2表示基因多复制了两个或者两个以上，−2则表示基因少复制了两个或者多个，0则表示该基因复制正常，没有发生拷贝数变异。 Table 2 The cnv expression matri id TCGA-CG-4449-10A-01D-1155-01 TCGA-BR-6852-11A-01D-1881-01 TCGA-BR-7715-10A-01D-2052-01 … NABP2 0 0 0 … RMND5A 0 −1 0 … PABPC1L 0 0 0 … CLSPN 0 0 0 … OTOA 0 0 0 … KRTAP2-4 0 0 0 … GOLGB1 0 0 0 … ZNF705A 0 0 0 … INO80B-WBP1 0 0 0 … … … … … … 表2. cnv表达矩阵 将下载的所有RNA-Seq数据通过perl脚本处理，得到mRNA的表达矩阵，并从Genesymbol数据库下载基因的注释文件，将基因对应的id转换为基因名，得到基因的表达矩阵，如表3所示。 Table 3 The gene expression matri id TCGA-HU-A4GC-11A-11R-A251-31 TCGA-BR-6457-11A-01R-1802-13 TCGA-HU-A4GP-11A-21R-A251-31 TCGA-CG-5722-11A-02R-1602-13 … AC127070.3 1 0 1 1 … RN7SL680P 1 1 1 0 … B3GALNT1P1 9 1 18 1 … LINC02099 0 1 1 0 … AC006065.5 0 0 0 0 … ACKR2 127 65 191 70 … OR7A3P 0 0 0 0 … CXXC1P1 0 0 0 0 … CEACAM19 300 41 534 58 … … … … … … … 表3. 基因表达矩阵 2.3. 基因的筛选 将得到的基因表达矩阵导入R，运用Bioconductor的软件包edgeR [ 6 ]，以p < 0.05和|logFC| > 1.5作为筛选差异基因的标准，筛选出胃癌正常组织和癌症组织之间的差异表达的基因，得到差异表达基因矩阵。对cnv的表达矩阵运用Perl脚本进行皮尔逊卡方检验，将检验得到的Pvalue值进行校正得到adjPvalue (校正后的Pvalue)，以adjPvalue < 0.05为筛选标准，筛选出发生拷贝数变异的差异基因，得到发生DNA拷贝数变异的差异表达矩阵。筛选出既发生差异表达又发生DNA拷贝数变异的基因。 2.4. GO富集分析和KEGG通路分析 生物学过程通常由一组基因组成，而不是单独的个别基因。富集分析的主要基础是，如果在给定的研究中生物学过程异常，则通过高通量筛选技术将共同发挥作用的基因，即具有较高的富集潜力的基因选作相关群体。这样的理由可以使大型基因列表的分析从单个面向基因的视图转移到基于相关基因组的分析。因为分析结论是基于一组相关基因而不是单个基因，所以它增加了研究者识别与所研究的生物学现象最相关的正确生物学过程的可能性 [ 7 ]。 DAVID是由美国科学家建立的注释和富集分析数据库，用于基因列表或大规模蛋白质的生物特征数据描述，旨在为从基因组研究衍生的大量基因提供功能解释，为研究人员提供一套全面的功能注释工具 [ 8 ]。为了了解筛选出来的差异表达基因在胃癌的发生、发展过程中所起的生物学作用，需要给予这些基因详细的生物学注释。将合并差异表达基因后得到的上、下调基因分别上传到DAVID在线数据库进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以Pvalue < 0.05为统计截断标准，筛选出可能参与胃癌发生发展过程的关键通路。 2.5. PPI网络及重要子网络 String数据库(http://www.string-db)是一款可以预测并评估蛋白质间相互作用的在线数据库，库旨在收集，评分和整合所有可公开获得的蛋白质间相互作用信息的来源，并通过计算预测对这些来源进行补充 [ 9 ]。为了进一步了解所筛选出来的差异表达基因之间的相互作用关系，将富集分析与通路分析所得到的差异表达基因导入String数据库，以0.7的高置信阈值来构建PPI网络。将结果导出到Cytoscape软件进行可视化，并使用其中的MCODE插件寻找到PPI网络中最重要的两个子网络。结合MalaCards疾病数据库，找出子网络中与胃癌相关的基因，运用Cytoscape的插件CytoHubba构建与这些基因相互作用最大的基因的子网络。