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user: 2. 实验材料 2.1. 实验对象 2.1.1. 真菌菌种 编号为3.0772的标准烟曲霉菌菌株(中国普通微生物菌种保藏中心)。 2.1.2. 实验动物 体重约为20 g的7周至8周龄健康C57BL/6雌性小鼠(济南鹏悦实验动物繁育有限公司)。 2.1.3. 小鼠腹腔中性粒细胞 利用percoll法由小鼠腹腔中提取，具体方法见下文(2.3.5提取小鼠腹腔中性粒细胞)。 2.2. 试剂和耗材 2.2.1. 烟曲霉菌性角膜炎模型的建立 水合氯醛(10%)青岛大学附属医院，封口膜(制备角膜接触镜)上海三踏生物有限公司，外科5-0黑丝线 上海浦东金环医疗用品股份有限公司。 2.2.2. 烟曲霉菌的培养 沙氏培养基 北京索莱宝公司。 2.2.3. 中性粒细胞提取 酪蛋白 美国Sigma公司，DMEM培养基 美国Gibco公司。 2.2.4. 动物和细胞实验预处理 1-甲基-DL-色氨酸(1-MT)美国Sigma公司。 2.2.5. RT-PCR RNA裂解液 大连TaKaRa公司，异丙醇分析纯 江苏强盛功能化学股份有限公司，逆转录试剂盒 南京挪威赞公司，氯仿分析纯 江苏强盛功能化学股份有限公司，SYBR 大连TaKaRa公司，DEPC水，上海生物工程有限公司，引物的设计与合成 大连TaKaRa公司。 2.3. 实验方法 2.3.1. 烟曲霉菌的培养与孢子、菌丝刺激液的制备 室温条件下，烟曲霉菌孢子接种于沙氏琼脂培养基，35℃孵育5天。在28℃的CO 2 恒温培养箱中培育7天。收取菌丝，置于摇床中，恒温37℃，120 rpm转速，进行3天到5天的培养并随时观察菌丝的形态，待菌丝为团块状时进行菌丝收集。研磨菌丝，制备烟曲霉菌菌液(1 × 10 8 CFU/ml)。4℃，4500 rpm转速条件下进行10分钟离心，离心后弃去上清液。在菌丝中加入75%乙醇，4℃存放8小时到16小时即可制备灭活菌丝。将灭活菌丝在4℃，4500 rpm转速条件下进行10分钟离心，离心后弃去上层酒精，使用无菌磷酸盐缓冲液清洗3遍，计数板计数，将浓度调整为1 × 10 8 CFU/ml。 2.3.2. 建立烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型 将8%的水合氯醛注入小鼠腹腔片刻后即可对小鼠实施麻醉，用尖刀片刮除小鼠角膜的上皮层(约占角膜面积的1\2~2\3)后，再将烟曲霉活菌(1 × 10 8 CFU/mL)涂抹在角膜中央的破损处，封口膜自制的小鼠角膜接触镜进行覆盖，缝合睑裂。使用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜感染情况，处死小鼠后进行角膜收集。实验设计严格遵循实验动物使用的伦理准则，并获取伦理委员会批准。 2.3.3. 小鼠角膜炎症评分 在烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立后第三天，对各组小鼠的角膜炎症程度进行评级划分，将角膜溃疡面积、溃疡形态、混浊程度各分为I~IV级(1~4分)，总分为三项评分之和(0~12分)，评分原则如表1 [ 16 ]。 Table 1 Clinical score of keratiti I级 II级 III级 IV级 溃疡面积 1%~25% 26%~50% 51%~75% 76%~100% 混浊程度 轻度混浊 较混浊 不均匀混浊 均匀、重度混浊 瞳孔可见 虹膜可见 虹膜不见 溃疡形态 不规则 轻度水肿 重度水肿，龛样溃疡或后弹力层膨出 穿孔或后弹力层膨出 表1. 角膜炎临床炎症评分 2.3.4. IDO抑制剂1-MT对动物模型的预处理 随机小鼠将分成两组，一组在建模前一天开始每天予以IDO特异性抑制剂1-MT (1 mg/ml)混悬液灌胃预处理，另一组给予等量PBS灌胃作为对照。每只小鼠的右眼构建烟曲霉菌性角膜炎的动物模型，左眼不予处理，在建模后第3天进行小鼠角膜收集，此时实验模型可分为四组：损伤对照组、1-MT组、感染组、1-MT + 感染组。随后，对收集的小鼠角膜进行RT-PCR实验。 2.3.5. 小鼠腹腔提取中性粒细胞 1) 称重9 g酪蛋白溶于50 ml 0.1 mol/L的NaOH溶液，向C57BL/6小鼠的腹腔内注射1 ml酪蛋白溶液，间隔24小时后再次注射1 ml酪蛋白溶液，3小时后引颈处死小鼠并使用75%乙醇消毒。 2) 使用已消毒的剪刀纵向剪开小鼠腹部皮肤，确保腹膜完整。使用5 ml注射器吸取5 ml含10% FBS的DMEM培养液，注入小鼠腹腔并对腹腔进行按摩，保证中性粒细胞能被充分冲洗下来，为更加充分地冲洗，重复冲洗一次。 3) 培养液在4℃，2000 rpm转速条件下进行10分钟离心，倒掉上清，DMEM重悬细胞后用percoll法对中性粒细胞进行分离。加入适量含有10%FBS的DMEM重悬细胞混匀后，显微镜下计数，将细胞接种到12孔板中，在37℃培养箱中孵育2小时到3小时之后贴壁的即为中性粒细胞。 2.3.6. 中性粒细胞的刺激实验 1) 将1-MT粉末溶于1 mM的NaOH中，再使用5 mM盐酸调整pH值到7.4，终浓度为50 mM，避光储存于4℃冰箱。其他试剂根据说明书进行溶解处理。 2) 加入IDO抑制剂1-MT (1 mM))预处理0.5小时。 3) 加入烟曲霉菌灭活菌丝(5 × 10 6 CFU/ml)与中性粒细胞共培养，不同时间点(0小时、4小时、8小时、12小时、18小时、20小时、24小时)收取细胞进行RT-PCR实验。 2.3.7. RT-PCR实验方法 1) 总RNA的提取 RNA裂解液收集小鼠腹腔中性粒细胞，裂解30分钟，12，000 rpm转速条件下进行5分钟离心，吸取上清液移入新的EP管中。将200 μl三氯甲烷加入上清液中，混匀后在室温条件下放置5分钟，待分层后再次在4℃，12，000 rpm转速条件下进行5分钟离心。完毕后可见样本分为三层，吸取上层RNA移入新的EP管中。加入相同体积的异丙醇，充分混匀后室温条件下放置10分钟。将样本第三次在4℃，12，000 rpm转速条件下进行10分钟离。去除上清液，将500 ml 75%的乙醇(由无水乙醇和DEPC水配置而成)沿管壁缓慢加入，充分混匀后在4℃，12，000 rpm转速条件下进行5分钟离心。室温条件下进行20分钟干燥。使用适量DEPC水溶解RNA，可储存于−80℃冰箱备用。 2) RNA浓度检测 吸取1 μl RNA，使用核酸蛋白分析仪对所有样本在260 nm/280 nm处的OD值(吸光度值)以及A260/280的比值进行分别测定。根据测得的RNA浓度计算2 μgRNA的样本溶液体积。 3) 逆转录反应 逆转录反应按照逆转录试剂盒说明书进行。 4) PCR反应 该反应重复40个循环(图1)，循环结束后记录循环数阈值结果。引物序列见表2。 图1. PCR反应条件 Table 2 Primer sequenc Gene Primer sequence mβ-action F:GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC R:GACTCATCGTACTCCTGCTTGC mIL-1β F:CGCAGCAGCACATCAACAAGAGC R:TGTCCTCATCCTGGAAGGTCCACG TNF-α F:CCTGTAGCCCACGTCGTAG R:GGGAGTAGACAAGGTACAACCC mIL-6 F:CACAAGTCCGGAGAGGAGAC R:CAGAATTGCCATTGCACAAC mIDO F:TCCTGGCAAACTGGAAGAAA R:CACCAATAGAGAGACGAGGAAGAAG mAhR F:ATTGCCAAGTGCCAAATGGA R:GGTTAAGTGTTCAGGTGCTGTAAGA mIL-10 F:TGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGAC R:CCTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTC mIL-12 F:GGGACCAAACCAGCACATTG R:TACCAAGGCACAGGGTCATCA 表2. 引物序列 2.3.8. 统计学处理 各个实验均独立操作，各组样本量n ≥ 6，至少重复操作三次。为了比较两组之间的差异，采用t检验来确定差异的显著性。数据以 x ¯ ± s 表示，采用Graphpad Prism 8.0软件，对各组结果进行统计学分析，以P < 0.05为标准，差异具有统计学意义。