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user: 2. 诊断方法 2.1. 临床诊断 鸭感染DTMUV后，采食量迅速下降，至少减少50%，产蛋量急剧下降至20%左右，部分病鸭出现体温升高，反应迟钝、排绿色水样粪便；严重者出现神经症状，表现为双腿瘫痪，步态不稳；病鸭零星死亡，剖检病死鸭的病理变化主要为卵泡充血、出血、萎缩和变性，肺、脾、肝有出血点，肝脏和脾脏肿大，胰腺出血和坏死，输卵管存在大量黏液，部分鸭只盲肠内容物呈现污绿色或黑色，恶臭 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]。结合临床症状和病理变化可进行初步诊断，但还要依赖于实验室诊断方法进行最终判定。 2.2. 病毒的分离与鉴定 病毒的分离与鉴定是最经典、最准确的病原学检测方法，可分离得到活体病毒，对病毒的深入研究具有重要意义，但是该方法周期长，操作复杂，不适用于快速诊断。感染病鸭的卵巢、脾脏、肝脏和脑等病变组织均可作为分离DTMUV的样本，加无菌PBS或生理盐水将组织病料充分研磨后经反复冻融、低速离心、过滤除菌步骤后采用尿囊腔接种9~12日龄鸭胚或9~10日龄SPF鸡胚，盲传1~2代，收集尿囊液接种鸭胚成纤维细胞培养，可分离得到DTMUV [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]。曹宗喜 [ 18 ] 等从某鸭场的疑似鸭坦布苏病病死鸭中分离到1株病毒，并对该毒株进行PCR鉴定和序列分析，结果显示，分离株的序列与GenBank上登录的DTMUV序列的同源性在99%以上。李方韬 [ 19 ] 等人从山东省某种鸭场送检的鸭胚中分离到一株DTMUV，SDBZ株，该病毒可引起鸭胚组织器官病变，致胚胎死亡并呈现出血性水肿。王宾宾 [ 20 ] 等人从2015年采集自浙江鸭养殖场的病鸭卵巢病料分离得到2株DTMUV，经全基因组测序后进行比对分析，与GenBank中的19株DTMUV参考序列相比，在核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平上，其同源性分别大于97.1%和98.4%。 2.3. 分子生物学检测方法 分子生物学检测技术主要有逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction， RT-PCR)，套氏RT-PCR，实时荧光定量PCR和逆转录环介导等温扩增技术(RT Loop-mediated isothermal amplification， RT-LAMP)等，因具有快速、灵敏及特异性强等优点，已成为实验室常用的病原学检测手段。 2.3.1. 常规RT-PCR 目前对于DTMUV的常规RT-PCR方法，主要是针对E蛋白及非结构蛋白NS1、NS3及NS5等基因保守区域设计特异性引物建立的RT-PCR方法。万春和等 [ 21 ] 根据黄病毒NS5蛋白编码区的保守区域设计特异性引物，建立了检测DTMUV的RT-PCR方法，该方法具有良好的特异性，最低可检测到20 pg的病毒核酸。王建昌等 [ 22 ] 针对DTMUV的E蛋白编码区保守区域设计引物，建立了一步法RT-PCR，该方法最低可以检测到103拷贝/μL的DTMUV核酸。 2.3.2. 套式RT-PCR 为提高检测的特异性和敏感性，有学者在RT-PCR方法的基础上建立了套氏RT-PCR，如在E蛋白编码区设计两对特异性引物，通过两次PCR扩增获得DTMUV特异性片段，敏感性比普通RT-PCR方法提高了10倍 [ 23 ]。 2.3.3. 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR是一种敏感性高、特异性强，并能对检测样品进行定量分析的PCR方法。李庆阳等 [ 24 ] 针对DTMUV保守基因片段设计特异性引物和Taq Man探针，建立的DTMUV实时荧光定量PCR，比常规PCR方法敏感性提高了至少100倍，可用于DTMUV的检测和定量分析。刘洋等 [ 25 ] 采用TaqMan荧光标记探针技术，针对DTMUV JXSP株的保守囊膜蛋白E基因建立了快速检测DTMUV的实时荧光RT-PCR方法，试验证实该方法不会对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒等11种家禽流行病病毒发生非特异性扩增，灵敏度可达20拷贝/反应，可用于DTMUV的快速诊断和大规模检测。Yan等 [ 26 ] 建立的DTMUV E蛋白基因特异性的TaqMan探针荧光定量RT-PCR，敏感性是常规RT-PCR的100倍。 2.3.4. RT-LAMP方法 LAMP是由Notomi等 [ 27 ] 建立的一种新型核酸扩增技术，其工作原理是针对目的基因六个区域设计四条引物，通过链置换Bst DNA聚合酶在恒温条件下短时间内实现指数级的扩增，可通过肉眼观察判定结果，具有高特异性和高灵敏度。Wang等 [ 28 ] 针对DTMUV E基因保守区域设计了一套特异性引物，建立的RT-LAMP检测方法敏感度比常规RT-PCR高，检测限为2拷贝/μL。吴植等 [ 29 ] 根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因高度保守区设计了一套引物，通过优化反应体系各组分浓度、反应时间和温度，建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法，试验结果显示该方法的灵敏度是常规RT-PCR的100倍。该方法虽然在检测敏感性上不如荧光定量PCR，但其所需检测设备简单，特异性好，试验周期短，更适合野外现场和实验条件有限的基层机构使用。董嘉文 [ 30 ] 等针对DTMUV E基因保守区域设计LAMP引物，结合实时荧光技术建立了DTMUV特异性的实时荧光RT-LAMP检测方法，该方法在反应前加入饱和荧光染料SYTO-9，在ABI 7500荧光定量PCR仪中进行反应，荧光信号的累积与LAMP产物形成同步进行，只需根据扩增曲线判定结果，灵敏度是传统RT-PCR方法的100倍，因且不易形成气溶胶污染，有效避免了假阳性问题，满足疾病准确诊断要求。张伟等 [ 31 ] 针对DTMUV E基因保守区域设计引物建立了DTMUV RT-LAMP检测体系，并对比使用荧光染色剂SYBR Green Ⅰ和钙黄绿素、锰离子对扩增产物的可视化判定，SYBR GreenⅠ的显色敏感性为10拷贝/μL，钙黄绿素和锰离子组合显色极限为1000拷贝/μL，敏感性较SYBR GreenⅠ低，但其能有效避免交叉污染且操作简便，适合用于条件相对落后的基层实验室检测。 2.3.5. 多重RT-PCR检测方法 多重PCR能够同时检测和鉴别多种病原，在多种病原混合感染可能时的鉴别诊断中具有快速、便捷等优势，临床应用价值高。孙敏华等 [ 32 ] 建立了一种能够同时检测引起家禽产蛋下降的鸭坦布苏病毒、H9亚型禽流感病毒、产蛋下降综合征病毒三种病原的荧光定量PCR检测方法，经过对临床样品的检测结果说明三重荧光PCR方法比常规PCR敏感性高。李海琴 [ 33 ] 等建立了同时检测H5、H9亚型禽流感病毒和DTMUV的三重PCR检测方法，对临床200份样品的检测结果证明该方法快速、敏感、特异性强，适用于临床检测应用。张艳芳 [ 34 ] 等根据DTMUV E基因和鸭瘟病毒(DPV)UL6基因保守区域设计引物建立同时检测两种病毒的RT-PCR方法，特异性良好，不与鸭新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒发生非特异性反应，能同时检出500 fg的DTMUV和600 fg的DPV，敏感性高，满足临床检测要求。 2.4. 血清学检测方法 2.4.1. 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA) ELIA检测方法具有快速、高通量、敏感性高、特异性强等优点，已成为DTMUV血清学诊断的常用方法。王善辉等 [ 35 ] 利用杆状病毒表达系统，将DTMUV E蛋白基因在昆虫细胞中表达以获得更接近天然构想且能最大限度保留抗原表位的重组蛋白，并以该重组蛋白建立了DTMUV抗体特异性检测的间接ELISA方法，同时使用全病毒作为包被抗原的间接ELISA检测方法对来自江苏的135份樱桃谷鸭血清样品进行检测，两者符合率为93.1%。傅秋玲 [ 36 ] 等截短表达DTMUV E蛋白的主要优势抗原表位E1蛋白并以此为包被抗原建立间接ELISA检测方法，对来自福建省的237份麻鸭血清样品进行初步应用，通过与以全病毒作为包被抗原的间接ELISA检测方法比较，两者符合率为95.1%，可用于监测我国鸭坦布苏病毒疫苗的免疫效果。中国农业科学院上海兽医研究所科研人员建立的间接ELISA血清学检测方法简便快速，易于标准化，适于大规模样品的初步筛查 [ 37 ]。瑞普(保定)生物药业有限公司与中国农业科学院上海兽医研究所合作对该方法进一步优化并实现了生产转化，研制了DTMUV间接ELISA抗体检测试剂盒，初步应用试验结果表明，该试剂盒特异性好、敏感性高，可以检测到DTMUV感染后3 d的鸭血清DTMUV抗体转阳。在对300份临床样品的检测中，该检测试剂盒与中和试验总符合率为94.0% [ 38 ]。 黄病毒属中各个病毒E蛋白具有相似性，因此各个病毒血清存在一定交叉反应性，利用DTMUV E蛋白或纯化的灭活病毒作为包被抗原建立的ELISA血清学检测方法均存在黄病毒阳性血清交叉问题，为鸭坦布苏病毒病的确诊造成了困难 [ 39 ] [ 40 ]。李晨曦 [ 41 ] 等人以纯化的单克隆抗体1A5为筛选分子，采用噬菌体展示技术鉴定DTMUV E蛋白的特异性抗原表位，再利用DNAStar软件分析该表位序列在DTMUV中的保守性以及同其它黄病毒E蛋白相应位点的氨基酸序列相似性，成功筛选出DTMUV E蛋白的一个高度保守的线性抗原表位87YAEYI91，利用该表位建立Epitope-ELISA血清学检测方法，同时使用中和试验作为标准通过对126份鸭血清样品进行检测对比，结果证实Epitope-ELISA检测方法相对特异性为100%，相对敏感度为96%，但在该方法中反应的亲和力有待进一步提高。Chen等 [ 42 ] 以2种DTMUV E蛋白特异性单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法，不与鸭瘟病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鸭1型肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒发生非特异性反应，同时采用RT-PCR方法检测191份临床样本，二者符合度85.8%。 2.4.2. 乳胶凝集试验 乳胶凝集试验(LAT)操作简便、不需要特殊仪器设备，可在1~5 min内肉眼观察结果，已广泛用于畜禽传染病的血清学检测。万春和 [ 43 ] 等以浓缩纯化的DTMUV为检测抗原，通过与特异性DTMUV阳性血清反应后出现肉眼可见的凝集颗粒而建立了DTMUV抗体乳胶凝集检测方法，经试验证实该方法具有良好的特异性；同时采用间接ELISA方法对80份鸭血清进行检测，二者符合率为85.3%，因乳胶凝集试验简便、快速、特异等优点，可用于临床样品的快速诊断。