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user: 3. 结果 3.1. 大鲵病原菌的分离结果 从患病死亡大鲵病灶肌、肝、脾、胰、肾部分离出优势生长株菌，进一步对其进行革兰氏染色、氧化酶试验、麦康凯培养、溶血试验、过氧化氢试验、克氏双糖铁试验等生化及生理学特征检测，获得6株菌。将其编号为TG-1、TG-2、TG-3、TG-4、TG-5、TG-6 (表1)。 Table 1 Culture characteristics of pathogenic bacteri 项目 菌株 TG-1 TG-2 TG-3 TG-4 TG-5 TG-6 革兰染色 − − − − − − 氧化酶 + + + + + − 麦康凯 + + + + + + 溶血 − β − − α − 过氧化氢 + + + + + + 克氏双糖铁 K/A(−) K/A(+) K/A(−) K/K(−) K/A(−) K/K(−) 表1. 病原菌的培养特性 注：K/A为分解葡萄糖，不分解乳糖，K/K为不分解葡萄糖与乳糖，(+)为产气，(−)为不产气。 3.2. 鲫鱼致病性试验结果 TG-5菌株组死亡鲫鱼体表出血，眼球充血突出，剖检可见血性腹水，肝胰脏颜色变浅，肠道粘膜层充血发红。TG-2菌株组死亡鱼体出血严重，眼球充血突出，鳞片部分掉落。剖检可见大量血性腹水，血水偏黑色，肝胰脏出血，肠道粘膜层充血发红，肌肉组织稍有溃烂。其他几株菌的试验组及对照组无死亡，结果显示TG-2与TG-5菌为致病菌(表2)。 3.3. 16SrRNA测序鉴定结果 将TG-2、TG-5菌株基因组进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后显示目的条带大小约为1500 bp (见图1)，经上海生工生物工程技术服务有限公司测序，得到大小为1453 pb、1448 pb的序列。将检获得的测序列在NCBI上比对和数据分析。TG-2与TG-5的序列覆盖度最高为99%，TG-2与TG-5的99%的序列的相似度为99%。将NCBI上TG-2与TG-5比对的基因序列在DNASTAR的Megalign进行同源性比对(见图2)。若16SrRNA全长的同源性 ≥ 99%，为同种细菌。若在97%~98.9%，一般为同属不同种。若 < 95%，则为不同属 [ 6 ] 。 TG-2与TG-5的最高同源性菌均为KC202278.1号菌，达98.9%、98.5%。TG-2和TG-5的同源性略有不同，其进化树不在一个分支上。综合数据分析为：TG2与TG5均为变形菌门(Proteobacteria)，变形菌纲(Proteobacteria)，气单胞菌目(Aeromonas)，气单胞菌科(Aeromonadaceae)，气单胞菌属(Aeromonas)中的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。 Table 2 Pathogenicity test of crucian car 组别 剂量(ml) 菌株 感染尾数 每天死亡情况(d) 死亡率 1 2 3 4 5-10 试验组 0.2 TG-1 10 0 0 0 0 0 0% TG-2 10 6 4 0 0 0 80% TG-3 10 0 0 0 0 0 0% TG-4 10 0 0 0 0 0 0% TG-5 10 5 3 0 0 0 70% TG-6 10 0 0 0 0 0 0% 对照组 0.2 生理盐水 10 0 0 0 0 0 0% 空白组 0 无 10 0 0 0 0 0 0% 表2. 鲫鱼致病性试验结果 图1. TG-2、TG-5菌株的16SrRNA PCR扩增结果 图2. TG-2、TG-5的16SrRNA基因序列系统发育树 3.4. 全自动生化鉴定结果 致病菌TG-2、TG-5均为革兰阴性需氧菌，所以采用BIOFOSUN革兰阴性需氧菌鉴定板，将其培养了24 h后使用BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析仪读取板条(见表3、表4、表5)。根据BIOFOSUN-GN48鉴定板说明书 [ 7 ] 所知，相似指数S ≥ 0.5，可报告的种鉴定结果。相似指数 < 0.5，无鉴定结果。 Table 3 BIOFOSUN GN-48 identification result of TG- 底物 判定 底物 判定 水 − 蚁酸 + 土温80 + α-羟基丁酸 − N-乙酰基-D-半乳糖胺 V+ β-羟基丁酸 − 树胶醛糖 V+ γ-羟基丁酸 − D-阿糖醇 − P-羟基苯乙酸 − D-纤维二糖 − D，L-乳酸 + D-果糖 + 丙二酸 − D-半乳糖 V+ 砂糖酸 − α-D-葡萄糖 + 酮戊二酸 + 甘油 + L-丙氨酸 + α-D-乳糖 − L-丙氨酰-氨基乙酸 + 麦芽糖 + L-天冬酰胺酸 + D-甘露醇 + L-谷氨酸 + D-蜜二糖 − L-组氨酸 + β-甲基-D-葡糖苷 V+ 羟基-L-脯氨酸 V− D-阿洛酮糖 + L-亮氨酸 − D-棉子糖 − L-焦谷氨酸 − D -山梨醇- I D-丝氨酸 V+ 蔗糖 + γ-氨基丁酸 − 松二糖 − 肌苷 + 丙酮酸甲基脂 + 胸腺嘧啶脱氧核苷 + 琥珀酸单脂 I 腐胺 + 顺式乌头酸 − D，L-α-甘油磷酸盐 + 柠檬酸 − α-D-葡萄糖-1-磷酸盐 + 表3. TG-2 BIOFOSUN GN-48鉴定结果 注：“+”为阳性，“−”为阴性，“V+”为不相称阳性，“V−”为不相称阴性，“I”为中界。 Table 4 BIOFOSUN GN-48 identification result of TG- 底物 判定 底物 判定 水 − 蚁酸 − 土温80 V− α-羟基丁酸 − N-乙酰基-D-半乳糖胺 + β-羟基丁酸 − 树胶醛糖 + γ-羟基丁酸 − D-阿糖醇 − P-羟基苯乙酸 − D-纤维二糖 − D，L-乳酸 + D-果糖 + 丙二酸 − D-半乳糖 + 砂糖酸 − α-D-葡萄糖 + 酮戊二酸 − 甘油 + L-丙氨酸 V− α-D-乳糖 − L-丙氨酰-氨基乙酸 − 麦芽糖 + L-天冬酰胺酸 + D-甘露醇 + L-谷氨酸 + D-蜜二糖 − L-组氨酸 + β-甲基-D-葡糖苷 + 羟基-L-脯氨酸 − D-阿洛酮糖 + L-亮氨酸 − D-棉子糖 − L-焦谷氨酸 − D -山梨醇- − D-丝氨酸 + 蔗糖 + γ-氨基丁酸 − 松二糖 − 肌苷 + 丙酮酸甲基脂 V− 胸腺嘧啶脱氧核苷 V− 琥珀酸单脂 V− 腐胺 − 顺式乌头酸 − D，L-α-甘油磷酸盐 + 柠檬酸 − α-D-葡萄糖-1-磷酸盐 + 表4. TG-5 BIOFOSUN GN-48鉴定结果 注：“+”为阳性，“−”为阴性，“V+”为不相称阳性，“V−”为不相称阴性，“I”为中界。 Table 5 Biochemical identification results of TG-2 and TG- 菌株 种类 概率 相似指数 距离指数 TG-2 类嗜水气单胞菌DNA第二组 61% 0.520 2.131 嗜水气单胞菌DNA第一组 39% 0.334 2.278 豚鼠气单胞菌DNA第四组 0% 0.000 5.396 TG-5 嗜水气单胞菌DNA第一组 79% 0.606 3.518 中间气单胞菌DNA第5B组 16% 0.117 4.061 类嗜水气单胞菌DNA第二组 2% 0.013 4.796 表5. TG-2、TG-5生化鉴定结果 TG-2的相似指数为0.520，TG-5的相似指数为0.606。两者的指数都大于0.5；因此，TG-2为嗜水气单胞菌DNA第二组，TG-5为嗜水气单胞菌DNA第一组；将48种生化反应对照《伯杰氏系统细菌学手册》气单胞菌种属(Aeromonas)，其结果为TG-2嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila)，TG-5为嗜水气单胞菌无气亚种(Aeromonas hydrophila subsp. anaerogenes)。 3.5. 药敏试验结果 药敏试验结果表明头孢他啶，多粘菌素B对两种菌敏感，其中头孢他啶敏感性最高。TG-2对头孢哌酮，头孢曲松的敏感性也较强(见表6)。 Table 6 Drug sensitivity test result 药物名称 TG-2 TG-5 平均抑菌圈直径/mm 抑菌强度 平均抑菌圈直径/mm 抑菌强度 多粘菌素B 12.83 S 13.83 S 复方新诺明 0 R 0 R 万古霉素 0 R 0 R 头孢唑林 0 R 0 R 哌拉西林 23.3 S 10 R 诺氟沙星 0 R 0 R 米诺环素 19.67 S 17.67 I 羧芐西林 0 R 0 R 氨芐西林 0 R 0 R 多西环素 14.67 I 0 R 四环素 14.67 I 0 R 新霉素 20.67 S 20.5 R 卡那霉素 22.5 S 0 R 庆大霉素 21.83 S 15.17 R 丁胺卡那 25.5 S 16 R 苯唑西林 0 R 0 R 头孢氨苄 0 R 0 R 头孢哌酮 32.83 S 8 R 头孢他啶 32.83 S 25.67 S 头孢曲松 34.67 S 0 R 头孢呋辛 25.67 S 0 R 表6. 药物敏感性试验结果 注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感。 3.6. 小鼠致病试验结果 TG-2组小鼠出现轻微腹胀，肠道充气，壁薄，轻微充血，肝脏肿大出血，有的肝脏部分泛白，肾脏肿大，胃壁较硬。TG-5组小鼠与TG-2组的病理变化相似(见表7)。 3.7. 美蛙致病试验结果 试验组发病蛙皮肤出现不同程度的溃烂，腹部与四肢呈大片红色，肛门和四肢部位明显。TG-2菌株组解剖后腹腔有大量淡黄色腹水，暴露于空气中呈胶冻样，肝脏肿大出血，有的表面有灰白色点状病灶，脾肿大，肾充血肿胀。TG-5菌株组解剖后肝脏肿大表面红黄相间，胃充血，脾肿大，肾边缘泛白(见表8)。 Table 7 Pathogenic test in mic 组别 剂量(ml) 菌株 感染只数 每天死亡情况(d) 死亡率 1 2 3 4 5 6-14 试验组 0.2 TG-2 5 2 3 0 0 0 0 100% TG-5 5 2 2 1 0 0 0 100% 对照组 0.2 生理盐水 5 0 0 0 0 0 0 0% 空白组 0 无 5 0 0 0 0 0 0 0% 表7. 小鼠致病试验结果 Table 8 Pathogenic test of fro 组别 剂量(ml) 菌株 感染只数 每天死亡情况(d) 死亡率 1 2 3 4 5 6-14 试验组 0.2 TG-2 10 0 1 4 1 1 0 70% TG-5 10 1 0 3 0 0 0 40% 对照组 0.2 生理盐水 10 0 0 0 0 0 0 0% 空白组 无 10 0 0 0 0 0 0 0% 表8. 美蛙致病试验结果 3.8. 病理切片观察结果 接种TG-2与TG-5菌发病致死蛙的各脏器组织病理变化明显，但两株菌致死蛙病理症状之间无明显差异。通过对美蛙肝正常与病理组织切片的比较观察，可见(见图3)：镜检肝细胞绝大部分坏死消失，肝细胞肿大，胞质溶解，空泡变性，肝细胞核浓缩、碎裂，肝细胞索分布紊乱、断裂，肝血窦扩张、融合，间质被炎性细胞浸润，肝脏中有大量的淤血、出血和坏死灶。对美蛙肾脏正常与病理组织切片的比较观察，可见(见图4)：肾小囊腔扩张中间含有血浆和蛋白渗出物，上皮细胞肿大，广泛性的颗粒、空泡变性，胞核浓缩、碎裂。肾间质血管淤血、出血，炎性细胞浸润。肾小管管腔中不同程度存在渗出物和红细胞等物质。