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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 2.1.1. 菌种来源 由东北农业大学农场基地发病田块采集发病植株和土壤，−20℃冷冻保存。 2.1.2. 供试引物 采用杨佩文等 [ 5 ] 设计的十字花科蔬菜根肿菌ITS区特异性引物，对此次采集到的甘蓝根肿病疑似病例病原菌进行分子检测和鉴定。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，其类型及序列见表1。 Table 1 Primer types and sequence 引物 Primer 方向 Direction 类型 Type 序列(bp) Primer sequences (bp) 引物1 Forward Plasmodiophora genus 5′AGGTGA ACCTGCGGAAGGAT 3′ (20) 引物2 Reverse Plasmodiophora genus 5′TTCAGCGGGTAATCCTACCT 3′ (20) 表1. 引物的类型和序列 2.2. 方法 2.2.1. 田间病样采集及症状描述 2013年9月中旬，在东北农业大学发病田块，采集具有典型“肿根”症状的病株，根据病害田间危害的症状特点进行描述记载，查阅相关资料，对病害进行初步诊断。 2.2.2. 徒手切片观察 取病根鲜样，洗净后，用解剖刀切取肿根部位，尽量切薄，在载玻片上滴一滴清水，将薄片置于其上，盖上盖玻片，显微镜下观察肿根组织内部情况，是否有病原孢子存在。 2.2.3. 病原菌的分离和保存 芸薹根肿菌为专性寄生菌，无法分离培养，到目前为止，体外培养根肿菌的尝试尚未获得成功 [ 6 ] ，对发病植株内的病原菌，只能将其配置成孢子悬浮液进行分离和保存 [ 7 ] ，具体方法如下：取洗净的甘蓝肿根用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后，四层纱布过滤，500 r/min离心5分钟，小心取上清液，4000 r/min离心15 min，弃上清液，用无菌水悬浮沉淀，3500 r/min离心10 min，弃上清，再次用无菌水悬浮沉淀，此步重复3次，最后弃上清液，重新用无菌水悬浮沉淀，制成孢子悬浮液，利用血球计数板将孢子悬浮液浓度调至2 × 10 8 个/mL。4℃保存备用。 2.2.4. 扫描电镜观察 将配置好的孢子悬浮液4000 r/min离心后沉淀，用2%戊二醛固定2小时后，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，CO 2 临界点干燥离子溅射镀金，于S-3400N扫描电镜下观察。 2.2.5. 病原孢子萌发测试 为了检验分离得到的病原菌休眠孢子是否可以萌发，参考前人报道的甘蓝根肿病菌休眠孢子最适萌发条件 [ 8 ] 对上述分离得到的孢子悬浮液进行萌发试验，方法如下：将根肿病高感品种“京丰一号”种子消毒后催芽2~3 d，在50 ml小烧杯底部放上泡沫薄片，倒入5 ml Hoagland 营养液，将催芽后的种子播入其中，每杯10株，7 d后收集获得含根分泌物的溶液，并调节pH至6.2。将冷冻的肿根取出，黑暗条件下24℃腐烂5天后，配置孢子悬浮液，取一毫升孢子悬浮液放入5 ml收集好的根系分泌物中，24℃下黑暗培养5天后，利用1%地衣红(溶于45%醋酸中)染色来判定休眠孢子是否萌发，显微镜下未萌发的休眠孢子为暗红色，已萌发的休眠孢子不着色。 2.2.6. 致病性测定 为证明上述实验分离得到的孢子为此次发现的“甘蓝根肿病”的病原菌孢子，且仍具有侵染活性，我们采用室内和田间两种接种方法将分离得到的孢子悬浮液接种到健株上，具体方法如下： 1) 室内接种鉴定：将配制好的孢子悬浮液与灭菌基质(蛭石:草炭:灭菌土 = 1:1:2的比例混合)混匀，使混匀后灭菌基质中休眠孢子浓度达2 × 10 8 个/g基质，在25℃黑暗条件下保湿48 h，然后在装有灭菌基质的培养钵中挖一圆柱形小洞(直径30 mm，高35 mm)，将混合好的菌土撒入其中，然后将消毒后的“京丰一号”种子播入，共接种30株，设置未接种对照组，将对照组与处理组放在温室中培养，六周后调查病情。 2) 田间接种鉴定：在东北农业大学园艺站甘蓝育种研究室接种圃内，将配置好的孢子悬浮液与接种圃中灭过菌的土壤混合，使菌土中孢子浓度达2 × 10 8 个孢子/g土，然后将消毒后的“京丰一号”种子播入其中，共接种30株，设置未接种对照组，六周后调查病情。 采用司军 [ 3 ] 制定的室内和田间根肿病分级标准进行分级，分级标准如下所示： 甘蓝根肿病室内人工接种病情分级标准如下：0级：根部无任何肿瘤；1级：主根肿大，其直径小于2倍茎基，或须根有小肿瘤；肿大部分直径在4 mm以下；3级：主根肿大，其直径为茎基2~3倍，肿大部分直径约4~6 mm；5级：主根肿大，其直径为茎基3~4倍，肿大部分直径约6~8 mm；7级：主根肿大，其直径为茎基4倍以上，肿大部分直径约8 mm以上 [ 7 ] 。 甘蓝根肿病田间人工接种病情分级标准：0级：根系生长正常、无肿瘤；1级：根系的主根不发病，部分侧根、须根上有较小的肿瘤；2级：根系的主根发病较轻，微微膨大，部分侧根、须根上有明显的肿瘤；3级：根系的主根发病较重，异常膨大，龟裂，大部分侧根、须根有明显的肿瘤；4级：根系上几乎无须根，主根异常膨大、龟裂 [ 7 ] 。 2.2.7. 病原菌的分子鉴定 1) 发病植株中病原菌DNA提取与纯化：病原菌基因组DNA的提取和纯化采用奥斯伯等提出的CTAB法 [ 9 ] 加以改进，具体方法如下：取0.2 g冻干的病根，加液氮研细，加入700 ul预热的CTAB，0.4%巯基乙醇，2% PVP，65℃水浴90 min，每10 min上下混匀一次；室温下加24:1的氯仿：异戊醇700 ul，静置10 min以上；使用冷冻离心机4℃下12，000 r/h离心10 min，取上清600 ul转新离心管中，加600 ul 24:1的氯仿：异戊醇，混匀置室温放置10 min；12，000 r/h离心10 min，取上清500 ul转新管，加500 ul预冷的异丙醇，放于−20℃ 30 min至沉淀析出；再次12，000 r/h离心10 min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清，用600 ul 70%乙醇洗涤沉淀2~3次，室温下微干，加入300 ul去离子水溶解沉淀，DNA溶解后，加2 ul RNase，37℃水浴30 min，加入300 ul去离子水，600 ul 24:1的氯仿：异戊醇，充分震荡，12，000 r/h 4℃离心10 min；取上清500 ul，加等体积24:1的氯仿：异戊醇，充分震荡，12，000 r/h 4℃离心10 min；取上清400 ul，转新管，加80 ul，3 mol∙L −1 预冷的NaAC，和1 ml预冷的无水乙醇，混匀放入−20℃冰箱内，40 min至沉淀；12，000 r/h离心10 min，弃上清；用600 ul，70%乙醇洗涤2~3次，在无菌操作台吹至微干，最后用50 ulTE缓冲液溶解DNA，−20℃保存备用。因为根肿菌为专性寄生菌，不能分离培养，因此其基因组DNA直接从根肿组织中提取，所以提取到的DNA中同时含有寄主植物DNA和病原菌DNA。 2) 土壤中病原菌DNA提取：采用−80冻融法提取病原菌基因组DNA。因为根肿菌为土传病害，因而在发病土壤中存在大量病原菌，因土壤研磨不便，笔者设计采用−80冻融法提取土壤中病原菌DNA，具体方法如下：取10 g带菌土壤溶于20 ml无菌水中，置于摇床上320 r/min摇1 h，将混合液四成纱布过滤，将滤液4000 r/min离心15 min，弃上清，将沉淀重溶于20 ml无菌水中，3100 r/min离心10 min，弃上清，此步骤重复三次，最后在沉淀集中于1.5 ml离心管，在其中加入1 ml 65℃预热的CTAB裂解缓冲液，然后将其放入−80℃冰箱中30 min后取出，迅速置于65℃水浴锅中，如此反复5次，得到病原菌DNA粗提液，纯化步骤同CTAB法。 3) 健康植株根部DNA提取：方法与发病植株中病原菌DNA提取与纯化相同。 利用十字花科根肿菌ITS区特异性引物对病原菌DNA和健株根部DNA进行PCR扩增，PCR反应体系：5 μL 10 × PCR buffer (含Mg 2+ )，4 μL dNTP (10 mmol/L)，0.25 μL Easy Taq DNA polymerase (以上试剂均由康为试剂公司提供)，2 μL上游引物1，2 μL下游引物2，模板DNA 1 μL，用ddH2O定容至50 μL。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，然后进入40个循环的扩增反应，即94℃变性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸1 min。循环结束后72℃延伸7 min。 采用大连宝生物公司的DNA凝胶回收纯化试剂盒，从1.0%的琼脂糖凝胶中回收特异性片段进行纯化，纯化后的目的片段送由博仕生物技术有限公司测序。获得的序列在GenBank数据库中进行BLAST比对和同源性分析。