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user: 3. 结果与分析 3.1. AFLP各引物组合的扩增条带多态性分析 利用AFLP分子标记三对选择性引物组合一共产生了14，260条带(见表3)，扩增总位点498个位点， Table 2 Primer combinations of selective amplificatio EcoRI Primer(+3)5'to3 MseI Primer(+3)5'to3' E-AAC GACTGCGTACCAATTCAAC M-CAA GATGAGTCCTGAGTAACAA E-ACC GACTGCGTACCAATTCACC M-CCA GATGAGTCCTGAGTAACCA E-ACA GACTGCGTACCAATTCACA M-CAG GATGAGTCCTGAGTAACAG E-AGG GACTGCGTACCAATTCAGG M-CGA GATGAGTCCTGAGTAACGA E-ACG GACTGCGTACCAATTCACG M-CTA GATGAGTCCTGAGTAACTA E-ACT GACTGCGTACCAATTCACT M-CAT GATGAGTCCTGAGTAACAT E-AGC GACTGCGTACCAATTCAGC M-CAC GATGAGTCCTGAGTAACAC 表2. 选择性扩增引物组合表 Table 3 Amplification result of 3 AFLP primer combination 引物组合 Primer combinations 总带数 Number of total band 总位点数 Number of polymorphic 多态位点数 Number of total loci 多态位点多分率(%) Polymorphism rate E-AAC/M-CAA 5017 159 123 77.35 E-AAC/M-CAC 4253 185 133 71.89 E-ACA/M-CAT 4990 154 132 85.71 Total 14，260 498 388 78.31 表3. 3对AFLP 引物组合的扩增结果 其中388个为多态位点，多态位点百分率为78.31%，平均每对引物扩增出的多态位点为129个位点。结果表明：引物组合E-AAC/M-CAC扩增的总点数最多含5017条带，但多态性较弱，而引物组合E-ACA/M-CAT扩增多态百分率最高为85.71%。 3.2. 遗传多样性分析 滇重楼遗传多样性相关指标水平存在差异(表4)，在物种水平上多态位点百分率(PPL)为88.15%，有效等位基因数(Ne)为1.4995，Nei’s基因多样性为0.2849和Shannon信息指数(I)为0.4158。在居群水平上，PPL范围在42.75%~66%，最高为巧家(QJ)，最低则是通海(YX)，表明其杂合程度较高。有效等位基因数(Ne)可以较好地反映在居群中起作用的等位基因的数目，从而了解居群中等位基因的丰富程度。居群中有效等位基因数(Ne)范围1.2475~1.3788之间，Ne较高的为临翔(LC)、永胜(YS)和巧家(QJ)，而相对较低的有永善(YA)富宁(FN)通海(YX)。Nei’s基因多样性指数(Nei’s)和Shannon信息指数(I)均能反映种群间遗传多样性，Nei’s和I的平均值分别为 0.1821、0.2742。在居群间，临翔(LC)、墨江(MJ)和镇沅(ZY)等居群Nei’s及I值均高于其他居群，表明这些居群具有丰富的遗传多样性，而通海(YX)和永善(YA)等居群的遗传多样性最低。在居群水平上，云南省15个地区的滇重楼遗传多样性较为丰富，但在物种水平上，滇重楼的遗传分化水平偏低。 3.3. 遗传变异分析 滇重楼居群间遗传变异Popgene分析结果(表5)。群体总的遗传多样性(Ht)为0.2519，而居群内的遗传多样性(Hs)为0.1868，据此计算出的群体间遗传分化系数Gst为0.2583，即居群间的遗传变异占总变异的25.83%，而居群内的遗传变异为74.17%，表明滇重楼的遗传变异主要来源于居群内，而居群间也存的分化程度很低。居群间基因流(Nm)为0.7178，表明居群之间遗传交换较多。 Table 4 Genetic diversity of P. polyphylla var. yunnanensis from different population based on AFLP analysi 居群 多态位点百分率(PPL %) 观测等位基因数(Na) 有效等位基因数(Ne) 基因多样性指数(Nei’s) Shannon信息指数(I) DQ 50 1.5000 1.2644 0.1569 0.2388 FN 50 1.5000 1.2644 0.1569 0.2388 LC 66 1.6600 1.3788 0.2212 0.3329 LQ 58.25 1.5825 1.3317 0.1941 0.2923 MD 58.25 1.5825 1.3120 0.1864 0.2837 MJ 53.75 1.5375 1.3123 0.1822 0.2736 QJ 62 1.6200 1.3498 0.2049 0.3093 SP 52.50 1.5250 1.3110 0.1813 0.2719 PB 45.75 1.4575 1.2771 0.1612 0.2413 XW 48.25 1.4825 1.3013 0.1720 0.2554 YA 42.25 1.4225 1.2475 0.1446 0.2170 YP 60 1.6000 1.3441 0.2011 0.3025 YS 63.75 1.6375 1.3532 0.2084 0.3153 YX 42.75 1.4275 1.2673 0.1557 0.2325 ZY 61.50 1.6150 1.3470 0.2040 0.3080 居群水平 54.33 1.5433 1.3108 0.1821 0.2742 物种水平 48.25 1.8715 1.4226 0.2768 0.3903 表4. 基于AFLP的滇重楼不同居群遗传多样性 Table 5 Nei’s analysis genetic diversity of the populations of P. polyphylla var. yunnanensi 项目 样本数 总基因多样性(Ht) 群体内基因多样性(Hs) 基因分化系数(Gs)t 基因流(Nm) 平均Mean 143 0.2519 0.1868 0.2583 0.7178 St. Dev 0.0322 0.0174 表5. AFLP标记对滇重楼居群基因多样性Nei’s分析 3.4. 聚类分析和主坐标分析 滇重楼不同居群间的遗传变异可以揭示其相互间的进化关系。基于AFLP三对引物在云南省15个地区的滇重楼扩增片段，计算滇重楼居群间的遗传相似系数。根据Nei’s遗传距离(D)和遗传一致度(I) (表4)，用NTSYS-pc 2.1软件对15个滇重楼居群进行UPGMA聚类分析(图1)，进一步阐明滇重楼居群间的遗传关系。 从遗传的一致度分析，滇重楼个居群的亲缘关系都比较接近，15份滇重楼种植资源之间均有较高的遗传相似度。从聚类图中可以看出，当GSC值为0.9时，可以将滇重楼种质明显分为2大类群，其中维西(WX)就单独归为一类，剩余十四个居群为一大类群。当GSC值为0.92时，可以将滇重楼种质明显分为3大类群，第I是最大的一个类群，包括8个居群，其GSC值介于0.86~0.97之间。该类群中，GSC值最相近的是永胜(YS)和通海(TH)，其次是富宁(FN)和屏边(PB)。该类群在GSC值约为0.932处可明显分为2亚类，其中墨江(MJ)单独为一类。富宁(FN)、屏边(PB)、临翔(LC)、禄劝(LQ)、永胜(YS)、通海(YX)和石屏(SP)为一亚类。GSC介于0.88~0.97之间。 第II类群包括6个居群，GSC介于0.89~0.97之间，又可以在GSC为0.93时分为两个亚类，永善(YA)单独为一亚类，其余弥渡(MD)、镇沅(ZY)、永平(YP)、巧家(QJ)、宣威(XW)为一类。 为了更直观的表示滇重楼种质间的相互距离，对15个滇重楼居群AFLP的结果进行主坐标PCA (Principal coordinate analysis)分析，结果显示，PCA1、PCA2和PCA3分别占总变异的9.12%、17.60%和9.87%，前两个主坐标代表总变异的26.72%，前三个主坐标点总变异的36.59%。由第一、第二主坐标进行PCA分析的二维图(图2)可以看出，将滇重楼各居群分布较为散乱。由第一、二、三主坐标进行的 PCA 分析三维图(图3)可以比较清晰地看出，滇重楼居群分为三大类，与根据AFLP的聚类分析结果，不用地区的滇重楼种质资源基本以地理位置和海拔分布作为不同类群的划分，当然也有小部分例外。说明原始物种的起源进化和生态环境变化对滇重楼的遗传多样性影响较大，这与滇重楼基于AFLP标记的遗传多样性分析研究结果相一致。