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user: 2. 熊果酸抗肿瘤机制 2.1. 作用于凋亡相关蛋白和基因 细胞凋亡是多基因严格控制的过程，主要与细胞凋亡相关蛋白的表达有关，其作用途径见图2。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、原癌基因C-myc、抑癌基因P53等。Bcl-2基因，是原癌基因的一种，具有抑制凋亡的作用。按功能可将目前已发现的Bcl-2蛋白家族分为两类：一、抗凋亡蛋白，如Bcl-2/Bcl-xl、XIAP和Mcl-1等；二、促凋亡蛋白，如Bax、Bad、Bak、Bim和Bid等 [ 2 ] 。Caspase家族中，Caspase-2，Caspase-8，Caspase-9和Caspase-10诱导细胞凋亡；Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7执行细胞凋亡，其中Caspase-3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，可以降解PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase)，DFF-45 (DNA Fragmentation Factor-45)，抑制DNA的修复并启动DNA的降解。 2.1.1. 活化Caspase 通常情况下，Caspase家族间可以相互激活，导致级联反应，促使细胞凋亡，在多种肿瘤组织及正常人体组织中广泛表达，可通过线粒体通路和死亡受体通路被激活。王晓芹等 [ 3 ] 报道，在熊果酸诱导下，多种急性白血病细胞均能发生凋亡，如组织细胞淋巴瘤细胞U937、人急性T细胞白血病细胞JurKat和急髓白血病M3细胞HL-60等。实验证明，这种诱导作用可能受Mcl-1下调的影响，其作用机制表现为在熊果酸作用下首先引起了Mcl-1的下调，随后又引起凋亡相关蛋白(Caspase-3和Caspase-9)的降解/活化及PARP的降解，最终促进细胞的凋亡。 图1. 3β-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸 图2. 凋亡相关基因作用途径 2.1.2. 抑制Survivin基因 Survivin基因是迄今为止发现的最强凋亡抑制因子，Survivin基因编码产生的Survivin蛋白以二聚体的形式存在，是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of Apoptosis Protein， IAP)的重要成员。Survivin蛋白可通过抑制多种内源和外源凋亡相关因子，如Caspase-3、Caspase-7和P53等产生抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能。因此，抑制其表达和(或)功能可抑制细胞的生长、分化，引起细胞分裂缺陷，促使细胞凋亡。Survivin也参与了血管形成过程，能通过调节内皮细胞有丝分裂，促进血管生成。Survivin可以在多种肿瘤组织中过量表达，而在正常终末分化的成人组织中几乎不表达，与肿瘤不良预后和耐药性密切相关，使抑制Survivin成为治疗癌症和克服肿瘤细胞耐药性的新策略 [ 4 ] 。 2.1.3. 激活p53基因 p53基因属抑癌基因，在细胞凋亡过程中有着至关重要的作用，其不仅与肿瘤的发生、发展关系紧密，还参与细胞生长、分化及凋亡的调控，人类癌症中约有1/2是由该基因突变引起的。肝脏保护因子-15、超氧化物歧化酶-2和转录激活因子-3是p53的靶基因，可以阻止癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡 [ 5 ] 。熊果酸对肝癌SMMC-7721细胞也有诱导作用，使其细胞发生凋亡。其作用机制为，熊果酸引起p53基因以及Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调 [ 6 ] 。 2.1.4. 下调Bcl-2基因 Bcl-2抑制细胞凋亡，不影响细胞周期及分化，其通过许多刺激因素如辐射热、渗透、休克等阻止细胞死亡，致使突变物聚集，受损的细胞继续存活，使肿瘤细胞得以进一步发生和发展。在一项体内研究中发现熊果酸可以抑制抗阿霉素人肝癌细胞系HePG2增殖及诱导其凋亡，其机制是熊果酸能激活Bak，释放凋亡诱导因子(AIF)，以非Caspase途径诱导细胞发生凋亡 [ 7 ] 。 2.1.5. 抑制环氧合酶 环氧合酶(Cyclooxygenase， COX)包括COX-1和COX-2两种同工酶。在多数正常组织中，COX-2不表达，而在多种肿瘤及癌前病变中有高度表达。研究表明，COX-2的过度表达可抑制肿瘤细胞凋亡。P38 MAPK抑制剂SB203580通过抑制p38 MAPK途径，可使COX-2不表达，说明COX-2的表达是通过p38 MAPK途径介导的。熊果酸可以抑制MAPK信号通路进而抑制COX-2的表达，抑制COX-2的抗凋亡作用，进而发挥熊果酸诱导细胞凋亡的作用 [ 8 ] 。 2.1.6. 诱导活性氧 熊果酸可以诱导膀胱癌细胞(NT-UB1)产生活性氧(Reactive Oxygen Species， ROS)，ROS可使细胞阻滞于G1期或G2/M期，进而引起细胞凋亡或导致细胞坏死 [ 9 ] 。熊果酸还可通过诱导ROS的产生，JNK的活化，从而引起死亡受体(DR4和DR5)的上调和诱饵受体(DcR2)、细胞存活蛋白的下调，最终增强凋亡配体TRAIL诱导细胞凋亡的作用 [ 10 ] 。 2.2. 作用于信号转导途径 2.2.1. 抑制NF-кB途径 人类许多疾病包括肿瘤的发病机制中都有核因子кB (NF-кB)的参与。NF-кB被广泛认为是一种抗凋亡因子，在许多肿瘤的病理过程和化学耐药中起重要作用 [ 11 ] 。当细胞受到致凋亡因子、与细胞分裂增殖有关的因素、细胞因子等外来刺激时，NF-кB被活化，活化后的NF-кB与细胞核内一些基因启动子中的序列特异性结合，进而调节或启动下游基因的转录，因此抑制肿瘤细胞的NF-кB通路可以诱导细胞凋亡、阻断细胞周期，起到抗肿瘤作用 [ 12 ] 。孙爱平 [ 13 ] 等研究发现，熊果酸可增强单核细胞系THP-1细胞HMFB1的表达和NF-кB的活性，不同浓度的熊果酸对HMFB1的表达和NF-кB的活性的影响呈现出一定的双向性，其中以1μmol/L的熊果酸作用最强。 2.2.2. 抑制PI3K-Akt信号通路 磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号通路(Phosphoinositide 3-Kinase-Serine/Threonine Kinase， PI3K-Akt)参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节 [ 14 ] 。活化的PI3K-Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)、Bad、p53、Caspase-9等，从而维持细胞周期正常运行、抑制细胞的凋亡、促进细胞增殖。熊果酸诱导人肝癌细胞HepG2的研究表明，在熊果酸作用下PI3K-Akt信号通路被抑制、Survivin及Bcl-2表达下降、Bax/Bcl-2比值增加，激活Caspase-3，最终导致HepG2细胞凋亡，此作用方式呈浓度和时间依赖性 [ 15 ] 。 2.2.3. 抑制STAT3信号通路 JAK/STAT(Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription)是一条从细胞外到细胞核的信号转导通路 [ 16 ] (见图3)。JAK/STAT途径的激活对于细胞的生长、增殖和转化产生重要影响。Pathak [ 17 ] 等发现，熊果酸诱导多发性骨髓瘤细胞发生凋亡并使细胞周期阻滞在G0/G1期，其作用机制是通过抑制STAT3上游因子，包括Kinases c-Src、Janus-activated kinase 1、Janus-activated kinase 2和ERK1/2的活化而实现的。熊果酸还可下调STAT3调控的基因，包括Cyclin D1、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin、Mcl-1和VEGF的表达，抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。 图3. 经典的JAK-STAT信号通路 2.2.4. 对MAPK信号通路的影响 丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase， MAPK)是一组具有丝氨酸/苏氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，是胞外信号刺激细胞增殖分化的细胞内信息传递的共同通路 [ 18 ] 。MAPK主要由细胞外信号调节激酶(ERK1/2，又称为p44/p42)、应激活化蛋白激酶(JUN/SAPKs)和p38这3个家族成员组成。熊果酸可以激活非雄激素依赖性前列腺癌细胞中的JNK，引起Bcl-2磷酸化和降解，诱导Caspase-9活化，促进凋亡蛋白Bax释放增多，使Bax对Bcl-2比例增大，促进细胞凋亡 [ 19 ] 。 2.2.5. 钙离子途径 线粒体在控制细胞的生存和死亡过程中，起着非常重要的作用。线粒体对细胞间的钙离子浓度进行调节，诱导细胞发生凋亡。熊果酸刺激促进钙离子内流，明显提高人白血病细胞内的钙离子水平，从而阻断细胞凋亡。最近研究发现，线粒体通透性转换孔在诱导细胞凋亡过程中起重要作用，而熊果酸则可通过钙离子内流促进线粒体通透性转换孔的开放，进而使线粒体膜通透性发生改变，同时促使凋亡前体蛋白，如细胞色素C、凋亡诱导因子的释放，进而活化Caspase-9和Caspase-3，最终诱发细胞凋亡 [ 20 ] 。 2.2.6. 碱性鞘磷脂酶途径 熊果酸在人类结肠癌细胞(HT-29)中选择性增强肠碱性鞘磷脂酶活性，该效应优先于Caspase活性。因此，碱性鞘磷脂酶的活化，对熊果酸在HT-29细胞中的促凋亡作用有重要影响 [ 21 ] 。 2.3. 细胞毒作用 熊果酸对多种肿瘤细胞株均有直接的杀伤作用，细胞毒试验结果表明，熊果酸对白血病细胞(HL-60)、人肺腺癌细胞(A549)有显著的细胞毒作用。熊果酸的细胞毒作用可能是通过激活癌细胞中的多聚ADP核糖多聚糖或内切酶来攻击肿瘤细胞核及核小体，最终导致肿瘤细胞溶解 [ 22 ] 。 2.4. 抗DNA损伤 始发突变是肿瘤形成的第一阶段，涉及致癌物的代谢活化、活化致癌物与靶细胞DNA的结合、DNA的损伤与修复以及致癌物DNA加成物的形成等。针对上述过程进行干扰，则可达到抗始发突变的作用，从而抑制肿瘤的形成。RAMOS [ 23 ] 等发现通过细胞介导作用，熊果酸能抗DNA损伤，即将细胞用熊果酸预处理后再加入细胞毒物才可起到抗DNA损伤作用，同时加入时则没有这种效应，并且发现熊果酸能够增强损伤后DNA的修复作用。最近，Shanthakumar [ 24 ] 等研究显示，熊果酸对紫外线诱导的DNA损伤具有显著的保护作用，从而有效地抑制DNA的突变和癌变的启动。 2.5. 阻遏细胞周期 肿瘤的发生主要是因为细胞周期失调，肿瘤细胞生长不受机体约束而无限增殖化。阻遏细胞周期对抑制肿瘤细胞生长有重要作用，药物作用示意图见图4。研究分析细胞周期，发现熊果酸处理后，人肝癌SMMC-7721细胞的增长受到明显抑制，且此抑制作用呈明显的时间、剂量依赖性。其作用机制为熊果酸诱导SMMC-7721细胞阻滞在S期，这种阻滞作用与p21和p53基因以及增殖细胞核抗原(PCNA)基因的变化有关 [ 25 ] 。熊果酸可将人结肠癌HT-29细胞阻滞于G1期，对其有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用，且随着熊果酸浓度的增加，细胞凋亡率也相应增加 [ 26 ] 。 2.6. 调节机体免疫功能 机体的免疫功能与肿瘤的发生有密切关系，当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发生率增高。因此，刺激激活免疫细胞、提高人体免疫功能，一直是肿瘤预防和治疗的研究热点。方学辉 [ 27 ] 等研究发现经熊果酸处理过的荷瘤小鼠，其外周血白细胞数和脾脏指数、胸腺指数升高，同时荷瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平也有所提高，H22荷瘤小鼠的肿瘤生长受到明显抑制，这种抑制作用可能与增强机体的免疫功能有关。 2.7. 抗氧化作用 体内产生过量的活性氧可造成碱基缺失、DNA链断裂、蛋白质交联以及碱基与核糖体氧化，影响抑癌基因表达，最后导致肿瘤的发生、发展，熊果酸抗促癌及抗始发突变作用也可通过抗氧化作用实现，这样减少了肿瘤发生的概率 [ 28 ] 。卢静 [ 29 ] 等研究发现熊果酸对超氧阴离子和羟自由基有明显的清除作用，对超氧阴离子的最高清除率可达88.42%，但是清除作用弱于同浓度下的VC。熊果酸对羟自由基的清除作用最高可达86.35%，并且强于同浓度下的甘露醇，具有明显的抗氧化性，从而发挥抗肿瘤作用。 图4. 细胞增殖周期和药物作用示意图 2.8. 抑制肿瘤侵袭、转移 细胞分化异常是肿瘤细胞最本质的特征，肿瘤细胞的侵袭行为是其分化异常的一种表现。肿瘤患者死亡的主要原因是由于肿瘤的侵袭、转移，而其黏附作用是肿瘤细胞转移扩散的基础，肿瘤细胞内外基质的相互作用也有黏附分子的参与，而熊果酸可显著降低黏附分子表达水平，从而产生抗侵袭作用 [ 30 ] 。 2.9. 抑制肿瘤血管生成 血管生成在肿瘤细胞的形成中起着至关重要的作用，血管再生是实体瘤的增长和转移灶形成的重要因素，因此抑制血管生成是控制肿瘤生长和转移的重要途径之一。 Kanjoormana [ 31 ] 等研究发现高转移B16F-10黑素瘤细胞诱导C57BL/6小鼠的肿瘤相关毛细血管的形成，熊果酸可以抑制这种诱导作用，实验表明，熊果酸处理过的动物体内血清血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF)、一氧化氮和促炎细胞因子的水平与对照动物相比显著减少；经适量浓度熊果酸处理过的B16F-10黑色素瘤细胞内VEGF和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达明显减弱；血清金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)和白介素-2(IL-2)水平经熊果酸处理后则显著升高。金属蛋白酶在血管生成中有重要的作用，经明胶酶谱分析表明熊果酸对基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表达有抑制作用。 熊果酸通过抑制PI3K-Akt途径引起黏附分子(如E-选择蛋白，CD-31和I-CAM)的表达上调，VEGF和FGF-2及受体表达下调，PGE2对PGD2的比例增加，肿瘤血管的生成得到抑制 [ 32 ] 。 2.10. 抗肿瘤的其他机制 Lu [ 33 ] 等报道熊果酸对人神经胶质瘤DBTRD-05MG细胞凋亡和自噬没有促进作用，而是通过产生活性氧和耗竭还原型谷胱甘肽，打开线粒体通透性转换孔和减少三磷酸腺苷(ATP)，引起线粒体功能障碍，导致脑瘤细胞坏死。