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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验菌株 乳双岐杆菌(B. lactis) GKK2：葡萄王公司自婴儿肠道分离筛选获得，经16S rRNA鉴定为乳双岐杆菌。 2.2. 乳双岐杆菌GKK2益生菌冻干粉末制备 GKK2培养于1 L MRS培养基中，经37℃、16小时培养后，以5000 rpm、25℃、离心10分钟取得菌泥，混入20%脱脂乳粉后冷冻干燥而得。 2.3. 乳双岐杆菌GKK2菌数测定 以Guava ® easyCyte™进行乳双岐杆菌GKK2菌数测定，测定GKK2之总菌菌数、活菌菌数及死菌菌数。 2.4. 实验动物 Balb/c雄鼠5周大共24只，购自国家动物中心。动物饲养于中国医药大学动物中心小鼠专用房内之独立IVC (individual ventilated caging system)小鼠饲育系统，室温维持于22℃ ± 2℃，湿度40%~60%，定时12小时光照与黑暗，饲料及无菌逆渗透水均任由小鼠自由取食。小鼠饲养2周适应环境后开始进行实验。 2.5. 实验设计 2.5.1. 实验分组 将5周龄Balb/c雄鼠，共分为4组，各组之小鼠均随机分配为6只。组别包括喂食生理食盐水组、OVA诱导组、GKK2-100组及GKK2-300组。除了生理食盐水组之外，其余各组小鼠均进行卵白蛋白(OVA)致敏步骤。 2.5.2. 管灌喂食产品之剂量及途径 小鼠灌食剂量之计算依据实验动物与人体表面积比的等效剂量换算系数，小鼠与人的换算系数为9.01。小鼠每周秤量体重一次，每组计算出平均体重后，依成人(以体重60公斤计算)每日服用剂量1 × 10 10 cfu/day，加以换算每天应管灌小鼠之剂量，公式如下所示： 小 鼠 每 日 喂 食 产 品 剂 量 ( g ) = { 成 人 剂 量 / 60 公 斤 ( 成 人 体 重 ) } × 小 鼠 体 重 ( 公 斤 )                                                                               × 9 .0 1 ( 小 鼠 与 人 的 换 算 系 数 ) 实验样品每日以0.9%生理食盐水新鲜配制，各组小鼠分别管灌喂食0.2 ml体积之生理食盐水、安慰剂溶液或是不同浓度之GKK2溶液。各组小鼠每天管灌喂食，计划执行期间共连续投予60天。喂食GKK2剂量如下： 1) GKK2-100组：0.123 mg/day/kg 2) GKK2-300组：0.41 mg/day/kg 2.5.3. 实验流程 本实验设计流程如图1所示： 图1. Balb/c雄性小鼠之OVA致敏实验流程 2.5.4. 卵白蛋白抗原诱导小鼠过敏及气喘 将卵白蛋白抗原(OVA， 500 μg/ml)与不完全佐剂(Incomplete Freund’s adjuvant)以1:1等量均匀混合乳化后，以无菌过滤膜进行过滤后立即使用。各组小鼠于实验第30、40及50日，皆进行此过敏原之皮下注射，并且于第45天及第55天以喷雾2% OVA过敏原方式，进行10分钟呼吸道吸入(inhalation)以诱导小鼠产生过敏气喘。 2.5.5. 小鼠免疫细胞及血液之分离与制备 1) 血液取得及血清之分离与保存 收集小鼠腹腔巨噬细胞后，剪开腹部皮肤，以1 ml注射器于肝门静脉收集血液样本。收集小鼠全血检体，置于含有抗凝血剂之试管中，待进行血液中白血球分类计数。另外，收集小鼠全血检体于无含抗凝血剂的试管中，室温静置1小时后以1000 rpm离心10分钟，取得上清液检体即为血清。血清长期保存于−80℃，待日后分析血清中免疫球蛋白及过敏原诱发的特异性抗体。 2) 支气管肺泡冲洗液(Bronchoalveolar lavage fluid， BALF) 收集小鼠血液样本后，将小鼠下颚至胸腔的皮肤及骨骼剪开，把肌肉层拉开并使气管暴露，在气管靠近喉头处剪出个开口，插入0.965 mm的polyethylene Tubing末端接上25G的针头套管，用缝线将套管紧绑固定于气管上。将装有1 ml生理食盐水的注射针，慢慢将生理食盐水打进肺部至整个肺部完全膨胀，再回抽，如此反复三次后，将冲洗液以750 rpm，离心5分钟，下层细胞以1 ml生理食盐水回溶后，取100 ul支气管肺泡冲洗液，以细胞离心仪(cytospin)将细胞打至玻片做成细胞抹片，风干后，以刘氏染色法(Liu’s stain)染色。利用油镜(400×)观察200个白血球细胞种类，计算各占的百分比，乘上支气管肺泡冲洗液中细胞总数目，得出各白血球的绝对数目。 3) 脾脏细胞之取得 在无菌操作条件下，摘取小鼠腹部左上侧的脾脏，将脾脏放入含有3 ml PBS缓冲液的培养皿中，以干净无菌的10 ml针筒推进器尾端，将脾脏压紧并磨碎，以离心机1000 rpm离心10分钟，倒掉上清液。再加入cRPMI细胞培养液清洗后重复离心的步骤，并倒掉上清液，如此重复两次清洗动作。进行细胞计数后将细胞以cRPMI细胞培养液定量并进行相关实验。 2.6. 检验分析项目及方法 2.6.1. 呼吸道阻力测试 小鼠于牺牲前一天，以Buxco公司出产的Whole-body plethysmography (WBP)，进行非侵入性之小鼠呼吸道阻力变化的测量，其阻力变化是依据小鼠呼吸过程中测得的数值经计算机分析后，得到一个enhanced pause (Penh)值来表示，而数值越高代表呼吸道阻力越大。首先将小鼠放进动物舱中，测量小鼠的基础Penh值三分钟。接着将小鼠暴露在雾化的0.9% NaCl三分钟后，测量Penh值三分钟。接着将小鼠暴露在雾化的非特异性气管收缩刺激剂methacholine (3.125 mg/ml)三分钟后，测量Penh值(PenhMch)三分钟，以逐渐增高浓度的methacholine (6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25 mg/ml)重复上述步骤，本实验中是以Penh Ratio来表示结果，其资料分析是将各浓度methacholine所得到的PenhMch读值除以给予生理食盐水的PenhNaCl读值来计算之。 2.6.2. 气管肺泡冲洗液中白血球比例计算 取100 μl离心后的冲洗液滴于载玻片上后风干，以刘氏染色法(Liu’s stain)染色。利用油镜(100×)观察200个白血球细胞种类，计算各细胞数量之百分比。 2.6.3. 血清中过敏原诱发的特异性抗体之含量分析 利用sandwich-ELISA免疫呈色反应法，定量血清中过敏原诱发的特异性IgE及IgG2a含量。首先以coating buffer (pH 9.6)配制含适量之anti-mice单株抗体并添加100 μg/mL卵白蛋白(OVA)抗原，覆盖于96孔微量分析盘(Nunc-Immuno plate)上，静置1小时后，以wash buffer冲洗未结合的单株抗体，再以200 μl/well的blocking buffer填补未被单株抗体结合的部位。室温下反应30分钟后，再以wash buffer冲洗，然后加入100 μl小鼠血清或已知浓度的各种免疫球蛋白标准品。小鼠血清或是各种免疫球蛋白标准品经过室温1小时反应后，以wash buffer冲洗，再加入适当浓度连结HRP的抗各种免疫球蛋白的二级抗体100 μl/well。于室温反应30分钟后，以wash buffer冲洗，接着以100 μl TMB受质反应，经15分钟呈色后，加入100 μl 2N H 2 SO 4 终止呈色反应，于450 nm波长测定其吸光值。根据各种免疫球蛋白标准品与吸光值所显示的标准曲线，经过回归运算后得到的公式，可用内插法来推算血清中过敏原诱发的特异性抗体的浓度。 2.6.4. 脾脏细胞之特异性细胞激素分泌量分析 将前述所收集并置于−80℃保存之脾脏细胞液进行各种细胞激素分析。以ELISA方法分析IFN-γ含量。分析步骤为于96孔微量分析盘(Nunc-Immuno plate)上注入，以coating buffer配制含适量之anti-mice cytokine单株抗体100 μl，静置4℃隔夜后，以wash buffer冲洗未结合的单株抗体，再以200 μl/well的blocking buffer充填未被单株抗体结合的部位。室温下反应2小时后，再以wash buffer冲洗，然后加入100 μl淋巴细胞培养上清液或已知浓度的recombinant cytokine标准品。细胞培养上清液或是细胞激素标准品经过室温2小时反应后，以wash buffer冲洗，再加入适当浓度连结生物素(biotin)的抗细胞激素二级抗体100 μl/well。于室温反应1小时后，以wash buffer冲洗，接着加入适当浓度的HRP 100 μl/well，室温反应1小时后，以wash buffer冲洗，接着以100 μl TMB受质进行反应，经15分钟呈色后，加入50 μl 2N H 2 SO 4 终止呈色反应，于450 nm波长测定其吸光值。根据细胞激素标准品与吸光值所显示的标准曲线，经过回归运算后得到的公式，用内插法来推算细胞培养上清液中细胞激素的浓度。 2.7. 统计分析 本份测试报告的实验结果以mean ± SD表示，并以SPSS 12.0软件包于计算机中进行统计分析，以T-test测定各组间之差异，显著性差异之判断标准为p < 0.05。