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user: 6. 丙烯酰胺的检测方法 6.1. 色谱法 6.1.1. 气相色谱及其联用技术 关于中药材中丙烯酰胺的检测，我国目前尚无国家标准方法，但在2014年我国已发布食品中丙烯酰胺含量测定的标准方法即气相色谱串联质谱法(gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS)。结合“药食同源”的理论体系、GC-MS法的方法学特点以及丙烯酰胺的性质，GC-MS法被广泛应用于中药材中丙烯酰胺含量的测定。利用GC-MS法检测丙烯酰胺时一般采用稳定性同位素稀释技术，常以氘标记丙烯酰胺，将d 3 -丙烯酰胺用作内标物。Wawrzyniak等采用所述方法进行丙烯酰胺含量的测定，其结果表现出令人满意的重复性(RSD = 2.6%)，中等精度(RSD = 9.4%)和较高回收率(99%~105%) [ 60 ]。为满足GC-MS法对待测物质热稳定性、挥发性、极性等的要求，在进行丙烯酰胺的检测前，常需要对中药材样本进行适当的衍生化处理。常用的衍生化方法有溴化衍生 [ 61 ] [ 62 ]、甲硅烷基化衍生 [ 60 ]、占吨氢醇衍生 [ 63 ]、2-萘硫醇衍生 [ 64 ] 等。其中，最经典的衍生化方法为溴化衍生，在酸性条件下选用氢溴酸 [ 61 ] 或溴化钾/溴酸钾 [ 62 ] 为衍生剂进行衍生化反应，将丙烯酰胺转化为2，3-二溴丙酰胺或2-溴丙烯酰胺，提高丙烯酰胺稳定性与挥发性，降低极性，从而改善色谱行为和响应，提高检测器的灵敏度。 与普通的GC法相比，GC-MS法的突出特点是灵敏度高，MS灵感度远高于GC方法中的任何一种，同时也正是因为MS的存在，使得此方法检测费用升高，维护成本升高，难以大规模推广使用。因此，在进行丙烯酰胺的检测时，除质谱仪检测器外，电子捕获检测器(Electron Capture Detection， ECD) [ 61 ] [ 65 ]、氢火焰离子化检测器(Flame Ionization Detection， FID) [ 66 ]、氮磷化学发光检测器(Nitrogen Chemiluminescence Detection， NCD) [ 67 ] 等其他检测器也受到实验操作者的亲睐。 6.1.2. 液相色谱及其联用技术 液相色谱法(liquid chromatography， LC)与气相色谱法的主要区别在于LC法在一般实验中不需要对样本进行衍生化的前处理过程，避免了衍生化造成实验方法准确性和可重复性降低的缺点 [ 68 ]，能一定程度简化试验操作，提高实验效率。因此，液相色谱及其联用技术在日常实际检测工作中具有一定的优势。 液相色谱串联质谱法(liquid hromatography-mass spectrometry/mass spectrometry， LC-MS/MS)同GC-MS法都是我国现行的丙烯酰胺标准检测方法，常以水为提取剂，经固相萃取柱或基质分散固相萃取净化，以LC-MS/MS检测，内标法定量 [ 69 ]。此方法简单、耗时短、灵敏度高、可实现不同样品中丙烯酰胺的定性定量测定，但因丙烯酰胺分子量小，在使用LC-MS/MS法检测时常会遇到较大的干扰。Shi等在测定天门冬在加热过程中形成的丙烯酰胺的含量时，首次发现采用柱前衍生化结合常规液相色谱仪或高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography， HPLC)作为LC-MS/MS法的替代，可避免因丙烯酰胺分子量小而带来的共提物干扰，保证实验测定的精密度和准确度 [ 70 ]。Fernandes等则选择Orbitrap LC-MS法，凭借Orbitrap质谱仪提供的高分辨率、高灵敏度、高质量精度的性能优势，极大地改善了样本检测中的干扰问题 [ 71 ]。 6.1.3. 其他色谱法 近年来，依托不断发展的新技术，研究者们对丙烯酰胺的色谱检测方法进行了一系列的优化与创新。Ádám Tölgyesi在LC-MS法的基础上，建立了一种亲水作用色谱串联质谱法(hydrop interaction liquid chromatography-mass spectrometry， HILC-MS)测定丙烯酰胺的方法，与LC-MS这一标准方法相比，HILC-MS法改善了丙烯酰胺因强极性所造成的在常规反向色谱柱中保留差的色谱行为 [ 72 ]。吉冈俊明等引入了高灵敏度、高通量的方法——超临界流体色谱串联色谱法(supercritical fluid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry， SFC-MS/MS)进行低浓度的丙烯酰胺的测定，以兼具气体优势即扩散系数大与液体优势溶解能力强的超临界流体二氧化碳为流动相，通过压力、温度的调整，改变二氧化碳的密度，进而调整组分对丙烯酰胺的溶解度，实现高效萃取分离检测 [ 69 ]。 6.2. 毛细管电泳法 毛细管电泳法(capillary electrophoresis， CE)是除上述气相色谱及其联用技术和液相色谱及其联用技术外另一种用于丙烯酰胺定量分析的传统检测方法，它以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力， 依据样品中进入毛细管的各组组分之间分配系数和淌度上的差异，而进行分离分析，由此可见，待测物质带电是进行分离分析的关键。根据丙烯酰胺获得电荷的方式，CE法可以分为毛细管胶束电动色谱法(icellar electrokinetic chromatography， MEKC)、非水毛细管电泳(non-aqueous capillary electrophoresis， NACE)、毛细管区带电泳法(capillary zone clectrophoresis， CZE)等 [ 73 ]。CE法优势在于检测时所需样品较少，快速、经济等，但由于毛细管柱内径较小，导致分离效果差，检测灵敏度低，因此检测器的选择直接决定CE法的灵敏度。常用的高效CE检测器有电感耦合非接触电导率检测器 [ 74 ]、二极管阵列检测器 [ 75 ]、荧光检测器 [ 76 ] 等。 Table 1 The determination of acrylamide in thermally processed Chinese traditional medicin 中药材 前处理方法 检测方法 LOD 线性范围 回收率 研究者 天门冬 超声辅助 柱前衍生 HPLC 25 μg/kg 0.015~4.5 g/ml Shi等 [ 72 ] 燃香 固相萃取 HPLC 3 mg/kg 10~100 mg/L 96.6% 李振球等 [ 51 ] 白术 QuEChERS LC-MS 2 μg/ kg 2~150 ng/ mL 96.9%~102.9% Zhu等 [ 48 ] 炒山楂 固相萃取 HPLC 35 μg/kg 98%~101% 李辉等 [ 45 ] 焦山楂 活性炭 固相萃取 CE 0.10 mg/L 0.50~50.00 mg/L 93.3%~98.9% 韩康等 [ 54 ] 表1. 高温炮制中药材中丙烯酰胺的检测 6.3. 光谱法 对于丙烯酰胺的检测，常用的光谱法有比色法(colorimetry)、表面增强拉曼光谱法(surface enhanced raman spectroscopy， SERS)、荧光光谱法(fluorescence emission spectroscopy， FES)、红外光谱法(infrared spectrometry， IR)、紫外–可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry， UV-VIS)等。 比色法是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来定性定量检测待测物质的方法，其灵敏度低，所受干扰严重，误差大，只适用于可见光区的检测，但因其具有操作简便、成本低廉、结果肉眼可见优点等优点，近年来在分析化学尤其是快速检测领域发展迅速。杨桂英等建立了一种基于聚乙二醇单甲醚和纳米金的高分子复合材料即PEO-纳米金可视化检测丙烯酰胺的新方法，浓度在0.004~0.032 mg/ml的丙烯酰胺能使PEO-纳米金颗粒发生团聚，在一定浓度范围丙烯酰胺的浓度越大，PEO-纳米金团聚程度越大，并且这种团聚程度的改变可引起纳米金颜色的变化，借助肉眼与紫外–可见分光光度计实现对丙烯酰胺的快速检测 [ 77 ]。 SERS法是采用高性能的SERS基底如纳米颗粒基底、金属电极活性基底、贵金属溶胶基底等增强拉曼散射信号，根据增强放大的拉曼散射信号实现对待测物质的检测分析的技术，具有图谱指纹特性强、灵敏度高、快速等优点。Cheng等提出了一种基于银纳米棒/金纳米颗粒复合材料的表面增强拉曼光谱法以对丙烯酰胺进行快速定量检测，样品通过水和乙腈的混合物(1:1， v/v)提取，氯化钠和无水硫酸镁盐析，以稀硝酸涂抹包覆的银纳米棒/金纳米颗粒复合材料作为SERS基底，采用拉曼光谱仪进行分析，单个样品在5分钟之内即可完成检测，检测限低至1 μg/kg [ 78 ]。 FES法也叫荧光传感法，是利用物质分子在吸收能量后以光辐射的形式发出能反映出该物质特性的荧光。根据丙烯酰胺与荧光物质之间的荧光淬灭效应实现对丙烯酰胺的检测。Liu等以荧光胺为荧光物质，通过霍夫曼反应降解后的丙烯酰胺产物即丙烯胺与荧光胺生成吡咯烷酮，吡咯烷酮在480 nm下有强荧光发射，且荧光强度与丙烯酰胺的浓度呈线性正相关，通过检测荧光强度来测定样本中的丙烯酰胺浓度 [ 79 ]。此方法操作简单，耗时短，但只能用于有紫外吸收的物质的检测，Leila等通过荧光物质的改变建立了一种基于量子点检测的荧光光谱法，实现了对无紫外吸收的物质的检测。该方法是以表面官能化的碲化镉量子点为荧光基础，这种荧光物质能够与其他包含负电性原子(例如氧和氮)分子形成氢键结合丙烯酰胺结合，进而引发官能化的碲化镉量子点发生间距变化，间距的变化随即引起荧光强度的变化，结合二者的关系通过荧光光谱法进行丙烯酰胺的浓度测定 [ 80 ]。 6.4. 酶联免疫分析法 酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)法是借由抗原与抗体的特异性结合，检测酶催化底物后产生的颜色反应来分析待测物质，在食品卫生检测领域已被广泛应用。由于丙烯酰胺分子量小，缺乏免疫原性，因此，需要连接大分子的免疫载体蛋白以使其成为完全抗原刺激机体产生相应抗体。付云洁等以戊二醛作交联剂，通过形成Schiff碱共价键连接牛血清白蛋白载体和丙烯酰胺合成完全抗原 [ 81 ]；Preston等通过3-巯基苯甲酸衍生化丙烯酰胺，结合牛甲状腺球蛋白制得免完全抗原，相较于直接利用戊二醛共轭的方法，此方法获得的完全抗原亲和力更高 [ 82 ]；Quan等以N-丙烯酸琥珀酰亚胺酯为半抗原，钥孔血蓝蛋白为载体蛋白，缀合后将其作为完全抗原。同时，研究者还将增强化学发光技术与酶联免疫吸附试验技术联用以检测样本中的丙烯酰胺，其实验结果表现出与高效液相色谱法相近的良好精密度 [ 83 ]。此外，Sun等在酶联免疫分析法的基础上开发了仿生酶联免疫分析法(biomimetic enzyme-linked immunosorbent assay， BELISA)，以亲水性印迹膜作为仿生抗体，利用此仿生抗体对丙烯酰胺的特异性高结合力进行酶联免疫吸附实验。在适当条件下，此法灵敏度高(IC50， 8.0 ± 0.4 mg/L)，检出限低(IC15， 85.0 ± 4.2 µg/L) [ 84 ]。 6.5. 电化学生物传感法 电化学生物传感法(electrochemical biosensor， EB)是以酶、抗原、抗体、细胞、组织为敏感元件，以电极为转换器、以电容、电势、电流、电导率、电位等参数为特征检测信号实现对待测物质的定性或定量检测。近年来基于电化学生物传感器法的检测，已经成为食品卫生领域快速检测的新思路。Varmira等使用电化学生物传感器法对样品中的丙烯酰胺进行检测，他们利用丙烯酰胺与HG的N-端缬氨酸的α-NH 2 反应形成加合物，从而降低HG-Fe +3 还原峰电流的原理制备获得生物传感器，通过电化学阻抗谱、循环伏安法、能谱仪和扫描电子显微镜对修饰前后的丙烯酰胺进行表征，实现检测分析。该生物传感器法即使在高浓度的普通干扰物存在下也能选择性地检测丙烯酰胺，证实了该生物传感器的高选择性。此外，进一步的研究结果证实，该生物传感器具有响应时间短(小于8秒)，灵敏度高，长期稳定、重复性和再现性高的特点，在实际丙烯酰胺样品测定中具有一定的应用前景 [ 85 ]。 6.6. 分子印迹技术 基于超分子化学性的分子印迹技术(molecular imprinting technology， MIT)是针对模板分子制备具有特定空间结构和功能且对待测物质具有特异识别选择能力的聚合物的技术。该技术具有特异性强、选择性高、分离效率高等优点，但由于功能单体种类少，且对用于分子印迹聚合物的模板分子的要求高，该技术在实际中没有得到广泛应用 [ 86 ]。不少课题研究者组就此进行了探索，现阶段研究者们一致认为可以通过分子印迹技术与磁性材料技术的联用改善克服MIT的缺陷，扩大应用范围，其中常用的磁性材料主要有氧化铁纳米粒子 [ 87 ] [ 88 ]、氧化石墨烯 [ 89 ]。Zhang等用羧甲基葡聚糖修饰的磁性氧化铁纳米粒子作为载体，用丙酰胺作为虚拟模板分子，制备获得新型虚拟磁性分子印迹聚合物，用于丙烯酰胺的选择性检测，其回收率可达96.8% [ 88 ]。 6.7. 计算机视觉法 计算机视觉法(computer vision， CV)是通过计算机算法进行图像自动化处理用于实时在线检测的技术。该技术已在食品药品工业中广泛用于质量监测 [ 90 ]。Dutta等利用支持向量机分类器对样品中丙烯酰胺进行图像处理。为了提高丙烯酰胺识别的准确性和效率，研究者们采用主成分分析方法从分割后的样品图像中提取统计特征和纹理特征，并对其进行策略性压缩。当识别丙烯酰胺芯片样品的SVM分类器采用三阶多项式内核和γ-3径向基函数核时，该方法检测准确度可达94%以上，灵敏度达96% [ 91 ]。与传统方法相比，计算机视觉法最大的优势在于可以无损坏地完成样本中丙烯酰胺的测定，但当所检测的中药材样本基质过于复杂时，其检测的准确度还有待进一步考究。