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user: 3. 结果与分析 对荒漠化沙地土壤和衬膜水稻土壤两种不同土壤中的6个土壤样品进行测定。未经修复过的荒漠化沙地土壤编号为S1、S2、S3，经衬膜水稻种植技术修复的水稻土壤编号为W1、W2、W3。 3.1. OTUs聚类分析 通过对序列进行归类操作可以了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息。将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。得到的OTU数目如表1。 Table 1 Statistics of OTU number of single sample Sample ID Final_tags OTUs W_1 28，624 2693 W_2 28，624 2748 W_3 28，624 2626 S_1 28，624 2887 S_2 28，624 2926 S_3 28，624 2837 表1. 单个样本的OTU数目统计 为了比较直观的表现两组样本的OTU数目组及其样本或分组之间的重叠情况，绘制了可用于统计多个样本中所共有和独有的OTU数目的Venn [ 19 ] 图，如图1。根据OTU数目韦恩图可以看出，两种土壤之间OTU数目差异很大，荒漠化沙地土壤的OTU数目远远大于衬膜水稻土壤，两种土壤相同的OTU数目为1877。荒漠化沙地土壤样本间的差异性大于衬膜水稻土壤。 图1. OTU数目韦恩图 3.2. Alpha多样性分析 3.2.1. 稀释性曲线 如图2，样品稀释曲线 [ 20 ] 趋近平缓。曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU。因此，稀释性曲线表明样品目前的测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种，测序深度足够，测序数据量合理。 图2. 稀释曲线图 3.2.2. Shannon-Wiener曲线 如图3，Shannon-Wiener曲线趋向平坦，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。此外，由Shannon-Wiener曲线图可看出荒漠化沙地土壤样品的Shannon指数大于衬膜水稻土壤。 图3. Shannon-Wiener曲线图 3.2.3. Rank-Abundance曲线 Rank-abundance [ 21 ] 曲线是分析多样性的一种方式。Rank-abundance曲线可用来解释多样性的两个方面，即物种丰度和物种均匀度 [ 22 ]。在水平方向，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大。荒漠化沙地土壤的曲线跨越宽度大于衬膜水稻土壤，表明荒漠化沙地土壤的物种的丰度大于衬膜水稻土壤。曲线的形状(平滑程度)反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。与衬膜水稻土壤相比，荒漠化沙地土壤的曲线更平缓，表明荒漠化沙地土壤的物种的均度大于衬膜水稻土壤(见图4)。 图4. Rank-abundance曲线图 3.2.4. Alpha多样性指数 如图5 alpha多样性指数box图，具体数据见表2 alpha多样性指数统计表。 Table 2 Alpha diversity index statistical tabl Sample ID Chao1 goods_coverage observed_species PD_whole_tree Shannon Simpson S_1 3285.48 0.98 2887.00 200.15 9.82 1.00 S_2 3436.55 0.98 2925.90 188.53 9.84 1.00 S_3 3285.19 0.98 2837.00 189.05 9.87 1.00 W_1 3405.50 0.97 2692.90 185.63 9.20 0.99 W_2 3420.57 0.97 2747.90 184.62 9.35 0.99 W_3 3447.08 0.97 2625.90 177.06 9.16 0.99 表2. Alpha多样性指数统计表 图5. Alpha多样性指数box图 Chao 1：即菌种丰富度指数，用以估计群落中的OTU数目。衬膜水稻土壤样品的chao 1指数大于荒漠化沙地土壤，表明衬膜水稻土壤菌种的丰富度大于荒漠化沙地土壤，衬膜水稻土壤细菌群落的丰富度高。 goods_coverage和observed_species指数表征各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果代表了样本中微生物的真实情况。 PD_whole_tree [ 23 ]：谱系多样性，是兼顾考虑了物种丰度以及进化距离的多样性指数。数值越大，群落多样性越高。荒漠化沙地土壤样品的PD_whole_tree指数大于衬膜水稻土壤样品，因此，表明荒漠化沙地土壤群落多样性高于衬膜水稻土壤。 Shannon：用来估算样品中微生物多样性指数之一。Shannon值越大，说明群落多样性越高。荒漠化沙地土壤样品的Shannon值大于衬膜水稻土壤样品，表明荒漠化沙地土壤群落多样性高于衬膜水稻土壤。 Simpson [ 24 ]：用来估算样品中微生物多样性指数之一，结果中交付为1-D值。 Simpson指数兼顾丰富度和均匀度。D值在0~1之间，0表示无限多样，1表示没有多样性。所以1-D值越大，说明群落多样性越高。荒漠化沙地土壤样品的Simpson值大于衬膜水稻土壤样品，表明荒漠化沙地土壤群落多样性高于衬膜水稻土壤。 3.3. 物种组成分析 使用统计学的分析方法，观测两种土壤样本在不同分类水平上的群落结构。将多个样本的群落结构分析放在一起对比时，还可以观测其变化情况。本研究用柱状图可视化观察不同样本(或者分组)的物种组成情况 [ 25 ]。从门、纲、目、科、属等五个水平上作柱状图。 3.3.1. 两种土壤中微生物菌门组成 图6展示了两种土壤中门水平细菌群落结构，图中不同颜色色块代表不同门细菌种类，高度代表某一个门相对丰度的大小。结果表明，在门水平上各处理优势种群结构相似，但两种土壤细菌丰度存在差异。衬膜水稻土壤中变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)是优势菌群，相对丰度分别为34%、13%和6.7%。荒漠化沙地土壤中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobateria)是优势菌群，相对丰度分别为30%、23%和13%。采用衬膜水稻技术修复土壤和邻近荒漠化沙地土壤两种土壤所含变形菌门丰度相差不大。荒漠化土壤的放线菌门是衬膜水稻的三倍多，出现这种现象应该是由于放线菌一般为好气性，而荒漠化土壤都是沙土，透气性强。荒漠化土壤中所出现的酸杆菌门是新近被分出的一门细菌，对其知之甚少。在衬膜水稻土壤中的另一优势菌群为绿弯菌门，为兼性厌氧生物在有氧无氧环境都能生存。 图6. 土壤微生物菌门丰度图 3.3.2. 两种土壤中微生物菌纲组成 图7展示了两种土壤中纲水平细菌群落结构。结果表明，在纲水平上两种土壤优势种群结构存在很大差异，由于含量较少在图中无法显示，衬膜水稻土壤的菌纲种类略多于衬膜水稻土壤，细菌丰度也存在差异。衬膜水稻土壤中β变形菌纲(Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)是优势菌群，相对丰度分别为13%、10.7%和9.8%。荒漠化沙地土壤中β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria )是优势菌群，相对丰度分别为10.7%、10.5%和9.7%。衬膜水稻土壤和荒漠化沙地土壤中的优势菌群都集中在放线菌门和变形菌门，与对两种土壤进行的菌门分析呈现一致性。 3.3.3. 两种土壤中微生物菌目组成 图8展示了两种土壤中目水平细菌群落结构。结果表明，在目水平上两种土壤优势种群结构存在很大差异，由于含量较少在图中无法显示，衬膜水稻土壤的菌目种类略多于衬膜水稻土壤，细菌丰度也存在差异。衬膜水稻土壤中厌氧绳菌目(Anaerolineales)、微球菌目(Micrococcales)和伯克氏菌目(Burkholderiales)是优势菌群，相对丰度分别为8.9%、8.5%和6.7%。荒漠化沙地土壤中伯克氏菌目(Burkholderiales)、Blastocatellales菌目和鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)是优势菌群，相对丰度分别为7.2%、5.2%和4.9%。 图7. 土壤微生物菌纲丰度图 图8. 土壤微生物菌目丰度图 3.3.4. 两种土壤中微生物菌科组成 图9展示了两种土壤中科水平细菌群落结构。结果表明，在科水平上两种土壤优势种群结构存在很大差异，由于含量较少在图中无法显示，衬膜水稻土壤的菌科种类略多于衬膜水稻土壤，细菌丰度也存在差异。衬膜水稻土壤中无花果科(Anaerolineaceae)、微球菌科(Micromonosporaceae)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)是优势菌群，相对丰度分别为8.9%、7.2%和4.0%。荒漠化沙地土壤中Blastocatellaceae_Subgroup_4、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)和噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)是优势菌群，相对丰度分别为5.3%、3.8%和3.8%。 图9. 土壤微生物菌科丰度图 3.3.5. 两种土壤中微生物菌属组成 图10展示了两种土壤中属水平细菌群落结构。结果表明，在属水平上两种土壤优势种群结构存在很大差异，由于含量较少在图中无法显示，衬膜水稻土壤的菌属种类略多于衬膜水稻土壤，细菌丰度也存在差异。衬膜水稻土壤中假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、Anaerolinea和马赛菌属(Massilia)是优势菌群，相对丰度分别为7.2%、3.4%和2.6%。荒漠化沙地土壤中RB41、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)和马赛菌属(Massilia)是优势菌群，相对丰度分别为4.4%、2.5%和2.4%。 图10. 土壤微生物菌属丰度图 3.4. Beta多样性分析 3.4.1. 基于Unifrac的Heatmap 为了更好的显示多个样本之间的距离关系，将未加权与加权的unifrac [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] 样本距离矩阵用热力图表现出来，如图11所示。衬膜水稻土壤样本之间距离比较小，说明衬膜水稻土壤样本之间的相似性比较大，样本具有代表性。荒漠化沙地土壤样本之间距离略大于沙漠水稻土壤样本，但仍距离比较小，样本比较具有代表性。很明显衬膜水稻土壤样品与荒漠化沙地土壤样品之间距离多远，两种土壤差异性很大。 图11. 基于unirfac的heatmap图 3.4.2. PCA分析与PCoA分析 PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构 [ 29 ]。如图12所示，群落结构组成相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落结构组成差异很大的样品则会远远分开。衬膜水稻土壤样品间距离非常接近，表示群落组成结构相似。荒漠化沙地土壤样品间距离则偏大，由于沙漠沙地属于自然形成，范围比较大，衬膜水稻样地为人工生态系统，出现的这种情况较为正常。衬膜水稻土壤样品与荒漠化沙地土壤样品距离较大，群落结构组成差异性较大。 图12. 基于OTU水平的PCA分析 PCoA分析，即主坐标分析(principal co-ordinates analysis)，也是一种非约束性的数据降维分析方法，与PCA分析类似；主要区别在于，PCA基于欧氏距离，PCoA基于除欧氏距离以外的其它距离。如图13所示。PCoA分析结果与PCA分析结果一致。 图13. 基于bray-curtis的PCoA分析 3.4.3. NMDS分析 非度量多维尺度法(NMDS)是一种将多维空间的研究对象(样本或变量)简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法 [ 30 ]。其特点是根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，通过点与点间的距离体现不同样本间的差异程度 [ 31 ]。衬膜水稻土壤样品间距离非常接近，表示样本间差异性较小。荒漠化沙地土壤样品间距离则偏大，表示样本间差异性较大。由于荒漠化沙地属于自然形成，范围比较大，衬膜水稻样地为人工生态系统，出现的这种情况较为正常。衬膜水稻土壤样品与荒漠化沙地土壤样品距离较大，物种信息差异性较大(见图14)。 图14. OTU水平NMDS分析