DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 2. 材料和方法 2.1. 材料 实验材料为中烟90，该烟草品种是中国农科院烟草研究所通过三亲杂交，定向培育的烤烟新品种。 2.2. 主要试剂 Trizol (Invitrogen， USA)， SMART TM RACE cDNA Amplification Kit (BD Bioscience Clontech Company， USA)， SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit (BD Bioscience Clontech Company， USA)， pGEM-T Vector (Promega， USA)；其它常规试剂均为国产分析纯。 2.3. 总RNA的提取及RACE-Ready cDNA的合成 利用Trizol法提取烟草叶片总RNA，用SMART TM RACE cDNA Amplification Kit分别合成5′ RACE-Ready cDNA和3′ RACE-Ready cDNA。合成前者的反应体系为10 μL，含有1 μL的5′-RACE CDS Primer A，1 μL的BD SMART II TM A Oligonucleotide，1 μL总RNA(1 μg/μL)，2 μL去离子水，2 μL的5×First-Strand Buffer，1 μL的20 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，1 μL的10 mmol/L dNTP Mix和1 μL BD PowerScript反转录酶。3′cDNA合成的反应体系为10 μL，含有1 μL的3′-RACE CDS Primer A，1 μL总RNA(1 μg/μL)，3 μL的去离子水，2 μL的5 × First-Strand Buffer，1 μL的20 mmol/L DTT，1 μL的10 mmol/L dNTP Mix和1 μL BD PowerScript反转录酶。将反应体系在42℃温育1.5 hr以保证cDNA第一链的合成反应完成。再用Tricine-EDTA缓冲液把反应体系稀释10倍待用。 2.4. 快速扩增cDNA末端(5′和3′ RACE) 根据烟草的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因核心序列(登录号：AJ291721)，利用Primer3在线工具(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计基因特异性引物GSP1和GSP2。GSP1： 5′-GCGTCGGACCATCTGCTCCAACAAGA-3′；GSP2：5′-CGCTATGGGTGGTGGGACCGGTATGA-3′。 扩增5′cDNA末端的反应总体积为15 μL，其中含有10.6 μL ddH 2 O，1.5 μL 10 × BD Advantage 2 PCR Buffer，0.3 μL的10 mmol/L dNTP Mix，0.2 μL的50 × BD Advantage 2 Polymerase Mix，0.6 μL的5′RACE- Ready cDNA，0.6 μL的10 × UPM，0.3 μL的10 μmol/L GSP1。扩增3′cDNA末端的反应体系为15 μL，含有10.6 μL ddH 2 O，1.5 μL的10 × BD Advantage 2 PCR Buffer，0.3 μL的10 mmol/L dNTP Mix，0.2 μL的50 × BD Advantage 2 Polymerase Mix，0.6 μL的3′RACE- Ready cDNA，0.6 μL的10 × UPM，0.3 μL的10 μmol/L GSP2。使用Touchdown PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，72℃ 3 min，进行5轮循环；接着94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，循环5轮；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，共28轮循环；72℃延伸10 min。扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳分开，根据分子量标准判断并回收目的DNA片段，连入pGEM-T vector，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子并测序。对来源于5'和3' RACE的扩增产物分别测4个以上的克隆，通过比较测序结果消除因PCR反应可能出现的错配碱基。 2.5. DXS cDNA及其编码的氨基酸序列的分析 使用DNAtools 6软件进行核苷酸序列的翻译。使用Clustal X v1.8 [ 5 ] 软件进行氨基酸序列的比对分析。蛋白质理论等电点和分子量使用Compute pI/MW在线工具(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html)进行预测。蛋白质前体的信号肽使用SignalP 3.0 Server在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行预测。分子系统树使用ClustalX v1.8软件中的N–J选项(自举检验次数=1000)进行构建 [ 6 ] 。此外蛋白质序列中可能存在的磷酸化位点使用NetPhos 2.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行预测 [ 7 ] 。 2.6. DXS基因的组织表达特异性检测 利用Trizol法提取烟草幼茎、叶片、根尖和花朵的总RNA。按文献 [ 8 ] 的方法进行Northern 转膜和杂交。将各样品的总RNA(20 μg)在1.5%(w/v)的变性琼脂糖胶上电泳分开，转到硝酸纤维素膜上，以α-[ 32 P]dCTP标记的5′cDNA片段为探针，进行分子杂交。杂交条件为65℃ 16 hr；洗膜条件：用1 × SSC，0.2%(w/v)SDS于65℃洗15 min，再用0.5 × SSC，0.1% (w/v) SDS于65℃洗15 min；将洗好的膜与X光片夹于增感屏中，置于−20℃曝光7 d。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 烟草1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因cDNA的克隆 通过SMART-RACE扩增到DXS基因的5′cDNA片段和3′cDNA片段见图1，大小分别约为1.9 Kb和1.2 Kb。测序后经拼接获得了DXS基因的全长cDNA序列。 3.2. 由cDNA预测的蛋白质序列分析 该cDNA序列全长为2386 bp，所含的开放阅读框(ORF)编码718个氨基酸残基(图2)。在cDNA的3'末端有28个脱氧核苷酸组成的poly (A)。该cDNA全长序列已被登录到GenBank数据库(GenBank accession number: CBA12009)。 经预测，该蛋白序列中潜在的磷酸化位点可能有19个丝氨酸、11个苏氨酸和10个酪氨酸的磷酸化位点，它们分别是第24、51、57、59、87、107、159、174、176、248、269、273、315、346、392、549、634、645和683位的丝氨酸残基，第71、102、132、152、160、171、219、316、349、359和570位的苏氨酸残基，第64、65、128、178、224、232、305、375、553和678位的酪氨酸残基。这些位点的磷酸化可能对于酶分子空间构象的维持及行使其正常功能是必需的。预测表明该蛋白序列中不存在跨膜结构域，而其理论等电点和分子量分别为7.31和77.413 kDa。 将烟草的DXS与其它植物的DXS的氨基酸序列进行同源性比较，结果显示烟草的DXS与辣椒的 图1. 利用RACE克隆烟草DXS基因。M：DNA分子量标准 图2. 烟草DXS基因的cDNA序列及推导的氨基酸序列 DXS (登录号：O78328)的相似性最高，氨基酸同源性达96%；其次是番茄的DXS(登录号：AAD38941)，达95% (图3)。 根据同源序列分析烟草DXS与其它9种植物的DXS的进化关系。从进化树(图4)可以看出，来自植物的10个DXS可分为3大类，其中烟草的DXS与4种植物的DXS属于同一大类，而在这一大类中，烟草与辣椒，番茄的DXS关系最密切，它们形成一个独立的分支，暗示了它们可能由一个共同的祖先进化而来 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] ，在长期的进化过程中相当保守。系统分析结果还表明，植物的DXS基因及其编码的蛋白质在进化过程中发生了重大分化。 3.3. 对DXS基因表达的Northern印迹杂交分析 通过Northern印迹杂交检测了DXS基因在烟草的根、茎、叶和花器官中的表达水平(图5)。从图5可以看出，在叶片中，DXS基因的表达水平最高，其次是在幼茎中，而在根和花器官中该基因的表达水平很低，仅检测到微弱的杂交信号。
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user: 4. 讨论 目前，植物萜类物质在其生存和生长发育过程中的重要作用，以及对疾病治疗和保健方面的有效性逐渐为人们所认识。萜类物质是通过异戊二烯代谢途径合成的，首个关键酶DXS的研究虽仅有10余年 图3. 烟草DXS的氨基酸同源性序列比对分析。图中显示的是烟草的DXS (CBA12009)与辣椒的DXS (O78328)以及番茄的DXS (AAD38941)序列比对结果。其中完全保守的氨基酸用星号标识，较保守的氨基酸用双点标识，而一般保守的氨基酸用单点标识 图4. 使用邻接法构建的包含烟草的DXS与其它9种植物的DXS的进化树关系图。Nitab：烟草，GenBank登录号：CBA12009；Caann：辣椒，O78328；Solyc：番茄，AAD38941；Samil：红参，ACF21004；Arann：黄花蒿，AAD56390；Metru：苜蓿，CAD22530；Pumon：山葛，AAQ84169；Glmax：大豆，ACO72582；Ricom：蓖麻，EEF45457；Elgui：油棕，EEF45457。1000次的自举检验置信度值标于分支线上。比例尺代表每位点0.01个核苷酸的替换。名称用属名的前两个字母加上种名的前三个字母表示 图5. Northern blot杂交分析。探针为5′末端的cDNA片段；L、S、F和R分别代表烟草的叶、茎、花和根。以每个泳道中的rRNA作为内参。斜体“DXS”代表用于杂交中的基因探针。“28S”和“28S”分别代表总RNA中的“28S rRNA”和“18S rRNA” 历史，但已经取得了令人瞩目的成就 [ 11 ] 。 在异戊二烯代谢途径中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是关键酶，而1-脱氧木酮酸-5-磷酸酯合成酶(DXS)、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)均为萜类分子代谢途径中的限速酶。如Chappell等曾报道烟草倍半萜化合物会因为HMGR受到抑制而明显减少 [ 12 ] 。利用CaMV 35S启动子驱动薄荷的DXR基因并导入薄荷中，转基因植株的薄荷精油的含量会显著提高，甚至可达50% [ 13 ] [ 14 ] 。 我们知道烟叶香气是衡量其质量的重要因素之一，但是烟草中香味成分复杂且繁多，而且含量较低，如果增加单一物质的含量并不能显著提高香味，而且有可能导致香气组分发生改变，使得烟叶香气发生质的改变。鉴于此，要通过遗传修饰的方式改良烟草香味，需要考虑把HMGR、DXS和DXR等基因同时进行转移，筛选出香味浓郁的转基因植株，实现对多酚类化合物合成关键基因表达的人为调控，从整体上来影响烟叶类黄酮化合物的含量，增加烟叶的香气量。 烟草的DXR和HMGR基因全长cDNA序列(登录号分别为：DQ839130和U60452)已获得。本研究通过RACE技术成功获得了烟草DXS基因的全长cDNA序列，并通过Northern印迹杂交证实了烟草DXS基因在绿色组织主要在叶片中高水平表达，为研究该基因的功能及通过转基因方式调控其表达，及进一步改良烟草香气品质打下了良好基础。
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user: 摘 要 瘙痒是机体生理状态下自我保护的一种反应机制，也是很多系统性疾病和皮肤疾病的症状之一。本文就瘙痒的分类，引起瘙痒的分子机制，与组胺受体的联系，瘙痒的评价和测量方法以及瘙痒的治疗做一个综述。 关键词 :瘙痒，分类，机制，联系，评价与测量方法，治疗 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 瘙痒是许多皮肤病常见的临床表现，如湿疹，特应性皮炎，接触性皮炎，常伴有瘙痒的症状。瘙痒症发病时，疼痒难耐，严重影响患者的生活质量。 瘙痒产生原因复杂，实验证明，人的皮肤存在痒感的感受器，并通过神经末梢传向大脑。患部组织胺的释放能促进痒感。抓痒因压痛有止痒作用，但又促进释放更多的组织胺，加重痒感，形成痒–抓的恶性循环，导致更为严重的皮肤损伤和炎症。 治疗瘙痒可以预防因搔抓反应而引起的并发症，如神经性皮炎，胞脓疮等。中医认为，风邪、湿邪、热邪、血虚、虫淫等为致病的主要原因，治疗以疏风祛湿、清热解毒、养血润燥、活血化瘀为原则，以达到驱邪扶正止痒之功效。
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user: 2. 瘙痒的分类 2.1. 物理性瘙痒 物理性瘙痒通常临床表现为荨麻和黧豆等引起的瘙痒，也包括由屏蔽各种物理因素所引起的荨麻疹等，根据各自不同的特点又可进一步划分为以下类型： 皮肤划痕症：亦称人工荨麻疹。用钝器划过皮肤后，沿划痕发生条状隆起，伴有瘙痒，若不再刺激，不久即可自行消退，可与变态反应性荨麻疹伴发。 胆碱能性荨麻疹：临床上表现为人们在剧烈运动、体内温度过高时，身体出汗部位常出现皮疹并伴有轻度红晕，一般在出现后的几小时内自动消退，但又可再发，瘙痒时有时会有红斑出现而没有风团出现，甚至瘙痒部位或有剧痒的症状。有的患者还可伴有痉挛性腹痛、腹泻等症状。本病病程慢性，反复发作，皮内注射或口服胆碱能性药物，如乙酰、甲胆碱亦可引起同样发疹。 温热性荨麻疹：临床上变现为身体局部部位在接触了温热物体后会出现风团现象，更有甚者在燥热的环境中，患者除了会出现风团以外还可能会昏厥。 寒冷性荨麻疹：患者在接触冷水或其它冰冷物质后，接触部位出现瘙痒性水肿和风团，半小时至一小时左右可消失。多发于裸露部位如脸部和手部，严重者会累及其它部位。此病分为遗传性和获得性两种，遗传性的寒冷性荨麻疹属于常染色体显性遗传，出生后不久即可发病，并伴随患者终生；而获得性的寒冷性荨麻疹在儿童和青春期比较常见。当外界温度骤降时，例如接触冷水、冷物、淋雨或由温热环境进入冷环境之后，受冷部位发生风团或水肿，严重时可有双手指及口唇麻木、心悸、腹痛、腹泻、昏厥等症状，更有甚者出现休克。 日光性荨麻疹：患者在经过日光照射后，照射部位会出现红斑和风团，并伴有瘙痒，长波紫外线或可见光线都可能诱发此症状，可能是由于光敏感性物质诱发的光敏感性反应引起的。 压迫性荨麻疹：受压部位出现皮肤性水肿或风团，伴疼痛，皮肤受衣服腰带压迫或久坐数小时后，即可发生。 此外常见的瘙痒症除上述荨麻疹外还有由刺毛黧豆引起的瘙痒症状。刺毛黧豆(Mucuna pruriens， Cowhage)是一种热带豆科植物，其豆荚的毛刺有致痒作用，有效成分为黧豆蛋白酶(mucunain)。作为一种典型的非组胺致痒物质，与组胺致痒相比，黧豆毛刺给予人体表皮刺激后，仅在刺激点附近小区域内血管舒张，基本无疹块和微量轴突反射引起的红肿反应，并且搔抓反应对黧豆毛刺刺激痒觉抑制有很好的作用。由于一些疾病引起的慢性痒如过敏性皮炎，过敏性湿疹，肝脏或肾脏疾病并非组胺诱发，无法用抗组胺类药物解决。而刺毛黧豆作为典型的非组胺类致痒物质，其刺激产生的伤害性感受与过敏性皮炎病人相似。因此刺毛黧豆具有成为外周痒觉研究实验的重要工具。 2.2. 疾病性瘙痒 [ 1 ] HIV感染：HIV引起的瘙痒常常又由其他继发疾病引起，常见的有：湿疹、干燥症、银屑病、药物反应、嗜酸性毛囊炎、脂溢性皮炎 [ 2 ]。药物引起的瘙痒最为常见，主要是因为免疫功能失调，改变了药物的新陈代谢，瘙痒也可以来自系统性疾病，如慢性肾炎、肝脏疾病或者系统性淋巴瘤 [ 3 ]。 妊娠性瘙痒：一般为腹部的剧烈瘙痒，可扩展至大腿、胸部、胳膊、臀部，且在第二孕期易合并痒疹、毛囊炎，在第三孕期易合并荨麻疹，肝内胆汁淤积症伴发妊娠一般不常见。 恶性肿瘤：恶性肿瘤常会引起顽固性泛发性的皮肤瘙痒病。这是因为癌组织可产生多种生物活性物质，包括组织胺、酶、激素、抗原以及癌胚蛋白等，其分泌的多肽物质会引起全身性顽固性皮肤瘙痒。 老年性皮肤瘙痒症：老年性皮肤瘙痒症是以皮肤瘙痒为主要症状、没有原发性皮肤损害的一种皮肤病。老年人因皮肤萎缩退化变性、皮肤腺体功能低下、皮肤干燥、情绪波动等情况发生的瘙痒属生理性瘙痒；糖尿病、慢性肾功能不全、甲状腺功能亢进或减退、胆汁淤积、寄生虫感染和恶性肿瘤等疾病会引起病理性瘙痒。 心因性瘙痒：心因性瘙痒症是一种功能性发痒的皮炎，是心理疾病的一种。患者常见表现为焦虑、抑郁、精神严重变态引起的瘙痒，如寄生虫病妄想症等。
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user: 3. 引起瘙痒的分子机制 人体皮肤表层高密度的分布着特异性的感受器和传入神经纤维。交感神经仅仅只是皮肤神经系统的一部分，但是它不仅支配着人体的汗腺和皮脂腺，还支配着人体全身的毛囊和血管。人体皮肤表面的交感神经在受到刺激兴奋后释放出的乙酰胆碱和去甲肾上腺素与它们的特异性受体结合，进而激活靶细胞，发生生理活性。虽然局部麻醉或者切断神经可以同时消除疼痛和瘙痒，但瘙痒和疼痛是不同的独立的感觉形式 [ 4 ]。Andrew等 [ 5 ] 对猫的190个脊丘束神经元进行刺激，结果发现瘙痒通过感觉神经传导到神经节背根、脊索，再通过神经突触连接二级神经元，其轴突交叉至对侧，然后通过脊髓丘脑束到达丘脑的板层核，最后到达大脑皮质，引起痒觉 [ 6 ] [ 7 ]。 痒觉感受器存在于人体的真皮与表皮之间的感觉神经末梢，并且能够与一些瘙痒的传导介质(致痒因子，如组胺、5-羟色胺、内皮素、蛋白酶等等)特异性结合在一起，作用于人体的不同的皮肤细胞中，从而传递冲动导致瘙痒 [ 8 ]。 组胺(Histamine)一直被认为是引起瘙痒的重要生理活性物质。研究表明很多内、外源性的致痒源在皮肤组织内作用时就会释放组胺类物质，并作用于人体皮肤表面的靶细胞从而导致瘙痒。 5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine， 5-HT)是一种特异性的神经递质，是人体中的一种胺类物质并存在于血管中。5-羟色胺会引起人类瘙痒和疼痛的感受，是一种强效的致痒因子。研究表明，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)对缓解特应性皮炎、慢性肝病等相关疾病引起的瘙痒症状有一定的治疗作用 [ 9 ]。 内皮素1 (Endothelin-1， ET-1)是目前世界上最强的缩血管活物质，并且其作用于人体必须与人体细胞表面的特应性受体ETA或ETB结合。研究表明ET-1在人体中引起的瘙痒是因为内皮素ETA受体参与了瘙痒的信号的传递。研究发现，ET-1在人体中结合了ETA受体从而激活了瘙痒信号的传递 [ 10 ]。 蛋白酶(Proteases)经常被人们认为是引起非组胺性瘙痒的重要物质。近年来的研究表明，蛋白酶活化受体(Protease-activated receptor， PAR)的G蛋白耦联受体在蛋白酶引发的瘙痒机制中起重要的作用，主要分为PAR2和PAR4 [ 10 ]。其中PAR2是通过内源性胰蛋白酶将其激活，活化磷脂酶C激活TPRV1通道，引发人体的瘙痒。
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user: 4. 瘙痒与组胺受体的联系 组胺是贮存在人的嗜碱粒细胞和肥大细胞中一种化学介质，当人体内或外部因素刺激这些细胞时，就会诱导其释放，组胺通过与人体中的三种组胺受体H 1 、H 2 、H 3 特异性结合从而发挥作用，并且通过提高神经元内环磷腺苷(cAMP)的浓度引起瘙痒，同时，去极化的神经纤维也释放神经递质，如P物质 [ 4 ]。研究发现，组胺也可以通过与神经纤维的组胺3型(H 3 )受体结合来调节P物质的释放 [ 11 ]。由于组胺被释放到真皮中会引起血管性水肿，故而组胺产生的痒感通常伴有潮红和风团现象。风团和潮红是组胺产生瘙痒的特异反应，且它往往和以下几种疾病相关：荨麻疹、虫咬皮炎、弥漫性皮肤肥大细胞增生病、药物引起的瘙痒，但组胺不是所有疾病的瘙痒介质 [ 12 ]。 近年来的许多研究发现组胺依赖性痒与TRPV 1 通道 [ 13 ] 有很大的联系。以前认为组胺诱导的痒通过作用在感觉神经末梢的组胺受体 H 1 R。当Shim等发现打开TRPV 1 激活 H 1 R，一种热门控离子通道对辣椒素和酸反应，导致感觉神经元亚群激活。同时大多数对组胺反应的DRG神经元与TRPV 1 共表达，组胺依赖性痒显著减少通过敲除TRPV 1 基因 [ 14 ]。此外，组胺诱导的痒反应(搔抓)被消除在事先沉默TRPV 1 痒感觉神经元后，通过先前共注射组胺和膜不通透性的利多卡因衍生物QX-314，一种钠离子通道阻滞剂通过钝化钠电流后传入神经元穿过打孔道打开TRPV 1 。同样的处理，然而没有影响辣椒素引起的痛行为(擦拭)。这些发现表明TRPV 1 神经元亚群特异性介导痒，但对痛是可有可无的，TRPV 1 是一个主要的 H 1 R下游耦合离子通道，介导组胺依赖性痒。
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user: 5. 瘙痒的评价及测量方法 5.1. 瘙痒的评价标准 评价面积(9法则)，最大评分100 (注意：2岁以下婴儿和成人评价不完全相同)；山西医科大学第一医院皮肤性病科苏振兴。 评价采用以下六个临床特征：红斑/颜色加深；水肿/丘疹；渗出/结痂；剥蚀；苔藓化/痒疹；干燥。(前5个评价为单个平均的有代表性的部位，干燥评价为未受累部位)。 评分尺度：0~3，0 = 无；1是轻度；2是中度；3是重度，最大分值18分。两个视觉模拟标尺：患者评价过去3天(晚)前的瘙痒和睡眠丧失平局程度。前两项为客观SCORAD (Scoring Atopic Dermatitis Index)，可以独立使用，最大分值83分，加上第3项，最大分值103分。 这种评价标准具有速度快、操作简单、易得到评价结果等特点，但不同观察者对评价面积和严重程度的评价之间存在着差异(表1)。 5.2. 瘙痒的测量方法 5.2.1. 对患者挠痒的定量评价 为了评价止痒药物在临床上的作用，早期的研究者们常采用客观性指标评价痒。在Savin的睡眠 Table 1 SCORAD (scoring atopic dermatitis index 症状/体征 0分 1分 2分 3分 无 轻度 中度 重度 瘙痒 无瘙痒/搔抓 偶尔、轻微瘙痒/搔抓 持续或间断瘙痒/搔抓， 不影响睡眠 烦人的瘙痒/搔抓， 影响睡眠 红斑 此体征经仔细观察，不能确认 仔细观察后此体征确认 此体征明显，立即确认 此体征很明显 丘疹/水肿 此体征经仔细观察，不能确认 仔细观察后此体征确认 此体征明显，立即确认 此体征很明显 渗出/结痂 此体征经仔细观察，不能确认 仔细观察后此体征确认 此体征明显，立即确认 此体征很明显 抓痕 此体征经仔细观察，不能确认 仔细观察后此体征确认 此体征明显，立即确认 此体征很明显 皲裂 此体征经仔细观察，不能确认 仔细观察后此体征确认 此体征明显，立即确认 此体征很明显 苔癣样变 此体征经仔细观察，不能确认 仔细观察后此体征确认 此体征明显，立即确认 此体征很明显 表1. 特应性皮炎的评价 实验室，瘙痒的严重程度可以通过患者夜间睡眠是否被干扰来判断的，而夜间挠痒动作被认为是瘙痒的客观记录。实验室里通过使用脑电图记录、动眼脑电波记录和肌电图记录来记录患者整个夜间的睡眠质量。用胶带把电极固定在患者的双手的前臂腹侧，记录患者夜间的挠痒动作，另外采用双电极记录患者双手的肌肉电位。这项技术可以记录各睡眠阶段每一阵瘙痒发作时的频率和发作时程，以及睡眠中瘙痒时间的比例。但是连接在患者身上的导线可能会干扰患者的睡眠从而导致实验数据产生误差，而且若想采用这种方法来测定瘙痒必须要有睡眠实验室。Felix和Shuster为了测量患者在睡眠中的身体运动，通过在床上安装振动传感器来监测。此外，他们使用“自我转动的手表”测量了双腿和双手的运动。后来的实验结果表明这种实验并不能记录患者任何的挠痒动作。因此，一种被用来记录瘙痒运动的总时间的电磁肢体记录仪被科研工作者们发明了出来，这种电磁肢体记录仪能够同时记录对照组和瘙痒患者所有挠痒动作。另外，所有早期的挠痒记录都是在住院患者身上进行的，并不能代表所有的瘙痒患者夜间的睡眠质量。因此，研究者设计了一种通过将“雷达”传感器固定在距离瘙痒患者手臂一定距离的位置上，并且自动过滤患者肢体和躯干的大动作，来达到记录挠痒的测量目的。然而令人感到遗憾的是，只有一项采用这种技术的研究被发表。 研究者在患者家中做关于痒的进一步临床研究，这里是在夜间使用近红外录像带来记录患者的运动作为评价标准。研究者研制出一种新的设备——加速度仪(Actiwatch Plus，剑桥神经科技，剑桥，英国)。患者夜间在手腕佩戴加速度仪，用以记录挠痒动作的强度、数量和时间期限。研究者将患有特应性皮炎的儿童通过加速度仪的记录得到的数据与录像带进行了对比，结果表明，加速度仪记录的不仅有患者夜间的挠痒动作，还包括翻滚、低速摩擦以及被子下面的运动，而且这些动作表现都可以看成与疾病有关的症状。在成人的瘙痒研究中，研究者发现客观的运动活动与自我报告的睡眠质量之间呈负相关。另一种市面有售的监测夜间运动的监测仪是DigiTrac (IM系统，巴尔的摩，MD，美国)，需要夜间睡眠时戴在患者的优势手腕上。 多种皮肤病，如特应性湿疹，夜间瘙痒症状很严重，所以，对于夜间痒的记录非常有用。在其它情况下，例如大型临床试验中评价抗瘙痒治疗的效果时，日间挠痒和夜间挠痒或者每小时平均挠痒情况可能非常重要。所以，一种新型的测痒仪II被研制并用于记录储存24小时的挠痒情况。这种仪器将固定在患者优势手中指上的压电震动传感器的信号进行处理，并与患者手腕上像手表一样的计数器信息相对比。测痒仪测得的数据与计数器上记录的数据在统计学上相关性好。为了得到满意的24小时记录结果，患者必须在夜间持续佩戴这些装置，因此需要患者有较好的依从性。 5.2.2. 动物模型中对瘙痒的定量评价 在炎症介质研究中普遍应用的小型动物模型也被用于研究瘙痒。已经以不同的方式研究了皮内注射致痒剂之后的挠痒行为。日本山口氏 [ 15 ] 为了研究NC(伴有皮肤炎症的慢性瘙痒症的模型动物)小鼠的瘙痒反应，将此类小鼠放在普通环境下饲养一段时间后发现，从第3周开始，随着皮肤炎症的加重小鼠开始出现瘙痒反应(抓挠动作)，通过使用类鸦片拮抗药物纳屈酮(naltrexone)可以抑制小鼠的这种瘙痒反应。NC小鼠表现出来的瘙痒反应与人类的瘙痒反应极为类似，但是能够引起人的瘙痒反应的致痒物质—组织胺等却不能诱发NC小鼠的瘙痒反应。 日本学者野岛浩史 [ 16 ] 认为，避免一些没有作用的疼痛刺激(如注射针头的刺入)和减少违和感(如注射量的大小)在使用小鼠进行的瘙痒的研究中很重要。该学者从这个观点来看，采用蚊刺的方法制作的瘙痒模型是比较适用的。在实验过程中预先剃除小鼠背部的毛，把雌性斑蚊置于这一部位令其吸取血液。小鼠在开始被蚊叮咬的时候，开始有一定程度的抓挠动作，每隔3~4日反复进行蚊刺的处置，结果发现小鼠向蚊子叮咬部位的抓挠的次数逐渐增多，并且研究者发现当小鼠的后肢部位被蚊子叮咬后会啃咬该部位的现象。研究者发现在没有经过剃毛处理的小鼠的后肢部位注射致痒物质5-羟色胺时也会出现啃咬的现象，而注射生理盐水则没有这一现象，这种啃咬现象可以被类鸦片拮抗剂抑制。 5.3. 测量瘙痒的阈值、时限和强度 在早期关于瘙痒介质的实验中，试验物质外用于有划痕的皮肤上，或皮内注入，后来为了减轻注射疼痛，开始应用微电离技术来测定痒的诱发阈值或时限。 在临床环境中，特别是临床试验时，瘙痒的强度和性质，以及对不同治疗的反应是主要问题。医疗记录包括瘙痒性质如烧灼、刺痒、刺痛或者虫爬感，以及瘙痒的严重程度如轻微、中度或者严重干扰睡眠。因此，瘙痒分级标准开始引入瘙痒定量分级。
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user: 6. 瘙痒的治疗 6.1. 物理治疗 光疗窄波UVB (ultraviolet light， midrange sunbeam spectrum)作用于皮肤肥大细胞和其他皮肤内的潜在的致痒因子，增强机体对瘙痒刺激的抵抗能力，从而达到缓解瘙痒的目的 [ 17 ] ，UVB虽然是一种常用的治疗方法，但在使用这种方法时需要严格控制避免使患者出现晒伤等不良现象。若想要避免出现晒伤的现象，我们可以采用UVA来治疗瘙痒，UVA照射皮肤后可以影响细胞释放组胺和其他致痒物质，但是治疗过程较长，效果不明显。 皮肤区电刺激Nilsson等在临床对照试验中，对27例瘙痒患者应用皮肤区电刺激治疗，并选用皮电神经刺激疗法作为对照，结果发现，皮肤区电刺激疗法明显减轻瘙痒 [ 18 ]。 6.2. 外用药物治疗 弱酸性的清洁剂和润滑剂：人体皮肤表面的酸性物质可以减少皮肤刺激，我们一般使用弱酸性的清洗剂清洗皮肤表层保持皮肤在低酸性的环境中，从而减轻瘙痒。弱酸性的清洗剂一般用来治疗类似于干燥症、特应性皮炎、尿毒症等皮肤表面PH较高的疾病。 冷却剂：局部降温也可以止痒，通常是在瘙痒的部位做降温处理，比如用布包裹着冰块或使用湿冷的布在瘙痒的部位外敷，从而使瘙痒消退。患者也可以使用薄荷醇等冷却剂，外敷在瘙痒部位来使瘙痒消退，并且这些物质刺激神经末梢传递冷感从而掩盖痒觉，使用相对安全。 局部麻醉药：局部麻醉剂可以使局部的皮肤神经末梢暂时失活，从而达到抗瘙痒的作用，它们对中度瘙痒有较好疗效，尤其和冷却剂配合使用。并且局部麻醉剂注射后会被人体分解排出体外并不会损害人体的神经功能。 外用组胺剂：通过与组胺之间竞争性结合组胺受体，从而在组织内拮抗组胺在人体内发生作用，故可以有效的减轻瘙痒，尤其用于治疗荨麻疹和蚊虫叮咬，多虑平制剂是最有效的外用抗组胺剂。 辣椒素：辣椒素是广泛应用于各种疾病中的抗瘙痒药物，并且研究表明能用于治疗不同机制引起的瘙痒。外用辣椒素通过抑制人体细胞内P物质的合成从而减轻瘙痒，Lysy等人在44例慢性难治性瘙痒症患者身上使用了辣椒素并且进行了疗效观察，实验结果证明30例瘙痒患者的症状在很大程度上得到了缓解 [ 19 ]。Stander 等在33例患有结节性痒疹患者身上使用外用辣椒素并且对于他们的疗效进行了观察，结果发现33例患者的瘙痒症状都得到了缓解，因此该实验被评价为有效 [ 20 ]。 外用糖皮质激素：糖皮质激素在临床上具有抗炎症、抗毒、抗免疫、抗休克、抗肿瘤的作用，并在皮肤病中应用广泛，如皮炎、湿疹、寻常性痤疮等都能得到较好的治疗，但不能长期使用，长期使用可以会使患者的局部皮肤萎缩 [ 21 ]。 6.3. 系统性治疗 随着近年来对于瘙痒机制的进一步了解，治疗瘙痒除了传统的抗组胺药物外，科研工作者们也研发出更多的治疗瘙痒的新兴药物。 纳屈酮受体拮抗剂：Brune等让133例患有不同瘙痒症状的患者每天口服纳屈酮片50~150 mg，并对他们进行了疗效观察，结果发现其中86例瘙痒症患者的症状得到了很大程度的减轻，并且这86例患者中大多数患有结节性瘙痒、皮肤淋巴瘤和来源不明的瘙痒症 [ 22 ]。 帕罗西汀：Zylicz等人通过随机试验把帕罗西汀应用于26例患有系统性疾病的患者身上，让此26例患者每天口服帕罗西汀片20 mg，连续口服7天，结果发现24例患者在治疗后身体的瘙痒症状得到了很大程度的缓解。由此可见，帕西罗汀作为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂在应用于系统性疾病的患者身上能够取得较好疗效 [ 23 ]。 沙利度胺：Daly等把沙利度胺应用于治疗11例瘙痒患者 [ 24 ] ，其中包括银屑病、湿疹、结节性痒疹、老年性皮肤瘙痒症、原发性胆汁淤积症，其治疗机制目前尚不明确，并且作用机制可能为中枢镇静作用、对中枢的抑制作用和免疫调节作用。 昂丹司琼：昂丹司琼是一种高选择性的5-羟色胺(5-HT3)受体拮抗剂，具有非常高的选择性。研究表明其对胆汁淤积症及胆汁淤积症合并妊娠的患者均有减轻瘙痒的作用 [ 25 ]。 米氮平(mirtazapine)抗抑郁药：Davis等个案报道其对胆汁淤积症及肾衰、癌症患者引起的瘙痒有治疗作用 [ 26 ] ，且新的临床研究表明其对慢性夜间瘙痒效果较好 [ 27 ]。米氮平具有起效迅速、药效强而稳定、改善睡眠质量、不良反应较少等优点。
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user: 7. 结论 目前由于不同的病因，不同的细胞介质及不同神经传导回路，从而导致瘙痒的发生机制并不明确 [ 28 ] ，虽然现在各项研究表明神经系统、神经纤维以及多种如神经肽、神经递质、神经酶、细胞因子等各种介质在瘙痒的发生机制中起到各种作用，但是我们仍旧不能对瘙痒完全认识 [ 29 ] [ 30 ]。科学表明只有对瘙痒形成机制研究进展加以理解，才能在临床上为瘙痒的治疗提供更全面更完善的治疗方案。
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user: 摘 要 本文以间甲基苯腈和盐酸羟胺为原料，在催化剂作用下，通过微波和超声波的共同作用，合成间甲基苯脒肟。基于间甲基苯脒肟的产率为评价指标，进行了L 9 (3 3 )的正交试验，考察了催化剂的种类、微波功率、反应时间三个因素。结果表明：催化剂种类对反应影响最大，反应时间次之，而微波功率则影响最小。在不考虑反应物配比和超声波强度的情况下，采用苄基三乙基氯化铵作催化剂，微波功率400 W以及反应时间20分钟为最优的反应条件。 关键词 :微波，超声波，间甲基苯腈，间甲基苯脒肟，正交试验 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 苯脒肟又称苄胺肟、苯甲酰胺肟，是制备脒类化合物的必要中间体，而脒类化合物在农药、医药以及化工行业上都具有很广泛的用途。目前，脒类化合物通常采用pinner法 [ 1 ] 制备，而郑玉安等人 [ 2 ] 则采用取代苯甲腈类化合物在甲醇的酸性介质中发生醇解反应，再通过中和、氨化得到取代苯甲脒盐酸盐类化合物，但本法需要用到较大量的氯化氢气体和氨气，对实验室的要求较高，操作较为复杂难行。 对于无取代基(R=H)的芳环结构，或者芳环的对位有吸电子取代基时，该合成路线将会得到较高的产率。然而，当芳环的对位或间位有推电子取代基时，产率将会极大降低，甚至反应无法进行。本文合成的目标化合物是间位取代的甲基，属推电子取代基，按照常规的合成方法，产率较低。为此，本文在参考了Hitendra Kumar Lautre [ 3 ] 的间甲基苯脒肟合成路线与常州市天华制药有限公司 [ 4 ] 的一项专利苯甲脒合成方法的基础上，采用了微波和超声波同时进行了合成方法优化，获得较高的产率。即通过间甲基苯腈在碱性水溶液中与盐酸氢胺在催化剂的作用下，在微波和超声波的共同作用下发生反应，得到目标化合物间甲基苯脒肟 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] 。 为了优化合成反应条件，本文通过L 9 (3 3 )正交试验，优选得到最优的合成方法。
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user: 2. 仪器与试剂 2.1. 仪器 XH-300UL电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司)，XH-2008D超声波低温合成萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)，旋转蒸发器RE-52 (上海亚荣生化仪器厂)，恒温磁力搅拌器，电子天平，异形三口烧瓶(250 ml)，薄层色谱板。 2.2. 试剂 间甲基苯腈、盐酸羟胺、无水碳酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、苄基三乙基氯化铵、溴代十六烷基吡啶、蒸馏水、无水乙醇、无水乙醚、甲基叔丁基醚、石油醚、乙酸乙酯，以上试剂均为分析纯(AR)。
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user: 3. 实验内容 3.1. 间甲基苯脒肟的常规合成方法 称取15 g (0.14 mol)无水碳酸钠于250 ml的异形三口瓶中，加入150 ml蒸馏水，室温下搅拌至完全溶解。按顺序加入12 g间甲基苯腈(0.10 mol)，5 g盐酸羟胺(0.07 mol)，0.4 g的苄基三乙基氯化铵(催化剂)，加热至回流5 h。取样，薄层分析，与原料点对照，发现仅少量新物质生成，绝大多数仍为原料。 3.2. 间甲基苯脒肟的微波合成方法 在上述常规合成实验基础上，采用微波辐射催化法。设置微波功率600 W，以功率限定方式，辐射15 min。取样，薄层分析，与原料点对照，发现新物质生成大约有2/3，原料大约1/3。 3.3. 间甲基苯脒肟的超声波合成方法 在上述常规合成实验基础上，采用超声波法。设置功率1500 W，加热至回流30 min。取样，薄层分析，与原料点对照，发现新物质生成大约有1/2，原料大约1/2。 3.4. 间甲基苯脒肟的微波超声波组合合成方法 3.4.1. 反应式 3.4.2. 合成实验 在上述常规合成实验基础上，采用微波超声波联合合成法。设置微波功率600 W，超声波功率1500 W，微波辐射加热至回流20 min。取样，薄层分析，与原料点对照，基本上全部生成新物质，原料已无发现。 然后，将反应液冷却至5℃，在冰水浴的条件下向其滴加浓盐酸调节pH = 6。然后于旋转蒸发仪中减压旋蒸，残留物放冷后加入适量无水乙醇转移至烧杯中，室温放置5 h，减压抽滤，滤饼用50 ml的无水乙醇洗涤2次，合并滤液，并减压旋蒸，用甲基叔丁基醚和无水乙醇进行重结晶。析出白色晶体，过滤后真空干燥，获得13 g产品，产率：87%。mp：138~140℃， MS: M + 1 = 151。 1 H NMR (500 MHz， DMSO)， δ: 10.415(s， -OH)；7.364~7.563 (d， 4H， Ph-H); 2.540， 2.543， 2.547(s， -CH 3 ); 2.380 (s， 2H， -NH 2 )。 3.5. 间甲基苯脒肟合成的正交试验 为了优化合成条件，本文拟采用正交实验法。考虑到合成反应的多因素影响，实验条件和各原料配比全部进行正交实验，会导致庞大的实验表和产生巨大的实验量。为此，本文先进行实验条件的优化，为以后进一步进行各原料配比优化奠定基础。因此，本文按照上述的微波和超声波联合合成实验方法，在给定的反应物配比和超声波功率条件下(本实验仪器超声波最大功率为1500 W，因为理论上这种多相反应体系超声波功率越大反应越好，故而选择超声波功率固定值)，选择三种不同的催化剂(表面活性剂)、三个不同的微波功率和三个不同的反应时间，来考察此种原料配比下的最优反应条件。即正交实验表按照催化剂品种(A)、微波功率(B)、反应时间(C)三个因素在三个水平上进行实验研究，以期获得最优的实验反应条件。因素水平表如表1，正交试验结果如表2，表中Ki表示第i个因素试验指标之和，Rj表示最大值与最小值之差，简称极差， k ¯ i 表示Ki的平均值。 上表结果表明：由正交试验结果中的极差R值大小可以知道影响间甲基苯脒肟产率的因素间的关系为： R A > R C > R B 。即催化剂A影响最大，反应时间C次之，微波功率B影响最小。根据 k ¯ i 值的大小可以得到的最优组合是：A 2 B 2 C 3 ，即通过正交试验给出的最优条件是：苄基三乙基氯化铵，400 W，20 min.
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user: 4. 讨论 1) 本实验在优选合成方法时，首先对常规的热效应反应与微波反应进行了对比。结果表明，使用微波进行的间甲基苯脒肟的合成效率比常规热效应苄基三乙基氯化铵反应效率高得多。这是因为微波辐射可极大地增加分子间碰撞几率，特别是极大地增加了分子间有效碰撞几率。说明微波辐射大大促进了间甲基苯脒肟的合成。 2) 超声波也有助于反应进行。因为超声波产生的机械作用和声空化作用，声空化使得液体中空腔的形成、震荡、生长、收缩、直至崩溃，引发的物理、化学变化，从而增加分子的运动速率和分子碰撞几率，使其反应速度加快。机械作用将超声波作用于化学反应体系，促进了两相体系中的物质做剧烈的强迫运动，可以增加物质之间的扩散、传递，同时超声波还可以使物质表面剥离，进而使物质的界面更新。因此，超声波具有一定的加速反应作用。 3) 因为本文所涉及的实验是在两相中进行反应的，表面活性剂能够极好地改善反应界面，有助于反应进行。实验表明，不同的表面活性剂对反应具有较大的影响。 4) 在微波和超声波联合作用下，可以快速地促进了反应，并极大地提高了产率。 Table 1 Table of factor level with synthesis of m-methylbenzamidoxim 水平 因素 A B (W) C (min) 1 十六烷基三甲基溴化铵 200 10 2 苄基三乙基氯化铵 400 15 3 溴代十六烷基吡啶 600 20 表1. 间甲基苯脒肟的合成因素水平表 Table 2 Orthogonal experiment of m-methylbenzamidoxim 实验号 水平 产率(%) A B C 1 1 1 1 60 2 1 2 2 78 3 1 3 3 80 4 2 1 2 83 5 2 2 3 87 6 2 3 1 74 7 3 1 3 45 8 3 2 1 35 9 3 3 2 40 K 1 2.18 1.88 1.69 Σ = 5.82 K 2 2.44 2.00 2.01 K 3 1.20 1.94 2.12 k ¯ 1 0.73 0.63 0.56 k ¯ 2 0.81 0.67 0.67 k ¯ 3 0.40 0.65 0.71 0.41 0.04 0.15 R A > R C > R B 最优条件 A 2 B 2 C 3 表2. 间甲基苯脒肟的正交实验表 5) 由正交试验的极差R值可知，催化剂的种类对反应影响最大：苄基三乙基氯化铵最佳，十六烷基三甲基溴化铵次之，溴代十六烷基吡啶效果最差；然后是反应时间：当反应时间小于15分钟产率较低，大于15分钟产率提高，20分钟最佳。而微波辐射功率对反应影响不大，大于200 W即可，但400 W最佳。 6) 单独用超声波或者微波能催化化学反应 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] ，两者联用，效果更好。
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user: 5. 结论 本文通过微波与超声波组合作用于合成间甲基苯脒肟的反应体系，能够提高反应效率。本文以催化剂种类、微波功率和反应时间作为考察因素，设计了L 9 (3 3 )正交试验，结果表明：在不考虑反应物配比和超声波功率的情况下，采用苄基三乙基氯化铵作催化剂，微波功率400 W以及20分钟反应时间为最优的反应条件。 正交试验设计所得到的间甲基苯脒肟的合成方法，具有操作简便，稳定可行，可为进一步合成间甲基苯甲脒盐酸盐提供参考。
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user: 摘 要 无芒隐子草为多年生强旱生密丛禾草，是荒漠草原的建群种和优势种，不仅适口性好，而且具有抗热、抗旱、耐寒和耐践踏等特性，对荒漠草原生态系统的恢复和保育具有重要作用。该文以内蒙古荒漠草原无芒隐子草为研究对象，分析了不同载畜率(不放牧、轻度放牧、中度放牧、重度放牧)对无芒隐子草叶片解剖结构和N、P化学计量特征的影响，以探究无芒隐子草叶片上述性状对环境改变的响应与适应对策。结果表明：不同载畜率水平下，无芒隐子草叶片解剖结构除了上、下表皮细胞厚度之外，其余的指标均产生了显著变化(P < 0.05)，但随着载畜率的增加没有明显的一致性变化规律。所有的放牧处理均显著增加了无芒隐子草叶片中的全N含量(P < 0.05)。轻度和中度放牧没有显著影响叶片全P含量，而重度放牧显著降低了叶片的全P含量(P < 0.05)。任何放牧处理对叶片N:P比均没有显著影响。在CK条件下，无芒隐子草叶片的全N含量与上表皮细胞面积之间存在显著的负相关(P < 0.05)。在MG条件下，全P含量与上表皮细胞面积之间存在显著的正相关(P < 0.05)，同时与主脉厚度之间存在着极显著负相关(P < 0.01)。因此，在不同载畜率下，无芒隐子草叶片解剖结构及N、P化学计量学特征的变化和二者之间的关系均存在一定的差别。 关键词 :荒漠草原，无芒隐子草，解剖结构，氮和磷，化学计量学，载畜率 Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 生态化学计量学(ecological stoichiometry)既是研究生物系统能量平衡和多重化学元素(主要是碳、氮和磷)平衡的科学，也是分析化学元素平衡与生态学过程间相互作用的一种理论，还是研究植物元素分配的重要方法 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] ，更为研究碳(C)、氮(N)与磷(P)等元素在生态系统过程中的耦合关系提供了一种综合方法 [ 2 ] [ 4 ] 。由于元素化学功能的耦合性以及元素的不可替代性，植物对N与P的需求和利用存在严格的比例。植物N、P化学计量特征，包括：N、P浓度、N:P及N、P间异速指数等，在不同功能群、生长地区、生长季、器官之间以及环境梯度下存在明显的变化规律 [ 4 ] [ 5 ] 。 放牧对植被的影响一直是放牧生态学研究的重要领域之一，其研究内容主要集中在放牧对植物个体、种群、群落的影响以及放牧对土壤的影响 [ 6 ] 。草原植物对放牧的忍耐和适应，或抵抗和躲避是其生存和发育的策略和方式 [ 7 ] 。植物在长期放牧过程中，已经进化出多种适应机制，以保护其与非生物环境和放牧家畜的协调共存，并在群落中与其他物种保持良好的竞争 [ 8 ] [ 9 ] 。放牧对植物元素含量及化学计量学特征的作用机制已被提出 [ 4 ] [ 10 ] 。首先，放牧通过植物–土壤层面的反馈作用改变植物元素含量和化学计量特征。放牧增加植物根系分泌物中的化感物质，以刺激土壤微生物活性和周转率，提高土壤养分有效性，促进植物对养分的吸收和利用，从而影响植物体内元素的化学计量关系 [ 4 ] [ 11 ] 。然而，这些刺激性反馈作用在高放牧率或资源环境相对贫瘠的环境中是难以维持的；其次，放牧通过改变群落的结构与组成，进而影响植物的生长过程中元素含量及其化学计量特征 [ 4 ] [ 10 ] 。 此外，养分环境是植物赖以生存与发展的基础条件，在各种不同的生境中，聚生着特定的植物种类。植物长期生活在各种特定环境中，获得(或进化)了一些适应环境相对稳定的特性，其中包括形态结构方面的适应特征。同时，随着环境因子的改变，植物在形态结构上也出现某些变化，其中受影响比较大的主要是植物的营养器官 [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] 。有研究发现，长期放牧条件下，放牧率通过改变角质层厚度或表皮细胞的面积大小等影响了植物叶片解剖结构，进而影响植物对养分及化学元素的吸收。不同物种、功能群植物性状对放牧干扰反应程度不同，其结构和生态化学特征均受到放牧的显著影响 [ 15 ] 。因此，对不同载畜率水平下的植物叶片生态解剖与N、P化学计量特征的研究将能更好地阐明叶片生理生态对环境变化的响应机理。 无芒隐子草(Cleistogenes songorica)既是禾本科多年生强旱生草本植物，也是短花针茅(Stipa breviflora)荒漠草原的优势种之一，还是我国西部比较重要的牧草，具有很好的饲草价值。由于其具有抗旱、抗寒和耐风沙的特性，已成为一种具有重要生态和遗传价值的植物材料 [ 16 ] 。荒漠草原气候干旱，养分匮乏，物种之间的竞争主要是对水分资源和养分资源的竞争。叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，其结构特征不仅是生理作用的基础，也是环境变化的基础。叶片解剖结构的改变将影响其生理功效和对环境适应性的发挥，即植物解剖结构特征不仅能够反映所处环境的变化，也能够揭示植物对环境的适应过程和对策。 在此背景下，本文以内蒙古荒漠草原无芒隐子草为研究对象，拟解决两个科学问题：1) 无芒隐子草解剖结构是否对载畜率存在响应变化？2) 无芒隐子草叶片N、P化学计量特征是否随载畜率变化而变化，及其与解剖结构的相关性，由此探究无芒隐子草叶片解剖结构和N、P 化学计量特征等功能性状对载畜率的响应过程及适应对策，旨为荒漠草原退化生态系统的恢复与放牧管理提供基础依据。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 试验区自然概况 试验地设在内蒙古农牧业科学院四子王旗试验基地内，地理位置为：111˚53'41.7''E，41˚46'43.6''N，平均海拔为1456 m。研究区处于中温带大陆性季风气候区，春季气温变化剧烈，大风日数较多；夏季炎热，降雨集中，日照充裕；秋季秋高气爽，降雨逐渐减少；冬季漫长而寒冷，气候干燥，多寒潮寒流天气，土地封冻。根据四子王旗气象站1961~2010年监测气象数据显示，多年平均气温为3.6℃，年均降水量为311.4 mm，主要集中在6~9月，占全年降水量的70%以上。无霜期约90~105 d。 试验区植被是以短花针茅为建群种的荒漠草原，植物群落类型为短花针茅(Stipa breviflora) + 冷蒿(Artemisia frigida) + 无芒隐子草，植被低矮，平均高度一般为8 cm，且植被较稀疏，盖度为12%~18%。种类较贫乏，植物群落主要由20余种植物组成。主要多年生草本植物为短花针茅，无芒隐子草、阿尔泰狗娃花(Heteropappus altaicus)、银灰旋花(Convolvulus ammannii)、冰草(Agropyron cristatum)、羊草(Leymus chinensis)等；一、二年生草本植物有蓖齿蒿(Artemisia pectinata)、猪毛菜(Salsola collina)等。还有小半灌木冷蒿(Artemisia frigida)和木地肤(Kochia prostrata)，矮灌木狭叶锦鸡儿(Caragana stenophylla)，灌木小叶锦鸡儿(Caragana microphylla)等，其中无芒隐子草在群落中生物量所占比重为20%以上。土壤为淡栗钙土。 2.2. 研究内容与方法 2.2.1. 试验设计 整个放牧试验开始于2003年，至本试验取样时为止，已具有9年的连续放牧历史。采用完全随机区组设计，每个区组内设3个载畜率水平和1个无牧区作为对照，分别表示为轻度放牧(LG，0.93只/hm 2 ∙半年)、中度放牧(MG，1.82只/hm 2 ∙半年)、重度放牧(HG，2.71只/hm 2 ∙半年)和对照区(CK，不放牧)，各处理重复3次，共计12个试验区。各试验区面积基本相等，约为50 hm 2 。供试羊只为2岁蒙古细毛羯羊。试验期每年持续6个月(5月初至11月末)，期间各试验区供试羊只自由采食，夜间赶回畜圈休息，统一管理。 2.2.2. 样品采集 在2011年8月中旬从上述12个放牧试验区取材料。在各试验小区随机选择无芒隐子草株丛，并采集其新鲜叶片。叶片选择标准为：向阳面、完全成熟(从顶部数第3个成熟叶片)、无病虫害。将叶片切成0.5~1.0 cm的小段快速放入FAA固定液(70%酒精：冰乙酸：福尔马林溶液 = 90:5:5)中保存，封存后带回实验室进行相关性状观测。 同时，采集另一份相同标准的无芒隐子草完整叶片置于纸袋中，标记后带回实验室。 2.2.3. 切片制作和叶片解剖结构参数的测定 将固定的叶片段，先用蒸馏水清洗干净，然后用不同浓度(70%，85%，95%和100%)酒精依次脱水、经过二甲苯透明、渗蜡、包埋和修块等实验过程，采用石蜡切片法切成10~12 μm厚的切片，再用番红固绿对染，然后用加拿大树胶封片，充分干燥后，在Olympus光学显微镜下进行拍照，所得照片在Photoshop8.0软件下观测叶的上表皮角质层厚度(Ctue)、下表皮角质层厚度(Ctle)、上表皮细胞厚度(Tuec)、下表皮细胞厚度(Tlec)、上表皮细胞面积(Auec)、下表皮细胞面积(Alec)、主脉厚度(Mvt)和叶片厚度(Lt)等8项指标，每项指标重复5次，取其平均值。 2.2.4. 叶片N和P元素测定 将纸袋中的叶片清洗干净后，置于65℃恒温条件下烘干至恒重后，用球磨仪(Retsch MM400；Retsch， Haan， Germany)进行粉碎。粉碎样品的全N含量采用凯氏定氮法进行测定(Kjeltec 2300 Auto System II， Foss Tecator AB， Hoganas， Sweden)，全P含量用钼锑抗比色法进行测定 [ 17 ] 。 2.2.5. 数据处理 首先用Excel 2010对所有的原始数据进行初步分析、处理。然后用SAS 9.0软件(SAS Institute，Cary，North Carolina，USA)对数据进行方差分析以及各解剖结构指标之间、化学成分含量与各指标间做相关性分析。 所有作图均在Sigmaplot 11.0 (Systat Software Inc.)软件环境下完成。