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user: 4. 青蒿素生物合成的基因调控 由于青蒿素在植物青蒿中的含量很低，为了保证青蒿素的稳定供应，科研人员利用包括传统遗传育种、调控环境因子、利用微生物合成青蒿素，以及通过代谢工程改造青蒿植株等方法提高青蒿素的产量。 4.1. 青蒿发根体系的建立对青蒿素生物合成的调控 1994年，Weathers等 [ 28 ] 和秦明波、叶和春等 [ 29 ] 几乎同时建立了青蒿的发根培养体系；随后1998年刘本叶等又进一步研究了Ri质粒转化青蒿的各种影响因素，最终确定了最佳的转化条件，并利用农杆菌介导的转化体系筛选出的高产发根系，研究不同理化因子对发根生长及青蒿素生物合成的调控 [ 30 ] 。陈大华等人将棉花的(+)-δ-杜松烯合酶(CAD)的cDNA插入到植物表达载体中，通过发根农杆菌15834介导转化青蒿，获得了转基因发根，青蒿素含量与对照发根相比有所提高，CAD基因的导入和表达可能相应地促进青蒿转基因发根自身的FPS的表达 [ 31 ] 。 4.2. 青蒿素生物合成途径相关基因对青蒿素生物合成的调控 随着植物基因工程的发展，转基因技术被广泛地用于作物改良。人们也尝试了用转基因的方法提高青蒿中青蒿素的含量。 1996年，Vergauwe等通过Agrobacterium感染青蒿叶片，建立了Ti质粒介导的青蒿转化体系 [ 32 ] ；随后他们又详细研究了各种参数如外植体苗龄、种类、根癌农杆菌菌株类型及二元载体类型等对于青蒿转化的影响，进一步优化了Ti质粒介导的青蒿转化体系 [ 33 ] 。1999年陈等人将青蒿FPS基因转化青蒿，得到转基因青蒿毛状根和转基因植株发根系中的青蒿素含量提高，达到3.01 mg/g(DW)，与对照相比，青蒿素含量提高3~4倍 [ 34 ] 。转FPS的再生植株中，青蒿素含量最高可达10.08 mg/g(DW)，与野生型相比，青蒿素含量提高2~3倍 [ 26 ] 。因此，外源基因的导入，对青蒿转基因材料中倍半萜类物质的生物合成具有明显的调控作用。 研究表明，使用CaMV 35S强启动子过表达长春花(Catharanthus roseus. L) HMGR基因得到的转基因青蒿，植株中青蒿素的含量比野生型青蒿中高22.5%~38.9% [ 35 ] [ 36 ] 。此外，通过酿酒酵母(S. cerevisia)合成青蒿素的前体青蒿酸的过程中，青蒿的HMGR基因也被证实发挥了重要作用，HMGR的三拷贝工程酵母明显比单拷贝工程酵母青蒿酸产量多 [ 37 ] 。 Chen等在在青蒿中导入外源棉花(Gossypium arboretum) FPS基因，和非转基因的对照组相比，青蒿素的含量提高到2~3倍 [ 26 ] 。Banyai和Han [ 38 ] [ 39 ] 在青蒿中过表达青蒿的FPS基因，青蒿素的含量为野生型的2~2.5倍，并且青蒿素的含量和FPS基因的表达量有密切的相关性(R 2 = 0.78， P ≤ 0.01)。Ma等 [ 40 ] 通过过表达青蒿的ADS基因，得到转基因青蒿中青蒿素、青蒿酸、二氢青蒿酸的含量和对照组相比分别提高了82%、65%和59%。 为了提高青蒿素的含量，除了过量表达单个青蒿素生物合成途径的关键酶基因，也可以同时过表达两个或者更多的基因。Alam和Abdin在青蒿中过表达长春花的HMGR基因和青蒿的ADS基因，得到的转基因植株中，青蒿素含量最高的株系和野生型相比提高了7.65倍 [ 41 ] 。Wang等在青蒿中过表达HMGR和FPS基因，和对照组相比，转基因植株青蒿中青蒿素含量为对照组的2.8倍 [ 42 ] 。Tang等人过量表达CYP71AV1和CPR基因，得到的转基因青蒿中青蒿素含量最高约为对照的2.4倍 [ 43 ] 。Chen等将FPS、CYP71AV1和CPR基因同时构建在pCAMBIA2300载体上，并使用CaMV35启动子，和对照组相比，转基因青蒿的青蒿素含量提高了3.6倍 [ 44 ] 。Lu等通过过表达ADS、CYP71AV1和CPR基因使青蒿素的含量和对照组相比提高了2.4倍(15.1 mg/g DW) [ 45 ] 。 上述结果表明，过量表达单个或多个青蒿素代谢途径中的关键酶基因可以有效地增加青蒿素的合成。 4.3. 竞争支路的抑制对青蒿素生物合成的调控 在青蒿素合成途径中，FPP作为紫穗槐二烯的前体，同时也能被其他倍半萜烯合酶通过竞争支路合成倍半萜烯。在与青蒿素生物合成途径的竞争中，角鲨烯合酶(SQS)是催化甾醇生物合成途径的第一个关键酶 [ 46 ] 。Zhang等将青蒿素合成途径中SQS基因沉默，抑制萜类合成途径中甾醇的合成，将青蒿素含量提高了3.14倍 [ 47 ] 。β-石竹烯合酶(CPS)是将FPP转化成β-石竹烯的关键酶，也是青蒿素生物合成途径重要的竞争支路 [ 48 ] 。Chen等通过在青蒿中导入cDNA反义链(asCPS)来下调CPS基因。结果和对照组相比，所有转基因青蒿的β-石竹烯均明显下降40%~60%，而青蒿素含量在一些转基因株系中提高了54.9% [ 49 ] 。 上述结果表明，抑制萜类生物合成途径中影响青蒿素生物合成的竞争支路的生物合成，可以有效地增加青蒿素的合成。 4.4. 诱导子对青蒿素生物合成的调控 最近几年对于诱导子对青蒿素生物合成的调控研究较多，诱导子引起了植物代谢过程的一系列变化，最终使植物产生防卫反应，如关键酶基因的表达量的变化，次生代谢产物的变化以及植物体内活性氧的变化等。2007年，Waraporn等用壳聚糖诱导青蒿毛状根，使得毛状根中青蒿素的含量比野生型的高出6倍 [ 50 ] ；2009年Gao等人使用水杨酸诱导青蒿植株，青蒿素的含量比对照组高出54%，并且确定了水杨酸诱导青蒿植株的最优条件 [ 51 ] 。2010年，Wang等人利用甲基茉莉酸(MeJA)诱导青蒿植株，检测青蒿素、青蒿酸及二氢青蒿酸的含量分别提高了49%、80%、28% [ 52 ] 。Caretto等人用外源MeJA诱导青蒿悬浮细胞，在30分钟内产生响应，青蒿素量增加3倍 [ 53 ] 。 4.5. 转录因子对青蒿素生物合成的调控 通常植物的转录因子可以调节代谢途径中的一系列基因，过表达植物转录因子也就成为一种很有前景的调控植物次生代谢产物的方法 [ 54 ] 。茉莉酮酸酯转录响应因子ORCA3已被证实可以调节长春花中超过5种萜类吲哚生物碱生物合成途径相关的基因，过表达ORCA3基因可使长春花中一些萜类吲哚生物碱含量的增加 [ 55 ] - [ 57 ] 。 第一个在青蒿中克隆和验证的转录因子AaWRKY1可以同时结合到ADS和CYP71AV1启动子的W box上，从而激活青蒿素生物合成途径关键酶基因的表达 [ 58 ] 。Tang等通过过表达AaWRKY1使青蒿素含量提高了3.4倍，从而达到24.5 mg/g (DW) [ 59 ] 。 AaORA为青蒿中AP2/ERF家族中的腺毛特异的转录因子，也被证实可以上调青蒿素生物合成途径的多个基因。在青蒿中过表达AaORA可以使青蒿素合成途径关键基因ADS、CYP71AV1、DBR2和转录因子AaERF1的表达水平均显著升高，所得转基因植株中青蒿素含量比对照组最多提高了53% (11.9 mg/g DW)。AaERF1和AaERF2为AP2类茉莉酸应答的转录因子，正调控青蒿素的生物合成。在青蒿中过表达AaERF1或AaERF2，青蒿素和青蒿酸的含量相应增加；在青蒿中抑制AaERF1或者AaERF2，次生代谢产物的含量则降低 [ 60 ] 。 ADS基因和CYP71AV1基因作为青蒿素生物合成的关键基因，启动子含有E-box顺式元件，是bHLH转录因子的结合位点。Ji等人从青蒿腺毛cDNA文库中分离到AabHLH1，其表达受脱落酸和真菌诱导子壳聚糖的诱导。AabHLH1能结合E-box顺式元件，将其瞬时转化青蒿叶片能够调控青蒿素合成途径中的关键酶基因。表明AabHLH1能调控青蒿素的生物合成 [ 61 ] 。 在拟南芥的研究中发现，MYC2转录因子是JA信号通路的主要调节器 [ 62 ] 。在青蒿中，JA诱导青蒿素的生物合成，AaMYC2基因表达快速响应JA诱导。AaMYC2的表达激活CYP71AV1和DBR2的转录，导致青蒿素含量增加。与此相反，AaMYC2的RNAi转基因植株中AaMYC2的表达被抑制，青蒿素含量降低。同时，所述RNAi转基因青蒿对MeJA处理的灵敏度比野生型植物低。AaMYC2是青蒿素生物合成的正调节因子，对增加青蒿素的生产遗传工程具有很大的价值 [ 63 ] 。 青蒿素储存在青蒿的腺毛中，这些腺毛主要分布在青蒿叶、芽和萼片的表面 [ 64 ] [ 65 ] ， 所以普遍认为在腺毛中特异表达的基因在青蒿素的生物合成中有重要的作用。克隆到的AaWRKY1、AaORA和AabHLH转录因子都能结合腺毛特异的启动子，如ADS和CYP71AV1基因的启动子 [ 58 ] [ 66 ] 。近来，DBR2的启动子也被证实具有腺毛特异性，一些ADS和CYP71AV1启动子上的顺式作用元件同样能在DBR2的启动子区域找到 [ 67 ] 。至于转录因子能否和DBR2的启动子结合，还需要进一步地验证。 总的说来，过表达青蒿素生物合成途径的关键酶基因，阻碍竞争合成途径的关键酶基因，以及过表达转录因子等都是有效提高青蒿中青蒿素含量的方法。