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user: 4. 稻米香味的检测 4.1. 基于质谱技术的化学分析 目前，研究人员用水、盐酸、乙醇、二氯甲烷、CO 2 等溶剂分离纯化稻米中的香味化合物，然后对纯化的物质进行检测或结构分析。Nadaf等对Basmati及其他香米样品进行水蒸气减压蒸馏，再用二氯甲烷对收集的水蒸气冷凝物进行萃取，进一步浓缩、干燥后进行GC/MS (Gas chromatography/mass spectrometer)分析，测得几种香米中2-AP的含量范围是0.028~0.061 mg/kg [ 23 ]。Limpawattana等对100 g大米加入150 mL蒸馏水蒸煮，采用气相色谱闻嗅法(Gas chromatography-olfactometry)，米饭有13种香味属性，不同香米类型之间的风味差异远比单一的2-AP的浓度变化要复杂得多 [ 4 ]。Wijit等先用盐酸溶液对泰国茉莉香米种子中的挥发性成分进行提取，再用二氯甲烷反萃取，对纯化后的化合物进行GC/MS检测，测出35了种挥发性成分 [ 13 ]。应兴华等用无水乙醇和二氯甲烷提取结合GC/MS分析，发现清香米、泰香R207、Texmati、桂香丝糯和健2号等5个品种中含有2-AP [ 24 ]。Hien等用乙醇萃取，采用气相色谱-质谱/选择离子扫描法(Gas chromatography-mass spectrometry-selected ion monitoring， GC-MS-SIM )检测，测出36个香米中2-AP 含量为0~430.7 μg/kg，不同香米品种的2-AP含量差别较大 [ 25 ]。随着质谱技术的进一步发展，Lee等利用顶空固相微萃取(HS-SPME，Headspace solid phase microextraction)对无菌包装的即食香米饭进行检测，发现2-AP是米饭中最重要的香味化合物 [ 4 ]。孙谦等采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)检测稻米中的2-AP，用于快速鉴别香米真伪 [ 26 ]。Hopfer等结合顶空固相微萃取和气相色谱-串联质谱(Gas chromatography tandem mass spectrometry， HS-SPME-GC-MS/MS)实现了单粒米中2-AP的定量测定 [ 27 ]。 总体来看，该类技术用溶剂提取，顶空(吸附)萃取和固相微萃取等分离香味化合物，然后用色谱质谱分析，研究揭示了稻米香味的本质。该类技术常涉及较长周期的样品准备、昂贵的设备和专业技术人员对设备维护及操作，在一般的育种单位和大米加工企业不容易应用此类技术。由于2-AP已经实现人工合成，市面可能存在“掺香”或“添香”情况，稻米加工企业、食品管理部门和消费者并不容易通过该类技术判断稻米香味的真实性。另外，育种单位及种子生产企业在选育过程中不能利用该类技术对杂合单株和显性单株进行判断。 4.2. 育种及加工过程中的简单检测 4.2.1 . 嗅闻法 对抽穗开花期间的植株或成熟的稻米，可通过嗅闻样品来判别香味的有无及香味的浓淡程度。自然条件下，稻米或植株释放出的香味可能较淡。为了增加香味，将稻米籽粒或稻株营养器官放在密闭玻璃瓶内，加热后嗅其香味 [ 28 ]。碱可促进香稻中的2-AP挥发，研究人员将水稻样品放入小玻璃培养皿中，加氢氧化钾溶液处理后闻嗅，用以判别香味的有无及评定香味的等级 [ 29 ]。嗅闻法简单易行，常在品种选育和大米选购过程中采用，但由于缺乏客观标准，其分析结果不一定准确可靠，可能错失优良单株及材料。 4.2.2 . 咀嚼法 咀嚼品尝糙米籽粒、市场销售的大米或米饭，以评判有无香味及香味的浓淡程度。遗传育种试验中，常将糙米横切为两半，咀嚼不含胚的那一半，若有香味，则将另一半含胚的糙米培育成香稻植株 [ 12 ]。稻米香味受遗传基因的控制，也与一定的环境条件和存储加工因素有关。个人对大米香味的感受能力不尽相同，咀嚼法不一定能判断稻米香味的真实性。由于badh2是隐性基因，咀嚼法和嗅闻法都不能对优良的杂合或显性纯合单株进行判断和选择。 4.3. 分子标记鉴定香味控制基因 水稻的香味主要由badh2控制，利用该位点的优良等位变异进行分子标记辅助香稻资源鉴定、恢复系和不育系选育等已有大量研究(表1) [ 21 ] [ 22 ] [ 30 ] - [ 48 ]。约超过80%香米资源的badh2第7外显子有8bp缺失 [ 22 ]，较多的标记根据该差异进行设计 [ 21 ] [ 30 ] [ 32 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 42 ] [ 44 ] [ 45 ] [ 48 ]。badh2第2外显子的7bp的缺失与8bp缺失紧密连锁，也有标记据此设计 [ 21 ] [ 31 ] [ 38 ] [ 44 ] [ 48 ]。另外一部分标记根据启动子区、内含子区和其他外显子等位置的变异进行设计。这些标记较多的采用普通PCR扩增，结合琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，部分采用荧光标记进行检测。为了增加检测的通量，研究人员也开发了PCR/LDR标记、KASP标记和HRM荧光标记，结合DNA快捷提取技术，该类标记可用于批量快速检测 [ 31 ] [ 35 ] [ 36 ]。 目前，对badh2的检测需要DNA提取，PCR扩增和扩增产物检测，扩增产物检测大多以来依赖琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和基于设备的荧光检测，检测效率和通量有待提高。 Table 1 Markers and Application of Fragrance Gene badh 标记名称 标记及探针序列 badh2变异 位置 扩增产物 扩增及检测方法 育种应用 文献 Aromarker 第7外显子发生8bp缺失 400，392 bp 品种选育 [ 30 ] BAD2 ESP: TTGTTTGGAGCTTGCTGATG IFAP: CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC INSP: CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA EAP: AGTGCTTTACAAAGTCCCGC 第7外显子发生8bp缺失 577，585 bp 355 bp 257 bp 等位基因特异性PCR AGAR 资源鉴定 [ 32 ] Bad2.7CAPS Bad2.7Forward: CCAAGTGAAGGGGGTTGGCATTG Bad2.7Reverse: ACCAAAGGCATGATGTCAGGTCG 第14外显子1bp插入 255，188，121，67 bp， BslI 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 33 ] BADEX7-5 F: TGTTTTCTGTTAGGTTGCATT R: ATCCACAGAAATTTGGAAAC 第7外显子发生8bp缺失 95，103 bp 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 34 ] BADEX7-5 F: TGTTTTCTGTTAGGTTGCATT R: ATCCACAGAAATTTGGAAAC 第7外显子发生8bp缺失 95，103 bp 高分辨率溶解曲线(荧光标记) 资源鉴定 [ 35 ] BADH2_KASP Primer_AlleleFAM: TAACCATAGGAGCAGCTGAAG Primer_AlleleHEX: ACCTTAACCATAGGAGCAGCTGAAA Common reverse: TGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTA 第7外显子发生8bp缺失 KASP 荧光定量(荧光) 恢复系选育 [ 36 ] badh2-p-5'UTR F: ATAATATCGGTCGAAACATTTTTATT R: GAGAAGCTTTTACACTTTATGCACATC 5‘UTR的3bp和启动子8bp插入 480，158 &322 bp， AluI 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 37 ] badh2-PCR/LDR E2-F: GGGAGGCGCTGAAGAGGAAC E2-R: GTCACCACCCTACCTTGGC Probe-FLO: P-CGGCGCGCGCGCCCAGTCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM Probe-E2: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGGAGGTACTTGGCCCGGA Probe-NON: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGTACTTGGCCCGGACGGCGCC 第2外显子的7 bp的缺失 111，109 nt 普通PCR ABI3730 (荧光) 资源鉴定 [ 31 ] CAPS(Ehe I ) F: AGGCGCTGAAGAGGAAC R: TAGTCACCACCCTACCTTG 第2外显子突变 292，375，667 bp， Ehe I 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 38 ] fgr F: GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA R: GGAAACAAACCTTAACCATAG 第7外显子突变 274，266 bp 普通PCR PAGE 不育系选育 [ 39 ] FGR3 F: GTATACCCCATCAATGGAAAT R: CTTAACCATAGGAGCAGCTGA 第7外显子突变 125，117 bp 普通PCR PAGE 不育系选育 [ 40 ] FMbadh2-E2A F: CCTCTGCTTCTGCCTCTGAT R: GATTGCGCGGAGGTACTTG 第2外显子7bp缺失 200/207 bp (badh2-E2/Badh2) 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 21 ] FMbadh2-E2B F: CTTCTGCCTCTGATTAGCCT R: GCCGTGAGCCATATACACTT 第2外显子7bp缺失 643/650 bp (badh2-E2/Badh2) 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 21 ] FMbadh2-E4-5 F: TGCTGGATGCTTTGAGTA R: GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA 第4和5外显子间803bp缺失 321/1123 bp (badh2-E4-5/Badh2) 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 41 ] FMbadh2-E7 F: GGTTGCATTTACTGGGAGTT R: CAGTGAAACAGGCTGTCAAG 第7外显子8bp缺失 260/268 bp (badh2-E7/Badh2) 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 21 ] FMbadh2-E7A F: ACAAGGTACAGCTATTCCTCCT R:TAACCATAGGAGCAGCTGAA 第7外显子突变 153，145 bp， 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 42 ] FME12-3 F: TTGGTCCAGTGCTCTGTGTG R: GCACCAGCCAGACCATAAC 第12外显子3bp插入 192，189 bp 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 43 ] FME14I F: TCGATGCCGGAATTATCTGGGTGA R: TCCCCACGGCTCATCGGAGG 第14外显子1bp插入 60，205，266 bp， BslI 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 43 ] M2 2FN: GCGATTGCGCGGAGGTACTT 2FS: CACCCTCTCCACCCTCTGCTTC 第2外显子突变 203，210 bp 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 44 ] M7 7FS: AGGAATATATATATATATATATATATATAATG 7FN: ACCATAGGAGCAGCTGAAATATATAC 7nFS: GCGCAACAACAAGTGTATATTGTTT 7nFN: GCAGCTGAAGCCATAATCTTTTTAC 第7外显子突变 780，2 100 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 44 ] Mbadh2-E7B F: GGTTTATGTTTTCTGTTAGGTTGCA R: AGAGAGTTAGTAGAAAGAGAACAAA 第7外显子突变 130，138 bp 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 42 ] nksbadh2 F: GGTTGCATTTACTGGGAGTTATG R: TCCACAGAAATTTGGAAACAAAC 8bp缺失 90，82 bp 普通PCR PAGE 资源鉴定 [ 45 ] PM-FGR RFGR-Rn: GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT AACCATAGGAGCAGCTGAAGC RFGR-Rp: GAAGGTGACCAAGTTCATGCTT AACCATAGGAGCAGCTGAAAT RFGR-F: CTGTTAGGTTGCATTTACTGGGAG #1通用引物: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT #2通用引物: GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 第7外显子突变 普通PCR 酶标仪(荧光) 资源鉴定 [ 46 ] velbadh2-p-UTR badh2-p-5′UTR-F: ATAATATCGGTCGAAACATTTTTATT velbadh2-p-UTR-R: ACTAGTTGGTGTGCACATGAAG 启动子253bp缺失 203，456和461 bp 普通PCR AGAR 资源鉴定 [ 47 ] Xiang2 Xiang2F: CACCCTCTCCACCCTCTGCTTC Xiang2R: GCGATTGCGCGGAGGTACTT 第2外显子发生突变 约250 bp 普通PCR 测序 资源鉴定 [ 48 ] Xiang7 Xiang7F: AGTGACTGGATTAGGTTCT Xiang7R: CATCAAACACCACTATAGGAC 第7外显子突变 约500 bp 普通PCR 测序 资源鉴定 [ 48 ] 表1. 香味基因badh2的标记及应用 注：荧光–结合荧光标记或荧光探针进行荧光检测；PAGE-应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE)检测；AGAR-应用琼脂凝胶电泳(Agar gel electrophoresis)检测。