DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 摘 要 本文立足机器视觉，对智能电动车单目视觉的车道线图像检测和识别算法进行研究，主要包括原始图像获取、IPM逆透视图像的转换、滤波降噪(A)、霍夫直线检测、RANSAC和贝塞尔样条曲线拟合和反逆透视变换。实验测试结果表明，本文所改进的车道线检测和识别算法比较准确稳定，对于车辆的遮挡、树木的阴影、不清晰的车道线、明显弯曲的车道线等典型道路情景能够准确检测出车道线，为智能电动车在园区道路环境下自主行驶提供了可行性。 关键词 :智能电动车，车道线识别，算法，机器视觉 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 车道线智能检测识别是智能电动车的一项关键技术，它通过图像传感器感知地面的车道线信息找到最适合行驶区域行进，减少了交通事故发生几率。随着计算机硬件系统对图像处理速度提升飞跃，基于机器视觉的车道线图像检测算法处理速度快，更容易满足实时性要求。本文主要研究道路车道线图像预处理和检测识别提取算法，实现对车道线的跟踪以及车道发生偏离时进行预警，为无人驾驶智能电动车实现自主导航增加技术可能性。
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user: 2. 车道线检测算法的研究现状 从上世纪90年代开始机器视觉检测车道线的技术研究就已经开始 [ 1 ] - [ 7 ]，对CCD摄像头拍摄道路上的车道线进行检测，车道线的纹理特征、颜色与那些色彩分明纹理特征比较明显的物体相比，前者属于比较简单的类型。因为其特征不够鲜明因此对车道线特征的提取和辨别带来了一定的难度。迄今为止车道线的检测算法主要分为三大类：基于特征、基于区域、基于模板。 1) 基于特征的车道线检测算法 该检测算法是根据车道线的颜色特征和它的边缘来定位图片中的车道线，根据车道线的特征颜色在HSV模型下进行约束，对满足约束条件的像素点进行保留。这种检测方法的前提是车道线的颜色变化小并且车道线的边缘部分要足够的清晰，而对于外界环境的光照或者阴影下颜色变化比较明显的时候这种算法就会失效 [ 8 ]。因此这种检测算法只能作为一种辅助的手段，不能满足现实中车道线实时检测的要求。 2) 基于道路模型的车道线检测算法 道路模型一般可以分为：直线、线性双曲线、抛物线和B-样条曲线模型等。这类算法是通过用一些几何参数来表示这些道路模型 [ 9 ]。直线模型表示的方法比如有霍夫变换求出直线的参数，Wang Lei在他的论文中提出了一种基于Hough变换和Kalman滤波的分段双曲线模型车道线检测方法，该算法是对所感兴趣的区域用Sobel算子对某个特定的方向进行边缘检测，对近视场区域采用Hough变换对检测的边缘部分进行直线检测，对远视场区域采用加权双曲线模型对车道线进行拟合，因为将车道线分为了多个段落所以在对与弯曲的车道线能够有比较准确的判断，弯道的方向确定之后可以通过改变双曲线模型的参数进行比较精确的曲线拟合，该算法的优点在于对弯道的检测也会有很好的检测效果。加州理工大学计算机视觉实验室的Mohamed Aly在其论文中使用B-样条曲线模型进行车道线的检测。他的做法是通过RANSAC算法拟合B-样条曲线获取车道线的参数，接着对拟合的车道线进行扩充和延伸等后处理过程，实验检测效果表明该算法的检测的效果比较好，弊端就是在直线的倾角比较大时在所检测的效果就不是很理想，因此本文是在他的算法的基础上进行了一些调整和改变，对车道线有着比较稳定的检测效果。 3) 基于区域的车道线检测算法 该检测算法首先是需要确定车道线的大概位置，这与加州理工大学所提供的算法有一些类似，都是先进行直线检测，确定车道线在图片中的大概位置，然后对每一条车道线所确定的区域进行比较精确的检测。该算法的优点在于可以避开图片中其它的干扰因素，提高算法的实时性。 基于道路模型的车道线检测方法比较实用，噪声对该检测算法不会造成太大的干扰，检测效果稳定可靠，得到了比较广泛的应用，目前检测方式主要分为以下几类： 1) 基于双摄像头的车道线检测 [ 10 ] 双摄像头检测车道线的原理是通过双摄像头所拍摄的图片中车道线对应点的位置之差来获取车道线的三维几何信息。用双摄像头检测直线的优势在于能过获取图片中的大量信息，对车道线的定位精度高，检测的结果比较可靠，但是双摄像头的车道线检测方法增加了难度，相比之下，随着数字图像处理的能力的提高，单摄像头的检测效果已经能够满足实际的需求。 2) 基于逆透视变换的车道线检测 [ 11 ] 对视图直接进行边缘检测的，会有很多的干扰因素，比如图片中的树木、行驶的车辆、行人，天空等干扰因素多会对车道线的检测造成影响，但是经过逆透视变换之后的视图就不存在这一方面的问题，逆透视变换之后的图像只是对原视图的所感兴趣的区域进行检测减少了不必要的处理耗时，提高了算法的实时性，因此被广泛的应用到单目视觉之中，但是进行此类的车道线检测比如保证相机的内部参数不会发生变化并且摄像头的与地面的倾斜角度是固定的，由于无人驾驶车的摄像头基本上是在车顶上保持不动的，所以基于逆透视变换车道线检测算法是可行的。 3) 基于Gabor滤波器的车道线检测 [ 12 ] 该检测算法是根据车道线的纹理信息确定它的消失点的位置，然后以该点作为起始点的位置，以这个起始点辐射状的形式画线，根据辐射的线段上的每一个像素点计算它们的梯度方向的一致性，获取的最大的值即为第一主边界，根据所确定的第一边界的基础上求出第二边界，以此类推可以求出其它的边界，但是该算法的实时性比较差，因此对于不适于本文的检测算法。 4) 基于随机抽样一致性的车道线检测 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] 此方法进行车道线检测是在逆透视变换之后的视图中进行的，根据检测的直线获取感兴趣区域，该区域视为一组待观察的数据，这些数据中往往会有比较大的噪声或者是一些无效的点，该算法的检测原理是随机的选取待观察数据的一些点，通过这些点进行样条曲线模型拟合，反复的随机选取局内点和样条曲线拟合，找出多次选取中权值最大的拟合样条作为车道线的模型参数，该算法的优点在于即使在复杂的环境里也有很好的拟合效果。
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user: 3. 图像采集系统及摄像机标定 3.1. 图像采集系统构成 由于前视系统视角大，图像信息量广，并且易于安装，本文研究采用前视系统，将USB高清摄像头尽可能地安装在智能电动车较高位置，扩大视野范围。为了更好的查看地面情况，单目摄像机工作时一般都会有一个下倾角度，不同的角度摄像机所观察的视野有很大的变化，本文中所选的USB高清摄像头是可调的，调动的范围是0~45度，而在电动车行驶的过程中其下倾的角度是固定的，这样就可以稳定的进行视图转换。考虑到车辆在行驶的过程中是否会偏离原先的车道，因此在行驶的过程需要判断车身相对于车道线的位置，因此本文中的摄像头安装是在智能电动车正中的位置上。 图1. 图像采集摄像头 USB高清摄像头信息的是靠4G内存i5处理器的笔记本电脑所采集的，软件开发环境为Microsoft Visual C++2010，开发语言为C/C++ (OPENCV)，图像传感器的实物图如图1所示，它的相关参数如表1所示。 Table 1 Correlation parameter of image acquisition seno 参数 取值或可变范围 摄像机参数 摄像机个数 1 分辨率 640*480 帧率 7.5 fps 安装参数 俯仰角α 0~45 航向角β 0 摄像头距地面高度 1200 mm 表1. 图像采集传感器相关参数 3.2. 基于OPENCV摄像机标定 相机拍摄图片的过程可以看作为一个三维场景转换为二维场景的过程。常用线性摄像机成像模型进行描述。图2描述了线性摄像机模型对空间里的一点的透视投影成像过程。假设(x， y)为p点的图像坐标， ( X c ， Y c ， Z c ) 为空间点p在摄像机坐标系下的坐标。 图2. 线性摄像机模型 p点的世界坐标与其在图像坐标系上的投影点p的关系： Z c [ u v 1 ] = ( 1 d x 0 u 0 0 1 d y v 0 0 0 1 ) ( f 0 0 0 0 f 0 0 0 0 1 0 ) ( R t 0 T 1 ) [ X w Y w Z w 1 ] = ( a x 0 u 0 0 0 a y v 0 0 0 0 1 0 ) ( R t 0 T 1 ) [ X w Y w Z w 1 ] = M 1 M 2 X w = M X w 其中 a x = f / d x ， a y = f / d y ，R是一个3 × 3的正交矩阵，t是一个三位平移向量，M为一个3 × 4矩阵，称为投影矩阵， a x ， a y ， u 0 ， v 0 构成了 M 1 ，因为 a x ， a y ， u 0 ， v 0 取决于内部结构所以被称之为摄像机的内参数； M 2 摄像机相对于世界坐标系的位置信息决定了 M 2 矩阵，所以称 M 2 为摄像机的外参数。求解这些几何模型的参数的过程称之为相机的标定过程。求出的相机内参数可以有效的消除畸变。而不同的镜头类型求出的畸变参数是不同的。内标定计算4个内部线性参数 ( f x ， f y ， u x ， u y ) ，和5个畸变参数 ( k 1 ， k 2 ， k 3 ， p 1 ， p 2 ) ，它们合称为摄像机的内部参数。外标定则是计算从三维世界坐标系到三维摄像机坐标系的变换关系，包括旋转矩阵R和平移向量t，它们合称为外部参数。 采用棋盘格模板对摄像机进行标定。本文从用摄像机拍摄的图片中选取了12张不同角度的棋盘格图片。棋盘格大小为9*6，利用OpenCV的库函数对它进行标定。具体实现过程如下： 1) 根据实际需要，读取摄像机拍摄的棋盘图。选取的棋盘图如图3所示。 2) 调用findChessBoardCorners()函数提取毎一幅棋盘格图片的角点坐标值，角点坐标提取的精度是关键，角点精度越高其标定的结果越准确。 3) 调用函数findConnersPix()能够很精确的求出角点的位置坐标，可以达到亚像素级别。如图4所示。 4) 调用DrawChessboardComers()函数把检测到的所有的角点信息标记在棋盘上。检测的所有图片的角点位置如图5所示。 5) 得到多个视标图像的角点，通过对函数calibrateCamera()的调用可以的到相机的内外部参数如图6所示。 图3. 选取的12张棋盘格图片 图4. 所找到的角点位置 图5. 角点检测结果 图6. 求出的相机内部参数 6) 调用undistort()函数得出矫正后的图像。 7) 以XML文本格式保存标定的参数。
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user: 4. 逆透视映射(IPM) 逆透视变换是透视变换的逆过程，根据上面标定过程求取的相机内外参数，将图像从图像坐标系映射到世界坐标系的过程就是逆透视变换的过程。通过逆投影变换得到的IPM图像，有两个好处： 1) 有效消除非目标因素对车道线检测的干扰 直接对原视图进行车道线检测会增加大量的非目标因素，比如道路上的树木、远处的天空、行驶中的车辆与行人、地面上的一些交通标识都会对车道线的提取造成了干扰。在IPM视图上进行选定道路区域的边缘提取就几乎不存在这类问题，我们只对车辆行驶过程中的感兴趣区域进行检测，减少了不必要的处理耗时，提高了算法的实时性，图7中左边为原始图片，红色方框为感兴趣的区域，右边图片为感兴趣区域得到的俯视图图像。 图7. 逆透视映射示意图(图片来源：加州理工车道数据集) 2) 原本道路上平行的两条车道线在经过相机的透视变换之后变为了两条相交的线段，通过逆透视变换之后的图像可以消除透视变换带来的干扰，可以很直观有效的判断车道线在世界坐标系的位置，更加方便的求解出智能电动车与车道线的相对位置。 用OpenCV的库函数实现逆透视变换的过程。具体实现过程如下： 1) 从标定时保存的XML文件中提出相机内外参数。 2) 读取摄像机拍摄的棋盘图，如图8(左)所示。 3) 调用initUndist ortRectifyMap()函数，输入标定时得到的内外参数求出新的摄像机参数矩阵，以及xy坐标的重映射参数。 4) 根据xy坐标的重映射参数调用remap()函数对图片进行校正。 5) 调用findChessBoardCorners()和FindComerSubPix()函数求出棋盘格图片的角点坐标。如图8(右)所示。 6) 确定四个角点位置的坐标，四个角点为所求的角点的顶点位置，图8(右)中四个顶点的位置的。物理坐标系的坐标为(0，0)(8，0)(0，5)(8，5)，根据这四组坐标值调用getPerspectiveTransform()函数求出图像透视变换的矩阵H。 7) 根据求出的矩阵H，调用warpPerspectice()函数即可求出逆透视变换之后的图像。对于所求的矩阵H，H.at (2.2 = k)，k的值可以控制俯视图图片的大小。对于不同类型的摄像机所取的k值是不同的，根据所需求的俯视图的大小来控制k的值，对于同一类型的摄像机在一个固定的倾角拍摄图片时，k值确定之后对于以后检测的俯视图的图片尺寸是一样的。不同的k值对应的俯视图的如图9所示。 图8. 读取的原始图 8) 以XML文本格式保存逆透视变换之后的矩阵以及它的反逆透视变换矩阵H.inv()，得到它的单应矩阵和高度参数后，就能不用棋盘的情况下也能得到它的鸟瞰图图像。 图9. 逆透视变换。(a) 原始图像；(b) H = 11的逆透视变换后的图像；(c) H = 12的逆透视变换后的图像；(d) H = 13的逆透视变换后的图像
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user: 5. IPM图像数据预处理 获取IPM图像后，需要对数据进行预处理。首先是数据归一化，把IPM图像中的每个像素缩放到[0， 1]之中，并且将IPM图像中的每个像素值减去所有像素值的平均值，相当于是移去了图像的平均亮度值，对于逆透视映射(IPM)后的图像我们感兴趣的地方是车道线的位置，而不是它的光照度，因此这样的预处理是比较合理的。然后进行滤波处理，在不破坏图像细节的基础上对噪声进行消除或者抑制。常见三种线性滤波为方框滤波、均值滤波、高斯滤波，非线性滤波为中值滤波和双边滤波。本文采用高斯滤波。高斯滤波就是对整幅图像进行加权平均的过程，每一个像素点的值，都由其本身和邻域内的其他像素值经过加权平均后得到。高斯滤波的具体操作是：用一个模板(或称卷积、掩模)扫描图像中的每一个像素，用模板确定的邻域内像素的加权平均灰度值去替代模板中心像素点的值。对于抑制服从正态分布的噪声非常有效。 为减少各种噪声对特征检测造成干扰，比如行人、车辆、树荫、等干扰因素，在特征提取之前首先的处理工作是对IPM图像进行高斯滤波，这个处理工作的目的是在竖直的方向上检测直线，所以在y方向我们对其做一维高斯平滑滤波，经过实验比选，本文中所取纵向滤波尺度σ y 的值为5，横向滤波尺度σ x 的值为7，能够有效的减少很多的噪声干扰。如图10所示，可以看出σ x 的滤波尺度为7时明显比滤波尺度为5时的噪声要小。 图10. 高斯滤波。(a) 原始图像；(b) 逆透视变换后的图像；(c) σ x = 7，σ y = 5时滤波后的图像；(d) σ x = 5，σ y = 5时滤波后的图像 由于逆透视变换形成的左右边界经过高斯滤波后并不能有效的剔除掉，而这部分信息是原视图中是不存在的。本文研究在边界没有干扰因素时求出IPM图像中的左右边界线的坐标值，根据这两条直线将这两条直线划分为多个掩码区域进行边界的剔除，对每一帧图片都进行处理。 滤波处理后阈值化，通过从滤波后的图片中选择q%的分位点的值来实现的，对于低于这个分位点的值全部变为0，可以有效的剔除图片中的噪声，本文中q的取值为96.5，其不同的q值的处理效果图如图11所示。 图11. 阙值化后的IPM图像。(a) 分位点q = 95.5；(b) 分位点q = 96.5；(c) 分位点q = 97.5；(d) 分位点q = 98.5 阈值化并不是二值化，对于图片的值并不是单纯的0和1，保留了图片的原有像素值，今后样条曲线拟合会用到它的像素值。
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user: 6. 总结 本文叙述车道线检测图像获取和预处理全部过程算法，包括摄像头的安装和标定，相机的内外参数获取，对标定后的图像进行逆透视变换，得到IPM图，对IPM图进行高斯滤波，分析了滤波尺度的大小对噪声的影响。对IPM图滤波后形成的边界线进行处理，进而对边界线处理后残留的毛刺信号进行腐蚀处理。最后介绍了图像的分位点的大小对阈值化后图像车道线的影响。
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user: 摘 要 随着国内老龄化趋势的日渐严重，医疗卫生系统的可持续性发展越来越多地受到老年人群的威胁。在这种情况下，以肌少症为代表的老年综合征在公共卫生政策中发挥了愈发关键的作用，因此近年来受到了社会各界学者的关注。肌少症相关的临床及护理需求也随之而来，老年人的综合护理呈现出多种未满足的状态，本综述则以肌少症为中心，展开对老年人护理的现况、困难及展望展开论述。 关键词 :肌少症，护理，营养干预，抗阻运动 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 肌少症随年龄的增长其发病率逐渐升高，过多的肌肉丢失会导致运动障碍，呼吸功能下降和心力衰竭，从而导致肺部感染和压疮的发生率增加 [ 1 ]。因此，肌少症被认为是老年人和疾病消瘦者的严重损害。由于严重的危害，肌肉减少症的治疗作用受到越来越多的关注。肌少症的早期筛查和预防至关重要，肌少症主要治疗方法是康复运动，药物治疗，激素替代和营养支持等，贯彻肌少症防治过程的难点也是重点即使肌少症的临床和社区护理。
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user: 2. 肌少症 2.1. 肌少症的定义及流行病学 肌肉减少症(sarcopenia)简称肌少症，源自希腊文sarx (肌肉)和penia (减少)，于1989年由Rosenberg首次命名。自2010年起，欧洲老年肌少症工作组(European Working Group on Sarcopenia in Older People， EWGSOP)及国际肌少症工作组(International Working Group on Sarcopenia， IWGS)陆续发布并完善肌少症共识，目前国际较为认可的肌少症定义为：“与增龄相关的进行性、全身肌量减少、肌肉强度下降或肌肉生理功能减退的综合征” [ 2 ]。随着肌少症的进展，有可能导致身体残疾、生活质量差和死亡等不良后果 [ 1 ]。肌少症的发病率随年龄的增长而升高，研究表明，在亚洲，65~75岁老年人肌少症的估计患病率为4.1%~7.5%，而>80岁的年龄区间肌少症的发病率则飙升至12.8% [ 3 ]。年龄增长会使老年人肌肉的质量减少、肌肉的强度减弱，从而影响老年人的运动能力 [ 4 ]。国外有研究表明，肌少症是老年人在院外1年死亡率的预测因素 [ 5 ]。 2.2. 肌少症的诊断标准 肌少症可以定义为一种状态，表现在运动储备能力的逐渐丧失和对压力源缺乏反应 [ 6 ]。然而，肌少症仍然是一个不断发展的概念，其诊断标准依据不同的工具和方法，各地区及各文献中均有不同的标准被报道，迄今为止全球范围内还没有达成统一的共识。例如，2010年EWGSOP [ 1 ] 首次提出肌少症的诊断标准和肌少症的分级，以肌量减少、肌力下降及肌肉功能减退3个方面作为诊断标准 [ 5 ] [ 6 ]。而亚洲肌少症工作组(AWGS) [ 7 ] 在2014年公布的亚洲肌少症共识也采用了相似的诊断思路 [ 5 ] [ 7 ]，其诊断标准为：1) 肌肉质量的评估：通过双能X线骨密度仪(DXA)、电子计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等设备测量不同部位的肌肉质量；2) 肌肉力量的评估：手握力方便易测且可大致反映其他部位的肌肉力量，推荐测量手握力；3) 肌肉功能评估：步速是一项很好的客观指标，方便开展而且易于接受，推荐日常步速评估法评估肌肉功能，如6分钟步行试验及站立步行试验等 [ 5 ]。我国目前更多的倾向于AWGS的诊断标准：1) 双能X线吸收法测定全身骨骼肌质量，与身高平方的比值，男性<7.0 kg/m 2 、女性<5.4 kg/m 2 。2) 握力(男性<26 kg、女性<18 kg)、步速(6 m日常步速<0.8 m/s)：2项至少1项 [ 5 ]。 2.3. 肌少症的研究进展 目前我国老年人口正以前所未有的速度持续不断地增长 [ 8 ]。衰老对骨骼肌的影响随着年龄的增长愈发明显，主要以肌肉力量、耐力和肌肉数量不断变化为著 [ 5 ]。老年人身体活动受到限制，功能、认知和情感障碍等问题逐渐突出，跌倒和骨折的风险随之增加 [ 9 ]。目前国内外对肌少症的相关性研究甚少，诊断相关的工具即方法也较为欠缺和不便。例如，在肌肉质量的测量上，磁共振成像、计算机断层扫描、双能X射线吸收测定(DXA)、生物阻抗分析、肌酸排泄、超声波等均可进行测量，但只是测量肌肉质量的众多策略中的一小部分 [ 5 ]。且不幸的是，每种技术都有其独特的优点和缺点，临床上较难开展。 肌少症的早期、准确筛选对医疗系统尤其是老年人群意义重大，因为许多研究表明，肌少症是增加残疾、增加住院率及再住院率、降低生活质量和增加死亡率的有力预测因素 [ 5 ] [ 8 ] [ 9 ]。国际老年医学共识小组认识到肌少症是一种重要的医学综合征，并建议所有60岁以上的人都应该定期进行肌少症的筛选，筛选可在院内或者社区共同进行 [ 4 ]。一旦患者出现肌少症的倾向，则需加强肌少症的临床护理，以最大程度的预防肌少症的发生和恶化。 治疗方面，肌少症主要依靠早期发现、大力预防和专业护理。肌少症主要治疗方法是康复运动、营养干预和药物治疗等 [ 10 ]。其中较为临床广泛接受和认可的是以抗阻性运动训练为主的康复运动和临床营养干预。而肌少症的防治过程中最重要且最难攻克的方面就是肌少症的护理。
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user: 4. 结论 尽管衰老和肌少症并不是同义词，但随着年龄的增长，肌少症的患病比例显著增加。肌少症不是由单一的情况定义的，而是一种健康状态，其特征是身体、精神或社会衰退的风险增加，健康状态恶化，以及死亡 [ 40 ]。全面认识肌少症是十分重要的，因为早期发现有助于以预防和管理为重点的方案实施，以减少未来住院治疗，改善结果，增强活力和生活质量。 近几十年来，人们对老年人的肌少症和生活质量进行了广泛的研究，但没有统一的定义。目前肌少症的临床诊断及临床治疗尚未完善，全球范围内暂未达成统一共识。但需明确的一点是，护理人员和日常照料在肌少症的防治过程中置关重要。主要是抗阻性运动联合高蛋白饮食，尤其是富含亮氨酸和维生素D的高蛋白饮食，对延缓肌肉减少症老人的病情有效 [ 15 ]。如何更方便更快速帮助更多老年人预防肌少症，值得进一步研究。 总之，肌肉健康与老年人生活质量具有密切关联。临床工作中应扩宽思路，提高对老年人群肌少症的认识，应该同步考虑肌少症的日常护理和治疗，并对肌少症给予积极有效的防治。
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user: 利益冲突 作者声明不存在利益冲突。
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user: 摘 要 在竞争环境日趋激烈与全球价值链重构的影响下，集群网络作为重要的资源配置组织而广泛盛行，组织间关系尤其是组织间合作关系成为理论界与实业界的关注焦点。本文基于集群成长周期理论，运用系统动力学与仿真模拟方法，构建集群网络四个发展阶段与网络关系租金的动态匹配过程，探索网络权力、网络能力以及战略协同等对关系租金的影响。研究结果表明：网络能力、网络惯例以及战略协同与关系租金呈正相关，过高或过低的网络权力都不利于关系租金的产生。本研究对集群网络关系租金的获取与网络权力的合理配置具有重要的理论与现实意义。 关键词 :集群网络，关系租金，组织间关系，动态演化，仿真模拟 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 在竞争环境日趋激烈与全球价值链重构的影响下，环境动荡与外部竞争形成了“赢者通吃”的现象，企业间关系也日益复杂和网络化，为了缓解任复杂性以及环境的不确定性，企业间的组织形态逐渐从科层与市场转向网络组织(Thorelli，1986 [ 1 ]；林润辉和李维安，2014 [ 2 ]；彭正银，2002 [ 3 ])。此外，随着企业间联系越来越紧密，主流学者开始非常密集的使用“网络”概念来解读经济及社会发展中存在的现象及问题，如产业集群、企业集群、集群网络、网络组织、创新网络等。因此，集群网络作为重要的资源配置组织而广泛盛行，组织间关系尤其是组织间合作关系成为理论界与实业界的关注焦点。 集群网络主要是基于企业间合作关系而形成的网络，企业间合作关系是指不同企业之间在保持各自相对独立的前提下为了共同目标而形成的重复性的、高频次的合作关系(Podolny and Page， 1998) [ 4 ]。但是鉴于外部环境等不确定性等因素的影响，实践中合作网络往往不能够有效的实施(例如华为公司的合作案例等)，企业间协作的失败率甚至超过50% (Kale， Dyer and Singh， 2002; Kale and Singh， 2009; Lunnan and Haugland， 2008)，因此对集群网络的治理是其非常重要的一部分，因为集群网络是协同效应的必要非充分条件(孙国强，2003) [ 5 ]。彭正银(2002)认为网络治理是一种关系安排，这种安排是指组织或个体间通过经济或社会的关系而嵌入在以制度安排为核心的企业间关系网络中。从这个视角来看，网络治理更多体现一种关系治理。组织间关系包括关系的产生、发展、维护等多个阶段，尽管企业间网络联系相互作用方面的研究成果已相对丰富，但对整体网络演化的研究仍然缺乏，从某种程度上忽略了从产业集群到网络组织转换的过程，导致研究成果分层化，即忽视了将网络作为一个整体而对其关系性的研究(邹琳等，2018) [ 6 ]。因此如何协调集群网络中各企业成员的关系以及行为使该集群网络形成一个高效、有序、自治的行为规范与制度安排，成为集群网络成员间关系治理的一个关键问题。本文从整体网络视角出发，结合已有研究以及集群网络的不同发展阶段与不同阶段产生的关系租金进行动态演化仿真模拟研究，以揭示关系租金的影响因素及其相互作用。
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user: 4. 仿真模拟与结果分析 通过系统动力学分析软件Vensim PLE对网络演化过程与关系租金的动态匹配模型进行仿真模拟分析，对模型准确性与有效性进行验证，得到仿真结果如图4所示：1) 随着组织间关系的不断演化，网络关系回报率处于不断增长的趋势，并逐渐趋于平稳状态，形成阶段组织间关系回报率在趋于平稳时是最低的，而升级阶段的网络关系回报率前3年增长较慢，后续增长较快，而且到平稳期已经远远高于其他阶段的网络关系回报率；2) 形成阶段、发展阶段和成熟阶段的关系租金在持续到8年时趋于同一个水平线，而升级阶段的关系租金起点较低，但是经过10年左右的时间，已经远远高于其他阶段的关系租金，说明关系租金在集群网络升级阶段中具有较大的影响力；3) 集群网络发展过程中，集群形成阶段的企业数逐年减少，最后趋于稳定，而其他三个阶段的数量先增加又开始较少最后趋于稳定，需要注意的是鉴于区域内有企业不参与合作而退出网络，所以在前三个阶段该区域内的企业数量都呈现减少的趋势，但是对于网络升级阶段而言，区域内网络数量是指形成网络内的小网络或小组织的数量，所以呈现逐渐增长的趋势。 图4. 不同发展阶段仿真结果 为了进一步验证网络权力、网络能力、网络惯例以及战略协同对网络关系租金的影响，本文分别在控制其他变量的前提下调整其中某一个变量对模型进行模拟运行，结果如图5所示：1) 图5(a)可看出，在三个阶段中，战略协同在网络形成初期发生明显的变化，其中战略协同程度越高，对关系租金产生的影响效果越明显，但是随着时间的不断发展，战略协同对关系租金的影响力越来越小；2) 图5(b)可看出，网络惯例对网络形成初期影响较大，网络惯例越强，对关系租金影响越大，其中集群形成阶段由0.6变为0.9时发生了显著的变化，至于具体原因，需要进行进一步的调查与研究；3) 图5(c)为网络权力系数分别为0.3、0.6、0.9时对网络升级阶段关系租金的影响变化图，同样可以看出网络权力对网络发展过程中的影响是有限的，但是进一步发现网络权力为0.6时，网络关系租金的变化率是最高的，充分说明网络权力过高或者过低都不利于网络组织的形成；4) 图5(d)同样可以看出，通过对网络能力系数进行调节变化，可以发展网络能力对网络关系租金有显著正向的影响，而且网络能力越强，关系租金产生越多。 图5. 网络权力、网络惯例、战略协同、网络能力对关系租金的影响 研究结果表明，在全球价值链重构且竞争环境日趋激烈的环境下，企业仅靠企业内部资源或者某一外部资源已经不足以支撑企业的长远发展，因为企业必须通过组织间关系获取不同类型的网络资源，通过组织间合作、共享网络资源创造竞争优势，进而产生更多的关系租金。而从经济学的角度来看网络租金确实在一定程度上能够对网络整理的超额合作利润进行衡量，也是企业间合作的终极目的。Dyer (1996)指出关系租金是企业合作网络竞争优势的主要来源，也是集群网络保持竞争优势的永恒性指标。此外，中国式的关系与西方的关系又是有所区别的，企业间关系的产生不单纯包括西方研究者所考虑的因素，还包括更多或显性或隐性的原因，所以导致在中国对关系租金以及企业间关系的衡量更加困难，难以进行更加深入的分析，但这也是企业间关系研究中不可回避的问题。
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user: 5. 研究结论与启示 5.1. 研究结论 本文从集群网络发展的不同演化阶段进行界定，并进一步从组织间关系视角进行系统动力学研究，对网络发展过程与网络关系租金动态匹配模型进行仿真模拟分析，得到如下研究结论： 1) 企业集群、产业集群与网络组织存在显著的区别。严格来讲，企业集群更加倾向于企业的微观层面而产业集群是一种更为宏观的概念，但是从地理临近上而言，从已有学者的研究来看，又具有相似性。此外，随着组织间关系的不断建立与发展，集群会逐渐向网络组织的方向发展和演变，可以认为网络组织是一种升级化的产业集群，是一种完善的企业合作模式，能够产生协同效应的关系租金。 2) 通过仿真模拟发现，不同发展阶段会因组织间关系合作程度的不同产生相应的关系租金，而且关系租金的变化与网络组织的发展过程存在动态匹配性，其中网络关系回报率是衡量关系租金的一个重要的变量。在集群网络形成阶段，鉴于资源或区位优势等原因许多同类型的企业在某一区域集中出现，形成企业集群的集聚，此时企业规模较小，网络租金还尚未产生；随着企业集聚规模的扩大，越来越多的企业加入该集群或者与其建立合作关系，逐渐形成集群网络，其中一些企业由于占据了结构洞优势等而产生企业间良性互动并产生关系租金；当网络中关系租金达到最高值时，集群网络会由于治理不良等问题而降低对网络外成员的吸引力，也有部分网络成员退出网络，导致集群网络产生衰退。 3) 过高或过低的网络权力都不利于关系租金的形成，而网络能力、网络惯例以及战略协同都与关系租金呈正相关的关系。结果表明过高的网络权力会制约网络关系租金的产生，而过低的网络权力又不利于网络内成员进行互惠互动行为的产生。因为从理论上讲当网络权力较强时，企业拥有和可支配的网络资源较多，在网络内部具有强大的影响力会导致其他成员企业的模仿与追随，对网络组织的形成具有较大的主动性，但是这种网络权力会增强企业间的竞争，抑制网络的发展；当网络权力较弱时，企业间难以形成较强的核心竞争力，网络间关系会较松散，会进一步抑制企业获得网络资源的渠道和机会，会削弱企业网络参与合作的积极性，但是有学者从权力不对称的视角对网络成员关系进行分类，分为模块化网络、关系型网络以及核心领导型网络，而且也有学者认为核心领导型网络中核心企业尽管网络权力较高但是却也产生了较高的关系租金，而具体网络权力对关系租金的影响机制需要后续研究中进行更深入的分析。网络惯例是网络内成员在合作过程中形成的行为规范，能够协调企业间关系，促进网络稳定。集群网络能力具有动态性和学习性，会随着集群网络的不但演化进行动态调整，好的网络能力对集群网络的演化具有促进作用。而对于战略协同而言，在合作前期合作伙伴的选择过程中，战略协同较高的企业能够为后续更高效的合作提供基础，所以战略协同与关系租金成正比。 5.2. 管理启示 本文通过对集群网络演化以及关系租金进行动力学分析，认为集群网络的发展状况在区域经济发展过程中具有重要的意义，而关系租金是驱动组织间合作的重要因素，所以集群网络与关系租金相伴而生、共生发展，本文进一步从管理视角进行拓展得到如下启示： 1) 由于组织间关系网络本身鉴于其异质性、不可转移性以及持久性等特点，所以组织间关系网络可以被认为是一项不可模仿的资源、一种创造资源的手段，一个获得资源与信息的途径(罗珉，2007)。因此，在资源型经济转型发展过程中，政府部门理应把发展重点和关注点放在集群网络上，着力推进集群网络的演化和升级，进一步推动区域经济的发展。 2) 结合本文研究结论，发现在集群网络演化中，不同阶段关系租金的获得受到网络权力、战略协同、网络惯例、网络能力等因素的影响，所以说明通过调节这些因素都会在一定程度上影响网络关系租金的获得，进一步影响集群网络的发展。 3) 鉴于中国式关系的特殊性，可能还会存在一些有别于西方研究者所考虑的因素影响中国集群网络的发展，后续研究中需要对组织间关系进行更深入的、更符合中国情境进行研究，进一步明确不同企业在集群网络中的位置和地位，完善集群网络激励机制与监督机制，提高网络内资源配置效率，有助于中国经济的不断发展和国家实力的提升。
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user: 摘 要 正常人的关节软骨具有优秀的生物力学性能，不仅可以在关节间起缓冲作用，而且也在促进人体身体运动方面起着至关重要的作用。因此关节软骨的完整性至关重要。但是由于关节软骨缺乏血管和血供，因此自我修复极为困难，所以一旦关节软骨损伤，其损伤很难自我修复。同时关节软骨的损伤还常常伴有关节下骨的损伤，如若不做处理，进一步发展可进发为骨关节炎，对患者生活造成巨大影响。但是目前临床上对软骨损伤的治疗，如软骨钻磨、骨膜和软骨膜移植、软骨下骨钻孔、人工关节置换等治疗效果并不理想。近年来组织工程的迅速发展，为软骨及软骨下骨的修复提供了新途径及新方法。支架作为组织工程的核心内容之一起着至关重要的作用。传统的软骨组织工程修复关节软骨缺损，是在生物支架上种植软骨细胞，这种方法一方面细胞的种植率较低；另一方面，从修复的角度来看，软骨损伤通常伴随软骨下骨的损伤，单纯的运用软骨细胞修复软骨而忽略了软骨下骨的修复，其修复效率有限。因此本研究设想能否构建一种复合支架，在支架上层种植软骨细胞，支架下层种植成骨细胞，通过这种方式可以同时修复关节软骨及软骨下骨的损伤。复合支架的难点在于如何选择合适的材料。因此在深入认识关节软骨及关节下骨的基础上，我们选用医用明胶海绵与海藻酸钠水凝胶来构建复合支架。以往多项研究表明医用明胶海绵及海藻酸钠的生物相容性、孔径率及力学特性均可以支持其作为关节软骨组织工程的支架材料。本研究阐明了在关节软骨组织工程中构建明胶海绵–海藻酸钠水凝胶复合支架的可行性，为修复关节软骨缺损提供依据及技术支持。方法：1) 构建含成骨细胞的底层支架。选取适量明胶海绵，切成小块后灭菌；成骨细胞MC3T3-E1扩增后种植在明胶海绵上，体外培养诱导成骨细胞分化，监测成骨细胞在支架表面的贴附、增殖和分化状况。2) 制备并培养含细胞的复合支架。将含有软骨细胞的海藻酸钠溶液利用与CaCl₂溶液交联在明胶海绵支架上形成海藻酸钠水凝胶；培养形成的复合支架并检测支架下层成骨细胞在支架表面的贴附、增殖和分化状况及水凝胶中软骨细胞的增殖情况。3) 对含细胞的复合支架进行检测。将不同时间提取的复合支架标本进行检测，明确复合支架中碱性磷酸酶及糖胺聚糖的表达情况。结果：1) MC3T3-E1在明胶海绵支架上扩增生长良好，活/死细胞染色示随时间推移活细胞在支架上数量增多。2) 海藻酸钠水凝胶与明胶海绵支架接合良好，猪膝软骨细胞及MC3T3-E1分别在海藻酸钠水凝胶与明胶海绵支架上生长良好，活/死细胞染色示随时间推移两种活细胞在支架上数量增多。3)复合支架上的细胞与单纯明胶海绵及单纯海藻酸钠水凝胶上的细胞相比碱性磷酸酶及糖胺聚糖表达提升。结论：通过海藻酸钠溶液可以与CaCl₂溶液交联形成水凝胶的方法成功构建了组织工程复合支架，明胶海绵–海藻酸钠水凝胶复合支架较单纯的明胶海绵支架及单纯的海藻酸支架可以更好地促进MC3T3-E1细胞及猪膝软骨细胞的增殖和分化。明胶海绵–海藻酸钠水凝胶复合支架在关节软骨组织工程中具有良好的应用前景。 关键词 :软骨组织工程，明胶海绵，海藻酸钠水凝胶，复合支架 Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 关节软骨由软骨细胞、II型胶原和蛋白多糖组成，是覆盖关节腔滑膜关节骨端的透明软骨 [ 1 ]。健康的关节软骨具有优越的生物力学性能，在关节间起缓冲作用，分担机体的负荷 [ 2 ]。因此，软骨的完整性在促进身体运动方面起着至关重要的作用。然而，成人关节软骨比较脆弱，缺乏血管和血供，软骨细胞分布稀疏。因此，关节软骨一旦发生损伤是很难实现自我修复的 [ 3 ]。 但是关节软骨损伤却是骨科临床工作中经常会遇到的一种关节损伤类型。创伤、退变、肿瘤等多种原因都可以造成关节软骨损伤。同样这种损伤不仅会对关节软骨造成损伤，还常常伴有关节下骨的损伤，进一步可发展为骨关节炎，不仅会对病人及社会带来沉重的负担，也会造成患者生活质量的降低，影响患者的日常生活，也为临床工作的开展造成了一定的困难。目前对于关节软骨损伤临床上主要应用的修复方法有，软骨钻磨、骨膜和软骨膜移植、人工关节置换等技术 [ 4 ]。软骨钻磨技术主要是通过破坏钙化软骨层结构，来使位于软骨下骨中的骨髓间充质干细胞移行至软骨损伤区域，从而形成血凝块，骨髓间充质干细胞在血凝块中增殖分化形成纤维软骨，但是由于纤维软骨在各项性能上远逊于透明软骨，故其远期疗效欠佳。自体骨膜、软骨膜移植，不仅会造成供体区病损，而且由于供体区来源有限，对于较大的软骨缺损无法完成修补。异体骨膜、软骨膜移植则存在着供体来源寻找困难，疾病传播性高及易发生免疫排斥反应等缺点。人工关节置换适用于大面积软骨缺损，继发严重骨性关节炎的患者，这种手术会去除患者关节处的软骨，对患者造成创伤极大，并且会面临多种术后并发症。综上所述，这些方法可以一定程度上解决关节缺损的问题，但都存在较大的缺陷。 组织工程学是一种将生命科学与工程学有机结合的新技术。其目的是修复及再生组织。近年来组织工程技术在多个领域蓬勃发展，并获得了优秀的成绩。特别是软骨组织工程的迅速发展，为软骨及软骨下骨损伤的修复和再生提供了巨大的希望。关节软骨组织工程的工艺过程通常包括三个步骤：1) 体外培养、扩增治疗细胞；2) 在不同生长因子加载的三维支架中培养，形成细胞支架结构；3) 随后将构建物植入体内组织缺损中，随着原位新软骨的形成，支架逐渐降解 [ 5 ]。作为其中关键要素的支架，在关节软骨组织工程中起到了至关重要的作用。 传统的软骨组织工程修复关节软骨缺损，是在生物支架上种植软骨细胞，一方面细胞的种植率较低；另一方面，从修复的角度来看，软骨损伤通常伴随软骨下骨的损伤，单纯的运用软骨细胞修复软骨而忽略了软骨下骨的修复，其修复效率有限 [ 6 ]。而复合支架是通过各种物理化学的方法将许多原材料混合，相互弥补不足，形成最大限度地满足临床和组织工程的要求的支架，可以提高关节软骨损伤的修复程度 [ 7 ]。 构建关节软骨复合支架的难点在于如何选择合适的材料。关节软骨支架材料要满足以下三点要求：1) 支架材料不会导致机体发生免疫及炎症反应；2) 需要其具有无毒性及良好的生物相容性；3) 支架材料的降解性能及孔隙率等特性。 软骨组织工程的支架材料可以根据来源分为以下两大类：天然聚合物和合成聚合物。天然材料由于其良好的生物相容性、无毒性以及合适的降解速率而被广泛用于软骨组织工程 [ 8 ]。海藻酸盐是一种天然衍生的线性多糖，含有不同数量的(1-4)-连接-D-甘露醛酸和-L-古龙醛 [ 9 ]。酸海藻酸钠作为美国食品和药物管理局(FDA)批准的聚合物，已成为最重要的生物材料之一 [ 10 ]。海藻酸钠具有生物相容性好、毒性低、成本低、来源广等特点，已被广泛应用于各种生物医学领域 [ 11 ]。近年来多项研究表明海藻酸钠水凝胶在软骨组织工程方面发挥了不俗的表现 [ 12 ] [ 13 ]。Focaroli等人通过海藻酸钠与钙离子交联研制了一种可注射的海藻酸钠凝胶，这种海藻酸钠凝胶不仅能很好地适应软骨缺损，而且能促进新软骨与软骨组织的融合 [ 14 ]。医用可吸收明胶海绵作为如今医学常见的止血材料已经被广泛应用。医用明胶海绵的主要成分为明胶。明胶是胶原部分水解后的产物。胶原分子是一种通过三条多肽链互相缠绕形成的螺旋体结构，通过处理，胶原螺旋体可以发生变性，并会分解成由单条多肽链(α链)组成的α-组分、由两条α链组成的β-组分及由三条α链组成的γ-组分，以及小于α-组分或大于γ-组分的分子链碎片 [ 15 ]。医用明胶海绵作为医学临床工作常用的止血材料，其生物相容性无毒性、低免疫性及可降解性毋庸置疑。明胶海绵不仅能促进成骨细胞的黏附和增殖，还能促进细胞外基质的分泌 [ 16 ]。有研究表明在体外培养2周后，将明胶海绵骨细胞构建物移植到8例膝关节损伤骨缺损上。关节镜观察显示所有患者的关节下骨缺损都得到了修复 [ 17 ]。 如何将两种材料有机的结合到一起是下一步要解决的问题。海藻酸钠有一种特性是可以与不同二价金属离子如Ca 2+ 、Mg 2+ 交联 [ 18 ] [ 19 ]。由于海藻酸钠溶液可以与Ca 2+ 交联形成海藻酸钠水凝胶，我们可利用海藻酸钠的这一特性来构建复合支架：首先先在明胶海绵支架上种植成骨细胞，在体外培养一段时间后，待成骨细胞粘附在三维支架上后，向明胶海绵支架中滴入CaCl 2 溶液，再在明胶海绵支架上滴上含有软骨细胞的海藻酸钠溶液，然后利用CaCl 2 溶液与含软骨细胞的海藻酸钠溶液交联，这样就会在明胶海绵支架上形成海藻酸钠水凝胶，从而形成明胶海绵–海藻酸钠水凝胶复合支架。最近，有研究利用碳二亚胺化学和定向冷冻技术通过共价交联制备了海藻酸钠/胶原复合支架。通过这种方法，提高了支架的力学性能。在支架中加入II型胶原可促进人髌下脂肪垫基质细胞的增殖和软骨细胞外基质的生成 [ 20 ]。可见通过交联的方法将海藻酸钠与明胶海绵结合构建复合支架有一定可行性。 本研究是通过利用海藻酸钠可与Ca 2+ 交联形成水凝胶的方法，使海藻酸钠水凝胶与明胶海绵结合形成复合支架，与以往构建复合支架相比，这种方法不需要粘合剂等措施，即可将两种支架组合在一起，更加简单方便。同时在复合支架的下层培养成骨细胞，上层培养软骨细胞，形成细胞、支架共培养系统，检测支架的生物相容性及其他理化性质，为后续动物实验打下基础，同时解决单纯的运用软骨细胞修复软骨损伤的局限性，为提高软骨损伤的修复找到一个更为科学有效的方法。
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user: 3. 检测 3.1. 与MC3T3-E1细胞共培养明胶海绵支架活/死细胞检测 1) 培养不同时间间隔(3天、10天)后，在超净台中取与MC3T3-E1共培养的明胶海绵支架于干净的培养皿，用灭菌后的手术刀切除一薄片，余支架放回培养皿中继续培养。 2) 向切成薄片的支架加PBS约500 ul，然后加入0.5 ulcal (钙黄绿素-AM)、1 ulpI (碘化丙啶)，在黑暗条件下放入37℃含5%的CO 2 培养箱中30分钟。 3) 使用PBS冲洗2~3次，5 min/次。 4) 在表面荧光显微镜下观察(期间注意避光)。 3.2. 复合支架活/死细胞染色 1) 培养不同时间间隔(20天、30天，此天数是从构建底层支架算起)后，取复合支架于干净的培养皿，用灭菌后的手术刀切除一薄片，余支架放回培养皿中继续培养。 2) 向切成薄片的支架加PBS约500 ul，然后加入0.5 ulcal (钙黄绿素-AM)、1 ulpI (碘化丙啶)，在黑暗条件下放入37℃含5%的CO 2 培养箱中培养30分钟。 3) 使用PBS冲洗2~3次，5 min/次。 4) 在表面荧光显微镜下观察(期间注意避光)。 3.3. 碱性磷酸酶(ALP)检测 1) 冷却至室温备用所需要的试剂。 2) 配制显色底物溶液：取出显色底物粉末，向粉末中加入2.5 mL ALP反应缓冲液至粉末完全溶解，将溶液充分混匀，在冰上放置备用(现用现配，配制后6 h之内使用)。 3) 准备标准品工作液：将浓度为10 mmol/L的标准品溶液10 μL，加入到ALP反应缓冲液直到0.2 mL (标准品工作液浓度为0.5 mmol/L)。 4) 制备裂解液：首先用RIPA裂解液裂解含细胞的支架材料，然后用高通量研磨器研磨至呈匀浆状，在用离心机离心并取上清液。 5) 样品稀释：若待检测样品中的碱性磷酸酶活性较高，可以使用以下方式进行稀释：a) RIPA裂解液；b) 磷酸盐缓冲液；c) 试剂盒中的ALP反应缓冲液。 6) 检测板中空白对照孔、标准品孔及待检测样品孔的设计可以参考下表1。标准品的用量可设置为4 μL、8 μL、16 μL、24 μL、32 μL和40 μL，待检测样品适当稀释后加50 μL。 7) 混匀：使用移液枪头轻轻吹打混匀，并用低速离心壁上液体。 8) 孵育：37℃条件下温育5~10 min。(若样品中碱性磷酸酶活性较低时，可以延长孵育时间至30 min) 9) 终止：向每孔中加入100 μL反应终止液。因ALP活性不同会导致标准品孔和有碱性磷酸酶活性的孔显示出有不同深浅的黄色。 10) 检测：在405 nm波长处测定各孔吸光度值，显示出来的黄色在会在6个小时内稳定。 11) 计算个样品ALP含量，作柱状图。 Table 1 Data sheet of each component samplin 空白对照组 标准品 样品 ALP反应缓冲液 50 μL (100−x) μL − 显色底物 50 μL − − 样品 − − 50 μL 标准品工作液 − x μL 50 μL 表1. 各组分加样数据表 3.4. 糖胺多糖检测 1) 甲酸缓冲液配制：4 g甲酸钠、4 ml甲酸，去离子水补足至1 L，封闭储存。 2) DMB试剂配制：将DMB粉末80 mg加入12 ml乙醇，完全溶解后，加488 ml甲酸缓冲液，避光室温保存。 3) 裂解液配制：PBS配制后调pH值至6.4后，加入400 mg乙酸钠，200 mg EDTA二钠盐和40 mg半胱氨酸盐酸盐，4℃保存；使用裂解液时加入木瓜蛋白酶，现用现配。 4) 解离液配制：将0.2 g SDS粉末加入到100 ml去离子水中。 5) 硫酸软骨素标准品配制：称取1 g硫酸软骨素，溶于100 ml PBS中，同时加入0.005%的叠氮钠，得到10 mg/ml储存液；并将软骨素标准品稀释成1 mg/ml备用。 6) 裂解、研磨：将含细胞的支架材料中加入裂解液进行裂解(裂解为在冰上进行超声裂解)，然后用高通量研磨器研磨至呈匀浆状，在用离心机离心(高速离心具体为高速12，000 g离心10~15 min)并取上清液。 7) 混匀：吸取上清100 μl，加入1 ml DMB试剂，室温下摇动，使糖胺多糖和DMB充分结合。 8) 解离：高速离心(高速离心具体为高速12，000 g离心30 min)，沉淀糖胺多糖和DMB的结合体，加入解离液，室温放置10 min使DMB从糖胺多糖上解离出来。 9) 标准曲线制作：分别取5 ug、4 ug、3 ug、2 ug和1 ug的硫酸软骨素标准品，加入1 ml DMB试剂，室温下摇动；离心留沉淀，加解离液后，解离液完全解离DMB和糖胺多糖的结合体后，空白对照设置为解离液，于656 nm波长处测定吸光度值。 10) 计算实验组的糖胺多糖数值，统计分析。 3.5. 统计学分析 本实验应用GraphPad Prism7.00软件处理定量数据，实验数据以 X ¯ ± S 表示，以P < 0.05表示差异具有统计学意义。应用双因素方差分析进行两组实验在不同时间点的比较，在相同时间点两组间的比较应用单因素方差分析，实验数据均进行方差齐性检验，两两比较采用Lsd-t检验。
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user: 4. 结果 4.1. 明胶海绵支架的活/死细胞染色 在体外增殖培养的第3天以及通过诱导剂诱导成骨培养的第10天，进行活/死细胞荧光染色检测以用来评估接种在明胶海绵支架上MC3T3-E1细胞的活力和形态。在该染色方法中，活细胞的细胞质呈绿色，染色结果如图1。MC3T3-E1附着于明胶海绵微孔中生长，可见随着时间逐渐延长，MC3T3-E1细胞不断增殖，并且细胞外基质(ECM)分泌逐渐增加，在第10天可以看到明胶海绵微孔中的MC3T3-E1相互连接，并且随着时间推移，明胶海绵表面上的MC3T3-E1细胞亦表现出显著增殖。 图1. MC3T3-E1在明胶海绵支架上于荧光纤维镜下图 4.2. 明胶海绵海藻酸钠水凝胶复合支架的活/死细胞染色 在从构建底层支架算起进行体外增殖培养的第20天及30天，进行活/死细胞荧光染色检测以用来评估接种在复合支架上MC3T3-E1细胞和猪软骨细胞的活力和形态。在该染色方法中，活细胞的细胞质呈绿色，染色结果如图2。明胶海绵–海藻酸钠水凝胶构建复合体内胞活/死细胞染色结果如图2(C)。可见MC3T3-E1附着于明胶海绵微孔中生长，随着时间延长，MC3T3-E1细胞在明胶海绵表面及微孔内增殖良好，并且细胞外基质(ECM)分泌逐渐增加，猪软骨细胞也在海藻酸钠水凝胶中增殖良好，随时间延长细胞外基质(ECM)分泌逐渐增加。单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组体内胞活/死细胞染色结果如图2(A)、图2(B)。与复合支架相比，随着时间推移，单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组边缘细胞呈现明显的增殖趋势，然而，单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组内部的细胞密度在20~30天内几乎保持不变。增殖培养第20天至第30天，在相同时点间，与单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组相比，复合支架组观察到更高的细胞密度和细胞扩散比率。表明复合支架组可提供比单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组更好的细胞增殖与培养环境。 4.3. 碱性磷酸酶(ALP)检测结果 碱性磷酸酶(ALP)的表达是评估MC3T3-E1早中期分化的重要标志物。分别检测复合支架和单纯明胶海绵支架中MC3T3-E1在总培养天数第10，20，及30天中碱性磷酸酶的活性，结果如图3。从图中可以看出实验组及对照组中的MC3T3-E1细胞的ALP活性在培养20天内均明显增加，并在20天达高峰，并会在第30天出现表达下降。然后除去养的第10天外，在第20及30天，可以看出在复合支架中的碱性磷酸酶活性均高于单纯明胶海绵支架组(P < 0.05)。 图2. 细胞在不同支架下于荧光纤维镜下图 图3. 碱性磷酸酶表检测结果 4.4. 糖胺聚糖检测结果 糖胺聚糖是软骨细胞分泌的重要外基质之一。分别检测复合支架和单纯海藻酸钠支架中猪膝软骨细胞在培养的第10，20及30天中糖胺聚糖的含量，结果如图4。从图中可以看出实验组及对照组中的猪膝软骨细胞的糖胺聚糖的含量在培养30天内均明显增加，并在20天达高峰，30天糖胺聚糖的含量出现下降。然后除去培养的第10天外，在第20及30天，可以看出在复合支架中糖胺聚糖的含量的均高于单纯海藻酸钠支架组(P < 0.05)。 图4. 糖胺聚糖含量检测结果
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user: 5. 结论 由于创伤、肿瘤等不同原因引起的关节软骨损伤及由其随后带来的骨性关节炎不仅会给骨科临床工作带来困难，还会给患者带来身体上的痛苦，同时也会给国家社会经济带来负担。但是现今临床使用的外科技术的长期疗效不仅难以令人满意，还会给患者带来身体上的创伤。不过近年来软骨组织工程的高速发展带来了新的希望。传统的关节软骨组织工程技术修复关节软骨缺损，仅仅关注于软骨的修复而忽略了软骨下骨的修复，关节软骨下骨的损伤在关节软骨损伤中常常出现，所以在关节软骨损伤修复中同时修复关节软骨下骨的修复也至关重要。所以本研究设想能否构建一种复合支架，在支架上层种植软骨细胞，支架下层种植成骨细胞，然后将种植了细胞的组织工程复合支架在体外培养，这样分别在上层培养软骨、下层培养骨，通过这种方式可以在修复关节软骨的同时，也可以兼顾软骨下骨的修复。同时将软骨–骨修复面转换为软骨–软骨、骨–骨修复面，增加了修复效率。 本研究利用医用明胶海绵构建下层支架，其优势在于医用明胶海绵已在临床工作中广泛应用，其生物相容性、无毒性、低免疫性及可降解性毋庸置疑，并且医用明胶海绵拥有丰富的三维孔径结构，可以给予成骨细胞广泛的粘附增殖空间。其次实验结果显示MC3T3-E1附着于明胶海绵微孔中生长，可见随着时间逐渐延长，MC3T3-E1细胞不断增殖，并且细胞外基质(ECM)分泌逐渐增加，在第10天可以看到明胶海绵微孔中的MC3T3-E1相互连接。利用海藻酸钠水凝胶构建上层支架。海藻酸钠是一种很有前途的软骨组织工程支架材料，除了具有良好的生物相容性和低成本外，还具有易交联的特点 [ 20 ]。特别是容易与二价金属离子，如钙、镁离子交联。由于海藻酸钠溶液可以与Ca 2+ 交联形成海藻酸钠水凝胶，所以可利用海藻酸钠的这一特性来构建复合支架，首先先在明胶海绵支架上种植成骨细胞，在体外培养一段时间后，待成骨细胞粘附在三维支架上后，然后将CaCl₂溶液滴在明胶海绵支架上，再在明胶海绵支架上滴上含有软骨细胞的海藻酸钠溶液，然后利用CaCl₂溶液与含软骨细胞的海藻酸钠溶液交联，这样就会在明胶海绵支架上形成海藻酸钠水凝胶，从而形成明胶海绵–海藻酸钠水凝胶复合支架。通过体外培养，MC3T3-E1附着于明胶海绵微孔中生长，随着时间延长，MC3T3-E1细胞在明胶海绵表面及微孔内增殖良好，并且细胞外基质(ECM)分泌逐渐增加，猪软骨细胞也在海藻酸钠水凝胶中增殖良好，随时间延长细胞外基质(ECM)分泌逐渐增加。并且与复合支架相比，随着时间推移，单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组边缘细胞呈现明显的增殖趋势，然而，单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组内部的细胞密度在20~30天内几乎保持不变。增殖培养第20天至第30天，在相同时点间，与单纯海藻酸钠及明胶海绵支架组相比，复合支架组观察到更高的细胞密度和细胞扩散比率。ALP广泛存在于人体骨骼中，成骨细胞中的ALP作用产生磷酸，与钙生成磷酸钙沉积于骨中，ALP是基质矿化的早期成骨标志物 [ 21 ]。在体外培养的第10，20，及30天检测碱性磷酸酶的活性，除去培养的第10天外，在第20及30天，可以看出在复合支架中的碱性磷酸酶活性均高于单纯明胶海绵支架组。糖胺聚糖是软骨细胞分泌的重要外基质之一。通过糖胺聚糖的表达情况可明确软骨细胞的生长情况。在体外培养的第10天、20及30天中检测糖胺聚糖的含量，除去培养的第10天外，在第20及30天，可以看出在复合支架中糖胺聚糖的含量的均高于单纯海藻酸钠支架组。 本研究通过化学交联的方法制备了一种以明胶海绵为底层支架并以海藻酸钠水凝胶为上层支架的关节软骨组织工程复合支架。通过一系列实验结果表明复合支架可以更好的促进MC3T3-E1细胞及猪膝软骨细胞在体外的增殖和分化。下一步将继续构建关节软骨缺损动物模型，并研究该复合支架在体内的作为关节软骨缺损修复材料的可行性，为临床关节软骨缺损的治疗提供实验依据。