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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料 含有pET28a-Vdh表达质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株由实验室构建并保藏。卡那霉素(KAN)、六水氯化铁(FeCl 3 -6H 2 O)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和6-磷酸葡萄糖(G6P)购自Solarbio公司。5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、菠菜铁氧还蛋白(Fdx)和铁氧还蛋白还原酶(Fdr)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)均购自Sigma公司。LB培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒、蛋白预染Marker、二氯甲烷、甲醇等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，β-环糊精(PMβCD)购自国药(上海)国际医药卫生有限公司。 2.2. 蛋白诱导表达 将实验室构建的包含目的基因pET28a-Vdh的大肠杆菌BL21 (DE3)涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜。从LB琼脂培养基上随机挑取单克隆菌落加入到含有50 μg/mL卡那霉素，0.475 mM FeCl 3 -6H 2 O，0.5 mM 5-ALA的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600 ≈ 0.6。添加 0.5 mM诱导剂IPTG，37℃条件下继续培养6 h，未添加诱导剂的为阴性对照。4000 ×g离心10 min，弃去上清，收集菌体沉淀。使用PBS (pH7.4)使菌体沉淀重悬，在冰上使用超声破碎仪充分破碎菌体。离心后分别收集上清和沉淀，沉淀使用8 M尿素，50 mM Tris HCl，300 mM NaCl (pH 8.0)进行溶解，以备下一步实验使用。 2.3. 配体的准备 从PDB数据库中下载Vdh酶与VD 3 的复合物结构(PDB ID: 3A50) [ 9 ]，以其复合物的结构为模板进行虚拟筛选。该晶体使用PyMol保留同源二聚体中的A链，并分别保存Vdh蛋白和VD 3 的结构。使用Chimera对蛋白进行处理 [ 10 ]，只保留A链并补全缺失的结构，去掉水分子，添加氢原子，对酸性和碱性氨基酸进行质子化处理。将蛋白导入AutoDock 4.2软件中，合并非极性氢，最后保存为.pdbqt格式的文件备用。 2.4. 小分子库的准备 以VD 3 为结构基础在ZINC库中进行筛选，随后用OpenBabel软件将.sdf格式转换为.mol2格式 [ 11 ]。接着对小分子化合物进行预处理：ChemBio3D Ultra13.0中的calculations-MM2 minimize进行第一次能量最小化，最后再使用calculations-GAMESS interfere-minimize (Energy/Geometry)进行能量最小化，保存能量最小化结构的小分子，最后利用脚本将小分子生成.pdbqt格式文件进行下一步操作。 2.5. 分子对接 如图1所示，对接中心设置以VD 3 为中心，向四周扩展5.0 Å的距离，盒子应尽量包括周围的活性残基，但又不能太大，才能保证对接结果的准确性。设置盒子x，y，z大小分别为60 Å × 48 Å × 66 Å，中心设置为3.837，−18.67，−34.066，Spacing设置为默认值0.375。使用脚本依次将小分子对接到蛋白的活性中心。输出结果以打分高低自动排序，从中选出能量和结构较好的小分子进行下一步分析。结合能越低，表明小分子与蛋白的亲和力越高。 图1. VD 3 附近5.0 Å的氨基酸 2.6. 分子动力学 经过以上步骤，挑选出结合能最佳的16个小分子进行分子动力学模拟。小分子在GaussView 5.0中优化 [ 12 ]，选用B3LYP/6-31G (d， p)来进行计算RESP电荷替代原有的电荷信息。 模拟过程是在AMBER14中进行的 [ 13 ]。使用tleap模块给蛋白质加载ff14SB力场 [ 14 ] [ 15 ]，antechamber模块给小分子加载gaff立场 [ 16 ]。采用显示溶剂化模型TIP3P [ 17 ]，溶剂盒子边缘离蛋白质最近的距离为10 Å。在体系添加24个钠离子使整个体系呈中性环境。最后生成蛋白质和小分子的拓扑文件和坐标文件。 分子动力学分为能量最小化，加热，平衡，和动力学模拟四个过程，氢原子键长采用SHAKE算法约束 [ 18 ]，用PME (partical mesh ewald)方法处理非键相互作用 [ 19 ]。能量最小化分两个部分来完成，各进行2500步的计算。第一次能量最小化采用1000步的最陡下降法，1500步的共轭梯度法对体系的水分子和离子进行能量最小化，约束蛋白质。第二次对整个体系进行了2500步的能量最小化，前1000步采用最陡下降法，后1500步使用共轭梯度法。 加热过程采用拉格朗日(Langevin)恒温器控制，体系温度将从0 k加热到300 k，用时60 ps。随后在恒温恒压(NPT)系综下进行50，000步，100 ps的缓慢升压和密度处理使压强达到一个大气压(1 atm)，再次对体系进行250，000步的模拟 [ 20 ]。最后为了消除边界效应采用周期性边界条件的方法，将平衡后的体系在300 k温度下，非键相互作用的截断半径为10 Å [ 19 ]，进行了100 ns无约束的动力学模拟。 使用Amber自带的程序计算蛋白与小分子复合物的RMSD。 2.7. 结合自由能计算 Hou等人研究表明在计算蛋白质–小分子复合物体系的结合自由能时，广义伯恩表面积法(MM/GBSA)方法比分子力学泊松–玻尔兹曼表面积法(Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann Surface Area， MM/PBSA)方法更加准确 [ 21 ]，因此本文采用MM/GBSA方法来探究小分子与Vdh的结合情况。对于小分子与Vdh形成的复合物结构，我们采用MM/GBSA计算结合自由能。结合自由能可以简单的由如下公式(1)表示： 公式(1) Δ G bind = Δ G complex − Δ G receptor − Δ G ligand = Δ G vdw + Δ G ele + Δ G GB + Δ G SA (1) 其中，ΔG complex 代表复合物，ΔG receptor 代表受体，ΔG ligand 代表配体。每一项的总能(G)由分子力学(G MM )和溶剂化效应(Gsol)两部分组成，即G = G MM + G sol ，其中分子力学(G MM )等于范德华作用能(E vdw )和静电作用能(G ele )的和(G GMM = E vdw + G ele )，溶剂化效应(G sol )等于极性溶剂化自由能(G GB )和非极性溶剂化自由能(G SA )的和(G sol = G GB + G SA )。 2.8. 筛选结果验证 将16个化合物按照相似性分为4组，最后从中选出4个可以化合物进行催化验证。按照表1配置酶催化反应体系。在30℃下加入NADPH启动反应。48 h后，停止反应，用乙酸乙酯萃取反应混合液后旋转蒸发浓缩，用薄层色谱(TLC)分析法进行验证，展开剂为甲醇:二氯甲烷 = 1:10。 Table 1 Catalytic reaction syste Components Concentration Vdh 2 μM Substrate molecules 10 mM NADPH 200 μM GDH 1 U Tris·HCl， pH 7.5 50 mM NaCl 100 mM PMβCD 0.05%， w/v Fdx 100 μg/mL Fdr 0.1 U/mL 表1. 催化反应体系