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user: 3. 结果与讨论 3.1. 涂层反射红外光谱表征 图2为不同投料量的DBTA涂层的红外光谱。可以看到，D 2 T 1 、D 1 T 1 和D 1 T 1 样品在3371 cm −1 附近出现的宽峰，是DBA中酚羟基O-H和TAEA中氨基N-H伸缩振动，在1600~1450 cm −1 处存在的吸收峰是苯环骨架的C=C伸缩振动峰，它是苯环特征吸收峰，来源于形成涂层的原单体DBA中的特征官能团。在1658 cm −1 附近的吸收峰是C=O、C=N的伸缩振动峰，归因于氧化的儿茶酚结构以及氧化儿茶酚与氨基之间发生的席夫碱反应。此外，在1330~1270 cm −1 是芳香族仲胺和叔胺的C-N振动峰，说明与苯环和伯胺基发生了迈尔克加成反应有关。红外结果显示，在316L SS表面上不同投料比都能成功构建DBTA有机转化功能涂层。 图2. 不同样品涂层表面的红外光谱 3.2. 涂层表面XPS分析 为进一步研究不同投料比的DBTA涂层中元素的化学键合状态，采用XPS对有机转化涂层中各元素进行了全谱扫描(图3(a))并对涂层中相关元素进行了高分辨图谱分析(图3(b))。全谱扫描结果如图3(a)所示，所有样品表面都出现了C、N、O的元素信号，而SS表面没有出现N元素的峰，其余样品C、N、O的元素信号明显加强，说明SS表面均有DBA和TAEA的沉积。进一步对C1s、N1的高分辨图谱进行曲线拟合，如图3(b)所示。C1s高分辨谱被分为五种可能的键合状态，C1：283.8 eV (苯环骨架的C)；C2：284.4 eV (脂肪族C-C、C-H)；C3：285.5 eV (脂肪族C-N、芳香族C-N)，分别归属于TAEA中的伯胺基以及TAEA与DBA迈克尔加成反应产生的芳香族C-N；C4：286.7 eV (芳香族C=N、C-OH)，C=N来自于席夫碱反应产生的芳香族结构；C5：288.3 eV (醌基和醛基C=O)。N1s高分辨谱可以分为四种键合状态，N1：399.0 eV (TAEA伯胺C-N)；N2：399.6 eV (芳香族C=N)；N3：400.2 eV (芳香族C-N)；N4：401.3 eV (TAEA叔胺C-N)。该结果表明DBTA有机转化涂层的成功构建，进一步证明涂层制备过程中DBA和TAEA发生了迈克尔加成和席夫碱反应形成交联分子粘附到基底材料上。 3.3. 表面官能团定量表征结果 作为一种生物材料表面有机转化功能涂层，表面官能团是后续生物功能化的基础。为了获得表面酚羟基和胺基的密度，分别用Micro-BCA和酸性橙(AOII)比色法对酚羟基和胺基进行选择性标记。如图4所示，相比于SS表面，DBTA涂层明显保留了大量的胺基和酚羟基官能团，官能团密度最大值分别为32.1 ± 1.9 nmol/cm 2 和25.3 ± 1.8 nmol/cm 2 。从图4(a)可以看出，随着胺分子比例的增加，胺基密度增大，D 1 T 2 样品的胺基密度达到最大值。从图4(b)可以看出，随着DBA分子比例的增加，酚羟基密度增大，D 2 T 1 酚羟基的密度达到最大值。结果表明，我们可以通过不同的投料比成功引入不同的官能团密度，实现涂层表面功能基团含量的可调控性。 图3. (a) SS、D 2 T 1 、D 1 T 1 和D 1 T 2 涂层的XPS全谱分析；(b) SS、D 2 T 1 、D 1 T 1 和D 1 T 2 涂层的C1s和N1s高分辨图谱 图4. 不同样品表面胺基官能团(a) 和酚羟基官能团；(b) 密度定量结果(0.001 < **P < 0.01， ***P < 0.001， mean ± SD， N = 5) 3.4. 血小板粘附实验 对于心血管植入材料而言，材料表面的抗凝血性能是首要解决的问题，因此我们评价了不同样品表面的血小板粘附与激活情况，从样品表面血小板SEM图片(图5(a))和血小板计数结果(图5(b))可以看出，D 1 T 2 涂层表面血小板粘附量明显多于SS和其余样品且血小板出现了聚集，D 2 T 1 、D 1 T 1 表面粘附量较少于SS样品，同时D 2 T 1 表面的血小板聚集程度低于其余样品，这归因于D 2 T 1 样品中原儿茶醛的含量最多，可以抑制血小板的聚集。从血小板粘附形态来看，文献已有报道血小板在材料表面粘附有5种形态，分别为圆形、树枝状、树枝状铺展、铺展和完全铺展的形态 [ 13 ]，激活程度依次提高。发现所有样品组均呈现不同程度的激活状态，血小板伸出大量伪足，其中D 1 T 1 和D 1 T 2 部分血小板完全铺展，激活程度高于SS表面的血小板，这是因为相比于SS表面，改性后的D 2 T 1 、D 1 T 1 和D 1 T 2 样品表面通过官能团定量表征存在大量胺基官能团，表面的胺基官能团呈正电性，可以促进带负电荷的血小板的粘附与激活，这与很多文献报道胺基表面可以促进血小板的粘附与激活相一致 [ 14 ] [ 15 ]。 图5. (a) 不同样品表面血小板粘附的SEM图像；(b) 不同样品表面血小板粘附计数结果(0.01 < *P < 0.05， 0.001 < **P < 0.01， ***P < 0.001， mean ± SD， N = 5) 3.5. 内皮细胞培养实验结果 心血管植入物表面内皮化对于植入材料而言是至关重要的，为了研究内皮细胞在材料表面的生长行为，我们评价了样品表面内皮细胞粘附与增殖实验。从图6(a)内皮细胞罗丹明染色照片可以看到，细胞培养1天时，三种涂层表面细胞数量没有明显差异，当培养3天后，所有样品表面细胞明显发生了增殖，其形态都呈椭圆形或者圆形，图6(b)显示了SS、D 2 T 1 、D 1 T 1 和D 1 T 2 涂层的内皮细胞CCK-8结果，可以看到内皮细胞培养1天时，三种涂层的CCK-8都与SS没有明显差异，培养3天后，D 2 T 1 、D 1 T 1 相比于SS吸光度值有所降低，D 1 T 2 略高于SS对照样而明显高于其余样品组，说明D 2 T 1 、D 1 T 1 对内皮细胞有轻微毒性，但D 1 T 2 有利于内皮细胞的增殖。已有研究表明，中低密度的酚羟基有利于内皮细胞的存活 [ 16 ]，表面官能团定量结果显示D 1 T 2 具有相对较低的酚羟基密度，因此会促进内皮细胞的粘附与增殖。 3.6. 平滑肌细胞培养实验结果 心血管支架表面抑制平滑肌细胞的粘附与增殖是降低支架再狭窄的有效途径之一，因为我们除了对内皮细胞，进一步研究了DBTA涂层与平滑肌细胞的相互作用。从图7(a)平滑肌细胞罗丹明染色照片可以看到，细胞培养1天时，三种涂层表面细胞数量没有明显差异，当培养3天后，所有样品表面细胞明显发生了增殖，D 2 T 1 、D 1 T 1 表面平滑肌形态都呈显正常的细长、纺锤状，而D 1 T 2 表面出现很多呈短棒状的平滑肌。图7(b)显示了SS、D 2 T 1 、D 1 T 1 和D 1 T 2 涂层的平滑肌细胞CCK-8结果，可以看到平滑肌细胞培养1天时，三种涂层的CCK-8都与SS没有明显差异，培养3天后，D 2 T 1 、D 1 T 1 相比于SS没有显著性差异，而具有高胺基密度的D 1 T 2 的吸光度值低于SS，对平滑肌的增殖有一定抑制作用，有研究表明高活性酚羟基表面对平滑肌细胞活力和增殖的抑制作用较弱，一定量的胺基能够抑制平滑肌细胞的增殖 [ 16 ]。 图6. (a) 不同样品表面内皮细胞免疫荧光图片；(b) 不同样品表面内皮细胞CCK-8结果(0.01 < *P < 0.05， 0.001 < **P < 0.01， mean ± SD， N = 5) 图7. (a) 不同样品表面平滑肌细胞免疫荧光图片；(b) 不同样品表面平滑肌细胞CCK-8结果(0.01 < *P < 0.05， mean ± SD， N = 5)