DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 4. 结果 1) 常氧、低氧、低氧缺糖条件下人肺腺癌A549、人胚肺成纤维细胞MRC-5的增殖活性(图1) 在常氧培养条件下，A549细胞增殖能力低于MRC-5细胞(P < 0.05)；在低氧培养条件下，A549细胞与MRC-5细胞增殖能力相当(P > 0.05)；在低氧缺糖培养条件下，A549细胞与MRC-5细胞增殖能力相当(P > 0.05)。A549细胞在常氧、低氧、低氧缺糖条件下培养，OD值呈升高趋势，表明A549细胞增殖活力逐渐增强，MRC-5细胞常氧、低氧、低氧缺糖条件下培养，OD值呈下降趋势，表明MRC-5细胞增殖活力逐渐减弱。 2) 常氧、低氧、低氧缺糖条件下人肺腺癌A549、人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞培养上清液PH值(图2) 在常氧、低氧、低氧缺糖条件下培养，A549、MRC-5细胞培养上清液PH值中比较分别P > 0.05，无统计学差异，表明A549、MRC-5细胞培养上清液PH值无差异，但在常氧、低氧缺糖条件下培养，A549细胞培养液的PH值略低于MRC-5细胞培养液的PH值。 3) 常氧、低氧、低氧缺糖条件下人肺腺癌A549、人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞的葡萄糖消耗量以及乳酸的生成量(图3、图4) 在常氧、低氧、低氧缺糖条件下培养，A549细胞对葡萄糖的消耗大于MRC-5细胞P < 0.01，A549细胞的乳酸生成量于MRC-5细胞的乳酸生成量P < 0.05，提示在无论常氧、低氧、低氧缺糖条件下，A549对葡萄糖的利用高于MRC-5细胞，进行有氧糖酵解，A549细胞的乳酸生成量高于MRC-5细胞。 4) 常氧条件下养阴扶正汤对人肺腺癌A549的增殖抑制作用(图5) 在常氧培养条件下，空白血清对A549的增殖无影响，随着养阴扶正方汤药物浓度的增加，对A549的增殖抑制作用亦逐渐增强，高剂量养阴扶正汤药物血清疗效最显著(P < 0.01)。 5) 常氧条件下养阴扶正汤对人肺腺癌A549细胞培养上清液PH值的影响(图6) 在常氧培养条件下，空白血清、低剂量养阴扶正方药物血清、中剂量养阴扶正方药物血清、高剂量养阴扶正方药物血清对人肺腺癌A549细胞培养上清液PH值的无影响(P > 0.05)。 6) 常氧条件下养阴扶正汤对A549细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成、ATP生成的影响(图7、图8、图9) 图1. 常氧、低氧、低氧缺糖条件下A549、MRC-5细胞的增殖活性 图2. 常氧、低氧、低氧缺糖条件下A549、MRC-5细胞培养上清液PH值 图3. 常氧、低氧、低氧缺糖条件下A549、MRC-5细胞的葡萄糖消耗量 图4. 常氧、低氧、低氧缺糖条件下A549、MRC-5细胞的乳酸生成量 图5. 常氧条件下养阴扶正汤对人肺腺癌A549的增殖抑制作用 图6. 常氧条件下养阴扶正汤对人肺腺癌A549细胞培养上清液PH值的影响 常氧培养条件下，空白血清对A549的葡萄糖消耗、乳酸的生成、ATP的生成无影响(P > 0.05)，随着养阴扶正方药物血清剂量的增高，葡萄糖的消耗、乳酸的生成、ATP的生成亦减少，高剂量养阴扶正方药物血清疗效最显著(P < 0.05， P < 0.05)，表明养阴扶正方能够抑制A549进行有氧糖酵解。 图7. 常氧条件下养阴扶正汤对A549细胞的葡萄糖消耗量 图8. 常氧条件下养阴扶正汤对A549细胞的乳酸生成量的影响 图9. 常氧条件下养阴扶正汤对A549细胞的ATP生成的影响
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user: 5. 讨论 有氧糖酵解为恶性肿瘤细胞的生长提供了能量及有利的场所，赋予了肿瘤细胞旺盛的生命力，也就是说有氧糖酵解推动了恶性肿瘤的生长。养阴扶正方由黄芪、党参、沙参、天冬、麦冬、生白术、山药、白花蛇舌草、绞股蓝、茯苓、文术等药物组成，具有益气养阴，解毒化瘀散结之功。本课题组前期研究发现养阴扶正方具有明确的抗肺癌的作用，能够改善肺癌患者的临床症状，总有效率76.3%，稳定瘤灶，提高患者的生存质量，减轻化疗毒副反应；抑制人肺腺癌A549细胞的增殖和迁移，促进肺癌细胞凋亡，抑制瘤灶中PI3K、p-AKT的表达、bcl-2蛋白的表达，降低瘤灶N-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2的表达，促进bax、野生型p53蛋白增加E-cadherin的作用 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] 本研究表明，人肺腺癌A549细胞利用葡萄糖进行有氧糖酵解，为肺癌细胞的生长提供能量和有利的酸性微环境，养阴扶正汤可抑制人肺腺癌细胞A549的有氧糖酵解，进而抑制了人肺腺癌细胞A549的增殖，其分子机制有待于进一步研究。
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user: 摘 要 提曼–伯朝拉盆地是排名在西西伯利亚盆地之后的俄罗斯第二大产油气盆地。盆地经历了被动大陆边缘盆地和前陆盆地2个发育阶段，沉积了以古生界为主的厚约12 km的地层。上奥陶–下二叠统共发育了4套烃源岩，其中上泥盆统多曼尼克组的页岩和泥灰岩最为重要，油气主要储于中、上泥盆统和石炭系–下二叠统储层，盆地共发育3套区域性和2套半区域性盖层。成藏组合以地层–构造油气藏为主，油气运移方式既有垂向运移又有侧向运移。区域上，油气大多分布在盆地中东部和南部的大型隆起区和前渊凹陷带。分析表明该盆地依然有较好的勘探前景，最大的潜力区是盆地陆上油气聚集区向北延伸到伯朝拉海域的部分。 关键词 :提曼–伯朝拉盆地，石油地质，油气分布，勘探潜力，俄罗斯 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 俄罗斯提曼–伯朝拉盆地油气资源丰富，油气勘探始于19世纪中叶，近年来屡有突破，稳产找新将依然是下一步工作的重点。Driscole (1995)等人认为盆地主要经历前寒武纪的早期拉张和石炭纪后的碰撞2个阶段 [ 1 ] ；Ulmishek (1988)等人指出富含有机碳的晩泥盆世多曼尼克组泥岩对全盆地的生烃贡献起主导作用 [ 2 ] ；Dedeev (1994)统计出盆地碳酸盐岩与碎屑岩比例为6:4，且提出多期次多方向油气运移方式 [ 3 ] ；Petroconsultants (1996)和Bogatsky (1993)统计发现油气探明储量主要来自构造圈闭，其次是地层圈闭，而板块碰撞导致的地层倒转为大型圈闭的形成提供了有利条件 [ 4 ] [ 5 ] 。 本文以最新获取的油田储量数据为基础，应用石油地质综合研究方法，从沉积演化、烃源岩、储集层、盖层、油气成藏组合与运移等方面归纳了该盆地的油气地质特征，分析了油气分布的规律及主控因素，预测了有潜力的勘探区域和层系，为进一步研究该盆地与下一步的勘探提供了有力的指导和依据。
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user: 2. 基础地质特征 2.1. 地质概况 提曼–伯朝拉盆地位于俄罗斯欧洲部分东北缘，行政区划属科米自治共和国和阿尔汉格尔斯克省涅涅茨基民族州。盆地东至乌拉尔山，西南到提曼山岭，北濒巴伦支海，轮廓为一个巨大的倒置三角形，面积约35 × 10 4 km 2 (图1) [ 6 ] [ 7 ] 。沉积地层以古生界为主，最大厚度约12 km。 该盆地地势平坦，西部和西南部的提曼山岭是一条北西–南东向延伸的低山脉，长达800~900 km，宽约40~400 km，是美晋河与伯朝拉河的分水岭。本地区海拔在南部200~250 m，北部可达470 m。提曼山岭以东是属于苔原覆盖的低丘陵平原。自西向东，主要构造有伊日马–伯朝拉凹陷、伯朝拉–科日瓦长垣、科尔文长垣、霍列伊维尔凹陷、瓦兰杰伊–阿齐瓦构造带等(图1) [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] 。 图1. 提曼–伯朝拉盆地区域构造图 2.2. 盆地演化及地层 提曼–伯朝拉盆地基底形成于贝加尔构造运动期(前寒武纪晚期)，由火山岩碎屑岩和变质岩组成 [ 10 ] 。沉积演化可简单的分为被动大陆边缘盆地和前陆盆地2个阶段 [ 1 ] [ 7 ] [ 8 ] 。 2.2.1. 被动大陆边缘盆地阶段 前里菲期–晚寒武世的拉张作用导致了北–北西走向的由火山岩充填的地堑带的形成。奥陶纪持续的拉张促使乌拉尔洋开启，而且在演化中的大陆架和斜坡上沉积了碳酸盐岩和碎屑岩。在早古生代，被动大陆边缘沉积了远源碳酸盐岩。到中泥盆世(艾菲尔期–弗拉期)，在浅海和滨海环境广泛沉积了大量碎屑岩，这些碎屑岩来源于早泥盆世地层倒转发生上拱产生的基底隆起形成的山脊。中弗拉期的沉降作用导致了浅海环境的形成，而且在陆架边缘和基底隆起周围形成了大量的碳酸盐礁体，被多曼尼克组富含有机质的页岩和泥灰岩所分开。 2.2.2. 前陆盆地阶段 乌拉尔洋在早石炭世开始闭合，使盆地发生倒转。在维宪期(早石炭世)，沉积了大量碎屑岩，被石炭系和下二叠世的石灰岩和蒸发岩夹层所覆盖。在萨克马尔–亚丁斯克期(早二叠世)，东欧板块和西伯利亚板块开始碰撞。挤压和逆冲作用导致了乌拉尔山西部前陆盆地的形成。前渊充填了晚二叠世到三叠纪的超过2000 m厚的磨拉石沉积物。 三叠纪北极隆升使盆地北部地壳减薄，而且使盆地向北倾斜：盆地北部地台区沉积了上二叠统和三叠系沉积物，而且近海部分被侏罗–白垩系沉积物覆盖。 中渐新世已存断层的再次活动被认为与北冰洋板块运动有关，这使得乌拉尔山和盆地内的地层倒转，造成了大规模的地层剥蚀。在陆上部分，上新统和第四系河湖相碎屑岩不整合覆盖在下白垩统和更年轻的沉积物之上 [ 8 ] 。 提曼–伯朝拉盆地沉积盖层以明显的角度不整合覆盖在里菲–文德系基底之上，而且地层较完整。沉积盖层厚度在提曼一带仅数百米，在地台的深洼地内为6~8 km，到前乌拉尔凹陷达10~12 km (图2) [ 7 ] 。
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user: 3. 油气地质特征 3.1. 生储盖特征 3.1.1. 烃源岩 盆地主要发育4套烃源岩，时间范围是晚奥陶–早二叠世(图2，表1)。其中最重要的一套是弗拉–法门阶(上泥盆统)多曼尼克组的暗色页岩和泥灰岩 [ 2 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] 。该地层的形成得益于中弗拉–杜内期的浅海封闭环境和低的沉降速率 [ 14 ] 。多曼尼克组的厚度范围为13~500 m，有机碳(TOC)含量较高，为0.1%~23.6%，镜质体反射率(Ro)为0.76%~1%，表明该套烃源岩成熟度较高，它在整个盆地广泛分布 [ 15 ] 。这套烃源岩有非常大的生烃潜力，在伊日马–伯朝拉凹陷质量最好。油气田在该组中的分布明显受多曼尼克组烃源岩的控制：在多曼尼克生烃区以外的区域没有油气显示。其余的烃源岩有下古生界碳酸盐岩、中泥盆统页岩以及下二叠统页岩和煤层 [ 8 ] [ 11 ] [ 12 ] 。 3.1.2. 储层 奥陶–三叠纪期间的浅海环境促成了多套储层的发育(见图2，表2)。其中主要储层分布在中-上泥盆统、中–上石炭统和下二叠统。 中泥盆统发育了一套滨海浅滩相砂岩 [ 16 ] ，孔隙度为12%~23%，渗透率可达上千mD。在上泥盆统渐变为裂缝和孔洞较发育的礁石灰岩和礁白云岩，喀斯特化明显 [ 17 ] ，孔隙度高达12%~30%，渗透率较高，储层总厚度在伯朝拉–科日瓦长垣达到最大值约2000 m。中–上石炭统储层以浅水陆架环境沉积的石灰岩和白云质灰岩为主 [ 18 ] ，孔隙度范围17%~30%，夹层可达1000 m厚，各个组之间横向连续。下二叠统储层孔隙度和渗透率变化较大，地层厚约200 m，沉积相包括盆地相、礁相和碳酸盐浅滩相，岩性以白云质灰岩为主 [ 9 ] 。 3.1.3. 盖层 3套区域性和2套半区域性盖层为盆地的油气保存提供了有效的封堵条件(图2，表3)。 上奥陶统–下志留统富硫碳酸盐岩、上泥盆世泥岩和粉砂岩、下二叠统泥岩和蒸发岩为分布于全盆地的区域性盖层。其中，下二叠统亚丁斯克阶泥岩以及空谷阶蒸发岩构成了盆地内最大油田——武克特尔油田的盖层 [ 8 ] 。 3.2. 油气成藏组合及运移 盆地共发育16套油气成藏组合，其中最主要的有4套，且都为地层–构造油气藏，它们是下古生界组合(石油储量占15%的)、中泥盆统–下弗拉阶碎屑岩组合(石油占23%，天然气占11%)、上泥盆统–杜内阶碳酸盐岩组合(石油占13%)和维宪–空谷阶组合(石油占21%，凝析油和天然气分别占到88%和77%) [ 8 ] 。 图2. 提曼–伯朝拉盆地地层柱状图 [ 8 ] Table 1 Statistics of source rocks in Timan-Pechora Basin [8 烃源岩 厚度(m) 岩性 时间 TOC(%) 干酪根 Ro(%) 沃尔库塔组 50~1300 泥页岩、煤层 早二叠世 0.5~25 III 0.68~0.98 多曼尼克组 13~500 页岩、泥灰岩 晚泥盆世 0.1~23.6 II 0.76~1 阿弗宁组 300~1200 泥岩 中泥盆世 0.5~0.7 II 0.80~1 伊日马–奥姆拉群 200~2000 碳酸盐岩 奥陶–早泥盆世 0.1~13.1 II 0.74~1 表1. 提曼–伯朝拉盆地烃源岩特征表 [ 8 ] Table 2 Statistics of reservoirs in Timan-Pechora Basin [8 储层 岩性 孔隙度(%) 渗透率(mD) 重要性 三叠系 砂岩 20~24 100~2000 次要 上二叠统 砂岩 18~25 140~500 次要 下二叠统 砂岩、碳酸盐岩 5~25 20~1000 主要 中–上石炭统 白云岩、白云质灰岩、灰岩 17~30 430~1000 主要 下石炭统 砂岩、粉砂岩 20~30 60~150 次要 中–上泥盆统 砂岩、碳酸盐岩 12~30 9~1200 主要 下古生界 灰岩、白云岩 6~15 平均100 有意义 表2. 提曼–伯朝拉盆地储集层特征表 [ 8 ] Table 3 Statistics of cap rocks in Timan-Pechora Basin [8 盖层 岩性 时间 厚度/m 范围 恰尔卡博日组 泥岩 早三叠世 130~400 半区域 余恩–雅克哈群和沃尔库塔组 泥岩、蒸发岩 早二叠世 50~300 区域 阿莱克辛组 泥灰岩、泥岩 下石炭世 - 半区域 基恩组和萨尔加耶夫组 泥岩、粉砂岩 上泥盆世 15~200 区域 伊日马–奥姆拉群 碳酸盐岩 奥陶–志留纪 - 区域 表3. 提曼–伯朝拉盆地盖层特征表 [ 8 ] 油气运移方式既有层内侧向运移，又有层间垂向运移 [ 3 ] [ 19 ] 。在提曼–伯朝拉盆地东北部的霍列伊维尔凹陷，上泥盆统储集层和烃源岩分布于同一层位，上覆盖层阻止了油气在垂向上的扩散，因此本地区该层系油气以侧向运移为主(见图3)。盆地经历了早期强烈的拉张作用和后期的改造，中部和北部长垣带发育了多条深断层，使得二叠系甚至更深层的油气沿着这些断层垂向运移到三叠系及以上浅部储层聚集成藏，在这些地区油气垂向运移比较明显(见图4)。 图3. 提曼–伯朝拉盆地东北部油气侧向运移模式图 [ 3 ] 图4. 提曼–伯朝拉盆地中部和北部长垣带油气垂向运移模式图 [ 3 ]
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user: 4. 油气分布规律及主控因素 提曼–伯朝拉盆地是排名在西西伯利亚盆地之后的俄罗斯第二大油气产区，自2012年以来年产油当量一直保持在20.0 × 10 6 t左右。据IHS资料显示(最新的统计资料是2009年，2010~2018年并未对该盆地做新的评估统计)，截止到2009年，提曼–伯朝拉盆地已探明石油储量为21.4 × 10 8 t，凝析油为1.0 × 10 8 t，天然气为1.18 × 10 12 m 3 ，总体油当量为33.0 × 10 8 t。其中石油占总储量的64.7%，凝析油占3.2%，天然气占32.1% (见图5，表4)。在已发现的油气田中，油当量超过1.0 × 10 8 t的有6个，按储量大小排列分别为武克特尔油田(4.1 × 10 8 t)、乌萨油田(2.3 × 10 8 t)、哈里亚金油田(1.7 × 10 8 t)、沃泽伊油田(1.5 × 10 8 t)、雅列格油田(1.3 × 10 8 t)和拉亚沃日气田(1.3 × 10 8 t)。这其中有3个分布在科尔文长垣 [ 8 ] 。 图5. 提曼–伯朝拉盆地油气储量比例图 在提曼–伯朝拉盆地，油气分布呈现明显的不均一性。区域上，油气主要分布在盆地的中东部(见图6)。该地区烃源岩已成熟，大型长垣隆起较发育，如科尔文长垣、伯朝拉–科日瓦长垣、切尔尼舍夫隆起带等，这些隆起有利于油气的聚集成藏，比如科尔文长垣上就发育了乌萨、沃泽伊和哈里亚金3个大型油田。与隆起带相间分布的凹陷带(如霍列伊维尔凹陷)也聚集了相当数量的油气。在盆地南部以发育前渊凹陷为主，该环境下容易发育大型油气藏，盆地内最大的油田武克特尔油田就发育在乌拉尔南部前渊凹陷——上伯朝拉凹陷的北部。因此，油气在区域上的分布主要受烃源灶和构造圈闭展布的控制。 层系上，石油主要储于中泥盆统(31.5%)和石炭系–下二叠统(25.5%)，天然气和凝析油主要储于石炭系–下二叠统，储量分别占到了77.8%和88.1%。从总的油当量而言，储量最多的层系是石炭系–下二叠统，占总量的44.3%，其次是中泥盆统，占总量的24.6% (见表4)。区域性盖层控制着油气的层系分布，优质盖层之下的储集层往往是油气易于富集的层系 [ 20 ] 。比如武克特尔油田就位于下二叠统余恩–雅克哈群和沃尔库塔组的一套区域性泥岩和硬石膏之下。 Table 4 Strata distribution of oil and gas reserves in Timan-Pechora Basin [8 层位 石油 凝析油 天然气 油当量 储量 所占比例 储量 所占比例 储量 所占比例 储量 所占比例 10 6 t % 10 6 t % 10 8 m 3 % 10 6 t % 三叠系 98.5 4.6 0.7 0.6 219.7 1.9 118.9 3.6 上二叠统 158.1 7.4 0.6 0.6 374.1 3.2 192.4 5.8 石炭系–下二叠统 545.2 25.5 91.2 88.1 9181.2 77.8 1462.7 44.3 上泥盆统 289.3 13.5 1.4 1.3 285.8 2.4 316.4 9.6 中泥盆统 672.6 31.5 9.6 9.2 1431.4 12.1 811 24.6 下古生界 373.9 17.5 0.1 0.1 305.2 2.6 401.4 12.2 总计 2137.5 100 103.5 100 11797.4 100 3302.8 100 表4. 提曼–伯朝拉盆地油气储量层系分布 [ 8 ] 图6. 提曼–伯朝拉盆地区域油气分布及剖面图
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user: 5. 勘探潜力区分析及有利区预测 油气发现过程分析表明，尽管该盆地已经历近百年的油气勘探，对于盆地的研究也较为成熟，但是每年新增的油气储量并没有明显减少的趋势，反而在近年来有小幅度的增长(图7)。据此认为，该盆地依然具有良好的勘探潜力。 图7. 提曼–伯朝拉盆地年增油气储量直方图 [ 3 ] 经过分析，在层系上应该继续把中–上泥盆统和石炭系–下二叠统作为重点勘探层位，尤其注意碳酸盐岩生物礁的发育层位。在区域上，要在生烃灶发育的区域，着重找构造和地层圈闭发育的地区，也就是继续以古隆起和前渊区凹陷作为重点勘探对象，由于大型古隆起已研究得比较成熟，可以考虑把重点放在勘探程度较低的次级隆起带上。最为重要的勘探潜力区是盆地延伸到伯朝拉海域的部分，因为它是陆上油气聚集区的外延部分 [ 16 ] [ 21 ] ，比如科尔文长垣、索罗金–瓦兰杰伊长垣和阿齐瓦凹陷等构造的陆上部分都已发现多个大型油气田，而与陆上部分处于相同古沉积环境、经历相同构造运动的海上外延部分也应该有大量的油气存在(图6)。
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user: 6. 结论 1) 提曼–伯朝拉盆地经历了被动大陆边缘盆地和前陆盆地2个演化阶段，发育多套生、储、盖组合，成藏组合以地层–构造油气藏为主。 2) 提曼–伯朝拉盆地的油气分布呈现出明显的不均一性。烃源岩发育区和构造圈闭展布区共同控制了油气的区域分布，而大型区域性和半区域性盖层又决定了油气在层系上的分布。大油气田主要分布在盆地的中东部的隆起带和南部前渊凹陷带，主要含油层系是石炭系–下二叠统。 3) 陆上长垣隆起和凹陷等油气聚集带延伸到北部海域的部分是下一步的重点勘探潜力区域，其次是陆上大油气田附近的小型隆起带，而上古生界依然作为层系上的勘探重点。
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user: 摘 要 目的：观察DKK4在结肠癌肝转移组织中的表达差异和DKK4基因对结肠癌细胞耐受5-FU的作用。方法：收集17例同时性结肠癌肝转移肿瘤组织，通过免疫组化分析原发灶和转移灶DKK4蛋白的表达差异。利用CRISPR-Cas9技术敲除人结肠癌SW480细胞DKK4基因，使用蛋白电泳和RT-PCR评估基因编辑效果，并分析DKK4表达对结肠癌细胞耐受5-FU杀伤的影响。结果：在17例结肠癌肝转移组织中，原发灶DKK4染色阳性率为20% (2/10)，肝转移灶染色阳性率70% (7/10)，提示肝转移灶DKK4蛋白表达明显高于结肠原发灶。利用CRISPR/Cas9技术成功敲除人结肠癌SW480细胞DKK4基因，在含有5%、10% 5-FU的培养基中，WT-DKK4 SW480细胞可继续增殖，但DKK4-KO SW480细胞则随5-FU浓度增加而加速死亡。结论：结肠癌肝转移灶组织中DKK4表达更高，且DKK4表达水平对结肠癌细胞耐受5-FU杀伤有极为重要的影响，提示DKK4可能是影响肿瘤耐受5-FU化疗的重要因素和潜在治疗靶点。 关键词 :DKK4蛋白，结肠癌肝转移，化疗耐药，基因编辑 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 研究背景 结直肠癌是全球肿瘤相关死亡率第二最高的恶性肿瘤 [ 1 ] ，其发病率和死亡率近年在我国有持续升高的趋势。尽管5-氟尿嘧啶类(5-FU)药物为基础的化疗方案能有效提高结直肠癌的无瘤生存率和晚期肿瘤的缓解率，但结直肠癌患者存在不同程度的5-Fu耐药 [ 2 ] ；且这种耐药性尚无有效地预测，一旦肿瘤对氟尿嘧啶类药物形成耐药，临床上难以逆转。因此，寻找一种能有效预测、减少或对抗肿瘤细胞5-FU耐药性形成的分子靶点，是提高结直肠癌临床疗效和降低死亡率的重要手段。 目前研究发现，人类DKK4 (dickkopf homolog 4)蛋白的表达水平与氟尿嘧啶类化疗耐药性有密切关系 [ 3 ] ：结肠癌组织中DKK4表达增多的患者多表现出对5-FU化疗耐药；转染DKK4-cDNA的结肠癌细胞可明显增强对5-FU的耐受性，并有较高的存活率。我们的前期研究也发现：肝转移瘤中DKK4 mRNA的表达水平明显高于结肠原发病灶(74倍)，两者组织DKK4 mRNA表达差异与其5-FU化疗敏感性差异相一致 [ 4 ] 。因此，本文章拟首先通过临床肿瘤标本检测对比原发肿瘤与肝转移瘤中DKK4蛋白的表达差异，再通过CRISPR-Cas9技术敲除人结肠癌细胞DKK4的表达，进行体外细胞培养和5-FU试验，初步分析DKK4表达对结肠癌细胞耐受5-FU的影响。
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user: 2. 研究方法 2.1. 实验材料 人结肠癌细胞株SW480由我院肿瘤研究所实验室传代和保存。细胞培养使用RPMI-1640细胞培养液(含10%新生小牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml)，在37℃、5%CO 2 培养箱中进行传代培养。转染后的SW480细胞使用相同培养方法和条件。 2.2. DKK4基因CRISPR/Cas9编辑敲除 2.2.1. DKK4-gRNA的设计 利用人类DKK4 DNA序列在软件上设计可行的gRNA序列(https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp)；根据所提供的可行gRNA序列选择3段合适的序列由OriGene技术公司进行gRNA质粒构建和包装。候选片段序列：1) 5’ ATGGTGGCGGCCGTCCTGCT 3’；2) 5’ TCCTGGACTTCAACAACATC 3’ (图1)。分别使用2条候选gRNA构建质粒进行后续体外细胞敲除实验，以确定效率最高的gRNA片段。 图1. CRISPR/Cas9工作原理 2.2.2. CRISPR/Cas9质粒转染和验证 转染前18~24小时将待转染的SW480细胞以3 × 10 5 个/孔接种于6孔板，待细胞扩增至5 × 10 5 个/孔。转染前15分钟先将gRNA和模板DNA等量混合于Opti-MEM，然后缓慢加入待转染细胞培养液中；转染24小时后更换新鲜培养液，并使用1.5 ug/ml puromycin (Gibco， A11138-03)进行药物筛选；72小时后将细胞以1:10传代扩增，继续使用1.5 ug/ml puromycin对阳性细胞进行筛选，并观察细胞荧光表达情况(有GFP荧光者代表转染成功)。经药物初步筛选后的DKK4 knock-out SW480人结肠癌细胞进行GFP荧光流式细胞分选。分选后的GFP阳性细胞继续培养72小时，待检测验证。 2.2.3. 细胞DKK4 knock-out效果验证 对经药物筛选和流式分选的阳性细胞进行DKK4蛋白水平(Western blot)和核酸水平(RT-PCR)检测：收集经转染的SW480结肠癌细胞，提取总蛋白。40 ug蛋白行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳转膜，室温封闭2 h，抗人DKK4一抗(Abcam， ab38589) (Origene， TA302466) 4℃孵育过夜，二抗室温反应2 h，DAB法显色结果，经凝胶成像系统处理分析，计算灰度值；以ß-actin为内参对照。 RT-PCR检测：按RNeasy试剂盒(QIAGEN)说明书操作步骤提取细胞DNA，提取后测OD260、OD260/OD280评估DNA含量与纯度。使用PCR反应体系(Origene公司)进行DKK4 RT-PCR基因表达分析。反应条件如下：预变性94℃ × 6 min；变性94℃ × 1 min、退火54℃ × 30 s、延伸72℃ × 1 min，40个循环；4℃恒温保存。PCR结果由BIO-RAD系统进行阅读和分析。 2.4. 体外细胞5-FU药敏实验和生长曲线绘制 将筛选阳性的SW480细胞以5 × 10 3 个/孔接种于培养板上进行培养，24小时后更换培养液并分别加入10 ug/ml、50 ug/ml的5-FU进行处理。每48小时更换一次新鲜培养液并行活细胞计数。记录每孔活细胞数变化并绘制曲线。 2.5. 免疫组化染色 收集2017年临床中进行同期手术切除的结肠癌肝转移病例，术前未接受抗肿瘤治疗。结肠原发灶和肝转移灶组织均经HE染色证实腺癌。免疫组化染色采用二步法进行：组织切片脱蜡、水化、修复抗原，PBS洗涤后加入3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，反应10分钟，稀释一抗孵育4℃过夜，PBS洗涤3次后二抗孵育室温30分钟，二氨基联苯氨(DAB)染色。DKK4阳性染色评分根据既往文献方法进行 [ 5 ] ：DKK4蛋白在肿瘤组织中定位于胞浆，按细胞着色程度评分为：棕褐色3分，棕黄色2分，淡黄色1分，无着色为0分。按着色细胞的数量评分：一个视野内着色细胞大于75%为4分，51%~75%为3分，11%~50%为2分，小于10%为1分，阴性为0分。最后两者相加，0~3分为阴性表达，4~6分为阳性表达。结果判断由2名病理科医师双盲阅片。 2.6. 统计分析 连续变量以均数 ± 标准差形式表示，用t检验进行比对分析；免疫组化实验结果采用半定量等级分析，用非参数检验进行比对。采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。以P < 0.05为具有显著性差异。
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user: 3. 结果 3.1. DKK4在结肠癌原发灶和肝转移灶的表达差异 从临床数据库中收集到17例同期进行结肠癌肝转移手术切除的病理组织，并进行DKK4染色分析。结果显示：17例结肠癌原发肿瘤中，DKK4染色阳性率35.3% (6/17)，肝转移灶染色阳性率70.6% (7/10)，P = 0.042 (表1)。显微镜下所见，在结肠原发病灶组织中DKK4蛋白主要定位于肿瘤细胞质边缘，胞质和胞核内较少阳性染色。肝转移灶组织中见DKK4蛋白较均匀分布于细胞质内，且染色较深(图2)。该部分结果进一步证实肝转移灶DKK4表达明显高于结肠原发灶。 Table 1 Differential expression of DKK4 protein in primary and liver metastases of colon cance DKK4蛋白表达(例数) P值 阳性 阴性 结肠原发灶 6 11 0.042 肝转移灶 12 5 表1. 结肠癌原发灶与肝转移灶DKK4蛋白的表达差异分析 图2. 结肠癌原发灶和肝转移灶DKK4蛋白的表达差异 3.2. CRISPR/Cas9敲除DKK4基因的效果 对人结肠癌SW480细胞进行CRISPR/Cas9敲除DKK4基因，转染和药物筛选后48小时见部分细胞呈绿色荧光(GFP阳性)，持续药物筛选后存活细胞均呈绿色荧光表达，生长状态良好，提示载体转染成功(图3)。收集经药物筛选和流式细胞分选的阳性细胞，蛋白电泳结果显示，阳性细胞中DKK4蛋白表达明显下降(图4)。RT-PCR结果亦显示阳性细胞中DKK4表达量接近空白对照水平。验证结果提示CRISPR/Cas9敲除SW480细胞DKK4基因的效果良好。 图3. 结肠癌原发灶和肝转移灶DKK4蛋白的表达差异 图4. CRISPR/Cas9敲除人结肠癌细胞DKK4后的蛋白表达情况 3.3. 转染细胞5-FU药敏试验 在正常培养基中，野生型DKK4和DKK4-KO SW480人结肠癌细胞的增殖过程无明显差异(图5(a))。在含有5%、10% 5-FU的培养基中，WT-DKK4 SW480细胞尚可继续保持增殖，但DKK4-KO SW480细胞则随5-FU浓度增加而加速死亡(图5(b))。 图5. 5-FU作用下野生型和DKK4-KO 人结肠癌SW480细胞的生长情况
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user: 4. 讨论 本研究首先通过临床肿瘤组织标本检测，证实肝转移灶中DKK4蛋白的表达明显高于结肠原发病灶；再通过CRISPR/Cas9技术敲除人结肠癌细胞DKK4基因，并进行5-FU药敏试验，结果显示敲除DKK4表达的结肠癌细胞对5-FU失去耐药性，在5-FU作用下比野生型细胞更容易死亡。该结果与既往研究提示DKK4能诱导肿瘤细胞耐受5-FU的结果相一致。 人类DKKs家族蛋白共有4种，DKK4是其中一种，也是目前为止了解最少的一个成员。DKK4最早由Krupnik等人在1999年首次报道 [ 5 ] ，目前已知人类DKK4基因定位于常染色体8p11.2~p11.1，蛋白分子量约34kDa [ 6 ] 。在正常成人的组织中DKK4表达量比较低，但在炎症和肿瘤等病理状态下可出现表达异常：如在溃疡型结肠炎、胃癌、食管癌、子宫内膜癌和肾癌组织均可检测到DKK4 mRNA或蛋白的表达升高 [ 7 ] - [ 12 ] ；而在肝细胞癌中DKK4蛋白多呈表达下调，可能与肝癌细胞中DKK4基因常有杂合性丢失有关 [ 13 ] [ 14 ] 。结直肠癌中DKK4的表达状态目前尚有争议：有研究显示结直肠癌组织中DKK4 mRNA表达明显高于周围正常粘膜，但也有报道认为DKK4在结肠癌细胞中呈表达下调；且在不同人结肠癌细胞系中DKK4表达水平也有差异 [ 15 ] 。而作者既往的研究和本研究结果均证实，肝转移灶中DKK4蛋白和mRNA的表达水平均明显高于结肠原发病灶。这也与临床上常见化疗过程中结直肠癌原发灶比肝转移灶更容易出现退缩的现象相符。文献报道也认为，结直肠癌细胞中DKK4的表达增多可增加细胞自身对5-FU的耐受性：Ebert等对74例接受以5-FU为基础的辅助化疗的结直肠癌患者进行疗效和病理分析，结果也显示化疗的有效性与肿瘤组织中TFAP2E的甲基化状态和DKK4的表达水平密切相关，且不受MSI状态、5-FU代谢途径的影响 [ 3 ] 。 目前认为DKK4的表达主要受转录因子AP2E (Transcription Factor AP-2E， TFAP2E)的甲基化状态影响：TFAP2E的高度甲基化可激活DKK4启动子，增加DKK4的转录和表达 [ 3 ] ；结直肠癌和胃癌组织标本的检测结果也显示，肿瘤DKK4蛋白表达水平、细胞TFAP2E甲基化程度及肿瘤对5-FU化疗敏感性三者间密切相关，揭示TFAP2E很可能通过DKK4介导作用增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] ，但具体机制仍未明确。而根据DKK4的生物学活性，目前认为DKK4是经典Wnt信号通路的一个拮抗剂，主要抑制上游FZD-Wnt低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (LRP5/6)复合物的形成，继而阻断Wnt信号的下传，使胞内β-catenin维持磷酸化，最后被蛋白酶体降解而无法在胞核内积聚 [ 14 ] 。在肾癌模型中，当上调肿瘤细胞DKK4的表达后，可观察到一系列Wnt/β-catenin靶基因的表达下降 [ 19 ] 。然而，新近研究发现，某些情况下过表达DKK4对肿瘤有促进作用：如对低表达DKK4的人结肠癌细胞系DLD-1进行过表达修饰，可明显增强肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力，沉默表达DKK4后这些细胞功能则受到抑制 [ 20 ] 。因此，虽然DKK4被认为是Wnt/β-catenin信号通路的一个抑制物，但其对某些肿瘤的促进作用提示DKK4的功能可能不仅仅涉及Wnt/β-catenin。而DKK4如何增强肿瘤对5-FU耐受性的机制仍未清楚。 总括而言，本研究通过观察性研究证实肝转移灶组织中DKK4的表达明显高于结肠癌原发灶，并利用CRISPR/Cas9技术敲除DKK4基因，发现DKK4对结肠癌细胞耐受5-FU杀伤有极为重要的作用。但本研究仅局限于体外细胞的基因敲除试验，相关分子机制及通路仍有待深入探讨和研究，并需更多动物试验和临床数据进一步验证DKK4在5-FU化疗耐药中的重要性。
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user: 5. 结论 结肠癌肝转移灶组织中有更高水平DKK4表达，且DKK4表达水平对结肠癌细胞耐受5-FU杀伤有极为重要的影响，提示DKK4可能是影响肿瘤耐受5-FU化疗的重要因素和潜在治疗靶点。
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user: 摘 要 目的：探讨细胞遗传学染色体核型分析技术联合间期荧光原位杂交(FISH)对多发性骨髓瘤(MM)患者异常核型检测的灵敏度及其在临床诊断中的应用价值。方法：回顾性的分析了82例确诊MM患者同时采用常规细胞遗传学染色体核型分析方法及FISH技术(使用经浆细胞富集后的细胞)检测患者核型异常情况，比较两者的阳性率。结果：在进行常规染色体核型分析的82例患者中有7例(8.64%)发现异常核型；其中4例为复杂核型。74例为正常核型，1例(1.22%)未见分裂相。在同时进行FISH检测的这82例患者标本中47例(57.31%)存在异常核型。联合进行常规染色体核型分析和FISH检测的82例患者异常核型检出49例(59.76%)。结论：常规染色体核型分析联合间期荧光杂交技术检测可显著提高MM患者异常检出率，为临床治疗和预后评估提供线索。 关键词 :染色体核型分析，间期荧光原位杂交技术，多发性骨髓瘤 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma， MM)，是一种单克隆B淋巴细胞恶性增殖的浆细胞恶性肿瘤 [ 1 ] ，多发生于中老年人，且男性发病率略高于女性 [ 2 ] ，症状复杂多样，主要临床表现为高钙血症、反复感染、贫血、肾功能不全和骨质破坏等靶器官损害 [ 3 ] 。目前仍无法治愈。细胞遗传学是近年来研究最多的MM预后分层因素之一。研究认为MM患者的临床表现，疾病过程及预后的异质性与MM细胞的不同生物学特性密切相关，而决定MM细胞不同生物学行为的核心因素是细胞的不同遗传学特征。MM的遗传学改变多为同时包含数量和结构改变的复杂核型异常，所有23对染色体均有受累。目前应用比较多的细胞遗传学异常危险分层是Mayo Clinic提出的MM危险分层(Mayo stratification of myeloma and risk-adapted therapy， m SMART)见表1，依据患者的细胞遗传学结果将患者分为低危组、中危组和高危组三组，不仅可以评估患者的预后，而且具有指导治疗的价值，根据患者染色体异常进行危险分层治疗 [ 4 ] 。由此可见，MM的细胞遗传学数量和结构的异常检测率有着非常重要的意义。但是常规的染色体核型分析阳性率很低，本研究联合FISH方法，发现可以极大提高阳性率，增加对临床的指导意义。
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user: 2. 资料和方法 2.1. 病例资料 收集上海金域医学检验所2017年02月~2018年04月确诊为多发性骨髓瘤的患者标本同时检测骨髓染色体核型分析和间期荧光原位杂交。其中男性患者50例，女性患者32例，男女比例为1.56:1，82例患者年龄范围为44~84岁，中位数年龄为64岁。(伦理许可申明：我们是商业化检测公司，对各医院送检标本进行常规检测，检测后不保留患者标本，及时按照国家和公司规定处理残留的标本。本文只是对病例资料进行回顾性总结，不涉及患者隐私和利益，对患者无不利影响)。 Table 1 mSMART hazard stratificatio 危险分层 分层标准 高危 FISH: del (17p)， t (14;16)， t (14;20) GEP：高危标志 中危 FISH: t (4; 14) 常规核型分析技术检出del (13) 亚二倍体 浆细胞标记指数 ≥ 3% 低危 其他异常包括FISH检出t (11; 14)， t (6; 14) 表1. mSMART危险分层 注：mSMART为Mayo骨髓瘤分层及风险调整治疗；FISH为荧光原位杂交；GEP为基因表达谱。 2.2. 检测方法 2.2.1. G显带染色体核型分析 无菌抽取患者骨髓2 ml~3 ml (肝素钠抗凝)，按1 × 10 6 /ml~2 × 10 6 /ml每个标本接种两瓶培养基， 其中一瓶添加l ps刺激剂，培养3天，另一瓶不加l ps的培养2天。收获前，分别加入20 ug/ml秋水仙素20 μl混匀，放入37℃孵育箱继续培养，4小时后收获。1300 rpm离心10 min，弃上清液；加入0.075 M KCl溶液(预温至37℃) 8.0 ml左右，轻轻混匀，置37℃温浴35 min；沿着管壁缓缓加入1 ml固定液(甲醇：冰醋酸 = 3:1)，轻轻地混匀，1300 rpm离心10 min (室温)；离心后弃上清液，缓慢加入固定液约8.0 ml，混匀，放置45 min固定；1300 rpm离心10 min，离心后弃上清液，加入固定液约8.0 ml，混匀，放置12小时(过夜)固定；离心1300 rpm离心10 min，弃上清液，加适量固定液配成细胞悬液。制片后置于90℃的烤箱中烘烤1.5小时。冷却后胰酶消化，姬姆萨染液染色。每例标本分析20个中期分裂相依据《国际人类染色体命名系统》《ISCN2016》做出诊断报告。根据克隆的标准，至少两个细胞有同样的染色体增加或结构异常，或至少三个细胞有一致的染色体丢失。肿瘤细胞遗传学检查时只有克隆性异常才有报告价值，判断为阳性。 2.2.2. FISH检测 使用CD138磁珠分选富集浆细胞：将外周血(使用30 μm滤过器)或骨髓血(使用100 μm滤过器)通过滤过器，去除血凝块、骨块；每1 ml血液加50 μl全血CD138磁珠，充分混匀后在2℃~8℃孵育15分钟；然后每1 ml血液加2 ml~5 ml autoMACS Running Buffer (裂解红细胞)，室温445 × g离心10分钟；去上清，通过加等体积autoMACS Running Buffer重悬细胞沉淀；将经过3 ml autoMACS Running Buffer冲洗的全血过滤柱置于磁力架上，加入细胞悬液，使用3 × 3 ml autoMACS Running Buffer过柱；将全血过滤柱从磁力架上拿下来置于一新的收集管中，加5 ml Whole Blood Column Elution Buffer，将吸附柱上的细胞洗脱，加autoMACS Running Buffer制成细胞悬液；每个检测探针滴一张片，放入56℃烤箱中烘烤2小时，将玻片浸入50 ml 2 × SSC中，2缸各洗涤3 min；于70%、80%、100%酒精中依次放置3 min进行梯度脱水(≤6个载玻片/缸)；风干玻片；用0.2 ml EP管混合探针(0.5 µl~1.0 µl)和缓冲液(探针：缓冲液 = 1:10)，按检测项目依次混合好探针，在杂交区域加入足量的探针(5.0 µl~10.0 µl)，再加上合适大小的盖玻片封盖检测区域，用封片胶封闭盖玻片四周。运行Thermo Brite™程序，参数如下：75℃度变性5 mins，37℃杂交14 h~18 h；从−20℃取出DAPI II，置于室温解冻，加50 ml杂交后洗涤缓冲液(0.4 × SSC/0.3% NP-40)至考普林缸内，水浴升温至72℃ ± 1℃，至少保留30分钟；再取一个考普林缸(Coplin缸)，加入50 ml杂交后洗涤缓冲液，室温放置；用镊子小心的揭开封片胶，移去盖玻片，去掉玻片上多余的封片胶，将载玻片浸没在72℃ ± 1℃的杂交后洗涤缓冲液内3分钟(≤6个载玻片/缸)；从洗涤缓冲液中取出所有载玻片，暗室直立风干(使用密闭抽屉或密闭室内的架子即可)；在载玻片目标区上加入10 μL的DAPI II复染液，盖上盖玻片。在进行信号计数之前，将载玻片置于玻片盒。选择好合适的滤光片后，开始计数细胞中的杂交信号，信号分析采用Meta systems ISIS分析软件(Isis V 5.5.3/5.3.3)，每例计数200个间期细胞，计算阳性细胞百分比。阳性细胞比率大于正常域值者为阳性。FISH检测的探针包括RB1，CKS1B/CDKN2C (P18)，IGH，IGH/CCND1，IGH/FGFR3，TP53/CEP17，13q14.3/13q34(D13S319/LAMP1)，IGH/MAF。(注：CUT-OFF值说明：实验室开展项目之前需进行方法学验证，建立自己实验室的CUT-OFF值)。 2.3. 统计分析 以百分比来表示染色体核型异常的阳性率，常规染色体分析与FISH的阳性率比较用卡方检验，采用STATA11.0统计软件，P < 0.05认为有统计学差异。
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user: 3. 结果 1) 常规染色体核型分析82例MM患者标本，1例培养失败。7例为阳性(其中4例为复杂核型)，阳性率为(7/81， 8.64%)。同时进行FISH检测的82例MM标本，47例阳性，阳性率为(47/82， 57.31%)，同时进行核型分析和浆胞富集后的间期荧光原位杂交实验，总阳性率为(49/82， 59.76%)。有2例染色体结果阳性FISH结果阴性，原因为染色体核型分析检测出复杂核型，而FISH探针未覆盖异常的染色体位点。常规染色体分析与FISH的阳性率存在显著统计学差异，P值 < 0.001。两种方法学检测的阳性率比较见表2。 Table 2 Positive rates of MM by different method 检测方法 例数 阳性数 阳性率(%) 染色体核型分析 81 * 7 8.64 FISH 82 47 57.31 染色体核型分析+FISH 82 49 59.76 表2. 不同方法学检测MM阳性率情况 * 有一例患者无分裂相 2) 82例MM标本通过FISH检测分析发现47例为阳性，探针阳性分布(表3)：RB1探针检测的13q14缺失25例，占总阳性比为53.19%；CKS1B/CDKN2C (P18)探针检测的1q21扩增拷贝阳性34例，占总阳性比为72.34%；IGH探针检测的IGH重排阳性16例，占总阳性比为34.04%；IGH/CCND1探针检测的t (11; 14)阳性2例，占总阳性比为4.25%；IGH/FGFR3探针检测的t (4; 14)阳性8例，占总阳性比为17.02%；TP53/CEP17探针检测的17p13.1阳性6例，占总阳性比为12.77%；13q14.3/13q34 (D13S319/LAMP1)检测的13q14.3阳性3例，占总阳性比为6.38%；IGH/MAF探针检测的t (14; 16)阳性为0，阳性率为0.00%。 Table 3 Positive probe distribution ratio in 47 M 探针名称 检测位点 阳性数 阳性率(%) RB1 13q14缺失 25 53.19 CKS1B/CDKN2C(P18) 1q21扩增拷贝 34 72.34 IGH IGH重排 16 34.04 IGH/CCND1 t (11; 14) 2 4.25 IGH/FGFR3 t (4; 14) 8 17.02 TP53/CEP17 17p13.1 6 12.77 13q14.3/13q34(D13S319/LAMP1) 13q14.3 3 6.38 IGH/MAF t (14; 16) 0 0.00 表3. 47例多发性骨髓瘤FISH检测阳性探针分布比率
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user: 4. 讨论 通过本研究发现：同时联合检测常规染色体核型和FISH可以极大提高多发性骨髓瘤阳性检出率，从8.64%提高到59.76%。常规细胞遗传学方法的染色体异常检出率低有以下几点原因：1) 骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，增殖缓慢，骨髓浸润程度不同。2) 染色体核型分析只能检测分裂中期的染色体，并且只分析20个细胞。3) 对染色体质量要求较高，异常的细胞有时形态很差，难以分析辨别。4) 核型分析分辨率低，对于一些微小片段丢失，例如RB1缺失，隐匿的异常，例如t (4; 14) (p 16; q 32)核型分析肉眼难以发现。FISH检测阳性率高。FISH的优势在于，1) 不仅可以分析中期分裂相细胞，也可以分析大量间期细胞，分析细胞数是染色体的10倍数量级，2) 可以发现并分析20 Kb的微小染色体缺失或畸变，能够对已知序列片段的变化进行高度敏感而特异的检测，特别是染色体显带不易分辨的倒位、丢失以及复杂的染色体异常改变。3) 通过浆细胞富集更可以提高检测标本中浆细胞比例，进一步提高检出率。FISH 检测技术的应用可以弥补常规染色体核型分析技术的不足之处。但是FISH检测是用已知的探针检测靶基因的技术，且它的探针是有限的，不能覆盖全部染色体，对于不确定的染色体异常及涉及到多条染色体复杂核型，非常见的异常，FISH技术难以检测。而常规染色体核型分析则不受此限制。所以也需要检测染色体。如本研究中，就有2例患者染色体阳性，但是FISH未发现。 国外也有类似报道，在多发性骨髓瘤的检测中，核型分析常得到正常的结果，FISH对于有临床意义的异常染色体(例如13q-，17p-，IGH重排)的检测具有更高的灵敏度。但是核型分析检测出的复杂结构和数目异常FISH则无法检出。13q-，IGH重排和亚二倍体等核型均是MM重要的预后因素，表明对于多发性骨髓瘤，联合使用核型分析和FISH检测对临床具有重要意义 [ 5 ] 。 根据我们的研究，国内MM中最常见的核型异常有1q21扩增拷贝，13q14缺失，IGH重排，t (4; 14)，P53缺失。在多发性骨髓瘤中，17p13.1 (抑癌基因位点P53)的缺失导致TP53的杂合性丢失，被认为是MM高危特征。存在TP53缺失的MM患者无进展生存时间(PFS)和OS较短 [ 6 ] 。1号染色体异常也是多发性骨髓瘤常见改变。1q21的获得/扩增与疾病的进展和不良预后有关 [ 7 ] 。RB1基因缺失多见于多发性骨髓瘤(MM)。染色体13q-常伴随17p-，1q+和(或) t (4; 14)，单独13q-不是独立预后因素。13q-的预后不良与17p-，1q+和(或) t (4; 14)的发生有关。位于14q32位点上的IGH基因(编码免疫球蛋白重链)重排，最常见的三种易位按出现频率高低依次是t (4; 14) (p16; q32)，t (11; 14) (q13; q32)和t (14; 16) (q32; q23)。一些研究证实t (4; 14)和t (14; 16)是影响MM患者生存的独立预后不良因素。t (11; 14) (q13; q32)对PFS和OS均无显著影响 [ 8 ] 。 因此联合应用染色体核型分析，浆细胞富集后的FISH检测，可以提高MM患者染色体异常的检出率。两者应该联合应用可以更全面准确发现MM患者的异常核型，更好地为临床提供治疗指导和预后评估。
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user: 摘 要 目的：研究双酰基取代单环β-内酰胺类化合物对脑胶质瘤细胞(U87)、宫颈癌细胞(HeLa)、肝癌细胞(HepG2)3种肿瘤细胞和1种正常细胞间充质干细胞(MSC)的体外抗肿瘤活性。方法：采用MTT法测定了不同药物浓度对细胞的抑制作用，以半数抑制浓度(IC 50 )评价目标化合物的抗肿瘤活性。结果：实验结果表明双酰基取代单环β-内酰胺对U87、HeLa、HepG2和MSC正常细胞都具有一定的抑制作用，其中，化合物5a对HepG2细胞增殖的抑制活性最强，其IC 50 值为8.15 μmol/L。结论：初步的体外抗肿瘤活性测试显示双酰基取代单环β-内酰胺类化合物具有抑制肿瘤细胞的生长，表现出潜在的抗肿瘤活性。 关键词 :双酰基取代单环β-内酰胺，体外抗肿瘤活性研究 Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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user: 1. 引言 肿瘤对人类的健康和生存构成重大威胁，是世界面临的最重要的社会问题之一。目前，在临床上对于肿瘤的治疗手段主要是化疗方法，然而常用的抗肿瘤药普遍存在疗效低、毒副作用大、易产生多药耐药性等缺点 [ 1 ] [ 2 ] ，因此研究新型抗肿瘤新药是一项迫切且意义重大的任务。β-内酰胺作为一类重要的四元杂环骨架，是抗生素化合物的核心部分，具有杀菌能力强、毒性低和临床疗效好等优点。单环β-内酰胺是分子内含有吖丁啶2-酮结构的化合物，它除在抗细菌方面的应用外，还具有抗肿瘤、抗结核以及各种酶的抑制剂 [ 3 ] 。如单环β-内酰胺Combretastatin A-4类似物对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231具有较强的细胞抑制活性(图1)。因此其合成方法也备受人们的关注 [ 4 ] [ 5 ] ，特别是多组分反应合成β-内酰胺。例如，通过β-氨基酸、醛和异腈 [ 6 ] [ 7 ] 或β-酮酸、胺和异腈 [ 8 ] [ 9 ] 的Ugi 4C-3CR)一步合成β-内酰胺，也有应用Passerini或Ugi的缩合中间体合成β-内酰胺 [ 10 ] [ 11 ] 等。但2-芳酰基-2-氨酰基单环β-内酰胺的抗肿瘤活性少见报道，这里我们在前期研究基础上 [ 12 ] ，采用MTT (3-(4， 5-二甲基噻唑-2) 2， 5-二苯基四氮唑溴盐)法研究新型双酰基取代的单环β-内酰胺抑制肿瘤细胞增殖活性。 图1. β-内酰胺Combretastatin A-4类似物
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user: 2. 实验材料 2.1. 实验材料 人脑胶质瘤细胞(U87)、宫颈癌细胞(HeLa)、肝癌细胞(HepG2)间充质干细胞(MSC)由湖北医药学院胚胎干细胞湖北省重点实验室研究所科研工作站传代保种；实验药物参考文献方法 [ 12 ] ，以伯胺1、芳基酮醛2、异腈3和α-溴乙酸4各个组分的结构变化合成结构多样性的2-芳酰基-2-氨基酰基吖丁啶-4-酮衍生物5，合成路线和药物结构见图2。 图2. 双酰基单环β-内酰胺衍生物5的制备 2.2. 方法 2.2.1. 细胞培养 脑胶质瘤细胞(U87)、宫颈癌细胞(HeLa)、肝癌细胞(HepG2)和间充质干细胞(MSC，正常细胞)用RPMI-1640培养液于CO 2 孵箱中 37 ℃ 、5% CO 2 饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。 2.2.2. MTT比色法 将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5 × 10 4 个/mL，接种于96孔培养板，每孔接种100 μL，加入测试药物5a-5 h (用培养液稀释10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L不同浓度)，同时设阴性对照组(不加药)和阳性对照(顺铂)，每组均设4个复孔，37℃培养24 h，弃上清后加MTT (5 mg/mL) 100 μL，弃去上清液，加DMSO 100 μL，在平板摇床上摇匀，用全自动酶联免疫检测仪于495 nm波长处测定吸光度(OD)值，求出IC 50 。整个试验操作都在湖北医药学院干细胞研究湖北省重点实验室完成。 抑制率(%) = [A495(阴性对照)-A495(加药组)]/A495(阴性对照) × 100 2.2.3. 结果与讨论 实验数据以c ± s表示，数据分析采用SPSS17.0统计软件进行。用Origin软件，通过半对数拟合直线求IC 50 值，结果见表1。 Table 1 Antitumor activities of diacyl substituted β-Lactam derivatives 5 (IC50， μmol/L Compound Anti-proliferative effect (IC 50 ， μmol/L) U87 HeLa HepG2 MSC 5a 29.58 81.92 8.15 55.00 5b 68.11 82.71 36.76 62.35 5c 52.90 76.62 33.16 53.18 5d 41.80 83.92 17.75 12.00 5e 46.58 80.12 16.64 55.94 5f 58.00 75.00 11.30 31.18 5g 39.00 47.95 32.34 45.18 5h 16.64 42.35 20.66 18.94 Cis-platium 38.12 47.31 17.27 19.15 表1. 双酰基单环β-内酰胺衍生物5的抗肿瘤活性(IC 50 ， μmol/L) a Positive control. 根据测试数据显示双酰基取代单环β-内酰胺类化合物对脑胶质瘤细胞(U87)、宫颈癌细胞(HeLa)、肝癌细胞(HepG2)三中肿瘤细胞和一种正常细胞间充质干细胞(MSC)都能一定程度抑制细胞的生长，其中U87、HeLa表现出中等程度的细胞毒性，对HepG2肿瘤细胞表现较为突出，IC 50 值在8.15 μmol/L~36.76 μmol/L，基本与抗肿瘤药物顺铂活性一致(IC 50 值17.27 μmol/L)，对间充质干细胞(MSC)正常细胞IC 50 值多数在40 μmol/L~50 μmol/L范围，表现出比HepG2细胞较低毒性。基本构效关系分析显示R 1 和R 2 为叔丁基或正丁基的活性较好(如：5a、5f)，R 1 和R 2 为异丙基或环己基活性稍差一点(如：5c、5d)，但R 1 为苯基，R 2 为环己基时，也表现较好的活性(5 h)。
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user: 3. 结论 本文在前期研究基础上，通过体外药物活性试验，采用MTT法测定了双酰基取代单环β-内酰胺类化合物分别对U87、HeLa、HepG2和正常细胞MSC生长的抑制活性，结果显示该类化合物具有潜在的抗肿瘤活性。此研究结果为单环β-内酰胺衍生物的抗肿瘤药物研究奠定了一定的研究基础，对于开发新的先导化合物具有重要意义。