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user: 5. 念珠菌的耐药分子机制 念珠菌的耐药性问题日益严重，与此同时其耐药机理也逐渐研究透彻，主要体现在以下5个方面：1) 增强药物外排泵的表达；2) 药物靶酶过表达或突变；3) 药物靶标合成减少；4) 生物膜形成；5) 其他耐药途径。阐明耐药菌株的耐药性机理将有助于指导临床合理用药以及为新抗真菌药物的开发指明方向。 5.1. 增强药物外排泵的表达 念珠菌减少胞内药物浓度的机制之一是增强药物外排泵的表达，此机制主要体现在耐唑类药物方面。念珠菌细胞膜上有两种重要的耐药蛋白：ABC转运蛋白超家族(ATP binding cassette transporters， ABCT)和主要易化扩散载体超家族(major facilitator super-family， MFS)，两者都具有药物外排功能。念珠菌基因组上的ABCT家族能编码相应蛋白：Cdr1、Cdr2 (白色念珠菌)，CgCDR1，CgCDR2，CgSNQ2 (光滑念珠菌)，CpCdr1 (近平滑念珠菌)，CkAbc1 (克柔念珠菌)，CdCDR1 (都柏林念珠菌)，与氟康唑耐药有关 [ 19 ] [ 20 ] 。研究发现白色念株菌的Cdr1对氟康唑耐药性的影响比Cdr2p更大 [ 21 ] [ 22 ] 。而且Cdr1和Cdr2的表达是受锌簇转录因子Tac1 (Transcriptional activator of CDR)基因调控，目前已发现Tac1基因中有19种获得性功能(Gain-of-function， GOF)突变与氟康唑耐药性有关 [ 23 ] [ 24 ] 。 白色念珠菌、近平滑念珠菌与都柏林念珠菌的MFS中，Mdr1是与耐唑类药物有关的蛋白 [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] 。其受一种锌簇转录因子Mrr1的调控。研究表明Mrr1蛋白失活后会导致白色念珠菌对氟康唑耐药性的丧失 [ 28 ] 。在没有额外刺激的情况下，Tac1与Mrr1的GOF突变就能使转运蛋白编码基因处于活跃状态和固有的高水平表达 [ 29 ] [ 30 ] 。在光滑念珠菌中，Tpo3p转运蛋白与Pdr1转录因子与唑类耐药有关 [ 31 ] [ 32 ] ，但在其他的念珠菌中，尚未发现明显与唑类耐药相关的MFS转运蛋白。 5.2. 药物靶酶过表达或突变 由ERG11基因编码的羊毛甾醇14α-去甲基化酶(14DM)在真菌细胞膜成分-麦角甾醇合成途径中发挥关键作用。唑类药物通过与14DM结合发挥作用。ERG11基因的过表达能使14DM产生增多，从而保证在唑类药物作用下仍有足够14DM参与麦角甾醇合成，进而导致唑类药物耐药性的产生。锌簇转录因子Upc2调控ERG11基因的表达，其GOF突变是导致白色念珠菌ERG11基因上调表达的常见原因 [ 33 ] 。热带念珠菌耐唑类药物菌株中存在过表达ERG11基因，但光滑念珠菌与克柔念珠菌中，ERG11基因的过表达对耐药性的产生影响不大 [ 20 ] 。 ERG11基因突变是念珠菌耐药性产生的另一重要机制。在白色念珠菌ERG11基因中已发现超过140种大多在105~165，266~287和405~488位点的与唑类耐药有关的氨基酸置换 [ 34 ] [ 35 ] 。氨基酸的置换可通过另外两种途径引起唑类药物的耐药：1) 氨基酸置换位点位于与唑类药物结合的14DM位点，突变导致药物与靶酶的亲和力降低，如：V437I、S453F、N490K，Y132F，Y132H [ 36 ] [ 37 ] ；2) 14DM的空间结构改变，药物不易与靶酶结合，如：V51G，C75W，Y79D，V94G，T123I [ 37 ] [ 38 ] 。ERG11基因突变(Y132F位点)也在非白色念珠菌(如近平滑念珠菌与热带念珠菌)的耐唑类药物菌株中被发现 [ 26 ] [ 39 ] [ 40 ] 。 5.3. 药物靶标合成减少 两性霉素B作用于麦角甾醇的合成，两性霉素B压力筛选下，念珠菌通过降低麦角甾醇合成途径中的基因表达使麦角甾醇合成量减少，增强菌株自身的两性霉素B的耐药性。白色念珠菌中，干扰麦角甾醇合成中的相关基因(ERG2、ERG3、ERG6、和ERG11基因)则能减少麦角甾醇合成，ERG2，ERG3，ERG5和ERG11基因的缺失或同时突变会导致念珠菌对唑类和两性霉素B交叉耐药的产生 [ 35 ] [ 41 ] 。光滑念珠菌的CgERG6基因突变也与耐多烯类药物有关 [ 42 ] 。近平滑念珠菌的ERG3基因R135I错义突变与耐唑类药物相关 [ 43 ] 。 β-1，3-D葡聚糖是真菌细胞壁的组成成分，是棘白菌素的作用位点。其主要催化亚基由FKS1基因编码，该基因的点突变会导致棘白菌素耐药性的产生，FSK1基因的点突变主要位于两个不同的热点突变区域：HS1和HS2 [ 44 ] 。临床上分离得到白色念珠菌的FSK1突变主要发生在相应氨基酸区域640~650 (HS1)及1345~1365 (HS2)区域 [ 45 ] 。并且，发生在HS1的点突变S645P，S645Y，以及S645F能显著的降低白色念珠菌对棘白菌素的敏感性 [ 46 ] 。而近平滑念珠菌对棘白菌素耐药很可能是由于FSK1基因突变热点区域的自然多态性(P660A，P647A) [ 47 ] [ 48 ] 。耐棘白菌素药物的光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌中，FSK1基因也发生了点突变 [ 44 ] [ 49 ] 。 5.4. 生物被膜的形成 生物被膜是一种由真菌形成的富含多糖细胞外基质的微生物群落，能有效阻止药物进入细胞。形成生物被膜中的白色念珠菌对唑类药物的抗性比浮游菌高1000倍，抗棘白菌素类高2~20多倍 [ 50 ] [ 51 ] 。研究表明，白色念珠菌形成的生物被膜能对多种药物产生耐药 [ 52 ] 。生物被膜耐药的机制与以下几个原因相关：1) 细胞外基质形成物理屏障，防止抗菌药物进入细胞群落 [ 53 ] [ 54 ] 。2) 生物被膜各组分参与和维持生物被膜功能，如ABC与MFS转运蛋白参与生物膜的形成 [ 55 ] ，HSP90调节生物被膜的耐药功能 [ 56 ] [ 57 ] ，eDNA维持生物膜结构完整性和稳定性 [ 58 ] ，耐药株细胞补充被破坏的生物被膜 [ 59 ] 等。 5.5. 其他耐药途径 由ERG3基因编码的甾醇Δ 5，6 -去饱和酶在麦角甾醇生物合成后期发挥作用。唑类药物作用该酶位点，使得甾醇Δ 5，6 -去饱和酶会将无毒的14-甲基甾醇中间产物转化成细胞毒性甾醇14-甲基-3，6-二醇，并在细胞中积累，最终导致细胞死亡。因此，ERG3基因失活或缺失会阻止毒性物质积累，同时甾醇中间产物会转化为14-去甲基粪甾醇，该物质能部分替代麦角甾醇的功能，从而导致念珠菌对所有唑类药物的交叉耐药性的产生 [ 49 ] [ 60 ] 。同时，ERG3基因缺失后会导致细胞膜麦角甾醇的缺失，也表现出对两性霉素B的交叉耐药 [ 61 ] 。白色念珠菌中，已发现超过18种与耐药有关的ERG3基因位点突变，其中，W332R、H243N、T330A、A351V、K97E、V237A、D147G、K97E、L193P、A353T、D19E氨基酸置换菌株均对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等药物产生耐药，并发现在氟康唑或伊曲康唑的压力下，耐药菌株中14-甲基粪甾醇含量明显增多 [ 62 ] [ 63 ] 。 氟胞嘧啶在真菌细胞内发挥药效需要胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase， CD)和尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyl transferase， UPRT)的转化。真菌对氟胞嘧啶的耐药产生多是编码UPRT的FUR1基因突变以及编码CD的FCA1基因(白色念珠菌)或FCY1基因突变造成的 [ 64 ] [ 65 ] 。