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user: 3. 结果与讨论 3.1. 单因素实验结果 3.1.1. 酶添加量对还原糖含量的影响 在料液比1:12，酶解温度为90℃的小麦胚芽粉溶液中，分别按酶添加量为10、20、30、40、50 U/mL加入α-淀粉酶水解60 min。冷却至室温，取离心后的上清液测定还原糖含量，结果见图1。当酶添加量较低时，小麦胚芽酶解液中还原糖含量呈现显著增大的趋势。这可能是因为在酶解反应的初期，反应速率与酶含量成正比。增加酶含量，底物与酶充分接触、结合，淀粉颗粒迅速被降解成小分子的糖类，因此酶解液中还原糖含量不断增加。当继续增加酶浓度时，底物与酶分子的结合程度达到饱和，没有更多的接触位点与底物结合反应，还原糖含量趋于平缓。因此，α-淀粉酶酶添加量最适宜单因素浓度为40 U/mL，可得还原糖含量为(6.40 ± 0.009)%。 图1. 加酶量对还原糖含量的影响 3.1.2. 料液比对还原糖含量的影响 在加酶量为40 U/mL，酶解温度为90℃，酶解时间60 min的条件下，研究料液比1:8、1:10、1:12、1:14、1:16对酶解反应还原糖含量的影响。冷却至室温，取离心后的上清液测定还原糖含量，结果如图2所示。随着溶剂用量的增加，还原糖含量逐渐增大，当料液比在1:10时，还原糖含量达到最大值。随后再增大溶剂用量，还原糖含量随之降低。这可能是由于较大的料液比将淀粉酶和底物浓度稀释，酶解效果反而下降。因此，最适宜的料液比为1:10，还原糖含量为(9.48 ± 0.013)%。 图2. 料液比对还原糖含量的影响 3.1.3. 酶解时间对还原糖含量的影响 选取最适宜料液比1:10、加酶量为40 U/mL的小麦胚芽液，酶解温度90℃，考察酶解时间分别为30、45、60、75、90 min对酶解反应还原糖含量的影响。冷却至室温，取离心后的上清液测定还原糖含量，结果见图3。随着酶解时间的延长，还原糖含量先逐渐增大，超过60 min后还原糖含量随时间延长而逐渐降低，在60 min时出现最大值。酶解时间增加还原糖含量反而降低，可能是由于底物浓度的降低和产物的增加对反应的抑制作用。所以，最适酶解时间为60 min，还原糖含量为(11.62 ± 0.002)%。 图3. 酶解时间对还原糖含量的影响 3.1.4. 酶解温度对还原糖含量的影响 选取最适料液比1:10、加酶量为40 U/mL的小麦胚芽液以最适酶解时间60 min，在80℃-100℃的温度梯度下分别进行酶解反应。冷却至室温，取离心后的上清液测定还原糖含量，结果见图4。在80℃~90℃范围内，还原糖含量随着温度的上升而增加，这可能是由于淀粉在加热条件下吸水膨胀，更容易与淀粉酶接触反应。继续增加酶解温度，还原糖含量降低，这可能是因为高温下部分α-淀粉酶失活，酶解反应下降。所以，最适酶解温度为90℃，其还原糖含量为(13.75 ± 0.003)%。 图4. 酶解温度对还原糖含量的影响 3.2. 响应面法优化酶解条件 3.2.1. 响应面法优化实验设计 以α-淀粉酶加酶量、酶解时间及酶解温度为影响因素，酶解产物还原糖含量为响应值，采用Design-Expert. V8.0.6软件进行设计与分析，通过响应面法优化酶解工艺，实验因素水平设计见表1。 Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental desig 因素 水平 −1 0 1 A酶添加量/(U∙mL − 1 ) 35 40 45 B酶解温度/(℃) 85 90 95 C酶解时间/(min) 50 60 70 表1. Box-Behnken试验设计因素及水平 3.2.2. 响应面法的实验设计与结果 根据Box-Behnken试验设计原理，结合单因素实验结果，酶解工艺响应面优化的数据结果如表2所示。 Table 2 BBD and results for amylase hydrolysi 试验号 A:酶添加量/(U·mL −1 ) B:酶解温度(℃) C:酶解时间/(min) 还原糖含量% 1 1 (45) 1 (95) 0 (60) 12.97 2 1 0 (90) 1 (70) 14.74 3 0 (40) 0 0 13.65 4 −1 (35) −1 (85) 0 11.45 5 0 −1 −1 (50) 10.64 6 0 0 0 13.86 7 0 0 0 13.95 8 0 1 1 14.45 9 0 0 0 14.04 10 −1 1 0 12.17 11 0 1 −1 11.94 12 −1 0 1 13.05 13 0 −1 1 14.05 14 1 0 −1 12.02 15 0 0 0 14.32 16 1 −1 0 13.86 17 −1 0 −1 10.55 表2. 酶解反应响应面优化设计与试验结果 根据表2结果，利用Design-Expert. V8.0.6软件建立小麦胚芽粉酶解液还原糖含量(Y)对酶添加量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)的二次多项回归模型：Y = 13.964 + 0.79625A + 0.1925B + 1.39125C − 0.4025AB + 0.055 AC − 0.2225BC − 0.7645A 2 − 0.587B 2 − 0.6095C 2 。 还原糖含量(%)在回归方程中，A、B、C变量的正系数表明该变量的正向变化能引起响应值的增加，负的二次项的系数表明方程的抛物面开口向下，具有极大值点，能够进行最优分析 [ 10 ] 。 3.2.3. 模型的建立与显著性检验 利用Design-Expert. V8.0.6软件对各试验条件下的数据结果(表2)进行二次多元回归拟合，得到了方差分析结果，如表3所示。 Table 3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model on amylase hydrolysi Source SS Df MS F-Value Prob > F 显著性 Model 27.82 9 3.09 29.09 <0.0001 ** A 5.07 1 5.07 47.74 0.0002 ** B 0.3 1 0.3 2.79 0.1388 C 15.48 1 15.48 145.74 <0.0001 ** AB 0.65 1 0.65 6.1 0.0429 * AC 0.01 1 0.01 0.12 0.7457 BC 0.2 1 0.2 1.86 0.2144 A 2 2.46 1 2.46 23.16 0.0019 ** B 2 1.45 1 1.45 13.65 0.0077 ** C 2 1.56 1 1.56 14.72 0.0064 ** 失拟项 0.5 3 0.17 2.76 0.1756 纯误差 0.24 4 0.06 总和 28.56 16 R 2 0.97 R Adj 2 0.94 R Pred 2 0.71 Adeq Precision 17.5 表3. 酶解反应响应面模型的方差分析 注： ** .P < 0.01，差异极显著； * .P < 0.05，差异显著。 利用Design-Expert. V8.0.6软件进行二次多元回归拟合，由软件失拟项测试推荐的二次模型拟合实验数据，采用二次模型进行变异分析。回归方程中各变量对响应值(还原糖含量)影响的显著性由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高 [ 11 ] 。由表3方差分析结果可知，总回归方程模型F检验p值 < 0.0001，达到极显著的水平。决定系数R 2 = 0.97，纯误差 = 0.06，说明该模型与实际值拟合良好。并且回归方程的失拟项 = 0.1756 (>0.05)，失拟性不显著，说明未知因素对实验结果干扰很小，可以用于优化小麦胚芽淀粉酶解实验的理论预测。A (p = 0.0002)、C(p < 0.0001)这2个因素对试验模型是极显著的。这3个因素对酶解反应还原糖含量影响大小排序依次是C > A > B，即酶解时间 > 酶添加量 > 酶解温度。 3.2.4. 各因素交互作用对还原糖含量的响应面分析 通过观察图5中响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映酶添加量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)之间的交互作用对小麦胚芽淀粉酶解后的还原糖含量的影响，当等高线呈椭圆形或马鞍形时表示两因素交互作用显著，而呈圆形则表示两因素交互作用不显著 [ 12 ] 。 图5. 酶解反应三维响应面(A)、(B)、(C)和二维等高线图(a)、(b)、(c)，(a) 酶添加量与酶解温度；(b) 酶添加量与酶解时间；(c) 酶解温度与酶解时间 由图5(a)可知，酶添加量的变化曲面比酶解温度的变化曲面陡峭，说明酶解温度比酶解时间的影响更显著一些，与方差分析结果相符。由图5(b)可知，酶解时间的变化曲面和酶添加量的变化曲面均较陡峭，说明酶解时间和酶添加量对还原糖含量的影响均较显著，与方差分析结果相符。由图5(c)可知，酶解时间的变化曲面较陡峭，相比之下，酶解温度的变化曲面平缓一些，说明酶解时间较酶解温度对还原糖含量的影响显著，与方差分析结果相符。 3.2.5. 最佳条件的确定和回归模型的验证 响应面曲线及其等高线分析，模型方程优化求解表明，小麦胚芽酶解最佳工艺条件为酶添加量为44.05 U/mL，酶解温度为88.35℃，酶解时间为69.80 min，在此条件下得到的还原糖含量为14.98%。实际操作中稍作调整确定的最佳工艺条件为酶添加量44 U/mL，酶解温度88℃，酶解时间70 min，在此条件下进行验证实验，得到的还原糖含量为(14.75 ± 0.36)%，与模型的预测值基本相符。