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user: 3. 结果与讨论 3.1. 提取剂的选择 在选择样品前处理方法时，既希望尽可能多地提取咖啡的组分，又要考虑后续液相色谱测定的需要。考虑到通常饮用方法，首先尝试用水提取，但提取物十分复杂，呈棕色混悬液，离心10 min之后亦无改善，很难通过滤膜过滤，无法上机检测；水饱和的正丁醇提取成分由于糖类物质过多，导致色谱图基线显著提高，难以落平，色谱峰分离效果差，且液相色谱系统压力持续增大，多次测试会对液相色谱系统造成不利影响；考虑到糖类物质难溶于醇，所以尝试用乙醇提取咖啡组分，所得组分相对简单，也没有大量的糖类物质，但所得色谱图中除了氯原酸色谱峰比较突出外，基本无其它色谱峰，信息量太少，难以全面精确的表达咖啡的整体特征；采用甲醇提取咖啡组分，结果表明，提取物组分比较丰富，且无大量糖类物质，所得色谱图中氯原酸色谱峰突出，还有其它的不少的指纹峰，且分离度较好，信息量丰富，能够全面准确的表征咖啡本质特征，符合指纹图谱的要求，因此确定用甲醇作为咖啡指纹图谱前处理提取剂。 3.2. 流动相的选择 为了尽可能多地得到分离度较好的色谱峰，首先在很宽范围内120 min内有机流动相从5%增加到95%进行梯度洗脱尝试，结果发现，流动相的组成对色谱洗脱效果有显著影响。甲醇–水体系色谱峰响应较低，且基线不稳定，难以得到良好的色谱图；甲醇–乙酸铵体系，色谱峰的响应有所改善，但分离度不佳，众多小峰呈粘连状态；甲醇-0.1%甲酸水溶液体系，色谱峰响应高，约为甲醇–乙酸铵体系响应的两倍，且分离度较好，以绿原酸为主峰，左右各有数量不等的小峰，符合指纹图谱的要求，所以最终确定使用甲醇-0.1%甲酸水溶液体系作为流动相。在确定上述流动相体系后，在不显著降低色谱峰分离度的前提下进一步优化色谱条件，最终得到1.2.2节所述的色谱条件。 3.3. 咖啡标准色谱峰的建立 按照1.2节所述方法，采集90个纯咖啡样品的色谱图，经中药色谱图分析和数据管理系统分析处理获得咖啡标准图谱，作为对照指纹图谱，详见图1。 图1. 咖啡高效液相色谱标准指纹图谱(放大图为1-10#咖啡色谱图重叠结果) 3.4. 精密度实验 通过考察多次测定同一咖啡样品中主要成分绿原酸含量的结果，评价测定样品色谱图方法的精密度。首先配置绿原酸系列标准溶液，并按照1.2节所述色谱条件，建立起绿原酸的标准曲线，具体为Y = 8.56X + 0.94，R = 1.000。然后随机抽取90个纯咖啡样品中的1个样品，称取10个平行样品，并按照1.2节所述条件进行色谱测试，结合前述绿原酸标准曲线，计算出样品中绿原酸的含量。结果表明，10次平行测试结果的相对标准偏差(RSD)为3.4%，测定样品色谱图方法的精密度良好，具体数据如表1所示。 Table 1 Results of 10 times parallel measurements of chlorogenic acid conten N 保留时间 峰面积 峰高 称样量(g) 定容体积(mL) 浓度(μg/mL) 测定结果(%) 1 24.052 6458.6 307.8 0.9980 10 754.7 0.76 2 24.094 6876.4 320.3 1.0010 10 803.6 0.80 3 24.037 7085.6 329.7 1.0090 10 828 0.82 4 23.996 7043.7 328.9 1.0080 10 823.1 0.82 5 24.018 6941.5 321.4 1.0030 10 811.2 0.81 6 24.09 6611.5 307.7 1.0000 10 772.6 0.77 7 24.067 6926.5 321 1.0040 10 809.4 0.81 8 24.079 6642.5 308.6 1.0020 10 776.2 0.77 9 24.093 7225.8 336 1.0030 10 844.4 0.84 10 24.061 7081.5 330.6 1.0000 10 827.6 0.83 平均值 24.0587 6889.36 321.2 -- -- 805.1 0.8 RSD (%) 0.14 3.6 3.2 -- -- 3.6 3.4 表1. 同一样品绿原酸含量10次平行测定的结果 通过考察多次测定同一咖啡样品相似度的结果，评价测定样品相似度方法的精密度。随机抽取90个纯咖啡样品中的1个样品，称取6个平行样品，按照1.2节所述的测定样品色谱图，结合咖啡标准指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版计算出样品峰面积相关系数法的相似度，结果如表2和表3所示。 Table 2 Results of 17 characteristic peaks by 6 times parallel measurements HPLC fingerprin 编号 保留时间 S1 S2 S3 S4 S5 S6 对照指纹图谱 保留时间RSD (%) 峰面积RSD (%) 匹配数目 1 9.791 21.043 22.232 22.788 24.266 21.741 21.909 22.33 0.1 4.97 6 2 12.945 58.143 63.101 64.246 67.814 71.345 69.969 65.77 0.07 7.46 6 3 14.691 208.302 216.115 207.783 184.42 215.289 190.14 203.675 0.22 6.52 6 4 21.784 503.079 534.785 525.774 541.48 549.485 564.411 536.502 0.08 3.92 6 5 22.801 4073.729 4318.098 4336.369 4582.117 4466.375 4578.054 4392.457 0.05 4.39 6 6 23.324 1037.368 1085.278 1049.599 1104.312 1073.476 1068.55 1069.764 0.15 2.25 6 7 27.53 258.218 269.798 267.238 289.506 277.41 283.988 274.36 0.06 4.2 6 8 28.291 28.071 27.773 28.244 35.493 30.111 30.522 30.036 0.07 9.67 6 9 28.644 119.876 128.727 127.741 149.617 137.055 134.987 133 0.04 7.63 6 10 33.374 54.826 59.996 57.802 59.131 63.083 59.261 59.016 0.02 4.58 6 11 34.887 20.631 23.198 23.233 25.035 24.393 21.941 23.072 0.03 6.96 6 12 35.717 38.97 42.398 41.443 45.591 44.208 45.44 43.008 0.05 5.99 6 13 36.028 45.347 49.372 50.364 52.752 52.822 60.696 51.892 0.03 9.85 6 14 39.671 51.744 53.181 59.943 60.168 62.585 64.493 58.686 0.03 8.73 6 15 43.119 60.898 63.561 62.581 67.131 67.703 70.457 65.389 0.05 5.53 6 16 43.593 39.586 43.211 43.62 49.302 49.688 46.604 45.335 0.04 8.64 6 17 44.216 37.08 35.514 39.475 40.148 43.082 40.068 39.228 0.03 6.73 6 表2. 同一咖啡样品6次平行测试液相色谱指纹图谱17个共有峰结果 Table 3 Results of similarity calculation by 6 times parallel measurements HPLC fingerprin S1 S2 S3 S4 S5 S6 对照指纹图谱 S1 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.993 1.000 S2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.993 1.000 S3 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.994 1.000 S4 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.994 1.000 S5 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.994 1.000 S6 0.993 0.993 0.994 0.994 0.994 1.000 0.996 对照指纹图谱 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.996 1.000 表3. 同一咖啡样品6次平行测试液相色谱指纹图谱相似度计算结果 由表2和表3可知，该样品的液相色谱图中17个共有色谱峰，其保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于0.2%；峰面积的相对标准偏差(RSD)在10%以内。且液相色谱指纹图谱相似度皆大于0.99，测定样品相似度方法的精密度良好。 3.5. 相似度计算方法的选择 通过考察不同计算方法所得纯咖啡样品与标准指纹图谱相似度和掺假咖啡样品与标准指纹图谱相似度的差异，评价相似度计算方法的适用性。将黑大麦粉、巴西莓果粉、黑玉米粉按不同比例掺入咖啡样品中，得到咖啡掺假样品，按照1.2节所述的测定样品色谱图，结合咖啡标准指纹图谱，利用中药色谱图分析和数据管理系统计算出样品6种相似度。结果表明：峰面积相关系数法、峰高相关系数法、峰面积夹角余弦法、峰高夹角余弦法可以显著地反映出咖啡掺假结果。但是全图谱相关系数法和全图谱夹角余弦法效果不明显。在添加到10 wt%掺假物的情况下，全图谱相关系数法和全图谱夹角余弦法所得的相似度结果仍然居高不下，不利于结果的甄别。因此，本试验增加30 wt%和50 wt%的黑大麦粉掺假咖啡样品进行试验，结果如表4所示。 Table 4 Results of similarity calculation by using 6 methods of adulterated coffee from black barley flou N 峰面积相关系数法 峰面积夹角余旋法 峰高相关系数法 峰高夹角余旋法 全谱图相关系数法 全谱图夹角余旋法 1# 0.987810 0.978716 0.988183 0.985092 0.992887 0.991189 2# 0.970725 0.958788 0.991925 0.989346 0.996650 0.995763 3# 0.125629 0.005302 0.230029 0.073929 0.314785 0.376331 4# 0.229387 0.201627 0.212878 0.114877 0.290602 0.311343 5# 0.226341 0.123238 0.242357 0.119393 0.755483 0.802145 6# 0.222161 0.116166 0.234256 0.113483 0.802284 0.839435 7# 0.915157 0.908189 0.985407 0.975559 0.984982 0.986786 8# 0.984535 0.975745 0.995197 0.990122 0.997379 0.997529 9# 0.939517 0.917930 0.994112 0.980947 0.996017 0.996603 10# 0.970765 0.959108 0.990650 0.982033 0.996356 0.996824 11# 0.951665 0.941302 0.996285 0.989901 0.996946 0.997246 12# 0.941271 0.920100 0.974156 0.963130 0.989772 0.990642 13# 0.983077 0.961842 0.975984 0.966702 0.977252 0.977557 表4. 黑大麦粉掺假咖啡样品6种方法计算相似度结果 该试验中3#、4#、5#和6#为黑大麦粉掺假咖啡样品，其中5#和6#分别为50 wt%和30 wt%的大麦掺假咖啡样品，相对于其他4方法相似度在0.25以下，全图谱相关系数法相似度和全图谱夹角余弦法相似度均在0.75以上。很显然全图谱相关系数法和全图谱夹角余弦法相似度计算结果不符合纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品相似度小于0.4的标准，不适合用于鉴别咖啡方法中相似度的计算，而峰面积相关系数法、峰高相关系数法、峰面积夹角余弦法和峰高夹角余弦法适用于鉴别咖啡方法中相似度计算，且均由良好效果。 3.6. 可鉴别最小掺假量 通过考察本方法的可鉴别最小掺假量，评价本方法的鉴别能力。抽取纯咖啡样品和掺假咖啡样品组成测试组，按照1.2节所述的测定样品色谱图，结合咖啡标准指纹图谱，利用中药色谱图分析和数据管理系统计算出样品峰面积相关系数法相似度、峰高相关系数法相似度、峰面积夹角余弦法相似度和峰高夹角余弦法相似度，以纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4为标准，确定本方法对各种掺假物的可鉴别最小掺假量，结果如表5、表6和表7所示。结果表明，本方法对黑大麦粉、巴西莓果粉和黑玉米粉可鉴别最小掺假量均低至1 wt%，具有很强的鉴别能力。 Table 5 Inspection results of minimum adulteration amount of black barley flou N 峰面积相关系数法 峰面积夹角余旋法 峰高相关系数法 峰高夹角余旋法 1# 0.987810 0.978716 0.988183 0.985092 2# 0.970725 0.958788 0.991925 0.989346 3# 0.934867 0.930454 0.975295 0.966533 4# 0.973779 0.962235 0.994417 0.987005 5# 0.951987 0.916571 0.948415 0.938012 6# 0.932940 0.904161 0.957854 0.947072 7# 0.958898 0.948407 0.980428 0.967344 8# 0.215534 0.099108 0.231860 0.111468 9# 0.222161 0.116166 0.234256 0.113483 10# 0.226341 0.123238 0.242357 0.119393 11# 0.222608 0.112736 0.234244 0.112395 12# 0.229387 0.201627 0.212878 0.114877 13# 0.310854 0.121357 0.278201 0.054283 表5. 黑大麦粉可鉴别最小掺假量的考察结果 表5中8#，9#，10#，11#，12#，13#样品为掺假咖啡样品，分别是含1 wt%、2 wt%、5 wt%、8 wt%、10 wt%黑大麦粉的掺假咖啡样品。测试结果满足纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4的标准，可以确定本方法对黑大麦粉的可鉴别最小掺假量为1 wt%。 Table 6 Inspection results of minimum adulteration amount of Brazilian berry powde N 峰面积相关系数法 峰面积夹角余旋法 峰高相关系数法 峰高夹角余旋法 1# 0.253683 0.219390 0.202287 0.058474 2# 0.144190 0.060544 0.225249 0.141741 3# 0.143973 0.058387 0.221356 0.139467 4# 0.153879 0.067944 0.226606 0.143470 5# 0.136390 0.021145 0.231257 0.137735 6# 0.144601 0.022861 0.240862 0.142486 7# 0.947617 0.932628 0.942241 0.920048 8# 0.971091 0.967345 0.979105 0.965162 9# 0.940528 0.941124 0.963589 0.960850 10# 0.949318 0.900086 0.959273 0.946665 表6. 巴西莓果粉可鉴别最小掺假量的考察结果 表6中1#、2#、3#、4#、5#、6#样品为掺假咖啡样品，分别是含1 wt%，2 wt%，5 wt%，8 wt%、10 wt%巴西莓果粉的掺假咖啡样品。测试结果满足纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4的标准，可以确定本方法对巴西莓果粉的可鉴别最小掺假量为1 wt%。 Table 7 Inspection results of minimum adulteration amount of black corn flou N 峰面积相关系数法 峰面积夹角余旋法 峰高相关系数法 峰高夹角余旋法 1# 0.947617 0.932628 0.942241 0.920048 2# 0.940528 0.941124 0.963589 0.960850 3# 0.971091 0.967345 0.979105 0.965162 4# 0.949318 0.900086 0.959273 0.946665 5# 0.124083 0.015755 0.192189 0.056430 6# 0.163529 0.067663 0.240126 0.147115 7# 0.143973 0.058387 0.221356 0.139467 8# 0.173336 0.069592 0.248600 0.149735 9# 0.157593 0.065442 0.230494 0.143466 10# 0.164584 0.071107 0.232381 0.143518 表7. 黑玉米粉可鉴别最小掺假量的考察结果 表7中5#，6#，7#，8#，9#，10#样品为掺假咖啡样品，分别是含1 wt%、2 wt%、5 wt%、8 wt%、10 wt%黑玉米粉的掺假咖啡样品。测试结果满足纯咖啡样品相似度大于0.9，而掺假咖啡样品小于0.4的标准，可以确定本方法对巴西莓果粉的可鉴别最小掺假量为1 wt%。