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user: 3. 结果与讨论 3.1. 微流控CL芯片的设计和表征 基于MEMS技术和化学发光原理，以快速检测抗氧化活性物质为研究目标，设计了集成混合、氧化还原反应和化学发光检测功能区的微流控芯片。如图2所示。 所设计的芯片包含四个结构单元，每个结构单元含一个蛇形通道、一个高效混合通道、一个椭圆形检测区D、一个废液出口W以及A、B、C、E四个进液口。其中A、C分别用于待测样本和缓冲液的进液口，B、E分别用于H 2 O 2 溶液和发光试剂Luminol (含Cu 2+ )的进液口。芯片前端的蛇形混合通道用于样本或缓冲液与H 2 O 2 两者的预混合，后端的高效混合区用于待测样本及H 2 O 2 与化学发光试剂Luminol的快速混合反应区，混合区之后的椭圆形区域作为化学发光的检测窗口。所有通道深80.00 μm，宽200.00 μm，进液口直径为1.00 mm。椭圆形检测窗口体积约为0.60 μL。除椭圆形检测区，芯片其余部分均用黑胶布贴住，保证了光电倍增管接受的光信号全部来自检测区域。这种设计的优势在于：多流道可将空白、对照和样本同步分析测试；流道上的蛇型混合通道与环型混合器组合具有更为良好的混合效率，以保障化学发光试剂和样本的充分混合，提高检测结构的稳定性；采用中心废液出口，方便整个测试系统采用负压输液，并保证4条通路在测试过程中的一致性。 3.2. 微流控芯片CL测试条件的优化 3.2.1. 溶剂流速对发光强度的影响 为获得更多的发光信号，使得待测试样与化学发光试剂混合物通过检测口时，发出的最大强度的光恰好被光电倍增管(PMT)采集到，因此，控制好进液流速非常重要。如果流速过快，还没等到大部分光信号发射，混合溶液可能已经流入废液池了，相反，如果流速过慢，溶液在经过检测池之前已经在混合通道出现最大发射信号，那么检测池所检测到的信号会降低，这样都不利于提高化学发光的灵敏度。本实验采用微泵精确控制试剂的流速，检测流速在2.0~14.0 µL∙min −1 范围内与化学发光强度的关系，变化曲线如图2(a)所示。结果表明随着流速的增加CL信号强度也随之增加，当流速为10 µL∙min −1 时信号强度达到最大值，再进一步增加进液流速到14 µL∙min −1 时，CL信号强度逐渐减。当溶剂流速在2.0到10.0 µL∙min −1 范围内逐渐增加时，反应物的混合效率也逐渐增加，反应信号强度也随之增加；当流速由10.0 µL∙min −1 继续增加到14.0 µL∙min −1 时，反应物在反应、检测通道内的保留时间会降低，在有限的保留时间内最大发射光不会出现，从而导致发光信号强度降低。因此实验中采用10.0 µL∙min −1 的溶剂流速进行实验。 3.2.2. 试剂浓度对化学发光强度的影响 化学发光试剂对发光强度有直接的影响，有必要对二者的浓度进行优化。Luminol化学发光反应体系的最理想的pH范围是10.00~11.00，发光体系中碳酸盐缓冲液的存在能提高化学发光强度，实验所采用的缓冲液浓度为0.25 mol∙L −1 ，pH10.47。 实验对Luminol和H 2 O 2 的浓度对发光强度的影响进行了考察，Cu 2+ 浓度固定0.50 × 10 −3 mol∙L −1 H 2 O 2 浓度固定在1.00 mmol∙L −1 ，Luminol浓度在1.00 × 10 −5 mol∙L −1 到1.00 × 10 −3 mol∙L −1 之间变化，当Luminol浓度为0.50 mmol∙L −1 时发光信号强度达到最大值，增大浓度，化学发光强度基本不再增加，因此，采用0.50 mmol∙L −1 Luminol进行实验。 将Luminol浓度固定在0.50 mmol∙L −1 ，将H 2 O 2 浓度在1.00 × 10 −4 mol∙L −1 到0.01 mol∙L −1 之间进行变化，化学发光强度随H 2 O 2 浓度增大而增大，但是H 2 O 2 浓度过高，溶液易产生气泡，化学发光信号不稳定，因此，采用1 mmol∙L −1 浓度的H 2 O 2 进行实验。 实验对催化剂Cu 2+ 浓度对化学发光强度的影响进行了考察，随着Cu 2+ 浓度的增大，化学发光信号强度亦随之增大，当Cu 2+ 铜离子浓度与Luminol浓度一致后，化学发光信号强度趋于平稳，因此选择Cu 2+ 浓度为0.50 mmol∙L −1 。具体情况如图3(b)~图3(d)所示。 3.3. 厚朴酚、和厚朴酚标品标准曲线制作 Luminol-H 2 0 2 -Cu 2+ 化学发光体系首次有K.M. Kim [ 11 ] 等人提出，该体系在425 nm波长下产生蓝色荧光。体系中H 2 O 2 作为氧化剂而存在，当检测体系中有抗氧化剂存在时，抗氧化剂能够清除H 2 O 2 ，从而 图3. 微流控CL芯片上流速(a)、luminol浓度(b)、H 2 O 2 浓度(c)和Cu 2+ 浓度(d)对CL信号强度的影响(厚朴酚浓度0.20 mg∙mL − 1 ，和厚朴酚浓度0.02 mg∙mL − 1 ) 使化学发光强度减弱。实验中固定H 2 O 2 和Luminol化学发光试剂的量，并通过化学发光强度的减小量与抗氧化剂浓度之间建立定量关系。 采用DMSO溶剂将厚朴酚标品配成0.004 mg∙mL −1 、0.020 mg∙mL −1 、0.100 mg∙mL −1 、0.200 mg∙mL −1 、0.500 mg∙mL −1 五个浓度的标品溶液，将和厚朴酚标品配成0.001 mg∙mL −1 、0.005 mg∙mL −1 、0.010 mg∙mL −1 、0.050 mg∙mL −1 、0.100 mg∙mL −1 五个浓度的标品溶液，按2.4所述微流控芯片操作方法进行测试，测试结果如图4所示。 以标品对H 2 O 2 的清除率为纵坐标，标品浓度为横坐标，制作发光抑制标准曲线。在最优条件下，得到的厚朴酚、和厚朴酚回归方程如表1所示，厚朴酚、和厚朴酚相关系数均大于0.970，和厚朴酚检测限为0.300 μg∙ml −1 ，浓度为0.010 mg∙mL −1 和厚朴酚标品测试的相对标准偏差为3.46%，样本耗样量仅为1.67 µl，测试时间为30 s，显示所设计的微流控CL芯片具有良好的可行性和低耗样量的优点。 采用SPSS17.0软件进行分析，计算出标品对H 2 O 2 清除率为50%时所需标品浓度为IC 50 ，IC 50 值用来衡量厚朴酚与和厚朴酚的抗氧化能力。IC 50 越小，表明样本抗氧化能力越强。 厚朴酚清除H 2 O 2 的IC 50 为0.166 ± 0.040 mg∙mL −1 ，和厚朴酚清除H 2 O 2 的IC 50 为0.038 ± 0.005 mg∙mL −1 ，二者均有较好的抗氧化活性，和厚朴酚IC 50 比厚朴酚低一个数量级，因此，选用和厚朴酚作为实际样本厚朴药材系列提取物的当量转化对象。 3.4. 厚朴系列提取物样本的CL芯片测试和分析 将2.5方法所得的5种样本浸膏分别配制成一不同浓度的溶液且一式两份，其中第二份加入和厚朴酚标品，这两份均采用2.6所叙述的方法进行检测，每个浓度的样品测定三次，并计算样本对H 2 O 2 的清除率，根据表1的回归方程计算样本的当量含量(表2)，表3为8%乙醇提取物的加标实验情况。当量抗氧化活性浓度计算公式如下： 图4. 不同浓度厚朴酚(a)、和厚朴酚(b)标品化学发光测试图谱。测试条件：Luminol浓度为0.50 mmol∙L −1 ；H 2 O 2 浓度为1.00 mmol∙L −1 ；Cu 2+ 浓度为0.50 mmol∙L −1 ；T：16℃，Hi-V：−800 V Table 1 The regression equation of Magnolol and honokiol antioxidant activity. Test conditions: luminol concentration was 0.50 mmol∙L−1; H2O2 concentration is 1.00 mmol∙L−1; Cu2+ concentration was 0.50 mmol∙L−1， Buffer pH = 10.47， flow rate: 10.00 μL∙min−1 抗氧化剂线性范围回归方程y = (a ± SD)x + (b ± SD)(n = 3) (mg∙ml −1 ) (μg∙ml −1 ) 相关系数(r) IC 50 (mg∙ml −1 ) LOD 厚朴酚0.004~0.500 y = (141.4 ± 12.8)x + (26.592 ± 4.025) 0.984 0.166 ± 0.040 1.000 和厚朴酚0.001~0.100 y = (861.9 ± 68.2)x + (16.704 ± 2.236) 0.973 0.038 ± 0.005 0.300 表1. 厚朴酚和厚朴酚抗氧化活性回归方程(测试条件：0.50 mmol∙L −1 Luminol，1.00 mmol∙L −1 H 2 O 2 ，0.50 mmol∙L −1 Cu 2+ ，缓冲液pH=10.47，流速：10.00 µL∙min −1 ) 备注：x：标品浓度(mg∙ml −1 )；y：抑制率(%) Table 2 CL series chip test results of Magnolia extract samples. Test conditions: luminol concentration was 0.50 mmol∙L−1; hydrogen peroxide concentration is 1.00 mmol∙L−1; Cu2+ concentration was 0.50 mmol∙L−1， Buffer pH = 10.47， flow rate: 10.00 µL∙min−1 样本 样本浓度(mg∙mL −1 ) I 0 ± SD I ± SD 平均抑制率(%) 当量抗氧化活性浓度(mg和厚朴酚/g wt) 水提物 4.000 1378.2 ± 21.5 605.0 ± 14.3 56.1 11.4± 0.2 20%乙醇提取物 4.000 1401.6 ± 22.6 740.1 ± 15.6 47.2 8.8± 0.3 40%乙醇提取物 1.500 1354.0 ± 21.3 486.5 ± 12.6 64.1 36.7± 0.3 60%乙醇提取物 1.200 1406.9 ± 19.1 597.9 ± 11.3 57.5 39.4± 0.1 80%乙醇提取物 0.500 1396.2 ± 18.8 667.4 ± 15.7 52.2 82.4± 0.2 表2. 厚朴系列提取物样本的CL芯片测试结果(测试条件：0.50 mmol∙L −1 Luminol，1.00 mmol∙L −1 H 2 O 2 ，0.50 mmol∙L −1 Cu 2+ ，缓冲液pH=10.47，流速:10.00 µL∙min − 1 ) 备注：和厚朴酚IC 50 = 0.038 ± 0.005 mg∙mL − 1 。 Table 3 The spiked recovery rate determination results of 80% ethanol extract samples (n = 3); Test conditions: luminol concentration was 0.50 mmol∙L−1; hydrogen peroxide concentration is 1.00 mmol∙L−1; Cu2+ concentration was 0.50 mmol∙L−1， Buffer pH = 10.47， flow rate: 10.00µL∙min−1 样本 加标量(mg∙ml −1 ) 平均加标回收量(mg∙ml −1 ) RSD (%) 平均回收率(%) 80%乙醇提取物 0.25 0.23 6.7 94.8 0.50 0.52 5.2 104.8 1.00 0.91 7.3 91.2 表3. 80%乙醇提取物样本加标回收率测定结果(n = 3)；(测试条件：0.50 mmol∙L −1 Luminol，1.00 mmol∙L −1 H 2 O 2 ，0.50 mmol∙L −1 Cu 2+ ，缓冲液pH = 10.47，流速:10.00 µL∙min − 1 ) 80%乙醇提取物所含当量抗氧化物较高，因此可以推断80%提取物中厚朴酚、和厚朴酚含量较高，因此厚朴80%乙醇提取物可作为中成药作进一步研究应用。加标实验回收率均大于百分之九十，表明所设计的微流控CL芯片在实际样本应用中具有较高的稳定性，可望进一步为中药活性成分的检测和筛选提供技术途径。