system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与讨论 3.1. 结果分析 3.1.1. 菌株的形态 从墨鱼干样品中分离纯化到耐盐菌株NYJ2，它在牛肉膏蛋白胨培养基(5% NaCl)平板上，28℃培养48 h生长形成的菌落呈乳白色、隆起、边缘整齐。在牛肉膏蛋白胨培养液(5% NaCl)中28℃恒温振荡培养48 h，在室温下静置半小时可见培养液底部出现絮凝状物。显微镜镜检细菌涂片观察到菌体细胞呈杆状或短杆状。 3.1.2. 菌株NYJ2的生长条件 耐盐度测定结果是菌株NYJ2在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液均可生长繁殖，其中1%~10% NaCl生长良好。在无NaCl和高于15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中未见生长。表明菌株NYJ2是一种中度嗜盐菌。 生长温度范围试验结果是菌株NYJ2在10℃、25℃、37℃、42℃、46℃试验点下可生长繁殖，其中25℃~42℃生长最好，55℃未见生长。 生长pH范围试验结果是菌株NYJ2在pH 5~8范围内均可生长繁殖，而在pH 4和pH 9时未见生长。 3.1.3. 16S rDNA序列分析 提取NYJ2的基因组DNA后，进行16S rDNA部分序列PCR扩增，PCR产物测序得1490 bp核苷酸片段，在Genbank中提交的登录号是KT149393。序列在Genbank中进行BLAST搜索比对，结果表明它与枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)和芽胞杆菌属(Bacillus)中的部分菌株的16S rRNA基因序列的一致性高达98%。选择枝芽胞杆菌属中的一些模式菌株与待测菌株NYJ2的16S rRNA基因序列构建系统发育树(见图1)，菌株NYJ2与枝芽胞杆菌属的模式株盐脱氮枝芽胞杆菌(Virgibacillus halodenitrificans)聚类在同一分枝，表明两者之间的亲缘关系最近。因此，鉴定NYJ2是一种枝芽胞杆菌，暂定名为Virgibacillus sp. NYJ2。 3.1.4. 食品防腐添加剂抗性试验 试验结果见表1。在最大容许剂量下，山梨酸钠(0.1%)、苯甲酸钠(0.1%)、双乙酸钠(0.1%)、脱氢乙酸钠(0.05%)和焦亚硫酸钠(0.01%)都不能抑制菌株NYJ2生长繁殖。只有0.05%的乳酸链球菌素有抑制该菌生长繁殖的效果。 3.2. 讨论 本研究表明枝芽胞杆菌与墨鱼干表面白斑的形成有一定关系，它对产品安全性或品质影响应引人关注。根据文献资料 [ 4 ] 整理得到枝芽胞杆菌属的一些模式菌株的生物学特性见表2，表明枝芽胞杆菌属菌株所分离的环境主要是含高盐环境：如盐田、盐湖或者高盐食品环境。枝芽胞杆菌属菌种能在含盐(NaCl等)浓度范围较宽的培养基中，是一类典型的耐盐细菌(/嗜盐细菌)。由此可见，枝芽胞杆菌适应生长在水活度较低的基质上，墨鱼干无疑是该菌的良好生长基质。 研究人员对枝芽胞杆菌属在食品中的生态分布持乐观的评价。枝芽胞杆菌属能够促进食品发酵的进程以及改善发酵食品的风味，如韩国的发酵酱(Jeotgal) [ 5 ] 和中国四川的川冬菜 [ 6 ] 的发酵生产，还作为发酵剂缩短鱼露 [ 7 ] 的发酵时间。该属细菌还能产生有激酶活性的盐诱导性肽 [ 8 ] ；以及各种酶系，甚至有抗微生物物质 [ 9 ] ；还合成相容性溶质四氢甲基嘧啶羧酸(Ectoine) [ 10 ] ，它可作为渗透压调节因子，在生物医药中有应用前景 [ 11 ] 。或许枝芽胞杆菌能用做发酵剂用于墨鱼干的罨蒸发花工序，而有益于产品的风味和品质。如果人们对墨鱼干制品中的枝芽胞杆菌菌斑有所介意，可利用0.05%的乳酸链球菌素来抑制菌株NYJ2的生长繁殖。 图1. 基于16S rRNA基因构建的N-J系统发育树 Table 1 The effects of food additive preservative on growth and reproduction of the strain NYJ 食品防腐添加剂 添加量(%) 生长状况 食品防腐添加剂 添加量(%) 生长状况 山梨酸钠 0.1 + 双乙酸钠 0.1 + 0.05 + 0.05 + 0.025 + 0.025 + 0.0125 ++ 0.0125 ++ 苯甲酸钠 0.1 + 脱氢乙酸钠 0.05 + 0.05 + 0.025 + 0.025 + 焦亚硫酸钠 0.01 + 0.0125 ++ 0.0005 ++ 乳酸链球菌素 0.05 - 表1. 食品防腐添加剂对菌株NYJ2生长繁殖的影响 注：“-”表示培养液澄清，无菌生长；“+”表示培养液微浑浊菌已生长；“++”表示培养液浑浊，菌明显生长。 Table 2 The contrast of growth characteristics of several type strains belonging to the genus Virgibacillus and the strain NYJ 序号 名称 耐盐度(%) 生长温度(℃) 生长酸碱度 分离环境 1 V. halodenitrificans 2~23 (3~7) 10~45 (35~40) 5.8~9.6 (ND) 法国盐田 2 V. byunsanensis 0~20 (8) 4~40 (ND) 6.0~ND (7.0~8.0) 韩国盐田 3 V. campisalis 0.5~20 (4~5) 15~40 (37) 6.0~9.0 (7.5~8.0) 韩国盐田 4 V. koreensis 0~20 (5~10) 10~45 (25) 5.5~9.0 (7.0) 韩国盐田 5 V. halophilus 0~18 (ND) 5~45 (ND) 5.0~10.0 (ND) 日本挂川(Kakegawa)野外土样 6 V. sediminis 1~20 (5~10) 10~55 (35~40) 6.0~10.5 (7.5~8.0) 柯柯盐湖沉积物(中国西北) 7 V. kekensis 0~25 (10) 10~50 (37) 6.0~10.0 (7.0) 柯柯盐湖水(中国西北) 8 V. albus 1~17 (5~10) 15~45 (25~30) 4.0~9.0 (7.0) 中国罗布泊盐湖土样 9 V. xinjiangensis 0~20 (5~7) 8~52 (32~35) 6.5~9.5 (7.5~8.0) 中国新疆盐湖 10 V. subterraneus 0~25 (9) 10~50 (30) 6.0~9.0 (7.5) 柴达木盆地盐碱土样(中国) 11 V. salinus 3~20 (10) 15~40 (37) 6.0~10.0 (7.5) 锡林浩特附近盐湖沉积物(中国内蒙古) 12 V. zhanjiangensis 1~15 (4~7) 10~45 (30) 6.0~10.0 (6.5) 硇洲岛潮滩海水(中国南海) 13 V. litoralis 2~25 (5~10) 10~45 (30) 6.0~10.0 (8.0) 硇洲岛盐渍土(中国南海) 14 V. chiguensis 0~30 (5~10) 15~50 (40) 5.0~9.0 (7.5) 台南七股地区废弃盐场 15 V. soli 3~20 (10) 15~40 (37) 6.0~10.0 (7.5) 台湾阳明山土样 16 V. halotolerans 0.5~16.5 (3~5) 8~35 (27~30) 6.5~8.5 (7.0~8.0) 德国牛奶制品 17 V. alimentarius 0~30 (9~10) 4~40 (37) 7.0~11.0 (10.0) 韩国高盐发酵斑鰶(gizzard shad)食品 18 V. siamensis 1~20 (5~10) 10~55 (35~40) 6.0~10.5 (7.5~8.0) 泰国发酵鱼(Pla-Ra) 19 Virgibacillus sp. NYJ2 0.5~15 (1~10) 10~46 (25~42) 5~8 墨鱼干 表2. 菌株NYJ2与枝芽胞杆菌属部分模式菌株的生长特性的比较