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user: 3. 结果与分析 3.1. 不同浓度海藻糖对低温中长春花表型的影响 在图1中可以看到LT以及LT + T处理后对长春花幼苗形态的影响。与CK相比，在低温胁迫下，长春花幼苗表现出茎与根生长相对较短，叶片更致密，植株矮小、叶片发黄等现象。而低温胁迫后外加海藻糖后根与茎生长与低温处理相比有所增长，但还是低于CK组。 图1. 不同浓度海藻糖对低温中长春花表型的影响 3.2. 不同浓度海藻糖对低温中长春花叶片叶绿素含量的影响 图2(A-D)所示，在低温处理48小时后，随着海藻糖浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及叶绿素总含量都呈现先升高后降低的趋势并且显著低于CK (P < 0.05)。在海藻糖处理浓度为5 mmol/L时，达到最高。叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及叶绿素总含量在施加5 mmol/L海藻糖与LT相比分别增加了61.86%、54.83%、82.84%和61.86%。表明在低温条件下，外源施加一定浓度的海藻糖能够有效促进长春花幼苗叶绿素的合成，且5 mmol/L浓度的海藻糖处理效果最为明显。 3.3. 不同浓度海藻糖对低温中长春花叶片丙二醛含量的影响 图2(E)所示，4℃低温胁迫处理48小时后，与CK相比，MDA的含量显著上升(P < 0.05)，随着海藻糖浓度的增加，叶片中丙二醛的含量呈现持续降低的趋势，并且明显低于LT (P < 0.05)，与LT相比分别降低了37.5%、50%和55.5%，说明在低温处理下，外源施加海藻糖能有效降低叶片中MDA的含量，减少叶片膜脂过氧化的程度，缓解低温胁迫带来的伤害。 图2. 长春花叶片叶绿素含量的变化(E)。丙二醛含量的变化。不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) 3.4. 不同浓度海藻糖对低温中长春花叶片保护性酶活性的影响 由图3可知，低温胁迫下长春花幼苗叶片SOD、POD、CAT和APX活性均低于对照组(CK)的酶活性活性，LT中SOD、POD、APX和CAT与CK相比酶活分别降低了50.9%、46.7%、40%和25%，说明低温胁迫后长春花幼苗中抗氧化酶的活性降低。随着外源海藻糖不断增加，幼苗中酶的活性先升高后降低，当海藻糖浓度为5 mmol/L时，提升达到最大值；继续增加海藻糖到10 mmol/L后，幼苗中酶的活性逐渐降低。说明高浓度的海藻糖有抑制抗氧化酶活性的作用。当海藻糖浓度为5 mmol/L时，效果最为显著(P < 0.01)。说明外源海藻糖可大幅提高低温下抗氧化酶的活性，且最适宜海藻糖浓度为5 mmol/L。 3.5. 不同浓度海藻糖对低温中长春花叶片初生代谢物积累的影响 图4所示为样品13的GC-MS原始色谱图。由图可以看出，GC-MS色谱S峰基线较平稳，且色谱峰被有效的分离，该方法稳定、可靠，研究数据可进行后续统计分析和处理。对GC-MS原始数据进行预处理后，根据色谱峰的保留时间等信息在NIST数据库和Wiley Registry代谢组数据库对检测到的色谱峰定性注释，共定性出了59种代谢产物。 图3. (A)~(D)不同浓度海藻糖处理对低温下长春花叶片保护性酶活性的影响。不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) 图4. GC-MS样品13的原始色谱图 研究低温胁迫下不同浓度海藻糖处理下长春花幼苗叶片的初生代谢物的变化差异，对CK组和不同实验组进行了偏最小二乘回归分析(PLS-DA分析)。通过PLS-DA方法能较好的将CK与处理组区分开(R 2 = 0.0859， Q 2 = 0.966) (图5)，LT位于置信区间左侧，CK与低温加海藻糖的组位于置信区间右侧，CK与LT + T1、LT + T3聚在一起区别不大并且CK与LT + T1几乎完全重叠没有差别。说明LT + T1即5 mmol/L海藻糖溶液处理效果最佳，其次是10 mmol/L。低温胁迫外加海藻糖后代谢物的变化与CK相似，证明海藻糖通过影响初生代谢来缓解低温胁迫带来的伤害。 图5. 偏最小二乘法分析(PLS-DA) 根据模式识别模型的VIP (variable importance for the projection)值筛选差异代谢物。VIP值并结合t检验，从59种初生代谢产物中共鉴定了23种具有显著差异的化合物。糖类化合物7种、酸类化合物7种和其他化合物9种。将通过GC-MS技术得到的数据归一化处理后，进行聚类分析，得到低温胁迫不同浓度海藻糖处理下长春花叶片差异化合物的热图(图6 )。与CK相比，糖类化合物如甘露糖在低温处理后明显积累而低温处理加海藻糖后含量显著降低；有机酸类化合物像丙酸、苹果酸、没食子酸低温处理后含量显著降低低温处理后施加外源添加海藻糖含量显著上升；一些抗逆物质如尸胺、硅烷低温处理后含量显著上升处理后外源添加海藻糖其含量显著下降。 3.6. 差异合物的代谢途径富集分析 根据MetaboAnalyst3.0的通路分析模块，对这些显著变化的代谢物进行代谢途径富集分析。共有13条相关代谢途径。路径分析的结果如图7所示，最后得出半乳糖代谢、硫代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、柠檬酸循环(TCA循环)和果糖和甘露糖代谢是6种受影响最严重的代谢途径。 图6. 显著差异代谢物的层次聚类分析热图 3.7. 次生代谢关键酶基因的表达情况 3.7.1. 总RMA的提取 以长春花叶片为材料，提取总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳分析总RNA质量，长春花叶片的总RNA完整性好，条带清晰，共有3条条带；从上到下分别是28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA (图8)。使用UV-2600紫外分光光度计检测RNA的吸光度(表2)计算OD260/280比值，均在1.8~2.0之间。综上，RNA的提取质量良好。 图7. 相关代谢途径富集分析 图8. 长春花叶片总RNA琼脂糖凝胶电泳图 Table 2 OD260/280 rati Sample name OD260/280 CK 1.94 LT 1.97 LT + T1 1.96 LT + T2 1.88 LT + T3 1.89 表2. OD260/280比值 CK: Control Check; LT: Low Temperature; LT + T1: Low Temperature + 5 mmol/L Trehalose; LT + T2: Low Temperature + 10 mmol/L Trehalose; LT + T3: Low Temperature + 20 mmol/L Trehalose. 3.7.2. 设计Real-Time PCR引物 根据长春花已知酚类代谢途径选取4个酶基因(CrPAL、CrC4H、CrDXR和CrOMT)和生物碱代谢途径选取4个关键酶基因(CrTDC、CrSTR、CrLAMT和CrGES)以及内参基因CrActin3，利用Primer Premier 5设计Real-Time PCR的特异性引物，引物序列如表3。 Table 3 Primers used in this chapte Primer name Sequence(5’-3’) CrActin3-F CGGGTCCTTCAATTGTTCAT CrActin3-R AAACTCATCGCCCTCTCAAG CrPAL-F TCCCACACACTGCCACACTC CrPAL-R CAAGGAGTGATGTTGTGGTT CrC4H-F GCTTATTTGCCGCCATCATT CrC4H-R TGATTCAAGTCATCCCCAAC CrSTR-F GGGTTCTACACTTCCGTCCA CrSTR-R CACAATGGTCTTTTCTCTGG CrTDC-F ATCCGATCAAACCCATACCA CrTDC-R CGTCATCCTCGACCATTTTT CrLAMT-F CACCATGGTTGCCACAATTGATTCC CrLAMT-R TTAATTTCCCTTGCGTTTCAAG CrDXR-F TCGCTGCAGAACTTAGAGCA CrDXR-R GCCAACATCCCAAATGATTC CrGES-F CTGATTAAACCCTACCAAAGCT CrGES-R AATAATCCCAAAGGCGAAG CrOMT-F GTGGATTCTCCATGACTGGAACGA CrOMT-R GATTATCACCTTTCCACCCTTCGC 表3. 本章所有的引物 3.7.3. 次生代谢关键酶基因的表达情况 CrPAL、CrC4H、CrDXR、CrOMT是酚类化合物代谢途径关键酶基因(图9(A))。这些基因在低温处理后均被显著上调。说明低温处理不仅上调生物碱途径也上调酚类代谢途径的上游途径，而外加海藻糖后均显著下调(P < 0.01)。苯丙氨酸裂解酶(PAL)是限制长春花中酚类化合物形成的第一个主要酶，CrPAL基因在低温胁迫后显著上调，与CK相比基因表达量增张了300多倍，说明酚类代谢途径在低温胁迫后显著上调，酚类化合物的合成是植物应对低温胁迫的一个生活史策略，通过合成酚类化合物调控自身代谢来实验逆境。外加海藻糖后CrPAL表达回复到CK水平，说明海藻糖通过调控酚类化合物合成与代谢来缓解低温胁迫的伤害。 CrTDC、CrLAMT、CrSTR和CrGES均是TIA生物合成途径中重要的限速酶基因(图9(B))。低温胁迫后这些关键酶基因的表达均显著上调(P < 0.01)，CrTDC、CrLAMT、CrSTR和CrGES与CK相比分别上调了140%、399%、400%和143%，表明低温胁迫后会使生物碱代谢途径显著上调。而低温胁迫后施加海藻糖，这些关键酶基因显著下调(P < 0.05)恢复到CK的基因表达，说明海藻糖通过下调生物碱代谢来缓解低温胁迫的伤害。 图9. 低温胁迫后外加海藻糖长春花叶片(A)酚类途径关键酶基因表达情况(B)生物碱途径关键酶基因的表达情况