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user: 3. 结果 3.1. 纳米银的生物合成检测 多粘类芽孢杆菌菌株381发酵后制备的无细胞发酵液与10 mM的AgNO 3 溶液避光反应72 h后，可见混合溶液由初始的浅黄色变为红棕色，全波长光谱扫描结果显示反应后溶液在418 nm有明显的吸收峰，纯硝酸银溶液和无细胞发酵液扫描结果均没有此特征吸收峰(图1(a)和图1(b))。银离子被还原成单质纳米银后，在不同光波频率激发下，纳米银结构可产生专一性的表面等离子体共振效应(surface plasmon resonance， SPR)，并对特定频率光波(400~460 nm)有显著吸收，这是纳米银颗粒的典型特征，其峰值与颗粒的密度成正相关，这已经在微生物及植物提取物合成纳米银的实验中被证实 [ 6 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 15 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]。因此本实验结果表明菌株381可在细胞外进行纳米银颗粒的生物合成。 3.2. 纳米银颗粒生物合成的条件选择 3.2.1. 反应时间对纳米银颗粒合成的影响 10 mM AgNO 3 溶液与381菌株的无细胞发酵液按1:1 (v:v)的比例混合后，初期(0~6 h内)溶液并无明显的颜色变化，12 h后反应溶液在450 nm附近开始出现微弱的吸收峰，24 h后扫描吸收峰逐渐偏向短波长(见图2(a))，溶液颜色逐渐加深，但底部无沉淀物生成。72 h后溶液吸收峰稳定在418 nm，表明有纳米银颗粒的持续生成。反应期间典型吸收峰的光吸收值随反应时间延长持续增大(见图2(b))，表明菌液的还原力可在较长时间内保持活性，其中的代谢产物可使纳米颗粒趋向稳定，并能保持良好的分散性，溶液颜色均一。因此选择72 h作为菌株381胞外合成纳米银的反应时间。 图1. 多粘类芽孢杆菌381合成纳米银溶液的吸收光谱及颜色变化 图2. 反应时间对纳米银生成的影响。(a) 不同反应时间的吸收光谱；(b) 418 nm的光吸收值变化 3.2.2. 混合体积比对纳米银合成的影响 将381菌株的无细胞发酵液分别与10 mM AgNO 3 溶液按不同的比例混合，反应72 h，对反应溶液的全波长扫描结果见图3(a)。菌液增多，硝酸银含量过少，纳米银的生产量少，无明显吸收峰。硝酸银过多，菌液的还原力不足，纳米银的生成量也少，典型吸收峰降低(见图3(b))。当菌液和硝酸银比例在1:1时，纳米银的合成效率最好，反应72 h后吸收值达到最大，明显好于其他比例条件，因此选择1:1作为后续实验配比。 3.2.3. 硝酸银浓度对纳米银颗粒合成的影响 381菌株的无细胞发酵液分别与2~10 mM的硝酸银溶液按1:1比例混合，反应72 h后，反应溶液的吸收光谱结果见图4。硝酸银作为银离子供体，在浓度较低(2~4 mM)时，溶液基本没有吸收峰，当银离子浓度增加到6 mM后，特征吸收峰开始出现，OD 418 也随银离子浓度升高而明显增大，在10 mM时达到最高值(图4(a)和图4(b))。但在浓度为8 mM时，溶液在560 nm附近出现第二个吸收峰，表明生成的纳米颗粒粒径不均一，可能是由于某些菌液成分导致部分纳米银颗粒团聚，颗粒变大进而其吸收峰红移。硝酸银浓度再增大，菌液成分更多参与到纳米颗粒的生成反应中，OD 418 持续增大，560 nm吸收峰消失，表明此时颗粒分散均匀，因此选择10 mmol/L的硝酸银溶液用于细菌纳米银的绿色合成反应。 图3. 菌株无细胞发酵液与硝酸银不同配比对纳米银合成的影响。(a) 纳米银的吸收光谱；(b) 418 nm的光吸收值变化 图4. 不同浓度的AgNO 3 对纳米银颗粒合成的影响。(a) 合成纳米银的吸收光谱；(b) 418 nm的光吸收值变化 3.2.4. 菌液pH对纳米银合成的影响 无细胞发酵液的pH对纳米银的生成有显著的影响。在同等供体浓度及配比条件下，酸化处理的无细胞发酵液不能有效还原银离子生成纳米银，表现为特征吸收峰较低。在pH 7时，纳米银的生成量达到第一个峰值，吸收峰在418 nm附近(见图5(a))。随溶液变为碱性(pH 8)，OD 418 峰值降低，最大吸收峰偏向450 nm，表明此时生成的纳米银粒径增大。溶液pH达到9时，纳米银溶液的吸收峰恢复到418 nm，峰值增大(见图5(b))，表明此时合成的纳米银颗粒较小，生产量加大，这与高pH条件提高了菌液中还原剂物质的活性有关 [ 24 ]，同时碱性环境也使纳米银颗粒彼此间的斥力增强，阻止了小颗粒纳米粒子的团聚 [ 25 ]，因此pH 9更有利于381的菌液进行纳米银的合成，与文献中的结果类似 [ 26 ] [ 27 ]。 图5. 无细胞发酵液的pH对纳米银颗粒合成的影响。(a) 合成纳米银的吸收光谱；(b) 418 nm的光吸收值变化 3.3. 生物合成纳米银颗粒的抑菌性能 选择10 mM硝酸银为底物，以1:1比例与菌株的无细胞发酵液混合，在pH 9条件下避光反应72 h，最终得到生物合成的纳米银溶液。采用平板打孔法测试不同用量纳米银溶液对三种细菌的抑制效果(见图6)，结果发现在涂菌平板小孔中添加60 μL的纳米银，对金黄色葡萄球菌和桑青枯菌的抑菌圈分别可达到18.43 mm和10.95 mm (见表1)，均显著高于20 μL使用量时的抑菌作用，表明纳米银用量的增加可以增强溶液的生物活性。对桑疫病菌M4-13的抑菌作用不明显，不同使用量之间无显著差异。通过液体培养法进一步测定不同浓度纳米银水溶液对两株细菌的抑菌作用，发现其对金黄色葡萄球菌和青枯菌的最小抑制浓度分别为50 μg/mL和30 μg/mL (见表2)。 图6. 合成纳米银的抑菌作用 Table 1 Antibacterial activity of AgNPs synthesized by strain 38 抑菌圈 菌株 硝酸银 0.01 M 青霉素 1 mg/mL 原菌液 AgNPs 20 μL AgNPs 40 μL AgNPs 60 μL 金黄色葡萄球菌 10.37 ± 0.86 c 23.42 ± 2.27 a 7.19 ± 0.89 c 9.77 ± 3.17 c 15.36 ± 1.09 b 18.43 ± 2.85 b 青枯菌 7.11 ± 1.23 d 13.66 ± 2.04 a 8.67 ± 0.90 cd 9.05 ± 0.66 c 10.17 ± 0.77 bc 10.95 ± 0.55 b M4-13 7.76 ± 2.62 a 7.32 ± 0.36 a 6.83 ± 0.29 a 7.57 ± 1.41 a 8.97 ± 1.60 a 8.93 ± 0.22 a 表1. 菌株381合成纳米银颗粒的抑菌活性 注：不同字母表示不同处理组数据间差异显著(P < 0.05)。 Table 2 The minimum inhibitory concentration of synthetic AgNPs to pathogenic bacteri 抑菌效果 菌株 纳米银溶液浓度(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 青枯菌 + + + − − − − − − − 金黄色葡萄球菌 + + + + + − − − − − 表2. 菌株合成纳米银颗粒对病原菌的最小抑菌浓度 注：+表示有菌生长；−表示无菌生长。 3.4. 讨论 细菌可通过菌体及菌体浸泡液或发酵液在细胞内和细胞外两种途径进行纳米金属颗粒的生物合成 [ 14 ] [ 15 ] [ 18 ]。细菌生长过程中产生的酶及还原性物质可将溶液中的银离子还原成单质纳米银，后者可吸附于细胞壁或分散于细胞外液中，经细胞破碎和分离后得到纳米银产物。利用细菌的发酵液进行纳米银的胞外合成，无细胞参与还原过程，更易于进行纳米银的分离和收集 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。利用细菌、真菌、植物提取物等进行纳米银的生物合成，得到的纳米银溶液均呈现橙红到棕红色的颜色变化，并在410~460 nm波长范围内显示特征吸收峰，这是由于纳米银粒子所具有的等离子体共振效应所致，可以作为纳米银合成的判定标准 [ 28 ] - [ 38 ]。本实验我们利用一株桑叶内生菌，多粘类芽孢杆菌菌株381的无细胞发酵液经避光反应合成纳米银，反应后溶液颜色由浅黄色变为橙红色，紫外可见光光谱扫描显示在418 nm处出现典型吸收峰，因此可以判断该菌株可以进行纳米银的胞外合成。 纳米银的生物合成受到反应时间、温度、银离子浓度、溶液pH等因素的影响。利用微生物进行纳米银的合成所需时间长短不一，从几分钟到数十小时不等，一方面与微生物代谢产物中还原性物质的浓度与活性有关，另一方面也与纳米银在溶液中的分散性和稳定性有关。大肠杆菌可在反应1 h后得到均一的纳米银颗粒 [ 17 ]，来源于植物的内生真菌，如人参内生镰刀菌和白屈菜内生烟曲霉则在分别在反应后的6 h和24 h得到纳米银产物 [ 32 ] [ 33 ]。反应温度可影响还原反应的速度，一般在接近菌株的适宜生长温度时，纳米银的合成效率较高。如同属真菌的烟曲霉/镰刀菌及黒附球菌与硝酸银的最适反应温度均在25℃~33℃之间 [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]，符合真菌的生长温度，而大肠杆菌/北极副球菌(Paracoccus sp. Arc7-R13)/流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae等细菌合成纳米银的温度则在35℃~37℃ [ 17 ] [ 18 ] [ 35 ]。溶液酸碱性的变化可以影响菌液中还原性物质的分子结构，继而影响金属银离子的还原过程，同时也影响纳米银与保护性分子的结合作用 [ 24 ] [ 25 ] [ 27 ]，因此不同微生物发酵产物对酸碱的敏感性不同，适应进行纳米银合成的pH条件也有区别，一般在中性及碱性条件下合成效率较好 [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]。综合以上影响因素，可以获得菌株胞外合成纳米银的适宜条件，如烟曲霉的发酵液在pH = 7、25℃、反应24 h合成纳米银的效率最高，其合成的纳米银的吸收峰在424 nm [ 33 ]。黑附球菌生物合成纳米银的工艺，为硝酸银浓度为1.0 mM、pH为7及温度为33℃时可快速进行纳米银的合成，且产物的稳定性良好 [ 34 ]。人参内生尖孢镰刀菌，在硝酸银浓度为1 mM、p H为7、25℃条件下反应6 h可获得纳米银的最高产率 [ 32 ]。北极海域菌株Arc7-R13进行银纳米颗粒合成的优化条件为AgNO 3 浓度为4 mmol/L，在37℃，pH = 7时利于纳米银的生成 [ 18 ]。本实验表明，来源于桑叶的内生类芽孢杆菌381在37℃，与10 mmol/L的硝酸银1:1 (v/v)反应72 h后，合成的产物381-AgNPs在418 nm处达到吸收峰的最高值，无细胞菌液在碱性条件性更适合进行纳米银的合成。381-AgNPs在合成120 h后仍可保持良好的分散性，溶液的光谱吸收峰无明显变化。 生物合成的纳米银可通过释放银离子作用于细菌的细胞膜、呼吸链以及形成自由基等方式起到抗菌作用 [ 2 ] [ 9 ] [ 16 ] [ 18 ] [ 25 ] [ 30 ]，纳米银粒子的抑菌能力与其粒径大小、浓度及形貌等因素有关，也与合成方法有一定关系 [ 18 ] [ 19 ] [ 32 ] [ 34 ]。实验表明生物合成的纳米银具有更好的生物活性，某些生物分子还可以覆盖在纳米粒子表面，增加其稳定性。张杰等以钩状木霉为微生物材料合成纳米银粒子，产物对枯草芽孢杆菌的MBC为5 mg/L，MIC为4 mg/L，致死效果好于对大肠杆菌的致死效果 [ 9 ]。北极副球菌合成的银纳米颗粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌均具有良好的抑制作用 [ 18 ]。Baker Syed等利用分离自大戟科植物Euphorbia hirta L.的内生细菌EH419合成了纳米银，其对大肠杆菌、芽孢杆菌等四种病原菌的抑菌圈均大于10 mm，其机制可能是通过破坏细胞壁导致细胞内容物泄露，并可结合到胞内的硫醇基团从而破坏DNA的结构抑制其复制功能 [ 29 ]。Ghasem Rahimi等利用白色念珠菌制备的纳米银对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌作用 [ 30 ]。Eun-Young Jang等利用弯曲假单胞杆菌Pseudomonas geniculata H10制备纳米银，表现出良好的抗氧化作用 [ 31 ]。Ajah HA等利用流感嗜血杆菌胞外合成纳米银，其对绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，链球菌Streptococcus spp.，克雷伯氏菌Klebsiella spp.，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，大肠杆菌Escherichia coli，沙雷氏菌Serratia spp.和白色念珠菌Candida albicans等病原菌的抑菌圈在10~33 mm [ 35 ]。Baker Syed等利用内生荧光假单胞菌CA417合成纳米银，其对肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae (MTCC 7407)和黄单胞菌Xanthomonas campestris具有良好的抗性，并能增强卡那霉素对肺炎杆菌(MTCC 7407)的作用，具有良好的抗生素协同作用 [ 36 ]。纳米银还具有抗病毒及肿瘤活性，在生物学和医学领域有着广泛的应用前景。烟曲霉合成的纳米银对人卵巢癌细胞A2780具有较好的抑制效果 [ 33 ]，分离自人参的尖孢镰刀菌，其合成纳米银产物对对肿瘤细胞有明显抑制生长作用，并随纳米银浓度的增大促进细胞凋亡作用 [ 32 ]。本实验室利用多粘类芽孢杆菌菌株381合成的纳米银溶液对桑青枯菌和金黄色葡萄球菌均表现出较好的抑菌活性，其最小抑菌浓度分别为50 μg/mL和30 μg/mL (见表2)。 纳米银的生物合成与微生物的代谢产物密切相关，已有实验表明菌株发酵产物中的蛋白、多酚类、多糖类等组分在纳米银的还原及颗粒稳定等方面起到重要作用。张杰等人发现，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyqueciens)在进行纳米银合成过程中产生了两种新的蛋白质，有效促进了纳米银的合成和稳定性的提高 [ 37 ]。Bhainsa等人发现 [ 38 ] 烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)培养滤液中的蛋白成分对金属银离子的还原起到了关键作用，两者混合后，在短短数分钟内便可以得到银纳米粒子(5~25 nm)。桑叶内生菌株381，其代谢产物中含有黄酮类/多酚类等化学成分 [ 23 ]，可能在纳米银的生物合成过程中发挥一定作用，但对其纳米银的具体合成机制还需要进一步的实验研究进行解释。