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user: 3. 结果 3.1. 测序数据评估 文库测序得到的获得的Raw Data经处理分别得到Clean Reads，用比对软件SOAPaligner/SOAP2 [ 16 ] 将Clean Reads与参考基因组(甜橙)进行比对。结果表明SY1、SY2、SY3、SZ1、SZ2和SZ3获得的clean reads分别为11528402、11334516、11286963、11414971、11329671、11352636，6个样本中clean reads所占的比例在92.69%~95.07%。 3.2. 差异表达基因分析的GO分类与富集分析 3.2.1. 差异基因的筛选 以qvalue < 0.005 且log2 (fold change) > 1为标准对SY1/SZ1、SY2/SZ2、SY3/SZ3三个组合之间的差异基因进行筛选。结果表明SY1/SZ1中，差异表达基因总数为271 (上调表的基因244个，下调表达的基因27个)。SY2/SZ2的差异表达基因为509 (上调表达基因265个，下调表达基因244个)。SY3/SZ3的差异表达基因为878，其中上调表达基因193个，下调表达基因为685个(图1)。 图1. 沙田柚自花授粉与异花授粉花柱差异表达基因的统计 3.2.2. 差异表达基因的GO功能显著性富集分析 在SY1/SZ1中，生物过程、细胞组分和分子功能三个功能富集分析的基因数分别为741个，425个，198个。其中，生物过程的741个基因分为19个功能基因群；细胞组分中的425个基因分为12个功能基因群；分子功能中的198个基因分为8个功能基因群。SY2/SZ2中生物过程、细胞组分、分子功能三个功能富集分析的基因个数分别为1199个，797个，384个。其中，生物过程的1199个基因分为21个功能基因群；细胞组分中的797个基因分为13个功能基因群；而分子功能中的384个基因则分为12个功能基因群。SY3/SZ3比对中，生物过程、细胞组分和分子功能富集分析的基因个数分别为2227个，1389个，715个。其中，生物过程中的2227个基因可分为21个功能基因群；细胞组分中的1389个基因分为14个功能基因群；分子功能中的715个基因分为10个功能基因群。 3.3. 差异表达基因的Pathway显著性富集分析 SY1/SZ1差异表达基因注释到146条KEGG代谢通路中(表2)。其中注释到淀粉和蔗糖代谢途径(ko00500)通路的基因数量最多，为10个(6.85%)，其次是戊糖和葡萄糖醛酸酯互变途径(ko00040)，以及聚糖降解(ko00511)途径，数量均为6 (4.11%)。 Table 2 Differentially expressed genes enriched of KEGG pathways in SY1-VS-SZ 途径 差异基因注释 Qvalue Pathway ID 其他聚糖降解 6 (4.11%) 0.001404909 ko00511 糖和葡萄糖醛酸酯互变现象 6 (4.11%) 0.019126583 ko00040 淀粉和蔗糖代谢 10 (6.85%) 0.019696451 ko00500 表2. SY1/SZ1差异表达基因Pathway显著性富集统计 SY2/SZ2差异表达基因注释到251个KEGG代谢通路中(表3)。其中注释代谢途径(ko01100)通路的基因数量最多，为73个(29.08%)，其次为次生代谢产物的生物合成途径(ko01110)和植物激素信号转导途径(ko04075)，基因数量分别为44个(17.53%)和26个 (10.36%)。 Table 3 Differentially expressed genes enriched of KEGG pathways in SY2-VS-SZ 途径 差异基因注释 Qvalue Pathway ID 淀粉和蔗糖代谢 18 (7.17%) 0.0003874210 ko00500 戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象 10 (3.98%) 0.0004252822 ko00040 苯丙素的生物合成 14 (5.58%) 0.0004252822 ko00940 次生代谢产物的生物合成 44 (17.53%) 0.0074408390 ko01110 氨基糖和核苷酸糖代谢 9 (3.59%) 0.0074408390 ko00520 苯丙氨酸代谢 7 (2.79%) 0.0074408390 ko00360 氰基氨基酸代谢 7 (2.79%) 0.0117669696 ko00460 醚脂类代谢 10 (3.98%) 0.0129689933 ko00565 植物激素信号转导 26 (10.36%) 0.0129689933 ko04075 代谢途径 73 (29.08%) 0.0196072044 ko01100 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 (1.99%) 0.0204112822 ko00250 黄酮和黄酮醇生物合成 6 (2.39%) 0.0219457980 ko00944 α-亚麻酸代谢 5 (1.99%) 0.0432683354 ko00592 异喹啉生物碱生物合成 3 (1.2%) 0.0481040160 ko00950 表3. SY2/SZ2差异表达基因Pathway显著性富集统计 SY3/SZ3差异表达基因注释到KEGG代谢通路为481条(表4)。与SY2/SZ2相同，注释到代谢途径(ko01100)通路的基因数量最多，为157 (32.64%)，其次为次生代谢产物的生物合成途径(ko01110)和植物激素信号转导途径(ko04075)，基因数量分别为118 (24.53%)和47 (9.77%)。 Table 4 Differentially expressed genes enriched of KEGG pathways in SY3-VS-SZ 途径 差异基因注释 Qvalue Pathway ID 次生代谢产物的生物合成 118 (24.53%) 3.111726e-17 ko01110 黄酮类生物合成 33 (6.86%) 7.801713e-15 ko00941 黄酮和黄酮醇生物合成 21 (4.37%) 1.799464e-11 ko00944 二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素的生物合成 28 (5.82%) 1.799464e-11 ko00945 代谢途径 157 (32.64%) 8.988912e-08 ko01100 苯丙素的生物合成 26 (5.41%) 1.093121e-07 ko00940 柠檬烯、蒎烯降解 17 (3.53%) 2.702901e-06 ko00903 玉米素生物合成 14 (2.91%) 9.886923e-05 ko00908 泛醌和其他吡咯醌生物合成 11 (2.29%) 1.350563e-04 ko00130 其他聚糖降解 9 (1.87%) 7.671060e-04 ko00511 植物激素信号转导 47 (9.77%) 7.671060e-04 ko04075 氰基氨基酸代谢 10 (2.08%) 6.456259e-03 ko00460 醚脂类代谢 15 (3.12%) 7.769444e-03 ko00565 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 7 (1.46%) 9.855672e-03 ko00400 角质，亚角质和蜡生物合成 8 (1.66%) 9.855672e-03 ko00073 油菜素类固醇生物合成 4 (0.83%) 1.048609e-02 ko00905 戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象 10 (2.08%) 1.057777e-02 ko00040 淀粉和蔗糖代谢 20 (4.16%) 1.133609e-02 ko00500 花青素生物合成 2 (0.42%) 1.882419e-02 ko00942 苯丙氨酸代谢 8 (1.66%) 2.536549e-02 ko00360 α-亚麻酸代谢 7 (1.46%) 3.322518e-02 ko00592 半乳糖代谢 8 (1.66%) 3.731857e-02 ko00052 苯并嗪类生物合成 4 (0.83%) 3.792505e-02 ko00402 胞吞作用 18 (3.74%) 3.851186e-02 ko04144 倍半萜和三萜生物合成 4 (0.83%) 3.854513e-02 ko00909 类胡萝卜素生物合成 10 (2.08%) 3.935430e-02 ko00906 单萜生物合成 3 (0.62%) 4.441394e-02 ko00902 抗坏血酸和醛酸代谢 7 (1.46%) 4.441394e-02 ko00053 表4. SY3/SZ3差异表达基因Pathway显著性富集统计 3.4. 自交与异交花柱共有的差异表达基因 在SY1/SZ1、SY2/SZ2、SY3/SZ3组合差异表达基因分别统计的基础上，对在SY1/SZ1、SY2/SZ2和SY3/SZ3均达到差异表达的基因进行挖掘，结果表明共有30个基因在自交花柱与异交花柱之间达到差异表达水平，其表达量(Reads Per Kilobase per Million，RPKM)及功能注释见表5。在30个差异表达基因中目前G0、KEGG、NR数据库中未有功能注释(包括注释为hypothetical protein、uncharacterized protein或predicted protein)的基因为11个，其中无注释的基因4个。 Table 5 Differentially expressed genes coexisted in self- and cross-pollinated style Gene ID SY1 Y2 SY3 SZ1 SZ2 SZ3 Function annotation Unigene12309_All 0.00 0.20 0.41 1.13 2.78 2.18 hypothetical protein Unigene15891_All 0.92 6.72 2.08 10.49 20.99 11.71 protein serine/threonine kinase activity Unigene30969_All 1.74 22.25 8.33 19.71 59.16 33.84 alpha-L-fucosidase; hydrolase activit; Unigene27111_All 0.54 2.63 0.89 5.02 10.11 5.15 Ribonuclease H Unigene21493_All 5.62 58.07 14.88 51.21 117.95 60.43 alpha-galacturonidase; polygalacturonase Unigene32078_All 8.85 79.77 33.15 68.58 202.73 110.23 — Unigene37536_All 1.62 1.26 0.85 12.61 11.30 3.02 cation-transporting ATPase activity Unigene9477_All 1.82 13.47 5.07 13.72 34.81 19.28 predicted protein Unigene27143_All 0.67 4.39 1.25 4.62 11.00 5.99 Xyloglucan galactosyltransferase Unigene24605_All 4.17 19.20 6.38 26.50 44.38 19.09 UDP-glucosyl transferase Unigene2299_All 12.18 36.84 22.90 58.40 117.90 68.80 cell wall modification Unigene1873_All 16.09 43.79 20.06 73.69 145.29 59.30 — Unigene17404_All 16.53 14.05 4.87 3.72 35.95 17.25 predicted protein Unigene13392_All 14.58 55.81 27.44 60.06 136.27 76.54 uncharacterized protein Unigene34584_All 2.09 9.05 4.62 8.56 29.28 18.43 cetate beta-D-glucosyltransferase Unigene31258_All 2.68 7.98 4.66 10.41 28.54 11.61 2-alkenal reductase activity Unigene21006_All 11.72 38.32 23.09 45.11 108.25 67.45 — Unigene24125_All 10.88 31.69 11.12 40.51 70.47 51.12 xyloglucosyl transferase； Unigene5640_All 6.18 19.11 10.75 22.14 64.04 37.50 uncharacterized protein Unigene9582_All 3.20 8.24 3.89 10.41 22.10 13.59 LOB domain-containing protein Unigene20618_All 4.24 13.65 4.05 13.61 32.93 17.26 conserved hypothetical protein Unigene23161_All 19.04 6.45 19.58 56.51 96.35 43.17 conserved hypothetical protein Unigene676_All 2.05 3.48 0.90 5.44 7.07 3.72 ATP binding protein Unigene17565_All 4.79 13.54 4.74 12.45 30.40 14.30 predicted protein Unigene24843_All 7.00 18.23 6.05 17.19 37.90 18.21 hypothetical protein Unigene5338_All 3.47 0.09 2.97 8.22 7.66 12.23 adiponectin receptor Unigene15711_All 9.96 27.57 16.36 21.14 13.57 3.84 — Unigene29154_All 6.21 20.08 7.53 0.00 0.00 1.75 hypothetical protein Unigene10706_All 1.58 3.92 2.03 0.00 0.00 0.10 predicted protein Unigene13515_All 42.37 96.34 47.84 13.03 14.04 16.98 DNA binding protein 表5. 自交与异交花柱之间差异表达基因 注：—示数据库中无任何注释。 3.5. qRT-PCR分析 分别提取自交和异交1~3d花柱总RNA，反转录后进行定量PCR验证。结果表明6个差异表达基因(EBA、SRA、UBP、RIB、RIH和CBP)在自交和异交1~3d花柱的相对表达量与表达谱分析的变化趋势一致(图2)。 图2. 差异表达基因qPCR验证