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user: 3. 结果与分析 3.1. 粒毛盘菌生物量增长曲线 本研究从培养第七天(培养七天之后生物量较为显著)开始检测发酵液中粒毛盘菌YM240生物量，并绘制其生长曲线(图1)。从图1中可以看出，随着发酵时间的延长，生物量逐渐提高，但是发酵后期的增长率逐渐降低，推测原因为发酵液中营养物质的浓度已经处于下降趋势，限制了粒毛盘菌的生物量的增加。同时，从图1中还可以看出在发酵第11天，粒毛盘菌YM240的生物量达到了最大值，为8.7 g/L。本课题组前期研究了不同的培养条件对萼状粒毛盘菌生物量和胞外多糖产量的影响，不同培养条件萼状粒毛盘菌的生物量为6~12 g/L [ 15 ]。赵天瑞等人研究了吲哚乙酸对冬虫夏草生物量的影响，结果显示吲哚乙酸对冬虫夏草的生长有一定的刺激作用，最大的生物量为18.3 g/L [ 16 ]。与之前的研究结果相比，本研究中获得的生物量稍低，可能的原因为不同的菌种和培养条件对生物量有一定的影响。 图1. 粒毛盘菌YM240生物量变化曲线 3.2. 粒毛盘菌胞外多糖生产曲线 在发酵过程中，通过苯酚-硫酸法检测其发酵液中的胞外多糖含量。由图2可以看出，发酵液中的胞外多糖含量在发酵第7~9天内不断提高，在发酵第10天的时候胞外多糖的含量达到了峰值，为139.8 mg/L。之后，胞外多糖含量明显下降。可能的原因推测为随着发酵过程的进行，发酵液中的营养物质不断消耗，在第10天的时候发酵液中的营养物质已经达到了临界值，真菌开始通过降解胞外多糖来获得必须的营养物质，导致胞外多糖的浓度开始下降。和本课题组前期研究结果相比 [ 15 ] ，我们在这里报道的多糖产量较低，主要的原因可能是不同的菌种和发酵条件可能对多糖产量有影响。同时，本研究中的多糖含量是经过分离纯化之后的多糖量，在分离纯化过程中去除了蛋白质等杂质，并且透析过程中也会损失部分多糖，所以最终获得的多糖含量较低，而前期的报道中主要是测量粗多糖的含量，因此报道的数值较大 [ 17 ] [ 18 ]。 图2. 粒毛盘菌YM240发酵液中胞外多糖(LEP)生产曲线 3.3. 胞外多糖(LEP)的分级分离 对LEP进行脱蛋白、脱色和透析处理后，进一步使用Sephadex G-100对LEP进行初步分离纯化。LEP经凝胶柱层析洗脱后得到四个主要的洗脱峰，分别是用蒸馏水，0.1 mol/L NaCl，0.3 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaCl四种溶液洗脱得到的多糖曲线(图3)。由图3可知蒸馏水洗脱条件下所得多糖峰面积最大即洗脱含量最多，在0.1 mol/L NaCl洗脱条件下获得的多糖含量稍少，而0.3 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl洗脱条件下获得的多糖组分最少，这和之前的研究报道结果较为相似 [ 19 ]。根据LEP的分级分离洗脱曲线可以判断LEP主要由不带电荷的中性多糖(蒸馏水洗脱部分)和带有部分负电荷的酸性多糖(0.1 mol/L NaCl洗脱部分)组成，且中性多糖的含量略多于酸性多糖的含量 [ 20 ]。 图3. 粒毛盘菌胞外多糖(LEP)的分级分离洗脱曲线 3.4. LEP对α-葡萄糖苷酶抑制率 消化道分泌多种消化酶，其中α-葡萄糖苷酶可以水解葡萄糖苷键，释放葡萄糖，提高血糖浓度，因此通过抑制α-葡萄糖苷酶能够有效抑制餐后血糖上升，这也成为筛选降血糖药物的常规检测方法 [ 21 ]。目前为止，α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(Acarbose)是2型糖尿病常见的和有效的临床治疗剂之一。本研究中检测粒毛盘菌胞外多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并且与降血糖药品阿卡波糖进行对比。由图4可知，粒毛盘菌YM240胞外多糖具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，但不如药品阿卡波糖抑制强烈；并且在一定范围内，随着多糖浓度增大，其抑制作用越强；由于随着浓度增加，其抑制增长率在下降，推测可能是由于多糖的抑制作用趋于稳定或者饱和造成。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高可以达到80%作用，而同等浓度下LEP对α-葡萄糖苷酶的抑制率大约为40%左右。多种真菌多糖对α-葡萄糖苷酶都有一定的抑制作用。朱振元等人报道了蛹虫草多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，发现多糖的抑制作用低于阿卡波糖，半数抑制浓度为4.22 mg/mL，而且当浓度较高时其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用趋于平缓，呈现出饱和的状态，这与我们的研究结果较为一致 [ 12 ]。而鲁梅芳等人研究了灰树花多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，他们报道的半数抑制浓度为35.79 mg/mL，远高于我们的实验结果，说明LEP对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用 [ 22 ]。 3.5. LEP对α-淀粉酶的抑制率 食物中的淀粉类物质通过肠道过程中经过α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解产生葡萄糖，随后会被小肠吸收进入血液。研究表明，抑制α-淀粉酶是治疗糖尿病重要的方法之一 [ 23 ]。本研究中检测了LEP对α-淀粉酶的抑制作用，并且与降血糖药品阿卡波糖进行效果对比。由图5可知，LEP具有抑制α-淀粉酶的作用，但不如药品阿卡波糖抑制强烈；并且在一定范围内，随着多糖浓度增大，其抑制作用越强；同图4中显示的结果相似，随着真菌多糖浓度的增加，其对α-淀粉酶的抑制增长率下降，这和之前的报道结果类 图4. LEP对α-葡萄糖苷酶抑制率 似，说明多糖对α-淀粉酶的活性抑制作用可能有饱和效应 [ 24 ]。影响多糖对α-淀粉酶抑制活性的因素较多，不仅包括其分子结构和空间构象，还包括多糖中杂质的含量。尤玲玲等人报道了黄秋葵多糖的对α-淀粉酶的抑制活性，研究结果表明相比于粗多糖，经过脱蛋白处理后的多糖其对α-淀粉酶的抑制活性显著降低 [ 13 ]。 图5. LEP对α-淀粉酶的抑制率 3.6. LEP对脂肪酶抑制率 本研究中针对LEP的降血脂活性主要通过脂肪酶抑制率和胆酸盐结合实验来确定。脂肪酶抑制实验原理是脂肪酶水解油脂产生脂肪酸，游离脂肪酸再与NaOH结合，通过滴定来确定消耗NaOH的量间接确定脂肪酶的活性，多种活性多糖在脂肪酶水解甘油三酸酯反应中起抑制剂作用。由图6可知，在一定范围内，随着LEP浓度增大，其抑制作用也增强，在LEP达到3 mg/mL的浓度后，脂肪酶的抑制率达到44%以上，但是之后随着多糖浓度的提高，抑制率增长比较缓慢，推测可能的原因是LEP对脂肪酶的抑制作用达到饱和。何刚等人研究了黑木耳多糖对脂肪酶的抑制作用，其研究结果显示当黑木耳多糖对脂肪酶的最高抑制率为47%作用，之后即使提高多糖浓度亦不会降低脂肪酶的活性，他们推测黑木耳多糖可以改变脂肪酶的构象，从而影响其催化活性，但是不能使脂肪酶失活 [ 25 ]。 图6. LEP对脂肪酶的抑制率 3.7. LEP的胆酸盐结合率 胆酸盐是体内排泄胆固醇的主要途径，大部分胆酸盐经过肠道-肝脏进行回收，而通过结合胆酸盐，促进胆酸盐排泄可以有效排除体内胆汁酸，间接降低胆固醇含量，达到降低血脂的目标 [ 26 ]。本研究中以甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠作为标准物质，首先在387 nm波长下检测不同浓度的甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠标准溶液的吸光值，根据标准溶液的吸光值计算其回归方程，分别为y = 0.1919x + 0.0.0581和y = 0.1726x + 0.0588，相关系数分别为R 2 = 0.9984和R 2 = 0.9976。 然后分别制备1.6 μM和2.0 μM的甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠溶液作为检测LEP胆酸盐结合率的工作溶液，在不同LEP浓度情况下检测反应溶液的吸光值来判断LEP的胆酸盐结合率，具体结果整理在图7和图8中。从结果中可以看出，LEP对两种形式的胆酸盐都有一定的结合能力，当LEP浓度达到5 mg/mL的时候，对胆酸盐的结合率达到了30%和40%左右，说明其具有一定的降血脂活性。同文献报道的结果相比，LEP的胆酸盐结合率和赵艳等人报道的水溶性红雪茶多糖结合胆酸盐率比较接近 [ 27 ] ，但是低于王振宇等人报道的黑木耳多糖的胆酸盐结合率 [ 25 ]。 图7. LEP对甘氨胆酸钠结合率 图8. LEP对牛磺胆酸钠酸钠结合率