DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 2. 推行电子招投标的意义 1、保障公平 电子招投标的系统是透明性、且具有开发的互联网技术。电子招投标与我国传统模式的结合，在一定程度上可以避免暗箱操作，保证招投标的公平正义 [ 1 ]。另一点是信息对称，电子招标过程中的信息披露是公开透明的。例如在网上发布招标公告和评标结果，有利于招标人和投标人掌握对称信息 [ 2 ]。 2、提高效率 从事做标书的人都知道，传统的投标方式是投标人员做好标书，要去异地投标，现在电子招投标过程中，我们在全国各地任何地方，只要有锁，都可以上传上去，此时地域是没有限制的，这样的话大大提高了效率。 3、降低成本 无纸化操作，省钱且环保，符合我国推行绿色发展的要求，可节约大量的纸张，降低招投标成本。 4、规范管理 电子招投标的整个过程是在公开透明的环境下进行的，在系统展开工作的过程中受到多方面的监督，包括监管部门，包括投标人，包括代理公司，或者同行之间互相监督，需规范环节中的操作，若有些环节操作不当会引起他人质疑，可以进行投诉。 但是电子招投标系统仍存在一些问题，比如在电子招投标尚未全面普及的时候有的投标人不能真正理解电子评标的作用，目前也普遍缺少数据标准接口，只能接受政府指定的软件接口，在项目进行过程中，缺乏清标规则和可行的评标方法，投标人编制电子标书文件时出现问题无法得到有效的服务和帮助等等 [ 3 ]。 那么这些问题便是建设工程电子招投标过程中的风险所在。在我们所认知的风险中，风险是具有两面性的，风险给事件所带来不确定危险性和后果产生的消极性。风险是在事件中客观存在的、不可预料不可避免的、其所带来的后果很大程度上也是负面消极的。所以需要风险识别判断影响项目的执行风险因素，在研究过程中，将理论与实际相结合，以便全面识别建设项目电子招投标系统面临的风险。
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user: 3. 风险管理中的风险识别 风险管理(Risk Management)是指一个项目或企业在一定风险环境下如何将风险降到最低的管理过程 [ 4 ]。风险管理是指通过对风险的理解、度量和分析，选择最有效的方式，主动、有目的、有计划地处理风险，力求以最小的成本获得最大的安全保障的管理方法。 风险管理的基本步骤包括风险识别、风险评价、风险管理效果评价和风险管控 [ 5 ]。 3.1. 风险识别的流程 风险识别：是经济单位和个人对潜在风险进行判断、分类和梳理，识别风险性质的过程 [ 6 ]。 风险识别的具体流程如图1： 图1. 风险识别的具体流程图 3.2. 风险识别的原则 3.2.1. 全面周详的原则 在风险识别过程中，需要全面、系统地调查和了解各种风险事件存在的概率和可能情况，甚至损失的严重程度。损失的概率及其后果的严重程度将直接影响人们对损失的计量，并最终决定风险政策措施。因此，有必要充分了解各种风险的存在和发生，以及由此产生的损失后果的详细情况，以便及时、清晰地为决策者提供相对完整的决策信息。 3.2.2. 综合考察的原则 招标人、投标人和业主面临的风险是一个复杂的系统，包括不同类型、不同性质和不同程度的损失风险。任何单一的独立的分析方法都难以处理所有的风险，因此选择多种分析方法较为保险。根据风险清单的列举可知常用的方法有专家访谈法、问卷调查法、德尔菲法、SWOT法、头脑发风暴发等方法。 3.2.3. 量力而行的原则 风险识别的目的是为风险管理提供前提和决策依据，以确保投标方、招标方和业主方以最小的支出获得最大的安全保障，减少风险损失。 3.2.4. 科学计算的原则 风险识别应以严谨的数学理论为分析工具，在一般估计的基础上进行统计计算，得到较为科学合理的分析结果。 3.2.5. 系统化、制度化原则 风险识别是风险管理的前提和基础，识别的准确性在很大程度上决定了风险管理的效果。为了保证风险分析的准确性，将进行全面、系统的调查分析。 3.3. 风险识别的方法 风险识别的方法有很多种，主要有专家访谈法、流程图法、工作分解结构法(WBS)、情景分析法。下面简单介绍专家访谈法和流程图法： 3.3.1. 专家访谈法 专家访谈法是通过对某一专业知识领域和业务领域的专业人员进行访谈来识别风险因素。用此方法需要将专家所在的领域合理进行搭配，切勿从单一领域专家进行采访咨询，最主要的一点是访问过程中需客观。对于电子招投标行业，选择建筑工程、信息技术、计算机科学等相关领域的专家作为访谈对象。但疫情期间面对面访谈的举措不太推荐。 3.3.2. 流程图法 流程图法(Flow-chart Method)是较有效的结构化方法，通过图形与文字搭配，对项目过程中的每一阶段、每一环节逐一进行调查分析，通过梳理发现从中的潜在风险，找出导致风险发生的因素，得知系统内部关联关系，并分析风险产生后可能造成的损失以及对整个组织可能造成的不利影响。 使用流程图法对电子招投标系统进行风险分析时，首先是对电子招投标流程进行整理，绘制出相应的流程图，分解出每一阶段每一环节的工作内容，分析各环节的风险因子。并根据招投标工作的特征，前后环节的关联，发现风险因子的变化。最后归纳整理风险因素，列出风险清单。
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user: 4. 编制风险清单 值得注意一点的是，在电子招投标过程中，每一个环节的操作都是不可逆的，每一个错误的判断都有可能对项目工程产生影响。而根据前期的电子招投标流程图，分析系统运行过程，找到其中潜在的风险因素，结合收集的资料和专家意见，建立建设项目电子招投标的风险清单。下面对各阶段的风险进行分析： 4.1. 招标阶段 4.1.1. 选择合适的招标代理机构 招标代理机构对项目直接操纵，根据企业资质、诚信体系、人员能力慎重选择；招标人委托的勘察设计方所出具的文件是否具备招投标的条件。 4.1.2. 招标代理机构和投标单位登记注册信息 在相关单位及企业的信息登记中，投标单位和投标人的登记信息是否真实、合法、有效，信息是否正确写入公共服务平台信息资源库。 4.1.3. 招标公告发布 招标人或委托的代理机构发布的媒介或渠道是否符合法律法规。 4.1.4. 资格审查文件的上传 投标人应按要求填写资格审查文件，并在有效期内提交；资格预审文件是否注重结合招标项目特点编制资格预审文件。 4.2. 投标阶段 4.2.1. 招标文件获取 潜在投标人的企业信息(资质、人员、业绩、奖励等综合实力)是否实行透明管理，透明管理下的潜在投标人的信息是否真实有效，是否获得招标文件。 4.2.2. 投标文件递交 投标人是否按要求填写投标文件，是否有电子签章、校验及加密；投标人是否在投标截止时间前上传投标文件；是否有围标、恶意投标等行为。 4.2.3. 投标保证金的缴纳 投标人是否在规定的时间内缴纳投标保证金；招标人是否接收到投标保证金。 4.3. 开标评标阶段 4.3.1. 电子签到及身份验证 参加开标的人员是否通过网络远程办理电子签到；参与开标的各方主体是否进行身份验证。 4.3.2. 各方监督 唱标行为是否符合法律法规，开标全过程是否有视频直播平台进行现场监督；投标文件公开后是否存在串标等违法行为；评标报告是否上传到公共服务平台进行监督；评标公证人员是否公平公正，评标委员会是否按规定进行监督，相关专家是否从法律专家库中选出，专家级别和人数是否符合要求。 4.4. 定标阶段 4.4.1. 定标结果 确定的中标人是否是根据评标委员会的结果确定；发放中标通知书是否符合法律法规。 4.4.2. 现场监督 专家的专业技术能力能否参与项目评标，行政监管部门是否到场合理合法监督；公布中标人之前，是否存在泄漏相关信息行为，评标全过程是否有视频直播平台以供行政监督部门监督，评标过程的视频记录是否完整以供后续查验。 在电子招投标运行过程中，不仅有流程图识别出的风险因素，还同时有其他风险因素事件影响着项目的进行。基于对相关文献研究、建设工程招投标行业领域的专家访问，及本人所学的知识和工作经验，归纳整理建设工程电子招投标运行过程中的风险事件，将风险因素识别结果主要分为环境风险、技术风险、经济风险、管理风险四大类。如表1所示： Table 1 Risk factors identifie 电子招投标系统总体风险评价 一级指标 序号 二级指标 环境风险 1 法律法规保障不到位 2 国家及行业的政策非法干预 3 自然灾害及意外事故 技术风险 4 各方参与人员技术水平 5 系统建立应急事故处理方案 6 系统操作界面的合理性、方便操作 经济风险 7 企业内部财务状况 8 通货膨胀 管理风险 9 各方管理水平的高低 10 团队的协作与沟通 11 系统专家库的设置与抽取是否合理 表1. 识别的风险因素
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user: 5. 总结 通过风险识别和风险评价，确定了项目活动中存在的风险，计算分析风险发生的概率和发生以后可能产生的影响，后续风险评价阶段的工作主要是将风险识别出的风险因子量化，计算其发生的概率和可能发生的损失来分析项目的风险水平，并根据项目本身对风险承受的能力来制定风险应对措施。 风险应对一般有风险回避、风险转移、风险自留和三种主要应对方法，结合项目在电子招投标流程中的性质和进行程度，制定综合或者单一措施风险应对方法，在各个阶段对风险进行控制，以来降低风险给建设项目带来的损失。
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user: 摘要 本试验主要借助高温固相法来合成523镍钴锰三元材料，通过研究时间、温度以及Zr掺杂量对性能的影响，找出最佳的工艺条件。由试验数据进行对比和分析可以看出：当掺杂锆含量为0.7%，烧结时间为10小时，烧结温度为920℃时，镍钴锰酸锂三元材料的性能是最佳的。其主要性能指标为：振实密度TD2.93 g∙cm −3 ，粒度D50为7.52 um，PH值为11.33，1.0 C初始容量为174.37 mAh∙g −1 ，循环50次容量为171.34 mAh∙g −1 ，50次容量保持率为98.26%。本试验结果对镍钴锰酸锂三元材料制备具有一定的参考意义。
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user: 1. 前言 动力电池关键的核心材料是正极材料，当前，动力型锂离子电池按其正极材料的不同，呈现出改性锰酸锂、磷酸铁锂和镍钴锰酸锂三元材料三大技术路线，这三大技术路线各自拥有自己的特色 [ 1 ] [ 2 ]。 镍钴锰酸锂三元材料集合了各种材料的导电性和循环性以及电池的高容量和高安全性产品，比如钴酸锂，镍酸锂等 [ 3 ]。其最大优势是在确保安全的前提下，符合了国家给新能源汽车用动力电池企业下达的三个硬性指标(单体电池300 Wh/Kg以上，循环寿命2000次，成本低于每瓦时1元) [ 4 ] [ 5 ]。高电压镍钴锰酸锂三元材料也成为这些年来产品生产量增长最快的正极材料品种 [ 6 ]。 523镍钴锰酸锂离子电池正极材料具有中等的镍含量，较高的能量密度，可控的安全性能等，既能满足当前企业生产条件控制标准，又能满足数码及动力电池对能量密度及客户对其安全性的需求。 本试验主要采用高温固相法 [ 7 ] 合成高压镍钴锰酸锂，以碳酸锂与镍钴锰氢氧化物前驱体为原料，通过晶体结构分析与计算，采用Zr体相掺杂对镍钴锰523进行改性研究，达到改善其在高电压下的电化学稳定性的目的 [ 8 ]。
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user: 2. 试验试剂、设备及研究方案 2.1. 试验试剂 本试验使用的主要试验药品见表1。 Table 1 The reagents of experimen 材料名称 表达式 等级 生产厂家 氧化锆 ZrO 2 工业级 湖南化工公司 523镍钴锰三元前驱体 Ni 0.5 Co 0.2 Mn 0.3 (OH) 2 电池级 湖南邦普循环公司 碳酸锂 Li 2 CO 3 (Li% = 18.68%) 电池级 赣峰锂业 表1. 试验试剂 2.2. 试验所用到设备 本试验所用到的主要仪器见表2。 Table 2 Equipment used for the experimen 仪器名称 型号 产家 激光粒度分析仪 LA-300 堀场(中国)贸易有限公司 马弗炉 KSL-1100X 合肥科晶材料有限公司 电池测试仪 CT-4008 深圳市新威能源技术有限公司 手套箱 MNIUIVESAR (1220-100) 米开罗那(中国)有限公司 表2. 试验所用到设备 2.3. 试验技术方案与研究方法 本试验研究掺杂锆对高电压镍钴锰酸锂性能影响的工艺流程图见图1。 图1. 试验工艺流程图 本试验研究方法： 高温固相法：镍钴锰的氢氧化物前驱体和碳酸锂或氢氧化锂，按一定的比例混合均匀再掺杂后，在700到1000度之间煅烧。
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user: 4. 结论 本试验研究掺杂氧化锆的工艺参数对高电压镍钴锰酸锂性能的影响，通过振实密度、pH值、电学性能测试和粒度分布等分析手段对高电压镍钴锰酸锂的各项性能进行分析研究。 从试验研究结果对比表明可以得出结果：本试验主要采用高温固相法合成高电压镍钴锰酸锂，在试验中通过加入不同氧化锆(ZrO 2 )添加剂的用量，探究烧结温度、烧结时间对镍钴锰酸锂三元材料性能的影响。当取掺杂量为0.7%时，综合性能指标最佳。当烧结温度(T)为920℃时，综合性能指标最佳。当烧结时间(t)为10小时，综合性能指标最佳。当综合性能最佳时，即锆掺杂量为0.7%，烧结温度为920，烧结时间为10时，相关性能指标为：振实密度TD达到2.93，D50为7.52 um，pH为11.33，1.0 C容量达到174.37 mAh∙g −1 ，50次电池的容量保持率为98.26%。
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user: 摘要 本文利用苯基环氧乙烷为唯一碳源从咖啡渣中筛选出7株具有呕吐毒素降解潜力的菌株，通过iElisa酶联免疫法确定呕吐毒素降解率，最终得到一株呕吐毒素降解能力较强的菌株XY-3。通过分子生物学技术对其进行鉴定，并初步探究了其生理生化特性。结果表明，筛选得到的菌株XY-3为解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)，其在24 h内对呕吐毒素的降解率可达到27.71%。XY-3为革兰氏阳性菌，可利用多种碳源，并具有较强的耐盐性，但是对酸性环境较敏感。本研究可为呕吐毒素生物降解拓展研究范围，并为后续的研究提供基础支撑。
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user: 1. 引言 真菌毒素是真菌的次级代谢产物，普遍出现于受真菌污染的谷物、农作物中，从而对食品和饲料产生污染。真菌毒素可对动物和人类产生严重的健康威胁，国际癌症研究组织和世界卫生组织曾研究表明真菌毒素不仅可以引起人畜急性中毒、诱发癌症还会导致儿童发育迟缓，在全球范围内约有1.6亿五岁以下儿童因真菌毒素影响而发育不良。因此对于真菌毒素的防治和降解是全球性的课题，具有深远的意义和价值 [ 1 ]。 呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol， DON)，是由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌等镰刀菌产生的次级代谢产物，也是谷物中最常见的B型单端孢霉烯类毒素 [ 2 ]。呕吐毒素其结构为3α， 7α， 15一三羟基草镰孢霉-9-烯-8-酮，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂，在高温、高压以及酸性条件下非常稳定，具有较强的细胞毒性，免疫毒性和遗传毒性 [ 3 ] [ 4 ]。有研究表明对于以鸡为例的家禽来讲，日粮中呕吐毒素的摄入会严重影响家禽的饲料摄入、生长状态以及免疫系统功能 [ 5 ]，从而增加了家禽感染传染性疾病的可能性，影响其生产性能，对家禽养殖者造成巨大的经济损失 [ 6 ] [ 7 ]。此外，呕吐毒素对于一系列神经细胞也显示出明显的神经毒性。呕吐毒素可通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导神经元细胞凋亡、影响神经递质的分泌、脂质过氧化和钙稳态，并增加了血脑屏障的通透性，从而产生神经毒性 [ 8 ]。对于人脑而言，已知研究表明呕吐毒素可以影响人脑中的多巴胺能受体，从而引起呕吐，腹泻，头痛和发烧等症状，对人体健康产生威胁 [ 9 ]。 当前对于呕吐毒素的脱毒方法主要可分为物理、化学和生物脱毒三个方法。物理方法和化学方法是当前呕吐毒素脱毒的主要方法，其中物理方法主要可分为热处理、漂白研磨、吸附、辐射处理等，化学脱毒法主要有强酸、强碱及臭氧处理等方法 [ 10 ]。虽然物理和化学脱毒方法在实际生产中具有应用面较广、价格低廉等优势，但是仍存在如降低农产品、饲料质量，降低食品营养价值及风味、有机物残留等缺点，限制了物理化学等脱毒方法在生产中的应用 [ 11 ]。生物脱毒具有反应条件温和、不使用有害化学试剂、对原料感官性状和适口性影响较小以及营养成分损失较少等优点，是当前食品、饲料处理过程中极具前景和潜力的呕吐毒素降毒方法，其主要机理可分为微生物菌体的吸附作用以及微生物的酶促降解作用 [ 12 ] [ 13 ]。其中微生物的酶促降解作用其机理主要有三种：1) C12、C13的开环氧化；2) 3C-OH的氧化、糖苷化或异构化作用；3) 水合作用 [ 14 ] [ 15 ]。有研究表明一些微生物可以利用呕吐毒素作为唯一碳源维持其生长，并通过以上三种机理将呕吐毒素转化为低毒甚至是无毒的产物，从而实现呕吐毒素脱毒的目的。因此脱毒菌株的筛选是当前呕吐毒素生物降解研究的关键和热点 [ 16 ]。 本文以从咖啡渣中筛选出了一株降解呕吐毒素的解单端孢菌素微杆菌XY-3，利用iELISA酶联免疫法测定了其对呕吐毒素的降解率，并对其生理生化特征进行了鉴定，为筛选新的呕吐毒素降解菌和在实际生产中呕吐毒素降解的应用提供了理论基础，具有一定的应用前景和价值。
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user: 2. 材料与仪器 2.1. 试验材料 LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加水定容至1 L，121℃灭菌15 min。 LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，加水定容至1 L，121℃灭菌15 min。 筛选培养基：硫酸铵1 g，磷酸二氢钾3 g，磷酸氢二钾6 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.001 g，氯化钙0.05 g，玉米浆0.1 g，琼脂20 g，加水定容至1 L，121℃灭菌15 min。灭菌后，待稍冷却后加入经0.22 μm有机膜过滤后的苯基环氧乙烷至15 mmol/L作为唯一碳源，振荡分散均匀 [ 17 ]。 呕吐毒素标准品购于青岛普瑞邦生物工程有限公司；呕吐毒素iELisa呕吐毒素检测试剂盒购于北京中检维康生物技术有限公司；Lysis Buffee for Microogranism to Direct PCR试剂盒购买于北京宝日医生物技术有限公司；使用试剂均为分析纯。 2.2. 试验设备 SW-CJ-1FD超净工作台，购于苏州安泰空气技术有限公司；XLS-3750高压蒸汽灭菌锅，购于日本松下三洋公司；ZQLY-180F振荡培养箱，购于上海知楚仪器有限公司；LRH-250生化培养箱，购于上海一恒科技有限公司；3K15冷冻离心机，购于德国Sigma公司；SpectraMax Plus 384酶标仪，购于美国Bio-Rad公司；光学显微镜，购于日本Olympus公司。
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user: 3. 实验方法 3.1. 细菌的富集与分离 取5 g样品与45 ml的无菌水中，充分振荡混合后梯度稀释，取100 μl涂布于LB培养基，于37℃培养48 h。根据菌落形态及生长状况，挑去不同形态的单菌落在LB培养基中划线纯化，纯化后的菌株用50%甘油于−80℃中冷冻保存备用。 3.2. 呕吐毒素降解菌初筛 将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，37℃连续活化两代后，取1 ml菌液于2 ml离心管中，4℃，6000 xg离心10 min，去除上清液，用无菌水洗涤两次，梯度稀释。取100 μl不同稀释度的菌悬液涂布于筛选固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养，观察菌落生长状况。记录可在筛选培养基上生长的菌株，进行进一步筛选。 3.3. 呕吐毒素降解菌复筛 取初筛菌株于筛选培养基中37℃，180 r/min条件下培养24 h，发酵液于4℃，8000 xg条件下离心10 min，收集上清液，以苯基环氧乙烷为底物，利用酶标仪测定发酵上清液中的降解酶活力，筛选出降解活力最高的菌株 3.3.1. 苯基环氧乙烷标准曲线的测定 于1.5 ml的离心管中，加入135 μl磷酸盐缓冲溶液(pH = 8)与15 μl浓度分别为50、100、200、300、400、500 mmol/L的苯基环氧乙烷溶液，立即加入150 μl丙酮，充分振荡后依次加入三乙二醇二甲醚、三乙胺、230 mmol/L的4-(对硝基苄基)吡啶溶液各50 μl，混合震荡后取200 μl混合溶液于96孔板中，30℃保温90 min，分别测定在580 nm处的吸光值，绘制标准曲线。 3.3.2. 不同菌株降解酶活性的测定 于1.5 ml的离心管中，加入135 μl上清液与15 μl 200 mmol/L的苯基环氧乙烷溶液，30℃保温10 min后立即加入150 μl丙酮，充分振荡后依次加入三乙二醇二甲醚、三乙胺、230 mmol/L的4-(对硝基苄基)吡啶溶液各50 μl，混合震荡后取200 μl混合溶液于96孔板中，30℃保温90 min，分别测定在580 nm处的吸光值，以苯基环氧乙烷浓度为X轴，以相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将在30℃下，每分钟水解1 μmol苯基环氧乙烷所要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 3.4. 呕吐毒素降解率的测定 3.4.1. 呕吐毒素标准曲线的测定 根据iELisa呕吐毒素检测试剂盒说明书测定绘制呕吐毒素标准曲线，具体步骤如下：取50 μl呕吐毒素标准品于微孔中，依次加入50 μl的DON酶标抗原与50 μl DON抗体，震荡均匀避光于室温温育30 min，甩干孔液，加入250 μl洗涤液充分洗涤30 s，充分洗涤三次。洗涤完毕后在吸水纸上用力拍干孔液，加入150 μl底物，避光室温温育10 min后，每孔加入50 μl反应终止液，测定450 nm处的吸光值，以呕吐毒素标准品浓度值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。 3.4.2. 呕吐毒素浓度降解率测定 以呕吐毒素纯品为底物，测定菌株呕吐毒素降解能力。挑取复筛菌株接种于50 ml的LB液体培养基中，37℃，180 r/min培养24 h，作为种子液。以2%的接种量再次接种于LB液体培养基中，相同培养条件培养24 h，作为发酵液。取990 μl发酵液于离心管中，加入10 μl浓度为100 μg/ml的呕吐毒素标准工作液，于37℃，180 r/min培养48 h，以LB液体培养基作为对照。48 h后将待检测液于10，000 xg离心5 min，取上清液经0.22 μm的无菌过滤器过滤后，用酶联免疫试剂盒测定上清液中呕吐毒素剩余含量，计算呕吐毒素降解率，测定方法与3.4.1相同。 3.5. 呕吐毒素降解菌的鉴定 将XY-3划线接种于LB培养基中，37℃培养24 h后观察菌株生长状态、色泽和菌落特征并进行革兰氏染色实验，按《伯杰氏细菌鉴定手册》说明，对XY-3进行形态学和生理生化鉴定 [ 18 ]。 3.6. 呕吐毒素降解菌的分子生物学鉴定 根据Buffee for Microogranism to Direct PCR试剂盒说明书要求，提取菌株基因组。使用细菌通用引物7F和1540R进行PCR扩增。扩增产物委托杭州擎科生物技术有限公司进行测序，所得序列利用Blast与GenBank数据库进行比对，并利用MEGA 7.0软件根据亲缘关系构建菌株进化树。 3.7. 统计分析 实验数据均使用SPSS 22.0软件进行单因素ANOVA分析，进一步利用Duncan检验进行组件显著性差异分析，p < 0.05表示具有显著性差异。
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user: 4. 结果与分析 4.1. 脱毒菌株的筛选 苯基环氧乙烷与呕吐毒素具有相同的C12、C13环氧结构，是低成本且有效的呕吐毒素脱毒菌株筛选方法之一。按照3.1的方法，从咖啡渣样品中筛选出来的菌株中，共筛选获得7株可在以苯基环氧乙烷为唯一碳源的初筛培养基中优势生长的菌株，分别编号为XY-1，XY-2，XY-3，XY-4，XY-5，XY-6，XY-7。通过测定这7株优势生长菌株对苯基环氧乙烷降解的酶活力，对这7株菌株进行复筛。从图1中可以看出，在7株菌株中，除XY-2外其余菌株上清液均能对苯基环氧乙烷有降解作用，其中XY-3与XY-5可以显著降低苯基环氧乙烷的含量，说明XY-3和XY-5极有可能产生具有降解呕吐毒素作用的胞外酶，并具有较强酶活性。 图1. 苯基环氧乙烷标准曲线(A)及各菌株对其降解效果测定(B) 4.2. 呕吐毒素降解率测定 根据3.4的方法利用呕吐毒素酶联免疫试剂盒，对酶活性较强的5株菌(XY-1， XY-3， XY-4， XY-5， XY-6)，进行呕吐毒素降解率测定。由图2可得，这5株菌均对呕吐毒素具有降解作用，其中XY-3较其他菌株能显著降解培养基中的呕吐毒素，在24 h内其降解率达到27.71%，故取XY-3作为优势菌株进行进一步研究。 4.3. 脱毒菌株的鉴定 4.3.1. 菌株形态学特征 对XY-3进行菌落形态和革兰氏染色剪点，如图3(A)所示，XY-3在LB培养基中37℃培养24 h后，菌落形态呈圆形、金黄色不透明，表面凸起湿润光滑，边缘整齐。菌落革兰氏染色结果如图3(B)所示，经显微镜1000倍放大后观察可得XY-3为革兰氏阳性菌，在显微镜下菌体呈短杆状，无芽孢。 图2. 呕吐毒素标准曲线(A)及各菌株对其降解效果测定(B) 图3. 菌株XY-3的菌落形态(A)及革兰氏染色(B) (10 × 100) 4.3.2. 菌株16S rDNA鉴定 使用Lysis Buffee for Microogranism to Direct PCR试剂盒提取XY-3基因组，并对其进行PCR扩增。将扩增产物进行基因组测序，将测序结果于NCBI中进行BLAST比对，并通过MEGA软件构建XY-3亲缘进化树。比对结果如图4亲缘关系进化树所示，XY-3与KF953537.1 Microbacterium trichothecenolyticum strain M03 L05 (解单端孢菌素微杆菌)亲缘关系最近，结合其菌落形态特征和DNA同源性比对结果，将XY-3确认为解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)。 4.3.3. 菌株生理生化特征 对XY-3进行部分生理生化特性鉴定，包括生长实验及化学敏感性实验，实验结果如表1、表2、表3所示，结果表明XY-3可分泌接触酶和β-半乳糖醛酸酶，并能利用如a-D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、蔗糖、D-麦芽糖等多种碳源促进生长。同时XY-3具有较强的耐盐能力，对多种抗生素如利福霉素SV、氨曲南、萘啶酸等不敏感，但在pH为5.0以及盐酸胍、十四烷硫酸钠、夫西地酸存在的条件下较为敏感，无法生长。 图4. 菌株XY-3基于16SrDNA的系统进化树 Table 1 Basic physiological and biochemical identification of strain XY- 实验项目 结果 实验项目 结果 接触酶 + β-半乳糖醛酸 + 精氨酸双水解酶 − 氧化酶 − 柠檬酸利用 − 鸟氨酸脱羧酶 − 赖氨酸脱羧酶 − 产生H 2 S − 脲酶 − 色氨酸脱羧酶 − 产生吲哚 − VP反应 − 表1. XY-3生理生化鉴定 Table 2 Carbon source analysis and identification of strain XY- 实验项目 结果 实验项目 结果 实验项目 结果 a-D-葡萄糖 + 明胶 + D-甘露醇 + 吐温40 + 3-甲基-D-葡萄糖 − D-丝氨酸 − D-甘露糖 + D-水杨酸 + D-阿糖醇 − γ-氨基丁酸 − D-半乳糖醛酸 − 丙酸 − D-果糖 + L-丙氨酸 + 肌醇 − D-乳酸甲酯 − L-半乳糖酸内酯 − 甲酸 − D-半乳糖 + L-精氨酸 − 甘油 + L-乳酸 + D-葡糖-6-磷酸 + D-纤维二糖 + 龙胆二糖 + L-天冬氨酸 + D-麦芽糖 + 柠檬酸 + D-果糖-6-磷酸 + D-海藻糖 + 蔗糖 + L-谷氨酸 + 奎宁酸 − α-酮戊二酸 − D-葡萄糖醛酸 − β-甲基-D-葡糖苷 − 松二糖 + L-组氨酸 − 糖质酸 − L-苹果酸 + 葡糖醛酰胺 + N-乙酰-D-葡糖胺 − 水苏糖 − L-焦谷氨酸 − 果胶 + D-棉子糖 − 甘氨酸-L-脯氨酸 − N-乙酰-β-D-甘露糖胺 − 肌苷 + L-丝氨酸 + D-天冬氨酸 − α-D-乳糖 + p-羟基苯乙酸 + N-乙酰-D-半乳糖胺 − D-山梨醇 − 粘酸 − D-葡糖酸 + D-蜜二糖 − β-羟基-D，L-丁酸 + N-乙酰神经氨酸 − 表2. XY-3碳源分析鉴定 Table 3 Sensitivity test of strain XY- 实验项目 结果 实验项目 结果 1% NaCl + 盐酸胍 − 4% NaCl + 萘啶酸 + 8% NaCl + 十四烷硫酸钠 − pH 6.0 + 夫西地酸 − pH 5.0 − 氯化锂 + 利福霉素SV + 溴酸钠 + 氨曲南 + 亚碲酸钾 + 1%乳酸钠 + 丁酸钠 + 表3. XY-3敏感性鉴定
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user: 5. 结论 本研究通过呕吐毒素类似物从咖啡渣中筛选出7株具有降解呕吐毒素潜力的菌株，并对前5株优势菌株进行呕吐毒素降解率测定。在含有呕吐毒素的培养基中培养后，通过iElisa酶联免疫试剂盒最终筛选出一株具有较高呕吐毒素降解率的菌株XY-3，在24 h内其降解率为27.71%。经分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)，并通过一系列生理生化鉴定，初步了解了XY-3的生长特性和化学敏感性。上述研究为呕吐毒素降解菌株的筛选提供了理论基础，并进一步拓展了微生物在呕吐毒素降解中的应用前景，为后续的研究提供了基础和参考。
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user: 摘要 致病疫霉(Phytophthora infestans)是马铃薯最具破坏性的病原体。本试验比较了不同培养基对致病疫霉生长、无性生殖、有性生殖的影响。结果显示，在黑麦培养基(RA)、胡萝卜培养基(CA)和放置玻璃纸的黑麦培养基(CP)上，菌株P7723的生长速率大小顺序为CP > CA、RA；菌株HQK8-3的生长速率为RA > CP > CA。不同培养基对卵孢子的形态及发育过程无明显影响，两个菌株在CA上的卵孢子数量最高，为701个/cm 2 ，是RA上的2.48倍，是CP上的70.1倍。卵孢子在CA上的存活率为55%，在RA上为67%，在CP上为48%。不同培养基对孢子囊的形态没有影响。不管是单独培养还是对峙培养，菌株HQK8-3和P7723在胡萝卜培养基上产的孢子囊数量最多，在RA上产得较少，在CP上不产孢子囊。不管是单独培养还是对峙培养，在CP上收集到的菌丝体生物量最多，CA上次之，RA上最少。因此，综合以上指标，胡萝卜培养基更适合在致病疫霉生长及有性、无性生殖研究中被用来收集生物样本，该实验结果为今后深入研究致病疫霉时能够获得足够量符合条件的生物样本奠定了基础。
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user: 1. 引言 马铃薯被联合国列为继小麦、水稻和玉米之后世界第四大粮食作物 [ 1 ]，在世界人口不断增长的时代，增加马铃薯产量对于防止全球营养不良和饥饿至关重要 [ 2 ]。致病疫霉(Phytophthora infestans)是马铃薯最具破坏性的病原体 [ 3 ]，也是卵菌纲的模式生物，它在19世纪爱尔兰马铃薯饥荒期间导致数百万人死亡 [ 4 ]。 致病疫霉具有无性和有性生命周期。无性生殖时以孢子囊或菌丝体侵染植物，是田间侵染过程中完成其生活史的主要阶段。有性生殖时，遗传物质重组导致了遗传变异和各地更复杂化的生理小种，产生的厚壁卵孢子又能抵抗冷冻、干燥、干旱、微生物降解，并在土壤中以静止状态持续多年 [ 5 ]，然后卵孢子萌发出孢子囊或菌丝继续存活，使作物品种抗性丧失，从而对世界马铃薯、番茄和其他50个茄属(Solanum)植物生产构成严重的威胁 [ 6 ]。 在科研实验中，能够比较容易收集到足够量的生物样本对进行疫霉菌生态学、生物学、遗传分析、分子分析及致病性的测定等方面具有重要意义。不同的培养条件对疫霉菌的生长、生殖等会产生不同的影响。Mokhtar M. Satour等认为辣椒疫霉 [ 7 ] 卵孢子在V8培养基上产量最多；Thawee Kaosiri等对比了CA、CV-8A和SM培养基对棕榈疫霉 [ 8 ] 卵孢子数量的影响，其中CA上产量最多；M.A. DOSTER等研究结果显示利用低温，并向培养基中添加玉米油、亚麻子油或小麦胚芽油，会使丁香疫霉 [ 9 ] 卵孢子数量增加；Richard C等使用V8-CaCOa液体培养基诱导寄生疫霉 [ 10 ] 产生大量卵孢子；孙志宁等 [ 11 ] 也比较了CA、V8、RA、BA和OMA产致病疫霉孢子囊情况，其中OMA和BA能产生孢子囊，其余培养基均未产生孢子囊；李岩 [ 12 ] 采用玻璃纸胡萝卜琼脂培养大豆疫霉菌，10 d内没有产生卵孢子，表示此方法只适合培养大豆疫霉菌纯营养菌丝。以上大部分方法只是针对所研究的疫霉菌，尚不知道这些方法是否也能适用于致病疫霉。本试验比较了不同培养基对致病疫霉生长、无性生殖、有性生殖的影响，为今后深入研究致病疫霉时能够获得足够量符合条件的生物样本奠定了基础。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 供试菌株 致病疫霉菌株 HQK8-3 (A1交配型)由内蒙古农业大学农学院周洪友教授惠赠，致病疫霉菌株P7723 (A2交配型)由福建农科院兰成忠研究员惠赠。所有的致病疫霉菌株均于18℃黑暗条件下培养。 2.2. 方法 2.2.1. 培养基制备 1) 黑麦培养基(RA)。参照郑小波的方法 [ 13 ]，称取50 g黑麦种子，加去离子水1000 mL，浸泡24~36小时，121℃灭菌20 min，经四层纱布过滤除渣，上清液补水至1000 mL，加20 g琼脂。121℃灭菌20 min。 2) 胡萝卜培养基(CA)。参照郑小波的方法 [ 13 ]，将200 g新鲜的胡萝卜切成小片，加去离子水500 mL，用组织捣碎机捣碎约40秒，经四层纱布过滤去渣，上清液补水至1000 mL，加20 g琼脂。121℃灭菌20 min。 3) 放置玻璃纸的黑麦培养基(CP)。将玻璃纸裁剪为与培养皿大小一致的圆形，121℃灭菌20 min，放入配置好的黑麦培养基上。 2.2.2. 生长曲线的测定及菌落形态观察 分别将菌株P7723和HQK8-3进行对峙培养和单独培养。对峙培养时，将新鲜培养的菌株P7723和HQK8-3，从菌落边缘用蓝枪头扎取菌丝块，两菌块相距3.5 cm，分别接种于不同培养基平皿上。单独培养时，将新鲜培养的菌株P7723和HQK8-3，从菌落边缘用蓝枪头扎取菌丝块，单独接种于不同培养基的中间。所有菌都在18℃条件下黑暗培养8 d，观察供试菌株在不同培养基上的菌落形态。从第三天开始，用十字交叉法测定菌落直径，直至接种后8 d，计算生长速率，每种培养基设置3个生物学重复。生长速率=菌落直径/培养时间，使用SPSS软件分析生长速率的差异。 2.2.3. 卵孢子的数量测定及形态观察 将菌株P7723和HQK8-3在不同培养基上对峙培养，当两种交配类型的菌丝体发生交接开始，在交接面用蓝枪头扎取菌块，在光学显微镜下镜检，观察卵孢子的形态特征，统计每个菌块的卵孢子数量，每种培养基测量3个重复，然后根据菌丝块面积，换算成每cm 2 菌丝块上产生多少个卵孢。 2.2.4. 卵孢子的活力测定 MTT染色法：将对峙培养的平板，用手术刀收集交接面的菌丝，放入0.05% MTT溶液中，36℃、黑暗静置培养24 h，在光学显微镜下观察，统计不同颜色卵孢子数量，每种培养基至少统计100个卵孢子，计算卵孢子活力率。存活率 = 紫色和红色卵孢子的总数/卵孢子的总数。 2.2.5. 孢子囊的数量测定及形态观察 培养方法同2.2.1与2.2.2，将对峙培养、单独培养在不同培养基上的菌株，从第5天开始，用蓝枪头在菌落的不同位置均匀的扎取菌块，在显微镜下镜检，观察孢子囊的形态特征，并记录每个菌块的孢子囊数量，每种培养基测量3个重复，然后根据菌丝块面积，计算每cm 2 菌丝块上的孢子囊数量。 2.2.6. 菌丝体生物量的测定 培养方法同2.2.1与2.2.2，当对峙培养的两种交配类型的菌丝体交接第7天时，用手术刀收集交接面的菌丝，单独培养的也在同一天，用手术刀收集整个菌落的菌丝，称量菌丝体重量，每种培养基设3个生物学重复。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 不同培养基对致病疫霉的生长曲线及菌落形态的影响 将致病疫霉菌株接种在不同培养基上，每天检测菌落直径，绘制其生长曲线。致病疫霉菌株P7723和HQK8-3的菌落直径随时间的变化如图1(a)所示，在接种3~8天内，菌落直径随时间呈现直线上升趋势。计算菌株P7723和HQK8-3的生长速率(图1(b))，菌株P7723在3种培养基上的生长速率大小顺序为CP > CA、RA，菌株HQK8-3在3种培养基上的生长速率为RA > CP > CA。观察两个菌株在不同培养基上的形态特征(图2)，菌株P7723在不同培养基上的菌落特征有较明显差异，在CA平板上的菌落为棉絮状，气生菌丝很多，菌丝较厚、色白，有白色斑点；在CP和RA上，菌落扁平，气生菌丝较少，色较淡。而菌株HQK8-3在3种培养基上的菌落特征没有明显差异，都为棉絮状，气生菌丝很多，菌丝较厚、色白。 图1. 菌株P7723和HQK8-3在三种培养基上的生长曲线及生长速率 图2. 菌株P7723和HQK8-3单独培养和对峙培养7天时的菌落形态 3.2. 不同培养基对致病疫霉卵孢子数量、形态及活力的影响 将菌株P7723和HQK8-3在不同培养基上对峙培养，从两个菌株的菌丝发生交接开始观察交接面卵孢子的数量及形态特征。如图3(a)所示，两个菌株在CA上交接3天开始产卵孢子，7天时卵孢子数最多为701个/cm 2 ；在RA上交接2天开始产卵孢子，4天时卵孢子数最多为282个/cm 2 ；在CP上交接4天开始产卵孢子，7天时卵孢子数最多为10个/cm 2 。三种培养基中CA上的卵孢子数量最高，是RA上的2.48倍，是CP上的70.1倍。 三种培养基上的卵孢子形态无明显差异(图4)，均为卵圆形，黄褐色，大小为13.36~28.06 µm，均值22.10 µm，发育早期为单壁，发育成熟时会出现双壁，卵孢子的双壁率随发育时间呈现不断增高的趋势(图3(b))。在两个菌株的交接面内均没有观察到孢子囊，但在非交接面观察到了孢子囊。在CA上，菌株P7723和HQK8-3在交接面外的区域均能产生孢子囊；在RA上，菌株HQK8-3的非交接面会产生孢子囊，菌株P7723的非交接面不会产生孢子囊；在CP上，菌株P7723和HQK8-3的非交接面区域都没有产生孢子囊。 图3. 致病疫霉的卵孢子数量及双壁率 图4. 菌株P7723和HQK8-3对峙培养时的有性生殖和无性生殖 观察卵孢子的发育过程(图5)。交接1~3天时，两株菌的菌丝接触后，产生卵原细胞的菌丝会穿雄器(图5(A))，此过程较快，不易观察到，之后卵原细胞穿过雄器不断膨大(图5(B))；交接3~4天时，卵原细胞会完全膨大(图5(C))，大量的菌丝细胞质向膨胀的卵原细胞流动，卵原壁的表面积扩大，但厚度保持不变，与菌丝壁的厚度相近，在这个阶段，有大量的“功能性”细胞质(核糖体、线粒体、内质网、高尔基体及其囊泡)和细胞核，约占这个卵原细胞原生质空间的60%，剩下的是由类脂体和液泡组成的“储存”细胞质；交接5~6天，在完成扩张阶段后，卵原细胞内形成了一个大的卵球，卵原细胞壁不断增厚(图5(D))，液泡和类脂内含物占卵球细胞质的85%~95%；交接6~7天，卵原细胞发育为成熟的卵孢子(图5(E))，细胞核通常位于卵球的外围，被含有大量细胞质核小体、粗面内质网和线粒体的细胞质所包围；交接8天后，卵原细胞发育为休眠的卵孢子，形成卵质体和细胞核(图5(F))，细胞核一般有1个或多个。在RA和CP上的卵孢子发育过程和在CA上的相同。 图5. 在CA培养基上致病疫霉的卵孢子发育过程 MTT是一种活体染色剂，卵孢子经MTT染色后，红色或紫色的被认为是可存活的，死亡的卵孢子是黑色和未染色的 [ 14 ]。在对峙培养7天后，在交接面取样对卵孢子进行MTT染色(图6)。图6(A)和图6(B)为完全膨大的卵孢子，MTT染色后呈紫色和红色，为休眠期可存活的卵孢子；图6(C)和图6(D)为双壁的卵孢子，MTT染色后呈紫色和红色，也为休眠期可存活的卵孢子；图6(E)的卵孢子染色后呈黑色，图6(F)的卵孢子染色后未染色，都为无活力的卵孢子。根据染色情况来统计不同培养基上的卵孢子存活率。卵孢子在CA上的存活率为55%，在RA上为67%，在CP上为48%。 3.3. 不同培养基对致病疫霉孢子囊数量及形态的影响 在不同培养时间检测不同培养基上致病疫霉菌株产孢子囊的数量并观察孢子囊形态特征。在胡萝卜培养基上，菌株HQK8-3和P7723均产孢子囊(图7(a))；单独培养时，菌株HQK8-3在11天时孢子囊数量最多，为359个/cm 2 ；菌株P7723在7天时孢子囊数量最多，为18个/cm 2 。对峙培养时，菌株HQK8-3在13天时孢子囊数量最多，为441个/cm 2 ；菌株P7723在9天时孢子囊数量最多，为52个/cm 2 。在黑麦培养基上，菌株HQK8-3产孢子囊，菌株P7723不产孢子囊(图7(b))；单独培养时，菌株HQK8-3在7天时孢子囊数量最多，为65个/cm 2 ；对峙培养时，菌株HQK8-3在7天时孢子囊数量最多，为99个/cm 2 。对峙培养时，在两个菌株菌丝交接面内不会产生孢子囊，但在交接面外仍然会进行无性生殖，孢子囊数量也没有减少。不同培养基对两个菌株的孢子囊形态均未产生明显影响(图8)。而在CP培养基上，不管是单独培养还是对峙培养，两个菌株均不产生孢子囊。 图6. 卵孢子的MTT染色 图7. 不同培养基上致病疫霉的孢子囊产量 图8. 不同培养基上的孢子囊形态 3.4. 不同培养基对致病疫霉菌丝体生物量的影响 在后期实验中，需要在HQK8-3和P7723两个菌株对峙培养的交接面上收集到足够的菌丝，因此，接下来对两个菌株在不同培养基上对峙培养时交接面上收集到的菌丝量及单独培养时的菌丝量进行了检测。将菌株HQK8-3和P7723对峙培养，在两个菌株交接7天后，收集交接面的菌丝并称重(图9(a))。CA上可收集到的菌丝重量为3.8 mg/板，RA上的菌丝重量为0.2 mg/板，CP上的菌丝重量为22.8 mg/板，CP上的菌丝重量是CA上的6倍，是RA上的114倍(图9(b))。 单独培养时，P7723在CA上的菌丝重量为2.4 mg/板，RA上为0.1 mg/板，CP上为27.1 mg/板；HQK8-3在CA上的菌丝重量为10.1 mg/板，RA上为2.7 mg/板，CP上为29.4 mg/板。不同培养基对致病疫霉菌株单独培养和对峙培养时菌丝量的影响相同。两个菌株在CP上收集的菌丝量均显著多于在CA和RA上的菌丝量，菌丝重量都在20 mg以上，在CA上收集的菌丝重量在2 mg~11 mg之间，在RA上收集的菌丝重量小于3 mg (图9)。 图9. 不同培养基上致病疫霉的菌丝体生物量
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user: 4. 讨论 综上，三种培养方法对致病疫霉菌株的菌丝体、孢子囊、卵孢子形态均未产生影响。在CP上收集的菌丝量明显高于另外两种培养基，但是CP上的卵孢子数量极少，也没有观察到孢子囊，说明放置了玻璃纸的培养方法会影响菌株的有性生殖和无性生殖，因此，该方法不适合检测致病疫霉有性生殖或无性生殖过程时用来收集样品。而CA和RA上两个菌株的交接面均可以产生大量的卵孢子，且在两种培养基上，卵孢子的发育过程相同，虽然在CA上的卵孢子存活率要低于RA上的，但是CA上的卵孢子数量远远高于RA上的。在CA和RA上，单独培养、对峙培养的非交接面均可正常产生孢子囊，CA上的孢子囊数量明显高于RA上的。此外，对峙培养、单独培养时，CA上收集到的菌丝体生物量均明显高于RA上的。因此，根据以上指标，胡萝卜培养基更适合在致病疫霉生长及有性、无性生殖研究中被用来收集生物样本。 CA培养基被许多人作为产卵孢子的培养基，例如，荔枝霜疫霉 [ 15 ] 在CA上卵孢子的产量最高，棕榈疫霉 [ 8 ] 在CA上产的卵孢子最多，培养大豆疫霉 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] 卵孢子时也用CA，上述结果与本研究结果相同。本文中致病疫霉卵孢子的形态与烟草疫霉 [ 19 ]、辣椒疫霉 [ 20 ]、大豆疫霉 [ 21 ] 等相似。DON E. HEMMES等 [ 22 ] 使用电镜观察辣椒疫霉卵孢子发育形态，接种后77~100小时卵孢子为单壁，117小时后卵孢子变为双壁，190小时发育为成熟卵孢子，本试验结果与辣椒疫霉相似，致病疫霉卵孢子的发育过程也是从单壁变为双壁，并且在菌丝交接后的6~7天发育为成熟的卵孢子。兰成忠等 [ 23 ] 的研究结果显示，辣椒疫霉在OMA、CA和RA培养基可产生孢子囊，王良华 [ 24 ] 的研究结果显示大豆疫霉在PDA培养基上生长缓慢，在利马豆、玉米粉、V8汁等培养基上生长较快，在RA和V8上可产生孢子囊 [ 25 ]，但本研究中致病疫霉菌株P7723在RA上不产孢子囊，在CA上只产生极少量孢子囊，而菌株HQK8-3在这两种培养基上均可产生大量孢子囊，这可能与致病疫霉菌株的具体特性有关。李岩 [ 9 ] 采用胡萝卜和玻璃纸胡萝卜培养基培养大豆疫霉菌，两种培养基均产生孢子囊，玻璃纸胡萝卜培养基上菌丝生长速度比胡萝卜培养基上的慢，10天内胡萝卜培养基产生了卵孢子，而玻璃纸胡萝卜培养基没有产生卵孢子，在产卵孢子方面与本研究结果相同，说明在培养基上放置玻璃纸这种方法只适合培养大豆疫霉或致病疫霉纯营养菌丝，不适合用来培养致病疫霉和大豆疫霉卵孢子。
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user: 摘要 本研究使用切换图片命名任务，主要考查二语词汇主观熟悉度在言语产生过程中对中–英双语者语码切换代价的影响。结果显示：在以切换代价(被动控制)作为转换代价的指标时，不论二语词汇熟悉度高低，被试均未出现语码转换的不对称性。而以混合代价(主动控制)作为语码切换的指标时，在词汇熟悉度较高情况下呈现出语码转换代价的对称性，符合双语言激活模型；反之，在词汇熟悉度较低时，出现了语码转换代价的不对称性，结果与预期相符合，与抑制控制模型相匹配。这表明，二语词汇熟悉度的与否，对双语者言语产生中的语码转换代价产生影响，并为进一步整合两种理论模型提供依据，丰富了已有研究结果。
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user: 2. 实验方法 2.1. 被试 34名非英语专业大学生(15男，17女)，年龄20~24岁，母语均为汉语，英语平均习得年龄平均为12岁。 2.2. 材料 正式实验共有四个block，图片选自张清芳和杨玉芳评定的图片库，每张图片均对应一个中文词和一个英文词(如，dog——狗)。根据图库中已有命名一致性、表象一致性评分进行选取，最终选择命名一致性高于80%，表象一致性高于3，同时图片所对应英文词汇的词长进行平衡，最后共选用了240张常用的动物、物体黑白图片。15名与正式实验被试英语水平相当的本科生对这240张图片对应的英文词汇的主观熟悉度进行7点等级测评(1-相当不熟悉，7-相当熟悉)，根据所得评分将图片分为高熟悉组和低熟悉组。 2.3. 实验设计 本实验采用2 (语言类型：汉语、英语) × 2 (切换类型：切换、无切换) × 2词汇熟悉度(高熟悉组、低熟悉组)三因素被试内实验设计。 2.4. 实验流程 正式实验中，被试被要求完成两类任务——单一语言命名任务和混合语言命名任务。单一语言命名任务分为中文命名和英文命名，各有40个试次，混合语言命名任务分为词汇熟悉度高低两组，各有80个试次。此外，在混合语言命名任务中，所有刺激被分为两种类型的试次，切换试次和无切换试次。切换试次是指当前图片与前一张图片以不同语言命名，无切换试次是指当前图片使用与前一张图片以相同语言命名。每一个混合block包含40个切换试次和40个无切换试次，两种试次随机出现。 每张图片均出现在电脑屏幕中央，红色和绿色圆圈出现在图片上方3厘米处作为命名语言提示，红色圆圈用中文命名，绿色圆圈用英文命名。 使用DMDX程序呈现刺激图片，电脑刷新率60 Hz。图片呈现在黑色背景正中央，被试眼睛距离电脑大约60厘米，图片命名录音以及命名反应时均被DMDX记录。实验采用图片命名范式，正式实验开始前，屏幕中央首先指导语，要求被试又快又正确地对图片进行命名，并根据指导语提示做出相应的反应。正式实验开始后，每个试次会首先呈现300 ms注视点，紧随200 ms黑屏，之后命名语言提示(红绿圆圈)以及图片同时呈现2500 ms，同时要求被试根据命名语言提示大声命名图片，间隔1000 ms后呈现下一试次。整个实验过程共需30分钟。
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user: 3. 结果分析 研究只对正确反应的反应时和错误率进行分析，首先删除7名错误率高于40%的被试的数据，并将2.5个标准差以外的极端数据进行剔除。表1、表2中呈现的是混合语言命名任务下的平均反应时和错误率。 3.1. 针对反应时和错误率的三因素重复测量方差分析 Table 1 Mean error rate M(SD 实验条件 命名语言 切换 无切换 高熟悉度 L1 0.15(0.12) 0.17(0.16) L2 0.23(0.14) 0.23(0.12) 低熟悉度 L1 0.20(0.11) 0.20(0.09) L2 0.40(0.12) 0.29(0.10) 表1. 平均错误率M(SD) Table 2 Mean reaction time M(SD) (Unit: ms 实验条件 命名语言 切换 无切换 高熟悉度 L1 1352(143) 1302(157) L2 1271(166) 1314(166) 低熟悉度 L1 1416(134) 1340(157) L2 1456(136) 1391(136) 表2. 平均反应时M(SD) (单位：ms) 对所有被试在各个条件下的反应时及错误率进行三因素重复测量方差分析。 以下为错误率重复测量方差分析的结果，语言类型主效应显著，F 1 (1，25) = 24.23，p < 0.01；切换类型主效应显著，F 1 (1，25) = 4.88，p < 0.05；词汇熟悉度主效应显著，F 1 (1，25) = 27.74，p < 0.05；语言类型与切换类型交互作用显著，F 1 (1，25) = 6.74，p < 0.05，进一步的简单效应分析得出，在使用第二语言命名时上，切换的错误率明显高于无切换时，p < 0.01；语言类型与词汇熟悉度交互作用显著，F 1 (1，25) = 14.91，p < 0.01，进一步进行简单效应分析得出，在使用非母语进行命名时，二语词汇熟悉度较高时的错误率显著低于熟悉度较低的情况，p < 0.01；切换类型与词汇熟悉度交互作用显著，F 1 (1，25) = 8.84，p < 0.01，进一步进行简单效应分析得出，无论是切换试次还是非切换试次，二语词汇熟悉度较低时错误率均显著高于二语词汇熟悉度较高的情况，p < 0.01；语言类型、切换类型和词汇熟悉度三者交互作用不显著，F 1 (1，25) = 3.56，p > 0.05； 以下为反应时重复测量方差分析的结果，语言类型、切换类型和词汇熟悉度三因素间交互作用不显著；三个自变量两两间交互作用也不显著。 3.2. 切换代价和混合代价分析 在本研究中语码转换代价的指标有切换代价和混合代价两种，前者指在混合语言命名任务中，切换系列与无切换系列在反应时上的差异；后者指在混合语言命名任务中，无切换系列与单一语言命名系列在反应时上的差异。切换代价和混合代价如表3所示。 Table 3 Switching cost and mixing cost M(SD) (Unit: ms 实验条件 命名语言 切换 无切换 高熟悉度 L1 50(18) 161(135) L2 58(21) 113(126) 低熟悉度 L1 76(19) 170(114) L2 64(23) 42(122) 表3. 切换代价及混合代价M(SD) (单位：ms) 之后进一步对L1切换至L2、L2切换至L1两类切换代价在不同词汇度熟悉度下进行配对样本t检验，结果显示在词汇熟悉高低两水平下，其反应时之间均无差异，t = −0.34，p > 0.05；t = 0.47，p > 0.05。表明从一语切换至二语的切换代价相较于从二语切换至一语时，无论词汇熟悉度高低与否两类切换代价均未出现语码切换代价的不对称性，结果符合特定语言提取观。 之后进一步对L1切换至L2、L2切换至L1两类切换代价在不同词汇度熟悉度下进行配对样本t检验，结果显示在词汇熟悉较高水平下，t = 1.70，p > 0.05，在词汇熟悉度较高时，被试在两类切换中的混合代价并无显著差异，符合特定语言提取观；在词汇熟悉较低水平下，t = 4.17，p < 0.01，表明在面对熟悉度较低的词汇时，双语者在从L2切换至L1的混合代价显著大于从L1切换至L2的混合代价，结果符合非特定语言提取观。
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user: 4. 讨论 本实验采取切换范式及图片命名任务，探讨了第二语言词汇熟悉度这一变量对双语者言语产生中语码切换代价的影响及其作用机理。当以切换低价作为指标时，不论是高熟悉组还是低熟悉组，中–英双语者均未出现语码切换代价的不对称性，均符合特定语言提取观。反之，以混合代价作为参照指标时，汉英双语者在词汇熟悉度较高的情况下，并未出现语码转换的不对称性，同样符特定语言提取观，而在词汇熟悉度较低组时，汉英双语者出现的语码切换的不对称性，符合非特定语言提取观的抑制模型。结果表明，词汇熟悉度的高低是影响双语者在言语产生中语码切换代价的关键因素，在词汇熟悉度较高情况下，出现了语码切换的对称性，在词汇熟悉度较低情况下，出现了语码切换的不对称性。 近年来，研究者对双语者语码切换代价及其不对称性产生的原有有极大的兴趣，但是关于其产生具体缘由还没有学界统一的认定。王敬欣在其2014年实验中，探究命名语言提示与刺激间隔对双语者语码切换代价的影响，发现在短间隔出现了语码切换代价的不对称现象，长时间间隔下则并未出现。因此，由于本研究中试次之间间隔时间为1000 ms，间隔时间稍长，因而在反应时上未能体现研究结果，但在以混合代价为指标时，出现与预期相符的结果，而混合代价更能表现出命名两种语言时的时间差异。 本研究采用言语产生经典的图片命名范式，结论显示在混合语言命名中，切换类型与无切换类型相比需要更多时间反应。当以切换代价作为指标时，无论词汇熟悉度是高或低，结果均未出现切换代价的不对称性，同预期结果不一致，对此有以下两种解释，其一根据特定语言提取观可知，由于本研究采用被试均为英语熟练程度较高的双语者，因而受试者在语码切换过程并未对非目标语言进行抑制，两种语言在词汇选择过程中共同得到激活，但是最终选择目标语言时，非目标语言并没有对目标语言造成干扰，而是通过语言标签来选取目标词。其二切换代价这一指标代表注意控制双机制中的被动控制，被动控制类似自动化的加工过程，可以自动且快速地解决被大脑监控系统发现的干扰，无需调配过多的认知资源，因而在时间间隔较短的情况下，被动控制会快速参与进来，降低非目标语言的激活水平，因而受试者在词汇熟悉度较低的情况下，由于二语词汇熟悉度较低，因而其对一语的抑制程度更大才能准确提取二语词汇，因此从L2转换至L1相对从L1转换到L2时，需要更多时间解除之前L1的抑制状态，进而导致不对称性切换代价的产生。但是由于本研究由于本研究中试次之间间隔时间为1000 ms，这可能在更大程度上允许可主动控制的参与，即受试者可以在事先调动充足的认知资源，以便对目标语言进行额外激活或者直接停用非目标语言以促进目标词汇的提取，因此，即便是在词汇熟悉度较低时，由于双语者主动控制的参与，导致目标语言进行的额外激活以及非目标语言的主动停用，因而实验结果在熟悉度高低两水平下均未出现语码切换代价的不对称性。因而当以混合代价为指标进行方差分析时，中英双语者在词汇熟悉度较高时，未出现混合代价的不对称性，在词汇熟悉度较低时出现了混合代价的不对称性，即受试者在从L2~L1相对于L1~L2，付出了更多的混合代价。 本研究结果表明，词汇熟悉度可以作为整合语码切换中两种模型的关键因素，双语者在熟悉度较高的词汇下，两种语言系统的语义层面和词汇层面均可直接通达，因而在切换状态下进行词汇选取时，非目标词无法干扰目标词提取，也无需对其进行抑制，词汇挑选直接根据目标语言的语言节点进行，更符合特定语言提取观中。在面对第二语言词汇熟悉度较低的词汇时，非母语词汇水平只能通过母语词汇层面间接通达，此时，在切换状态下进行词汇提取时，从L2转换至L1时，由于被试在前一个试次使用第二语言命名，双语者无法直接在概念层面抑制第一语言，只能在词汇层面才能对一语进行抑制，因而在该试次中，需要接触之前对第一语言词汇层面的抑制，进而有更多的转换代价产生，在词汇熟悉度较低时，双语者语码切换符合非特定语言提取观中抑制控制模型。