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user: 3. 结果与讨论 3.1. 不同品系、部位及溶剂之苦瓜萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长影响 脂肪细胞形成之过程，包括有前脂肪细胞的增生与脂肪细胞的分化，而前脂肪细胞的增生已被证实是脂肪细胞分化的先决条件 [ 20 ] [ 21 ] 。因此，本实验利用不同品系、部位及溶剂之苦瓜萃取物，探讨其对3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长和细胞周期调控之影响。表1~3为不同品系、部位与溶剂之苦瓜萃取物对 Table 1 Effects of different solvent extracts from the seed and fruit of Momordica charantia on cell growth in 3T3-L1 preadipocyte Cell growth (%) Bitter melon extracts (mg/mL) 0 50 100 250 WESMC 100.0 ± 0.1 80.3 ± 7.4 * 79.6 ± 11.6 * 52.7 ± 3.1 * MESMC 100.0 ± 3.6 86.5 ± 6.3 * 86.4 ± 2.1 * 91.9 ± 4.0 * EESMC 100.0 ± 2.4 98.1 ± 4.6 99.1 ± 4.8 96.5 ± 3.0 AESMC 100.0 ± 4.2 93.8 ± 2.9 * 96.9 ± 1.7 100.9 ± 4.1 EAESMC 100.0 ± 8.3 97.9 ± 5.3 94.7 ± 7.2 * 102.5 ± 1.2 WEFMC 100.0 ± 6.1 81.1 ± 7.7 * 73.8 ± 7.0 * 54.8 ± 5.6 * MEFMC 100.0 ± 5.2 98.1 ± 3.2 89.1 ± 6.6 * 100.4 ± 8.9 EEFMC 100.0 ± 4.3 98.7 ± 6.2 100.7 ± 6.6 101.2 ± 5.3 AEFMC 100.0 ± 5.1 101.0 ± 4.6 105.8 ± 3.2 112.1 ± 2.0 * EAEFMC 100.0 ± 4.0 105.6 ± 10.1 105.2 ± 5.5 101.2 ± 9.3 表1. 苹果苦瓜种子和果肉不同溶剂萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长影响 Cell growth (%) is expressed as control at 100%. Data are expressed as the mean ±SD (n = 3). * p < 0.05 indicates significant difference from the control. 3T3-L1 preadipocytes were incubated with 0 - 250 mg/mL of bitter melon extracts for 48 h at 37˚C in 5% CO 2 incubator. WE， water extract; ME， methanol extract; EE， ethanol extract; AE， acetone extract; EAE， ethyl acetate extract; S， seed; F， fruit; MC， Momordica charantia Table 2 Effects of different solvent extracts from the seed and fruit of Momordica charantia MDS72 on cell growth in 3T3-L1 preadipocyte Cell growth (%) Bitter melon extracts (mg/mL) 0 50 100 250 WESMCMDS72 100.0 ± 11.8 47.1 ± 10.4 * 45.2 ± 9.7 * 34.3 ± 5.9 * MESMCMDS72 100.0 ± 5.0 100.9 ± 7.5 102.2 ± 3.5 111.9 ± 5.5 * EESMCMDS72 100.0 ± 4.0 102.7 ± 5.7 99.4 ± 4.0 98.9 ± 3.3 AESMCMDS72 100.0 ± 5.2 95.3 ± 7.1 94.9 ± 5.6 96.5 ± 7.1 EAESMCMDS72 100.0 ± 6.5 95.3 ± 10.0 95.0 ± 11.0 70.9 ± 2.8 * WEFMCMDS72 100.0 ± 6.7 94.2 ± 3.9 93.6 ± 5.5 62.4 ± 7.6 * MEFMCMDS72 100.0 ± 11.3 99.5 ± 6.0 99.8 ± 2.0 95.4 ± 10.1 EEFMCMDS72 100.0 ± 2.4 102.5 ± 3.4 97.1 ± 3.5 99.5 ± 5.0 AEFMCMDS72 100.0 ± 4.6 101.5 ± 3.7 104.5 ± 5.0 99.9 ± 2.1 EAEFMCMDS72 100.0 ± 1.9 93.8 ± 5.2 * 88.6 ± 1.9 * 104.2 ± 9.6 表2. 苦瓜明道选72种子和果肉不同溶剂萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长影响 Cell growth (%) is expressed as control at 100%. Data are expressed as the mean ± SD (n = 3). * p < 0.05 indicates significant difference from the control. 3T3-L1 preadipocytes were incubated with 0 - 250 mg/mL of bitter melon extracts for 48 h at 37˚C in 5% CO 2 incubator. MCMDS72， Momordica charantia MDS72 3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长影响。表1为苹果苦瓜种子与果肉不同溶剂萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长影响，结果得知，苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)与苹果苦瓜种子甲醇萃取物(MESMC)在浓度50至250 mg/mL时，皆可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长(p < 0.05)，且其最佳抑制作用分别为52.7% (250 mg/mL WESMC)与86.4% (100 mg/mL MESMC)。苹果苦瓜种子丙酮萃取物(AESMC)于浓度 Table 3 Effects of different solvent extracts from the seed and fruit of Momordicacharantia ONS33 on cell growth in 3T3-L1 preadipocyte Cell growth (%) Bitter melon extracts (mg/mL) 0 50 100 250 WESMCONS33 100.0 ± 8.2 112.1 ± 5.3 * 96.6 ± 7.4 71.1 ± 3.9 * MESMCONS33 100.0 ± 2.9 98.5 ± 1.3 88.9 ± 2.9 * 113.8 ± 2.3 * EESMCONS33 100.0 ± 2.7 102.2 ± 4.3 101.2 ± 2.6 98.3 ± 10.7 AESMCONS33 100.0 ± 2.7 102.1 ± 3.5 103.5 ± 4.2 114.7 ± 3.6 * EAESMCONS33 100.0 ± 6.7 102.7 ± 4.1 95.9 ± 0.7 97.8 ± 9.5 WEFMCONS33 100.0 ± 11.6 119.6 ± 2.9 * 92.9 ± 11.9 144.2 ± 14.3 * MEFMCONS33 100.0 ± 2.7 99.8 ± 3.6 99.8 ± 4.4 102.3 ± 2.0 EEFMCONS33 100.0 ± 3. 1 100.3 ± 4.1 98.5 ± 4.5 117.1 ± 6.2 * AEFMCONS33 100.0 ± 2.3 93.4 ± 2.3 * 87.5 ± 4.3 * 92.8 ± 3.2 * EAEFMCONS33 100.0 ± 6.0 103.6 ± 5.0 112.3 ± 5.7 * 112.7 ± 7.6 * 表3. 苦瓜冲绳选33种子和果肉不同溶剂萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞生长影响 Cell growth (%) is expressed as control at 100%. Data are expressed as the mean ± SD (n = 3). * p < 0.05 indicates significant difference from the control. 3T3-L1 preadipocytes were incubated with 0 - 250 mg/mL of bitter melon extracts for 48 h at 37 ˚C in 5% CO 2 incubator. MCONS33， Momordica charantia ONS33. 50 mg/mL时可显著抑制细胞生长至93.8% (p < 0.05)，苹果苦瓜种子乙酸乙酯萃取物(EAESMC)在100 mg/mL可降低细胞生长至94.7% (p < 0.05)，而苹果苦瓜种子乙醇萃取物(EESMC)则无显著抑制3T3-L1前脂肪细胞生长之作用。苹果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 于浓度50至250 mg/mL时，皆具有显著降低3T3-L1前脂肪细胞生长之能力(p < 0.05)，且于浓度250 mg/mL时可降低细胞生长至54.8%。苹果苦瓜果肉甲醇萃取物(MEFMC)于浓度100 mg/mL时，能显著降低细胞生长至89.1%，苹果苦瓜果肉乙醇萃取物(EEFMC)、苹果苦瓜果肉丙酮萃取物(AEFMC)与苹果苦瓜果肉乙酸乙酯萃取物(EAEFMC)则无法抑制3T3-L1前脂肪细胞之生长。研究指出，以苦瓜萃取物(1 mg/mL)处理3T3-L1前脂肪细胞48和72小时后，其可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞之细胞增生 [ 22 ] 。 苦瓜明道选72种子与果肉不同溶剂萃取物对3T3-L1前脂肪细胞生长之影响，由表2得知，苦瓜明道选72种子水萃取物(WESMCMDS72)于浓度50、100与250 mg/mL时，皆具显著抑制3T3-L1前脂肪细胞生长之作用(p < 0.05)，其可分别降低至47.1%、45.2%与34.3%。苦瓜明道选72种子乙酸乙酯萃取物(EAESMCMDS72)于浓度250 mg/mL时，可降低3T3-L1前脂肪细胞生长至70.9% (p < 0.05)。但是苦瓜明道选72种子甲醇萃取物(MESMCMDS72)、苦瓜明道选72种子乙醇萃取物(EESMCMDS72)与苦瓜明道选72种子丙酮萃取物(AESMCMDS72)则对3T3-L1前脂肪细胞之生长不具有抑制作用。苦瓜明道选72果肉水萃取物(WEFMCMDS72)于浓度250 mg/mL时，能显著降低3T3-L1前脂肪细胞生长至62.4% (p < 0.05)，苦瓜明道选72果肉乙酸乙酯萃取物(EAEFMCMDS72)于浓度50与100 mg/mL时皆具显著抑制作用(p < 0.05)，其分别降低至93.8%与88.6%。苦瓜明道选72果肉甲醇萃取物(MEFMCMDS72)，苦瓜明道选72果肉乙醇萃取物(EEFMCMDS72)与苦瓜明道选72果肉丙酮萃取物(AEFMCMDS72)则不具抑制3T3-L1前脂肪细胞生长之能力。研究显示，以2%、5%和10%苦瓜汁处理人类初代脂肪细胞后，均可显著抑制其细胞增生之作用 [ 17 ] 。 表3为苦瓜冲绳选33种子与果肉不同溶剂萃取物对3T3-L1前脂肪细胞生长之影响，结果显示，苦瓜冲绳选33种子水萃取物(WESMCONS33)于浓度250 mg/mL时，可显著降低3T3-L1前脂肪细胞生长至71.1% (p < 0.05)，苦瓜冲绳选33种子甲醇萃取物(MESMCONS33)于浓度100 mg/mL时，可降低细胞生长至88.9% (p < 0.05)。苦瓜冲绳选33种子乙醇萃取物(EESMCONS33)、苦瓜冲绳选33种子丙酮萃取物(AESMCONS33)与苦瓜冲绳选33种子乙酸乙酯萃取物(EAESMCONS33)无法显著抑制3T3-L1前脂肪细胞生长之能力。苦瓜冲绳选33果肉丙酮萃取物(AEFMCONS33)于浓度50、100与250 mg/mL时皆具显著抑制作用(p < 0.05)，其最佳降低生长之作用为87.5% (100 mg/mL)。但是，苦瓜冲绳选33果肉水萃取物(WEFMCONS33)、苦瓜冲绳选33果肉甲醇萃取物(MEFMCONS33)、苦瓜冲绳选33果肉乙醇萃取物(EEFMCONS33)与苦瓜冲绳选33果肉乙酸乙酯萃取物(EAEFMCONS33)则无法显著降低3T3-L1前脂肪细胞之生长。苦瓜萃取物中富含三萜类(葫芦烷型三萜类与三萜皂苷类)、酚类物质(没食子酸、儿茶素和表儿茶素)与共轭亚麻油酸等成分物质，过去报导指出，其可显著降低3T3-L1前脂肪细胞之增生 [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] 。利用富含三萜类之苦瓜与苦瓜种子萃取物处理3T3-L1前脂肪细胞，其可显著降低3T3-L1前脂肪细胞之细胞存活率 [ 28 ] [ 29 ] 。研究指出，酚类物质可显著降低3T3-L1前脂肪细胞增生，进而降低3T3-L1脂肪细胞之成脂作用 [ 30 ] [ 31 ] 。此外，Chou等(2012)研究亦指出，苦瓜所含之9c， 11t， 13t共轭亚麻油酸可显著降低3T3-L1前脂肪细胞之存活率，并透过活化ERK，促使PPARg磷酸化，进而抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化 [ 32 ] 。综合上述结果得知，在30种苦瓜萃取物中，以苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)、苹果苦瓜果肉水萃取物(WEFMC)与苦瓜明道选72果肉水萃取物(WEFMCMDS72)具有较佳抑制3T3-L1前脂肪细胞生长之能力，故后续研究将针对此三种苦瓜萃取物，探讨其对3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期调控与诱发细胞凋亡之影响。 3.2. 苹果苦瓜种子水萃取物、苹果苦瓜果肉水萃取物与苦瓜明道选72果肉水萃取物对 3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期调控影响 细胞周期停滞与细胞凋亡被视为是细胞增生受阻之主要反应，细胞停滞可提供受损DNA之修补机会，而细胞凋亡则会造成严重之DNA受损而促使细胞走向死亡 [ 33 ] 。利用流式细胞分析技术评估具潜力之苦瓜萃取物，由本研究得知，30种苦瓜萃取物并无法从诱发3T3-L1前脂肪细胞凋亡之方式达到减低前脂肪细胞增生之作用，因此本研究将针对3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期调控进行探讨。图1为苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)、苹果苦瓜果肉水萃取物(WEFMC)与苦瓜明道选72果肉水萃取物(WEFMCMDS72)对3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期调控之影响。由图1得知，苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)于浓度0 mg/mL时，其G0/G1期之分布为62.7%，而处理苹果苦瓜种子水萃取物25至100 mg/mL时，G0/G1期分布百分比分别为81.3%、80.6%与80.0% (p < 0.05)。苹果苦瓜果肉水萃取物(WEFMC)于浓度0 mg/mL时，其G0/G1期细胞周期分布为68.8%，而处理苹果苦瓜果肉水萃取物(50 mg/mL WEFMC)后，其G0/G1期分布提升至72.3% (p < 0.05)。由图1得知，苦瓜明道选72果肉水萃取物(WEFMCMDS72)于浓度0 mg/mL时，其细胞周期分布于G0/G1期之比例为64.0%，而处理苦瓜明道选72果肉水萃取物(WEFMCMDS72) 25、50与100 mg/mL后，G0/G1期分布分别显著提升至80.8%、76.6%与67.5% (p < 0.05)。综合上述结果得知，苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)对3T3-L1前脂肪细胞具有最佳调控细胞周期停滞于G0/G1期之结果。Popovich等(2010)研究结果指出，富含三萜类化合物之苦瓜萃取物，可使3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期停滞于G2/M期，进而抑制3T3-L1前脂肪细胞之增生与油脂堆积 [ 28 ] 。综合以上结果得知，苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)对3T3-L1前脂肪细胞周期停滞于G0/G1期之作用最为显著，故后续研究将针对苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)进行细胞周期停滞相关之分子机制探讨。 图1. 苹果苦瓜种子水萃取物、苹果苦瓜果肉水萃取物与苦瓜明道选72果肉水萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期影响。细胞周期分布(%)表示是以控制组设定为100%。数据的呈现是以平均值 ± 标准偏差(重复数 = 3)。*p < 0.05表示与控制组有显著差异。WESMC为苹果苦瓜种子水萃取物，WEFMC苹果苦瓜果肉水萃取物，WESMCMDS72苦瓜明道选72果肉水萃取物 3.3. 苹果苦瓜种子水萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期调控相关蛋白表现之影响 细胞周期调控主要由两个蛋白家族所调控，包括细胞周期蛋白依赖型激酶(CDKs)与细胞周期蛋白 (cyclins)。研究指出，cyclins与CDKs结合后才具有调控细胞周期之进程，能使细胞通过细胞周期的不同阶段。CDK2会与D型或E型cyclin结合，CDK4和CDK6则与D型cyclin结合，进而调控G1期的进程。CKI (CDK inhibitor) 为cyclin/CDK复合体之抑制子，包含p21家族(p21、p27与p57)与INK4家族(p15、p16、p18与p19)，主要作为调节CDKs，进而抑制受损细胞从G1期进入S期 [ 34 ] 。肿瘤抑制子p53与视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein， Rb)之功能相似，为细胞与肿瘤生长之抑制子，能调控细胞从G1期进入S期 [ 35 ] 。研究指出，Rb蛋白的磷酸化(失活态)，会使cyclin D1与CDK4和CDK6形成复合体，导致细胞周期进入S期。此外，Rb蛋白失活时易导致细胞不当增生与肿瘤形成，进而导致癌症的发生 [ 36 ] [ 37 ] 。图2为苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)对3T3-L1前脂肪细胞之细胞周期相关蛋白表现之影响。已知p18、CDK6、cyclin D1与pRB为调控G1期进程之相关蛋白，由图2结果显示，以25 mg/mL之苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)处理3T3-L1前脂肪细胞后，p18蛋白质表现于1至12小时均具有显 图2. 苹果苦瓜种子水萃取物对3T3-L1前脂肪细胞之p18、CDK6、cyclin D1、p-RB、p-p53、p27与CDK2蛋白质表现之影响。3T3-L1前脂肪细胞培养于37˚C、5%二氧化碳培养箱中，以25 mg/mL苹果苦瓜种子水萃取物处理0 - 12 h。相对蛋白质表现之定量是以Image J软件进行分析，并以b-actin蛋白质表现量为参考进行计算(重复数 = 3)。WESMC为苹果苦瓜种子水萃取物 著提升作用(p < 0.05)，且最大作用为6小时(3.16)；CDK6在12小时具有最佳抑制作用，其抑制能力为0.86；在细胞周期蛋白cyclin D1之表现上以苹果苦瓜种子水萃取物(WESMC)处理9与12小时皆具抑制作用，其抑制蛋白表现分别为0.85与0.58。在p-Rb蛋白表现上，于9与12小时皆具显著抑制作用(p < 0.05)，其最大抑制蛋白表现为0.86 (12小时)。p-p53、p27和CDK2为G1期进入S期之重要调控蛋白。此外，p-p53与p27蛋白质表现于1至6小时皆具显著提升作用(p < 0.05)，且最大表现作用分别为1.11 (6小时)与1.11 (1小时)；CDK2则在12小时具有最佳抑制作用，其抑制表现为0.87。研究指出，富含三萜类化合物之苦瓜叶乙醇萃取物，能藉由提升p21与p27，并抑制CDK2、CDK4、cyclin D1与cyclin E之表现，进而诱导前列腺癌细胞之细胞周期停滞在G1期 [ 38 ] 。