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user: 3. 结果与分析 3.1. 聚合物的制备和表征 图1为GCH的合成路线图。在EDC/NHS催化作用下，壳聚糖的氨基与组氨酸的羧基发生酰胺化反应，得到CH。经EDC/NHS催化乳糖酸共价接枝至CH制得GCH。 图1. GCH的合成路线图 图2为CS、GC、CH和GCH的 1 H NMR图谱。2.0 ppm处信号峰为壳聚糖乙酰基上甲基质子峰，3.1 ppm处为壳聚糖骨架的质子峰。CH和GCH的 1 H NMR图谱中，7.4 ppm处出现新的质子峰，为His中咪唑环的特征氢峰 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] ，表明His成功接枝至CS和GC。茚三酮显色法测得CH和GCH中His的接枝度分别为17.3 ± 1.7%和20.9 ± 0.3%。GC和GCH的 1 H NMR图谱中位于4.5 ppm处的信号峰为乳糖酸的次甲基氢峰 [ 15 ] ，表明乳糖酸成功接枝至CS及CH。计算半乳糖环次甲基氢峰与壳聚糖乙酰基甲基氢峰的峰面积比值，得GC和GCH的半乳糖修饰度分别为12.3%和13.1%。 图2. CS、CH、GC和GCH的 1 H NMR图谱 3.2. 聚合物缓冲能力 图3为CS、CH、GC和GCH的缓冲能力测定结果，可见在pH 3.0至7.0范围内，CH和GCH的缓冲能力明显强于CS。这是由于CH和GCH中的咪唑基团的pKa为6.0，可在酸性条件下吸附大量质子 [ 16 ] ，因此缓冲能力较强。 图3. 聚合物的酸碱滴定曲线 3.3. NP的制备与表征 荷负电的阴离子TPP可交联阳离子聚合物成稳定的NP，常作为小分子交联剂用于基因递送。VEGF siRNA经TPP交联与阳离子聚合物形成NP，表1所示为聚合物/TPP质量比为15:1时NC的粒径和Zeta电势，可见NP的粒径为160 nm~220 nm，多分散性指数(PDI)接近于0.3，粒径分布均匀，Zeta电势为21 mV~23 mV。 Table 1 Particle sizes and Zeta potentials of nanocomplexes at polymer/TPP weight ratio of 1 Sample Particle size (nm) Zeta Potential (mV) CSNP 167.3 ± 4.1 (0.291) 21.8 ± 1.1 CHNP 215.0 ± 11.9 (0.359) 21.0 ±2.4 GCNP 166.5 ± 6.3 (0.323) 21.4 ± 0.7 GCHNP 189.3 ± 4.3 (0.244) 22.1 ± 0.6 表1. 聚合物/TPP质量比为15:1时NP的粒径和Zeta电势 注：括号中的值表示多分散性指数(PDI)的值。各组值为平均值±SD值(n = 3)。 图4所示为CS、CH、GC和GCH在不同聚合物/TPP质量比时形成NP的粒径和Zeta电势，可见聚合物/TPP质量比为8:1至20:1时，各聚合物均可形成纳米尺度颗粒，且多分散性良好(PDI均小于0.3)。NP的Zeta电势随着聚合物/TPP质量比增加而上升，这是由于随着聚合物/TPP质量比的增加，NP表面正电荷量也随之增加。 图4. 不同聚合物/TPP质量比时NP的粒径(a)和Zeta电势(b) 3.4. 凝胶阻滞 荷负电的siRNA在电场作用下向正极迁移，产生明显的电泳条带，经阳离子聚合物缩合形成NP后可经静电吸附和物理缠绕包载siRNA于NP内部，使siRNA滞留在加样孔中无法移动，阻碍siRNA的电泳迁移。故以琼脂糖凝胶电泳试验定性考察阳离子聚合物与siRNA的结合能力。图5(a)所示为凝胶阻滞试验结果，GCHNP在聚合物/TPP质量比为8:1至20:1的范围内，均能有效阻滞siRNA的电泳迁移。图5(b)所示为聚合物/TPP质量比为15:1时各NP的凝胶阻滞试验结果，可见裸siRNA有明显的电泳条带，而各NP组均被阻滞在上样孔中，表明当聚合物/TPP质量比为15:1时，CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP均可有效缩合siRNA，完全阻滞siRNA的电泳行为。 图5. (a) 不同GCH/TPP质量比时GCHNP的凝胶阻滞图，(b) 聚合物/TPP质量比为15:1时，各NP组的凝胶阻滞图。1~5分别代表裸siRNA、CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP 3.5. NP的稳定性 3.5.1. 核酶稳定性 NP在递送过程中需要抵抗核酶对siRNA的破坏，以保证siRNA在到达肿瘤细胞时结构完整，因此需借助合适的递送载体。图6所示为NP与核酶共孵育后的琼脂糖凝胶电泳图，可见裸siRNA经RNase A处理后无电泳条带，而CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP组可见清晰电泳条带，表明CS、CH、GC和GCH均可有效保护siRNA免遭核酶降解。 图6. 载siRNA聚合物NP分别与RNase A共孵育后的琼脂糖凝胶电泳图。1代表未经RNaseA处理的裸siRNA。2~6分别代表经RNase A处理后的裸siRNA、CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP 3.5.2. 肝素钠解离 肝素纳可模拟体内荷负电物质对NP的解离作用，抵抗高浓度肝素钠解离一定程度可说明聚合物NP在体内可抵抗荷负电物质的解离作用。图7所示为NP经不同浓度肝素钠处理后的凝胶电泳图，可见CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP肝素钠完全解离浓度分别为1 mg/mL、0.4 mg/mL、0.4 mg/mL和0.4 mg/mL，表明siRNA与壳聚糖衍生物的结合力较壳聚糖减弱，可能是由于壳聚糖上的氨基被取代引起的。 图7. 载siRNANP经肝素钠解离后琼脂糖凝胶电泳图 3.5.3. 抗稀释和离子强度稳定性 NP在递送过程中需要对抗体液稀释和高强度离子变化对NP结构的破坏，为保证siRNA在到达肿瘤细胞时结构完整，因此需借助合适的递送载体。以水和PBS分别稀释NP100倍，测定NP的粒径和Zeta电势，考察NP的稳定性。表2所示为水和PBS稀释后NP的粒径和Zeta电势，可见稀释后CSNP、CHNP、GCNP和GCHNP粒径稍增加，Zeta电势降低，这是由于高离子强度的稀释介质可产生“静电屏蔽效应”，减弱阳离子聚合物与siRNA间的结合力，使NP粒径增大、Zeta电势降低 [ 17 ] [ 18 ] 。 Table 2 Particle sizes and Zeta potentials of nanoparticles after dilution by water and PB Sample Dilution by water at 100 folds Dilution by PBS at 100 folds Particle size (nm) Zeta potential (mV) Particle size (nm) Zeta potential (mV) CSNP 204.9 ± 5.3 23.6 ± 3.2 216.1 ± 3.41 1.4 ± 0.5 CHNP 228.6 ± 2.8 19.7 ± 1.0 217.2 ± 4.6 2.3 ± 0.3 GCNP 215.3 ± 10.2 19.6 ± 1.0 226.2 ± 3.7 2.7 ± 0.7 GCHNP 209.0 ± 8.8 19.0 ± 3.1 214.2 ± 6.4 2.0 ± 0.7 表2. NP经水和PBS稀释100倍后的粒径和电势 3.6. 细胞毒性 基因递送载体应具备良好的安全性，以MTT试验考察聚合物细胞毒性。图8所示为不同浓度聚合物与QGY-7703细胞共培养24 h后的MTT试验结果，可见聚合物浓度为0.01 mg/mL~2 mg/mL时，各组细胞存活率均超过90%，表明聚合物的细胞毒性较小，安全性较好。 图8.在聚合物浓度为0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1和2 mg/mL溶液中细胞暴露24 h后的相对存活率 3.7. 体外释放 siRNA释放的标准曲线为：I = 36.601C – 0.5733，r = 0.997，表明在0.1 μg/mL~0.5 μg/mL范围内荧光强度(I)与FAM-NC siRNA浓度(C， μg/mL)线性关系良好。图9所示为NP在0.2 mol/L PBS(pH 7.4)中的siRNA释放曲线，可见CSNP、CHNP、GCNP、GCHNP的12h累积释放量分别为20.9%、84.6%、75.9%和69.3%，表明各NP均可有效释放siRNA，且CHNP、GCNP和GCHNP的siRNA的释放快于CSNP，这可能是由于壳聚糖与siRNA的结合力较强所致，与肝素钠解离试验结果一致。 图9. 浓度为0.2 mol/L的PBS (pH 7.4)在37℃时，溶液中CSNP、CHNP、GCNP、GCHNP的siRNA释放曲线