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user: 3. 鱼类应对溶解氧变化的适应调控机制 3.1. 溶解氧对鱼类抗氧化系统的影响 氧化应激(Oxidation stress)是指机体在内外环境中存在有害刺激(比如药物、高温、低氧等)的条件下，体内产生活性氮自由基(Reactive Ntrogen Species， RNS)和活性氧自由基(Reactive Oxidative Species， ROS)引起细胞和组织的生理和病理反应 [ 19 ]。在低氧胁迫状态下，鱼类红细胞数量以及血红素与氧的结合能力增加，对氧的输送能力提高，以保障鱼体代谢所需的氧供应，同时血细胞比容和白细胞数量显著提高，抵抗缺氧所造成的损伤 [ 20 ]。由于可利用的氧的含量不足，机体的氧化磷酸化反应受到显著抑制，超氧阴离子(O 2− )，过氧化氢(H 2 O 2 )，羟基(-OH)等活性自由基的含量大幅度提高，生物体受到胁迫，影响鱼类的生理代谢过程，为降低ROS引起的损伤，鱼类抗氧化酶防御系统随之启动，通过超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases， SOD)，过氧化氢酶(Catalases， CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase， GSH)清除超氧阴离子自由基和过氧化氢来维持内稳态平衡。SOD能够清除有危害性的活性氧，通过催化歧化作用将过氧化物自由基转变成过氧化氢和氧。鲤(Cyprinus carpio)的肝脏、脑和鳃等组织中的SOD酶活性在低氧条件下显著增加 [ 21 ]。CAT能够催化H 2 O 2 发生歧化反应(2H 2 O 2 = O 2 + 2H 2 O)，防止H 2 O 2 在铁螯合物作用下与O 2 反应生成对生物体危害更大的-OH，同时也能清除超氧阴离子，同时可消除SOD作用下生成的H 2 O 2 ，与SOD共同组成一套活性氧清除酶系统，以清除机体内活性氧自由基。研究发现大多数鱼类在低氧胁迫环境条件下，其SOD和CAT活性显著提高 [ 22 ]。抗氧化剂谷胱甘肽以两种形式存在于生物体内：双硫氧化型(G-S-S-G)和硫醇还原型(G-SH)，正常生理条件下，谷胱甘肽主要以还原型G-SH为主。G-SH在谷胱甘肽过氧化酶GSH-Px的作用下还原细胞内产生的自由基和H 2 O 2 ，同时自己被氧化为GSSG；随后，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GR)的催化下生成G-SH。G-SH中含有非常活泼的巯基(-SH)，易被超氧阴离子、过氧化物、H 2 O 2 等氧化脱氢，从而清除体内的自由基，同时还能保护并修复酶分子中-SH，保护酶的活性 [ 23 ]。在低氧条件下，血浆皮质醇的浓度显著上升，复氧后也会降低至正常水平，如果再次给予低氧刺激，皮质醇也会再次升高，因此用于评价鱼类应激 [ 24 ]。在斑点叉尾鮰、大菱鲆和卵形鲳鲹等多种鱼中发现此种现象 [ 25 ]。丙二醛(Malondialdehyde， MDA)是自由基作用于脂质发生脂质过氧化反应的终产物，因此MDA含量常用来反映机体氧化损伤和细胞损害 [ 26 ]。 3.2. 鱼类低氧应答分子调控机制的研究进展 鱼类的低氧应答机制是鱼类低氧适应的一种重要的适应措施。鱼类对低氧的适应一般可分为长期适应和急性应激反应。低氧诱导因子(Hypoxia-induce factors， HIF)是维持生物体内氧稳态平衡重要环境因子，此外通过刺激和特异性抑制PHD (脯氨酸羟基化酶，HIF-prolyl hydroxylase)酶活性可以稳定HIF [ 27 ] ，证明了HIF和PHD是动物体适应低氧环境的重要调控因子。 3.2.1. 低氧诱导因子(HIF) 低氧诱导因子(HIF)是动物维持体内氧稳态平衡的核心转录因子，首先在哺乳动物的低氧调控过程中被发现，被证实是低氧信号传导途径中最为关键的因子 [ 28 ]。HIF是由对氧敏感的α亚基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和对氧不敏感的β亚基(HIF-1β)形成的异源二聚体，HIF-1α决定HIF-1的活性水平。 由于低氧诱导因子HIF-α在信号传导中起关键作用，对低氧诱导因子的调控研究成为目前主要研究方向。低氧诱导因子的调控研究主要为转录和翻译后。目前对HIF-α的主要研究进展发生于其翻译后的调控研究，转录水平的调控导报较少。Rius (2008)发现NF-kB可以诱导HIF-1α的转录表达，进而在先天免疫和炎症反应中发挥作用 [ 29 ]。HIF同时参与氧气传感、氧气运输、血管生成、新陈代谢变化和红细胞生成等过程中的基因表达。HIF基因在低氧信号传到中的重要作用已在一些鱼类中得到阐明。急性低氧能增强HIF-1α在河鲈(Perca fluviatilis)脑和肝中的表达，但慢性低氧在其肌肉中无明显差异。而在印度鲶(Clarias batrachus)上，急性低氧导致其HIF-1α和HIF-2α在脑、肝和肾中的表达增加，慢性低氧导致HIF-1α和HIF-2α在脾和肌肉中的表达增加 [ 30 ]。另外，在某些斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)中，HIF-αm RNA的表达水平先减少后增加 [ 31 ]。 3.2.2. 脯氨酸羟基化酶(prolyl hydroxylase， PHD) 脯氨酸羟基化酶(PHD)作为细胞氧气水平的直接感受器，是低氧应激的重要调控因子，它有三个成员组成：PHD1，PHD2和PHD3，受HIF-1α蛋白的调控 [ 32 ]。其中PHD2是HIF-1α的关键调控因子 [ 33 ] ，起主要作用利用氧分子作为底物对低氧诱导因子进行羟基化。羟基化后的低氧诱导因子被pVHL (Von Hippel-Lindau)识别并结合VBC (VHL， Elongin B， Elongin C) E3泛素连接酶复合体，导致低氧诱导因子降解 [ 34 ]。目前，一些鱼类的PHD基因序列已经有了相关报道，如大西洋鲑(Salmo salar)，斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和斑马鱼(Danio rerio)。尽管对鱼类PHD蛋白的功能知之较少，但一般认为，它们可能跟其他物种的PHD蛋白类似，对HIF-α蛋白的稳定性起重要调控作用。 3.2.3. 天冬氨酸羟化酶(HIF-1 asparaginyl hydroxylase， FIH-1) FIH-1与PHD功能类似，它通过对HIF-α的羟化，而是阻碍一些转录激活因子与HIF-α蛋白的结合，从而抑制HIF-α的活性 [ 35 ]。在斑马鱼和斑点叉尾鮰上，FIH-1蛋白被鉴定和报道。 3.2.4. pVHL蛋白(Von Hippel-Lindau) pVHL蛋白是VBC泛素连接酶复合体的主要成员，与E3泛素连接酶结合，间接调控HIF-α活性 [ 36 ]。在常氧条件下，它与羟基化的HIF-α结合，引起HIF-α的蛋白酶体降解，在低氧信号的调控中起重要作用。目前对斑马鱼VHL基因的功能已有了较为清楚的了解。与哺乳动物类似，VHL突变纯合体导致胚胎致死。 低氧应激条件下，鱼类代谢相关的基因有葡萄糖转运子GLUTs (Glucose transporters)表达，在草鱼的肾脏中已被证实 [ 37 ] ，在大西洋鳕(Gadus morhua)的鳃中GLUT1 m RNA被表达发现 [ 38 ]。而控制鱼红细胞生成的红细胞生成素(Erythropoietin， EPO)，在河豚(Takifugu rubripes)中第一个被克隆 [ 39 ]。在其他鱼类的肾脏中也有被发现。在对青石斑鱼、鲑鱼的研究中发现，鱼类新生血管生成的基因VEGF在低氧条件下表达，增强氧气供应 [ 40 ]。