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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 拟南芥(哥伦比亚)野生型和GAL4-GFP增强子诱捕转化株系(Enhaner trap lines)的种子从诺丁汉欧洲拟南芥种质资源中心(http://nasc.life.nott.ac.uk)获得。35SSGVG/UAS::WOX5转基因株系 [ 4 ] 的种子和pFP101载体分别由日本奈良科技大学(Nara Institute of Science and Technology) Keiji Nakajima教授和法国格勒诺布尔大学(Université Grenoble Alpe) François Parcy 教授赠与 (http://www.isv.cnrs-gif.fr/jg/alligator/vectors.html)。大肠杆菌菌株DH5α，限制性内切酶及其它分子生物学试剂或试剂盒购自Takara 公司(http://www.takarabiomed.com.cn)。根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404购自天根生化科技有限公司(http://www.tiangen.com)。引物合成和测序服务由上海Invitrogen生物技术有限公司(http://www.hbnxyhd.bioon.com.cn)或北京擎科新业生物技术有限公司(http://www.tsingke.net)提供。 2.2. 种子消毒及植物的培养与生长条件 拟南芥种子用10%体积的次氯酸 + 90%体积的纯酒精混合溶液消毒，浸泡10分钟后用酒精洗3~4遍，在无菌台吹干后用无菌牙签点种于用1% (w/v)琼脂固化的1/2 MS培养基上，置于22℃，16 h光照/8 h黑暗的培养箱中萌发。用于显微观察的幼苗留在上述培养箱中直到观察期结束。用于转化，杂交和种子扩繁或转基因位点纯化的幼苗，萌发或观察结束后移栽至营养土中(PINDSTRUOP)，置于22℃，16 h光照/8 h黑暗的植物生长室中生长。 2.3. 载体构建 pFP101载体改造：在构建本研究需要的表达载体前，我们先对pFP101进行了改造，具体细节如下：用HindIII + XbaI对pFP101质粒进行双酶切，经电泳和胶回收后，用T4连接酶插入一个人工合成的多克隆位点，改造后的载体命名为pFPL，其中(从5'开始依次)含HindIII，BglII，ApaI，SacI，SacII，SpeI，XhoI，XbaI，BamHI，SalI，PstI单酶切克隆位点，同时失去了原来载体中的CaMV 35S启动子(图1(A))。 驱动载体pFP-WOX5p::GAL4-VP16的构建：以拟南芥(哥伦比亚)野生型基因组DNA为模板，用表1中所列的相关引物通过PCR扩增获得一个4.6 kb的WOX5基因的启动子片段，用In-Fusion无缝克隆方法(In-Fusion HD Cloning Kit，Takara-Clontech)将其从BglII位点插入pFPL，形成的中间载体经测序验证后，再从BamHI位点插入GAL4/VP16的编码序列，后者从GAL4-GFP增强子诱捕转化株系J1511的基因组DNA扩增获得，建成的载体命名为pFP-WOX5p::GAL4-VP16 (图1(B))。 目标基因表达载体构建：本研究构建了3个目标基因表达载体，即pFP-UAS::GFP， pFP-UAS::WOX5-GR和pFP-UAS::FEZ-GR (图1(B))。其中的UAS启动子由J1511基因组DNA扩增而来，用In-Fusion克隆方法将其插入pFPL的BglII位点，形成中间载体pFP-UAS。由pFP-UAS载体的BamHI位点插入小鼠糖皮质激素受体中的激素结合部位的编码序列GR片段形成另一个中间载体pFP-UAS-GR。GR从35S::GVG/UAS::WOX5基因组DNA扩增获得。GFP、WOX5和FEZ的编码系列分别以J1511基因组DNA，35S::GVG/UAS::WOX5基因组DNA和由(哥伦比亚)野生型RNA合成的cDNA为模板经PCR扩增获得。GFP编码序列由BamHI位点插入中间载体pFP-UAS形成pFP-UAS::GFP；WOX5和FEZ的编码系列则由BamHI位点插入pFP-UAS-GR，建成pFP-UAS::WOX5-GR和pFP-UAS::FEZ-GR。与GR融合的目标基因编码蛋白在植物细胞中需要有外源提供的糖皮质激素才可进入细胞核。上述片段扩增所用引物见表1，构建过程中每个片段进入载体后都经测序进行了验证。 图1. 表达载体示意图 2.4. 转化及转基因植株鉴定 植物表达载体通过热激法转化进入土壤农杆菌LBA4404，用花序浸染法获得拟南芥转基因种子 [ 11 ] ，后者通过种皮绿色荧光识别筛选，萌发后在苗期用PCR分子检测进一步验证。各载体的转化植株验证时所用引物如下：pFP-WOX5p::GAL4-VP16转化株用WOX5p(JC)-5 + VP16(JC)-3；pFP-UAS::GFP转化株用UAS(JC)-5 + GFP(JC) -3；pFP-UAS::WOX5-GR转化株用WOX5(JC)-5 + GR(JC)-3；pFP-UAS::FEZ-GR转化株用FEZ(JC) -5 + GR(JC)-3。上述引物的序列信息见表2。 Table 1 Primers used in the construction of expression vector 基因或片段名称 引物序列 * pFPL多克隆位点 正链：5'-AGCTTAGATCTGGGCCCACGCGTGAGCTCCCGCGGACTAGTCTCGAGT-3' 反链：5'-CTAGACTCGAGACTAGTCCGCGGGAGCTCACGCGTGGGCCCAGATCTA-3' WOX5p Forward: 5'-GCTCAAGCTAAGCTTAGATCTGTGGTAGTGCTCAAGCTGGAG-3' Reverse: 5'-GCTCAAGCTAAGCTTAGATCTTAATCTAAGTGTTGCTTCGTTTGTAG-3' GAL4/VP16 Forward: 5'-TCTCGAGTCTAGAGGATCCATGAAGCTCCTGTCCTCCATC-3' Reverse: 5'-CGACCTGCAGGCATGGATCCTACCCACCGTACTCGTCAATTC-3' UAS Forward: 5'-CACGCGTGGGCCCAGATCTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3' Reverse: 5'-GCTCAAGCTAAGCTTAGATCTCGGTGTCATCTATGTTACTAGATC-3' GR Forward: 5'-GTCTCGAGTCTAGAGGATCCATGGTGAAGACTAATCTTTTTCT-3' Reverse: 5'-TCTGCAGGTCGACGGATCTTAAAGCTCATCATGTTTGTATAGTTC-3' GFP Forward: 5'-GTCTCGAGTCTAGAGGATCCATGGTGAAGACTAATCTTTTTCT-3' Reverse: 5'-GTCTCGAGTCTAGAGGATCCATGGTGAAGACTAATCTTTTTCT-3' WOX5 Forward: 5'-GTCTCGAGTCTAGAGGATCCATGTCTTTCTCCGTGAAAGGTC-3' Reverse: 5'-TTTCGAGCTTCAGGATCCAGAAAGCTTAATCGAAGATCTAATGG-3' FEZ Forward: 5'-TCTCGAGTCTAGAGGATCCATGGCGGCTGATCCTTCGG-3' Reverse: 5'-TTTCGAGCTTCAGGATCTGTACTGGAGAAACAAGCTGGC-3' 表1. 载体构建所用引物 * 引物中加粗字体标注的为与载体相同的序列，为方便In-Fusion克隆的重组反应而添加。表中所有引物为作者自主设计。 Table 2 Primers used for the confirmation of transgenic line 引物名称 序列 WOX5p (JC)-5 (正向) 5'-TGGTTCCGATATACAACTTATGCATG-3' VP16 (JC)-3 (反向) 5'-AGGGCATCGGTAAACATCTGCTC-3' UAS (JC)-5 (正向) 5'-ACAATCCCACTATCCTTCGCAAG-3' GR (JC)-3 (反向) 5'-GTGTAAGTTTCTGAAGCCTGGTATC-3' WOX5 (JC)-5 (正向) 5'-GAGGCAGAAACGTCGTAAAATCTC-3' GFP (JC) -3 (反向) 5′-TTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG-3′ FEZ (JC)-5 (正向) 5′-CAAAACTAGTAATAGTACAACTCCATC-3′ 表2. 转化植株鉴定引物 * 表中所有引物为作者自主设计。 2.5. 显微镜观察 共聚焦显微镜观察：将幼苗根浸于滴加在载玻片上的10 µg/ml碘化丙啶(propidium iodide)溶液中，轻轻盖上盖玻片，用奥林巴斯FV1200共聚焦显微镜观察和拍照，波长设置为激发光488 nm，检测波长510 nm。 光学显微镜观察：(拟南芥)幼苗根用50%乳酸:30% H 2 O:20%卢戈耳氏溶液(Lugol’s solution)混合液装片，用Nikon ECLIPSE 80i微分干涉相差显微镜观察，用DS-Ri1数码相机和NIS-Elements软件拍照和进行图像处理。