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user: 4. 菌黄素的生物合成机制 4.1. 菌黄素依赖特殊的II型聚酮合酶途径进行合成 类似于大部分微生物次级代谢产物，菌黄素的生物合成相关基因也是成簇的分布于基因组上。1993年Poplawsky等 [ 20 ] 首次利用基因组文库回补实验在Xcc “B-24”分离株中发现一段25.4-Kbp的序列能回补18株菌黄素缺失突变体，随后该实验室从这一序列中鉴定了pigABCDEFG基因簇(约18.6-Kbp)参与菌黄素的生物合成 [ 21 ] 。2002年，Goel等 [ 22 ] 利用Xcc的pig基因簇序列作探针在Xoo的基因组中也发现了菌黄素生物合成基因簇部分片段，该基因簇中共有14个开放阅读框，其中3个ORF分别编码酰基载体蛋白(ACP)、脱水酶(DH)和酰基转移酶(AT)，且是菌黄素生物合成必需的基因，据此作者首次提出菌黄素可能通过II型聚酮合酶(PKS)途径进行合成。 根据已发表的基因组序列，Cao等 [ 12 ] 采用RecET克隆技术直接克隆了Xcc的pig基因簇(Xcc4015-Xcc3998)，并实现了在铜绿假单胞菌M18中异源表达菌黄素，由此进一步确定pig基因簇负责菌黄素的生物合成。通过基因敲除作者鉴定了11个核心基因(xanA2B2CDEFGHKLM)是菌黄素生物合成必需的(见图2)。根据生物信息学分析，xanM、xanL、xanC、xanH和xanE分别编码酮基合酶(KS)、链长因子(CLF)、ACP、酮基还原酶(KR)和DH，它们是II型PKS途径中典型元件。该途径中的KS/CLF不同于链霉菌中典型酮基合酶，构成了新的一类KS/CLF元件，因此菌黄素通过特殊的II型PKS途径进行生物合成。Wang等 [ 17 ] 鉴定了溶酶杆菌菌黄素类似物的生物合成基因簇，该基因簇中大部分基因与pig基因簇同源，也包含KS、CLF、ACP、KR、DH等典型的II型PKS蛋白，突变这些基因亦导致无菌黄素合成。Zhou等 [ 23 ] 发现pig类似基因簇广泛的存在于黄单胞菌科中，例如Xylella fastidiosa、Pseudoxanthomonas spadis、Frateuria aurantia等，且大部分黄单胞菌科细菌能产生黄色素。综合以上，菌黄素或菌黄素结构类似物广泛存在于黄单胞菌科细菌中，且具有保守的生物合成途径，即通过特殊的II型PKS途径进行合成。 图2. 野油菜黄单胞菌菌黄素生物合成基因簇 [ 12 ] 4.2. 3-HBA是菌黄素生物合成前体物 早期Poplawsky等 [ 21 ] [ 24 ] 发现pig基因簇中的xanB2介导一种可扩散信号的产生，命名为DF，并认为DF是调控菌黄素生物合成的关键因子。Chun等 [ 25 ] 初步推测DF是丁内酯类化合物，随后Yajima等 [ 26 ] ，He等 [ 18 ] [ 27 ] 的研究结果否定这一推测，并由He等 [ 18 ] 重新鉴定了DF为3-羟基苯甲酸(3-HBA)。基于前期报道的菌黄素结构中含有3-羟基苯甲酰基团，He等 [ 18 ] 首次提出3-HBA并非一种信号分子，而应该是菌黄素生物合成的前体物。除此之外，还有几条证据支持这一观点 [ 18 ] ：1) 3-HBA缺失突变株完全丧失菌黄素合成能力，这更像中断了菌黄素合成途径而非中断调控菌黄素合成的信号传导途径；2) 虽然3-HBA缺失突变株在胞外多糖的产生、细胞活力、抗氧化活性、致病性等方面受到影响，但负责以上表型的基因表达水平未受影响，说明3-HBA不参与调控以上基因的表达；3) 突变pig基因簇另一基因Xcc4015也导致菌黄素无法合成但不影响3-HBA的产生，ΔXcc4015菌株呈现的表型与ΔxanB2类似，说明以上表型变化主要是由菌黄素缺失引起的。后期仍需深入的研究进一步证实3-HBA是菌黄素生物合成的前体物，比如通过同位素标记喂养试验。 4.3. XanB2一种新型分支酸酶，负责合成3-HBA 早期多篇研究报道了xanB2是3-HBA产生的关键基因，直至2013年XanB2的生化功能才被阐述。Zhou等 [ 23 ] 纯化了Xcc的XanB2蛋白，首次在体外证实XanB2是一种新型的双功能分支酸裂解酶，催化分支酸水解为3-HBA和4-HBA，其中3-HBA是菌黄素生物合成的前体物。作者进一步发现Xcc基因组中并无常见的4-HBA合成酶UbiC，UbiC是辅酶Q生物合成途径中关键酶；且突变xanB2导致辅酶Q显著降低，由此证实XanB2产生的4-HBA主要参与了辅酶Q的生物合成。XanB2也是一类保守存在的分支酸裂解酶，在黄单胞菌及苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)及Xylophilus ampelinus等细菌中也发现了xanB2的同源蛋白，这也解释了为什么以上细菌也能回补3-HBA缺失突变株菌黄素的产生 [ 24 ] 。Schöner等 [ 28 ] 在杂草内生菌Azoarcus sp. BH72中发现XanB2的同源蛋白ArcB，且证实与XanB2具有同样的功能。有趣的是，arcB也参与了一种菌黄素类似色素arcuflavin的生物合成，arcuflavin的生物合成基因簇部分基因与pig基因簇同源，也是通过II型PKS或FAS途径合成。 4.4. XanA2和XanC负责激活3-HBA，进一步参与PKS途径 3-HBA作为前体物通过II型PKS途径合成菌黄素的芳香基多烯脂部分，根据典型的PKS生物合成途径，3-HBA需激活为3-HBA-CoA或3-HBA-S-ACP。Cao等 [ 12 ] 在Xcc的pig基因簇中鉴定了xanA2 (即Xcc4015)编码AMP连接酶，体外酶活证实XanA2催化两步反应：激活3-HBA腺苷酰化形成3-HBA-AMP，然后把3-HBA转移至xanC编码的ACP的巯基形成3-HBA-S-ACP。XanA2还能激活3-HBA的类似物如4-HBA、3-MHBA、4， 3-AHBA及BA等腺苷酰化。该结果解释了为何在xanB2突变体中外源添加4-HBA、3-MHBA、4，3-AHBA也能诱导菌黄素或菌黄素类色素的合成 [ 18 ] 。即4-HBA，3-MHBA，4，3-AHBA等也可能作为前体物参与菌黄素的生物合成。有趣的是4-HBA介导合成的菌黄素为暗黄色，近期我们实验室的研究结果(未发表)显示该暗黄色色素在吸收光谱、色谱分离等方面均存在差异，而造成这种差异的原因还不清楚。 4.5. 菌黄素芳香基多烯链的后修饰过程 菌黄素结构中的芳香环和多烯链上具有溴化修饰，而pig基因簇中有两个基因可能编码卤化酶(xanB1和xanJ)，Cao等 [ 12 ] 在Xcc中分别或同时敲除xanB1和xanJ均不影响菌黄素的合成，但敲除xanJ影响其菌落颜色变浅且不影响菌黄素产量；Goel等 [ 22 ] 在Xoo中敲除xanB1亦不影响菌黄素的产量以及溴化修饰。因此，xanB1或xanJ是否参与菌黄素的溴化修饰还有待进一步阐述。Cao等在Xcc的pig基因簇中鉴定了一个特殊的糖基转移酶(xanK)参与菌黄素的合成，并推测菌黄素整体结构中含有糖基化修饰。除此之外，pig基因簇中含有两个编码溶血磷脂–脂酰转移酶家族蛋白的基因(xanD和xanF)亦参与菌黄素的合成，根据菌黄素特殊的磷脂类结构，我们推测xanD和xanF可能催化芳香基多烯酸与甘油磷酸的酯化反应 [ 12 ] 。由于菌黄素结构信息的缺乏，关于菌黄素芳香基多烯链的后修饰过程仍需进一步验证。 综上所述，菌黄素的生物合成主要分为以下4个阶段(见图3)：1) 利用XanB2水解莽草酸途径产物分支酸合产生3-HBA和4-HBA，其中3-HBA再通过XanA2激活合成起始单元3-HBA-S-ACP。2) 3-HBA-S-ACP经II型PKS途径加载延伸单元丙二酰-CoA，然后经过酮基还原酶和脱水酶的还原作用形成芳香基多烯酸。3) 芳基多烯酸进一步与甘油或甘油磷酸酯化，生成磷脂类化合物。4) 最后经过糖基化、卤化、甲基化等修饰，合成最终的菌黄素，再经转运蛋白转运至细胞外膜，嵌合于磷脂双分子层。 4.6. 菌黄素与其它代谢产物生物合成途径之间的关联 黄单胞菌能产生多种代谢产物来更好的适应生存环境，包括菌黄素、胞外多糖、胞外酶、DSF家族