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user: 2. 成骨相关信号通路 2.1. BMP-SMAD信号通路 骨代谢同时受多种细胞因子及生长因子的调控，骨形态发生蛋白(BMPs)便是其中之一。BMPs在骨代谢过程中起着关键性的调控作用。BMPs属于转化生长因子β (TGF-β)超家族，是一类多效性细胞因子，根据序列相似性和功能可以将BMPs分为4个亚族：1) BMP-2和BMP-4；2) BMP-5、-6、-7、-8a和-8b；3) BMP-9和BMP-10；4) BMP-3、-3b、-11、-12、-13、-14、-15和-16，其中，BMP-2、-7、-6、-9能够促进骨质形成 [ 3 ] ，而BMP-3对成骨具有负调控作用 [ 4 ] 。TGF-β超家族的成员均通过结合双受体系统—I型和II型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体(BMPR-I、BMPR-II)介导信号转导。而在膜信号传入核内的过程中，Smad信号通路发挥着主要作用。 BMP信号分子结合并激活BMPR-II，使得BMPR-I磷酸化并进一步磷酸化BMP活化型Smads (BR-Smads)的C末端DNA结合域，磷酸化的BR-Smads与共同通路型Smads (Co-Smads)结合形成异质低聚体进入核内与转录因子相互作用，共同调控目的基因的表达 [ 5 ] 。在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中BMP通过BR-Smads直接或间接诱导Runx2的表达，BR-Smads又可以与Runx2以物理结合的方式进一步诱导成骨分化 [ 6 ] 。I-Smads则可以抑制BR-Smads和Co-Smads的作用。此外，Samds的活性还受到许多因素的调控。小C端结构域磷酸酶1、2 (SCP-1、SCP-2)介导Smads的去磷酸化可抑制后者的转录活性 [ 7 ] 。泛素连接酶1(SMURF1)能够修饰Smad1、5 [ 8 ] ，SMURF2仅介导Smad1的泛素化 [ 9 ] 。 近年来借助实验生物反应器发现机械应力引起的骨代谢与BMP-Smads信号通路有着密切的关系：在应力刺激下的细胞具有更高的BMP反应性并更早激活Smads通路 [ 10 ] ；机械负荷能减少BMP拮抗分子的表达 [ 11 ] ；应力作用可以使BMP-2、BMP-7、碱性磷酸酶(ALP) I型胶原的表达量增加 [ 12 ] 。然而，这一现象在不同种类的细胞间并不完全一致 [ 13 ] 。 2.2. Wnt/β-Catenin信号通路 Wnts是一类与卷曲蛋白受体(FZD)结合的分泌型糖蛋白。Wnt家族分泌的因子参与细胞极化、分化、迁移、增殖和生物学功能等多个细胞生理过程。Wnt蛋白可以大致分为两类：一类激活经典的Wnt信号通路，即Wnt/β-Catenin信号通路；另一类由Wnt5a激活非经典的Wnt通路，配体与FZD结合后不依赖于β-Catenin和LRP5/6。 Wnt/β-Catenin信号通路中，Wnt配体与FZD或低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (LRP5/6)形成复合物。当胞外缺乏Wnt蛋白时，该复合体无法形成，此时在糖蛋白激酶-3 (GSK-3)作用下导致β-Catenin蛋白水解，胞浆及核内的β-Catenin水平降低，最终抑制Wnt/β-Catenin信号通路。在该信号通路中，GSK-3的活性受大肠腺瘤样蛋白(APC)和轴蛋白(Axin)形成的多肽复合体的调控。当Wnt分子与LRP5/6-FZD受体复合体结合，LRP5/6胞内端磷酸化而产生Axin的结合位点，Axin结合到该位点能抑制GSK-3介导的β-Catenin水解，引起β-Catenin增加并进入核内，与细胞核中的T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)转录复合物结合，作为转录激活因子可引起下游靶基因表达，从而发挥调控作用 [ 14 ] 。 研究证实Wnt/β-Catenin信号通路通过控制间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞的分化和功能来调控骨代谢。间充质细胞条件性β-Catenin基因敲除鼠在骨骼发育期表现出显著减弱的成骨分化 [ 15 ] 。然而，Wnt/β-Catenin信号通路对成骨分化的影响还取决于细胞所处的发育阶段。体外激活Wnt/β-Catenin信号通路可以促进间充质干细胞的增殖，但抑制其成骨分化 [ 16 ] 。一旦间充质干细胞开始向成骨细胞系分化，Wnt/β-Catenin信号通路虽能促进细胞生长和分化，但阻碍其终末分化为成熟的成骨细胞 [ 17 ] 。这一阶段依赖的现象同样表现在人类疾病中，如骨纤维异常增殖症是由于上调的Wnt/β-Catenin信号通路引起的成骨细胞分化和成熟障碍所导致的 [ 16 ] 。 2.3. Notch信号通路 Notch信号通路在进化上高度保守，其在细胞发育、增殖、凋亡和分化均具有调控作用。Notch的受体和配体为跨膜蛋白，其发挥功能依赖于相邻细胞间的相互接触。哺乳动物拥有4种Notch受体(Notch1-4)，并根据结构不同将12种配体分为四类。 当相邻细胞表面的同源配体与受体结合，Notch受体的胞外部分和跨膜部分分别经TACE、γ-分泌酶水解，引起Notch受体胞内部分(NICD)从细胞膜上脱落并移入核内。在细胞核中NICD与RBPJ、MAML相互作用，将转录抑制子转化为激活子，激活下游HES家族、HEY家族等的基因表达 [ 18 ] 。 目前已有大量研究证明Notch信号通路在成骨分化中起作用。Tezuka等发现Notch1在成骨前体细胞(MC3T3-E1)分化的早期阶段表达增高，同时，NICD过表达的MC3T3-E1细胞在成骨分化过程中钙结节的形成量显著增加；此外，外源性Notch可以诱导多能间充质细胞系(C3H10T1/2)成骨分化，抑制成脂分化 [ 19 ] 。用hMSCs重复出上述现象的同时，发现Notch下游基因Hes-1能与Runx2相互作用并增强后者作为转录激活子的活性；Notch信号通路的激活子Maml也发现能够激活骨组织Runx2的转录 [ 20 ] 。NICD转基因鼠的成骨显著增加且表现为严重的骨硬化症，其骨组织结构异常紊乱且骨钙素(OCN)的表达明显减少，提示成骨细胞存在成熟缺陷，可能是NICD与Runx2结合并抑制后者激活OCN导致成骨细胞的未成熟状态 [ 21 ] 。也有研究团队利用NICD转基因鼠得到骨量减少的表型 [ 22 ] 。总体来说，Notch信号通路在成骨分化过程中具有调控作用，但具体机制仍存在一定的争议。 2.4. Hedgehog信号通路 Hedgehog信号通路同样在进化上高度保守，在发育和内稳态方面起着重要作用。在哺乳动物，Hedgehog蛋白可分为三类：Sonic Hedgehog (SHH)， Indian Hedgehog (IHH)， Desert Hedgehog (DHH)。当胞外Hedgehog蛋白与跨膜受体(PTC)结合即解除对SMO抑制并进一步使之磷酸化，SMO激活使Hedgehog通路转录效应子Ci/Gli从Cos2释放转移入细胞核，激活相应下游靶基因的表达 [ 23 ] 。 PTCh1缺陷病人及小鼠模型表现为骨量增加，PTCh1缺陷的成骨前体细胞由于与Runx2的反应性增加及GLI3抑制物产生减少而表现为成骨分化速度增快 [ 24 ] 。与此相对，GLI1缺乏小鼠的表型为骨量减少、成骨分化减弱和破骨细胞生成增加 [ 25 ] 。另一份体外实验提出SHH能上调成骨细胞系Osx的表达，促进成骨细胞产生并间接上调破骨细胞的活力，引起骨吸收增加及骨强度下降 [ 26 ] 。在骨缺损修复初期，IHH和PTC1均表达增加 [ 27 ] ；在重塑期，成骨细胞内SHH激活以调控成骨细胞增殖、分化，破骨细胞形成以及血管生成 [ 28 ] 。利用IHH/MSCs/支架材料复合物的组织工程实验结果显示骨修复加快 [ 29 ] 。可见，Hedgehog信号通路在促进成骨分化上具有显著的作用，但三个配体分别所起的作用及机制尚有待研究。 2.5. MAPK信号通路 传统的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括三个亚家族成员：1) ERK1/2、ERK5；2) JNK1/2/3；3) p38。MAPK通路主要参与转导胞外刺激(环境压力、生长因子、细胞因子等)引起细胞生长、分化和凋亡。一旦细胞接触刺激物，MAPKK激酶(MAP3K)被激活并磷酸化MAPK激酶(MAP2K)，而后磷酸化激活MAPKs [ 30 ] 。 研究发现MAPKs在骨骼发育和骨代谢中起着重要作用，大部分研究均指向p38和ERK，JNK在成骨分化中所起的作用尚有一定的争议。如通过化学抑制JNK或siRNA干扰其表达，均引起矿化减少、成骨标志物表达下降，而其活性状态下促进成骨 [ 31 ] 。但也发现在hMSCs抑制JNK后ALP的活性增加而成骨加强 [ 32 ] 。 ERK1/2均表达于成骨细胞并在骨代谢中具有相似的功能。首先通过调控骨钙素启动子激活抑制性MEK1，此时小鼠表现为颅骨和锁骨缺陷，与Runx2缺乏的表型相似。而Runx+/−的表型可以被活性MEK1恢复 [ 32 ] 。Matsushita通过ERK1/2双突变鼠证明ERK1/2在成骨分化中具有促进作用，并能够抑制软骨膜周围的软骨分化 [ 33 ] 。Runx2磷酸化被普遍认为是ERK信号通路促进成骨分化的机制：MEK1抑制物可阻滞Runx2诱导的骨钙素表达 [ 34 ] ；ERK1/2特异的丝氨酸残基(Ser301、319)与Runx2的激活能力有关 [ 35 ] 。 选择性p38抑制剂作用于成骨细胞系或原代细胞的结果显示p38在受成骨诱导性配体BMP2、Wnt蛋白、PTH激活后表现出调控成骨分化、胞外基质沉积及矿化的作用。p38被BMP激活后通过促进SMAD1磷酸化及核定位促进成骨分化 [ 36 ] 。P38通路在Wnt3a作用下可以募集间充质干细胞 [ 37 ] 。PTH通过蛋白激酶A(PKA)激活p38调控成骨细胞的功能，说明PTH是p38上游分子之一 [ 38 ] 。 2.6. FGF信号通路 成纤维细胞生长因子(FGFs)家族由22个分泌性多肽组成，能与4个高度同源的酪氨酸激酶受体(FGFR1-4)结合，引起FGFR二聚化并磷酸化自身的酪氨酸残基，以激活多个信号转导途径及下游基因，具有调控多种生长相关进程的作用，包括软骨内成骨和膜内成骨 [ 39 ] 。 目前已发现成骨细胞能表达FGF2和FGF18。内源性FGF2表达的重要性已得到广泛关注，FGF2失效会引起成骨细胞数目减少、骨量下降 [ 40 ] 。这一表型在自然生长状态下或PTH诱导下均发现与FGF2相关，提示这一分子与骨发育密切相关 [ 41 ] 。其他成员如FGF18，该基因敲除鼠表现为骨骼延迟形成 [ 42 ] 。FGF分子能激活多个成骨相关信号通路，如wnt、ERK、p38、PLCγ和PKC等，通过激活这些信号通路，FGF可以间接地调控成骨相关基因的表达 [ 43 ] 。FGFR2激活的人成骨细胞Runx2表达显著增加 [ 44 ] 。在FGFR激活的小鼠体内检测到Sox2的表达上调，并且细胞增殖速度加快 [ 45 ] 。