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user: 2. 方法 2.1. 数据来源 本文的数据来源于Zenodo(https://zenodo.org/record/28343#.VzCY5PmEBFn)，由Prum等 [ 7 ] 人于2015年所构建，是由靶定下一代DNA测序方法得到的序列数据，其中包含可以代表鸟类所有主要分支的198个鸟类和2个鳄目类(crocodilians)共200个物种的数据。本文通过比较由Prum等人研究的198种鸟类与Jarvis等人研究的48种鸟类属的一致性，从而将两种不同的数据名称进行了对应，最终得到了能够代表不同属的47种鸟类，如表1所示。例如，Prum等人研究的198种鸟中只有一种企鹅，为洪堡企鹅; 而Jarvis等人研究的48种鸟中同为企鹅属的有两种企鹅，分别为帝企鹅和洪堡企鹅; 故本文应用洪堡企鹅的数据。因此，由英文常用名和Prum等人命名的鸟类一定对应相同的属，但对应的具体鸟类可能不同。为方便与不同进化树进行比较及分析，本文均用英文常用名表述鸟类。具体地，每一种鸟类的DNA序列包含由靶定基因组中约259个基因所产生的394个序列片段，这些片段多数是两侧为可变区域的保守序列，其中每个基因平均约有1524个碱基，最后每种鸟类的DNA序列约有390，000个碱基。 在建树过程中，时间参数依据Prum等得到的地质化石较准时间，即文献 [ 7 ] 附录中图7所示的时间，由此确定了每一物种的产生时间。 2.2. 本文研究的47种鸟类名称和记号 为方便与Prum和Jarvis构建的进化树进行比较，本文对47种鸟类的英文常用名、记号、对应于英文常用名的中文常用名 [ 2 ] 、以及Prum对鸟类的命名进行了一一对应(如表1所示)。字母记号的规则为：前面的大写字母表示多层次分类，之后的两位数字对应物种在其分类中的编号，最后一位小写英文字母代表编号后更加细致的分类，若没有则不写。 因此，198种鸟类的字母记号具体如下：P01-P09表示Palaeognathae， G01-G16表示Galloanserae， Table 1 The name and mark of 47 avian 序号 英文常用名 中文常用名 记号 Prum对鸟类的命名 1 Common ostrich 非洲鸵鸟 P01 I0453_90121_Struthionidae_Struthio_camelus 2 White-throated tinamou 白喉䳍 P06t I0432_5886_Tinamidae_Eudromia_elegans 3 Turkey 火鸡 G04g I0448_52755_Numididae_Numida_malagris 4 Chicken 鸡 G09g I0374_2419_Phasianidae_Gallus_gallus 5 Peking duck 北京鸭 G12a I0283_6026_Anatidae_Dendrocygna_viduata 6 Downy woodpecker 绒啄木鸟 NIC22 I0259_3344_Picidae_Picus_canus 7 Carmine bee-eater 红蜂虎 NIC10 I0199_955_Meropidae_Merops_muelleri 8 Zebra finch 斑马雀 NIA49p I0456_3321_Paridae_Poecile_lugubris 9 Medium-ground finch 中地雀 NIA50p I0455_1245_Alaudidae_Calandrella_brachydactyla 10 American crow 短嘴鸦 NIA48p I0197_832_Corvidae_Corvus_albus 11 Golden-collared manakin 金领娇鹟 NIA41p I0246_2823_Tyrannidae_Tyrannus_albogularis 12 Rifleman 刺鹩 NIA13p I2829_RIFL_Acanthisittidae_Acanthisitta_chloris 13 Speckled mousebird 斑胸鼠鸟 NIC01 I0410_52764_Coliidae_Colius_colius 14 Bar-tailed trogon 斑尾非洲咬鹃 NIC05 I0190_295_Trogonidae_Apaloderma_aequatoriale 15 Chimney swift 烟囱褐雨燕 NS10a I0247_2886_Apodidae_Chaetura_brachyura 16 Anna’s hummingbird 安氏蜂鸟 NS11a I0219_1489_Trochilidae_Topaza_pella 17 Common cuckoo 大杜鹃 NC06o I0423_2497_Cuculidae_Cuculus_optatus 18 Kea 啄羊鹦鹉 NIA07 I0389_14873_Psittacidae_Nestor_meridionalis 19 Budgerigar 虎皮鹦鹉 NIA12 I0240_2217_Psittacidae_Deroptyus_accipitrinus 20 Chuck-will’s-widow 卡氏夜鹰 NS02 I0258_3336_Caprimulgidae_Caprimulgus_europaeus 21 Yellow-throated sandgrouse 黄喉沙鸡 NC11c I0411_53231_Pteroclididae_Pterocles_bicinctus 22 Brown mesite 褐拟鹑 NC09c I0363_345610_Mesitornithidae_Mesitornis_unicolor 23 Sunbittern 日鳽 NA19 I0396_16818_Eurypygidae_Eurypyga_helias 24 Hoatzin 麝雉 NIM01 I0369_848_Opisthocomidae_Opisthocomus_hoazin 25 Red-crested turaco 红冠蕉鹃 NC01o I0192_375_Musophagidae_Tauraco_macrorhynchus 26 Mac Queen’s bustard 亚洲波斑鸨 NC03o I0281_5967_Otididae_Ardeotis_kori 27 Pigeon 鸽子 NC16c I0211_1232_Columbidae_Columba_livia 28 Turkey vulture 红头美洲鹫 NIM02a I0202_1066_Cathartidae_Cathartes_burrovianus 29 Cuckoo-roller 鹃三宝鸟 NIC03 I0367_449184_Leptosomidae_Leptosomus_discolor 30 Rhinoceros hornbill 马来犀鸟 NIC08 I2828_3250_Bucerotidae_Bucorvus_leadbeateri 31 Peregrine falcon 游隼 NIA04 I0236_2079_Falconidae_Falco_sparverius 32 Bald eagle 白头海雕 NIM07a I0185_86_Accipitridae_Buteo_jamaicensis 33 White-tailed eagle 白尾海雕 NIM08a I0268_3790_Accipitridae_Accipiter_superciliosus 34 Red-legged seriema 红腿叫鹤 NIA01 I0421_1173_Cariamidae_Cariama_cristata 表1. 47种鸟类的名称和记号 Continued NS01-NS13表示Neoaves-Strisores，NC01-NC16表示Neoaves-Columbaves，NG01-NG09表示Neoaves-Gruiforms，NA01-NA43表示Neoaves-Aequorlitornithes，NIM01-NIM10表示与Neoaves- In-opinaves-Accipitriformes相关的混合鸟类， NIC01-NIC26表示Neoaves-Inopinaves-Coraciimorphae， NIA01-NIA56表示Neoaves-Inopinaves-Ausralaves， NIA13p-NIA56p中的字母p表示subclass passeriformes。通过分析新命名的字母记号可以直接了解物种分类的从属问题，方便快速判断所构进化树的准确性。 2.3. 数据预处理 k联体是指在核苷酸序列中连续排列的k个碱基。由于下载得到的测序数据中含有碱基不确定的位点(占序列总长的0.56%~5.76%)，如强配对碱基(S)，次黄嘌呤碱基(I)，含氨基碱基(M)等，为了保证序列长度不变，同时避免引入虚假的k联体，将这些位点用“−”表示。这样，经过预处理后的序列数据则是由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)四种碱基及“−”组成。 本文不考虑含有“−”的k联体，故仅包含字母的k联体最多只有4 k 种。我们从经预处理后的47种鸟类的基因组序列资料出发，统计k联体(k = 9 − 14)的频数及其相应频率。据此构建进化树。 2.4. 核苷酸k联体的非联配算法 我们采用k联体的非联配算法 [ 11 ] (KNA算法: k-mer Non-aligned Algorithm)来计算进化距离。对于任意两保守序列 和 设其核苷酸 型k联体的频率分别为 和 ，则两序列之间的距离定义为: (1) 根据(1)式，利用k联体频率可计算出47种鸟类两两之间的进化距离值，从而得到一个47 × 47维的距离矩阵。 2.5. 用NJ算法构建鸟类进化树 邻接法(Neighbor-Joining，简称为NJ)是由Saitou和Nei [ 12 ] 于1987年提出的，是一种基于距离矩阵的快速聚类方法。该算法不需要关于分子钟的假设，不考虑任何优化标准。其基本思想是进行类的合并时不仅要求待合并的类是相近的，而且要求待合并的类远离其他的类，从而通过对完全没有解析出的星状进化树进行分解，来不断改善星状树。在递推过程中NJ算法不仅考虑一对对的距离，而且考虑了整个树中距离之和的极小化。 特别是，在NJ算法的递推过程中要对一对物种(如物种1和物种2)的分支长度求和，记为S 12 : (2) 其中，N表示物种总数，d 1k 和d 2k 分别表示物种1和2与其它物种之间的距离值，d 12 表示物种1和2之间的距离值，d ij 表示除了物种1和2之外的其他物种两两之间的距离值。当S 12 为求得的所有S ij 中最小值时，表示1和2即为邻近物种。很显然，式(2)中物种1和物种2是对称的，即两物种替换后S 12 值不变。由此说明一个姐妹支上的两个邻近物种是可以上下互换的。