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user: 2. 实验材料 2.1. 实验物品 2.1.1. 实验对象 8周龄SPF级C57BL/6雌鼠，体重19~23 g，购自济南鹏跃实验动物有限公司(中国济南)。所有C57BL/6小鼠根据ARVO关于在眼科动物中使用动物眼科及视觉的声明，这项研究遵循了赫尔辛基宣言的宗旨。 2.1.2. 实验烟曲霉菌 中国普通微生物文化采集中心(中国北京)提供烟曲霉菌株(NO3.0772)。 2.1.3. 实验细胞 RAW264.7从中国科学院上海获得。 2.2. 实验主要相关耗材 2.2.1. 真菌培养所需耗材及试剂 Sabouroud培养基 北京Solarbio公司；无水乙醇 南京宏益化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)北京Solarbio公司。 2.2.2. 制备动物模型相关耗材与试剂 封口膜 美国National Can公司；8%水合氯醛，青岛大学附属医院提供；1 ml注射器，山东新华安得医疗用品有限公司；外科5-O黑丝线，上海浦东金环医疗用品股份有限公司；75%酒精，南京宏益化学试剂有限公司；眼科显微器械，美国Fisher Scientific公司。 2.2.3. 小鼠角膜局部处理及RAW细胞处理所需试剂 黄芩素(BE) MCE公司；二甲基亚砜(DMSO) 北京Solarbio公司。 磷酸盐缓冲液(PBS)北京Solarbio公司。 2.2.4. Real-time PCR相关试剂及耗材 RNAiso Plus大连宝生物工程有限公司；EP管 美国Corning公司；氯仿 南京宏益化学试剂有限公司；异丙醇 南京宏益化学试剂有限公司；无水乙醇 南京宏益化学试剂有限公司；八联排 美国Axygen公司；DEPC水 上海生物工程有限公司；RNAisoPlus 中国大连TaKaRa；SYBR PremixExTaq 中国大连TaKaRa；Prime Script RT reagent kit with g DNA Eraser 中国大连TaKaRa。 2.2.5. Elisa相关试剂及耗材 小鼠的IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒R & D Systems (SanDiego， CA， USA)；小鼠的TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒R & D Systems (SanDiego， CA， USA)；小鼠的IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒R & D Systems (SanDiego， CA， USA)。 2.3. 实验方法 2.3.1. 烟曲霉菌培养与菌丝的制备 取冻存的烟曲霉菌标准菌株，在超净台上，将其接种于Sabouroud琼脂固体培养基，置于28℃的恒温箱内孵育7天。在显微镜下观察到菌株生长状态，待其生长良好时，用消毒后洁净的接种环刮取培养基来收集烟曲霉菌的孢子和菌丝，接种于经过高压消毒后的300 ml Sabouroud液体培养基的无菌烧瓶内，用纱布严密包扎盛有液体培养基的无菌烧瓶瓶口。放置37℃的120 rpm摇床培养箱中培养5天。当烟曲霉菌菌丝生长至团块状菌丝形态时，收集菌丝于无菌玻璃管中，研磨棒研磨并制备均匀混悬液。将研磨后菌液置于离心机4℃，4500 rpm，离心10分钟，离心结束后弃上清，并用无菌PBS洗涤菌丝沉淀3次后再次离心10分钟后弃上层培养液。一部分加入不含胎牛血清的DMEM混匀，得到有活性的烟曲霉菌菌丝；另一部分菌丝中加入75%的酒精混匀，并置于4℃冰箱过夜灭活菌丝。第二天将其离心后弃上层酒精，再使用 PBS 洗涤菌丝沉淀3次，再次离心，弃去洗涤液，然后细胞培养液得到灭活的菌丝悬液。细胞计数板并调整其终浓度为1 × 10 7 CFU/ml。 2.3.2. 小鼠真菌性角膜炎模型的建立 采用8%水合氯醛腹腔内注射法对C57BL/6小鼠进行麻醉，麻醉成功后，将小鼠并固定于操作台。显微镜下，用洁净刀片在小鼠角膜中央划伤上皮深达浅基质层，(约2 mm直径范围)，然取已制备好的浓度为1 × 10 7 CFU/mL的具有活性的烟曲霉菌菌丝5 μL覆盖于角膜上皮缺损位置，在菌丝表面放置上软性角膜接触镜，最后用5-0缝合线缝合上下眼睑1针，使其闭合。右眼为空白对照组。将小鼠随机分为两组，分别为BE处理组，和DMSO处理组。第一天拆线后每天三次给药处理，给药方式为眼水点眼，并于1，3天拍照并对小鼠角膜进行炎症评分。炎症评分和分度，评分标准参考Wu [ 22 ]。 2.3.3. RAW细胞处理 将培养在6孔板或12孔板的RAW细胞于温箱培养24小时后，给予灭活烟曲霉菌菌丝刺激1小时后，加入BE或DMSO，菌丝感染8小时后收集12孔板的细胞用于PCR实验，用于检测IL-1β，TNF-α和IL-6的mRNA表达水平。菌丝感染24小时后收集24孔板的上清液用于Elisa实验用于检测IL-1β，TNF-α和IL-6的蛋白表达水平。 2.3.4. Real-time RT-PCR实验方法 1. Total RNA的提取 (1) 将含有角膜或者细胞的RNA裂解液的EP管置于冰盒上，使其充分裂解30分钟。 (2) 将EP管于4℃，12000 rpm，离心5分钟后取上清并置于另一洁净EP管中。 (3) 加入与RNA裂解液1/5体积量相等的三氯甲烷，并上下颠倒震荡EP管15秒使其彻底混匀。室温放置5分钟后再置于4℃，12000 rpm，离心15分钟。 (4) 离心后小心取出EP管，小心地吸取最上层的液体转移至另一洁净EP管中，注意不要碰到蛋白层以及最下层液体。 (5) 向含有最上层液体的EP管中加入等体积的异丙醇，并将EP管上下颠倒震荡混匀15秒，并置于室温下10分钟。 (6) 置于离心机，4℃，12，000 rpm，离心10分钟后弃上清液，此时乳白色的RNA沉淀于EP管管底，弃掉上清液。 (7) 加入75%酒精(使用DEPC水配制)，并上下颠倒15秒。置于4℃，12，000 rpm，离心5分钟后小心弃掉酒精。 (8) 室温下干燥EP管沉淀约20分钟后，加入适量DEPC水10~15 μl，吹打、震荡使其彻底溶解后，立即测定RNA含量以及纯度。 2. Total RNA含量及浓度测定 使用核酸浓度分析设备测定260 nm、280 nm处吸光度(opticaldensity，OD值)以及两者比值，根据所测样本RNA浓度建立2 μg RNA体系，计算所需RNA体积。 3. PCR 配置相应混合待测液，立即置PCR仪上，进行内参及目的基因扩增反应。扩增条件为：95℃预变性30 s → 95℃变性5 s、60℃ 30 s (重复40个循环) → 95℃退火、延伸15 s → 60℃ 30 s → 95℃溶解15 s。反应结束后，根据各样本的内参及目的基因循环数，计算目的分子的mRNA相对表达量。引物序列见表1。 Table 1 Primer sequence of target gen Gene Primer Nucleotide Sequence GenBank β-Actin (mouse) F R 5’-GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C-3’ 5’-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C-3’ NM_007393.3 IL-1β (mouse) F R 5’-CGC AGC AGC ACA TCA ACA AGA GC-3’ 5’-TGT CCT CAT CCT GGA AGG TCC ACG-3’ NM_008361.4 TNF-α (mouse) F R 5’-ACC CTC ACA CTC AGA TCA TCT T-3’ 5’-GGT TGT CTT TGA GAT CCA TGC-3’ NM_013693.3 IL-6 (mouse) F R 5’-TGATGGATGCTACCAAACTGGA-3’ 5’-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3’ NM_001314054.1 表1. 目的基因引物序列 F， forward; R， reverse. 2.3.5. ELISA 按照蛋白酶抑制剂：PBS缓冲液为495:5配制小鼠角膜保存液。每组6个角膜。研磨器进一步磨碎角膜组织，然后离心后取上清。24孔板的上清液于1500 g离心取上清液。 按照ELISA试剂盒的说明书进行实验： (1) 96孔板中加入Capture Antibody室温下孵育一整夜。 (2) 弃去液体，加入Wash Buffer，浸泡1~2分钟，拍干，重复洗板3次。 (3) 加入Reagent Diluent在室温下孵育1小时。 (4) 重复(2)步骤洗涤。 (5) 加入标准品工作液以及样本，室温孵育2小时。 (6) 重复(2)步骤洗涤。 (7) 加入Detection Antibody在室温下孵育2小时。 (8) 重复(2)步骤洗涤。 (9) 加入Streptavidin-HRP在室温避光下孵育20分钟。 (10) 重复(2)步骤洗涤。 (11) 加入Substrate Solution在室温避光下孵育20分钟。 (12) 加入Stop Solution立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD)值。 (13) 根据OD值，计算样品浓度。 2.4. 统计学方法 每项实验均独立重复至少三次，实验数据用x ± s表示，对各组实验进行统计学分析，采用单因素方差分析(ANOVA)对三组或三组以上的数据进行比较，并采用未配对双尾t检验对多组数据进行比较。P < 0.05差异具有统计学意义。