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user: 2. 材料和方法 2.1. 数据来源 线虫RNA-seq数据来自NCBI GEO datasets数据库中的GSE63823 [ 16 ] ，为一组线虫不同生长发育阶段：胚胎期(embryo)、幼虫期(L1~L4)、成虫期(adult)的total RNA(rRNA-deplete)及对应时期经核酸外切酶RNase R处理后的RNA-seq数据，测序数据信息统计如表1所示。 线虫参考基因组(Ce6)及基因组注释信息从数据库UCSC[ 17 ] 中下载得到。 线虫miRNA成熟体序列从miRNA收录数据库miRBase (v21) [ 18 ] 中下载得到。 2.2. 数据分析方法 2.2.1. 数据预处理 使用FastQC (v0.10.1)(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)对测序数据进行质量检测，确保质量可以进行后续的分析；如果测序质量不好，可用Trimmomatic (v0.30)[ 19 ] 进行质量控制。 2.2.2. 环状RNA的预测 本文使用find_circ流程[ 8 ] 对线虫环状RNA进行预测。find_circ流程首先将不能和基因组比对上的读段两端各取20 bp作为锚点，再将锚点作为独立的读段往基因组上比对并寻找唯一匹配位点，如果两个锚点的比对位置在线性上方向呈反向，就延长锚点的读段，直至找到环状RNA的接合位置，若此时两侧的序列分别为GT/AG剪接信号，则判断为环状RNA。相关程序可在circBase[ 20 ] 数据库中下载得到。预测步骤如下： Table 1 The RNA-seq datasets of C. elegan Datasets Stage Treatment Coverage GSM1558150 embryo None ~29.9 x GSM1558151 embryo RNase-R ~69.3 x GSM1558152 L1 None ~51.8 x GSM1558153 L1 RNase-R ~64.4 x GSM1558154 L2 None ~38.5 x GSM1558155 L2 RNase-R ~61.5 x GSM1558156 L3 None ~44.7 x GSM1558157 L3 RNase-R ~63.3 x GSM1558158 L4 None ~46.4 x GSM1558159 L4 RNase-R ~54.8x GSM1558160 adult None ~41.4 x GSM1558161 adult RNase-R ~65.9 x 表1. 线虫RNA-seq数据集 1) 基因组建索引：bowtie2-build genome.fa genome.fa(bowtie2v2.2.1)。 2) 安装python包：numpy (http://www.numpy.org/)和pysam (https://pypi.python.org/pypi/pysam)。 3) 建立一个文件夹genome，里面存放基因组中各个染色体的fasta文件，文件命名需同基因组fasta文件里的id相同。 4) 将处理后的读段比对到参考基因组上并将结果排序和转换成BAM格式：bowtie2 –p 20 - -very-sensitive --score-min=C，-15，0 –q –x genome.fa -1sample_1.fastq -2 sample_2.fastq 2>log/sam- ple.bowtie2.log| samtools view -hbuS - |samtools sort – sample。 5) 取出未匹配上的读段：samtools view -hf 4 sample.bam|samtools view -Sb -> BAM/unmapped_sample. bam。 6) 将未匹配的读段两端各取20 bp作为锚点序列：python unmapped2anchors.py BAM/unmapped_ sample.bam|gzip>gzip/sample_anchors.qfa.gz。 7) 将锚点同基因组比对，并得到可能的环状RNA位点：bowtie2 –p 23 --reorder --score-min=C，-15，0 -q -x genome.fa -U gzip/sample_anchors.qfa.gz |python find_circ.py -G genome -p sample -s log/find_ circ.log >bed/ sample.sites.bed 2>bed/sample.sites.reads。 8) 筛选候选环状RNA：grep circ bed/sample.sites.bed | grep -v chrM | python sum.py -2，3 |python scorethresh.py -16 1|python scorethresh.py -15 2|python scorethresh.py -14 2 |python scorethresh.py 7 2 |python scorethresh.py 8，9 35 |python scorethresh.py -17 100000 > bed/sample.circ_candidates.bed。 2.2.3. 表达量统计 Cufflinks (v2.2.0) [ 21 ] 是一款常用的转录本组装工具，它利用Tophat (v2.0.11) [ 22 ] 比对的结果来组装转录本，估计这些转录本的丰度并且可以检测样本间的表达差异及可变剪接。 利用FPKM[ 23 ] (Reads per kilobase of exon model per Million mapped reads)归一化各个转录本的表达量。 FPKM计算公式： 流程如下： 1) 基因组建索引：bowtie2-build genome.fa genome.fa； 2) Tophat比对：tophat -a 8 -m 0 -I 300000 -p 20 --library-type fr-unstranded --no-novel-indels --segment- mismatches 2 -G genome.gtf -o tophat/sample genome.fa sample.fastq 3) Cufflinks组装转录本并估计表达量：cufflinks -p 20 -G genome.gtf --library-type fr-unstranded -o cufflinks/sample tophat/sample/accepted_hits.bam 我们选取Y 45F 10D.4为管家基因[ 24 ] ，用下面的归一化公式计算环状RNA的表达量： 2.2.4. miRNA结合位点统计 我们使用滑动窗口的方法确定线虫各个miRNA在环状RNA上的结合位点数，窗口大小为7 bp，窗口的滑动步长为1 bp，先用perl脚本提取线虫成熟体miRNA的种子序列(第2~8 nt)，然后每滑动一次窗口，判断该窗口是否同种子序列反向互补，若反向互补，则判定为该miRNA的一个结合位点。 2.2.5. 内含子反向互补配对 根据内含子互补配对驱动环化模型，我们使用blast将环状RNA的上下游内含子序列进行比对，为了尽可能使blast 2.2.29+结果倾向于更长的匹配，我们设定参数为：-ungapped -word_size 6 -penalty -1，编写perl脚本统计内含子内部和内含子间的反向互补配对数目。