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user: 2. 材料和方法 2.1. 样品采集 实验用中华绒螯蟹于2018年12月取自上海海洋大学崇明基地成蟹养殖池塘，挑选活力良，肢体健全个体用于样品采集，采样前对蟹进行称重，随后迅速解剖出卵巢并进行称重，计算性腺指数，随后置于−80℃冰箱中保藏，挑选性腺指数10以上个体的样品用于进一步的蛋白纯化。 2.2. 试剂配制 参考《基因工程试验指南》中聚丙烯酰胺变性凝胶电泳相关实验方法配制所需试剂，具体配方如下。 匀浆缓冲液：IM Tris-HCl (pH = 7.6) 10 ml、NaCl 2.925 g、EDTA：0.05 g和100mM PMSF 0.5 ml用蒸馏水定容至500 ml； PBS缓冲液：KH 2 PO 4 0.1 g、Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 1.45 g、NaCl 4.0 g和KCl 0.1 g用蒸馏水定容至500 ml； 丙烯酰胺单体贮液：14.55 g丙烯酰胺加上0.45 g N，N'-甲叉双丙烯酰胺，先用40 mL双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50 mL，过滤。用棕色瓶4℃保存备用。 浓缩胶缓冲液贮液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8)：3.03 g Tris溶解在40 mL双蒸水中，用4 mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至50 mL。保存在4℃备用。 分离胶缓冲液贮液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH8.9)：18.16 g Tris溶解在80 mL双蒸水中，用4 mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至100 mL，保存在4℃备用。 10% (AP)过硫酸铵：0.1 g过硫酸铵溶入1.0 mL双蒸水，使用前新鲜配制。 电极缓冲液(0.025 mol/L Tris，0.2 mol/L甘氨酸，pH8.3)：15.14 g Tris加上72.07 g甘氨酸，用双蒸水稀释到5 L。可在室温保存一个月。 样品缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH6.8)：2 ml浓缩胶缓冲液贮液加上1 mL 87%甘油、0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10 mL，可在-20℃保存6个月。 分离胶配方双蒸水：6.6 ml、30%丙烯酰胺溶液：8.0 ml、1.5 mol/L Tris (pH8.8)： 5.0 ml、10% AP (W/V)：200 ul、TEMED：15 ul。 浓缩胶配方：双蒸水：6.8 ml、30%丙烯酰胺溶液：1.7 ml、1 mol/L Tris (pH6.8)：1.25 ml、10%过硫酸铵(W/V)：100 ul、TEMED：10 ul [ 7 ]。 2.3. 蛋白分离 蛋白初分离参考江洪波(2003)研究方法，取5.0 g左右中华绒螯蟹的成熟卵巢，加入10 ml预冷的匀浆缓冲液，用手持式分散机充分冰浴匀浆，然后将匀浆液在4℃下12，000转离心30分钟，取紫色上清液3~5 ml，并加入等体积的饱和硫酸铵溶液，冰浴2 h后在4℃下12000转离心30分钟，弃上清液，向离心管中加入5 ml的PBS缓冲液溶解沉淀，重复以上步骤3次，最后用5 ml PBS缓冲液溶解沉淀，用于蛋白纯化 [ 8 ]。 采用伯乐全自动蛋白质和多肽的纯化仪(型号：BioLogic DouFlowTM，美国伯乐公司生产)对卵巢提取物进行分离纯化．其中凝胶柱体积为120 ml，装入30 ml凝胶，纯化前首先采用PBS溶液平衡凝胶柱，流速3 mL/min，平衡3小时。用注射器上样蛋白提取液(蛋白浓度约为l mg/ml)，流速为0.6 ml，在280 nm和470 nm条件下检测洗脱液的吸光度(OD)，当出现蛋白组分时每lmL收集一次。洗脱液于−70摄氏度保存备用。 2.4. 蛋白纯化 将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分离胶(12%)和浓缩胶(5%)。过硫酸铵和TEMED最后加入，加入后聚合即开始，应立即混匀倒入两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，应该留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有2.5 cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约0.5 cm高的双蒸水，待分离胶聚合完全后，倾去上层的双蒸水，用双蒸水清洗凝胶顶层，用吸水纸吸去残余的水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层，插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔，加入电极缓冲液 [ 7 ]。 将中华绒螯蟹卵黄磷蛋白洗脱液经PBS稀释为浓度20 ug/ul后与上样缓冲液4:1混合，用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在100 ml的底物液中，染色1小时，待胶带显色后立即照相。然后将凝胶进行染色，中华绒螯蟹卵黄磷蛋白共有两个亚基条带，分别为70和100 kD，对条带进行割胶回收蛋白。 2.5. 动物免疫 初免抗原为蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化。二免、三免、四免抗原为蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。五免冲击为蛋白与等体积生理盐水混合，冲击免疫。选用健康Blbc小鼠，6~8周龄。一免：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂+蛋白；二免：第14天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白；三免：第28天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白；四免：第42天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白；四免后采血：第49天，尾根静脉采血10 ul，ELISA检测抗血清效价；五免：第56天，免疫用抗原为生理盐水+蛋白。五免冲击后5天，取小鼠脾脏，研磨后与SP2/0进行细胞融合，并铺板。 2.6. 亚克隆筛选及建立细胞株 融合后14~16天，镜检观察细胞，取上清elisa检测。阳性孔细胞转孔，并有限稀释，进入第一轮亚克隆筛选。6~7天后，镜检观察细胞，取上清elisa检测。阳性孔细胞转孔，并有限稀释，进入第二轮亚克隆筛选。5~6天后，镜检观察细胞，取上清elisa检测。阳性孔细胞转孔，并有限稀释，进入第三轮亚克隆筛选。第三轮亚克隆筛选后，elisa检测阳性细胞株，扩大培养，90%铺满培养皿后，取少量接入T25瓶中，剩余细胞收集并冻存。 2.7. 腹水制备 提前1周给小鼠腹腔注射矿物油。T25瓶中细胞培养至90%铺满，收集细胞，注射入小鼠腹腔。8~20天内观察小鼠腹腔，鼓胀到行动受限时，收集腹水。腹水离心并过滤后，用等体积PBS稀释，ProteinAG纯化，收集抗体。 2.8. 抗体效价检测 将抗原用0.05m ol/L碳酸盐(PH = 9.6)稀释至3 ug/ml，100 ul/孔，4℃孵育过夜。取出用0.05% Tween-20 (PBST)洗涤三次，3分钟/次。每孔加入5%脱脂奶粉(PBST) 150 μl封闭液，37℃封闭120分钟。取出用0.05% Tween-20 (PBST)洗涤三次，3分钟/次。将抗体分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，至1:512K，37℃孵育1小时。取出用5% Tween-20 (PBST)洗涤三次，3分钟/次。加辣根酶标记山羊抗兔IgG (H+L)。1:8000稀释，37℃孵育45分钟。取出用0.05% Tween-20 (PBST)洗涤五次，3分钟/次。加入底物溶液(TMB) 100 μl/孔，反应5~10分钟，最后加入100 μl 2 mol/L硫酸终止反应。用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。 2.9. 免疫组化验证 选取中华绒螯蟹囊胚期、原肠期、卵内无节幼体期胚胎和大眼幼体作为实验材料，验证制备的抗体的特异性，胚胎经波恩液固定24小时后，转移至70%的酒精保存，随后经过梯度脱水，浸蜡(56℃~58℃)，包埋后进行切片，切片厚度为5~7 μm。(神经组织先经过2%琼脂预包埋其他处理步骤相同)，切片经过脱蜡水化后，进行抗原热修复10分钟(修复液为枸橼酸修复液Ph6.0)，随后滴加0.3%双氧水用于封闭内源性过氧化物酶活性10分钟，PBST漂洗三次，每次2分钟，滴加鼠抗中华绒螯蟹卵黄磷蛋白，稀释比例为1:200，湿盒中4℃过夜，PBST漂洗三次，每次2分钟，滴加二抗(抗鼠IgG-hrp)，湿盒中37℃孵育1小时，PBST漂洗三次，每次2分钟，DAB显色后封片，随后拍照。