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user: 4. 结果 4.1. 体外抑菌实验结果 10%乙醇溶剂具有一定的抑菌效果，但仅限于乙醇接触区域，且透明圈(抑菌圈)一致为牛津杯内径0.6 cm，对各组抑菌圈直径大小进行计数统计。空白组与各药物浓度组抑菌圈直径大小统计结果见表2，愈疡胶囊浓度增加至0.15 g/mL时，抑菌圈平均直径达到1.3108 cm，表现出优秀的抑菌效果，当药物浓度增加至0.2 g/mL和0.25 g/mL，抑菌圈直径变化不显著，抗菌效果不再发生明显变化。 Table 2 Statistics of antibacterial effects of Yuyang Capsules at various concentrations (n = 3 药物浓度(g/mL) 重复试验 抑菌圈平均直径 x ¯ ± S D (cm) RSD (%) 抑菌圈 比值 1 2 3 空白组 0.6 0.6 - - 0.05 0.7100 0.7125 0.7050 0.7092 ± 0.0038 0.54 1.1819 0.10 0.9225 0.9175 0.9150 0.9183 ± 0.0038 0.42 1.5306 0.15 1.3175 1.3125 1.3025 1.3108 ± 0.0076 0.58 2.1847 0.20 1.3725 1.3825 1.3800 1.3783 ± 0.0052 0.38 2.2972 0.25 1.4025 1.3900 1.4050 1.3992 ± 0.0080 0.57 2.3319 表2. 各浓度下愈疡胶囊抑菌效果统计(n = 3) 4.2. 愈疡胶囊最佳抑菌浓度 根据各组抑菌圈直径同空白对照组抑菌圈直径的比值与药物浓度的关系，绘制药物浓度与抑菌效果曲线图，结果如图1，愈疡胶囊在0.05~0.15 g/mL之间对P. aeruginosa的抑菌效果呈剂量依赖性，在超过0.15 g/mL时抑菌效果逐渐趋于平稳，且实验效果在三组平行实验中均呈现上述趋势。三组平行实验RSD在0.37%~0.56%之间，远低于3%，表明该实验结果具有较好的稳定性和较高的可信度。通过药物浓度与抑菌圈比值所作的曲线图，得到愈疡胶囊最佳抑菌药效浓度为0.175 g/mL。 图1. 药物浓度与抑菌圈比值变化关系 4.3. 愈疡胶囊对P. aeruginosa膜的损伤 为进一步探讨愈疡胶囊的抗菌机制，利用SEM观察P. aeruginosa形态变化。如图2所示，未经治疗的细菌展现出光滑的表面，完整无缺的菌膜结构。而愈疡胶囊治疗会导致P. aeruginosa表面粗糙，出现皱褶、凹陷、扭曲以及一定程度上的膜损伤。该实验结果表明愈疡胶囊对膜的破坏可能是抑制P. aeruginosa的机理之一。 图2. PBS和愈疡胶囊处理后的铜绿假单胞菌的形貌图 4.4. 感染组织菌落计数结果 通过涂布平板法观察给药3天后愈疡胶囊对大鼠皮肤组织中细菌清除效果。不同治疗组处理后皮肤组织中的细菌铺板结果如图3所示。阳性对照组和高剂量愈疡胶囊组的琼脂板上菌落数明显减少。 图3. 感染组织细菌平板菌落数图 组织中细菌残余数量计算结果如表3所示。经PBS治疗后小鼠皮肤内细菌数约为3.505 × 10 6 CFU，而高、中、低剂量愈疡胶囊治疗后皮肤内细菌数会减少，分别约为3.389 × 10 5 、1.392 × 10 6 和3.137 × 10 6 CFU。与PBS组相比，愈疡胶囊治疗后皮肤组织中活菌数量呈现出数量级降低。与阿莫西林组相比，高剂量愈疡胶囊表现出更优秀的抗菌效果，这些结果表明愈疡胶囊能够有效抑制P. aeruginosa，菌落数随给药浓度增大逐渐减少，可以作为抗生素的潜在替代者。 Table 3 Count of bacterial of infected tissu 编号 组织重量 稀释倍数 菌落数 组织中细菌数个/g A1 0.99 100 694 3.505*10 6 B1 1.06 100 124 5.849*10 5 C1 1.05 100 117 3.389*10 5 D1 0.97 100 270 1.392*10 6 E1 1.02 100 640 3.137*10 6 表3. 感染组织细菌计数 4.5. 大鼠皮肤组织中炎症因子含量测定 通过ELISA试剂盒测量大鼠烫伤皮肤组织中炎症因子含量如表4所示。模型组中，细菌感染导致伤口组织中表达大量促炎因子TNF-α和IL-6，表明模型组中感染组织发生明显炎症症状。经愈疡胶囊和阿莫西林治疗后，促炎因子TNF-α和IL-6表达下降，炎症细胞因子分泌减少会在一定程度上减轻炎症。而同阿莫西林组一样，典型的抗炎因子IL-10和TGF-β因为愈疡胶囊的治疗显示出高表达，高于模型组，且随着药物剂量增加而升高，抗炎因子的较高表达表明了愈疡胶囊在体内具有潜在的抗炎作用。这些炎症相关因子的表达证实了愈疡胶囊可能是通过NF-kB通路调控组织修复的。因此，愈疡胶囊能够缓解烫伤感染伤口的炎症反应加速创伤愈合。 Table 4 Inflammatory factor content of infected tissue(x ± s， n = 3， pg/mL 分组 剂量mg/kg IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α 模型组 6.67 ± 0.17 23.45 ± 0.79 11.03 ± 0.11 54.79 ± 3.56 阳性对照组 120 5.87 ± 0.17 20.01 ± 0.84 9.79 ± 0.16 48.21 ± 2.94 愈疡胶囊高剂量组 600 5.99 ± 0.24 20.32 ± 1.04 9.92 ± 0.21 47.56 ± 2.91 愈疡胶囊中剂量组 300 6.11 ± 0.31 21.06 ± 1.47 10.01 ± 0.27 50.84 ± 3.13 愈疡胶囊低剂量组 150 6.41 ± 0.28 22.16 ± 1.93 10.35 ± 0.24 51.93 ± 3.11 表4. 感染组织炎症因子含量(x ± s， n = 3， pg/mL) 4.6. 大鼠皮肤组织中炎症因子含量测定 H&E染色结果如图4所示，PBS模型组：表皮缺失，皮下组织坏死、红肿，组织结构不清，皮下血管显著充血、水肿并伴有炎症相关细胞(巨噬，中性粒)浸润，皮下组织疏松、水肿、增宽，结缔组织溶解，残留组织形成网状结构，多量嗜中性、嗜酸性粒细胞浸润，坏死区域较大；阿莫西林组：较PBS模型组症状略轻，肉芽组织形成区域较大，大部分动物皮肤组织感染较轻，皮下在清除一些坏死脱离的物质及炎性残物；愈疡胶囊高剂量组：新生肉芽组织向表面生长，吞噬、溶解、消化、替代、清除坏死组织，向表面推进，大量创伤被结缔组织填充，切割伤口坏死边缘填平，残存有未完全修复创面，感染得到控制；愈疡胶囊中剂量组：病变程度基本同阿莫西林组；愈疡胶囊低剂量组：病变较重，基本同PBS模型组；病理学检验结果：动物病理组织观察，愈疡胶囊高剂量组治疗效果较好，对P. aeruginosa有抑制作用。评分统计结果如表5所示。结合评分根据统计学分析，愈疡胶囊组结果和其他组药效结果有显著性差异。 图4. H&E染色镜检结果 Table 5 Light microscope score statistics tabl 光镜评分 A1 (个) B1 (个) C1 (个) D1 (个) E1 (个) 1 - 6 6 3 - 2 2 2 1 4 3 3 8 2 3 3 7 表5. 光镜评分统计表 计算大鼠烫伤感染伤口面积大小评价大鼠伤口愈合情况，如表6所示。治疗2天后，高剂量愈疡胶囊和阿莫西林治疗组的大鼠伤口面积明显减小，随治疗时间延长，高剂量愈疡胶囊治疗组伤口愈合面积愈合加快，在治疗的最后一天减小到15 mm 2 左右，效果优于阳性对照组。这与皮肤组织中炎症因子测量结果一致，表面愈疡胶囊能够有效清除细菌，调节组织炎症反应，促进伤口愈合。 Table 6 The result of skin healing of bacterial infection and scald model (x ± s， n = 3， mm2 分组 2 (天) 4 (天) 6 (天) 8 (天) 模型组 75.35 ± 6.91 66.22 ± 6.58 59.04 ± 5.47 57.43 ± 5.21 阿莫西林组 65.09 ± 6.58 55.84 ± 5.65 44.01 ± 4.87 26.13 ± 3.62 愈疡胶囊高剂量组 64.38 ± 6.72 53.97 ± 5.62 37.93 ± 4.01 15.09 ± 3.73 愈疡胶囊中剂量组 67.61 ± 6.87 61.67 ± 6.15 47.21 ± 5.23 27.81 ± 4.01 愈疡胶囊低剂量组 71.45 ± 6.99 65.31 ± 6.72 57.21 ± 5.62 50.24 ± 5.12 表6. 细菌感染烫伤模型皮肤愈合情况(x ± s， n = 3， mm 2 )