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user: 4. 讨论 网络药理学是利用计算机模拟和生物网络识别预测中药药效物质、作用靶点及通路，而中药药效物 图9. 分子对接结果可视化 图10. 分子对接得分图 质基础研究是进行中药整体功效和作用本质研究的关键步骤之一 [ 10 ]。中药中有多数药材属于多个基原品种，比如威灵仙，大黄、石苇等，值得注意的是，多基原药材威灵仙来源于威灵仙、棉团铁线莲和东北铁线莲，有研究发现威灵仙药材中威灵仙分离得到和常春藤型皂苷化合物各28个，而东北铁线莲齐墩果酸型化合物15个，未见常春藤型皂苷型化合物，棉团铁线莲也未见常春藤型皂苷型化合物的报道 [ 11 ]。这些来源于不同品种的威灵仙由于成分差异在网络药理学预测中可能会导致靶点的误筛和作用机制不明确等现象，最终导致预测的结果不可靠。而本文预测滨蒿和茵陈蒿时同样发现，两者的关键化学成分存在较大差异，预测结果也表明，滨蒿和茵陈蒿抗肝炎的作用靶点及作用机制存在相同性和差异性，这也提示我们在临床应用中两者应该区别使用，符合中医理论中的辨证论治。因此不同品种的多基原药材在网络药理学预测中应考虑品种问题，不能一概而论。 迄今为止，有关茵陈及其制剂抗肝炎方面的报道较多，茵陈又分为滨蒿和茵陈蒿，研究发现滨蒿和茵陈蒿对抗肝炎、肝癌、肝硬化等方面具有较好的治疗效果，但目前未有对滨蒿和茵陈蒿抗肝炎的机制比较的报道 [ 12 ]。网络药理学通过挖掘大量数据，可对滨蒿和茵陈蒿化合物作用靶点与机制进行初步的筛选与分析。通过网络药理学及分子对接预测结果表明，滨蒿的主要化学成分Hyperoside、quercetin等，这几类成分已被证实具有抗肝炎的作用。例如槲皮素对Con A诱导的小鼠，能显著降低了血清促炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-4的水平，表明槲皮素对急性肝损伤具有保护作用 [ 13 ]。茵陈蒿的主要化学成分folic acid等，已有研究表明叶酸可减轻DEN诱发的肝损伤，并减少肝癌的发生 [ 14 ]。茵陈蒿的主要化学成分滨蒿和茵陈蒿抗肝炎均与Hepatitis B、TNF signaling pathway等通路有关，滨蒿抗肝炎主要通路是Pathways in cancer，其作用机制与AKT1，BCL2，PRKCA，EGFR和IL6等基因有关。茵陈蒿抗肝炎主要通路是Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)，其作用机制与IL6，TNF，RXRA，RELA和AKT1等基因有关。 本研究中，AKT1基因是滨蒿抗肝炎的关键靶点，INS基因是茵陈蒿抗肝炎综合排名较前的的两个基因，IL6是滨蒿和茵陈蒿抗肝炎均具有关键的靶点，这3个基因在滨蒿和茵陈蒿发挥抗肝炎的作用中起着重要作用，AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与多种生物学过程，包括代谢，增殖，细胞存活，生长，胰岛素信号传导和血管生成等，通过一系列下游底物的丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化来介导的 [ 15 ]。有研究发现阻断AKT1能抑制NF-κB的表达水平和肝癌的发展，因此AKT1在肝细胞癌细胞系的增殖和迁移中起重要作用，该研究同时证明抑制AKT1表达可能通过抑制SMMC-7721和Hep G2细胞中的NF-κB通路，从而抑制肝癌细胞的增殖及迁移 [ 16 ]。AKT1基因在滨蒿中参与Pathways in cancer、Hepatitis B、Pancreatic cancer、Prostate cancer和Proteoglycans in cancer通路，这些通路主要与癌症相关，AKT1基因在茵陈蒿中参与了Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)、Inflammatory bowel disease (IBD)、Toxoplasmosis和T cell receptor signaling pathway等通路的调控，这些通路主要与肝病、肠炎等疾病相关。INS又称血清胰岛素，是一种多功能的蛋白质激素，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起着重要的调节作用。INS可增加了细胞对单糖、氨基酸和脂肪酸的渗透性，可加速肝内糖酵解、戊糖磷酸循环和糖原合成。INS由胰腺中胰岛素β细胞分泌，进入血液后被肝脏摄取，而肝炎特别是病毒性肝炎可使INS的分泌减少，从而引起其他疾病如胰腺炎症。ALB白蛋白又称清蛋白，主要由肝实质细胞合成，是血浆中主要的蛋白成分。白蛋白有维持血管内外体液的平衡，组织蛋白的补充修复，血浆中主要的蛋白载体等功能 [ 17 ]。IL-6是具有多种免疫活性的细胞因子，一般是由单核巨噬细胞、内皮细胞产生，病毒性肝炎参与免疫病理反应一般通过IL-6的调控有关，这可能与HBcAg诱导IL-6，最后促使患者产生抗HBc。也可能通过激活T、B等免疫细胞，或使肝细胞白蛋白合成减少，导致免疫系统发生紊乱最终导致病毒性肝炎 [ 18 ]。 通过比较滨蒿和茵陈蒿的作用通路的异同性不难发现，Hepatitis B在滨蒿和茵陈蒿中均有分布，且富集结果显著性较大，这说明滨蒿和茵陈蒿可能对病毒性肝炎都具有抑制作用，乙型肝炎病毒(HBV)是一种包膜病毒，RNA的转录模板中的pregenomic RNA (pgRNA)与病毒聚合酶蛋白相互作用，启动包衣进入核心颗粒。核心颗粒在内质网中完成与包膜蛋白的组装，最终被释放。HBV感染可导致慢性肝炎，然后引发肝硬化最终导致肝癌的发生，这又称为“肝癌三部曲” [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。HBV蛋白靶向宿主蛋白参与多种功能，从而调节转录、细胞信号级联、增殖、分化和凋亡。通过比较滨蒿和茵陈蒿抗肝炎的差异性不难发现，滨蒿的预测结果主要以抗癌症为主，对诸多癌症均有作用通路，其中也包括了肝癌，这说明滨蒿可能对肝硬化和肝癌治疗效果更好，而茵陈蒿预测结果主要以抗炎通路为主，这说明茵陈蒿可能对肝炎治疗效果更好。比较结果发现，滨蒿和茵陈蒿在治疗肝炎时两者是存在差异性的，其分析结果在临床使用上解决了滨蒿和茵陈蒿两者均作为茵陈使用的模糊性。 图11. 滨蒿活性成分潜在靶点在Pathways in cancer信号通路上的标注图 图12. 茵陈蒿活性成分潜在靶点在Pathways in cancer信号通路上的标注图 滨蒿抗肝炎主要通路是Pathways in cancer，其通路包含MAPK (ERK) signaling Pathway、PI3K signaling Pathway、WNT signaling Pathway等通路。根据Keggmapper分析结果，肝癌(Hepatocellular carcinoma Liver cancer)在Pathways in cancer通路中与PI3K signaling、WNT signaling和Calcium signaling有关，其调控主要通过直接或间接PI3K-Akt，最终抑制Sustained angiogenesis、Evading apoptosis和Proliferation的发生，如图11所示。 茵陈蒿抗肝炎主要通路是Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)，其通路包含TNF signaling Pathway、PI3K signaling Pathway、Insulin signaling pathway等通路。根据Keggmapper分析结果，由于IL6和TNF-α通过直接或间接激活Akt，Akt磷酸化抑制GSK-3，从而间接作用Hepatocyte insulin resistance。Hepatocyte insulin resistance激活INS基因，最终导致脂肪酸合成，如图12所示。 本文运用网络药理学挖掘和筛选滨蒿、茵陈蒿的活性成分，并对其作用靶点与机制进行初步的筛选与分析，在对其对应的关键靶点及机制进行分析时，发现滨蒿、茵陈蒿的关键靶点AKT1、INS等及相应的通路与糖尿病机制相关，而据目前研究发现，茵陈的降血糖机制是通过促进外周组织对葡萄糖的利用、提高其对胰岛的敏感性，并抑制葡萄糖的吸收而降低血糖的作用 [ 22 ]。有研究发现以茵陈为主药的茵陈蒿汤可改善湿热困脾型2型糖尿病患者的血脂水平，这又与有相关报道茵陈可用来治疗糖尿病相吻合。滨蒿、茵陈蒿抗肝炎的机制与Pathways in cancer、Measles有关，但滨蒿、茵陈蒿抗肝炎的具体机制还需进一步研究和验证。