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user: 3. 结果与讨论 3.1. MCPA-Na降解菌株的分离纯化及鉴定 经过连续富集与逐级驯化培养，从土壤样品中分离得到了6株细菌菌株，再通过复筛得到对0.1% MCPA-Na具有降解能力的4株菌株，分别标记为KE-01、KE-02、KE-03、KE-04，均能在MCPA-Na含量为0.1%的培养基中生长。 4株菌株的形态特征描述如表1所示，图1~4分别为菌落形态图、革兰氏染色、芽孢染色及电镜扫描的结果(从左到右依次为KE-01、KE-02、KE-03、KE-04)。从图2~4可以看出分离筛选的降解MCPA-Na的菌株均为杆菌。 通过形态观察和生理生化实验(见表2)，可以初步确定菌株属于杆菌属，为了进一步对菌株进行鉴定，利用细菌的的16S rDNA的通用引物进行PCR扩增，得到的扩增产物如图5所示。测序成功后将菌株DNA序列与Genbank细菌基因库中序列进行比对，发现4株菌株KE-01 (Genbank登录号KY274847)、KE-02 (Genbank登录号KY274848)、KE-03 (Genbank登录号KY303833)、KE-04 (Genbank登录号KY274849)与多株芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的相似程度较高，达到100%。根据16SrDNA序列，结合其生理生化性质可确定4株菌株均为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。利用MEGA5.0构建系统进化树结果见图6。 Table 1 Morphological characteristics of strai 特征 KE-01 KE-02 KE-03 KE-04 个体 杆状，有芽孢，革兰氏阳性 杆状，有芽孢，革兰氏阳性 杆状，有芽孢，革兰氏阳性 杆状，有芽孢，革兰氏阳性 菌落 乳白色，不透明，较大，圆形，边缘整齐 乳白色，不透明，小，圆形，边缘不整齐 乳白色，不透明，圆形，边缘规则，表面光滑凸起 乳白色，不透明，较大，表面光滑，边缘规则 表1. 菌株形态特征 图1. 菌落形态 图2. 革兰氏染色(1600×) 图3. 菌株芽孢染色(1600×) 图4. 电镜扫描结果(3000×) 图5. 16S rDNA PCR扩增产物 图6. 菌株系统进化树 Table 2 Physiological and biochemical identification of strain 接触酶 V-P试验 葡萄糖产酸 明胶液化 淀粉水解 硝酸还原 吲哚产生 KE-01 + − + + − − + KE-02 + + + + − − + KE-03 + + + + + + − KE-04 + − + − − − + 表2. 菌株生理生化鉴定 “+”表示阳性，“−”表示阴性。 3.2. 降解菌株的筛选 通过配制不同浓度的MCPA-Na标准溶液，利用紫外分光光度计 [ 14 ] 在特征吸收波长283 nm测定吸光度值，进行3次测量，求得平均值，以MCPA-Na标准溶液为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(如图7)，得拟合方程为y = 0.0035x + 0.0022 (R 2 = 0.9881)。 将菌株接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养48 h，通过对培养前后菌液吸光值与标准曲线的比对得到MCPA-Na浓度，计算4株菌株降解率，如表3所示。对比得到降解能力最强的菌株为KE-04，48 h降解率达到51.54%。MCPA-Na本身呈紫红色，加入培养基后培养基呈现橘红色，经过48 h的培养后，4瓶培养基中橘红色颜色变浅或消失。 通过对菌株KE-04生长曲线的测定，可以确定KE-04降解效率与生长的关系(见图8)。菌株KE-04较快进入对数期，其中在0 h~24 h生长较快，24 h后OD值趋于平缓，说明菌株生长受到限制。而在0 h~40 h，MCPA-Na的降解速率随底物浓度增大而加快，培养40 h后MCPA-Na的降解率为58.54%，40 h后，MCPA-Na降解变化不大，基本趋稳定，这一现象说明菌液浓度不再增加。 3.3. 最优操作条件 相同条件下，KE-04在以4.0%蔗糖为碳源、2.0%酵母浸粉为氮源、加入NaCl提供无机盐的pH为8.0的培养基中，在40℃下180 r/min震荡培养48小时测定到最大降解率，可达到63.84%。再运用响应面法进行进一步优化： 1) Box-Behnken实验 通过Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验确定出了影响降解率的主要因素：碳源(4.0%、4.5%、5%)、氮源(1.0%、1.5%、2.0%、)、无机盐(0.04%、0.05%、0.06%)和pH (7.0、7.5、8.0)，进行四因素三水平的响应面分析实验，29个实验点给出的实验结果如表4。 通过Design Expert 8.0软件对表4中Box-Behnken设计及实验结果进行回归分析，得到分析结果如表5所示。可以得出此模型F = 115.36，P < 0.0001，表明该回归模型的结果是显著的；失拟项P = 0.9098 > 0.05，说明该模型的失拟项是不显著的，因此该模型选择是正确。此外，对其进行可信度分析见表6，回归系数R 2 = 0.9914，调整回归系数 R adj . 2 = 0.9828，预测回归系数 R pred . 2 = 0.9693，说明该模型可以解释99.14%实验操作，表明拟合度比较好。根据回归分析得到该模型的二次回归方程： Y = + 68 . 79 + 0. 17A − 0. 48B + 1 . 46C + 0. 88D − 1 . 83AB − 2 . 44AC + 2 . 77AD + 1 . 19BC             − 1 .0 7BD + 0. 23CD − 9 . 93A 2 − 11 .0 4B 2 − 9 . 51C 2 − 9 . 29D 2 响应面实验3D图与等高线图如图9~14所示，由图可以看出模型的开口向下，实验结果存在最大值。并根据等高线图可判断，最大值落在我们的实验范围以内。 通过以上一系列分析可知，本实验的最优实验操作条件为：蔗糖(碳源)浓度为4.74%，酵母浸粉(氮源)浓度为2.34%，NaCl (无机盐)浓度为0.41%，初始pH为7.8，降解率预测值为69.64%。 图7. MCPA-Na的标准曲线图 图8. KE-04菌株生长与降解率的关系 Table 3 Comparison of degradation rate in 48 KE-01 KE-02 KE-03 KE-04 MCPA-Na质量浓度/(mg/L) 0 h 78.34 69.39 63.42 75.36 48 h 46.10 54.76 41.63 29.89 降解率/% 41.15 21.08 34.36 58.54 表3. 菌株48 h降解率的比较 Table 4 Design and results of Box-Behnken optimization experiment Std 试验号 因子1 A：碳源/% 因子2 B：氮源/% 因子3 C：无机盐/% 因子4 D：pH 反应1 降解率/% 2 1 1 −1 0 0 50.06 23 2 0 −1 0 1 50.55 26 3 0 0 0 0 66.67 13 4 0 −1 −1 0 49.23 24 5 0 1 0 1 47.36 12 6 1 0 0 1 54.45 16 7 0 1 1 0 49.56 5 8 0 0 −1 −1 48.02 17 9 −1 0 −1 0 45.08 19 10 −1 0 1 0 53.96 8 11 0 0 1 1 52.68 6 12 0 0 1 −1 50.79 28 13 0 0 0 0 68.23 14 14 0 1 −1 0 45.64 18 15 1 0 −1 0 49.46 1 16 −1 −1 0 0 46.45 20 17 1 0 1 0 48.58 21 18 0 −1 0 −1 47.26 7 19 0 0 −1 1 48.98 10 20 1 0 0 −1 46.18 11 21 −1 0 0 1 47.35 22 22 0 1 0 −1 48.36 15 23 0 −1 1 0 48.39 25 24 0 0 0 0 68.83 3 25 −1 1 0 0 49.49 4 26 1 1 0 0 45.79 27 27 0 0 0 0 69.89 9 28 −1 0 0 −1 50.16 29 29 0 0 0 0 68.33 表4. Box-Behnken设计及结果 Table 5 ANOVA analysis for regression equatio 试验号 平方和 自由度 平均方差 F P 模型 1766.44 14 126.17 115.36 <0.0001 significant A-碳源 0.34 1 0.34 0.31 0.5841 B-氮源 2.75 1 2.75 2.51 0.1354 C-无机盐 25.67 1 25.67 23.47 0.0003 D-pH 9.36 1 9.36 8.56 0.0111 AB 13.36 1 13.36 12.21 0.0036 AC 23.81 1 23.81 21.77 0.0004 AD 30.69 1 30.69 28.06 0.0001 BC 5.66 1 5.66 5.18 0.0391 BD 4.6 1 4.6 4.21 0.0595 CD 0.22 1 0.22 0.2 0.6634 A 2 639.38 1 639.38 584.59 <0.0001 B 2 790.17 1 790.17 722.45 <0.0001 C 2 586.43 1 586.43 536.18 <0.0001 D 2 559.46 1 559.46 511.51 <0.0001 残差 15.31 14 1.09 失拟项 7.32 10 0.73 0.37 0.9098 not significant 纯误差 7.99 4 2 总和 1781.75 28 表5. 回归方程的方差分析 Table 6 Analysis of reliabilit 平均值 52.34 回归系数R 2 0.9914 调整回归系数 R adj . 2 0.9828 预测回归系数 R pred . 2 0.9693 变异系数/% 2.00 表6. 可信度分析 图9. 碳源、氮源对降解率影响的3D图和等高线图 图10. 碳源、无机盐对降解率影响的3D图和等高线图 图11. 碳源、pH 对降解率影响的3D图和等高线图 图12. 氮源、无机盐对降解率影响的3D图和等高线图 图13. 氮源、pH对降解率影响的3D图和等高线图 图14. 无机盐、pH对降解率影响的3D和等高线图 由以上操作确定的条件：蔗糖5.0%、酵母浸粉2.0%、NaCl 0.41%，初始pH 7.8，其他条件不变，重新配置培养基，设置3次重复实验，测得降解率分别为69.32%、69.74%、69.61%，平均值为69.56%，比优化前的61.26%提高了13.55%，说明此次优化获得的条件对降解率的提高是有效的。