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user: 2. 实验部分 2.1. 实验材料 2.1.1. 实验药品 EP低分子肝素分子量对照品(Heparin Low-Molecular-Mass for Calibration CRS，EP对照品。数均分子量Mna = 3800)从欧洲药监局购买，批号为batch 3。 WHO低分子肝素分子量对照品(Low Molecular Weight Heparin for Molecular Weight Calibration，WHO对照品)从英国国家生物制品检定所购买，批号为05/112。 依诺肝素钠CRS (Enoxaparin Sodium CRS，重均分子量标示量为4480 Da)从欧洲药监局购买，批号为batch 5。 依诺肝素钠注射液(克赛 ® )购自赛诺菲安万特公司，批号为4SC98、5SA66、5SL48。 依诺肝素钠原料药为国内某公司生产，批号为150402、150403。 依诺肝素钠注射液为国内某公司生产，批号为160202、160203。 2.1.2. 仪器与试剂 岛津高效液相色谱仪20 A (紫外检测器、示差检测器、ALS自动进样器、二元泵)，MS205DU型电子分析天平(METTLER TOLEDO)。 D-(+)-葡萄糖为优级纯(百灵威科技)；葡聚糖2000为优级纯(上海迈瑞尔化学技术有限公司)；硫酸、硫酸钠、醋酸铵为分析纯(西陇化工股份有限公司)；水为娃哈哈纯净水。 2.2. 实验方法 2.2.1. 硫酸钠体系 1) 色谱条件：色谱柱：TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm)；柱温：30℃；紫外检测器和示差检测器联用，紫外检测波长：234 nm，示差检测器温度：35℃；流速：0.5 mL·min −1 ；进样量：25 μL；流动相：0.2 mol·L −1 硫酸钠水溶液(硫酸调pH值5.0)。 2) 溶液的制备：供试品溶液的制备分别取依诺肝素钠CRS、依诺肝素钠注射液(克赛)、依诺肝素钠(自制)、依诺肝素钠注射液(自制)适量，分别加硫酸钠流动相溶解并稀释成每1 mL中约含依诺肝素钠10 mg的溶液，分别作为供试品溶液1。 系统适用性溶液的制备分别精密称取葡聚糖2000和葡萄糖各约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解，作为系统适用性溶液1。 EP对照品溶液的制备精密称取EP对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解，作为EP对照品溶液1。 WHO对照品溶液的制备精密称取WHO对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解，作为WHO对照品溶液1。 3) 实验过程： 专属性和系统适用性试验 分别取空白溶剂(0.2 mol·L −1 硫酸钠水溶液)、“1.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液1、系统适用性溶液1、EP对照品溶液1、WHO对照品溶液1各25 μL，注入液相色谱仪。空白溶剂不干扰本品出峰；系统适用性溶液1示差色谱图中理论板数按葡萄糖峰计算为21379，葡萄糖峰和葡聚糖2000峰分离度为8.80；依诺肝素钠CRS、EP对照品和WHO对照品示差色谱图中主峰保留时间在葡萄糖(保留时间为22.196 min)和葡聚糖2000 (保留时间为12.035 min)的保留时间之间。色谱图见图1。 图1. 硫酸钠体系专属性和系统适用性试验色谱图1 样品测定精密量取“2.2.1”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液1、EP对照品溶液1、WHO对照品溶液1各25 μL，注入液相色谱仪，记录紫外和示差色谱图。根据EP对照品(Mna = 3800)，采用手工取18个点，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；根据WHO对照品宽分布标样表，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；EP对照品和WHO对照品的校正曲线表见表1，样品测定结果见表2。 Table 1 Reference calibration curve of sodium sulfate syste 选点个数 WHO对照品 EP对照品 保留时间(min) 分子量 保留时间(min) 分子量 1 13.421 18，000 13.808 14，314 2 13.713 15，600 14.217 12，801 3 14.063 13，600 14.617 11，069 4 14.404 12，000 15.008 9859 5 15.079 9600 15.400 8943 6 15.529 8400 15.775 7841 7 16.063 7200 16.133 7007 8 16.354 6600 16.343 6661 9 16.671 6000 16.628 6071 10 17.012 5400 16.961 5559 11 17.363 4800 17.437 4841 12 17.746 4200 17.726 4128 13 18.154 3600 18.240 3482 14 18.588 3000 18.605 3053 15 19.063 2400 19.101 2421 16 19.604 1800 19.664 1860 17 20.271 1200 20.298 1247 18 21.246 600 21.254 583 校正曲线 logM = −0.00275648T 3 + 0.1320164T 2 − 2.238323T + 17.17206 logM = − 0.002832371T 3 + 0.1349939T 2 − 2.269252T + 17.21699 相关系数R 0.99995 0.99978 离差 0.0038896 0.0074436 表1. 硫酸钠体系对照品校正曲线 Table 2 Determination results of samples by sodium sulfate syste EP对照品计算结果 WHO对照品计算结果 差值 批号 重均分 子量(Da) 小于 2000 Da (%) 2000 Da~ 8000 Da (%) 重均分子量(Da) 小于 2000 Da (%) 2000 Da ~8000 Da (%) 重均分子量(Da) 小于2000 Da (%) 2000 Da~ 8000 Da (%) 依诺肝素钠CRS 4447 16.58 74.04 4393 16.52 73.75 54 0.06 0.29 5SL48 4265 17.55 74.46 4221 17.37 74.34 44 0.18 0.12 5SA66 4263 17.57 74.43 4220 17.29 74.44 43 0.28 0.01 4SC98 4277 17.33 74.59 4233 17.35 74.23 44 0.02 0.36 160202 4271 17.94 73.75 4220 17.82 73.62 51 0.12 0.13 160203 4347 17.99 73.02 4299 17.49 73.3 48 0.50 0.28 150402 4272 18.22 73.39 4228 17.66 73.76 44 0.56 0.37 150403 4327 17.54 73.78 4279 17.74 73.17 48 0.20 0.61 表2. 硫酸钠体系样品测定结果 2.2.2. 醋酸铵体系 1) 色谱条件：色谱柱：TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm)；柱温：30℃；紫外检测器和示差检测器联用，紫外检测波长：234 nm，示差检测器温度：35℃；流速：0.5 mL·min −1 ；进样量：25 μL；流动相：0.1 mol·L −1 醋酸铵水溶液。 2) 溶液的制备: 供试品溶液的制备供试品溶液的制备分别取依诺肝素钠CRS、依诺肝素钠注射液(克赛)、依诺肝素钠(自制)、依诺肝素钠注射液(自制)适量，分别加醋酸铵流动相溶解并稀释成每1 mL中约含依诺肝素钠10 mg的溶液，分别作为供试品溶液2。 系统适用性溶液的制备分别精密称取葡聚糖2000和葡萄糖各约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解，作为系统适用性溶液2。 EP对照品溶液的制备精密称取EP对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解，作为EP对照品溶液2。 WHO对照品溶液的制备精密称取WHO对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解，作为WHO对照品溶液2。 3) 实验过程： 专属性和系统适用性试验 分别取空白溶剂(0.1 mol·L −1 醋酸铵水溶液)、“2.2.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液2、系统适用性溶液2、EP对照品溶液2、WHO对照品溶液2各25 μL，注入液相色谱仪。空白溶剂不干扰本品出峰；系统适用性溶液2示差色谱图中理论板数按葡萄糖峰计算为22077，葡萄糖峰和葡聚糖2000峰分离度为9.22；依诺肝素钠CRS、EP对照品和WHO对照品示差色谱图中主峰保留时间在葡萄糖(保留时间为22.200 min)和葡聚糖2000 (保留时间为11.964 min)的保留时间之间。色谱图见图2。 图2. 醋酸铵体系专属性和系统适用性试验色谱图2 样品测定精密量取“2.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液2、EP对照品溶液2、WHO对照品溶液2各25 μL，注入液相色谱仪，记录紫外和示差色谱图。根据EP对照品(Mna = 3800)，采用手工取18个点，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；根据WHO对照品宽分布标样表，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；EP对照品和WHO对照品的校正曲线表见表3，样品测定结果见表4。 Table 3 Reference calibration curve of ammonium acetate syste 选点个数 WHO对照品 EP对照品 保留时间(min) 分子量 保留时间(min) 分子量 1 12.571 18，000 12.605 16，285 2 12.779 15，600 12.842 14，480 3 13.046 13，600 13.208 12，509 4 13.304 12，000 13.600 10，634 5 13.829 9600 13.950 9407 6 14.139 8400 14.300 8020 7 14.629 7200 14.503 7533 8 14.888 6600 14.742 6956 9 15.154 6000 15.010 6228 10 15.454 5400 15.311 5502 11 15.771 4800 15.642 4811 12 16.121 4200 16.012 4209 13 16.496 3600 16.413 3403 14 16.913 3000 16.851 2912 15 17.371 2400 17.345 2409 16 17.938 1800 17.934 1906 17 18.663 1200 18.614 1185 18 19.821 600 19.749 584 校正曲线 logM = −0.002409928T 3 + 0.1095525T 2 − 1.823136T + 14.62927 logM = −0.002151357T 3 + 0.09614305T 2 − 1.59638T + 13.36678 相关系数R 0.99964 0.99964 离差 0.0103785 0.0100719 表3. 醋酸铵体系校正曲线 Table 4 Determination results of samples by ammonium acetate syste EP对照品计算结果 WHO对照品计算结果 差值 批号 重均分子量(Da) 小于 2000 Da (%) 2000 Da ~8000 Da (%) 重均分子量(Da) 小于 2000 Da (%) 2000 Da ~8000 Da (%) 重均分子量(Da) 小于 2000 Da (%) 2000 Da ~8000 Da (%) 依诺肝素钠CRS 4388 16.24 73.97 4381 16.17 73.78 7 0.07 0.19 5SL48 4242 17.54 73.75 4236 16.77 74.38 6 0.77 0.63 5SA66 4224 17.55 73.91 4252 16.95 74.02 28 0.60 0.11 4SC98 4236 17.32 74.10 4252 16.93 74.02 16 0.39 0.08 160202 4265 17.50 73.46 4259 17.20 73.55 6 0.30 0.09 160203 4294 17.48 73.19 4294 17.15 73.27 0 0.33 0.08 150402 4245 17.61 73.50 4250 17.42 73.36 5 0.19 0.14 150403 4294 17.55 73.11 4289 17.22 73.25 5 0.33 0.14 表4. 醋酸铵体系样品测定结果