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user: 2. 材料与方法 2.1. 仪器和试剂 橄榄粉(云南文山一缘药业)，DPPH(西亚试剂)，福林酚(广东光华科技股份有限公司)(阿拉丁)，真空冷冻干燥机(上海比朗仪器制造有限公司)，UV-1100紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，TENSOR27傅立叶变换红外光谱(德国布鲁克公司)等。 2.2. 实验方法 2.2.1. 实验步骤 1) 用电子天平称取3 g橄榄干粉于250 mL锥形瓶中，加入指定乙醇浓度与固液比的乙醇溶液，混合均匀后将其放置于常温下的单槽式超声波清洗机(功率300 W)中，进行超声协同提取。提取一段时间后，通过纱布过滤后，将溶液离心后除去沉淀即初提取液。 2) 取1 mL初提取液稀释并定容到50 mL容量瓶，剩余提取液样品放置于冰箱保存待用。取1 mL样品于50 mL容量瓶中，滴加1.5 mL福林酚和10 mL去离子水，于避光处放置5 min后，加入6 mL的10%碳酸钠溶液，静置60 min反应过，在765 nm波长下测定吸光度，以焦性没食子酸为标量计算提取液中的多酚含量。 3) 将储存待用的提取液装入500 mL四口烧瓶中，通过水浴加热蒸出残留在提取液中的乙醇，得到脱醇溶液，装盘后放入冷冻箱结冰，次日放入冷冻干燥机进行脱水处理，得到橄榄多酚干粉。 4) 将干粉溶解于溶液中，稀释处理后，进行DPPH自由基消除能力、羟基自由基消除能力等抗氧化功能的测定。 2.2.2. 没食子酸标准曲线 1) 用电子天平准确称取焦性没食子酸0.0507 g，用蒸馏水溶解，定容至100 mL容量瓶备用，作为没食子酸标准液。 2) 用天平量取10 g无水碳酸钠固体，加入60 mL蒸馏水溶解，将碳酸钠溶液转移到容量瓶，用少量蒸馏水分别清洗烧杯三次，残液转移至容量瓶，定容，得到10% Na 2 CO 3 溶液。 3) 吸取3.0 mL、6.0 mL、9.0 mL、12.0 mL、15.0 mL没食子酸标准液分别定容于50 mL容量瓶内。然后从没食子酸系列梯度溶液中吸取1.0 mL溶液加入25 mL容量瓶中，加入10 mL蒸馏水摇匀，用移液管移取1.50 mL福林酚试剂，摇匀后放置在黑暗处，5 min后加入6 mL 10% Na 2 CO 3 溶液摇匀，然后在室温下避光放置反应60 min，以蒸馏水作参比，在波长765 nm处测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线 [ 11 ] 。 2.2.3. 单因素实验 1) 超声时间对橄榄多酚提取率的影响 取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中，加入65%乙醇100 mL (65 mL乙醇 + 35 mL蒸馏水)，在50℃的超声水浴中加热30 min、40 min、50 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。 2) 提取温度对橄榄多酚提取率的影响 取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中，加入65%乙醇100 Ml (65 mL乙醇 + 35 mL蒸馏水)，分别在40℃50℃、60℃、70℃下反应40 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。 3) 乙醇浓度对橄榄多酚提取率的影响 取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中，分别加入35%、45%、55%、65%乙醇100 mL。分别在50℃下反应40 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。 4) 料液比对橄榄多酚提取率的影响 取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中，分别加入65%的45 mL、60 mL、75 mL、90 mL的乙醇，分别在50℃下反应40 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。 2.2.4. 二次正交旋转组合实验 由以上四个单因素实验可知，该四个因素均对提取率有较大影响，分别为：超声时间、温度、乙醇浓度、料液比，其中超声虽然随着时间增加产率仅有少量提升，出于实际生产效率仍选择40 min为中间水平。二次正交旋转组合实验设计分别使用−2，−1，0，1，2表示每个因素的5个水平，如表1。以橄榄多酚的提取率为目标，运用数据处理软件SAS得出，整个实验有36组，设计如表2，以优化橄榄多酚提取的最佳工艺条件 [ 12 ] 。 2.2.5. 用红外吸收光谱鉴定提取物成分 将冷冻干燥获得的橄榄多酚提取物干粉加入溴化钾研磨均匀成粉，取适量样品进行压片，得到薄膜片放入样品架在4000~400波数进行红外吸收光谱测量。 2.2.6. 橄榄多酚对DPPH消除率的测定 1) 1 m mol∙L −1 DPPH溶液的制备 用分析天平准确量取19.716 mg的DPPH固体定容于50 mL棕色瓶中，定容可得到1 m mol∙L − 1 的DPPH溶液。使用时需稀释10倍使用。 2) 橄榄提取物系列浓度梯度溶液制备 取0.25 g橄榄多酚提取物用无水乙醇定容于100 mL容量瓶，得到2.5 mg∙mL − 1 原液①。从原液①中量取2 mL橄榄溶液定容于50 mL容量瓶，得到0.1 mg∙mL − 1 溶液②。从溶液②中取10 mL溶液定容于50 mL容量瓶，得到0.02 mg∙mL − 1 溶液③。从溶液②中取5 mL定容于50 mL容量瓶中，得到0.01 mg∙mL − 1 溶液④。从溶液②中取2.5 mL定容于50 mL容量瓶中，得到0.005 mg∙mL − 1 溶液⑤。从溶液②中取0.5 mL定容于50 mL容量瓶中，得到0.001 mg∙mL − 1 溶液⑥。以上制备得到0.1 mg∙mL − 1 、0.02 mg∙mL − 1 、0.01 mg∙mL − 1 、0.005 mg∙mL − 1 、0.001 mg∙mL − 1 系列浓度梯度溶液。 Table 1 Combination experiment design of quadratic regression orthogona 水平 因素 超声时间/min 温度/℃ 乙醇浓度/% 料液比 −2 30 40 45 1:20 −1 35 45 50 1:25 0 40 50 55 1:30 1 45 55 60 1:35 2 50 60 65 1:40 表1. 二次正交旋转组合实验设计表 3) 橄榄多酚对DPPH清除率的测定 分别用移液管移取0.1 mg∙mL − 1 、0.02 mg∙mL − 1 、0.01 mg∙mL − 1 、0.005 mg∙mL − 1 、0.001 mg∙mL − 1 的橄榄多酚溶液2.0 mL至试管中，分别加入2.0 mL乙醇和2.0 mL 0.1 m mol∙L − 1 的DPPH溶液，另外取一直空试管加入2 mL蒸馏水和2 mL 0.1 mmol∙L − 1 的DPPH溶液，作为空白样使用。将这一系列试管摇晃均匀后放置于黑暗处静置30 min，在波长517 nm处测定吸光度。用Vc作为参照，计算DPPH清除率。 DPPH 清 除 率 = [ 1 − ( A x − A y ) / A 0 ] × 100 % (1) 其中，A x 为加入样品和DPPH溶液反应后的吸光度；A y 为加入样品和等体积乙醇溶液的吸光度；A 0 为空白对照样的吸光度。 4) Vc、BHA对DPPH清除率的测定 分别制备Vc、BHA系列浓度梯度溶液，得到0.1 mg∙mL − 1 、0.02 mg∙mL − 1 、0.01 mg∙mL − 1 、0.005 mg∙mL − 1 、0.001 mg∙mL − 1 的Vc溶液和BHA溶液。分别移取各样品溶液2.0 mL至试管中，分别加入2.0 mL乙醇和2.0 mL 0.1 m mol∙L − 1 的DPPH溶液，另外取一直空试管加入2 mL蒸馏水和2 mL 0.1 m mol∙L − 1 的DPPH溶液，作为空白样使用。将这一系列试管摇晃均匀后放置于黑暗处静置30 min，在波长517 nm处测定吸光度 [ 13 ] 。 2.2.7. 二次回归正交旋转组合设计实验 二次回归正交旋转组合设计实验用spss软件进行方差分析和显著性检测进行分析后，再用sas软件拟合二次回归正交优化方程，最后matlab软件对提取因素间的交互作用进行分析。