DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 4. 问卷调查设计与分析 本研究在借鉴前人研究成果的基础上，应用德尔菲专家调查法，采用李克特七级量表编制形成“兰州大学英语专业混合式教学效果调查问卷”，该调查问卷用于探究教学效果影响因素之间的相互关系，共有7个模块35个道题目组成。问卷大致可以分为三部分，第一部分为参与者的基本数据，记录了参与者的基本信息(例如年级、性别、联系方式等)；第二部分收集参与者对分析模型中每个变量的评价(见表7)，通过从1 (非常不满意)到7 (非常满意) 7分制测量。第三部分采取多选、排序以及开放式问答的形式，收集参与者对于混合式教学的具体看法。2021年4月，研究者向兰州大学外国语学院2019级74名学生和2020级77名学生发放了网络问卷和纸质问卷，最终共回收反馈问卷127份，数据清洗后得到完整的有效问卷121份，有效率约为95.28%。 表7中学生对四大影响因素的打分情况由高到低依次是：教师 > 环境 > 平台 > 学生。教师方面，“信息技术应用能力”(5.376)和“教学创新能力”(5.335)相较教师因素中的其他题项分数最低，但在所有题项中分数偏高。这意味着教师的教学综合素质能够在很大程度上满足学生的学习需求，也一定程度上说明“信息技术应用能力”和“教学创新能力”存在相关性；学生方面，学生对自身评价的得分明显低于其他影响因素的得分。这说明一方面学生对混合式教学中应用的信息技术操作熟练。但另一方面，这显现出学习者无论是自身的基础知识、自学能力、学习投入及学习态度，都没有在混合式教学中展现出高水平，说明学生目前尚未能充分利用混合式教学的优势；平台方面，“功能完善程度”(4.631)的分数明显低于其他题项，说明平台的基础功能不能较好地满足英语学习者的基本需求；环境方面，网络环境的安全性和稳定性分数稍低(5.013)，总体评分较高且差异不大，说明学习环境良好。就教学效果而言，“学生总体评价”得分(5.809)和“学生满意度”得分(5.757)明显高于“学习兴趣及积极性”得分(4.767)与“学习获得感与满足感”得分(4.699)，表明学生虽然对混合式教学持积极态度，但并未及时转化为实际的学习成效。在数据整理的过程中，研究者发现两个年级各个影响的打分情况非常相似，表明学生对于影响教学效果的主观因素和客观因素评价基本一致。 Table 7 Students’ scores on evaluation conten 影响因素 评价内容 平均分 总平均分 教师因素 A1专业知识水平 5.695 5.559 A2信息技术应用能力 5.376 A3教学创新能力 5.335 A4教学态度 5.874 A5教学能力 5.514 学生因素 B1基础知识掌握情况 4.704 4.635 B2自主学习能力 4.439 B3学习投入 4.697 B4学习态度 4.699 平台因素 C1性能稳定性 5.060 5.004 C2功能完善程度 4.631 C3操作难易程度 5.229 C4资源配置 5.097 环境因素 D1整体学习氛围 5.356 5.320 D2学习设备充足且便利 5.537 D2物理学习环境及设施条件 5.372 D4网络环境的安全性和稳定性 5.013 教学效果 E1学习兴趣及积极性 4.767 5.258 E2学习获得感与成就感 4.699 E3学生总体评价 5.809 E4学生满意度 5.757 表7. 学生对影响因素中各题项的评分 Table 8 Students’ assessment of consent to blended teachin 题项 2019级 学生同意率 2020级 学生同意率 平均 同意率 支持多元化教学 72.73% 81.97% 77.35% 提供大量课内外学习资源和途径 42.42% 80.33% 61.38% 互补单一在线学习和传统课堂学习的缺陷 57.58% 78.69% 68.13% 符合当下师生的教与学的习惯 54.55% 73.77% 64.16% 提升学生自主学习和探索能力 56.06% 65.57% 60.82% 提高教师和学生“教与学”的参与度 45.45% 67.21% 56.33% 教学评价更加合理和真实 27.27% 47.54% 37.41% 对学习能力要求高 33.33% 34.43% 33.88% 线上教学平台的功能不完善 51.52% 47.54% 49.53% 教学设计中平台的功能没有得到充分发挥 43.94% 49.18% 46.56% 充分发挥教师的引导作用 33.33% 55.74% 44.54% 学习负担重 43.94% 40.98% 42.46% 学习效率低 37.88% 44.26% 41.07% 不能调动学生积极性 37.88% 36.07% 36.97% 教师不能很好地利用平台优势 34.85% 39.34% 37.10% 表8. 学生对混合式教学相关表述的同意度 以上为学生对于混合式教学的具体评价(见表8)。2019级学生和2020级学生均对混合式教学效果表示肯定，但是2019级学生对各个正向表述的同意率明显低于2020级。在平均同意率高于50%的部分，两个年级的学生针对“提供大量课内外学习资源和途径”的同意率差异最大(2019级同意率为42.42%，2020级同意率为80.33%，相差39.71%)。在平均同意率低于50%的部分，分别仅有27.27%和33.33%的2019级学生认为“教学评价更加合理和真实”和“充分发挥教师的引导作用”。而对于这两项，2020级学生同意率比2019级学生同意率高出约20%。 在对混合式教学各因素打分基本一致的情况下，两个年级学生在混合式教学相关表述中产生明显的分歧，主要原因如下：2020级学生的绝大部分课程在课前、课中、课后三个阶段均采用混合式教学模式，而2019级学生的混合式教学设计主要针对课后阶段，即2019级混合式教学覆盖范围远小于2020级。由此可见，在一定程度上，混合式教学使用范围越广泛，学习资源、教学评价真实性和教师引导发挥的优势越明显，而且该模式可以有效顺应师生教学习惯、弥补单一课程形式的不足，有利于提升师生参与度。
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user: 5. 师生访谈分析 根据问卷调查结果，研究者在两个年级中每班随机抽取4学生参加访谈，共邀请两个年级共32名学生。此外，邀请11位兰州大学外国语学院教师接受采访。 师生访谈主要内容如图所示(见图3)。约81.82%的教师在访谈中表示，虽然混合式教学的优势明显，但是疫情常态化后该教学模式才得以普遍应用，部分教师尚未摸索出适宜相关课程的混合教学比例，更加倾向于大量的线下教学活动。约63.64%的教师表示，尽管线上教学能够减少教师教授重复性内容，但是由于部分课程课时紧张、课程内容多，混合式教学要求需要教师具备高效的工作能力和大量的前期准备，对教师的信息技术应用能力要求很高，具有一定的操作难度，鲜有教师深入应用混合式教学。其次，约90.91%教师提出教学平台尚有很大的优化提升空间。平台出现的操作繁琐、部分答题形式不全面、批改功能灵活度低等问题，大大降低了教师的使用概率。最后，所有教师根据学生的实际学习情况指出，教学的目的在于应用信息和技术提高教学效果，而不是应用信息和技术本身。相较于教学形式，学生的自主学习能力是影响教学效果的重要因素，甚至是决定性因素。研究者发现，教师对于混合式教学的理论认知水平较高，但是在实际操作中未能积极地利用混合式教学，主要原因在于教师信息技术应用能力有待提高、教学平台的可操作性、功能完善度低，且不能针对性地满足语言教学的需求。 图3. 师生访谈主要内容汇总 90%以上学生在访谈中表示，对于基础英语、语言学导论、英语国家概况等基础知识类课程，面授教学能够更好地营造语言氛围、传达文化内涵。混合式教学相较于传统的课堂教学，提供了集中课程资源的教学平台，便于学生反复学习教学内容。87.5%的学生认为该类课程线上线下的比例设置为3:5最为适宜。而对于文化与翻译、英语口语、英语视听说等技能实践类课程，学生认为不能仅仅依靠教师的课堂讲授和多样的教学形式，更需要学习者通过大量的针对性练习提高专业水平，即自身的学习态度和学习投入占主导地位。71.875%的学生认为线上线下的比例为1:1最为适宜。另外，学生表示在使用电子设备时，自控能力和注意力集中程度需要维持在较高的水平，否则可能会受到其他信息干扰，而仅有53.125%的学生认为自己符合该条件，并有93.75%的学生希望教学平台设置“学习模式”功能以减少其他干扰。最后，81.25%学生认为教师虽然具有高水平的专业素养和教学能力，但是部分教师的创新意识趋于保守，未能将课程特点与教学平台的优势深入结合，进而设计合理的教学形式。教师的授课形式在一定程度上影响学生的参与度和获得感。 访谈结果说明教师、学生、平台三者联系紧密。教学平台的可操作性直接影响到教师对混合式教学的利用程度，教师的课程设计直接作用于学生，学生对于教学平台的反馈很大程度上受教师课程设计的影响。因此，为提高混合式教学效果，平台方面应当实现操作门槛低、灵活度高的要求，为教学设计提供便利。教师应当在保证完成课程任务的基础上，着重提高教学创新能力，利用教学平台设计有效的教学活动。学生应当着重提升自主学习能力，在学习专注度和学习效率方面实现突破。
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user: 6. 结论与建议 本研究中共有五项假设得到证实：“教师因素”和“学生因素”对“教学效果”有显著的直接正向影响(H1和H2)，“平台因素”对“教学效果”有显著的间接正向影响(H3)；“教师因素”对“学生因素”有显著的直接正向影响(H5)；“平台因素”对“学生因素”和“教师因素”(H6和H8)有显著的直接正向影响。相反，“环境因素”对教师、学生、平台及教学效果的影响不显著。 结合混合式教学效果影响因素模型、问卷及访谈结果，笔者提出以下建议：1) 学生自身的学习态度、投入、能力对教学效果起着关键作用。作为教学内容的输入和输出方，学习者应当进一步加深对专业学习重要性的认识，充分认识自身因素对教学效果的决定性作用，加强与教师的沟通，深入对教学平台的利用，努力适应混合式教学模式；再者，学生应当基于现有的基础知识水平自主探索出适宜的学习方法，充分利用网络资源拓宽学习途径，加大对语言学习的投入。2) 教师应当注重对创新意识和创新能力的培养和提升。教师不仅直接影响学生，还通过教学平台间接影响学生。问卷结果显示教师信息技术应用能力和教学平台技术支持联系紧密，混合式教学利用率与学生对于教学效果的评价同向变化。教师应当主动克服新型教学模式中的技术困难，探索和应用深层次的混合式教学，努力实现工作效率和教学效果最优化。此外，为减轻教师教学负担，使之投入更多精力用于课程设计，学校应当给予一定的政策支持并为教师提供专业的混合式教学指导，展示校内外基于混合式教学的高质量课程，促进教师实践体验交流和协同合作。3) 混合式教学强调教育和技术的深度融合，教学平台的完善和发展要始终立足于师生的实际教学需求。信息技术提供方应当深入开展市场调研，打造操作便捷、专业针对性强、功能完备的教学平台，提供专业技术指导协助教师革新教学模式，阶段性地收集师生反馈并及时完善系统，进而提高教师和学生的课程体验。4) “环境因素”对“学生因素”和“教学效果”没有显著的作用效果。但是，良好的学习环境应当是师生投入教学的基础，学校需要尽可能地为师生提供适宜的教学环境。 综上所述，教师和学生是“教”与“学”过程的直接参与者，教学平台起到媒介作用，三者组成混合式教学的三大要素。作为语言学习者，学生应当利用好互联网与信息技术深度融合的优势，横向扩宽知识广度，纵向挖掘语言学习深度。教师的部分教学目的通过教学平台实现，教学成果由学生展现。教师应当顺应时代潮流，革新教学方法，根据课程特点和要求适当分配线上线下教学比例，广泛、深入地开展混合式教学。教学平台的设计应当遵循为教师和学生服务的原则，提供智能化、个性化、精准化的服务。因此，增强混合式教学的教学效果需要教师、学生、平台三方高度、有效地整合。
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user: 摘要 直接乙醇燃料电池(DEFCs)由于乙醇(C 2 H 5 OH)能量密度高、燃料来源广泛且价格便宜等优点，已经成为未来新能源电动汽车和便携式电源等的最佳选择之一。铂(Pt)基纳米材料是DEFCs阳极催化反应中应用最广泛的催化剂之一，但活性低、储量少等问题阻碍了其商业化应用。因此，开发非Pt基电催化剂对于DEFCs的发展起着至关重要的作用。近年来，钯(Pd)基纳米催化剂因具有与Pt相近的电子结构和晶体结构，在乙醇氧化反应(EOR)中备受关注。本文主要介绍Pd基纳米材料液相可控制备的研究进展，并基于材料的结构、形貌和组分探究其对催化乙醇氧化机制的影响。
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user: 1. 引言 随着国民经济的快速发展，能源消耗日益加剧、环境污染问题日趋严重。如何开发清洁可再生能源以及发展高效的能源转换装置成为当今科学发展的重大挑战。在高效的能源转换装置中，燃料电池(DEFCs)是将乙醇的化学能直接转换成电能的能量转化装置。在众多燃料电池中，直接乙醇燃料电池由于乙醇具有能量密度高、毒性低、可再生、成本低等优势，成为未来新能源电动汽车的主要动力源之一 [ 1 ] - [ 6 ]。目前，铂(Pt)由于其优异的物理化学特性，使得其成为最佳的燃料电池阳极电催化剂之一。然而，Pt的全球储量稀少使得催化剂成本大幅提升，因而限制了Pt在直接乙醇燃料电池中的商业化发展 [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]。此外，Pt和一氧化碳(CO)之间存在着较强的结合力，极易受到CO的吸附而占据其催化位点，从而导致电催化剂失活。近年来，钯(Pd)由于与Pt具有类似的晶型结构，原子半径以及稳定的物理化学特性，使得它在乙醇氧化(EOR)领域备受关注 [ 11 ]。 对于Pd基纳米催化剂而言，尽管之前的研究报道该类材料在催化EOR的活性和稳定性上取得较大进展，仍然有两个主要因素限制了它们的实际应用：1) 相对低的EOR活性和较差的稳定性；2) 由于EOR中间体CO易吸附在其表面，从而占据Pd表面的活性位点，导致催化剂表面毒化，使得Pd催化剂失去催化活性。为了提高EOR活性，一方面可以增加Pd催化剂的活性位点数量或者其活性表面积，有效地增加乙醇氧化反应速率。另一方面，通过合金化Pd来提高EOR活性，即将Pd与其他金属相结合，通过改善Pd的电子结构，优化反应物和中间体与其表面活性位点的结合强度，从而提高Pd催化EOR的活性。除此之外，一种较有效的方法是将Pd纳米材料与另一种有助于有效去除CO或者其他有毒中间体的材料混合。在这些复合材料的体系中，Pd与其他金属氧化物或者氢氧化物的协同作用会削弱乙醇氧化产生的中毒物种对其表面活性位点的结合强度，进而改善Pd催化EOR活性和稳定性。本文基于材料的结构、形貌和组分等方面，介绍了Pd基纳米材料可控制备及其催化乙醇氧化的研究进展，并对其未来的研究方向进行展望。
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user: 2. 碳载Pd基纳米材料 为了支撑催化材料，同时提高贵金属Pd的利用率和电催化性能，需要引入支撑载体。碳材料由于其导电性好，拥有较好的稳定性和较高的比表面积，成为目前应用最广泛的催化剂载体之一 [ 12 ]。但是传统的碳载体表面含有大量缺陷和不饱和键，在EOR过程中容易被氧化，从而导致其负载在上面的贵金属纳米粒子容易团聚迁移，进而降低催化剂的催化性能。为了解决这一问题，研究人员制备了具有新型纳米结构的高度石墨化碳，包括碳纳米管(CNTs)，纳米碳纤维(CNFs)和碳纳米卷(CNCs)等 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]。通过提高碳载体的石墨化程度，增强Pd纳米材料与C之间的相互作用力，从而提高催化剂的催化活性和稳定性 [ 16 ]。 例如，Zhang等研究者利用氧化镁作为模板，制备出了空心石墨碳纳米笼(CN)。以空心石墨碳纳米笼作为载体，将Pd纳米颗粒负载其上，形成了具有空心框架结构碳基载体的Pd基复合材料(见图1) [ 17 ]。电化学测试实验结果表明，由于介孔中空结构的较大比表面积，Pd NPs的均匀分散性以及其本身优异的导电性等特点，制备出来的碳基载体Pd复合材料(Pd/CN)与Pd/RGO以及Pd/C催化剂相比，Pd/CN催化剂在碱性溶液中对EOR的电流密度可达2411.5 mA·mg −1 ，表现出较高的电催化活性。除此之外，为了进一步提高催化剂的催化活性和稳定性，研究人员通过掺杂氮(N)、硼(P)等元素 [ 18 ] [ 19 ]，以及二氧化钛、二氧化硅等 [ 20 ] [ 21 ] 化合物修饰碳载体，改变碳的表面电子状态。典型的碳载体是改性将富电子的氮原子与材料结合，可以促进π结合能力，进而提高催化活性 [ 22 ]。 图1. Pd/CN的(a)合成示意图和(b)扫描电镜图；(c) Pd/CN，Pd/RGO和Pd/C在1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH中的循环伏安曲线图 [ 17 ] 在掺杂其他元素或者化合物修饰碳载体方面，Yao等人采用喷雾干燥法制备了一种新型的氧化石墨烯(GO)包覆咪唑基沸石骨架-8 (ZIF-8)微球，并将其煅烧得到空心氮掺杂石墨烯微球(ZGC) (见图2) [ 23 ]。ZGC可作为Pd纳米颗粒的支撑材料，用于乙醇氧化反应(EOR)。与其他材料相比，这种新型ZGC前驱体具有一些优势：1) 三维中空结构中含有高度有序的纳米孔结构，氮掺杂结构为载体催化剂提供了更多的活性位点，为催化反应提供了更多的空间；2) 独特的三维结构可以避免催化剂的聚集和失活；3) 石墨烯和纳米碳的纳米结构转化为微球结构提供了易于操作的过程。优化后的ZGC具有较高的有序分级孔结构，且Pd/ZGC电催化剂的电催化活性(2490 mA·mg −1 )高于Pd/ZIF (1494 mA·mg −1 )、Pd/rGO (1232 mA·mg −1 )和Pd/C (467 mA·mg −1 )。基于以上分析，Pd/ZGC具有优异的电催化性能可归因于其独特的结构，在直接乙醇燃料电池(DEFCs)中具有广阔的应用前景。 图2. (a) Pd/ZGC的合成示意图；(b) Pd/ZGC，Pd/ZIF，Pd/rGO和Pd/C在1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH中的循环伏安曲线图 [ 23 ]
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user: 3. Pd基合金纳米材料 采用其他金属元素合金化Pd纳米材料，可以得到催化效果优异的Pd基合金纳米材料。为了进一步提高Pd基催化剂的催化活性和稳定性，研究人员使用其他金属，例如Ru [ 24 ]、Sn [ 25 ]、Ag [ 26 ]、Au [ 27 ]、Co [ 28 ] 等合成多组分Pd基双金属或三金属催化剂。 3.1. 二元合金 在最初探索Pd基合金催化纳米材料时，研究人员是在Pt基催化剂的基础上，加入Pd从而形成PtPd双金属合金催化剂。Pd元素的加入不仅可以降低Pt的负载量，还可以加速乙醇氧化过程并改善CO对于Pt的毒化作用。Ren等学者利用两步还原法，在还原氧化石墨烯(RGO)上制备出PtPd合金纳米颗粒 [ 29 ]。实验研究表明，所合成的PtPd/RGO催化剂与单金属Pt或Pd催化剂相比，对乙醇氧化反应具有更高的催化活性和稳定性。 随着研究的不断深入，越来越多的金属元素被证明可以与Pd合金化并形成Pd基双金属纳米材料，在EOR过程中表现出提高的催化活性。Wang等以碳纤维(CFC)为模板，在其上制备出形貌均一的PdCo纳米管阵列(NTA)，形成结构稳定的柔性电催化剂(PdCo NTAs/CFC) (见图3) [ 30 ]。研究表明，与Pd NTAs/CFC和商业Pd/C催化剂相比，PdCo NTAs/CFC表现优异的电催化活性和稳定性。更重要的是，PdCo NTAs/CFC具有出色的柔韧性，在不同的变形状态(例如正常、弯曲和扭曲状态)下，其EOR活性几乎保持不变。 图3. PdCo NTAs/CFC的(a)合成示意图和(b)扫描电镜图；PdCo NTAs/CFC，Pd NTAs/CFC和Pd/C在1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH中的(c)循环伏安曲线图和(d)计时电流曲线图 [ 30 ] 在合成Pd基双金属催化剂基础上，研究人员可以制备出特定结构的纳米材料，如三维贵金属网络(NWs)、纳米花、纳米针、纳米枝晶或核壳层等 [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ]。并且经过系统地研究发现，Pd基双金属催化剂的形貌与结构对EOR性能有显著的影响。在这些晶型结构中，三维贵金属网络结构由于其高比表面积、低密度等优异特性，受到研究者们的广泛关注。Fu等学者采用一锅法合成了三维Pd-Ag金属网络结构(3D Pd-Ag BANWs) [ 34 ]。如图4所示，通过扫描电镜研究发现3D Pd-Ag BANWs具有泡沫多孔状。进一步的透射电镜表征表明，Pd-Ag BANWs网络结构是由融合的纳米粒子粘连组成。通过性能测试可以发现，3D Pd-Ag BANWs在碱性溶液中表现出比商业Pd/C催化剂更好的电催化活性和稳定性。这可能是由于三维的网络结构在催化的过程中可以使得催化剂维持其特定的形貌，同时Ag的加入可以有效的调节Pd的电子结构，进而改善Pd的催化性能。 3.2. 三元及多元合金 三元或者多元合金催化剂不仅能提高Pd基催化剂催化活性，而且在多元合金状态下，利用多元素的对Pd的协同调节作用，能进一步增强催化剂的抗毒化性和稳定性。基于此，很多研究者致力于探究三元甚至多元合金的催化剂对EOR性能影响。例如，Zhao等研究者通过一锅法制备了直径为4.0 nm的三元钯铜钴(PdCuCo)合金纳米线(见图5) [ 35 ]。研究结果表明，三元钯铜钴合金纳米线提高了乙醇在碱性介质中电氧化的质量活性(MA)。Pd 31 Cu 61 Co 8 NWs的质量活性(7.45 A·mg −1 )分别是商业Pd黑和Pd/C的8.5倍和12.4倍。并且通过原位傅里叶变换红外光谱和结构表征的结果阐明了Pd 31 Cu 61 Co 8 NWs提高稳定性的反应机理和活性增强。PdCuCo三元催化剂的作用机制在于其表面电子效应和表面缺陷位点的存在。与此同时，表面Cu和Co的共存是另一个关键因素，这些Cu和Co具有很高的活化水产生活性氧的能力。 图4. 3D Pd-Ag BANWs的扫描电镜图和(b)透射电镜图；Pd NWs，Pd 67 Ag 33 ， Pd 50 Ag 50 ，Pd 33 Ag 67 BANWs和Pd/C在(c)1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH中的循环伏安曲线图和(d)计时电流曲线图 [ 34 ] 图5. (a) Pd 31 Cu 61 Co 8 NWs的透射电镜图；PdCuCo NWs和Pd纳米粒子和Pd black在1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH中的(b)循环伏安曲线图和(c)计时电流曲线图；(d) Pd 31 Cu 61 Co 8 NWs的原位红外光谱图 [ 35 ] 此外，Lv等开发了一种简便的溶液相方法，以双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)为模板，以乙醇/H 2 O为混合溶剂，合成了具有连续介孔骨架和圆柱形开放介孔的三金属PdAgCu介孔团簇(MNSs) (见图6) [ 36 ]。所合成的PdAgCu MNSs不仅可以精确地调控尺寸(从21到104 nm)，而且还可以调控元素比和组成(PdAgCu， PdAgPt， PdAgFe， PdPtCu和PdCuRu)。因此，该体系为研究电催化中三金属介孔团簇的尺寸效应提供了一种简单的方法。实验结果表明，平均直径为36 nm的PdAgCu MNSs在乙醇氧化反应中表现出最高的催化活性(4.64 A mg −1 )，质量活性是其他尺寸的1.1~1.7倍，是商业Pd/C的5.9倍。通过动力学研究发现，PdAgCu MNSs的电催化性能取决于其内部电子转移和传质过程的优化和平衡。此研究提出的多金属MNS纳米催化剂的尺寸效应可以为合理设计具有广泛应用价值的纳米催化剂提供一种通用的合成方法。 图6. PdAgCu MNS的(a)合成示意图和(b)透射电镜图；(c)不同尺寸的PdAgCu MNS和商业PdB在1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH 中的质量活性图 [ 36 ] 三元或者多元合金催化剂虽然在乙醇氧化性能上要优于二元合金催化剂，但是通过多金属协同作用优化其催化性能，将大大增加合成方法，表征和涉及的机制的复杂性。由此可见，三元或者多元合金催化剂的设计合成还有待进一步的研究。
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user: 4. Pd-金属氧化物复合纳米材料 很多研究证明金属氧化物与Pd的协同作用能够有效提高Pd基催化剂在乙醇氧化中的催化性能。例如，Shu等研究者以Cu 2 O介孔球为模板，在三嵌段共聚物Pluronic P123 (EO 20 PO 70 EO 20 )的作用下，采用电化学置换反应制备出一种荔枝壳类纳米结构CuO/Pd催化剂(HLN CuO/Pd) [ 37 ]。采用扫描电镜对最佳比例HLN CuO/Pd催化剂的形貌与结构进行表征，得到尺寸均一的荔枝壳类纳米结构。HLN CuO/Pd催化剂对碱性介质中的乙醇氧化具有较高的催化活性，其催化质量活性分别为商业Pd/C和Pd black的5.9倍与10.8倍。与此同时，HLN CuO/Pd催化剂对CO具有优异的抗毒化作用(见图7)。综上所述，HLN CuO/Pd催化剂具有显著的电化学催化性能，其原因是其独特的荔枝状开放式纳米结构以及Pd与CuO载体之间的相互作用，可以有效保持催化剂的结构与形貌，并优化Pd表面电子结构，进而改善其催化EOR性能。 图7. HLN CuO/Pd的(a)合成示意图和(b)扫描电镜图；(c) HLN CuO/Pd，Pd/C和Pd black在1 M NaOH + 1 M C 2 H 5 OH中的循环伏安曲线图；(d) HLN CuO/PdO和Pd/C在1 M NaOH中的CO剥离实验 [ 37 ] 先前的研究已经表明氧化物能与Pd基纳米颗粒结合生成非均相纳米结构，能有效提高催化剂的活性和稳定性。在此基础上，一些研究者开发出一种将氧化物或者化合物修饰在金属表面的“逆”非均相纳米结构催化剂。He [ 38 ] 等制备了一系列的金属氧化物/钯纳米结构，并用于碱性溶液中氧释放反应(OER)研究。通过实验证明，位于金属氧化物-Pd界面上的高价Pd δ + 产生了更多的d带空位，从而改善了表面含氧物种的吸附并最终增强了OER性能。 在此基础上，Chen等人进行了进一步研究 [ 39 ]。他们通过水热法合成了非晶CuO x 纳米层包覆Pd纳米线(Pd NW) (Pd NW @ cCuO x )的“反向”异质结构。然后，采用等离子体处理方法，将表面的非晶CuO x 层转变为晶体CuO x ，从而得到晶态CuO x 催化剂包覆Pd纳米线(Pd NW @ cCuO x ) (见图8)。通过电化学实验进行测试，可以发现具有Pd-cCuO x 界面的催化剂比具有Pd-aCuO x 界面或原始Pd表面的催化剂在乙醇氧化中具有更高的活性和稳定性。并且在反应过程中，Pd-cCuO x 界面的Pd δ + 会转变为Pd 5 O 4 。因此，Pd NW@cCuO x 催化剂展现出较好的抗毒性。综上所述，这种特殊的“逆”非均相纳米结构在乙醇氧化方面具有较好的研究前景。 图8. (a) 具有不同Pd-O-Cu界面的PdNW@CuO x 异质结构的合成示意图；(b) PdNW@cCuO x 的透射电镜图；PdNW@cCuO x ，PdNW@aCuO x 和PdNW在1 M NaOH + 1 M C 2 H 5 OH中的(c)循环伏安曲线图和(d)计时电流曲线图 [ 39 ]
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user: 5. Pd-金属氢氧化物复合纳米材料 目前，主要通过两种方法来提高贵金属催化剂的电催化性能。一种是上述提到Pd与过渡金属合金化，以调节催化剂表面与反应物或反应中间体之间的相互作用。另一种则是构建由Pd和氧化物或氢氧化物组成的复合材料 [ 40 ]。特别是非晶态氢氧化物，其中在EOR过程中可以提供吸附态羟基(OH ad )，有利于进一步氧化除去吸附在Pd活性位点上的吸附态中间产物(例如CO等)。 在众多氢氧化物中，非晶态的氢氧化镍(Ni(OH) 2 )在碱性介质中能够促进水解离并形成OH ad ，氧化去除临近Pd活性位点上吸附的CO等中间产物，进而可以提高Pd的抗毒化特性。因此，Pd与非晶态氢氧化物间协同作用研究受到广泛关注。例如，Li等人通过结合葡萄糖辅助的水热方法和电沉积方法，合成了一种用于EOR的自支撑复合电催化剂 [ 41 ]。该复合催化剂由在镍泡沫上生长的Ni(OH) 2 纳米片，葡萄糖水热碳化产生的非晶态碳和沉积的Pd纳米颗粒组成。通过研究发现，Ni(OH) 2 的存在提供了大量吸附态羟基(OH ad )组分，可促进Pd位点上碳质物种的氧化去除，提高EOR稳定性。电化学实验结果表明，所制备的Pd/Ni(OH) 2 @C/NF复合催化剂在碱性溶液中表现出较高的活性和良好的稳定性。 此外，Huang等研究者通过两步法制备了由纳米级Pd颗粒、非晶态的Ni(OH) 2 纳米薄片以及石墨烯载体组成的复合电催化剂(Pd/Ni(OH) 2 /rGO x ) [ 42 ]。该复合电催化剂在催化乙醇氧化过程中具有 > 1500 mA·mg −1 的高质量比峰值电流。并且Pd/Ni(OH) 2 /rGO x 复合催化剂表现出良好的稳定性。更重要的是，通过CO剥离实验研究发现，由于非晶态Ni(OH) 2 表面存在大量的晶型缺陷，有利于促进水分解产生OH ad ，可以持续氧化去除Pd活性位点上吸附的中间产物，进而增强了Pd催化剂的抗毒化性(见图9)。 由于Pd与氢氧化物之间的协同作用，Pd基复合催化剂在EOR过程中表现出的较好催化活性与稳定性。然而该系列Pd基复合材料主要是通过物理混合或者沉积的方式组合在一起，使得其中的Pd纳米材料在EOR过程中容易发生团聚，影响催化剂的活性和长期的稳定性。因此，如何开发出一种采用稳健的化学方式将Pd纳米颗粒与载体材料强耦合在一起成为该领域的一大挑战。为了得到强耦合结构的Pd基复合材料，Yuan等学者成功合成了强耦合结构的链状PdBi-Bi(OH) 3 复合材料(见图10) [ 43 ]。在该复合材料中，由于Pd电子结构的调节和Bi的掺入带来大量缺陷以及Bi(OH) 3 的表面修饰，PdBi-Bi(OH) 3 纳米链表现出为5.30 A·mg −1 质量活性。更重要的是，Bi(OH) 3 的表面修饰通过Langmuir-Hinshelwood机制大大促进了有毒中间体(尤其是CO)的氧化去除。除此之外，由于强耦合界面结构的特性，PdBi-Bi(OH) 3 复合材料表现出优异的EOR稳定性。通过20万秒稳定性测试后，EOR活性没有明显损失。该研究强调了非贵金属氢氧化物与Pd之间强耦合结构的构建对提高EOR活性和稳定性的重要性，同时也为DEFCs的商业应用提供了良好的思路。
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user: 6. 结论与展望 DEFCs是一种高效的新能源转换装置，其阳极乙醇具有能量密度高、毒性低、可再生、低成本等优势，是实现低污染，环境友好型可持续发展的潜在能源燃料。高效且稳定的电催化效率是直接乙醇燃料电池大规模商业化应用的必要条件，这需要开发出性能优越的电催化剂。Pd基纳米材料作为直接乙醇燃料电池非常重要的组成部分，长期以来受到研究者们的广泛关注。了解Pd基纳米材料的研究进展，包括Pd基纳米材料的合成方法，形貌与结构对催化性能影响等，并深入探究相应的电催化性质，对于探索寻找高活性和高稳定性Pd基催化剂具有重要的意义。与此同时，对于开发简便且成本低廉的生产工艺起到了重要作用。目前，DEFCs的电催化剂的研究和开发上虽然有了很大的进步，但是现有的Pd基催化剂 图9. Pd/Ni(OH) 2 /rGO x 的(a)合成示意图和(b)扫描电镜图；Pd/Ni(OH) 2 /rGO x ，Pd/rGO x 和Pd/C在1 M KOH + 1 M C 2 H 5 OH中的(c)循环伏安曲线图和(d)计时电流曲线图；(e) Pd/C和(f) Pd/Ni(OH) 2 /rGO在1 M KOH中的CO剥离实验；(g) Pd/rGO和(h) Pd/Ni(OH) 2 /rGO的原位红外光谱图 [ 42 ] 图10. (a) PdBi-Bi(OH) 3 纳米链的合成示意图；PdBi-Bi(OH) 3 和商业Pd/C在1 M NaOH + 1 M C 2 H 5 OH中的(b)循环伏安曲线图，(c) 计时电流曲线图和(d)长期稳定性测试 [ 43 ] 在催化活性和稳定性仍然存在着较大的提升空间。如何制备出一种能够广泛应用与商业化的Pd基催化剂仍然是今后的研究重点。
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user: 摘要 目的：应用ROC曲线分析1.5T磁共振成像诊断踝关节运动损伤患者的准确性。方法：将2018年1月至2019年12月我院收治的100例踝关节运动损伤患者纳入研究，收集患者一般临床资料，并采用1.5T核磁共振对受试者踝关节进行平扫检查，记录患者踝关节骨折、骨挫伤等损伤发生情况，检查结果由2名经验丰富的影像医师对影像结果进行分析及报告，所有患者均行关节镜检查以明确最终诊断，分析1.5T核磁共振成像对踝关节运动损伤的敏感性及诊断价，并应用ROC曲线对1.5T磁共振成像诊断踝关节运动损伤的准确性进行分析。结果：共有21例患者为踝关节骨折，与MRI诊断一致，两种方法检查的一致率为100% (100/100)，具有较高的一致性(Kappa = 1.000， P = 0.000)，敏感性为100%；有65例患者为踝关节韧带损伤，MRI平扫诊断60例，两种方法检查的一致率为89% (89/100)，具有较高的一致性(Kappa = 0.766， P = 0.000)，敏感性为88.24%；对于跟腱断裂的患者，MRI检查亦能正确显示，敏感性为100%。结论：1.5T核磁共振成像对踝关节韧带、肌腱及软骨损伤的诊断具有较高的敏感性及诊断价值，可以有效显示踝关节损伤，安全无创，能为早期临床治疗提供客观依据。
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user: 1. 引言 踝关节运动损伤是因运动导致的损害，为下肢最常见的骨科损伤，无论在运动员还是非运动员中均比较常见，约占因运动所致创伤总数的21%，仅次于膝关节创伤 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]。踝关节运动损伤可进展成为长期问题，遗留后遗症状，早期创伤性踝关节骨性关节炎等会影响患者的正常生活活动，导致患者体力活动减少，影响患者生活质量 [ 4 ] [ 5 ]。此外，慢性踝关节不稳作为踝关节损伤最常见的长期影响之一，严重影响患者生活质量 [ 6 ]。尽管踝关节损伤常被视为轻度伤害，但其仍是目前重要的公共卫生问题 [ 7 ]。关节镜检查是踝关节软组织损伤诊断的“金标准”，但因其为有创性检查，患者接受度相对较差，故提高无创性踝关节损伤检出率是目前仍需客服及解决的问题。核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging， MRI)是目前临床常用的影像学检查，对软组织损伤具有较高的分辨率，为骨骼、肌腱及韧带等损伤的首选检查方法 [ 8 ] [ 9 ]。而目前国内针对MRI与踝关节运动损伤的相关研究多集中于描述性分析，而针对MRI诊断准确性的相关研究较少，故基于此，本试验通过分析MRI对踝关节运动损伤的准确性进行研究，以便为MRI的临床应用提供理论依据，现将研究结果报道如下。
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user: 2. 资料及方法 2.1. 一般资料 将2018年1月至2019年12月我院收治的100例踝关节运动损伤患者纳入研究，纳入标准：①单侧踝关节运动损伤患者；② 同意行关节镜检查者；③ 临床资料完整。排除标准：① 合并MRI检查禁忌症者；② 既往踝关节骨折、下肢手术史者；③ 合并先天骨骼畸形者；④ 合并严重心、脑、肾等脏器功能障碍者；⑤ 合并严重精神–神经系统疾病，不能配合者；⑥ 孕妇及哺乳期妇女。本研究通过本院伦理委员会审核并批准，且所有患者对本试验知情并签署知情同意。在纳入研究的100例患者中，含男性68例，女性32例，年龄为17~72岁，平均年龄(45.78 ± 10.96)岁，体质量指数(BMI) 16.9~26.3 kg·m −2 ，平均BMI为(22.31 ± 1.72) kg·m −2 ，左踝关节61例，右踝关节39例，其中行走时扭伤21例，运动伤79例。 2.2. 检查方法 1) 设备在患者行MRI检查前，嘱患者仔细阅读并签署《磁共振检查知情同意书》，并在进行检查前移除患者身上含金属的物品。应用1.5T超导核磁共振(Aera，德国西门子公司)对患者进行检查，嘱患者仰卧位，双下肢伸直，患侧足部自然放松，通常使患者踝关节呈跖屈20˚稍旋后位，并对检查部位进行固定，以避免患侧足内外旋，采用足先进式，应用踝关节专用相控阵线圈对患者损伤侧踝关节进行扫描。扫描方位如下：① 横轴位：平行于距骨顶，由下胫腓联合扫描至跟骨下缘；② 冠状位：以横轴位为定位，以平行内外踝连线平面自前舟骨前部向后至足跟后缘进行冠状位扫描；③ 矢状位：以横轴位为定位，垂直于内外踝连线平面自内踝(或外踝)边缘至外踝(或内踝)边缘进行扫描。常规MRI扫描为PD + Tse + FS，应用快速自旋回波序列对患者冠状面T1W1扫描(TR：472.00 ms，TE：11.00 ms，层厚：3.0 mm，层间距：0.3 mm)；应用质子密度加权压脂序列对患者横轴面(TR：3250.00 ms，TE：27.00 ms，层厚：3.0 mm，层间距：0.3 mm)，冠状面(TR：3900.00 ms，TE：30.00 ms，层厚：3.0 mm，层间距：0.3 mm)及矢状面(TR：3130.00 ms，TE：33.00 ms，层厚：3.0 mm，层间距：0.6 mm)进行扫描。 2) 影像分析主要对患者损伤踝关节的骨骼、韧带、肌腱及软骨损伤情况进行观察。韧带损伤：根据韧带轮廓、完整性及韧带周围或内部PDWI-FS序列是否出现高信号明确。肌腱损伤：根据肌腱的连续性，PDWI-FS序列内部是否出现高信号，肌腱周围是否出现片状液体信号包绕明确。且所有病变均需在2种以上不同序列图像中显示方可确定为异常，且所有影像图片均由2位经验丰富的影像科医师采用双盲法进行阅片，当两位医师诊断意见不一致时，由上级医师对有争议的影像进行评判，作为最终诊断结果。 2.3. 数据分析 采用SPSS 22.0软件对数据进行分析，计数资料用例(n)表示，组间比较采用c 2 检验；采用Kappa检验对MRI与关节镜检查的一致性指数进行评价，并应用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve， ROC)评估MRI的诊断效能，以P < 0.05为差异有统计学意义。
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user: 3. 结果 1) MRI对踝关节骨折、骨挫伤的诊断根据关节镜确诊结果，共有21例患者为踝关节骨折，经MRI诊断亦发现21例骨折患者，两种方法检查的一致率为100% (100/100)，具有较高的一致性(Kappa = 1.000， P = 0.000)，ROC曲线示MRI检查的敏感性为100%，特异性为100%，95% CI为0.964~1.000，Youden指数为1.00，见表1及图1。 Table 1 MRI diagnosis of fracture and bone contusion of ankle join MRI 关节镜 合计 + − + 21 0 21 − 0 79 79 合计 21 79 100 表1. MRI对踝关节骨折、骨挫伤的诊断 图1. MRI诊断踝关节骨折、骨挫伤的ROC曲线 2) MRI对踝关节韧带损伤的诊断根据关节镜确诊结果，共有65例患者为踝关节韧带损伤，其中外侧副韧带损伤55例，内侧三角韧带损伤3例，单纯胫腓韧带断裂3例，胫腓前韧带断裂合并三角韧带损伤4例；MRI平扫诊断共有60例患者出现踝关节韧带损伤，两种方法检查的一致率为89% (89/100)，具有较高的一致性(Kappa = 0.766， P = 0.000)，ROC曲线示MRI检查的敏感性为92.3%，特异性为100%，95% CI为0.903~0.990，ROC曲线诊断的Youden指数为0.923，见表2及图2。 Table 2 MRI diagnosis of ankle ligament injur MRI 关节镜 合计 + − + 57 3 60 − 8 32 40 合计 65 35 100 表2. MRI对踝关节韧带损伤的诊断 图2. MRI对踝关节韧带损伤的诊断的ROC曲线 3) MRI对踝关节肌腱损伤的诊断纳入研究病例出现肌腱损伤患者较少，共6例患者为跟腱断裂，MRI全部正确显示肌腱连续性中断，敏感性为100%，特异性为100%，95% CI为0.964~1.000，ROC曲线诊断的Youden指数为1.00；有14例患者为肌腱腱鞘炎，MRI表现为肌腱腱鞘内积液。 4) MRI对踝关节软骨损伤的诊断共有46例患者为软骨损伤，其中11例经关节镜诊断与MRI诊断一致，有35例患者MRI表现为关节腔积液；有61例患者经MRI检查显示肌肉软组织挫伤。
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user: 4. 讨论 踝关节是人体重要的负重关节，踝关节的稳定性对于人体的负重及运动功能具有重要意义 [ 10 ] [ 11 ]。踝关节的运动损伤临床较为常见，除可造成患者踝关节局部疼痛、肿胀及使患者行动不利外，若损伤处理不及时，还会加重患者病情，甚至出现后遗症，导致患者出现功能性踝关节不稳等后遗症状，除给患者带来经济负担外，还严重影响患者生活质量 [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]。而踝关节运动损伤主要为骨损伤，韧带、肌腱损伤及软骨损伤等，MRI是目前诊断踝关节运动损伤的重要方式 [ 11 ] [ 15 ] [ 16 ]，本研究旨在分析MRI诊断踝关节运动损伤的准确性，以便为临床后续治疗及康复提供更为准确的数据支持。 本研究结果显示，MRI对骨折、骨挫伤的诊断价值最高，与关节镜检查结果完全一致，具有100%的敏感性，在骨折急性期时，T 2 WI上的骨折线受周围骨髓水肿高信号影响，使患者骨折线较为模糊，故主要在T 1 WI上对骨折进行观察，可在T 1 WI见到线样的长T1、T2信号。而骨挫伤则无明显的骨折线，骨挫伤为松质骨骨小梁微小断裂，同时伴骨髓内出血或水肿，故可在T 2 WI上压脂现象上见到斑片状高信号影，T 1 WI上则表现为斑片状低信号影。而X线检查及关节镜并不能发现骨挫伤所致的水肿，此外，MRI对于骨折及骨挫伤诊断的敏感性较高，是因为MRI能有效、准确的对踝关节骨骼损伤后出现的骨内微量出血及水肿等病理变化进行显像，从而及时诊断，避免不必要的有创检查。而及时指导骨折或骨挫伤患者休息及康复可加速骨骼恢复，避免过多负重使骨小梁进一步塌陷，故对于临床症状较重，而X现检查未见明显异常的患者进行进一步MRI检查具有重要意义 [ 17 ]。 而MRI与最终确诊结果对韧带损伤诊断的一致率为89%，具有较高的一致性，诊断的敏感性为92.3%。韧带损伤是踝关节最常见的损伤，尤以外侧副韧带受累最为常见，正常情况下，韧带在MRI显像为低信号影，而当韧带损伤时，在MRI则表现为不规则条片状结构，韧带结构部分或完全消失，伴信号增强，且与周围结构界限不清。韧带损伤在多数MRI成像中可以较好的观察到，而对于跟腓韧带损伤的诊断则相对困难，因跟腓韧带很难完成的呈现在MRI图像上，故MRI成像对跟腓韧带的完整性很难进行评判，从而导致诊断能力下降，但踝关节损伤最长累及距腓前韧带，而距腓后韧带则很少累及 [ 18 ] [ 19 ]，故MRI对韧带损伤的诊断价值仍较高。 此外，本次纳入研究的患者中有，共6例患者为跟腱断裂，MRI全部正确显示，有14例患者为肌腱腱鞘炎，MRI表现为肌腱腱鞘内积液。肌腱损伤可分为肌腱炎、腱鞘炎等6类，而肌腱炎在MRI上则表现为腱鞘内积液变多，呈长T1、T2液体信号影增加。而肌腱撕裂根据撕裂程度不同，MRI表现不同，肌腱完全断裂在MRI上表现为肌腱连续性完全中断，T 2 WI信号增高，并可在撕裂处见到液体信号，而慢性撕裂则表现为信号中等度增高，表现为肌腱萎缩或增粗，肌腱损伤相对比较容易判断。MRI对软骨损伤准确性诊断较MRI对其他踝关节损伤相对较差，尽管PDWI能有效观察踝关节软骨，并良好显示其解剖结构，但因缺乏与软骨下骨的对比，故很对软骨损伤情况进行判断，而T 2 WI尽管能清晰显示软骨与软骨下骨的分界，但其软骨表明轮廓显示一般，且与关节内液体分界较差，故MRI对软骨的诊断性相对较差。 综上，MRI可对踝关节的软组织进行多参数、多方位的扫描及成像，可对踝关节损伤时的骨髓、骨皮质、韧带及肌腱出现的异常信号进行反应，具有较高的敏感性，与关节镜检查具有较高的一致性。但MRI检查时间较长，且受成像技术、临床阅片技术等多种因素限制，使其临床应用受限，故应加强临床学习，使MRI具有更广阔的应用前景。
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user: 摘要 由于三个等位基因I A 、I B 、i的不同组合，红细胞表面带有不同的抗原，因而ABO血型分为A型、B型、AB型、O型。其中A型血个体的基因型可能是I A I A 或I A i，B型血个体的基因型可能是I B I B 或I B i，因此，利用血清学方法无法直接判断A或B型血个体的基因型。根据I A 、I B 与i基因在序列上的区别，应用PCR与限制性内切酶片段长度多态性相结合的技术，可以进行人ABO血型的基因型鉴定。本实验用PCR-RFPL法对一名A型血个体进行基因型鉴定，并用测序进行验证。结果显示，PCR-RFLP法与测序得到的结论一致，说明该方法可行性较高。
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user: 1. 引言 ABO血型系统是第一个被描述的红细胞血型系统，也是最具有临床意义的一个系统 [ 1 ]。ABO血型由I A 、I B 、i等位基因的组合决定，其中I A 、I B 基因分别编码N-乙酰半乳糖胺转移酶和D-半乳糖糖基转移酶，可以对抗原前体H进行不同的修饰，从而得到A、B抗原；i基因由于碱基缺失导致密码子移位，终止密码子提前出现，不能合成相关的酶，因此，抗原前体H保持不变 [ 2 ]。基因型为I A I B 的个体为AB血型，ii的个体为O血型，I A I A 或I A i的个体为A血型，I B I B 或I B i的个体为B血型。 人的ABO血型在分析家谱、亲缘关系鉴定等方面有重要的作用，因此鉴定个体的ABO血型和基因型有重要的意义。利用带有A抗原的红细胞遇到A抗体会凝集，带有B抗原的红细胞遇到B抗体也会凝集的特性，可以将抗体加入到血液样品中，如果发生凝集，则待测个体有对应的抗原。根据个体的抗原的种类，可以确定其血型。AB或O型血的个体的基因型可以直接确定，但A或B血型的个体由于可能是杂合子或纯合子，基因型无法通过抗体凝集法确定。 ABO血型决定基因定位于9q34.1-9q34.2，包含了7个外显子和6个内含子。其中第6、7号外显子负责编码ABO糖基转移酶的催化结构域 [ 3 ]。本文采用Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)方法鉴定A或B血型个体的基因型。由于6号外显子上G258的存在，I A 或I B 基因与i基因相比，在这个位点多出了一个BstEII酶的酶切位点，而少了一个KpnI酶切位点 [ 3 ]。首先PCR扩增一段在I A 基因和I B 基因中完全相同且包含G258的DNA片段(i基因中对应的片段没有G258)，然后用限制性内切酶处理PCR产物，最后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带来判断PCR产物的成分，进而确定待测个体的基因型。
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user: 2. 实验材料 2.1. 实验用品 2.1.1. 试剂 人唾液DNA提取试剂盒购自上海生工；高保真PCR试剂购自擎科公司；引物由上海铂尚公司合成；PCR产物纯化试剂盒购自MACHEREY-NAGEL公司；DNA 10× loading buffer购自诺唯赞公司；BstEII和KpnI限制性内切酶购自NEB公司；DNA marker购自全式金公司。 2.1.2. 仪器与耗材 移液器，1.5 mL EP管，金属浴，PCR仪，琼脂糖凝胶电泳装置，凝胶成像仪，台式离心机，锥形瓶，药匙，电子天平，微波炉，NanoDrop2000超微量分光光度计。
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user: 3. 实验方法 3.1. DNA提取 分别收集一名AB血型个体、一名O型血个体和一名A型血个体的唾液，按照人唾液DNA提取试剂盒的使用说明书提取DNA。取250 uL唾液至1.5 mL EP管中，加入350 μL Buffer CL和20 μL Proteinase K，震荡混匀，65℃水浴20 min，间或混匀。向离心管中加入300 μL无水乙醇，充分混匀，然后将全部溶液和沉淀物转移至硅胶膜吸附柱内(吸附柱放入收集管中)，10000 rpm离心1 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Wash Solution (已经加过乙醇)，10，000 rpm离心1 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中，并重复一次。将吸附柱放回收集管中，12，000 rpm离心2 min。取出吸附柱，放入一个新的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入50 μL TE Buffer，静置3 min，12，000 rpm离心2 min，得到人唾液基因组DNA，并用NanoDrop2000测浓度。 3.2. PCR扩增 根据ABO血型基因6号外显子序列设计引物如下： 引物1：5’-GCTGCTTCGTTCTCTCCTCT-3’ 引物2：5’-TGAACACAAGGAGAGACCTC-3’ 这两个引物可以用于扩增一段包含G258的区域，序列长度为674 bp。设置4组PCR反应：#1组：用A血型个体的DNA样品作为模板；#2组：用AB血型个体的DNA样品作为模板；#3组：用O血型个体的DNA样品作为模板；#4组：用等量O血型个体的DNA样品和AB血型个体的DNA样品作为模板。每组配置两管50 uL反应体系。PCR反应条件：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸10 s，35个循环，72℃延伸1 min。 3.3. PCR产物鉴定、测序和纯化 用1%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间25 min。每管取1 μL PCR产物混合0.1 μL 10× loading buffer上样。如果出现目的条带，则每组各取一管送测序，另一管进行PCR产物纯化，用于后续实验。如果杂带较少，则直接纯化；如果杂带较多，则将剩余PCR产物电泳并进行凝胶回收。 用PCR产物纯化试剂盒进行凝胶回收。将剩下的4管PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间25 min。切下只含有目的条带的凝胶，放入1.5 mL EP管中，每100 mg凝胶加入200 uL Buffer NT1，50℃加热10 min，间或震荡。收集柱放入收集管中，将液体倒入收集柱中，11，000 g离心30 s。倒去废液，将收集柱重新放回收集管中。向收集柱中加入700 uL Buffer NT3，11，000 g离心30 s，倒去废液，将收集柱重新放回收集管中，并重复一次。11，000 g离心1 min，将收集柱放入干净的1.5 mL EP管中，EP管用70℃金属浴加热2 min。向收集柱中加入30 uL Buffer NE，室温静置1min，11，000 g离心1 min。得到纯化的DNA片段。 3.4. 酶切消化 分别使用BstEII和Kpn I消化4种纯化后的PCR产物。构建10 uL酶切反应体系和10 uL对照体系(后者除了将限制性内切酶换为等量的双蒸水之外，与前者完全相同)，37℃反应1 h。 3.5. 酶切结果检测 配制1%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间30 min。取9 μL PCR产物混合1 μL 10×上样缓冲液上样，根据条带判断基因型。
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user: 4. 实验结果 4.1. PCR-RFLP 鉴定结果 引物1和2用于扩增一段含有G258的片段，用于区分A或B基因与O基因。图1为PCR的电泳检测结果，可以看到每一管反应体系都出现了目的条带。A或B基因的PCR产物(以下简称pA)长度为674 bp，在G258的位置有一个BstEII酶切位点；O基因的PCR产物(以下简称pO)长度为673 bp，在缺失G258的位置有一个KpnI酶切位点。因此，pA被BstEII酶切为478 bp和196 bp的片段，被KpnI切为530 bp和144 bp的片段；pO无法被BstEII酶切，被KpnI切为334 bp、195 bp和144 bp的片段。不同基因型的个体的PCR产物由于含有不同的片段，在经过酶切后会有不同的电泳结果。表1为基因型对应的电泳结果，+表示会出现这个条带。注意表中标注的DNA片段的长度均为估计值，实际长度可能与这些值相差几个碱基，但这种微小的差异对琼脂糖凝胶电泳的结果基本没有影响。 图1. PCR电泳结果 Table 1 Genotype and enzyme digestion result 基因型 血型 BstEII酶切 KpnI酶切 674 bp 478 bp 196 bp 674 bp 530 bp 334 bp 195 bp 144 bp I A I A A (纯合) + + + + I A I B AB + + + + I B I B B (纯合) + + + + I A i A (杂合) + + + + + + + I B i B (杂合) + + + + + + + ii O + + + + 表1. 基因型与对应的酶切结果 本实验用O血型个体和AB血型个体的基因组样本作为对照，检测了一名A血型个体的基因型。AB血型个体的PCR产物(#2)中只有pA；O型血个体的PCR产物(#3中只有pO)；等量AB血型个体基因组和O血型个体基因组的混合物的PCR产物(#4)中有pA和pO，因而可以被看做A或B型血的杂合子的基因组PCR产物。图2为各组的PCR产物酶切后的电泳结果，其中#1为待测A型血个体的实验结果。从电泳结果可知，#1的结果总是与#2相同，所以待测A血型个体为纯合子，基因型为AA。 图2. 酶切电泳结果 4.2. 测序结果 #1、#2和#3的测序峰图清晰，无杂峰(如图3(a)、图3(b)和图3(c))。#1和#2中存在G258，说明二者中只含有pA；而#3中没有G258，说明#3中只含有pO。#4的G258的位置有G对应的黑色峰，但从G258的位置开始全都是杂峰，且多数位置是两个不同颜色的峰(如图3(d))。这说明#4中有两种DNA片段，且其中一种片段(即pA)有G258，另一种(即pO)没有，所以从G258的位置开始出现错位。#2、#3和#4的测序结果与之前预测的各组的PCR产物的成分对应。#1的测序结果与#2完全相同，说明待测的A血型个体为纯合子，基因型为AA，这个结果与PCR-RFLP实验的结果相同。 图3. 测序结果
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user: 5. 结语 ABO血型是一种重要的血型分类系统，在输血、刑侦、鉴定亲缘关系等领域有重要的作用。利用红细胞在相应的抗体的作用下可以凝集的特点，可以快速判断待测个体的血型。如果确定该个体为AB型血或O型血，则基因型可以直接确定；但如果该个体为A型血或B型血，则抗体凝集的方法无法判断基因型。对于A或B型血的个体，判断其基因型最好用判断等位基因种类的方法。随着分子生物学技术的迅猛发展，血型的基因检测研究也取得了突破性进展。有通过双链探针，采用实时PCR方法对个体进行ABO血型基因的分型，也有应用单管PCR，通过基因扫描(Gene Scan)的方法进行ABO血型基因的分型，还有采用分子信标的方法对ABO血型进行基因分型 [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。 国内许多高校在遗传学实验教学过程中也经常采用PCR-RFLP技术对ABO血型进行基因分型，并取得不错的教学效果 [ 7 ] [ 8 ]。在实际的教学过程中，我们发现由于PCR片段设计得过短，DNA酶切并电泳之后，小片段经常看得不是很清楚。因此，我们重新设计了引物，使PCR产物长度达到了674 bp，同时，选用了BstEII和KpnI对一份PCR产物进行酶切分型，简化了实验步骤，大大提高了成功率，所有的酶切分型结果同时用测序继续进行了验证，证实本实验方法切实有效。为了更方便地确定结果，在对AB血型DNA进行处理的同时也将等量AB型血的DNA与O型血DNA混合并处理。如果待测样本的酶切结果与AB型血DNA的酶切结果相同，则待测个体为纯合子；如果待测样本与混合DNA的酶切结果相同，则个体为杂合子。这样不仅方便确定结果，还可以证明AB型血的DNA的酶切结果与混合DNA不同的原因是二者的DNA成分不同，而不是某个反应体系中酶切不彻底。 无论是BstEII酶切，KpnI酶切，还是测序，结果都显示待测个体为纯合子。所以，任何一种方法都可以鉴定A或B血型个体的基因型。考虑到测序所需要的时间较长，所以推荐酶切法，且只需要一种限制酶进行反应就可以得出结论。 本实验在加深学生对ABO血型系统的了解的同时，锻炼了学生的动手能力和设计、优化实验方案的能力，比如PCR的过程可以让学生根据电泳鉴定结果判断反应体系和程序是否合适，进而掌握优化PCR反应的方法；学生考虑设计几组实验、每组实验如何设计的过程可以增强学生的逻辑思考能力。通过最终的实验结果，可以加深学生对复等位基因的理解，同时领会表现型与基因型的关系。本实验是上海科技大学遗传学实验课程的自主设计实验，旨在让学生通过自己设计实验，感受到科研的趣味性和实际用途，在实验成功后获得成就感，为之后的科研生活打下基础。