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user: 3. 统计结果分析 3.1. 差异表达基因 通过R软件的edgeR包和Perl脚本，得到1867个既发生差异表达又发生DNA拷贝数变异的差异表达基因，包括946个上调的差异表达基因，921个下调的差异表达基因，图1为这些差异表达基因的火山图，红色表示上调的基因，绿色表示下调的基因，中间的黑色代表正常范围内表达的基因。 图1. 差异表达基因的火山图 3.2. 差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路分析 3.2.1. 上调差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路分析 如图2所示，上调差异表达基因的功能富集分析显示，上调的差异基因显著富集于趋化因子介导的信号通路、胞间信号、ERK1和ERK2级联的正调控、DNA复制、细胞分化、G1/S有丝分裂细胞周期的转变、G蛋白偶联受体信号通路、细胞增殖的正调控以及免疫反应等生物过程(Biological Processes)。细胞组分(Cell Component)主要聚集于细胞外区域、细胞外空间、蛋白质细胞外基质、血液微粒、胶原三聚体、血小板α颗粒管腔、细胞表面、细胞外基质、内质网腔和高尔基流明等。分子功能(Molecular Function)主要与丝氨酸型内肽酶活性、序列特异性DNA结合、激素活性、生长因子活性、受体结合、转录激活子活性：RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合、细胞因子活性、钙离子结合、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性DNA结合以及染色质结合等活动相关。 KEGG通路分析结果显示，上调的差异基因显著富集于细胞因子与细胞因子受体的相互作用、细胞周期、蛋白质的消化吸收、脂肪的消化吸收、PI3K-Akt信号通路、黑色素瘤、ECM-受体相互作用、胰腺分泌、膀胱癌和Wnt信号通路等。 图2. 上调差异表达基因的功能富集分析和通路分析 3.2.2. 下调差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路分析 如图3所示，下调差异表达基因的功能富集分析显示，下调的差异基因显著富集于消化不良、离子跨膜转运、运输、钠离子迁移、细胞增殖的正调控、细胞粘附、氧化还原过程、细胞表面受体信号通路、细胞对肿瘤坏死因子的反应以及脂质代谢等生物过程(Biological Processes)。细胞组分(Cell Component)主要聚集于细胞外空间、质膜、细胞外泌体、质膜的组成部分、细胞外区域、顶质膜、细胞表面、膜的整体成分、细胞连接和受体复合物等。分子功能(Molecular Function)主要与结构分子活性、钙离子结合、脂质结合、运输活动、氧化还原酶活性、钙调蛋白结合、肌动蛋白结合、铁离子结合、锌离子结合以及受体结合等活动相关。 KEGG通路分析结果显示，上调的差异基因显著富集于胃酸分泌、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、PPAR信号通路、化学致癌作用、脂肪的消化吸收、胰岛素分泌、胰腺分泌、蛋白质的消化吸收和AMPK信号通路等。 图3. 下调差异表达基因的功能富集分析和通路分析 3.3. PPI网络及重要子网络 将富集分析与通路分析所得到的689个上调基因与824个下调基因导入String数据库，以0.7的高置信阈值来构建PPI网络。如图4所示，图中的黄色表示表达上调的差异基因，蓝色表示表达下调的差异基因。将结果导入Cytoscape软件进行可视化，并使用其中的MCODE插件寻找到PPI网络中最重要的两个子网络。如图5所示，子网络1中包含32个上调基因和39个下调基因，子网络2中的35个基因全为上调基因。 GeneCardsSuite (http://www.genecards.org)是一个可搜索的集成数据库，该数据库自动集成了来自约150个网络来源的以基因为中心的数据，包括基因组，转录组学，蛋白质组学，遗传，临床和功能信息。在其中的MalaCards疾病数据库中找到了499个与胃癌相关的基因，其中有八个基因出现在子网络1和子网络2中。分别为GAST、CCKBR、TOP2A、AURKA、CXCL8、PLK1、ECT2、TPX2。 图4. 差异表达基因的蛋白质相互作用网(PPI) 图5. PPI中两个重要的子网络 3.4. 构建核心网络寻找胃癌驱动基因 使用Cytoscape的插件CytoHubba构建与GAST、CCKBR、TOP2A、AURKA、CXCL8、PLK1、ECT2、TPX2这八个基因相互作用的网络，如图6所示。 图6. 胃癌的核心子网络 该网络中包含上调差异基因25个，下调差异基因17个，找出其中基因差异表达与基因拷贝数呈正相关的基因，即在基因拷贝数增加的同时，基因的表达上调；相反在基因拷贝数减少时，基因的表达下调。得到如表4所示的26个驱动基因。图7为这26个基因所在的染色体位置圈图。 Table 4 Gene differential expression is positively correlated with gene copy numbe Gene copy_number group PLK1 1 up AGT 1 up BLM 1 up FOXM1 1 up ERBB2 2 up NEK2 1 up IFNG 2 up MMP1 1 up TERT 1 up PRKACG 1 up GNGT1 1 up F2 1 up KNG1 1 up CDK1 1 up EXO1 1 up TPX2 1 up AURKA 1 up TOP2A 1 up CXCL8 1 up ECT2 1 up SH3GL2 −1 down TIAM1 −1 down RHOV −1 down GNA15 −1 down TFF2 −1 down CCKBR −1 down 表4. 基因差异表达与基因拷贝数呈正相关的基因 图7. 驱动基因在染色体上的位置圈图 3.5. 驱动基因与胃癌的发生发展 筛选出的26个胃癌驱动基因中，有19个基因被相关的文献报道与胃癌的发生发展有关，其中极光激酶A (AURKA)位于染色体臂20q13中，是一个在胃腺癌中经常扩增和过度表达的基因，Dar等人 [ 10 ] 的结果表明AURKA调节GSK-3β磷酸化和活性，导致胃癌中β-catenin/TCF复合物的积累和活化，AURKA过表达会增强胃癌细胞的细胞增殖。CCKBR基因编码胃泌素和胆囊收缩素(CCK) (大脑和胃肠道的调节肽)的G蛋白偶联受体。该蛋白是B型胃泌素受体，对硫酸化和非硫酸化CCK类似物均具有很高的亲和力，主要存在于中枢神经系统和胃肠道中。Zhou等 [ 11 ] 人的结果表明胃泌素mRNA的表达水平与恶性肿瘤的进展和转移密切相关，胃泌素/CCK-B受体的自分泌或旁分泌途径的存在可能在胃癌的发病机理，特别是在进展中起重要作用。CXCL8又名白介素(IL-8)是一种趋化因子，可吸引中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和T细胞，但不吸引单核细胞。它也参与嗜中性粒细胞活化。Yasumoto等人 [ 12 ] 的结果表明IL-8可能是由胃癌细胞局部产生的，并且T淋巴细胞通过嗜中性白细胞浸润直接或间接渗透到肿瘤部位，这些发现还增加了以下可能性：癌症来源的IL-8诱导的白细胞浸润可能在启动对肿瘤细胞的免疫反应，并可能控制肿瘤细胞的生长和转移。ECT2基因编码的蛋白质是鸟嘌呤核苷酸交换因子和与Rho特异性交换因子和酵母细胞周期调节剂有关的转化蛋白。该基因的表达随DNA合成的开始而升高，并在G2和M期保持升高。通过与肿瘤细胞中的致癌PARD6A-PRKCI复合物相关联来刺激RAC1的活性，从而协调地驱动肿瘤细胞的增殖和侵袭。ERBB2通常称为HER2，HER2扩增是胃癌以及其他各种癌症中常见的分子异常，近些年已在20%至30%的胃癌中检测到人类表皮生长因子受体2 (HER2)的扩增，并与不良预后相关。Tanizaki等人 [ 13 ] 研究发现在具有HER2扩增的胃癌细胞中，S-1和HER2靶向剂的组合发挥了由TS抑制介导的协同抗肿瘤作用。TOP2A基因位于17号染色体上HER2的附近，是许多化疗药物的靶标，Liang [ 14 ] 等人的研究表明在胃癌中TOP2A基因扩增与HER2基因扩增显着相关。NEK2基因编码参与有丝分裂调控的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，控制有丝分裂细胞中的中心体分离和双极纺锤体形成以及减数分裂细胞中的染色质凝缩，在G2/M过度时调节PLK1活性以及CDK介导的磷酸化。PLK1基因编码的Ser/Thr蛋白激酶属于CDC5/Polo亚家族。它在有丝分裂过程中高度表达，并且在许多不同类型的癌症中均发现其水平升高。癌细胞中这种蛋白质的消耗会显着抑制细胞增殖并诱导凋亡。Chen等人 [ 15 ] 发现PLK1基因敲减与细胞周期蛋白B表达增加，cdc2活性增加(但与表达水平无关)，G2/M处的胃癌细胞蓄积，有丝分裂纺锤体形成不当，染色体分离延迟以及胞质分裂滞后或停滞有关。PLK1表达受阻可能导致胃癌细胞有丝分裂减少甚至凋亡，揭示PLK1可能是胃癌的重要治疗靶点。端粒酶(TERT)是大多数真核生物中染色体末端复制必不可少的核糖核酸酶。在祖细胞和癌细胞中活跃。在正常的体细胞中无活性或极低活性端粒酶全酶复合物的催化成分，其主要活性是通过充当逆转录酶来延长端粒，该逆转录酶通过在酶的RNA成分内复制模板序列，在染色体末端添加简单的序列重复。Yasui等人 [ 16 ] 通过逆转录聚合酶链反应在人胃癌和非肿瘤性黏膜中检测了TERT和其他端粒酶成分的表达，研究发现与相应的非肿瘤性粘膜相比，肿瘤性粘膜表现出TERT表达增加和端粒酶活性升高，在免疫组织化学中，在所有癌组织的肿瘤细胞核中均检测到TERT蛋白的强表达，而在非肿瘤性粘膜细胞以及基质成分(淋巴细胞除外)中，TERT的表达弱或阴性。这些发现表明，与端粒酶活性相关的TERT表达增加可能是诊断胃癌的新标志。TFF2是三叶因子家族(TFF)域肽中的成员之一，TFF成员在肠粘膜防御和修复以及肿瘤发生中起作用，Leung等人 [ 17 ] 的研究表明TFF1和TFF2表达之间存在显着相关性，可能与多步胃癌发生途径的早期阶段有关。TPX2主要参与有丝分裂细胞周期，细胞凋亡，细胞周期以及激活蛋白激酶活性等生物过程，Heidebrecht等人 [ 18 ] 研究发现TPX2 (p100)可能被证明是一种更可靠的细胞增殖指标，并且与癌症的预后更加紧密相关。BLM是一种蛋白质编码基因，参与DNA复制和修复。Broberg等人 [ 19 ] 研究发现BLM复合物中的某些多态性是一般的癌症易感性标志物，并且可能参与了几种细胞类型的肿瘤转化。FOXM1基因编码的蛋白质是参与细胞增殖的转录激活因子，调节DNA复制和有丝分裂所必需的细胞周期基因的表达。在控制细胞增殖中发挥作用。Kim等人 [ 20 ] 的研究结果表明在人类肿瘤衍生的众多细胞系中发现了Foxm1水平升高。在多种人类肿瘤中还发现Foxm1蛋白的表达增加，包括肝细胞癌，基底细胞癌，乳腺腺癌，星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，表明Foxm1调节各种人类癌症中的细胞增殖。IFNG基因编码可溶性细胞因子，由被特定抗原或有丝分裂原激活的淋巴细胞产生。IFNG (干扰素γ)除具有抗病毒活性外，还具有重要的免疫调节功能。它是巨噬细胞的有效活化剂，对转化细胞具有抗增殖作用，并且可以增强I型干扰素的抗病毒和抗肿瘤作用。MMP1编码基质金属肽酶，Tsuchiya等人 [ 21 ] 的研究表明MMP-1启动子中多态性位点的2G等位基因比1G等位基因具有更高的转录活性。携带MMP-1的11q22等位基因失衡经常在各种癌症中观察到，可能与晚期疾病有关，并且与癌症的侵袭和转移有关。CDK1 (细胞周期蛋白依赖性激酶1)，通过调节中心体周期以及有丝分裂的发生，在控制真核细胞周期中起关键作用；通过与多个相间周期素相关联，促进G2-M过渡，并调节G1进程和G1-S过渡。Johnson等人 [ 22 ] 的研究证实了CDK2和CDK1抑制剂在癌症治疗中的治疗潜力。CDK2敲减导致G1积累，而CDK1耗竭导致G2/M减慢，而双CDK1/2耗竭导致抗雌激素敏感和耐药的细胞进一步G2/M积累和细胞死亡，从而确认CDK2和CDK1是乳腺癌的靶标癌症治疗。EXO1 (核酸外切酶1)是参与错配修复系统的重要核酸酶，有助于维持基因组稳定性，调节DNA重组和介导细胞周期停滞。TIAM1是与T淋巴瘤的转移相关的基因， 该基因在细胞侵袭，转移和癌变中起重要作用。Liu等人 [ 23 ] 通过研究抑制TIAM1表达对直肠癌细胞增殖和转移的影响，发现TIAM1在结直肠癌的转移中确实起着因果作用。Bau等人 [ 24 ] 的研究发现EXO1中潜在的多态性可能会通过影响EXO1的修复活性而改变癌症风险，进而推测EXO1中的单核苷酸多态性(SNPs)可能与胃癌的风险有关。