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user: 3. 结果与分析 3.1. 1、2、3年生“北林雄株2号”插穗不定根生根 本研究所用的插穗来源于山东冠县国营苗圃的杨树杂交三倍体新品种 “北林雄株2号”。图1显示来自不同年龄(1、2、3年生)母株的茎插穗在经过5天的栽培后不定根的生根情况。1年生插穗下部观察到明显的较长的不定根，而2年生插穗上观察到较短的不定根，3年生插穗只有根原基出现。此外，1年生插穗呈现绿色，而2、3年生插穗与1年生的相比显示出黄褐色，并且较为干枯。形态学观察表明1年生插穗生根能力最强。 图1. 1、2、3 年生不同年龄母株杂交三倍体杨树“北林雄株2号”插穗扦插五天后的生根情况 3.2. 数据产出统计 样本双端测序数据来自Illumina平台。鉴于数据错误率对结果的影响，我们采用Trimmomatic [ 6 ] 软件对原始数据进行质量预处理，并对整个质控过程中的reads数进行统计汇总。质量预处理步骤：去接头 (Adaptor)，去除低质量Reads，从3’端及5’端以不同方式去除低质量碱基，统计原始测序量、有效测序量、Q30、GC含量，并进行综合评价。本研究共有3个样品，分别为1、2、3年生的扦插五天的插穗，简称为D5_1、D5_2、D5_3，各样本的原始数据Q30分布在 96.06%~96.60%，有效数据量分布在7.03~7.07 G，平均GC含量为44.16 % (表1)。 Table 1 The results of sequencing data quality preprocessin Sample raw reads raw bases clean reads clean bases Valid bases (%) Q30 (%) GC (%) D5_1 49，088，622 7，363，293，300 48，425，840 7，052，914，610 95.78 96.60 44.15 D5_2 49，290，980 7，393，647，000 48，430，534 7，031，920，975 95.11 96.14 43.90 D5_3 49，403，722 7，410，558，300 48，506，858 7，069，986，952 95.40 96.06 44.43 表1. 测序数据质量预处理结果一览表 3.3. 常见功能数据库注释 在本研究中，3个样品共拼接出Unigene 38，321条，总长度为43，432，678 bp，平均长度为1133 bp。Unigene的数据库注释结果如下：28，984个(75.63%)基因注释到NR库，27，039个(70.56%)基因注释到 eggNOG库，21，268个(55.50%)基因注释到Swissprot库，19，163个(50.01%)基因注释到GO库，15，673个(40.90%)基因注释到KOG库，10，592个(27.64%)基因注释到KEGG库。此外，还有55个(0.14%)基因注释到Pfam库(表2)。其中，注释到NR和eggnog数据库的基因最多，注释到NR、eggNOG、Swissprot和GO数据库的基因均超过了总基因数的50%。 Table 2 Summary for the BLASTx results of Populus “Beilinxiongzhu 2” transcriptome against six database 注释数据库 注释基因数 基因比例(%) NR 28，984 75.63 eggNOG 27，039 70.56 Swissprot 21，268 55.50 GO 19，163 50.01 KOG 15，673 40.90 KEGG 10，592 27.64 Pfam 55 0.14 表2. “北林雄株2号”转录组数据注释结果统计 图2对各数据库共同注释的基因进行了统计。结果显示，被3个及以上数据库同时注释的基因达到22，760个(59.39%)，其中14，860个(38.78%)基因同时注释到5个及以上数据库，表明基因注释的可信度较高。 图2. 各数据库注释统计图。上方柱状图上的数字代表下方对应矩阵中加黑点数据库的交集，左边的柱子代表各数据库注释到基因总数 3.4. 主成分分析 利用Unigene的表达量进行主成分分析(Principal Component Analysis， PCA)，考察样品分布情况，对样本间关系进行探究或者对实验设计进行验证。PCA可以从不同维度展现样品间的关系。样本聚类距离或者PCA距离越近，说明样本越相似。不同组样本分布在二维的不同区域，同组的样品在空间分布比较集中。由图3可知，3个数据点处于不同象限，可清晰地被PC1 (81%)分离，并进一步被PC2 (19%)分离，说明实验设计合理。此外，1、2年生的插穗样品和3年生的插穗样品之间差距较大，而1年生和2年生的插穗样品间较为相似。 图3. 主成分分析图。主成分分析图显示方差最主要的组成部分。PC1表示主成分1 (81% 的方差贡献率)，PC2表示主成分2 (19%的方差贡献率) 3.5. 差异Unigene筛选 将三组数据进行两两比较，并将差异基因以柱形图、维恩图和火山图进行统计和分析(图4)。在D5_2/D5_1、D5_3/D5_1、D5_3/D5_2三组中，差异上调表达基因数目分别为972，1670，1418个，差异下调表达基因数目分别为1292，918，877个(图4(a))。维恩图显示，三个比较组的共同差异表达基因有52个(图4(b))。火山图可以显示差异基因的整体分布情况。图中，红色为显著上调的差异基因，绿色为显著下调的差异基因，灰色为无差异基因。X轴的绝对值越大，差异倍数越大；Y轴数值越大表明差异越显著。如图4(c)~(e)所示，D5_2/D5_1组下调表达基因最多，而D5_3/D5_1组上调表达基因最多。三组中只有D5_2/D5_1组下调表达基因多于上调表达基因。与D5_2/D5_1相比，D5_3/D5_1和D5_3/D5_2 中差异倍数较大(X > 5)、显著性较大(Y > 5)的基因数目明显增多，说明3年生样品与1年生、2年生插穗之间差异更大，与PCA结果一致。 图4. (a) 各比较组中显著上调和下调基因数统计；(b) 差异表达基因维恩图；(c)~(e) D5_2/D5_1、D5_3/D5_1、D5_3/D5_2差异基因表达火山图。灰色为无差异基因，红色为显著上调的差异基因，绿色为显著下调的差异基因；X轴为log 2 Fold change，Y轴方向为log 10 P value的展示 3.6. 差异Unigene GO富集分析 使用Gene Ontology数据库对三组差异基因进行功能显著性富集分析。分析发现，在D5_2/D5_1、D5_3/D5_1、D5_3/D5_2三个比较组中，差异上调表达基因主要有105、83和73个显著富集条目，差异下调表达基因主要有106、126、101个显著富集条目。 与1年生杨树插穗相比，2年生样品中差异上调表达基因在氧化磷酸化、线粒体电子传递、呼吸链、细胞色素c氧化酶活性等功能富集，差异下调表达基因在油菜素内酯的合成、乙烯激活信号通路、水杨酸介导的信号通路等功能富集(图5(a))。3年生与1年生插穗相比，差异上调表达基因在木葡聚糖代谢、类黄酮生物合成、植物型细胞壁等功能富集，差异下调表达基因在乙烯激活信号通路、赤霉素生物合成、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、蛋白质水解调节等功能富集(图5(b))。3年生插穗与2年生插穗相比，差异上调表达基因在木聚糖代谢过程、乙烯激活信号通路、过氧化氢分解过程、植物型细胞壁等功能富集，差异下调表达基因在有氧呼吸、呼吸电子传递链、蛋白质水解的调节、细胞色素c氧化酶活性等功能富集(图5(c))。综上所述，不同年龄的杨树插穗材料在不定根生根时，呼吸作用、植物激素信号转导、细胞壁合成和蛋白质代谢可能是影响不定根生根的主要因素。 图5. GO富集top 30条形图。(a)：D5_2/D5_1；(b)：D5_3/D5_1；(c) D5_3/D5_2。图中X坐标为GO条目名称，Y坐标为-log 10 P value 3.7. 差异Unigene KEGG富集分析 KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，利用KEGG数据库对差异Unigene进行Pathway分析，通过Pathway分析可以找到显著富集差异Unigene的Pathway条目，寻找不同样品的差异Unigene可能和哪些细胞通路的改变有关。 在D5_2/D5_1、D5_3/D5_1、D5_3/D5_2三个比较组中，差异表达基因在KEGG Level 2水平主要注释到以下几个代谢通路：信号转导、能量代谢、翻译、糖代谢、其他次生代谢产物的生物合成、氨基酸代谢、运输和分解代谢。这些结果表明，随着母株年龄的增长，插穗的内源激素、总糖、次生代谢产物、蛋白质等的含量发生了变化，对不定根生根产生了影响(图6(a)~(c))。 图7中，X轴为富集分值，气泡越大的条目包含的差异Unigene数目越多，气泡颜色由紫-蓝-绿-红变化，表明其富集P value值逐渐变小，显著程度逐渐增大。由KEGG pathway富集分析可知，植物激素信号转导(ko04075)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500)、苯丙烷类生物合成(ko00940)、类黄酮生物合成(ko00941)、氨基糖和核苷酸糖代谢(ko00520)、核糖体(ko03010)、碳代谢(ko01200)是共同显著富集的代谢途径(图7(a)~(c)、表3)。 在D5_2/D5_1组中，差异基因富集的KEGG通路下调基因明显多于上调基因，而D5_3/D5_1、D5_3/D5_2组中差异基因富集的KEGG通路上调基因明显多于下调基因(表3)。这些结果表明，2年生的插穗和1年生插穗相比，植物激素信号转导、淀粉和蔗糖以及氨基酸代谢、次生代谢产物合成等代谢途径起到了抑制作用，而3年生插穗和1年生插穗相比、3年生插穗和2年生插穗相比，这些代谢途径起到了促进作用。 3.8. 差异共表达Unigene分析 在D5_2/D5_1、D5_3/D5_1、D5_3/D5_2三个比较组中，差异共表达的基因共有52个(图4(b))。其中共下调表达的基因有5个(表4)，共上调表达的基因有4个(表5)，其他基因呈现出先上调后下调或先下调后上调的趋势。 Table 3 KEGG differential gene enrichment pathwa id Term D5_2/D5_1 D5_3/D5_1 D5_3/D5_2 up down P-value up down P-value up down P-value ko00940 Phenylpropanoid biosynthesis 6 24 4.74E−13 22 7 9.03E−15 21 2 7.48E−09 ko00941 Flavonoid biosynthesis 1 7 1.05E−04 9 1 2.40E−07 8 0 4.78E−05 ko04075 Plant hormone signal transduction 9 13 2.86E−02 22 11 3.62E−08 18 7 1.12E−03 ko00500 Starch and sucrose metabolism 8 10 3.56E−03 24 8 1.67E−09 27 9 1.54E−10 ko00520 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 6 6 1.17E−03 14 2 8.90E−04 15 4 1.67E−04 ko01200 Carbon metabolism 2 8 2.43E−05 7 5 7.53E−04 9 6 6.32E−03 ko03010 Ribosome 36 19 2.83E−06 3 2 2.32E−04 3 14 7.33E−05 表3. KEGG差异基因富集pathway 图6. 上下调差异表达Unigene在KEGG Level 2水平分布图。(a) D5_2/D5_1；(b) D5_3/D5_1；(c) D5_3/D5_2 图7. KEGG富集top 20气泡图。(a) D5_2/D5_1；(b) D5_3/D5_1；(c) D5_3/D5_2 Table 4 Differentially co-down-regulated gene Gene id NR id NR annotation KEGG description Pathway TRINITY_DN20971_c0_g1_i1 gi|743820744| PREDICTED: probable carboxylesterase 17 [Populus euphratica] - - TRINITY_DN21087_c0_g1_i1 gi|743850687| PREDICTED: ethylene-responsive transcription factor 1B-like [Populus euphratica] ethylene-responsive transcription factor 1 ko04075 TRINITY_DN24672_c0_g1_i1 gi|566156925| hypothetical protein POPTR_0002s08430g [Populus trichocarpa] - - TRINITY_DN27792_c0_g1_i3 gi|566163504| hypothetical protein POPTR_0003s19170g [Populus trichocarpa] - - TRINITY_DN29358_c0_g2_i2 gi|224132940| no apical meristem-like family protein [Populus trichocarpa] - - 表4. 差异共下调表达基因 Table 5 Differentially co-up-regulated gene Gene id NR id NR annotation KEGG description pathway TRINITY_DN17301_c0_g1_i2 gi|743846459| PREDICTED: kirola-like [Populus euphratica] - - TRINITY_DN17739_c0_g1_i2 gi|566199338| hypothetical protein POPTR_0013s04040g [Populus trichocarpa] - - TRINITY_DN20139_c0_g2_i1 gi|743899685| PREDICTED: peroxidase 64-like [Populus euphratica] peroxidase ko00940 TRINITY_DN21486_c0_g1_i2 gi|224091096| POPTR_0006s10750g [Populustrichocarpa] - - 表5. 差异共上调表达基因 共下调表达的基因中，TRINITY_DN21087_c0_g1_i1是响应乙烯的转录因子。APETALA 2/ETHYLENE RESPONSE FACTORS (AP2/ERFs)家族是植物最大的转录因子调控家族之一 [ 14 ]，家族成员可以分为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist 5个亚家族。其中ERF可通过参与乙烯介导的信号转导途径参与基因表达调节，进而参与植物发育的多个进程。在杨树中，PtaERF003基因表达的上调促进了不定根生长 [ 15 ]。共上调表达的基因中，TRINITY_DN20139_c0_g2_i1基因功能为过氧化物酶，应答氧化应激胁迫并参与生长素的代谢。过氧化氢可通过二胺氧化酶增加不定根的生成 [ 16 ]，过氧化物酶的增加可导致过氧化氢含量下降，从而抑制不定根的形成。