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user: 3. 结果与讨论 3.1. 单因素实验结果 乙醇体积分数、提取温度、提取时间和料液比对石榴皮多酚提取率的影响如图1所示。 由图1可知，乙醇体积分数为70%时，多酚的提取率最大，为9.86%，提取温度在55℃左右提取率维持在9.73%左右；当提取时间为4 h时多酚的提取率为9.86%，料液比为1:20 (g/mL)时，多酚提取率最大。四个因素对石榴皮多酚提取率的影响较明显。因此可确定正交试验的因素和水平。 3.2. 最佳工艺条件的确定 正交试验结果如表2所示。 使用SPSS 22.0进行方差分析，结果如表3所示。 由表2极差分析可见，影响提取的因素大小为：料液比 > 提取时间 > 乙醇体积分数 > 提取温度，最佳提取条件为A 3 B 3 C 3 D 3 时即乙醇体积分数80%、提取温度60℃、料液比1:30 (g/ mL)、提取时间5 h。 从表3方差分析可知，料液比和提取时间对石榴皮多酚的提取影响显著，乙醇体积分数和提取温度 图1. 不同因素对石榴皮多酚提取率的影响 Table 2 Orthogonal experimental design and results of polyphenol extraction process from pomegranate pee 试验号 因素 提取率/% A乙醇体积分数/% B提取温度/℃ C料液比/g∙mL −1 D提取时间/h 1 1 1 1 1 7.41 2 1 2 2 2 10.52 3 1 3 3 3 11.64 4 2 1 2 3 11.13 5 2 2 3 1 10.2 6 2 3 1 2 8.66 7 3 1 3 2 12.00 8 3 2 1 3 9.31 9 3 3 2 1 10.45 K 1 9.86 10.18 8.46 9.35 K 2 9.99 10.01 10.70 10.39 K 3 10.59 10.25 11.28 10.69 R 0.73 0.24 2.82 1.34 表2. 石榴皮多酚提取工艺的正交实验设计及结果 Table 3 Analysis of variance of orthogonal tests of polyphenol extracted from pomegranate pee 来源 第Ⅲ平方和 自由度 平均值平方 F P 显著性 修正的模型 17.174 a 6 2.862 62.634 0.016 * 截距 926.594 1 926.594 20275.571 0.000 乙醇体积分数 0.901 2 0.450 9.853 0.092 料液比 13.306 2 6.653 145.584 0.007 ** 提取时间 2.967 2 1.484 32.464 0.030 * 错误 0.091 2 0.046 总计 943.859 9 校正后总数 17.266 8 表3. 石榴皮多酚提取的正交试验的方差分析 a. R 2 = 0.995 (调整的R 2 = 0.979)；*表示差异显著；**表示差异极显著。 对石榴皮多酚的提取影响不显著。为了节约成本，确定石榴皮多酚的提取的最佳组合为A 2 B 2 C 3 D 3 即乙醇体积分数70%、提取温度55℃、料液比1:30 (g/mL)、提取时间5 h。在最佳组合提取条件下，进行三次重复验证试验，得石榴皮多酚提取率为12.68%。 3.3. 树脂的筛选 5种树脂对石榴皮多酚对石榴皮粗提取液总多酚的吸附量、吸附率、解析率以及回收率见表4。 由表4看出DM130具有最高的吸附率和解析率分别为85.00%、71.93%，回收率是75%，相比其他几种的大孔树脂都高，这可能与它本身较高的比表面积和较小的孔径以及合适的表面积结构有关，所以选定 DM130分离和纯化石榴皮多酚。 3.4. 大孔吸附树脂动态吸附与解析 当流出液的多酚质量浓度ρf (mg/mL)达到其上样液的10%时即认为多酚已达泄露点。以ρf对流出液体积(V)作图，同一浓度的上样液以2 BV/h流速上柱后的动态吸附曲线见图2。 由图2可知，上样量从2 BV时开始有较大幅度的多酚泄露，之后随着上样量的不断增大，泄漏量也逐渐增加，到了10 BV之后，流出液的多酚浓度(0.25 mg/mL)已经超过上样液(2 mg/mL)的10%浓度了，即已达到泄漏点。达到12 BV，上样完毕。一般而言，上样量越小，流出液多酚浓度就越低，吸附率会越高，上样量多会导致纯化周期延长，使效率降低 [ 9 ] [ 10 ] 。综合考虑，5 g树脂选择上样量为12 BV是适宜的。 由图3可知，当70%乙醇洗脱剂的用量为1 BV时，多酚的解析量不大，此时洗脱剂中的多酚浓度为0.41 mg/mL，随后洗脱剂的用量逐渐增加，多酚浓度也逐渐增大，在洗脱剂用量为3 BV时，洗脱剂中的多酚含量是最大的，为40.17 mg/mL。绝大部分的多酚在洗脱剂的用量为5 BV时洗脱下来，所以乙醇洗脱剂的用量为5 BV。 Table 4 Static Adsorption Performance of Five Macroporous Adsorption Resin 树脂型号 极性 吸附量(mg/g) 吸附率(%) 解析率(%) 回收率(%) D101 非极性 95.38 76.30 87.29 66.60 DM130 非极性 106.25 85.00 88.26 75.00 AB-8 弱极性 102.25 81.80 83.86 68.60 NKA-9 极性 98.38 78.70 80.30 63.20 S-8 极性 103.88 83.10 87.12 72.40 表4. 5种大孔吸附树脂静态吸附性能 图2. 石榴皮多酚吸附曲线 图3. 石榴皮多酚解析曲线 纯化后石榴皮多酚纯度是90.56%，比纯化前的20.58%提高了69.98%。可见，采用大孔吸附树脂纯化效果较好。 3.5. 多酚的性质鉴定 3.5.1. 特征颜色反应 分别取石榴皮粗提物(样品1)和大孔吸附树脂纯化物(样品2)，加入显色剂，通过观察颜色变化对样品定性分析。实验结果如表5所示。 由表5可见石榴皮粗提物和多酚纯化物里面都含有黄酮类物质的结构特征C 6 ¯ C 3 ¯ C 6 ，此外也都含有酚羟基，所以初步判断提取物及纯化物中都含有多酚类物质。 3.5.2. 紫外光谱分析 在200~400 nm波长范围内扫描器紫外可见光谱，结果如图4所示。 由图4可见，石榴皮粗提物、大孔吸附树脂纯化物在260 nm处都具有吸收峰，符合多酚类物质苯甲酰结构紫外光谱吸收特点。在300~400 nm间也有吸收峰，但紫外吸收不明显，这说明黄酮类化合物I带吸收弱，表明含有少量的黄酮类物质。 3.6. 石榴皮多酚的抗氧化性分析 3.6.1. 对DPPH的清除作用 石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物和对DPPH自由基清除作用见图5。由图5可知，石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物在一定范围内随着质量的提高，清除自由基的能力也逐渐增强，其剂量效应整体呈较好的直线关系，图中显示多酚纯化物的自由基清除率为14%~51%左右，维生素C的清除率在25%~59%，二者相差不大，多酚粗提物的自由基清除率表现为最低，这与时双千 [ 10 ] 的结果相似。说明石榴皮多酚具有较强的自由基清除能力，即具有较好的抗氧化性。 3.6.2. 对羟自由基的清除能力 石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物和对羟基清除作用见图6。由图6可知，石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物在一定范围内随着质量的提高，对羟自由基清除作用也逐渐增强，多酚纯化物对羟自由基清除率为20%~25%，多酚粗提物的最差，为13%~18%。维生素C的羟基清除率明显高于石榴皮多酚的清除率，说明石榴皮多酚对羟自由基的清除率不如维生素C效果好。