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user: 3. JNK信号通路与脑缺血再灌注损伤细胞凋亡 细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的，由基因精确调控的程序性死亡方式，是一种重要的机体自稳态调控机制。JNK作为MAPK信号级联途径中的重要一环，在CIRI诱导的神经细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用 [ 13 ]。ZHU等 [ 14 ] 发现短暂性全脑缺血再灌注引起大鼠海马 CA1区GluK6的泛素化水平持续升高，使其与MLK3的结合增加，下游JNK3被过度激活，可能是缺血再灌后神经元凋亡的原因。ZHEN等 [ 15 ] 通过缺血2 h、再灌注22 h构建了小鼠局灶性CIRI模型，发现假手术组p-JNK表达很低，CIRI组大脑皮质和海马区p-JNK表达急剧上升，抑制JNK的激活可改善CIRI大鼠的神经行为功能，缩减脑组织的梗死面积。这些结果表明，JNK信号通路的激活参与了CIRI，但具体机制尚未阐述透彻。目前的研究表明CIRI通过JNK信号通路诱导神经元凋亡主要涉及三条路径：线粒体途径、死亡受体途径、内质网途径。 3.1. 线粒体途径 JNK可通过非转录依赖的方式直接调控细胞质内靶蛋白的活性而介导细胞凋亡。一部分活化的JNK 留在细胞质中，通过磷酸化Bcl-2家族成员而介导线粒体途径细胞凋亡的发生，此过程并不促进基因的转录表达。Bcl-2家族成员根据其结构和功能的差异性可分为3类，即Bcl2、Bcl-xl、Bcl-w等抗凋亡蛋白，Bax、Bak、Bok等促凋亡蛋白以及Bid、Bim、Bad、Puma等BH3-only蛋白。其中Bax是线粒体通路的主要效应者。活性JNK能磷酸化直接激活Bax，也能磷酸化接头蛋白14-3-3和Bcl-2家族的Bcl-2、Bim、Bid、Bad等成员而间接激活Bax。活化的Bax发生构象改变形成寡聚体并整合到线粒体外膜上，使之通透性增加，释放位于线粒体双层膜间的细胞色素C (Cytc)、细胞凋亡诱导因子(AIF)、Smac/DIABLO、核酸内切酶G (EndoG)等促凋亡的线粒体蛋白。在ATP/dATP存在的情况下，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域(CARD)募集胞质中的Caspase-9前体，经过其自身剪切活化并启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋。Smac/DIABLO可解除凋亡抑制蛋IAPs对Caspase的抑制，启动caspase依赖的线粒体途径的细胞凋亡。AIF和EndoG则能入核直接裂解DNA并引起染色质凝聚，通过非caspase依赖的线粒体途径介导细胞凋亡。 WANG等 [ 16 ] 构建了大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型，发现活化的JNK1/2会诱导Bad丝氨酸128位点发生磷酸化，导致与接头蛋白14-3-3的结合减弱，游离的Bad与线粒体膜上Bcl-Xl结合，使Bim等BH3-only蛋白得到释放，最后激活Bax而改变线粒体膜结构引起凋亡。CHO等 [ 17 ] 构建了沙土鼠短暂性全脑缺血再灌注模型，运用TUNEL、Western blot、免疫组织化学染色和免疫荧光等技术检测沙土鼠的组织标本。结果显示伴随caspase-3、Bax表达增加，海马CA1区TUNEL阳性细胞比例增多，同时Bcl-2表达下降。ZHANG等 [ 18 ] 用人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)构建了缺氧/复氧(H/R)模型，得到了相似的结果，从体外验证了H/R同样可以启动线粒体途径介导的细胞凋亡。 3.2. 死亡受体通路 JNK通过转录依赖的方式介导死亡受体途径及线粒体途径的细胞凋亡。活化的JNK从细胞质转移入核，通过磷酸化激活c-Jun、c-Fos、Elk-1、ATF-2等转录因子而实现对凋亡相关基因的表达调控。活化的JNK入核后激活相关转录因子诱导肿瘤坏死因子(TNF)、FasL等死亡配体的表达而启动死亡受体通路的细胞凋亡：① TNF→肿瘤坏死因子受体(TNFR)→肿瘤坏死因子受体I型相关死亡结构域蛋白(TRADD)→含有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)→caspase8→细胞凋亡，② FasL→Fas→死亡诱导信号复合物(DISC)→caspase8→caspase3→细胞凋亡；活性JNK入核后也能激活相关转录因子诱导Bim、Bid、DP5等BH3-only蛋白的表达，进一步激活Bax等促凋亡效应蛋白，从而启动线粒体通路的细胞凋亡。 Yu等 [ 19 ] 发现大鼠局灶性脑缺血灌注会诱导GluR6-PSD95-MLK3信号传导模块的组装，促进JNK激活，从而上调FasL的转录表达，同时也促使Bax向线粒体移位，引起细胞色素C的释放和caspase-3的激活，最终引起海马CA1区的神经细胞凋亡。抑制FasL/Fas信号通路的基因表达可以减轻脑缺血再灌注带来的损伤 [ 20 ]。GUAN等 [ 21 ] 在大鼠全脑缺血再灌注损伤模型中发现海马CA1区DP5蛋白的表达水平提高，免疫共沉淀显示Bcl-2与DP5结合增强，而与Bax的结合减弱，推测激活的JNK通过促进DP5的表达，解除了Bcl-2对Bax的结合抑制， 使Bax转移至线粒体引起细胞凋亡。 3.3. 内质网通路 近年越来越多研究表明，内质网应激(ERS)参与缺血性脑卒中的发生发展。内质网是真核细胞内合成及修饰蛋白质、脂类及糖类，贮存和释放钙离子的重要场所。正常情况下，内质网应激作为一种适应性保护反应可被诸多物理、化学及生物性刺激触发，并引起未折叠蛋白反应(UPR)，进一步激活蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、需肌醇激酶1 (IRE1)、活化转录因子6 (ATF6)三条信号通路，减少蛋白质的合成，加速未折叠蛋白的降解及正确折叠以减轻内质网压力，恢复内质网稳态，促进细胞存活 [ 22 ]。但是脑缺血再灌注后，神经细胞内钙超载、兴奋性氨基酸细胞毒性作用、大量自由基生成及炎性反应等持久强烈的病理性因素诱发过度的ERS并进一步激活细胞的程序性死亡途径，引起细胞凋亡，加重缺血缺氧损伤。对此，ZHAO等 [ 23 ] 研究证实ERS参与了脑缺血再灌注后JNK介导的神经元凋亡。 众多研究表明需肌醇酶1 (IRE1)-肿瘤坏死因子相关因子2 (TRAF2)-细胞凋亡信号调节激酶1 (ASK1)-JNK信号通路在内质网应激介导细胞凋亡中发挥重要作用，过强的内质网应激反应激活IRE1，活化的IRE1又募集TRAF2，然后与ASK1形成IRE1－TRAF2－ASK1复合物，激活JNK诱导细胞凋亡 [ 24 ]。CHEN等 [ 25 ] 采用双侧颈总动脉结扎法诱导大鼠CIRI，经过蛋白质组学分析，发现神经元的凋亡与 IRE1/TRAF2复合体的形成以及JNK1/2的持续激活密切相关。 葡萄糖调节蛋白(GRP78)是重要的内质网伴侣分子，对维持内质网稳态具有重要作用。正常情况下，GRP78与IRE1、ATF-6、PERK结合而处于无活性状态，发生ERS时，与三者解离转而结合未折叠蛋白，协助蛋白质的正确折叠。脑缺血早期UPR介导的GRP78表达增加，对神经细胞具有保护作用，诱导GRP78 的表达可以减轻神经元的凋亡 [ 26 ]。长期过强的应激使内质网自稳功能失调，GRP78合成减少，细胞发生凋亡 [ 27 ]。李建民等 [ 28 ] 缺血再灌注早期GRP78与JNK表达趋势一致，后期出现GRP78表达持续下降，而JNK表达依然增高，应用SP600125抑制JNK活性后，GRP78表达增加。推测持久过强的ERS降低了GRP78的表达，释放出大量游离的IRE-1，促使IRE1-TRAF-2–ASK1复合体形成，激活JNK，介导细胞凋亡。