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user: 2. 实验部分 2.1. 主要仪器和试剂 Bruker Smart APEX II CCD单晶X-射线衍射仪(德国Bruker公司)，Bruker AV500型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)，Agilent质谱仪(美国Agilent公司)；Varian 640-IR傅立叶变换红外光谱仪(安捷伦公司)，Sarteorius-BS110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，WRS-1B数字熔点仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)，Vario ELIII型元素分析仪(德国Elementar公司)。SW-CJ-1F博讯超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；YXQ-SL-100G博讯高压蒸汽灭菌锅(上海东亚压力容器制造有限公司)；LRH-250生化恒温培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)；DHG-9246A精宏电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。 图1. 目标化合物的合成路线图 化学试剂：吡啶-2，6-二(4-氨基-1，2，4-三氮唑-5-硫醇) 参照文献 [ 19 ] 制备，苄溴及氯乙酸甲酯等均购自山东西亚化学工业有限公司，其余试剂均为市售分析纯，实验前未作纯化处理。 供试菌种：大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 8739)，白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CICC 10786)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)。 2.2. 2，6-吡啶-二(4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫醚) (化合物2)的合成 化合物2a的合成参照文献 [ 20 ] 进行，在100 mL二口瓶中加入2，6-二(4-氨基-1，2，4-三氮唑-5-硫醇) 3.073 g (0.01 mol)、氢氧化钾1.127 g (0.02 mol)和水60 mL，搅拌至完全溶解后冰浴下缓慢滴加氯乙酸甲酯2.5 mL，反应4 h后薄层析(V 乙醇 :V 乙酸乙酯 = 1:5)跟踪至反应结束，析出大量的白色固体，抽滤，用水反复洗涤。固体烘干即得粗产物，用1:1的无水乙醇–乙酸乙酯重结晶即得白色粉末固体产物2a。 吡啶-2，6-二(4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫代乙酸甲酯)(化合物2a)：白色粉末，产率71%，m.p.: 170˚C~171˚C。 1 H NMR (DMSO-d6， 500 MHz) δ: 1.21~1.24 (t， 6H， -CH 3 )， 4.15 (m， 4H， -CH 2 -)， 6.43 (s， 2H， -NH 2 )， 8.14~8.17 (m， 2H， PyH). 13 C NMR (DMSO-d6， 125 MHz，) δ: 168.9， 154.3， 152.5， 146.7， 139.1， 123.4， 61.7， 33.0， 14.5. ESI-MS， m/z: 474.08[M + Na] + . IR(KBr)， n， cm −1 : 3426.47， 3340.40， 3180.39， 2982.51， 2934.08， 1741.96， 1724.22， 630.44， 1589.47， 1573.63， 1506.58， 1461.51， 1422.80， 1372.97， 1361.91， 1304.44， 1257.66， 1207.66， 1175.60， 1144.70， 1112.11， 1044.98， 1021.99， 991.42， 904.54， 864.18， 829.62， 789.77， 745.73， 713.27， 694.63， 673.63， 559.28。元素分析，C 15 H 17 N 9 O 4 S 2 ，实测值(计算值)，%：C 39.87 (39.90)，H 3.82 (3.80)，N 27.95 (27.92)。 化合物2b的合成：在100 mL二口瓶中加入2，6-二(4-氨基-1，2，4-三氮唑-5-硫醇) 3.073 g (0.01 mol)和 DMF 50 mL，加热下搅拌至完全溶解后加入碳酸钾2.764 g (0.02 mol)，搅拌至溶液呈现黄绿色后自然冷却至室温，再加入苄溴2.5 mL，室温搅拌反应4 h后薄层析(V 乙醇 :V 乙酸乙酯 = 1:5)跟踪至反应结束，将反应液倒入大量的水中，陈化片刻，析出大量的白色固体，抽滤，固体用水反复洗涤后烘干即得粗产物，用DMF重结晶即得白色固体颗粒，收集白色固体颗粒烘干即得产物2b。 吡啶-2，6-二(4-氨基-1，2，4-三氮唑-3-硫代苄溴) (化合物2b)：白色固体粉末，产率63%，m.p.: 150˚C~151˚C。 1 H NMR (DMSO-d6， 500 MHz) δ: 4.50 (s， 4H， -CH 2 -)， 6.40 (s， 2H， -NH 2 )， 7.26~7.29 (t， 2H， J = 15， PhH)， 7.32~7.36 (t， 4H， J = 20， PhH)， 7.48~7.50 (d， 4H， J = 10， PhH)， 8.16 (s， 3H， PyH)。 13 C NMR (DMSO-d6， 125 MHz) δ: 154.5， 152.2， 146.8， 139.2， 138.0， 129.6， 128.9， 127.9， 123.5， 34.8. ESI-MS， m/z: 510.13[M + Na] + . IR(KBr)， n， cm −1 : 3337.38， 3185.18， 3083.85， 3026.18， 1617.99， 1589.07， 1573.09， 1493.83， 1461.84， 1423.27， 1250.20， 1200.96， 1162.24， 1134.03， 1069.82， 1052.37， 1030.14， 991.22， 920.22， 821.93， 789.60， 769.88， 737.29， 702.61， 675.21， 560.79。元素分析，C 23 H 21 N 9 S 2 ，实测值(计算值)，%：C 56.70 (56.65)，H 4.32 (4.34)，N 25.91 (25.85)。 2.4. 单晶培养 取少许的化合物2b，用DMF加热溶解为饱和溶液，静止自然冷却，数天后即可析出大量的无色透明大颗粒晶体，收集晶体用于晶体结构测试。 2.5. 晶体结构的测定 选取尺寸大小适当的单晶置于Bruker Smart APEX II CCD衍射仪，以石墨单色化的CuKα (λ = 0.154184 nm)射线在低温下进行测试晶胞参数并收集晶体衍射数据。分子结构用SHELX-97程序进行解析和结构优化，用直接法解出非氢原子坐标，氢原子坐标由Fourier合成法得出，经各项异性修正，表1为化合物2b的主要晶体学数据和结构修正参数。 Table 1 Main crystal data and structure refinement for compound 2 参数 值 参数 值 经验分子式 C 23 H 21 N 9 S 2 Z值 8 相对分子质量(g/mol) 487.14 计算密度/(g/cm 3 ) 1.254 测试温度/K 293(2) 吸收系数μ (CuKa)/mm −1 0.092 辐射波长λ/nm 1.54184 单胞中电子数目F(000) 1836 晶系 单斜 晶体尺寸/mm 3 0.21 × 0.23 × 0.24 空间群 P21 扫描收集范围q/˚ 1.88~29.62 晶胞参数a/nm 1.15827(6) 极限指数 −14 ≤ h ≤ 15 b/nm 1.14176(5) −15 ≤ k ≤ 12 c/nm 3.4828(2) −28 ≤ l ≤ 44 α/˚ 90 最终偏离因子[I > 2σ (I)] R1 = 0.1594 β/˚ 91.380(4) Rw = 0.3678 γ/˚ 90 偏离因子(全部) R1 = 0.1744 体积V/nm 3 4.6045(4) wR2 = 0.3787 表1. 化合物2b的晶体结构测试条件及主要晶体学数据表 2.6. 抑菌活性测试 采用96孔板倍比稀释法测定化合物2a和2b的最低抑菌浓度(MIC)。细菌用LB培养，真菌用PDB液体培养。各供试菌株液体培养8 h，用0.5麦氏标准比浊法作对照，调整菌液浓度到1 × 10 5 cfu/mL的菌液待用。准确称取待测化合物2a及2b，分别用DMSO溶解配制成100 mg/mL母液，再用LB稀释成1 mg/mL工作液，采用倍比稀释法用LB依次稀释第1~11孔大待测物的浓度为：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125、0.9765625和0.48828125 μg/mL，第12孔为空白培养基对照，再分别加入100 μL浓度为1 × 10 5 cfu/mL菌液，细菌置于30˚C恒温箱中培养24 h，真菌置于28˚C恒温箱中培养24 h。培养结束后，比较检测组与空白对照组浑浊度差异，观察孔内无明显细菌生长且液体相对澄清、无沉淀，所含的药物浓度即为最低抑菌浓度(MIC)值。