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user: 2. 试验材料及方法 2.1. 试验材料 2.1.1. 植物材料 本试验所用到的山丹材料来源于内蒙古蒙草生态环境(集团)股份有限公司抗旱植物研究所。 2.1.2. miR396a和miR396f前体序列 miR396a和miR396f前体序列是本课题组在做山丹转录组测序得到的，其中miR396a前体序列长度210 bp，miR396f前体序列长度为504 bp，具体序列见表1。 2.1.3. 表达载体 本试验所用到的UBI-pCANBIA1301表达载体购自于北京信诺金达生物科技有限公司，该载体的启动子为Ubi启动子，标记基因为GUS基因，抗性基因为卡那霉素抗性基因，植物筛选标记基因为潮霉素抗性基因。UBI-pCANBIA1301质粒图谱见图1。 图1. UBI-pCANBIA1301质粒图谱 Table 1 miR396aand miR396f precursor sequenc 基因名称 序列(5’~3’) miR396a 前体 ggtccttcttgtattcttccacagctttcttgaactgcatccatccatggttgctgagatctgaattgcagttcaataaagctgtgggaaattacgagcagag accaaaagaagcagaattctaatcacaccgctgtatgtatcctttccctgtaagtcaacaattttatatatttttatttgatgctaaaattaacaattttgtattcc miR396f 前体 tgctcccatacctctctatctccatggatcccttcaagaatttggagccaaagaaagatcagtcagaaactagattgtggtatatatttttccacggctttcttgaactatgtaccc taatctattctccttctcatgcaattttccccttaaacaaaagggaaaatatggaatgaaaggaaaggcagatcattcggtgcacaattcaagaaagcagtggaaaaacatga cacatcttctccttcactcgcatcatccccagttgcaaaatgaggtttgatgccaaacaaattctctttctttcaaaatgagccgaggtttcctctgctctttaatttcaggtttcttgtg taatttactgctttttaatttcaagatatcattgctttatactgaattttctgctttgagattctgtcctgtttaaaactgtgtacataaggtatattatcatgaattta gattacctctcgaaactggatgaaattgaacttctgttttctc 表1. miR396a和miR396f前体序列 2.1.4. 菌株 本试验所用到的农杆菌EHA105菌株来自于北京市农林科学院蔬菜花卉研究所西瓜课题组，大肠杆菌菌株T1购自于北京TaKaRa公司。 2.1.5. 试剂 DNA提取试剂盒、PCR所用的反应体系以及卡那霉素和氨苄青霉素均购自于北京TaKaRa公司，切胶回收试剂盒、酶切连接用到的试剂以及BamHI酶和KpnI酶均购自北京宝生物工程有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒以及其他试剂则购北京自天根生化科技有限公司。 2.1.6. 培养基 LB液体培养基和固体培养基均是参照已有实验配方自行配制而成 [ 11 ] 。 2.2. 试验方法 2.2.1. 山丹总DNA提取 在无菌工作台中，取新鲜的山丹无菌苗的叶片，立即置于液氮中速冻，然后用DNA提取试剂盒，提取山丹叶片的总DNA。 2.2.2. miR396a和miR396f前体引物合成 引物设计运用DNAMAN，酶切位点确定运用VectorNTISuite7，参照UBI-pCAMBIA1301多克隆位点以及miR396a和miR396f前体的酶切位点，在基因片段的5'端引入BamHI酶切位点，在3'端引入KpnI酶切位点，并且在两端加保护碱基，交给华大基因合成引物，miR396a前体的引物扩增目的片段长度为227 bp，退火温度为60℃，miR396f前体的引物扩增目的片段长度为489 bp，退火温度为60℃，引物序列如下(大写字母部分为引入的酶切位点，划线部分为引入的保护碱基)： miR396a前体的正向引物：ataGGATCCggtccttcttgtattcttc miR396a前体的反向引物：ggGGTACCggaatacaaaattgttaat miR396f前体的正向引物：ataGGATCCttcaagaatttggagccaaag miR396f前体的反向引物：ggGGTACCgagaaaacagaagttcaatt 2.2.3. 百合miR396a和miR396f前体克隆 以山丹总DNA为模板，加入合成好的引物，进行PCR反应。反应体系为25 μL，其中模板1 μL、引物各1 μL、Mix 12.5 μL、ddH 2 O 9.5 μL。PCR反应程序为：95℃预变性4 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s共30个循环，72℃延伸7 min；4℃保存。 反应结束后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测及回收，电泳检测条带长度正确后，进行下一步试验。 2.2.4. miR396a和miR396f克隆载体构建 将切胶回收的miR396a和miR396f各取5 μL，分别与1 μL T1 Simple cloning Vector混合后，25℃反应5 min。结束后将此4 μL产物加入到100 μL的T1大肠杆菌感受态中，用冻融法进行转化后，加入250 μL室温的LB培养基，在37℃的条件下摇晃培养1 h。取8 μL 500 mM的IPTG和40 μL X-gal混合，均匀的涂在固体LB平板上，37℃放置30 min。然后将培养了1 h的转化后的T1大肠杆菌离心后取沉淀，涂在上一步制好的平板上，置于37℃下过夜培养12 h，进行蓝白斑筛选。 挑取白斑于10 μL的ddH 2 O中，取其中1 μL进行菌液PCR鉴定，其余9 μL加到具有抗性的500 μL LB液体培养基(含有氨苄青霉素50 mg/L)中，小摇6 h，取PCR鉴定中电泳条带长度为目的条带长度的菌液，进行测序鉴定miR396a和miR396f的单克隆载体构建成功。 2.2.5. miR396a和miR396f表达载体构建 双酶切连接时，先对T1-miR396a和、T1-miR396f和UBI-pCAMBIA1301质粒进行双酶切。双酶切体系为10× FastDigest Green Buffer 2 μL，质粒10 μL，FastDigest BamHI 1 μL，FastDigest KpnI 1 μL，加ddH 2 O到20 μL；配制好双酶切体系后混匀，37℃放置30 min，进行酶切反应，酶切后回收载体及目的片段。 再按照连接体系加入酶切产物，连接体系共20 μL，其中10× Reaction Buffer 2 μL，目的片段回收产物10 μL，UBI-pCAMBIA1301回收产物4 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，ddH 2 O 3 μL，22℃反应60 min，进行连接转化。取出感受态细胞T1放于解冻后加入连接产物，用冻融法将连接好的载体转化到大肠杆菌中；每管加800 μL没有抗生素的LB液体培养基，37℃振荡复苏，离心1 min后涂布到抗性平板上；平板放置于室温吹干，倒置于37℃培养箱培养菌落。然后各选取8个菌落进行菌落PCR鉴定，确定条带大小是目的条带大小后，再选取前两个送去公司进行测序验证，验证结果正确，说明miR396a和miR396f表达载体构建成功。 2.2.6. UBI-pCANBIA1301-396a和UBI-pCANBIA1301-396f质粒转化农杆菌 首先制备农杆菌感受态，并提取构建好的质粒载体。活化待转化的农杆菌和含有表达载体质粒的大肠杆菌，当农杆菌菌液OD600约为0.6的时候，用常规的感受态制备方法进行农杆菌感受态制备 [ 12 ] 。当大肠杆菌菌液OD600约为0.6的时候，用质粒提取试剂盒对含有UBI-pCANBIA1301-396a质粒和UBI-pCANBIA1301-396f质粒的大肠杆菌进行质粒提取。 最后进行UBI-pCANBIA1301-396a质粒和UBI-pCANBIA1301-396f质粒转化农杆菌EHA105的感受态。取5 μL提取好的载体质粒DNA，加入到刚解冻的200 μL农杆菌EHA105的感受态中，用冻融法进行转化，然后在其中加入1 ml常温的LB液体培养基(含利福平50 mg/L)，28℃振荡培养8 h；取100 μL涂于具有抗性的LB平板(含利福平50 mg/L和卡那霉素50 mg/L)，28℃培养28 h。挑取单菌落于1 ml具有抗性的液体LB培养基(含有利福平50 mg/L和卡那霉素50 mg/L)，小摇6 h；取小摇后的菌液做菌液PCR进行检测验证，将确认转化成功的菌液加入到5 ml的液体LB培养基(含利福平50 mg/L和卡那霉素50 mg/L)中，进行过夜摇菌，当菌液的OD600约为0.6的时候，保存于−80℃，以备后续试验所用。