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user: 3. 结果与分析 3.1. 16S rRNA和COI基因片段的碱基组成 16S rRNA和COI基因片段的碱基组成如表2所示，虾虎鱼科不同种鱼类16S rRNA序列的碱基组成总体趋势基本一致：平均碱基组成分别为T 22.0%，C 24.6%，A 30.2%，G 23.2%，其中碱基A含量最高，其它3个碱基含量相近，平均A + T含量(52.2%)明显高于G + C含量(47.8%)。COI序列的碱基组成总体趋势也基本一致：平均碱基组成分别为T 30.2%，C 27.4%，A 23.9%，G 18.5%，其中碱基T含量最高，其次为碱基C、A、G依次降低，平均A + T含量(54.2%)明显高于G+C含量(45.8%)。 3.2. 16S rRNA和COI基因各密码子的碱基偏向性 密码子3个位点中的碱基组成有显著差异(见表3)：虾虎鱼科不同种鱼类16S rRNA序列各密码子的碱基组成基本一致，3个密码子位点的各碱基含量差异较小，在3个密码子间T的变幅为21%~22%，C的变幅为23.4%~26.6%，A的变幅为30.0%~30.4%，G的变幅为20.6%~25.1%。COI序列各密码子的碱基组成差异较大，其中，1st密码子中T含量最多，高达42%，2st密码子中G的含量较为特殊，仅为10.8%，出现了反G偏倚现象，而3st密码子恰好与1 st密码子中碱基含量相反，T的含量最低(18%)，而G的含量最高(29.7%)，COI序列密码子的碱基使用频率存在明显的偏向性。 3.3. 16S rRNA和COI基因片段的碱基变异 测序获得虾虎鱼科7属8种24个个体的16S rRNA基因片段，比对得到16S rRNA基因长度为535 bp Table 2 The bases contents of 16S rRNA and COI gene of 8 Gobiidae specie 种类 16S rRNA COI T/% C/% A/% G/% T/% C/% A/% G/% A. ommaturus 20.9 24.6 31.8 22.6 30.6 27.3 23.8 18.3 L. ocellicauda 22.1 25.0 29.0 23.9 28.5 29.0 24.8 17.6 O.lacepedii 21.7 25.5 30.6 22.3 31.0 25.8 25.0 18.2 S.histiophorus 23.0 23.5 30.3 23.2 31.2 26.7 24.3 17.8 T. trigonocephalus 22.7 24.2 29.1 23.9 31.2 25.6 23.6 19.7 P.javanicus 22.5 23.8 30.4 23.4 30.3 27.1 22.8 19.8 T. barbatus 21.4 25.8 28.8 24.0 29.6 28.4 23.9 18.0 R. giurinus 22.8 24.1 30.2 23.0 27.8 30.3 23.1 18.9 平均值/% 22.0 24.6 30.2 23.2 30.2 27.4 23.9 18.5 (A+T)/% 52.2 54.2 (G+C)/% 47.8 45.8 表2. 虾虎鱼科8种鱼类的16S rRNA和COI基因序列的碱基组成 Table 3 Nucleotide frequencies of 16S rRNA and COI partial sequence of 8 Gobiidae species (% 基因类型 碱基 密码子第1位点 密码子第2位点 密码子第3位点 16S rRNA T 22.0 22.0 21.0 C 26.6 23.7 23.4 A 30.4 30.0 30.1 G 20.6 24.0 25.1 COI T 42.0 31.0 18.0 C 27.6 27.9 26.7 A 15.4 30.7 25.6 G 15.0 10.8 29.7 表3. 8种虾虎鱼科鱼类的16S rRNA和COI基因部分序列中各碱基分布频率(%) 序列，共编码178个氨基酸。24条16S rRNA序列共有12个单倍型，共检测到保守位点374个，变异位点161个(约占30.1%)，包括简约信息位点158个，单变位点3个，插入/缺失位点15个；共有26个转换位点，24个颠换位点，转换与颠换比值(Si/Sv)为1.51。测序获得虾虎鱼科7属8种24个个体的COI基因片段，对比得到COI基因长度为641 bp的序列，共编码213个氨基酸。24条COI序列共有12个单倍型，共检测到保守位点420个，变异位点221个(约占34.5%)，全部为简约信息位点，没有单变位点，未发现插入/缺失位点；共有58个转换位点，45个颠换位点，转换与颠换比值(Si/Sv)为1.29。8种虾虎鱼的2种基因片段都显示第2密码子位点碱基替换最多，尤其COI基因的第2密码子位点的转换值和颠换值明显高于其它2个密码子位点(表4)。 3.4. 16S rRNA和COI基因的突变饱和分析 分别将16S rRNA和COI基因序列中成对比较推断的碱基替代率和Kumura双参数距离进行比较来 验证虾虎鱼科鱼类各自的基因中是否存在突变饱和现象。线粒体16S rRNA和COI基因序列全部位点的转换率和颠换率与相应的序列差异的散点图如图1所示。图中显示这两个基因序列中的碱基替代率与遗传距离之间均呈现明显的线性关系，因此，它们在虾虎科鱼类中不存在突变饱和现象。 3.5. 遗传距离分析 研究显示，不同物种的16S rRNA和COI序列均各不相同，不同种之间未有序列共享现象。8种虾虎鱼科鱼类种间和种内遗传距离如表5所示，16S rRNA的种内平均K2P遗传距离较小，仅为0.002，而平均种间遗传距离为0.169，约为种内遗传距离的84倍，其中纹缟虾虎鱼和髭缟虾虎鱼的种间遗传距离最小为0.100，拉氏狼牙虾虎鱼和斑尾刺虾虎鱼的遗传距离最大为0.237。相比较而言，8种虾虎鱼科鱼 Table 4 Sequence variations of 16S rRNA and COI gene of 8 Gobiidae specie 基因类型 密码子位点 不变位点 转换位点(si) 颠换位点(sv) 转换位点/颠换位点 R = si/sv 16S rRNA 第1位点 139 8 9 0.98 第2位点 135 14 9 1.53 第3位点 138 13 6 2.26 全部位点 412 26 24 1.51 COI 第1位点 214 0 0 0 第2位点 121 49 43 1.14 第3位点 203 9 1 7.73 全部位点 538 58 45 1.29 表4. 8种虾虎鱼科鱼类的16S rRNA和COI基因序列各密码子位点碱基变异 Table 5 Genetic distance pairwise and within-species of 16S rRNA (DOWN) and COI (UP) gene in 8 Gobiidae specie 种间 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 种内 16S rRNA COⅠ 1 A. ommaturus 0.189 0.228 0.222 0.224 0.235 0.213 0.221 0.255 1.379 0.001 0.001 2 L. ocellicauda 0.170 0.227 0.212 0.234 0.216 0.211 0.232 0.249 1.384 0.003 0.000 3 O. lacepedii 0.237 0.212 0.185 0.226 0.236 0.231 0.221 0.240 1.344 0.000 0.002 4 S. histiophorus 0.175 0.144 0.163 0.208 0.232 0.169 0.188 0.245 1.282 0.000 0.000 5 T. trigonocephalus 0.194 0.138 0.217 0.153 0.263 0.180 0.209 0.274 1.239 0.000 0.000 6 P. javanicus 0.175 0.153 0.194 0.150 0.169 0.221 0.219 0.287 1.255 0.000 0.000 7 T. barbatus 0.184 0.128 0.193 0.156 0.100 0.166 0.176 0.239 1.265 0.000 0.003 8 R. giurinus 0.211 0.147 0.198 0.164 0.156 0.138 0.132 0.250 1.295 0.008 0.000 9 C. lucidus 0.221 0.209 0.242 0.221 0.246 0.170 0.235 0.196 1.345 0.002 0.001 10 L. maculatus 0.200 0.220 0.238 0.209 0.228 0.200 0.220 0.219 0.126 0.003 0.000 表5. 虾虎鱼科8种鱼类16S rRNA (下)和COI (上)基因的种间和种内遗传距离 图1. 线粒体16S rRNA和COI基因的转换、颠换和P-Distance之间的散点图 类COI序列的种内平均遗传距离仅为0.001，种间遗传距离为0.215，为种内遗传距离的215倍，明显大于16S rRNA序列的种间差异，而COI序列的种间遗传距离最小值是青弹涂鱼与髭缟虾虎鱼之间的遗传距离为0.169，距离最远的是爪哇拟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼间的遗传距离为0.263。16S rRNA 和COI基因片段在不同分类阶元中K2P遗传距离的分布情况见图2。除种内16S rRNA的K2P遗传距离略高于COI基因外，同属种间、同科属间及同目科间的16S rRNA基因的K2P遗传距离均明显低于COI基因。 3.6. 虾虎鱼科鱼类的分子系统分类分析 对虾虎鱼科7属8种24个个体与中国花鲈和棘头梅童鱼2个外群的16S rRNA和COI基因序列构建分子进化图谱，结果如图3所示。从图中可明显看出两种基因序列的虾虎鱼科鱼类均形成单系群。在16S rRNA基因序列的亲缘关系图谱中，出现在虾虎鱼科分支基层的为拉氏狼牙虾虎鱼，其次为斑尾刺虾虎鱼，髭缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼构成姐妹分支(置信度为90%)，说明二者亲缘关系较近(图3(a))；而在COI基因序列的亲缘关系图谱中，出现在虾虎鱼科分支基层的是爪哇拟虾虎鱼，其次为斑尾刺虾虎鱼和睛尾蝌蚪虾虎鱼，并且斑尾刺虾虎鱼和睛尾蝌蚪虾虎鱼形成姊妹分支，其置信度为83%，表明二者具有较近的亲缘关系(图3(b))。