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user: 3. 实验方法与结果 3.1. 色谱条件 色谱柱为InertsiL ® ODS-SP (5 μm， 4.6 mm × 250 mm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸(梯度洗脱，洗脱梯度如表1所示)，检测波长为210 nm，流速为1 mL/min，柱温35℃，进样量5 μL。HPLC色谱图如图1所示。 3.2. 对照品溶液的制备 分别精密称取柯里拉京对照品5.1 mg和丹酚酸B对照品42.0 mg，置50 mL棕色具塞容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取10 mL置50 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含柯里拉京0.0204 mg，丹酚酸B 0.168 mg的对照品混合溶液。 3.3. 标准曲线和线性范围 取柯里拉京和丹酚酸B对照品混合溶液，分别吸取3、5、10、15、20、25μL注入高效液相色谱仪，测定。以柯里拉京和丹酚酸B对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程柯里拉京Y = 2054966X + 17329 (r = 0.9997)，如图2所示；丹酚酸B Y = 1988937X + 44923 (r = 0.9999)，如图3所示。由测定结果可知，柯里拉京在0.061~0.510 μg范围内，丹酚酸B在0.504~4.203 μg范围内线性关系良好(r柯里拉京 = 0.9997，r丹酚酸B = 0.9999)。 3.4. 供试品溶液的制备 取复方扶正柔肝颗粒0.2 g (精密称定，批号T20140101)，置锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理20 min (全溶，呈澄清溶液)，冷却至室温，再称定重量，50%乙醇补足重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜即得。 Table 1 The program list of Gradient elutio 保留时间 t/min 流动相A0.2% 磷酸(%) 流动相B 乙腈(%) 0 89 11 25 89 11 30 76 24 55 76 24 60 5 95 表1. 梯度洗脱程序表 图1. 扶正柔肝颗粒HPLC含量测定色谱图 3.5. 方法学考察实验 1) 精密度试验 精密称取扶正柔肝颗粒0.2005 g，置150 mL具塞锥形瓶内，精密移取50%乙醇50 mL，称重，超声20 min，使呈澄清溶液，冷却至室温，补重，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，进样10 μL，测定，结果如表2所示。 由实验结果可知，柯里拉京及丹酚酸B的RSD值均在2%以内，说明仪器精密度良好。 2) 重复性试验 平行称取叶下珠复方II号颗粒六份(批号T20140101)，每份0.2 g (精密称定)，加至150 mL具塞锥形瓶内，精密称定为：a) 0.2005；b) 0.2008；c) 0.2003；d) 0.2007；e) 0.2005；f) 0.2004。精密移取50%乙醇50 mL加入锥形瓶内，称重，超声20 min，使呈澄清溶液，冷却至室温，相应溶剂补足失重，吸取溶液并过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液，六个平行样品分别进样10 μL，测定，结果如表3所示。 由实验结果可知，柯里拉京及丹酚酸B含量的RSD值均在2.5%以内，说明本法重现性良好。 图2. 柯里拉京标准曲线图 图3. 丹酚酸B标准曲线图 Table 2 The result of precision experimen 柯里拉京 丹酚酸B 保留时间 RSD 峰面积 含量/mg∙g −1 RSD 保留时间 RSD 峰面积 含量/mg∙g −1 RSD 精密度-1 25.229 1.09% 176，615 1.933 1.38% 52.893 0.30% 3，475，096 43.008 1.01% 精密度-2 24.843 174，842 1.911 52.593 3，411，867 42.215 精密度-3 24.779 177，427 1.943 52.594 3，502，207 43.348 精密度-4 24.518 177，499 1.944 52.445 3，438，748 42.552 精密度-5 24.521 176，398 1.930 52.506 3，427，804 42.415 精密度-6 24.619 171，757 1.874 52.521 3，476，437 43.025 表2. 精密度试验结果 Table 3 The result of reproducibility experimen 柯里拉京 丹酚酸B 保留时间 RSD 峰面积 含量/mg∙g −1 RSD 保留时间 RSD 峰面积 含量/mg∙g −1 RSD 重复性-1 25.229 0.84% 176，615 1.933 2.32% 52.893 0.24% 3，475，096 43.008 1.42% 重复性-2 24.660 175，098 1.912 52.551 3，370，383 41.633 重复性-3 24.725 173，695 1.899 52.576 3，445，516 42.680 重复性-4 24.717 172，797 1.885 52.583 3，417，555 42.245 重复性-5 24.753 175，081 1.914 52.603 3，438，134 42.545 重复性-6 24.808 166，406 1.810 52.617 3，348，219 41.438 表3. 重现性试验结果 3) 稳定性试验 取同一批号供试品溶液各5 μL，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入高效液相色谱仪测定。结果如表4所示。 由测定结果可知，柯里拉京峰面积的RSD为1.95%，丹酚酸B峰面积的RSD为1.37%，表明供试品溶液在24h内稳定。 4) 加样回收率试验 分别精密称取六份已知含量的扶正柔肝颗粒0.1 g (批号T20140101)，分置50 mL容量瓶内；精密称定为a) 100.1 mg；b) 100.0 mg；c) 100.1 mg；d) 99.9 mg；e) 100.2 mg；f) 100.1 mg。分别精密移取对照品混合液(浓度：柯里拉京0.019 mg/mL，丹酚酸B 0.403 mg/mL的混合标准溶液)各10 mL加入六个容量瓶中，采用供试品的制备方法同法制备样品，得待测样品溶液。测定结果如表5所示。 由实验结果可知，柯里拉京和丹酚酸B的加样回收实验的回收率均在95%~105%之间，说明样品制备方法是合适的。 3.6. 样品测定 分别取三个不同批次的扶正柔肝颗粒，精密称定，按照“2.4”项下供试品溶液的制备，同法制备样品溶液，进样，测定，结果如表6所示。 Table 4 The result of stability tes 柯里拉京 丹酚酸B 峰面积 RSD 峰面积 RSD 稳定性-1 176，615 1.95% 3，475，096 1.37% 稳定性-2 177，427 3，502，207 稳定性-3 184，804 3，409，820 稳定性-4 177，733 3，399，709 稳定性-5 183，617 3，379，498 稳定性-6 181，789 3，439，900 表4. 稳定性试验结果 Table 5 The result of recovery tes 称样量/ mg 柯里拉京 丹酚酸B 样品含量/mg 加标量/mg 检出量/mg 回收率 均值% RSD% 样品含量/mg 加标量/mg 检出量/mg 回收率 均值 RSD% 100.1 0.1894 0.19 0.381 100.85 101.41% 1.68 4.230 4.03 8.342 101.93 103.30 1.11 100.0 0.1892 0.19 0.379 99.89 4.226 4.03 8.343 102.06 100.1 0.1894 0.19 0.386 103.49 4.230 4.03 8.401 103.33 99.9 0.1890 0.19 0.384 102.64 4.222 4.03 8.414 103.84 100.2 0.1896 0.19 0.378 99.17 4.234 4.03 8.420 103.67 100.1 0.1894 0.19 0.384 102.43 4.230 4.03 8.470 104.96 表5. 加样回收率试验结果 Table 6 The result of Corilagin and Salvianolic acid B in Fu Zheng Rou Gan of three batches by HPL 批次 取样量/g 柯里拉京含量mg/g 均值 丹酚酸B含量mg/g 均值 T20140101 0.2005 1.8956 1.8928 (RSD = 0.15%) 42.2416 42.2594 (RSD = 0.04%) 0.2016 1.8930 42.2712 0.2035 1.8899 42.2655 T20140501 0.2050 1.9002 1.8956 (RSD = 0.29%) 42.1388 42.2395 (RSD = 0.21%) 0.2033 1.8969 42.2895 0.2012 1.8896 42.2901 T20140801 0.2040 1.9055 1.9023 (RSD = 0.24%) 42.3025 42.1662 (RSD = 0.53%) 0.2011 1.8971 42.2899 0.2022 1.9043 41.9062 表6. 三批次扶正柔肝颗粒含量测定结果