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user: 4. 讨论 EBV属于疱疹病毒γ亚科，其基因组为dsDNA，长度为172 kbp，可至少编码100余种病毒蛋白。2014年，癌症基因组计划(TCGA)项目团队在Nature期刊上报道了一项关于胃癌分子分型的研究，EBV 感染型、染色体不稳定型、微卫星不稳定型、基因组稳定型；将胃癌进行分子分型，有利于胃癌患者进行个体化的精准治疗，比如利于患者进行分子靶向治疗。EBV + 型胃癌在全球范围内的阳性率存在较大的差异，发生率约为2%~20%，平均约为10% [ 3 ]。有研究显示，在正常癌旁胃上皮细胞以及胃癌浸润的淋巴组织细胞中EBERs检测为阴性，提示EBV在胃癌的发生发展中有一定的作用。因此，利用EBV通过与核糖核蛋白相结合从而可稳定与细胞核中的特性，以此可确定EBV临床感染。原位杂交技术检测EBER存在被认为是诊断EBV感染的金标准 [ 4 ]。本研究应用原位杂交方法检测出EBV阳性率为12.8% (10/78)，与国外文献报道胃癌组织中EBV感染率相符。本研究显示EBV感染情况与患者性别、年龄、淋巴结有无转移、胃腺癌分化程度、浸润深度、临床分期中尚无统计学意义。这与国外的研究基本相符 [ 5 ]。 幽门螺杆菌可致胃部产生炎症、破坏胃黏膜组织、影响胃酸产生，是大部分胃炎、胃十二指肠溃疡的病因，与胃黏膜相关B细胞淋巴瘤密切相关。有关文献报道，在胃癌患者中，Hp感染者约17.5%~86.2% [ 6 ]。目前检测胃癌组织中Hp感染的方法有特殊染色美兰法、中性红染色法、苏木素-伊红染色法、尿素14C呼气试验以及免疫组织化学检测方法。我国有文献报道，免疫组织化学方法检测胃部组织Hp感染具有不受患者服用药物、胃部分切除术、胃黏膜出血等影响，具有切片易长期保存的优点，且敏感性、准确性、特异性高，以及有良好的对比度 [ 7 ]，故Hp的免疫组织化学检测被认为是金标准。本研究采用免疫组织化学检测方法检测胃癌组织中Hp感染情况，结果显示Hp的阳性率为57.7% (45/78)，与文献报道基本相符。本研究发现胃癌组织中Hp感染与患者性别、年龄、淋巴结有无转移、胃腺癌分化程度、浸润深度、临床分期中尚无明显联系，与国外研究结果相一致 [ 8 ]。近年国外有研究将胃癌组织中EBV感染与Hp感染联系起来进行分析两者对胃癌的生成、发展的作用 [ 9 ]，并有研究表明，胃癌组织中EBV、Hp感染会促进胃癌组织中相关肿瘤蛋白表达。 人表皮生长因子受体2(HER2)是位于17q21的癌基因，编码一种分子质量185000的跨膜糖蛋白，隶属于ErbB－受体家族中的，且具有酪氨酸激酶活性。EB病毒相关胃癌中EBV约半数表达潜伏性膜蛋白2A (latent membrane protein 2A， LMP2A)。LMP2A是一种由497个氨基酸组成的蛋白，LMP2A通过诱导抑制ERK信号通路的激活从而降低细胞抗失巢凋亡。Iwakiri等 [ 10 ] 研究表明EB病毒阳性的上皮细胞有活化的细胞外信号调节激酶通路(ERK)。这些研究结果表明EB病毒感染的相关上皮恶性肿瘤发生可能与LMP2A诱导ERK信号活化所致。Zhang等 [ 11 ] 收集了78例EBVaGC、216例EBVnGC胃癌组织，采用免疫组织化学方法检测HER2，发现了HER2在EBVaGC表达显著降低，这表明可能由LMP2A引起HER2表达降低。本研究通过采用Mann-whitney U检验方法分析得出胃癌组织中EBV感染情况与胃癌组织中HER2表达无显著差异，这与国外文献有一定的差异，主要考虑本研究中总样本量较少，实验误差大，可采用扩大样本量的方法再次研究。 人类P53基因定位在17号染色体短臂上，它编码的蛋白质的分子量为43.7KDa，P53是一个转录序列，有维持基因组稳定的作用。EBV阳性胃癌中的分子特征包括PD-L1/2过表达、PIK3CA、ARID1A以及P53突变等，上述分子特征中P53突变是胃癌中基因改变事情最为普遍的一种，P53突变可导致P53蛋白表达上调。EBV阳性胃癌中，EBV早期复制需要P53的野生型参与，而病毒复制中晚期又可被病毒产物降解，从而使野生型P53失去抑癌作用，因此促进肿瘤的发生 [ 12 ]。Ishii等 [ 13 ] 研究表明胃癌组织中EBV阳性和EBV阴性中P53检出率无统计学差异，但是EBV阳性组胃癌组织中P53过表达率低于EBV阴性组，提示胃癌组织中EBV感染与P53表达异常有关。本组实验中，采用Mann-whirney U检验统计学方法比较胃癌组织中EBVaGC与EBVnGC P53表达情况，结果提示不论胃癌组织是否感染EBV与胃癌组织中P53表达无显著差异。EBVaGC组织中EBV感染与P53表达的相关性需进一步深入探讨研究。 Ki-67是一种细胞增殖核抗原蛋白，Ki-67除了不在G0期表达，在G1、S、G2、M期均有表达，其中在M期可达到最高峰，随着细胞有丝分裂结束，Ki-67随后降解，因此并提出与细胞有丝分裂整个过程密切相关，且Ki-67与肿瘤的发生发展有关，可以反映细胞的增殖活动。国外有研究者将EBV阳性胃癌组织中与EBV阴性胃癌组织中Ki-67蛋白表达进行研究分析，结果提示EBV阳性胃癌中的细胞增殖指数明显低于EBV阴性胃癌 [ 15 ]。另有研究表明在EBER阳性淋巴上皮瘤样胃癌中细胞增殖指数值低于阴性的胃癌，提示EBVaGC中细胞增殖活性较EBVnGC细胞增殖活性低，这与相关文献提示EBVaGC的预后较好有关。本实验通过研究EBV阳性胃癌组织中与EBV阴性胃癌组织中Ki-67的表达情况，采用Mann-whirney U检验统计学方法进行检验，结果提示胃癌组织中EBV感染情况与Ki-67蛋白表达情况差异无统计学意义，与上述研究有所出入，此差异无统计学意义。 我国有研究发现胃癌组织中Hp感染情况与胃癌组织中HER2表达无相关性，HER2蛋白阳性表达情况与患者年龄、性别、临床分期及肿瘤发生部位也无相关性 [ 14 ]。本实验采用免疫组织化学检测胃癌组织中Hp感染情况及HER2表达情况，采用Mann-whirney U检验统计学方法进行检验，结果显示胃癌组织中Hp感染情况与HER2蛋白表达情况差异无统计学意义，且HER2表达与患者性别、年龄、淋巴结转移、浸润深度、腺癌分化程度、肿瘤临床分期无相关性，与上述研究相近。但也有研究表明 [ 15 ]，胃癌组织中Hp感染与胃癌的发生发展密切相关，而且Hp感染阳性情况与HER2蛋白的表达率有一定程度的促进效果。 有关文献报道 [ 16 ]，P53、NF-κB、IL-1β的表达与胃癌组织中的Hp感染有正相关性，且均参与胃癌的发生与发展，推测可能是胃癌组织中Hp感染导致胃部炎性反应和抑癌基因失活，最后形成胃癌。我国有文献报道称 [ 17 ]，P53在胃癌组织中表达阳性率在Hp阳性组高于阴性组，且胃癌组织中P53表达与Hp感染呈正相关，推测可能机制是胃癌组织中Hp感染使胃黏膜上皮细胞野生型的P53基因突变，从而使得P53表达上调，进而参与胃癌的发生发展。本实验采用免疫组织化学检测胃癌组织中Hp感染情况及P53表达情况，采用Mann-whirney U检验统计学方法进行检验，结果提示胃癌组织中Hp感染情况与P53蛋白表达情况有显著性差异，进一步进行胃癌组织中Hp阳性组与Hp阴性组两组之间的P53表达情况的Spearman相关性分析，结果提示胃癌组织中Hp感染情况与P53蛋白表达情况有相关性(r s = 0.477， P = 0.00)，且与Hp感染呈正相关(r s = 0.477)，P53表达情况与患者性别、年龄、有无淋巴结转移、浸润深度、腺癌分化程度及临床分期无显著差异。与上述文献报道基本相符。 有不同的研究报道关于组织中Hp对细胞增殖的作用，一部分体外试验提示Hp是抑制细胞增殖的因素 [ 18 ]，但是相当一部分研究显示胃组织中Hp感染是胃上皮增生的促进因素。我国也有研究报道，随着胃癌形成的胃黏膜组织病变的加重，胃癌组织中Hp阳性组中的Ki-67表达显著上升 [ 19 ]。我国近年有文献报道 [ 20 ]，Hp阳性胃癌组Ki-67的表达高于Hp阴性胃癌组，表明Hp影响胃癌的发生发展的机制可能为促进细胞增殖和血管增生。本实验采用免疫组织化学检测胃癌组织中Hp感染情况及Ki-67表达情况，采用Mann-whirney U检验统计学方法进行检验，结果提示胃癌组织中Hp感染情况与Ki-67蛋白表达情况有显著性差异，进一步进行胃癌组织中Hp阳性组与Hp阴性组两组之间的P53表达情况的Spearman相关性分析，结果提示胃癌组织中Hp感染情况与P53蛋白表达情况有相关性(r s = 0.415， P = 0.00)，且与Hp感染呈正相关(r s = 0.415)，且胃癌组织中Ki-67表达情况与患者性别、年龄、有无淋巴结转移、浸润深度、腺癌分化程度及临床分期无相关性。与上述文献报道基本相符。胃癌组织中Ki-67表达与Hp感染呈正相关，考虑与胃癌组织中Hp促进胃上皮增生有关。 目前胃癌组织中EBV感染联合Hp感染对胃癌组织中的相关蛋白表达的影响的研究较少。国外有关文献报道提示，胃癌组织中同时感染EBV及Hp可以诱导比单独感染EBV或者Hp更严重的炎症反应，使得胃癌的风险增加。有研究表明 [ 21 ]，EBV、Hp二者的共同的诱导途径可通过TCF-4、β-catenin信号传导通路激活胃上皮转化因子，从而改变胃上皮细胞在胃癌的发生发展中的作用。此外EBV和Hp感染的胃癌组织中B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2， bcl2)的表达升高，这提示着胃癌组织中Bcl2过度表达可能是两者合并感染的结果之一。已有很多报道称EBV感染可引起广泛甲基化，且慢性胃炎中的Hp感染可诱导胃上皮甲基化可能参与胃癌的发生发展。以上研究均提示胃癌组织中EBV、Hp二者同时感染有相互影响。但国外也有研究表明EBV虽然与Hp有导致胃部炎症形成的共同毒力因子，且有临床证据表明胃部组织中EBV活动可以和Hp共同促进上皮细胞炎症发生，但是两者之间无相关性 [ 22 ]。我国有文献报道，胃癌组织中EBV感染和Hp感染的阳性率之间无相关性，EBV与Hp感染可能是胃癌发生发展中的两个独立因素 [ 23 ]。本研究将胃癌组织中EBV或Hp感染组与两者联合感染组与P53及Ki-67蛋白表达程度的差异性用Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较，结果提示EBV、Hp单独感染组与两者联合感染组P53 (P = 1.000)、Ki-67 (P = 1.000)蛋白表达的影响无显著差异。进一步将胃癌组织中EBV感染情况与Hp感染情况进行一致性分析，结果发现两者之间不存在感染一致性(Kappa = −0.127， P = 0.058)。本次实验结果提示胃癌组织中EBV、Hp二者联合感染对相关蛋白的表达无显著影响，胃癌组织中EBV、Hp感染可能为胃癌发生发展的独立因素。