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user: 4. 讨论 研究表明，检测miRNA的方法包括实时RT-PCR、northern blot、微阵列杂交、克隆和测序以及原位杂交(In Situ Hybridization， ISH)等分子生物学方法，目前，ISH已被广泛应用于福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织标本中miRNA的检测 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]。ISH对三阴乳腺癌的分析显示，miR-150水平在淋巴结转移患者中显著降低，提示miR-150可能负性调控TNBC细胞转移 [ 3 ]。ISH检测miR-21在壶腹腺癌、壶腹发育不良病灶和正常十二指肠粘膜样本中的表达显示，所有正常的样本呈阴性或微弱miR-21表达，而80.8%的壶腹腺癌显示miR-21高表达 [ 8 ]。ISH检测显示，结直肠癌癌细胞和基质的成纤维细胞miR 221和miR 222水平升高，表明miR 221和miR 222在肿瘤间质中高表达与CRC患者的转移和恶性潜能有关 [ 9 ]。ISH分析表明，miR-4317在NSCLC组织中表达下调，尤其是在淋巴结转移和晚期临床分期组织中。并且，miR-4317高表达的NSCLC患者总体生存更好 [ 10 ]。采用ISH检测miR-182-5p在肝癌组织中的表达表明，miR-182-5p在肝癌高表达与肝癌术后预后不良及早期复发有关，结果RT-PCR检测相同 [ 11 ]。原位杂交显示，与正常细胞和组织相比，乳腺癌组织和细胞中miR-223表达明显降低，而STIM1表达明显升高，miR-223与STIM1表达呈负相关。MiR-223通过负性调控STIM1的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，miR-223/STIM1轴可能是治疗乳腺癌患者的潜在治疗靶点 [ 12 ]。ISH显示miR-143在细胞质表达，主要在良性组织的腔细胞中表达，而miR-145表达在细胞核，在肌上皮细胞中有很强的染色。这两种miRNA都存在于乳腺癌上皮细胞和间质纤维母细胞中，表明miR-143和-145具有肿瘤抑制典型的功能特性和表达模式 [ 13 ]。ISH分析显示，胃肠的神经内分泌瘤(GI-NENs)的肝转移瘤中miR-96表达明显高于原发性NENs，与qRT-PCR检测结果一致，表明ISH分析可有助于评估GI-NENs患者 [ 14 ]。原位杂交显示，miR-21与MALAT1在原发性甲状腺髓样癌MTCs中表达增强。Real-time PCR检测原发性MTCs中miR-21和MALAT1的表达明显高于正常甲状腺，与ISH的结果一致，提示miR-21和MALAT1高表达可能调节MTCs进展 [ 15 ]。原位杂交显示，与非癌组织相比，胶质瘤癌组织的miRNA-375和CTGF表达有显著差异。miRNA-375高表达通过CTGF-EGFR通路抑制胶质瘤癌细胞的发生 [ 16 ]。原位杂交证实82例胰腺癌中miR-92b-3p表达水平明显低于非癌性胰腺组织。miR-92b-3p表达水平的降低与肿瘤大小、较高的淋巴结转移、晚期TNM分期和生存率降低密切相关。表明miR-92b-3p表达降低可能在PC的发生发展中发挥重要作用 [ 17 ]。原位杂交显示，在淋巴结阴性的侵袭性乳腺癌中，与良性乳腺组织相比，miRNA-494水平降低，并预示着乳腺癌死亡风险。因此，miRNA-494的检测可帮助淋巴结阴性乳腺癌患者识别侵袭性乳腺癌的亚群，miRNA-494可作为乳腺癌的预后判断标志，ISH方法可应用于常规病理诊断 [ 18 ]。miR-301a属于癌基因，ISH检测miR-301a在380例乳腺癌组织中的表达，发现141例miR-301a高表达，miR-301a的高表达与OS的降低有关，因此，在乳腺组织活检标本中检测miR-301a的表达，可能成为早期诊断的重要标志。并且，miR-301a可能作为乳腺癌患者的潜在治疗靶点 [ 19 ]。 原位杂交显示，miR-21在44%的胃癌组织与51%的肿瘤间质中高表达，肿瘤细胞的miR-21与临床病理因素无关，而间质miR-21与肿瘤分期、大小、淋巴结转移等因素有关，间质miR-21表达在肿瘤进展过程中逐渐升高，并且，在结缔组织增生性反应的浸润性区域表现出较强的间质阳性。qRT-PCR结果表明，肿瘤间质也比肿瘤和非肿瘤组织显示出更高的miR-21表达，提示间质miR-21表达与胃癌的进展密切相关，可能是胃癌治疗的靶点 [ 20 ]。本研究采用组织芯片与原位杂交检测表明，miR-22在胃癌组织中表达下调明显低于在正常组织，并且，miR-22低表达与临床分期和淋巴结转移密切相关。 大量研究证明，miR-22不仅在生物学上影响衰老的进程、能源供应、血管生成、EMT、增殖、迁移、侵袭、转移和细胞凋亡，而且，从遗传学或表观遗传学通过CNAs (拷贝数的改变)、SNPs (单核苷酸多态性)、甲基化、乙酰化与羟甲基化在不同的肿瘤中发挥抑制或促进肿瘤双重的效果。miR-22可能在某些肿瘤中成为一种有前途的、互补的甚至独立的肿瘤生物标志物，并对早期诊断、治疗、监督疗效和预后产生重要的作用 [ 21 ]。ATP citrate lyase (ACLY)是一种开始重新合成脂类的关键酶，在肿瘤细胞中表达上调，而miR-22在骨肉瘤、前列腺癌、子宫颈癌与肺癌中表达下调，ACLY与miR-22在肿瘤中表达呈负相关，miR-22通过靶向ACLY抑制肿瘤生存与转移，结果提示miR-22可转录后调控ACLY具有治疗骨肉瘤、前列腺癌、子宫颈癌与肺癌的作用 [ 22 ]。miR-22通过下调ACLY的表达抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长和转移 [ 23 ]。miR-22在宫颈癌组织和细胞相对非肿瘤组织和正常人类宫颈癌HCK1T细胞表达下调。而组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6)在宫颈癌组织和癌细胞系中与miR-22呈负相关MiR-22通过抑制增殖和迁移，靶向HDAC6诱导宫颈癌细胞凋亡，发挥抑癌作用。这一新发现的E6/p53/miR-22/HDAC6调控网络可能是子宫颈癌的候选治疗靶点 [ 24 ]。miR-22在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中的表达明显低于邻近非癌组织。miR-22高表达可显著降低OSCC细胞活力、迁移和侵袭。在OSCC组织和细胞中，miR-22表达与NLRP3表达呈负相关。miR-22可能通过靶向NLRP3在OSCC中发挥抑制作用 [ 25 ]。miR-22在膀胱癌组织中下调，miR-22高表达可体内外显著抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。并且，miR-22通过直接靶向MAPK1抑制细胞增殖/凋亡和通过抑制Snail和MAPK1/Slug/vimentin反馈环，在体外和体内抑制膀胱癌细胞EMT [ 26 ]。 目前，miR-22在胃癌中的准确表达、功能和机制尚不清楚 [ 27 ]。Jafarzadeh-Samani等显示，胃癌组织中miR-22的表达率较正常组织显著降低，表明miR-22可能是早期检测胃癌的良好诊断生物标志物 [ 28 ]。miR-22在胃贲门腺癌(GCA)组织较正常组织明显高表达，并且GCA患者血清miR-22水平明显较正常人增高，提示miR-22可能是胃癌诊断的生物标记 [ 29 ]。有人证明，胃癌患者血清中miR-22的水平较健康对照组显著降低，相反，miR-21的水平明显高于对照组。生物信息学分析显示，Sp1是miR-21靶点，而PTEN是miR-22的靶点，提示其是胃癌潜在的生物标志物 [ 30 ]。Zuo等发现，胃癌组织中miR-22的表达显著降低与患者整体生存率较差相关。miR-22作为抑癌基因，其高表达通过靶向MMP14和Snail明显抑制胃癌细胞的生长、迁移侵袭和EMT以及体内肿瘤生长、腹膜扩散和肺转移 [ 27 ]。幽门螺杆菌感染是慢性炎症导致胃癌发生的主要原因，而NLRP3在炎症发生过程中起着至关重要的作用。幽门螺杆菌感染可抑制miR-22的表达，促进NLRP3的表达，从而引发了上皮细胞失控的增殖和胃癌发生。然而，MiR-22可直接靶向NLRP3，在体内外降低其致癌作用。因此，miR-22抑制NLRP3并维持胃微环境稳态的机制，可作为胃癌干预的潜在靶点 [ 31 ]。 近年来，驱使miR-22高表达或研发上调miR-22的天然植物有效成分已成为治疗肿瘤新策略。miR-22在肾细胞癌中下调与肿瘤分期和淋巴结转移有关。实施miR-22高表达可抑制肾细胞癌细胞增殖、迁移侵袭与移植瘤生长和诱导凋亡。并且，miR-22高表达通过直接靶向SIRT1活化p53及其下游靶点p21与PUMA，裂解凋亡标志物CASP3与PARP和抑制EMT，表明miR-22高表达具有治疗肾细胞癌的新的潜在的作用 [ 32 ]。研究表明，miR-22在肿瘤发生发展中可调控抑制肿瘤干细胞CSC表型与功能。姜黄、大豆异黄酮、茶多酚、白藜芦醇、维生素D等天然植物有效因子通过靶向CSC相关基因上调miR-22抑制肿瘤增殖、迁移、侵袭与转移 [ 33 ]。黄酮类化合物白杨黄素chrysin具有抑制胃癌细胞增殖的作用，白杨黄素可改变miRNAs的表达，上调miR-22，可能是其作用的分子机制 [ 34 ]。进一步研究显示，用纳米包裹的chrysin与单体的chrysin相比，miR-22增加更为显著，表明纳米包裹的chrysin在抑制人胃细胞生长作用比单体的chrysin更有效 [ 35 ]。二烯丙基二硫(diallyl disulfide， DADS)是大蒜中烯丙基硫化物的一种脂溶性的有效成分，对多种肿瘤均有明显的抑制作用 [ 36 ]。我们发现，DADS可上调miR-22通过Wnt-1通路明显抑制胃癌细胞增殖与迁移侵袭 [ 37 ]。然而，DADS上调miR-22抑制胃癌细胞增殖与迁移侵袭的详细分子机制尚待深入研究。