system: [SYSTEM]

user: 2. 材料与方法 2.1. 主要仪器 Varian Mercury-400型核磁共振仪(美国Varian公司)；UPLC-QTOF型高分辨质谱(美国沃特世公司)；ZF-7C型三用紫外分析仪(上海慧鑫科学仪器有限公司)。 图1. 川芎嗪衍生物合成路线 2.2. 川芎嗪衍生物的合成 本文根据生物电子等排原理和拼合原理，以川芎嗪为先导化合物，筛选了含有酚羟基、氨基、吗啉等基团的化合物，在碱性环境下经威廉姆森醚化反应得到一系列酯类川芎嗪衍生物，再经水解反应得到含有羧基的8个新型川芎嗪衍生物A~H，其结构经 1 H-NMR、 13 C-NMR和LC-MS确证。 以化合物D为例：以三溴化磷和(3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇为原料，以四氢呋喃为溶剂反应得到2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪，再与化合物对氨基苯甲酸甲酯化合物经过亲核取代反应得到4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸甲酯川芎嗪氨类衍生物，最后经过水解得到4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(化合物D)。白色粉末； 1 H NMR δ：7.82 (s， 1H， Ar-H)，7.81 (s， 1H， Ar-H)，6.75 (s， 1H， Ar-H)，6.73 (s， 1H， Ar-H)，4.46 (s， 2H， CH 3 )，2.56 (s， 3H， CH 3 )，2.55 (s， 3H， CH 3 )，2.52 (s， 3H， CH 3 )； 13 C NMR δ = 152.53， 151.81， 149.63， 148.66， 148.27， 147.40， 131.31， 118.14， 112.20， 45.47， 19.82， 19.66， 18.69；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 272.41。 用类似的方法合成得到化合物A、B、C、E、F、G、H。 化合物A：4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)苯甲酸；白色粉末； 1 H NMR δ：8.01 (s， 1H)，7.12 (s， 1H)，7.99 (s， 1H)，7.11 (s， 1H)，5.27 (s， 2H)，2.54 (s， 3H)，2.58 (s， 3H)； 13 C NMR δ = 168.27， 162.42， 151.50， 149.73， 149.08， 145.59， 131.45， 123.39， 114.14， 69.19， 19.94， 19.73， 18.88；ESI-MS(m/z) [M-H] − = 271.17。 化合物B：2-(4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)苯基)乙酸；白色粉末； 1 H NMR δ：7.23 (s， 1H， Ar-H)，7.21 (s， 1H， Ar-H)，7.00 (s， 1H， Ar-H)，6.98 (s， 1H， Ar-H)，5.17 (s， 2H， CH 2 )，3.55 (s， 2H， CH 2 )，2.57 (s， 3H， CH 3 )，2.53 (s， 3H， CH 3 )； 13 C NMR δ = 174.45， 157.61， 149.77， 148.11， 146.19， 130.09， 127.47， 114.48， 69.13， 36.39， 19.91， 19.69， 18.92；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 288.44。 化合物C：3-(4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)苯基)丙酸；白色粉末； 1 H NMR δ：7.17 (s， 1H， Ar-H)，7.16 (s， 1H， Ar-H)，6.96 (s， 1H， Ar-H)，6.94 (s， 1H， Ar-H)，5.15 (s， 2H， CH 2 )，2.59 (s， 2H， CH 2 )，2.57 (s， 3H， CH 3 )，2.56 (s， 2H， CH 2 )，2.54 (s， 3H， CH 3 )； 13 C NMR δ = 157.07， 151.22， 149.77， 148.89， 146.27， 133.59， 123.98， 114.51， 69.14， 35.57， 29.79， 19.90， 19.67， 18.92；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 302.45。 化合物E：2-(4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯基)乙酸合物；白色粉末； 1 H NMR δ：7.08 (s， 1H， Ar-H)，7.06 (s， 1H， Ar-H)，6.72 (s， 1H， Ar-H)，7.06 (s， 1H， Ar-H)，6.72 (s， 1H， Ar-H)，6.71 (s， 1H， Ar-H)，4.37 (s， 2H， CH 3 )，2.55 (s， 3H， CH 3 )，2.54 (s， 3H， CH 3 )，2.51 (s， 3H， CH 3 )； 13 C NMR δ = 153.89， 149.32， 148.56， 148.22， 148.13， 147.28， 129.57， 123.43， 112.87， 45.27， 40.07， 19.80， 19.62， 18.69；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 286.43。 化合物F：2，6-二甲基-4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)吗啉；淡黄色油状； 1 H NMR δ：3.66~3.68 (d， 1H， CH， J = 12)，3.59 (s， 2H， CH 2 )，2.62~2.66 (t， 2H， CH 2 ， J = 12)，2.59 (s， 3H， CH 3 )，2.51 (s， 3H， CH 3 )，1.88~1.91 (t， 2H， CH 2 ， J = 12)，1.14~1.15 (d， 3H， CH 3 ， J = 6)； 13 C NMR δ = 149.99， 149.65， 148.01， 147.99， 71.69， 62.01， 21.58， 21.47， 20.95， 19.09；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 251.42。 化合物G：4-((3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)硫代吗啉合物；淡黄色油状； 1 H NMR δ：3.62 (s， 2H， CH 2 )，2.76 (s， 2H， CH 2 )，2.66 (s， 2H， CH 2 )，2.58 (s， 3H， CH 3 )，2.51 (S， 3H， CH 3 )，2.50 (S， 3H， CH 3 )； 13 C NMR δ = 150.08， 149.65， 147.94， 147.66， 62.78， 54.96， 29.70， 27.99， 21.57， 21.45， 20.95；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 239.44。 化合物H：(E)-3-(4-(3，5，6-三甲基吡嗪-2-基)甲氧基)苯基)丙烯酸；白色粉末； 1 H NMR δ：7.64~7.61 (d， 1H， CH， J = 18)，7.58~7.56 (d， 1H， Ar-H， J = 12)，7.09~7.08 (d， 1H， Ar-H， J = 6)，6.38~6.35 (d， 1H， CH， J = 18)，5.24 (s， 2H， CH 2 )，2.58 (s， 3H， CH 3 )，2.54 (s， 3H， CH 3 )；ESI-MS(m/z) [M+H] + = 300.41。 化合物A~H结构式见图2。 图2. 化合物A~H结构图 2.3. 抗血小板聚集试验 2.3.1. 富血小板血浆(PRP)与贫血小板血浆(PPP)的制备 取禁食24 h家兔用利多卡因局部麻醉，颈动脉插管取血，注入含1/10容量的3.8%枸橼酸钠溶液的硅化离心管中，将血液与抗凝剂轻轻混匀，以900 rpm/min，离心5 min后，再次800 rpm/min离心5 min，取上层淡黄色液体为富血小板血浆(PRP)，将剩余部分以3000 rpm/min离心10 min，取上清液即得贫血小板血浆(PPP)。 2.3.2. 血小板聚集率的测定 将制备好的富血小板血浆(PRP)置37℃摇床温育20 min，用移液器精密移取温育后的PRP 90 μL于96孔板中，再加入5 μL待测化合物，涡旋混匀，然后逐级稀释，制得终浓度为100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L、6.25 μmol/L、3.12 μmol/L的血浆样品，37℃温育振摇5 min，平行制备2组，记为A组和B组。将酶标仪设置震动一次时间为10 s，测定波长为570 nm，将经温育震荡的96孔板置于酶标仪上快速震摇10 s后测定吸光度，每30 s测定一次，连续测3次，记各孔三次吸光度均值为A 0 。A组加入诱导剂二磷酸腺苷(ADP)，使ADP终浓度为5 μmol/L，B组加入诱导剂花生四烯酸(AA)，使AA终浓度为0.5 mmol/L，将其放置摇床37℃震荡5 min后，每30 s测定一次吸光度，直至吸光度不再变化，记平行孔的吸光度均值为A。 2.3.3. 统计学处理 实验数据处理使用SPSS进行统计分析，用 x ¯ ± s 表示，P < 0.05为差异具有统计学意义。直线回归方程计算半数有效浓度IC 50 。按以下公式计算血小板聚集率(aggregation rate， AR)和药物对血小板聚集抑制率(aggregation inhibition rate， AIR)： AR = [(加入ADP前A值 − 加入ADP后A值)/加入ADP前A值] × 100%； AIR = [1 − (给药管聚集百分率/对照管聚集百分率)] × 100%。 2.3.4. 抗血小板聚集活性 与空白组比较，不同浓度的待测样品能抑制ADP和AA诱导的体外血小板聚集，并呈剂量相关性。化合物H有显著的体外血小板抑制作用，活性明显强于阿司匹林。其中化合物A、D、F、H抗血小板聚集作用优于阿司匹林，其在100 μmol/L时对ADP抑制率分别为72.56%、66.95%、78.48%、88.93%，对AA抑制率分别为68.64%、62.08%、78.48%、84.91%。其抑制ADP诱导血小板聚集的IC 50 分别为：30.71 μmol/L、37.38 μmol/L、21.85 μmol/L、8.52 μmol/L，阿司匹林IC 50 为44.66 μmol/L；其抑制AA诱导血小板聚集的IC 50 分别为：33.42 μmol/L、46.19 μmol/L、24.92 μmol/L、12.08 μmol/L，阿司匹林IC 50 为46.58 μmol/L，化合物H抗血小板聚集作用最强，结果见表1。 Table 1 IC50 values of target compounds against platelet aggregation in vitr Compd IC 50 (μmol/L) AA ADP Aspirin 46.58 44.66 A 33.42 30.71 B 60.21 55.28 C 129.38 111.58 D 46.19 37.38 E 75.23 66.82 F 24.92 21.85 G 65.82 51.65 H 12.08 8.52 表1. 体外抗血小板聚集的IC 50 值