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user: 3. 方法与结果 3.1. 两亲性海藻酸酯(HA)的制备 HA的制备方法参照文献 [ 6 ] ：称取0.5 g NaAlg和0.5 g TSA，加至35 ml DMF，55℃搅拌30 min，依次加入0.3 g EDC、3.0 g十六醇，55℃反应30 h；加入4倍体积乙醇，室温搅拌30 min，8000 r/min离心20 min得到沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤三次，离心，溶解，透析3 d，冻干得产物HA。图2为NaAlg和HA的热重分析(Thermogravimetric Analysis， TGA)曲线图。 由图可知：NaAlg和HA均表现为两阶段失重过程，第一阶段为50℃~180℃，这主要为分子中吸附和结合水脱除所致。NaAlg第二阶段失重从216℃开始，并持续到270℃，为羧基热分解脱去CO 2 及相邻羟基脱水造成；相比NaAlg，HA失重更明显，是由于酯键受热分解释放CO 2 、相邻羟基脱去水分子，同时侧链受热分解成小分子，说明十六醇成功接枝至NaAlg。 3.2. 半乳糖(Gal)修饰的HA (HA-Gal)制备 将40 mg HA溶于10 ml去离子水，分别加入4、8和16 mg半乳糖胺，加适量的EDC和NHS (n(EDC): n(NHS):n(半乳糖胺) = 1.2:1.2:1)，于室温反应24 h，透析、冷冻干燥，分别命名为HA-Gal1、HA-Gal2和 图2. 标准试验系统结果曲线 HA-Gal3。图3为NaAlg、HA、HA-Gal1、HA-Gal2和HA-Gal3傅里叶变换红外(Fourier Transform Infrared Spectrometer， FT-IR)图谱。 与NaAlg谱线相比，HA谱线中出现了一些新的吸收峰，1686 cm −1 和1296 cm −1 处的小尖峰为酯基中的C=O和C-O伸缩振动峰，说明HA合成。与HA相比，由于HA-Gal中N-H的伸缩振动，HA-Gal 3430 cm −1 处的宽峰发生红移；1610 cm −1 处的强峰为C=O和酰胺I相互叠加的结果。 图4为HA、HA-Gal1、HA-Gal2和HA-Gal3的 1 H-NMR图谱。3.6~5.1 ppm处的信号峰为NaAlg的氢峰。HA图谱中1.6~2.0 ppm处为HA侧链上亚甲基氢峰，1.0~1.3 ppm处为HA侧链上甲基氢峰，亦说明HA合成。HA-Gal图谱3.0~4.0 ppm处为半乳糖胺的特征峰。配制一系列标准浓度的Gal甲苯溶液，通过气相色谱测定不同浓度溶液的峰面积，然后进行线性拟合，得到Gal的标准曲线(检测器：FID，毛细管色谱柱：HP-INNOWAX，30 m × 0.25 mm × 0.25mm。汽化室温度：250℃，检测器温度：280℃，用高纯氮(99.99%)作为载气。色谱柱初温120℃，保持1 min，然后，以10℃/min的升温速率升至230℃，保持3 min。分流比：10:1，进样量：1 ml)。分别称取10 mg HA-Gal样品溶解在1 mol/L的NaOH溶液中，60℃下搅拌24 h然后加入适量甲苯，再充分搅拌1 h，3000 rpm分离，移取上层有机相，重复三次，将上层液进行气相色谱分析。根据气相色谱得到的峰面积计算出甲苯中Gal的浓度，最后计算得到HA-Gal1、HA-Gal2和HA-Gal3的Gal接枝比分别为3.4%、7.8%和11.4% [ 11 ] 。 3.3. 纳米粒的制备和表征 HA-Gal水中可自组装形成以十六醇为疏水核心、海藻酸和半乳糖为亲水外壳的核-壳结构纳米粒，疏水核心有利于包载难溶性药物。分别取2 ml (2 mg/ml) HA、HA-Gal1、HA-Gal2和HA-Gal3溶液，超声(120 W) 15 min，得纳米粒悬液，加入80 ml (10 mg/ml) DOX溶液，超声(120 W) 15 min，即得载DOX纳米粒悬液，分别记为DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3。分别离心，收集上清，测定吸光值，计算DOX包封率(encapsulation efficiency， EE)和载药量(loading capacity，LC，质量分数)。各载药纳米粒粒径、Zeta电势、EE和LC见表1。 图3. NaAlg、HA、HA-Gal1、HA-Gal2和HA-Gal3的FT-IR图谱 图4. HA、HA-Gal1、HA-Gal2和HA-Gal3的 1 H NMR图谱 Table 1 Particle size， Zeta potentials， EE and LC of DOX/HA， DOX/HA-Gal1， DOX/HA-Gal2 and DOX/HA-Gal3 (， n = 3 样品 粒径 (nm) Zeta电势(mV) EE (%) LC (%) 空白纳米粒 包载DOX DOX/HA 172.4 ± 1.7 183.4 ± 1.8 −53.7 ± 0.5 79.4 ± 0.7 13.7 ± 0.1 DOX/HA-Gal1 170.8 ± 1.2 211.2 ± 4.9 −50.0 ± 0.4 77.5 ± 1.4 13.4 ± 0.2 DOX/HA-Gal2 182.7 ± 7.4 231.4 ± 6.0 −37.1 ± 0.8 78.2 ± 0.6 13.5 ± 0.1 DOX/HA-Gal3 236.1 ± 6.3 245.3 ± 5.1 −29.8 ± 0.8 80.1 ± 0.3 13.8 ± 0.1 表1. DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3的平均粒径、Zeta电势、EE和LC ( ， n = 3) 由表可知，随着Gal接枝比的增大，纳米粒粒径增大，这可能由于Gal修饰使表面亲水层增厚 [ 12 ] ；同时Zeta电势增加，可能由于海藻酸骨架游离的羧基随Gal接枝比增大而减少。以扫描电镜(scanning electron microscope， SEM)观察其形貌，可见DOX/HA-Gal2成球形，大小约为200 nm (图5)。 3.4. 体外释放 分别量取1 ml 1 mg/ml DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3纳米粒悬液(按“3.3”项下方法制备)，加至透析袋中(MWCO 3500 Da)，浸入50 ml 0.2 mol/mL PBS (pH 7.4)，37℃、100 r/min振荡温育。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24和48 h取样1 ml，测定荧光强度。每次取样后补加1 ml新鲜PBS。由标准曲线得DOX含量，并计算累计释放量(%)。如图6所示，DOX物理包埋于纳米粒后的释药行为呈二相性，即包括初期突释和后期的缓释；前期的突释可能为少量游离及纳米粒表面粘附的DOX快速释放所致，DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3的DOX 48 h累计释放分别达到80%、82%、88%和93%。 3.5. 细胞摄取 按2.3项下方法制备含DOX的纳米粒。以1 × 10 5 细胞/孔的密度接种QGY-7703细胞至24孔板，37℃、5% CO 2 培养24 h；每3孔为一组，按每孔5 mg DOX加入纳米粒，37℃、5% CO 2 分别培养0.5、2和4 h；吸弃孔内液体，以0.2 mol/L PBS (pH 7.4)洗涤三次，加入0.5 ml 0.5% (w/v) SDS溶液(pH 8.0)，37℃、100 r/min振荡培养30 min以裂解细胞；酶标仪测定细胞裂解液中DOX含量，Lowry法测定蛋白质含量。摄取量以每1 mg蛋白质含DOX的量(mg)表示(mg/mg)。 纳米粒粘附至细胞表面后会被细胞内化，摄取入胞，细胞摄取效率和药物递送效率正相关 [ 13 ] 。 图7为QGY-7703细胞对纳米粒的摄取试验结果，可见在QGY-7703细胞中，纳米粒在0.5~4 h内可提高药物的细胞摄取量，且摄取量随Gal接枝比的增加而增加，其可能为靶向配体Gal修饰度和纳米粒的粒径、电势等物理性质共同作用的结果。 3.6. 细胞毒性试验 以1 × 10 4 细胞/孔的密度接种QGY-7703细胞至96孔板，37℃、5% CO 2 培养24 h；更换新鲜培养基，每3孔为一组，加入终浓度分别为25、50、250和500 mg/ml的空白纳米粒，以加等体积0.2 mol/L PBS (pH 7.4)为对照，37℃、5% CO 2 培养48 h；MTT法测定细胞存活率。 图8为QGY-7703细胞与不同浓度空白纳米粒共培养48 h的存活率，可见在25~500 mg/ml浓度范围内纳米粒对细胞活力无显著影响(p > 0.05)，可确保后续体外细胞试验结果的准确性。 图5. DOX/HA-Gal2的SEM照片 图6. DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3体外释放曲线(n = 3) 图7. QGY-7703细胞对纳米粒的摄取(n = 3) 图8. QGY-7703细胞分别与空白纳米粒共培养48 h后的细胞存活率(n = 3) 3.7. 体外细胞抑制 按2.6项下培养细胞，每6孔为一组，分别加入适量游离DOX、DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3纳米粒悬液，使孔内DOX终浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2和5 mg/ml，以加入0.2 mol/L PBS (pH 7.4)的细胞为阴性对照，37℃、5% CO 2 培养48 h；用MTT法测定各试验组相对细胞存活率，计算半数抑制浓度(IC 50 )。 图9为QGY-7703细胞分别与游离DOX溶液和纳米粒共培养48 h后的细胞存活率，可见细胞存活率随药物浓度升高而降低。DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3组的细胞存活率显著低于游离DOX组，表明纳米粒可增强药物的肿瘤细胞抑制作用。游离DOX、DOX/HA、DOX/HA-Gal1、DOX/HA-Gal2和DOX/HA-Gal3的IC 50 分别为1.12、0.68、0.64、0.51和0.46 mg/ml，表明体外抗增殖能力随着靶向配体接枝比的增加而增强，与细胞摄取结果一致，纳米粒提高了DOX的肿瘤细胞摄取效率，更多药物入胞，抑制肿瘤细胞增殖。