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user: 4. 细胞穿膜肽作为转运载体的应用 4.1. 细胞穿膜肽作为转运载体在癌症治疗中的应用 CPPs依赖性的药物传递系统，已用于各种疾病的治疗研究，包括：神经性疾病、哮喘、局部缺血、糖尿病以及癌症，其中癌症的治疗研究居于首位。作为有效的转运工具，CPPs已成功将多种细胞毒性药物导入肿瘤细胞，用于诱导肿瘤细胞凋亡。 4.1.1. CPPs介导小分子药物的跨膜转运 小分子抗癌药物具有体积小和亲油特性，能够高效扩散进入肿瘤细胞，但当肿瘤细胞频繁地暴露于相同的药物时就会出现多重耐药性(multidrug resistance， MDR)。为了解决这个问题，一些研究者尝试将这些药物和CPPs结合，介导这些小分子药物进入细胞。Dubikovskaya等通过二硫键将八聚精氨酸R8与抗癌药物紫杉酚连接，形成R8-紫杉酚共价物 [ 21 ]。结果显示，对于紫杉酚敏感的肿瘤模型，R8-紫杉酚共价物与紫杉酚单独作用具有相似的效应，而对于具有紫杉酚抗性的肿瘤模型，R8-紫杉酚共价物要比紫杉酚单独作用更容易诱导肿瘤细胞凋亡。小分子药物与CPPs结合有很多优点，除了能够克服多重耐药性，还能够增加药物的水溶性，提高药物的利用率。为了增加抗癌药物的细胞毒性和靶向转运，Lee等利用化学方法将阿霉素、TAT和聚合壳聚糖骨架结合，产生壳聚糖/阿霉素/TAT嵌合体，与无TAT嵌合的阿霉素或者壳聚糖/阿霉素相比，此嵌合体显示出更有效的细胞内化，且能够改变阿霉素在生物体内的分布，增强肿瘤定位，从而显著地抑制肿瘤生长 [ 22 ]。 4.1.2. CPPs介导多肽和蛋白质的跨膜转运 抑癌基因发生突变，可引起多种癌症的发生 [ 23 ] [ 24 ]。一些研究者尝试向癌细胞内转运抑癌基因相对应的全长蛋白质或者多肽，用于恢复该类蛋白质的功能，以达到治疗癌症的目的。Snyder等构建了TAT-p53嵌合肽，通过腹腔注射到晚期腹膜癌转移的小鼠体内，与平均存活时间为10天的对照组相比，实验组小鼠的平均存活时间提高了6倍以上 [ 25 ]。为了恢复p16蛋白活性，Hosotani等通过二硫键将p16蛋白的20个氨基酸残基构成的短肽与penetratin共价连接，并在胰腺肿瘤动物模型中验证其功效。结果显示，该复合物能够明显抑制肿瘤的增长(处理组肿瘤：79 ± 17 mg；对照组肿瘤：149 ± 12 mg) [ 26 ]。 一些研究者尝试采用不同的处理方法诱导肿瘤细胞的凋亡。第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活物(second mitochondria-derived activator of caspase， SMAC)作为线粒体起源的蛋白质，在线粒体调控细胞凋亡过程中起着重要作用 [ 27 ]。当SMAC从线粒体释放后，能够使细胞凋亡蛋白的抑制剂失活，从而促进细胞凋亡。Fulda等将SMAC氨基端的7个氨基酸残基与TAT构成嵌合肽，体外研究发现此嵌合肽并不能有效促进肿瘤细胞凋亡，但却使肿瘤细胞对细胞凋亡刺激剂敏感，如肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand， TRAIL)。在人胶质瘤异种移植的小鼠模型中，TRAIL与SMAC-TAT肽的结合物能够明显抑制肿瘤的生长，且使用0.6或者2 μg的TRAIL时能够将肿瘤细胞根除 [ 28 ]。植物来源的白树毒素，属于核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins， RIPs)，当其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration， IC50)为皮摩尔水平时，即能有效抑制蛋白翻译，然而由于其穿膜能力较差，往往达不到治疗肿瘤的效果 [ 29 ]。为了克服这一障碍，Park等将白树毒素与TAT或者LMWP通过化学方法结合，在小鼠结肠癌细胞中显示出较强的抗肿瘤活性，且当CPPs和白树毒素嵌合肽注射总剂量达到100 ug时，能够完全抑制肿瘤生长 [ 30 ]。 4.1.3. CPPs介导基因的跨膜转运 基因、反义寡核苷酸链以及小干扰RNA(small interference RNA， siRNAs)可能是治疗癌症的有效方法 [ 31 ]。RNA干扰技术对靶基因具有高度特异性且具有独特的肿瘤抑制效应，使其成为了特别有吸引力的治疗策略，然而，siRNA药物电荷较强且尺寸偏大，细胞穿透能力较弱。曾尝试利用阳离子脂质体、阳离子聚合物以及CPPs介导siRNA进入细胞，其中CPPs由于毒性较低，引起了广泛的关注。siRNA可以共价或者非共价的形式与CPPs结合，虽然共价结合是最理想的结合形式，但由于二者之间超强的电荷作用，极易形成紧密的复合体或者聚合体，与siRNA和CPP按1:1共价结合体相比，不易通过细胞膜。此外，带负电荷的siRNA极易中和阳离子型CPPs的电荷，使siRNA和CPPs失去其原有的生物学功能。考虑到共价结合的诸多不利因素，研究者们纷纷选择将siRNA以非共价的形式与CPPs结合，且主要关注siRNA-CPP嵌合肽在体外研究的可行性，动物体内的研究也在持续增加。 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)在肿瘤生长所必须的血管生成中扮演着重要作用，封闭VEGF受体或者沉默VEGF基因是治疗肿瘤的有效方法。Kim等利用胆固醇和R9的嵌合体作为载体，与抗VEGF的siRNA(即siVEGF)结合形成胆固醇/R9/siVEGF复合体，能够明显地抑制肿瘤生长和血管生成 [ 32 ]。Cyclin B是一种有丝分裂周期蛋白，对于细胞分裂至关重要，但在肿瘤细胞中表达明显失调，一些研究者尝试使用RNA干扰技术达到治疗的目的。Crombez等将抗cyclinB1的siRNA与缩短版的MPG(命名为MPG-8)结合，形成siRNA/MPG-8复合体，能够明显下调cyclinB1的表达水平，诱导细胞周期发生阻滞，从而抑制各种肿瘤细胞的增殖 [ 33 ]。 4.1.4. CPPs介导纳米粒子的跨膜转运 虽然细胞穿膜肽的跨膜机制尚不完全清楚，但已被广泛用于各种纳米粒子的跨膜转运，例如磁性纳米粒子、脂质纳米粒子、金纳米粒子、胶团和量子点等。1999年，Josephson等将TAT与交联氧化铁颗粒(cross-linked iron oxide particles，CLIOs)结合形成TAT/CLIO复合体，平均粒径41 nm，与无TAT结合的CLIO相比，穿膜效率提高了约100倍，能够有效标记细胞，有利于核磁共振成像或者磁性分选 [ 34 ]。随着TAT/CLIO比值的增加，TAT/CLIO的穿膜效率呈非线性增长，当其比值达到15时，穿膜效率最高。此外，脂质体与CPPs结合形成的复合体能够有效进入各种细胞，如小鼠心脏肌细胞、小鼠肺癌细胞和人乳腺癌细胞等，且脂质体的穿膜效率与CPPs的密度成正比 [ 35 ]。与TAT/脂质体复合物相比，penetratin/脂质体复合物的穿膜速度更快，1 h内即可达到最大吸收值。鉴于CPPs能够成功介导各种纳米粒子的跨膜转运，研究者们对利用CPP/纳米粒子复合体转运各种抗肿瘤药物产生了浓厚的兴趣。Balzeau等利用CPP修饰的脂质纳米胶囊装载紫杉醇，能够高效进入恶性胶质瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长 [ 36 ]。 4.2. 细胞穿膜肽作为转运载体在海洋生物中的应用 目前关于CPPs的转导机制仍存有争议，然而现有研究表明无论是动物细胞还是高等植物细胞，CPPs都能够适用，但CPPs在海洋生物中的研究较为匮乏，主要集中在海洋生物育种和疫苗递送等方面。海洋生物育种方面，郝萧等为获得红鳍东方鲀精巢细胞的iPS细胞，选取Oct4与Sox2这两个维持胚胎干细胞特征所必须的转录因子，同时引入细胞穿膜肽11R，通过原核表达系统诱导表达出其编码蛋白。与体外培养的红鳍东方鲀精巢细胞系的细胞共孵育，发现细胞穿膜肽能有效介导Oct4和Sox2重组蛋白穿膜进入红鳍东方鲀精巢细胞，且主要集中于细胞核内，为红鳍东方鲀精巢细胞诱导转化为iPS细胞，进行优质、高产、抗逆红鳍东方鲀的细胞工程育种奠定了基础 [ 37 ]。韦一凡等成功利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)标记的九聚精氨酸(FITC-R9)转入浒苔、紫菜和海带这三种常见的大型海藻，转入的效率与藻体细胞壁结构有一定联系，且R9对大型海藻的光合作用没有负面影响。此外，还探索了细胞穿膜肽非共价连接siRNA导入微藻的条件，其中杜氏盐藻能够大量摄入R9/siRNA复合体。这些工作将为今后的大型海藻育种、藻类基因沉默和基因功能的研究提供技术支持 [ 38 ] [ 39 ]。在疫苗递送方面，Sun等在海豚链球菌的保护抗原Sia10的氨基端和羧基端分别引入细胞穿膜肽Antp和TAT，构建了四种融合蛋白，其中TAT-Sia10融合蛋白穿膜能力最强。将TAT-Sia10融合蛋白从腹腔注入牙鲆体内，此融合蛋白能够穿过前肾淋巴细胞和鳃细胞，同时增强巨噬细胞活性和外周血白细胞增殖，上调与免疫相关的基因表达。而且接种免疫2~8周后诱导产生特异性的抗体，提高了牙鲆存活率 [ 40 ]。此外，Ma等也成功将细胞穿膜肽应用于细菌载体疫苗研究，并在斑马鱼中进行了验证 [ 41 ]。