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user: 3. 方法与结果 3.1. 丹参酮类成分的含量测定 借鉴杨树生 [ 7 ] 等的方法，在试验中改进，方法如下。 3.1.1. 色谱条件与系统适应性条件 色谱柱为Welch C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇：水(70:30)；等度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长270 nm；柱温25℃；进样体积为10 μL。 3.1.2. 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取，丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I对照品各10 mg，用甲醇制成丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I分别为0.1 mg/ml、0.08 mg/ml、0.1 mg/ml、0.1 mg/ml的丹参酮类混合对照品溶液。供试品溶液的制备：取丹参样品粉末约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，再用微孔滤膜(孔径0.45 μm，下同)滤过，即得供试品溶液。 3.1.3. 样品测定 按3.1.1项下色谱条件，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪测定，即得。 3.2. 丹酚酸类成分的含量测定 参考张友芹 [ 8 ] 等的方法，在试验中改进，方法如下。 3.2.1. 色谱条件与系统适应性条件 色谱柱为Welch C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇：乙腈(10:1) (A)，1%甲酸(B)；梯度洗脱(0~5 min，30%的流动相B；5~6 min，30%~45%的流动相B；6~20 min，45%的流动相B；20~22 min，45%~30%的流动相B；22~25 min，30%的流动相B)；流速1.0 ml/min；检测波长280 nm；柱温40℃；进样体积为10 μL。 3.2.2. 溶液的制备 对照品溶液的制备：取丹酚酸B、丹酚酸A和丹参素钠对照品，精密称定10 mg，加甲醇–水(8:2)混合溶液制成丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素钠均为0.1 mg/ml的丹酚酸类混合对照品溶液，即得。供试品溶液的制备：取丹参样品粉末约0.15 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇–水(8:2)混合溶液，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇–水(8:2)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，移至10 ml量瓶中，加甲醇–水(8:2)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。 3.2.3. 样品测定 按3.2.1项下色谱条件，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪测定，即得。 3.3. 方法学验证 3.3.1. 线性关系考察 丹参酮类成分的线性关系考察：精密吸取二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA混合对照品液，加甲醇分别配制二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA浓度为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml，丹参酮I浓度为0.8、4.0、8.0、12.0、16.0 μg/ml的混合标准品溶液，按2.1项下色谱条件，精密吸取不同浓度的混合标准品溶液各进样10 μl，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，含量为横坐标绘制标准曲线。丹酚酸类的线性关系考察：用甲醇–水(8:2)混合溶液分别配置丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素钠均为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml的混合标准品溶液，按照2.2项下色谱条件精密吸取不同浓度的混合标准品溶液各进样10 μl，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，含量为横坐标绘制标准曲线。 得到的7种成分线性回归方程见表1。 Table 1 Regression equation and linear range of component 成分 回归方程 r 线性范围(μg/ml) 二氢丹参酮I y = 0.5777x + 0.0386 0.9995 1.041~20.82 丹参酮I y = 0.6631x + 0.038 0.9996 0.8376~16.752 隐丹参酮 y = 0.8037x + 0.0444 0.9998 0.968~19.36 丹参酮IIA y = 0.9427x − 0.2012 0.9999 1.118~22.36 丹参素钠 y = 0.096x + 0.0058 0.9995 1.033~20.66 丹酚酸B y = 0.1995x − 0.0197 0.9999 1.068~21.36 丹酚酸A y = 0.4968x − 0.0117 0.9998 1.084~21.68 表1. 各成分的回归方程及线性范围 3.3.2. 精密度试验 丹参酮类成分的精密度试验：精密吸取丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I混合对照品溶液10 μl，按3.1项下含量测定方法，重复进样6次，计算RSD；结果分别为0.51%、0.69%、0.75%、0.62%。丹酚酸类成分的精密度试验：精密吸取丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素钠混合对照品溶液10 μl，按3.2项下含量测定方法，重复进样6次，计算RSD；结果分别是：0.71%、0.58%、0.81%。结果表明精密度试验符合要求。 3.3.3. 稳定性试验 丹参酮类成分稳定性试验：取同一供试品溶液，按3.1项下含量测定方法测定分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h进样，测定含量，计算RSD，验证24 h内供试品溶液中丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I的含量的稳定性，结果是1.21%、2.05%、1.54%、1.32%。丹酚酸类的稳定性试验：取同一供试品溶液，按3.3.3项下含量测定方法测定分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h进样，测定含量，计算RSD，验证24 h内供试品溶液中丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素的含量的稳定性，结果为2.29%、1.69%、1.61%。 3.3.4. 重复性试验 丹参酮类成分的重复性试验：精密称取6份同一丹参样品粉末，按3.1项下方法制备6组供试品溶液，再按照按3.1项下含量测定方法测定，计算RSD，结果是1.86%、2.12%、1.76%、1.98%。丹酚酸类成分的重复性试验：精密称取6份同一丹参样品粉末，按2. 2项下方法制备6组供试品溶液，再按照按3.2项下含量测定方法测定，计算RSD，结果为1.85%、1.56%、2.06%。 3.3.5. 加样回收率试验 丹参酮类成分的重复性试验：取已知4种丹参酮成分含量的丹参供试品溶液6份，分别精确加入与样品中的含量相等的丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I对照品溶液，按照3.1项下含量测定方法测定含量，得到丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I的加样回收率(RSD值)分别为99.85% (1.59%)、100.5% (1.68%)、101.2% (2.25%)、98.24% (1.82%)。丹酚酸类成分的加样回收率试验：取己知含量的丹参样品粉末0.15 g (6份)，精密称定，分别精密加入样品含量的100%的丹酚酸A、丹酚酸B和丹参素标准品，按3.2项下方法制备溶液和测定方法测定，计算回收率和RSD，结果分别是96.82% (1.23%)、101.2% (2.06%)、98.67% (2.43%)。两类成分的回收率数据均满足加样回收率要求(95%~105%)，且RSD值均较低，表明加样回收率试验结果符合相关规定要求。 3.4. 含量测定 3.4.1. 色谱条件与系统适用性 本试验的色谱条件与系统适用性结果如图1和图2。 图1. 丹参酮类成分的混合对照品(a)和丹参供试品(b)的HPLC图。(1，二氢丹参酮I；2，丹参酮I；3，隐丹参酮；4，丹参酮IIA) 图2. 丹酚酸类的混合对照品(a)和丹参供试品(b)的HPLC图。(1，丹参素；2，丹酚酸B；3，丹酚酸A) 由图1和图2可以看出，丹参酮类和丹酚酸类的混合对照品和供试品图中。的各峰都被分离开来，分离度高，且峰形良好，表明两种色谱条件的系统适用性良好。 3.4.2. 含量测定 将两种方法制成的丹参饮片制备溶液，按本试验的测定方法测定7种丹参酮类和丹酚酸类成分的含量。结果见表2。 Table 2 Compositions content of two types of processing methods of SMRR in Sichuan (n = 6 样 品 质量分数(%) 传统丹参 加工炮制一体化丹参 丹参酮类 丹参酮IIA 0.214 ± 0.013 0.253 ± 0.003 丹参酮I 0.041 ± 0.002 0.051 ± 0.001 隐丹参酮 0.042 ± 0.003 0.043 ± 0.004 二氢丹参酮I 0.045 ± 0.005 0.052 ± 0.006 总和 0.342 0.399 丹酚酸类 丹酚酸B 3.582 ± 0.042 4.125 ± 0.023 丹酚酸A 0.016 ± 0.006 0.022 ±0.004 丹参素 0.011 ± 0.003 0.012 ±0.001 总和 3.609 4.159 表2. 两种方法炮制的川丹参饮片化学成分测定结果(n = 6) 从表2中的试验结果可知，两种方法炮制的丹参饮片相比，工炮制一体化丹参饮片的丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I的含量分别高出18.22%、24.39%、2.38%和15.55%，丹参酮类成分含量的总和高出16.66%；丹酚酸A、丹酚酸B和丹参素的含量分别高出15.16%、37.50%、9.09%，丹酚酸类成分含量的总和高出15.24%；表明加工炮制一体化法炮制的丹参饮片质量较好。