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user: 2. 角膜缘干细胞的标识与定位 2.1. 角膜上皮干细胞的概念 干细胞是一类未充分分化、具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞 [ 2 ]。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。角膜上皮干细胞属于成体干细胞中的单能干细胞，发育等级较低，一般仅能向角膜上皮细胞分发。角膜上皮干细胞历经干细胞、短暂扩增细胞(Transient Amplifying Cells， TACs)和终末分化细胞(Terminally Differentiated Cells， TDCs) 3个分化阶段而构成不断更新的角膜上皮组织。1986年，Schermer等 [ 3 ] 通过研究指出，角膜缘干细胞位于约1.5 mm的角膜缘环形区域内上皮细胞基底层的Vogt栅栏内。角膜上皮干细胞因长期被定位于角膜缘上皮的基底层而又称为角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells， LSCs)。 2.2. 角膜缘干细胞的物理定位与标识 自Davanger首次提出角膜缘干细胞的概念以来，寻找角膜缘干细胞特异性标记物的研究从未中断，但始终未找到一种或一组能直接确定角膜缘干细胞的绝对特异性标记物。在寻找角膜上皮干细胞标志物的各种研究中，主要的依据和方法有：(1) 定位依据。根据角膜上皮干细胞仅位于角膜缘基底层的判断，寻找仅表达于角膜缘上皮基底层细胞的标记物，认为这些标记物就是角膜缘干细胞特异性标记物。由于这个判断本身需要通过特异性标记物来证实，以此作为寻找角膜缘干细胞的依据，缺乏严谨性。既使如此，最新研究表明，过去认为仅表达于角膜缘的LSCs的特异性标记物在中央角膜也有所表达 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]，只是表达量的多少存在差异，特异性标记物并不特异，以仅表达于角膜缘上皮基底层的分子作为LSCs标记物的传统观点需要修正。Lyngholm等 [ 7 ] 用二维聚乙烯酰胺凝胶电泳联合质谱法分析眼表上皮细胞中多种蛋白的表达，发现在角膜缘和角膜中央上皮表达水平有明显差异的蛋白多达25种，这些标记物的差异只能说明角膜缘上皮基底细胞与角膜中央上皮细胞有所不同，但无法证明角膜缘上皮基底细胞就是干细胞。(2) 表达共识表记物。将表达于人类其它干细胞的共识标记物作为角膜缘干细胞标记物。常见的共识标记物有原始干细胞转运蛋白家族ABCG2、ABCB5、转录因子p63、类鸟苷酸结合蛋白3、TCF4、细胞黏附分子integrinβ1、Bmi-l等 [ 5 ] [ 6 ] [ 8 ]，体外角膜基底细胞培养表明这些标记物主要表达于角膜缘基底层，但也可部分表达于中央角膜的基底层和基底上层，依据共识标记物，还不能认定角膜上皮干细胞仅位于角膜缘上皮基底部。(3) 具有干细胞的某些形态和功能特点。角膜缘上皮基底层细胞具有干细胞的某些形态和功能特点，比如角膜缘上皮基底部细胞与角膜中央上皮基底层细胞不同，体积更小，内含色素；角膜缘的肿瘤发病率高于角膜中央区，结合肿瘤更易发生于低分化、增殖能力强的细胞这一特点，提示角膜上皮干细胞可能存在于角膜缘；角膜缘上皮细胞部分或全部缺损后，角膜出现结膜化、新生血管等，这种情况可以通过LSCs移植得到改善。角膜缘上皮基底层细胞的这些形态和功能特点提示角膜缘可能是角膜上皮干细胞的主要存在部位，但并不能作为角膜缘基底细胞是干细胞的直接证明，也不能据此排除角膜其它部位存在干细胞的可能性。因为，人体组织细胞的增殖分化都是由所处的微环境诱导的，角膜缘与角膜中央区微环境明显不同，两处的上皮细胞在形态和功能上自然会存在差异，不能将这种差异完全归于普通细胞与干细胞之间的差异。此外，人体组织的增殖和愈合能力与血供营养有关，角膜缘血管网丰富，增殖愈合能力强于中央角膜，因此，角膜中央上皮受损通常由角膜缘上皮修复，这与干细胞是否存在角膜缘可能无关。总之，现在发现的各种LSCs标记物并无绝对的特异性，无法通过现有LSCs标记物鉴定角膜上皮干细胞。各种LSCs标识物研究表明，角膜缘基底层的上皮细胞与角膜其它区域的上皮细胞存在明显差异，角膜缘基底层是角膜上皮干细胞可能的储存部位，但不能排除角膜其它区域也存在角膜上皮干细胞的可能性。 2.3. 角膜缘干细胞的功能定位与作用 角膜上皮干细胞的主要功能是能更新修复角膜上皮，保持角膜上皮的完整性。完整的角膜上皮可使角膜免受外界物理或化学损伤，阻碍病原微生物侵袭损伤，抑制免疫炎症及角膜新生血管形成，从而维持眼表的稳定。虽然无法通过角膜干细胞标识物对角膜上皮干细胞进行物理定位，但如果能证明只有角膜缘基底细胞才具有角膜上皮干细胞的功能，那么就能确定角膜上皮干细胞只位于角膜缘，从而在功能上实现对角膜上皮干细胞的定位。角膜上皮干细胞的功能定位研究主要围绕两方面进行：一方面研究，在仅仅去除角膜缘上皮细胞的情况下，是否可以造成持续性角膜上皮结膜化、角膜新生血管形成、角膜炎症和溃疡等典型的LSCD表现；另一方面研究，对于LSCD病变，是否只能通过角膜缘干细胞移植来治愈，移植角膜中央上皮、结膜上皮或其它组织治疗均无效。对于第一方面，刘先宁等 [ 9 ] 通过两种方法构建LSCD动物模型，I组10只实验兔去除角膜缘内外2 mm以内的上皮及浅基质层组织；II组10只实验兔在I组基础上同时清除角膜中央上皮及浅基质层组织。结果发现I组有6只兔子在平均7 d的时间点角膜完全自愈，角膜维持透明并无新生血管形成，构建LSCD模型失败；II组10只实验兔均符合LSCD标准，成功率100%。由此表明，仅仅去除角膜缘上皮及基质层，并不能造成LSCD模型，只有连同角膜中央上皮及基质层去除的情况下，才能造成LSCD模型，提示角膜中央上皮也具有增殖修复能力， 表明在角膜中央区也可能存在角膜上皮干细胞。Huang等 [ 10 ] 实验发现，完全性角膜缘损毁的兔中央角膜上皮依然能够长期存活，但如再刮除中央区上皮，则不能通过周边的结膜化上皮再生。Majo等 [ 11 ] 的一项动物实验，通过360度烧灼野鼠的环角膜缘区域，包括角膜缘上皮和其下基质，使其不可能有任何LSCs残留，建立了完全性的角膜缘缺失模型。灼伤眼的角膜在整个实验的4个月观察期中均保持透明，且未观察到角膜溃疡或基质血管，表明角膜缘上皮完整与否与LSCD无必然联系，同时强烈提示中央区角膜上皮具有类似干细胞的自我修复更新、维持生理稳态的能力。Dua等 [ 12 ] 对被诊断为完全性LSCD的8例患眼进行了观察，这8眼均为360度角膜缘干细胞缺失，周边角膜和角膜缘上皮完全结膜化，但中央区角膜上皮仍完整和正常。经过超60个月的观察发现，角膜结膜化区域已完全结膜化，共焦显微镜下可见结膜化的上皮细胞、杯状细胞和新生血管，已无角膜缘干细胞存在可能，但中央角膜上皮细胞“岛”的上皮仍长期维持正常形态，表现为浅表细胞呈多边形、翼状细胞分化良好、以及较小的基底细胞。Dua等的研究提示，在角膜缘LSC完全缺失的情况下，角膜中央区上皮细胞同样可以维持角膜上皮透明性及生理稳态，LSC也许并不是维持角膜上皮完整性及生理稳态不可或缺的原因。对于另一方面，有研究证明，对于角膜缘的完全性损伤，并非只能通过角膜缘干细胞移植才能修复，移植角膜中央区上皮细胞、结膜上皮或口腔上皮等到角膜缘后也同样可以修复角膜上皮损伤，维持角膜透明。2008年，Majo等在《Nature》上发表研究报告 [ 11 ]，从被β-gal标记的供体鼠角膜中央获取了包括角膜上皮及其基质在内的全层植片，并植入角膜缘损毁的裸鼠的角膜缘，植片迅速与受体鼠的角膜缘融合并保持活性，成功地修复角膜缘受损区，且在9个月时间内标记的角膜上皮与相邻的未标记的角膜缘上皮之间的界限分明，表明修复完全依赖于移植的供体鼠中央角膜上皮而不是受体鼠自身的角膜缘上皮。如果将被β-gal标记的供体鼠角膜中央上皮移植到角膜缘上皮被刮除的受体鼠角膜中央，受体鼠角膜缘上皮缺损区被移植的供体鼠角膜中央上皮所修复，表明角膜中央上皮具有修复角膜缘上皮的功能。另外，由Chang等 [ 13 ] 研究发现，通过准分子激光指环形切除人角膜旁中央区上皮及浅基质层，保留中央区岛状上皮及角膜缘上皮，然后通过组织培养法观察切除区上皮愈合情况，结果表明，缺损区可同时被中央区角膜上皮和角膜缘上皮修复，中央区上皮修复速度甚至快于角膜缘区上皮。术后中央区上皮细胞密度增加了36%，而角膜缘区上皮细胞密度反而没有明显变化。如果在上述指环形切除的基础上同时切除角膜缘区的上皮及浅基质层，角膜缘仍可被角膜中央区的上皮细胞修复。Chang等的研究提示，角膜上皮受损后，上皮的向心性和离心性修复同时存在，而既往认为上皮缺损后只能靠角膜缘上皮的向心性修复而愈合，这也表明中央角膜上皮具有类似干细胞的再生特性，不但参与维持角膜上皮的完整性，也参与修复角膜缘区域的损伤。此外，尚有利用结膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、羊膜上皮细胞等非角膜缘干细胞治疗LSCD成功的报道，表明LSCD治疗成功的关键是要恢复上皮的完整性与稳定性，与是否移植角膜缘干细胞无关 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]。总之，综合现有各种研究，不管是通过标识定位的角度还是功能定位的角度，都难以证实角膜上皮干细胞只存在于角膜缘部位。在角膜缘之外可能有其他干细胞起到维持角膜自我更新的作用，因为长期自我更新以及能够维持移植物存活的能力是干细胞所特有的，无法单纯依赖角膜中央分裂次数有限的TAC来实现。此外，大量研究表明，在微环境的诱导下，成体干细胞可以跨系、甚至跨胚层分化为不同来源的细胞，称之为干细胞的“可塑性” [ 17 ] [ 18 ]，因此也不排除角膜中央上皮基底细胞或移植的其它组织上皮细胞，在微环境改变诱导下，获得了角膜干细胞的特性，使它拥有可以独立再生和维持上皮植片的能力，从而更新修复角膜上皮，重建角膜生理稳态。这也从另一方面证明，角膜缘上皮干细胞在角膜上皮自我修复及更新上并不是不可或缺的。