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user: 2. 材料和方法 实验动物及主要试剂、C57和ICR小鼠和BALB/C小鼠，(20 ± 1) g，雌雄随机，购自武汉大学实验动物中心，结肠癌细胞株CT26为本科保存，BSA购自武汉四季青生物工程材料研究所，荧光标记小鼠抗体CD117-PE磁珠和CEA-PE抗体的免疫磁珠试剂盒、抗生物素，磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自武汉中山试剂公司，T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、双荧光检测系统均购自美国Promega公司，HeLa细胞和测序鉴定正确的小鼠RAN基因为本实验室保存，总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自Sigma公司；PCR回收试剂盒(Sigma公司)、pGEM-Teasy载体连接试剂盒、pGL3-Basic载体、pGI3-promoter载体均为Promega公司产品。流式细胞仪(FACSCalibur)购自BD公司。基因共表达载体pIRES1neo、重组质粒pcDNA-CEA、重组质粒pMD18T-EPO、绿色荧光蛋白、BCA蛋白定量试剂盒、DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶、I型胶原酶(GIBCO 公司，美国)；感受态细胞DH5α和免疫磁珠分选系统(MACS)购自武汉博士德公司PCR仪、全自动生化分析仪、倒置相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司，日本)。 2.1. 小鼠骨髓胚胎干细胞收集 颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，用注射器插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，进行细胞计数，加入生物素化抗体混合物10 μl/10 7 个细胞，混匀。 2.2. 造血干细胞的磁珠纯化和收集 含抗体CD117磁珠分离造血干细胞：用缓冲液按40 μl/10 7 个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10 μl/10 7 个细胞，混匀，4℃~8℃孵育10 min。加入缓冲液30 μl/10 7 个细胞，20 μl抗生物素微珠，混匀，4℃~8℃孵育15 min。加入5 ml缓冲液洗涤细胞，1500 r/min离心10 min，完全去除上清液。加入CD117微珠20 μl/10 7 个细胞，混匀；所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1500 μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞，将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。 2.3. CEA启动子引物设计PCR的扩增 根据GenBank中CEA序列以及pEGFP质粒中CMV启动子序列设计引物，并分别在各上下游引物5'端引入Bgl II和Hind III酶切位点。CEA启动子的引物序列：上游：上游5’-GAATTCCCCGGGACCCTGCTGGG-3’，下游5’-GCTTGAGTTCCAGGAACGTTTTGGGATCC-3’，产物386 bp，CMV启动子的引物序列：上游： 5’ -GCGAGATCTA ATCAATTACGGGGTCAT-3'，下游：5’-GCGAAGCTTGGAT CTGACGGTTC ACTA-3'，引物两端分别添加酶切位点和保护碱基。CEA的聚合酶链反应((PCR)扩增：用50 u1体系，以1 μg DNA为模板；分别加入Taq酶1.5 U，上下游引物各50 pmol，dNTPs 10 nmol。以HepG2基因组DNA为模板扩增CEA启动子片段，以质粒pFGFP为模板扩增启动子。CEA启动子片段扩增用热启动法。PCR产物用10%琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收得到CEA启动子片断。 2.4. 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的CEA-EPO重组腺病毒载体的构建、纯化和滴度测定 用KpnI和Xho I双酶切取DNA片段，插入穿梭质粒中的相同位点，将EPO-cDNA插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点，用CEA基因启动子替代pcDNA3.1质粒的CMV启动子，构建成CEA-EPO重组质粒。产生重组腺病毒pAd-GFP/CEA-EPO，克隆筛选出阳性重组穿梭质粒pAdTrack/CEA-EPO，取1.0 μg质粒经内切酶Pme I线性化后与0.1 μg腺病毒骨架质粒pAdEasy-1混合，导入E.coliBJ5183菌，发生同源重组后的重组腺病毒质粒pAd-EGFP-CEA-EPO获得卡那霉素(50 μg/ml)抗性，小量提取质粒以1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，最终经PacI酶切分析和PCR扩增CEA-EPO片段鉴定重组腺病毒质粒，用CEA-EPO基因启动子中的Sma I单一酶切位点进行初步酶切鉴定。用T4DNA连接酶将PCR纯化产物与pGEM-Teasy载体相连，将连接好的载体转化Jm109感受态大肠杆菌，蓝白筛选，取阳性克隆接种于含5 ml Amp的LB培养液中，37℃振摇过夜。取800 μl液送武汉中山生物技术有限公司测序，荧光显微镜下观察或根据细胞病变效应判断病毒的产生。大量扩增病毒，并经CsCl超速离心纯化。纯化病毒颗粒用PBS稀释后−80℃冻存备用，病毒滴度根据空斑形成试验测定。由此包装、生产出携带CEA-EPO及和GFP基因的重组腺病毒，对表达GFP的细胞计数，观察感染效率。 2.5. 造血干细胞体外转染CEA及EPOmRNA基因 实验分组及方法：根据处理方法不同，将造血干细胞分为4组：A组为空载GFP质粒转染组，B组为单纯CEA转染组，C组为单纯EPO转染组，D组为CEA-EPO共转染组。取第3代血干细胞，以5 × 10 4 个/cm 2 密度接种于10孔板，待细胞达90%贴壁时，根据分组进行相应处理。其中A组加入DMEM培养基，B组采用不添加目的基因的空质粒转染，C、D组分别加入最佳MOI的CEA重组腺病毒和EPO重组腺病毒，D组同时加入最佳MOI的CEA-EPO重组腺病毒。于37℃、5%CO 2 培养箱中培养24 h后更换新鲜培养液。 2.6. 检测CEA及EPO基因和蛋白表达 转染细胞的CEA及EPO mRNA基因表达的半定量RT-PCR方法：检测分别取各组的造血干细胞，分选后表达强绿色荧光细胞，提取细胞总RNA后，用RT-PCR方法检测CEA及EPOmRNA基因在mRNA水平的表达。用Wesernblot法检测CEA及EPO蛋白表达，以β-actin作为内参照。 2.7. 病毒转染效率检测 培养7 d后倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，培养10填后各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化，吹打形成单个细胞，PBS清洗5 min后弃上清，再用PBS重新清洗2次，荧光显微镜下观察。成功转染细胞呈绿色表达。培养48 h时取各组细胞于100倍镜下随机取10个视野，计数荧光表达细胞数，并计算转染效率 = 荧光表达细胞数 ÷ 同视野下细胞总数 × 100%。 2.8. CEA及EPO双基因共转染红细胞疫苗的获得 在4组的小鼠尾静脉分别注射相关的疫苗，其中D组注射携带CEA及EPO干细胞，饲养1~3周后，处死小鼠，从小鼠外周血和脾脏收集外周血，再用表达CEA及EPO抗体的免疫磁珠分离转CEA及EPO基因的红细胞疫苗，即可大量获得双基因共转染CEA-EPO红细胞疫苗，同时设对照组。 2.9. 应用细胞红系相关标志抗体GPA 和 CD71标记，流式细胞证实红细胞疫苗培养成功 收集诱导的细胞，胰酶消化制成细胞悬液，取3 × 10 6 个细胞，PBS洗涤一遍，分别置于1.5 ml的EP管中，分别加入小鼠抗人GPA-PE、CD71-FITC抗体，阴性对照加小鼠IgG-PE和小鼠IgG-FITC，流式细胞仪分析所有细胞中各表面标志物阳性细胞的比率． 2.10. 转染红细胞疫苗的体外实验 双基因共转染CEA-EPO红细胞疫苗体外刺激小鼠单核细胞增殖的作用及增殖细胞对结肠癌细胞的杀伤作用，具体如下：皮下接种小鼠结肠癌细胞系CT26肿瘤后两周，自小鼠尾静脉采血，密度梯度法分离单个核细胞，单核细胞与肿瘤细胞按1:10，1:20，20:1，40:1的比例于20孔板上混合培养，每孔4 × 10 4 个单核细胞)设植物血凝素(PHA)作为对照，48小时后MTT法检测单核细胞杀伤率。靶细胞杀伤率 = (靶细胞OD + 单核细胞OD − 杀伤实验OD − 本底OD)/(靶细胞OD − 本底OD) × 100% 2.11. CEA-EPO基因转染红细胞疫苗的体内实验 研究双基因共转染红细胞疫苗对肿瘤成瘤性的影响，成瘤实验：收集处于对数生长期的结肠癌细胞株CT26，按以上所分成的4组，以每只小鼠5 × 10 5 个细胞数接种于BALB/c小鼠右侧腋窝皮下，制作荷瘤动物模型，再分别从尾静脉注射疫苗或空白载体。观察肿瘤的生长情况及小鼠的生存时间。每周两次用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积以公式1/2ab 2 计算，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径，长度单位为cm。 2.12. 统计学方法 使用 SPSS for windows统计软件分析。对计量资料采用t检验或方差分析，对计数资料采用χ2检验。