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user: 3. 皮卡 ® (PICKCa)佐剂及其疫苗在猴和人体有效性和安全性的研究 皮卡(PIC-Kanamycin-Cacl 2 )是双链聚肌苷酸聚胞苷酸及微量卡那霉素和氯化钙的复合物。PIC是大分子的聚阴离子，卡那霉素是多胺基化合物，带正电荷，与PIC聚阴离子结合，稳定了PIC的双链结构，可以在一定程度上抵抗核酸酶的降解。在PIC中加入氯化钙可增加对细胞的通透性和细胞的结合力，增加诱生出的干扰素产量[ 31 ] 。1979年，第二次国际干扰素会议期间，美国H. Lery博士将我国的PICKCa与他们制备的PIC和PICLC进行了熔点对照测定，结果PIC为57℃，PICKCa为80℃，PICLC为91℃。说明国产加入卡那霉素和氯化钙的PICKCa形成了较PIC相对分子质量更大的结合物，保护PIC双链结构不被灵长类以上动物核酸酶快速水解，从而有较好的稳定性，使其能够发挥应有的作用[ 31 ] 。 把皮卡作为佐剂以来，我们已在国内外发表若干篇皮卡佐剂疫苗的研究报告，包括狂犬病疫苗[ 32 ] - [ 35 ] 、乙肝疫苗[ 36 ] 、流感疫苗[ 37 ] -[ 39 ] 、SARS抗原[ 40 ] 等，其中大部分是小白鼠，个别是狗的试验结果。在法国巴斯德研究所我们比较了皮卡佐剂和铝佐剂在狂犬病疫苗中的效果，结果是铝佐剂疫苗与单纯疫苗比较虽然最终提高了抗体滴度，但延迟了抗体产生，对暴露后小白鼠致死性的感染完全没有保护作用，而皮卡佐剂狂犬病疫苗与铝佐剂疫苗、单纯疫苗比较产生的保护性抗体早、高、时间长；对暴露后小白鼠95%的致死性的感染几乎完全可以保护。因此，我们建议在当时中国含铝佐剂狂犬病疫苗中去掉铝佐剂[ 41 ] ，后来实现了。由于灵长类动物血清核酸酶减低dsRNA结构的稳定性，因此研制人用疫苗而评价dsRNA佐剂的有效性和安全性应该在灵长类动物甚至人体中进行。以下为皮卡佐剂及其疫苗在猴和人体中的安全性和有效性及其特点。 3.1. 皮卡佐剂是我国独有的人用抗病毒针剂药品 皮卡(PICKCa)原是抗病毒药物，商品名为聚肌胞注射液，是我国独有的具有国家标准的人用注射药品[ 42 ] 。国产聚肌胞注射液是无色澄清透明的液体，经过3年的观察测定，其含量、相对分子质量、增色效应和pH值均较稳定[ 31 ] 。聚肌胞注射液用于治疗病毒性角膜炎、单纯疱疹、流行性腮腺炎、预防呼吸道感染，也用于肝炎的辅助治疗。聚肌胞注射液国家标准 ， 临床用量为每次1~2 mg，隔日1次，肌肉注射。临床上不同病种注射针次不完全一致，如治疗慢性乙肝病人以0.02~0.04 mg/kg体重，每周2次肌注或静脉注射，疗程3~6个月为宜。天津市聚肌胞注射液标准采用每次2或4 ml (含2或4 mg)/针，隔日1次，肌肉注射。国产聚肌胞注射液药物代谢动力学表明，肌注小白鼠 3 H- PICKCa注射液0.1 ml/只，血液中5分钟即可检测到放射性，持续较高水平达48小时，至144小时降至<5%；脏器中30分钟放射性达到高峰，可见从血液进入组织的速度相当快，2~5小时逐渐下降，26小时下降至高峰值的60%，至144小时降至<17%，各脏器以肾、脾、肝最高，其次为肺、心、肌肉、脑；给药1小时后尿中即可检测到放射性，8小时排出26%，100小时排出注射量的44.5%。通过粪便排出量很少，100小时排出注射量的2.44%。说明肌注 3 H- PICKCa注射液吸收很快，5分钟即可检测到放射性，10小时达到高峰，144小时后基本排出，能很好地透过血脑屏障，排泄途径以肾脏为主。作为一种药物，在体内保持一定时间后能被降解排泄掉，因此有较好的安全性[ 31 ] 。另一方面，试验也表明，只要聚肌胞在人体内完整地存在1小时，作用于细胞膜上的受体就能使细胞发生一系列变化，产生出抗病毒蛋白来[ 43 ] ，这些特点使PICKCa有效、安全，不会像PICLC一样致出现毒性。 1981年，经国家批准PICKCa用于临床，很多厂家投入生产，如天津、北京、杭州、广州等，产量至少每年几千万支。仅浙江万马药业有限公司自1984年开始销售聚肌胞注射液，临床使用未发现严重的不良反应。该公司1999年销售1432.02万支，2000年销售1764.47万支，2001年销售1320.88万支。 3.2. 皮卡狂犬病疫苗在恒河猴体内的安全性和有效性(李烈涛，张译，林海祥等申请临床研究资料) 人用皮卡狂犬病疫苗里含有PICKCa 1 mg/ml/针，暴露后0、3、7、14、28天各注射1针。用磷测定法测定皮卡含量，用琼脂糖电泳法检测皮卡分子量，保证了作为疫苗佐剂皮卡生物功能及毒副作用的可控性。疫苗中皮卡的限量为1 mg，以标示量的100%~130%为合格。人用皮卡狂犬病疫苗的合格检测须通过国家聚肌胞注射液检测标准[ 42 ] 和国家人用狂犬病疫苗检测标准[ 44 ] 以及企业标准(林海祥，郭可謇，刘芳等申请临床研究资料)。 皮卡狂犬病疫苗在恒河猴的检定由国家药物安全监测评价中心进行。32只恒河猴肌肉注射皮卡狂犬病疫苗，高剂量组：2 ml/0天、2 ml/2天、1 ml/7天、1 ml/28天、1 ml/42天；低剂量组：1 ml/0天、1 ml/2天、0.5 ml/7天、0.5 ml/28天、0.5 ml/42天。在相当人体20倍剂量下皮卡佐剂和皮卡狂犬病疫苗安全评价结果为：1) 无免疫毒性，包括临床体征、免疫器官、抗核抗体、T淋巴细胞检测综合评价。2) 对注射局部无刺激作用。3) 对临床症状、心电图、血液、血清生化、尿液、眼睛无明显影响。4) 对各脏器未引起病理变化，包括脑、垂体、甲状腺及甲状旁腺、颌下腺、胸腺、心、肺及支气管、肝、肾、肾上腺、脾、睾丸、附睾、前列腺、卵巢和子宫、骨髓。5) 高、低剂量组血清中产生高达10~15倍保护性中和抗体(0.5 IU/ml)。已在新加坡进行临床研究。 3.3. 皮卡乙肝疫苗在猴体内的安全性和有效性(李烈涛，张译，林海祥等申请临床研究资料) 乙肝疫苗在恒河猴的长期毒性由国家药物安全监测评价中心进行，使用年龄约为2~3岁的、血清乙肝表面抗原和表面抗体均为阴性的40只恒河猴，通过肌肉注射给予皮卡乙型肝炎疫苗，高剂量组：1000 μg皮卡 + 40 μg抗原，低剂量组：500 μg皮卡 + 20 μg抗原；免疫时间：0、14、28、56、84天共5次。结果为：全部实验组动物的给药部位、体重、血压、心电图等指标均未见明显异常。临床症状观察、进食量、血液学检查指标、血清生化检查、尿检查指标均未见和供试品和佐剂相关的显著性改变。抗体检测结果表明，肌肉注射给予恒河猴皮卡乙型肝炎疫苗2周后能明显产生抗乙型肝炎病毒的抗体。脏器的大体病理学和组织病理学检查发现注射疫苗后脾脏的绝对重量和相对重量有增加的趋势，脾脏白髓生发中心的易染体巨噬细胞数量增多，有丝分裂相增多和白髓增生，这些病变具有可恢复趋势。未见其它和供试品相关的异常病变。 结论为：1) 皮卡乙肝疫苗按上述方案首次免疫后21、40天血清ELISA抗体皮卡乙肝疫苗组较无佐剂疫苗组增加50~60倍。2) 皮卡乙肝疫苗在相当人体20倍剂量下反复肌肉注射，猴体的耐受性、安全性良好。已在新加坡进行临床研究。 3.4. 皮卡狂犬病疫苗1期人体临床研究的安全性和有效性(林海祥，迮文远，刘瑜睻等申请临床研究资料) 根据卫生部药政局(96)制申体第19号临床研究批件于1998年5月在内蒙古土默特右旗对人用皮卡狂犬病原制疫苗进行I期人体观察，使用的的疫苗配方是：1) 2 mg/2ml皮卡(PICKCa) 2 ml与2 ml原制苗(未提纯的狂犬病疫苗)复合。2) 2 mg/2ml皮卡(PICKCa) 2 ml稀释法国维尔博狂犬病冻干疫苗。这两种疫苗与国产浓缩狂犬病疫苗进行了比较。主持单位卫生部北京生物制品研究所报告的结论为： 1) 人用皮卡狂犬病疫苗全程(5针)接种人体是安全的。 2) 人用皮卡狂犬病疫苗产生的中和抗体早于国产浓缩狂犬病疫苗，与法国维尔博疫苗近似。 3) 人用皮卡狂犬病疫苗和皮卡维尔博狂犬病疫苗刺激机体产生的干扰素显著高于国产狂犬病疫苗和法国维尔博狂犬病疫苗；人用皮卡狂犬病疫苗产生的干扰素还高于皮卡维尔博疫苗产生的干扰素。 4) 人用皮卡狂犬病疫苗不经浓缩对人体可产生较好的免疫反应，有实际应用前景。 5) 皮卡对人体有较好的免疫增强作用，是一有前途的人用佐剂。 综上所述，皮卡新佐剂与狂犬病原制苗或纯化苗复合后在I期人体观察中安全有效，不仅促进了体液免疫也促进了细胞免疫，显示了很好的佐剂作用。 需要说明的皮卡疫苗研究30年不是技术原因造成的拖延，相反是时时有好结果鼓励我们前行。如这次临床研究当时用的是未经纯化的狂犬病原制苗加皮卡制成，后改为纯化苗废弃原制苗故未批准继续临床研究，整整十年后即2006年5月皮卡狂犬病疫苗再次被国家药监局批准临床研究，然而这一次原申报单位已无力支撑继续研究破产了，而转入新单位被要求重新申报，又几乎过了十年现在我们又开始了新的申请征程。 3.5. 皮卡佐剂狂犬病疫苗促进人体免疫记忆细胞产生IFN-γ (林海祥，李烈涛，郭可謇等内部材料) 对2名志愿者全程5针免疫皮卡狂犬病疫苗2.5年后，取外周血单个核细胞，用狂犬病抗原体外刺激，以ELISPOT方法检测，下图1结果可见到志愿者外周血单个核细胞IFN-γ与未注射狂犬病疫苗正常人比较经相应抗原刺激后IFN-γ显著增加。 由于II型IFN-γ是由NK细胞和激活的T淋巴细胞产生，NK细胞产生的IFN-γ是在免疫早期，而且是非特异的，免疫2.5年产生的IFN-γ只能是由激活的T免疫记忆淋巴细胞产生，而且是特异性的，表明皮卡狂犬病疫苗对人体有很好的细胞免疫记忆反应，这是皮卡佐剂疫苗对人体十分重要的免疫特性。 3.6. 皮卡狂犬病疫苗作为未批准特殊商品疫苗的非法应用 国家药监局2月例行新闻发布会新闻发言人通报该公司违法添加核酸物质。中国药品生物制品检定所在回答记者问题所讲添加的核酸物质内容即是PICKCa佐剂。某公司是在美国上市公司，是主要生产狂犬病疫苗的企业。经国家不良反应中心监测该疫苗用于人体后无失败病例又无不良反应发生。 图1. 皮卡佐剂狂犬病疫苗促进人体免疫记忆细胞产生IFN-γ SPF数量 一个不争的事实是，被动物咬伤后接种了狂犬病疫苗仍然会发生狂犬病死亡，多在接种疫苗的过程中，甚至在疫苗全程注射后发病死亡[ 45 ] 。有不少报告，这种免疫失败率为10%~20% [ 46 ] [ 47 ] 。广西疾病预防控制中心报道，2003至2004年广西共报告狂犬病发病死亡病例1120例，对其中725例分析，有197例为被疯动物或疑似疯动物咬伤后注射狂犬病疫苗的，占725例发病死亡病例的27.2%，大多数(72.1%)在接种第4针、第5针疫苗后发病死亡[ 48 ] 。 这种特殊情况下大规模的现场应用至少是皮卡狂犬病疫苗人体应用安全有效的佐证而不应该被完全忽视。