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user: 2. 实验部分 2.1. 实验药品及仪器 2.1.1. 实验药品 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸、乙醇、甲醇均为分析纯品；实验室自制的焦脱镁叶绿酸-a (PPa)无需纯化即可直接使用。2-氨基对苯二甲酸(98%)、ZrCl 4 (97%) 、亚甲基蓝(MB 99%) 、PAH (Mw = 15，000~18，000)、1，3-二苯异苯呋喃(DPBF， 97%) [上海麦克莱林生化技术有限公司]。4’，6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI高效液相色谱法90%)、2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA 98%)、MTT (97%)、高糖培养基(DMEM)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、AM/PIA双染色试剂[哈尔滨百杰斯生物公司]。人肝癌细胞HepG-2由哈尔滨工业大学提供。 2.1.2. 仪器 扫描电子显微镜(SEM) (日立S-4800，日立有限公司，日本)；透射电镜(TEM， Tecnai G2 f200s-twin)；紫外–可见分光光度计(日立有限公司，日本)；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR) (布鲁克公司，德国)；D5005型X射线衍射仪(西门子，德国)；酶标仪(WD-2102A，北京六一；物科技有限公司)；荧光倒置显微镜(DM IL IED， Leica HistoCore PEARL)；X射线光电子能谱(日本UlVAC-PHI公司)。 2.2. 化学合成 2.2.1. Zr-MOF的合成 本文采用溶剂热法合成了MOF。2-氨基对苯二甲酸(NH 2 -BDC) (108.6 mg)溶于DMF (5 mL)。八水氯化锆(ZrCl 4 ) (56.2 mg)溶于DMF (5 mL)。两种溶液在高压反应釜中混合，并在反应混合物中加入醋酸(1.0 mL)。溶液在120℃加热24小时，产生MOF。然后对样品进行纯化，离心(9000 rpm， 20 min)收集，然后进行溶剂交换(3 × DMF)，提取NPs孔内残留的DMF，将沉淀浸泡在丙酮中24 h。此过程重复2次。然后将样品粉末在室温下真空干燥。 2.2.2. Zr-MOF-PPa@PAH的合成 将20 mg MOF纳米材料分散于20 mL乙醇中，超声分散30 min。然后加入5 mL PPa乙醇溶液(1 mg/mL)，室温下避光搅拌24 h，样品经纯化后离心(9000 rpm， 20 min)，然后进行溶剂交换(3 × 乙醇，3 × 水)。20 mg MOF-PPa在水中分散，超声分散30 min。PAH水溶液(Mw = 18，000， 5 mL， 20 mg)用NaOH溶液(2 M)调节pH值为7.25。然后将PAH溶液加入到上述Zr-MOF-PPa溶液中，在室温下混合，避光搅拌过夜。将获得的Zr-MOF-PPa@PAH纳米颗粒用水洗涤几次，样品离心(9000 rpm， 20 min)，真空干燥。 2.3. 粒径、电位和稳定性的试验 利用动态光散射仪(DLS)测定50 μg/mL MOF-PPa的粒径、电位及在含有10% FBSDMEM和PBS的稳定性试验。 2.4. PPa的pH的响应释放实验 称取30 mg Zr-MOF-PPa@PAH，放入透析袋中，一份加入10 mL pH = 7.4的PBS (0.01 M)缓冲溶液，一份加入10 mL pH = 6.4的PBS (0.01 M)缓冲溶液，一份将PBS加入10 mL pH = 5.6的PBS (0.01 M)缓冲溶液缓冲液，放于磁力搅拌器上保持恒温37℃，并以100 rpm的搅拌。从0~12小时，每隔1小时分别取样用紫外–可见分光光度计测量波长670 nm处的峰的吸光度，计算PPa的释放量。 2.5. Zr-MOF-PPa@PAH单线态氧的测定 用DPBF (在DMF中1 mg/mL)为 1 O 2 捕获剂，以MB为参比样品，测定PPa，Zr-MOF-PPa@PAH的 1 O 2 量子产率。首先，固定待测样品和MB在671 nm处的吸收相同，约为0.10 OD。然后分别加入DPBF (30 µL)，经670 nm激光照射(功率密度为0.1 W/cm 2 )，测量在不同时间DPBF溶液在415 nm吸光度，计算随辐照时间的衰减速率ln(A 0 /A t )，拟合出一阶线性方程。按公式(1)计算光敏剂的 1 O 2 量子产率。 Φ s = Φ MB t MB t s (1) 其中t s 和t MB 分别为待测样品和MB存在时DPBF的吸收降低至一阶指数衰减的时间。 为MB在DMF中的 1 O 2 量子产率，定为0.49. 求得样品Zr-MOF-PPa@PAH和自由PPa的 1 O 2 量子产率分别为38.4%和53.6%。 2.6. 细胞培养 肝癌细胞(HepG-2)在含10%胎牛血清和1% 100 mg/mL抗生素(青霉素链霉素)的DMEM中培养，37℃，95%的湿度和5%的CO 2 。DMEM培养基每2天更换一次。在所有的实验中，细胞用胰蛋白酶从培养板上消化，然后重悬在新鲜培养基中培养。 2.7. 细胞毒性检测 将HePG-2细胞置于DMEM中96孔(100 μL，4000个细胞)中。每孔孵育24 h。然后将不同浓度的PPa或Zr-MOF-PPa@PAH孵育细胞，PPa的浓度为(0.625， 1， 1.25， 2.5， 3.75， 5 μg/mL)时。细胞与不同浓度的孵化PSs 4 h和暴露于光线10分钟(通过670 nm过滤器氙灯，10 mW/cm 2 )。照射后，细胞在pH = 7.4的DMEM中继续培养24小时。丢弃全部液体，将细胞置于含3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑溴化(MTT， C = 0.5 mg/mL)的培养基中孵育4 h，将150 μL二甲基亚砜(DMSO)加入到溶出的紫色甲砜中，用酶标仪在490 nm波长下检测吸光度(A)值。细胞存活率(%)按下式计算： 细胞存活率(%) = A s /A c × 100% 暗毒对照组与未辐照实验组相同。 2.8. Zr-MOF-PPa@PAH的细胞摄取 将HepG-2细胞接种于6孔细胞培养板(每孔1 × 10 5 个细胞)，孵育24小时。Zr-MOF-PPa@PAH在37℃下分别孵育15、30、60、75和180 min。弃去培养基，PBS洗3次，2.5%戊二醛固定10分钟。弃去戊二醛溶液，PBS洗3次。后用2 mg/mL DAPI对HepG-2细胞进行10分钟染色。最后用PBS冲洗三次以去除DAPI染料后，盖上玻璃，放在载玻片上，使用倒置显微镜进行荧光成像。 2.9. Zr-MOF-PPa@PAH在细胞内活性氧( 1 O 2 )观察 DCFH-DA为单线态氧 1 O 2 探针，在488 nm激发下发出绿色荧光。用1 mL含Zr-MOF-PPa@PAH的DMEM，PPa浓度为2.5 μg/mL处理六孔板上的粘附HePG-2细胞(细胞密度为1 × 10 5 )，孵育2 h。PBS洗2次，50 μM DCFH-DA孵育30 min。PBS洗3次，然后用670 nm激光，功率密度为10 mW/cm 2 的光照射0、2、3、6、10 min。曝光后用PBS洗3次，立即用FIM观察。 2.10. 活死细胞双染色实验 将HepG-2细胞接种于6孔细胞培养板(每孔1 × 10 5 个细胞)，孵育24小时。用1 mL含PPa、Zr-MOF-PPa@PAH的DMEM，PPa浓度为2.5 μg/mL处理六孔板上的粘附HePG-2细胞(细胞密度为1 × 10 5 )，不同的材料经过3个小时的吞噬作用，细胞与PBS冲洗三次，然后1 mL PBS，用670 nm光照射0、2、5、10 min，加入AM (2 mmol/L)和PI (4 mmol/L)孵育15分钟。孵育15分钟后进行FIM分析。