system: [SYSTEM]

user: 3. 结果与讨论 3.1. 样品测序质量分析 稀释曲线(Rarefaction Curve)用于描述组内样品多样性的曲线，可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样品中物种的丰富程度。对样品随机抽样，以抽取的测序数据量与对应的物种数构建稀释曲线如图3所示，当随机抽取的测序数量大于30000条时，曲线趋向平坦，表明测序数据量渐进合理，更多的资料量对发现新的OUT (Operational Taxonomic Units)边际贡献率较小。而当测序数量相同时，细菌群落OTU数量表现为组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 ) > 组别A (TMAH 0 mg∙L − 1 ) > 组别C (TMAH 3000 mg∙L − 1 )，表明组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 )微生物丰富度明显高于其他样品。 Rank Abundance曲线(图4)反映了样品中物种的丰富度和均匀度。当水平曲线跨度较大，表示物种的丰富度较高；而在垂直方向上曲线平滑程度较小，表明测定样品中物种的均匀程度相对较低。图4明显得知组别B-TMAH 1000 mg∙L − 1 的曲线跨度大，代表物种的丰富度高于其他两组。 图3. 样品的稀释曲线图 图4. 样品的Rank Abundance曲线图 3.2. 细菌菌种丰度与歧异度 由表3可知，组别A-TMAH 0 mg∙L − 1 得到的拼接序列数共有76，832条Tags，在97%的序列相似性条件下，可分为2809个OTUs，包括40，260条Unique Tags，40，247条Taxon Tags；组别B TMAH-1000 mg∙L − 1 得到的拼接序列数共有78，493条Tags，在97%的序列相似性条件下，可分为2651个OTUs，包括43，352条Unique Tags，43，335条Taxon Tags；组别C-TMAH 3000 mg∙L − 1 得到的拼接序列数共有74，489条Tags，在97%的序列相似性条件下，可分为1851个OTUs，包括38，180条Unique Tags，38，180条Taxon Tags。从这些资料可以看出，生物硝化系统中含有TMAH 1000 mg∙L − 1 者，其与TMAH 0 mg∙L − 1 者的生物菌群数量差异不大，但丰富度略高于TMAH 0 mg∙L − 1 者；而当TMAH提高至3000 mg∙L − 1 总体微生物总数变低且微生物种类比较单一。TMAH的加入使得环境内的菌种丰富度提高，但浓度提高到一定比例时，TMAH的毒性会造成微生物数量及种类变少。 Table 3 Numbers of Tags and OTU OTU 组别 Total_Tags Unique_Tags Taxon_Tags OTUs A 0 mg∙L − 1 76，832 40，260 40，247 2809 B 1000 mg∙L − 1 78，493 43，352 43，335 2651 C 3000 mg∙L − 1 74，489 38，180 38，180 1851 表3. 样品的Tags和OTUs数目统计 样品中的OTU数量可代表物种丰富度，可进一步分析其物种丰富度指数(Community Richness)、物种均匀度指数(Community Evenness)以及物种多样性指数(Community Diversity)。物种丰富度即为物种的数目，数目愈多代表丰富度愈大，生物多样性也就越高。物种均匀度说明一个群集中各个物种个体数目的分配状况，反映出各个物种个体数目分配的均匀程度，一个群集中各物种的个体数目愈相近者，代表物种均匀度高。在物种丰富度相同的状况下物种均匀度越高者，则说明物种多样性越高。 根据OTU聚类分析结果和研究需求，当样品数大于5时，对所有样品进行均一化处理，分析不同样品之间共有和特有的OTU并绘制花瓣图(图5)。从图中可以直观的看出不同样品OTU数目组成相似性重迭情况，3个样品共有的OTU数目为105，不同样品中特有OTU表现为组别B-TMAH 1000 mg∙L − 1 最高(155)，组别A-TMAH 0 mg∙L − 1 次之(121)组别C-TMAH 3000 mg∙L − 1 最低(57)。 图5. 基于OTUs绘制的花瓣图 3.3. TMAH浓度对微生物群落结构之影响 稀释曲组别A (TMAH 0 mg∙L − 1 )序列数据库比对后共得到14个门、26个纲、51个目、71个科、113个 图6. 分类层级为门之结构组成 图7. 分类层级为属之结构组成 属及113个种。以门分类层级来看，Chloroflexi为最优势、Proteobacteria次之再来是Planctomycetes (图6)。以属的分类层级来看，Caldilineaceae (Genus uncultured)为最优势、Reyranella次之再来是Gemmata (图7)。 组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 )序列数据库比对后共得到18个门、32个纲、65个目、96个科、150个属及175个种。以门分类层级来看，Chloroflexi为最优势、Proteobacteria次之再来是 Planctomycetes (图6)。以属的分类层级来看，Caldilineaceae (Genus uncultured)为最优势、Reyranella次之再来是Gemmata (图7)。 组别C (TMAH 3000 mg∙L − 1 )序列数据库比对后共得到14个门、23个纲、46个目、62个科、97个属及113个种。以门分类层级来看，Proteobacteria为最优势、Chloroflexi次之再来是Planctomycetes (图6)。以属的分类层级来看，Reyranella为最优势、Caldilineaceae (Genus uncultured)次之再来是Planctomicrobium (图7)。 3.4. 样品复杂度分析 Alpha多样性主要是探讨样品内的微生物群落多样性，通过分析评估各样品中微生物群落的物种丰富度和多样性的差异。序列相似度大于97%的情况下可聚类成一个OUT，通常被认为是源自同一个种(Species Boundary)，所得的Alpha多样性指数取平均值如表4所示。分析表明，所有取样点的多样性测序结果Coverage均高于99%，表明测序结果覆盖度好且具有较高可信度，能够代表样本的真实情况。Shannon指数和Simpson指数则是反映物种丰富度和均匀度的2个重要参数，其值越大代表个体分配越均匀、群落多样性越高，从表4可以看出，3组菌落的Shannon多样性指数和Simpson多样性指数排序分别为组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 ) > 组别A (TMAH 0 mg∙L − 1 ) > 组别C (TMAH 3000 mg∙L − 1 )，结果表明高浓度TMAH系统中细菌微生物群落多样性相对较低。Chao1指数是生态学中用于估算样本物种丰富度的常用指数，表现为组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 )值最大、组别C (TMAH 3000 mg∙L − 1 )最低，表明前者群落的丰富度最高，而后者丰富度最低。 Table 4 Diversity index of bacterial communit 样品名称 菌群多样性 菌群丰富度 测序深度 测定方法 Shannon指数 Simpson指数 chao1 覆盖度 Goods coverage % 组别A 0 mg∙L − 1 4.329 9.627 424 100 组别B 1000 mg∙L − 1 4.629 10.028 476 100 组别C 3000 mg∙L − 1 3.746 6.789 276 100 表4. 微生物群落多样性指数 3.5. 聚类分析 为了进一步得到不同样品间群落结构差异，对OTU进行多序列比对并基于Weighted Unifrac距离矩阵构建非加权组平均聚类树形图(Unweighted Pairgroup Method with Arithmetic Mean， UPGMA)结果如图8所示，组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 )和组别A (TMAH 0 mg∙L − 1 )相似度最高，组别C (TMAH 3000 mg∙L − 1 )与其他样品间距离最远，相似度最低。 3.6. 综合讨论 由表5(A)以上的分析结果可知，浮霉菌门(Planctomycetes)中的Gemmata属于组别A占22.52%，在组别B及组别C却减少至10.29%及5.13%；放线菌门(Actinobacteria)中的Rhodococcus属于组别A占2.68%，在组别B及组别C也减少至 < 2%，相对数量明显，表明TMAH对Gemmata属及Rhodococcus属有较大的抑制作用。 图8. UPGMA聚类树形图 表5(B)显示组别B (TMAH 1000 mg∙L − 1 )与组别A (TMAH 0 mg∙L − 1 )相比，增加TMAH浓度的变异性，带入了新的真菌物种(如：变形菌门(Proteobacteria) Brachymonas属、拟杆菌门(Bacteroidetes) Flavobacterium属)，其菌种丰富度也明显提高。但以上菌种于TMAH浓度3000 mg∙L − 1 时，其占比锐减，受到高浓度TMAH一定程度的抑制。 变形菌门(Proteobacteria)中的Reyranella属通常出现在含氮系统的中后期，相关研究表明，变形菌门在生物脱氮及诸多污染物降解过程中起着重要作用 [ 12 ]，随着TMAH浓度增加其生长环境和代谢基质方面都更加有利于Reyranella属繁殖，最终表现为随着TMAH浓度的增加其数量也增加，以上现象于浮霉菌门(Planctomycetes) Planctomicrobium属及变形菌门(Proteobacteria) Castellaniella属的占比中也呈现递增的趋势。 Table 5 (A) TMAH inhibition (B) relative abundance of TMAH 1000 ppm (C) optimum bacteria of high TMAH concentraio 比较项目 菌属名 组别A 0 mg∙L − 1 组别B 1000 mg∙L − 1 组别C 3000 mg∙L − 1 (A) TMAH抑制 Gemmat 22.52% 10.29% 5.13% Rhodococcus 2.68% 1.86% 1.74% (B) TMAH 1000相对丰富度 Brachymonas 0.00% 0.24% 0.07% Flavobacterium 0.00% 0.18% 0.01% (C) 高浓度TMAH最适菌 Reyranella 24.05% 26.55% 37.54% Planctomicrobium 0.29% 2.43% 13.36% Castellaniella 0.12% 0.18% 4.50% 表5. 各项目探讨(A) TMAH抑制(B) TMAH1000相对丰富度(C)高浓度TMAH最适菌