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user: 3. 模型建立 3.1. 数据预处理 本文下载的乳腺癌基因表达矩阵如表1所示，行名表示探针，列名为每一例患者的编号；表2为患者基本信息。将两个表格通过患者编号进行合并，并通过“Status”将患者分为ER+乳腺癌组与ER−乳腺癌组分别进行研究。 Table 1 The microarray data of breast cance ID_REF GSM36777 GSM36778 GSM36779 GSM36780 GSM36781 ... 1007_s_at 3848.1 6520.9 5285.7 4043.7 4263.6 ... 1053_at 228.9 112.5 178.4 398.7 417.7 ... 117_at 213.1 189.8 269.7 312.4 327.1 ... 121_at 1009.4 2083.3 1203.4 1104.4 1043.3 ... 1255_g_at 31.8 145.8 42.5 108.2 69.2 ... 1294_at 551.5 802.8 557.5 568.5 653.2 ... 1316_at 176.7 278.4 183.3 187.7 185.8 ... 1320_at 11.9 28.3 56.4 42.1 21.8 ... 1405_i_at 309.3 449 101.9 899.1 3629.3 ... 1431_at 49.9 122.9 85.9 90.7 96 ... ... ... ... ... ... ... ... 表1. 乳腺癌基因芯片数据 Table 2 The basic information of breast cance ID Time Relapse Status GSM36777 79 0 ER+ GSM36778 50 1 ER+ GSM36779 132 0 ER+ GSM36780 84 0 ER- GSM36781 147 0 ER+ GSM36782 66 0 ER+ GSM36783 52 0 ER+ GSM36784 57 1 ER+ GSM36785 57 0 ER+ GSM36786 66 0 ER+ ... ... ... ... 表2. 乳腺癌患者基本信息 将上述分组后的表格分别与表3所示的探针与基因匹配表结合进行整理，转换为每一个基因的表达值进行研究。若探针与基因为“一对一”的关系(即一个探针对应一个基因)，则将相应表达值作为基因的表达值；若探针与基因为“一对空”或“一对多”，此时由于不能确定探针对应的是哪个基因的表达值，因此将其删除；若探针与基因为“多对一”，则取表达量较高的值作为此基因的表达值。经处理之后，ER+乳腺癌组与ER−乳腺癌组分别得到12，548和11，923个基因的表达值。 初始数据一般都具有冗余性、不完整性和不规范性，无法直接进行数据分析。一些无意义的数据的存在会严重影响算法的执行，若存在噪音干扰，还会造成结果的偏差。因此，对不理想的原始数据预处理是进行数据分析的首要步骤。为了去除芯片间的系统误差，本文对数据进行了分位数标准化 [ 5 ] ；同时为了减少背景噪音，将小于50的基因表达值赋值为50；接着对数据进行以2为底的对数化变换；再将变异系数小于3%的基因剔除，此时ER+乳腺癌组与ER−乳腺癌组分别剩余11，960和11，846个基因的表达值。最后对每一个基因表达值进行编码，计算每组全部基因表达值的25%、50%、75%分位数，小于等于25%分位数的编码为1，大于25%分位数且小于等于50%分位数的编码为2，大于50%分位数且小于等于75%分位数的编码为3，大于75%分位数的编码为4 [ 6 ] 。经过预处理的基因编码矩阵如表4与表5所示。 Table 3 The matching table of probes and gene ID_REF Gene 1053_at RFC2 117_at HSPA6 121_at PAX8 1255_g_at GUCA1A 1316_at THRA 1320_at PTPN21 1405_i_at CCL5 1431_at CYP2E1 1438_at EPHB3 1487_at ESRRA ... ... 表3. 探针与基因匹配表 Table 4 The encoding matrix of ER+ breast cance ID A1CF A2M A4GALT A4GNT AAAS ... GSM36777 2 4 2 2 2 ... GSM36778 3 4 1 2 1 ... GSM36779 2 4 1 2 2 ... GSM36781 3 4 1 2 1 ... GSM36782 2 4 2 2 2 ... GSM36783 2 4 1 2 2 ... GSM36784 3 4 2 2 1 ... GSM36785 2 4 1 2 2 ... GSM36786 2 4 1 2 1 ... GSM36787 3 4 1 2 1 ... ... ... ... ... ... ... ... 表4. ER+乳腺癌基因编码值矩阵 Table 5 The encoding matrix of ER− breast cance ID A1CF A2M A4GALT A4GNT AAAS ... GSM36780 2 4 1 2 1 ... GSM36788 3 4 1 2 2 ... GSM36791 3 4 1 2 1 ... GSM36793 3 4 1 2 2 ... GSM36795 3 4 2 2 2 ... GSM36797 3 4 1 1 1 ... GSM36798 2 4 1 2 1 ... GSM36800 2 4 2 2 3 ... GSM36808 3 4 2 2 1 ... GSM36809 2 4 2 1 1 ... ... ... ... ... ... ... ... 表5. ER−乳腺癌基因编码值矩阵 3.2. 单因素Cox比例风险回归模型初步筛选基因 Cox比例风险回归模型 [ 7 ] 是由英国的生物统计学家Cox D R提出的比例风险模型。风险函数(hazard function)是描述生存时间分布的一个重要函数。如终点事件为死亡(复发)，风险函数表示t时刻仍存活的病人在t时刻的瞬间死亡(复发)率： h ( t ) = lim Δ t → 0 在 时 间 t 生 存 的 病 人 死 ( 复 发 ) 于 区 间 ( t ， t + Δ t ) 的 概 率 Δ t 称为瞬时死亡(复发)率或条件死亡(复发)速率。 Cox提出的比例风险模型是：病人具有 X i 1 ， X i 2 ， ⋯ ， X i p 的伴随变量值，则第i名病人生存(复发)到时间t的风险函数是基础风险函数与自变量的函数的乘积： h i ( t ) = h 0 ( t ) × f ( β 1 X i 1 + ⋯ + β p X i p ) h 0 ( t ) 即当所有的伴随变量都为0时的风险函数。其中定义伴随变量的函数 f ( x i j β ) 为指数形式，因此 h i ( t ) = h 0 ( t ) × exp ( β 1 X i 1 + ⋯ + β p X i p ) ln h i ( t ) h 0 ( t ) = β 1 X i 1 + ⋯ + β p X i p Cox模型是一个风险比对数的线性模型， β j 实际意义为当伴随变量 X j 每改变一个单位时所引起的相对风险度的自然对数的改变量。 β j 不仅反映出协变量的作用强度，而且反映它的作用方向 [ 8 ] 。 我们对训练集数据使用单因素的Cox比例风险回归模型进行基因初步筛选，对于ER+乳腺癌组，以 P < 0.05 作为入选标准。经过筛查，有999个基因对ER+乳腺癌的复发具有显著性影响，结果见表6 (结果保留两位小数)。如基因ABCB8，其b值为0.96，e b 值为2.61，表明每当ABCB8的编码值增加一个单位，其复发风险比扩大到原来的2.61倍，说明对于ER+乳腺癌患者来说，ABCB8是其复发的风险基因；对于基因ABLIM1，其b值为−0.97，e b 值为0.38，表明每当ABCB8的编码值增加一个单位，其复发的风险比缩小到原来的0.38，说明对于ER+乳腺癌患者来说，ABLIM1是其复发的保护基因。 对于ER−乳腺癌组，以 P < 0.001 作为入选标准(在此分别使用 P < 0.05 、 P < 0.01 、 P < 0.001 为限定条件对基因进行筛选，通过对最终结果进行比较，此步将P值严格限定为0.001)。经过筛查，有13个基因对ER−乳腺癌的复发具有显著性影响，结果见表7。 Table 6 Primary screening genes by univariate Cox proportional hazards regression model (ER+ Gene coef exp(coef) z Pr(>|z|) lower.95 upper.95 ABCB8 0.96 2.61 2.14 0.03 1.08 6.28 ABCC1 0.83 2.28 2.14 0.03 1.07 4.86 ABCC5 1.10 3.00 2.53 0.01 1.28 7.04 ABCE1 0.77 2.16 2.26 0.02 1.11 4.20 ABCF2 1.09 2.98 2.57 0.01 1.29 6.86 ABI3BP 3.37 29.16 2.92 0.00 3.03 280.37 ABLIM1 −0.97 0.38 −2.58 0.01 0.18 0.79 ABLIM3 −0.50 0.60 −2.31 0.02 0.39 0.93 BAG5 −1.17 0.31 −2.19 0.03 0.11 0.88 BARD1 0.72 2.05 2.74 0.01 1.23 3.42 ... ... ... ... ... ... ... 表6. 单因素Cox比例风险模型初步筛选基因(ER+) Table 7 Primary screening genes by univariate Cox proportional hazards regression model (ER− Gene coef exp(coef) z Pr(>|z|) lower.95 upper.95 ABCC2 1.40 4.08 3.66 0.000252594 1.92 8.65 AKT1 −1.72 0.18 −3.57 0.000362096 0.07 0.46 ATP4B 1.72 5.56 3.43 0.000608925 2.08 14.82 BTN3A2 −1.48 0.23 −3.37 0.000753891 0.10 0.54 CD200 1.60 4.95 3.40 0.000671633 1.97 12.44 FICD −1.91 0.15 −3.57 0.000356132 0.05 0.42 MAPKAP1 −2.18 0.11 −3.29 0.000992481 0.03 0.41 PARP4 −1.97 0.14 −3.64 0.000276686 0.05 0.40 POLDIP2 −2.44 0.09 −3.79 0.000150915 0.02 0.31 RECQL5 −2.45 0.09 −3.36 0.000778005 0.02 0.36 ... ... ... ... ... ... ... 表7. 单因素Cox比例风险模型初步筛选基因(ER−) 3.3. 计算风险分数，对患者进行分类 通过上一步的筛查，有999个基因与ER+乳腺癌患者复发显著相关，13个基因与ER−乳腺癌患者复发显著相关。本文使用所筛选的基因计算患者的风险分数，每例患者的风险分数为以相应Cox回归系数为权重的基因编码值的线性组合 [ 9 ] [ 10 ] 。接着使用风险分数对每一例患者进行高风险和低风险标记的划分，由于两组数据复发人数分别占每组人数的38.28%和35.06%，因此在此都选择风险分数的60%分位数作为对患者进行分类的阈值(≤60%分位数为低风险标记；>60%分位数为高风险标记)，如表8与表9所示，其中0代表低风险标记，1代表高风险标记。 本文将训练集建模过程中得到的999个基因和13个基因的Cox回归系数和分类阈值直接应用于每组的测试集，计算测试集中每例患者的得分并进行高风险标记和低风险标记的划分。 最后，对分类结果进行检验，如图1与图2 Kaplan-meier曲线显示，两组数据的训练集和测试集中，低风险标记的患者相较于高风险标记的患者都有着较高的中位未复发时间。对数秩检验(log-rank test)显示，低风险标记与高风险标记的ER+乳腺癌患者的未复发率差异显著(训练集： χ 2 = 76.4 ， P < 0.001 ；测试集： χ 2 = 6.6 ， P = 0.01 )，低风险标记与高风险标记的ER−乳腺癌患者的未复发率差异同样也显著(训 Table 8 Calculate the risk scores and classify the ER+ breast cancer of training se ID Time Relapse Score Group GSM36945 92 0 −412.13 0 GSM37036 15 1 −197.87 1 GSM36850 121 0 −403.01 0 GSM36882 99 0 −404.50 0 GSM36998 5 1 −305.18 0 GSM37041 9 1 −202.26 1 GSM37035 14 1 −14.10 1 GSM36986 77 1 −276.82 1 GSM36913 109 0 −32.40 0 GSM36792 71 1 10.41 1 ... ... ... ... ... 表8. ER+乳腺癌训练集患者风险分数及分类情况 Table 9 Calculate the risk scores and classify the ER− breast cancer of training se ID Time Relapse Score Group GSM36886 94 0 −25.73 0 GSM36808 58 0 −25.73 0 GSM36926 24 1 −23.81 0 GSM37040 6 1 −11.71 1 GSM37042 14 1 −14.59 1 GSM36978 148 0 −25.73 0 GSM36891 87 0 −25.73 0 GSM37045 123 0 −27.33 0 GSM36875 7 1 −6.97 1 GSM37056 82 0 −25.61 0 ... ... ... ... ... 表9. ER−乳腺癌训练集患者风险分数及分类情况 图1. ER+乳腺癌999-基因标记Kaplan-Meier曲线 图2. ER−乳腺癌13-基因标记Kaplan-Meier曲线 练集： χ 2 = 49.1 ， P < 0.001 ；测试集： χ 2 = 5.8 ， P = 0.02 )。 3.4. LASSO方法筛选基因 由于数据中基因数量多而样本量较少，并且各基因间可能存在交互作用，因此选用LASSO方法对基因进行进一步筛选。LASSO对于高维度、强相关、小样本的生存资料数据较为适用。LASSO的基本思想是在回归系数的绝对值之和小于一个常数的约束条件下，使残差平方和最小化，从而使某些回归系数严格等于0，来得到可以解释的模型 [ 11 ] [ 12 ] 。 min β ∑ i = 1 n ( y i − ∑ j = 1 p β j x i j ) 2   ，     subject   to       ∑ j = 1 p | β j | ≤ λ 该方法的估计参数 β ^ ( Lasso ) = arg   min { ∑ i = 1 n ‖ y i − ∑ j = 1 p x i j β j ‖ 2 + λ ∑ j = 1 p | β j | } ，     λ 为 调 整 参 数 随着l的增加， ∑ j = 1 p | β i | 项就会减小，这时候一些自变量的系数就逐渐被压缩为0，以此达到对高维资 料进行降维的目的。LASSO方法的降维是通过惩罚回归系数的数量来实现的。 交叉验证法 [ 13 ] 是比较常用的推测估计调整参数l的方法，如k折交叉验证。在k折交叉验证中，所有的数据观测值被大致分为k等份，然后轮流以其中所有可能的k-1份为训练集对数据进行拟合，剩下1份作为测试集，即测试集与训练集的观测值数目之比约为1:(k-1)，一共计算k次，得到拟合测试集时的误差率(或其他指标)那样的k个指标，再做平均。在对每个模型都做一遍之后，最后选择误差率最小的模型。 我们选择10折交叉验证的方法来估计调整参数l。对于ER+乳腺癌组，当 ln λ = − 1.50   ，   λ = 0.22 时，误差率取得最小值，此时进一步筛选出了5个基因：CCDC69、KIF18A、KIF23、PLA2G15、RAI2；对于ER−乳腺癌组，当 ln λ = − 2.53 ，   λ = 0.08 时，误差率取得最小值，此时进一步筛选出了10个基因：ABCC2、AKT1、ATP4B、CD200、FICD、PARP4、POLDIP2、RECQL5、THPO、XRCC1。 3.5. 生存树方法进行预测 生存树方法是由Gordon和Olshen [ 14 ] 在分类与回归树的基础上改进而成的，不同于普通的分类树，其对截尾生存资料同样适用。通过递归分割计算，树逐渐进行生长。即选择某一截断点将根节点分为两部分，在分开的两个子样本中，其生存分布差异达到最大，即两组人群的预后相差达到最大。最优划分 s * 满足 G ( s * ， h ) = max s ∈ s h G ( s ， h ) 这里， G ( s ， h ) 表示两样本log-rank检验统计量，其中s表示节点h内所有可能的截断方式，重复应用这个规则进行划分。 树的停止规则为：1) 结点内样本例数太小；2) 划分函数的测度不够充分，即划分得到的两个子结点的生存分布无差别。这时就得到了一棵初始树(initialtree) [ 15 ] 。一般情况下初始树过大，会产生过度拟合的现象，在对未来样本进行预测时较为不准确，而且不容易解释，因此，需要通过剪枝过程对初始树的节点进行删减，控制树的复杂度 [ 16 ] 。 对于ER+乳腺癌，本文使用所筛选的5个基因对训练集数据建立生存树模型，并将结果应用于测试集，得到了如图3所示的一棵生存树。将第1、2、3、4、5、7个叶节点作为低风险标记，第6、8、9个叶节点作为高风险标记。 对于ER−乳腺癌，本文使用所筛选的10个基因对训练集数据建立生存树模型，进一步筛选出了5个基因：AKT1、CD200、FICD、THPO、XRCC1。将此结果应用于测试集，得到了如图4所示的一棵生存树。然后将第1、2、3、5、6个叶节点作为低风险标记，第4、7、8个叶节点作为高风险标记。 同样，对分类结果进行检验，如图5与图6 Kaplan-meier曲线显示，两组数据的训练集和测试集中，低风险标记的患者相较于高风险标记的患者都有着较高的中位未复发时间。对数秩检验显示，低风险标记与高风险标记的ER+乳腺癌患者的未复发率差异显著(训练集： χ 2 = 60.2 ， P < 0.001 ；测试集： χ 2 = 9 ， P = 0.003 )，低风险标记与高风险标记的ER−乳腺癌患者的未复发率差异同样也显著(训练集： χ 2 = 52.3 ， P < 0.001 ；测试集： χ 2 = 4.3 ， P = 0.04 )。 图3. ER+乳腺癌生存树 图4. ER−乳腺癌生存树 图5. ER+乳腺癌5-基因标记Kaplan-Meier曲线 图6. ER−乳腺癌5-基因标记Kaplan-Meier曲线