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user: 2. 泛素–蛋白酶体系统(UPS)和自噬–溶酶体系统(ALS)交互作用的异常放大 是肿瘤骨骼肌消耗的关键因素 对于肿瘤晚期恶病质患者骨骼肌消耗这一棘手问题，研究人员正在针对其机制进行大量实验研究，试图寻找到防治的突破口。据最新研究发现，无论是生理性或病理性的骨骼肌消耗，泛素–蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system， UPS)和自噬–溶酶体系统(autophagy-lysosomal system， ALS)是骨骼肌肌肉蛋白降解最关键的两大系统 [ 5 ] 。越来越多的证据表明，UPS和ALS在增加蛋白降解方面发挥着交互协同作用，在萎缩的骨骼肌中，由于受到上游信号分子的调控，ALS与UPS的作用被异常放大。 2.1. UPS在肿瘤晚期恶病质骨骼肌消耗中发挥重要作用 骨骼肌消耗是肌肉蛋白质合成下降和/或分解代谢加速的结果，蛋白质代谢受多种途径调节，其中ATP依赖的UPS是机体最重要的蛋白降解系统。UPS主要包括泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素交联酶(E2)、泛素连接酶(E3)和蛋白酶体5个部分，其中E3能够将泛素分子连接到目的蛋白质的某个赖氨酸上，将目的蛋白多泛素化，形成多泛素链从而被蛋白酶体所识别进而将靶蛋白降解。研究发现，两个肌肉特异性的E3连接酶：肌萎缩蛋白(Atrogin-1)和肌环指蛋白1(MuRF1)在肌萎缩时显著激活，研究者普遍认为，编码Atrogin-1和MuRF1的基因可能是控制肌肉蛋白分解的关键基因。已有研究提示在肿瘤恶病质状态时，与肌肉消耗有关的信号途径都通过Atrogin-1和MuRF1发挥效应。 2.2. 上游信号通路对UPS进行蛋白质降解调控 现已证实，主要有3条信号通路控制着Atrogin-1和MuRF-1的表达：①减弱的IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路，其在肌肉蛋白质合成中起着重要作用，其机制为通过阻遏Atrogin-1和MuRF1的表达来抑制蛋白的降解；②活化的转录因子FoxO家族，如FoxO1和FoxO3，他们控制着E3连接酶的活性；③增强的核因子-κB(NF-κB)信号通路，其活化可增强UPS内包括MuRF1等多种成分的表达 [ 6 ] [ 7 ] ，从而导致E1水解途径活化和表达增加 [ 8 ] ，进而引起肌肉降解。 蛋白分解诱导因子(PIF)及某些炎症因子如IL-1β、IL-6、TNFα调控着以上这些通路。PIF是一个24kDa的硫化糖蛋白，从恶病质的肿瘤小鼠和患者血液中均可分离出，没有恶病质的肿瘤患者及其他原因引起消耗状态的患者中没有发现这种因子。PIF通过RNA依赖的蛋白激酶(PKR)和真核起始因子2(eIF2)的磷酸化加强对肌原纤维中肌球蛋白的降解，PKR则通过eIF2激酶的独立活化机制来活化NF-κB。IL-1β、IL-6、TNFα则通过影响肌卫星细胞的再生和分化功能，延缓损伤后肌肉的修复能力，其机制主要为通过肌肉生长抑素(Mstn)损害IGF-1/PI3K/Akt信号途径，降低肌源性分化素(MyoD)和肌细胞生成素(myog)的表达 [ 9 ] [ 10 ] 。有研究发现，荷瘤小鼠伴肌肉消耗时其Mstn的mRNA水平升高2-3倍，而当小鼠过表达可拮抗Mstn功能的分子Folistatin时，其体重增加了327%。另外，TNF-α还能通过激活NF-κB，使之迅速进入细胞核，启动转录因子FoxO，进而导致MuRF-1表达，并引起肌肉蛋白的降解。 除IGF-1/PI3K/Akt信号途径外，Mstn等TGFβ配体家族成员在ActRIIB介导的信号通路中亦对骨骼肌蛋白降解发挥着重要作用 [ 11 ] 。Mstn、activin A等可与ActRIIB结合，通过一系列信号途径启动Atrogin-1和MuRF-1表达，导致肌肉蛋白分解。Han和他的研究团队报道ActRIIB可能是一个有效治疗骨骼肌消耗的靶点。通过将ActRIIB的可溶形式sActRIIB作为一种诱饵分子，可以使Mstn及其他TGF-β家族的成员失活 [ 12 ] ，对肿瘤恶病质状态小鼠治疗后，不仅阻止了肌肉分解，增加了肌肉量，还能逆转心肌和骨骼肌萎缩，改善了诸多症状。其机制为sActRIIB提高磷酸化FoxO3α/总FoxO3α的水平，进而降低Atrogin-1和MuRF1表达，同时还与刺激肌卫星细胞增殖有关。因此，Mstn/Actvin-ActRIIB信号途径可能是肌肉消耗的一条重要通路，ActRIIB可能是一个治疗肌肉消耗的重要靶点。 2.3. ALS在肿瘤晚期恶病质骨骼肌消耗中的作用 自噬是一种进化上高度保守的、以降解细胞内大分子物质和受损细胞器等，来维持代谢平衡及细胞环境稳定的分解代谢途径。其过程受与自噬有关的基因(ATG)调节，ATG基因调控着自噬体的形成。自噬体是由双层膜包裹待降解物质而形成的细胞质泡，自噬体随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在这里待降解物质被溶酶体的酸性水解酶消化水解并释放回细胞质中，以实现循环利用和某些细胞器的更新。而细胞对这种合成与降解的精细调节，不仅对维持细胞的内环境稳态有重要意义，而且在肿瘤等疾病的发生发展中也占有重要的地位。 ALS系统和UPS系统对蛋白降解所占的作用比例因作用靶点及降解环境的不同而有所区别 [ 5 ] 。在机体正常环境下，UPS起主导作用，但是在萎缩的骨骼肌中，ALS与UPS的作用均被放大，其中ALS降解蛋白质的作用可上升到40% [ 5 ] 。最新研究表明，肿瘤晚期恶病质小鼠骨骼肌中ALS被激活，且用胰岛素只能部分抑制经TNF-α处理的C 2C 12肌管细胞的自噬效应 [ 13 ] 。 2.4. ALS相关的信号分子 自噬过程的调控机制非常复杂，已知与ALS相关的信号分子包括： ① AMPK：AMPK是细胞体内的一个感受能量的激酶，在自噬过程中发挥重要作用 [ 14 ] 。AMPK能够感受ATP的变化，诱导自噬的发生，从而进行细胞内物质的降解，以重新产生能量 [ 15 ] 。而除AMPK外，活化的NF-κB也可以通过增强ALS的活动引起肌肉蛋白的降解 [ 16 ] ，而相应的，活化的AMPK也同NF-κB一样，可通过增强E3连接酶Atrogin-1和MuRF1的表达引起肌肉萎缩 [ 17 ] 。 ② Beclin 1：Beclin 1基因是自噬相关基因ATG6的哺乳动物同源基因，自噬发生的初期阶段依赖于Beclin 1参与形成的化合物。 ③ TOR：TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，是自噬的主要抑制通路。当细胞生长因子存在及营养丰富时，其通过磷酸化自噬相关基因ATG13，使后者与ATG1亲和力下降，抑制了自噬的发生；而在细胞营养缺乏时，ATG13去磷酸化，与ATG1结合进而激活自噬。 ④ PI3K：PI3K是参与调节细胞生长、分化、凋亡及迁移的酶家族。不同类型的PI3K在自噬中的作用不同，有的可以抑制自噬，有的则是自噬发生所必需的脂类，缺乏则自噬不能发生。 ⑤ LC3：LC3是一种直接参与细胞自噬过程的蛋白质，LC3前体形成后，首先加工成胞浆可溶性形式LC3-I，随后被修饰成膜结合形式LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3-Ⅱ即被溶酶体中的水解酶降解。LC3-II含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。当哺乳动物细胞发生自噬时，细胞内LC3的含量及LC3-I向LC3-II的转化均明显增加。因此，通过检测细胞内LC3-II的含量变化，就可以判断细胞状态，判断其自噬是被诱导还是被抑制。实验发现，将C 2C 12肌管细胞培养在结肠癌细胞C26条件的培养液24 h和36 h后，LC3-I大量转化为LC3-II，并且在接种了C26细胞荷瘤小鼠的骨骼肌中也发现LC3-I大量转化为LC3-II，均表明ALS在肿瘤恶病质骨骼肌消耗中的重要作用。 ⑥ ROS：ROS是NF-κB信号级联中有效的活化剂 [ 18 ] 。实验证实，经结肠癌细胞C26条件培养基处理后的成肌细胞及肌管细胞中存在ROS增长，表明了线粒体的不稳定性。而功能失调的线粒体正是ALS活跃的另一标志，ALS选择性地移除受损线粒体的过程叫做线粒体自噬 [ 19 ] ，mtDNA：nuDNA的比率下降是线粒体自噬的重要标志，实验发现，在结肠癌小鼠骨骼肌中这一比率大幅下降。 2.5. TRAF6是UPS和ALS交互作用的重要连接点 虽然现已明确UPS和ALS在增加蛋白质降解中发挥着交互作用，但在骨骼肌消耗效应中，具体调控UPS和ALS两个系统的上游信号调控机制仍在研究过程中 [ 20 ] 。现已知肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6)是调控UPS和ALS交互作用异常放大的重要上游信号分子。 肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)是一种重要的接头分子，在多种信号通路中发挥重要的作用 [ 21 ] ，包括NF-κB和PI3Ks信号通路 [ 22 ] [ 23 ] 。TRAF6是TRAF家族中比较特殊的一个成员 [ 24 ] 。作为一种重要的泛素连接酶(E3)，TRAF6参与推动赖氨酸63多聚泛素链的合成以达到降解蛋白质的目的 [ 25 ] 。而越来越多的证据也表明TRAF6可直接作用于自噬。TRAF6的缺失可以保护肌纤维间和肌纤维膜下线粒体的正常分布，并阻止自噬泡和自噬体的形成 [ 5 ] 。已有实验证实，TRAF6基因敲除小鼠可通过抑制蛋白酶体和溶酶体两条通路中的信号分子抑制骨骼肌消耗的发生。此外，TRAF6在Beclin 1信号通路中亦发挥重要作用。Beclin 1有两个TRAF6结合位点和泛素结合域，其泛素结合域可以优先与赖氨酸63泛素链结合，而其与TRAF6的结合则可以促进Beclin 1的赖氨酸63泛素化，后者在诱导自噬的过程中发挥重要作用。