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user: 3. 结果与分析 3.1. 酵母菌发酵桔皮酵素单因素实验结果 3.1.1. 发酵时间对SOD活性的影响 桔皮酵素在pH4的初始值、0.15%的酵母菌接种量、18%的加糖量、27℃的发酵条件下，由图1可知，SOD活力波动幅度较大，当发酵时间为1~4天时，SOD活力上升较快，在4天时达到最高点1226.35 U/ml，当大于4天小于6天时，活力下降，在7天与8天时有一个小范围波动。因而，当在发酵第4天时，SOD活性最高。 图1. 发酵时间对SOD活性的影响 3.1.2. 初始pH值对SOD活性的影响 桔皮酵素在4天的发酵时间、0.15%的酵母菌接种量、18%的加糖量、27℃的温度下发酵，使用新鲜柠檬调节酸度，以SOD活力为评价指标，由图2可知，随着pH的逐步提升，SOD活力也随之提高，在pH4时到达最高点，为1224.63 U/ml，当初始pH大于4后SOD活性开始下降。因此可认定在此条件下最适初始pH为4。 图2. 初始pH对SOD活性的影响 3.1.3. 接种量对SOD活性的影响 桔皮酵素在发酵时间4 d、初始pH 4、加糖量18%、27℃条件下发酵，以SOD活力为评价指标，由图3可知，随着接种酵母菌量的增多，SOD活力因此而升高，当酵母菌的接种量到达0.20%时，活性最高，达1170.26 U/ml，当接种量超过0.20%，SOD活性开始逐步迟缓下降。因而可认定在此条件下最适酵母菌接种量为0.20%。 图3. 接种量对SOD活性的影响 3.1.4. 加糖量对SOD活性的影响 桔皮酵素在发酵时间4 d、酵母菌接种量0.15%、加糖量18%、27℃的温度下进行发酵，以SOD活力为评价指标，由图4可知，当加糖量为范围为12%~18%时，SOD活力随加糖量上升而上升，加糖量为18%时SOD活力为1175.63 U/ml，当加糖量大于18%时，SOD活力逐渐降低。由此实验可认定，在此条件下，最优加糖量为18%。 图4. 加糖量对SOD活性的影响 3.2. Box-Behnken响应面试验结果及试验设计 基于单因素实验所得的结果，按照Box-Behnken的试验设计原理进行响应面试验。一般包括以下的几个步骤: 试验设计、模型的构建与检验、最佳组合条件的优化及验证等 [ 18 ]。响应值设定为SOD活性，四个因素分别为发酵时间、初始pH、接种量、加糖量，对发酵工艺进行优化，制订科学的试验设计方案，结果见表3。 Table 3 Response surface test design scheme and result 序号 A：发酵时间 B：初始pH C：接种量 D：加糖量 SOD活力U/ml 1 −1 −1 0 0 1153.65 2 0 −1 −1 0 1125.11 3 −1 0 −1 0 1128.58 4 −1 0 1 0 1136.61 5 0 0 1 −1 1163.45 6 0 0 −1 1 1133.87 7 −1 1 0 0 1157.07 8 −1 0 0 1 1159.11 9 0 1 −1 0 1126.79 10 0 1 0 −1 1137.26 11 1 1 0 0 1149.61 12 1 −1 0 0 1141.28 13 1 0 −1 0 1109.92 14 −1 0 0 −1 1125.98 15 0 0 0 0 1226.73 16 0 0 1 1 1149.43 17 0 −1 0 −1 1134.19 18 0 1 1 0 1128.15 19 0 0 −1 −1 1157.88 20 1 0 0 −1 1150.01 21 0 −1 1 0 1142.42 22 0 0 0 0 1226.57 23 0 0 0 0 1199.25 24 0 1 0 1 1163.78 25 0 −1 0 1 1157.31 26 0 0 0 0 1220.93 27 0 0 0 0 1223.26 28 1 0 1 0 1123.73 29 1 0 0 1 1134.27 表3. 响应面试验设计方案及结果 3.2.1. 模型的构建与检验 基于此结果，运用Design-Expert 11v程序对表3实行模型构建，得到的多元二次回归方程，如下： Y = 1219.348 − 4.35 A + 0.7250 B + 5.14 C + 2.42 D + 1.23 AB + 1.44 AC − 12.22 AD − 3.99 BC + 0.8500 BD + 2.50 CD − 42.17 A 2 − 36.32 B 2 − 47.66 C 2 − 30.08 D2 进行方差分析及其显著性检验用于模型的检验，结果见于表4。 Table 4 Analysis of varianc 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 Model 27，949.37 14 1996.38 9.92 <0.0001 A-发酵时间 226.90 1 226.90 1.13 0.3064 B-初始pH 6.31 1 6.31 0.0313 0.8620 C-接种量 316.62 1 316.62 1.57 0.2304 D-加糖量 70.08 1 70.08 0.3481 0.5646 AB 6.03 1 6.03 0.0299 0.8651 AC 8.35 1 8.35 0.0415 0.8415 AD 597.07 1 597.07 2.9655 0.1071 BC 63.60 1 63.60 0.3159 0.5830 BD 2.89 1 2.89 0.0144 0.9063 CD 24.95 1 24.95 0.1239 0.7301 A 2 11，537.17 1 11，537.17 57.30 <0.0001 B 2 8558.48 1 8558.48 42.51 <0.0001 C 2 14，733.28 1 14，733.28 73.18 <0.0001 D 2 5870.58 1 5870.58 29.16 <0.0001 残差 2818.77 14 201.34 失拟项 2290.38 10 229.04 1.73 0.3138 纯误项 528.39 4 132.10 总差 30，768.14 28 表4. 方差分析 基于表4方差分析所示，可知：此模型的P < 0.0001，证实为极显著，失拟项P = 0.3138 > 0.05，证实为不显著。模型方差分析中A2、B2、C2、D2的P值均 < 0.0001，证明影响极为显著。而交互的AB、 图5. 各因素交互响应面图及等高线图 AC、AD、BC、BD、CD的P值均>0.05，证明影响不显著。R 2 值为0.9083说明此模型拟合性较好。 运用Design-Expert 11v程序，对四种因素交互性影响实行数据处理，取得此回归方程的响应面图及等高线图，于图5所示。如图5所示，等高线轮廓的形态可以反映出各因素之间彼此作用的强弱情况，形状为椭圆表示这两个因素之间彼此作用强烈，圆形则相反 [ 19 ]。图中交互的AB、AC、AD、BC、BD、CD等高线形状均为圆形，相互作用不强烈，与方差分析得到的结果并无差别。 3.2.2. 表格 经由Design-Expert 11v软件的数据处理结果，所显示的最优发酵条件为：3.941天发酵时间，初始pH3.954，0.203%的酵母菌接种量，18.109%的加糖量，软件所预测的SOD活力为1219.68 U/ml。 为验证此最佳发酵条件，并操作便捷，采用的发酵条件为：发酵时间：4天，初期pH4，接种量0.2%，加糖量18%，所测得的SOD活力为1216.35 U/ml，与软件所预测SOD活力相差较小，说明，此模型合理，可为桔皮酵素的制备，生产，加工提供一定的依据与参考。 3.3. 产品品质测定结果 3.3.1. 感观指标 基于响应面所得到的最适发酵条件，制得的桔皮酵素产品，经10位经过培训的，不同性别、不同年龄对产品的感官评价，根据感官评定评分表进行打分，所得到的平均分为8.5分。对产品的普遍评价为：果香较少，色泽浅黄色透明清澈，酸甜适宜，无苦涩味。 3.3.2. 表格 按照团体标准T/CBFIA 08003-2017《食用植物酵素》所规定的要求，本产品所测得的酒精度、氯化钠含量、菌落总数、大肠菌群数均符合标准。 酒精度：0.3 g/100 g < 0.5 g/100 g 氯化钠：0.1 g/100 g < 0.2 g/100 g 菌落总数：86 CFU/ml < 102 CFU/ml 大肠菌群数：1 MPN/100 ml < 10 MPN/100 ml。