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user: 2. 材料与方法 2.1. 实验用虾 实验用虾购买自养殖场外观健康的淡水长脚大虾(M. rosenbergii)，平均每尾重25 g，养于 pH = 7.0，水温 23˚C，充分打气的淡水循环养殖虾池中，养殖密度约每平方公尺4~5尾，驯养至少三天后才可以进行实验。养殖期间每日喂食人工饲料2次，饲料来自屏东科技大学郑文腾教授，配方详见Chiu等(2010) [ 21 ] 。 2.2. 褐藻多醣的喂食和虾子存活率 本研究室曾以 4 μg的褐藻多醣注射处理淡水长脚大虾，显示其能增强proPO基因的表现 [ 22 ] ；以500 μg/L的褐藻多醣浸泡草虾后发现可以改变肝胰脏内细菌的组成 [ 18 ] 。所以，本实验选择介于注射与口浸泡之间的不同浓度，以决定适当的喂食浓度。将褐藻多醣溶于已灭菌处理的0.01 M的磷酸盐缓冲液(PBS)，并调整浓度为200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL。使用1 mL空针筒接上细软管，以软管接触虾口器，每一尾虾注入100 μL褐藻多醣。本实验共有三个实验组，分别是喂食20 mg/prawn、30 mg/prawn及40 mg/prawn，对照组喂食等体积的PBS。连续喂食10天期间，每日观察并纪录虾子死亡数目，换算存活率。 2.3. 虾子肝胰脏中细菌的分离与鉴定 无菌方式取出完整的虾子肝胰脏与肠子，浸泡入20 mL无菌0.85% NaCl。用研钵磨碎组织，以2000 rpm于4˚C离心10 min后，取上清液。以无菌5.0 μm的滤纸抽气过滤上清液后，以8000 rpm离心10 min。以无菌0.85% NaCl悬浮并稀释菌液至适当浓度，取100 mL菌液均匀涂抹至胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板，于28˚C隔夜培养至少24小时。最后，每个实验组和对照组都随机挑出30个单一菌落(single colony)。所有菌落委请基隆米克斯公司进行菌种鉴定。 2.4. 毒力(virulence)测试 本实验选择来自哺乳动物且被认定是益生菌株的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ATCC10012)作为对照，针对出现于褐藻多醣处理后虾子肝胰脏内的特定菌株进行对虾子的毒力测试。L. plantarum及分离自虾体肝胰脏内的菌株分别接种至培养基Brain heart infusion broth (BHIB)及TSB后，于28˚C及转速130 rpm，培养至对数晚期(late log phase)。取15 mL菌液，经离心并悬浮于PBS (pH = 7.56， 420 ± 5m Osm/kg)，制备成菌液，调整浓度至1 × 10 9 CFU/mL。取100 μL菌液注射于虾子腹腔第一节后，于72小时内计数虾子的死亡数目，换算出专一性死亡率，12小时内死亡属非专一性死亡。 专 一 性 死 亡 率 ( % ) = ( 实 验 组 死 亡 只 数 − 非 专 一 死 亡 数 ) / ( 总 数 − 非 专 一 死 亡 数 ) × 1 00 % 。 2.5. 菌株胞外液的制备 分离自虾子的菌株以及三株虾子的致病菌Lactococcus garvieae S99、Aeromonas hydrophila及A. veronii ATCC 9071中，除L. garvieae接种至BHIB，其他菌株都接种至TSB，于28˚C及转速130 rpm培养至不同生长时期。取不同生长时期的菌液，4˚C下离心取上清液。以磷酸缓冲液(PB， pH = 7.0)在4˚C下透析18至24小时后，冷冻干燥以浓缩。抑菌测试前，以Poor-nutrient broth (PNB)回溶并调整浓度。 2.6. 抑菌测定 实验分成两部分进行。第一部份实验是制备三株致病菌的菌液，菌株培养至对数晚期后，于4˚C下离心后，以0.85% NaCl清洗两次后，以PNB回溶，并调整菌液至OD 600 为0.01。第二部分实验则是制备分离自虾子的菌株成对数晚期菌液样本。两部分的实验各自分为三组，空白组加入90 μL PNB及10 μL PNB，对照组加入90 μL菌液及10 μL PNB，实验组加入90 μL菌液及10 μL胞外液样本；各组培养于28˚C后，每一小时以光波600 nm测吸光值。 2.7. 包裹菌株之饲料的制备 褐藻酸(alginic acid)主要为褐藻细胞壁或是细胞间质中的一种阴离子结构多醣，且为不溶性胶体酸，可做为包裹其他物质之用。本实验将虾子的饲料粉末分别与PBS、褐藻酸溶液和含褐藻酸之菌液，以1：1 (W:V)的比例混合后，以去除针头的3 mL空针筒将饲料挤出，风干30分钟，将饲料切成1 mm ´ 3 mm大小，再放置室温7天。取放置不同天数的饲料10颗，溶于10 mL的0.85% NaCl，10倍连续稀释后，取100 mL涂抹至TSA平板，于28˚C隔夜培养后，计数每颗饲料平均含菌落数。 2.8. 虾子的易感性测试 实验分两部分进行，第一部分将培养至对数晚期的菌液调整浓度至1 × 10 8 CFU/mL后，取菌液100 μL直接喂食虾子；第二部分是将包裹菌株的饲料喂食虾子，每天两次，每次每一尾虾子10颗。两部分实验的虾子连续喂食5天，于停喂第一天将100 μL致病菌L. garvieae (1 × 10 8 CFU/mL)注射感染虾子。接着于72小时内观察虾子死亡数目，并计算获得各实验组的专一性死亡率。 2.9. 酚氧化酵素活性的测定 以内含抗凝剂的针筒抽取虾血淋巴(hemolymph)后，以3200 rpm于4˚C离心5分钟，取出上清液，即血浆样本；沈淀的血球以PBS悬浮后，于4˚C转速12，000 rpm离心30分钟可使细胞破裂，悬浮于PBS，即获得血球细胞萃取液(hemocyte lysate supernatant; HLS)样本。以Bradford方法测定样本蛋白质浓度。 酚氧化酵素(PO)活性测试以1.6 mg/mL之L-DOPA (L-3，4-dihydroxyphenyl-alanine)为受质。不论血浆或HLS样本都分成两组，一组取50 µL样本，加入50 µL浓度1 mg/mL胰蛋白酶(Trypsin)，另一组以PBS取代胰蛋白酶。其后于37˚C作用15分钟后，加入200 µL新鲜制备之DOPA，立即于波长490 nm测吸光值。取前五分钟内且单位时间内最大变化的OD数值，以变化0.001为1 U，获得PO活性，以(ΔU/Δt)/mg表示。根据Chao等实验指出，实验样本不加入胰蛋白酶测得的PO活性，视为样本内已存在由proPO转化成PO的含量，以PO S 表示；样本加入胰蛋白酶后所测得的PO活性，视为样本内原含有的proPO总量，以PO T 表示 [ 23 ] 。 2.10. 谷胱甘肽过氧化酶活性( Glutathione Peroxidase， GPx) 本实验使用GPx检测试剂套组测定HLS的GPx活性。根据实验手册步骤进行之。活性测定原理为利用GSH为还原当量来源，经GPx作用将过氧化物质氢过氧化枯烯(cumenehydroperoxide)还原成醇类，再以NADPH与谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)将此反应产生的氧化态二硫化谷胱甘肽(glutathione disulfide)迅速转换成还原态，反应伴随NADPH氧化成NADP + 。测定每单位时间内NADPH氧化成NADP + 的速率得知GPx活性。一单位GPx定义为每分钟 NADPH所氧化的微莫耳数。 2.11. 统计分析 抑菌力及血淋巴之PO和GPx的活性数据以one-way ANOVA进行各不同喂食处理组间的比较，分析后有显着差异者(p < 0.05)，再以Duncan比较各组间的差异。