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user: 4. 结果与分析 4.1. 菌种的分离与初筛 通过MRS培养基培养观察是否产生溶钙圈，革兰氏染色，过氧化氢酶试验，从自然培养的发酵辣椒及其发酵液中分离出80株疑似乳酸菌，乳酸菌在生长过程中会产生乳酸，在相同培养条件下，pH越低其乳酸含量越高，因此为加快试验效率，可通过pH的高低来反映这80株疑似乳酸菌产酸能力的强弱，比较这80株疑似乳酸菌的pH和OD600值，以对比其产酸能力和生长能力，实验结果如表3。 Table 3 Strain of the pH and OD600 valu 菌株编号 pH OD 600 菌株编号 pH OD 600 菌株编号 pH OD 60 LJ1 4.20 1.811 LJ28 4.79 1.375 LJ55 4.80 1.141 LJ2 4.31 1.822 LJ29 5.35 0.627 LJ56 4.49 1.466 LJ3 4.19 1.851 LJ30 4.22 1.693 LJ57 5.24 1.301 LJ4 4.19 1.694 LJ31 5.13 0.975 LJ58 5.63 0.722 LJ5 4.21 1.828 LJ32 4.18 1.811 LJ59 4.21 1.828 LJ6 4.18 1.767 LJ33 5.74 0.450 LJ60 5.31 1.774 LJ7 4.18 1.690 LJ34 4.69 1.633 LJ61 5.88 0.346 LJ8 4.19 1.800 LJ35 5.43 0.721 LJ62 4.34 1.701 LJ9 4.29 1.442 LJ36 4.55 1.461 LJ63 4.67 0.971 LJ10 4.18 1.825 LJ37 5.93 0.215 LJ64 5.38 0.723 LJ11 4.22 1.252 LJ38 5.58 0.554 LJ65 4.45 1.767 LJ12 4.24 1.397 LJ39 5.21 1.037 LJ66 5.62 0.568 LJ13 5.76 0.359 LJ40 5.78 0.453 LJ67 4.78 1.156 LJ14 4.22 1.580 LJ41 4.40 1.195 LJ68 4.40 1.680 LJ15 4.22 1.396 LJ42 5.69 0.557 LJ69 4.2 1.836 LJ16 4.32 1.393 LJ43 5.24 1.033 LJ69 5.78 0.786 LJ17 4.40 1.320 LJ44 4.33 1.822 LJ71 4.35 1.555 LJ18 5.82 0.407 LJ45 4.35 1.643 LJ72 5.71 0.310 LJ19 4.34 1.420 LJ46 5.90 0.644 LJ73 4.82 1.013 LJ20 4.29 1.384 LJ47 4.65 1.085 LJ74 5.35 0.655 LJ21 4.98 0.914 LJ48 4.58 1.132 LJ75 4.82 0.969 LJ22 4.37 1.421 LJ49 4.93 0.983 LJ76 4.48 1.599 LJ23 4.34 1.419 LJ50 5.83 0.340 LJ77 5.96 0.204 LJ24 4.25 1.558 LJ51 4.71 0.917 LJ78 4.57 1.690 LJ25 5.82 0.603 LJ52 4.19 1.851 LJ79 5.31 0.960 LJ26 5.82 0.370 LJ53 4.36 1.694 LJ80 5.20 0.938 LJ27 4.36 1.366 LJ54 4.53 1.467 表3. 菌株pH值及OD600值 根据表3可知，分离得到的80株疑似乳酸菌37℃培养24 h后，其pH都集中在4.18~5.96之间，OD600值都在0.215~1.851之间，在这80株菌中，菌LJ 1、LJ 3、LJ 5、LJ 6、LJ 8、LJ 10、LJ 32、LJ 52、LJ 59、LJ 69在培养24 h后，其pH较低，都在4.21以下，且增殖能力较强，OD600值都在1.700以上。接种前，MRS液体培养基的pH在6.2~6.4之间，接种疑似乳酸菌后，菌在其生长过程中产生乳酸，导致发酵体系pH下降，MRS培养基是乳酸菌选择性培养基，乳酸菌在MRS培养基中生长良好，且可以抑制其他细菌的生长，因此初步选定产酸能力、繁殖能力优于菌株LJ 1、LJ 3、LJ 5、LJ 6、LJ 8、LJ 10、LJ 32、LJ 52、LJ 59、LJ 69这10株菌进行亚硝酸盐降解能力的试验。 4.2. 菌种复筛 按照2.9的方法绘制出亚硝酸盐标准曲线，如图1，得到的标准曲线其R 2 为0.99953，即所有观测点中有99.953%的点落在这条直线上，因此标准曲线具有较高的可信度。 图1. NIT含量测定标准曲线 初筛得到的10株菌株接种于含150 mg/L亚硝酸钠的150 ml MRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24 h后，测定培养液中亚硝酸盐剩余含量，计算得到各菌株的亚硝酸盐降解率 [ 17 ]，结果如图2所示。 图2. 亚硝酸盐降解率 根据图2可以看到，初筛后的菌株对亚硝酸钠都有比较高的降解能力，其亚硝酸盐降解率都在80%以上，但不同菌株之间降解亚硝酸盐的能力有差异，降解能力最低LJ3在24 h内亚硝酸盐降解率为82.44%，而LJ8在24 h的降解率达到了98.69%，亚硝酸盐降解能力强的菌，制成发酵剂后，能在较短的时间内将亚硝酸盐含量降低到一个安全的水平，因此取亚硝酸盐降解率在95%以上的两株菌LJ1和LJ8进行下一步生长曲线的测定与鉴定。 4.3. 分离菌株生长曲线 LJ1和LJ8的生长曲线如图3所示，从图中可以看出，LJ1在9 h之前处于对数生长期，在此期间大量繁殖，其OD600达到了1.8，此时的活菌数为1.12 × 10 9 CFU/mL，9 h之后开始进入稳定期；LJ8的生长曲线与LJ1大致相同，都是在9 h之前处于对数生长期，在此期间大量繁殖，其OD600达到了1.82，此时的活菌数为1.42 × 10 9 CFU/mL，9 h之后开始进入稳定期。结合LP-7501S的生长曲线 [ 21 ]，三株菌株进入稳定期的时间相差不大，且生长习性相近，说明这三株菌株适宜进行复配。 图3. 生长曲线 4.4. 分离菌株的鉴定 将筛选得到的两株生长习性相近的疑似乳酸菌LJ1和LJ8进行分子生物学鉴定，结果如下。 由图4的电泳图谱可以看出，LJ1和LJ8在1500 bp均处出现了清晰且无杂带的荧光条带，说明此次PCR扩增成功，可用于后续的16S rDNA序列的测定。 1) 菌LJ1 16SrDNA测序结果及同源性对比分析 将LJ1的16SrDNA序列在核糖体数据库RDP (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)上比对，并在NCBI上进行BLAST序列比对，菌LJ1跟发酵乳杆菌属10个不同菌种的BLAST序列进行比较，其匹配度较高，覆盖率都为100%，E值为零，即完全匹配，匹配一致性均在99%以上，最高可达到99.93%，因此可以证明菌株LJ1属于发酵乳杆菌属的亚种，命名为LF-8001。 2) 菌LJ816SrDNA测序结果及同源性对比分析 将LJ8的16SrDNA序列在核糖体数据库RDP (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)上比对，并在NCBI上进行BLAST序列比对，菌LJ2跟发酵乳杆菌属8个不同菌种的BLAST序列进行比较，其匹配度较高，覆盖率都为99%，E值为零，即完全匹配，匹配一致性均在99%以上，最高可达到99.93%，因此可以证明菌株LJ2也属于发酵乳杆菌属的亚种，命名为LF-8002。 图4. 菌株LJ1和LJ8的PCR产物电泳图谱 由图5可以看出，采用The Neighbor-joining Method法构建发育树，菌株LF-8001和LF-8002与NCBI数据库中Lactobacillus fermentum属进行对比，可信任度达到100%，基因相似性大于99.93，确定菌株LF-8001和LF-8002属于乳酸菌属发酵乳杆菌亚种。 图5. 发酵乳杆菌16SrRNA基因序列的系统发育树 4.5. 复合发酵剂配比对辣椒发酵效果的影响 按照3.8的方法，得出复合发酵剂不同菌种配比对发酵辣椒成熟时pH、总酸、亚硝酸盐含量影响的结果见表4，复合发酵剂不同配比对发酵辣椒成熟时感官影响的结果见表5。 由表4和表5可以看到，在相同发酵时间(72 h)内，自然发酵辣椒与接种发酵辣椒相比其总酸较低、亚硝酸盐含量较高，且基本无发酵辣椒的风味；发酵成熟时，自然发酵的辣椒和接种发酵的辣椒其亚硝酸盐含量均低于国标，且第14组试验其亚硝酸盐含量最低，结合感官评价可以看到，单一菌种发酵制备的辣椒感官评分低于接种复合发酵剂制备的辣椒，其主要是香气和滋味不足；按照第14组试验的菌种配比，接种发酵辣椒进行发酵，其感官评价最接近于自然发酵至成熟的辣椒，其得到的发酵辣椒颜色呈自然鲜红色，发酵香味浓郁，酸辣适中，风味协调，质地较为均匀。因此，综合考虑产酸能力、亚硝酸盐降解能力和感官评价等指标，最佳复合发酵剂配方菌种比例为：LF-8001:LF-8002:LP-7501S = 3:3:2。 Table 4 The influence of fermentation strains combination for physical and chemical properties of Fermented Peppe 编号 菌种比例 LF-8001:LF-8002:LP-7501S pH 总酸(%) 亚硝酸盐含量(mg/kg) 1 自然发酵72 h 4.67 0.09 7.68 2 自然发酵至成熟 3.71 0.31 3.51 3 1:0:0(仅LF-8001) 3.51 0.17 0.46 4 0:1:0(仅LF-8002) 3.55 0.21 0.57 5 0:0:1(仅LP-7501S) 3.49 0.18 0.49 6 1:1:1 3.46 0.26 0.50 7 1:2:2 3.31 0.24 0.29 8 1:3:3 3.40 0.21 0.46 9 2:1:2 3.39 0.21 0.33 10 2:2:3 3.38 0.21 0.38 11 2:3:1 3.47 0.16 0.25 12 3:1:3 3.41 0.20 0.58 13 3:2:1 3.46 0.30 0.70 14 3:3:2 3.38 0.27 0.25 表4. 发酵剂不同配比对发酵辣椒理化性质的影响 Table 5 The influence of fermentation strains combination for Sense of Fermented Peppe 编号 菌种比例 LF-8001:LF-8002:LP-7501S 色泽 香气 滋味 口感 总分 1 自然发酵72 h 23 8 9 20 60 2 自然发酵至成熟 23 24 24 20 91 3 1:0:0 (仅LF-8001) 20 18 16 18 72 4 0:1:0 (仅LF-8002) 19 18 15 19 71 5 0:0:1 (仅LP-7501S) 20 17 17 18 72 6 1:1:1 22 22 18 18 80 7 1:2:2 20 21 20 18 79 8 1:3:3 20 23 15 18 76 9 2:1:2 21 21 19 17 78 10 2:2:3 22 22 20 18 82 11 2:3:1 21 21 20 18 80 12 3:1:3 19 20 22 17 82 13 3:2:1 20 22 21 18 81 14 3:3:2 23 23 20 19 85 表5. 发酵剂不同配比对发酵辣椒感官的影响