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user: 2. 实验方法 2.1. 考察盐酸埃克替尼对HCC827细胞的增殖抑制作用 由于盐酸埃克替尼难溶于水，直接加入水中会产生沉淀，无法给药。应用细胞培养用二甲基亚砜(DMSO)配置(在常温时，DMSO的终浓度控制在0.1%以内对细胞实验是无干扰的)，将配置好的盐酸埃克替尼溶液作为储备液用于后续实验。用电子分析天平称取固定剂量盐酸埃克替尼，加入DMSO，配置成10 mg/ml的盐酸埃克替尼母液，梯度稀释法稀释成不同浓度，将埃克替尼母液用DMSO和PBS混合液体(体积比1:1)稀释10倍，配置成1 mg/ml的盐酸埃克替尼溶液，用PBS稀释10倍，配置成0.1 mg/ml的盐酸埃克替尼溶液备用。 向处于对数生长期的HCC827细胞加入含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化3~5分钟，加入配置好的RPMI1640完全培养基，1000 rpm离心3 min，吸去上清液。再次加入RPMI1640完全培养基，反复吹打HCC827细胞使之成单细胞悬液，吸取20微升细胞悬液利用细胞计数仪计数，按照6000个/孔的密度铺到96孔细胞培养板中，十字交叉晃动96孔细胞培养板使细胞在各孔中均匀分布，之后放置于37℃、5% CO 2 氛围的细胞培养箱中，继续培养24小时，倒置荧光显微镜下观察到细胞贴壁后，移除旧培养基。向96孔板中的HCC827细胞加入含不同浓度盐酸埃克替尼的新鲜培养基(加入前预热至37℃)，使各孔的盐酸埃克替尼的浓度范围为0.01 μmol/L~25 μmol/L。之后将细胞放入培养箱继续培养48小时，取出96孔细胞培养板，向各孔细胞加入10微升CCK-8检测试剂，放回细胞培养箱孵育2小时，之后取出96孔细胞培养板，室温冷却5分钟，振荡30秒混匀，利用酶标检测仪测定各孔细胞培养液在450 nm波长处的OD值。以没有加药的HCC827细胞孔作为对照，没有接种细胞但加了培养液的孔为空白组，计算盐酸埃克替尼各给药组的细胞活力，按照下列公式计算，公式中的A代表酶标检测仪测定的OD值： 细 胞 活 力 = [ A ( 给 药 ) − A ( 空 白 ) ] / [ A ( 对 照 ) − A ( 空 白 ) ] × 100 % 盐酸埃克替尼每个浓度进行5个复孔的考察，绘制盐酸埃克替尼对HCC827细胞的抑制曲线，计算IC50，为后续实验的盐酸埃克替尼浓度范围提供依据。 肿瘤细胞的无限增殖是其恶性程度的主要特征之一，因此我们采用CCK-8法考察了盐酸埃克替尼对体外培养的HCC827细胞增殖的抑制作用。图1为生长状态良好的HCC827细胞在不同浓度的盐酸埃克替尼作用48小时的情况下，细胞增殖所受到的影响，可以看出盐酸埃克替尼对HCC827细胞的增殖抑制存在剂量依赖的相关性，(Y = −6.3893X + 86.35， r = −0.828)随着浓度从0.01 μM增加到25 μM，细胞存活数量逐渐减少，细胞的增殖受到明显抑制，在浓度达到0.5 μM之后，细胞增殖抑制不再随盐酸埃克替尼浓度的增加而明显增加，我们推测，可能是部分细胞对盐酸埃克替尼耐受作用比较强。经计算，盐酸埃克替尼在48小时的作用情况下，对HCC827细胞的IC50为0.61 μM。 图1. 不同浓度的盐酸埃克替尼对HCC827细胞的增殖能力的影响(P < 0.05) 2.2. 氯硝柳胺乙醇胺与盐酸埃克替尼对HCC827细胞增殖的协同作用 同盐酸埃克替尼一样，氯硝柳胺乙醇胺也难溶于水，并且其溶解度要小于盐酸埃克替尼，在水中极易形成沉淀析出，由于其溶解度小，故口服难以吸收。我们配制氯硝柳胺乙醇胺储备溶液的方法与盐酸埃克替尼类似，首先利用电子分析天平称取一定量的氯硝柳胺乙醇胺，加入细胞培养用二甲基亚砜(DMSO)，配制成5 mg/ml的氯硝柳胺乙醇胺母液。然后采用梯度稀释法配制不同浓度的氯硝柳胺乙醇胺溶液，在稀释的过程中有机溶剂DMSO的比例要高于盐酸埃克替尼，第一步稀释先将氯硝柳胺乙醇胺母液用DMSO和PBS的混合液(体积比1:1)稀释5倍，配制成1 mg/ml的氯硝柳胺乙醇胺溶液，之后继续用PBS稀释10倍配制成0.1 mg/ml的氯硝柳胺乙醇胺溶液作为储备液用于后续实验，配制好的氯硝柳胺乙醇胺稀溶液呈亮黄色，澄清无沉淀。氯硝柳胺乙醇胺稳定性较差，在光照条件下易分解，因此其溶液需要避光保存。氯硝柳胺乙醇胺溶液在长期储存过程中容易出现沉淀析出，用前需要检查溶液状态，最好是现配现用。 为考察氯硝柳胺乙醇胺与盐酸埃克替尼对HCC827细胞增殖的协同作用，首先按照考察盐酸埃克替尼对HCC827细胞增殖抑制作用的方法，实验中向各孔细胞中分别给予含0.01、0.05、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10、25 μM盐酸埃克替尼和0.1、0.5、1.0 μM的氯硝柳胺乙醇胺(根据IC50确定)的新鲜培养基(加入前预热至37℃)，并设置对照组，每组5个复孔。绘制氯硝柳胺乙醇胺的浓度抑制曲线，计算在48小时作用情况下，氯硝柳胺乙醇胺对HCC827细胞的半数抑制浓度IC50。 向处于对数生长期的HCC827细胞中加入胰酶，消化3~5分钟，加入配置好的RPMI1640完全培养基，1000 rpm离心3分钟，吸去上清液，加入配置好的RPMI1640完全培养基，反复吹打细胞为单细胞悬液，吸取20微升细胞悬液计数，以6000个/孔铺到96孔细胞培养板中，十字交叉晃动细胞培养板使细胞在各空中分布均匀，置入37℃、5% CO 2 氛围的细胞培养箱中，培养24小时，镜下观察细胞贴壁后移除旧培养基后将细胞铺于96孔板，向各孔细胞中分别加入含不同浓度药物的新鲜培养基，放入培养箱培养48小时，取出96孔细胞培养板，冷却5分钟，震荡30秒混匀，酶标检测仪测定各孔细胞培养液在450 nm波长处的OD值。 氯硝柳胺乙醇胺本身具有抗肿瘤作用，为考察氯硝柳胺乙醇胺对盐酸埃克替尼的增效作用，我们先采用CCK-8法考察了氯硝柳胺乙醇胺对体外培养的HCC827细胞增殖的抑制作用，以确定氯硝柳胺乙醇胺的联用浓度。 图2为生长状态良好的HCC827细胞在不同浓度的氯硝柳胺乙醇胺作用48小时下所受到的影响，可以看出氯硝柳胺乙醇胺对HCC827细胞的增殖抑制同样存在剂量依赖的相关性，随着浓度从0.01 μM增加到25 μM，细胞的增殖受到的抑制也在增加，在浓度达到2.5 μM之后，细胞增殖抑制达到饱和状态。经计算，氯硝柳胺乙醇胺在48小时的作用情况下，对HCC827细胞的IC50为0.46 μM。 图2. 不同浓度的氯硝柳胺乙醇胺对HCC827细胞增殖能力的影响(P < 0.05) 随后我们考察氯硝柳胺乙醇胺对盐酸埃克替尼的增效作用。图3为固定氯硝柳胺乙醇胺的浓度为0.1、0.5和1.0 μM三个浓度，增加盐酸埃克替尼的浓度，考察HCC827细胞增殖受到的抑制情况。可以看出，与单用盐酸埃克替尼相比，氯硝柳胺乙醇胺1.0 μM组的盐酸埃克替尼对细胞的抑制作用最明显，在极低浓度下细胞的生长即可被明显抑制。在埃克替尼浓度达到2.5 μM之后，细胞增殖抑制达到饱和状态。固定浓度的氯硝柳胺联合盐酸埃克替尼，不同浓度的盐酸埃克替尼各组之间的细胞存活率进行统计学分析，p < 0.05，差异具有统计学意义。 图3. 盐酸埃克替尼联合氯硝柳胺对细胞增殖能力的影响 2.3. 氯硝柳胺乙醇胺联合盐酸埃克替尼对HCC827细胞凋亡的影响 在预处理好的细胞中加入含盐酸埃克替尼、氯硝柳胺乙醇胺、盐酸埃克替尼 + 氯硝柳胺乙醇胺的新鲜培养基(加入前预热至37℃)，并设置空白对照组。进行流式细胞仪检测时，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒提供的方案进一步处理，由于Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时应注意避光；反应完毕后尽快检测，由于细胞凋亡是一个不断变化的过程，反应1 h后荧光强度即开始衰减。 向对数生长期的HCC827细胞中加入胰酶，消化3~5分钟，加入配置好的RPMI1640完全培养基，1000 rpm离心3分钟，去上清液，再次加入37℃预热的RPMI1640完全培养基，反复吹打细胞使之成单细胞悬液，吸取20微升细胞悬液利用细胞计数仪计数，2 × 10 5 个/孔的密度铺到6孔细胞培养板中，晃动6孔细胞培养板使细胞在各孔中均匀分布，置于37℃、5% CO 2 氛围的细胞培养箱中，培养24小时使细胞充分贴壁生长，加入不同浓度的药物，于培养箱继续培养24小时，取出6孔细胞培养板，移除培养基，PBS冲洗2次，加入胰蛋白酶消化3~5 min，加入2 ml 4℃预冷的PBS，轻轻吹打细胞，收集细胞并进行细胞计数。取3 × 10 5 个细胞，200目细胞筛网过滤，1000 g、4℃离心5 min，弃上清液，加入冷的PBS 1 ml重悬，再次1000 g、4℃离心5 min，吸去PBS，重悬细胞于200 μl 1× Annexin V binding缓冲液，向细胞中加入10 μl的FITC-Annexin V试液轻轻混匀，4℃避光反应15分钟，加入10 μl × Annexin V binding，使终反应体积为500 μl，加入5 μl PI试液，以未处理HCC827细胞孔作为空白，进行流式细胞仪检测。 为了进一步研究盐酸埃克替尼与氯硝柳胺乙醇胺对HCC827细胞的协同作用，我们利用流式细胞术考察了两药联合作用时的细胞凋亡情况。从图4可以看出，未处理的细胞，细胞凋亡的比例比较低，早期凋亡、晚期凋亡加坏死细胞的比例总和不超过10%，且基本不存在细胞坏死的情况。图5为将各组的凋亡比例的柱状图。可见单独使用盐酸埃克替尼可以引起比较明显的细胞凋亡，主要表现在增加晚期凋亡的细胞比例，坏死细胞的比例也有明显增加，并且0.5 μM盐酸埃克替尼组的细胞凋亡和坏死比例均明显高于0.1 μM盐酸埃克替尼组，说明HCC827的凋亡与盐酸埃克替尼存在剂量相关性。单独使用氯硝柳胺乙醇胺也可以促进HCC827的细胞凋亡，主要表现为晚期凋亡细胞的比例增加。联合应用组与单独应用组相比，HCC827细胞的晚期凋亡和坏死的比例都有所增加，而细胞早期凋亡的比例没有明显变化，说明联合应用可以促进细胞凋亡的发生，并加速细胞坏死。联合组比盐酸埃克替尼单药组有更高的细胞凋亡比例，表明氯硝柳胺乙醇胺与盐酸埃克替尼对HCC827细胞凋亡有协同促进作用。 图4. 流式细胞术测定各组HCC827凋亡情况 图5. 各处理组的细胞不同凋亡时期所占的比例