DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 4. CBA联赛主客场差异分析 4.1. 主客场胜率的差异性检验 球队在主客场的战绩有所不同，然而这种差异是否显著呢?首先需要对主客场胜率的数据进行正态性检验，若数据服从正态分布，则使用配对样本的t检验；若不服从正态分布，则使用非参数检验的方法。 利用EVIEWS软件对19支球队的主客场胜率数据分别进行正态性检验，主客场胜率数据的JB统计量分别为1.373和0.646，其伴随概率分别为0.503和0.724，在0.05显著性水平下，无法拒绝数据来自正态性总体的假设，可以认为19支球队主客场的胜率服从正态分布，结果见图1和图2。 接下来利用SPSS软件对主客场胜率差异使用配对样本的t检验，计算得出的t统计量的值为6.925，P值为0.000，结果说明主客场胜率存在显著的差异。而且从主客场胜率的原始数据中可以看到，除了辽宁队外，其余各队的主场成绩都好于客场成绩，这说明CBA联赛的确存在主场优势。 4.2. 主客场差异的原因分析 利用SPSS软件，对19支球队各队主客场的12项技术指标(详见3.3.1)、国内球员和外援的综合能力指标(详见3.3.3)在显著性水平为0.05的单侧检验下进行非参数检验中的Mann-Whitney检验。 检验的原假设H 0 ：考察的指标在主客场不存在差异；备择假设H 1 ：考察的正指标在主场大于客场(考察的负指标在主场小于客场)。检验结果见表2。 由表2可知，各球队的4项技术指标(助攻、封盖、失误、得分)均严格体现了主客场差异，主场的各项正指标显著地大于客场，主场的各项负指标显著地小于客场。
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user: 5. CBA球队常规赛成绩影响因素的回归分析 5.1. 回归模型的因变量和自变量 为建立线性回归模型，选择以比赛胜率(WIN)为因变量。 自变量包括以下几个部分： 1) 19支球队常规赛的11项技术指标：2分球命中率(2P)、3分球命中率(3P)、罚球命中率(FT)、篮板(TRB)、助攻(AST)、抢断(STL)、封盖(BLK)、失误(TOV)、犯规(PF)、得分(PTS)、失分(LOS)； 2) 核心国内球员效率值(DOM)、核心外援效率值(FOR)； 3) 主客场因素(FIELD)作为虚拟变量(主场值为1，客场值为0)； 4) 主客场因素与主客场差异原因(助攻(AST)、封盖(BLK)、失误(TOV)和得分(PTS))的交互效应：FIELD*AST、FIELD*BLK、FIELD*TOV和FIELD*PTS。 5.2. 回归模型的拟合结果 首先通过自变量对数化处理(FIELD变量除外)对数据进行进一步地处理，再使用逐步回归法逐一删除不显著的变量，得到最终的拟合结果如下： 其相应参数检验结果见表3。回归结果显示，在0.05的显著性水平下，除了主客场因素与得分的交互效应和常数项的回归系数不太显著外(但能通过在0.10的显著性水平下的检验)，其余变量的回归系数都能通过显著性检验。回归方 图1. 2014~2015赛季CBA联赛19支球队主场胜率数据的正态性检验 图2. 2014~2015赛季CBA联赛19支球队客场胜率的正态性检验 Table 2 Mann-Whitney test of the causes of performance differences between home and away matches of 19 teams in 2014-2015 CBA regular seaso 胜率 助攻 封盖 失误 得分 Sig. 0.017 0.002 0.040 0.023 0.004 显著性 显著 显著 显著 显著 显著 表2. 2014~2015赛季CBA联赛19支球队主客场表现差异原因分析的Mann-Whitney 检验 Table 3 Regression analysis results of winning ratio of 19 teams in 2014-2015 CBA regular matches and its influencing factor 变量 篮板(TRB) 助攻(AST) 封盖(BLK) 犯规(PF) 得分(PTS) 失分(LOS) T统计量 2.339 −2.134 −2.984 −2.216 5.209 −12.859 P值 0.0273 0.0424 0.0061 0.0357 0.0000 0.0000 表3. 2014~2015赛季19支球队常规赛胜率与其影响变量的回归分析结果一览表 程的 ，调整后的 ，统计量 ，其伴随概率 。同时，该回归模型通过相关统计诊断进行考察，并未发现模型存在残差异方差性、序列相关性和多重共线性。因此可以认为模型的拟合效果较好。 5.3. 回归模型的解释 5.3.1. 场均得分和场均失分对球队常规赛成绩的影响 场均得分和场均失分无论在主场还是客场都会对球队常规赛的胜率产生非常显著的影响，其影响程度在所有影响因素中是最大的，场均得分对球队胜率产生正影响，场均失分对球队胜率产生负影响，这两个指标回归系数的符号均与理论值一致。 场均得分数和场均失分数代表了一个球队的整体进攻能力和防守能力，可见在CBA联赛缺少超级球星的情况下，球队的整体作战能力是球队取得常规赛好成绩的根本保证。比如：常规赛排名第一的广东队便拥有超强的整体能力，场均得分为116.61分，排在全部球队的第2位；场均失分为100.66分，排在全部球队的首位。 5.3.2. 主客场因素对球队常规赛成绩的影响 主客场因素对球队胜率的影响也是显著的。从影响程度上来看，主客场因素仅次于场均得分和场均失分，并与二者共同构成影响各球队常规赛成绩最重要的三个因素。主客场因素指标回归系数的符号为正说明在主场，球迷的期望值、球迷的加油助威和球迷营造的主场氛围等因素会给主队球员带来更强烈的获胜欲望。比如：常规赛排名第4的北京队的客场胜率仅为47.37%，但凭借主场仅负一场的优异表现成功地闯进了季后赛。 主客场因素通过交互效应还会对球队常规赛的各项技术指标产生影响。主客场因素与助攻和封盖的交互效应均通过了显著性检验，主场效应会在一定程度上弥补助攻和封盖这两项技术指标对常规赛成绩产生的负影响。而在主场作战也有可能给主队球员带来一定的压力，这在主客场因素与场均得分的交互效应中可以得到体现，只是这个指标并未通过0.05的显著性水平的检验。 5.3.3. 主要的技术指标对球队常规赛成绩的影响 篮板、犯规、助攻和封盖这四项技术指标对球队胜率的影响是显著的，但对胜率的影响程度不如场均得失分和主客场因素。 篮板和犯规的回归系数的符号分别为正和为负，与理论值保持一致。 助攻的回归系数的符号为负，这看似与理论值不一致，但实际上反映了当前CBA联赛各球队缺少具有球场统治力的球员的，各队的进攻过于依赖整体，一旦球队整体进攻的某个环节出现问题将会对比赛结果产生一定的负面影响。比如：常规赛排名14~16名的三队(江苏队、浙江队和福建队)的场均助攻数都能排在全部球队的中游位置，但这三队并没有取得与之相应的常规赛成绩。 封盖的回归系数的符号也为负，这体现CBA联赛各队攻防转换能力的欠缺，封盖得来的机会并不能转化为自己球队的有效得分反而为对手做了嫁衣。比如：常规赛排名第9的新疆队和第12的上海队都有实力较强的内线球员，其场均封盖数高出其他球队一大截，但由于球队攻防转换能力的不足并没有把这一优势转化为胜势。 5.3.4. 国内球员和外援对球队常规赛成绩的影响 国内球员和外援对CBA联赛球队的作用是广大球迷和篮球专业人士热议的话题，普遍观点认为外援统治了CBA赛场，是左右各球队常规赛成绩的最关键因素，而国内球员仅仅是赛场上的配角。 本文所做的线性回归模型从统计学的角度否定了这一普遍观点。核心外援效率值这一指标甚至没有被列入常规赛成绩的影响因素；核心国内球员虽然通过了回归系数的显著性检验，但在所有影响因素中是影响程度最小的。回归分析再一次佐证了CBA联赛各球队更加注重整体进攻和整体防守能力，单个球员对球队成绩的影响不会显著。
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user: 6. 总结和建议 6.1. 总结 本文利用2014~2015赛季CBA常规赛的各项统计数据，通过Mann-Whitney检验方法分析了CBA联赛主客场差异的原因，随后在逐步回归的基础上建立了线性回归模型，得到了影响CBA球队常规赛成绩的主要因素，并对这些影响因素进行了深入的分析(详见5.3.3)。 6.2. 建议 根据上文的分析针对CBA联赛和球队的发展提出以下建议供参考： 1) CBA联赛各球队需要借鉴篮球运动发达国家对青少年篮球运动员的培养经验，利用好市场资源，打造完善的青少年篮球运动员的培养体系(如专业训练、校园篮球、高校篮球等)，为CBA联赛和各球队未来的发展打下坚实的基础。 2) CBA联赛各球队需要改善自身的训练体系。球队需要根据球员的能力和潜力制定周密的训练计划和比赛计划，需要在身体素质、营养保证和伤病控制方面进行更加科学地把握。 3) CBA联赛各球队需要进一步总结外援引进和管理方面的经验。需要利用好市场资源，提升引援的水平；需要借鉴科学的外援管理经验，让外援的价值发挥到最大，也推动国内球员的发展和进步。 4) CBA联赛各球队应该充分利用主场优势帮助球队提升成绩。这需要各球队在经营管理层面精心打造主场球市，打造各球队的篮球文化和品牌价值；需要各球队借助市场化的手段开发球员的商业价值，为球队创造球星效应。
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user: 摘 要 CBA联赛是国内篮球运动员提升竞技水平和积累比赛经验的大舞台，而随着CBA联赛市场化和职业化的深入发展，CBA联赛19支球队纷纷引进了外籍球员以期提高球队的竞技水平和联赛成绩，也希望外援的加盟能在一定程度上推动国内球员的进步。就在CBA联赛如火如荼发展之际，中国男篮在近几年的亚洲大赛上屡次铩羽而归，甚至失去了“亚洲霸主”的地位，中国男篮竞技水平下滑的背后折射出的是CBA联赛人才造血能力和青少年球员培养方面的不足。本文从2014~2015赛季CBA联赛国内球员与外援竞技水平的对比分析出发，利用一系列统计分析方法，层层深入地分析了国内球员与外援竞技水平差异的状况，总结出国内球员竞技水平的现状，并以此为根据提出了推动CBA联赛国内球员发展和进步的相关建议。 关键词 :CBA联赛，竞技水平，国内球员，外援，统计分析
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user: 1. 引言 CBA联赛，即中国男子篮球职业联赛，作为培养中国篮球人才的摇篮，在过去20年的时间里为中国国家男子篮球队输送了大量的优秀球员，如第一位登陆NBA联赛(全美职业篮球联赛)的王治郅、在NBA联赛中取得辉煌成就的姚明、在NBA征战多年的巴特尔和易建联，这几位顶级国内球员扛起了中国男子篮球的大旗，为国家队在亚洲和世界赛场创造佳绩做出了不朽的贡献。 CBA联赛自2005年正式更名为中国男子篮球职业联赛以来，在市场化和职业化的道路上稳步前进，国内球员也在这个繁荣发展的联赛中得到锤炼和进步。篮球职业联赛的标志则是篮球人才的合理流动和优化配置，因此，CBA联赛的19支球 1 队纷纷引进了高水平外援以期提高球队的竞技水平和联赛成绩，也希望高水平外援的加盟能在一定程度上推动国内球员的进步。 然而，随着姚明的退役，与姚明同时代的球员已过运动生涯的巅峰，中国国家男子篮球队近年来在亚洲赛场和世界赛场屡次铩羽而归，甚至丢掉了“亚洲霸主”的头衔：2009年亚锦赛决赛负于伊朗、2013年亚锦赛负于中华台北止步8强、2014年亚运会取得第5名的成绩；2010年世锦赛取得第16名的成绩、2012年奥运会在12支参赛队伍中排名垫底。鉴于中国男篮国家队成绩的连续下滑，重新审视CBA联赛国内球员的竞技水平状况和CBA联赛的人才“造血功能”是非常必要的。 本文以2014~2015赛季CBA联赛中外援的竞技水平作为参照，利用一系列统计分析方法，逐步深入地分析CBA联赛中国内球员竞技水平的现状，并以此为根据提出相关的建议和意见，以期为中国篮球的复苏建言献策。
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user: 2. 研究现状 随着CBA联赛的关注度与日俱增，国内学者在CBA球队建设、国内球员的发展、球队成绩和外援问题等方面的研究如雨后春笋。 李成梁、崔鲁祥(2008)总结了CBA联赛发展历程中国内球员在年龄、身高、技术等方面的变化，为提升CBA联赛的水平和我国竞技篮球运动水平提出了参考建议[ 1 ] 。张茜、赵甜甜(2013)比较分析了2011~2012赛季CBA常规赛国内球员和外援在身体形态、年龄及个人技术等方面的差异，并对各球队的训练、营养和医疗体系的建设提出了建议 [ 2 ] 。 李国岩(2008)对比分析了2005~2006赛季CBA联赛总决赛国内球员和国外球员的各项技术指标，指出要充分发挥国内球员在外线能力和外援在内线能力的优势，各球队要利用外援在身体对抗上的优势以弥补国内球员在身体素质上的不足 [ 3 ] 。郭嵘岑(2012)对2010~11赛季CBA职业联赛中外球员贡献率做了比较分析，认为国内球员对球队的综合贡献率与外援相比差距明显，球员综合贡献率指标可以为球队管理、球员价值评估和球员选拔提供量化参考 [ 4 ] 。于博远、折娜(2009)同样运用对比分析法对2006~2007赛季CBA联赛常规赛国内球员和外援的技术指标，认为外援仍然是CBA联赛舞台上的主力军，外援能够左右球队的常规赛成绩 [ 5 ] 。
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user: 3. 数据来源和指标选择 3.1. 数据来源 本文使用2014~2015赛季CBA联赛常规赛19支球队国内球员和外援的各项技术统计指标和数据。有关数据来自新浪网体育频道CBA联赛数据库(2015年5月30日)。 3.2. 指标选择 针对本文研究问题的需要，特别地从CBA常规赛各个球队(八一队除外)中筛选出核心国内球员和核心外援，利用核心队员的各项技术指标分别代表各队中国内球员和外援的最高竞技水平，在此基础上对二者的差异进行比较分析，从而得到国内球员竞技水平的现状。 核心球员的选择标准主要依据球员的效率值指数 2 和出场次数进行筛选。尽管有些队员综合能力很强，效率值指数很高，但是由于伤病等其他原因，出场次数不多，因此这部分球员对球队常规赛成绩的影响并不显著，在这种情况下应该选择出场次数最多的次佳球员进行分析。本文筛选出的各队核心国内球员和核心外援见表1。 因为不同球队的核心队员在球场上的位置不同，因此各类指标之间的差异较大，为了综合考虑不同位置的球员的能力，故选择了衡量篮球运动员各方面能力的11项技术指标(出场次数、2分球命中率、3分球命中率、罚球得分、篮板、助攻、抢断、封盖、失误、犯规、得分)。所有指标(除出场次数外)均使用场均值，其中，失误和犯规是负指标，其他均是正指标。
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user: 5. 结论和建议 5.1. 结论 本文通过使用主成分分析、聚类分析和Mann-Whitney检验等方法对2014~2015赛季CBA联赛核心国内球员和核心外援在竞技水平上的差异进行了层层深入的分析，从而总结出当前CBA联赛国内球员竞技水平状况如下： 1) CBA联赛的国内球员缺少超级球星。易建联仍然是当前CBA联赛国内球员的旗帜性人物，其他国内球员尚不具备与外援抗衡的实力。随着年龄的增长，易建联终究会走向职业生涯的末期，从现有核心国内球员的实力来看，王哲林最有可能接替易建联成为CBA联赛国内球员的领军人物。 2) 中国篮球出现了严重的人才断档，老球员和年轻球员青黄不接。CBA联赛中曾经辉煌的实力球员已经走向职业生涯的末期，年轻球员成长缓慢、发展潜力有限，CBA联赛和中国篮球仍然没有摆脱人才匮乏的局面，这导致各个位置上的国内球员与外援的竞技水平差距都非常大。内线年轻球员以王哲林、韩德君和周琦为代表，综合能力还显得很稚嫩；外线年轻球员发展潜力有限。 3) CBA联赛的国内球员与外援在各项技术能力和整体能力上的差距非常显著。其根源在于青少年时期没有为未来发展打下良好的基础，导致当前国内球员的发展潜力有限。 Table 4 Mann-Whitney test of the causes of athletic level differences of core domestic players and foreign players of 19 teams in 2014-2015 CBA regular seaso 罚球 篮板 助攻 抢断 失误 得分 Sig. 0.000 0.032 0.000 0.001 0.000 0.000 显著性 显著 显著 显著 显著 显著 显著 出场次数 2分球 3分球 封盖 犯规 Sig. 0.840 0.284 0.191 0.795 0.773 显著性 不显著 不显著 不显著 不显著 不显著 表4. 2014~2015赛季CBA常规赛核心国内球员和核心外援竞技水平差异影响因素的Mann-Whitney检验 5.2. 建议 根据上述国内球员竞技水平的现状的分析，提出以下建议供参考： 1) CBA联赛和中国篮球需要悉心栽培当前为数不多的潜力球员(如王哲林、韩德君和周琦等)。球队需要根据球员的能力和潜力制定周密的训练计划和比赛计划，需要在身体素质、营养保证和伤病控制方面进行更加科学地把握，年轻球员应该重在培养而不是使用。CBA联赛需要在潜力球员的商业价值上进行合理打造，为联赛创造球星效应才能更好地发展青少年篮球运动，才会有更多优质的人才资源。 2) 当前CBA联赛和中国篮球的发展需要再次激发老队员的能量。面对年轻球员成长缓慢和发展潜力有限的困境，中国篮球需要依靠CBA联赛老队员的经验继续坚守和再次挖潜来支撑，完成这个艰难的新老交替过程。 3) CBA联赛和中国篮球需要借鉴篮球运动发达国家对青少年篮球运动员的培养经验，利用好市场资源，打造完善的青少年篮球运动员的培养体系(如专业训练、校园篮球、高校篮球等)，为中国篮球的复兴打下坚实的基础。
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user: 摘 要 利用冯∙卡门薄膜大挠度理论，结合达朗贝尔原理，建立正交异性张拉平面膜结构非线性自由振动的控制方程。然后利用伽辽金法对其进行简化，并采用同伦摄动法进行求解，得到振动频率的近似解析解。通过算例，计算了结构的非线性振动频率，并将本文结果与精确解进行比较分析。分析表明：本文所求得的近似解析解与精确解之间的最大误差小于4%。因此本文的近似解析解与精确解非常接近，且本文所得解形式更为简单，计算也更方便，有利于在工程中进行推广应用。 关键词 :膜结构，非线性振动，正交异性，摄动法
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user: 1. 引言 张拉平面膜结构主要用于会展中心、停车场和体育馆等公共设施的平面型屋盖结构中[ 1 ] [ 2 ] 。由于这种结构自重轻、刚度小，因而在外荷载作用下容易产生振动，以致膜面松弛变形，甚至导致整个膜结构失效。如亚特兰大奥运会主馆佐治亚穹顶于1995年在一次强风袭击下，有四片薄膜被撕裂；加拿大蒙特利尔奥林匹克体育场的一片膜结构在1999年的一场暴风雪中突然破裂；韩日世界杯济州岛体育场膜屋盖在2002年6月和8月先后两次在台风的袭击下出现膜材撕裂。国内的，如广州颐和山庄楼顶膜结构在2003年夏季台风中被撕裂；温州大学体育场看台膜结构在2004年8月台风“云娜”作用下发生整体破坏。2012年4月，甘肃某中学的体育场看台顶棚膜结构被强风撕裂。因此研究建筑膜结构在外荷载作用下的振动问题，对膜结构的动力设计进行优化控制，进而防止或减少由于振动导致的膜结构工程事故具有重要意义。对膜结构自由振动问题的深入研究，是进行膜结构在外荷载作用下受迫振动问题研究的基础。 目前，国内外学者对薄膜结构自由振动作了一定的研究。1999年，Vega等对带有内部斜撑的矩形薄膜的自由振动进行了研究，得到了其振动频率的解析解 [ 3 ] 。2002年和2004年，Kang等对倾斜和弯曲复合矩形薄膜的自由振动进行了研究，得到了倾斜度和弯曲度对其振动频率的影响 [ 4 ] [ 5 ] 。2009年，Reutskiy发展了一种新的数值分析方法对任意形状的薄膜的非线性振动进行了研究，该方法基于频谱分析系统物理响应的数学模拟 [ 6 ] 。在国内，1980年，钱国桢研究了二向受力不同的矩形薄膜、圆形及椭圆形薄膜的自由振动问题，得到了任意外形薄膜自然频率的近似解 [ 7 ] 。1993年，袁驷和张亿果利用有限元线法对薄膜的固有振动这一特征值模型问题作了分析求解，并通过算例证明了求解方法的有效性 [ 8 ] 。2010年，罗吉和罗亮生研究了圆环膜的横向自由振动，利用该振动的数学模型，得到了其固有频率和节线的计算公式，该结果可用于涉及圆环膜振动的领域，也可以用于某些乐器 [ 9 ] 。2010年，林文静等构造六节点三角形单元，用于平面薄膜自由振动的有限元分析，给出了三个典型算例表明，六节点三角形单元的计算结果比ANSYS三角形单元更接近理论解，即六节点三角形单元具有更高的精度 [ 10 ] 。 以上的这些研究都是针对均匀的膜结构进行的研究，且得到的结果比较复杂而不利于工程应用。本文将采用近似解析方法同伦摄动法对正交异性的平面张拉建筑膜结构的振动问题进行研究，以得到简便有效，且适于工程应用的非线性振动频率计算公式。
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user: 2. 控制方程和边界条件 正交异性膜结构正交两个方向为受力的主方向，且正交两个方向的材料特性不一样。简化后的张拉平面膜结构模型如图1所示，正交的两个方向为x、y方向，其尺寸分别为a、b；x、y方向预张力分别为N 0x 和N 0y 。 则相应的位移边界条件如下： (1) (2) 根据冯∙卡门薄膜大挠度理论和达朗贝尔原理 [ 11 ] ，建立图1所示膜结构非线性自由振动的控制方程如下： 图1. 四边简支的矩形平面膜结构 (3) (4) 式中 为膜材面密度；h为膜材厚度； 和 分别为x和y向弹性模量；φ表示应力函数 ；w表示挠度 ；σ 0x 和σ 0y 表示x和y向的初始张拉应力；σ 0xy 表示初始剪切应力；G表示剪切模量；μ 1 和μ 2 表示x和y向的泊松比。
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user: 3. 控制方程的简化 满足边界条件(1)和(2)的挠度函数和应力函数可以表示成如下形式： (5) (6) 其中 表示振型函数； ， 为， 为未知函数。 根据薄膜振动理论，满足边界条件(1)的振型函数为： (7) 其中m和n为整数，表示x和y方向上的正弦半波数。 将(5)和(6)代入(4)得： (8) 将(7)和(8)得： (9) 分析方程(9)的解的结构， 设方程(9)的解为： (10) 将(10)代入(9)得： (11) 比较方程(11)两边的系数得： 将(10)代入边界条件(2)得： 将 、 、 、 、 、 、 、 、 代入(10)，然后再将(10)代入(6)可得： (12) 将(5)，(6)和(12)代入(3)中，然后根据伽辽金法得： (13) 很明显，方程(13)是一个关于 的非线性微分方程： (14) 其中： 将 ， 和 代入(14)得： 令： ， ，可得： (15) 在(15)式中， 并不是小参数，即(15)式是一个强非线性振动方程。
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user: 4. 控制方程的求解 方程(15)和它的初始条件可以表示成如下形式： (16) 其中 为振动的初始位移。 根据同伦摄动法 [ 12 ] ，可以构造一个同伦满足下式： (17) 其中 。 设方程(17)的解具有如下形式： (18) 其中 为待确定的函数。 将(18)代入(17)得： (19) (20) 令 作为方程(17)的初始近似解，其中 为未知数。则根据(20)可以得到： (21) 方程(21)是一个线性微分方程，其解为： (22) 为了消除可能在下次迭代计算中出现的永久项，可以令 的系数为零。 (23) 在(23)中，因为 ，所以必有： (24) 因此控制方程的振动频率为： (25) 振动频率的精确解为 [ 13 ] ： (26) 其中 通过L-P摄动法求解得到的频率为 [ 14 ] ： (27)
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user: 5. 算例分析 选用工程中常用的膜材作为算例进行计算。 向的弹性模量为 ， 向的弹性模量为 ，膜材面密度为 ；膜材厚度为h = 0.8 mm；膜材长宽为a = 1 m，b = 1 m，初始张拉应力为 。 将以上的材料参数代入式(25)，(26)和(27)计算膜材振动的频率，计算结果如下表1和图2~4。对计算结果进行比较分析可得： Table 1 Frequency values (rad/s) under different initial displacemen 阶数 公式 初位移a 0 (m) 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 w 0 →0 1 (25) 749.32 682.31 616.22 551.38 488.31 427.80 371.13 320.38 278.82 250.88 240.95 (26) 725.63 661.75 598.82 537.18 477.30 419.93 366.21 317.97 278.09 250.82 240.95 (27) 1251.66 1059.62 887.80 736.20 604.80 493.63 402.66 331.91 281.38 251.06 240.95 2 (25) 1447.47 1323.23 1201.25 1082.34 967.63 858.84 758.58 670.71 600.64 554.80 538.78 (26) 1405.22 1286.99 1171.08 1058.21 949.45 846.33 751.16 667.32 599.71 554.73 538.78 (27) 2161.18 1852.93 1577.12 1333.76 1122.84 944.38 798.36 684.80 603.68 603.68 538.78 3 (25) 1752.38 1594.08 1437.77 1284.18 1134.44 990.34 854.77 732.60 631.70 563.27 538.78 (26) 1695.88 1544.89 1395.98 1249.87 1107.64 970.97 842.48 726.44 629.80 563.10 538.78 (27) 3034.62 2560.41 2136.12 1761.74 1437.28 1162.74 938.11 763.40 638.61 563.74 538.78 表1. 不同初始位移下的振动频率 图2. 不同初始位移下的一阶振动频率 图3. 不同初始位移下的二阶振动频率 图4. 不同初始位移下的三阶振动频率 ① 按照式(25)，(26)和(27)计算的所有频率值都随着初始位移的增加而增加。这是因为随着初始位移的增加，膜材的内力和横向刚度都将增加，因此膜面也将振动得更快，因此频率就高。这也反映了膜材振动的非线性特性。同时，在相同初位移下的振动频率随着阶数的增加而增加。当初位移接近零的时候，按照式(25)，(26)和(27)计算的频率都相同且等于按照小挠度理论计算的频率。 ② 按照式(25)计算的频率值比按照式(26)计算的频率值稍大，且它们之间的误差随着初位移的增加而逐渐增大；在表1中，最大的误差为3.3%。按照式(27)计算的频率也比按照式(26)计算的频率大，它们之间的误差随着初始位移的增加而显著增大；在表1中，最大的误差为78.9%。 ③ 当初始位移较小，且阶数较低时，按照式(25)，(26)和(27)计算的频率值非常接近。当a 0 ≤ 0.04时，它们三者之间的最大误差为11.34%。因此，可以认为当 时，运用式(25)和(27)计算前三阶频率可以满足工程精度要求，且非常简便。 ④ 很显然，式(25)的精度要高于(27)。式(27)只适用于薄膜的弱非线性振动，即式(27)只对小参数有效。而式(25)不仅适于弱非线性，也适于强非线性的情况，即式(27)不仅对小参数有效，而且对大参数也有效。 根据表1和图2~4的数据，进一步讨论：当初始位移为0.1 m时，按照式(25)和(26)计算的频率值的最大误差为3.3%，那么当初位移a 0 更大，甚至a 0 →∞时，为讨论式(25)的精度，构造如下极限： 因此，对于任意的初位移，按照式(25)计算的结果与精确解的最大差小于等于4%。
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user: 6. 结论 本文采用同伦摄动法求解了四边简支矩形正交异性膜结构非线性自由振动的控制方程，得到了非线性振动频率的近似解析解。本文所得公式(25)的精度比按照L-P摄动法求得的公式(27)的精度更高，且公式(25)不仅适于弱非线性振动，也适于强非线性振动。另外，对于任意的初始位移a 0 ，按照公式(25)计算的结果与精确解(26)的最大误差小于4%。因此本文求解出的计算公式(25)完全能满足工程精度要求，且公式简单实用。本文的研究结果为建筑膜结构和其他膜结构的动力设计提供了理论计算依据。
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user: 摘 要 钳状氮杂环卡宾广泛用于阴离子识别和金属卡宾络合物制备。本文合成了四种含蒽环的钳状氮杂环卡宾前体和一种银氮杂环卡宾络合物，并对其结构进行了表征。 关键词 :氮杂环卡宾，蒽，钳状
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user: 1. 引言 自从上世纪90年代Arduengo [ 1 ] 等分离得到游离的氮杂环卡宾后，二十多年来人们对氮杂环卡宾开展了深入而广泛的研究 [ 2 ] - [ 5 ] 。金属氮杂环卡宾的用途很广，可用于诸如：催化 [ 5 ] 、医疗 [ 6 ] 等方面。已报道的金属氮杂环卡宾主要集中在对其结构、催化性能 [ 2 ] - [ 5 ] 的研究，也有少数文献报道了它们的识别性能 [ 7 ] [ 8 ] 。近年来，以氮杂环卡宾前体作为作为主客体化学中识别主体的研究引起了科学家们的注意 [ 9 ] - [ 12 ] 。这类主体主要利用咪唑环2位C上的C–H键与阴离子作用形成非传统的氢键，从而实现对某些阴离子的识别。钳状氮杂环卡宾前体对阴离子存在潜在的识别能力，同时也可以与金属化合物形成金属氮杂环卡宾络合物。本文合成了含蒽环的一系列钳状氮杂环卡宾前体和一个银氮杂环卡宾络合物，并对产物进行了NMR表征。
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user: 2. 实验部分 2.1. 仪器与试剂 Bruker Advanece III-400 Hz型核磁共振仪，TMS做内标，DMSO-d 6 为溶剂，药品、试剂除1a、1b、1-(2-甲基吡啶)咪唑、苄基咪唑自制外其余均为市售分析纯。 2.2. 化合物的合成(图1) 化合物1a、1b参照文献制备[ 13 ] [ 14 ] 。 化合物2的合成：将苄基咪唑(0.88 g， 5.5 mmol)和化合物1 a (1.13 g， 2.5 mmol)溶解于30 ml无水四氢呋喃溶液后回流24小时左右，析出淡黄色沉淀，TLC监测至反应结束。过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤1~2次后用甲醇溶解，然后加入NH 4 PF 6 饱和水溶液进行阴离子交换，得到淡黄色固体产物。粗产品经乙睛/乙醚重结晶，得到1.72 g化合物2，产率：76.9%，熔点：173℃~175℃。 1 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 9.28 (s， 2H， NCHN)， 8.91 (d， 1H， J = 0.77 Hz)， 8.45 (s， 1H)， 7.89 (t， 2H， J = 1.78 Hz)， 7.76 (t， 2H， J = 1.7 Hz)， 7.64 (d， 2H， J = 8.9 Hz)， 7.44~7.28 (m， 2H)， 7.30~7.22 (m， 10H)， 6.88 (d， 2H， J = 7.4 Hz)， 5.27 (s， 4H， ArCH 2 )， 4.47 (t， 4H， J = 6.8 Hz， OCH 2 )， 4.28 (t， 4H， J = 6.1 Hz， NCH 2 )。 化合物3的合成：反应物为1a和甲基咪唑，反应条件参照2的合成，产品为浅黄色固体，产率：75.6%，熔点：198℃~200℃。 1 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 9.12 (s， 2H， NCHN)， 8.84 (s， 1H)， 8.47 (s， 1H)， 7.81 (t， 2H， J = 1.5 Hz)， 7.63 (t， 4H， J = 7.3 Hz)， 7.42 (q， 2H， J = 7.5 Hz)， 6.90 (s， 2H， J = 7.3 Hz)， 4.45 (t， 4H， J = 6.8 Hz)， 4.30 (t， 4H， J = 6.1 Hz)， 3.70 (s， 6H， NCH 3 )。 化合物4的合成：反应物为1b和1-(2-甲基吡啶)咪唑，反应条件参照2的合成，得淡黄色黄固体。产率：78.7%，熔点：178℃~180℃。 1 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 9.34 (s， 2H， NCHN)， 8.93 (s， 1H)， 图1. 目标化合物的合成 8.46 (s， 1H)， 8.43~8.41 (m， 1H)， 7.90 (t， 2H， J = 1.8 Hz)， 7.84~7.44 (m， 6H)， 7.62 (d， 2H， J = 7.9 Hz)， 7.42 (t， 2H， J = 7.9 Hz)， 7.36~7.30 (m， 4H)， 6.88 (d， 2H， J = 7.4 Hz)， 5.45 (s， 4H， PyCH 2 )， 4.52 (t， 4H， J = 6.8 Hz)， 4.29 (t， 4H， J = 6.2 Hz， NCH 2 )， 2.57~2.50 (m， 4H， CH 2 ). 13 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 154.2， 153.7， 149.8， 137.8， 137.4， 132.8， 126.4， 124.0， 123.9， 122.8， 122.7， 120.6， 114.9， 103.6， 65.1， 53.4， 47.0， 29.4。 化合物5的合成：反应物为1b和甲基咪唑，反应条件参照2的合成，得浅黄色固体。产率：68.4%，熔点：146℃~148℃。 1 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 9.11 (s， 2H)， 8.86 (s， 1H)， 8.47 (s， 1H)， 7.81 (s， 2H)， 7.81~7.64 (m， 4H)， 7.42 (t， 2H)， 6.91 (d， 2H)， 4.47 (t， 4H， OCH 2 )， 4.31 (t， 4H， NCH 2 )， 3.70 (s， 6H， NCH 3 )， 2.52~2.25 (m， 4H， CH 2 )。 化合物6的合成：将0.225 g (0.25 mmol) 2和0.07 g (0.30 mmol) Ag 2 O，加入50 mL圆底烧瓶后，加入6 mL DMSO溶液，氮气保护下，80℃避光反应约24小时后停止反应。滤去未反应的Ag 2 O，滤液加入100 mL蒸馏水，析出白色固体。冷却至室温，抽滤，固体干燥后用乙腈/乙醚重结晶，得产品0.13 g。产率：62.3%，熔点：186℃。 1 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 9.06 (d， 1H， J = 0.8 Hz)，8.45 (s， 1H)， 7.64~7.58 (m， 4H)， 7.54 (d， 2H， J = 1.8 Hz)， 7.44~7.34 (m， 6H)， 6.98~6.79 (m， 8H)， 5.48 (s， 4H， ArCH 2 )， 4.73 (t， 4H， CH 2 O， J = 4.5 Hz)， 4.36 (t， 4H， NCH 2 ， J = 4.5 Hz). 13 HNMR (DMSO-d 6 ， 25℃， TMS) δ (ppm) 137.7， 132.6， 128.7， 127.9， 127.7， 126.3， 123.7， 121.0， 115.0， 103.4， 67.5， 54.2， 51.4。
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user: 3. 结果与讨论 3.1. 合成过程讨论 1a，1b在合成过程中采用无水乙腈作为溶剂，无水碳酸钾作为碱，加大1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷的用量可以提高产量，具体实验过程中我们通常加入5当量的二溴代物。1a，1b与取代咪唑反应较为容易，但反应后生成含溴离子的咪唑鎓盐，易在空气中潮解，通过与NH 4 PF 6 进行阴离子交换后可以避免此种情况出现。受邻位咪唑鎓N正离子吸电子效应的影响，化合物2中五元咪唑环C–2上的氢变得活泼，在一些弱碱作用下极易形成卡宾。由于氧化银具有一定的碱性，可以利用其制备银卡宾。实验过程中通常加入1~2当量的氧化银，反应后有时会有银镜现象出现，没反应的氧化银可以在反应后过滤掉。考虑到银卡宾见光会逐渐分解，实验最好在避光条件下进行。 3.2. 化合物6的氢谱分析及应用前景 化合物6与化合物2相比咪唑环2位C上氢已经没有，体现在核磁共振氢谱上，即可观察到化合物6在化学位移9.28 (s， 2H)处咪唑环2位C上的氢信号消失，说明了银卡宾络合物6的生成。我们认为，银氮杂环卡宾络合物目前相对容易合成，后续工作可以利用其作为中间体合成钯等具有催化性能的较难合成的金属卡宾络合物。同时，银氮杂环卡宾络合物具有一定的杀菌潜力，后续工作可以测试其对某些细菌的作用情况。此外，钳状氮杂环卡宾前体有望利用与某些阴离子之间产生非传统的C-H…X氢键作用进行识别性能探索。
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user: 4. 结论 本文合成了四种含蒽环的钳状氮杂环卡宾前体和一种银氮杂环卡宾络合物，取得了62%以上的产率，并通过NMR谱确定产物结构。目标产物可用于金属氮杂环卡宾的合成并有望用于分子识别中。
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user: 摘 要 单域抗体(single-domain antibody， sdAbs)是近年来利用基因工程技术从骆驼科动物和软骨鱼血清中克隆得到的只保留重链可变区的具有抗原结合活性的新型抗体，具有分子量小、特异性高、亲和性好、稳定性高、组织穿透力强、免疫原性低和制备成本低等优点，在诊断、治疗和检测等领域已取得一定成果并获得广泛关注。本文综述了单域抗体的发展历程、结构特征、表达纯化、理化性质及应用方向，特别是对进化上更早出现、抗原结合性能更加多样的鲨鱼sdAbs进行了详尽分析，并对其发展前景和可能面临的问题作了展望。 关键词 :单域抗体，纳米抗体，重链抗体，骆驼，鲨鱼，免疫球蛋白新抗原受体
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user: 1. 引言 自上世纪七十年代以来，杂交瘤技术(hybridoma technology)，DNA重组(recombinant DNA)，蛋白质工程(protein engineering)和噬菌体展示技术(phage display technology)为以抗体为主的生技药品在疾病的治疗和诊断中的研究和发展提供了一个新的平台[ 1 ] -[ 4 ] ，大大推动了生技药品在临床上的应用和商业上的推广。 1975年，Kohler和Milstein提出了小鼠杂交瘤技术 [ 3 ] ，为单克隆抗体(monoclonal antibodies， mAbs)的发展提供了理论基础。相比传统的从血清中提取的多克隆抗体，mAbs具有特异性高、均一性好的优点。只要细胞株不发生基因突变，杂交瘤细胞就可以在体外永久存活并传代 [ 5 ] ，产生所需的均一抗体。然而，由于mAbs固有的亲和性的局限性大大限制了其应用范围，其成本高、周期长、工序复杂、体积大、稳定性差、不同批次之间差异较大等不足也对mAbs的临床应用提出了挑战。1988年，Skerra等 [ 6 ] 首次运用基因工程技术和分子生物学操作技术在基因水平上设计并改造抗体基因结构，在细菌中同时表达出抗体重链可变区(heavy-chain variable， VH)和轻链可变区(light-chain variable， VL)，成功获得了功能性重组抗体，称可变区抗体片段(Fv， Fragment of variable)。以此为基础，研究人员又将重链和轻链可变区进一步连接、获得了功能性单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment， scFv)。如图1(a)所示，与之前获得的包含轻链(VL及CL)和重链可变区(VH)及一个重链恒定区(CH1)的抗原结合片段(antigen-binding fragment， Fab)的分子量(约50 kDa)相比，Fv/scFv的相对分子质量更小(约25 kDa)，约为γ-免疫球蛋白(immunoglobulin-γ， IgG)全抗的1/6，具有分子量小、组织分布特异性强和免疫原性低等特点。由于缺少重链恒定区片段(Fc)，Fv/scFv不能与细胞膜的Fc受体结合，而且分子小，可以穿过血脑屏障，大大扩展了其应用前景。此后，随着分子生物学等基础学科的不断成熟，基因重组技术的飞速发展和对抗体结构更深入的认识，出现了继多克隆抗体、单克隆抗体之后的第三代抗体—基因工程抗体。 1989年，Hamers-Casterman等 [ 7 ] 偶然发现骆驼(单峰驼)血液中有半数的抗体是重链抗体(heavy-chain antibodies， HCAbs)，它是一种缺失了轻链的重链二聚体抗体(图1(a))。HCAbs普遍存在于单峰驼(Camelus dromedarius)、亚州双峰驼(Camelus bactrianus)、南美洲的大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)、羊 图1. 骆驼的三种抗体、鲨鱼IgNAR和相应的sdAbs示意图 驼(Vicugna pacos)等种类的偶蹄目(Artiodactyla)胼足亚目(Tylopoda)骆驼科(Camelidae)动物血清中 [ 8 ] 。1995年之后，又相继在未免疫及免疫的铰口鲨(nurse shark， Ginglymostoma cirratum)、大星鲨(smooth dogfish， Mustelus canis)、白斑角鲨(spiny dogfish， Squalus acanthias)、鰩鱼(skate)和魟鱼(ray)等软骨鱼纲(Chondrichthyes)发现了与HCAbs相似的无轻链的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor， IgNAR) [ 9 ] - [ 11 ] 。鲨鱼血清中含有高达约350 mM尿素(人体中含量低于20 mM)，这种恶劣的体内环境极大地增加了IgNAR的稳定性和溶解性。 1997年，Ghahroudi等 [ 12 ] 利用噬菌体展示技术获得骆驼重链可变区片段(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody， VHH)基因库，经多轮淘选后得到了只含有一个结构域的最小单元抗原结合片段，被称为单域抗体(single-domain antibodies， sdAbs)。其后，研究人员又从鲨鱼新抗原受体可变区片段(variable NAR， VNAR)基因库 [ 13 ] 中获得了结构相似的sdAbs。这种椭球形的小分子抗体的直径仅2.5 nm，长4 nm，相对分子质量仅15 kDa，因此也被称为纳米抗体(nanobodies， Nbs) [ 14 ] 。其固有的高特异性、高亲和力和高热稳定性使得sdAbs在其被发现后20多年的研究中取得了瞩目的成果，成为生技药品的一颗新星，在免疫、诊断、医学成像、检测等领域中受到越来越多的关注。 目前已有文献分别综述了骆驼源sdAbs的结构、特性和应用等方面内容，但都不太全面，极少涉及在进化上更早的以鲨鱼为代表的海洋软骨鱼类sdAbs相关研究进展，且近年来sdAbs相关的研究发展较快，涌现出许多新的研究成果和新技术。因此本文综述了近年来单域抗体研究进展，特别是鲨鱼sdAbs的结构及特性，并展望了单域抗体的应用前景和面临的问题。
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user: 2. 重链抗体和单域抗体结构特征 单域抗体是重链抗体的可变区结构域，其结构影响抗体VH与VL的结合，决定着抗体的许多性质(图1)。重链抗体广泛存在于骆驼科和软骨鱼纲动物血清中，是趋同进化的典型例证，但由于进化起源上的差异等因素 [ 10 ] ，二者的抗体间有许多不同特征。 由于骆驼科动物养殖容易，研究方便，并与人源IgG同源，故早些年的研究对象主要集中于骆驼科动物。如图1(a)所示，骆驼血清中的IgG有三种类型 [ 15 ] ：由两条重链和两条轻链组成的传统四聚体抗体 IgG1，其相对分子质量和人源IgG接近，为150 kDa；两种缺失轻链和重链的CH1区的HcAbs (IgG2和IgG3)，其相对分子质量分别为92 kDa和90 kDa，这是由于IgG2的铰链区(hinge)要长于IgG3型抗体 [ 16 ] 。氨基酸序列分析发现 [ 2 ] ，骆驼VHH与VH在第二个框架区(framework region 2， FR2)有4个标志性的氨基酸残基不相同 [ 17 ] [ 18 ] ，使得VHH不能与VL对应的区域结合，进而形成独特的HCAbs重链二聚体抗体结构。 目前所发现的骆驼科动物血清中均同时存在传统IgG和HCAbs，只是二者所占的比例在不同动物中不尽相同 [ 19 ] ，在普通的双峰驼中，HCAbs的比例可达50%~80%，而在南美洲大羊驼中可能仅占10%~25%。这对于我们选择何种免疫过的骆驼作为我们的研究对象尤为关键。 随着研究的深入，近年来，sdAbs在以鲨鱼为主的软骨鱼中的研究也越来越受到关注。与骆驼HCAbs相比，软骨鱼IgNAR有5个重链恒定区(constant region of heavy chain， CH)，即CH1-5，其晶体结构尚未被探知。与骆驼VHH相同，利用基因工程技术和噬菌体展示技术同样可以将鲨鱼VNAR表达为鲨鱼单域抗体(shark sdAbs)，根据VNAR中二硫键的数目与位置 [ 21 ] ，研究人员将鲨鱼IgNAR分为三种类型(图2)。每个VNAR均含有两个抗原互补决定区(complementarity-determining region， CDR)和两个超变区(hypervariable region， HV)。其中传统的CDR2缺失，被HV2取代，形成一个柔性接头，连接FR2和FR3。 I型IgNAR只在铰口鲨中被发现过 [ 22 ] ，或许只存于这一个物种中，其VNAR的FR2和FR4区分别有一个半胱氨酸(Cys)残基，而其CDR3有两个Cys残基。对I型IgNAR的VNAR晶体结构分析(图3(a)和图3(b) [ 20 ] )，研究人员发现除去与其他型VNAR、人类VH、骆驼VHH的FR1和FR3存在的一对维持基本结构的典型的二硫键外，其FR2与CDR3和CDR3与FR4之间还存在两对非典型的二硫键，这使得CDR3折叠成更紧密的结构，并指向HV2。这种结构大大增加了抗体的热稳定性，但同时也限制了其结构的灵活性，因此降低了抗体对抗原的多样性。 II型IgNAR在VNAR的CDR1与CDR3之间形成非典型二硫键，使得CDR3可以像骆驼的VHH (图3(c))的CDR3一样伸展出来，其VNAR的构像与框架也与VHH比较相似。 III型IgNAR一般只在软骨鱼年幼时(小于1岁)出现 [ 23 ] ，其结构与II型IgNAR比较相似，只是在VNAR的CDR1有一个保守的色氨酸(Trp/W)残基。其CDR3仅有约15个氨基酸残基，缺乏多样性，却形成保护新生鱼的第一道防线 [ 11 ] ，在成年软骨鱼免疫系统成熟的过程中发挥了重要作用。 另外，Liu等 [ 24 ] 还发现了没有形成二硫键的IIb型以及同IIb型结构相似但和III型一样在CDR1有一个保守色氨酸残基的IIIb型IgNAR。但制备出的缺少二硫键的sdAbs稳定性差，亲和力低，其应用前景有限。 图2. 软骨鱼IgNAR按VNAR的二硫键的数目和位置划分出的三种类型 图3. VNAR与VHH晶体结构图 [ 20 ]
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user: 3. 单域抗体的表达与纯化 目前，sdAbs已经可以成熟地采用基因工程的方法进行大量表达，sdAbs制备的核心是建立一个容量较大的基因库，并从中淘选出目的基因片段。 3.1. 单域抗体基因文库的建立 驼源与鲨鱼源sdAbs在抗体的表达纯化及特性分析的操作方法相仿，一般从新鲜的经免疫的或未经免疫的动物外周血液淋巴细胞中提取RNA，逆转录后建立抗体cDNA文库，之后可借助噬菌体展示技术 [ 25 ] 将抗体cDNA连接到噬菌粒载体转化到大肠杆菌(图4)，再进行基因库的保藏与目标基因的淘选工作，以大大提高目标产物的筛选效率，也有的采用酵母展示技术 [ 26 ] [ 27 ] 和核糖体展示技术 [ 28 ] [ 29 ] 等。 根据抗体基因的来源，我们将噬菌体抗体文库分为两类 [ 30 ] [ 31 ] ：天然库(naïve library)和合成库 图4. SdAbs的噬菌体展示示意图 (synthetic library)。天然库是未加修饰的完全拷贝动物的抗体基因建立的基因库；合成库包括全合成库和半合成库(semi-synthetic library)。因抗体的框架区基因序列具有一定保守性，而CDR的基因序列则多变并决定抗体的抗原结合性质。因此，半合成库是将天然库与全合成库相结合 [ 32 ] ，只合成相对高变的序列，在大大减少工作量的同时保证噬菌体抗体文库的多样性。目前相关研究主要采用半合成库，其成功度取决于文库的大小和质量。一个能让人满意的噬菌体抗体文库至少要达到109个单位的拷贝数 [ 33 ] ，这将直接影响最终筛选出的单域抗体的特异性、亲和性以及稳定性。从头开始建立一个全新的基因库需要约4~6个月，市面上已经有相关的sdAbs噬菌体基因库出售 [ 11 ] 。 噬菌体展示技术一般选用pIII蛋白和pVIII蛋白展示，前者是噬菌体尾部蛋白的组成部分，可以允许大片段的插入，后者是噬菌体衣壳蛋白，只能展示一段非常短的肽链(6~8个残基)，如图4所示。而编码驼源VHH的基因约为360 nt (IgNAR与之相仿)，表达的sdAbs约由120个氨基酸残基组成，因此研究者通常采用PHEN2，MS2等 [ 34 ] 噬菌体进行基于pⅢ蛋白的单价展示。这些噬菌体一般是溶源性温和噬菌体，在短时间内不能快速增殖，因此在进行扩增淘选时还需要在辅助噬菌体 [ 35 ] 帮助下裂解宿主细胞。 3.2. 目标抗体的淘选 淘选(panning)是从海量的噬菌体抗体文库中采用固相化的抗原富集特异性目标抗体基因的过程。由于噬菌体展示技术可以使融合蛋白表达在噬菌体衣壳表面，利用抗原富集目标抗体的同时使携带了目标抗体基因的噬菌体富集。将这些目标抗体基因分离出来可以很容易地进行表达纯化与分析。 要得到特异性较高的目标抗体基因一般需三轮淘选，每轮淘选可以纯化约4~10倍 [ 36 ] 。由于文库中每种噬菌体抗体的拷贝数很少，而库容量巨大，因此第一轮淘选条件要尽量地非严谨，否则会适得其反，增加偶然因素造成的风险。第一轮淘选后，每种噬菌体的拷贝数大幅提高，随后其操作严谨性也应大幅提高。 3.3. 重组抗体的表达纯化 SdAbs可在细菌、真菌和植物中大量表达，即便是在细菌中也能够形成二硫键，可保证目标sdAbs结构的正确性和功能的完整性。在表达前，通常给目标抗体基因加上组蛋白标签(6XHis tag)，这样就可以通过固相金属镍亲和柱高效地纯化目标抗体。如有必要，还可以经凝胶过滤等蛋白质分离技术对目标抗体进一步纯化。如Liu等 [ 37 ] 获得的羊驼和鲨鱼sdAbs产物的得率分别为10~20 mg/L和0.5~1.0 mg/L。
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user: 4. 单域抗体的理化性质 4.1. 单域抗体对抗原的特异性 单域抗体CDR区是主要的抗原结合区域，其基因库的多样性决定了淘选得到的目标抗体对抗原的特异识别能力。Liu等 [ 38 ] 淘选出的鲨鱼源抗葡萄球菌肠毒素B(SEB)和抗蓖麻毒素(ricin) sdAbs对结构相似的非特异性抗原的结合率分别低于1%和0.1%，表现出高度抗原结合选择性。目前，研究者们已经制备出多种具有高度特异性的基于VHH或IgNAR的sdAbs，可靶向于噬菌体、病毒、细菌和真菌等微生物及其分泌的毒素等大分子蛋白质。如Walper、Graef和Goldman等从驼源和鲨鱼单域抗体库中淘选出高特异性抗炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的孢子和营养细胞 [ 39 ] ，抗金黄色葡萄球菌肠毒素B (Staphylococcus aureus Enterotoxin B， SEB) [ 40 ] ，抗相思子凝集素(abrus agglutinin) [ 41 ] 的sdAbs，可用于免疫和检测等领域。 4.2. 单域抗体的亲和性 目前，关于人源scFv抗体的研究也很热门。scFv是由一条VL和一条VH随机地连接而成，这使得抗体的多样性提高，但同时也会因其不确定的组合而降低抗体的亲和性。而sdAbs则没有这方面的后顾之忧，如驼源VHH的热动力学结合与解离常数为10 5 ~10 6 M −1 ∙s −1 (k on )和10 −2 ~10 −4 s −1 (k d )，表现出良好的亲和性 [ 33 ] 。Liu等 [ 38 ] 淘选出的亲和力更高的铰口鲨源sdAbs，因其HV4的特殊序列，与抗原间的范德华力更强，其解离常数仅10 −7 s −1 ，与传统IgG相当。另外，由于sdAbs的CDR3区较长，可以深入到抗原内部与之更好地结合。 4.3. 单域抗体的稳定性 热稳定性是sdAbs相对于传统IgG、Fab、scFv抗体最明显的优势。一方面由于sdAbs分子尺寸小，结构紧凑；另一方面，VNAR非典型二硫键也赋予了sdAbs优良的热稳定性 [ 40 ] [ 42 ] 。SdAbs的变性温度在70℃~80℃之间 [ 37 ] [ 43 ] ，远高于scFv的57℃ [ 44 ] 。即便在95℃下加热一小时，来源于星鲨的sdAbs仍然能够保持一定的活性 [ 24 ] ，这一性质大大拓展了sdAbs的应用领域。有趣的是，研究人员还发现，有些sdAbs的活性会在复性后获得更好的活性，可能是由于复性过程使蛋白质更好地折叠 [ 38 ] 。 额外的非典型二硫键不仅影响sdAbs分子的热稳定性，同时还影响其化学稳定性。这使得它可以在约60℃~80℃、2.3~3.3 M的盐酸胍溶液中保持活性 [ 45 ] ，抵抗变性剂引起的蛋白质失活，这一特性使得sdAbs可以加入到洗发水中治疗因头皮屑中的糠秕马拉色氏霉菌引起的皮下感染 [ 46 ] 。同时这些二硫键还可以保护sdAbs避免被胰凝乳蛋白酶降解 [ 47 ] ，因此这类sdAbs还可以用于口服。然而，为增加sdAbs的亲和力和稳定性而人为地增加二硫键数目或改变二硫键位置的同时也会影响CDR3对抗原的特异性，故需要综合考虑。