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user: 3. 小麦条锈菌毒性基因的研究进展 3.1. 植物病原菌效应基因的研究进展 效应蛋白通过抑制植物的防卫反应来增强病原菌的致病性，是病原菌关键的毒性因子。因此，鉴定病原菌得效应基因可深入的研究植物抗病机制以及病原菌如何适应寄主植物。目前，锈菌中只鉴定出了少数锈菌效应基因，主要来自蚕豆、锈菌和亚麻锈菌 [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]。成玉林等 [ 29 ] 以抑PCD为标准对小麦条锈菌效应基因进行了大规模的的筛选、鉴定和功能分析。在其研究中，沉默PsKE1或PsKE2能够引起条锈菌在小麦上毒性的明显降低。目前鉴定的大多数病菌效应基因沉默或缺失后不会显著影响其病菌的毒性 [ 30 ]，所以可以认为这两个效应基因是小麦条锈菌的关键效应基因。根据他的研究得出小麦条锈菌效应蛋白PsKE1和PsKE2的毒性机制。当条锈菌侵染寄主后，利用吸器将这两个效应蛋白分泌并转入到寄主细胞内。进入寄主细胞内后，PsKE1和PsKE2首先在细胞质与TaTrx-m4互作，抑制植物细胞的坏死。之后，PsKE1和PsKE2进入细胞核中并与PKDM7-1互作，调节防卫相关基因表达。与此同时，PsKE1同时在细胞质和细胞核中与TaDHN-1互作，进行调控JA通路。 3.2. 小麦条锈菌Ras基因的研究进展 Ras信号通路在很多生命活动中起着重要的调控作用，并且小麦条锈菌基因组中含有两个编码Ras蛋白的基因PsRas1和PsRas2。成玉林等探究了小麦条锈菌Ras基因在病原菌致病性、菌丝发育以及PCD中的作用。在一些丝状真菌中这两个Ras基因在进化上是属于两个不同的遗传分支，小麦条锈菌也与之相同 [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ]。在一些丝状真菌中，ras1缺失突变体是致死的所以Ras1可能是一个必需的基因 [ 31 ] [ 33 ] [ 34 ]。Ras2的缺失突变体能够引起菌丝发育减缓和致病性的降低 [ 31 ] [ 32 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]。但是其实验结果表明小麦条锈菌与其他丝状真菌不太相同，PsRas1在致病性中仅有较小的作用，但PsRas2在条锈菌的致病性中却起着性对重要作用 [ 29 ]。另外，MAPKs被证实参与真菌的PCD [ 38 ]。其研究表明PsRas1瞬时表达能够诱导植物PCD，Ras-MAPK信号通路很可能参与小麦条锈菌的PCD。 3.3. 小麦条锈菌SR蛋白激酶基因的研究进展 经过长时间的进化，病原真菌形成了复杂的信号传导机制用来识别和对抗植物的防卫反应 [ 39 ]。SR蛋白已被证实与病原真菌的生命活动及致病性有关 [ 40 ]。SRPKs是SR蛋白的一个重要调节因子，目前已经证实大部分SRPKs是定位于细胞质的，作用是通过磷酸化来调节SR蛋白的核输入 [ 41 ]。少部分却定位于细胞核来调节SR蛋白的核定位 [ 42 ]。 成玉林等鉴定了一个小麦条锈菌新的激酶基因并命名为PsSRPKL [ 29 ]。该基因在条锈菌侵染小麦后18 h高量表达，而小麦条绣菌的吸器形成的阶段大约在接种后24 h [ 43 ]。试验显示了PsSRPKL是定位于细胞核的一种SRPK。结果表明了PsSRPKL很可能是通过调节其靶标SR蛋白的核定位来参与调控和影响条锈菌的致病性，并在不同的环境刺激中进行调控作用 [ 29 ]。 3.4. 小麦条锈菌III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因(PsPik1)的功能分析 何付新等将小麦条锈菌中的PsPik1基克进行了隆因，并分析其序列表明属于III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶β蛋白 [ 44 ]。对PsPik1的表达模式进行荧光定量PCR分析。在接种后6 h，PsPik1上调表达，夏孢子萌发并形成芽管在这一时间段。已证实在条锈菌萌发形成芽管的过程中芽管前端钙离子浓度是增加的 [ 45 ]，并且PsNCS1基因此时的表达水平也是较高的 [ 46 ]。在酵母中，细胞质内钙离子浓度升高时，钙离子传感蛋白Frq1就会与钙离子相结合，蛋白构象发生变化即Pik1蛋白产生U型弯曲，这种构象变化有利于激活相对应得激酶活性 [ 47 ]。与此同时Pik1与N端豆蔻酰化的Frq1结合使二聚体Pik1-Frq定位到TGN [ 47 ]。因此推测在条绣菌夏孢子萌发形成芽管时，钙离子浓度升高，促进了PsNCS1的结合并产生构象变化，使结合了钙离子的PsNCS1和PsPik1结合并定位于TGN，进而调节高尔基体的脂质转运、蛋白分泌等过程 [ 44 ]。 在接种条绣菌后12、18、24 h后，PsPik1基因上调表达。已经证实在条绣菌侵染12 h时，其侵入气孔形成气孔下囊形成菌丝；侵染18 h时，菌丝蔓延于寄主叶肉细胞间，接触到叶肉细胞后形成吸器母细胞；侵染24 h时，吸器母细胞侵入叶肉细胞形成吸器，吸器可以从寄主细胞吸收营养物质，自此以后条绣菌就可以利用寄主营养进行寄生生活 [ 4 ]。在酵母中，定位于细胞核的Pik1基因在转录、mRNA的加工与输出中起到重要的作用 [ 48 ]。而定位于TGN的Pik1基因会参与脂质转运、囊泡运输与蛋白转运等过程 [ 48 ]。根据酵母已研究出的结论，以及试验结果可推测出，PsPik1基因在条锈菌侵染早期对脂质、糖类与蛋白质的产生发挥了关键的作用 [ 44 ]。在接种条绣菌7天至11天，PsPik1的表达水平先上升后又恢复。在这一时间段，随着菌丝扩展延伸，条锈菌形成产孢基底菌丝进而使孢子堆产生 [ 4 ]。Pik1是在酵母中使酵母生存必需的激酶 [ 49 ]，在营养缺乏的时，Pik1与蛋白Bmh1p和蛋白Bmh2p结合，反应结果抑制了有Pik1参与的脂质运输、蛋白分泌等过程，当营养恢复时，Pik1也会恢复到原来的状态，这个过程在营养缺乏时对维持酵母的正常生长起到重要的作用 [ 49 ]。条锈菌发育全部过程当中，其夏孢子的生长代谢一直处在比较低的水平。因此认为PsPik1参与了条锈菌的产孢过程并在维持夏孢子活力方面有着一定作用 [ 44 ]。何付新等瞬时沉默PsPik1后，条锈菌的潜育期显著延长，产孢量明显下降，生长发育过程受到严重抑制，证明了PiPik1基因很有可能是条锈菌的一个重要的致病基因 [ 44 ]。 3.5. 小麦条锈菌PsCdc2基因的转录表达分析 代西维等首次从小麦条锈菌中克隆得到了PsCdc2基因，并对其进行了序列分析 [ 50 ]。多序列比对显示，这类基因的蛋白质序列十分保守，其含有CDK蛋白的多个保守序列 [ 51 ]。包含激酶结构域中的一段保守序列“PSTAIRE”其在真菌中也十分保守 [ 52 ]。它的氨基酸一级结构检测显示该蛋白分子量与Cdc2类蛋白相一致 [ 53 ] [ 54 ]。并且进行了进化树分析显示PsCdc2与小麦秆锈菌Cdc2蛋白同源性最近。现阶段已经证实磷酸酶和激酶可能是真菌繁殖生长，信号传导侵入的相关形态的主要调控元件 [ 55 ]。Cdc2可以磷酸化特定的蛋白，推进细胞周期的运行，调控细胞周期 [ 53 ]。 代西维等对该基因进行了亲和非亲和的互作表达，从表达的趋势上推断这个基因可以调控条锈菌细胞的周期循环以及影响条绣菌的初生菌丝产生与生长和吸器母细胞的形成，断定PsCdc2基因是一个致病相关的基因 [ 50 ]。 3.6. 小麦条锈菌PsNCS1基因的克隆及转录表达特征 郭军等首次从小麦条锈菌中克隆得到了PsNCS1基因 [ 46 ]。然后对其进行了序列分析，得到此基因编码的蛋白质序列，该蛋白质序列十分保守并且含有EF-hand结构域和N末端豆蔻酰化，根据目前已研究出的结果，该蛋白质序列与已知真菌中的NCS-1蛋白相一致 [ 56 ]。运用荧光定量RT-PCR证实该基因参与了条绣菌夏孢子形成与芽管延伸的阶段。张洪等已研究证明条绣菌侵染前期，夏孢子与芽管前端的Ca 2+ 含量明显上升 [ 45 ]。这进一步说明了条锈菌夏孢子和芽管中Ca 2+ 浓度的升高促进了与PsNCS1的结合，进而诱导PsNCS1基因高量表达。 3.7. 小麦条锈菌钙调素依赖蛋白激酶基因PsCamk的功能 秦娟等首次从小麦条锈菌中克隆得到了编码蛋白为CaMK类家族的CaMK基因 [ 57 ]。先现已有研究证明CaMK调控细胞功能是通过作为钙信号途径下游关键的蛋白，影响经过途径中关键酶与转录因子的表达。相比较CaMK在动植物中的研究，在病原真菌中研究的较少，在哺乳动物中起到重要的作用 [ 58 ]。现已发现两个编码CaMK的基因(cmk1、cmk2)于酿酒酵母中 [ 59 ]，并对酵母的生长有着关键的作用 [ 60 ] [ 61 ]。另外在栗酒裂殖酵母 [ 62 ] 和构巢曲霉 [ 63 ] [ 64 ] 盘长孢状刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides) [ 65 ] 中都发现获得了CaMK基因。 秦娟等通过对PsCaMK基因进行表达谱分析得出PsCamk在小麦条锈菌初期孢子萌发和芽管形成的过程中起作用 [ 57 ]，当用KN-93处理后，小麦条锈菌夏孢子萌发明显被抑制，原因可能为KN-93抑制了CaMK和CaM的结合致使Ca 2+ 信号通路的中断 [ 66 ]。 3.8. 小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能分析 病菌侵染寄主的关键步骤是要穿透宿主细胞壁，研究表明在病原菌侵染寄主植物时，会分泌降解植物细胞壁的降解酶类，主要为果胶酶，目前为止，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶研究的较为广泛 [ 67 ]。大量试验表明，病原菌可通过果胶水解酶和裂解酶分解寄主植物的细胞壁 [ 68 ] ｡已有研究证实，蔓枯病菌(Didymella bryoniae)以及灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等在侵染植物时会产生果胶酶分解寄主的组织，使寄主植物腐烂 [ 69 ] [ 70 ]。在Wattad等 [ 71 ] ｡对炭疽菌(Colletotrichum magna)和Ke等 [ 72 ] 对苹果腐烂菌和的研究中，也证明果胶酶在病菌侵染植物时有着关键性的作用。 李曼等通过RACE技术获得了条锈菌果胶酶PsPL1基因 [ 73 ]，其编码的蛋白序列与秆锈菌和叶锈菌的果胶酶蛋白高度同源。根据果胶酶在病原菌侵染植物中起到的关键性作用，认为PsPL1基因可能是小麦赤霉病的毒性基因之一。 3.9. 小麦条锈菌效应蛋白基因PSTG_23616的表达特征分析 宋平等获得了锈菌特异的效应蛋白PSTG_23616，该基因没有在在锈菌以外的真菌中发现同源基因 [ 74 ]。RXLR类效应蛋白和CRN类效应蛋白在卵菌效应蛋白中有着关键性的作用 [ 75 ]，宋平等发现PSTG_23616基因是定位在胞内的并且可以对BAX诱导的坏死反应产生抑制效果，认为PSTG_23616是一种胞内效应蛋白。 在接种条绣菌后6~18 h，PSTG_23616基因出现上调表达，Bhairi等从菜豆锈菌中得到了UaINF24基因，因为该基因在菜豆锈菌附着胞开始分化的时期内表达，则认定UaINF24基因参与病菌的附着胞形成 [ 76 ] [ 77 ]。据此推断PSTG_23616基因在条绣菌前期侵染过程起到作用，而效应蛋白的分泌主要场所是吸器 [ 25 ]，推测出PSTG_23616基因是在吸器形成得阶段分泌发挥作用，并能抑制BAX诱导的与HR反应类似的PCD反应 [ 78 ]。综上推断出PSTG_23616在小麦条绣菌侵染初期起到关键的毒性作用，PSTG_23616基因为条绣菌的毒性基因之一。 3.10. 小麦条锈菌一个产孢相关基因PsCon1的表达特征分析 陈玥颖等首次克隆的得到了与产孢相关的基因PsCon1 [ 79 ]，该基因编码的蛋白具有两个保守结构域 [ 80 ]。con基因作为一类产孢相关基因，该基因编码的蛋白结构与前人研究得到的结果相一致 [ 80 ]，可推断出PsCon1蛋白是小麦条绣菌的一个功能蛋白。 通过实时荧光定量PCR显示，PsCon1基因在接种条绣菌后6 h和24 h时的表达量相对较高。根据Wang等 [ 81 ] 与康振生等 [ 82 ] [ 83 ] 关于条绣菌侵染过程的研究，推测出PsCon1基因调控影响条绣菌前期吸器和芽管的生成生长，以及对条绣菌生长后期夏孢子的产生起到关键性的作用。综上PsCon1基因是与小麦条锈病致病相关的毒性基因。 3.11. 小麦条锈病菌MAPK基因的功能以及致病机理研究 在真核生物中MAPK级联途径的存在十分广泛且保守性高，朱晓果等首次根据玉米瘤黑粉已研究的成果，在小麦中搜索得到了7个MPAK级联途径激酶基因，包括PsUBC2、PsKPP4、PsFUZ7、PsKPP2、PsKPP6和PsCRK1、PsPRF1 [ 84 ]。 对玉米瘤黑粉的研究中，Kpp2和Kpp6在功能上存在一定的重叠 [ 85 ] [ 86 ] [ 87 ]，并且已有研究表明MAPK信号途径在真菌中的功能也有部分重叠 [ 88 ] [ 89 ] [ 90 ]。试验发现除PsKPP2外，其余6个MAPK信号通路相关基因在前期互作过程中的表达量均有所上升，这些结果说明了这6个MAPK相关基因可能在条绣菌侵染前期的定殖和菌丝蔓延过程中发挥着关键的作用。据此推断出在小麦条锈菌中，PsKPP6与PsKPP2也可能存在着功能冗余，且PsKPP2可能在某种条件下诱导表达。 3.11.1. 小麦条锈菌MAPK基因PsAMPK1的功能分析 大量研究显示，促分裂素原活化蛋白激酶(MPAK)在植物病原菌的侵染过程中具有着关键的作用｡郭军等克隆获得了一个小麦条锈菌的MAPK基因，命名为PsAMPK1 [ 91 ] ｡试验证明，PsAMPK1不仅能部分恢复小麦赤霉病菌mapl突变体的营养生长和致病性，同时也能部分恢复稻瘟pmkl突变体的附着胞形成和病菌侵染｡实时定量分析表明PsAMPK1在病菌侵染初期呈上调表达，并在吸器形成阶段基因表达量达到最高｡所有研究结果表明，小麦赤霉病菌和稻瘟菌可作为研究小麦条锈菌保守基因的替代体系，同时PsAMPK1可能在调节条锈菌的侵染和生长过程中具有重要的作用 [ 91 ]。 3.11.2. 小麦条锈菌关键激酶基因PsKPP4及PsKPP6功能分析 朱晓果等 [ 84 ] 通过生物信息学分析及多序列比对，发现PsKPP4含有典型的磷酸化位点，与其他真菌中的同源物相似度较高。PsKPP4与酵母MST11和玉米瘤黑粉Kpp4相似，含有一个SAM (sterile alpha motif)结构域。在玉米瘤黑粉中，KPP4与UBC2在酵母双杂中的互作中需要通过各自的SAM结构域来完成 [ 92 ]；在稻瘟菌中，SAM结构域对于MST11在附着胞形成和植物感染中的调节功能至关重要 [ 93 ] 因此，SAM结构域作为蛋白互作的关键位点，可能在小麦条锈菌PsKPP4基因调控生长发育过程中也发挥着重要的作用。 MAPK信号通路中各类激酶的定位情况决定着它们功能能否正常的发挥，这也是其发挥调节功能的决定条件。前期的研究发现，在未刺激的细胞中，MAPK一般存在于细胞质中，并与不同的蛋白相互锚定 [ 94 ]。而MAPK受到信号刺激后可以转移进入核内，这个转移的过程需要MAPK的磷酸化。，结果显示PsKPP4定位于细胞质中，可能经过一系列信号传导，最终磷酸化下游MAPK，调控不同生理生化过程。 酵母双杂交实验验证了PsKPP4可以与上游的PsUBC2进行互作，两者可能在调控条锈生长发育过程中共同发挥作用。因此综上所述，MAPK级联通路中MAPKKK蛋白激酶PsKPP4和MAPKK蛋白激酶PsUBC2在小麦条锈菌的生长发育过程中可能发挥着重要的作用，为以后病害防治提供了潜在的靶标。 3.11.3. 小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析 朱晓果等 [ 84 ] 通过筛选在小麦条锈中发现了一个具有HMG-box的蛋白PsPRF1在植物和酵母中过表达可引起植物细胞坏死并且具有降解DNA的功能。可能PsPRF1在小麦条锈菌与植物互作过程中发挥着特异的功能。 ETs也在植物种有所报道，ETs可以在植物防御根尖感染的真菌过程中发挥重要作用 [ 95 ] [ 96 ]。不同细胞释放ETs的共同特点是可以捕获和杀死大多数微生物，它们是具有抗菌分子修饰的DNA骨架 [ 97 ] [ 98 ]。考虑到PsPRF1能够诱导植物细胞的坏死且能降解核酸。我们推测：一方面，PsPRF1可能参与到自身的细胞凋亡过程中去，另外一方面可能通过降解植物外源DNA物质的侵入，从而限制了植物对病原菌的抑制作用。但具体的机制还需要进一步的探索。 在小麦条锈菌侵染小麦过程中，PsPRF1在夏孢子萌发初期具有较高的转录水平我们推测PsPRF1可能在前期小麦条锈菌的侵染、定殖过程中发挥着重要的作用。根据原生质体定位实验结果显示，PsPRF1定位于细胞核中，可能其能够在细胞核里发挥功能。PsPRF1确实参与到小麦条锈菌的致病过程中。沉默PsPRF1后，可以降低小麦的产孢，尤其是前期菌丝的侵染蔓延受到抑制。 因此，PsPRF1可能在小麦条锈菌侵染定殖的过程中发挥着重要的作用，推测可能通过降解抑制小麦的一些DNA分子，来保证自身的侵染定殖成功。 3.11.4. 小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析 在玉米瘤黑粉中，FUZ7是细胞信号传递过程中关键的组分，并且参与到细胞内的一系列生理生化反应，包括菌丝交配和致病力。在稻瘟菌中，与FUZ7同源的Mst7参与到附着胞的形成及毒性作用中来。在本研究中，生物信息学分析及多序列比对结果显示，条锈菌PsFUZ7含有典型的磷酸化位点，且蛋白结构与其他真菌存在较高的相似性。由此，我们确定条锈菌MAPKK相关基因在真菌进化上存在一定程度的保守性。前期实验，我们发现PsFUZ7基因在条锈菌与小麦互作的过程中前期表达水平比较高，从芽管萌发(6 h)的时期持续上调表达到条锈菌成功定殖(18~24 h)及扩展(大约72 h)，推测它可能在小麦条锈菌整个侵染过程中发挥着重要的作用。 前期通过VIGS初步筛选功能基因过后，我们初步确定PsFUZ7可能在小麦条锈菌侵染过程中发挥着重要的作用。为了进一步明确其如何发挥作用的，我们对沉默PsFUZ7后的小麦条锈菌进行了细胞组织学观察。根据上述体内和体外实验来看，MAPKK基因在小麦条锈菌的分化和发育过程中发挥着重要的作用。其中，PsFUZ7的沉默可能导致小麦条锈菌信号传导受到很大程度的影响，从而影响了小麦条锈菌的生长发育。 综上，本章研究中我们克隆并鉴定了一个条锈菌MAPKK基因PsFUZ7，并证明抑制它的表达可以影响真菌的生长发育。说明它在条锈菌的生长发育和致病过程中发挥着重要作用，为后期构建小麦持续稳定抗锈病材料提供了候选基因资源。