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user: 2. 材料与方法 2.1. 材料与试剂 菌株：粒毛盘菌YM240由合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离。 葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯仿购自天津市博迪化工有限公司；可溶性淀粉、3，5-二硝基水杨酸、四水合酒石酸钾钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、聚乙烯醇、橄榄油、胰脂肪酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶、阿卡波糖购自国药集团化学试剂有限公司；α-葡萄糖苷酶、PNPG购自阿拉丁试剂公司；浓盐酸、浓硫酸、苯酚购自上海中成化学试剂有限公司；其他常规药品均为市售分析纯药品。 2.2. 仪器与设备 SW-CJ-ICU型超净工作台，上海博讯实业有限公司；250 D数显光照培养箱，江苏省正基仪器有限公司；TDL-50B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-85旋转蒸发仪，上海青浦沪西仪器厂；冷冻干燥机FD-1B-50，北京博医康实验仪器有限公司；分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；680 iMark 酶标仪；美国伯乐公司；100 L发酵罐，镇江东方生物工程设备公司。 2.3. 粒毛盘菌YM240发酵条件 2.3.1. 种子发酵液制备 发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L。配制1 L，分装于10个250 mL锥形瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃下灭菌30分钟。待冷却至室温，在超净工作台内将保藏良好的YM 240菌种接种于装有活化培养液的锥形瓶中，置于摇床内在25℃条件下活化4天，摇床转速为160 r/min。 2.3.2. 大罐发酵 配置70 L的发酵液，发酵液配方与种子发酵液一致，称取定量的葡萄糖，酵母膏，蛋白胨于5 L量杯中溶解待定。 使用100 L自控发酵罐进行发酵。首先将发酵罐清洗干净，然后倒入发酵液，加入蒸馏水至70 L，倒入10 mL左右色拉油(消泡剂)，于121℃高压灭菌30 min。灭菌结束后待发酵液冷却到30℃时，无菌条件下接种种子液。发酵条件设定为温度30℃、搅拌速度 180 r/min，发酵时间12天。 2.3.3. 生物量测定 于250 mL锥形瓶中接种一定量的粒毛盘菌，摇床培养。培养一定时期，将发酵液抽滤，菌丝体用蒸馏水清洗2~3次后于60℃干燥箱中烘干至恒重，称重换算为菌体干重，并记录不同发酵时间的生物量结果(生物量 = 菌体干重/发酵液体积)。 2.4. 粒毛盘菌YM240胞外多糖的提取纯化 2.4.1. LEP粗多糖分离 发酵结束后，将70 L发酵液抽滤后，滤液抽入旋转蒸发仪中，利用真空泵抽真空于50℃条件下浓缩，直至留下1 L左右的浓缩液。向发酵液浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇溶液，在4℃条件下醇沉12 h。然后在室温条件在4000 r/min离心10 min，取沉淀物，为LEP粗多糖 [ 7 ]。 2.4.2. LEP的初步纯化 1) 脱蛋白 由于粗多糖含有一定量的蛋白质，需要进行脱蛋白处理，本研究采用Sevage法脱蛋白 [ 8 ]。取多糖溶液加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿、正丁醇体积比5:1)，将混合物剧烈振摇20 min，静止20 min。用分液漏斗分液，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白，重复以上操作至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质时，最终将多糖液集中于干净烧杯。 2) 脱色 脱蛋白结束后，进行H 2 O 2 脱色处理 [ 9 ] ，向多糖溶解液中加入其体积10%的浓度30%的H 2 O 2 ，50℃保温脱色2天，期间每隔12小时加一次H 2 O 2 ，脱色最终得到淡黄色的溶液。 3) 多糖透析 将脱蛋白、脱色处理后的多糖水溶液置于透析袋(直径25 mm、截留分子量3500 Da)中，自来水逆向流动透析48 h，再用蒸馏水透析24 h。将透析后的多糖溶液倒入培养皿中分装，−80℃冷冻24 h，最后冷冻干燥即得粒毛盘菌YM240胞外多糖(LEP)。 2.5. 粒毛盘菌YM240胞外多糖的分级分离 过柱前对Sephadex G-100凝胶进行预处理 [ 10 ] ，使用玻璃层析柱(1.6 × 60 cm)，填充高度50 cm，蒸馏水平衡过夜，平衡流速0.5~1 mL/min，上样量为15 mg，用双蒸水洗脱，层析柱上端进液口链接恒流泵，每2.5分钟收集一管，每管2 mL。分别用蒸馏水，0.1 mol/L，0.3 mol/L，0.5 mol/L NaCl进行洗脱。用苯酚-硫酸法逐管追踪检测，于490 nm下测定吸光度，以管数对吸光度值绘制其洗脱曲线，分离得到组分较多的单一组分。 2.6. 苯酚-硫酸法测多糖含量 采用苯酚-硫酸法测多糖含量 [ 11 ] ，取1 mL LEP溶液、5 mL浓硫酸、1 mL 6%的苯酚于试管中混匀，静置10 min，在25℃水浴中保温20 min，490 nm处测吸光值。对照葡萄糖标准曲线，求得多糖含量。 2.7. 发酵过程中发酵液多糖含量的测定 取发酵第7~11天的锥形瓶内的发酵液利用苯酚-硫酸法测多糖含量。 2.8. LEP对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 参照相关文献并做一定的修改，检测LEP对α-葡萄糖苷酶的抑制活性 [ 12 ]。通过100 mM磷酸盐缓冲盐水(PBS， pH 5.0)制备不同浓度(0.1， 0.5， 1.0， 3.0， 5.0 mg/mL)样品溶液，α-葡萄糖苷酶(2 U/mL)和对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG， 1.5 mM)。将样品(10 μL)和α-葡萄糖苷酶(20 μL)的混合物在37℃下保持10 min。再加入20 μL的PNPG在37℃下温育20 min，最后加入200 μL Na 2 CO 3 (1 M)终止反应。不含样品的混合物作为对照，阿卡波糖(Acarbose)作为阳性对照，再做各自的空白实验。在400 nm读取吸光度，α-葡萄糖苷酶的抑制百分比按下式计算：抑制率(%) = [1 − (A 样品实验组 − A 样品空白组 )/(A 对照实验组 − A 对照空白组 )] × 100%。 2.9. LEP对α-淀粉酶的抑制作用 参照相关文献检测LEP对α-淀粉酶的抑制作用 [ 13 ]。在0.1 M PBS (pH6.9)中制备不同浓度(0.1， 0.5， 1.0， 3.0， 5.0 mg/mL)样品溶液、2 U/mL α-淀粉酶和1%可溶性淀粉。通过将10 mg/mL 3，5-二硝基水杨酸与120 mg/mL 酒石酸钠钾四水合物在0.4 M氢氧化钠中混合来制备定体积二硝基水杨酸(DNS)试剂。在500 μL样品中加入500 μL的α-淀粉酶，37℃下水浴10 min，随后加入500 μL的马铃薯淀粉，37℃下水浴10 min，加入1 mL DNS试剂终止反应，100℃保持5 min。冷却至室温后，用10 mL去离子水稀释混合物。没有样品的反应混合物作为对照，阿卡波糖作为阳性对照，再做各自的空白实验。在540 nm处测量吸光度，按下式计算α-淀粉酶的抑制百分比：抑制率(%) = [1 − (A 样品实验组 − A 样品空白组 )/(A 对照实验组 − A 对照空白组 )] × 100%。 2.10. LEP对脂肪酶抑制作用 脂肪酶抑制实验参照相关文献并做一定修改 [ 14 ]。取100 mL锥形瓶12个，每瓶加入5 mL 0.025 mol/L PBS和4 mL聚乙烯醇橄榄油乳化液，置于40℃水浴中保温5 min。实验过程如下：1) 在1个锥形瓶中各加人l mL脂肪酶溶液，从加入酶液开始计时，继续保温30 min；取出后立即各加入体积分数为95%的乙醇15 mL，以停止酶作用；再加入酚酞指示剂3滴，用0.05 mol/L氢氧化钠滴定至溶液呈粉红色为止，记录氢氧化钠消耗的量。另取1只锥形瓶设对照，不加入脂肪酶，按相同方法进行，再做各自的空白实验。2) 取5只锥形瓶，先加入多糖溶液1 mL，再加入l mL脂肪酶溶液，然后按(1)进行实验。另取5只锥形瓶设空白对照，不加入脂肪酶，按相同方法进行。 2.11. LEP胆酸盐结合能力实验(模拟肠道环境) 本研究通过检测LEP胆酸盐结合能力判断其降血脂活性，实验方法参照相关文献 [ 14 ]。首先利用甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠绘制胆酸盐标准曲线，然后在模拟肠道环境下检测LEP与胆酸盐结合能力，判断其体外降血脂活性。 1) 胆酸盐标准曲线的绘制 首先分别绘制胆酸盐标准曲线，取不同浓度的标准溶液(甘氨胆酸钠0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L，牛磺胆酸钠0.05、0.10、0.1 5、0.20、0.25、0.30 mmol/L) 2 mL于具塞试管中，加入6 mL质量分数60%的H 2 SO 4 。反应溶液于70℃水浴20 min，取出冰浴5 min，在387 nm波长处测定吸光度。以胆酸盐含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘得胆酸盐含量标准曲线，由标准曲线求得样液中胆酸盐的浓度。 2) 模拟肠道环境下LEP与胆酸盐结合实验 分别移取3 mL不同浓度的LEP多糖溶液于100 mL具塞锥形瓶中，加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶(用pH6.3的0.1 mol/L PBS配制)，1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，在37℃条件下恒温振荡消化1 h，模拟肠道环境；以0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.3，随后加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶(用pH6.3的0.1 mol/L PBS配制)，在37℃条件下，振荡速度为150 r/min，恒温振荡消化1 h，模拟肠道环境进行消化。每个样品中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨胆酸钠(用pH 6.3的0.1 mol/L PBS配制)、0.5 mmol/L牛磺胆酸钠(用pH6.3的0.1 mol/L PBS配制)，在37℃条件下恒温振荡l h后混合物转移至离心管中，4000 r/min离心20 min，取上清液，比色法测定甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠含量，每个样品平行3次。甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率按式(1)、(2)计算。 甘 氨 胆 酸 钠 结 合 率 ( % ) = ( C 1 − C 2 ) / C 1 × 100 (1) 式中：C1为甘氨胆酸钠加入量/μmol；C2为甘氨胆酸钠剩余量/μmol。 牛 磺 胆 酸 钠 结 合 率 ( C3 − C4 ) / C3 × 1 00 (2) 式中：C3为牛磺胆酸钠加入量/μmol；C4为牛磺胆酸钠剩余量/μmol。