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user: 3. OLK诊断流程与技术 3.1. 规范化诊断流程 目前在全球范围内被广泛使用的OLK临床诊断步骤主要包括四个层次 [ 2 ] [ 16 ]，第一层次指初次就诊时的临床印象诊断，一般即进行传统目视检查(conventional visual examination， COE)；第二层次指去除可能造成上皮角化的因素2~4周后，口腔黏膜上白色改变无改善，即可作临床观察诊断；第三层次指进行了切取活检，结合显微镜下的病理表现符合OLK的损害特征而确诊；第四层次则指进行了外科手术，切除所有临床可见损害并进行了组织病理学检查而作出的诊断；根据Warnakulasuriya等学者 [ 1 ] 流程图结合国内文献 [ 16 ] 等综合草拟的OLK临床四层式诊断思路如图1所示。这四层诊断逻辑层层递进，体现了OLK是一种具有排他性诊断特点的疾病。此外，学者们针对OLK特点，还提出了LSCP分期体系 [ 6 ] [ 7 ]。该体系分别从损害大小(L)及部位(S)、临床类型(C)和病理学特点(P)进行描述分期，分期越高，癌变危险性越大。无论哪一种诊断体系，由于一旦诊断为OLK，则必须明确其异常增生程度，因此OLK想要做到早期、无创和精细化诊断尚需要有一定的进展。 3.2. 无创化辅助技术 3.2.1. 生物染料染色法 当今口腔黏膜专科医生都致力于能够在临床上通过无创的手段对OLK的异常增生程度做一个预判，以辅助制定治疗方案。其中，在临床中比较简便易行的一个方法是生物染料染色法，具有代表性的为甲苯胺蓝染色法。甲苯胺蓝染色可使富含DNA及RNA的组织染色，对恶变组织有高度的敏感性和适中的特异性，且临床操作简便，易于推广。但是由于白斑表面存在角化，可能因缺乏细胞间小管孔而难以着色，故甲苯胺蓝对OLK的染色可能存在假阴性结果。有文献报道甲苯胺蓝染色法检测低–中度上皮异常增生的假阴性率可高达58% [ 17 ]，并且该染色法也存在着一定的假阳性率，同时椅旁操作需要耗费十几分钟时间，临床操作效率较低。 图1. 作者团队基于Warnakulasuriya等国内外学者的OLK临床四层式诊断流程模式图 3.2.2. 自体荧光成像检查 光学检查中的自体荧光成像检查已经具有较为成熟的装置，如VELscope已经通过FDA审批上市，应用于临床。VELscope利用了正常黏膜组织中存在着的被适当波长光源(400~460 nm)激发后会产生荧光的生物荧光基团表现出的自体荧光现象 [ 18 ]，通过区别病变组织中这些生物荧光基团被破坏而出现荧光缺失现象来无创性地判断口腔黏膜组织是否处于异常状态。 实际操作中，口腔内的正常组织在VELscope照射下呈淡绿色，恶变区域表现为荧光缺失。毫无疑问，VELscope能够提高不同状态下的黏膜组织的区分度，但同时存在缺乏量化诊断的指标，依赖使用者的判断，及存在漏诊、误诊的现象。Sawan等 [ 19 ] 通过了一项囊括748名临床病人的临床实验比较了VELscope检查结果和活检金标准结果，肯定了VELscope结果与活检病理结果具有较高的一致性，同时，他们认为使用VELscope可以帮助医生在手术中更好的确认切取或切除的范围。Ganga等 [ 20 ] 比较了200例病人的VELscope结果和病理结果，发现VELscope的敏感度为76%，特异度为66.29%，阳性预测率为24.36%，阴性预测率为95.08%。因此，他们认为较高的阴性预测率虽然限制了VELscope在诊断癌变组织上的效率，但是其阴性结果可以很好的缓解病人的焦虑情绪。同时，他们发现OLK和一部分OSCC在VELscope下表现为荧光增加，这也一定程度上阻碍了VELscope在OLK癌变早期诊断上的应用。Hanken [ 21 ] 对120名口腔黏膜可疑病变患者运用VELscope进行检查，发现其敏感性为22%，特异性为8.4%。我们可以发现不同学者运用VELscope检查的结果差异非常大，这也正体现了前述提到的该检测方法具有非常强烈的主观性，常需依赖使用者的判断。对于这个弊端，Huang等 [ 22 ] 计算出了一种可以用于量化口腔正常黏膜组织、OPMD和口腔癌的VELscope荧光图像的算法，并提出未来对不同区域的黏膜组织使用更多不同种类的光源，经过升级算法可以更准确的区别这三种黏膜的不同状态。现有研究对其在临床上是否能够有效率地辅助早期诊断口腔癌及OPMD仍待大样本检验和进一步优化设备技术。 另外一个具有良好发展前景的无创诊断方法是唾液学检查，也被称之为唾液活检 [ 23 ]。继基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)被广泛关注于血清和组织学检测之外，通过检测正常人、OPMD和OSCC患者唾液中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)的表达水平，Ghallab等发现OSCC组和OPMD组的MMP-9的水平均显著高于对照组 [ 23 ]，提示唾液MMP-9可以作为OPMD如OLK癌变的早期诊断标志。虽然临床应用最广泛的体液检测是血液，但唾液具有易获取、易保存和转运、采集无创等特点，正在被科学家们越来越多地选择研究。Wang等 [ 24 ] 发现，在头颈肿瘤患者的血浆和唾液中均可稳定检出肿瘤DNA即tDNA，但是唾液中tDNA检出率为100%，高于口腔癌患者血浆中tDNA即ctDNA检出率为80%，提示对于口腔癌患者，“唾液活检”可能优于常规的液体活检。 3.2.3. 脱落细胞学等分子层面新的检查技术 脱落细胞学检查作为一项传统技术，其技术敏感性和特异性在不断提高，临床中已有扩大范围的应用，比如宫颈脱落细胞学检查可以用于筛查宫颈癌。类似地，针对口腔黏膜也可以获取到脱落细胞，而对于OPMD病损区的脱落细胞学检查则有助于帮助口腔黏膜病医生判断该病损的状态，预测其发展和转归情况。近年来，也逐渐成为口腔癌早期筛查的推荐方法。 一般地，口腔黏膜病医生刮取拟检查部位的黏膜脱落细胞，病理科医生进行制片和读片，在显微镜下进行细胞形态学观察。但传统口腔脱落细胞学检查无法刮取到上皮全层的细胞，且仅用人工判断细胞形态随机性大、评价指标单一，所以容易出现假阳性和假阴性。现在，通过无创的细胞刷可以刷取到上皮全层细胞，并采取薄层液基细胞制片技术，能显著提高其敏感性 [ 25 ]。此外，除了人工在镜下评价细胞形态，现在还可以使用计算机全自动细胞图像分析系统评估脱落细胞，提高数据准确率 [ 26 ]。 在评价脱落细胞形态的基础上，有越来越多的指标可以帮助判断脱落细胞的状态。孙正等的研究 [ 27 ] 表明OLK病损区脱落细胞的微核率高低和组织病变程度存在关联，微核频率的高低反映组织DNA损伤程度，可以作为观察和预测OLK癌变可能的中间标志物。同样的，现阶段也可以直接对脱落细胞进行DNA定量分析。有研究 [ 28 ] 表明，DNA定量分析技术在检测口腔癌相关疾病具有较为优异的灵敏度和特异度，分别是95.65%和81.20%，在诊断异常增生时由于受到取材区黏膜状态的干扰容易出现假阳性。但由于其是采用计算机辅助的检测方式，诊断标准明确，故和其他方法联合应用可以用于OSCC及OPMDs的筛查。 除了光学检查、唾液标记物检查 [ 23 ] [ 29 ] 及脱落细胞学检查等，越来越多的OSCC和OPMD早期诊断标记物将被不断发现和深入研究。而随着分子理论与技术的不断深入和挖掘，近年来有更多用于监测OLK是否癌变的早期诊断方法问世。 从表观遗传学角度，我们可以通过解读DNA甲基化来分析环境因素与患癌概率之间的关系。研究 [ 30 ] 发现，OLK和OSCC存在多个甲基化改变的CpG位点，而OSCC比OLK拥有更多的发生改变的CpG位点。在OLK转变为OSCC的进程中，DNA低甲基化现象逐渐增多，异常甲基化可能是一个良好的早期诊断OSCC的标志物。从基因角度，有学者 [ 31 ] 发现，p53基因失活可导致口腔黏膜上皮向OSCC转变，且p53突变的主导作用在异常增生早期更加明显。因此，其可作为辅助检测OSCC早期筛查的基因标志物。从细胞与信号通路角度，Stasikowska-Kanicka等 [ 32 ] 发现从上皮异常增生逐渐转变为OSCC的过程中，CD163+细胞数量和PD-L1的免疫表达增加而CD8+细胞数量减少，认为进一步研究PD-1/PD-L1通路的发生机制将可以帮助临床医生通过检测CD8+、CD163+细胞的数量来预测口腔异常增生与恶变的可能性，形成逆转OPMD的监测指标。 这些新技术提供了一些全新的监测OLK进展的思路，联合运用传统方法将会进一步助力OSCC早期诊断和OPMD预测癌变的发展。