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user: 3. 结果与分析 3.1. 野生沙杵菇的分类鉴定 3.1.1. 生长环境和形态学描述 沙杵菇采集地位于鄂尔多斯市准格尔旗西北部的沙漠地，该菌株每年夏秋季，天气转凉的雨后出菇，生长地主要是长满蒿属植物的沙地。 沙杵菇子实体菌盖为圆柱形，高约10 cm，直径约4 cm，菌盖与菌褶表面为白色或浅灰色，较为光滑，颜色随成长逐渐加深，菌盖表皮开裂成鳞片状。菌柄为细长的白色光滑圆柱体，根部粗壮，长度约15 cm，直径约2 cm。菌肉呈白色，孢子呈黑色，椭圆形(见图1)。初步判断沙杵菇属于毛头鬼伞。 图1. 沙杵菇形态图 3.1.2. PCR扩增产物的检测与分析 用真菌ITS通用引物ITS4和ITS5对沙杵菇进行了PCR扩增获得了在500~750 bp之间的单一条带(见图2)。 图2. 沙杵菇ITS序列PCR结果。M：DL5000 Marker；1：沙杵菇PCR结果 3.1.3. ITS序列分析 PCR扩增产物经华大基因测序，得到633 bp的沙杵菇ITS序列(见图3)。经BLAST比对得到相似度较高的序列全部来源于鬼伞属的毛头鬼伞，最高相似度可达98%。为构建这株鬼伞属的系统发育树，从NCBI上下载其他10个相似度最高的毛头鬼伞序列(登录号为：JF907838.1、MN622775.1、EU326221.1、KX015766.1、FJ501551.1、EU520190.1、EU520139.1、JQ901433.1、KR733588.1、JQ901440.1)。 图3. 沙杵菇ITS区域碱基序列 3.1.4. ITS序列琼脂糖凝胶电泳检测 经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到以CTAB法提取的6份来自不同地区的毛头鬼伞基因组 DNA为模板PCR扩增的ITS序列均在750 bp左右，条带单一明亮，无拖尾(见图4)。 图4. 6个地区毛头鬼伞ITS序列PCR扩增结果。M：DL5000 Marker；1~6：分别为云南、江西、上海、福建、浙江、江苏毛头鬼伞ITS序列PCR结果 3.1.5. 测序结果和BLAST序列比对结果分析 将沙杵菇ITS序列与6份不同地区采集的毛头鬼伞ITS序列以及NCBI上相似度最高的10个毛头鬼伞ITS序列进行对比。沙杵菇ITS序列和6分不同地区采集的毛头鬼伞(Coprinu comatus)的ITS序列同源性高达100%，与NCBI上毛头鬼伞ITS序列同源性最低为97%。 3.1.6. 系统发育分析结果 NCBI上选取与沙杵菇ITS序列相似度最高的10株毛头鬼伞，以及从6个不同地区(浙江、江苏、云南、上海、福建、江西)采集的毛头鬼伞，使用MEGA-X软件，采用最大邻接(Neighbor-Joining method)法构建系统发育树(见图5)。由系统发育树可以看出，17份毛头鬼伞分为两大支。沙杵菇与来自江西、上海、江苏、福建、云南、浙江的毛头鬼伞聚为一支，其中与来自江西的毛头鬼伞亲缘关系最为接近，而数据库中相似性最高的10株被聚在另一支。 图5. 基于ITS序列构建的沙杵菇系统发育树 3.2. 沙杵菇呈味物质分析和鲜味评价 3.2.1. 游离氨基酸 沙杵菇样品中呈鲜氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和呈甜氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸)含量丰富，占游离氨基酸总量的41.44%，各组分浓度均大于味道阈值，说明呈味氨基酸对于沙杵菇的鲜美口感有较高贡献(见表1)。 Table 1 The contents of fresh and sweet amino acids in shachu mushroo 氨基酸种类 Types of amino acids 含量(g/100g干样品) Content (g/100g dry sample) 含量(g/100g鲜样品) Content (g/100g fresh sample) 天冬氨酸Aspartic acid 0.214 0.022 谷氨酸Glutamate 0.481 0.050 丙氨酸Alanine 0.537 0.056 甘氨酸Glycine 0.096 0.010 丝氨酸Serine 0.223 0.023 苏氨酸Threonine 0.401 0.042 总量Total 1.952 0.203 表1. 沙杵菇中呈鲜和呈甜氨基酸含量 注：鲜味(Asp + Glu)；甜味(Ser + Gly + Thr + Ala + Pro)；苦味(His + Ile + Leu + Phe + Arg + Met + Val)；无滋味(Cys + Lys + Tyr)。 3.2.2. 主要呈味核苷酸 沙杵菇中含有较为丰富的5’-腺苷酸和5’-鸟苷酸，未检出5’-肌苷酸，其中5’-鸟苷酸超过阈值对沙杵菇的呈鲜有一定贡献(见表2)。 Table 2 The content of 5’-nucleotide in shachu mushroo 5’-腺苷酸 5’-adenosine monophosphate 5’-鸟苷酸 5’-guanosine acid 5’-肌苷酸 5’-inosinic acid 1 0.135 mg/g 0.250 mg/g 未检出 2 0.134 mg/g 0.259 mg/g 未检出 阈值Threshold 0.5 mg/g 0.125 mg/g 0.5 mg/g 表2. 沙杵菇中5’-核苷酸的含量 3.2.3. 有机酸 沙杵菇鲜样和干样中有机酸含量丰富，乙酸与柠檬酸的含量显著，其次是苹果酸和丁二酸，酒石酸、抗坏血酸、富马酸在沙杵菇含量稍低(见表3)。 Table 3 The contents of various organic acids in the shachu mushroo 有机酸种类 Types of organic acids 含量(mg/100g干样品) Content (mg/100g dry sample) 含量(mg/100g鲜样品) Content (mg/100g fresh sample) 酒石酸Tartaric acid 1791.81 184.65 苹果酸Malic acid 4200.18 212.65 抗坏血酸Ascorbic acid 614.21 18.29 乙酸Acetic acid 15500.60 540.84 柠檬酸Citric acid 10824.87 740.64 富马酸Fumaric acid 34.88 26.05 丁二酸Succinic acid 4299.90 918.10 表3. 沙杵菇中各种有机酸的含量 3.2.4. 可溶性糖 经过检测，沙杵菇内可溶性糖的含量为4.5%。 3.2.5. 鲜味评价 经过计算得出，沙杵菇的EUC值为37.43 g MSG/100g。其含义为每1 g沙杵菇干粉所能产生的鲜味强度相当于0.3743 g味精所产生的鲜味。EUC值被分为4个水平：第一水平为 1000 g MSG/100g干重以上，第2水平为介于100~1000g MSG/100g干重，第3水平为介于10~100g MSG/100g干重，小于10 g MSG/100g属第4水平 [ 18 ]。可以看出沙杵菇属于第3水平。 3.2.6. 野生沙杵菇氨基酸营养价值评价 沙杵菇总氨基酸含量丰富，共检测到17种氨基酸(色氨酸未检测)，其中人体必需氨基酸7种，非必需氨基酸10种。必需氨基酸含量占总氨基酸含量的49.73%，总氨基酸含量有11.369 mg/100mg干样品(见表4)。参考FAO/WHO提出的理想模式，必需氨基酸含量在40%左右的蛋白质质量较优。沙杵菇蛋白质氨基酸属优质蛋白食材，是一种氨基酸含量丰富的营养食品。按照FAO/WHO的标准和全鸡蛋模式，沙杵菇的EAAI分别为139.17和105.69 (高于常见的松蘑：74.46、肉蘑：86.83、牛肝菌：70.97)，说明沙杵菇中必需氨基酸比例较适宜，容易被人体消化和利用。由AAS和CS可知，沙杵菇的第一限制氨基酸是赖氨酸，第二限制氨基酸是亮氨酸(见表5)。 Table 4 Total amino acid content of shachu mushroo 氨基酸种类 Types of amino acids 含量(g/100g干样品) Content (g/100g dry sample) 含量(g/100g鲜样品) Content (g/100g fresh sample) 天冬氨酸Aspartic acid 1.061 0.111 苏氨酸Threonine 0.597 0.063 丝氨酸Serine 0.500 0.052 谷氨酸Glutamate 1.507 0.158 甘氨酸Glycine 0.509 0.053 丙氨酸Alanine 0.906 0.095 胱氨酸Cystine 0.195 0.020 缬氨酸Valine 1.323 0.139 蛋氨酸Methionine 0.561 0.059 异亮氨酸Isoleucine 0.553 0.058 亮氨酸Leucine 0.850 0.089 酪氨酸Tyrosine 0.475 0.050 苯丙氨酸Phenylalanine 0.583 0.061 赖氨酸Lysine 0.530 0.056 组氨酸Histidine 0.176 0.018 精氨酸Arginine 0.509 0.053 脯氨酸Proline 0.534 0.056 总含量Total content 11.369 1.191 表4. 沙杵菇样品总氨基酸含量 Table 5 AAS， CS and EAAI of the shachu mushroo 氨基酸 Amino acids 沙杵菇 Shachu mushroom FAO/WHO模式 FAO/WHO model 全鸡蛋模式 Whole egg mode 氨基酸评分(AAS) Amino acid score (AAS) 化学评分(CS) Chemical score (CS) 异亮氨酸Isoleucine 49 40 52.4 1.23 0.94 亮氨酸Leucine 75 70 84.1 1.07 0.89 苏氨酸Threonine 53 40 53.9 1.33 0.98 缬氨酸Valine 116 50 57.6 2.32 2.01 蛋氨酸 + 胱氨酸 Methionine + Cystine 66 35 51.2 1.89 1.28 苯丙氨酸 + 酪氨酸 Phenylalanine + Tyrosine 93 60 95.5 1.55 0.97 赖氨酸Lysine 47 55 64.9 0.85 0.72 必需氨基酸指数(EAAI) Essential amino acid index (EAAI) 139.17 105.69 表5. 沙杵菇的AAS、CS、EAAI