DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 5. 适合农村规划的人口测算方法 5.1. 正确认识历史人口数据 历史人口数据仅能反映过去一段时间内人口变化的动态与趋势，适用于人口波动相对稳定的情况下，对于经济发展形势及国家政策走向不具备灵敏、机动的反应。在我国大力建设美丽乡村的时代背景下，人口的变化具有太多的不确定性，因此应彻底摒弃以历史人口数据为依据测算人口自然增长率，进而进行人口简单预测的方法，而是仅仅只将其视为可供参考的因素之一纳入综合考虑。 5.2. 严谨对待人口年龄结构 由于我国农村人口呈现出典型的年龄两级分化现象，即人口老龄化、低龄化严重，这一现象会导致人口死亡率、生育率等随时间分布的不确定性，从而对人口的自然增长率造成影响。因此在进行农村规划的人口测算时，必须严谨对待年龄结构这一因素。总体而言，在人口老龄化、低龄化问题突出的农村中，其预期的人口自然增长率应该相应降低，以符合实际的村情，从而使人口测算的结果更具真实性、准确性。 5.3. 科学分析区域发展动向 由传统城乡不平衡的二元经济结构所导致，大量的农村青壮年人口涌入城市务工，这是导致农村人口的频繁波动的最主要原因。而伴随着小城镇经济的快速发展及国家、地方政府对“三农”问题的持续扶助，令许多农村劳动力在家门便能找到合适的就业机会，也由此农村人口的大量回流。因此在进行农村人口测算时，必须充分关注区域范围内的建设、发展动向，科学分析区域在未来所能提供的就业机会，以便对于农村人口回流做出更为精准的预测。 5.4. 合理评价村庄产业布局 村庄的产业布局能够决定其对外来人口的吸引力，由此影响村庄的人口规模。因此，在进行农村人口测算时，应对科学分析各类上位规划进行，合理评价村庄的资源禀赋，在此基础上论证村庄未来产业布局的各种可能性，并由此进行就业人口、旅游人口等外来人口规模的测算。同时，良好的村庄产业布局也会导致农村人口回流，因此还必须针对这部分回流的人口进行准确地预测。 5.5. 综合运用多种测算方法 由于我国农村人口的不确定性较强，易受政策引导、经济发展等因素的影响，因此在进行农村人口测算时，切忌采取单一的测算方式。一般来说，我国农村人口的变化常由自然变动、机械变动以人口流动三方面组成，其中自然变动经由人口统计数据可测算得出，机械变动与流动人口可综合分析各级政策引导、区域发展动向、村庄产业布局等要素后得出。在具体的测算方法选择上，时间序列预测法、宋健人口预测模型、Leslie人口预测模型、Logistic人口预测模型均与农村人口变化大、基数小、规律性弱的特点所不符，而马尔萨斯(Malthus)模型、人工神经网络预测法、王广州系统仿真结构功能模型(CPPS)、系统动力学法由于操作过于复杂，在农村规划中不具备操作条件，因此，均不适用于农村规划中的人口测算。相较而言，人口自然增长法、灰色预测法、线性回归法这三种测算方式无论是在可行性还是在符合我国农村人口特点上，都具有极高的吻合度，适宜将之进行综合运用。
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user: 6. 结语 人口测算是规划领域中的核心问题。农村人口的规模决定了建设用地规模、配套基础设施等多项关键内容，因此科学、严谨地对农村人口规模进行测算是进行农村规划的必要前提。我国正处于城镇化进程高速发展时期，农村人口规模受政策引导、经济发展的影响非常大，有太多的波动性和不确定性，因此在进行人口测算时，应根据村庄的具体情况具体分析，综合考虑多方因素，运用多种测算方式进行对比，甄选出其中最科学、合理的数据。只有如此，才能以真正科学的方式开展整个农村规划工作。
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user: 摘 要 在计算恒星的引力势能以及形成时标的时候，如果采用均匀球模型，会产生较大误差，因为恒星的密度从中心到表面差异非常大。我们采用Eggleton’s恒星演化程序构建了6种不同金属丰度、30种不同质量的零龄主序恒星模型。Eggleton’s恒星演化程序把恒星分成199个均匀同心壳层。我们推导出了恒星每个壳层的引力势能的精确表达式，精确地算出了恒星的引力势能；进而算出了恒星的引力势能系数和形成时标。我们算出的恒星引力势能系数和形成时标与前人的数据是一致的，我们的计算结果与年轻星团的观测图景也是相符合的。 关键词 :恒星演化，零龄主序，引力势能，形成时标
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user: 1. 引言 恒星是由星云塌缩而形成的，在塌缩的过程中会释放引力势能。释放出的引力势能一半用来给原始恒星升温，一半向外辐射出去[ 1 ] 。原始恒星需要不断收缩，释放引力势能来弥补对外辐射的能量损失，原始恒星不断收缩，温度也就越来越高。当原始恒星的核心温度达到大约700万度时，氢聚变启动，原始恒星也就演化成了真正的恒星[ 2 ] ；恒星获得了稳定的能量来源，可以弥补对外的辐射损失；恒星停止收缩，进入主序演化阶段。 原始恒星在塌缩的过程中，一般先沿着Hayashi线演化，然后再沿着亨耶轨迹演化；原始恒星的光度有时大于其零龄主序恒星的光度，有时小于其零龄主序恒星的光度。如果近似认为原始恒星的光度和零龄主序恒星的光度相等，则原始恒星在收缩过程中释放的引力势能除以两倍的零龄主序光度，就是恒星的形成时标[ 1 ] [ 2 ] 。而原始恒星刚开始塌缩的时候，尺度比零龄主序星大很多，引力势能可以近似为零。所以求出零龄主序星的引力势能，也就求出了原始恒星在塌缩过程释放的引力势能，进而求出恒星的形成时标。而恒星的形成时标同时也是恒星的热弛豫时标。 恒星的形成时标是热时标，而恒星的演化寿命是核时标。对于相同恒星来说，热时标与核时标相比，时间很短。大多数球状星团都是年老的贫金属星团，在确定它们的演化年龄时，可以忽略恒星的形成时间。而对于特别年轻的星团来说，恒星的形成时标对于确定星团的年龄来说，意义重大。质量较大的恒星由于形成的快，已经演化到主序阶段；而质量较小的恒星由于形成的慢，尚未演化到主序阶段。认真查找年轻星团中质量最小的主序星，该主序星的形成时间就是星团年龄的下限，甚至可以近似认为是星团的年龄。所以，求出恒星的引力势能、形成时标，就可以限制甚至确定年轻星团的年龄。而精确的求出零龄主序星的引力势能，是求出恒星形成时标的基础。 恒星结构和演化历来是云南天文台的主要研究方向。黄润乾院士著的《恒星物理》，李焱首席研究员编著的《恒星结构演化引论》，不仅总结了自己多年的研究成果，还借鉴了其他团组的研究成果以及整个恒星演化领域的研究成果，都堪称经典。两本书在推导恒星引力势能的表达式时，都把恒星近似看成密度均匀的球体[ 1 ] [ 2 ] 。实际上恒星从中心到表面，密度变化非常大，均匀球近似显得太粗糙。《恒星物理》和《恒星结构演化引论》也注意到这一点，可能是由于篇幅的限制，并没有给出求恒星引力势能的详细具体的表达式。 不同的恒星演化程序，尽管具体编程和操作方法不同，但是基本原理都是相同的。那就是把恒星分成很多同心壳层，每个壳层内的温度、密度、化学丰度都是相同的。由于恒星密度从中心到表面相差很大，恒星半径也比较大；所以，恒星的每个壳层不能看成是无限薄球壳，而应该看成是厚壳层。精确地求出每个壳层的引力势能，然后求和，就可以精确地算出主序星的引力势能；进而可以比较精确地算出不同质量、不同金属丰度恒星的形成时标。
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user: 2. 恒星演化程序物理输入 我们用1995版的Eggleton’s恒星演化程序来计算恒星演化，获取恒星演化数据[ 3 ] -[ 8 ] 。对流超射系数采用0.12 [ 9 ] [ 10 ] ，初始氢丰度和金属丰度的关系为 [ 8 ] 。我们用OPAL高温不透明度表[ 11 ] [ 12 ] 和Wichita大学低温不透明度表[ 13 ] 构建了与Eggleton’s恒星演化程序相匹配的不透明度表[ 14 ] [ 15 ] 。金属元素混合模型，就是各种不同金属元素的相对比例，我们采用Grevesse and Sauval (1998)标准太阳模型[ 16 ] 。 本文中，我们计算了6种金属丰度的引力势能，金属丰度分别为：0.0001、0.001、0.004、0.01、0.02、0.04。恒星质量按照等对数间隔抽取， ，最小质量为 ，最大质量不超过 [ 2 ] ，总共有30种不同质量的恒星。Eggleton’s恒星演化程序将恒星分成199层，每个壳层内密度、温度、化学丰度等参量都相同。我们构建了每个恒星的零龄主序演化模型，零龄主序模型内包括每个壳层的质量、半径、光度、化学丰度。恒星的零龄主序演化模型是计算恒星引力势能、形成时标的基础。
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user: 3. 恒星引力势能公式推导 对于质量为 ，半径为 ，密度均匀的球体，设其密度为 ，必有： (1) 均匀球的引力势能为： (2) 恒星的密度从中心到表面变化太大，用均匀球模型计算引力势能会产生很大的误差。所以需要首先精确地计算每一个壳层的引力势能，然后再求和，算出恒星总的引力势能。第 个壳层的外半径是 ，半径为 的球壳内的总质量是 ；第 个壳层的外半径是 ，半径为 的球壳内的总质量是 。则第 个壳层的质量为 ，第 个壳层的外半径和内半径分别为 和 ；第 个壳层的密度为 ， 必然满足： ，整理可得： (3) 在第 个壳层内选取一个半径为 ，厚度为 的无限薄球壳， 必然满足： ，如图1所示。则半径为 的薄球壳之内的恒星总质量为： (4) 薄球壳本身的质量为： (5) 第 个壳层的引力势能为： 图1. 恒星壳层示意图 (6) 我们采用Eggleton’s恒星演化程序，恒星分为199层。第1层就是半径为 的密度均匀的球体，根据公式(2)可以求出第1层的引力势能；第2层至第199层的引力势能可以根据公式(6)求出；则恒星总的引力势能为： (7) 恒星的引力势能还可以写成 的形式，其中 为引力势能系数[ 1 ] 。恒星的质量和半径是最基本的恒星演化数据，可以由Eggleton’s恒星演化程序算出，恒星的引力势能可以由公式(7)求出，所以恒星引力势能系数ξ可以由下面的公式求出， (8)
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user: 5. 与前人工作对比 5.1. 恒星引力势能系数 《恒星物理》指出，恒星的引力势能系数可以近似认为是1.5 [ 1 ] 。而我们的计算表明，零龄主序恒星的引力势能系数介于0.8472至2.0726之间。对于太阳来说，零龄主序时，引力势能系数是1.4120；而太阳现在的引力势能系数是1.6110。我们的计算结果显然与《恒星物理》中的观点是一致的。 5.2. 恒星形成时标 《恒星结构演化引论》指出小质量恒星的形成时标比较长，可以长达几亿年甚至十亿年；而大质量恒星的形成时标很短，仅仅需要大约十万年，质量特别大的恒星的形成时标就更短了[ 2 ] 。我们的计算表明，对于金属丰度为0.02的恒星来说，质量为0.5012、0.2512、0.1259和 的小质量恒星，形成时标分别为2.046、2.980、5.478和9.878亿年。对于小质量恒星的形成时标，我们的计算结果显然与《恒星结构演化引论》的观点是一致的。 大质量恒星的定义有所不同，大质量恒星的质量下限也就有所差异。《恒星物理》定义大质量恒星为氦燃烧结束后形成的碳氧核电子是非简并的，质量下限大约是 [ 1 ] 。而大质量恒星也可以定义为恒星在赫氏空隙就启动氦燃烧，质量下限大约是 [ 17 ] 。我们的计算表明，金属丰度为0.02，质量为 的恒星的形成时标为12.95万年；质量为 的恒星的形成时标为7.843万年；质量更大的恒星形成时标更短，甚至只需要大约1万年。对于大质量恒星的形成时标，我们的计算结果显然与《恒星结构演化引论》的观点也是一致的。 5.3. R136年轻星团 为了庆祝哈勃望远镜升空25周年，今年3月份NASA公布了一系列精美的天文图片，中国各大网站也都争相转载。其中有一张是大麦哲伦星云中的R136年轻星团的照片，年龄大约是几百万年，可以看出星团中的恒星几乎都是蓝白色的亮星。一般来说，年轻星团都是金属富的，金属丰度可以近似看成是0.02。通过表3可以看出，金属丰度为0.02，质量为1.9953 的恒星的形成时标为478万年。因此可以近似认为，R136年轻星团中质量大于1.9953 的恒星已经形成，开始了正常的主序阶段演化；而质量小于1.9953 的恒星还处在主序前收缩阶段，中心氢聚变尚未启动。 而对于Eggleton’s恒星演化程序来说，1.9953 的恒星在氢燃烧结束后，氦核的电子刚好是非简并的；即质量为1.9953 的恒星就是中等质量恒星的质量下限[ 17 ] 。可以大致认为，R136年轻星团中的中等质量恒星和大质量恒星已经开始正常恒星演化；而小质量恒星还没有演化到零龄主序，还处在主序前演化阶段。 质量为1.9953 的恒星在零龄主序时的光度为15.68 ，有效温度为9053 K。根据维恩位移定律，可以求出峰值波长为320纳米，已经处在紫外波段；恒星看起来是蓝白色的。质量大于1.9953 的恒星会更亮、更蓝。所以，R136年轻星团中的恒星几乎全都是蓝白色的亮星。显然，我们的计算结果与R136年轻星团的观测照片也是一致的。
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user: 摘 要 目的：总结经治158例结石性胆囊炎胆囊切除术手术治疗术式选择评价及其疗效比较分析。方法：对2006年07月至2014年12月作者经治的158例结石性胆囊炎等病例采用开腹胆囊切除术(Operate Cholecystectomy， OC，以下简称OC)或经腹腔镜胆囊切除术(Laproscopic Cholecystectomy， LC，以下简称LC)等两种不同手术方法进行手术治疗，并对开腹胆囊切除术(OC)与经腹腔镜胆囊切除术(LC)两种不同术式选择进行评价，并对其不同手术治疗方式的疗效进行比较分析。结果：采用OC与LC两种手术术式治疗结石性胆囊炎其术式选择及其疗效各有其优缺点、适应症及其禁忌症。结论：治疗结石性胆囊炎，常规选择术式有两种，即开腹胆囊切除术(OC)术式和经腹腔镜胆囊切除术(LC)术式。开腹胆囊切除术(OC)术式，其优点：主要是对病程长、疑难复杂的慢性病例较适用；缺点：对病人手术损伤相对较大，病人术后恢复相对较慢，住院时间相对较长，病人一般情况下不选择其作为胆囊切除术的首选术式。经腹腔镜胆囊切除术(LC)，其优点：主要是对病程短、单纯性的急性病例较适用，且术中损伤小，术后恢复较快，住院时间相对较短，一般病人要求作为胆囊切除术的首选术式；缺点：主要是手术器械较复杂且价格较昂贵，手术费用高；对于那些病程长、疑难复杂的慢性病例不适用；手术直观性差，术者不能用手直接触摸探查病灶特点、性质。 关键词 :胆囊切除术，术式选择评价，疗效比较分析
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user: 1. 引言 胆囊切除术(Cholecystectomy)是目前国内外肝胆外科临床上手术治疗急性、慢性胆囊炎，胆囊结石等的主要手术方法，但在手术术式上可视受术患者的具体病情、手术适应症及其禁忌症不同却有其不同的选择。目前，国内外医学界临床上常采用开腹胆囊切除术(Operate Cholecystectomy， OC)或经腹腔镜胆囊切除术(Laproscopic Cholecystectomy， LC)等两种不同手术方法或术式对结石性胆囊炎等患者进行手术治疗。经腹腔镜胆囊切除术(Laproscopic Cholecystectomy， LC)，是1987年03月法国医生Philipe Mouret应患者要求成功完成的首例经腹腔镜胆囊切除术，患者术后恢复的顺利程度极大地引起了人们高度的兴趣和重视。此后，经腹腔镜胆囊切除术(LC)术式风靡全球。以上这两种术式的选择在具体病人病例特点、手术适应症、禁忌症等方面都有其独特的特点，而且采用OC与LC两种不同术式治疗结石性胆囊炎患者，其疗效比较也不尽相同[ 1 ] -[ 7 ] 。现对作者本人2006年11月至2010年03月经治的158例结石性胆囊炎患者采用OC与LC两种不同手术术式对患者进行手术治疗的术式选择及其疗效作以回顾性比较分析，与同行商榷，报告如下：
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user: 2. 临床资料 1) 一般资料 经治病例158例，其中，男性80例，女性78例，平均年龄37~75岁，平均56岁；急性胆囊炎79例，慢性胆囊炎79例；结石性胆囊炎150例，非结石性胆囊炎8例；病史5小时~20年不等，炎性发作超过48小时的123例，困难型慢性胆囊炎27例，胆囊管交汇变异的12例，胆囊动脉有变异的8例。 2) 其他资料 经治病例158例中，有过各种手术史的病例16例，其中，有肝胆外科手术史的病例6例，其他疾病手术史的病例10例；单纯性胆囊炎性(含结石性)疾病136例，合并其他疾病得得病例22例。 3) OC与LC手术术式选择及临床比较分析(表1)。
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user: 3. 方法 作者经过长期仔细的临床观察，且通过总结经治158例结石性胆囊炎胆囊切除术手术治疗术式选择评价及其疗效比较分析，发现在经治158例结石性胆囊炎胆囊切除术手术治疗术式选择评价上有其明显的特征，即4个不同：术式选择不同、手术指证不同、手术禁忌症不同、术后相关情况及具体处理不同；但在不同手术方式的疗效上却大致相同，即1个相同。 3.1. 术式选择不同 目前临床上常规采用两种不同的胆囊切除术，即开腹胆囊切除术(OC)与经腹腔镜胆囊切除术(LC)两种不同术式选择，虽然选择的胆囊切除术的术式尽管不尽相同，但要达到的胆囊切除的具体目的和结果却是基本相同的。以上这两种胆囊切除手术的手术方式不同： 1) 开腹胆囊切除术(OC)：目前临床上常规采用的开腹胆囊切除术(OC)有顺行法、逆行法、顺逆结合法3种手术方法，作者以顺行法胆囊切除术(OC)为例，简要介绍其手术主要方法及步骤为：1、选择切口及探查；2、显露术野；3、切开肝总管与胆总管前腹膜并钝性分离；4、仔细解剖胆囊三角，仔细谨慎辨认并初步处理胆囊管及胆囊动脉；5、自胆囊颈部向胆囊底部游离胆囊；6、再次仔细解剖胆囊三角，再次仔细谨慎确认并钳夹、双重结扎、切断胆囊管及胆囊动脉；7切除并移去胆囊(标本必要时可送病检)；8、仔细处理胆囊床并仔细止血；9、冲洗术野；10、必要时温氏孔处放置引流管；11、逐层缝合腹壁各层，关腹终术。 Table 1 The surgical methods selection and comparative analysis of the number of cases between OC and LC (cases 术式 急性胆囊炎 慢性胆囊炎 合计 % 开腹(OC) 21 58 79 50 腔镜(LC) 70 9 79 50 表1. OC与LC手术术式选择及例数比较分析(例) 注：以上OC与LC各选79例病例，两种术式对比例数均等，有利于比较，客观性更强 2) 经腹腔镜胆囊切除术(LC)：亦有顺行法、逆行法、顺逆结合法3种手术方法。 目前常采用4孔穿刺法或3孔穿刺法，亦以顺行法胆囊切除术(OC)为例，简要介绍其手术主要方法及步骤为：1、建立气腹；2、选择切口及戳卡；3、置入腹腔镜及清晰显露术野；4、置入穿刺套管和腹腔镜器械；5、探查病变；6、仔细游离胆囊三角；7、仔细谨慎辨认并处理胆囊管及胆囊动脉；8、沿胆囊床剥离胆囊；9、取出胆囊；10、处理胆囊床、仔细电凝止血；11、缝合腹壁切口，终术。 3.2. 手术指征不同 1) 开腹胆囊切除术(OC)： 1、初次发作的急性胆囊炎：包括化脓性、坏疽性、梗阻性胆囊炎。经积极及时非手术治疗疗效不佳，如胆囊逐渐进行性肿大，腹部阳性体征显著，胆囊局部触痛、肌紧张明显，全身情况不好，如体温升高，脉快，化验白细胞总数及中性粒细胞显著增高，应及时果断考虑尽快手术治疗，免致引起胆囊坏死或穿孔等严重并发症。2、慢性胆囊炎急性发作者：经全面检查可除外能引起类似症状的其他上腹部疾病。此种病例病程长，B超提示胆囊壁厚，周围粘连广泛，胆囊造影证实胆囊功能可能丧失，且易因胆汁滞留继发感染，或已并发胆道结石(多发或单发)，合并症多，并发症多，非手术治疗已难奏效，应及时手术治疗。3、有症状的胆囊结石。4、胆囊息肉(直径在1 cm以上者)或胆囊癌。5、胆漏。6、胆囊外伤性破裂。 2) 经腹腔镜胆囊切除术(LC)： 1、无症状的胆囊结石(结石直径 > 2 cm或多发性小结石)。2、无症状的胆囊结石，合并糖尿病、心脑血管病，在病情控制良好期。3、有症状的单纯性胆囊结石。4、有症状的非结石性胆囊炎。5、胆囊息肉样病变，直径 > 1 cm，特别是单发、宽基、短期迅速增大者。 3.3. 禁忌症不同 1) 开腹胆囊切除术(OC)： 1、不能用胆囊病变解释的右上腹慢性疼痛，B超和胆囊造影未发现胆囊异常。2、梗阻性黄疸原因未明确前不能盲目切除胆囊。3、严重重要脏器功能不全或其他严重内科疾病不能耐受胆囊切除者。 2) 经腹腔镜胆囊切除术(LC)： 1、疑为胆囊恶性病变者。2、心肝肺肾等重要脏器功能严重障碍者。3、出血性疾病有出血倾向或凝血功能障碍者。4、妊娠合并胆石症者。5、有中上腹部手术病史，有可疑腹腔内广泛粘连者。6、合并严重膈疝。7、Mirizzi综和症。8、合并胆肠漏。 3.4. 结果不同 (见结果部分)。
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user: 4. 结果 1) 开腹胆囊切除术(OC)与经腹腔镜胆囊切除术(LC)结果比较(见表2所示)： 2) 开腹胆囊切除术(OC)与经腹腔镜胆囊切除术(LC)优缺点比较(见表3所示)： 开腹胆囊切除术(OC)与经腹腔镜胆囊切除术(LC)两种手术方式各有其优缺点，我们在临床上对各个具体手术病例手术前选择手术方式时，视每个具体病例的不同病情特点来选择其合适的适合他们自己的手术方式，取长避短，从而取得了比较理想的手术治疗效果。
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user: 摘 要 目的：观察通淋逐瘀汤(简称通淋汤)配合静滴阿奇霉素及克林霉素治疗慢性前列腺炎(CPS)合并增生(BPH) (简称前列腺炎合并增生)的临床疗效观察研究。方法：将CPS合并BPH125例患者随机分为通淋逐瘀汤配合静滴阿奇霉素及克林霉素中西医结合治疗组(以下简称治疗组) 50例，单用前列康胶囊(浙江康恩贝制药股份有限公司生产)对照治疗35例(对照1组)和单用三金片(桂林三金药业股份有限公司生产)对照治疗40例(对照2组)，比较3组的临床疗效。结果：治疗组对CPS合并BPH的总有效率为92%，明显高于对照1组(83%)和对照2组(78%)，治疗组疗效分别优于对照1组和对照2组，均为P < 0.05。结论：通淋逐瘀汤配合静点阿奇霉素及克林霉素中西医结合治疗CPS合并BPH，能迅速改善CPS合并BPH患者的症状，其临床疗效、症状好转率优于单用前列康胶囊或单用三金片治疗CPS合并BPH。 关键词 :通淋逐瘀汤，前列腺炎合并增生，临床研究
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user: 1. 引言 慢性前列腺炎属于前列腺症候群的一种类型，有细菌性与非细菌性两种类型，是泌尿外科及男性科治疗非常棘手的一种常见病、多发病及疑难病，占泌尿外科门诊及住院部就诊患者的30%~60%，甚至更多。我院于2001年1月至2009年2月采用中药通淋逐瘀汤配合静滴阿奇霉素注射液及克林霉素注射液治疗CPS合并BPH病例125例，疗效满意。现报告如下，与同行商榷：
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user: 2. 资料与方法 2.1. 一般资料 2001年1月~2009年2月，选择本院泌尿外科及男性病科的门诊及病房具有CPS合并BPH临床表现并为慢性者，中医辩证属湿热瘀血证的患者125例作为观察病例，随机分为3组：通淋逐瘀汤配合静滴阿奇霉素注射液及克林霉素注射液中西医结合治疗组(治疗组)、单用前列康胶囊治疗对照1组(对照1组)、单用三金片治疗对照2组(对照2组)。治疗组50例，年龄(38 ± 12)岁，病程(5.5 ± 5.3)年。对照1组35例，年龄(40 ± 13)岁；病程(6.3 ± 6.0)年。对照2组40例，年龄(40 ± 11)岁；病程(5.8 ± 5.6)年。3组年龄、病程资料比较，经统计学处理差异无统计学意义，具有可比性。 2.2. 病例选择标准 2.2.1. 诊断标准 1) 参照美国国立卫生研究院慢性前列腺炎症状积分指数(NIH—CPSI)等诊断标准。 2) 对照中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》(精浊证诊疗标准)。 3) 中医分型按中华人民共和国卫生部《中药新药临床研究指导原则》。 4) 主要参照“成都会议”诊疗标准。诊断标准如下：临床表现，有不同程度的腰背酸痛，外生殖器、会阴部胀痛、隐痛、尿涩痛、尿频、尿滴白、遇劳症状加重或复发，或伴有性功能障碍，如勃起障碍、早泄、遗精等。肛门指检前列腺不同程度肿大、质软或韧，实验室检查示前列腺液常规镜检白细胞 > 10个/HP，卵磷脂小体数量减少。 2.2.2. 纳入病例标准 包括：① 符合中医隆闭、淋浊湿热瘀血证诊断标准 [ 1 ] ；② 符合西医前列腺炎慢性期合并增生诊断标准 [ 2 ] ；③ 病情程度属轻、中度者；④ 发作期病程在3 d以上者；⑤ 年龄20~80岁，无合并其它疾病，无进行其它药物治疗并自愿接受临床治疗观察者。 2.2.3. 排除病例标准 包括：① 除外其它疾病所引起的尿频、尿急、尿痛、会阴部胀痛、尿不尽等 [ 3 ] 。② CPS合并BPH属重度或急重者。③ 合并其它疾病、正在接受其他药物治疗者。 2.3. 治疗方法 治疗组用通淋逐瘀汤：地龙 20 克 ，金银花 15 克 ，蒲公英 15 克 ，黄芪 30 克 ，连翘 15 克 ，扁蓄 15 克 ，瞿麦 10 克 ，荔枝核 20 克 ，桔核 20 克 ，泽泻 15 克 ，巴戟天 20 克 ，淫羊藿 20 克 ，山茱萸 30 克 ，穿山甲 10 克 ，甘草 10 克 等。杀菌排毒，清热利湿，活血化瘀，扶正祛邪。每日1剂，文火加1000~1500毫升水煎，日分2次服。 配合两组静滴：第一组：5%葡萄糖注射液或0.9%的生理盐水250~500毫升中加入阿奇霉素注射液 0.5 克 静脉点滴，每分钟15~20滴左右。第二组：5%葡萄糖注射液或0.9%生理盐水250~500毫升加入克林霉素注射液 0.9 克 静脉点滴，滴速每分钟15~20滴左右，7天为一疗程，3周为一个治疗周期。 2.4. 治疗观察指标 显效、有效、无效和总有效率。 2.4.1. 显效或治愈 自觉症状消失，前列腺指诊恢复正常或改善；前列腺液镜检，连续三次正常；分段尿及前列腺细菌定位检查中VB3、EPS细菌培养阴性 [ 4 ] ； 2.4.2. 有效 症状及前列腺质地改善；前列腺液镜检白细胞数正常；VB3、EPS未转阴。 2.4.3. 无效 症状及前列腺指诊质地无改善，前列腺液镜检无改善；VB3、EPS细菌培养仍阳性。 2.5. 安全检验指标 血常规、血小板、尿常规、大便常规加隐血、尿道分泌物病原体检测、肝功。 2.6. 统计学方法 统计处理采用SPSSl0.0 for windows 2003统计软包对数据进行统计处理，计量资料用x ± S表示，以P < 0.05表示差异有显著意义 [ 5 ] 。 2.7. 中医证侯疗效：分4级 临床控制：治疗后证侯疗效率 ≥ 95%；显效：95%治疗后证侯疗效率 ≥ 70%；有效：75% > 治疗后证侯疗效率 ≥ 30%；无效：治疗后证侯疗效率 < 30%。证侯疗效率 = (治疗前总积分 − 治疗后总积分) ÷ 治疗前总积分 × 100%。
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user: 3. 结果 3.1. 3组临床疗效比较，详见表1 3组总有效率比较，治疗组分别与对照1组和对照2组比较，差异均有统计学意义差异(均为P < 0.05)。对照1组与对照2组比较，差异无统计学意义(P < 0.05)。 3.2. 3组证侯疗效率分析，详见表2 3组证侯疗效率比较，治疗组分别与对照l组和对照2组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。对照1组与对照2组比较，差异无统计学意义(P < 0.05)。 3组证侯积分比较，详见表3，结果表明，3组治疗后证侯积分较治疗前降低(P < 0.01或P < 0.05)；组间比较，治疗组降低的程度优于对照1组和对照2组(均为P < 0.05)，对照1组和对照2组比较则无统计学意义差异(P > 0.05)。
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user: 4. 讨论 慢性前列腺炎(CPS)及前列腺增生症(BPH)是一种泌尿外科和男性科疾病的临床常见类型，它是由各种致病因素引起的以前列腺炎症性反应为主的一种疾病，属前列腺炎症侯群(Prostatitis Syndrome， PS)的一种常见临床类型。中国中医药学会男科学分会前列腺疾病专业委员会于 1998 年 5 月 20 日 在成都召开第三次会议，会上，讨论拟定了类前列腺类综合症(又称前列腺类症侯群)诊疗标准试行稿，CPS合并BPH不仅是男性科常见病，多发病，而且是泌尿外科及男性生殖病领域内最充满困惑的一组前列腺疾病，在全世界范围内目前呈迅速增加的趋势，发病率高，向年轻化发展，发病规律和发病特性不断改变，不但中年人多见，在我市以煤矿下井工人、铁路工人、打工族、新婚男性多见，CPS严重时腺体细胞因炎症扩散，不断代偿增长肥大，形成前列腺增生症(BPH)，影响性功能和生育能力，产生全身及局部症状，严重影响社会劳动者健康状况，使其劳动能力下降，在病原体感染中以革兰氏阴性杆菌及沙眼衣原体、解脲支原体感染多见 [ 6 ] 。中医属淋浊、N1~N2，为湿热下注于下焦，湿热瘀阻局部所致 [ 7 ] 。根据上述病机，我们用本法以中药治本，清热利湿，活血化瘀，利尿解毒，扶正祛邪；用西药阿奇霉素杀灭沙眼衣原体、解脲支原体，用克林霉素杀灭革兰氏阴性杆菌及泌尿生殖道各种常见细菌，以增强疗效，缩短疗程，节约治疗经费，解放劳动力，解放生产力[ 8 ] 。本观察结果表明，治疗组的总有效率为92%，分别与对照1 Table 1 Efficacy Analysis of two groups cases (% 组别 例数 临床控制 显效 有效 无效 显效率 总有效率 治疗组 对照1组 对照2组 50 35 40 20 8 8 1 10 10 10 11 13 4 6 9 72 51 45 92 83 78 表1. 2组疾病疗效分析例数(%) Table 2 The comparison of syndromes efficacy rate between 3 Groupscases (% 组别 例数 临床控制 显效 有效 无效 显效率 总有效率 治疗组 对照1组 对照2组 50 35 40 19 9 9 18 9 12 9 10 10 4 7 9 74 54 53 92 83 78 表2. 3组证侯疗效率比较例数(%) Table 3 The comparison of syndrome integral between 3 Groups (X ± S 组别 例数 治疗前 治疗后 治疗组 对照1组 对照2组 50 35 40 19.6 ± 1.8 19.3 ± 2.1 19.9 ± 2.0 4.7 ± 4.0 ※※ 8.2 ± 2.5 ※ 9.5 ± 3.3 ※ 表3. 3组证侯积分比较(X ± S) 组内治疗前后比较， ※※ P < 0.01， ※ P < 0.05；治疗组与对照1.2组比较P < 0.05 组(83%)及对照2组(78%)相比，疗效好，疗效比较差异，具有明显的统计学意义(P < 0.05)，具有广阔的推广意义和新药开发前景。
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user: 摘 要 基因编辑技术的飞速发展为基因功能研究工作提供了更多有力的工具。近十年来相继出现的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR)已经可以让研究人员很方便的对特定的目的基因进行突变、修复或替换等操作，从而为生物学研究及医学治疗领域带来革命性的变化。本文就有代表性的基因编辑技术的种类、原理及其研究进展进行了综述，并对它们各自的特点及应用前景和值得进一步研究的问题进行了探讨。 关键词 :基因编辑，方法，原理，应用
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user: 1. 引言 随着DNA测序技术的快速进步，越来越多的物种基因组序列成为已知，但鉴定这些基因的功能仍然是一项十分艰巨的任务。作为鉴定基因功能最重要的策略，获得其突变体是优先考虑的手段。然而，无论是依赖自发突变还是通过物理、化学手段如射线和化学诱变剂处理，或者利用转座子以及T-DAN插入，都只能被动的获得随机出现的基因突变体材料，并且基因出现突变的频率通常较低。因此，虽然过去运用这些手段对很多基因的功能鉴定提供了巨大的帮助，但它们目前已经难以满足日益扩大的基因功能研究的需求。令人鼓舞的是，近十年来基因编辑技术的出现为克服上述矛盾开辟了新的途径，特别是锌指核酸酶(ZFN)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及最近发展起来的规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR)技术，为基因编辑提供了前所未有的方便和快捷，吸引了全世界研究人员的广泛关注。 基因编辑就是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变 [ 1 ] - [ 3 ] 。与射线或化学诱变剂导致的DNA随机突变不同的是，基因编辑技术是定向改变基因的组成和结构，具有高效、可控和定向操作的特点。因此，基因编辑技术被麻省理工科技评论评为2014年十大突破性科学技术 (http://www.technologyreview.com/lists/technologies/2014/)，其中CRISPR还获得2015年度生命科学突破奖(https://breakthroughprize.org/News/21)。 虽然各种基因编辑技术的原理及作用方式并不相同，但它们的共同之处是基因编辑都建立在使目标基因DNA产生双链断裂(Double Strand Breaking， DSB)的基础上。因为DNA分子单链断裂或缺失后容易被细胞内的各种修复机制所修复而不产生任何改变 [ 4 ] ，但DNA双链断裂的结果则有很大的不同。细胞内DNA双链断裂的修复有两种方式，即同源重组修复(Homologous Recombination， HR)和非同源末端链接修复(Non-Homologous End Join， NHEJ) [ 5 ] [ 6 ] 。当DNA发生双链断裂后，如果细胞内存在与裂口两端同源的序列，则进行同源重组修复，外源DNA片段可借此插入断裂序列中对原来的基因进行敲除或将外源基因插入基因组DNA而形成所谓的基因敲入；若细胞内无同源序列存在，双链断裂的DNA分子则通过NHEJ连接，由于无模板可以利用，这种“硬”连接容易导致碱基的缺失、增加或改变而引起突变。实际上，无论是HR修复还是NHEJ修复，都可以产生较于原来基因的不同变化。虽然DNA双链断裂对基因组而言是严重的伤害[ 7 ] ，但这种变化正是研究基因功能所需要的。下面我们就基因编辑技术的种类及其特点分别进行简单的介绍。
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user: 2. 同源重组(Homologous Recombination， HR) 从使基因发生定向改变这个角度而言，早期的基因编辑技术可以追溯到同源重组这种方法。基于同源重组的基因编辑被称为基因打靶或基因靶向技术(gene targeting)，例如依赖大肠杆菌细胞内的Rec A或酵母的RAD54重组酶，基因靶向技术可以对目标基因或基因的部分序列进行替换、删除，或在细胞内存在同源序列的情况下插入外源DNA序列。运用同源重组对基因进行编辑的方法已经在微生物、植物和动物中取得了成功[ 2 ] 。不过，该方法的一个主要局限在于重组频率低，约为10 −4 ~10 −5 [ 2 ] 。虽然对微生物及培养的动物细胞系、甚至对一些苔藓植物如小立碗藓来说，同源重组技术可以获得满意的基因编辑效率，但对高等植物或动物，基于同源重组的基因靶向技术由于效率太低，在实践上难以广泛应用，尽管也有少数成功的例子[ 8 ] [ 9 ] 。据分析，高等动、植物中同源重组效率低下的原因可能在于这些细胞内同源重组酶的效率不高，因为有研究显示，转入外源的同源重组酶基因后，这些物种中的同源重组效率提高了一个数量级[ 8 ] [ 9 ] 。
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user: 3. 锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease， ZFN) 人工核酸酶ZFN可以算是第一种具有普遍适用性的基因编辑技术。我们知道，分子生物学中广泛使用的工具酶主要是II型限制性核酸内切酶，绝大多数情况下这些酶的切割位点位于其DNA识别序列之中。不过，IIS型的核酸内切酶(如Fok I)则不同，其识别序列和切割序列相距9个核苷酸，并且切割和识别功能分别由酶蛋白的不同结构域完成。人工核酸酶正是利用了IIS型核酸内切酶的这一特点，在保留它的非特异的酶切割功能结构域的基础上，将其DNA识别结构域用能够识别特定核苷酸序列的、人工合成的结构域取代，这样就构成了能够根据人们的需要而识别特定DNA序列并进行切割的人工核酸酶。 按此原理构建的锌指核酸酶ZFN就是由一系列锌指结构单元与Fok I的核酸酶切活性区域组合而成的(图1)，它具有对特定的DNA序列进行识别和切割的能力。ZFN对不同DNA序列识别的机理在于组成其锌指蛋白基元(Motif)的种类及排列方式。锌指结构是很早就发现的一类能与DNA分子相互作用的蛋白结构基元。在人类基因组中，约有3%蛋白含有这样的结构[ 10 ] 。锌指结构基元一般由30个左右的氨基酸组成，其结合锌离子的保守氨基酸为四个半胱氨酸残基(Cys-)或两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基(His-)。空间结构上，锌指结构从N端到C端由两个反向的β平行结构和一个α螺旋组成。α螺旋的1、3、6位氨基酸残基分别特异性的结合其识别DNA分子中三个连续的碱基[ 11 ] [ 12 ] ，亦即不同的锌指结构基元中其α螺旋的1、3、6位上氨基酸残基是不同的，因此，将不同的锌指结构单位(通常3~6个)组合起来就可以形成识别18~36 bp的一段双链DNA序列。所以，选择不同的锌指结构单位组合起来并且和Fok I连接，就构成了能针对特定的目标序列进行切割的人工核酸酶(图1)。不仅如此，Fok I需要形成二聚体才具有酶切活性[ 13 ] ，虽然Fok I自身二聚化也能产生对DNA的切割作用，但切割效率极低并且容易产生非特异切割，所以在设计ZFN时，还需要对Fok I进行突变，使之不能形成同源二聚体；并且研究显示，当两个结合不同靶序列的突变Fok I相距5~6 bp就可以形成异源二聚体而具有酶切功能，这样设计的另一个优点是可以增加ZFN识别的特异性[ 14 ] 。 ZFN这种基因编辑方法在一系列的模式生物中都获得了成功[ 15 ] ，研究显示ZFN基因编辑效率约为30%，相对于同源重组，其编辑效率无疑具有了质的提高。不过，目前它还存在一些不足，一个突出的问题是所谓的脱靶效应，即合成的核酸酶并没有对预先设定的目标DNA序列进行识别和切割。出现这种情况的原因在于组成人工核酸酶的各个锌指结构单元之间存在相互影响，即存在所谓上下文依赖(Context-dependant)，也就是说将不同锌指结构单位连接起来后，其DNA识别序列并不是它们单独存在时分别识别的核苷酸组序列的简单相加[ 16 ] [ 17 ] 。因此，这种脱靶效应很大程度上还是目前对锌指结构单 图1. ZFN核酸酶结构及其工作原理示意图。图中显示ZFN的组成以及目标DNA经锌指核酸酶切割后的两种不同的连接(修复)方式(参考文献[ 15 ] ) 元之间的相互影响缺乏足够了解造成的。由于受专利等因素的影响，不同的研究机构对他们研究出的结果并没有充分共享。相信随着以后对锌指结构单元之间相互影响的深入了解，ZFN脱靶问题可能会得到较好的解决。
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user: 4. 转录激活子样效应因子核酸酶TALEN (Transcription Activation Like Effector Nuclease) 在ZFN问世不久，另一种人工核酸酶TALEN也被开发出来。与ZFN一样，TALEN也是利用一种对DNA分子特异识别的蛋白结构与Fok I的酶切活性结构域组合形成的。与ZFN不同的是，TALEN利用的是黄杆菌(Xanthomonas)的转录因子激活样效应因子(Transcription Activation Like Effector)中DNA序列识别模块作为特异识别DNA序列的基础[ 18 ] 。TALEN识别模块一般由34个氨基酸组成(图2)，其组成的氨基酸除了第12和13位外其余都是保守的，因此第12/13位氨基酸被称为可变的双氨基酸残基RVD (Repeat Variable Di-residue)，正是这两个氨基酸决定了TALEN结合DNA上核苷酸的种类[ 19 ] -[ 21 ] 。实际上，组成DNA分子的四种不同碱基都有与之对应的TALEN识别模块(图2)，所以在构建TALEN人工核酸酶时原理相对简单，只需将表达不同的TALEN识别模块序列按目标序列的顺序连接起来，再与Fok I酶的编码序列融合即可完成。不过，由于目标序列的每个碱基都需要一个TALEN识别模块，所以整个构建过程工作量较大。目前，在拟南芥等多种生物中其基因编辑的作用已经得到验证[ 18 ] [ 22 ] 。 除了原理简单，TALEN的另一个优势在于，理论上说对任意的核苷酸序列，都能以它为靶标构建一个特异的TALEN核酸酶。在编辑效率方面，TALEN虽然也还没有达到理想的程度，但相对于ZFN还是有所提高[ 23 ] ，并且有更好的特异性，使其在医疗用途中更加安全，不过脱靶效应仍然存在。实际上所谓“脱靶”产生的影响并不只是降低了基因编辑的成功率，因为无论是ZFN还是TALEN，它们识别的目标基因的序列长度一般只有十几个碱基，而在整个基因组中，不可避免的有一些与目标序列相似的序列存在，所以，脱靶后更大的危害在于人工核酸酶对基因组中具有与靶序列相似的基因进行编辑，从而产生不可预测的后果。在医学治疗领域的基因编辑运用中，这种情况尤其需要避免。不过，最近的研究表明，通 图2. TALEN结构及组成示意图(https://www.addgene.org/talen/)。图中红色和紫色的椭圆形结构为TALEN的识别模块 过运用一套扩展的RVD有效的增强了TALEN的特异性及编辑效率，这种新的技术有望在生物及医学领域得到更广泛的应用 [ 24 ] 。 对于其构建复杂的问题，目前已有公司开发出商业化的试剂盒，特别是采用新的克隆技术如GOLDEN GATE CLONING [ 25 ] ，最快一天左右的时间就可以构建针对一个目标基因特定序列的TALEN核酸酶，不过这种技术使用成本仍然较高。
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user: 5. 规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins， CRISPR) 如果说ZFN和TALEN技术的出现使基因编辑研究获得了很大的成功，那么最近的CRISPR则让这一领域的发展产生了飞跃。CRISPR目前还没有较为统一的中文名称，这里我们将其译为“规律性间隔的短回文序列重复簇”。 实际上早在1987年，日本的研究人员就发现E. coli中存在一些29 bp的重复序列，这些重复序列被一些长度与重复序列类似(32 bp)的但彼此不同的间隔序列(spacer)分开，不过他们当时并不清楚这些序列存在的意义 [ 26 ] 。2002年，Jansen等 [ 27 ] 将这些间隔排列的重复序列命名为CRISPR。直到2007年，CRISPR和Cas核酸酶才被发现与细菌的适应性免疫有关，并且这种机制在细菌和古细菌中普遍存在 [ 28 ] 。随后的研究显示CRISPR-Cas系统的种类及组成成分较多，但一个来自产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、由Cas9蛋白组成的CRISPR系统由于其组成简单引起了研究人员的深入探索，该系统只有三个必须的组成部分，即tracrRNA，CrRNA和Cas9核酸酶 [ 6 ] 。 根据Jiang等 [ 29 ] 的研究，CRISPR/Cas9系统发挥作用的基本过程可分为三个阶段，即间隔序列获得期、CRISPR/Cas表达期和DNA干扰期(图3)。在间隔序列获得期病毒或质粒侵染细菌时，病毒或质粒DNA被宿主的核酸酶切割成短的DNA片段，符合条件的切割片段作为protospacers而被整合进宿主基因组的CRISPR基因座中成为新的spacer。CRISPR中已经存在的spacers则是以前外源DNA入侵时留下的“记录”。彼此不同的spacer被重复序列(repeat)隔开。在间隔序列和重复序列附近还存在编码Cas9核酸酶的区域以及转录生成traCrRNA的非编码区。 随后CRISPR/Cas9的表达期内，spacers和repeats序列一起被转录成长链的pre-CrRNA，同时tracrRNA和Cas9也被转录出来(图3)。当tracrRNA与pre-CrRNA中由repeat序列转录形成的区域互补结合形成双链RNA (guide RNA)后，引发双链RNA特异的RNaes III对pre-CrRNA进行剪切形成成熟的CrRNA，这个过程同时还需要Cas9的参与 [ 6 ] 。每个成熟的CrRNA中包含由spacer转录出来的长20 图3. CRISPR/Cas9组成及工作原理示意图(根据参考文献 [ 29 ] ，有修改) 个核苷酸的引导序列和由repeat转录形成的、与tracrRNA互补的区域，其中引导序列是能与入侵DNA互补结合的区域。 在DNA干扰期，CrRNA与tracrRNA结合后形成的guide RNA (gRNA)引导Cas9一起与入侵病毒或质粒DNA结合，导致Cas9核酸酶在入侵DNA核苷酸中PAM (核苷酸组成为5’-NGG-3’或5’-NAG-3’)5’端上游3个碱基处对入侵DNA进行双链切割产生断裂，从而破坏入侵DNA使细菌免受侵害 [ 6 ] [ 30 ] 。由于PAM的5’端与目标序列(即与引导序列互补的外源DNA区域)的3’端相连，所以切割实际上发生在引导序列结合的范围内。 在CRISPR/Cas9系统对入侵DNA序列的识别过程中，除了gRNA中的引导序列与靶DNA通过碱基配对识别以外，外源DNA序列上的PAM序列也发挥着至关重要的作用 [ 30 ] ，因为外源入侵DNA的PAM序列诱变后即可躲过CRISPR/Cas9系统的警戒而免受切割 [ 31 ] 。简单地说，PAM是CRISPR/Cas9系统识别“自己”或“异己”的策略，因为CRISPR/Cas9操纵子的DNA中虽有能与引导序列配对的spacer序列，但其邻近的repeat序列中无PAM序列，所以CRISPR/Cas9不会对其产生切割。 同时，详细的研究还显示，Cas9蛋白实际上包含与HNH和RuvC这两个内切酶同源的结构域，HNH结构域特异地切割靶DNA中与CrRNA互补的DNA链，RuvC酶类似的结构域则切割非互补链。诱变这两个区域中的任何一个都会导致Cas9与靶DNA结合后只能产生具有单链切割的环状而非双链断裂的线性DNA分子 [ 6 ] [ 32 ] 。不仅如此，Jinek等 [ 6 ] 还发现在引导序列与目标DNA互补结合过程中，远离PAM的一端能容忍一些碱基的错配，但这种情况可能导致脱靶效应的产生，Hsu等 [ 33 ] 报道在人类细胞系中运用CRISPR/Cas9的确有脱靶现象出现。 针对CRISPR/Cas 9系统这一问题，Ran等 [ 34 ] 对CRISPR/Cas9进行了深入的研究，他们发现，两个适当位移的不同gRNA (即两个不同gRNA与各自的目标序列结合后，它们之间的距离保持在一定范围以内)与Cas9n (突变Cas9的RuvC类似的结构域使之形成只有HNH酶活性的切割酶)一起能在靶DNA上产生双链切割的同时大大降低可能出现的脱靶效应，在培养的鼠受精卵中实验表明这种策略具有良好的应用潜力 [ 34 ] 。这种策略成功的原因可能在于用两个sgRNA的方式相当于将CRISPR/Cas9系统中特异识别序列的长度增加了一倍，因此其识别特异性大大增加。 在高等植物领域，运用CRISPR/Cas9对水稻中不同靶基因的研究表明，约一半的胚细胞中靶基因被该系统进行了编辑，并且在T0代就可以比较容易的获得纯合突变体植株。尤其重要的是其脱靶效应非常低，因此，CRISPR/Cas9是水稻研究的一个有效工具 [ 35 ] 。不仅如此，在高等动物中对灵长类动物进行CRISPR/Cas9基因编辑的研究也表明，通过对单细胞胚进行sgRNA和Cas9的mRNA共同注射，研究人员成功获得了同时对两个靶基因进行了修饰的食蟹猴，并且他们没有检测到脱靶现象的发生 [ 36 ] ，这个结果说明CRISPR技术在医学上有巨大的应用潜力。 此外，研究还发现将转录tracrRNA和CrRNA的DNA编码序列连接在一起，转录后形成一个人工设计的gRNA同样可以有效引导Cas9对靶基因进行编辑 [ 6 ] [ 32 ] 。因此，整个CRISPR/Cas9系统使用起来非常简单：只需要根据目标序列设计引物扩增spacer，再将其整合进含有tracRNA和Cas9表达盒的载体，就完成了基因编辑载体的准备工作。此外，为适应真核生物的细胞结构，一般在设计编辑载体时要在Cas蛋白编码序列一端或两端加上核定位信号。目前很多实验室已经构建了专门用于基因敲除的CRISPR/Cas9载体 [ 37 ] [ 38 ] 。
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user: 6. 结语 人工核酸酶ZFN和TALEN都是依靠蛋白质对核苷酸序列的识别，其切割的机制更是直接利用了天然存在的核酸酶的结构域，从原理上说，人工核酸酶和天然存在的限制性核酸内切酶并无本质区别，尤其是天然的II型核酸内切酶多数为同源二聚体结构，所以通常它识别和切割具有回文结构的序列，这一点与人工核酸酶采用的工作原理也有相似之处。那么，天然的限制性核酸内切酶对DNA的识别是否同样依靠锌指结构或TALEN等类似的机制？尽管目前还不清楚，但弄清楚这个问题可能会带来更多新的发现。 有趣的是，与十多年前发现并得到广泛应用的RNAi机制类似，CRISPR/Cas9也是利用短的双链RNA介导目标基因的沉默 [ 39 ] 。不同的是，RNAi是在转录水平干扰外源入侵基因的表达，而CRISPR/Cas9是破坏外源入侵生物DNA组成和结构从而导致外源基因被彻底破坏。尽管机制存在区别，但它们都是微生物防御体系的重要组成部分。由此可见，短的双链RNA在生物的防御体系中扮演着极其重要的角色 [ 29 ] 。然而，目前发现细菌中大约只有40%的种类存在CRISPR这种防御机制，因此研究具备和不具备CRISPR体系的细菌的防御策略有何不同也是一个值得深入关注的问题。 对比人工核酸酶和CRISPR/Cas9系统可以发现，CRISPR/Cas9的优势主要体现在两个方面：一是用于基因敲除的CRISPR载体构建极其简单，只需要根据推荐的序列合成spacer并将其整合进载体，就完成了基因编辑载体体外的操作过程；二是CRISPR/Cas9与DNA靶序列结合有更高的特异性 [ 40 ] ，原因是ZFN和TALEN对靶DNA的识别是依靠蛋白质与DNA的相互作用(实际上是组成蛋白质的氨基酸残基在空间结构上与DNA碱基侧链基团之间的相互作用)，其特异性相对较低；而CRISPR/Cas9系统对靶DNA序列的识别则是RNA和DNA按照碱基互补配对原则进行的，因此特异性更高。除此之外，相对于同源重组，CRISPR不仅有更高的效率，适应范围也更加广泛。目前的研究表明该技术适合从原核生物到高等动植物在内的所有生物类群，而且，对CRISPR的酶切基团进行诱变后可以对DNA进行单链切割以及可以同时进行多基因或单基因的多靶点编辑[ 34 ] 。 对生物学领域的研究者来说，CRISPR的优势在于它能非常方便的对感兴趣的基因进行编辑使之产生突变，从而极大的方便了阐明每个基因的功能。然而，医学领域的专家更关注运用该技术进行基因治疗的潜力。尽管目前还只是处于初始阶段，但可以预料，CRISPR将给生命科学和医学领域带来难以估量的重要影响。
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user: 摘 要 为把人从一些单调、重复性的劳动中解放出来，减少人类的重复繁琐的体力劳动。提出一种基于单片机控制的桂林米粉智能售卖系统，主要由软件和硬件主成。根据生产工艺的任务要求来确定被控制的系统需要完成的各项动作，通过控制电机的正反转实现机械手的左转、右转、上升、下降等动作，以及这些动作之间的联系和完成顺序。本设计拟采用C程序设计语言进行编程，控制电机运转，结合人工智能、传感器、模糊控制的思想，使机械手臂的动作控制更人性化。 关键词 :STM32，机械手臂，控制系统
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user: 1. 引言 工业机器人的技术水平和应用程度在一定程度上反映了一个国家工业自动化的水平。目前，工业机器人主要承担着焊接、喷涂、搬运以及堆垛等重复性并且劳动强度极大的工作，其工作方式一般采取示教再现的方式[ 1 ] 。
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user: 2. 总体方案设计 基于单片机的机械控制系统一般都要重新下载程序才能改变动作。这样的控制系统不利于不同客户多场合使用，本设计的特点是可现场编程、智能语音输入的控制方式。因此这个机械手臂控制系统更能适应复杂多变的环境。确定系统框图如下图1所示。
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user: 3. 机械设计 机械臂主要由底座支架、主轴承、上下轴承、米线开合器和搅拌器构成，分别由4个减速电机控制转向，其中两个电机分别是控制左右摆动和上下摆动，另外的两个电机是用来控制米线器的开合和米粉的搅拌。关节之间由齿轮轴承带动连接，设置了反馈形成闭环系统。本设计机械部分设计的模型结构如图2所示。
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user: 4. 电路设计方案 4.1. 控制核心单片机 STM32系列单片机是意法半导体(ST)公司生产的单片机，是ST公司利用ARM Cortex-M3内核专为要求高性能、低成本、低功耗的嵌入式应用而专门设计的。按性能分成两个不同的系列：STM32F103“增强型”系列和STM32F101“基本型”系列。两个系列都内置32 K到128 K的闪存，不同的是SRAM的最大容量和外设接口的组合。增强型系列时钟频率达到72 MHz，是同类产品中性能最高的产品；基本型时钟频率为36 MHz。时钟频率72 MHz时，从闪存执行代码，STM32功耗36 mA，是32位市场上功耗最低的产品，相当于0.5 mA/MHz。相对于MSP430等16位单片机的产品来说，价格相当，性能却翻倍了。就内部硬件资源而言，STM32F103ZET6含有512 K闪存程序存储器、64 K的SRAM、112个IO端口、11个定时器。物美价廉因此被广泛应用，网上相关资料多、支持库函数和寄存器开发，常见的KEIL4 MDK开发环境相对熟悉。 4.2. 机械关节电机 直流减速电机就是齿轮减速电机，其内部含有齿轮减速箱和一个普通的直流电机。在比较高的减速比下，减速电机具有很强的力矩，减速电机具有噪声小，容易控制，工耗低的特点。通过这种齿轮箱可以调节转速和力矩，因此，广泛应用于钢铁、机械等行业。由于步进电机转速很快的时候，容易丢步，造成系统定位不准，步进电机一般用于精确计算场合，其价格高，一个步进电机最少需要四个控制IO接口，程序控制复杂，运动较慢。减速直流电机是一个合适的选择。 4.3. 电机驱动方式 电机的驱动方式有多种，常见的有继电器驱动和L298N双H桥的电机专用驱动芯片。其中，继电器是一个单刀双掷开关，两个继电器和一些元件可以构成一个“H桥”，实现电机正反转。但是，继电器在工作时需要消耗部分的电流，本设计需要控制4个电机，故需要8个继电器，因此，造成静态和动态功耗也很大。不利于使用电池供电。另一方面，当继电器工作起来时，产生“滴答滴答”的响声，对周围环境造成极大的影响。L298N不一样，其可以用来驱动继电器、线圈、直流电动机和步进电机等感性负载。芯片中的H桥可以提供2安培的电流，供电电压范围从2.5伏到48伏，芯片内部逻辑部分采用5伏供电，可以接受5伏TTL电平。