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user: 3. 方法与结果 3.1. 菊花中绿原酸、木犀草苷、槲皮素HPLC-DAD测定条件 3.1.1. 样品提取方法 分别取0.25 g菊花样品：取样地点为河北的小黄菊、小白菊、大黄菊；取样地点为西藏的小黄菊(西藏温室)、小白菊、大黄菊、小黄菊(西藏露天)。精密称定，置于锥形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，密塞，称定重量，超声处理40 min后，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，分离上清液，后置于4℃冰箱。取0.5 mL样品液，过0.22 µm有机膜，后进样分析。 3.1.2. 对照品溶液的制备 分别称取1.00 mg的绿原酸、木犀草苷和槲皮素，置于1 mL的容量瓶中，用70%的甲醇稀释至刻度，配成1 mg/mL的标准储存液。分别吸取适量的上述标准储存溶液，置于同一容量瓶中，采用70%甲醇稀释至实验需求的浓度。 3.1.3. HPLC条件 采用Aglient SB C18 (250 mm × 4.6 mm， 5 μm)，以乙腈A-0.5%甲酸水溶液B为流动相；梯度洗脱条件：0~10 min，10%~20% A；10~25 min，20%~20% A；25~30 min，20%~36% A；30~40 min，36%~36% A；40~45 min，36%~40% A；45~50 min，40%~50% A；50~60 min，50%~90% A。柱温为25℃，体积流量为0.8 mL/min，进样量为5 µL，检测波长为348 nm [ 12 ] ；各茶用菊花样品绿原酸、木犀草苷、槲皮素的HPLC图见图1。 3.1.4. 标准曲线的建立 吸取一定体积的3种标准储备液，采用70%甲醇稀释至一定体积，配成不同浓度的混合标准液；按上述色谱条件进样分析，测定各化合物的峰面积，以各化合物浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程，见表1。 根据标准曲线，求得各标准品的回归方程为：绿原酸“y = 26.919x + 3.7684”，木犀草苷“y = 17.733x − 124.66”，槲皮素“y = 16.831x + 18.794，R 2 = 0.9997”，总黄酮“y = 0.005x − 0.0229”，回归系数和线性范围为：绿原酸“R 2 = 1.0000，0.05~50.00 μg/mL”，木犀草苷“R 2 = 0.9993，0.05~50.00 μg/mL”，槲皮素“R 2 = 0.9997，0.10~50.00 μg/mL”。结果表明，在各标准液的线性范围内化合物浓度与峰面积具有良好的线性关系。 图1. 混合标准对照品与样品HPLC图 Table 1 The results of three standard products HPLC about regression equation， linear range， detection limit and quantitative limit measuremen 化合物 出峰时间/min 回归方程 线性范围 (μg/mL) 相关系数 (R 2 ) 检出限 (µg/mL) 定量限 (µg/mL) 绿原酸 10.30 y = 26.919x + 3.7684 0.05~50.00 1.0000 0.010 0.033 木犀草苷 17.80 y = 17.733x − 124.66 0.05~50.00 0.9993 0.010 0.033 槲皮素 35.80 y = 16.831x + 18.794 0.10~50.00 0.9997 0.023 0.077 总黄酮 y = 0.005x − 0.0229 0.10~50.00 0.9945 0.013 0.067 表1. 3种标准品HPLC分析回归方程、线性范围及检测限、定量限测定结果 3.1.5. 三种有效成分的含量测定 供试品溶液制备方法制备样品溶液，采用上述色谱条件分别进样分析，获得3种化合物色谱峰面积，将测得结果带入表1 HPLC-DAD线性回归方程，计算菊花样品中三种化合物的含量，结果如表2。 由表2结果可知，西藏产的小白菊与河北产的小白菊之间绿原酸的含量具有显著性差异，小黄菊和大黄菊亦是呈现同样的结果；西藏地区的小白菊与河北产的小白菊之间木犀草苷的含量具有显著性的差异，西藏地区的小黄菊与河北地区的小黄菊之间木犀草苷的含量也具有显著性的差异，大黄菊也呈现同样的结果；西藏地区小白菊与河北地区小白菊之间槲皮素的含量具有显著性的差异，西藏地区的小黄菊与河北地区的小黄菊之间槲皮素的含量也具有显著性的差异，大黄菊也呈现同样的结果(p < 0.05)。 3.2. 总黄酮测定 3.2.1. 提取过程 取各类菊花样品0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，密塞，摇匀，超声处理10分钟，放置3小时以上，过滤。 3.2.2. 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含芦丁0.20 mg的溶液。 3.2.3. 标准曲线的建立 精密量取对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，使混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，用紫外–可见分光光度法，以500 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程，结果见表1。 3.2.4. 总黄酮含量的测定 精密量取滤液2 mL，置25 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试样品溶液。精密量取供试品溶液2 mL，置于25 mL量瓶中，照标准曲线的制备方法，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得总黄酮的含量(见表3)。 由表3可知，针对各茶用菊花总黄酮的含量，西藏地区植的小白菊的含量明显高于河北地区种植的小白菊，西藏地区种植的小黄菊和大黄菊总黄酮的含量也呈现高于河北地区的特点(p < 0.05)。 3.3. 统计分析 数据处理和统计分析采用SPSS22.0软件，结果以均值 ± 标准差( x ¯ ± s )表示。 Table 2 The determination of 3 active components in chrysanthemum samples (μg∙g−1， n = 10 样品名 绿原酸 木犀草苷 槲皮素 河北小黄菊 1290.069 1290.069 91.055 河北小白菊 812.276 812.276 144.190 河北大黄菊 585.573 739.097 86.608 西藏小黄菊(温室种植) 2100.673 1967.229 144.520 西藏小白菊 2073.958 1297.930 196.174 西藏大黄菊 2171.616 1282.469 156.882 西藏小黄菊(露天种植) 2418.569 2017.748 148.917 表2. 菊花样品中3种有效成分含量测定(μg∙g −1 ， n = 10) Table 3 The determination of total flavonoids in chrysanthemum samples (μg∙g−1， n = 10 样品名 总黄酮含量 河北小黄菊 7334.308 河北小白菊 7090.643 河北大黄菊 7456.140 西藏小黄菊(大棚种植) 7913.012 西藏小白菊 7517.057 西藏大黄菊 7577.973 西藏小黄菊(露天种植) 8765.838 表3. 菊花样品中总黄酮含量测定(μg∙g −1 ， n = 10)