DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 3. 模拟结果与分析 3.1. 合金力学性能的改变 图2给出5种Ni含量浓度梯度不同的Cu-Ni合金沿垂直于浓度梯度方向拉伸的应力应变曲线。如图所示，Ni含量沿Z轴梯度变化，合金沿垂直于梯度方向的力学性能，包括屈服强度、杨氏弹性模量和拉伸塑性变形能力都受到了一定的影响。这说明，可以通过调节Ni的浓度梯度来改善Cu-Ni合金材料的性能，从而得到强度更高塑性更好的合金材料。 Ni浓度梯度的改变对Cu-Ni合金沿垂直于梯度方向弹性杨氏模量的影响比较明显。如图3所示，随着Ni浓度梯度的增加，Cu-Ni合金的弹性杨氏模量呈现出逐渐增加的趋势。金属材料的弹性模量与材料自身的晶体特性密切相关，其值的大小直接反映了晶体中原子的结合力，原子排列致密度与原子直径和体积直接相关，原子排列的致密度越高，原子间的结合力愈强，材料的弹性模量愈大 [ 2 ] 。元素的致密度参数J与原子直径d和摩尔体积V呈反比，若不计晶体类型差异及价电子的影响，且配位数都取值为12 图1. Ni含量由0%变化到14%的纳米晶Cu-Ni合金模型及截面图 图2. Ni浓度梯度不同的Cu-Ni合金沿垂直于浓度梯度方向拉伸的应力–应变曲线 时，原子间距即为原子直径，则J = 1/(VD)。相关研究表明 [ 3 ] ，B和Fe元素的致密度参数大于Cu，在Cu中惨入微量B或Fe后，导致晶格收缩，使合金固溶体的弹性模量提高了。Ni的晶格常数比Cu要小，它的致密度参数也比Cu要大，因此Ni的惨入也会提高合金的弹性模量。Ni浓度梯度的增加会使合金中Ni的含量一起增加，因此Ni浓度梯度的增加会使Cu/Ni合金的杨氏弹性模量的增加。 Ni浓度梯度的改变不仅会对Cu-Ni合金的杨氏弹性模量产生影响，而且对合金的屈服强度及延展性有一定的影响。图4给出Ni浓度梯度不同的Cu-Ni合金强度和延展性变化趋势图。如图4(a)所示，随着Ni浓度梯度的增加，Cu-Ni合金的屈服强度先降低，然后逐渐增加。Ni浓度梯度较小时，Ni原子的引入造成的晶格畸变较小，晶体内部能量增加较小，所以具有较高的屈服应力。Peierls应力为位错运动克服点阵阻力所需的临界应力。1969年，Arsenault [ 4 ] 在Ta中惨入Nb元素，制备成Ta + 9at.%Nb合金，研究发现，当温度低于250 K时，该合金的屈服应力低于纯Ta，发生了固溶弱化。1972年，Pink等 [ 5 ] 在V 图3. Ni浓度梯度不同的Cu-Ni合金垂直于梯度方向杨氏弹性模量的变化趋势 图4. Ni浓度梯度不同的Cu-Ni合金垂直于梯度方向屈服强度和延展性的变化趋势 中惨入少了Ti元素，研究发现，当温度低于100 K时，也会出现固溶弱化现象。Peters等 [ 6 ] 在对Nb-Mo固溶体合金的研究中发现，当Mo含量很低时，合金的Peierls应力减小，导致合金软化，强度降低，但随着Mo含量的增加，合金的强度会呈现出递增的趋势。溶质原子含量较低时，其附近原子间键合力的减小会引起Peierls应力下降，在点缺陷附近发生双重扭结形核(double kink nucleation)导致位错运动增加 [ 7 ] ，因此会发生固溶弱化。本文中，当Cu-Ni合金中Ni浓度梯度较小时，材料会出现固溶弱化现象，其屈服强度会先降低。 两原子形成最强共价键上的共价电子对数 可表征原子间的相互作用， 值越大，原子间结合力越强，固溶体合金的强度则越高。合金中溶质原子含量变化，其相应的 值也会改变。文献 [ 8 ] 中定义了固溶强化系数S来描述合金的固溶强化效果，S为合金中相结构单元与基体最强共价键对数的统计值之比。李飞 [ 9 ] 等利用电子理论对Mg-Al合金的固溶强化进行了研究，在Mg基体中溶入Al原子将引起晶格畸变，导致固溶强化，Mg-Al合金的固溶强化系数为： (1) 研究表明，Al的质量分数为0%、2%、4%、6%、8%、10%时，Mg-Al合金相应的固溶强化系数是逐渐递增的。在本节中，当Cu-Ni合金中Ni浓度梯度大于一定值时，随着浓度梯度的继续增加，Cu-Ni合金的固溶强化系数S Cu-Ni 会随之增加，因此固溶体合金屈服强度会随之Ni浓度梯度的增加而增高。 如图4(b)所示，Ni浓度梯度较小时，Cu-Ni合金的延展性能最好，这是由于Ni浓度梯度较小时，各个区域的Ni含量较少，所造成的晶格畸变较少，产生的缺陷也相对较少，因此其表现出较好的延展性。随着Ni浓度梯度的增加，合金的延展性有较明显的降低，这是因为Ni浓度梯度逐渐增加，合金内部晶格畸变越来越严重，所产生的缺陷也越来越多，这严重的降低了合金的延展性能。而当Ni浓度梯度很大的时候，合金内部Ni的含量比Cu要高时，合金的延展性会有上升的趋势。 3.2. 微观结构演变 材料力学性能的改变与材料的微观结构变化有着密切的联系，因此对Ni浓度梯度不同的Cu-Ni合金在拉伸过程中微观结构变化的研究就非常有意义了。图5给出浓度梯度不同的纳米晶Cu-Ni合金沿垂直于梯度方向拉伸时，其微观结构演化图。通过观察Cu-Ni合金拉伸过程中微观结构的变化，来分析其对材料力学性能的的影响。 图5(a 2 )为应变达到7.8%时，纳米晶合金内部微观结构截面图，如图所示，在椭圆红框内，位错在晶界处塞积，在该晶界处造成应力集中，导致裂纹在此处产生。图5(a 3 )、图5(b 3 )为应变达到8.8%时，纳米晶合金内部微观结构截面图，图中红色圆框有孔洞产生，该处为三叉晶界，原子错排比较严重，往往容易造成应力集中，所以孔洞容易在此处产生。低浓度梯度时，晶界对位错运动的阻碍作用相对溶质原子要大，所以Ni浓度梯度增加时，合金的强度首先会下降。与低浓度梯度的纳米晶合金相同，随着应变的加载，孔洞首先出现在三叉晶界处，如图5(c 2 )、图5(d 2 )、图5(e 2 )所示，在椭圆红框内，同一晶界处产生了孔洞，这是因为该处原子错排严重，容易造成应力集中。应变的继续加载，材料内部会相继出现裂纹。然而值得注意的是裂纹出现的位置都是在Ni含量接近50%的区域，如图5(c 3 )、图5(d 3 )、图5(e 3 )所示，红色圆框内为裂纹出现的位置正是处于Ni含量接近50%的区域。Ni原子溶入纯铜中，因为晶格常数的不同会导致产生晶格畸变，在Baskaran等 [ 1 ] 的研究中，Ni含量的变化会使Cu-Ni合金的晶格常数发生改变，虽然两元素的晶格常数非常接近，但仍有2.7%的晶格失配率 [ 10 ] 。当Cu-Ni合金中Cu和Ni两组元的含量都比较高时，即都接近50%时，失配的原子团增加，导致该区域拉伸塑性变形能力降低，因此在Ni含量接近50%的区域更容易出现裂纹。如图5(e 3 )所示，当Ni含量沿Z轴由0%增加到70%时，浓度梯度很大时，裂纹不仅会在椭圆红框和红色圆框区域出现，同时还会在Cu含量较高的区域出现。纯 图5. Ni浓度梯度不同的Cu-Ni合金拉伸过程中的微观演化图 Ni的强度和延展性都比纯铜要高，对于Ni含量梯度变化的Cu/Ni合金而言，各个区域的力学性质都有差异，Ni含量较高的区域其强度及延展性要比Cu含量较高的区域要高，因此富Cu区域更容易出现裂纹。
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user: 4. 总结 本文利用分子动力学方法模拟了Ni含量梯度变化的Cu-Ni合金沿垂直于梯度方向的拉伸试验。结构表明，Cu-Ni合金的弹性杨氏模量随着Ni浓度梯度的增加而增大；屈服强度先降低，然后逐渐增加；延展性在Ni浓度梯度最小或最大时表现最好。屈服阶段过后，合金内部裂纹首先在三叉晶界处产生，然后出现在Ni含量接近50%的区域；当Ni浓度梯度非常大时，富Cu区域也较容易产生裂纹。
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user: 摘 要 活性炭是一种应用广泛的吸附材料，找寻来源广、处理简单的活性炭原材料也一直是人们关注的课题。以树叶为原料制备活性炭，在资源循环利用的同时希望得到高性能活性炭的制备方法。设计正交试验对活性炭的比表面积、微孔面积以及甲醇饱和吸附量进行分析，得到磷酸法制备树叶活性炭的最佳条件为：质量分数50%的磷酸与树叶浸渍比3:1条件下浸渍12小时，350℃活化1小时。表征结果显示，活性炭比表面积为774.4 m 2 /g，微孔面积148.2 m 2 /g，孔径结构以中孔为主；表面官能团以酸性官能团为主，占官能团总含量的95.3%，酸性官能团主要为醇羟基和酚羟基；等电点为5.33。 关键词 :活性炭，树叶，循环利用，表征
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user: 1. 引言 活性炭是一种高比表面积及孔隙结构丰富的优良吸附材料，具有石墨微晶结构[ 1 ] 、微孔结构发达、吸附能力强等显著特征，在制药、化工、制糖、食品加工、农业以及日常生活等领域均有广泛的应用。制备活性炭的原料多样，几乎所有含碳材料均可用来生产活性炭。传统活性炭的原料主要分为植物类和矿物类[ 2 ] 。最早期，人们制备活性炭主要材料是木材，但是木材生产周期长、价格贵，不能满足现代工业对活性炭的需求，而且砍伐树木破坏环境，造成全球森林覆盖面积减少，是导致全球变暖的原因之一。之后资源丰富、价格低廉的煤炭活性炭(如烟煤、无烟煤、褐煤等[ 3 ] -[ 5 ] )渐渐取代了木质活性炭(如木材、木屑、竹子等[ 6 ] -[ 8 ] )。但煤炭资源也终究有限，因此寻求新的来源广、性能好、价格低的活性炭原料一直是我们非常关注的一个课题。 近年来，我国城市绿化面积不断增长，然而伴随着绿化面积的增长，大量的落叶如何处理也成为了一个人们关注的问题。一般情况下，落叶被收集后采用堆放燃烧的方式处理，既浪费资源也会形成CO、二噁英等有毒有害的物质，同时还会产生烟尘，对大气造成严重的污染。 本研究以樟树叶作原材料为例，采用磷酸活化法制备活性炭，通过改变活化温度、磷酸浓度、浸渍比这三个条件，以及综合考虑比表面、微孔面积、甲苯饱和吸附浓度，得出最佳的树叶活性炭制备条件，以求在合理利用树叶资源的同时得到新的性能良好的活性炭，同时对新制得的活性炭的部分性能进行了表征。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 试验材料 拾取浙江工业大学校园内掉落的普通樟树叶，洗净烘干后用搅碎机搅碎(大小约为1 cm当量直径)储存备用。 2.2. 试验仪器 7890A-5975C气象色谱和质谱联用(GC-MS)，美国安捷伦公司；ZWC-100中流量大气采样器，杭州恒达工业自动化技术有限公司；ASAP-2020比表面仪，美国Micromeritics Instrument公司；HZ-9310K恒温摇床，江苏太仓华利达实验设备公司；YFX7100-CC马弗炉，上海意丰电阻炉有限公司；HJ-6A数显恒温磁力搅拌器，金坛市医疗仪器厂；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；pHS-3C酸度计，上海雷磁仪器厂。 2.3. 试验药品 分析纯：二硫化碳(CS 2 )、磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、硝酸、甲苯、无水硫酸钠。色谱纯：甲醇、丙酮。上述分析纯均购自阿拉丁，色谱纯均为TEDIA试剂。
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user: 3. 试验内容 3.1. 树叶活性炭的制备 按一定的浸渍比例(磷酸质量Mp：树叶质量My)将一定浓度的磷酸溶液与树叶碎片混合，常温下浸渍12个小时后取出，在108℃的烘箱内烘约3小时，后置于马弗炉内热解活化1小时。活性炭冷却后用蒸馏水清洗至中性，在105℃下烘干，研磨过60目的标准筛，即制得树叶活性炭产品，置于干燥器内储存。 3.2. 样品表征试验 3.2.1. 比表面积孔隙结构试验 活性炭的氮气吸附比表面积TSA测定：先将待测样品在105℃下真空脱气12小时，以确保活性炭孔结构清洁无覆盖，然后根据BET测试方法，在液氮温度为77 K时，用氮气作吸附质，通过ASAP-2020比表面仪测定。 3.2.2. Boehm滴定 [ 9 ] 试验 活性炭表面官能团的含量均采用薄膜滴定的方法测定。方法通过不同强度的酸或碱与活性炭表面不同的含氧基团反应，从而对活性炭表面官能团进行定性和定量分析。一般情况下认为碳酸氢钠能够中和羧基；碳酸钠则能中和羧基与内酯基；氧氧化钠能中和羧基、内酯基以及酚羟基；盐酸能够中和活性炭表面所有的碱性官能团。根据最终消耗酸或碱的量即可计算相应官能团的含量。具体操作方法如下： 准确称取0.5 g树叶活性炭样品置于100 ml具塞锥形瓶中，加入50 mL浓度为0.05 mol/L的HCL/ NaOH/ Na 2 CO 3 / NaHCO 3 溶液，然后将装有样品的锥形瓶放入恒温振荡器内振荡24 h，在室温条件静置分层，用中性滤纸过滤。之后用移液管精确量取滤液25 mL，用酚酞作指示剂，使用浓度为0.05 mol/L的NaOH/ HCL/ HCL/ HCL标准溶液来滴定过量的HCL/NaOH直至溶液出现微红色，通过消耗NaOH/ HCL/ HCL/ HCL溶液的体积计算活性炭表面所含碱性官能团/酸性官能团/羧基与内酯基/羧基的含量。 其中酚羟基的含量通过上述测得的酸性官能团的量减去羧基与内酯基的量计算得到；内酯基的含量 通过羧基与内酯基的量减去羧基的量计算得到。 3.2.3. 等电点滴定试验 在某一pH值下分散系中的ξ电位变成零，此时的pH值叫做等电点。因此，等电点可以用来表示活性炭的表面电荷，这种方法能够更好地研究溶液pH值对吸附剂的影响。本试验中采用批量平衡实验[ 10 ] 来测定树叶活性炭的等电点。测定方法如下：分别在11个100 mL的锥形瓶中配制50 mL、0.01 mol/L的NaCl溶液，用NaHCO 3 或HCL溶液将编号的NaCl溶液的pH依次调至2~12，然后分别加入0.15 g的树叶活性炭，在室温条件下将锥形瓶置于恒温振荡器内振荡2 h后静置24 h，用pH计测定溶液的pH并记录。最后以溶液原始pH值(pH 1 )为横坐标，反应后的pH值(pH 2 )为纵坐标作图。当pH 1 和pH 2 相等时，相应的pH 1 即为树叶活性炭的等电点。 3.3. 树叶活性炭的甲苯饱和吸附量试验 甲苯是现实生活中常见的污染物，挥发性强，对人们的生活造成一定的影响。因此本研究以甲苯饱和吸附量来探讨树叶活性炭的吸附性能。 选取大口内径为0.8 cm的滴管，在滴管小口端用少量清洁的玻璃棉堵塞，称取制得的活性炭0.2 g置于滴管内，用玻璃棉堵塞另一端。图1为树叶活性炭的甲苯饱和吸附能力试验装置图。锥形瓶中装有一定量的甲苯，抽气一定时间后停止抽气并更换活性炭采样管，采样管抽气时间分别为15 s、30 s、1 min、1.5 min、2 min、3 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min。采样结束后将活性炭转移至10ml玻璃离心管内，先加入1 g无水Na 2 SO 4 ，后加入2 mL CS 2 ，震荡一分钟后静置1小时使活性炭充分解吸。从混合液中取40 μL到10mL的容量瓶，稀释至刻度，摇匀后取20 μL至进样瓶，后加CS 2 至1 mL，用GC-MS对甲苯的浓度进行分析。
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user: 5. 结论 本研究以树叶为原材料，设计正交试验考查磷酸浓度、活化温度和浸渍比这三个方面对树叶活性炭的最佳制备方法进行了探讨，同时对在最优条件下制得的树叶活性炭的部分性质进行表征。具体结果如下： (a) 在试验范围内，树叶活性炭的最佳制备方法为：在质量分数50%的磷酸下将磷酸与树叶按浸渍比3:1混合后浸渍12小时，后以350℃活化1小时。 (b) 在最优条件下制得的树叶活性炭的比表面积为774.4 m 2 /g，微孔面积为148.2 m 2 /g，甲苯饱和吸附量为228.4 mg/g。 Table 5 The content of surface functional groups in the leaves activated carbo 总碱量mmol/g 总酸量mmol/g 羟基mmol/g 酚羟基mmol/g 羰基mmol/g 0.105 2.123 0.882 0.754 0.487 表5. 树叶活性炭表面基团含量表 图2. 树叶活性炭的等电点分析图 (c) 采用boehm滴定和等电点滴定两种方法对树叶活性炭的表面化学特性进行分析。结果表明，利用磷酸活化发制备的活性炭表面以酸性基团为主，且主要为醇羟基和酚羟基，等电点约为5.33。
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user: 摘 要 针对目前国内钻具生产车间噪声污染严重问题，采取在钻具管排架上增设降噪防碰机构，来降低钻具间的接触力和由此产生的噪声污染，从而改善工人的工作环境。研制的无动力防碰机构，依靠自身重力实现自动回弹和通过前一根钻具的重力实现对后一根钻具的阻挡，有效降低钻具碰撞产生的噪音强度。通过现场监测，降噪防碰钻具管排装置较常规钻具管排机由钻具碰撞产生的噪音低位端峰值下降30.6%，低位端平均值下降24.7%，高位端峰值下降31.1%，高位端平均值下降32.9%，降噪效果明显。同时，该机构结构简单、使用方便，具有很高的推广应用价值。 关键词 :防喷，降噪，钻具输送，分贝
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user: 1. 引言 在钻具生产车间，频繁运送钻具，80 dB以上高分贝噪声不绝于耳，工作人员长期置身于此种环境中，极易导致身体健康问题，如肾上腺素分泌增多、心跳加快、血压升高、烦躁易怒、甚至神经衰弱、耳聋、色觉、视野异常等[ 1 ] -[ 7 ] 。噪音危害已被世界公认为继空气污染之后的人类公共健康的第二个杀手[ 8 ] 。然而，在钻具生产车间，噪音随处可闻，尤其钻具间碰撞产生的噪声最为突出，降噪问题亟待解决。目前，国内外还未见专门针对钻具车间噪声问题提出有效解决方案的报道[ 9 ] -[ 11 ] 。 为此，本文拟查找钻具生产车间噪声主要来源，通过在钻具管排架上设计防碰机构，来降低钻具间接触力，使钻具生产车间主要噪声源的噪音强度降低或消弱，从而减小噪音对工人健康的伤害。
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user: 2. 钻具生产车间噪声来源 通过观察和检测整个钻具生产过程，发现钻具车间噪声主要来源有钻具碰撞噪声、修订焊缝残余飞边噪声、气缸排气噪声、摩擦焊机工作噪声及车床噪声等。 2.1. 钻具碰撞噪声 钻具碰撞噪声是钻具车间的主声源，检测数据如表1所示。这种噪音具有突发性和连续性特点，对人体产生很大伤害。 2.2. 修磨噪声 钻具焊接后会在焊缝处留有残余飞边，必须通过修磨清除，在修磨过程中砂轮与管体摩擦会产生巨大的噪声(表2)。此种噪声持续时间长。 2.3. 气缸排气湍流噪声 摩擦焊车间气缸使用多，动作频繁，气缸排气湍流引发强烈啸叫(表3)，属气体动力性非稳态噪声。此种噪声属于间息性，但间隔时间较短。 2.4. 摩擦焊机产生的噪声 摩擦焊机工作时管体和接头摩擦焊接时摩擦面产生的摩擦噪声(表4)。此种噪声也属于间息性，噪声值较高。 2.5. 管螺纹车床噪声 管螺纹车床运转时产生的噪声(表5)。此种噪声持续时间长，对人体某些器官伤害较大。
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user: 3. 降噪控制措施 3.1. 钻具碰撞缓冲降噪 通过在钻具架上增加缓冲装置，降低钻具滚动过程中的速度，减小冲击力，降低噪声，解决钻具在运送过程中自由滚动相互碰撞而发生的巨大噪声问题。 Table 1 Monitoring data of drill impact nois 测量点 组号 一组 二组 三组 平均 管排机高位端 峰值 102.3 110.3 113.4 108.67 平均值 85.1 88.6 83.4 85.70 管排机低位端 峰值 106.6 115.7 118.2 113.50 平均值 89.2 98.3 88.4 91.97 表1. 钻具碰撞噪声监测数据(单位：dB) Table 2 Monitoring data of drill grinding nois 测量点 一组 二组 三组 平均 外磨飞边旁 87.9 88.2 86.4 87.5 内磨飞边旁 90.6 89.3 91.7 90.53 表2. 钻具修磨噪声监测数据(单位：dB) Table 3 Monitoring data of cylinder exhaust turbulence nois 测量点 一组 二组 三组 平均 排气口旁 88.7 87.9 88.2 88.27 表3. 气缸排气湍流噪声监测数据(单位：dB) Table 4 Monitoring data of friction welding machine nois 测量点 一组 二组 三组 平均 焊机旁 83.5 84.1 83.6 83.73 表4. 摩擦焊机噪声监测数据(单位：dB) Table 5 Monitoring data of lathe nois 测量点 一组 二组 三组 平均 车床平头旁 83 82.7 83.1 82.93 表5. 车床噪声监测数据(单位：dB) 3.2. 空压机隔离降噪 通过建立独立的具有隔音效果的空压机房，减少空压机运转噪声对人体的危害。 3.3. 修磨隔离降噪、工人倒班 通过建立独立的具有隔音效果的修磨工序房，同时为工作人员配备良好的防噪工具，采用轮班制，减少、降低噪声。
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user: 4. 无动力降噪防碰钻具输送装置 钻具输送流水线设计原理是利用钻具趋低滚动原理，设计一组倾斜的钻具排放架，当钻具放在管排架的高位时，钻具存有较高重力势能，依靠自身重力沿斜坡向低位端滚动，转化为动能，直到运动到最低位，与已经处于低位的钻具接触碰撞，产生巨大的金属碰撞噪声。为了解决此问题，通过在常规钻具管排架上增设无动力防碰机构来降低噪声分贝值。 4.1. 方案设计 降噪防碰钻具输送装置是由管排架和管排架上添加的一系列无动力防碰机构组成，如图1所示。 无动力防碰机构依靠自身重力实现自动回弹和通过前一根钻具的重力实现无动力防碰机构对后一根钻具的有效阻挡(图2)。无钻具通过时，因无动力防碰机构挡块头部较重，尾部处于翘起状态。当前一根钻具滚过，利用钻具的重力压起无动力防碰机构的尾部使机构前段翘起，在后一根钻具撞向前一根钻具之前，无动力防碰机构型机构翘起的头部阻挡着后一根钻具前进并使之与前一根钻具保持一定距离，等前一根钻具起走以后，后一根钻具将沿着倾斜的管排架继续前进，同时压着前一个无动力防碰机构的尾部，使头部翘起，阻挡相邻后面钻具的继续前进。以此类推，将在管排架上形成一个标准有序的排列，同时阻挡了钻具间的相互碰撞，从而实现降低噪音的目的。 4.2. 无动力防碰机构制备 (1) 结构设计与装配 该机构以销轴为轴心，旋转角度0˚~35˚，要求头部重量要大于尾部重量。设计如图3所示，装配如图4所示。 (2) 材质选择 本体：20号钢； 吸能片：硫化塑料； 销轴：40Cr； 限位柱：45号钢。 (3) 组装(图5)
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user: 5. 降噪防碰测试 5.1. 噪音测试 测试对象：中原油田钻井管具工程处钻具生产车间。 车间生产现状：该车间有固定设备40余台套，其中C-125-J型钻具摩擦对焊设备1台套、电动单梁吊3台套、管螺纹车床8台套、热处理设备20台套，主要对钻具进行焊接和热处理，生产钻具能力17，200根/年，平均每天要对150~300根钻具进行流水线处理。 图1. 无动力防碰机构 图2. 无动力防碰机构 图3. 无动力防碰机构设计图 图4. 无动力防碰机构装配 噪声测试：在车间内分别对降噪防碰钻具管排装置和常规钻具管排机进行噪音对比测试。生产状态和未生产状态各五组，表6为降噪防碰钻具管排装置噪音监测数据，表7为常规钻具管排机噪音监测数据。图6为降噪防碰钻具管排装置噪声监测过程，图7常规钻具管排机噪声监测过程。 5.2.分析 由表1、表2监测数据可知，降噪防碰钻具管排装置低位端噪音平均值为66.32 dB，峰值为76.04 dB。高位端噪音平均值为51.36 dB，峰值为74.88 dB。监测值均达到工业企业噪音四类标准(55-70 dB)，也低于80 dB，故不会对人体造成伤害。而常规钻具管排机低位端噪音平均值为88.06 dB，峰值为109.6 dB。高位端噪音平均值为76.52 dB，峰值为108.74 dB，严重超标，工人工作环境十分恶劣。对比两种管排装 图5. 无动力防碰机构组装 图6. 降噪防碰钻具管排装置 Table 6 Monitoring data of anti collision drill pip 组号 一组 二组 三组 四组 五组 平均 管排装置高位端 峰值 73.4 75.7 70.3 74.4 80.6 74.88 平均值 49.8 54.3 50.8 45.9 56 51.36 管排装置低位端 峰值 76.5 80.2 73.2 74 76.3 76.04 平均值 62.3 70 65.5 64.7 69.1 66.32 表6. 降噪防碰钻具管排装置噪音监测数据(单位：dB) Table 7 Monitoring data of conventional drill pip 组号 一组 二组 三组 四组 五组 平均 管排装置高位端 峰值 109.7 106.2 114.1 108.7 105 108.74 平均值 80.1 70.8 65.1 84.6 82 76.52 管排装置低位端 峰值 103.6 112.5 116.4 105.7 109.8 109.6 平均值 87.2 90.6 85.4 91 86.1 88.06 表7. 常规钻具管排机噪音监测数据(单位：dB) 图7. 常规钻具管排机 置的监测数据，降噪防碰钻具管排装置较常规钻具管排机钻具碰撞产生的噪音低位端峰值下降30.6%，噪音平均值下降24.7%，高位端峰值下降31.1%，噪音平均值下降32.9%，机构降噪效果明显。该机构设计巧妙、结构简单、使用方便，具有很高的应用价值。
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user: 6. 结论 (1) 通过巧妙设计，无动力防碰机构实现了依靠自身重力自动回弹和通过前一根钻具的重力实现对后一根钻具的阻挡目的，有效降低钻具碰撞产生的巨大噪音，减小对工人身体的直接伤害。 (2) 通过现场监测，降噪防碰钻具管排装置产生的噪音达到工业企业噪音四类标准，有效改善了工人的工作环境。
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user: 摘 要 本文以高原低涡资料为基础，统计分析了2003~2012年高原低涡的活动规律，结果表明：高原低涡主要生成于高原东部，生涡高频区主要分布在唐古拉山、杂多、德格、曲麻莱和柴达木五个地区。移出高原的高原低涡主要生成于高原东部，高原移出低涡高频生成源地在曲麻莱最为集中。高原低涡出现次数的年际变化在2003~2009年呈明显增加趋势，2010年出现转折次数减少，2011~2012年继续增加。高原低涡集中出现在每年的4~9月，其中6月份最多。93.0%的高原低涡持续时间在60h以内。随着持续时间的增加，高原低涡的出现次数显著减少。高原移出低涡的路径主要集中在东北、东南、东三个方向，移入的地区主要分布在甘肃、四川、陕西和宁夏四个地区。 关键词 :高原低涡，移出低涡，生成源地，持续时间，移动路径
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user: 1. 引言 高原低涡是青藏高原夏季主要的降水系统之一，高原初生的低涡多为暖性结构[ 1 ] 。在有利天气形势下，高原低涡主要影响高原西部、中部的降水[ 2 ] 。个别高原低涡会东移出高原，夏季常在四川地区引发区域性暴雨天气过程，东移出川时，引起我国中东部(包括长江中下游、黄淮流域、甚至华北地区)一次大范围暴雨、雷暴等灾害性天气[ 3 ] -[ 5 ] ，以及城市内涝、山洪、滑坡、泥石流等次生灾害[ 2 ] 。 吴永森、陈乾(1964)提出了高原低涡的客观事实[ 6 ] [ 7 ] ，叶笃正、高由禧(1979)指出高原低涡的水平尺度约500 km，垂直厚度约2~3 km，在一定条件下，它们会移出高原[ 8 ] 。1977年以后，较大规模的高原低涡研究开始涌现[ 9 ] ，青藏高原低值系统协作组(1978)和青藏高原气象科学研究拉萨会战组(1981)对于高原低涡的的发生发展进行了大量的天气学研究，取得了开创性的研究成果[ 10 ] [ 11 ] 。高原低涡是500 hPa等压面上反映的生成于青藏高原，有闭合等高线的低压或有三个站风向呈气旋式环流的低涡[ 12 ] ，初期水平尺度为400~500 km，发展盛期可达600~800 km，生命史一般为1~3 d [ 1 ] [ 2 ] 。高原低涡在低涡中心附近400 hPa以下以辐合为主，无辐散层在400 hPa~300 hPa之间，300 hPa以上为辐散层，在其中心附近自低层到100 hPa均为上升运动，低涡降水主要集中在低涡中心附近400 km范围内，初生低涡降水中心在低涡东南侧，成熟涡降水中心在低涡东侧。低涡形成后，一般沿切变线东移，多数在高原东部消亡或者减弱并入东移低槽，少数低涡可移出高原影响下游地区[ 1 ] 。 孙国武等(1987)研究发现对流层上部大尺度环境场对高原低涡发展东移有重要影响[ 13 ] 。罗四维等(1991)通过对1979年一次高原西部低涡的诊断分析得出，地面感热加热对低涡的生成发展起决定性作用[ 14 ] 。李国平(2005)研究高原边界层对高原低涡结构的动力作用时发现，高原上较强的边界层动力“抽吸泵”作用对高原低涡的流场结构及发展有显著作用[ 15 ] 。王鑫等(2009)、唐信英等(2014)分别对1980~2004年和1998~2011年青藏高原的低涡活动特征做了统计分析[ 16 ] [ 17 ] 。李国平等(2014)基于NCEP资料统计了近30年夏季青藏高原低涡的特征，并对低涡高发年和低发年的低频大气环流场进行了对比分析[ 18 ] 。郁淑华等(2002， 2006~2008， 2012)对高原低涡的观测事实、高原低涡对降水影响的统计分析、高原东移低涡的大尺度条件、冷空气对高原低涡移出高原的影响，影响我国东部洪涝灾害的高原东移低涡的环流场等进行了详细的研究[ 19 ] -[ 25 ] 。柳草等(2009)通过对2001年一次东移高原低涡的动力结构特征研究发现，低涡处于高原上时，涡区在边界层一直有水汽辐合，移出高原后在低空只存在微弱的水汽辐合甚至辐散[ 26 ] 。王伏村(2014)通过对2012年一次高原移出低涡引起下游地区大暴雨的个例分析认为，高原低涡向北移出高原与冷暖平流的南北向分布有密切关系，高空位涡下传是高原低涡发展的原因之一[ 27 ] 。由此可见，通过对高原低涡活动规律进行统计和分析，对于高原下游地区暴雨天气过程的预报具有重要意义。 前人对于2003~2011年高原低涡的活动特征已有统计研究，主要是对夏季高原低涡的整体活动特征做了具体统计分析[ 16 ] [ 18 ] ，对于全年高原低涡的分析侧重于时间分布和其移出高原的影响系统[ 17 ] 。本文利用科学出版社出版的《青藏高原低涡切变线年鉴》(2003～2012) [ 12 ] ，统计分析2003~2012年10年中高原低涡及高原移出低涡的空间分布、时间变化、生命史、移出的地区和移向等活动特征。
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user: 2. 资料和方法 本文所用资料为中国气象局成都高原气象研究所编撰的《青藏高原低涡切变线年鉴》(2003~2012) [ 12 ] 。本文采用线性倾向估计方法对气象要素资料序列进行趋势分析，在判断变化趋势程度是否显著时，对相关系数进行T检验[ 28 ] 。
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user: 3. 高原低涡活动的空间分布 高原东(西)部低涡指低涡中心位置分别在92.5˚E以东(西)的低涡[ 12 ] 。由图1可见，2003~2012年共生成高原低涡457个，高原低涡主要生成于高原东部，共376个，占82.3%，高原西部仅生成81个，占17.7%，纬向分布来看，绝大多数高原低涡生成集中在32˚~35˚N。生涡高频区主要有唐古拉山、杂多、德格、曲麻莱和柴达木五个地区，另外还有申扎、那曲等弱高频生涡地区，这与王鑫等(2009)统计的1980~2004年5~9月高原低涡生成源地的高频中心(那曲东北部、德格东北部、松潘附近和申扎至改则一带)有所不同[ 16 ] 。 高原低涡移出高原指低涡中心移出海拔 ≥ 3000 m的青藏高原地区[ 12 ] 。由图2可见，2003~2012年移出高原的高原低涡共100个，移出高原的概率为21.9%，其中高原东部低涡移出率为22.3%，高原西部低涡移出率为19.8%。移出高原的高原低涡主要生成于高原东部，占84%，高原西部仅生成16个，占16%。移出高原的低涡和总的高原低涡高频生成源地基本一致，其中在曲麻莱最为集中。这1998~2004年5~9月移出高原的高原低涡的主要生成源地(羌塘、那曲、柴达木、松潘)有所不同[ 29 ] 。
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user: 4. 高原低涡活动的时间分布 4.1. 高原低涡活动的年际变化 由图3可见，高原低涡在2009年出现次数最多，为57次，而在2003年出现次数最少，仅33次，年平均出现次数为45.7次。高原低涡按照地理位置分为高原东部低涡和高原西部低涡。高原东部低涡同样在2009年出现次数最多，为44次，而在2003年出现次数最少，仅25次，年平均出现37.6次。高原东部低涡和高原低涡的年际变化曲线基本一致，2003~2009年低涡次数呈明显增加趋势，2010年出现转折次数减少，2011~2012年继续增多。高原西部低涡在2007年出现次数最多，为14次，而在2010年和2011年出现次数最少，均为4次，年平均出现8.1次。 通过计算，高原低涡年出现次数以2.4次/a的倾向率增加，相关系数为0.619，通过了α = 0.05的显 图1. 2003~2012年高原低涡生成源地分布图 图2. 2003~2012年移出高原的高原低涡生成源地分布图 著性检验，呈显著性增加趋势；高原东部年出现次数以2.7次/a的倾向率增加，相关系数为0.775，通过了α = 0.01的显著性检验，呈显著性增加趋势；高原西部年出现次数以−0.2次/a的倾向率减少，未通过显著性检验，呈不显著减少趋势。 由图4可见，高原低涡在2012年移出次数最多，为16次，而在2006年和2009年移出次数最少，均为6次，年平均移出次数为10次。高原东部低涡同样在2012年移出次数最多，为14次，而在2006年和2009年移出次数最少，均为4次，年平均移出8.4次。高原东部低涡和高原低涡的年际变化曲线基本一致，2009年之前移出次数呈振荡趋势，2009年之后明显增多。高原西部低涡在2005年移出次数最多，为4次，而在2004年和2011年移出次数均为0，年平均移出1.6次。 通过计算，高原年移出次数以0.8次/a的倾向率增加，相关系数为0.608，通过了α = 0.05的显著性检验，呈显著性增加趋势；高原东部年移出次数以0.9次/a的倾向率增加，相关系数为0.631，通过了α = 0.05 图3. 2003~2012年高原低涡出现次数年变化及线性趋势 图4. 2003~2012年高原低涡移出次数年变化及线性趋势 的显著性检验，也呈显著性增加趋势；高原西部年移出次数以−0.1次/a的倾向率减少，未通过显著性检验，呈不显著减少趋势。 4.2. 高原低涡活动的月际变化 由图5可见，高原低涡集中出现在每年的4~9月，其中6月份最多，为94次，12月份最少，仅有5次，月平均出现38.1次。高原东部低涡的月际变化和高原低涡基本一致，主要出现在4~9月，其中6月份最多，为85次，而2月份最少，仅有1次，月平均出现31.3次。而高原西部低涡集中出现在每年的3~6月，其中5月份最多，为19次，9月、10月和12月最少，均仅有1次，月平均出现6.8次。 由图6可见，移出高原的高原低涡集中出现在每年的4~9月，其中6月份最多，为32次，2月、11月和12月最少，均未出现高原移出低涡，月平均出现8.3次。高原东部低涡移出次数的月际变化和高原低涡基本一致，主要出现在4~9月，其中6月份最多，为24次，而2月、11月和12月最少，均未出现， 图5. 2003~2012年高原低涡出现次数月变化 图6. 2003~2012年高原低涡移出次数月变化 月平均出现7次。而高原西部低涡移出集中出现在每年的5~6月，其中6月份最多，为8次，4月、8月和9月分别移出2次、1次和1次，其他月份的高原西部低涡未移出高原，月平均出现1.3次。
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user: 5. 高原低涡的生命史 由图7可见，在2003~2012年457次高原低涡中，高原低涡持续时间达12 h的有216次，占47.3%，持续达24 h的高原低涡有103次，占22.5%，持续达36 h的高原低涡有50次，占10.9%，持续时间在60 h以内的高原低涡有425次，占总低涡数的93.0%。随着持续时间的增加，高原低涡的次数显著减少，持续时间在96 h及以上的共13次，仅占总低涡数的2.8%。持续时间达180 h的仅有1次。 由图8可见，在2003~2012年100次移出的高原低涡中，高原低涡的持续时间均在24 h及以上，持续时间在60 h及以下的高原低涡占移出高原低涡总数的71%，持续时间在84 h及以下的高原低涡占移出 图7. 2003~2012年高原低涡生命史的统计分布图 图8. 2003~2012年移出高原的高原低涡生命史统计分布图 高原低涡总数的88%，持续96 h及以上的只占12%。移出高原低涡持续时间最长达180 h，仅有1次。
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user: 6. 高原低涡移出高原的地区和移向统计 由表1可见，100次移出的高原低涡，最终移入的地区有7个省(直辖市、自治区)，分别是新疆、甘肃、宁夏、四川、陕西、重庆、贵州、云南、内蒙古。移入甘肃的最多，占移出高原低涡总数的43%，四川其次，占29%，陕西第三，占11%，宁夏第四，占8%，其余四个地区所占的比例均在3%及以下。从分年份的统计我们还可以看出，每年高原低涡移入甘肃和四川的次数所占比例都很高，除了2009年每年也都有高原低涡移入陕西，这三个地区是高原低涡移入的主要地区，其他5个地区仅有个别年份有高原低涡移入。 由图9和表2可见，高原低涡移出高原的移动路径共有7个方位，分别为西北、北、东北、东、东南、南和西南，东北路径的最多，占41%，对应甘肃、宁夏和内蒙古，东南路径的其次，占27%，对应 图9. 2003~2012年高原低涡移出高原的移动路径统计图 Table 1 The distribution of districts the Tibetan Plateau vortex moving into moving out of the plateau in 2003-201 年份 新疆 甘肃 宁夏 四川 陕西 重庆 贵州 云南 内蒙古 合计 2003 3 2 3 1 9 2004 5 2 2 1 10 2005 5 3 1 9 2006 1 1 2 2 6 2007 2 4 1 1 1 9 2008 3 5 1 9 2009 1 2 2 1 6 2010 8 2 1 1 12 2011 1 9 1 1 1 1 14 2012 6 2 5 1 1 1 16 合计 1 43 8 29 11 2 1 2 3 100 表1. 2003~2012年高原移出低涡移入的地区分布 Table 2 The distribution of moving routes of the Tibetan Plateau vortex moving out of the plateau in 2003-201 年份 NW N NE E SE S SW 合计 1月 1 1 2 2月 0 3月 1 1 1 3 4月 1 1 6 4 12 5月 7 2 5 14 6月 3 16 4 9 32 7月 1 8 3 5 2 19 8月 1 1 4 1 1 2 10 9月 2 3 1 6 10月 1 1 2 11月 0 12月 0 合计 3 5 41 20 27 2 2 100 表2. 2003~2012年高原低涡移出高原的移动路径统计表 四川、重庆、云南和贵州，向东路径第三多，占20%，对应陕西，东北、东和东南三种移动路径的高原低涡共占移出低涡总数的88%，其余4种路径一共仅占12%，南和西南路径所占比例最少，均仅为2%。 由表2可见，除了未发生高原低涡移出的2月、11月和12月外，东北、东南和东三种移动路径所占比例高，表明高原低涡移出高原以东北、东南、东三个方向移动为主，其余5中移动方向均零散出现在3、4、6、7、8五个月份中。
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user: 7. 结论 本文较详细的统计了2003~2012年高原低涡的空间分布、时间变化、生命史、移出的地区和移向等活动特征，得到以下主要结论： 1) 高原低涡主要生成于高原东部，纬向分布来看，绝大多数高原低涡生成集中在32˚~35˚N。生涡高频区主要分布在唐古拉山、杂多、德格、曲麻莱和柴达木五个地区。低涡移出高原的概率为21.9%，移出高原的高原低涡主要生成于高原东部，占84%，高原移出低涡高频生成源地和高原低涡生成源地分布基本一致，在曲麻莱最为集中。 2) 高原东部低涡和高原低涡的年际变化曲线基本一致，2003~2009年低涡次数呈明显增加趋势，2010年出现转折次数减少，2011~2012年继续增多。高原西部低涡在2007年出现次数最多，而在2010年和2011年出现次数最少。高原东部移出低涡和高原移出低涡的年际变化曲线基本一致，2009年之前移出次数呈振荡趋势，2009年之后明显增多。高原西部低涡在2005年移出次数最多，而在2004年和2011年无移出低涡。 3) 高原低涡集中出现在每年的4~9月，其中6月份最多，12月份最少，月平均出现38.1次。高原东部低涡的月际变化和高原低涡基本一致，月平均出现31.3次，而高原西部低涡集中出现在每年的3~6月，其中5月份最多，9月、10月和12月最少，月平均出现6.8次。高原移出低涡出现次数的月际变化和高原低涡基本相同，高原西部低涡移出集中出现在每年的5~6月，其中6月份最多。 4) 93.0%高原低涡持续时间在60 h以内。高原低涡随着持续时间的增加，高原低涡的次数显著减少，持续时间在96 h及以上的低涡次数仅占2.8%。88%高原移出低涡的持续时间在84 h以内，持续时间在96 h及以上的低涡次数仅占12%。 5) 高原移出低涡移入的地区主要分布在甘肃、四川、陕西和宁夏四个地区。高原移出低涡的路径主要集中在东北、东南、东三个方向。
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user: 摘 要 卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，卵巢上皮癌死亡率居各类妇科肿瘤的首位。探索高效安全的治疗手段，已经成为卵巢癌治疗领域的热点问题。目的：应用噬菌体展示技术体内筛选、鉴定并评价卵巢癌特异性结合七肽，为卵巢癌靶向给药系统的构建及肿瘤靶向诊疗技术的研究奠定基础。方法：噬菌体展示七肽库Ph.D.-7 TM 在卵巢癌A2780荷瘤模型体内进行3轮淘选。经ELISA、体内外结合、结合抑制和免疫荧光试验鉴定肿瘤阳性噬菌体单克隆及其对应展示肽的特异性，MTT试验、划痕试验考察靶向肽对相关细胞行为的影响。结果：测序结果中表达HGGVRLY肽(HGG肽)的噬菌体单克隆PC-H所占比例达到27%，ELISA中PC-H对A2780细胞显示出高亲和力及显著特异性(P < 0.05)。体内、体外反筛结果表明PC-H对A2780细胞和肿瘤组织具有很强亲和力。结合抑制实验及荧光显微成像证明了HGG肽对A2780细胞的靶向性，且HGG肽对肿瘤细胞的行为无显著影响，对正常细胞无抑制。结论：应用体内噬菌体肽库技术成功筛选出可与卵巢癌A2780细胞特异性结合的靶向肽HGGVRLY，其细胞相容性良好，可用于卵巢癌的诊断和靶向治疗。 关键词 :卵巢癌A2780细胞，体内淘选，噬菌体展示，靶向，七肽
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user: 1. 引言 癌症因具有较强的恶性增殖和侵袭转移能力，在世界范围内致死率排名第二。发病率与死亡率呈持续上升趋势，全球2012年新发癌症病例约1400万，因癌症死亡约820万[ 1 ] 。卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，在美国更是首位妇科致死性癌症[ 2 ] 。卵巢癌病例中绝大部分(>85%)属于上皮性的肿瘤[ 3 ] 。而上皮性卵巢癌通常难以检测且具有较高的致病率和死亡率，目前治疗手段主要是手术切除术结合放疗、化疗[ 4 ] ，尽管最初响应率可以达到80%，但其存在的正常组织毒性及免疫抑制[ 5 ] 、耐药性[ 6 ] 、腹腔分散[ 7 ] 等问题严重制约了其临床治疗效果。 靶向给药系统借助载体、配体或抗体将药物选择性地浓集定位于靶组织或靶细胞，在维持所需组织药物水平的同时有效避免药物对人体的毒副作用，已经成为最有潜力的治疗手段之一，而构建靶向给药系统的关键是筛选出肿瘤组织特异性结合配体。相对正常卵巢，卵巢癌细胞具有多重变异，比如某些受体结合位点的暴露或高表达，并且卵巢癌细胞还存在许多潜在或被证实的靶标分子，例如生长因子ErbB/EGF受体[ 8 ] [ 9 ] 、细胞周期操纵子cyclin D1 [ 10 ] [ 11 ] 、跨膜炎症整合素ITGB1 [ 12 ] 等，因此，有可能针对卵巢癌细胞或组织的特异性受体筛选靶向配体。相对于单克隆抗体和生物大分子配体，多肽配体易于大量合成并可进行配向性衍生化[ 13 ] ，同时可避免被网状内皮系统捕获而倍受青睐。 肿瘤靶向多肽的传统淘选是在体外建立的蛋白质或者多肽平台上，大量淘选后进行体内检验，包括基因组学和蛋白质组学方法。传统淘选方法虽能对确定标靶进行淘选，但由于工作量大、准确率低且获得的多肽特异性低，而逐渐被其它方法取代。噬菌体展示肽库技术是将多肽或蛋白质片段展示于丝状噬菌体上，进而从组建的文库中提取具有所需性质多肽序列的一种筛选技术，具有可多轮筛选、快速扩增，无需预知靶标信息等诸多优势。体内噬菌体展示多肽技术能在复杂的生物体内环境下进行，最大可能地模拟细胞受体于活体内的状况，因而在获取肿瘤特异性配基方面优势显著[ 14 ] 。已成功筛选出胃癌[ 15 ] [ 16 ] 、肝癌[ 17 ] 、乳腺癌[ 18 ] -[ 20 ] 等十多种癌症的靶向多肽配基，部分多肽已在成像、载药等研究中获得应用。 A2780细胞系作为最常见且恶性程度高的上皮性卵巢癌亚型之一，对基质膜的粘附能力弱因而迁移侵袭能力强[ 7 ] 。本研究以A2780为靶标，采用噬菌体展示7肽库Ph.D.-7 TM 体内淘选鉴定与卵巢癌A2780细胞特异性结合的多肽，探索其作为卵巢癌靶向治疗特异性配体的可行性，为卵巢癌靶向给药系统的构建及肿瘤靶向诊疗技术的研究奠定基础。
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user: 2. 材料与方法 2.1. 试剂材料 2.1.1. 试剂 噬菌体展示随机七肽库Ph.D.-7 TM 购自美国New England Biolabs公司，肽库所展示7肽融合于pIII蛋白，含约2 × 10 9 pfu克隆。用于噬菌体扩增的宿主大肠杆菌ER 2738 (雄性F + 菌种)包含于该试剂盒。RPIM1640/DMEM培养基购自Gibco公司，小牛血清(NCS)、胰蛋白酶出自Hyclone公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司，琼脂糖、琼脂粉为Amresco公司生产，HRP/anti-M13购自GE Healthcare公司，NP-40、FITC标记链霉亲和素购自Sigma公司，其他试剂均为化学纯。 2.1.2. 细胞系及细胞培养 A2780、SKOV3、HUVEC、A549以及L929五种细胞购自四川大学移植工程与移植免疫重点实验室。细胞培养条件：10%NCS-RPMI1640培养基，在37℃、5%CO 2 恒温培养箱中培养。 2.1.3. 动物及异植瘤建模 BALB/c的4~6周龄雌性裸鼠，购买并寄养于四川大学动物中心，严格按照动物中心的试验规范【SYXK(川)2009-045】进行SPF级饲养和试验。肿瘤种植当日，消化A2780细胞，至107个/200 µL，注射入裸鼠右侧腋窝。肿瘤细胞潜伏期10天，15~20天长成直径1 cm的球形异植瘤，成瘤率99%。 2.2. 试验方法 2.2.1. 噬菌体展示肽库的体内筛选 尾静脉注射噬菌体原始肽库至裸鼠体内(输入量4.0 × 10 10 pfu)，循环10 min时用10%的水合氯醛麻醉，5 min后剪开胸腹腔，用约50 mL PBS进行心脏灌流。取肿瘤及卵巢，剪碎、匀浆、测定滴度。再将肿瘤回收噬菌体扩增，重新尾静脉注射于裸鼠，如此重复进行第二、三轮筛选（输入量分别为2.7 × 10 10 pfu和8.1 × 10 9 pfu）。 2.2.2. 测序、单克隆扩增、七肽合成 从第三轮肿瘤回收噬菌体菌板中随机挑取蓝斑单克隆，按照肽库说明书，进行噬菌体单克隆的DNA提取及扩增。已确定序列的候选靶向肽HGGVRLY与随机对照肽VINYYQQ均委托上海波泰生物科技有限公司合成，HPLC检测纯度达95%以上。 2.2.3. 噬菌体单克隆的ELISA鉴定 将A2780、SKOV3、A549、HUVEC以及L929五种细胞分别接种于96孔板，长至80%覆盖率后，无血清RPMI1640孵育1 h，4%多聚甲醛固定20 min，3%H 2 O 2 作用5~15 min去除内源酶活性，PBS-2% BSA在室温下封闭细胞2 h，加入3 × 10 8 pfu的所挑选噬菌体单克隆溶液100μL/孔孵育1 h。洗板后，加入用PBS-2%BSA稀释的HRP/抗M13噬菌体单抗复合物(1:2000) 100 μL/孔，37℃下孵育1 h。洗板后，加入TMB显色液100 μL/孔，室温避光孵育15 min，直至显色至预期深浅。加50 μL/孔的2 M H 2 SO 4 溶液终止反应10~30 min，终止后使用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光值。 2.2.4. 噬菌体体外回输验证 将A2780细胞接种到24孔板中，过夜覆盖率为80%，无血清RPMI1640培养基孵育1 h。PBS-1%BSA在37℃封闭1 h，加入稀释的10 10 pfu所挑选噬菌体单克隆孵育1 h。期间洗板用PBS-0.2%BSA清洗2-3次，每次5 min。最终加入1%NP-40裂解细胞200 μL/孔，收集于微量离心管中。记录其总体积量，并检测滴度。每个实验组2~3个平行，进行2次重复实验。 2.2.5. 噬菌体体内回输验证 体内回输法具体步骤同上，将候选肿瘤阳性噬菌体单克隆与空白噬菌体M13KE分别尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内(输入量为10 10 pfu)，15 min循环后进行心脏灌流。每组的实验裸鼠数n = 3，且在收集肿瘤组织时，同时收集正常组织(脑、心、肝、脾、肺、肾、卵巢)的大部分组织进行组织匀浆并测定各器官中富集噬菌体的滴度。 2.2.6. 七肽-噬菌体竞争试验 A2780细胞按10 5 个/孔接种于24孔板，置37℃、5% CO 2 恒温培养箱过夜，至覆盖度80%，无血清RPMI1640培养1 h，2%NCS-RPMI1640封闭1 h，此后将多肽(浓度梯度：0.01，0.1，1，10，100 µM)与细胞共孵育1 h，加入候选肿瘤阳性噬菌体单克隆(10 9 pfu) 1 h。期间0.2%BSA-PBS洗涤2~3次，每次5 min。最终加入1%NP-40裂解细胞，收集噬菌体测定滴度。 2.2.7. 生物素标记七肽的细胞免疫荧光鉴定 A2780、HUVEC分别接种于玻片上，培养至覆盖度达50%。无血清RPMI1640培养1 h，4%多聚甲醛固定10 min，2%BSA-0.05%triton-PBS封闭2 h，每孔加50 μM的生物素标记七肽室温结合1 h，FITC标记链霉亲和素室温避光孵育1 h，PBS洗涤，DAPI染细胞核10 min，PBS洗涤后激光共聚焦成像观察。 2.2.8. 七肽对细胞增殖、迁移的影响 MTT试验：A2780、HUVEC和L929细胞分别接种到96孔板，过夜，加入完全培养基稀释的多肽溶液(浓度梯度0.01，0.1，1，10 µM)，24 h后按10%的比例加入MTT试剂(5 mg/mL)，4 h后弃培养液，加入DMSO溶解沉淀，待完全混匀后酶标仪读取490 nm处吸光值。实验以未加多肽组为对照组。 划痕试验：A2780和HUVEC细胞分别接种到6孔板中，过夜，至覆盖度80%。用移液枪头水平划线，PBS清洗2次去除残落细胞，加入无血清RPMI1640稀释的50 µM多肽溶液培养24 h，由Image J软件测定迁移距离。实验以未加多肽组为对照组。 2.3. 数据分析 结果由PASW Statistics18统计分析，Graph Pad 5.0作图，DNAStar预测七肽的基本性质。数值以mean ± SD表示，显著水平为P < 0.05：显著级别按 < 0.001 < 0.01 < 0.05分别由“#，**，*”逐级表示。
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user: 3. 结果与讨论 3.1. A2780卵巢癌异植瘤模型的建立 荷瘤裸鼠无腹水及其它器官转移现象。肿瘤组织HE染色切片如图1，所建肿瘤模型为实体性肿瘤，细胞间界限不清，呈巢团状分布；细胞密集、体积大，异型显著，分化差；细胞核大小形态不一，核仁明显，核分裂像易见(约3~5个/HP)，以上皆说明该肿瘤组织细胞分化低，恶性高，组织形态特点与A2780型囊腺瘤特点相符，即人卵巢癌动物模型成功建立。 3.2. 噬菌体肽库在肿瘤组织的富集 在输入量逐轮递减的情况下，3轮体内筛选后，噬菌体多肽库在对照正常卵巢组织中回收率基本无变化，但在肿瘤部位的富集度(回收率Round3/Round 1)达到6.8倍。输入量递减，尽管可能使得肿瘤部位回收率未出现10倍以上的增加，但保证了在靶标量一定的情况下，真正高亲和肿瘤组织的噬菌体单克隆结合的积累。筛选结果如图2，三轮筛选后噬菌体肽库在肿瘤部位的富集效果显著，因此推测潜在肿瘤阳性噬菌体单克隆在肿瘤部位存在特异性积累，故终止筛选。 3.3. 噬菌体DNA测序结果 在测序成功的26个噬菌体单克隆中，展示七肽HGGVRLY (HGG)的单克隆PC-H出现几率高达27%，展示其它多肽序列的单克隆如PC-G，PC-M，PC-W，PC-L等出现几率较低。HGG肽经DNAStar预测，其等电点9.0，在中性溶液中带1个正电荷，亲水性良好，二级结构倾向为转角-β折叠。生理条件下，带正电的HGG肽易与肿瘤细胞表面带负电荷的磷脂分子结合，良好的亲水性和相对简单的二级结构更利于其可能参与整合的靶向平台的溶解和功能作用。 3.4. Cell Based-ELISA初步鉴定阳性噬菌体单克隆 选取测序比例较高的5个噬菌体单克隆以及空白噬菌体M13KE进行ELISA快速鉴定，结果如图3所示。各种肿瘤阳性噬菌体单克隆对A2780细胞的结合均显著高于M13KE，揭示噬菌体单克隆通过其展示的多肽与A2780结合。另一方面，各种肿瘤阳性噬菌体单克隆对A2780细胞的结合显著高于其它细胞系，证实了其结合的特异性，同时也印证了体内噬菌体筛选的有效性。此外，PC-H与A2780细胞的结合力显著高于其它肿瘤阳性噬菌体单克隆，故将其作为候选(最优)阳性噬菌体单克隆。 3.5. 噬菌体的体外、体内结合 体外结合结果如图4，PC-H与靶标的结合率是随机噬菌体单克隆PC-V的10倍，是空白噬菌体M13KE的4倍。体内结合实验中，噬菌体PC-H和空白噬菌体M13KE分别回输到荷瘤裸鼠，各组织回收结果如图5，肿瘤部位PC-H的富集量是M13KE的25倍，而其他组织中二者均无显著性差异。作为噬菌体单克隆特异性验证的主要实验手段，体外与体内结合结果证明PC-H对A2780细胞、肿瘤组织的具有显著性的强亲和能力且无关正常组织。因此，PC-H对A2780细胞及肿瘤组织的靶向性得到有力支持。 3.6. 七肽–噬菌体结合抑制实验 多肽–噬菌体结合抑制试验结果(图6)表明，对照多肽VIN对噬菌体单克隆PC-H与A2780的相对结合量呈不规律性的轻微抑制；而HGG肽对PC-H的结合呈现浓度依赖性抑制，即抑制效果的显著性随浓度增加而加强，最大抑制率可达50%以上。此结合抑制试验结果与前述PC-H对A2780细胞结合显著高 图1. 人卵巢癌异植瘤组织切片HE染色 图2. 噬菌体在三轮中的富集效应 图3. 噬菌体单克隆基于细胞包被的ELISA 图4. 噬菌体体外回收结果 于M13KE的试验结果共同印证了噬菌体单克隆通过其展示的多肽而不是通过其衣壳蛋白与A2780结合，同时证实了HGG肽可以独立于噬菌体衣壳蛋白与A2780细胞非随机性高亲和作用。 3.7. 生物素标记七肽的细胞免疫荧光鉴定 生物素标记多肽与细胞结合的免疫荧光观察结果示于图7。生物素标记HGG肽能够高强度结合A2780，但与HUVEC的结合非常微弱。而生物素标记VIN肽则对A2780细胞和HUVEC细胞结合都很少。结果既表明了HGG肽对A2780细胞的高度亲和性，同时也证实了HGG肽对A2780细胞的特异性和选择性。 3.8. 靶肽HGG对肿瘤细胞行为的影响 MTT实验结果如图8所示，HGG肽对卵巢癌细胞A2780的增殖无影响，而对正常细胞HUVEC和L929细胞均起到一定促进增殖的作用。迁移实验统计结果示于图9，HGG肽对A2780与HUVEC两种细 图5. PC-H和M13KE噬菌体体内回收结果 图6. 多肽对PC-H结合A2780细胞的抑制效应 图7. HGG与VIN的与细胞结合的免疫荧光结果(标尺为10 µm) 图8. HGG肽对不同细胞增殖活性的影响 图9. HGG肽对细胞迁移的影响(标尺为100 µm) 胞的迁移水平无显著影响。由此可知，HGG肽对正常细胞的增殖活性、迁移能力无不良影响，对肿瘤细胞也无促进或抑制效果。据此推测，HGG肽自身可能并不具备肿瘤抑制效应，但细胞相容性良好，可作为生物安全的靶向配基。