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user: 3. 结果与讨论 3.1. 诱导培养前后细胞的形态学变化 正常细胞被诱导培养后，形态发生了显著变化。如图3所示，在明场下，诱导培养前的HUVEC和CNLMG细胞边界清晰，呈接触抑制生长。然而，诱导培养后的HUVEC和CNLMG细胞形态朝卵巢癌细胞形态发展：大小不一、聚集生长、边界模糊和无明显接触抑制。共培养前后的SKOV3细胞无明显变化。由此可见，诱导培养后的HUVEC和CNLMG形态高度符合肿瘤细胞形态特征，而卵巢癌细胞形态基本不受影响。 DAPI染色发现，诱导培养前HUVEC和CNLMG细胞的细胞核主要呈圆形和椭圆形，两者均无明显巨核现象，核膜光滑且完整。诱导培养后HUVEC和CNLMG细胞的细胞核特征为：形态不一，呈椭圆形、圆形、蚕豆形等(黄色箭头)，出现巨核、双核(红色箭头)，且出现核膜不光滑不完整等现象(绿色箭头)。综上可推论，卵巢癌细胞可使正常细胞的形态朝肿瘤细胞形态发展。由此可初步推断，正常细胞可以被癌细胞诱导为肿瘤相关细胞。 3.2. 肿瘤相关细胞标志物蛋白的表达 对于HUVEC而言，如图4(a)所示，诱导培养的HUVEC比单独培养的HUVEC表达出更多的VEGF。TEM1是肿瘤内皮细胞的标志物，而在图4(b)图中，诱导培养的HUVEC过表达此种蛋白。由此可见，HUVEC细胞已经被肿瘤细胞所捕获，并且已表达出与肿瘤细胞有关的标志蛋白。在TME中，VEGF的过表达会促使血管在低氧的环境下迅速增生，增强血管的通透性，促进肿瘤细胞对营养的获取进而利于肿瘤细胞的增殖。肿瘤细胞分泌出能促进HUVEC快速生长的细胞因子，因此两者之间发生相互促进的交互作用。这也从另一个角度印证了CCK8的结果。 Western blot 实验结果如图4(c)所示，可以明显看到，诱导培养的HUVEC表达更多的VEGF，而单独培养的HUVEC则表达较少。诱导培养的HUVEC过表达TEM1，而单独培养的HUVEC则表达较少甚至不表达此种蛋白，这与ELISA检测上清液蛋白含量的结果是吻合的。因此，进一步地说明了HUVEC细胞被SKOV3诱导成为了肿瘤相关血管内皮细胞。 图3. 单独和诱导培养的细胞形态和荧光图像 图4. 单独培养和诱导培养的蛋白质表达：(a) 细胞上清中VEGF的蛋白表达；(b) TEM1在细胞上清液中的蛋白表达；(c) 蛋白质印迹实验检测VEGF和TEM1的蛋白表达；(d) 细胞上清中α-SMA的蛋白质表达；(e) FAP在细胞上清液中的蛋白质表达；(f) 蛋白质印迹实验检测α-SMA和FAP的蛋白质表达；n = 6，x ± s。与单独培养相比， * p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001 对于CNLMG而言，之前有大量研究者提出肿瘤相关细胞的验证，CAF表达α-SMA，而正常成纤维细胞(Normal fibroblast， NF)则不表达α-SMA，也有研究者提出CAF过表达此种蛋白。与此同时，他们还提出CAF过表达FAP，NF则表达较少此种蛋白。图4(d)和图4(e)结果表明，诱导培养的成纤维细胞比单独培养的成纤维细胞表达更多的α-SMA和FAP。图4(f)中条带的粗细也可以明显地看出CAF比NF表达更多的标志蛋白α-SMA和FAP。由此可以说明诱导培养的成纤维细胞朝着肿瘤相关细胞发展。 3.3. 单独培养和诱导培养的细胞活性 使用CCK-8试剂盒检测在不同时间点的单层和双层共培养细胞的细胞活力。结果如图5所示，图5(a)中诱导培养细胞活性在前3~5天显著增加，诱导培养的SKOV3细胞活性在前3天随着时间增加而增加，在第3天达到峰值，然后下降直至死亡；前5天诱导培养的HUVEC的活性随着时间的推移而增加，在第5天到达峰值，随之逐渐下降。为了找寻两种细胞最佳的诱导培养时间，用CCK8检测单独和诱导培养至第4天的细胞活性，结果如图5(b)所示，诱导培养的SKOV3细胞数量约为单独培养的2.3倍，诱导培养的HUVEC细胞数量约为单独培养的1.5倍。诱导培养的细胞均比单独培养的细胞表现出更高的细胞活性，即说明拥有更强的增殖能力。因此，将4天作为后续实验的诱导培养时间。 图5. 单独或诱导培养的细胞活性：(a) HUVEC和SKOV3细胞在不同时间的细胞活性；(b) HUVEC和SKOV3细胞在第4天的细胞活性；n = 6，x ± s。与单独培养的SKOV3相比， ### p < 0.001；与单独培养的HUVEC相比， *** p < 0.001；与单独培养相比， *** p < 0.001；(c) CNLMG和SKOV3细胞在不同时间点的细胞活性；(d) CNLMG和SKOV3细胞在第4天的细胞活性；n = 6，x ± s。与单独培养的SKOV3相比， ### p < 0.001；与单独培养的CNLMG相比， * p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001；与单独培养相比， *** p < 0.001 图5(c)中诱导培养细胞的活性在前4~5天显著增加，诱导培养的SKOV3细胞活性在前5天随着时间的增加而增加，在第5天达到峰值，然后下降；诱导培养的CNLMG细胞活性在第5天到达峰值，随之逐渐下降。用CCK8检测单独和诱导培养至第4天的细胞活性，结果如图5(d)所示，诱导培养的SKOV3细胞数量约为单独培养的1.3倍，诱导培养的CNLMG细胞数量约为单独培养的1.4倍。诱导培养的细胞均比单独培养的细胞表现出更高的细胞活性。 总的来说，诱导培养的HUVEC和CNLMG细胞与肿瘤细胞呈相互促进，相辅相成的作用，而相互促进的速度取决于HUVEC和CNLMG细胞本身的生长速度，若增殖速度较快，则相互促进的程度越强；若增殖速度越慢，则相互促进的程度越弱。 3.4. 肿瘤相关细胞对SKOV3迁移和侵袭能力的影响 通过迁移和侵袭实验，图6用三个组上层肿瘤细胞在12小时和24小时穿过膜后小室膜上的细胞数量来反映肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。一组表示孔板的下层只有含血清的培养基作为空白对照组，二组代表孔板下层接种正常细胞，三组则表示孔板下层接种肿瘤相关细胞。(I)中三组迁移的肿瘤细胞数量分别为：166 ± 67，208 ± 29，395 ± 43；侵袭的肿瘤细胞数量分别为：69 ± 24，200 ± 34，390 ± 28。(II)中迁移的肿瘤细胞数量分别为：147 ± 60，219 ± 45，425 ± 65；侵袭的肿瘤细胞数量分别为：122 ± 34，269 ± 26，406 ± 42。从(I)和(II)中都能看出第三组的数量最多，也就说明肿瘤相关细胞可以大大增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。 图6. 迁移和侵袭实验：(I)空白组，血管内皮细胞组和肿瘤相关内管内皮细胞组n = 6，x ± s。(II)空白组，成纤维细胞组和肿瘤相关成纤维细胞组。n = 6，x ± s 3.5. 肿瘤相关细胞对SKOV3细胞周期的影响 通过对比共培养前后SKOV3细胞周期的检测，进一步验证肿瘤相关细胞对肿瘤细胞增殖能力的影响。结果如图7所示，共培养前的SKOV3细胞在每个阶段的占比是：Dead为0.02%，G0~G1期为62.25%，S期的占比为12.32%，G2~M期为25.27%。共培养后的SKOV3细胞在每个阶段的占比是：Dead为0.03%，G0~G1期为62.02%，S期的占比为16.06%，G2~M期为21.70%。对比共培养前和共培养后的细胞周期发现，两者在Dead和G0~G1期这两个阶段没有明显差异，后者在S期的占比较大，而S期正是DNA复制阶段。由此可知，共培养后的SKOV3细胞在S期的占比会增多。但是后者在G2~M期的占比相对前者少，说明该时刻细胞的分裂数较前者少。而通过细胞增殖实验发现，共培养后的SKOV3表现出更高的细胞活性。结合两个实验结果可知，SKOV3细胞的增殖能力主要由S期中所复制的DNA数量决定。由此可知，肿瘤相关细胞可增强SKOV3细胞的增殖能力。 图7. 共培养前和共培养后SKOV3的细胞周期 3.6. 肿瘤相关细胞增强了SKOV3细胞的耐药性 通过荧光实验，探究了共培养前后的SKOV3对游离DOX药物的获取情况。结果如图8(a)所示，在明场下，共培养前后的SKOV3细胞均有红色的DOX药物聚集在细胞表面，而共培养后的SKOV3聚集较少的DOX。由此可知，共培养前的SKOV3对药物的刺激更加敏感，药物作用较强。通过对比共培养前后SKOV3的荧光强度发现，共培养前的SKOV3中的荧光较强，而共培养后的SKOV3中的荧光较弱，此荧光不仅在分布在细胞质中，细胞核中也大量聚集。通过此结果可初步验证肿瘤相关细胞可增强肿瘤细胞的耐药性。 图8. SKOV3细胞的耐药性：(a) 共培养前后的SKOV3抗耐药性测试；(b) 游离DOX药物在共培养前后对SKOV3细胞的抗增殖作用；与对照相比， *** p < 0.001；与单独培养的细胞相比， * p < 0.05 CCK8检测细胞活性结果如图8(b)所示，与Control相比，实验组在24小时内均表现出显著的抑制作用。对比两组实验组发现共培养后的SKOV3比共培养前的SKOV3表现出更高的细胞活性，进一步说明共培养后的SKOV3细胞的耐药性较共培养前的高。因此，可以认定肿瘤相关细胞可以一定程度地增强卵巢癌细胞的耐药能力。