DreamBlooms/HansPub-15000-to-45000 huggingface dataset:
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user: 2. 临床资料 病例1，患儿，女，3月，主因间断呕吐4天，发热2天，腹胀1天入院。入院初步诊断：消化道穿孔，泛发性腹膜炎，急行剖腹探查、肠穿孔修补、回肠末端造瘘、腹腔冲洗术。患儿术后仍持续发热，术后3天腹胀，造瘘口近端肠管反复脱出，手法复位后腹胀不缓解。腹部X线检查提示肠梗阻，肠镜检查示：“小肠结肠炎？造瘘口近端肠管肠套叠”。术后第8天，行急诊手术，术中见距近端造瘘口12 cm处有一约6 × 4 × 4 cm肿块，证实为肠套叠，病变肠管已坏死，行肠切除、肠吻合并关瘘术。自发病以来，患儿持续发热，二次手术后第7天，患儿腹胀明显，腹部X线检查报消化道穿孔，急诊再行回肠造瘘、腹腔冲洗术，术中发现原吻合口尚好，其近端肠管多处穿孔，遂再行肠造瘘术。病情平稳后转至北京、杭州等地治疗，经随访，患儿转院1月后因溃疡性肠炎渐加重而死亡。 病例2，患儿，男，35天，早产儿，胎龄32 + 5周，因呕吐、腹胀、肺炎入我院，入院初步诊断为：低位不全肠梗阻：肠狭窄？全结肠型巨结肠？败血症、重度贫血、低蛋白血症、早产儿，保守治疗效果不佳。急诊全麻下行剖腹探查，证实系先天性巨结肠，行肠造瘘术。术后第2天，患儿造瘘口渗血，造瘘口左上方似可扪及大小约4 cm × 3 cm包块，似有触痛。查腹部彩超回报：上腹部包块，肠套叠？遂再次行剖腹探查术，术中证实肠套叠，手法复位成功。术后给予对症支持治疗，痊愈出院。
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user: 3. 讨论 肠套叠是指某段肠管及其相应的系膜套入邻近的肠腔引起的肠梗阻，一般分为原发性肠套叠、继发性肠套叠与术后肠套叠，术后肠套叠主要表现为小肠梗阻 [ 2 ] 。术后肠套叠好发于初次手术后14天内 [ 2 ] 。 有学者认为，术后肠套叠是许多外科疾病如阑尾炎、肠旋转不良、美克耳氏憩室、腹膜后畸胎瘤、胚胎性肿瘤和巨结肠疾病等手术后的并发症 [ 3 ] 。由于原发疾病及手术的原因，术后肠套叠症状不典型，常被延迟诊断并需手术治疗。小婴儿对再次手术耐受性差，危险因素增加，在临床工作中需引起足够的重视。 3.1. 小婴儿术后肠套叠的临床特点 3.1.1. 病因 术后肠套叠是腹部手术后并发症之一，目前病因尚不明确。一般认为肠蠕动功能紊乱是主要原因。研究表明，异常的肠蠕动有许多诱发因素，如电解质紊乱、麻醉、药物、神经源性因素等，放疗和化疗也是诱因之一 [ 4 ] 。此外，腹部手术肠管暴露、干燥刺激加之婴幼儿自身免疫功能不完善，这些均使肠功能恢复延长。国外还有研究表明，脂多糖可以诱发术后肠套叠 [ 5 ] 。本组2例患儿系急腹症，均行肠造瘘，其中1例，患儿肠管从瘘口多次脱出，本身肠功能既紊乱，手法复位亦对肠管造成刺激，进而诱发造瘘口近端肠套叠，致肠坏死。该患儿原发穿孔病因不明，二次手术贸然关瘘后再穿孔，不得已再造瘘。虽转院治疗，也未能治愈，最终死亡。推测术后肠套叠的发生可能与患儿原发病导致的肠壁损伤及肠功能紊乱有关。 3.1.2. 临床表现 术后肠套叠的临床症状、体征均不同于原发性肠套叠，很少出现典型的腹痛、血便、腹部包块，多表现为腹胀，呕吐胆汁液等消化道梗阻症状，经禁食、胃肠减压不能缓解 [ 6 ] 。本组两例患儿中，1例主要表现为腹胀、发热，1例可触及包块，伴造瘘口渗血。这也提示我们对于造瘘后出现肠梗阻、造瘘口渗血的患儿，应警惕肠套叠的发生。 3.1.3. 诊断与治疗 术后肠套叠的症状不典型，所以诊断比较困难 [ 6 ] 。小婴儿术后出现的腹胀、呕吐等梗阻表现，加之因为伤口或瘘口的原因，触诊不能准确辨别病变存在，经常会误认为术后肠功能未恢复，或进行保守治疗，而延误了术后肠套叠的诊断。临床上对怀疑肠套叠患儿常进行腹部彩超、CT、钡剂灌肠或空气灌肠等辅助检查。其中腹部彩超及CT检查对于术后肠套叠的诊断更具有特异性。彩超可见“靶环征”和“套筒征” [ 7 ] ，CT检查可见套叠部呈分层状靶形、肾形等肿块样改变 [ 8 ] 。钡灌肠虽然也是检查肠套叠的一种方法，但由于术后肠套叠多为小肠套叠，钡剂灌肠一般不易到达梗阻部位，故不宜做钡剂灌肠确诊。空气灌肠受回盲部的限制，对小肠套叠的诊断率和治愈率不高 [ 9 ] 。本组中例1患儿经造瘘口行肠镜检查显示了肠套叠征象，但由于婴幼儿肠道系统发育尚不完善，肠壁较脆弱，肠镜检查属侵入性操作，易损伤肠壁，造成副损伤，故不作为常规检查。综上可知，对于术后出现肠梗阻的患儿，要想到肠套叠的可能，仔细的体格检查、加之彩超、CT/核磁等辅助检查，应该不难诊断。 术后肠套叠一旦确诊应及时治疗，尤其肠造瘘术后，若合并肠套叠不能及时诊断，造成肠坏死，需肠切除，甚至可造成短肠综合征，危及生命。本组中1例行剖腹探查时套叠肠管已发生缺血坏死，不得已切除套叠肠管，另1例中，及时剖腹探查时见肠管血运好，手法复位成功，避免了肠切除。 3.2. 小婴儿术后肠套叠的预防 小婴儿自身年龄小、体重轻，各系统功能发育尚不成熟，加之手术打击大，术后各项功能恢复较缓慢。因此，对于行腹部手术的小婴儿，为了减少其术后肠套叠的发生，应采取以下预防措施：1) 腹部手术前，充分进行肠道准备。2) 尽可能缩短手术时间，减少肠管暴露时间；3) 减少对腹膜及盆腔神经丛的干扰和刺激；4) 术中减少对肠管不必要的牵拉及挤压；5) 术后加强抗感染，注意维持水电解质及酸碱平衡，尤其应注意术后补钾，因低血钾可影响肠功能的恢复 [ 10 ] ；6) 术后酌情给予微波等物理治疗，加快肠功能恢复；7) 尽可能采用微创手术，降低手术创伤 [ 11 ] 。 总之，对于行腹部手术的小婴儿，尤其是肠管暴露时间长的手术，若术后出现肠梗阻症状和体征时，应给予高度重视，积极进行相关检查，以便明确是否发生肠套叠，做到早期明确诊断，第一时间得到治疗，避免延误病情而导致更严重的后果。
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user: 摘 要 目的：探讨胰腺癌中医证型出现状况的内在规律，加深目前中医对食管癌不同证型的认识，寻找其规律。方法：统计分析1979年以来国内公开报道的有关胰腺癌中医证型分型的文献，数据应用Frequencie法和卡方检验对收集到的文献和病例资料进行讨论。结果：按照入选标准和排除标准，共纳入29篇论文，分析结果显示胰腺癌常见证型有6种，分别为湿热毒邪、气滞血瘀、脾虚湿热、脾虚、气血两虚、脾虚气滞。胰腺癌证型以实证多见，湿热毒邪与气质血瘀是胰腺癌最常见的证型。其次是虚实夹杂与虚证，二者均多以脾虚为本，在脾虚基础上伴有湿热，气滞，血瘀等标实表现。结论：目前对胰腺癌中医证候的证型研究尚属于探索阶段，仍需展开大样本的中医证候调查以提高证据的可靠性与科学性。 关键词 :胰腺癌，中医，证型分析
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user: 1. 引言 胰腺癌是世界上恶性程度最高的肿瘤之一，确诊后中位生存期不超过6个月，5年生存率不到6% [ 1 ] 。其发病率位居世界肿瘤第9位，死亡率第4位，男性发病率与死亡率均高于女性 [ 2 ] 。近年来胰腺癌在中国的发病率呈上升趋势，已取代肝癌成为“癌中之王” [ 3 ] 。其主要原因是胰腺癌起病隐匿，早期诊断困难，进展迅速，肿瘤细胞对传统治疗敏感性差。 对于不可切除的胰腺癌患者，中医药治疗取得确切疗效，为了探讨胰腺癌中医证型出现情况的内在规律，明确主要的中医证型，使中医药治疗更有针对性，本文就相关文献进行了筛选、整理、比较和统计分析。
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user: 2. 资料收集 1) 资料来源。采用计算机检索与人工检索相结合的方法，检索1979~2015年间公开发表在国内各种医学期刊上的中医药及中西医结合治疗胰腺癌的全文文献，通过检索词“胰腺癌”或“胰腺恶性肿瘤”及二次检索词“证型”或“分型”或“辨证”或“中医”或“中西医”的检索方法。 2) 文献选择及排除标准。选择标准：a) 符合胰腺癌的诊断标准；b) 有明确的中医辨证分型；c) 文献属于临床研究，排除动物实验。排除标准：a) 重复发表的文献；同一研究单位资料来源相同，经分析后进行整合，删除重复内容；b) 资料来源不明，与临床实际情况明显不符的；c) 只记录自拟方名，无具体辨证和治则的。 3) 中医证名规范描述参考标准《中医诊断学》 [ 4 ] 第五版教材的中医基本证候描述。 4) 文献资料整理。通过检索，查阅了1979年以来国内公开发表的胰腺癌的中医文献共112篇，按文献入选标准进行筛选，共筛选出符合要求的文献29篇。在这29篇文献中，收集有确切胰腺癌各证型病例数的文献，共收集到病例289例。 5) 证型归纳方法。29篇文献中胰腺癌证型分类数不一，最少的分1型，最多的可达8型，涉及不同名称的中医证型多达30余种，将这30余种证型按异名同类及主证、次证、苔、脉的描述进行归纳。具体实施如下：a) 笼统的证型提法如实证、虚证、虚实夹杂证删除。b) 不同提法但实质相同或相似的归为同一证型：比如，瘀毒阻络、瘀毒内结、瘀毒内阻统一归为瘀毒内结；气血两亏、气血亏虚、气血虚弱统一归为气血两虚；脾气不足、脾气虚弱、脾胃气虚统一归为脾胃气虚；胃热阴伤、阴虚胃热统一归为胃热阴虚。c) 不同证型按其所述的主症及病因病机，实质相同或相似，归为一型：如痰湿凝滞、痰热中阻、痰气互结，都是由于痰湿凝滞，化热或者阻滞气机引起，因此可以归为痰湿凝滞。d) 将专方治疗文献中的治法转换成与其相应的证型，如清热利湿法转换成湿热蕴结证，活血化瘀法转换成血瘀证。最终总结出15个证型，其中各个证型及其在29篇文献中提到的频次如表1所示。
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user: 4. 统计结果 4.1. 证型频次分布情况(见表1) 根据表1频次多少将其划为常见证型与少见证型两大类，可认为常见证型有6种，分别为湿热毒邪、气滞血瘀、脾虚湿热、脾虚、气血两虚、脾虚气滞；少见证型有9种，分别为肝郁气滞、肝郁蕴热、痰瘀内阻、寒湿阻遏、正虚邪实、阴虚毒聚、肝脾两虚、阴虚内热。其中湿热毒邪所占比例最高，共计18篇文献，占64.3%；其次是气滞血瘀，共15篇文献，占53.6%；排在第三位的是脾虚湿热，共计9篇文献，占32.1%。 4.2. 298例病例中的中医证型分布表 由表2可以看出有明确中医证型的298例病例中这6种常见证型的病例所占比例由高到低依次为：1) 湿热毒邪；2) 气滞血瘀；3) 脾虚；4) 脾虚湿热；5) 脾虚气滞；6) 气血两虚。其中湿热毒邪最多，共90例，占30.21%；其次是气滞血瘀，共81例，占27.18%；排在第三位的是脾虚，共39例，占13.09%。 为了明确胰腺癌中医证型构成分布是否具有差异性，笔者对298例病人中各证型病例数进行了χ 2 检验。具体见表3。 Table 1 The literature of TCM syndrome type of frequency distribution table of 29 article 实证 虚实夹杂 虚证 频次 构成比(%) 频次 构成比(%) 频次 构成比(%) 湿热毒邪 18 64.3 脾虚湿热 9 32.1 气血两虚 5 17.9 气滞血瘀 15 53.6 脾虚气滞 3 10.7 肝脾两虚 1 3.6 肝郁气滞 2 7.1 正虚邪实 1 3.6 脾虚 5 17.9 肝郁蕴热 2 7.1 肝郁脾虚 2 7.1 阴虚内热 2 7.1 痰瘀内阻 2 7.1 阴虚毒聚 1 3.6 寒湿阻遏 1 3.6 表1. 29篇文献中中医证型频次分布表 Table 2 298 cases of TCM syndrome type distribution tabl 证型 例数 构成比(%) 湿热毒邪 90 30.21 气滞血瘀 81 27.18 脾虚 39 13.09 脾虚湿热 34 11.41 脾虚气滞 30 10.07 气血两虚 4 1.34 其他证型 20 6.71 表2. 298例病例中的中医证型分布表 Table 3 298 cases of TCM syndrome type distributio 比较组 χ 2 P值 1和2 0.664 0.415 1和3 25.732 <0.001 1和4 31.934 <0.001 1和5 37.563 <0.001 1和6 <0.001 * 2和3 18.406 <0.001 2和4 23.801 <0.001 2和5 28.795 <0.001 2和6 <0.001 * 3和4 0.390 0.532 3和5 1.328 0.249 3和6 <0.001 * 4和5 0.280 0.597 4和6 <0.001 * 5和6 <0.001 * 表3. 298例病例中中医证型分布 * 代表Fisher精确检验。 4.3. 298例病例中中医证型分布比较 由表3可以看出:第1和2组与第3、4、5、6组均有显著性差异(P < 0.001)；第3、4、5组的病例数相近，彼此之间比较无显著性差异(P < 0.001)；但是第3、4、5组与病例数最多的第1、2组和第6组间均有显著性差异(P < 0.001)。因此，可以认为298例胰腺癌最常见的证型为：湿热毒邪型、气滞血瘀型，第3、4、5组虽病例数相近，但均与脾虚有关，脾虚为本，也应作为胰腺癌的重要分型。
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user: 5. 讨论 中医对于胰腺癌并没有记载，但根据相关的临床表现，本病当属于祖国医学“积聚”、“癥瘕”、“膈痛”、“结胸”等范畴。古人对此病的病因和病机有着详尽论述。如朱丹溪《活法机要》：“壮人无积，虚则有之，脾胃怯弱，气血两衰，四时有感，皆能成积。”《证治汇补》中记载：“积之始生，因起居不时，忧虑过度，饮食失节、脾胃亏损、邪正相搏，结于腹中。”积证的发生多由于正气不足、饮食内伤、情志不遂、脏腑虚弱，脏腑功能受损，外邪乘虚而入，致使气血运行不畅，气血凝滞，久留不散，渐成肿块 [ 5 ] 。 通过本次的回顾性分析，笔者发现，胰腺癌以实证多见，湿热毒邪与气质血瘀是胰腺癌最常见的证型。胰腺癌常见证型有6种，分别为湿热毒邪、气滞血瘀、脾虚湿热、脾虚、气血两虚、脾虚气滞。其次是虚实夹杂与虚证，二者均多以脾虚为本，在脾虚基础上伴有湿热，气滞，血瘀等标实表现。脾者土也，主化生气血，升降清浊，万物之生长皆源于土，即土爰稼穑，多数医家认为肿瘤(积聚)乃脾胃怯弱所致。因此，对于晚期胰腺癌的中医药治疗中偏湿热毒邪者多以清热、化湿、解毒为主；偏气滞血瘀者多以理气活血之药为主。在此基础上配以健脾理气治药，标本兼顾，共奏扶正祛邪之功。现代医学认为，健脾理气中药能改善胰腺癌患者的免疫状态，在一定程度上抑制或者延缓肿瘤的生长、增殖和转移，能够提高T淋巴细胞的功能以及拮抗T抑制细胞，同时对NK细胞有调节作用 [ 6 ] 。黄芪、党参等健脾理气药能使体内白介素-2增加，能诱导T细胞表达白介素-2受体，能使LAK活性增加 [ 7 ] [ 8 ] 。 在本次文献分析中，笔者发现胰腺癌的辨证分型存在多种问题，如：辨证依据种类繁多，缺乏统一的标准；临床入组病例数较少，纳入、剔除标准不详，缺乏说服力；中医证候判定仍存在主观性，缺乏客观的评定标准等。 肿瘤的形成过程复杂多变，对其辨证治疗也必当辨阴阳气血之盛衰及各脏腑经络之虚实，在胰腺癌的治疗中传统医学的疗效有待明确并且进行深入地发掘与研究。
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user: 摘 要 人类视觉系统对于处理视觉输入刺激的两侧对称性十分敏感，许多研究者对对称性视知觉进行了广泛而深入的研究。从对称性知觉在视觉认知过程中的作用、对称性知觉的认知神经机制以及与之相关的认知模型等方面，文章总结近年来关于对称性知觉的实证和理论研究工作。结果显示，对称性知觉是一个包括通过多个滤波器进行预处理后，在高级视觉加工脑区进行信息整合，并在多个层面上与其他认知加工成分不断交互的开放性的视觉认知过程。 关键词 :对称性加工，知觉组织，视觉加工，认知模型
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user: 1. 引言 1.1. 概述 对称性现象广泛存在于自然界以及人类社会当中，与之相关的研究也横跨物理学、化学、计算机等多个科学领域。基于人类视觉系统对对称性特征的显著敏感性，心理学有关对称性的研究由来已久，最初的心理物理学研究是在1886年由  Mach (1886) 指导的。该研究囊括了许多对人类对称性知觉研究工作的精彩洞见。而之后有关对称性的研究取得了全面性的进展。举例来说，最新的一些实验研究关注于空间滤波器的作用  (Dakin & Watt， 1994) ，判别面部对称性处理过程的特异机制  (Sirovich & Meytlis， 2009) ，以及对对称性加工与其他诸如深度加工和运动加工的其他视觉加工过程的交互过程的考察。此外，有关神经成像研究也开始提出对称性检测在大脑中执行的位置与过程的观点  (Cattaneo et al.， 2014) 。 1.2. 对称性的本质 从几何学观点来看，对称性的概念涉及等距同构的群即二维或三维欧几里得空间保持对象结构不变的几何变换。等距同构包括镜射对称(又名镜面对称或两侧对称)、旋转对称，平移对称(又称重复)以及它们的复合形式。虽然人类视觉系统对所有的这些对称形式敏感，但是两侧对称可能是唯一最显著的、最常被提及的、与人类及其他脊椎动物最相关的对称形式。从现象学来看，对称的突出特点是它在被观察者观察到时能凸显对象的结构。
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user: 2. 对称性加工在知觉组织中的作用 2.1. 知觉形成 许多研究表明对视觉输入的知觉组织直接涉及对称性加工。例如，对称性影响客体知觉形成的关键步骤之一的图形——背景分离过程。  Driver (1992) 等人的研究发现在用两可图形作为视觉刺激时，被试倾向于把感知到的对称形状作为图形而把不对称的形状作为背景。  Machilsen et al. (2009) 的研究证实了在共现知觉组织中对称性加工的参与。结果发现当形状对称时检测到的心理生理阈值显著低于当形状不对称时检测到的阈值。而对对称性参与客体知觉形成的有力证据始于对运动恢复结构(structure-from-motion，SFM)现象的研究  (Treder & Meulenbroek， 2010) 。结果表明三维体积结构可以通过实点的正弦运动得到。然而，如果点动模式是二维对称的，结果有可能会是两个相互分离的表面朝相反的方向移动，这表明对称性直接参与感知对象的定义。 2.2. 自动化加工 对称性加工参与客体知觉的形成的事实并不必然地表明其加工是自动化的——不依赖于认知控制。然而，还是有些证据支持对称性加工是自动化的。首先，对称性加工快速并且抗干扰，表明其被早期视觉加工机制所支持  (Barlow & Reeves， 1979; Carmody et al.， 1977) 。第二而且是关键的一点，对称性在与任务无关的情况下仍能够影响实验表现。在一项被试必须判断两个物体的正面轮廓是否对称的任务中，与任务无关的外部轮廓也对称时，实验结果更好  (Koning & Wagemans， 2009; Bertamini， 2010;   van der Helm & Treder， 2009) 。第三，如前所述，对称性能决定图形——背景分离过程。在对患有单侧空间忽视症的被试进行图形-背景分离的视觉加工任务的研究中，结果发现被试将刺激对称的部分感知为图形(与健康被试一样)，即使他对对称性并没有意识体验  (Driver et al.， 1992) 。第四，当分心物的空间分布对称时会提高视觉搜索任务的效率  (Wolfe & Friedman-Hill， 1992) 。第五，基于部分对称的自然图片的显著性模型比传统的基于对比的图形更能预测人类眼动。这表明在眼动到达对称物体前局部对称就已经被检测到了，也就意味着对于对称性知觉外显注意并不是必须的  (Kootstra et al.， 2009) 。
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user: 3. 对称性加工与其他认知过程的关系 3.1. 注意与意识 注意是一个能调节外侧膝状体等部位的神经活动的多水平选择加工过程。最初的心理生理学研究表明知觉组织过程依赖于注意过程  (Kastner & Pinsk， 2004) 。更明确地说，知觉组织过程之前被认为是自动化的，而事实是只要在视野中被注意选中的时候才能做到。这一假说的支持者通过无意盲视范式来加以论证  (Mack et al.， 1992) 。同样也有证据表明知觉组织的发生不仅不需要意识，注意同样也不需要。不用依靠实验后的外显记忆(比如在无意盲视范式中)，一些研究证明了在实验期间的内隐组织效应  (Chan & Chua， 2003; Lamy et al.， 2006) 。例如，被试的任务是判断同时呈现的两条线段哪根更长。线段周围有许多随机分布的圆点。在无意盲视试次中，这些实点组成向内后向外的箭头，从而制造出Müller-Lyer错觉。虽然被试报告称没有感觉到组织图形，实验还是得到了线条判断的组织效应  (Moore & Egeth， 1997) 。这就支持了意识和潜意识知觉组织之间是分离的观点。 至于对称性加工，目前相关研究得到的结果很少。在一项脑成像研究中，  Sasaki (2005) 等人发现即使被试参与一项与对称性无关的实验任务，对称性特异的脑区活动依然存在。  Olivers和van der Helm (1998) 用注视点呈现后的一到四个靶子的搜索任务来研究这一问题。被试的任务是尽快地决定其中任何一个靶子是否对称。作者把发现的边际效应即反应时随着靶子数量增加而递减作为对称性在视野中并非并行计算的证据。然而，对于此研究还是存在些许疑议。第一，它与无意盲视范式有着相同的缺点：它需要被试做出外显的反应。也许诸如利用对称性进行的知觉组织并不需要意识参与，而外显的口头报考肯定需要意识。第二，研究还存在可能的易混淆点。当任务只有一个靶子时，整体显示是总体对称的。当增加靶子数量后，总体对称减弱，当被试将总体对称作为判断线索时就可能导致反应时的增加。有研究显示总体对称优于局部对称  (Nucci & Wagemans， 2007) 。 其他对称性——意识之间关系的相关研究是有关单侧空间忽视病人的个案研究。对于没有对称性视觉加工的意识经验，被试依然倾向于将刺激物的对称的部分感知为图形。当然，从临床个例研究很难作进一步推断，也很难说明结论能在多大程度上从对称性推论到其他组织原则。各种证据似乎支持知觉组织的发生不需要意识和注意的参与，但这一问题还远未解决。 3.2. 提示线索、预期和随意控制 研究表明对称性加工可能通过集中注意的方法受提示线索、预期和随意控制的影响。第一，知识影响对称性加工。如果对称轴的方向在各实验试次中不同但在每个试次前都加以提示的话，相对于中性提示线索，正性的提示线索会提高判断速率而负性的提示线索会降低判断反应速度  (Pashler， 1990; Wenderoth & Welsh， 1998a) 。第二，通过调整任务参数改变被试的实验预期会影响实验结果。特别的是，当大多数实验试次的刺激图形的对称轴都并非垂直或平行时，垂直对称的显著性也大幅降低，这意味着有注意的随意转换的参与  (Wenderoth & Welsh， 1998b) 。第三，在由对称点阵组成的SFM刺激中，被试至少能部分地随意控制感知物是否是基于运动的组织结果还是基于对称性的组织结果。
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user: 4. 对称性视知觉的神经机制 4.1. 功能脑成像研究 虽然对称性知觉的功能特性在某种程度上是易于理解的，但是它的神经基础还是有待进一步研究。有些证据表明在对称性加工阶段双眼视觉神经元会得到补充  (Julesz， 1960; Julesz， 1966) 。对称性既可以被双眼视差定性也可被其破坏。与这点一致，如果两个随机点阵的重叠部分对称，这两个点阵分别呈现给不同眼睛时会被感知到具有对称性  (Wenderoth， 2000) 。另一项研究认为V1和纹状体，单眼视觉和双眼视觉细胞都参与了对称性加工过程。通过使用对称点刺激，研究者得到对称轴显示与有向线条一样的倾斜后效的结果。根据这些结果，作者认为方向编码和对称编码可能具有相似的机制  (van der Zwan et al.， 1998) 。有研究显示的不同空间尺度和不同方向的有关对称性的同时性加工表明在V1等皮层发现的单个皮层过滤器可以促进对称性检测  (Dakin & Watt， 1994; Julesz & Chang， 1979;   Rainville & Kingdom， 1999) 。 在一项研究中，被试参加标杆任务即被试需要判断横断线之间是否等长  (Wilkinson & Halligan， 2002) 。结果表明对称的出现与否与右扣带回的活动有关，而后者涉及注意分配。但是，实验并没有在早期视觉皮层发现针对对称性加工的神经活动。对于对称点阵，主要针对对称性的活动出现在背外侧枕叶皮质区，早期视觉皮层同样没有神经活动。而随后的研究改变了这一事实，一个更广泛的包括V3A，V4d/v，V7和侧枕叶LOC的神经网络被辨别出来。这些脑区的反应基本不随刺激类型(例如点阵图和曲线图)和大小改变而变化  (Tyler et al.， 2005) 。研究揭示了这些活动部分受注意的调节，即便被试执行与刺激结构不相关的点探测任务时针对对称性的神经活动仍旧存在。这与对称性检测是自动化的作用于任何视觉输入刺激的加工过程的观点相一致。该研究的作者还发现V3A，V4d/v，V7和侧枕叶的激活强度与感知物的知觉显著性相关。换句话说，对双重或一重对称而言，四重对称激活更高，完美对称比富噪对称更高，垂直对称比水平对称激活更高  (Sasaki et al.， 2005) 。 4.2. 脑电研究 使用电生理手段进行的有关对称性加工的时间动力学研究完善了由fMRI研究展开的实证工作。与初级视觉皮层不明显参与对称性检测的观点相一致，对称性刺激改变的只有事件相关电位ERP的后期成分。例如，在一项审美加工机制的研究，被试需要判断实验所呈现的对称或非对称的抽象几何图形是否具有美感或时候对称。在对称性判断任务中，ERP在后电极位置刺激后500~1000 ms内出现一个后期持续的负电位(Sustained Posterior Negativity， SPN)  (Höfel & Jacobsen， 2007) 。在另一项研究中，被试看到的是每隔500 ms快速呈现的二重对称或随机点阵的二择图形。ERP在对称性图形中再次出现持续负电位，但是这次ERP成分在刺激后200ms即分离，比之前的研究实质上要早  (Norcia et al.， 2002) 。二者的结果在一项使用棋盘刺激图片的研究中都得到进一步支持  (Oka et al.， 2007) 。
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user: 5. 有关对称性加工的认知模型 最近几年来，许多对称性加工认知模型都得到发展。而大体上，可以区分四类对称性加工模型。对称性加工的表征模型定义了在对称性知觉下各个刺激成分的结构与关系。过程模型专门解释为了实现对称性表征，视觉源刺激是如何被操作执行的。最后，有两类既包括加工过程又包括神经结构的混合模型。第一个空间滤波模型通过空间机制引发在视觉皮层执行的空间滤波操作。第二个是人工神经网络模型。模型的功能单元通过抑制性连接或兴奋性连接与其他单元交互。这些连接的权重会在在ANN学习检测对称性的阶段进行调整。 5.1. 表征模型 对称性(和其他组织规则)知觉最有影响力的表征模型是转换方法(the Transformational Approach， TA)和全息方法(the Holographic Approach， HA)。在视觉研究中，  Garner (1974) 和  Palmer (1983) 提出并完善了TA方法。它认为对称性是一系列包括平移、镜射和旋转的几何转换。虽然TA起初用于描述3D结构，泛化到2D模式依旧没问题。TA将其优雅归于其数学根基即把对称形成分成一系列几何操作。通过这一点，TA提供了涵括人类视觉系统对其敏感的几何关系的通用框架。 与TA的运动不变性不同，  van der Helm和Leeuwenberg (1999， 2004) 提出的与之竞争的全息方法HA假定增长不变性。在这条规则下，每个子结构应该显示相同的规律性。基于数学分析结果，HA提出三种规则：重复、对称和交替。最后的规则——交替引起莫阿效应的产生，而实验显示视觉系统对这种模式敏感  (Glass， 1969) 。 TA和HA主要在对规则结构的表述上有所区别。HA将对称视为点结构而TA将对称视为块结构。此外，HA还就规则的适用性做了量化预测。例如，它预测了富噪对称的适配性的优雅降级，而这被关于对称性检测的所有文献所支持  (van der Helm， 2000) 。 5.2. 过程模型 对比表征模型，过程模型并不是对对称或其他规律的刺激部分的静态关系的描述，而是表述从视觉输入提取对称信息的动力学机制。 在  Jenkins (1983) 的成分过程模型中，对称匹配对由虚线连接，这些线方向保持一致并且中点共线。Jenkins推测视觉系统对于这些一级结构敏感并把这些作为对称性检测的锚点。他的检测模型由三部分组成，具体包括检测虚线的同向性，把最显著的点对整合成显著特征，估计特征的对称性。 Wagemans (1993) 指出一级结构对于对称性检测的理解仍不充分。特别是，使用仿射变换时，即使保持方向同向和中点共线对斜对称的对称性检测依然会减慢。这就导致他们提出了将对称点对连成相关四边形的更高级结构的重要性。他们认为对称性检测利用通过接连虚线的自助过程来形成这些更高级结构。 5.3. 空间滤波模型 90年代对称性检测的模型中出现了不同的空间滤波模型。这些模型拟合了视觉系统对空间频率和视觉输入的定位内容敏感的事实  (Graham， 1989; de Valois， 1977; de Valois et al.， 1985) 。空间滤波模型阐述了对空间频率、方向定位、空间相位敏感的作用机制。 Dakin和Watt (1994) 提出了两阶段模型。在滤波阶段，输入的图象进入负责特殊空间频率的定向滤波器转换成只有黑斑和白斑的三进制图象。在第二阶段，应用斑点校准过程来衡量色斑重心对齐假定的对称轴的程度。 Kovesi (1997， 1999) 和  Osorio (1996) 提出了更复杂的两阶段模型。他们意识到如果图形分解成频率成分，考虑到局部对称轴的位置其相位信息是有用的。特别的是，图形边缘、线条和对称轴这三类刺激特征都具备相位一致性。图形边缘由急剧亮度变化定义，所以相应的空间谐波可由0˚或180˚相位的正弦波标识。线条是包含90˚或270˚相位的空间谐波的亮度最大值或最小值。虽然对称轴没有亮度变化，但是它的空间谐波由90˚和270˚相位叠加而成。为了从输入图象提取对称性信息，他们使用正交滤波器(两个滤波器，一个正弦相位，一个余弦相位)来实现对称与非对称的测量。在第一滤波阶段后，信号被平方化。Osorio分别累计了完美对称滤波器和奇异对称滤波器的能量。当从完美对称滤波器加总的能量达到最大而从奇异对称滤波器中加总的能量接近为零时一些实点会作为在对称轴上而进行标记。Kovesi事先决定好每个空间尺度的输出间的绝对偏差通过加权平均来加总两个滤波器的输出。值得一提的是，这些模型计算的只是局部对称。信息没有在更大范围进行整合来得到全局对称轴，做到这一点的是Dakin和Watt。 对对称轴的全局计算是通过  Gurnsey (1998) 的三阶段模型实现的。第一阶段中图象通过高斯函数得到平滑图象。然后执行全局差分操作，计算图形中每列对称位置像素的亮度平方差。在第三阶段，差分操作的结果通过垂直滤波器明确地检测出对称轴。 5.4. 人工神经网络模型 对称性检测的人工网络模型(Artificial Neural Network，ANN)是一连串与认知科学平行发展相对没有交流的计算机视觉研究领域的研究成果。其中一个原因是，ANN模型只是作为有效的对称性检测器而非人类对称性知觉的模型。即便如此，ANN模型仍是模拟在视觉皮层发现的诸如侧抑制的功能单位之间的交互作用的卓有成效的工具。而且，也有人试图就对称性知觉设计一个生理上可信的ANN模型。 例如，  Latimer，Joung和Stevens (1994) 的ANN模型能模拟在不同对称轴方向的对称性检测中人类的各向异性，但是他们的模型局限在只适合6 × 6像素的二进制图象。  Fukushima和Kikuchi (2006) 提出了一个多层ANN模型来模拟外侧膝状体LGN和V1的早期视觉加工的功能。首先，视觉源输入经过一层对向心和离心对比敏感的模块，与LGN神经元和视网膜神经节细胞的功能相类似。得到的输出会投射到由边缘检测器组成的类似V1简单细胞的一层。接下来的一层是模糊边缘提取层，类似于V1的神经巨细胞。最后，通过收集位于假定对称轴的对侧的单元活动来提取局部对称信息。
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user: 6. 讨论与结论 对称性知觉是一个快速并对对称性敏感的认知过程。对称性加工自动化进行并参与客体知觉形成，而且易受高级认知活动的影响。对称显著性随对称轴方向变动，显著性由高到低排列的顺序是垂直对称—水平对称—斜对称。对称轴数量越多，知觉对称性越显著。当对称轴是凹的时，对称性加工效率更高。视觉系统对对称性信息的提取有一定局限，但具有规模不变性。对称性加工在神经结构基础上受到包括V3A，V7和LOC等视觉皮层的广泛神经网络的支持。 最近出现的很多对称性知觉的模型，事实上没有一个能够对这一复杂的过程给出全面的描述。除了没有实现对称性知觉的所有特性外，多数模型最致命的一点是它们的解释特异性。许多模型只适合特定类型的刺激，比如点刺激、图形轮廓或密集图形。当然，无法找到对称性知觉的一般模型也说明多重加工过程都参与其中。比如，人类对称性视觉加工既对接近对称轴的图形区域敏感也对轮廓模式敏感，即便二者明显有不同的空间属性。值得一提的是关于中心对称，还没有同等成熟的模型出现。即便如此，许多空间滤波和神经网络模型都默认对称性知觉的两级架构。第一级作为一种预处理过程由一个或多个滤波操作构成。第二级是从预处理的输出中提取对称特征数量的对称操作。这种对称操作有许多形式，例如全局差分算子、斑点校准测量、滤波输出的成对比较。对称性检测的过程并不发生在早期视觉皮层中，但这些皮层可以执行很多预处理过程。外显的对称性检测涉及更大视野的信息整合，因而可能在一些具有很大感受野的神经元的诸如LOC一类的神经结构得到进一步执行。
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user: 摘 要 目的：考察独处能力在情绪智力与消极情感之间的中介作用。方法：采用情绪智力量表、独处能力量表、消极情感量表调查了310高中生。结果：1) 情绪智力、独处能力均与消极情感呈显著负相关，情绪智力与独处能力呈显著正相关。2) 情绪智力与独处能力均能显著地负向预测消极情感，且情绪智力通过独处能力的完全中介作用对消极情感产生间接的影响。 关键词 :情绪智力，独处能力，消极情感，中介效应
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user: 1. 问题提出 青少年时期是毕生发展中的关键期，按照发展心理学家Hall的观点，个体进入青少年时期，便进入了一个“暴风骤雨”的时期，注定要经历动荡与冲突  (雷雳，张雷，2003) 。伴随着各种生活事件，青少年会更容易感受到消极的情绪情感体验  (Cohen， Tyrrell， Smith， & Ap， 1993; McCullough & Huebner， 2000; Luhmann， Hofmann， Eid， & Lucas， 2012) 。因此青少年如何调节自身的消极情绪情感对其自身发展有着重要的影响，这也是心理学和教育学理论和实践研究中的永恒主题。 情绪智力(emotional intelligence)自被提出以来，一直倍受心理学者和教育学者的关注。情绪智力研究的先驱  Salovey和Mayer (1997) 认为情绪智力是一种分析情绪、调节情绪和促进情绪发展的能力。而且，情绪智力水平较高的个体其识别和表达情绪、理解情绪以及调节自身消极情绪情感的能力较高  (Matthews， Zeidner， & Roberts， 2004) 。国内外均有研究证实了情绪智力可以负向预测个体的消极情绪情感  (Kafetsios & Zampetakis，2008；许远理，熊承清，2009，郭素然，伍新春，郭幽圻，唐顺艳，2011) 。但情绪智力是如何调节个体的消极情绪情感这一过程并没有得到过多的讨论。本研究将对此问题作出初步的探索。 独处(solitude)是指个体与外界无互动，或意识上与他人分离，并能够自由选择个人身心活动的状态。独处是一种能够容纳不同情绪体验的开放性客观状态，对个体有积极的建设性意义  (陈晓，周晖，2012) 。从概念上看，独处具有改善个体情绪情感的功能。有研究者通过经验采样法(experience sampling method)发现，中晚期的青少年认为独处是一种需要，并认为独处能提供自己一个重要的机会使他们能够独立，反省以及自我探索  (Freeman， Larson， & Csikszentmihalyi， 1986) 。这说明当青少年经历负性生活事件时，会采用独处的方式去不断地审视自己内在想法，体验感受，探索其成因以及事件带来的影响，对调节消极情绪情感有所帮助。Larson等人(1990)的研究发现，青少年在独处后，心情会变得更加正面、兴奋；选择远离他人以释放消极负面的情绪，这也有助于个体的情绪情感更新。我国学者认为，个体主动地、积极地寻求独处更能体验到积极的情感体验；独处能力强的青少年，更容易处理生活中的消极情感  (吴丽娟，陈淑芬，2006；李琼，郭永玉，2007；戴晓阳，陈小莉，余洁琼，2011) 。由此可知，独处是青少年一种常用的、能有效调节消极情绪情感的应对方式。 综上所述，情绪智力是一种可以调控个体消极情绪情感的能力，独处则是青少年一种应对消极情绪情感的、更为具体的方式。情绪智力的成分(识别、表达、理解和调节情绪情感)与独处的功能有相似之处，即情绪智力是有可能通过独处来调节消极情绪情感的。所以，本研究假设独处在情绪智力和消极情感之间起中介作用。
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user: 2. 研究方法 2.1. 调查对象 运用随机抽样对某高中的非毕业班学生进行调查，共发放问卷400份，回收有效问卷310份，有效回收率为90.12%。其中男生112人(36.13%)，女生198人(63.87%)，独生子女134人(43.23%)，非独生子女176人(57.77%)。该高中的非毕业班并没有重点班与非重点班之分。 2.2. 测量工具 2.2.1. 情绪智力量表(EIS) Schutle等人(1998)根据Mayer和Salovey的情绪智力理论开发了EIS，该量表单维，共30个条目，5点计分，总分越高，则表示个体的情绪智力水平越高。国内学者王才康(2002)将EIS翻译成中文，后经  刘艳梅(2008) 的再次修订形成21道题的简版EIS。本研究采用刘艳梅所修订的量表，内部一致性信度为0.81，良好。 2.2.2. 独处能力量表(the Capacity to be Alone Scale) 采用  Larson (1990) 所编制的独处能力量表，含独处应对和独处适应两个因子，共20个条目，5点计分，总分越高，则表示个体的独处能力越强。我国台湾学者吴秀娟和陈淑芬(2006)将此量表进行了翻译和修订。本研究中，该量表的内部一致性信度为0.86，良好。 2.2.3. 消极情感量表(NAS) 采用  邱林，郑雪，王雁飞(2008) 所修订的NAS，该量表单维，共9个条目，5点计分，总分越高，则表示个体的消极情感水平越高。本研究中，该量表的内部一致性信度为0.82，良好。 2.3. 数据处理 采用SPSS20.0对数据进行录入和处理。统计分析采用描述性统计，积差相关和bootstrapping中介检验。p值均取双侧概率。
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user: 3. 研究结果 3.1. 描述性统计结果与变量间的相关 本研究中各变量的均值平均数(M)、标准差(SD)以及变量间的相关矩阵，见表1。结果显示，情绪智力与独处能力呈显著正相关，消极情感与情绪智力和独处能力均呈显著负相关。 3.2. 独处能力在情绪智力与消极情感之间的中介效应 为进一步探讨情绪智力、独处能力与消极情感的关系，根据  温忠麟和叶宝娟(2014) 对中介效应检验的建议，应对中介效应模型是否显著进行bootstrapping检验。本次检验采取  Hayes和Preacher (2014) 所编写的SPSS语法插件来进行分析，选择插件中的模型4进行检验。结果显示，参数c’的置信区间是[−0.3055， −0.1153]，该置信区间不包括零，说明独处能力在情绪智力与消极情感关系中起中介作用。
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user: 4. 讨论 本研究考察了情绪智力与消极情感的关系，并探讨了独处能力在情绪智力与消极情感之间的中介作 Table 1 The correlation of emotional intelligence， solitude， and negative affec M±SD 情绪智力 独处能力 消极情绪 情绪智力 3.73 ± 0.41 1.00 独处能力 2.77 ± 0.42 0.269 ** 1.00 消极情绪 2.29 ± 0.76 −0.116 * −0.389 ** 1.00 表1. 情绪智力、独处能力与消极情感的相关 注： * p < 0.05； ** p < 0.01，下同。 用。结果发现，情绪智力、独处能力与消极情感的相关均显著，且两者均能负向预测消极情感。另外，逐步回归分析结果表明，情绪智力通过独处能力间接地影响消极情感。以上结果说明，情绪智力作为一种调控情绪情感的能力，不仅对高中生的消极情感起缓冲抑制作用，还能能够影响独处，并以它为中介进一步影响消极情感。研究结果符合研究假设。 4.1. 情绪智力对消极情感的直接作用 本研究发现高中生的情绪智力对其消极情感具有负向预测作用。也就是说，个体认识和调节情绪的能力越强，其受消极情感困扰的程度就越低。该结果与已有研究结论相一致，也符合Salovey和Mayer所提出的情绪智力理论框架，该理论认为情绪智力水平高的个体能对不愉快的情感保持开放和接纳的态度，以及能管理好自身的情绪，调节消极情感，促进积极情绪的发生  (Salovey & Mayer，1997；   王晓钧，2000) 。 4.2. 独处对消极情感的直接作用 本研究发现高中生的独处能力对其消极情感也具有负向预测作用，即更愿意进行独处、更享受的个体更能摆脱消极情感的体验。该结果已以往观点相一致。Buchloz (1997)从需求角度出发，认为独处是一种积极的应对方式，是个体成长中不可或缺的。如果独处需求得不到满足，则个体的内在就会出现问题。此外，独处可以用来解决矛盾，降低病态，从而缓解消极情感，促进自我整合和心理健康。 4.3. 独处在情绪智力与消极情感关系中的中介作用 本研究通过引入独处来考察其在情绪智力与消极情感关系之间的中介效应，获得了一些有意义的结果。从中介效应检验结果可以看出，情绪智力是通过独处的完全中介作用才能影响消极情感。这意味着独处是缓解高中生消极情感的必经方式。这也符合日常生活的经验和研究结果。例如，Hall (1905)的研究发现，“让我一个人独处(leave me alone)”是青少年最常使用的短语  (陈静怡，2004) 。这说明了独处可以为个体提供一个自我反省、自我调控、自我整合的机会。而要想运用情绪智力去调节消极情感，个体就必须要进行自我反省、自我调控、自我整合，所以可以认为情绪智力必须通过独处才能有效地实现调控消极情感的目标。
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user: 摘 要 目的：克隆毛果杨漆酶基因LAC-1，对其进行生物信息学分析，并构建原核表达载体在大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达并纯化目的蛋白，为植物漆酶基因蛋白体外结构与功能的研究提供一定的理论基础。方法：根据同源克隆的原理，利用已经研究公布的拟南芥中的漆酶基因序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，利用PCR技术克隆毛果杨漆酶基因的序列，构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21并表达重组蛋白，通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。结果：克隆获得了毛果杨漆酶基因的序列(命名LAC-1，基因登录号XP_002310245)，序列分析表明LAC-1具有漆酶基因的保守结构域，进化树分析表明该序列与拟南芥的漆酶基因AtLAC4有较高的同源性，利用所构建的原核表达载体，经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论：LAC-1属于毛果杨基因家族的一员，该漆酶基因可以在体外成功进行原核表达，为毛果杨漆酶基因家族成员的鉴定及后续活性功能的分析提供了一定的理论基础。 关键词 :毛果杨，LAC，基因克隆，序列分析，原核表达
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user: 1. 引言 【研究意义】漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色氧化酶家族，漆酶广泛存在于植物和真菌中 [ 1 ] [ 2 ] 。目前有关真菌漆酶的研究与应用已有大量报道，但高等植物中有关漆酶的研究却相对较少。长期以来，植物细胞壁丰富的过氧化物酶被认为是催化木质素单体氧化聚合的首要酶。最近的研究表明，漆酶分泌到植物细胞次生壁，在有氧气存在时，可以催化同样的聚合反应。植物中的漆酶基因家族庞大，毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)作为一种有代表性的模式植物，其基因组测序已经完成，因此，研究并确定毛果杨的中的漆酶基因序列对进一步研究并阐明漆酶基因在植物中的作用与功能具有重要的意义。【前人研究进展】近年来，有关漆酶基因克隆与表达的研究主要集中在真菌漆酶方面，而漆酶的异源表达大多数的研究集中于真核生物毕赤酵母的研究中，Yang J等 [ 3 ] 克隆了白腐真菌中的一个漆酶基因并在毕赤酵母GS115中成功实现异源表达；顾春娟等 [ 4 ] 在毛头鬼伞漆酶的研究中，在欲表达的漆酶氨基酸序列的N端加入10个氨基酸标签后在毕赤酵母KM71中成功表达并测得活性。真菌漆酶原核表达方面的研究相对较少，Salony等 [ 5 ] 首次在大肠杆菌中成功表达了真菌黑蛋巢菌布里尼的漆酶蛋白，随后Søren Brander等 [ 6 ] 将克劳氏芽孢杆菌的漆酶基因在大肠杆菌BL21中成功进行了表达。【本研究切入点】目前，有关漆酶原核表达的研究只在真菌漆酶中有过研究，而植物漆酶基因的原核表达的研究确鲜见报道。【拟解决的关键问题】以模式植物毛果杨为材料，克隆其漆酶基因，构建原核表达载体，研究植物漆酶基因能否在体外成功进行原核表达，为植物漆酶基因家族成员的鉴定及后续结构功能的研究提供一定的理论基础。
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user: 2. 材料与方法 2.2. 实验材料与主要试剂 实验材料毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)无性系取自北京林业大学生物化学与分子生物学研究室。大肠杆菌(Escherichia coli)JM109及BL21(DE3)由本实验室保存。表达载体pET-30a(+)由本实验室保存。克隆载体PMD-18T，Ex Taq酶购自TaKaRa公司。植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒与普通质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。T4-DNA连接酶，限制性内切酶Kpn I和BamH I购自promega公司。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司。 2.2 实验方法 2.2.1. 毛果杨漆酶基因LAC-1的电子克隆与序列分析 根据同源克隆的原理，利用已经研究确定的拟南芥中的漆酶基因AtLAC4序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，找到与AtLAC4同源性较高的毛果杨中的疑似漆酶的基因序列，利用DNAMAN等软件分析LAC-1(基因登录号XP_002310245)的序列，获得分析结果。 2.2.2. 毛果杨漆酶基因LAC-1的进化分析 通过在NCBI网站上进行BLAST比对分析，得到大量毛果杨漆酶基因LAC-1具有相近进化关系的基因序列，这些基因大量存在于不同植物中，如欧亚槭(Acer pseudoplatanus)、白桦树(Betula platyphylla)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、野生大豆(Glycine soja)、欧洲云杉(Picea abies)、海岸松(Pinus pinaster)、可可树(Theobroma cacao)等。BLAST结果显示，这些相关的基因全部来自漆酶基因家族。然后将这些漆酶基因与LAC-1进行了进化分析，并利用MEGA6.0软件绘制了进化树。 2.2.3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及LAC-1-pET 30a (+)表达载体的构建 以生长健壮的毛果杨的组培苗的叶片为材料，根据北京天根生物公司的总RNA提取试剂盒的操作流程，提取毛果杨的总RNA。用1%的琼脂糖凝胶对提取的总RNA进行电泳检测。根据北京天根公司反转录试剂盒的操作步骤，以Oligo(dT)18为引物进行反转录得到毛果杨的cDNA序列。设计加入酶切位点的上游引物5’-GGGGTACCATTCTAGGATTCATTCCTTTTC-3’(划线部分为Kpn I的酶切位点)，加入酶切位点的下游引物为5’-CGGGATCCGCAAGGTGGAAGATCCTTAGGA-3’(划线部分为BamH I的酶切位点)。以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因，25 µL的PCR体系包含：2 µL毛果杨cDNA(约100 ng)、上下游引物各1 µL (10 pm/µL)、2.5 µL (2.5 mmol/L)dNTP、2.5 µL 10 × Ex Taq buffer、0.5 µL Ex Taq酶(2.5 U/µL)、14.5 µL ddH 2 O。PCR条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min后保存于4℃。 PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将回收的产物与pMD-18T载体连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化产物涂布于含氨苄(100 mg/L)的LB培养基上后于37℃的培养箱中过夜培养。挑取单菌落扩大培养后，提取质粒进行PCR初步鉴定，将阳性个体送到北京六合华大基因公司进行测序鉴定。 对测序正确的阳性个体进行扩摇后，提取质粒，与质粒pET-30a(+)同时进行限制性内切酶(Kpn I和BamH I)的双酶切，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收酶切目的条带用T4-DNA连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布于含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上过夜培养，待长出单菌落后挑取单菌落于含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中扩大培养，提取菌液的质粒后进行双酶切(Kpn I和BamH I)鉴定，获得LAC-1-pET30a(+)的重组原核表达载体。 2.2.4. 毛果杨LAC-1的原核表达及纯化 将含表达载体LAC-1-pET30a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)在含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上划线后于37℃过夜培养到单菌落长出，挑取单菌落于20 mL的含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中过夜培养，取5 mL过夜培养的菌液按1:100的比例扩大培养到500 mL的含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中培养3 h左右到OD 600 为0.6左右，加入抽滤灭菌的IPTG(终浓度为0.3 mmol/L)溶液，于28℃、140 rpm的摇床中诱导培养3 h。获得的菌液在4000 rpm的条件下富集菌体，以未加IPTG诱导的转化菌株为空白对照，以12%的SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的诱导表达结果。根据QIAGEN公司的蛋白纯化手册的步骤对目的蛋白进行纯化，以12%的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化结果。
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user: 3. 结果与分析 3.1. 毛果杨漆酶基因LAC-1及其蛋白序列的分析 利用拟南芥漆酶基因AtLAC4对毛果杨基因组数据库同源检索，我们得到同源性较高的毛果杨的的基因LAC-1，对其进行序列分析可知，其基因全长为2198 bp，其中含有6个外显子和5个内含子，其CDS序列全长为1635 bp，编码545个氨基酸，该序列没有信号肽大小约为60 KD。通过其与拟南芥中漆酶基因的氨基酸比对分析可知(图1)，该序列中具有漆酶基因的三个铜离子的保守结合域，其中铜离子结合保守域I中的保守氨基酸为四个H(组氨酸)残基，铜离子结合保守域II中的保守氨基酸为N(天冬氨酸)、L(亮氨酸)、V(缬氨酸)、K(赖氨酸)、P(脯氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)，以及铜离子结合保守域III的四个保守氨基酸H(组氨酸)、C(半胱氨酸)、H(组氨酸)、L(亮氨酸)。 3.2. 毛果杨漆酶基因LAC-1的进化树分析 从进化树中可以清晰的看到(图2)，同一物种的不同漆酶在进化关系上都有比较大的差异，这充分说明漆酶基因家族中不同的漆酶的功能可能存在比较大的差异。毛果杨的漆酶基因LAC-1与野生大豆(G. soja)的laccase-4以及拟南芥的漆酶基因laccase-4具有比较相近的进化关系，最近的研究已经表明拟南芥的漆酶基因laccase-4在拟南芥的木质素合成过程中起到重要的作用，由此我们可以初步推测毛果杨漆酶基因LAC-1可能在毛果杨木质素合成过程发挥重要作用。 3.3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及表达载体的构建 利用毛果杨组培苗的叶片为实验材料进行毛果杨总RNA的提取，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的质量(如图3(a))，利用反转录后得到的cDNA为模板，通过PCR扩增得到大小约为1.7 Kb的片段(如图3(b))，与杨树基因组数据库中公布的漆酶的基因序列大小基本一致，将该片段回收后与pMD-18T载体连接转化大肠杆菌JM109，提取质粒进行初步的PCR鉴定，将得到的阳性送去测序，将测序结果与杨树基因组数据库中的序列进行比对，得到正确的LAC-1基因序列。将测序正确的毛果杨LAC-1与pET-30a(+)同时进行双酶切(Kpn I和BamH I)后连接，获得重组质粒LAC-1-pET30a(+)，然后进行双酶切鉴定(如图3(c))。 3.4. 重组蛋白的诱导表达及纯化 将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，以未加IPTG诱导的转化菌株为对照，进行12%的SDS-PAGE电泳，从电泳结果可得(图4(a))，在60 KD左右的位置经IPTG诱导后有一条明显的蛋白条带表达，由此可以说明毛果杨漆酶基因LAC-1在大肠杆菌BL21(DE3)中可以实现成功表达，但该表达蛋白以无活性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。由于表达载体pET-30a(+)中带有六个组氨酸的标签，因此按照QIAGEN公司的蛋白纯化手册中的包涵体蛋白的纯化通过Ni-NTA亲和层析对包涵体蛋白进行纯化，得到了纯化后的重组蛋白(图4(b))。