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user: 3. 结果 3.1. 海水水质 2018年6月调查海域进行了水环境调查，主要水质因子监测结果见表2。各因子的平面分布情况如图2所示。 Table 2 Statistical results of major monitoring indicator 水质因子 样品数量 范围 平均值 叶绿素a (mg/m 3 ) 13 0.36~42.12 6.18 浮游 植物 种类数 13 75 (总计) 丰度(×10 4 /L) 13 0.4~816 162 多样性指数 13 0.58~3.12 1.86 海域 水质 水温(℃) 13 21.2~23.7 22.3 盐度 13 20.7~32.3 29.3 溶解氧(mg/L) 13 6.54~15.1 8.30 pH 13 8.03~8.60 8.20 活性磷酸盐(mg/L) 13 <0.001~0.030 0.008 化学需氧量(mg/L) 13 0.36~8.29 1.31 无机氮(mg/L) 13 0.051~0.998 0.414 活性硅酸盐(mg/L) 13 0.311~1.26 0.648 表2. 海域主要指标监测统计结果 图2. 主要环境因子平面分布图 参照国家《海水水质标准》(GB3097-1997)，所测参数中无机氮和活性磷酸盐是海水水质超标因子，其中无机氮浓度普遍较高，均值为0.414 mg/L，91.7%的样品超一类海水标准，平面分布上看，位于杭州湾口的北部海域无机氮含量明显高于其它区域；活性磷酸盐均值0.013 mg/L，其中41.7%样品超过一类海水标准，平面分布情况与无机氮呈同样趋势。其余各水质参数均没有超过一类海水标准 [ 12 ] 。 3.2. 浮游植物 本调查共鉴定浮游植物6门20科38属56种，其中硅藻30种，占53.6%；甲藻21种，占37.5%；金藻、裸藻、隐藻、针孢藻和鞭毛藻类各1种，各占1.8%。主要种类有Hillea sp.、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)等。细胞丰度均值为1.03 × 10 5 /L。叶绿素a含量均值为3.16 mg/m 3 ，调查海域中部为叶绿素a含量的高值海域(图3)。其中在渔山列岛附近海域发现赤潮，在赤潮发生区域(J2018)叶绿素a含量为42.12 mg/m 3 ，浮游植物细胞丰度为8.16 × 10 8 /L，其中东海原甲藻丰度占98.5%，可以认为这是一次东海原甲藻事件(图4)。 图3. 海域叶绿素平面分布 图4. 各站位浮游植物细胞丰度 3.3. 微生物群落 3.3.1. 序列统计 采集赤潮发生海域测点(HAB01)和附近未发生赤潮海域测点(ZJ0205)表层水体微生物进行基于Illumina平台的高通量测序。共获微生物原始序列75451对(pair-end reads)，序列平均长度为412 bp。经质量控制和序列优化，筛选出高质量序列77430条。考虑到各站位测序数据差异较大，本研究进行了进一步随机抽样将数据标准化，以平衡采样误差对后续分析的影响。原始序列通过预处理，按97%序列相似度进行划分，共得到595个OTU，其详细分布见表3。 Table 3 Summary of sequence information of marine sediment microbe 站位 原始序列 有效序列 优化序列 可操作分类单位(OTUs) HAB01 38203 37983 37540 420 ZJ0205 37248 37045 36890 505 表3. 微生物序列信息统计 应用mothur软件对优化序列进行随机抽样，以抽到的序列数与它们的Chao1指数构建稀释曲线如图5所示。结果显示，各站位曲线均趋向平坦，说明本实验测序数量合理，OTU取样已达到或接近饱和，实验结果基本反映了样品的物种多样性。 图5. 海域沉积物微生物稀释曲线 3.3.2. 微生物种类组成 本次调查共鉴定细菌16门82科126属。其中门分类水平上，变形菌门(Proteobacteria)是第一优势门类，其序列数占总数的38.4%；其次是蓝细菌(Cyanobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，其序列数占总数的29.9%和24.3%。这三类细菌序列数占总数的92.6%，此外，放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和浮霉菌门(Planctomycetes)等也有一定数量的检出，赤潮发生区(HAB01)及附近海域(ZJ0205)微生物门类组成如图6所示。另外从属的分类水平上看，Bacillariophyta、Candidatus Pelagibacte和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)中的某些属是主要优势菌属，主要菌属组成如图7所示。 通过属水平的维恩(Venn-Diagram)图分析赤潮发生点及附近海域水体微生物群落的差异(图8)。从属水平上看，两区域共有微生物75属，占59.5%，共有物种占一半以上；赤潮发生海域水体微生物特有物种11属，占8.7%；附近海域水体特有微生物物种40属，占31.7%。从种类组成上看，二者有近一半的不同物种，双方水体微生物有一定程度的差异。 图6. 微生物种类组成(门水平) 图7. 微生物种类组成(属水平) 比较二类水体微生物的主要优势门类(表4)。从门水平上看，二类水体中相对丰度占前四位优势种其中有二个门类是重合的，赤潮水体的第一优势菌和附近海域的第二优势菌均是变形菌门，赤潮水体的第二优势菌和附近海域的第三优势菌均是拟杆菌门。但各优势菌所占比例双方差异较大，如赤潮区域第一优势菌为变形菌门(占46.1%)，在附近海域中占30.6%，而附近海域中第一优势菌蓝细菌(占42.0%)，在赤潮区域仅占17.7%。 图8. 微生物群落差异维恩图(属水平) Table 4 Dominant species of marine microbes (phylum level 第一优势菌 第二优势菌 第三优势菌 第四优势菌 HAB01 变形菌门(Proteobacteria)， 占46.1% 拟杆菌门(Bacteroidetes)， 占27.2% 蓝细菌(Cyanobacteria)， 占17.7% 疣微菌门(Verrucomicrobia)， 占1.0% ZJ0205 蓝细菌(Cyanobacteria)， 占42.0% 变形菌门(Proteobacteria)， 占30.6% 拟杆菌门(Bacteroidetes)， 占21.4% 放线菌门(Actinobacteria)， 占0.4%. 表4. 微生物主要优势种(门水平) 黄备等采用可培养技术对台州海域发生东海原甲藻赤潮及对照海域水体细菌进行分离纯化，并对获得菌株进行基于生化反应的种类鉴定 [ 13 ] 。结果表明，赤潮水体中主要优势菌为弧菌、假单胞菌等均属变形菌门，与本次调查结果一致。但其在未发生赤潮的朱家尖海域发现主要优势菌是黄杆菌、气单胞菌，而本次调查结果为蓝细菌门，二者差异较大。这是由于二次调查采用的技术手段不同，本次调查采用的16s高通量测序手段与传统的细菌生化鉴定存在着很大的差异，加上二者采样海域也不同，因此结果存在着相当的差异。王剑等对不同时期条纹环沟藻赤潮时间可培养细菌的单菌落16S rDNA序列测定对细菌进行了分子分类鉴定，发现细菌多是以变形菌门和拟杆菌门的细菌类群为主 [ 14 ] 。常虹等采用末端限制性酶切片段长度多态性分析(T-RFLP)等分子生物学方法，通过主成分分析、克隆文库的构建，研究深圳大鹏湾海域锥状斯氏藻赤潮发生期间细菌群落结构，结果发现细菌的种类主要属于变形杆菌门、拟杆菌门和厚壁菌门 [ 15 ] 。Hye-Eun Kang等对韩国巨济岛海域发生赤潮异弯藻期间的微生物群落进行了分子生物学研究，其中16S rDNA测序及种类鉴定结果显示在赤潮水体变形菌门和拟杆菌门是二大最主要的细菌类群，其次为厚壁菌门和放线菌门 [ 16 ] 。由此可见，采用分子生物学技术研究赤潮发生时水体微生物群落，虽然赤潮原因种、研究海域等条件均不相同，但从门水平上看，水体微生物群落结构比较相似。变形杆菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门是最主要的细菌类群。本次研究的结果也证实了这一结论。