Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị ung thư
Bài viết được tư vấn chuyên môn bởi Tiến sĩ Đặng Văn Đức - Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Times City. Năm 2017, cơ quan thực phẩm và dược phẩm hoa kỳ (FDA) đã cấp phép cho 2 dạng điều trị sử dụng CAR-T là Kymriah của hãng Novartis cho điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp ở trẻ em và Yescarta của hãng Kite Pharma cho các bệnh lymphoma không phải Hodgkin ở người lớn.Liệu pháp tế bào CAR-Tđã mở ra kỷ nguyên mới trong điều trị ung thư bằng tế bào miễn dịch. 1. Giới thiệu chung về liệu pháp tế bào CAR-T Khi tỷ lệ tử vong do các bệnh truyền nhiễm có xu hướng giảm xuống thì ung thư lại tăng lên và trở thành nguyên nhân thứ 2 dẫn đến tử vong sau các bệnh về tim mạch. Người ta dự đoán rằng một nửa đàn ông và một phần ba phụ nữ sẽ phát triển ung thư ở một vài thời điểm trong cuộc đời của họ, và một phần năm trong số đó sẽ chết vì ung thư. Từ khía cạnh miễn dịch học, các tế bào ung thư xuất phát từ các tế bào tự thân bị biến đổi mà thoát khỏi các cơ chế điều hoà phát triển bình thường của cơ thể
Việc nhận dạng và tấn công các tế bào ung thư của hệ thống miễn dịch cũng như sự trốn thoát của tế bào ung thư xảy ra theo ba giai đoạn: (I) Giai đoạn một là các tế bào ung thư được nhận dạng bởi hệ thống miễn dịch thông qua các kháng nguyên khối u và bị tiêu diệt. (II) Giai đoạn 2 là các tế bào ung thư tìm cách cân bằng nhờ việc duy trì sự tăng sinh và trải rộng được kiểm soát bởi đáp ứng miễn dịch thích nghi (adaptive). (III) Giai đoạn 3 là sự trốn thoát của các tế bào ung thư khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch nhờ tích luỹ thêm các đột biến làm cho các tế bào ung thư trở nên bất tử và di căn (Owen et al, 2018, Kuby Immunology, 8th edition). Cáctế bào lympho Tsở hữu thụ thể tế bào T đặc hiệu, nhạy cảm và liên tục tìm kiếm các tín hiệu ung thư, qua đó kích thích đáp ứng miễn dịch liên tiếp khi xác định được các kháng nguyên ung thư. Do vậy tế bào T có khả năng giết tế bào ung thư tiềm tàng một cách chính xác. Tuy nhiên, tế bào T thông thường chỉ có thể tấn công yếu ớt hoặc không thể chống lại tế bào đã bị biến đổi do: (I) Tính sinh kháng nguyên nghèo nàn (antigenicity). (II) Không biểu hiện kiểu hình rõ ràng
(II) Không biểu hiện kiểu hình rõ ràng. (III) Khả năng tương tác và ức chế đáp ứng miễn dịch cao của các tế bào biến đổi. Do vậy thụ thể kháng nguyên khảm (Chimeric Antigen Receptors, CARs) đã được phát triển để kích thích và hoạt hoá đáp ứng của tế bào T chống lại tế bào ung thư (Medler et al, 2015, Trends Cancer. Bracci et al, 2014, Cell Death Differ. D’Aloia et al, 2018, Cell Death Dis). Các thụ thể này được gọi là khảm bởi vì CARs kết hợp tính đặc hiệu của một vùng chức năng nhận dạng kháng nguyên ung thư có ái lực cao -thường có nguồn gốc từ một kháng thể đơn dòng- với các vùng chức năng hoạt hoá tế bào T trong cùng một thụ thể. Tế bào T biểu hiện CARs (CAR-T cells) có tiềm năng đáng kinh ngạc chống lại các bệnh ung thư máu. Hàng loạt các thử nghiệm lâm sàng sử dụng CD19-CAR-T cho thấy tỷ lệ đáp ứng từ 50-90% đồi với ung thư tế bào lympho B không kiểm soát được bằng các liệu pháp thông thường (Maude et al, 2014, N. Engl. J. Med. Brentjen et al, 2013, Sci. Transl. Med. Grupp et al, 2013 N. Engl. J. Med. Kochenderfer et al, 2015, J. Clin. Oncol. Schuster et al, 2015, Blood. Lee et al, 2015, Lancet, Gardner et al, 2017, Blood. Turtle et al, 2016, J. Clin. Invest
Clin. Oncol. Schuster et al, 2015, Blood. Lee et al, 2015, Lancet, Gardner et al, 2017, Blood. Turtle et al, 2016, J. Clin. Invest. Turtle et al, 2016, Sci. Transl. Med.). Năm 2017, cơ quan thực phẩm và dược phẩm hoa kỳ (FDA) đã cấp phép cho 2 dạng điều trị sử dụng CAR-T là Kymriah của hãng Novartis cho điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp ở trẻ em và Yescarta của hãng Kite Pharma cho các bệnh lymphoma không phải Hodgkin ở người lớn. Vào tháng 5 năm 2018, FDA tiếp tục cấp phép cho liệu pháp tế bào CAR-T Kymrial của hãng Novatis cho điều trị lymphoma không phải Hodgkin trên người lớn (nguồn www.fda.gov). Theo dữ liệu đăng ký trên CellTrials.org, hiện có 190 thử nghiệm lâm sàng dùng tế bào CAR-T đang được thực hiện trên nước Mỹ và 73% trong số đó nhắm tới điều trị ung thư máu và 27% nhắm tới các loại ung thư thể rắn. Ngoài raliệu pháp CAR-Tcũng được được áp dụng ở châu Âu như Anh (16 thử nghiệm), Bỉ (10 thử nghiệm), Đức (6 thử nghiệm), Pháp (3 thử nghiệm), Tây ban Nha (8 thử nghiệm), Italia (4 thử nghiệm)... Ở châu Á, Trung Quốc đứng đầu với 357 thử nghiệm lâm sàng, Nhật bản (3 thử nghiệm), Singapore (1 thử nghiệm). 2
Ở châu Á, Trung Quốc đứng đầu với 357 thử nghiệm lâm sàng, Nhật bản (3 thử nghiệm), Singapore (1 thử nghiệm). 2. Cấu trúc phân tử của CARs CARs chuyển các tín hiệu nhận dạng kháng nguyên thành một thác truyền tín hiệu tác động lên các chức năng đáp ứng của tế bào T như: tiết các nhân tố gây độc, các cytokine tiền viêm. Các thành phần quan trọng của thụ thể CAR gồm: (i) vùng nhận dạng kháng nguyên ngoại bào, ví dụ phân đoạn biến đổi chuỗi đơn (scFv), (ii) vùng xuyên màng tế bào và một vùng bản lề giúp đính thụ thể lên màng tế bào và phóng scFv ra không gian ngoại bào, và (iii) các vùng truyền tín hiệu nội bào được kích hoạt nhờ tương tác với kháng nguyên trên scFv (Hình 1) ) (Labanieh et al,Nature Biomedical Engineering, 2018). Vùng nhận dạng kháng nguyên: Tính đặc hiệu kháng nguyên của CAR được quyết định bởi vùng scFv (vùng chức năng nhỏ nhất của một kháng thể đơn dòng). scFv chỉ chứa vùng biến đổi chuỗi nhẹ và chuỗi nặng dung hợp lại với nhau thông qua một linker rất linh động
scFv chỉ chứa vùng biến đổi chuỗi nhẹ và chuỗi nặng dung hợp lại với nhau thông qua một linker rất linh động. Ưu điểm của việc sử dụng scFv làm vùng nhận dạng kháng nguyên CAR là: dễ ghép vào cấu trúc CAR chung và tính đặc hiệu cao do chúng được tao ra để gắn đặc hiệu kháng nguyên quan tâm (Hình 1) ) (Labanieh et al,Nature Biomedical Engineering, 2018). Vùng chức năng bản lề và xuyên màng: Vùng chức năng bản lề linh động là một đoạn peptide ngắn giúp scFv tự do biến đổi cấu hình, qua đó scFv tự do bám với kháng nguyên đích biểu hiện trên tế bào ung thư. Vùng này có thể được sử dung một mình hoặc liên kết với một vùng chức năng đệm để phóng scFv ra khỏi bề mặt tế bào T. Vai trò của vùng chức năng xuyên màng là tác động đến biểu hiện của CAR và liên kết với các protein màng nội sinh của tế bào T (Hình 1) (Labanieh et al,Nature Biomedical Engineering, 2018)
Vùng chức năng đồng hoạt hoá: Eshhar and các cộng sự là những người đầu tiên chứng minh được rằng gắn scFv với chuỗi z (zeta) hoặc gamma của thụ thể tế bào T (T cell receptor) mang lại cho tế bào lympho T tính đặc hiệu như kháng thể và khả năng hoạt hoá tất cả các chức năng của một tế bào hiệu ứng (effector), bao gồm sản xuất IL-2 và phá huỷ tế bào đích. Sau đó, rất nhiều nỗ lực đã được tiến hành để tạo ra các cấu trúc CAR khác nhau nhằm cải thiện chất lượng, sức mạnh và thời gian thu nhận tín hiệu từ các phân tử khảm. Những cải tiến mang tính cách mạng nhằm tăng khả năng tăng sinh, tiết IL-2, sống sót và chức năng gây độc của tế bào CAR-T bao gồm: gắn kèm chuỗi zeta z (thế hệ thứ nhất), gắn thêm chuỗi zeta và CD28 (thế hệ thứ 2), hoặc kết hợp thêm một vùng chức năng truyền tín hiệu thứ 3 (thế hệ thứ 3) như 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ICOS và CD27. Thế hệ thứ 4 bao gồm các CAR được bảo vệ để tăng cường tính bền bỉ trong môi trường khối u (Hình 1) (Labanieh et al,Nature Biomedical Engineering, 2018). Sau khi thiết kế xong CAR, cần đưa gen mã hoá nó vào tế bào T một cách bền vững
Sau khi thiết kế xong CAR, cần đưa gen mã hoá nó vào tế bào T một cách bền vững. Hai vector được sử dụng phổ biến nhất cho mục đích này là retrovirus mất khả năng nhân lên: g-retrovirus và lentivirus. Cả hai loại virus này đều sử dụng nguyên liệu di truyền là RNA mà được phiên mã ngược thành DNA sau khi chuyển nạp tế bào T, và sau đó được cài vào hệ gen của tế bào chủ và biểu hiện thành protein (Gomes-Silva et al, 2018, Biotechol J.PMID: 28960810). Nhờ những đặc điểm như vậy mà CAR có chức năng kép (a) nhận dạng các kháng nguyên biểu hiện trên bề mặt tế bào ung thư (b) chủ động kích thích và khuyếch đại các tín hiệu hoạt hoá và xúc tác phá huỷ tế bào ung thư. Ưu điểm của hệ thống này là (1) cung cấp các tế bào T được tái lập trình mang cơ chế hoạt hoá ex-novo (2) tránh được các cơ chế ức chế đáp ứng miễn dịch do tế bào ung thư gây ra và (3) nhận dạng kháng nguyên ung thư và xúc tác phá huỷ tế bào ung thư không cần thông qua HLA, bằng cách đó có thể vượt qua được các rào cản để liệu pháp miễn dịch tế bào được ứng dụng rộng rãi hơn (Gross et al, 1992, FASEB J). 3
3. Quy trình sản xuất CAR-T trong lâm sàng 3.1 Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi Bước đầu tiên trong quy trình sản xuất tế bào CAR-T tự thân là thu nhận tế bào máu đơn nhân từ máu ngoại vi của bệnh nhân, thường sử dụng leukapheresis (Hình 2). Bằng cách đó máu được lấy ra khỏi người bệnh để thu nhận tế bào miễn dịch chứa tế bào T trong khi các thành phần còn lại được đưa trở lại hệ thống lưu thông máu của bệnh nhân (Gomes-Silva et al, 2018, Biotechol J.PMID: 28960810. Vormittag et al, 2018, Curr Opin Biotechnol. Levine, 2015, Cancer Gene Ther, PMID: 25675873). 3.2 Tái lập trình tế bào T Sau đó có thể làm giàu tế bào T trước khi chuyển sang các bước kế tiếp. Tế bào T tiếp đó được hoạt hoá nhằm nhân lên và tăng cường khả năng biến đổi di truyền bởi vì hầu hết các hệ thống chuyển nạp/lây nhiễm yêu cầu các tế bào đã hoạt hoá và/hoặc đang phân chia. Có thể sử dụng các tế bào trình diện kháng nguyên dòng tuỷ như tế bào tua để hoạt hoá tế bào T. Tuy nhiên việc sử dụng các tế bào trình diện kháng nguyên tự nhiên này thường tốn thời gian, chi phí cao và tỷ lệ thành công biến đổi giữa các bệnh nhân
Có thể sử dụng tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo như dòng tế bào leukemia tuỷ K562 làm tế bào nuôi giúp hoạt hoá tế bào T. Có thể biểu hiện thụ thể hoạt hoá tế bào (ví dụ như CD40, CD80 và CD86) trên những tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo này nhằm tăng cường khả năng trợ giúp hoạt hoá tế bào T. Thêm nữa, có thể biến đổi di truyền các tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo này để biểu hiện các kháng nguyên được tế bào CAR-T nhận dạng, qua đó giúp nhân lên một cách chọn lọc các tế bào CAR-T đặc hiệu kháng nguyên. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và phổ biến nhất để hoạt hoá tế bào T là sử dụng kháng thể đơn dòng kháng CD3 và CD28. Những kháng thể này được phủ lên đĩa nuôi cấy hoặc được gắn với hạt từ hoặc tồn tại dưới dạng chất nền cấu trúc nano. Những phương pháp này tăng cường khả năng phân chia của tế bào T (Hình 2) (Gomes-Silva et al, 2018, Biotechol J.PMID: 28960810. Vormittag et al, 2018, Curr Opin Biotechnol. Levine, 2015, Cancer Gene Ther, PMID: 25675873). 3.3 Tăng sinh Tế bào T sau đó được chuyển nạp gen mã hoá cho CAR và nhân lên trong một vài ngày cho đến hàng tuần (Hình 2)
3.3 Tăng sinh Tế bào T sau đó được chuyển nạp gen mã hoá cho CAR và nhân lên trong một vài ngày cho đến hàng tuần (Hình 2). Mục đích của bước này là tạo ra lượng lớn tế bào CAR-T (1011 tế bào) để khi tiêm trở lại bệnh nhân chúng có thể tạo ra đủ hiệu quả kháng u. Mặc dù các hệ thống nuôi cấy tĩnh (ví dụ như đĩa và các chai nuôi cấy đáy bằng) được sử dụng rất phổ biến trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu, nhưng chúng thường đắt, tốn nhân công làm việc trong phòng thí nghiệm và khó đạt được lượng lớn tế bào. Do vậy trong nghiên cứu lâm sàng việc sản xuất liệu pháp tế bào CAR-T hầu hết dựa trên các hệ thống lò phản ứng sinh học với khả năng nuôi cấy quy mô lớn và ưu việt hơn. Trong các hệ thống này, tế bào nhân lên nhanh và dễ đạt được lượng lớn tế bào. Các hệ thống nuôi cấy đa nhiệm, bao gồm hoạt hoá, chuyển nạp, nuôi dưỡng, tăng sinh, rửa và thu hoạch tế bào trong một quy trình khép kín và tự động hoá sẽ làm giảm được các rủi ro về nhiễm trùng và giảm tổng chi phí vận hành trong phòng thí nghiệm và nguyên vật liệu
Hãng Miltenyi Biotec đã phát triển một hệ thống nuôi cấy khép kín và tự động bởi gọi là CliniMACS ProdigyTM, tích hợp máy tinh sạch tế bào miễn dịch từ máu với một hệ thống tách tế bào bằng từ tính, và một thiết bị nuôi cấy cho phép chuyển nạp virus vào tế bào T và nuôi cấy tăng sinh. Việc kết hợp tất cả các bước này trong một thiết bị sẽ làm giảm nhu cầu về phòng thí nghiệm vô trùng lớn. Với những cải thiện này, chỉ cần 7 đến 14 ngày để tăng sinh đủ số lượng tế bào CAR-T cần tiêm cho bệnh nhân (Gomes-Silva et al, 2018, Biotechol J.PMID: 28960810. Vormittag et al, 2018, Curr Opin Biotechnol. Levine, 2015, Cancer Gene Ther, PMID: 25675873). Mặc dù tế bào T nhân lên rất tốt in vitro, nhưng cần cân bằng giữa số lượng tế bào tối đa khi tăng sinh với khả năng biệt hoá cũng như kiệt sức của chúng bởi vì điều này làm tế bào T già đi và có tuổi thọ ngắn trong cơ thể sau khi truyền. Trong quá trình tăng sinh, tế bào T được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung cytokine tiền viêm để phát động quá trình sinh trưởng nhưng ngăn cản sự biệt hoá hoàn toàn, bằng cách đó cải thiện sức sống và chức năng đáp ứng khi được tiêm vào bệnh nhân
Các cơ sở lâm sàng khác nhau sử dụng các tổ hợp cytokine kháng nhau như IL-2, IL-7 và IL-15 hoặc IL-15 và IL-21, nhưng liệu cái nào tốt hơn thì vẫn đang được nghiên cứu chi tiết. Tuy nhiên, vai trò kép của IL-2 là tăng sinh cả tế bào T thường và tế bào T điều hoà thì có thể không tốt cho mục đích sử dụng CAR-T trong điều trị ung thư (Gomes-Silva et al, 2018, Biotechol J.PMID: 28960810. Vormittag et al, 2018, Curr Opin Biotechnol. Levine, 2015, Cancer Gene Ther, PMID: 25675873). 3.4 Chuẩn bị bệnh nhân Một vài ngày trước khi thực hiện liệu pháp tế bào CAR-T, bệnh nhân phải được hoá trị để làm giảm số tế bào lympho nội thân, và điều này cho phép tế bào CAR-T mọc ghép và trải rộng tốt hơn. Làm giảm lượng tế bào lympho nội thân còn tạo ra các “phòng trống” cho tế bào CAR-T và làm giảm ức chế miễn dịch, nguyên nhân có thể đe dọa đến sự trải rộng của tế bào CAR-T. Làm giảm tế bào lympho nội thân cũng giải phóng các cytokine viêm nội bào với vai trò quan trọng trong phát động chức năng tế bào CAR-T khi chúng được truyền vào (Hình 2) (Brudno et al, Nat Rev Clin Oncol, 2018, PMID: 28857075. Olweus, Nature Biotechnology, 2018, PMID: 28591119)
Olweus, Nature Biotechnology, 2018, PMID: 28591119). 3.5 Truyền tế bào CAR-T trở lại bệnh nhân Các tế bào CAR-T sau khi vượt qua được các đánh giá và kiểm tra chất lượng sẽ được truyền cho bệnh nhân. Liều lượng của tế bào CAR-T, bao gồm liều tế bào tối ưu, số liều truyền và thời gian truyền biến đổi tuỳ quy trình được thiết lập ở các trung tâm lâm sàng. Số lượng tế bào CAR-T đạt đỉnh trong khoảng 1 đến 2 tuần sau khi truyền. Mức độ trải rộng và tồn tại của tế bào CAR-T là một trong những yếu tố quan trọng để đánh giá hiểu quả của liệu pháp tế bào CAR-T. Tế bào CAR-T có khả năng phát triển thành tế bào T nhớ. Cụ thể hơn, tế bào CAR-T hướng đích CD19 có thể tồn tại tới 4 năm trong cơ thể (Brudno et al, Nat Rev Clin Oncol, 2018, PMID: 28857075. Olweus, Nature Biotechnology, 2018, PMID: 28591119. Porter et al, Sci Transl Med, 2015, PMID: 26333935). 4. Tác dụng phụ của CAR-T và các hướng tương lai Mặc dùliệu pháp tế bào CAR-Tđã chứng minh được tính khả thi trong lâm sàng, đôi khi liệu pháp tế bào CAR-T cũng gây rất nhiều độc tính có thể đe doạ tính mạng, như hội chứng giải phóng cytokine hay bão cytokine, gây độc thần kinh, tấn công nhầm đích và hội chứng suy hô hấp cấp
Những hiệu ứng bất lợi này dẫn tới nỗ lực phát triển các chương trình kiểm soát để điều chỉnh hoạt động của liệu pháp tế bào CAR-T. Rất nhiều phương pháp đã được khai phá và phát triển để lập trình các hệ thống thao tác di truyền kết hợp với hệ thống kiểm soát phản hồi và các mô đun an toàn bằng cách tận dụng những tiến bộ gần đây trong sinh học tổng hợp. Các chiến lược này bao gồm: (i) công tắc kiểm soát, (ii) các hệ thống CAR cảm ứng có thể dễ dàng bật tắt CAR theo mong muốn và (iii) hệ thống CAR nhạy cảm môi trường khối u để tâng cường khả năng diệt tế bào ung thư và làm giảm tấn công các tế bào khoẻ mạnh (Labanieh et al,Nature Biomedical Engineering, 2018). 5. Chi phí Chi phí điều trị CAR-T của hãng Novartis là 475.000 USD và của Kite Pharma là 373.000 USD. Tuy nhiên, chi phí này chưa bao gồm các chi phí liên quan đến điều trị, nằm viện và các chi phí xử lý tác dụng phụ liên quan (Dolgin, Nature, 2018, PMID: 29517030).