櫻田門外之變是發生于日本安政七年三月三日（1860年3月24日）的一起政治暗殺事件，不滿幕府大老兼彥根藩藩主井伊直弼的水戶藩激進浪士，于江戶城櫻田門（今東京都千代田區的警視廳正對面）外突襲準備進城的井伊直弼隊伍，井伊直弼當場慘死。
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自黑船來航后，主張開國的彥根藩主井伊直弼與主張攘夷的水戶藩主德川齊昭對立日深，之後又爲了十三代將軍的繼承人問題各自形成對立派系，政爭的結果由井伊直弼勝出，安政五年（1858年）井伊直弼出任幕府大老，不但獨斷地與美國簽訂《日美修好通商條約》。翌年（1859年）德川齊昭發動反攻，聯合越前藩主松平慶永、尾張藩主德川慶恕及自己的兒子一橋家當主一橋慶喜闖入江戶城質問井伊直弼，結果因為這種過於無禮的行為反遭井伊直弼下達永久退隱的處份。之後井伊直弼決定全力鎮壓反對勢力，大舉逮捕水戶藩及攘夷派的志士，並以嚴刑論處，釀成安政大獄，一時間風聲鶴唳，尤其水戶藩士的積怨已瀕臨界，有些謀畫暗殺的激進藩士為免連累本藩而事先脫藩變成浪士，反撲活動暗潮洶涌。
水戶藩的和等激進派浪人脫藩和薩摩藩的暗地溝通，打算帶領薩摩兵上京以孝明天皇敕書的名義發動軍事政變，但因薩摩藩局勢變化，兩藩士的計劃受挫。水戶的激進派決定策劃襲擊大老，薩摩只有有村一人蔘加。
暗殺
安政七年三月三日（1860年3月24日），這天是上巳之日，也是駐居在江戶的大名固定要進城謁拜的日子，以水戶藩浪士為主的暗殺集團決定於今日起事。
天寒未明，路上積雪處處，一行人飽餐一頓由東海道品川宿（今東京都品川區）的旅店出發，經過大木戶后在札之辻轉向，途經網坂（今東京都港區的慶應義塾大學附近）、神明坂、中之橋，接著穿過櫻田通，在愛宕山的愛宕神社與次會合，向櫻田門進發。此時共計有水戶浪士17人、薩摩浪士1人，後世合稱「櫻田十八士」。由於井伊直弼的宅邸在櫻田門附近，櫻田門為井伊直弼進城的必經之路，所以暗殺集團便埋伏在櫻田門附近等候，直弼身邊僅帶著隨從等人，並沒有任何防備。
當天不合時令地下著大雪，能見度很差，護衛的侍從穿著蓑衣，刀藏在裡面，對襲擊方來說是有利的條件。江戶幕府開幕以來在光天化日之下膽敢襲擊大名座轎是想也未曾想到的事情，造成彥根藩的大意。
上午9時許，井伊家開門，約60人的護衛隊伍圍繞著井伊直弼的大轎出來。暗殺團的森五六郎手持訴狀，偽裝成攔轎喊冤的樣子迅速接近井伊的隊伍，在與井伊家護衛糾纏之際，冷不防地拔刀砍殺井伊的護衛，其他護衛見狀蜂涌上前，此時暗殺團的黒澤忠三郎以手槍向井伊直弼的轎子開槍，貫穿轎子，射中井伊直弼的腰部與大腿，井伊直弼立刻無法動彈。這槍響同時也是暗殺團發動總攻擊的暗號，四面埋伏的暗殺份子紛紛突襲井伊隊伍。轎伕受驚嚇一轟而散。數名侍衛想搬動座轎，被當場斬倒，不得不放棄座轎。彥根藩士因為刀在袋中無法拔出，有的只能用刀鞘抵抗，有的徒手抓對方刀時手指被斬落，處於不利的境地。只有二刀流高手河西忠左衛門冷靜地脫掉蓑衣拔出刀來守護在座轎一側，斬殺了稻田重藏等襲擊者。但是一人難敵眾人最後被殺。河西刀刃捲起的刀儲存在彥根城博物館。
井伊從附近趕來的護衛雖有人數上的優勢，但因大雪與措手不及而招架不住敗退。暗殺團的稻田重藏首先攻入井伊直弼的轎子附近，但遭直弼身邊的護衛砍死。隨後唯一的薩摩藩浪士有村次左衛門成功擊倒轎旁的護衛，一把將受重傷井伊直弼由轎中拖出斬首，與廣岡子之次郎一同帶著井伊的首級突圍，但先後被砍成重傷，最後朝向日比谷門方向逃逸。有村次左衛門在若年寄的宅邸前切腹自盡，廣岡子之次郎則在姬路酒井家前切腹。暗殺團中同樣因重傷而切腹自殺的尚有山口辰之介及鯉淵要人。
通說襲擊事件后彥根藩邸馬上派人前往案發現場，回收了座轎和沾滿鮮血的手指、耳朵；但由於直弼的首級被帶走存放于遠藤家宅邸。彥根藩知道以後，謊稱遭有村帶走的是年齡、體格和直弼相仿的斗死藩士加田九郎太的首級，經溝通后將直弼首級帶回，在藩邸命典醫和軀體縫合後下葬。
暗殺團事成后各自散逃，8人帶傷向官府自首，2人于逃亡途中被捕，1人于逃亡兩年後自殺，只有2人在逃亡后得享餘年。
死傷者和處分
襲擊者中最初接近座轎的稻田重藏被河西斬倒后立刻死亡。有村次左衛門，廣岡小之次郎、山口辰之介、鯉淵要人等在彥根藩士的拚死反擊之下負重傷，到其他藩邸自首后切腹自刃，除此之外的要麼自首要麼被捕后被殺或死於獄中，只有增子金八和海后磋磯之介潛伏到明治年代活了下來。
井伊家除了井伊直弼另有8人死亡（當場死亡4人、傷重死亡4人）、13人負傷。死亡者準許保留武士名分。作為擔當直弼護衛失敗的責任，2年後1862年（文久2年）下達了對倖存者的處分決定：草刈鍬五郎等重傷者減俸並流放到藩領的下野國佐野幽禁處分，輕傷者全部被勒令切腹，無傷者和轎伕一律斬首、除去武士名分。處分不光涉及本人還連帶親族，對幕府家臣是很大的警示。
影響
井伊試圖把幕政由「與雄藩協調」的體制拉回「由幕府主導、阻止朝廷介入政治」的政治路線出現破綻，造成幕府權威喪失，幕末的尊王攘夷運動開始激化。最終拉開依靠恐怖暗殺來達到政治目的的序幕。
1864年（元治1年）天狗黨之亂中，彥根藩士口號是為井伊直弼報仇，封鎖中山道迎擊從筑波山向京都進發的水戶藩士。天狗黨人不得不走美濃經飛驒進入越前，最後在敦賀投降，武田耕云斎等水戶浪人352人在此被處決。彥根藩士處決水戶浪人的刑場是來迎寺。
其後的井伊家
據當時的官方記載：「井伊直弼急病發作，在與病魔鬥爭中提出家業繼承狀，受理中病死」。這是幕府爲了防止譜代大名井伊家和水戶藩進一步關係激化而作的掩蓋。井伊家的菩提寺豪德寺井伊直弼墓碑上所刻死亡日期是「三月二十八日」。是爲了隱瞞直弼的死訊，裝作直弼在櫻田門外受傷；將軍還給直弼的藩邸送來慰問品。大名們也紛紛效仿派使者來慰問，當中也有水戶藩的人，彥根藩士怒目相對。根據井伊家飛地世田谷代官大場家的記錄，爲了假裝直弼只不過是受傷，大場家的人還舉行了祈願直弼早日康復的儀式。然而襲擊過後尾張德川家等其他大名的座轎不斷經過，很多人看到雪地上的鮮血，大老被暗殺的事情很快傳揚出去。
1862年（文久2年）率兵上京的島津久光擁護勅使大原重徳要求幕府革新，要幕府在松平慶永的主導下清算井伊政權，結果罷免了直弼親信的老中安藤信正和久世広周、剝奪井伊家京都守護的家職、讓松平容保擔任京都守護。井伊家石高也從35萬石減為25萬石。彥根藩不得不把直弼心腹長野主膳和宇津木景福斬首並斷絕往來，但是沒有對他們減封。
華族令施行時井伊家被封為伯爵，這個爵位是按照減封后的石高作為標準。如果石高35萬石，井伊家認為領有半個近江國的話，應該是侯爵。然而減封后是9萬石左右，即使不減封石高15萬石也不可能是侯爵。爵位是按照華族令施行時的石高為準，跟因為安政大獄而遭到新政府冷遇完全沒有關係。戊辰戰爭中，鳥羽伏見之戰中和薩摩藩兵一同守衛東寺和大津最初就顯示出勤王的姿態，在逮捕近藤勇的過程中因為有功賞與2萬石。直弼的兒子井伊直憲的妻子是有棲川宮家，井伊家作為舊譜代大名已經受到很多優待。
相關人物
櫻田十八士
* 関鉄之介（徒士格，現場總指揮，沒參加格鬥；逃亡后被捕，1862年被斬首，享年40）
* 岡部三十郎忠吉（戰鬥現場清點，沒參加格鬥；逃亡后被捕，1861年被斬首，享年44）
* 稻田重藏正辰（郡方；本來要其與金子一同逃走，應本人強烈要求參加，戰死，享年47）
* 山口辰之介正（重傷后自刃，得年29）
* 鯉淵要人珍陳（神官；重傷后自刃，享年51）
* 廣岡子之次郎則賴（小普譜；重傷后自刃，得年21）
* 黑澤忠三郎勝算（馬廻組；自首后病死，享年33）
* 齋藤監物一德（神官；自首后因傷重死亡，享年39）
* 佐野竹之助光明（小普譜；自首后因傷重死亡，得年21）
* 大關和七郎增美（大番組；自首，1861年被斬首，得年26）
* 森五六郎直長（自首，1861年被斬首，得年24）
* 蓮田一五郎正實（寺社方；自首，1861年被斬首，得年29）
* 森山繁之介政德（町方屬吏；自首1861年被斬首，得年27）
* 海后磋磯之介（神職；逃亡后改名為菊池剛藏，明治維新后在警視廳水戶縣警察本部供職1903年沒，享壽78）
* 杉山彌一郎當人（留付列；自首，1861年被斬首，享年38）
* 廣木松之介有良（町方屬吏；逃亡后1862年自刃，得年27）
* 增子金八（逃亡后1881年歿，享年59）
* 有村次左衛門兼清（薩摩藩士；重傷后自刃，得年23）
彥根藩側
* 井伊直弼（大老，彥根三十五萬石藩主；享年46）
* 巖崎德之進重光（伊賀奉行；負傷，歸宅后死亡）
* 小河原秀之丞宗親（小姓；戰死，享年30）
* 加田九郎太包種（騎馬徒士；戰死，享年31）
* 河西忠左衛門良敬（劍豪；戰死，享年30）
* 日下部三郎右衛門令立（物頭；負傷，在藩邸死亡，享年39）
* 越石源次郎滿敬（負傷，歸宅后死亡）
* 澤村軍六之文（戰死）
* 永田太郎兵衛正備（戰死）
* 朝比奈三郎八（無傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
* 朝比奈文之進（無傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
* 小幡又八郎（無傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
* 小島新太郎（無傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
* 長野十之丞（無傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
* 藤田忠藏（輕傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
* 水谷求馬（無傷，歸宅后入獄，1862年被斬首）
參與襲擊
* 金子孫二郎教孝（郡奉行，主謀；在伏見被捕，1861年被斬首，享年58）
* 高橋多一郎愛諸（小姓頭取，矢倉奉行，主謀之一；在大阪自刃，享年47）
* 高橋莊左衛門諸惠（多一郎的長子；在大阪自刃，得年19）
* 有村雄介兼武（次左衛門兄長；和薩摩藩的聯絡人、金子、佐藤一同上京；在伏見薩摩藩邸被捕，切腹，得年28）
* 佐藤鉄三郎（金子的副手，和金子一起在伏見被捕。流放后更名為安島鐵三郎，后寫書記錄下暗殺和上京途中的經過，明治期任水戶藩吏，1915年去世）
* 川崎孫四郎健干（郡吏，在大坂的聯絡人；自刃，享年35）
* 小室治作（高橋的隨從，自刃）
* 大貫多介則光（高橋的隨從，被捕后死於獄中。得年26）
* 山崎獵藏恭禮（和薩摩藩士的聯絡人，被捕后絕食死。享年33）
* 島男也龍雄（笠間藩士，高橋的隨從，被捕后1861年死於獄中，享年53）
* 小野寺慵齋（土浦藩士，兵學者；參謀之一，1861年自刃）
* 宮田瀨兵衛（事件后聲稱有關，向熊本藩自首，死於獄中，享年47）
其他
* 飯田左馬忠彥（國學者，也是有棲川宮家的家臣，懷疑與此事有關聯而被抓，自殺。享壽63）
* 滝本いの（關鐵之介的情人。原本是吉原谷本樓的妓女。隱藏鐵之介。被追蹤鐵之介的幕吏所抓，在傳馬町牢內受拷問致死，得年23）
* 佐久良東雄良哉（京都妙法院的武士。因為隱藏高橋多一郎，莊左衛門遭逮捕，絕食死，享年50）
* 後藤權五郎輝（鄉士。和事件無關但因和當事人原本是朋友。用廣木松之介的名義自首。1862年死於獄中，享年32）
和解
櫻田門外之變中敵對的水戶和彥根在事件發生110年後的1970年締結為友好城市。水戶以偕樂園的梅花、彥根以城壕中的天鵝互贈對方。水戶和彥根和解的中介是敦賀，敦賀是天狗黨之亂中屠殺天狗黨的地方。水戶和敦賀因為天狗黨的關係，在1964年結為友好城市。
2013年彥根市長選舉時，有反對者指出候選人之一有村國知是仇人有村次左衛門的後代，這樣人的怎麼能成為彥根市市長。